NO325532B1 - Pyrrolsubstituerte 2-indolinoner, farmasoytisk preparat omfattende slike, fremgangsmate for a modulere den katalytiske aktiviteten til en proteinkinase in vitro basert pa bruk av slike forbindelser, samt anvendelse av slike forbindelser til fremstilling av medikamenter for behandling av sykdommer. - Google Patents

Pyrrolsubstituerte 2-indolinoner, farmasoytisk preparat omfattende slike, fremgangsmate for a modulere den katalytiske aktiviteten til en proteinkinase in vitro basert pa bruk av slike forbindelser, samt anvendelse av slike forbindelser til fremstilling av medikamenter for behandling av sykdommer. Download PDF

Info

Publication number
NO325532B1
NO325532B1 NO20023831A NO20023831A NO325532B1 NO 325532 B1 NO325532 B1 NO 325532B1 NO 20023831 A NO20023831 A NO 20023831A NO 20023831 A NO20023831 A NO 20023831A NO 325532 B1 NO325532 B1 NO 325532B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
compound
pyrrole
carboxylic acid
dimethyl
group
Prior art date
Application number
NO20023831A
Other languages
English (en)
Other versions
NO20023831L (no
NO20023831D0 (no
Inventor
Peng Cho Tang
Chung Chen Wei
Todd A Miller
Li Xiaoyuan
Sun Li
Shahrzad Shirazian
Congxin Liang
Thomas Vojkovsky
Asaad D Nematalla
Michael Hawley
Original Assignee
Sugen Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27391578&utm_source=***_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=NO325532(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Sugen Inc filed Critical Sugen Inc
Publication of NO20023831D0 publication Critical patent/NO20023831D0/no
Publication of NO20023831L publication Critical patent/NO20023831L/no
Publication of NO325532B1 publication Critical patent/NO325532B1/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D233/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings
    • C07D233/54—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D233/56—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with only hydrogen atoms or radicals containing only hydrogen and carbon atoms, attached to ring carbon atoms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D207/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D207/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D207/30—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D207/32—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with only hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D207/33—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with only hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached to ring carbon atoms with substituted hydrocarbon radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D209/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D209/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom condensed with one carbocyclic ring
    • C07D209/44—Iso-indoles; Hydrogenated iso-indoles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D231/00—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazole or hydrogenated 1,2-diazole rings
    • C07D231/02—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazole or hydrogenated 1,2-diazole rings not condensed with other rings
    • C07D231/10—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazole or hydrogenated 1,2-diazole rings not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D231/12—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazole or hydrogenated 1,2-diazole rings not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with only hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D249/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having three nitrogen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D249/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having three nitrogen atoms as the only ring hetero atoms not condensed with other rings
    • C07D249/08—1,2,4-Triazoles; Hydrogenated 1,2,4-triazoles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
    • C07D401/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings
    • C07D401/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
    • C07D401/14—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing three or more hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D403/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00
    • C07D403/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings
    • C07D403/06—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings linked by a carbon chain containing only aliphatic carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D403/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00
    • C07D403/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings
    • C07D403/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D403/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00
    • C07D403/14—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing three or more hetero rings

Abstract

Den foreliggende oppfinnelse angår pyrolsubstituerte 2-indolinonforbindelser og deres farmasøytisk akseptable salter som modulerer aktiviteten til proteinkinaser og derfor er forventet å være anvendelige for forebyggelsen og behandlingen av proteinkinaserelaterte cellulære sykdommer slik som kreft.

Description

BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN
Oppfinnelsens område
Den foreliggende oppfinnelse angår visse 3-pyrrolsubstituerte 2-indolinonforbindelser. Oppfinnelsen angår videre fremgangsmåte for å modulere den katalytiske aktiviteten til en proteinkinase in vitro basert på bruk av slike forbindelser samt anvendelse av slike forbindelser til fremstilling av medikamenter for behandling av sykdommer. Fremgangsmåter for fremstilling av slike forbindelser er også beskrevet.
Kjent teknikk
PK'er er enzymer som katalyserer fosforyleringen av hydroksygrupper på tyrosin-, serin- og tyrosinrester på proteiner. Konsekvensen av denne forsåvidt enkle aktiviteten er forskyvning; cellevekst, differensiering og proliferering, dvs. så og si alle aspekter ved en celles liv er på én eller annen måte avhengig av PK-aktivitet. Videre har unormal PK-aktivitet blitt relatert til en mengde sykdommer som strekker seg fra relativt ikke livstruende sykdommer slik som psoriasis til ekstremt virulente sykdommer slik som glioblastoma (hjernekreft).
PK'er kan formålstjenelig fordeles på to klasser, proteintyrosinkinaser (PTK'er) og serin-treoninkinaser (STK'er).
Ett av de primære aspektene ved PTK-aktivitet er deres rolle i forhold til vekstfaktorreseptorer. Vekstfaktorerreseptorer er celleoverflateproteiner. Når vekstfaktorreseptorer bindes til en vekstfaktorligand omdannes vekstfaktorreseptoren til en aktiv form som reagerer med proteiner på den indre overflaten av en cellemembran. Dette medfører fosforylering av trypsinrester på reseptoren og andre proteiner og til dannelsen av komplekser med mangfoldige cytoplasmatiske signalmolekyler på innsiden av cellen som igjen påvirker mange cellulære responser, slik som celledeling (proliferering), celledifferensiering, cellevekst, eksklusjon av metabolske virkninger på det ekstracellulære mikromiljø osv. For en mer fullstendig diskusjon, se Schlessinger og Ullrich, Neuron. 9:303-391 (1992).
Vekstfaktorreseptorer med PTK-aktivitet er kjent som reseptortyrosinkinaser («RTK'er»). De omfatter en stor familie transmembrane reseptorer med ulik biologisk aktivitet. Inntil nå er i det minste nitten (19) distinkte underfamilier av RTK'er blitt identifisert. Et eksempel på dette er underfamilien angitt som «HER»-RTK'er som inkluderer EGFT (epitelvekstfaktorreseptor), HER2, HER3 og HER4. Disse RTK'er består av et ekstracellulært glykosylert ligandbindingsdomene, et transmembrant domene og et intracellulært cytoplasmatisk katalytisk domene som kan fosforylere tyrosinrester på proteiner. En annen RTK-underfamilie består av insulinreseptor (IR), insulinlignende vekstfaktor I-reseptor (IGF-IR) og insulinreseptorrelatert reseptor (IRR). IR og IGF-IR reagerer med insulin, IGF-I og IGF-II og danner en heterotetramer av to fullstendig ekstracellulære glykosylerte a-subenheter og to P-subenheter som krysser cellemembranen og som inneholder tyrosinkinasedomene.
En tredje RTK-underfamilie er referert til som platelettutledet vekstfaktorreseptor («PDGFR»)-gruppen som inkluderer PDGFRoc, PDGFRp, CSFIR, c-kit og c-fms. Disse reseptorene består av glykosylerte ekstracellulære domener sammensatt av varierende antall immunoglobulinlignende løkker og et intracellulært domene hvori tyrosinkinase-domenet er avbrutt av ubeslektede aminosyresekvenser.
En annen gruppe som på grunn av dets likheter med PDGFR-underfamilien ofte legges inn under sistnevnte gruppe er fosterleverkinase («flk»)-reseptorunderfamilien. Denne gruppen er antatt å bestå av kinaseinnskuddsdomenereseptor føtal leverkinase-1 (KDR/FLK-1, VEGF-R2), flk-lR, flk-4 og fms-lignende tyrosinkinase 1 (flt-1).
Et ytterligere medlem av tyrosinkinase vekstfaktorreseptorfamilien er fibroblastgruppe-faktoren («FGF»)-reseptorundergruppen. Denne gruppen består av fire reseptorer, FGFR1-4, og syv ligander FGF1-7. Selv om den enda ikke er godt definert synes det som om reseptorene består av et glykosylert ekstracellulært domene inneholdende et variabelt antall immunoglobulinlignende løkker og et intracellulært domene hvori tyrosinkinasesekvensen er avbrutt av regioner av ubslektede aminosyresekvenser.
Enda et annet medlem av tyrosinkinasevekstfaktorreseptorfamilien er den vaskulære endotele vekstfaktor («VEGF»)-reseptorundergruppen. VEGF er et dimert glykoprotein som ligner på PDGF men har forskjellige biologiske funksjoner og målcellespesifisitet in vivo. Spesielt er det for tiden antatt at VEGF spiller en essensiell rolle i vaskulogenesen og angiogenesen.
En mer fullstendig liste over kjente RTK-underfamilier er beskrevet i Plowman et al., DN& P. 7(6): 334-339 (1994).
I tillegg til RTK'ene finnes det også en familie av fullstendig intracellulære PTK'er kalt «ikke-reseptortyrosinkinaser» eller «cellulære tyrosinkinaser». Den sistnevnte angivelsen, forkortet «CTK» vil bli anvendt heri. CTK'er inneholder ikke ekstracellulære og transmembrane domener. Til nå har over CTK'er i 11 underfamilier (Src, Frk, Btk, Csk, Abl, Zap70, Fes, Fps, Fak, Jak og Ack) blitt identifisert. Src-underfamilien synes så langt å være den største gruppen CTK'er og inkluderer Src, Yes, Fyn, Lyn, Lek, Blk, Hek, Fgr og Yrk. For en mer detaljert diskusjon av CTK'er, se Bolen, Oncogene. 8:2025-2031 (1993).
Serin/treonin-kinaser, STK'er, slik som CTK'er, er hovedsakelig intracellulære selv om det er noen få reseptorkinaser av STK-typen. STK'er er den mest kjente av de cytosoliske kinasene; dvs. kinaser som utøver deres funksjon i den delen av cytoplasma som ikke utgjøres av de cytoplasmatiske organellene og cytoskjelettet. Cytosol er den regionen inne i cellen hvor mye av cellens intermediære metabolske og biosyntetiske aktivitet foregår; f.eks. er det i cytosol at proteiner syntetiseres på ribosomer.
RTK'er, CTK'er og STK'er har blitt innblandet i mangfoldige patogene tilstander inkludert i betydelig grad kreft. Andre patogene tilstander som har blitt assosiert med PTK'er inkluderer uten begrensning psoriasis, hepatisk cirrose, diabetes, angiogenese, restenose, øyesykdommer, reumatoid artritt og andre inflammatoriske sykdommer, immunologiske sykdommer slik som autoimmun sykdom, kardiovaskulære sykdommer slik som aterosklerose og mangfoldige nyretilstander.
Med hensyn til kreft er de to hovedhypotesene fremsatt for å forklare den overdrevne cellulære prolifereringen som driver tumorutvikling relatert til funksjoner kjent for å være PK-regulerte. Det vil si det er foreslått at malign cellevekst er et resultat av en nedbrytning i en mekanisme som kontrollerer celledeling og/eller differensiering. Det har blitt vist at proteinproduktene av et antall protoonkogener er involvert i signal-overføringsreaksjonsveiene som regulerer cellevekst og differensiering. Disse proteinproduktene av protoonkogener inkluderer de ekstracellulære vekstfaktorer, transmembrane vekstfaktor PTK-reseptorer (RTK'er), cytoplasmatiske PTK'er (CTK'er) og cytosoliske STK'er som diskutert ovenfor.
I lys av den tidlige linken mellom PK-relaterte cellulære aktiviteter og de svært mange humane sykdommene er det ingen overraskelse at en stor innsats er brukt i et forsøk på å identifisere måter å modulere PK-aktivitet. Noen av disse forsøkene har involvert bioetterligningstilnærminger ved anvendelse av større molekyler som etterligner de involvert i de aktuelle cellulære prosesser (f.eks. mutantligander (US patent nr. 4 966 846); løselige reseptorer og antistoffer (WO 94/10202, Kendall and Thomas, Proe. Nat' l Acad. Sei.. 90: 10705-09 (1994), Kim, et al., Nature. 362: 841-844 (1993)); RNA-ligander (Jelinek, et al., Biochemistrv. 33: 10450-56); Takano, et al., Mol. Bio. Cell 4:358A (1993); Kinsella, et al., Exp. Cell Res. 1999: 56-62 (1992); Wright, et al., L Cellular Phvs.. 152: 448-57) og tyrosinkinaseinhibitorer (WO 94/03427; WO 92/21660; WO 91/15495; WO 94/14808; US patentsøknad nr. 5 330 992; Mariani, et al., Proe. Am. Assoc. Cancer Res.. 35: 2268 (1994)).
I tillegg til det ovenfor beskrevne er det blitt gjort forsøk på å identifisere små molekyler som virker som PK-inhibitorer. F.eks. har bis-monosykliske, disykliske og heterosykliske arylforbindelser (PCT WO 92/20642), vinylenazaindolderivater (PCT WO 94/14808) og l-syklopropyl-4-pyridylquinoliner (US patent nr. 5 330 992) blitt beskrevet som tyrosinkinaseinhibitorer. Styrylforbindelser (US patent nr. 5 217 999), styrylsubstituerte pyridylforbindelser (US patent nr. 5 302 606), quinasolinderivater (EP søknad nr. 0 566 266 Al), selenaindoler og selenider (PCT WO 94/03427), trisykliske polyhydroksylforbindelser (PCT WO 92/21660) og benzylfosfonsyreforbindelser (PCT WO 91/15495) blitt beskrevet som PTK-inhibitorer anvendelige ved behandlingen av kreft.
Den foreliggende oppfinnelse er rettet på visse 3-pyrrolsubstituerte 2-indolinonforbindelser som utøver PK-modulerende evner og derfor er anvendelige ved fremstilling av medikamenter til behandling av sykdommer relatert til unormal PK-aktivitet.
Følgelig angår den foreliggende oppfinnelse i ett aspekt 3-pyrrolsubstituerte 2-indolinoner med formel (I):
hvori:
R<1> er valgt fra gruppen bestående av hydrogen, halogen, Ci.ioalkyl, Ca.gsykloalkyl, C6-i2aryl, pyridyl, hydroksy, Ci.ioalkoksy, (CH2)rOH og -C(0)NR<8>R<9>, hvori R<8> og R<9> er hver uavhengig valgt fra hydrogen og C6_i2aryl, der arylgruppen eventuelt er substituert med en eller flere halogenatomer eller Ci-ioalkoksygrupper;
R er valgt fra gruppen bestående av hydrogen, halogen, Ci-ioalkyl, trihalometyl, hydroksy, Ci.ioalkoksy, cyano, C6-i2aryl, pyridyl og -S(0)2NR<13>R<14>, hvori R<13> og R<14 >uavhengig er valgt fra Ci-ioalkyl, C6-i2aryl og pyridyl;
R er valgt fra gruppen bestående av hydrogen, halogen, Ci-ioalkyl, trihalometyl, hydroksy, Ci.ioalkoksy, -(CO)R<15>, C6-i2aryl og pyridyl, hvori R<15> er valgt fra hydroksy og Ci.ioalkoksy;
R4 er valgt fra gruppen bestående av hydrogen, halogen, Ci.ioalkyl, hydroksy og Ci-ioalkoksy;
R<5> er valgt fra hydrogen og Ci.ioalkyl;
R6 er -C(0)R<10-> hvori R<10> er -N(R<n>)(CH2)„R<12>, der R<11> er hydrogen eller Cj. loalkyl og R<12> er valgt fra gruppen bestående av -NR13R<14>, -C(0)R<15>, pyridyl og imidazolyl, der R13 og R<14> er hver uavhengig valgt fra gruppen bestående av Ci-ioalkyl, Cs.ssykloalkyl, C6-i2aryl og pyridyl, eller R13 og R<14> sammen med nitrogenatomet danner en pyrrolidino, piperidino, morfolino eller piperazinogruppe, eventuelt substituert med Ci-ioalkyl og R<15> er valgt fra gruppen hydroksy og Ci.ioalkoksy;
R7 er valgt fra Ci.ioalkyl og C6-i2aryl;
n og r er uavhengig 1, 2, 3 eller 4;
eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.
Fortrinnsvis er R<1> er valgt fra gruppen bestående av hydrogen, Ci^alkyl, (CH2)rOH og
-C(0)NR<8>R<9>; R er valgt fra gruppen bestående av hydrogen, halogen, Ce.^aryl og -S(0)2NR<13>R<14>;
R3 er valgt fra gruppen bestående av hydrogen, Ci-4alkyl, Ci.4alkoksy, C6-i2aryl, pyridyl og-C(0)R<15>;
R4 er hydrogen;
R<5> er valgt fra hydrogen og CMalkyl;
R er valgt fra CMalkyl og Cg.^aryl; og
r er 2 eller 3.
eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.
I et annet aspekt er denne oppfinnelsen rettet på et farmasøytisk preparat omfattende én eller flere forbindelser med formel (I) eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav og en farmasøytisk akseptabel eksipient.
I et tredje aspekt er denne oppfinnelsen rettet på anvendelse av en forbindelse med formel (I) for fremstilling av et medikament for behanding av sykdommer mediert ved unormal proteinkinaseaktivitet, spesielt reseptortyrosinkinaser (RTK'er), ikke-reseptorproteintyrosinkinaser (CTK'er) og serin/treonin-proteinkinaser (STK'er), i en organisme, spesielt mennesker. Slike sykdommer inkluderer kreft, diabetes, hepatisk cirrose, kardiovaskulær sykdom slik som aterosklerose, angiogenese, immunologisk sykdom slik som autoimmun sykdom og nyresykdom.
I et fjerde aspekt er denne oppfinnelsen rettet på en fremgangsmåte for å modulere den katalytiske aktiviteten til PK'er, spesielt, reseptortyrosinkinaser (RTK'er), ikke-reseptorproteintyrosinkinaser (CTK'er) og serin/treonin-proteinkinaser (STK'er), ved anvendelse av en forbindelse ifølge denne oppfinnelsen in vitro. Spesielt er reseptorproteinkinasen hvis katalytisk aktivitet moduleres ved hjelp av en forbindelse ifølge denne oppfinnelsen valgt fra gruppen bestående av EGF, HER2, HER3, HER4, IR, IGF-1R, IRR, PDGFRcc, PDGFR|5, CSFIR, C-Kit, C-fms, Flk-1R, Flk4, KDR/Flk-1, Fit-1, FGFR-1R, FGFR-2R, FGFR-3R og FGFR-4R. Den cellulære tyrosinkinasen hvis katalytiske aktivitet moduleres ved hjelp av en forbindelse ifølge denne oppfinnelsen er valgt fra gruppen bestående av Src, Frk, Btk, Csk, Abl, ZAP70, Fes/Fps, Fak, Jak, Ack, Yes, Fyn, Lyn, Lek, Blk, Hek, Fgr og Yrk. Serin-treonin proteinkinasen, viss katalytiske aktivitet moduleres ved hjelp av en forbindelse ifølge denne oppfinnelsen, er valgt fra gruppen bestående av CDK2 og Raf.
DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN
Definisjoner
Om ikke angitt på annen måte har de følgende uttrykk anvendt i beskrivelsen og kravene den følgende betydning som diskutert nedenfor: «Alkyl» henviser til et mettet alifatisk hydrokarbonradikal inkludert rettkjedede og forgrenede kjedegrupper med 1-20 karbonatomer (om et nummerisk område er angitt heri; f.eks. betyr «1-20» at gruppen, i dette tilfellet alkylgruppen, kan inneholde 1 karbonatomer, 2 karbonatomer, 3 karbonatomer osv. opptil og inkludert 20 karbonatomer). Alkyl grupper inneholdende fra 1-4 karbonatomer er referert til som lavere alkylgrupper. Når nevnte lavere alkylgrupper mangler substituenter er de henvist til som usubstituerte lavere alkylgrupper. Mer foretrukket er en alkylgruppe en alkylgruppe med mellomstørrelse med 1-10 karbonatomer, f.eks. metyl, etyl, propyl, 2-propyl, n-butyl, isobutyl, tert-butyl, pentyl og lignende. Mer foretrukket er det en lavere alkyl med 1-4 karbonatomer f.eks. metyl, etyl, propyl, 2-propyl, n-butyl, iso-butyl eller tert-butyl og lignende.
«Sykloalkyl» henviser til 3-8 allkarbonmonosyklisk ring, en allkarbon 5-/6- eller 6-/6-fusert bisyklisk ring eller en multisyklisk fusert ringgruppe (et «fusert»-ringsystem betyr at hver ring i systemet deler et nærliggende karbonatompar med hver annen ring i systemet), hvori én eller flere av ringene kan inneholde én eller flere dobbeltbindinger, men hvor ingen av ringene har et fullstendig konjugert pi-elektronsystem.
Eksempler på sykloalkylgrupper er syklopropan, syklobutan, syklopentan, syklopenten, sykloheksan, sykloheksadien, adamantan, sykloheptan, sykloheptatrien og lignende.
«Aryl» henviser til en all-karbonmonoksyklisk eller fusert polysyklisk ringgruppe (dvs. ringer som deler nærliggende karbonatompar) med 1-12 karbonatomer med et fullstendig kongugert pi-elektronsystem. Eksempler på arylgrupper er fenyl, naftalenyl og antracenyl.
«Hydroksy» henviser til en -OH-gruppe.
«Alkoksy» henviser til både en -O- (usubstituert alkyl) og en -0-(usubstituert sykloalkyl)-gruppe. Representative eksempler inkluderer metoksy, etoksy, propoksy, butoksy, syklopropyloksy, syklobutyloksy, syklopentyloksy, sykloheksyloksy og lignende.
«Halo»-gruppe henviser til fluor, klor, brom eller jod, fortrinnsvis fluor eller klor.
«Trihalometyl »-gruppe henviser til en -CX3-gruppe hvori X er en halogruppe som definert heri.
«Cyano» henviser til en -CsN-gruppe.
«Eventuelt» betyr at den påfølgende beskrevne hendelse eller tilfelle kan men trenger ikke å forekomme og at beskrivlsen inkluderer tilfeller hvor hendelsen eller forekomsten skjer eller hendelser hvor det ikke skjer. F.eks. betyr «heterosyklisk gruppe eventuelt substituert med en alkylgruppe» at alkyl kan men ikke trenger å være tilstede og beskrivelsen inkluderer situasjoner hvor heterosykelgruppen er substituert med en alkylgruppe og situasjoner hvor heterosyklogruppen ikke er substituert med alkylgruppen.
Uttrykket «2-indolinon», «indolin-2-on» og «2-oksindol» anvendes om hverandre heri for å henvise til et molekyl med den kjemiske strukturen:
Uttrykket «pyrrol» henviser til et molekyl med den kjemiske strukturen:
Uttrykket «pyrrolsubstituert 2-indolinon» og «3-pyrrolidenyl-2-indolinon» anvendes om hverandre heri for å henvise til en kjemisk forbindelse med den generelle strukturen vist i formel (I).
Forbindelser som har den samme molekylformelen men som er forskjellig i egenskapen eller sekvensen av bindingen av deres atomer eller arrangementet av deres atomer i rommet er kaldt «isomerer». Isomerer som er forskjellig i deres atomarrangement i rommet angis «stereoisomerer». Stereoisomerer som ikke er speilbilder av en annen er kalt «diastereomerer» og de som er ikke-superomvendte speilbilder av hverandre er kalt «enantiomerer». Når en forbindelse har et asymmetrisk senter f.eks. når det er bundet til fire forskjellige grupper er par av enantiomerer mulig. En enantiomer kan være kjennetegnet ved den absolutte konfigurasjonen av dets asymmetriske senter og er beskrevet ved hjelp av R- og S-sekvensreglene til Cahn og Prelog eller ved hjelp av måter hvori molekyler roterer i planet av polarisert lys og angis som dekstrorotatorisk eller levorotatorisk (dvs. henholdsvis som (+) eller (-)-isomerer. En chiral forbindelse kan eksistere som enten individuelle entantiomerer eller som en blanding derav. En blanding inneholdende like deler av enantiomerene kalles en «racemisk blanding».
Forbindelsene ifølge denne forbindelsen kan ha én eller flere asymmetriske sentre; slike forbindelser kan derfor fremstilles som individuelle (R)- eller (S)-stereoisomerer eller som blandinger derav. Dersom R<6->substituenten i en forbindelse med formel (I) er 2-hydroksyetyl da er f.eks. karbonet som hydroksygruppen er bundet et asymmetrisk senter og derfor kan forbindelsen ved formel (I) eksistere som en (R)- eller (S)-stereoisomer. Om det ikke er angitt på annen måte er beskrivelsen og navngivningen av en spesifikk forbindelse i beskrivelsen og kravene ment å inkludere både individuelle enantiomerer og blandinger, racemiske og andre derav. Fremgangsmåtene for bestemmelse av stereokjemi og separeringen av stereoisomerer er velkjent for fagmannen på området (se diskusjonen i kapittel 4 i «Advanced Organic Chemistry», 4. utgave, J. MNarch, John Wiley and Sons, New York, 1992).
Forbindelsene med formel (I) kan utøve fenomenet med tautomerisme og strukturell isomerisme. F.eks. kan forbindelsene beskrevet heri oppta en E- eller en Z-konfi-gurasjon omkring dobbeltbindingene som forbinder 2-indolinonenheten til pyrrolenheten eller de kan være en blanding av E og Z. Denne oppfinnelsen omfatter enhver tautomerisk eller strukturell isomerisk form eller blanding derav som har evnen til å modulere RTK, CTK og/eller STK-aktivitet.
Et «farmasøytisk preparat» henviser til en blanding av én eller flere av forbindelsene beskrevet heri, eller fysiologiske/farmasøytisk akseptable salter eller forløper-medikamenter derav, med andre kjemiske komponenter, slik som fysiologiske/- farmasøytiske akseptable bærere og eksipienter. Formålet med et farmasøytisk preparat er å lette administreringen av en forbindelse til en organisme.
Som anvendt heri henviser en «fysiologisk/farmasøytisk akseptabel bærer» til en bærer eller et fortynningsmiddel som ikke signifikant medfører irritasjon for en organisme og ikke negativt påvirker den biologiske aktiviteten og egenskapene til den administrerte forbindelse.
En «farmasøytisk akseptabel eksipient» henviser til en inaktiv forbindelse tilsatt til et farmasøytisk preparat for ytterligere å lette administreringen av en forbindelse. Ikke-begrensende eksempler på eksipienter inkluderer kalsiumkarbonat, kalsiumfosfat, ulike sukkere og stivelsestyper, cellulosederivater, gelatin, vegetabilske oljer og polyetylenglykoler.
Som anvendt heri henviser uttrykket «farmasøytisk akseptabelt salt» til de salter som bibeholder foreldreforbindelsens biologiske effektivitet og egenskaper. Slike salter inkluderer: (i) syreaddisjonssalter som oppnås ved omsetning av den frie basen av foreldreforbindelsen med uorganiske syrer slik som saltsyre, hydrobromsyre, salpetersyre, fosforsyre, svovelsyre og perklorsyre og lignende, eller med organiske syrer slik som eddiksyre, oksalsyre, (D)- eller (L)-malinsyre, maleinsyre, metansulfonsyre, etansulfonsyre, p-toluensulfonsyre, salicylsyre, vinsyre, sitronsyre, ravsyre eller malonsyre og lignende, fortrinnsvis saltsyre eller (L)-malinsyre slik som L-malatsaltet av 5-(5-fluor-2-okso-l,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre(2-dietylaminoetyl)amid; eller (2) salter dannet når et surt proton som er tilstede i foreldreforbindelsen enten erstattes med et metallion, f.eks. et alkalimetallion, et jordalkaliion eller et aluminiumion; eller koordinater med en organisk base slik som etanolamin, dietanolamin, trietanolamin, trometamin, N-metylglukamin og lignende.
«PK» henviser til reseptorproteintyrosinkinase (RTK'er), ikke-reseptor- eller
«cellulær»-tyrosinkinase (CTK'er) og serintreoninkinaser (STK'er).
«Fremgangsmåte» henviser til måter, midler, teknikker og prosedyrer for å oppnå et gitt mål inkludert men ikke begrenset til de måter, midler, teknikker og fremgangsmåter enten kjent for eller som lett kan utvikles fra kjente måter, midler, teknikker og fremgangsmåter av fagmannen innenfor de kjemiske, farmasøytiske, biologiske, biokjemiske og medisinske teknikk.
«Modulering» eller «modulerende» henviser til en endring av den katalytiske aktiviteten til RTK'er, CTK'er og STK'er. Spesielt henviser modulering til aktiveringen av den katalytiske aktivitet til RTK'er, CTK'er og STK'er, fortrinnsvis aktiveringen eller inhiberingen av den katalytiske aktiviteten til RTK'er, CTK'er og STK'er, avhengig av konsentrasjonen av forbindelsen eller saltet som RTK'en, CTK'en eller STK'en utsettes for, mer foretrukket inhiberingen av den katalytiske aktiviteten til RTK'en, CTK'en og STK'en.
«Katalytisk aktivitet» henviser til fosforyleringshastigheten av tyrosin under påvirkning, direkte eller indirekte, av RTK'er og/eller CTK'er eller fosforyleringen av serin eller treonin under påvirkning, direkte eller indirekte av STK'er.
«A o bringe i kontakt» henviser til å bringe en forbindelse ifølge oppfinnelsen og en mål-PK sammen på en slik måte at forbindelsen kan påvirke den katalytiske aktiviteten til PK'en, enten direkte dvs. ved å påvirke kinasen selv eller indirekte, dvs. ved å virke sammen med et annet molekyl som den katalytiske aktiviteten til kinasen er avhengig av. «Å bringe i kontakt» på den måten kan utføres «in vitro», dvs. i et testrør, på en petriskål eller lignende. I et testrør kan det å bringe i kontakt kun involvere en forbindelse og en PK av interesse eller det kan involvere hele celler. Celler kan også oppbevares eller dyrkes i cellekulturskåler og bringes i kontakt med en forbindelse i det
miljøet. I denne betydning kan en spesifikk forbindelses evne til å påvirke en PK-relatert sykdom, dvs. ICso-verdien til forbindelsen, definert nedenfor, bestemmes. For celler utenfor organismen eksisterer det mange fremgangsmåter som er velkjent for fagmannen på området for å bringe PK'ene i kontakt med forbindelsene inkludert men ikke begrenset til direkte cellemikroinjeksjon og et antall transmembrane bæreteknikker.
«In vitro» henviser til fremgangsmåter utført på et kunstig miljø slik som f.eks. uten begrensning i et testrør eller kulturmedium.
«PK-relaterte sykdommer», «PK-dreven sykdom», og «unormal PK-aktivitet» refererer alle til tilstander kjennetegnet ved upassende, dvs. under eller mer vanlig over PK-katalytisk aktivitet, hvor den spesifikke PK kan være en RTK, en CTK eller en STK. Upassende katalytisk aktivitet kan oppstå som et resultat som enten: (1) PK-ekspresjon i celler som normalt ikke uttrykker PK'er, (2) økt PK-ekspresjon som medfører uønsket celleproliferering, differensiering og/eller vekst, eller (3) redusert PK-ekspresjon som medfører uønsket reduksjon i celleproliferering, differensiering og/eller vekst. Overaktivitet av en PK henviser til enten amplifisering av genet som koder for en spesifikk PK eller fremstilling av et PK-aktivitetsnivå som korrelerer med en celleprolifererings-, differensierings- og/eller vekstsykdom (dvs. ettersom PK-nivået øker øker alvorlighetsgraden av én eller flere av symptomene på den cellulære sykdommen). Underaktivitet er selvfølgelig motsatt, hvori alvorligheten av én eller flere symptomer av en cellulær sykdom øker ettersom PK-aktivitetsnivået synker.
«Behandle», «behandling» og «behandlingen» henviser til en fremgangsmåte for å lindre eller stanse en PK-mediert cellulær sykdom og/eller dets medførte symptomer. Med spesifikt hensyn på kreft betyr disse uttrykkene enkelt at den forventede levealderen til individer rammet av en krefttype øker eller at én eller flere av symptomene på sykdommen reduseres.
«Organisme» henviser til enhver levende enhet omfattende i det minste en celle. En levende organisme kan være så enkel som f.eks. en enkel eukariot celle eller så kompleks som et pattedyr, inkludert et menneske.
«Terapeutisk effektiv mengde» henviser til den mengden av forbindelsen som administreres som vil til en viss grad lindre én eller flere av symptomene på sykdommen som behandles. Med hensyn til anvendelse av forbindelsene over til fremstilling av
medikamenter for behandlingen av kreft henviser en terapeutisk effektiv mengde til den mengden som virker slik at: (1) størrelsen på tumoren reduseres; (2) tumormetastase inhiberes (dvs. til en viss grad senker, fortrinnsvis stopper); (3) tumorvekst inhiberes til en viss grad (dvs. senkes til en viss grad, fortrinnsvis stanses) og/eller (4) én eller flere av symptomene assosiert med kreften bedres til en viss grad (eller fortrinnsvis elimineres).
«Monitorering» betyr å observere eller detektere virkningen av å bringe en forbindelse i kontakt med en celle som utvikler en spesifikk PK. Den observerte eller detekterte effekten kan være en endring i cellefenotype, i den katalytiske aktiviteten til en PK eller en endring i bindingen mellom en PK med en naturlig bindingspartner. Teknikker for å observere eller detektere slike virkninger er velkjent i teknikkens stand.
De ovenfor nevne virkninger er valgt fra en endring eller et fravær av endring i en cellefenotype, en endring eller fravær av en endring i den katalytiske aktiviteten av nevnte proteinkinase eller en endring eller fravær av endring i bindingen av nevnte proteinkinase til en naturlig bindingspartner i et endelig aspekt av denne oppfinnelsen.
«Cellefenotype» henviser til det utvendige utseendet av en celle eller vev eller de biologiske funksjoner til cellen eller vevet. Eksempler på en cellefenotype er cellestørrelse, cellevekst, celleproliferering, celledifferensiering, celleoverlevelse, apoptose og næringsopptak og anvendelse. Slike fenotypiske egenskaper måles ved hjelp av velkjente teknikker innenfor området.
«Naturlig bindingspartner» henviser til et polypeptid som binder til en spesifikk PK i en celle. Naturlige bindingspartnere kan spille en rolle i utbredelsen av et signal i en PK-mediert signaloverføringsprosess. En endring i bindingen av den naturlige bindingspartneren med PK'en kan manifesteres som en økt eller redusert konsentrasjon av PK/naturlig bindingspartner-komplekset og som et resultat som en observerbar endring i PK'enes evne til å mediere signaloverføring.
Representative forbindelser ifølge oppfinnelsen er vist i tabell 1 nedenfor.
Nummeme på forbindelsene svarer til eksempelnummere i eksempeldelen. Det vil si at syntesen av forbindelse 1 i tabell 1 er beskrevet i eksempel 1. Forbindelsene presentert i tabell 1 er eksempler på utførelsesformer ifølge oppfinnelsen.
Foretrukne utførelsesformer
Mens den bredeste definisjonen er angitt i sammendraget av oppfinnelsen er visse forbindelser med formel (I) angitt nedenfor foretrukne.
Foretrukne utførelsesformer er forbindelser med formel (I) i følge krav 2, er de hvori R<3 >er C6-i2aryl.
Ytterligere foretrukne utførelsesformer er forbindelser med formel (I) ifølge krav 2, er de hvori n er 1, 2, eller 3; R<11> er hydrogen; og R<12> er valgt fra gruppen bestående av
-C(0)R15> pyridyl, imidazolyl og -NR13R14 .
Enda ytterligere foretrukne forbindelser med formel (I) i følge krav 4, er de hvori R12 er -NR<13>R<14>, hvori R13 og R<14> uavhengig er valgt fra gruppen bestående av Ci-4alkyl, pyridyl og, kombinert, -(CH2)4, -(CH2)5, -CH2)20(CH2)2-, og -(CH2)2N(CH3)(CH2)2-.
Foretrukne forbindelse med formel (I) eller salt i følge krav 1, er de hvori R11 er hydrogen eller usubstituert Ci.4alkyl; n er 2 eller 3; og R<12> er -NR13R1<4>, hvori R13 og R<14 >er uavhengig usubstituert CMalkyl.
Foretrukne forbindelser med formel (I) eller salt i følge krav 1, er de hvori R11 er hydrogen eller usubstituert CMalkyl; n er 2 eller 3; og R<12> er -NR13R1<4>, hvori R13 og R14 sammen danner en gruppe valgt fra -(CH2)4, -(CH2>5, -CH2)20(CH2)2- og -
(CH2)2N(CH3)(CH2)2-.
Ytterligere foretrukne forbindelser med formel (I) ifølge krav 2, er de hvori R<1> er - C(0)NR8R9 , hvori R<8> er hydrogen og R<9> er C6-i2aryl.
En foretrukket forbindelse med formel (I) ifølge krav 1 har formelen
eller er et farmasøytisk akseptabelt salt derav.
En foretrukket forbindelse med formel (I) i følge krav 1, er forbindelsen L-malatsaltet av 5-(5-fluor-2-okso-l,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre (2-dietylaminoetyl)amid.
En foretrukket forbindelse med formel (I) i følge krav 1 har formelen
eller er et farmasøytisk akseptabelt salt derav.
Anvendelse
PK'ene viss katalytiske aktivitet moduleres ved hjelp av forbindelser ifølge denne oppfinnelsen, inkluderer proteintyrosinkinaser som det finnes to typer av, reseptortyrosinkinaser (RTK'er) og cellulære tyrosinkinaser (CTK'er), og serintreoninkinaser (STK'er). RTK-mediert signaloverføring initieres ved en ekstracellulær binding mellom en spesifikk vekstfaktor (ligand), etterfulgt av reseptordimerisering, påfølgende stimulering av den indre proteintyrosinkinaseaktiviteten og fosforylering. Bindingsseter dannes deretter for intracellulære signaloverføringsmolekyler og medrører dannelse av komplekser med et spektrum av cytoplasmatiske signalmolekyler som letter den passende cellulære responsen (for eksempel celledeling, metabolske effekter på ekstracellulært mikromiljø osv.). Se Schlessinger og Ullrich, 1992, Neuron 9: 303-391.
Det har blitt vist at tyrosinfosforyleringsseter på vekstfaktorreseptorer fungerer som høyaffinitetsbindingsseter for SH2 (src homologi)-domener til signalmolekyler. Fantl et al., 1992, Cell 69:413-423, Songyang et al., 1994, Mol. Cell. Biol. 14:2777-2785), Songyang et al., 1993, Cell 72: 767-778, og Koch et al., 1991, Science 252: 668-678. Flere intracellulære substratproteiner som assosierer med RTK'er har blitt identifisert. De kan deles inn i to prinsippielle grupper: (1) substrater som har et katalytisk domene og (2) substrater som mangler slikt domene men som tjener som adaptorer og assosierer med katalytisk aktive molekyler. Songyang et al., 1993, Cell 72: 767-778. Interaksjons-spesifisiteten mellom reseptorer og SH2-domenene til deres substrater bestemmes av aminosyrerestene umiddelbart rundt den fosforylerte tyrosinresten. Forskjeller i bindingsaffinitetene mellom SH2-domener og aminosyresekvensen rundt fosfotyrosin-resten på spesifikke reseptorer er samsvarende med den observerte forskjellen i deres substratfosforyleringsprofiler. Songyang et al., 1993, Cell 72: 767-778. Disse observasjonene antyder at funksjonen til hver RTK er bestemt ikke bare av dets ekspresjonsmønster og ligandtilgjengelighet men også av mønsteret av nedstrøms signaloverføringsreaksjoner som aktiveres av en spesifikk reseptor. Fosforylering tilveiebringer følgelig et viktig reguleringstrinn som bestemmer selektiviteten til signalreaksjonsveiene som rekrutteres av spesifikke vekstfaktorreseptorer så vel som differensieringsfaktorreseptorer.
STK'er, som er primært cytosoliske, påvirker den interne biokjemien i cellen, ofte som en nedstrøms respons til en PTK-hendelse. STK'er har blitt innblandet i signal - prosessene som initierer DNA-syntesen og påfølgende mitose som medfører celleproliferering.
Følgelig resulterer PK-signaloverføring i, blant andre responser, til celleproliferering, differensiering, vekst og metabolisme. Unormal celleproliferering kan resultere i et vidt mønster av sykdommer og tilstander, inkludert utviklingen av neoplasi slik som karsinom, sarkom, glioblastom og hemangiom, sykdommer slik som leukemi, psoriasis, arterosklerose, artritt og diabetisk retinopati og andre sykdommer relatert til ukontrollert angiogenese og/eller vaskulogenese.
En nøyaktig forståelse av den mekanisme som forbindelsen hemmer PK'er med er ikke nødvendig for å utøve den foreliggende oppfinnelse. Det er antatt at forbindelsene binder til aminosyrene i den katalytiske regionen til PK'er. PK'er har typisk en "bilobate"-struktur hvori ATP synes å binde i kløften mellom de to lommene i en region hvor aminosyrene er konservert blant PK'ene. Inhibitorer av PK'er antas å binde ved hjelp av ikke-kovalente interaksjoner slik som hydrogenbindinger, van der Waals-krefter og ioniske interaksjoner i den samme generelle regionen hvor tidligere nevnte ATP binder til PK'ene. Nærmere bestemt er det antatt at 2-indolinonkomponenten i forbindelsen ifølge denne oppfinnelsen binder i det generelle rommet som normalt okkuperes av adeninringen i ATP. Spesifisiteten til et spesifikt molekyl for en spesifikk PK kan derfor komme som et resultat av ytterligere interaksjoner mellom de ulike substituentene på 2-indolinonkjernen og aminosyredomenene spesifikke for spesifikke PK'er. Forskjellige indolinsubstituenter kan følgelig bidra til foretrukken binding til spesifikke PK'er. Evnen til å velge forbindelser som er aktive ved forskjellige ATP-bindingsseter (eller andre nukleotidbindingsseter) gjør forbindelsene spesielt anvendelige for å oppnå ethvert protein med et slikt sete. Forbindelsene beskrevet heri har følgelig anvendelse i in vifro-analyser for slike proteiner.
I tillegg tilveiebringer forbindelsen ifølge den foreliggende oppfinnelse en anvendelse av forbindelsene til fremstilling av medikamenter til terapeutisk tilnærming til behandlingen av mange ulike faste tumorer, inkludert karsinom, sarkom inkludert Kaposis sarkom, erytroblastom, glioblastom, meningiom, astrocytom, melanom og myoblastom. Indikasjoner kan inkludere hjernekreft, blærekreft, eggstokk-kreft, magekreft, pankreaskreft, tykktarmskreft, blodkreft, lungekreft og benkreft.
Ytterligere eksempler på type sykdommer relatert til utilstrekkelig PK-aktivitet som forbindelsene beskrevet heri kan være anvendelige for fremstilling av medikamenter ved forebygging, behandling eller studier, er celleproliferative sykdommer, fibrotiske sykdommer og metabolske sykdommer.
Celleproliferative sykdommer som kan forhindres, behandles eller ytterligere studeres inkluderer kreft, blodåreproliferative sykdommer og mesangiale celleproliferative sykdommer.
Blodåreproliferative sykdommer henviser til sykdommer relatert til unormal vaskulogenese (blodåredannelse) og angiogenese (spredning av blodårer). Mens vaskulogenese og angiogenese spiller en viktig rolle i flere normale fysiologiske prosesser slik som embryoutvikling, korpus luteum-dannelse, sårheling og organregenerering spiller de også en viktig rolle i kreftutvikling hvor de resulterer i dannelse av nye kapillærer som er nødvendig for å holde en tumor i live. Andre eksempler på blodåreprolifereringssykdommer inkluderer artritt hvor nye kapillærblodårer invaderer ledd og ødelegger brusk, og øyesykdommer, slik som diabetisk retinopati hvor nye kapillærer i retina invaderer glasslegemet, blør og forårsaker blindhet.
To strukturelt beslektede RTK'er som binder VEGF med høy affinitet har blitt identifisert: fms-lignende tyrosin-l-(fit-l)-reseptor (Shibuya et al., 1990, Oncogene. 5:519-524; De Vries et al., 1992, Science. 255: 989-991) og KDR/FLK-1-reseptoren, også kjent som VEGF-R2. Vaskulær endotel vekstfaktor (VEGF) er blitt rapportert å være et endotelcellespesifikt mitogen med in vifrø-endotelcellevekstpromoterende aktivitet. Ferrara & Henzel, 1989, Biochein. Biophvs. Res. Comm.. 161:851-858; Vaisman et al., 1990, J. Biol. Chem.. 265:19461-19566. Informasjon beskrevet i US søknad med serienr. 08/193829, 038596 og 07/975750 foreslår sterkt av VEGF ikke bare er ansvarlig for endotelcelleproliferering men også er den primære regulator av normal og patologisk angiogenese. Se generelt Klagsburn & Soker, 1993, Current Bioloev. 3(10)699-702; Houck, et al., 1992, J. Biol. Chem.. 267: 26031-26037.
Normal vaskulogenese og angiogenese spiller en viktig rolle i mange fysiologiske prosesser slik som embryoutvikling, sårheling, organregenerering og kvinnelige reproduktive prosesser slik som eggstokkutvikling i corpus luteum i løpet av eggløsning og livmorvekst etter graviditet. Folkman & Shing, 1992, J. Biolo<g>ical Chem.. 267(16): 10931-34. Ukontrollert vaskulogenese og/eller angiogenese har blitt assosiert med sykdommer slik som diabetes så vel som maligne faste tumorer som er avhengig av vaskularisering for vekst. Klgasburn & Soker, 1993, Current Bioloev. 3(10): 699-702; Folkham, 1991, J. Nati. Cancer Inst.. 82: 4-6; Weidner, et al., 1991, Ne End. J. Med.. 324: 1-5.
VEGF's antatte rolle i endotelcelleproliferering og migrering gjennom angiogenese og vaskulogenese indikerer en viktig rolle for KDR/FLK-1-reseptoren i disse prosesser. Sykdommer slik som diabetes mellitus (Folkman, 198, i Xlth Congress of Thrombosis and Haemostasis (Verstraeta, et al., red., sidene 583-596, Leuven University Press, Leuven) og artritt så vel som malign tumorvekst kan være et resultat av ukontrollert angiogenese. Se for eksempel Folkman, 1971, N. End. J. Med.. 285:1182-1186. Reseptorene som VEGF spesifikt binder til er et viktig og kraftig terapeutisk mål for reguleringen og moduleringen av vaskulogenese og/eller angiogenese og mange alvorlige sykdommer som involverer unormal cellulær vekst er forårsaket av slike prosesser. Plowman, et al., 1994, DN& P. 7(6):334-339. Nærmere bestemt gjør den svært spesifikke funksjonen til KDR/FLK-1-reseptoren i neovaskularisering til et målvalg for terapeutiske tilnærminger for behandling av kreft og andre sykdommer som involverer den ukontrollerte danneslen av blodårer.
De beskrevne forbindelser er i stand til å regulere og/eller modulere tyrosinkinasesignal-overføring inkludert KDR/FLK-1-reseptorsignaloverføring for å hemme eller fremme angiogenese og/eller vaskulogenese, dvs. forbindelser som hemmer, forhindrer eller påvirker signaloverføringen av KDR/FLK'en når denne aktiveres av ligander slik som VEGF. Selv om det er antatt at forbindelsene virker på en reseptor eller andre komponenter langs tyrosinkinasesignaloverføringsreaksjonsveien, kan de også virke direkte på tumorcellene som er et resultat av ukontrollert angiogenese.
Selv om nomenklaturen av de humane og murine motpartene av slekten "fik-1 "-reseptor er forskjellig er de på mange måter forvekslbare. Den murine reseptor, Flk-1 og dets humane motpart, KDR deler en sekvenshomologi på 93,4 % innen det intracellulære domenet. På samme måte finner murin FLK-1 human VEGF med den samme affiniteten som muse VEGF, og følgelig aktiveres den av ligander utledet fra begge arter. Millauer et al., 1993, Cell, 72:835-846; Quinn et al., 1993, Proe. Nati. Acad. Sei. USA. 90:7533-7537. FLK-1 assosierer også med og deretter tyrosinfosforylering human RTK-substrater (for eksempel PLC-y eller p85) når den ko-uttrykkes i 293-celler (humane embryonale nyrefibroblaster).
Modeller som er avhengig av FLK-1-reseptoren er derfor direkte anvendelig for å forstå KDR-reseptoren. Anvendelse av den murine FLK-1-reseptoren i fremgangsmåter som identifiserer forbindelser som regulerer den murine signaloverføringsreaksjonsveien er for eksempel direkte anvendelig for identifiseringen av forbindelser som kan anvendes for å regulere den humane signaloverføringsreaksjonsveien, dvs. som regulerer aktiviteten relatert til KDR-reseptoren. Følgelig kan kjemiske forbindelser som er identifisert in vitro som inhibitorer av KDR-FLK-1 bli bekreftet i egnede in vivo-modeller. Både in vivo muse og rotte dyremodeller er vist å være av verdifull verdi for undersøkelsen av det kliniske potensialet til midler som virker på den KDR/FLK-1 - induserte signaloverføringsreaksj onsveien.
Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer følgelig en fremgangsmåte for å modulere den katalytiske aktiviteten til en proteinkinase in vitro, kjennetegnmed ved å bringe nevnte proteinkinase i kontakt med en forbindelse eller et salt i følge krav 1.
Reseptortyrosinkinasemediert signaloverføring initieres gjennom ekstracellulære interaksjoner med en spesifikk vekstfaktor (ligand), etterfulgt av reseptordimerisering, påfølgende stimulering av den indre proteintyrosinkinaseaktiviteten og autofosforylering. Bindingsseter dannes derigjennom for intracellulær signaloverfør-ingsmolekyler som medrører dannelse av komplekser med et spekter av cytoplasmatiske signaldannende molekyler som letter den passende cellulære responsen, for eksempel celledeling og metabolske virkninger på det ekstracellulære mikromiljøet. Se Schlessinger og Ullrich, 1992, Neuron. 9:1-20.
Den nære homologien på de intracellulære regioner til KDR/FLK-1 med den til PDGF-P-reseptoren (50,3 % homologi) og/eller den beslektede fit-1-reseptoren indikerer induksjonen av overlappende signaloverføringsreaksjonsveier. For PDGF-P-reseptoren har for eksempel medlemmer av src-familien (Twamley et al., 1993, Proe. Nati. Acad. Sei. USA. 90: 7696-7700), fosfatidylinositol-3'-kinase (Hu et al., 1992, Mol. Cell. Biol.. 12: 981-990), fosfolipase-cy (Kashishian & Cooper, 1993, Mol. Cell. Biol.. 4: 49-51), ras-GTPase-aktiverende protein, (Kashishian et al., 1992, EMBO J.. 11: 1373-1382), PTP-ID/syp (Kazlauskas et al., 1993, Proe. Nati. Acad. Sei. USA. 10 90: 6939-6943), Grb2 (Arvidsson et al., 1994, Mol. Cell. Biol.. 14:6715-6726), og adaptermolekylene Shc og Nek (Nishimura et al., 1993, Mol. Cell. Biol.. 13: 6889-6896), vist å binde til regioner som involverer ulike autofosforyleringsseter. Se generelt Claesson-Welsh, 1994, Prog. Growth Factor Res.. 5: 37-54. Følgelig er det sannsynlig at signal-overføringsreaksjonsveier aktivert av KDR/FLK-1 inkluderer ras-reaksjonsveien (Rozakis et al., 1992, Nature. 360: 689-692), PI-3'-kinase-, src-medierte og plcy-medierte reaksjonsveiene. Hver av disse reaksjonsveiene kan spille en kritisk rolle i den angiogene og/eller vaskulogene virkningen til KDR/FLK-1 i endotelceller. Fibrotiske sykdommer henviser til den unormale dannelsen av ekstracellulære matriser. Eksempler på fibrotiske sykdommer inkluderer hepatisk cirrose og mesengiale celleproliferative sykdommer. Hepatisk cirrose er kjennetegnet ved økningen i ekstracellulære matriks-bestanddeler, hvilket resulterer i dannelsen av et hepatisk arr. En økt ekstracellulær matriks som resulterer i et hepatisk arr kan også være forårsaket av en virusinfeksjon, slik som hepatitt. Lipocytter synes å spille en viktig rolle i hepatisk cirrose. Andre fibrotiske sykdommer er aterosklerose.
Mesangiale celleproliferative sykdommer henviser til sykdommer forårsaket av unormal proliferering av mesangialceller. Mesangiale proliferative sykdommer inkluderer ulike humane nyresykdommer slik som glomerulonepritt, diabetisk nefropati og malign nefrosklerose så vel som slike sykdommer som trombotisk mikroangiopatisyndromer, transplantatavstøtninger, og glomerulopatier. RTK-PDGFR'en har blitt innblandet i opprettholdelsen av mesangial celleproliferering. Floege et al., 1993, Kidnev International 43: 47S-54S.
Mange krefttyper er celleproliferative sykdommer og som nevnt tidligere har PK'er blitt assosiert med celleproliferative sykdommer. Følgelig er det ikke overraskende at PK'er slik som for eksempel medlemmer av RTK-familien har blitt assosiert med utviklingen av kreft. Noen av disse reseptorene, slik som EGFR (Tuzi et al., 1991, Br. J. Cancer 63: 227-233, Torp et al., 1992, APMIS 100: 713-719) HER2/neu (Slamon et al., 1989, Science 244: 707-712) og PDGF-R (Kumabe et al., 1992, Oncoeene. 7: 627-633), er overuttrykt i mange tumorer og/eller vedvarende aktivert gjennom autokrine løkker. Faktisk er det demonstrert at disse reseptorene er overuttrykt i de mest vanlige og alvorlige krefttyper (Akbasak og Suner-Akbasak et al., 1992, J. Neurol. Sei.. 111: 119-133, Dickson et al., 1992, Cancer Treatment Res. 61: 249-273, Kore et al., 1992, L Clin. Invest. 90: 1352-1360) og autokrine "loops" (Lee og Donoghue, 1992, J. Cell. Biol.. 118: 1057-1070, Kore et al., supra. Akbasak og Suner-Akbasak et al., supra har blitt demonstrert. For eksempel har EGFR blitt assosiert med skvamøst cellekarsinom, astrocytom, glioblastom, hode- og nakkekreft, lungekreft og blærekreft. HER2 har blitt assosiert med bryst-, eggstokk-, mage-, lunge-, pankreas- og blærekreft. PDGFR har blitt assosiert med glyoblastom og melanom så vel som lunge-, eggstokk- og prostatakreft. RTK-c-met har også blitt assosiert med malign tumordannelse. For eksempel har c.met blitt assosiert med blant andre krefttyper kolorektal-, tyroid-, pankreatisk-, mage- og hepatocellulære karsinom og lymfom. I tillegg har c-met blitt forbundet med leukemi. Overekspresjon av c-met-genet har også blitt påvist i pasienter med Hodgkins sykdom og Burkitts sykdom.
IGF-IR har i tillegg til å være innblandet i næringsstøtte og i type-II diabetes også blitt assosiert med flere krefttyper. For eksempel har IGF-I blitt ansett som en autokrin vekststimulator for flere tumortyper, for eksempel humane brystkreftkarsinomceller (Arteaga et al., 1989, J. Clin. Invest. 84:1418-1423) og små lungetumorceller (Macauley et al., 1990, Cancer Res. 50:2511-2517). I tillegg synes IGF-I også å være en autokrin stimulator av humane glyom mens den integrert er involvert i den normale veksten og differensieringen av nervesystemet. Sandberg-Norqvist et al., 1993, Cancer Res. 53: 2475-2478. Viktigheten av IGF-IR og dets ligander i celleproliferering er ytterligere støttet gjennom det faktum at mange celletyper i kultur (fibroblaster, epitelceller, glatte muskelceller, T-lymfocytter, myeloidceller, kondrocytter og osteoblaster (stamceller av benmargen)) stimuleres til å vokse av IGF-I. Goldring og Goldring, 1991, Eukaryotic Gene Express ion. 1: 301-326. Baserga og Coppola foreslo at IGF-IR spiller en sentral rolle i transformasjonsmekanismen og som sådan kunne være et foretrukket mål for terapeutiske intervensjoner for et bredt spekter av humane ondartetheter. Baserga, 1995, Cancer Res.. 55: 249-252, Baserga, 1994, Cell 79: 927-930, Coppola et al., 1994, Mol. Cell. Biol.. 14: 4588-4595.
STK'er har blitt innblandet i mange typer kreft inkludert blant annet brystkreft (Cance, et al., Int. J. Cancer. 54: 571-77 (1993)).
Assosiasjonen mellom unormal PK-aktivitet og sykdom er ikke begrenset til kreft. For eksempel har RTK'er blitt assosiert med sykdommer slik som psoriasis, diabetes melhus, endometriose, angiogenese, ateromatøs plakkutvikling, Alzheimers sykdom, restenose, von Hippell-Lindau-sykdom, epidermal hyperproliferering, neurodegenerative sykdommer, aldersrelatert flekkregenerering og hemangiom. For eksempel har EGFR blitt indikert i sårheling i hornhinnen og huden. Defekter i insulin-R og IGF-IR er indikert i type-II diabetes melitus. En mer fullstendig korrelasjon mellom spesifikke RTK'er og deres terapeutiske indikasjoner er beskrevet i Plowman et al., 1994, DN& P 7: 334-339.
Som nevnt tidligere er ikke bare RTK'er men også CTK'er inkludert src, abl, fps, yes, fyn, lyn, lek, blk, hek, fgr og yrk (oversikt av Bolen et al., 1992, FASEB J.. 6: 3403-3409) involvert i proliferative og metabolske signaloverføringsreaksjonsveier. Følgelig ble det forventet og det har blitt vist at de er involvert i mange PTK-medierte sykdommer hvortil den foreliggende forbindelser er rettet. For eksempel har det blitt vist at mutert src (v-src) er et onkoprotein (pp60v src) i kylling. Videre overføres den cellulære homolog, den protoonkogene pp60c src, onkogene signaler fra mange reseptorer. Overekspresjon av EGFR eller HER2/neu i tumorer medfører den konstitutive aktiveringen av pp60c src, som er karakteristisk for maligne celler men fraværende i normale celler. Mus som mangler ekspresjonen av c-src har på den annen side en osteopetrotisk fenotype, hvilket indikerer en nøkkeldeltagelse av c-src i osteoplastfunksjon og en mulig medvirkning i beslektede sykdommer.
På lignende måte har Zap70 blitt innblandet i T-cellesignaler som kan være relatert til autoimmune sykdommer.
STK'er har blitt assosiert med betennelse, autoimmune sykdommer, immunresponser og hyperprolifereringssykdommer slik som restenose, fibrose, psoriasis, osteoartritt og reumatoid artritt.
PK'er har også blitt involvert i embryoimplantering. Forbindelsene kan følgelig tileiebringe en effektiv fremgangsmåte for å forhindre slik embryoimplantering og derved være anvendelig som prevensjonsmiddel. Ytterligere sykdommer som kan behandles eller forebygges er immunologiske sykdommer slik som autoimmun sykdom, AIDS og kardiovaskulære sykdommer slik som aterosklerose.
Endelig er både RTK'er og CTK'er for tiden mistenkt for å være involvert i hyperimmune sykdommer.
Eksempler på effekten av et antall eksempler på forbindelser ifølge denne oppfinnelsen på ulike PTK'er er vist i tabell 2 nedenfor.
Administrering og farmasøytiske preparater
En forbindelse ifølge den foreliggende oppfinnelse eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav kan administreres som sådan til en human pasient eller kan administreres i farmasøytiske preparater hvori det forannevnte materialet blandes med egnede bærere eller eksipienter. Teknikker for dannelse og administrering av medikamenter kan finnes i "Remington's Pharmacological Sciences", Mack Publishing Co., Easton, PA, siste utgave.
Som anvendt heri henviser "administrere" eller "administrering" til leveringen av en forbindelse med formel (I) eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav eller av et farmasøytisk preparat inneholdende en forbindelse med formel (I) eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav ifølge denne oppfinnelsen til en organisme med det formål å forebygge eller behandle en PK-relatert sykdom.
Egnede administreringsruter kan inkludere men er ikke begrenset til oral, rektal, transmukosal eller intestinal administrering eller intramuskulær, subkutan, intramedulær, intraviteale, intraperetonale, intranasale eller intraokkulære injeksjoner. Den foretrukne administreringsruten er oral eller parenteral.
Alternativt kan en administrere forbindelsen på en lokal heller enn systemisk måte, for eksempel via injeksjon av forbindelsen direkte inn i en fast tumor, ofte i en depo- eller forsinket frigjøringsformulering.
Videre kan man administrere medikamentet i et målrettet medikamentleveringssystem, for eksempel i et liposom dekket med tumorspesifikke antistoff. Liposomene vil bindes til og tas opp selektivt av tumoren.
Farmasøytiske preparater ifølge den foreliggende oppfinnelse kan fremstilles ved hjelp av fremgangsmåter velkjent innen teknikkens stand, for eksempel ved hjelp av midler for konvensjonell blanding, oppløsning, granulering, dragee-dannelse, pulverisering, emulgering, innkapsling, fanging eller lyofiliseringsprosesser.
Farmasøytiske preparater for anvendelse i henhold til den foreliggende oppfinnelse kan formuleres på konvensjonelle måter ved anvendelse av én eller flere fysiologisk akseptable bærere omfattende eksipienter og hjelpestoffer som letter fremstillingen av de aktive forbindelsene i preparater som kan anvendes farmasøytisk. Passende formuleringer avhenger av administreringsruten som velges.
For injeksjon kan forbindelsene ifølge oppfinnelsen formuleres i vandige løsninger, fortrinnsvis i fysiologiske forenlige buffere slik som Hanks løsning, Ringers løsning eller fysiologisk saltoppløsningsbuffer. For transmukosal administrering anvendes penetreringsmidler passende for den barrieren som skal penetreres i formuleringen. Slike penetreringsmidler er velkjent i teknikkens stand.
For oral administrering kan forbindelsene formuleres ved å kombinere de aktive forbindelser med farmasøytisk akseptable bærere velkjent i teknikkens stand. Slike bærere gjør forbindelsene ifølge den foreliggende oppfinnelse i stand til å bli formulert som tabletter, piller, pastiller, drageer, kapsler, væsker, geler, siruper, oppslemminger, suspensjoner og lignende for oralt inntak av en pasient. Farmasøytiske preparater for oral anvendelse kan dannes ved anvendelse av faste eksipienter, eventuelt male den resulterende blandingen og fremstille blandingen av granulater, etter tilsetting av andre egnede hjelpestoffer om ønskelig for å oppnå tabletter eller dragee-kjerner. Anvendelige eksipienter er spesielt fyllstoffer slik som sukker, inkludert laktose, sukrose, mannitol eller sorbitol, cellulosepreparater slik som for eksempel maisstivelse, hvetestivelse, risstivelse og potetstivelse og andre materialer slik som gelatin, gummitragakant, metylcellulose, hydroksypropylmetylcellulose, natriumkarboksymetylcellulose og/eller polyvinylpyrrolidon (PVP). Om ønskelig kan nedbrytningsmidler tilsettes, slik som kryssbundet polyvinylpyrrolidon, agar eller alginat. Et salt slik som natriumalginat kan også anvendes.
Dragee-kjerner tilveiebringes med egnede overtrekk. For dette formål kan konsentrerte sukkerløsninger anvendes som eventuelt kan inneholde arabingummi, talkum, polyvinylpyrrolidon, karbopolgel, polyetylenglykol og/eller titaniumdioksid, lakkløsninger og egnede organiske løsningsmidler eller løsningsmiddelblandinger. Fargestoffer eller pigmenter kan tilsettes til tablettene eller dragee-overdrekkene for identifisering eller for å karakterisere ulike kombinasjoner av aktive forbindelsesdoser.
Farmasøytiske preparater som kan anvendes oralt inkluderer "push-fit"-kapsler dannet av gelatin så vel som myke forseglede kapsler dannet av gelatin og/eller plastdannere slik som glyserol eller sorbitol. "Push-fit"-kapslene kan inneholde de aktive ingrediensene i blanding med et fyllstoff slik som laktose, et bindemiddel slik som stivelse og/eller et smøremiddel slik som talkum eller magnesiumstearat og eventuelt stabilisatorer. I myke kapsler kan de aktive forbindelsene løses eller suspenderes i egnede væsker, slik som fettoljer, flytende parafin eller flytende polyetylenglykoler. Stabilisatorer kan også tilsettes i disse preparatene.
Farmasøytiske preparater som også kan anvendes inkluderer harde gelatinkapsler. Som et ikke-begrensende eksempel kan den orale kapselmedikamentformuleringen med den aktive forbindelsen være som en 50 og 200 mg dosestyrke (henholdsvis formulerings-kode J-011248-AA-00 og J-011248-AA-01). De to dosestyrkene dannes fra de samme granulater ved å fylle opp harde gelatinkapsler med forskjellig størrelse, størrelse 3 for 50 mg-kapselen og størrelse 0 for 200 mg-kapselen. Preparatformuleringen kan for eksempel være som indikert i tabell 2.
Kapslene kan bli pakket i brune glass eller plastikkflasker som beskytter den aktive forbindelsen mot lys. Beholderne som inneholder den aktive forbindelseskapsel-formuleringen må lagres ved kontrollert romtemperatur (15-30°C).
For administrering gjennom inhalering leveres forbindelsene for anvendelse i henhold til den foreliggende oppfinnelse passende i form av en aerosolspray ved anvendelse av en trykkfylt pakke eller forstøvningsapparat og en egnet gass, for eksempel uten begrensning diklordifluormetan, triklorfluormetan, diklortetrafluoretan eller karbondioksid. I tilfelle av en trykkfylt aerosol kan doseringsenheten kontrolleres gjennom å tilveiebringe en ventil for levering av en målt mengde. Kapsler og beholdere av for eksempel gelatin for anvendelse i en inhalator eller insuflator kan formuleres slik at de inneholder en pulverblanding av forbindelsen og en egnet pulverbase slik som laktose eller stivelse.
Forbindelsene kan også formuleres for parenteral administrering, for eksempel gjennom bolusinjeksjon eller kontinuerlig infusjon. Formuleringer for injeksjon kan presenteres i enhetsdoseringsform, for eksempel i ampuller eller multidoseringsbeholdere med et tilsatt konserveringsmiddel. Preparatene kan ta form som suspensjoner, løsninger eller emulsjoner i olje eller vandige vehikler og kan inneholde formuleringsmateriale slik som oppløsningsmidler, stabiliseringsmidler og/eller dispergeringsmidler.
Farmasøytiske preparater for parenteral administrering inkluderer vandige løsninger av en vannløselig form, slik som uten begrensning et salt av den aktive forbindelse. I tillegg kan suspensjoner av de aktive forbindelsene fremstilles i en lipofil bærer. Egnede lipofile bærere inkluderer fettoljer slik som sesamolje, syntetiske fettsyreestere slik som etyloleat og triglyserider eller materialer slik som liposomér. Vandige injeksjons-suspensjoner kan inneholde substanser som øker viskositeten til suspensjonen, slik som natriumkarboksymetylcellulose, sorbitol eller dekstran. Eventuelt kan suspensjonen også inneholde egnede stabilisatorer og/eller midler som øker løseligheten til forbindelsene for å tillate fremstilling av svært konsentrerte løsninger.
Alternativt kan den aktive ingrediensen være i pulverform for blanding med en egnet bærer, for eksempel sterilt, pyrogenfritt vann før anvendelse.
Forbindelsene kan også formuleres i rektale preparater slik som stikkpiller eller retensjonsenemaer, ved anvendelse av for eksempel konvensjonelle stikkpillebaser slik som kokossmør eller andre glyserider.
I tillegg til formuleringene beskrevet ovenfor kan forbindelsene også formuleres som depotpreparater. Slike langtidsvirkende preparater kan administreres ved implantering (for eksempel subkutan eller intramuskulær) eller ved hjelp av intramuskulær injeksjon. En forbindelse ifølge denne oppfinnelsen kan formuleres for denne administreringsrute med egnede polymere eller hydrofobe materialer (for eksempel i en emulsjon med en farmakologisk akseptabel olje), med ionebytteresiner eller som et delvis løselig derivat slik som uten begrensning et delvis løselig salt.
Et eksempel på en farmasøytisk bærer for hydrofobe forbindelser ifølge oppfinnelsen er et kooppløsende system omfattende benzylalkohol, et ikke-polart overflateaktivt middel, en vannblandbar organisk polymer og en vandig fase slik som VPD-kooppløsnings-systemet. VPD er en løsning av 3 % vekt/volum benzylalkohol, 8 % vekt/volum av den ikke-polare overflateaktive Polysorbate 80 og 65 % vekt/volum polyetylenglykol 300, dannet opptil et volum i absolutt etanol. VPD-kooppløsningssystemet (VPD:D5W) består av VPD fortynnet 1:1 med en 5 %-dekstrose-i-vann-løsning. Dette kooppløsnings-systemet løser hydrofobe forbindelser godt og gir selv lav toksisitet i forhold til systemisk administrering. Andelen av et slikt kooppløsningssystem kan naturligvis variere svært uten å ødelegge dets løselighet og toksisitetsegenskaper. Identiteten til kooppløsningskomponentene kan videre varieres: for eksempel kan andre lavtoksiske ikke-polare overflateaktive midler anvendes i stedet for Polysorbate 80, fraksjons-størrelsen til polyetylenglykol kan variere, andre bioforenlige polymerer kan erstatte polyetylenglykol, for eksempel polyvinylpyrrolidon og andre sukkere eller polysakkarider kan erstatte dekstrose.
Alternativt kan andre leveringssystemer for hydrofobe farmasøytiske forbindelser anvendes. Liposomér og emulsjoner er velkjente eksempler på leveringsvehikler eller bærere for hydrofobe medikamenter. I tillegg kan visse organiske løsningsmidler slik som dimetylsulfoksid også anvendes selv om det ofte er på bekostning av større toksisitet.
I tillegg kan forbindelsene leveres ved anvendelse av forsinket frigjørings system, slik som semipermeable matriser av faste hydrofobe polymerer inneholdende det terapeutiske middelet. Ulike forsinkede frigjøringsmaterialer har blitt etablert og er velkjent for fagmannen på området. Forsinkede frigjøringskapsler kan avhengig av deres kjemiske natur frigjøre forbindelsene i fra noen få uker opptil over hundre dager. Avhengig av kjemikaliets natur og den biologiske stabiliteten til det terapeutiske midlet kan ytterligere strategier for proteinstabilisering anvendes.
De farmasøytiske preparatene heri kan også omfatte egnede faste eller gelfasebærere eller eksipienter. Eksempler på slike bærere eller eksipienter inkluderer men er ikke begrenset til kalsiumkarbonat, kalsiumfosfat, ulike sukkere, stivelse, cellulosederivater, gelatin og polymerer slik som polyetylenglykoler.
Mange av de PK-modulerende forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan tilveiebringes som fysiologisk akseptable salter hvori den krevde forbindelse kan danne den negativt eller positivt ladede delen. Eksempler på salter hvori forbindelsene danner den positivt ladede enheten inkluderer uten begrensning kvaternært ammonium (definert andre steder heri), salter slik som saltsyre, sulfat, karbonat, melkesyre, vinsyre, malat, maleat, suksinat, hvori nitrogenatomet til den kvaternære ammoniumgruppen er et nitrogen av den valgte forbindelsen ifølge denne oppfinnelsen som har reagert med den passende syre. Salter hvori en forbindelse ifølge denne oppfinnelsen danner den negativt ladede delen inkluderer uten begrensning natrium, kalium, kalsium og magnesium. Saltet dannes gjennom reaksjonen av en karboksylsyregruppe i forbindelsen med en passende base (for eksempel natriumhydroksid (NaOH), kaliumhydroksid (KOH), kalsiumhydroksid (Ca(OH)2), osv.).
Farmasøytiske preparater egnet for anvendelse i den foreliggende oppfinnelse inkluderer preparater hvori de aktive ingrediensene er inneholdt i en mengde tilstrekkelig for å oppnå det tilsiktede formål, for eksempel moduleringen av PK-aktivitet eller behandlingen eller forebyggingen av en PK-relatert sykdom.
Nærmere bestemt betyr den terapeutisk effektive mengde en mengde av forbindelsen som er effektiv for å forebygge, lette eller lindre symptomer på sykdom eller forlenge overlevelsen til individet som behandles. k
Bestemmelse av en terapeutisk effektiv mengde er godt innenfor fagmannens kapasitet, spesielt i lys av den detaljerte beskrivelsen tilveiebragt heri.
For enhver forbindelse anvendt i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan den terapeutisk effektive mengden eller dosen estimeres initielt fra cellekulturanalyser. Deretter kan doseringen formuleres for anvendelse i dyremodeller for så å oppnå et konsentrasjonsområde i sirkulasjonen som inkluderer IC50 som bestemt i cellekultur (dvs. den konsentrasjon av testforbindelse som oppnådde halvparten av maksimal inhibering av PK-aktiviteten). Slik informasjon kan deretter anvendes for en mer nøyaktig bestemmelse av anvendelig dose i mennesker.
Toksisitet og terapeutisk effektivitet til forbindelsene beskrevet heri kan bestemmes ved hjelp av standard farmasøytiske prosedyrer i cellekulturer eller eksperimentelt i dyr, for eksempel ved å bestemme IC50 og LD50 (hvorav begge er diskutert andre steder heri) for en spesifikk forbindelse. De oppnådde data fra disse cellekulturanalyser og dyrestudier kan anvendes for å danne et doseområde for anvendelse i mennesker. Dosen kan variere avhengig av doseringsformen som anvendes og administreringsruten som utnyttes. Den eksakte formuleringen, administreringsruten og doseringen kan velges av den individuelle lege i lys av pasientens tilstand. (Se for eksempel Fingl, et al., 1975, i "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch. 1 p. 1).
Doseringsmengden og intervallet kan justeres individuelt for å tilveiebringe plasmanivåer av den aktive forbindelsen som er tilstrekkelig for å opprettholde den kinasemodulerende effekten. Disse plasmanivåene er henvist til som minste effektive konsentrasjon (MECer). MECen vil variere for hver forbindelse men kan estimeres fra in vitro- data, for eksempel den konsentrasjon som er nødvendig for å oppnå 50-90 % inhibering av en kinase kan beregnes ved anvendelse av analysene beskrevet heri. Dosene som er nødvendig for å oppnå MECen vil avhenge av de individuelle kjennetegnende og administreringsruten. HPLC-analyser eller bioanalyser kan anvendes for å bestemme plasmakonsentrasjoner.
Doseringsintervallet kan også bestemmes ved anvendelse av MEC-verdi. Forbindelser burde administreres ved anvendelse av et regime som opprettholder plasmanivåer over MECen i 10-90 % av tiden, fortrinnsvis mellom 30-90 % og mest foretrukket mellom 50-90 %.
For tiden kan de terapeutisk effektive mengdene av forbindelsene med formel (I) være i området fra tilnærmet 25 mg/m<2> til 1500 mg/m<2>/dag; fortrinnsvis omkring 3 mg/m<2>/dag. Enda mer foretrukket 50 mg/qm qd til 400 mg/qd.
I tilfelle av lokal administrering eller selektivt opptak kan den effektive lokale konsentrasjonen av medikamentet ikke være relatert til plasmakonsentrasjonen og andre prosedyrer kjent innen teknikkens stand kan anvendes for å bestemme den korrekte doseringsmengden og intervallet.
Mengden av et preparat som administreres vil selvfølgelig avhenge av individet som behandler, alvorlighetsgraden av sykdommen, administreringsmåten, bedømmelsen av den foreskrivende lege osv.
Preparatene kan om ønskelig presenteres i en pakke eller dispenerutstyr, slik som et FDA-passende kit, som kan inneholde én eller flere enhetsdoseformer inneholdende den aktive ingrediensen. Pakken kan for eksempel omfatte metall- eller plastikkfolie, slik som en blisterpakning. Pakken eller dispenseranordningen kan være fulgt av instruksjoner for administrering. Pakken eller dispenseren kan også være fulgt av et notat assosiert med beholderen i en form krevd av myndighetene som regulerer fremstillingen, anvendelsen eller salget av legemidler, hvis notis er bevis på etatens godkjenning av preparatformen eller formen eller veterinær administrering. For eksempel kan et slikt notis være et merke godkjent av "US Food and Drug Administration" for foreskrevne medikamenter eller av et godkjent produktinnlegg. Preparater omfattende forbindelse ifølge oppfinnelsen formulert i en kompatibel farmasøytisk bærer kan også fremstilles, plasseres i en passende beholder og merkes for behandling av en indikert tilstand. Egnede tilstander indikert på merket kan inkludere behandling av en tumor, inhibering av angioginese, behandling av fibrose, diabetes og lignende.
Det er også et aspekt ved den foreliggende oppfinnelse at en forbindelse beskrevet heri eller et salt kan kombineres med andre kjemoterapeutiske midler for behandlingen av sykdommen eller tilstanden beskrevet ovenfor. For eksempel kan en forbindelse, salt kombineres med alkylerende midler slik som fluorurasil (5-FU) alene eller i ytterligere kombinasjon med leukovorin; eller andre alkylerende midler slik som andre pyrimidin-analoger slik som UFT, kapecitabin, gemicitabin og cytarabin, alkylsulfonatene, f.esk. busulfan (anvendt i behandlingen av kronisk granulocytisk leukemi), improsulfan og piposulfan; aziridiner, for eksempel benzodepa, karboquanon, meturedepa og uredepa; etyleniminer og metylmelaminer, for eksempel altretamin, trietylenmelamin, trietylen-fosforamid, trietylentiofosforamid og trimetylomelamin; og nitrogensennepp, for eksempel klorambucil (anvendt i behandlingen av kronisk lymfosykisk leukemi, primær makroglubelinemi og non-Hodgkins lymfom), syklofosfamid (anvendt i behandlingen av Hodgkins sykdom, multippel mulom, neuroblastom, brystkreft, eggstokk-kreft, lungekreft, Wilms tumor og rabdomyosarkom), estramustin, ifosfamid, novembrichin, prednimustin og uracilsennepp (anvendt i behandlingen av primær trombocytose, non-Hodgkins lymfom, Hodgkins sykdom og eggstokk-kreft); og triaziner for eksempel dekarbazin (anvendt i behandlingen av myktvevssarkom).
En forbindelse eller salt av denne oppfinnelsen kan også anvendes i kombinasjon med andre antimetabolske kjemoterapeutiske midler slik som folinsyreanaloger, for eksempel metotreksat (anvendt i behandlingen av akutt lymfocyttisk leukemi, choreokarsinom, mykosefungiodes brystkreft, hode- og nakkekreft og osteogen sarkom) og pteropterin; og purinanaloger slik som mørk kaskopurin og tioguanin som anvendes i behandlingen av akutt granulocytisk, akutt lymfocytisk og kronisk granulocytisk leukemi.
Det skal forstås at en forbindelse eller salt av denne oppfinnelsen også kan anvendes i kombinasjon med naturlige produkter basert på kjemoterapeutiske midler slik som vinkaalkaloider for eksempel vindastin (anvendt i behandlingen av bryst- og testikkelkreft), vinkristin og vindesin; epipodosilotoksinene for eksempel etoposid og feniposid, hvor begge er anvendelige i behandlingen av testikkelkreft og kaposis sarkom; de antibiotiske kjemoterapeutiske midlene for eksempel deunorubisin, doktorubisin, efirubisin, mitomisin (anvendt for å behandle mage-, servøs, tarm-, bryst-, blære- og pankreaskreft), daktinomysin, hemosolomid, prikamisin, bleomysin (anvendt i behandlingen av hud-, øsofagus- og geniturtraktkreft); og de enzymatiske kjemoterapeutiske midlene slik som L-asparaginase.
I tillegg til de ovenfor nevnte kan en forbindelse eller salt av denne oppfinnelsen også anvendes i kombinasjoner med platinakoordinasjonskomplekser (cysplastin osv.); substituerte urea slik som hydroksyurea; metylhydrazinderivater for eksempel prokarbasin; adrenokortikoide undertrykkere, for eksempel mitotan, aminogluketimid; og hormon- og hormonantagonister slik som adrenokortikosteroider (for eksempel stednison), progestiner (for eksempel hydroksyprogesteronkastroat); østrogener (for eksempel dietyltilesterol); antiøsterogener slik som samoksisen; androgener for eksempel testosteronpropeonat; og aromaseinhibitorer slik som anastrosol.
En kombinasjonen av en forbindelse av denne oppfinnelsen vil være effektiv i kombinasjon med mitoksantron eller paklitaksell for behandlingen av faste tumorkreft eller leukemier slik som akutt myelogen (ikke-lymfocytisk) leukemi.
Generell syntetisk fremgangsmåte
Den følgende generelle metodologien kan anvendes for å fremstille forbindelsen ifølge denne oppfinnelsen: Et egnet substituert 2-oksindol (1 ekvivalent), det passende substituerte aldehydet (1,2 ekvivalenter) og en base (0,1 ekvivalenter) blandes i et løsningsmiddel (1-2 ml/mmol 2-oksindol) og blandingen varmes deretter opp i fra omtrent 2 til omtrent 12 timer. Etter avkjøling filtreres presipitatet som dannes, vaskes med kald etanol eller eter og vakuumtørkes, hvilket gir et fast produkt. Dersom det ikke dannes noe presipitat konsentreres reaksjonsblandingen og resten tritueres med diklormetan/eter, det resulterende faste stoffet samles ved hjelp av filtrering og tørkes deretter. Produktet kan eventuelt renses videre ved hjelp av kromatografi.
Basen kan være en organisk eller en uorganisk base. Dersom en organisk base anvendes er det fortrinnsvis en nitrogenbase. Eksempler på organiske nitrogenbaser inkluderer diisopropylamin, trimetylamin, trietylamin, anilin, pyridin, 1,8-diazabisyklo [5.4.1] undek-7-en, pyrrolidin og piperidin.
Eksempler på uorganiske baser er ammoniakk, alkalimetall- eller jordalkalihydroksider, fosfater, karbonater, bikarbonater, bisulfater og amider. Alkalimetallene inkluderer litium, natrium og kalium mens jordalkalimetallene inkluderer kalsium, magnesium og barium.
I en for tiden foretrukket utførelsesform av denne oppfinnelsen er basen et alkalimetall eller en alkalisk jorduorganisk base fortrinnsvis et alkalimetall eller et jordalkalihydroksid når løsningsmidlet er et protisk løsningsmiddel.
Det vil være klart for fagmannen på området, basert både på generelle kjente prinsipper innenfor organisk syntese og på beskrivelsen heri hvilken base som vil være den mest passende for utførelsen av reaksjonen.
Løsningsmidlet som reaksjonen utføres i kan være et protisk eller at aprotisk løsnings-middel, fortrinnsvis er det et protisk løsningsmiddel. Et «protisk løsningsmiddel» er et løsningsmiddel som har hydrogenatom(er) kovalent bundet til oksygen- eller nitrogen-atomer som gjør hydrogenatomene passe sure og som derfor i stand til å bli «delt» med en oppløsning gjennom hydrogenbinding. Eksempler på protiske løsningsmidler inkluderer uten begrensning vann og alkoholer.
Et «aprotisk løsningsmiddel» kan være polart eller ikke-polart men i hvert tilfelle inneholder det ikke sure hydrogener og kan derfor ikke være i stand til å hydrogenbinde med oppløsninger. Eksempler på ikke-polare aprotiske løsningsmidler er pentan, heksan, benzen, toluen, metylenklorid og karbontetraklorid. Eksempler på polare aprotiske løsningsmidler er kloroform, tetrahydrofuran, dimetylsulfoksid og dimetylformamid.
I en for tiden foretrukket utførelsesform av denne oppfinnelsen er løsningsmidlet et protisk løsningsmiddel, fortrinnsvis vann eller en alkohol slik som etanol.
Reaksjonen utføres ved en temperatur større enn romtemperatur. Temperaturen er vanligvis fra omtrent 30°C til omtrent 150°C, fortrinnsvis omtrent 80°C til omtrent 100°C, mer foretrukket omtrent 75°C til omtrent 85°C som er omtrent kokepunktet til etanol. Med «omtrent» menes det at temperaturområdet fortrinnsvis er innenfor 10°C av den indikerte temperaturen, mer foretrukket innenfor 5°C av den indikerte temperaturen og mest foretrukket innenfor 2°C av den indikerte temperaturen. Med «omtrent 75°C» menes f.eks. derfor 75°C + 10°C, fortrinnsvis 75°C + 5°C og mer foretrukket 75°C + 2°C.
2-oksindoler og aldehyder kan lett syntetiseres ved anvendelse av teknikker velkjent innenfor den kjemiske teknikk. Fagmannen på området vil forstå at andre syntetiske reaksjonsveier for dannelse av forbindelsen ifølge den foreliggende oppfinnelse er tilgjengelig.
EKSEMPLER
De følgende fremstillinger og eksempler er gitt for å gjøre fagmannen på området i stand til å klart forstå og utøve den foreliggende oppfinnelse..
Synteseeksempler
Metode A: Formylering av pyrroler
POCI3 (1,1 ekvivalent) tilsettes dråpevis til dimetylformamid (3 ekvivalenter) ved -10°C etterfulgt av tilsetting av det passende pyrrol løst i dimetylformamid. Etter røring i 2 timer fortynnes reaksjonsblandingen med H2O og gjøres basisk til pH 11 med 10 N KOH. Presipitatet som dannes samles ved hjelp av filtrering, vaskes med H2O og tørkes i en vakuumovn, hvilket gir det ønskede aldehyd.
Metode B: Forsåpning av pyrrolkarboksylsyreestere
En blanding av en pyrrolkarboksylsyreester og KOH (2-4 ekvivalenter) i EtOH kokes med tilbakeløpskjøling inntil fullstendig reaksjon er indikert ved hjelp av tynnsjiktskromatografi (TLC). Den avkjølte reaksjonsblandingen sur gjøres til pH 3 med 1 N HC1. Presipitatet som dannes samles ved hjelp av filtrering, vaskes med H20 og tørkes i en vakuumovn, hvilket gir den ønskede pyrrolkarboksylsyren.
Metode C: Amidering
Til en rørt løsning av en pyrrolkarboksylsyre løst i dimetylformamid (0,3 M) tilsettes 1-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimid (1,2 ekvivalenter), 1-hydroksybenzotriazol (1,2 ekvivalenter), og trietylamin (2 ekvivalenter). Det passende amin tilsettes (1 ekvivalent) og reaksjonen røres inntil det indikeres ved hjelp av TLC at den er fullstendig. Etylacetat tilsettes deretter til reaksjonsblandingen og løsningen vaskes med mettet NaHCC<3 og saltoppløsning (med ekstra salt), tørkes over vannfritt MgSC«4 og konsentreres hvilket gir det ønskede amid.
Metode D: Kondensering av aldehyder og oksindoler inneholdende karboksylsyresubstituenter
En blanding av oksindol (1 ekvivalent), 1 ekvivalent av aldehydet og 1-3 ekvivalenter piperidin (eller pyrrolidin) i etanol (0,4 M) røres ved 90-100°C inntil TLC indikerer at reaksjonen er fullstendig. Blandingen konsentreres deretter og resten surgjøres med 2 N HC1. Presipitatet som dannes vaskes med H2O og EtOH og tørkes deretter i en vakuumovn, hvilket gir produktet.
Metode E: Kondensering av aldehyder og oksindoler som ikke inneholder karboksylsyresubstituenter
En blanding av oksindolet (1 ekvivalent), 1 ekvivalent av aldehydet og 1-3 ekvivalenter av piperidin (eller pyrrolidin) i etanol (0,4 M) røres ved 90-100°C inntil TLC indikerer at reaksjonen er fullstendig. Blandingen avkjøles til romtemperatur og det faste stoffet som dannes samles ved hjelp av vakuumfiltrering, vaskes med etanol og tørkes, hvilket gir produktet. Dersom det ikke dannes et presipitat ved avkjøling av reaksjonsblandingen konsentreres blandingen og renses ved hjelp av kolonnekromatografi.
C. Eksempler på oksindolsynteser
De viste alternative rutene til oksindol såvel som andre oksindoler som kan anvendes for å danne forbindelsene vil være tydelig for fagmannen på området basert på den følgende beskrivelse.
5-amino-2-oksindol
5-nitro-2-oksindol (6,3 g) ble hydrogenen i metanol over 10 % palladium på karbon hvilket ga 3,0 g (60 % utbytte) av tittelforbindelsen som et hvitt fast stoff.
5-brom-2-oksindol
2-oksindol (1,3 g) i 20 ml acetonitril ble avkjølt til -10°C og 2,0 g N-bromsuksinimid ble sakte tilsatt under røring. Reaksjonen ble rørt i 1 time ved -10°C og 2 timer ved 0°C. Presipitatet ble samlet, vasket med vann og tørket, hvilket ga 1,9 g (90 % utbytte) av tittelforbindelsen.
4- metyl-2-oksindol
Dietyloksalat (30 ml) i 20 ml tørr eter ble tilsatt under røring til 19 g kaliumetoksid løst i 50 ml tørr eter. Blandingen ble avkjølt på et isbad og 20 ml 3-nitro-o-xylen i 20 ml tørr eter ble sakte tilsatt. Den tykke mørk røde blandingen ble varmet med tilbakeløpskjøling i 0,5 timer, konsentrert til et mørkt rødt fast stoff og behandlet med 10 % natriumhydroksid inntil nesten alt av det faste stoffet var oppløst. Den mørk røde blandingen ble behandlet med 30 % hydrogenperoksid inntil rødfargen var forandret til gul. Blandingen ble behandlet alternativt med 10 % natriumhydroksid og 30 % hydrogenperoksid inntil den mørke rødfargen ikke lenger var tilstede. Det faste stoffet ble filtrert av og filtratet surgjort med 6 N saltsyre. Det resulterende presipitatet ble samlet ved hjelp av vakuumfiltrering, vasket med vann, og tørket undre vakuum, hvilket ga 9,8 g (45 % utbytte) 2-metyl-6-nitrofenyleddiksyre som et off-white fast stoff. Det faste stoffet ble hydrogenert i metanol over 10 % palladium på karbon, hvilket ga 9,04 g av tittelforbindelsen som et hvitt fast stoff.
7-brom-5-klor-2-oksindol
5- klor-2-oksindol (16,8 g) og 19,6 g N-bromsuksinimid ble løst i 140 ml acetonitril og kokt med tilbakeløpskjøling i 3 timer. Tynnsjiktskromatografi (silika, etylacetat) ved 2 timers koking med tilbakeløpskjøling viste 5-klor-2-oksindol eller N-bromsuksinimid (Rf 0,8), produkt (Rf 0,85) og et annet produkt (Rf 0,9) hvis andeler ikke ble endret etter ytterligere 1 time koking med tilbakeløpskjøling. Blandingen ble avkjølt til 10°, presipitatet ble samlet ved hjelp av vakuumfiltrering, vasket med 25 ml etanol og sugetørket i 20 min. i «the funnel», hvilket ga 14,1 g vått produkt (56 % utbytte). Det faste stoffet ble løst i 200 ml denaturert etanol og vellingen vasket ved hjelp av røring og koking med tilbakeløpskjøling i 10 min. Blandingen ble avkjølt på et isbad til 10°C. Det faste produktet ble samlet ved hjelp av vakuumfiltrering, vasket med 25 ml etanol og tørket under vakuum ved 40°C, hvilket ga 12,7 g (51 % utbytte) 7-brom-5-klor-2-oksindol.
5-fluor-2-oksindol
5-fluorisatin (8,2 g) ble løst i 50 ml hydrazinhydrat og kokt med tilbakeløpskjøling i 1 time. Reaksjonsblandingen ble deretter hellet over i isvann. Presipitatet ble deretter filtrert, vasket med vann og tørket i en vakuumovn, hvilket ga tittelforbindelsen.
5-nitro-2-oksindol
2-oksindol (6,5 g) ble løst i 25 ml konsentrert svovelsyre og blandingen ble oppbevart ved -10°C til -15°C mens 2,5 ml skummende salpetersyre ble tilsatt dråpevis. Etter tilsettingen av salpetersyre ble reaksjonsblandingen rørt ved 0°C i 0,5 timer og hellet over i isvann. Presipitatet ble samlet ved hjelp av filtrering, vasket med vann og krystallisert fra 50 % eddiksyre. Krystallproduktet ble deretter filtrert, vasket med vann og tørket under vakuum, hvilket ga 6,3 g (70 %) 5-nitro-2-oksindol.
5-aminosulfonyl-2-oksindol
Til en 100 ml flaske fylt med 27 ml klorsulfonsyre ble 13,3 g 2-oksindol sakte tilsatt.
Reaksjonstemperaturen ble holdt under 30°C gjennom tilsettingen. Etter tilsettingen ble reaksjonsblandingen rørt ved romtemperatur i 1,5 timer, varmet til 68°C i 1 time, avkjølt og hellet over i vann. Presipitatet ble vasket med vann og tørket i en vakuumovn, hvilket ga 11,0 g 5-klorsulfonyl-2-oksindol (50 % utbytte) som ble anvendt uten ytterligere rensing.
5-klorsulfonyl-2-oksindol (2,1 g) ble tilsatt til 10 ml ammoniumhydroksid i 10 ml etanol og rørt ved romtemperatur over natt. Blandingen ble konsentrert og det faste stoffet samlet ved hjelp av vakuumfiltrering, hvilket ga 0,4 g (20 % utbytte) av tittelforbindelsen som et off-white fast stoff.
5-isopropylaminosulfonyl-2-oksindol
Til en 100 ml flaske fylt med 27 ml klorsulfonsyre ble 13,3 g 2-oksindol sakte tilsatt. Reaksjonstemperaturen ble holdt under 30°C gjennom tilsettingen. Reaksjonsblandingen ble rørt ved romtemperatur i 1,5 timer, varmet til 68°C i 1 time, avkjølt og hellet over vann. Presipitatet som ble dannet ble filtrert, vasket med vann og tørket i en vakuumovn, hvilket ga 11,0 g (50 %) 5-klorsulfonyl-2-oksindol som ble anvendt uten ytterligere rensing.
En suspensjon av 3 g 5-klorsulfonyl-2-oksindol, 1,15 g isopropylamin og 1,2 ml pyridin i 50 ml diklormetan ble rørt ved romtemperatur i 4 timer hvor det i løpet av denne tiden ble dannet et hvitt fast stoff. Det faste stoffet ble samlet ved hjelp av vakuumfiltrering, vellingen vasket med varm etanol, avkjølt, samlet ved hjelp av vakuumfiltrering og tørket under vakuum ved 40°C over natt, hvilket ga 1,5 g (45 %) 5-isopropylaminosulfonyl-2-oksindol.
'H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 8 10,69 (s, br, 1H, NH), 7,63 (dd, J = 2 og 8 Hz, 1H), 7,59 (d, J = 2 Hz, 1H), 7,32 (d, J = 7 Hz, 1H, NH-S02-), 6,93 (d, J = 8 Hz, 1H), 3,57 (s, 2H), 3,14-3,23 (m, 1H, CH-(CH3)2), 0,94 (d, J = 7 Hz, 6H, 2xCH3).
5-fenylaminosulfonyl-2-oksindol
En suspensjon av 5-klorsulfonyl-2-oksindol (1,62 g, 7 mmol), anilin (0,782 ml, 8,4 mmol) og pyridin (1 ml) i diklormetan (20 ml) ble rørt ved romtemperatur i 4 timer. Reaksjonsblandingen ble fortynnet med etylacetat (300 ml) og surgjort med 1 N saltsyre (16 ml). Det organiske laget ble vasket med natriumbikarbonat og saltoppløsning, tørket og konsentrert. Resten ble vasket med etanol (3 ml) og deretter kromatografert på silikagel og eluert med metanol/diklormetan 1:9, hvilket ga 5-fenylaminosulfonyl-2-oksindol.
'H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 8 10,71 (s, br, 1H, NH), 10,10 (s, br, 1H, NH), 7,57-7,61 (m, 2H), 7,17-7,22 (m, 2H), 7,06-7,09 (m, 2H), 6,97-7,0 (m, 1H), 6,88 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 3,52 (s, 2H).
2-okso-2,3-dihydro-lH-indol-5-sulfonsyrepyridin-3-ylamid
En løsning av 5-klorsulfonyl-2-oksindol (3 g) og 3-aminopyridin (1,46 g) i pyridin (15 ml) ble rørt ved romtemperatur over natt og hvorigjennom et brunt fast stoff ble dannet i løpet av denne tiden. Det faste stoffet ble filtrert, vasket med etanol og tørket under vakuum hvilket ga 1,4 g (38 %) av 2-okso-2,3-dihydro-lH-indol-5-sulfonsyre pyridin-3-ylamid.
'H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 8 10,74 (s, 1H, NH), 10,39 (s, 1H, S02NH), 8,27-8,28 (d, 1H), 8,21-8,23 (m, 1H), 7,59-7,62 (m, 2H), 7,44-7,68 (m, 1H), 7,24-7,28 (m, 1H), 6,69-6,71 (d, 1H), 3,54 (s, 2H).
MS m/z (APCI+) 290,2.
5-fenyloksindol
5-brom-2-oksindol (5 g, 23,5 mmol) ble løst i 110 ml toluen og 110 ml etanol under røring og litt varme. Tetrakis (trifenylfosfin)palladium(O) (1,9 g, 1,6 mmol) ble tilsatt etterfulgt av 40 ml (80 mmol) 2M vandig natriumkarbonat. Til denne blandingen ble benzenborsyre (3,7 g, 30,6 mmol) tilsatt og blandingen ble varmet i 100°C-oljebad i 12 timer. Reaksjonen ble avkjølt, fortynnet med etylacetat (500 ml), vasket med mettet
natriumbikarbonat (200 ml), vann (200 ml), IN HC1 (200 ml) og saltoppløsning (200 ml). Det organiske laget ble tørket over magnesiumsulfat og konsentrert, hvilket ga et fast brunt stoff. Finfordeling med diklormetan ga 3,8 g (77 %) 5-fenyl-2-oksindol som et lys brunt fast stoff.
'H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 8 10,4 (br, s, 1H, NH), 7,57 (dd, J = 1,8 og 7,2 Hz, 1H), 7,5 til 7,35 (m, 5H), 7,29 (m, 1H), 6,89 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 3,51 (s, 2H, CH2CO).
MS m/z 209 [M<+>].
På lignende måte kan de følgende oksindoler fremstilles:
6-(3,5-diklorfenyl)-l,3-dihydroindol-3-on
'H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 8 10,46 (br, 1H, NH), 7,64 (d, J = 1,8 Hz, 2H), 7,57 (m, 1H), 7,27 (m, 2H), 7,05 (d, J = 1,1 Hz, 1H), 3,5 (s, 2H).
MS-EI m/z 277/279 [M]<+>.
6-(4-butylfenyl)-l,3-dihydroindol-2-on
<*>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 8 10,39 (s, 1H, NH), 7,49 (d, J = 8,0 Hz, 2H), 7,25 (d, J = 8 Hz, 3H), 7,17 (dd, J = 1,5 og 7,8 Hz, 1H), 6,99 (d, J = 1,5 Hz, 1H), 3,48 (s, 2H, CH2CO), 2,60 (t, J = 7,5 Hz, 2 Hz, CH2CH3), 1,57 (m, 2H, CH2), 1,32 (m, 2H, CH2), 0,9 (t, J = 7,5 Hz, 3H, CH3).
6-(5-isopropyl-2-metoksyfenyl)-l,3-dihydroindol-2-on
'H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 8 10,29 (br s, 1H, NH), 7,16-7,21 (m, 2H), 7,08 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,97-7,01 (m, 2H), 6,89 (d, J = 0,8 Hz, 1H), 3,71 (s, 3H, OCH3), 3,47 (s, 2H, CH2CO), 2,86 (m, 1H, CH(CH3)2), 1,19 (d, J = 6,8 Hz, 6H, CH(CH3)2).
MS-EI m/z 281 [M]<+>.
6-(4-etylfenyl)-l,3-dihydroindol-2-on
'H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 8 10,39 (br s, 1H, NH), 7,50 (d, J = 8,2 Hz, 2H), 7,28 (d, J = 8,2 Hz, 2H), 7,25 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 7,17 (dd, J = 1,6 & 7,5 Hz, 1H), 6,99 (d, J = 1,6 Hz, 1H), 3,48 (s, 2H, CH2CO), 2,63 (q, J = 7,6 Hz, 2H, CH2CH3), 1,20 (t, J = 7,6 Hz, 3H, CH2CH3).
MS-EI m/z 237 [M]<+>.
6-(3-isopropylfenyl)-l,3-dihydroindol-2-on
<!>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 8 10,37 (br s, 1H, NH), 7,43 (m, 1H), 7,35-7,39 (m, 1H), 7,17-7,27 (m, 3H), 7,01 (d, J = 1,8 Hz, 1H), 3,49 (s, 2H, CH2CO), 2,95 (m, 1H, CH(CH3)2), 1,24 (d, J = 6,8 Hz, 6H, CH(CH3)2).
MS-EI m/z 251 [M]<+>.
6-(2,4-dimeoksyfenyl)-l,3-dihydroindol-2-on
<*>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 8 10,28 (br s, 1H, NH), 7,17 (m, 2H), 6,93 (dd, J = 1,6 & 7,6 Hz, 1H), 6,86 (d, J = 1,6 Hz, 1H), 6,63 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,58 (dd, J = 2,4 & 8,5 Hz, 1H), 3,79 (s, 3H, OCH3), 3,74 (s, 3H, OCH3), 3,45 (s, 2H, CH2CO).
MS-EI m/z 269 [M]<+>.
6-pyridin-3-yl-l,3-dihydroindoI-2-on
'H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 8 10,51 (s, 1H, NH), 8,81 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 8,55 (dd, J = 1,8 og 5,7 Hz, 1H), 8 (m, 1H), 7,45 (dd, J = 5,7 og 9,3 Hz, 1H), 7,3 (m, 2H), 7,05 (s, 1H), 3,51 (s, 2H, CH2CO).
MS m/z 210 [M]<+>.
2-okso-2,3-dihydro-lH-indol-4-karboksylsyre-(3-klor-4-etoksyfenyl)amid Til en løsning 4-karboksy-2-oksindol (200 mg, 1,13 mmol) og 3-klor-4-metoksyfenyl-amin (178 mg, 1,13 mmol) i dimetylformamid (15 ml) ved romtemperatur ble benzotriazol-l-yloksytris (dimetylamino)fosfoniumheksafluorfosfat (BOP reagens, 997 mg, 2,26 mmol) tilsatt etterfulgt av 4-dimetylaminopyridin (206 mg, 1,69 mmol). Blandingen ble rørt ved romtemperatur i 72 timer. Reaksjonen ble deretter fortynnet med etylacetat (300 ml), vasket med mettet natriumbikarbonat (100 ml), vann 2 N saltsyre (100 ml), vann (3x200 ml) og saltoppløsning. Det ble deretter tørket over magnesiumsulfat og konsentrert. Resten ble finfordelt med etylacetat, hvilket ga 2-okso-2,3-dihydro-lH-indol-4-karboksylsyre(3-klor-4-metoksyfenyl)-amid som et rosa fast stoff.
<]>HNMR (360 MHz, DMSO-d6) 8 10,50 (s, br, 1H, NH), 10,12 (s, br, 1H, NH), 7,9 (s, J = 2,5 Hz, 1H), 7,62 (dd, J = 2,5 & 9 Hz, 1H), 7,38 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 7,32 (t, J = 7,6 Hz, 1H), 7,13 (d, J = 9 Hz, 1H), 6,98 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 3,83 (s, 3H, OCH3), 3,69 (s,
2H, CH2).
MS-EI m/z 316 [M]+.
4- karboksy-2-oksindol
En løsning av trimetylsilyldiazometan i heksan (2 M) ble tilsatt dråpevis til en løsning av 2,01 g 2-klor-3-karboksynitrobenzen i 20 ml metanol ved romtemperatur inntil det ikke forekom ytterligere gassutvikling. Eddiksyre ble deretter tilsatt i brått overskudd til trimetylsilyldiazometan. Reaksjonsblandingen ble fordampet under vakuum og resten ble tørket i en ovn over natt. Det oppnådde 2-klor-3-metoksykarbonylnitrobenzen var rent nok for den følgende reaksjon.
Dimetylmalonat (6,0 ml) ble tilsatt til en iskald løsning av 2,1 g natriumhydrid i 15 ml DMSO. Reaksjonsblandingen ble rørt ved 100°C i 1 time og deretter avkjølt til romtemperatur. 2-klor-3-metoksykarbonylnitrobenzen (2,15 g) ble tilsatt i én porsjon og blandingen ble varmet til 100°C i 1,5 timer. Reaksjonsblandingen ble deretter avkjølt til romtemperatur, hellet over i isvann, surgjort til pH 5 og ekstrahert med etylacetat. Det organiske laget ble vasket med saltoppløsning, tørket over vannfritt natriumsulfat og konsentrert, hvilket ga 3,0 g dimetyl-2-metoksykarbonyl-6-nitrofenyl-malonat.
Dimetyl-2-metoksykarbonyl-6-nitrofenylmalonat (3,0 g) ble kokt med tilbakeløpskjøling i 50 ml 6 N saltsyre over natt. Blandingen ble konsentrert til tørrhet, 20 ml etanol og 1,1 g tinn(II)klorid ble tilsatt og blandingen ble kokt med tilbakeløpskjøling i 2 timer. Blandingen ble filtrert gjennom Celite, konsentrert og kromatografert på silikagel ved anvendelse av etylacetat:heksan:eddiksyre som elueringsmiddel, hvilket ga 0,65 g (37 %) 4-karboksy-2-oksindol som et hvitt fast stoff.
'HNMR (360 MHz, DMSO-d6) 5 12,96 (s, br, 1H, COOH), 10,74 (s, br, 1H, NH), 7,53 (d, J = 8 Hz, 1H), 7,39 (t, J = 8 Hz, 1H), 7,12 (d, J = 8 Hz, 1H), 3,67 (s, 2H)
D. Syntese av pyrrolsubstituert 2-indolinoner.
Eksempel 37
5- ( 5- brom- 2- okso- 1. 2- dihvdroindol- 3- vlidenmetvl)- 2- isopropvl- 4- fenvl- lH- pvrrol- 3-karboksvlsvre-( 3- dietvlaminopropvl) amid
En blanding av 2-aminoacetofenonsaltsyre (1 ekvivalent), etylisobutyrylacetat (1,2 ekvivalenter) og natriumacetat (2,4 ekvivalenter) i H20 ble rørt ved 100°C i 18 timer og deretter avkjølt til romtemperatur. Det vandige laget ble dekantert av og oljen ble løst i etylacetat. Det ble deretter vasket med vann og saltoppløsning og deretter tørket, hvilket ga (93 %) 2-isopropyl-4-fenyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyreetylester som en rødbrun olje.
'HNMR (300 MHz, DMSO-d6) 8 11,21 (s, br, 1H, NH), 7,14-7,27 (m, 5H), 6,70 (d, J = 2,7 Hz, 1H), 4,02 (q, J = 7,1 Hz, 2H, OCH2CH3), 3,65 (m, 1H, CH(CH3)2), 1,22 (d, J = 7,5 Hz, 6H, CH(CH3)2), 1,04 (t, J = 7,1 Hz, 3H, OCH2CH3).
MS-EI m/z 257 [M<+>].
Det ovenfor nevnte pyrrolet ble formylert ved anvendelse av fremgangsmåte A, hvilket ga (41 %) 5-formyl-2-isopropyl-4-fenyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyreetylester som et rødaktig fast stoff.
<J>HNMR (300 MHz, DMSO-d6) 8 12,35 (s, br, 1H, NH), 9,14 (s, 1H, CHO), 7,36 (s, 5H), 3,96 (q, J = 7,1 Hz, 2H, OCH2CH3), 3,74 (m, 1H, CH(CH3)2), 1,29 (d, J = 6,9 Hz, 6H, CH(CH3)2), 0,90 (t, J = 7,1 Hz, 3H, OCH2CH3).
MS-EI m/z 285 [M<+>].
Pyrrolkarboksylsyreesteren ble hydrolysert ved anvendelse av fremgangsmåte B, hvilket ga (57 %) 5-formyl-2-isopropyl-4-fenyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre som et beige fast stoff.
<*>HNMR (300 MHz, DMSO-d6) 8 12,28 (s, br, 1H, COOH), 12,02 (s, br, 1H, NH), 9,10 (s, 1H, CHO), 7,35 (s, 5H), 3,81 (m, 1H, CH(CH3)2), 1,28 (d, J = 6,9 Hz, 6H, CH(CH3)2).
MS-EI m/z 257 [M<+>].
5-brom-l,3-dihydroindol-2-on (120 mg, 0,31 mmol) ble kondensert med 5-formyl-2-isopropyl-4-fenyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre-(3-dietylaminopropyl)amid (fremstilt ved hjelp av fremgangsmåte C), hvilket ga 120 mg (71 %) av tittelforbindelsen.
<*>HNMR (300 MHz, DMSO-d6) 814,23 (s, br, 1H, NH), 11,08 (s, br, 1H, NH), 7,38-7,55 (m, 7H, Ar-H & CONHCH2), 7,30 (s, 1H, H-vinyl), 7,26 (dd, J = 1,8 & 7,8 Hz, 1H), 6,85 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 3,36 (m, 1H, CH(CH3)2), 3,07 (m, 2H, CH2), 2,34 (q, J = 7,1 Hz, 4H, N(CH2CH3)2), 2,22 (t, J = 6,9 Hz, 2H, CH2), 1,40 (m, 2H, CH2), 1,31 (d, J = 6,9
Hz, 6H, CH(CH3)2), 0,86 (t, J = 7,1 Hz, 6H, N(CH2CH3)2).
MS m/z 565,1 [M<+>+l].
Eksempel 38
5-( 5- brom- 2- okso- 1. 2- dihvdroindol- 3- vlidenmetvl)- 2- isopropvl- 4- fenvl- lH- pvrrol- 3-karboksylsvre-( 3- pvrrolidin- l- vlpropvl) amid
5-(5-brom-2-okso-l,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-2-isopropyl-4-fenyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre (127 mg, 0,28 mmol) ble kondensert med 3-pyrrolidin-l-yl-propylamin (43 mg, 0,336 mmol), hvilket ga 140 mg (66 %) av tittelforbindelsen.
■hNMR (300 MHz, DMSO-d6) 8 14,40 (s, br, 1H, NH), 7,38-7,47 (m, 7H), 7,23-7,27 (m, 2H), 6,84 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 3,36 (m, 1H, CH(CH3)2), 3,08 (m, 2H, CH2), 2,30 (m, 4H, 2xCH2), 2,20 (t, J = 7,0 Hz, 2H, CH2), 1,62 (m, 4H, 2xCH2), 1,42 (t, J = 7,0 Hz, 2H, CH2), 1,31 (d, J = 7,2 Hz, 6H, CH(CH3)2).
MS-EI m/z 560 og 562 [M<+->l og M<+>+l].
Eksempel 39
5-( 5- brom- 2- okso- 1. 2- dihvdroindol- 3- vlidenmetvl)- 2- isopropvl- 4- fenvl- lH- pvrrol- 3-karboksvlsvre ( 2- dietvlaminoetvl) amid
5-brom-l,3-dihydroindol-2-on (57 mg, 0,27 mmol) ble kondensert med 5-formyl-2-isopropyl-4-fenyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre-(2-dietylaminoetyl)amid (120 mg), hvilket ga 78 mg (53 %) av tittelforbindelsen som et gult fast stoff.
'HNMR (300 MHz, DMSO-d6) 8 14,23 (s, br, 1H, NH), 11,09 (s, br, 1H, NH), 7,38-7,51 (m, 6H), 7,25-7,28 (m, 2H), 7,19 (t, 1H, CONHCH2), 6,85 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 3,43 (m, 1H, CH(CH3)2), 3,11 (m, 2H, CH2), 2,28-2,39 (m, 6H, N(CH2CH3)2 & CH2, 1,31 (d, J = 6,9 Hz, CH(CH3)2), 0,85 (t, J = 7,0 Hz, 6H, N(CH2CH3)2.
MS-EI m/z 548 og 550 [M<+->l og M<+>+l].
Eksempel 40
5-( 5- brom- 2- okso- 1. 2- dihvdroindol- 3- vlidénmetvl)- 2- isopropvl- 4- fenvl- lH- pvrrol- 3-karboksvlsvre- r3-( 4- metvlpiperazin- l- vl) propvllamid
5-brom-l,3-dihydroindol-2-on (53 mg, 0,25 mmol) ble kondensert med 5-formyl-2-isopropyl-4-fenyl-1 H-pyrrol-3 -karboksylsyre- [3 -(4-metylpiperazin-1 -yl)propyl] amid (300 mg), hvilket ga 65 mg av tittelforbindelsen.
■hNMR (300 MHz, DMSO-d6) 8 14,22 (s, br, 1H, NH), 11,08 (s, br, 1H, NH), 7,23-7,50 (m, 9H), 6,85 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 3,37 (m, 1H, CH(CH3)2), 3,05 (m, 2H, CH2), 2,24 (m, 8H, 4xCH2), 2,11 (m, 5H, CH2 & CH3), 1,42 (m, 2H, CH2), 1,31 (d, J = 7,2 Hz, 6H, CH(CH3)2).
MS-EI m/z 589 og 591 [M<+->l og M<+>+l].
Eksempel 42
5-( 5- brom- 2- okso- 1. 2- dihvdroindol- 3- vlidenmetvl)- 2- metvl- 4- fenvl- lH- pvrrol- 3-karboksvlsvre-( 2- pvrrolidin- l- vletvl) amid
5-brom-l,3-dihydroindol-2-on (44 mg, 0,21 mmol) ble kondensert med 5-formyl-2-metyl-4-fenyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre-(2-pyrrolidin-l-yletyl)amid (70 mg, fremstilt på samme måte som isopropylanalogen ovenfor), hvilket ga 0,03 g (27 %) av tittelforbindelsen som et gult fast stoff.
'HNMR (300 MHz, DMSO-d6) 8 13,87 (s, br, 1H, NH), 11,11 (s, br, 1H, NH9, 7,36-7,51 (m, 6H), 7,26 (dd, J = 1,8 & 8,1 Hz, 1H), 7,2 (s, 1H, H-vinyl), 7,09 (m, 1H, CONHCH2), 6,83 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 3,17 (m, 2H, NCH2), 2,48 (m, CH3), 2,29-2,35 (m, 6H, 3xNCH2), 1,59 (m, 4H, 2xCH2).
MS-EI m/z 518 og 520 [M<+->l og M<+>+l].
Eksempel 44
5-( 5- brom- 2- okso- 1. 2- dihvdroindol- 3- vlidenmetvl)- 2- metvl- 4- fenvl- lH- pvrrol- 3-karboksvlsvre-( 2- dimetvlaminoetvl) amid
5-brom-l,3-dihydroindol-2-on (46 mg, 0,22 mmol) ble kondensert med 5-formyl-2-metyl-4-fenyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre-(2-dimetylaminoetyl)amid (65 mg), hvilket ga 60 mg (55 %) av tittelforbindelsen som et gult fast stoff.
<*>HNMR (360 MHz, DMSO-d6) 8 13,86 (s, br, 1H, NH), 11,09 (s, br, 1H, NH), 7,47-7,49 (m, 2H), 7,38-7,41 (m, 4H), 7,26 (dd, J = 2,2 & 8,3 Hz, 1H), 7,21 (s, 1H, H-vinyl), 7,04 (m, 1H, CONHCH2), 6,77 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 3,15 (m, 2H, NCH2), 2,48 (m, CH3), 2,16 (t, J = 6,8 Hz, 2H, 3xNCH2), 2,02 (s, 6H, 2xNCH3).
MS m/z 493 og 494,8 [M<+> og M<+>+2].
Eksempel 47
5-( 5- brom- 2- okso- 1. 2- dihvdroindol- 3- vlidenmetvl)- 2- metvl- 4- fenyl- lH- pvrrol- 3-karboksvlsvre-( 3- dietvlaminopropvl) amid
5-brom-l,3-dihydroindol-2-on (0,47 g, 2,2 mmol) ble kondensert med 5-formyl-2-metyl-4- fenyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre-(3-dietylaminopropyl)amid (0,75 g), hvilket ga 0,11 g (42 %) av tittelforbindelsen som et orange fast stoff-
'HNMR (300 MHz, DMSO-d6) 8 13,86 (s, br, 1H, NH), 7,42-7,46 (m, 3H), 7,37-7,50 (m, 7H), 7,24-7,28 (m, 2H), 6,83 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 3,09 (m, 2H, NCH2), 2,45 (s, 3H, CH3), 2,38 (q, J = 7,1 Hz, 4H, 2xNCH2CH3), 2,26 (t, J = 6,9 Hz, 2H, NCH2), 1,42 (m, 2H, NCH2), 0,87 (t, J = 7,1 Hz, 6H, 2xNCH2CH3).
MS-EI m/z 535,0 og 537 [M<+> og M<+>+2].
Eksempel 48
5- ( 5- brom- 2- okso- 1. 2- dihvdroindol- 3- vlidenmetvl)- 2. 4- dimetvl- lH- pvrrol- 3-karboksvlsvre-( 2- dimetvlaminoetvl) amid
En blanding av tert-butyl-3-oksobutyrat og natriumnitritt (1 ekvivalent) i eddiksyre ble rørt ved romtemperatur, hvilket ga tert-butyl-2-hydroksymino-3-oksobutyrat.
Etyl-3-oksobutyrat (1 ekvivalent), sinkstøv (3,8 ekvivalenter) og råproduktet tert-butyl-2-hydroksimino-3-oksobutyrat i eddiksyre ble rørt ved 60°C i 1 time. Reaksjonsblandingen ble hellet over i H20 og filtratet ble samlet, hvilket ga (65 %) 2-tert-butyloksykarbonyl-3,5-dimetyl-4-etoksykarbonylpyrrol.
En blanding av 2-tert-butyloksylkarbonyl-3,5-dimetyl-4-etoksykarbonylpyrrol og trietylortoformat (1,5 ekvivalenter) i trifluoreddiksyre ble rørt ved 15°C i 1 time. Reaksjonen ble konsentrert og resten ble renset, hvilket ga (64 %) 2,4-dimetyl-3-etoksykarbonyl-5-formylpyrrol som gule nåler.
2,4-dimetyl-3-etoksykarbonyl-5-formylpyrrol ble hydrolysert ved anvendelse av fremgangsmåte B, hvilket ga (90 %) 5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre.
<!>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 8 12 (br s, 2H, NH og C02H), 9,58 (s, 1H, CHO), 2,44 (s, 3H, CH3), 2,40 (s, 3H, CH3).
MS m/z 267 [M<+>].
5- brom-l,3-dihydroindol-2-on (0,17 g, 0,8 mmol) ble kondensert med 5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre-(2-dimetylaminoetyl)amid (0,2 g, fremstilt ved hjelp av fremgangsmåte C) ved anvendelse av fremgangsmåte B, hvilket 0,3 g (83 %) av tittelforbindelsen som et gult fast stoff.
'HNMR (360 MHz, DMSO-d6) 8 13,60 (s, br, 1H, NH), 10,94 (s, br, 1H, NH), 8,07 (d, J = 1,8 Hz, 1H, H-4), 7,75 (s, 1H, H-vinyl), 7,44 (t, J = 5,2 Hz, 1H, CONHCH2), 7,24 (dd, J = 1,8 & 8,4 Hz, 1H, H-6), 6,82 (d, J = 8,4 Hz, 1H, H-7), 3,26-3,33 (m, 2H, NCH2), 2,42 (s, 3H, CH3), 2,41 (s, 3H, CH3), 2,38 (t, J = 6,7 Hz, 2H, NCH2), 2,18 (s, 6H, N(CH3)2).
MS-EI m/z 430 og 432 [M<+->l og M<+>+l].
Eksempel 49
2. 4- dimetvl- 5-( 2- okso- 6- fenvl- 1. 2- dihvdroindol- 3- vlidenmetvl)- lH- pyrrol- 3-karboksvlsvre-( 2- dimetvlaminoetvDamid
6- fenyl-l,3-dihydroindol-2-on (0,17 g, 0,8 mmol) ble kondensert med 5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre-(2-dimetylaminoetyl)amid (0,2 g), hvilket ga 0,13 g (36 %) av tittelforbindelsen som et gul-orange fast stoff.
'HNMR (360 MHz, DMSO-d6) 8 13,59 (s, br, 1H, NH), 10,93 (, br, 1H, NH), 7,85 (d, J = 7,92 Hz, 1H, H-4), 7,63-7,65 (m, 3H), 7,40-7,47 (m, 3H), 7,32-7,36 (m, 1H, Ar-H), 7,30 (dd, J = 1,6 & 7,9 Hz, 1H, H-5), 7,11 (d, J = 1,6 Hz, 1H, H-7), 3,28-3,34 (m, 2H, NCH2), 2,43 (s, 3H, CH3), 2,41 (s, 3H, CH3), 2,38 (t, J = 6,8 Hz, 2H, NCH2), 2,18 (s, 6H, N(CH3)2).
MS-EI m/z 428 [M<+>].
Eksempel 50
5-( 5- klor- 2- okso- 1. 2- dihvdroindol- 3- vlidenmetyl)- 2. 4- dimetyl- lH- pvrrol- 3-karboksvlsvre-( 2- dimetvlaminoetvl) amid
5-klor-l,3-dihydroindol-2-on (0,1 g, 0,6 mmol) ble kondensert med 5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre-(2-dimetylaminoetyl)amid (0,15 g), hvilket ga 0,22 g (90 %) av tittelforbindelsen som et gult fast stoff.
'HNMR (300 MHz, DMSO-d6) 8 13,61 (s, br, 1H, NH), 10,98 (, br, 1H, NH), 7,96 (d, J = 2,0 Hz, 1H, H-4), 7,75 (s, 1H, H-vinyl), 7,50 (t, J = 5,5 Hz, 1H, CONHCH2), 7,12 (dd,
J = 2,0 & 8,3 Hz, 1H, H-6), 6,86 (d, J = 8,3 Hz, 1H, H-7), 3,26-3,31 (m, 2H, NCH2), 2,42 (s, 3H, CH3), 2,40 (s, 3H, CH3), 2,36 (t, J = 6,6 Hz, 2H, NCH2), 2,17 (s, 6H, N(CH3)2).
MS-EI m/z 386 [M<+>].
Eksempel 51
5-( 5- brom- 2- okso- 1. 2- dihvdroindol- 3- vlidenmetvl)- 2. 4- dimetvl- lH- pvrrol- 3-karboksvlsvre-( 2- dietvlaminoetvl) amid
5-brom-l,3-dihydroindol-2-on (0,17 g, 0,8 mmol) ble kondensert med 5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre-(2-dietylaminoetyl)amid (0,2 g), hvilket ga 0,09 g (26 %) av tittelforbindelsen som et gult fast stoff.
'HNMR (360 MHz, DMSO-d6) 8 13,61 (s, br, 1H, NH), 10,98 (, br, 1H, NH), 8,09 (d, J = 1,7 Hz, 1H, H-4), 7,76 (s, 1H, H-vinyl), 7,42 (t, J = 5,5 Hz, 1H, CONHCH2), 7,24 (dd, J = 1,7 & 8,0 Hz, 1H, H-6), 6,82 (d, J = 8,0 Hz, 1H, H-7), 3,23-3,32 (m, 2H, NCH2), 2,46-2,55 (m, 6H, 3xNCH2), 2,43 (s, 3H, CH3), 2,42 (s, 3H, CH3), 0,96 (t, J = 7,2 Hz, 6H, 2xNCH2CH3).
MS-EI m/z 458 og 460 [M<+->l og M<+>+l].
Eksempel 52
5-( 5- brom- 2- okso- 1. 2- dihvdroindol- 3- vlidenmetvl)- 2. 4- dimetvl- lH- pyrrol- 3-karboksylsvre-( 2- pyrrolidin- l- vletvl) amid
5-brom-l,3-dihydroindol-2-on (0,09 g, 0,4 mmol) ble kondensert med 5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre-(2-pyrrolidin-l-yletyl)amid (0,1 g), hvilket ga 0,14 g (81 %) av tittelforbindelsen som et gul-orange fast stoff.
<*>HNMR (300 MHz, DMSO-d6) 8 13,61 (s, br, 1H, NH), 10,98 (, br, 1H, NH), 8,09 (d, J = 1,9 Hz, 1H, H-4), 7,76 (s, 1H, H-vinyl), 7,53 (t, J = 5,5 Hz, 1H, CONHCH2), 7,24 (dd, J = 1,9 & 8,5 Hz, 1H, H-6), 6,81 (d, J = 8,5 Hz, 1H, H-7), 3,29-3,35 (m, 2H, NCH2), 2,54 (t, J = 6,9 Hz, 2H, NCH2), 2,47 (m, under DMSO), 2,42 (s, 3H, CH3), 2,40 (s, 3H, CH3), 1,66-1,69 (m, 4H, 2xCH2).
MS-EI m/z 456 og 458 [M<+->l og M<+>+l].
Eksempel 53
5-( 5- brom- 2- okso- 1. 2- dihvdroindol- 3- vlidenmetvl)- 2. 4- dimetvl- lH- pyrrol- 3-karboksvlsvre-( 3- imidazol- l- ylpropvl) amid
5-brom-l,3-dihydroindol-2-on (0,09 g, 0,4 mmol) ble kondensert med 5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre-(3-imidazol-l-ylpropyl)amid (0,1 g), hvilket ga 0,1 g (59 %) av tittelforbindelsen som et orange fast stoff.
'HNMR (300 MHz, DMSO-d6) 8 13,63 (s, br, 1H, NH), 10,99 (, br, 1H, NH), 8,09 (d, J = 2,2 Hz, 1H, H-4), 7,77 (s, 1H, H-vinyl), 7,71 (t, J = 5,7 Hz, 1H, CONHCH2), 7,65 (s, 1H, Ar-H), 7,25 (dd, J = 2,2 & 8,4 Hz, 1H, H-6), 7,20 (s, 1H, Ar-H), 6,89 (s, 1H, Ar-H), 6,82 (d, J = 8,4 Hz, 1H, H-7), 4,02 (t, J = 6,7 Hz, 2H, NCH2), 3,18 (q, J = 6,7 Hz, 2H, NCH2), 2,43 (s, 3H, CH3), 2,41 (s, 3H, CH3), 1,93 (m, 2H, CH2).
MS-EI m/z 467 og 469 [M<+->l og M<+>+l].
Eksempel 56
2. 4- dimetvl- 5-( 2- okso- 5- fenyl- 1. 2- dihvdroindol- 3- ylidenmetvl)- lH- pvrrol- 3-karboksvlsvre-( 2- dietvlaminoetvl) amid
5-fenyl-l,3-dihydroindol-2-on (80 mg, 0,4 mmol) ble kondensert med 5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre-(2-dietylaminoetyl)amid (0,1 g), ved anvendelse av fremgangsmåte B, hvilket ga 79 mg (46 %) av tittelforbindelsen.
'HNMR (300 MHz, DMSO-d6) 8 13,66 (s, br, 1H, NH), 10,95 (, br, 1H, NH), 8,15 (d, J = 1,2 Hz, 1H), 7,81 (s, 1H, H-vinyl), 7,71 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 7,40-7,47 (m, 4H), 7,31 (m, 1H), 6,95 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 3,2-3,31 (m, 2H, NCH2), 2,46-2,55 (m, 6H, 3xNCH2), 2,44 (s, 6H, 2xCH3), 0,96 (t, J = 7,4 Hz, 6H, 2xNCH2CH3.
MS-EI m/z 456 [M<+>].
Eksempel 57
2. 4- dimetvl- 5-( 2- okso- 5- fenvl- 1. 2- dihvdroindol- 3- vlidenmetvl)- lH- pvrrol- 3-karboksvlsvre-( 2- pvrrolidin- l- yletvl) amid
5-fenyl-l,3-dihydroindol-2-on )0,04 g, 0,2 mmol) ble kondensert med 5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre-(2-pyrrolidin-l-yletyl)amid (0,04 g), hvilket ga tittelforbindelsen som et gul-orange fast stoff. •hNMR (300 MHz, DMSO-d6) 8 13,65 (s, br, 1H, NH), 10,96 (, br, 1H, NH), 8,15 (d, J = 1,0 Hz, 1H), 7,80 (s, 1H, H-vinyl), 7,71 (d, J = 7,2 Hz, 2H), 7,49 (t, J = 6,3 Hz, 1H, CONHCH2), 7,41-7,46 (m, 3H), 7,31 (m, 1H), 6,95 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 4,08 (m, 4H, 2xNCH2), 3,32 (m, 2H, NCH2), 2,55 (t, J = 7,1 Hz, 2H, NCH2), 2,47 (m, under DMSO), 2,43 (s, 6H, 2xCH3), 1,66 (m, 4H, 2xCH2).
MS-EI m/z 454 [M<+>].
Eksempel 58
2. 4- dimetvl- 5-( 2- okso- 5- fenvl- 1. 2- dihvdroindol- 3- vlidenmetvl)- lH- pvrrol- 3-karboksvlsvre-( 3- irhidazol- l- vlpropvl) amid
5- fenyl-l,3-dihydroindol-2-on (8 mg, 0,04 mmol) ble kondensert med 5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre-(3-imidazol-l-ylpropyl)amid (10 mg), hvilket ga 10 mg (59 %) av tittelforbindelsen som et orange fast stoff.
■hNMR (300 MHz, DMSO-d6) 8 13,67 (s, br, 1H, NH), 10,96 (, br, 1H, NH), 8,16 (d, J = 1,2 Hz, 1H), 7,81 (s, 1H, H-vinyl), 7,65-7,72 (m, 4H), 7,44 (m, 3H), 7,31 (m, 1H, CONHCH2), 7,21 (s, 1H, Ar-H), 4,02 (t, J = 6,5 Hz, 2H, NCH2), 3,19 (q, J = 6,5 Hz, 2H, CONHCH2), 2,44 (s, 6H, 2xCH3), 1,93 (m, 2H, CH2CH2 CH2).
MS-EI m/z 465 [M<+>].
Eksempel 59
2. 4- dimetvl- 5-( 2- okso- 6- fenvl- 1. 2- dihvdroindol- 3- vlidenmetvl)- lH- pvrrol- 3-karboksvlsyre-( 2- dietvlaminoetvl) amid
6- fenyl-l,3-dihydroindol-2-on (0,08 g, 0,4 mmol) ble kondensert med 5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre-(2-dietylaminoetyl)amid (0,1 g), hvilket ga 65 mg (38 %) av tittelforbindelsen som et gult fast stoff.
'HNMR (300 MHz, DMSO-d6) 8 13,61 (s, br, 1H, NH), 10,99 (, br, 1H, NH), 7,86 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 7,62-7,66 (m, 3H), 7,40-7,47 (m, 3H), 7,28-7,36 (m, 2H), 7,10 (d, J = 1,2 Hz, 1H), 3,26 (m, 2H, NCH2), 2,46-2,55 (m, 6H, 3xNCH2), 2,44 (s, 3H, CH3), 2,41 (s, 3H, CH3), 0,97 (t, J = 7,2 Hz, 6H, 2xNCH2CH3).
MS-EI m/z 456 [M<+>].
Eksempel 60
2. 4- dimetyl- 5-( 2- okso- 6- fenvl- 1. 2- dihvdroindol- 3- vlidenmetvl)- lH- pvrrol- 3-karboksvlsyre-( 2- pvrrolidin- l- vletvl) amid
6-fenyl-l,3-dihydroindol-2-on (30 mg, 0,15 mmol) ble kondensert med 5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre-(2-pyrrolidin-l-yletyl)amid (40 mg), hvilket ga 5,9 mg (8,5 %) av tittelforbindelsen som et gul-orange fast stoff.
<:>HNMR (300 MHz, DMSO-d6) 8 13,60 (s, br, 1H, NH), 10,99 (, br, 1H, NH), 7,86 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 7,63-7,66 (m, 3H), 7,51 (m, 1H, CONHCH2), 7,45 (m, 2H), 7,28-7,36 (m, 2H), 7,10 (d, J = 1,5 Hz, 1H), 3,31 (m, 6H, 3xNCH2), 2,55 (t, J = 6,6 Hz, 2H, NCH2), 2,43 (s, 3H, CH3), 2,40 (s, 3H, CH3), 1,67 (m, 4H, 2xCH2).
MS-EI m/z 454 [M<+>].
Eksempel 61
2. 4- dimetvl- 5-( 2- okso- 6- fenvl- 1. 2- dihvdroindol- 3- vlidenmetvl)- lH- pvrrol- 3-karboksvlsvre-( 3- imidazol- l- vlpropvl) amid
6-fenyl-l,3-dihydroindol-2-on (8 mg, 0,04 mmol) ble kondensert med 5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre-(3-imidazol-l-ylpropyl)amid (10 mg), hvilket ga 7,3 mg (43 %) av tittelforbindelsen som et orange fast stoff.
'HNMR (300 MHz, DMSO-d6) 8 13,62 (s, br, 1H, NH), 10,99 (, br, 1H, NH), 7,86 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 7,62-7,70 (m, 5H), 7,45 (m, 2H), 7,35 (m, 1H), 7,30 (dd, J = 1,4 & 8,2 Hz, 1H), 7,21 (s, 1H), 7,10 (d, J = 1,4 Hz, 1H), 6,89 (s, 1H), 4,02 (t, J = 6,9 Hz, 2H, CH2), 3,19 (m, 2H, NCH2 CH2), 2,43 (s, 3H, CH3), 2,41 (s, 3H, CH3), 1,93 (t, J = 6,9 Hz, 2H, NCH2).
MS-EI m/z 465 [M<+>],
Eksempel 63
2. 4- dimetvl- 5-( 2- okso- 6- pyridin- 3- vl- 1. 2- dihvdroindol- 3- vlidenmetvl)- lH- pyrrol- 3-karboksvlsvre-( 2- dietvlaminoetvl) amid
6-pyridin-3-yl-l,3-dihydroindol-2-on (40 mg, 0,19 mmol) ble kondensert med 5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre-(2-dietylaminoetyl)amid (50 mg), hvilket ga 29 mg (33 %) av tittelforbindelsen som et lyseorange fast stoff.
'HNMR (300 MHz, DMSO-d6) 5 13,62 (s, br, 1H, NH), 11,05 (s, br, 1H, NH), 8,86 (s, br, 1H), 8,53 (d, J = 5,8 Hz, 1H), 8,04 (m, 1H), 7,91 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 7,70 (s, 1H, H-vinyl), 7,40-7,48 (m, 2H), 7,35 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 7,14 (s, 1H), 3,26 (m, 2H, NCH2), 2,48-2,55 (m, 3xNCH2), 2,42 (s, 3H, CH3), 2,38 (s, 3H, CH3), 0,96 (t, J = 6,9 Hz, 6H, 2xNCH2CH3).
MS-EI m/z 457 [M<+>].
Eksempel 64
2. 4- dimetvl- 5-( 2- okso- 6- pvridin- 3- vl- 1. 2- dihydroindol- 3- vlidenmetyl)- lH- pvrrol- 3-karboksvlsvre-( 2- pvrrolidin- l- vletvl) amid
6-pyridin-3-yl-l,3-dihydroindol-2-on (60 mg, 0,28 mmol) ble kondensert med 5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre-(2-pyrrolidin-l-yletyl)amid (75 mg), hvilket ga 90 mg (71 %) av tittelforbindelsen som et lyseorange fast stoff.
'HNMR (300 MHz, DMSO-d6) 8 13,61 (s, br, 1H, NH), 11,05 (s, br, 1H, NH), 8,86 (d, J = 1,5 Hz, 1H), 8,54 (dd, J = 1,5 & 4,8 Hz, 1H), 8,05 (m, 1H), 7,91 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 7,70 (s, 1H, H-vinyl), 7,44-7,53 (m, 2H), 7,36 (dd, J = 1,5 & 8,1 Hz, 1H), 7,15 (d, J = 1,2 Hz, 1H), 3,33 (m, 2H, NCH2), 2,47-2,57 (m, 6H, 3xNCH2), 2,43 (s, 3H, CH3), 2,41 (s, 3H, CH3), 1,67 (m, 4H, 2xCH2).
MS-EI m/z 455 [M<+>].
Eksempel 65
2. 4- dimetvl- 5-( 2- okso- 6- p vridin- 3 - yl- 1. 2- dihvdroindol- 3 - ylidenmetvl)- 1 H- p vrrol- 3 - karboksvlsvre-( 3- dimetvlaminopropvl) amid
6-pyridin-3-yl-l,3-dihydroindol-2-on (42 mg, 0,2 mmol) ble kondensert med 5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre-(3-dimetylaminopropyl)amid (50 mg), hvilket ga 67 mg (75 %) av tittelforbindelsen som et gul-brunt fast stoff.
'HNMR (360 MHz, DMSO-d6) 8 13,61 (s, br, 1H, NH), 11,00 (s, br, 1H, NH), 8,86 (s, br, 1H), 8,54 (s, br, 1H), 8,04 (m, 1H), 7,90 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,m69 (s, 1H, H-vinyl), 7,63 (m, 1H), 7,45-7,48 (m, 1H), 7,35 (dd, J = 1,7 & 8,0 Hz, 1H), 7,15 (d, J = 1,7 Hz, 1H), 3,21-3,27 (m, 2H, NCH2), 2,43 (s, 3H, CH3), 2,41 (s, 3H, CH3), 2,28 (m, 2H, NCH2), 2,14 (s, 6H, 2xNCH3), 1,64 (m, 2H, CH2).
MS-EI m/z 443 [M<+>].
Eksempel 66
2. 4- dimetvl- 5-( 2- okso- 5- fenvl- 1. 2- dihvdroindol- 3- vlidenmetyl)- lH- pvrrol- 3-karboksvlsvre-( 3- dimetylaminopropvl) amid
5-fenyl-l,3-dihydroindol-2-on (67 mg, 0,32 mmol) ble kondensert med 5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre-(3-dimetylaminopropyl)amid (81 mg), hvilket ga 40 mg (28 %) av tittelforbindelsen som et orange fast stoff.
<*>HNMR (300 MHz, DMSO-d6) 8 13,66 (s, br, 1H, NH), 10,92 (s, br, 1H, NH), 8,14 (s, 1H), 7,79 (s, 1H), 7,71 (m, 2H), 7,62 (m, 1H), 7,44 (m, 3H), 7,32 (m, 1H), 6,95 (m, 1H), 3,33 (m, 2H, NCH2), 2,43 (s, 6H, 2xCH3), 2,27 (m, 2H, NCH2), 2,13 (s, 6H, 2xNCH3), 1,63 (m, 2H, CH2).
MS-EI m/z 442 [M+].
Eksempel 67
2. 4- dimetvl- 5-( 2- okso- 5- fenyl- 1. 2- dihvdroindol- 3- vlidenmetvl)- lH- pvrrol- 3-karboksvlsvre-( 3- dietvlaminopropvl) amid
5- fenyl-l,3-dihydroindol-2-on (1,5 g, 7,16 mmol) ble kondensert med 5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre-(3-dietylaminopropyl)amid (2 g), hvilket ga 1,3 g (40 %) av tittelforbindelsen som et gul-orange fast stoff.
'HNMR (360 MHz, DMSO-d6) 8 13,64 (s, 1H, NH), 10,91 (s, 1H, NH), 8,14 (d, J = 1,4 Hz, 1H, ArH), 7,8 (s, 1H, ArH), 7,7 (dd, J = 1,2 og 8,5 Hz, 2H, ArH), 7,6 (t, J = 5,3 Hz, 1H, CONHCH2), 7,4 (m, 3H, ArH), 7,3 (t, J = 7,4 Hz, 1H, ArH), 6,9 (d, J = 8,0 Hz, 1H, ArH), 3,2 (m, 2H, CONHCIfc), 2,5 (m, 12H, 3xNCH2 og 2xCH}), 1,61 (m, 2H, CH^IfcCH^, 0,93 (t, J = 6,7 Hz, 6H, NCH2CH3).
MS-EI m/z 470 [M<+>].
Eksempel 68
2. 4- dimetvl- 5-( 2- okso- 6- fenyl- 1. 2- dihvdroindol- 3- vlidenmetvl)- lH- pvrrol- 3-karboksvlsvre-( 3- dietvlaminopropvl) amid
6- fenyl-l,3-dihydroindol-2-on (1,5 g, 7,16 mmol) ble kondensert med 5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre-(3-dietylaminopropyl)amid (2 g), hvilket ga 1,9 g (57 %) av tittelforbindelsen som et orange fast stoff.
'HNMR (360 MHz, DMSO-d6) 6 13,58 (s, 1H, NH), 10,94 (s, 1H, NH), 7,8 (d, J = 7,9 Hz, 1H, ArH), 7,6 (m, 4H, ArH), 7,4 (t, J = 7,5 Hz, 2H, ArH), 7,3 (m, 2H), 7,1 (d, J = 1,4 Hz, 1H, ArH), 3,2 (m, 2H, CONHCH2), 2,5 (m, 12H, 3xNCH2 og 2xCH3), 1,61 (m, 2H, CH2CH2CH2), 0,93 (t, J = 6,7 Hz, 6H, NCH2CH3).
MS-EI m/z 470 [M+].
Eksempel 69
3- r4-( 3- dietvlaminopropvlkarbamovl)- 3. 5- dimetvl- lH- pvrrol- 2- ylmetvlenl- 2- okso- 2. 3-dihvdro- lH- indol- 4- karboksvlsvre-( 3- klor- 4- metoksvfenvl) amid 2-okso-2,3-dihydro-lH-indol-4-karboksylsyre-(3-klor-4-metoksyfenyl)amid (1 g, 3,16 mmol) ble kondensert med 5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre-(3-dietylaminopropyl)amid (1 g, 3,58 mmol), hvilket ga 1,7 g (85 %) av tittelforbindelsen som et gul-orange fast stoff.
MS-EI m/z 578,2 [M<+>].
Eksempel 70
5-( 5- brom- 2- okso- 1. 2- dihvdroindol- 3- vlidenmetvl)- 2. 4- dimetvl- lH- pyrrol- 3-karboksvlsvre-( 3- dietvlaminopropyDamid
5-brom-l,3-dihydroindol-2-on (0,5 g, 2,36 mmol) ble kondensert med 5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre-(3-dietylaminopropyl)amid (0,51 g), hvilket ga 0,84 g av tittelforbindelsen som et rød-orange fast stoff.
'HNMR (360 MHz, DMSO-d6) 5 13,61 (s, 1H, NH), 10,99 (s, 1H, NH), 8,09 (d, J = 1,8 Hz, 1H, ArH), 7,7 (m, 4H), 7,2 (dd, J = 1,8 og 8,3 Hz, 2H, ArH), 6,8 (d, J = 7,8 Hz, 1H, ArH), 3,3 (br s, 4H, 2xNCH2), 3,2 (m, 2H, CONHCH2), 2,6 (br s, 2H, NCH2 og 2xCH3), 2,4 (s, 6H, 2xCH3), 1,66 (m, 2H, CH2CH2CH2), 0,98 (t, J = 7,1 Hz, 6H, NCH2CH3).
MS-EI m/z 472 og 474 [M<+->l og M<+>+l].
Eksempel 71
5-( 5- brom- 2- okso- 1. 2- dihvdroindol- 3- ylidenmetvl)- 2. 4- diisopropvl- lH- pvrrol- 3-karboksvlsvre-( 2- dietvlaminoetvl) amid
5-brom-l,3-dihydroindol-2-on (100 mg, 0,47 mmol) ble kondensert med 5-formyl-2,4-diisopropyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre-(2-dietylaminoetyl)amid (150 mg), hvilket ga 0,15 g (62 %) av tittelforbindelsen som et gul-orange fast stoff.
'HNMR (300 MHz, DMSO-d6) 5 13,97 (s, 1H, NH), 10,95 (s, 1H, NH), 8,09 (d, J = 1,3 Hz, 1H, ArH), 7,84 (m, 1H), 7,79 (s, 1H), 7,23 (dd, J = 1,3 og 8,1 Hz, 1H, ArH), 6,8 (d, J = 8,1 Hz, 1H, ArH), 3,5 (m, 1H, CH), 3,3 (m, 3H, CH og NHCH2), 2,5 (br m, 6H, 3xNCH2), 1,28 (d, J = 6,9 Hz, 6H, 2xCH3), 1,23 (d, J = 6,6 Hz, 6H, 2xCH3), 0,96 (m, 2xCH2CH3).
MS/EI m/z 514 og 516 [M<+->l og M<+>+l].
Eksempel 72
5-( 5- brom- 2- okso- 1. 2- dihvdroindol- 3- vlidenmetvl)- 2. 4- diisopropvl- lH- pvrrol- 3-karboksvlsvre-( 3- dietvlaminopropvDamid
5-brom-l,3-dihydroindol-2-on (90 mg, 0,42 mmol) ble kondensert med 5-formyl-2,4-diisopropyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre-(3-dietylaminopropyl)amid (140 mg), hvilket ga 54 mg (25 %) av tittelforbindelsen som et rødbrunt fast stoff.
'HNMR (300 MHz, DMSO-d6) 8 13,98 (s, 1H, NH), 10,96 (s, 1H, NH), 8,09 (d, J = 1,7 Hz, 2H), 7,78 (s, 1H, H-vinyl), 7,23 (dd, J = 1,7 og 8,1 Hz, 1H, ArH), 6,82 (d, J = 8,1 Hz, 1H, ArH), 3,5 (m, 1H, CH), 3,25 (m, 2H, NHCH2), 3,15 (m, 1H, CH), 2,7 (br s, 6H, 3xNCH2), 1,7 (br m, 2H, CH2CH2CH2), 1,28 (d, J = 6,9 Hz, 6H, 2xCH3), 1,24 (d, J = 5,9 Hz, 6H, 2xCH3), 1,06 (m, 6H, 2xCH2CH3).
MS-EI m/z 528 og 530 [M<+->l og M<+>+l].
Eksempel 73
5-( 5- brom- 2- okso- 1. 2- dihvdroindol- 3- ylidenmetvl)- 2. 4- diisopropvl- lH- pvrrol- 3-karboksvlsvre-( 3- pvrrolidin- 1 - vlpropvDamid
5-brom-l,3-dihydroindol-2-on (130 mg, 0,6 mmol) ble kondensert med 5-formyl-2,4-diisopropyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre-(3-pyrrolidin-l-ylpropyl)amid (150 mg, 0,45 mmol), hvilket ga 36 mg (15 %) av tittelforbindelsen som et brun-orange fast stoff.
<J>HNMR (300 MHz, DMSO-d6) 8 13,98 (s, 1H, NH), 10,97 (s, 1H, NH), 8,10 (d, J = 1,6 Hz, 2H), 7,78 (s, 1H, H-vinyl), 7,23 (dd, J = 1,6 og 7,6 Hz, 1H, ArH), 6,82 (d, J = 7,6 Hz, 1H, ArH), 3,5 (m, 1H, CH), 3,25 (m, 2H, NHCH2), 3,15 (m, 1H, CH), 2,7 (br s, 6H, 3xNCH2), 1,7 (br m, 6H, 3xNCH2CH2), 1,28 (d, J = 5,6 Hz, 6H, 2xCH3), 1,24 (d, J = 5,7 Hz, 6H, 2xCH3).
MS-EI m/z 526 og 528 [M<+->l og M<+>+l].
Eksempel 74
5-( 5- brom- 2- okso- 1. 2- dihvdroindol- 3- vlidenmetvl)- 2. 4- dimetvl- lH- pvrrol- 3-karboksvlsyre-( pyridin- 4- vlmetvDamid
5-brom-l,3-dihydroindol-2-on (170 mg, 0,8 mmol) ble kondensert med 5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre-(pyridin-4-ylmetyl)amid (200 mg), hvilket ga 14 mg (4 %) av tittelforbindelsen som et gult fast stoff.
'HNMR (300 MHz, DMSO-d6) 8 13,67 (s, 1H, NH), 11,01 (s, br, 1H, NH), 8,51 (dd, J = 1,6 & 4,3 Hz, 2H), 8,23 (t, J = 6,0 Hz, 1H, CONHCH2), 8,11 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 7,78 (s, 1H, H-vinyl), 7,31 (d, J = 6,0 Hz, 2H), 7,25 (dd, J = 1,9 & 8,1 Hz, 1H), 6,82 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 4,45 (d, J = 6,0 Hz, 2H, NCH2), 2,46 (s, 6H, 2xCH3).
MS-EI m/z 450 og 452 [M<+->l og M<+>+l].
Eksempel 80
5-( 5- fluor- 2- okso- 1. 2- dihvdroindol- 3- vlidenmetyl)- 2. 4- dimetvl- lH- pvrrol- 3-karboksvlsvre-( 2- dietvlaminoetvl) amid
5-fluor-l,3-dihydroindol-2-on (0,54 g, 3,8 mmol) ble kondensert med 5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre-(2-dietylaminoetyl)amid, hvilket ga 0,83 g (55 %) av tittelforbindelsen som et gul-grønt fast stoff.
<*>HNMR (360 MHz, DMSO-d6) 8 13,66 (s, 1H, NH), 10,83 (s, br, 1H, NH), 7,73 (dd, J = 2,5 & 9,4 Hz, 1H), 7,69 (s, 1H, H-vinyl), 7,37 (t, 1H, CONHCH2CH2), 6,91 (m, 1H), 6,81-6,85 (m, 1H), 3,27 (m, 2H, CH2), 2,51 (m, 6H, 3xCH2), 2,43 (s, 3H, CH3), 2,41 (s, 3H, CH3), 0,96 (t, J = 6,9 Hz, 6H, N(CH2CH3)2).
MS-EI m/z 398 [M<+>].
Eksempel 80
5- r5- fluor- 2- okso- 1. 2- dihvdroindol-( 3Z)- vlidenmetvll- 2. 4- dimetvl- lH- pvrrol- 3-karboksvlsvre-( 2- dietvlamino- etvl) amid
Hydrazinhydrat (55 %, 3000 ml) og 5-fluorisatin (300 g) ble oppvarmet til 100°C. Ytterligere 5-fluorisatin (500 g) ble tilsatt i porsjoner (100 g) i løpet av 120 min. under røring. Blandingen ble varmet til 110°C og rørt i 4 timer. Blandingen ble avkjølt til romtemperatur og de faste stoffene samlet ved hjelp av vakuumfiltrering, hvilket ga råstoffet (2-amino-5-fluorfenyl)-eddiksyrehydrazid (748 g). Hydrazidet ble løst i vann (700 ml) og blandingens pH ble justert til < pH 3 med 12 N saltsyre. Blandingen ble rørt i 12 timer ved romtemperatur. De faste stoffene ble samlet ved hjelp av vakuumfiltrering og vasket to ganger med vann. Produktet ble tørket under vakuum, hvilket ga 5-fluor-l,3-dihydroindol-2-on (600 g, 73 % utbytte) som et brunt pulver. 'H-NMR (dimetylsulfoksid-d6) 8 3,46 (s, 2H, CH2), 6,75, 6,95, 7,05 (3 x m, 3H, aromatisk), 10,35 (s, 1H, NH). MS m/z 152 [M+l].
3,5-dimetyl-lH-pyrrol-2,4-dikarboksylsyre-2-tert-butylester-4-etylester (2600 g) og etanol (7800 ml) ble rørt kraftig mens 10 N saltsyre (3650 ml) ble tilsatt sakte. Temperaturen økte fra 25°C til 35°C og gassutvikling begynte. Blandingen ble varmet til 54°C og rørt under ytterligere oppvarming i 1 time hvorved temperaturen var 67°C. Blandingen ble avkjølt ved 5°C og 32 1 is og vann ble tilsatt sakte med røring. Det faste stoffet ble samlet ved hjelp av vakuumfiltrering og vasket tre ganger med vann. Det faste stoffet ble lufttørket til konstant vekt hvilket ga 2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyreetylester (1418 g, 87 % utbytte) som et rosaaktig fast stoff. 'H-NMR (dimetylsulfoksid-d6) 8 2,10, 2,35 (2xs, 2x3H, 2xCH3), 4,13 (q, 2H, CH2), 6,37 (s, 1H, CH). 10,85 (s, 1H, NH). MS m/z 167 [M+l],
Dimetylformamid (322 g) og diklormetan (3700 ml) ble avkjølt på et isbad til 4°C og fosforoksyklorid (684 g) ble tilsatt under røring. Fast 2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyreetylester (670 g) ble sakte tilsatt i aliquoter i løpet av 15 min. Maksimumstemperaturen nådde 18°C. Blandingen ble varmet med tilbakeløpskjøling i 1 time, avkjølt til 10°C på et isbad og 1,6 1 isvann ble raskt tilsatt under kraftig røring. Temperaturen økte til 15°C. 10 N saltsyre (1,6 1) ble tilsatt under kraftig røring. Temperaturen økte til 22°C. Blandingen ble oppbevart i 30 min. og lagene fikk separere. Temperaturen nådde maksimum på 40°C. Det vandige laget ble justert til pH 12-13 med 10 N kaliumhydroksid (3,8 1) ved en hastighet som tillot temperaturen å nå og forbli 55°C i løpet av tilsettingen. Etter tilsettingen var fullstendig ble blandingen avkjølt til 10°C og rørt i 1 time. Det faste stoffet ble samlet ved hjelp av vakuumfiltrering og vasket 4 ganger med vann, hvilket ga 5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyreetylester (778 g, 100 % utbytte) som et gult fast stoff. 'H-NMR (DMSO-d6) 8 1,25 (t, 3H, CH3), 2,44, 2,48 (2xs, 2x3H, 2xCH3), 4,16 (q, 2H, CH2), 9,59 (s, 1H, CHO), 12,15 (br s, 1H, NH). MS m/z 195 [M+l].
5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyreetylester (806 g), kaliumhydroksid (548 g), vann (2400 ml) og metanol (300 ml) ble kokt med tilbakeløpskjøling i 2 timer med røring og deretter avkjølt til 8°C. Blandingen ble ekstrahert to ganger med diklormetan.
Det vandige laget ble justert til pH 4 med 1000 ml 10 N saltsyre og hvor temperaturen ble holdt under 15°C. Vann ble tilsatt for å lette røring. Det faste stoffet ble samlet ved hjelp av vakuumfiltrering, vasket tre ganger med vann og tørket under vakuum ved 50°C, hvilket ga 5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre (645 g, 93,5 % utbytte) som et gult fast stoff. NMR (DMSO-d6) 8 2,40, 2,43 (2xs, 2x3H, 2xCH3), 9,57 (s, 1H, CHO), 12,07 (br s, 2H, N+COOH). MS m/z 168 [M+l].
5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre (1204 g) og 6020 ml dimetylformamid ble rørt ved romtemperatur mens l-(3-dimetyl-aminopropyl-3-etylkarbodiimidsaltsyre (2071 g), hydroksybenzotriazol (1460 g), trietylamin (2016 ml) og dietyletylendiamin (1215 ml) ble tilsatt. Blandingen ble rørt i 20 timer ved romtemperatur. Blandingen ble fortynnet med 3000 ml vann, 2000 ml saltoppløsning og 3000 ml mettet natrium-bikarbonatløsning og pH ble justert til mer enn 10 med 10 N natriumhydroksid. Blandingen ble ekstrahert to ganger med 5000 ml 10 % metanol i diklormetan hver gang og ekstraktene ble kombinert, tørket over vannfritt magnesiumsulfat og rotasjons-fordampet til tørrhet. Blandingen ble fortynnet med 1950 ml toluen og rotasjons-fordampet igjen til tørrhet. Resten ble finfordeling med 3:1 heksan:dietyleter (4000 ml). De faste stoffene ble samlet ved hjelp av vakuumfiltrering, vasket to ganger med 400 ml etylacetat og tørket under vakuum ved 34°C i 21 timer, hvilket ga 5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre-(2-dietylaminoetyl)amid (819 g, 43 % utbytte) som et lysebrunt fast stoff. 'H-NMR (dimetylsulfoksid-d6) 8 0,96 (t, 6H, 2xCH3), 2,31, 2,38 (2xs, 2xCH3), 2,51 (m, 6H, 3xCH2), 3,28 (m, 2H, CH2), 7,34 (m, 1H, amid NH), 9,56 (s, 1H, CHO), 11,86 (s, 1H, pyrrol NH). MS m/z 266 [M+l].
5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre-(2-dietylaminoetyl)amid (809 g), 5-fluor-l,3-dihydroindol-2-on (438 g), etanol (8000 ml) og pyrrolidin (13 ml) ble varmet ved 78°C i 3 timer. Blandingen ble avkjølt til romtemperatur og de faste stoffene samlet ved hjelp av vakuumfiltrering og vasket med etanol. De faste stoffene ble rørt med etanol (5900 ml) ved 72°C i 30 min. Blandingen ble avkjølt til romtemperatur. De faste stoffene ble samlet ved hjelp av vakuumfiltrering, vasket med etanol og tørket under vakuum ved 54°C i 130 timer, hvilket ga 5-[5-fluor-2-okso-l,2-dihydroindol-(3Z)-
ylidenmetyl]-2,4-dimetyl-1 H-pyrrol-3-karboksylsyre-(2-dietylaminoetyl)amid (1013 g, 88 % utbytte) som et orange fast stoff. 'H-NMR (dimetylsulfoksid-d6) 8 0,98 (t, 6H, 2xCH3), 2,43, 2,44 (2xs, 6H, 2xCH3), 2,50 (m, 6H, 3xCH2), 3,28 (q, 2H, CH2), 6,84, 6,92, 7,42, 7,71, 7,50 (5xm, 5H, aromatisk, vinyl, CONH), 10,88 (s, 1H, CONH), 13,68 (s, 1H, pyrrol NH). MS m/z 397 [M-l].
Eksempel 81
3- r4-( 2- dietvlaminoetvlkarbamoyl)- 3. 5- dimetvl- lH- pvrrol- 2- vlmetvlenl- 2- okso- 2. 3-dihvdro- 1 H- indol- 6- karboks vis yre
2- okso-2,3-dihydro-lH-indol-6-karboksylsyre (80 mg, 0,45 mmol) ble kondensert med 5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre-(2-dietylaminoetyl)amid, hvilket ga 210 mg (92 %) av tittelforbindelsen som et gul-orange fast stoff.
'HNMR (360 MHz, DMSO-d6) 8 13,6 (s, 1H, NH), 7,76 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,66 (s, 1H, H-vinyl), 7,57 (dd, J = 1,5 & 8,0 Hz, 1H), 7,40-7,42 (m, 2H), 3,28 (m, 2H, CH2), 2,88 (m, H-piperidin), 2,54 (m, 6H, 3xCH2), 2,44 (s, 3H, CH3), 2,40 (s, 3H, CH3), 1,56 (m, H-piperidin), 0,97 (t, J = 6,98 Hz, 6H, N(CH2CH3)2).
MS m/z 424 [M+].
Eksempel 82
5-( 5- dimetvlsulfamovl- 2- okso- 1. 2- dihvdroindol- 3- vlidenmetvl)- 2. 4- dimetyl- lH- pvrrol-3- karboksvlsvre-( 2- pvrrolidin- l- vletvl) amid
2-okso-2,3-dihydro-lH-indol-5-sulfonsyredimetylamid (90 mg, 0,38 mmol) ble kondensert med 5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre-(2-pyrrolidin-l-yletyl)amid (100 mg), hvilket ga 100 mg (54 %) av tittelforbindelsen som et gult fast stoff.
<*>HNMR (360 MHz, DMSO-d6) 8 13,65 (s, 1H, NH), 11,30 (s, br, 1H, NH), 8,25 (d, 1H), 7,92 (s, 1H, H-vinyl), 7,48-7,53 (m, 2H), 7,07 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 3,33 (m, 2H, CH2), 2,61 (s, 6H, N(CH3)2), 2,56 (t, 2H, CH2), 2,49 (m, 4H, 2xCH2), 2,45 (s, 3H, CH3), 2,44 (s, 3H, CH3), 1,67 (m, 4H, 2xCH2).
MS-EI m/z 485 [M<+>].
Eksempel 87
5-( 5- dimetvlsulfamovl- 2- okso- 1. 2- dihydroindol- 3- vlidenmetvl)- 2. 4- dimetvl- lH- pvrro 3- karboksvlsyre-( 2- dietvlaminoetvl) amid
2-okso-2,3-dihydro-lH-indol-5-sulfonsyredimetylamid (90 mg, 0,38 mmol) ble kondensert med 5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre-(2-dietylaminoetyl)-amid (100 mg), hvilke ga 80 mg (43 %) av tittelforbindelsen som et gult fast stoff.
'HNMR (300 MHz, DMSO-d6) 5 11.30 (s, 1H, NH), 8,27 (d, J = 1,7 Hz, 1H), 7,94 (s, 1H, H-vinyl), 7,49 (dd, J = 1,7 & 8,0 Hz, 1H), 7,44 (m, 1H, CONHCH2CH2), 7,07 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 3,26 (m, 2H, CH2), 2,60 (s, 6H, N(CH3)2), 2,53 (m, 2H, CH2), 2,45-2,50 (m, 10H, 2xCH3 & N(CH2CH3)2, 0,96 (t, J = 7,2 Hz, 6H, N(CH2CH3)2).
MS-EI m/z 487 [M<+>].
Eksempel 126
2. 4- dimetvl- 5-( 2- okso- l, 2- dihvdroindol- 3- vlidenmetvl)- lH- pyrrol- 3- karboksvlsvre-( 2-dietvlaminoetvDamid
En blanding av l,3-dihydroindol-2-on (266 mg, 2 mmol), 5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre-(2-dietylaminoetyl)amid (530 ml, 2 mmol) og piperidin (1 dråpe) i etanol varme ved 90°C i 2 timer. Reaksjonen ble avkjølt til romtemperatur, det resulterende presipitatet ble samlet ved hjelp av vakuumfiltrering, vasket med etanol og tørket, hvilket ga 422 mg (55 %) av tittelforbindelsen som et lysegult fast stoff.
<:>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 8 13,7 (s, 1H, NH), 10,9 (s, 1H, NH), 7,88 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 7,64 (s, 1H, H-vinyl), 7,41 (t, J = 5,4 Hz, 1H, NH), 7,13 (dt, J = 1,2 & 7,6 Hz, 1H), 6,99 (dt, J = 1,2 & 7,6 Hz, 1H), 6,88 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 3,28 (m, 2H), 2,48-2,55 (m, 6H), 2,44 (s, 3H, CH3), 2,41 (s, 3H, CH3), 0,97 (t, J = 7,2 Hz, 6H, N(CH2CH3)2).
MS + veAPCI381 [M++l].
Eksempel 127
5-( 5- klor- 2- okso- 1. 2- dihvdroindol- 3- vlidenmetvl)- 2. 4- dimevl- lH- pvrrol- 3-karboksylsvre-( 2- dietvlamino- etvl) amid
En blanding av 5-klor-l,3-dihydroindol-2-on (335 mg, 2 mmol), 5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre-(2-dietylaminoetyl)amid (530 mg, 2 mmol) og piperidin (1 dråpe) i etanol ble varmet ved 90°C i 2 timer. Reaksjonen ble avkjølt til romtemperatur, det resulterende presipitatet ble samlet ved hjelp av vakuumfiltrering, vasket med etanol og tørket, hvilket ga 565 mg (68 %) av tittelforbindelsen som et orange fast stoff.
<*>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 8 13,65 (s, 1H, NH), 11,0 (s, 1H, NH), 7,98 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 7,77 (s, 1H, H-vinyl), 7,44 (t, NH), 7,13 (dd, J = 2,1 & 8,4 Hz, 1H), 6,87 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 3,28 (g, 2H), 2,48-2,53 (m, 6H), 2,44 (s, 3H, CH3), 2,43 (s, 3H, CH3), 0,97 (t, J = 7,0 Hz, 6H, N(CH2CH3)2).
MS + veAPCI415 [M++l].
Eksempel 128
2. 4- dimetvl- 5-( 2- okso- 1. 2- dihvdroindol- 3- vlidenmetvl)- lH- pvrrol- 3- karboksvlsvre-( 2-pvrrolidin- 1 - etvPamid
l,3-dihydroindol-2-on ble kondensert med 5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre-(2-pyrrolidin-l-yl-etyl)amid, hvilket ga tittelforbindelsen.
MS + ve APCI 379 [M<+>+l].
Eksempel 129
5-( 5- fluor- 2- okso- 1. 2- dihvdroindol- 3- vlidenmetvl)- 2. 4- dimetvl- lH- pvrrol- 3-karboksvlsvre-( 2- pyrrolidin- l- vletvl) amid
5-fluor-l,3-dihydroindol-2-on ble kondensert med 5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre-(2-pyrrolidin-l-yl-etyl)amid, hvilket ga tittelforbindelsen.
MS +ve APCI 397 [M++l].
Storskalaprosedyre:
5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre (61 g), 5-fluor-l,3-dihydroindol-2-on (79 g), etanol (300 ml) og pyrrolidin (32 ml) ble kokt med tilbakeløpskjøling i 4,5 timer. Eddiksyre (24 ml) ble tilsatt til blandingen og kokingen med tilbakeløpskjøling fortsatte i 30 min. Blandingen ble avkjølt ved romtemperatur og de faste stoffene samlet ved hjelp av vakuumfiltrering og vasket to ganger med etanol. De faste stoffene ble rørt i 130 min. i 40 % aceton i vann (400 ml) inneholdende 12 N saltsyre (6,5 ml). De faste stoffene ble samlet ved hjelp av vakuumfiltrering og vasket to ganger med 40 % aceton i vann. De faste stoffene ble tørket under vakuum, hvilket ga 5-[5-fluor-2-okso-l,2-dihydroindol-(3Z)-ylidenmetyl]-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre (86 g, 79 % utbytte) som et orange fast stoff. 'H-NMR (dimetylsulfoksid-d6) 8 2,48, 2,50 (2xs, 6H, 2xCH3), 6,80, 6,88, 7,68, 7,72 (4xm, 4H, aromatisk og vinyl), 10,88 (s, 1H, CONH),
12,12 (s, 1H, COOH), 13,82 (s, 1H, pyrrol NH).
MS m/z 299 [M-l].
5-[5-fluor-2-okso-l,2-dihydroindol-(3Z)-ylidenmetyl]-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre (100 g) og dimetylformamid (500 ml) ble rørt og benzotriazol-1-yloksytris(dimetylamino)fosfoniumheksafluorfosfat (221 g), l-(2-aminoetyl)pyrrolidin (45,6 g) og trietylamin (93 ml) ble tilsatt. Blandingen ble rørt i 2 timer ved omgivelsestemperatur. Det faste produktet ble samlet ved hjelp av vakuumfiltrering og vasket med etanol. De faste stoffene ble vellingsvasket ved røring i etanol (500 ml) i én time ved 64°C og avkjølt til romtemperatur. De faste stoffene ble samlet ved hjelp av vakuumfiltrering, vasket med etanol og tørket under vakuum, hvilket ga 5-[5-fluor-2-okso-l,2-dihydroindol-(3Z)-ylidenmetyl]-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre-(2-pyrrolidin-l-yl-etyl)amid (101,5 g, 77 % utbytte). 'H-NMR (dimetylsulfoksid-d6) 8 1,60 (m, 4H, 2xCH2), 2,40, 2,44 (2xs, 6H, 2xCH3), 2,50 (m, 4H, 2xCH29, 2,57, 3,35 (2xm, 4H, 2xCH2), 7,53, 7,70, 7,73, 7,76 (4xm, 4H, aromatisk og vinyl), 10,88 (s, 1H, CONH), 13,67 (s, 1H, pyrrol NH). MS m/z 396 [M+l].
Eksempel 130
5-( 5- klor- 2- okso- 1. 2- dihvdroindol- 3- ylidenmetvl)- 2. 4- dimetvl- lH- pvrrol- 3-karboksvlsyre-( 2- pvrrolidin- l- vletvl) amid
5-klor-l,3-dihydro-indol-2-on ble kondensert med 5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre-(2-pyrrolidin-l-yl-etyl)amid, hvilket ga tittelforbindelsen.
MS + ve APCI 413 [M<+>+l].
Eksempel 131
2. 4- dimetvl- 5-( 2- okso- 1. 2- dihvdro- indol- 3- vlidenmetvl)- lH- pvrrol- 3- karboksvlsvre-( 2-dimetvlaminoetvPamid
l,3-dihydro-indol-2-on ble kondensert med 5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre-(2-dimetylamino-etyl)amid, hvilket ga tittelforbindelsen.
'H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 8 13,63 (s, 1H, NH), 10,90 (s, 1H, NH), 7,78 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 7,63 (s, 1H H-vinyl), 7,48 (t, 1H, NH), 7,13 (dt, 1H), 6,98 (dt, 1H), 6,88 (d, J = 7,7 Hz, 1H), 3,31 (q, J = 6,6 Hz, 2H), 2,43 (s, 3H, CH3), 2,40 (s, 3H, CH3), 2,38 (t, J = 6,6 Hz, 2H), 2,19 (s, 6H, N(CH2CH3)2).
MS + ve APCI 353 [M++l].
Eksempel 132
5-( 5- fluor- 2- okso- 1. 2- dihvdro- indol- 3- vlidenmetvl)- 2. 4- dimetvl- lH- pyrrol- 3-karboksvlsvre-( 2- dimetylaminoetvl) amid
5-fluor-l,3-dihydro-indol-2-on ble kondensert med 5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre-(2-dimetylaminoetyl)amid, hvilket ga tittelforbindelsen.
<J>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 8 13,68 (s, 1H, NH), 10,90 (s, 1H, NH), 7,76 (dd, J = 2,4 & 9,4 Hz, 1H), 7,71 (s, 1H H-vinyl), 7,51 (t, 1H, NH), 6,93 (m, 1H), 6,84 (dd, J = 4,6 & 8,4 Hz, 1H), 3,31 (q, J = 6,6 Hz, 2H), 2,43 (s, 3H, CH3), 2,41 (s, 3H, CH3), 2,38 (t, J = 6,6 Hz, 2H), 2,19 (s, 6H, N(CH2CH3)2).
MS + ve APCI 371 [M<+>+l].
Eksempel 190
5- r5- fluor- 2- okso- 1. 2- dihvdroindol-( 3Z)- vlidenmetvn- 2. 4- dimetvl- lH- pyrrol- 3-karboksvlsvre- r2-( pvridin- l- vl) etvl1amid
5-[5-fluor-2-okso-l,2-dihydroindol-(3Z)-ylidenmetyl]-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre (120 mg, 0,4 mmol) ble ristet med EDC, HC1 (96 mg, 0,05 mmol), vannfritt 1-hydroksy-benztriazol (68 mg, 0,5 mmol), og 2-(2-aminoetylpyridin kjøpt fra Aldrich i vannfritt DMF (3 ml) i 2-3 dager ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen ble fortynnet med IM NaHC03 (1,5 ml), deretter med 8 ml vann. Det utfelte råstoffet ble samlet ved hjelp av filtrering, vasket med vann, tørket og renset ved hjelp av krystallisering eller kromatografi, hvilket ga 5-[5-fluor-2-okso-l,2-dihydroindol-(3Z)-ylidenmetyl]-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre-[2-(pyridin-l-yl)-etyl]amid.
Eksempel 189
5- r5- klor- 2- okso- 1. 2- dihvdroindol-( 3Z)- vlidenmetvll- 2. 4- dimetvl- lH- pvrrol- 3-karboksvlsvre- r2-( pvridin- l- vl) etvllamid
Ved å fortsette som beskrevet i tidligere eksempel men ved å erstatte 5-[5-fluor-2-okso-l,2-dihydroindol-(3Z)-ylidenmetyl]-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre med 5-[5-klor-2-okso-l,2-dihydroindol-(3Z)-ylidenmetyl]-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre (127 mg) ble 5-[5-klor-2-okso-l,2-dihydroindol-(3Z)-ylidenmetyl]-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre-[2-(pyridin-l-yl)etyl]amid.
Eksempel 192
545- brom- 2- okso- 1. 2- dihvdroindol- GZVvlidenmetvl1- 2. 4- dimetvl- lH- pvrrol- 3-karboks vis yre- r2- pvridin- 1 - vDetvll amid
Ved å gå frem som beskrevet i eksempel 190 ovenfor men ved å erstatte 5-[5-fluor-2-okso-l,2-dihydroindol-(3Z)-ylidenmetyl]-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre med 5-[5-brom-2-okso-l,2-dihydroindol-(3Z)-ylidenmetyl]-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre (145 mg) ble 5-[5-brom-2-okso-l,2-dihydroindol-(3Z)-ylidenmetyl]-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre-[2-(pyridin-l-yl)etyl]amid tilveiebragt.
Eksempel 191
5- r2- okso- 1. 2- dihvdroindol-( 3Z)- vlidenmetvll- 2. 4- dimetvl- lH- pvrrol- 3- karboksvlsvre-r2-( pyridin- l- vl) etyllamid
Ved å gå frem som beskrevet i eksempel 190 ovenfor men ved å erstatte 5-[5-fluor-2-okso-l,2-dihydroindol-(3Z)-ylidenmetyl]-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre med 5-[2-okso-l,2-dihydroindol-(3Z)-ylidenmetyl]-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre (113 mg) ble 5-[2-okso-l,2-dihydroindol-(3Z)-ylidenmetyl]-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre-[2-(pyridin-l-yl)etyl]amid tilveiebragt.
Eksempel 203
5- r5- cvano- 2- okso- 1. 2- dihvdroindol-( 3Z)- vlidenmetvll- 2. 4- dimetvl- lH- pyrrol- 3-karboksylsvre- r2-( pvridin- l- vl) etvllamid
Ved å gå frem som beskrevet i eksempel 190 ovenfor men ved å erstatte 5-[5-fluor-2-okso-l,2-dihydroindol-(3Z)-ylidenmetyl]-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre med 5-[5-cyano-2-okso-l,2-dihydroindol-(3Z)-ylidenmetyl]-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre (123 mg) ble 5-[5-cyano-2-okso-l,2-dihydroindol-(3Z)-ylidenmetyl]-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre-[2-pyridin-l-yl)etyl]amid tilveiebragt.
Eksempel 168
5-( 5- fluor- 2- okso- 1. 2- dihvdroindol- 3- vlidenmetvl)- 2. 4- dimetvl- lH- pvrrol- 3-karboksvlsvre- r2-( 4- metvlpiperazin- l- vl) etvll- amid
Til en rørt gulmudret blanding av 5-[5-fluor-2-okso-l,2-dihydroindol-(3Z)-ylidenmetyl]-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre (90 mg), DMF (0,8 ml) og TEA (0,084 ml) i et 20 ml reaksjonsrør ble BOP-reagens (199 mg) tilsatt. Blandingen ble klar på 5 min. 2-(4-metylpiperazin-l-yl)etylamin<I> (51 mg) ble tilsatt til den klare blandingen. Den resulterende løsningen ble rørt ved romtemperatur over natt. Gule faste produkter presipiterte fra reaksjonssystemet. Tynnsjiktskromatografi (10 % metanol i metylenklorid) viste at alt utgangsmateriale hadde blitt omdannet til produktet. Det faste stoffet ble isolert ved hjelp av vakuumfiltrering og vasket én gang med etanol (1 ml). Det faste stoffet ble sonikert i dietyleter (2 ml) i 20 min. og samlet ved hjelp av vakuumfiltrering. Etter tørking under vakuum ble 5-(5-fluor-2-okso-l,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre-(4-metylpiperazin-l-yletyl)amid (79 mg, 62 % utbytte) oppnådd.
'H NMR (DMSO-d6) 6 2,13 (s, 3H, CH3), 2,40, 2,42 (2xs, 6H, 2xCH3), 2,41 (m, 2H, CH2), 2,47 (m, 8H, 4xCH2), 3,30 (m, 2H, CH2), 6,82 (dd, J = 4,5, 8,7 Hz, 1H), 6,91 (td, <2>J = 2,4,<3>J = 8,8 Hz, 1H), 7,43 (t, J = 5,6 Hz, 1H), 7,70 (s, 1H), 7,75 (dd, J = 2,8, 9,6 Hz, 1H) (aromatisk og vinyl), 10,88 (s, 1H, CONH), 13,67 (s,lH, NH). LC-MS (m/z) 424,4 (M-l).
Eksempel 169
5-( 5- klor- 2- okso- 1. 2- dihvdroindol- 3- vlidenmetvl)- 2. 4- dimetvl- lH- pvrrol- 3-karboksvlsyre-( 4- metvlpiperazin- l- vletvl) amid
Ved å følge fremgangsmåten i eksempel 168 ovenfor men ved å erstatte 5-[5-fluor-2-okso-l,2-dihydroindol-(3Z)-ylidenmetyl]-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre med 5-[5-klor-2-okso-l,2-dihydroindol-(3Z)-ylidenmetyl]-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre (95 mg, 0,3 mmol) ga 5-(5-klor-2-okso-l,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre-(4-metylpiperazin-l-yletyl)amid (76 mg, 58 %).
'H NMR (DMSO-d6) 8 2,13 (s, 3H, CH3), 2,41, 2,42 (2xs, 6H, 2xCH3), 2,42 (m, 2H, CH2), 2,48 (m, 8H, 4xCH2), 3,30 (m, 2H, CH2), 6,84 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,11 (dd, J = 2,0, 8,0 Hz, 1H), 7,44 (t, J = 5,6 Hz, 1H), 7,76 (s, 1H), 7,97 (d, J = 2,0 Hz, 1H)
(aromatisk og vinyl), 10,98 (s, 1H, CONH), 13,62 (s, 1H, NH), LC-MS (m/z 440,2 (M-l).
Eksempel 170
5-( 5- brom- 2- okso- 1. 2- dihvdroindol- 3- vlidenmetvl)- 2. 4- dimetvl- lH- pvrrol- 3-karboksvlsvre-( 4- metvlpiperazin- l- vletvl) amid
Ved å følge fremgangsmåten beskrevet i eksempel 168 men ved å erstatte 5-(5-klor-2-okso-l,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre med 5-(5-brom-2-okso-l,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre ga 5-(5-brom-2-okso-l,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre-(4-metylpiperazin-l-yletyl)amid (39 mg, 54 %) oppnådd fra SU011670 (54 mg, 0,15 mmol).
'H NMR (DMSO-d6) 8 2,14 (s, 3H, CH3), 2,41, 2,42 (2xs, 6H, 2xCH3), 2,42 (m, 2H, CH2), 2,48 (m, 8H, 4xCH2), 3,31 (m, 2H, CH2), 6,80 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,23 (dd, J = 2,0, 8,0 Hz, 1H), 7,44 (t, J = 5,6 Hz, 1H), 7,76 (s, 1H), 8,09 (d, J = 2,0 Hz, 1H)
(aromatisk og vinyl), 10,99 (s, 1H, CONH), 13,61 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z 486,6 (M).
Eksempel 172
5-( 2- okso- 1. 2- dihvdroindol- 3- vlidenmetvl)- 2. 4- dimetvl- lH- pvrrol- 3- karboksvlsvre-( 4-metvlpiperazin- 1 - vletvPamid
Ved å følge fremgangsmåten beskrevet i eksempel 168 ovenfor men ved å erstatte 5-(5-fluor-2-okso-l,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre-SU014900 med 5-(2-okso-l,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre ga 5-(2-okso-l,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre-(4-metylpiperazin-l-yletyl)amid, SU014903 (136 mg, 84 %) oppnådd fra SU012120 (112,8 mg, 0,4 mmol).
'H NMR (DMSO-d6) 8 2,13 (s, 3H, CH3), 2,39, 2,42 (2xs, 6H, 2xCH3), 2,42 (m, 2H, CH2), 2,48 (m, 8H, 4xCH2), 3,30 (t, 2H, CH2), 6,86 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 6,96 (t, J = 7,4 Hz, 1H), 7,10 (t, J = 7,8 Hz, 1H), 7,41 (t, J = 5,4 Hz, 1H), 7,62 (s, 1H), 7,76 (d, J = 7,6 Hz, 1H) (aromatisk og vinyl), 10,88 (s, 1H, CONH), 13,61 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 406,6 (M-l).
Eksempel 171
5- r2- okso- 1. 2- dihydroindol-( 3Z)- ylidenmetvll- 2. 4- dimetvl- lH- pvrrol- 3- karboksvlsvre-r2-( 3. 5- dimetvlpiperazin- l- yl) etvl) amid
Til en rørt gul mudret blanding av 5-[2-okso-l,2-dihydroindol-(3Z)-ylidenmetyl]-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre (112,8 mg, 0,4 mmol), DMF (0,5 ml) og trietylamin (0,111 ml) i et 20 ml reaksjonsrør ble BOP-reagens (265 mg) tilsatt. Blandingen ble klar på 5 min. 2-(2,6-dimetylpiperazin-l-yl)etylamin (68,6 m) (se Tapia, L. Alonso-Cires, P. Lopez-Tudanca, R. Mosquera, L. Labeaga, A. Innerarity, A. Orjales, J. Med. Chem.. 1999, 42, 2870-2880) tilsatt til den klare blandingen. Den resulterende løsningen ble rørt ved romtemperatur over natt. Tynnsjiktkromatografi (10 % metanol i metylenklorid) viste at alt utgangsmaterialet hadde blitt omdannet til produktet. Reaksjonsblandingen ble fordampet til tørrhet og deretter renset ved hjelp av hurtigkromatografi (CH2C12/CH3OH=20/1-15/1) etterfulgt av rekrystallisering, hvilket ga 5-[2-okso-l,2-dihydroindol-(3Z)-ylidenmetyl]-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre-[2-(3,5-dimetylpiperazin-l-yl)etyl)amid (83 mg, 50 % utbytte).
<*>H NMR (DMSO-d6) 8 1,15, 1,16 (2xs, 6H, 2xCH3), 1,95 (t, J = 11,6 Hz, 2H, CH2), 2,41, 2,47 (2xs, 6H, 2xCH3), 2,50 (m, 2H, CH2), 3,03 (d, J = 10 Hz, 2H), 3,19 (m, 2H), 3,30 (m, 2H, CH2), 6,86 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 6,97 (t, J = 7,2 Hz, 1H), 7,11 (t, J = 7,8 Hz, 1H), 7,48 (t, J = 5,6 Hz, 1H), 7,61 (s, 1H), 7,75 (d, J = 7,6 Hz, 1H) (aromatisk og vinyl), 10,88 (s, 1H, CONH), 13,62 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 422,2 (M+l).
Eksempel 173
5- r5- fluor- 2- okso- 1. 2- dihvdroindol-( 3Z)- vlidenmetvll- 2. 4- dimetvl- lH- pvrrol- 3-karboksvlsvre- r2-( 3. 5- dimetvlpiperazin- l- yl) etvl) amid
Ved å følge fremgangsmåten beskrevet i eksempel 168 ovenfor ble den ønskede forbindelsen oppnådd (60 mg, 0,2 mmol).
'H NMR (DMSO-de) 8 0,891, 0,907 (2xs, 6H, 2xCH3), 1,49 (t, J = 10,54 Hz, 2H), 2,40, 2,42 (2xs, 6H, 2xCH3), 2,41 (m, 2H, CH2), 2,74 (m, 4H), 3,30 (m, 2H), 6,82 (dd, J = 4,5, 8,7 Hz, 1H), 6,90 (td, 2J = 2,4,<3>J = 8,4 Hz, 1H), 7,42 (t, J = 5,6 Hz, 1H), 7,70 (s, 1H), 7,74 (dd, J = 4,6, 8,4 Hz, 1H) (aromatisk og vinyl), 10,88 (s, 1H, CONH), 13,65 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 438,4 (M-l).
Eksempel 174
5- r5- klor- 2- okso- 1. 2- dihvdroindol-( 3Z)- vlidenmetvll- 2. 4- dimetvl- lH- pvrrol- 3-karboksvlsvre- r2-( 3. 5- dimetvlpiperazin- l- vl) etvOamid
Ved å følge fremgangsmåten i eksempel 171 ovenfor ble den ønskede forbindelsen (31,2 mg, 34 %) oppnådd fra 5-[5-klor-2-okso-l,2-dihydroindol-(3Z)-ylidenmetyl]-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre (63 mg, 0,2 mmol).
<!>H NMR (DMSO-d6) 8 1,15, 1,16 (2xs, 6H, 2xCH3), 1,95 (t, J = 11,6 Hz, 2H, CH2), 2,40, 2,42 (2xs, 6H, 2xCH3), 2,50 (m, 2H, CH2), 3,03 (d, J =11,2 Hz, 2H), 3,19 (m, 2H), 3,30 (m, 2H, CH2), 6,85 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,11 (dd, J = 2,0, 8,0 Hz, 1H), 7,52 (t, J =
5,6 Hz, 1H), 7,76 (s, 1H), 7,97 (d, J = 2,0 Hz, 1H) (aromatisk og vinyl), 10,99 (s, 1H, CONH), 13,63 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 456,2 (M+l).
Eksempel 175
5- r5- brom- 2- okso- 1. 2- dihvdroindol-( 3Z)- vlidenmetvll- 2. 4- dimetvl- lH- pvrrol- 3-karboksvlsvre- r2-( 3. 5- dimetvlpiperazin- l- vl) etvnamid
Ved å følge fremgangsmåten beskrevet i eksempel 171 ble den ønskede forbindelsen (40 mg, 40 %) oppnådd fra 5-[5-brom-2-okso-l,2-dihydroindol-(3Z)-ylidenmetyl]-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre (74 mg, 0,2 mmol).
<!>H NMR (DMSO-d6) 8 1,15, 1,16 (2xs, 6H, 2xCH3), 1,95 (t, J = 11,6 Hz, 2H, CH2), 2,40, 2,42 (2xs, 6H, 2xCH3), 2,50 (m, 2H, CH2), 3,03) d, J = 10,4 Hz, 2H), 3,19 (m, 2H), 3,30 (m, 2H, CH2), 6,81 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,24 (dd, J = 2,0, 8,4 Hz, 1H), 7,51 (t, J = 5,6 Hz, 1H), 7,76 (s, 1H), 8,10 (d, J = 2,0 Hz, 1H) (aromatisk og vinyl), 10,99 (s, 1H, CONH), 13,62 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 498,4 (M-l).
Biologiske eksempler
De følgende analyser ble utført for å finne de forbindelser som viste den optimale graden av den ønskede aktiviteten.
A. Analysefremgangsmåte
De følgende analyser kan anvendes for å bestemme aktivitetsnivået og effekten av de ulike forbindelsene ifølge den foreliggende oppfinnelse på én eller flere av PK'ene. Lignende analyser kan konstrueres langs den samme linjen for enhver PK ved anvendelse av teknikker velkjent på området.
Flere av analysene beskrevet heri utføres i en ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Sandwich Assay) format (Voller, et al., 1980, «Enzyme-Linked Immunosorbent Assay», Manual of Clinical Immunology, 2d ed., Rose and Friedman, Am. Soc. Of Microbiology, Washington, D.C., pp. 359-371). Den generelle fremgangsmåten er som følger: en forbindelse blir introdusert for celler som uttrykker testkinasen, enten naturlig eller rekombinant, i et valgt tidsrom, hvoretter, dersom testkinasen er en reseptor, en ligand som er kjent for å aktivere reseptoren blir tilsatt. Cellene lyseres og lysatet overføres til brønnene i en ELISA-plate som på forhånd er belagt med et spesifikt antistoff som gjenkjenner substratet til den enzymatiske fosforyleringsreaksjonen. Ikke-substratforbindelser av cellelysatet vaskes bort og mengden fosforylerin av substratet påvises med et antistoff som spesifikt gjenkjenner fosfotyrosin sammenlignet med kontrollceller som ikke var i kontakt med en testforbindelse.
De for tiden foretrukne protokollene for utføring av ELISA-eksperimentene for bestemte PK'er er tilveiebragt nedenfor. Tilpassing av disse protokollene for å bestemme aktiviteten av forbindelser mot andre RTK'er, såvel som for CTK'er og STK'er er imidlertid godt innenfor rammen av fagmannens kunnskaper. Andre analyser beskrevet heri måler mengden DNA dannet som respons på aktivering av testkinase, som er et generelt mål på en proliferativ respons. Den generelle fremgangsmåten for denne analysen er som følger: en forbindelse ble introdusert for celler som uttrykker testkinasen, enten naturlig eller rekombinant, i et valgt tidsrom hvoretter dersom testkinasen er en reseptor, en ligand som er kjent for å aktivere reseptoren ble tilsatt. Etter inkubering i det minste over natt ble et DNA-merkereagens, slik som 5-bromdeoksyuridin (BrdU) eller H<3->tymidin tilsatt. Mengden merket DNA ble detektert med enten et anti-BrdU-antistoff eller ved å måle radioaktiviteten og ble sammenlignet med kontrollceller som ikke var i kontakt med en testforbindelse.
GST-FLK-1-BIOANALYSE
Denne analysen analyserer tyrosinkinaseaktiviteten til GST-Flkl på poly(glu, tyr)-peptider.
Materialer og reagenser:
1. «Corning» 96-brønners ELISA-plater (Corning katalog nr. 5805-96).
2. poly(gly, tyr) 4:1, lyofilisat (Sigma katalog # P0275).
3. Fremstilling av poly(glu, tyr) (pEY)-belagt analyseplater: dekk 2 ug/brønn med poly(gly, tyr) (pEY) i 100 ug PB S, oppbevar ved romtemperatur i 2 timer eller ved 4°C over natt. Dekk platene godt for å forebygge fordamping. 4. PBS-buffer: for 11 bland 0,2 g KH2P04, 1,15 g Na2HP04, 0,2 g KC1 og 8 g NaCl i ca. 900 ml dH20. Når alle reagensene er oppløst, tilpass pH til 7,2 med HC1. Bring det totale volumet til 11 med dH20.
5. PBST-buffer: til 11 PBS-buffer tilsettes 1,0 ml Tween-20.
6. TBB - blokkeringsbuffer: for 11, bland 1,2 1 g TRIS, 8,77 g NaCl, 1 ml TWEEN-20 i tilnærmingsvis 900 ml dH20. Juster pH til 7,2 med HC1. Tilsett 10 g BSA, rør for å løse. Bring det totale volumet til 11 med dH20. Filtrer for å fjerne partikulært materiale. 7. 1 % BSA i PBS: for å danne en lx arbeidsløsning, tilsett 10 g BSA til tilnærmingsvis 990 ml PBS-buffer, rør for å løse opp. Juster det totale volumet til 1 1 med PBS-buffer, filtrer for å fjerne partikulært materiale.
8. 50 mM Hepes pH 7,5.
9. GST-Flklcd renset fra sf9-rekombinant baculovirustransformering (SUGEN, Inc.).
10. 4 % DMSO i dH20.
11. 10 mM ATP i dH20.
12. 40 mM MnCl2.
13. Kinasefortynningsbuffer (KDB): bland 10 ml Hepes (pH 7,5), 1 ml 5M NaCl,
40 ul 100 mM natriumortovandat og 0,4 ml 5 % BSA i dH20 med 88,56 ml dH20.
14. NUNC-96-brønners V-bunn polypropylenplater, Applied Scientific Katalog # AS-72092. 15. EDTA: bland 14,12 g etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) til tilnærmingsvis 70 ml dH20. Tilsett 10 N NaOH inntil EDTA er oppløst. Juster pH til 8,0. Juster det totale volumet til 100 ml med dH20. 16. l°-antistoff-fotrynningsbuffer: bland 10 ml 5 % BSA i PBS-buffer med 89,5 ml TBST. 17. Anti-fosfotyrosinmonoklonalt antistoff konjugert til pepperrotperoksidase (PY99 HRP, Santa Cruz Biotech). 18. 2,2'-azinobis-(3-etylbenztiazolin-6-sulfonsyre (ABTS, Moss, Cat. No.
ABST).
19. 10 % SDS.
Fremgangsmåte:
1. Dekk Corning 96-brønners ELISA-plater med 2 (lg polyEY-peptid i steril PBS som beskrevet i trinn 3 i materialer og reagenser. 2. Fjern ubundet væske fra brønnene ved å snu platen. Vask én gang med TBST. Snu platene på et papirhåndkle for å fjerne overskudd av væske. 3. Tilsett 100 \ l. 1 % BSA i PBS til hver brønn. Inkuber med røring i 1 time ved romtemperatur.
4. Repeter trinn 2.
5. Væt brønnene med 50 mM HEPES (pH 7,5) (150 ul/brønn).
6. Fortynn testforbindelsen med dH20/4 % DMSO til 4 ganger den ønskede endelige analysekonsentrasjonen i 96-brønners polypropylenplater. 7. Tilsett 25 (il fortynnet testforbindelse til ELISA-plate. I kontrollbrønner plasseres 25 ul dH20/4 % DMSO.
8. Tilsett 25 ul 40 mM MnCl2 med 4xATP (2 uM) til hver brønn.
9. Tilsett 25 ul 0,5 M EDTA til negative kontrollbrønner.
10. Fortynn GST-Flkl til 0,005 ug (5 ng)/brønn med KDB.
11. Tilsett 50 ul fortynnet enzym til hver brønn.
12. Inkuber under røring i 15 min. ved romtemperatur.
13. Stopp reaksjonen ved å tilsette 50 ul 250 mM EDTA (pH 8,0).
14. Vask 3X med TBST og snu platen på papirhåndkleet for å fjerne overskudd av væske. 15. Tilsett 100 ul antifosfotyrosin-HRP-konjugat til hver brønn, 1:5000 fortynnet i antistoff fortynningsbuffer. Inkuber under røring i 90 min. ved romtemperatur.
16. Vask som i trinn 14.
17. Tilsett 100 ul ABTS-løsning med romtemperatur til hver brønn.
18. Inkuber under røring i 10-15 min. Fjern alle bobler.
19. Stopp reaksjonen ved å tilsette 20 ul 10 % SDS til hver brønn.
20. Les resultater på Dynatech MR7000 ELISA-avleser med testfilter ved 410 nM og referansefilter ved 630 nM.
PYK2-BIO AN AL YSE
Denne analysen anvendes for å måle in vitro kinaseaktiviteten til HA-epitopemerkede full-lengde pyk2 (FL.pyk2-HA) i en ELISA-analyse.
Materialer og reagenser:
1. Corning 96-brønners ELISA-plater.
2. 12CA5 monoklonalt anti-HA-antistoff (SUGEN, Inc.).
3. PBS (Dulbeccos fosfatbufrede saltoppløsning (Gibco katalog # 450-1300EB). 4. TBST-buffer: for 11 blandes 8,766 g NaCl, 6,057 g TRIS og 1 ml 0,1 % Triton X-100 i tilnærmingsvis 900 ml dH20. Juster pH til 7,2 og bring volumet til 11. 5. Blokkeringsbuffer: for 1 1 blandes 100 g 10 % BSA, 12,1 g 100 mM TRIS, 58,44 g IM NaCl og 10 ml 1 % TWEEN-20.
6. FL.pyk2-HA fra sf9-cellelysater (SUGEN, Inc.).
7. 4 % DMSO i MilliQue H20.
8. 10 mM ATP i dH20.
9. IM MnCl2.
10. IM MgCl2.
11. IM ditiotreitol (DTT).
12. 10X kinasefosforyleringsbuffer: bland 5,0 ml IM Hepes (pH 7,5), 0,2 ml IM MnCl2, 1,0 ml 1 M MgCl2, 1,0 ml 10 % Triton-X-100 i 2,8 ml dH20. Rett før anvendelse tilsettes 0,1 ml IM DTT.
13. NUNC 96-brønners V-bunns polypropylenplater.
14. 500 mM EDTA i dH20.
15. Antistoff-fortynningsbuffer: for 100 ml, 1 ml 5 % BSA/PBS og 1 ml 10 % Tween-20 i 88 ml TBS.
16. HRP-konjugert anti-Ptyr PY99), Santa Cruz Biotech Cat. No. SC-7020.
17. AB TS, Moss, Cat. No. ABST-2000.
18. 10 % SDS.
Fremgangsmåte:
1. Dekk Corning 96-brønners ELISA-plater med 0,5 ug pr. brønn med 12CA5 anti-HA antistoff i 100 ul PBS. Lagres over natt ved 4°C. 2. Fjern ubundet HA-antistoff fra brønner ved å snu platen. Vask platen med dH20. Snu platen på et papirhåndkle for å fjerne overskudd av væske. 3. Tilsett 150 ul blokkeringsbuffer til hver brønn. Inkuber under røring i 30 min. ved romtemperatur.
4. Vask platen med 4x TBS-T.
5. Fortynn lysatet i PBS (1,5 ug lysat/100 ul PBS).
6. Tilsett 100 ul fortynnet lysat i hver brønn. Rist ved romtemperatur i 1 time.
7. Vask som i trinn 4.
8. Tilsett 50 ul 2X kinasebuffer til ELISA-platen inneholdende bundet pyk2-HA. 9. Tilsett 25 ul 400 uM testforbindelse i 4 % DMSO til hver brønn. For kontrollbrønner anvendes 4 % DMSO alene.
10. Tilsett 25 ul 0,5 M EDTA til negative kontrollbrønner.
11. Tilsett 25 ul 20 uM ATP til alle brønner. Inkuber med risting i 10 min.
12. Stopp reaksjonen ved å tilsette 25 ul 500 mM EDTA (pH 8,0) til alle brønner.
13. Vask som i trinn 4.
14. Tilsett 100 ul HRP-konjugert anti-Ptyr fortynnet 1:6000 i antistoff-fortynningsbuffer til hver brønn. Inkuber med risting i 1 time ved romtemperatur.
15. Vask platen 3X med TBST og IX med PBS.
16. Tilsett 100 ul ABST-løsning til hver brønn.
17. Om nødvendig stoppes utviklingen av reaksjonen ved å tilsette 20 ul 10 % SDS til hver brønn. 18. Avles platen på ELISA-avleser med testfilter ved 410 nM og referansefilter ved 630 nM.
FGFR1-BIOANALYSE
Denne analysen anvendes for å måle in vitro kinaseaktiviteten til FGF1-R i en ELISA-analyse.
Materialer og reagenser:
1. Costar 96-brønner ELISA-plater (Corning Katalog # 3369).
2. Poly(Glu-Tyr) (Sigma Katalog # P0275).
3. PBS (Gibco katalog # 450-1300EB).
4. 50 mM Hepes bufferløsning.
5. Blokkeringsbuffer (5 % BSA/PBS).
6. Renset GST-FGFR1 (SUGEN, Inc.).
7. Kinasefortynningsbuffer. Bland 500 ul IM Hepes (GIBCO), 20 ul 5 % BSA/PBS, 10 ul 100 mM natriumortovanadat og 50 ul 5M NaCl.
8. 10 mM ATP.
9. ATP/MnCl2-fosforyleringsblanding: bland 20 ul ATP, 400 ul 1 M MnCl2 og 9,56 ml dH20. 10. NUNC-96-brønner V-bunn polypropylenplater (Applied Scientific Katalog # AS-72092).
11. 0.5MEDTA.
12. 0,05 % ul TWEEN til 1 liter TBS.
13. Polyklonalt anti-fosfotyrosin kaninserum (SUGEN, Inc.).
14. Anti-kanin IgG-geiteperoksidasekonjugat (Biosource, Katalog # ALI0404).
15. ABTS-løsning.
16. ABTS/H202-løsning.
Fremgangsmåte:
1. Belegg Costar 96-brønners ELISA-plater med 1 ug Poly(Glu.Tyr) i 100 ul PBS pr. brønn. Lagres over natt ved 4°C.
2. Vask belagte plater én gang med PBS.
3. Tilsett 150 ul 5 % BSA/PBS-blokkeringsbuffer til hver brønn. Inkuber med risting i 1 time ved romtemperatur. 4. Vask platen to ganger med PBS, deretter én gang med 50 mM Hepes. Snu platene på et papirhåndkle for å fjerne overskudd av væske og bobler. 5. Tilsett 25 ul 0,4 mM testforbindelse i 4 % DMSO eller 4 % DMSO alene (kontroller) til platen. 6. Fortynn renset GST-FGFR1 i kinasefortynningsbuffer (5 ng kinase/50 ul KDB/brønn).
7. Tilsett 50 ul fortynnet kinase til hver brønn.
8. Start kinasereaksjonen ved å tilsette 25 ul/brønn av friskt fremstilt ATP/Mn++
(0,4 ml IM MnCl2, 40 ul 10 mM ATP, 9,56 ml dH20), fremstilt ferskt).
9. Dette er en rask kinasereaksjon og må stoppes med 25 ul 0,5M EDTA på en måte som ligner tilsettingen av ATP.
10. Vask platene med 4x fersk TBST.
11. Lag antistoff-fortynningsbuffer: per 50 ml: bland 5 ml 5 % BSA, 250 ul 5 % melk og 50 ul 100 mM natriumvanadat, bring til et endelig volum med 0,05 % TBST. 12. Tilsett 100 ul av antifosfotyrosin (1:10000 fortynnet i ADB) til hver brønn. Inkuber under risting i 1 time ved romtemperatur.
13. Vask som i trinn 10.
14. Tilsett 100 ul biokilde anti-kanin IgG-geiteperoksidasekonjugat til hver brønn (l:6000-fortynnet i ADB). Inkuber med risting i 1 time ved romtemperatur. 15. Vask som i trinn 10 og deretter med PBS for å fjerne bobler og overskudd av
TWEEN.
16. Tilsett 100 ul ABTS/H202-løsning til hver brønn.
17. Inkuber med røring i 10-20 min. Fjern alle bobler.
18. Avles analysen på Dynatech MR7000 ELISA-avleser: testfilter ved 410 nM, referansefilter 630 nM.
EGFR-BIOANALYSE
Denne analysen anvendes for in vifrø-kinaseaktivitet av FGF1-R i en ELISA-analyse.
Materialer og reagenser:
1. Corning 96-brønners ELISA-plater.
2. SUMOl monoklonalt anti-EGFR-antistoff (SUGEN, Inc.).
3. PBS.
4. TBST-buffer.
5. Blokkeringsbuffer: for 100 ml, bland 5,0 g «Carnation Instant Non-fat Milk<®>» med 100 ml PBS.
6. A431-cellelysat (SUGEN, Inc.).
7. TBS-buffer:
8. TBS + 10 % DMSO: for 11 bland 1,514 g TRIS, 2,192 g NaCl og 25 ml DMSO; bring til 1 liter totalt volum med dH20. 9. ATP (Adenosin-5'-trifosfat, fra kalvemuskel, Sigma Cat. No. A-5394), 1,0 mM løsning i dH2I. Dette reagenset bør lages umiddelbart før anvendelse og oppbevares på is.
10. l,0mMMnCl2.
11. ATP/MnCl2 fosforyleringsblanding: for å danne 10 ml, bland 300 ul 1 mM ATP, 500 (il MnCl2 og 9,2 ml dH20. Fremstilles rett før anvendelse, oppbevares på is.
12. NUNC-96-brønners V-bunn-polypropylenplater.
13. EDTA.
14. Polyklonal anti-fosfotyrosin kaninserum (SUGEN, Inc.).
15. Anti-kanin IgG geiteperoksidasekonjugat (Biosource Cat. No. ALI0404).
16. ABTS.
17. 30 % hydrogenperoksid.
18. ABTS/H202.
19. 0,2 M HC1.
Frem<g>angsmåte:
1. Belegg Corning 96-brønners ELISA-plater med 0,5 ug SUMOl i 100 ul PBS pr. brønn, lagres over natt ved 4°C. 2. Fjern ubundet SUMOl fra brønner ved å snu platene for å fjerne væske. Vask lx med dH20. Snu platen på et papirhåndkle for å fjerne overskudd av væske. 3. Tilsett 150 ul blokkeringsbuffer til hver brønn. Inkuber under røring i 30 min. ved romtemperatur. 4. Vask platen 3x med deionisert vann, deretter én gang med TBST. Snu platen på et papirhåndkle for å fjerne overskudd av væske og bobler.
5. Fortynn lysatet i PBS (7 ug lysat/100 ul PBS).
6. Tilsett 100 ul fortynnet lysat til hver brønn. Rist ved romtemperatur i 1 time.
7. Vask plater i trinn 4 ovenfor.
8. Tilsett 120 ul TBS til ELISA-platen inneholdende bundet EGFR.
9. Fortynn testforbindelsen 1:10 i TBS, tilsett brønnene.
10. Tilsett 13,5 ul fortynnet testforbindelse i ELISA-platen. Til kontrollbrønner tilsettes 13,5 ul TBS i 10 % DMSO.
11. Inkuber med røring i 30 min. ved romtemperatur.
12. Tilsett 15 ul fosforyleringsblanding til alle brønner bortsett fra negative kontrollbrønner. Endelig brønnvolum burde være tilnærmingsvis 150 ul med endelig konsentrasjon på 3 uM ATP/5 MnCl2 i hver brønn. Inkuber med risting i 5 min. 13. Stopp reaksjonen ved å tilsette 16,5 ul EDTA-løsning under røring. Rist i ytterligere 1 min.
14. Vask 4x med deionisert vann, 2x med TBST.
15. Tilsett 100 ul anti-fosfotyrosin (1:3000 fortynnet i TBST) pr. brønn. Inkuber med risting i 30-45 min. ved romtemperatur.
16. Vask som i trinn 4 ovenfor.
17. Tilsett 100 ul biokilde anti-kanin IgG geiteperoksidasekonjugat (1:2000 fortynnet i TBST) til hver brønn. Inkuber med risting i 30 min. ved romtemperatur.
18. Vask som i trinn 4 ovenfor.
19. Tilsett 100 ul ABTS/H202-løsning til hver brønn.
20. Inkuber 5-10 min. under røring. Fjern alle bobler.
21. Om nødvendig stoppes reaksjonen ved tilsetting av 100 ul 0,2 M HC1 pr.
brønn.
22. Avles analysen på Dynatech MR7000 ELISA-avleser: testfilter ved 410 nM, referansefilter ved 630 nM.
PDGFR-BIOANALYSE
Denne analysen anvendes for in vitro kinaseaktivitet til FGF1-R i en ELISA-analyse.
Materialer og reagenser:
1. Corning 96-brønners ELISA-plater.
2. 28D4C10 monoklonalt anti-PDGFR-antistoff (SUGEN, Inc.).
3. PBS.
4. TBST-buffer.
5. Blokkeringsbuffer (samme som for EGFR-bioanalyser).
6. PDGFR-p-uttrykkende NIH 3T3-cellelysat (SUGEN, Inc.).
7. TBS-buffer.
8. TBS + 10 % DMSO.
9. ATP.
10. MnCl2.
I 11. Kinasebufferfosforyleringsblanding: for 10 ml, bland 250 ul IM TRIS, 200 ul 5M NaCl, 100 ul IM MnCl2 og 50 ul 100 mM Triton X-100 i tilstrekkelig dH20 for å lage 10 ml.
12. NUNC 96-brønners V-bunns polypropylenplater.
13. EDTA.
14. Polyklonalt kanin antifosfotyrosinserum (SUGEN, Inc.).
15. Anti-kanin geite-IgG-peroksidasekonjugat (Biosource Cat. No. ALI0404).
16. AB TS.
17. Hydrogenperoksid, 30 %-løsning.
18. ABTS/H202.
19. 0,2 M HC1.
Fremgangsmåte:
1. Dekk «Corning» 96-brønners ELISA-plater med 0,5 ug 28D4C10 i 100 ul PBS pr. brønn, lagre over natt ved 4°C. 2. Fjern ubundet 28D4C10 fra brønnene ved å snu platen for å fjerne væske. Vask
lx med dH20. Snu platene på et papirhåndkle for å fjerne overskuddet av væske.
3. Tilsett 150 ul blokkeringsbuffer til hver brønn. Inkuber i 30 min. ved romtemperatur med risting. 4. Vask platen 3x med deionisert vann, deretter én gang med TBST. Snu platen på et papirhåndkle for å fjerne overskuddet av væske og bobler.
5. Fortynn lysatet i HNTG (10 ug lysat/100 ul NHTG).
6. Tilsett 100 ul fortynnet lysat til hver brønn. Rist ved romtemperatur i 60 min.
7. Vask platene som beskrevet i trinn 4.
8. Tilsett 80 (il kinasebuffer arbeidsblanding til ELISA-platen inneholdende bundet PDGFR.
9. Fortynn testforbindelsen 1:10 i TBS i 96-brønners polypropylenplater.
10. Tilsett 10 ul fortynnet testforbindelse til ELISA-plate. Til kontrollbrønner tilsettes 10 ul TBS + 10 % DMSO. Inkuber med risting i 30 min. ved romtemperatur. 11. Tilsett 10 ul ATP direkte til alle brønner bortsett fra negative kontrollbrønner (endelig brønnvolum bør være tilnærmingsvis 100 ul med 20 uM ATP i hver brønn). Inkuber i 30 min. med risting. 12. Stopp reaksjonen ved tilsetting av 10 (il EDTA-løsning til hver brønn.
13. Vask 4x med deionisert vann, to ganger med TBST.
14. Tilsett 100 ul anti-fosfotyrosin (1:3000 fortynnet i TBST) pr. brønn. Inkuber med risting i 30-45 min. ved romtemperatur.
15. Vask som i trinn 4.
16. Tilsett 100 ul Biosource anti-kanin geite-IgG-peroksidasekonjugat (1:2000 fortynnet i TBST) til hver brønn. Inkuber med risting i 30 min. ved romtemperatur.
17. Vask som i trinn 4.
18. Tilsett 100 ul ABTS/H202-løsning til hver brønn.
19. Inkuber i 10-30 min. med risting. Fjern alle bobler.
20. Om nødvendig stoppes reaksjonen ved tilsetning av 100 ul 0,2 M HC1 pr. brønn. 21. Avles analysen på Dynatech MR7000 ELISA-avleser med testfilter ved 410 nM og referansefilter ved 630 nM.
CELLULÆR HER-2-KINASEANALYSE
Denne analysen anvendes for å måle HER-2-kinaseaktivitet i hele celler i et ELISA-format.
Materialer og reagenser:
1. DMEM (GIBCO katalog # 11965-092).
2. Føtalt bovint serum (FBS, GIBCO katalog # 16000-044), varmeinaktivert i et vannbad i 30 min. ved 56°C.
3. Trypsin (GIBCO katalog # 25200-056).
4. L-glutamin (GIBCO katalog # 25030-081).
5. HEPES (GIBCO katalog # 15630-080).
6. Vekstmedium bland 500 ml DMEM, 55 ml varmeinaktivert FBS, 10 ml HEPES og 5,5 ml L-glutamin. 7. Sultemedium bland 500 ml DMEM, 2,5 ml varmeinaktivert FBS, 10 ml HEPES og 5,5 ml L-glutamin.
8. PBS.
9. Flatbunnet 96-brønns vevskulturmikrotiterplater («Corning» katalog # 25860).
10. 15 cm vevskulturplater (Corning katalog # 08757148).
11. «Corning»-96-brønns ELISA-plater.
12. NUNC 96-brønns V-bunnet polypropylenplater.
13. «Costar» overføringsinnsats for «Transtar»-96 (Costar katalog # 7610).
14. SUMO 1: monoklonalt anti-EGFR-antistoff (SUGEN, Inc.).
15. TBST-buffer.
16. Blokkeringsbuffer: 5 % «Carnation Instant Milk<®> i PBS.
17. EGF-ligand: EGF-201, Shinko American, Japan. Løs pulver i 100 |il av 10 mM HC1. Tilsett 100 ul 10 mM NaOH. Tilsett 800 ul PBS og overfør til et Eppendorfrør, lagre ved -20°C inntil det skal anvendes. 18. HNTG-lyseringsbuffer For 5X HNTG-løsning, blanding 23,83 g Hepes, 43,83 g NaCl, 500 ml glyserol og 100 ml Triton X-100 og tilstrekkelig dH20 for å danne 11 total løsning. For IX HNTG<*>, bland 2 ml HNTG, 100 ul 0,1 M Na3V04, 250 ul 0,2 M Na4P207 og 100 ul EDTA.
19. EDTA.
20. Na3V04. For å danne utgangsløsning, bland 1,84 g Na3V04 med 90 ml dH20.
Juster pH til 10. Kok i mikrobølgeovn i ett minutt (løsning blir klar). Avkjøl til romtemperatur. Juster pH til 10. Repeter oppvarmings/avkjølingssyklusen inntil pH forblir ved 10. 21. 200 mM Na4P207. 22. Polyklonalt kanin-antiserum spesifikk for fosfotyrosin (anti-Ptyr-antistoff, SUGEN, Inc.). 23. Affinitetsrenset antiserum, anti-kanin geite-IgG-antistoff, peroksidasekonjugat (Biosource Cat # ALI0404).
24. ABTS-løsning.
25. 30 % hydrogenåeroksidløsning.
26. ABTS/H202.
27. 0,2 M HC1.
Fremgangsmåte:
1. Dekk «Corning» 96-brønners ELISA-plater med SUMOl ved 1,0 ug pr. brønn i PBS, 100 ul endelig volum/brønn. Lagre over natt ved 4°C. 2. Etter én dags anvendelse fjernes beleggingsbufferen og platen vaskes tre ganger med dH20 og én gang med TBST-buffer. All vask i denne analysen bør utføres på denne måten, om det ikke er spesifisert på annen måte. 3. Tilsett 100 ul blokkeringsbuffer til hver brønn. Inkuber platen med risting i 30 min. ved romtemperatur. Rett før anvendelse vaskes platen.
4. Anvend EGFr/HER-2 chimer/3T3-C7-cellelinjen for denne analysen.
5. Velg plater med 80-90 % konfluens. Samle celler ved hjelp av trypsinering og sentrifugering ved 1000 rpm ved romtemperatur i 5 min. 6. Resuspender celler i sultemedium og tell med tryptanblokk. Overlevelse over 90 % er krevet. Så cellene i sultemedium ved en tetthet på 2500 celler pr. brønn, 90 ul pr. brønn i en 96-brønners mikrotiterplate. Inkuber utsådde celler over natt ved 37°C under 5 % C02.
7. Start analysen to dager etter utsåing.
8. Testforbindelser løses i 4 % DMSO. Prøver fortynnes deretter ytterligere direkte på plater med sulte-DMEM-medium. Vanligvis vil denne fortynningen være 1:10 eller større. Alle brønner overføres deretter til celleplaten ved en ytterligere 1:10-fortynning (10 ul prøve og medium i 90 ul sultemedium. Den endelige DMSO-konsentrasjonen burde være 1 % eller lavere. En standard seriefortynning kan også anvendes.
9. Inkuber under 5 % C02 ved 37°C i 2 timer.
10. Fremstill EGF-ligand ved å fortynne EGF-utgangsløsning (16,5 uM) i varm DMEM til 150 nM.
11. Fremstill fersk HNTG<*> tilstrekkelig for 100 ul pr. brønn; plasser på is.
12. Etter 2 timers inkubering med testforbindelse tilsettes fremstilt EGF-ligand til celler, 50 ul pr. brønn, til en endelig konsentrasjon på 50 nM. Positive kontrollbrønner mottar den samme mengden EGF. Negative kontroller mottar ikke EGF. Inkuber ved 37°C i 10 min.
13. Fjern testforbindelsen, EGF og DMEM. Vask celler én gang med PBS.
14. Overfør HNTG<*> til celler, 100 ul pr. brønn. Plasser på is i 5 min. Imens fjernes blokkeringsbufferen fra ELISA-platen og vaskes. 15. Skrap celler fra platen med en mikropipette og homogeniser cellematerialet ved hjelp av repeterende aspirering og løsing i HNTG<*->lyseringsbuffer. Overfør lysatet til en belagt, blokkert, vasket ELISA-plate. Eller anvend en «Costar»-overføringsinnsats for å overføre lysat til platen.
16. Inkuber med risting ved romtemperatur i 1 time.
17. Fjern lysatet, vask. Overfør fersk fortynnet anti-Ptyr-antistoff (1:3000 i TBST) til ELISA-platen, 100 ul pr. brønn.
18. Inkuber med risting ved romtemperatur i 30 min.
19. Fjern anti-Ptyr-antistoff, vask. Overfør fersk fortynnet «BIOSOURCE»-antistoff til ELISA-platen (1:8000 i TBST, 100 ul pr. brønn).
20. Inkuber med risting ved romtemperatur i 30 min.
21. Fjern «BIOSOURCE»-antistoff, vask. Overfør ferskt fremstilt ABTS/H202-løsning til ELISA-platen, 100 ul pr. brønn.
22. Inkuber med risting i 5-10 min. Fjern alle bobler.
23. Stopp reaksjonen ved tilsetting av 100 ul 0,2 M HC1 pr. brønn.
24. Les analysen på Dynatech MR7000-ELISA-avleser med testfiltersett ved 410 nM og referansefilter ved 630 nM.
CDK2/CYKLIN A-ANALYSE
Til denne analysen anvendes for å måle in v/frø-serin/treonin kinaseaktiviteten på humant cdk2/cyklin A i en tilnærmet scintillasjonsanalyse («Scintillation Proximity Assay, SPA).
Materialer og reagenser.
1. «Wallac»-96-brønn polyetylentereftalat-(fleksi)-plater (Wallac katalog # 1450-401).
2. Amersham Redivue [y^PJ-ATP (Amersham katalog #AH 9968).
3. Amersham streptavidindekkede polyvinyltoluen-SPA-kuler (Amersham katalog # RPNQ0007). Kulene bør fordeles på nytt i PBS uten magnesium eller kalsium ved 20 mg/ml. 4. Aktivert cdk2/cyklin A-enzymkompleks renset fra Sf9-celler (SUGEN, Inc.). 5. Biotynylert peptidsubstrat (Debtide). Peptidet biotin-X-PKTPKKAKKL løses i dH20 ved en konsentrasjon på 5 mg/ml.
Peptid/ATP-blanding: for 10 ml, bland 9,979 ml dH20, 0,00125 ml «cold» ATP, 0,010 ml Debtide og 0,010 ml y^P ATP. Den ultimate konsentrasjon pr. brønn vil være 0,5 |xM «cold» ATP, 0,1 ug Debtide og 0,2 uCi -/"P ATP. 7. Kinasebuffer: for 10 ml, bland 8,85 ml dH20, 0,625 ml TRIS (pH 7,4), 0,25 ml IM MgCl2, 0,25 ml 10 % NP40 og 0,025 ml IM DTT, tilsettes fersk rett før anvendelse.
8. 10 mM ATP i dH20.
9. IM Tris, pH justert til 7,4 med HC1.
10. IM MgCl2.
11. IM DTT.
12. PBS (Gibco katalog # 14190-144).
13. 0,5 M EDTA.
14. Stopp løsning: for 10 ml, bland 9,25 ml PBS, 0,005 ml 100 mM ATP, 0,1 ml 0,5 M EDTA, 0,1 ml 10 % Triton X-100 og 1,25 ml av 20 mg/ml SPA-kuler.
Fremgangsmåte:
1. Fremstill løsninger av testforbindelser ved 5x den ønskede endelige konsentrasjonen i 5 % DMSO. Tilsett 10 ul til hver brønn. For negative kontroller anvend 10 ul 5 % DMSO alene i brønner.
2. Fortynn 5 ul cdk2/cyklin A-løsning med 2,1 ml 2x kinasebuffer.
3. Tilsett 20 ul enzym til hver brønn.
4. Tilsett 10 ul 0,5 M EDTA til de negative kontrollbrønnene.
5. For å starte kinasereaksjonen tilsettes 20 ul peptid/ATP-blanding til hver brønn. Inkuber i 1 time uten risting.
6. Tilsett 200 ul stoppløsning til hver brønn.
7. Oppbevar i det minste i 10 min.
8. Sentrifuger platen ved tilnærmet 2300 rpm i 3-5 min.
9. Tell platen ved anvendelse av trilux eller lignende avleser.
MET-TRANSFOSFORYLERINGS ANALYSE
Denne analysen anvendes for å måle fosfotyrosinnivåer på poly(glutaminsyre:tyrosin (4:l))-substrat som et middel for å identifisere agonister/antagonister av met-transfosforylering av substratet.
Materialer og reagenser:
1. «Corning»-96-brønners ELISA-plater, Corning katalog # 25805-96.
2. PolyCglu, tyr) 4:1, Sigma, katalog nr. P 0275.
3. PBS, Gibco katalog # 450-1300EB.
4. 50 mM HEPES.
5. Blokkeringsbuffer: Løs 25 g bovint serumalbumin, Sigma kat. nr. A-7888, i 500 ml PBS, filtrer gjennom et 4 um-filter.
6. Renset GST-fusjonsprotein inneholdende Met-kinasedomenet, Sugen, Inc.
7. TBST-buffer.
8. 10 % vandig (MilliQue H20) DMSO.
9. 10 mM vandig (dH20) Adenosin-5'-trifosfat, Sigma kat. nr. A-5394.
10. 2X Kinasefortynningsbuffer: for 100 ml, bland 10 ml IM HEPES ved pH 7,5 med 0,4 ml 5 % BSA/PBS, 0,2 ml 0,1 M natriumortovanadat og 1 ml 5M natriumklorid i 88,4 ml dH20. 11. 4X ATP-reaksjonsblanding: for 10 ml, bland 0,4 ml 1 M manganklorid og 0,02 ml 0,1 M ATP i 9,56 ml dH20. 12. 4X negativ kontrollblanding: for 10 ml, bland 0,4 ml 1 M manganklorid i 9,6 ml dH20. 13. NUNC 96-brønn V-bunn polypropylenplater, Applied Scientific katalog # S-72092.
14. 500 mM EDTA.
15. Antistoff-fortynningsbuffer: for 100 ml, bland 10 ml 5 % BSA/PBS, 0,5 ml 5 % «Carnation Instant Milk<®>» i PBS og 0,1 ml 0,1 M natriumortovanadat i 88,4 ml
TBST.
16. Polyklonal kanin antofosfotyrosinantistoff, Sugen, Inc.
17. Anti-kanin geite-reddikperoksidasekonjugert antistoff, Biosource, Inc.
18. ABTS-løsning: for 1 1, bland 19,21 g sitronsyre, 35,49 g Na2HOP4 og 500 mg ABTS med tilstrekkelig dH20 for å lage 11. 19. ABTS/H202: bland 15 ml ABST-løsning med 2 ul H202 fem minutter før bruk. 20. 0,2 M HC1.
Fremgangsmåte:
1. Dekk ELISA-plater med 2 ug Poly(Glu-Tyr) i 100 ul PBS, lagre over natt ved 4°C.
2. Blokker platen med 150 ul 5 % BSA/PBS i 60 min.
3. Vask platen to ganger med PBS, én gang med 50 mM Hepes-buffer pH 7,4.
4. Tilsett 50 ul av den fortynnede kinasen til alle brønner. (Renset kinase er fortynnet med kinasefortynningsbuffer. Endelig konsentrasjon bør være 10 ng/brønn). 5. Tilsett 25 ul testforbindelse (i 4 % DMSO) eller DMSO alene (4 % i dH20) for kontroller til platen.
6. Inkuber kinase/forbindelsesblandingen i 15 min.
7. Tilsett 25 ul 40 mM MnCl2 til de negative kontrollbrønnene.
8. Tilsett 25 ul ATP/MnCl2-blanding til alle de andre brønnene (bortsett fra negative kontroller). Inkuber i 5 min.
9. Tilsett 25 (il 500 mM EDTA for å stoppe reaksjonen.
10. Vask platen 3x med TBST.
11. Tilsett 100 ul polyklonalt kanin-anti-Ptyr fortynnet 1:10000 i antistoff-fortynningsbuffer til hver brønn. Inkuber med risting ved romtemperatur i 1 time.
12. Vask platen 3x med TBST.
13. Fortynn «Biosource» HRP-konjugert anti-kanin antistoff 1:6000 i antistoff-fortynningsbuffer. Tilsett 100 ul pr. brønn og inkuber ved romtemperatur med risting i 1 time.
14. Vask platen én gang med PBS.
15. Tilsett 100 ul ABTS/H202-løsning til hver brønn.
16. Om nødvendig stoppes utviklingen av reaksjonen ve tilsetting av 100 ul 0,2 M HC1 pr. brønn. 17. Avlese platen på Dynatech MR7000 elisa-avleser med testfilter ved 410 nM og referansefilter ved 630 nM.
IGF-1-TRANSFOSFORYLERINGS ANALYSE
Denne analysen anvendes for å måle fosfotyrosinnivået i poly(glutaminsyre:tyrosin)
(4:1) for identifiseringen av agonister/antagonister av gst-IGF-l-transfosforylering av et substrat.
Materialer og reagenser:
1. Corning 96-brønner Elisa-plater.
2. Poly(Glu-tyr) (4:1), Sigma kat. nr. P 0275.
3. PBS, Gibco katalog # 450-1300EB.
4. 50 mM HEPES.
5. TBB-blokkeringsbuffer: for 1 1, bland 100 g BSA, 12,1 g TRIS (pH 7,5), 58,44 g natriumklorid og 10 ml 1 % TWEEN-20. 6. Renset GST-fusjonsprotein inneholdende IGF-1 kinasedomenet (Sugen, Inc.). 7. TBST-buffer: for 1 1, bland 6,057 g Tris, 8,766 g natriumklorid og 0,5 ml TWEEN-20 med nok dH20 til å lage 1 liter.
8. 4 % DMSO i Milli-Q H20.
9. 10 mM ATP i dH20.
10. 2X kinasefortynningsbuffer: for 100 ml, bland 10 ml 1 M HEPES (pH 7,5), 0,4 ml 5 % BSA i dH20, 0,2 ml 0,1 M natriumortovanadat og 1 ml 5 M natriumklorid med nok dH20 til å lage 100 ml. 11. 4X ATP-reaksjonsblanding: for 10 ml, bland 0,4 ml 1 M MnCl2 og 0,008 ml 0,01 M ATP og 9,56 ml dH20. 12. 4X negativ kontrollblanding: bland 0,4 ml 1 M manganklorid i 9,60 ml dH20.
13. NUNC 96-brønners V-bunnet polypropylenplater.
14. 500 mM EDTA i dHzO.
15. Antistoff-fortynningsbuffer: for 100 ml, bland 10 ml 5 % BSA i PBS og 0,1 ml 0,1 M natriumortovanadat i 88,4 ml TBST.
16. Polyklonal kanin-antifosfotyrosinantistoff, Sugen, Inc.
17. Anti-kanin HRP-konjugert geiteantistoff, Biosource.
18. ABTS-løsning.
20. ABTS/H202: bland 15 ml ABTS med 2 ul H202 5 min. før bruk. 21. 0,2 M HC1 i dH20.
Fremgan<g>småte:
1. Dekk ELISA-plate med 2,0 ug/brønn Poly(Glu, Tyr) 4:1 (Sigma P0275) i 100 ul PBS. Lagre platen over natt ved 4°C.
2. Vask platen én gang med PBS.
3. Tilsett 100 ul TBB-blokkeringsbuffer til hver brønn. Inkuber platen i 1 time med risting ved romtemperatur. 4. Vask platen én gang med PBS, deretter to ganger med 50 mM Hepes-buffer, pH7,5. 5. Tilsett 25 ul testforbindelse i 4 % DMSO (oppnådd ved å fortynne en utgangsløsning av 10 mM testforbindelse i 100 % DMSO med dF^O) til platen. 6. Tilsett 10,0 ng gst-IGF-l-kinase i 50 ul kinasefortynningsbuffer) til alle brønner. 7. Start kinasereaksjonen ved å tilsette 25 ul 4X ATP reaksjonsblanding til alle testbrønner og positive kontrollbrønner. Tilsett 25 ul 4X negativ kontrollblanding til alle negative kontrollbrønner. Inkuber i 10 min. med risting ved romtemperatur.
8. Tilsett 25 ul 0,5 M EDTA (pH 8,0) til alle brønner.
9. Vask platen 4x med TBST-buffer.
10. Tilsett polyklonalt kanin anti-fosfotyrosin ntisera ved en fortynning på 1:10000 i 100 ul antistoff-fortynningsbuffer til alle brønner. Inkuber med risting ved romtemperatur i 1 time.
11. Vask platen som i trinn 9.
12. Tilsett 100 ul «Biosource» anti-kanin HRP ved en fortynning på 1:10000 i antistoff-fortynningsbuffer til alle brønner. Inkuber med risting ved romtemperatur i 1 time. 13. Vask platen som i trinn 9, etterfulgt av én vask med PBS for å redusere bobler og overskudd av Tween-20.
14. Fremkall ved å tilsette 100 ul/brønn ABTS/H202 til hver brønn.
15. Etter omtrent 5 min. les av på ELISA-avleser med testfilter 410 nm og referansefilter 630 nm.
BRDU-INKORPORERINGS ANALYSER
De følgende analyser anvender celler fremstilt for å uttrykke en valgt reseptor og deretter evaluere effekten av en forbindelse av interesse på aktiviteten til ligand-indusert DNA-syntese ved å bestemme BrdU-inkorporering i DNA.
De følgende materialene, reagensene og fremgangsmåtene er generelle for hver av de følgende BrdU-inkorporeringsanalysene. Forskjellene i de spesifikke analyser er angitt.
Materialer og reagenser:
1. Den aktuelle ligand.
2. De aktuelle fremstilte celler.
3. BrdU-merkereagens: 10 mM i PBS (pH 7,4) (Boehringer Mannheim, Tyskland). 4. FixDenat: fikseringsløsning (klar til bruk) (Boehringer Mannheim, Tyskland). 5. Anti-BrdU-POD: monoklonalt museantistoff konjugert med peroksidase (Boehringer Mannheim, Tyskland). 6. TMB-substratløsning: tetrametylbenzidin (TMB, Boehringer Mannheim, Tyskland).
7. PBS vaskeløsning: IX PBS, pH 7,4.
8. Albumin, bovint (BSA), fraksjon V-pulver (Sigma Chemical Co., USA).
Generell fremgangsmåte:
1. Celler såes ut ved 8000 celler/brønn i 10 % CS, 2 mM Gin i DMEM, i en 96-brønners plate. Celler inkuberes over natt ved 37°C i 5 % CO2. 2. Etter 24 timer vaskes cellene med PBS og deretter serumsultes de i serumfritt medium (0 % CS DMEM med 0,1 % BSA) i 24 timer. 3. På dag 3 tilsettes den aktuelle ligand og testforbindelsen til cellene samtidig. De negative kontrollbrønnene mottar kun serumfritt DMEM med 0,1 % BSA; de positive kontrollbrønner mottar liganden men ikke noe testforbindelse. Testforbindelser fremstilles i serumfritt DMEM med ligand i en 96-brønners plate og seriefortynnes for 7 testkonsentrasjoner. 4. Etter 18 timer med ligandaktivering tilsettes fortynnet BrdU-merkereagens (1:100 i DMEM, 0,1 % BSA) og cellene inkuberes med BrdU (endelig konsentrasjon = 10 uM) i 1,5 timer. 5. Etter inkubering med merkereagens fjernes mediet ved hjelp av dekantering og platen settes opp-ned på et papirhåndkle. Fikseringsdenatureringsløsning tilsettes (50 |xl/brønn) og platene inkuberes ved romtemperatur i 45 min. på en platerister. 6. Fikseringsdenatureringsløsningen fjernes nøye ved hjelp av dekantering og platene snus opp-ned på et papirhåndkle. Melk tilsettes (5 % dehydrert melk i PBS, 200 ul/brønn) som en blokkeringsløsning og platen inkuberes i 30 min. ved romtemperatur på en platerister. 7. Blokkeringsløsningen fjernes ved dekantering og brønnene vaskes én gang med PBS. Anti-BrdU-POD-løsning (1:200 fortynnet i PBS, 1 % BSA) tilsettes (50 ul/brønn) og platen inkuberes i 90 min. ved romtemperatur på en platerister. 8. Antistoffkonjugatet fjernes nøye ved hjelp av dekantering og brønnene renses fem ganger med PBS og platene tørkes ved å snu dem opp-ned på et papirhåndkle. 9. TMB-substratløsning tilsettes (100 ul/brønn) og inkuberes i 20 min. ved romtemperatur på en platerister inntil fargeutviklingen er tilstrekkelig for fotometrisk deteksjon. 10. Absorbansen på prøvene måles ved 410 nm (på en «dobbel bølgelengde»-måte med et filter som leser ved 490 nm, som en referansebølgelengde) på en Dynatech ELISA-plateavleser.
EGF-indusert BrdU-inkorporeringsanalyse
Materialer og reagenser:
1. Muse-EGF, 201 (Toyobo Co., Ltd., Japan).
2. 3T3/EGFRc7.
EGF-indusert Her-2-drevet BrdU-inkorporeringsanalyse
Materialer og reagenser:
1. Muse-EGF, 201 (Toyobo Co., Ltd., Japan).
2. 3T3/EGFr/Her2/EGFr (EGFr med et Her-2-kinasedomene).
EGF-indusert Her-4-drevet BrdU-inkorporeringsanalyse
Materialer og reagenser:
1. Muse-EGF, 201 (Toyobo Co., Ltd., Japan).
2. 3T3/EGFr/Her4/EGFr (EGFr med et Her-4-kinasedomene).
PDGF-indusert BrdU-inkorporeringsanalyse
Materialer og reagenser:
1. Human PDGF B/B (Boehringer Mannheim, Tyskland).
2. 3T3/EGFRc7.
FGF-indusert BrdU-inkorporeringsanalyse
Materialer og reagenser:
1. Human FGF2/bFGF (Gibco BRL, USA).
2. 3T3c7&EGFr.
IGFl-indusert BrdU-inkorporeringsanalyse
Materialer og reagenser:
1. Humant rekombinant (G511, Promega Corp., USA).
2. 3T3/IGFlr.
Insulin-indusert BrdU-inkorporeringsanalyse
Materialer og reagenser:
1. Insulin, krystallinsk, bovint, Zinc (13007, Gibco BRL, USA). 2. 3T3/H25.
HGF-indusert BrdU-inkorporeringsanalyse
Materialer og reagenser:
1. Rekombinant human HGF (kat. nr. 249-HG, R&D Systems Inc., USA).
2. ExPC-3-celler (ATCC CRL-1687).
Fremgangsmåte:
1. Celler såes ved 9000 celler/brønn i RPMI10 % FBS i en 96-brønners plate. Celler inkuberes over natt ved 37 °C i 5 % C02. 2. Etter 24 timer vaskes cellene med PBS og deretter serumsultes de i 100 ul serumfritt medium (RPMI med 0,1 % BSA) i 24 timer. 3. På dag 3 tilsettes 25 ul inneholdende ligand (fremstilt ved 1 ug/ml i RPMI med 0,1 % BSA; endelig HGF-konsentrasjon er 200 ng/ml) og testforbindelser til cellene. De negative kontrollbrønnene tilsettes kun 25 ul serumfritt RPMI med 0,1 % BSA; de positive kontrollbrønnene tilsettes liganden (HGF) men ingen testforbindelse. Testforbindelsene fremstilles ved fem ganger deres endelige konsentrasjon i serumfritt RPMI med ligand i en 96-brønners plate og seriefortynnes slik at det oppnås syv testkonsentrasjoner. Vanligvis er den høyeste endelige konsentrasjonen av testforbindelsen 100 uM, og 1:3 fortynninger anvendes (dvs. endelig testforbindelseskonsentrasjonsområde er 0,137-100 uM). 4. Etter 18 timer ligandaktivering tilsettes 12,5 ul fortynnet BrdU-merkereagens (1:100 i RPMI, 0,1 % BSA) til hver brønn og cellene inkuberes med BrdU (endelig konsentrasjon er 10 uM) i 1 time.
5. Tilsvarende som den generelle fremgangsmåte.
6. Tilsvarende som den generelle fremgangsmåte.
7. Blokkeringsløsningen fjernes ved dekantering og brønnene vaskes én gang med PBS. Anti-BrdU-POD-løsning (1:100 fortynning i PBS, 1 % BSA) tilsettes (100 ul/brønn) og platen inkuberes i 90 min. ved romtemperatur på en platerister.
8. Tilsvarende som den generelle fremgangsmåte.
9. Tilsvarende som den generelle fremgangsmåte.
10. Tilsvarende som den generelle fremgangsmåte.
HUV-EC-C-analyse
Denne analysen anvendes for å måle en forbindelses aktivitet mot PDGF-R, FGF-R, VEGF, aFGF eller Flk-1/KDR, som alle naturlig uttrykkes av HUV-EC-celler.
DAGO
1. Vask og trypsiner HUV-EC-C-celler (humane umbilikale veneendotelceller, (American Type Culture Collection, katalog nr. 1730 CRL). Vask med Dulbeccos fosfatbufrede saltoppløsning (D-PBS, oppnådd fra Gibco BRL, katalog nr. 14190-029) 2 ganger ved omtrent 1 ml/10 cm<2> vevskulturflaske. Trypsiner med 0,05 % trypsin-EDTA
i ikke-enzymatisk celleoppløsningsløsning (Sigma Chemical Company, katalog nr. C-1544). 0,05 %-trypsinet dannes ved fortynning av 0,25 % trypsin/1 mM EDTA (Gibco, katalog nr. 25200-049) i celleoppløsningsløsningen. Trypsinering med omtrent 1 ml/15-30 cm vevskulturflaske i omtrent 5 min. ved 37°C. Etter cellene er blitt dekantert fra flasken tilsettes et likt volum analysemedium og dette overføres til et 50 ml sterilt sentrifugerør (Fisher Scientific, katalog nr. 05-539-6). 2. Vask cellene med omtrent 35 ml analysemedium i det 50 ml sterile sentrifugerøret ved å tilsette analysemedium, sentrifuger i 10 min. ved tilnærmet 2x g, aspirer supernatanten og resuspender med 35 ml D-PBS. Gjenta vaskingen to ganger til med D-PBS, resuspender cellene i omtrent 1 ml analysemedium/15 cm ry vevskulturflaske. Analysemedium består av F12K-medium (Gibco BRL, katalog nr. 21127-014) og 0,5 % varmeinaktivert føtalt bovint serum. Tell cellene med en «Coulter Counter<®>» (Coulter Electrinics, Inc.) og tilsett analysemedium til cellene for å oppnå en konsentrasjon på 0,1-1,0 x 10<5> celler/ml. 3. Tilsett cellene til 96-brønners flatbunnede plater ved 100 ul/brønn eller 0,8-1,0 x IO<4> celler/brønn, inkuber i omtrent 24 timer ved 37°C, 5 % C02.
DAG 1
1. Lag to gangers testforbindelsestitreringer i separate 96-brønns plater, vanligvis 50 uM ned til 0 uM. Anvend det samme analysemedium som nevnt for dag 0, trinn 2 ovenfor. Titreringer dannes ved å tilsette 90 ul 200 uM testforbindelse/brønn (4X den endelige brønnkonsentrasjonen) til toppbrønnen til en spesifikk platekolonne. Siden testprøveforbindelsen vanligvis er 20 mM i DMSO inneholder 200 uM medikament-konsentrasjon 2 % DMSO.
En fortynningsløsning laget til 2 % DMSO i analysemedium (F12K + 0,5 % føtalt bovint serum) anvendes som fortynningsmiddel for testforbindelsetitreringene for å fortynne testforbindelsen men holde DMSO-konsentrasjonen konstant. Tilsett dette fortynnings-midlet til de gjenværende brønnene i kolonnen ved 60 ul/brønn. Ta 60 ul fra de 120 ul av 200 uM testforbindelsesfortynning i toppbrønnen til kolonnen og bland med 60 ul i den andre brønnen til kolonnen. Ta 60 ul fra denne brønnen og bland med 60 ul i den tredje brønnen til kolonnen og så videre inntil 2X titreringer er ferdig. Når den nest siste brønnen er blandet tas 60 ul av de 120 ul i denne brønnen og fjernes. La den siste brønnen med 60 ul DMSO/mediefortynningsmiddel som en ikke-testforbindelseinne-holdende kontroll. Lag 9 kolonner av titrert testforbindelse, nok for tre brønner hver av: (1) VEGF (oppnådd fra Pepro Tech Inc., katalog nr. 100-200, (2) endotel cellevekstfaktor (ECGF) (også kjent som sur fibroblast vekstfaktor, eller aFGF) (oppnådd fra Boehringer Manneim Biochemica, katalog nr. 1439-600), eller (3) human PDGF B/B (1276-956, Boehringer Mannheim, Tyskland) og analysemediekontroll. ECGF leveres som et preparat med natriumheparin. 2. Overfør 50 ul/brønn av testforbindelsesfortynningene til de 96-brønners analyseplater inneholdende de 0,8-1,0 x IO4 celler/100 ul/brønn av de HUV-EC-C-cellene fra dag 0 og inkuber ca. 2 timer ved 37°C, 5 % CO2. 3. Tilsett 50 ul/brønn av 80 ug/ml VEGF, 20 ng/ml ECGF, eller mediekontroll i triplikat til hver testforbindelsesbetingelse. Som for testforbindelsene er vekstfaktor-konsentrasjonene 4x den ønskelige endelige konsentrasjon. Anvend analysemediet fra dag 0 trinn 2 for å danne konsentrasjonene av vekstfaktorene. Inkuber tilnærmingsvis 24 timer ved 37°C, 5 % CO2. Hver brønn vil nå ha 50 ul testforbindelsefortynning, 50 ul vekstfaktor eller medie og 100 ul celler som beregnes i 200 ul/brønn totalt. De 4X konsentrajsonene av testforbindelse og vekstfaktor blir følgelig IX når alt har blitt tilsatt til brønnene.
DAG 2
1. Tilsett 3H-tymidin (Amersham, katalog nr. TRK-686) ved 1 uCi/brønn (10 ul/brønn av 100 uCi/ml-løsning dannet i RPMI-mediet + 10 % varmeinaktivert føtalt bovint serum) og inkuber omtrent 24 timer ved 37°C, 5 % CO2. RPMI oppnås fra Gibco BRL, katalog nr. 11875-051.
DAG 3
1. Frys platene over natt ved -20°C.
DAG 4
Skrap platene og høst med en 96-brønners platehøster (Tomtec Harvester 96<®>) på filtermatter (Wallac, katalog nr. 1205-401), avles tellinger på en Wallac Betaplate™-væskescintillasjonsteller.
TABELL 3 viser resultatene fra biologisk testing av noen eksempelforbindelser ifølge oppfinnelsen. Resultatene er vist i form av IC50, mikromolar (uM)-konsentrasjonen av forbindelsen som er testet som kan forårsake en 50 % endring i aktiviteten til mål PKT'en sammenlignet med aktiviteten til PTK'en i en kontroll hvortil det ikke er tilsatt noen testforbindelse. Nærmere bestemt indikerer de viste resultatene den konsentrasjon av en testforbindelse som er nødvendig for å forårsake en 50 % reduksjon i aktiviteten til mål-PTK'en. Bioanalyser som har blitt eller kan anvendes for å evaluere forbindelser er beskrevet i detalj nedenfor.
IN V/VØ-DYREMODELLER
Xeno graft dyremodeller
Humane tumorers evne til å vokse som xenografter i atymiske mus (f.eks. Balb/c, nu/nu) tilveiebringer en anvendelig in vivø-modell for å undersøke den biologiske responsen til humene tumorterapier. Siden den første vellykkede xenotransplantasjonen av humane tumorer i atymiske mus, (Rygaard og Povlsen, 1969, Acta Pathol. Microbial. Scand. 77:758-760) har mange forskjellige humane tumorcellelinjer (f.eks. bryst, lunge, genitourinar, gastrointestinal, hode og nakke, glioblastom, ben og malign melanom) blitt transplantert og vellykket dyrket i mange mus. De følgende analysene kan anvendes for å bestemme aktivitetsnivået, spesifisiteten og effekten av forskjellige forbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelse. Tre generelle analysetyper er anvendelige for å evaluere forbindelser: cellulære/katalytiske, cellulære/biologiske og in vivo. Formålet ved de cellulære/katalytiske analysene er å bestemme en forbindelseseffekt på en TK's evne til å fosforylere tyrosiner på et kjent substrat i en celle. Formålet ved de cellulære/- biologiske analysene er å bestemme en forbindelseseffekt på den biologiske responsen stimulert av en TK i en celle. Formålet ved in vivø-analysene er å bestemme effekten til en forbindelse i en dyremodell for en spesifikk sykdom, slik som kreft.
Egnede cellelinjer for subkutane xenografteksperimenter inkluderer C6-celler (glioma, ATCC # CCL 107), A375 celler (melanoma, ATCC # CRL 1619), A431-celler (epidermoid karsinom, ATCC # CRL 1555), Calu 6-celler (lunge, ATCC # HTB 56), PC3-celler (prostata, ATCC # CEL 1435), SKOV3TP5-celler og NIH-3T3-fibroblaster som er konstruert genetisk for å overuttrykke EGFR, PDGFR, IGF-IR eller en hvilken som helst annen testkinase. De følgende protokollene kan anvendes for å utføre xenografteksperimenter: Atymiske hunnmus (BALB/c, nu/nu) ble oppnådd fra Simonsen Laboratorier (Gilroy, CA). Alle dyrene ble oppbevart under renrombetingelser i mikroisolatorbur med alfa-dri underlag. De mottok sterilt gnagerfor og vann etter behov.
Cellelinjer ble dyrket i passende medium (f.eks. MEM, DMEM, Ham's, F10 eller Ham's F12 pluss 5 %-10% føtalt bovint serum (FBS) og 2 mM glutamin (GLN)). Alle celle-kulturmedier (glutamin og føtalt bovint serum ble kjøpt fra Gibco Life Technologies (Grand Island, NY) om ikke annet er spesifisert. Alle cellene ble dyrket i en fuktig atmosfære av 90-95 % luft og 5-10 % CO2 ved 37°C. Alle cellelinjene ble rutinemessig subkulturen to ganger i uken og var negative for mykoplasma som bestemt ved hjelp av mykotestmetoden (Gibco).
Celler ble høstet ved eller nær konfluent med 0,05 % trypsin-EDTA og pelletert ved 450 x g i 10 min. Pelletter ble resuspendert i sterilt PBS eller medie (uten FBS) til en spesifikk konsentrasjon og cellene ble implantert i «hindflank» til musen (8-10 mus pr. gruppe, 2-10 x IO<6> celler/dyr). Tumurvekst måles i løpet av 3-6 uker ved anvendelse av venekalipetere. Tumorvolumer ble beregnet som et produkt av lengden ganger bredden ganger høyden om ikke annet er indikert. P-verdier ble beregnet ved anvendelse av Students t-test. Testforbindelser i 50-100 ul-eksipient (DMSO, eller VPD:D5W) kan gis ved hjelp av IP-injeksjon ved forskjellige konsentrasjoner som vanligvis ble startet 1 dag etter implantering.
Tumor invasjonsmodell
Den følgende tumor invasjonsmodellen har blitt utviklet og kan anvendes for evalueringen av terapeutisk verdi og effektivitet til forbindelsene som er identifisert og selektivt inhibere KDR/FLK—1-reseptor.
Fremgangsmåte
8 uker gamle unge mus (hunn) (Simonsen Inc.) ble anvendt som eksperimentdyr. Implanteringen av tumorceller kan bli utført i en «laminar flow hood». For anestesi ble xylazin/ketamin-coktail (100 mg/kg ketamin og 5 mg/kg xylazin) administrert intraperetonealt. Et midtlinjesnitt utføres for å frigjøre magehulrommet (tilnærmet 1,5 cm i lengde) for å injisere 10<7->tumorceller i et volum på 100 ul medium. Cellene ble injisert enten til «duodenal loben» til pancreas eller under tarmens serosa. Peritoneum og muskler ble lukket med en 6-0 kontinuerlig silketråd og huden lukkes ved anvendelse av sårklips. Dyret ble observert daglig.
Analyse
Etter 2-6 uker, avhengig av hovedobservasjoner av dyrene ble musen ofret og den lokale tumormetastasen til de ulike organer (lunger, lever, hjerne, mage, milt, hjerte, muskel) ble skåret ut og analysert (målinger av tumorstørrelse, grad av invasjon, immunkjemi, in situ-hybridiseringsbestemmelse osv.).
C-KIT-ANALYSE
Denne analysen anvendes for å påvise c-kit tyrosinfosforyleringsnivået.
M07E (humane akutt myeloid leukemi)-celler ble serumsultet over natt i 0,1 % serum. Celler ble forhåndsbehandlet med forbindelsen (samtidig med serumsultingen), forut for ligandstimulering. Celler ble stimulert med 250 ng/ml rh-SCF i 15 min. Etter stimulering ble celler lysert og immunopresipitert med et anti-c-kit antistoff. Fosfotyrosin og proteinnivåer ble bestemt ved hjelp av Western blotting.
MTT-PROLIFERERINGS ANALYSE
M07E-celler ble serumsultet og på forhånd behandlet med forbindelser som beskrevet for fosforyleringseksperimentene. Celler ble sådd ut ved 4 x 10<5->celler/brønn på en 96-brønners plate i 100 ul RPMI + 10 % serum. rh-SCF (100 ng/ml) ble tilsatt og platen ble inkubert i 48 timer. Etter 48 timer ble 10 ul 5 mg/ml MTT [3-(4,5-dimetytiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid) tilsatt og tillatt inkubert i 4 timer. Sur isopropanol (100 ul 0,04 N HC1 i isopropanol) ble tilsatt og den optiske tettheten ble målt ved en bølgelengde på 550 nm.
APOPTOSEANALYSE
M07E-celler ble inkubert +/- SCF og +/- forbindelse i 10 % FBS med rh-GM-CSF (10 ng/ml) og rh-IL-3 (10 ng/ml). Prøver ble analysert ved 24 og 48 timer. For å måle aktivert kaspase-3 ble prøver vasket med PBS og permeabilisert med iskaldt 70 % etanol. Cellene ble deretter farget med PE-konjugert polyklonalt kanin anti-aktiv kapase-3 og analysert ved hjelp av FACS. For å måle kuttet PARP ble prøver lysert og analysert ved hjelp av Western blotting med et anti-PARP-antistoff.
Ytterligere analyser
Ytterligere analyser som kan anvendes for å evaluere forbindelsen ifølge denne
oppfinnelsen inkluderer uten begrensning en bio-flk-1-analyse, en EGF-reseptor-HER2-kimær reseptoranalyse i hele celler, en bio-src-analyse, en bio-lck-analyse og en analyse som måler fosforyleringsfunksjonen til raf. Protokollene for hver av disse analysene kan finnes i US søknad med serienr. 09/099,842 som herved inkorporeres ved referanse inkludert alle tegninger.
Celletoksisitetsmåling
Terapeutiske forbindelser bør være mer virksomme ved inhibering av reseptortyrosin-kinaseaktivitet enn i å utøve en cytotoksisk effekt. Et mål på effektiviteten og celletoksisiteten til en forbindelse kan oppnås ved å bestemme den terapeutiske indeks, f.eks. IC50/LD50. IC50, den dose som kreves for å oppnå 50 % inhibering, kan måles ved anvendelse av standardteknikker slik som de beskrevet heri. LD50, den dose som resulterer i 50 % toksisitet kan også måles ved hjelp av standardteknikker (Mossman, 1983, J. Immunol. Methods. 65:55-63) ved å måle mengden frigjort LDH (Korzeniewski og Callewaert, 1983, J. Immunol. Methods. 64:313, Decker og Lohmann-Matthes, 1988, J. Immunol. Methods. 115:61) eller ved å måle den letale dose i dyremodeller. Forbindelser med en større terapeutisk indeks foretrekkes. Den terapeutiske indeksen bør være større enn 2, fortrinnsvis i det minste 10, mer foretrukket i det minste 50.
B. Eksempler på cellulære analyseresultater ved anvendelse av 5-(5-fluor-2-okso-l,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre-(2-dietylaminoetyl)amid.
For å bekrefte effekten til 5-(5-fluor-2-okso-l,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre-(2-dietylaminoetyl)amid (forbindelse 80) påvist i biokjemiske analyser (vide infra), ble nevnte forbindelses evne til å hemme ligandavhengig RTK-fosforylering evaluert i cellebaserte analyser ved anvendelse av NIH-3T3-museceller konstruert for å overuttrykke Flk-1 eller humant PDGFRp. 5-(5-fluor-2-okso-l,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre-(2-dietylaminoetyl)amid (forbindelse 80) hemmet VEGF-avhengig Flk-l-tyrosinfosforylering med en ICso-verdi på tilnærmingsvis 0,03 uM. Denne verdien tilsvarer den 0,009 uM Ki-verdien bestemt for hemming av Flk-1 av 5-(5-fluor-2-okso-l,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre-(2-dietylamino-etyl)amid (forbindelse 80) bestemt i biokjemiske analyser. Dette indikerer at 5-(5-fluor-2-okso-l,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre-(2-dietylamionoetyl)amid (forbindelse 80) lett penetrerer inn i celler. I samsvar med de biokjemiske data (vide infra) som indikerte at 5-(5-fluor-2-okso-l,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre-(2-dietylaminoetyl)amid (forbindelse 80) hadde sammenlignbar aktivitet mot Flk-1 og PDGFRP ble det også funnet at den inhiberte PDGF-avhengige reseptorfosforylering i celler med en ICso-verdi på tilnærmingsvis 0,03 \ iM. 5-(5-fluor-2-okso-l,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre-(2-dietylaminoetyl)amidets (forbindelse 80) evne til å hemme c-kit, en nært beslektet RTK som binder stamcellefaktor (SCF) ble bestemt ved anvendelse av M07E-celler som uttrykte denne reseptor. I disse cellene inhiberte 5-(5-fluor-2-okso-1,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-2,4-dimetyl- lH-pyrrol-3-karboksylsyre-(2-dietylaminoetyl)amid (forbindelse 80) SCF-avhengig c-kit fosforylering med en ICso-verdi på 0,01-0,1 uM. Denne forbindelsen inhiberte også SCF-stimulert c-kit-fosforylering i akutt myeloid leukemi (AML)-blastceller isolert fra det perifere blodet til pasienter.
I tillegg til å teste 5-(5-fluor-2-okso-l,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-2,4-dimetyl)-lH-pyrrol-3-karboksylsyre-(2-dietylaminoetyl)amidets (forbindelse 80) evne til å hemme ligandavhengig reseptorfosforylering i celler ble dets evne på ligandavhengig proliferative responser til celler også eksaminert in vitro (se tabell 4). I disse studiene ble celler utfordret ved serumsulting over natt indusert til å gjennomgå DNA-syntese ved tilsetting av den passende mitogene liganden. Som vist i tabell 4 inhiberte 5-(5-fluor-2-okso-l,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre-(2-dietylaminoetyl)amid (forbindelse 80) den PDGF-induserte prolifereringen av NIH-3T3-celler som overuttrykte PDGFRp eller PDGFRa med IC50-verdier på henholdsvis 0,031 og 0,069 uM og SCF-indusert proliferering av M07E-celler med en IC50-verdi på 0,007 uM.
Som vist i tabell 4 er det et generelt samsvar mellom de biokjemiske og cellulære aktiviteter til 5-(5-fluor-2-okso-l,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre-(2-dietylaminoetyl)amid (forbindelse 80) som støtter konklusjonen om at denne forbindelsen krysser cellulære membraner. Videre kan det konkluderes med at den cellulære responsen er et resultat av forbindelse 80's aktivitet mot det indikerte målet. I kontrast til dette krevdes vesentlig høyere konsentrasjoner av 5-(5-fluor-2-okso-l,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre-(2-dietylaminoetyl)amid (forbindelse 80) (> 10 [im) når den ble testet i nærvær av fullstendig vekstmedium in vitro for å hemme veksten av mangfoldige humane tumorceller (se tabell 5). Dette indikerer at forbindelsen ikke direkte inhiberer veksten av disse celler ved konsentrasjoner som kreves for å hemme ligandavhengig reseptorfosforylering og celleproliferering.
Kort fortalt blir resultatene vist i tabell 5 oppnådd ved inkubering av celler i 48 timer i fullstendig vekstmedium i nærvær av seriefortynninger av 5-(5-fluor-2-okso-l,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre-(2-dietylaminoetyl)amid. Ved slutten av vekstperioden ble det relativt antallet celler bestemt. ICso-verdier ble beregnet som konsentrasjonen av forbindelsen som hemmet veksten av celler med 50 % i forhold til ubehandlede celler. LDso-verdier ble beregnet som den konsentrasjon av forbindelsen som forårsaket en 50 %-reduksjon i antallet celler i forhold til antallet ved start av eksperimentet.
En mer relevant cellebasert analyse for å evaluere det anti-angiogene potensialet til 5-(5-fluor-2-okso-l,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre-(2-dietylaminoetyl)amid (forbindelse 80) er in vifro-mitogeneseanalysen ved anvendelse av humane umbilikale veneendotelceller (HUVECer) som et modellsystem for den endotele celleproliferering som er kritisk for den angiogene prosess. I denne analysen induseres en mitogen respons, målt som økt DNA-syntese i serumsultede HUVECer ved tilsetting av VEGF eller FGF. I disse cellene hemmet 5-(5-fluor-2-okso-l,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre-(2-dietylamino-etyl)amid (forbindelse 80) den VEGF- og FGF-induserte mitogene responsen på en doseavhengig måte med ICso-verdier på henholdsvis 0,004 uM og 0,7 |xM når forbindelsen var til stede gjennom hele den 48-timners analysen.
Kort fortalt ble de forannevnte resultatene oppnådd ved anvendelse av serumsultede HUVECer som ble inkubert med mitogene konsentrasjoner av VEGF (100 ng/ml) eller FGF (30 ng/ml) i nærvær av seriefortynninger av 5-(5-fluor-2-okso-l,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre-(2-dietylaminoetyl)amid (forbindelse 80) i 24 timer. Den mitogene responsen gjennom de følgende 24 timer i nærvær av ligand og inhibitor ble kvantitert ved å måle DNA-syntese basert på inkorporering av bromdioksyuridin i cellulært DNA.
I separate eksperimenter hemmet forbindelse 80 den VEGF-avhengige fosforyleringen av ERK Vi (p42/44 MAP-kinase), et tidlig nedstrøms mål for Flk-1/KDR på en doseavhengig måte. Den inhibitoriske aktiviteten til forbindelse 80 ble også vist å være langvarig i dette systemet; inhibering av VEGF-avhengig fosforylering av ERK Vi i så lenge som 48 timer etter fjerning av 5-(5-fluor-2-okso-l,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre-(2-dietylaminoetyl)amid (forbindelse 80) fra mediet etterfulgt av en kort (2 timer) eksponering for mikromolare konsentrasjoner av forbindelsen.
VEGF har blitt anerkjent som en viktig overlevelsesfaktor for endotelceller. Siden 5-(5-fluor-2-okso-l,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre-(2-dietylaminoetyl)amid (forbindelse 80) inhiberer den VEGF-avhengige mitogene responsen til HUVECer ble forbindelsens effekt på HUVEC-overlevelse undersøkt. I disse eksperimentene ble kuttingen av kaspase-3-substratet poly-ADP-ribosylpolymerase (PARP) anvendt som et mål for apoptose. HUVECer dyrket under serumfrie betingelser i 24 timer viste vesentlige nivåer på PARP-kutting som påvist ved hjelp av akkumuleringen av det 23 kDa PARP-kuttede fragmentet. Dette ble hovedsakelig forhindret ved tilsetningen av VEGF til cellemediet, hvilket indikerte at VEGF virker som en overlevelsesfaktor i denne analysen. 5-(5-fluor-2-okso-l,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre-(2-dietylaminoetyl)amid (forbindelse (80) har blitt vist å inhibere KDR-signallisering. Følgelig inhiberer 5-(5-fluor-2-okso-l,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre-(2-dietylaminoetyl)amid (forbindelse 80) VEGF-mediert HUVEC-overlevelse på en doseavhengig måte. Disse dataene indikerer følgelig at forbindelse 80 induserer apoptose i endotelceller i kultur i nærvær av VEGF.
C. In vivø-effektivitetsstudier
i. Effektivitet mot etablerte tumorxenografter
In vivø-effektivitetent il 5-(5-fluor-2-okso-l,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre-(2-dietylaminoetyl)amid (forbindelse 80) ble undersøkt i subkutane (SC) xenograftmodeller ved anvendelse av humane tumorceller implantert i «hindflank»-regionen til atymiske mus. Etter implantering ble tumorene tillatt etablert til en størrelse på 100-550 mm3 forut for innledning av oral behandling med forbindelsen.
Daglig oral administrering av forbindelse 80 forårsaket en doseavhengig inhibering av A431-tumorvekst når behandling ble initiert etter tumoren hadde vokst til en størrelse på 400 mm<3>. Statistisk signifikant (p < 0,05) inhibering av tumorvekst ble sett ved doser på 40 mg/kg/dag (74 % inhibering) og 80 mg/kg/dag (84 % inhibering) (se tabell 6). I innledende eksperimenter var en høyere dose (160 mg/kg/dag) av forbindelsen ikke mer effektiv mot etablerte A431-tumorer enn den 80 mg/kg/dag-dosen. Mus behandlet med den 160 mg/kg/dag-dosen av forbindelsen mistet i tillegg kroppsvekt, hvilket indikerte at den høyere dosen ikke ble godt tolerert. Lignende resultater ble oppnådd i et eksperiment hvori A431-tumorer kun ble tillatt å nå 100 mm3 i størrelse (se tabell 5). I dette andre eksperimentet oppstod fullstendig regresjon av tumoren i seks av åtte dyr behandlet med 80 mg/kg/dag i 21 dager. I disse seks dyrene vokste ikke tumoren videre i løpet av en 110 dagers observasjonsperiode etter endt behandling. I de to dyrene hvori tumoren vokste til en større størrelse (2000-3000 mm<3>) sluttet tumoren å vokse som respons på en andre runde med behandling med forbindelse 80. Legg merke til at 80 mg/kg/dag av 5-(5-fluor-2-okso-l,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre-(2-dietylaminoetyl)amid (forbindelse 80) har blitt godt tolerert selv ved kontinuerlige doseringer i mer enn 100 dager.
Resultatene vist i tabell 6 ble kort fortalt oppnådd ved anvendelse av A431-celler (0,5 x 106 celler/mus) som ble implantert SC i «hindflank regionen» til atymiske mus. Daglig oral administrering av 5-(5-fluor-2-okso-l,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre-(2-dietylaminoetyl)amid (forbindelse 80) i en kremoforbasert vesikkel eller vesikkelkontroll begynte når tumoren nådde det indikerte gjennom-snittelige volum. Tumorer ble målt ved anvendelse av vernier kalipetere og tumorvolum ble beregnet som produktet av lengde x bredde x høyde. P-verdier ble beregnet ved å sammenligne størrelsen til tumorer fra dyr som ble behandlet med forbindelse 80 (n=8) med dyrene som ble behandlet med en bærer (n=16) på eksperimentets siste dag ved anvendelse av den tohalede Student' s t-test.
Effektiviteten til forbindelse 80 mot etablerte humane tumorer av forskjellig opprinnelse ble bestemt ved anvendelse av Colo205 (colon carcinom), SF763T (gliom), og NCI-H460 (ikke små lungecellecarcinom) xenografter (se tabell 7). Disse eksperimentene ble utført ved anvendelse av 5-(5-fluor-2-okso-l,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre-(2-dietylaminoetyl)amid (forbindelse 80) administrert oralt ved 80 mg/kg/dag; en dose som var effektiv og godt tolerert.
I de ovenfor nevnte eksperimenter ble forbindelse 80 administrert én gang om dagen ved 80 mg/kg i en kremoforbasert vesikkel med én gang tumoren nådde den indikerte
størrelse. Prosent inhibering sammenlignet med vesikkelbehandlede kontrollgrupper ble beregnet ved slutten av eksperimentene. P-verdier ble beregnet ved å sammenligne tumorstørrelse til dyrene som hadde blitt behandlet med forbindelsen med tumorstørrelsen til de dyrene som var blitt behandlet med vesikkelen ved anvendelse av den tohalede Student's t-test.
5-(5-fluor-2-okso-l,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre-(2-dietylaminoetyl)amid (forbindelse 80) hemmet veksten til alle tumortypene vist i tabell 7 var det en forskjell i responsen til de forskjellige xenograft-modellene. Spesielt ble veksten til NCI-H460 og SF763T-tumorer arrestert eller svært saknet mens Colo205-tumorer, slik som A431 -tumorer avtok når de ble behandlet med 5-(5-fluor-2-okso-l,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre-(2-dietylaminoetyl)amid.
For å bestemme den molekulære basis for forskjellen på respons mellom xenograftmodeller ble SF763T-tumorer undersøkt. SF763T-tumorer som var mindre responsive for behandling med 5-(5-fluor-2-okso-l,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre-(2-dietylaminoetyl)amid har derfor blitt evaluert på det molekulære nivå ved anvendelse av immunohistologiske teknikker for å bestemme effekten av behandling med forbindelsen. Disse studiene ble først undersøkt på denne tumortypen fordi SF763T-tumorer er svært vaskularisert med mikroårer som sterkt uttrykker den endotele cellemarkøren CD31 og som derfor er godt egnet for studier av tumormikroåretetthet (MVD). Immunohistologisk evaluering av SF763T-tumorer indikerte at tumorer fra behandlede dyr hadde redusert MVD i forhold til vesikkelbehandlede kontroller, hvilket samsvarte med en anti-angiogen virkningsmekanisme for forbindelse 80; MVD var 24,2 + 4,1 i dyr behandlet med forbindelse 80 sammenlignet med 39,3 + 5,7 for de som var behandlet med bare vesikkelen. Som forventet fra den assosierte tumorvekstarresten var en uttalt inhibering av tumorcelleproliferering tydelig i tumorer som var behandlet med forbindelse 80. Disse tumorene hadde halvparten av den mytotiske indeksen i forhold til de vesikkelbehandlede tumorene (data ikke vist). Effekten av forbindelse 80 på MVD og tumorcelleproliferering indikerer at forbindelsen har uttalt anti-angiogen og anti-tumorvirkninger, selv under betingelser hvori tumoren ikke vokser.
Forbindelse 80's evne til å hemme PDGFR-fosforylering og påfølgende signallisering in vivo ble også evaluert i SF763-tumorer som uttrykker høye nivåer av PDGFRp. Behandling av SF763T-tumorer med forbindelse 80 inhiberte sterkt PDGFRP-tyrosinfosforylering i etablerte SF763T-tumorer. Forbindelse 80 reduserte også nivåene av fosforylert (aktivert) fosfolipase C-gamma (PLC-y), en umiddelbar nedstrøms indikator for PDGFR-aktivering. Disse dataene viser at oral administrering av forbindelse 80 forårsaker en direkte virkning på målaktiviteten (PDGFR) i tumorer in vivo.
Basert på demonstrasjonen av at evnen til forbindelse 80 til å hemme VEGF-avhengig signallisering i HUVECer in vitro var langvarig (vide supra), ble forbindelsens effektivitet evaluert når forbindelsen ble administrert sjelden i Colon205-tumormodellen. Som vist i tabell 8 var 80 mg/kg (91 % inhibering) og 40 mg/kg (84 % inhibering) effektivt når det ble administrert daglig, men ikke effektivt når det ble administrert to ganger i uken. I kontrast til dette hemmet en høyere dose av forbindelse 80 (160 mg/kg) (52 % inhibering) veksten av etablerte Colo205-tumorer når det ble administrert to ganger i uken, hvilket antyder at denne forbindelsen kan være effektiv når den administreres sjelden ved en høyere dose. Det skal bemerkes at doseringsregimene kan bestemmes av fasgmannen på området uten ytterligere eksperimentering.
Resultatene vist i tabell 8 ble kort fortalt oppnådd ved anvendelse av Colo205-celler (0,5 x IO<6> celler/mus) som var blitt implantert SC inn i «hindflank regionen» til atymiske mus. Oral administrering og forbindelse 80 i henhold til det angitte skjemaet startet når tumoren nådde 400 mm<3>. Tumorer ble målt ved anvendelse av «vernier»-kalipetere og tumorvolumet ble beregnet som produktet av lengden x bredden x høyden. P-verdier ble beregnet ved å sammenligne størrelsen til tumorene for dyr som var behandlet med forbindelse 80 med dyrene som var blitt behandlet med en bærer på den siste dagen av eksperimentet ved anvendelse av den tohalede student's t-test.
ii. Effekt av forbindelse 80 i en utbredt sykdomsmodell
I tillegg til å støtte den langvarige veksten av faste primære tumorer er angiogenese også en essensiell komponent som støtter utviklingen av «disseminated» sykdom som følge av metastase fra den primære tumoren. Virkningen av forbindelse 80 på utviklingen av «disseminated» sykdom ble undersøkt i B16-Fl-musemelanom
lungekoloniseringsmodellen. I denne modellen inokuleres B16-F1-celler intravenøst gjennom halevenen til atymiske mus som koloniserer lungene og danner tumorer. Som
vist i tabell 8 reduserer oral administrering av forbindelse 80 ved 80 mg/kg/dag effektivt byrden av B16-Fl-celler i lungen som evaluert ved å måle den totale lungevekten. Disse data antyder at forbindelse 80 kan hemme utbredt sykdom in vivo.
Resultatene vist i tabell 9 ble kort fortalt oppnådd ved anvendelse av atymiske mus som var blitt inokulert med B16-Fl-tumorceller (5xl0<5> celler/mus) via halevenen. Mus ble behandlet daglig med oralt administrert forbindelse 80 ved 80 mg/kg/dag (n=10) eller bærer (n=18) i 24 dager etter tumorcelleinokulering. Ved slutten av behandlingsperioden ble musene ofret og lungene deres fjernet og veid. Prosent inhibering ble beregnet ved å sammenligne lungevekten til de dyrene som var blitt behandlet med forbindelse 80 med lungevekten til dyrene som kun hadde blitt behandlet med vesikkel. P-verdier ble beregnet ved anvendelse av den tohalede Student's t-test.
D. Eksempler på biologisk aktivitet
Eksempler på in vitro-aktiviteten til forbindelser ifølge denne oppfinnelsen er vist i tabell 2.
KONKLUSJON
I studier som undersøker de farmakokinetiske egenskapene til forbindelsene ifølge de foretrukne utførelsesformer av den foreliggende oppfinnelse er det blitt demonstrert at oral administrering av en enkel dose av nevnte forbindelser resulterer i høy oral biotilgjengelighet i mus. Den gode orale biotilgjengeligheten og lineære farmakokinetikken indikerer at forbindelsene ifølge de foretrukne utførelsesformer av den foreliggende oppfinnelse har fordelaktige farmakokinetiske egenskaper.
Forbindelsene ifølge de foretrukne utførelsesformer av den foreliggende oppfinnelse er i tillegg potent inhibitor av tyrosinkinaseaktiviteten til det splittede kinasedomenet
RTK'er Flk-1/KDR og PDGFR som er involvert i angiogenese, og RTK c-kit'en, en reseptor for stamcellefaktor (SCF), som er involvert i visse hematologiske krefttyper. Ved høyere konsentrasjoner hemmer også forbindelsene ifølge de foretrukne utførelsesformer av den foreliggende oppfinnelse tyrosinkinaseaktiviteten til FGFR-1, en tredje RTK involvert i angiogenese. I samsvar med deres biokojemiske aktivitet hemmer forbindelsene ifølge de foretrukne utførelsesformer av den foreliggende oppfinnelse den ligandavhengige tyrosinfosforyleringen av RTK'er-målet og den in virrø-mitogene responsen til humane umbilikale veneendotelceller (HUVECer) stimulert med VEGF eller FGF, til PDGFR-uttrykkende NIH-3T3-celler stimulert med PDGF og til M07E-akutt myoloid leukemiceller stimulert med SCF. I kontrast til dette hemmer ikke forbindelsene ifølge de foretrukne utførelsesformer av den foreliggende oppfinnelse direkte prolifereringen av tumorceller i fullstendig vekstmedium bortsett fra ved konsentrasjoner som er 2-3 ganger høyere enn de som kreves for å hemme de ligandavhengige mitogene responsene. I musexenograftstudier hemmet forbindelsene ifølge de foretrukne utførelsesformer av den foreliggende oppfinnelse veksten av etablerte humane tumorer av ulik opprinnelse på en doseavhengig måte og ved konsentrasjoner som blir godt tolerert selv ved langvarig (> 100 dager) dosering. Ved 80 mg/kg/dag induserte forbindelsene ifølge de foretrukne utførelsesformer av den foreliggende oppfinnelse tilbaketrekking av store etablerte A431- og Colo205-tumorer og forårsaket vesentlig veksthemming eller stase av SF763T- og NCI-H460-tumorer. I mus som bærer SF763T-tumorer forårsaket forbindelsen ifølge de foretrukne utførelsesformer av den foreliggende oppfinnelse reduksjoner i mikroåretetthet, fosforylering av PDGFR i tumorene og mitotisk indeks i tumorcellene. Ved denne dosen hemmet også forbindelsen ifølge de foretrukne utførelsesformer av den foreliggende oppfinnelse lungekolonialisering av B16-F1-tumorceller i en tumormetastasemodell. Regimestudier viste at forbindelsene ifølge de foretrukne utførelsesformer av den foreliggende oppfinnelse er mest effektive når de administreres daglig. Direkte bevis for den anti-angiogene aktiviteten til forbindelsen ifølge de foretrukne utførelsesformer av den foreliggende oppfinnelse ble påvist i SF763T-tumorer hvori mikroåretettheten ble redusert. Direkte bevis for at forbindelsene ifølge de foretrukne utførelsesformer av den foreliggende oppfinnelse hemmet PDGFR-fosforylering og signaliseing in vivo ble også oppnådd i SF763T-tumorer.
Sett i sammenheng støtter disse data antagelsen om at oralt administrerte forbindelser ifølge de foretrukne utførelsesformer av den foreliggende oppfinnelse er anti-angiogene midler for fremstilling av medikamenter som er anvendelige ved behandlingen av krefttyper, inkludert faste tumorer og hematologiske ondartetheter hvori angiogenese og/eller signalisering gjennom c-kit er viktig i sykdomspatologien.
Det vil forstås at forbindelsene, fremgangsmåtene og farmasøytiske preparater ifølge den foreliggende oppfinnelse er effektive i modelleringen av PK-aktivitet og derfor er forventet å være effektive som terapeutiske midler mot RTK-, CTK- og STK-relaterte sykdommer.
Fagmannen på området vil også lett forstå at den foreliggende oppfinnelse godt kan tilpasses for å utføre formålene og oppnå de nevnte ender og fordeler såvel som de iboende heri. De molekulære komplekser og fremgangsmåtene, prosedyrene, molekylene, spesifikke forbindelsene beskrevet heri er eksempler på for tiden representative foretrukne utførelsesformer.
Alle patenter og publikasjoner nevnt i beskrivelsen er beskrivende for nivået på fagmannen som oppfinnelsen angår.

Claims (17)

1. Forbindelse med formel (I): hvori: R<1> er valgt fra gruppen bestående av hydrogen, halogen, Ci-ioalkyl, C3. ssykloalkyl, C6-i2aryl, pyridyl, hydroksy, Ci.ioalkoksy, (CH2)rOH og -C(0)NR<8>R<9>, hvori R Q og R Q er hver uavhengig valgt fra hydrogen og C6.i2aryl, der arylgruppen eventuelt er substituert med en eller flere halogenatomer eller Ci.ioalkoksygrupper; R er valgt fra gruppen bestående av hydrogen, halogen, Ci-ioalkyl, trihalometyl, hydroksy, Ci.ioalkoksy, cyano, C6-i2aryl, pyridyl og -S(0)2NR<13>R<14>, hvori R<13> og R<14 >uavhengig er valgt fra Ci-ioalkyl, C6-i2aryl og pyridyl; R er valgt fra gruppen bestående av hydrogen, halogen, Ci-ioalkyl, trihalometyl, hydroksy, Ci.ioalkoksy, -(CO)R<15>, C6-i2aryl og pyridyl, hvori R15 er valgt fra hydroksy og Ci.ioalkoksy; R<4> er valgt fra gruppen bestående av hydrogen, halogen, Ci.ioalkyl, hydroksy og Ci.ioalkoksy; R<5> er valgt fra hydrogen og Ci-ioalkyl; R<6> er -C(0)R<10-> hvori R<10> er -N(R<n>)(CH2)„R<12>, der R<11> er hydrogen eller Ci. loalkyl og R<12> er valgt fra gruppen bestående av -NR13R<14>, -C(0)R<15>, pyridyl og imidazolyl, der R og R er hver uavhengig valgt fra gruppen bestående av Ci.ioalkyl, Cs.ssykloalkyl, C6-i2aryl og pyridyl, eller R13 og R<14> sammen med nitrogenatomet danner en pyrrolidino, piperidino, morfolino eller piperazinogruppe, eventuelt substituert med Ci.ioalkyl og R<15> er valgt fra gruppen hydroksy og Ci-ioalkoksy; R7 er valgt fra Ci-ioalkyl og C6-i2aryl; n og r er uavhengig 1, 2, 3 eller 4; eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.
2. Forbindelse ifølge krav 1, hvori R<1> er valgt fra gruppen bestående av hydrogen, CMalkyl, (CH2)rOH og -C(0)NR<8>R<9>; R fyer valgt fra gruppen bestående av hydrogen, halogen, C6-i2aryl og -S(0)2NR<13>R<14>; R er valgt fra gruppen bestående av hydrogen, Ci^alkyl, Ci-4alkoksy, C6-i2aryl, pyridyl og-C(0)R<15>; R4 er hydrogen; R<5> er valgt fra hydrogen og CMalkyl; R7 er valgt fra CMalkyl og C6-i2aryl; og r er 2 eller 3.
3. Forbindelse i følge krav 2, hvori R3 er C6-i2aryl.
4. Forbindelse ifølge krav 2, hvori n er 1, 2, eller 3; R<11> er hydrogen; og R<12> er valgt fra gruppen bestående av -C(0)R15' pyridyl, imidazolyl og -NR13R14.
5. Forbindelse i følge krav 4, hvori R<12> er -NR<13>R<14>, hvori R13 og R<14> er uavhengig valgt fra gruppen bestående av CMalkyl, pyridyl og, kombinert, -(CH2)4, -(CH2)5, -CH2)20(CH2)2-, og -(CH2)2N(CH3)(CH2)2-.
6. Forbindelse eller salt i følge krav 1, hvori R<11> er hydrogen eller usubstituert Ci.4alkyl; n er 2 eller 3; og R<12> er -NR<I3>R<14>, hvori R13 og R<14> er uavhengig usubstituert d.4alkyl.
7. Forbindelse eller salt i følge krav 1, hvori: R<11> er hydrogen eller usubstituert Ci-4alkyl; n er 2 eller 3; og R er -NR R , hvori R og R sammen danner en gruppe valgt fra (CH2)4, -(CH2)S, -CH2)20(CH2)2- og -(CH2)2N(CH3)(CH2)2- .
8. Forbindelse ifølge krav 2, hvori R<1> er -C(0)NR8R9 , hvori R<8> er hydrogen og R<9 >er C6-i2aryl.
9. Forbindelse ifølge krav 1 med formelen eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.
10. Forbindelse i følge krav 1, hvori forbindelsen er L-malatsaltet av 5-(5-fluor-2-okso-l,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre (2-dietylaminoetyl)amid.
11. Forbindelse i følge krav 1 med formelen eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.
12. Farmasøytisk preparat omfattende en forbindelse i følge krav 1 og en farmasøytisk akseptabel bærer eller eksipient.
13. Fremgangsmåte for å modulere den katalytiske aktiviteten til en proteinkinase in vitro, karakterisert vedå bringe nevnte proteinkinase i kontakt med en forbindelse eller ét salt i følge krav 1.
14. Fremgangsmåte i følge krav 13, karakterisert ved at nevnte proteinkinase er valgt fra gruppen bestående av en reseptortyrosinkinase, en ikke-reseptortyrosinkinase og en serin-treoninkinase.
15. Anvendelse av en forbindelse eller salt i følge krav 1, for fremstilling av et medikament for behandling av proteinkinaserelaterte sykdom, hvori nevnte proteinkinaserelaterte sykdom er valgt fra gruppen bestående av skjelettcellekarsinom, astrocytoma, Kaposis sarkom, glioblastom, lungekreft, blærekreft, hode og nakkekreft, melanom, eggstokkreft, prostatakreft, brystkreft, små-cellet-lungekreft, gliom, kolorektal kreft, urogenital kreft og gastrointestinal kreft.
16. Anvendelse i følge krav 15, hvori nevnte proteinkinaserelaterte sykdom er valgt fra gruppen bestående av diabetes, en autoimmun sykdom, en hyperprolifererende sykdom, restenose, fibrose, psoriasis, von Heppel-Lindaus sykdom, osteoartritt, reumatoid artritt, angigenese, en inflammatorisk sykdom, en immunologisk sykdom og en kardiovaskulær sykdom.
17. Anvendelse i følge krav 15, hvori nevnte organisme er et menneske.
NO20023831A 2000-02-15 2002-08-13 Pyrrolsubstituerte 2-indolinoner, farmasoytisk preparat omfattende slike, fremgangsmate for a modulere den katalytiske aktiviteten til en proteinkinase in vitro basert pa bruk av slike forbindelser, samt anvendelse av slike forbindelser til fremstilling av medikamenter for behandling av sykdommer. NO325532B1 (no)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US18271000P 2000-02-15 2000-02-15
US21642200P 2000-07-06 2000-07-06
US24353200P 2000-10-27 2000-10-27
PCT/US2001/004813 WO2001060814A2 (en) 2000-02-15 2001-02-15 Pyrrole substituted 2-indolinone protein kinase inhibitors

Publications (3)

Publication Number Publication Date
NO20023831D0 NO20023831D0 (no) 2002-08-13
NO20023831L NO20023831L (no) 2002-10-15
NO325532B1 true NO325532B1 (no) 2008-06-09

Family

ID=27391578

Family Applications (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20023831A NO325532B1 (no) 2000-02-15 2002-08-13 Pyrrolsubstituerte 2-indolinoner, farmasoytisk preparat omfattende slike, fremgangsmate for a modulere den katalytiske aktiviteten til en proteinkinase in vitro basert pa bruk av slike forbindelser, samt anvendelse av slike forbindelser til fremstilling av medikamenter for behandling av sykdommer.
NO2008019C NO2008019I2 (no) 2000-02-15 2008-12-08 Sunitinib
NO2010002C NO2010002I2 (no) 2000-02-15 2010-02-09 Toceranibfosfat.
NO2019005C NO2019005I1 (no) 2000-02-15 2019-02-05 N-[2-(dietylamino)etyl]-5-[(Z)-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihydro-3H-indol-3-yliden)metyl]-2,4-dimetyl-1H-pyrrol-3-karboksamid (sunitinib), samt farmasøytisk akseptable salter

Family Applications After (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO2008019C NO2008019I2 (no) 2000-02-15 2008-12-08 Sunitinib
NO2010002C NO2010002I2 (no) 2000-02-15 2010-02-09 Toceranibfosfat.
NO2019005C NO2019005I1 (no) 2000-02-15 2019-02-05 N-[2-(dietylamino)etyl]-5-[(Z)-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihydro-3H-indol-3-yliden)metyl]-2,4-dimetyl-1H-pyrrol-3-karboksamid (sunitinib), samt farmasøytisk akseptable salter

Country Status (43)

Country Link
US (4) US6573293B2 (no)
EP (1) EP1255752B1 (no)
JP (1) JP3663382B2 (no)
KR (1) KR100713960B1 (no)
CN (1) CN1329390C (no)
AR (1) AR034118A1 (no)
AT (1) ATE369359T1 (no)
AU (2) AU2001239770B2 (no)
BE (1) BE2010C009I2 (no)
BG (1) BG65764B1 (no)
BR (2) BRPI0108394B8 (no)
CA (1) CA2399358C (no)
CO (1) CO5280092A1 (no)
CR (2) CR20120007A (no)
CY (3) CY1108032T1 (no)
CZ (1) CZ303705B6 (no)
DE (3) DE122008000002I1 (no)
DK (1) DK1255752T3 (no)
EA (1) EA005996B1 (no)
ES (1) ES2290117T3 (no)
FR (1) FR08C0002I2 (no)
HK (1) HK1051188A1 (no)
HR (1) HRP20020751B1 (no)
HU (1) HU228979B1 (no)
IL (1) IL151127A0 (no)
IS (1) IS2491B (no)
LT (1) LTC1255752I2 (no)
LU (2) LU91407I2 (no)
ME (1) ME00415B (no)
MX (1) MXPA02008021A (no)
MY (1) MY130363A (no)
NL (2) NL300332I2 (no)
NO (4) NO325532B1 (no)
NZ (1) NZ520640A (no)
PE (1) PE20011083A1 (no)
PL (1) PL211834B1 (no)
PT (1) PT1255752E (no)
RS (1) RS50444B (no)
SI (1) SI1255752T1 (no)
SK (1) SK287142B6 (no)
TW (1) TWI306860B (no)
UA (1) UA73976C2 (no)
WO (1) WO2001060814A2 (no)

Families Citing this family (331)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6569868B2 (en) 1998-04-16 2003-05-27 Sugen, Inc. 2-indolinone derivatives as modulators of protein kinase activity
US20040226056A1 (en) * 1998-12-22 2004-11-11 Myriad Genetics, Incorporated Compositions and methods for treating neurological disorders and diseases
MXPA01007099A (es) 1999-01-13 2002-03-27 Univ New York State Res Found Metodo novedoso para disenar inhibidores de la proteina cinasa.
AR034118A1 (es) * 2000-02-15 2004-02-04 Sugen Inc Compuestos de 2-indolinonas sustituidas con pirroles inhibidoras de proteinquinasas; sus composiciones farmaceuticas e intermediarios de sintesis
US7030219B2 (en) 2000-04-28 2006-04-18 Johns Hopkins University B7-DC, Dendritic cell co-stimulatory molecules
TWI270545B (en) 2000-05-24 2007-01-11 Sugen Inc Mannich base prodrugs of 3-(pyrrol-2-ylmethylidene)-2-indolinone derivatives
WO2001094312A2 (en) 2000-06-02 2001-12-13 Sugen, Inc. Indolinone derivatives as protein kinase/phosphatase inhibitors
CA2414468A1 (en) 2000-06-30 2002-01-10 Sugen, Inc. 4-heteroaryl-3-heteroarylidenyl-2-indolinones and their use as protein kinase inhibitors
EP1506962B1 (en) 2000-10-20 2008-07-02 Eisai R&D Management Co., Ltd. Nitrogen-containing aromatic heterocycles
EP1349852A2 (en) * 2000-12-20 2003-10-08 Sugen, Inc. 4-(hetero)aryl substituted indolinones
AR042586A1 (es) * 2001-02-15 2005-06-29 Sugen Inc 3-(4-amidopirrol-2-ilmetiliden)-2-indolinona como inhibidores de la protein quinasa; sus composiciones farmaceuticas; un metodo para la modulacion de la actividad catalitica de la proteinquinasa; un metodo para tratar o prevenir una afeccion relacionada con la proteinquinasa
EP1247809A3 (en) * 2001-03-30 2003-12-17 Pfizer Products Inc. Triazine compounds useful as sorbitol dehydrogenase inhibitors
US6599902B2 (en) 2001-05-30 2003-07-29 Sugen, Inc. 5-aralkysufonyl-3-(pyrrol-2-ylmethylidene)-2-indolinone derivatives as kinase inhibitors
WO2003002109A2 (en) * 2001-06-29 2003-01-09 Ab Science Use of tyrosine kinase inhibitors for treating autoimmune diseases
AR038957A1 (es) * 2001-08-15 2005-02-02 Pharmacia Corp Terapia de combinacion para el tratamiento del cancer
DK3168218T3 (en) 2001-08-15 2019-01-14 Pharmacia & Upjohn Co Llc Crystalline comprising an L-malic acid salt of N- [2- (DIETHYLAMINO) ETHYL] -5 - [(5-FLUOR-1,2-DIHYDRO-2-OXO-3H-INDOL-3-YLIDE) METHYL] -2,4 -DIMETHYL-1H-PYRROL-3-CARBOXAMIDE FOR USE AS A MEDICINE
JP2005506982A (ja) 2001-09-10 2005-03-10 スージェン・インコーポレーテッド キナーゼ阻害剤としての３−（４，５，６，７−テトラヒドロインドール−２−イルメチリデン）−２−インドリノン誘導体
CA2462950A1 (en) * 2001-10-10 2003-04-17 Sugen, Inc. 3-[4-(substituted heterocyclyl)-pyrrol-2-ylmethylidene]-2-indolinone derivatives as kinase inhibitors
US7005445B2 (en) 2001-10-22 2006-02-28 The Research Foundation Of State University Of New York Protein kinase and phosphatase inhibitors and methods for designing them
WO2003035621A1 (en) * 2001-10-22 2003-05-01 The Research Foundation Of State University Of New York Protein kinase and phosphatase inhibitors, methods for designing them, and methods of using them
US20030080191A1 (en) * 2001-10-26 2003-05-01 Allen Lubow Method and apparatus for applying bar code information to products during production
TWI259081B (en) * 2001-10-26 2006-08-01 Sugen Inc Treatment of acute myeloid leukemia with indolinone compounds
US20030187026A1 (en) 2001-12-13 2003-10-02 Qun Li Kinase inhibitors
US6797825B2 (en) 2001-12-13 2004-09-28 Abbott Laboratories Protein kinase inhibitors
AU2002366245A1 (en) * 2001-12-17 2003-06-30 International Barcode Corporation Double-sided bar code doubling as a single bar code
US20050131733A1 (en) * 2001-12-17 2005-06-16 Allen Lubow Sealable individual bar coded packets
CA2470480C (en) 2001-12-27 2010-12-14 Theravance, Inc. Indolinone derivatives useful as protein kinase inhibitors
AU2003216282A1 (en) 2002-02-15 2003-09-09 Pharmacia And Upjohn Company Llc Process for preparing indolinone derivatives
AU2003233576A1 (en) * 2002-05-17 2003-12-02 Sugen, Inc. Novel biomarkers of tyrosine kinase inhibitor exposure and activity in mammals
ITMI20021620A1 (it) * 2002-07-23 2004-01-23 Novuspharma Spa Composto ad ativita' antitumorale
WO2004016211A2 (en) * 2002-08-08 2004-02-26 Vanderbilt University Pi3k antagonists as radiosensitizers
AU2003259713A1 (en) * 2002-08-09 2004-02-25 Theravance, Inc. Oncokinase fusion polypeptides associated with hyperproliferative and related disorders, nucleic acids encoding the same and methods for detecting and identifying the same
US20040121407A1 (en) * 2002-09-06 2004-06-24 Elixir Pharmaceuticals, Inc. Regulation of the growth hormone/IGF-1 axis
HN2003000272A (es) * 2002-09-10 2008-07-29 Pharmacia Italia Spa Formulaciones que comprenden un compuesto de indolinona
CA2506546A1 (en) * 2002-11-15 2004-06-17 Exelixis, Inc. Kinase modulators
AR042042A1 (es) * 2002-11-15 2005-06-08 Sugen Inc Administracion combinada de una indolinona con un agente quimioterapeutico para trastornos de proliferacion celular
US7452913B2 (en) * 2003-02-24 2008-11-18 Pharmacia & Upjohn Company Polymorphs of pyrrole substituted 2-indolinone protein kinase inhibitors
US20040209937A1 (en) * 2003-02-24 2004-10-21 Sugen, Inc. Treatment of excessive osteolysis with indolinone compounds
EA010727B1 (ru) 2003-02-26 2008-10-30 Суджен, Инк. Аминогетероарильные соединения в качестве ингибиторов протеинкиназ
US20040266843A1 (en) * 2003-03-07 2004-12-30 Sugen, Inc. Sulfonamide substituted indolinones as inhibitors of DNA dependent protein kinase (DNA-PK)
US7157577B2 (en) * 2003-03-07 2007-01-02 Sugen Inc. 5-sulfonamido-substituted indolinone compounds as protein kinase inhibitors
EP1604665B1 (en) * 2003-03-10 2011-05-11 Eisai R&D Management Co., Ltd. C-kit kinase inhibitor
US20050043233A1 (en) 2003-04-29 2005-02-24 Boehringer Ingelheim International Gmbh Combinations for the treatment of diseases involving cell proliferation, migration or apoptosis of myeloma cells or angiogenesis
DE10334582A1 (de) * 2003-07-28 2005-02-24 Basf Ag Verfahren zur Herstellung von Maleinsäureanhydrid
WO2005023765A1 (en) * 2003-09-11 2005-03-17 Pharmacia & Upjohn Company Llc Method for catalyzing amidation reactions by the presence of co2
RU2319702C2 (ru) * 2003-10-02 2008-03-20 Фармация Энд Апджон Компани Ллс Негигроскопическая кристаллическая малеатная соль 5-[(z)-(5-фтор-2-оксо-1,2-дигидро-3h-индол-3-илиден)метил]-n-[(2s)-2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропил]-2,4-диметил-1h-пиррол-3-карбоксамида, фармацевтическая композиция и способ лечения рака
PL1680140T3 (pl) * 2003-10-16 2011-11-30 Imclone Llc Inhibitory receptora-1 czynnika wzrostu fibroblastów i związane z nim sposoby leczenia
JP4890255B2 (ja) 2003-11-07 2012-03-07 ノバルティス バクシンズ アンド ダイアグノスティックス，インコーポレーテッド 改良された薬物特性を有するキノリノン化合物の薬学的に受容可能な塩
CN100450998C (zh) 2003-11-11 2009-01-14 卫材R&D管理有限公司 脲衍生物的制备方法
CA2547066A1 (en) * 2003-11-26 2005-06-16 The Scripps Research Institute Advanced indolinone based protein kinase inhibitors
US20050171182A1 (en) * 2003-12-11 2005-08-04 Roger Briesewitz Methods and compositions for use in the treatment of mutant receptor tyrosine kinase driven cellular proliferative diseases
US20050152943A1 (en) * 2003-12-23 2005-07-14 Medtronic Vascular, Inc. Medical devices to treat or inhibit restenosis
WO2005118543A1 (ja) * 2004-06-03 2005-12-15 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. キナーゼ阻害薬およびその用途
EP1765313A2 (en) 2004-06-24 2007-03-28 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Compounds for immunopotentiation
SE0401790D0 (sv) * 2004-07-07 2004-07-07 Forskarpatent I Syd Ab Tamoxifen response in pre- and postmenopausal breast cancer patients
US20060009510A1 (en) * 2004-07-09 2006-01-12 Pharmacia & Upjohn Company Llc Method of synthesizing indolinone compounds
CA2578066C (en) * 2004-08-26 2011-10-11 Pfizer Inc. Enantiomerically pure aminoheteroaryl compounds as protein kinase inhibitors
WO2006030826A1 (ja) 2004-09-17 2006-03-23 Eisai R & D Management Co., Ltd. 医薬組成物
CN100432071C (zh) * 2004-11-05 2008-11-12 中国科学院上海药物研究所 取代1h－吲哚－2－酮类化合物及其制备方法和用途
GT200500321A (es) 2004-11-09 2006-09-04 Compuestos y composiciones como inhibidores de proteina kinase.
NZ561138A (en) * 2005-03-23 2009-06-26 Pfizer Prod Inc Anti-CTLA4 antibody and indolinone combination therapy for treatment of cancer
EP2444419A1 (en) 2005-04-26 2012-04-25 Pfizer Inc. P-Cadherin antibodies
MX2007014087A (es) * 2005-05-12 2008-02-07 Pfizer Combinaciones y procedimientos para usar un compuesto de indolinona.
DK1922307T3 (da) 2005-05-18 2012-04-02 Array Biopharma Inc Heterocykliske inhibitorer af MEK og fremgangsmåder til anvendelse heraf
CA2609353C (en) 2005-05-23 2015-04-28 Novartis Ag Crystalline and other forms of 4-amino-5-fluoro-3-[6-(4-methylpiperazin-1-yl)-1h-benzimidazol-2-yl]-1h-quinolin-2-one lactic acid salts
BRPI0611419A2 (pt) * 2005-05-26 2010-09-08 Scripps Research Inst composto, sal, tautÈmero ou pró-fármaco, método para a modulação da atividade catalìtica de uma proteìna cinase e processo para a sìntese de uma pirrolil-indolinona
US20100105031A1 (en) * 2005-08-01 2010-04-29 Esai R & D Management Co., Ltd. Method for prediction of the efficacy of vascularization inhibitor
WO2007015578A1 (ja) 2005-08-02 2007-02-08 Eisai R & D Management Co., Ltd. 血管新生阻害物質の効果を検定する方法
JP5161777B2 (ja) 2005-09-07 2013-03-13 アムジェン フレモント インク． アクチビン受容体様キナーゼ−１に対するヒトモノクローナル抗体
US20080275101A1 (en) 2005-09-19 2008-11-06 Pfizer Inc. Solid Salt Forms Of A Pyrrole Substituted 2-Indolinone
JPWO2007052849A1 (ja) 2005-11-07 2009-04-30 エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 血管新生阻害物質とｃ−ｋｉｔキナーゼ阻害物質との併用
UA96139C2 (uk) 2005-11-08 2011-10-10 Дженентек, Інк. Антитіло до нейропіліну-1 (nrp1)
CN101389331A (zh) * 2005-12-29 2009-03-18 斯克里普斯研究学院 基于吲哚满酮的氨基酸衍生物的蛋白激酶抑制剂
JO2660B1 (en) 2006-01-20 2012-06-17 نوفارتيس ايه جي Pi-3 inhibitors and methods of use
CN101007801A (zh) * 2006-01-27 2007-08-01 上海恒瑞医药有限公司 吡咯取代的2－二氢吲哚酮衍生物、其制法与医药上的用途
AR060358A1 (es) 2006-04-06 2008-06-11 Novartis Vaccines & Diagnostic Quinazolinas para la inhibicion de pdk 1
TW200813091A (en) 2006-04-10 2008-03-16 Amgen Fremont Inc Targeted binding agents directed to uPAR and uses thereof
WO2007124288A1 (en) 2006-04-19 2007-11-01 Novartis Ag Indazole compounds and methods for inhibition of cdc7
UA91129C2 (ru) 2006-05-09 2010-06-25 Пфайзер Продактс Инк. Производные циклоалкиламинокислот и фармацевтическая композиция, которая их содержит
CN101443009A (zh) * 2006-05-18 2009-05-27 卫材R&D管理有限公司 针对甲状腺癌的抗肿瘤剂
DE102006024834B4 (de) * 2006-05-24 2010-07-01 Schebo Biotech Ag Neue Indol-Pyrrol-Derivate und deren Verwendungen
US20090203693A1 (en) * 2006-06-29 2009-08-13 Eisai R & D Management Co., Ltd. Therapeutic agent for liver fibrosis
US7838542B2 (en) 2006-06-29 2010-11-23 Kinex Pharmaceuticals, Llc Bicyclic compositions and methods for modulating a kinase cascade
CA2656836A1 (en) 2006-07-13 2008-01-17 Zymogenetics, Inc. Interleukin 21 and tyrosine kinase inhibitor combination therapy
CL2007002225A1 (es) 2006-08-03 2008-04-18 Astrazeneca Ab Agente de union especifico para un receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (pdgfr-alfa); molecula de acido nucleico que lo codifica; vector y celula huesped que la comprenden; conjugado que comprende al agente; y uso del agente de un
AR062207A1 (es) 2006-08-04 2008-10-22 Takeda Pharmaceutical Derivados de imidazopiridazina inhibidores de quinasas utiles para prevenir y/o tratar el cancer.
RU2445312C2 (ru) 2006-08-23 2012-03-20 Кудос Фармасьютиклз Лимитед ПРОИЗВОДНЫЕ 2-МЕТИЛМОРФОЛИН ПИРИДО-, ПИРАЗО- И ПИРИМИДО-ПИРИМИДИНА В КАЧЕСТВЕ ИНГИБИТОРОВ mTOR
CN101511793B (zh) * 2006-08-28 2011-08-03 卫材R&D管理有限公司 针对未分化型胃癌的抗肿瘤剂
AU2007294686B2 (en) 2006-09-15 2013-10-31 Equinox Sciences, Llc Kinase inhibitor compounds
BRPI0718029A2 (pt) 2006-11-06 2013-11-26 Supergen Inc Derivados de imidazo(1,2-b)piridazina e pirazolo(1,5-a)pirimidina e seu uso como inibidores da proteína cinase
CN101535302A (zh) * 2006-11-06 2009-09-16 株式会社泰丽巴镠斯 新型羟基吲哚衍生物
ATE547411T1 (de) 2006-12-04 2012-03-15 Jiangsu Simcere Pharmaceutical R & D Co Ltd 3-pyrrolo-cyclohexylen-2-dihydroindolinonderiva e und anwendungen davon
JP5319306B2 (ja) 2007-01-29 2013-10-16 エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 未分化型胃癌治療用組成物
MX2009008386A (es) 2007-02-06 2009-10-16 Pfizer Derivados de 2-amino-5,7-dihidro-6h-pirrolo[3,4-d] pirimidina como inhibidores de proteinas de choque termico-90 para tratar cancer.
US8044056B2 (en) 2007-03-20 2011-10-25 Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd. Adenine compound
US20090004213A1 (en) * 2007-03-26 2009-01-01 Immatics Biotechnologies Gmbh Combination therapy using active immunotherapy
US20090042906A1 (en) * 2007-04-26 2009-02-12 Massachusetts Institute Of Technology Methods for treating cancers associated with constitutive egfr signaling
WO2008138184A1 (fr) 2007-05-14 2008-11-20 Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co.Ltd. Dérivés de pyrrolo-azacycles, leur procédé de fabrication et leur utilisation en tant qu'inhibiteurs de protéine kinases
WO2008145398A1 (en) * 2007-06-01 2008-12-04 Pfizer Italia S.R.L. 4-arylpyrrole substituted 2-indoline derivatives active as protein kinase inhibitors
JP5352476B2 (ja) 2007-06-05 2013-11-27 武田薬品工業株式会社 キナーゼ阻害剤としての二環式複素環化合物
US8324395B2 (en) 2007-08-23 2012-12-04 Takeda Pharmaceutical Company Limited Heterocyclic compound and use thereof
US20090062368A1 (en) * 2007-08-29 2009-03-05 Protia, Llc Deuterium-enriched sunitinib
US8299106B2 (en) * 2007-09-06 2012-10-30 Boston Biomedical, Inc. Compositions of kinase inhibitors and their use for treatment of cancer and other diseases related to kinases
CA2701057C (en) 2007-10-11 2015-03-24 Astrazeneca Ab Pyrrolo[2,3-d]pyrimidin derivatives as protein kinase b inhibitors
CN101848895B (zh) 2007-11-09 2013-10-23 卫材R&D管理有限公司 血管新生抑制物质和抗肿瘤性铂络合物的组合使用
CA2699306A1 (en) 2007-11-21 2009-05-28 Teva Pharmaceutical Industries Ltd. Sunitinib hemi-l-malate, polymorphs and preparation thereof, polymorphs of racemic sunitinib malate, compositins containing sunitinib base and malic acid and preparation thereof
US20100256392A1 (en) * 2007-11-21 2010-10-07 Teva Pharmaceutical Industries Ltd. Polymorphs of sunitinib base and processes for preparation thereof
WO2009074862A1 (en) * 2007-12-12 2009-06-18 Medichem S.A. Polymorphic forms of a 3-pyrrole substituted 2-indolinone
MX2010006800A (es) 2007-12-19 2010-10-05 Genentech Inc 5-anilinoimidazopiridinas y metodos de uso de las mismas.
JP2011506560A (ja) 2007-12-20 2011-03-03 ノバルティス アーゲー Ｐｉ３キナーゼ阻害剤として用いられるチアゾール誘導体
NZ586575A (en) 2007-12-21 2012-03-30 Genentech Inc Azaindolizines and methods of use
MX2010008187A (es) * 2008-01-29 2010-08-10 Eisai R&D Man Co Ltd Uso combinado de inhibidor de angiogenesis y taxano.
EP2113248A1 (en) 2008-04-29 2009-11-04 Ratiopharm GmbH Pharmaceutical composition comprising N-[2-(diethylamino)ethyl]-5-[(5-fluoro-1,2-dihydro-2-oxo-3H-indol-3-ylidene)methyl]-2-,4-dimethyl-1H-pyrrole-3-carboxamide
US20100310668A1 (en) * 2008-02-13 2010-12-09 Ratiopharm Gmbh Pharmaceutical compositions comprising n-[2-(diethylamino)ethyl]-5-[(5-fluoro-1,2-dihydro-2-oxo-3h-indol-3-ylidene)methyl]-2,4-dimethyl-1h-pyrrole-3-carboxamide
EP2090306A1 (en) 2008-02-13 2009-08-19 Ratiopharm GmbH Pharmaceutical compositions comprising N-[2-(diethylamino)ethyl]-5-[(5-fluoro-1,2-dihydro-2-oxo-3H-indol-3-ylidene)methyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrole-3-carboxamide
CN101255154B (zh) * 2008-02-18 2011-09-07 靳广毅 一种取代的2-吲哚啉酮衍生物和制备方法及其应用
WO2009104021A2 (en) * 2008-02-21 2009-08-27 Generics [Uk] Limited Novel polymorphs and processes for their preparation
EP2098521A1 (en) 2008-03-06 2009-09-09 Ratiopharm GmbH Crystal forms of N-[2-(diethylamino) ethyl]-5-[fluoro-1,2-dihydro-2-oxo-3H-indol-3-ylidene)methyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrolle-3-carboxamide and methods for their prepparation
US20090247767A1 (en) * 2008-03-31 2009-10-01 Teva Pharmaceutical Industries Ltd. Processes for preparing sunitinib and salts thereof
WO2009128083A1 (en) * 2008-04-16 2009-10-22 Natco Pharma Limited Novel polymorphic forms of sunitinib base
US8158656B2 (en) * 2008-05-16 2012-04-17 Shenzhen Chipscreen Biosciences Ltd. 2-indolinone derivatives as multi-target protein kinase inhibitors and histone deacetylase inhibitors
WO2009140928A1 (zh) * 2008-05-23 2009-11-26 上海医药工业研究院 二氢吲哚酮衍生物
WO2009154697A2 (en) * 2008-05-28 2009-12-23 Massachusetts Institute Of Technology Disc-1 pathway activators in the control of neurogenesis
EP2313371B1 (en) * 2008-06-13 2012-08-15 Medichem, S.A. Process for preparing a 3-pyrrole substituted 2-indolinone malate salt
KR20110036055A (ko) * 2008-06-23 2011-04-06 낫코 파마 리미티드 고순도의 수니티닙 및 이의 약학적으로 허용가능한 염의 개선된 제조 방법
EP2138167A1 (en) * 2008-06-24 2009-12-30 ratiopharm GmbH Pharmaceutical composition comprising N-[2-(Diethylamino)ethyl]-5-[(5-fluoro-1,2-dihydro-2-oxo-3H-indol-3-ylidene) methyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrole-3-carboxamide
WO2009156837A2 (en) * 2008-06-26 2009-12-30 Medichem, S.A. Amorphous form of a 3-pyrrole substituted 2-indolinone malate salt
CN102137866A (zh) * 2008-06-30 2011-07-27 赛林药物股份有限公司 羟吲哚化合物
AU2009269149B2 (en) 2008-06-30 2016-03-17 Mesoblast, Inc. Treatment of eye diseases and excessive neovascularization using a combined therapy
DE102008031038A1 (de) 2008-06-30 2009-12-31 Alexander Priv.-Doz. Dr. Dömling Sutent zur Anwendung in der Organtransplantation
EP2318364A2 (en) * 2008-07-02 2011-05-11 Generics [UK] Limited Preparation of 3-pyrrole substituted 2-indolinone derivatives
US20110257237A1 (en) * 2008-07-10 2011-10-20 Generics [Uk] Limited Process for the preparation of crystalline forms of sunitinib malate
KR20110036588A (ko) 2008-07-24 2011-04-07 테바 파마슈티컬 인더스트리즈 리미티드 수니티닙 아세테이트 및 이의 다형을 통한 수니티닙 말레이트의 제조 방법
EP2342195B1 (en) 2008-07-24 2014-09-10 Medichem, S.A. Crystalline forms of a 3-pyrrole substituted 2-indolinone malate salt
WO2010017541A2 (en) * 2008-08-08 2010-02-11 The Johns Hopkins University Compositions and methods for treatment of neurodegenerative disease
AU2009288730B2 (en) 2008-08-25 2013-06-20 Amplimmune, Inc. Compositions of PD-1 antagonists and methods of use
AU2009286521A1 (en) * 2008-08-25 2010-03-04 Generics [Uk] Limited Novel polymorphs of sunitinib and processes for their preparation
US20110223188A1 (en) * 2008-08-25 2011-09-15 Solomon Langermann Targeted costimulatory polypeptides and methods of use to treat cancer
WO2010023473A2 (en) * 2008-08-25 2010-03-04 Generics [Uk] Limited Novel crystalline form and processes for its preparation
KR20110066927A (ko) * 2008-09-05 2011-06-17 임페리얼 이노베이션스 리미티드 생체 내 영상화제로서 사용하기 위한 이사틴 유도체
KR20110057244A (ko) 2008-09-19 2011-05-31 메디뮨 엘엘씨 Ｄｌｌ4에 대한 항체 및 이의 용도
EP2350056A1 (en) * 2008-10-10 2011-08-03 Medichem, S.A. Process for preparing a 3-pyrrole subsituted 2-indolinone malate salt
EP2181991A1 (en) * 2008-10-28 2010-05-05 LEK Pharmaceuticals D.D. Novel salts of sunitinib
EP2186809A1 (en) * 2008-11-13 2010-05-19 LEK Pharmaceuticals D.D. New crystal form of sunitinib malate
US20100222371A1 (en) * 2008-11-20 2010-09-02 Children's Medical Center Corporation Prevention of surgical adhesions
JP5579619B2 (ja) 2008-12-01 2014-08-27 武田薬品工業株式会社 複素環化合物およびその用途
JO3101B1 (ar) 2008-12-02 2017-09-20 Takeda Pharmaceuticals Co مشتقات بنزوثيازول كعوامل مضادة للسرطان
UY32351A (es) 2008-12-22 2010-07-30 Astrazeneca Ab Compuestos de pirimidinil indol para uso como inhibidores de atr
EP2379595A2 (en) 2008-12-23 2011-10-26 AstraZeneca AB Targeted binding agents directed to 5 1 and uses thereof
EP2373643A4 (en) 2009-01-02 2013-08-07 Hetero Research Foundation NEW SUNITINIB MALATE POLYMORPHS
PL2387563T5 (pl) 2009-01-16 2023-03-13 Exelixis, Inc. Sól jabłczanowa N-(4-{[6,7-bis(metyloksy)chinolin-4-ylo]oksy}fenylo-N′-(4-fluorofenylo)cykloproano-1,1-dikarboksyamidu oraz jej krystaliczne postaci do leczenia raka
SG2014009138A (en) 2009-02-05 2014-03-28 Immunogen Inc Novel benzodiazepine derivatives
CN102307875A (zh) 2009-02-09 2012-01-04 苏伯俭股份有限公司 吡咯并嘧啶基axl激酶抑制剂
US9265764B2 (en) * 2009-02-27 2016-02-23 Massachusetts Institute Of Technology Uses of chemicals to modulate GSK-3 signaling for treatment of bipolar disorder and other brain disorders
TW201035088A (en) 2009-02-27 2010-10-01 Supergen Inc Cyclopentathiophene/cyclohexathiophene DNA methyltransferase inhibitors
ES2529205T3 (es) 2009-03-13 2015-02-17 Cellzome Limited Derivados de pirimidina como inhibidores de mTOR
WO2010108503A1 (en) 2009-03-24 2010-09-30 Life & Brain Gmbh Promotion of neuronal integration in neural stem cell grafts
WO2010118986A1 (en) 2009-04-14 2010-10-21 Cellzome Limited Fluoro substituted pyrimidine compounds as jak3 inhibitors
WO2010120386A1 (en) 2009-04-17 2010-10-21 Nektar Therapeutics Oligomer-protein tyrosine kinase inhibitor conjugates
EP2255792A1 (en) 2009-05-20 2010-12-01 Ratiopharm GmbH Pharmaceutical compositions for N-[2-(Diethylamino)ethyl]5-[(fluoro-1,2-dihydro-2-oxo-3H-indole-3-ylidene) methyl]-2,4-dimenthyl-1H-pyrrole-3-carboxamide
US8211901B2 (en) 2009-05-22 2012-07-03 Shenzhen Chipscreen Biosciences Ltd. Naphthamide derivatives as multi-target protein kinase inhibitors and histone deacetylase inhibitors
EP2264027A1 (en) * 2009-05-27 2010-12-22 Ratiopharm GmbH Process for the preparation of N-[2-(Diethylamino)ethyl]-5-[(5-fluoro-1,2-dihydro-2-oxo-3H-indol-3-ylidene) methyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrole-3-carboxamide
US8389580B2 (en) 2009-06-02 2013-03-05 Duke University Arylcyclopropylamines and methods of use
CN101906076B (zh) 2009-06-04 2013-03-13 深圳微芯生物科技有限责任公司 作为蛋白激酶抑制剂和组蛋白去乙酰化酶抑制剂的萘酰胺衍生物、其制备方法及应用
US8293753B2 (en) 2009-07-02 2012-10-23 Novartis Ag Substituted 2-carboxamide cycloamino ureas
WO2011004200A1 (en) 2009-07-10 2011-01-13 Generics [Uk] Limited Novel pyrrole derivatives
FR2948940B1 (fr) * 2009-08-04 2011-07-22 Servier Lab Nouveaux derives dihydroindolones, leur procede de preparation et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent
WO2011029807A1 (en) 2009-09-11 2011-03-17 Cellzome Limited Ortho substituted pyrimidine compounds as jak inhibitors
CA2774634A1 (en) 2009-09-16 2011-03-24 Ranbaxy Laboratories Limited Salts of sunitinib
WO2011048082A1 (en) 2009-10-20 2011-04-28 Cellzome Limited Heterocyclyl pyrazolopyrimidine analogues as jak inhibitors
US20120271056A1 (en) 2009-11-12 2012-10-25 Ranbaxy Laboratories Limited Process for the preparation of crystalline form i of l-malic acid salt of sunitinib
US8916716B2 (en) 2009-11-19 2014-12-23 Ranbaxy Laboratories Limited Process for the preparation of crystalline form II of L-malic acid salt of sunitinib
SI3279215T1 (sl) 2009-11-24 2020-07-31 Medimmune Limited Usmerjena vezavna sredstva proti B7-H1
WO2011068233A1 (en) 2009-12-03 2011-06-09 Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd. Imidazoquinolines which act via toll - like receptors (tlr)
WO2011095802A1 (en) 2010-02-02 2011-08-11 Generics [Uk] Limited Hplc method for analyzing sunitinib
WO2011100325A2 (en) 2010-02-09 2011-08-18 Sicor Inc. Polymorphs of sunitinib salts
AU2011215900A1 (en) 2010-02-10 2012-07-26 Immunogen, Inc. CD20 antibodies and uses thereof
JP5770751B2 (ja) 2010-02-22 2015-08-26 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ピリド［３，２−ｄ］ピリミジン系のＰＩ３Ｋデルタ阻害化合物および使用方法
WO2011104555A2 (en) 2010-02-25 2011-09-01 Generics [Uk] Limited Novel process
EP2542536B1 (en) 2010-03-04 2015-01-21 Cellzome Limited Morpholino substituted urea derivatives as mtor inhibitors
EP2542550A1 (en) 2010-03-04 2013-01-09 Ranbaxy Laboratories Limited Process for the direct preparation of malic acid salt of sunitinib
CN102858739A (zh) * 2010-03-10 2013-01-02 斯索恩有限公司 酰胺化吡咯甲酸酯化合物的方法
AU2011228765A1 (en) 2010-03-18 2012-10-11 Ranbaxy Laboratories Limited Process for the preparation of malic acid salt of sunitinib
US9162981B2 (en) 2010-03-23 2015-10-20 The Johns Hopkins University Compositions and methods for treatment of neurodegenerative disease
WO2011128699A2 (en) 2010-04-16 2011-10-20 Generics [Uk] Limited Novel process
MX2012012328A (es) 2010-04-30 2013-05-06 Cellzome Ltd Compuestos pirazol como inhibidores de jak.
WO2011138565A1 (fr) 2010-05-05 2011-11-10 Biorebus Association pharmaceutique contenant l'acide lipoïque, l'acide hydroxycitrique et une somatostatine a titre de principes actifs
EP2392324A1 (en) 2010-06-01 2011-12-07 Societe De Coordination De Recherches Therapeutiques Rhenium complexes and their pharmaceutical use
SA111320519B1 (ar) 2010-06-11 2014-07-02 Astrazeneca Ab مركبات بيريميدينيل للاستخدام كمثبطات atr
US9012458B2 (en) 2010-06-25 2015-04-21 Eisai R&D Management Co., Ltd. Antitumor agent using compounds having kinase inhibitory effect in combination
WO2012000970A1 (en) 2010-07-01 2012-01-05 Cellzome Limited Triazolopyridines as tyk2 inhibitors
WO2012006503A1 (en) 2010-07-09 2012-01-12 Genentech, Inc. Anti-neuropilin antibodies and methods of use
AR082418A1 (es) 2010-08-02 2012-12-05 Novartis Ag Formas cristalinas de 1-(4-metil-5-[2-(2,2,2-trifluoro-1,1-dimetil-etil)-piridin-4-il]-tiazol-2-il)-amida de 2-amida del acido (s)-pirrolidin-1,2-dicarboxilico
US9040545B2 (en) 2010-08-20 2015-05-26 Cellzome Limited Heterocyclyl pyrazolopyrimidine analogues as selective JAK inhibitors
US8426418B2 (en) 2010-08-27 2013-04-23 CollabRx Inc. Method to treat melanoma in BRAF inhibitor-resistant subjects
WO2012042421A1 (en) 2010-09-29 2012-04-05 Pfizer Inc. Method of treating abnormal cell growth
WO2012058780A1 (en) 2010-11-01 2012-05-10 Scinopharm (Kunshan) Biochemical Technology Co., Ltd. Processes for the preparation of 3-(pyrrol-2-yl)methylene)-2-pyrrolones using 2-silyloxy-pyrroles
WO2012059941A1 (en) * 2010-11-04 2012-05-10 Ind-Swift Laboratories Limited Process for preparation of sunitinib malate and salts thereof
EP2638018A1 (en) 2010-11-09 2013-09-18 Cellzome Limited Pyridine compounds and aza analogues thereof as tyk2 inhibitors
JP2014503500A (ja) 2010-11-18 2014-02-13 シンタ ファーマスーティカルズ コーポレーション 低酸素状態に基づく酸素感受性薬剤による治療に適した被験体の事前選択
CA2818612C (en) 2010-11-19 2020-12-29 Forsight Vision4, Inc. Therapeutic agent formulations for implanted devices
TWI410425B (zh) 2010-12-03 2013-10-01 Lilly Co Eli 唑并［５，４－ｂ］吡啶－５－基化合物
US9827326B2 (en) 2010-12-23 2017-11-28 Nektar Therapeutics Polymer-sunitinib conjugates
JP6009457B2 (ja) 2010-12-23 2016-10-19 ネクター セラピューティクス ポリマー−デスエチルスニチニブコンジュゲート
AP2013007043A0 (en) 2011-01-31 2013-08-31 Novartis Ag Novel heterocyclic derivatives
SG191965A1 (en) 2011-02-15 2013-08-30 Immunogen Inc Methods of preparation of conjugates
CA2827171C (en) 2011-02-17 2019-04-09 Cancer Therapeutics Crc Pty Limited Fak inhibitors
EP2675794B1 (en) 2011-02-17 2019-02-13 Cancer Therapeutics Crc Pty Limited Selective fak inhibitors
GB201103578D0 (en) 2011-03-02 2011-04-13 Sabrepharm Ltd Dipyridinium derivatives
US8630703B2 (en) 2011-03-09 2014-01-14 Technion Research & Development Foundation Limited Treatment utilizing hydrophobic weak bases chemotherapeutic agents and illumination
CN102115469A (zh) * 2011-03-21 2011-07-06 浙江大学 吲哚啉-2-酮类衍生物的制备和用途
JP2014510122A (ja) 2011-04-04 2014-04-24 セルゾーム リミテッド ｍＴＯＲ阻害剤としてのジヒドロピロロピリミジン誘導体
SG193527A1 (en) 2011-04-08 2013-10-30 Beta Pharma Inc New indolinone protein kinase inhibitors
CA2828946C (en) 2011-04-18 2016-06-21 Eisai R&D Management Co., Ltd. Therapeutic agent for tumor
WO2012143320A1 (en) 2011-04-18 2012-10-26 Cellzome Limited (7h-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-2-yl)amine compounds as jak3 inhibitors
CN102898402B (zh) * 2011-04-26 2016-01-20 北京大学 一种苯并异硒唑酮修饰的吡咯甲酸酯取代的吲哚酮类化合物及其应用
EP3444363B1 (en) 2011-06-03 2020-11-25 Eisai R&D Management Co., Ltd. Biomarkers for prediciting and assessing responsiveness of thyroid and kidney cancer subjects to lenvatinib compounds
EP3812387A1 (en) 2011-07-21 2021-04-28 Sumitomo Dainippon Pharma Oncology, Inc. Heterocyclic protein kinase inhibitors
US20140179664A1 (en) 2011-07-28 2014-06-26 Cellzome Limited Heterocyclyl Pyrimidine Analogues As JAK Inhibitors
WO2013017479A1 (en) 2011-07-29 2013-02-07 Cellzome Limited Pyrazolo[4,3-c]pyridine derivatives as jak inhibitors
WO2013017480A1 (en) 2011-07-29 2013-02-07 Cellzome Limited Pyrazolo[4,3-c]pyridine derivatives as jak inhibitors
EP2739252A4 (en) 2011-08-05 2015-08-12 Forsight Vision4 Inc SMALL MOLECULE ADMINISTRATION USING AN IMPLANTABLE THERAPEUTIC DEVICE
EP2760863A1 (en) 2011-09-20 2014-08-06 Cellzome Limited Pyrazolo[4,3-c]pyridine derivatives as kinase inhibitors
US9175011B2 (en) 2011-09-21 2015-11-03 Cellzone Limited Morpholino substituted urea or carbamate derivatives as MTOR inhibitors
ES2592219T3 (es) 2011-10-07 2016-11-28 Cellzome Limited Derivados de {(4-(4-morfolino-dihidrotieno[3,4-d]pirimidin-2-il)aril}urea o carbamato como inhibidores de mTOR
CN102499917B (zh) 2011-10-25 2014-12-17 澳门大学 吲哚酮类化合物在制备神经保护药物中的应用
JP6059731B2 (ja) 2011-10-28 2017-01-11 ノバルティス アーゲー 新規プリン誘導体および疾患の処置におけるその使用
CN103130774B (zh) * 2011-11-22 2016-06-22 齐鲁制药有限公司 具有酪氨酸激酶抑制作用的化合物及其制备方法和应用
CN103127096B (zh) * 2011-12-02 2015-11-25 杨子娇 吡咯基取代的吲哚类化合物在治疗青光眼病的应用
US20130178520A1 (en) 2011-12-23 2013-07-11 Duke University Methods of treatment using arylcyclopropylamine compounds
AU2012357038B2 (en) 2011-12-23 2016-05-12 Cellzome Limited Pyrimidine-2,4-diamine derivatives as kinase inhibitors
CN102491932A (zh) * 2011-12-26 2012-06-13 天津科技大学 一种3-吲哚啉酮类衍生物及其制备方法及其应用
ES2709110T3 (es) 2012-03-23 2019-04-15 Laurus Labs Ltd Un proceso mejorado para la preparación de sunitinib y sus sales de adición de ácido
WO2013158367A1 (en) 2012-04-20 2013-10-24 Annji Pharmaceutical Co., Ltd. Cyclopropanecarboxylate esters of purine analogues
PL399027A1 (pl) 2012-04-27 2013-10-28 Instytut Farmaceutyczny Sposób otrzymywania N-[2-(dietylamino)etylo]-5-formylo-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksyamidu o wysokiej czystosci i jego zastosowanie do wytwarzania sunitynibu
CN102653521B (zh) * 2012-04-27 2014-08-06 首都师范大学 吲哚-2-酮的哌嗪硫代甲酰肼衍生物及其制备方法和用途
EP3563865A3 (en) 2012-05-04 2019-12-04 Pfizer Inc Prostate-associated antigens and vaccine-based immunotherapy regimens
CA2872526A1 (en) 2012-05-16 2013-11-21 Novartis Ag Dosage regimen for a pi-3 kinase inhibitor
BR112014030278A2 (pt) 2012-06-08 2017-06-27 Sutro Biopharma Inc anticorpo, e, composição.
EP3135690A1 (en) 2012-06-26 2017-03-01 Sutro Biopharma, Inc. Modified fc proteins comprising site-specific non-natural amino acid residues, conjugates of the same, methods of their preparation and methods of their use
US9238644B2 (en) 2012-08-17 2016-01-19 Cancer Therapeutics Crc Pty Limited VEGFR3 inhibitors
EP2887965A1 (en) 2012-08-22 2015-07-01 ImmunoGen, Inc. Cytotoxic benzodiazepine derivatives
KR102182800B1 (ko) 2012-08-31 2020-11-25 서트로 바이오파마, 인크. 아지도 기를 포함하는 변형된 아미노산
WO2014041349A1 (en) 2012-09-12 2014-03-20 Cancer Therapeutics Crc Pty Ltd Tetrahydropyran-4-ylethylamino- or tetrahydropyranyl-4-ethyloxy-pyrimidines or -pyridazines as isoprenylcysteincarboxymethyl transferase inhibitors
WO2014045101A1 (en) 2012-09-21 2014-03-27 Cellzome Gmbh Tetrazolo quinoxaline derivatives as tankyrase inhibitors
JP6243918B2 (ja) 2012-10-16 2017-12-06 トレロ ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド Ｐｋｍ２調節因子およびそれらの使用方法
US9260426B2 (en) 2012-12-14 2016-02-16 Arrien Pharmaceuticals Llc Substituted 1H-pyrrolo [2, 3-b] pyridine and 1H-pyrazolo [3, 4-b] pyridine derivatives as salt inducible kinase 2 (SIK2) inhibitors
CA2889866A1 (en) 2012-12-21 2014-06-26 Eisai R&D Management Co., Ltd. Amorphous form of quinoline derivative, and method for producing same
JP6494533B2 (ja) 2013-02-28 2019-04-03 イミュノジェン・インコーポレーテッド 細胞結合剤及び細胞毒性剤としてのマイタンシノイドを含む複合体
EP2961435B1 (en) 2013-02-28 2019-05-01 ImmunoGen, Inc. Conjugates comprising cell-binding agents and cytotoxic agents
EP2970206A1 (en) * 2013-03-13 2016-01-20 Boston Biomedical, Inc. 3-(aryl or heteroaryl) methyleneindolin-2-one derivatives as inhibitors of cancer stem cell pathway kinases for the treatment of cancer
US9968603B2 (en) 2013-03-14 2018-05-15 Forsight Vision4, Inc. Systems for sustained intraocular delivery of low solubility compounds from a port delivery system implant
CA2905993C (en) 2013-03-14 2022-12-06 Tolero Pharmaceuticals, Inc. Substituted 4-amino-pyrimidinyl-2-amino-phenyl derivatives and pharmaceutical compositions thereof for use as jak2 and alk2 inhibitors
AR095443A1 (es) 2013-03-15 2015-10-14 Fundación Centro Nac De Investig Oncológicas Carlos Iii Heterociclos condensados con acción sobre atr
US9206188B2 (en) 2013-04-18 2015-12-08 Arrien Pharmaceuticals Llc Substituted pyrrolo[2,3-b]pyridines as ITK and JAK inhibitors
CN104119321B (zh) * 2013-04-28 2017-09-08 齐鲁制药有限公司 二氢吲哚酮衍生物的二马来酸盐及其多晶型物
NZ714049A (en) 2013-05-14 2020-05-29 Eisai R&D Man Co Ltd Biomarkers for predicting and assessing responsiveness of endometrial cancer subjects to lenvatinib compounds
WO2014194030A2 (en) 2013-05-31 2014-12-04 Immunogen, Inc. Conjugates comprising cell-binding agents and cytotoxic agents
US9764039B2 (en) 2013-07-10 2017-09-19 Sutro Biopharma, Inc. Antibodies comprising multiple site-specific non-natural amino acid residues, methods of their preparation and methods of their use
FR3008411B1 (fr) * 2013-07-12 2015-07-03 Servier Lab Nouveau sel de la 3-[(3-{[4-(4-morpholinylmethyl)-1h-pyrrol-2-yl]methylene}-2-oxo-2,3-dihydro-1h-indol-5-yl)methyl]-1,3-thiazolidine-2,4-dione, sa preparation, et les formulations qui le contiennent
DK3039424T3 (da) 2013-08-28 2020-08-31 Crown Bioscience Inc Taicang Genekspressionssignaturer, der er prædiktive for et individs respons på en multikinaseinhibitor, og fremgangsmåder til anvendelse af disse
EP3055298B1 (en) 2013-10-11 2020-04-29 Sutro Biopharma, Inc. Modified amino acids comprising tetrazine functional groups, methods of preparation, and methods of their use
CA2838585A1 (en) 2013-10-18 2015-04-18 Hari Babu Matta An ascorbic acid salt of sunitinib
US9604968B2 (en) 2013-10-18 2017-03-28 Sun Pharmaceutical Industries Limited Pure crystalline Form II of L-malic acid salt of sunitinib and processes for its preparation
PE20171142A1 (es) 2013-11-01 2017-08-10 Pfizer Vectores para expresion de antigenos asociados a prostata
US20170000778A1 (en) 2013-12-06 2017-01-05 Emmanuelle di Tomaso Dosage regimen for an alpha-isoform selective phosphatidylinositol 3-kinase inhibitor
CN104829596B (zh) * 2014-02-10 2017-02-01 石家庄以岭药业股份有限公司 吡咯取代吲哚酮类衍生物、其制备方法、包含该衍生物的组合物、及其用途
CN103923014A (zh) * 2014-05-05 2014-07-16 宁夏宝马药业有限公司 环肌酸制备方法
EP3177289A4 (en) 2014-08-08 2018-03-21 Forsight Vision4, Inc. Stable and soluble formulations of receptor tyrosine kinase inhibitors, and methods of preparation thereof
CN106660964B (zh) 2014-08-28 2021-09-03 卫材R&D管理有限公司 高纯度喹啉衍生物及其生产方法
TWI595006B (zh) 2014-12-09 2017-08-11 禮納特神經系統科學公司 抗ｐｄ－１抗體類和使用彼等之方法
WO2016114322A1 (ja) 2015-01-13 2016-07-21 国立大学法人京都大学 筋萎縮性側索硬化症の予防及び／又は治療剤
US20180028662A1 (en) 2015-02-25 2018-02-01 Eisai R&D Management Co., Ltd. Method for Suppressing Bitterness of Quinoline Derivative
KR20170122809A (ko) 2015-03-04 2017-11-06 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션 암을 치료하기 위한 pd-1 길항제 및 vegfr/fgfr/ret 티로신 키나제 억제제의 조합
EP3611506B1 (en) 2015-04-20 2021-11-17 Sumitomo Dainippon Pharma Oncology, Inc. Predicting response to alvocidib by mitochondrial profiling
WO2016184793A1 (en) 2015-05-15 2016-11-24 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for treating a patient with vegfr inhibitor-resistant metastatic renal cell carcinoma
CA2985804A1 (en) 2015-05-18 2016-11-24 Tolero Pharmaceuticals, Inc. Alvocidib prodrugs having increased bioavailability
GB201510019D0 (en) 2015-06-09 2015-07-22 Cancer Therapeutics Crc Pty Ltd Compounds
RU2729936C2 (ru) 2015-06-16 2020-08-13 Эйсай Ар Энд Ди Менеджмент Ко., Лтд. Противораковое средство
US10568887B2 (en) 2015-08-03 2020-02-25 Tolero Pharmaceuticals, Inc. Combination therapies for treatment of cancer
EA037327B1 (ru) 2015-09-22 2021-03-12 Грейбуг Вижн, Инк. Соединения и композиции для лечения глазных расстройств
GB2543550A (en) 2015-10-21 2017-04-26 Hox Therapeutics Ltd Peptides
JP2018532750A (ja) 2015-11-02 2018-11-08 ノバルティス アーゲー ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ阻害剤の投薬レジメン
CA3004886A1 (en) 2015-11-12 2017-05-18 Graybug Vision, Inc. Aggregating microparticles for medical therapy
CN109069664B (zh) 2016-01-27 2022-05-13 苏特罗生物制药公司 抗cd74抗体偶联物，包含抗cd74抗体偶联物的组合物以及抗cd74抗体偶联物的使用方法
JP2019508405A (ja) 2016-02-08 2019-03-28 ヴィトリサ セラピューティクス， インコーポレイテッド 改良された硝子体内半減期を有する組成物およびその使用
EP3228630A1 (en) 2016-04-07 2017-10-11 IMBA-Institut für Molekulare Biotechnologie GmbH Combination of an apelin antagonist and an angiogenesis inhibitor for the treatment of cancer
CN107459519A (zh) 2016-06-06 2017-12-12 上海艾力斯医药科技有限公司 稠合嘧啶哌啶环衍生物及其制备方法和应用
US10870694B2 (en) 2016-09-02 2020-12-22 Dana Farber Cancer Institute, Inc. Composition and methods of treating B cell disorders
WO2018060833A1 (en) 2016-09-27 2018-04-05 Novartis Ag Dosage regimen for alpha-isoform selective phosphatidylinositol 3-kinase inhibitor alpelisib
EA201991071A1 (ru) 2016-10-28 2019-11-29 Композиции и способы для лечения ezh2-опосредованного рака
WO2018094275A1 (en) 2016-11-18 2018-05-24 Tolero Pharmaceuticals, Inc. Alvocidib prodrugs and their use as protein kinase inhibitors
KR102495436B1 (ko) 2016-12-05 2023-02-02 에이프로스 테라퓨틱스, 인크. 산성 기를 함유하는 피리미딘 화합물
US10786502B2 (en) 2016-12-05 2020-09-29 Apros Therapeutics, Inc. Substituted pyrimidines containing acidic groups as TLR7 modulators
EP3551185A4 (en) 2016-12-08 2021-07-14 Icahn School of Medicine at Mount Sinai COMPOSITIONS AND METHODS OF TREATMENT OF CDK4 / 6 MEDIATED CANCER
CA3047557A1 (en) 2016-12-19 2018-06-28 Tolero Pharmaceuticals, Inc. Profiling peptides and methods for sensitivity profiling
CN106916143B (zh) * 2017-03-14 2019-09-27 哈尔滨医科大学 一种预防和治疗冠心病的药物及其应用
CA3056923A1 (en) 2017-03-23 2018-09-27 Graybug Vision, Inc. Drugs and compositions for the treatment of ocular disorders
EP3621654A4 (en) 2017-05-10 2021-02-17 Graybug Vision, Inc. PROLONGED-RELEASE MICROPARTICLES AND SUSPENSIONS OF THESE INTENDED FOR MEDICAL THERAPY
US20200207859A1 (en) 2017-07-26 2020-07-02 Sutro Biopharma, Inc. Methods of using anti-cd74 antibodies and antibody conjugates in treatment of t-cell lymphoma
US11497756B2 (en) 2017-09-12 2022-11-15 Sumitomo Pharma Oncology, Inc. Treatment regimen for cancers that are insensitive to BCL-2 inhibitors using the MCL-1 inhibitor alvocidib
WO2019055909A1 (en) 2017-09-18 2019-03-21 Sutro Biopharma, Inc. ALPHA ANTI-FOLATE ANTIBODY-RECEPTOR CONJUGATES AND USES THEREOF
WO2019075367A1 (en) 2017-10-13 2019-04-18 Tolero Pharmaceuticals, Inc. PKM2 ACTIVATORS IN COMBINATION WITH OXYGEN REACTIVE SPECIES FOR THE TREATMENT OF CANCER
NL2019801B1 (en) 2017-10-25 2019-05-02 Univ Leiden Delivery vectors
EP3762381A4 (en) 2018-03-06 2022-01-05 Icahn School of Medicine at Mount Sinai SERINE THREONINE KINASE (AKT) DEGRADATION / INTERRUPTION COMPOUNDS AND METHODS OF USE
EP3539536A1 (en) 2018-03-15 2019-09-18 MH10 Spolka z ograniczona odpowiedzialnoscia A pharmaceutical composition of sunitinib or its salt thereof in its polymorphic form i
WO2020216450A1 (en) 2019-04-25 2020-10-29 Synthon B.V. Pharmaceutical composition comprising amorphous sunitinib
CN112513031A (zh) 2018-06-04 2021-03-16 阿普罗斯治疗公司 可用于治疗与tlr7调节相关的疾病的含酸性基团的嘧啶化合物
GB201810092D0 (en) 2018-06-20 2018-08-08 Ctxt Pty Ltd Compounds
GB201810581D0 (en) 2018-06-28 2018-08-15 Ctxt Pty Ltd Compounds
CN112512597A (zh) 2018-07-26 2021-03-16 大日本住友制药肿瘤公司 用于治疗与acvr1表达异常相关的疾病的方法以及用于此的acvr1抑制剂
US20220047716A1 (en) 2018-09-17 2022-02-17 Sutro Biopharma, Inc. Combination therapies with anti-folate receptor antibody conjugates
AU2019391097A1 (en) 2018-12-04 2021-05-20 Sumitomo Pharma Oncology, Inc. CDK9 inhibitors and polymorphs thereof for use as agents for treatment of cancer
AU2019407426A1 (en) 2018-12-21 2021-07-22 Daiichi Sankyo Company, Limited Combination of antibody-drug conjugate and kinase inhibitor
KR20210146290A (ko) 2019-02-12 2021-12-03 스미토모 다이니폰 파마 온콜로지, 인크. 헤테로시클릭 단백질 키나제 억제제를 포함하는 제제
JP2022525149A (ja) 2019-03-20 2022-05-11 スミトモ ダイニッポン ファーマ オンコロジー， インコーポレイテッド ベネトクラクスが失敗した急性骨髄性白血病（ａｍｌ）の処置
CN114364798A (zh) 2019-03-21 2022-04-15 欧恩科斯欧公司 用于治疗癌症的Dbait分子与激酶抑制剂的组合
US11712433B2 (en) 2019-03-22 2023-08-01 Sumitomo Pharma Oncology, Inc. Compositions comprising PKM2 modulators and methods of treatment using the same
EP3962951A1 (en) 2019-05-03 2022-03-09 Sutro Biopharma, Inc. Anti-bcma antibody conjugates
CA3137916A1 (en) 2019-05-06 2020-11-12 Ichan School Of Medicine At Mount Sinai Heterobifunctional compounds as degraders of hpk1
CA3152674A1 (en) 2019-08-31 2021-03-04 Etern Biopharma (Shanghai) Co., Ltd. Pyrazole derivatives for fgfr inhibitor and preparation method thereof
CN114761006A (zh) 2019-11-08 2022-07-15 Inserm(法国国家健康医学研究院) 对激酶抑制剂产生耐药性的癌症的治疗方法
WO2021148581A1 (en) 2020-01-22 2021-07-29 Onxeo Novel dbait molecule and its use
WO2021178597A1 (en) 2020-03-03 2021-09-10 Sutro Biopharma, Inc. Antibodies comprising site-specific glutamine tags, methods of their preparation and methods of their use
CN111233841A (zh) * 2020-03-17 2020-06-05 湖北扬信医药科技有限公司 一种舒尼替尼有关物质及其制备方法和用途
WO2023278424A1 (en) * 2021-06-28 2023-01-05 The Regents Of The University Of California Methods for treating and ameliorating t cell related diseases
CN113717159A (zh) * 2021-09-16 2021-11-30 中国药科大学 吲哚酮类化合物及其药物组合物、制备方法及用途
WO2023081923A1 (en) 2021-11-08 2023-05-11 Frequency Therapeutics, Inc. Platelet-derived growth factor receptor (pdgfr) alpha inhibitors and uses thereof
WO2023228095A1 (en) 2022-05-24 2023-11-30 Daiichi Sankyo Company, Limited Dosage regimen of an anti-cdh6 antibody-drug conjugate
US20240058465A1 (en) 2022-06-30 2024-02-22 Sutro Biopharma, Inc. Anti-ror1 antibody conjugates, compositions comprising anti ror1 antibody conjugates, and methods of making and using anti-ror1 antibody conjugates
WO2024017372A1 (zh) * 2022-07-22 2024-01-25 成都百裕制药股份有限公司 一种吲哚酮衍生物及其应用

Family Cites Families (101)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL230368A (no) 1957-08-19
DE878539C (de) 1939-08-17 1953-06-05 Hoechst Ag Verfahren zur Herstellung von Methinfarbstoffen
BE507136A (no) 1950-11-18
BE553661A (no) 1955-12-23
NL96047C (no) 1956-06-08
NL251055A (no) 1959-04-29
FR1398224A (fr) 1964-05-06 1965-05-07 Ici Ltd Procédé de teinture de matières textiles de polyacrylonitrile
US3308134A (en) 1965-10-22 1967-03-07 Mcneilab Inc Spiro(indan-2, 3'-indoline)-1, 2'-diones
US3551571A (en) 1967-05-19 1970-12-29 Endo Lab Methods for reducing pain,reducing fever and alleviating inflammatory syndromes with heteroaromatic pyrrol-3-yl ketones
US3564016A (en) 1968-03-07 1971-02-16 Endo Lab Method of decarbonylation
US4070366A (en) 1968-06-12 1978-01-24 Canadian Patents & Development Limited Alkylation process
FR1599772A (no) 1968-09-17 1970-07-20
US3922163A (en) 1970-01-30 1975-11-25 Upjohn Co Organic compounds and process
US3715364A (en) 1970-12-28 1973-02-06 Merck & Co Inc Nitroimidazole carboxamides
DE2159361A1 (de) 1971-11-30 1973-06-14 Bayer Ag Nitrofuranderivate, verfahren zu ihrer herstellung sowie ihre verwendung als arzneimittel
DE2159362A1 (de) 1971-11-30 1973-06-14 Bayer Ag Nitrofuranderivate, verfahren zu ihrer herstellung sowie ihre verwendung als arzneimittel
DE2159360A1 (de) 1971-11-30 1973-06-14 Bayer Ag Nitrofuranderivate, verfahren zu ihrer herstellung sowie ihre verwendung als arzneimittel
DE2159363A1 (de) 1971-11-30 1973-06-14 Bayer Ag Antimikrobielle mittel
GB1384599A (en) 1972-05-04 1975-02-19 Colgate Palmolive Co Coloured detergent compositions
US3880871A (en) 1973-09-27 1975-04-29 Squibb & Sons Inc Isothiocyanophenyl substituted imidazoles
US4002643A (en) 1975-06-27 1977-01-11 Mcneil Laboratories, Inc. Preparation of β-acyl pyrroles
US4002749A (en) 1975-08-12 1977-01-11 E. R. Squibb & Sons, Inc. Substituted indolinones
US4053613A (en) 1975-09-17 1977-10-11 E. R. Squibb & Sons, Inc. 1,3,thiazolinyl and 1,3 thiazinyl substituted indolinones
DE2855306A1 (de) 1978-12-21 1980-07-10 Boehringer Sohn Ingelheim Mittel zur senkung der herzfrequenz
GR73560B (no) 1979-02-24 1984-03-15 Pfizer
US4376110A (en) 1980-08-04 1983-03-08 Hybritech, Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
US4343923A (en) 1980-08-07 1982-08-10 Armstrong World Industries, Inc. Process for reducing the acid dye uptake of polyamide textile materials with N-acylimidazole compound
CH646956A5 (de) 1981-12-15 1984-12-28 Ciba Geigy Ag Imidazolide.
EP0095285A1 (en) 1982-05-21 1983-11-30 Sumitomo Chemical Company, Limited N-acylimidazoles, their production and use
US4493642A (en) 1982-12-27 1985-01-15 Bogdon Glendon J Orthodontic device and associated orthodontic method
DE3310891A1 (de) 1983-03-25 1984-09-27 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Neue indolinon-(2)-derivate, verfahren zu ihrer herstellung, diese verbindungen enthaltende arzneimittel und zwischenprodukte
US4489089A (en) 1983-04-06 1984-12-18 American Cyanamid Company Substituted N-[ω-(1H-imidazol-1-yl)alkyl]-amides
EP0124482B1 (de) 1983-04-29 1989-11-08 Ciba-Geigy Ag Neue Imidazolide und deren Verwendung als Härter für Polyepoxidverbindungen
DE3415138A1 (de) 1984-04-21 1985-10-31 Basf Ag, 6700 Ludwigshafen N-(azolylcarbamoyl)-hydroxylamine und diese enthaltende fungizide
DE3426419A1 (de) 1984-07-18 1986-01-23 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Neue oxindol-derivate, verfahren zu ihrer herstellung, diese verbindungen enthaltende arzneimittel und zwischenprodukte
US4560700A (en) 1985-02-08 1985-12-24 Merrell Dow Pharmaceuticals Inc. Pyrrole-3-carboxylate cardiotonic agents
JPH078851B2 (ja) 1985-07-29 1995-02-01 鐘淵化学工業株式会社 ３−フエニルチオメチルスチレン誘導体
US4966849A (en) 1985-09-20 1990-10-30 President And Fellows Of Harvard College CDNA and genes for human angiogenin (angiogenesis factor) and methods of expression
WO1993012786A1 (en) 1986-07-10 1993-07-08 Howard Harry R Jr Indolinone derivatives
US4853404A (en) 1986-10-13 1989-08-01 Tanabe Seiyaku Co., Ltd. Phenoxyacetic acid derivatives composition and use
JP2539504B2 (ja) 1987-03-11 1996-10-02 鐘淵化学工業株式会社 ヒドロキシスチレン誘導体
US5202341A (en) 1987-03-11 1993-04-13 Kanegafuchi Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha Hydroxystyrene compounds having tyrosine kinase inhibiting activity
US5089516A (en) 1987-03-11 1992-02-18 Kanegafuchi Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha 1-phenyl-3,5-pyrazolidinedione hydroxystyrene compounds which have tyrosine kinase inhibiting activity
US5043348A (en) 1987-04-24 1991-08-27 Cassella Aktiengesellschaft Pyrrolealdehydes, their preparation and their use
US5217999A (en) 1987-12-24 1993-06-08 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Styryl compounds which inhibit EGF receptor protein tyrosine kinase
DE3808071A1 (de) 1988-03-11 1989-09-21 Basf Ag Verfahren zur herstellung von acylierten imidazolen
US4868304A (en) 1988-05-27 1989-09-19 Iowa State University Research Foundation, Inc. Synthesis of nitrogen heterocycles
CA1339784C (en) 1988-06-23 1998-03-31 Shinya Inoue Pyrrolecarboxylic acid derivatives
JPH06104658B2 (ja) 1988-06-23 1994-12-21 三菱化成株式会社 ピロールカルボン酸誘導体
GB8816944D0 (en) 1988-07-15 1988-08-17 Sobio Lab Compounds
DE3824658A1 (de) 1988-07-15 1990-01-18 Schering Ag N-hetaryl-imidazolderivate
US5084280A (en) 1988-12-15 1992-01-28 Chapman Chemical Company Wood preservation composition and method
DE3902439A1 (de) 1989-01-27 1990-08-02 Basf Ag Pflanzenschuetzende mittel auf basis von 1-aryl- bzw. 1-hetarylimidazolcarbonsaeureestern
US5047554A (en) 1989-04-18 1991-09-10 Pfizer Inc. 3-substituted-2-oxindole derivatives
DE69031649T2 (de) 1989-07-25 1998-02-26 Taiho Pharmaceutical Co Ltd Oxoindolderivate
US5258357A (en) 1989-10-07 1993-11-02 Basf Aktiengesellschaft Carboxamides, their preparation and their use as herbicides
CA2032421A1 (en) 1989-12-20 1991-06-21 Mitsubishi Chemical Corporation Pyrrolealdehyde derivative
GB9004483D0 (en) 1990-02-28 1990-04-25 Erba Carlo Spa New aryl-and heteroarylethenylene derivatives and process for their preparation
CA2012634A1 (en) 1990-03-20 1991-09-20 Hassan Salari Tyrphostins for treatment of allergic, inflammatory and cardiovascular diseases
US5302606A (en) 1990-04-16 1994-04-12 Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals Inc. Styryl-substituted pyridyl compounds which inhibit EGF receptor tyrosine kinase
US5196446A (en) 1990-04-16 1993-03-23 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Certain indole compounds which inhibit EGF receptor tyrosine kinase
IT1247509B (it) 1991-04-19 1994-12-17 Univ Cagliari Composti di sintesi atti all'impiego nella terapia delle infezioni da rhinovirus
US5480883A (en) 1991-05-10 1996-01-02 Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals Inc. Bis mono- and bicyclic aryl and heteroaryl compounds which inhibit EGF and/or PDGF receptor tyrosine kinase
ES2108120T3 (es) 1991-05-10 1997-12-16 Rhone Poulenc Rorer Int Compuestos bis arilicos y heteroarilicos mono- y biciclicos que inhiben tirosina quinasa receptora de egf y/o pdgf.
GB9115160D0 (en) 1991-07-12 1991-08-28 Erba Carlo Spa Methylen-oxindole derivatives and process for their preparation
US5124347A (en) 1991-07-31 1992-06-23 Warner-Lambert Co. 3-5-ditertiarybutylphenyl-4-hydroxymethylidene derivatives of 1,3-dihydro-2H-indole-2-ones as antiinflammatory agents
HU219131B (hu) 1991-10-18 2001-02-28 Monsanto Co. Módszer és fungicid készítmény növények torsgombabetegségének gátlására és a hatóanyagok
US5389661A (en) 1991-12-05 1995-02-14 Warner-Lambert Company Imidazole and 1,2,4-triazole derivatives with angiotensin II antagonist properties
US5322950A (en) 1991-12-05 1994-06-21 Warner-Lambert Company Imidazole with angiotensin II antagonist properties
AU661533B2 (en) 1992-01-20 1995-07-27 Astrazeneca Ab Quinazoline derivatives
FR2689397A1 (fr) 1992-04-01 1993-10-08 Adir Utilisation des dérivés de la 3-(3,5-Ditert-Butyl-4-Hydroxybenzylidenyl) Indoline-2-one pour l'obtention de médicaments.
DE4211531A1 (de) 1992-04-06 1993-10-07 Cassella Ag Verfahren zur Herstellung von Pyrrolderivaten
FR2694004B1 (fr) 1992-07-21 1994-08-26 Adir Nouvelles 3-(Hydroxybenzylidényl)-indoline-2-ones et 3-(hydroxybenzylidényl)-indoline-2-thiones, leurs procédés de préparation, et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent.
US5565324A (en) 1992-10-01 1996-10-15 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Complex combinatorial chemical libraries encoded with tags
US5330992A (en) 1992-10-23 1994-07-19 Sterling Winthrop Inc. 1-cyclopropyl-4-pyridyl-quinolinones
GB9226855D0 (en) 1992-12-23 1993-02-17 Erba Carlo Spa Vinylene-azaindole derivatives and process for their preparation
JP3507124B2 (ja) 1993-05-26 2004-03-15 塩野義製薬株式会社 ベンジリデン誘導体の製造法
DE59402281D1 (de) 1993-06-28 1997-05-07 Bayer Ag Massefärben von Kunststoffen
US5332736A (en) 1993-11-01 1994-07-26 Ortho Pharmaceutical Corporation Anti-convulsant aroyl aminoacylpyrroles
US5610173A (en) 1994-01-07 1997-03-11 Sugen, Inc. Formulations for lipophilic compounds
GB9507298D0 (en) 1995-04-07 1995-05-31 Pharmacia Spa Substituted indolylmethylene-oxindale analogues as tyrosine kinase inhibitors
US5880141A (en) 1995-06-07 1999-03-09 Sugen, Inc. Benzylidene-Z-indoline compounds for the treatment of disease
US5786488A (en) 1996-11-13 1998-07-28 Sugen, Inc. Synthetic methods for the preparation of indolyquinones
JP3246712B2 (ja) 1995-11-15 2002-01-15 株式会社トクヤマ エテニルアミド化合物の製造方法
EP0788890A1 (en) 1996-02-06 1997-08-13 Agfa-Gevaert N.V. Dyes and dye-donor elements for thermal dye transfer recording
CA2206201A1 (en) 1996-05-29 1997-11-29 Yoshiaki Isobe Pyrazole derivatives and their pharmaceutical use
ES2208935T3 (es) 1996-08-01 2004-06-16 Merckle Gmbh Acidos acil-pirrol-dicarboxilicos y acidos acil-indol-dicarboxilicos, asi como sus derivados como inhibidores de la fosfolipasa a2 citosolica.
ES2239393T3 (es) * 1997-05-07 2005-09-16 Sugen, Inc. Derivados de 2-indolinona utilizados como moduladores de la actividad de la proteina-quinasa.
US6133305A (en) 1997-09-26 2000-10-17 Sugen, Inc. 3-(substituted)-2-indolinones compounds and use thereof as inhibitors of protein kinase activity
CA2314156C (en) * 1998-05-29 2010-05-25 Sugen, Inc. Pyrrole substituted 2-indolinone protein kinase inhibitors
US6462072B1 (en) 1998-09-21 2002-10-08 Gpi Nil Holdings, Inc. Cyclic ester or amide derivatives
CN1526448A (zh) 1998-12-14 2004-09-08 ���ռ�ҩ��ɷ����޹�˾ 用于治疗***直肠病的药物和方法
TR200101860T2 (tr) * 1998-12-17 2001-12-21 F.Hoffmann-La Roche Ag Sikline bağlı kinaz inhibitörleri olarak 4-alkenil (ve alkinil) oksidoller
US6284894B1 (en) 1998-12-18 2001-09-04 Nycomed Imaging As Preparation of allylic aromatic compounds
AU760964B2 (en) * 1998-12-31 2003-05-22 Sugen, Inc. 3-heteroarylidenyl-2-indolinone compounds for modulating protein kinase activityand for use in cancer chemotherapy
JP5336686B2 (ja) * 1999-11-24 2013-11-06 スージェン， インク． 遊離酸または遊離塩基としてイオン化可能な医薬品のための処方
MXPA02006263A (es) * 1999-12-22 2004-02-26 Sugen Inc Metodos de modulacion de la funcion de la cinasa de tirosina c-kit de la proteina con compuestos de indolinona.
AR034118A1 (es) * 2000-02-15 2004-02-04 Sugen Inc Compuestos de 2-indolinonas sustituidas con pirroles inhibidoras de proteinquinasas; sus composiciones farmaceuticas e intermediarios de sintesis
TWI270545B (en) 2000-05-24 2007-01-11 Sugen Inc Mannich base prodrugs of 3-(pyrrol-2-ylmethylidene)-2-indolinone derivatives
CA2414468A1 (en) * 2000-06-30 2002-01-10 Sugen, Inc. 4-heteroaryl-3-heteroarylidenyl-2-indolinones and their use as protein kinase inhibitors
EP1349852A2 (en) * 2000-12-20 2003-10-08 Sugen, Inc. 4-(hetero)aryl substituted indolinones

Also Published As

Publication number Publication date
DK1255752T3 (da) 2007-11-26
HUP0204433A2 (hu) 2003-04-28
DE122010000004I1 (de) 2010-04-15
KR100713960B1 (ko) 2007-05-02
HRP20020751B1 (en) 2011-01-31
NO20023831L (no) 2002-10-15
YU61402A (sh) 2005-07-19
CN1439005A (zh) 2003-08-27
ATE369359T1 (de) 2007-08-15
CR20120007A (es) 2012-02-24
BRPI0117360A2 (pt) 2012-01-24
HRP20020751A2 (en) 2004-12-31
NO2010002I1 (no) 2010-03-08
EA005996B1 (ru) 2005-08-25
BG107078A (bg) 2003-04-30
NO2019005I1 (no) 2019-02-11
DE60129794T2 (de) 2007-12-06
TWI306860B (en) 2009-03-01
PE20011083A1 (es) 2001-10-26
SK13262002A3 (sk) 2003-03-04
JP2003523340A (ja) 2003-08-05
LTPA2008002I1 (lt) 2019-02-25
ME00415B (me) 2011-10-10
CA2399358C (en) 2006-03-21
UA73976C2 (uk) 2005-10-17
LU91407I9 (no) 2018-12-28
KR20030003229A (ko) 2003-01-09
NL300332I1 (nl) 2008-03-03
NO20023831D0 (no) 2002-08-13
BRPI0117360B1 (pt) 2018-11-13
CA2399358A1 (en) 2001-08-23
MXPA02008021A (es) 2004-04-05
LU91657I2 (fr) 2010-05-03
EA200200862A1 (ru) 2003-02-27
NO2008019I2 (no) 2011-10-17
AU2001239770B2 (en) 2006-01-05
CR20120009A (es) 2012-02-07
IL151127A0 (en) 2003-04-10
LTC1255752I2 (lt) 2019-08-26
AU3977001A (en) 2001-08-27
JP3663382B2 (ja) 2005-06-22
MY130363A (en) 2007-06-29
NO2010002I2 (no) 2010-12-06
NL300332I2 (nl) 2008-04-01
US20050176802A1 (en) 2005-08-11
LU91407I2 (fr) 2008-03-10
HUP0204433A3 (en) 2007-08-28
NO2008019I1 (no) 2009-01-12
US7572924B2 (en) 2009-08-11
BRPI0108394B8 (pt) 2021-05-25
SI1255752T1 (sl) 2007-12-31
RS50444B (sr) 2010-03-02
WO2001060814A2 (en) 2001-08-23
BRPI0117360B8 (pt) 2021-07-06
HU228979B1 (en) 2013-07-29
US7125905B2 (en) 2006-10-24
EP1255752A2 (en) 2002-11-13
CZ20023081A3 (cs) 2003-02-12
FR08C0002I1 (no) 2008-03-21
PT1255752E (pt) 2007-10-17
CZ303705B6 (cs) 2013-03-27
US20020156292A1 (en) 2002-10-24
ES2290117T3 (es) 2008-02-16
CN1329390C (zh) 2007-08-01
NL300430I1 (nl) 2010-03-01
HK1051188A1 (en) 2003-07-25
CY2008004I1 (el) 2009-11-04
DE60129794D1 (de) 2007-09-20
IS2491B (is) 2009-01-15
AR034118A1 (es) 2004-02-04
PL211834B1 (pl) 2012-06-29
BG65764B1 (bg) 2009-10-30
NL300430I2 (nl) 2010-04-01
BR0108394A (pt) 2004-06-22
BE2010C009I2 (no) 2020-01-30
CY2010004I1 (el) 2012-01-25
US20070010569A1 (en) 2007-01-11
BRPI0108394B1 (pt) 2018-12-11
WO2001060814A3 (en) 2002-01-24
US20040063773A1 (en) 2004-04-01
CY2010004I2 (el) 2012-01-25
DE122008000002I1 (de) 2008-04-17
CY1108032T1 (el) 2011-04-06
FR08C0002I2 (fr) 2009-01-02
EP1255752B1 (en) 2007-08-08
IS6501A (is) 2002-08-13
CY2008004I2 (el) 2009-11-04
SK287142B6 (sk) 2010-01-07
NZ520640A (en) 2005-04-29
PL361209A1 (en) 2004-09-20
CO5280092A1 (es) 2003-05-30
US6573293B2 (en) 2003-06-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
NO325532B1 (no) Pyrrolsubstituerte 2-indolinoner, farmasoytisk preparat omfattende slike, fremgangsmate for a modulere den katalytiske aktiviteten til en proteinkinase in vitro basert pa bruk av slike forbindelser, samt anvendelse av slike forbindelser til fremstilling av medikamenter for behandling av sykdommer.
EP1370554B1 (en) 3-(4-amidopyrrol-2-ylmethylidene)-2-indolinone derivatives as protein kinase inhibitors
US20040138269A1 (en) Substituted pyrroles as kinase inhibitors
AU2001239770A1 (en) Pyrrole substituted 2-indolinone protein kinase inhibitors
US6635640B2 (en) 4-heteroaryl-3-heteroarylidenyl-2-indolinones and their use as protein kinase inhibitors
NO318083B1 (no) Pyrrolsubstituert 2-indolinon protein kinase inhibitorer
US6797725B2 (en) Prodrugs of a 3-(pyrrol-2-ylmethylidene)-2-indolinone derivatives
US7214700B2 (en) (2-Oxindol-3-ylidenyl) acetic acid derivatives and their use as protein kinase inhibitors

Legal Events

Date Code Title Description
CREP Change of representative

Representative=s name: BRYN AARFLOT AS POSTBOKS 449 SENTRUM OSLO, 0104 NO

SPCF Filing of supplementary protection certificate

Free format text: PRODUCT NAME: PALLADIA - TOCERANIB; NAT. REG. NO/DATE: EU/2/09/100/001-3/NO 20091029; FIRST REG. NO/DATE: EU/2/09/100/001-003 20090923

Spc suppl protection certif: 2010002

Filing date: 20100209

SPCG Granted supplementary protection certificate

Free format text: PRODUCT NAME: PALLADIA - TOCERANIB; NAT. REG. NO/DATE: EU/2/09/100/001-3/NO 20091029; FIRST REG. NO/DATE: EU/2/09/100/001-003 20090923

Spc suppl protection certif: 2010002

Filing date: 20100209

Extension date: 20240923

SPCG Granted supplementary protection certificate

Free format text: PRODUCT NAME: SUTENT - SUNITINIB; NAT. REG. NO/DATE: EU106347001-003 20060727; FIRST REG. NO/DATE: EU , EU106347001-003 20060719

Spc suppl protection certif: 2008019

Filing date: 20081208

Extension date: 20210719

SPCF Filing of supplementary protection certificate

Free format text: PRODUCT NAME: N-[2-(DIETYLAMINO)ETYL]-5-[(Z)-(5-FLUORO-2-OKSO-1,2-DIHYDRO-3H-INDOL-3-YLIDEN)METYL]-2,4-DIMETYL-1H-PYRROL-3-KARBOKSAMID (SUNITINIB), SAMT FARMASOEYTISK AKSEPTABLE SALTER; NAT. REG. NO/DATE: NO , 2008019 20081208

Spc suppl protection certif: 2019005

Filing date: 20190205

SPCG Granted supplementary protection certificate

Free format text: PRODUCT NAME: N-(2-(DIETYLAMINO)ETYL)-5-((Z)-; REG. NO/DATE: 2008019 20081208

Spc suppl protection certif: 2019005

Filing date: 20190205

Extension date: 20220124

SPCG Granted supplementary protection certificate

Free format text: PRODUCT NAME: N-(2-(DIETYLAMINO)ETYL)-5-((Z)-; REG. NO/DATE: 2008019 20081208

Spc suppl protection certif: 2019005

Filing date: 20190205

Extension date: 20220124

MK1K Patent expired
SPCX Expiry of an spc

Spc suppl protection certif: 2019005

SPCX Expiry of an spc

Spc suppl protection certif: 2008019