ES2239393T3 - Derivados de 2-indolinona utilizados como moduladores de la actividad de la proteina-quinasa. - Google Patents
Derivados de 2-indolinona utilizados como moduladores de la actividad de la proteina-quinasa.Info
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Abstract
La invención se refiere a nuevas 2-indolinonas y a sus sales y prodrogas fisiológicamente aceptables que modulan la actividad de la proteína quinasa y por lo tanto se espera que sean útiles en la prevención y el tratamiento de los desórdenes celulares relacionados con la proteína quinasa tales como el cáncer.
Description
Derivados de 2-indolinona
utilizados como moduladores de la actividad de la
proteína-quinasa.
La presente invención se refiere a nuevos
derivados de la 2-indolinona, más en particular a
diaza-indolinonas sustituidas, a composiciones
farmacéuticas que contienen tales compuestos y al uso de tales
compuestos para la fabricación de medicamentos destinados al
tratamiento de trastornos relacionados con una actividad anormal de
la proteína-quinasa ("PK").
Lo que sigue se presenta únicamente como
información de antecedentes y no se admite que sea técnica anterior
de la presente invención.
Las PK son enzimas que catalizan la fosforilación
de los grupos hidroxi de los restos tirosina, serina y treonina de
las proteínas. Las consecuencias de esta actividad aparentemente
simple son sorprendentes; el crecimiento, la diferenciación y la
proliferación celulares, es decir, virtualmente todos los aspectos
de la vida celular dependen de un modo u otro de la actividad de las
PK. Por otro lado, la actividad anormal de las PK se ha relacionado
con una fuente de trastornos, que van desde enfermedades
relativamente poco amenazadoras para la vida, como es la psoriasis,
hasta enfermedades extremadamente virulentas, como es el
glioblastoma (cáncer cerebral).
Las PK pueden subdividirse en dos grupos, las
proteína-tirosina-quinasas (PTK) y
las serina-treonina-quinasas
(STK).
Uno de los principales aspectos de la actividad
de las PTK es su interacción con los receptores de factor de
crecimiento. Los receptores de factores de crecimiento son
proteínas de la superficie celular. Cuando se fijan a un ligando de
factor de crecimiento, los receptores de factor de crecimiento se
convierten en una forma activa que interacciona con proteínas en la
superficie interna de la membrana celular. Esto conduce a la
fosforilación de los restos tirosina del receptor y otras proteínas
y a la formación, dentro de la célula, de complejos con un gran
número de moléculas de señal citoplasmáticas que, a su vez, afectan
a numerosas respuestas celulares, por ejemplo la división celular
(proliferación), la diferenciación celular, el crecimiento celular,
la expresión de efectos metabólicos en un microentorno
extracelular, etc. Para una revisión más completa, ver Schlessinger
y Ullrich, en Neuron 9, 303-391,
1992.
1992.
Los receptores de factor de crecimiento que
tienen actividad de PK se conocen como
tirosina-quinasas receptoras ("RTK").
Comprenden un amplio grupo de receptores transmembrana con
actividades biológicas diversas. Actualmente se han identificado
por lo menos diecinueve (19) subgrupos distintos de las RTK. Un
ejemplo de ellas es el subgrupo denominado RTK "HER", que
incluye los EGFR (epithelial growth factor receptor), los HER2, HER3
y HER4. Estas RTK tienen un dominio extracelular glucosilado para la
fijación del ligando, un dominio transmembrana y un dominio
intracelular catalítico citoplasmático que puede fosforilar los
restos tirosina de las
proteínas.
proteínas.
Otro subgrupo de las RTK es el formado por
receptores de insulina (IR), receptores de factor de crecimiento I
similares a la insulina (IGF-1R) y los receptores
afines a los receptores de insulina (IRR). El IR y el
IGF-1R interaccionan con la insulina, el
IGF-I y el IGF-II para formar un
heterotetrámero de dos subunidades \alpha glucosiladas totalmente
extracelulares y dos subunidades \beta, que cruzan la membrana
celular y que contienen el dominio
tirosina-quinasa.
Un tercer subgrupo de las RTK se denomina grupo
de receptores de factor de crecimiento derivados de plaquetas
("PDGFR"), que incluye el PDGFR\alpha, el PDGFR\beta, el
CSFIR, el c-kit y el c-fms. Estos
receptores contienen dominios extracelulares glucosilados de un
número variable de bucles similares a la inmunoglobulina y un
dominio intracelular en el que el dominio
tirosina-quinasa está interrumpido por secuencias de
aminoácido no afines.
Otro grupo que, por su similaridad con el
subgrupo PDGFR, se incluye algunas veces dentro del este último
grupo, es el subgrupo de receptores de quinasa hepática fetal
("flk"). Se cree que este grupo está formado por el receptor de
dominio de inserto/quinasa hepática fetal 1
(KDR/FLK-1), el flk-1R, el
flk-4 y la tirosina-quinasa 1
similar a la fms (flt-1).
Otro miembro del grupo de receptores de factor de
crecimiento de tirosina quinasa es el factor de crecimiento de
fibroblasto ("FGF"). Este grupo está formado por cuatro
receptores FGFR1-4 y siete ligandos
FGF1-7. Aunque todavía no se han definido bien,
parece que los receptores contienen un dominio glucosilado
extracelular, que lleva un número variable de bucles de tipo
inmunoglobulina y un dominio intracelular, en el que la secuencia
PTK está interrumpida por regiones de secuencias de aminoácidos no
afines.
Un listado más completo de los subgrupos de RTK
conocidos se describe en Plowman y col., DN&P 7(6),
334-339, 1994.
Además de las RTK existe también un grupo de PTK
totalmente intracelulares, llamadas
"tirosina-quinasas no receptoras" o
"tirosina-quinasas celulares". Este último
término, abreviado por "CTK", es el que se empleará en esta
descripción. Las CTK no contienen dominios extracelulares ni
transmembrana. Actualmente se han identificado 24 CTK, agrupadas en
11 subgrupos (Src, Frk, Btk, Csk, Abl, Zap70, Fes/Fps, Fak, Jak y
Ack). El subgrupo Src parece ser, con diferencia, el grupo más
amplio de las CTK que incluye los elementos Src, Yes, Fyn, Lyn, Lck,
Blk, Hck, Fgr e Yrk. Para una revisión más detallada de las CTK,
véase Bolen, Oncogene 8, 2025-2031, 1993.
Al igual que las CTK, las
serina-treonina-quinasas o STK son
predominantemente intracelulares, a pesar de haber pocas quinasas
receptoras del tipo STK. Las STK son las quinasas citosólicas más
frecuentes; es decir, quinasas que realizan su función en aquella
parte del citoplasma que es distinta de los orgánulos
citoplasmáticos y del citoesqueleto. El citosol es la región dentro
de la célula en la que tiene lugar la mayor parte de la actividad
biosintética y metabólica intermedia de la célula; es decir, en el
citosol tiene lugar la síntesis de proteínas de los ribosomas.
Las RTK, las CTK y las STK intervienen en una
gran variedad de estados patogénicos, incluido un gran número de
cánceres diversos. Otros estados patológicos, que se han asociados
con las PTK incluyen pero no se limitan a ellas: la psoriasis, la
cirrosis hepática, la diabetes, la aterosclerosis, la angiogénesis,
la restinosis, las enfermedades oculares, la artritis reumatoide y
otros trastornos inflamatorios, las enfermedades autoinmunes y una
gran variedad de trastornos renales.
En lo que respecta al cáncer existen dos
hipótesis principales, que se han propuesto para explicar la
proliferación celular excesiva que conduce al desarrollo de tumores
y se refieren a funciones conocidas como funciones reguladas por las
PK. Es decir, se ha sugerido que el crecimiento celular maligno
resulta del colapso del mecanismo que controla la división y/o
diferenciación celular. Se ha constatado que los productos proteicos
de un gran número de proto-oncogenes intervienen en
los mecanismos de transducción de señales que regulan el crecimiento
y la diferenciación celulares. Estos productos proteicos de los
proto-oncogenes incluyen los factores de crecimiento
extracelular, los receptores PTK de factor de crecimiento
transmembrana (RTK), las PTK citoplasmáticas (CTK) y las STK
citosólicas, ya aludidas antes.
En vista del nexo aparente entre las actividades
celulares relacionadas con las PK y un gran número de trastornos
humanos, no es sorprendente que se haya dedicado un gran esfuerzo a
la identificación de los mecanismos que modulan la actividad de las
PK. Algunos de ellos se han abordado con ensayos biomiméticos
utilizando moléculas grandes, de estructura similar a la que
interviene en los actuales procesos celulares (p.ej. ligandos
mutantes, solicitud US-4 966 849); receptores y
anticuerpos solubles (solicitud WO 94/10202; Kendall y Thomas, Proc.
Natl. Acad. Sci. 90, 10705-09, 1994; Kim y
col., Nature 362, 841-844, 1993); ligandos de
RNA (Jelinek y col., Biochemistry 33,
10450-56; Takano y col., Mol. Bio. Cell 4,
358A, 1993; Kinsella y col., Exp. Cell Res. 199,
56-62, 1992; Wright y col., J. Cellular Phys.
152, 448-57) e inhibidores de
tirosina-quinasa (WO 94/03427; WO 92/21660; WO
91/15495; WO 94/14808; patente US-5 330 922; Mariani
y col., Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 35, 2268,
1994).
1994).
En fechas más recientes se han efectuado intentos
de identificación de moléculas pequeñas que actúan como inhibidores
de las PK. Como inhibidores de las PTK se han descrito por ejemplo
compuestos arilo monocíclicos, bicíclicos y heterocíclicos (PCT WO
92/20642), derivados de vinileno-azaindol (PCT WO
94/14808) y
1-ciclopropil-4-piridilquinolonas
(patente US-5 330 992). Se han descrito como
inhibidores de las PTK, útiles para el tratamiento del cáncer,
compuestos estirilo (patente US-5 217 999),
compuesto piridilo sustituidos por estirilo (patente
US-5 302 606), derivados de quinazolina (solicitud
EP-0 566 266 A1), selenoindoles y selenuros (PCT WO
94/03427), compuestos polihidroxílicos tricíclicos (PCT WO
92/21660) y compuestos ácido bencilfosfónico (PCT WO 91/15495).
Nuestros propios esfuerzos por identificar
moléculas orgánicas pequeñas, que modulan la actividad PK y que,
además, podrían ser útiles para el tratamiento y prevención de
trastornos derivados de la actividad anormal de las PC, nos han
llevado a descubrir un grupo de nuevos derivados de la
2-indolinona, que presentan una excelente actividad
moduladora de las PK y que constituyen el objeto de esta
invención.
La presente invención se refiere en general a
nuevos derivados de la 2-indolinona y sus sales, que
modulan la actividad de las
proteína-tirosina-quinasas
receptoras (RTK),
proteína-tirosina-quinasas no
receptoras (CTK) y proteína-quinasas de
serina/treonina (STK). La invención se refiere en particular a
diaza-2-indolinonas sustituidas por
3-metilidenilo.
La presente invención se refiere además a
composiciones farmacológicas que contienen compuestos descritos o
sus sales fisiológicamente aceptables y un diluyente o excipiente
farmacéuticamente aceptable.
La invención se refiere además al uso de tales
compuestos en la fabricación de medicamentos para el tratamiento de
trastornos relacionados con una actividad anormal de las
proteína-quinasas, por ejemplo del cáncer, de otros
trastornos proliferantes, diabetes, enfermedad autoinmune,
trastornos inflamatorios y angiogénesis.
\newpage
En un primer aspecto, la presente invención se
refiere a compuestos que tienen la estructura química general:
\vskip1.000000\baselineskip
en la
que
A^{2} y A^{4} son nitrógeno y A^{1} y
A^{3} son carbono o bien A^{1} y A^{3} son nitrógeno y
A^{2} y A^{4} son carbono, dando por supuesto que si A^{1},
A^{2}, A^{3} y A^{4} es nitrógeno, entonces no existe R^{3},
R^{4}, R^{5} y R^{6}, respectivamente;
R^{1} se elige entre el grupo formado por
hidrógeno; alquilo C1-C10, cicloalquilo, alquenilo
C2-C10, alquinilo C2-C10, arilo,
heteroarilo, trihalometanocarbonilo, heteroalicíclico, hidroxi,
alcoxi C1-C10, C-carboxi,
O-carboxi, C-amido,
C-tioamido, guanilo, guanadinilo, ureidilo,
sulfonilo y trihalometanosulfonilo;
R^{2} se elige entre el grupo formado por
hidrógeno; alquilo C1-C10, cicloalquilo, arilo y
halógeno;
R^{3}, R^{4}, R^{5} y R^{6}, con
independencia entre sí, se eligen entre el grupo formado por
hidrógeno; alquilo C1-C10, trihalometilo,
cicloalquilo, alquenilo C2-C10, alquinilo
C2-C10, arilo, heteroarilo, heteroalicíclico,
hidroxi, tiohidroxi, alcoxi C1-C10, ariloxi,
tiohidroxi, tioalcoxi C1-C10, tioariloxi, sulfinilo,
sulfonilo, S-sulfonamido,
N-sulfonamido,
N-trihalometanosulfonamido, carbonilo, aldehído,
trihalometil-carbonilo, C-carboxi,
O-carboxi, ciano, nitro, halógeno, cianato,
isocianato, tiocianato, isotiocianato, O-carbamilo,
N-carbamilo, O-tiocarbamilo,
N-tiocarbamilo, fosfonilo, guanilo, guanadinilo,
ureidilo, C-amido, N-amido, amino,
amonio cuaternario, -NR^{18}R^{19};
R^{18} y R^{19}, con independencia entre sí,
se eligen entre el grupo formado por hidrógeno, alquilo
C1-C10, cicloalquilo, arilo, carbonilo, acetilo,
trihalometilcarbonilo, C-carboxi,
trihalometanosulfonilo, sulfonilo, C-peptidilo y,
juntos, forman un anillo heterocíclico de cinco o seis
eslabones;
Z es oxígeno;
Q es
\vskip1.000000\baselineskip
J^{1} se elige entre el grupo formado por
oxígeno, nitrógeno y azufre;
J^{2}, J^{3} y J^{4}, con independencia
entre sí, se eligen entre el grupo formado por carbono, nitrógeno,
oxígeno y azufre, de tal manera que el anillo heteroarilo de cinco
eslabones sea uno ya conocido en la técnica química, dando por
supuesto además que si J^{2}, J^{3} o J^{4} es nitrógeno,
oxígeno o azufre, entonces no existe R^{8}, R^{8'} o R^{8''},
respectivamente; de igual manera, cuando J^{1} es oxígeno o
azufre, entonces R^{7} no existe;
R^{7} se elige entre el grupo formado por
hidrógeno, alquilo C1-C10, cicloalquilo,
trihalometilcarbonilo, arilo, guanilo, carboxilo, sulfonilo y
trihalometanosulfonilo;
uno de R^{8}, R^{8'} o R^{8''} es H o un
grupo -(alk_{1})rM; en el que (alk_{1}) es CH_{2}; r
es un número de 1 a 3, ambos incluidos; y M se elige entre el grupo
formado por hidroxi, amino, carboxi, morfolinilo, piperazinilo,
tetrazolilo, N-carbamilo,
O-carbamilo, S-sulfonamido,
N-sulfonamido, sulfonilo,
-S(O)_{2}OH y fosfonilo;
los dos restantes de R^{8}, R^{8'} o
R^{8''}, con independencia entre sí, se eligen entre el grupo
formado por:
hidrógeno;
alquilo C1-C4 sin sustituir;
alquilo C1-C4 sustituido por uno
o varios grupos elegidos entre halógeno, hidroxilo, alcoxi
C1-C4 sin sustituir, amino,
S-sulfonamido, -NR^{18}R^{19} o carboxi;
alcoxi C1-C4 sin sustituir;
alcoxi C1-C4 sustituido por uno o
varios halógenos;
arilo sin sustituir;
arilo sustituido por uno o varios grupos elegidos
entre alquilo C1-C4 sin sustituir; alcoxi
C1-C4 sin sustituir; halógeno; trihalometilo; amino;
-NR^{18}R^{19}; hidroxi y S-sulfonamido;
heteroarilo sin sustituir;
heteroarilo sustituido por uno o varios grupos
elegidos entre alquilo C1-C4 sin sustituir; alcoxi
C1-C4 sin sustituir; halógeno; hidroxi; alcoxi sin
sustituir; amino; y -NR^{18}R^{19};
heteroalicíclico sin sustituir;
heteroalicíclico sustituido por uno o varios
grupos elegidos entre alquilo C1-C4 sin sustituir;
halógeno; hidroxi;
alcoxi sin sustituir; amino; y
-NR^{18}R^{19};
halógeno;
ciano;
carboxi; y
un anillo cicloalquilo, arilo, heteroarilo o
heteroalicíclico de seis eslabones, formado por combinación de
R^{8} y R^{8'} o de R^{8'} y R^{8''};
y las sales fisiológicamente aceptables de los
mismos.
Tal como se utiliza en esta descripción, el
término "alquilo" significa hidrocarburos alifáticos saturados,
incluidos los restos de cadena lineal y los de cadena ramificada.
El grupo alquilo tiene de 1 a 10 átomos de carbono. Con preferencia
especial es alquilo inferior, que tiene de 1 a 4 átomos de carbono.
El grupo alquilo puede estar sustituido o sin sustituir. Si está
sustituido, el o los restos sustituyentes pueden ser uno o varios,
elegidos individualmente entre cicloalquilo sin sustituir, elegido
entre el grupo formado por ciclopropano, ciclobutano, ciclopentano,
ciclopenteno, ciclohexano, adamantano, ciclohexadieno, cicloheptano
y cicloheptatrieno; arilo sin sustituir, elegido entre el conjunto
formado por fenilo, naftalenilo y antracenilo; heteroarilo sin
sustituir, elegido entre el conjunto formado por pirrol, furano,
tiofeno, imidazol, oxazol, tiazol, pirazol, piridina, pirimidina,
quinolina, isoquinolina, purina y carbazol; heteroalicíclico sin
sustituir, elegido entre el conjunto formado por piperidina,
morfolina, piperazina, pirrolina, pirrolidina, dihidrotiofeno y
tetrahidrofurano; hidroxi; alcoxi C1-C4; ariloxi;
tiohidroxi; tioalcoxi C1-C4; tioariloxi; ciano;
halógeno; carbonilo; tiocarbonilo; O-carbamilo;
N-carbamilo; O-tiocarbamilo;
N-tiocarbamilo; C-amido;
N-amido; C-carboxi;
O-carboxi; cianato; isocianato; tiocianato;
isotiocianato; nitro; sililo; amino y -NR^{18}R^{19}, en el que
R^{18} y R^{19} se eligen con independencia entre sí entre el
conjunto formado por hidrógeno, alquilo C1-C4 sin
sustituir, cicloalquilo sin sustituir, ya definido antes, arilo sin
sustituir, ya definido antes, carbonilo, trihalometilcarbonilo,
C-carboxi, trihalometilsulfonilo, sulfonilo y,
juntos, forman un anillo heteroalicíclico de cinco o de seis
eslabones, ya definido antes.
Un resto "cicloalquilo" significa cualquier
anillo exclusivamente carbonado, monocíclico o fusionado (es decir,
anillo que comparte un par de átomos de carbono adyacentes), en el
que uno o varios anillos no tienen un sistema de electrones pi
completamente conjugados. El resto cicloalquilo se elige entre
ciclopropano, ciclobutano, ciclopentano, ciclopenteno, ciclohexano,
adamantano, ciclohexadieno, cicloheptano y cicloheptatrieno. Un
resto cicloalquilo puede estar sustituido o sin sustituir. Cuando
está sustituido, el o los restos sustituyentes son uno o varios,
elegidos individualmente entre el alquilo C1-C4 sin
sustituir; arilo sin sustituir, elegido entre el conjunto formado
por fenilo, naftalenilo y antracenilo; heteroarilo sin sustituir
elegido entre el conjunto formado por pirrol, furano, tiofeno,
imidazol, oxazol, tiazol, pirazol, piridina, pirimidina, quinolina,
isoquinolina, purina y carbazol; un heteroalicíclico sin sustituir,
elegido entre el conjunto formado por la piperidina, morfolina,
piperazina, pirrolina, pirrolidina, dihidrotiofeno y
tetrahidrofurano; hidroxi; alcoxi C1-C4; ariloxi;
tiohidroxi; tioalcoxi C1-C4; tioariloxi; ciano;
halógeno; carbonilo; tiocarbonilo; carboxi;
O-carbamilo; N-carbamilo;
C-amido; N-amido; nitro; amino y
-NR^{18}R^{19}, en el que R^{18} y R^{19} tienen los
significados definidos anteriormente.
Un resto "alquenilo" significa un resto
alquilo, ya definido anteriormente, que tiene por lo menos dos
átomos de carbono y por lo menos un doble enlace
carbono-carbono.
Un resto "alquinilo" significa un resto
alquilo, ya definido antes, que tiene por lo menos dos átomos de
carbono y por lo menos un triple enlace
carbono-carbono.
Un resto "arilo" significa cualquier resto
exclusivamente carbonato, monocíclico o policíclico por fusión de
anillos (es decir, anillos que comparten pares de átomos de carbono
adyacentes), que tienen un sistema de electrones pi completamente
conjugados. El resto arilo se elige entre fenilo, naftalenilo y
antracenilo. El resto arilo puede estar sustituido o sin sustituir.
Si está sustituido, el o los grupos sustituyentes son uno o varios y
se eligen entre halógeno; trihalometilo; alquilo
C1-C4 sin sustituir; arilo sin sustituir, elegido
entre el conjunto formado por fenilo, naftalenilo y antracenilo;
heteroarilo sin sustituir, elegido entre el conjunto formado por el
pirrol, furano, tiofeno, imidazol, oxazol, tiazol, pirazol,
piridina, pirimidina, quinolina, isoquinolina, purina y carbazol;
heteroalicíclico sin sustituir, elegido entre el conjunto formado
por la piperidina, morfolina, piperazina, pirrolina, pirrolidina,
dihidrotiofeno y tetrahidrofurano; hidroxi; alcoxi
C1-C4; ariloxi; tiohidroxi; tioalcoxi
C1-C4; tioariloxi; ciano; nitro; carbonilo;
tiocarbonilo; C-carboxi; O-carboxi;
O-carbamilo; N-carbamilo;
O-tiocarbamilo; N-tiocarbamilo;
C-amido; N-amido; sulfinilo,
sulfonilo; S-sulfonamido;
N-sulfonamido; trihalometanosulfonamido; amino y
-NR^{18}R^{19}, en el que R^{18} y R^{19} tienen los
significados definidos anteriormente.
Tal como se emplea en esta descripción, un resto
"heteroarilo" significa un resto monocíclico o de anillo
fusionado (es decir, anillos que comparten un par de átomos
adyacentes), que tienen en el o en los anillos uno o varios átomos
elegidos entre el conjunto formado por nitrógeno, oxígeno y azufre
y, además, tienen un sistema de electrones pi completamente
conjugados. El resto heteroarilo se elige entre el pirrol, furano,
tiofeno, imidazol, oxazol, tiazol, pirazol, piridina, pirimidina,
quinolina, isoquinolina, purina y carbazol. El grupo heteroarilo
puede estar sustituido o sin sustituir. Si está sustituido, el o los
grupos sustituyentes son uno o varios y se eligen entre alquilo
C1-C4 sin sustituir; cicloalquilo sin sustituir,
elegido entre el conjunto formado por el ciclopropano, ciclobutano,
ciclopentano, ciclopenteno, ciclohexano, adamantano,
ciclohexadieno, cicloheptano y cicloheptatrieno; arilo sin
sustituir, elegido entre el conjunto formado por el fenilo,
naftalenilo y antracenilo; halógeno; trihalometilo; hidroxi; alcoxi
C1-C4; ariloxi; tiohidroxi; tioalcoxi
C1-C4; tioariloxi; ciano; nitro; carbonilo;
tiocarbonilo; sulfonamido; carboxi; sulfinilo; sulfonilo;
O-carbamilo; N-carbamilo;
O-tiocarbamilo; N-tiocarbamilo;
C-amido; N-amido; amino y
-NR^{18}R^{19}, en el que R^{18} y R^{19} tienen los
significados definidos anteriormente.
Un resto "heteroalicíclico" significa un
resto monocíclico o de anillos fusionados, que tiene en el o en los
anillos uno o varios átomos elegidos entre el grupo formado por
nitrógeno, oxígeno y azufre. Los anillos pueden tener uno o varios
dobles enlaces. Sin embargo, los anillos no tienen un sistema de
electrones pi completamente conjugados. El resto heteroalicíclico se
elige entre la piperidina, morfolina, piperazina, pirrolina,
pirrolidina, dihidrotiofeno y tetrahidrofurano. El anillo
heteroalicíclico puede estar sustituido o sin sustituir. Si está
sustituido, el o los grupos sustituyentes se eligen entre alquilo
C1-C4 sin sustituir; cicloalquilo sin sustituir,
elegido entre el conjunto formado por ciclopropano, ciclobutano,
ciclopentano, ciclopenteno, ciclohexano, adamantano, ciclohexadieno,
cicloheptano y cicloheptatrieno; halógeno; trihalometilo; hidroxi;
alcoxi C1-C4; ariloxi; tiohidroxi; tioalcoxi
C1-C4; tioariloxi; ciano; nitro; carbonilo;
tiocarbonilo; carboxi; O-carbamilo;
N-carbamilo; O-tiocarbamilo;
N-tiocarbamilo; sulfinilo; sulfonilo;
C-amido; N-amido; amino y
-NR^{18}R^{19}, en el que R^{18} y R^{19} tienen los
significados definidos anteriormente.
Un grupo "hidroxi" significa un grupo
-OH.
Un grupo "alcoxi" significa tanto un resto
-O-alquilo como un resto
-O-cicloalquilo, en los que alquilo y cicloalquilo
tienen los significados definidos anteriormente.
Un grupo "ariloxi" significa tanto un resto
-O-arilo como un resto
-O-heteroarilo, en los que arilo y heteroarilo
tienen los significados definidos antes.
Un grupo "heteroalicicloxi" significa un
resto -O-heteroalicíclico, en el que
heteroalicíclico tiene el significado definido antes.
Un grupo "tiohidroxi" significa un grupo
-SH.
Un grupo "tioalcoxi" significa tanto un
resto -S-alquilo como un resto
-S-cicloalquilo, en los que alquilo y cicloalquilo
tienen los significados definidos antes.
Un grupo "tioariloxi" significa tanto un
resto -S-arilo como un restos
-S-heteroarilo, en los que arilo y heteroarilo
tienen los significados definidos anteriormente.
Un grupo "carbonilo" significa un grupo
-C(=O)-R'', en que R'' se elige entre el conjunto
formado por hidrógeno, alquilo, cicloalquilo, arilo, heteroarilo (la
unión se realiza sobre un carbono del anillo) y heteroalicíclico (la
unión se realiza sobre un carbono del anillo), ya definidos
anteriormente.
Un grupo "trihalometilcarbonilo" significa
un grupo X_{3}CC(=O)- en el que X es un grupo halógeno, ya
definido.
Un grupo "aldehído" significa un grupo
carbonilo en el que R'' es hidrógeno.
Un grupo "tiocarbonilo" significa un grupo
-C(=S)-R'', en el que R'' tiene el significado
definido en la descripción.
Un grupo "O-carboxi"
significa un grupo R''C(=O)O-, en el que R'' tiene el
significado definido en la descripción.
Un grupo "C-carboxi"
significa grupos -C(=O)OR'', en los que R'' tiene el
significado definido en la descripción.
Un resto "acetilo" significa un resto
-C(=O)CH_{3}.
Un grupo "carboxialquilo" significa un grupo
-(CH_{2})_{s}-C(O)OR'', en
el que s es 1-6 y R'' ya se ha definido antes.
Un grupo ácido carboxílico significa un grupo
C-carboxi, en el que R'' es hidrógeno.
Un grupo "halógeno" significa flúor, cloro,
bromo o yodo.
Un grupo "trihalometilo" significa un grupo
-CX_{3}, en que X es un grupo halógeno ya definido.
Un grupo "trihalometanosulfonilo" significa
grupos X_{3}CS(=O)_{2}-, en los que X tiene el significa
ya definido.
Un grupo "ciano" significa un grupo
-C=N.
Un grupo "cianato" significa un grupo
-CNO.
Un grupo "isocianato" significa un grupo
-NCO.
Un grupo "tiocianato" significa un grupo
-CNS.
Un grupo "isotiocianato" significa un grupo
-NCS.
Un grupo "sulfinilo" significa un grupo
-S(=O)-R'', en el que R'' tiene el significado
definido en esta descripción.
Un grupo "sulfonilo" significa un grupo
-S(=O)_{2}R'', en el que R'' tiene el significado definido
en esta descripción.
Un grupo "sulfonamido" significa un resto
-S(=O)_{2}-NR^{18}R^{19}, en el que
R^{18} y R^{19} tienen los significados definidos en esta
descripción.
Un resto "trihalometanosulfonamido"
significa un resto X_{3}CS(=O)_{2}N(R^{18})- en
el que X y R^{18} tienen los significados definidos.
Un resto "O-carbamilo" es un
resto -OC(=O)NR^{18}R^{19}, en el que R^{18} y R^{19}
tienen los significados ya definidos.
Un resto "N-carbamilo" es un
resto R^{19}OC(=O)NR^{18}-, en el que R^{18} y R^{19}
tienen los significados ya definidos.
Un resto "O-tiocarbamilo" es
un resto -OC(=S)NR^{18}R^{19}, en el que R^{18} y
R^{19} tienen los significados ya definidos.
Un resto "N-tiocarbamilo" es
un resto R^{19}OC(=S)NR^{18}-, en el que R^{18} y
R^{19} tienen los significados ya definidos.
Un grupo "amino" significa un grupo
-NR^{18}R^{19}, en el que R^{18} y R^{19} son, ambos,
hidrógeno.
Un grupo "amonio cuaternario" significa un
grupo -^{+}NR^{18}R^{18'}R^{19}, en el que R^{18} y
R^{19} tienen los significados definidos y R^{18'} significa lo
mismo que R^{18} y R^{19}.
Un resto "C-amido" significa
un resto -C(=O)-NR^{18}R^{19}, en el que
R^{18} y R^{19} tienen los significados definidos.
Un resto "N-amido" significa
un resto R^{18}C(=O)NR^{19}-, en el que R^{18} y
R^{19} tienen los significados definidos.
Un resto "C-tioamido"
significa un resto -C(=S)-NR^{18}R^{19}, en el
que R^{18} y R^{19} tienen los significados definidos.
Un grupo "nitro" significa un grupo
-NO_{2}.
Un grupo "metilenodioxi" significa un grupo
-OCH_{2}O-, en el que los átomos de oxígeno están unidos a átomos
de carbono adyacentes del anillo.
Un grupo "etilenodioxi" significa un grupo
-OCH_{2}CH_{2}O-, en el que los átomos de oxígeno están unidos a
átomos de carbono adyacentes del anillo.
Un resto "guanilo" significa un resto
R^{18}R^{19}NC(=N)-, en el que R^{18} y R^{19} tienen los
significados definidos.
Un resto "guanadinilo" significa un resto
-R^{18}NC(=N)NR^{18'}R^{19}, en el que R^{18} y
R^{19} tienen los significados definidos antes y R^{18'} tiene
el mismo significado que R^{18} y R^{19}.
Un resto "ureidilo" significa un resto
-NR^{18}C(=O)NR^{18'}R^{19}, en el que R^{18} y
R^{19} tienen los significados definidos antes y R^{18'} tiene
el mismo significado que R^{18} y R^{19}.
Un resto "fosfonilo" significa un resto
-OP(=O)_{2}OR'', en el que R'' tiene el significado
definido antes.
Un resto "C-peptidilo"
significa un grupo formado por la reacción del grupo
2-amino de un aminoácido con el grupo carboxi de
otro aminoácido; es decir, un resto peptidilo tiene la estructura
general -(NCHRC(=O)_{n}-, en el que el resto R puede ser el
mismo o diferentes en función del aminoácido empleado para formar el
resto peptidilo, la designación "C-peptidilo"
se refiere a la situación en la que el resto peptidilo se une a una
molécula de no aminoácido mediante el carbono C(=O).
Un "grupo polar" significa un grupo, en el
que los núcleos de los átomos que están unidos entre sí mediante
enlaces covalentes para formar el grupo no comparten los electrones
del o de los enlaces covalentes, uniéndolos por igual; es decir, la
nube electrónica es más densa en torno a un átomo que en torno a
otro. El resultado de ello es que un extremo del o de los enlaces
covalentes es relativamente negativo y el otro extremo es
relativamente positivo; es decir, existe un polo negativo y un polo
positivo. Los ejemplos de grupos polares incluyen, pero no se
limitan a: hidroxi, alcoxi, carboxi, nitro, ciano, amino, amonio
cuaternario, amido, ureidilo, sulfonamido, sulfinilo, sulfonilo,
fosfono, morfolino, piperazinilo y tetrazolilo.
Un resto "espirocicloalquilo" significa un
resto cicloalquilo que comparte un átomo de carbono de anillo con
otro anillo.
Un grupo "espiroheteroalicíclico" significa
un resto heteroalicíclico que comparte un átomo de carbono de anillo
con otro anillo.
Un resto "N-hidroxilamino"
significa un resto R''ONR^{18}-, en el que R'' y R^{18} tienen
los significados definidos.
Un grupo "polihidroxialquilo" significa un
resto alquilo no ramificado de 1 a 8 átomos de carbono, con
preferencia de 1 a 4 átomos de carbono, sustituido por 2 ó más, con
preferencia 3 ó más grupos exclusivamente hidroxilo.
Un grupo "morfolinilo" significa un grupo
que tiene la siguiente estructura química:
Un resto "tetrazolilo" significa un resto
que tiene la siguiente estructura química:
\newpage
Un resto "aminotriazolilo" significa un
resto que tiene la siguiente estructura química:
Un resto "1-piperazinilo"
significa un resto que tiene la siguiente estructura química:
Los ejemplos no limitantes de anillos heteroarilo
de 5 eslabones Q, ya conocidos en la técnica química, incluyen los
siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
En una forma preferida de ejecución de esta
invención, R^{1}, R^{2} y R^{7} son hidrógeno.
En otra forma preferida de ejecución de esta
invención, R^{3}, R^{4}, R^{5} y R^{6}, con independencia
entre sí, se eligen entre el conjunto formado por:
hidrógeno;
alquilo C1-C4 sin sustituir;
alquilo C1-C4 sustituido por un
resto elegido entre el conjunto formado por cicloalquilo sin
sustituir, halógeno, hidroxi, alcoxi C1-C4 sin
sustituir, C-carboxi, arilo sin sustituir,
heteroarilo sin sustituir, heteroalicíclico sin sustituir, amino,
amonio cuaternario y -NR^{18}R^{19};
cicloalquilo sin sustituir;
hidroxi;
alcoxi C1-C4 sin sustituir;
alcoxi C1-C4 sustituido por un
resto elegido entre el conjunto formado por uno o varios grupos
halógeno, arilo sin sustituir y heteroarilo sin sustituir;
trihalometilo;
halógeno;
arilo sin sustituir;
arilo sustituido por uno o varios restos elegidos
con independencia entre sí entre el conjunto formado por alquilo
C1-C4 sin sustituir; alquilo C1-C4
sustituido por uno o varios restos halógeno; trihalometilo;
halógeno; hidroxi; y alcoxi C1-C4 sin sustituir;
ariloxi sin sustituir;
ariloxi sustituido por uno o varios grupos
elegidos con independencia entre sí entre el conjunto formado por
halógeno; alquilo C1-C4 sin sustituir; alquilo
C1-C4 sustituido por uno o varios restos halógeno;
arilo sin sustituir; hidroxi; alcoxi C1-C4 sin
sustituir; amino y -NR^{18}R^{19};
S-sulfonamido;
heteroarilo sin sustituir;
heteroarilo sustituido por uno o varios restos
elegidos con independencia entre sí entre el conjunto formado por
hidrógeno; alquilo C1-C4 sin sustituir; alquilo
C1-C4 sustituido por uno o varios restos halógeno;
trihalometilo; halógeno; hidroxi, alcoxi C1-C4 sin
sustituir; ariloxi sin sustituir; amino;
S-sulfonamido y -NR^{18}R^{19};
heteroalicíclico sin sustituir;
heteroalicíclico sustituido por uno o varios
restos elegidos con independencia entre sí entre el conjunto formado
por alquilo C1-C4 sin sustituir; alquilo
C1-C4 sustituido por uno o varios restos halógeno;
(alquilo C1-C4 sin
sustituir)-alcoxi; hidroxi; amino;
S-sulfonamido o -NR^{18}R^{19};
(alquilo C1-C4 sin
sustituir)-C-carboxi;
ácido carboxílico;
(alquilo C1-C4 sin
sustituir)-carbonilo;
aldehído;
(arilo sin
sustituir)-carbonilo;
acetilo;
S-sulfonamido;
N-sulfonamido;
amino; y
-NR^{18}R^{19}.
Las formas preferidas de ejecución adicionales de
la invención son aquellas en las que:
cualquiera par de R^{8}, R^{8'} y R^{8''}
son restos -(alk_{1})rM;
J^{1} se elige entre el conjunto formado por
nitrógeno, oxígeno y azufre y J^{2}, J^{3} y J^{4} son
carbono;
J^{1} y J^{3} son nitrógeno y J^{2} y
J^{4} son carbono.
En la siguiente tabla 1 se recogen ejemplos de
compuestos específicos de esta invención.
\vskip1.000000\baselineskip
La transducción de señales mediada por la RTK se
inicia por interacción extracelular con un factor de crecimiento
específico (ligando) y posterior dimerización del receptor,
estimulación transitoria de la actividad intrínseca de las
proteína-tirosina-quinasas y
fosforilación. Los sitios de unión para ello se crean para las
moléculas de transducción de señales intracelulares y conducen a la
formación de complejos con un espectro de moléculas señalizadoras
citoplasmáticas que facilitan la respuesta celular apropiada (p.ej.
división celular, efectos metabólicos en el microentorno
extracelular). Véase Schlessinger y Ullrich, 1992, Neuron 9,
303-391.
Se ha observado que los sitios de fosforilación
de la tirosina de los receptores del factor de crecimiento actúan
como sitios de fijación de alta afinidad para los dominios SH2
(homología src) de las moléculas señalizadoras, ver Fantl y col.,
Cell 69, 413-423, 1992; Songyang y col., Mol.
Cell. Biol. 14, 2777-2785, 1994; Songyang y
col., Cell 72, 767-778, 1993; y Koch y col.,
Science 252, 668-678, 1991. Se han
identificado diversas proteínas de sustrato intracelular, que se
asocian con las RTK. Pueden dividirse en dos grupos principales: (1)
sustratos que tienen un dominio catalítico; y (2) sustratos a los
que les falta dicho dominio, pero que actúan como adaptadores y se
asocian a moléculas catalíticamente activas, ver Songyang y col.,
Cell 72, 767-778, 1993. La especificidad de
las interacciones entre los receptores y los dominios SH2 de su
sustrato viene determinada por los restos aminoácido que rodean de
modo adyacente al resto de tirosina fosforilada. Las diferencias en
las afinidades de fijación entre los dominios SH2 y las secuencias
de aminoácidos que rodean a los restos fosfotirosina de receptores
concretos son coherentes con las diferencias observadas en sus
perfiles de fosforilación de sustrato, ver Songyang y col., Cell
72, 767-778, 1993. Estas observaciones
sugieren que la función de cada RTK viene determinada no solo por su
modelo de expresión y la disponibilidad del ligando, sino también
por la disposición de las vías de transducción de señal hacia la
línea de salida que se activan con un receptor particular. La
fosforilación proporciona, pues, un paso regulador importante que
determina la selectividad de las vías de señalización reclutadas por
receptores específicos de factor de crecimiento, así como por
receptores de factor de diferenciación.
Las STK, por ser primariamente citosólicas,
afectan la bioquímica interna de la célula a menudo en forma de
respuesta descendente a un fenómeno PTK. Las STK intervienen en el
proceso de señalización que inicia la síntesis del DNA y posterior
mitosis, que conducen a la proliferación celular.
De este modo, la señal PK se traduce, entre otras
respuestas, en proliferación, diferenciación, crecimiento y
metabolismo celulares. La proliferación celular anormal puede
traducirse en un amplio abanico de trastornos y enfermedades,
incluido el desarrollo de neoplasia, por ejemplo carcinoma, sarcoma,
leucemia, gliobastoma, hemangioma, psoriasis, arteriosclerosis,
artritis y retinopatía diabética (y otros trastornos relacionados
con una angiogénesis y/o vasculogénesis incontroladas).
No se requiere un conocimiento preciso del
mecanismo por el que los compuestos de la invención inhiben las PK
con vistas a la puesta en práctica de la presente invención. Sin
embargo, sin pretender adoptar ningún mecanismo ni teoría concretos,
se cree que los compuestos interaccionan con los aminoácidos de la
región catalítica de las PK. Las PK poseen como se sabe una
estructura bilobulada, en la que el ATP (trifosfato de adenosina)
parece fijarse sobre la hendidura existente entre ambos lóbulos, en
una región en la que los aminoácidos se conservan entre las PK. Se
cree que los inhibidores de las PK se fijan por interacciones no
covalente, por ejemplo puentes de hidrógeno, fuerzas de van der Waal
e interacciones iónicas en la misma región general en la que el ATP
mencionado se fija sobre las PK. Más en concreto, se supone que el
componente 2-indolinona de los compuestos de esta
invención se fija en el espacio general que normalmente ocupa el
anillo adenina del ATP. La especificidad de una molécula concreta
para una PK concreta puede surgir como resultado de interacciones
adicionales entre varios sustituyentes del núcleo
2-indolinona provistos de dominios aminoácido
específicos de PK concretas. Por lo tanto, diferentes sustituyentes
indolinona pueden contribuir a la fijación preferencial sobre PK
concretas. La capacidad de seleccionar estos compuestos activos en
diferentes sitios de fijación del ATP (o de otros nucleótidos) hace
que los compuestos sean útiles para impactar sobre la diana
constituida por cualquier proteína que tenga tal sitio; es decir, no
solamente las PK, sino también las
proteína-fosfatasas. Los compuestos descritos en
esta invención tienen, pues, utilidad para ensayos "in
vitro" sobre dichas proteínas y poseen efectos terapéuticos
"in vivo" a través de dichas proteínas.
En otro aspecto, esta invención se refiere al uso
de un compuesto según la invención para la fabricación de un
medicamento destinado al tratamiento de una enfermedad elegida entre
un cáncer, elegido entre el conjunto formado por un carcinoma
celular escamoso, un astrocitoma, un glioblastoma, un cáncer de
mama, un glioma, un melanoma, un cáncer de pulmón, un cáncer de
pulmón de células pequeñas, un cáncer de vejiga, un cáncer de
ovarios, un cáncer de próstata, un cáncer de cabeza o de cuello; un
trastorno proliferante elegido entre el conjunto formado por una
restinosis, una fibrosis, una psoriasis, una osteoartritis y una
artritis reumatoide; una diabetes, una enfermedad autoinmune, un
trastorno inflamatorio y una angiogénesis.
En otro aspecto, la presente invención se refiere
a una composición farmacéutica que contiene un compuesto o una sal,
descritos en la presente, y un excipiente o diluyente
farmacéuticamente aceptable.
Tal como se emplea en esta descripción,
"administrar" o "administración" significa la entrega de
un compuesto, sal o profármaco de la presente invención o de una
composición farmacológica que contenga un compuesto, una sal o un
profármaco de esta invención, a un organismo con el fin de prevenir
o tratar un trastorno relacionado con la PK.
Las vías apropiadas de administración pueden
incluir, sin limitarse a ellas: la administración oral, rectal,
transmucosa o intestinal; o la inyección intramuscular, subcutánea,
intramedular, intratecal, intraventricular directa, intravenosa,
intraperitoneal, intranasal o intraocular.
Como alternativa, se puede administrar el
compuesto en un modo más local que sistémico, por ejemplo mediante
la inyección directa de un compuesto a un tumor sólido, a menudo en
forma de "depot" o de formulación de liberación
persistente.
Además se puede administrar el fármaco en un
sistema de entrega intencionado del fármaco, por ejemplo en un
liposoma que esté recubierto con un anticuerpo específico del tumor.
Los liposomas pueden ser detectados y absorbidos selectivamente por
el tumor.
Las composiciones farmacológicas de la presente
invención pueden fabricarse por procesos ya conocidos de la
técnica; p.ej. mediante un proceso convencional de mezclado,
disolución, granulación, prensado de grageas, levigación,
emulsionado, encapsulado, oclusión o liofilización.
Las composiciones farmacológicas para el uso
según la presente invención pueden formularse, por tanto, de un modo
convencional empleando uno o varios vehículos fisiológicamente
aceptables, que comprenden excipientes y adyuvantes que facilitan
el procesado de los compuestos activos en los preparados que pueden
utilizarse farmacéuticamente. La formulación idónea dependerá de la
vía de administración que se elija.
Para la inyección, los compuestos de la invención
pueden formularse en soluciones acuosas, con preferencia en tampones
fisiológicamente compatibles, por ejemplo la solución de Hank, la
solución de Ringer o un tampón salino fisiológico. Para la
administración transmucosa pueden emplearse en la formulación
penetrantes apropiados para atravesar la barrera de la mucosa. Tales
penetrantes son conocidos en general en la técnica.
Para la administración oral, los compuestos
pueden formularse fácilmente combinando los compuestos activos con
excipientes farmacéuticamente aceptables, bien conocidos en la
técnica. Tales excipientes permiten la formulación de los compuestos
de la invención en tabletas, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos,
geles, jarabes, emulsiones, suspensiones y similares, para que el
paciente a tratar puede ingerirlos oralmente. Los preparados
farmacológicos para el uso oral pueden fabricarse empleando un
excipiente sólido, moliendo opcionalmente la mezcla resultante y
procesando la mezcla de gránulos, después de añadir los adyuvantes
idóneos, si se desea, para obtener tabletas o núcleos de gragea. Los
excipientes idóneos son, en concreto, cargas de relleno, tales como
azúcares, incluidas la lactosa, la sucrosa, la manita y la sorbita;
los preparados de celulosa, por ejemplo el almidón de maíz, el
almidón de trigo, el almidón de arroz, el almidón de patata, la
gelatina, la goma tragacanto, la metilcelulosa, la
hidroxipropilmetilcelulosa, la carboximetilcelulosa sódica y/o la
polivinilpirrolidona (PVP). Si se desea pueden añadirse elementos
desintegrantes, por ejemplo polivinilpirrolidona reticulada, goma
agar o ácido algínico o una sal del mismo, por ejemplo el alginato
sódico.
Los núcleos de grageas se dotan de las envolturas
apropiadas. A tal efecto pueden utilizarse soluciones concentradas
de azúcar, que pueden contener opcionalmente goma arábiga, talco,
polivinilpirrolidona, gel Carbopol, polietilenglicol y/o dióxido de
titanio, soluciones de laca o barniz y disolventes orgánicos o
mezclas de disolventes apropiados. Pueden añadirse a las envolturas
de las tabletas o grageas colorantes o pigmentos para identificar o
caracterizar las diferentes combinaciones de dosis del principio
activo.
Las composiciones farmacológicas que pueden
utilizarse por vía oral incluyen las cápsulas de tipo
empuje-encaje (push-fit), fabricadas
con gelatina, así como las cápsulas blandas selladas, fabricadas con
gelatina y un plastificante, por ejemplo la glicerina o la sorbita.
Las cápsulas empuje-encaje pueden contener los
ingredientes activos mezclados con cargas de relleno, por ejemplo
lactosa, aglutinantes, por ejemplo almidones y/o lubricantes, por
ejemplo talco o estearato magnésico y, opcionalmente,
estabilizantes. En las cápsulas blandas, los compuestos activos
pueden disolverse o suspenderse en líquidos apropiados, por ejemplo
aceites grasos, parafina líquida o polietilenglicoles líquidos.
Pueden añadirse además estabilizantes.
Todas las formulaciones para la administración
oral deberían presentarse en dosis idóneas para tal
administración.
Para la administración bucal, las composiciones
pueden adoptar la forma de tabletas o pastillas, formuladas de
manera convencional.
Para la administración por inhalación, los
compuestos a utilizar según la presente invención se administran de
modo conveniente en forma de nebulizador aerosol, a partir de un
bote o nebulizador presurizado, empleando el propelente adecuado,
p.ej. el diclorodifluormetano, el triclorofluormetano, el
diclorotetrafluoretano, el dióxido de carbono u otro gas adecuado.
En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación
puede determinarse mediante una válvula que entregue una cantidad
calibrada. Las cápsulas o cartuchos por ejemplo de gelatina para
usar en un inhalador o insuflador pueden formularse para que
contengan una mezcla pulverulenta del compuesto y una base polvo
adecuada, por ejemplo lactosa o almidón.
Los compuestos pueden formularse para la
administración parenteral por inyección, p.ej. por inyección de bolo
o por infusión continua. Las formulaciones para la inyección pueden
presentarse en forma de dosis unitaria, p.ej. en ampollas o en
envases multidosis, que lleven incorporado un conservante. Las
composiciones pueden adoptar la forma de suspensión, solución o
emulsión en vehículos aceitosos o acuosos y pueden agentes
auxiliares de formulación, por ejemplo agentes de suspensión,
estabilizantes y/o dispersantes.
Las composiciones farmacológicas para la
administración parenteral incluyen las soluciones acuosas de los
compuestos activos en una forma soluble en agua. Adicionalmente, las
suspensiones de los compuestos activos pueden prepararse en forma de
suspensiones inyectables aceitosas apropiadas. Los disolventes o
vehículos lipófilos idóneos incluyen los aceites grasos, por ejemplo
el aceite de sésamo, o los ésteres sintéticos de ácidos grasos, por
ejemplo el oleato de etilo o los triglicéridos, o los liposomas. Las
suspensiones inyectables acuosas pueden contener sustancias que
aumenten la viscosidad de la suspensión, por ejemplo la
carboximetilcelulosa sódica, la sorbita o el dextrano.
Opcionalmente, la suspensión puede contener además estabilizantes
idóneos o agentes que aumenten la solubilidad de los compuestos para
permitir la fabricación de soluciones muy concentradas.
Como alternativa, el ingrediente activo puede
adoptar la forma de polvo para reconstitución antes del uso con un
vehículo idóneo, p.ej. agua estéril libre de pirógenos.
Los compuestos pueden formularse también en forma
de composiciones rectales, tales como supositorios o enemas de
retención, p.ej. que contienen bases de supositorio convencionales,
por ejemplo manteca de cacao u otros glicéridos.
Además de las formulaciones descritas
anteriormente, los compuestos pueden formularse también en forma de
preparado "depot". Estas formulaciones de acción prolongada
pueden administrarse por implantación (por ejemplo subcutánea o
intramuscular) o por inyección intramuscular. Los compuestos pueden
formularse por ejemplo con materiales poliméricos o hidrófobos
idóneos (por ejemplo en forma de emulsión en un aceite aceptable) o
con resinas de intercambio iónico o en forma de derivados de
solubilidad escasa, por ejemplo en forma de una sal de solubilidad
escasa.
Las composiciones farmacológicas presentes pueden
contener además excipientes o vehículos idóneos, sólidos o en fase
gel. Los ejemplos de tales excipientes o vehículos incluyen pero no
se limitan a: carbonato cálcico, fosfato cálcico, varios azúcares,
almidones, derivados de celulosa, gelatina y polímeros, por ejemplo
polietilenglicoles.
Muchos de los compuestos moduladores de las PK de
la invención pueden proporcionarse en forma de sales
fisiológicamente aceptables, en las que el compuesto reivindicado
puede constituir la especie cargada negativamente o positivamente.
Los ejemplos de sales, en las que el compuesto forma el resto
cargado positivamente, incluyen pero no se limitan a: amonio
cuaternario (definido anteriormente), sales como el clorhidrato, el
sulfato, el carbonato, el lactato, el tartrato, el maleato, el
succinato, etc., formadas por reacción de un grupo amino con el
ácido apropiado. Las sales, en las que el compuesto forma la especie
cargada negativamente, incluyen pero no se limitan a: las sales de
sodio, potasio, calcio y magnesio, formadas por reacción de un grupo
ácido carboxílico de la molécula con la base apropiada (p.ej.
hidróxido sódico (NaOH), hidróxido potásico (KOH), hidróxido cálcico
(Ca(OH)_{2}), etc.).
Las composiciones farmacológicas idóneas para el
uso en la presente invención incluyen composiciones en las que los
ingredientes activos están contenidos en una cantidad eficaz para
lograr el propósito buscado.
De forma más específica, una cantidad
terapéuticamente eficaz significa una cantidad de un compuesto que
es eficaz para prevenir, aliviar o mejorar los síntomas de una
enfermedad o prolongar la supervivencia del sujeto tratado.
La determinación de una cantidad terapéuticamente
eficaz está dentro de la incumbencia de los expertos en la materia,
en especial a la luz de la descripción detallada que se facilita
seguidamente.
Para cualquier compuesto utilizado en los métodos
de la invención, la cantidad o dosis terapéuticamente eficaz puede
estimarse inicialmente a partir de los ensayos con cultivos
celulares. A continuación puede formularse la dosificación para el
uso en modelos animales, de modo que se logre un intervalo de
concentraciones circulantes que incluya la IC_{50} ya determinada
en el cultivo celular (es decir, la concentración del compuesto a
ensayar que logra una inhibición semimáxima de la actividad de la
PK). Tal información puede utilizarse después para determinar con
mayor precisión las dosis útiles para los humanos.
La toxicidad y la eficacia terapéutica de los
compuestos descritos en la presente pueden determinarse por
procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o en
animales experimentales, p.ej. para determinar la LD_{50} (la
dosis letal para el 50% de la población) y la ED_{50} (la dosis
terapéuticamente eficaz en el 50% de la población). La proporción de
dosis entre efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico
y puede expresarse como la proporción entre la LD_{50} y la
ED_{50}. Son preferidos los compuestos que poseen índices
terapéuticos elevados. Los datos obtenidos a partir de estos ensayos
en cultivos celulares y en estudios con animales pueden utilizarse
para formular un intervalo de dosis
destinado a pacientes humanos. La dosificación de tales compuestos se sitúa con preferencia en el intervalo de concentraciones circulantes que incluye la ED_{50} con toxicidad escasa o nula. La dosificación puede variar dentro de amplios márgenes, en función de la forma de dosificación empleada y de la vía de administración utilizada. La formulación, la vía de administración y la dosificación exactas podrán elegirse por parte del médico concreto en vista del estado de salud del paciente (véase p.ej. Fingl y col., "The Pharmacological Basis of Therapeutics", 1975, cap. 1, p. 1).
destinado a pacientes humanos. La dosificación de tales compuestos se sitúa con preferencia en el intervalo de concentraciones circulantes que incluye la ED_{50} con toxicidad escasa o nula. La dosificación puede variar dentro de amplios márgenes, en función de la forma de dosificación empleada y de la vía de administración utilizada. La formulación, la vía de administración y la dosificación exactas podrán elegirse por parte del médico concreto en vista del estado de salud del paciente (véase p.ej. Fingl y col., "The Pharmacological Basis of Therapeutics", 1975, cap. 1, p. 1).
La cantidad y el intervalo de dosificación pueden
ajustarse de forma individual para proporcionar niveles en plasma
del resto activo, que sean suficientes para mantener los efectos de
modulación de la quinasa, o bien una concentración eficaz mínima
(MEC). La MEC variará para cada compuesto, pero puede estimarse a
partir de los datos "in vitro"; p.ej. la concentración
necesaria para lograr una inhibición del 50-90% de
la quinasa utilizando los ensayos descritos en la presente. Las
dosificaciones necesarias para lograr la MEC dependerán de las
características individuales y de la vía de administración. Sin
embargo pueden utilizarse ensayos HPLC o bioensayos para determinar
las concentraciones en plasma.
Los intervalos de dosificación empleados pueden
determinarse también empleando el valor de la MEC. Los compuestos
deberían administrarse empleando un régimen que mantenga niveles en
plasma por encima de la MEC durante un 10-90% del
tiempo, con preferencia entre el 30 y el 90% y con preferencia
especial entre el 50 y el 90%.
En los casos de administración local o toma
selectiva,la concentración local eficaz del fármaco puede no
guardar relación con la concentración en plasma.
La cantidad de composición administrada
dependerá, obviamente, del sujeto a tratar, del peso del sujeto, de
la gravedad de la dolencia, de la manera de administración y del
criterio del facultativo que firma la receta.
Si se desea, las composiciones pueden presentarse
en un envase o en un dispositivo dispensador, por ejemplo un kit
aprobado por la FDA, que puede contener una o varias formas de
dosificación unitaria, que contengan el ingrediente activo. El
envase puede constar por ejemplo de una lámina de plástico o de
metal, por ejemplo un envase de tipo blíster. El envase o
dispositivo dispensador pueden acompañarse con la hoja de
instrucciones de administración. El envase o dispositivo dispensador
puede ir acompañado además de una hoja informativa pegada sobre el
recipiente en una forma prescrita por la agencia gubernativa que
regula la fabricación, uso y venta de productos farmacéuticos, dicho
hoja informativa deberá reflejar la aprobación de la agencia en la
forma de composiciones o de administración humana o veterinaria.
Dicha hoja informativa puede ser, por ejemplo, del tipo de una
etiqueta aprobada por la Foods and Drug Administration de EE.UU.
para la prescripción de fármacos o del tipo de folletín aprobado
adjunto al producto. Las composiciones que contienen un compuesto de
la invención formulado en un vehículo o excipiente farmacéuticamente
compatible pueden además fabricarse, colocarse en un recipiente
apropiado y etiquetarse para el tratamiento de una enfermedad
indicada. Las enfermedades apropiadas que se indican en la etiqueta
pueden incluir el tratamiento de un tumor, la inhibición de la
angiogénesis, el tratamiento de la fibrosis, de la diabetes y
similares.
Los compuestos de la invención así como los
2-oxindoles y aldehídos, que son productos previos
de síntesis, pueden obtenerse fácilmente empleando técnicas bien
conocidas de la química. Los expertos en la materia comprenderán
fácilmente que se dispone de otras vías de síntesis para generar
los compuestos de la invención y que las siguientes se facilitan
únicamente a título de ejemplo y no son limitantes.
Puede emplearse la siguiente metodología general
para obtener los compuestos de esta invención.
Se mezclan los 2-oxindoles
oportunamente sustituidos (1 equiv.), los aldehídos oportunamente
sustituidos (1,2 equiv.) y la piperidina (0,1 equiv.) con etanol
(1-2 ml/mmol de 2-oxindol) y después
se calienta la mezcla a 90ºC durante un período de 3 a 5 horas. Se
enfría la mezcla reaccionante, se concentra y se acidifica hasta pH
3. Se filtra el precipitado formado, se lava con agua hasta pH 7 y
después con etanol frío, acetato de etilo y/o hexano y se seca con
vacío, obteniéndose el compuesto deseado. Opcionalmente puede seguir
purificándose el producto por cromatografía.
Los aldehídos útiles para la síntesis de los
compuestos de esta invención pueden obtenerse por numerosos
procedimientos de síntesis, bien conocidos de los expertos en la
materia. Por ejemplo, se pueden aplicar los procedimientos descritos
en las siguientes publicaciones para obtener algunos de los
aldehídos de esta invención:
J. Med. Chem. 36(23),
3674-3685, 1993;
Chem. Commun. 393, 1966;
Chem. Heterocycl. Compd. (EN) 10,
50-52, 1974; y
J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1:EN,
1237-1243, 1974.
En la tabla 2 se recoge una lista de aldehídos
adicionales que pueden utilizarse para obtener los compuestos de
esta invención.
Se apreciará que, en cualquier serie determinada
de compuestos, se obtendrá un espectro de actividades biológicas. En
sus formas preferidas de ejecución, esta invención se refiere a
nuevas 2-indolinonas que poseen la capacidad de
modular la actividad de las RTK, CTK y STK. Los siguientes ensayos
se emplean para seleccionar aquellos compuestos que presentan la
actividad deseada en un grado óptimo.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Pueden utilizarse los siguientes ensayos "in
vitro" para determinar el nivel de actividad y el efecto de
los diferentes compuestos de la presente invención en una o varias
PK. Pueden diseñarse ensayos similares sobre la misma base para
cualquier PK, empleando métodos bien conocidos de la técnica.
Los ensayos celulares/catalíticos descritos se
efectúan en un formato ELISA. El procedimiento general es el
siguiente: se introduce un compuesto en células que expresan la
quinasa a ensayar, ya sea de forma natural o recombinante, durante
un cierto período de tiempo, después del cual, si la quinasa a
ensayar es un receptor, se añade un ligando conocido para activar el
receptor. Se lisan las células y se transfiere el material lisado a
los hoyos de una placa ELISA recubiertos previamente con un
anticuerpo específico que reconozca el sustrato de la reacción de
fosforilación enzimática. Se eliminan por lavado los componentes del
lisado celular que no pertenecen al sustrato y se detecta la
cantidad de fosforilación del sustrato con un anticuerpo que
reconozca específicamente la fosfotirosina y se compara con las
células de control que no se han puesto en contacto con el compuesto
ensayado.
Los ensayos celulares/biológicos descritos miden
la cantidad de DNA generado en respuesta a la actividad de la
quinasa a ensayar, lo cual es una medición general de la respuesta
proliferante. El procedimiento general de este ensayo es el
siguiente: se introduce un compuesto en células que expresan la
quinasa a ensayar, ya sea de modo natural o recombinante, durante un
cierto período de tiempo, después del cual, si la quinasa a ensayar
es un receptor, se añade un ligando conocido para activar el
receptor. Después de una incubación de por lo menos una noche se
añade un reactivo para marcar el DNA, por ejemplo la
bromodesoxi-uridina (BrdU) o la
3H-timidina. Se detecta la cantidad de DNA marcado
ya sea con anticuerpo anti-BrdU, ya sea midiendo la
radiactividad y se compara con las células de control que no se han
puesto en contacto con el compuesto ensayado.
Pueden utilizarse ensayos inmunosorbentes ligados
aenzimas (ELISA) para detectar y medir la presencia de la actividad
de las PK. El ensayo ELISA puede realizarse con arreglo a métodos ya
conocidos, descritos por ejemplo por Voller y col.,
"Enzyme-Linked Immunosorbent Assay", en Manual
of Clinical Immunology, 2ª edición, 1980, coordinado por Rose y
Friedman, pp. 359-371, Am. Soc. of Microbiology,
Washington, D.C.
El método descrito puede adaptarse para
determinar la actividad con respecto a una PK específica. Por
ejemplo, se facilitan seguidamente métodos preferidos para llevar a
cabo los ensayos ELISA de PK específicas. La adaptación de estos
métodos para determinar la actividad de un compuesto sobre otros
miembros de la familia de las RTK, así como de las CTK y de las STK,
es algo que puede abordarse con el acervo de conocimientos de los
expertos en la materia.
Se realiza un ensayo ELISA para medir la
actividad de la quinasa del receptor de la FLK-1 y,
de modo más específico, la inhibición o la activación de la
actividad de la TK en el receptor de la FLK-1. Se
realiza específicamente el siguiente ensayo para determinar la
actividad de quinasa del receptor de la FLK-1 en
células diseñadas genéticamente para expresar la
Flk-1.
Materiales. Se utilizan los siguientes reactivos
y materiales.
a. placas ELISA de 96 hoyos de Corning (Corning,
nº de catálogo: 25805-96);
b. IgG de cabra anti-conejo de
Cappel (nº de catálogo: 55641);
c. PBS (Gibco, nº de catálogo:
450-1300EB);
d. tampón TBSW (50 mM Tris (pH 7,2), 150 mM NaCl
y 0,1% de Tween-20);
e. etanolamina patrón (etanolamina del 10% (pH
7,0), almacenada a 4ºC);
f. tampón HNTG (20 mM tampón HEPES (pH 7,5), 150
mM NaCl, 0,2% de Triton X-100 y 10% de
glicerina);
g. EDTA (0,5 M (pH 7,0) en forma de patrón
100X);
h. ortovanadato sódico (0,5 M en forma de patrón
100X);
i. pirofosfato sódico (0,2 M, en forma de patrón
100X);
j. placas NUNC de polipropileno de 96 hoyos de
fondo V (Applied Scientific, nº de catálogo:
AS-72092);
k. células NIH3T3 C7#3 (células que expresan
FLK-1);
l. DMEM con L-glutamina 1X alta
en glucosa, nº de catálogo: 11965-050);
m. FBS, Gibco (nº de catálogo:
16000-028);
n. L-glutamina, Gibco (nº de
catálogo: 25030-016);
o. VEGF, PeproTech. Inc. (nº de catálogo:
100-20) (guardado como patrón 1 \mug/100 \mul en
H_{2}O destilada Milli-Q y almacenado a
-20ºC);
p. antisuero
anti-FLK-1 purificado por
afinidad;
q. anticuerpo monoclonal UB40, específico de la
fosfotirosina (ver Fendley y col., Cancer Research 50,
1550-1558, 1990);
r. IgG-POD de cabra
anti-ratón, calidad EIA (BioRad, nº de catálogo:
172-1011);
s. solución del ácido
2,2-azino-bis-(3-etilbenzo-tiazolina-6-sulfónico)
(ABTS) (100 mM ácido cítrico (anhidro), 250 mM Na_{2}HPO_{4}
(pH 4,0), 0,5 mg/ml de ABTS (Sigma, nº de catálogo:
A-1888)), esta solución debe guardarse en la
oscuridad a 4ºC, hasta el momento de su utilización;
t. H_{2}O_{2} (solución al 30%) (Fisher, nº
de catálogo: H325);
u. ABTS/H_{2}O_{2} (15 ml de solución de
ABTS, 2 \mul de H_{2}O_{2}) preparado 5 minutos antes del uso
y mantenido a temperatura ambiente;
v. HCl patrón, 0,2 M en H_{2}O;
w. sulfóxido de dimetilo (100%) (Sigma, nº de
catálogo: D-8418); e
y. tripsina-EDTA (Gibco BRL, nº
de catálogo: 25200-049).
Procedimiento. Se emplea el siguiente
procedimiento para realizar el ensayo:
1. Se recubren las placas ELISA de 96 hoyos de
Corning con 1,0 \mug por hoyo del anticuerpo IgG
anti-conejo de Cappel en 0,1 M Na_{2}CO_{3} de
pH 9,6. Se completa un volumen final de 150 \mul en cada hoyo. Se
recubren las placas a 4ºC durante una noche. Las placas pueden
guardarse por lo menos durante dos semanas, si se almacenan a
4ºC.
2. Se cultivan las células en medio de
crecimiento (DMEM, suplementado con 2,0 mM
L-glutamina, 10% de FBS) en platos de cultivo
apropiados, hasta que sean confluyentes a 37ºC, con un 5% de
CO_{2}.
3. Se recolectan las células por tripsinización y
se siembran en placas de poliestireno Corning 25850 de 96 hoyos de
fondo redondo, con 25.000 células/hoyo en 200 \mul de medio de
crecimiento.
4. Se cultivan las células por lo menos durante
un día a 37ºC, 5% de CO_{2}.
5. Se lavan las células con D-PBS
1X.
6. Se añaden 200 \mul/hoyo de medio de
desnutrición (DMEM, 2,0 mM L-glutamina, 0,1% de
FBS). Se incuba a 37ºC durante una noche, 5% de CO_{2}.
7. Se diluyen los compuestos 1:20 en placas de
polipropileno de 96 hoyos empleando medio de desnutrición. Se diluye
el sulfóxido de dimetilo 1:20 para utilizar en los hoyos de
control.
8. Se saca el medio de desnutrición de las placas
de cultivo celular de 96 hoyos y se añaden 162 \mul de medio de
desnutrición recién preparado a cada hoyo.
9. Se añaden 18 \mul de una dilución del
compuesto diluido 1:20 (de la etapa 7) a cada hoyo más la dilución
1:20 del sulfóxido de dimetilo a los hoyos de control (+/- VEGF),
hasta una dilución final de 1:200 después de la estimulación
celular. La concentración final del sulfóxido de dimetilo es del
0,5%. Se incuba la placa a 37ºC, 5% de CO_{2} durante dos
horas.
10. Se retira el anticuerpo no fijado de las
placas ELISA por inversión de la placa para sacar el líquido. Se
lava 3 veces con TBSW + 0,5% de etanolamina, pH 7,0. Se golpea
suavemente la placa sobre una servilleta de papel para eliminar el
exceso de líquido y las burbujas.
11. Se bloquean las placas con TBSW + 0,5% de
etanolamina, pH 7,0, 150 \mul por hoyo. Se incuba la placa durante
treinta minutos, al tiempo que se agita sobre un agitador de placas
de microvaloración.
12. Se lava la placa 3 veces del modo descrito en
la etapa 10.
13. Se añaden a cada hoyo 0,5 \mug de antisuero
de conejo policlonal anti-FLU-1
purificado por afinidad. Se ajusta el volumen final a 150
\mul/hoyo con TBSW + 0,5% de etanolamina, pH 7,0. Se incuba la
placa durante treinta minutos con agitación.
14. Se añaden 180 \mul de medio de desnutrición
a las células y se estimulan las células con 20 \mul/hoyo de una
solución 10,0 mM de ortovanato sódico y 500 ng/ml de VEGF
(resultando una concentración final de 1,0 mM de ortovanato sódico y
50 ng/ml de VEGF por hoyo) a 37ºC durante ocho minutos, 5% de
CO_{2}. Los hoyos de control negativo reciben únicamente el medio
de desnutrición.
15. Pasados ocho minutos se sacan los medios de
las células y se lavan una vez con 200 \mul/hoyo de PBS.
16. Se lisan las células en 150 \mul/hoyo de
HNTG con agitación a temperatura ambiente durante cinco minutos. La
formulación HNTG incluye el ortovanadato sódico, pirofosfato sódico
y EDTA.
17. Se lava la placa ELISA tres veces del modo
descrito en la etapa 10.
18. Se trasvasan los lisados celulares de la
placa de las células a la placa ELISA y se incuba con agitación
durante dos horas. Se trasvasa el lisado celular por pipeteo,
rascando los hoyos.
19. Se lava la placa tres veces del modo descrito
en la etapa 10.
20. Se incuba la placa ELISA con 0,02 \mug/hoyo
de UB40 en TBSW + 0,5% de etanolamina. Se ajusta el volumen final a
150 \mul/hoyo. Se incuba con agitación durante 30 minutos.
21. Se lava la placa tres veces del modo descrito
en la etapa 10.
22. Se incuba la placa ELISA con IgG de cabra
anti-ratón de tipo EIA, diluida 1:10.000, conjugada
con peroxidasa de rábano rusticano en TBSW + 0,5% de etanolamina, pH
7,0. Se ajusta el volumen final a 150 \mul/hoyo. Se incuba con
agitación durante treinta minutos.
23. Se lava la placa del modo descrito en la
etapa 10.
24. Se añaden 100 \mul de solución
ABTS/H_{2}O_{2} a cada hoyo. Se incuba durante diez minutos con
agitación.
25. Se añaden 100 \mul de HCl 0,2 M para lograr
una concentración final 0,1 M de HCl para interrumpir la reacción de
revelado de color. Se agita durante 1 minuto a temperatura
ambiente. Se eliminan las burbujas con una suave corriente de aire y
se lee la placa ELISA en un lector de placas ELISA a 410 nm.
Ensayo
1
Se determina la actividad de la
HER2-quinasa en células EGFR-NIH3T3
completas del modo siguiente:
Materiales y reactivos. Se utilizan los
siguientes materiales y reactivos para efectuar el ensayo:
a. EGF: concentración patrón: 16,5 ILM; EGF 201,
TOYOBO Co. Ltd., Japón.
b. 05-101 (UBI) (un anticuerpo
monoclonal que reconoce un dominio extracelular del EGFR).
c. anticuerpo anti-fosfotirosina
(anti-Ptyr) (policlonal) (véase Fendley y col., ya
citado).
d. anticuerpo de detección: IgG de cabra
anti-conejo conjugado con peroxidasa de rábano
rusticano, TAGO Inc., Burlingame, CA.
e. tampón TBST:
| Tris-HCl, pH 7,2 | 50 mM |
| NaCl | 150 mM |
| Triton X-100 | 0,1 |
f. HNTG 5X patrón:
| HEPES | 0,1 M |
| NaCl | 0,75 M |
| glicerina | 50% |
| Triton X-100 | 1,0% |
g. ABTS patrón:
| ácido cítrico | 100 mM |
| Na_{2}HPO_{4} | 250 mM |
| HCl conc. | 0,5 pM |
| ABTS* | 0,5 mg/ml |
| * (2,2'-azinobis(ácido 3-etilbenzotiazolinasulfónico)). |
Se mantiene la solución en la oscuridad a 4ºC
hasta el momento del uso.
h. Reactivos patrón de:
EDTA 100 mM, pH 7,0
Na_{3}VO_{4} 0,5 M
Na_{4}(P_{2}O_{7}) 0,2 M
Procedimiento. Se aplica el procedimiento
siguiente:
1. Se recubren placas ELISA (Corning, 96 hoyos,
nº de catálogo: 25805-96) con el anticuerpo
05-101 a razón de 0,5 g por hoyo en PBS, volumen
final/hoyo: 100 \mul, y se almacena a 4ºC durante una noche. Las
placas recubiertas son buenas durante 10 días, si se mantienen
guardadas a 4ºC.
\newpage
2. El día de su utilización se quita el tampón de
recubrimiento y se sustituye por 100 \mul de tampón de bloqueo
(leche desnatada en polvo Carnation Instant al 5% en PBS). Se incuba
la placa, se agita a temperatura ambiente(entre 23 y 25ºC)
durante 30 minutos. Inmediatamente antes del uso se quita el tampón
de bloqueo y se lava la placa 4 veces con tampón TBST.
1. Para este ensayo puede utilizarse la línea
celular NIH3T3 que sobreexpresa un receptor quimérico que contiene
el dominio extracelular EGFR y el dominio intracelular de la
HER2-quinasa.
2. Para el ensayo se eligen platos que tengan una
confluencia del 80-90%. Se tripsinizan las células y
se interrumpe la reacción añadiendo un 10% de suero fetal bovino. Se
suspenden las células en medio DMEM (CS al 10% en medio DMEM) y se
centrifuga una vez a 1500 rpm a temperatura ambiente durante 5
minutos.
3. Se resuspenden las células en el medio de
siembra (DMEM, al 0,5% en suero bovino) y se cuentan las células
empleando azul tripano. La viabilidad superior al 90% es aceptable.
Se siembran las células en medio DMEM (0,5% en suero bovino) en una
densidad de 10.000 células por hoyo, 100 \mul por hoyo, en una
placa de microvaloración de 96 hoyos. Se incuban las células en un
5% de CO_{2} a 37ºC durante 40 horas.
1. Se examina con un microscopio invertido si las
células sembradas están contaminadas. Se diluye el fármaco patrón
(10 mg/ml en DMSO) 1:10 en medio DMEM, después se transfieren 5
\mul a un hoyo TBST hasta una dilución final de fármaco 1:200 y
una concentración final de DMSO del 1%. En los hoyos de control se
introduce únicamente DMSO. Se incuba en un 5% de CO_{2} a 37ºC
durante dos horas.
2. Se prepara el ligando EGF: se diluye el EGF
patrón en DMEM de tal manera que después se trasvasar 10 \mul de
EGF diluido (dilución 1:12) se logre una concentración final de 100
nM.
3. Se prepara HNTG* fresco suficiente para 100
\mul por hoyo y se coloca sobre hielo.
| HNTG* (10 ml): | |
| HNTG patrón | 2,0 ml |
| H_{2}O milli-Q | 7,3 ml |
| EDTA, 100 mM, pH 7,0 | 0,5 ml |
| Na_{3}VO_{4}, 0,5 M | 0,1 ml |
| Na_{4}(P_{2}O_{7}), 0,2 M | 0,1 ml |
4. Pasados 120 minutos de incubación con el
fármaco se añade el ligando SGF preparado a las células, 10 \mul
por hoyo, hasta una concentración final de 100 nM. En los hoyos de
control se introduce únicamente el DMEM. Se incuba con agitación a
temperatura ambiente durante 5 minutos.
5. Se eliminan el fármaco, el EGF y el DMEM. Se
lavan las células dos veces con PBS. Se transfiere el HNTG* a las
células, 100 \mul por hoyo. Se coloca sobre hielo durante 5
minutos. A continuación se elimina el tampón de bloqueo de otra
placa ELISA y se lava con TBST del modo descrito antes.
6. Con una pipeta, fijada con seguridad a un
aparato de micropipeteo, se rascan las células de la placa y se
homogeneíza el material celular aspirando repetidamente y
dispensando el tampón de lisis HNTG*. Se transfiere el lisado a una
placa ELISA recubierta, bloqueada y lavada. Se incuba a temperatura
ambiente con agitación durante una
hora.
hora.
7. Se retira el lisado y se lava 4 veces con
TBST. Se transfiere el anticuerpo anti-Ptyr recién
diluido a una placa ELISA a razón de 100 \mul por hoyo. Se incuba
a temperatura ambiente con agitación durante 30 minutos en presencia
del antisuero anti-Ptyr (dilución 1:3000 en
TBST).
8. Se quita el anticuerpo
anti-Ptyr y se lava 4 veces con TBST. Se transfiere
el anticuerpo IgG anti-conejo TAGO recién diluido a
la placa ELISA a razón de 100 \mul por hoyo. Se incuba a
temperatura ambiente con agitación durante 30 minutos (dilución
1:3000 del anticuerpo IgG anti-conejo en TBST).
9. Se elimina el anticuerpo de detección TAGO y
se lava 4 veces con TBST. Se transfiere la solución de
ABTS/H_{2}O_{2} recién preparada a la placa ELISA, 100 \mul
por hoyo. Se incuba con agitación a temperatura ambiente durante 20
minutos (solución de ABST/H_{2}O_{2}: 1,0 \mul de
H_{2}O_{2} del 30% en 10 ml de ABTS patrón).
10. Se interrumpe la reacción añadiendo 50 \mul
de H_{2}SO_{4} 5N (opcional) y se determina la densidad óptica
(O.D.)a 410 nm.
11. Se determina la señal de fosfotirosina máxima
restando el valor de los controles negativos de los controles
positivos. A continuación se calcula la inhibición porcentual del
contenido en fosfotirosina de los hoyos que contienen extractos,
después de haber restado los controles negativos.
Todos los medios de cultivo celular, la glutamina
y el suero fetal bovino se adquieren en Gibco Life Technologies
(Grand Island, NY), a menos que se indique lo contrario. Todas las
células se cultivan en atmósfera húmeda con un
90-95% de aire y un 5-10% de
CO_{2} a 37ºC. Todas las líneas celulares se subcultivan de forma
rutinaria dos veces por semana y son negativas en micoplasma, según
las determinaciones realizadas por el método Mycotect (Gibco).
Para los ensayos ELISA se cultivan células
(U1242, obtenidas de Joseph Schlessinger, NYU) hasta una confluencia
del 80-90% en medio de crecimiento (MEM con un 10%
de FBS, NEAA, 1 mM NaPyr y 2 mM GLN) y se siembran en placas de
cultivo de tejido de 96 hoyos en un 0,5% de suero, a razón de 25.000
a 30.000 células por hoyo. Después de una noche de incubación en un
medio que contiene un 0,5% de suero se cambian las células a un
medio exento de suero y se tratan con el compuesto a ensayar en un
incubador a 37ºC durante 2 h en un 5% de CO_{2}. A continuación se
estimulan las células con ligando durante 5-10
minutos y después se lisan con HNTG (20 mM Hepes, 150 mM NaCl, 10%
de glicerina, 5 mM EDTA, 5 mM Na_{3}VO_{4}, 0,2% de Triton
X-100 y 2 mM NaPyr). Se transfieren los lisados
celulares (0,5 mg/hoyo en PBS) a placas ELISA que se han recubierto
previamente con un anticuerpo específico de receptor y que se han
bloqueado con un 5% de leche en TBST (50 mM
Tris-HCl, pH 7,2, 150 mM NaCl y 0,1% de Triton
X-100) a temperatura ambiente durante 30 min. Se
incuban los lisados a temperatura ambiente con agitación durante 1
hora. Se lavan las placas con TBST cuatro veces y después se incuban
con anticuerpo policlonal anti-fosfotirosina a
temperatura ambiente durante 30 minutos. Se elimina el exceso de
anticuerpo anti-fosfotirosina enjuagando la placa
con TBST cuatro veces. Se añade el anticuerpo IgG de cabra
anti-conejo a la placa ELISA a temperatura ambiente
durante 30 min y después se enjuaga con TBST cuatro veces más. Se
añade a las placas ELISA el ABTS (100 mM ácido cítrico, 250 mM
Na_{2}HPO_{4} y 0,5 mg/ml de
2,2'-azino-bis(ácido
3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico))
más H_{2}O_{2} (1,2 ml de H_{2}O_{2} del 30% a 10 ml de
ABTS) para iniciar el revelado del color. Pasados de 15 a 30 min de
la adición del ABTS se registra la absorbancia a 410 nm con una
longitud de onda de referencia de 630 nm.
Puede utilizarse el siguiente procedimiento para
medir el nivel de fosfotirosina en el receptor
IGF-I, que indica la actividad de
tirosina-quinasa del receptor
IGF-I.
Materiales y reactivos. Se utilizan los
siguientes materiales y reactivos:
a. La línea celular que se utiliza en este ensayo
es la 3T3/IGF-1R, una línea celular de ingeniería
genética que sobreexpresa el receptor IGF-1.
b. Se cultiva la NIH3T3/IGF-1R en
un incubador a 37ºC con un 5% de CO_{2}. El medio de crecimiento
es DMEM + 10% de FBS (inactivado con calor) + 2 mM
L-glutamina.
c. Anticuerpo 17-69
anti-IGF-1R purificado por
afinidad
d. D-PBS:
| KH_{2}PO_{4} | 0,20 g/l |
| K_{2}HPO_{4} | 2,16 g/l |
| KCl | 0,20 g/l |
| NaCl | 8,00 g/l (pH 7,2) |
e. Tampón de bloqueo: TBST más un 5% de leche
(leche desnatada en polvo Carnation Instant).
f. Tampón TBST:
| Tris-HCl | 50 mM |
| NaCl | 150 mM (pH 7,2/HCl 10N) |
| Triton X-100 | 0,1% |
Se prepara una solución patrón de TBS (10X) y se
añade Triton X-100 al tampón durante la
dilución.
g. Tampón HNTG:
| HEPES | 20 mM |
| NaCl | 150 mM (pH 7,2/HCl 1N) |
| glicerina | 10% |
| Triton X-100 | 0,2% |
Se prepara la solución patrón (5X) y se mantiene
a 4ºC.
h. EDTA/HCl: 0,5 M, pH 7,0 (NaOH) en forma de
patrón 100X.
i. Na_{3}VO_{4}: 0,5 M en forma de patrón
100X y partes alícuotas se guardan a -80ºC.
j. Na_{4}P_{2}O_{7}: 0,2 M en forma de
patrón 100X.
k. Factor de crecimiento 1, similar a la
insulina, de Promega (nº de catálogo: G5111).
l. Antisuero policlonal
anti-fosfotirosina de conejo.
m. IgG de cabra anti-conejo,
conjugado con POD(anticuerpo de detección), Tago (nº de cat.
4520, lote nº 1802): Tago Inc., Burlingame, CA.
n. Solución de ABTS
(2,2'-azinobis(ácido
3-etilbenzotizolinasulfónico)):
| ácido cítrico | 100 mM |
| Na_{2}HPO_{4} | 250 mM (pH 4,0/HCl 1N) |
| ABTS | 0,5 mg/ml |
Se guarda la solución de ABTS en la oscuridad a
4ºC. La solución tiene que desecharse si vira al verde.
o. Peróxido de hidrógeno: solución al 30% que se
guarda en la oscuridad a 4ºC.
Procedimiento. Todos los pasos que siguen se
realizan a temperatura ambiente, a menos que se indique expresamente
lo contrario. Todos los lavados de la placa ELISA se efectúan por
enjuague de la placa con agua del grifo tres veces y después un
enjuague con TBST. Se seca la placa golpeándola suavemente sobre
servilletas de papel.
1. Las células, que se han cultivado en platos de
cultivo de tejido (Corning 25020-100) hasta una
confluencia del 80-90%, se recolectan con
tripsina-EDTA (0,25%, 0,5 ml/D-100,
GIBCO).
2. Se resuspenden las células en DMEM + 10% de
FBS + 2 mM L-glutamina fresco y se transfieren a
placa de cultivo de tejido de 96 hoyos (Corning,
25806-96) a razón de 20.000 células/hoyo (100
\mul/hoyo). Se incuba durante 1 día y después se sustituye el
medio por un medio exento de suero (90/\mul) y se incuba a 37ºC
durante una noche con un 5% de CO_{2}.
1. Se recubre la placa ELISA (Corning
25805-96) con anticuerpo
anti-IGF-1R a razón de 0,5
\mug/hoyo en 100 \mul de PBS por lo menos durante 2 horas.
2. Se quita la solución de recubrimiento y se
sustituye por 100 \mul de tampón de bloqueo y se agita durante 30
minutos. Se retira el tampón de bloqueo y se lava la placa
inmediatamente antes de añadir el lisado.
1. Se ensayan los fármacos en un estado libre de
suero.
2. Se diluye el fármaco patrón (en DMSO del 100%)
en proporción 1:10 con DMEM en una placa de polipropileno de 96
hoyos y se transfieren 10 \mul/hoyo de esta solución a las células
para lograr una dilución final del fármaco de 1:100 y una
concentración final de DMSO del 1,0%. Se incuban las células a 37ºC
durante 2 horas en un 5% de CO_{2}.
3. Se prepara un tampón de lisis celular fresco
(HNTG*)
| HNTG | 2 ml |
| EDTA | 0,1 ml |
| Na_{3}VO_{4} | 0,1 ml |
| Na_{4}(P_{2}O_{7}) | 0,1 ml |
| H_{2}O | 7,3 ml |
4. Después de dos horas de incubación del fármaco
se transfieren 10 \mul/hoyo de ligando IGF-1 200
nM en PBS a las células (concentración final = 20 nM) y se incuba a
37ºC durante 10 minutos con un 5% de CO_{2}.
5. Se quitan los medios y se añaden 100
\mul/hoyo de HNTG* y se agita durante 10 minutos. Se observan las
células con el microscopio para ver si están lisadas
adecuadamente.
6. Se utiliza una pipeta de 12 canales para
rascar las células de la placa y se homogeneíza el lisado por
aspiración repetida y dispensado. Se transfieren todos los lisados a
la placa ELISA recubierta con anticuerpo y se agita durante 1
hora.
7. Se quita el lisado, se lava la placa, se
transfiere el anti-pTyr (1:3.000 en TBST) 100
\mul/hoyo y se agita durante 30 minutos.
8. Se quita el anti-pTyr, se lava
la placa, se transfiere el TAGO (1:3.000 con TBST) 100 \mul/hoyo y
se agita durante 30 minutos.
9. Se quita el anticuerpo de detección, se lava
la placa y se transfiere ABTS/H_{2}O_{2} fresco (1,2 \mul de
H_{2}O_{2} sobre 10 ml de ABTS) 100 \mul/hoyo a la placa para
iniciar el revelado del color.
10. Se mide la O.D. a 410 nm con una longitud de
onda de referencia de 630 nm con un aparato Dynatec MR5000.
Se determina la actividad de quinasa del receptor
EGF en células de ingeniería genética para expresar el
EGF-Rhumano del modo descrito a continuación:
Materiales y reactivos. Se emplean los siguientes
materiales y reactivos.
a. Ligando EGF: concentración patrón = 16,5
\muM; EGF 201, TOYOBO Co. Ltd., Japón.
b. Anticuerpo 05-101 (UBI) (un
anticuerpo monoclonal que reconoce un dominio extracelular del
EGFR).
c. Anticuerpo anti-fosfotirosina
(anti-Ptyr) (policlonal).
d. Anticuerpo de detección: IgG de cabra
anti-conejo, conjugado con peroxidasa de rábano
rusticano, TAGO Inc., Burlingame, CA.
e. Tampón TBST:
| Tris-HCl, pH 7 | 50 mM |
| NaCl | 150 mM |
| Triton X-100 | 0,1 |
f. Patrón 5X de HNTG:
| HEPES | 0,1 M |
| NaCl | 0,75 M |
| glicerina | 50 |
| Triton X-100 | 1,0% |
g. Patrón de ABTS:
| ácido cítrico | 100 mM |
| Na_{2}HPO_{4} | 250 mM |
| HCl conc. | pH 4,0 |
| ABTS* | 0,5 mg/ml |
Se mantiene la solución a 4ºC en la oscuridad
hasta el momento de utilizarla.
h. Reactivos patrón de:
| EDTA | 100 mM, pH 7,0 |
| Na_{3}VO_{4} | 0,5 M |
| Na_{4}(P_{2}O_{7}) | 0,2 M |
Procedimiento. Se utiliza el procedimiento
siguiente.
1. Se recubren placas ELISA (Corning, 96 hoyos,
nº de catálogo: 25805-96) con el anticuerpo
05-101 a razón de 0,5 \mug por hoyo en PBS,
volumen final/hoyo: 150 \mul, y se almacena a 4ºC durante una
noche. Las placas recubiertas son buenas durante 10 días, si se
mantienen guardadas a 4ºC.
2. El día de su utilización se quita el tampón de
recubrimiento y se sustituye por tampón de bloqueo (leche desnatada
en polvo Carnation Instant al 5% en PBS). Se incuba la placa, se
agita a temperatura ambiente (entre 23 y 25ºC) durante 30 minutos.
Inmediatamente antes del uso se quita el tampón de bloqueo y se lava
la placa 4 veces con tampón TBST.
1. Para este ensayo puede utilizarse la línea
celular NIH 3T3/C7 (Honegger y col., Cell 51,
199-209, 1987).
2. Se eligen para el ensayo los platos que tengan
una confluencia del 80-90%. Se tripsinizan las
células y se interrumpe la reacción añadiendo un 10% de CS en medio
DMEM. Se suspenden las células en medio DMEM (CS al 10% en medio
DMEM) y se centrifuga una vez a 1000 rpm a temperatura ambiente
durante 5 minutos.
3. Se resuspenden las células en medio de siembra
(DMEM, al 0,5% en suero bovino) y se cuentan las células empleando
azul tripano. Es aceptable una viabilidad superior al 90%. Se
siembran las células en medio DMEM (al 0,5% en suero bovino) con una
densidad de 10.000 células por hoyo, 100 \mul por hoyo, en una
placa de microvaloración de 96 hoyos. Se incuban las células
sembradas en un 5% de CO_{2} a 37ºC durante unas 40 horas.
1. Se comprueba si las células sembradas están
contaminadas empleando un microscopio invertido. Se diluye el
fármaco patrón (10 mg/ml en DMSO) 1:10 en medio DMEM, después se
transfieren 5 \mul al hoyo de ensayo para una dilución final del
fármaco de 1:200 y una concentración final de DMSO del 1%. En los
hoyos se control se introduce únicamente DMSO. Se incuba a 37ºC con
un 5% de CO_{2} durante una hora.
2. Se prepara el ligando EGF: se diluye el EGF
patrón en DMEM de tal manera que después de transferir 10 \mul de
EGF diluido (dilución 1:12) se logre una concentración final de 25
nM.
3. Se preparan 10 ml de HNTG* fresco, suficientes
para 100 \mul por hoyo, dicho HNTG* consta de: HNTG patrón (2,0
ml), H_{2}O milli-Q (7,3 ml), EDTA 100 mM, pH 7,0
(0,5 ml), Na_{3}VO_{4} 0,5 M (0,1 ml) y
Na_{4}(P_{2}O_{7}) 0,2 M (0,1 ml).
4. Se coloca sobre hielo.
5. Después de una incubación de dos horas con el
fármaco se añade el ligando EGF preparado a las células, 10 \mul
por hoyo, para obtener una concentración final de 25 nM. En los
hoyos de control se deposita únicamente DMEM. Se incuba a
temperatura ambiente con agitación durante 5 minutos.
6. Se elimina el fármaco, el EGF y el DMEM. Se
lavan las células dos veces con PBS. Se transfiere el HNTG* a las
células, 100 \mul por hoyo. Se coloca sobre hielo durante 5
minutos. A continuación se elimina el tampón de bloqueo de otra
placa ELISA y se lava con TBST del modo descrito antes.
7. Con una pipeta fijada con seguridad a un
aparato de micropipeteo se rascan las células de la placa y se
homogeneíza el material celular por aspiración repetida y
dispensado del tampón de lisis HNTG*. Se transfiere el lisado a una
placa ELISA recubierta, bloqueada y lavada. Se incuba a temperatura
ambiente con agitación durante una hora.
8. Se quita el lisado y se lava 4 veces con TBST.
Se transfiere el anticuerpo anti-Ptyr recién diluido
a la placa ELISA, a razón de 100 \mul por hoyo. Se incuba con
agitación a temperatura ambiente durante 30 minutos en presencia del
suero anti-Ptyr (dilución 1:3000 en TBST).
9. Se saca el anticuerpo
anti-Ptyr y se lava 4 veces con TBST. Se transfiere
el anticuerpo IgG anti-conejo recién diluido con
TAGO 30 a la placa ELISA a razón de 100 \mul por hoyo. Se incuba a
temperatura ambiente con agitación durante 30 minutos (anticuerpo
IgG anti-conejo, dilución 1:3000 en TBST).
10. Se saca el anticuerpo de detección y se lava
4 veces con TBST. Se transfiere la solución ABTS/H_{2}O_{2}
recién preparada a la placa ELISA, 100 \mul por hoyo. Se incuba a
temperatura ambiente durante 20 minutos. Solución
ABTS/H_{2}O_{2}: 1,2 \mul de H_{2}O_{2} del 30% en 10 ml
de ABTS patrón.
11. Se interrumpe la reacción añadiendo 50 \mul
de H_{2}SO_{4} 5N (opcional) y se determina la O.D. a 410
nm.
12. Se determina la señal máxima de fosfotirosina
restando el valor de los controles negativos del de los controles
positivos. A continuación se calcula la inhibición porcentual del
contenido de fosfotirosina de los hoyos que contienen extracto,
después de la sustracción de los controles negativos.
Con este ensayo se determina la actividad de
Met-tirosina-quinasa analizando los
niveles de tirosina-quinasa de la proteína Met en el
receptor Met.
a. HNTG (solución patrón 5X): se disuelven 23,83
g de HEPES y 43,83 g de NaCl en unos 350 ml de H_{2}O destilada.
Se ajusta el pH a 7,2 con HCl o NaOH, se añaden 500 ml de glicerina
y 10 ml de Triton X-100, se mezclan, se añade
H_{2}O destilada hasta un volumen total de 1 l. Para preparar 1 l
de solución de trabajo 1X se añaden 200 ml de solución patrón 5X a
800 ml de H_{2}O destilada, se comprueba el pH y se ajusta si
fuera necesario y se almacena a
4ºC.
4ºC.
b. PBS (solución salina tamponada con fosfato de
Dulbecco), Gibco, nº de catálogo: 450-1300EG
(solución 1X).
c. Tampón de bloqueo: se cargan sobre 500 ml de
H_{2}O destilada 100 g de BSA, 12,1 g de Tris, pH 7,5, 58,44 g de
NaCl y 10 ml de Tween-20, se diluye hasta un volumen
total de 1 l.
d. Tampón de quinasa: a 500 ml de H_{2}O
destilada se le añaden 12,1 g de TRIS, pH 7,2, 58,4 g de NaCl, 40,7
g de MgCl_{2} y 1,9 g de EGTA; se completa hasta un volumen total
de 1 l con H_{2}O destilada.
e. PMSF (fluoruro de fenilmetilsulfonilo), Sigma,
nº de catálogo: P-7626; a 435,5 mg se le añade
etanol del 100% hasta un volumen total de 25 ml; vortex.
f. ATP (fuente bacteriana), Sigma, nº de
catálogo: A-7699; se guarda el polvo a -20ºC; para
preparar la solución lista para el uso se disuelven 3,31 mg en 1 ml
de H_{2}O dest.
g. Anti-fosfotirosina conjugada
con RC-20H HRPO, de Transduction Laboratories, nº de
catálogo: E120H.
h. Turbo TMB (TM) para ELISA de 1 paso
(3,3',5,5'-tetrametilbencidina), de Pierce, nº de
catálogo: 34022.
i. H_{2}SO_{4}, se añade 1 ml del ácido conc.
(18N) a 35 ml de H_{2}O dest.
j. TRIS-HCl, Fischer, nº de
catálogo: BP152-5; a 121,14 g del material se le
añaden 600 ml de H_{2}O Milli-Q, se ajusta el pH a
7,5 (ó 7,2) con HCl, se completa un volumen a 1 l añadiendo H_{2}O
Milli-Q.
k. NaCl, Fischer, nº de catálogo:
S271-10; se prepara una solución 5M.
l. Tween-20, Fischer, nº de
catálogo: S337-500.
m. Na_{3}VO_{4}, Fischer, nº de catálogo:
S454-50; a 1,8 g de material se le añaden 80 ml de
H_{2}O Milli-Q, se ajusta el pH a 10,0 con HCl o
NaOH, se hierve en microondas, se enfría, se comprueba el pH, se
repite el procedimiento hasta que el pH sea estable e igual a 10,0,
se añade H_{2}O Milli-Q hasta un volumen total de
100 ml, se divide en partes alícuotas de 1 ml y se almacena a
-80ºC.
n. MgCl_{2}, Fischer, nº de catálogo:
M33-500; se prepara una solución 1M.
o. HEPES, Fischer, nº de catálogo:
BP310-500; a 200 ml de H_{2}O
Milli-Q se le añaden 59,6 g de material, se ajusta
el pH a 7,5, se completa el volumen hasta un total de 250 ml, se
filtra en condiciones estériles.
p. Albúmina bovina (BSA), Sigma, nº de catálogo:
A-4503; a 30 gramos de material se le añade agua
destilada estéril para completar un volumen total de 300 ml, se
almacena a 4ºC.
q. Tampón TBST: a aprox. 900 ml de H_{2}O dest.
en una probeta graduada de 1 l se les añaden 6,057 g de TRIS y 8,766
g de NaCl, una vez disueltos, se ajusta el pH a 7,2 con HCl, se
añade 1,0 ml de Triton X-100 y se completa hasta un
volumen total de 1 l con H_{2}O dest.
r. IgG de cabra anti-conejo
purificado por afinidad (molécula completa), Cappel, nº de catálogo:
55641.
s. Anticuerpo IgG policlonal de conejo
anti-h-Met (C-28),
Santa Cruz Chemical, nº de catálogo: SC-161.
t. Células quiméricas EGFR/Met transfectadas
transitoriamente (EMR), (Komada y col., Oncogene 8,
2381-2390, 1993).
u. Tampón de carbonato sódico, Na_{2}CO_{3},
Fischer, nº de catálogo: S495); a 10,6 g de material se les añaden
800 ml de H_{2}O Milli-Q, una vez disueltos se
ajusta el pH a 9,6 con NaOH, se completa un volumen total de 1 l con
H_{2}O Milli-Q, se filtra y se almacena a 4ºC.
Todas las etapas que siguen se llevan a cabo a
temperatura ambiente, a menos que se indique explícitamente lo
contrario. Todos los lavados de las placas ELISA se realizan por
enjuague 4x con TBST.
Este procedimiento puede llevarse a cabo la noche
anterior o inmediatamente antes de iniciar la captura del
receptor.
1. Se descongelan rápidamente los lisados en un
baño de agua a 37ºC con una agitación de remolino hasta que
desaparezcan los últimos cristales.
2. Se lisan los perdigones celulares con HNTG 1x
que contiene PMSF 1 mM. Se utilizan 3 ml de HNTG por cada plata de
15 cm de células. Se añade 1/2 del volumen de HNTG calculado, se
trata el tubo en el vortex durante 1 min, se añade la cantidad
restante de HNTG, se trata en el vortex durante otro min.
3. Se equilibran los tubos, se centrifugan a
10.000 rpm durante 10 min a 4ºC.
4. Se reúnen los líquidos sobrenadantes, se
retira una parte alícuota para la determinación de la proteína.
5. Se congela rápidamente la muestra recogida en
un baño de hielo seco/etanol. Esta etapa se realiza con
independencia de si el lisado se va a almacenar durante una noche o
bien se va a utilizar inmediatamente después de la determinación de
la proteína.
6. Se efectúa la determinación de la proteína
empleando el método estándar del ácido bicinconínico (BCA) (kit de
reactivo para el ensayo BCA, de Pierce Chemical, nº de catálogo:
23225).
1. Se recubren las placas ELISA de 96 hoyos de
Corning con 5 \mug de anticuerpo de cabra
anti-conejo por hoyo en tampón carbonato, llenando
un volumen total de 50 \mul del hoyo. Se almacena durante una
noche a 4ºC.
2. Se quita el anticuerpo de cabra
anti-conejo no fijado invirtiendo la placa para
vaciar el líquido.
3. Se añaden 150 \mul de tampón de bloqueo a
cada hoyo. Se incuba a temperatura ambiente con agitación durante 30
min.
4. Se lava 4X con TBST. Se sacude ligeramente la
placa sobre servilletas de papel para eliminar el exceso de líquido
y las burbujas.
5. Se añade 1 \mug de anticuerpo de conejo
anti-Met por hoyo, diluido en TBST, hasta completar
un volumen total de 100 \mul.
6. Se diluye el lisado en HNTG (90 \mug de
lisado/100 \mul).
7. Se añaden 100 \mul de lisado diluido a cada
hoyo. Se agita a temperatura ambiente durante 60 min.
8. Se lava 4X con TBST. Se sacude ligeramente
sobre servilletas de papel para eliminar el exceso de líquido y las
burbujas.
9. Se añaden 50 \mul del tampón de lisado 1X
por hoyo.
10. Se diluyen los compuestos/extractos 1:10 en
tampón quinasa 1X en una placa de polipropileno de 96 hoyos.
11. Se transfieren 5,5 \mul del fármaco diluido
a los hoyos de la placa ELISA. Se incuba a temperatura ambiente con
agitación durante 20 min.
12. Se añaden 5,5 \mul de la solución 60 \muM
de ATP por hoyo. No se introduce ATP en los controles negativos. Se
incuba a temperatura ambiente con agitación durante 90 min.
13. Se lava 4X con TBST. Se golpea suavemente la
placa sobre servilletas de papel para eliminar el exceso de líquido
y las burbujas.
\newpage
14. Se añaden 100 \mul de RC20 por hoyo
(dilución 1:3000 en tampón de bloqueo). Se incuba a temperatura
ambiente con agitación durante 30 min.
15. Se lava 4X con TBST. Se golpea suavemente la
placa sobre servilletas de papel para eliminar el exceso de líquido
y las burbujas.
16. Se añaden 100 \mul de
Turbo-TMB por hoyo. Se incuba con agitación durante
30-60 min.
17. Se añaden 100 \mul de H_{2}SO_{4} 1M
por hoyo para interrumpir la reacción.
18. Se lee el resultado del ensayo en un lector
ELISA Dynatech MR7000. Filtro de ensayo = 450 nm, filtro de
referencia = 410 nm.
Se realiza este ensayo para determinar la
actividad de la proteína-quinasa src midiendo la
fosforilación de un péptido biotinilado como resultado.
a. Levadura transformada con src, de Courtneidge
Laboratory (Sugen, Inc., Redwood City, California).
b. Lisados celulares: se convierten en perdigones
las células de levaduras que expresan src, se lavan una vez con
agua, se vuelven a formar perdigones y se almacenan a -80ºC hasta el
momento de su utilización.
c. Se prepara el EEEYEEYEEEYEEEYEEEY biotinilado
en el extremo N por procedimientos estándar bien conocidos por los
expertos en la materia.
d. DMSO: Sigma, St. Louis, MO.
e. Placa ELISA de 96 hoyos: Corning 96 Well Easy
Wash, placa modificada de fondo plano, Corning, nº de catálogo:
25805-96. f. Placas de polipropileno de fondo en V
de 96 hoyos NUNC, para diluir los compuestos, de Applied Scientific,
nº de catálogo: A-72092.
g. Reactivo Vectastain ELITE ABC: Vector,
Burlingame, Ca.
h. Anticuerpo monoclonal (= mab)
anti-src (327): para expresar el Src recombinante
se utiliza el Schizosaccharomyces pombe
(Superti-Furga y col., EMBO J. 12,
2625-2634; Superti-Furga y col.,
Nature Biochem. 14, 600-605). Se cultiva la
cepa S. pombe SP200 (h-s leul.32 ura4
ade210) del modo descrito y se realizan las transformaciones con
plásmidos de expresión pRSP por el método del acetato de litio
(Superti-Furga, ya citado). Se cultivan las células
en presencia de tiamina 1 \muM para reprimir la expresión del
promotor nmtl o en ausencia de tiamina para inducir la
expresión.
i. Anticuerpo monoclonal
anti-fosfotirosina, UBI 05-321 (en
su lugar puede utilizarse el UB40).
j. Sustrato
Turbo-TMB-peroxidasa para ELISA:
Pierce Chemical.
a. PBS (solución salina tamponada con fosfato de
Dulbecco), GIBCO PBS, GIBCO, nº de catálogo:
450-1300EB.
b. Tampón de bloqueo: leche desnatada (Carnation)
al 5% en PBS.
c. Tampón carbonato: Na_{2}CO_{3} de Fischer,
nº de catálogo: S495; se prepara una solución patrón 100 mM.
d. Tampón de quinasa: 1,0 ml (de una solución
patrón 1M) de MgCl_{2}; 0,2 ml (de una solución patrón 1M) de
MnCl_{2}; 0,2 ml (de una solución patrón 1M) de DTT; 5,0 ml (de
una solución patrón 1M) de HEPES; 0,1 ml de TX-100;
se completa un volumen total de 10 ml con H_{2}O
Milli-Q.
e. Tampón de lisis: 5,0 HEPES (de una solución
patrón 1M); 2,74 ml de NaCl (de una solución patrón 5M); 10 ml de
glicerina; 1,0 ml de TX-100; 0,4 ml de EDTA (de una
solución patrón 100 mM); 1,0 ml de PMSF (de una solución patrón 100
mM); 0,1 ml de Na_{3}VO_{4} (de una solución patrón 0,1 M); se
completa un volumen total de 100 ml con H_{2}O
Milli-Q.
f. ATP: Sigma, nº de catálogo:
A-7699; se prepara una solución patrón 10 mM (5,51
mg/ml).
g. TRIS-HCl: Fischer, nº de
catálogo: BP 152-5; a 600 ml de H_{2}O
Milli-Q se les añaden 121,14 g de material, se
ajusta el pH a 7,5 con HCl, se completa hasta un volumen total de 1
l con H_{2}O Milli-Q.
h. NaCl, Fischer, nº de catálogo:
S271-10, se prepara una solución patrón 5M con
H_{2}O Milli-Q.
i. Na_{3}VO_{4}, Fischer, nº de catálogo:
S454-50; a 80 ml de H_{2}O Milli-Q
se les añaden 1,8 g de material; se ajusta el pH a 10,0 con HCl o
NaOH; se hierve en microondas; se enfría;se comprueba el pH, se
repite el ajuste del pH hasta que se mantenga estable después del
ciclo de calentamiento/enfriamiento; se completa un volumen total de
100 ml con H_{2}O Milli-Q; se divide en partes
alícuotas de 1 ml y se almacena a -80ºC.
j. MgCl_{2}, Fischer, nº de catálogo:
M33-500; se prepara una solución patrón 1M con
H_{2}O Milli-Q.
k. HEPES, Fischer, nº de catálogo: BP
310-500; a 200 ml de H_{2}O
Milli-Q se le añaden 59,6 g de material; se ajusta
el pH a 7,5, se completa un volumen total de 250 ml con H_{2}O
Milli-Q, se filtra en condiciones estériles
(solución patrón 1M).
l. Tampón TBST: a 900 ml de H_{2}O dest. se les
añaden 6,057 g de TRIS y 8,766 g de NaCl; se ajusta el pH a 7,2 con
HCl, se añade 1,0 ml de Triton-X100; se completa un
volumen total de 1 l con H_{2}O dest.
m. MnCl_{2}, Fischer, nº de catálogo
M87-100; se prepara una solución patrón 1M con
H_{2}O Milli-Q.
n. DTT, Fischer, nº de catálogo:
BP172-5.
o. TBS (solución salina tamponada con TRIS): a
900 ml de H_{2}O Milli-Q se le añaden 6,057 g de
TRIS y 8,777 g de NaCl; se completa un volumen total de 1 l con
H_{2}O Milli-Q.
p. Mezcla de reacción de quinasa: cantidad por
placa de ensayo (100 hoyos): 1,0 ml de tampón de quinasa, 200 \mug
de GST-\boxempty, se completa un volumen final de
8,0 ml con H_{2}O MilliQ.
q. EEEYEEYEEEYEEEYEEEY marcado con biotina: se
prepara una solución patrón del péptido (1 mM, 2,98 mg/ml) en agua,
inmediatamente antes del uso.
r. Reactivo Vectastain ELITE ABC: para preparar
14 ml del reactivo de trabajo se añade 1 gota del reactivo A a 15 ml
de TBST y se invierte el tubo varias veces para mezclar su
contenido. Después se añade 1 gota del reactivo B. Se coloca el tubo
en un agitador orbital a temperatura ambiente y se mezcla durante
30 minutos.
1. Se recubre la placa ELISA con 0,5 \mug/hoyo
de mab anti-src en 100 \mul de tampón carbonato
sódico, pH 9,6, a 4ºC durante una noche.
2. Se lavan los hoyos una vez con PBS.
3. Se bloquea la placa con 0,15 ml de leche al 5%
en PBS a temperatura ambiente durante 30 min.
4. Se lava la placa 5X con PBS.
5. Se añaden 10 \mug/hoyo de lisados de
levadura transformada con src, diluidos en tampón de lisis (volumen
total por hoyo: 0,1 ml). (La cantidad de lisado puede variar entre
las partidas.) Se agita la placa a temperatura ambiente durante 20
minutos.
1. Placa 4G10: se recubre con 0,5 \mug/hoyo de
4G10 en 100 \mul de PBS durante una noche a 4ºC y se bloquea con
150 \mul de leche al 5% en PBS a temperatura ambiente durante 30
minutos.
1. Se quitan las proteínas no fijadas de las
anteriores etapas 1-7 y se lavan las placas 5X con
PBS.
2. Se añaden 0,08 ml de la mezcla de reacción de
la quinasa por hoyo (que contienen 10 \mul del tampón de quinasa
10X y EEEYEEYEEEYEEEYEEEY-biotina 10 \muM
(concentración final) por hoyo diluida con agua.
3. Se añaden 10 \mul del compuesto diluido en
agua, que contiene un 10% de DMSO y se pre incuba a temperatura
ambiente durante 15 minutos.
4. Se inicia la reacción de la quinasa añadiendo
10 \mul/hoyo de ATP 0,05 mM en agua (concentración final: 5 \muM
de ATP).
5. Se agita la placa ELISA a temperatura ambiente
durante 15 min.
6. Se interrumpe la reacción de la quinasa
añadiendo 10 \mul de EDTA 0,5 M por hoyo.
7. Se transfieren 90 \mul de líquido
sobrenadante a una placa ELISA recubierta con 4G10 y bloqueada, de
la anterior sección B.
8. Se incuba durante 30 min. a temperatura
ambiente con agitación.
9. Se lava la placa 5X con TBST.
10. Se incuba con el reactivo Vectastain ELITE
ABC (100 \mul/hoyo) a temperatura ambiente durante 30 min.
11. Se lavan los hoyos 5X con TBST.
12. Se revela con Turbo-TMB.
Con este ensayo se determinan las actividades de
proteína-quinasa de la lck midiendo la fosforilación
de la
GST-\boxempty como resultado.
GST-\boxempty como resultado.
a. Levadura transformada con lck. Se utiliza el
Schizosaccharomyces pombe (Superti-Furga y
col., EMBO J. 12, 2625-2634;
Superti-Furga y col., Nature Biochem. 14,
600-605) para expresar la Lck recombinante. Se
cultiva la cepa S. pombe SP200 (h-s
leul.32 ura4 ade210) del modo descrito y se realizan las
transformaciones con plásmidos de expresión pRSP por el método del
acetato de litio (Superti-Furga, ya citado). Se
cultivan las células en presencia de tiamina 1 \muM para inducir
la expresión.
b. Lisados celulares: se preparan perdigones de
células de levadura que expresan la lck, se lavan con agua una
vez,se vuelven a convertir en perdigones y se almacenan congeladas
a -80ºC hasta el momento del uso.
c. GST-\boxempty: el DNA que
codifica la proteína de fusión de la GST-\boxempty
para la expresión en bacterias se obtiene de Arthur Weiss del
Instituto Médico Howard Hughes de la Universidad de California, San
Francisco. Se cultivan las bacterias transformadas a 25ºC con
agitación durante una noche. Se purifica la
GST-\boxempty por cromatografía de afinidad de
glutationa, Pharmacia, Alameda, CA.
d. DMSO, Sigma, St. Louis, MO.
e. Placa ELISA de 96 hoyos, Corning o6 Well Easy
Wash, placa modificada de fondo plano, Corning, nº de catálogo:
25805-96.
f. Placas de polipropileno de fondo en V de 96
hoyos NUNC, para la dilución de los compuestos, Applied Scientific,
nº de catálogo: AS-72092.
g. Antisuero de conejo anti-GST
purificado, Amrad Corporation (Australia), nº de catálogo:
90001605.
h. IgG-HRP de cabra
anti-conejo, Amersham, nº de catálogo: V010301.
i. IgG de oveja anti-ratón (H+L),
Jackson Labs, nº de catálogo:
5215-005-003.
j. Mab anti-Lck (3A5), Santa Cruz
Biotechnology, nº de catálogo: sc-433.
k. UBI 05-321 monoclonal
anti-fosfotirosina (en su lugar puede utilizarse el
UB40).
a. Solución 1X de PBS (solución salina tamponada
con fosfato de Dulbecco), GIBCO PBS, GIBCO, nº de catálogo:
450-1300EB.
b. Tampón de bloqueo: 100 g de BSA, 12,1 g de
TRIS, pH 7,5, 58,44 g de NaCl, 10 ml de Tween-20,
se completa un volumen total de 1 l con H_{2}O
Milli-Q.
c. Tampón carbonato: Na_{2}CO_{3} de Fischer,
nº de catálogo: S495; se prepara una solución patrón 100 mM con
H_{2}O Milli-Q.
d. Tampón de quinasa: 1,0 ml (de una solución
patrón 1M) de MgCl_{2}; 0,2 ml (de una solución patrón 1M) de
MnCl_{2}; 0,2 ml (de una solución patrón 1M) de DTT; 5,0 ml (de
una solución patrón 1M) de HEPES; 0,1 ml de TX-100;
se completa un volumen total de 10 ml con H_{2}O
Milli-Q.
e. Tampón de lisis: 5,0 HEPES (de una solución
patrón 1M); 2,74 ml de NaCl (de una solución patrón 5M); 10 ml de
glicerina; 1,0 ml de TX-100; 0,4 ml de EDTA (de una
solución patrón 100 mM); 1,0 ml de PMSF (de una solución patrón 100
mM); 0,1 ml de Na_{3}VO_{4} (de una solución patrón 0,1 M); se
completa un volumen total de 100 ml con H_{2}O
Milli-Q.
f. ATP: Sigma, nº de catálogo:
A-7699; se prepara una solución patrón 10 mM (5,51
mg/ml).
g. TRIS-HCl: Fischer, nº de
catálogo: BP 152-5; a 600 ml de H_{2}O
Milli-Q se les añaden 121,14 g de material, se
ajusta el pH a 7,5 con HCl, se completa hasta un volumen total de 1
l con H_{2}O Milli-Q.
h. NaCl, Fischer, nº de catálogo:
S271-10, se prepara una solución patrón 5M con
H_{2}O Milli-Q.
i. Na_{3}VO_{4}, Fischer, nº de catálogo:
S454-50; a 80 ml de H_{2}O Milli-Q
se les añaden 1,8 g de material; se ajusta el pH a 10,0 con HCl o
NaOH; se hierve en microondas; se enfría; se comprueba el pH, se
repite el ajuste del pH hasta que se mantenga estable después del
ciclo de calentamiento/enfriamiento; se completa un volumen total de
100 ml con H_{2}O Milli-Q; se divide en partes
alícuotas de 1 ml y se almacena a -80ºC.
j. MgCl_{2}, Fischer, nº de catálogo:
M33-500; se prepara una solución patrón 1M con
H_{2}O Milli-Q.
k. HEPES, Fischer, nº de catálogo: BP
310-500; a 200 ml de H_{2}O
Milli-Q se le añaden 59,6 g de material; se ajusta
el pH a 7,5, se completa un volumen total de 250 ml con H_{2}O
Milli-Q, se filtra en condiciones estériles
(solución patrón 1M).
l. Albúmina bovina (BSA), Sigma, nº de catálogo:
A4503; a 150 ml de H_{2}O Milli-Q se le añaden 30
g de material, se completa un volumen total de 300 ml con H_{2}O
Milli-Q, se filtra con un filtro de 0,22 \mum y se
almacena a 4ºC.
m. Tampón TBST: a 900 ml de H_{2}O dest. se les
añaden 6,057 g de TRIS y 8,766 g de NaCl; se ajusta el pH a 7,2 con
HCl, se añade 1,0 ml de Triton-X100; se completa un
volumen total de 1 l con H_{2}O dest.
n. MnCl_{2}, Fischer, nº de catálogo
M87-100; se prepara una solución patrón 1M con
H_{2}O Milli-Q.
o. DTT, Fischer, nº de catálogo:
BP172-5.
p. TBS (solución salina tamponada con TRIS): a
900 ml de H_{2}O Milli-Q se le añaden 6,057 g de
TRIS y 8,777 g de NaCl; se completa un volumen total de 1 l con
H_{2}O Milli-Q.
q. Mezcla de reacción de quinasa: cantidad por
placa de ensayo (100 hoyos): 1,0 ml de tampón de quinasa, 200 \mug
de GST-\boxempty, se completa un volumen final de
8,0 ml con H_{2}O MilliQ.
1. Se recubre con IgG de oveja
anti-ratón a razón de 2,0 \mug/hoyo en 100 \mul
de tampón carbonato sódico de pH 9,6 a 4ºC durante una noche.
2. Se lavan los hoyos una vez con PBS.
3. Se bloquea la placa con 0,15 ml de tampón de
bloqueo a temp. ambiente durante 30 min.
4. Se lava la placa 5X con PBS.
5. Se añade 0,5 \mug/hoyo de mab 3A5
anti-lck en 0,1 ml de PBS a temperatura ambiente
durante 1-2 horas.
6. Se lava la placa 5X con PBS.
7. Se añaden 20 \mug/hoyo de lisados de
levadura transformada con lck, diluidos en tampón de lisis (volumen
total por hoyo: 0,1 ml). (La cantidad de lisado puede variar entre
partidas). Se agita la placa a 4ºC durante una noche para impedir la
pérdida de actividad.
1. Placa UB40: 1,0 \mug/hoyo de UB40 en 100
\mul de PBS a 4ºC durante una noche y se bloquea con 150 \mul de
tampón de bloqueo por lo menos durante 1 hora.
1. Se quitan las proteínas no fijadas de las
anteriores etapas 1-7 y se lavan las placas 5X con
PBS.
2. Se añaden 0,08 ml de mezcla de reacción de
quinasa por hoyo (que contienen 10 \mul de tampón de quinasa 10X y
2 \mug de GST-\boxempty por hoyo, diluido con
agua).
3. Se añaden 10 \mul de compuesto diluido en
agua que contiene un 10% de DMSO y se preincuba a temperatura
ambiente durante 15 minutos.
4. Se inicia la reacción de la quinasa añadiendo
10 \mul/hoyo de ATP 0,1 mM en agua (concentración final de ATP: 10
\muM).
5. Se agita la placa ELISA a temperatura ambiente
durante 60 min.
6. Se interrumpe la reacción de la quinasa
añadiendo 10 \mul de EDTA 0,5 M por hoyo.
7. Se transfieren 90 \mul de líquido
sobrenadante a una placa ELISA recubierta con 4G10 y bloqueada, de
la anterior sección B.
8. Se incuba a temperatura ambiente con agitación
durante 30 min.
9. Se lava la placa 5X con TBST.
10. Se incuba con anticuerpo de conejo
anti-GST en una dilución 1:5000 en 100 \mul de
TBST a temperatura ambiente durante 30 min.
11. Se lavan los hoyos 5X con TBST.
12. Se incuban con IgG-HRP de
cabra anti-conejo en una dilución 1:20.000 en 100
\mul de TBST a temperatura ambiente durante 30 min.
13. Se lavan los hoyos 5X con TBST.
14. Se revela con Turbo TMB.
En el siguiente ensayo se determina la cantidad
defosforilación catalizada por RAF de su proteína diana MEK así
como de la MAPK, diana de la MEK. La secuencia del gen RAF se
describe en Bonner y col., Molec. Cell. Biol. 5,
1400-1407, 1985 y es fácilmente accesible en muchos
bancos de datos de secuencias de genes. La construcción del vector
ácido nucleico y las líneas celulares utilizadas para esta porción
de la invención se describe totalmente en Morrison y col., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 85, 8855-8859, 1988.
1. Células de Sf9 (Spodoptera frugiperda);
GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD.
2. Tampón RIPA: 20 mM Tris/HCl, pH 7,4; 137 mM
NaCl; 10% de glicerina; 1 mM de PMSF; 5 mg/l de aprotenina; 0,5% de
Triton X-100.
3. Proteína de fusión
tiorredoxina-MEK (T-MEK): se realiza
la expresión y la purificación de la T-MEK por
cromatografía de afinidad con arreglo a los procedimientos del
fabricante. Nº de catálogo: K 350-01 y R
350-40, Invitrogen Corp., San Diego, CA.
4. His-MAPK (ERK 2); se expresa
la MAPK marcada con His en células XL1 Blue transformadas con el
vector pUC18 que codifica la His-MAPK. Se purifica
la His-MAPK por cromatografía de afinidad en Ni. Nº
de catálogo: 27-4949-01, Pharmacia,
Alameda, CA, del modo descrito en la presente.
5. IgG de oveja anti-ratón,
Jackson Laboratories, West Grove, PA. Nº de catálogo:
515-006-008, lote nº 28563.
6. Anticuerpo específico de la
proteína-quinasa RAF-1: URP2653 de
UBI.
7. Tampón de recubrimiento: PBS (solución salina
tamponada con fosfato), GIBCO-BRL, Gaithersburg,
MD.
8. Tampón de lavado: TBST - 50 mM Tris/HCl, pH
7,2, 150 mM NaCl, 0,1% de Triton X-100.
9. Tampón de bloqueo: TBST, 0,1% de etanolamina,
pH 7,4.
10. DMSO, Sigma, St. Louis, MO.
11. Tampón de quinasa (KB): 20 mM HEPES/HCl, pH
7,2; 150 mM NaCl, 0,1% de Triton X-100, 1 mM PMSF, 5
mg/l de aprotenina; 75 mM de ortovanadato sódico; 0,5 mM DTT y 10 mM
MgCl_{2}.
12. Mezcla de ATP: 100 mM MgCl_{2}, 300 mM ATP,
10 mCi ATP-P^{33}
(DuPont-NEN)/ml.
13. Solución de interrupción: ácido fosfórico del
1%; Fisher, Pittsburgh, PA.
14. Vellones (mats) de filtro de fosfato de
celulosa Wallac; Wallac, Turku, Finlandia.
15. Solución de lavado del filtro: ácido
fosfórico del 1%; Fisher, Pittsburgh, PA.
16. Colector de placas Tomtec, Wallac, Turku,
Finlandia.
17. Lector de placas beta Wallac nº 1205, Wallac,
Turku, Finlandia.
18. Placas de polipropileno de fondo en V y 96
hoyos NUNC, para compuestos, de Applied Scientific, nº de catálogo:
AS-72092.
Todos los pasos siguientes se efectúan a
temperatura ambiente, a menos que se indique lo contrario.
1. Recubrimiento de la placa ELISA: se recubren
los hoyos ELISA con 100 ml de antisuero de oveja
anti-ratón purificado por afinidad (1 mg/100 ml de
tampón de recubrimiento) a 4ºC durante una noche. Las placas ELISA
pueden utilizarse durante dos semanas si se almacenan a 4ºC.
2. Se invierte la placa y se quita el líquido. Se
añaden 100 ml de solución de bloqueo y se incuba durante
30 min.
30 min.
3. Se saca la solución de bloqueo y se lava
cuatro veces con tampón de lavado. Se golpea suavemente la placa
sobre servilletas de papel para eliminar el exceso de líquido.
4. Se añade 1 mg del anticuerpo específico de
RAF-1 a cada hoyo y se incuba durante 1 hora. Se
lava del modo descrito en el paso 3.
5. Se descongelan los lisados de células Sf9
infectadas con RAS/RAF y se diluyen con TBST hasta 10 mg/100 ml. Se
añaden 10 mg de lisado diluido a los hoyos y se incuba durante 1
hora. Se agita la placa durante la incubación. No se introducen
lisados en los controles negativos. Se obtienen los lisados de
células de insecto Sf9 infectadas con RAS/RAF por infección de las
células con baculovirus recombinantes en una MOI de 5 para cada
virus y se recolectan al cabo de 48 horas. Se lavan las células una
vez con PBS y se lisan en tampón RIPA. Se elimina el material
insoluble por centrifugación (5 min a 10.000 rpm). Se congelan
partes alícuotas de lisados en hielo seco/etanol y se almacenan a
-80ºC hasta el momento de su utilización.
6. Se elimina el material no fijado y se lava del
modo descrito anteriormente (paso 3).
7. Se añaden 2 mg de T-MEK y 2 mg
de His-MAPK por hoyo y se ajusta el volumen a 40 ml
con tampón de quinasa. Los métodos de purificación de la
T-MEK y MAPK de los extractos celulares se facilitan
mediante
ejemplos.
ejemplos.
8. Se diluyen los compuestos (solución patrón: 10
mg/ml de DMSO) o los extractos previamente: 20 veces en TBST más un
1% de DMSO. Se añaden 5 ml de los compuestos/extractos prediluidos a
los hoyos descritos en el paso 6. Se incuba durante 20 min. Los
controles no reciben fármaco.
9. Se inicia la reacción de la quinasa por
adición de 5 ml de mezcla ATP; se agitan las placas en un agitador
de placas ELISA durante la incubación.
10. Se interrumpe la reacción de la quinasa
después de 60 min por adición de 30 ml de solución de interrupción a
cada hoyo.
11. Se coloca el vellón de fosfocelulosa y la
placa ELISA en el recolector de placas Tomtec. Se recolecta y se
lava el filtro con la solución de lavado de filtros siguiendo las
recomendaciones del fabricante. Se secan los vellones del filtro. Se
sellan los vellones del filtro y se colocan en un soporte. Se
inserta el soporte en un aparato de detección radiactiva y se
cuantifica el fósforo radiactivo existente en los vellones del
filtro.
Como alternativa se pueden transferir 40 \mul
de partes alícuotas de hoyos individuales de la placa de ensayo a
las posiciones correspondientes del vellón de filtro de
fosfocelulosa. Se secan los filtros con aire y se colocan en una
bandeja. Se agita suavemente la bandeja, cambiando la solución de
lavado a intervalos de 15 min durante 1 hora. Se secan los vellones
de filtro con aire. Se sellan los vellones de filtro y se colocan en
un soporte, idóneo para medir el fósforo radiactivo de las muestras.
Se inserta el soporte en un dispositivo de detección y se cuantifica
el fósforo radiactivo de los vellones de filtro.
Con este ensayo se analiza la actividad de
proteína-quinasa de la CDK2 en un sustrato
exógeno.
A. Tampón A (80 mM Tris, pH 7,2; 40 mM
MgCl_{2}): se disuelven 4,84 g de Tris (peso total = 121,1 g/mol),
4,07 g de MgCl_{2} (peso total = 203,31 g/mol) en 500 ml de
H_{2}O. Se ajusta el pH a 7,2 con HCl.
B. Solución de histona H1 (0,45 mg/ml de histona
H1 y 20 mM HEPES, pH 7,2 (un pH de 7,4 es correcto): se disuelven 5
mg de histona H1 (Boehringer Mannheim) en 11,111 ml de 20 mM HEPES,
pH 7,2 (477 mg de HEPES, peso total = 238,3 g/mol) en 100 ml de
H_{2}O bidestilada, se almacenan partes alícuotas de 1 ml a
80ºC.
C. Solución ATP (60 \muM ATP, 300 \mug/ml de
BSA, 3 mM DTT): 120 \mul 10 mM ATP, 600 \mul 10 mg/ml de BSA
hasta 20 ml, se almacenan partes alícuotas de 1 ml a -80ºC.
D. Solución de CDK2: cdk2/ciclina A en 10 mM
HEPES, pH 7,2, 25 mM NaCl, 0,5 mM DTT, 10% de glicerina, se almacena
a 80ºC en partes alícuotas de 9 \mul.
1. Se preparan soluciones de inhibidores a tres
veces la concentración final de ensayo deseada en H_{2}O
bidest./
DMSO del 15% en volumen.
DMSO del 15% en volumen.
2. Se dispensan 20 \mul de los inhibidores a
los hoyos de las placas de polipropileno de 96 hoyos (ó 20 \mul de
DMSO del 15% para los controles positivos y negativos).
3. Se descongela la solución de histona H1 (1
ml/placa), la solución de ATP (1 ml/placa más 1 parte alícuota para
los controles negativos) y la solución de CDK2 (9 \mul/placa). Se
mantiene la CDK2 sobre hielo hasta el momento del uso. Se divide
apropiadamente la solución de CDK2 en partes alícuotas para evitar
la repetición de ciclos de
congelación-descongelación.
4. Se diluyen 9 \mul de solución de CDK2 en 2,1
ml de tampón A (por placa). Se mezcla. Se dispensan 20 \mul a cada
hoyo.
5. Se mezcla 1 ml de la solución de histona H1
con 1 ml de solución de ATP (por placa) en un tubo de 10 ml de tapón
roscado. Se añade
\gamma-ATP-P^{33} hasta una
concentración de 0,15 \muCi/20 \mul (0,15 \muCi/hoyo en el
ensayo). Se mezcla cuidadosamente para evitar la espumación del BSA.
Se añaden 20 \mul a los hoyos apropiados. Se mezclan las placas en
un agitador de placas. Para el control negativo se mezcla la
solución de ATP con una cantidad igual de 20 mM HEPES, pH 7,2, y se
añade \gamma-ATP-P^{33} hasta
una concentración de 0,15 \muCi/20 \mul de solución. Se añaden
20 \mul a los hoyos apropiados.
6. Se deja que las reacciones progresen durante
60 minutos.
7. Se añaden 35 \mul de TCA del 10% a cada
hoyo. Se mezcla el contenido de las placas en un agitador de
placas.
8. Se depositan 40 \mul de cada muestra en una
casilla de vellón de filtro P30. Se dejan secar los vellones
(aprox. 10-20 minutos).
9. Se lavan los vellones de filtro 4 X 10 minutos
con 250 ml de ácido fosfórico del 1% (10 ml de ácido fosfórico por
litro de agua bidest.).
10. Se recuentan los vellones de filtro con un
lector de placas beta.
\newpage
Ensayo
1
(1) PDGF: PDGF B/B humana,
1276-956, Boehringer Mannheim, Alemania.
(2) Reactivo de marcado de BrdU: 10 mM en PBS (pH
7,4), Boehringer Mannheim, Alemania, nº de catálogo: 1 647 229.
(3) FixDenat: solución de fijación (lista para el
uso), nº de catálogo: 1 647 229, Boehringer Mannheim, Alemania.
(4)
Anti-BrdU-POD: anticuerpo monoclonal
de ratón conjugado con peroxidasa, nº de catálogo: 1 647 229,
Boehringer Mannheim, Alemania.
(5) Solución de sustrato TMB: tetrametilbencidina
(TMB), lista para el uso, nº de catálogo: 1 647 229, Boehringer
Mannheim, Alemania.
(6) Solución de lavado de PBS: PBS 1X, pH 7,4, de
fabricación propia (Sugen, Inc., Redwood City, California).
(7) Albúmina bovina (BSA): fracción V en polvo;
A-8551, Sigma Chemical Co., EE.UU.
(8) Línea celular 3T3, de ingeniería genética,
para expresar la PDGF-R humana.
(1) Se siembran las células a razón de 8000
células/hoyo en DMEM, 10% de CS, 2 mM Gln en una placa de 96 hoyos.
Se incuban las células a 37ºC con un 5% de CO_{2} durante una
noche.
(2) Después de 24 horas se lavan las células con
PBS y entonces se desnutren en un medio exento de suero (0% de CS
DMEM con un 0,1% de BSA) durante 24 horas.
(3) En el día 3 se añaden simultáneamente el
ligando (PDGF, 3,8 nM, preparado en DMEM con un 0,1% de BSA) y los
compuestos a ensayar a las células. Los hoyos de control negativo
reciben DMEM exento de suero únicamente con un 0,1% de BSA; las
células de control positivo reciben el ligando (PDGF) pero no el
compuesto a ensayar. Los compuestos a ensayar se preparan en DMEM
exento de suero con ligando en una placa de 96 hoyos y se diluyen en
series para obtener 7 concentraciones de ensayo.
(4) Después de 20 horas de la activación del
ligando se añade el reactivo de marcado BrdU diluido (1:100 en DMEM,
0,1% de BSA) y se incuban las células con BrdU (concentración final
= 10 \muM) durante 1,5 horas.
(5) Después de la incubación con el reactivo de
marcado se quita el medio por decantación y golpeo suave de la placa
invertida sobre servilletas de papel. Se añade la solución FixDenat
(50 \mul/hoyo) y se incuban las placas a temperatura ambiente
durante 45 minutos sobre un agitador de placas.
(6) Se quita por completo la solución FixDenat
por decantación y golpes suaves en la placa invertida sobre
servilletas de papel. Se añade leche (leche deshidratada al 5% en
PBS, 200 \mul/hoyo) como solución de bloqueo y se incuba la placa
durante 30 minutos a temperatura ambiente sobre un agitador de
placas.
(7) Se quita la solución de bloqueo por
decantación y se lavan los hoyos una vez con PBS. Se añade una
solución de anti-BrdU-POD (dilución
1:100 en PBS, 1% de BSA) (100 \mul/hoyo) y se incuba la placa
durante 90 minutos a temperatura ambiente en un agitador de
placas.
(8) Se elimina por completo el anticuerpo
conjugado por decantación y enjuague de los hoyos 5 veces con PBS y
se seca la placa por inversión y golpes suaves sobre servilletas de
papel.
(9) Se añade solución de sustrato TMB (100
\mul/hoyo) y se incuba durante 20 minutos a temperatura ambiente
en un agitador de placas hasta que el color revelado es suficiente
para la detección fotométrica.
(10) Se mide la absorbancia de las muestra a 410
nm (en modo "longitud de onda dual" con una lectura de filtro a
490 nm, como longitud de onda de referencia) en un lector Dynatech
de placas ELISA.
\newpage
Ensayo
2
(1) EGF: EGF de ratón, 201; Toyobo Co. Ltd.,
Japón.
(2) Reactivo de marcado BrdU: 10 mM en PBS (pH
7,4), nº de catálogo: 1 647 229, Boehringer Mannheim, Alemania.
(3) FixDenat: solución de fijación (lista para el
uso), nº de catálogo: 1 647 229, Boehringer Mannheim, Alemania.
(4)
Anti-BrdU-POD: anticuerpo monoclonal
de ratón conjugado con peroxidasa, nº de catálogo: 1 647 229,
Boehringer Mannheim, Alemania.
Boehringer Mannheim, Alemania.
(5) Solución de sustrato TMB: tetrametilbencidina
(TMB), lista para el uso, nº de catálogo: 1 647 229, Boehringer
Mannheim, Alemania.
(6) Solución de lavado de PBS: PBS 1X, pH 7,4, de
fabricación propia (Sugen, Inc., Redwood City, California).
(7) Albúmina bovina (BSA): fracción V en polvo;
A-8551, Sigma Chemical Co., EE.UU.
(8) Línea celular 3T3, de ingeniería genética,
para expresar la EGF-R humana.
(1) Se siembran las células a razón de 8000
células/hoyo en 10% de CS, 2 mM Gln en DMEM, en una placa de 96
hoyos. Se incuban las células a 37ºC con un 5% de CO_{2} durante
una noche.
(2) Después de 24 horas se lavan las células con
PBS y entonces se desnutren en un medio exento de suero (0% de CS
DMEM con un 0,1% de BSA) durante 24 horas.
(3) En el día 3 se añaden simultáneamente el
ligando (EGF, 2 nM, preparado en DMEM con un 0,1% de BSA) y los
compuestos a ensayar a las células. Los hoyos de control negativo
reciben DMEM exento de suero únicamente con un 0,1% de BSA; las
células de control positivo reciben el ligando (EGF) pero no el
compuesto a ensayar. Los compuestos a ensayar se preparan en DMEM
exento de suero con ligando en una placa de 96 hoyos y se diluyen en
series para obtener 7 concentraciones de ensayo.
(4) Después de 20 horas de la activación del
ligando se añade el reactivo de marcado BrdU diluido (1:100 en DMEM,
0,1% de BSA) y se incuban las células con BrdU (concentración final
= 10 \muM) durante 1,5 horas.
(5) Después de la incubación con el reactivo de
marcado se quita el medio por decantación y golpeo suave de la placa
invertida sobre servilletas de papel. Se añade la solución FixDenat
(50 \mul/hoyo) y se incuban las placas a temperatura ambiente
durante 45 minutos sobre un agitador de placas.
(6) Se quita por completo la solución FixDenat
por decantación y golpes suaves en la placa invertida sobre
servilletas de papel. Se añade leche (leche deshidratada al 5% en
PBS, 200 \mul/hoyo) como solución de bloqueo y se incuba la placa
durante 30 minutos a temperatura ambiente sobre un agitador de
placas.
(7) Se quita la solución de bloqueo por
decantación y se lavan los hoyos una vez con PBS. Se añade una
solución de anti-BrdU-POD (dilución
1:100 en PBS, 1% de BSA) (100 \mul/hoyo) y se incuba la placa
durante 90 minutos a temperatura ambiente en un agitador de
placas.
(8) Se elimina por completo el anticuerpo
conjugado por decantación y enjuague de los hoyos 5 veces con PBS y
se seca la placa por inversión y golpes suaves sobre servilletas de
papel.
(9) Se añade solución de sustrato TMB (100
\mul/hoyo) y se incuba durante 20 minutos a temperatura ambiente
en un agitador de placas hasta que el color revelado es suficiente
para la detección fotométrica.
(10) Se mide la absorbancia de las muestra a 410
nm (en modo "longitud de onda dual" con una lectura de filtro a
490 nm, como longitud de onda de referencia) en un lector Dynatech
de placas ELISA.
\newpage
Ensayo
3
(1) EGF: EGF de ratón, 201; Toyobo Co. Ltd.,
Japón.
(2) Reactivo de marcado BrdU: 10 mM en PBS (pH
7,4), nº de catálogo: 1 647 229, Boehringer Mannheim, Alemania.
(3) FixDenat: solución de fijación (lista para el
uso), nº de catálogo: 1 647 229, Boehringer Mannheim, Alemania.
(4)
Anti-BrdU-POD: anticuerpo monoclonal
de ratón conjugado con peroxidasa, nº de catálogo: 1 647 229,
Boehringer Mannheim, Alemania.
Boehringer Mannheim, Alemania.
(5) Solución de sustrato TMB: tetrametilbencidina
(TMB), lista para el uso, nº de catálogo: 1 647 229, Boehringer
Mannheim, Alemania.
(6) Solución de lavado de PBS: PBS 1X, pH 7,4, de
fabricación propia.
(7) Albúmina bovina (BSA): fracción V en polvo;
A-8551, Sigma Chemical Co., EE.UU.
(8) Línea celular 3T3, de ingeniería genética,
para expresar un receptor quimérico que tenga el dominio
extracelular de la EGF-R y el dominio intracelular
de la Her2.
(1) Se siembran las células a razón de 8000
células/hoyo en DMEM, 10% de CS, 2 mM Gln, en una placa de 96
hoyos. Se incuban las células a 37ºC con un 5% de CO_{2} durante
una noche.
(2) Después de 24 horas se lavan las células con
PBS y entonces se desnutren en un medio exento de suero (0% de
CSDMEM con un 0,1% de BSA) durante 24 horas.
(3) En el día 3 se añaden simultáneamente el
ligando (EGF = 2 nM, preparado en DMEM con un 0,1% de BSA) y los
compuestos a ensayar a las células. Los hoyos de control negativo
reciben DMEM exento de suero únicamente con un 0,1% de BSA; las
células de control positivo reciben el ligando (EGF) pero no el
compuesto a ensayar. Los compuestos a ensayar se preparan en DMEM
exento de suero con ligando en una placa de 96 hoyos y se diluyen en
series para obtener 7 concentraciones de ensayo.
(4) Después de 20 horas de la activación del
ligando se añade el reactivo de marcado BrdU diluido (1:100 en DMEM,
0,1% de BSA) y se incuban las células con BrdU (concentración final
= 10 \muM) durante 1,5 horas.
(5) Después de la incubación con el reactivo de
marcado se quita el medio por decantación y golpeo suave de la placa
invertida sobre servilletas de papel. Se añade la solución FixDenat
(50 \mul/hoyo) y se incuban las placas a temperatura ambiente
durante 45 minutos sobre un agitador de placas.
(6) Se quita por completo la solución FixDenat
por decantación y golpes suaves en la placa invertida sobre
servilletas de papel. Se añade leche (leche deshidratada al 5% en
PBS, 200 \mul/hoyo) como solución de bloqueo y se incuba la placa
durante 30 minutos a temperatura ambiente sobre un agitador de
placas.
(7) Se quita la solución de bloqueo por
decantación y se lavan los hoyos una vez con PBS. Se añade una
solución de anti-BrdU-POD (dilución
1:100 en PBS, 1% de BSA) (100 \mul/hoyo) y se incuba la placa
durante 90 minutos a temperatura ambiente en un agitador de
placas.
(8) Se elimina por completo el anticuerpo
conjugado por decantación y enjuague de los hoyos 5 veces con PBS y
se seca la placa por inversión y golpes suaves sobre servilletas de
papel.
(9) Se añade solución de sustrato TMB (100
\mul/hoyo) y se incuba durante 20 minutos a temperatura ambiente
en un agitador de placas hasta que el color revelado es suficiente
para la detección fotométrica.
(10) Se mide la absorbancia de las muestra a 410
nm (en modo "longitud de onda dual" con una lectura de filtro a
490 nm, como longitud de onda de referencia) en un lector Dynatech
de placas ELISA.
\newpage
Ensayo
4
(1) Ligando IGF1: humano, recombinante; G511,
Promega Corp., EE.UU.
(2) Reactivo de marcado BrdU: 10 mM en PBS (pH
7,4), nº de catálogo: 1 647 229, Boehringer Mannheim, Alemania.
(3) FixDenat: solución de fijación (lista para el
uso), nº de catálogo: 1 647 229, Boehringer Mannheim, Alemania.
(4)
Anti-BrdU-POD: anticuerpo monoclonal
de ratón conjugado con peroxidasa, nº de catálogo: 1 647 229,
Boehringer Mannheim, Alemania.
(5) Solución de sustrato TMB: tetrametilbencidina
(TMB), lista para el uso, nº de catálogo: 1 647 229, Boehringer
Mannheim, Alemania.
(6) Solución de lavado de PBS: PBS 1X, pH 7,4, de
fabricación propia (Sugen, Inc., Redwood City, California).
(7) Albúmina bovina (BSA): fracción V en polvo;
A-8551, Sigma Chemical Co., EE.UU.
(8) Línea celular 3T3, de ingeniería genética,
para expresar el receptor IGF-1 humano.
(1) Se siembran las células a razón de 8000
células/hoyo en DMEM, 10% de CS, 2 mM Gln, en una placa de 96
hoyos. Se incuban las células a 37ºC con un 5% de CO_{2} durante
una noche.
(2) Después de 24 horas se lavan las células con
PBS y entonces se desnutren en un medio exento de suero (0% de CS
DMEM con un 0,1% de BSA) durante 24 horas.
(3) En el día 3 se añaden simultáneamente el
ligando (IGF1 = 3,3 nM, preparado en DMEM con un 0,1% de BSA) y los
compuestos a ensayar a las células. Los hoyos de control negativo
reciben DMEM exento de suero únicamente con un 0,1% de BSA; las
células de control positivo reciben el ligando (IGF1) pero no el
compuesto a ensayar. Los compuestos a ensayar se preparan en DMEM
exento de suero con ligando en una placa de 96 hoyos y se diluyen en
series para obtener 7 concentraciones de ensayo.
(4) Después de 16 horas de la activación del
ligando se añade el reactivo de marcado BrdU diluido (1:100 en DMEM,
0,1% de BSA) y se incuban las células con BrdU (concentración final
= 10 \muM) durante 1,5 horas.
(5) Después de la incubación con el reactivo de
marcado se quita el medio por decantación y golpeo suave de la placa
invertida sobre servilletas de papel. Se añade la solución FixDenat
(50 \mul/hoyo) y se incuban las placas a temperatura ambiente
durante 45 minutos sobre un agitador de placas.
(6) Se quita por completo la solución FixDenat
por decantación y golpes suaves en la placa invertida sobre
servilletas de papel. Se añade leche (leche deshidratada al 5% en
PBS, 200 \mul/hoyo) como solución de bloqueo y se incuba la placa
durante 30 minutos a temperatura ambiente sobre un agitador de
placas.
(7) Se quita la solución de bloqueo por
decantación y se lavan los hoyos una vez con PBS. Se añade una
solución de anti-BrdU-POD (dilución
1:100 en PBS, 1% de BSA) (100 \mul/hoyo) y se incuba la placa
durante 90 minutos a temperatura ambiente en un agitador de
placas.
(8) Se elimina por completo el anticuerpo
conjugado por decantación y enjuague de los hoyos 5 veces con PBS y
se seca la placa por inversión y golpes suaves sobre servilletas de
papel.
(9) Se añade solución de sustrato TMB (100
\mul/hoyo) y se incuba durante 20 minutos a temperatura ambiente
en un agitador de placas hasta que el color revelado es suficiente
para la detección fotométrica.
(10) Se mide la absorbancia de las muestra a 410
nm (en modo "longitud de onda dual" con una lectura de filtro a
490 nm, como longitud de onda de referencia) en un lector Dynatech
de placas ELISA.
El siguiente procedimiento puede utilizarse
también para medir la actividad de un compuesto contra los
PDGF-R, FGF-R, VEGF, aFGF o
Flk-1/KDR, todos los cuales se expresan naturalmente
mediante células HUV-EC.
Día
0
1. Se lavan y se tripsinizan las células
HUV-EC-C (células endoteliales de
vena umbilical humana) (American Type Culture Collection; nº de
catálogo: 1730 CRL). Se lavan dos veces con solución salina
tamponada con fosfato de Dulbecco (D-PBS; obtenida
de Gibco BRL; nº de catálogo: 14190-029) a razón de
1 ml/10 cm^{2} de matraz de cultivo de tejido. Se tripsinizan con
tripsina al 0,05% en EDTA en una solución de disociación celular no
enzimática (Sigma Chemical Company; nº de catálogo:
C-1544). La tripsina al 0,05% se prepara diluyendo
tripsina del 0,25% en EDTA 1 mM (Gibco; nº de catálogo:
25200-049) en la solución de disociación celular. Se
tripsiniza con aprox. 1 ml/25-30 cm^{2} del matraz
de cultivo de tejido a 37ºC durante unos 5 minutos. Una vez las
células se han despegado del matraz se añade un volumen igual de
medio de ensayo y se transfieren a un tubo estéril de centrífuga de
50 ml (Fisher Scientific; nº de catálogo:
05-539-6).
2. Se lavan las células con 35 ml de medio de
ensayo en el tubo estéril de centrífuga de 50 ml añadiendo el medio
de ensayo, se centrifuga a una velocidad de 200 rpm durante 10
minutos, se aspira el líquido sobrenadante y se suspende de nuevo en
35 ml de D-PBS. Se repite el lavado dos veces más
con D-PBS, se suspenden de nuevo las células en
aprox. 1 ml de medio de ensayo/15 cm^{2} de frasco de cultivo de
tejido. El medio de ensayo consiste en medio F12K (Gibco BRL; nº de
catálogo: 21127-014) + 0,5% de suero fetal bovino
inactivado con calor. Se cuentan las células con un contador de
Coulter Electronics Inc.) y se añade medio de ensayo a las células
para obtener una concentración de 0,8 a 1,0 x 10^{5}
células/ml.
3. Se añaden las células a placas de fondo plano
de 96 hoyos a razón de 100 \mul/hoyo o bien de 0,8 a 1,0 x 10
células/hoyo; se incuban a 37ºC con un 5% de CO_{2} durante
\approx 24 h.
Día
1
1. Se realizan valoraciones del fármaco por
duplicado en placas separadas de 96 hoyos, por lo general desde 50
\muM hasta 0 \muM. Se utiliza el mismo medio de ensayo, ya
mencionado anteriormente en el día 0, paso 2. Se efectúan las
valoraciones añadiendo 90 \mul/hoyo del fármaco en una
concentración 200 \muM (4X la concentración final del hoyo) en el
hoyo superior de una columna concreta de la placa. Dado que la
concentración del fármaco patrón es normalmente 20 mM en DMSO, la
concentración 200 \muM de fármaco contiene un 2% de DMSO.
Por lo tanto, se utiliza un diluyente que consta
de un 2% de DMSO en medio de ensayo (F12K + 0,5% de suero fetal
bovino) como diluyente para las valoraciones de fármaco con el fin
de diluir el fármaco, pero manteniendo constante la concentración
de DMSO. Se añade este diluyente a los hoyos restantes de la
columna a razón de 60 \mul/hoyo. Se toman 60 \mul de los 120
\mul de la dilución 200 \muM de fármaco del hoyo superior de la
columna y se mezclan con los 60 \mul del segundo hoyo de la
columna. Se toman 60 \mul de este hoyo y se mezclan con los 60
\mul del tercer hoyo de la columna y así sucesivamente hasta
completar valoraciones por duplicado. Cuando se ha mezcla el
penúltimo hoyo, se toman 60 \mul de los 120 \mul de este hoyo y
se descartan. Se deja el último hoyo con 60 \mul de DMSO/medio
diluyente como control que no contiene fármaco. Se forman 9 columnas
de fármaco valorado, suficientes para triplicar los hoyos para 1)
VEGF (obtenido de Pepro Tech Inc., nº de catálogo:
100-200; 2) factor de crecimiento de células
endoteliales (ECGF) (también conocido como factor de crecimiento de
fibroblasto ácido, o aFGF) (obtenido de Boehringer Mannheim
Biochemica, nº de catálogo: 1439 600); o 3) PDGF B/B humano
(1276-956, Boehringer Mannheim, Alemania) y el
control con medios de ensayo. El ECGF se presenta en forma de
preparado con heparina sódica.
2. Se transfieren 50 \mul/hoyo de las
diluciones de fármaco a las placas de ensayo de 96 hoyos que
contienen de 0,8 a 1,0 x 10^{4} células/100 \mul/hoyo de células
HUV-EC-C del día 0 y se incuban a
37ºC con un 5% de CO_{2} durante \approx 2 h.
3. Se añaden por triplicado 50 \mul/hoyo de 80
\mug/ml de VEGF, 20 ng/ml de ECGF o medio de control a cada
concentración de fármaco. Al igual que para los fármacos, las
concentraciones del factor de crecimiento son 4X la concentración
final deseada. Se utilizan los medios de ensayo del día 0, paso 2,
para ajustar las concentraciones de los factores de crecimiento. Se
incuban a 37ºC con un 5% de CO_{2} durante aproximadamente 24
horas. Cada hoyo tendrá 50 \mul de fármaco diluido, 50 \mul de
factor de crecimiento o medio y 100 \mul de células, es decir un
total de 200 \mul/hoyo. De este modo, las concentraciones 4X de
los fármacos y de los factores de crecimiento quedan reducidas a 1X
después de haber añadido todos los ingredientes a los hoyos.
Día
2
1. Se añade timidina-H^{3}
(Amersham; nº de catálogo: TRK-686) a razón de 1
\muCi/hoyo (10 \mul/hoyo de 100 \muCi/ml de solución preparada
en medio RPMI + 10% de suero fetal bovino inactivado con calor) y se
incuba a 37ºC con un 5% de CO_{2} durante \approx 24 h. Nota: se
prepara la timidina-H^{3} en medio RPMI porque
todas las demás aplicaciones en las que se utiliza la
timidina-H^{3} requieren la realización de ensayos
en RPMI. La diferencia de medios en este paso probablemente no sea
significativa. El RPMI se obtiene de Gibco BRL, nº de catálogo:
11875-051.
Día
3
1. Se congelan las placas a -20ºC durante una
noche.
\newpage
Día
4
1. Se descongelan las placas y se recolectan con
un recolector de placas de 96 hoyos (Tomtec Harvester 96®) en
vellones de filtro (Wallac; nº de catálogo:
1205-401); se lee el recuento en un contado de
centelleo líquido Wallac Betaplate™.
La capacidad de los tumores humanos de crecer en
forma de injertos ajenos en ratones atímicos (p.ej. el Balb/c,
nu/nu) proporciona un modelo "in vivo" útil para
estudiar la respuesta biológica a las terapias de tumores humanos.
Después del primer trasplante ajeno de tumores humanos a ratones
atímicos realizado con éxito (Rygaard y Povlsen, Acta Pathol.
Microbial. Scand. 77, 758-760, 1969), se han
venido trasplantando y cultivado con éxito en ratones desnudos (sin
pelo) múltiples líneas celulares tumorales humanas (p.ej. cáncer de
mama, de pulmón, de vías génito-urinarias,
gastro-intestinales, de cabeza y cuello, de
glioblastoma, de hueso y de melanomas malignos). Se realizan los
ensayos siguientes para determinar el nivel de actividad, la
especificidad y el efecto de los diferentes compuestos de la
presente invención. Para evaluar los compuestos son útiles tres
tipos generales de ensayos: celulares/catalíticos,
celulares/biológicos e "in vivo". El objeto de los
ensayos celulares/catalíticos consiste en determinar el efecto de
un compuesto en la capacidad de la TK para fosforilar tirosinas en
un sustrato conocido de una célula. El objeto de los ensayos
celulares/biológicos consiste en determinar el efecto de un
compuesto en la respuesta biológica estimulada por una TK en una
célula. El objeto de los ensayos "in vivo" consiste en
determinar el efecto de un compuesto en un modelo animal de un
trastorno particular, por ejemplo de un cáncer.
Las líneas celulares idóneas para los ensayos de
injerto ajeno subcutáneo incluyen las células C6 (glioma, ATCC # CCL
107), células A375 (melanoma, ATCC # CRL 1619), células A431
(carcinoma epidermoide, ATCC # CRL 1555), células Calu 6 (pulmón,
ATCC # HTB 56), células PC3 (próstata, ATCC # CRL 1435), células
SKOV3TP5 y fibroblastos NIH 3T3 generados por ingeniería genética
para sobreexpresar los EGFR, PDGFR, IGF-1R y
cualquier otra quinasa a ensayar. El procedimiento siguiente puede
aplicarse para realizar los ensayos de injerto ajeno
(xenograft):
Se obtienen los ratones atímicos hembras (BALB/c,
nu/nu) de los Simonsen Laboratories (Gilroy, CA). Se mantienen todos
los animales en condiciones de recinto limpio en jaulas
microaislantes con lecho Alpha-dri. Reciben pienso
estéril para roedores y agua a discreción.
Se cultivan las líneas celulares en un medio
apropiado (por ejemplo MEM, DMEM, Ham's F10 o Ham's F12 más 5% - 10%
de suero fetal bovino (FBS) y glutamina 2 mM (GLN)). Todos los
medios de cultivo, la glutamina y el suero fetal bovino se adquieren
en Gibco Life Technologies (Grand Island, NY), a menos que se
indique lo contrario. Todas las células se cultivan en atmósfera
húmeda con un 90-95% de aire y un
5-10% de CO_{2} a 37ºC. Todas las líneas
celulares se subcultivan de modo rutinario dos veces por semana y
son negativas en cuanto a microplasma, según resulta del método
Mycotest (Gibco).
Se recolectan las células en o casi en
confluencia con tripsina al 0,05% en EDTA y se convierten en
perdigones o culotes por centrifugación a 450 rpm durante 10 min. Se
resuspenden los perdigones en PBS estéril o en medio (sin FBS) hasta
una concentración concreta y se implantan las células en la ijada
trasera de los ratones (8-10 ratones por grupo,
2-10 x 10^{6} células/animal). Se mide el
crecimiento tumoral después de 3-6 semanas
empleando calibres Venier. Se calculan los volúmenes de los tumores
como producto de longitud x anchura x altura, a menos que se
indique lo contrario. Los valores P se calculan utilizando el test t
de Student. Se administran los compuestos a ensayar en
50-100 \mul de excipiente (DMSO o VPD:D5W) por
inyección i.p. en diferentes concentraciones, empezando por lo
general el día uno después de la implantación.
Se ha desarrollado el siguiente modelo de
invasión tumoral que puede utilizarse para la evaluación del valor
terapéutico y de la eficacia de los compuestos identificados para
inhibir selectivamente el receptor KDR/FLK-1.
Como animales experimentales se emplean ratones
desnudos (= sin pelo) hembras de 8 semanas de edad (Simonsen Inc.).
La implantación de las células tumorales se realiza en una campana
de flujo laminar. Para la anestesia se administra por vía
intraperitoneal un cóctel de xilazina/cetamina (100 mg/kg de
cetamina y 5 mg/kg de xilazina). Se practica una incisión central
para exponer la cavidad abdominal (una longitud de aproximadamente
1,5 cm) para inyectar 10^{7} células tumorales en un volumen de
100 \mul de medio. Se inyectan las células ya sea en el lóbulo
duodenal del páncreas, ya sea debajo de la membrana serosa del
colon. Se cierran el peritoneo y los músculos con una sutura
continua de seda 6-0 y se cierra la piel empleando
grapas de heridas. Los animales se observan diaria-
mente.
mente.
Después de 2-6 semanas, en
función de las observaciones de los animales a simple vista, se
sacrifican los ratones y se extirpan por incisión las metástasis
tumorales locales de varios órganos (pulmón, hígado, cerebro,
estómago, bazo, corazón, músculos) y se analizan (mediciones del
tamaño del tumor, grado de invasión, inmunoquímica e hibridación
"in situ").
Los compuestos terapéuticos deberían ser más
potentes en inhibir la actividad de la
proteína-quinasa que en ejercer un efecto
citotóxico. Una medición de la eficacia y de la toxicidad celular de
un compuesto puede realizarse determinando el índice terapéutico:
IC_{50}/LD_{50}. La IC_{50}, la dosis requerida para lograr
una inhibición del 50%, puede medirse empleando técnicas estándar,
como las descritas anteriormente. La LD_{50}, la dosis que
provoca una toxicidad del 50%, puede medirse también por técnicas
estándar (ver Mossman, J. Immunol. Methods 65,
55-63, 1983), midiendo la LDH liberada (Korzeniewski
y Callewaert, J. Immunol. Methods 64, 313, 1983; Decker y
Lohmann-Matthes, J. Immunol. Methods 115, 61,
1988), o bien midiendo la dosis letal en modelos animales. Son
preferidos los compuestos que tienen un índice terapéutico grande.
El índice terapéutico debería ser mayor que 2, con preferencia por
lo menos 10, con preferencia especial por lo menos 50.
Se habrá observado, pues, que los compuestos y
las composiciones farmacológicas de la presente invención son
eficaces para modulas la actividad de la PK y, por lo tanto, se
espera que sean eficaces como agentes terapéuticos contra los
trastornos relaciones con las RTK, las CTK y las STK.
Claims (10)
1. Una 2-indolinona que tiene la
estructura química:
\vskip1.000000\baselineskip
en la
que
A^{2} y A^{4} son nitrógeno y A^{1} y
A^{3} son carbono o bien A^{1} y A^{3} son nitrógeno y
A^{2} y A^{4} son carbono, dando por supuesto que si A^{1},
A^{2}, A^{3} y A^{4} es nitrógeno, entonces no existe R^{3},
R^{4}, R^{5} y R^{6}, respectivamente;
R^{1} se elige entre el grupo formado por
hidrógeno; alquilo C1-C10, cicloalquilo, alquenilo
C2-C10, alquinilo C2-C10, arilo,
heteroarilo, trihalometanocarbonilo, heteroalicíclico, hidroxi,
alcoxi C1-C10, C-carboxi,
O-carboxi, C-amido,
C-tioamido, guanilo, guanadinilo, ureidilo,
sulfonilo y trihalometanosulfonilo;
R^{2} se elige entre el grupo formado por
hidrógeno; alquilo C1-C10, cicloalquilo, arilo y
halógeno;
R^{3}, R^{4}, R^{5} y R^{6}, con
independencia entre sí, se eligen entre el grupo formado por
hidrógeno; alquilo C1-C10, trihalometilo,
cicloalquilo, alquenilo C2-C10, alquinilo
C2-C10, arilo, heteroarilo, heteroalicíclico,
hidroxi, tiohidroxi, alcoxi C1-C10, ariloxi,
tiohidroxi, tioalcoxi C1-C10, tioariloxi, sulfinilo,
sulfonilo, S-sulfonamido,
N-sulfonamido,
N-trihalometanosulfonamido, carbonilo, aldehído,
trihalometil-carbonilo, C-carboxi,
O-carboxi, ciano, nitro, halógeno, cianato,
isocianato, tiocianato, isotiocianato, O-carbamilo,
N-carbamilo, O-tiocarbamilo,
N-tiocarbamilo, fosfonilo, guanilo, guanadinilo,
ureidilo, C-amido, N-amido, amino,
amonio cuaternario, -NR^{18}R^{19};
R^{18} y R^{19}, con independencia entre sí,
se eligen entre el grupo formado por hidrógeno, alquilo
C1-C10, cicloalquilo, arilo, carbonilo, acetilo,
trihalometilcarbonilo, C-carboxi,
trihalometanosulfonilo, sulfonilo, C-peptidilo y,
juntos, forman un anillo heterocíclico de cinco o seis
eslabones;
Z es oxígeno;
Q es
J^{1} se elige entre el grupo formado por
oxígeno, nitrógeno y azufre;
J^{2}, J^{3} y J^{4}, con independencia
entre sí, se eligen entre el grupo formado por carbono, nitrógeno,
oxígeno y azufre, de tal manera que el anillo heteroarilo de cinco
eslabones sea uno ya conocido en la técnica química, dando por
supuesto además que si J^{2}, J^{3} o J^{4} es nitrógeno,
oxígeno o azufre, entonces no existe R^{8}, R^{8'} o R^{8''},
respectivamente; de igual manera, cuando J^{1} es oxígeno o
azufre, entonces R^{7} no existe;
R^{7} se elige entre el grupo formado por
hidrógeno, alquilo C1-C10, cicloalquilo,
trihalometilcarbonilo, arilo, guanilo, carboxilo, sulfonilo y
trihalometanosulfonilo;
uno de R^{8}, R^{8'} o R^{8''} es H o un
grupo -(alk_{1})rM; en el que (alk_{1}) es CH_{2}; r
es un número de 1 a 3, ambos incluidos; y M se elige entre el grupo
formado por hidroxi, amino, carboxi, morfolinilo, piperazinilo,
tetrazolilo, N-carbamilo,
O-carbamilo, S-sulfonamido,
N-sulfonamido, sulfonilo,
-S(O)_{2}OH y fosfonilo;
los dos restantes de R^{8}, R^{8'} o
R^{8''}, con independencia entre sí, se eligen entre el grupo
formado por:
hidrógeno;
alquilo C1-C4 sin sustituir;
alquilo C1-C4 sustituido por uno
o varios grupos elegidos entre halógeno, hidroxilo, alcoxi
C1-C4 sin sustituir, amino,
S-sulfonamido, -NR^{18}R^{19} o carboxi;
alcoxi C1-C4 sin sustituir;
alcoxi C1-C4 sustituido por uno o
varios halógenos;
arilo sin sustituir;
arilo sustituido por uno o varios grupos elegidos
entre alquilo C1-C4 sin sustituir; alcoxi
C1-C4 sin sustituir; halógeno; trihalometilo; amino;
-NR^{18}R^{19}; hidroxi y S-sulfonamido;
heteroarilo sin sustituir;
heteroarilo sustituido por uno o varios grupos
elegidos entre alquilo C1-C4 sin sustituir; alcoxi
C1-C4 sin sustituir; halógeno; hidroxi; alcoxi sin
sustituir; amino; y-NR^{18}R^{19};
heteroalicíclico sin sustituir;
heteroalicíclico sustituido por uno o varios
grupos elegidos entre alquilo C1-C4 sin sustituir;
halógeno; hidroxi; alcoxi sin sustituir; amino; y
-NR^{18}R^{19};
halógeno;
ciano;
carboxi; y
un anillo cicloalquilo, arilo, heteroarilo o
heteroalicíclico de seis eslabones, formado por combinación de
R^{8} y R^{8'} o de R^{8'} y R^{8''};
y las sales fisiológicamente aceptables de los
mismos;
y en la que:
alquilo C1-C10 está opcionalmente
sustituido por cicloalquilo sin sustituir, elegido entre el grupo
formado por ciclopropano, ciclobutano, ciclopentano, ciclopenteno,
ciclohexano, adamantano, ciclohexadieno, cicloheptano y
cicloheptatrieno; arilo sin sustituir, elegido entre el conjunto
formado por fenilo, naftalenilo y antracenilo; heteroarilo sin
sustituir, elegido entre el conjunto formado por pirrol, furano,
tiofeno, imidazol, oxazol, tiazol, pirazol, piridina, pirimidina,
quinolina, isoquinolina, purina y carbazol; heteroalicíclico sin
sustituir, elegido entre el conjunto formado por piperidina,
morfolina, piperazina, pirrolina, pirrolidina, dihidrotiofeno y
tetrahidrofurano; hidroxi; alcoxi C1-C4; ariloxi;
tiohidroxi; tioalcoxi C1-C4; tioariloxi; ciano;
halógeno; carbonilo; tiocarbonilo; O-carbamilo;
N-carbamilo; O-tiocarbamilo;
N-tiocarbamilo; C-amido;
N-amido; C-carboxi;
O-carboxi; cianato; isocianato; tiocianato;
isotiocianato; nitro; sililo; amino y -NR^{18}R^{19}, en el que
R^{18} y R^{19} se eligen con independencia entre sí entre el
conjunto formado por hidrógeno, alquilo C1-C4 sin
sustituir, cicloalquilo sin sustituir, ya definido antes, arilo sin
sustituir, ya definido antes, carbonilo, trihalometilcarbonilo,
C-carboxi, trihalometilsulfonilo, sulfonilo y,
juntos, forman un anillo heteroalicíclico de cinco o de seis
eslabones, ya definido antes;
cicloalquilo se elige entre el conjunto formado
por ciclopropano, ciclobutano, ciclopentano, ciclopenteno,
ciclohexano, adamantano, ciclohexadieno, cicloheptano y
cicloheptatrieno; y está opcionalmente sustituido por alquilo
C1-C4 sin sustituir; arilo sin sustituir, ya
definido antes; heteroarilo sin sustituir, ya definido antes; un
heteroalicíclico sin sustituir, ya definido antes; hidroxi; alcoxi
C1-C4; ariloxi; tiohidroxi; tioalcoxi
C1-C4; tioariloxi; ciano; halógeno; carbonilo;
tiocarbonilo; carboxi; O-carbamilo;
N-carbamilo; C-amido;
N-amido; nitro; amino y -NR^{18}R^{19}, en el
que R^{18} y R^{19} tienen los significados definidos
anteriormente; alquenilo C2-C10 está opcionalmente
sustituido del modo indicado anteriormente para alquilo
C1-C10;
alquinilo C2-C10 está
opcionalmente sustituido del modo indicado anteriormente para
alquilo C1-C10;
arilo se elige entre el conjunto formado por
fenilo, naftalenilo y antracenilo; y está opcionalmente sustituido
por halógeno; trihalometilo; alquilo C1-C4 sin
sustituir; arilo sin sustituir, ya definido antes; heteroarilo sin
sustituir, ya definido antes; heteroalicíclico sin sustituir, ya
definido antes; hidroxi; alcoxi C1-C4; ariloxi;
tiohidroxi; tioalcoxi C1-C4; tioariloxi; ciano;
nitro; carbonilo; tiocarbonilo; C-carboxi;
O-carboxi; O-carbamilo;
N-carbamilo; O-tiocarbamilo;
N-tiocarbamilo; C-amido;
N-amido; sulfinilo, sulfonilo;
S-sulfonamido; N-sulfonamido;
trihalometanosulfonamido; amino y -NR^{18}R^{19}, en el que
R^{18} y R^{19} tienen los significados definidos
anteriormente;
heteroarilo se elige entre el conjunto formado
por pirrol, furano, tiofeno, imidazol, oxazol, tiazol, pirazol,
piridina, pirimidina, quinolina, isoquinolina, purina y carbazol; y
está opcionalmente sustituido por alquilo C1-C4 sin
sustituir; cicloalquilo sin sustituir, ya definido antes; arilo sin
sustituir, ya definido antes; halógeno; trihalometilo; hidroxi;
alcoxi C1-C4; ariloxi; tiohidroxi; tioalcoxi
C1-C4; tioariloxi; ciano; nitro; carbonilo;
tiocarbonilo; sulfonamido; carboxi; sulfinilo; sulfonilo;
O-carbamilo; N-carbamilo;
O-tiocarbamilo; N-tiocarbamilo;
C-amido; N-amido; amino y
-NR^{18}R^{19}, en el que R^{18} y R^{19} tienen los
significados definidos anteriormente;
heteroalicíclico se elige entre el conjunto
formado por la piperidina, morfolina, piperazina, pirrolina,
pirrolidina, dihidrotiofeno y tetrahidrofurano; y está opcionalmente
sustituido por alquilo C1-C4 sin sustituir;
cicloalquilo sin sustituir, ya definido anteriormente; halógeno;
trihalometilo; hidroxi; alcoxi C1-C4; ariloxi;
tiohidroxi; tioalcoxi C1-C4; tioariloxi; ciano;
nitro; carbonilo; tiocarbonilo; carboxi;
O-carbamilo; N-carbamilo;
O-tiocarbamilo; N-tiocarbamilo;
sulfinilo; sulfonilo; C-amido;
N-amido; amino y -NR^{18}R^{19}, en el que
R^{18} y R^{19} tienen los significados definidos
anteriormente.
2. El compuesto o la sal de la reivindicación 1,
en el que R^{1} es hidrógeno.
3. El compuesto o la sal de la reivindicación 1,
en el que R^{2} es hidrógeno.
4. El compuesto o la sal de la reivindicación 1,
en el que R^{7} es hidrógeno.
5. El compuesto o la sal de una cualquiera de las
reivindicaciones de 1 a 4, en el que R^{3}, R^{4}, R^{5} y
R^{6}, con independencia entre sí, se eligen entre el conjunto
formado por:
hidrógeno;
alquilo C1-C4 sin sustituir;
alquilo C1-C4 sustituido por un
resto elegido entre el conjunto formado por cicloalquilo sin
sustituir, halógeno, hidroxi, alcoxi C1-C4 sin
sustituir, C-carboxi, arilo sin sustituir,
heteroarilo sin sustituir, heteroalicíclico sin sustituir, amino,
amonio cuaternario y -NR^{18}R^{19};
cicloalquilo sin sustituir;
hidroxi;
alcoxi C1-C4 sin sustituir;
alcoxi C1-C4 sustituido por un
resto elegido entre el conjunto formado por uno o varios grupos
halógeno, arilo sin sustituir y heteroarilo sin sustituir;
trihalometilo;
halógeno;
arilo sin sustituir;
arilo sustituido por uno o varios restos elegidos
con independencia entre sí entre el conjunto formado por alquilo
C1-C4 sin sustituir; alquilo C1-C4
sustituido por uno o varios restos halógeno; trihalometilo;
halógeno; hidroxi; y alcoxi C1-C4 sin sustituir;
ariloxi sin sustituir;
ariloxi sustituido por uno o varios grupos
elegidos con independencia entre sí entre el conjunto formado por
halógeno; alquilo C1-C4 sin sustituir; alquilo
C1-C4 sustituido por uno o varios restos halógeno;
arilo sin sustituir; hidroxi; alcoxi C1-C4 sin
sustituir; amino y -NR^{18}R^{19};
S-sulfonamido;
heteroarilo sin sustituir;
heteroarilo sustituido por uno o varios restos
elegidos con independencia entre sí entre el conjunto formado por
hidrógeno; alquilo C1-C4 sin sustituir; alquilo
C1-C4 sustituido por uno o varios restos halógeno;
trihalometilo; halógeno; hidroxi, alcoxi C1-C4 sin
sustituir; ariloxi sin sustituir; amino;
S-sulfonamido y -NR^{18}R^{19};
heteroalicíclico sin sustituir;
heteroalicíclico sustituido por uno o varios
restos elegidos con independencia entre sí entre el conjunto formado
por alquilo C1-C4 sin sustituir; alquilo
C1-C4 sustituido por uno o varios restos halógeno;
(alquilo C1-C4 sin
sustituir)-alcoxi; hidroxi; amino;
S-sulfonamido o -NR^{18}R^{19};
(alquilo C1-C4 sin
sustituir)-C-carboxi;
ácido carboxílico;
(alquilo C1-C4 sin
sustituir)-carbonilo;
aldehído;
(arilo sin
sustituir)-carbonilo;
acetilo;
S-sulfonamido;
N-sulfonamido;
amino; y
-NR^{18}R^{19}.
6. El compuesto o la sal de una cualquiera de las
reivindicaciones de 1 a 5, en el que cualquier par R^{8}, R^{8'}
y R^{8''} son restos -(alk_{1})rM.
7. El compuesto o la sal de una cualquiera de las
reivindicaciones de 1 a 6, en el que J^{1} se elige entre el
conjunto formado por nitrógeno, oxígeno y azufre y J^{2}, J^{3}
y J^{4} son carbono.
8. El compuesto o la sal de una cualquiera de las
reivindicaciones de 1 a 6, en el que J^{1} y J^{3} son nitrógeno
y J^{2} y J^{4} son carbono.
9. Una composición farmacéutica que contiene un
compuesto o una sal según una cualquiera de las reivindicaciones de
1 a 8 y un excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable.
10. El uso de un compuesto según una cualquiera
de las reivindicaciones de 1 a 8 para la fabricación de un
medicamento destinado al tratamiento de una enfermedad elegida entre
un cáncer elegido entre el grupo formado por un carcinoma celular
escamoso, un astrocitoma, un glioblastoma, un cáncer de mama, un
glioma, un melanoma, un cáncer de pulmón, un cáncer de pulmón de
células pequeñas, un cáncer de vejiga, un cáncer de ovarios, un
cáncer de próstata, un cáncer de cabeza o de cuello; un trastorno
proliferante elegido entre el conjunto formado por una restinosis,
una fibrosis, una psoriasis, una osteoartritis y una artritis
reumatoide; una diabetes, una enfermedad autoinmune, un trastorno
inflamatorio y una angiogénesis.
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