NO318083B1 - Pyrrolsubstituert 2-indolinon protein kinase inhibitorer - Google Patents

Pyrrolsubstituert 2-indolinon protein kinase inhibitorer Download PDF

Info

Publication number
NO318083B1
NO318083B1 NO20005916A NO20005916A NO318083B1 NO 318083 B1 NO318083 B1 NO 318083B1 NO 20005916 A NO20005916 A NO 20005916A NO 20005916 A NO20005916 A NO 20005916A NO 318083 B1 NO318083 B1 NO 318083B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
dimethyl
pyrrol
dihydroindol
oxindole
oxo
Prior art date
Application number
NO20005916A
Other languages
English (en)
Other versions
NO20005916D0 (no
NO20005916L (no
Inventor
Peng Cho Tang
Gerald Mcmahon
Li Sun
Original Assignee
Sugen Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sugen Inc filed Critical Sugen Inc
Publication of NO20005916D0 publication Critical patent/NO20005916D0/no
Publication of NO20005916L publication Critical patent/NO20005916L/no
Publication of NO318083B1 publication Critical patent/NO318083B1/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D403/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00
    • C07D403/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings
    • C07D403/06—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings linked by a carbon chain containing only aliphatic carbon atoms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D209/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D209/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom condensed with one carbocyclic ring
    • C07D209/04—Indoles; Hydrogenated indoles
    • C07D209/30—Indoles; Hydrogenated indoles with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, directly attached to carbon atoms of the hetero ring
    • C07D209/32—Oxygen atoms
    • C07D209/34—Oxygen atoms in position 2

Description

Foreliggende oppfinnelse omhandler generelt organisk<!>kjemi, biokjemi,
farmakologi og medisin. Mer spesielt omhandler den nye pyrrolsubstituerte 2-indolinonforbindelser, og deres fysiologisk akseptable salter og forløpermedikamenter, som modulerer aktiviteten til proteinkinaser ("PK'er"), og således er antatt å forevise en gangnende effekt på sykdommer relatert til unormal PK-aktivitet. ■
Følgende er fremlegges kun som bakgrunnsinformasjon og er ikke ment å skulle
være teknikkens stand i henhold til den foreliggende oppfinnelsen.
PK'er er enzymer som katalyserer fosforyleringen av hydroksygrupper på tyrosin,
serin og treoninrestene til proteiner. Konsekvensene av denne tilsynelatende enkle aktiviteten er overveldende; cellevekst, differensiering og proliferasjon, dvs. i virkeligheten er alle aspekter av en celles liv på én eller annen måte avhengig av PK-aktivitet. Videre har unormal PK-aktivitet blitt relatert til en rekke sykdommer,
som strekker seg fra relativt ikke-livstruende sykdommer såsom psoriasis, til ekstremt virulente sykdommer såsom glioblastom (hjernekreft).
PK'ene kan med fordel bli brutt ned i to klasser, proteintyrosinkinasene (PTK'er)
og serintreoninkinase (STK'er).
Ett av de viktigste aspektene ved PTK-aktivitet er deres involvering med vekstfaktorreseptorer. Vekstfaktorreseptorer er celleoverflateproteiner. Når disse er bundet av en vekstfaktorligand, blir vekstfaktorreseptorene omdannet til en aktiv form som intragerer med proteiner på den indre overflaten av en cellemembran.
Dette fører til fbsforylering på tyrosinrester på reseptoren og andre proteiner, og til dannelsen på innsiden av cellen av komplekser med ulike cytoplastiske signalmolekyler som, i sin rur, påvirker.fl ere cellulære responser såsom celledeling (proliferasjon), celledifferensiering, cellevekst, ekspresjon av metabolske effekter i forhold til det ekstracellulære mikromiljøet osv: For en mer fullstendig diskusjon,
se Schlessinger og Ullrich, Neuron, 9:303-391 (1992) som er inkorporert ved referanse, inkludert enhvert tegning, som om det skulle vært lagt frem i sin helhet heri.
Vekstfaktorreseptorer med PTK-aktivitet er kjent som reseptortyrosinkinaser
("RTK'er"). De omfatter en stor familie av transmembranreseptorer med ulik biologisk aktivitet. På det nåværende tidspunkt har minst nitten (19) distingte underfamilier med RTK'er blitt identifisert. Et eksempel på disse er underfamilien designert "HER" RTK'er, som inkluderer EGFR (epitelial vekstfaktorreseptor),
HER2, HER3 og HER4. Disse RTK'ene består av et ekstracellulært glykosylert ligandbindingsdomene, et transmembrandomene og et intracellulært cytoplasmisk katalytisk domene som kan fosforylere tyrosinrester på proteiner.
En annen RTK-underfamilie utgjøres av insulinreseptor (IR)!, inslulinlignende vekstfaktor I reseptor (IGF-IR) og insulinreseptorbeslektet reseptor (IRR). IR og IGF-IR interagerer med insulin, IGF-I og IGF-II for å danne en heterotetramer av
to fullstendig ekstracellulære glykosilerte a-subenheter og to p-subenheter som krysser cellemembranen, og som inneholder tyrosinkinasedomene.
Den tredje RTK-underfamilie blir referert til som den blodplateavledede vekstfaktorreseptor ("PDGFR")-gruppen, som inkluderer PDGFRa, PDGFRJ3,
CSFIR, c-kit og c-fms. Disse reseptorene består av glykosylerte ekstracellulære domener som er laget av et variabelt antall med immunglobulinlignende løkker, og et intracellulært domene hvori tyrosinkinasedomenet blir avbrutt av ikke-
beslektede aminosyresekvenser.
En annen gruppe som, som følge av sin likhet med PDGFR-underfamilien, noen ganger innbefattes i den sistnevnte gruppen, er fosterleverkinase ("flk")-reseptor-underfamilien. Denne gruppen er antatt å bestå av kinaseinskuddsdomene-reseptor føtal leverkinase-1 (KDR/FLK-1), fik-IR, flk-4 og fms-lignende tyrosinkinase 1
. (flt-1).
Et ytterligere medlem av tyrosinkinasevekstfaktor-reseptorfamilien er fibroblast-
. vekstfaktoren ("FGF")-reseptorsubgruppen. Denne gruppen består av fire
reseptorer, FGFR1-4, og syv ligander, FGF1-7. Selv om de fremdeles ikke er godt definert, synes det som om reseptorene består av et glykosylert ekstracellulært domene som inneholder et variabelt antall med immunglobulinlignende løkker, og
et intracellulært domene der tyrosinkinasesekvensen blir avbrutt av regioner med ikke-beslektede aminosyresekvenser.
Enda et annet medlem av tyrosinkinase vekstfaktor-reseptorfamilien er den
vaskulære endotelvekstfaktor ("VEGF") reseptorsubgruppen. VEGF er et dimer-glykoprotein som ligner PDGF, men som har ulike biologiske funksjoner og målcellespesifisitet in vivo. Spesielt er VEGF på det nåværende tidspunkt antatt å spille en essensiell rolle i vaskulogenese og angiogenese.
En mer fullstendig opplisting av de kjente RTK-underfamiliene er beskrevet i Plowman et al., DN& P. 7(6):334-339 (1994), som herved er inkorporert ved
referanse, inkludert enhver tegning, som om den var fullstendig lagt frem heri.
I tillegg til RTK'ene, eksisterer det også en familie med utelukkende intracellulære PTK'er kalt "ikke-reseptortyrosinkinaser" eller "cellulære tyrosinkinaser". Denne sistnevnte betegnelsen, forkortet "CTK" vil bli benyttet heri. CTK'er inneholder ikke ekstracellulære og transmembrane domener. På det nåværende tidspunkt har over 24 CTK'er i 11 underfamilier (Src, Frk, Btk, Csk, Abl, Zap70, Fes, Fps, Fak,
Jak og Ack) blitt identifisert. Src-underfamilien synes så langt å være den største gruppen av CTK'er, og inkluderer Src, Yes, Fyn, Lyn, LckJ Blk, Hek, Fgr og Yrk. For en mer detaljert diskusjon av CTK'er, se Bolen, Oncogene. 8:2025-2031
(1993), som er inkorporert ved referanse, inkludert enhver tening, som om den var . lagt frem i sin helhet heri.
Serin/treoninkinasene, STK'er er, på samme måte som CTK'éne, hovedsakelig" intracellulære, selv om det er noen få reseptbrkinaser av STK-typen. STK'er er de . mest vanlige av de cytosoliske kinasene; dvs. kinaser som utfører sin funksjon i den delen av cytoplasmaen som er forskjellig fra de cytoplasmiske organellene og cytoskjelettet. Cytosolen er regionen inne i cellen der mye av cellens intermediære metabolske og biosyntetiske aktivitet finner sted; f.eks. er det i cytosol at proteiner blir syntetisert på ribosomer.
RTK'er, CTK'er og STK'er har alle vært implisert i en rekke patogene tilstander inkludert, spesielt, kreft. Andre patogene tilstander som har vært assosiert med PTK'er inkluderer, uten begrensning, psoriassis, hepatisk kirose, diabetes, angiogenese, restenose, øyensykdommer, reumatoid artritt og andre inflammatoriské sykdommer, immunologiske sykdommer såsom autoimmun sykdom, kardiovasku-lær sykdom såsom arterosklerose og flere ulike nyresykdommer.
Med hensyn til kreft, er to av hovedhypotesene for å forklare den overdrevne, cellulære proliferasjonen som fører til tumorutvikling, relatert til funksjoner som er kjent å være PK-regulert. Det vil si det har vært antydet at malign cellevekst er et resultat av nedbrytning i mekanismene som kontrollerer celledeling og/eller differensiering. Det har blitt vist at proteinproduktene av et antall proto-onkogener er involvert i signaltransduksjonsveiene som regulerer cellevekst og differensiering. Disse proteinproduktene fra proto-onkogener inkluderer ekstracellulære vekstfaktorer, transmembran vekstfaktor PTK-reseptorer (RTK'er), cytoplasmiske
. PTK'er (CTK'er) og cytosoliske STK'er, diskutert over.
I lys av koblingen som synes å være mellom PK-relaterte cellulære aktiviteter og flere ulike humane sykdommer, er det ingen overraskelse at det har vært lagt stor vekt på et forsøk på å identifisere veier for å modulere PK-aktivitet. Noen av disse har involvert etterliknende tilnærminger som benytter store molekyler som har mønster etter de som er involvert i den aktuelle, cellulære prosessen (f.eks. mutant-ligander (U.S. App. nr. 4 966 849); løselige reseptorer og antistoffer (søknad nr. WO 94/10202, Kendall og Thomas, Proe. Nat' 1 Acad. Sei., 90:10705-09 (1994), Kim, et al., Nature. 362:841-844 (1993)); RNA-ligander (Jelinek, et al., Biochemistrv. 33:10450-56); Takano, et al.. Mol. Bio. Cell 4:358A (1993): Kinsella, et al., Exp. Cell Res. 199:56-62 (1992); Wright, et al., J. Cellular Phvs.. 152:448-57) og tyrosinkinaseinhibitorer (WO 94/03427; wo 92/21660; wo 91/15495; wo 94/14808; US pat. nr. 5 330 992; Mariåni, et al., Proe. Am. Assoc. Cancer Res.. 35:2268 (1994)).
I tillegg til ovennevnte, har det vært gjort forsøk på å identifisere små molekyler
som fungerer som PK-inhibitorer. F.eks. har bismonosyklisk, bissyklisk og heterosykliske arylforbindelser(PCT WO 92/20642), vinylenazaindolderivater (PCT WO 94/14808) og l-syklopropyl-4-pyridylquinoloner (US pat. nr. 5 330 992) blitt beskrevet som tyrosinkinaseinhibitorer. Styrylforbindelser (US pat. nr. 5 217 999), styrylsubstituerte pyridylforbindelser (US pat. nr. 5 302 606), quinazo-linderivater (EP søknad nr. 0 566 266 Al), selenaindoler og selenider (PCT WO 94/03427), trisyklisk polyhydroksyforbindelser (PCT WO 92/21660) og bezylfos-fosyreforbindelser (PCT WO 91/15495) har alle vært beskrevet som PTK-inhibitorer som er. nyttige i behandlingen av kreft.
Våre egne forsøk på å identifisere små organiske molekyler som modellerer PK-aktivitet, og som derfor antas å være nyttige i behandlingen og forhindringen av sykdommer sorri involverer unormal PK-aktivitet, har ført oss til oppdagelsen av en familie med nye pyrrolsubstituerte 2-indolinonforbindelser som viser PK-modulér-ende evne, og derved er antatt å ha en gangnende effekt mot sykdommer relatert til unormal PK-aktivitet; det er disse forbindelsene som er temaet for denne oppfinnelsen.
Således omhandler den foreliggende oppfinnelsen generelt nye pyrrolsubstituerte 2-indolinoner som modulerer aktiviteten til reseptortyrosinkinaser (RTK'er), ikke-reseptorproteintyrosinkinaser (CTK'er) og serin/treoninproteinkinaser (STK'er). I tillegg omhandler den foreliggende oppfinnelsen fremstillingen og anvendelse av . farmasøytiske sammensetninger av de fremlagte forbindelsene, og deres fysiolog-
iske akseptable salter og forløpermedikamenter, i behandlingen eller hindringen av
PK-drevede sykdommer såsom, f.eks. og ikke begrenset til, kreft, diabetes,
hepatisk kirose, kardiovaskulære sykdommer såsom aterosklerose, angiogenese, immunologiske sykdommer såsom autoimmune sykdommer og nyresykdommer.
Begrepet "2-indolinon", indolin-2-on og "2-oksindol" blir benyttet om hverandre
heri for å referere til ef molekyl som har den kjemiske strukturen:
En "pyrrol" refererer til et molekyl som har den kjemiske strukturen:
"Pyrrolsubstituert 2-indolinon" og "3-pyrroIidenyl-2-indolinon" blir benyttet om hverandre heri for å referere til en kjemisk forbindelse som har den generelle strukturen vist i formel 1.
En "farmasøytisk sammensetning" refererer til en blanding av én eller flere av forbindelsene beskrevet heri, eller fysiologiske akseptable salter eller forløpermedikamenter derav, med andre kjemiske komponenter, såsom fysiologiske akseptable bærere og tilsetningsstoffer. Hensikten med en farmasøytisk sammensetning er å forenkle administreringen av en forbindelse til en organisme.
Et "forløpermedikament" refererer til et agens som blir omdannet til det aktuelle (parent) medikamentet in vivo. Forløpermedikamenter er ofte nyttige fordi de i noen situasjoner kan være enklere å administrere enn de aktuelle medikamenter. De kan f.eks. være biotilgjengelige ved oral administrering, mens det aktuelle medikamentet ikke er det. Forløpermedikamentet kan også har forbedret løselighet i farmasøytiske sammensetninger i forhold til foreldremedikamentet. Et eksempel, uten begrensning, på et forløpermedikament vil være en forbindelse i henhold til den foreliggende oppfinnelsen som blir administrert som en ester ("forløper-medikamentet") for å forenkle overgangen over cellemembranen, der vannløselig-het er bestemmende for mobilitet, men deretter blir metabolsk hydrolysert til karboksylsyren, den aktive enheten, straks den er på innsiden av cellen der vannløseligheten er en fordel.
Et annet eksempel på et forløpermedikament kan være et kort polypeptid, f.eks. og uten begrensning, et 2-10 aminosyrepolypeptid, bundet gjennom en terminal aminogruppe til en karboksygruppe på en forbindelse i henhold til oppfinnelsen, hvori polypeptidet blir hydrolysert eller metabolisert in vivo for å frigi det aktive molekylet.
Et "pyrrolaldehyd" refererer til et molekyl som har den kjemiske strukturen:
Som benyttet heri refererer en "fysiologisk akseptabel bærer" seg til en bærer eller fortynningsmiddel som ikke forårsaker signifikant irritasjon for en organisme, og som ikke motvirker den biologiske aktiviteten og egenskapene til den administrerte forbindelsen.
Et "tilsetningsstoff'. refererer til en inert substans som tilsettes en farmasøytisk sammensetning for ytterligere å forenkle administreringen av en forbindelse. Eksempler uten begrensning, på tilsetningsstoffer inkluderer kalsiumkarbonat, kalsiumfosfat, ulike sukker og typer av stivelse, cellulosederivater, gelatin, vegetabilske oljer og polyetylenglykoler.
1. KJEMI
Generelle strukturelle trekk.
I ett aspekt omhandler den foreliggende oppfinnelsen pyrrolsubstituert 2-indolinonér som, i tillegg til å være på annen måte eventuelt substituert på begge pyrrolene og 2-indolinondelene av forbindelsen, nødvendigvis er substituert på . pyrrolenheten med én eller flere hydrokarbonkjeder som i seg selv er substituert med minst én polar gruppe. Fysiologisk akseptable salter og forløpermedikamenter av de krevde forbindelsene er også innenfor omfanget til denne oppfinnelsen.
En "hydrokarbonkjede" refererer til en alkyl, alkényl eller alkynylgruppe som definert heri.
En "polar"-gruppe refererer til en gruppe hvori kjernen til atomene som er kovalent bundet til hverandre for å danne gruppen, ikke deler elektronene i de kovalente . bindingene men deler dem likt; dvs. at elektronskyen er tettere omkring ett atom enn et annet. Dette resulterer i at én ende av den kovalente bindingen/bindingene er relativt negativ, og den andre enden er relativt positiv; dvs. det er en negativ pol og en positiv pol. Eksempler på polare grupper inkluderer, uten begrensning, hydroksy, alkoksy, karboksy, nitro, cyano, amino, ammonium, amido, ureido, sulfonamido, sulfinyl, sulfonyl, fosfono, morfolino, piperazinyl og tetrazolo.
Selv om de ikke ønsker å være bundet av noen spesiell teori, antar søkerne på dette tidspunktet åt de polare gruppene kan interagere elektronisk, f.eks., men uten begrensning, via hydrogenbindinger, Van'der Walls krefter og/eller ionebindinger (men ikke kovalente bindinger), med aminosyrer på det PTK-aktive setet. Disse interaksjonene kan åssisetere molekylene i henhold til oppfinnelsen til å binde til et aktivt sete med tilstrekkelig fasthet for å interferere med, eller hindre, det naturlige substratet frå å entre setet. Polare grupper kan også bidra til selektiviteten til forbindelsene; dvs. en polar gruppe kan ha større affinitet for et PTK-bindings-domene enn andre polare grupper, slik at forbindelsen som inneholder den første spesielle polare gruppen er mer potent enn forbindelsene som inneholder de andre polare gruppene.
Således omhandler et aspekt ved den foreliggende oppfinnelsen pyrrolsubstituerte 2-indolinonforbindelser som har den følgende kjemiske strukturen:
hvori:
R<1> , R2 og R7 er hydrogen; R<3> er H, Ci-C6-alkyl, eventuelt substituert med OH; R<4 >og R<5> er uavhengig valgt fra gruppen som består av hydrogen; aminsulphonyl eventuelt substituert med Ci-Cg-alkyl; hydroksy; Ci-C6-alkoksykarbonyl; halo; usubstituert Ci-Cé-alkyl; Ci-Cé-alkyl substituert med karboksy; usubstituert Cj-C6-alkoksy; karboksy; usubstituert fenyl; fenyl substituert med en eller flere usubstituerte Ci-C6-alkylalkoksy; morfolin; eller morfolinylsulfonyl; R<6> er hydrogen; R<8> er H eller Ci-C6-alkyl; R<*> er -(CH2)(CH2)-C(=0)OH; morfolinyl eller
■di-Cj-Ce-alkylamin; R<!0> er usubstituert Cj-Ce-alkyl.
I et foretrukket aspekt ved den foreliggende oppfinnelse har den pyrrolsubstituerte 2-indolinonforbindelsen følgende formel kalt 3-[2,4-dimetyl-5-(2-okso-l,2-dihydroindol-3-yliden^ yl]propionsyre.
I et annet aspekt ved den foreliggende oppfinnelse er fortrinnsvis R<3> hydrogen eller Cj-Ce-alkyl, eventuelt substituert med OH; R4 og R<5> er uavhengig valgt fra gruppen bestående av hydrogen, halo, usubstituert Ci-Ce alkyl, Ci-Ce alkyl substituert méd karboksy, usubstituert Ci-C6-alkoksy, fenyl substituert med en eller flere usubstituerte Ci-Ce-alkylalkoksy, morfolin eller morfolinylsulfonyl; og R6 er hydrogen.
I ytterligere et annet aspekt er fortrinnsvis R hydrogen eller C1-C6 - alkyl,
eventuelt substituert med OH; R<4>og R<5> ér uavhengig valgt fra gruppen bestående av
hydrogen, halo, usubstituert C1-C6 -alkyl, fenyl substituert med en eller flere usubstituerte Ci-C6-alkoksygrupper, aminsulfonyl substituert med C1-C6 -alkyl; og R<6> er hydrogen.
Forbindelsene i følge oppfinnelsen er i enda et annet aspekt ved oppfinnelsen valgt fra gruppen bestående av: 3-[5-(5-Klor-2-okso-1,2-dihydroindol-3-yiidenmetyl)-2,4-dimetyl-l H-pyrrol-3-yl]-propionsyre,
3-[2,4-Dimetyl-5-(2-okso-l,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-lH-pyrrol-3-yl]-propionsyre,
3-[5-(5-Brom-2-okso-l,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-yl]-propionsyre,
3-[5-(5-Iod-2-okso-l,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-yl]-propionsyre,
3-[2,4-Dimetylr5-(4-metyl-2-okso-l,2-dihydroindol-3-ylidermietyl)-lH
yl]-propionsyre,
3-[2,4-DimetyI-5-(5-metyl-2-okso-l,2-dihydroindol-3^
ylj-propionsyre,
3-[5-(6-Hydroksy-2-okso-l,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-2,4-dirnetyl-lH-pyiTol-3-yl]-propionsyre,
3-[5-(6-Metoksy-2-okso-1,2-dihydrdindol-3-ylidenmetyl)-2,4-dirnetyl-1 H-pyrrol-3-yl]-propionsyre,
3-{5-[6-(3-Metoksyfenyl)-2-okso-l,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl]-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-yl}-propionsyre,
3-{5-[6-(3-Etoksyfenyl)-2-okso-l,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl]-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-yl}-propionsyre,
3-[2,4-Dimetyl-5-(2-okso-6-fenyl-l12-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-lH-pyrrol-3-yl]-propionsyre,
3- {5-[6-(4-Metoksyfenyl)-2-okso-1,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl]-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-yl}-propionsyre,
3-{5-[6-(2-Metoksyfenyl)-2-okso-l}2-dihydroindol-3-ylidenmetyl]-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-yl}-propionsyre,
3-[2,4-DimetyI-5-(6-morfolin-4-yl-2-o"kso-l ,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl) -1H-pyrrol-3-yl]-propionsyre, og 3-[5-Klor-4-metyI-2-okso-l,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-yl] -propionsyre.
Ytterligere foretrukne fororbindelser er valgt fra gruppen bestående av: 3-[3,5-Dimetyl-4-(3-morfolin-4-ylpropyl)-lH-pyrrol-2-ylmetylen]-l,3-dihydroindol-2-on
5-Brom-3-[3,5-dimetyI-4-(3-morfolin-4-ylpropyl)-lH-pyrrol-2-ylmetylen]-l,3-dihydroindol-2-on
3-[3,5-Dimetyl-4-(3-morfolin-4-ylpropyl)-lH-pyrrol-2-ylrnetylen]-6-fenyl-l,3-dihydroindol-2-on
3-[3,5-Dimetyl-4-(3-morfolih-4-ylpropyl)-1 H-pyrrol-2-ylmetylen]-6-(2-methoksyfenyl)-1,3-dihydroindol-2-on
3-[3,5-Dimetyl-4-(3-morfolin-4-ylpropyl)-lH-pyrrol-2-ylmetylen]-6-(3-metoksyfenyl)-1,3-dihydroindol-2-on
3-[3,5-Dimetyl-4-(3-morfolin-4-ylpropyl)-lH-pyrrol-2-ylmetylen]-6-(4-metoksyfehyl)-1,3-dihydroindol-2-on
3-[4-(3-Dimetylaminpropyl)-3,5-dimetyl-lH-pyrrol-2-ylmetylen]-l,3-dihydroindol-2- on
5-Brom-344-(3-dimetylamihpropyl)-3,5-dimetyl-lH-pyrrol-2-ylmetylen^
dihydroindol-2-on
3- [4-(3-Dimetyiaminpropyl)-3,5-dimctyl-lH-pyrrol-2-ylmetylen]-6-fenyl-l,3-dihydroindol-2-on
3-[4-(3-Dimetylaminpropyl)-3,5-dimetyl-1 H-pyrrol-2-ylmctylen]-6-(2-metoksyfenyl)-1,3-dihydroindol-2-on
3-[4-(3-Dimetylaminpropyl)-3,5-dimetyl-1 H-pyrrol-2-ylmetylee]-6-(3-metoksyfenyl)-l,3-dihydroindoI-2-on
3-[4-(3-Dimetylaminpropyl)-3,5-dimetyl-lH-pyrTol-2-ylmetylen]-6-(4'-metoksyfenyl)-1,3-dihydroindol-2-on
5- Klor-3-[4-(3-dimetylaminpropyl)-3,5-dimetyl-lH-pyrrol-2-ylmetylen]-l,3-dihydroindol-2-on
6- Klor-3-[4-(3-dimetylaminpro^
dihydroindol-2-on
3-[4-(3-Dimetylaminpropyl)-3,5-dimetyl-lH-pyrrol-2-ylmetylen]-5-metoksy-l,3-dihydroindol-2-on
3-[4-(3-Dimetylaminpropyl)-3,5-dimetyl-lH-pyrrol-2-ylmetylen]-6-metoksy-l,3-dihydroindol-2-on
3-[4-(3-Dimetylaminpr6pyl)-3,5-dimetyl-lH-pyrrol-2-yl^
dihydroindol-2-on
3-[4-(3-Dimetylaminpropyl)-3,5-dimetyl-l H-pyrrol-2-ylmetylen]-4-metyl-l ,3-dihydroindol-2-on
3-[4-(3-Dimetylaminpropyl)-3,5-dimetyi-lH-pyrrol-2-ylmetylen]-4-(2-hydroksyetyl)-l ,3-dihydroindol-2-on
3-[4-(3-Dimetylaminpropyl)-3,5-dimetyl-lH-pyrrol-2-ylrnetylen]-2-okso-2,3-dihydro-1 H-indole-5-sulfonsyréamide
3-[4-(3-Dimetylaminpropyl)-3,5-dimetyl-lH-pyiTol-2-ylmetylen]-2-okso-2,3-dihydro-1 H-indole-5-sulfonsyre isopropylamid
3-[4-(3-Dimetylaminpropyl)-3,5-dimetyl-lH-pyrroI-2-ylmetylen]-5-(morfoH
sulfonyI)-l,3-dihydroindol-2-on, og
3-[4-(3-Dimetylaminpropyl)-3,5-dimetyl-lH-pyrrol-2-ylmetylen]-2-okso-2,3-di hydro -1 H-indo 1 e-5 -sul fonsyredimetyl ami d.
I enda et annet aspekt ved den foreliggende oppfinnelse tilveiebringes et farmasøytisk preparat omfattende en forbindelse ifølge oppfinnelsen og en fysiologisk akseptabel bærer eller eksipient.
Den foreliggende oppfinnelse angår videre en anvendelse av en terapeutisk effektiv mengde av en forbindelse i følge oppfinnelsen til fremstilling av et medikament for behandling av en proteinkinaserelatert tilstand i en organisme..Fortrinnsvis er nevnte proteinkinaserelaterte tilstand er valgt fra gruppen av en reseptortyrosinrelatert tilstand, en ikke-reseptortyrosinkinase tilstand og en en serintreoninkinaserelatert tilstand. Mer foretrukket er nevnte proteinkinaserelaterte tilstand er valgt fra gruppen bestående av en EGFR-relatert tilstand, en PGFR-relatert tilstand og IGFR-relatert tilstand og en fik- relatert tilstand. I enda et annet aspekt ved den foreliggende oppfinnelse er nevnte proteinkinaserelaterte tilstand er valgt fra gruppen bestående av gruppen en squamouscellekarcinom, astrocytom, Kaposi's sarcom, glioblastom, lungekreft, blærekreft, hode- og nakkekreft, melanom, eggstokk-kreft, prostatakreft, brystkreft, liten celle ("small ceH")-lungekreft, gliom,
colorectal kreft, genitourinær kreft og gastrointestinal kreft.
I ytterligere et annet aspekt er nevnte protein kinaserelaterte tilstand er valgt fra gruppen bestående av diabetes, en hyperprolifererende tilstand, angiogeneser, en inflammatorisk tilstand, en immunologisk tilstand og en kardiovasculær tilstand,, mer foretrukket valgt fra gruppen bestående av diabetes, en hyperprolifereringstilstand, angiogeneser, en inflammatorisk tilstand, en immunologisk tilstand, og en kardiovasculær tilstand.-
I ytterligere et annet aspekt ved oppfinnelsen anvendes en terapeutisk effektiv mengde av en forbindelse i følge oppfinnelsen til fremstilling av et medikament for behandling.av en proteinkinaserelatert tilstand i en organisme, hvori nenvte organisme er et pattedyr, fortrinnsvis et menneske. Nevnte hyperprolifererende tilstand er fortrinssvis valgt fra gruppen bestående a<y> restenose, fibrose og psoriasis. Nevnte inflammatoriske tilstand er fortrinnsvis valgt fra gruppen bestående av osteoartritt og reumatoid artritt.
Videre er nevnte immunologiske tilstand en autoimmun tilstand. Som benyttet heri refererer begrepet "alkyl" til et mettet alifatisk hydrokarbon inkludert rettkjedede og forgrenede kjedegrupper. Fortrinnsvis har alkylgruppen 1-6 karbonatomer (når det er et nummerisk område; f.eks. "1-6", som blir nevnt heri, betyr det at gruppen,
i dette tilfellet alkylgruppen, kan inneholde 1 karbonatom, 2 karbonatomer, 3
karbonatomer osv. opptil og inkludert 6 karbonatomer). Alkylgruppen kan være substituert eller usubstituert. Når den er substituert er substituentgruppen(e)
fortrinnsvis én eller flere individuelt valgt fra hydroksy, alkoksy, karbonyl, amin.
En "hydroksy"-gruppe refererer til en -OH gruppe.
En "karbonyl"-gruppe refererer til en -C(=0)-R"-gruppe, der R" er valgt fra gruppen som består av hydrogen, alkyl, sykloalkyl, aryl, heteroaryl, (bundet via et ringkarbon) og heteroalisyklisk (bundet via et ringkarbon), som definert heri.
En "sulfonyI"-gruppe refererer til en -S(=0)2R"-gruppe hvori, i tillegg til å være som definert over, R" også kan være en hydroksygruppe.
En "amin"-gruppe refererer til en -N<ll>R<12>-gruppe, hvori R11 og R12 begge er hydrogen.
i En "morfolino"-gruppe refererer til en gruppe som har den kjemiske strukturen:
De kjemiske formlene referert til heri kan forevise fenomenet med tautomerisme og strukturell isomeri. F.eks. kan forbindelsene beskrevet heri innta en E eller Z - konfigurasjon omkring dobbeltbindingen som binder sammen 2-indolinonenheten med pyrrolenheten, eller de kan være en blanding av E og Z. Foreliggende oppfinnelse omfatter enhver tautomer eller strukturell isomer form og blandinger derav, som viser evnen til å modulere RTK, CTK og/eller STK-aktivitet, og er ikke begrenset til en spesiell tautomer eller strukturell isomer form.
2. SYNTESE/KOMBINATORISKE BIBLIOTEKER
Et kombinatorisk bibliotek med minst ti 3-pyrrolidinyl-2-indolin-forbindelser som kan bli dannet ved å reagere oksindoler med struktur 2, med aldehyder med struktur 3 beskrives i det følgende.
hvori R<1->R<10> er som definert ovenfor.
Som benyttet heri refererer et "kombinatorisk bibliotek" seg til alle forbindelsene dannet ved reaksjonen av hver forbindelse av en dimensjon, med en forbindelse i hver av de andre dimensjonene i en multidimensjonell oppstilling av forbindelsene. I betydningen i den foreliggende oppfinnelsen er oppstillingen todimensjonal, og én dimensjon representerer alle oksindolene i foreliggende oppfinnelse, og den andre dimensjonen representerer alle aldehydene i foreliggende oppfinnelse. Hver oksindol kan bli reagert med hver og én aldehyd, for å danne en 3-pyrrolidinyl-2-indolinon-forbindelse. Alle 3-pyrrolidinyl-2-indolinon-forbindelsene dannet på denne måten er innenfor omfanget til den foreliggende oppfinnelsen. Også innenfor omfanget til den foreliggende oppfinnelsen er mindre kombinatoriske biblioteker dannet ved reaksjonen av noen av oksindol ene med alle aldehydene, alle oksindolene med noen av aldehydene, eller noen av oksindolene med noen av aldehydene.
Oksindolen i det ovennevnte kombinatoriske biblioteket, kan fortrinnsvis velges fra gruppen som består av oksindol selv, og substituerte oksindoler såsom, uten begrensning, 6-bromoksindol, 5-hydroksyoksindol, 5-metoksyoksindol, 6-metoksyoksindol, 5-fenylaminosulfonyloksindol, 4-[2-(2-isopropylfenoksy)-etyl]oksindol, 4-[2-(3-isopropylfenoksy)etyl]oksindol, 4-[2-(4-isopropylfenoksy)etyl]oksindol, 5-fluoroksindol, 6-fluoroksindol, 7-fluoroksindol, 6-trifluormetyloksindol, 5-klorksindol, 6-klorksindol, indol-4-karboksylsyre, 5-bromoksindol, 6-(N-acetamido)-oksindol, 4-metylenoksindol, 5-metyloksindoI, 4-metyl-5-klorksindol, 5-etyloksindol, 6rhydroksyoksindol, 5-acetyloksindol, oksindol-5-karboksylsyre, 5-metoksyoksindol, 6-metoksyoksindol, 5-aminooksindol, 6-aminooksindol, 4-(2-N-morfolinoetyl)oksindol, 7-azaoksindol, oksindol-4-karbaminsyre t-butylester, oksindol-6-karbaminsyre t-butylester, 4-(2-karboksyetyl)oksindol, 4-n-butyloksindol, 4,5-dimetoksyoksindoI, 6-(metansulfonamido)oksindol, 6-(benzamido)oksindol, 5-etoksyoksindol, 6-fenyloksindol, 6-(2-metoksyfen-1-yI)oksindol, 6-(3-metoksyfen-l-yl)oksindol, 6-(4-metoksyfen-l-yl)oksindol, 5-aminosulfonyloksindol, 5-isopropylaminosulfonyloksindol, dimetylaminosulfonyloksindol, 5-(N-morfolinosulfonyl)oksindol og-4-(2-hydroksyétyl)oksindol.
Aldehydet i det ovennevnte kombinatoriske biblioteket kan velges fra gruppen som består av, uten begrensning, 3-(5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-yI) propionsyre, 3-(5-formyl-4-metyl-lH-pyrroI-3-yl) propionsyre, 3-(l-benzyl-5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-yl) propionsyre, 3-(5-formyl-l-metoksykarbonylmetyl-2,4-dimetyl-1 H-pyrrol-3-yl) propionsyre, 3-(5-formyl-l ,2,4-trirhetyl-lH-pyrrol-3-yl) propionsyre, 3-[5-formyl-I-(3-metoksy-benzyl)-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-yl] propionsyremetylester, 3-(l-sykloheksylmetyl-5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-yl) propionsyremetylester, 3-[l-(2,2-dimetyl-propyl)-5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-yl] propionsyremetylester, l,3,5-trimetyl-4-(3-morfolin-4-yl-3-okso-propyl)-lH-pyrrol-2-karbaldehyd, 3-(5-formyl-l,2,4-trimetyl-lH-pyrrol-3-yl)-N-(2-morfolin-4-yl-etyl)propionamid, 3-(5-formyl-l,2,4-trimetyl-lH-pyrrol-3-yl)-N-fenylpropionamid, l,3J5-trimetyl-4-(3-okso-3-piperidin-l-yl-propyl)-lH-pyrrol-2-karbaldehyd, 1,3,5-trimetyl-4-(3 -okso-3-pyrrolidin-1 -yl-propyl)-1 H-pyrrol-2-karbaldehyd, 3-(5-formyl-l,2,4-trimetyl-lH-pyrrol-3-yl)-N-(4-metoksy-fenyl)propionamid, 3-(5-formyl-l ,2,4-trimetyl-lH-pyrroI-3-yl)-N-(4-metoksy-fenyl)propionamid, N-(4-fluor-fenyl)-3-(5-formyl-1,2,4-trimetyl-1 H-pyrrol-3-yl)propionamid, 3-(5-formyl-1,2,4-trimetyl-1 H-pyirol-3-yl)-N-(4-trifluormetyl-fenyl)propionamid, 3-[5-formyl-l-(3-metoksy-benzyl)-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-yl] propionsyre, 3-(l-sykloheksylmetyl-5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-yl) propionsyre, 3-[l-(3-fluor-benztl)-5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-yl] propionsyremetylester, 3<:>(l-benzyl-5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-yl) propionsyre, 3-[l-(4-fluorbenzyl)-5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-yl] propionsyremetylester, 3-[l-(4-fluor-benzyl)-5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrroI-3-yl] propionsyre, 3-[l-(3-fluor-benzyl)-5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-yl] propionsyre, 3,5-dimetyl-4-(3-morfolin-4-yl-propyl)- lH-pyrrol-2-karbaldehyd, 4-(3-dimetylamino-propyl)-3,5-dimetyl-1 H-pyrrol-2-karbaldehyd, 5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre, 3,5-dimetyl-4-(4-metyl-piperazin-l-karbonyl)-1 H-pyrrol-2-karbaldehyd, 5-formyI-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre (2-dimetylaminoetyI)amid.
Det beskrives også en fremgangsmåte for syntesen av 3-pyrrolidinyl-2-indolinon med formel 1, som omfatter å reagere en oksindol med formel 2 med et aldehyd med formel 3 i et løsningsmiddel, fortrinnsvis i nærværet av en base.
Eksempler på oksindoler med formel 2 som kan reagere med et aldehyd med formel 3 for å gi 3-pyrrolidinyl-2-indolinoner med formel 1, er oksindol selv, og substituerte oksindoler såsom, uten begrensning, 6-bromoksindol, 5-' hydroksyoksindol, 5-metoksyoksindol, 6-metoksyoksindol, 5-fenylaminosulfonyloksindol, 4-[2-(2-isopropylfenoksy)-etyl]oksindol, 4-[2-(3-isopropyIfenoksy)etyI]oksindol, 4-[2-(4-isopropylfenoksy)etyl]oksindol, 5-fluoroksindol, 6-fluoroksindol, 7-fluoroksindol, 6-trifluormetyloksindol, 5-kloroksindol, 6-kloroksindol, indol-4-karboksylsyre, 5-bromoksindol, 6-(N-acetamido)-oksindol, 4-metyloksindol, 5-metyloksindoI, 4-metyl-5-kloroksindol, 5-etyloksindol, 6-hydroksyoksindol, 5-acetyloksindol, oksindol-5-karboksylsyre, 5-metoksyoksindol, 6-metoksyoksindol, 5-aminooksindbl, 6-aminooksindol, 4-(2-N-morfolinoetyl)oksindol, 7-azaoksindol, oksindol-4-karbaminsyre t-butylester, oksindol-6-karbaminsyre t-butylester, 4-(2-karboksyetyl)oksindol, 4-n-butyloksindol, 4,5-dimetoksyoksindol, 6-(metansulfonamido)oksindol, 6-(benzamido)oksindol, 5-etoksyoksindol, 6-fenyloksindol, 6-(2-metoksyfen-1-yl)oksindol, 6-(3-metoksyfen-l-yl)oksindol, 6-(4-metoksyfen-l-yl)oksindol, 5-aminosulfonyloksindol, 5-isopropylaminosulfonyloksindol, dimetylaminosulfonyloksindol, 5-(N-morfolinosulfonyl)oksindol og 4-(2-hydroksyetyl) oksindo 1.
Eksempler på aldehyder med struktur 3 som kan reagere med oksindoler med struktur 2 er, uten begrensning, 3-(5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-yl) propionsyre, 3-(5-formyl-4-metyl-lH-pyrrol-3-yl) propionsyre, 3-(1-benzyl-5-formyl-2,4.dimetyl-lH-pyrrol-3-yl) propionsyre, 3-(5-formyl-l-metoksykarbonyImetyl-2,4-dimetyl-1 H-pyrrol-3-yl) propionsyre, 3-(5-formyl-1,2,4-trimetyl-1 H-pyrrol-3-yl) propionsyre, 3-[5-formyl-1 -(3-metoksy-benzyl)-2,4-dimetyl-1 H-pyrrol-3-yl] propionsyremetylester, 3-( l-sykloheksylmetyl-5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-yl) propionsyremetylester, 3-[l-(2,2-dimetyl-propyl)-5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-yl] propionsyremetylester, 1,3,5-trimetyl-4-(3-morfolin-4-yl-3-okso-propyl)-lH-pyrrol-2-karbaldehyd, 3-(5-formyl-l,2,4-trimetyl-1 H-pyrrol-3-yl)-N-(2-morfolin-4-yl-etyl)propionamid, 3-(5-formyl-l,2,4-trimetyl-lH-pyrrol-3-yl)-N-fenylpropionamid, l,3,5-trimetyl-4-(3-okso-3-piperidin-l-yl-propyl)-l H-pyrrol-2-karbaldehyd, 1,3,5-trimetyl-4-(3-okso-3-pyrrolidin-l -yl-propyl)-lH-pyrrol-2-karbaldehyd, 3-(5-formyl-l,2,4-trimetyl-lH-pyrrol-3-yl)-N-(4-metoksy-fenyl)propionamid, 3-(5-formyl-1,2,4-trimetyl-1H-pyrrol-3-yl)-N-(4-metoksy-fenyl)propionamid, N-(4-fluor-fenyl)-3-(5-formyl-1,2,4-trimetyl-1H-pyrrol-3-yl)propionamid} 3-(5-formyl-l,2,4-trimetyl-lH-pyrrol-3-yl)-N-(4-trifluormetyl-fenyl)propionamid, 3-[5-formyl-1 -(3-metoksy-benzyl)-2,4-dimetyl-1 H-pyrrol-3-yl] propionsyre, 3-( 1 -sykloheksylmetyl-5-formyl-2,4-dimetyl-1H-pyrrol-3-yl) propionsyre, 3-[l-(3-fluor-benzyl)-5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-yl] propionsyremetylester, 3-0-benzyl-5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-yl) propionsyre, 3-[l-(4-fluorbenzyl)-5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-yl] propionsyremetylester, 3-[l-(4-fluor-benzyl)-5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-yl] propionsyre, 3-[i-(3-fluor-benzyl)-5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-yl] propionsyre, 3,5-dimetyl-4-(3-morfolin-4-yl-prbpyl)-lH-pyrrol-2-karbaldehyd, 4-(3-dimetylamino-propyl)-3,5-dimetyl-lH-pyrrol-2-karbaldehyd, 5-formyl-2,4-dimetyl-1 H-pyrrcil-3-karboksylsyre, 3,5-dirhetyl-4-(4-metyl-piperazin-l -karbonyl)-lH-pyrrol-2-karbaldehyd, 5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre (2-dimetylaminoetyl)amid.
Reaksjonen kan bli utført i nærvær av en base. Basen kan være en organisk eller en uorganisk base. Dersom en organisk base blir benyttet, er det fortrinnsvis en nitrogenbase. Eksempler på organiske nitrogenbaser inkluderer, men er ikke begrenset til, diisopropylamin, trimetylamin, trietylamin, anilin, pyridin, 1,8-diazabisyklo[5,4,l]undec-7-en, pyrrolidin og piperidin.
Eksempler på uorganiske baser er, uten begrensning, ammoniakk, alkalisk metall eller alkaliske jordhydroksider, fosfater, karbonater, bikarbonater, bisulfater og amider. De alkaliske metallene inkluderer litium, natrium og kalium, mens de alkaliske jordmetallene inkluderer kalsium, magnesium og barium.
Når løsningsmidlet er et "protisk" løsningsmiddel, såsom vann eller alkohol, er basen et alkalisk metall eller en uorganisk jorduorganisk base, fortrinnsvis et . alkalimetall eller et alkalisk jordhydroksid.
Det vil være åpenbart for personer med kunnskaper i faget basert både på generelle kjente prinsipper med uorganisk syntese og det som er lagt frem heri, hvilke baser som vil være de mest passende for reaksjonen som skal utføres.
Løsningsmidlet som reaksjonen blir utført i, kan være et "protisk" eller et "aprotisk" løsningsmiddel, fortrinnsvis er det et "protisk" løsningsmiddel. Et "protisk løsningsmiddel" er et løsningsmiddel som har hydrogenatom(er) kovalent. bundet til oksygen- eller nitrogenatomer, som etterlater hydrogenatomene passende sure, og derved er istand til å bli "delt" med et oppløst stoff gjennom hydrogenbinding. Ikke begrensende eksempler på protiske løsningsmidler inkluderer vann og alkoholer.
Et "aprotisk løsningsmiddel" kan være polart eller ikke-polart, men i-hvert tilfelle inneholder det ikke sure hydrogener, og er derfor ikke istand til å hydrogenbinde med det oppløste stoffet. Ikke begrensende eksempler på ikke-polare aprotiske løsningsmidler er pentan, heksan, benzen, toluen, metylenklorid og karbontetraklorid.
Eksempler på polare aprotiske løsningsmidler er kloroform, tetrahydrofuran, dimetylsulfoksid og dimetylformamid.
Løsningsmidlet kan være et protisk løsningsmiddel, fortrinnsvis vann eller alkohol såsom etanol.
Reaksjonen blir utført ved temperaturer som er høyere enn romtemperatur. Temperaturen er generelt fra omkring 30°C til omkring 150°C, fortrinnsvis omkring 80°C til omkring 100°C, mest fortrinnsvis omkring 75°C til omkring 85°C, som er omkring kokepunktet for etanol. Ved "omkring" menes at temperaturområdet er fortrinnsvis innen 10 °C av de indikerte temperaturene, mer fortrinnsvis innen 5°C av de indikerte temperaturene og mest fortrinnsvis innen 2°C av de indikerte temperaturene. Således menes f.eks. ved "omkring 75°C", 75°C + 10°C, fortrinnsvis 75°C + 5°C og mest fortrinnsvis 75°C ± 2°C.
3. BIOKJEMI/FARMAKOTERAPI
Den foreliggende beskrivelse omhandler også en fremgangsmåte for moduleringen av den katalytiske aktiviteten til en PK, ved å bringe en PK i kontakt med en forbindelse fra den foreliggende oppfinnelsen eller et fysiologisk akseptabelt salt eller forløpermedikament derav.
Som benyttet heri refererer "PK" seg til reseptorproteintyrosinkinase (RTK'er), ikke-reseptor eller "cellulær" tyrosinkinase (CTK'er), og serin-treoninkinaser (STK'er).
Begrepet "fremgangsmåte" refererer til metoder, måter, teknikker og fremgangsmåter for å oppnå et gitt mål, inkludert men ikke begrenset til, de måtene, metodene, teknikkene og fremgangsmåtene som enten er kjent for, eller enkelt kan bli utledet fra kjente måter, metoder, teknikker og fremgangsmåter av personer som praktiserer fagene kjemi, farmasi, biologi, biomedisin og medisin.
Som benyttet heri refererer begrepet "modulerer" eller "modulering" seg til endringen av den katalytiske aktiviteten til RTK'er, CTK'er og STK'er. Spesielt refererer modulering seg til aktiveringen av den katalytiske aktiviteten til RTK'er, CTK'er og STK'er, fortrinnsvis aktiveringen eller inhiberingen av den katalytiske aktiviteten til RTK'er, CTK'er og STK'er, avhengig av konsentrasjonen av forbindelsen eller saltet som RTK, CTK eller STK blir eksponert for, eller mer fortrinnsvis, inhibisjonen av den katalytiske aktiviteten til RTK'er, CTK'er og STK'er.
Begrepet "katalytisk aktivitet" som benyttet heri, refererer til hastigheten av fosforyleringen av tyrosin under påvirkningen, direkte eller indirekte, av RTK'er og/eller CTK'er, eller forsfofyleringen av serin og treonin under påvirkningen, direkte eller indirekte av STK'er.
Begrepet "å bringe i kontakt" som benyttet heri, refererer til å bringe en forbindelse i henhold til den foreliggende oppfinnelsen og en mål-PK sammen på en slik måte at forbindelsen kan påvirke den katalytiske aktiviteten til PK, enten direkte, dvs. ved å interagere med kinasen selv, eller indirekte, dvs. ved å interagere med et annet molekyl som den katalytiske aktiviteten til kinasen er avhengig av. Slik "kontakt" kan oppnås "in vitro", dvs. i et testrør, en petriskål eller lignende. I et testrør kan kontakten involvere kun en forbindelse og en PK av interesse, eller den kan involvere hele celler. Celler kan også bli opprettholdt eller dyrket i celledyrkingsskåler, og bli kontaktet med en forbindelse i det miljøet.
I denne sammenhengen kan evnen en spesiell forbindelse har til å påvirke en PK-relatert sykdom, dvs. IC50 til forbindelsen, definert under, bli bestemt før anvendelse av forbindelsen in vivo der mer komplekse levende organismer blir forsøkt. For celler på utsiden av organismen eksisterer det flere metoder som er vel kjent for personer innen faget, for å få PK'er i kontakt med forbindelsene inkludert, men ikke begrenset til, direkte cellemikroinjeksjon og flere transmembrane bæreteknikker.
Moduleringen av den katalytiske aktiviteten til PK'er ved å benytte en forbindelse fra den foreliggende oppfinnelsen kan bli utføres in vitro eller in vivo.
"In vitro" refererer til fremgangsmåter som utføres i et kunstig miljø, såsom, f.eks. og uten begrensning, i et prøverør eller et dyrkningsmedium.
Som benyttetheri refererer begrepet "in vivo" seg til fremgangsmåter som utføres inne i en levende organisme såsom, og uten begrensning, en mus, rotte eller kanin.
Proteinkinasen, hvis katalytiske aktivitet skal moduleres ved hjelp av en forbindelse i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, er valgt fra gruppen som består av reseptor-protein-tyrosinkinaser, cellulære tyrosinkinaser og serin-treoninkinaser.
Reseptor-proteinkinasen, hvis katalytiske aktivitet blir modulert av en forbindelse fra den foreliggende oppfinnelsen, er valgt fra gruppen som bestpr av EGF, HE.R2, . HER3, HER4, IR, IGF-1R, IRR, PDGFRa, PDGFR<p>, CSFIR, C-Kit, C-fms, Flk-1R, Flk4, KDR/Flk-1, Flt-1, FGFR-1R, FGFR-2R, FGFR-3R og FGFR-4R.
Den cellulære tyrosinkinasen, hvis katalytiske aktivitet blir modulert av en forbindelse fra den foreliggende oppfinnelsen, er valgt fra gruppen som består av Ser, Frk, Btk, Csk, Abl, ZAP70, Fes/Fps, Fak, Jak, Ack, Yes, Fyn, Lynm Lek, Blk, Hek, Fgr og Yrk.
Serin-treonin-proteinkinasen hvis katalytiske aktivitet blir modulert av en
. forbindelser fra den foreliggende oppfinnelsen, ér valgt fra gruppen som består av CDK2 og Raf.
En farmasøytisk sammensetning av en forbindelse i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, med en farmasøytisk akseptabel bærer, er enda et annet aspekt ved den foreliggende oppfinnelsen. Slik farmasøytisk sammensetning kan også inneholde tilsetningsstoffer.
Som benyttet heri refererer "PK-relatert sykdom", "PK-drevet sykdom" og "unormal PK-aktivitet" seg til en tilstand karakterisert ved upassende, dvs. under
eller vanligvis over, PK-katalytisk aktivitet, der den spesielle PK kan være en RTK, en CTK eller en STK. Upassende katalytisk aktivitet kan oppstå som et resultat av enten: (1) PK-ekspresjon i celler som normalt ikke uttrykker PK'er, (2) økt PK-ekspresjon som fører til uønsket celleproliferasjori, differensiering og/eller vekst, eller (3) redusert PK-ekspresjon som fører til uønskede reduksjoner i celleproliferasjon, differensiering og/eller vekst. Overaktivitet av en PK refererer til enten oppformering av genet som koder for en spesiell PK, eller produksjon av et nivå av PK-aktivitet som kan korrelere med en celleproliferasjon, differensiering og/eller vekstsykdom (dvs. ettersom nivået av PK øker øker også alvorligheten av
ett eller flere av symptomene på den cellulære sykdommen). Underaktivitet er selvfølgelig det motsatte, hvori alvorligheten av én eller flere symptomer på en cellulær sykdom øker ettersom nivået av PK-aktiviteten avtar.
Som benyttet heri, refererer begrepene "hindre", "hindring" og "forhindring" seg til en fremgangsmåte for å hindre en organisme fra å motta en PK-relatert sykdom i førsteinstans.
Som benyttet heri refererer begrepene "behandle", "å behandle" og "behandling" seg til en fremgangsmåte for å lindre eller motvirke en PK-mediert cellulær sykdom og/eller dens ledsagende symptomer. Spesielt med hensyn til kreft, betyr disse begrepene ganske enkelt at forventet levetid til et individ påvirket av kreft, vil bli økt, eller at én eller flere av symptomene på sykdommen vil bli redusert.
Begrepet "organisme" refererer til enhver levende enhet som omfatter minst én celle. En levende organisme kan være så enkel som f.eks. en enkel eukariot celle, eller så kompleks som et pattedyr, inkludert et menneske.
Begrepet "terapeutisk effektiv mengde" som benyttet heri refererer til den mengden av forbindelsen som blir administrert, og som til en hvis grad vil lette én eller flere av symptomene på sykdommen som skal behandles. Med hensyn til behandlingen av kreft, refererer en terapeutisk effektiv mengde seg til en mengde som har effekten av (1) å redusere størrelsen på tumoren, (2) å inhibere (dvs., redusere til .
noen grad, fortrinnsvis stoppe) tumormetastasering, (3) å inhibere i noen grad, (dvs. å senke i noen grad, fortrinnsvis stoppe) tumorvekst, og/eller (4) å lette i noen grad (eller fortrinnsvis eliminere) én eller flere symptomer assosiert med kreften.
De ovennevnte refererte proteinkinaserelaterte sykdommene blir valgt fra gruppen som består av en reseptorproteinkinase-relatert sykdom, en cellulær tyrosinkinasesykdom og en serin-treonin-kinaserelatert sykdom.
I enda et annet aspekt blir de ovennevnte refererte proteinkinaserelaterte sykdommer valgt fra gruppen som består av en EGFR-relatert sykdom, en PDGFR-relastert sykdom, en IGFR-relatert sykdom og en flk-relatert sykdom.
Den ovennevnte refererte proteinkinaserelasterte sykdommen er .kreft, valgt fra gruppen som består av sjellcellekarsinom, sarkomer såsom Kaposis sarkom, astriocytom, glioblastom, lungekreft, blærekreft, kolorektal kreft, gastrointestinal kreft, hode- og nakkekreft, melanom, ovariékreft, prostatakreft, brystkreft, småcelle-lungekreft og gliom.
Den ovennevnte refererte proteinkinasesykdommen er valgt fra gruppen som består av diabetes, en hyperproliferativ sykdom, von Hippel-Lindau sykdom, restinose, fibrose, psoriasis, osteoartritt, reumatoid artritt, en infallatorisk sykdom og angiogenese.
Ytterligere sykdommer som kan bli behandlet eller forhindret ved å benytte forbindelser i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, er immunologiske sykdommer såsom autoimmune sykdommer (AIDS) og kardiovaskulære sykdommer såsom arterosklerose.
En kjemisk forbindelse som modulerer den katalytiske aktiviteten til en proteinkinase kan bli identifisert ved å bringe celler som uttrykker nevnte proteinkinase i kontakt med en forbindelse, salt eller et forløpermedikament som er en 3-pyrroli-denyl-2-indolinon i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, og deretter å monitorere nevnte celler for en effekt.
Ved "monitorere" menes å observere eller detektere effekten ved å kontakte en forbindelse med en celle som uttrykker en spesiell PK. Den observerte eller detekterte effekten kan være en endring i cellefenotype, i den katalytiske aktiviteten til en PK eller-en endring i interaksjonen mellom PK med en naturlig bindingspartner. Teknikker for å observere eller detektere slike effekter er vel kjent i faget.
Den ovennevnte effekten er valgt fra en endring eller et fravær av endring i en cellefenotype, eller endring eller fravær av endring i den katalytiske aktiviteten til nevnte'proteinkinase, eller en endring eller fravær av endring i interaksjonen mellom nevnte proteinkinase med naturlig bindingspartner.
"Cellefenotype" refererer seg til den ytre åpenbaringen av en celle eller vev eller den biologiske funksjonen til cellen eller vevet. Eksempler uten begrensning, på en cellefenotype er cellestørrélsé, cellevekst, celleproliferasjon, celledifferensiering, celleoverlevelse, apoptose, næringsopptak og anvendelse. Slike fenotype
karakteristika er målbare ved teknikker som er vel kjent i faget.
En "naturlig bindingspartner" refererer til et polypeptid som binder til en spesiell PK i en celle. Naturlige bindingspartnere kari spille en rolle i å overføre et signal i en PK-mediert signaltransduksjonsprosess. En endring i interaksjonen av den naturlige bindingspartneren med PK, kan manifestere seg som en økning eller reduksjon i konsentrasjonen av PK/naturlig bindingspartnerkompleks, og som et resultat, i en observerbar endring i enden til PK til å mediere signaltransduksjon.
En forbindelse beskrevet heri, eller dens salt eller forløpermedikament, kan kombineres med andre kjemoterapeutiske agens for behandlingen av sykdommene og forstyrrelsene diskutert over. F.eks. kan en forbindelse, salt eller forløper-medikament i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, kombineres med alkylerende agens såsom fluoruracil (5-FU) alene, eller i ytterligere kombinasjon med leukovorin; eller andre alkylerende agens såsom, uten begrensning, andre pyrimi-dinanaloger såsom UFT, kapesitabin, gemsitabin og cytarabin, alkylsulfonater, f.eks. busulfan (benyttet i behandlingen av kronisk granulocyttleukemi), impro-sulfan og piposulfan; aziridiner, f.eks. benzodepa, karbiikon,- meturedepa og uredepa; etyleniminer og metylmelaminer, f.eks. altretamin, trietylenmelamin, trietylenfosforamid, trietylentiofosforamid og trimetylolmelamin; og nitrogen-sennepper, f.eks. klorambucil (benyttet i behandlingen av kronisk lymfocytt-leukemi, primær makroglobulinemi og ikke-;Hodgkins lymfom), syklofosfamid (benyttet i behandlingen av Hodgkins sykdom, multippelt myelom, neuroblastom, brystkreft, ovariekreft, lungekreft, Wilms tumor og rabdomysarkom), estramustin, ifosfomid, novembrichin, prednimustin og uracilsennepp (benyttet i behandlingen av primære trombocytose, ikke-Hodgkins lymfom, Hodgkins sykdom og ovariekreft); og triaziner, f.eks. dakarbazin (benyttet i behandlingen av bløtvevssarkom)..
På samme måte kan eri forbindelse, salt eller forløpermedikament i henhold til den foreliggende oppfinnelsen antas å ha en fordelaktig effekt i kombinasjon med andre antimetabolitt kjemoterapeutiske agens såsom, uten begrensning, folsyreanaloger, f.eks. metotreksat (benyttet i behandlingen av akutt lymfocytt leukemi, koriokarsin-om, mykosefungidose brystkreft, hode- og nakkekreft, og osteogenetisk sarkom) og pteropterin; og purinanalogene såsom merkaptopurin og tioguanin som finner anvendelse i behandlingen av akutt granulocytt, akutt lymfocytt og kronisk granul o cyttl eukemi er.
En forbindelse, salt eller forløpermedikament i henhold til den foreliggende oppfinnelsen kan også antas å vise seg å være effektiv i kombinasjon med.naturlige produktbaserte kjemoterapeutiske agens såsom, uten begrensning, vinkalkaloidene, f.eks. vinblastin (benyttet i behandlingen av bryst- og testikkelkreft), vinkristin og vindesin; epipodofylotoksiner, f.eks. etoposid og teniposid, begge som er nyttige i behandlingen av testikkekreft og Kaposis sarkom; de antibiotikaterapeutiske
agensene, f.eks. daunorubicin, doksorubicin, epirubicin, mitomycin (benyttet i
. behandlingen av mage-, cervix-, colon-, bryst-, blære- og pankreakreft), daktino-mycin, temozolomid, plikamycin, bleomycin (benyttet i behandlingen av hud-, spiserørs- og "genitourinary trakt" kreft); og de enzymatisk kjemoterapeutiske agensene såsom L-asparaginase.
1 tillegg til ovennevnte, kan en forbindelse, salt eller forløpermedikament i henhold
til den foreliggende oppfinnelsen også antas å ha en nyttig effekt når den benyttes i kombinasjon med platina-koordineringskomplekser (cisplatin, osv.); substituerte ureaer såsom hydroksyreau; metylhydrasinderivater, f.eks. prokarbasin; adreno-kortikale suppressanter, f.eks. mitotan, aminoglutetimid; og hormon og hormon-antagonister såsom adrenokortikosteroidene (f.eks. prednison), progestiner (f.eks.
hydroksyprogesteronkaproar); østrogener (f.eks. dietylstilbesterol); antiøsterogener såsom tamoksifen; androgener, f.eks. testosteronpropionat; og aromataseinhibitorer (såsom anastrozol).
Endelig kan kombinasjonen av en forbindelse i henhold til den foreliggende forbindelsen antas å være spesielt effektiv i kombinasjon med mitoksantron eller paklitaksel i behandlingen av faste tumorkrefttyper eller leukemier såsom, uten begrensning, akutt myelogen (ikke-lymfocytt) leukemi.
En nåværende foretrukket forbindelse i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, som kan antas å ha en nyttig effekt i kombinasjon med én eller flere av de ovennevnte kjemoterapeutiske agensene, er 3-[2,4-dimetyl-5-(2-okso-l,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-lH-pyrrol-3-yl]propionsyre.
1. KORT BESKRIVELSE AV TABELLENE
Tabell 1 viser de kjemiske strukturene og biologiske aktiviteten til noen eksempelforbindelser i henhold til den foreliggende oppfinnelsen. Forbindelsesnumrene korresponderer til eksempelnumrene i eksempelavsnittet. Det vil si at syntesen av forbindelse 1 i tabell 1 er beskrevet i eksempel 1. Bioassayene som er benyttet er beskrevet i detalj under. Resultatene er rapportert i form av IC50, den mikromolare (uM) konsentrasjonen av forbindelsen som er testet som førte til en 50 % endring i aktiviteten til mål PTK sammenlignet med aktiviteten til PTK i en kontroll der det ikke var tilsatt noen testforbindelse. Spesielt indikerer resultatene som er vist konsentrasjonen av en testforbindelse som er nødvendig for å forårsake 50 % reduksjon av aktiviteten til mål PTK. Forbindelsene som er presentert i tabell
1 er kun eksempler, og er ikke ment å skulle være begrensende for omfanget av foreliggende oppfinnelse på noen måte.
Tabell 2 viser de kjemiske strukturene til noen ytterligere forbindelser i den foreliggende oppfinnelsen. Som i tabell 1 korresponderer forbindelsesnumrene til eksempelnumrene. Den generelle beskrivelsen av bioassayené over anvendes også for bioassayené vist i tabell 2.
2. INDIKASJONER/MÅLSYKDOMMER
PK'ene hvis katalytiske aktivitet blir modulert av forbindelsene i den foreliggende oppfinnelsen, inkluderer proteintyrosinkinaser som det er to typer av, reseptortyrosinkinaser (RTK.'er) og cellulære tyrosinkinaser (CTK'ér), og serin-treonin-kinaser (STK'er). RTK-mediert signaltransduksjon blir initiert av ekstracellulær interaksjon med en spesifikk vekstfaktor (ligand), etterfulgt av reseptordimerisering, transient stimulering av den indre protein-tyrosin-. kinaseaktiyiteten og fosforylering. Bindingsseter blir deretter dannet for intracellulær signaltransduksjonsmolekyler, og fører til dannelsen av komplekser med et spekter av cytoplastmiske signalmolekyler som forenkler den passende cellulære responsen (f.eks. celledeling, metabolske effekter på det ekstracellulære mikromiljøet, osv.). Se Schlessinger og Ullrich, 1992, Neuron 9:303-391.
Det har blitt vist at tyrosinfosforyleringsseter på vekstfaktorreseptorer fungerer som høyaffinitetsbindingsseter for SH2 (src-homologi) domener på signalmolekyler. Fantl et al., 1992, CeU 69:413-423, Songyang et al., 1994, Mol. Cell. Biol. 14:2777-2785), Songyang et al., 1993, CeU 72:767-778, og Koch et al., 1991, Science 252:668-678. Flere intracellulære substratproteiner som assosierer med RTK'er har blitt identifisert. De kan bli delt i to prinsippielle grupper: (1) substrater som har et katalytisk domene, og (2) substrater som mangler et slikt domene, men som fungerer som adaptere og assosierer med katalytisk aktive molekyler. Songyang et al., 1993, Cell 72:767-778.'Spesifisiteten til interaksjonene mellom reseptorer og SH2-domener på deres substrater blir bestemt av aminosyreresetene som umiddelbart omgir den fosforylerte tyrosinresten. Forskjeller i bindingsaffiniteter mellom SH2-domener og aminosyresekvenser som omgir fosfotyrosinrestene på spesielle reseptorer, er konsistente med de.observerte forskjellene i deres substratfosforyleringsprofiler. Songyang et al., 1993, Cell 72:767-778. Disse observasjonene tyder på at funksjonen av hver RTK blir bestemt ikke bare av dens mønster for ekspresjon og.ligandtilgjengelighet, men også av rekken av nedstrøms signaltransduksjonsveier som blir aktivert av en spesiell reseptor. Således tilveiebringer fosforylering et viktig regulatorisk trinn som bestemmer selektiviteten til signalveiene som kreves av spesifikke vekstfaktorreseptorer, såvel som differensieringsfaktorreseptorer.
STK'er, som primært er cytosoliske, påvirker den indre biokjemien til en celle, ofte som en ned-linje (down-line) respons på en PTK-hendelse. STK'er har vært ' involvert i signalprosessen sorri initierer DNA-syntese, og påfølgende mitose som leder til celleproliferasjon.
Således resulterer PK-signaltransduksjonsresultater i, blant andre responser, celleproliferasjon, differensiering, vekst og metabolisme. Unormal celleproliferasjon kan være resultatet i et vidt spekter av unormalheter og sykdommer, inkludert utviklingen av neoplasi såsom karsinom, sarkom, glioblastom og hemangiom, sykdommer såsom leukemi, psoriasis, arterioskleroser, artritt og diabetisk retinopati og andre sykdommer relatert til ukontrollert angiogenese og/eller vaskulogenese.
En presis forståelse av mekanismen som forbindelsene i den foreliggende oppfinnelsen benytter for å inhibere PK'er, er ikke påkrevet for å praktisere den foreliggende oppfinnelsen. Imidlertid, ved her ikke å være bundet til noen spesiell mekanisme eller teori, antas.det at forbindelsene interagerer med aminosyrene i den katalytiske regionen til PK'er. PK'er viser vanligvis en dobbellapp (bi-lobat) struktur hvori ATP synes å binde i kløften mellom de to lappene i en region der aminosyrene er konservert blant PK'er. Inhibitorer av PK'er antas å binde ved ikke-kovalente interaksjoner såsom hydrogenbinding, van der Waals krefter og ioniske interaksjoner, i den samme generelle regionen der den førnevnte ATP binder til PK'ene. Mer spesifikt antas det at 2-indolinon-komponenten i forbindelsene i den foreliggende oppfinnelsen binder i det generelle rommet som normalt okkuperes av adeninringen til ATP. Spesifisiteten til et spesielt molekyl for en spesiell PK kan derved oppstå som et resultat, av ytterligere interaksjoner mellom de ulike substituentene på 2-indolinon-kjernen og aminosyredomenene spesifikke for spesielle PK'er. Således kan ulike indolinsubstituenter bidra til . fordelaktig binding til spesielle PK'er. Evnen til å velge forbindelser som er aktive ved ulike ATP (eller andre nukleotid) bindingsseter, gjør forbindelsene i den foreliggende oppfinnelsen nyttige for å kunne målrette ethvert protein med et slikt sete. Forbindelsene angitt heri kan derved ha utnyttelse som in vitro assayer for slike proteiner, såvel som å vise in vivo terapeutiske effekter via interaksjon med slike proteiner.
I et annet aspekt er proteinkinasen, den katalytiske aktiviteten som blir modulert ved kontakt med en forbindelse i den foreliggende oppfinnelsen, proteintyrasinkinase, mer spesielt en reseptor-tyrosinkinase. Blant reseptor-tyrosin-kinasene hvis katalytiske aktivitet kan bli modulert med en forbindelse fra den foreliggende oppfinnelsen, eller salt derav, er, uten begrensning EGF, HER2, HER3, HER4, IR, IGF-IR, IRR, PDGFRcc, PDGFRp\ CSFIR, C-Kit, C-fms, Flk-1 R, Flk4, KDR/Flk-1, Fit-1, FGFR-1R, FGFR-2R, FGFR-3R og FGFR-4R.
Proteintyrosinkinasen hvis katalytiske aktivitet blir modulert ved kontakt med en forbindelse fra den foreliggende oppfinnelsen; eller et salt eller . forløpermedikament derav, kan også være en ikke-reseptor eller cellulær protein-tyrosin-kinase (CTK). Således kan den katalytiske aktiviteten til CTK'er såsom, uten begrensning, Ser, Frk, Btk, Csk, Abl, ZAP70, Fes, Fps, Fak, Jak, Ack, Yes, Fyn, Lyn,, Lek, Blk, Hek, Fgr og Yrk, bli modulert i kontakt med en forbindelse eller salt fra den foreliggende oppfinnelsen.
Enda en annen gruppe med PK'er som kan få sin katalytiske aktivitet modulert ved kontakt med en forbindelse fra den foreliggende oppfinnelsen, er serin-treonin-proteinkinasene såsom, uten begrensning, CDK2 og Raf.
Foreliggende oppfinnelse er derfor rettet på forbindelser som modulerer PK-signaltransduksjon ved å påvirke den enzymatiske aktiviteten til RTK'er, CTK'er og/eller STK'er, ved derved å interferere med signalene omsatt via slike proteiner. Mer spesielt er den foreliggende oppfinnelsen rettet mot forbindelser som modulerer RTK, CTK og/eller STK-mediert signaltransduksjonsveier som en terapeutisk tilnærming for å kurere mange typer av faste tumorer, inkludert, men ikke begrenset til, karsinomer, sarkomer, inkludert Kaposis sarkom, erytroblastom, glioblastom, meningiom, astrocytom, melanom og myoblastom. Behandling eller hindring av ikke-faste tumorkrefttyper såsom leukemi er også omfattet av den foreliggende oppfinnelsen. Indikasjoner kan inkludere, men er ikke begrenset til, hjernekreft, blærekreft, ovariekreft, mavekreft, pankreaskreft, colonkreft, blodkreft, lungekreft og benkreft.
Ytterligere eksempler, uten begrensning, på typer av sykdommer relatert til upassende PK-aktivitet som forbindelsene beskrevet heri kan være nyttige for å hindre, behandle eller studere, er celleproliferative sykdommer, fibrotiske sykdommer og metabolske sykdommer. '
Celleproliferative sykdommer, som kan bli hindret, behandlet eller ytterligere studert ved den foreliggende oppfinnelsen, inkluderer kreft, blodåreproliferative sykdommer og mesangial celleproliferative sykdommer.
Blodåreproliferative sykdommer .refererer til sykdommer relatert til unormal vaskulogenese (blodåredannelse) og angiogenese (spredning av blodårer). Mens vaskulogenese og angiogenese spiller en viktig rolle i et antall av normale fysiologiske prosesser såsom embryoutvikling, corpus luteum dannelse," sårheling og organregenerering, spiller de også en avgjørende rolle i.kreftutvikling, der de resulterer i dannelsen av nye kappillærer som er nødvendig for å holde en tumor i live. Andre eksempler på blodåreproliferative sykdommer inkluderer artritt, der nye kappillarblodårer invaderer sammenføyningen og ødelegger brusk, og okkulare sykdommer, såsom diabetisk, retinopati, der nye kappillareri retina invaderer vitreous, blør og fører til blindhet.
To strukturelt relaterte RTK'er har blitt identifisert å binde VEGF med høy affinitet: den fms-lignende tyrosin 1 (fit-1) reseptoren (Shibuya et al., 1990, Oncoeene. 5:519-524; De Vries et al., 1992, Science; 255:989-991) og KDR/FLK-1 reseptoren, også kjent som VEGF-R2. Vaskuiær endotelvekstfaktor (VEGF) har vært rapportert å være et endotelcellespesifikt mitogen med in vitro endotelcellevekstpromoterende aktivitet. Ferrara & Henzel, 1989, Biochein. Biophvs. Res. Comm. : 161:851-858; Vaisman et al., 1990, J. Biol. Chem.. 265:19461-19566. Informasjon satt frem i US søknad serienr. 08/193,829, 08/038,596 og 07/975,750, indikerer kraftig at VEGF ikke bare er ansvarlig for endotelcelleproliferasjon, men også at den er den primære regulatoren av normal og patologisk angiogenese. Se generelt, Klagsburn & Soker, 1993, Current Bioloev, 3(10)699-702; Houck, et al., 1992, J. Biol. Chem., 267:26031-26037.
Normal vaskulogenese og angiogenese spiller viktige roller i ulike fysiologiske prosesser såsom embryoutvikling, sårleging, organregenerering og kvinnelige reproduktive prosesser såsom follikkelutvikling i corpus luteum under eggløsning, og plasentavekst etter graviditet. Folkman & Shing, 1992, J. Biological Chem., 267(16): 10931-34. Ukontrollert vaskulogenese og/eller angiogenese har vært assosiert med sykdommer såsom diabetes, såvel som med malign fast tumor som er avhengig av vaskularisering for vekst. Klagsburn & Soker, 1993, Current Biolo<gy>. 3(10):699-702; Folkham, 1991. J. Nati. Cancer Inst.. 82:4-6; Weidner, et al., 1991, New Engl. J. Med.. 324:1-5.
Den oppsummerte rollen til VEGF i endotelcelleproliferering og migrering under angiogenese og vaskulogenese, indikerer en viktig rolle for KDR/FLK-1 reseptoren i disse prosessene. Sykdommer såsom diabetes mellitus (Folman, 198, i Xlth Congress of Thrombosis and Haemostasis (Verstraeta, et al., red.), sidene 583-596, Leuven University Press, Leuven) og artritt, så vel som malign tumorvekst, kan resultere fra ukontrollert angiogenese. Se f.eks. Folkman, 1971, N. En<g>l. J. Med.. • 285:1182-1186. Reseptorene som VEGF spesifikt binder til er et viktig og kraftig terapeutisk mål for reguleringen og moduleringen av vaskulogenese og/eller angiogenese, og ulike andre alvorlige sykdommer som involverer unormal cellevekst forårsaket av slike prosesser. Plowman, et al., 1994, DN&P,
7(6):334-339, Mer spesielt gjør KDR/FLK-1 reseptoren sin svært spesifikke rolle i nevrovaskulariseringen til et valgt mål for for terapeutiske tilnærminger i behandlingen av kreft og andre sykdommer som involverer den ukontrollerte dannelsen av blodårer.
Således omhandler et aspekt ved den foreliggende oppfinnelsen, forbindelser som
er istand til å regulere og/eller modulere tyrosinkinase signaltransduksjon, inkludert KDR/FLK-1 reseptorsignaltransduksjon, for å inhibere eller fremme . angiogenese og/eller vaskulogenese, dvs. forbindelser som inhiberer, hindrer eller interfererer med signalet overført av KDR/FLK-1 når denne aktiveres av ligander såsom VEGF. Selv om det er antatt at forbindelsene i den foreliggende oppfinnelsen virker på en reseptor eller andre komponenter langs tyrosinkinase-signaltransduksjonsveien, kan de også virke direkte på tumorcellene som er et resultat av ukontrollert angiogenese.
Selv om nomenklaturen til menneske og musemotparten til den generiske "flk-I" reseptoren er forskjellig, er de på mange måter omvekslende. Musereseptoren,
Flk-1, og dens humane motpart,' KDR, deler en sekvenshomologi på 93,4 % inne i
det ekstracellulære domenet. På samme måte binder muse FLK-I human VEGF
med den samme affiniteten som muse VEGF, og i henhold til dette, blir aktivert av liganden avledet fra enhver av artene. Millauer et al., 1993, Cell. 72:835-846;
Quinn et al., 1993, Proe. Nati. Acad. Sei. USA. 90:7533-7537. FLK-1 assosierer
også med, og deretter tyrosinfosforylerer, humane RTK-substrater (f.eks. PLC-y eller p85) når disse ko-uttrykkes i 293 celler (humane embryonale nyrefibroblaster).
Modeller som er basert på FLK-1 reseptoren er derfor direkte brukbare for å forstå KDR-reseptoren. F.eks. er anvendelsen av muse FLK-1 reseptoren i fremgangsmåter som identifiserer forbindelser som regulerer musesignaltransduksjonsveien, direkte overførbar på identifiseringen av forbindelser som kan bli benyttet for å regulere den humane signaltransduksjonsveien, dvs. som regulerer aktivitet relatert til KDR-reseptoren. Således kan kjemiske forbindelser identifisert som inhibitorer av KDR/FLK-1 in vitro, bli bekreftet i passende in vivo modeller. Både in vivo muse- og rottedyremodeller har blitt demonstrert å være av utmerket verdi for studeringen av det kliniske potensialet til agens som virker på KDR/FLK-1 induserende signaltransduksjonsvei.
Således er i ett aspekt, foreliggende oppfinnelse rettet på forbindelser som regulerer, modulerer og/eller inhiberer vaskulogenese og/eller angiogenese, ved å påvirke den enzymatiske aktiviteten til KDR/FLK-1 reseptoren, og å interferere med signalet overført av KDR/FLK-1.1 et annet aspekt er den foreliggende oppfinnelsen rettet mot forbindelser som regulerer, modulerer og/eller inhiberer KDR/FLK-1 mediert signaltransduksjonsvei som en terapeutisk tilnærming til behandlingen av mange typer av faste tumorer inkludert, men ikke begrenset til, glioblastom, melanom og Kaposis sarkom, og ovarie-, lunge-, bryst-, prostata-, pankreas-, colon- og epidermoid karsinom. I tillegg tyder data på at administrering av forbindelser som inhiberer den,KDR/FLK-l medierte signaltransduksjonsveien, også kan bli benyttet i behandlingen av hemangiom, restenoise og diabetes retinopati.
Et ytterligere aspekt ved den foreliggende oppfinnelsen omhandler hemming av vaskulogenese og angiogenese ved andre reseptorrhedierte veier, inkludert veien som omfatter fit-1 reseptoren ved anvendelsen i følge oppfinnelsen.
Reseptortyrosinkinasemediert signaltransduksjon blir initiert av ekstracellulær interaksjon med en spesifikk vekstfaktor (ligand), etterfulgt av reseptordimerisering, forbigående stimulering av den indre proteintyrosinkinaseaktiviteten og autofosforylering. Bindingsseter blir derved dannet for intracellulær signaltransduksjonsmolekyler, som fører til dannelsen av komplekser med et spektrum av cytoplasmiske signalmolekyler som forenkler den passende cellulære responsen, f.eks. celledeling og metabolske effekter for det ekstracellulære mikromilkøet. Se Schlessinger og Ullrich, 1992, Neuron. 9:1-20.
Den nære homologien til de intracellulære regionene til KDR/FLK-1, med den til PDGF-p reseptor (50,3 % homologi), og/eller den beslektede flt-1 reseptoren, indikerer induksjonen av overlappende signaltransduksjonsveier. F.eks. har for PDGF-p reseptoren, medlemmer av src-familien (Twamley et al., 1993, Proe. Nati.
Acad. Sei. USA. 90:7696-7700), fosfatidylinositol-3'-kinase (Hu et al., 1992, ! Mol. Cell. Biol.. 12:981-990), fosfolipase cy (Kashishian & Cooper, 1993, Mol Cell. Biol.. 4:49-51), ras-GTPase-aktiverende protein, (Kashishian et al., 1992, EMBO L, 11:1373-1382), PTP-ID/syp (Kazlauskas et al., 1993, Proe. Nati. Acad. Sei. USA. 10 90:6939-6943), Grb2 (Arvidsson et al., 1994, Mol. CeU. Biol.. 14:6715-6726), og adaptermolekylene Shc og Nek (Nishimura et al., 1993, Mol. Cell. Biol..l3:6889-6896). blitt vist å binde til regioner som involverer ulike autofosforyleringsseter. Se generelt Claesson-Welsh, 1994, Pro<g>. Growth Factor Res.. 5:37-54. Således er det sannsynlig at signaltransduksjonsveiene aktivert av KDR/FLK-1 inkluderer ras-veien (Rozakis et al., 1992, Nature. 360:689-692), PI-3'-kinasen, de src-medierte og de plcy-medierte veiene. Hver av disse veiene kan spille en kritisk rolle i den angiogenetiske og/eller vaskulogenetiske effekten til KDR/FLK-1 i endotelceller. Som en konsekvens er enda et ytterligere aspekt ved den foreliggende oppfinnelsen anvendelsen av de organiske forbindelsene beskrevet heri for å modulere angiogenese og vaskulogenese, siden slike prosesser er kontrollert av disse veiene.
Motsatt er sykdommer relatert til krymping, kontraksjon eller lukking av blodårer, såsom restenose, også involvert, og kan bli behandlet eller forhindret ved fremgangsmåtene i den foreliggende oppfinnelsen.
Fibrotiske sykdommer refererer til den unormale dannelsen av ekstracellulær matrikser. Eksempler på fibrotiske sykdommer inkluderer hepatisk kirose og mesangial celleproliferative sykdommer. Hepatisk kirose er karakterisert ved økningen i ekstracellulær matriksinnhold, som resulterer i dannelsen av et hepatisk arr. En økt ekstracellulær matriks som resulterer i et hepatisk arr, kan også bli . forårsaket av viral infeksjon såsom hepatitt. Lipocytter synes å spille en viktig rolle i hepatisk kirose. Andre fibrotiske sykdommer involvert inkluderer aterosklerose.
Mesangialcelleproliferative sykdommer refererer til sykdommer som skyldes unormal proliferasjon av mesangialceller. Mesangialproliferative sykdommer inkluderer ulike humane nyresykdommer såsom glomerulusnefritt, diabetesnefropati og malign nefrosklerose, såvel som slike sykdommer som trombotisk mikroangiopatisyndromer, transplantasjonsavstøtning, og glomerulopatier. RTK PDGFR har vært involvert i opprettholdelsen av mesangial celleproliferasjon. Floege et al., 1993. Kidney International 43:47S-54S.
Mange kreftformer er celleproliferative sykdommer og, som nevnt over, har PK'er vært assosiert med celleproliferative sykdommer. Således er det ikke overraskende at PK'er såsom f.eks. medlemmer av RTK-familien, har vært assosiert med utviklingen av kreft: Noen av disse reseptorene, som f.eks. EGFR (Tuzi et al., 1991. Br. J. Cancer 63:227-233, Torp et al., 1992, APMIS 100:713-719) HER2/neu
(Slamon et al., 1989, Science 244:707-712) og PDGF-R (Kumabe et al., 1992, Qn co gene, 7:627-633) er overuttrykt i mange tumorer, og/eller persistent aktivert av autokrine looper. Faktisk har det vært demonstrert, i de mest vanlige og alvorlige kreftformene, overekspresjon av disse reseptorene (Akbasak og Suner- . Akbasak et al.. 1992. J. Neurol. Sei.. 111:119-133, Dickson et al., 1992. Cancer Treatment Res.. 61:249-273, Kore et al., 1992. J. Clin. Invest. 90:1352-1360) og autokrine looper (Lee og Donoghue, 1992, J. Cell. Biol.. 118:1057-1070, Kore et al., supra. Akbasak og Suner-Akbasak et al., su<p>ra). F.eks. har EGFR vært assosiert med skjellcellekarsinom/astrocytom, glioblastom, hode- og nakkékreft, lungekreft og blærekreft. HER2 har vært assosiert med bryst-, ovarie-, gastris-, lunge-, pankreas- og blærekreft. PDGFR har vært assosiert med glioblastom og melanom såvel som lunge-, ovarie- og prostatakreft. RTK c-met har også vært assosiert med malign tumordannelse. F.eks. har c-met vært assosiert med blant annet kolorektal-, tyroid-, pankreas-, gastrisk- og •hepatocellulaer karsinom og lymfom. I tillegg har c-met vært koblet til leukemi. Overekspresjon av c-met genet har også vært detektert i pasienter med Hodgkins sykdom og Burkitts sykdom.
TGF-IR har, i tillegg til å være implisert i næringssupport og i type-II diabetes vært assosiert med flere typer av kreft. F.eks. har. IGF-I vært involvert som en autokrin vekststimulator for .flere tumortyper, f.eks. human brystkreftkarsinomceller (Arteaga et al., 1989, J. Clin. Invest. 84:1418-1423) og små lungetumorceller (Macauley et al., 1990, Cancer Res.. 50:2511-2517). I tillegg synes IGF-I, mens den integrert er involvert i den normale veksten og differensieringen til nervesystemet, også å være en autokrin stimulering for humane gliomer. Sandberg-Nordqvist et al., 1993, Cancer Res. 53:2475-2478. Viktigheten av IGF-IR og dens ligander i celleproliferasjon blir videre støttet av det faktum at mange celletyper i kultur (fibroblaster, epitelceller, glattmuskelceller, T-lymfocytter, myloidceller, kondrocytter og osteoblaster (stamcellene til benmargen)) blir stimulert til å vokse av IGF-I. Goldring og Goldring, 1991, Eukarvotic Gene Ex<p>ression. 1:301-326.1 en serie av nye publikasjoner antyder Baserga at IGF-IR spiller en sentral rolle i mekanismen for transformasjon, og som sådan, kunne være ét foretrukket mål for terapeutisk intervensjon for et vidt spekter av humane maligniteter. Baserga, 1995, . Cancer Res.. 55:249-252, Baserga, 1994, Cell 79:927-930, Coppola et al., 1994, Mol. Cell. Biol.. 14:4588-4595.
STK'er har vært involvert i mange typer av kreft inkludert spesielt brystkreft (Cance, et al., Int. J. Cancer. 54:571-77 (1993)).
Assosiasjonen mellom unormal PK-aktivitet og sykdom er ikke begrenset til kreft. F.eks. har RTK'er vært assosiert med sykdommer såsom psoriasis, diabetes mellitus, endometriose, angiogenese, ateromatøs plakkutvikling, Alzheimers sykdom, von Hippel-Lindau sykdom, epidermal hyperproliferasjon, nevrodegenerative sykdommer, aldersrelaterte makulær degenerering og hemangiomer. F.eks. har EGFR vært indikert i hornhinne- og dermal sårheling. Defekter i Insulin-R og IGF-IR er indikert i type-II diabetes mellitus. En mer fullstendig korrelasjon mellom spesifikke RTK'er og deres terapeutiske indikasjoner er lagt frem i Plowman et al., 1994, DN& P 7:334-339.
Som bemerket over er det ikke bare RTK'er, men også CTK'er inkludert, men ikke begrenset til, src, abl, fps, yes, fyn, lyn, lek, blk, hek, fgr og yrk (oversikt av Bolen et al., 1992, FASEB J.. 6:3403-3409) som er involvert i den proliferative og metabolske signaltransduksjonsveien, og således kunne antas, og har vært vist, å være involvert i mange PTK-medierte sykdommer som den foreliggende oppfinnelsen er rettet mot. F.eks. har mutert src (v-src) vært vist å være et onkoprotein (pp60<v>"<src>) i kylling. Videre har dens cellulære homolog, proto-onkogenet pp60<c*sre> vært vist å overføre onkogene signaler for mange reseptorer. Overekspresjon av EGFR eller HER2/nau i tumorer fører til den konstitutive aktiveringen av pp60c src, karakteristisk for maligne celler, men fraværende i normale celler. På den annen side viser mus med svikt i ekspresjonen av c-src, en osteop.etrotisk fenotype, som indikerer en nøkkeldeltagelse av c-src i osteokalstfunksjon og mulig involvering i relaterte sykdommer.
På samme vis har Zap70 vært involvert i T-celle-signalisering, som kan være beslektet med autoimmune sykdommer.
STK'er har vært assosiert med inflammasjon, autoimmun sykdom, immunresponser og hyperproliferative sykdommer såsom restenose, fibrose, psoriasis, osteoartritt og reumatoid artritt.
PK'er har også vært involvert i embryoimplantering. Således kan forbindelsene i
den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringe en effektiv fremgangsmåte for å hindre slike embryoimplantasjoner, og derved være nyttig som vekstkontrollagens.
Endelig er både RTK'er og CTK'er nåværende antatt å være involvert i hyperimmune sykdommer.
En fremgangsmåte for å identifisere en kjemisk forbindelse som modulerer den katalytiske aktiviteten til én eller flere av de ovennevnte diskuterte proteinkinasene, beskrives heri. Fremgangsmåten involverer å kontakte celler.som uttrykker den ønskede proteinkinasen med en forbindelse fra den foreliggende oppfinnelse (eller dens salter eller forløpermedikamenter), og å måle cellene for enhver effekt som forbindelsen har på dem. Effekten kan være enhver observerbar, enten for det nakne øyet eller via anvendelse av instrumentering, endring eller fravær av endring i en celles fenotype. Endringen eller fravær av endring i en celles fenotype målt kan være, f.eks. uten begrensning, en endring eller fravær av endring i den katalytiske aktiviteten til proteinkinasen i cellene, eller'en endring eller fravær av endring i interaksjonen mellom proteinkinasen med en naturlig bindingspartner.
Eksempler på effekten av et antall med eksempelforbindelser fra den foreliggende oppfinnelsen på flere PTK'er er vist i tabell 1 og 2, og i den biologiske eksempeldelen under. Forbindelsene og data presentert er ikke å anse for å være begrensende for omfanget av den foreliggende oppfinnelsen på noen som helst måte.
5. FARMASØYTISKE SAMMENSETNINGER OG ANVENDELSE
En forbindelse fra den foreliggende oppfinnelsen, et prodmedikament derav eller et fysiologisk akseptabelt salt av enten forbindelsen eller dens forløpermedikament, kan administreres som sådan til en menneskelig pasient, eller kan bli administrert i farmasøytiske sammensetninger der de foregående materialene er blandet med
passende bærere eller tilsetningsstoff(er). Teknikker for formulering og administrering av medikamenter kan bli funnet i "Remington's Pharmacological Sciences" , Mack Publishing Co., Easton, PA, siste utgave.
Admini strasi ons veier
Som benyttet heri refererer "administrerer" eller "administrering" seg til avleveringen av en forbindelse, salt eller forløpermedikament i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, eller en farmasøytisk sammensetning som inneholder en forbindelse, salt eller forløpermedikament fra foreliggende oppfinnelse, til en organisme i den hensikt å hindre eller behandle en PK-relatert sykdom'. .Passende administrasjons vei er kan inkludere, uten begrensning, oral, rektal, transmukosal eller intestinal administrering eller intramuskulær, subkutan, intramedullær, intratekal, direkte intraventrikulær, intravenøs, intravitreal, intrapéritonal, intranasal eller intraokkulære injeksjoner. De.foretrukne
. administrasjonsveiene er orale eller parenterale.
Alternativt kan man administrere forbindelsen på en lokal i stedet for en systemisk måte, f.eks. via injeksjon av forbindelsen direkte til en fast tumor, ofte i et depot eller i en forlenget frigivelsesformulering.
Videre kan man administrere medikamentet i et målrettet medikamentavleverings-system, f.eks. i en liposom belagt med tumorspesifikt antistoff. Liposomene vil være målrettet mot, og blir selektivt tatt opp av, tumoren.
Sammensetning/ formulering
Farmasøytiske sammensetninger i henhold til den foreliggende oppfinnelsen kan produseres ved fremgangsmåter som er vel kjent i faget, f.eks. ved metoder for tradisjonell blanding, oppløsning, granulering, beleggirlg, pulverisering, erhulsifisering, innkapsling, fanging eller lyofiliseringsprosesser.
Farmasøytiske sammensetninger for anvendelse i samsvar med den foreliggende oppfinnelsen kan være formulert på tradisjonelle måter, ved å benytte én eller flere fysiologisk akseptable bærere som omfatter tilsetningsstoffer og hjelpestoffer som forenkler prosesseringen av de aktive forbindelsene inn i prepareringer som kan bli benyttet farmasøytisk. Eri passende formulering er avhengig av administrasjonsveien som velges.
For injeksjon kan forbindelsene i den foreliggende oppfinnelsen formuleres i vandige løsninger, fortrinnsvis i fysiologiske kompatible buffere såsom Hanks løsning, Ringers løsning eller fysiologisk saltbuffer. For transmukosal administrering er stoffer som penetrerer barrieren som skal gjennomtrenges passende å benytte i formuleringen. Slike penetrasjonsstoffer er generelt kjent i faget.
For oral administrering kan forbindelsene bli formulert ved å kombinere de aktive forbindelsene med farmasøytisk akseptable bærere som er vel kjent i faget. Slike bærere gjør det mulig for forbindelsene i henhold til oppfinnelsen å bli formulert som tabletter, piller, lozenger, drops, kapsler, væsker, geler, sirupper, "slurries", suspensjoner og lignende, for oralt inntak av en pasient. Farmasøytiske prepareringer for oral anvendelse kan bli laget ved å benytte et fast tilsetningsstoff, eventuelt å måle den resulterende blandingen, og å prosessere blandingen av granuler, etter å ha tilsatt andre passende hjelpestoffer dersom dette er ønskelig, for å oppnå tabletter eller dropskjerner. Nyttige tilsetningsstoffer er spesielt fyllere såsom sukker, inkludert laktose, sukrose, mannitol eller sorbitol, cellulosepre-pareringer såsom f.eks. maisstivelse, hvetestivelse, risstivelse og potétstivelse og andre materialer såsom gelatin, gummitragacanth, metylcellulose, hydroksypropyl-metylcellulose, natriumkarboksymetylcellulose og/eller polyvinyl-pyrrolidon (PVP). Dersom det er ønskelig kan disintegrerende agens tilsettes, såsom kryss-koblede polyvinylpyrrolidon, agar, eller algininsyre. Et salt såsom natriumalginat kan også bli benyttet.
Dropskjerner blir tilveiebragt ved passende belegginger. For denne hensikten kan konsentrerte sukkerløsninger bli benyttet, som eventuelt kan inneholde gummi: arabic, talkum, polyvinylpyrrolidon, karbopolgel, polyetylenglykol og/eller titaniumdioksid, lakkerløsninger og passende organiske løsningsmidler eller løsningsmiddelblandinger. Fargestoff eller pigmenter kan tilsettes til tablettene eller dropsbelegginger for identifisering eller for å karakterisere ulike kombinasjoner av aktive forbindelsesdoser.
I
Farmasøytiske sammensetninger som kan bli benyttet oralt inkluderer "push-fit" kapsler laget av gelatin, såvel som myke, forseglede kapsler laget av gelatin og et bløtgjøringsmiddel, såsom glyserol eller sorbitol. "Push-fit" kapslene kan inneholde de aktive bestanddelene i en tilblanding med en fyller såsom laktose, et bindemiddel såsom stivelse og/eller et smøremiddel såsom talkum eller mågnesiumstearat, og, eventuelt stabilisatorer. I myke kapsler kan de aktive forbindelsene bli oppløst eller suspendert i passende væsker, såsom fettoljer, flytende parafin eller flytende polyetylenglykoler. Stabilisatorer kan bli tilsatt til disse formuleringene også.
For administrering ved inhalaering blir forbindelsene til anvendelse i samsvar med den foreliggende oppfinnelsen, tradisjonelt avlevert i formen av en aerosolspray, . som benytter en pakke under trykk eller et forstøvningsapparat, og et passende drivmiddel, f.eks. uten begrensning, diklordifluormetan, triklorfluormetan, diklortetra-fluoretan eller karbondioksid. I tilfellet med aerosoler under trykk, kan doseenheten bli kontrollert ved å tilveiebringe en klaff for å avlevere en tilmålt mengde. Kapsler og beholdere av f.eks. gelatin for anvendelse i en inhalator eller insufflator, kan bli formulert for å inneholde en pulverblanding av forbindelsen og eri passende pulverbase såsom laktose eller stivelse.
Forbindelsene kan også bli formulert for parenteral administrering, f.eks. ved bolusinjeksjon eller kontinuerlig infusjon. Formuleringer for injeksjon kan bli presentert i enhetsdoseform, f.eks. i ampuller eller i multidosebeholdere, med et tilsatt konserveringsmiddel. Sammensetningene kan være i form av suspensjoner, oppløsninger eller emulsjoner i olje eller vandige transportmidler, og kan inneholde formuleringsmaterialer såsom suspenderende, stabiliserende og/eller dispergerende agens.
Farmasøytiske sammensetninger for parenteral administrering inkluderer vandige løsninger av en vannløselig form, såsom, uten begrensning, et salt av den aktive forbindelsen. I tillegg kan suspensjoner av de aktive forbindelsene fremstilles i et lipofilt transportmiddel. Passende lipofilé transportmidler inkluderer fettoljer såsom sesamolje, syntetiske fettsyreestere såsom etyloleat og triglyserider, eller materialer såsom liposomer. Vandige injeksjonssuspensjoner kan inneholde substanser som øker viskositeten til suspensjonen, såsom natriumkarboksymetylcellulose, sorbitol eller dekstran. Eventuelt kan suspensjonen også inneholde passende stabilisatorer og/eller agens som øker løseligheten til forbindelsene, for å tillate prepareringen av høyt konsentrerte løsninger.
Alternativt kan den aktive bestanddelen være i pulverform for å bli satt sammen med et passende transportmiddel, f.eks. sterilt pyrogenfritt vann, før anvendelse.
I
Forbindelsene kan også være formulert i rektale sammensetninger, såsom stikk-
piller eller retensjonsklyster, ved å benytte f.eks. tradisjonelle stikkpillebaser såsom kakaosmør. eller andre glyserider.
I tillegg til formuleringene beskrevet over kan forbindelsene også bli formulert som depotprepareringer. Slike langtidsvirkende formuleringer kan bli administrert ved implantasjon (f.eks. subkutant eller intramuskulært), eller ved intramuskulær injeksjon. En forbindelse i den foreliggende oppfinnelsen kan bli formulert for denne administrasjons vei en med passende polymere eller hydrofobe materialer
(f.eks. i en emulsjon med en farmakologisk akseptabel olje), med ioneutbytter-harpikser, eller som et sparsomt løselig derivat såsom, uten begrensning, et
sparsomt løselig salt.
Et ikke-begrensende eksempel på farmasøytisk bærer for de hydrofobe
forbindelsene i henhold til oppfinnelsen, er et ko-løsningsmiddelsystem som
omfatter benzylalkohol, et ikke-polart overflateaktivt stoff, en vannblandbar organisk polymer og en vannfase såsom VPD koløsningssystemet. VPD er en løsning på 3 % vekt/volum benzylalkohol, 8 % vekt/volum av det ikke-polare overflateaktive stoffet Polysorbat 80™, og 65 % vekt/volum polyetylenglykol 300, gjort opp til volum i absolutt etanol. VPD koløsningssystemet (VPD:D5W) består av VPD fortynnet 1:1 med en 5 % dekstrose i vannløsening. Dette koløsnings-systemet løser opp hydrofobe forbindelser godt, og produserer selv liten toksisitet ved systemisk administrering. Naturlig nok kan andelene av slike koløsnings-systemer bli variert vesentlig uten å ødelegge deres løselighet og toksisitetskarak-teristikker. Videre kan identiteten til koløsningskomponentene varieres: f.eks., kan andre lavtoksisitets, ikke-polare overflateaktive stoffer bli benyttet i stedet for Polysorbat 80™, fraksjonsstørrelsen av polyetylenglykol kan varieres, andre bio-kompatible polymerer kan erstatte polyetylenglykol, f.eks. polyvinylpyrrolidon og andre sukkere eller polysakkarider kan substituere for dekstrose.
Alternativt kan andre avleveringssystemer for hydrofobe farmasøytiske
forbindelser bli benyttet. Liposomer og emulsjoner er velkjente eksempler på avleveringstransportmidler eller bærere for hydrofobe medikamenter. I tillegg kan visse organiske løsningsmidler såsom dimetylsulfoksid også bli benyttet, selv om det ofte blir på bekostning av en høyere toksisitet.
I tillegg kan forbindelsene bli avlevert ved å benytte et forlenget frigivelsessystem, såsom semipermeable matrik&er av faste hydrofobe polymerer som inneholder det terapeutiske agenset. Ulike forlengede frigivelsesmaterialer har blitt etablert og er vel kjent for personer med kunnskap i faget. Forlengede frigivelseskapsler kan, avhengig av sin kjemiske natur, frigi forbindelsene fra noen få uker og opptil over 100 dager. Avhengig av den kjemiske egenskapen og den biologiske stabiliteten til det terapeutiske reagenset, kan ytterligere strategier for proteinstabilisering bli benyttet.
De farmasøytiske sammensetningene heri kan også omfatte passende faste stoffer eller gelfasebærere eller tilsetningsstoffer. Eksempler på slike bærere eller tilsetningsstoffer inkluderer, men er ikke begrenset til, kalsiumkarbonat, kalsiumfosfat, ulike sukkere, stivelser, celTulosederivater, gelatin og polymerer såsom polyetylenglykoler.
Mange-av de PK-modulerende forbindelsene i henhold til oppfinnelsen kan bli tilveiebragt som fysiologisk akseptable salter, hvori den patentkrevde forbindelsen kan danne den negativt eller den positivt ladede spesien. Eksempler på salter der forbindelsen danner den positivt ladde enheten inkluderer, uten begrensning, kvaternært ammonium (definert annensteds heri), salter såsom saltsyre, sulfat, karbonat, laktat, tartrat, maleat, succinat, hvori nitrogenat<p>met til den kvatemære ammoniumgruppen er et nitrogen av den valgte forbindelsen i henhold til oppfinnelsen, som har reagert med den passende syren. Salter der en forbindelse i henhold til den foreliggende oppfinnelsen danner den negativt ladde spesien inkluderer, uten begrensning,'natrium, kalium, kalsium og magnesiumsalter dannet ved reaksjonen av en karboksylsyregruppe i forbindelsen med en passende base (f.eks. natriumhydroksid (HaOH), kaliumhydroksid (KQH), kalsiumhydroksid (Ca(OH)2), osv.).
Dosering
Passende farmasøytiske sammensetninger inkluderer sammensetninger hvori de aktive ingrediensene er inneholdt i en mengde som er tilstrekkelig for å oppnå den
tiltenkte hensikten, dvs. moduleringen av PK-aktivitet eller behandlingen eller hindringen av en PK-relatert sykdom.
Mer spesielt betyr en terapeutisk effektiv mengde, en mengde av forbindelsen som er effektiv for å hindre, lindre eller forbedre symptomer på sykdom, eller forlenge overlevelsen til subjektet som blir behandlet.
Bestemmelse av en terapeutisk effektiv mengde er godt innenfor det som er mulig for en person med kunnskaper i faget, spesielt i lys av den detaljerte fremleggingen som tilveiebringes heri.
For enhver forbindelse som benyttes i fremgangsmåtene i foreliggende oppfinnelse, kan den terapeutisk effektive mengden eller dosen bli estimert initielt fra celledyrk-ingsassay. Deretter.kan dosen bli formulert for anvendelse i dyremodeller slik at man oppnår et sirkulerende konsentrasjonsområde som inkluderer den ICso slik den er bestemt i cellekultur (dvs. konsentrasjonen til testforbindelsen som oppnår en halv-maksimal inhibisjon av PK-aktiviteten). Slik informasjon kan deretter bli benyttet for mer nøyaktig å bestemme nyttige doser i mennesker.
Toksisitet og terapeutisk effekt av forbindelsene beskrevet heri kan bli bestemt ved standard farmasøytiske prosedyrer i cellekulturer eller forsøksdyr, f.eks. ved å bestemme IC50 og LD50 (begge som blir diskutert annensteds heri) for en forbindelse. Dataene som fremkommer fra disse celledyrkingsassayene og dyrestudiene kan bli benyttet i å formulere et område for dosering til anvendelse i mennesker. Doseringen.kan variere avhengig av doseformen som benyttes, og administrasjonsruten som benyttes. Den eksakte formuleringen, administrasjonsvei og dosering kan bli valgt av den individuelle lege i lys av pasientens tilstand. (Se f.eks. Fingl, et al., 1975, i "The Pharmacological Basis of Therapeutics", kap. 1, s.
Dosemengder og intervall kan bli justert individuelt for å tilveiebringe plasmanivåer av de aktive bestanddelene som er tilstrekkelig for å opprettholde de kinasemodulerende effektene. Disse plasmanivåene blir referert til som minimal - effektive konsentrasjoner (MECer). MEC vil variere for hver forbindelse, men kan estimeres fra in vitro data, f.eks. konsentrasjonen som er nødvendig for å oppnå 50-90 % inhibisjon av en kinase kan .bli sikret ved å benytte assayet beskrevet heri. Doser som .er nødvendig for å oppnå MEC vil avhenge av individuelle karakter-istikker og administrasjonsveier. HPLC-assay eller bioassay kan bli benyttet for å bestemme plasmakonsentrasjoner.
Doseintervaller kan også bli bestemt ved å benytte MEC-verdi. Forbindelser bør bli administrert ved å benytte et regime som opprettholder plasmanivåer over MEC for 10-90 % av tiden, fortrinnsvis mellom 30-90 %, og mest fortrinnsvis mell1o<m> 50-90 %<.>
I tilfeller med lokal administrering eller selektivt opptak, er det mulig at den effektive lokale konsentrasjonen av medikamentet ikke kan bli relatert til plasma-konsentrasjonen, og andre prosedyrer som er kjent i faget kan måtte bli benyttet for å bestemme den korrekte dosemengden pg intervallet.
Mengden av en sammensetning som administreres vil selvfølgelig være avhengig av subjektet som blir behandlet, alvorligheten av sykdommen, administrasjonsvei og vurderingen av foreskrivende lege osv.
Pakking
Sammensetningene kan, dersom det er ønskelig, bli presentert i en pakke eller dispenseranordning, såsom et FDA-godkjent sett, som kan inneholde én eller flere enhetsdoseformer som inneholder den aktive bestanddelen. Pakken kan f.eks. omfatte metall eller plastikkfolie, såsom en plasterpakke. Pakken eller dispenser-anordningen kan ledsages av instruksjoner for administrasjon. Pakken eller dispenseren kan også bli ledsaget av en notis assosiert med beholderen i en form foreskrevet av et statlig selskap som regulerer produksjonen, anvendelse eller salg av farmasøytiske produkter, det notisen reflekterer godkjenningen fra foretaket av formen på sammensetningene for human eller verinær administrering. Slik notis kan f.eks. være merking godkjent av U.S. Food and Drug Administration for å foreskrive medikamenter eller for et godkjent produkt. Sammensetninger som omfatter en forbindelse i henhold til oppfinnelsen, som er formulert i en . kompatibel farmasøytisk bærer kan også fremstilles, plasseres i en passende beholder og merkes for behandling av en indikert tilstand. Passende tilstander indikert på merkingen kan inkludere behandling av kreft, inhibisjon av angiogenese, behandling av fibrose, diabetes og lignende.
6. SYNTESE
Forbindelsene i den foreliggende oppfinnelsen, såvel som forløper 2-oksindolene og aldehydene, kan enkelt syntetiseres ved å benytte teknikker som er vel kjent i kjemifaget. Det vil være åpenbart for personer med kunnskaper i faget at andre syntetiske veier for å danne forbindelsene i henhold til oppfinnelsen er tilgjengelig, og at det følgende legges frem som et eksempel, og ikke er ment å skulle være begrensende.
A. Generell syntetisk prosedyre.
Den følgende generelle metodologien kan bli benyttet for å fremstille forbindelsene i den foreliggende-oppfinnelsen: Den passende substituerte 2-oksindol (1 ekvivalent), den passende substituerte aldehyd (1,2 ekvivalent) og piperidin (0,1 ekvivalent) blir blandet med etanol (1-2 ml/mmol 2-oksindol), og blandingen blir deretter varmet til 90°C i 3-5 timer. Etter nedkjølingen blir reaksjonsblandingen konsentrert og surgjort til pH 3. Presipitatet som dannes blir filtrert, vasket med vann til pH 7 og deretter kald etanol, etylacetat og/eller heksan og vakuumtørket for å gi målforbindelsen. Produktet kan eventuelt bli videre renset ved kromatografi.
B. 2-oksindoler..
De følgende eksemplene er representative synteser av 2-oksindolforløpere til forbindelsene i den foreliggende oppfinnelsen. Disse 2-oksindolene vil danne de patentkrevde forbindelsene i reaksjon med et passende substituert pyrrolaldehyd ved å benytte den ovennevnte generelle syntesefremgangsmåten, eller fremgangsmåtene eksemplifisert i del C under. Det skal forstås at de følgende syntesene ikke er ment å være begrensende enten med hensyn til syntesetilnærming, eller med hensyn til oksindolene hvis syntese er eksemplifisert.
5-amino-2-oksindol
5-nitro-2roksindol (6,3 g) ble hydrogenert i metanol over 10 % palladium på
karbon ofr å gi 3,0 g (60 % utbytte) av tittelforbindelsen som et hvitt fast stoff.
. 5-brom-2-oksindol
2-oksindol (1,3 g) i 20 ml acetonitril ble kjølt ned til 10°C, og 2,0 g N-bromsuccinimid ble sakte tilsatt ved røring. Reaksjonen ble rørt i 1 time ved -10°C og 2 timer ved 0°C. Présipitatet ble samlet, vasket med vånn og tørket for å gi 1,9 g (90 % utbytte) av tittelforbindelsen.
4- metyl-2-oksindoI
Dietyloksalat (30 ml) i 20 ml med tørr eter ble tilsatt med røring til 19 g med kaliumetoksid suspendert i 50 ml med tørr eter. Blandingen ble kjølt ned på et isbad, og 20 ml med 3-nitro-o-xylen i 20 ml med tørr eter ble sakte tilsatt. Den tykke mørke røde blandingen ble varmet til tilbakestrømming i 0,5 timer, konsentrert til mørk rødt fast stoff, og behandlet med 10 % natriumhydroksid inntil nesten alt det faste stoffet var oppløst. Den mørke røde blandingen ble behandlet med 30 % hydrogenperoksid inntil den røde fargen endret seg til gul. Blandingen ble behandlet alternativt med 10 % natriumhydroksid og 30 % hydrogenperoksid inntil den mørke røde fargen ikke lenger var tilstede. Det faste stoffet ble filtrert vekk, og filtratet surgjort med 6N saltsyre. Det resulterende présipitatet ble samlet ved vakuumfiltrering, vasket med vann, og tørket undre vakuum for å gi 9,8 g (45
% utbytte) av 2-metyl-6-nitrofenyleddiksyre som et off white fast stoff. Det faste stoffet ble hydrogenert i metanol over 10 % palladium på karbon for å gi 9,04 g av tittelforbindelsen som ét hvitt fast stoff.
7-brom-5-klor-2-oksindol
5- klor-2-oksindol (16,8 g) og 19,6 g av N-bromsuccinimid ble suspendert i i40 ml med acetonitril og, tilbakestrømmet i 3 timer. Tynnsjiktskromatografi (silika, etylacetat) ved 2 timer etter tilbakestrømming viser 5-klor-2-oksindol eller N: bromsuccinimid (Rf 0,8), produkt (Rf 0,85) og et annet produkt (Rf 0,9) hvis proporsjoner ikke endret seg etter ytterligere 1 time med refluks. Blandingen ble kjølt ned til lO^C, présipitatet ble samlet ved vakuumfiltrering,-vasket med 25 ml etanol og sugetørket i 20 min. i trakten for å gi 14,1 g vått produkt (56 % utbytte). Det faste stoffet ble suspendert i 200 ml med denaturert etanol og vellingvasket
ved røring og tilbakestrømming i 10 min. Blandingen ble kjølt ned på isbad til 10°C. Det faste produktet ble samlet ved vakuumfiltrering, vasket med 25 ml med etanol og tørket under vakuum ved 40°C for å gi 12,7 g (51 % utbytte) med 7-brom-5-klor-2-oksindol.
5-fluor-2-oksindol
5-fluorisatin (8,2 g) ble løst opp i 50 ml med hydrasinhydrat og tilbakestrømmet i 1
I
time. Reaksjonsblandingen ble deretter helt over på isvann. Présipitatet ble deretter filtrert, vasket med vann og tørket i vakuumovn for å gi tittelforbindelsen.
5-nitro-2-oksindol
2-oksindol (6,5 g) ble løst opp i 25 ml konsentrert svovelsyre, og blandingen opprettholdt ved -10 til -15°C, mens 2,1 ml med skummende salpetersyre ble tilsatt dråpevis. Etter tilsetningen av salpetersyre ble reaksjonsblandingen rørt ved 0°C i 0,5 timer, og helt over på isvann. Présipitatet ble samlet ved filtrering, vasket med vann og krystallisert fra 50 % eddiksyre. Det krystallingske produktet ble deretter filtrert, vasket med vann og tørket under vakuum for å gi 6,3 g (70 %) av 5-nitro-2-oksindol.
5-jod-2-oksindoI
2-oksindol (82,9 g) ble suspendert i 630 ml med eddiksyre med mekanisk røring,
og blandingen ble kjølt ned til 10°C på et isvannbad. Fast N-jodsuccinimid (175 g)
ble tilsatt porsjonsvis over 10 min. Etter at tilsetningen var fullstendig ble
blandingen rørt i 1 time ved 10°C. Det oppløste faste stoffet, som alltid hadde vært tilstede, ble svært tykt på dette tidspunktet. Det faste stoffet ble samlet ved vakuumfiltrering, vasket med 100 ml 50 % eddiksyre i vann og deretter med 200
ml med.vann, og sugetørket i 20 min. i trakten. Produktet ble tørket under vakuum for å gi 93,5 g (36 %) med 5-jod-2-oksindol som inneholdt omkring 5 % 2-oksindol ved proton NMR.
5-metyl~2-oksindol
5-metylisatin (15,0 g) og 60 ml med hydrasinhydrat ble vannet til 140-160°C i 4
timer. Tynnsjiktskromatografi (etylacetat:heksan 1:2, silikagel) viste at det ikke var noe utgangsmateriale igjen. Reaksjonsblandingen ble kjølt ned til romtemperatur,
helt over på 300 ml med isvann, og surgjort til pH 2 med 6N saltsyre. Etter å ha stått ved romtemperatur i 2 dager ble présipitatet samlet ved vakuumfiltrering,
vasket med vann og tørket under vakuum for å gi 6,5 g (47 % utbytte) av 5-metyl-2-oksindol. ,
5-brom-4-metyloksindol og 5,7-dibrom-4-metyloksindol
4-metyl-2-oksindoI (5 g) i 40 ml med acetonitril ble behandlet med 7,26 g med N-bromsuccinimid og rørt ved romtemperatur i 4 timer. Tynnsjiktskromatografi (etylacetat:heksan 1:2, silikagel) viste en blanding med 5-brom (Rf 0,3) og 5,7T dibjom (Rf 0,5) produkter. Ytterligere 7,26 g med N-bromsuccinimid ble tilsatt, og blandingen ble rørt i ytterligere 4 timer. Det faste stoffet ble samlet ved vakuumfiltrering, vasket med 20 ml med acetonitril og tørket for å gi en 1:1
blanding av mono og dibromforbindelser. Filtratet ble konsentrert og kromato-
grafert på silikagel (etylacetat:heksan (1:2)) for å gi 1,67 g av 5-brom-4-metyl-2-oksindol som et beige fast stoff. Den gjenværende 1:1 blandingen med faste stoffer
I
ble rekrystallisert to ganger fra iseddiksyre for å gi 3,2 g med 5,7-dibrom-4-metyl-2-oksindol som et lyst orange fast stoff. Filtratene fra disse materialene ble kromatografert som over for å gi 0,6 g med 5-brom-4-metyl-2-oksindol og 0,5 g med 5,7-dibrom-4-metyl-2-oksindol.
6-fluor-2-oksindol
Natriumhydrid (2,6 g) og 14,5 g med dimetylmalonat ble rørt og varmet til 100°C i 160 ml dimetylsulfoksid i 1 time. Blandingen ble kjølt ned til romtemperatur, 7,95
g med 2,5-difluornitrobenzen ble tilsatt, og blandingen ble rørt i 30 min. Blandingen ble deretter varmet til 100°C i 1 time, kjølt ned til romtemperatur og helt over i 400 ml med mettet ammoniumkloirdløsning. Blandingen ble ekstrahert med 200 ml etylacetat, og det organiske laget vasket med saltløsning, tørket over vannfritt natriumsulfat og konsentrert under vakuum. Resten ble krystallisert fra . metanol for å gi 24,4 g (80 % utbytte) av dimetyl-4-fluor-2-nitrofenylmalonat som et hvitt fast stoff, Rf 0,2, på tynnsjiktskromatografi (etylacetat:heksan 1:6,
silikagel). Filtratet ble konsentrert og kromatografert på en kolonne med silikagel (etylacetat:heksan 1:8) for å gi ytterligere 5,03 g med dimeityl 4-fluor-2-nitro-fenylmalonat, i en total mengde på 29,5 g (96 % utbytte).
Dimetyl 4-fluor-2-nitrofenylmalonat (5,0 g) ble tilbakestrømmet i 20 ml med 6N saltsyre i 24.timer. Reaksjonen ble kjølt ned, og det hvite faste stoffet samlet ved vakuumfiltrering, vasket med vann og tørket for å gi 3,3 g (87 % utbytte) med 4-fluor-2-nitrofenyleddiksyre, Rf 0,6 på tynnsjiktskromatografi (etylacetat:heksan 1:2, silikagel).
4- fluor-2-nitro fenyl eddiksyre (3,3 g) løst opp i 15 ml med eddiksyre ble hydrogenert over 0,45 g med 10 % palladium på karbon ved 60 psi H2 i 2 timer: Katalysatoren ble fjernet ved filtrering og vasket med 15 ml metanol. De kombinerte filtratene blé konsentrert og fortynnet med vann. Présipitatet ble samlet ved vakuumfiltrering, vasket med vann og tørket for å gi 1,6 g (70 % utbytte) av 6-fluor-2-oksindol, Rf 0,24 på tynnsjiktskromatografi. Filtratet ble konsentrert for å
gi et lilla fast stoff med-et NNM-spektrum lignende til den.første rapporten. Kromatografi av det lilla faste stoffet (etylacetat:heksari 1:2, silikagel) ga et annet utbytte av 6-fluor-2-oksindol som et hvitt fast stoff.
5- aminosulfonyl-2-oksindol
Til en 100 ml flaske ladet med 27 ml med klorsulfonsyre ble det tilsatt sakte 13,3 g av 2-oksindol. Reaksjonstemperaturen ble opprettholdt under 30°C under tilsetningen. Etter tilsetningen ble reaksjonsblandingen rørt ved romtemperatur i 1,5 timer, varmet til 68°C i 1 time, kjølt ned og helt over i vann. Présipitatet ble vasket med vann og tørket i en vakuumovn for å gi 11,0 g av 5-klorsulfonyl-2-oksindol (50 % utbytte) som ble benyttet uten ytterligere rensing.
I
5-klofsulfonyl-2-oksindol (2,1 g) ble tilsatt til 10 ml med ammoniumhydroksid i 10 ml med etanol og rørt ved romtemperatur over natt. Blandingen ble konsentrert og det faste stoffet samlet ved vakuumfiltrering for å gi 0,4 g (20 % utbytte) av tittelforbindelsen som et offwhite fast stoff.
5-metylaminosulfonyl-2-oksindol
En suspensjon på 3,38 g med 5-klorsulfonyl-2-oksindol i 10 ml 2M metylamin i tetrahydrofuran ble rørt ved romtemperatur i 4 timer, og under denne tiden ble det. dannet et hvitt fast stoff. Présipitatet ble samlet ved vakuumfiltrering, vasket to ganger med 5 ml vann og tørket under vakuum ved 40°C over natt, hvilket ga 3,0 g (88 % utbytte) av 5-metylaminosulfonyl-2-oksindol.
5-(4-trifluormetylfenylaminosulfonyl)-2-oksindol
En suspensjon på 2,1 g med 5-klorsulfonyl-2-oksindbl, 1,6 g med 4-trifluormetyl-anilin og 1,4 g med pyridin i 20 ml med diklormetan ble rørt ved romtemperatur i 4 timer. Présipitatet som ble dannet ble samlet ved vakuumfiltrering, vasket to ganger med 5 ml med vann og tørket under vakuum ved 40°C over natt for å gi 2,4 g av råproduktet som inneholdt visse urenheter ved tynnsjiktkromatografi. Råproduktet ble kromatografert på silikagel som eluerte med etylacetat:heksan (1:2) for å gi 1,2 g (37 % utbytte) av 5-(4-trifluormetylfenyl-aminosulfonyl)-2-oksindol.
5- (morfolinosulfonyl)-2-oksindol
En suspensjon på 2,3 g méd 5-klorsulfonyl-2-oksindol og 2,2 g med morfolin i 50 ml med diklormetan ble rørt ved romtemperatur i 3 timer. Det hvite présipitatet ble samlet ved vakuumfiltrering, vasket med etylacetat og heksan, og tørket under vakuum ved 40°C over natt for å gi 2,1 g (74 % utbytte) av 5-(morfolinosulfonyl)-2-oksindol.
6- trifluormetyl-2-oksindol
Dimetylsulfoksid (330 ml) ble tilsatt til 7,9 g med natriumhydrid, etterfulgt av
dråpevis tilsetning med 43,6 g dietyloksalat. Blandingen ble varmet til 100°C i 1 time, og kjølt ned.til romtemperatur. 2-nitro-4-trifluormetyltoluen (31,3 g) ble tilsatt, reaksjonen rørt i 30 min. ved romtemperatur og deretter varmet til 100°C i 1 time. Reaksjonen ble kjølt ned og helt over i en blanding med mettet vandig ammoniumkloird, etylacetat og heksan. Det organiske laget ble vasket med mettet ammoniumklorid, vann og saltløsning, tørket og konsentrert for å gi dimetyl 2-(2-nitro-4-trifluormetylfenyl)malonat.
Diesteren ble oppløst i en blanding av 6,4 g med litiumklorid og 2,7 ml med vann i 100 ml med dimetylsulfoksid, og varmet til 100°C i 3 timer. Reaksjonen ble kjølt ned og helt over i en blanding av etylacetat og saltløsning. Den organiske fasen ble vasket med saltløsning, tørket med natriumsulfat, konsentrert og kromato grafert på silikagel (10 % etylacetat i heksan). Fraksjonene som inneholdt produktet ble fordampet for å gi 25,7 g med metyl 2-nitro-4-trifluormetylfenylacetat.
Metyl 2-nitro-4-trifluormetylfenylacetat (26 mg) ble hydrogenert over 10 % palladium på karbon, og deretter varmet ved 100°C i 3 timer. Katalysatoren ble fjernet ved filtrering og løsningsmidlet fordampet for å gi tittelforbindelsen.
5-(2-kloretyl)oksindol
5-kloracetyI-2-oksindol (4,18 g) i 30 ml med trifluoreddiksyre på et isbad, ble behandlet med 4,65 g med trietylsilan og rørt ved romtemperatur i 3 timer. Blandingen ble helt over i 150 ml med vann, og présipitatet samlet ved vakuumfiltrering, vasket med 50 ml med vann og tørket for å gi 2,53 g (65 % utbytte) av 5-(2-kloretyl)-2-oksindol som et rødbrunt fast stoff.
5-metoksykarbonyl-2-oksindol
5-jod-2-oksindol (17 g) ble tilbakestrømmet med 2 g med palladiumdiacetat, 18,2 g med trietylamin, 150 ml med metanol, 15 ml med dimetylsulfoksid og 2,6 g med
DPPP i en atmosfære mettet med karbonmonoksid. Etter 24 timer ble reaksjonen filtrert for å fjerne katalysatoren, og filtratet konsentrert. Konsentratet ble kromatografert på silikagel (30 % etylacetat i heksan). Fraksjonene som inneholdt produktet ble konsentrert og tillatt å stå. Presipitatproduktet ble samlet ved
vakuumfiltrering for å gi 0,8 g (7 %) av tittelforbindelsen som et offwhite fast
stoff.
4-karboksy-2-oksindol En løsning med trimetylsilyldiazometan i heksan (2M) ble tilsatt dråpevis til en løsning med 2,01 g av 2-klor-3-karboksy-nitrobenzen i 20 ml metanol ved romtemperatur, inntil det ikke kom noe videre gass. Overskuddet med trimetyl-silyldiazo-metan ble undertrykket med eddiksyre. Reaksjonsblandingen ble tørket ved rotasjonspumpe, og resten ble videre tørket i et vakuum over natt. Produktet (2-klor-3-metoksykarbonyl-nitrobenzen) var rent nok for den videre reaksjonen.
Dimetylmalonat (6,0 ml) ble tilsatt til en iskald suspensjon med 2,1 g med natriumhydrid i 15 ml med DMSO. Reaksjonsblandingen ble deretter rørt ved 100°C i 1 time, og deretter kjølt ned til romtemperatur. 2-klor-3-metoksykarbonylnitrobenzen (2,15 g) ble tilsatt til den ovennevnte blandingen i én porsjon, og blandingen ble varmet til 100°C i 1,5 timer. Reaksjonsblandingen ble deretter kjølt ned til romtemperatur og helt over i isvann, surgjort til pH 5, og ekstrahert med etylacetat. Det organiske laget ble vasket med saltløsning, tørket over vannfri natriumsulfat og konsentrert for å gi 3,0 g med dimetyl-2-metoksykarbonyl-6-nitrofenylmalonat.
Dimetyl-2-metoksykarbonyl-6-nitrofenylmalonat (3,0 g) ble tilbakestrømmet i 50 ml med 6 N saltsyre over natt. Blandingen ble konsentrert til tørrhet og kokt med tilbakestrømming i 2 timer med 1,1 g med tinn(II) klorid i 20 ml med etanol. Blandingen ble filtrert gjennom Celite, konsentrert og kromatografert på silikagel (etylacetat:heksan:eddiksyre) for å gi 0,65 g (37 % utbytte) av 4-karboksy-2-oksindol som et hvitt fast stoff.
5-karboks-2-oksindol
2-oksindol (6,7 g) ble tilsatt til en rørt løsning ved 23 g med aluminiumklorid i 30 ml med dikloretan i et isbad. Kloracetylklorid (11,3 g) ble sakte tilsatt, og hydrogengass utviklet seg. Etter ti min. med røring ble reaksjonen varmet ved 40-50°C i 1,5 timer. Tynnsjiktskromatografi (etylacetat, silikagel) viste at det ikke var noe igjen av utgangsmaterialet. Blandingen ble kjølt ned til romtemperatur og helt over i isvann. Présipitatet ble samlet ved vakuumfiltrering, vasket med vann og tørket under vakuum for å gi 10,3 g (98 %) med 5-kloracetyl-2-oksindol som et offwhite fast stoff.
En suspensjon med 9,3 g med 5-kloracetylr2-oksindol ble rørt i 90 ml pyridin ved 80-90°C i 3 timer, deretter kjølt ned til romtemperatur. Présipitatet ble samlet ved vakuumfiltrering og vasket med 20 ml etanol. Det faste stoffet ble løst opp i 90 ml 2,5N natriumhydroksid og rørt ved 7O-80°C i 3 timer. Blandingen ble kjølt ned til romtemperatur og surgjort til pH 2 med 0,5 N saltsyre. Présipitatet ble samlet ved
vakuumfiltrering og vasket nøye med vann for å gi råproduktet 5-karboksy-2-oksindol som et mørkebrunt fast stoff. Etter å ha stått over natt ga filtratet 2 g med 5-karboksy-2-oksindol som et gult fast stoff. Det mørkebrune råproduktet ble løst opp i varm metanol, det uløselige materialet fjernet ved filtrering og filtratet konsentrert for å gi 5,6 g med 5-karboksy-2-oksindol som et brunt fast stoff. Det kombinerte utbyttet var 97 %.
5-karboksyetyl-2-oksindol
5-cyanoetyl-2-oksindol (4,02 g) i 10 ml med vann som inneholdt 25 ml med konsentrert saltsyre ble tilbakestrømmet i 4 timer. Blandingen ble kjølt ned, vann tilsatt og det resulterende faste stoffet samlet ved vakuumfiltrering, vasket med vann og tørket for å gi 1,9 g (44 % utbytte) av tittelforbindelsen som et gult fast stoff.
5-jod-4-metyl-2-oksindol
Til 2 g med 4-metyl-2-oksindol i 40 ml med iseddiksyre på et isbad ble det tilsatt 3,67 g med N-jodsuccinimid. Blandingen ble rørt i 1 time, fortynnet med 100 ml 50 % eddiksyre i vann og filtrert. Det resulterende hvite faste stoffet ble tørket under høyt vakuum for å gi 3,27 g (88 % utbytte) av tittelforbindelsen som et offwhite fast stoff.
5-klor-4-metyl-2-oksindol
En suspensjon på 3,0 g med 4-metyl-2-oksindol ble rørt i 50 ml med acetonitril ved romtemperatur, mens 3,3 g med N-klorsuccinimid ble tilsatt i porsjoner. Trifluoreddiksyre (1 ml) ble deretter tilsatt. Suspensjonen ble rørt ved romtemperatur i 3 dager, og i den tiden var et fast stoff alltid tilstede. Det hvite faste stoffet ble samlet ved vakuumfiltrering, vasket med en liten mengde kald aceton og tørket over natt i vakuumovn ved 40°C for å gi 2,5 g (68 %) av 5-klor-4-metyl-2-oksindol.
5-butyl-2roksindol
Trietylsilan (2,3 g) ble tilsatt til 2 g 4-butanoyl-2-oksindol i 20 ml med trifluoreddiksyre ved romtemperatur, og løsningen ble rørt i 3 timer. Reaksjonen ble helt over på isvann, for å gi en rød olje som ble fast etter å ha stått. Det faste stoffet ble samlet ved vakuumfiltrering, vasket med vann og heksan og tørket for å gi 1,7 g (91 % utbytte) av tittelforbindelsen for et offwhite fast stoff..
5-etyl-2-oksindol
Til 5-acetyl-2-oksiridol (2 g) i 15 ml med trifluoreddiksyre på et isbad, ble det sakte tilsatt 1,8 g med trietylsilan; reaksjonen ble deretter rørt ved romtemperatur i 5 timer. En ml med trietylsilan ble tilsatt og røringen ble opprettholdt over natt.
Reaksjonsblandingen ble helt over i isvann, og det resulterende faste stoffet samlet ved vakuumfiltrering, vasket med vann og tørket under vakuum for å gi 1,3 g (71 ' % utbytte) av tittelforbindelsen som et gult fast stoff.
5-(morfolin-4-etyl)-2-oksindol
5-kloretyl-2-oksindol (2,3 g), 1,2 ml med morfolin og 1,2 ml med diisopropyletylamin ble varmet over natt ved 100°C i 10 ml med dimetylsulfoksid. Blandingen ble kjølt ned, helt over i vann og ekstrahert med etylacetat. Det organiske laget ble
vasket med saltløsning, tørket og fordampet. Resten ble kromatografert på silikagel (5 % metanol i kloroform) for å gi 0,9 g (31 %) av tittelforbindelsen som et hvitt fast. stoff..
5-(4-metoksykarbonylbenzamido)-2-oksindol En blanding rried 82,0 mg 5-amino-2-oksindol og 131,0 mg 4-metoksykarbonyl-benzoylklorid i pyridin ble rørt ved romtemperatur i 3 timer, og helt over i isvann. Presipitatet.ble filtrert, vasket med vann og tørket i en vakuumovn for å gi 138,0 mg med 5-(4-metoksykarbonylbenzamido)-2-oksindol (81 % utbytte).
5-(4-karboksybenzamido)-2-oksindol
5-(4-metoksykarbonylbenzamido)-2-oksindol (0,9 g) og 0,4 g med natriumhydroksid i 25 ml med etanol ble tilbakestrømmet i 3 timer. Blandingen ble konsentrert, vann tilsatt og blandingen surgjort med 6N saltsyre. Présipitatet ble samlet ved vakuumfiltrering for å gi 0,75 g (87 %) av tittelforbindelsen som et hvitt fast stoff.
5-metoksy-2-oksindol
Kloralhydrat (9,6 g) ble løst opp i 200 ml med vann som inneholdt 83 g av natriumsulfat. Løsningen ble varmet til 60°C, en løsning med 11,4 g med hydroksylaminhydroklorid i 50 ml med vann ble tilsatt, bg blandingen ble holdt ved 60°C. I en separat flaske ble 6,4 g med 4-anisidin og 4,3 ml med konsentrert saltsyre i 80 ml med vann, varmet til 80°C. Den første løsningen ble tilsatt til den andre, og blandingen ble tilbakestrømmet i 2 min., hvoretter den ble kjølt ned sakte til romtemperatur og deretter kjølt ned på isbad. Det fargede présipitatet ble samlet ved vakuumfiltrering, vasket med vann og tørket under vakuum for å gi 8,6 g (85 % utbytte) av N-(2-hydroksimino-acetyl)anisidin.
Konsentrert svovelsyre (45 ml) som inneholdt 5 ml med vann ble vannet til 60°C, ' og 8,6 g med N-(2-hydroksiminoacetyl)anisidin ble tilsatt i én porsjon. Den rørte blandingen ble varmet til 93°C i 10 min. og deretter tillatt å kjøle ned til romtemperatur. Blandingen ble helt over på 500 g med is, og ekstrahert 3 ganger med etylacetat. De kombinerte ekstraktene ble tørket over vannfri natriumsulfat og konsentrert for å gi 5,1 g (65 % utbytte) med 5-metoksysatin som et mørk rødt fast stoff. 5-metoksysatin (5,0 g) og 30 ml med hydrazinhydrat ble varmet til tilbakestrømming i 15 min. Reaksjonsblandingen ble kjølt ned til romtemperatur, og 50 ml med vann ble tilsatt. Blandingen ble ekstrahert 3 ganger med 25 ml med etylacetat h<y>er gang, de organiske lagene kombinert, tørket over vannfri natriumsulfat og konsentrert for å gi et gult fast stoff. Det faste stoffet ble rørt i etylacetat og 1,1 g av uløselig materiale ble fjernet ved vakuumfiltrering og spart på. Dette materialet viste seg å være 2-hydrazinokarbonylmetyl-4-anisidin. Filtratet ble konsentrert og kromatografert på silikagel som eluerte med etylacetat:heksan (1:1) for å gi 0,7 g av 5-metoksy-2-oksindol som et gult fast stoff. 1,1 g med 2-hydra-zinokarbonylmetyl-4-anisidin ble tilbakestrømmet i 1 time i 20 ml med IN natriumhydroksid. Blandingen ble kjølt ned, surgjort til pH 2 med konsentrert saltsyre og ekstrahert tre ganger med 25 ml med etylacetat hver gang. De organiske ekstraktene ble kombinert, vasket med saltløsning, tørket over vannfri natriumsulfat og konsentrert for å gi 0,8 g med 5-metoksy-2-oksindol som et gult fast stoff. Det kombinerte utbyttet var 1,5 g eller 33 %.
7-azaoksindol
. 3,3-dibrom-7-azaoksindol (2,9 g) ble løst opp i en blanding av 20 ml med eddiksyre og 30 ml med acetonitril. Til løsningen ble det tilsatt 6,5 g med sinkstøv. Blandingen ble rørt i 2 timer ved romtemperatur. Det faste stoffet ble filtrert fra
blandingen og løsningsmidlet fordampet. Resten ble grumset opp med etylacetat. Etylacetatløsningen som inneholdt uløselig fast stoff ble passert gjennom en kort kolonne med silikagel. Den samlede etylacetatløsningen ble fordampet, og resten tørket under vakuum for å gi 1,8 g (utbytte 91 %) med 7-azaoksindoleddiksyresalt.
5- dimety 1 ami no sulfony 1 -2-oksi ndo 1
En løsning med 2,3 g med 5-klorsulfonyl-2-oksindol i 10 ml med 2M dimetylamin i metanol ble rørt ved romtemperatur i 4 timer, og det ble dannet et hvitt fast stoff. Présipitatet ble samlet ved vakuumfiltrering, vasket med 5 ml med IN natriumhydroksid og 5 ml med IN saltsyre, og tørket under vakuum ved 40°C over natt for å gi 1,9 g (79 % utbytte) med 5-dimetylamino-sulfonyl-2-oksindol.
6- fenyl-2-oksindol
Dimetylmalonat (10 ml) i 25 ml med dimetylsulfoksid ble tilsatt dråpevis til 3,5 g natriumhydrid suspendert i 25 ml dimetylsulfoksid, og blandingen varmet ved 100°C i 10 min. Blandingen ble kjølt ned til romtemperatur og 4,7 g med 4-fluor-3-nitrobifenyl i 25 ml med dimetylsulfoksid ble tilsatt. Blandingen ble varmet ved 100°C i 2 timer, kjølt ned og undertrykket med 300 ml med mettet ammonium-kloridløsning. Blandingen ble ekstrahert tre ganger med etylacetat og de kombinerte organiske lagene ble vasket med vann og saltløsning og fordampet for å gi, som en gul.olje, råproduktet dimetyl-3-nitrobifenyI-4-malonat.
Råproduktet dimetyl-3-nitrobifényl-4-malonat ble tilbakestrømmet i 30 ml med 6 N saltsyre i 24 timer. Présipitatet ble samlet ved filtrering, vasket med vann og tørket for å gi 4,5 g med 3-nitrobifenyl-4-eddiksyre som et kremfarget fast stoff.
Jernpulver (2,6 g) ble tilsatt alt sammen samtidig til 4,5 g med 3-nitrobifenyl-4-eddiksyre i 40 ml med eddiksyre. Blandingen ble tilbakestrømmet i 2 timer konsentrert til tørrhet og tatt opp i etylacetat. De faste stoffene ble fjernet ved filtrering, og filtratet vasket to ganger med IN saltsyre og saltløsning, og tørket over vannfri natriumsulfat. Filtratet ble konsentrert for å gi 3,4 g (93 % utbytte) med 6-fenyl-2-dksindol som et lysebrunt fast stoff.
6-(2-metoksyfenyl)-2-oksindol
Tetrakis (trifenylfosfin)palladium (I g) ble tilsatt til en blanding med 5 g 2-metoksyferiylboronsyre, 6,6 g 5-brom-2-fluomitrobenzen og 30 ml med 2 M natriumkarbonatløsning i 50 ml med toluen og 50 ml med etanol. Blandingen ble tilbakestrømmet i 2 timer, konsentrert, og resten ekstrahert to ganger med etylacetat. Etylacetatlaget ble vasket med vann og saltløsning, deretter tørket og konsentrert for å gi en mørk grønn olje som ble fast ved stillstand, råprodukt 4-f]uor-2'-metoksy-3-nitro fenyl.
Dimetylmalonat (14 ml) ble tilsatt dråpevis til 2,9 g med natriumhydrid suspendert i 50 ml med dimetylsulfoksid. Blandingen ble varmet ved 100°C i 15 min. og kjølt ned til romtemperatur. Råproduktet 4-fluor-2'-metoksy-3-nitrobifenyl i 60 ml dimetylsulfoksid ble tilsatt, og blandingen ble varmet ved 100°C i 2 timer. Reaksjonsblandingen ble kjølt ned, og undertrykket med 300 ml med mettet natriumkloridløsning og ekstrahert to ganger med etylacetat. Ekstraktene ble kombinert, vasket med mettet ammoniumklorid, vann og saltløsning, tørket over vannfritt natriumsulfat og konsentrert for å gi råproduktet dimetyl 2'-metoksy-3-nitrobifenyl-4-malonat som en gul olje.
Råprodukt dimetyl 2'-metoksy-3-nitrobifenyl-4-mal'onat ble varmet ved 100°C i 50 ml med 6 N saltsyre i 24 timer og kjølt ned. Présipitatet ble samlet ved filtrering, . vasket med vann og heksan og tørket for å "gi 9,8 g med 2'-metoksy-2-nitrobifenyl-4-eddiksyre som et lysfarget fast stoff.
Jernpulver (5 g) ble tilsatt i en porsjon til 9,8 g med 2'-metoksy-3-nitrobifenyl-4-eddiksyre i 50 ml med iseddiksyre ble varmet til 100°C i 3 timer. Reaksjonsblandingen ble konsentrert til tørrhet, sonikert i etylacetat og filtrert for å fjerne uløseligheter. Filtratet ble vasket to ganger med IN saltsyre, vann og deretter saltløsning, tørket over vannfritt natriumsulfat og konsentrert. Resten ble kromato grafert på silikagel i etylacetat:heksan (1:2) for å gi 5,4 g med 6-(2-metoksyfenyI)-2-oksindol som et rosefarget fast stoff.
6-(3-metoksyfenyl)-2-oksindol
Tetrakis (trifenylfosfin)palladium (0,8 g) ble tilsatt til en blanding med 5 g 3-metoksyfenylboronsyre, 5 g 5-brom-2-fluor-nitrobenzen og 11 ml med 2 M natriumkarbonatløsning i 100 ml med to luen. Blandingen ble tilbakestrømmet i 2 timer, fortynnet med vann og ekstrahert med etylacetat. Etylacetatet ble vasket med mettet natriumbikarbonat og saltløsning, og deretter tørket og konsentrert for å gi et oljeaktig fast stoff. Det faste stoffet ble kromato grafert på silikagel (etylacetat:heksan (1:6)) for å gi 4,3 g (77 % utbytte) med 4-fluor-3'-metoksy-3-nitrobifenyl.
Dimetylmalonat (9,7 ml) ble tilsatt dråpevis i 2,0 g natriumhydrid suspendert i 50 ml med dimetylsulfoksid. Blandingen ble varmet til 100°C i 35 min. og kjølt ned til romtemperatur. 4-fIuor-2'-metoksy-3-nitrobifenyl (4,2 g) i 50 ml dimetylsulfoksid ble tilsatt, og blandingen ble varmet ved 100°C i 1 time. Reaksjonsblandingen ble kjølt ned og undertrykket med 300 ml med mettet ammoniumkloridløsning, og ekstrahert to ganger med etylacetat. Ekstraktene ble kombinert, vasket med saltløsning, tørket over vannfritt natriumsulfat og konsentrert for å gi råproduktet dimetyl-3'-metoksy-4-nitrobifenyl-4-malonat som et lysegult fast stoff.
Råproduktet dimetyl 3'-metoksy-3-nitrobifenyl-4-malonat ble varmet ved 110°C i 45 ml 6N saltsyre i fire dager og deretter kjølt ned. Présipitatet ble samlet ved
filtrering, vasket med vann og heksan og tørket for å gi 5,3 g med 3'-metoksy-2-nitrobifenyl-4-eddiksyre som et lysfarget fast stoff.
3'-metoksy-3-nitrobifenyl-4-eddiksyre (5,2 g) ble løst opp i metanol og hydrogenert over 0,8 g med 10 % palladium på karbon i 3 timer ved
romtemperatur. Katalysatoren ble fjernet ved filtrering, vasket med metanol og filtratene kombinert og konsentrert for å gi et brunt fast stoff. Det faste stoffet ble kromatografert på silikagel i etylacetat: heks an: eddiksyre (33:66:1) for å gi 3,0 g med 6-(3-metoksyfenyl)-2-oksindol som et rosa fast stoff.
6-(4-metoksyfenyl)r2-oksindol
Tetrakis (trifenylfosfin)palladium (I g) ble tilsatt til en blanding med 5 g med 4-metoksyfenylboronsyre, 6,6 g med 5-brom-2-fluornitrobenzen og 30 ml med 2 M natriumkarbonatløsning i 50 ml med toluen og 50 ml med etanol. Blandingen ble tilbakestrømmet i 2 timer, konsentrert og resten ble ekstrahert to ganger med .etylacetat. Etylacetatlaget ble vasket med vann og saltløsning, tørket og konsentrert for å gi et brunt oljeaktig fast stoff. Det faste stoffet ble kromatografert på silikagel (5 % etylacetat i heksan) for å gi råproduktet 4-fluor-4'-metoksy-3-nitrobifenyl som et blekt gult fast stoff. . Dimetylmalonat (10 ml) ble tilsatt dråpevis til 2,0 g med natriumhydrid suspendert i 60 ml med dimetylsulfoksid. Blandingen ble varmet til 100°C i 10 min. og kjølt ned til romtemperatur. Råproduktet 4-fluor-2'-metoksy-3-nitrobifenyl (5,2 g) i 50 ml med dimetylsulfoksid ble tilsatt, og blandingen ble varmet ved 100°C i 2 timer. Reaksjonsblandingen ble kjølt ned og undertrykket med 300 ml med mettet
natriumkloirdløsning og ekstrahert tre ganger med etylacetat. Ekstraktene ble kombinert og vasket med mettet ammoniumklorid, vann og saltløsning, tørket over vannfritt natriumsulfat og konsentrert for å gi råproduktet dimetyl 4'-metoksy-3-nitrobifenyl-4-malonat som en gul olje.
Rå dimetyl 4'-metoksy-3-nitro-bifenyl-4-malonåt ble varmet ved 100°C i 60 ml. med 6N saltsyre i 15 timer og kjølt ried. Présipitatet ble samlet ved filtrering, vasket med vann og heksan og tørket for å gi 7,2 g med rå 4'-metoksy-3-nitrobifenyl-4-eddiksyre som et lysfarget fast stoff.
Jernpulver (3,6 g) ble tilsatt i én porsjon til 7,2 g med 4'-metoksy-3-nitrobifenyl-4-eddiksyre i 50 ml med iseddiksyre og varmet i 100°C over natt. Reaksjonsblandingen ble konsentrert til tørrhet, sonikert i etylacetat og filtrert for å
fjerne uløseligheter. Filtratene ble vasket to ganger med IN saltsyre og saltløsning, tørket over vannfritt natriumsulfat og konsentrert for å gi 2,7 g med 6-(4-metoksyfenyl)-2-oksindol som et rosefarget fast stoff.
6-(3-etoksyfenyl)-2-oksindol
Tetrakis (trifenylfosfin)palladium (0,8 g) ble tilsatt til en blanding med 4,2 g med 3-etoksyfenylboronsyre, 5,0 g med 5-brom-2-fluornitrobenzen og 22 ml med 2 M natriumkarbonatløsning i 50 ml med toluen og 50 ml med etanol. Blandingen ble tilbakestrømt i 2 timer, konsentrert, vann ble tilsatt og blandingen ble ekstrahert to ganger med etylacetat. Etylacetatlaget ble vasket med vann og saltløsning, deretter tørket og konsentrert. Resten ble kromatografert på silikagel (5 % etylacetat i heksan) for å gi 5,3 g (90 % utbytte) av rå 4-fluor-3'-etoksy-3-nitrobifenyl som en gul olje.
. Dimetylmalonat (11,4 ml) ble tilsatt dråpevis til 4,0 g natriumhydrid suspendert i 20 ml dimetylsulfoksid. Blandingen ble varmet til 100°C i 10 min. og deretter kjølt
ned til romtemperatur. Rå 4-fluor-3'-etoksy-3-nitrobifenyl (5,3 g) i 25 ml med dimetylsulfoksid ble tilsatt og blandingen ble varmet til 100°C i 2 timer. Reaksjonsblandingen ble kjølt ned og undertrykket med 300 ml med mettet ammoniumkloridløsning og ekstrahert tre ganger med etylacetat. Ekstraktene ble kombinert, vasket med vann og saltløsning og deretter tørket over vannfritt natriumsulfat og konsentrert for å gi rå dimetyl 3'-etoksy-3-nitrobifenyl-4'-malonat som en gul olje.
Rå dimetyl 3'-etoksy-3-nitrobifenyl-4-malonat ble varmet til 100°C i 60 ml med 6N saltsyre i fire dager og deretter kjølt ned. Présipitatet ble samlet ved filtrering, vasket med vann og heksan og tørket for å gi 4,7 g med rå 3'-etoksy-3-nitrobifenyl-4-eddiksyre som et lysfarget fast stoff.
Jernpulver (2,4 g) ble tilsatt i én porsjon til 4,6 g med 3'-etoksy-3-nitrobifenyl-4-eddiksyre i 40 ml med glasial eddiksyre, og tilbakestrømt i 2 timer. Reaksjonsblandingen ble konsentrert til tørrhet, behandlet repetert med etylacetat og filtrert for å fjerne uløseligheter. Filtratet ble vasket to ganger med IN saltsyre og saltløsning, og deretter tørket over vannfritt natriumsulfat og konsentrert for å
gi 3,5 g (91 % utbytte) av 6-(3-etoksyfenyl)-2-oksindol som et lysebrunt fast stoff.
6-brom-2-oksindol
Dimetylmalonat (13 ml) ble tilsatt dråpevis til 2,7 g natriumhydrid suspendert i 20 ml dimetylsulfoksid. Blandingen ble varmet til 100°C i 10 min. og deretter kjølt ned til romtemperatur. 5-brom-2-fluornitrobenzen (5,0 g) i 25 ml med dimetylsulfoksid ble tilsatt, og blandingen ble varmet til 100°C i 2 timer. Reaksjonsblandingen ble kjølt ned og undertrykket med 300 ml med ammoniumkloridløsning og ekstrahert tre ganger med etylacetat. Ekstraktene ble kombinert, vasket med mettet ammoniumklorid, vann og saltløsning, tørket over . vannfritt natriumsulfat og konsentrert for å gi rå dimetyl 4-brom-2-nitrofenylmalonat som en blek gul olje.
Rå dimetyl 4-brom-2-nitrofenylmalonat ble varmet ved 110°C i 40 ml med 6N saltsyre i 24 timer og deretter kjølt ned. Présipitatet ble samlet ved filtrering, vasket med vann og tørket for å gi 5,3 g (89 % utbytte) med 4-brom-2-nitro-fenyleddiksyre som et offwhite fast stoff.
4- brom-2-nitrofenyleddiksyre (0,26 g), 0,26 g sinkpulver og 3 ml 50 % svovelsyre i 5 ml med etanol ble varmet i 100°C over natt. Reaksjonsblandingen ble filtrert,
fortynnet med litt eddiksyre, konsentrert for å fjerne etanol, fortynnet med vann og ekstrahert to ganger med etylacetat. De kombinerte ekstraktene ble vasket med saltløsning, tørket over vannfritt natriumsulfat og konsentrert for å gi 0,19 g (90 % utbytte) av 6-brom-2-oksindol som et gult fast stoff.
. 5-acetyl-2-oksindol
2- oksindol (3 g) ble suspendert i 1,2-dikloretan og 3,2 ml acetylklorid ble sakte tilsatt. Den resulterende suspensjonen ble varmet i 50°C i 5 timer, kjølt ned og helt over i vann. Det resulterende présipitatet ble samlet ved vakuumfiltrering, vasket i rikelig med vann og tørket under vakuum for å gi 2,9 g (73 % utbytte) av tittelforbindelsen som et brunt fast stoff.
5- butanoyl-2-oksindol
Til 15 g aluminiumklorid suspendert i 30 ml 1,2-diklor-etan på et isbad ble det tilsatt 7,5 g med 2-oksindol, og deretter 12 g med butanoylklorid. Den resulterende suspensjonen ble varmet til 50°C over natt. Blandingen ble helt over i isvann og ekstrahert tre ganger med etylacetat. De-kombinerte etylacetatlagene ble vasket med saltløsning, tørket over natriumsulfat og konsentrert til tørrhet for å gi et brunt ■ fast stoff. Det faste stoffet ble kromatografert på silikagel (50 % etylacetat i heksan) for å gi 3 g (25 %) av tittelforbindelsen som et gult fast stoff.
5- cyanoetyl-2-oksindol
Kaliumcyanid (2,0 g) ble tilsatt i 15 ml i dimetylsulfoksid og varmet til 90°C. 5- - kloretyl-2-oksindol (3,0 g) oppløst i 5 ml dimetylsulfoksid ble tilsatt sakte med røring, og reaksjonen varmet til 150C i 2 timer. Blandingen ble kjølt ned, helt over isvann og présipitatet samlet ved vakuumfiltrering, vasket med vann, tørket og deretter kromatografert på silikagel (5 % metanol i kloroform) for å gi 1,2 g (42 % utbytte) av tittelforbindelsen.
6- morfolino-4-yl)-2-oksindol
6-amino-2-oksindol (2,2 g), 4,0 g 2, 2'-dibrometyleter og 7,9 g natriumkarbonat ble tilbakestrømmet i 20 ml etanol over natt, konsentrert og fortynnet méd 50 ml med
vann. Blandingen ble ekstrahert tre ganger med 50 ml med etylacetat og de organiske ekstraktene kombinert, vasket med 20 ml med saltløsning, tørket over vannfritt natriumsulfat og konsentrert til tørrhet. Det faste stoffet ble kromatografert på en kolonne av silikagel (etylacetat: heks an (1:1) som inneholdt 0,7 % eddiksyre) for å gi 1,2 g (37 % utbytte) av tittelforbindelsen som et beige fast stoff.
6-(3-trifluoracetylfenyl)-2-oksindol
3- aminofenylboronsyre (3,9 g), 5 g 5-brom-2-fluor-nitrobenzen, 0,8 g tetrakis
(trifenylfosfin)palladium og 23 ml med 2 M natriumbikarbonatløsning i 50 ml med - toluen ble tilbakestrømmet under nitrogen i 2,5 timer. Reaksjonsblandingen ble helt over i 200 ml med isvann, og blandingen ekstrahert tre ganger med 50 ml med etylacetat. De kombinerte organiske lagene ble vasket med 50 ml med vann og 20 ml med saltløsning, tørket over vannfritt natriumsulfat og konsentrert for å gi 9,7 g (92 % utbytte) av 2-fluor-5-(3-aminofenyl)nitrobenzen som en mørk brun olje.
Trifluoreddiksyreanhydrid (5,4 ml) ble sakte tilsatt til en rørt løsning med 9,7 g 2-fluor-5-(3-aminofenyl)-nitrobenzen, og 5,3 ml med trietylamin i 50 ml med diklormetan ved 0°C, og blandingen ble rørt i ytterligere 20 min. Blandingen ble konsentrert og resten kromatografert på en kolonne med silikagel (10 % etylacetat i heksan) for å gi 8,6 g (65 % utbytte) av 2-fluor-5-(3-trifluorazetamidofenyl)nitrobenzen'som en blek orange olje som ble fast ved hensetting...
Dimetylmalonat (9,6 ml) ble tilsatt dråpevis til en rørt løsning med 3,2 g med 60 % natriumhydrid i mineralolje i 40 ml vannfri dimetylsulfoksid under nitrogen. Blandingen ble rørt i 10 min, og 2-fluor<:>5-(3-trifluoracetamido-fenyl)nitrobenzen i 20 ml dimetylsulfoksid ble tilsatt. Den resulterende mørke røde blandingen ble
varmt til 100°C i 2 timer. Reaksjonen ble undertrykket ved å helle den over i 100
ml med mette ammoniumkloridløsning og ekstrahert to ganger med,50 ml metylacetat. Den organiske fasen ble vasket med 50 ml hver med mettet ammoniumkloirdløsning, vann og saltløsning, tørket over vannfri natriumsulfat og . konsentrert til en gul olje. Oljen ble kromatografert på en kolonne med silikagel (etylacetat:heksan (1:4)) for å gi 4,4 g (50 % utbytte) av dimetyI-2-[2-nitro-4-(3-trifiuoracetamidofenyl)fenyl]-malonat som et blekt gult fast stoff.
Dimetyl 2-[2-nitro-4-(3-trifluoracetamidofenyl)-fenyl]malonat (4,4 g) ble tilbakestrømmet over natt i 50 ml 6N saltsyre. Reaksjonsblandingen ble kjølt ned til romtemperatur og de faste stoffene ble samlet ved vakuumfiltrering, vasket med vann og tørket under vakuum for å gi 2,7 g (73 % utbytte) av 2-[2-nitro-4-(3-trifluoracetamidofenyl)fenyl] eddiksyre.
2-[2-nitro-4-(3-trifluoracetamidofenyl)fenyl]eddiksyre (100 mg) og 50 g jernpulver i 3 ml eddiksyre ble varmet til 100°C i 2 timer. Reaksjonsblandingen ble konsentrert og resten sonikert i 5 ml etylacetat. De uløselig faste stoffene ble fjernet ved vakuumfiltrering, og filtratet vasket med IN saltsyre, vann og saltløsning, tørket over vannfri natriumsulfat og konsentrert for å gi 10 mg (14 % utbytte) av tittelforbindelsen som et rosefarget fast stoff.
B. Aldehyder
5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyfrol-3-karboksylsyre
t-butyl-3-oksobutyrat (158 g, 1 mol) ble løst opp i 200 ml med eddiksyre i en 500
ml 3-halset rundbunnet flaske utstyrt med et termometer, addisjonstrakt og mekanisk røring. Blandingen ble kjølt ned i et isbad til omkring 10°C. Natriumnitritt (69 g, 1 mol) ble tilsatt i løpet av 75 min. noe som holdt temperaturen under 15°C. Det kalde badet ble fjernet og blandingen rørt i 30 min., og deretter fikk den stå i 3,5 timer for å gi t-butyl-2-hydroksimino-3-oksobutyrat.
Etyl-3-oksobutyrat (130 g, 1 mol) ble løst opp i 400 ml med eddiksyre i en 2 1 3-halset rundbunnet flaske utstyrt med et termometer, en addisjonstrakt, mekanisk røring, og plassert i et oljebad. Sinkstøv (50 g, 0,76 mol) ble tilsatt, og blandingen varmet til 60°C ved røring. t-butyl-2-hydroksimino-3-oksobutyratløsningen fremstilt over ble sakte tilsatt, temperaturen på reaksjonsblandingen ble opprettholdt ved omkring 65°C. Mer sinkstøv ble deretter tilsatt (4 x 50 g, 3,06 mol) der den siste porsjonen ble tilsatt etter at all t-butylesteren hadde blitt tilsatt. Ved slutten av tilsetningene var temperaturen 64°C. Temperaturen ble økt til 70-75°C; rørt i 1 time og deretter helt over i 5 I med vann.
Det grå flytende présipitatet ble samlet ved vakuumfiltrering og vasket med 2 1 med vann for å gi 354 g med vått råprodukt. Råproduktet ble løst opp 1 1 med varm metanol og filtrert varmt for å fjerne sink. Filtratet ble kjølt ned og det ble dannet et presipitat. Présipitatet som ble samlet ved vakuumfiltrering og tørket for å gi 118 g med produkt. Filtratet ble puttet i kjøleskapet over natt, og ytterligere produkt presipiterte. Totalt 173,2 g med 3,5-dimetyl-lH-pyrrol-2J4-dikarboksylsyre 2-tert-butylester 4-etylester ble oppnådd.
3,5-dimetyl-lH-pyrrol-2s4-dikarboksylsyre 2-tert-butylester 4-etylester (80,1 g, 0,3 mol) og 400 ml trifluoreddiksyre ble rørt i 5 min. i en 2 1 3-halset rundbunnet flaske utstyrt med mekanisk røring og varmet til 40°C i et oljebad. Blandingen ble deretter kjølt ned til -5°C, og trietylortoformat (67,0 g, 0,45 mol) ble tilsatt alt på én gang. Temperaturen økte til 15°C. Blandingen ble rørt i 1 min, fjernet fra det kalde badet og deretter rørt i 1 time. Trifluoreddiksyren ble fjernet ved rotasjonsfordampirig, og resten puttet i kjøleskapet der det ble fast stoff. Det faste stoffet ble løst opp ved oppvarming, og helt over i 500 g med is. Blandingen ble ekstrahert med 800 ml med diklormetan for å gi en rød løsning og et brunt presipitat, og begge ble samlet på. Presipitetat ble isolert og vasket med 150 ml med mettet natriumbikarbonatløsning. Diklormetanfasen ble også vasket med 150 ml med natriumbikarbonat. Diklormetanløsningen ble deretter vasket tre ganger mer ved 100 ml med vann. Diklormetanløsningen ble fordampet til tørrhet. Den mørke resten som ble igjen ble rekrystallisert to ganger fra etylacetat som inneholdt Darco sot for å gi gylne gule nåler. Det brune présipitatet ble rekrystallisert fra 350 ml etylacetat som på samme måte inneholdt Darco for å gi et gul-rødt fast stoff. Alt det rekrystalliserte faste materialet ble kombinert, og rekrystallisert fra 500 ml med etanol for å gi 37,4 g (63,9 %) av 5-formyl-2,4-dimetyI-lH-pyrroI-3-
karboksylsyreetylester som gule nåler (sm.p. I65.6-I66,3°C, lit. 163-164°C). Restene som ble oppnådd etter fordamping av etylacetat og etanol morlutene ble kombinert og rekrystallisert fra 500 ml. med etanol for å gi et annet.utbytte (10,1 g) eller produkt, som skitne gule nåler.
5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyreetylester (2 g, 10 mmol) ble tilsatt til en løsning med kaliumhydroksid (3 g, 53 mmol) løst opp i etanol (3 ml) og vann (10 ml). Blandingen ble tilbakestrømmet i 3 timer, kjølt ned til romtemperatur og surgjort med 6N saltsyre til pH 3. Det faste stoffet som ble dannet ble samlet ved filtrering, vasket med vann og tørket i vakuumovn over natt for å gi 1,6 g (93 %) med 5-formyl-2,4-dimetyl-l H-pyrrol-3-karboksylsyre.
'H NMR (300 MHz, DMSO-d6)8: 12,09 (s, br, 2H, NH & COOH), 9,59 (s, 1H, CHO), 2,44 (s, 3H, CH3), 2,40 (s, 3H, CH3).
5:formyl-2,4-dimetyl-1 H-pyrrol-3-karboksylsyre (2-dimetylaminoetyl)amid
Til en blanding med 5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre (1,67 g, 10 mmol) i dimetylforamid (10 ml) bie tilsatt benzotriazol-1-yloksytris(dimetylamino)-fosfoniumheksafluorfosfat (BOP-reagens, 6 g, 13,5 mmol), etterfulgt av 3 ml dusopropylétylamin. Etter røring i 5 min. ble 1 ml med N,N-dimetyletylendiamin tilsatt, og blandingen ble rørt ved romtemperatur i 24 timer. Til reaksjonsblandingen ble det tilsatt 25 ml med IN natriumhydroksid og 25 ml med saltløsning. Etter røring i 30 min. ble reaksjonsblandingen helt over i vann (100 ml) og ekstrahert (3 x 200 ml) med 10 % metanol i'diklormetan. De organiske lagene ble kombinert, tørket over vannfri natriumsulfat og fordampet ved å benytte en rotasjonsfordamper. Resten som var igjen ble renset ved kromatografi (silikagelkolonné, 5-10 % metanol i diklormetan) for å gi l g (42 %) med 5-fortnyl-2.4- dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre (2-dimetylamino-etyI)-amid.
'H-NMR (360 MHz, DMSO-d6): 5 11,77 (s, 1H, NH), 9,53 (s, 1H, CHO), 7,34 (t, J = 5,6 Hz, 1H, CONH), 3,27 (m, 2H, CONCH2CH2), 2,37 (t, J = 6,8 Hz, 2H, CONCH2CH2), 2,35 (s, 3H, CH3), 2,3 (s, 3H, CH3), 2,17 (s, 6H, 2 x CH3).
MS m/z 238,3 [M+l]<+.>
3.5- dimetyl-4-(4-metyl-piperazin-1 -karbonyl)-1 H-pyrrol-2-karboksaldehyd °TiI en blanding med 5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-karboksylsyre (1,67 g, 10 mmol) i dimetylformamid (10 ml) ble det tilsatt benzotriazol-1-yloksytris(dimetylamino)-fosfoniumheksafluorfosfat (BOP-reagens, 6 g, 13,5 mmol), etterfulgt av 3 ml med diisopropyletylamin. Etter røring i 5 min. ble 2 ml med 1 -metylpiperazin tilsatt, og blandingen ble rørt ved romtemperatur i 24 timer. Til reaksjonen ble det deretter tilsatt 25 ml med IN natriumhydroksid og 25 ml
med saltløsning. Etter røring i 30 min. ble reaksjonsblandingen helt over i vann
(100 ml) og ekstrahert (3 x 200 ml) med 10 % metanol i diklormetan. De organiske lagene ble kombinert, tørket over vannfritt natriumsulfat og fordampet på en rotasjonsfordamper. Resten som var igjen ble renset ved kromatografi (silikagelkolonne, 5-10 % med metanol i diklormetan) for å gi 1 g (40 %) av 3,5-
. dimetyl-4-(4-metyl-piperazin-1 -karbonyl)-1 H-pyrrol-2-karboksaldehyd.
'H-NMR (360 MHz, DMSO-d6) 5: 11,82 (s, 1H, NH), 9,50 (s, 1H, CHO), 3,14 (br m, 4H, 2xCH2), 2,29 (br m, 4H, 2xCH2), 2,19 (s, 3H, CH3), 2,17 (s, 3H, CH3), 2,14 (s, 3H, CH3).
MS EI 249 [M]<+>.
C. Eksempler - syntese av pyrrolsubstituert 2-indolinoner
De følgende syntesene av representative forbindelser i henhold til oppfinnelsen er kun vist for å være eksempler, og er ikke konstruert for å være begrensende for omfanget av oppfinnelsen, heller ikke for den syntetiske tilnærmingsmåten eller med hensyn til forbindelsene som er omfattet av den foreliggende oppfinnelsen.
Eksempel 1
3- [5-(5-klor-2-okso-1,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-4-metyl-1 H-pyrrol-3-yl]-propionsyre
4- (2-karboksyetyl)-2-formyl-3-metylpyrrol (4,5 g),.4,2 g med 5-klor-2-oksindol, og 2,9 ml med piperidin i 50 ml med etanol ble varmet til 95°C i 5 timer. Reaksjonsblandingen ble kjølt ned og konsentrert. Resten ble suspendert i aceton og det gule présipitatet ble filtrert, vasket med kald etanol, 2 N vandig saltsyre og vann til pH 6, deretter tørket i vakuumovn over natt for å gi 7,2 g av tittelforbindelsen (88 %) som et gult fast stoff.
'H-NMR (360 MHz, DMSO-d6) 6: 13,31 (s, br, 1H, NH-1'), 12,06 (s, br, 1H, COOH), 10,88 (s, br, 1H, NH-1), 7,93 (d, J = 1,88 Hz, 1H, H-4), 7,75 (s, 1H, H- • vinyl), 7,19 (d, J = 3,1 Hz, 1H, H-2'), 7,1 (dd, b, J = 1,88, 8,40 Hz, 1H, H-6), 6,84 (d, J = 8,40 Hz, 1H, H-7), 2,65 (t, J = 7,44 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2,46 (t, J = 7,44 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2,28 (s, 3H, CH3).
Eksempel 2 3- [5-(6-metoksy-2-okso-l,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-4-metyl-lH-pyrrol-3-yl]-propionsyre
4- (2-karboksyetyl)-2-formyl-3-metylpyrrol (190 mg), 163 mg med 6-metoksy-2-oksindol og 2 dråper med piperidin i 2 ml met etanol ble varmet til 90°C i 3 timer. Reaksjonsblandingen ble kjølt ned og konsentrert. Resten ble suspendert i 6 N vandig saltsyre. Présipitatet ble filtrert, vasket med vann til pH 6, og tørket i en vakuumovn for å gi 140 mg med tittelforbindelsen (43 %) som et brunt fast stoff.
'H-NMR (360 MHz, DMSO-d6) 5: 13,1 (s, br, 1H, NH-1'), 12,04 (s, br, 1H, COOH), 10,76 (s, br, 1H, NH-1), 7,63 (d, J = 8,29 Hz, 1H, H-4), 7,46 (s, 1H, H-vinyl), 7,07 (d, J = 3,03 Hz, 1H, H-2'), 6,55 (dd, J = 2,32, 8,29 Hz, 1H, H-5), 6,43
(d, J = 2,32 Hz, 1H, H-7), 3,74 (s, 3H, OCH3), 2,63 (t, J = 7,31 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2,45 (t, J = 7,31 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2,23 (s, 3H, CH3); MS
. m/z (relativ intensitet, %) 327 ([M+l]<+>, 10.0).
Eksempel 3 3-[5-(5-klor-2-okso-l,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-yl]-propionsyre 3-(2-karboksyetyl)-2,4-dimetyl-5-formylpyrrol (220 mg), 147 mg 5-klor-2-oksindol
og 2 dråper med piperidin i 2 ml med etanol ble varmet til 90°C i 3 timer. - Reaksjonsblandingen ble kjølt ned og konsentrert. Resten ble suspendert i 6 N med vandig saltsyre. Présipitatet ble filtrert, vasket med vann til pH 6 og. tørket i en vakuumovn for å gi 172 mg med tittelforbindelsen (50 %) som et brunt fåst stoff.
'H-NMR (360 MHz, DMSO-d6) 6: 13,42 (s, br, 1H, NH-1'), 12,03 (s, br, 1H, COOH), 10,80 (s, br, 1H, NH-1), 7,87 (d, J = 2,06 Hz, 1H, H-4), 7,67 (s, 1H, H-vinyl), 7,06 (dd, J « 2,06, 8,3 Hz, 1H, H-6), 6,83 (d, J = 8,3, lH,H-7), 2,64 (t, J =
7,6 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2,34 (t, J = 7,6 Hz, 2H, CH2CH2C00H), 2,29 (s, 3H, CH3), 2,27 (s, 3H, CH3); MS m/z (relativ intensitet, %) 345 ([M+l]<+>, 64).
Eksempel 4
3-[4-metyl-5-(2-okso-l,2-dihydroindol-3-ylidenmetyI)-lH-pyrrol-3-yl]-propionsyre Natriummetall (1,5 g) ble plassert i en 3 1 3-halset rundbunnet flaske utstyrt med et
termometer, tilbakestrømmingskondenser og mekanisk røring, og plassert i et oljebad. Absolutt etanol (1 1) ble tilsatt med røring. Når natriumet hadde løst seg opp, ble 350 g med pentan-2,4-dion tilsatt, alt i ett, og deretter ble 310 g metylakrylat tilsatt i løpet av 30 min. Blandingen ble varmet med tilbakestrøm i 2,5 timer og deretter tillatt nedkjølt til romtemperatur over natt. Iseddik (3 ml) ble tilsatt, og løsningsmidlet fjernet ved rotasjonsfordampning. Resten ble filtrert
gjennom en lapp med diatomjord, og destillert i en «wiped film» fremdeles ved 0,1 mm. Destillatet ble redestillert ved å benytte 10 inch vakuumpakket Vigreux kolonne for å gi 518 g av etyl 5-acetyl-4-oksoheksanoat, kokepunkt 84-92°C ved 0,2-0,7 mm.
Til en 5 1 trehalset flaske utstyrt med et termometer og en mekanisk rører og
varmet på et dampbad, ble det tilsatt 350 g etyl 5-acetyl-4-oksoheksanoat, 329 g etylaminomalonatsaltsyre, 133 g natriumacetat og 1,2 1 eddiksyre. Blandingen ble varmet til 99°C i løpet av 37 min. Ved 62°C utviklet det seg karbondioksid raskt. Etter totalt 35 min. ved 99 % gass, hadde C02-utviklingen sunket betraktelig. Etter ytterligere 1 time ble blandingen kjølt ned, natriumklorid fjernet ved vakuum-
filtrering og løsningsmidlet fordampet. Resten ble blandet med 1 1 med kaldt vann. Présipitatet ble samlet ved vakuumfiltrering, vasket med 400 ml vann og løst opp i 1 1 med varm 95 % etanol. Løsningen ble behandlet med 20 g med Darco G-60,
varmfiltrert, og kjølt ned til romtemperatur. Det krystallinske faste stoffet ble samlet ved vakuumfiltrering, vasket to ganger på filteret med 200 ml med 50 % etanol og tørket under vakuum ved 70°C for å gi 285 g (64 % utbytte) med 2-etoksykarbonyl-4-(2-etoksykarbonyletyl)-3,5-dimetylpyrrol. Filtratet ble satt i kjøleskapet over natt for å gi ytterligere 53,1 g (11,9 % utbytte) av produktet med
et totalt utbytte på 75,9 %).
2-etoksykarbonyl-4-(2-etoksykarbonyletyl)-3,5-dimetylpyrrol (285 g) og 3500 ml med etyleter ble plassert i en 5 1 tre-halset flaske utstyrt med en mekanisk rører, en tilbakestrømmingskondensator. og en addisjonstrakt, og kjølt ned i et isbad. Svovelklorid (435 g) ble tilsatt dråpevis over 145 min. Tilsetningen fortsatte til blandingen ble klumpete og grønn, og deretter klar. Ved slutten av tilsetningen ble
-blandingen klar og lys gul. Blandingen ble rørt i en ytterligere time og deretter varmet til tilbakestrømming i 1 time. Blandingen ble kjølt ned og rotasjonsfordampet, fortynnet med 1500 ml med eter, og rotasjonsfordampet igjen. Fortynningen og fordampingen ble repetert igjen! Resten ble tilsatt til 8 1 med vann som inneholdt 802 g med eddiksyre og 535 g med natriumhydroksid. Blandingen ble forsiktig varmet til 85°C og deretter tillatt å kjøle ned over natt med røring. Det vandige laget, som inneholdt faste stoffer, ble separert og ekstrahert med 800 ml med eter. De faste stoffene og eterlaget ble tilsatt til 2,5 1 med vann som inneholdt 300 g med natriumkarbonat, rørt i 1 time og filtrert for å fjerne en liten mengde
7 g) med fast stoff. Svovelsyre (137 g) ble tilsatt til blandingen bg det resulterende présipitatet vasket to ganger med 250 ml med vann og tørket under vakuum for å gi 56,4 g med produktet. Svovelsyre (92 g) ble tilsatt til filtratet og det resulterende présipitatet vasket to ganger med 0,5 1 med vann og tørket under vakuum for å gi 220 g med produkt og totalt 276,4 g (86,8 % utbytte) av 2-karboksy-5-etoksykarbonyl-3-(2-etoksykarbonyletyl)-4-metylpyrrol. 2-karboksy-5-etoksykarbonyl-3-(2-etoksykarbonyletyl)-4-metylpyrrol (50,5 g) og 400 ml 10 % natriumhydroksidløsning ble varmet til 180°C i en Parr autoklav i 90 min. Denne prosessen ble repetert fire ganger inntil det var totalt 252,5 g med 2-karboksy-5-etoksykarbonyl-3-(2-etoksykarbonyletyl)-4-metylpyrrol som hadde blitt behandlet. De fem løsningene ble kombinert og rotasjonsfordampet til et volum på omkring 1,8 1 med tykk sort rest. Blandingen ble kjølt ned-til 10°C i et vannbad, og 50 % svovelsyre ble sakte tilsatt for å holde temperaturen ved < 20°C, inntil pH var 2. Etyleter (1400 ml) ble tilsatt, blandingen filtrert og présipitatet samlet opp.
Présipitatet ble ekstrahert i Soxhlet ekstrator med 500 ml med eter. De kombinerte eterlagene ble vasket med 250 ml vann, etterfulgt av 150 ml med vann. De kombinerte vannlagene ble tilbakeekstrahert med 150 ml med eter. Alle eterlagene ble rotasjonsfordampet og resten tørket for å gi 123,5 g med 3-(2-karboksyetyl)-4-metylpyrrol.
3-(2-karboksyetyl)-4-metylpyrrol (123 g) ble blandet med 1500 ml med etyleter og 250 ml med metanol i en magnetisk rørermottakerflaske. En separat 3 1, trehalset rundbunnet flaske var utstyrt med en magnetisk rører, et destillasjonshode og en kondensator som førte til innløpet til mottakerflasken, og varmet i et vannbad. Inn i den 3 1 flasken ble det plassert 240 g med Diazald oppløst i 1800 ml med etyleter,
. og en løsning med 73 g med kaliumhydoksid oppløst i 360 ml med 95 % etanol og 112 ml med vann. Den 3 1 flasken ble rørt og varmet til 65-75°C i et vannbad, og diazometan-eterblandingen ble destillert inn i den rørte mottakerflasken i løpet av omkring 2,5 timer. Etyleter (200 ml) ble tilsatt til 3 1 flasken, og destillasjonen opprettholdt inntil den var fullstendig. Mottakerflasken ble rørt i ytterligere 30
min. og deretter ble 10 ml med eddiksyre tilsatt. Blandingen ble ekstrahert to ganger med 500 ml med vann, deretter to ganger med 200 ml med mettet nåtriumbikarbonat. Eterlagene ble tørket over vannfri natriumsulfat og destillert og etterlot seg en mørktflytende rest. Resten ble destillert to ganger i en 4 inch Vigreux kolonne, og én gang gjennom en 10 inch vakuumpakket Vigraux kolonne for å gi 108 g (80,6 % utbytte) med 3-(2-etoksykårbonyletyl).4.metylpyrrol.. Kokepunkt 108-113°C ved 0,5 mm.
Dimetylformamid ble ladet på en 500 ml, tre-halset rundbunnet flaske utstyrt med mekanisk røring, et termometer og dråpetrakt, og opprettholdt under en nitrogenatmosfære. Flasken ble kjølt ned til 0°C, og 58,4 ml med fosforoksyklorid ble tilsatt dråpevis i løpet av 80 min. Dikloretan (280 ml) ble tilsatt, og blandingen tillatt å varme opp til romtemperatur, og deretter kjølt ned til -10°C. 3-(2-metoksykarbonyl-etyl)-4-metoksypyrrol (55,7 g) oppløst i 80 ml dikloretan ble tilsatt dråpevis i løpet av 1 time, og blandingen rørt i ytterligere 35 min. Blandingen ble rotasjonsfordampet ved < 30°C. Den flytende resten ble helt over i 2700 ml med iskald 2 N natriumhydroksidløsning. Den resulterende løsningen ble vannet til 88°C i løpet av 20 min., og deretter opprettholdt ved denne temperaturen i ytterligere 30 min. Løsningen ble kjølt ned til omgivelsestemperatur, og ekstrahert med 200 ml med etyleter. Den vandige løsningen ble kjølt ned til 0°C og ■ surgjort til pH 3,5 ved sakte å tilsette 1350 ml med N-saltsyre. Det gule présipitatet ble samlet ved vakuumfiltrering, vasket fire ganger med 100 ml med vann, og tørket i en vakuumovn ved omgivelsestemperatur for å gi 54,4 g (90,2 % utbytte)
av rå 4-(2-karboksyetyl)-2-formyl-3-metylpyrrol.
Råmaterialet ble plassert i en tilbakestrømmende blanding med 425 ml med etanol og 700 ml med etyleter, og varmfiltrert for å fjerne uløselig rest som var igjen. Filtratet ble puttet i fryseren, og det resulterende présipitatet samlet ved vakuumfiltrering og vasket med 50 ml med eter. Filtratet ble benyttet igjen for å ekstrahere den uløselige resten, varmfiltrert og puttet i fryseren. Det resulterende présipitatet og det første présipitatet ble kombinert for å gi 26,1 g med 4-(2-karboksyetyl)-2-formyl-3-metylpyrrol som et brunt pulver, sm.p. 149,0-150,3°C.
Filtratet ble kombinert med filtratet fra en tidligere fremstilling, og konsentrert for å gi 43 g med brunt fast stoff. Det faste stoffet ble puttet inn i en tilbakestrømmingsblanding med 500 ml med eter og 100 ml etanol, filtrert. Filtratet ble behandlet med Norit og tilbakestrømmet og varmfiltrert igjen. Filtratet ble puttet i fryseren for å gi tre ytterligere utbytter med 4-(2-karboksyetyl)-2-formyl-3-etylpyrrol, 7,7 g, sm.p. 148-15TC, 3,2 g sm.p. 128-134°C og 4,1 g, sm.p.' 148,2-150,0°C.
4-(2-karboksyetyl)-2-formyl-3-metylpyrrol (9,0 g) og 6,0 g med 2-oksindol i 50 ml med etanol ble varmet til 70°C i en 250 ml trehalset rundbunnet flaske utstyrt med et termometer, en tilbakestrømmingskondensator og en magnetisk rører. Når mesteparten åv det faste stoffet hadde løst seg opp, ble 4,5 g med piperidin sakte
tilsatt, og blandingen tilbakestrømmet i 4 timer. Eddiksyre (12 ml) ble sakte tilsatt og resulterte i et rikelig presipitat. Blandingen ble tilbakestrømmet i 5 min., kjølt ned til romtemperatur og deretter ble présipitatet samlet ved vakuumfiltrering og vasket med 30 ml metanol. Présipitatet ble slurryvasket og reflukset i 30 ml metanol, kjølt ned til romtemperatur, samlet ved vakuumfiltrering, vasket med 20 ml med etanol og tørket under vakuum for å gi 11,9 g (80 % utbytte) av 3-[4-(2-karboksyetyl)-3-metylpyrrol-2-metylidenyl]-2-indolinon, SU6663, som et orange fast stoff..
'H-NMR (360 MHz, DMSO-d6) 8: 13,29 (s, br, 1H, NH-1'), 12,05 (s, br, 1H, .
COOH), 10,78 (s, br, 1H, NH-1), 7,73 (d, J = 7,43 Hz, 1H, H-4), 7,61 (s, 2H, H-vinyl), 7,13 (d, J = 2,75 Hz, 1H, H-2'), 7,10 (t, J = 7,43 Hz, 1H; H-6), 6,97 (t, J 7,43 Hz, 1H, H-5), 6,85 (d, J = 7,43 Hz, 1H, H-7), 2,64 (t, J = 7,38 Hz, 2H, CH2CH2C00H), 2,46 (t, J = 7,38 Hz, 2H, CH2CH2C00H), 2,25 (s, 3H, CH3); MS m/z (relativ intensitet, %) 297 ([M+l]<+>, 100).
Eksempel 5
3-[2,4-dimetyl-5-(2-okso-l,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-lH-pyrrol-3-yl]-propionsyre
2,4-dimetyl-5-etoksykarbdnyl-3-(2-etoksykarbonyletyl)-pyrrol (1,07 kg) og 3,2 1 5 N natriumhydroksid ble mekanisk rørt i en 12 1 tre-halset rundbunnet flaske utstyrt med en tilbakestrømmingskondenser og en ytterligere trakt, og varmet på et oljebad. Blandingen ble tilbakestrømmet i 3 timer hvoretter den indre temperaturen var 96°C, alle faste stoffer var oppløst, og tynnsjiktskromatografi viste at hydrolysen var fullstendig. Varmebadet ble fjernet, blandingen kjølt ned til 50°C i et vannbad. 12N saltsyre (~ 1,3 1) ble sakte tilsatt. Etter at omkring 50 %' av syren
var tilsatt, begynte gassutviklingen, og temperauren nådde 60°C. Ettersom mer syre ble tilsatt økte gassutviklingen, og et gult presipitat ble dannet. Den endelige pH-en ble justert til 3,5 med saltsyre. Blandingen ble kjølt ned på et isbad til.8°C. De . faste stoffene ble samlet ved vakuumfiltrering, vasket to ganger med 0,5 1 med destillert vann og tørket i 48 timer i vakuumovn ved 55-60°C for å gi 677 g (101 % utbytte) av 3-(2-karboksyetyl)-2,4-dimetylpyrrpl.
'H-NMR (360 MHz, DMSO-d6) 5: 11,9 (s, 1H, COOH), 9,9 (s, 1H, NH), 6,2 (s,
1H, aromatisk), 2,5 (t, 2H, CH2), 2,2 (t, 2H, CH2), 2,0 (s, 3H, CH3), 1,9 (s, 3H, CH3); sm.p. 134-136°C.
Dimetylformamid (28,5 g) i 250 ml med diklormetan i en 1 1 tre-halset rundbunnet flaske utstyrt med en magnetisk rører, et termometer og en dråpetrakt, ble kjølt ned i et issaltbad til -1°C. Fosforoksyklorid (59,3 g) ble plassert i dråpetrakten, og sakte tilsatt til reaksjonsblandingen. Trakten ble flushet med 25 ml med diklormetan for å være sikker på at all fosforoksykloridet. Maksimumstemperatur som ble nådd i blandingen var 5°C. Blandingen ble rørt i 15 min., hvorunder temperaturen var -3°C. Fast 3-(2-karboksyetyl)-2,4-dimetylpyrrol (32,6 g) ble tilsatt i porsjoner i løpet av 15 min. Maksimumstemperaturen som ble nådd i blandingen var 7°C. Den rød-svarte blandingen ble rørt i 30 min. mer, og deretter varmet til tilbakestrømming i 1 time. Blandingen ble kjølt ned til 15°C, og 300 ml med vann ble tilsatt, noe som førte til en kraftig reaksjon hvoretter temperaturen økte. Blandingen ble rørt og kjølt ned til 22°C, og lagene separert og samlet. Det organiske laget ble ekstrahert med 100 ml med vann, og det vandige laget kombinert og vasket med 50 ml med diklormetan. De organiske lagene ble kastet. Det vandige laget ble justert til pH 11 med ~ 180 ml med 10 N natriumhydroksid. Temperaturen økte til 40°C. Blandingen ble rørt i 30 min. der temperaturen var 27°C. Blandingen ble surgjort til pH 2 med ~ 120 ml med ION saltsyre, som økte temperaturen til 30°C. Etylacetat (150 ml) ble tilsatt til blandingen, og blandingen ble rørt for å ekstrahere produktet. Under røringen ble en vesentlig mengde med fast stoff synlig på toppen av vannlaget. Etylacetatlaget ble separert, og det vandige laget og det faste stoffet ble ekstrahert to ganger med 100 ml etylacetat. Det faste stoffet som fremdeles var tilstede ble samlet ved vakuumfiltrering, vasket nøye med vann og tørket under vakuum ved 40°C for å gi 12 g (31 % utbytte) av 3-(2-karboksyetyl)-2,4-dimetyl-5-formylpyrrol som et brun-svart fast stoff. Tynnsjiktskromatografi (diklormetameddiksyre, 95:5, silikagel) viste en flekk ved Rf 0,7, og en farget flekk på det opprinnelige stedet. Etylacetatlagene ble kombinert, tørket over vannfri natriumsulfat og fordampet til et brun-svart fast stoff som tørket under vakuum ved 40°C for å gi 21 g (55 % utbytte, totalt utbytte 86 %) av 3-(2-karboksyetyl)-2,4-dimetyl-5-formylpyrrol, identisk i utseende til det tidligere faste stoffet ved tynnsjiktskromatografi.
Alternativt ble dimetylformamid (124 ml) i 750 ml med diklormetan i en 5 1 tre-halset rundbunnet flaske utstyrt med mekanisk røring, et termometer og dråpetrakt, kjølt ned på et issaltbad til -9°C. Svoveloksyklorid (114 ml) ble tilsatt raskt via dråpetrakten, som ble flushet inn i reaksjonsblandingen med 50 ml med diklormetan. Maksimumstemperaturen som ble nådd i blandingen var -4°C. Fast 3-(2-karboksyetyl)-2,4-dimetylpyrrol (133,6 g) ble tilsatt i porsjoner i løpet av 20 min. Maksimumstemperaturen som ble nådd i blandingen var 3°C. Den mørke . rødaktige blandingen ble varmet til tilbakestrømming i 1 min., og deretter kjølt ned til -1°C. Blandingen ble kjølt ned til 1°C, og 800 ml med isvann ble raskt tilsatt. Maksimumstemperaturen som ble nådd var 15°C. Det organiske laget ble separert og kastet. Det vandige laget ble sakte justert til pH 12-13 med ~ 800 ml med 10N kaliumhydroksid, og det ble tilsatt is for å kontrollere temperaturen. Temperaturen økte til 37°C. Blandingen ble rørt i 90 min. ved omgivelsestemperatur, og på det tidspunktet viste tynnsjiktskromatografi kun små rester av lysfarget materiale ved startpunktet, med produktet ved Rf 0,3. Blandingen ble kjølt ned til 0°C. Blandingen ble surgjort til pH 3 med ~ 600 ml med 10 N saltsyre, og is ble tilsatt for å kontrollere temperaturen. Maksimumstemperaturen som ble nådd var 10°C.
■Blandingen ble rørt i 1 time i iskaldt miljø. Det faste stoffet ble samlet ved vakuumfiltrering, vasket fire ganger med 100 ml vann, og tørket under vakuum ved 50-60°C for å gi 140,6 g (90 % utbytte) med 3-(2-karboksyetyl)-2,4-dimetyl-5-formylpyrrol som et brunt fast stoff.
'H NMR (d6-DMSO): 8 12,0 (s, 1H, COOH), 11,3 (s, 1H, NH), 9,4 (s, 1H, CHO), 2,6 (t, 2H, CH2), 2,3 (t, 2H, CH2), 2,2 (s, 3H, CH3), 2,1 (s, 3H, CH3). sm.p. 145-147°C.
3-(2-karboksyetyl)-2,4-dimetyl-5-formylpyrrol (18,2 g) og 11,7 g 2-oksindol ble løst opp i 100 ml med etanol ved oppvarming i en 250 ml rundbunnet flaske utstyrt med en magnetisk rører og en tilbakestrømmingskondensater i et oljebad. Pyrrolidin (7,0 g) ble tilsatt, og reaksjonsblandingen tilbakestrømmet i 2 timer, og det ble dannet store mengder med et brun-sort fast stoff. Tynnsjiktskromatografi.
(etyl acetat'.etanol'.eddiksyre 96:2:2, silikagel) viste fraværet av oksindolutgangsmaterialet. 8 ml med eddiksyre ble tilsatt, og blandingen tilbakestrømt i 15 min. Den tykke blandingen ble fortynnet med 50 ml med etanol, og kjølt ned til 10°C. Det faste stoffet ble samlet ved vakuumfiltrering og vasket med 50 ml etanol. Det faste stoffet ble rørt i 125 ml etanol og tilbakestrømt i 10 min., kjølt ned til 10°C, samlet ved vakuumfiltrering og vasket med 50 ml etanol. Produktet ble tørket over natt ved 45°C under vakuum for å gi 25,5 g (88 % utbytte) med 3-[2,4-dimetyl-3-(2-karboksyetyl)pyrrol-5-metylidenyl]-2-indolinon som et orange fast stoff.
Alternativt ble en blanding med 3-(5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-yl)-propionsyre (10 g, 51 mmol), 2-oksindol (6,5 g, 49 mmol) og natriumhydroksid (40
g, 58.mmol) løst opp i 50 ml med vann og rørt ved 50°C i 4 timer. Reaksjonsblandingen ble kjølt ned til romtemperatur, filtrert og filtratet surgjort til
pH 3 med 12 N saltsyre.
Det faste stoffet som presipiterte ble samlet ved vakuumfiltrering, vasket med 10 ml med vann og tørket under vakuum over natt. Det rå faste stoffet ble slurryvasket med varm etanol to ganger. Det faste stoffet ble deretter samlet ved vakuumfiltrering, vasket med 10 ml etanol, tørket under vakuum for å gi 13,8 g (91
%) med 3-[2,4-dimetyl-5-(2-okso-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmetyl)-1 H-pyrrol-3-yl]-propionsyre.
'H-NMR (360 MHz, DMSO-d6): 8.13,38 (s, br," 1H, NH-1.'), 12,05 (s, br, 1H,
COOH), 10,70 (s, br, 1H, NH-1), 7,69 (d, J = 7,39 Hz, 1H, H-4), 7,53 (s, 1H, H-vinyl), 7,06 (t, J = 7,39 Hz, 1H, H-6), 6,95 (t, J = 7,39 Hz, 1H, H-5), 6,85 (d, J =
7,39 Hz, 1H, H-7), 2,63 (t, J = 7,45 Hz, 2H, CH2CH2CaOH), 2,34 (t, J = 7,45 Hz,
2H, CH2CH2COOH), 2,28 (s, 3H, CH3), 2,24 (s, 3H, CH3); MS m/z (relativ intensitet, %) 311 ([M+l]<+>} 100).
Eksempel 6
3-[5-(5-brom-2-Okso-l,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-4-metyl-lH-pyrrol-3-yl]-propionsyre
2-oksindol (53,3 g) ble suspendert i 640 ml acetonitril, og blandingen ble kjølt ned til 7°C i et isbad ved mekanisk røring. Fast N-bromsuccinimid (74,8 g) ble tilsatt i porsjoner i løpet av 20 min. Etter at omkring 1/3 av N-bromsuccinimidet var blitt tilsatt (i løpet av 5 min.), hadde temperaturen økt til 12°C. Tilsetningen opphørte inntil temperaturen i blandingen hadde sunket til 10°C. Tilsetningen ble tatt opp igjen men temperaturen ble holdt.under 12°C. Etter at tilsetningen var fullstendig ble blandingen rørt i 1 time ved 10°C, og deretter i ytterligere 1 time hvor blandingen fikk lov til å varmes opp til romtemperatur. Présipitatet ble samlet ved vakuumfiltrering, vasket med 80 ml etanol, og sugd tørt i 20 min. -i filtreringstrakten for å gi produkt som inneholdt 6,4 % med 2-oksindol med HPLC.
Det faste stoffet ble suspendert i 1440 ml med denaturert etanol og slamvasket ved
. røring, og tilbakestrømt i 5 min., hvoretter det meste av det faste stoffet var oppløst. Blandingen ble kjølt ned på et isbad til 13°C. Det faste produktet ble
samlet ved vakuumfiltrering, vasket med 80 % etanol og tørket under vakuum for å gi 57,7 g (68,0 %) med 5-brom-2-oksindol som inneholdt 1,13 % 2-pksindol ved HPLC. Slamvasking med 30 % mindre etanol ga et bedre utbytte (88 %), men inneholdt mer 2-oksindol (1,76 %).
'H-NMR (360 MHz, DMSO-d6): 8 10,44 (s, br, 1H, NH-1), 7,32-7,36 (m, 2H),
6,76 (d, J = 8,50 Hz, 1H, H-7), 3,5 (s, 2H, CH2); MS m/z 212,1/214,1
(M<+>/[M+2]<+>).
4-(2-karboksyetyl)-2-formyl-3-metylpyrrol (90 mg), 106 mg 5-brom-2-oksindol og 75 ul piperidin,i 2 ml etanol ble varmet til 95<0>C i 5 timer. Reaksjonsblandingen ble kjølt ned og konsentrert. Resten ble suspendert i 2 N .vandig saltsyre. Présipitatet .ble filtrert, vasket med vann til pH 6 og tørket i en vakuumovn for å gi 120 mg (64 %) av tittelforbindelsen som et brunt fast stoff.
'H-NMR (360 MHz, DMSO-d6): 5 13,31 (s, br, 1H, NH-1'), 12,06 (s, br, 1H, COOH), 10,90 (s, br, 1H, NH-1), 8,06 (s, br, lH, H-4), 7,75 (s, 1H, H-vinyl), 7,23 (d, br, J - 8,50 Hz, 1H, H-6),.7,19 (d, J = 2,84 Hz, 1H, H-2'), 6,80 (d, br, J = 8,50 Hz, 1H, H-7), 2,65 (t, J = 7,65 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2,46 (t, J = 7,65 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2,28 (s, 3H,'CH3); MS m/z 375,1/377,2 (M<+>/[M+2]<+>).
Eksempel 7
3- [5-(5-jod-2-okso-l,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-4-metyl-lH-pyrrol-3-yl]-propionsyre
2-oksindol (82,9 g) ble suspendert i 630 ml eddiksyre, og blandingen ble mekanisk rørt og kjølt ned til 10°C i et isvannbad. Fast N-jodsuccinimid (175 g) ble tilsatt i porsjoner i løpet av. 10 min. Etter at tilsetningen var fullstendig ble blandingen rørt i 1 time ved 10°C. Det suspenderte faste stoffet som alltid var tilstede ble svært tykt på dette tidspunktet. Det faste stoffet ble samlet ved vakuumfiltrering, vasket med 100 ml med 50 % eddiksyre i vann, og deretter med 200 ml med vann og sugd tørt i løpet av 20 min. i filtreringstrakten. Produktet ble tørket under vakuum for å
gi 93;5 g (36 %) med 5-jod-2-oksindol som inneholdt omkring 5 % 2-oksindol ved proton NMR.
1 H-NMR (360 MHz, DMSO-d6): 8 10,45 (s, 1H, NH-1), 7,49 (s, 1H, H-4), 7,48 (d, J = 8,10 Hz, 1H, H-6), 6,64 (d, J = 8,10 Hz, 1H, H-7, og 3,46 (s, 2H, CH2-3); MS m/z 258 [M-l]<*.>'
4- (2-karboksyetyl)-2-formyl-3-metylpyrrol (90. mg), 130 mg 5-jod-2-oksindol og 75
1 piperidin i 2 ml etanol ble varmet ved 95°C i 5 timer. Reaksjonsblandingen ble kjølt ned og konsentrert. Resten ble suspendert i 2 N vandig saltsyre. Présipitatet
ble filtrert, vasket med vann til pH 6, og tørket i en vakuumovn for å gi 162 mg (77 %) av tittelforbindelsen som et brunt fast stoff.
<L>H-NMR (360 MHz, DMSO-d6): 8 13,30 (s, br, 1H, NH-1'), 12,06 (s, br, 1H, COOH), 10,88 (s, br, 1H, NH-1), 8,18 (s, br, 1H, H-4), 7,73 (s, 1H, H-vinyl), 7,40
(d, br, J = 8,03 Hz, 1H, H:6), 7,19 (d, J = 2,94 Hz, 1H, H-2'), 6,69 (d, br, J = 8,03
Hz, 1H, H-7), 2,65 (t, J = 7,40 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2,46 (t, J = 7,40 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2,28 (s, 3H, CH3); MS m/z 423 [M+l]<+>.
Eksempel 8
3- [4-metyl-5-(4-metyl-2-okso-l,2-dihydroindol-3-yliden^ propionsyre Dietyloksalat (30 ml) i 20 ml tørreter ble tilsatt med røring til 19 g kaliumetoksid suspendert i 50 ml med tørreter. Blandingen ble kjølt ned på et isbad, og 20 ml med 37nitro-o-xylen i 20 ml med tørreter ble sakte tilsatt. Den tykke mørke røde blandingen ble varmet til tilbakestrømming i 0,5 timer, konsentrert til et mørk rødt fast stoff, og behandlet med 10 % natriumhydroksid inntil nesten alt det faste stoffet var løst opp. Den mørke røde blandingen ble behandlet med 30 % hydrogenperoksid inntil en rød farge forandret seg til gul. Blandingen ble behandlet alternativt med 10 % natriumhydroksid og 30 % hydrogenperoksid inntil den mørke røde fargen ikke lenger var tilstede. Det faste stoffet ble filtrert, og filtratet surgjort med 6 N saltsyre. Det resulterende présipitatet ble samlet ved vakuumfiltrering,
vasket med vann, tørket under vakuum for å gi 9,8 g (45 % utbytte) med 2-metyl-6-nitrofenyleddiksyre som et off-white fast stoff. Det faste stoffet ble hydrogenert i metanol over 10 % palladium på karbon for å gi 9,04 g ved 4-metyl-2-oksindol som et hvitt fast stoff.
'H-NMR (360 MHz, DMSO-d6): 8 10,27 (s, br, 1H, NH-1), 7,06 (t, J = 7,71 Hz, 1H, H-6), 6,74 (d, J = 7,73 Hz, H-5), 6,63 (d, J = 7,73 Hz, 1H, H-7), 3,36 (s, 2H, CH2), 2,18 (s, 3H, CH3).
4- (2-karboksyetyl)-2-formyl-3-metyipyrrol (90 mg), 74 mg 4-metyl-2-oksindol og 75 pil piperidin i 2 ml med etanol ble varmet til 95°C i 5 timer. Reaksjonsblandingen ble kjølt ned og konsentrert. Resten ble suspendert i 6 N
vandig saltsyre. Présipitatet ble filtrert, vasket med vann til pH 6 og tørket i en vakuumovn for å gi 80 mg (52 %) av tittelforbindelsen som et brunt fast stoff.
'H-NMR (360 MHz, DMSO-d6): 8 13,33 (s, br, 1H, NH-1'), 10,84 (s, br, 1H, NH- .
1), 7,54 (s, 1H, H-vinyl), 7,12 (d, J = 2,0 Hz, 1H, H-2'), 7,01 (t, J = 7,75 Hz, 1H,
H-6), 6,79 (d, J = 7,75 Hz, H-5), 6,74 (d, J = 7,75 Hz, 1H, H-7), 2,64 (t, J = 7,65
Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2,57 (s, 3H, CH3), 2,42 (t, J 7,65 Hz, 2H,
CH2CH2COOH), 2,19 (s, 3H, CH3); MS m/z (relativ intensitet, %) 311 ([M+l]<+>,
100).
Eksempel 9
3-[4-metyl-5-(5-metyl-2-oko-l,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-lH-pyrrol-3-yl]-propionsyre
5- metylisatin (15,0 g) og 60 ml hydrazinhydrat ble varmet ved 140-160°C i 4 timer.
Tynnsjiktskromatografi (etylacetat:heksan 1:2, silikagel) viste at det ikke var noe gjenværende utgangsmateriale. Reaksjonsblandingen ble kjølt ned til romtemperatur, helt over i 300 ml med isvann og surgjort til pH 2 med 6 N
saltsyre. Etter å ha stått ved romtemperatur i 2 dager ble présipitatet samlet ved vakuumfiltrering, vasket med vann og tørket under vakuum for å gi 6,5 g'(47 %
utbytte) av 5-metyl-2-oksindol.
1 H-NMR (360 MHz, DMSO-d6): 5 10,20 (s, br, 1H, NH-i), 6,99 (s, 1H, H-4), 6,94
(d, J = 8,11 Hz, 1H, H-6), 6,68 (d, J = 8,11 Hz, 1H, H-7), 3,39 (s, 2H, CH2-3), og 2,22 (s, 3H, CH3-5).
4-(2-karboksyetyl)-2-formyl-3-metylpyrrol (90 mg), 74 mg 5-metyl-2-oksindol og 75 ul piperidin i-2.ml med etanol ble varmet ved 95°C i 5 timer.
Reaksjonsblandingen ble kjølt ned og konsentrert. Resten ble suspendert i 6 N
vandig saltsyre. Présipitatet ble filtrert, vasket med vann til pH 6 og tørket i en vakuumovn for å gi 65 mg (42 %) av tittelforbindelsen som et brunt fast. stoff.
'H-NMR (360 MHz, DMSO-d6): 5 13,30 (s, br, 1H, NH-1'), 12,05 (s, br, 1H,
COOH), 10,67 (s, br, 1H, NH-1), 7,57 (s, 2H, H-vinyl, H-4), 7,12 (d, J = 2,65 Hz,
1H, H-2'), 6,91 (d, J = 7,82 Hz, 1H, H-6), 6,74 (d, J = 7,82 Hz, 1H, H-7), 2,65 (t, J
= 6,94 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2,46 (t, J = 6,94 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2,30 (s,
3H, CH3), 2,25 (s, 3H, CH3); MS m/z (relativ intensitet, %) 311 ([M+l]<+>, 100).
Eksempel 10 3- [5-(5,6-dimetoksy-2-okso-l,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-4-metyl-lH-pyrrol-3-yl]-propionsyre 4- (2-karboksyetyl)-2-formyl-3-metylpyrrol (90 mg), 97. mg 5,6-dimétoksy-2-
oksindol og 75 ul piperidin i 2 ml med etanol ble varmet ved. 95°C i 5 timer. Reaksjonsblandingen ble kjølt ned og konsentrert. Resten ble suspendert i 6 N
vandig saltsyre. Présipitatet ble filtrert, vasket med vann til pH 6 og tørket i en vakuumovn for å gi 104 mg (58 %) av tittelforbindelsen som et brunt fast stoff.
1 H-NMR (360 MHz, DMSO-d6): 8 13,19 (s, br, 1H, NH-1'), 12,05 (s, br, 1H,
COOH), 10,53 (s, br, 1H.NH-1), 7,46 (s, 1H), 7,41 (s, 1H), 7,02 (s, 1H, H-2'),
6,45 (s, 1H), 3,74 (s, 3H, OCH3), 3,70 (s, 3H, OCH3), 2,59 (t, J = 7,43 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2,44 (t, J = 7,43 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2,22 (s, 3H, CH3); MS m/z 357 [M+lf.
Eksempel 11
3- [5-(6-klor-2-okso-lf2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-4-metyl-lH-pyrrol-3-yl]-propionsyre
4- (2-karboksyetyl)-2-formyl-3-metylpyrrol (200 mg), 167,6 mg 6-klor-2-oksindol og 166 ul piperidin i 2 ml med etanol ble varmet ved.95°C i 5 timer.
Reaksjonsblandingen ble kjølt ned og konsentrert. Resten ble suspendert i 6 N vandig saltsyre. Présipitatet ble filtrert, vasket med vann til pH 6 og tørket i en vakuumovn for å gi 246 mg (74 %) av tittelforbindelsen som et brunt fast stoff.
'H-NMR (360 MHz, DMSO-d6): 5 13,22 (s, br, 1H, NH-1'), 12,09 (s, br, 1H, COOH), 10,95 (s, br, 1H, NH-1), 7,78 (d, J = 7,95 Hz, 1H, H-4), 7,66 (s, 1H, H-vinyl), 7,18 (d, J = 2,64 Hz, 1H, H-2'), 7,01 (dd, J = 1,90, 7,95 Hz, 1H, H-5), 6,86
(d, J = 1,90 Hz, 1H, H-7), 2,65 (t, J = 7,14 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2,45 (t, J = 7,14 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2,26 (s, 3H, CH3).
Eksempel 12 . 3-[4-2-karboksyetyl)-3-metyl-lH-pyrrol-2-ylmetylen]-2-okso-2,3-dihydro-lH-indol-5-karboksylsyremetylester.
5-jod-2-oksindol (17 g) ble tilbakestrømmet med 2 g palladiumdiacetat, 18,2 trietylamin, 150 ml metanol, 15 ml dimetylsulfoksid og 2,6 g DPPP i en atmosfære
mettet med karbonmonoksid. Etter 24 timer ble reaksjonsblandingen filtrert for å fjerne katalysatoren, og filtratet ble konsentrert. Konsentratet ble kromatografert på silikagel ved å benytte 30 % etylacetat i heksan. Reaksjonene som inneholdt produktet ble konsentrert og fikk lov å stå. Produktet som presipiterte ble samlet
. ved vakuumfiltrering for å gi 0,8 g (7 %) med 5-metoksykarbonyl-2-oksindol som
et off-white fast stoff. ■ -
'HNMR (360 MHz, DMSO-d6): 5 10,70 (s, br, 1H, NH-1), 7,83 (dd, J = 1,77, 8,29 Hz, 1H, H-6), 7,77 (s, br, 1H, H-4), 6,89 (d, J = 8,29 (Hz, 1H, H-7), 3,80 (s, 3H, COOCH3-5), 3,51 (s, 2H,'CH2-3).
4-(2-karboksyetyl)-2-formyl-3-metylpyrrol (90,6 mg), 88,6 mg' 5-metoksykarbonyl-2- oksindol, og 75 ul piperidin i 2 ml med etanol ble varmet ved 95°C i 5 timer. Reaksjonsblandingen ble kjølt ned og konsentrert. Resten ble suspendert i 6 N vandig saltsyre. Présipitatet ble filtrert, vasket med vann til pH 6 og tørket i en vakuumovn for å gi 123 mg (69 %) av tittelforbindelsen som et gult fast stoff.
'HNMR (360 MHz, DMSO-d6): 5 13,27 (s, br, 1H, NH-1'), 12,0 (s, vbr, 1H, COOH), 11,16 (s, br, 1H, NH-1), 8,36 (s, br, 1H, H-4), 7,80 (s, 1H, H-vinyl), 7,40 (dd, J= 1,80, 8,14 Hz, 1H, H-6), 7,20 (d, J = 2,91 Hz, 1H, H-5'), 6,96 (d, J = 8,14 Hz, 1H, H-7), 3,84 (s, 3H, COOCH3X 2,66 (t, J = 7,55 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2,46 (t, J = 7,55 Hzm.2H, CH2CH2COOH), 2,30 (s, 3H, CH3); MS m/z (relativ intensitet, %) 355 ([M+l]<+>, 100).
Eksempel 13
3- [4-(2-karboksy-etyl)-3-metyl-lH-pyrrol-2-ylmetylen]-2-okso-2,3-dihydro-lH-indol-5-karboksylsyre
2-oksindol (6,7 g) ble tilsatt til en rørt suspensjon med 23 g aluminiumklorid i 30
ml dikloretan på isbad. Kloracetylklorid (11,3 g) ble sakte tilsatt og
. hydrogenkliridgass utviklet seg. Etter 10 min. med røring ble reaksjonen varmet til 40-50°C i 1,5 timer. Tynnsjiktskromatografi (etylacetat, silikagel) viste at det ikke var noe gjenværende utgangsmateriale. Blandingen ble kjølt ned til romtemperatur og helt over på isvann. Présipitatet ble samlet ved vakuumfiltrering, vasket med vann og tørket under vakuum for å gi 10,3 g (98 %) med 5-kloracetyl-2-oksindol som et off-white fast stoff. En suspensjon med 9,3 g 5-kloracetyl-2-oksindol ble rørt i 90 ml pyridin ved 80-90°C i 3 timer, og deretter kjølt ned til romtemperautr. Présipitatet ble samlet ved vakuumfiltrering og vasket med 20 ml etanol. Det faste stoffet ble løst opp i 90 ml med 2,5 N natriumhydroksid og rørt ved 70-80°C i 3 timer. Blandingen ble kjølt ned til romtemperatur og surgjort til pH 2 med 0,5 N saltsyre. Présipitatet ble samlet ved vakuumfiltrering og vasket nøye med vann for å gi rå 5-karboksy-2-oksindol som et mørkebrunt fast stoff. Etter å ha stått over natt ga filtratet 2 g med 5-karboksy-2-oksindol som et gult fast stoff. Det mørke brune råproduktet ble løst opp i varm metanol, det uløselige materialet fjernet ved filtrering og filtratet konsentrert for å gi 5,6 g med 5-karboksy-2-oksindol som et brunt fast stoff. Det kombinerte utbyttet var 97 %. 'HNMR (360 MHz, DMSO-d6): 5 12,56 (s, br, 1H, COOH-5), 10,70 (s, 1H, NH-1), 7,82 (dd, J = 1,57, 7,79 Hz, 1H, H-6), 7,74 (s, br, 1H, H-4), 6,87 (d, J = 7,79 Hz, 1H, H-7), og 3,53 (s, 2H, CH2-3). MS m/z (relativ intensitet, %) 178 ([M+l]<+>, 100). 4-(2-karboksyetyl)-2-formyl-3-metylpyrrol (90,6 mg), 88,6 mg.5-karboksy-2-oksindol og 75 ul piperidin i 2 ml med etanol ble varmet ved 95°C i 5 timer. Reaksjonsblandingen ble kjølt ned og konsentrert. Resten ble suspendert i 6 N vandig saltsyre. Présipitatet ble filtrert, vasket med vann til pH 6 og tørket i en vakuumovn. Råproduktet ble renset ved kromatografi på silikagelkolonne ved å benytte etylacetat-heksan-eddiksyre som elueringsmiddel for å gi 51 mg (30 %) av tittelforbindelsen som et gult fast stoff. <]>HNMR (360 MHz, DMSO-d6): 6 13,27 (s, br, 1H, NH-1), 12,28 (s, vbr, 2H, 2xCOOH), 11,11 (s, br, 1H, NH-1), 8,34 (d, J = 1,36 Hz, 1H, H-4), 7,78 (s, 1H, H-vinyl), 7,40 (dd, J = 1,36, 8,20 Hz, 1H, H-6), 7,19 (d, J = 3,07 Hz, 1H, H-5'), 6,93 . (d, J = 8,20 Hz, 1H, H-7), 2,65 (t, J = 7,56 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2,46 (t, J = 7,56 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2,29 (s, 3H, CH3); MS m/z 341,0 [M+l]<+>.
Eksempel 14
3-[4-metyl-5-(2-okso-5-suIfamoyl-l,2-dihydroindol-3-yliden-metyI)-lH-pyrrol-3-yl]-propionsyre
Til en 100 ml flaske ladet med 27 ml med klorsulfonsyre ble det sakte tilsatt 13,3 g 2- oksindol. Reaksjonstemperaturen ble opprettholdt under 30°C under tilsetningen. Etter tilsetningen ble reaksjonsblandingen rørt ved romtemperatur i 1,5 time,
varmet til 68°C i 1 time, kjølt ned og helt over i vann. Présipitatet ble vasket med vann og tørket i en vakuumovn for å gi 11,0 g med 5-klorsulfonyl-2-oksindol (50
% utbytte), som ble benyttet uten ytterligere rensing.
. 5-klorsulfonyl-2-oksindol (2,1 g) ble tilsatt til 10 ml ammoniumhydroksid i 10 ml. etanol og rørt ved romtemperatur over natt. Blandingen ble konsentrert og def faste stoffet samlet ved vakuumfiltrering for å gi 0,4 g (20 % utbytte) med 5-aminosulfonyl-2-oksindol som et off-white fast stoff.
'HNMR (360 MHz, DMSO-d6): 5 10,67 (s, lH, NH-1), 7,63-7,66 (m, 2H, H-4,6), 7,13 (s, 2H, 5-S02NH2), 6,91 (d, J = 8,04 Hz, 1H, H-7), og 3,56 (s, 2H, CH2-3);
MS m/z (relativ intensitet, %) 211 ([M-l]<+>, 100).
4-(2-karboksyetyl-2-formyl-3-metylpyrrol (90,6 mg), 106 mg 5-aminosulfonyI-2-
. oksindol og 75 ul piperidin i 2 ml med etanol ble vannet ved 95°C i 5 timer. Reaksjonsblandingen ble kjølt ned og konsentrert. Resten ble suspendert i 6 N vandig saltsyre. Présipitatet ble filtrert, vasket med vann til pH 6 og tørket i en vakuumovn for å gi 132 mg (70 %) av tittelforbindelsen som et gult fast stoff.
?HNMR (360 MHz, DMSO-d6): 5 13,28 (s, br, 1H, NH-1'), 12,0 (s, vbr, 1H," COOH), 11,15 (s, br, 1H, NH-1), 8,20 (d, J = 1,60 Hz, lH,.H-4), 7,73 (s, IH, H-vinyl), 7,59 (dd, J = 1,60, 8,17 Hz; 1H, H-6), 7,22 (d, J = 2,85 Hz, 1H, H-2'), 7,10
(s, 2H, NH2), 6,98 (d, J = 8,17 Hz, 1H, H-7), 2,67 (t, J = 7,41 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2,46 (t, J = 7,41 Hz, 2H, CH2CH2C00H), og 2,29 (s, 3H, CH3).
Eksempel 15
3- [4-metyl-5-(5-metylsulfamoyl-2-okso-l,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-lH-
. pyrrol-2-yl]-propionsyre En suspensjon med 3,38 g med 5-klorsulfonyl-2-oksindol i 2 ml 2 M metylamin i tetrahydrofuran ble rørt ved romtemperatur i 4 timer ved hvilken tid et hvitt fast stoff var tilstede. Présipitatet ble samlet ved vakuumfiltrering, vasket to ganger med 5 ml med vann, og tørket under vakuum ved 40°C over natt for å gi 3,0 g (88
% utbytte) av 5-metylaminosulfonyl-2-oksindol.
'HNMR (360 MHz, DMSO-d6): 8 10,87 (s, br, 1H, NH-1), 7,86 (s, br, 1H, 5-SO2NHCH3), 7,61 (d, J = 7,80 Hz, 1H, H-6), 7,32 (d, J = 4,67 Hz, 1H, H-4), 6.97
.(d, J = 7,80 Hz, 1H, H-7), 2,53 (s, 2H, CH2-3), og 2,36 (s, 3H, 5-S02NHCH3) MS m/z (relativ intensitet, %) 226 (M<+>, 100). 4- (2-karboksyetyl)-2-foimiyl-3-metylpyrrol (90,6 mg), 113 mg 5-metylaminosuIfonyl-2-oksindol og 75 ul piperidin i 2 ml med etanol ble varmet ved 95°C i 5 timer. Reaksjonsblandingen ble kjølt ned og konsentrert. Resten ble suspendert i 6 N vandig saltsyre. Présipitatet ble filtrert, vasket med vann til pH 6 og tørket i en vakuumovn for å gi 163 mg (83 %) av tittelforbindelsen som et gult faststoff. 'HNMR (360 MHz, DMSO-d6): 5 13,30 (s, br, 1H, NH-1'), 12,0 (s, vbr, 1H,: COOH), 11,19 (s, br, 1H, NH-1), 8,18 (d, J = 1,64 Hz, 1H, H-4), 7,80 (s, 1H, H-vinyl), 7,53 (dd, J = 1,64, 8,17 Hz, 1H, H-6), 7,23 (d, J = 2,80 Hz, 1H, H-2'), 7,13 (q, J = 5,15 Hz, 1H, NHCH3), 7,02 (d, J = 8,17 Hz, 1H, H-7), 3,84 (s, 3H, COOCHj), 2,66 (t, J = 7,54 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2,47 (t, J = 7,54 Hz,'2H, CH2CH2COOH), 2,41 (d, 'J 5,15 Hz, 3H, NCH3), 2,30 (s,'3H, CH3); MS m/z 390 [M+l]<+>..
Eksempel 16 3-{3-[4-(2-karboksy-etyl)-3-metyl-lH-pyrrol-2-ylmetylen]-2-okso-2,3-dihydro-lH-indol-5-yl}-propionsyre
5- kloracetyl-2-oksindol (4,18 g) i 30 ml trifluoreddiksyre på et isbad ble behandlet med 4,65 g trietylsilan, og rørt ved romtemperatur i 3 timer. Blandingen ble helt over i 150 ml med vann og présipitatet samlet ved vakuumfiltrering, vasket med 50 ml med vann og tørket for å gi 2,53 g (65 % utbytte) av 5-(2-kloretyl)-2-oksiridol som et rød-brunt faststoff.
Kaliumcyanid (2,0 g) ble tilsatt i 15 ml dimetylsulfoksid og varmet til 90°C. 5-kloretyl-2-oksindol (3,0 g) oppløst i 5 ml med dimetylsulfoksid ble sakte tilsatt med røring, og reaksjonen varmet til 150°C i 2 timer. Blandingen ble kjølt ned, helt over på isvann og présipitatet samlet ved vakuumfiltrering, vasket med vann og tørket for å gi råproduktet. Råmaterialet ble kromatografert på silikagel ved å benytte 5 % metanol i kloroform for å gi 1,2 g (42 % utbytte) av tittelforbindelsen.
5-cyanoetyl-2-oksindol (4,02 g) i 10 ml med vann som inneholdt 25 ml med konsentrert saltsyre ble tilbakestrømmet i 4 timer. Blandingen ble kjølt ned, vann tilsatt og det resulterende faste stoffet samlet ved vakuumfiltrering, vasket med vann og tørket for å gi 1,9 g (44 % utbytte) av 5-karboksyetyl-2-oksindpl med et gult fast stoff.
'HNMR (360 MHz, DMSO-d6): 8 12,00 (s, br, 1H, 5-CH2CH2COOH), 10,21 (s,
1H, NH-1), 7,05 (s, 1H, H-4), 6,99 (d, J = 8,68 Hz, 1H, H-6), 6,69 (d,.J = 8,68 Hz, 1H, H-7), 3,40 (s, 2H, CH2-3), 2,74 (t, J = 7,44 Hz, 2H, 5-CH2CH2COOH), og 2,46 (t, J = 7,44 Hz, 2H, -CH2CH2COOH).
4- (2-karboksyetyl)-2-formyl-3-rnetylpyrrol (90,6 mg), 102,6 mg 5-karboksyetyI-2-oksindol og 75 ul piperidin i 2 ml med etanol ble varmet ved 95°C i 5 timer. Reaksjonsblandingen ble kjølt ned og konsentrert. Resten ble suspendert i 6 N vandig saltsyre. Présipitatet ble filtrert, vasket med vann til pH 6 og tørket i en vakuumovn over natt. Det rå faste stoffet ble.renset ved kromatografi på silikagelkolonne og eluert med etylacetat-heksan-eddiksyre for å gi 121 mg (66 %) av tittelforbindelsen som et gult fast stoff.
'HNMR (360 MHz, DMSO-d6): 5 13,30 (d, J = 2,38 Hz, 1H, NH-1'), 12,0.3 (s,
vbr, 2H, 2xCOOH), 10,68 (s, br, 1H, NH-1), 7,63 (s, 1H, H-4), 7,59 (s, 1H, H- ■ vinyl), 7,12 (d, J 2,64 Hz, 1H, H-2'), 6,96 (dd, J = 1,22, 7,93 Hz, 1H, H-6), 6,75 (d, J = 7,93 Hz, 1H, H-7), 2,81 (t, J « 7,75 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2,65 (t, J = 7,75 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2,55 (t, J = 7,75 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2,46 (t, J
= 7,42 Hz, CH2CH2COOH), og 2,26 (s, 3H, CH3).
Eksempel 17
3- [5-(5-etyl-2-okso-lj2-dihydro-indol-3-ylidenmetyl)-4-metyl-lH-pyrrol-3-yl]-propionsyre
2-oksindol (3 g) ble suspendert i 1,2-dikloretan og sakte behandlet med 3,2 ml acetylklorid. Den resulterende suspensjonen ble varmet til 50°C i 5 timer, kjølt ned og helt over i vann. Det resulterende présipitatet ble samlet ved vakuumfiltrering, vasket i rikelig med vann og tørket under vakuum til 2,9 g (73 % utbytte) med 5-acetyl-2-oksindol som et brunt fast stoff.
5- acetyl-2-oksindol (2 g) i 15 ml trifluoreddiksyre i ét isbad ble sakte behandlet med 1,8 g trietylsilan, og deretter rørt ved romtemperatur i 5 timer. 1 ml med trietylsilan ble tilsatt, og røringen ble opprettholdt over natt. Reaksjonsblandingen ble helt over i isvann og det resulterende présipitatet behandlet ved vakuumfiltrering, vasket med rikelig med vann, og tørket under vakuum for å.gi 1,3 g (71 % utbytte) med tittelforbindelsen som et gult fast stoff.
'HNMR (360 MHz, DMSO-d6): 5 10,25 (s, br, NH-1), 7,03 (s, 1H, H-4), 6,97 (d, J
= 8,05 Hz, 1H, H-6), 6,69 (d, J = 8,05 Hz, 1H, H-7), 3,40 (s, 2H, CH2-3), 2,51 (q, J = 7,69 Hz, 2H, CH2CH3-5), og 1,12 (t, J = 7,42 Hz, 3H, CH2CH3-5).
4- (2-karboksyetyl)-2-formyl-3-metylpyrrol (90,6 mg), 80,5 mg 5-etyl-2-oksindol,
og 75 ul med piperidin i 2 ml med etanol ble varmet ved 95°C i 5 timer. Reaksjonsblandingen ble kjølt ned og konsentrert. Resten ble suspendert i 6 N med vandig saltsyre. Présipitatet ble filtrert, vasket med vann til pH 6 og tørket i en vakuumovn over natt. Det rå faste stoffet ble renset ved kromatografi på silikagelkollonner og eluert med etylacetat-heksan-eddiksyre for å gi 52 mg (32 %) med tittelforbindelsen.
'HNMR (360 MHz, DMSO-d6): 8 13,31 (s, br, 1H, NH-1'), 12,0 4 (s, vbr, 1H, COOH), 10,66 (s, 1H, NH-1), 7,59 (s, 2H, H-4 og H-vinyl), 7,11 (d, J = 3,29 Hz, 1H, H-2'), 6,94 (d, J = 7,85 Hz, 1H, H-6), 6,75 (d, J = 7,85 Hz, 1H, H-7), 2,65 (t, J
= 7,66 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2,57 (q, J = 7,83 Hz, 2H, CH3CH2), 2,46 (t, J = 7,66 Hz, CH2CH2COOH), 1,20 (t, J = 7,83, 3H, CH3CH2), 2,26 (s, 3H, CH3); MS m/z 325 [M+l)+.
Eksempel 18
3-[5-(5-metoksy-2-okso-l,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-4-metyl-lH-pyrrol-3-yl]-propionsyre
Kloralhydrat (9,6 g) ble løst opp i 200 ml med vann som inneholdt 83 g
■natriumsulfat. Løsningen ble varmet til 60°C, en løsning med 11,4 g hydroksylamin saltsyre i 50 ml med vann ble tilsatt, og blandingen ble holdt ved 60°C. I en separat flaske ble 6,4 g 4-anisidin og 4,3 ml konsentrert saltsyre i 80 ml med vann varmet til 80°C. Den første løsningen ble tilsatt til den andre løsningen, og den resulterende blandingen ble tilbakestrømt i 2 min., kjølt sakte ned til romtemperatur og deretter kjølt ned på et isbad. Det fargede présipitatet ble samlet ved vakuumfiltrering, vasket med vann og tørket under vakuum i 8,6 g (85 % utbytte) av N-(2-hydroksyiminoacetyl)anisidin.
Konsentrert svovelsyre (45 ml) som inneholdt 5 ml med vann ble varmet til 60°C, og 8,6 g N-(2-hydroksyiminoacetyl)anisidin ble tilsatt i én porsjon. Den rørte blandingen ble varmet ved 93°C i 10 min. og deretter tillatt å kjøle ned til romtemperatur. Blandingen ble helt over i 500 g med is og ekstrahert tre ganger med etylacetat. De kombinerte ekstraktene ble tørket over vannfri natriumsulfat og konsentrert for å gi 5,1 g (65 % utbytte) av 5-metoksyisatin som et mørkerødt fast stoff.
5-metoksysatin (5,0 g) og 30 ml hydrazinhydrat ble varmet til tilbakestrømming i
15 min. Reaksjonsblandingen ble kjølt ned til romtemperatur og 50 ml med vann tilsatt. Reaksjonsblandingen ble ekstrahert tre ganger 25 ml med etylacetat, de organiske lagene ble kombinert, tørket over vannfri natriumsulfat og konsentrert for å gi et gult fast stoff. Det faste stoffet ble rørt i etylacetat, og 1,1 g av det uløselige materialet ble fjernet ved vakuumfiltrering og spart på. Dette materialet viste seg å være 2-hydrazino-karbonylmetyl-4-anisidin. Filtratet ble konsentrert og kromatografert på silikagel og eluert med etylacetat:heksan 1:1 for å gi 0,7 g med 5-metoksy-2-oksindol som et skittent gult fast stoff. 1,1 g med 2-hydrazinkarbonylmetyl-4-anisidin ble tilbakestrømmet i 1 time i 20 ml med IN natriumhydroksid. Blandingen ble kjølt ned, surgjort til pH 2 med konsentrert
. saltsyre og ekstrahert tre ganger med 25 ml etylacetat. Det organiske ekstraktet ble kombinert, vasket med saltløsning, tørket over vannfri natriumsulfat og konsentrert
p
for å gi 0,8 g med 5-metoksy-2-oksindoI som et skittent fast gult stoff. Det kombinerte utbyttet var 1,5 g eller 33 %.
'HNMR (360 MHz, DMSO-d6): 5 10,13 (s, 1H, NH-1), 6,84 (s, 1H, H-4), 6,72 (d,
J = 8,68 Hz, IH, H-6), 6,69 (d, J = 8,68 Hz, 1H, H-7), 3,68 (s, 3H, OCH3-5), 3,41
(s, 2H, CH2-3). MS m/z (relativ intensitet, %) 163 ([M+lf, 100).
4-(2-karboksyetyl)-2-formyl-3-metylpyrrol (90 mg), 82 mg med 5-metoksyy-2-oksindol, og 2 dråper piperidin i 2 ml med etanol ble varmet til 95°C over natt. Reaksjonsblandingen ble kjølt ned og konsentrert. Resten ble suspendert i 6 N av vandig saltsyre. Présipitatet ble filtrert, vasket med vann til pH 6 og tørket i en vakuumovn over natt for å gi 110 g (67 %) av tittelforbindelsen som et brunt fast stoff.
'HNMR (360 MHz, DMSO-d6): 8 13,38 (s, br, 1H, NH-1'), 12,03 ,(s, vbr, 1H, COOH), 10,57 (s, 1H, NH-1), 7,63 (s, 1H, H-vinyl), 7,42. (d, J = 2,46 Hz, 1H, H-4), 7,12 (d, J = 3,08 Hz, 1H, H-2'), 6,74 (d, J = 8,26 Hz, 1H, H-6), 6,75 (dd,'j = 2,46, 8,26 Hz, 1H, H-7), 3,77 (s, 3H, OCH3), 2,65 (t, J = 7,40 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2,46 (t, J = 7,40 Hz, CH2CH2COOH), 2,27 (s, 3H, CH3); MS m/z (relativ intensitet, . %)327 ([M+1]+, 100).
Eksempel 19 3-[5-(5-brom-2-okso-l,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-2J4-dimetyl-lH-pvrrolr3-yl]-propionsyre
3-(2-karboksyetyl)-2,4-dimetyl-5-formylpyrrol (97,5 mg), 106 mg 5-brom-2-oksindol, og 7.5 ul piperidin i 3 ml med etanol ble varmet til 95°C i 5 timer.
Reaksjonsblandingen ble kjølt ned og konsentrert. Resten ble suspendert i 6 N vandig saltsyre. Présipitatet ble filtrert, vasket med vann til pH 6 og tørket i en vakuumovn over natt for å gi 171 mg (88 %) av tittelforbindelsen som et orange fast stoff. -
'HNMR (360 MHz, DMSO-d6): 5 12,04 (s, vbr, 1H, COOH), 10,80 (s, br, 1H, NH-1), 8,0 (d, J = 2,06 Hz, 1H, H-4), 7,67- (s, 1H, H-vinyl); 7,19 (dd, J = 2,06, 8,40 Hz,
1H, H-6), 6,79 (d, J = 8,40 Hz, 1H, H-7), 2,65 (t, J = 7,63 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2,35 (t, J = 7,63 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2,29 (s, 3H, CH3), 2,27 (s;. 3H, CH3);
MS m/z (relativ intensitet; %) 389 ([M+l]<+>, 100).
3-[5-(5-jod-2-okso-l,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3iyl]-propionsyre
3-(2-karboksyetyl)-2,4-dimetyl-5-formylpyrrol (97,5 mg), 130 mg 5-jod-2-
oksindol, og 75 p.1 piperidin i 3 ml med etanol ble varmet ved 95°C i 5 timer. Reaksjonsblandingen ble kjølt ned og konsentrert. Resten ble suspendert i 6 N vandig saltsyre. Présipitatet blefiltrert, vasket med vann til pH 6 og tørket i en
vakuumovn over natt for å gi 155 mg (71 %) av tittelforbindelsen som et orange stoff.
'HNMR (360 MHz, DMSO-d6): 5 13,41 (s, br, 1H, NH-1'), 12,03 (s, br, 1H, COOH), 10,79 (s, br, 1H, NH-1), 8,12 (d, J = 1,70 Hz, 1H, H-4), 7,65 (s, 1H, H-vinyl), 7,36 (dd, J = 1,70, 7,93 Hz, 1H, H-6), 6,79-(d, J = 7,93 Hz, IH, H-7), 2,64 (t, J = 7,76 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2,34 (f, J = 7,76 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2,29 (s, 3H, CH3), 2,27 (s, 3H, CH3); MS m/z (relativ intensitet, %) 437 ([M+l]<+>, 100).
Eksempel 20
3-[5-(5-jod-2-okso-l,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-yl]-propionsyre
3-(2-karboksyetyl)-2,4-dimetyl-5-formylpyrrol (97,5 mg), 130 mg 5-jod-2-oksindol, og 75 ul piperidin i 3 ml med etanol ble rørt ved 95°C i 5 timer. Reaksjonsblandingen ble kjølt ned og konsentrert. Resten ble suspendert i 6 N vandig saltsyre. Présipitatet ble filtrert, vasket med vann til pH 6 og tørket i en vakuumovn over natten for å gi 155 mg av tittelforbindelsen (71 %) som et orange fast stoff.
'HNMR (360 MHz, DMSO-d6): 5 13,41 (s, br, IH, NM'), 12,03 (s, br, 1H, COOH), 10,79 (s, br, IH, NH-1), 8,12 (d, J = 1,70 Hz, IH, H-4), 7,65 (s, IH, H-vinyl), 7,36 (dd, J = 1,70, 7,93 Hz, IH, H-6), 6,79 (d, J = 7,93 Hz, IH, H-7), 2,64 (t, J = 7,76 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2,34 (t, J = 7,76 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2,29 (s, 3H, CH3), 2,27 (s, 3H, CH3)..
MS m/z (relativ intensitet, %) 437 ([M+l]\ 100).
Eksempel 21
3-[2,4-dimetyl-5-(4-metyl-2-okso-1,2-dihydroindol-3-yliden-metyl)-l H-pvrrol-3-yl]-propionsyre
3-(2-karboksyetyl)-2,4-dimetyl-5-formylpyrrol (97,5 mg), 74 mg 4-metyl-2-oksindol, og 75 ul piperidin i 3 ml med etanol ble. varmet ved 95°C i 5 timer. Reaksjonsblandingen ble kjølt ned og konsentrert. Resten ble suspendert i 6 N med vandig saltsyre. Présipitatet ble filtrert med vann og vasket til pH 6 og tørket i en vakuumovn over natt for å gi 60 mg (37 %) av tittelforbindelsen som et grønt fast stoff.
'HNMR (360 MHz, DMSO-d6): 5 13,41 (s, br, IH, NH-1'), 12,03 (s, br, IH, COOH), 10,72 (s, br, IH, NH-1), 7,50 (s, IH, H-vinyl), 7,01 (t, JF = 7,82 Hz, IH, H-6), 6,79 (d, J = 7,82 Hz, H-5), 6,74 (d, J = 7,82 Hz, IH, H-7), 2,64 (t, J = 7,76 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2,56 (s, 3H, CH3), 2,34 (t, J = 7,76 Hz, 2H, CH2CH2COOH),
2,29 (s, 3H, CH3), 2,18 (s, 3H, CH3); MS m/z (relativ intensitet, %) 325 ([M+l]<+>, 100).
Eksempel 22
3-[2,4-dimetyl-5-(5-metyl-2-okso-l,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-lH-pyrrol-3-yl]-propionsyre
3-(2-karboksyetyl)-2,4-dimetyl-5-formylpyfrol (97,5 mg), 74 mg 5-metyl-2-oksindol, og 75 ul piperidin i 3 ml med etanol ble varmet med 95°C i 5 timer. Reaksjonsblandingen ble kjølt ned og konsentrert. Resten ble suspendert i 6 N saltsyre. Présipitatet ble filtrert, vasket med vann til pH 6 og tørket i en vakuumovn over natt for å gi 104 mg (64 %) av tittelforbindelsen som et gult fast stoff.
'HNMR (360 MHz, DMSO-d6): 8 13,38 (s, br, IH, NH-1'), 12,02 (s, b'r, IH, COOH), 10,57 (s, br, IH, NH-1), 7,52 (s, br, IH, H-4), 7,50 (s, IH, H-vinyl), 6,87 (d, J = 7,86 Hz, IH, H-6), 6,73 (d, J = 7,86 Hz, IH, H-7), 2,63 (t, J = 7,49 Hz, 2H,
CH2CH2COOH), 2,34 (t, J = 7,49 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2,29 (s, 3H, CH3), 2,28 (s, 3H, CH3), og 2,24 (s, 3H,.CH3); MS m/z (relativ intensitet, %) 325 ([M+l]<+>, 66).
Eksempel 23
3-[5-(6-hydroksy-2-okso-l,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-yl]-propionsyre
3,'26 g med 6-metoksy-2-oksindol i 60 ml med diklormetan ble kjølt ned til -2°C, og 40 ml 1 M bortribromidløsning i diklormetan ble tilsatt dråpevis. Reaksjonsblandingen ble rørt i et isbad i 1 time, og deretter ved romtemperatur i 1 time. Den ble deretter helt over i isvann og ekstrahert med etylacetat. Det organiske laget ble vasket med vann og saltløsning, tørket over vannfri natriumsulfat, konsentrert, présipitatet som ble dannet ble filtrert og deretter tørket i en vakuumovn over natt for å gi 2,56 g med 6-hydroksy-2-oksindol (86 % utbytte).
'HNMR (360 MHz, DMSO-d6): 5 10,13 (s, IH, NH-1), 9,22 (s, IH, OH-6), 6,93
(d, J = 7,76 Hz, IH, H-4), 6,27-6,31 (m, 2H, H-5,7), og 3,29 (s, 2H, CH2-3);.MS m/z. 150 [M+l]+.
3-(2-karboksyetyl)-2,4-dimetyl-5-formylpyrrol (82 mg), 63 mg 6-hydroksy-2-oksindol, 48 ul piperidin i 2 ml med etanol ble varmet ved 90°C i to dager. Reaksjonsblandingen ble kjølt ned, konsentrert og renset ved silikagelkolonnekromatografi eluerte med etylacetat-heksan-eddiksyre for å gi 55 mg (40 %) av tittelforbindelsen som et mørk brunt faststoff.
'HNMR (360 MHz, DMSO-d6): 8 13,10 (s, br, IH, NH-1'), 12,0 (s, vbr, IH,
COOH), 10,51 (s, br, IH, NH-1), 9,41 (s, IH, OH), 7,44 (d, J = 7,83, IH, H-4), 7,29 (s, IH, H-vinyl), 6,37 (dd, J = 2,16, 7,83 Hz, IH, H-5), 6,33 (d, J = 2,16 Hz, IH, H-7), 2,62 (t, J = 7,75 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2,32 (t, J = 7,75 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2,25 (s, 3H, CH3), 2,20 (s, 3H, CH3); MS m/z 325 [M+l]<+>.
Eksempel 24
3-[5-(6-metoksy-2-okso-l,2-dihydroi yl]-propionsyre
3-(2-karboksyetyI)-2,4-dimetyl-5-formylpyrrol (97,5 mg), 82 mg 6-metoksy-2-bksindol og 2 dråper piperidin med 2 ml med etanol ble varmet i 95°C over natt. Reaksjonsblandingen ble kjølt ned og konsentrert. Resten ble suspendert i 2 N vandig saltsyre. Présipitatet ble filtrert, vasket med varin til pH 6 og tørket i en vakuumovn over natt for å gi 130 mg (76 %) av tittelforbindelsen som et gult fast stoff.
'HNMR (360 MHz, DMSO-d6): 8 13,15 (s, br, 1H,NH-1'), 11,75 (s, vbr, IH, COOH), 10,65 (s, br, IH, NH-1), 7,58 (d, J = 8,27, IH, H-4), 7,29 (s, IH, H-vinyl), 6,37 (dd, J = 2,26, 8,27 Hz, IH, H-5), 6,33 (d, J = 2,26. Hz, IH, H-7), 8,74 (s, 3H, OCH3), 2,62 (t, J = 7,67 Hz, 2H, CH2CH2COOH(m 2,33 (t, J = 7,67 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2,26 (s, 3H, CH3), og 2,22 (s, 3H, CH3); MS m/z (relativ intensitet, %)-341 ([M+l]<+>, 100).
Eksempel 25
3- [5-(6-hydroksy-2-okso-l,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-4-metyl-lH-pyrrol-3-yl]-propionsyre
4- (2-karboksyetyl)-2-formyl-3-metylpyrrol (543-mg), 450 mg 6-hydroksyT2-oksindol, og 45.0 ul piperidin i 10 ml med etanol ble varmet til 90°C over natt. Reaksjonsblandingen ble kjølt ned og konsentrert. Resten ble suspendert i 2 N vandig saltsyre. Présipitatet ble filtrert, vasket med vann til pH 6 og tørket i en vakuumovn over natt for å gi et brunt fast stoff.
'HNMR (360 MHz, DMSO-d6): 8 13,05 (s, br, IH, NH-1'), 10,60 (s, br, IH, NH-1), 9,4 (s, IH, OH), 7,49 (d, J = 8,08, IH, H-4), 7,35 (s, IH, H-vinyl), 7,02 (d, J = 3,22 Hz, IH, H-2'), 6,38 (dd, J = 2,28, 8,08 Hz, IH, H-5), 6,32 (d,-J = 2,28 Hz, IH, H-7), 2,62 (t, J 7,67 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2,44 (t, J = 7,67 Hz, 2H, CH2CH2COOH), og 2,21 (s, 3H, CH3); MS m/z (relativ intensitet, %)313 ([M+l]<+>, 60).
Eksempel 26 3-[5-(6-hydroksy-2-okso-l,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-4-metyl-lH-pyrrol, 3-yl]-propionsyre 3,5-dimetoksy-benzylester
3-[5-(6-hydroksy-2-okso-l,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-4-metyl-lH-pyrrol-3-yl]-propionsyre (100 mg), 56 mg 3,5-dimetoksy-benzylklorid og 207 mg kaliumkarbonat i 2 ml vandig dimetylformamid ble varmet ved 90°C over natt.
reaksjonsblandingen ble kjølt ned, helt over i vann og ekstrahert med etylacetat. Det oragniske laget ble vasket med vann og saltløsning, tørket over vannfri
natriumsulfat og konsentrert. Råproduktet ble renset ved kromatografi på silikagelkolonne og eluert med etylacetat-heksan-eddiksyre for å gi 39 mg av tittelforbindelsen som et brunt fast stoff.
<l>HNMR (360 MHz, DMSO-d6): 8 13,06 (s; br, IH, NH-1'), 10,60 (s, br, IH, NH-1), 9,4 (s, br, IH, OH), 7,49 (d, J = 8,03, IH, 4-H), 7,35 (s, IH, H-vinyl), 7,01 (d, J = 3,08 Hz, 1H, H-2'), 6,47.(d, J = 2,29 Hz, 2H, aromatisk), 6,42 (t, J = 2,29 Hz, IH, aromatisk), 6,38 (dd, J = 2,15, 8,03 Hz, IH, H-5), 6,33 (d, J = 2,15 Hz, IH, H-7), 5,01 (s, 2H, CH2-Ph), 3,70 (s, 6H, 2xOCH3), 2,59-2,72 (m, 4H, CH2CH2COOH), og 2,20 (s, 3H, CH3).
Eksempel 27
3-{5-[6-(3-metoksy-fenyl)-2-okso-l,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl]-2,4-dimetyl-
1 H-pyrrol-3-yl}-propionsyre
Tetrakis (trifenylfosfin)palladium (0,7 g) ble tilsatt til en blanding med 5 g med 3-metoksyfenylborsyre, 3,8 g 5-brom-2-fluornitrobenzen og 11 ml 2 M natriumkarbonatløsning i 100 ml med toluen. Blandingen ble tilbakestrømt i 2
timer, fortynnet med vann og ekstrahert med etylacetat. Etylacetatet ble vasket med mettet natriumbikarbonat og deretter saltløsning, tørket og konsentrert for å gi et oljeaktig fast stoff. Det faste stoffet ble kromatografert på silikagel ved å .benytte etylacetat:heksan (1:6) for å gi 4,3 g (77 % utbytte) med 4-fluor-3'-metoksy-3-nitrobifenyl..
Dimetylmalonat (9,7 ml) ble tilsatt dråpevis til 2,0 g med natriumhydrid suspendert i 50-ml med dimetylsulfoksid. Blandingen ble varmet ved 100°C i 35 min., og deretter kjølt ned til romtemperatur. 4-fluor-2'-metoksy-3-nitrobifenyl (4,2 g) i 50 ml dimetylsulfoksid ble tilsatt pg blandingen varmet til 100°C i 1 time. Reaksjonsblandingen ble kjølt ned og undertrykket med 300 ml med mettet ammoniumkloridløsning, og ekstrahert to<m>ganger med etylacetat. Ekstraktene ble kombinert, vasket med saltløsning, tørket over vannfri natriumsulfat og konsentrert for å gi rå dimetyl 3'-metoksy-3-nitrobifenyl-4-malonat som et blekt gult fast stoff.
Rå 3'-metoksy-3-nitro-bifenyl-4-malonat ble. varmet ved 110°C i 45 ml med.6 N saltsyre i 4 dager og kjølt ned. Présipitatet ble samlet ved filtrering, vasket med vann og heksan og tørket for å gi 5,3 g med 3'-metoksy-2-nitrobifenyl-4-eddiksyre som et lyst farget fast stoff.
3'-metoksy-3-nitrobifenyl-4-eddiksyre (5,2 g) ble løst opp i metanol og hydrogenert over 0,8 g 10 % palladium på karbon i 3 timer ved romtemperatur.
Katalysatoren ble fjernet ved filtrering, vasket med metanol og filtratene kombinert <1 >og konsentrert for å gi et brunt fast stoff.
Det faste stoffet ble kromatografert på silikagel i etylacetat:heksan:eddiksyre 33:66:1 for å gi 3,0 g (75 % utbytte basert på 4-fluor-3,-metoksy-3-nitrobifenyl) av 6-(3-metoksyfenyl)-2-oksindol som et rosa fast stoff.
'HNMR (360 MHz, DMSO-d6): 5 10.39 (s, br, IH, NH), 7,35 (t, J = 7,85 Hz, IH), 7.26 (d, J = 7,78 Hz, IH), 7,19 (dd, J = 1,22, 7,8 Hz, IH), 7,13-7,16 (m, IH), 7,09-7,1 (m, IH), 7,01 (d, J = 1,48 Hz, IH), 6,90-6,93 (m, IH), 3,8 (s, 3H, OCH3), 3,49 (s, 2H, CH2); MS m/z (relativ intensitet,. %) 240,0([m+1 ]\ 100).
3-(2-karboksyetyI)-2,4-dimetyl-5-formylpyrrol (117 mg), 120 mg 6-(3-metoksyfenyl)-2-oksindol og 3 dråper piperidin i 3 ml med etanol ble varmet ved 90°C over natt. Reaksjonsblandingen ble kjølt ned <p>g konsentrert. Resten ble suspendert i 6 N vandig saltsyre. Présipitatet ble filtrert, vasket med vann til pH 6 og tørket i en vakuumovn over natt for å gi 190 mg (91 %) av tittelforbindelsen
som et brunt fast stoff.
'HNMR (360 MHz, DMSO-d6): 5 13,38 (s, br, IH, NH-1'), 12,04 (s, br, IH, COOH), 10,79 (s, br, IH, NH-1), 7,77 (d, J = 8,05, IH, H-4), 7,58 (s, IH, H-vinyl), 7.27 (dd, J = 1,49, 8,05 Hz, IH, H-5), 7,09 (d,.J = 1,49 Hz, IH, H-7), 6,89-7,59 (m, 4H), 3,81 (s, 3H, OCH3), 2,65 (t, J = 7,62 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2,35 (t, J =
7,62 Hz, 2H, CH2CH2COOHj, 2,30 (s, 3.H, CH3), og 2,27 (s, 3H, CH3); MS m/z (relativ intensitet, %) 417 ([M+l]<+>, 75).
Eksempel 28
'3-[5-(6-brom-2-okso-l,2-dihydroindol-3-yleidenmetyl)-4-metyl-lH-pyrrol-3-yl]-propionsyre
Dimetylmalonat (13 ml) ble tilsatt dråpevis til 2,7 g natriumhydrid suspendert i 20. ml dimetylsulfoksid. Blandingen ble varmet til 100°C i 10 min. og kjølt ned til romtemperatur. 5-brom-2-fluornitrobenzen (5,0 g) i 25 ml dimetylsulfoksid ble tilsatt, og blandingen ble varmet ved 100°C i 2 timer. Reaksjonsblandingen ble kjølt ned og undertrykket med 300 ml med mettet ammoniumkloridløsning, og . ekstrahert tre ganger med etylacetat. Ekstraktene ble kombinert, vasket med mettet ammoniumklorid, vann og saltløsning, tørket over vannfri natriumsulfatløsning og konsentrert for å gi rå dimetyl 4-brom-2-nitrofenylmalonat som en lys gul olje.
Rå dimetyl 4-brom-2-nitrofenylmalonat ble vannet ved 110°C i 40 ml med 6 N saltsyre i 24 timer og kjølt ned. Présipitatet ble samlet ved filtrering, vasket med vann og tørket for å gi 5,3 g (89 % utbytte) med 4-brom-2-nitrofenyleddiksyre som et off-white fast stoff.
4-brom-2-nitrofenyleddiksyre (0,26 g), 0,26 g sinkpulver og 3 ml 50 % svovelsyre i 5 ml etanol ble varmet ved 100°C over natt. Reaksjonsblandingen ble filtrert,
fortynnet med litt eddiksyre, konsentrert for å fjerne etanol, fortynnet med vann og ekstrahert to ganger med etylacetat. De kombinerte ekstraktene ble vasket med saltløsning, tørket over vannfri natriumsulfat og konsentrert for å gi 0,19 g (90 % utbytte) med 6-brom-2-oksindoI som et gult fast stoff.
'HNMR (360 MHz, DMSQ-d6): 8.10,45 (s, br, IH, NH-1), 7,14 (d, J 7,89 Hz,
IH, H-4), 7,09 (dd, J = 1,53, 7^89 Hz, IH, H-5), 6,93 (d, J = 1,53 Hz, IH, H-7), og 3,43 (s, 2H, CH2-3); MS m/z (relativ intensitet, %) 210 ([M-2]<+>, 100) og 212 (M<+>, 100)..
4-(2-karboksyety])-2-formy]-3-metylp<y>rrol (90 mg), 106 mg 6-brom-2-oksindol, og 3 dråper piperidin i 3 ml med etanol ble varmet ved 90°C i 4 timer. Reaksjonsblandingen ble kjølt ned og konsentrert. Resten ble suspendert i 6 N
vandig saltsyre. Présipitatet ble filtrert og vasket med vann til pH 6 og tørket i en vakuumovn over natt for å gi 172 mg (92 %) av tittelforbindelsen med et gult fast stoff....
'HNMR (360 MHz, DMSO-d6): 8 13,22 (s, br, IH, NH-1'), 12,04 (s, br, IH,
COOH), 10,92 (s, br, IH, NH-1), 7,73 (d, J = 8,37, IH, H-4), 7,67 (s, IH, H-vinyl), 7,18 (d, J = 3,22 Hz, IH, H-2'), 7,14 (dd, J = 1,33, 8,37 Hz, IH, H-5), 6,99 (d, J =
1,33 Hz, IH, H-7), 2,64 (t, J = 7,39 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2,46 (t, J 7,39 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2,25 (s, 3H, CH3); MS (APCI) m/z 375,0 [M+l]<+>.
Eksempel 29. 3- {5-(6-(3-metoksy-fenyl)-2-okso-l,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl]-4-metyl-lH-pyrrol-3-yl}-propionsyre
4- (2-karboksyetyl)-2-formyl-3-metylpyiTol (90,5 mg), 120 mg 6-(3-metoksyfenyl)-2- oksindol og 3 dråper piperidin i 3 ml med etanol ble varmet ved 90°C over natt. Reaksjonsblandingen ble kjølt ned og konsentrert. Resten ble suspendert i 6 N
vandig saltsyre. Présipitatet ble filtrert, vasket med vann til pH 6 og tørket i en vakuumovn over natt for å gi 195 mg (97 %) med tittelforbindelsen som et brunt fast stoff.
'HNMR (360 MHz, DMSO-d6): .5 13,29 (s, br, IH, NH-1'), 12.07 (s, br, IH,
COOH), 10,88 (s, br, IH, NH-1), 7,82 (d, J =- 7,77, IH, H-4), 7,65 (s, lH,.H-vinyl), . 7,27 (dd, J= 1,41, 7,77 Hz, IH, H-5), 7,09 (d, J = 1,41 Hz, IH, H-7), 6,89-7,36 /m, 5H), 3,82 (s, 3H, OCH3), 2,65 (t, J = 7,55 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2,47 (t, J =
7,55 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2,27 (s, 3H, CH3); MS (APCI) m/z 401 [M-l]<+>.
Eksempel 30 3- {5-[6-(3-etoksy-fenyl)-2-okso-l,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl]-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-yl}-propionsyre Tetrakis(trifenylfosfin)palladium (0,8 g) ble tilsatt til en blanding med 4,2 g med 3-etoksyfenylboronsyre, 5,0 g 5-brom-2-fluornitrobenzen og 22 ml 2 M natriumkarbonatløsning i 50 ml toluen og 50 ml etanol. Blandingen ble tilbakestrømmet i 2 timer og deretter konsentrert. Vann ble tilsatt og blandingen ble ekstrahert to ganger med etylacetat. De kombinerte etylacetatlagene ble vasket med vann og saltløsning, deretter tørket og konsentrert. Resten ble kromatografert
på silikagel ved å benytte 5 % etylacetat i heksan for å gi 5,3 g (90 % utbytte) med rå 4-fluor-3'-etoksy-3-nitrobifenyl som en gul olje.
Dimetylmalonat (11,4 ml) ble tilsatt dråpevis til 4,0 g natriumhydrid suspendert i 20 ml dimetylsulfoksid. Blandingen ble varmet til 100°C i 10 min., og kjølt ned til
romtemperatur. Rå 4-fluor-3'-etoksy-3-nitrobifenyl (5,3 g) i 25 ml dimetylsulfoksid ble tilsatt, og blandingen ble varmet ved 100°C i 2 timer. Reaksjonsblandingen ble
kjølt ned, undertrykket med 300 ml mettet ammoniumkloridløsning og ekstrahert tre ganger med etylacetat. Ekstraktene ble kombinert, vasket med vann og saltløsning, tørket over vannfri natriumsulfat og konsentrert for å gi rå dimetyl 3'-etoksy-3-nitrobifenyl-4-malonat som en gul olje.
Rå dimetyl 3'-etoksy-3-nitrobifenyl-4-malonat ble varmet ved 100°C i 60 ml 6 N saltsyre i totalt 4 dager og kjølt ned..Présipitatet ble samlet ved filtrering], vasket med vann og heksan, og tørket for å gi 4,7 g (77 % utbytte basert på 5-bron>2-fluornitrobenzen) med rå 3'-etoksyH3-nitrobifenyl-4-eddiksyre som et lyst farget fast stoff.
Jernspon (2,4 g) ble tilsatt i én porsjon til 4,6 g 3'-etoksy-3-nitrobifenyl-4-eddiksyre i 40 ml iseddiksyre, og blandingen ble tilbakestrømt i 2 timer. Reaksjonsblandingen.ble konsentrert til tørrhet, behandlet repetert méd etylacetat og filtrert for å fjerne uløselig materiale. Filtratet ble vasket-to ganger med 1 N saltsyre, deretter med saltløsning, tørket over vannfri natriumsulfat og konsentrert. - for å gi 3,5 g (91 % utbytte) med 6-(3-etoksyfenyl)-2-oksindol som et lysebrunt fast stoff.
'HNMR (360.MHz, DMSO-d6): 5 10,4 (s, br, IH, NH), 7,33 (t, J = 8,4 Hz, IH, H-3'), 7,35 (d, J = 7,77 Hz, IH), 7,19 (dd, J = 1,3, 7,66 Hz, IH), 7,13 (d, J = 7,69 Hz, IH), 7,07-7,08 (m, IH), 7,0 (s, br, IH), 6,9 (dd, J = 2,82, 8,08 Hz, IH), 4,08 (q, J = 7 Hz, 2H, OEt), 3,49 (s, 2H, CH2), 1,34 (t, J ? 7 Hz, 3H, OEt); MS m/z (relativ
intensitet, %) 254,2 ([M+l]<+>, 100).
3-(2-karboksyetyl)-2,4-dimetyl-5-formylpyrrol (87,6 mg), 127 mg 6-(3-etoksyfenyl)-2-oksindol, og 2 dråper piperidin i 2 ml etanol ble varmet ved 90°C over natt. Reaksjonsblandingen ble kjølt ned og konsentrert. Resten ble suspendert
i 6 N vandig saltsyre. Présipitatet ble filtrert, vasket med vann til pH 6 og tørket i en vakuumovn over natt for å gi 227 mg med tittelforbindelsen.(-100 %) som et brunt fast stoff.
'HNMR (360 MHz, DMSO-d6): 5 13,38 (s, br, IH, NH-1'), 12,06 (s, br, IH,
COOH), 10,81 (s, br, IH, NH-1), 7,77 (d, J = 7,97, IH, H-4), 7,58 (s, IH, H-vinyl),
7,26 (dd, J = 1,35, 7,97 Hz, IH, H-5), 7,08 (d, J = 1,35 Hz, lH,.H-7), 6,87-7,-36 (m, 4H), 4,09 (q, J = 7,0 Hz, 2H, CH3CH2); 2,65 (t, J = 7,54 Hz, 2H, CH2CH2COOH),
2,47 (t, J = 7,54 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2,30 (s, 3H, CH3), 2,26 (s, 3H, CHj),
1,34 (t, J = 7,0 Hz, 3H, CH3CH2); MS m/z (relativ intensitet, %) 431 ([M+l]<+>, 21).
Eksempel 31
3- {5-[6-(3-etoksy-fenyl)-2-okso-l,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl]r4-metyl-lH-. pyrroI-3-yl}-propionsyre
4- (2-karboksyetyl)-2-formyl-3-metylpyrrol (90,5 mg), 127 mg 6-(3-etoksyfenyl)-2-oksindol og 2 dråper piperidin i 2 ml med etanol ble varmet ved 90°C over natt. Reaksjonsblandingen ble kjølt ned og konsentrert. Resten ble suspendert i 6 N
vandig saltsyre. Présipitatet ble filtrert, vasket med vann til pH 6 og tørket i en vakuumovn over natt for å gi 200 mg (96 %) av tittelforbindelsen som et brunt fast stoff.
'HNMR (360 MHz, DMSO-d6): 5 13,29 (s, br, IH, NH-1'), 12,07 (s, vbr, IH, .
COOH), 10,88 (s, br, IH, NH-1), 7,82 (d, J = 7,97, IH, H-4), 7,65 (s, IH, H-vinyl),. 7,28 (dd, J = 1,20, 7,97 Hz, IH, H-5), 7,08 (d, J = 1,20 Hz, IH, H-7), 6,87-7,36 (m, . 5H), 4,09 (q, J = 6,98 Hz, 2H, CH3CH2), 2,65 (t, J = 7,47 Hz, 2H, CH2CH2COOH),'
2,47 (t, J = 7,47 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2,27 (s, 3H, CH3), 1,34 (t, J = 6,98 Hz,
3H, CH3CH2).
Eksempel 32
3-[2,4-dimetyl-5-(2-okso-6-fenyl-l,2-dihydroindoi-2-ylidenmetyl)-lH-pyrrol-3-yl]-propionsyre
Tetrakis(trifenylfosfin)paIIadium (0,8 g) ble tilsatt til en blanding med 3,1 g med benzenborsyre, 5 g 5-brpm-2.-fluornitrobenzen og 22 ml 2 M
natriumkarbonatløsning i 50 ml toluen og 50 ml etanoh Blandingen ble tilbakestrømt i 2 timer, konsentrert og resten ekstrahert to ganger med etylacetat. Etylacetatlaget ble vasket med vann og saltløsning, tørket og konsentrert for å gi en
gul olje. Oljen ble kromatografert på silikagel ved å benytte 5 % etylacetat i heksan for å gi 4,75 g (96 % utbytte) av 4-fluor-3-nitrobifenyl som en gul olje.
Dimetylmalonat (10 ml) i 25 ml med dimetylsulfoksid ble tilsatt dråpevis til 3,5 g natriumhydroksid suspendert i 25 ml dimetylsulfoksid, og blandingen ble varmet
ved 100°C i 10 min. Blandingen ble kjølt ned til romtemperatur og 4,7 g med 4-
fluor-3-nitrobifenyl i 25 ml dimetylsulfoksid ble tilsatt. Blandingen ble vårmet ved 100°C i 2 timer, kjølt ned og undertrykket med 300 ml med mettet ammoniumkloridløsning. Blandingen ble ekstrahert tre ganger med etylacetat, og de kombinerte organiske lagene vasket med vann og saltløsning og fordampet for å gi en gul olje, rå dimetyl-3-nitrobifenyl-4-malonat..
Rå dimetyl-3-nitrobifenyl-4-malonat ble tilbakestrømmet i 30 ml med 6 N saltsyre i 24 timer. Présipitatet ble samle ved filtrering, vasket med vann' og tørket for å gi
4,5 g (80 % basert på 4-fluor-3-nitrpbifenyl) med 3-nitrobifenyl-4-eddiksyre som et kremfarget fast stoff.
Jérnspon (2,6 g) ble tilsatt, alt på én gang, til 4,5 g 3-nitrobifenyl-4-eddiksyre i 40 ml eddiksyre. Blandingen ble tilbakestrømt i 2 timer, konsentrert til tørrhet og tatt opp i etylacetat. De faste stoffene ble fjernet ved filtrering, og filtratet vasket to ganger med 1 N saltsyre og saltøsning, og tørket over vannfri natriumsulfat. Filtratet ble konsentrert for å gi 3,4 g (93 % utbytte) med 6-fenyl-2-oksindol som et lysebrunt fast stoff.
'HNMR (360 MHz, DMSO-d6): 5 10,4 (s, br, IH, NH-1), 7,57-7,6 (m, 2H), ■ '' 7,42-7,46 (m, 2H), 7,32-7,37 (m, IH), 7,27 (d, J = 7,7, IH, H-4), 7,19 (dd, J = 1,6, 7,7 Hz, IH, H-5), 7,01 (d, J = 1,6 Hz, IH, H-7), 3,49 (s,-2H, CH2); MS m/z (relativ intensitet, %) 210 ([M+l]<+>, 100).
3-(2-karboksyetyl)-2,4-dimetyl-5-formylpyrrol (97,6 mg), 105 mg 6-fenyl-2-oksindol og 2 dråper'piperidin i 2 ml med etanol ble varmet ved 90°C over natt. Reaksjonsblandingen ble kjølt ned og konsentrert. Resten ble suspendert i 6 N vandig saltsyre. Présipitatet ble filtrert, vasket med vann til pH 6 og tørket i en vakuumovn over natt for å gi 138 mg (71 %) av tittelforbindelsen som et brunt fast stoff.
<l>HNMR (360 MHz, DMSO-d6): 13,38 (s, br, IH, NH-1'), 12,05 (s, br, IH, COOH), 10,81 (s, br, IH, NH-1), 7,78 (d, J = 7,84, IH, COOH), 10,81 (s, br, IH, NH-1), 7,78 (d, J = 7,84, IH, H-4), 7,58 (s, IH, H-vinyl), 7,25-7,63 (m, 6H), 7,09 (s, br, IH, H-7), 2,64 (t, J = 7,71 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2,35 (t, J = 7,71 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2,30 (s, 3H, CH3), og 2,26 (s, 3H, CH3); MS m/z (relativ intensitet, %) 387 ([M+l]<+>, 100).
Eksempel 33 3- [4-metyl-5-(2-okso-6-fenyl-l,2-dihydro-indol-3-ylidenmetyl)-lH-pyrrol-3-yl]-propionsyre
4- (2-karboksyetyl)-2-formyl-3-metylpyrrol (90,5 mg), 105 mg 6-fenyl-2-oksindol og 2 dråper piperidin i 2 ml med etanol ble varmet ved 90°C over natt. Reaksjonsblandingen ble kjølt ned og konsentrert. Resten ble suspendert i 6 N
vandig saltsyre. Présipitatet ble filtrert, vasket med vann til pH 6 og tørket i en vakuumovn over natt for å gi 146 mg (78 %) av tittelforbindelsen som et brunt fast stoff.
'HNMR (360 MHz, DMSO-d6): 8 13,29 (s, br, IH, NH-1'), 1,01 (s,.vbr, IH,
COOH), 10,89 (s, br, IH, NH-1), 7,83 (d, J = 7,92,.IH, H-4), 7,65 (s, IH, H-vinyl), 7,30-7,65 (m, 5H), 7,16 (d J = 2,83 Hz, lH,'H-2'), 7,28 (dd, J = 1,58, 7,92 Hz, IH, H-5), 7,09 (d, J = 1,58 Hz, IH, H-7), 2,66 (t, J = 7,76 Hz, 2H, CH2CH2COOH),
2,45 (t, J = 7,76 Hz, 2H, CH2CH2COOH), og 2,27 (s, 3H, CH3); MS m/z (relativ intensitet, %) 373 ([M+l]<+>, 100). ■
Eksempel 34
3- {5-[6-(4-metoksy-fenyl)-2-okso-l,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl]-4-metyl-lH-pyrrol-3-yl}-propionsyre
Tetrakis(trifenylfosfin)palladium (1 g) ble tilsatt til en blanding med 5 g 4-metoksyfenylborsyre, 6,6 g 5-brom-2-fluornitrobenzen og 30 ml 2 M natriumkarbonatløsning i 50 ml toluen og 50 ml etanol. Blandingen ble tilbakestrømt i 2 timer, konsentrert, og resten ekstrahert to ganger med etylacetat. Etylacetatlaget ble vasket med vann og saltløsning, tørket og kosentrert for å gi et brunt oljeaktig fast stoff.
Det faste stoffet ble kromatografert på silikagel ved å benytte 5 % etylacetat i
heksan for å gi rå 4-fluor-4'-metoksy-3-nitrobifenyl som et blekt gult fast stoff.
Dimetylmalonat (10 ml) ble tilsatt dråpevis til 2,0 g av natriumhydrid suspendert i
60 ml dimetylsulfoksid. Blandingen ble varmet til 100°C i 10 min. og kjølt ned til romtemperatur. Rå 4-fluor-2'-metoksy-3-nitrobifenyl (5, g) i 50 ml dimetylsulfoksid ble tilsatt,-og blandingen ble varmet ved 100°C i to timer. Reaksjonsblandingen ble kjølt ned og undertrykket med 300 ml med mettet natriumkloridløsning og ekstrahert tre ganger med etylacetat. Ekstraktene ble kombinert, vasket med mettet ammoniumklorid, vann og saltløsning, tørket over vannfri natriumsulfat og konsentrert for å gi rå dimetyl-4'-metoksy-3-nitrobifenyl-4- malonat som en gul olje.
Rå 4'-metoksy-3-nitro-bifenyl-4-malonat ble varmet ved 100°C i 60 ml 6 N
saltsyre i 15 timer og kjølt ned. Présipitatet som ble dannet ble samlet ved filtrering, vasket med vann og heksan, og tørket for å gi 7,2 g med rå 4'-metoksy-3-nitrobifenyl-4-eddiksyre som et lyst farget fast stoff.
Jernspon (3,6 g) ble tilsatt i en porsjon til 7,2 g 4'-metoksy-3-nitrobifenyl-4-eddiksyre i 50 ml iseddik og varmet ved 100°C over natt. Reaksjonsblandingen ble konsentrert til tørrhet, sonikert i etylacetat og filtrert for å fjerne uløselige stoffer. Filtratet ble vasket to ganger med 1 N saltsyre, deretter med saltløsning, tørket over . vannfri natriumsulfat og konsentrert for å gi 2,7 g (54 % utbytte basert på 5-brom-2-fluornitrobenzen) med 6-(4-metoksyfenyl)-2-oksindol som et rosafarget fast stoff.
'HNMR (360 MHz, DMSO-d6): 5 10,38 (s, br, IH, NH-1), 7,52 (d, J = 9 Hz, 2H),
7,23 (d, J = 7,3 Hz, IH, H-4), 7,14 (dd,J = 1,38, 7,3 Hz, IH, H-5), 7,0 (d, J = 9 Hz, 2H), 6,96 (d, J = 1,38 Hz, IH, H-7), 3,78 (s, 3H, OCH3), 3,47 (s, 2H, CH2); MS m/z (relativ intensitet, %) 214,0 ([M+l]+, 100).
4-(2-karboksyetyl)-2-formyl-3-metylpyrrol (90,5 mg), 120 mg 6-(4-metoksyfenyl)-2- oksindol og 3 dråper piperidin i 2 ml med etanol ble varmet ved 90°C over natt. Reaksjonsblandingen ble kjølt ned og konsentrert. Resten ble suspendert i 6 N
vandig saltsyre. Présipitatet ble filtrert, vasket med vann til pH 6 og tørket i en vakuumovn over natt for å gi 118 mg (59 %) av tittelforbindelsen som et brunt fast stoff. •
'HNMR (360 MHz, DMSO-d6): 8 13,26 (s, br, IH, NH-1'), 10,83 (s, br, IH, NH-
1), 7,78 (d, J = S,07 Hz, IH, H-4), 7,61 (s, IH, H-vinyl), 7,56 (d, J = 8,97 Hz, 2H),
7,22 (dd, J = 1,44, 8,07 Hz, IH, H-5), 7,13 (d, J = 3,09 Hz, IH, H-2'), 7,04 (d, J = 1,44 Hz, IH, H-7), 7,0 (d, J = 8,97 Hz, 2H), 3,79 (s, 3H, OCH3), 2,65 (t, J = 7,54
Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2,44 (t, J = 7,54 Hz, 2H, CH2CH2COOH), og 2,27' (s, 3H, CH3; MS m/z (relativ intensitet, %) 404 ([M+l]<+>, 100).
Eksempel 35 3- {5-[6-(4-metoksy-fenyl)-2-okso-l,2-dihydroiondol-3-ylidenmetyl]-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-yl}-propionsyre
3-(2-karboksyetyl)-2,4-dimety]-5-formylpyrrol (98 mg), 120mg6-(4-metoksyfenyl)-2-oksindol og 3 dråper piperidin i 2 ml etanol ble varmet ved 90°C . over natt. Reaksjonsblandingen ble kjølt ned og konsentrert. Resten ble suspendert i 6 N vandig saltsyre. Présipitatet ble filtrert, vasket med vann til pH 6 og tørket i en vakuumovn over natt for å gi 118 mg (57 %) av tittelforbindelsen som et brunt fast stoff.
'HNMR (360 MHz, DMSO-d6): 5 13,35 (s, br, 1H, NH-1'), 12,02 (s, br, IH,
COOH), 10,75 (s, br, IH, NH-l), 7,73 (d, J = 6,75 Hz, IH, H-4), 7,56 (d, J = 9,01
Hz, 2H), 7,54 (s, IH, H-vinyl), 7,21 (dd, J = 1,59, 6,75 Hz, IH, H-5), 7,04 (d, J =
1,59 Hz, IH, H-7), 7,01 (d, J = 9,01. Hz, 2H), 3,79 (s, 3H, OCH3), 2,65 (t, J = 7,54 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2,35 (t, J = 7,54 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2,29 (s, 3H,
CH3), og 2,26 (s, 3H, CH3); MS m/z (relativ intensitet, %) 417 ([M+l]\ 100).
Eksempel 36
3-{5-[6-(2-metoksy-fenyl)-2-okso-l,2-dihydroindol-3-ylidénmetyl]-4-metyl-lH-pyrrol-3-yl}-propionsyre
Tetrakis(trifenylfosfin)palladium (I g) ble tilsatt til en bIlanding med 5 g med 2-
. metoksyfenylborsyre, 6,6 g 5-brom-2-fluornitrobenzen og 30 ml 2M natriumkarbonatløsning i 50 ml toluen og 50 ml etanol. Blandingen ble tilbakestrømmet i 2 timer, konsentrert og resten ekstrahert to ganger med etylacetat. De kombinerte etylacetatlagene ble vasket med vann og saltløsning, tørket, og konsentrert for å gi en mørk grønn olje som ble fast når den stod, for å gi rå 4-fluor-2Vmetoksy-3-nitrobifenyl.
Dimetylmalonat (14 ml) ble tilsatt dråpevis til 2,9 g natriumhydrid suspendert i 50 ml dimetylsulfoksid. Blandingen ble varmet ved 100°C i 15 min; og kjølt ned til romtemperatur.
Rå 4-fluor-2'-metoksy-3-nitrobifenyI i 60 ml med dimetylsulfoksid ble tilsatt, og blandingen ble varmet ved 100°C i 2 timer. Reaksjonsblandingen ble kjølt ned og undertrykket med 300 ml med mettet ammoniumkloridløsning og ekstrahert to ganger med etylacetat. Ekstraktene ble kombinert, vasket med mettet ammoniumklorid, vann og saltløsning, tørket over vannfri natriumsulfat og . konsentrert for å gi rå dimetyl 2'-metoksy-3-nitrobifenyl-4-malonat som en gul olje.
Rå 2'-metoksy-3-nitrobifenyl-4-malonat ble varmet ved 10.0°C i 50 ml 6 N saltsyre
. i 24 timer og kjølt ned. Présipitatet ble samlet ved filtrering, vasket med vann og heksan, og tørket for å gi 9,8 med 2'-metoksy-2-nitrobifenyl-4-eddiksyre som et lyst farget fast stoff...
Jernspon (5 g) ble tilsatt i én porsjon til 9,8 g 2'-metoksy-3-nitrobifenyl-4-eddiksyre i 50 ml med iseddik, og blandingen ble vannet til 100°C i 3 timer. Reaksjonsblandingen ble konsentrert til tørrhet, sonikert i etylacetat og filtrert for å fjerne uløseligheter. Filtratet ble vasket to ganger med 1 N saltsyre, vann og saltløsning, tørket over vannfri natriumsulfat og konsentrert. Resten ble . kromatografert på silikagel ved å benytte etylacetat:heksan 1:2 for å gi 5,4 g (69 utbytte basert på 5-brom-2-fluornitrobenzen) med 6-(2-metoksyfenyl)-2-oksindol som et rosa farget fast stoff.
'HNMR (360 MHz, DMSO-d6): 6 10,32 (s, br, IH, NH), 7,29-7,34 (m, IH), 7,19-7,25 (m, 2H), 7,08 (d, J = 8 Hz, IH, H-4), 6,97-7,02 (m, 2H), 6,91 (d, J = 1,05 Hz, IH, H-7), 3,8 (s, 3H, OCH3), 3,47 (s, 2H, CH2); MS m/z (relativ intensitet, %) 239,8 (100, [M+l]<+>).
4-(2-karboksyetyl)-2-formyl-3-metylpyiTol (217 mg), 239 mg 6-(2-metoksyfenyl)-2-oksindol og 3 dråper piperidin i 2 ml med etanol ble varmet ved 90°C over natt. Reaksjonsblandingen ble kjølt ned og konsentrert. Resten ble suspendert i 6 N vandig saltsyre. Présipitatet ble filtrert, vasket med vann til pH 6 og tørket i en
vakuumovn over natt for å gi 348 mg (86 %) av tittelforbindelsen som et brunt fast stoff.
'HNMR (360 MHz,.DMSO-d6): 5 13,29 (s, br, IH, NH-1'), 11,59 (s, br, IH,
COOH), 10,78 (s, br, IH, NH-1), 7,75 (d, J = 8,13 Hz, IH, H-4), 7,62 (s, IH, H-'
vinyl), 7,0-7,34 (m, 7H), 3,76 (s, 3H, OCH3), 2,66 (t, J = 7,46 Hz, 2H,
CH2CH2COOH), 2,46 (t, J = 7,46 Hz, 2H, CH2CH2COOH), og 2,27 (s, 3H, CH3);
MS m/z (relativ intensitet, %) 401 ([M+l]<+>, 100).
Eksempel 37
3-{5-[6-(2-metoksy-fenyl)-2-okso-l,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl]-2,4-dimetyl-1 H-pyrroI-3-yl}-propionsyre 3-(2-karboksyetyl)-2,4-dimetyl-5-formylpyrror(234 mg), 239 mg 6-(2-metoksyfenyl)-2-oksindol og 3 dråper piperidin i 2.ml med etanol ble varmet ved 90°C over natt. Reaksjonsblandingen ble kjølt ned og konsentrert. Resten ble suspendert i 6 N vandig saltsyre. Présipitatet ble filtrert, vasket med vann til pH 6
og tørket i en vakuumovn over natt.
►
Det rå faste stoffet ble renset ved kromatografi på silikagelkolonne, eluert med etylacetat:heksan 1:1 som inneholdt 0,1 % eddiksyre for å gi 182 mg (44 %) av tittelforbindelsen som et brunt fast stoff.
'HNMR (360 MHz, DMSO-d6): 5 13,38 (s, br, IH, NH-1'), 12,0 (s, br, IH,
COOH), 10,7 (s, br, IH, NH.l), 7,71 (d, J = 7,74 Hz, IH, H-4), 7,55 (s, IH, H-
vinyl), 7,0-7,33 (m, 6H), 3,76 (s, 3H, OCH3), 2,65 (t, J = 7,6 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2,35 (t, J = 7,6 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2,3 (s, 3H, CH3), og 2,26 (s, 3H, CH3); MS (APCI neg) m/z (relativ intensitet, %) 415 ([M-l], 100).
Eksempel 38 3-[2,4-dimetyl-5-(6-morfolin-4-yl-2-okso-l,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-lH-pyrrol-3 -yl] -propionsyre
Tinnkloriddihydrat (225 g) ble tilsatt til en løsning med 2,4-dinitrofenyleddiksyre
(22,6 g) i etanol (450 ml). Blandingen ble varmet ved 90°C i 10 timer. Reaksjonsblandingen. ble kjølt ned og gjort basisk til pH 11 med 12M natriumhydroksid. De faste stoffene ble fjernet ved filtrering, og filtratet konsentrert. Resten ble behandlet med etanol (300 ml). Uløselighetene ble filtrert og vasket med etanol (5 x 60 ml). De kombinerte etanolvaskene ble fordampet og tørket under vakuum for å gi 15 g med 6-amino-2-oksindol som et brunt pulver.
'HNMR (360 MHz, DMSO-d6): 6 10,03 (s, br, NH), 6,78 (d, J = 8,55 Hz, IH, H-
4), 6,09-6,11 (m, 2H), 4,95 (s, br, 2H, NH2), 3,22 (s, 2H, H-3); MS (+APCI) m/z.
(relativ intensitet, %) 147 ([M-1 f, 100).
6-amino-2-oksindol (2,2 g), 4,0 g 2,2'-dibrometyleter og 7,9 g natriumkarbonat ble tilbakestrømmet over natt i 20 ml metanol, konsentrert og fortynnet med 50 ml med vann. Blandingen ble ekstrahert tre ganger med 50 ml etylacetat, de organiske ekstraktene ble kombinert, vasket med 20 ml saltløsning, tørket over vannfri natriumsulfat og konsentrert til tørrhet. Det faste stoffet ble kromatografert på én . kolonne med silikagel som eluerte med etylacetat:heksan 1:1 som inneholdt 0,7 % eddiksyre for å gi 1,2 g (37 % utbytte) med 6-morfolin-4-yl)-2-oksindol som et beige fast stoff.
'HNMR (360 MHz, DMSO-d6): 8 10,2 (s, br, IH, NH-1), 7,02 (d, J = 7,87 Hz, IH, H-4), 6,47 (dd, J = 2,11, 7,87 Hz, IH, H-5), 6,37 (d, J = 2,11 Hz, IH, H-7), 3,69-3,72 (m, 4H), 3,32 (s, 2H, CH2), 3,01-3,04 (m, 4H); MS m/z (relativ intensitet, %) 219 ([M+l]<+>, 100).
3-(2-karboksyetyl)-2,4-dimetyl-5-formylpyrrol (3,3 g), 4 g 6-(morfolin-4-yl)-2-oksindol og 1,8 ml piperidin i 60 ml med etanol ble varmet ved 90°C i 7 timer. Reaksjonsblandingen ble kjølt ned og konsentrert. Resten ble suspendert i 6 N . vandig saltsyre. Présipitatet ble filtrert, vasket med vann til pH 6 og tørket i en vakuumovn over natt. Det resulterende faste stoffet ble renset ved kromatografi på silikagelkolonne, eluert med etylacetat-heksan-eddiksyre for å gi 2,78 g (38 % utbytte) av tittelforbindelsen som et brunt fast stoff.
'HNMR (360 MHz, DMSO-d6): 8 13,13 (s, br, IH, NH-1<*>), 12,02 (s, br, IH, COOH), 10,57 (s, br, IH, NH-1), 7,52 (d, J = 8,46 Hz, IH, H-4), 7,32 (s, IH, H-vinyl), 6;58 (ddm J = 1,99, 8,46 Hz; IH, H-5), 6,41 (d, J = 1,99 Hz, IH, H-7), 3,71-3,74 (m, 4H), 3,06-3,09 (m, 4H), 2,62 (t, J = 7,57 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2,33 (t, J = 7,57 Hz, 2H; CH2CH2COOH), 2,26 (s, 3H, CH3), og 2,21 (sm 3H,
CH3); MS m/z (relativ intensitet; %) 396 ([M+l]<+>, 100).
i
Eksempel 39
3-[5-(5-klor-4-metyl-2-okso-1,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-2,4-dimetyl-1H-pyrrol-3-yl]-propionsyre
En suspensjon med 3,0 g 4-metyl-2-oksindol ble rørt i 50 ml acetonitril ved romtemperatur, mens 3,3 g med N-klor-suceinimid ble tilsatt i porsjoner. Trifluoreddiksyre (1 ml) ble deretter tilsatt. Suspensjonen ble rørt ved romtemperatur i 3 dager, der det alltid var faste stoffer tilstede. Det hvite faste stoffet ble samlet ved vakuumfiltrering, vasket med en liten mengde kald aceton og tørket over natt i en vakuumovn ved 40°C for å gi 2,5 g (68 %) med 5-klor-4-m ety 1-2-oksi ndo 1-
'HNMR (360 MHz, DMSO-d6): 8 10,38 (s, br, IH, NH), 7,19 (d, J = 8 Hz, lH, aromatisk), 6,64 (d, J = 8 Hz, IH, aromatisk), 3,46 (s, 2H, H-3), 2,19 (s, 3H, CH3).
I
3-(2-karboksyetyl)-2,4-dimetyl-5-formylpyrrol (98 mg), 91 mg 5-klor-4-metyl-2-oksindol og 2 dråper piperidin i 2 ml med etanol ble varmet ved 90°C i 4 timer. Reaksjonsblandingen ble kjølt ned og konsentrert. Resten ble suspendert i 6 N
vandig saltsyre. Présipitatet ble filtrert, vasket med vann til pH 6 og tørket i en vakuumovn over natt for å gi 100 mg med tittelforbindelsen.
<J>HNMR (360 MHz, DMSO-d6): 8 13,47 (s, br, IH, NH-1'), 12,03 (s, br, IH,
COOH), 10,83 (s, br, IH, NH-1), 7,61 (s, IH, H-vinyl), 7,14 (d, J = 8,17 Hz, IH, aromatisk), 6,74 (d, J = 8,17 Hz, IH, aromatisk), 2,64 (s, 3H, CH3), 2,64 (t, J =
7,62 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2,34 (t, J = 7,62 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2,3 (s, .
3H, CH3), og 2,20 (s, 3H, CH3)..
Eksempel 40
3- [5-(5-klor-4-metyl-2-okso-I,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-4-metyl-lH-pyrrol-3-yl]-propionsyre
4- (2-karboksyetyl)-2-formyl-3-metylpyrrol (91 mg), 91 mg 5-klor-4-metyl-2-
oksindol og 2 dråper piperidin i 2 ml med etanol ble varmet ved 90°C i 4 timer. Reaksjonsblandingen ble kjølt ned og konsentrert. Resten ble suspendert i 6 N
vandig saltsyre. Présipitatet ble filtrert, vasket med vann til pH 6 og tørket i en vakuumovn over hatt for å gi 95 mg med tittelforbindelsen.
<]>HNMR (360 MHz, DMSO-d6): 8.13,36 (s, br, IH, NHr 1'), 11,98 (s, br, IH,. COOH), 10,92 (s, br, IH, NH-1), 7,68 (s, IH), 7,19 (d, J = 7,14 Hz, IH,
aromatisk), 7,17 (s, IH), 6,75 (d, J = 7,14 Hz, IH, aromatisk), 2,66 (s, 3H, CH3-4)," 2,66 (t, J = 7,51 Hz, 2H, .CH2CH2COOH), 2,45 (t, J = 7,51 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2,21 (s, 3H, CH3); MS m/z (relativ intensitet, %) 345 ([M+l]<+>, 100).
Eksempel 41
3-[2,4-dimetyl-5-(2-okso-l ,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-lH-pyrrol-3-yl]-propionsyre, natriumsalt
En suspensjon med 8 g med 3-[2,4-dimetyl-5-(2-okso-l,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-lH-pyrrol-3-yl] .propionsyre i 60 ml med vann ble tilsatt til 0,98 g med natriumhydroksid i 10 ml med vann. Blandingen ble rørt ved romtemperatur i 30 min. og filtrert. Filtratet ble frosset og lyofilisert for å gi 8 g med tittelforbindelsen.
Alternativt ble en suspensjon med 117 g med 318-005 i 470 ml med vann tilsatt til 16,47 g med natriumhydroksid i 74 ml vann. Blandingen ble rørt ved romtemperatur i 15 min. og filtrert: Filtratet ble tilsatt til 210 ml med etanol og det resulterende présipitatet som ble dannet ble samlet ved sugfiltrering. Etter tørking I var det oppnådd totalt 106 g av tittelforbindelsen.
'HNMR (360 MHz, DMSO-d6): 8 13,34 (s, br, IH, NH-1'), 10,82 (s, br, IH, NH-1), 7,65 (d, J = 7,52 Hz, IH, H-4), 7,5 (s, IH, H-vinyl), 7,04 (t, J = 7,52 Hz, IH, H-6), 6,93 (t, J = 7,52 Hz, IH, H-5), 6,85 (d, J = 7,52 Hz, IH, H-7), 2,55 (t, J = 6,95 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2,28 (s, 3H, CH3), 2,24 (s, 3H, CH3) og 1,99 (t, J = 6,95 Hz, 2H, CH2CH2COOH).
Eksempel 42
3-[3,5-dimetyl-4-(3 -morfolin-4-ylpropyl)-1 H-pyrrol-2-ylmetylen]-1,3-dihydroindol-2-on
Trinn 1: Til en suspensjon med 3-(2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-yl)-propionsyre (10 g, 60,8 mmol) i 60 ml med diklormetan, ble det tilsatt 1, T-karbonyldiimidazol (11,6 g, 71,8 mmol) etterfulgt av morfolin (5,5 ml, 60,8 mmol) og N,N-diisopropyletylamin (Hunigs base, 10 ml, 60,8 mmol). Den mørke røde reaksjonsblandingen ble rørt ved romtemperatur over natt og helt over i isvann. Det organiske laget ble vasket med saltløsning inntil vasken hadde en pH på omkring 6, tørket over vannfri natriumsulfat og konsentrert. Råproduktet ble renset på en silikagelkolonne og eluert med diklormetan-metanol (98:2) for å gi 13,84 g (96 %) med 3-(2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-yl)-l-morfolin-4-yl-propan-l-on.
Trinn 2: Til en suspensjon med litiumaluminiumhydrid (2,67 g, 70 mmol) i
tetrahydrofuran (100 ml) ble det tilsatt dråpevis en løsning med 3-(2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-yl)-l-morfolin-4-yi-propan-l-on (13,84 g, 59 mmol) i tetrahydrofuran (50 . ml). Reaksjonsblandingen ble rørt ved 80°C i 1 time og kjølt det på et isbad. Is ble tilsatt til reaksjonsblandingen sakte, inntil gassutviklingen opphørte. Noen fa
dråper med 2N natriumhydroksid ble tilsatt, og reaksjonsblandingen ble rørt ved romtemperatur i 30 min. Reaksjonsblandingen ble deretter ekstrahert med etylacetat, tørket over vannfi rnatriumsulfat og konsentrert for å gi-10,37 g (79 %) méd 4-[3-(2,4-dimetyl-1 H-pyrrol-3-yl)-propyl]-morfolin som en lysebrun olje, som ble benyttet uten ytterligere rensing.
Trinn 3: Til en iskald løsning med N,N-dimetylformamid (5,5 ml, 70 mmol) i diklormetan (30 ml) ble det dråpevis tilsatt fosforoksyklorid (6,5 ml, 70 mmol). Når tilsetningen var fullstendig ble reaksjonsblandingen rørt ved romtemperatur i 15 min., hvoretter en løsning med 3,5-dimetyl-4-(3-morfolin-4-yl-propyl)-lH-pyrrol-2-karboksyaldehyd (10,37 g, 46,6 mmol) i diklormetan (20 ml) ble tilsatt dråpevis ved 0°C. Den endelige reaksjonsblandingen ble tilbakestrømmet ved 60°C i 4 timer, og deretter kjølt ned på et isbad. Is ble sakte tilsatt til reaksjonsblandingen, etterfulgt av tilsetningen av 2 N natriumhydroksid inntil pH 12 ble nådd. Reaksjonsblandingen ble rørt ved romtemperatur i 30 min, og deretter ekstrahert med etylacetat. Det organiske laget ble vasket med saltløsning, tørket over vannfri natriumsulfat og konsentrert for å gi råproduktet som ble renset på silikagelkolonne, eluert med diklormetan-metanol-ammoniumhydroksid (9,5:0;5) .
I
for å gi 4,57 g (39 %) med 3,5-dimetyl-4-(3-morfolin-4-yl-propyl)-lH-pyrrol-2-karbaldehyd som en mørk rød olje: 'HNMR (360 MHz, DMSO-d6) 5 11,34 (s, br, IH, NH-1), 9,40 (s, IH, CHO-2), 3,55 (t, J = 4,68 Hz, 4H, 0(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4), 2,28-2,34 (m, 5H, 0(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4), 2,21 (t, 2H, J = 7,10 Hz, 2H,
0(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4) CH3-3), 2,19 (s, 3H, CH3-5), 2,14 (s, 3H, CH3-3), 1,51 (quint, J = 7,10 Hz, 2H, 0(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4),
MS m/z (relativ intensitet, %) 251 ([M+l]+, 100).
Trinn 4: En blanding med l,3-dihydroindol-2-on (133 mg, 1,0 mmol), 3,5-dimetyl-4- (3-morfolin-4-yl-propyl)-lH-pyrrol-2-karboksaldehyd (250 mg, 1,0 mmol) og 3 . dråper pyrrolidin i 2,0 ml med etanol ble tilbakestrømmet ved 90°C i 4 timer, og deretter kjølt ned til romtemperatur. Présipitatet ble filtrert, vasket med kald etanol og heksan, og tørket i en vakuumovn over natt for å gi 308,9 mg (85 %) med 3-[3,5-dimetyl-4-(3-morfolin'-4-yl-propyl)-lH-pyTrol-2-ylmetylen]-l,3-dihydroindol-2-on som et gult fast stoff:.
'HNMR (300 MHz, DMSO-d6) 8 13,37 (s, lH-NH-1'), 10,71 (s, IH, NH-1), 7,68 (d, J = 7,47 Hz, IH, H-4), 7,53 (s, IH, H-vinyl), 7,06 (dt, J = 7,47 Hz, IH, H-6), 6,94 (dt, J = 7,74 Hz, IH, H-5), 6,84 (d, J = 7,47 Hz, IH, H-7), 3,55 (t, J = 4,37
Hz, 4H, 0(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4'), 2,40 (t, J = 7,31 Hz, 2H, 0(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4')J 2,31 (t, J = 4,37 Hz, 4H,
OfCH^H^NCHiC^C^^'), 2,28 (s, 3H, CH3-3'), 2,23 (s, 3H, CH3-5'), 2,23 (t, J = 7,31 Hz, 2H, 0(CH2CH2)NCH2CH2CH2-4'), 1,56 (quint, J = 7,31 Hz, 2H, 0(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4'),
MS m/e (relativ intensitet, % ) 365 (M<+>, 100).
Eksempel 43 5- brom-3-[3,5-dimetyl-4-(3-morfolin-4-yl-prppyl)-1 H-pyrrol-2-ylmetylen]-1,3-dihydroindol-2-bn En blanding med 5-brom-l,3-dihydroindol-2-on (212 mg, 1,0 mmol), 3,5-dimetyl-4-(3-morfolin-4-yl-propyl)-lH-pyrrol-2-karbaldehyd (250 mg, 1,0 mmol) og 3
dråper pyrrolidin i 2,0 ml med etanol ble tilbakestrømmet ved 90°C i 4 timer, og
=■ deretter kjølt ned til romtemperatur. Présipitatet ble filtrert, vasket med kald etanol og heksan og tørket i en vakuumovn over natt i 399,8 mg (90 %) med 5-brom-3-[3,5-dimetyl-4-(3-morfolin-4-yl-propyl)-lH-pyrrol-2-ylmetylen]-l,3-dihydroindol-2-on som et rødt fast stoff: r
'•HNMR (300 MHz, DMSO-d6) 8 13,43 (s, IH, NH-1'), 10,81 (s, IH, NH-1), 7,99 (d, J = 2,07 Hz, IH, H-4), 7,66 (s, IH, H-vinyl), 7,18 (dd, J = 2,07, 7,58 Hz, IH, . H-6), 6,79 (d, J = 7,58 Hz, IH, H-7), 3,55 (t, J = 4,39 Hz, 4H,
0(CHjCH2)2NCH2CH2CH2-4'), 2,40 (t, J = 7,32 Hz, 2H,
0(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4'),;2,31 (t, J = 4,39 Hz, 4H,
0(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4'), 2,29 (s, 3H, CH3-3'), 2,26 (s, 3H, CH3-5'), 2,23 (t, J = 7,32 Hz, 2H, 0(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4'), 1,56 (quint., J = 7,32 Hz, 2H, 0(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4'),
MS m/e (relativ intensitet, %) 443 (M\ 100), 445 ([M+2]<+>, 100).
Eksempel 44
3-[3,5-dimetyl-4-(3-morfolin-4-yl-propyl)-lH-pyrrol-2-ylmetyleni-6-fenyl-l,3-dihydroindol-2-on
Ved å benytte prosedyren i eksempel 2, ble 88 % utbytte med tittelforbindelsen oppnådd som et gult fast stoff: 'HNMR (300 MHz, DMSO-d6) 5 13,37 (s, IH, NH-1'), 10,81 (s, IH, NH-1), 7,77 (d, J = 8,20 Hz, IH, H-4), 7,62 (d, J 7,39 Hz, 2H, H-2", 6"), 7,58 (s, IH, H-. vinyl), 7,44 (t, J = 7,39 Hz, 2H, H-3", 5"), 7,32 (t, br, J = 7,39 Hz, IH, H-4"), 7,26 (dd, J = 1,49, 8,29 Hz, IH, H-5), 7,09 (d, J = 1,49 Hz, IH, H-7), 3,56 (t, J = 4,48 Hz, 4H, 0(CHjCH2)2NCH2CH2CH2-4'), 2,41 (t, J = 7,18 Hz, 2H, 0(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4'), 2,31 (t, J = 4,48 Hz, 4H,
0(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4'), 2,29 (s, 3H, CH3-3'), 2,26 (s, 3H, CH3-5'), 2,24 (t, J = 7,18 Hz, 2H, 0(CH2CH2)2NCHjCH2CH2-4'), 1,56 (quint., J = 7,18 Hz, 2H, 0(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4'j,
MS m/e (relativ intensitet, %) 441 (M<+>, 100).
Eksempel 45
3-[3,5-dimetyl-4-(3-morfolin-4-yl-propyl)-lH-pyrrol-2-ylmetylen]-6-(2-metoksyfenyl)-1,3-dihydroindoI-2-on Ved å benytte fremgangsmåten i eksempel 2, ble 86 % utbytte av tittelforbindelsen oppnådd som et gult fast stoff:
'HNMR (300 MHz, DMSO-d6) 5 13,37 (s, 1H,NH-1'), 10,72 (s, IH, NH-1), 7,71 (d, J = 7,79 Hz, IH, H-4), 7,55 (s, IH, H-vinyl), 7,27-7,34 (m, 2H), 6,98-7,10 (m, .4H), 3,76 (s, 3H, OCH3-2"), 3,56 (t, J = 4,50 Hz, 4H, 0(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4'), 2,41 (t, J = 7,12 Hz, 2H, 0(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4'), 2,21-2,31 (m, 6H, 0(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4<i>), 2,29 (s, 3H, CH3-3'), 2,25 (s, 3H, CH3-5'), 1,57 (quint.,. J = 7,12 Hz, 2H, 0(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4'),
MS m/e (relativ intensitet, %) 471 (M<+>, 100).
Eksempel 46
3-[3,5-dimetyl-4-(3-morfolin-4-yl-propyl)-lH-pyrrol-2-ylmetylen]-6-(3-m eto ksyfenyl) -1,3 -dihydro indol -2 -on
I
Ved å benytte fremgangsImåten i eksempel 2, ble 87 % utbytte av tittelforbindelsen oppnådd som et gult fast stbff:
'HNMR (300 MHz, DMSO-d6) 5 13,38 (s, IH, NH-1'), 10,80 (s, IH, NH-1), 7,76
(d, J = 7,93 Hz, IH, H-4), 7,57 (s, IH, H-vinyl), 7,35 (t, J = 8,08 Hz,'lH, H-5"), 7,26 (dd, J = 1,73, 7,93 Hz, IH, H-5), 7,18 (d, br, J = 8,08 Hz, IH, H-4"), 7,13 (t, br, J = 1,94 Hz, IH, H-2"), 7,08 (d, J = 1,73 Hz, IH, H-7), 6,90 (dd, J = 1;94, 8,08 Hz, IH, H-6"), 3,81 (s, 3H, OCH3-3"), 3,56.(t, J = 4,38 Hz, 4H, 0(CHj,CH2)2NCH2CH2CH2-4'), 2,41 (t, J = 7,19 Hz, 2H, ©(CHjCH^NCHzCH^Hj^'), 2,31 (t,J = 4,38 Hz, 4H, 0(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4'), 2,29 (s, 3H, CH3-3'), 2,26 (s, 3H, CH3-5'), 2,24 (t,
J = 7,19 Hz, 2H, 0(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4'), 1,56 (quint., J 7,19 Hz, 2H, 0(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4'),
MS m/e (relativ intensitét,%) 471 (M<+>, 100).
Eksempel 47
3-[3,5-dimetyl-4-(3-morfolin-4-yl-propyl)-lH-pyrrol-2-ylmetylen]-6-(4-metoksyfenyl)-l,3-dihydroindoi-2-on Ved å benytte fremgangsmåten i eksempel 2, ble 52 % utbytte av tittelforbindelsen oppnådd som et gult fast stoff.
'HNMR (300 MHz, DMSO-d6) 8 13,35 (s, IH, NH-1'), 10,77 (s, IH, NH-1); 7,72 (d, J = 7,97 Hz, IH, H-4), 7,55 (d, J = 8,57 Hz, 2H, H-2",6"), 7,54 (s, IH, H-vinyl), 7,20.(dd, J = 1,35, 7,97 Hz,"lH, H-5), 7,04 (d, J = 1,35 Hz, IH, H-7), 6,99
(d, J = 8,57 Hz, IH, H-3",5"), 3,78 (s, 3H, OCH3-4"), 3,55 (t, J = 4,57 Hz, 4H, ..0(CH^CH2)2NCH2CH2CH2-4'), 2,40 (t, J = 6,97 Hz, 2H,
0(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4'), 2,30 (t, J = 4,57 Hz, 4H,
0(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4'), 2,28 (s, 3H, CH3-3'), 2,24 (s, 3H, CH35'), 2,23 (t,
J = 6,97 Hz, 2H, 0(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4'), 1,55 (quint., J = 6,97 Hz, 2H, 0(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4'),
MS m/e (relativ intensitet, %) 471 (M<+>,' 100).
Eksempel 48
3-[4-(3-dimetylaminopropyl)-3,5-dimetyl-1 H-pyrrol-2-ylmetylen-1,3-dihydroindol-2-on Ved å benytte trinnene 1, 2 og 3 i eksempel 1, ble 63 % utbytte av 4-(3-dimetylaminopropyl)-3,5-dimetyl-lH-pyrrol-2-karboksaldehyd som en mørk rød olje oppnådd:
'HNMR (360 MHz, DMSO-d6) 8 11,33 (s,br, IH, NH-1), 9,40 (s, IH, CHO-2),
2,30 (t, J = 7,42 Hz, 2H, (CH3)2NCH2CH2CH2-4), 2,18 (s, 3H, CH3-3), 2,15 (t, J = 7,42 Hz, 2H, (CH3)2NCH2CH2CH2-4), 2,14 (s, 3H, CH3-5), 2,10 (s, 6H, '
(CH3)2NCH2CH2CH2-4), 1,47 (quint., J = 7,42 Hz, 2H, (CH3)2NCH2CH2CH2-4),
MS m/z (relativ intensitet, %) 208 ([M+l]<+>, 100).
Ved å benytte trinn 4 ieksempel 1, ble 52 % utbytte av tittelforbindelsen oppnådd
som et gult fast stoff:
'HNMR (360 MHz, DMSO-d6) 8 13,38 (s, IH, NH-1'), 10,70 (s, IH, NH-1), 7,68
(d, J = 7,54 Hz, IH, H-4), 7,53 (s, IH, H-vinyl), 7,06 (t, ) = 7,54 Hz, IH, H-6),
6,94 (t, J = 7,54 Hz, IH, H-5), 6,85 (d, J = 7,54 Hz, IH, H-7), 2,38 (t, J = 7,25 Hz, 2H (CH3)2 NCH2CH2CH2-4'), 2,27 (s, 3H, CH3-3'), 2,23 (s, 3H, CH3-5'), 2,17 (t, J = 7,25 Hz, 2H (CH3)2NCH^CH2CH2-4'), 2,11 (s, 6H, (CH3)2NCH2CH2CH2-4'),
1,52 (quint., J = 7,25 Hz, 2H, (CH3)2NCH2CH2CH2-4')S
MS m/z (relativ intensitet, %) 323 (M<+>, 100)..
Eksempel 49
5-brom-3-[4-(3-dimetylaminopropyl)-3;5-dimetyl-lH-pyrrol-2-ylmetylen]-l,3-dihydroindol-2-on Ved å benytte fremgangmsåten i eksempel 2, ble 71 % utbytte av tittelforbindelsen oppnådd som et rødt fast stoff:
'HNMR.(360 MHz, DMSO-d6) 8 13,42 (s, IH, NH-1'), 10.81 (s, IH, NH-1), 7,98
(d, J = 1,89 Hz, IH, H-4); 7,66 (s, IH, H-vinyl), 7,17 (dd, J = 1,89, 8,23 Hz, IH,
H-6), 6,79 (d, J = 8,23 Hz, IH, H-7), 2,38 (t, J = 7,23 Hz, 2H,
(CH3)2NCH2CH2CH2-4'), 2,27 (s, 3H, CH3-3'), 2,25 (s, 3H, CH3-5'), 2,16 (t, J =
7,23 Hz, 2H, (CH3)2NCH2CH2CH2-4'), 2,10 (s, 6H, (CH3)2NCH2CH2CH2-4')) 1,51
(quint., J = 7,23 Hz, 2H, (CH^CHjCH^'),
MS m/z (relativ intensitet, %) 401 ([M-lf, 100) og 403 ([M+l]<+>, 100.
Eksempel 50
3-[4-(3-dimetylaminopropyl)-3,5-dimetyl-lH-pyrrol-2-ylmetylen]-6-fenyl-l,3-dihydroindol-2-on
Ved å benytte fremgangsmåten i eksempel 2, ble 83 % utbytte av tittelforbindelsen oppnådd som et orange fast stoff:
• t
'HNMR (360 MHz, DMSO-d6) 8 13,38 (s, IH, NH-1'), 10,81 (s, IH, NH-1), 7,77
(d, J = 7,82 Hz, IH, H-4), 7,62 (d, J = 7,59 Hz, 2H, H-2",6"), 7,58 (s, IH, H-vinyl), 7,44 (t, J = 7,59 Hz, 2H, H-3",5"), 7,32 (t, J = 7,59 Hz, IH, H-4"), 7,27
(dd, J= 1,11,7,82 Hz, IH, H-5), 7,09 (d, J = 1,11 Hz, IH, H-7), 2,39 (t, J = 7,18
Hz, 2H, (CH^NCHzCHzCHj^'), 2,29 (s, 3H, CH3-3'). 2,25 (s, 3H, CH3-5'), 2,17
(t, J = 7,18 Hz, 2H, (CH3)2NCH2CH2CH2-4'), 2,11 (s, 6H, (CH3)2NCH2CH2CH2-
4'), 1,53 (quint., J = 7,18 Hz, 2H, (CH3)2NCH2CH2CH2-4')J MS m/z (relativ intensitet, %) 399 (M<+>, 100).
Eksempel 51
3-[4-(3-dimetylaminopropyl)-3,5-dimetyl-lH-pvrrol-2-ylmetylen]-6-(2-metoksyfenyl)-l,3-dihydroindol-2-on
Ved å benytte fremgangsmåten i eksempel 2, ble 83 % utbytte av tittelforbindelsen oppnådd som et gult fast stoff: 'HNMR (360 MHz, DMSO-d6) 5 13,38 (s,'lH, NH-1'), 10,72 (s, IH, NH-1), 7,70 - . (d, J = 8,06 Hz, IH, H-4), 7,55 (s, IH, H-vinyl), 7,28-7,36 (m, 2H, H-4",5"), 7,14 (d, J = 8,32 Hz, IH, H-6"), 7,04 (dd, J = 1,21, 8,06 Hz, IH, H-5), 6,99 (d, J = 7,42 Hz, IH, H-3"), 6,99 (d, J = 1,21 Hz, IH, H-7) 3,76 (s, 3H, OCH3-2"), 2,39 (t, J 7,24 Hz, 2H, (CH3)2NCH2CH2CH2-4'), 2,28 (s, 3H, CH2-3'), 2,25 (s, 3H, CH3-5'), 2,18 (t, J = 7,24 Hz, 2H, (CH3)2NCH2CH2CH2-4'), 2,11 (s, 6H, (CH3)2NCH2CH2CH2-4,)S 1,53 (quint., J = 7,24 Hz, 2H, (CH3)2NCH2CH2CH2-4'j, MS m/z (relativ intensitet, %) 429 (M<+>, 100). Eksempel 52 3-[4-(3-dimetylaminopropyl)-3,5-dimetyl-lH-pyrroI-2-ylmetylen]-6-(3-metoksyfenyl)-l,3-dihydroindol-2-on Ved å benytte fremgangsmåten i eksempel 2, ble 83. % utbytte av tittelforbindelsen oppnådd som et rødt fast stoff: 'HNMR (360 MHz, DMSO-d6) 5 13,38 (s, IH, NH-1'), 10,80 (s, IH, NH-1), 7,60
(d, J = 8,06 Hz, 1H..H-4), 7,57 (s, IH, H-vinyl), 7,35 (t, J = 8,15 Hz, IH, H-5"), 7,26 (dd, J = 1)39, 8,06 Hz, IH, H-5), 7,19 (d, br, J = 8,15 Hz, H-6"), 7,13 (m, IH, H-2"), 7,09 (d, J = 1,39 Hz, IH, H-7), 6,90 (dd^ J = 2,57, 8,15 Hz, IH, H-4"), 3,81 .
(s, 3H, OCH3-3"), 2,39 (t, J = 7,17 Hz, 2H, (CH3)2NCH2CH2CH2-4'), 2,29 (s, 3H, CH3-3'), 2,25 (s, 3H, CH3-5'), 2,17 (t, J = 7,17 Hz, 2H, (CH^NCHjCHzCHz^*), 2,11 (s, 6H, (CH3)2NCH2CH2CH2-4'), 1,53 (quint., J = 7,17 Hz, 2H, (CH3)2NCH2CH2CH2-4'),
MS m/z (relativ intensitet, %) 429 (M<+>, 100).
Eksempel 53 3-[4-(3-dimetylaminopropyl)-3,5-dimetyl-lH-pyrrol-2-ylmetylen]-6-(4-metoksyfenyl)-l,3-dihydroindol-2-on
Ved å benytte fremgangsmåten i eksempel 2, ble 83 % utbytte av tittelforbindelsen oppnådd som et brunt fast stoff:
'HNMR (360 MHz, DMSO-d6) 5 13,35 (s, IH, NH-1'), 10,77 (s, IH, NH-1), 7,73
(d, J = 7,82 Hz, IH, H-4), 7,56 (d, J = 8,83 Hz, 2H, H-2",6"), 7,54 (s, IH, H-vinyl), 7,20 (dd, J.= 1,64, 7,82 Hz, IH, H-5), 7,04 (d, J = 1,64 Hz, H-7), 7,00 (d, J
= 8,83 Hz, 2H, H-3",5), 3,78 (s, 3H, OCH3-4"), 2,39 (t, J = 7,24 Hz, 2H, I (CH3)2NCH2CH2CH2-4'), 2,28 (s, 3H, CH3-3'), 2,25 (s, 3H, CH3-5')5 2,17 (t, J =
I
7,24 Hz, 2H, (CH3)2NCH2CH2CH2-4'), 2,11 (s, 6H (CH3)2NCH2CH2CH2-4'), 1,52 (quint., J = 7,24 Hz, 2H, (CH^NCHzCIkCHj^'),
MS m/z (relativ intensitet, %) 429 (M<+>, 100).
Eksempel 54
5- klor-3-[4-(3-dimetylaminopropyI)-3,5-dimetyl-lH-pyrrol-2-ylmetylen]-l,3-dihydroinddl-2-on
Ved å benytte fremgangsmåten i eksempel 2, ble 53 % utbytte av tittelforbindelsen oppnådd som et brunt fast stoff:
'HNMR (360 MHz, DMSO-d6) 5 13,43 (s, IH, NH-1'), 30,84 (s, IH, NH-1), 7,87
(d, J = 1,85 Hz, 1H^ H-4), 7,66 (s, IH, H-vinyl), 7,05 (dd, J = 1,85, 8,15 Hz, IH,
H-6), 6,83 (d, J = 8,15 Hz, 1H, H-7), 2,36-2,45 (m, 4H, (CH^NCHjiC^CH^'),
2,30 (s, 6H, (CHj)2NCH2eH2CH2-4'), 2,28 (s, 3H, CH3-3'), 2,26 (s, 3H, CH3-5'),
1,58 (quint., J = 7,52 Hz, 2H, (CH3)2NCH2CH2CH2-4'),
MS m/z (relativ intensitet, %) 357 ([M-l f, 100).
Eksempel 55
6- klor-3-[4-(3-dimetylaminopropyl)-3,5-dimetyl-lH-pyrr61-2-ylmetylen]-l,3-dihydroindo 1-2-on
Ved å benytte fremgangsmåten i eksempel 2, ble 77 % utbytte av tittelforbindelsen oppnådd:
MS EI 357 [M-l)+.
Eksempel 56
3-[4-(3-dimetylaminopropyl)-3,5-dimetyl-lH-pyrfol-2-ylmetylen]-5-metoksy-l,3-dihydroindol-2-on
Ved å benytte fremgangsmåten' i eksempel 2, ble 77 % utbytte av tittelforbindelsen oppnådd:
MS EI 353 [M]+.
Eksempel 57
3-[4-(3-dimetylaminopropyl)-3,5-dimetyl-lH-pyrrol-2-ylmetylen]-6-metoksy-l,3-dihydroindol-2-on
Ved å benytte fremgangsmåten i eksempel 2, ble 74 utbytte av tittelforbindelsen oppnådd.
Eksempel 58
3-[4-(3-dimetylaminopropyl)-3,5-dimetyl-lH-pyrrol-2-yImetylen]-5-metyI-1,3-dihydroindol-2-on
Ved å benytte fremgangsmåten i eksempel 2, ble 45 % utbytte av tittelforbindelsen oppnådd:
MSEI 337 [M]+.
I
Eksempel 59
3-[4-(3-dimetylaminopropyl)-3^ 1,3-dihydroindol-2-on
Ved å benytte fremgangsmåten i eksempel 2, ble 99 % utbytte av tittelforbindelsen oppnådd:
'HNMR (300 MHz, DMSO-d6) 5 13,45 (s, br^ IH, NH), 10,78 (s, br, IH, NH), 7,50
.(s, IH, H-vinyl), 6,98 (t, J = 8,1 Hz, IH, H-6), 6,76 (t, J = 8,1 Hz,.2H, H-5 & H-7), 2,88 (m, 2H, CH2), 2,64 (s, 6H, 2xCH3), 2,56 (s, 3H, CH3), 2,43 (t, J = 7,4 Hz, 2H, CH2), 2,29 (s, 3H, CH3), 2,19 (s, 3H, CH3), 1,65-1,75 (m, 2H, CH2),
MS EI 337 [Mf.
Eksempel 60
3-[4-(3-dimetylaminopropyl)-3,5-dimetyl-lH-pyrrol<:>2-ylmetylen]-4-(2-hydroksy-etyl)-l ,3-dihydroindoI-2-on Ved å benytte fremgangsmåten i eksempel 2, ble 98 % utbytte av tittelforbindelsen oppnådd. '
Eksempel 61
3-[4-(3-dimetylaminopropyl)-r3,5-dimetyl-lH-pyrrol-2-ylmetylen]-2-okso-2,3-dihydro-1 H-indol-5-svovelsyreamid
Ved å benytte fremgangsmåten i eksempel 2, ble 59 % utbytte av tittelforbindelsen oppnådd:
'HNMR (300 MHz, DMSO-d6) 5 13,41 (s, IH, NH-1'), 11,12 (s, IH, NH-1), 8,16
(d, J =1,78 Hz, IH, H-4), 7,66 (s, IH, H-vinyl), 7,-55 (dd, J = 1,78, 8,18 Hz, IH, H-6), 7,11 (s, br, 2H, ibNSO-5), 6,98 (d, J = 8,18 Hz, IH, H-7), 2,47-2,50 (m, 2H, (CH3)2NCH2CH2CH2-4'),'2,41 (t, J = 7,37 Hz,.2H, (CH3)2NCH2CH2CH2-4'),.2,36
(s, 6H, (CH3)2NCH2CH2CH2-4,)J 2,30 (s, 3H, CH3-3'), 2,28 (s, 3H, CH3-5'), 1,61 (quint., J = 7,37 Hz, 2H, (CH3)2NCH2CH2CH2-4').
Eksempel 62
3-[4-(3-dimetylaminopropyl)-3,5-dimetyl-lH-pyrrol-2-ylmetylen]-2-okso-2,3-dihydro-lH-indol-5-svovelsyreisopropylamid
Ved å benytte fremgangsmåten i eksempel 2, ble 64 % utbytte av tittelforbindelsen
.oppnådd:
MS EI 444 [M]<+>.
Eksempel 63
3-[4-(3-dimetylaminopropyl)-3,5-dimetyl-lH-pyrrol-2-ylmetylen]-5-(morfolin-4-sulfonyl)-l,3-dihydroindol-2-on Ved å benytte fremgangsmåten i eksempel 2 ble 90 % utbytte av tittelforbindelsen
I
oppnådd.
MS EI 472 [Mf.
Eksempel 64
3-[4-(3-dimetylaminopropyl)-3,5-dimetyl-lH-pyrrol-2-ylmetylen]-2-okso-2,3-dihydro-1 H-indoI-5-suIfonsyredimetylamid
Ved å benytte fremgangsmåten i krav 2, ble 92 % utbytte av tittelforbindelsen oppnådd:
<l>HNMR (300 MHz, DMSO-d6) 5 13,5 (s, br, IH, NH), 12,21 (s, br, IH, NH), 8,18
(d, J = 1,8 Hz, IH, H-4), 7,84 (s, IH, H-vinyl), 7,44 (dd, J = 1,8, 8,4 Hz, IH, H-6), 7,05 (d, J = 8,4 Hz, IH, H-7), 2,59 (s, 6H, 2xCH3), 2,59-2,64 (m, 2H, CH2), 2,44
(s, 6H, 2xCH3), 2,38-2,44 (m, 2H, CH2), 2,31 (s, 6H, 2xCH3), 1,59-1,69 (m, 2H, CH2),
MS EI 430 [Mf.
7. Biologisk evaluering
Det vil være åpenbart at.i en hvilken som helst gitt serie av forbindelser, kan et spekter av biologisk aktivitet oppnås. I sin nåværende foretrukne utforminger omhandler den foreliggende oppfinnelsen nye pyrrolsubstituerte 2-indolinoner som demonstrerer evnen til å modulere RTK-, CTK- og STK-aktivitet. De følgende assayene blir utførtfor å velge ut de forbindelsene som viser optimal grad av den ønskede aktiviteten.
A. Assayprosedyrer
De følgende in vitro assayene kan bli benyttet for å bestemme nivået av aktivitet og effekt av de ulike forbindelsene i den foreliggende oppfinnelsen, på én eller flere av PK'ene. Lignende assay kan konstrueres langs de samme linjene for en hvilken som helst PK ved å benytte teknikker som er vel kjent i faget.
De cellulære/katalytiske assayene beskrevet heri blir utført i et ELISA-format. Den generelle fremgangsmåten er som følger: en forbindelse blir introdusert i celler som uttrykker testkinasen, enten naturlig eller rekombinant, i en gitt tidsperjode hvoretter, dersom testkinasen er en reseptor, en ligand som er kjent for å aktivere reseptoren, blir tilsatt. Cellene blir lysert, og lysate.t blir overført til brønner på en ELISA-plate som på forhånd er belagt med et spesifikt antistoff som gjenkjenner substratet til den enzymatiske fosforyleringsreaksjonen. Ikke-substratkomponenter av cellelysater blir vasket vekk, og mengden med fosforylering på substratet blir detektert med et antistoff spesifikt gjenkjennende fosfotyrosin, sammenlignet med kontrollceller som ikke var belagt med en testforbindelse. De cellulære/biologiske assayene beskrevet heri måler mengden med DNA som dannes som en respons på aktivering av testkinasen, som er et generelt mål på en proliferativ respons. Den generelle fremgangsmåten for dette assayet er som følger: en forbindelse blir introdusert i celler som uttrykker testkinasen, enten naturlig eller rekombinant, i en gitt tidsperjode hvoretter, dersom testkinasen er en reseptor, en ligand som er kjent for å aktivere reseptoren blir tilsatt. Etter inkubering minst over natt, tilsettes et DNA-merkende reagens såsom bromdeoksyuridin (BrdU) eller 3H-tymidin.. Mengden med merket DNA blir detektert enten med et anti-BrdU antistoff eller ved å måle radioaktivitet, og blir sammenlignet med kontrollceller som ikke har vært i kontakt med testforbindelse.
Cellulære/ katalytiske assay
Enzymkoblet immunsorbent assay (ELISA) kan bli benyttet for å detektere og måle
. nærværet av PK-aktivitet. ELISA kan bli utført i henhold til kjente fremgangsmåter, som er beskrevet f.eks. i Voller, et al., 1980, "Enzyme-Linked Immunosorbent Assay" i: Manual of Clinical Immunology, 2. utgave, redaktør Rose og Friédman, sidene 359-371 Am. Soc. Of Microbiology, Washington, D.C.
Den angitte protokollen kan tilpasses for å bestemme aktiviteten med hensyn til' en spesifikk PK. Det vil si de foretrukne protokollene for å utføre ELISA-eksperimentene for spesifikke PK<*>er er tilveiebragt under. Imidlertid er tilpassing av disse protokollene for å bestemme en forbindelses aktivitet for andre medlemmer av RTK-familien, såvel som for CTK'er og STK'er, godt innenfor kunnskapsomfanget til personer med kunnskaper i faget.
. FLK- 1 assa<y>
Et ELISA-assay blir utført for å måle kinaseakti vi teten til FLK-1 reseptoren, og mer spesifikt, inhibisjonen eller aktiveringen av PK-aktivitet på FLK-1 reseptoren. Spesifikt kan det følgende assay bli utført for å måle kinaseakti vitet til FLK-1 reseptor i celler som er genetisk konstruert for å uttrykke Flk-1.
Materialer og reagenser.
a. Corning 96-brønners ELISA-plate (Corning Catalog nr. 25805-96),
b. Cappel geit anti-kanin IgG (katalog nr. 55641),
c. PBS (Gibco katalog nr. 450-1300EB),
d. TBSW-buffer (50 mM Tris (pH 7,2), 150 mM NaCl og 0,1 % Tween-20), e. Etanolaminstamløsning (10 % etanolamin (pH 7,0), lagret ved 4°C),
f. HNTG-buffer (20 nM HEPES-buffer (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,2 % Triton X-100 og 10 % glyserol),
g. EDTA (0,5 M (pH 7,0) som en lOOX stamløsning),'
h. Natriumortovanadat (0,5 M som en 100X stamløsning),
i. Natriumpyrofosfat (0,2 M som en 100X stamløsning),
j. NUNC 96 brønn V-bunnet polypropylenplaster (Applied Scientific katalog' nr. AS-72092),
k. NIH3T3 C7#3 celler (FLK-1 utviklingsceller),
1. DMEM med IX høyglykose L-glutamin (katalog nr. 11965-050),
m. FBS, Gibco (katalog nr. 16000-028),
n. L-glutamin, Gibco (katalog, nr. 25030-016),
o. VEGF, PeproTech, Inc. (katalog nr. 100-20) (oppbevart som 1 ug/100 ul stamløsning i milli-Q dH20 og lagret ved -20°C,
p: Affinitetsrenset anti-FLK-l-antiserum,
q. UB40 monoklonalt antistoff spesifikt for fosfotyrosin (se Fendley, et al., 1990, Cancer Research 50:1550-1558),
r. EIA kvalitet geit anti-mus IgG-POD (BioRad katalog nr. 1721011),
s. 2,2-azino-bis(3-etylbenz-tiazolin-6-sulfonsyre (ABTS) løsning (100 mM sitronsyre (vannfri), 250 mM Na2HP04 (pH 4,0), 0,5 mg/ml ABTS (Sigma katalog nr. A-I 888)), løsningen bør lagres i mørket ved 4°C inntil den skal benyttes,
t. H202 (30 % løsning) (Fisher katalog nr. H325),
u. ABTS/H202 (15 ml. ABTS-løsning, 2 ul H202) fremstilt 5 min. før - anvendelse, og stående ved romtemperatur,
v. 0,2 M HC1 stamløsning i H20,
w. dimetylsulfoksid (100 % (Sigma katalog nr. D-8418), og y. Trypsin-EDTA (Gibco BRL katalog nr. 25200-049).
Protokoll
1. Belegg Corning 96-brønners ELISA-plater med 1,0 ug pr. brønn Cappel anti-kanin IgG antistoff i 0.1M Na2CC>3 pH 9,6. Sluttvolumet bringes til 150 ul pr. brønn. Belegg plater over natt ved 4°C. Platene kan oppbevares i opptil to uker når de lagres ved 4°C. 2. Dyrk celler i vekstmedium (DMEM, supplert med 2,0 mM L-glutamin, 10 % FBS) i passe dyrkingsskåler inntil konfluens ved 37°C, 5 % C02. 3. Høst celler ved trypsinering og så i Corning 25850 polystyren 96-brønners rundbunnede celleplater, 25000 celler/brønn i 200 ul med dyrkningsmedium.
4. Dyrk celler minst én dag ved 37°C, 5 % C02.
5. Vask celler med D-PBS IX.
6. Tilsett 200 ul/brønn med sultemedium (DMEM, 2,0 mM l-glutamin, 0,1 % FBS). Inkuber over natt ved 37°C, 5 % C02. 7. Fortynn forbindelser 1:20 i polypropylen 96-brønners plater ved å benytte sultemedium. Fortynn dimetylsulfoksid 1:20 for anvendelse i kontrollbrønner. 8. Fjern sultemediumet fra 96-brønners celledyrkningsplatene, og tilsett 162 ul med friskt sultemedium til hver brønn. 9. Tilsett 18 ul med 1:20 fortynnet forbindelse fortynnet (fra trinn 7) til hver brønn, pluss den 1:20 dimetylsulfoksidfortynningen til kontrollbrønnene (+/- | VEGF), til en sluttfortynning på 1:200 etter cellestimulering. Endelig dimetylsulfoksid er 0,5 %. Inkuber platen ved 37°C, 5 % C02 i to timer. 10. Fjern ubundet antistoff fra ELISA-platene ved å invertere platene for å fjerne væsken. Vask 3 ganger med TNSW + 0,5 % etanolamin, pH 7,0. Stryk platene på et papirhåndkle for å fjerne overskudd av væske og bobler. 11. Blokker platene med TBSW + 0,5 % etanolamin, pH 7,0, 150 ul pr. brønn. Inkuber platene 30 min. mens de rister på en mikrotiterplaterister.
12. Vask platene 3 ganger som beskreve i trinn 10.
13. Tilsett 0,5 ug/brønn med affinitetsrenset anti-FLU-1 polyklonal kanin antiserum. Bring sluttvolumet til 150 ul/brønn med TBSW + 0,5 % etanolamin pH 7,0. Inkuber platen i 30 min. mens de ristes. 14. Tilsett 180 ul med sultemedium til cellene og stimuler cellene med 20 ul/brønn 10,0 mM natriumortovandat og 500 ng/ml VEGF (som resulterer i en sluttkonsentrasjon på 1,0 mM natriumortovandat, og 50 ng/ml VEGF pr. brønn) i åtte min. ved 37°C, 5 % CO2. Negative kontrollbrønner mottar kun sultemedium. 15. Etter åtte min. ble mediumet fjernet fra cellene og vasket én gang ved 200 ul/brønn PBS. 16. Lyser cellene i 150 ul/brønn HNTG, mens de ristes ved romtemperatur i fem min. HNTG-formulering inkluderer natriumortovanadat, natrium pyrofosfat og
EDTA.
17. Vask ELISA-platene tre ganger som beskrevet i trinn 10.
18. Overfør cellelysatene fra celleplaten til ELISA-platen, og inkuber med risting i to timer. For å overføre cellelysatet, pipetter opp og ned mens brønnene skrapes (scrapping the wells).
19. Vask platene tre ganger som beskrevet i trinn 10.
20. Inkuber ELISA-plater med 0,02 ug/brønn UB40 i TBSW + 0,5 % etanolamin. Bring sluttvolumet til 150 ul/brønn. Inkuber mens det ristes i 30 min.
21. Vask platene tre ganger som beskrevet i trinn 10.
22. Inkuber ELISA-platene med 1:10000 fortynnet EIA-kvalitét geit anti-mus IgG-konjugert pepperrotperoksidase i TBSW + 0,5 % etanolamin, pH 7,0. Bring sluttvolumet til 150 ul/brønn. Inkuber mens det ristes i 30 min.
23. Vask platene som beskrevet i trinn 10.
24. Tilsett 100 ul med ABTS/H202 løsning til brønn. Inkuber 10 min. mens det ristes. 25. Tilsett 100 ul med 0,2 M HC1 for 0,1 M HC1. sluttkonsentrasjon for å stoppe
fargeutviklingsreaksjonen. Rist 1 min. ved romtemperatur. Fjern bobler med forsiktig strøm med luft, og les ELISA-platene i en ELISA-plateieser ved 410 nm.
EGF- reseptor- HER2 kimere reseptorassayi hele celler.
HER2 kinaseaktivitet i hele EGFR-NIH3T3 celler er målt og beskrevet under":
I'
Materialer og reagenser.
a. EGF: stamkonsentrasjon: 16,5 ILM, EG 201, TOYOBO, Co., Ltd., Japan.
b. 05-101 (UBI) (et monoklonalt antistoff som gjenkjenner et EGFR ekstracellulært domene). c. Anti-fosfotyrosin antistoff (anti-Ptyr) (polyklonal) (se Fendley, et al.,
supra).
d. Deteksjonsantistoff: Geit anti-kanin IgG pepperrotperoksidasekonjugat,
TAGO, Inc., Burlingame, CA.
h. Stamløsninger med:
( EDTA 100 mM pH 7,0
Na3V04 0,5 M. Na4(P207) 0,2 M
Fremgangsmåte. For-belegg ELISA-plate 1. Belegg ELISA-plater (Corning, 96-brønner, kat. #25805-96) med 05-101 antistoff som 0,5 |ag pr. brønn i PBS, 100 \ x\ sluttvolum/brønn, og lagre over natt ved 4°C. Belagte plater er holdbare i opptil 10 dager når de lagres ved 4°C. 2. Den dagen de skal benyttes fjernes beleggingsbufferen, og erstattes med 100 ul blokkeringsbuffer (5 % "Carnation Instant Non-Fat Dry Milk" i PBS). Inkuber platen, rist ved romtemperatur (omkring 23°C-25<<>>C) i 30 min. Rett før anvendelse fjernes blokkeringsbufferen og platene vaskes 4 ganger med TBST-buffer.
Utsåing av celler
1. En NIH3T3-cellelinje som overuttrykker en kimerisk reseptor som inneholder det EGFR-ekstracellulære domenet og intracellulært HER2
kinasedomene kan bli benyttet i dette assayet.
1. Velg skåler som er 80-90 % konfluens for eksperimentet. Trypsiner cellene og stopp reaksjonene ved å tilsette 10 % føtalt bovint serum. Suspender cellene i DMEM-medium (10 % CS DMEM medium) og sentrifuger straks ved 1500 rpm ved romtemperatur i 5 min. 3. Resuspender cellene i utsåingsmediumet (DMEM, 0,5 % bovint serum) og tell celler ved å benytte trypan blå. Viabilitet over 90 % er akseptabelt. Så cellene i DMEM-medium (0,5 % bovint serum) ved en tetthet på 10000 celler pr. brønn, 100 ul pr. brønn, i en 96-brønners mikrotiterplate. Inkuber de utsådde cellene i 5 % C02 ved 37°C i omkring 40 timer.
Assayfremgangsmåte
1. Sjekk de utsådde cellene for kontaminering ved å benytte et invertert mikroskop. Fortynn medikamentstamløsningen (10 mg/ml i DMSO) 1:10 i DMEM-medium, overfør deretter 5 ul til en TBST-brønn for en sluttmedikamentfortynning . på 1:200, dg en slutt DMSO-konsentrasjon på 1 %. Kontroll celler mottar kun DMSO. Inkuber i 5 % C02 ved 37°C i 2 timer. 2. Fremstill EGF-ligand: fortynn stamløsning EGF i DMEM slik at ved overføring av 10 ul fortynnet EGF (1:12 fortynning), oppnås en sluttkonsentrasjon på 100 nM. 3. FremstiH frisk HNTG<*> tilstrekkelig til 100 ul pr. brønn, og plasser på is. HNTG* (10 ml): 4. Etter 120 min. inkubering med medikament, tilsett fremstilt SGF-ligand til cellene, 10 ul pr. brønn, til en sluttkonsentrasjon på 100 nM. Kontrollceller mottar DMEM alene. Inkuber med risting ved romtemperatur i 5 min. 5. Fjern medikamentet, EGF og DMEM. Vask cellene to ganger i PBS.
Overfør HNTG<*> til cellene, 100 ul pr. brønn. Plasser på is i 5 min. I mellomtiden fjern blokkeringsbuffer fra andre ELISA-plater og vask med TBST som beskrevet over. 6. Med en pipettetupp sikkert festet til en mikropipette, skrap cellene fra platene og homogeniser cellematerialet ved repetert å suge og fordele HNTG<* >lyseringsbuffer. Overfør lysat til en belagt, blokkert og vasket ELISA-plate. Inkuber ristende ved romtemperatur i 1 time. 7. Fjern lysatet og vask fire ganger med TBST. Overfør nylig fortynnede | anti-Ptyr antistoff til ELISA-platen med 100 ul pr. brønn. Inkuber ristende ved romtemperatur i 30 min. i nærværet av anti-Ptyr antiserum (1:3000 fortynning i
TBST).
8. Fjern anti-Ptyr antistoff og vask fire ganger med TBST. Overfør de nylig fortynnede TAGO anti-kanin IgG antistoffet til ELISA-platen med 100 pl pr. brønn. Inkuber ristende ved romtemperatur i 30 min. (anti-kanin IgG antistoff: 1:3000 fortynning i TBST). 9. Fjern TAGO-deteksjonsantistoff og vask fire ganger med TBST. Overfør nylig fremstilt ABTS/H202-løsning til ELISA-plate, 100 ul pr. brønn. Inkuber ristende ved romtemperatur i 20 min. (ABTS/H202 løsning: 1,0 ul 30 % H202 i 10 ml ABTS-stamløsning. 10. Stopp reaksjonen ved å tilsette 50 ul 5N H2S04 (valgfri), og bestemm O.D. ved 410 nm.
11. Det maksimale fosfotyrosinsignalet blir bestemt ved å subtrahere
verdien til de negative kontrollene, fra de positive kontrollene. Prosent inhibisjon
av fosfotyrosininnholdet for ekstraktinneholdende brønner blir deretter beregnet, etter subtraksjon av de negative kontrollene.
PPGF- R assay
Alle cellekulturmediene, glutamin og føtalt bovint serum kan skaffes til veie fira Gibco Life Technologies (Grand Island, NY), med mindre annet er spesifisert. Alle cellene blir dyrket i en fuktig atmosfære med 90-95 % luft, og 5-10 % C02 ved 37°C. Alle. cellelinjene blir rutinemessig splittet to ganger i uken og er negative for mykoplasma bestemt ved Mycotect-metoden (Gibco).
For ELISA-assay blir celler (Ul242, fremskaffet fra Joseph Schlessinger, NYU) dyrket til 80-90.% konfluens i vekstmedium (MEM med 10 % FBS, NEAA, 1 mM NaPyr og 2 mM GLN), og sådd i 96-brønners vevsdyrkingsplater i 0,5 % serum
med 25000 til 30000 celler pr. brønn. Etter over natt inkubering i 0,5 % seruminneholdende medium, blir cellene skiftet til serumfritt medium og behandlet med testforbindelse i 2 timer i en 5 % C02, 37°C inkubator. Cellene blir deretter stimulert med ligand i 5-10 min., etterfulgt av lysering med HNTG (20 mM Hepes, 150 mM NaCl, 10 % glyserol, 5 mM EDTA, 5 mM Na3V04, 0,2 % Triton X-100 og 2 mM NaPyr). Cellelysater (0,5 mg/brønn i PBS) ble overført til ELISA-plater som på forhånd er belagt med reseptorspesifikt antistoff, og som hadde blitt blokkert med 5 % melk i TBST (50 mM Tris-HCl pH 7,2, 150 mM NaCl og 0,1 % Triton X-100) ved romtemperatur i 30 min. Lysater blir inkubert med risting i 1 time ved romtemperatur. Platen blir vasket med TBST fire ganger, og deretter inkubert med polyklonalt anti-fosfotyrosin-antistoff ved romtemperatur i 30 min. Overskudd med anti-fosfotyrosin-antistoff blir fjernet ved å rense platen med TBST fire ganger.
Geit anti-kanin IgG-antistoff blir tilsatt til ELISA-platen i 30 min. ved romtemperatur, etterfulgt av rensing med TBST fire flere ganger. ABTS (100 mM sitronsyre, 250 mM Na2HP04 og 0,5 mg/ml 2,2'-azino-bis(3-etylbenztiazolin-6-sulfonsyre)) pIuss.H202 (1,2 ml 30 % H202 til 10 ml ABTS) blir tilsatt til ELISA-platene for å starte fargeutvjkling. Absorbans ved 410 nm med en referansebølgelengde på 630 nm blir notert omkring 15-30 min etter ABTS-tilsetning.
IGF- 1 RESEPTORASSAY
Den følgende protokollen kan bli benyttet for å måle fosfotyrosinnivå på IGF-1 reseptor, som indikerer IGF-1 reseptor tyrosinkinaseaktivitet.
Materialer og reagenser
a. Cellelinjen, som benyttes i dette assayet er 3T3/IGF-1R, en cellelinje som er genetisk konstruert for å overuttrykke IGF-1 reseptor.
b. NIH3T3/IGF-1R blir dyrket i en inkubator med 5 % C02 ved 37°C. Vekstmediumet er DMEM + 1.0 % FBS (yarmeinaktivert) + 2 mM L-glutamin.
c. Affinitetsrenset anti-lGF-lR antistoff 17-69.
d. D-PBS:
e. Blokkeringsbuffer: TBST pluss 5 % melk (Carnation Instant Non-Fat Dry Milk).
f. TBST buffer:
■ Stamløsning med TBS (10X) blir fremstilt, og Triton X-100 blir tilsatt til bufferen under fortynning, g. HNTG-buffer:
Stamløsning (5X) blir fremstilt og oppbevart ved 4°C.
h. EDTA/HC1: 0,5 M pH 7,0 (NaOH) som 100X stamløsning.
i. Na3V04: 0,5 M som 100X stamløsning og porsjoner blir oppbevart ved 80°C. j. Na4P207: 0,2 M som 100X stamløsning. k. Insulinlignende vekstfaktor-1 fra Promega (katalog nr. G5111). 1. Kanin polyklonalt anti-fosfotyrosinantiserum. I m. Geit anti-kanin IgG, POD-konjugat (deteksjonsantistoff), Tago (kat. nr. 4520, Lot nr. 1802): Tago, Inc., Burlingame, CA. n. ABTS (2,2'-azinobis(3:etyIbenztiazolinsulfonsyre))løsning:
ABTS-løsning bør oppbevares i mørket og 4°C. Løsningen bør kastes når den blir grønn.
0. Hydrogenperoksid: 30 % løsning oppbevares i mørket og 4°C.
Fremgangsmåte.
Alle de følgende trinnene blir utført ved romtemperatur med mindre det spesifikt indikeres annerledes. Alle ELISA-platevaskinger blir utført ved å rense platen méd springvann tre ganger, etterfulgt av én TBST-rens. Platene tørkes med papirhåndklær.
Celleutsåing:
1. Cellene, som er dyrket i vevskulturskåler (Corning 25020-100) til 80-90 % konfluens, blir høstet med trypsin-EDTA (0,25 %, 0,5 ml/D-100, GIBCO. 2. Resuspendert celle i frisk DMEM + 10 % FBS + 2 mM L-glutamin, overført til 96-brønners vevskulturplater (Corning, 25806-96) med 20000
celler/brønn (100 ul/brønn). Inkubere 1 dag, erstatt deretter mediumet med serumfritt medium (90/ul) og inkuber i 5 % CO2 og 3.7°C over natt.
ELISA?platebelegging og blokkering:
1. Belegg ELISA-plate (Corning 25805-96) med anti-IGF-lR-anti stoff med - 0,5 jig/bfønn i 100 pl PBS i minst 2 timer. 2. Fjern beleggingsløsningen og erstatt med 100 ul blokkeringsbuffer og rist i 30 min. Fjern blokkeringsbufferen og vask platen rett før lysatet tilsettes.
Assayfremgangsmåter: 1. Medikamentene blir testet under serumfrie forhold. 2. Fortynn medikamentstamløsningen (i 100 % DMSO) 1:10 med DMEM i 96-brønners poly-propylenplater, og overfør 10 ul/brønn av denne løsningen til cellene for å oppnå en endelig medikamentfortynning 1:100 og endelig DMSO-kons.entrasjon på 1,0 %. Inkuber deretter cellene i 5 % CO2 ved 37°C i 2 timer.
3. Fremstill frisk cellelyseringsbuffer (HNTG<*>)
4. Etter medikamentinkubering i to timer, overføres 10 ul/brønn med 200 nM IGF-1 ligand i PBS til cellene (sluttkonsentrasjon er 20 nM), og inkuberes ved 5 % C02 ved 37°C i 10 min. 5. Fjern mediumet og tilsett 100 ul/brønn HNGT<*> og rist i 10 min. Se på cellene under mikroskop og se hvorvidt de er tilstrekkelig lysert.
, 6. Benytt en 12-kanal pipette for å skrape cellene fra platen og homogeniser lysatet ved repetert aspirering og dispergering. Overfør hele lysatet til antis.toffbelagte ELISA-plater og rist i 1 time.
7. Fjem lysatet, vask platen, overfør anti-pTyr (1:3000 med TBST) 100
ul/brønn, og rist i 30 min.
8. Fjern anti-pTyr, vask platen, overfør TAGO (1:3000 med TBST) 100 pl/brønn, og rist i 30 min. 9. Fjern deteksjonsantistbffet, vask platen, og overfør frisk ABTS/H202 (1,2 ul H202 til 10 ml ABTS) 100 ul/brønn til platen for å starte fargeutvikling.
Mål OD ved 410 nm med en referansebølgelengde på630 nm i Dynatec MR5000.
EGFR- assav EGF reseptorkinaseaktivitet i celler genetisk fremstilt for å uttrykke human EGF-R kan måles som beskrevet under: Materialer og reagenser
a. EGF-ligand: stamkonsentrasjon = 16,5 uM, EGF 201, TOYOBO, CO.,
Ltd. Japan.
b. 05-101 (UBI) (et monoklonalt antistoff.som gjenkjenner et EGF
ekstracellulært domene).
c. Anti-fosfotyosinantistoff (anti-Ptyr) (polyklonal).
d. Deteksjonsantistoff: geit anti-kanin IgG pepperrotperoksidasekonjugat, TAGO, Inc., Burlingame, CA. Oppbevar løsningen i mørket ved 4°C inntil den skal benyttes, h. Stamreagenser av
Fremgangsmåte
For-belegg ELlSA-plate
1. Belegg ELISA-plater (Corning, 96 brønner,.kat. nr. 25805-96) med
05-101 antistoff med 0,5 ug/brønn i PBS, 150 ul sluttvolum/brønn, og lagre over natt ved 4°C. Belagte plater er holdbare i inntil 10 dager når de lagres ved 4°C.
2. Den dagen de skal benyttes fjernes beleggingsbufferen og erstattes av
. blokkeringsbuffer. (5 % Carnation Instant NonFat Dry Milk i PBS). Inkuber platen, rist, ved romtemperatur, (omkring 23°C til 25°C) i 30 min. Rett før anvendelse fjernes blokkeringsbufferen, og platene vaskes fire ganger med TBST-buffer.
j
Utsåing av celler
1. NIH 3T3/C7-cellelinje (Honegger, et al.; Cell 61:199-209, 1987) kan bli benyttet i dette assayet. 2. Velg skåler som har 80-90 % konfluens for eksperimentet. Trypsiner celler og stopp reaksjonen ved å tilsette 10 % CS DMEM-medium. Suspender cellen i DMEM-medium (10 % CS DMEM-medium) og sentrifuger 1 gang ved 1000 rpm ved romtemperatur i 5 min.
3. Resuspender celler i utsåingsmedium (DMEM, 0,5 % bovint serum) og
tell cellene ved å benytte trypan-blå. Viabiiitet over 90 % er akseptabelt. Så cellene i DMEM-medium (0,5 % bovint serum) ved en tetthet på 10000 celler'pr. brønn,
100 pl pr. brønn, i en 96-brønners mikrotiterplate. Inkuber utsådde celler i 5 %
C02 ved 37°C i omkring 40 timer.
Assayfremgangsmåte
1. Sjekk utsådde celler for kontaminering ved å benytte et invertert mikroskop. Fortynn testforbindelsesstamløsningene (10 mg/ml i DMSO) 1:10 i DMEM-medium, overfør deretter 5 ul til en testbrønn for en
testforbindelsesmedikamentfortynning på 1:200, og en endelig DMSO-
konsentrasjon på 1 %. Kontrollceller mottok DMSO alene. Inkuber i 5 % C02 ved 37°C i 1 time.
2. Fremstill EGF-ligand: fortynn stokk EGF i DMEM slik at ved overføring
av 10 ul fortynnet EGF (1:12 fortynning) oppnås en endelig konsentrasjon på 25 nM. i 3. Fremstill fersk 10 ml HNTG<*> tilstrekkelig til 100 ul pr. brønn, hvor
HNTG<*> omfatter: HNTG-stamløsning (2,0 ml), milli-Q H20 (7,3 ml), EDTA, 100 mM, pH 7,0 (0,5 ml), Na3V04 0,5 M (0,1 ml) og Na4(P207), 0,2 M (0,1 ml).
4. Plasser på is.
5. Etter to timers inkubering med medikament tilsett fremstilt EGF-ligand
til cellene, 10 ul pr. brønn, for å oppnå en sluttkonsentrasjon på 25 nm. Kontrollceller mottar DMEM alene. Inkuber, rist ved romtemperatur i 5 min.. 6. Fjern testforbindelsen, EGF og DMEM. Vask cellene to ganger med PBS.
Overfør HNTG<*> til cellene, 100 ul pr. brønn. Plasser på is i 10 min. I mellomtiden fjernes blokkeringsbuffer fra andre ELISA-plater som vaskes med TBST som beskrevet over.
7. Med en pipettetopp som er sikkert festet til en mikropipette, skrapes cellene fra platen og cellematerialet homogeniseres ved repetert å suge inn og ut
HNTG<*->lyseringsbuffer. Overfør lysatet til en belagt, blokkert-og vasket ELISA-plate. Inkuber, rist ved romtemperatur i 1 time.
8. Fjern lysat og vask fire ganger med TBST. Overfør nylig fortynhede anti-Ptyr antistoff til ELISA-platen ved 100 ul pr. brønn. Inkuber ristende ved romtemperatur i 30 min. i nærværet av anti-Ptyr antiserum (1:3000 fortynning i
TBST).
9. Fjern anti-Ptyr antistoffet og vask fire ganger med TBST. Overfør det friske, fortynnede TAGO 30 anti-kanin IgG-antistoffet til ELISA-platen med 100 pl pr. brønn. Inkuber ristende ved romtemperatur i 30 min. (anti-kanin IgG-antistoff: 1:3000 fortynning i TBST). 10. Fjern deteksjonsantistoffet og vask fire ganger med TBST. Overfør nylig fremstilt ABTS/H202-løsning til ELISA-plater, 100 pl pr. brønn. Inkuber ved romtemperatur i 20 min. ABTS/H202-løsning: 1,2 pl 30 % H202 i 10 ml ABTS-stamløsning. 11. Stopp reaksjonen ved å tilsette 50 pl 5N H2SO4 (valgfritt), og bestem
O.D. ved 410 nm.
12. Det maksimale fosfotyrosinsignalet blir bestemt ved å subtrahere verdien for de negative kontrollene fra de positive kontrollene. Prosent inhibisjon av fosfotyrosininnhold for ekstraktinneholdende brønner blir deretter beregnet, etter subtraksjon av de negative kontrollene.
Met- autofosforyleringsassay
Dette assayet bestemmer Met-tyrosinkinaseaktivitet ved å analysere Met-proteinkinasenivået på Met-reseptoren.
Reagenser
a. HNTG (5X stamløsning): oppløs 23,83 g HEPES og 43,83 g NaCl i omkring 350 ml dH20. Juster pH til 7,2 med HC1 eller NaOH, tilsett 500 ml glyserol og 10 ml Triton X-100, bland, tilsett dH20 til 1 1 totalt volum. For å lage 1 1 av IX arbeidsløsning tilsett 200 ml 5X stamløsning til 800 ml dH20, sjekk og juster pH som nødvendig, lagre ved 4°C.
b. PBS (Dulbeccos fosfat-bufret saltløsning), Gibco kat. nr. 450-1300EB
(IX løsning).
c. Blokkeringsbuffer: i 500 ml dH20 plasser 100 g BSA, 12,1 g Tris-pH 7,5, 58,44 g NaCl og 10 ml Tween-20, fortynn til 1 1 totalvolum. . d. Kinasebuffer: til 500 ml dH20 tilsett 12,1 g TRIS (pH 7,2), 58,4 g NaCl, 40,7 g MgCl2 og 1,9 g EGTA, bring-det hele til 1 1 totalvolum med dH20.
e. PMSF (fenylmetylsulfonylfluorid), Sigma kat. nr. P-7626, til 435,5 mg, tilsett 100 % etanol til 25 ml totalvolum, vorteks.
f. ATP (bakteriell kilde), Sigma kat. nr. A-7699, lagre pulveret ved -20°C,
for å lage opp en løsning for anvendelse, oppløs 3,31 mg i 1 ml dH20.
g. RC-20H HRPO konjugert anti-fosfotyrosin, Transduction Laboratories
kat. nr. E120H.
h. Pierce 1-Step™ Turbo TMB-ELISA (3,3', 5,5'-tetrametylbenzidin, Pierce kat. nr. 34022.
i. H2S04, tilsett 1 ml kons. (18 N) til 35 ml dH20.
j. TRIS HCL, Fischer kat. nr. BP 152-5, til 121,14 g av materialet, tilsett 600 ml MilliQ H20, juster pH til 7,5 (eller 7,2) med HC1, bring volumet til 1 1 med MilliQ H20.
k. NaCl, Fischer kat. nr. S271-10, lag opp 5M løsning.
1. Tween-20, Fischer kat. nr. S337-500.
m. Na3V04, Fischer kat. nr. S454-50, til 1,8 g materiale tilsett 80 ml MilliQ H20, juster pH til 10,0 med HC1 eller NaOH, kok i mikrobølgeovn, kjøl ned, sjekk pH, repeter prosedyren inntil pH er stabil ved 10,0, tilsett MilliQ H20 til 100 ml totalvolum, lag 1 ml porsjoner og.lagre ved-80°C.
n. MgCl2, Fischer kat. nr. M33-500, lag opp 1 M løsning.
o. HEPES, Fischer kat. nr. BP310-500, til 200 ml MilliQ H20, tilsett 59,6 g materiale, juster pH til 7,5, bring volumet til 250 ml totalt, sterilfiltrer.
p. Albumin, bovin (BSA), Sigma kat. nr. A-4503, til 30 g materiale tilsett sterilt destillert vann for å gi et totalvolum på 300 ml, lagre ved 4°C.
q. TBST-buffer: til omkring 900 ml dH20 i en 11 gradert sylinder tilsett 6,057 g TRIS og 8,766 g NaCl, når dette er oppløst, juster pH til 7,2 med HC1, tilsett 1,0 ml Triton Z-100 og bring til 1 1 totalvolum med dH20.
r. Geit affinitetsrenset antistoff kanin IgG (hele molekyler), Cappel kat. nr. 55641.
s. Anti h-Met (C-28) kanin polyklonalt IgG-antistoff, Santa Cruz Chemical kat. nr. SC-161/
t. Transient transfektert EGFT/Met kimere celler (EMR) (Komada, et al., Oncogene, 8:2381-2390 (1993).
u. Natriumkarbonatbuffer, (Na2C04, Fischer kat. nr. S495): til 10,6 g materiale tilsett 800 ml MilliQ H20, når det er oppløst juster pH til 9,6 med NaOH, bring det hele til 1 1 totalvolum med MilliQ H20, filtrer, lagre ved 4°C.
Fremgangsmåte
Alle de følgende trinnene blir utført ved romtemperatur med mindre det er spesifisert annet. All ELISA-plate vasking er ved rensing 4X med TBST.
EMR-lysering
Denne fremgangsmåten kan utføres natten før eller umiddelbart før starten på reseptorfangingen.
1. Tin raskt lysater i 37°C vannbad med en omdreiende bevegelse inntil de siste krystallene forsvinner. 2. Lyser cellepelleten med IX HNTG som inneholder 1 mM PMSF. Benytt 3 ml med HNTG pr. 15 cm skål med celler. Tilsett halvparten av det beregnede HNTG-volumet, vorteks rør i 1 min., tilsett den gjenværende mengden av HNTG, .vorteks i ytterligere 1 min.
3. Balanser rørene, sentrifuger ved 10000 x g i 10 min. ved 4°C.
4. Slå sammen supematantene, fjern en porsjon for proteinbestemmelse.
5. Frys raskt de sammenslåtte prøvene i tørris/etanolbad. Dette trinnet blir utført uavhengig av hvorvidt lysatene kan lagres over natt, eller benyttes umiddelbart etter proteinbestemmelse. 6. Utfør proteinbestemmelse ved å benytte standard bicinchoninsyre (BCA) fremgangsmåte (BCA Assay Reagent Kit from Pierce Chemical kat. nr. 23225).
ELISA-fremgangsmåte
1. Belegg Corning 96-brønners ELISA-plater med 5 ug pr. brønn geit anti-kanin antistoff i karbonatbuffer med et totalbrønnvolum på 50. ul. Lagre over natt ved 4°C..
2. Fjern ubundet geit antikaninantistoff ved å snu platene og fjerne væsken.
3. Tilsett 150 ul med blokkeringsbuffer til hver brønn. Inkuber i 30 min. med risting. 4. Vask 4X med TBST. Tørk platene på et papirhåndkle for å fjerne
overskudd av væske og bobler.
5. Tilsett 1 ug pr. brønn med kanin anti-Met antistoff fortynnet i TBST i et
totalbrønnvolum på 100 pl.
6. Fortynnlysatet i HNTG (90 ug lysat/100 pl).
7. Tilsett 100 pl med fortynnet lysat til hver brønn. Rist i 60 min.
8. Vask 4X med TBST. Tørk på papirhåndkle for å fjerne overskudd av
væske og bobler. i
9. Tilsett 50 pl med IX lysatbuffer fra brønn.
10. Fortynn forbindelser/ekstrakter 1:10 i IX kinasebuffer i en polypropylen 96-brønners plate. 11. Overfør 5,5 ul med fortynnet forbindelse til ELISA-platebrønner. Inkuber ved romtemperatur ved risting i 20 min. 12. Tilsett 5,5 pl med 60 pM ATP-løsning pr. brønn. Negative kontroller mottar ikke ATP. Inkuber i 90 min., med risting. 13. Vask 4X med TBST. Tørk platene på papirbåndkler for å fjerne overskudd av væske og bobler. 14. Tilsett 100 pl pr. brønn med RC20 (1:3000 fortynning i blokkeringsbuffer). Inkuber i 30 min. med risting. 15. Vask 4X med TBST. Tørk platen på papirhåndkle for å fjerne overskudd av væske og bobler. 16. Tilsett 100 pl pr. brønn med Turbo-TMB. Inkuber med risting i 30-60 min.
17. Tilsett 100 pl pr. brønn med 1M.H2S04 for å stoppe reaksjonen.
18. Les assay på Dynatech MR7000 ELISA-leser. Testfilter = 450. nm, referansefilter = 410 nm.
Biokjemisk src- assav
Dette assayet blir benyttet for å bestemme src-proteinkinaseaktivitet som måler fosforylering av et biotinylert peptid som utlesning (readout).
Materialer og reagenser:
a. Gjær transformert med src (Sugen, Inc., Redwood City, California).
b. Cellelysater: gjærceller som uttrykker src blir gjort til en pellet, vasket én gang med vann, re-pelletert og lagret ved -80°C inntil det skal anvendes. c. N-terminal biotinylert EEEYÉEYEEEYEEEYEEEY blir fremstilt ved standard fremgangsmåter som er vel kjent av personer med kunnskap i faget.
d. DMSO: Sigma, St. Louis, MO.
e. 96-brønners ELISA-plate: Corning 96-brønners Easy Wash, modifisert flatbunnet plate, Corning kat. nr. 25805-96.
f. NUNC 96-brønners V-bunnet polypropylenplater for fortynning av forbindelser: Applied Scientific kat. nr. A-72092.
g. Vekastain ELITE ABC reagens: Vector, Burlingame, CA.
h. Anti-src (327) mab: Schizosaccharomyces Pombe blir benyttet for å uttrykke rekombinant Src (Superti-Furga, et ak, EMBO J.. 12:26252634. Superti-Furga, et al., Nature Bichem.. 14:600-605). S: Pombe stamme SP200 (h-s leul.32 ura4 ade210) blir dyrket som beskrevet og transformasjoner er pRSP-ekspresjonsplasmider blir gjort ved litiumacetatmetoden (Superti-Furga, supra).
i Celler blir dyrket i nærværet av 1 pM tiamin for å undertrykke ekspresjon fra nmtl-promoteren, eller i fraværet av tiamin for å indusere ekspresjon. i. Monoklonal anti-fosfotyrosin, UBI 05-321 (UB40 kan bli benyttet i stedet).
j. Turbo TMB-ELISA peroksidasesubstrat: Pierce Chemical.
Bufferløsninger
a. PBS (Dulbeccos fosfat-bufret saltløsning): GIBCO PBS, GIBCO kat. nr. 450-1300EB.
b. Blokkeringsbuffer: 5 % melk uten fett (Carnation) i PBS.
c. Karbonatbuffer: Na2C04 fra Fischer, kat. nr. S495, lag en 100 mM
stamløsning.
d. Kinas ebu f fer: 1,0 ml (fra IM stamløsning) MgCl2, 0,2 ml (fra en IM stamløsning) MnCl2, 0,2 ml (fra en IM stamløsning) DTT, 5,0 ml (fra en IM stamløsning) HEPES, 0,1 ml TX-100, bring det hele til 10 ml totalvolum med MilliQ H20.
e. Lyseringsbuffer: 5,0 HEPES (fra IM stamløsning),.2,74 ml NaCl (fra 5M stamløsning), 10 ml glyserol, 1,0 ml TX-100, 0,4 ml ÉDTA (fra en 100 mM stamløsning), 1,0 ml PMSF (fra en 100 mM stamløsning), 0,1 ml Na3V04 (fra en 0,1 M stamløsning), bring det hele til 100 ml totalvolum med MilliQ H20.
f. ATP: Sigma kat. nr. A-7699, lag opp 10 mM stamløsning (5,51 mg/ml).
g. TRIS-HC1: Fischer kat. nr. BP 152-5, til 600 ml MilliQ H20 tilsett 121,14
g materiale, juster pH til 7,5 med HC1, bring til 1 1 totalvolum med MilliQ H20.
h. NaCl: Fischer kat. nr. S271-10, .lag opp 5M stamløsning med MilliQ H20.
i. Na3V04: Fischer kat. nr. S454-50, til 80 ml MilliQ H20,tilsett 1,8 g materiale, juster pH til 10,0 med HC1 eller NaOH, kok i en mikrobølgeovn, kjøl
ned, sjekk pH, repeter pH-justeringen inntil pH forblir stabil etter oppvarming/nedkjølingssyklusen, bring til 100 ml totalvolum med MilliQ H20, lag 1 ml porsjoner og lagre ved -80°C.
j. MgCl2: Fischer kat. nr. M33-500, lag opp IM stamløsning med MilliQ
H20.
k. HEPES: Fischer kat. nr. BP 310-500, til 200 ml MilliQ H20, tilsett 59,6 g materiale, juster pH til 7,5, bring til 250. ml totalvolum med MilliQ H20, sterilfiltr.er (IM stamløsning). 1. TBST-buffer: TBST-buffer: Til 900 ml dH20 tilsett 6,057 g TRIS og 8,766 g NaCl, juster pH til 7,2 med HC1, tilsett 1,0 ml Triton-XlOO, bring til 1 1 totalvolum med dH20.
m. MnCl2: Fischer kat. nr. M87-100, lag opp IM stamløsning med MilliQ
H20.
n. DTT: Fischer kat. nr. BP172.5.
o. TBS (TRIS-bufret saltløsning): til 900 ml MilliQ H20 tilsett 6,057 g
TRIS og 8,777 g NaCl, bring til 1 1 totalvolum med MilliQ H20.
p. Kinasereaksjonsblanding: Mengde pr. assayplate (100 brønner): 1,0 ml
kinasebuffer, 200 ug GST-^, bring til sluttvolum på 8,0 ml med MilliQ H20.
q. Biotinmerket EEEYEEYEEEYEEEYEEEY: Lag peptidstamløsning (1
mM, 2,98 mg/ml) i ferskt vann rett før anvendelse.
r. Vectastatin ELITE ABC-reagens: For å fremstille 14 ml med arbeidsreagens, tilsett 1 dråpe med reagens A til 15 ml TBST og snu rørene flere ganger for å blande. Tilsett deretter 1 dråpe med reagens B. Plasser rørene på
orbitalrister ved romtemepratur og bland i 30 min.
Fremgangsmåter:
Fremstilling av src-belagt ELISA-plate
1..Belegg ELISA-plate med 0,5 ug/brønn anti-src mab i 100 ul med pH 9,6. natriumkarbonatbuffer, hold ved 4°C over natt.
2. Vask brønnene én gang med PBS.
3. Blokker platene med 0,15 ml 5 % melk i PBS i 30 min. ved romtemperatur.
4. Vask platene 5X med PBS.
5. Tilsett 10 ug/brønn med src-transformert gjærlysater fortynnet i lyseringsbuffer (0,1 ml totalvolum pr. brønn). (Mengde med lysat kan variere mellom batchene). Rist platene i 20 min. ved romtemperatur.
Fremstilling av fosfotyrosin antistoff-belagt ELISA-plate
1. 4G10 plate: belegg 0,5 ug/brønn 4G10 i 100 ul PBS over natt ved 4°c, og blokker med 150 pl med 5 % melk i PBS i 30 min. ved romtemperatur.
Kinase assay-fremgangsmåte
1. Fjern ubundne proteiner fra platene og vask platene 5X med PBS.
2. Tilsett 0,08 ml med kinasereaksjonsblanding pr. brønn (inneholder 10 pl med 10X kinasebuffer og 10 pM (sluttkonsentrasjon) biotin-EEEYEEYEEEYEEEYEÉEY pr. brønn fortynnet i vann. 3. Tilsett 10 pl med forbindelse fortynnet i vann som inneholder 10 % DMSO og pre-inkubert i 15 min. ved romtemperatur. 4. Start kinasereaksjonen ved å tilsette 10 pg/brønn med 0,05 mM ATP i vann (5 pM ATP sluttkonsentrasjon).
5. Rist ELISA-plater i 15 min. ved romtemperatur.
6. Stopp kinasereaksjonen ved å tilsette 10 pl med 0,5 M EDTA pr. brønn.
7. Overfør 90 pl supernatant til en blokker 4G10 belagt ELISA-plate.
8. Inkuber i 30 min. mens det ristes ved romtemperatur.
9. Vask platen med 5X med TBST.
10. Inkuber med Vectastatin ELITE ABC reagens (100 pl/brønn) i 30 min. ved romtemperatur. • 11. Vask brønnene 5X med TBST.
12. Utvikle med Turbu TMB:
Biokjemisk lek- assav
Dette assayet blir benyttet for å bestemme lck-proteinkinaseaktiviteter som måler fosforylering av GST-^ som utlesning.
Materialer og reagenser:
a. Gjær transformert med lek. Schizosaccharomyces Pombe blir benyttet for
å uttrykke rekombinant Lek (Superti-Furga, et al., EMBO J. 12:2625-2634, Superti-Furga, et al., Nature Biotech.. 14:600-605). S. Pombe stamme SP200 (h-s IeuL 32
ura 4 ade210) blir dyrket som beskrevet, og transformasjoner med pRSP-ekspresjonsplasmider blir gjort ved litiumacetatfremgangsmåten (Superti-Furga, supra). Celler blir dyrket i nærvær av 1 uM tiamin for å indusere ekspresjon.
b. Cellelysater: Gjærceller som uttrykker lek blir gjort til en pellet, vasket
én gang i vann, repelletert og lagret frosne ved -80°C inntil de skal benyttes.
c. GST-^: DNA som koder for GST-£ fusjonsprotein for ekspresjon i bakterie oppnådd fra Arthur Weiss på Howard Hughes Medical Institute ved University of Claifornia, San Francisco. Transformerte bakterier er dyrket over natt mens de ristet ved 25°C. GST-^ blir renset ved glutationaffinitetskromatografi, Pharmacia, Alameda, CA.
d. DMSO: Sigma, St. Louis, MO..
e. 96-brønners ELISA-plate: Corning 96-brønners Easy Wash, modifisert flatebunnet plate, Corning kat. nr. 25805-96.
. f. NUNC 96-brønners V-bunnet polypropylenplater for fortynning av forbindelser: Applied Scientific kat. nr. AS-72092. g. Renset kanin anti-GST antisreum: Amrad Corporation (Australia) kat, nr. -90001605.
h. Geit anti-kanin-IgG-HRP: Amersham kat. nr. V010301.
i. Sau anti-mus IgG (H+L): Jackson Labs kat. nr. 5215-005-003.
j. Anti-Lck (3A5) mab: Santa Cruz Biotechnology kat. nr. sc-433.
k. Monoklonal anti-fosfotyrosin UBI 05-321 (UB40 kan bli benyttet
isteden).
Bufferløsning
a. PBS (Dulbeccos fosfatbufret saltløsning) IX løsning: GIBCO PBS;
GIBCO kat. nr. 450-1300EB.
b. Blokkeringsbuffer: 100 g BSA, 12,1 g TRIS (ph 7,5), 58,44 g NaCl, 10
ml Tween-20, bring det hele til 1 1 totalvolum med MilliQ H20.
c. Karbonatbuffer: Na2C04 fra Fischer, kat. nr. S495, lag 100 mM løsning
med MilliQ H20.
d. Kinasebuffer: 1,0 ml (fra IM stamløsning) MgCl2, 0,2 ml (fra en IM stamløsning) MnCl2, 0,2 ml (fra en IM stamløsning) DTT, 5,0 ml (fra en IM stamløsning), HEPES, 0,1 ml TX-100, bring til 10 ml totalvolum med MilliQ H20.
e. Lyseringsbuffer: 5,0 HEPES (fra IM stamløsning), 2,74 ml NaCl (fra 5M stamløsning), 10 ml glyserol, 1,0 ml TX-100, 0,4 ml EDTA (fra en 100 mM stamløsning), 1,0 ml PMSF (fra en 100 mM stamløsning), 0,1 ml NajVCv (fra en 0,1 M stamløsning), bring til 100 ml totalt volum med MilliQ H20.
' f. ATP: Sigma kat. nr. A-7699, lag 10 mM stamløsning (5,51 mg/ml)..
g. TRIS-HC1: Fischer kat. nr. BP 152-5, .til 600 ml MilliQ H20 tilsett 121,14 materiale, juster pH til 7,5 med HC1, bring til 1 1 totalt volum med MilliQ H20.
h. NaCl: Fischer kat. nr. S271-10, lag 5M stamløsning med MilliQ H20. i. Na3V04: Fischer kat. nr. S454-50, til 80 ml MilliQ H20. tilsett 1,8 g materiale, juster pH til 10,0 med HC1 eller NaOH, kok i mikrobølgeovn, kjøl ned, sjekk pH, repeter pH-justeringen inntil pH forblir stabil etter oppvarming/nedkjølingssyklusene,.bring til 100 ml totalvolum med MilliQ H20, lag 1 ml porsjoner og lagre ved -80°C.
j. MgCl2: Fischer kat. nr. M33-500, lag opp IM stamløsning med MilliQ
H20.
k. HEPES: Fischer kat. nr. BP 310-500, til 200 ml MilliQ H20, tilsett 59,6 g materiale,.juster til pH 7,5, bring til 250 ml totalvolum med MilliQ H20, sterilfiltrert (IM stamløsning); 1. Albumin.-bovin (BSA), Sigma kat. nr. 44503, til 150 ml MilliQ H20. tilsett 30 g materiale, bring 300 ml totalvolum med MilliQ H20, filtrer gjennom 0,22jig filter, lagre ved 4°C.. m. TBST-buffer: Til 900 ml dH20 tilsett 6,057 g TRIS og 8,766 g NaCl, juster pH til 7,2 med HC1, tilsett 1,0 ml Triton-XlOO, bring til 1 1 totalvolum med dH20.
n. MnC12: Fischer kat. nr. M87-100, lag opp IM stamløsning med MilliQ
H20. '
0. DTT: Fischer kat. nr. BP 172-5.
p. TBS (TRIS-bufret saltløsning): til 900 ml MilliQ H20 tilsett 6,057 g
TRIS og 8,777 g NaCl, bring til 1 1 totalvolum med MilliQ H20.
q. Kinasereaksjonsblanding: Mengde pr. assay plate (100 brønner): 1,0 ml kinasebuffer, 200 ug GST-J;, bring til sluttvolum på 8,0 ml med MilliQ H20.
Fremgangsmåter:
Fremstilling av Lck-belagt ELISA-plate
1. Belegg 2,0 ug/brønn sau anti-mus IgG i 100 ul med pH 9,6
natriumkarbonatbuffer ved 4°C over natt.
2. Vask brønnene én gang med PBS. I
3. Blokker platene med 0,15 ml blokkeringsbuffer i 30 min. ved romtemperatur.
4. Vask platene 5X med PBS.
5. Tilsetr 0,5 ug/brønn med anti-lck (mab 3A5) i 0,1 ml PBS ved romtemperatur i 1-2 timer.
6. Vask platen med 5X med PBS.
7. Tilsett 20 pg/brønn med lck-transformert gjærlysat fortynnet i lyseringsbuffér (0,1. ml totalvolum pr. brønn). Rist platene ved 4<*>C over natt for å hindre tap av aktivitet.
Fremstilling av fosfotyrosin antistoff-belagt ELISA-plate
1. UB40-plate: 1,0 ug/brønn UB40 i 100 ul med PBS over natt ved 4°C, og, blokker med 150 ul med blokkeringsbuffer i minst 1 time.
Kinaseassayprosedyre
1. Fjern ubundet protein fra platene og vask platene 5X med PBS.
2. Tilsett 0,08 nil kinasereaksjonsblanding pr. brønn (inneholder 10 ul med
. 10X kinasebuffer og 2 |ig GST-^ pr. brønn fortynnet med vann).
3. Tilsett 10 ul med forbindelse fortynnet i vann som inneholder 10 % DMSO og preinkuber i 15 min. ved romtemperatur. 4. Start kinasereaksjonen ved å tilsette 10 pl/brønn med 0,1 mM ATP i vann
(10 uM ATP-sluttkonsentrasjon).
5. Rist ELISA-platene i 60 min. ved romtemperatur.
6. Stopp kinasereaksjonen ved å tilsette 10 ul med 6,5 M EDTA pr. brønn.
7. Overfør 90 ul supernatant til en blokkert 4G10 belagt ELISA-plate fra avsnitt B over..
8. Inkuber mens det ristes i 30 min. ved romtemperatur.
9. Vask platene 5X med TBST.. f 10. Inkuber med kanin anti-GST antistoff ved 1:5000 fortynning i 100 ul
TBST i 30 min. ved romtemperatur.
11. Vask brønnene 5X med TBST.
12. Inkuber med geit anti-kanin-IgG-HRP ved 1:20000 fortynning i 100 ul
med TBST i 30 min. ved romtemperatur.
13. Vask brønnene 5X med TBST.
14. Utvikle med Turbo TMB.
Assa<y> som måler fosforvlerin<g>sfunksionen av RAF
Det følgende assay rapporterer mengden med RAF-katalysert fosforylering av dets mål protein MEK, såvel som MEKs mål-MAPK. RAF-gensekvensen er beskrevet i Bonner et al., 1985, Molec. Cell. Biol., 5:1400-1407, og er enkelt tilgjengelig i
flere gensekvensdatabanker. Konstruksjon av nukleinsyrevektoren og cellelinjene som benyttes i denne delen av oppfinnelsen er fullt ut beskrevet i Morrison' et al., 1988. Proe. Nati. Acad-, Sei. USA. 85:8855-8859..
Materialer og reagenser 1. Sf9 (Spodoptera frugiperda) celler, GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD. 2. RIPA-buffer: 20 mM Tris/HCl pH 7,4, 137 mM NaCl, 10 % glyserol, 1 . mM PMSF, 5 ml/l Aprotenin, 0,5 % Triton X-100.
3. Thioredoksin-MEK fusjonsprotein (T-MEK): T-MEK ekspresjon og
. rensing ved affinitetskromatografi blir utført i henhold til produsentens fremgangsmåter. Katalog nr. K 350-01 og R 350-40, Invitrogen Corp.; San Diego,
CA.
4. His-MAPK (ERK 2), His-merket MAPK blir uttrykt i XLI Blué celler transformert med pUC18-vektor som koder for His-MAPK. His-MAPK blir renset ved Ni-affinitetskromatografi. Kat. nr. 27-4949-01, Pharmacia, Alameda, CA, som beskrevet heri. ■ . 5. Sau anti-mus IgG: Jackson laboratories, West Grove, PA. Katalog nr. 515-006-008, Lot nr. 28563.
6. RAF-1 proteinkinase-spesifikt antistoff:URP2653 fraUBI.
7. Beleggingsbuffer:. PBS,-fosfatbufret saltløsning, GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD. 8. Vaskebuffer: TBST (50 mM Tris/HCi pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,1 %
Triton X-100).
9. Blokkeringsbuffer: TBST, 0,1 % etanolamin pH 7,4!
10. DMSO, Sigma, St. Louis, MO.
11. Kinasebuffer (KB): 20 mM HEPES/HC1 pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,1 % Triton X-100, 1 mM PMSF, 5 mg/l Aprotenin, 75 mM natriumortovabadatm 0,5 NN. DTT og 10 mM MgCl2. 12. ATP-blanding: 100 mM MgCl2, 300 mM ATP, 10 mCi y<33>P ATP (Dupont-NEN)/ml..
13. Stoppløsning: 1 % fosforsyre, Fisher, Pittsburgh, PA.
14. Wallac cellulosefosfatfiltermatter, Wallac, Turku, Finland.
15. Filtervaskeløsning: 1 % fosforsyre, Fisher, Pittsburgh, PA.
16. Tomtec platehøster, Wallac, Turku, Finland.
17. Wallac betaplateleser nr. 1205, Wallac, Turku, Finland.
18. NUNC 96-brønners V-buhnet polypropylenplater for forbindelser, Applied Scientific katalog nr. AS-72092.
Fremgangsmåte
Alle de følgende trinnene blir utført ved romtemperatur med mindre annet er spesifisert. 1. ELISA-pIatebelegging: ELISA-brønner blir belagt med 100 ml med sau anti-mus affinitetsrenset antiserum (1 mg/100 ml beleggingsbuffer) over natt ved 4°C. ELISA-plater kan bli benyttet i to uker når de lagres ved 4°C. 2. Inverter plate og fjern væske. Tilsett 100 ml med blokkeringsløsning og
inkuber i 30 min.
3. Fjern blokkeringsløsning og vask fire ganger med vaskebuffer. Tørk
platene på papirhåndkle for å fjerne overskudd av væske.
4. Tilsett 1 mg med antistoff spesifikt for RAF-1 til hver brønn og inkuber i
1 time. Vask som beskrevet i trinn 3.-
5. Tinn lysater fra RAS/RAF-infiserte Sf9-celler og fortynn TBST til 10 mg/100 ml. Tilsett 10 mg med fortynnet lysat til brønnene og inkuber i 1 time. Rist platen under inkubering. Negative kontroller mottar ikke lysat. Lysater fra RAS/RAF-infiserte Sf9 insektceller blir fremstilt etter at cellene er infisert med rekombinant bakulovirus ved en MOI på 5 for hver virus, og høste 48 timer senere. Celene blir vasket én gang med PBS og lysert i RIPA-buffer. Uløselig materiale blir fjernet ved sentrifugering (5 min. ved 1000 x g). Porsjoner med lysater blir frosset i ,tørris/etanol og kagret ved -80°C inntil de skal benyttes.
6. Fjern ikke-bundet materiale og vask som beskrevet over (trinn 3).
7. Tilsett 2 mg med T-MEK. og 2 mg med His-MAEPK pr. brønn og juster volumet til 40 ml med kinasebuffer. Fremgangsmåter for å rense T-MEK og MAPK fra cellekestrakter er tilveiebragt heri ved eksempel. 8. Prefortynn forbindelser (stamløsning 10 mg/ml DMSO) eller ekstrakter 20 ganger i.TBST pluss 1 % DMSO. Tilsett 5 ml av prefortynnet, forbindelser/ekstrakter til brønnene som beskrevet i trinn 6. Inkuber i 20 min. Kontroll mottar, ikke medikament. 9. Start kinasereaksjonen med tilsetting av 5 ml ATP-blanding, rist platene på en ELISA-platerister under inkubering. 10. Stopp kinasereaksjonen etter 60 min. ved tilsetting av 30 ml stoppløsning til hver brønn. 11. Plasser fosfocellulosematten og ELISA-platen i Tomtecplatehøsteren.
Høst og vask filteret med filtervaskeløsning som angitt i produsentens anbefaling. Tørk filtermattene. Forsegl filtermattene og plasser dem i en holder. Sett holderen inn i et radioaktivt deteksjonsapparat og kvantifiser den radioaktive mengden med fosfor på filtermattene.
i Alternativt kan 40 ml porsjoner fra individuelle brønner på assayplaten overføres' til de korresponderende posisjonene på fosfocellulosefiltermatten. Etter lufttørking av filtrene, putt dem i et trau. Beveg forsiktig på trauet, skift vaskeløsning med 15 min. intervaller i 1 time. Lufttørk filtermattene. Forsegl filtermattene og plasser
dem i. en holder som er passende for å måle den radioaktive fosforen i prøvene. Sett holderen i en deteksjonsanordning og kvantifiser den radioaktive fosforen på
filtermattene.
CDK2/ svklin A - inhibisionsassay
Dette assayet analyserer proteinkinaseaktiviteten til CDK2 i eksogene substrater.
Reagenser:'
A. Buffer A: (80 mM Tris (pH 7,2), 40 mM MgCl2), 4,84 g. Tris (F.W. = 121,1 g/mol), 4,07 g MgCl2 (F.W. = 203,31 g/mol) oppløst i 500 ml H20. Juster pH til 7,2 med HC1.
B. Histon Hl løsning (0,45 mg/ml Histon Hl og 20 mM HEPES pH 7,2: 5 g Histon Hl (Boehringer Mannheim) i 11,111 ml 20 mM HEPES pH 1, 2 (4,77 mg HEPES (F.W. = 238,3 g/mol) oppløst i 100 ml ddH20, lagret i 1 ml porsjoner ved
-80°C. C. ATP-løsning (60 pM ATP, 300 ug/ml BSA, 3 mM DTT): 120 pl 10 mM ATP, 600 pl 10 mg/ml BSA til 20 ml, lagret i 1 ml porsjoner ved -80°C. D. CDK2-Iøsning: cdk2/syklin A i 10 mM HEPES pH 7,2, 25 mM NaCl, 0,5 mM DTT, 10 % glyserol, lagret i 9 pl porsjoner ved -80°C.'
. Protokoll
1. Fremstill løsninger av inhibitorer på tre ganger den ønskede sluttassaykonsentrasjonen i ddH20/l5 % DMSO regnet på volum. 2. Fordel 20 pl med inhibitorer til brønner med polypropylen 96-brønners plater (eller 20 pl 15 % DMSP for positive og negative kontroller).. 3. Tin Histon Hl løsning (1 ml/plate), ATP-løsning (1 ml/plate pluss 1 porsjon for negativ kontroll), og CDK2-løsning (9 pl/plate). Oppbevar CDK2 på is inntil den skal benyttes. Porsjoner CDK2-løsning som er passende for å unngå' repeterte fryse- og tinesykluser. 4. Fortynn 9 pl CDK2-løsning i 2,1 ml buffer A (pr. plate). Bland. Fordel 20 pl i hver brønn.
5. Bland 1 ml Histon Hl.løsning med 1 ml ATP-løsning (pr. plate) i et 10
ml rør med skrutopp. Tilsett <y33>P ATP til en konsentrasjon på 0,15 pCi/20 pl (0,15 pCi/brønn i assay). Bland forsiktig for å unngå BSA skumming. Tilsett 20.pl til passende brønner. Bland platene på plateristér. For negativ kontroll, bland ATP-løsning med en tilsvarende mengde med 20 mM HEPES pH 7,2 og tilsett y<33>P ATP til en konsentrasjon på 0,15 pCi/20 pl løsning. Tilsett 20 pl til passende brønner.
6. La reaksjonen gå i 60 min.
7. Tilsett 35 pl 10 % TC A til hver brønn. Bland platene på en plateristér.
8. Plasser 40 pl av hver prøve på P30-filtermattefirkanter, Tillat mattene å tørke (omkring 10-20 min.). 9. Vask filtermattene 4x10 min. med 250 ml 1 % fosforsyre (10 ml fosforsyre pr. liter ddH20).
10. Tell filtermattene med beta-plateleser.
Cellulære/biologiske assay I PDGF- indusert BrdU inkor<p>orasionsassa<y>
Materialer og reagenser:
(1) PDGF: human PDGF B/B, 1276-956, Boehringer Mannheim, Tyskland. (2) BrdU-merkingsreagens: 10 mM i PBS (pH 7,4), kat. nr. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Tyskland. (3) FixDenat: fikseringsløsning (klar til bruk), kåt. nr. 1 647 229,
Boehringer Mannheim, Tyskland.
(4) Anti-BrdU-POD: mus monoklonalt antistoff konjugert med peroksidase,
kat. nr. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Tyskland.
(5) TMB-substratløsning: tetrametylbenzidin (TMB), klar til bruk, kat. nr.
1 647 229, Boehringer Mannheim, Tyskland.
(6) PBS-vaskeløsning: IX PBS, pH 7m4 (Sugen, Inc., Redwood City, Claifomia). (7) Albumin, bovin (BSA): fraksjon V-pulver A-8551, Sigma Chemical Co.,
USA.
(8) 3T3-cellelinje genetisk konstruert for å uttrykke human PDGF-R.
Protokoll
(1) Celler blir sådd med 8000 celler/brønn i DMEM, 10 % CS, 2 mM Gin i
en 96-brønners plate. Celler ble inkubert over natt ved 37°C i 5 % CO2.
(2) Etter 24 timer ble cellene vasket med PBS, og deretter serumsultet i
serumfritt medium (0 % CS DMEM med 0,1 % BSA) i 24 timer.
(3) På dag 3 blir ligand (PDGF, 3,8 nM, fremstilt i DMEM med 0,1 % BSA) og testforbindelser tilsatt til cellene samtidig. De negative kontrollbrønnene mottar serumfri DMEM med 0,1 % BSA alene,.de positive kontrollcellene mottar liganden (PDGF) men ikke testforbindelsen. Testforbindélser blir fremstilt i serumfri DMEM med ligand i en 96-brønners plate og serielt fortynnet for 7 testkonsentrasjoner. (4) Etter 20 timer med ligandaktivering blir fortynnet BrdU merkingsreagens.(l :100 i DMEM, 0,1 % BSA) tilsatt, og cellene ble inkubert med BrdU (sluttkonsentrasjon = 10 uM) i 1,5 timer. (5) Etter inkubering med merkereagens blir mediumet fjernet ved dekantering og tapping og platene invertert på et papirhåndkle. FixDenat-løsning ble tilsatt (50 ul/brønn) og platene ble inkubert ved romtemperatur i 45 min. på en plateristér. (6) FixDenat-løsningen blir nøye fjernet ved dekantering og tapping for å tørke platene på et papirhåndkle. Melk blir tilsatt (5 % dehydrert melk i PBS, 200 pl/brønn) som en blokkeringsløsning, og platene blir inkubert i 30 min. ved romtemperatur på en plateristér. (7) Blokkeringsløsningen blir fjernet ved dekantering, og brønnene blir vasket én gang med PBS. Anti-BrdU-POD-Iøsning (l:loo fortynning i PBS, 1 % BSA) blir tilsatt (100 ul/brønn) og platene blir inkubert i 90 min. ved romtemperatur på en plateristér. (8) Antistoffkonjugatet blir nøye fjernet ved dekantering og rensing av brønnene 5 ganger med PBS, og platene blir tørket ved å snu dem og tørke dem på
et papirhåndkle.
(9) TMB-substratløsning blir tilsatt (100 ul/brønn) og inkubert i 20 min. ved romtemperatur på en plateristér inntil fargeutvikling er tilstrekkelig for fotometrisk
. deteksjon. (10) Absorbansen av prøvene blir målt ved 410 nm (i "dual wavelength" måte med en filterleser ved 490 nm, som referansebølgelengde) på en Dynatech ELISA-plateleser.
EGF- indusert BrdU inkorporeringsassay
Materialer og reagenser
(1) EGF: mus EGF, 201, Toyobo, C6.3 Ltd. Japan..
(2) BrdU-merkingsreagens: 10 mM i PBS (pH 7,4), kat. nr. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Tyskland.
(3) FixDenat: fikseringsløsning (klar til bruk), kat. nr. 1 647 229,
Boehringer Mannheim, Tyskland.
(4) Anti-BrdU-POD: mus monoklonalt antistoff konjugert med peroksidase, kat. nr. 1 647 29, Boehringer Mannheim, Tyskland.
(5) TMB-substratløsning: tetrametylbenzidin (TMB), klar til bruk, kat. nr.
1 647 229, Boehringer Mannheim, Tyskland.
(6) PBS-yaskeløsning: IX PBS, pH 7,4 (Sugen, Inc., Redwood City,
California).
(7) Albumin, bovin (BSA): fraksjon V-pulver, A-8551, Sigma Chemical
Co., USA. (8) 3T3-cellelinje genetisk konstruert for å uttrykke human EGF-R.
Fremgangsmåte
(1) Cellene blir sådd ved 8000 celler/brønn i 10 % CS, 2 mM Gin i DMEM i
en 96-brønners plate. Cellene ble inkubert over natt ved 37°C i 5 % CO2.
(2) Etter 24 timer blir cellene vasket med PBS, og deretter blir de sultet for
serum i serumfritt medium (0 % CS DMEM med 0,1 % BSA) i 24 timer.
(3) På dag 3 blir liganden (EGF, 2 nM, fremstilt i DMEM med 0,1 % BSA) og testforbindelsen tilsatt til cellene samtidig. De negative kontrollbrønnene mottar serumfritt DMEM med 0,1 % BSA alene, de positive kontrollcellene mottar liganden (EGF) men ikke testforbindelse. Testforbindelsene blir fremstilt i serumfri DMEM med ligand i en 96-brønners plate, og serielt fortynnet for 7 testkonsentrasjoner. (4) Etter 20 timer med ligandaktivering blir fortynnet BrdU-merkingsreagens (1:100 i DMEM, 0,1 % BSA) tilsatt og cellene blir inkubert med BrdU (sluttkonsentrasjon = 10 uM) i 1,5 timer. (5) Etter inkubering med merkingsreagens blir mediumet fjernet ved dekantering, og ved å tørke de inverterte platene på et papirhåndkle. FixDenat-løsning blir' tilsatt (50 ul/brønn) og platene blir inkubert ved romtemperatur i 45 min. på en plateristér. (6) FixDenat-løsningen blir bøye fjernet ved dekantering og ved å tørke de inverterte platene på et papirhåndkle. Melk blir tilsatt (5 % dehydrert melk i PBS, 200 ul/brønn) som en blokkeringsløsning, og platene blir inkubert i 30 min. ved. romtemperatur på en plateristér. (7) Blokkeringsløsningen ble fjernet ved dekantering og brønnene ble vasket én gang med PBS. Anti-BrdU-POD-løsning (1:100 fortynning i PBS, 1 % BSA) ble tilsatt (100 pl/brønn) og platene ble inkubert i 90 min. ved romtempertur på en plateristér.
(8) Antistoffkonjugater blir nøye fjernet ved å dekantere og rense brønnene
5 ganger med PBS, platen blir tørket ved å invertere <p>g tørke platene på et papirhåndkle. (9) TMB-substratiøsningen blir tilsatt (100 pl/brønn) og inkubert i 20 min. ved romtemperatur på en plateristér inntil fargeutvikling er tilstrekkelig for fotometrisk deteksjon. (10) absorbansen av prøvene blir målt ved 410 nm (i "dual wavelength"
måte med en filterleser ved ,490 nm, som referansebølgelengde) på en Dynatech ELISA-plateleser.
EGF- indusert Her2- drevet BrdU- inkorporering
Materialer og reagenser
(1) EGF: mus EGF, 201, Toyobo, Co., Ltd. Japan.
(2) BrdU-merket reagens: 10 mM i PBS (pH 7,4), kat. nr. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Tyskland.
(3) FixDenat: fikseringsløsning (klar til bruk), kat. nr. 1 647 229,
Boehringer Mannheim, Tysklnad. '
(4) Anti-BrdU-POD: mus monoklonalt antistoff konjugert med peroksidase, kat. nr. l 647 229, Boehringer Mannheim, Tyskland.
(5) TMB-substratløsning: tetrametylbenzidin (TMB) klar til bruk, kat. nr.
1 647 229, Boehringer Mannheim, Tyskland.
(6) PBS-vaskeløsning: IX PBS, pH 7,4, laget på huset.
(7) Albumin, bovin (BSA): fraksjons V-pulver, A-8551, Sigma Chemical
Co., USA. t (8) 3T3-cellelinjer konstruert for å uttrykke en kimer reseptor som har den ekstracellulære domenen til EGF-R og den intracellulære domenen til Her2.
Protokoll
(1) Cellene blir sådd med 8000 celler/brønn i DMEM, 10 % CS, 2 mM Gin i
I
en 96-brønners plate. Celle blir inkubert over natt ved 37°C i 5 % CO2.
(2) Etter 24 timer blir cellene vasket med PBS og deretter blir de sultet for serum i serumfritt medium (0 % CS DMEM med 0,1 % BSA) i 24 timer. (3) På dag 3 blir ligand (EGF = 2 nM, fremstilt i DMEM med 0,1 % BSA) og testforbindelser tilsatt til cellene samtidig. De negative kontrollbrønnene mottar serumfri DMEM med 0,1 % BSA alene, de positive kontrollcellene mottar liganden (EGF) men ikke noen testforbindelse. Testforbindelsene blir fremstilt i serumfri . DMEM med ligand i 96-brønners plate, og serielt fortynnet til 7 testkonsentrasjoner. (4) Etter 20 timer med ligandaktiveririg blir fortynnet BrdU-merkingsreagens (1:100 i DMEM, 0,1 % BSA) tilsatt, og cellene blir inkubert med BrdU (sluttkonsentrasjon =10 uM= i 1,5 timer. (5) Etter inkubering med merkingsreagens blir mediumet fjernet ved dekantering, og tørking av de inverterte platene på papirhåndkle. FixDenat-løsning. blir tilsatt (50 ulfljrøfin), og platene blir inkubert ved romtemperatur i 45 min. på en plateristér. (6) FixDénat-løsningen blir nøye fjernet ved dekantering og ved å tørke de . inverterte platene på et papirhåndkle. Melk blir tilsatt (5 % dehydrert melk i PBS, 200 pl/brønn) som en blokkeringsløsning, og platene blir inkubert i 30 min. ved. romtemperatur på en plateristér. (7) Blokkeringsløsningen blir fjernet ved dekantering og brønnene blir vasket én gang med PBS. Anti-BrdU-POD-løsning (1:100 fortynning i PBS, 1 % BSA) blir tilsatt (100 ul/brønn), og platene blir inkubert i 90 min. ved romtemperatuar på en plateristér. (8) Antistoffkonjigatet blir nøye fjernet ved dekantering og ved å rense brønnene 5 gnager med PBS, og platene blir tørket ved å invertere dem og å tørke derri på papirhåndkle. (9) TMB-substratløsning blir tilsatt (100 ul/brønn) og inkubert i 20 min. ved romtemperatur på en plateristér inntil fargeutvikling er tilstrekkelig til fotometrisk deteksjon. (10) Absorbansen på prøvene blir holdt ved 410 nm (i "dual wavelength mode" med en filterlesing på 490 nm, som referansebølgelengde) på en Dynatech ELISA-plateleser.
IGFl- indusert BrdU inkorporeringsassay
Materialer og reagenser
(1) IGF 1-ligand: human, rekombinant, G511, Promega Corp., USA.
(2) BrdU-merkingsreagens: 10 mM i PBS (pH 7,4), kat. nr. 1 647 229,
Boehringer Mannheim, Tyskland. I
(3) FixDenat: fikseringsløsning (klar til bruk), kat. nr. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Tyskland.
(4) Anti-BrdU-POD: mus monoklonalt antistofIf konjugert med peroksidase,
kat. nr. 1 647 229, Boehringer, Mannheim, Tyskland.. ,
(5) TMB-substratløsning: tetrametylbenzidin (TMB), klar til bruk, kat. nr.
1 647 229, Boehringer Mannheim, Tyskland.
(6) PBS-vaskeløsning: IX PBS, pH 7,4 (Sugen, Inc., Redwood City, California).
(7) Albumin, bovin (BSA): fraksjon V-pulver, A-8551, Sigma Chemical
Co., USA.
(8) 3T3-cellelinje genetisk konstruert for å uttrykke human IGF-1 reseptor.
Protokoll
(1) Cellene blir sådd med 8000 celler/brønn i DMEM, 10 % CS, 2 mM Gin i
en 96-brønners plate. Cellene ble inkubert over natt ved 37°C i 5 % CO2.
(2) Etter 24 timer ble cellene vasket med PBS, og deretter blir de sultet for serum i serumfritt medium (0 % CS DMEM med 0,1 % BSA) i 24 timer.
(3) På dag 3-blir ligand (IGF1 = 3,3 nM, fremstilt i DMEM med 0,1 % BSA)
og testforbindelser tilsatt til'cellene samtidig. De negative kontrollbrønnene mottar . serumfri DMEM med 0,1 % BSA alene, de positive kontrollcellene mottar liganden (IGF1) men ikke testforbindelse. Testforbindelser blir fremstilt i serumfri DMEM med ligand i en 96-brønners plate, og serielt fortynnet for 7 testkonsentrasjoner.
(4) Etter 16 timer med ligandaktivering blir fortynnet BrdU-
merkingsreagens (1:100 i DMEM, 0,1 % BSA) tilsatt, og cellene blir inkubert med BrdU (sluttkonsentrasjon = 10 uM) i 1,5 timer. (5) Etter inkubering rried merkingsreagens blir mediumet fjernet ved dekantering og tørking av de inverterte platene på et papirhåndkle. FixDenat-løsning blir tilsatt (50 ul/brønn) og platene blir inkubert ved romtemperatur i 45 min. på en plateristér. (6) FixDénat-løsningen blir nøye fjernet ved dekantering for å tørke den inverterte plate på et papirhåndkle. Melk blir tilsatt (5 % dehydrert melk i PBS,
200 pl/brønn) som en blokkeringsløsning og platene blir inkubert i 30 min. ved romtemperatur på en plateristér.
(7) Blokkeringsløsningén blir fjernet ved dekantering og brønner blir vasket
én gang med PBS. Anti-BrdU-POD-løsnin g (1:100 fortynning i PBS, 1 % BSA)
ble tilsatt (100 ul/brønn), og platene ble inkubert i 90 min. ved romtemperatur på
en plateristér.
(8) Antistoffkonjugatet blir nøye fjernet ved dekantering og rensing av brønnene 5 ganger med PBS, og platene blir tørket ved invertering og ved å tørke dem på papirhåndkle.
(9) TMB-substratløsningen blir tilsatt (100 pl/brønn) og inkubert i 20 min.
ved romtemperatur på en plateristér inntil fargeutvikling er tilstrekkelig for fotometrisk deteksjon. (10) Absorbansen av prøvene blir målt véd 410 nm (i "dual wavelength» måte med en filterleser ved 490 nm, som eri referansebølgelengde) på en Dynatech ELISA-plateleser.
FGF- indusert BrdU inkorporeringsassay
Dette assayet måler FGF-indusert DNA-syntese i 3Tc7/EGFr-celler som utrykker endogene FGF-reseptorer.
Materialer og reagenser:
1. FGF: human FGF2/bFGF (Gibco BRL, nr. 13256-029).
2. BrdU-merkingsreagens (10 mM PBS (pH 7,4), Boehringer Mannheim kat. nr. 1 647 229).
3,. FixDenat fikseringsløsning (Boehringer Mannhemi kat. nr. 1 647 229).
4. Anti-BrdU-POD (mus monoklonal! antistoff konjugert med peroksidase, Boehringer Mannheim kat. nr. 1 647 229).
5. TMB (tetrametylbenzidin, Boehringer Mannheim kat. nr. 1 647 229).
6. PBS-vaskeløsning, pH 7,4 (Sugen, Inc.):
7. Albumin, bovin (BSA), fraksjon V-pulver (Sigma Chemical Co., kat. nr.
A-8551).
Fremgangsmåte
1. 3t3-konstruert cellelinje: 3T3c7/EGFr.
2. Celler blir sådd med 8000 celler/brønn i DMEM, 10 % CS og 2 mM Gin i
en 96-brønners plate. Inkubert 24 timer ved 37°C i 5 % C02.
3. Etter 24 timer vask cellene med PBS, og deretter sult dem for serum i
serumfritt medium (0 % DMEM, 0,1 % BSA) i 24 timer.
4. Tilsett ligand (FGF2 (1,5 nM i DMEM med 0,1 % BSA) og testforbindelse samtidig. Negative kontrollbrønnér mottar serumfri DMEM med 0,1
% BSA alene, positive kontrollbrønnér som mottar FGF2-ligand med ikke noe testforbindelse. Testforbindelser blir fremstilt i serumfri DMEM med ligand i en 96-brønners plate og serielt fortynnet for å lage (7) testkonsentrasjoner.
5. Etter 20 timer tilsett fortynnet BrdU-merkingsreagens (1:100 BrdU:DMEM), 0,1 % BSA, sluttkonsentrasjon er 10 uM) til celler og inkuber i 1,5 time. 6. Dekanter medium. Fjern rester av materialene med papirhåndkle. Tilsett FixDenat (50 ul/brønn) og inkuber ved romtemperatur ved 45 min. på en plateristér. 7. Fjern FixDénat-løsningen. Tilsett blokkeringsløsning (5 % dehydrert melk i PBS (200 pl/brønn)) og inkuber i 30 min. ved romtemperatur på en plateristér.
8. Dekanter blokkeringsløsningen, vask cellene én gang med PBS. Tilsett
I
anti-BrdU-POD-løsning (1:100 fortynning i PBS, 0,1 % BSA), inkuber i 90 min. ved romtemperatur på en plateristér.
9. Dekanter antistoffkonjugat, rens brønnene 5 ganger med PBS. Tørk platene ved å invertere dem på et papirhåndkle og ved å klappe forsiktig. 10. Tilsett TMB-løsning (100 ul/brønn), inkuber i 20 min. ved romtemperatur på en plateristér inntil fargeutvikling er tilstrekkelig for fotometrisk deteksjon. 11. Mål absorbansen ved ved 410 nM på en Dynatech ELISA-plateleser ved å benytte "Dual wavelength» måte med et filter ved 490 nM.
Biokjemisk EGFR assay
Dette assayet måler in vitro kinaseaktivitet av EGFR ved å benytte ELISA.
Materialer og reagenser
1. Coming 96-brønners ELISA-plater (Corning katalog nr. 25805-96). ,
2. SUMOl monoklonal anti-EGFR antistoff (Biochemistry Lab, SUGEN, Inc.). 3. PBS (Dulbeccos fosfatbufret saltløsning, Gibco katalog nr. 450-1300EB).
4. TBST-buffer
9. Adenosin-5'-trifosfat (ATP, fra hestemuskel, Sigma, kat. nr. A-5394).
Fremstill en 1,0 mM løsning i dH20. Dette reagenset bør lages opp umiddelbart før anvendelse og oppbevares på is.
10, MnCl2. <1>
Fremstill en 1,0 M stamløsning i drl^O.
11. ATP/MnCb fosforyleringsblanding
Dette reagenset bør fremstilles umiddelbart før anvendelse og oppbevares på is.
12. NUNC 96-brønners V-bunnet polypropylenplater (Applied Scientific
kat. nr. AS-72092).
13. Etylendiamintetraeddiksyre (EDTA).
Fremstill 200 mM arbeidsløsning i dH20. Justert til pH 8,0 med 10 N
NaOH.
14. Kanin polyklonalt anti-fosfotyrosinserum (Biochemistry Lab, SUGEN, Inc.).
15. Geit anti-kanin IgG-peroks.idasekonjugat (Biosource kat. nr. ALI0404).
16. ABTS (2,2<*->azino-bis(3-etylbenztiazolin-6-sulfonsyre), Sigma kat. nr. A-1888).
Bland først to ingredienser i omkring 900 ml dr^O, juster pH til 4,0 med fosforsyre. Tilsett ABTS, dekk over, la det sette seg i omkring 0,5 timer, filtrer. Løsningen må oppbevares i mørket ved 4°C inntil den skal brukes. 17. Hydrogenperoksid 30 % løsning (Fisher kat. nr. H325).
18. ABTS/H2O2
Bland 15 ml ABTS-løsning og 2,0 ul H2O2. Fremstill 5 min. før anvendelse.
19. 0.2MHCI.
Fremgangsmåte
1. Belegg Corning 96-brønners ELISA-plater med 0,5 ug SUMOl i 100 pl
PBS pr. brønn, lagre over natt i 4°C. I
2. Fjern ubundet SUMOl fra brønnene ved å snu platene og fjerne væsken.
Vask 1 x med dH20. Tørk platene på papirhåndkle for å fjerne overskudd av væske.
I
3. Tilsett 150 ug med hlokkeringsbuffer til hver brønn. Inkuber i 30 min. ved romtemperatur med risting.
4; Vask plate med 3x med deionisert vann, deretter én gang med TBST. Tørk platene på et papirhåndkle for å fjerne overskudd av væske og bobler.
5. Fortynn lysat i PBS (7 ug lysat/100 ul PBS).
.6. Tilsett 100 ul med. fortynnet lysat til hver brønn. iRist ved romtemperatur i 60 min.
7. Vask platene som beskrevet i 4 over.
8. Tilsett 120 fil TBS til ELISA-platene som inneholder fanget EGFR.
9. Fortynn testforbindelsen 1:10 i TBS i 96-brønners polypropylenplater
. (dvs. 10 pl forbindelse + 90 pl TBS).
10. Tilsett 13,5 pl fortynnet testforbindelse til ELISA-platen. Til kontrollbrønnér (brønner som ikke mottar testforbindelse), tilsett 13,5 pl TBS + 10
% DMSO.
11. Inkuber i 30 min. mens det ristes ved romtemperatur.. 12. Tilsett 15 pl fosforyleringsblanding direkte "til alle brønnene bortsett fra negative kontrollbrønnér som ikke mottar ATP/MriCl2 (sluttbrønnvolum bør være omkring 150 pl med 3 pM ATP/5 mM MnCl2 sluttkonsentrasjon i hver brønn). Inkuber 5 min. med.risting. 13. Etter 5 min. stopp reaksjonen ved tilsetting 16,5 pl med 200 mM EDTA (pH 8,0) til hver brønn, rist kontinuerlig. Etter at EDTA'en har blitt tilsatt, rist i 1 min.
14. Vask 4x med deionisert vann, to ganger med TBST.
15. Tilsett 100 pl anti-fosfotyrosin (1:3000 fortynning i TBST) pr. brønn. Inkuber 30-45 min. ved romtemperatur med risting. 16. Vask som beskrevet i 4 over. 17. Tilsett 100 pl Biosource geit anti-kanin IgG-peroksidasekonjugat (1:2000 fortyning i TBST) til hver brønn. Inkuber 30 min. ved romtemperatur ved risting.
18. Vask som beskrevet i 4 over.
19. Tilsett 100 pl med ABTS/H202-løsning til hver brønn.
20. Inkuber 5-10 min. med risting. Fjem bobler.
21. Dersom det er nødvendig stopp reaksjonen med tilsetning av 100 pl 0,2 M HC1 pr. brønn. 22. Les assay på Dynatech MR7000 ELISA-leser. Testfilter: 410 nm, referansefilter: 630 Nm.
Biokjemisk PDGFR assav
Dette assayet måler in vitro kinaseaktiviteten til PDGFR ved å benytte ELISA.
Materialer og reagenser
Med mindre annet er bemerket er fremstillingen av arbeidsløsning av de følgende reagensene den samme som den for biokjemisk EGFR-assay over. 1. Gorning 96-brønners ELISA-plater (Corning katalog nr. 25805-96). 2. 28D4C10 monoklonalt anti-PDGFR-antistoff (Biochemistry Lab, SUGEN, Inc.). 3. PBS (Dulbeccos fosfatbufret saltløsning, Gibco, katalog nr. 450-1300EB).
4. TBST-buffer.
5. Blokkeringsbuffer.
6. PDGFR-p* uttrykkende NIH 3T3 cellelysat (Screening Lab, SUGEN, Inc.).
7. TBS-buffer.'
8. TBS + 10% DMSO.
9. Adenosin-5'-trifosfat (ATP, fra Equine muskel, Sigma kat. nr. A-5394).
10. MnCl2.
11. Kinasebuffer fosforyleringsblanding.
12. NUNC 96-brønners V-bunnet polypropylenplater (Applied Scientific kat. nr. AS-72092).
13. Etylendiamintetraeddiksyre (EDTA).
14. Kanin polyklonalt anti-fosfotyrosinserum (Biochemistry Lab, SUGEN,
-Inc.).
15. Geit anti-kanin IgG peroksidasekonjugat (Biosource kat; nr. ALI0404). 16. 2,2'-azino-bis(3-etylbenztiazolin-6-sulfonsyre) (ABTS,. Sigma kat. nr. A-I 888).. - 17. Hydrogenperoksid 30 % løsning (Fisher kat. nr. H325).
18. ABTS/H2O2.
19. 0,2 MHC1. Fremgangsmåte 1. Belegg Corning 96-brønners ELISA-plater med 0,5 ug 28D4C10 i 100 ul PBS pr. brønn, lagre over natt ved 4°C. 2. Fjern ubundet 28D4C10 fra brønner ved å snu platene for å fjerne væsken. Vask lx med dH20. Tørk platene på et papirhåndløe for å fjerne overskydd av væske. 3. Tilsett 150 ul med blokkeringsbuffer til hver brønn. Inkuber i 30 min. ved
I
romtemperatur med risting.
4. Vask platene 3x med deionisert vann, deretter én gang med TBST. Tørk
platene på et papirhåndkle for å fjerne overskuss av væske og bobler.
5. Fortynn lysat i HNTG (10 ug lysat/100 ul HNTG).
6. Tilsett 1.00 ul med fortynnet lysat til hver brønn. Rist ved romtemperatur i
60 min.
7. Vask platene som beskrevet i 4 over.
8. Tilsett 80 ul arbeidskinasebufferblanding til ELISA-platen som
inneholder fanget PDGFR.
9. Fortynn testforbindelsen 1:10 i TBS i 96-brønners polypropylenplater
(dvs. 10 fil forbindelse + 90 fil TBS).
10. Tilsett 10 fil fortynnet testforbindelse til ELISA-plate. Til kontrollbrønnér (brønner som ikke mottar noen testforbindelse) tilsett 10 fil TBS + 10% DMSO.
■11. Inkuber i 30 min. mens det ristes ved romtemperatur.
12. Tilsett 10 fil ATP direkte til alle brønnene, bortsett fra negativ kontrollbrønn (sluttbrønnvolum skal være omkring 100 ul med 20 pM ATP i hver brønn). Inkuber 30 min. ved risting.. 13. Etter 30 min., stopp reaksjonen ved å tilsette 10 pl med 200 mM EDTA (pH 8,0) i hver brønn. 14. Vask 4x med deionisert vann, to ganger med TBST.
15. Tilsett 100 pl anti-fosfotyrosin (1:300.0 fortynning i TBST) pr. brønn.
. Inkuber 30-45 min. ved romtemperatur med risting.
16. Vask som beskrevet i 4 over.
17. Tilsett 100 pl Biosource geit anti-kanin IgG-peroksidasekonjugat (1:2000 fortynning i TBST) til hver brønn. Inkuber 30 min. ved romtemperatur med risting.
18. Vask som beskrevet i 4 over.
19. Tilsett 100 pl med ABTS/H202-løsning til hver brønn.
20. Inkuber 10-30 min. med risting. Fjern bobler.
21. Dersom nødvendig stopp reaksjonen med tilsetning av 100 pl 0,2 M HC1 pr. brønn. 22. Les assay på Dynatech MR7000 ELISA-leser: testfilter: 410 nM, referansefi.lter : 630 nM.
Biokjemisk FGFR assay
Dette assay måler in vitro kinaseakti vitet til Myc-GyrB-FGFR fusjonsproteinet ved å benytte ELISA.
I
Materialer og reagenser
1.HNTG
For å lage 1 liter med 5x stamløsning, løs opp HEPES og NaCl i omkring 350 ml dH20, juster pH til 7,2 med HC1 eller NaOH (avhengig av HEPES'en som blir benyttet), tilsett glyserol, Triton X-100 og deretter dH20 til volum. 2. PBS (Dulbeccos fosfat-bufret saltløsning, Gibco katalog nr. - 450-1300EB).
3. Blokkeringsbuffer.
4. Kinasebuffer.
5. Fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF, Sigma, kat. nr. P-7626):
Arbeidsløsning: 100 mM i etanol.
6. ATP (bakteriekilde, Sigma kat. nr. A-7699).
Benytt 3,31 mg pr. ml MilliQ H20 for en stamkonsentrasjon på 6 mM. 7. Biptinkonjugert anti-fosfotyrosinmab (klon 4G10, Upstate Biotéchnology Inc. kat. nr. 16-103, ser.nr. 14495). ' 8. Vectastain Elite ABC reagens (Avidin peroksidasekonjugat, Vector Laboratories kar. nr. PK6 100).
9. ABTS-løsning.
10. Hydrogenperoksid 30 % løsning (Fisher katalog nr. H325).
11. ABTS/H202. 12. 0.2MHC1. 13. TRIS HC1 (Fischer kat. nr. BP 152-5).
Fremstill 1,0 mM løsning i MilliQ H20, juster pH to 7,2 med HC1.
14. NaCl (Fisher kat. nr. S271-10).
Fremstill 5 M løsning i MilliQ H20.
I-
. 15. MgCl2 (Fisher kat. nr. M33-500).
16. HEPES (Fisher kat. nr. BP310-500).
Fremstill 1 M løsning i MilliQ H20, juster pH til 7,5, sterilfiltrer.
17. TBST-buffer.
18. Natriumkarbonatbuffer (Fisher kat. nr. S495).
Fremstill 0,1 M løsning i MilliQ H20, juster pH .til 9,6 med NaOH, filtrer.
. 19..Ditiotreitol (DTT, Fisher kat. nr. BP172-25).
Fremstill 0,5 mM arbeidslønning i MilliQ H20 rett før anvendelse. Lagre ved -20°C inntil anvendelse, fjern overskudd.
20. MnCl2.
21. Triton X-100.
22. Geit a-kånin IgG (Cappel).
23. Affinitetsrenset kanin a GST GyrB (Biochemistry Lab, SUGEN, Inc.).
Fremgangsmåte
Allé de følgende trinnene blir utført ved romtemperatur med mindre annet er indikert. 1. Belegg Corning 96-brønners ELISA-plater med 2 pg geit a-kanin antistoff pr. brønn i karbonbufferslik at det totale brønnvolumet er 100 pl.. Lagre over natt ved 4°C. 2. Fjern ubundet geit a-kanin antistoff ved å snu platene og fjerne væsken.
Tørk platene på et papirhåndkle for å fjerne overskudd av væske og bobler.
3. Tilsett 150 pl blokkeringsbuffer (5 % "Low Fat" melk i PBS) til hver brønn. Inkuber mens det ristes på en mikrotiterplaterister i 30 min. 4. Vask 4x med TBST. Tørk platene på et papirhåndkle for å fjerne
overskudd av væske og bobler.
5. Tilsett 0,5 ug kanin a-GyrB antistoff pr. brønn. Fortynn antistoff i DPBS til et sluttvolum på 100 pl pr. brønn. Inkuber méns det ristes på en mikrotiterplaterister ved romtemperatur i 1 time.
6. Vask 4x med TBST som beskrevet i trinn 4.
7. Tilsett 2 ug COS/FGFR-cellelysat (Myc-GyrB-FGFR-kilde) i HNTG til hver brønn for å gi et sluttvolum på 100 pl pr. brønn. Inkuber mens det ristes på en mikrotiterplaterister i 1 time.
8. Vask 4X med TBST som beskrevet i trinn 4.
9. Tilsett 80 pl med lx kinasebuffer pr. brønn.
10. Fortynn testforbindelsen 1:10 i lx kinasebuffer + I % DMSO i en
polypropylen 96-brønners plate.
11. Overfør 10 pl med fortynnet testforbindelseløsning.og kontrollbrønnér fra polypropylenplatebrønner til de korresponderende ELISA-platébrønnene, inkuber med risting på mikrotiterplaterister i 20 min. li. Tilsett 10 pl med 70 pM ATP fortynnet i kinasebuffer for positiv kontroll og testbrønner (slutt ATP-konsentrasjon er 7 pM/brønn). Tilsett 10 pl lx kinasebuffer til negative kontrollbrønnér. Inkuber med risting på en mikrotiterplaterister i 15 min.
13. Stopp kinasereaksjonen ved å tilsette 5 pl 0,5 M EDTA til alle
brønnene.
14. Vask 4x med TBST som beskrevet i trinn 4.
15. Tilsett 100 pl biotin konjugert a-fosfotyrosin mab (b4G10) fortynnet i .
TBST til hver brønn. Inkuber med risting på en mikrotiterplaterister i 30 min.
16. Fremstill Vectastain ABC reagens. Tilsett 1 dråpe reagens A til 15 ml TBST. Bland ved å snu rørene flere ganger. Tilsett 1 dråpe reagens B og bland igjen.
17. Vask 4x-med TBST som beskrevet i trinn 4.
18. Tilsett 1.00 pl ABC HRP reagens til hver brønn. Inkuber med risting på en mikrotiterplaterister i 30 min. 19. Vask 4x med TBST som beskrevet i trinn 4..
20. Tilsett 100 pl med ABTS/H202-løsning til hver brønn.
22. Inkuber 5^15 min. med risting. Fjern bobler.
23. Dersom nødvendig stopp reaksjonen ved å tilsette 100 pl med 0,2 M HCl/brønn. 24. Les assayet på Dynatech MR7000 ELISA-plateleser, testfilter: 410 nM, referansefilter: 630 nM.
Biokjemisk FLK- 1 assay
Dette assayet evaluerer fik-1 -autofosforyleringsaktivitet in vitro ved å benytte
ELISA.
Materialer og reagenser
1. 15 cm vevskulturskåler. 2. Flk-1/NIH-celler: NIH-fibroblastlinje som overtrykker human flk-1 klon
3 (SUGEN, Inc., skaffet fra MPI, Martinsried, Tyskland).
3. Dyrkningsmedium: DMEM pluss varmeinaktivert 10 % FBS og 2 mM glutamin (Gibco-BRL). 4. Sultemedium: DMEM pluss 0,5 % varmeinaktivert FBS, 2 mM glutamin
(Gibco-BRL).
5. Corning 96-brønners ELISA-plater (Coming kat. nr. 25805-96).
6. L4 eller E3 8 monoklonalt antistoff spesifikt for fik-1, renset ved
protein<:>A agaroseaffinitetskromatografi (SUGEN, Inc.).
7. PBS (Dulbeccos fosfatbufret saltløsning) Gibco kat. nr. 450-1300EB).
8. HNTG (se BIOKJEMISK FGFR for fremstilling).
9. Pierce BCA-proteinbestemmelseskit.
10. Blokkeringsbuffer.
11. TBST (pH 7,0)..
12. Kinasebuffer.
13. Kinase stoppløsning: 200 mM EDTA.
14. Biotinylert 4G10, spesifikk for fosfotyrosin (UBI, kat. nr. nr. 16-103).
15. AB kit (Vector Laboratories kat, nr. PK 4000).
16. DMSO.
17. NUNC 96-brønners V-bunnet polypropylenplater (Applied Scientific
kat. nr. AS-72092).
18..Turbo-TMB (Pierce).
19. Turbo-tMB stoppløsning: 1 M H2S04.
20. ATP (Sigma kat. nr. A-769.9).
21. 20 % DMSO i TBS (pH 7,0).
Fremgangsmåte
Celledyrking pg lysatfremstilling
1. Så cellene i dyrkningsmedium og dyrk i 2-3 dager til 90-100 % konfluens
ved 37°C og 5 % C02. Overskrid ikke passasje nr. 20. 2. Fjern mediumet og vask cellene to ganger med PBS. Lyser med HNTG-lyseringsbuffer. Samle alle lysatene og vorteksbland demi 20-30 sek. 3. Fjern uløselig materiale ved sentrifugering (5-10 min. ved omkring 10000
xg).
4. Bestem proteinkonsentrasjonen ved å benytte BCA7sett.
5. Del lysatene i 1 mg porsjoner, lagre ved -80°C.
Assay-prosedyre
1. Belegg Corning 96-brønners ELISA-plater med 2 ug/brønn renset L4
(eller E 38) i 100 ul med PBS. Lagre over natt ved 4°C.
2. Fjern ubundne proteiner fra brønner ved å snu platene og ved å fjerne væsken. Vask én gang med dH20, tørk platene med papirhåndkle for å fjerne væske. 3. Blokker platene med 150 pl blokkeringsbuffer pr. brønn. Inkuber i 45-60 min. med risting ved 4°C.
4. Fjern blokkeringsbufferen og vask ELISA-platene tre ganger med dH20
og én gang med TBST. Tørk platene på et papirhåndkle for å fjerne overskudd av væske.
5. Fortynn lysatene i PBS for å gi en sluttkonsentrasjon.på 50 ug/100 pl.
Tilsett 100 pl med fortynnet lysat til hver brønn. Inkuber med risting ved 4°C over natt. 6. Fjern ubundne proteiner fra brønnene ved å snu platene'. Vask som i trinn . 4.
I
7. Tilsett 80 pl med kinasebuffer til brønnene (90 pl til negative
kontrollbrønnér).
8. Fortynn testforbindelser (normalt 10 ganger) i brønner med en
polypropylenplate som inneholder 20 % DMSO i TBS.
9. Tilsett 10 pl med de fortynnede forbindelsene til ELISA-brønner som inneholder immobilisert flk-1 og rist. Kontrollbrønnér mottar ingen forbindelser. 10. Fra stam 1 mM ATP, fremstill 0,3 mM ATP-løsning i dHiO (alternativt
kan kinasebuffer benyttes).
11. Tilsett 10 pl med 0,5 mM ATP til alle brønnene bortsett fra de negative
kontrollene. Inkuber i 60 min. ved romtemperatur ved risting.
12. Etter' 1 time stoppes kinasereaksjonen ved å tilsette 11 pl 200 mM
EDTA. Risti 1-2 min.
13. Vask ELISA-platen 4 ganger med dr^O og to ganger med TBST. .14. Tilsett 100 pl med 1:5000 biotinylert 4G10:TBST til alle brønnene.
Inkuber 45 min. med risting ved romtemperatur:
15. Mens det ovennevnte inkuberes, tilsett 50 pl med løsninger A og B fra ABC-settet til 10 ml med TBST. Disse løsningene må bli blandet omkring 30 min. før anvendelse.
16. Vask platene som i trinn 4.
17. Tilsett 100 pl med det fordannéde A og B komplekset til alle brønnene.
Inkuber 30 min. med risting ved romtemperatur.
18. Vask platene som i trinn 4.
19. Tilsett 100 pl turbo-TMB. Rist ved romtemperatur i 10-15 min. 20. Når fargen i de positive kontrollbrønnene når en absorbanse på omkring 0,35-0,4, stopp reaksjonen med 100 pl med turbu-TMB stoppløsning. 21. Les platene på Dynatech MR7000 ELISA-leser, testfilter: 450nM, referansefilter: 410 nM.
HUV- EC- C assay
Den følgende protokollen kan bli benyttet for å måle en forbindelses aktivitet mot PDGF-R, FGF-R, VEGF, aFGF eller Flk-1/KDR, alle som naturlig uttrykkes av HUV-EC-celler.
Pag 0
1. Vask og trypsiner HUV-EC-C-celler (humane navlestrengvene-endotelceller, (American Type Culture. Collection, katalog nr. 1730 CRL). Vask med Dulbeccos fosatbufret saltløsning (D-PBS, skaffet til veie fra Gibco BRL, katalog nr. 14190-029) 2 ganger med omkring 1 ml/10 cm<2> av vevskulturflasken. Trypsiner med 0,05 % trypsin-EDTA i ikke-enzymatisk celledissosiasjonsløsning (Sigma Chemical Company, katalog nr. C-1544). Den 0,05 % trypsinen blir laget ved å fortynne 0,25 % trypsin/1 mM EDTA (Gibco, katalog nr. 25200-049) i celledissosiasjonsløsningen. Trypsin med omkring 1 ml/25-30 cm ved vevskulturflaske i omkring 5 min. ved'37°C. Etter at cellene har løsnet fra flasken tilsett et like volum som assaymedium og overfør til et 50 ml sterilt sentrifugeringsrør (Fisher Scientific, katalog nr. 05-539-6).
2. Vask cellene med omkring 35 ml assaymedium i det 50 ml sterile sentrifugerøret ved å tilsette assaymediumet,. sentrifugere i 10 min. ved omkring 200 x g, sug av supematanten og resuspender med 35 ml D-PBS. Repeter vasken to ganger til med D-PBS, resuspender cellene i omkring 1 ml assaymedium(15 cm<2>
med vevskulturflaske. Assaymedium består av F12K-medium (Gibco BRL, katalog nr. 211127-014) og 0,5 % varmeinaktivert føtalt bovint serum. Del cellene med Coulter Counter<®> (Coulter Electronics, Inc.) og tilsett assaymedium til cellene for å oppnå en konsentrasjon på 0,8-1,0 x 10<5> celler/ml.
3. Tilsett celler til 96-brønners flatbunnede plater med 100 ul/brønn, eller 0,8-1,0 x 10<4> celler/brønn, inkuber -24 timer ved 37°C, 5 % C02-
Dag 1
1. Lag to ganger testforbindelsestitreringer i separate 96-brønners plater, generelt 50 pM og ned til 0 pM. Anvend det samme assaymediumet som nevnt i dag 0, trinn 2 over. Titreringer blir gjort ved å tilsette 90 pl/brønn med testforbindelse ved 200 pM (4X sluttbrønnkonsentrasjonen) til toppbrønnen på en spesiell platekolonne. Siden stamtestforbindelsen vanligvis er 20 mM i DMSO, inneholder de 200 pM medikamentkonsentrasjonene 2 % DMSO.
En fortynning gjort opp til 2 % DMSO i assaymedium (F12K + 0,5 % føtalt bovint serum) blir benyttet som fortyhningsniiddel for testforbindelsestitreringene for å . fortynne testforbindelsen, men å holde DMSO-konsentrasjonen konstant. Tilsett dette fortynningsmidlet til de gjenværende brønnene i kolonnen med 60 ul/brønn.
Ta 60 pl fra de 120 pl méd 200 pM testforbindelsesfortynning i toppbrønnen av kolonnen, og bland med de 60 pl i den andre brønnen i kolonnen. Ta 60 pl fra denne brønnen og bland med de 60 pl i den tredje brønnen på kolonnen, og så
videre inntil to gangers titreringer er fullstendig. Når den ved siden av den siste brønnen er blandet, ta 60 pl av de 120 pl i denne brønnen og kast det. Etterlat den siste brønnen med 60 pl med DMSP/medium fortynnet som en ikke-testforbindelsesinneholdende kontroll. Lag 9 kolonner med titrerte testforbindelser,
nok til triplikatbrønner hver for: (1) VEGF (fremskaffet fra Pepro Tech Inc.,
katalog nr. 100-200, (2) endotelcellevekstfaktor (ECGF) (også kjent som sur fibroblastvekstfaktor eller aFGF) (skaffet fra Boehringer Mannheim Biochemica,.
katalog nr. 1439 600), eller (3) human PDGF B/B (1276-956, Boehringer Mannheim, Tyskland) og assaymediakontroll. ECGF kommer som en preparering
med natriumheparin.
2. Overfør 50 pl/brønn med testforbindelsefortynninger til de 96-brønners assayplatene som inneholder 0,8-1,0 x IO<4> celler/100 ul/brønn med HUV-EC-C-cellene fra dag 0 og inkuber ved ~2 timer ved 37°C, 5 % CO"2.
3.1 triplikat, tilsett 50 ul/brønn med 80 ug/ml VEGF, 20 ng/ml ECGF eller mediumkontroll til hver testforbindelsestilstand. Som med testforbindelsene er vekstfaktorkonsentrasjonene 4X den ønskede sluttkonsentrasjonen. Benytt assaymediumet fra dag 0 trinn 2, for å lage konsentrasjoner med vekstfaktorer. Inkuber omkring 24 timer med 37°C, 5 % C02- Hver brønn vil ha 50 ul testforbindelsesfortynning, 50 pl vekstfaktor eller medium og 100 pl celler, noe som gir 200 pl/brønn totalt. Således blir 4X konsentrasjonene med testforbindelse og vekstfaktorer IX, straks alt har blitt tilsatt til brønnene. 1 ■
Dag 2
1. Tilsett 3H-tymidin (Amersham, katalog nr. TRK-6.86) med 1 <p>Ci/brønn (10 pl/brønn med 100 pCi/ml løsning laget opp i RPMI-medium + 10 % varmeinaktivert føtalt bovint serum) og inkuber ved -24 timer ved 37°C, 5 % C02. RPMI skaffes tilveie fra Gibco BRL, katalog nr. 11875-051.
PAG 3
1. Frys platene over natt ved -20°C.
DAG 4
Tin platene og høst med en 96-brønners platehøster (Tomtec Harvester 96<®>) på filtermatter (Wallac, katalog nr. 1205-401), les tellingene på en Wallac Betaplate™ . væskescintillasjonsteller.
In vivo dyremodeller
Xenotransplantasions dyremodeller
Evnen humane tumorer har til å vokse som xenotransplantasjoner i atymiske mus (f.eks. Balb/c, nu/nu) tilveiebringer en nyttig in vivo modell for å studere den biologiske responsen på terapier for humane tumorer. Siden den første suksessfulle xenotransplantasjonen av humane tumorer i atymisk mus (Rygaard og Povlsen, 1969, Acta Pathol. Microbial. Scand. 77:758-760),' har mange ulike humane tumorcellelinjer (f.eks. bryst, lunge, genitourinary, gastro-intestinal, hode og nakke, glioblastom, ben og maligne melanomer) blitt transplantert og dyrket med suksess i nakne mus. De følgende assayene kan bli benyttet for å bestemme nivået av aktivitet, spesifisitet og effekt av de ulike forbindelsene på den foreliggende . oppfinnelsen, tre generelle typer med assay er nyttige for å evaluere forbindelser: cellulær/katalytisk, cellulær/biologisk og in vivo. Hensikten med de cellulære/katalytiske assayene er å bestemme effekten av en forbindelse på evnen
til en TK til å fosforylere tyrosiner på et kjent substrat i en celle. Hensikten med de cellulære/biologiske assayene er å bestemme effekten av en forbindelse på den biologiske responsen stimulert av en TK i en celle. Hensikten med in vivo assayene
er å bestemme effekten av en forbindelse i en dyremodell på en spesiell sykdom såsom kreft.
Passende cellelinjer for subkutan xenotransplantasjonseksperimenter inkluderer C6-celler (glioma, ATCC nr. CCL 107), A375-celler (melanom, ATCC nr. CRL 1619), A431 -celler (epidermoid karsinom, ATCC nr. CRL 1555), Calu 6 celler (lunge, ATCC nr. HTB 56), PC3-celler (prostata, ATCC nr. CRL 1435), SKOV3TP5-celler og NIH 3T3-fibroblaster genetisk konstruert for å overuttrykke EGFR, PDGFR, IGF-IR og en hvilken som helst annen kinase. Den følgende protokollen kan bli benyttet for å utføre xenotransplantasjonseksperimenter: Hunn atymiske mus (BALB(c,. nu/nu) blir skaffet til veie fra Simonsen Laboratories (Gilroy, CA). Alle dyr blir opprettholdt under stefilromstilstander i mikroisolatorbokser med alfa-dri-underlag. De mottar sterilt rottefSr og vann ad libitum.
Cellelinjer blir dyrket i passende medium (f.eks. MEM, DMEM, Ham's F10, eller Ham' s F12 pluss 5 %-10 % føtalt bovint serum (FBS) og 2 mM glutamin (GLN)). Alle celledyrkningsmediene, glutamin og føtalt bovint serum blir skaffet til veie fra Gibco Life Technologies (Grand Island, NY) med mindre annet er spesifisert. Alle cellene blir dyrket i fuktig atmosfære med 90-85 % luft og 5-1.0 C02 ved 37°C.~ Alle cellelinjene blir rutinemessig splittet to ganger i uken og er negative for mykoplasma bestemt ved Mycotect metoden (Gibco).
Cellene blir høstet ved eller nær konfluens med 0,05 % Trypsin-EDTA, og kjørt ned til en pellet ved .450 x g i 10 min. Pelletene blir resuspendert i steril PBS eller medium (uten FBS) til en spesiell konsentrasjon, og cellene blir implantert i bakenden på musen (8-10 mus pr. gruppe, 2-10 x IO<6> celler/dyr). Tumorvekst blir målt over 3-6 uker ved å benytte vene calliper ("venier calipers1'). Tumorvolumer blir beregnet som produktet av lengde x bredde x høyde med mindre annet er indikert. P-verdier blir beregnet ved å benytte Students t-test. Testforbindelser i 50-100 ul tilsetningsstoff (DMSO eller VPD:D5 W) kan bli levert ved IP-injeksjon ved ulike konsentrasjoner som generelt starter ved dag én etter implantering.
Tumor invasionsmodeU
Den følgende tumor invasjonsmodellen har blitt utviklet og kan bli benyttet for evalueringen av terapeutisk verdi og effekt av forbindelsene identifisert til selektivt å inhibere KDR/FLK-1 reseptor.
Fremgangsmåte
8 uker gamle nakne mus (hunn) (Simonsen Inc.) blir benyttet som eksperimentdyr.
Implantasjon av tumorceller kan bli utført i en "laminar flow hood". For anestesi blir xylazin/ketamin cocktail (100 mg/kg ketamin og 5 mg/kg xylazin) administrert intraperitonealt. Et midtlinjesnitt blir gjort for å eksponere bukhulen (omkring 1,5 cm i lengde) for å injisere IO7 tumorceller i et volum på 100 ul medium. Cellene blir injisert enten i duodenal lapp i pankreas, eller under serosa i colon. Peritoneum . og muskler blir lukket med en 6-0 silkekontinuerlig søm, og huden blir lukket ved å benytte sårklips. Dyrene blir observert daglig.
Analyse
Etter 2-6 uker, avhengig av helhetsobservasjoner av dyrene, blir musene avlivet, og de lokale tumormetastasene i ulike organer (lunge, lever, hjerne, mage, milt, hjerte, muskel) blir kuttet ut og analysert (målt for tumorstørrelse, grad av invasjon, immunkjemi, in situ hybridiseingsdeterminering, osv.).
Målinger av celletoksisitet
Terapeutiske forbindelser bør være mer kraftige i å inhibere reseptortyrosinkinaseaktivitet enn i å gi cytotoksisk effekt. En måling av effektiviteten og cellétoksisiteten av en forbindelse kan oppnås ved a bestemme den terapeutiske indeksen, dvs. ICso/LDso- IC50, dosen som kreves for å oppnå 50 % inhibisjon, kan bli målt ved å benytte standard teknikker såsom de beskrevet heri. LD50, dosen som resulterer i 50 % toksisitet, kan også bli målt ved standard teknikker (Mossman. 1983. J. Immunol. Methods. 65:55-63) ved å måle mengden LDH som frigis (Korzeniewski og Callewaert, 1983, J. Immunol. Methods. 64:313,. Decker og Lohmann-Matthes, 1988, i . Immunol. Methods. 115:61), eller ved å måle den dødelige dosen i dyremodeller. Forbindelser med en stor terapeutisk indeks er foretrukket. Den terapeutiske indeksen bør være større enn 2, fortrinnsvis minst 10, mer fortrinnsvis minst 50..
B. Eksempler - biologisk aktivitet Eksempler på in vitro kraftfullheten av forbindelser i henhold til den foreliggende oppfinnelsen er vist i tabell 1 og 2. Dataene viser at forbindelsene generelt er ganske kraftige mot ulike PTK'er in vitro. Forbindelsene opprettholder også utmerket aktivitet når testet in vivo. F.eks. viser flere av forbindelsene fra den foreliggende oppfinnelsen, når de administreres oralt, markert redusert gjennomsnittelig størrelse på C6 gliom tumorer subkutant implantert i mus. Imidlertid var forbindelse 5 merkbart bedre enn de andre forbindelsene i den foreliggende oppfinnelsen. I ett eksperiment ble C6 humane gliomaceller (3 X IO<6 >celler, n = 10-20 dyr/gruppe) implantert subkutant i bakdelen på hunn BALB/c nu/nu mus på dag 0. Oral administrering av forbindelser 3, 5, 19 og 20 i vandig Iabrasol ved 200 mg/kg/dag begynte én dag etter implantering. Tumorvekst ble målt ved å benytte "vernier calipers" og tumorvolumer ble beregnet som produktet av lengden x bredden x høyden. I
Som vist i den følgende grafen viste alle forbindelsene som ble testet en markert inhibisjon sammenlignet med kun transpbrtmiddelkontrollen. Imidlertid skiller forbindelse 5 seg overraskende og klart ut fra de andre, tatt i betraktning den nære strukturelle likheten til forbindelsene som ble testet. Det vil si at mens forbindelser 3, 19 og 21 samlet seg omkring 40-45 % inhibisjon av tumorvekst ved dag 18 etter implantasjon, inhiberer forbindelse 5 tumorvekst med 80-85 % på det tidspunktet.
■ Den uventede effekten av forbindelse 5 in vivo, spesielt ved oral administrering,
blir videre demonstrert når den blir sammenlignet med forbindelse 65:
Forbindelse 65 manifesterer nesten en størrelsesorden større kraftfullhet in vitro enn forbindelse 5 (data ikke vist). Imidlertid, når de testes intraperetonealt i mus mot to ulike tumorcellelinjer, SF763T og SF767T, er forbindelse 5 fra litt (5 % mer inhibisjon ved da 21) til merkbart (14 % kraftigere inhibisjon ved 21 dager) mer effektiv enn forbindelse 65.
Forskjellen i aktivitet mellom forbindelse 5 og forbindelse 65 er enda større når de to forbindelsene blir administrert oralt. Den orale effekten av forbindelse 65 og flere av dens analoger, forbindelser 66-69, er vist grafisk under:
Som det kan ses av grafen viser forbindelse 65 administrert oralt med 200
mg/kg/dag, omkring 65 % inhibisjon av C6-tumorer 18 dager etter subkutan implantering i mus, som er merkbart overlegent til dens egne analoger, som gir i gjennomsnitt omkring 14-16 % inhibisjon av tumorvekst. Overraskende nok er imidlertid den orale effekten av forbindelse 65 fremdeles merkbart mindre enn den til forbindelse 5, som, som bemerket over, demonstrerer 80-85 % inhibisjon på det samme tidspunktet i den samme tumonnodellen.
Når man sammenligner med forbindelse 70, viser forbindelse 5 signifikant mindre
(dvs. kraftigere potens) Kj'er (inhibisjonskonstanter) mot FGF-R1 (1,2 for forbindelse 5 versus 19,49 for forbindelse 70) og PDGFR (data ikke vist).
Den uventede overlegenheten til forbindelse 5 blir videre demonstrert når dens
orale effekt blir sammenlignet med den til en nær analog, forbindelse 71:
. Til tross for den strukturelle likheten viser, når den testes oralt med 200 mg/kg/dag mot subkutant implantert C6 humane melanomtumorer i BALB/c nu/nu mus, ved 18 dager etter implantasjon, forbindelse 71 bare 57 % inhibisjon av tumorvekst (data ikke vist), sammenlignet igjen med de 80-85 % inhibisjon som vises av forbindelse 5.
Basert på den ovennevnte overraskende effekten av forbindelse 5 hår den administreres oralt, er forbindelse 5 på det nåværende tidspunkt en foretrukket utforming av den foreliggende oppfinnelsen.
KONKLUSJON
Således skal det forstås at forbindelsene, fremgangsmåtene og farmasøytiske sammensetninger i den foreliggende oppfinnelsen er effektive i å modulere PK-. aktivitet, og derfor antas å være effektive som terapeutiske agens mot RTK, CTK-, og STK-relaterte sykdommer.
En person med kunnskaper i faget vil innse at den foreliggende oppfinnelsen er vel tilpasset til å utføre hensiktene og å oppnå målene og fordelene som eir nevnt, såvel som de som er. iboende heri. De molekylære kompleksene og fremgangsmåtene, prosedyrer, behandlinger, molekyler, spesifikke forbindelser beskrevet heri er på det nåværende tidspunkt representative for foretrukne utforminger,, er eksemplifiserende, og er ikke ment å være begrensende for omfanget av • oppfinnelsen. Endringer deri og andre anvendelser vil åpenbare seg for personer med kunnskaper i faget, og er omfattet innen ånden til oppfinnelsen og er definert i omfanget av kravene.
Det vil være åpenbart for en person med kunnskaper i faget at varierende substitusjoner og modifikasjoner kan bli gjort i oppfinnelsen som er lagt frem heri, uten å avlede fra omfanget og ånden ved oppfinnelsen.
Alle patenter og publikasjoner som er nevnt i spesifikasjonen er indikative på nivåene for personer med kunnskaper i faget som oppfinnelsen henvender seg til. Alle patenter og publikasjoner er herved inkorporert ved referanse i samme grad som om hver individuelle publikasjon var spesifisert og individuelt indikert for å være inkorporert ved referanse.
Oppfinnelsen slik den illustrativt er beskrevet heri kan bli utført i fraværet av et hvilket som helst element eller elementer, begrensning eller begrensninger, som
ikke spesifikt er angitt heri. Således kan, f.eks., hver gang heri et hvilket som helst av begrepene "omfatter", "i det vesentlige består av" og "betår av" bli erstattet med et hvilket som helst av de to andre begrepene. Begrepene og uttrykkene som har blitt benyttet er benyttet for å være beskrivende og ikke begrensende, og det er ingen hensikt at det i bruken av. slike begreper og ekspresjoner skal ekskluderes noen ekvivalenter.av trekkene som er vist og beskrevet i deler derav, men det skal
gjenkjennes at ulike modifikasjoner er mulige innenfor omfanget av oppfinnelsen som kreves. Således skal det forstås at selv om den foreliggende oppfinnelsen har spesifikt blitt angitt med foretrukne utforminger og eventuelle trekk, kan modifikasjoner og variasjoner av konseptene heri angitt bli gjort av personer med kunnskaper i faget, og at kvalifikasjonene og variasjonene anses for å være innenfor omfanget til den foreliggende oppfinnelsen slik den er definert i de vedlagte kravene.
I tillegg, der trekk eller aspekter ved oppfinnelsen er beskrevet i form av "Mårkush
groups", vil personer med kunnskaper i faget gjenkjenne at oppfinnelsen også derved er beskrevet i form av et hvilket som helst individuelt medlem eller undergruppe av medlemmer av "Markush group". F.eks., dersom X er beskrevet til å kunne være valgt fra gruppen som består av bromin, klorin, og jodin, er krav for X for denne angis å være bromin, og krav for X der denne angis å være bromin og klorin, fult beskrevet.
Andre utforminger er. dekket av de følgende kravene.

Claims (18)

1. Pyrrolsubstituert 2-indolinon, karakterisert ved at den har den kjemiske strukturen: hvori: R<1>; R2 og R7 er hydrogen; R<3> er H, C]-C6-alkyl, eventuelt substituert med OH; R<4> og R' er uavhengig valgt fra gruppen som består av: hydrogen; aminsulphonyl eventuelt substituert med Ci-Cg-alkyl; hydroksy; Ci-Cfi-alkoksykarbonyl; halo; usubstituert Ci-Ce-alkyl; Ci-C6-alkyl substituert med karboksy; usubstituert OCe-alkoksy; I karboksy; usubstituert fenyl; fenyl substituert med en eller flere usubstituerte Cj-Ce-alkylalkoksy; morfolin; eller morfolinylsulfonyl; R6 er hydrogen; R<8> er H eller Ci-C6-alkyl; R<9> er -(CH2)(CH2)-C(=0)OH; morfolinyl eller di-Ct-C6-alkylamin; R<10> er usubstituert Ci-C6-alkyl.
2. Forbindelse, karakterisert ved at den har strukturen kalt 3-[2,4-dimetyl-5-(2-okso-I,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-lH-pyrrol-3-yl] propionsyre.
3. Forbindelse i følge krav 1, karakterisert ved at' R<3>er hydrogen eller Ci-C6-alkyl, eventuelt substituert med OH; R4 og R<5> er uavhengig valgt fra gruppen bestående av: hydrogen; halo; usubstituert Ci- C$ alkyl; Ci-Cg alkyl substituert med karboksy; | usubstituert Ci-C6-alkoksy; fenyl substituert med en eller flere usubstituerte Ci-C6-aikyIaikoksy, morfolin eller morfolinylsulfonyl; R6 ér hydrogen. ■
4. Forbindelse i følge krav 1, karakterisert ved at: R<3> er hydrogen eller Ci-Cé -alkyl, eventuelt substituert med OH, R<*>og R<5> er uavhengig valgt fra gruppen bestående av: hydrogen, halo, usubstituert Cj-Ce-alkyl, . fenyl substituert med en eller flere usubstituerte Ci-Ce-alkoksygrupper, aminsulfonyl substituert med Ci-Cc-alkyl; og R<6> er hydrogen;
5. Forbindelse valgt fra gruppen bestående av: 3-[5-(5-Klor-2-okso-l,2-dihydroindol-3-ylidénmetyl)-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-yl]-propionsyre, 3-[2,4-Dimetyl-5-(2-okso-l,2-dihydroindol-3-ylidenmetyi)-lH-pyrrol-3-yl]-propionsyre, 3-[5-(5-Brom-2-okso-l,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-yl]-rpropionsyre, 3-[5-(5-Iod-2-okso-l,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-yl]-propionsyre, ■I 3-(2,4-Dimetyl-5-(4-metyl-2-okso yl]-propionsyre, 3-[2,4-Dimetyl-5-(5-metyl-2-okso-l,2-dihydroin^ . yl]-propionsyre, 3-[5-(6-Hydroksy-2-okso-l,2-dihydroindol-3-ylidenrnetyl)-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-yl]-propionsyre, 3-[5-(6-Metoksy-2-okso-1,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-2,4^dimetyl-1 H-pyrrol-3-yl]-propiorisyre, 3-{5-[6-(3-Metoksyfenyl)-2-okso-l,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl]-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-yl}-propionsyre, 3-{5-[6-(3-Etoksyfenyl)-2-okso-l,2-dihydroindoi-3-ylidenmetyl]-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3 -yl} -propionsyre, 3-[2,4-Dimetyl-5-(2-okso-6-fenyl-l,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-lH-pyrrol-3-yl]-propionsyre, 3- {5-[6-(4-Metoksyfenyl)-2-okso-1,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl]-2^4-dimetyl-1H-pyrrol-3-yl}-propionsyre, 3-{5-[6-(2-Metoksyfenyl)-2-okso-l,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl]-2,4-dimetyl-lH-pyrrol-3-yl}-propionsyre, 3-[2,4-Dimetyl-5-(6-morfolin-4-yl-2-okso-1,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl) -1H-pyrrol-3-yl]-propionsyre, og 3-[5-Klor-4-metyl-2-okso-l,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-2,4-dimetyl-lH-pyrrol- I 3-yl]-pro'pionsyre.
6. Forbindelse valgt fra gruppen bestående av: 3-[3.,5-Dimetyl-4-(3-morfolin-4-ylpropyl)- lH-pyrroI-2-ylmetylen]-1,3-dihydroindol-2-on 5-Brom-3-[3)5-dirnetyl-4-(3-rnorfolin-4-ylpropyl)-lH-pyrrol-2-ylmetylen]-l,3-dihydroindol-2-on 3-[3,5-Dimetyl-4-(3-morfolin-4-ylpropyl)-lH-pyrrol-2-ylmetylen]-6-fenyl-l,3> dihydroindol-2-on 3-t3,5-Dimetyl-4-(3-morfolin-4-ylpropyl)-lH-pyrrol-2-ylmetylen]-6-(2-methoksyfenyl)-l ,3-dihydroindol-2-on 3-[3,5-Dimetyl-4-(3-morfolin-4-ylpropyl)-lH-pyrrol-2-ylmetylen]-6-(3-metoksyfehyl)-1,3-dihydroindol-2-on 3-[3,5-Dimetyl-4-(3-rnorfolin-4-ylpropyl)-lH-pyrrol-2-ylmetylen]-6-(4-metoksyfenyl)-1,3-dihydroindol-2-on 3-[4-(3-Dimetylaminpropyl)-3,5-dirnetyl-lH-pyrrol-2-ylmetylen]-l,3-dihydroindol-2- on 5-Brom-3-[4-(3-dimetylaminpropyl)-3,5-dimetyl-lH-pyrrol-2-ylmetylen]-l,3-dihydroindol-2-on
3- [4-(3-Dimetylaminpropyl)-3,5-dimetyl-lH-pyrroI-2-ylmetylen]-6-fenyl-l,3-dihydroindol-2-on 3-[4-(3-Dimetylaminpropyl)-3,5-dimetyl-lH-pyrrol-2-ylmetylen]-6-(2-metoksyfenyl)-l,3-dihydroindol-2-on 3-[4-(3-Dimetylaminpropyl)-3,5-dimetyl-1 H-pyrrol-2-ylmétyIee]-6-(3-" metoksyfenyl)-1,3-dihydroindol-2-on 3-[4-(3-DimetylaminpropyI)-3,5-dimetyI-IH-pyrrol-2-yImetylen]-6-(4-metoksyfenyl)-l ,3-dihydroindol-2-on I 5- Klor-3-[4-(3-dimetyIamm^ dihydroindol-2-on 6- KlorO-[4-(3-dimetyraminpropyl)-3;5-dimetyl-1 H-pyrrol-2-ylmetylen]-l,3-dihydroindol-2-on 3-[4-(3-Dimetylaminpropyl)-3,5-dimetyl-1 H-pyrrol-2-ylmetylen]-5-metoksy-l ,3-dihydroindol-2-dn 3-[4-(3-Dimetylaminpropyl)-3,5-dimetyl-lH-pyrrol-2-ylmetylen]-6-metoksy-l,3-dihydroindol-2-on 3-[4-(3-Dimetylaminpropyl)-3,5-dimetyl-lH-pyrrol-2-ylmetylen]-5-metyl-lJ3-dihydroindol-2-on 3-[4-(3-Dimetylaminpropyl)-3,5-dimetyl-lH-pyrrol-2-ylmetylen]-4-metyl-dihydroindol-2-on '3-[4-(3-Dimetylaminpropyl)-3,5-dimetyl-lH-pyrrol-2-ylmetylen]-4-(2-hydroksyétyl)-l,3-dihydroindol-2-on 3-[4-(3-Dimetylaminpropyl)-3,5-dimetyl-lH-pyrrol-2-ylmetylen]-2-okso-2,3-dihydro-1 H-indole-5-sulfonsyreamide 3-[4-(3-Dimetylaminpropyl)-3,5-dimetyl-lH-pyrrol-2-ylmetylen]-2-okso-2,3-dihydro-lH-indole-5-sulfonsyre isopropylamid 3-[4-(3-Dimetylaminpropyl)-3,5-dimetyl-lH-pyrrol-2-ylmetylen]-5-(morfolin-4-sulfonylJ-l^-dihydroindoKZ-on, og 3-[4-(3-Dimetylaminpropyl)-3,5-dimetyl-lH-pyrrol-2-ylmetylen]-2-okso-2,3-dihydro-lH-indole-5-sulfonsyredimetylamid.
7. Farmasøytisk preparat omfattende en forbindelse ifølge kravene 1-6 og en fysiologisk akseptabel bærer eller eksipient.
8. Anvendelse av terapeutisk effektiv mengde av en forbindelse i følge kravene -1 -6 til fremstilling av et medikament for behandling av en proteinkinaserelatert tilstand i en organisme.
9. " Anvendelse i følge krav 8, hvori nevnte proteinkinaserelaterte tilstand er valgt fra gruppen av en reseptortyrosinrelatert tilstand, en ikke-reseptortyrosinkinase tilstand og en en serintreoninkinaserelatert tilstand.
10. Anvendelse i følge 9, hvori nevnte proteinkinaserelaterte tilstand er valgt fra gruppen bestående av en EGFR-relatert tilstand, en PGFR-relatert tilstand og IGFR-relatert tilstand og en fik-relatert tilstand.
11. Anvendelse i følge 8, hvori nevnte proteinkinaserelaterte tilstand er valgt fra gruppen bestående av gruppen en squamouscellekarcinom, astrocytom, Kaposi's sarcom,. glioblastom, lungekreft, blærekreft, hode- og nakkekreft, melanom, eggstokk-kreft, prostatakreft, brystkreft, liten celle ("small call")-lungekreft, gliom, colorectal kreft, genitourinær kreft og gastrointestinal kreft.
12. ' Anvendelse i følge 8, hvori nevnte protein kinaserelaterte tilstand er valgt fra 'gruppen bestående av diabetes, én hyperprolifererende tilstand, angiogeneser, en inflammatorisk tilstand, en immunologisk tilstand og en kardiovasculær tilstand.
13. Anvendelse i følge 12, hvori nevnte protein kinaserelaterte tilstand er valgt fra gruppen bestående av diabetes, én hyperprolifereringstilstand, angiogeneser, en inflammatorisk tilstand, en immunologisk tilstand og en kardiovasculær tilstand.
14. Anvendelse i følge 8, hvori nevnte organisme er et pattedyr.
15. Anvendelse i følge 8, hvori nevnte organisme er et menneske.
16. Anvendelse i følge 12, hvori nevnte hyperprolifererende tilstand er valgt fra i gruppen bestående av restenose, fibrose og psoriasis.
17. Anvendelse i følge 12, hvori nevnte inflammatoriske tilstand er valgt fra gruppen bestående av osteoartritt og reumatoid artritt.
18. Anvendelse i følge 12, hvori nevnte immunologiske tilstand er en autoimmun tilstand.
NO20005916A 1998-05-29 2000-11-22 Pyrrolsubstituert 2-indolinon protein kinase inhibitorer NO318083B1 (no)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US8731098P 1998-05-29 1998-05-29
US11610699P 1999-01-15 1999-01-15
PCT/US1999/012069 WO1999061422A1 (en) 1998-05-29 1999-05-28 Pyrrole substituted 2-indolinone protein kinase inhibitors

Publications (3)

Publication Number Publication Date
NO20005916D0 NO20005916D0 (no) 2000-11-22
NO20005916L NO20005916L (no) 2001-01-29
NO318083B1 true NO318083B1 (no) 2005-01-31

Family

ID=26776832

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20005916A NO318083B1 (no) 1998-05-29 2000-11-22 Pyrrolsubstituert 2-indolinon protein kinase inhibitorer

Country Status (24)

Country Link
US (2) US6395734B1 (no)
EP (2) EP2020408B1 (no)
JP (1) JP4528440B2 (no)
KR (1) KR100743287B1 (no)
CN (1) CN1250526C (no)
AR (1) AR018408A1 (no)
AU (1) AU759226B2 (no)
BR (1) BR9910792A (no)
CA (1) CA2314156C (no)
CO (1) CO5031249A1 (no)
DK (1) DK2020408T3 (no)
EA (1) EA005032B1 (no)
ES (1) ES2429573T3 (no)
HK (1) HK1126770A1 (no)
HU (1) HUP0103617A2 (no)
IL (2) IL139934A0 (no)
NO (1) NO318083B1 (no)
NZ (1) NZ508815A (no)
PL (1) PL344477A1 (no)
PT (1) PT2020408E (no)
SK (1) SK287132B6 (no)
TR (1) TR200003514T2 (no)
TW (1) TWI229073B (no)
WO (1) WO1999061422A1 (no)

Families Citing this family (242)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5880141A (en) 1995-06-07 1999-03-09 Sugen, Inc. Benzylidene-Z-indoline compounds for the treatment of disease
US6906093B2 (en) * 1995-06-07 2005-06-14 Sugen, Inc. Indolinone combinatorial libraries and related products and methods for the treatment of disease
US6316429B1 (en) * 1997-05-07 2001-11-13 Sugen, Inc. Bicyclic protein kinase inhibitors
US6051593A (en) * 1997-06-20 2000-04-18 Sugen, Inc. 3-(cycloalkanoheteroarylidenyl)-2- indolinone protein tyrosine kinase inhibitors
US6569868B2 (en) 1998-04-16 2003-05-27 Sugen, Inc. 2-indolinone derivatives as modulators of protein kinase activity
US6395734B1 (en) 1998-05-29 2002-05-28 Sugen, Inc. Pyrrole substituted 2-indolinone protein kinase inhibitors
TR200101858T2 (tr) 1998-12-17 2001-12-21 F.Hoffmann-La Roche Ag JNK protein kinaz inhibitörleri olarak 4-ariloksindoller
CN1138773C (zh) 1998-12-17 2004-02-18 霍夫曼-拉罗奇有限公司 4-链烯基(和炔基)氧吲哚作为细胞周期蛋白-依赖性激酶尤其是cdk2的抑制剂
US6153634A (en) * 1998-12-17 2000-11-28 Hoffmann-La Roche Inc. 4,5-azolo-oxindoles
US20030119895A1 (en) * 1998-12-23 2003-06-26 Pharmacia Corporation Methods using a combination of a 3-heteroaryl-2-indolinone and a cyclooxygenase-2 inhibitor for the treatment of neoplasia
US6689806B1 (en) * 1999-03-24 2004-02-10 Sugen, Inc. Indolinone compounds as kinase inhibitors
UA74803C2 (uk) 1999-11-11 2006-02-15 Осі Фармасьютікалз, Інк. Стійкий поліморф гідрохлориду n-(3-етинілфеніл)-6,7-біс(2-метоксіетокси)-4-хіназолінаміну, спосіб його одержання (варіанти) та фармацевтичне застосування
ES2367007T3 (es) * 1999-11-24 2011-10-27 Sugen, Inc. Derivados de indolinona ionizables y su uso como ligandos de ptk.
US6878733B1 (en) 1999-11-24 2005-04-12 Sugen, Inc. Formulations for pharmaceutical agents ionizable as free acids or free bases
US6313310B1 (en) 1999-12-15 2001-11-06 Hoffmann-La Roche Inc. 4-and 5-alkynyloxindoles and 4-and 5-alkenyloxindoles
AU784266B2 (en) * 1999-12-22 2006-03-02 Sugen, Inc. Indolinone derivatives for modulation of c-kit tyrosine kinase
US6339100B1 (en) 1999-12-29 2002-01-15 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods for inhibiting mastocytosis
JP2003535038A (ja) * 1999-12-30 2003-11-25 スージェン・インコーポレーテッド 蛋白質キナーゼ活性の調節および癌化学療法において用いるための３−ヘテロアリーリデニル−２−インドリノン化合物
EP1255752B1 (en) * 2000-02-15 2007-08-08 Sugen, Inc. Pyrrole substituted 2-indolinone protein kinase inhibitors
US20020028828A1 (en) 2000-05-02 2002-03-07 Chung-Chen Wei (2-oxindol-3-ylidenyl)acetic acid derivatives and their use as protein kinase inhibitors
MY128449A (en) 2000-05-24 2007-02-28 Sugen Inc Prodrugs of 3-(pyrrol-2-ylmethylidene)-2-indolinone derivatives
US6706709B2 (en) 2000-06-02 2004-03-16 Sugen, Inc. Indolinone derivatives as protein kinase/phosphatase inhibitors
JP2004502686A (ja) 2000-06-30 2004-01-29 スージェン・インコーポレーテッド ４−ヘテロアリール−３−ヘテロアリーリデニル−２−インドリノンおよび蛋白質キナーゼ阻害剤としてのその使用
PE20020776A1 (es) * 2000-12-20 2002-08-22 Sugen Inc Indolinonas 4-aril sustituidas
AR032028A1 (es) 2001-01-05 2003-10-22 Pfizer Anticuerpos contra el receptor del factor de crecimiento similar a insulina
AR042586A1 (es) 2001-02-15 2005-06-29 Sugen Inc 3-(4-amidopirrol-2-ilmetiliden)-2-indolinona como inhibidores de la protein quinasa; sus composiciones farmaceuticas; un metodo para la modulacion de la actividad catalitica de la proteinquinasa; un metodo para tratar o prevenir una afeccion relacionada con la proteinquinasa
JP2004529110A (ja) 2001-03-06 2004-09-24 アストラゼネカ アクチボラグ 脈管損傷活性を有するインドール誘導体
US6797725B2 (en) * 2001-04-09 2004-09-28 Sugen, Inc. Prodrugs of a 3-(pyrrol-2-ylmethylidene)-2-indolinone derivatives
KR20040000507A (ko) * 2001-05-24 2004-01-03 야마노우치세이야쿠 가부시키가이샤 3-퀴놀린-2(1ｈ)-일리덴인돌린-2-온 유도체
US6599902B2 (en) 2001-05-30 2003-07-29 Sugen, Inc. 5-aralkysufonyl-3-(pyrrol-2-ylmethylidene)-2-indolinone derivatives as kinase inhibitors
AU2002345792A1 (en) 2001-06-21 2003-01-08 Pfizer Inc. Thienopyridine and thienopyrimidine anticancer agents
JP2004537537A (ja) * 2001-06-29 2004-12-16 アブ サイエンス 炎症性疾患を治療するためのチロシンキナーゼ阻害剤の使用法
CA2452390A1 (en) * 2001-06-29 2003-01-09 Ab Science Use of tyrosine kinase inhibitors for treating bone loss
WO2003002106A2 (en) 2001-06-29 2003-01-09 Ab Science Use of tyrosine kinase inhibitions for treating allergic diseases
US7727731B2 (en) 2001-06-29 2010-06-01 Ab Science Potent, selective and non toxic c-kit inhibitors
ATE343415T1 (de) 2001-06-29 2006-11-15 Ab Science Die verwendung von c-kit hemmer zur behandlung von entzündlichen darmerkrankungen
AR038957A1 (es) 2001-08-15 2005-02-02 Pharmacia Corp Terapia de combinacion para el tratamiento del cancer
EP1434774A1 (en) 2001-10-10 2004-07-07 Sugen, Inc. 3-(4-substituted heterocyclyl)-pyrrol-2-ylmethylidene)-2-indolinone derivatives as protein kinase inhibitors
TWI259081B (en) * 2001-10-26 2006-08-01 Sugen Inc Treatment of acute myeloid leukemia with indolinone compounds
AR039067A1 (es) 2001-11-09 2005-02-09 Pfizer Prod Inc Anticuerpos para cd40
US20030187026A1 (en) 2001-12-13 2003-10-02 Qun Li Kinase inhibitors
US6797825B2 (en) 2001-12-13 2004-09-28 Abbott Laboratories Protein kinase inhibitors
CA2470480C (en) * 2001-12-27 2010-12-14 Theravance, Inc. Indolinone derivatives useful as protein kinase inhibitors
EP1483268A2 (en) 2002-03-01 2004-12-08 Pfizer Inc. Indolyl-urea derivatives of thienopyridines useful as anti-angiogenic agents
JP2005524710A (ja) * 2002-05-06 2005-08-18 ジェネンテック・インコーポレーテッド 骨欠陥の治療へのｖｅｇｆの用途
UA77303C2 (en) 2002-06-14 2006-11-15 Pfizer Derivatives of thienopyridines substituted by benzocondensed heteroarylamide useful as therapeutic agents, pharmaceutical compositions and methods for their use
EP1558444B1 (en) 2002-06-24 2016-09-21 Tufts University Silk biomaterials and methods of use thereof
US20050032871A1 (en) * 2002-09-03 2005-02-10 Sugen, Inc. Sulfonylated pyrrole-2-indolinone derivatives as kinase inhibitors
AR042042A1 (es) * 2002-11-15 2005-06-08 Sugen Inc Administracion combinada de una indolinona con un agente quimioterapeutico para trastornos de proliferacion celular
WO2004050681A2 (en) 2002-11-15 2004-06-17 Exelixis, Inc. Kinase modulators
AU2003284572A1 (en) * 2002-11-22 2004-06-18 Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd. 2-oxoindoline derivatives
JP4879492B2 (ja) * 2002-11-27 2012-02-22 アラーガン、インコーポレイテッド 疾患の治療のためのキナーゼ阻害剤
EP1585743B1 (en) 2002-12-19 2007-05-23 Pfizer Inc. 2-(1h-indazol-6-ylamino)- benzamide compounds as protein kinases inhibitors useful for the treatment of ophthalmic diseases
DK2476667T3 (da) 2003-02-26 2014-09-15 Sugen Inc Aminoheteroaryl-forbindelser som proteinkinase-inhibitorer
US20040266843A1 (en) * 2003-03-07 2004-12-30 Sugen, Inc. Sulfonamide substituted indolinones as inhibitors of DNA dependent protein kinase (DNA-PK)
US7157577B2 (en) * 2003-03-07 2007-01-02 Sugen Inc. 5-sulfonamido-substituted indolinone compounds as protein kinase inhibitors
JP4698596B2 (ja) 2003-04-10 2011-06-08 タフツ ユニバーシティー 濃縮された水性シルクフィブロイン溶液およびそれらの使用
KR20110129988A (ko) 2003-07-18 2011-12-02 암젠 인코포레이티드 간세포 성장인자에 결합하는 특이 결합제
EP1653946A4 (en) * 2003-08-06 2007-04-04 Sugen Inc 3-CYCLOPENTYLIDENE-1,3-DIHYDROINDOL-2-ONES GEOMETRICALLY LIMITED AS POWERFUL INHIBITORS OF PROTEIN KINASES
EP1660504B1 (en) 2003-08-29 2008-10-29 Pfizer Inc. Thienopyridine-phenylacet amides and their derivatives useful as new anti-angiogenic agents
AR045563A1 (es) 2003-09-10 2005-11-02 Warner Lambert Co Anticuerpos dirigidos a m-csf
JP2007509173A (ja) 2003-10-24 2007-04-12 シエーリング アクチエンゲゼルシャフト インドリノン誘導体類及び疾病状態、例えば癌の処理へのそれらの使用
DK1689721T3 (da) * 2003-11-26 2010-09-20 Pfizer Prod Inc Aminopyrazolderivater som GSK-3-ihibitorer
UA82577C2 (en) 2003-12-23 2008-04-25 Пфайзер Инк. Quinoline derivatives
EP1765313A2 (en) 2004-06-24 2007-03-28 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Compounds for immunopotentiation
KR100859891B1 (ko) 2004-08-26 2008-09-23 화이자 인코포레이티드 단백질 키나제 억제제로서 거울상이성질체적으로 순수한아미노헤테로아릴 화합물
GT200500321A (es) 2004-11-09 2006-09-04 Compuestos y composiciones como inhibidores de proteina kinase.
ES2450566T3 (es) 2004-11-30 2014-03-25 Amgen Inc. Análogos de quinazolina y quinolinas y su uso como medicamentos para tratar el cáncer
DE602006016085D1 (de) 2005-03-16 2010-09-23 Genentech Inc Biologische marker prediktiv für das ansprechen von krebs auf inhibitoren der kinase des rezeptors für epidermalen wachstumsfaktor
AU2006230563B8 (en) 2005-03-31 2010-06-17 Agensys, Inc. Antibodies and related molecules that bind to 161P2F10B proteins
BRPI0608096A2 (pt) 2005-04-26 2009-11-10 Pfizer anticorpos p-caderina
WO2006119148A2 (en) * 2005-04-29 2006-11-09 The Ohio State University Research Foundation Keratinocyte growth factor receptor - tyrosine specific inhibitors for the prevention of cancer metastatis
PL2960253T3 (pl) 2005-09-07 2018-11-30 Amgen Fremont Inc. Ludzkie przeciwciała monoklonalne przeciwko kinazie podobnej do receptora aktywiny-1
ES2374450T3 (es) 2005-09-20 2012-02-16 OSI Pharmaceuticals, LLC Marcadores biológicos predictivos de respuesta anticancerígena para inhibidores de cinasa del receptor del factor de crecimiento 1 similar a insulina.
US20080108664A1 (en) 2005-12-23 2008-05-08 Liu Belle B Solid-state form of AMG 706 and pharmaceutical compositions thereof
JO2660B1 (en) 2006-01-20 2012-06-17 نوفارتيس ايه جي Pi-3 inhibitors and methods of use
AR059066A1 (es) 2006-01-27 2008-03-12 Amgen Inc Combinaciones del inhibidor de la angiopoyetina -2 (ang2) y el inhibidor del factor de crecimiento endotelial vascular (vegf)
MX2008009557A (es) 2006-01-27 2009-01-07 Shanghai Hengrui Pharm Co Ltd Inhibidores de la cinasa de proteina de la pirrolo [3,2-c] piridin-4-ona-2-indolinona.
JP2009526050A (ja) 2006-02-10 2009-07-16 アムジエン・インコーポレーテツド Ａｍｇ７０６の水和物形態
KR100647350B1 (ko) * 2006-04-03 2006-11-23 김상민 시밍장치
AR060358A1 (es) 2006-04-06 2008-06-11 Novartis Vaccines & Diagnostic Quinazolinas para la inhibicion de pdk 1
MX2008013430A (es) 2006-04-19 2009-01-26 Novartis Vaccines & Diagnostic Compuestos de indazol y metodos para la inhibición de cdc7.
BRPI0711358A2 (pt) 2006-05-09 2011-09-27 Pfizer Prod Inc derivados do ácido cicloalquilamino e suas composições farmacêuticas
PE20121506A1 (es) 2006-07-14 2012-11-26 Amgen Inc Compuestos triazolopiridinas como inhibidores de c-met
US8217177B2 (en) 2006-07-14 2012-07-10 Amgen Inc. Fused heterocyclic derivatives and methods of use
US20100028451A1 (en) 2006-09-26 2010-02-04 Trustees Of Tufts College Silk microspheres for encapsulation and controlled release
AU2007314521A1 (en) * 2006-10-06 2008-05-08 Merck Sharp & Dohme Corp. Non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors
CA2672438A1 (en) 2006-12-20 2008-07-03 Amgen Inc. Substituted heterocycles and methods of use
EP2118069B1 (en) 2007-01-09 2014-01-01 Amgen Inc. Bis-aryl amide derivatives useful for the treatment of cancer
EP2114898A2 (en) 2007-02-16 2009-11-11 Amgen Inc. Nitrogen-containing heterocyclyl ketones and their use as c-met inhibitors
US9102916B2 (en) 2007-02-27 2015-08-11 Trustees Of Tufts College Tissue-engineered silk organs
US8642067B2 (en) 2007-04-02 2014-02-04 Allergen, Inc. Methods and compositions for intraocular administration to treat ocular conditions
EP2076289B1 (en) 2007-04-13 2014-11-12 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods for treating cancer resistant to erbb therapeutics
US9808557B2 (en) 2007-08-10 2017-11-07 Trustees Of Tufts College Tubular silk compositions and methods of use thereof
DK2188313T3 (en) 2007-08-21 2017-12-11 Amgen Inc HUMAN C-FMS ANTI-BINDING PROTEINS
WO2009030270A1 (en) * 2007-09-03 2009-03-12 Novartis Ag Dihydroindole derivatives useful in parkinson's disease
CN101952282A (zh) 2007-12-20 2011-01-19 诺瓦提斯公司 用作pi 3激酶抑制剂的噻唑衍生物
US8993615B2 (en) * 2008-08-08 2015-03-31 The Johns Hopkins University Compositions and methods for treatment of neurodegenerative disease
JP5836125B2 (ja) 2008-10-16 2015-12-24 ユニバーシティ オブ ピッツバーグ − オブ ザ コモンウェルス システム オブ ハイヤー エデュケイション 高分子量メラノーマ関連抗原に対する完全ヒト抗体およびその使用
CN101397295B (zh) * 2008-11-12 2012-04-25 深圳微芯生物科技有限责任公司 作为组蛋白去乙酰化酶抑制剂的2-吲哚满酮衍生物、其制法和用途
CN102307875A (zh) 2009-02-09 2012-01-04 苏伯俭股份有限公司 吡咯并嘧啶基axl激酶抑制剂
US20120189641A1 (en) 2009-02-25 2012-07-26 OSI Pharmaceuticals, LLC Combination anti-cancer therapy
US20110171124A1 (en) 2009-02-26 2011-07-14 Osi Pharmaceuticals, Inc. In situ methods for monitoring the EMT status of tumor cells in vivo
US8642834B2 (en) 2009-02-27 2014-02-04 OSI Pharmaceuticals, LLC Methods for the identification of agents that inhibit mesenchymal-like tumor cells or their formation
WO2010099138A2 (en) 2009-02-27 2010-09-02 Osi Pharmaceuticals, Inc. Methods for the identification of agents that inhibit mesenchymal-like tumor cells or their formation
TW201035088A (en) 2009-02-27 2010-10-01 Supergen Inc Cyclopentathiophene/cyclohexathiophene DNA methyltransferase inhibitors
EP2401613A2 (en) 2009-02-27 2012-01-04 OSI Pharmaceuticals, LLC Methods for the identification of agents that inhibit mesenchymal-like tumor cells or their formation
US8293753B2 (en) 2009-07-02 2012-10-23 Novartis Ag Substituted 2-carboxamide cycloamino ureas
JP6095367B2 (ja) 2009-07-13 2017-03-15 ジェネンテック， インコーポレイテッド 癌治療のための診断方法および組成物
US20120128670A1 (en) 2009-07-31 2012-05-24 OSI Pharmaceuticals, LLC mTOR INHIBITOR AND ANGIOGENESIS INHIBITOR COMBINATION THERAPY
US20120157471A1 (en) 2009-09-01 2012-06-21 Pfizer Inc. Benzimidazole derivatives
EP2475996A1 (en) 2009-09-11 2012-07-18 F. Hoffmann-La Roche AG Method to identify a patient with an increased likelihood of responding to an anti-cancer agent
MX2012002909A (es) 2009-09-17 2012-04-19 Hoffmann La Roche Metodos y composiciones para su uso en diagnostico de pacientes con cancer.
WO2011073521A1 (en) 2009-12-15 2011-06-23 Petri Salven Methods for enriching adult-derived endothelial progenitor cells and uses thereof
EP2517707A4 (en) 2009-12-25 2013-06-12 Taiho Pharmaceutical Co Ltd ANTITUM REAGENT OR POSTOPERATIVE ADJUVANT CHEMOTHERAPEUTIC FOR THE TREATMENT OF LIVER CELL CARCINOMA
AU2010336257B2 (en) 2009-12-25 2014-07-03 Taiho Pharmaceutical Co., Ltd. Method for Predicting Therapeutic Effects of Chemotherapy on Hepatocellular Carcinoma Patients
KR20120127495A (ko) 2010-02-12 2012-11-21 화이자 인코포레이티드 8-플루오로-2-｛4-［(메틸아미노)메틸］페닐｝-1,3,4,5-테트라하이드로-6ｈ-아제피노［5,4,3-ｃｄ］인돌-6-온의 염 및 다형체
AU2011223655A1 (en) 2010-03-03 2012-06-28 OSI Pharmaceuticals, LLC Biological markers predictive of anti-cancer response to insulin-like growth factor-1 receptor kinase inhibitors
US20110275644A1 (en) 2010-03-03 2011-11-10 Buck Elizabeth A Biological markers predictive of anti-cancer response to insulin-like growth factor-1 receptor kinase inhibitors
WO2011153224A2 (en) 2010-06-02 2011-12-08 Genentech, Inc. Diagnostic methods and compositions for treatment of cancer
ES2695899T3 (es) 2010-06-16 2019-01-11 Univ Pittsburgh Commonwealth Sys Higher Education Anticuerpos contra endoplasmina y su uso
WO2011161217A2 (en) 2010-06-23 2011-12-29 Palacký University in Olomouc Targeting of vegfr2
SG187120A1 (en) 2010-07-19 2013-02-28 Hoffmann La Roche Method to identify a patient with an increased likelihood of responding to an anti-cancer therapy
WO2012010549A1 (en) 2010-07-19 2012-01-26 F. Hoffmann-La Roche Ag Method to identify a patient with an increased likelihood of responding to an anti-cancer therapy
US20130177500A1 (en) 2010-07-23 2013-07-11 Trustee Of Boston University Anti-despr inhibitors as therapeutics for inhibition of pathological angiogenesis and tumor cell invasiveness and for molecular imaging and targeted delivery
AR082418A1 (es) 2010-08-02 2012-12-05 Novartis Ag Formas cristalinas de 1-(4-metil-5-[2-(2,2,2-trifluoro-1,1-dimetil-etil)-piridin-4-il]-tiazol-2-il)-amida de 2-amida del acido (s)-pirrolidin-1,2-dicarboxilico
WO2012042421A1 (en) 2010-09-29 2012-04-05 Pfizer Inc. Method of treating abnormal cell growth
ES2543151T3 (es) 2010-10-20 2015-08-17 Pfizer Inc Derivados de 2-piridina como moduladores del receptor Smoothened
UY33883A (es) 2011-01-31 2012-08-31 Novartis Ag Novedosos derivados heterocíclicos
US20120214830A1 (en) 2011-02-22 2012-08-23 OSI Pharmaceuticals, LLC Biological markers predictive of anti-cancer response to insulin-like growth factor-1 receptor kinase inhibitors in hepatocellular carcinoma
CA2830516C (en) 2011-03-23 2017-01-24 Amgen Inc. Fused tricyclic dual inhibitors of cdk 4/6 and flt3
US9150644B2 (en) 2011-04-12 2015-10-06 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Human monoclonal antibodies that bind insulin-like growth factor (IGF) I and II
TR201905909T4 (tr) 2011-04-19 2019-05-21 Pfizer Kanser tedavisi için anti-4-1bb antikorlarının ve adcc indükleyici antikorların kombinasyonları.
WO2012145652A1 (en) 2011-04-20 2012-10-26 Trustees Of Tufts College Dynamic silk coatings for implantable devices
WO2012149014A1 (en) 2011-04-25 2012-11-01 OSI Pharmaceuticals, LLC Use of emt gene signatures in cancer drug discovery, diagnostics, and treatment
HUE052198T2 (hu) 2011-07-21 2021-04-28 Sumitomo Dainippon Pharma Oncology Inc Heterociklusos protein kináz inhibitorok
WO2013025939A2 (en) 2011-08-16 2013-02-21 Indiana University Research And Technology Corporation Compounds and methods for treating cancer by inhibiting the urokinase receptor
MD20140023A2 (ro) 2011-09-22 2014-06-30 Pfizer Inc. Derivaţi de pirolpirimidină şi purină
EP3275902A1 (en) 2011-10-04 2018-01-31 IGEM Therapeutics Limited Ige anti-hmw-maa antibody
MX340452B (es) 2011-10-28 2016-07-08 Novartis Ag Novedosos derivados de purina y su uso en el tratamiento de enfermedades.
IN2014CN04183A (no) 2011-11-08 2015-07-17 Pfizer
AR090263A1 (es) 2012-03-08 2014-10-29 Hoffmann La Roche Terapia combinada de anticuerpos contra el csf-1r humano y las utilizaciones de la misma
WO2013142119A1 (en) 2012-03-20 2013-09-26 Trustees Of Tufts College Silk reservoirs for drug delivery
WO2013152252A1 (en) 2012-04-06 2013-10-10 OSI Pharmaceuticals, LLC Combination anti-cancer therapy
EP2836236B1 (en) 2012-04-13 2019-01-02 Trustees Of Tufts College Methods and compositions for preparing a silk microsphere
ES2621257T3 (es) * 2012-04-20 2017-07-03 Annji Pharmaceutical Co., Ltd. Ésteres de ciclopropanocarboxilato de análogos de purinas
AU2013263043B2 (en) 2012-05-16 2016-06-16 Novartis Ag Dosage regimen for a PI-3 kinase inhibitor
WO2014012101A1 (en) 2012-07-13 2014-01-16 Trustees Of Tufts College Silk powder compaction for production of constructs with high mechanical strength and stiffness
US9505749B2 (en) 2012-08-29 2016-11-29 Amgen Inc. Quinazolinone compounds and derivatives thereof
WO2014062838A2 (en) 2012-10-16 2014-04-24 Tolero Pharmaceuticals, Inc. Pkm2 modulators and methods for their use
CN102887851B (zh) * 2012-11-02 2014-03-19 天津希恩思生化科技有限公司 化合物3,5-二甲基-1h-吡咯-2,4-二甲醛及其制备方法
US9260426B2 (en) 2012-12-14 2016-02-16 Arrien Pharmaceuticals Llc Substituted 1H-pyrrolo [2, 3-b] pyridine and 1H-pyrazolo [3, 4-b] pyridine derivatives as salt inducible kinase 2 (SIK2) inhibitors
KR102334260B1 (ko) 2013-03-14 2021-12-02 스미토모 다이니폰 파마 온콜로지, 인크. Ｊａｋ2 및 ａｌｋ2 억제제 및 이들의 사용 방법
CA2905090C (en) 2013-03-15 2022-10-25 Trustees Of Tufts College Low molecular weight silk compositions and stabilizing silk compositions
US11376329B2 (en) 2013-03-15 2022-07-05 Trustees Of Tufts College Low molecular weight silk compositions and stabilizing silk compositions
US9206188B2 (en) 2013-04-18 2015-12-08 Arrien Pharmaceuticals Llc Substituted pyrrolo[2,3-b]pyridines as ITK and JAK inhibitors
US10285702B2 (en) 2013-04-24 2019-05-14 Trustees Of Tufts College Bioresorbable biopolymer anastomosis devices
DK3052102T3 (da) 2013-10-04 2020-03-09 Aptose Biosciences Inc Sammensætninger til behandling af cancere
UA115388C2 (uk) 2013-11-21 2017-10-25 Пфайзер Інк. 2,6-заміщені пуринові похідні та їх застосування в лікуванні проліферативних захворювань
RU2680246C1 (ru) 2013-12-06 2019-02-19 Новартис Аг Схема приема для селективного по альфа-изоформе ингибитора фосфатидилинозитол-3-киназы
CN106536753B (zh) 2014-04-04 2020-07-21 中美冠科生物技术（太仓）有限公司 用于确定对mek/erk抑制剂的应答性的方法
WO2015155624A1 (en) 2014-04-10 2015-10-15 Pfizer Inc. Dihydropyrrolopyrimidine derivatives
EA033919B1 (ru) 2014-04-30 2019-12-10 Пфайзер Инк. Соединённые циклоалкилом дигетероциклические производные
WO2016001789A1 (en) 2014-06-30 2016-01-07 Pfizer Inc. Pyrimidine derivatives as pi3k inhibitors for use in the treatment of cancer
CN106999578B (zh) 2014-07-31 2022-03-04 美国政府(由卫生和人类服务部的部长所代表) 针对epha4的人类单克隆抗体和其用途
US10758645B2 (en) 2014-12-17 2020-09-01 Tufts University Injectable, flexible hydroxyapatite-silk foams for osteochondral and dental repair
ES2746839T3 (es) 2014-12-18 2020-03-09 Pfizer Derivados de pirimidina y triazina y su uso como inhibidores de AXL
EP3242934B1 (en) 2015-01-08 2021-08-18 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Factors and cells that provide for induction of bone, bone marrow, and cartilage
US9901574B2 (en) 2015-04-20 2018-02-27 Tolero Pharmaceuticals, Inc. Predicting response to alvocidib by mitochondrial profiling
CA2984421C (en) 2015-05-01 2024-04-09 Cocrystal Pharma, Inc. Nucleoside analogs for treatment of the flaviviridae family of viruses and cancer
EP3298021B1 (en) 2015-05-18 2019-05-01 Tolero Pharmaceuticals, Inc. Alvocidib prodrugs having increased bioavailability
WO2017009751A1 (en) 2015-07-15 2017-01-19 Pfizer Inc. Pyrimidine derivatives
AU2016296984B2 (en) 2015-07-20 2021-08-26 Massachusetts Eye And Ear Infirmary Biodegradable silk ear tubes
EP3331510A4 (en) 2015-08-03 2019-04-03 Tolero Pharmaceuticals, Inc. COMBINATORIAL THERAPIES FOR THE TREATMENT OF CANCER
JP2018532750A (ja) 2015-11-02 2018-11-08 ノバルティス アーゲー ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ阻害剤の投薬レジメン
CA3006743A1 (en) 2015-12-03 2017-06-08 Agios Pharmaceuticals, Inc. Mat2a inhibitors for treating mtap null cancer
US10864299B2 (en) 2016-04-29 2020-12-15 Trustees Of Tufts College Artificial silk based innervated cornea
WO2018006037A1 (en) 2016-07-01 2018-01-04 Trustees Of Tufts College Innervated artificial skin
WO2018026853A1 (en) 2016-08-01 2018-02-08 Trustees Of Tufts College Biomimetic mechanical tension driven fabrication of nanofibrillar architecture
WO2018060833A1 (en) 2016-09-27 2018-04-05 Novartis Ag Dosage regimen for alpha-isoform selective phosphatidylinositol 3-kinase inhibitor alpelisib
WO2018094275A1 (en) 2016-11-18 2018-05-24 Tolero Pharmaceuticals, Inc. Alvocidib prodrugs and their use as protein kinase inhibitors
EP3362471B1 (en) 2016-12-19 2021-11-17 Sumitomo Dainippon Pharma Oncology, Inc. Profiling peptides and methods for sensitivity profiling
BR112019012976A2 (pt) 2016-12-22 2019-12-31 Amgen Inc inibidores de kras g12c e métodos de uso dos mesmos
US20200000713A1 (en) 2017-01-20 2020-01-02 Massachusetts Institute Of Technology Injectable polymer micro-depots for controlled local drug delivery
JOP20190272A1 (ar) 2017-05-22 2019-11-21 Amgen Inc مثبطات kras g12c وطرق لاستخدامها
IL293443A (en) 2017-09-08 2022-07-01 Amgen Inc kras g12c inhibitors and methods of using them
US11497756B2 (en) 2017-09-12 2022-11-15 Sumitomo Pharma Oncology, Inc. Treatment regimen for cancers that are insensitive to BCL-2 inhibitors using the MCL-1 inhibitor alvocidib
WO2019075367A1 (en) 2017-10-13 2019-04-18 Tolero Pharmaceuticals, Inc. PKM2 ACTIVATORS IN COMBINATION WITH OXYGEN REACTIVE SPECIES FOR THE TREATMENT OF CANCER
US11419947B2 (en) 2017-10-30 2022-08-23 Massachusetts Institute Of Technology Layer-by-layer nanoparticles for cytokine therapy in cancer treatment
US20210236644A1 (en) 2017-11-10 2021-08-05 Cocoon Biotech Inc. Ocular applications of silk-based products
WO2019213516A1 (en) 2018-05-04 2019-11-07 Amgen Inc. Kras g12c inhibitors and methods of using the same
CA3099118A1 (en) 2018-05-04 2019-11-07 Amgen Inc. Kras g12c inhibitors and methods of using the same
CA3099045A1 (en) 2018-05-10 2019-11-14 Amgen Inc. Kras g12c inhibitors for the treatment of cancer
US11096939B2 (en) 2018-06-01 2021-08-24 Amgen Inc. KRAS G12C inhibitors and methods of using the same
AU2019284472A1 (en) 2018-06-11 2020-11-26 Amgen Inc. KRAS G12C inhibitors for treating cancer
WO2020050890A2 (en) 2018-06-12 2020-03-12 Amgen Inc. Kras g12c inhibitors and methods of using the same
KR20210038906A (ko) 2018-07-26 2021-04-08 스미토모 다이니폰 파마 온콜로지, 인크. 비정상적 acvr1 발현과 연관된 질환을 치료하는 방법 및 그에 사용하기 위한 acvr1 억제제
JP2020090482A (ja) 2018-11-16 2020-06-11 アムジエン・インコーポレーテツド Ｋｒａｓ ｇ１２ｃ阻害剤化合物の重要な中間体の改良合成法
WO2020106640A1 (en) 2018-11-19 2020-05-28 Amgen Inc. Kras g12c inhibitors and methods of using the same
JP7377679B2 (ja) 2018-11-19 2023-11-10 アムジエン・インコーポレーテツド がん治療のためのｋｒａｓｇ１２ｃ阻害剤及び１種以上の薬学的に活性な追加の薬剤を含む併用療法
CN113490499A (zh) 2018-12-04 2021-10-08 大日本住友制药肿瘤公司 用作治疗癌症的活性剂的cdk9抑制剂及其多晶型物
US20220002311A1 (en) 2018-12-20 2022-01-06 Amgen Inc. Kif18a inhibitors
WO2020132651A1 (en) 2018-12-20 2020-06-25 Amgen Inc. Kif18a inhibitors
MX2021007158A (es) 2018-12-20 2021-08-16 Amgen Inc Heteroarilamidas utiles como inhibidores de kif18a.
TW202034924A (zh) 2018-12-20 2020-10-01 美商安進公司 Kif18a 抑制劑
JP2022520361A (ja) 2019-02-12 2022-03-30 スミトモ ダイニッポン ファーマ オンコロジー， インコーポレイテッド 複素環式タンパク質キナーゼ阻害剤を含む製剤
EP3931195A1 (en) 2019-03-01 2022-01-05 Revolution Medicines, Inc. Bicyclic heteroaryl compounds and uses thereof
KR20210146288A (ko) 2019-03-01 2021-12-03 레볼루션 메디슨즈, 인크. 이환식 헤테로사이클릴 화합물 및 이의 용도
WO2020191326A1 (en) 2019-03-20 2020-09-24 Sumitomo Dainippon Pharma Oncology, Inc. Treatment of acute myeloid leukemia (aml) with venetoclax failure
AU2020245437A1 (en) 2019-03-22 2021-09-30 Sumitomo Pharma Oncology, Inc. Compositions comprising PKM2 modulators and methods of treatment using the same
EP3738593A1 (en) 2019-05-14 2020-11-18 Amgen, Inc Dosing of kras inhibitor for treatment of cancers
JOP20210310A1 (ar) 2019-05-21 2023-01-30 Amgen Inc أشكال الحالة الصلبة
CA3142608A1 (en) 2019-06-04 2020-12-10 Cocoon Biotech Inc. Silk-based products, formulations, and methods of use
CN114401953A (zh) 2019-08-02 2022-04-26 美国安进公司 Kif18a抑制剂
MX2022001302A (es) 2019-08-02 2022-03-02 Amgen Inc Inhibidores de kif18a.
MX2022001295A (es) 2019-08-02 2022-02-22 Amgen Inc Inhibidores de kif18a.
MX2022001181A (es) 2019-08-02 2022-02-22 Amgen Inc Inhibidores de kif18a.
MX2022004656A (es) 2019-10-24 2022-05-25 Amgen Inc Derivados de piridopirimidina utiles como inhibidores de kras g12c y kras g12d en el tratamiento del cancer.
AU2020379734A1 (en) 2019-11-04 2022-05-05 Revolution Medicines, Inc. Ras inhibitors
CA3160142A1 (en) 2019-11-04 2021-05-14 Revolution Medicines, Inc. Ras inhibitors
US11739074B2 (en) 2019-11-04 2023-08-29 Revolution Medicines, Inc. Ras inhibitors
AU2020380315A1 (en) 2019-11-08 2022-05-26 Revolution Medicines, Inc. Bicyclic heteroaryl compounds and uses thereof
CN114728960A (zh) 2019-11-14 2022-07-08 美国安进公司 Kras g12c抑制剂化合物的改善的合成
AU2020383535A1 (en) 2019-11-14 2022-05-05 Amgen Inc. Improved synthesis of KRAS G12C inhibitor compound
CN114980976A (zh) 2019-11-27 2022-08-30 锐新医药公司 共价ras抑制剂及其用途
WO2021142026A1 (en) 2020-01-07 2021-07-15 Revolution Medicines, Inc. Shp2 inhibitor dosing and methods of treating cancer
WO2021155006A1 (en) 2020-01-31 2021-08-05 Les Laboratoires Servier Sas Inhibitors of cyclin-dependent kinases and uses thereof
WO2021257736A1 (en) 2020-06-18 2021-12-23 Revolution Medicines, Inc. Methods for delaying, preventing, and treating acquired resistance to ras inhibitors
CN116209438A (zh) 2020-09-03 2023-06-02 锐新医药公司 使用sos1抑制剂治疗具有shp2突变的恶性疾病
CN116457358A (zh) 2020-09-15 2023-07-18 锐新医药公司 作为ras抑制剂以治疗癌症的吲哚衍生物
CN112661639A (zh) * 2020-12-07 2021-04-16 浙江工业大学 一种4-乙酰丁酸酯类化合物合成方法
CA3203111A1 (en) 2020-12-22 2022-06-30 Kailiang Wang Sos1 inhibitors and uses thereof
WO2022235870A1 (en) 2021-05-05 2022-11-10 Revolution Medicines, Inc. Ras inhibitors for the treatment of cancer
EP4334324A1 (en) 2021-05-05 2024-03-13 Revolution Medicines, Inc. Covalent ras inhibitors and uses thereof
EP4334321A1 (en) 2021-05-05 2024-03-13 Revolution Medicines, Inc. Ras inhibitors
AR127308A1 (es) 2021-10-08 2024-01-10 Revolution Medicines Inc Inhibidores ras
WO2023081923A1 (en) 2021-11-08 2023-05-11 Frequency Therapeutics, Inc. Platelet-derived growth factor receptor (pdgfr) alpha inhibitors and uses thereof
WO2023114954A1 (en) 2021-12-17 2023-06-22 Genzyme Corporation Pyrazolopyrazine compounds as shp2 inhibitors
EP4227307A1 (en) 2022-02-11 2023-08-16 Genzyme Corporation Pyrazolopyrazine compounds as shp2 inhibitors
WO2023172940A1 (en) 2022-03-08 2023-09-14 Revolution Medicines, Inc. Methods for treating immune refractory lung cancer
WO2023240263A1 (en) 2022-06-10 2023-12-14 Revolution Medicines, Inc. Macrocyclic ras inhibitors
US20230399313A1 (en) * 2022-06-10 2023-12-14 Advenchen Pharmaceuticals, LLC Biological activities of 5-(2-(4-(4-fluoro-2-methyl-1h-indol-5-yloxy)-6-methoxyquinolin-7-yloxy)ethyl)-5-azaspiro[2.4]-heptan-7-ol crystalline, phosphoric acid salt and its enantiomers

Family Cites Families (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3308134A (en) 1965-10-22 1967-03-07 Mcneilab Inc Spiro(indan-2, 3'-indoline)-1, 2'-diones
US3859693A (en) 1973-06-12 1975-01-14 Charles P Breed Sliding snap shackle
US4002749A (en) 1975-08-12 1977-01-11 E. R. Squibb & Sons, Inc. Substituted indolinones
US4053613A (en) 1975-09-17 1977-10-11 E. R. Squibb & Sons, Inc. 1,3,thiazolinyl and 1,3 thiazinyl substituted indolinones
US4966849A (en) 1985-09-20 1990-10-30 President And Fellows Of Harvard College CDNA and genes for human angiogenin (angiogenesis factor) and methods of expression
CA1284681C (en) 1986-07-09 1991-06-04 Alcan International Limited Methods and apparatus for the detection and correction of roll eccentricity in rolling mills
US5217999A (en) 1987-12-24 1993-06-08 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Styryl compounds which inhibit EGF receptor protein tyrosine kinase
GB9004483D0 (en) 1990-02-28 1990-04-25 Erba Carlo Spa New aryl-and heteroarylethenylene derivatives and process for their preparation
DE69105495T2 (de) 1990-04-02 1995-04-06 Pfizer Benzylphosphonsäure-tyrosinkinaseinhibitoren.
US5302606A (en) 1990-04-16 1994-04-12 Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals Inc. Styryl-substituted pyridyl compounds which inhibit EGF receptor tyrosine kinase
WO1992007830A2 (en) 1990-10-29 1992-05-14 Pfizer Inc. Oxindole peptide antagonists
US5480883A (en) 1991-05-10 1996-01-02 Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals Inc. Bis mono- and bicyclic aryl and heteroaryl compounds which inhibit EGF and/or PDGF receptor tyrosine kinase
CA2102780C (en) 1991-05-10 2007-01-09 Alfred P. Spada Bis mono-and bicyclic aryl and heteroaryl compounds which inhibit egf and/or pdgf receptor tyrosine kinase
WO1992021660A1 (en) 1991-05-29 1992-12-10 Pfizer, Inc. Tricyclic polyhydroxylic tyrosine kinase inhibitors
GB9300059D0 (en) 1992-01-20 1993-03-03 Zeneca Ltd Quinazoline derivatives
JPH07508038A (ja) 1992-05-20 1995-09-07 メルク　エンド　カンパニー　インコーポレーテッド ４−アザステロイドの１７−エーテル及びチオエーテル
SK283413B6 (sk) 1992-08-06 2003-07-01 Warner-Lambert Company 2-Tioindoly, 2-indolíntióny a polysulfidy, ich selénové analógy a farmaceutické prostriedky na ich báze
US5330992A (en) 1992-10-23 1994-07-19 Sterling Winthrop Inc. 1-cyclopropyl-4-pyridyl-quinolinones
ATE348110T1 (de) 1992-10-28 2007-01-15 Genentech Inc Hvegf rezeptor als vegf antagonist
US6177401B1 (en) 1992-11-13 2001-01-23 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften Use of organic compounds for the inhibition of Flk-1 mediated vasculogenesis and angiogenesis
GB9226855D0 (en) 1992-12-23 1993-02-17 Erba Carlo Spa Vinylene-azaindole derivatives and process for their preparation
AU2096895A (en) 1994-03-07 1995-09-25 Sugen, Incorporated Receptor tyrosine kinase inhibitors for inhibiting cell proliferative disorders and compositions thereof
GB9412719D0 (en) 1994-06-24 1994-08-17 Erba Carlo Spa Substituted azaindolylidene compounds and process for their preparation
GB9423997D0 (en) * 1994-11-28 1995-01-11 Erba Carlo Spa Substituted 3-arylidene-7-azaoxindole compounds and process for their preparation
GB9501567D0 (en) 1995-01-26 1995-03-15 Pharmacia Spa Hydrosoluble 3-arylidene-2-oxindole derivatives as tyrosine kinase inhibitors
US5880141A (en) 1995-06-07 1999-03-09 Sugen, Inc. Benzylidene-Z-indoline compounds for the treatment of disease
US5786488A (en) 1996-11-13 1998-07-28 Sugen, Inc. Synthetic methods for the preparation of indolyquinones
AU733890B2 (en) 1996-08-21 2001-05-31 Sugen, Inc. Crystal structures of a protein tyrosine kinase
ES2251741T3 (es) * 1996-08-23 2006-05-01 Sugen, Inc. Bibliotecas combinatorias de indolinona y productos afines y metodos para el tratamiento de enfermedades.
WO1998024432A2 (en) 1996-12-05 1998-06-11 Sugen, Inc. Use of indolinone compounds as modulators of protein kinases
ES2384551T3 (es) 1997-03-05 2012-07-06 Sugen, Inc. Formulaciones para agentes farmacéuticos hidrófobos
AU6887698A (en) 1997-04-08 1998-10-30 Sugen, Inc. Study and treatment of diseases related to specific cellular functions of receptor protein tyrosine kinases
ATE292623T1 (de) * 1997-05-07 2005-04-15 Sugen Inc 2-indolinonderivate als modulatoren der proteinkinase-ativität
AU8071698A (en) 1997-06-13 1998-12-30 Sugen, Inc. Novel heteroaryl compounds for the modulation of protein tyrosine enzyme relatedcellular signal transduction
GB9716557D0 (en) 1997-08-06 1997-10-08 Glaxo Group Ltd Benzylidene-1,3-dihydro-indol-2-one derivatives having anti-cancer activity
AU3363599A (en) 1998-03-26 1999-10-18 Max-Planck Institut Fur Biochemie Heterocyclic families of compounds for the modulation of tyrosine protein kinase
US6395734B1 (en) * 1998-05-29 2002-05-28 Sugen, Inc. Pyrrole substituted 2-indolinone protein kinase inhibitors

Also Published As

Publication number Publication date
NZ508815A (en) 2005-02-25
PT2020408E (pt) 2013-09-13
EA005032B1 (ru) 2004-10-28
TR200003514T2 (tr) 2002-05-21
IL139934A0 (en) 2002-02-10
JP2002516310A (ja) 2002-06-04
ES2429573T3 (es) 2013-11-15
KR20010083039A (ko) 2001-08-31
EP1082305A4 (en) 2001-09-26
HK1126770A1 (en) 2009-09-11
SK18062000A3 (sk) 2001-06-11
NO20005916D0 (no) 2000-11-22
EP1082305A1 (en) 2001-03-14
CA2314156A1 (en) 1999-12-02
CN1311775A (zh) 2001-09-05
DK2020408T3 (da) 2013-09-30
IL139934A (en) 2007-10-31
BR9910792A (pt) 2002-01-29
CA2314156C (en) 2010-05-25
HUP0103617A2 (hu) 2002-02-28
TWI229073B (en) 2005-03-11
EA200001258A1 (ru) 2001-08-27
CN1250526C (zh) 2006-04-12
AR018408A1 (es) 2001-11-14
PL344477A1 (en) 2001-11-05
EP2020408A1 (en) 2009-02-04
AU4410299A (en) 1999-12-13
US6395734B1 (en) 2002-05-28
EP2020408B1 (en) 2013-06-26
NO20005916L (no) 2001-01-29
WO1999061422A1 (en) 1999-12-02
KR100743287B1 (ko) 2007-07-26
US20030105151A1 (en) 2003-06-05
CO5031249A1 (es) 2001-04-27
SK287132B6 (sk) 2009-12-07
US7119090B2 (en) 2006-10-10
JP4528440B2 (ja) 2010-08-18
AU759226B2 (en) 2003-04-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
NO318083B1 (no) Pyrrolsubstituert 2-indolinon protein kinase inhibitorer
US6573293B2 (en) Pyrrole substituted 2-indolinone protein kinase inhibitors
WO2000008202A2 (en) 3-methylidenyl-2-indolinone modulators of protein kinase
NO326604B1 (no) 3-(4-amidopyrrol-2-ylmetliden)-2-indolinonderivater, fremstilling av slike, farmasoytiske preparater inneholdende slike, metode for a modulere den katalytiske aktiviteten til en proteinkinase in vitro med slike forbindelser samt anvendelse av slike forbindelser for fremstilling av medikament for behandling av sykdommer hos pattedyr
AU2001239770A1 (en) Pyrrole substituted 2-indolinone protein kinase inhibitors
JP2002511852A (ja) 蛋白質キナーゼ活性の調節剤としての２−インドリノン誘導体
WO2000012084A1 (en) Geometrically restricted 2-indolinone derivatives as modulators of protein kinase activity
CA2368041A1 (en) Indolinone compounds as kinase inhibitors
WO2002002551A1 (en) 4-heteroaryl-3-heteroarylidenyl-2-indolinones and their use as protein kinase inhibitors
US7214700B2 (en) (2-Oxindol-3-ylidenyl) acetic acid derivatives and their use as protein kinase inhibitors
US6531502B1 (en) 3-Methylidenyl-2-indolinone modulators of protein kinase
MXPA00011770A (en) Pyrrole substituted 2-indolinone protein kinase inhibitors
CZ20004412A3 (cs) Pyrrolem substituované 2-indoIinony jako inhibitory proteinkinázy

Legal Events

Date Code Title Description
MM1K Lapsed by not paying the annual fees