PT1255752E - Inibidores de proteína quinases: 2-indolinonas substituídas com pirrolo - Google Patents

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PT1255752E
PT1255752E PT01914376T PT01914376T PT1255752E PT 1255752 E PT1255752 E PT 1255752E PT 01914376 T PT01914376 T PT 01914376T PT 01914376 T PT01914376 T PT 01914376T PT 1255752 E PT1255752 E PT 1255752E
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ylidenemethyl
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Cho Peng Tang
Todd Miller
Xiaoyuan Li
Li Sun
Chung Chen Wei
Shahrzad Shirazian
Congxin Liang
Tomas Vojkovsky
Asaad S Nematalla
Michael Hawley
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Pharmacia & Upjohn Co Llc
Sugen Inc
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Description

-1-
DESCRIÇÃO
"INIBIDORES DE PROTEÍNA QUINASE 2-INDOLINONA SUBSTITUÍDOS COM PIRROLO"
INFORMAÇÃO CRUZADA
Este pedido reivindica prioridade ao abrigo de 35 U.S.C.119 (e) reportada aos pedidos provisórios U.S. com os números de série 60/182 710, apresentado em 15 de Fevereiro de 2000, 60/216 422, apresentado em 6 de Julho de 2000 e n° de série 60/243 532, apresentado em 27 de Outubro de 2000, cujas descrições aqui são dadas como integralmente incorporadas por citação.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Campo da Invenção A presente invenção relaciona-se com certos compostos de 2-indolinona substituídos com 3-pirrolo que modulam a actividade de proteína quinases ("PKs"). Os compostos desta invenção são por isso úteis no tratamento de patologias relacionadas com actividade de PK anormal. Também se descreve composições farmacêuticas compreendendo estes compostos, métodos de tratamento de doenças utilizando composições farmacêuticas compreendendo estes compostos e métodos para a sua preparação.
Estado da Técnica A seguir apresenta-se informação que é apenas de fundo e que não se considera que constitua estado da técnica em relação à presente invenção. -2-
As PKs são enzimas que catalisam a fosforilação de grupos hidroxilo nos residuos de tirosina, serina e treonina de proteínas. As consequências desta actividade aparentemente simples são avassaladoras; o crescimento, diferenciação e proliferação celulares, i.e., virtualmente todos os aspectos da vida celular dependem de uma maneira ou de outra da actividade de PK. Além disso, a actividade anormal de PK foi relacionada com uma variedade de doenças, que vão desde doenças relativamente sem risco de vida como a psoríase até doenças extremamente virulentas tais como glioblastoma (cancro do cérebro).
As PKs podem ser convenientemente divididas em duas classes, as proteínas tirosinas quinases (PTKs) e as serinas treoninas quinases (STKs).
Um dos principais aspectos da actividade de PTK é o seu envolvimento com receptores de factores de crescimento. Os receptores de factores de crescimento são proteínas da superfície das células. Quando ligados por um ligando de factores de crescimento, os receptores de factores de crescimento são convertidos numa forma activa que interactua com proteínas na superfície interior da membrana celular. Isto leva à fosforilação de resíduos de tirosina do receptor e outras proteínas e à formação dentro da célula de complexos com uma variedade de moléculas de sinalização citoplasmáticas que, por sua vez, provocam numerosas respostas celulares tais como divisão celular (proliferação) , diferenciação celular, crescimento celular, expressão de efeitos metabólicos para o microambiente extracelular, etc. Para uma discussão mais completa, ver Schlessinger e Ullrich, Neuron, 9:303-391 (1992) que aqui é dado como integralmente incorporado por citação, incluindo todos os desenhos. -3-
Os receptores de factores do crescimento com actividade de PTK são conhecidos como tirosinas quinases receptoras ("RTKs"). Compreendem uma grande família de receptores transmembranares com actividade biológica diversificada. Presentemente, foram identificadas pelos menos dezanove (19) subfamílias diferentes de RTKs. Um exemplo destas é a subfamília chamada RTKs "HER", que inclui EGFR (receptor do factor de crescimento epitelial), HER2, HER3 e HER4. Estas RTKs consistem num domínio extracelular de ligação a ligandos glicosilados, num domínio transmembranar e num domínio catalítico citoplasmático intracelular que pode fosforilar os resíduos de tirosina das proteínas.
Outra subfamília de RTK consiste no receptor de insulina (IR), no receptor de factor de crescimento I semelhante a insulina (IGF-1R) e no receptor relacionado com o receptor de insulina (IRR) 0 IR e o IGF-1R interactuam com insulina, IGF-I e IGF-II para formar um heterotetrâmero com duas subunidades extracelulares α totalmente glicosiladas e duas subunidades β que atravessam a membrana celular e que contêm o domínio de tirosina quinase.
Uma terceira subfamília de RTKs é referida como o grupo dos receptores de factor de crescimento derivado de plaquetas ("PDGFR") , que inclui PDGFRCC, PDGFRP, CSFIR, c-kit e c-fms. Estes receptores consistem em domínios extracelulares glicosilados constituídos por números variáveis de ansas semelhantes a imunoglobina e um domínio intracelular em que o domínio de tirosina quinase está interrompido por sequências de aminoácidos não relacionadas.
Outro grupo que, devido à sua semelhança com a subfamília de PDGFR, é por vezes incluído no último grupo -4- é a subfamília de receptores de quinases de fígado de feto ("flk"). Crê-se que este grupo é constituído por receptor do domínio de inserção da quinase/quinase-1 de fígado fetal (KDR/FLK-1, VEGF-R2), flk-lR, flk-4 e tirosina quinase 1 semelhante a fms (flt-1).
Outro membro da família dos receptores de factor de crescimento tirosinas quinases é o subgrupo dos receptores de factor de crescimento de fibroblastos ("FGF"). Este grupo consiste em quatro receptores, FGFRl-4, e sete ligandos, FGF1-7. Embora ainda não bem definidos, aparentemente os receptores consistem num domínio extracelular glicosilado contendo um número variável de ansas semelhantes a imunoglobina e um domínio intracelular em que a sequência da tirosina quinase está interrompida por regiões de sequências de aminoácidos não relacionadas.
Ainda outro membro da família de receptores de factor de crescimento tirosinas quinases é o subgrupo dos receptores de factor de crescimento endotelial vascular (VEGF"). 0 VEGF é uma glicoproteína dimérica semelhante a PDGF mas in vivo tem funções biológicas e especificidade para células alvo diferentes. Em particular, presentemente crê-se que o VEGF desempenha um papel essencial na vasculogénese e na angiogénese.
Uma listagem mais completa das subfamílias de RTK conhecidas está descrita em Plowman et al., DN&P, 7 (6):334-339 (1994) que é aqui dada como integralmente incorporada por citação, incluindo quaisquer desenhos, como se aqui estivesse completamente descrita.
Para além das RTKS, também existe uma família de PTKS inteiramente intracelulares chamada "tirosinas quinases não receptoras" ou "tirosinas quinases celulares". Será aqui utilizada esta última designação, abreviadamente -5- "CTK". As CTKs não contêm domínios extracelulares e transmembranares. Presentemente, foram identificadas mais de 24 CTKs em 11 subfamílias (Src, Frk, Btk, Csk, Abl, Zap70, Fes, Fps, Fak, Jak e Ack) . A subfamília Src parece por agora ser o maior grupo de CTKs e inclui Src, Yes, Fyn, Lyn, Lck, Blk, Hck, Fgr e Yrk. Para uma discussão mais pormenorizada de CTKs, ver Bolen, Oncogene, 8:2025-2031 (1993), que é aqui dada como incorporada por citação, incluindo quaisquer desenhos, como se aqui estivesse completamente descrita.
As serinas/treoninas quinases, STKs, como as CTKs, são predominantemente intracelulares embora haja algumas quinases receptoras do tipo STK. As STKs são as mais comuns das quinases citossólicas; i.e., quinases que executam as suas funções na parte do citoplasma que não os organelos citoplasmáticos e citoesqueleto. O citossol é a região dentro da célula em que ocorre muita da actividade metabólica e biossintética intermediária da célula; e.g., é no citossol que as proteínas são sintetizadas em ribossomas.
As RTKs, CTKs e STKs foram todas elas implicadas numa multiplicidade de estados patogénicos incluindo, significativamente, cancro. Outros estados patogénicos que foram associados a PTKs incluem, sem limitação, psoríase, cirrose hepática, diabetes, angiogénese, restenose, doenças oculares, artrite reumatóide e outras doenças inflamatórias, doenças imunológicas tais como doença autoimune, doença cardiovascular tal como aterosclerose e uma variedade de doenças renais.
No que se refere ao cancro, duas das principais hipóteses avançadas para explicar a proliferação celular excessiva que provoca o desenvolvimento de tumores -6- relacionam-se com funções conhecidas por serem reguladas por PKs. Isto é, foi sugerido que o crescimento de células malignas resulta de uma degradação dos mecanismos que controlam a divisão e/ou diferenciação celular. Demonstrou-se que os produtos proteínas de vários proto-oncogenes estão envolvidos nas vias de transdução de sinais que regulam o crescimento e a diferenciação celular. Estes produtos proteínas de proto-oncogenes incluem os factores de crescimento extracelulares, os receptores PTK de factores de crescimento transmembranares, PTKs citoplasmáticos (CTKs) e STKs citossólicos, discutidos acima.
Tendo em conta a ligação aparente entre actividades celulares relacionadas com PKs e a ampla variedade de doenças humanas, não é de surpreender que esteja a ser dispendido um grande esforço numa tentativa para identificar formas de modular a actividade de PKs. Algum deste esforço envolveu abordagens biomiméticas utilizando moléculas grandes decalcadas das envolvidas nos processos celulares reais (e.g., ligandos mutantes (pedido U.S. N° 4 966 849) ; receptores e anticorpos solúveis (pedido N° WO 94/10202, Kendall e Thomas, Proc. Nat'l Acad. Sei., 90:10705-09 (1994), Kim et ai., Nature, 362:841-844 (1993)); ligandos de ARN (Jelinek et ai., Biochemistry, 33:10450-56); Takano et ai., Mol. Bio. Cell 4:358A (1993); Kinsella et ai., Exp. Cell Res. 199:56-62 (1992); Wright et ai., J. Cellular Phys., 152:44857) e inibidores de tirosinas quinases (WO 94/03427; WO 92/21660; W091/15495; WO 94/14808; patente U.S. N° 5 330 992; Mariani et ai., Proc. Am. Assoe. Câncer Res., 35:2268 (1994)).
Para além das referidas acima, foram feitas
tentativas para identificar moléculas pequenas que actuam como inibidores de PKs. Por exemplo, compostos de arilo bis-monocíclicos, bicíclicos e heterocíclicos (PCT WO -7- 92/20642), derivados de vinileno-azaindole (PCT WO 94/14808) e l-ciclopropil-4-piridilquinolonas (patente U.S. N° 5 330 992) foram descritos como inibidores de tirosinas quinases. Compostos de estirilo (patente U.S. N° 5 217 999), compostos de piridilo substituídos com estirilo (patente U.S. N° 5 302 606), derivados de quinazolina (pedido EP N° 0 566 266 Al), selenaindoles e selenetos (PCT WO 94/03427), compostos tricíclicos polihidroxilados (PCT WO 92/21660) e compostos de ácido benzilfosfónico (PCT WO 91/15495) foram todos eles descritos como inibidores de PTKs úteis no tratamento de cancro.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção é dirigida a certos compostos de 2-indolina 3-substituídos com pirrolo que apresentam capacidade de modulação de PK e são por isso úteis no tratamento de doenças relacionadas com actividade anormal de PK.
Em conformidade, num aspecto, a presente invenção relaciona-se com 2-indolinonas 3-substituídas com pirrolo de fórmula (I) :
em que: (I) -8- R-*- é seleccionado de hidrogénio, (C1-C4) alquilo, (CH2)rR16 e -C(0)NR8R9; R3 é seleccionado de hidrogénio, halogéneo, arilo e -S(0)2NR13R14; R3 é seleccionado de hidrogénio, (C1-C4)alquilo, (Ci — C4)alcoxi, arilo, heteroarilo e -C(0)r13; R4 é hidrogénio; R3 é seleccionado de hidrogénio e (C1-C4)alquilo; R6 é -C(0)R10; R7 é seleccionado de hidrogénio, (C1-C4)alquilo e arilo; R8 e R9 são seleccionados independentemente de hidrogénio, alquilo e arilo; rIO é -N(rH) (CH2)nR·*·3^ em que n é 1, 2 ou 3, rH é hidrogénio e R-*-3 é seleccionado de hidroxilo, (C1 — C4)alcoxi, -C(0)R13, heteroarilo e -NR13R^4; R13 e R14 são seleccionados independentemente do grupo que consiste em hidrogénio, (C1-C4)alquilo, cicloalquilo, arilo e heteroarilo; ou r13 e R34 podem combinar-se para formar um grupo heterociclo; r!5 é seleccionado do grupo que consiste em hidrogénio, hidroxilo, (C1-C4)alcoxi e ariloxi;
Rl^ é seleccionado de hidroxilo e -C(0)R-'-3; e -9- r é 2 ou 3; ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.
Derivados de indolinona e a sua utilização prevista estão referidos nas seguintes publicações: patente US 5 886 020; pedidos de patente internacional WO98/50356, W099/61422 e WO00/38519 (publicado em 6 de Julho de 2000); J. Med. Chem. 1998, 41,2588-2603. Derivados de oxindole e a sua utilização prevista estão referidos na seguinte publicação: WO00/35908 (publicado em 22 de Junho de 2000). Formulações para agentes farmacêuticos ionizáveis como ácidos livres ou bases livres estão referidas na seguinte publicação: W001/37820 (publicado em 31 de Maio de 2001).
Num segundo aspecto esta invenção é dirigida a uma composição farmacêutica compreendendo um ou mais compostos de fórmula (I) ou um seu sal farmaceuticamente aceitável e um excipiente farmaceuticamente aceitável.
Num terceiro aspecto, esta invenção é dirigida à utilização de um composto de fórmula (I) ou um seu sal farmaceuticamente aceitável no fabrico de um medicamento para o tratamento de uma doença relacionada com proteínas quinases, num organismo, em particular em seres humanos, (I) . Essas doenças incluem a título de exemplo e não de limitação, cancro, diabetes, cirrose hepática, doença cardiovascular tal como aterosclerose, angiogénese, doença imunológica tal como doença autoimune e doença renal.
DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO
Definições
Salvo indicação em contrário os seguintes termos utilizados na especificação e reivindicações têm os significados discutidos adiante: -10- "Alquilo" refere-se a um radical de hidrocarboneto alifático saturado incluindo grupos de cadeia linear e cadeia ramificada com 1 a 24 átomos de carbono. Exemplos de grupos alquilo incluem metilo, etilo, propilo, 2-propilo, n-butilo, iso-butilo ou terc-butilo, e outros semelhantes. O grupo alquilo está não substituído. "Cicloalquilo" refere-se a um anel monocíclico com 3 a 8 membros todos de carbono, um anel bicíclico condensado com 5 membros/6 membros ou 6 membros/6 membros todos de carbono ou um grupo em anel condensado multicíclico (um sistema de anéis "condensado" significa que cada anel do sistema partilha um par adjacente de átomos de carbono com cada um dos outros anéis do sistema) em que um ou mais dos anéis podem conter uma ou mais ligações duplas mas nenhum dos anéis tem um sistema de electrões pi completamente conjugado.
Exemplos, sem limitação, de grupos cicloalquilo são ciclopropano, ciclobutano, ciclopentano, ciclopenteno, ciclohexano, ciclohexadieno, adamantano, cicloheptano, cicloheptatrieno e outros semelhantes. O grupo cicloalquilo está não substituído. "Arilo" refere-se a grupos monocíclicos ou policíclicos de anéis condensados (i.e., anéis que partilham pares adjacentes de átomos de carbono) todos de carbono com 1 a 12 átomos de carbono que têm um sistema de electrões pi completamente conjugados. Exemplos, sem limitação, de grupos arilo são fenilo, naftalenilo e antracenilo. O grupo arilo pode estar substituído ou não substituído. Quando substituído, o grupo arilo está substituído com um ou dois substituintes seleccionados de halogéneo, alquilo, trihalogenoalquilo, hidroxilo, mercapto, ciano, N-amido, mono ou dialquilamino, carboxilo -li ou N-sulfonamido. "Heteroarilo" refere-se a um grupo monocíclico ou em anel condensado (i.e., anéis que partilham um par adjacente de átomos de carbono) com 5 a 12 átomos no anel contendo um, dois ou três heteroátomos no anel seleccionados de N, 0 ou S, sendo os restantes átomos do anel C, e, além disso, tendo um sistema de electrões pi completamente conjugados. Exemplos, sem limitação, de grupos heteroarilo não substituídos são pirrolo, furano, tiofeno, imidazole, oxazole, tiazole, pirazole, piridina, pirimidina, quinolina, isoquinolina, purina e carbazole. 0 grupo heteroarilo pode estar substituído ou não substituído. Quando substituído, o grupo heteroarilo está substituído com um ou dois substituintes seleccionados independentemente de halogéneo, alquilo, trihalogenoalquilo, hidroxilo, mercapto, ciano, N-amido, mono ou dialquilamino, carboxilo ou N-sulfonamido. "Heterociclo" significa um radical cíclico saturado com 3 a 8 átomos no anel em que um ou dois átomos do anel são heteroátomos seleccionados de N, 0 ou S(0)n (em que n é um número inteiro desde 0 a 2), sendo os restantes átomos do anel C, em que um ou dois átomos de C podem estar opcionalmente substituídos por um grupo carbonilo. Mais especificamente o termo heterociclilo inclui, mas não está limitado a tetrahidropiranilo, 2,2-dimetil-l,3-dioxolano, piperidino, W-metilpiperidin-3-ilo, piperazino, W-metilpirrolidin-3-ilo, 3-pirrolidino, morfolino, tiomorfolino, 1-óxido de tiomorfolino, 1,1-dióxido de tiomorfolino, 4-etiloxicarbonilpiperazino, 3-oxopiperazino, 2-imidazolidona, 2-pirrolidinona, 2-oxohomopiperazino, tetrahidropirimidin-2-ona e os seus derivados. 0 grupo heterociclo está opcionalmente substituído com um ou dois substituintes seleccionados independentemente de halogéneo, alquilo, alquilo -12- substituído com carboxilo ou éster, hidroxilo, mono ou dialquilamino. "Hidroxilo" refere-se a um grupo -OH. "Alcoxi" refere-se tanto a um grupo -0-(alquilo não substituído) como -0- (cicloalquilo não substituído). Exemplos representativos incluem, mas não estão limitados a, e.g., metoxi, etoxi, propoxi, butoxi, ciclopropiloxi, ciclobutiloxi, ciclopentiloxi, ciclo-hexiloxi e outros semelhantes. "Ariloxi" refere-se tanto a um grupo -0-arilo como -O-heteroarilo, tal como aqui definidos. Exemplos representativos incluem, mas não estão limitados a fenoxi, piridiniloxi, furaniloxi, tieniloxi, pirimidiniloxi, piraziniloxi, e outros semelhantes, e os seus derivados. "Mercapto" refere-se a um grupo -SH. "Éster" refere-se a um grupo -C(0)0-R", em que R" é seleccionado do grupo que consiste em alquilo, trihalogenometilo, cicloalquilo, arilo opcionalmente substituído, heteroarilo opcionalmente substituído (ligado através de um átomo de carbono).
Grupo "halogéneo" refere-se a flúor, cloro, bromo ou iodo, preferencialmente flúor ou cloro.
Grupo "trihalogenometilo" refere-se a um grupo -CX3 em que X é um grupo halogéneo tal como aqui definido. "Ciano" refere-se a um grupo -C^N. "N-sulfonamido" refere-se a um grupo -NR^^S(O)2R^^, com r!8 e R-*-^ tal como aqui definidos. -13- "N-amido" refere-se a um grupo R^8C (0)NR^9-, com R18 e R19 tal como aqui definidos. R-*-8 e R·*·9 são seleccionados independentemente de hidrogénio e alquilo.
Os termos "2-indolinona", "indolin-2-ona" e "2- oxindole" são aqui utilizados intermutavelmente para referir uma molécula com a estrutura quimica:
0 termo "pirrolo" refere-se a uma molécula com a estrutura quimica:
H 0 termo "2-indolinona substituída por pirrolo" e "3-pirrolidenil-2-indolinona" são aqui utilizados intermutavelmente para referir um composto químico com a estrutura geral ilustrada na Fórmula (I).
Os compostos que têm a mesma fórmula molecular mas diferem quanto à natureza ou sequência das ligações dos seus átomos ou da disposição espacial dos seus átomos são chamados "isómeros". Os isómeros que na disposição espacial dos seus átomos são chamados "estereoisómeros". Os estereoisómeros que não são imagens num espelho um do -14- outro são chamados "diastereómeros" e aqueles que são imagens num espelho não sobreponíveis um do outro são chamados "enantiómeros". Quando um composto tem um centro assimétrico, por exemplo, está ligado a quatro grupos diferentes, é possível um par de enantiómeros. Um enantiómero pode ser caracterizado pela configuração absoluta do seu centro assimétrico e é descrito pelas regras de sequenciação R e S de Cahn e Prelog, ou pelo modo como a molécula faz rodar o plano da luz polarizada e designado como dextrorrotatório ou levorrotatório (i.e., como isómeros (+) ou (-) respectivamente). Um composto quiral pode existir como enantiómero individual ou como uma sua mistura. Uma mistura contendo iguais proporções dos enantiómeros é chamada uma "mistura racémica".
Os compostos desta invenção podem ter um ou mais centros assimétricos; esses compostos podem portanto ser produzidos como estereoisómeros (R) ou (S) individuais ou como misturas suas.
Salvo indicação em contrário, a descrição ou designação de um composto especifico na especificação e reivindicações pretende incluir tanto os enantiómeros individuais como as suas misturas, racémicas ou outras. Os métodos para a determinação da estereoquímica e para a separação de estereoisómeros são bem conhecidos na arte (ver discussão no Capítulo 4 de "Advanced Organic Chemistry", 4th edition J. March, John Wiley and Sons, New York, 1992) .
Os compostos de Fórmula (I) podem apresentar o fenómeno de tautomeria e isomeria estrutural. Por exemplo, os compostos aqui descritos podem adoptar uma configuração E ou Z em torno da ligação dupla que liga a unidade de 2-indolinona à unidade de pirrolo ou podem ser uma mistura de E e Z. Esta invenção abrange qualquer forma tautomérica -15- ou isomérica estrutural e as suas misturas que possuem a aptidão para modular actividade de RTK, CTK e/ou STK e não está limitada a qualquer uma forma tautomérica ou isomérica estrutural.
Uma "composição farmacêutica" refere-se a uma mistura de um ou mais dos compostos aqui descritos, ou os seus sais ou pró-fármacos fisiologicamente/farmaceuticamente aceitáveis, com outros componentes químicos, tais como veículos e excipientes fisiologicamente/farmaceuticamente aceitáveis. 0 objectivo da uma composição farmacêutica é facilitar a administração de um composto a um organismo. 0 composto de Fórmula (I) também pode actuar como um pró-fármaco. Um "pró-fármaco" refere-se a um agente que é convertido no fármaco mãe in vivo. Os pró-fármacos são frequentemente úteis porque, em algumas situações, podem ser mais fáceis de administrar do que o fármaco mãe. Podem, por exemplo, ser biodisponíveis por administração oral ao passo que o fármaco mãe não é. 0 pró-fármaco também pode ter solubilidade melhorada em composições farmacêuticas em comparação com o fármaco mãe. Um exemplo, sem limitação, de um pró-fármaco seria um composto da presente invenção que é administrado como um éster (o "pró-fármaco") para facilitar a transmissão através da membrana celular quando a solubilidade em água é nociva para a mobilidade mas depois é hidrolisado metabolicamente ao ácido carboxílico, a entidade activa, uma vez no interior da célula onde a solubilidade em água é vantajosa.
Um exemplo adicional de um pró-fármaco podia ser um polipéptido curto, por exemplo, sem limitação, um polipéptido com 2-10 aminoácidos, ligado através de um grupo carboxilo de um composto desta invenção em que o polipéptido é hidrolisado ou metabolizado in vivo para -16- libertar a molécula activa. Os pró-fármacos de um composto de Fórmula (I) estão dentro do âmbito desta invenção.
Adicionalmente, está contemplado que um composto de Fórmula (I) seria metabolizado por enzimas no corpo do organismo tal como um ser humano para produzir um metabolito que pode modular a actividade das proteínas quinases. Esses metabolitos estão dentro do âmbito da presente invenção.
Tal como aqui utilizado, um "veículo fisiologicamente/farmaceuticamente aceitável" refere-se a um veículo ou diluente que não causa irritação significativa num organismo e que não suprime a actividade biológica e propriedades do composto administrado.
Um "excipiente farmaceuticamente aceitável" refere-se a uma substância inerte adicionada a uma composição farmacêutica para facilitar mais a administração de um composto. Exemplos, sem limitação, de excipientes incluem carbonato de cálcio, fosfato de cálcio, vários açúcares e tipo de amido, derivados de celulose, gelatina, óleos vegetais e polietileno glicóis.
Tal como aqui utilizado, o termo "sal farmaceuticamente aceitável" refere-se aos sais que retêm a eficácia biológica e propriedades do composto mãe. Esses sais incluem: (i) sal de adição de ácido que é obtido por reacção da base livre do composto mãe com ácidos inorgânicos tais como ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico e ácido perclórico e outros semelhantes, ou com ácidos orgânicos tais como ácido acético, ácido oxálico, ácido (D) ou (L) málico, ácido maleico, ácido -17- metanossulfónico, ácido etanossulfónico, ácido p-toluenossulfónico, ácido salicilico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido succínico ou ácido malónico e outros semelhantes, preferencialmente ácido clorídrico ou ácido (L) -málico tal como o sal L-malato da (2-dietilaminoetil)amida do ácido 5-(5-fluoro-2-oxo-l,2-di-hidroindol-3-ilidenometil)-2, 4-dimetil-lii-pirrolo-3-carboxílico; ou (2) sais formados quando um protão ácido presente no composto mãe é substituído por um ião de um metal, e.g., um ião de um metal alcalino, um ião de um metal alcalino-terrosos, ou um ião alumínio; ou coordena com uma base orgânica tal como etanolamina, dietanolamina, trietanolamina, trometamina, N-metilglucamina e outras semelhantes. "PK" refere-se a proteína tirosina quinase receptora (RTKs), a tirosina quinase não receptora ou "celular" (CTKs) e serinas treoninas quinases (STKs). "Método" refere-se a modos, meios, técnicas e procedimentos para realizar uma dada tarefa incluindo, mas não limitada aos modos, meios, técnicas e procedimentos quer conhecidos, quer prontamente desenvolvidos a partir de modos, meios, técnicas e procedimentos conhecidos por quem pratica as artes da química, farmacêutica, biológica, bioquímica e médica. "Modulação" ou "modular" refere-se à alteração da actividade catalítica de RTKs, CTKs e STKs. Em particular, modular refere-se à activação da actividade catalítica de RTKs, CTKs e STKs, preferencialmente a activação ou inibição da actividade catalítica de RTKs, CTKs e STKs, dependendo da concentração do composto do sal ao qual a RTK, CTK ou STK é exposta ou, mais preferencialmente, a -18- inibição da actividade catalítica de RTKs, CTKs e STKs. "Actividade catalítica" refere-se à taxa de fosforilação de tirosina sob a influência, directa ou indirecta de RTKs e/ou CTKs ou de fosforilação de serina e treonina sob a influência, directa ou indirecta, de STKs. "Fazer contactar" refere-se a juntar um composto desta invenção e uma PK alvo de tal modo que o composto pode afectar a actividade catalítica da PK, quer directamente, i.e., por interacção com a própria quinase, quer indirectamente, i.e., por interacção com outra molécula da qual está dependente a actividade catalítica da quinase. Esse "fazer contactar" pode ser realizado in vitro, i.e., num tubo de ensaio, placa de Petri ou outra semelhante. Num tubo de ensaio, fazer contactar pode envolver só um composto e uma PK de interesse ou pode envolver células inteiras. As células também podem ser mantidas ou cultivadas em placas de cultura de células e feitas contactar com um composto nesse ambiente. Neste contexto, a aptidão de um composto particular para afectar uma doença relacionada com PK, i.e., a IC50 do composto, definida adiante, pode ser determinada antes de ser tentada a utilização dos compostos in vivo com organismos vivos mais complexos. Para células fora do organismo, existem múltiplos métodos, e são bem conhecidos pelos especialistas na matéria, para levar as PKs ao contacto com os compostos incluindo, mas não limitados a micro-injecção directa na células e numerosas técnicas com transportadores transmembranares. "In vitro" refere-se a procedimentos realizados num ambiente artificial tal como, e.g., sem limitação, num tubo de ensaio ou num meio de cultura.
In vivo" refere-se a procedimentos realizados com um -19- organismo vivo tal como, sem limitação, um murganho, rato ou coelho. "Doença relacionada com PK," "doença determinada por PK " e "actividade de PK anormal" referem-se todas a uma patologia caracterizadas por actividade catalítica inapropriada de PK, i.e., sub- ou, mais vulgarmente, sobre-actividade, em que a PK particular pode ser uma RTK, uma CTK ou uma STK. A actividade catalítica inapropriada pode surgir como o resultado de: (1) expressão de PK em células que normalmente não exprimem PKs, (2) expressão aumentada de PK conduzindo a proliferação, diferenciação e/ou crescimento celular indesejados, ou (3) expressão diminuída de PK conduzindo a reduções indesejadas de proliferação, diferenciação e/ou crescimento celular. Sobre-actividade de uma PK refere-se ou à amplificação do gene que codifica uma PK particular ou produção de um nível de actividade de PK que se pode correlacionar com doença da proliferação, diferenciação e/ou crescimento celular (isto é, à medida que aumenta o nível de PK, aumenta a gravidade de um ou mais dos sintomas da doença patologia). Sub-actividade, é claro, é o inverso, em que a gravidade de um ou mais sintomas de uma patologia celular aumenta a medida que diminui o nível de actividade de PK. "Tratar", "tratando" e "tratamento" referem-se a um método de aliviar ou suprimir uma patologia celular mediada por PK e/ou os sintomas acompanhantes. Em relação particularmente a cancro, estes termos significam simplesmente que será aumentada a esperança de vida de um indivíduo que sofre de cancro será aumentada ou que serão reduzidos um ou mais sintomas da doença. "Organismo" refere-se a qualquer entidade viva constituída por pelo menos uma célula. Um organismo vivo pode ser tão simples como, por exemplo, uma única célula -20- eucariótica ou tão complexo como um mamífero, incluindo um ser humano. "Quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se à quantidade do composto a ser administrado que vai aliviar em certa medida um ou mais dos sintomas da doença a ser tratada. Na referência ao tratamento de cancro, uma quantidade terapeuticamente eficaz refere-se à quantidade que tem o efeito de: (1) redução do tamanho do tumor; (2) inibição (isto é, abrandamento em certa medida, preferencialmente paragem) de metástase tumoral; (3) inibição (isto é, abrandamento em certa medida, preferencialmente paragem) de crescimento tumoral, e/ou, (4) alívio em certa medida (ou, preferencialmente, eliminação) de um ou mais sintomas associados ao cancro. "Monitorização" significa observação ou detecção do efeito de fazer contactar um composto com uma célula que exprime uma PK particular. O efeito observado ou detectado pode ser uma alteração do fenotipo da célula, da actividade catalítica de uma PK ou uma alteração da interacção de uma PK com um parceiro de ligação natural. As técnicas para observação ou detecção desses efeitos são bem conhecidas na arte. O efeito acima referido é seleccionado de uma alteração ou uma ausência de alteração de um fenotipo da célula, uma alteração ou uma ausência de alteração da actividade catalítica da preferida proteína quinase ou uma alteração ou uma ausência de alteração num fenotipo da interacção da referida proteína quinase com um parceiro de ligação natural num aspecto final desta invenção. -21- "Fenotipo da célula" refere-se ao aspecto exterior de uma célula ou tecido ou à função biológica da célula ou do tecido. Exemplos, sem limitação, de um fenotipo da célula são tamanho da célula, crescimento celular, proliferação celular, diferenciação celular, sobrevivência da célula, apoptose e consumo e utilização de nutrientes. Essas caracteristicas fenotipicas são susceptiveis de determinação por técnicas bem conhecidas na arte. "Parceiro de ligação natural" refere-se a um polipéptido que se liga a uma PK particular numa células. Os parceiros de ligação naturais podem desempenhar um papel na propagação de um sinal num processo de transdução de sinais mediado por PK. Uma alteração na interacção do parceiro de ligação natural com a PK pode manifestar-se ela própria como uma concentração aumentada ou diminuída do complexo PK/parceiro de ligação natural e, como resultado, numa alteração observável na aptidão da PK para mediar a transdução de sinais.
Compostos representativos da presente invenção estão apresentados na Tabela I a seguir. 1 (3-dietilaminopropil) amida do ácido 5-(5-bromo-2-oxo-1,2-di-hidroindol-3-ilidenometil)-2-isopropil-4-fenil-lH-pirrolo-3-carboxílico 2 0^-0 a, j- N TfYW 1 (3-pirrolidin-l-ilpropil)-amida do ácido 5-(5-bromo-2-oxo-1,2-di-hidroindol-3-ilidenometil)-2-isopropil-4-fenil-lH-pirrolo-3-carboxílico -22- 3 '•opr (2-dietilaminoetil)amida do ácido 5-(5-bromo-2-oxo-l,2-di-hidroindol-3-ilidenometil)-2-isopropil-4-fenil-lH-pirrolo-3-carboxílico 4 (3-(4-metilpiperazin-l-il)-propil)amida do ácido 5—(5— bromo-2-oxo-l,2-di-hidroindol-3-ilidenometil)-2-isopropil-4-fenil-lH-pirrolo-3-carboxílico 5 (2-pirrolidin-l-il-etil)amida do ácido 5—(5— bromo-2-oxo-l,2-di-hidroindol-3-ilidenometil)- 2- metil-4-fenil-lH-pirrolo- 3- carboxílico 6 (2-dietilamino-etil)amida do ácido 5-(5-bromo-2-oxo-l,2-di-hidroindol-3-ilidenometil)-2-metil-4-fenil-lfl-pirrolo-3-carboxílico 7 Sk- ‘'ttp (3-dietilaminopropil)amida do ácido 5-(5-bromo-2-oxo-1,2-di-hidroindol-3-ilidenometil)-2-metil-4-fenil-lfl-pirrolo-3-carboxílico -23- 8 V>R (2-dietilamino-etil)amida do ácido 5-(5-bromo-2-oxo-l,2-di-hidroindol-3-ilidenometil)-2,4,-dimetil-4-fenil-lH-pirrolo-3-carboxílico 9 (2-dietilamino-etil)amida do ácido 2,4-dimetil-5-(2-oxo-6-fenil-l,2-di-hidroindol-3-ilidenometil)-lfl-pirrolo-3-carboxilico 10 (2-dietilaminoetil)amida do ácido 5-(5-cloro-2-oxo-l,2-di-hidroindol-3-ilidenometil)-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxilico 11 Λ “Ό^Γ^ (2-dietilaminoetil) amida do ácido 5-(5-bromo-2-oxo-l, 2-di-hidroindol-3-ilidenometil)-2,4-dimetil-lfí-pirrolo-3-carboxilico 12 β'Χψ Ò (2-pirrolidin-l-il-etil)amida do ácido 5—(5— bromo-2-oxo-l,2-di-hidroindol-3-ilidenometil)-2,4-dimetil-lfí-pirrolo-3-carboxilico 13 (3-imidazol-l-ilpropil) amida do ácido 5-(5-bromo-2-oxo-1,2-di-hidroindol-3-ilidenometil)-2,4-dimetil-lfí-pirrolo-3-carboxílico -24- 14 (2-dietilaminoetil)amida do ácido 2,4-dimetil-5-(2-oxo-5-fenil-l,2-di-hidroindol-3-ilidenometil) -lfí-pirrolo-3-carboxílico 15 (2-pirrolidin-l-il-etil)amida do ácido 2,4-dimetil-5-(2-oxo-5-fenil-1,2-di-hidroindol-3-ilidenometil)-lfí-pirrolo-3-carboxilico 16 (3-imidazol-l-ilpropil) amida do ácido 2,4-dimetil-5-(2-οχο-6-fenil-l,2-di-hidroindol-3-ilidenometil)-lH-pirrolo-3-carboxilico 17 o*^ (2-dietilaminoetil) amida do ácido 2,4-dimetil-5-(2-oxo-6-fenil-l,2-di-hidroindol-3-ilidenometil)-lH-pirrolo-3-carboxilico 18 (2-pirrolidin-l-il- etil)amida do ácido 2,4-dimetil-5-(2-oxo-6-fenil-1,2-di-hidroindol-3-ilidenometil)-lfí-pirrolo-3-carboxilico 19 0 Η V_>H oOp'* (3-imidazol-l-ilpropil) amida do ácido 2,4-dimetil-5-(2-οχο-6-fenil-l,2-di-hidroindol-3-ilidenometil)-lfí-pirrolo-3-carboxilico -25- 20 Λ* 0 O (2-dietilaminoetil)amida do ácido 5-[6-(3,5-di-hidro-fenil)-2-oxo-l,2-di-hidroindol-3-ilidenometil)-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxílico 21 0 ΊΓ (2-dietilaminoeti1) amida do ácido 2,4-dimetil-5-(2-oxo-6-piridin-3-il-l,2-di-hidroindol-3-idenometil)-1H-pirrolo-3-carboxílico 22 0 0 KH (2-pirrolidin-l-il-etil)amida do ácido 2,4-dimetil-5-(2-oxo-6-piridin-3-il-l,2-di-hidroindol-3-ilidenometil)-lH-pirrolo-3-carboxilico 23 Çf0» (3-dimetilamin-propil)amida do ácido 2,4-dimetil-5-(2-oxo-6-piridin-3-il-l,2-di-hidroindol-3-ilidenometil)-lH-pirrolo-3-carboxilico 24 H (3-dimetilamino-propil)amida do ácido 2,4-dimetil-5-(2-οχο-5-fenil-l,2-di-hidroindol-3-ilidenometil)-lfí-pirrolo-3-carboxilico 25 °T^V~ (3-dietilaminopropil)amida do ácido 2,4-dimetil-5-(2-οχο-5-fenil-l,2-di-hidroindol-3-ilidenometil)-lfí-pirrolo-3-carboxilico -26- 26 0 Μ \>íl (3-dietilaminopropil)amida do ácido 2,4-dimetil-5-(2-οχο-6-fenil-l,2-di-hidroindol-3-ilidenometil)-lH-pirrolo-3-carboxilico 27 0. (3-dietilaminopropil)amida do ácido 5-(5-bromo-2-oxo-1,2-di-hidroindol-3-ilidenometil)-2,4-dimetil-lfl-pirrolo-3-carboxilico 28 tX (2-dietilaminoeti1) amida do ácido 5-(5-bromo-2-oxo-l, 2-di-hidroindol-3-ilidenometil)-2,4-diisopropil-lfí-pirrolo-3-carboxílico 29 ’xxP^c H (3-dietilaminoepropil)amida do ácido 5-(5-bromo-2-oxo-1,2-di-hidroindol-3-ilidenometil)-2,4-diisopropil-lfí-pirrolo-3-carboxílico 30 •χι^^0 (3-pirrolidin-l-ilpropil)-amida do ácido 5-(5-bromo-2-oxo-1,2-di-hidroindol-3-ilidenometil)-lfl-pirrolo-3-carboxilico 31 jbro •Otp (piridin-4-ilmetil) amida do ácido 5-(5-bromo-2-oxo-l, 2-di-hidroindol-3-ilidenometil)-2,4-dimetil-lfí-pirrolo-3-carboxílico -27- 32 (2-pirrolidin-l-il-etil)amida do ácido 5-[6-(4-butil-fenil)-2-oxo-l,2-di-hidroindol-3-ilidenometil]-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxílico 33 ο 0 (2-pirrolidin-l-il-etil)amida do ácido 5—[6— (4— etil-fenil)-2-oxo-l,2-di-hidroindol-3-ilidenometil]-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxílico 34 ο 0 (2-pirrolidin-l-il-etil)amida do ácido 5—[6—(3— isopropil-fenil)-2-oxo-l,2-di-hidroindol-3-ilidenometil]-2,4-dimetil-lfl-pirrolo-3-carboxílico 35 ν 1 ^Β (2-dietilaminoetil)amida do ácido 5-(5-fluoro-2-oxo-l,2-di-hidroindol-3-ilidenometil)—2,4-dimetil-lfl-pirrolo-3-carboxílico 36 q ns ácido 3-(4-(2-dietilaminoetilcarbamoil)-3,5-dimetil-lfí-pirrol-2-ilmetileno-2-oxo-2,3-di-hidro-lH-indole-6-carboxílico 37 Λ.-*"' νθ£^ ΟΗ " (2-pirrolidin-l-il-etil)amida do ácido 5—(5— (dimetilsulfamoíl-2-oxo-l, 2-di-hidroindol-3-ilidenometil)-2,4-dimetil-lfí-pirrolo-3-carboxílico -28- 38 (2-pirrolidin-l-il-etil)amida do ácido 5—[5—(3— cloro-fenilsulfamoíl)-2-oxo-1,2-di-hidroindol-3-ilidenometil]-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxílico 39 , J> (2-pirrolidin-l-il-etil)amida do ácido 2,4-dimetil-5-[2-oxo-5-piridin-3-ilsulfamoíl)-1,2-di-hidroindol-3-ilidenometil]-lH-pirrolo-3-carboxílico 40 3-[3,5-dimetil-4- (4-metil-piperazino-1-carbonil) -lfí-pirrol-2-ilmetileno-[4-(2-hidroxi-etil)-1,3-di-hidroindol-2-ona 41 fenilamida do ácido 3-[3,5-dimetil-4-(4-metil-piperazino-l-carbonil)-lH-pirrol-2-ilmetileno]-2-oxo-2, 3-di-hidro-lH-indole-5-sulfónico 42 Ο 0 *á& 2-(dietilaminoetil)amida do ácido 5- (5-dimetilsulfamoíl-2-oxo-1,2-di-hidroindol-3-ilidenometil-2,4-dimetil-lfí-pirrolo-3-carboxílico -29- 43 b A"Jj : (2-dietilaminoetil)amida do ácido 5-[5-(3-cloro-fenil)sulfamoíl]-2-oxo-1,2-di-hidroindol-3-ilidenometil)-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxílico 44 ο ο-/ ΊύέΓ éster etílico do ácido {[4-metil-5-(4-metil-5-metilsulfamoíl-2-oxo-1,2-di-hidro-indol-3-ilidenometil)-1H-pirrolo-3- carbonil]amino}acético 45 éster etílico do ácido {[4-metil-5-(5-metilsulfamoíl-2-oxo-1,2-di-hidro-indol-3-ilidenometil)-1H-pirrolo-3- carbonil]amino}acético 46 ‘*α?Η ácido ([4-metil-5-(5-metilsulfamoíl-2-oxo-1,2-di-hidro-indol-3-ilidenometil)-1H-pirrolo-3- carbonil]amino}acético 47 metilamida do ácido 3-[3-metil-4-(pipedino-1-carbil) -lfí-pirrol-2-ilmetileno)-2-oxo-2,3-di-hidro-1H-índole-5-sulfónico -30- 48 0 -.ν'"'"* ^CH, rrCo CMl (2-dietilaminoetil)amida do ácido 2,4-dimetil-5-[2-oxo-1,2-di-hidro-indol-(3 Z) — ilidenometil]-1H-pirrolo-3-carboxílico 381 [M+l] 49 rCH, M,C l ~1CH, SXCH* 0 (2-dietilaminoetil)amida do ácido 5-[5-cloro-2-oxo-1,2-di-hidroindol-(3 Z)-ilidenometil]-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxílico 415 [M+l] 50 „iC ^γΓΓ'Μ· ^Γ° (2-pirrolidin-l-iletil)amida do ácido 2,4-dimetil-5-[2-oxo-1,2-di-hidroindol-(3 Z)-ilidenometil]-2,4-dimetil-líí-pirrolo-3-carboxilico 379 [M+l] 51 mxV. lO CM' \Λ>° (2-pirrolidin-l-iletil)amida do ácido 5-[ 5-fluoro-2-oxo-l,2-di-hidroindol- (3 Z) -ilidenometil]-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxílico 397 [M+l] 52 (2-pirrolidin-l-iletil)amida do ácido 5-[5-cloro-2-oxo-l,2-di-hidroindol- (3 Z) -ilidenometil]-1H-pirrolo-3-carboxílico 413 [M+H] -31- 53 Γ* rrí/ CM’ (2- dimetilaminoetil)amida do ácido 2,4-dimetil-5-[2-oxo-l,2-di-hidroindol- (3Z)-ilidenometil]-2,4-dimetil-lfí-pirrolo-3-carboxílico 353 [M+H] 54 o Bvc«> 0yvTBlos I x^° (2-acetilamino-etil)amida do ácido 5-[5-cloro-2-oxo-l,2-di-hidroindol- (3Z)-ilidenometil]-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxílico 399 [M-l] 55 0 (1,C ÍL./^ 1 Jl β ΎΥ^Ο ^ IXjf0 (2-acetilamino- etil)amida do ácido 5- [ 5-fluoro-2-oxo-l,2-di- hidroindol- (3Z)- ilidenometil]-2,4- dimetil-lH-pirrolo-3- carboxílico [383 [M-l] 56 0 HVCM· Vn~í u T >o (2-acetilamino-etil)amida do ácido 2,4-dimetil-5-[2-oxo-l,2-di-hidroindol- (3Z)-ilidenometil]-1H-pirrolo-3-carboxilico 365 [M-l] -32- 57 'ay'* [3- (2-oxo-tetrahidro-pirimidin-l-il)propil]-amida do ácido 5 —[5— bromo-2-oxo-l,2-di-hidroindol-(3Z)-ilidenometil]-2,4-dimetil-lfí-pirrolo-3-carboxílico 500 [M+l] 502 [M+l] 58 Sk(j °γ,γ·0 CM· [3- (2-oxo-tetrahidro-pirimidin-l-il)propil]-amida do ácido 5-[5-cloro-2-oxo-l,2-di-hidroindol-(3Z)-ilidenometil]-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxílico 454 [M-l] 59 o 'Ό#" [3- (2-oxo-tetrahidro-pirimidin-l-il)propil]-amida do ácido 5-[5-fluoro-2-oxo-l,2-di-hidroindol-(3Z)-ilidenometil]-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxilico 438 [M-l] 60 or* [3- (2-oxo-tetrahidro-pirimidin-l-il)propil]-amida do ácido 2,4-dimetil-5-[2-oxo-l,2-di-hidroindol-(3Z)-ilidenometil]-1H-pirrolo-3-carboxílico 422 [M+l] -33- 61 trifluoro-acetato de 4-[2-({5-[5-bromo-2-oxo-1,2-di-hidroindol- (3Z)-ilidenometil]-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carbonil}amino}-etil]-2-oxo-l-piperazínio 486 [N+l] 488 [M+l] 62 «Μ ο [2-(2-oxo-imidazolidin-1-il)etil]amida do ácido 5-[5-bromo-2-oxo-l,2-di-hidroindol- (3Z) -ilidenometil]-2,4-dimetil-líí-pirrolo-3-carboxílico 470 [M-l] 472 [M-l] 63 Cox 0 M-i M,<y>lt 0 °τγ€οίί ^ [2-(2-oxo-imidazolidin-1-il)etil]amida do ácido 5-[5-cloro-2-oxo-l,2-di-hidroindol- (3 Z) -ilidenometil]-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxilico 428 [M+l] 64 0 N ~i ^V-/'R 0 |T>í [2-(2-oxo-imidazolidin-1-il)etil]amida do ácido 5-[5-fluoro-2-oxo-l,2-di-hidroindol-(3 Z)-ilidenometil]-2,4-dimetil-lfí-pirrolo-3-carboxílico 412 [M+l] 65 r>m V* H» 0?' [2-(2-oxo-imidazolidin-1-il)etil]amida do ácido 2,4-dimetil-5-[2-oxo-1,2-di-hidroindol-(3 Z)-ilidenometil]-1H-pirrolo-3-carboxílico 392 [M-l] 392 [M-l] -34- 66 r.-3 éster etílico do ácido {4-[2-({5-[ 5-bromo-2-oxo-1,2-di-hidroindol-(3 Z)-ilidenometil]-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboniljamino)etil]-piperazin-l-il}acético 558 [M+l] 560 [M+l] 67 •V r.-vo ·#· éster etílico do ácido {4-[2- ({5-[5-cloro-2-oxo-1,2-di-hidroindol-(3 Z)-ilidenometil]-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carbonil}amino)etil]-piperazin-l-il}acético 514 [M+l] 68 "Λ r'«v 0 H j i ·# éster etílico do ácido {4-[2- ({5-[5-fluoro-2-oxo-1,2-di-hidroindol-(3 Z)-ilidenometil]-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carbonil}amino)etil]-piperazin-l-il}acético 498 [M+l] 69 •vKf^b [3-(2-oxo-azepan-l-il)propil]amida do ácido 5-[5-bromo-2-oxo-l,2-di-hidroindol- (3Z)-ilidenometil]-2,4-dimetil-li7-pirrolo-3-carboxílico 511 [M-l] 513 [M-l] 70 v»~^b "wO* ^ i T Vo [3- (2-oxo-azepan-l-il)propil]amida do ácido 5-[5-cloro-2-oxo-l,2-di-hidroindol- (3Z)-ilidenometil]-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxílico 469 [M+l] -35- 71 [3- (2-oxo-azepan-l-il)propil]amida do ácido 5-[5-fluoro-2-oxo-l,2-di-hidroindol-(3Z)-ilidenometil]-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxílico 453 [M+l] 72 0 'νλτ^ϋ [3- (2-oxo-azepan-l-il)propil]amida do ácido 2,4-dimetil-5-[2-oxo-1,2-di-hidroindol-(3Z)-ilidenometil]-1H-pirrolo-3-carboxílico 435 [M+l] 73 0 B rcH> I Τ >0 Η (2-acetilaminoetil)amida do ácido 5-[5-bromo-2-oxo-1,2-di-hidroindol-(3 Z)-ilidenometil]-2,4-dimetil-líí-pirrolo-3-carboxílico 443 [M+l] 445 [M+l] 74 . jb . ΰ}~ trifluoro-acetato de 4-[2- ( (5-[5-fluoro-2-oxo-1,2-di-hidroindol-(3Z)-ilidenometil]-2,4-dimetil-líí-pirrolo-3-carbonil}amino}-etil]-2-oxo-l-piperazínio 426 [M+l] 75 0 p *V ^ :X trifluoro-acetato de 4-[2-((2,4-dimetil-5-[2-oxo-1,2-di-hidroindol-(3Z)-ilidenometil]-1H-pirrolo-3-carbonil}-amino)-etil]-2-oxo-l-piperazinio 408 [M+l] -36- 76 0 . JJ "V>i W'0 trifluoro-acetato de 4-[2- ( (5-[5-cloro-2-oxo-1,2-di-hidroindol- (3Z)-ilidenometil]-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carbonil}-amino)-etil]-2-oxo-l-piperazínio 440 [M-l] 77 § rf1· /1 3 r« CU *γγ^ο* íí [2-(4-metil-piperazin-l-il)-etil]-amida do ácido 5- (5-fluoro-2-oxo-l,2-di-hidroindol-(3Z)-ilidenometil]-2,4-dimetil-lfí-pirrolo-3-carboxílico 424 [M-l] 78 ? 0'CM* Π M Λν CU, Ov^j H |TV» [2- (4-metil-piperazin-l-il)-etil]-amida do ácido 5-[5-cloro-2-oxo-l,2-di-hidroindol- (3 Z) -ilidenometil]-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxilico 440 [M-l] 79 o r^CH· 1*· |T >0 H [2-(4-metil-piperazin-l-il)-etil]-amida do ácido 5-[5-bromo-2-oxo-l,2-di-hidroindol- (3 Z) -ilidenometil]-2,4-dimetil-li7-pirrolo-3-carboxilico 484 [M-l] 486 [M-l] 80 f rf"· lA3 0 [2- (4-metil-piperazin-l-il)-etil]-amida do ácido 2,4-dimetil-5-[2-oxo-1,2-di-hidroindol-(3 Z)-ilidenometil] -lfí-pirrolo-3-carboxílico 406 [M-l] -37- 81 , Λ [2- (3,5-dimetil-piperazin-l-il)-etil]-amida do ácido 2,4-dimetil-5-[2-oxo-l,2-di-hidroindol- (3Z)-ilidenometil]-1H-pirrolo-3-carboxílico 422 [M+l] 82 χ [2-(3,5-dimetil-piperazin-l-il)-etil]-amida do ácido 5—[5— fluoro-2-oxo-l,2-di-hidroindol-(3Z)-ilidenometil]-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxilico 438 [M-l] 83 χ 0 Γγ> 0__/n CH- ΤΎ>ο M [2-(3,5-dimetil-piperazin-l-il)-etil]-amida do ácido 5—[5— cloro-2-oxo-l,2-di-hidroindol-(3 Z)-ilidenometil]-2,4-dimetil-lfí-pirrolo-3-carboxílico 456 [M+l] 84 X 8 r" /ΐ'ί». frwvH [2- (3,5-dimetil-piperazin-l-il)-etil]-amida do ácido 5-[5-bromo-2-oxo-l,2-di-hidroindol- (3Z)-ilidenometil]-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxílico 498 [M-l] 500 [M-l] -38- 85 0 ___/'Ν^Ο VJ. JríH ívff6' B [ Vo [3-(4-metil-piperazin-l-il-propil]amida do ácido 2,4-dimetil-5-[2-oxo-1,2-di-hidroindol-(3Z)-ilidenometil]-1H-pirrolo-3-carboxílico 422 [M+l] 86 v^N-c«, ίν,^ν-^ « CH> [3-(4-metil-piperazin-l-il-propil]amida do ácido 5-[5-fluoro-2-oxo-l,2-di-hidroindol-(3 Z)-ilidenometil]-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxílico 438 [M-l] 87 °v^C« '^ T T >»o [3-(4-metil-piperazin-l-il-propil]amida do ácido 5-[5-cloro-2-oxo-l,2-di-hidroindol- (3Z) -ilidenometil]-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxílico 454 [M-l] 88 9, e, /' m^cm, 5 TVo [3-(4-metil-piperazin-l-il-propil]amida do ácido 5-[5-bromo-2-oxo-l,2-di-hidroindol- (3 Z) -ilidenometil]-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxílico 498 [M-l] 500 [M-l] 89 ο Γ^ν'Ν'0 -/a U3>° (3-pirrolidin-l-il-2-ona)-amida do ácido 5-[5-cloro-2-oxo-l,2-di-hidroindol- (3 Z) -ilidenometil]-2,4-dimetil-lfí-pirrolo-3-carboxílico 480 [M+l] -39- 90 ο Λ ΤΧ 9 tH· U cf.co,H trifluoroacetato de 4-[2 - ({5-[5-cloro-2-oxo-1,2-di-hidroindol-(3Z)-ilidenometil]-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carbonil}amino)-etil]-2-oxo-l-piperazínio -440 [M-l] 91 0 0 H,cr^^ó c.s^wT« CH· u>° H (3-pirrolidin-l-il-2-ona)-amida do ácido 5-[5-cloro-2-oxo-l,2-di-hidroindol- (3Z) -ilidenometil]-2,4-dimetil-lfí-pirrolo-3-carboxílico 92 νφ·~ (3-pirrolidin-l-il-2-ona)-amida do ácido 5-[5-fluoro-2-oxo-l,2-di-hidroindol- (3 Z) -ilidenometil]-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxílico 93 Η 0 /, n CH> aC. (3-pirrolidin-l-il-2-ona)-amida do ácido 5-[2-oxo-l,2-di-hidroindol- (3 Z) -ilidenometil]-1H-pirrolo-3-carboxílico 94 CH· TJL>° ΟΡ,ΟΟ,Η (2-piridin-2- iletil)amida do ácido 5- [5-cloro-2-oxo-l,2-di- hidroindol- (3 Z) - ilidenometil]-2,4- dimetil-lfí-pirrolo-3- carboxílico -40- 95 F - CM· ITVo CF,CO,H sal trifluoroacetato de (2-piridin-2-iletil)amida do ácido 5-[5-fluoro-2-oxo-l,2-di-hidroindol-(3 Z)-ilidenometil]-2,4-dimetil-lfí-pirrolo-3-carboxílico 96 CP-n 0 CIH H sal cloridrato de (2-piridin-2-iletil)amida do ácido 5-[2-oxo-l,2-di-hidroindol-(3Z)-ilidenometil]-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxílico 97 TX í! N 8rvvT» CH' T"T>0 CFjCO.H rt sal trifluoroacetato de (2-piridin-2-iletil)amida do ácido 5-[5-bromo-2-oxo-l,2-di-hidroindol-(3 Z)-ilidenometil]-2,4-dimetil-lfí-pirrolo-3-carboxílico 98 \}τΓ^* (2-etilaminoetil)amida do ácido 5- [ 5-fluoro-2-oxo-1,2-di-hidroindol-(3 Z)-ilidenometil]-2,4-dimetil-li7-pirrolo-3-carboxilico 99 Q NH, 'O#0' (2-aminoetil)amida do ácido 5-[5-fluoro-2-oxo-1,2-di-hidroindol-(3 Z)-ilidenometil]-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxilico -41- 100 (carboximetil)amida do ácido 5-[5-fluoro-2-oxo-1,2-di-hidroindol-(3 Z)-ilidenometil]-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxílico 101 trifluoroacetato da (3-pirrolidin-l-il-2-ona-propil)amida do ácido 5-[5-bromo-2-oxo-1,2-di-hidroindol- (3Z) -ilidenometil]-1H-pirrolo-3-carboxílico
Os números dos compostos correspondem aos números dos Exemplos da secção dos Exemplos. Isto é, a síntese do Composto 1 da Tabela 1 está descrita no Exemplo 1. Os compostos apresentados na Tabela 1 são apenas exemplificativos e não são para ser considerados como limitativos do âmbito desta invenção por qualquer forma.
FORMAS DE REALIZAÇÃO PREFERIDAS
Embora a definição mais lata esteja apresentada no Sumário da Invenção, certos compostos de Fórmula (I) apresentados adiante são preferidos. (1) Um grupo preferido de compostos de Fórmula (I) é aquele em que R-*-, e são hidrogénio. (2) Outro grupo preferido de compostos de Fórmula (I) é aquele em que Rl, r2 e R^ são hidrogénio. (3) Outro grupo preferido de compostos de Fórmula (I) -42- é aquele em que Rl, e R^ são hidrogénio. (4) Outro grupo preferido de compostos de Fórmula (I) é aquele em que R^, r3 e R^ são hidrogénio. (5) Outro grupo preferido de compostos de Fórmula (I) é aquele em que R-*-, R^, r3 e R^ são hidrogénio. (6) Outro grupo mais preferido de compostos de Fórmula (I) é aquele em que:
Rl é hidrogénio, alquilo, -C(0)Nr8r9, preferencialmente hidrogénio ou metilo, particularmente hidrogénio; r2 é hidrogénio, cloro, bromo, flúor, fenilo, dimetilaminossulfonilo, 3-clorofenil- aminossulfonilo, aminossulfonilo, metilaminossulfonilo, fenilaminossulfonilo, piridin-3-il-aminossulfonilo, dimetilaminossulfonilo, isopropilaminossulfonilo, preferencialmente hidrogénio, flúor ou bromo; r3 é hidrogénio, metoxi, carboxilo, fenilo, piridin-3-ilo, 3,4-diclorofenilo, 4-n- butilfenilo, 3-isopropilfenilo, preferencialmente hidrogénio ou fenilo; e R^ é hidrogénio.
Dentro do grupo (6) preferido referido acima um grupo mais preferido de compostos é aquele em que: R5 é hidrogénio, metilo, etilo, isopropilo, terc-butilo, isobutilo ou n-butilo, preferencialmente -43- hidrogénio ou metilo; e é hidrogénio, metilo, etilo, isopropilo, n-, iso-ou terc-butilo, fenilo, preferencialmente metilo, hidrogénio ou fenilo. (7) Mais uma forma de realização presentemente preferida desta invenção é um composto com uma estrutura como a descrita acima em que r!3 e r!4 são seleccionados independentemente do grupo que consiste em hidrogénio, alquilo, heteroarilo e, combinados, -(CH2)4~t -(CH2)5"f - (CH2)20(CH2)2_ou -(CH2)2N(CH3) (CH2)2-.
Utilidade
As PKs cuja actividade catalítica é modulada pelos compostos desta invenção incluem tirosina quinases proteicas de que há dois tipos, as tirosina quinases receptoras (RTKs) e as tirosina quinases celulares (CTKs), e as serinas treoninas quinases (STKs). A transdução de sinais mediada por RTK é iniciada por interacção extracelular com um factor do crescimento específico (ligando), seguida por dimerização do receptor, estimulação transitória da actividade intrínseca da tirosina quinase proteica e fosforilação. Deste modo são criados locais de ligação para moléculas de transdução e induzem a formação de complexos com um espectro de moléculas sinalizadores citoplasmáticas que facilitam a resposta celular apropriada (e.g., divisão celular, efeitos metabólicos no microambiente extracelular, etc.). Ver Schlessinger e Ullrich, 1992, Neuron 9:303-391.
Demonstrou-se que os sítios de fosforilação da -44- tirosina em receptores de factores do crescimento funcionam como sítios de ligação de afinidade elevada para os domínios SH2 (homologia src) das moléculas de sinalização. Fantl et al., 1992, Cell 69:413-423, Songyang et al., 1994, Mol. Cell. Biol. 14:2777-2785), Songyang et al., 1993, Cell 72:767-778 e Koch et al., 1991, Science 252:668-678. Foram identificados vários substratos proteicos intracelulares que se associam às RTKs. Podem ser divididos em dois grupos principais: (1) substratos que possuem um domínio catalítico, e (2) substratos que não têm o referido domínio mas que servem como adaptadores e se associam a moléculas cataliticamente activas. Songyang et al., 1993, Cell 72:767-778. A especificidade das interacções entre receptores de domínios SH2 dos seus substratos é determinada pelos resíduos dos aminoácidos que circundam imediatamente o resíduo de tirosina fosforilada. As diferenças das afinidades de ligação entre domínios SH2 e as sequências de aminoácidos que circundam os resíduos de fosfotirosina em receptores específicos são consistentes com as diferenças observadas nos seus perfis de fosforilação do substrato. Songyang et al., 1993, Cell 72:767-778. Estas observações sugerem que a função de cada RTK é determinada não só pelo seu padrão de expressão e disponibilidade do ligando mas também pela disposição das vias de transdução de sinais a jusante que são activadas por um receptor particular. Assim, a fosforilação proporciona um passo regulador importante o qual determina a selectividade das vias de sinalização recrutadas por receptores de factores de crescimento específicos, bem como receptores de factores de diferenciação.
As STKs, sendo sobretudo citossólicas, afectam a bioquímica interna da célula, frequentemente como uma resposta a jusante de um evento de PTK. As STKs foram implicadas no processo de sinalização que inicia a síntese do ADN e a mitose subsequente que conduz à proliferação -45- celular.
Assim, a transdução de sinais de PK resulta, entre outras respostas, em proliferação, diferenciação, crescimento e metabolismo celular. A proliferação celular anormal pode resultar numa ampla variedade de patologias e doenças, incluindo o desenvolvimento de neoplasias tais como carcinoma, sarcoma, glioblastoma e hemangioma, doenças tais como leucemia, psoriase, arteriosclerose, artrite e retinopatia diabética e outras doenças relacionadas com angiogénese e/ou vasculogénese descontroladas. Não é necessário uma compreensão exacta do mecanismo pelo qual os compostos desta invenção inibem PKs para praticar a presente invenção. Contudo, sem ficar ligado a qualquer mecanismo ou teoria particular, crê-se que os compostos interactuam com os aminoácidos da região catalítica das PKs. As PKs tipicamente possuem uma estrutura bilobada em que ATP parece ligar-se à fenda entre os dois lóbulos numa região em que os aminoácidos são conservados entre PKs. Crê-se que os inibidores de PKS se ligam por interacções não covalentes tais como ligações hidrogénio, forças de van der Waals e interacções iónicas na mesma região geral em que o ATP anteriormente referido se liga às PKs. Mais especificamente, crê-se que o componente 2-indolinona dos compostos desta invenção se ligam no espaço geral normalmente ocupado pelo anel de adenina do ATP. A especificidade de uma molécula particular para uma PK particular pode então surgir como o resultado de interacções adicionais entre os vários substituintes do núcleo 2-indolinona e os domínios de aminoácidos específicos de PKs particulares. Assim, diferentes substituintes na indolinona podem contribuir para ligação preferencial a PKs específicas. A capacidade de seleccionar compostos activos em diferentes sítios de -46- ligação de ATP (ou outro nucleotido) torna os compostos desta invenção úteis para tomar como alvo qualquer proteína que disponha de um desses sítios. Os compostos aqui descritos têm assim utilidade em ensaios in vitro para essas proteínas bem como a apresentação in vivo de efeitos terapêuticos através da interacção com essas proteínas.
Adicionalmente, os compostos da presente invenção proporcionam uma abordagem terapêutica para o tratamento de muitos tipos de tumores sólidos, incluindo mas não limitados a carcinomas, sarcomas incluindo sarcoma de Kaposi, eritroblastoma, glioblastoma, meningioma, astrocitoma, melanoma e mioblastoma. 0 tratamento ou prevenção de cancros de tumores não sólidos tais como leucemia estão contemplados por esta invenção. As indicações podem incluir, mas não estão limitadas a cancros do cérebro, cancros de bexiga, cancros do ovário, cancros gástricos, cancros do pâncreas, cancros do cólon, cancros do sangue, cancros dos pulmões e cancros dos ossos.
Exemplos adicionais, sem limitação, dos tipos de doenças relacionadas com actividade de PKs desapropriada em cuja prevenção, tratamento e estudo os compostos aqui descritos podem ser úteis são doenças proliferativas celulares, doenças fibróticas e doenças metabólicas.
As doenças proliferativas celulares que podem ser impedidas, tratadas ou adicionalmente estudadas pela presente invenção incluem cancro, doenças proliferativas dos vasos sanguíneos e doenças proliferativas celulares mesangiais.
As doenças proliferativas dos vasos sanguíneos referem-se a doenças relacionadas com vasculogénese -47- (formação de vasos sanguíneos) e angiogénese (disseminação de vasos sanguíneos) anormais. Se bem que a vasculogénese e angiogénese desempenhem papéis importantes numa variedade de processos fisiológicos normais tais como o desenvolvimento embrionário, a formação do corpo lúteo, a cicatrização de feridas e a regeneração de órgãos, também desempenham um papel fulcral no desenvolvimento do cancro onde resultam na formação de novos capilares necessários para manter vivo um tumor. Outros exemplos de doenças da proliferação dos vasos sanguíneos incluem a artrite, onde novos vasos sanguíneos capilares invadem a articulação e destroem a cartilagem, e doenças oculares, como a retinopatia diabética, em que novos capilares na retina invadem o vítreo, sangram e provocam cegueira.
Foram identificadas duas RTKs estruturalmente relacionadas que se ligam a VEGF com afinidade elevada: o receptor de tirosina 1 semelhante a fms (fit-1) (Shibuya et al., 1990, Oncogene, 5:519-524; De Vries et al., 1992, Science, 255:989-991) e o receptor KDR/FLK-1, também conhecido como VEGF-R2. O factor de crescimento do endotélio vascular (VEGF) foi descrito como sendo um mitogénio específico de células endoteliais com actividade promotora do crescimento celular endotelial in vitro. Ferrara & Henzel, 1989, Biochem. Biophys. Res. Comm., 161:851-858; Vaisman et al., 1990, J. Biol. Chem., 265:19461-19566. A informação apresentada nos pedidos U.S. com os N°s de Série 08/193 829, 08/038 596 e 07/975 750, sugerem fortemente que o VEGF não só é responsável pela proliferação das células endoteliais, mas também é o principal regulador da angiogénese normal e patológica. Ver genericamente Klagsburn & Soker, 1993, Current Biology, 3(10) 699-702; Houck et al., 1992, J. Biol.
Chem., 267:26031-26037. -48- A vasculogénese e a angiogénese normais desempenham papéis importantes numa variedade de processos fisiológicos tais como o desenvolvimento embrionário, a cicatrização de feridas, a regeneração de orgãos e os processos reprodutivos femininos tais como o desenvolvimento de folículos no corpo lúteo durante a ovulação e o crescimento placentário após a gravidez. Folkman & Shing, 1992, J. Biological Chem., 267 (16):10931-34. A vasculogénese e/ou a angiogénese descontrolada tem sido associada a doenças tais como diabetes bem como a tumores sólidos malignos que dependem da vascularização para crescer. Klagsburn & Soker, 1993, Current Biology, 3 (10) :699-702; Folkham, 1991, J. Natl. Câncer Inst., 82:4-6; Weidner et al., 1991, New Engl. J. Med., 324:1-5. 0 presumível papel do VEGF na proliferação e migração das células endoteliais durante a angiogénese e a vasculogénese indica um papel importante para o receptor KDR/FLK-1 nestes processos. Doenças tais como a diabetes mellitus (Folkman, 198, em Xlth Congress of Thrombosis e Haemostasis (Verstraeta et al., eds.), pp. 583-596, Leuven University Press, Leuven) e a artrite, bem como o crescimento de tumores malignos podem resultar de angiogénese descontrolada. Ver e.g., Folkman, 1971, N. Engl. J. Med., 285:1182-1186. Os receptores aos quais o VEGF se liga especificamente são um alvo terapêutico importante e poderoso para a regulação e modulação da vasculogénese e/ou da angiogénese e uma variedade de doenças graves que envolvem crescimento celular anormal causado por esses processos. Plowman et al., 1994, DN & P, 7(6):334-339. Mais particularmente, o papel altamente específico do receptor KDR/FLK-1 na neovascularização torna-o um alvo de eleição para abordagens terapêuticas para o tratamento de cancro e outras doenças que envolvem a formação não controlada de vasos sanguíneos. -49-
Assim, a presente invenção proporciona compostos capazes de regular e/ou modular a transdução de sinais de tirosino quinases incluindo a transdução de sinais dos receptores de KDR/FLK-1 de forma a inibir ou promover a angiogénese e/ou a vasculogénese, isto é, compostos que inibem, impedem ou interferem com o sinal transduzido por KDR/FLK-1 quando activados por ligandos tais como VEGF. Embora se acredite que os compostos da presente invenção actuam num receptor ou outro componente ao longo da via de transdução de sinais de tirosino quinases, também podem actuar directamente sobre as células tumorais que resultam de angiogénese descontrolada.
Embora a nomenclatura dos parceiros humano e murino do receptor "flk-1" genérico seja diferente, são, em muitos aspectos, intermutáveis. 0 receptor murino, Flk-1, e o seu correspondente humano, KDR, partilham uma homologia de sequência de 93,4% no seio do domínio intracelular. Analogamente, o FLK-1 murino liga-se a VEGF humano com a mesma afinidade que a VEGF murino, e em conformidade, é activado pelo ligando derivado de ambas as espécies. Millauer et al., 1993, Cell, 72:835-846; Quinn et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90:7533-7537. A FLK-1 também se associa a e subsequente fosforila tirosina de substratos de RTK humanos (e.g., PLC-γ ou p85) quando co-expressa em células 293 (fibroblastos de rim embrionário humano).
Os modelos que dependem do receptor FLK-1 são portanto directamente aplicáveis na compreensão do receptor KDR. Por exemplo, a utilização do receptor FLK-1 murino em métodos que identificam compostos que regulam a via de transdução de sinais murina são directamente aplicáveis na identificação de compostos que podem ser utilizados para regular a via de transdução de sinais -50- humana, isto é, que regulam a actividade relacionada com o receptor KDR. Assim, os compostos químicos identificados como inibidores de KDR/FLK-1 in vitro, podem ser confirmados em modelos in vivo adequados. Demonstrou-se que os modelos animais de murganho e rato in vivo são muito valiosos para examinar o potencial clínico de agentes que actuam sobre a via de transdução de sinais induzida por KDR/FLK-1.
Assim, a presente invenção proporciona compostos que regulam, modulam e/ou inibem a vasculogénese e/ou a angiogénese afectando a actividade enzimática do receptor KDR/FLK-1 receptor e interferindo com o sinal transduzido por KDR/FLK-1. Assim a presente invenção proporciona uma abordagem terapêutica para o tratamento de muitos tipos de tumores sólidos incluindo, mas não limitados a glioblastoma, melanoma e sarcoma de Kaposi, e carcinoma do ovário, pulmão, mama, próstata, pâncreas, cólon e epidermóide. Além disso, os dados sugerem que a administração de composto que inibem a via de transdução de sinais mediada por KDR/Flk-1 também podem ser utilizados no tratamento de hemangioma, restenose e retinopatia diabética.
Além disso, esta invenção relaciona-se com a inibição de vasculogénese e angiogénese por vias mediadas por outros receptores, incluindo a via compreendendo o receptor flt-1. A transdução de sinais mediada por tirosina quinases receptoras é iniciada por interacção extracelular com um factor do crescimento específico (ligando), seguida por dimerização do receptor, estimulação transitória da actividade intrínseca da tirosina quinase proteica e autofosforilação. Deste modo são criados sítios de ligação para moléculas de transdução de sinais intracelulares o -51- que conduz à formação de complexos com um espectro de moléculas sinalizadoras citoplasmáticas que facilitam a resposta celular apropriada, e.g., divisão celular e efeitos metabólicos no microambiente extracelular. Ver Schlessinger e Ullrich, 1992, Neuron 9:1-20. A homologia próxima das regiões intracelulares de KDR/FLK-1 e a do receptor PDGF-P (50,3% de homologia) e/ou o receptor flt-1 relacionado indica a indução de vias de transdução de sinais sobrepostas. Por exemplo, para o receptor PDGF-P, demonstrou-se que os membros da familia src (Twamley et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90:7696-7700), fosfatidilinositol-3'-quinase (Hu et al., 1992, Mol. Cell. Biol., 12:981-990), fosfolipase cy (Kashishian & Cooper, 1993, Mol. Cell. Biol., 4:49-51), proteina activante de ras-GTPase, (Kashishian et al., 1992, EMBO J., 11:1373-1382), PTP-ID/syp (Kazlauskas et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 10 90:6939-6943), Grb2 (Arvidsson et al., 1994, Mol. Cell. Biol., 14:6715-6726) , e as moléculas adaptadoras Shc e Nck (Nishimura et al., 1993, Mol. Cell. Biol., 13:6889-6896), se ligam a regiões que envolvem diferentes sítios de autofosforilação. Ver genericamente Claesson-Welsh, 1994, Prog. Growth Factor Res., 5:37-54. Assim, é provável que as vias de transdução de sinais activadas por KDR/FLK-1 incluam a via do ras (Rozakis et al., 1992, Nature, 360:689-692), de Pl-3'-quinase, as vias mediadas por src e mediadas por plcy. Cada uma destas vias pode desempenhar um papel crítico no efeito angiogénico e/ou vasculogénico de KDR/FLK-1 em células endoteliais. Consequentemente, ainda um aspecto adicional desta invenção relaciona-se com a utilização dos compostos orgânicos aqui descritos para modular a angiogénese e a vasculogénese na medida em que esses processos são controlados por estas vias.
Inversamente, as doenças relacionadas com a redução, -52- contracção ou fecho de vasos sanguíneos, tais como a restenose, também estão implicadas e podem ser tratadas ou impedidas pelos métodos desta invenção.
As doenças fibróticas referem-se à formação anormal de matrizes extracelulares. Exemplos de doenças fibróticas incluem a cirrose hepática e as doenças proliferativas das células mesangiais. A cirrose hepática é caracterizada pelo aumento dos constituintes da matriz extracelular resultando na formação de uma cicatriz hepática. Uma matriz extracelular aumentada que resulta numa cicatriz hepática também pode ser causada por uma infecção virai como a hepatite. Os lipócitos parecem desempenhar um papel principal na cirrose hepática. Outras doenças fibróticas envolvidas incluem a aterosclerose.
As doenças proliferativas das células mesangiais referem-se a doenças causadas por proliferação anormal das células mesangiais. As doenças proliferativas mesangiais incluem diversas doenças renais humanas, tais como a glomerulonefrite, a nefropatia diabética e a nefrosclerose maligna bem como doenças como as síndromes microangiopáticas trombóticas, a rejeição de transplantes e as glomerulopatias. 0 RTK de PDGFR foi implicado na manutenção da proliferação das células mesangiais. Floege et al., 1993, Kidney International 43:47S-54S.
Muitos cancros são doenças proliferativas celulares e, como observado anteriormente, as PKs foram associadas às doenças proliferativas celulares. Assim, não é de surpreender que PKs tais como, por exemplo, membros da família RTK tenham sido associadas ao desenvolvimento do cancro. Alguns destes receptores, como o EGFR (Tuzi et al., 1991, Br. J. Câncer 63:227233, Torp et al., 1992, APMIS 100:713-719), o HER2/neu (Slamon et al., 1989, Science 244:707-712) e o PDGF-R (Kumabe et al., 1992, -53-
Oncogene, 7:627-633) encontram-se sobre-expressos em muitos tumores e/ou persistentemente activados por alças autócrinas. Na realidade, nos cancros mais comuns e graves foram demonstradas estas sobre-expressões dos receptores (Akbasak e Suner-Akbasak et al., 1992, J. Neurol. Sei., 111:119-133, Dickson et al., 1992, Câncer Treatment Res. 61:249-273, Korc et al., 1992, J. Clin. Invest. 90:1352-1360) e alças antócrinas (Lee e Donoghue, 1992, J. Cell. Biol., 118:1057-1070, Korc et al., supra, Akbasak e Suner-Akbasak et al., supra). Por exemplo, o EGFR tem sido associado ao carcinoma de células escamosas, astrocitoma, glioblastoma, cancro da cabeça e pescoço, cancro do pulmão e cancro da bexiga. O HER2 tem sido associado ao cancro da mama, do ovário, do estômago, do pulmão, do pâncreas e da bexiga. O PDGFR tem sido associado ao glioblastoma e ao melanoma bem como ao cancro do pulmão, do ovário e da próstata. A RTK c-met também tem sido associada à formação de tumores malignos. Por exemplo, o c-met tem sido associado, entre outros cancros, a carcinomas colorrectal, da tiróide, do pâncreas, gástrico e carcinomas hepatocelulares e linfomas. Adicionalmente o c-met tem sido associado a leucemia. A sobre-expressão do gene c-met também foi detectada em doentes com doença de Hodgkins e doença de Burkitts. 0 IGF-IR, para além de estar implicado no suporte nutricional e na diabetes de tipo II, também foi associado a vários tipos de cancros. Por exemplo, o IGF-I tem sido implicado como um estimulador do crescimento autócrino para diversos tipos de tumores, e.g. as células de carcinoma do cancro da mama humano (Arteaga et al., 1989, J. Clin. Invest. 84:1418-1423) e células do tumor do pulmão das células peguenas (Macauley et al., 1990, Câncer Res., 50:2511-2517). Além disso, o IGF-I, se bem que integralmente envolvido no crescimento e diferenciação normais do sistema nervoso, também parece ser um -54- estimulador autócrino de gliomas humanos. Sandberg-Nordqvist et al., 1993, Câncer Res. 53:2475-2478. A importância do IGF-IR e dos seus ligandos na proliferação celular é adicionalmente sustentada pelo facto de muitos tipos de células em cultura (fibroblastos, células epiteliais, células musculares lisas, linfócitos T, células mielóides, condrócitos e osteoblastos (as células indiferenciadas da medula óssea)) serem estimuladas a crescer pelo IGF-I. Goldring e Goldring, 1991, Eukaryotic Gene Expression, 1:301-326. Baserga e Coppola sugerem que o GF-IR desempenha um papel central no mecanismo de transformação e, como tal, poderia ser um alvo preferido para intervenções terapêuticas num espectro largo de doenças malignas humanas. Baserga, 1995, Câncer Res., 55:249-252, Baserga, 1994, Cell 79:927-930, Coppola et al., 1994, Mol. Cell. Biol., 14:4588-4595.
As STKs têm sido implicadas em muitos tipos de cancro incluindo, nomeadamente, o cancro da mama (Cance et al., Int. J. Câncer, 54:571-77 (1993)). A associação entre actividade de PK anormal e doença não está restringida ao cancro. Por exemplo, as RTKs têm sido associadas a doenças tais como psoriase, diabetes mellitus, endometriose, angiogénese, desenvolvimento de placa ateromatosa, doença de Alzheimer, restenose, doença de von Hippel-Lindau, hiperproliferação epidérmica, doenças neurodegenerativas, degeneração macular relacionada com a idade e hemangiomas. Por exemplo, o EGFR foi indicado na cicatrização de feridas da córnea e da derme. Defeitos no Insulina-R e no IGF-IR estão referidas na diabetes mellitus de tipo II. Uma correlação mais completa entre RTKs especificas e as suas indicações terapêuticas está apresentada em Plowman et ai., 1994, DN & P 7:334-339. -55-
Como observado anteriormente, não só as RTKs mas também as CTKs incluindo, mas não limitadas a src, abl, fps, yes, fyn, lyn, lck, blk, hck, fgr e yrk (revisão por Bolen et al., 1992, FASEB J., 6:3403-3409) encontram-se envolvidas na via de transdução de sinais proliferativos e metabólicos e podia-se assim esperar, e foi demonstrado, que estão envolvidas em muitas doenças mediadas por PTKs às quais é dirigida a presente invenção. Por exemplo, demonstrou-se que o src mutado (v-src) é uma oncoproteina (pp60v-src) na galinha. Além disso, o seu homólogo celular, o proto-oncogene pp60c-src transmite os sinais oncogénicos de muitos receptores. A sobre-expressão do EGFR ou de HER2/neu em tumores conduz à activaçâo constitutiva da pp60c-src, que é caracteristica de células malignas mas que está ausente das células normais. Por outro lado, murganhos deficientes na expressão do c-src apresentam um fenotipo osteopétrico, indicando uma participação chave do c-src na função do osteoclasto e um possivel envolvimento em patologias relacionadas.
Analogamente, o Zap70 tem sido implicado na sinalização de células T que podem relacionar-se com doenças autoimunes.
As STKs têm sido associadas a inflamação, doença autoimune, respostas imunitárias e doenças da hiperproliferação tais como restenose, fibrose, psoríase, osteoartrite e artrite reumatóide.
As PKs também têm sido implicadas na implantação de embriões. Assim, os compostos desta invenção podem proporcionar um método eficaz para prevenção dessa implantação de embriões e ser assim úteis como agentes de controlo da natalidade. Patologias adicionais que podem ser tratadas ou prevenidas utilizando os compostos desta invenção são doenças imunológicas tais como doença -56- autoimune, SIDA e doenças cardiovasculares tais como a aterosclerose.
Finalmente, tanto as RTKs como as CTKs são actualmente suspeitas de estarem envolvidas em doenças hiperimunes.
Exemplos do efeito de vários compostos exemplificativos desta invenção sobre várias PTKs estão apresentados na Tabela 2 adiante. Os compostos e os dados apresentados não são para ser considerados por qualquer forma como limitativos do âmbito desta invenção.
Administração e Composição Farmacêutica
Um composto da presente invenção ou um seu sal farmaceuticamente aceitável pode ser administrado como tal a um doente ser humano ou pode ser administrado em composições farmacêuticas em que os materiais anteriores são misturados com veiculos ou excipientes adequados. As técnicas de formulação e administração de fármacos podem ser encontradas em "Remington's Pharmacological Sciences", Mack Publishing Co., Easton, PA., edição mais recente.
Tal como aqui utilizado, "administrar" ou "administração" refere-se à administração de um composto de Fórmula (I) ou de um seu sal farmaceuticamente aceitável ou de uma composição farmacêutica contendo um composto de Fórmula (I) ou um seu sal farmaceuticamente aceitável desta invenção a um organismo para efeitos da prevenção ou tratamento de uma doença relacionada com uma PK.
As vias de administração adequadas podem incluir, sem limitação, a administração oral, rectal, transmucosas ou -57- intestinal ou injecções intramusculares, subcutâneas, intramedulares, intratecais, intraventriculares directas, intravenosas, intravitreas, intraperitoneais, intranasais ou intra-oculares. As vias de administração preferidas são oral e parentérica.
Alternativamente, o composto pode ser administrado de modo local em vez de sistémico, por exemplo, por meio de injecção do composto directamente num tumor sólido, muitas vezes numa formulação em depósito ou de libertação sustentada.
Além disso, o fármaco pode ser administrado num sistema de distribuição direccionada do fármaco, por exemplo, num lipossoma revestido com anticorpo especifico para o tumor. Os lipossomas serão direccionados e incorporados selectivamente pelo tumor.
As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser produzidas por processos bem conhecidos na arte, e.g., por meio de processos convencionais de mistura, dissolução, granulação, produção de drageias, levigação, emulsionação, encapsulação, retenção ou liofilização.
As composições farmacêuticas para utilização de acordo com a presente invenção podem ser formuladas de modo convencional utilizando um ou mais veículos fisiologicamente aceitáveis compreendendo excipientes e auxiliares que facilitam o processamento dos compostos activos em preparações que podem ser utilizadas farmaceuticamente. A formulação correcta está dependente da via de administração escolhida.
Para injecção, os compostos da invenção podem ser formulados em soluções aquosas, preferencialmente em tampões compatíveis fisiologicamente tais como solução de -58-
Hank, solução de Ringer ou tampão de soro fisiológico. Para administração transmucosas, são utilizados na formulação penetrantes apropriados à barreira a ser permeada, Esses penetrantes são de uma forma geral conhecidos na arte.
Para administração oral, os compostos podem ser formulados por combinação dos compostos activos com veículos farmaceuticamente aceitáveis bem conhecidos na arte. Esses veículos permitem que os compostos da invenção sejam formulados como comprimidos, pílulas, pastilhas, drageias, cápsulas, líquidos, geles, xaropes, suspensões espessas, suspensões e outras semelhantes, para ingestão oral por um doente. As preparações farmacêuticas para utilização oral podem ser preparadas utilizando um excipientes sólido, opcionalmente com trituração da mistura resultante, e processando a mistura de grânulos, após a adição de outros auxiliares adequados se desejado, para obter comprimidos ou núcleos de drageias. Os excipientes úteis são, em particular, cargas tais como açúcares, incluindo lactose, sacarose, manitol ou sorbitol, preparações de celulose tais como, por exemplo, amido de milho, amido de trigo, amido de arroz e fécula de batata e outros materiais tais como gelatina, goma tragacanta, metil celulose, celulose, hidroxipropilmetilcelulose, carboximetilcelulose de sódio e/ou polivinil pirrolidona (PVP). Se desejado, podem adicionar-se agentes desintegrantes, tais como polivinil pirrolidona reticulada, agar ou ácido algínico. Também se pode utilizar um sal tal como alginato de sódio.
Os núcleos das drageias são proporcionados com revestimentos adequados. Para este fim, podem ser utilizadas soluções concentradas de açúcar que podem opcionalmente conter goma arábica, talco, polivinil pirrolidona, gel de carbopol, polietileno glicol e/ou -59- dióxido de titânio, soluções de lacas, e solventes orgânicos ou misturas de solventes adequados. Pode adicionar-se matérias corantes ou pigmentos aos revestimentos dos comprimidos ou drageias para identificação e para caracterizar diferentes combinações de doses do composto activo.
As composições farmacêuticas que podem ser utilizadas oralmente incluem cápsulas de encaixar feitas de gelatina, bem como cápsulas moles seladas feitas de gelatina e um plastificante, tal como glicerol ou sorbitol. As cápsulas de encaixar podem conter as substâncias activas em mistura intima com uma carga tal como lactose, um aglutinante tal como amido e/ou um lubrificante tal como talco ou estearato de magnésio e, opcionalmente, estabilizadores. Nas cápsulas moles, os compostos activos podem ser dissolvidos ou suspensos em líquidos adequados, tais como óleos gordos, parafina líquida ou polietileno glicóis líquidos. Os estabilizadores também podem ser adicionados a estas formulações.
As composições farmacêuticas que também podem ser utilizadas incluem cápsulas de gelatina duras. Como um exemplo não limitativo, a formulação do produto farmacêutico oral em cápsulas com composto activo pode ter doses com a concentração de 50 e 200 mg (códigos de formulação J-011248-AA-00 e J-011248-AA-01, respectivamente). As duas dosagens são preparadas a partir dos mesmos grânulos por enchimento em cápsulas de gelatina duras de tamanhos diferentes, tamanho 3 para a cápsula de 50 mg e tamanho 0 para a cápsula de 200 mg. A composição da formulação pode ser, por exemplo, como indicado na Tabela 2. TABELA 2 -60-
Nome do componente/qualidade Concentração no granulado (% p/p) Quantidade numa cápsula de 50 mg (mg) Quantidade numa cápsula de 200 mg (mg) Código da formulação J-011248-AA J-011248-AA-00 J-011248-AA-01 Composto activo NF 65,0 50,0 200,0 Manitol NF 23,5 18,1 72,4 Croscarmelose de sódio NF 6,0 4,6 18,4 Povidona K 30 NF 5,0 3,8 15,2 Estearato de magnésio NF 0,5 0,38 1,52 Cápsula, amarelo Suécia NF Tamanho 3 Tamanho 0
As cápsulas podem ser embaladas em frascos de vidro castanho ou de plástico para proteger o composto activo da luz. Os recipientes contendo a formulação de cápsulas do composto activo têm de ser conservados à temperatura ambiente controlada (15-30°C).
Para administração por inalação, os compostos para utilização de acordo com a presente invenção são convenientemente administrados na forma de uma apresentação para pulverização de aerossol utilizando uma embalagem pressurizada ou um nebulizador e um propulsor adequado, e.g., sem limitação, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano ou dióxido de carbono. No caso de um aerossol pressurizado, a unidade de dosagem pode ser controlada proporcionando uma válvula para distribuir uma quantidade doseada. Podem ser formuladas cápsulas e cartuchos, por exemplo de gelatina, para utilização num inalador ou insuflador, contendo uma mistura em pó do composto e de uma base em pó adequada tal como lactose ou amido. -61-
Os compostos também podem ser formulados para administração parentérica, e.g., por injecção bolus ou perfusão continua. As formulações para injecção podem ser apresentadas em forma de dosagem unitária, e.g., em ampolas ou em recipientes multi-dose, com um conservante adicionado. As composições podem tomar formas tais como suspensões, soluções ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos, e podem conter materiais de formulação tais como agentes de suspensão, estabilizadores e/ou agentes dispersantes.
As composições para administração parentérica incluem soluções aquosas de uma forma solúvel em água, tal como, sem limitação, um sal do composto activo. Adicionalmente podem ser preparadas suspensões dos compostos activos num veículo lipófilo. Os veículos lipófilos adequados incluem óleos gordos tais como óleo de sésamo, ésteres sintéticos de ácidos gordos tais como oleato de etilo e triglicéridos, ou materiais tais como lipossomas. As suspensões aquosas para injecção podem conter substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão, tais como carboximetil celulose de sódio, sorbitol ou dextrano. Opcionalmente, a suspensão também pode conter estabilizadores adequados e/ou agentes que aumentam a solubilidade dos compostos para permitir a preparação de soluções altamente concentradas.
Alternativamente, a substância activa pode estar em forma de pó para reconstituição com um veículo adequado, e.g., água estéril, isenta de pirogénios, antes da utilização.
Os compostos também podem ser formulados em composições rectais tais como supositórios ou enemas de retenção, utilizando, e.g., bases convencionais para supositórios tais como manteiga de cacau ou outros -62- glicéridos.
Para além das formulações descritas anteriormente, os compostos também podem ser formulados como preparações em depósito. Essas formulações de actuação prolongada podem ser administradas por implantação (por exemplo, subcutaneamente ou intramuscularmente) ou por injecção intramuscular. Um composto desta invenção pode ser formulado para esta via de administração com materiais poliméricos ou hidrófobos adequados (por exemplo, numa emulsão com um óleo farmacologicamente aceitável), com resinas de permuta iónica, ou como um derivado pouco solúvel em água tal como, sem limitação, um sal pouco solúvel.
Um exemplo não limitativo de um veiculo farmacêutico para os compostos hidrófobos da invenção é um sistema co-solvente compreendendo álcool benzilico, um tensoactivo não polar, um polimero orgânico miscivel com água e uma fase aquosa tal como o sistema co-solvente VPD. VPD é uma solução de 3% p/v de álcool benzilico, 8% p/v do tensoactivo não polar Polissorbato 80 e 65% p/v de polietileno glicol 300, completado ao volume com etanol absoluto. O sistema co-solvente VPD (VPD:D5W) consiste em VPD diluído 1:1 com uma solução de dextrose a 5% em água. Este sistema co-solvente dissolve bem os compostos hidrófobos, e provoca ele próprio baixa toxicidade por administração sistémica. Naturalmente, as proporções deste sistema co-solvente podem ser consideravelmente variadas sem destruir as suas características de solubilidade e toxicidade. Além disso, a identidade dos componentes do co-solvente pode ser variada: por exemplo, pode utilizar-se outros tensoactivos não polares de baixa toxicidade em vez de Polissorbato 80, o tamanho da fracção de polietileno glicol pode ser variado, outros polímeros biocompatíveis podem substituir o polietileno glicol, e.g. -63- polivinilpirrolidona, e outros açúcares ou polissacáridos podem substituir a dextrose.
Alternativamente, podem ser utilizados outros sistemas de administração para compostos farmacêuticos hidrófobos, Os lipossomas e as emulsões são exemplos bem conhecidos de veículos ou transportadores para administração desses fármacos hidrófobos. Além disso, também podem ser utilizados certos solventes orgânicos tais como sulfóxido de dimetilo, embora muitas vezes à custa de maior toxicidade.
Adicionalmente, os compostos podem ser administrados utilizando um sistema de libertação sustentada, tal como matrizes semi-permeáveis de polímeros hidrófobos sólidos contendo o agente terapêutico. Foram estabelecidos diversos materiais de libertação sustentada e são bem conhecidos pelos especialistas na matéria. As cápsulas de libertação sustentada podem, dependendo da sua natureza química, libertar os compostos ao longo de algumas semanas até mais de 100 dias. Dependendo da natureza química e da estabilidade biológica do reagente terapêutico, podem ser utilizadas estratégias adicionais para a estabilização das proteínas.
As composições farmacêuticas aqui descritas também podem compreender veículos ou excipientes sólidos ou fase de gel adequados. Exemplos desses veículos ou excipientes incluem, mas não estão limitados a carbonato de cálcio, fosfato de cálcio, vários açúcares, amidos, derivados de celulose, gelatina e polímeros tais como polietileno glicóis.
Muitos dos compostos da invenção moduladores de PKs podem ser proporcionados como sais fisiologicamente aceitáveis em que o composto reivindicado pode formar a -64- espécie carregada negativamente ou positivamente. Exemplos de sais em que o composto forma a unidade carregada positivamente incluem, sem limitação, amónio quaternário (aqui definido noutro sitio), sais tais como o cloridrato, sulfato, carbonato, lactato, tartarato, malato, maleato, succinato em que o átomo de azoto do grupo amónio quaternário é um átomo de azoto do composto seleccionado desta invenção que reagiu com o ácido apropriado. Os sais em que um composto desta invenção forma a espécie carregada negativamente incluem, sem limitação, os sais de sódio, potássio, cálcio e magnésio formados pela reacção de um grupo ácido carboxilico do composto com uma base apropriada (e.g. hidróxido de sódio (NaOH), hidróxido de potássio (KOH) , hidróxido de cálcio (Ca (OH)2), etc.).
As composições farmacêuticas adequadas para utilização na presente invenção incluem composições em que os componentes substâncias activas estão contidos numa quantidade suficiente para obter o fim pretendido, e.g., a modulação da actividade de PK ou o tratamento ou prevenção de uma doença relacionada com PK.
Mais especificamente, uma quantidade terapeuticamente eficaz significa uma quantidade de composto eficaz para prevenir, aliviar ou melhorar os sintomas da doença ou prolongar a sobrevivência do indivíduo a ser tratado. A determinação de uma quantidade terapeuticamente eficaz está dentro da capacidade dos especialistas na matéria, especialmente com base na descrição pormenorizada aqui apresentada.
Para qualquer composto utilizado nos métodos da invenção, a quantidade ou dose terapeuticamente eficaz pode ser inicialmente calculada a partir de ensaios de cultura de células. Depois pode ser formulada a dosagem -65- para utilização em modelos animais de modo a obter uma gama de concentrações circulantes que inclua a IC50 determinada na cultura de células (i.e., a concentração do composto de teste que provoca metade da inibição máxima da actividade de PK) . Essa informação pode então ser utilizada para determinar com mais precisão as doses úteis em seres humanos. A toxicidade e a eficácia terapêutica dos compostos aqui descritos podem ser determinadas por procedimentos farmacêuticos correntes em culturas de células ou animais experimentais, e.g., por determinação da IC50 e da LD50 (de que ambas são aqui discutidas noutro sitio) para um dado composto. Os dados obtidos a partir destes ensaios em cultura de células e destes estudos animais podem ser utilizados na formulação de uma gama de dosagens para utilização em seres humanos. A dosagem pode variar dependendo da forma de dosagem utilizada e da via de administração utilizada. A formulação exacta, a via de administração e a dosagem podem ser escolhidas por um médico individual tendo em consideração o estado do doente. (Ver e.g., Fingi et al., 1975, em "The
Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch. 1, p. 1). A quantidade e o intervalo de dosagem podem ser ajustados individualmente para proporcionar níveis plasmáticos da espécie activa que são suficientes para manter os efeitos de modulação da quinase. Estes níveis plasmáticos são referidos como concentrações eficazes mínimas (MECs) . A MEC vai variar para cada composto mas pode ser estimada a partir de dados in vitro, e.g., a concentração necessária para obter 50-90% de inibição de uma quinase pode ser determinada utilizando os ensaios aqui descritos. As dosagens necessárias para obter a MEC vão depender das características individuais e da via de administração. Podem ser utilizados os ensaios por HPLC ou -66- bioensaios a fim de determinar as concentrações plasmáticas.
Os intervalos de dosagem também podem ser determinados utilizando o valor da MEC. Os compostos devem ser administrados utilizando um regime que mantém os niveis plasmáticos acima da MEc durante 10-90% do tempo, preferencialmente entre 30-90% e mais preferencialmente entre 50-90%.
Presentemente, as quantidades terapeuticamente eficazes de compostos de Fórmula (I) podem variar desde aproximadamente 25 mg/m^ a 1500 mg/m^ por dia; preferencialmente cerca de 3 mg/m^/dia. Ainda mais preferencialmente 50 mg/qm qd até 400 mg/qd.
Em casos de administração local ou absorção selectiva, a concentração eficaz local do fármaco pode não estar relacionada com a concentração plasmática e podem ser utilizados outros procedimentos conhecidos na arte para determinar a quantidade de dosagem e o intervalo correctos. A quantidade de uma composição administrada estará, é claro, dependente do indivíduo a ser tratado, da gravidade da doença, da forma de administração e da avaliação do médico que prescreve, etc.
As composições podem, se desejado, ser apresentadas numa embalagem ou dispositivo distribuidor, tal como um kit aprovado pela FDA, que pode conter uma ou mais formas de dosagem unitárias contendo a substância activa. A embalagem pode por exemplo compreender folha metálica ou plástica, tal como uma embalagem "blister", A embalagem ou dispositivo distribuidor pode ser acompanhado por instruções para administração. A embalagem ou o -67- dispositivo distribuidor também pode ser acompanhado por uma informação associada ao recipiente numa forma preconizada por uma agência governamental reguladora do fabrico, utilização ou comércio de fármacos, informação essa que reflecte a aprovação pela agência da forma das composições ou da administração humana ou veterinária. Essa informação, por exemplo, pode ser da rotulagem aprovada pela U.S. Food and Drug Administration para fármacos vendidos com receita médica ou de um suplemento de um produto aprovado. Também podem ser preparadas composições compreendendo um composto da invenção formuladas num veiculo farmacêutico compatível, colocadas num recipiente apropriado e rotuladas para tratamento de uma patologia indicada. As patologias adequadas indicadas no rótulo podem incluir o tratamento de um tumor, inibição da angiogénese, tratamento de fibrose, diabetes e outras semelhantes. É também um aspecto desta invenção que um composto aqui descrito, ou um seu sal ou pró-fármaco, pode ser combinado com outros agentes quimioterapêuticos para o tratamento de doenças e patologias discutidas acima. Por exemplo, um composto, sal ou pró-fármaco desta invenção pode ser combinado com agentes alquilantes tais como fluorouracilo (5—FU) só em em combinação adicional com leucovorina; ou outros agentes alquilantes tais como, sem limitação, outros análogos de pirimidina tais como UFT, capecitabina, gemcitabina e citarabina, os alquil sulfonatos, e.g., bussulfão (utilizado no tratamento de leucemia granulocítica crónica), improssulfâo e pipossulfão; aziridinas, e.g., benzodepa, carboquone, meturedepa e uredepa; etilenoiminas e metilmelaminas, e.g., altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotio-fosforamida e trimetilolmelamina; e as mostardas de azoto, e.g., clorambucil (utilizado no tratamento de leucemia -68- linfocítica crónica, macroglobulinemia primária e linfoma não Hodgkin), ciclofosfamida (utilizada no tratamento de doença de Hodgkin, mieloma múltiplo, neuroblastoma, cancro da mama, cancro do ovário, cancro do pulmão, tumor de Wilm e rabdomiossarcoma) , estramustina, ifosfamida, novembrichin, prednimustina e mostarda de uracilo (utilizada no tratamento de trombocitose primária, linfoma não Hodgkin, doença de Hodgkin e cancro do ovário); e triazina, e.g., dacarbazina (utilizada no tratamento de sarcoma dos tecidos moles).
Um composto, sal ou pró-fármaco desta invenção também pode ser utilizado em combinação com outros agentes quimioterapêuticos antimetabolitos tais como, sem limitação, análogos do ácido fólico, e.g. metotrexato (utilizado no tratamento de leucemia linfocítica aguda, coriocarcinoma, mycosis fungoides, cancro da mama, cancro da cabeça e pescoço e sarcoma osteogénico) e pteropterina; e os análogos de purina tais como mercaptopurina e tioguanina que têm utilização no tratamento de leucemias granulociticas agudas, linfociticas agudas e granulociticas crónicas.
Está contemplado que um composto, sal ou pró-fármaco desta também pode ser utilizado em combinação com agentes quimioterapêuticos à base de produtos naturais tais como, sem limitação, os alcaloides de vinca, e.g., vinblastina (utilizada no tratamento de cancro da mama e dos testículos), vincristina e vindesina; as epipodofilotoxinas, e.g., etoposido e teniposido, de que ambos são úteis no tratamento de cancro dos testículos e sarcoma de Kaposi; os agentes quimioterapêuticos antibióticos, e.g., daunorrubicina, doxorrubicina, epirrubicina, mitomicina (utilizada para tratar cancro do estômago, cólo do útero, cólon, mama, beziga e pâncreas), dactinomicina, temozolomida, plicamicina, bleomicina -69- (utilizada no tratamento de cancro da pele, esófago e tracto genito-urinário); e os agentes quimioterapêuticos enzimáticos tais como a L-asparaginase.
Para além do que foi referido acima, um composto, sal ou pró-fármaco desta invenção também pode ser utilizado em combinação com os complexos de coordenação de platina (cisplatina, etc.); ureias substituídas tais como hidroxiureia; derivados de metil hidrazina, e.g., procarbazina; supressores adrenocorticais, e.g., mitotano, aminoglutetimida; e hormonas e antagonistas de hormonas tais como os adrenocorticosteróides (e.g., prednisona), progestinas (e.g., caproato de hidroxiprogesterona); estrogénios (e.g., dietil estilbesterol); anti-estrogénios tais como tamoxifeno; androgénios, e.g., propionato de testosterona; e inibidores de aromatase tais como anastrozole.
Finalmente, também está contemplado que a combinação de um composto desta invenção vá ser eficaz em combinação com mitoxantrona ou paclitaxel para o tratamento de cancros com tumores sólidos ou leucemias tais como, sem limitação, leucemia mielogénea aguda (não linfocitica).
Procedimento Sintético Geral. A seguinte metodologia geral pode ser utilizada para preparar os compostos desta invenção: 0 2-oxindole apropriadamente substituído (1 equiv.), o aldeído apropriadamente substituído (1,2 equiv.) e a base (0,1 equiv.) são misturados num solvente (1-2 mL/mmol de 2-oxindole) e a mistura é depois aquecida durante desde cerca de 2 até cerca de 12 horas. Após arrefecimento, o precipitado que se forma é filtrado, lavado com etanol ou éter frio e seco em vácuo para dar o produto sólido. Se -70- não se formar precipitado, a mistura reaccional é concentrada e o resíduo é triturado com diclorometano/éter, o sólido resultante é recolhido por filtração e depois seco. O produto pode ser opcionalmente adicionalmente purificado por cromatografia. A base pode ser uma base orgânica ou inorgânica. Se se utilizar uma base orgânica, preferencialmente é uma base azotada. Exemplos de bases azotadas orgânicas incluem, mas não estão limitadas a diisopropilamina, trimetilamina, trietilamina, anilina, piridina, 1,8-diazabiciclo[5.4.1]undec-7-eno, pirrolidina e piperidina.
Exemplos de bases inorgânicas são, sem limitação, amoníaco, hidróxidos, fosfatos, carbonatos, bicarbonatos e bissulfatos de metais alcalinos ou alcalino-terrosos e amidas. Os metais alcalinos incluem lítio, sódio e potássio enquanto que os metais alcalino-terrosos incluem cálcio, magnésio e bário.
Numa forma de realização presentemente preferida desta invenção, quando o solvente é um solvente prótico, tal como água ou álcool, a base é uma base inorgânica de um metal alcalino ou alcalino terroso, preferencialmente um hidróxido de um metal alcalino ou alcalino terroso.
Será evidente para os especialistas na matéria quer com base em princípios gerais conhecidos da síntese orgânica quer com base nas descrições aqui apresentadas qual a base que seria mais apropriada para a reacção contemplada. 0 solvente em que é realizada a reacção pode ser um solvente prótico ou aprótico, preferencialmente é um solvente prótico. Um solvente "prótico" é um solvente que -71- tem átomos de hidrogénio covalentemente ligados a átomos de oxigénio ou azoto que tornam os átomos de hidrogénio apreciavelmente ácidos e por isso capazes de serem "partilhados" com um soluto através de ligações hidrogénio. Exemplos de solventes próticos incluem, sem limitação, água e álcoois.
Um solvente "aprótico" pode se polar ou não polar mas, em ambos os casos, não contém hidrogénios ácidos e portanto não é capaz de formar ligações hidrogénios com solutos. Exemplos, sem limitação, de solventes apróticos não polares, são pentano, hexano, benzeno, tolueno, cloreto de metileno e tetracloreto de carbono. Exemplos de solventes apróticos polares são clorofórmio, tetrahidrofurano, sulfóxido de dimetilo e dimetilformamida.
Numa forma de realização presentemente preferida desta invenção, o solvente é um solvente prótico, preferencialmente água ou um álcool tal como etanol. A reacção é realizada a temperaturas superiores à temperatura ambiente. A temperatura é geralmente desde cerca de 30°C a cerca de 150°C, preferencialmente cerca de 80°C a cerca de 100°C, mais preferencialmente cerca de 75°C a cerca de 85°C, que é cerca do ponto de ebulição do etanol. Por "cerca de" significa-se que a gama de temperatura está preferencialmente dentro de 10 graus Celsius da temperatura indicada, mais preferencialmente dentro de 5 graus Celsius da temperatura indicada e, mais preferencialmente ainda, dentro de 2 graus Celsius da temperatura indicada. Assim, por exemplo, por "cerca de 75°C" significa-se 75°C ± 10°C, preferencialmente 75°C + 5°C e mais preferencialmente 75°C ± 2°C.
Os 2-oxindoles e aldeídos podem ser prontamente -72- sintetizados utilizando técnicas bem conhecidas nas artes químicas. Será entendido pelos especialistas na matéria que estão disponíveis outras vias sintéticas para formação dos compostos da invenção e que o que se segue é apresentado a título de exemplo e não de limitação.
EXEMPLOS
As seguintes preparações e exemplos são apresentados para permitir aos especialistas na matéria compreender mais claramente e pôr em prática a presente invenção. Não devem ser considerados como limitativos do âmbito da invenção, mas simplesmente como ilustrativos e representativos da invenção.
Exemplos Sintéticos Método A: Formilação de pirrolos
POCI3 (1,1 equiv.) é adicionado gota a gota a dimetilformamida (3 equiv.) a -10°C seguido por adição do pirrolo apropriado dissolvido em dimetilformamida. Após agitação durante duas horas, a mistura reaccional é diluída com H2O e basificada a pH 11 com KOH 10 N. O precipitado que se forma é recolhido por filtração, lavado com H2O e seco numa estufa de vácuo para dar o aldeído desej ado. Método B: Saponificação de ésteres de ácidos pirrolo-carboxílicos
Uma mistura de um éster de ácido pirrolocarboxílico e KOH (2-4 equiv.) em EtOH é aquecida a refluxo até reacção completa ser indicada por cromatografia em camada fina -73- (TLC). A mistura reaccional arrefecida é acidificada a pH 3 com HC1 1 N. O precipitado que se forma é recolhido por filtração, lavado com H20 e seco numa estufa de vácuo para dar o ácido pirrolocarboxilico desejado. Método C: Amidação A uma solução com agitação de ácido pirrolocarboxilico dissolvido em dimetilformamida (0,3 M) é adicionada l-etil-3-(3-dimetilamino-propil)carbodiimida (1,2 equiv.), 1-hidroxibenzotriazole (1,2 equiv.) e trietilamina (2 equiv.). A amina apropriada é adicionada (1 equiv.) e a reacção é agitada até reacção completa ser indicada por TLC. Adiciona-se então acetato de etilo à mistura reaccional e a solução é lavada com NaHC03 saturado e solução aquosa saturada de cloreto de sódio (com sal extra) , seca sobre MgSC>4 anidro e concentrada para dar a amida desejada. Método D: Condensação de aldeídos e oxindoles contendo substituintes ácidos carboxílicos
Uma mistura do oxindole (1 equivalente), 1
equivalente do aldeído e 1-3 equivalentes de piperidina (ou pirrolidina) em etanol (0,4 M) é agitada a 90-100°C até reacção completa ser indicada por TLC. A mistura é depois concentrada e o resíduo acidificado com HC1 2 N. O precipitado que se forma é lavado com H2O e EtOH e depois seco numa estufa de vácuo para dar o produto. Método Ξ: Condensação de aldeídos e oxindoles que não contêm substituintes ácidos carboxílicos
Uma mistura do oxindole (1 equivalente), 1
equivalente do aldeído e 1-3 equivalentes de piperidina (ou pirrolidina) em etanol (0,4 M) é agitada a 90-100°C -74- até reacção completa ser indicada por TLC. A mistura é arrefecida até à temperatura ambiente e o sólido que se forma é recolhido por filtração com vácuo, lavado com etanol e seco para dar o produto. Se não se formar um precipitado por arrefecimento da mistura reaccional, a mistura é concentrada e purificada por cromatografia em coluna. C. Exemplos de sínteses de oxindoles
Os seguintes exemplos da síntese de oxindoles representativos não são para ser considerados de modo algum como limitativos do âmbito desta invenção. Vias alternativas para os oxindoles ilustrados bem como para outros oxindoles a ser utilizados para preparar os compostos desta invenção tornar-se-ão evidentes para os especialistas na matéria com base nas descrições seguintes. Essas sínteses e oxindoles estão dentro do âmbito e espírito desta invenção. 5-Amino-2-oxindole 5-Nitro-2-oxindole (6,3 g) foi hidrogenado em metanol com paládio a 10% sobre carvão para dar 3,0 g (60% de rendimento) do composto em epígrafe como um sólido branco. 5-Bromo-2-oxindole 2-Oxindole (1,3 g) em 20 mL de acetonitrilo foi arrefecido a 10°C e adicionou-se lentamente 2,0 g de N-bromossuccinimida com agitação. A reacção foi agitada durante 1 hora a -10°C e 2 horas a 0°C. O precipitado foi recolhido, lavado com água e seco para dar 1,9 g (90% de rendimento) do composto em epígrafe. 4-Metil-2-oxindole -75-
Oxalato de dietilo (30 mL) em 20 mL de éter seco foi adicionado com agitação a 19 g de etóxido de potássio suspenso em 50 mL de éter seco. A mistura foi arrefecida num banho de gelo e adicionou-se lentamente 20 mL de 3-nitro-o-xileno em 20 mL de éter seco. A mistura espessa vermelha escura foi aquecida a refluxo durante 0,5 h, concentrada até um sólido vermelho escuro e tratada com hidróxido de sódio a 10% até praticamente todo o sólido se ter dissolvido. A mistura vermelha escura foi tratada com peróxido de hidrogénio a 30% até a cor vermelha mudar para amarela. A mistura foi tratada alternadamente com hidróxido de sódio a 10% e peróxido de hidrogénio a 30% até a cor vermelha escura já não estar presente. O sólido foi separado por filtração e o filtrado acidificado com ácido clorídrico 6 N. 0 precipitado resultante foi recolhido por filtração com vácuo, lavado com água e seco em vácuo para dar 9,8 g (45% de rendimento) de ácido 2-metil-6-nitrofenilacético como um sólido esbranquiçado. O sólido foi hidrogenado em metanol com paládio a 10% sobre carvão para dar 9,04 g do composto em epígrafe como um sólido branco. 7-Bromo-5-cloro-2-oxindole 5-Cloro-2-oxindole (16,8 g) e 19,6 g de N-bromossuccinimida foram suspensos em 140 mL de acetonitrilo e aquecidos a refluxo durante 3 horas. A cromatografia em camada fina (sílica, acetato de etilo) às 2 horas de refluxo mostrou 5-cloro-2-oxindole ou N-bromossuccinimida (Rf 0,8), produto (Rf 0,85) e um segundo produto (Rf 0,9) cujas proporções não se alteraram após outra hora de refluxo. A mistura foi arrefecida a 10°C, o precipitado foi recolhido por filtração com vácuo, lavado com 25 mL de etanol e seco com sucção durante 20 minutos no funil para dar 14,1 g de produto húmido (56% de -76- rendimento). 0 sólido foi suspenso em 200 mL de etanol desnaturado e lavado em suspensão por agitação e aquecimento a refluxo durante 10 minutos. A mistura foi arrefecida num banho de gelo a 10°C. O produto sólido foi recolhido por filtração com vácuo, lavado com 25 mL de etanol e seco em vácuo a 40°C para dar 12,7 g (51% de rendimento) de 7-bromo-5-cloro-2-oxindole. 5-Fluoro-2-oxindole 5-Fluoroisatina (8,2 g) foi dissolvida em 50 mL de hidrato de hidrazina e aquecida a refluxo durante 1,0 h. As misturas reaccionais foram então vertidas em água gelada. O precipitado foi então filtrado, lavado com água e seco numa estufa de vácuo para dar o composto em epigrafe. 5-Nitro-2-oxindole 2-Oxindole (6,5 g) foi dissolvido em 25 mL de ácido
sulfúrico concentrado e a mistura mantida a -10 a -15°C enquanto se adicionou 2,1 mL de ácido nítrico fumante gota a gota. Após a adição do ácido nítrico a mistura reaccional foi agitada a 0°C durante 0,5 h e vertida em água gelada. O precipitado foi recolhido por filtração, lavado com água e cristalizado de ácido acético a 50%. O produto cristalino foi então filtrado, lavado com água e seco em vácuo para dar 6,3 g (70%) de 5-nitro-2-oxindole. 5-Aminossulfonil-2-oxindole A um balão de 100 mL carregado com 27 mL de ácido clorossulfónico adicionou-se lentamente 13,3 g de 2-oxindole. A temperatura da reacção foi mantida abaixo de 30°C durante a adição. Após a adição, a mistura reaccional foi agitada à temperatura ambiente durante 1,5 h, aquecida -77- a 68°C durante 1 h, arrefecida e vertida em água. 0 precipitado foi lavado com água e seco numa estufa de vácuo para dar 11,0 g de 5-clorossulfonil-2-oxindole (50% de rendimento) que foi utilizado sem purificação adicional. 5-Clorossulfonil-2-oxindole (2,1 g) foi adicionado a 10 mL de hidróxido de amónio em 10 mL de etanol e agitado à temperatura ambiente de um dia para o outro. A mistura foi concentrada e o sólido recolhido por filtração com vácuo para dar 0,4 g (20% de rendimento) do composto em epígrafe como um sólido esbranquiçado. 5-Isopropilaminossulfonil-2-oxindole A um balão de 100 mL carregado com 27 mL de ácido clorossulfónico foi lentamente adicionado 13,3 g de 2-oxindole. A temperatura da reacção foi mantida abaixo de 30°C durante a adição. A mistura reaccional foi agitada à temperatura ambiente durante 1,5 horas, aquecida a 68°C durante 1 hora, arrefecida e vertida em água. O precipitado que se formou foi filtrado, lavado com água e seco numa estufa de vácuo para dar 11,0 g (50%) de 5-clorossulfonil-2-oxindole que foi utilizado sem purificação adicional.
Uma suspensão de 3 g de 5-clorossulfonil-2-oxindole, 1,15 g de isopropilamina e 1,2 mL de piridina em 50 mL de diclorometano foi agitada à temperatura ambiente durante 4 horas período durante o qual se formou um sólido branco. O sólido foi recolhido por filtração com vácuo, lavado ewm suspensão com etanol quente, arrefecido, recolhido por filtração com vácuo e seco em vácuo a 40°C de um dia para o outro para dar 1,5 g (45%) de 5-isopropilaminossulfonil-2-oxindole. 1H NMR (360 MHz, DMS0-d6) δ 10,69 (s, br, 1H, NH) , 7,63 -78-
(dd, J = 2 e 8 Hz, 1H) , 7,59 (d, J = 2 Hz, 1H) , 7,32 (d, J = 7 Hz, 1H, NH-S02-), 6,93 (d, J = 8 Hz, 1H) , 3,57 (s, 2H) , 3,14-3,23 (m, 1H, CH-(CH3) 2) , 0,94 (d, J = 7 Hz, 6H, 2xCH3). 5-Fenilaminossulfonil-2-oxindole
Uma suspensão de 5-clorosulfonil-2-oxindole (1,62 g, 7 mmol), anilina (0,782 mL, 8,4 mmol) e piridina (1 mL) em diclorometano (20 ml) foi agitada à temperatura ambiente durante 4 horas. A mistura reaccional foi diluida com acetato de etilo (300 mL) e acidificada com ácido clorídrico 1 N (16 mL) . A camada orgânica foi lavada com bicarbonato de sódio e solução aquosa saturada de cloreto de sódio, seca e concentrada. O resíduo foi lavado com etanol (3 mL) e depois cromatografado em gel de sílica eluindo com metanol/diclorometano 1:9 para dar 5-fenilaminossulfonil-2-oxindole. 1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) Ô 10,71 (s, br, 1H, NH) , 10,10 (s, br, 1H, NH) , 7,57-7,61 (m, 2H) , 7,17-7,22 (m, 2H) , 7,06-7,09 (m, 2H) , 6,97-7,0 (m, 1H), 6,88 (d, J = 8,4 Hz, 1H) , 3,52 (s, 2H) .
Piridin-3-ilamida do ácido 2-oxo-2,3-di-hidro-lH-indole-5-sulfónico
Uma solução de 5-clorossufonil-2-oxindole (3 g) e 3-aminopiridina (1,46 g) em piridina (15 mL) foi agitada à temperatura ambiente de um dia para o outro altura em que estava presente um sólido castanho. O sólido foi filtrado, lavado com etanol e seco em vácuo para dar 1,4 g (38%) de piridin-3-ilamida do ácido 2-oxo-2,3-di-hidro-lfí-indole-5-sulfónico. 1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 10,74 (s, 1H, NH) , 10,39 (s, 1H, S02NH) , 8,27-8,28 (d, 1H) , 8,21-8,23 (m, 1H) , 7,59- 7,62 (m, 2H), 7,44-7,68 (m, 1H), 7,24-7,28 (m, 1H), 6,69- -79- 6,71 (d, 1H), 3,54 (s, 2H). MS m/z (APCI+) 290,2. 5- Feniloxindole 5-Bromo-2-oxindole (5 g, 23,5 mmol) foi dissolvido em 110 mL de tolueno e 110 mL de etanol com agitação e ligeiro aquecimento. Tetraquis(trifenilfosfina)paládio(0) (1,9 g, 1,6 mmol) foi adicionado seguido por 40 mL (80 mmol) de carbonato de sódio aquoso 2 Μ. A esta mistura foi adicionado ácido benzeno borónico (3,7 g, 30,6 mmol) e a mistura foi aquecida num banho de óleo a 100°C durante 12 horas. A reacção foi arrefecida, diluída com acetato de etilo (500 mL), lavada com bicarbonato de sódio saturado (200 mL), água (200 mL), HC1 1 N (200 mL) e solução aquosa saturada de cloreto de sódio (200 mL). A camada orgânica foi seca sobre sulfato de magnésio e concentrada para dar um sólido castanho. A trituração com diclorometano deu 3,8 g (77%) de 5-fenil-2-oxindole como um sólido castanho dourado. 1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 10,4 (br s, 1H, NH), 7,57 (dd, J = 1,8 e 7,2 Hz, 1H) , 7,5 a 7,35 (m, 5H) , 7,29 (m, 1H) , 6,89 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 3,51 (s, 2H, CH2CO) . MS m/z 209 [M+].
De modo semelhante podem ser preparados os seguintes oxindoles: 6- (3,5-Diclorofenil)-1,3-di-hidroindol-2-ona 1H NMR (360 MHz, DMS0-d6) δ 10,46 (br, 1H, NH), 7,64 (d, J= 1,8 Hz, 2H) , 7,57 (m, 1H) , 7,27 (m, 2H) , 7,05 (d, J = 1,1 Hz, 1H) , 3,5 (s, 2H) . MS-EI m/z 277/279 [M]+. 6-(4-Butilfenil)-1,3-di-hidroindol-2-ona -80- 1H NMR (360 ΜΗζ, DMSO-d6) δ 10,39 (s, 1Η, ΝΗ) , 7,49 (d, J= 8,0 Hz, 2H), 7,25 (d, J = 8 Hz, 3H) , 7,17 (dd, J = 1,5 e 7,8 Hz, 1H), 6,99 (d, J = 1,5 Hz, 1H), 3,48 (s, 2H, CH2CO), 2,60 (t, J = 7,5 Hz, 2 Hz, CH2CH3) , 1,57 (m, 2H,
Cfí2), 1,32 (m, 2H, Cfí2) , 0, 9 (t, J = 7,5 Hz, 3H, CH3) . 6-(5-Isopropil-2-metoxifenil)-1,3-di-hidroindol-2-ona !h NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 10,29 (br s, 1H, NH) , 7,16-7,21 (m, 2H), 7,08 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,97-7,01 (m, 2H) , 6,89 (d, J = 0,8 Hz, 1H) , 3,71 (s, 3H, OCH3) , 3,47 (s, 2H, CH2CO), 2,86 (m, 1H, CH (CH3) 2) , 1,19 (d, J = 6,8 Hz, 6H, CH (Ci73) 2) MS-EI m/z 281 [M] + . 6-(4-Etilfenil)-1,3-di-hidroindol-2-ona 1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) Ò 10,39 (br s, 1H, NH), 7,50 (d, J = 8,2 Hz, 2H) , 7,28 (d, J = 8,2 Hz, 2H) , 7,25 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7,17 (dd, J = 1,6 & 7,5 Hz, 1H), 6,99 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 3,48 (s, 2H, CH2CO), 2,63 (q, J = 7,6 Hz, 2H, CH2CH3), 1,20 (t, J = 7,6 Hz, 3H, CH2C7Í3) . MS-EI m/z 237 [M]+. 6-(3-Isopropilfenil)-1,3-di-hidroindol-2-ona 1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 10,37 (br s, 1H, NH), 7,43 (m, 1H), 7,35-7,39 (m, 1H) , 7,17-7,27 (m, 3H) , 7,01 (d, J = 1,8 Hz, 1H) , 3,49 (s, 2H, CH2CO) , 2,95 (m, 1H, CH(CH3)2), 1,24 (d, J = 6,8 Hz, 6H, CH (CÍÍ3) 2) -MS-EI m/z 251 [M] + . 6-(2,4-Dimetoxifenil)-1,3-di-hidroindol-2-ona 1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 10,28 (br s, 1H, NH) , 7,17 (m, -81- 2Η) , 6,93 (dd, J = 1,6 & 7,6 Hz, 1H) , 6,86 (d, J = 1,6 Hz, 1H), 6,63 (d, J = 2,4 Hz, 1H) , 6,58 (dd, J = 2,4 & 8,5 Hz, 1H), 3,79 (s, 3H, OCH3), 3,79 (s, 3H, OCH3), 3,45 (s, 2H, CH2CO) . MS-EI m/z 269 [M]+. 6-Piridin-3-il-l,3-di-hidroindol-2-ona !h NMR (360 MHz, DMSO-d6) 6 10,51 (s, 1H, NH), 8,81 (d, J = 2,5 Hz, 1H) , 8,55 (dd, J = 1,8 e 5,7 Hz, 1H) , 8 (m, 1H) , 7,45 (dd, J = 5,7 e 9,3 Hz, 1H) , 7,3 (m, 2H) , 7,05 (s, 1H), 3,51 (s, 2H, CH2CO). MS m/z 210 [M]+. (3-Cloro-4-etoxifenil)-amida do ácido 2-oxo-2,3-di-hidro-lfí-indole-4-carboxílico A uma solução de 4-carboxi-2-oxindole (200 mg, 1,13 mmol) e 3-cloro-4-metoxifenilamina (178 mg, 1,13 mmol) em dimetilformamida (15 mL) à temperatura ambiente foi adicionado haxafluorofosfato de benzotriazol-1-iloxitris(dimetilamino)fosfónio (reagente BOP, 997 mg, 2,26 mmol) seguido por 4-dimetilaminopiridina (206 mg, 1,69 mmol). A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 72 horas. A reacção foi então diluída com acetato de etilo (300 mL), lavada com bicarbonato de sódio saturado (100 mL), água, ácido clorídrico 2 N (100 mL), água (3x200 mL) e solução aquosa saturada de cloreto de sódio. Foi então seca sobre sulfato de magnésio e concentrada. O resíduo foi triturado com acetato de etilo para dar (3-cloro-4-metoxifenil)amida do ácido 2-oxo-2,3- di-hidro -1H- indole-4-carboxílico como um sólido cor de rosa. 1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 610,50 (s, br, 1H, NH) , 10, 12 (s, br, 1—1 NH) , 7,9 (s, J = 2, 5 Hz, 1H) , 7,62 (dd, J = 2,5 & 9 Hz, 1H) , 7,38 (d, J = 7, 6 Hz, 1H) , 7,32 (t, J = -82- 7,6 Hz, 1H), 7,13 (d, J = 9 Hz, 1H) , 6,98 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 3,83 (s, 3H, 0CH3), 3,69 (s, 2H, CH2) . MS-EI m/z 316 [M] + . 4-Carboxi-2-oxindole
Uma solução de trimetilsilildiazometano em hexano (2 M) foi adicionada gota a gota a uma solução de 2,01 g de 2-cloro-3-carboxinitrobenzeno em 20 mL de metanol à temperatura ambiente até não ocorrer mais evolução de gás. Adicionou-se então ácido acético para desactivar o excesso de trimetilsilildiazometano. A mistura reaccional foi evaporada em vácuo e o resíduo foi seco numa estufa de um dia para o outro. O 2-cloro-3-metoxicarbonilnitrobenzeno obtido era suficientemente puro para a reacção seguinte.
Malonato de dietilo (6,0 mL) foi adicionado a uma suspensão gelada de 2,1 g de hidreto de sódio em 15 mL de DMSO. A mistura reaccional foi agitada a 100°C durante 1 hora e depois arrefecida até à temperatura ambiente. 2-Cloro-3-metoxicarbonilnitrobenzeno (2.15 g) foi adicionado numa porção e a mistura foi aquecida a 100°C durante 1,5 horas. A mistura reaccional foi então arrefecida até à temperatura ambiente, vertida em água gelada, acidificada a pH 5 e extraída com acetato de etilo. A camada orgânica foi lavada com solução aquosa saturada de cloreto de sódio, seca sobre sulfato de sódio anidro e concentrada para dar 3,0 g de 2-metoxicarbonil-6-nitrofenil-malonato de dimetilo. 2-Metoxicarbonil-6-nitrofenilmalonato de dimetilo (3,0 g) foi aquecido a refluxo em 50 mL de ácido clorídrico 6 N de um dia para o outro. A mistura foi concentrada até à secura, adicionou-se 20 mL de etanol e 1,1 g de cloreto de estanho(II) e a mistura foi aquecida a refluxo durante 2 horas. A mistura foi filtrada através de -83-
Celite, concentrada e cromatografada em gel de sílica utilizando acetato de etilo:hexano:ácido acético como eluente para dar 0,65 g (37%) de 4-carboxi-2-oxindole como um sólido branco. 1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 12,96 (s, br, 1H, COOH), 10,74 (s, br, 1H, NH), 7,53 (d, J = 8 Hz, 1H) , 7,39 (t, J = 8 Hz, 1H) , 7,12 (d, J = 8 Hz, 1H) , 3,67 (s, 2H) . D. Síntese de 2-indolinonas substituídas com pirrolo.
Exemplo 1 (3-Dietilaminopropil)amida do ácido 5-(5-bromo-2-oxo-l,2-di-hidroindol-3-ilidenometil)-isopropil-4-fenil-lff-pirrolo-3-carboxílico
Uma mistura de cloridrato de 2-aminoacetofenona (1 equiv.), isobutirilacetato de etilo (1,2 equiv.) e acetato de sódio (2,4 equiv.) em H20 foi agitada a 100°C durante 18 horas e depois arrefecida até à temperatura ambiente. A camada aquosa foi separada por decantação e o óleo foi dissolvido em acetato de etilo. Foi então lavado com água e solução aquosa saturada de cloreto de sódio e depois seco para dar (93%) éster etílico do ácido 2-isopropil-4-fenil-lH-pirrolo-3-carboxílico como um óleo castanho avermelhado. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 11,21 (s, br, 1H, NH) , 7,14-7,27 (m, 5H) , 6,70 (d, J = 2,7 Hz, 1H) , 4,02 (q, J = 7,1 Hz, 2H, OCH2CH3), 3,65 (m, 1H, Cff(CH3)2), 1,22 (d, J = 7,5 Hz, 6H, CH(CH3)2), 1,04 (t, J= 7,1 Hz, 3H, OCH2CÍ73) . MS-EI m/z 257 [M+]. O pirrolo acima referido foi formilado utilizando o método A para dar (41%) éster etílico do ácido 5-formil-2-isopropil-4-fenil-lH-pirrolo-3-carboxílico como um sólido avermelhado. -84- !h NMR (300 ΜΗζ, DMSO-d6) δ 12,35 (s, br, 1Η, NH) , 9,14 (s, 1H, CHO), 7,36 (s, 5H), 3,96 (q, J = 7,1 Hz, 2H, OCH2CH3), 3,74 (m, 1H, CH(CH3)2), 1.29 (d, J = 6,9 Hz, 6H, CH(CH3)2), 0,90 (t, J = 7,1 Hz, 3H, OCH2CÍ/3) . MS-EI m/z 285 [M+]. O éster do ácido pirrolocarboxílico foi hidrolisado utilizando o método B para dar (57%) ácido 5-formil-2-isopropil-4-fenil-li7-pirrolo-3-carboxílico como um sólido bege. !h NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 12,28 (s, br, 1H, COOH), 12,02 (s, br, 1H, NH), 9,10 (s, 1H, CHO), 7,35 (s, 5H), 3,81 (m, 1H, CH(CH3)2), 1,28 (d, J = 6,9 Hz, 6H, CH(CH3)2). MS-EI m/z 257 [M+]. 5-Bromo-l,3-di-hidroindol-2-ona (120 mg, 0,31 mmol) foi condensada com (3-dietilaminopropil)amida do ácido 5-formil-2-isopropil-4-fenil-ltf-pirrolo-3-carboxílico (preparada pelo método C) para dar 120 mg (71%) do composto em epigrafe. !h NMR (300 MHz, DMSO-d6) 014,23 (s, br, 1H, NH) , 11,08 (S, br, 1H, NH) , 7,38-7, 55 (m, 7H, Ar-H & CONCH2) , 7,30 (s, 1H, H-vinilo) , 7,26 (dd, J = 1,8 & 7,8 Hz, 1H) , 6,85 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 3,36 (m, 1H, CH(CH3)2), 3,07 (m, 2H, CH2), 2,34 (q, J = 7,1 Hz, 4H, N(CH2CH3)2), 2,22 (t, J = 6,9 Hz, 2H, CH2), 1,40 (m, 2H, CH2) , 1,31 (d, J = 6,9 Hz, 6H, CH(CH3)2), 0,86 (t, J = 7,1 Hz, 6H, N(CH2CH3)2). MS m/z 565,1 [M++l].
Exemplo 2 (3-Pirrolidin-l-ilpropil)amida do ácido 5-(5-bromo-2-oxo-1,2-di-hidroindol-3-ilidenometil)-2-isopropil-4-fenil-lH-pirrolo-3-carboxílico Ácido 5-(5-bromo-2-oxo-1,2-di-hidroindol-3-ilideno- -85- metil) -2-isopropil-4-fenil-ltf-pirrolo-3-carboxílico (127 mg, 0,28 mmol) foi condensado com 3-pirrolidin-l-il-propilamina (43 mg, 0,336 mmol) para dar 140 mg (66%) do composto em epígrafe. !η NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 14,40 (s, br, 1H, NH) , 7,38-7,47 (m, 7H), 7,23-7,27 (m, 2H), 6,84 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 3,36 (m, 1H, Cfí(CH3)2), 3,08 (m, 2H, CH2) , 2,30 (m, 4H, 2xCH2 ) , 2,20 (t, J = 7,0 Hz, 2H, CH2) , 1,62 (m, 4H, 2xCH2) , 1,42 (t, J= 7,0 Hz, 2H, CH2) , 1,31 (d, J = 7,2 Hz, 6H, CH(CJÍ3)2) · MS-EI m/z 560 e 562 [M+-1 e M++1].
Exemplo 3 (2-Dietilaminoetil)amida do ácido 5-(5-bromo-2-oxo-l,2-di-hidroindol-3-ilidenometil)-2-isopropil-4-fenil-lfl-pirrolo- 3-carboxílico 5-Bromo-l,3-di-hidroindol-2-ona (57, g, 0,27 mmol) foi condensada com (2-dietilaminoetil)amida do ácido 5-formil-2-isopropil-4-fenil-ltf-pirrolo-3-carboxílico (120 mg) para dar 78 mg (53%) do composto em epígrafe como um sólido amarelo. !h NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 14,23 (s, br, 1H, NH) , 11,09 (s, br, 1H, NH) , 7,38-7,51 (m, 6H) , 7,25-7,28 (m, 2H) , 7,19 (t, 1H, CONHCH2), 6,85 (d, J = 7,8 Hz, 1H) , 3,43 (m, 1H, CH(CH3)2), 3,11 (m, 2H, CH2), 2,28-2,39 (m, 6H, N (CH2CH3)2 & CH2, 1,31 (d, J = 6,9 Hz, CH(CH3)2), 0,85 (t, J= 7,0 Hz, 6H, N (CH2CÍ/3) 2 · MS-EI m/z 548 e 550 [M+-1 e M++1].
Exemplo 4 [3-(4-Metilpiperazin-l-il)propil]amida do ácido 5—(5— bromo-2-oxo-l,2-di-hidroindol-3-ilidenometil)-2-isopropil- -86- 4-fenil-l#-pirrolo-3-carboxílico 5-Bromo-l,3-di-hidroindol-2-ona (53 mg, 0,25 mmol) foi condensada com [3- (4-metilpiperazin-l-il)propil]amida do ácido 5-formil-2-isopropil-4-fenil-lH-pirrolo-3-carboxílico (300 mg) para dar 65 mg do composto em epígrafe. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 14,22 (s, br, 1H, NH) , 11,08 (s, br, 1H, NH) , 7,23-7,50 (m, 9H) , 6,85 (d, J = 8:7 Hz, 1H), 3,37 (m, 1H, CH(CH3)2), 3,05 (m, 2H, CH2) , 2,24 (m, 8H, 4xCH2), 2,11 (m, 5H, CH2 & CH3) , 1,42 (m, 2H, CH2) , 1,31 (d, J = 7,2 Hz, 6H, CH(CH3)2). MS-EI m/z 589 e 591[M+-1 e M++1].
Exemplo 5 (2-Pirrolidin-l-iletil)amida do ácido 5-(5-bromo-2-oxo-1,2-di-hidroindol-3-ilidenometil)-2-metil-4-fenil-lff-pirrolo-3-carboxílico 5-Bromo-l,3-di-hidroindol-2-one (44 mg, 0,21 mmol) foi condensada com (2-pirrolidin-l-iletil)amida do ácido 5-formil-2-metil-4-fenil-lH-pirrolo-3-carboxílico (70 mg, preparada do mesmo modo que o análogo isopropilo, acima) para dar 0,03 g (27%) do composto em epígrafe como um sólido amarelo. !h NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,87 (s, br, 1H, NH) , 11,11 (s, br, 1H, NH) , 7,36-7,51 (m, 6H) , 7,26 (dd, J = 1,8 & 8,1 Hz, 1H), 7,2 (s, 1H, H-vinilo) , 7,09 (m, 1H, CONHCH2), 6,83 (d, J = 8,1 Hz, 1H) , 3,17 (m, 2H, NCH2) , 2,48 (m, CH3) , 2,29-2,35 (m, 6H, 3xNCB2) , 1,59 (m, 4H, 2xCH2) . MS-EI m/z 518 e 520 [M+-1 e M++1]. MS-EI m/z 546 [M+].
Exemplo 6 -87- (2-Dimetilaminoetil)amida do ácido 5-(5-bromo-2-oxo-l,2- di-hidroindol-3-ilidenometil)-2-metil-4-fenil-lfl-pirrolo-3-carboxílico 5-Bromo-l,3-di-hidroindol-2-ona (46 mg, 0,22 mmol) foi condensada com (2-dimetilaminoetil)amida do ácido 5-formil-2-metil-4-fenil-lfí-pirrolo-3-carboxílico (65 mg) para dar 60 mg (55%) do composto em epígrafe como um sólido amarelo. !h NMR (360 MHz, DMSO-d6) Ô 13,86 (s, br, 1H, NH) , 11,09 (s, br, 1H, NH), 7,47-7, 49 (m, 2H) , 7,38-7,41 (m, 4H) , 7,26 (dd, J = 2,2 & 8,3 Hz, 1H) , 7,21 (s, 1H, H-vinil) , 7,04 (m, 1H,C0NHCH2), 6,77 (d, J = 8,3 Hz, 1H) , 3,15 (m, 2H, NCH2), 2.48 (m, CH3), 2,16 (t, J = 6,8 Hz, 2H,3xNCH2), 2,02 (s, 6H, 2xNCH3). MS m/z 493 e 494,8 [M+ e M++2] .
Exemplo 7 (3-Dietilaminopropil)amida do ácido 5-(5-bromo-2-oxo-l,2-di-hidroindol-3-ilidenometil)-2-metil-4-fenil-lH-pirrolo-3-carboxílico 5-Bromo-l,3-di-hidroindol-2-ona (0,47 g, 2,2 mmol) foi condensada com (3-dietilaminopropil)amida do ácido 5-formil-2-metil-4-fenil-lH-pirrolo-3-carboxílico (0,75 g) para dar 0,11 g (42%) do composto em epígrafe como um sólido cor de laranja. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 6 13,86 (s, br, 1H, NH) , 7,42- 7,46 (m, 3H), 7,37-7,50 (m, 7H) , 7,24-7,28 (m, 2H), 6,83 (d, J = 8,1 Hz, 1H) , 3 ,09 (m, 2H, NCH2), 2,45 (s, 3H, CH3) , 2,38 (q, J = 7,1 Hz, 4H, 2XNCH2CH3) , 2,26 (t, J = 6,9 Hz, 2H, NCH2), 1,42 (m, 2H, NCH2), 0,87 (t, J = 7,1
Hz, 6H, 2xNCH2CH3). MS-EI m/z 535,0 e 537 [M+ e M++2]. -88-
Exemplo 8 (2-Dimetilaminoetil)amida do ácido 5-(5-bromo-2-oxo-l,2- di-hidroindol-3-ilidenometil)-2,4-dimetil-lfl-pirrolo-3-carboxílico
Uma mistura de 3-oxobutirato de terc-butilo e nitrito de sódio (1 equiv.) em ácido acético foi agitada à temperatura ambiente para dar 2-hidroximino-3-oxobutirato de terc-butilo. 3-0xobutirato de etilo (1 equiv.), pó de zinco (3,8 equiv.) e o 2-hidroximino-3-oxobutirato de terc-butilo em bruto em ácido acético foi agitado a 60°C durante 1 h. A mistura reaccional foi vertida em H2O e o filtrado foi recolhido para dar (65%) 2-terc-butiloxicarbonil-3,5- dimetil-4-etoxicarbonilpirrolo.
Uma mistura de 2-terc-butiloxicarbonil-3,5-dimetil-4-etoxicarbonilpirrolo e ortoformato de trietilo (1,5 equiv.) em ácido trifluoroacético foi agitada a 15°C durante 1 hora. A reacção foi concentrada e o resíduo foi purificado para dar (64%) 2,4-dimetil-3-etoxicarbonil-5- formilpirrolo como agulhas amarelas. 2,4-Dimetil-3-etoxicarbonil-5-formilpirrolo foi hidrolisado utilizando o método B para dar (90%) ácido 5-f ormil-2,4-dimetil-lfí-pirrolo-3-carboxílico . 1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 12 (br s, 2H, NH e C02H) , 9,58 (s, 1H, CHO), 2,44 (s, 3H, CH3) , 2,40 (s, 3H, CH3) . MS m/z 267 [M+]. 5-Bromo-l,3-di-hidroindol-2-ona (0,17 g, 0,8 mmol) foi condensada com (2-dimetilaminoetil)amida do ácido 5-formil-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxílico (0,2 g, preparada pelo método C) utilizando o método B para dar -89- 0,3 g (83%) do composto em epígrafe como um sólido amarelo. 1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,60 (s, br, 1H, NH) , 10,94 (S, br, 1H, NH), 8,07 (d, J = 1,8 Hz, 1H, H-4), 7,75 (s, 1H, H-vinilo), 7,44 (t, J = 5,2 Hz, 1H, CONÍ/CH2), 7,24 (dd, J = 1,8 & 8,4 Hz, 1H, H-6) , 6,82 (d, J= 8,4 Hz, 1H, H—7) , 3, 26-3, 33 (m, 2H, NCJÍ2), 2,42 (s, 3H, CH3) , 2,41 (s, 3H, CH3), 2,38 (t, J= 6,7 Hz, 2H, NCH2) , 2,18 (s, 6H, N(CH3)2) · MS-EI m/z 430 e 432 [M+-1 e M++1].
Exemplo 9 (2-Dimetilaminoetil)amida do ácido 2,4-dimetil-5-(2-oxo-6-fenil-1,2-di-hidroindol-3-ilidenometil)-lff-pirrolo-3-carboxílico 6-Fenil-l,3-di-hidroindol-2-ona (0,17 g, 0,8 mmol) foi condensada com (2-dimetilaminoetil)amida do ácido 5-formil-2,4-dimetil-lfí-pirrolo-3-carboxilico (0,2 g) para dar 0,13 g (36%) do composto em epígrafe como um sólido amarelo alaranjado. !h NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,59 (s, br, 1H, NH), 10 ,93 (br, 1H, Nff), 7,85 (d, J = 7,92 Hz, 1H, H-4), 7,63-7 , 65 (m, 3H) , O 1 (m, 3H, ), 7,32-7,36 (m, 1H, Ar-ff) , 7 ,30 (dd, J= 1,6 & 7,9 Hz, 1H, H- -5) , 7,11 (d, J = 1,6 Hz, 1H, H—7) , 3, 28-3,34 (m, 2H, NCff21 1, 2,43 (s, 3H, CH3), 2,41 (s, 3H, CH3) , 2,38 (t, J = 6 r 8 Hz, 2H, NCH2) , 2,18 (s, 6H, N(CH3)2) · MS-EI m/z 428 [M+].
Exemplo 10 (2-Dimetilaminoetil)amida do ácido 5-(5-cloro-2-oxo-l,2-di-hidroindol-3-ilidenometil)-2, 9-dimetil-lff-pirrolo-3-carboxílico -90- 5-Cloro-l,3-di-hidroindol-2-ona (0,1 g, 0,6 mmol) foi condensada com (2-dimetilaminoetil)amida do ácido 5-formil-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxílico (0,15 g) para dar 0,22 g (90%) do composto em epígrafe como um sólido amarelo. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,61 (s, br, 1H, NH) , 10,98
(br, 1H, NH), 7,96 (d, J = 2,0 Hz, 1H, H-4), 7,75 (s, 1H, H-vinilo), 7,50 (t, J = 5,5 Hz, 1H, CONHCH2) , 7,12 (dd, J = 2,0 & 8,3 Hz, 1H, H-6), 6,86 (d, J = 8,3 Hz, 1H, H-7) , 3,26-3,31 (m, 2H, NCH2) , 2,42 (s, 3H, CH3) , 2,40 (s, 3H, CH3), 2,36 (t, J = 6,6 Hz, 2H, NCH2), 2,17 (s, 6H, N(CH3)2) · MS-EI m/z 386 [M+].
Exemplo 11 (2-Dietilaminoetil)amida do ácido 5-(5-bromo-2-oxo-l,2-di-hidroindol-3-ilidenometil)-2,4-dimetil-lff-pirrolo-3-carboxílico 5-Bromo-l,3-di-hidroindol-2-ona (0,17 g, 0,8 mmol) foi condensada com (2-dietilaminoetil)amida do ácido 5-formil-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxílico (0,2 g) para dar 0,09 g (26%) do composto em epígrafe como um sólido amarelo. 1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,61 (s, br, 1H, NH) , 10,98
(br, 1H, NH), 8,09 (d, J = 1,7 Hz, 1H, H-4), 7,76 (s, 1H, H-vinilo), 7,42 (t, J = 5,5 Hz, 1H, CONHCH2) , 7,24 (dd, J = 1,7 & 8,0 Hz, 1H, H-6), 6,82 (d, J = 8,0 Hz, 1H, H-7), 3,23-3,32 (m, 2H, NCH2), 2,46-2,55 (m, 6H, 3xNCH2), 2,43 (s, 3H, CH3), 2,42 (s, 3H, CH3) , 0,96 (t, J = 7,2 Hz, 6H, 2xNCH2CH3). MS-EI m/z 458 e 460 [M+-1 e M++1].
Exemplo 12 -91- (2-Pirrolidin-l-iletil)amida do ácido 5-(5-bromo-2-oxo-1,2-di-hidroindol-3-ilidenometil)-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxílico 5-Bromo-l,3-di-hidroindol-2-ona (0,09 g, 0,4 mmol) foi condensada com (2-pirrolidin-l-iletil)amida do ácido 5-formil-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxílico (0,1 g) para dar 0,14 g (81%) do composto em epígrafe como um sólido amarelo alaranjado. !h NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,61 (s, br, 1H, NH) , 10,98 (br, 1H, NH) , 8,09 (d, J = 1,9 Hz, 1H, H-4) , 7,76 (s, 1H, H-vinilo), 7,53 (t, J =5,5 Hz, 1H, CONHCH2), 7,24 (dd, J = 1,9 & 8,5 Hz, 1H, H-6), 6,81 (d, J = 8,5 Hz, 1H, H-7) , 3,29-3, 35 (m, 2H, NCH2), 2,54 (t, J = 6,9 Hz, 2H, NCH2) , 2,47 (m, sob DMSO) , 2,42 (s, 3H, CH3) , 2,40 (s, 3H, CH3) , 1,66-1,69 (m, 4H, 2xCH2). MS-EI m/z 456 e 458 [M+-1 e M++1].
Exemplo 13 (3-Imidazol-l-ilpropil)amida do ácido 5-(5-bromo-2-oxo-1,2-di-hidroindol-3-ilidenometil)-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxílico 5-Bromo-l,3-di-hidroindol-2-ona (0,09 g, 0,4 mmol) foi condensada com (3-imidazol-l-ilpropil)amida do ácido 5-formil-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxílico (0,1 g) para dar 0,1 g (59%) do composto em epígrafe como um sólido cor de laranja. \—1 NMR (300 MHz , DMSO- -d6) δ 13, 63 (s, br, 1H t NH) , 10 , 99 (b r, 1H, NH) , 8, 09 (d, J = 2,2 Hz, 1H, H-4) , 7, 77 (s, 1H, H- vin O 1—1 -H i—1 (t, J = = 5, 7 Hz, 1H, CONHCH2), 7, 65 (s, 1H, Ar -H) , 7,25 (dd, J = 2 ,2 'ví1 co 03 Hz, 1H, H-6) , 7, 20 (S, 1H, Ar -H) Oó OO (s, 1H, Ar-H) , 6,81 . (d, , J= : 8,4 Hz, 1H , H- 7), 4, 02 (t, J = = 6, 7 Hz, 2H, NCH2) , 3, 18 11 >“D t? 6 ,7 Hz, 2H, -92- NCH2), 2,43 (s, 3H, CH3) , 2,41 (S, 3H, CH3) , 1,93 (m, 2H, CH2) . MS-EI m/z 467 e 469 [M+-1 e M++1].
Exemplo 14 (2-Dietilaminoetil)amida do ácido 2,4-dimetil-5-(2-oxo-5-fenil-1,2-di-hidroindol-3-ilidenometil) -lff-pirrolo-3-carboxílico 5-Fenil-l,3-di-hidroindol-2-ona (80 mg, 0,4 mmol) foi condensada com (2-dietilaminoetil)amida do ácidso 5-formil-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxílico (0,1 g) utilizando o método B para dar 79 mg (46%) do composto em epígrafe. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) Ô 13,66 (s, br, 1H, NH), 10,95 (br, 1H, NH) , 8,15 (d, J = 1,2 Hz, 1H) , 7,81 (s, 1H, H- vinilo), 7,71 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 7,40-7,47 (m, 4H) , 7,31 (m, 1H) , 6,95 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 3,2-3,31 (m, 2H, NCH2),
2,46-2,55 (m, 6H, 3xNCH2), 2,44 (s, 6H, 2xCH3), 0,96 (t, J =7,4 Hz, 6H, 2xNCH2CH3). MS-EI m/z 456 [M+].
Exemplo 15 (2-Pirrolidin-l-iletil)amida do ácido 2,4-dimetil-5-(2-οχο-5-fenil-l,2-di-hidroindol-3-ilidenometil)-lH-pirrolo-3-carboxílico 5-Fenil-l, 3-di-hidroindol-2-ona (0,04 g, 0,2 mmol) foi condensada com (2-pirrolidin-l-iletil)amida do ácido 5-formil-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxílico (0,04 g) para dar o composto em epígrafe como um sólido amarelo alaranjado. !η NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,65 (s, br, 1H, NH) , 10,96 (br, 1H, NH) , 8,15 (d, J = 1,0 Hz, 1H) , 7,80 (s, 1H, H- -93- vinilo) , 7,71 (d, J = 7,2 Hz, 2H) , 7,49 (t, J = 6,3 Hz, 1H, CONHCH2), 7,41-7,46 (m, 3H) , 7,31 (m, 1H), 6,95 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 4,08 (m, 4H, 2xNCH2), 3,32 (m, 2H, NCH2) , 2,55 (t, J = 7,1 Hz, 2H, NCff2), 2,47 (m, sob DMSO) , 2,43 (s, 6H, 2xCH3) , 1,66 (m, 4H, 2xCH2) . MS-EI m/z 454 [M+].
Exemplo 16 (3-Imidazol-l-ilpropil)amida do ácido 2,4-dimetil-5-(2-οχο-5-fenil-l,2-di-hidroindol-3-ilidenometil)-lH-pirrolo-3-carboxílico 5-Fenil-l,3-di-hidroindol-2-ona (8 mg, 0,04 mmol) foi condensada com (3-imidazol-l-ilpropil)amida do ácido 5-formil-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxílico (10 mg) para dar 10 mg (59%) do composto em epígrafe como um sólido cor de laranja. !h NMR (300 MHz, DMSO-d6) Ô 13,67 (s, br, 1H, NH) , 10,96 (br, 1H, NH), 8,16 (d, J = 1,2 Hz, 1H) , 7,81 (s, 1H, H- vinilo) , 7, 65-7,72 (m, 4H) , 7,44 (m, 3H) , 7,31 (m, 1H, CONHCH2), 7,21 (s, 1H, Ar-H) , 4,02 (t, J = 6,5 Hz, 2H, NCH2), 3,19 (q, J = 6,5 Hz, 2H, CONHCH2) , 2,44 (s, 6H, 2xCH3) , 93 (m, 2H, CH2CH2CH2) . MS-EI m/z 465 [M+].
Exemplo 17 (2-Dietilaminoetil)amida do ácido 2,4-dimetil-5-(2-oxo-6-fenil-1,2-di-hidroindol-3-ilidenometil)-lg-pirrolo-3- carboxílico 6-Fenil-l, 3-di-hidroindol-2-ona (0,08 g, 0,4 mmol) foi condensada com (2-dietilaminoetil)amida do ácido 5-formil-2,4-dimetil-li7-pirrolo-3-carboxílico (0,1 g) para dar 65 mg (38%) do composto em epígrafe como um sólido -94- amarelo. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,61 (s, br, 1H, NH) , 10,99 (br, 1H, NH) , 7,86 (d, J = 7,8 Hz, 1H) , 7, 62-7, 66 (m, 3H) , 7,40-7,47 (m, 3H) , 7,28-7,36 (m, 2H), 7,10 (d, J = 1,2 Hz, 1H) , 3,26 (m, 2H, NCi?2), 2,46-2,55 (m, 6H, 3xNC#2) , 2,44 (s, 3H, Cfí3), 2,41 (s, 3H, CH3) , 0,97 (t, J = 7,2 Hz, 6H, 2XNCH2CH3). MS-EI m/z 456 [M+].
Exemplo 18 (2-Pirrolidin-l-iletil)amida do ácido 2,4-dimetil-5-(2-οχο-6-fenil-l,2-di-hidroindol-3-ilidenometil)-lH-pirrolo-3-carboxílico 6-Fenil-l,3-di-hidroindol-2-ona (30 mg, 0,15 mmol) foi condensada com (2-pirrolidin-l-iletil)amida do ácido 5-formil-2,4-dimetil-17í-pirrolo-3-carboxilico (40 mg) para dar 5,9 mg (8,5%) do composto em epígrafe como um sólido amarelo alaranjado. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,60 (s, br, 1H, NH) , 10,99 (br, 1H, NH), 7,86 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 7, 63-7, 66 (m, 3H) , 7,51 (m, 1H, CONfíCH2), 7,45 (m, 2H) , 7,28-7,36 (m, 2H) , 7,10 (d, J = 1,5 Hz, 1H) , 3,31 (m, 6H, 3xNC7Í2), 2,55 (t, J = 6,6 Hz, 2H, NCH2), 2,43 (s, 3H, CH3), 2,40 (s, 3H, CH3) , 1,67 (m, 4H, 2xCH2). MS-EI m/z 454 [M+].
Exemplo 19 (3-Imidazol-l-ilpropil)amida do ácido 2,4-dimetil-5-(2-οχο-6-fenil-l,2-di-hidroindol-3-ilidenometil)-lff-pirrolo-3-carboxílico 6-Fenil-l,3-di-hidroindol-2-ona (8 mg, 0,04 mmol) foi condensada com (3-imidazol-l-ilpropil)amida do ácido 5- -95- formil-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxílico (10 mg) para dar 7,3 mg (43%) do composto em epígrafe como um sólido cor de laranja. !h NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,62 (s, br, 1H, NH) , 10,99 (br, 1H, NH), 7,86 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 7,62-7,70 (m, 5H), 7,45 (m, 2H) , 7,35 (m, 1H) , 7,30 (dd, J = 1,4 & 8,2 Hz, 1H) , 7,21 (s, 1H) , 7,10 (d, J = 1,4 Hz, 1H), 6,89 (s, 1H), 4,02 (t, J = 6,9 Hz, 2H, CH2) , 3,19 (m, 2H, NCH2CH2) , 2,43 (s, 3H, CH3), 2,41 (s, 3H, CH3) , 1,93 (t, J = 6,9 Hz, 2H, NC#2) . MS-EI m/z 465 [M+].
Exemplo 20 (2-Dietilaminoetil)amida do ácido 5-[6-(3,5-diclorofenil)-2-oxo-l,2-di-hidroindol-3-ilidenometil]-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxílico 6-(3, 5-Diclorofenil)-1,3-di-hidroindol-2-ona (64 mg, 0,23 mmol) foi condensada com (2-dietilaminoetil)amida do ácido 5-formil-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxílico (60 mg) para dar 53 mg (44%) do composto em epígrafe como um sólido castanho claro. 1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,62 (s, br, 1H, NH) , 10,99 (s, 1H, NH), 7,89 (d, J = 7,9 Hz, 1H, H-4), 7,69-7,71 (m, 3H) , 7,55 (m, 1H, CONHCH2) , 7,37 (m, 2H) , 7,14 (d, J = 1,4
Hz, 1H, H-7), 3,27 (m, 2H, NCH2), 2,48-2,58 (m, 6H,
3xNCH2), 2,45 (s, 3H, CH3) , 2,42 (s, 3H, CH3) , 0,97 (t, J =6,8 Hz, 6H, 3xNCH2CH3). MS m/z 526,9 [M++1].
Exemplo 21 (2-Dietilaminoetil)amida do ácido 2,4-dimetil-5-(2-oxo-6-piridin-3-il-l,2-di-hidroindol-3-ilidenometil)-lff-pirrolo-3-carboxílico -96- 6-Piridin-3-il-l,3-di-hidroindol-2-ona (40 mg, 0,19 mmol) foi condensada com (2-dietilaminoetil)amida do ácido 5-formil-2,4-dimetil-líf-pirrolo-3-carboxilico (50 mg) para dar 29 mg (33%) do composto em epígrafe como um sólido cor de laranja claro. !η NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,62 (s, br, 1H, NH) , 11,05 (s, br, 1H, NH) , 8,86 (s, br, 1H) , 8,53 (d, J = 5,8 Hz, 1H), 8,04 (m, 1H), 7,91 (d, J = 8,1 Hz, 1H) , 7,70 (s, 1H, H-vinilo) , 7,40-7,48 (m, 2H) , 7,35 (d, J = 7,5 Hz, 1H) , 7,14 (s, 1H), 3,26 (m, 2H, NCH2) , 2,48-2,55 (m, 3xNCH2) , 2,42 (s, 3H, CH3), 2,38 (s, 3H, CH3), 0,96 (t, J = 6,9 Hz, 6H, 2XNCH2CH3) . MS-EI m/z 457 [M+].
Exemplo 22 (2-Pirrolidin-l-iletil)amida do ácido 2,4-dimetil-5-(2-oxo-6-piridin-3-il-l, 2-di-hidroindol-3-ilidenometil) -177-pirrolo-3-carboxílico 6-Piridin-3-il-l,3-di-hidroindol-2-ona (60 mg, 0,28 mmol) foi condensada com (2-pirrolidin-l-iletil)amida do ácido 5-formil-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxílico (75 mg) para dar 90 mg (71%) do composto em epígrafe como um sólido cor de laranja claro. !h NMR (300 MHz, DMSOd6) δ 13,61 (s, br, 1H, NH) , 11,05 (s, br, 1H, NH) , 8,86 (d, J = 1,5 Hz, 1H) , 8,54 (dd, J = 1.5 & 4,8 Hz, 1H), 8,05 (m, 1H), 7,91 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 7,70 (s, 1H, H-vinilo), 7,44-7,53 (m, 2H) , 7,36 (dd, J = 1.5 & 8,1 Hz, 1H) , 7,15 (d, J = 1,2 Hz, 1H) , 3,33 (m, 2H, NCH2), 2,47-2,57 (m, 6H, 3xNCH2), 2,43 (s, 3H, CH3), 2,41 (s, 3H, CH3), 1,67 (m, 4H, 2xCH2) MS-EI m/z 455 [M+].
Exemplo 23 -97- (3-Dimetilaminopropil)amida do ácido 2, 4-dimetil-5-(2-oxo-6-piridin-3-il-l,2-di-hidroindol-3-ilidenometil)-1H-pirrolo-3-carboxílico 6-Piridin-3-il-l,3-di-hidroindol-2-ona (42 mg, 0,2 mmol) foi condensada com (3-dimetilaminopropil)amida do ácido 5-formil-2,4-dimetil-li7-pirrolo-3-carboxilico (50 mg) para dar 67 mg (75%) do composto em epígrafe como um sólido amarelo acastanhado. H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13, 61 (s, br, 1H, NH) , 11,00 :s, br, 1H, NH), 8,86 (s, br , 1H), 8,54 1 (s, br, . 1H) , 8,04 X 1H), 7,90 (d, . J = 8,0 Hz, 1H) , 7,69 (s, 1H, H-vinilo), ',63 (m, 1H), 7, 45-7, 48 (m, 1H), 7 ,35 (dd, J = 1,7 & 8,0
Hz, 1H), 7,15 (d, J = 1,7 Hz, 1H), 3,21-3,27 (m, 2H, NCH2), 2,43 (s, 3H, CH3), 2,41 (s, 3H, CH3), 2,28 (m, 2H, NCÍ72) , 2,14 (s, 6H, 2xNCH3) , 1,64 (m, 2H, CH2) . MS-EI m/z 443 [M+].
Exemplo 24 (3-Dimetilaminopropil)amida do ácido 2,4-dimetil-5-(2-oxo-5-fenil-l,2-di-hidroindol-3-ilidenometil)-lH-pirrolo-3-carboxílico 5-Fenil-l,3-di-hidroindol-2-ona (67 mg, 0,32 mmol) foi condensada com (3-dimetilaminopropil)amida do ácido 5-formil-2,4-dimetil-lfí-pirrolo-3-carboxílico (81 mg) para dar 40 mg (28%) do composto em epígrafe como um sólido cor de laranja. !h NMR (360 MHz, DMSO-d6) Ô 13,66 (s, br, 1H, NH) , 10,92 (s, br, 1H, NH), 8,14 (s, 1H), 7,79 (s, 1H), 7,71 (m, 2H), 7,62 (m, 1H), 7,44 (m, 3H) , 7,32 (m, 1H) , 6,95 (m, 1H) , 3,33 (m, 2H, NCH2) , 2,43 (s, 6H, 2xCH3) , 2,27 (m, 2H, NCH2), 2,13 (s, 6H, 2xNCH3), 1,63 (m, 2H, CH2). MS-EI m/z 442 [M+]. -98-
Exemplo 25 (3-Dietilaminopropil)amida do ácido 2,4-dimetil-5-(2-oxo-5-fenil-l,2-di-hidroindol-3-ilidenometil)-lH-pirrolo-3-carboxílico 5-Fenil-l,3-di-hidroindol-2-ona (1,5 g, 7,16 mmol) foi condensada com (3-dietilaminopropil)amida do ácido 5-formil-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxílico (2 g) para dar 1,3 g (40%) do composto em epigrafe como um sólido amarelo alaranjado. !h NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,64 (s, 1H, NH) , 10,91 (s, 1H, NH) , 8,14 (d, J = 1,4 Hz, 1H, ArH) , 7,8 (s, 1H, ArH), 7,7 (dd, J = 1,2 e 8,5 Hz, 2H, ArH) , 7,6 (t, J = 5,3 Hz, 1H, CONHCH2), 7,4 (m, 3H, ArH), 7,3 (t, J= 7,4 Hz, 1H,
ArH), 6,9 (d, J = 8,0 Hz, 1H, ArH), 3,2 (m, 2H, CONHCH2) , 2,5 (m, 12H, 3xNCH2 e 2xCH3) , 1,61 (m, 2H, CH2CH2CH2) , 0,93 (t, J = 6,7 Hz, 6H, NCH2CH3). MS-EI m/z 470 [M+].
Exemplo 26 (3-Dietilaminopropil)amida do ácido 2,4-dimetil-5-(2-oxo-6-fenil-l,2-di-hidroindol-3-ilidenometil)-lH-pirrolo-3-carboxilico 6-Fenil-l, 3-di-hidroindol-2-ona (1,5 g, 7,16 mmol) foi condensada com (3-dietilaminopropil)amida do ácido 5-formil-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxílico (2 g) para dar 1,9 g (57%) do composto em epigrafe como um sólido cor de laranj a. !h NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,58 (s, 1H, NH) , 10,94 (s, 1H, NH), 7,8 (d, J = 7,9 Hz, 1H, ArH), 7,6 (m, 4H, ArH), 7,4 (t, J = 7,5 Hz, 2H, ArH), 7,3 (m, 2H), 7,1 (d, J = 1,4 Hz, 1H, ArH), 3,2 (m, 2H, CONHCH2), 2,5 (m, 12H, 3xNCH2 e -99- 2xCH3), 1,61 (m, 2H, CH2CH2CH2) , 0,93 (t, J = 6,7 Hz, 6H, NCH2CH3) . MS-EI m/z 470 [M+].
Exemplo 27 (3-Dietilaminopropil)amida do ácido 5-(5-bromo-2-oxo-l,2-di-hidroindol-3-ilidenometil)-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxílico 5-Bromo-l,3-di-hidroindol-2-ona (0,5 g, 2,36 mmol) foi condensada com (3-dietilaminopropil)amida do ácido 5-formil-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxílico (0,51 g) para dar 0,84 g do composto em epígrafe como um sólido vermelho alaranjado. 1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,61 (s, 1H, NH) , 10,99 (s, 1H, NH) , 8,09 (d, J = 1,8 Hz, 1H, ArH) , 7,7 (m, 4H) , 7,2 (dd, J = 1,8 e 8,3 Hz, 2H, ArH) , 6,8 (d, J = 7,8 Hz, 1H, Arff), 3,3 (br s, 4H, 2xNCJÍ2), 3,2 (m, 2H, CONHCH2), 2,6 (br s, 2H, NCH2 e 2xCH3) , 2,4 (s, 6H, 2xCH3) , 1,66 (m, 2H, CH2CH2CH2), 0,98 (t, J = 7,1 Hz, 6H, NCH2CH3). MS-EI m/z 472 e 474 [M+-1 e M++1].
Exemplo 28 (2-Dietilaminoetil)amida do ácido 5-(5-bromo-2-oxo-l,2-di-hidroindol-3-ilidenometil)-2,4-diisopropil-lff-pirrolo-3-carboxílico 5-Bromo-l,3-di-hidroindol-2-ona (100 mg, 0,47 mmol) foi condensada com (2-dietilaminoetil)amida do ácido 5-formil-2,4-diisopropil-lB-pirrolo-3-carboxílico (150 mg) para dar 0,15 g (62%) do composto em epígrafe como um sólido amarelo alaranjado. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,97 (s, 1H, NH) , 10,95 (s, 1H, NH), 8,09 (d, J = 1,3 Hz, 1H, ArH), 7,84 (m, 1H) , 7,79 -100- (s, 1H), 7,23 (dd, J = 1,3 e 8,1 Hz, 1H, ArH) , 6,8 (d, J = 8,1 Hz, 1H, Ar H) , 3,5 (m, 1H, CE), 3,3 (m, 3H, C H e NHCH2) r 2,5 (br m, 6H, 3xNCH2), 1,28 (d, J = 6,9 Hz, 6H, 2xCH3) , 1,23 (d, J = 6,6 Hz, 6H, 2xCí/3) , 0,96 (m, 6H, 2xCH2Cfí3) . MS-EI m/z 514 e 516 [M+-1 e M++1].
Exemplo 29 (3-Dietilaminopropil)amida do ácido 5-(5-bromo-2-oxo-l,2-di-hidroindol-3-ilidenometil)-2,4-diisopropil-lH-pirrolo-3-carboxílico 5-Bromo-l,3-di-hidroindol-2-ona (90 mg, 0,42 mmol) foi condensada com (3-dietilaminopropil)amida do ácido 5-formil-2,4-diisopropil-lH-pirrolo-3-carboxílico (140 mg) para dar 54 mg (25%) do composto em epígrafe como um sólido vermelho acastanhado. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,98 (s, 1H, NH) , 10,96 (s, 1H, NH) , 8,09 (d, J =1,7 Hz, 2H), 7,78 (s, 1H, H-vinilo) , 7,23 (dd, J = 1,7 e 8,1 Hz, 1H, ArH), 6,82 (d, J = 8,1 Hz, 1H, ArH), 3,5 (m, 1H, C H) , 3,25 (m, 2H, NHCH2) , 3,15 (m, 1H, CH) , 2,7 (br s, 6H, 3xNCH2) , 1,7 (br m, 2H, CH2CH2CH2), 1,28 (d, J = 6,9 Hz, 6H, 2xCH3) , 1,24 (d, J = 5,9 Hz, 6H, 2xCH3), 1,06 (m, 6H, 2XCH2CH3). MS-EI m/z 528 e 530 [M+-1 e M++1].
Exemplo 30 (3-Pirrolidin-l-ilpropil)amida do ácido 5-(5-bromo-2-oxo-1,2-di-hidroindol-3-ilidenometil)-2,4-diisopropil-lH-pirrolo-3-carboxílico 5-Bromo-l,3-di-hidroindol-2-ona (130 mg, 0,6 mmol) foi condensada com (3-pirrolidin-l-ilpropil)amida do ácido 5-formil-2,4-diisopropil-lH-pirrolo-3-carboxilico (150 mg, -101- 0,45 mmol) para dar 36 mg (15%) do composto em epígrafe como um sólido castanho dourado alaranjado.
Ifí NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,98 (s, 1H, NH) , 10,97 (s, 1H, NH), 8,10 (d, J = 1,6 Hz, 2H), 7,78 (s, 1H, H-vinilo) , 7,23 (dd, J = 1,6 e 7,6 Hz, 1H, ArH) , 6,82 (d, J = 7,6 Hz, 1H, ArH) , 3,5 (m, 1H, CH) , 3,25 (m, 2H, NHCH2) , 3,15 (m, 1H, CH) , 2,7 (br s, 6H, 3xNCtf2) , 1.7 (br m, 6H, 3xNCH2CH2). 1.28 (d, J = 5,6 Hz, 6H, 2xCH3) , 1,24 (d, J = 5,7 Hz, 6H, 2xCJÍ3) . MS-EI m/z 526 e 528 [M+-1 e M++1].
Exemplo 31 (Piridin-4-ilmetil)amida do ácido 5-(5-bromo-2-oxo-l,2-di-hidroindol-3-ilidenometil)-2,4-dimetil-lff-pirrolo-3-carboxílico 5-Bromo-l,3-di-hidroindol-2-ona (170 mg, 0,8 mmol) foi condensada com (piridin-4-ilmetil)amida do ácido 5-formil-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxílico (200 mg) para dar 14 mg (4%) do composto em epígrafe como um sólido amarelo. 1h NMR (300 MHz, DMSO-d6) Ô 13,67 (s, 1H, NH) , 11,01 (s, br, 1H, NH), 8,51 (dd, J = 1,6 & 4,3 Hz, 2H), 8,23 (t, J = 6,0 Hz, 1H, CONHCH2), 8,11 (d, J = 1,9 Hz, 1H) , 7,78 (s, 1H, H-vinilo), 7,31 (d, J = 6,0 Hz, 2H), 7,25 (dd, J = 1,9 & 8,1 Hz, 1H), 6,82 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 4,45 (d, J = 6,0 Hz, 2H, NCH2), 2,46 (s, 6H, 2xCH3). MS-EI m/z 450 e 452 [M+-1 e M++l].
Exemplo 32 (2-Pirrolidin-l-iletil)amida do ácido 5-[6-(4-butilfenil)-2-oxo-l,2-di-hidroindol-3-ilidenometil]-2,4-dimetil-lff-pirrolo-3-carboxílico -102- 5-[6-(4-Butilfenil)]-1,3-di-hidroindol-2-ona (50 mg, 0,19 mmol) foi condensada com (2-pirrolidin-l-iletil)amida do ácido 5-formil-2,4-dimetil-líí-pirrolo-3-carboxílico (50 mg) para dar 74 mg (76%) do composto em epígrafe como um sólido cor de laranja. 1H NMR (360 MHz, DMS0-d6) δ 13,58 (s, 1H, NH) , 10,93 (s, br, 1H, NH) , 7,82 (d, J = 7,9 Hz, 1H) , 7,63 (s, 1H, H-vinilo) , 7,54 (d, J = 7,9 Hz, 2H) , 7,46 (m, 1H, CONH) , 7,26 (m, 3H) , 7,09 (s, 1H) , 3,30 (m, 2H, CH2) , 2,52-2,63 (m, 4H, 2xCH2), 2,49 (m, 4H, 2xCH2) , 2,43 (s, 3H, CH3) , 2,40 (s, 3H, CH3), 1,68 (m, 4H, 2xCH2) , 1,58 (m, 2H, CH2) , 1,34 (m, 2H, CH2) , 0,91 (t, J= 7,2 Hz, 3H, CH2CH3) . MS-EI m/z 510 [M+].
Exemplo 33 2-Pirrolidin-l-iletil)amida do ácido 5-[6-(4-etilfenil)-2-oxo-1,2-di-hidroindol-3-ilidenometil] -2,4-dimetil-lff-pirrolo-3-carboxílico 6-(4-Etilfenil)-1,3-di-hidroindol-2-ona (45 mg, 0,19 mmol) foi condensada com 2-pirrolidin-l-iletil)amida do ácido 5-formil-2,4-dimetil-líí-pirrolo-3-carboxílico (50 mg) para dar 60 mg (65%) do composto em epígrafe como um sólido amarelo alaranjado. 1R NMR (300 MHz, DMS0-d6) δ 13,59 (s, 1H, NH) , 10,96 (s, br, 1H, NH) , 7,83 (d, J = 8,4 Hz, 1H) , 7,64 (s, 1H, H-
vinilo), 7,51-7,56 (m, 3H), 7,25-7,30 (m, 3H), 7,08 (d, J = 1 Hz, 1H), 3,31 (m, 2H, CH2), 2,63 (m, 2H, CH2CH3), 2,55 (m, 2H, CH2), 2,49 (m, 4H, 2xCH2), 2,42 (s, 3H, CH3), 2,40 (s, 3H, CH3), 1,67 (m, 4H, 2xCH2), 1,20 (t, J= 7,5 Hz, 3H, CH2CH3). MS-EI m/z 482 [M+].
Exemplo 34 -103- (Pirrolidin-l-iletil) amida_do_ácido_5- [6- (3- isopropilfenil)-2-oxo-l,2-di-hidroindol-3-ilidenometil] -2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxilico 6-(3-Isopropilfenil)-1,3-di-hidroindol-2-ona (48 mg, 0,19 mmol) foi condensada com (pirrolidin-l-iletil)amida do ácido 5-formil-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxilico (50 mg) para dar 59 mg (63%) do composto em epigrafe como um sólido cor de laranja. !h NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,63 (s, 1H, NH) , 10,97 (s, br, 1H, NH), 7,87 (d, J = 7,8 Hz, 1H) , 7,68 (s, 1H, H- vinilo) , 7,24-7,55 (m, 6H) , 7,13 (s, 1H) , 3,34 (m, 2H, CH2), 3,30 (m, 1H, CH(CH3)2), 2,60 (m, 2H, CH2) , 2,50 (m, 4H, 2xCH2), 2,45 (s, 3H, CH3) , 2,43 (s, 3H, CH3) , 1,70 (m,4H, 2xCH2), 1,27 (d, J = 6,9 Hz, 6H, CH(CH3)2). MS-EI m/z 496 [M+].
Exemplo 35 (2-Dietilaminoetil)amida do ácido 5-(5-fluoro-2-oxo-l,2-di-hidroindol-3-ilidenometil)-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3- carboxilico 5-Fluoro-l,3-di-hidroindol-2-ona (0,54 g, 3,8 mmol) foi condensada com (2-dietilaminoetil)amida do ácido 5-formil-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxílico para dar 0,83 g (55%) do composto em epigrafe como um sólido amarelo esverdeado. 1H NMR (360 MHz, DMS0-d6) Ô 13,66 (s, 1H, NH) , 10,83 (s, br, 1H, NH), 7,73 (dd, J = 2,5 & 9,4 Hz, 1H), 7,69 (s, 1H, H-vinilo), 7,37 (t, 1H, CONHCH2CH2) , 6,91 (m, 1H) , 6,81- 6,85 (m, 1H), 3,27 (m, 2H, CH2), 2,51 (m, 6H, 3xCH2), 2,43 (s, 3H, CH3), 2,41 (s, 3H, CH3) , 0,96 (t, J = 6,9 Hz, 6H, N(CH2CH3)2) · MS-EI m/z 398 [M+]. -104-
Exemplo 35 (Síntese alternativa) (2-Dietilamino-etil)amida do ácido 5-[5-fluoro-2-oxo-l,2-di-hidro-indol-(3Z)-ilidenometil]-2,4-dimetil-lff-pirrolo-3-carboxílico
Hidrato de hidrazina (55%, 3000 mL) e 5-fluoroisatina (300 g) foram aquecidos a 100°C. Adicionou-se mais 5-fluoro-isatina (500 g) em porções (100 g) ao longo de 120 minutos com agitação. A mistura foi aquecida a 110°C e agitada durante 4 horas. A mistura foi arrefecida até à temperatura ambiente e os sólidos foram recolhidos por filtração com vácuo para dar hidrazida do ácido (2-amino5-fluoro-fenil)-acético em bruto (748 g). A hidrazida foi suspensa em água (700 mL) e o pH da mistura foi ajustado para < pH 3 com ácido clorídrico 12 N. A mistura foi agitada durante 12 horas à temperatura ambiente. Od sólidos foram recolhidos por filtração com vácuo e lavados duas vezes com água. O produto foi seco em vácuo para dar 5-fluoro-l,3-di-hidro-indol-2-ona (600 g, 73% de rendimento) como um pó castanho, NMR (sulf óxido de dimetilo-d6) Ô 3,46 (s, 2H, CH2), 6,75, 6,95, 7,05 (3 x m, 3H, aromáticos), 10,35 (s, 1H, NH). MS m/z 152 [M+l]. Éster 2-terc-butílico éster 4-etílico do ácido 3,5-dimetil-lH-pirrolo-2,4-dicarboxílico (2600 g) e etanol (7800 mL) foram agitados vigorosamente enquanto se adicionava lentamente ácido clorídrico 10 N (3650 mL) . A temperatura aumentou de 25°C para 35°C e começou a evolução de gás. A mistura foi aquecida a 54°C e agitada com aquecimento adicional durante uma hora altura em que a temperatura era de 67°C. A mistura foi arrefecida a 5°C e adicionu-se lentamente 32 L de gelo e água com agitação. O sólido foi recolhido por filtração com vácuo e lavado três vezes com água. O sólido foi seco ao ar até peso constante para dar éster etílico do ácido 2,4-dimetil-lH-pirrolo-3- -105- carboxílico (1418 g, 87% de rendimento) como um sólido rosado. -*-H NMR (sulfóxido de dimetilo-d6) δ 2,10, 2,35 (2xs, 2x3H, 2xCH3), 4,13 (q, 2H, CH2) , 6,37 (s, 1H, CH) , 10,85 (s, 1H, NH). MS m/z 167 [M+l].
Dimetilformamida (322 g) e diclorometano (3700 mL) foram arrefecidos num banho de gelo a 4°C e adicionou-se oxicloreto de fósforo (684 g) com agitação. Éster etilico do ácido 2,4-dimetil-l#-pirrolo-3-carboxílico sólido (670 g) foi adicionado lentamente em aliquotas ao longo de 15 minutos. A temperatura máxima atingida foi 18°C. A mistura foi aquecida a refluxo durante uma hora, arrefecido a 10°C num banho de gelo e adicionou-se rapidamente 1,6 L de água gelada com agitação vigorosa. A temperatura aumentou para 15°C, adicionou-se ácido clorídrico 10 N (1,6 L) com agitação vigorosa. A temperatura aumentou para 22°C. A mistura foi deixada em repouso durante 30 minutos e deixou-se que as camadas se separassem. A temperatura atingiu um máximo de 40°C. A camada aquosa foi ajustada para pH 12-13 com hidróxido de potássio 10 N (3,8 L) a uma taxa tal que deixou a temperatura atingir e manter-se a 55°C durante a adição. Depois de completada a adição a mistura foi arrefecida a 10°C e agitada durante 1 hora. O sólido foi recolhido por filtração com vácuo e lavado quatro vezes com água para dar éster etílico do ácido 5-formil-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxílico (778 g, 100% de rendimento) como um sólido amarelo. NMR (DMSO-d6) δ 1,25 (t, 3H, CH3), 2,44, 2,48 (2xs, 2x3H, 2xCH3), 4,16 (q, 2H, CH2), 9,59 (s, 1H, CHO), 12,15 (br s, 1H, NH). MS m/z 195 [M+l]. Éster etílico do ácido 5-formil-2,4-dimetil-ltf-pirrolo-3-carboxílico (806 g), hidróxido de potássio (548 g), água (2400 mL) e metanol (300 mL) foram aquecidos a refluxo durante duas horas com agitação e depois arrefecidos a 8°C. A mistura foi extraída duas vezes com -106- diclorometano. A camada aquosa foi ajustada para pH 4 com 1000 mL de ácido clorídrico 10 N mantendo a temperatura abaixo de 15°C. Adicionou-se água para facilitar a agitação. O sólido foi recolhido por filtração com vácuo, lavado três vezes com água e seco em vácuo a 50°C para dar ácido 5-formil-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxílico (645 g, 93,5% de rendimento) como um sólido amarelo. NMR (DMSO-d6) δ 2,40, 2,43 (2xs, 2x3H, 2xCH3) , 9,57 (s, 1H, CHO) , 12,07 (br s, 2H, NH+COOH). MS m/z 168 [M+l]. Ácido 5-formil-2,4-dimetil-li7-pirrolo-3-carboxílico (1204 g) e 6020 mL de dimetilformamida foram agitados à temperatura ambiente enquanto se adicionava cloridrato de 1-(3-dimetil-aminopropil-3-etilcarbodiimida (2071 g), hidroxibenzotriazole (1460 g), trietilamina (2016 mL) e dietiletilenodiamina (1215 mL). A mistura foi agitada durante 20 horas à temperatura ambiente. A mistura foi diluída com 3000 mL de água, 2000 mL de solução aquosa saturada de cloreto de sódio e 3000 mL de solução saturada de bicarbonato de sódio e o pH ajustado para mais do que 10 com hidróxido de sódio 10 N. A mistura foi extraída duas vezes com 5000 mL de cada vez de 10% de metanol em diclorometano e os extractos foram combinados, secos sobre sulfato de magnésio anidro e evaporados até à secura em evaporador rotativo. A mistura foi diluída com 1950 mL de tolueno e novamente evaporada em evaporador rotativo até à secura. O resíduo foi triturado com hexano:éter dietílico 3:1 (4000 mL) . Os sólidos foram recolhidos por filtração com vácuo, lavados duas vezes com 400 mL de acetato de etilo e secos em vácuo a 34°C durante 21 horas para dar (2-dietilamino-etil)amida do ácido 5-formil-2,4-dimetil-lfí-pirrolo-3-carboxílico (819 g, 43% de rendimento) como um sólido castanho claro. NMR (sulfóxido de dimetilo-dg) δ 0,96 (t, 6H, 2xCH3), 2,31,2,38 (2xs, 2xCH3), 2,51 (m, 6H 3xCH2), 3,28 (m, 2H, CH2) , 7,34 (m, 1H, NH de amida), 9,56 (s, 1H, CHO), 11,86 (s, 1H, pirrolo NH) . MS m/z 266 -107- [M+l]. (2-Dietilaminoetil)amida do ácido 5-formil-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxílico (809 g) , 5-fluoro-l,3-di-hidro-indol-2-ona (438 g) , etanol (8000 mL) e pirrolidina (13 mL) foram aquecidos a 78°C durante 3 horas. A mistura foi arrefecida até à temperatura ambiente e os sólidos recolhidos por filtração com vácuo e lavados com etanol. Os sólidos foram agitados com etanol (5900 mL) a 72°C durante 30 minutos. A mistura foi arrefecida até à temperatura ambiente. Os sólidos foram recolhidos por filtração com vácuo, lavados com etanol e secos em vácuo a 54°C durante 130 horas para dar (2-dietilamino-etil)-amida do ácido 5-[5-fluoro-2-oxo-l,2-di-hidro-indol(3Z)- ilidenometil] -2,4-dimetil-líf-pirrolo-3-carboxílico (1013 g, 88 % de rendimento) como um sólido cor de laranja. -*-H NMR(sulfóxido de dimetilo-d6) δ 0,98 (t, 6H, 2xCH3), 2,43, 2,44 (2xs, 6H, 2xCH3), 2,50 (m, 6H, 3xCH2), 3,28 (q, 2H, CH2), 6,84, 6,92, 7,42, 7,71, 7,50 (5xm, 5H, aromático, vinilo, CONH), 10,88 (s, 1H, CONH), 13,68 (s, 1H, pirrolo NH). MS m/z 397 [M-l].
Exemplo 36 Ácido 3-[4-(2-dietilaminoetilcarbamoíl)-3,5-dimetil-lff-pirrol-2-ilmetileno]-2-oxo-2,3-di-hidro-lH-indole-6-carboxilico Ácido 2-oxo-2,3-di-hidro-lH-indole-6-carboxilico (80 mg, 0,45 mmol) foi condensado com (2-dietilaminoetil)amida do ácido 5-formil-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxilico para dar 210 mg (92%) do composto em epigrafe como um sólido amarelo alaranjado. :Η NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,6 (s, 1H, NH) , 7,76 (d, J = 1,5 & 8.0 Hz, 1H) , 7,66 (s, 1H, H-vinilo) , 7,57 (dd, J = 8.0 -108- Ηζ, 1Η) , 7,40-7,42 (m, 2Η) , 3,28 (m, 2Η, CH2) , 2,88 (m, Η de piperidina) , 2,54 (m, 6H, 3xCH2), 2,44 (s, 3H, CH3) , 2,40 (s, 3H, CH3), 1,56 (m, H de piperidina), 0,97 (t, J = 6,98 Hz, 6H, N(CH2CH3)2). MS m/z 424 [M+].
Exemplo 37 (2-Pirrolidin-l-iletil) amida_do_ácido_5- (5- dimetilsulfamoíl-2-oxo-l,2-di-hidroindol-3-ilidenometil)-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxílico
Dimetilamida do ácido 2-oxo-2,3-di-hidro-lH-indole-5-sulfónico (90 mg, 0,38 mmol) foi condensada com (2-pirrolidin-l-iletil)amida do ácido 5-formil-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxílico (100 mg) para dar 100 mg (54%) do composto em epígrafe como um sólido amarelo. 1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,65 (s, 1H, NH) , 11,30 (s, br, 1H, NH) , 8,25 (d, 1H) , 7,92 (s, 1H, H-vinilo) , 7,48 — 7,53 (m, 2H), 7,07 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 3,33 (m, 2H, CH2), 2,61 (s, 6H, N (CH3) 2) t 2,56 (t, 2H, CH2) , 2,49 (m, 4H, 2xCH2), 2,45 (s, 3H, CH3) , 2,44 (s, 3H, CH3) , 1,67 (m, 4H, 2xCH2). MS-EI m/z 485 [M+].
Exemplo 38 (Pirrolidin-l-iletil)amida do ácido 5-[5-(3-clorofenil-sulfamoíl)-2-oxo-l,2-di-hidroindol-3-ilidenometil]-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxílico (3-Clorofenil)amida do ácido 2-oxo-2,3-di-hidro-lH-indole-5-sulfónico (120 mg, 0,38 mmol) foi condensada com 2-pirrolidin-l-iletil)amida do ácido 5-formil-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxílico ((100 mg) para dar 150 mg (69%) do composto em epígrafe como um sólido amarelo alaranjado. -109- !h NMR (360 ΜΗζ, DMSO-d6) δ 13,55 (s, 1Η, ΝΗ), 11,26 (br s, 1Η, NH), 10,30 (br s, 1H, NH) , 8,26 (d, 1H) , 7,79 (s, 1H, H-vinilo) , 7,51-7,57 (m, 2H), 7,22 (t, J = 8,1 Hz, 1H), 7,15 (m, 1H), 7,07 (m, 1H) , 7,0 (m, 2H) , 3,44 (m, 2H, CH2), 2,57 (t, J = 7,0 Hz, 2H, CH2) , 2,49 (m, 4H, 2xCH2), 2,44 (s, 3H, CH3), 2,43 (s, 3H, CH3), 1,68 (m, 4H, 2xCH2). MS m/z 568 [M+].
Exemplo 39 (2-Pirrolidin-l-iletil)amida do ácido 2,4-dimetil-5-[2-oxo-5- (piridin-3-ilsulfamoil)-1,2-di-hidroindol-3-ilidenometil]-lH-pirrolo-3-carboxílico
Piridin-3-ilamida do ácido 2-oxo-2,3-di-hidro-lH- indole-5-sulfónico (110 mg, 0,38 mmol) foi condensada com 2- pirrolidin-l-iletil)amida do ácido 5-formil-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxílico (100 mg) para dar 150 mg (74%) do composto em epígrafe como um sólido cor de laranja. 1H NMR (360 MHz, DMS0-d6) δ 13,58 (s, 1H, NH), 8,21 (d, J = 2,0 Hz, 2H) , 8,04 (m, 1H) , 7,76 (s, 1H, H-vinilo), 7,49- 7,54 (m, 2H), 7,41 (m, 1H), 7,14 (m, 1H), 6,94 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 3,33 (m, 2H, CH2) , 2,56 (t, J = 7,06 Hz, 2H, CH2), 2,49 (m, 4H, 2xCH2) , 2,43 (s, 6H, 2xCH3) , 1,68 (m, 4H, 2xCH2). MS m/z 535 [M+].
Exemplo 40 3- [3,5-Dimetil-4-(4-metilpiperazino-l-carbonil)-lH-pirrol-2-ilmetileno]-4-(2-hidroxietil)-1,3-di-hidroindol-2-ona 4-(2-Hidroxietil)-1,3-di-hidroindol-2-ona (71 mg, 0,4 mmol) foi condensada com 3,5-dimetil-4-(4-metil-piperazino-l-carbonil)-lH-pirrolo-2-carbaldeído para dar 90 mg (55%) do composto em epígrafe como um sólido cor de -110- laranj a. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 14,25 (s, 1H, NH) , 10,88 (s, 1H, NH) , 7,57 (s, 1H, H-vinilo) , 7,03 (m, 1H) , 6,75-6,82 (m, 2H), 4,86 (m, ΙΗ,ΟΗ), 3,70 (m, 2H, CH2), 3,04 (m, 2H, CH2), 2,48 (m, 4H, 2xCH2), 2,28 (br s, 7H) , 2,19 (s, 3H, CH3), 2,18 (s, 3H, CH3) . MS m/z (+vos) 409,3 [M+].
Exemplo 41
Fenilamida do ácido 3-[3,5-dimetil-4-(4-metilpiperazino-l-carbonil) -lH-pirrol-2-ilmetileno] -2-oxo-2,3-di-hidro-lH-indole-5-sulfónico
Fenilamida do ácido 2-oxo-2,3-di-hidro-lH-indole-5-sulfónico (110 mg, 0,4 mmol) foi condensada com 3,5-dimetil-4-(metilpiperazino-l-carbonil)-lH-pirrolo-2- carbaldeído (100 mg) para dar 50 mg (24%) do composto em epigrafe como um sólido amarelo. !η NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,52 (s, 1H, NH) , 11,26 (s, 1H, NH) , 10,08 (s, 1H, NH) , 8,21 (d, J = 1,6 Hz, 1H), 7,75 (s, 1H, H-vinilo), 7,50 (dd, J = 1,6 & 8,3 Hz, 1H) , 7,19 (m, 2H), 7,10 (m, 2H) , 6,97 (m, 2H) , 2,49 (m, 4H, 2xCH2) , 2,28 (m, 10H, 2xCH3 & 2xCH2) , 2,18 (s, 3H, CH3) . MS-EI m/z 519 [M+].
Exemplo 42 (2-Dietilaminoetil)amida do ácido 5-(5-dimetilsulfamoíl-2-oxo-1,2-di-hidroindol-3-ilidenometil)-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxílico
Dimetilamida do ácido 2-oxo-2,3-di-hidro-lH-indole-5-sulfónico (90 mg, 0,38 mmol) foi condensada com (2- dietilaminoetil)amida do ácido 5-formil-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxílico (100 mg) para dar 80 mg (43%) do -111- composto em epígrafe como um sólido amarelo. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 11,30 (s, 1H, NH) , 8,27 (d, J = 1,7 Hz, 1H) , 7,94 (s, 1H, H-vinilo) , 7,49 (dd, J = 1,7 & 8,0 Hz, 1H), 7,44 (m, 1H, CONÍÍCH2CH2) , 7,07 (d, J = 8,0
Hz, 1H) , 3,26 (m, 2H, CH2) , 2,60 (s, 6H, N (CH3) 2) #- 2,53 (m, 2H, CH2), 2,45-2,50 (m, 10H, 2xCH3 & N(CH2CH3)2, 0,96 (t, J = 7,2 Hz, 6H, N(CH2CH3)2)· MS-EI m/z 487 [M+].
Exemplo 43 (2-Dietilaminoetil)amida do ácido 5-[5-(3-clorofenil-sulfamoíl)-2-oxo-l,2-di-hidroindol-3-ilidenometil]-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxílico (3-Clorofenil)amida do ácido 2-oxo-2,3-di-hidro-lH-indole-5-sulfónico (120 mg, 3,8 mmol) foi condensada com (2-dietilaminoetil) amida do ácido 5-formil-2,4-dimetil-líí-pirrolo-3-carboxí lico (100 mg) para dar 80 mg (37%) do composto em epígrafe como um sólido amarelo. 1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,55 (s, 1H, NH) , 11,24 (s, 1H, Ni7) , 10,29 (s, 1H, NH) , 8,25 (d, J = 1,87 Hz, 1H) , 7,79 (s, 1H, H-vinilo), 7,52 (dd, J = 1,87 & 8,3 Hz, 1H), 7,42 (m, 1H, CONÍÍCH2CH2) , 7,22 (t, J = 8,02 Hz, 1H) , 7,15 (t, J = 2 Hz, 1H) , 7,08 (m, 1H) , 7,0 (m, 2H) , 3,27 (m, 2H, CH2) , 2,48-2,57 (m, 6H, 3xCfí2) , 2,45 (s, 3H, CH3),44 (s, 3H, CH3), 0,97 (t, J = 7,0 Hz, 6H, N(CH2CH3)2). MS m/z 570,1 [M+].
Exemplo 44 Éster etílico do ácido { [4-metil-5-(4-metil-5-metil-sulfamoí1-2-oxo-1,2-dihydrindol-3-ilidenometil)-1H-pirrolo-3-carbonil]-amino}-acético O éster etílico do ácido 4-metil-lH-pirrolo-3- -112- carboxílico (ref. lit. D. O. Cheng, T. L. Bowman e E. LeGoff; J. Heterocyclic Chem.; 1976; 13; 1145-1147) foi formilado utilizando o método A, hidrolisado utilizando o método B seguido por amidação (método C) para dar éster etílico do ácido [(5-formil-4-metil-lH-pirrolo-3-carbonil)-amino]-acético. 4-Metil-5-metilaminosulfonil-2-oxindole (50 mg, 0,21 mmol) foi condensado com éster etílico do ácido [(5-formil-4-metil-lH-pirrolo-3-carbonil)-amino]-acético (100 mg, 0,42 mmol) e piperidina (0,1 mL) em etanol (2 mL) para dar 50 mg (52%) do composto em epígrafe. !η NMR (360 MHz, DMSO-d6) 013,59 (s, 1H, NH), 11,29 (v.br. s, 1H, NH-CO), 8,33 (t, J = 5,8 Hz, 1H, CONHCH2), 7,83 (d, J = 3,11 Hz, 1H), 7,80 (s, 1H, H-vinilo), 7,71 (d, J = 8,5
Hz, 1H), 7,34 (br m, 1H, NHCH3) , 6,89 (d, J= 8,5 Hz, 1H), 4,11 (q, J = 7,1 Hz, 2H, OCH2CH3) , 3,92 (d, J = 5,8 Hz, 2H, GlyCH2), 2,86 (s, 3H, CH3) , 2,48 (s, 3H, CH3) , 2,42 (d, J = 4,71 Hz, 3H, HNCH3) , 1.20 (t, J = 7,1 Hz, 3H, OCH2CH3). MS-EI m/z 460 [M+].
Exemplo 45 Éster etílico do ácido { [4-metil-5-(5-metilsulfamoíl-2-oxo-1,2-di-hidro-indol-3-ilidenometil)-lfí-pirrolo-3-carbonil]-amino}-acético
Uma mistura de 5-metilaminossulfonil-2-oxindole (0,06 g, 0,22 mmol), éster etílico do ácido [(5-formil-4-metil-lH-pirrolo-3-carbonil)-amino]-acético (0,075 g, 0,27 mmol) e piperidina (2 gotas) em etanol (5 mL) foi aquecida num tubo selado a 90°C durante 12 h. Após arrefecimento, o precipitado foi recolhido por filtração com vácuo, lavado com etanol, triturado com diclorometano/éter e seco para dar 0,035 g (36%) do composto em epígrafe como um sólido -113- castanho amarelado.
!η NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,6 (s, 1H, NH) , 11 (v.br. s, 1H, NH-CO) , 8,30 (t, J= 5,7 Hz, 1H, CONRCH2), 8,25 (d, J 1,2 Hz, 1H) , 7,88 (s, 1H, H-vinilo) , 7,84 (d, J = 3,3 Hz, 1H) , 7,57 (dd, J = 1,9 & 8,5 Hz, 1H) , 7,14 (br m, 1H, NHCH3), 7,04 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 4,11 (q, J = 6,7 Hz, 2H, OCH2CH3), 3,92 (d, J= 5,7 Hz, 2H, GlyCH2), 2,55 (s, 3H, CH3), 2,41 (m, 3H, NCH3), 1,20 (t, J = 6,7 Hz, 3H, OCH2CH3) . MS m/z 446 [M+] .
Exemplo 46 Ácido_([4-metil-5-(5-metilsulfamoíl-2-oxo-l, 2-di-hidro- indol-3-ilidenometil)-lH-pirrolo-3-carbonil]-amino}-acético
Uma mistura de éster etílico do ácido [ (5-formil-4-metil-lfí-pirrolo-3-carbonil)-amino]-acético (0,142 g, 0,59 mmol) e NaOH 1 N (1,2 mL) em metanol (10 mL) foi agitada à temperatura ambiente durante 1 h. A reacção foi concentrada e o resíduo foi condensado com 5-metilaminossulfonil-2-oxindole (0,13 g, 0,48 mmol) e piperidina (0,12 mL) em etanol (12 mL) para dar 0,11 g (52%) do composto em epígrafe. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,98 (br s, 1H, NH) , 8,17 (s, 1H) , 7,80 (s, 1H) , 7,75 (d, J = 3,1 Hz, 1H), 7,51 (dd, J = 2 & 8,2 Hz, 1H) , 7,21 (m em br. s, 2H) , 6,97 (d, J = 8,1 Hz, 1H) , 3,41 (d, J = 4,2 Hz, 2H, CH2NH) , 2,54 (s, 3H, pirrolo-CH3), 2,39 (s, 3H, ArCH3). MS m/z 417 [M-l] + .
Exemplo 48 (2-Dietilamino-etil)amida do ácido 2,9-dimetil-5-(2-oxo-1,2-di-hidro-indol-3-ilidenometil)-lH-pirrolo-3- -114- carboxílico
Uma mistura de 1,3-di-hidro-indol-2-ona (266 mg, 2 mmol), (2-dietilamino-etil)-amida do ácido 5-formil-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxílico (530 mg, 2 mmol) e piperidina (1 gota) em etanol foi aquecida a 90°C durante 2 horas. A reacção foi arrefecida até à temperatura ambiente, o precipitado resultante foi recolhido por filtração com vácuo, lavado com etanol e seco para dar 422 mg (55%) do composto em epígrafe como um sólido amarelo claro. !h NMR (400 MHz, DMS0-d6) δ 13,7 (s, 1H, NH), 10,9 (s, 1H, NH) , 7,88 (d, J = 7,6 Hz, 1H) , 7,64 (s, 1H, H-vinilo) , 7.41 (t, J = 5,4 Hz, 1H, NH), 7,13 (dt, J = 1,2 & 7,6 Hz, 1H) , 6,99 (dt, J = 1,2 & 7,6 Hz, 1H) , 6,88 (d, J = 7,6 Hz, 1H) , 3,28 (m, 2H) , 2,48-2,55 (m, 6H) , 2,44 (s, 3H, CH3) , 2.41 (s, 3H, CH3), 0,97 (t, J = 7,2 Hz, 6H, N(CH2CH3)2). MS + vos APCI 381 [M+ + 1].
Exemplo 49 (2-Dietilamino-etil)amida do ácido 5-(5-cloro-2-oxo-l,2-di-hidro-indol-3-ilidenometil)-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxilico
Uma mistura de 5-cloro-l,3-di-hidro-indol-2-ona (335 mg, 2 mmol), (2-dietilamino-etil)-amida do ácido 5-formil-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxílico (530 mg, 2 mmol) e piperidina (1 gota) em etanol foi aquecida a 90°C durante 2 horas. A reacção foi arrefecida até à temperatura ambiente, 0 precipitado resultante foi recolhido por filtração com vácuo, lavado com etanol e seco para dar 565 mg (68%) do composto em epígrafe como um sólido cor de laranja. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13,65 (s, 1H, NH), 11,0 (s, 1H, NH), 7,98 (d, J = 2,1 Hz, 1H) 7,77 (s, 1H, H-vinilo), 7,44 -115- (t, NH) , 7,13 (dd, J = 2, 1 & 8,4 Hz, 1H) 6,87 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 3,28 (g, 2H) , 2,48-2,53 (m, 6H) , 2,44 (s, 3H, CH3), 2,43 (s, 3H, CH3), 0,97 (t, J = 7,0 Hz, 6H, N(CH2CH3)2) · MS + vos APCI 415 [M+ + 1] .
Exemplo 50 (2-Pirrolidin-l-etil)-amida do ácido 2,4-dimetil-5-(2-oxo-1,2-di-hidro-indol-3-ilidenometil)-lH-pirrolo-3-carboxílico 1,3-Di-hidro-indol-2-ona foi condensada com (2-pirrolidin-l-il etil)-amida do ácido 5-formil-2,4-dimetil-ltf-pirrolo-3-carboxílico para dar o composto em epígrafe. MS +vos APCI 379[M+ + 1].
Exemplo 51 (2-Pirrolidin-l-il-etil)amida do ácido 5-(5-fluoro-2-oxo-1,2-di-hidro-indol-3-ilidenometil)-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxílico 5-Fluoro-l,3-di-hidro-indol-2-ona foi condensada com (2-pirrolidin-l-il-etil)amida do ácido 5-formil-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxílico para dar o composto em epígrafe. MS +vos APCI 397 [M+ + 1].
Procedimento de aumento de escala: Ácido 5-formil-2,4-dimetil-ltf-pirrolo-3-carboxílico (61 g), 5-fluoro-l,3-di-hidro-indol-2-ona (79 g), etanol (300 mL) e pirrolidina (32 mL) foram aquecidos a refluxo durante 4,5 horas. Adicionou-se ácido acético (24 mL) à mistura e o aquecimento a refluxo foi continuado durante -116- 30 minutos. A mistura foi arrefecida até à temperatura ambiente e os sólidos recolhidos por filtração com vácuo e lavados duas vezes com etanol. Os sólidos foram agitados durante 130 minutos em 40% de acetona em água (400 mL) contendo ácido clorídrico 12 N (6,5 mL) . Os sólidos foram recolhidos por filtração com vácuo e lavados duas vezes com 40% de acetona em água. Os sólidos foram secos em vácuo para dar ácido 5-[5-fluoro-2-oxo-l,2-di-hidro-indol-(3 Z)-ilidenometil]-2,4-dimetil-ltf-pirrolo-3-carboxílico (86 g, 79% de rendimento) como um sólido cor de laranja. 1h NMR (sulfóxido de dimetilo-d6) δ 2,48, 2,50 (2xs, 6H, 2xCH3), 6,80, 6,88, 7,68, 7,72 (4xm, 4H, aromáticos e vinílico), 10,88 (s, 1H, CONH), 12,12 (s, 1H, COOH), 13,82 (s, 1H, NH de pirrolo). MS m/z 299 [M-l]. Ácido 5-[5-fluoro-2-oxo-l,2-di-hidro-indol-(3 Z)- ilidenometil]-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxílico (100 g) e dimetilformamida (500 mL) foram agitados e adicionou-se hexafluorofosfato de benzotriazoliloxitris(dimetilamino) fosfónio (221 g) , 1-(2-aminoetil)pirrolidina (45,6 g) e trietilamina (93 mL) . A mistura foi agitada durante 2 horas à temperatura ambiente. O produto sólido foi recolhido por filtração com vácuo e lavado com etanol. Os sólidos foram lavados por suspensão e agitação em etanol (500 mL) durante uma hora a 64°C e arrefecidos até à temperatura ambiente. Os sólidos foram recolhidos por filtração com vácuo, lavados com etanol e secos em vácuo para dar (2-pirrolidin-l-il-etil)-amida do ácido 5—[5— fluoro-2-oxo-l,2-di-hidro-indol-(3Z)-ilidenometil]-2, 4-dimetil-líí-pirrolo-3-carboxílico (101,5 g, 77% de rendimento), NMR (sulfóxido de dimetilo-d6) δ 1,60 (m, 4H, 2xCH2), 2,40, 2,44 (2xs, 6H, 2xCH3) , 2,50 (m, 4H, 2xCH2), 2,57, 3,35 (2xm, 4H, 2XCH2), 7,53, 7,70, 7,73, 7,76 (4xm, 4H, aromáticos e vinílico), 10,88 (s, 1H, CONH), 13,67 (s, 1H, pirrolo NH). MS m/z 396 [M+l]. -117-
Exeinplo 52 (2-Pirrolidin-l-il-etil)-amida do ácido 5-(5-cloro-2-oxo-1,2-di-hidro-indol-3-ilidenometil)-2,4-dimetil-lff-pirrolo-3-carboxílico 5-Cloro-l,3-di-hidro-indol-2-ona foi condensada com (2pirrolidin-l-il-etil)-amida do ácido 5-formil-2,4-dimetil-lfí-pirrolo-3-carboxilico para dar o composto em epígrafe. MS +vos APCI 413 [M+ + 1].
Exemplo 53 (2-Dimetilaminoetil)-amida do ácido 2, 4-dimetil-5-(2-oxo-1, 2-di-hidro-indol-3-ilidenometil)-lH-pirrolo-3-carboxílico 1,3-Di-hidro-indol-2-ona foi condensada com (2-dimetilaminoetil)-amida do ácido 5-formil-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxílico para dar o composto em epígrafe.
Ih nmr (400 MHz, DMSO -d6) δ 13,63 (s, 1H, NH) , 10,90 (s, 1H, NH) , 7,78 > (d, J = 7,8 Hz, 1H), 7,63 (s, 1H, H-vinilo), 7,48 (t, 1H, NH) , 7, 13 (dt, 1H) , 6, 98 (dt, 1H) , 6,88 (d, J = 7,7 Hz, 1H), 3,31 (q, J = 6,6 Hz, 2H) , 2,43 (s, 3H, CH3), 2,40 (s, 3H, CH3), 2,38 (t, J = 6,6 Hz, 2H) , 2,19 (s, 6H, N (CH2CH3)2) MS +vos APCI 353 [M+ + 1].
Exemplo 98 (2-Etilamino-etil)amida do ácido 5-[5-fluoro-2-oxo-l, 2-di-hidro-indol-(3Z)-ilidenometil]-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxílico (2-Etilamino-etil)amida do ácido 5-formil-2,4-dimetil-lfí-pirrolo-3-carboxilico (99 g), etanol (400 mL), -118- 5-fluoro-2-oxindole (32 g) e pirrolidina (1,5 g) foram aquecidos a refluxo durante 3 horas com agitação. A mistura foi arrefecida até à temperatura ambiente e os sólidos recolhidos por filtração com vácuo. Os sólidos foram agitados em etanol a 60°C, arrefecidos até à temperatura ambiente e recolhidos por filtração com vácuo. 0 produto foi seco em vácuo para dar (2-etilamino-etil)-amida do ácido 5-[5-fluoro-2-oxo-l,2-di-hidroindol-(3 Z)-ilidenometil]-2,4-dimetil-lfí-pirrolo-3-carboxílico (75 g, 95% de rendimento), NMR (sulfóxido de dimetilo-d6) δ 1,03 (t, 3H, CH3), 2,42, 2,44 (2xs, 6H, 2xCH3) , 2,56 (q, 2H, CH2), 2,70, 3,30 (2xt, 4H, 2xCH2), 6,85, 6,92, 7,58, 7,72, 7, 76 (5xm, 5H, aromáticos, vinilico e CONH) , 10,90 (br s, 1H, CONH), 13,65 (br s, 1H, NH de pirrolo) . MS m/z 369 [M-l] .
Exemplo 95 [2-(Piridin-l-il) etil]amida do ácido 5-[5-fluoro-2-oxo-1,2-di-hidro-indol-(3Z)-ilidenometil]-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxilico. Ácido 5-[5-fluoro-2-oxo-l,2-di-hidro-indol-(3 Z)- ilidenometil] -2,4-dimetil-li7-pirrolo-3-carboxílico (120 mg, 0,4 mmol) foi agitado com EDC,HC1 (96 mg, 0,5 mmol), 1-hidroxi-benztriazole anidro (68 mg, 0,5 mmol) e 2— (2— aminoetilpiridina adquirida a Aldrich em DMF anidra (3 mL) durante 2-3 dias à temperatura ambiente. A mistura reaccional foi diluída com NaHC03 1 M (1,5 ml) e depois com 8 mL de água. O produto em bruto precipitado foi recolhido por filtração, lavado com água, seco e purificado por cristalização ou cromatografia para dar [2-(piridin-l-il)-etil]amida do ácido 5-[5-fluoro-2-oxo-l,2-di-hidro-indol- (3Z) -ilidenometil] -2,4-dimetil-líf-pirrolo-3-carboxílico. -119-
Exemplo 94 [2-(Piridin-l-il)etil]amida do ácido 5-[5-cloro-2-oxo-l,2-di-hidro-indol-(3Z)-ilidenometil]-2,4-dimetil-lg-pirrolo-3-carboxílico.
Procedendo como descrito no exemplo anterior mas substituindo ácido 5-[5-fluoro-2-oxo-l,2-di-hidro-indol-(3Z)-ilidenometil]-2, 4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxilico por ácido 5-[5-cloro-2-oxo-l,2-di-hidro-indol-(3Z)-ilidenometil]-2,4-dimetil-lfí-pirrolo-3-carboxilico deu [2-(piridin-l-il)etil]amida do ácido 5-[5-cloro-2-oxo-l,2-di-hidro-indol- (3Z)-ilidenometil]-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxílico.
Exemplo 97 [2-(Piridin-l-il)etil]amida do ácido 5-[5-bromo-2-oxo-l,2-di-hidro-indol-(3Z)-ilidenometil]-2,4-dimetil-lg-pirrolo-3-carboxílico.
Procedendo como descrito no Exemplo 95 acima mas substituindo ácido 5-[5-fluoro-2-oxo-l,2-di-hidro-indol-(3Z)-ilidenometil]-2,4-dimetil-lfí-pirrolo-3-carboxilico por ácido 5-[5-bromo-2-oxo-l,2-di-hidro-indol-(3 Z)- ilidenometil] -2,4-dimetil-líí-pirrolo-3-carboxílico (145 mg) deu [2-(piridin-l-il)etil]amida do ácido 5- [5-bromo-2-oxo-1,2-di-hidro-indol-(3Z)-ilidenometil]-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxílico.
Exemplo 96 [2-(piridin-l-il)etil]amida do ácido 5-[2-oxo-l,2-di-hidro-indol- (3Z) -ilidenometil] -2,4-dimetil-lfí-pirrolo-3-carboxilico -120-
Procedendo como descrito no Exemplo 95 acima mas substituindo ácido 5-[5—fluoro-2-oxo-l,2-di-hidro-indol-(3Z) -ilidenometil] -2, 4-dimetil-l#-pirrolo-3-carboxílico por ácido 5-[2-oxo-l,2-di-hidro-indol-(3Z)-ilidenometil]-2,4-dimetil-ltf-pirrolo-3-carboxílico (113 mg) deu [2-(piridin-l-il)etil]amida do ácido 5-[2-oxo-l,2-di-hidro-indol- (3z)-ilidenometil]-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxílico.
Exemplos 91, 92, 93 e 101
Procedendo como descrito nos Exemplos 95, 94, 96 e 97 acima mas substituindo 2-(2-aminoetil)piridina por 1-(2-aminoetil)pirrolidina, adquirida a Aldrich Chemical
Company, Inc., deu os compostos desejados.
Exemplos 62-65
Procedendo como descrito no Exemplos 95, 94, 96 e 97 acima mas substituindo 2-(2-aminoetil)piridina por 1—(2 — aminoetil)imidazolin-2-ona (preparada por aquecimento de carbonato de dimetilo com bis(2-aminoetil)amina (2 equivalentes) num balão selado a 150°C durante 30 min, seguindo o procedimento descrito na patente U.S. 2613212 (1950), de Rohm & Haas Co. O produto em bruto foi purificado em sílica utilizando uma mistura eluente de clorofórmio-metanol-amoníaco aquoso 80:25:2) deu os compostos desejados.
Exemplos 66-68 e 89
Procedendo como descrito no Exemplos 95, 94, 96 e 97 acima mas substituindo 2-(2-aminoetil)piridina por éster etílico do ácido 4-(2-aminoetil)piperazino-l-acético (preparado como se segue: Éster etílico do ácido piperazino-l-acético (11,22 g) foi tratado com -121- iodoacetonitrilo (5,0 mL) na presença de carbonato de potássio (6,9 g) em acetato de etilo (260 mL) a 0°C. Depois de completada a adição do iodoacetonitrilo (45 min), a mistura reaccional foi subsequentemente agitada à temperatura ambiente durante 11 horas. A mistura reaccional foi filtrada e o filtrados evaporado. O resíduo foi hidrogenado na presença de boreto de cobalto (preparado a partir de C0CI2 e borohidreto de sódio) à temperatura ambiente a 50 psi durante 2 dias em etanol. A filtração, evaporação e purificação cromatográfica utilizando uma mistura eluente de clorofórmio-metanol-amoníaco aquoso 80:25:2 deu a amina desejada (3,306 g) como um óleo amarelo pálido) deu os compostos desejados.
Exemplo 69-72
Procedendo como descrito no Exemplos 95, 94, 96 e 97 acima mas substituindo 2-(2-aminoetil)piridina por l-(3-aminopropil)-azepin-2-ona (preparada de acordo com o procedimento descrito em Kraft A. : J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 6, 1999, 705-14, excepto que a hidrólise de DBU foi realizada a 145°C sem solvente em presença de hidróxido de lítio (1 h, 5 mL de DBU, 2 mL de água, 420 mg de hidrato de hidróxido de lítio). A purificação do produto em bruto em sílica utilizando uma mistura eluente de clorofórmio-metanol-amoníaco aquoso 80:40:4 deu l-(3-aminopropil)-azepin-2-ona (4,973 g, 87% de rendimento)) deu os compostos desejados.
Exemplos 54-56 e 73
Procedendo como descrito no Exemplos 95, 94, 96 e 97 acima mas substituindo 2-(2-aminoetil) piridina por N-acetiletileno diamina (preparada por aquecimento de uma mistura de acetato de etilo com etileno diamina (1,5 equivalentes) a 160°C durante 1 h num reactor selado. A -122- destilação em vácuo deu o produto desejado com 56% de rendimento. A N-acetiletileno diamina também está disponível da Aldrich) deu os compostos desejados.
Exemplos 57-60
Procedendo como descrito no Exemplos 95, 94, 96 e 97 acima mas substituindo 2-(2-aminoetil)piridina por 1—(3— aminopropil)-tetrahidro-pirimidin-2-ona (preparada do mesmo modo que 1-(3-aminopropil)-azepin-2-ona de acordo com o procedimento descrito em Kraft A.: J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 6, 1999, 705-14: Resumidamente, 1,3,4,6,7,8-hexahidro-2H-pirimido[1,2-a]pirimidina (4,939 g), hidrato de hidróxido de lítio (918 mg) e 2 ml de água foram aquecidos sem solvente num reactor selado a 145°C durante 1 h. 0 produto em bruto foi purificado numa coluna de sílica em clorofórmio-metanol-amoníaco aquoso 80:40:4 para dar amina pura (5,265 g, 94% de rendimento).
Exemplos 61, 74-75 e 90
Procedendo como descrito no Exemplos 95, 94, 96 e 97 acima mas substituindo 2-(2-aminoetil)piridina por 1-(2-aminoetil)-piperazin-2-ona (preparada como se segue: Adicionou-se cloreto de terc-butildifenilsililo tal e qual (25 mL, 97,7 mmol) gota a gota a uma solução de DBU (19,5 ml, 130 mmol) e bis (2-aminoetil) amina (4,32 mL, 40 mmol) em dimetilacetamida anidra (80 mL) à temperatura ambiente com arrefecimento num banho de água ao longo de 5 minutos. A mistura foi agitada durante 5 horas. Adicionou-se éster etílico do ácido bromoacético tal e qual (6,70 mL, 60 mmol) com arrefecimento até à temperatura ambiente. A reacção foi agitada durante 25 minutos, depois evaporada em alto vácuo. O resíduo foi dissolvido em metanol (200 mL) , adicionou-se KHCO3 (10 g) e KF (12 g, 200 mmol) e a mistura foi agitada a 60°C durante 5 horas. Adicionou-se -123- 10 g de Na2CC>3, agitou-se durante 10 minutos, arrefeceu-se e filtrou-se. Os filtrados foram evaporados. O residuo foi extraído com hexanos (2 vezes 250 mL) . O material insolúvel em hexano foi dissolvido em etanol (60 mL), filtrado e evaporado. O resíduo foi purificado numa coluna de sílica em clorofórmio-metanol-amoniaco aquoso 80:40:4 para dar amina pura (4,245 g, 74% de rendimento)) deu os compostos desejados.
Exemplo 77 [2-(4-Metilpiperazin-l-il)-etil]-amida do ácido 5—(5— fluoro-2-oxo-l,2-di-hidro-indol-3-ilidenometil)-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxílico A uma mistura lamacenta amarela com agitação de ácido 5-[5-fluoro-2-oxo-l,2-di-hidro-indol-(3Z)-ilidenometil]-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxílico (90 mg), DMF (0,8 mL) e TEA (0,084 mL) num tubo de reacção de 20 mL, foi adicionado reagente BOP (199 mg). A mistura tornou-se transparente em 5 min. Adicionou-se 2-(4-metilpiperazin-l-il)etilaminal (51 mg) à mistura transparente. A solução resultante foi agitada à temperatura ambiente de um dia para o outro. Do sistema reaccional precipitaram produtos sólidos amarelos. A cromatografia em camada fina (10% de metanol em cloreto de metileno) mostrou que todo o material de partida tinha sido convertido no produto. O sólido foi isolado por filtração com vácuo e lavado uma vez com etanol (1 mL) . O sólido foi sonicado em éter dietílico (2 mL) durante 20 min e recolhido por filtração com vácuo. Após secagem em vácuo, obteve-se (4-metilpiperazin-l-il-etil)-amida do ácido 5-(5-fluoro-2-oxo-1,2di-hidro-indol-3-ilidenometil)-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxílico (79 mg, 62% de rendimento). 1H NMR (DMS0-d6) δ 2,13 (s, 3H, CH3) , 2,40, 2,42 (2xs, 6H, 2xCH3), 2,41 (m, 2H, CH2) , 2,47 (m, 8H, 4xCH2), 3,30 (m, -124- 2Η, CH2), 6,82 (dd, J=4,5, 8,7 Hz, 1H) , 6,91 (td, 2J=2,4, 3J=8,8 Hz, 1H), 7,43 (t, J=5,6 Hz, 1H), 7,70 (s, 1H), 7,75 (dd, J=2,8, 9,6 Hz, 1H) (aromático e vinílico) , 10,88 (s, 1H, CONH), 13,67 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 424,4 (M-l).
Exemplo 78 (4-Metilpiperazin-l-iletil)-amida do ácido 5-(5-cloro-2-oxo-1,2-di-hidro-indol-3-ilidenometil)-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxilico
Seguindo o procedimento do Exemplo 77 acima mas substituindo o ácido 5-[5-fluoro-2-oxo-l,2-di-hidro-indol-(3 Z)-ilidenometil]-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxílico pelo ácido 5- [5-cloro-2-oxo-l,2-di-hidro-indol-(3Z) -ilidenometil]-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxílico (95 mg, 0,3 mmol) deu a (4-metilpiperazin-l-iletil)-amida do ácido 5- (5-cloro-2-oxo-l,2-di-hidro-indol-3-ilidenometil)-2,4-dimetil-lií-pirrolo-3-carboxílico (76 mg, 58%) . 1R NMR (DMS0-d6) 02,13 (S, 3H, CH3), 2,41, 2,42 (2xs, 6H, 2xCH3), 2,42 (m, 2H, CH2) , 2,48 (m, 8H, 4xCH2), 3,30 (m, 2H, CH2), 6,84 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,11 (dd, J = 2,0, 8,0 Hz, 1H), 7,44 (t, J= 5,6 Hz, 1H), 7,76 (s, 1H), 7,97 (d, J =2,0 Hz, 1H) (aromático e vinílico), 10,98 (s, 1H, CONH), 13,62 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 440,2 (M-l).
Exemplo 79 (4-Metilpiperazin-l-il-etil)-amida do ácido 5-(5-bromo-2-oxo-1,2-di-hidro-indol-3-ilidenometil)-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxílico
Seguindo o procedimento descrito no Exemplo 77, mas substituindo 0 ácido 5-(5-cloro-2-oxo-l,2-di-hidro-indol-3-ilidenometil)-2,4-dimetil-l#-pirrolo-3-carboxílico pelo ácido 5-(5-bromo-2-oxo-l,2-di-hidro-indol-3-ilidenometil)- -125- 2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxílico obteve-se (4- metilpiperazin-l-il-etil)-amida do ácido 5-(5-bromo-2-oxo-1,2-di-hidro-indol-3-ilidenometil)-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxílico (39 mg, 54%) a partir de SU011670 (54 mg, 0,15 mmol). NMR (DMSO-d6) δ 2,14 (s, 3H, CH3), 2,41, 2,42 (2xs, 6H, 2xCH3), 2,42 (m, 2H, CH2) , 2,48 (m, 8H, 4xCH2), 3,31 (m, 2H, CH2), 6,80 (d, J=8,0 Hz, 1H), 7,23 (dd, J=2,0, 8,0 Hz, 1H), 7,44 (t, J=5,6 Hz, 1H), 7,76 (s, 1H), 8,09 (d, J=2,0 Hz, 1H) (aromático e vinilico) , 10,99 (s, 1H, CONH), 13,61 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z)486,6 (M).
Exemplo 81 (4-Metilpiperazin-l-il-etil)-amida do ácido 5-(2-oxo-l,2-di-hidro-indol-3-ilidenometil)-2,4-dimetil-li7-pirrolo-3- carboxilico
Seguindo o procedimento descrito no Exemplo 77 acima mas substituindo o ácido 5-(5-fluoro-2-oxo-l,2-di-hidro-indol-3-ilidenometil)-2,4-dimetil-ltf-pirrolo-3-carboxilico SU014900 por ácido 5-(2-oxo-l,2-di-hidro-indol-3-ilidenometil) -2,4-dimetil-líí-pirrolo-3-carboxilico obteve-se (4-metilpiperazin-l-il-etil)-amida do ácido 5-(2-oxo-1,2di-hidro-indol-3-ilidenometil)-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxílico, SU014903 (136 mg, 84%) a partir de SU012120 (112,8 mg, 0,4 mmol). !h NMR (DMSO-d6) 6 2,13 (s, 3H, CH3), 2,39, 2,42 (2xs, 6H, 2xCH3), 2,42 (m, 2H, CH2) , 2,48 (m, 8H, 4xCH2), 3,30 (t, 2H, CH2), 6,86 (d, J=8,0 Hz, 1H) , 6,96 (t, J=7,4 Hz, 1H) , 7,10 (t, J=7,8 Hz, 1H), 7,41 (t, J=5,4 Hz, 1H) , 7,62 (s, 1H) , 7,76 (d, J=7,6 Hz, 1H) (aromático e vinilico), 10,88 (s, 1H, CONH), 13,61 (S, 1H, NH). LC-MS (m/z) 406,6 (M-l).
Exemplo 80 -126- [2-(3,5-Dimetilpiperazin-l-iljetil)amida do ácido 5-[2-oxo-1,2-di-hidro-indol- (3Z) -ilidenometil] -2,4-dimetil-lff-pirrolo-3-carboxílico A uma mistura amarela lodosa com agitação de ácido 5-[2-oxo-l,2-di-hidro-indol-(3Z)-ilidenometil]-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxílico (112,8 mg, 0,4 mmol), DMF (0,5 mL) e trietilamina (0,111 mL) num tubo de reacção de 20 mL, foi adicionado reagente BOP (265 mg). A mistura tornou-se transparente em 5 min. Adicionou-se 2-(2,6-dimetilpiperazin-l-il)etilamina (68,6 mg) (ver Tapia, L. Alonso-Cires, P. Lopez-Tudanca, R. Mosquera, L. Labeaga, A. Innerarity, A. Orjales, J. Med. Chem., 1999, 42, 2870-2880) à mistura transparente. A solução resultante foi agitada à temperatura ambiente de um dia para o outro. A cromatografia em camada fina (10% de metanol em cloreto de metileno) mostrou que todo o material de partida tinha sido convertido no produto. A mistura reaccional foi evaporada até à secura e depois purificada por cromatografia rápida (CH2CI2/CH3OH = 20/1-15/1) seguida por recristalização para dar [2-(3,5-dimetilpiperazin-l-il)etil)amida do ácido 5-[2-oxo-l,2-di-hidro-indol-(3Z)-ilidenometil]-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxílico (83 mg, 50% de rendimento). 1H NMR (DMS0-d6) Ô 1,15, 1,16 (2xs, 6H, 2xCH3) , 1,95 (t, J=ll,6 Hz, 2H, CH2), 2,41, 2,47 (2xs, 6H, 2xCH3), 2,50 (m, 2H, CH2), 3,03 (d, J=10 Hz, 2H) , 3,19 (m, 2H) , 3,30 (m, 2H, CH2), 6,86 (d, J=8,0 Hz, 1H) , 6,97 (t, J=7,2 Hz, 1H) , 7,11 (t, J=7,8 Hz, 1H) , 7,48 (t, J=5,6 Hz, 1H) , 7,61 (s, 1H) , 7,75 (d, J=7,6 Hz, 1H) (aromático e vinilico) , 10,88 (S, 1H, CONH), 13,62 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 422,2 (M+l).
Exemplo 82 [2-(3,5-Dimetilpiperazin-l-il)etil)amida do ácido 5-[5-fluoro-2-oxo-l,2-di-hidro-indol-(3Z)-ilidenometil]-2,4- -127- dimetil-lff-pirrolo-3-carboxílico
Seguindo o procedimento descrito no Exemplo 77 acima obteve-se o composto desejado (60 mg, 0,2 mmol). !h NMR(DMSO-d6) δ 0,891, 0,907 (2xs, 6H, 2xCH3), 1,49 (t, J=10,4 Hz, 2H), 2,40, 2,42 (2xs, 6H, 2xCH3) , 2,41 (m, 2H, CH2), 2,74 (m, 4H), 3,30 (m, 2H), 6,82 (dd, J=4,5, 8,7 Hz, 1H), 6,90 (td, 2J=2,4, 3J=8,4 Hz, 1H), 7,42 (t, J=5,6 Hz, 1H), 7,70 (s, 1H), 7,74 (dd, J=4,6, 8,4 Hz, 1H) (aromático
e vinilico), 10,88 (s, 1H, CONH), 13,65 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 438,4 (M-l).
Exemplo 83 [2-(3,5-Dimetilpiperazin-l-il) etil)amida do ácido 5-[5-cloro-2-oxo-1,2-di-hidro-indol-(3Z)-ilidenometil]-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxílico
Seguindo o procedimento do Exemplo 80 acima obteve-se o composto desejado (31,2 mg, 34%) a partir do ácido 5— [5— cloro-2-oxo-1,2-di-hidro-indol-(3Z)-ilidenometil]-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxílico (63 mg, 0,2 mmol). 1H NMR (DMS0-d6) δ 1,15, 1,16 (2xs, 6H, 2xCH3) , 1,95 (t, J=ll,6 Hz, 2H, CH2), 2,40, 2,42 (2xs, 6H, 2xCH3), 2,50 (m, 2H, CH2), 3,03 (d, J=ll, 2 Hz, 2H) , 3,19 (m, 2H) , 3,30 (m, 2H, CH2), 6,85 (d, J=8,4 Hz, 1H), 7,11 (dd, J=2,0, 8,0 Hz, 1H), 7,52 (t, J=5, 6 Hz, 1H) , 7,76 (s, 1H) , 7,97 (d, J=2,0
Hz, 1H) (aromático e vinilico), 10,99 (s, 1H, CONH), 13,63 (s, 1H, NH) . LC-MS (m/z) 456, 2 (M+l) .
Exemplo 84 [2-(3,5-Dimetilpiperazin-l-il)etil)amida do ácido 5-[5-bromo-2-oxo-l,2-di-hidro-indol-(3Z)-ilidenometil]-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxílico -128-
Seguindo o procedimento descrito no Exemplo 80 obteve-se o composto desejado (40 mg, 40%) a partir do ácido 5-[5-bromo-2-oxo-l,2-di-hidro-indol-(3Z)-ilidenometil]-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxilico (74 mg, 0,2 mmol). !h NMR (DMSO-d6) δ 1,15, 1,16 (2xs, 6H, 2xCH3), 1,95 (t, J=ll,6 Hz, 2H, CH2), 2,40, 2,42 (2xs, 6H, 2xCH3), 2,50 (m, 2H, CH2), 3,03 (d, J=10,4 Hz, 2H), 3,19 (m, 2H), 3,30 (m, 2H, CH2), 6,81 (d, J=8,4 Hz, 1H), 7,24 (dd, J=2,0, 8,4 Hz, 1H) , 7,51 (t, J=5,6 Hz, 1H) , 7,76 (s, 1H) , 8,10 (d, J=2,0 Hz, 1H) (aromático e vinilico), 10,99 (s, 1H, CONH), 13,62 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 498,4 (M-l).
Exemplos Biológicos
Os ensaios seguintes são utilizados para encontrar os compostos que demonstram o grau óptimo da actividade desej ada. A. Procedimentos de ensaio.
Os ensaios seguintes podem ser utilizados para determinar o nivel de actividade e o efeito dos diferentes compostos da presente invenção sobre uma ou mais das PKs. Ensaios semelhantes podem ser concebidos segundo as mesmas linhas para qualquer PK utilizando técnicas bem conhecidas na arte. Vários dos ensaios aqui descritos são realizados num formato ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Sandwich Assay) (Voller et ai., 1980, "Enzyme-Linked Immunosorbent Assay," Manual of Clinicai Immunology, 2ded., Rose e Friedman, Am. Soc. Of Microbiology, Washington, D. C., páginas 359-371). 0 procedimento geral é como a seguir: um composto é introduzido em células que exprimem a quinase de teste, quer naturalmente quer recombinantemente, durante um -129- período de tempo seleccionado após o que, se a quinase de teste for um receptor, é adicionado um ligando que se sabe que activa o receptor. As células são lisadas e o lisado é transferido para os poços de uma placa ELISA previamente revestida com um anticorpo especifico que reconhece o substrato da reacção de fosforilação enzimática. Os componentes não substratos do lisado celular são removidos por lavagem e a quantidade de fosforilação no substrato é detectada com um anticorpo que reconhece especificamente fosfotirosina em comparação com células de controlo que não entraram em contacto com um composto de teste.
Os protocolos presentemente preferidos para realização das experiências ELISA para PKs especificas estão apresentados adiante. Contudo, a adaptação destes protocolos para determinação da actividade de compostos contra outras RTKs, bem como de CTKs e STKs, está dentro do âmbito dos conhecimentos dos especialistas na matéria. Outros ensaios aqui descritos medem a quantidade de ADN produzida em resposta à activação de uma quinase de teste, que é uma medida geral de uma resposta proliferativa. 0 procedimento geral para este ensaio é o seguinte: um composto é introduzido em células que exprimem a quinase de teste, quer naturalmente quer recombinantemente, durante um período de tampo seleccionado após o qual, se a quinase de teste for um receptor, é adicionado um ligando que se sabe que activa o receptor. Após incubação pelo menos de um dia para o outro, adiciona-se um reagente de marcação de ADN tal como 5-bromodesoxiuridina (BrdU) ou H^-timidina. A quantidade de ADN marcado é detectada com um anticorpo anti-BrdU ou por medição da radioactividade e é comparada com células de controlo que não entraram em contacto com um composto de teste. BIOENSAIO DE GST-FLK-1 -130-
Este ensaio analisa a actividade de tirosina quinase de GST Flkl em péptidos poli(glu,tyr).
Materiais e Reagentes: 1. Placas para ELISA Corning com 96 poços (Catálogo
Corning n° 5805-96). 2. poli(glu,tyr) 4:1, liofilizado (Catálogo Sigma # P0275) . 3. Preparação de placas de ensaio revestidas com poli (glu,tyr) (pEY) : Revestir 2 yg/poço de poli (glu, tyr) (pEY) em 100 yL de PBS, manter à temperatura ambiente durante 2 horas ou a 4°C de um dia para o outro. Cobrir bem as placas para evitar evaporação. 4. Tampão PBS: para 1 L, misturar 0,2 g de KH2PO4, 1,15 g de Na2HP04, 0,2 g de KC1 e 8 g de NaCl em aproximadamente 900 mL de dH20. Quando todos os reagentes estiverem dissolvidos, ajustar o pH para 7,2 com HC1. Levar o volume total a 1 L com dH20. 5. Tampão PBST: a 1 L de tampão PBS, adicionar 1,0 mL de Tween-20. 6. Tampão de Bloqueamento TBB: para 1 L, misturar 1,21 g de TRIS, 8,77 g de NaCl, 1 mL de TWEEN-20 em aproximadamente 900 mL de dH20. Ajustar o pH para 7,2 com HC1. Adicionar 10 g de BSA, agitar para dissolver. Levar o volume total a 1 L com dH20.
Filtrar para remover partículas de matéria. 7. 1% de BSA em PBS: Para preparar lx solução de trabalho, adicionar 10 g de BSA a aproximadamente 990 -131- mL de tampão PBS, agitar para dissolver. Ajustar o volume total para 1 L com tampão PBS, filtrar para remover partículas de matéria. 8. Hepes 50 mM pH 7,5. 9. GST-Flklcd purificada a partir de transformação em baculovírus recombinante em sf9 (SUGEN, Inc.). 10. DMSO a 4% em dH20. 11. ATP 10 mM em dH20.
12. MnCl2 40 mM 13. Tampão de Diluição de Quinase (KDB): misturar 10 mL de Hepes (pH 7,5), 1 mL de NaCl 5 M, 40 pL de ortovanadato de sódio 100 mM e 0,4 mL de BSA a 5% em dH20 com 88,56 mL de dH20. 14. Placas de polipropileno com 96 poços de fundo em V NUNC, Catálogo Applied Scientific # AS-72092. 15. EDTA: misturar 14,12 g de ácido etilenodiaminatetraacético (EDTA) com aproximadamente 70 mL de dH20. Adicionar NaOH 10 N até o EDTA se dissolver. Ajustar o pH para 8,0. Ajustar o volume total para 100 mL com dH20. 16. Tampão de Diluição de Anticorpos a Io: misturar 10 mL de BSA a 5% em tampão PBS com 89,5 mL de TBST. 17. Anticorpo monoclonal anti-fosfotirosina conjugado com peroxidase de rábano (PY99 HRP, Santa Cruz Biotech). 18. Ácido 2,2'-azinobis(3-etilbenzotiazolino-6-sulfónico) -132- (ABTS, Moss, N° de Cat. ABST) . 19. SDS a 10%.
Procedimento: 1. Revestir placas de ELISA com 96 poços Corning com 2pg de poliEY péptido em PBS estéril como descrito no passo 3 de Materiais e Reagentes. 2. Remover dos poços o liquido não ligado invertendo a placa. Lavar uma vez com TBST. Dar umas pancadinhas na placa sobre uma toalha de papel para remover o excesso de liquido. 3. Adicionar 100 pL de BSA a 1% em PBS a cada poço.
Incubar, com agitação, durante 1 h à temperatura ambiente. 4. Repetir o passo 2. 5. Molhar os poços com HEPES 50 mM (pH 7,5) (150 pL/poço). 6. Diluir o composto de teste com dH20/4% de DMSO até 4 vezes a concentração de ensaio final desejada em placas de polipropileno com 96 poços. 7. Adicionar 25 pL de composto de teste diluído à placa de ELISA. Nos poços de controlo, colocar 25 pL de dH20/4% de DMSO. 8. Adicionar 25 pL de MnCl2 40 mM com 4xATP (2 pM) a cada poço. 9. Adicionar 25 pL de EDTA 0,5 M aos poços de controlo -133- negativo. 10. Diluir GST-Flkl para 0,005 pg (5 ng)/poço com KDB. 11. Adicionar 50 pL de enzima diluída a cada poço. 12. Incubar, com agitação, durante 15 minutos à temperatura ambiente. 13. Parar a reacção por adição de 50 pL de EDTA 250 mM (pH 8,0) . 14. Lavar 3x com TBST e secar a placa numa toalha de papel para remover o líquido em excesso. 15. Adicionar 100 pL por poço de conjugado de anti- fosfotirosina e HRP, diluição de 1:5.000 em tampão de diluição de anticorpos. Incubar, com agitação, durante 90 min à temperatura ambiente. 16. Lavar como no passo 14. 17. Adicionar 100 pL de solução ABTS à temperatura ambiente a cada poço. 18. Incubar, com agitação, durante 10 a 15 minutos.
Retirar quaisquer bolhas. 19. Parar a reacção por adição de 20 pL de SDS a 10% a cada poço. 20. Ler os resultados num leitor de placas ELISA Dynatech MR7000 com filtro de teste a 410 nM e filtro de referência a 630 nM. BIOENSAIO DE PYK2 -134-
Este ensaio é utilizado para medir a actividade de quinase in vitro de pyk2 de comprimento total marcada com epitopo de HA (FL-pyk2-HA) num ensaio ELISA.
Materiais e reagentes: 1. Placas para ELISA Corning com 96 poços. 2. anticorpo monoclonal anti-HA 12CA5 (SUGEN, Inc.) 3. PBS (Soro fisiológico tamponado com fosfato de Dulbecco (Catálogo Gibco # 450-1300EB) 4. Tampão TBST: para 1 L, misturar 8,766 g de NaCl, 6, 057 g de TRIS e 1 mL de Triton X-100 a 0,1% em aproximadamente 900 mL de dH20. Ajustar o pH para 7,2, levar o volume a 1 L. 5. Tampão de Bloqueamento: para 1 L, misturar 100 g de BSA a 10%, 12,1 g de TRIS 100 mM, 58,44 g de NaCl 1 M e 10 mL de TWEEN-20 a 1%. 6. FL-pyk2-HA de lisados de células sf9 (SUGEN, Inc.). 7. DMSO a 4% em MilliQue H2O. 8. ATP 10 mM em dH20. 9. MnCl2 1 M. 10. MgCl2 1 M. 11. Ditiotreitol (DTT) 1 M. 12. 10X Tampão de fosforilação de quinase: misturar 5,0 -135- mL de Hepes 1 M (pH 7,5), 0,2 mL de MnCl2 1 M, 1,0 mL de MgCl2 1 M, 1,0 mL de Triton X-100 a 10% em 2,8 mL de dH20. Imediatamente antes de usar, adicionar 0,1 mL de DTT 1 M. 13. Placas de polipropileno com 96 poços de fundo em V NUNC. 14. EDTA 500 mM em dH20. 15. Tampão de diluição de anticorpos: para 100 mL, 1 mL de 5% de BSA/PBS e 1 mL de Tween-20 a 10% em 88 mL de TBS . 16. Anti-Ptyr conjugado com HRP PY99), Santa Cruz Biotech N° Cat. SC-7020. 17. ABTS, Moss, N° Cat. ABST-2000. 18. SDS a 10%.
Procedimento: 1. Revestir placas para ELISA com 96 poços Corning com 0,5 pg por poço de anticorpo anti-HA 12CA5 em 100 pL de PBS. Guardar de um dia para o outro a 4°C. 2. Remover anticorpo HA não ligado dos poços invertendo a placa. Lavar a placa com dH2<0. Secar a placa numa toalha de papel para retirar o liquido em excesso. 3. Adicionar 150 pL de Tampão de Bloqueamento a cada poço. Incubar, com agitação, durante 30 min à temperatura ambiente. 4 .
Lavar a placa 4x com TBS-T. -136- 5. Diluir o lisado em PBS (1,5 pg de lisado/100 pL de PBS) . 6. Adicionar 100 pL de lisado diluído a cada poço. Agitar à temperatura ambiente durante 1 h. 7 . Lavar como no passo 4. 8. Adicionar 50 pL de 2X Tampão de quinase à placa de ELISA contendo pyk2-HA capturado. 9. Adicionar 25 pL de composto de teste 400 pM em DMSO a 4% a cada poço. Para os poços de controlo utilizar só DMSO a 4%. 10. Adicionar 25 pL de EDTA 0,5 M aos poços de controlo negativo. 11. Adicionar 25 pL de ATP 20 pM a todos os poços. Incubar, com agitação, durante 10 minutos. 12. Parar a reacção por adição de 25 pL de EDTA 500 mM (pH 8,0) a todos os poços. 13. Lavar como no passo 4. 14. Adicionar 100 pL de anti-Ptyr conjugado com HRP diluído 1:6000 em Tampão de Diluição de Anticorpos a cada poço. Incubar, com agitação, durante 1 h à temperatura ambiente. 15. Lavar a placa 3X com TBST e IX com PBS. 16. Adicionar 100 pL de solução de ABST a cada poço. -137- 17. Se necessário, parar a reacção de desenvolvimento por adição de 20 pL de SDS a 10% a cada poço. 18. Ler a placa num leitor de ELISA com filtro de teste a 410 nM e filtro de referência a 630 nM. BIOENSAIO DE FGFR1
Este ensaio é utilizado para medir a actividade de quinase in vitro de FGFl-R num ensaio por ELISA.
Materiais e Reagentes: 1. Placas para ELISA com 96 poços Costar (Catálogo Corning # 3369). 2. Poli(Glu-Tyr) (Catálogo Sigma # P0275). 3. PBS (Catálogo Gibco # 450-1300EB) 4. Solução Tampão Hepes 50 mM. 5. Tampão de Bloqueamento(5% de BSA/PBS). 6. GST-FGFR1 purificado (SUGEN, Inc.) 7. Tampão de Diluição de Quinase.
Misturar 500 pL de Hepes 1 M (GIBCO), 20 pL de 5% de BSA/PBS, 10 pL de ortovanadato de sódio 100 mM e 50 pL de NaCl 5 M.
8. ATP 10 mM 9. Mistura de fosforilação de ATP/MnCl2: misturar 20 pL de ATP, 400 pL de MnCl2 1 M e 9,56 mL de dH20- -138- 10. placas de polipropileno com 96 poços de fundo em V NUNC (Catálogo Applied Scientific # AS-72092). 11. EDTA 0,5 M. 12. TBST a 0,05%.
Adicionar 500 pL de TWEEN a 1 litro de TBS. 13. Soro policlonal anti-fosfotirosina de coelho (SUGEN, Inc.). 14. Conjugado de IgG e peroxidase anti-coelho de cabra (Catálogo Biosource # ALI0404). 15. Solução de ABTS. 16. Solução de ABTS/H2O2.
Procedimento: 1. Revestir placas de ELISA com 96 poços com 1 pg por poço de Poli(Glu, Tyr) em 100 pL de PBS. Guardar de um dia para o outro a 4°C. 2. Lavar as placas revestidas uma vez com PBS. 3. Adicionar 150 pL de 5% de BSA/Tampão de Bloqueamento PBS a cada poço. Incubar, com agitação, durante 1 h à temperatura ambiente. 4. Lavar a placa 2x com PBS, depois uma vez com Hepes 50 mM Hepes. Secar as placas numa toalha de papel para retirar o líquido em excesso e as bolhas. 5. Adicionar à placa 25 pL de composto de teste 0,4 mM em DMSO a 4% DMSO ou só DMSO a 4% (controlos). -139- 6. Diluir GST-FGFR1 purificada em Tampão de Diluição de Quinase (5 ng de quinase/50 μL de KDB/poço). 7. Adicionar 50 pL de quinase diluída a cada poço. 8. Iniciar a reacção da quinase por adição de 25 pL/poço de ATP/Mn++ preparada de fresco (0,4 mL de MnC12 1 M, 40 pL de ATP 10 mM, 9,56 mL de dH20) , preparada de fresco). 9. Esta é uma reacção de quinase rápida e tem de ser parada com 25 pL de EDTA 0,5 M de modo semelhante à adição de ATP. 10. Lavar a placa 4x com TBST fresco. 11. Preparar o Tampão de Diluição de Anticorpos: Por 50 mL:
Misturar 5 mL de BSA a 5%, 250 pL de leite a 5% e 50 pL de vanadato de sódio 100 mM, levar ao volume final com TBST a 0,05%. 12. Adicionar 100 pL por poço de anti-fosfotirosina (diluição de 1:10000 em ADB). Incubar, com agitação durante 1 h à temperatura ambiente. 13. Lavar como no passo 10. 14. Adicionar 100 pL por poço de conjugado de IGg e peroxidase anti-coelho de cabra Biosource (diluição de 1:6000 em ADB). Incubar, com agitação durante 1 h à temperatura ambiente. 15. Lavar como no passo 10 e depois com PBS para retirar as bolhas e o TWEEN em excesso. -140- 16. Adicionar 100 yL de solução de ABTS/H2O2 solução a cada poço. 17. Incubar, com agitação, durante 10 a 20 minutos. Remover quaisquer bolhas. 18. Ler o ensaio num leitor ELISA Dynatech MR7000: filtro de teste a 410 nM, filtro de referência a 630 nM.
BIOENSAIO DE EGFR
Este ensaio é utilizado para determinar a actividade de quinase in vitro de FGF1-R num ensaio por ELISA.
Materiais e Reagentes: 1. Placas de ELISA com 96 poços Corning. 2. Anticorpo monoclonal anti-EGFR SUMOl (SUGEN, Inc.).
3. PBS
4. Tampão TBST 5. Tampão de Bloqueamento: para 100 mL, misturar 5,0 g de leite magro instantâneo Carnation Instant Non-fatMilk® com 100 mL de PBS. 6. Lisado de células A431 (SUGEN, Inc.). 7 . Tampão TBS: 8. TBS + 10% de DMSO: para 1 L, misturar 1,514 g de TRIS, 2,192 g de NaCl e 25 mL de DMSO; levar o volume total a 1 litro com dH20. -141- 9. ΑΤΡ (5'-trifosfato de adenosina, de músculo de cavalo, catálogo Sigma N° A-5394), solução 1,0 mM em dH20. Este reagente deve ser preparado imediatamente antes da utilização e mantido em gelo. 10. MnCl2 1,0 mM. 11. Mistura de fosforilação de ATP/MnCl2: para preparar 10 mL, misturar 300 pL de ΑΤΡ 1 mM, 500 pL de MnCl2 e 9,2 mL de dH20. Preparar imediatamente antes da utilização, manter em gelo. 12. Placas de polipropileno com 96 poços de fundo em V NUNC. 13. EDTA. 14. Soro policlonal anti-fosfotirosina de coelho (SUGEN, Inc.). 15. Conjugado de IgG e peroxidase anti-coelho de cabra (Catálogo Biosource N° ALI0404). 16. ABTS. 17. Peróxido de hidrogénio a 30%. 18. ABTS/H2O2. 19. HC1 0,2 M.
Procedimento: 1. Revestir placas de ELISA com 96 poços Corning com 0,5 pg de SUM01 em 100 pL de PBS por poço, guardar de um -142- dia para o outro a 4°C. 2. Remover o SUM01 não ligado dos poços invertendo a placa para remover o líquido. Lavar lx com dH20.
Secar a placa numa toalha de papel para remover o líquido em excesso. 3. Adicionar 150 pL de Tampão de Bloqueamento a cada poço. Incubar, com agitação, durante 30 min à temperatura ambiente. 4. Lavar a placa 3x com água desionizada, depois uma vez com TBST. Secar a placa numa toalha de papel para remover o liquidos em excesso e as bolhas. 5. Diluir o lisado em PBS (7 pg de lisado/100 pL de PBS) . 6. Adicionar 100 pL de lisado diluído a cada poço.
Agitar à temperatura ambiente durante 1 h. 7. Lavar as placas como em 4, acima. 8. Adicionar 120 pL de TBS à placa de ELISA contendo EGFR capturado. 9. Diluir o composto de teste 1:10 em TBS, colocar no poço. 10. Adicionar 13,5 pL de composto de teste diluído à placa de ELISA. Para poços de controlo, adicionar 13,5 pL de TBS em DMSO a 10%. 11. Incubar, com agitação, durante 30 minutos a temperatura ambiente. -143- 12. Adicionar 15 pL de mistura de fosforilação a todos os poços excepto o poço de controlo negativo. 0 volume final do poço deve ser aproximadamente 150 pL com uma concentração final de 3 μΜ de ATP/5 mM de MnCl2 em cada poço. Incubar com agitação durante 5 minutos. 13. Parar a reacção por adição de 16,5 pL de solução de EDTA enquanto se agita. Agitar durante mais 1 min. 14. Lavar 4x com água desionizada, 2x com TBST. 15. Adicionar 100 pL de anti-fosfotirosina (diluição de 1:3000 em TBST) por poço. Incubar, com agitação, durante 30-45 min à temperatura ambiente. 16. Lavar como em 4, acima. 17. Adicionar a cada poço 100 pL de conjugado de IgG e peroxidase anti-coelho de cabra Biosource (diluição de 1:2000 em TBST). Incubar com agitação durante 30 min à temperatura ambiente. 18. Lavar como em 4, acima. 19. Adicionar 100 pL de solução de ABTS/H2O2 a cada poço. 20. Incubar 5 a 10 minutos com agitação. Remover quaisquer bolhas. 21. Se necessário, parar a reacção por adição de 100 pL de HC1 0,2 M por poço. 22. Ler o ensaio num leitor ELISA Dynatech MR7000 ELISA: filtro de teste a 410 nM, filtro de referência a 630 nM. -144-
BIOENSAIO DE PDGFR
Este ensaio é utilizado para determinar a actividade de quinase in vitro de FGF1-R num ensaio em formato ELISA.
Materiais e Reagentes: 1. Placas para ELISA com 96 poços Corning 2. Anticorpo monoclonal anti-PDGFR 28D4C10 (SUGEN, Inc.) . 3. PBS. 4. Tampão TBST. 5. Tampão de Bloqueamento (o mesmo que para o ensaio de EGFR). 6. Lisado de células NIH 3T3 que exprimem PDGFR (SUGEN, Inc.) . 7. Tampão TBS. 8. TBS + 10% de DMSO. 9. ATP. 10. MnCl2. 11. Mistura de fosforilação tampão de quinase: para 10 mL, misturar 250 pL de TRIS 1 M, 200 pL de NaCl 5 M, 100 pL de MnCl2 1 M e 50 pL de Triton X-100 100 mM em dH20 suficiente para perfazer 10 mL.
12. Placas de polipropileno de 96 poços com fundo em V -145- NUNC. 13. EDTA. 14. Soro policlonal anti-fosfotirosina de coelho (SUGEN, Inc.) . 15. Conjugado de IgG e peroxidase anti-coelho de cabra (Catálogo Biosource N° ALI0404). 16. ABTS. 17. Peróxido de hidrogénio, solução a 30%. 18. ABTS/H202- 19. HC1 0,2 M.
Procedimento: 1. Revestir placas de ELISA com 96 poços Corning com 0,5 pg de 28D4C10 em 100 pL de PBS por poço, guardar de um dia para o outro a 4°C. 2. Remover 28D4C10 não ligado dos poços invertendo a placa para remover liquido. Lavar lx com dH20. Secar a placa numa toalha de papel para remover o liquido em excesso. 3. Adicionar 150 pL de Tampão de Bloqueamento a cada poço. Incubar durante 30 min à temperatura ambiente com agitação. 4 . Lavar a placa 3x com água desionizada, depois uma vez com TBST. Secar a placa numa toalha de papel para remover o liquido em excesso e bolhas. -146- 5. Diluir lisado em HNTG (10 pg de lisado/100 pL de HNTG). 6. Adicionar 100 pL de lisado diluído a cada poço. Agitar à temperatura ambiente durante 60 min. 7 . Lavar as placas tal como descrito no Passo 4. 8. Adicionar 80 pL de mistura tampão da quinase de trabalho à placa de ELISA contendo PDGFR capturado. 9. Diluir o composto de teste 1:10 em TBS em placas de polipropileno com 96 poços. 10. Adicionar 10 pL de composto de teste diluído à placa de ELISA. Aos poços de controlo, adicionar 10 pL de TBS +10% de DMSO. Incubar com agitação durante 30 minutos à temperatura ambiente. 11. Adicionar 10 pL de ATP directamente a todos os poços excepto ao poço de controlo negativo (o volume final do poço deve ser aproximadamente 100 pL com ATP 20 pM em cada poço.) Incubar 30 minutos com agitação. 12. Parar a reacção por adição de 10 pL de solução de EDTA a cada poço. 13. Lavar 4x com água desionizada, duas vezes com TBST. 14. Adicionar 100 pL de anti-fosfotirosina (diluição de 1:3000 em TBST) por poço. Incubar com agitação durante 30-45 min à temperatura ambiente. 15. Lavar como no Passo 4. -147- 16. Adicionar 100 pL de conjugado de IgG e peroxidase anti-coelho de cabra Biosource (diluição de 1:2000 em TBST) a cada poço. Incubar com agitação durante 30 min à temperatura ambiente. 17. Lavar como no Passo 4. 18. Adicionar 100 pL de solução de ABTS/H2O2 a cada poço. 19. Incubar 10 a 30 minutos com agitação. Remover quaisquer bolhas. 20. Se necessário parar a reacção com a adição de 100 pL de HC1 0,2 M por poço. 21. Ler o ensaio num leitor de ELISA Dynatech MR7000 com filtro de teste a 410 nM e filtro de referência a 630 nM.
ENSAIO DE QUINASE HER-2 CELULAR
Este ensaio é utilizado para medir a actividade de quinase HER-2 em células inteiras em formato ELISA.
Materiais e Reagentes: 1. DMEM (Catálogo GIBCO # 11965-092). 2. Soro Fetal de Bovino (FBS, Catálogo GIBCO # 16000-044), inactivado pelo calor num banho de água durante 30 min a 56°C. 3. Tripsina (Catálogo GIBCO # 25200-056). L-Glutamina (Catálogo GIBCO # 25030-081) -148- 5. HEPES (Catálogo GIBCO # 15630-080). 6. Meio de Crescimento
Misturar 500 mL de DMEM, 55 mL de FBS inactivado pelo calor, 10 mL de HEPES e 5,5 mL de L-Glutamina. 7 . Meio de Privação
Misturar 500 mL de DMEM, 2,5 mL de FBS inactivado pelo calor, 10 mL de HEPES e 5,5 ml de L-Glutamina. 8. PBS. 9. Placas de microtitulação para cultura de tecidos com 96 poços de fundo redondo (Catálogo Corning # 25860). 10. Placas para cultura de tecidos com 15 cm (Catálogo Corning # 08757148). 11. Placas de ELISA com 96 poços Corning. 12. Placas de polipropileno de 96 poços com fundo em V NUNC. 13. Cartuchos de Transferência Costar para o Transtar 96 (Catálogo Costar # 7610) . 14. SUMOl: anticorpo monoclonal anti-EGFR (SUGEN, Inc.). 15. Tampão TBST. 16. Tampão de Bloqueamento: 5% de Carnation Instant Milk® em PBS. 17. Ligando de EGF: EGF-201, Shinko American, Japão. Suspender o pó em 100 pL de HC1 10 mM. Adicionar 100 pL de NaOH 10 mM. Adicionar 800 pL de PBS e -149- transferir para um tubo Eppendorf, guardar a -20°C até estar pronto para utilização.
18. Tampão de Lise HNTG
Para solução mãe 5X HNTG, misturar 23,83 g de Hepes, 43, 83 g de NaCl, 500 mL de glicerol e 100 mL de Triton X-100 e dH20 suficiente para perfazer 1 L de solução total. For IX HNTG*, misturar 2 mL de HNTG, 100 pL de Na3V04 0,1M, 250 pL de Na4P207 0,2M e 100 pL de EDTA. 19. EDTA. 20. Na3V04. Para preparar a solução mãe, misturar 1,84 g de Na3V04 com 90 mL de dH20. Ajustar o pH a 10. Levar à ebulição em microondas durante um minuto (solução torna-se limpida). Arrefecer até à temperatura ambiente. Ajustar o pH a 10. Repetir o ciclo de aquecimento/arrefecimento até o pH permanecer a 10. 21. Na4P207 200 mM. 22. Antissoro policlonal de coelho especifico para fosfotirosina (anticorpo anti-Ptyr, SUGEN, Inc.). 23. Antissoro purificado por afinidade, anticorpo IgG anti-coelho de cabra, conjugado com peroxidase (Catálogo Biosource # ALI0404). 24. Solução de ABTS. 25. Solução de peróxido de hidrogénio a 30%. 26. ABTS/H2O2. 27. HC1 0,2 M. -150-
Procedimento: 1. Revestir placas de ELISA com 96 poços Corning com SUM01 a 1,0 pg por poço em PBS, volume final de 100 pL/poço. Guardar de um dia para o outro a 4°C. 2. No dia da utilização, remover o tampão de revestimento e lavar a placa 3 vezes com dH20 e uma vez com tampão TBST. Todas as lavagens deste ensaio devem ser realizadas deste modo, salvo indicação em contrário. 3. Adicionar 100 pL de Tampão de Blogueamento a cada poço. Incubar a placa, com agitação, durante 30 min à temperatura ambiente. Imediatamente antes da utilização, lavar a placa. 4. Utilizar linha celular EGFr/HER-2 quimérico/3T3-C7 para este ensaio. 5. Escolher placas com 80-90% de confluência. Colher células por tripsinização e centrifugar a 1000 rpm à temperatura ambiente durante 5 min. 6. Ressuspender as células em meio de carência e contar com azul tripano. É necessária viabilidade superior a 90%. Semear as células em meio de carência a uma densidade de 2.500 células por poço, 90 pL por poço, numa placa de microtitulação com 96 poços. Incubar as células semeadas de um dia para o outro a 37°C sob 5% de CC>2. 7. Iniciar o ensaio dois dias após a semeadura.
Os compostos de teste são dissolvidos em DMSO a 4%. -151-
As amostras são então adicionalmente diluidas directamente em placas com DMEM de carência. Tipicamente, esta diluição será de 1:10 ou superior. Todos os poços são então transferidos para a placa com as células a uma diluição adicional de 1:10 (10 pL de amostra e meio em 90 pL de meio de carência. A concentração final de DMSO deve ser de 1% ou inferior. Também se pode utilizar uma diluição em série normalizada. 9. Incubar sob 5% de C02 a 37°C durante 2 horas. 10. Preparar ligando EGF por diluição de solução mãe de EGF (16,5 pM) em DMEM morno para 150 nM. 11. Preparar HNTG* fresco suficiente para 100 pL por poço; colocar em gelo. 12. Após 2 horas de incubação com composto de teste, adicionar ligando de EGF preparado às células, 50 pL por poço, para uma concentração final de 50 nM. Os poços de controlo positivo recebem a mesma quantidade de EGF. Os controlos negativos não recebem EGF, Incubar a 37°C durante 10 min. 13. Remover o composto de teste, EGF e DMEM. Lavar as células uma vez com PBS. 14. Transferir HNTG* para células, 100 pL por poço. Colocar em gelo durante 5 minutos. Entretanto, remover o tampão de bloqueamento da placa de ELISA e lavar. 15. Raspar as células da placa com um micropipetador e homogeneizar o material celular por aspiração repetida e administração do tampão de lise HNTG*. -152-
Transferir o lisado para uma placa de ELISA revestida, bloqueada e lavada,. Ou utilizar um cartucho de transferência Costar para transferir o lisado para a placa. 16. Incubar, com agitação, à temperatura ambiente durante 1 h. 17. Remover o lisado e lavar. Transferir anticorpo anti-Ptyr diluído de fresco (1:3000 em TBST) para a placa de ELISA, 100 pL por poço. 18. Incubar, com agitação, à temperatura ambiente, durante 30 min. 19. Remover o anticorpo anti-Ptyr e lavar. Transferir o anticorpo BIOSOURCE diluído de fresco para a placa de ELISA (1:8000 em TBST, 100 pL por poço). 20. Incubar, com agitação, à temperatura ambiente durante 30 min. 21. Remover o anticorpo BIOSOURCE e lavar. Transferir solução de ABTS/H2O2 preparada de fresco para a placa de ELISA, 100 pL por poço. 22. Incubar, com agitação, durante 5-10 minutos. Remover quaisquer bolhas. 23. Parar a reacção com a adição de 100 pL de HC1 0,2M por poço. 24. Fazer a leitura do ensaio num leitor de ELISA Dynatech MR7000 com filtro de teste regulado a 410 nM e filtro de referência a 630 nM. -153-
ENSAIO DE CDK2/CICLINA A
Este ensaio é utilizado para medir a actividade de serina/treonina quinase in vitro de cdk2 humana/ciclina A num Ensaio de Proximidade de Cintilações (Scintillation Proximity Assay, SPA).
Materiais e Reagentes. 1. Placas flexíveis de tereftalato de polietileno com 96 poços (Catálogo Wallac # 1450-401). 2. [γ33ρ] ATP Amersham Redivue (Catálogo Amersham #AH 9968) . 3. Pérolas SPA de poliviniltolueno revestidas com estreptavidina Amersham (Catálogo Amersham #RPNQ0007). As pérolas devem ser reconstituídas em PBS sem magnésio ou cálcio, a 20 mg/mL. 4. Complexo de cdk2/ciclina A activado purificado a partir de células Sf9 (SUGEN, Inc.). 5. Substrato péptido biotinilado (Debtide). Péptido biotina-X-PKTPKKAKKL é dissolvido em dH20 a uma concentração de 5 mg/mL.
6. Mistura de péptido/ATP: para 10 mL, misturar 9,979 mL de dH20, 0,00125 mL de ATP "frio", 0,010 mL de
Debtide e 0,010 mL de γ33ρ ATP. A concentração final por poço será de 0,5M de ATP "frio", 0,1 yg de
Debtide e 0,2 yCi de γ33ρ ATP. 7. Tampão de quinase: para 10 mL, misturar 8,85 mL de dH20, 0,625 mL de TRIS (pH 7,4), 0,25 mL de MgCl2 1 M, 0,25 mL de NP40 a 10% e 0,025 mL de DTT 1 M, -154- adicionado de fresco imediatamente antes da utilização. 8. ATP 10 mM em dH20. 9. Tris 1 M, pH ajustado para 7,4 com HC1. 10. MgCl2 1 M. 11. DTT 1 M. 12. PBS (Catálogo Gibco # 14190-144). 13. EDTA 0,5 M. 14. Solução de paragem: Para 10 mL, misturar 9,25 mL de PBS, 0,005 mL de ATP 100 mM, 0,1 mL de EDTA 0,5 M, 0,1 mL de Triton X-100 a 10% e 1,25 mL de pérolas SPA a 20 mg/mL.
Procedimento: 1. Preparar soluções de compostos de teste a 5x a concentração final desejada em DMSO a 5%. Adicionar 10 pL a cada poço. Para controlos negativos, utilizar 10 pL só de DMSO a 5% nos poços. 2. Diluir 5 pL de solução de cdk2/ciclina A com 2,1 mL 2x tampão de quinase. 3. Adicionar 20 pL de enzima a cada poço. 4. Adicionar 10 pL de EDTA 0,5 M aos poços de controlo negativo. 5. Para iniciar a reacção da quinase, adicionar 20 pL de -155- mistura de péptido/ATP a cada poço. Incubar durante 1 h sem agitação. 6. Adicionar 200 pL de solução de paragem a cada poço. 7. Manter durante pelo menos 10 min. 8. Centrifugar a placa a aproximadamente 2300 rpm durante 3-5 min. 9. Contar a placa utilizando um Trilux ou um leitor semelhante.
ENSAIO DE TRANSFOSFORILAÇÃO DE MET
Este ensaio é utilizado para medir os níveis de fosfotirosina num substrato poli(ácido glutâmicortirosina (4:1)) como meio de identificação de agonistas/antagonistas da transfosforilação de met do substrato.
Materiais e Reagentes: 1. Placas de ELISA com 96 poços Corning, Catálogo Corning # 25805-96. 2. Poli (glu, tyr) 4:1, Catálogo Sigma N° P 0275.
3. PBS, Catálogo Gibco # 450-1300EB
4. HEPES 50 mM 5. Tampão de Bloqueamento: Dissolver 25 g de Albumina de Soro de Bovino, Catálogo Sigma N° A-7888, em 500 mL de PBS, filtrar através de um filtro de 4 pm. -156- 6. Proteína de fusão GST purificada contendo o domínio de quinase Met, Sugen, Inc. 7. Tampão TBST. 8. DMOS aquoso a 10% (H20 MilliQue). 9. 4'-Trifosfato de adenosina aquoso (dH20) 10 mM,
Catálogo Sigma N° A-5394. 10. 2X Tampão de Diluição de Quinase: para 100 mL, misturar 10 mL de HEPES 1 M a pH 7,5 com 0,4 mL de 5% de BSA/PBS, 0,2 mL de ortovanadato de sódio 0,1 Me 1 mL de cloreto de sódio 5 M em 88,4 mL de dH20. 11. 4X Mistura de Reacção de ATP: para 10 mL, misturar 0,4 mL de cloreto de manganês 1 M e 0,02 mL de ATP 0,1 M em 9,56 mL de dH20. 12. 4X Mistura de Controlos Negativos: para 10 mL, misturar 0,4 mL de cloreto de manganês 1 M em 9,6 mL de dH20. 13. Placas de polipropileno de 96 poços com fundo em V NUNC, Catálogo Applied Scientific # S-72092 14. EDTA 500 mM. 15. Tampão de Diluição de Anticorpos: para 100 mL, misturar 10 mL de 5% de BSA/PBS, 0,5 mL de 5% de Carnation Instant Milk® em PBS e 0,1 mL de ortovanadato de sódio 0,1 M em 88,4 mL de TBST. 16. Anticorpo antifosfotirosina policlonal de coelho, Sugen, Inc. -157- 17. Anticorpo anti-coelho de cabra conjugado com peroxidase de rábano, Biosource, Inc. 18. Solução de ABTS: para 1 L, misturar 19,21 g de ácido cítrico, 35, 49 g de Na2HPC>4 e 500 mg de ABTS com dH20 suficiente para perfazer 1 L. 19. ABTS/H2O2: misturar 15 mL de solução de ABST com 2 L de H2O2 cinco minutos antes da utilização. 20. HC1 0,2 M.
Procedimento: 1. Revestir placas de ELISA com 2 pg de Poli (Glu-Tyr) em 100 pL de PBS, guardar de um dia para o outro a 4°C. 2. Bloquear a placa com 150 pL de 5% de BSA/PBS durante 60 min. 3. Lavar a placa duas vezes com PBS, uma vez com tampão Hepes 50 mM pH 7,4. 4. Adicionar 50 pL da quinase diluída a todos os poços. (A quinase purificada é diluída com Tampão de Diluição de Quinase. A concentração final deve ser de 10 ng/poço.) 5. Adicionar à placa 25 pL do composto de teste (em DMSO a 4%) ou só DMSO (4% em dH20) para os controlos. 6. Incubar a mistura de quinase/composto durante 15 minutos. 7. Adicionar 25 pL de MnCl2 40 mM aos poços de controlo negativo. -158- 8. Adicionar 25 pL de mistura de ATP/MnCl2 a todos os outros poços (excepto os controlos negativos). Incubar durante 5 min. 9. Adicionar 25 pL de EDTA 500 mM para parar a reacção. 10. Lavar a placa 3x com TBST. 11. Adicionar 100 pL de anti-Ptyr policlonal de coelho diluído 1:10.000 em Tampão de Diluição de Anticorpos a cada poço. Incubar, com agitação, à temperatura ambiente durante uma hora. 12. Lavar a placa 3x com TBST. 13. Diluir anticorpo anti-coelho conjugado com HRP Biosource 1:6.000 em Tampão de Diluição de Anticorpos. Adicionar 100 pL por poço e incubar à temperatura ambiente, com agitação, durante uma hora. 14. Lavar a placa IX com PBS. 15. Adicionar 100 pL de solução de ABTS/H2O2 a cada poço. 16. Se necessário, parar a reacção de desenvolvimento com a adição de 100 pL de HC1 0,2 M por poço. 17. Ler a placa num leito de placas de ELISA Dynatech MR7000 com o filtro de teste a 410 nM e o filtro de referência a 630 nM. ENSAIO DE TRANSFOSFORILAÇÃO DE IGF-1
Este ensaio é utilizado para medir o nível de fosfotirosina em poli (ácido glutâmico:tirosina) (4:1) para -159- a identificação de agonistas/antagonistas da transfosforilação de gst-IGF-1 de um substrato.
Materiais e Reagentes: 1. Placas de ELISA com 96 poços Corning. 2. Poly(Glu-tyr) (4:1), Catálogo Sigma N° P 0275. 3. PBS, Catálogo Gibco # 450-1300EB.
4. HEPES 50 mM 5. Tampão de Bloqueamento TBB: para 1 L, misturar 100 g de BSA, 12,1 g de TRIS (pH 7,5), 58,44 g de cloreto de sódio e 10 mL de TWEEN-20 a 1%. 6. Proteína de fusão GST purificada contendo o domínio de quinase de IGF-1 (Sugen, Inc.) 7. Tampão TBST: para 1 L, misturar 6, 057 g de Tris, 8,766 g de cloreto de sódio e 0,5 ml de TWEEN-20 com dH20 suficiente para perfazer 1 litro. 8. DMDO a 4% em H2O Milli-Q. 9. ATP 10 mM em dH20. 10. 2X Tampão de Diluição de Quinase: para 100 mL, misturar 10 mL de HEPEs 1 M (pH 7,5), 0,4 mL de BSA a 5% em dH20, 0,2 mL de ortovanadato de sódio 0,1 M e 1 mL de cloreto de sódio 5 M com dH20 suficiente para perfazer 100 mL. 11. 4X Mistura de Reacção de ATP: para 10 mL, misturar 0,4 mL de MnCl2 1 M e 0,008 mL de ATP 0,01 M e 9,56 -160- mL de dH20. 12. 4X Mistura de Controlos Negativos: misturar 0,4 mL de cloreto de manganês 1 M em 9,60 mL de dH20. 13. Placas de polipropileno de 96 poços com fundo em V NUNC. 14. EDTA 500 mM em dH20. 15. Tampão de Diluição de Anticorpos: para 100 mL, misturar 10 mL de BSA a 5% em PBS, 0,5 mL de Carnation Instant Non-fat Milk® a 5% em PBS e 0,1 mL de ortovanadato de sódio 0,1 M em 88,4 mL de TBST. 16. Anticorpo antifosfotirosina policlonal de coelho, Sugen, Inc. 17. Anticorpo anti-coelho de cabra conjugado com HRP, Biosource, Inc. 18. Solução de ABTS. 20. ABTS/H2O2: misturar 15 mL de ABTS com 2 μΐ de H2O2 5 minutos antes da utilização. 21. HC1 0,2 M em dH20.
Procedimento: 1. Revestir uma placa de ELISA com 2,0 pg/poço de Poli (Glu, Tyr) 4:1 (Sigma P0275) em 100 pL de PBS.
Guardar a placa de um dia para o outro a 4°C. 2.
Lavar a placa uma vez com PBS. -161- 3. Adicionar 100 yL de Tampão de Bloqueamento TBB a cada poço. Incubar a placa durante 1 hora com agitação à temperatura ambiente. 4. Lavar a placa uma vez com PBS, depois duas vezes com tampão Hepes 50 mM pH 7,5. 5. Adicionar à placa 25 yL de composto de teste em DMSO a 4% (obtido por diluição de uma solução mãe de composto de teste 10 mM em 100% de DMSO com dH20). 6. Adicionar 10,0 ng de quinase gst-IGF-1 em 50 yL de
Tampão de Diluição de Quinase) a todos os poços. 7. Iniciar a reacção da quinase por adição de 25 yL de 4X Mistura de Reacção de ATP a todos os poços de teste e poços de controlo positivo. Adicionar 25 yL de 4X Mistura de Controlos Negativos a todos os poços de controlo negativo. Incubar durante 10 minutos com agitação à temperatura ambiente. 8. Adicionar 25 yL de EDTA 0,5 M (pH 8,0) a todos os poços. 9. Lavar a placa 4x com Tampão TBST. 10. Adicionar antissoros antifosfotirosina policlonais a uma diluição de 1:10.000 em 100 yL de Tampão de Diluição de Anticorpos a todos os poços. Incubar, com agitação, à temperatura ambiente durante 1 hora. 11. Lavar a placa como no passo 9. 12. Adicionar 100 yL de HRP anti-coelho Biosource a uma diluição de 1:10.000 em Tampão de Diluição de Anticorpos a todos os poços. Incubar, com agitação, à -162- temperatura ambiente durante 1 hora. 13. Lavar a placa como no passo 9, seguida por uma lavagem com PBS para reduzir as bolhas e o Tween-20 em excesso. 14. Revelar por adição de 100 pL/poço de ABTS/H2O2 a cada poço. 15. Após cerca de 5 minutos, ler num leitor de placas de ELISA com filtro de teste a 410 nm e filtro de referência a 630 nm.
ENSAIOS DE INCORPORAÇÃO DE BRDU
Os seguintes ensaios utilizam células produzidas por engenharia genética para exprimir um receptor seleccionado e avaliar depois o efeito de um composto de interesse sobre a actividade de sintese de ADN induzida por ligados por determinação da incorporação de BrdU no ADN.
Os materiais, reagentes e procedimento seguintes são gerais para cada um dos ensaios de incorporação de BrdU seguintes. Estão indicadas as variações nos ensaios específicos.
Materiais e Reagentes: 1. O ligando apropriado. 2. As células produzidas por engenharia genética apropriadas. 3. Reagente de Marcação com BrdU: 10 mM, em PBS (pH 7,4) (Boehringer Mannheim, Alemanha). -163- 4. FixDenat: solução de fixação (pronta a utilizar) (Boehringer Mannheim, Alemanha). 5. Anti-BrdU-POD: anticorpo monoclonal de murganho conjugado com peroxidase (Boehringer Mannheim, Alemanha). 6. Solução de Substrato TMB: tetrametilbenzidina (TMB, Boehringer Mannheim, Alemanha). 7. Solução de Lavagem PBS: IX PBS, pH 7,4. 8. Albumina, Bovina (BSA), pó da fracção V (Sigma Chemical Co., EUA).
Procedimento Geral: 1. As células são semeadas a 8000 células/poço em CS a 10%, Gin 2 mM em DMEM, numa placa com 96 poços. As células são incubadas de um dia para o outro a 37°C em 5% de C02- 2. Após 24 horas, as células são lavadas com PBS, e depois são submetidas a carência de soro em meio isento de soro (0% de CS DMEM com 0,1% de BSA) durante 24 horas. 3. No dia 3, o ligando apropriado e o composto de teste são adicionados simultaneamente às células. Os poços de negativo recebem só DMEM isento de soro com 0,1% de BSA; as células de controlo positivo recebem o ligando mas não o composto de teste. Os compostos de teste são preparados DMEM isento de soro com ligando numa placa com 96 poços, e são diluídos em série para 7 concentrações de teste. -164- 4. Após 18 horas de activação pelo ligando, é adicionado o reagente de marcação BrdU diluído (1:100 em DMEM, 0,1% de BSA) e as células são incubadas com BrdU (concentração final = 10 μΜ) durante 1,5 horas. 5. Após a incubação com o reagente de marcação, o meio é removido por decantação e por meio de pancadas suvaes na placa invertida sobre uma toalha de papel. A solução de FixDenat é adicionada (50 pL/poço) e as placas são incubadas à temperatura ambiente durante 45 minutos num agitador de placas. 6. A solução FixDenat é cuidadosamente removida por decantação e por pancadas suaves na placa invertida sobre uma toalha de papel. Adiciona-se leite (leite desidratado a 5% em PBS, 200 pL/poço) como uma solução de bloqueamento e a placa é incubada durante 30 minutos à temperatura ambiente num agitador de placas. 7. A solução de bloqueamento é removida por decantação e os poços são lavados uma vez com PBS. Adiciona-se solução de Anti-BrdU-POD (diluição 1:200 em PBS, 1% de BSA) (50 pl/poço) e a placa é incubada durante 90 minutos à temperatura ambiente num agitador de placas. 8. O conjugado de anticorpo é cuidadosamente removido por decantação e lavagem dos poços 5 vezes com PBS, e a placa é seca por inversão e pancadas suaves sobre uma toalha de papel. 9. A solução do substrato TMB é adicionada (100 pL/poço) e incubada durante 20 minutos à temperatura ambiente num agitador de placas até o desenvolvimento da cor ser suficiente para detecção fotométrica. -165- 10. As absorvâncias das amostras são medidas a 410 nm (no modo de "comprimento de onda duplo" com um filtro lendo a 4 90 nm, como comprimento de onda de referência) num leitor de placas de ELISA Dynatech.
Ensaio de Incorporação de BrdU Induzida por EGF
Materiais e Reagentes: 1. EGF de murganho, 201 (Toyobo Co., Ltd., Japão). 2. 3T3/EGFRC7.
Ensaio de Incorporação de BrdU Induzida por EGF e
Orientada por Her-2
Materiais e Reagentes: 1. EGF de murganho, 201 (Toyobo Co., Ltd., Japão). 2. 3T3/EGFr/Her2/EGFr (EGFr com um domínio da quinase Her-2).
Ensaio de Incorporação de BrdU Induzida por EGF e
Orientada por Her-4
Materiais e Reagentes: 1. EGF de murganho, 201 (Toyobo Co., Ltd., Japão). 2. 3T3/EGFr/Her4/EGFr (EGFr com um domínio da quinase Her-4).
Ensaio de Incorporação de BrdU Induzida por PDGF -166-
Materiais e Reagentes: 1. PDGF B/B humana (Boehringer Mannheim, Alemanha). 2. 3T3/EGFRc7.
Ensaio de Incorporação de BrdU Induzida por FGF
Materiais e Reagentes: 1. FGF2/bFGF humana (Gibco BRL, EUA). 2. 3T3c7/EGFr
Ensaio de Incorporação de BrdU Induzida por IGF-1
Materiais e Reagentes: 1. Ligando IGF-1, humano, recombinante (G511, Promega Corp., EUA) 2. 3T3/IGFlr.
Ensaio de Incorporação de BrdU Induzida por Insulina
Materiais e Reagentes: 1. Insulina, cristalina, bovina, Zinco (13007, Gibco BRL, EUA). 2. 3T3/H25.
Ensaio de Incorporação de BrdU Induzida por HGF
Materiais e Reagentes: -167- 1. HGF humana, recombinante (Catálogo R&D Systems, Inc., EUA, N° 249-HG). 2. Células BxPC-3 (ATCC CRL-1687).
Procedimento: 1. As células são semeadas a 9000 células/poço em RPMI 10% FBS numa placa com 96 poços. As células são incubadas de um dia para o outro a 37°C em 5% de C02- 2. Após 24 horas, as células são lavadas com PBS, e depois são submetidas a carência de soro em 100 pL de meio isento de soro (RPMI com 0,1% de BSA) durante 24 horas. 3. No dia 3, 25 pL contendo ligando (preparado a 1 pg/mL em RPMI com 0,1% de BSA; a concentração final de HGF é de 200 ng/mL) e compostos de teste são adicionados às células. Os poços de controlo negativo recebem só 25 pL de RPMI isento de soro com 0,1% de BSA; as células de controlo positivo recebem o ligando (HGF) mas não composto de teste. Os compostos de teste são preparados a 5 vezes as suas concentrações finais em RPMI isento de soro com ligando numa placa com 96 poços, e diluidos em série para dar 7 concentrações de teste. Tipicamente, a concentração final mais alta de compostos de teste é 100 pM, e são utilizadas diluições 1:3 (i.e. a gama de concentração final de composto de teste é 0,137-100 pM) . 4. Após 18 horas de activação pelo ligando, adiciona-se 12,5 pL de reagente de marcação BrdU diluído (1:100 em RPMI, 0,1% de BSA) a cada poço e as células são incubadas com BrdU (a concentração final é 10 pM) durante 1 hora. -168- 5. 0 mesmo que no Procedimento Geral. 6. 0 mesmo que no Procedimento Geral. 7. A solução de bloqueamento é removida por decantação e os poços são lavados uma vez com PBS. Adiciona-se solução de Anti-BrdU-POD (diluição 1:100 em PBS, 1% de BSA) (100 pL/poço) e a placa é incubada durante 90 minutos à temperatura ambiente num agitador de placas. 8. O mesmo que no Procedimento Geral. 9. O mesmo que no Procedimento Geral. 10. 0 mesmo que no Procedimento Geral.
Ensaio com HUV-EC-C
Este ensaio é utilizado para medir a actividade de um composto contra PDGF-R, FGF-R, VEGF, aFGF ou Flk-l/KDR, de que todos são expressos naturalmente por células HUV-EC. DIA 0 1. Lavar e tripsinizar células HUV-EC-C (células endoteliais da veia umbilical humanas, (American Type Culture Collection, n° de catálogo 1730 CRL). Lavar com soro fisiológico tamponado com fosfato de Dulbecco (D-PBS, obtido de Gibco BRL, n° de catálogo 14190-029) 2 vezes a cerca de 1 mL/10 cm2 do frasco de cultura de tecidos. Tripsinizar com 0,05% de tripsina-EDTA em solução para dissociação de células não enzimática (Sigma Chemical Company, n° de -169- catálogo C-1544). A tripsina a 0,05% é preparada por diluição de 0,25% de tripsina/EDTA 1 mM (Gibco, n° de catálogo 25200-049) na solução para dissociação de células. Tripsinizar com cerca de 1 mL/25-30 cm^ do frasco de cultura de tecidos durante cerca de 5 minutos a 37°C. Depois de as células se terem destacado do frasco, adicionar um volume igual de meio de ensaio e transferir para um tubo de centrífuga de 50 mL estéril (Fisher Scientific, n° de catálogo 05-539-6). 2. Lavar as células com cerca de 35 mL de meio de ensaio no tubo de centrífuga de 50 mL estéril por adição do meio de ensaio, centrifugação durante 10 minutos a aproximadamente 200 x g, aspiração do sobrenadante e ressuspensão em 35 mL de D-PBS. Repetir a lavagem mais duas vezes com D-PBS, ressuspender as células em cerca de 1 mL de meio de ensaio/15 cm^ de frasco de cultura de tecidos. O meio de ensaio é constituído por meio F12K (Gibco BRL, n° de catálogo 21127-014) e 0,5% de soro fetal de bovino inactivado pelo calor . Contar as células com um contador Coulter® (Coulter Electronics, Inc.) e adicionar meio de ensaio às células para obter uma concentração de 0,8-1,0 x 10^ células/mL. 3. Adicionar células a placas com 96 poços de fundo plano a 100 yL/poço ou 0,8-1,0 x 10^ células/poço, incubar ~24 h a 37°C, 5% de C02. DIA 1 1. Preparar titulações duplas dos compostos de teste em placas com 96 poços separadas, geralmente de 50 μΜ para baixo até 0 μΜ. Utilizar o mesmo meio de ensaio que o referido no dia 0, passo 2 acima. As titulações -170- são preparadas por adição de 90 pg/poço de composto de teste a 200 μΜ (4X a concentração final do poço) até ao poço do topo de uma coluna particular da placa. Uma vez que o composto mãe de teste é normalmente 20 mM em DMSO, a concentração de fármaco de 200 μΜ contém 2% de DMSO.
Um diluente preparado até 2% de DMSO em meio de ensaio (F12K + 0,5% de soro fetal de bovino) é utilizado como diluente para titulações do composto de teste de modo a diluir o composto de teste mas manter constante a concentração de DMSO. Adicionar este diluente aos restantes poços da coluna a 60 pL/poço. Tomar 60 pL dos 120 pL da diluição do composto de teste a 200 pM no poço do topo da coluna e mistura com os 60 pL do segundo poço da coluna. Tomar 60 pL deste poço e misturar com os 60 pL dp terceiro poço da coluna, e assim por adiante até estarem concluídas as titulações duplas. Quando é misturado o poço adjacente ao último, tomar 60 pL dos 120 pL deste poço e rejeitar. Deixar o último poço com 60 pL de DMSO/diluente do meio como um controlo não contendo composto de teste. Preparar 9 coluna de composto de teste titulado, suficientes para poços em triplicado para cada um de: (1) VEGF (obtido de Pepro Tech Inc., n° de catálogo 100-200, (2) factor de crescimento de células endoteliais (ECGF) (tambéwm conhecido como factor de crescimento de fibroblastos ácido, ou aFGF) (obtido de Boehringer Mannheim
Biochemica, n° de catálogo 1439 600), ou (3) PDGF B/B humano (1276-956, Boehringer Mannheim, Alemanha) e controlo de meio de ensaio. O ECGF é fornecido como uma preparação com heparina sódica. 2. Transferir 50 pL/poço das diluições do composto de teste para as placas de ensaio com 96 poços contendo -171- 0,8-1,0 χ 10^ células/100 pL/poço das células HUV-EC-C do dia 0 e incubar ~2 h a 37°C, 5% de C02. 3. Em triplicado, adicionar 50 pL/poço de 80 pg/mL de VEGF, 20 ng/mL de ECGF, ou controlo do meio a cada condição de composto de teste. Tal como com os compostos de teste, as concentrações de factor de crescimento são 4X a concentração final desejada. Utilizar o meio de ensaio do dia 0 passo 2 para preparar as concentrações de factores de crescimento. Incubar aproximadamente 24 horas a 37°C, 5% de CO2.
Cada poço terá 50 pL de diluição de composto de teste, 50 pL de factor de crescimento ou de meio, e 100 pL de células, o que perfaz um total de 200 pL/poço. Assim as 4X concentrações de composto de teste e factores de crescimento tornam-se IX quando tudo tiver sido adicionado aos poços. DIA 2 1. Adicionar ^n-timidina (Amersham, n° de catálogo TRK-686) a 1 pCi/poço (10 pL/poço de 100 pCi/mL de solução preparada em meio RPMI + 10% de soro fetal de bovino inactivado pelo calor) e incubar ~24 h a 37°C, 5% de CO2. 0 RPMI é obtido de Gibco BRL, n° de catálogo 11875-051. DIA 3 1. Congelar as placas de um dia para o outro a -20°C. DIA 4
Descongelar as placas e colher com um equipamento para colheita de placas com 95 poços (equipamento para colheita Tomtec 96@) em matrizes de filtração (Wallac, n° -172- de catálogo 1205-401), ler as contagens num contador de cintilações liquido Wallac Betaplate™. A TABELA 3 mostra os resultados dos ensaios biológicos de alguns compostos exemplificativos desta invenção. Os resultados são expressos em termos da IV50, a concentração micromolar (μΜ) do composto a ser testado que provoca uma alteração de 50% da actividade da PKT alvo em comparação com a actividade da PTK num controlo ao qual não foi adicionado composto de teste. Especificamente, os resultados apresentados indicam que a concentração de um composto de teste necessária para causar uma redução de 50% da actividade da PTK alvo. Os bioensaios que foram ou podem ser utilizados para avaliar compostos estão descritos em pormenor adiante. TABELA 3
Ex. fkkGST IC50 (pM) bio PGFRl bio IC50 (pM) bio PDGF IC50 (pM) bio EGF IC50 (pM) EGF célula r IC50 (pM) Her2 Quinas e IC50 cdk2 spa C50 (pM) bio pyk2 IC50 (pM) 1 0,22 3,06 10,78 9,84 1,4 2 4,17 3,06 6,04 8,97 2,16 3 3,38 4,69 3,67 14,54 3,53 4 4,5 7,9 6,52 6,27 5 0,1 0,12 11,95 74,55 20,43 6 <0,05 0,02 20,73 67,46 6, 99 7 0,08 1,56 0,06 11,42 41,54 8,4 >20 1,05 8 0,006 0,3 <0,78 17,88 21,58 7,93 0,09 9 <0,78 >100 43,86 >100 10 <0,78 >100 20,43 >100 11 0,006 1, 66 0,01 18,1 21,61 23,24 16, 69 0,35 12 0,08 1,26 <0,78 12,53 >100 >100 10, 66 0,45 -173- 13 <0,78 >100 >100 >100 14 2,32 3,19 >100 10,03 7,11 15 0,06 7,98 >100 9,97 6, 94 16 21,14 >100 >100 >100 17 <0,78 >100 >100 >100 18 <0,78 >100 >100 >100 19 <0,78 >100 >100 >100 20 8,00 8,32 >100 >100 >100 21 0,21 <0,78 8,59 >100 >100 22 0,55 <0,78 30,49 >100 >100 23 0,37 <0,05 >100 74,36 15,97 24 <0,05 >100 11,84 2,76 25 0,39 24,77 31,38 19,79 2,56 26 1,16 0,03 >100 23,52 34,13 27 0,09 1,50 0,0030 10,57 6,42 7,99 12,62 0,63 28 15,21 22,5 >100 9,91 29 6,06 10,54 >100 39,94 9,65 30 5,95 14,12 >100 39,5 8,59 31 1,2 0,09 46,75 >100 32 2,7 61,55 >100 >100 33 0,49 25,01 >100 >100 34 1,49 >100 27,39 >100 35 0,13 4,29 0,001 >100 50,19 17,19 0,28 36 0,21 0,18 >100 >100 37 2,03 7,69 6,88 >100 >100 0,31 38 0,34 0,41 9, 46 2,18 86,9 0,008 39 1,38 12,51 67,2 5,86 0,006 40 0,2 0,8 2,59 >100 3,76 41 1,45 1,3 19, 6 41,8 >100 3,58 42 3,27 7,56 6,46 >100 9,1 0,17 43 0,35 1,18 8,06 2,36 >100 0,09 44 >20 >100 >100 >100 <0,000 5 45 0,91 12,9 >100 >100 0,006 -174- 46 1,93 1,2 >100 >100 0,002 47 1,38 61,63 >100 >100 <0,000 5
MODELOS ANIMAIS IN VIVO
MODELOS ANIMAIS DE XENOENXERTOS A capacidade de tumores humanos para crescerem como xeno-enxertos em murganhos atímicos (e.g., Balb/c, nu/nu) proporciona um modelo in vivo útil para o estudo da resposta biológica a terapêuticas para tumores humanos. Desde o primeiro xenotransplante bem sucedido de tumores humanos em murganhos atímicos (Rygaard e Povlsen, 1969, Acta Pathol. Microbíal. Scand., 77:758-760), muitas linhas celulares tumorais humanas diferentes (e.g., da mama, pulmão, genito-urinária, gastro-intestinal, cabeça e pescoço, glioblastoma, osso e melanomas malignos) têm sido transplantadas e desenvolvidas com êxito em murganhos glabros. Os ensaios seguintes podem ser utilizados para determinar o nível de actividade, especificidade e efeito dos diferentes compostos da presente invenção. Três tipos gerais de ensaios são úteis para avaliação de compostos: celulares/catalíticos, celulares/biológicos e in vivo. O objecto dos ensaios celulares/catalíticos é determinar o efeito de um composto sobre a aptidão de uma TK para fosforilar tirosinas num substrato conhecido numa célula. O objecto dos ensaios celulares/biológicos é determinar o efeito de um composto sobre a resposta biológica estimulada por uma TK numa célula. O objecto dos ensaios in vivo é determinar o efeito de um composto num modelo animal de uma doença específica tal como cancro.
As linhas celulares adequadas para experiências com xenio-enxertos subcutâneos incluem células C6 (glioma, -175- ATCC # CCL 107), células A375 (melanoma, ATCC # CRL 1619), células A431 (carcinoma epidermóide, ATCC # CRL 1555), células Caiu 6 (pulmão, ATCC # HTB 56) , células PC3 (próstata, ATCC # CRL 1435), células SKOV3TP5 e fibroblastos NIH 3T3 produzidos por engenharia genética para sobre-exprimirem EGFR, PDGFR, IGF-1R ou qualquer outra quinase de teste. Pode ser utilizado o seguinte protocolo para realizar experiências com xeno-enxertos:
Murganhos atimicos fêmeas (BALB/c, nu/nu) são obtidos de Simonsen Laboratories (Gilroy, CA). Todos os animais são mantidos em condições de salas brancas em gaiolas Micro-isolator com camas Alfa-dri. Receberam comida para roedores esterilizada e água ad libitum.
As linhas celulares são cultivadas em meio apropriado (por exemplo, MEM, DMEM, FIO de Ham, ou F12 de Ham mais 5%-10% de soro fetal de bovino (FBS) e 2 mM de glutamina (GLN)) . Todos os meios para cultura de células, glutamina, e soro fetal de bovino foram comprados a Gibco Life Technologies (Grand Island, NY) salvo indicação em contrário. Todas as células são cultivadas numa atmosfera húmida de 90-95% de ar e 5-10% de CO2 a 37°C. Todas as linhas celulares são em rotina subcultivadas duas vezes por semana e são negativas para micoplasma como determinado pelo método Mycotect (Gibco).
As células são colhidas à ou próximo da confluência com 0,05% de tripsina-EDTA e sedimentadas a 450 x g durante 10 min. Os sedimentos são ressuspensos em PBS ou meios (sem FBS) estéreis até uma concentração particular e as células são implantadas no flanco traseiro dos murganhos (8-10 murganhos por grupo, 2-10 x 10^ células/animal). O crescimento tumoral é medido ao longo de 3 a 6 semanas utilizando -176- paquímetros. Os volumes tumorais são calculados como o produto do comprimento x largura x altura salvo indicação em contrário. Os valores P são calculados utilizando o teste t de Student. Os compostos de teste em 50-100 yL de excipiente (DMSO, ou VPD:D5W) podem ser administrados por injecção IP em diferentes concentrações geralmente começando no dia um após a implantação.
MODELO DE INVASÃO TUMORAL O seguinte modelo de invasão tumoral foi desenvolvido e pode ser utilizado para a avaliação do valor terapêutico e da eficácia dos compostos identificados como inibindo selectivamente o receptor KDR/FLK-1.
Procedimento
Utiliza-se murganhos glabros com 8 semanas de idade (fêmeas) (Simonsen Inc.) como animais experimentais. A implantação das células tumorais pode ser realizada numa hote de fluxo laminar. Para anestesia, administra-se intraperitonealmente uma mistura de xilazina/cetamina (100 mg/kg de cetamina e 5 mg/kg de xilazina). Efectua-se uma incisão na linha média para expor a cavidade abdominal (aproximadamente 1,5 cm de comprimento) para injectar 107 células tumorais num volume de meio de 100 pL. As células são injectadas ou no lóbulo duodenal do pâncreas ou sob a serosa do cólon. O peritoneu e os músculos são fechados com uma sutura de seda 6-0 e a pele é fechada utilizando pinças para feridas. Os animais são observados diariamente.
Análise -177-
Após 2-6 semanas, dependendo das observações macroscópicas dos animais, os murganhos são sacrificados e as metástases tumorais locais de diversos orgãos (pulmão, figado, cérebro, estômago, baço, coração, músculo) são excisadas e analisadas (medição do tamanho do tumor, grau de invasão, imunoquimica, determinação da hibridação in situ, etc.).
ENSAIO DE C-KIT
Este ensaio é utilizado para detectar o nível de fosforilação de c-kit tirosina. Células M07E (leucemia mielóide aguda humana) foram mantidas em carência de soro de um dia para o outro em soro a 0,1%. As células foram pré-tratadas com o composto (concorrentemente com a carência de soro), antes da estimulação com ligando. As células foram estimuladas com 250 ng/mL de rh-SCF durante 15 minutos. Após a estimulação, as células foram lisadas e imunoprecipitadas com um anticorpo anti-c-kit. Os níveis de fosfotirosina e de proteína foram determinados por imunotransferência de Western.
ENSAIO DE PROLIFERAÇÃO DE MTT Células M07E foram mantidas em carência de soro e pré-tratadas com composto tal como descrito para as experiências de fosforilação. As células foram plaqueadas @ 4 x 1C)5 células/poço em numa placa com 96 poços, em 100 pL de RPMI + 10% de soro. Adicionou-se rh-SCF (100 ng/mL) e a placa foi incubada durante 48 horas. Após 48 horas, adicionou-se 10 pL de 5 mg/mL de MTT [brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazólio) e deixou-se incubar durante 4 horas. Adicionou-se isopropanol ácido (100 pL de HC1 0,04 N em isopropanol) e mediu-se a -178-
densidade óptica a um comprimento de onda de 550 nm. ENSAIO DE APOPTOSE Células M07E foram incubadas +/-SCF e +/-composto em 10% de FBS com rh-GM-CSF (10 ng/mL) e rh-IL-3 (10 ng/mL) . As amostras foram analisadas às 24 e 48 horas. Para medir a capase-3 activada, as amostras foram lavadas com PBS e permeabilizadas com etanol a 70% gelado. As células foram então coradas com caspase 3 anti-activa de coelho policlonal conjugada com PE e analisada por FACS. Para medir a PARP clivada, as amostras foram lisadas e analisadas por transferência de Western com um anticorpo anti-PARP.
Ensaios adicionais
Ensaios adicionais que podem ser utilizados para avaliar os compostos desta invenção incluem, sem limitação, um ensaio de bio-flk-1, um ensaio do receptor EGF-receptor HER2 quimérico em células inteiras, um ensaio de bio-src, um ensaio de bio-lck e um ensaio para determinar a fosforilação em função de raf. Os protocolos para cada um destes ensaios podem ser encontrados no pedido U.S. N° de Série 09/099 842, que aqui é dado como incorporado por citação, incluindo quaisquer desenhos.
Medição da Toxicidade Celular
Os compostos terapêuticos devem ser mais potente na inibição da actividade das tirosinas quinases receptoras do que na manifestação de um efeito citotóxico. Uma medida da eficácia e da toxicidade celular de um composto pode ser obtida por determinação do indice terapêutico, i.e., IC50/LD50. A IC50, a dose necessária para se obter 50% de inibição, pode ser determinada utilizando técnicas -179- correntes tais como as aqui descritas. A LD50, a dosagem que resulta em 50% de toxicidade, também pode ser determinada por técnicas correntes (Mossman, 1983, J. Immunol. Methods, 65:55-63), por determinação da quantidade de LDH libertada (Korzeniewski e Callewaert, 1983, J. Immunol. Methods, 64:313, Decker e Lohmann-Matthes, 1988, J. Immunol. Methods, 115:61), ou por determinação da lose letal em modelos animais. São preferidos os compostos com um índice terapêutico grande. O índice terapêutico deve ser superior a 2, preferencialmente pelo menos 10, mais preferencialmente pelo menos 50. B. Exemplo de Resultados de Ensaios Celulares Utilizando (2-dietilamino-etil)amida do ácido 5-(5-fluoro-2-oxo-l,2-di-hidroindol-3-ilidenometil)-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxílico.
Para confirmar a potência de (2-dietilamino-etil) amida do ácido 5- (5-fluoro-2-oxo-l,2-di-hidroindol-3-ilidenometil)-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxílico (Composto 35) detectada em ensaios bioquímicos (vide infra), a aptidão do referido composto para inibir a fosforilação por RTK dependente de ligandos foi avaliada em ensaios à base de células utilizando células de murganho NIH-3T3 preparadas por engenharia genética para sobre-exprimirem Flk-1 ou PDGFRP humana. A (2-dietilamino-etil) amida do ácido 5-(5-fluoro-2-oxo-l,2-di-hidroindol-3-ilidenometil) -2,4-dimetil-lfí-pirrolo-3-carboxílico (Composto 35) inibiu a fosforilação de tirosina por Flk-1 dependente de VEGF com um valor da IC50 de aproximadamente 0,03 μΜ. Este valor é semelhante ao valor de Ki de 0,008 μΜ determinado para a inibição de Flk-1 por (2-dietilamino-etil)amida do ácido 5-(5-fluoro-2-oxo-l,2-di-hidroindol-3-ilidenometil) -2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxílico (Composto 35) determinado em ensaios -180- bioquímicos. Isto indica que a (2-dietilamino-etil)amida do ácido 5-(5-fluoro-2-oxo-l, 2-di-hidroindol-3- ilidenometil)-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxílico (Composto 35) penetra prontamente nas células. Consistente com os dados bioquímicos (vide infra) indicando que a (2-dietilamino-etil)amida do ácido 5-(5-fluoro-oxo-l,2-di-hidroindol-3-ilidenometil) -2, 4-dimetil-líí-pirrolo-3-carboxílico (Composto 35) tem actividade comparável contra Flk-1 e PDGFR, também se verificou que inibia a fosforilaçâo de receptores dependentes de PDGF em células com um valor de IC50 de aproximadamente 0,03 μΜ. A aptidão da (2-dietilamino-etil)amida do ácido 5-(5-fluoro-2-oxo-1,2-di-hidroindol-3-ilidenometil)-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxílico (Composto 35) para inibir c-kit, uma RTK relacionada de perto que liga factor de células estaminais (SCF), foi determinada utilizando células M07E que exprimem este receptor. Nestas células, a (2-dietilamino-etil) amida do ácido 5- (5-fluoro-2-oxo-l,2-di-hidroindol-3-ilidenometil)-2,4-dimetil-l#-pirrolo-3-carboxílico (Composto 35) inibiu a fosforilaçâo de c-kirt dependente de SCF com um valor de IC50 de 0,01-0,1 μΜ. Este composto também inibiu a fosforilaçâo de c-kit estimulada por SCF em blastos de leucemia mielóide aguda (acute myeloid leukemia, AML) isolados do sangue periférico de doentes.
Para além de se testar a aptidão de (2-dietilamino-etil) amida do ácido 5- (5-fluoro-2-oxo-l,2-di-hidroindol-3-ilidenometil) -2,4-dimetil-lfí-pirrolo-3-carboxilico (Composto 35) para inibir a fosforilaçâo de receptores dependente de ligandos em células, o seu efeito na resposta proliferativa de células dependente de ligandos também foi examinada in vitro (ver Tabela 4). Nestes estudos, células quiescentes por privação de soro de um dia para o outro foram induzidas a sofrer síntese de ADN por adição do ligando mitogénico adequado. Como ilustrado na Tabela 4, a (2-dietilamino-etil)amida do ácido 5-(5- -181- fluoro-2-oxo-l,2-di-hidroindol-3-ilidenometil)-2, 4-dimetil-líí-pirrolo-3-carboxílico (Composto 35) inibiu a proliferação induzida por PDGF de células NIH-3T3 que sobre-exprimem PDGFRP ou PDGFRoc com valores da IC50 de 0,031 e 0,069 μΜ, respectivamente, e a proliferação induzida por SCF de células M07E com um valor da IC50 de 0,007 μΜ. TABELA 4
Bioquí mico IC50 Celular Receptor Krl (μΜ) Fosforilação do Receptor (μΜ) Proliferação dependente do ligando (μΜ) Flk-l/KDR 0,009 0,032 0,0043 PDGFRa 0,008 0,034 0,0314 pdgfrP ND ND 0,0695 FGFR 0,83 ND 0,73 c-kit ND 0,01-0,16 0,0076 ND = Não determinado 1 Determinado utilizando enzima recombinante 2 Determinado utilizando células NIH-3T3 com carência de soro que exprimem Flk-1 3 Determinado utilizando HUVECs com carência de soro 4 Determinado utilizando células NIH-3T3 com carência de soro que exprimem PDGFRD 5 Determinado utilizando células NIH-3T3 com carência de soro que exprimem PDGFRG 6 Determinado utilizando células M07E com carência de soro
Como ilustrado na Tabela 4, há uma concordância genérica entre as actividades bioquimica e celular da (2-dietilamino-etil)amida do ácido 5-(5-fluoro-2-oxo-l,2-di-hidroindol-3-ilidenometil)-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxílico (Composto 35) apoiando a conclusão de que este -182- compostos atravessa membranas celulares. Além disso, pode concluir-se que as respostas celulares são um resultado da actividade do composto 35 contra o alvo indicado. Em contraste, quando testado na presença de meio de crescimento completo in vitro, concentrações substancialmente mais elevadas da (2-dietilamino-etil)amida do ácido 5-(5-fluoro-2-oxo-l,2-di-hidroindol-3-ilidenometil)-2,4-dimetil-li7-pirrolo-3-carboxilico (Composto 35) (>10 μΜ) foram necessárias para inibir o crescimento de uma variedade de células tumorais humanas (ver Tabela 5) . Isto indica que o composto não inibiu directamente o crescimento destas células a concentrações necessárias para inibir a fosforilação do receptor dependente dos liqandos e a proliferação celular. TABELA 5
Linha Celular Origem IC50 (μΜ) LD50 (μΜ) HT29 Carcinoma do cólon 10 22 A549 Carcinoma do pulmão 9,5 22 NCI-H460 Carcinoma do pulmão NSC 8,9 20 SF767T Glioma 7,9 14 A431 Carcinoma epidermóide 6,0 18
Resumidamente, os resultados apresentados na Tabela 5 foram obtidos por incubação de células durante 48 h em meio de crescimento completo na presença de diluições em série da (2-dietilamino-etil)amida do ácido 5-(5-fluoro-2-oxo-1,2-di-hidroindol-3-ilidenometil)-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxílico. No final do periodo de crescimento, determinou-se o número relativo de células. Os valores da IC50 foram calculados como a concentração de composto que -183- inibiu o crescimento das células em 50% em relação a células não tratadas. Os valores da LD50 foram calculados como a concentração de composto que provocou uma redução de 50% no número de células em relação às do inicio da experiência.
Um ensaio à base de células mais relevante no qual avaliar o potencial anti-angiogénico de (2-dietilamino-etil)amida do ácido 5-(5-fluoro-2-oxo-l,2-di-hidroindol-3-ilidenometil) -2,4-dimetil-lí/-pirrolo-3-carboxílico (Composto 35) é o ensaio da mitogénese in vitro utilizando células endoteliais de veia umbilical humanas (HUVECs) como um sistema modelo para a proliferação celular endotelial crítica para o processo angiogénico. Neste ensaio, uma resposta mitogénica, medida como um aumento da síntese de ADN, é induzida em HUVECs carenciadas de soro por adição de VEGF ou FGF. Nestas células, a (2-dietilamino-etil)amida do ácido 5-(5-fluoro-2-oxo-l,2-di-hidroindol-3-ilidenometil)-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxílico (Composto 35) inibiu a resposta mitogénica induzida por VEGF e FGF de modo dependente da dose com valores da IC50 de 0,004 μΜ e 0,7 μΜ, respectivamente, quando o composto estava presente durante o ensaio de 48 h.
Resumidamente, os resultados anteriormente referidos foram obtidos utilizando HUVECs carenciadas de soro que foram incubadas com concentrações mitogénicas de VEGF (100 ng/mL) ou FGF (30 ng/mL) na presença de diluições em série de (2-dietilamino-etil)amida do ácido 5-(5-fluoro-2-oxo-1,2-di-hidroindol-3-ilidenometil) -2,4-dimetil-lií-pirrolo-3-carboxílico (Composto 35) durante 24 h. A resposta mitogénica durante as 24 h seguintes na presença de ligando e de inibidor foi quantificada por medição da síntese de ADN baseada na incorporação de bromodesoxiuridina no ADN celular. -184-
Em experiências separadas, o composto 35 inibiu a fosforilação dependente de VEGF de ERK 1/2 (p42/quinase 44MAP), um alvo precoce a jusante de Flk-l/KDR, de modo dependente da dose. Também se demonstrou que a actividade inibidora do composto 35 era duradoura neste sistema; inibindo a fosforilação dependente de VEGF de ERK 1/2 durante tanto tempo como 48 horas após a remoção da (2-dietilamino-etil)amida do ácido 5-(5-fluoro-2-oxo-l,2-di-hidroindol-3-ilidenometil)-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxílico (Composto 35) do meio na sequência de uma exposição curta (2 h) a concentrações micromolares do composto. 0 VEGF foi reconhecido como sendo um factor de sobrevivência importante para as células endoteliais. Uma vez que a (2-dietilamino-etil)amida do ácido 5-(5-fluoro-2-oxo-l,2-di-hidroindol-3-ilidenometil)-2,4-dimetil-lfí-pirrolo-3-carboxílico (Composto 35) inibe a resposta mitogénica dependente de VEGF de HUVECs, foi investigado o efeito do composto sobre a sobrevivência de HUVECs. Nestas experiências, a clivagem do substrato de caspase 3 poli-ADP-ribosil polimerase (PARP) foi utilizada como um indicador da apoptose. HUVECs cultivadas em condições isentas de soro durante 24 horas apresentaram níveis substanciais de clivagem de PARP, detectada pela acumulação do fragmento de clivagem de PARP com 23 kDa. Isto foi largamente impedido pela adição de VEGF ao meio celular, indicando que o VEGF actua como um factor de sobrevivência neste ensaio. Demonstrou-se que a (2-dietilamino-etil)amida do ácido 5-(5-fluoro-2-oxo-l,2-di-hidroindol-3-ilidenometil)-2,4-dimetil-l#-pirrolo-3-carboxílico (Composto 35) inibe a sinalização de KDR. Em conformidade, a (2-dietilamino-etil)amida do ácido 5-(5-fluoro-2-oxo-l,2di-hidroindol-3-ilidenometil)-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxílico (Composto 35) inibiu a -185- sobrevivência de HUVECs mediada por VEGF de forma dependente da dose. Assim, estes dados indicam que o composto 35 induziu apoptose em células endoteliais em cultura na presença de VEGF. C. Estudos de Eficácia in vivo i. Eficácia Contra Xenoenxertos de Tumores Estabelecidos A eficácia in vivo da (2-dietilamino-etil)amida do ácido 5-(5-fluoro-2-oxo-l,2-di-hidroindol-3- ilidenometil)-2,4-dimetil-ltf-pirrolo-3-carboxilico (Composto 35) foi estudada em modelos de xenoenxertos subcutâneos (SC) utilizando células de tumores humanos implantadas na região do flanco traseiro de murganhos atimicos. Após a implantação, deixou-se que os tumores se estabelecem até um tamanho de 100-550 mm^ antes de iniciar o tratamento oral com o composto. A administração oral diária de composto 35 causou uma inibição dependente da dose do crescimento do tumor A431 quando o tratamento foi iniciado depois de os tumores terem crescido até um tamanho de 400 mm^. Observou-se inibição estatisticamente significativa (P <0,05) do crescimento do tumor a doses de 40 mg/kg/dia (74% de inibição) e 80 mg/kg/dia (84% de inibição) (ver Tabela 6) . Em experiências preliminares, uma dose mais alta (160 mg/kg/dia) do composto não foi mais eficaz contra tumores A431 estabelecidos do que a dose de 80 mg/kg/dia. Além disso, os murganhos tratados com a dose de 160 mg/kg/dia perderam peso corporal, indicando que a dose mais alta não foi tão bem tolerada. Obteve-se resultados semelhantes numa experiência em que só se deixou que os tumores A431 atingissem um tamanho de 100 mm^ (ver Tabela 5) . Nesta segunda experiência, ocorreu regressão completa dos tumores em seis dos oito animais tratados com 80 mg/kg/dia -186- durante 21 dias. Nestes seis animais, os tumores não tornaram a crescer durante um período de observação de 110 dias após o final do tratamento. Nos dois animais em que os tumores tornaram a crescer até um tamanho grande (2000— 3000 mm^), os tumores regrediram em resposta a uma segunda volta de tratamento com composto 35. O que é importante, em todas as experiências de eficácia, a (2-dietilamino-etil)amida do ácido 5-(5-fluoro-2-oxo-l,2-di-hidroindol-3-ilidenometil) -2,4-dimetil-lfí-pirrolo-3-carboxílico (Composto 35) a 80 mg/kg/dia foi bem tolerada, mesmo quando administrada continuamente durante mais de 100 dias. TABELA 6
Volume Inicial do Tumor (mm3) Compostol (mg/kg/dia) % de inibição (dia) Valor de P 80 84(36) 0,001 400 40 74(36) 0,003 20 51(36) 0,130 80 93(40) 0,002 100 40 75(40) 0,015 20 61(40) 0,059 1 Composto 35
Resumidamente, os resultados apresentados na Tabela 6 foram obtidos utilizando células A431 (0,5 x 10^ células/murganho) que foram implantadas SC na região do flanco traseiro de murganhos atímicos. A administração oral diária de (2-dietilamino-etil)amida do ácido 5-(5- -187- fluoro-2-oxo-l,2-di-hidroindol-3-ilidenometil)-2,4-dimetil-ltf-pirrolo-3-carboxílico (Composto 35) num veículo à base de Cremophor ou controlo do veículo começou quando os tumores atingiram o volume médio indicado. Os tumores foram medidos utilizando craveiras e o volume dos tumores foi calculado como o produto do comprimento x largura x altura. Os valores P foram calculados por comparação do tamanho dos tumores de animais que foram tratados com composto 35 (n=8) com os de animais que foram tratados com veículo (n=16), no último dia da experiência, utilizando o teste t de Student bilateral. A eficácia do composto 35 contra tumores humanos estabelecidos de diferentes origens foi determinada utilizando xenoenxertos de Colo205 (carcinoma do cólon), SF763T (glioma) e NCI-H460 (carcinoma do pulmão de células não pequenas) (ver Tabela 7) . Estas experiências foram realizadas utilizando (2-dietilamino-etil)amida do ácido 5- (5-fluoro-2-oxo-l,2-di-hidroindol-3-ilidenometil)-2,4-dimetil-lfí-pirrolo-3-carboxilico (Composto 35) administrado oralmente a 80 mg/kg/dia; uma dose que foi eficaz e bem tolerada. TABELA 7
Tipo de Tumor Volume Inicial do Tumor (mm^) % de Inibição (dia) Valor de P A4311 Epidermóide 100 93(40) 0,002 A4311 Epidermóide 400 84(36) 0,001 Colo205 Cólon 370 77(54) 0,028 NCI-H460 Pulmão 300 61(54) 0,003 SF763T Glioma 550 53(30) 0,001 1 Os dados são da experiência descrita na Tabela 5
Nas experiências acima referidas, o composto 80 foi administrado uma vez por dia a 80 mg/kg num veículo à base -188- de Cremophor quando os tumores atingiram o tamanho indicado. A percentagem de inibição em comparação com o grupo tratado com veiculo foi calculada no termo das experiências. Os valores P foram calculados por comparação dos tamanhos dos tumores dos animais que tinham sido tratados com o composto com os tamanhos dos tumores dos animais que tinham sido tratados com o veiculo, utilizando o teste t de Student bilateral.
Embora a (2-dietilamino-etil)amida do ácido 5—(5— fluoro-2-oxo-l,2-di-hidroindol-3-ilidenometil)-2,4-dimetil-ltf-pirrolo-3-carboxílico (Composto 35) inibisse o crescimento de todos os tipos de tumores indicados na Tabela 7, houve uma diferença na resposta dos diferentes modelos de xenoenxertos. Especificamente, o crescimento dos tumores NCI-H460 e SF763T foi parado ou grandemente abrandado enquanto que os tumores Colo205, tal como os tumores A431, regrediram quando tratados com (2-dietilamino-etil)amida do ácido 5-(5-fluoro-2-oxo-l,2-di-hidroindol-3-ilidenometil)-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxílico.
De forma a determinar a base molecular da diferença de resposta entre modelos de xenoenxertos, foram estudados tumores SF763T. Assim, tumores SF763T, que respondiam menos ao tratamento com (2-dietilamino-etil)amida do ácido 5- (5-fluoro-2-oxo-l,2-di-hidroindol-3-ilidenometil)-2,4-dimetil-lfí-pirrolo-3-carboxílico, foram avaliados ao nivel molecular utilizando técnicas imuno-histológicas para determinar o efeito do tratamento com o composto. Estes estudos foram inicialmente realizados neste tipo de tumor porque os tumores SF763T são altamente vascularizados com microvasos que exprimem fortemente o marcador celular endotelial CD31 e são por isso muito adequados para estudos de densidade de microvasos em tumores (microvessel density, MVD). A avaliação imuno-histológica dos tumores -189- SF763T indicou que os tumores de animais tratados tinham MVD reduzida em relação a controlos tratados com veiculo, consistente com um mecanismo de acção anti-angiogénico para o composto 35; a MVD era 24,2 ± 4,1 em animais tratados com composto 35, em comparação com 39,3 ± 5,7 para os que foram tratados só com o veiculo. Como previsto da paragem do crescimento tumoral associado, uma inibição pronunciada da proliferação das células tumorais foi evidente em tumores que foram tratados com composto 35. Estes tumores tinham metade do indice mitótico dos de tumores tratados com veiculo (dados não apresentados). 0 efeito do composto 35 na MVD e na proliferação de células tumorais indica que o composto tem profundos efeitos anti-angiogénico e anti-tumoral, mesmo em condições em que os tumores não regridem. A aptidão do composto 35 para inibir a fosforilação de PDGFR e a sinalização subsequente in vivo também foi avaliada em tumores SF763T, que exprimem níveis elevados de PDGFR. 0 tratamento dos tumores SF763T com composto 35 inibiu fortemente a fosforilação de tirosina por PDGFR em tumores SF763T estabelecidos. 0 composto 35 também reduziu os níveis de fosfolipase C gama (PLC-γ) fosforilada, um indicador imediato a jusante da activação de PDGFR. Estes dados demonstram que a administração oral de composto 35 inibe a sinalização provoca um efeito directo na actividade alvo (PDGFR) em tumores in vivo.
Com base na demonstração de que a aptidão do composto 35 para inibir a sinalização dependente de VEGF em HUVECs in vitro foi duradoura (vide supra), a eficácia do composto foi avaliada quando o composto foi administrado infrequentemente no modelo de tumor Colo205. Como ilustrado na Tabela 8, 80 mg/kg (91% de inibição) e 40 mg/kg (84% de inibição) foram eficazes quando administradas diariamente, mas não quando administradas -190- duas vezes por semana. Em contraste, uma dose maior do composto 35 (160 mg/kg) inibiu (52% de inibição) o crescimento de tumores Colo205 estabelecidos quando administrado duas vezes por semana, sugerindo que este composto pode demonstrar eficácia quando administrado infrequentemente numa dose mais alta. Deve notar-se que os regimes de dosagem podem ser determinados pelas pessoas com conhecimentos correntes da matéria sem necessidade de experimentação. TABELA 8
Dose (mg/kg) Frequência % de Inibição Valor de P 160 Duas vezes por semana 52 0,085 Uma vez por semana 17 NS 80 Diariamente 91 0,039 Duas vezes por semana 19 NS Uma vez por semana 0 NS 40 Diariamente 84 0,028 Duas vezes por semana 36 NS NS: não significativo (P >0,05)
Resumidamente, os resultados apresentados na Tabela 8 foram obtidos utilizando células Colo205 (0,5 x 10^ células/murganho) que tinham sido implantadas SC na região do flanco traseiro de murganhos atimicos. A administração oral do composto 35 de acordo com o regime indicado começou quando os tumores atingiram 400 mm^. Os tumores foram medidos utilizando craveiras e o volume dos tumores -191- foi calculado como o produto do comprimento x largura x altura. Os valores P foram calculados por comparação do tamanho dos tumores de animais que foram tratados com composto 35 com os de animais que foram tratados com veiculo, no último dia da experiência, utilizando o teste t de Student bilateral. ii. Eficácia do Composto 35 num Modelo de Doença Disseminada
Para além de apoiar o crescimento sustentado de tumores primários sólidos, a angiogénese também é um componente essencial de apoio ao desenvolvimento de doença disseminada devida a metástase a partir do tumor primário. 0 efeito do composto 35 no desenvolvimento de doença disseminada foi examinado no modelo de colonização do pulmão pelo melanoma de murganho B16-F1. Neste modelo, células B16-F1 inoculadas intravenosamente através da veia da cauda de murganhos atímicos colonizam os pulmões e formam tumores. Como indicado na Tabela 8, a administração oral de composto 35 a 80 mg/kg/dia reduziu efectivamente a carga de células B16-F1 no pulmão como avaliado por medição do peso total do pulmão. Estes dados sugerem que o composto 35 pode inibir a doença disseminada in vivo. TABELA 9
Peso do pulmão (g) % de Inibição Valor P Veiculo 0,83 ± 0,07 - - Composto^ 0,41 ± 0,04 50 <0,001 1 Composto 35
Resumidamente, os resultados apresentados na Tabela 9 foram obtidos utilizando murganhos atimicos que tinham sido inoculados com células tumorais B16-F1 (5 x 10^ células/murganho) através da veia da cauda. Os murganhos -192- foram tratados diariamente com composto 35 administrado por via oral a 80 mg/kg/dia (n=10) ou veiculo (n=18) durante 24 dias após a inoculação das células tumorais. No final do periodo de tratamento, os murganhos foram sacrificados e os seus pulmões retirados e pesados. A percentagem de inibição foi calculada por comparação do peso dos pulmões dos animais que tinham sido tratados com composto 35, com o peso dos pulmões dos animais que só tinham sido tratados com veiculo. Os valores P foram determinados utilizando o teste t de Student bilateral. D. Exemplos de Actividade Biológica
Exemplos da potência in vitro de composto desta invenção estão apresentados na Tabela 2.
CONCLUSÃO
Em estudos para investigar as características farmacocinéticas dos compostos das formas de realização preferidas da presente invenção demonstrou-se que a administração oral de uma única dose dos referidos compostos resultou em elevada biodisponibilidade oral em murganhos. A boa biodisponibilidade oral e a farmacocinética linear indicam que os compostos das formas de realização preferidas da presente invenção têm características farmacocinéticas favoráveis.
Além disso, os compostos das formas de realização preferidas da presente invenção são inibidores potentes da actividade de tirosina quinase do domínio de quinase dividida RTKsFlk-l/KDR e PDGFR, que estão envolvidos na angiogénese, e c-kit de RTK, um receptor do factor de células estaminais (SCF), que está envolvido em certos cancros hematológicos. A concentrações mais altas, os compostos das formas de realização preferidas da presente -193- invenção também inibiram a actividade de tirosina quinase de FGFR-1, uma terceira RTK envolvida na angiogénese. De forma consistente com a sua actividade bioquímica, os compostos das formas de realização preferidas da presente invenção inibem a fosforilação de tirosina dependente do ligando de RTKs alvo e a resposta mitogénica in vitro de células endoteliais da veia umbilical humanas (HUVECs) estimuladas com VEGF ou FGF, de células NIH-3T3 que exprimem PDGFR e de células M07E de leucemia mielóide aguda estimuladas com SCF. Em contraste, os compostos das formas de realização preferidas da presente invenção não inibem directamente a proliferação de células tumorais em meio de crescimento completo excepto a concentrações 2 a 3 ordens de grandeza superiores às necessárias para inibir as respostas mitogénicas dependentes do ligando. Em estudos de xeno-enxertos em murganhos, os compostos das formas de realização preferidas da presente invenção inibiram o crescimento de tumores humanos estabelecidos de várias origens de forma dependente da dose e a concentrações que eram bem toleras mesmo por administração prolongada (>100 dias). A 80 mg/kg/dia, os compostos das formas de realização preferidas da presente invenção induziram a regressão de tumores grandes estabelecidos A431 e Colo205, e provocaram uma inibição substancial do crescimento ou estase de tumores SF763T e NCI-H460. Em murganhos com tumores SF763, os compostos das formas de realização preferidas da presente invenção causaram reduções da densidade da microvascularização, fosforilação de PDGFR nos tumores e índice mitótico nas células tumorais. Nesta dose, os compostos das formas de realização preferidas da presente invenção também inibiram a colonização dos pulmões por células tumorais B16-F1 num modelo de metástase tumoral. Estudos dos regimes de administração demonstraram que os compostos das formas de realização preferidas da presente invenção são mais eficazes quando administrados diariamente. Prova directa -194- da actividade anti-angiogénica dos compostos das formas de realização preferidas da presente invenção foi detectada em tumores SF763T em que a densidade da microvascularização estava reduzida. Prova directa de que os compostos das formas de realização preferidas da presente invenção inibem a fosforilação de PDGFR e sinalização in vivo foi também obtida em tumores SF763T.
Tomados conjuntamente, estes dados apoiam a noção de que compostos das formas de realização preferidas da presente invenção administrados oralmente são agentes anti-angiogénicos para o tratamento de cancros, incluindo tumores sólidos e doenças malignas hematológicas em que a angiogénese e/ou a sinalização através de c-kit são importantes na patologia da doença.
Entender-se-á que os compostos, métodos e composições farmacêuticas da presente invenção são eficazes na modulação da actividade de PK e que portanto se espera que sejam agentes terapêuticos eficazes contra doenças relacionadas com RTK, CTK e STK.
Todas as patentes e publicações mencionadas na especificação são indicadoras dos niveis dos especialistas na matéria com à qual diz respeito a invenção. Todas as patentes e publicações aqui são dadas como incorporadas por citação tal como se cada publicação individual fosse especificamente e individualmente indicada como estando incorporada por citação. A invenção aqui descrita de forma ilustrativa pode ser adequadamente posta em prática na ausência de qualquer elemento ou elemento, limitação ou limitações que não estejam especificamente aqui descritos. Assim, por exemplo, em cada caso aqui descrito qualquer dos termos "compreendendo", "consistindo essencialmente em" e "que -195- consiste em" pode ser substituído por qualquer dos dois outros termos. Os termos e expressões que foram empregues são utilizados como termos de descrição e não de limitação, e não há intenção de, na utilização desses termos e expressões, excluir quaisquer equivalentes das características apresentadas e descritas ou de partes suas, mas reconhece-se que são possíveis várias modificações dentro do âmbito da invenção reivindicada. Assim, deve entender-se que embora a presente invenção tenha sido especificamente descrita por formar de realização preferidas e características opcionais, os especialistas na matéria podem recorrer à modificação e variação dos conceitos aqui descritos e que essas modificações e variações são consideradas como estando dentro do âmbito desta invenção tal como definida pelas reivindicações anexas.
Além disso, quando características ou aspectos da invenção são descritos em termos de grupos de Markush, os especialistas na matéria reconhecerão que a invenção também está dessa forma descrita em termos de qualquer membro ou subgrupo individual do grupo de Markush. Por exemplo, se X está descrito como seleccionado do grupo que consiste em bromo, cloro e iodo, as reivindicações em que X é bromo e as reivindicações em que X é bromo e cloro encontram-se completamente descritas.
Outras formas de realização estão dentro das reivindicações anexas. — 196—
0)

Claims (11)

  1. -1- REIVINDICAÇÕES 1. Composto de fórmula (I)
    ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, em que: R-*- é seleccionado de hidrogénio, (C1-C4) alquilo (CH2)rR16 e -C(0)NR8R9; R3 é seleccionado de hidrogénio, halogéneo, arilo e S(0)2NR13R14; R3 é seleccionado de hidrogénio, (C1-C4)alquilo, (c^-C4)alcoxi, arilo, heteroarilo e -C(0)R13; R4 é hidrogénio; R3 é seleccionado de hidrogénio e (C1-C4)alquilo; R6 é -C(0)R10; R3 é seleccionado de hidrogénio, (C1-C4)alquilo e arilo; R8 e R9 são seleccionados independentemente de hidrogénio, alquilo e arilo; rIO ^ -N(R44) (CH2)nR·*·3^ em que n é 1, 2 ou 3, rH é hidrogénio e R-*-3 é seleccionado de hidroxilo, (Ci~ C4)alcoxi, -C(0)R·*-3, heteroarilo e -Nr13r14; R13 e R14 são seleccionados independentemente do grupo que consiste em hidrogénio, (C1-C4)alquilo, cicloalquilo, arilo e heteroarilo; ou r!3 e R-'-4 podem combinar-se para formar um grupo heterociclo; R-*-3 é seleccionado do grupo que consiste em hidrogénio, hidroxilo, (C1-C4)alcoxi e ariloxi; -2- r!6 é seleccionado de hidroxilo e -C(0)r15; e r é 2 ou 3; e em que: alcoxi refere-se a O-alquilo ou O-cicloalquilo; ariloxi refere-se a O-arilo ou O-heteroarilo; heteroarilo refere-se a um qrupo com anel monocíclico ou anéis condensados, com 5 a 12 átomos no anel dos quais um, dois ou três átomos do anel são heteroátomos seleccionados de N, 0 ou S, sendo os restantes átomos do anel átomos de C; grupo heterociclo refere-se a um radical cíclico saturado com 3 a 8 átomos no anel em que um ou dois átomos do anel são heteroátomos seleccionados de N, 0 ou S(0)ru em que n é um número inteiro de 0 a 2, sendo os restantes átomos do anel átomos de C, em que um ou dois átomos de C estão opcionalmente substituídos por um grupo carbonilo; os grupos alquilo, alcoxi e cicloalquilo estão não substituídos; os grupos arilo e heteroarilo estão opcionalmente substituídos com um ou dois substituintes seleccionados independentemente de halogéneo, (C]_-C4)alquilo, trihalogeno(C1-C4)alquilo, hidroxilo, mercapto, ciano, 17-amido, mono- ou di(Ci-C4)alquilamino, carboxilo e N-sulfonamido; o grupo heterociclo está opcionalmente substituído com um ou dois substituintes seleccionados independentemente de halogéneo, -(Ci—C 4)alquilo, (C1-C4)alquil-carboxilo, -(C1-C4)alquil-éster, hidroxilo e mono- ou di(C1-C4)alquilamino.
  2. 2. Composto de acordo com a reivindicação 1, em que r!3 e r!4 são seleccionados independentemente de hidrogénio, (C1-C4)alquilo, heteroarilo e, combinados, - (CH2) 4“#· -(CH2)5-, - (CH2) 20 (CH2) 2~ e -(CH2)2N(CH3) (CH2)2-· Composto de acordo com a reivindicação 1, em que n é 2 ou 3 e r!2 é -NR18R14 em que r13 e r14 São independentemente (C1-C4)alquilo. Composto de acordo com a reivindicação 1, em que n é 2 ou 3 e r!2 é -NR-*-3r14 em que R^8 e R·^ se combinam para formar um grupo seleccionado de -(CH2)4_, (CH2)5-, -(CH2)20(CH2)2- ou - (CH2)2N (CH3) (CH2)2“· Composto de acordo com a reivindicação 1, em que r! é -C (0)NR8R9, em que R8 é hidrogénio e R9 é arilo. Composto de acordo com a reivindicação 1 de fórmula
    ou um seu sal farmaceuticamente aceitável. Composto de acordo com a reivindicação 1, que é o sal L-malato de (2-dietilaminoetil)amida do ácido 5— (5— fluoro-2-oxo-l,2-di-hidroindol-3-ilidenometil)-2, 4-dimetil-lí/-pirrolo-3-carboxílico. Composto de acordo com a reivindicação 1 de fórmula -4-
    ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.
  3. 9. Composição farmacêutica compreendendo um composto de acordo com a reivindicação 1 ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, e um veiculo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
  4. 10. Composição farmacêutica compreendendo um composto de acordo com a reivindicação 6 ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, e um veiculo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
  5. 11. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 10, compreendendo o sal L-malato de (2- dietilaminoetil)amida do ácido 5-(5-fluoro-2-oxo-l,2-di-hidroindol-3-ilidenometil)-2,4-dimetil-lH-pirrolo-3-carboxílico.
  6. 12. Utilização de um composto de acordo com a reivindicação 1 ou 6 ou de um seu sal farmaceuticamente aceitável, no fabrico de um medicamento para o tratamento de uma doença relacionada com uma proteína quinase num organismo.
  7. 13. Utilização de acordo com a reivindicação 12, em que a referida doença é relacionada com uma proteína quinase é seleccionada de uma doença relacionada com uma tirosina quinase receptora, uma doença relacionada com uma tirosina quinase não receptora e -5- uma doença relacionada com uma serina-treonina quinase.
  8. 14. Utilização de acordo com a reivindicação 12, em que a referida doença é relacionada com uma proteína quinase seleccionada de uma doença relacionada com EGFR, uma doença relacionada com PDGFR, uma doença relacionada com IGFR e uma doença relacionada com flk.
  9. 15. Utilização de acordo com a reivindicação 12, em que a referida doença relacionada com uma proteína quinase é um cancro seleccionado de carcinoma de células escamosas, astrocitoma, sarcoma de Kaposi, glioblastoma, cancro do pulmão, cancro da bexiga, cancro da cabeça e pescoço, melanoma, cancro do ovário, cancro da próstata, cancro da mama, cancro do pulmão das células pequenas, glioma, cancro colorrectal, cancro genito-urinário e cancro gastrointestinal.
  10. 16. Utilização de acordo com a reivindicação 12, em que a referida doença relacionada com uma proteína quinase é seleccionada de diabetes, uma doença autoimune, uma doença de hiperproliferação, restenose, fibrose, psoríase, doença de von Heppel-Lindau, osteoartrite, artrite reumatóide, angiogénese, uma doença inflamatória, uma doença imunológica e uma doença cardiovascular.
  11. 17. Utilização de acordo com a reivindicação 12, em que o referido organismo é um ser humano.
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