DE60129794T2

DE60129794T2 - Pyrrol substituierte indolin-2-on protein kinase inhibitoren

Info

Publication number: DE60129794T2
Application number: DE60129794T
Authority: DE
Inventors: Peng Cho Morago TANG; Todd Bend MILLER; Xiaoyuan Los Altos LI; Li Foster City SUN; Chung Chen Foster City WEI; Shahrzad Corte Madera SHIRAZIAN; Congxin Sunnyvale LIANG; Tomas San Mateo VOJKOVSKY; Asaad S. Concord NEMATALLA; Michael Kalamazoo HAWLEY
Original assignee: Sugen LLC; Pharmacia and Upjohn Co LLC
Current assignee: Sugen LLC; Pharmacia and Upjohn Co LLC
Priority date: 2000-02-15
Filing date: 2001-02-15
Publication date: 2007-12-06
Anticipated expiration: 2021-02-16
Also published as: CN1329390C; NO2019005I1; US20020156292A1; US6573293B2; SK287142B6; BRPI0108394B8; ES2290117T3; NZ520640A; NO2008019I2; HRP20020751A2; CR20120007A; NL300430I2; BRPI0108394B1; KR20030003229A; KR100713960B1; AU2001239770B2; NL300430I1; CY1108032T1; DE122008000002I1; IS6501A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf bestimmte 3-Pyrrol-substituierte 2-Indolinonverbindungen, die die Aktivität von Proteinkinasen („PKs") modulieren. Die Verbindungen dieser Erfindung sind daher zur Behandlung von Krankheiten, die mit abnormaler PK-Aktivität in Verbindung stehen, nützlich. Pharmazeutische Zusammensetzungen, die diese Verbindungen umfassen, Verfahren zur Behandlung von Krankheiten, die pharmazeutische Zusammensetzungen, die diese Verbindungen umfassen, nutzen und Verfahren zur Herstellung dieser werden ebenso offenbart.
Stand der Technik
Folgendes wird nur als Hintergrundinformation geliefert und gilt nicht als Stand der Technik für die vorliegende Erfindung.
PKs sind Enzyme, die die Phosphorylierung von Hydroxygruppen an Tyrosin-, Serin- und Threoninresten von Proteinen katalysieren. Die Folgen dieser anscheinend einfachen Aktivität sind folgenschwer; Zellwachstum, -differenzierung und -proliferation, d. h., im Grunde alle Aspekte des Zellebens, hängen auf die eine oder andere Weise von der PK-Aktivität ab. Ferner ist die abnormale PK-Aktivität mit zahlreichen Störungen in Verbindung gebracht worden, von im Prinzip nicht lebensbedrohlichen Krankheiten wie Psoriasis bis zu extrem virulenten Krankheiten wie Glioblastom (Gehirnkrebs).
Die PKs können praktischerweise in zwei Klassen unterteilt werden, die Protein-Tyrosin-Kinasen (PTKs) und die Serin-Threonin-Kinasen (STKs).
Einer der wesentlichsten Aspekte der PTK-Aktivität ist ihre Beteiligung an Wachstumsfaktorrezeptoren. Wachstumsfaktorrezeptoren sind Zelloberflächenproteine. Gebunden durch einen Wachstumsfaktorliganden, werden Wachstumsfaktorrezeptoren in eine aktive Form umgewandelt, die mit Proteinen auf der inneren Oberfläche einer Zellmembran interagiert. Dies führt zur Phosphorylierung an Tyrosinresten des Rezeptors und anderen Proteinen und zur Bildung von Komplexen mit einer Vielzahl zytoplasmischer Signalmoleküle innerhalb der Zelle, die wiederum zahlreiche zelluläre Antworten wie Zellteilung (Proliferation), Zelldifferenzierung, Zellwachstum, Expression metabolischer Wirkungen auf die extrazelluläre Mikroumgebung usw. bewirken. Für eine vollständigere Erörterung, siehe Schlessinger und Ullrich, Neuron, 9: 303–391 (1992), aufgenommen durch Verweis, einschließlich der hierin vollständig dargelegten Zeichnungen.
Wachstumsfaktorrezeptoren mit PTK-Aktivität sind als Rezeptor-Tyrosin-Kinasen („RTKs") bekannt. Sie umfassen eine große Familie von Transmembranrezeptoren mit diverser biologischer Aktivität. Bisher sind mindestens neunzehn (19) unterschiedliche Unterfamilien von RTKs identifiziert worden. Ein Beispiel dieser ist die Unterfamilie der „HER"-RTKs, die den EGFR (Epithel-Wachstumsfaktorrezeptor), den HER2, den HER3 und den HER4 umfassen. Diese RTKs bestehen aus einer extrazellulären glycosylierten Ligandenbindungsdomäne, einer Transmembrandomäne und einer intrazellulären zytoplasmischen katalytischen Domäne, die Tyrosinreste an Proteinen phosphorylieren können.
Eine andere RTK-Unterfamilie besteht aus einem Insulinrezeptor (IR), einem Insulin-like Wachstumsfaktor I-Rezeptor (IGF-1R) und einem Insulinrezeptor-verwandten Rezeptor (IRR). IR und IGF-1R interagieren unter Bildung eines Heterotetramers aus zwei vollständig extrazellulären, glycosylierten α-Untereinheiten und zwei β-Untereinheiten, die die Zellmembran kreuzen und die die Tyrosinkinasedomäne enthalten, mit Insulin, IGF-I und IGF-II.
Eine dritte RTK-Unterfamilie wird als die Gruppe der aus Blutplättchen abgeleiteten Wachstumsfaktorrezeptoren („PDGFR") bezeichnet, die PDGFRα, PDGFRβ, CSFIR, c-kit und c-fms umfaßt. Diese Rezeptoren bestehen aus glycosylierten extrazellulären Domänen, bestehend aus einer variablen Anzahl an Immunoglobin-artigen Schleifen, und einer intrazellulären Domäne, worin die Tyrosinkinasedomäne durch nicht verwandte Aminosäuresequenzen unterbrochen ist.
Eine andere Gruppe, die aufgrund ihrer Ähnlichkeit zu der PDGFR-Unterfamilie manchmal der letzteren Gruppe zugeordnet wird, ist die Fetale-Leber-Kinase-Rezeptor-Unterfamilie („flk"). Es wird angenommen, daß diese Gruppe aus dem Kinase-Insert-Domain-Receptor-Fetal-Liver-Kinase-1 (KDR/FLK-1, VEGF-R2), flk-1R, flk-4 und fms-like Tyrosinkinase 1 (flt-1) besteht.
Ein weiterer Vertreter der Tyrosinkinase-Wachstumsfaktorrezeptor-Familie ist die Untergruppe der Fibroblasten-Wachstumsfaktorrezeptoren („FGF"-Rezeptoren). Diese Gruppe besteht aus vier Rezeptoren, FGFR1–4, und sieben Liganden, FGF1–7. Obgleich noch nicht ausreichend definiert, scheinen die Rezeptoren aus einer glycosylierten extrazellulären Domäne, enthaltend eine variable Anzahl an Immunoglobin-artigen Schleifen, und einer intrazellulären Domäne, in der die Tyrosinkinasesequenz durch Regionen nicht verwandter Aminosäuresequenzen unterbrochen ist, zu bestehen.
Ein noch anderer Vertreter der Tyrosinkinase-Wachstumsfaktorrezeptor-Familie ist die Untergruppe der vaskulären Endothel-Wachstumsfaktorrezeptoren („VEGF"-Rezeptoren). VEGF ist ein dimeres Glycoprotein ähnlich PDGF, hat jedoch andere biologische Funktionen und Targetzellspezifitäten in-vivo. Genauer gesagt wird angenommen, daß VEGF derzeit eine wichtige Rolle bei der Vaskulogenese und Angiogenese spielt.
Eine vollständigere Auflistung der bekannten RTK-Unterfamilien wird in Plowman et. al., DN&P, 7 (6): 334–339 (1994), durch Verweis aufgenommen, einschließlich der hierin vollständig dargelegten Zeichnungen, beschrieben.
Neben RTKs existiert eine Familie gänzlich intrazellulärer PTKs, die so genannten „Nicht-Rezeptor-Tyrosinkinasen" oder „zellulären Tyrosinkinasen". Die letztere Bezeichnung, abgekürzt „CTK", wird hierin verwendet. CTKs enthalten keine extrazellulären und Transmembrandomänen. Bisher sind über 24 CTKs in 11 Unterfamilien (Src, Frk, Btk, Csk, Abl, Zap70, Fes, Fps, Fak, Jak und Ack) identifiziert worden. Die Src-Unterfamilie scheint bisher die größte Gruppe von CTKs zu sein und umfaßt Src, Yes, Fyn, Lyn, Lck, Blk, Hck, Fgr und Yrk. Für eine genauere Erörterung der CTKs siehe Bolen, Oncogene, 8: 2025–2031 (1993), hierin durch Verweis aufgenommen, einschließlich der hierin vollständig dargelegten Zeichnungen.
Die Serin/Threoninkinasen, STKs, wie CTKs, sind überwiegend intrazellulär, obgleich es einige Rezeptorkinasen vom STK-Typ gibt. STKs sind die verbreitetsten Zytosol-Kinasen; d. h., Kinasen, die ihre Funktion in einem anderen Teil des Zytoplasmas als den zytoplasmischen Organellen und dem Zytoskelett ausüben. Das Zytosol ist die Region innerhalb der Zelle, in der der größte Teil der intermediären metabolischen und biosynthetischen Aktivität der Zelle stattfindet; beispielsweise werden Proteine im Zytosol auf Ribosomen synthetisiert.
RTKs, CTKs und STKs sind alle in zahlreiche pathogene Zustände verwickelt gewesen, die bezeichnenderweise Krebs einschließen. Andere pathogene Zustände, die mit PTKs in Verbindung gebracht worden sind, umfassen ohne Einschränkung Psoriasis, Leberzirrhose, Diabetes, Angiogenese, Restenose, Augenerkrankungen, Rheumatoidarthritis und andere Entzündungskrankheiten, immunologische Störungen, wie die Autoimmunkrankheit, kardiovaskuläre Krankheiten wie Atherosklerose und eine Vielzahl an Nierenkrankheiten.
Im Hinblick auf Krebs beziehen sich zwei der Haupthypothesen, die die übermäßige Zellproliferation, die die Tumorentwicklung fördert, weiter erklären, auf Funktionen, die bekanntermaßen PK-reguliert sind. Das heißt, es ist angedeutet worden, daß das maligne Zellwachstum aus einem Zusammenbruch der Mechanismen, die die Zellteilung und/oder -differenzierung kontrollieren, resultiert. Es ist gezeigt worden, daß Proteinprodukte aus einer Vielzahl von Protoonkogenen in die Signaltransduktionswege involviert sind, die das Zellwachstum und die Zelldifferenzierung regulieren. Diese Proteinprodukte aus Protoonkogenen umfassen die oben erörterten extrazellulären Wachstumsfaktoren, Transmembran-Wachstumsfaktor-PTK-Rezeptoren (RTKs), Zytoplasma-PTKs (CTKs) und Zytosol-STKs.
Im Hinblick auf die scheinbare Verknüpfung zwischen PK-bezogenen zellulären Aktivitäten und einer breiten Vielzahl menschlicher Erkrankungen, ist es keine Überraschung, daß große Bemühungen in einem Ansatz zur Identifizierung von Wegen zur Modulation der PK-Aktivität unternommen worden sind. Einige dieser Bemühungen umfaßten biomimetische Ansätze unter Verwendung großer Moleküle, basierend auf denen, die in die tatsächlichen zellulären Prozesse involviert sind (z. B. mutante Liganden (US-Anmeldg. Nr. 4,966,849); lösliche Rezeptoren und Antikörper (Anmeldg. Nr. WO 94/10202, Kendall and Thomas, Proc. Nat'l Acad. Sci., 90: 10705–09 (1994), Kim, et. al., Nature, 362: 841–844 (1993)); RNA-Liganden (Jelinek, et. al., Biochemistry, 33: 10450–56); Takano, et. al., Mol. Bio. Cell 4: 358A (1993); Kinsella, et. al., Exp. Cell Res. 199: 56–62 (1992); Wright, et. al., J. Cellular Phys., 152: 44857) und Tyrosinkinaseinhibitoren (WO 94/03427; WO 92/21660; WO 91/15495; WO 94/14808; US-Pat. Nr. 5,330,992; Mariani, et. al., Proc. Am. Assoc. Cancer Res., 35: 2268 (1994)).
Des weiteren sind Versuche unternommen worden, kleine Moleküle, die als PK-Inhibitoren agieren, zu identifizieren. Beispielsweise sind bis-monocylische, bicyclische und heterocyclische Arylverbindungen (PCT WO 92/20642), Vinylenazaindolderivate (PCT WO 94/14808) und 1-Cyclopropyl-4-pyridylchinolone (US-Pat. Nr. 5,330,992) als Tyrosikinaseinhibitoren beschrieben worden. Styrylverbindungen (US-Pat. Nr. 5,217,999), Styryl-substituierte Pyridylverbindungen (US-Pat. Nr. 5,302,606), Chinazolinderivate (EP-Anmeldg. Nr. 0 566 266 A1), Selenindole und Selenide (PCT WO 94/03427), tricyclische Polyhydroxylverbindungen (PCT WO 92/21660) und Benzylphosphonsäureverbindungn (PCT WO 91/15495) sind alle als PTK-Inhibitoren beschrieben worden, die bei der Behandlung von Krebs nützlich sind.
Auf Indolinonderivate und ihre vorgesehene Verwendung wird in den folgenden Veröffentlichungen Bezug genommen: US-Patent 5,886,020; internationale Patentanmeldungen WO 98/50356, WO 99/61422 und WO 00/38519 (veröffentlicht am 6. Juli 2000); J. Med. Chem. 1998, 41, 2588–2603. Auf Oxindolderivate und ihre vorgesehene Verwendung wird in den folgenden Veröffentlichungen Bezug genommen: WO 00/35908 (veröffentlicht am 22. Juni 2000). Auf Formulierungen für pharmazeutische Mittel, die als freie Säuren oder freie Basen ionisierbar sind, wird in der folgenden Veröffentlichung Bezug genommen: WO 01/37820 (veröffentlicht am 31. Mai 2001).
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung ist auf bestimmte 3-Pyrrol-substituierte 2-Indolinonverbindungen gerichtet, die PK-modulierende Fähigkeit aufweisen und daher bei der Behandlung von Störungen, die mit abnormaler PK-Aktivität in Verbindung stehen, nützlich sind.
Demgemäß bezieht sich die vorliegende Erfindung in einem Aspekt auf ein 3-Pyrrolsubstituiertes 2-Indolinon der Formel (I):
worin:
R¹ aus Wasserstoff, (C₁-C₄)-Alkyl, -(CH₂)_rR¹ ⁶ und -C(O)NR⁸R⁹ ausgewählt ist;
R² aus Wasserstoff, Halogen, Aryl und -S(O)₂NR¹³R¹⁴ ausgewählt ist;
R³ aus Wasserstoff, (C₁-C₄)-Alkyl, (C₁-C₄)-Alkoxy, Aryl, Heteroaryl und -C(O)R¹ ⁵ ausgewählt ist;
R⁴ Wasserstoff ist;
R⁵ aus Wasserstoff und (C₁-C₄)-Alkyl ausgewählt ist;
R⁶ -C(O)R¹⁰ ist;
R⁷ aus Wasserstoff, (C₁-C₄)-Alkyl und Aryl ausgewählt ist;
R⁸ und R⁹ unabhängig aus Wasserstoff, Alkyl und Aryl ausgewählt sind;
R¹⁰ -N(R¹¹)(CH₂)_nR¹² ist, worin n 1, 2 oder 3 ist, R¹¹ Wasserstoff ist und R¹² aus Hydroxy, (C₁-C₄)-Alkoxy, -C(O)R¹⁵, Heteroaryl und -NR¹³R¹⁴ ausgewählt ist;
R¹³ und R¹⁴ unabhängig aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, (C₁-C₄)-Alkyl, Cycloalkyl, Aryl und Heteroaryl, ausgewählt sind; oder
R¹³ und R¹⁴ unter Bildung einer Heterocyclogruppe verbunden sein können;
R¹⁵ aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, Hydroxy, (C₁-C₄)-Alkoxy und Aryloxy, ausgewählt ist;
R¹⁶ aus Hydroxy und -C(O)R¹⁵ ausgewählt ist; und
r 2 oder 3 ist;
oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon.
In einem zweiten Aspekt ist diese Erfindung auf eine pharmazeutische Zusammensetzung gerichtet, die eine oder mehrere Verbindungen der Formel (I) oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon und einen pharmazeutisch akzeptablen Trägerstoff umfaßt.
In einem dritten Aspekt ist diese Erfindung auf die Verwendung einer Verbindung der Formel (I) oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes davon bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer mit Proteinkinase in Verbindung stehenden Störung in einem Organismus, insbesondere bei Menschen, gerichtet. Solche Störungen umfassen beispielsweise und ohne Einschränkung Krebs, Diabetes, Leberzirrhose, kardiovaskuläre Krankheiten wie Atherosklerose, Angiogenenese, immunologische Krankheiten wie die Autoimmunkrankheit und Lebererkrankungen.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Definitionen
Sofern nicht anders angegeben haben die in der Beschreibung und den Ansprüchen verwendeten Ausdrücke die nachstehend angegebenen Bedeutungen:
„Alkyl" bezieht sich auf einen gesättigten aliphatischen Kohlenwasserstoffrest, der geradkettige und verzweigtkettige Gruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen umfaßt. Beispiele für Alkylgruppen umfassen Methyl, Ethyl, Propyl, 2-Propyl, n-Butyl, iso-Butyl oder tert-Butyl und dergleichen. Die Alkylgruppe ist unsubstituiert.
„Cycloalkyl" bezieht sich auf einen 3- bis 8gliedrigen monocyclischen vollständig aus Kohlenstoff bestehenden Ring, einen kondensierten bicyclischen 5gliedrigen/6gliedrigen oder 6gliedrigen/6gliedrigen vollständig aus Kohlenstoff bestehenden Ring oder eine multicycli sche kondensierte Ringgruppe (unter einem „kondensierten" Ringsystem ist zu verstehen, daß jeder Ring in dem System ein nachbarständiges Paar Kohlenstoffatome mit jedem anderen Ring in dem System teilt), in der ein oder mehrere Ringe eine oder mehrere Doppelbindungen enthalten kann/können, einer der Ringe jedoch ein komplett konjugiertes pi-Elektronensystem aufweist.
Beispiele für Cycloalkylgruppen sind ohne Einschränkung Cyclopropan, Cyclobutan, Cyclopentan, Cyclopenten, Cyclohexan, Cyclohexadien, Adamantan, Cycloheptan, Cycloheptatrien und dergleichen. Die Cycloalkylgruppe ist unsubstituiert.
„Aryl" bezieht sich auf vollständig aus Kohlenstoff bestehende monocyclische oder ringkondensierte polycyclische Gruppen (d. h., Ringe, die nachbarständige Kohlenstoffatompaare teilen) mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen mit einem komplett konjugierten pi-Elektronensystem. Beispiele für Arylgruppen sind ohne Einschränkung Phenyl, Naphthalenyl und Anthracenyl. Die Arylgruppe kann substituiert oder unsubstituiert sein. Sofern substituiert, ist die Arylgruppe mit ein oder zwei Substituenten, unabhängig ausgewählt aus Halogen, Alkyl, Trihalogenalkyl, Hydroxy, Mercapto, Cyano, N-Amido, Mono- oder Dialkylamino, Carboxy oder N-Sulfonamido, substituiert.
„Heteroaryl" bezieht sich auf eine Gruppe monocyclischer oder kondensierter Ringe (d. h., Ringe, die nachbarständige Atompaare teilen) mit 5 bis 12 Ringatomen, die ein, zwei oder drei Ringheteroatome, ausgewählt aus N, O oder S, enthalten, wobei die verbleibenden Ringatome C sind, und überdies ein komplett konjugiertes pi-Elektronensystem aufweisen. Beispiele für unsubstituierte Heteroarylgruppen sind ohne Einschränkung Pyrrol, Furan, Thiophen, Imidazol, Oxazol, Thiazol, Pyrazol, Pyridin, Pyrimidin, Chinolin, Isochinolin, Purin und Carbazol. Die Heteroarylgruppe kann substituiert oder unsubstituiert sein. Sofern substituiert, ist die Heteroarylgruppe gegebenenfalls mit einem oder zwei Substituenten, unabhängig ausgewählt aus Halogen, Alkyl, Trihalogenalkyl, Hydroxy, Mercapto, Cyano, N-Amido, Mono- oder Dialkylamino, Carboxy oder N-Sulfonamido, substituiert.
Unter „Heterocyclus" ist ein gesättigter cyclischer Rest mit 3 bis 8 Ringatomen zu verstehen, worin ein oder zwei Ringatome Heteroatome, ausgewählt aus N, O oder S(O)_n (worin n eine ganze Zahl von 0 bis 2 ist), sind, wobei die verbleibenden Ringatome C sind, worin ein oder zwei C-Atome gegebenenfalls durch eine Carbonylgruppe ersetzt sein können. Genauer gesagt umfaßt der Ausdruck Heterocyclyl Tetrahydropyranyl, 2,2-Dimethyl-1,3-dioxolan, Piperidino, N-Methylpiperidin-3-yl, Piperazino, N-Methylpyrrolidin-3-yl, 3-Pyrrolidino, Morpholino, Thiomorpholino, Thiomorpholino-1-oxid, Thiomorpholino-1,1-dioxid, 4-Ethyloxycarbonylpiperazino, 3-Oxopiperazino, 2-Imidazolidon, 2-Pyrrolidinon, 2-Oxohomopiperazino, Tetrahydropyrimidin-2-on und deren Derivate, sind aber nicht darauf beschränkt. Die Heterocyclusgruppe ist gegebenenfalls substituiert mit einem oder zwei Substituenten, unabhängig ausgewählt aus Halogen, Alkyl, Alkyl, substituiert mit Carboxy, oder Ester, Hydroxy, Mono- oder Dialkylamino.
„Hydroxy" bezieht sich auf eine -OH-Gruppe.
„Alkoxy" bezieht sich sowohl auf eine -O-(unsubstituiertes Alkyl)- als auch eine -O-(unsubstituiertes Cycloalkyl)-Gruppe. Repräsentative Beispiele umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Methoxy, Ethoxy, Propoxy, Butoxy, Cyclopropyloxy, Cyclobutyloxy, Cyclopentyloxy, Cyclohexyloxy und dergleichen.
„Aryloxy" bezieht sich sowohl auf eine -O-Aryl- als auch eine -O-Heteroarylgruppe, wie hierin definiert. Repräsentative Beispiele umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Phenoxy, Pyridinyloxy, Furanyloxy, Thienyloxy, Pyrimidinyloxy, Pyrazinyloxy und dergleichen, und deren Derivate.
„Mercapto" bezieht sich auf eine -SH-Gruppe.
„Ester" bezieht sich auf eine -C(O)O-R"-Gruppe, worin R" aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Alkyl, Trihalogenmethyl, Cycloalkyl, gegebenenfalls substituiertem Aryl, gegebenenfalls substituiertem Heteroaryl (gebunden durch einen Ringkohlenstoff).
„Halogen-"gruppe bezieht sich auf Fluor, Chlor, Brom oder Iod, bevorzugt Fluor oder Chlor.
„Trihalogenmethyl-"gruppe bezieht sich auf eine -CX₃-Gruppe, worin X eine Halogengruppe ist, wie hierin definiert.
„Cyano" bezieht sich auf eine -CN-Gruppe.
„N-Sulfonamido" bezieht sich auf eine -NR¹⁸S(O)₂R¹⁹-Gruppe, wobei R¹⁸ und R¹⁹ wie hierin definiert sind.
„N-Amido" bezieht sich auf eine R¹⁹C(O)NR¹⁹-Gruppe, wobei R¹ ⁸ und R¹⁹ wie hierin definiert sind.
R¹⁸ und R¹⁹ sind unabhängig aus Wasserstoff und Alkyl ausgewählt.
Die Ausdrücke „ 2-Indolinon", „Indolin-2-on" und „ 2-Oxindol" werden hierin austauschbar in bezug auf ein Molekül mit der folgenden chemischen Struktur verwendet:
Der Ausdruck „Pyrrol" bezieht sich auf ein Molekül mit der folgenden chemischen Struktur:
Die Ausdrücke „Pyrrol-substituiertes 2-Indolinon" und „ 3-Pyrrolidinyl-2-indolinon" werden hierin austauschbar in bezug auf eine chemische Verbindung mit der in Formel (I) gezeigten allgemeinen Struktur verwendet.
Verbindungen, die dieselbe molekulare Formel haben, sich aber im Wesen und der Bindungsfolge ihrer Atome oder der Anordnung ihrer Atome im Raum unterscheiden, werden „Isomere" genannt. Isomere, die sich in bezug auf die Anordnung ihrer Atome im Raum unterscheiden, werden „Stereoisomere" genannt. Stereoisomere, die keine Spiegelbilder voneinander sind, werden „Diastereomere" genannt und die, die keine deckungsgleichen Spiegelbilder voneinander sind, werden „Enantiomere" genannt. Hat eine Verbindung ein asymmetrisches Zentrum, ist sie beispielsweise an vier unterschiedliche Gruppen gebunden, ist ein Paar von Enantiomeren möglich. Ein Enantiomer kann durch die absolute Konfiguration seines asymmetrischen Zentrums gekennzeichnet sein, und wird durch die R- und S-Sequenzregeln von Cahn und Prelog oder durch die Art und Weise, in der das Molekül die Ebene von polarisiertem Licht dreht, beschrieben und als rechtsdrehend oder linksdrehend (d. h., als (+)- bzw. (–)-Isomere) bezeichnet. Eine chirale Verbindung kann entweder als ein einzelnes Enantiomer oder als ein Gemisch davon vorliegen. Ein Gemisch, enthaltend gleiche Anteile der Enantiomere, wird „racemisches Gemisch" genannt.
Die Verbindungen dieser Erfindung können ein oder mehrere asymmetrische Zentren besitzen; solche Verbindungen können daher als einzelne (R)- oder (S)-Stereoisomere oder als Gemische davon hergestellt werden. Sofern nicht anders angegeben, soll die Beschreibung oder Namensgebung einer bestimmten Verbindung in der Beschreibung und den Ansprüchen sowohl einzelne Enantiomere und Gemische, racemisch oder anderweitig, davon umfassen. Die Verfahren zur Bestimmung der Stereochemie und der Trennung von Stereoisomeren sind in der Technik allgemein bekannt (siehe Erörterung in Kapitel 4 von „Advanced Organic Chemistry", 4. Aufl., J. March, John Wiley and Sons, New York, 1992).
Die Verbindungen der Formel (I) können das Phänomen von Tautomerie und struktureller Isomerie zeigen. Beispielsweise können die hierin beschriebenen Verbindungen eine E- oder Z-Konfiguration über die Doppelbindung, die die 2-Indolinoneinheit mit der Pyrroleinheit verbindet, annehmen, oder sie können ein Gemisch aus E und Z sein. Diese Erfindung umfaßt jede tautomere oder strukturell isomere Form und Gemische davon, die die Fähigkeit besitzt, RTK-, CTK- und/oder STK-Aktivität zu modulieren, und ist nicht auf eine tautomere oder strukturell isomere Form beschränkt.
Eine „pharmazeutische Zusammensetzung" bezieht sich auf ein Gemisch aus einer oder mehreren der hierin beschriebenen Verbindungen oder physiologisch/pharmazeutisch akzeptabler Salze oder Prodrugs davon, mit anderen chemischen Komponenten wie physiologisch/pharmazeutisch akzeptablen Trägern und Bindemitteln. Der Zweck einer pharmazeutischen Zusammensetzung ist es, die Verabreichung einer Verbindung an einen Organismus zu erleichtern.
Die Verbindung der Formel (I) kann auch als ein Prodrug dienen. Ein „Prodrug" bezieht sich auf ein Mittel, das in-vivo in das Stammarzneimittel umgewandelt wird. Prodrugs sind oftmals nützlich, da sie in einigen Situationen leichter zu verabreichen sind als das Stammarzneimittel. Sie können zum Beispiel durch orale Verabreichung bioverfügbar sein, was das Stammarzneimittel andererseits nicht ist. Das Prodrug kann gegenüber dem Stammarzneimittel in pharmazeutischen Zusammensetzungen auch besser löslich sein. Ein Beispiel eines Prodrugs wäre ohne Einschränkung eine Verbindung der vorliegenden Erfindung, die als ein Ester (das „Prodrug") verabreicht wird, um die Übermittlung durch eine Zellmembran zu erleichtern, wo Wasserlöslichkeit für die Mobilität schädlich ist, dann aber in der Zelle metabolisch in eine Carbonsäure, die aktive Komponente, hydrolysiert wird, wo die Wasserlöslichkeit von Vorteil ist.
Ein weiteres Beispiel für ein Prodrug kann ein kurzes Polypeptid sein, zum Beispiel, ohne Einschränkung darauf, ein Polypeptid aus 2–10 Aminosäuren, gebunden mittels einer terminalen Aminogruppe an eine Carboxygruppe einer Verbindung dieser Erfindung, worin das Polypeptid in-vivo hydrolysiert oder metabolisiert wird, um so das aktive Molekül freizusetzen. Die Prodrugs einer Verbindung der Formel (I) liegen im Umfang dieser Erfindung.
Überdies wird in Betracht gezogen, daß eine Verbindung der Formel (I) durch Enzyme im Körper des Organismus wie dem des Menschen unter Erzeugung eines Metaboliten, der die Aktivität der Proteinkinasen modulieren kann, metabolisiert wird. Solche Metabolite liegen im Umfang der vorliegenden Erfindung.
Wie hierin verwendet bezieht sich ein „physiologisch/pharmazeutisch akzeptabler Träger" auf einen Träger oder ein Verdünnungsmittel, der/das keine signifikante Irritation für einen Organismus hervorruft und die biologische Aktivität und Eigenschaften der verabreichten Verbindung nicht aufhebt.
Ein „pharmazeutisch akzeptables Bindemittel" bezieht sich auf eine inerte Substanz, die einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur weiteren Erleichterung der Verabreichung einer Verbindung zugegeben wird. Beispiele für Bindemittel umfassen ohne Einschränkung darauf Calciumcarbonat, Calciumphosphat, verschiedene Zucker und Arten von Stärke, Cellulosederivate, Gelatine, pflanzliche Öle und Polyethylenglycole.
Wie hierin verwendet bezieht sich „pharmazeutisch akzeptables Salz" auf die Salze, die die biologische Wirksamkeit und Eigenschaften der Stammverbindung erhalten. Solche Salze umfassen:

(i) Säureadditionssalz, erhalten durch die Umsetzung der freien Base der Stammverbindung mit anorganischen Säuren wie Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Salpetersäure, Phosphorsäure, Schwefelsäure und Perchlorsäure und dergleichen, oder mit organischen Säuren wie Essigsäure, Oxalsäure, (D)- oder (L)-Äpfelsäure, Maleinsäure, Methansulfonsäure, Ethansulfonsäure, p-Toluolsulfonsäure, Salicylsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Bernsteinsäure oder Malonsäure und dergleichen, bevorzugt Salzsäure oder (L)-Äpfelsäure wie das L-Malatsalz von 5-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylaminoethyl)amid; oder
(ii) Salze, gebildet, wenn ein saures Proton in der Stammverbindung entweder durch ein Metallion, z. B. ein Alkalimetallion, ein Erdalkalimetallion oder ein Aluminiumion, ersetzt wird, oder mit einer organischen Base wie Ethanolamin, Diethanolamin, Triethanolamin, Tromethamin, N-Methylglucamin und dergleichen koordiniert.

„PK" bezieht sich auf Rezeptorprotein-Tyrosinkinasen (RTKs), Nicht-Rezeptor- oder „zelluläre" Tyrosinkinasen (CTKs) und Serin-Threoninkinasen (STKs).
„Verfahren" bezieht sich auf Weisen, Mittel, Techniken und Vorgänge zur Erfüllung einer gegebenen Aufgabe, einschließlich, aber ohne Einschränkung auf die Weisen, Mittel, Techniken und Vorgänge die entweder bekannt sind oder ohne weiteres aus bekannten Weisen, Mitteln, Techniken und Vorgängen und Verfahren von praktizierenden Chemikern, Pharmazeutikern, Biologen, Biochemikern und Medizinern entwickelt werden können.
„Modulierung" oder „Modulieren" bezieht sich auf die Veränderung der katalytischen Aktivität von RTKs, CTKs und STKs. Insbesondere bezieht sich modulieren auf die Aktivierung der katalytischen Aktivität von RTKs, CTKs und STKs, bevorzugt die Aktivierung oder Inhibierung der katalytischen Aktivität von RTKs, CTKs und STKs, in Abhängigkeit der Konzentration der Verbindung oder des Salzes, denen die RTK, CTK oder STK ausgesetzt ist oder stärker bevorzugt die Inhibierung der katalytischen Aktivität von RTKs, CTKs und STKs.
„Katalytische Aktivität" bezieht sich auf die Phosphorylierungsrate von Tyrosin unter dem direkten oder indirekten Einfluß von RTKs und/oder CTKs oder die Phosphorylierung von Serin und Threonin unter dem direkten oder indirekten Einfluß von von STKs.
„Kontaktierung" bezieht sich auf das Inkontaktbringen einer Verbindung dieser Erfindung und einer Ziel-PK auf eine Art und Weise, daß die Verbindung die katalytische Aktivität der PK, entweder direkt, d. h., durch die Interaktion mit der Kinase selbst, oder indirekt, d. h., durch die Interaktion mit einem anderen Molekül, von dem die katalytische Aktivität der Kinase abhängt, beeinflussen kann. Eine solche „Kontaktierung" kann „in-vitro", d. h., in einem Teströhrchen, einer Petrischale oder dergleichen bewirkt werden. In einem Teströhrchen kann die Kontaktierung auch nur eine Verbindung und eine in Frage kommende PK oder ganze Zellen umfassen. Zellen können auch in Zellkulturschalen gehalten und herangezogen werden und mit einer Verbindung in dieser Umgebung kontaktiert werden. In diesem Zusammenhang kann die Fähigkeit einer bestimmten Verbindung, eine PK-bezogene Störung zu beeinflussen, das heißt, der IC₅₀ der Verbindung, nachstehend definiert, bestimmt werden, bevor eine Verwendung der Verbindungen in-vivo mit komplexeren lebenden Organismen ausprobiert wird. Für Zellen außerhalb des Organismus existieren mehrere Verfahren, die einem Fachmann allgemein bekannt sind, mit denen die PKs mit den Verbindungen in Kontakt gebracht werden können, einschließlich, aber nicht beschränkt auf direkte Zellmikroinjektion und zahlreiche Transmembranträgertechniken.
„In-vitro" bezieht sich auf Verfahren, die in einer künstlichen Umgebung durchgeführt werden, wie beispielsweise in einem Teströhrchen oder einem Kulturmedium, sind aber nicht darauf beschränkt.
„In-vivo" bezieht sich auf Verfahren, die in einem lebenden Organismus durchgeführt werden, wie einer Maus, einer Ratte oder einem Kaninchen, sind aber nicht darauf beschränkt.
„PK-bezogene Störung", „PK-gesteuerte Störung" und „abnormale PK-Aktivität" beziehen sich alle auf einen Zustand, der durch unangemessene, d. h., katalytische PK-Unteraktivität oder üblicher PK-Überaktivität gekennzeichnet ist, wobei die betreffende PK eine RTK, CTK oder STK sein kann. Eine unangemessene katalytische Aktivität kann im Ergebnis entweder: (1) PK-Expression in Zellen, die normalerweise keine PKs exprimieren, (2) gesteigerte PK- Expression, die zu unerwünschter Zellproliferation, -differenzierung und/oder -wachstum führt, oder (3) verringerte PK-Expression, die zu unerwünschten Verringerungen der Zellproliferation, -differenzierung und/oder -wachstum führt, entstehen. Überaktivität einer PK bezieht sich entweder auf die Amplifizierung des Gens, das eine bestimmte PK kodiert, oder die Erzeugung eines Niveaus an PK-Aktivität, das mit einer Zellproliferations-, -differenzierungs- und/oder -wachstumsstörung korreliert (das heißt, wenn das Niveau der PK steigt, verstärkt sich die Schwere eines oder mehrerer der Symptome der zellulären Störung). Unteraktivität ist natürlich das Gegenteil, wobei die Schwere von einem oder mehreren Symptomen einer zellulären Störung steigt, wenn das Niveau der PK-Aktivität sinkt.
„Behandelt", „Behandeln" und „Behandlung" beziehen sich auf Verfahren zur Linderung oder Aufhebung einer PK-vermittelten zellulären Störung und/oder ihrer Begleitsymptome. Insbesondere in bezug auf Krebs bedeuten diese Ausdrücke einfach nur, daß die Lebenserwartung eines von Krebs befallenen Individuums steigen wird, oder daß ein oder mehrere Symptome dieser Krankheit verringert werden.
„Organismus" bezieht sich auf irgendein Lebewesen, das mindestens aus einer Zelle besteht. Ein lebender Organismus kann zum Beispiel so einfach wie eine einzelne eukariotische Zelle oder so komplex wie ein Säuger, einschließlich eines Menschen, sein.
„Therapeutisch wirksame Menge" bezieht sich auf die Menge der zu verabreichenden Verbindung, die zu einem gewissen Ausmaß ein oder mehrere Symptome der zu behandelnden Störung lindert. Bezogen auf die Behandlung von Krebs bezieht sich eine therapeutisch wirksame Menge auf die Menge, die folgendermaßen wirkt:

(1) die Größe des Tumors verringert;
(2) Tumormetastasen inhibiert (das heißt, diese in einem gewissen Ausmaß verlangsamt, bevorzugt stoppt);
(3) das Tumorwachstum in einem gewissen Ausmaß inhibiert (das heißt, dies in einem gewissen Ausmaß verlangsamt, bevorzugt stoppt) und/oder,
(4) ein oder mehrere Symptome, die mit Krebs in Verbindung stehen, zu einem gewissen Ausmaß lindert (oder bevorzugt eliminiert).

„Überwachung" bedeutet die Beobachtung oder den Nachweis der Wirkung der Kontaktierung einer Verbindung mit einer Zelle, die eine bestimmte PK exprimiert. Die beobachtete oder detektierte Wirkung kann eine Veränderung des Zellphenotyps, der katalytischen Aktivität einer PK oder eine Veränderdung der Interaktion einer PK mit einem natürlichen Bindungspartner sein. Techniken zur Beobachtung oder Detektion solcher Wirkungen sind in der Technik allgemein bekannt.
Die angesprochene Wirkung ist ausgewählt aus einer Veränderung oder keiner Veränderung des Zellphenotyps, einer Veränderung oder keiner Veränderung der katalytischen Aktivität der Proteinkinase oder einer Veränderung oder keiner Veränderung der Interaktion der Proteinkinase mit einem natürlichen Bindungspartner in einem letzten Aspekt dieser Erfindung.
„Zellphenotyp" bezieht sich auf die äußerliche Erscheinung einer Zelle oder eines Gewebes oder die biologische Funktion der Zelle oder des Gewebes. Beispiele für einen Zellphenotyp sind Zellgröße, Zellwachstum, Zellproliferation, Zelldifferenzierung, Zellüberleben, Apoptose und Nährstoffaufnahme und Verwendung, jedoch ohne Beschränkung darauf. Solche phenotypischen Merkmale sind durch in der Technik allgemein bekannte Techniken meßbar.
„Natürlicher Bindungspartner" bezieht sich auf ein Polypeptid, das an eine bestimmte PK in einer Zelle bindet. Natürliche Bindungspartner können eine Rolle bei der Verbreitung eines Signals in einem PK-vermittelten Signaltransduktionsprozeß spielen. Eine Veränderung der Interaktion des natürlichen Bindungspartners mit der PK kann sich selbst als eine höhere oder geringere Konzentration des PK/Natürlicher Bindungspartner-Komplexes und infolgedessen, in einer beobachtbare Veränderung der Fähigkeit der PK, die Signaltransduktion zu vermitteln, manifestieren.
Repräsentative Verbindungen der vorliegenden Erfindung werden in der nachstehenden Tabelle I gezeigt.
Die Nummern der Verbindungen entsprechen den Nummern der Beispiele im Beispielabschnitt. Daß heißt, die Synthese von Verbindung 1 in Tabelle 1 wird in Beispiel 1 beschrieben. Die in Tabelle 1 dargestellten Verbindungen sind nur beispielhaft und sollen den Umfang dieser Erfindung in keinster Weise einschränken.
BEVORZUGTE AUSFÜHRUNGSFORMEN
Während die breiteste Definition in der Zusammenfassung der Erfindung dargelegt wird, sind bestimmte Verbindungen der Formel (I), die nachstehend dargelegt werden, bevorzugt.

(1) Eine bevorzugte Gruppe von Verbindungen der Formel (I) ist die, worin R¹, R³ und R⁴ Wasserstoff sind.
(2) Eine weitere bevorzugte Gruppe von Verbindungen der Formel (I) ist die, worin R¹, R² und R⁴ Wasserstoff sind.
(3) Eine weitere bevorzugte Gruppe von Verbindungen der Formel (I) ist die, worin R¹, R² und R³ Wasserstoff sind.
(4) Eine weitere bevorzugte Gruppe von Verbindungen der Formel (I) ist die, worin R², R³ und R⁴ Wasserstoff sind.
(5) Eine weitere bevorzugte Gruppe von Verbindungen der Formel (I) ist die, worin R¹, R², R³ und R⁴ Wasserstoff sind.
(6) Eine weitere, noch stärker bevorzugte Gruppe von Verbindungen der Formel (I) ist die, worin: R¹ Wasserstoff, Alkyl, -C(O)NR⁸R⁹, vorzugsweise Wasserstoff oder Methyl, insbesondere Wasserstoff, ist; R² Wasserstoff, Chlor, Brom, Fluor, Phenyl, Dimethylaminosulfonyl, 3-Chlorphenylaminosulfonyl, Aminosulfonyl, Methylaminosulfonyl, Phenylaminosulfonyl, Pyridin-3-yl-aminosulfonyl, Dimethylaminosulfonyl, Isopropylamino-sulfonyl, vorzugsweise Wasserstoff, Fluor oder Brom, ist; R³ Wasserstoff, Methoxy, Carboxy, Phenyl, Pyridin-3-yl, 3,4-Dichlorphenyl, 4-n-Butylphenyl, 3-Isopropylphenyl, vorzugsweise Wasserstoff oder Phenyl, ist; und R⁴ Wasserstoff ist.

In der obigen bevorzugten Gruppe (6) ist eine stärker bevorzugte Gruppe von Verbindungen die, worin: R⁵ Wasserstoff, Methyl, Ethyl, Isopropyl, tert-Butyl, Isobutyl oder n-Butyl, vorzugsweise Wasserstoff oder Methyl, ist; und R⁷ Wasserstoff, Methyl, Ethyl, Isopropyl, n-, Iso- oder tert-Butyl, Phenyl, vorzugsweise Methyl, Wasserstoff oder Phenyl, ist.
(7) Eine weitere gegenwärtig bevorzugte Ausführungsform dieser Erfindung ist eine Verbindung mit einer Struktur, wie oben beschrieben, worin R¹³ und R¹⁴ unabhängig aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus Wasserstoff, Alkyl, Heteroaryl und, kombiniert, -(CH₂)₄-, -(CH₂)₅-, -(CH₂)₂O(CH₂)₂- oder -(CH₂)₂N(CH₃)(CH₂)₂-.

NUTZEN
Die PKs, deren katalytische Aktivität von den Verbindungen dieser Erfindung moduliert wird, umfassen Protein-Tyrosinkinasen, von denen es zwei Arten gibt, Rezeptortyrosinkinasen (RTKs) und zelluläre Tyrosinkinasen (CTKs), und Serin-Threoninkinasen (STKs). Die RTK-vermittelte Signaltransduktion wird durch die extrazelluläre Interaktion mit einem spezifischen Wachstumsfaktor (Ligand) initiiert, gefolgt von der Rezeptordimerisierung, vorübergehender Stimulierung der intrinsischen Protein-Tyrosinkinase-Aktivität und Phosphorylierung. Dadurch werden Bindungsstellen für intrazelluläre Signaltransduktionsmoleküle erzeugt, die zur Bildung von Komplexen mit einem Spektrum zytoplasmischer Signalmoleküle führen, die die entsprechende Zellantwort erleichtern (z. B. Zellteilung, metabolische Wirkungen auf die extrazelluläre Mikroumgebung usw.). Siehe, Schlessinger und Ullrich, 1992, Neuron 9: 303–391.
Es ist gezeigt worden, daß Tyrosinphosphorylierungsstellen auf Wachstumsfaktorrezeptoren als hochaffine Bindungsstellen für SH2-Domänen (src-Homologie) von Signalmolekülen fungieren. Fantl et. al., 1992, Cell 69: 413–423, Songyang et. al., 1994, Mol. Cell. Biol. 14: 2777–2785, Songyang et. al., 1993, Cell 72: 767–778, und Koch et. al., 1991, Science 252: 668–678. Mehrere intrazelluläre Substratproteine, die mit RTKs assoziieren, sind identifiziert worden. Diese können in zwei Hauptgruppen unterteilt werden: (1) Substrate, die eine katalytische Domäne aufweisen, und (2) Substrate, denen eine solche Domäne fehlt, die aber als Adapter dienen und mit katalytisch aktiven Molekülen assoziieren. Songyang et al., 1993, Cell 72: 767–778. Die Spezifität der Interaktionen zwischen Rezeptoren und SH2-Domänen ihrer Substrate wird durch die Aminosäurereste, die den phosphorylierten Tyrosinrest unverzüglich umgeben, bestimmt. Differenzen in den Bindungsaffinitäten zwischen SH2-Domänen und den Aminosäuresequenzen, die die Phosphotyrosinreste auf bestimmten Rezeptoren umgeben, stimmen mit den beobachteten Differenzen in ihren Substratphosphorylierungsprofilen überein. Songyang et. al., 1993, Cell 72: 767–778. Die Beobachtungen lassen darauf schließen, daß die Funktion jeder RTK nicht nur durch ihr Expressionsmuster und die Ligandenverfügbarkeit, sondern auch durch die Anordnung der nachgeordneten Signaltransduktionswege, die von einem bestimmten Rezeptor aktiviert werden, bestimmt wird. Daher liefert die Phosphorylierung einen wichtigen Regulierungsschritt, der die Selektivität von Signalwegen, die von speziellen Wachstumsfaktorrezeptoren sowie Differenzierungsfaktorrezeptoren rekrutiert werden, bestimmt.
STKs, die überwiegend zytosolisch sind, beeinflussen die interne Biochemie der Zelle, oftmals als eine nachgeordnete Antwort auf ein PTK-Ereignis. STKs sind am Signalgebungsprozeß beteiligt gewesen, der die DNA-Synthese und die anschließend Mitose initiiert, was zur Zellproliferation führt.
Daher führt die PK-Signaltransduktion, abgesehen von anderen Reaktionen, zur Zellproliferation, -differenzierung, -wachstum und -metabolismus. Abnormale Zellproliferation kann zu einer Vielzahl von Störungen und Krankheiten führen, einschließlich der Entwicklung von Neoplasie wie Karzinom, Sarkom, Glioblastom und Hämangiom, Störungen wie Leukämie, Psoriasis, Arteriosklerose, Arthritis und diabetischer Retinopathie, und anderen Störungen, die mit unkontrollierter Angiogenese und/oder Vaskulogenese in Verbindung stehen.
Zur Praktizierung der vorliegenden Erfindung ist ein genaues Verständnis des Mechanismus, durch den die Verbindungen dieser Erfindung PKs inhibieren, nicht erforderlich. Ohne sich jedoch hierdurch an einen bestimmten Mechanismus oder eine bestimmte Theorie binden zu wollen, wird angenommen, daß die Verbindungen mit den Aminosäuren in der katalytischen Region der PKs interagieren. PKs besitzen typischerweise eine bilobäre Struktur, in der ATP scheinbar an den Spalt zwischen den beiden Lobi einer Region, wo die Aminosäuren unter PKs konserviert sind, binden. Es wird angenommen, daß Inhibitoren der PKs durch nicht-kovalente Interaktionen wie Wasserstoffbindung, Van-der-Waals-Kräfte und ionische Interaktionen in derselben gemeinsamen Region, in der das vorgenannte ATP an die PKs bindet, binden. Genauer gesagt glaubt man, daß die 2-Indolinonkomponente der Verbindungen dieser Erfindung in dem gemeinsamen Raum, der normalerweise vom Adeninring von ATP eingenommen wird, bindet. Die Spezifität eines bestimmten Moleküls für eine bestimmte PK kann dann als ein Ergebnis zusätzlicher Interaktionen zwischen den verschiedenen Substituenten an dem 2-Indolinonkern und den Aminosäuredomänen, die für bestimmte PKs spezifisch sind, hervorgehen. Daher können unterschiedliche Indolinonsubstituenten an der bevorzugten Bindung an bestimmte PKs beteiligt sein. Die Fähigkeit zur Auswahl von Verbindungen, die an unterschiedlichen ATP-(oder anderen Nukleotid-)Bindungsstellen aktiv sind, macht die Verbindungen dieser Erfindung zur Targetierung irgendeines Proteins mit einer solchen Stelle nützlich. Die hierin offenbarten Verbindungen sind daher in In-vitro-Assays für solche Proteine von Nutzen, und zeigen zudem in-vivo therapeutische Wirkungen durch die Interaktion mit solchen Proteinen.
Überdies liefern die Verbindungen der vorliegenden Erfindung einen therapeutischen Ansatz zur Behandlung vieler Arten fester Tumore, einschließlich, aber ohne Beschränkung auf Karzinome, Sarkome, einschließlich Kaposi-Sarkom, Erythroblastom, Glioblastom, Meningiom, Astrozytom, Melanom und Myoblastom. Die Behandlung oder Vorbeugung von nicht solidem Tumorkrebs wie Leukämie werden von dieser Erfindung ebenso erfaßt. Indikationen können Gehirnkrebs, Blasenkrebs, Eierstockkrebs, Magenkrebs, Pankreaskrebs, Darmkrebs, Blutkrebs, Lungenkrebs und Knochenkrebs umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt.
Weitere Beispiele für Arten von Störungen, die mit einer unangemessenen PK-Aktivität verbunden sind, bei denen die hierin beschriebenen Verbindungen nützlicherweise zur Verhinde rung, Behandlung und Untersuchung verwendet werden können, sind Zellproliferationsstörungen, fibrotische Störungen und metabolische Störungen, sind aber nicht darauf beschränkt.
Zellproliferative Störungen, die durch die vorliegende Erfindung verhindert, behandelt oder weiter untersucht werden können, umfassen Krebs, proliferative Störungen der Blutgefäße und proliferative Störungen von Mesangiumzellen.
Proliferative Störungen der Blutgefäße beziehen sich auf Störungen, die mit abnormaler Vaskulogenese (Blutgefäßbildung) und Angiogenese (Verbreitung der Blutgefäße) verbunden sind. Während Vaskulogenese und Angiogenese wichtige Rollen in einer Vielzahl normaler physiologischer Prozesse wie der Embryoentwicklung, Gelbkörperbildung, Wundheilung und Organregeneration spielen, spielen sie auch eine Schlüsselrolle bei der Krebsentwicklung, wo sie zur Bildung neuer Kapillaren führen, die zur Lebenderhaltung eines Tumors notwendig sind. Andere Beispiele für proliferative Störungen der Blutgefäße umfassen Arthritis, wo neue Kapillarblutgefäße in das Gelenkt eindringen und den Knorpel zerstören, und Augenerkrankungen wie diabetische Retinopathie, wo neue Kapillaren in der Retina in den Glaskörper eindringen, bluten und zur Erblindung führen.
Zwei strukturell verwandte RTKs binden nachgewiesenermaßen VEGF mit einer hohen Affinität: der fms-like Tyrosin 1-Rezeptor (fit-1) (Shibuya et. al., 1990, Oncogene, 5: 519–524; De Vries et. al., 1992, Science, 255: 989–991) und der KDR/FLK-1-Rezeptor, auch bekannt als VEGF-R2. Es ist berichtet worden, daß der vaskuläre Endothel-Wachstumsfaktor (VEGF) ein Endothelzellen-spezifisches Mitogen mit In-vitro-Endothelzellwachstums-fördernder Aktivität ist. Ferrara & Henzel, 1989, Biochein. Biophys. Res. Comm., 161: 851–858; Vaisman et. al., 1990, J. Biol. Chem., 265: 19461–19566. Die in US-Anmeldung Ser.-Nr. 08/193,829, 08/038,596 und 07/975,750 gelieferten Informationen lassen eindeutig darauf schließen, daß VEGF nicht nur für die Endothelzellproliferation verantwortlich ist, sondern auch der Hauptregulator normaler und pathologischer Angiogenese ist. Siehe allgemein Klagsburn & Soker, 1993, Current Biology, 3 (10) 699–702; Houck, et. al., 1992, J. Biol. Chem., 267: 26031–26037.
Normale Vaskulogenese und Angiogenese spielen wichtige Rollen in einer Vielzahl physiologischer Prozesse wie der Embryoentwicklung, der Wundheilung, der Organregeneration und weiblicher Reproduktionsprozesse wie der Follikelentwicklung im Gelbkörper während der Ovulation und dem Plazentawachstum nach einer Schwangerschaft. Folkman & Shing, 1992, J. Biological Chem., 267 (16): 10931–34. Unkontrollierte Vaskulogenese und/oder Angiogenese ist mit Krankheiten wie Diabetes sowie mit malignen soliden Tumoren, die für ihr Wachstum auf Vaskularisation angewiesen sind, in Verbindung gebracht worden. Klagsburn & Soker, 1993, Current Biology, 3 (10): 699–702; Folkham, 1991, J. Natl. Cancer Inst., 82: 4–6; Weidner, et. al., 1991, New Engl. J. Med., 324: 1–5.
Die mutmaßliche Rolle von VEGF bei der Endothelzellproliferation und -migration während Angiogenese und Vaskulogenese kennzeichnet eine wichtige Rolle für den KDR/FLK-1-Rezeptor in diesen Prozessen. Krankheiten wie Diabetes mellitus (Folkman, 198, in XI. Congress of Thrombosis and Haemostasis (Verstraeta, et. al., Hrsg.), S. 583–596, Leuven University Press, Leuven) und Arthritis, sowie malignes Tumorwachstum können aus unkontrollierter Angiogenese resultieren. Siehe z. B. Folkman, 1971, N. Engl. J. Med., 285: 1182–1186. Die Rezeptoren, an die VEGF spezifisch bindet, sind ein wichtiges und bedeutendes therapeutisches Ziel für die Regulierung und Modulierung von Vaskulogenese und/oder Angiogenese und einer Vielzahl von schweren Krankheiten, die abnormales zelluläres Wachstum, das durch diese Prozesse verursacht wird, umfassen. Plowman, et. al., 1994, DN&P, 7 (6): 334–339. Insbesondere die hochspezifische Rolle des KDR/FLK-1-Rezeptors bei der Neovaskularisation macht ihn zu einem Wahlziel therapeutischer Ansätze zur Behandlung von Krebs und anderen Krankheiten, die die unkontrollierte Bildung von Blutgefäßen umfassen.
Daher liefert die vorliegende Erfindung Verbindungen, die die Tyrosinkinasesignaltransduktion, einschließlich der KDR/FLK-1-Rezeptorsignaltransduktion, zur Inhibierung oder Förderung der Angiogenese und/oder Vaskulogenese regulieren und/oder modulieren können, das heißt, Verbindungen, die das Signal, transduziert durch KDR/FLK-1, bei der Aktivierung durch Liganden wie VEGF inhibieren, verhindern oder mit diesem interferieren. Obgleich davon ausgegangen wird, daß die Verbindungen der vorliegenden Erfindung auf einen Rezeptor oder eine andere Komponente entlang des Tyrosinkinasesignaltransduktionsweges einwirken, können sie auch direkt auf die Tumorzellen, die aus einer unkontrollierten Angiogenese resultieren, wirken.
Obgleich sich die Nomenklatur der Mensch- und Maus-Pendants des generischen „flk-I"-Rezeptors unterscheidet, sind sie in vielen Gesichtspunkten austauschbar. Der Mausrezeptor, Flk-1, und sein menschliches Pendant, KDR, teilen sich eine Sequenzhomologie von 93,4 innerhalb der intrazellulären Domäne. Dem ähnlich bindet Maus-FLK-I humanes VEGF mit derselben Affinität wie Maus-VEGF und wird dementsprechend durch den Liganden, der aus einer der beiden Spezies stammt, aktiviert. Millauer et. al., 1993, Cell, 72: 835–846; Quinn et. al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7533–7537. FLK-1 assoziiert auch mit menschlichen RTK-Substraten und Tyrosin phosphoryliert diese danach (z. B. PLC-γ oder p85), wenn sie in 293-Zellen coexprimiert werden (humane embryonale Nierenfibroblasten).
Modelle, die sich auf den FLK-1-Rezeptor verlassen, sind daher direkt zum Verständnis des KDR-Rezeptors anwendbar. Beispielsweise ist die Verwendung des Maus-FLK-1-Rezeptors in Verfahren, die Verbindungen identifizieren, die den Maus-Signaltransduktionsweg regulieren, direkt für die Identifikation von Verbindungen, die zur Regulierung des humanen Signaltransduktionsweges verwendet werden, das heißt, die Aktivität in Verbindung mit dem KDR-Rezeptor regulieren, anwendbar. Daher können chemische Verbindungen, die als In-vitro-Inhibitoren von KDR/FLK-1 identifiziert worden sind, in geeigneten In-vivo-Modellen bestätigt werden. Es ist demonstriert worden, daß sowohl In-vivo-Maus- als auch -Ratten-Tiermodelle zur Überprüfung des klinischen Potentials von Mitteln, die auf den KDR/FLK-1-induzierten Signaltransduktionsweg wirken, überaus wertvoll sind.
Daher liefert die vorliegende Erfindung Verbindungen, die Vaskulogenese und/oder Angiogenese regulieren, modulieren und/oder inhibieren, indem sie die enzymatische Aktivität des KDR/FLK-1-Rezeptors beeinflussen und mit dem von KDR/FLK-1 transduzierten Signal interferieren. Daher liefert die vorliegende Erfindung einen therapeutischen Ansatz zur Behandlung vieler Arten solider Tumore, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Glioblastom, Melanom und Kaposi-Sarkom und Eierstock-, Lungen-, Brust-, Prostata-, Pankreas-, Darm- und Epidermoidkarzinom. Überdies lassen die Daten darauf schließen, daß die Verabreichung von Verbindungen, die den KDR/Flk-1-vermittelten Signaltransduktionsweg inhibieren, auch bei der Behandlung von Hämangiom, Restenose und diabetischer Retinopathie genutzt werden kann.
Ferner bezieht sich diese Erfindung auf die Inhibierung von Vaskulogenese und Angiogenese durch andere Rezeptor-vermittelte Wege, einschließlich des Weges, der den flt-1-Rezeptor umfaßt.
Rezeptor-Tyrosinkinase-vermittelte Signaltransduktion wird durch die extrazelluläre Interaktion mit einem speziellen Wachstumsfaktor (Ligand) initiiert, gefolgt von Rezeptordimerisierung, vorübergehender Stimulierung der intrinsischen Protein-Tyrosinkinase-Aktivität und Autophosphorylierung. Dabei werden Bindungsstellen für intrazelluläre Signaltransduktionsmoleküle erzeugt, die zur Bildung von Komplexen mit einem Spektrum zytoplasmischer Signalmoleküle führen, die die entsprechende Zellantwort erleichtern (z. B. Zellteilung, metabolische Wirkungen auf die extrazelluläre Mikroumgebung usw.). Siehe Schlessinger und Ullrich, 1992, Neuron, 9: 1–20.
Die enge Homologie der intrazellulären Regionen von KDR/FLK-1 mit der des PDGF-β-Rezeptors (50,3 % Homologie) und/oder des verwandten flt-1-Rezeptors kennzeichnet die Induktion überlappender Signaltransduktionswege. Beispielsweise ist für den PDGF-β-Rezeptor gezeigt worden, daß Mitglieder der src-Familie (Twamley et. al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7696–7700), Phosphatidylinositol-3'-kinase (Hu et al., 1992, Mol. Cell. Biol., 12: 981–990), Phospholipase cγ (Kashishian & Cooper, 1993, Mol. Cell. Biol., 4: 49–51), ras-GTPase-Aktivierungsprotein, (Kashishian et. al., 1992, EMBO J., 11: 1373–1382), PTP-ID/syp (Kazlauskas et. al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 10 90: 6939–6943), Grb2 (Arvidsson et. al., 1994, Mol. Cell. Biol., 14: 6715–6726) und die Adapter-Moleküle Shc und Nck (Nishimura et. al., 1993, Mol. Cell. Biol., 13: 6889–6896) an Regionen binden, die unterschiedliche Autophosphorylierungsstellen umfassen. Siehe allgemein Claesson-Welsh, 1994, Prog. Growth Factor Res., 5: 37–54. Daher ist es wahrscheinlich, das Signaltransduktionswege, die durch KDR/FLK-1 aktiviert werden, den ras-Weg (Rozakis et. al., 1992, Nature, 360: 689–692), die PI-3'-Kinase, die src-vermittelten und die plcγ-vermittelten Wege umfassen. Jeder dieser Wege kann eine kritische Rolle bei der angiogenen und/oder vaskulogenen Wirkung von KDR/FLK-1 in Endothelzellen spielen. Demzufolge bezieht sich ein weiterer Aspekt dieser Erfindung auf die Verwendung der hierin beschriebenen organischen Verbindungen zur Modulierung von Angiogenese und Vaskulogenese, wenn solche Prozesse durch diese Wege kontrolliert werden.
Andererseits sind auch Störungen, die mit der Schrumpfung, Konzentration oder dem Verschluß von Blutgefäßen in Verbindung stehen, wie Restenose, einbezogen und können durch die Verfahren dieser Erfindung behandelt oder verhindert werden.
Fibrotische Störungen beziehen sich auf die abnormale Bildung extrazellulärer Matrizes. Beispiele für fibrotische Störungen umfassen Leberzirrhose und Mesangiumzellproliferationsstörungen. Leberzirrhose ist durch den Anstieg extrazellulärer Matrixbestandteile gekennzeichnet, der zur Bildung eines Leberschadens führt. Eine erhöhte extrazellulärer Matrix, die zu einem Leberschaden führt, kann auch durch eine Virusinfektion wie Hepatitis hervorgerufen werden. Lipozyten scheinen eine Hauptrolle bei Leberzirrhose zu spielen. Andere fibrotische Störungen umfassen Atherosklerose.
Mesangiumzellproliferationsstörungen beziehen such auf Störungen, die durch eine abnormale Proliferation von Mesangiumzellen verursacht werden. Mesangiumproliferationsstörungen umfassen verschiedene humane Nierenerkrankungen wie Glomerulonephritis, diabetische Nephropathie und maligne Nephrosklerose sowie Störungen wie thrombotische Mikroangiopathiesyndrome, Transplantatabstoßung und Glomerulopathien. Der RTK-PDGFR ist an der Erhaltung der Mesangiumzellproliferation beteiligt gewesen. Floege et. al., 1993, Kidne International 43: 47S–54S.
Viele Krebsarten sind Zellproliferationsstörungen und wie bereits erwähnt, sind PKs mit Zellproliferationsstörungen assoziiert worden. Daher ist es nicht überraschend, daß PKs wie zum Beispiel die Vertreter der RTK-Familie, mit der Entwicklung von Krebs in Verbindung gebracht worden sind. Einige dieser Rezeptoren wie EGFR (Tuzi et. al., 1991, Br. J. Cancer 63: 227–233, Torp et. al., 1992, APMIS 100: 713–719) HER2/neu (Slamon et. al., 1989, Science 244: 707–712) und PDGF-R (Kumabe et. al., 1992, Oncogene, 7: 627–633) werden in vielen Tumoren überexprimiert und/oder ständig durch autokrine Schleifen aktiviert. Tatsächlich sind in den verbreitetsten und schwersten Krebsarten diese Rezeptorüberexpressionen (Akbasak and Suner-Akbasak et. al., 1992, J. Neurol. Sci., 111: 119–133, Dickson et. al., 1992, Cancer Treatment Res. 61: 249–273, Korc et. al., 1992, J. Clin. Invest. 90: 1352–1360) und autokrinen Schleifen (Lee and Donoghue, 1992, J. Cell. Biol., 118: 1057–1070, Korc et. al., supra, Akbasak and Suner-Akbasak et. al., supra) demonstriert worden. Beispielsweise ist EGFR mit Plattenepithelkarzinom, Astrozytom, Glioblastom, Hals- und Nak kenkrebs, Lungenkrebs und Blasenkrebs assoziiert worden. HER2 ist mit Brust-, Eierstock-, Magen-, Lungen-, Pankreas- und Blasenkrebs assoziiert worden. PDGFR ist mit Glioblastom und Melanom sowie Lungen-, Eierstock- und Prostatakrebs assoziiert worden. Die RTK c-met ist auch mit maligner Tumorbildung assoziiert worden. Zum Beispiel ist c-met unter anderem mit Magen-Darm-, Thyroid-, Pankreas-, Magen- und hepatozellulären Karzinomen und Lymphomen assoziiert worden. Überdies ist c-met mit Leukämie verbunden gewesen. Die Überexpression des c-met-Gens ist auch bei Patienten mit der Hodgkins-Krankheit und der Burkitts-Krankheit nachgewiesen worden.
Der IGF-IR ist, neben seiner Mitwirkung bei der Ernährungshilfe und Typ-II-Diabetes, mit mehreren Krebsarten assoziiert worden. Beispielsweise war IGF-I als ein autokriner Wachstumsstimulator in mehrere Tumorarten, z. B. humane Brustkrebskarzinomzellen (Arteaga et. al., 1989, J. Clin. Invest. 84: 1418–1423) und kleine Lungentumorzellen (Macauley et. al., 1990, Cancer Res., 50: 2511–2517), verwickelt. Überdies scheint IGF-I, während er vollständig in das normale Wachstum und die normale Differenzierung des Nervensystems involviert ist, auch ein autokriner Stimulator humaner Gliome zu sein. Sandberg-Nordqvist et. al., 1993, Cancer Res. 53: 2475–2478. Die Wichtigkeit von IGF-IR und seinen Liganden für die Zellproliferation wird ferner durch die Tatsache gestützt, daß viele Zellarten in Kultur (Fibroblasten, Epithelzellen, Glattmuskelzellen, T-Lymphozyten, Myeloidzellen, Chondrozyten und Osteoblasten (die Stammzellen des Knochenmarks)) hinsichtlich des Wachstums durch IGF-I stimuliert werden. Goldring and Goldring, 1991, Eukaryotic Gene Expression, 1: 301–326. Baserga und Coppola weisen darauf hin, daß IGF-IR eine zentrale Rolle im Transformationsmechanismus spielt und als solches ein bevorzugtes Ziel für therapeutische Interventionen für ein breites Spektrum humaner Malignitäten sein könnte. Baserga, 1995, Cancer Res., 55: 249–252, Baserga, 1994, Cell 79: 927–930, Coppola et. al., 1994, Mol. Cell. Biol., 14: 4588–4595.
STKs haben in vielen Krebsarten mitgewirkt, einschließlich insbesondere Brustkrebs (Cance, et. al., Int. J. Cancer, 54: 571–77 (1993)).
Die Assoziation zwischen abnormaler PK-Aktivität und Krankheit ist nicht auf Krebs beschränkt. Beispielsweise sind RTKs mit Krankheiten wie Psoriasis, Diabetes mellitus, Endometriose, Angiogenese, atheromatöser Plaqueentwicklung, der Alzheimer-Krankheit, Reste nose, der von-Hippel-Lindau-Krankheit, epidermaler Hyperproliferation, neurodegenerativen Krankheiten, altersbedingter Makuladegeneration und Hämangiomen assoziiert worden. Beispielsweise hat EGFR bei kornealer und dermaler Wundheilung Indikation. Defekte in Insulin-R und IGF-1R haben bei Diabetes mellitus Typ II Indikation. Eine vollständigere Korrelation zwischen speziellen RTKs und ihren therapeutischen Indikationen ist in Plowman et. al., 1994, DN&P 7: 334–339 angegeben.
Wie bereits erwähnt, sind nicht nur RTKs sondern auch CTKs einschließlich, aber nicht beschränkt auf src, abl, fps, yes, fyn, lyn, lck, blk, hck, fgr und yrk (für einen Überblick siehe Bolen et. al., 1992, FASEB J., 6: 3403–3409) in den proliferativen und metabolischen Signaltransduktionsweg involviert, und es ist daher zu erwarten und gezeigt worden, daß sie in viele PTK-vermittelte Störungen, auf die die vorliegende Erfindung gerichtet ist, involviert sind. Beispielsweise ist gezeigt worden, daß mutiertes src (v-src) ein Onkoprotein (pp60^v-src) in Huhn ist. Überdies überträgt sein zelluläres Homologon, das Protoonkogen pp60^c-src onkogene Signale vieler Rezeptoren. Die Überexpression von EGFR oder HER2/neu in Tumoren führt zur konstitutiven Aktivierung von pp60^c-src, das für maligne Zellen charakteristisch ist, in normalen Zellen aber fehlt. Auf der anderen Seite zeigen Mäuse, die c-src nicht exprimieren, einen osteopetrotischen Phenotyp, der eine Schlüsselbeteiligung von c-src bei der Osteoklastenfunktion und eine mögliche Involvierung in ähnliche Störungen anzeigt.
Dem ähnlich ist Zap70 an der T-Zellsignalgebung, die sich auf Autoimmunstörungen beziehen, beteiligt gewesen.
STKs sind mit Entzündungen, Autoimmunkrankheiten, Immunantworten und Hyperproliferationsstörungen wie Restenose, Fibrose, Psoriasis, Osteoarthritis und Rheumatoidarthritis assoziiert worden.
PKs sind auch an der Embryoimplantation beteiligt gewesen. Daher können die Verbindungen dieser Erfindung ein effektives Verfahren zur Verhinderung einer solchen Embryoimplantation liefern und so als Geburtenkontrollmittel nützlich sein. Weitere Störungen, die unter Verwendung der Verbindungen dieser Erfindung behandelt oder verhindert werden können, sind immunologische Störungen wie Autoimmunkrankheiten, AIDS und kardiovaskuläre Störungen wie Atherosklerose.
Abschließend ist anzumerken, daß derzeit vermutet wird, daß RTKs und CTKs in Hyperimmunstörungen involviert sind.
Beispiele für die Wirkung mehrerer exemplarischer Verbindungen dieser Erfindung auf einige PTKs werden nachstehend in Tabelle 2 gezeigt. Die dargestellten Verbindungen und Daten sollen den Umfang dieser Erfindung in keinster Weise einschränken.
Verabreichung und pharmazeutische Zusammensetzung
Eine Verbindung der vorliegenden Erfindung oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon können als solche an einen menschlichen Patienten verabreicht werden oder können in pharmazeutischen Zusammensetzungen verabreicht werden, in denen die vorstehenden Materialien mit geeigneten Trägern oder Bindemitteln gemischt werden. Techniken zur Bildung und Verabreichung von Arzneimitteln sind in „Remington's Pharmacological Sciences", Mack Publishing Co., Easton, PA., jüngste Auflage, zu finden.
Wie hierin verwendet, beziehen sich „verabreichen" oder „Verabreichung" auf die Abgabe einer Verbindung der Formel (I) oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes davon oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die eine Verbindung der Formel (I) oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon dieser Erfindung enthält, an einen Organismus zum Zwecke der Vorbeugung oder Behandlung einer PK-bedingten Störung.
Geeignete Wege zur Verabreichung umfassen, sind aber nicht beschränkt auf orale, rektale, transmukosale oder intestinale Verabreichung oder intramuskuläre, subkutane, intramedulläre, intrathekale, direkt intraventrikuläre, intravenöse, intravitreale, intraperitoneale, intranasale oder intraokulare Injektionen. Die bevorzugten Verabreichungswege sind oral und parenteral.
Alternativ kann man die Verbindung bevorzugt eher lokal als systemisch verabreichen, zum Beispiel mittels Injektion der Verbindung direkt in einen soliden Tumor, oftmals in Form einer Depot- oder nachhaltig wirkenden Formulierung.
Ferner kann man das Arzneimittel in einem angestrebten Arzneimittelfreisetzungssystem, zum Beispiel in einem Liposom, beschichtet mit einem Tumor-spezifischen Antikörper, verabreichen. Die Liposome werden von dem Tumor selektiv targetiert und aufgenommen.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können durch in der Technik allgemein bekannte Verfahren hergestellt werden, z. B. mittels herkömmlicher Misch-, Auflöse-, Granulier-, Drageeherstellungs-, Pulverisier-, Emulgier-, Einkapsel-, Kompressions- oder Lyophilisierverfahren.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung können in einer herkömmlichen Art und Weise unter Verwendung eines oder mehrerer physiologisch akzeptabler Träger formuliert werden, die Trägerstoffe und Hilfsmittel, welche das Verarbeiten der aktiven Verbindungen zu Präparaten, die pharmazeutisch verwendet werden können, erleichtern, umfassen. Die richtige Formulierung hängt vom ausgewählten Verabreichungsweg ab.
Für die Injektion können die Verbindungen der Erfindung zu wässerigen Lösungen, vorzugsweise in physiologisch verträgliche Puffer, wie Hank-Lösung, Ringer-Lösung oder physiologische Kochsalzlösungspuffer, formuliert werden. Zur transmukosalen Verabreichung werden Eindringmedien, die die Barriere durchdringen können, in der Formulierung verwendet. Derartige Eindringmedien sind in der Technik allgemein bekannt.
Zur oralen Verabreichung können die Verbindungen ohne weiteres durch Vereinigen der aktiven Verbindungen mit pharmazeutisch akzeptablen Trägern, die in der Technik bekannt sind, formuliert werden. Derartige Träger ermöglichen es, daß die Verbindungen der Erfindung als Tabletten, Pillen, Pastillen, Dragees, Kapseln, Flüssigkeiten, Gele, Sirups, Aufschlämmungen, Suspensionen und dergleichen zur oralen Nahrungsaufnahme durch einen Patienten formuliert werden können. Pharmazeutische Präparate zur oralen Verwendung können unter Verwendung eines festen Trägerstoffes, gegebenenfalls Mahlen des resultierenden Gemisches und Verarbeiten des Gemisches aus Körnchen nach der Zugabe geeigneter anderer Hilfsmittel, wenn gewünscht, um so Tabletten oder Drageekerne zu erhalten, erzeugt werden. Geeignete Trägerstoffe sind im besonderen: Füllstoffe, wie Zucker, einschließlich Laktose, Saccharose, Mannitol oder Sorbitol; Cellulosepräparate wie beispielsweise Maisstärke, Wei zenstärke, Reisstärke, Kartoffelstärke und andere Materialien wie Gelatine, Tragantgummi, Methylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Natriumcarboxymethylcellulose und/oder Polyvinylpyrrolidon (PVP). Nach Bedarf können Lösungsvermittler zugegeben werden, wie vernetztes Polyvinylpyrrolidon, Agar oder Alginsäure. Ein Salz wie Natriumalginat kann auch verwendet werden.
Drageekerne werden mit geeigneten Überzügen ausgestattet. Für diesen Zweck können konzentrierte Zuckerlösungen verwendet werden, die gegebenenfalls Gummi arabicum, Talk, Polyvinylpyrrolidon, Carbopol-Gel, Polyethylenglycol und/oder Titandioxid, Lacklösungen und geeignete organische Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemische enthalten können. Farbstoffe oder Pigmente können den Tabletten- oder Drageeüberzügen zur Identifizierung oder Charakterisierung unterschiedlicher Kombinationen von Dosen der aktiven Verbindungen zugegeben werden.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, die oral verwendet werden können, umfassen Eindrückkapseln aus Gelatine sowie weiche, verschlossene Kapseln aus Gelatine und einem Weichmacher, wie Glycerol oder Sorbitol. Die Eindrückkapseln können die Wirkstoffe in Beimischung mit einem Füllstoff wie Laktose, einem Bindemittel wie Stärke und/oder einem Schmiermittel wie Talk oder Magnesiumstearat, und gegebenenfalls Stabilisatoren enthalten. In weichen Kapseln können die aktiven Verbindungen in geeigneten Flüssigkeiten, wie Fettölen, flüssigem Paraffin oder flüssigen Polyethylenglycolen, gelöst oder suspendiert sein. In diese Formulierungen können ebenfalls Stabilisatoren gegeben werden.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, die auch verwendet werden können, umfassen harte Gelatinekapseln. Als ein nicht einschränkendes Beispiel kann die orale Arzneimittelproduktformulierung der aktiven Verbindung in Kapselform bei Dosisstärken von 50 und 200 mg vorliegen (Formulierungscodes J-011248 AA-00 bzw. J-011248-AA-01). Die beiden Dosisstärken werden aus denselben Körnchen erhalten, indem verschieden große harte Gelatinekapseln, Größe 3 für die 50-mg-Kapsel und Größe 0 für die 200-mg-Kapseln, gefüllt werden. Die Zusammensetzung der Formulierung kann zum Beispiel wie in Tabelle 2 angezeigt aussehen. TABELLE 2
Die Kapseln können in braune Glas- oder Kunststoffflaschen verpackt werden, um die aktive Verbindung vor Licht zu schützen. Die Behälter, die die aktive Verbindung in Form einer Kapselformulierung enthalten, müssen bei kontrollierter Raumtemperatur gelagert werden (15–30 °C).
Zur Verabreichung durch Inhalation werden die Verbindungen zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung günstigerweise in Form eines Aerosolsprays unter Verwendung einer unter Druck gesetzten Packung oder eines Verneblers und eines geeigneten Treibmittels, z. B., ohne Beschränkung darauf, Dichlordifluormethan, Trichlorfluormethan, Dichlortetrafluorethan oder Kohlendioxid, geliefert. Im Falle eines unter Druck gesetzten Aerosols kann die Dosiereinheit durch die Bereitstellung eines Ventils zur Abgabe einer abgemessenen Menge kontrolliert werden. Kapseln und Patronen zum Beispiel aus Gelatine zur Verwendung in einem Inhalator oder einem Insufflator können so formuliert werden, daß sie ein Pulvergemisch der Verbindung und eine geeignete Pulvergrundlage wie Lactose oder Stärke enthalten.
Die Verbindungen können auch zur parenteralen Verabreichung, z. B. durch Bolusinjektion oder kontinuierliche Infusion, formuliert werden. Formulierungen zur Injektion können in Einheitsdosierform, z. B. in Ampullen, oder in Mehrfachdosenbehältern mit einem zusätzlichen Konservierungsstoff, vorliegen. Die Zusammensetzungen können Formen wie Suspensionen, Lösungen oder Emulsionen in öligen oder wässerigen Vehikeln annehmen und kön nen Formulierungsmaterialien wie Suspendier-, Stabilisierungs- und/oder Dispergiermittel enthalten.
Pharmazeutische Zusammensetzungen zur parenteralen Verabreichung umfassen wässerige Lösungen einer wasserlöslichen Form, wie zum Beispiel, ohne Beschränkung darauf, ein Salz der aktiven Verbindung. Außerdem können Suspensionen der aktiven Verbindungen in einem lipophilen Vehikel hergestellt werden. Geeignete lipophile Vehikel umfassen Fettöle, wie Sesamöl, synthetische Fettsäureester wie Ethyloleat und Triglyceride oder Materialien wie Liposome. Wässerige Injektionssuspensionen können Substanzen enthalten, die die Viskosität der Suspension erhöhen, wie Natriumcarboxymethylcellulose, Sorbitol oder Dextran. Gegebenenfalls kann die Suspension auch geeignete Stabilisatoren und/oder Mittel enthalten, die die Löslichkeit der Verbindungen erhöhen, um so die Herstellung hoch konzentrierter Lösungen zu ermöglichen.
Alternativ kann der Wirkstoff zur Konstitution mit einem geeigneten Vehikel, z. B. sterilem pyrogenfreiem Wasser, vor der Verwendung in Pulverform vorliegen.
Die Verbindungen können auch in rektale Zusammensetzungen wie Zäpfchen oder Retentionseinläufe, zum Beispiel unter Verwendung herkömmlicher Zäpfchengrundlagen wie Kakaobutter oder anderen Glyceriden, formuliert werden.
Zusätzlich zu den oben beschriebenen Formulierungen können die Verbindungen ebenso als Depotpräparate formuliert werden. Derartige langwirkende Formulierungen können durch Implantation (beispielsweise subkutan oder intramuskulär) oder durch intramuskuläre Injektion verabreicht werden. Eine Verbindung dieser Erfindung kann für diesen Verabreichungsweg mit geeigneten polymeren oder hydrophoben Materialien (beispielsweise als eine Emulsion in einem pharmakologisch akzeptablen Öl), mit Ionenaustauschharzen oder als schwerlösliches Derivat, beispielsweise, ohne Beschränkung darauf, als schwerlösliches Salz, formuliert werden.
Ein nicht einschränkendes Beispiel für einen pharmazeutischen Träger für die hydrophoben Verbindungen der Erfindung ist ein Hilfslösungsmittelsystem, das Benzylalkohol, ein nicht-polares oberflächenaktives Mittel, ein wassermischbares organisches Polymer und eine wäs serige Phase umfaßt, wie das VPD-Hilfslösungsmittelsystem. VPD ist eine Lösung aus 3 % Gewicht/Volumen Benzylalkohol, 8 % Gewicht/Volumen des nicht-polaren oberflächenaktiven Mittels Polysorbat 80 und 65 % Gewicht/Volumen Polyethylenglycol 300, aufgefüllt in absolutem Ethanol. Das VPD-Hilfslösungsmittelsystem (VPD : D5W) besteht aus VPD, 1 : 1 mit einer 5-%-Dextrose-in-Wasser-Lösung verdünnt. Dieses Hilfslösungsmittelsystem löst hydrophobe Verbindungen gut, und erzeugt bei der systemischen Verabreichung selbst wenig Toxizität. Natürlich können die Anteile eines Hilfslösungsmittelsystems beträchtlich variiert werden, ohne seine Löslichkeits- und Toxizitätsmerkmale zu zerstören. Außerdem kann die Identität der Hilfslösungsmittelkomponenten variiert werden: beispielsweise können andere nicht-polare oberflächenaktive Mittel mit geringer Toxizität anstelle von Polysorbat 80 verwendet werden; die Fraktionsgröße von Polyethylenglycol kann verändert werden; andere bioverträgliche Polymere können Polyethylenglycol ersetzen, beispielsweise Polyvinylpyrrolidon; und Dextrose kann durch andere Zucker oder Polysaccharide ersetzt werden.
Alternativ können andere Abgabesysteme für hydrophobe pharmazeutische Verbindungen eingesetzt werden. Liposome und Emulsionen sind allgemein bekannte Beispiele für Abgabevehikel oder -träger für hydrophobe Arzneimittel. Überdies können auch bestimmte organische Lösungsmittel, wie Dimethylsulfoxid, eingesetzt werden, obgleich dies oftmals mit höherer Toxizität verbunden ist.
Außerdem können die Verbindungen unter Verwendung eines nachhaltig wirkenden Systems, wie semipermeablen Matrizes aus festen hydrophoben Polymeren, enthaltend das Therapeutikum, zugeführt werden. Verschiedene Materialien mit verzögerter Freisetzung sind etabliert worden und dem Fachmann allgemein bekannt. Kapseln mit verzögerter Freisetzung können in Abhängigkeit ihrer chemischen Natur die Verbindungen in wenigen Wochen bis zu 100 Tagen freisetzen. In Abhängigkeit der chemischen Natur und der biologischen Stabilität des Therapeutikums können zusätzliche Strategien zur Proteinstabilisierung eingesetzt werden.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen hierin können auch geeignete Fest- oder Gelphasen-Träger oder -trägerstoffe umfassen. Beispiele für derartige Träger oder Trägerstoffe umfassen Calciumcarbonat, Calciumphosphat, verschiedene Zucker, Stärken, Cellulosederivate, Gelatine und Polymere, wie Polyethylenglycole.
Viele der PK-modulierenden Verbindungen der Erfindung können als physiologisch akzeptable Salze bereitgestellt werden, indem die beanspruchte Verbindung die negativ oder positiv geladene Spezies bildet. Beispiele für Salze, in denen die Verbindung die positiv geladene Einheit bildet, umfassen ohne Einschränkung Quartärammonium (hierin woanders definiert), Salze wie das Hydrochlorid, Sulfat, Carbonat, Lactat, Tartrat, Malat, Maleat, Succinat, worin das Stickstoffatom der Quartärammoniumgruppe ein Stickstoff der ausgewählten Verbindung dieser Erfindung ist, das mit der geeigneten Säure umgesetzt wurde. Salze, in denen eine Verbindung dieser Erfindung die negativ geladene Spezies bildet, umfassen ohne Einschränkung Natrium-, Kalium-, Calcium- und Magnesiumsalze, gebildet durch die Umsetzung einer Carbonsäuregruppe in der Verbindung mit einer geeigneten Base (z. B. Natriumhydroxid (NaOH), Kaliumhydroxid (KOH), Calciumhydroxid (Ca(OH)₂) usw.).
Pharmazeutische Zusammensetzungen, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, umfassen Zusammensetzungen, in denen die Wirkstoffe in einer Menge enthalten sind, die ausreicht, um den vorgesehenen Zweck, zum Beispiel die Modulierung der PK-Aktivität oder die Behandlung oder Vorbeugung einer PK-bedingten Störung, zu erreichen.
Genauer gesagt ist unter einer therapeutisch wirksamen Menge eine Menge der Verbindung zu verstehen, die wirksam Symptome der Krankheit verhindert, lindert oder aufhebt oder das Überleben des behandelten Individuums verlängert.
Die Bestimmung einer therapeutisch wirksamen Menge gehört zu den allgemeinen Fähigkeiten eines Fachmanns, insbesondere im Lichte der hierin gelieferten ausführlichen Offenbarung.
Für jede Verbindung, die in den Verfahren der Erfindung verwendet wird, kann die therapeutisch wirksame Menge oder Dosis zu Beginn aus Zellkulturassays festgelegt werden. Dann kann die Dosierung zur Verwendung in Tiermodellen formuliert werden, um so einen zirkulierenden Konzentrationsbereich zu erhalten, der den IC₅₀, bestimmt in der Zellkultur (d. h., die Konzentration der Testverbindung, die eine halbmaximale Inhibierung der PK-Aktivität erreicht) umfaßt. Diese Informationen können dann dazu verwendet werden, nützliche Dosen für Menschen genauer zu bestimmen.
Die Toxizität und therapeutische Wirksamkeit der hierin beschriebenen Verbindungen kann durch pharmazeutische Standardverfahren in Zellkulturen oder Versuchstieren, z. B. durch Bestimmung des IC50 und LD50 (die beide anderswo hierin erörtert werden) für die jeweilige Verbindung, bestimmt werden. Die aus diesen Zellkulturassays und Tierstudien erhaltenen Daten können zur Formulierung eines Dosierbereiches zur Verwendung bei Menschen verwendet werden. Diese Dosierung kann in Abhängigkeit der eingesetzten Dosierform und des genutzten Verabreichungsweges variieren. Die genaue Formulierung, der Verabreichungsweg und die Dosierung können durch den jeweiligen Arzt unter Berücksichtigung des Zustandes des Patienten gewählt werden. (Siehe z. B. Fingl, et. al., 1975, in „The Pharmacological Basis of Therapeutics", K. 1, S. 1).
Dosiermenge und -intervall können individuell eingestellt werden, um Plasmakonzentrationen der aktiven Spezies bereitzustellen, die zur Aufrechterhaltung der Kinase-modulierenden Wirkungen ausreichen. Diese Plasmakonzentrationen werden als minimale Wirkkonzentrationen (MECs) bezeichnet. Die MEC wird für jede Verbindung variieren, kann jedoch aus In-vitro-Daten ermittelt werden, z. B. kann die Konzentration, die zur Erlangung einer 50- bis 90%igen Inhibierung einer Kinase erforderlich ist, unter Verwendung der hierin beschriebenen Assays festgelegt werden. Dosierungen, die zur Erlangung der MEC erforderlich sind, werden von den jeweiligen Merkmalen und dem Verabreichungsweg abhängen. HPLC-Assays oder Bioassays können zur Bestimmung der Plasmakonzentrationen verwendet werden.
Unter Verwendung des MEC-Wertes können auch die Dosierintervalle bestimmt werden. Die Verbindungen sollten unter Verwendung eines Regimes verabreicht werden, das Plasmakonzentrationen für 10–90 % der Zeit, bevorzugt zwischen 30 und 90 % und am stärksten bevorzugt zwischen 50 und 90 % über der MEC hält.
Derzeit können therapeutisch wirksame Mengen der Verbindungen der Formel (I) im Bereich von ungefähr 25 mg/m² bis 1500 mg/m² pro Tag; bevorzugt etwa 3 mg/m²/Tag liegen. Noch stärker bevorzugt sind 50 mg/m²/Tag bis 400 mg/Tag.
Im Falle der lokalen Verabreichung oder selektiven Aufnahme steht die wirksame lokale Konzentration des Arzneimittels nicht mit der Plasmakonzentration in Verbindung, und es können andere in der Technik bekannte Verfahren zur Bestimmung der korrekten Dosiermenge und -intervalls eingesetzt werden.
Die Menge einer verabreichten Zusammensetzung wird natürlich von dem zu behandelnden Individuum, der Schwere der Krankheit, der Art und Weise der Verabreichung, den Anordnungen des behandelnden Arztes usw. abhängen.
Die Zusammensetzungen können nach Bedarf in einer Packung oder einer Spendevorrichtung, wie einem von der FDA genehmigten Kit, vorliegen, die eine oder mehrere Einheitsdosierformen enthalten können, die den Wirkstoff enthalten. Die Packung kann zum Beispiel Metall- oder Kunststoffolie umfassen, wie eine Blisterpackung. Der Packung oder Spendervorrichtung können Anweisungen hinsichtlich der Verabreichung beiliegen. Der Packung oder Spendervorrichtung kann ebenso eine mit dem Behälter verbundene Mitteilung in einer von einer Regierungsbehörde, die die Herstellung, Verwendung oder den Verkauf von Pharmazeutika regelt, vorgeschriebenen Form, beiliegen, wobei dieser Mitteilung die Genehmigung für die Form der Zusammensetzungen oder die Verabreichung an Mensch oder Tiere durch die Behörde zu entnehmen ist. Eine solche Mitteilung kann zum Beispiel aus der von der US Food and Drug Administration zur Verschreibung von Arzneimitteln genehmigten Etikettierung oder einer genehmigten Produkteinlage bestehen. Zusammensetzungen, die eine Verbindung der Erfindung, formuliert in einem kompatiblen pharmazeutischen Träger, umfassen, können auch zur Behandlung eines indizierten Umstandes hergestellt, in einem geeigneten Behälter plaziert und markiert werden. Geeignete Umstände auf dem Etikett können die Behandlung eines Tumors, die Inhibierung von Angiogenese, die Behandlung von Fibrose, Diabetes und dergleichen umfassen.
Ein Aspekt dieser Erfindung ist auch, daß eine hierin beschriebene Verbindung oder ihr Salz oder ihr Prodrug mit anderen chemotherapeutischen Mitteln zur Behandlung der oben erörterten Krankheiten und Störungen kombiniert werden kann. Beispielsweise kann eine Verbindung, ein Salz oder ein Prodrug dieser Erfindung mit Alkylierungsmitteln wie Fluoruracil (5-FU), allein oder zusätzlich in Kombination mit Leukovorin; oder anderen Alkylierungsmitteln, wie anderen Pyrimidinanaloga, wie UFT, Capecitabin, Gemcitabin und Cytarabin, Alkylsulfonaten, z. B. Busulfan (das bei der Behandlung chronischer Granulozytenleukämie verwendet wird), Improsulfan und Piposulfan; Aziridinen, z. B. Benzodepa, Carboquon, Me turedepa und Uredepa; Ethyleniminen und Methylmelaminen, z. B. Altretamin, Triethylenmelamin, Triethylenphosphoramid, Triethylenthiophosphoramid und Trimethylolmelamin; und den Stickstoffsenfgasen, z. B. Chlorambucil (das bei der Behandlung chronischer Lymphozytenleukämie, primärer Makroglobulinämie und Nicht-Hodgkin's-Lymphom verwendet wird), Cyclophosphamid (das bei der Behandlung der Hodgkin's-Krankheit, multiplem Myelom, Neuroblastom, Brustkrebs, Eierstockkrebs, Lungenkrebs, Wilm's-Tumor und Rhabdomyosarkom verwendet wird), Estramustin, Ifosfamid, Novembrichin, Prednimustin und Uramustin (das bei der Behandlung primärer Thrombozytose, Nicht-Hodgkin's-Lymphom, der Hodgkin's-Krankheit und Eierstockkrebs verwendet wird); und Triazin, z. B. Dacarbazin (das bei der Behandlung von Weichgewebesarkom verwendet wird), kombiniert werden.
Eine Verbindung, ein Salz oder ein Prodrug dieser Erfindung kann auch in Kombination mit anderen chemotherapeutischen Antimetabolitmitteln, wie Folsäureanaloga, z. B. Methotrexat (das bei der Behandlung akuter Lymphozytenleukämie, Choriokarzinom, Mycosis fungiodes, Brustkrebs, Kopf- und Halskrebs und osteogenem Sarkom verwendet wird) und Pteropterin; und Purinanaloga wie Mercaptopurin und Thioguanin, die bei der Behandlung akuter Granulozyten-, akuter Lymphozyten- und chronischer Granulozytenleukämie Anwendung finden, sind aber nicht darauf beschränkt.
Es wird in Betracht gezogen, daß eine Verbindung, ein Salz oder ein Prodrug dieser Erfindung auch in Kombination mit chemotherapeutischen Mitteln auf der Basis von Naturprodukten wie Vincaalkaloiden, z. B. Vinblastin (das bei der Behandlung von Brust- und Hodenkrebs verwendet wird), Vincristin und Vindesin; Epipodophylotoxinen, z. B. Etoposid und Teniposid, die beide bei der Behandlung von Hodenkrebs und dem Kaposi-Sarkom nützlich sind; antibiotischen chemotherapeutischen Mitteln, z. B. Daunorubicin, Doxorubicin, Epirubicin, Mitomycin (die zur Behandlung von Magen-, Zervix-, Darm-, Brust, Blasen- und Pankreaskrebs verwendet werden), Dactinomycin, Temozolomid, Plicamycin, Bleomycin (die bei der Behandlung von Haut-, Ösophagus- und Urogenitaltraktkrebs verwendet werden); und enzymatischen chemotherapeutischen Mitteln wie L-Asparaginase verwendet werden kann.
Außerdem können eine Verbindung, ein Salz oder ein Prodrug dieser Erfindung auch in Kombination mit den Platinkoordinationskomplexen (Cisplatin usw.); substituierten Harnstoffen wie Hydroxyharnstoff Methylhydrazinderivaten, z. B. Procarbazin; adrenokortikalen Hemmstoffen, z. B. Mitotan, Aminoglutethimid; und Hormon und Hormonantagonisten wie den Adrenokortikosteroiden (z. B. Prednison), Progestinen (z. B. Hydroxyprogesteroncaproat); Östrogenen (z. B. Diethylstilbesterol); Antiöstrogenen wie Tamoxifen; Androgenen, z. B. Testosteronpropionat; und Aromataseinhibitoren wie Anastrozol verwendet werden.
Schließlich wird ebenso in Betracht gezogen, daß die Kombination einer Verbindung dieser Erfindung in Kombination mit Mitoxantron oder Paclitaxel zur Behandlung von soliden Tumorkrebsarten oder Leukämie wie akuter myelogener (Nicht-Lymphozyten-) Leukämie wirksam sein wird.
Allgemeines Syntheseverfahren
Die folgende allgemeine Verfahrensweise kann zur Herstellung der Verbindungen dieser Erfindung eingesetzt werden:
Das geeignet substituierte 2-Oxindol (1 Äqu.), der geeignet substituierte Aldehyd (1,2 Äqu.) und eine Base (0,1 Äqu.) werden in einem Lösungsmittel (1–2 ml/mmol 2-Oxindol) gemischt und das Gemisch wird dann für etwa 2 bis etwa 12 Stunden erwärmt. Nach dem Abkühlen wird der gebildete Niederschlag abfiltriert, mit kaltem Ethanol oder Ether gewaschen und vakuumgetrocknet, wodurch das feste Produkt erhalten wird. Bildet sich kein Niederschlag, wird das Reaktionsgemisch konzentriert und der Rest wird mit Dichlormethan/Ether verrieben, der resultierende Feststoff wird durch Filtration gesammelt und dann getrocknet. Das Produkt kann durch Chromatographie gegebenenfalls weiter gereinigt werden.
Die Base kann eine organische oder eine anorganische Base sein. Wird eine organische Base verwendet, ist diese bevorzugt eine Stickstoffbase. Beispiele für organische Stickstoffbasen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Diisopropylamin, Trimethylamin, Triethylamin, Anilin, Pyridin, 1,8-Diazabicyclo[5.4.1]undec-7-en, Pyrrolidin und Piperidin.
Beispiele für anorganische Basen sind ohne Einschränkung Ammoniak, Alkalimetall- oder Erdalkalimetallhydroxide, Phosphate, Carbonate, Bicarbonate, Bisulfate und Amide. Die Alkalimetalle umfassen Lithium, Natrium und Kalium, während die Erdalkalimetalle Calcium, Magnesium und Barium umfassen.
In einer derzeit bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Base, wenn das Lösungsmittel ein protisches Lösungsmittel wie Wasser oder Alkohol ist, eine anorganische Alkalimetall- oder Erdalkalimetallbase, bevorzugt ein Alkalimetall- oder Erdalkalimetallhydroxid.
Einem Fachmann wird, basierend auf allgemeinen Prinzipien der organischen Synthese und den Offenbarungen hierin, klar sein, welche die für die in Betracht gezogene Reaktion geeignetste Base sein wird.
Das Lösungsmittel, in dem die Reaktion durchgeführt wird, kann ein protisches oder ein aprotisches Lösungsmittel sein, bevorzugt ist es ein protisches Lösungsmittel. Ein „protisches Lösungsmittel" ist ein Lösungsmittel, das Wasserstoffatome aufweist, die kovalent an Sauerstoff- oder Stickstoffatome gebunden sind, die die Wasserstoffatome merklich sauer und daher mit einem gelösten Stoff durch Wasserstoffbindung „teilbar" machen. Beispiele für protische Lösungsmittel umfassen ohne Einschränkung Wasser und Alkohole.
Ein „aprotisches Lösungsmittel" kann polar oder nicht-polar sein, enthält in beiden Fällen jedoch keine sauren Wasserstoffe und ist daher nicht zur Wasserstoffbindung mit gelösten Stoffen fähig. Beispiele für nicht-polare aprotische Lösungsmittel sind ohne Einschränkung Pentan, Hexan, Benzol, Toluol, Methylenchlorid und Kohlenstofftetrachlorid. Beispiele für polare aprotische Lösungsmittel sind Chloroform, Tetrahydrofuran, Dimethylsulfoxid und Dimethylformamid.
In einer derzeit bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung ist das Lösungsmittel ein protisches Lösungsmittel, bevorzugt Wasser oder ein Alkohol wie Ethanol.
Die Reaktion wird bei Temperaturen über Raumtemperatur durchgeführt. Die Temperatur beträgt im allgemeinen etwa 30 °C bis etwa 150 °C, bevorzugt etwa 80 °C bis etwa 100 °C, am stärksten bevorzugt etwa 75 °C bis etwa 85 °C, was über dem Siedepunkt von Ethanol liegt. Unter „etwa" ist zu verstehen, daß der Temperaturbereich bevorzugt innerhalb von 10 °C der angezeigten Temperatur, stärker bevorzugt innerhalb von 5 °C der angezeigten Temperatur und am stärksten bevorzugt innerhalb von 2 °C der angezeigten Temperatur, liegt. Daher ist zum Beispiel unter „etwa 75 °C" 75 °C ± 10 °C, bevorzugt 75 °C ± 5 °C und stärksten bevorzugt 75 °C ± 2 °C, zu verstehen.
2-Oxindole und Aldehyde können ohne weiteres unter Verwendung von Techniken, die in der Chemie allgemein bekannt sind, synthetisiert werden. Ein Fachmann wird erkennen, daß andere Synthesewege zur Bildung der Verbindungen der Erfindung zugänglich sind und das folgendes als Beispiel und nicht zur Einschränkung angeboten wird.
BEISPIELE
Die folgenden Herstellungen und Beispiele werden angegeben, damit ein Fachmann die vorliegende Erfindung besser verstehen und durchführen kann. Sie sollen den Umfang der Erfindung nicht einschränken, sondern diese lediglich veranschaulichen und darstellen.
Synthesebeispiele
Verfahren A: Formylierung von Pyrrolen
POCl₃ (1,1 Äquiv.) wurde tropfenweise zu Dimethylformamid (3 Äquiv.) bei –10 °C zugegeben, gefolgt von der Zugabe des geeigneten in Dimethylformamid gelösten Pyrrols. Nach dem Rühren für zwei Stunden wurde das Reaktionsgemisch mit H₂O verdünnt und auf pH 11 mit 10 N KOH basisch gemacht. Der gebildete Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt, mit H₂O gewaschen und im Vakuumofen getrocknet, wodurch der gewünschte Aldehyd erhalten wurde.
Verfahren B: Verseifung von Pyrrolcarbonsäureestern
Ein Gemisch aus einem Pyrrolcarbonsäureester und KOH (2 bis 4 Äquiv.) in EtOH wurde unter Rückfluß erhitzt, bis Dünnschichtchromatographie (DC) die Beendigung der Reaktion anzeigte. Das abgekühlte Reaktionsgemisch wurde auf pH 3 mit 1 N HCl angesäuert. Der gebildet Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt, mit H₂O gewaschen und im Vakuumofen getrocknet, wodurch die gewünschte Pyrrolcarbonsäure erhalten wurde.
Verfahren C: Amidierung
Zu einer gerührten Lösung aus einer Pyrrolcarbonsäure, gelöst in Dimethylformamid, (0,3 M) wurden 1-Ethyl-3-(3-dimethylamino-propyl)carbodiimid (1,2 Äquiv.), 1-Hydroxybenzotriazol (1,2 Äquiv.) und Triethylamin (2 Äquiv.) zugegeben. Das entsprechende Amin wurde zugegeben (1 Äquiv.) und die Reaktion gerührt, bis DC die Beendigung der Reaktion angab. Ethylacetat wurde dann zu dem Reaktionsgemisch zugegeben und die Lösung wurde mit gesättigtem NaHCO₃ und Salzlösung (mit extra Salz) gewaschen, über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet und konzentriert, wodurch das gewünschte Amid erhalten wurde.
Verfahren D: Kondensation von Aldehyden und Oxindolen, die Carbonsäuresubstituenten enthalten
Ein Gemisch aus dem Oxindol (1 Äquivalent), 1 Äquivalent des Aldehyds und 1–3 Äquivalenten Piperidin (oder Pyrrolidin) in Ethanol (0,4 M) wurde bei 90–100 °C gerührt, bis DC die Beendigung der Reaktion angab. Das Gemisch wurde dann konzentriert und der Rest mit 2N HCl angesäuert. Der gebildete Niederschlag wurde mit H₂O und EtOH gewaschen und dann im Vakuumofen getrocknet, wodurch das Produkt erhalten wurde.
Verfahren E: Kondensation von Aldehyden und Oxindolen, die keine Carbonsäuresubstituenten enthalten
Ein Gemisch aus dem Oxindol (1 Äquivalent), 1 Äquivalent des Aldehyds und 1–3 Äquivalenten Piperidin (oder Pyrrolidin) in Ethanol (0,4 M) wurde bei 90–100 °C gerührt, bis DC die Beendigung der Reaktion angab. Das Gemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, und der gebildete Feststoff wurde durch Vakuumfiltration gesammelt, mit Ethanol gewaschen und getrocknet, wodurch das Produkt erhalten wurde. Bildet sich beim Abkühlen des Reaktionsgemisches kein Niederschlag, wird das Gemisch konzentriert und durch Säulenchromatographie gereinigt.
C. Beispiele von Oxindolsynthesen
Die folgenden Beispiele der Synthese repräsentativer Oxindole sollen den Umfang der Erfindung in keinster Weise einschränken. Alternative Wege zu den gezeigten Oxindolen sowie anderen Oxindolen, die für die Herstellung der Verbindungen dieser Erfindung nützlich sind, werden einem Fachmann, basierend auf den folgenden Offenbarungen, offensichtlich. Solche Synthesen und Oxindole liegen im Umfang und Sinn dieser Erfindung.
5-Amino-2-oxindol
5-Nitro-2-oxindol (6,3 g) wurde in Methanol über 10 % Palladium auf Kohlenstoff hydriert, wodurch 3,0 g (60 % Ausbeute) der Titelverbindung als weißer Feststoff erhalten wurden.
5-Brom-2-oxindol
2-Oxindol (1,3 g) in 20 ml Acetonitril wurde auf –10 °C abgekühlt und 2,0 g N-Bromsuccinimid wurden langsam unter Rühren zugegeben. Die Reaktion wurde für 1 Stunde bei –10 °C und 2 Stunden bei 0 °C gerührt. Der Niederschlag wurde gesammelt, mit Wasser gewaschen und getrocknet, wodurch 1,9 g (90 % Ausbeute) der Titelverbindung erhalten wurden.
4-Methyl-2-oxindol
Diethyloxalat (30 ml) in 20 ml trocknem Ether wurde unter Rühren zu 19 g Kaliumethoxid, suspendiert in 50 ml trockenem Ether, zugegeben. Das Gemisch wurde in einem Eisbad abgekühlt und 20 ml 3-Nitro-o-xylol in 20 ml trockenem Ether wurden langsam zugegeben. Das dicke dunkelrote Gemisch wurde unter Rückfluß für 0,5 h erhitzt, zu einem dunkelroten Feststoff konzentriert und mit 10%igem Natriumhydroxid behandelt, bis fast der gesamte Feststoff gelöst war. Das dunkelrote Gemisch wurde mit 30%igem Wasserstoffperoxid behandelt, bis die Rotfärbung zu gelb wechselte. Das Gemisch wurde abwechselnd mit 10%igem Natriumhydroxid und 30%igem Wasserstoffperoxid behandelt, bis keine dunkelrote Farbe mehr vorlag. Der Feststoff wurde abfiltriert und das Filtrat mit 6N Salzsäure angesäuert. Der resultierende Niederschlag wurde durch Vakuumfiltration gesammelt, mit Wasser gewaschen und unter Vakuum getrocknet, wodurch 9,8 g (45 % Ausbeute) 2-Methyl-6-nitrophenylessigsäure als gebrochen weißer Feststoff erhalten wurden. Der Feststoff wurde in Methanol über l 0 % Palladium auf Kohlenstoff hydriert, wodurch 9,04 g der Titelverbindung als weißer Feststoff erhalten wurden.
7-Brom-5-chlor-2-oxindol
5-Chlor-2-oxindol (16,8 g) und 19,6 g N-Bromsuccinimid wurden in 140 ml Acetonitril suspendiert und unter Rückfluß für 3 Stunden erhitzt. Dünnschichtchromatographie (Siliciumdioxid, Ethylacetat) bei 2 Stunden Rückfluß zeigte 5-Chlor-2-oxindol oder N-Bromsuccinimid (Rf 0,8), Produkt (Rf 0,85) und ein zweites Produkt (Rf 0,9), deren Anteile sich nach einer weiteren Stunde Rückfluß nicht veränderten. Das Gemisch wurde auf 10 °C abgekühlt, der Niederschlag wurde durch Vakuumfiltration gesammelt, mit 25 ml Ethanol gewaschen und für 20 Minuten im Trichter trocken gesaugt, wodurch 14,1 g nasses Produkt (56 % Ausbeute) erhalten wurden. Der Feststoff wurde in 200 ml denaturiertem Ethanol suspendiert und die Aufschlämmung wurde unter Rühren und Erhitzen unter Rückfluß für 10 Minuten gewaschen. Das Gemisch wurde in einem Eisbad auf 10 °C abgekühlt. Das feste Produkt wurde durch Vakuumfiltration gesammelt, mit 25 ml Ethanol gewaschen und unter Vakuum bei 40 °C getrocknet, wodurch 12,7 g (51 % Ausbeute) 7-Brom-5-chlor-2-oxindol erhalten wurden.
5-Fluor-2-oxindol
5-Fluorisatin (8,2 g) wurde in 50 ml Hydrazinhydrat gelöst und unter Rückfluß für 1,0 h erhitzt. Die Reaktionsgemische wurden dann in Eiswasser gegossen. Der Niederschlag wurde dann filtriert, mit Wasser gewaschen und im Vakuumofen getrocknet, wodurch die Titelverbindung erhalten wurde.
5-Nitro-2-oxindol
2-Oxindol (6,5 g) wurde in 25 ml konzentrierter Schwefelsäure verdünnt und das Gemisch bei –10 bis –15 °C gehalten, während 2,1 ml rauchende Salpetersäure tropfenweise zugegeben wurden. Nach der Zugabe der Salpetersäure wurde das Reaktionsgemisch bei 0 °C für 0,5 h gerührt und in Eiswasser gegossen. Der Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt, mit Wasser gewaschen und aus 50%iger Essigsäure kristallisiert. Das kristalline Produkt wurde dann filtriert, mit Wasser gewaschen und unter Vakuum getrocknet, wodurch 6,3 g (70 %) 5-Nitro-2-oxindol erhalten wurden.
5-Aminosulfonyl-2-oxindol
Zu einem 100-ml-Kolben, beschickt mit 27 ml Chlorsulfonsäure, wurden langsam 13,3 g 2-Oxindol zugegeben. Die Reaktionstemperatur wurde während der Zugabe unter 30 °C gehalten. Nach der Zugabe wurde das Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur für 1,5 h gerührt, auf 68 °C für 1 h erhitzt, abgekühlt und in Wasser gegossen. Der Niederschlag wurde mit Wasser gewaschen und in einem Vakuumofen getrocknet, wodurch 11,0 g 5-Chlorsulfonyl-2-oxindol (50 % Ausbeute) erhalten wurden, das ohne weitere Reinigung verwendet wurde.
5-Chlorsulfonyl-2-oxindol (2,1 g) wurde zu 10 ml Ammoniumhydroxid in 10 ml Ethanol zugegeben und bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Das Gemisch wurde konzentriert und der Feststoff durch Vakuumfiltration gesammelt, wodurch 0,4 g (20 % Ausbeute) der Titelverbindung als gebrochen weißer Feststoff erhalten wurden.
5-Isopropylaminosulfonyl-2-oxindol
Zu einem 100-ml-Kolben, beschickt mit 27 ml Chlorsulfonsäure, wurden langsam 13,3 g 2-Oxindol zugegeben. Die Reaktionstemperatur wurde während der Zugabe unter 30 °C gehalten. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für 1,5 Stunden gerührt, auf 68 °C für 1 Stunde erhitzt, abgekühlt und in Wasser gegossen. Der gebildete Niederschlag wurde filtriert, mit Wasser gewaschen und in einem Vakuumofen getrocknet, wodurch 11,0 g (50 %) 5-Chlorsulfonyl-2-oxindol erhalten wurden, das ohne weitere Reinigung verwendet wurde.
Eine Suspension aus 3 g 5-Chlorsulfonyl-2-oxindol, 1,15 g Isopropylamin und 1,2 ml Pyridin in 50 ml Dichlormethan wurde bei Raumtemperatur für 4 Stunden gerührt, wobei sich während dieser Zeit ein weißer Feststoff bildete. Der Feststoff wurde durch Vakuumfiltration gesammelt, mit heißem Ethanol durch Aufschlämmung gewaschen, abgekühlt, durch Vakuumfiltration gesammelt und unter Vakuum bei 40 °C über Nacht getrocknet, wodurch 1,5 g (45 %) 5-Isopropylaminosulfonyl-2-oxindol erhalten wurden.
¹HNMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 10,69 (s, br, 1H, NH), 7,63 (dd, J = 2 und 8 Hz, 1H), 7,59 (d, J = 2 Hz, 1H), 7,32 (d, J = 7 Hz, 1H, NH-SO₂-), 6,93 (d, J = 8 Hz, 1H), 3,57 (s, 2H), 3,14-3,23 (m, 1H, CH-(CH₃)₂), 0,94 (d, J = 7 Hz, 6H, 2 × CH₃).
5-Phenylaminosulfonyl-2-oxindol
Eine Suspension aus 5-Chlorsulfonyl-2-oxindol (1,62 g, 7 mmol), Anilin (0,782 ml, 8,4 mmol) und Pyridin (1 ml) in Dichlormethan (20 ml) wurde bei Raumtemperatur für 4 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Ethylacetat (300 ml) verdünnt und mit 1N Salzsäure (16 ml) angesäuert. Die organische Schicht wurde mit Natriumbicarbonat und Salzlösung gewaschen, getrocknet und konzentrieit. Der Rest wurde mit Ethanol (3 ml) gewaschen und dann auf Kieselgel unter Elution mit Methanol/Dichlormethan 1 : 9 chromatographiert, wodurch 5-Phenylaminosulfonyl-2-oxindol erhalten wurde.
¹H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 10,71 (s, br, 1H, NH), 10,10 (s, br, 1H, NH), 7,57-7,61 (m, 2H), 7,17-7,22 (m, 2H), 7,06-7,09 (m, 2H), 6,97-7,0 (m, 1H), 6,88 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 3,52 (s, 2H).
2-Oxo-2,3-dihydro-1H-indol-5-sulfonsäurepyridin-3-ylamid
Eine Lösung aus 5-Chlorsufonyl-2-oxindol (3 g) und 3-Aminopyridin (1,46 g) in Pyridin (15 ml) wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt, wobei zu dieser Zeit ein brauner Feststoff vorlag. Der Feststoff wurde filtriert, mit Ethanol gewaschen und unter Vakuum getrocknet, wodurch 1,4 g (38 %) 2-Oxo-2,3-dihydro-1H-indol-5-sulfonsäurepyridin-3-ylamid erhalten wurden.
¹H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 10,74 (s, 1H, NH), 10,39 (s, 1H, SO₂NH), 8,27-8,28 (d, 1H), 8,21-8,23 (m, 1H), 7,59-7,62 (m, 2H), 7,44-7,68 (m, 1H), 7,24-7,28 (m, 1H), 6,69-6,71 (d, 1H), 3,54 (s, 2H).
MS m/z (APCI+) 290,2.
5-Phenyloxindol
5-Brom-2-oxindol (5 g, 23,5 mmol) wurde in 110 ml Toluol und 110 ml Ethanol unter Rühren und ein wenig Wärme gelöst. Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) (1,9 g, 1,6 mmol) wurde zugegeben, gefolgt von 40 ml (80 mmol) 2M wässerigem Natriumcarbonat. Zu diesem Gemisch wurde Benzolboronsäure (3,7 g, 30,6 mmol) zugegeben und das Gemisch wurde in einem 100-°C-Ölbad für 12 Stunden erhitzt. Die Reaktion wurde abgekühlt, mit Ethylacetat (500 ml) verdünnt, mit gesättigtem Natriumbicarbonat (200 ml), Wasser (200 ml), 1N HCl (200 ml) und Salzlösung (200 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und konzentriert, wodurch ein brauner Feststoff erhalten wurde. Das Verreiben mit Dichlormethan ergab 3,8 g (77 %) 5-Phenyl-2-oxindol als gelb-braunen Feststoff.
¹H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 10,4 (br s, 1H, NH), 7,57 (dd, J = 1,8 und 7,2 Hz, 1H), 7,5 bis 7,35 (m, 5H), 7,29 (m, 1H), 6,89 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 3,51 (s, 2H, CH₂CO).
MS m/z 209 [M⁺].
In der gleichen Art und Weise können die folgenden Oxindole hergestellt werden:
6-(3,5-Dichlorphenyl)-1,3-dihydroindol-2-on

¹H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 10,46 (br, 1H, NH), 7,64 (d, J = 1,8 Hz, 2H), 7,57 (m, 1H), 7,27 (m, 2H), 7,05 (d, J = 1,1 Hz, 1H), 3,5 (s, 2H).
MS-EI m/z 277/279 [M]⁺.

6-(4-Butylphenyl)-1,3-dihydroindol-2-on

¹H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 10,39 (s, 1H, NH), 7,49 (d, J = 8,0 Hz, 2H), 7,25 (d, J = 8 Hz, 3H), 7,17 (dd, J = 1,5 und 7,8 Hz, 1H), 6,99 (d, J = 1,5 Hz, 1H), 3,48 (s, 2H, CH₂CO), 2,60 (t, J = 7,5 Hz, 2H, CH₂CH₃), 1,57 (m, 2H, CH₂), 1,32 (m, 2H, CH₂), 0,9 (t, J = 7,5 Hz, 3H, CH₃).

6-(5-Isopropyl-2-methoxyphenyl)-1,3-dihydroindol-2-on

¹H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 10,29 (br s, 1H, NH), 7,16-7,21 (m, 2H), 7,08 (d, J = 97-7,01 (m, 2H), 6,89 (d, J = 0,8 Hz, 1H), 3,71 (s, 3H,2,4 Hz, 1H), 6, OCH₃), 3,47 (s, 2H, CH₂CO), 2,86 (m, 1H, CH(CH₃)₂), 1,19 (d, J = 6,8 Hz, 6H, CH(CH₃)₂).
MS-EI m/z 281 [M]⁺.

6-(4-Ethylphenyl)-1,3-diliydroindol-2-on

¹H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ1H, 10,39 (br s, NH), 7,50 (d, J = 8,2 Hz, 2H), 7,28 (d, J = 8,2 Hz, 2H), 7,25 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 7,17 (dd, J = 1,6 & 7,5 Hz, 1H), 6,99 (d, J = 1,6 Hz, 1H), 3,48 (s, 2H, CH₂CO), 2,63 (q, J = 7,6 Hz, 2H, CH₂CH₃), 1,20 (t, J = 7,6 Hz, 3H, CH₂CH₃).
MS-EI m/z 237 [M]⁺.

6-(3-Isopropylphenyl)-1,3-dihydroindol-2-on

¹H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 10,37 (br s, 1H, NH), 7,43 (m, 1H), 7,35-7,39 (m, 1H), 7,17-7,27 (m, 3H), 7,01 (d, 7 = 1,8 Hz, 1H), 3,49 (s, 2H, CH₂CO), 2,95 (m, 1H, CH(CH₃)₂), 1,24 (d, J = 6,8 Hz, 6H, CH(CH₃)₂).
MS-EI m/z 251 [M]⁺.

6-(2,4-Dimethoxyphenyl)-1,3-dihydroindol-2-on

¹H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 10,28 (br s, 1H, NH), 7,17 (m, 2H), 6,93 (dd, J = 1,6 & 7,6 Hz, 1H), 6,86 (d, J = 1,6 Hz, 1H), 6,63 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,58 (dd, J = 2,4 & 8,5 Hz, H), 3,79 (s, 3H,1 OCH₃H,), 3,74 (s, 3 OCH₃), 3,45 (s, 2H, CH₂CO).
MS-EI m/z 269 [M]⁺.

6-Pyridin-3-yl-1,3-dihydroindol-2-on

¹H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 10,51 (s, 1H, NH), 8,81 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 8,55 (dd, J = 1,8 und 5,7 Hz, 1H), 8 (m, 1H), 7,45 (dd, J = 5,7 und 9,3 Hz, 1H), 7,3 (m, 2H), 7,05 (s, 1H), 3,51 (s, 2H, CH₂CO).
MS m/z 210 [M]⁺.

2-Oxo-2,3-dihydro-1H-indol-4-carbonsäure(3-chlor-4-ethoxyphenyl)-amid
Zu einer Lösung aus 4-Carboxy-2-oxindol (200 mg, 1,13 mmol) und 3-Chlor-4-methoxyphenylamin (178 mg, 1,13 mmol) in Dimethylformamid (15 ml) bei Raumtemperatur wurde Benzotriazol-1-yloxytris(dimethylamino)phosphoniumhexafluorphosphat (BOP-Reagens, 997 mg, 2,26 mmol), gefolgt von 4-Dimethylaminopyridin (206 mg, 1,69 mmol) zugegeben. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 72 Stunden gerührt. Die Reaktion wurde dann mit Ethylacetat (300 ml) verdünnt, mit gesättigtem Natriumbicarbonat (100 ml), Wasser, 2N Salzsäure (100 ml), Wasser (3 × 200 ml) und Salzlösung gewaschen. Es wurde dann über Magnesiumsulfat getrocknet und konzentriert. Der Rest wurde mit Ethylacetat verrieben, wodurch 2-Oxo-2,3-dihydro-1H-indol-4-carbonsäure(3-chlor-4-methoxyphenyl)-amid als pinkfarbener Feststoff erhalten wurde.
¹HNMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 10,50 (s, br, 1H, NH), 10,12 (s, br, 1H, NH), 7,9 (s, J = 2,5 Hz, 1H), 7,62 (dd, J = 2,5 & 9 Hz, 1H), 7,38 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 7,32 (t, J = 7,6 Hz, 1H), 7,13 (d, J = 9 Hz, 1H), 6,98 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 3,83 (s, 3H, OCH₃), 3,69 (s, 2H, CH₂).
MS-EI m/z 316 [M]⁺.
4-Carboxy-2-oxindol
Eine Lösung aus Trimethylsilyldiazomethan in Hexan (2 M) wurde tropfenweise zu einer Lösung aus 2,01 g 2-Chlor-3-carboxynitrobenzol in 20 ml Methanol bei Raumtemperatur zugegeben bis keine weitere Gasentwicklung auftrat. Essigsäure wurde dann zugegeben, um das überschüssige Trimethylsilyldiazomethan zu quenchen. Das Reaktionsgemisch wurde unter Vakuum eingedampft und der Rest wurde in einem Ofen über Nacht getrocknet. Das erhaltene 2-Chlor-3-methoxycarbonylnitrobenzol war rein genug für die folgende Reaktion.
Dimethylmalonat (6,0 ml) wurde zu einer eiskalten Suspension aus 2,1 g Natriumhydrid in 15 ml DMSO zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei 100 °C für 1 Stunde gerührt und dann auf Raumtemperatur abgekühlt. 2-Chlor-3-methoxycarbonylnitrobenzol (2,15 g) wurde in einem Teil zugegeben und das Gemisch wurde auf 100 °C für 1,5 Stunden erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde dann auf Raumtemperatur abgekühlt, in Eiswasser gegossen, auf pH 5 angesäuert und mit Ethylacetat extrahiert. Die organische Schicht wurde mit Salzlösung gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und konzentriert, wodurch 3,0 g des Dimethyl-2-methoxycarbonyl-6-nitrophenyl-malonats erhalten wurden.
Dimethyl-2-methoxycarbonyl-6-nitrophenylmalonat (3,0 g) wurde in 50 ml 6N Salzsäure über Nacht unter Rückfluß erhitzt. Das Gemisch wurde zur Trockne konzentriert, 20 ml Ethanol und 1,1 g Zinn(II)chlorid wurden zugegeben und das Gemisch wurde unter Rückfluß für 2 Stunden erhitzt. Das Gemisch wurde durch Celite filtriert, konzentriert und auf Kieselgel unter Verwendung von Ethylacetat : Hexan : Essigsäure als Elutionsmittel chromatographiert, wodurch 0,65 g (37 %) 4-Carboxy-2-oxindol als weißer Feststoff erhalten wurden.
¹HNMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 12,96 (s, br, 1H, COOH), 10,74 (s, br, 1H, NH), 7,53 (d, J = 8 Hz, 1H), 7,39 (t, J = 8 Hz, 1H), 7,12 (d, J = 8 Hz, 1H), 3,67 (s, 2H).
D. Synthese von Pyrrol-substituierten 2-Indolinonen.
Beispiel 1
5-(5-Brom-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2-isopropyl-4-phenyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(3-diethylaminopropyl)amid
Ein Gemisch aus 2-Aminoacetophenonhydrochlorid (1 Äquiv.), Ethylisobutyrylacetat (1,2 Äquiv.) und Natriumacetat (2,4 Äquiv.) in H₂O wurde bei 100 °C für 18 Stunden gerührt und dann auf Raumtemperatur abgekühlt. Die wäßrige Schicht wurde abdekantiert und das Öl wurde in Ethylacetat gelöst. Es wurde dann mit Wasser und Salzlösung gewaschen und dann getrocknet, wodurch (93 %) 2-Isopropyl-4-phenyl-1H-pyrrol-3-carbonsäureethylester als rotbraunes Öl erhalten wurde.
¹HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 11,21 (s, br, 1H, NH), 7,14-7,27 (m, 5H), 6,70 (d, J = 2,7 Hz, 1H), 4,02 (q, J = 7,1 Hz, 2H, OCH₂CH₃), 3,65 (m, 1H, CH(CH₃)₂), 1,22 (d, J = 7,5 Hz, 6H, CH(CH₃)₂), 1,04 (t, J = 7,1 Hz, 3H, OCH₂CH₃).
MS-EI m/z 257 [M⁺].
Das obige Pyrrol wurde unter Verwendung von Verfahren A formyliert, wodurch (41 %) 5-Formyl-2-isopropyl-4-phenyl-1H-pyrrol-3-carbonsäureethylester als rötlicher Feststoff erhalten wurde.
¹HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 12,35 (s, br, 1H, NH), 9,14 (s, 1H, CHO), 7,36 (s, 5H), 3,96 (q, J = 7,1 Hz, 2H, OCH₂CH₃), 3,74 (m, 1H, CH(CH₃)₂), 1,29 (d, J = 6,9 Hz, 6H, CH(CH₃)₂), 0,90 (t, J = 7,1 Hz, 3H, OCH₂CH₃).
MS-EI m/z 285 [M⁺].
Der Pyrrolcarbonsäureester wurde unter Verwendung von Verfahren B hydrolysiert, wodurch (57 %) 5-Formyl-2-isopropyl-4-phenyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure als beigefarbener Feststoff erhalten wurde.
¹HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 12,28 (s, br, 1H, COOH), 12,02 (s, br, 1H, NH), 9,10 (s, 1H, CHO), 7,35 (s, 5H), 3,81 (m, 1H, CH(CH₃)₂), 1,28 (d, J = 6,9 Hz, 6H, CH(CH₃)₂).
MS-EI m/z 257 [M⁺].
5-Brom-1,3-dihydroindol-2-on (120 mg, 0,31 mmol) wurde mit 5-Formyl-2-isopropyl-4-phenyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(3-diethylaminopropyl)amid (hergestellt durch Verfahren C) kondensiert, wodurch 120 mg (71 %) der Titelverbindung erhalten wurden.
¹HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 14,23 (s, br, 1H, NH), 11,08 (s, br, 1H, NH), 7,38-7,55 (m, 7H, Ar-H & CONHCH₂), 7,30 (s, 1H, H-Vinyl), 7,26 (dd, J = 1,8 & 7,8 Hz, 1H), 6,85 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 3,36 (m, 1H, CH(CH₃)₂), 3,07 (m, 2H, CH₂), 2,34 (q, J = 7,1 Hz, 4H, N(CH₂CH₃)₂), 2,22 (t, J = 6,9 Hz, 2H, CH₂), 1,40 (m, 2H, CH₂), 1,31 (d, J = 6,9 Hz, 6H, CH(CH₃)₂), 0,86 (t, J = 7,1 Hz, 6H, N(CH₂CH₃)₂).
MS m/z 565,1 [M⁺ + 1].
Beispiel 2
5-(5-Brom-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2-isopropyl-4-phenyl-4-1H-pyr-3-carbonsäure(3-pyrrolidin-1-ylpropyl)amid
5-(5-Brom-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2-isopropyl-4-phenyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure (127 mg, 0,28 mmol) wurde mit 3-Pyrrolidin-1-yl-propylamin (43 mg, 0,336 mmol) kondensiert, wodurch 140 mg (66 %) der Titelverbindung erhalten wurden.
¹HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 14,40 (s, br, 1H, NH), 7,38-7,47 (m, 7H), 7,23-7,27 (m, 2H), 6,84 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 3,36 (in, 1H, CH(CH₃)₂), 3,08 (m, 2H, CH₂), 2,30 (m, 4H, 2 × CH₂), 2,20 (t, J = 7,0 Hz, 2H, CH₂), 1,62 (m, 4H, 2 × CH₂), 1,42 (t, J = 7,0 Hz, 2H, CH₂), 1,31 (d, J = 7,2 Hz, 6H, CH(CH₃)₂).
MS-EI m/z 560 und 562 [M⁺ – 1 und M⁺ + 1].
Beispiel 3
5-(5-Brom-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2-isopropyl-4-phenyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylaminoethyl)amid
5-Brom-1,3-dihydroindol-2-on (57 g, 0,27 mmol) wurde mit 5-Formyl-2-isopropyl-4-phenyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylaminoethyl)amid (120 mg) kondensiert, wodurch 78 mg (53 %) der Titelverbindung als gelber Feststoff erhalten erhalten.
¹HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 14,23 (s, br, 1H, NH), 11,09 (s, br, 1H, NH), 7,38-7,51 (m, 6H), 7,25-7,28 (m, 2H), 7,19 (t, 1H, CONHCH₂), 6,85 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 3,43 (m, 1H, CH(CH₃)₂), 3,11 (m, 2H, CH₂), 2,28-2,39 (m, 6H, N(CH₂CH₃)₂ & CH₂), 1,31 (d, J = 6,9 Hz, CH(CH₃)₂), 0,85 (t, J = 7,0 Hz, 6H, N(CH₂CH₃)₂).
MS-EI m/z 548 und 550 [M⁺ – 1 und M⁺+ 1].
Beispiel 4
5-(5-Brom-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2-isopropyl-4-phenyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure[3-(4-methylpiperazin-1-yl)propyl]amid
5-Brom-1,3-dihydroindol-2-on (53 mg, 0,25 mmol) wurde mit 5-Formyl-2-isopropyl-4-phenyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure[3-(4-methylpiperazin-1-yl)propyl]amid (300 mg) kondensiert, wodurch 65 mg der Titelverbindung erhalten wurden.
¹HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 14,22 (s, br, 1H, NH), 11,08 (s, br, 1H, NH), 7,23-7,50 (m, 9H), 6,85 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 3,37 (m, 1H, CH(CH₃)₂), 3,05 (m, 2H, CH₂), 2,24 (m, 8H, 4 × CH₂), 2,11 (m, 5H, CH₂ & CH₃), 1,42 (m, 2H, CH₂), 1,31 (d, J = 7,2 Hz, 6H, CH(CH₃)₂).
MS-EI m/z 589 und 591 [M⁺ – 1 und M⁺ + 1].
Beispiel 5
5-(5-Brom-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2-methyl-4-phenyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-pyrrolidin-1-ylethyl)amid
5-Brom-1,3-dihydroindol-2-on (44 mg, 0,21 mmol) wurde mit 5-Formyl-2-methyl-4-phenyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-pyrrolidin-1-ylethyl)amid (70 mg, hergestellt in gleicher Weise wie das obige Isopropylanalogon) kondensiert, wodurch 0,03 g (27 %) der Titelverbindung als gelber Feststoff erhalten wurden.
¹HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,87 (s, br, 1H, NH), 11,11 (s, br, 1H, NH), 7,36-7,51 (m, 6H), 7,26 (dd, J = 1,8 & 8,1 Hz, 1H), 7,2 (s, 1H, H-Vinyl), 7,09 (m, 1H, CONHCH₂), 6,83 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 3,17 (m, 2H, NCH₂), 2,48 (m, CH₃), 2,29-2,35 (m, 6H, 3 × NCH₂), 1,59 (m, 4H, 2 × CH₂).
MS-EI m/z 518 und 520 [M⁺ – 1 und M⁺ + 1]
Beispiel 6
5-(5-Brom-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2-methyl-4-phenyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-dimethylaminoethyl)amid
5-Brom-1,3-dihydroindol-2-on (46 mg, 0,22 mmol) wurde mit 5-Formyl-2-methyl-4-phenyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-dimethylaminoethyl)amid (65 mg) kondensiert, wodurch 60 mg (55 %) der Titelverbindung als gelber Feststoff erhalten wurden.
¹HNMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,86 (s, br, 1H, NH), 11,09 (s, br, 1H, NH), 7,47-7,49 (m, 2H), 7,38-7,41 (m, 4H), 7,26 (dd, J = 2,2 & 8,3 Hz, 1H), 7,21 (s, 1H, H-Vinyl), 7,04 (m, 1H, CONHCH₂), 6,77 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 3,15 (m, 2H, NCH₂), 2,48 (m, CH₃), 2,16 (t, J = 6,8 Hz, 2H, 3 × NCH₂), 2,02 (s, 6H, 2 × NCH₃).
MS m/z 493 und 494,8 [M⁺ und M⁺ + 2].
Beispiel 7
5-(5-Brom-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2-methyl-4-phenyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(3-diethylaminopropyl)amid
5-Brom-1,3-dihydroindol-2-on (0,47 g, 2,2 mmol) wurde mit 5-Formyl-2-methyl-4-phenyl-1H-pyrrol-3carbonsäure(3-diethylaminopropyl)amid (0,75 g) kondensiert, wodurch 0,11 g (42 %) der Titelverbindung als orangefarbener Feststoff erhalten wurden.
¹HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,86 (s, br, 1H, NH), 7,42-7,46 (m, 3H), 7,37-7,50 (m, 7H), 7,24-7,28 (m, 2H), 6,83 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 3,09 (m, 2H, NCH₂), 2,45 (s, 3H, CH₃), 2,38 (q, J = 7,1 Hz, 4H, 2 × NCH₂CH₃), 2,26 (t, J = 6,9 Hz, 2H, NCH₂), 1,42 (m, 2H, NCH₂), 0,87 (t, J = 7,1 Hz, 6H, 2 × NCH₂CH₃).
MS-EI m/z 535,0 und 537 [M⁺ und M⁺ + 2].
Beispiel 8
5-(5-Brom-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethly-1H-pyrrol-3-carbonsäure-(2-dimethylaminoethyl)amid
Ein Gemisch aus tert-Butyl-3-oxobutyrat und Natriumnitrit (1 Äquiv.) in Essigsäure wurde bei Raumtemperatur gerührt, wodurch tert-Butyl-2-hydroximino-3-oxobutyrat erhalten wurde.
Ethyl-3-oxobutyrat (1 Äquiv.), Zinkstaub (3,8 Äquiv.) und das rohe tert-Butyl-2-hydroximino-3-oxobutyrat in Essigsäure wurden bei 60 °C für 1 Stunde gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde in H₂O gegossen und das Filtrat wurde gesammelt, wodurch (65 %) 2-tert-Butyloxycarbonyl-3,5-dimethyl-4-ethoxycarbonylpyrrol erhalten wurde.
Ein Gemisch aus 2-tert-Butyloxycarbonyl-3,5-dimethyl-4-ethoxycarbonylpyrrol und Triethylorthoformiat (1,5 Äquiv.) in Trifluoressigsäure wurde bei 15 °C für 1 Stunde gerührt. Die Reaktion wurde konzentriert und der Rest wurde gereinigt, wodurch (64 %) 2,4-Dimethyl-3-ethoxycarbonyl-5-formylpyrrol als gelbe Nadeln erhalten wurde.
2,4-Dimethyl-3-ethoxycarbonyl-5-formylpyrrol wurde unter Verwendung von Verfahren B hydrolysiert, wodurch (90 %) 5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure erhalten wurde.
¹H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 12 (br s, 2H, NH und CO₂H), 9,58 (s, 1H, CHO), 2,44 (s, 3H, CH₃), 2,40 (s, 3H, CH₃).
MS m/z 267 [M⁺].
5-Brom-1,3-dihydroindol-2-on (0,17 g, 0,8 mmol) wurde mit 5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-dimethylaminoethyl)amid (0,2 g, hergestellt durch Verfahren C) unter Verwendung von Verfahren B kondensiert, wodurch 0,3 g (83 %) der Titelverbindung als gelber Feststoff erhalten wurden.
¹HNMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,60 (s, br, 1H, NH), 10,94 (s, br, 1H, NH), 8,07 (d, J = 1,8 Hz, 1H, H-4), 7,75 (s, 1H, H-Vinyl), 7,44 (t, J = 5,2 Hz, 1H, CONHCH₂), 7,24 (dd, J = 1,8 & 8,4 Hz, 1H, H-6), 6,82 (d, J = 8,4 Hz, 1H, H-7), 3,26-3,33 (m, 2H, NCH₂), 2,42 (s, 3H, CH₃), 2,41 (s, 3H, CH₃), 2,38 (t, J = 6,7 Hz, 2H, NCH₂), 2,18 (s, 6H, N(CH₃)₂).
MS-EI m/z 430 und 432 [M⁺ – 1 und M⁺ + 1].
Beispiel 9
2,4-Dimethyl-5-(2-oxo-6-phenyl-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-1H-pyrrol-3-carbonsäure-(2-dimethylaminoethyl)amid
6-Phenyl-1,3-dihydroindol-2-on (0,17 g, 0,8 mmol) wurde mit 5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-dimethylaminoethyl)amid (0,2 g) kondensiert, wodurch 0,13 g (36 %) der Titelverbindung als gelb-orangefarbener Feststoff erhalten wurden.
¹HNMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,59 (s, br, 1H, NH), 10,93 (s, br, 1H, NH), 7,85 (d, J = 7,92 Hz, 1H, H-4), 7,63-7,65 (m, 3H), 7,40-7,47 (m, 3H), 7,32-7,36 (m, 1H, Ar-H), 7,30 (dd, J = 1,6 & 7,9 Hz, 1H, H-5), 7,11 (d, J = 1,6 Hz, 1H, H-7), 3,28-3,34 (m, 2H, NCH₂), 2,43 (s, 3H, CH₃), 2,41 (s, 3H, CH₃), 2,38 (t, J = 6,8 Hz, 2H, NCH₂), 2,18 (s, 6H, N(CH₃)₂).
MS-EI m/z 428 [M⁺].
Beispiel 10
5-(5-Chlor-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure-(2-dimethylaminoethyl)amid
5-Chlor-1,3-dihydroindol-2-on (0,1 g, 0,6 mmol) wurde mit 5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-dimethylaminoethyl)amid (0,15 g) kondensiert, wodurch 0,22 g (90 %) der Titelverbindung als gelber Feststoff erhalten wurden.
¹HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,61 (s, br, 1H, NH), 10,98 (s, br, 1H, NH), 7,96 (d, J = 2,0 Hz, 1H, H-4), 7,75 (s, 1H, H-Vinyl), 7,50 (t, J = 5,5 Hz, 1H, CONHCH₂), 7,12 (dd, J = 2,0 & 8,3 Hz, 1H, H-6), 6,86 (d, J = 8,3 Hz, 1H, H-7), 3,26-3,31 (m, 2H, NCH₂), 2,42 (s, 3H, CH₃), 2,40 (s, 3H, CH₃), 2,36 (t, J = 6,6 Hz, 2H, NCH₂), 2,17 (s, 6H, N(CH₃)₂).
MS-EI m/z 386 [M⁺].
Beispiel 11
5(5-Brom-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure-(2-diethylaminoethyl)amid
5-Brom-1,3-dihydroindol-2-on (0,17 g, 0,8 mmol) wurde mit 5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylaminoethyl)amid (0,2 g) kondensiert, wodurch 0,09 g (26 %) der Titelverbindung als gelber Feststoff erhalten wurden.
¹HNMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,61 (s, br, 1H, NH), 10,98 (s, br, 1H, NH), 8,09 (d, J = 1,7 Hz, 1H, H-4), 7,76 (s, 1H, H-Vinyl), 7,42 (t, J = 5,5 Hz, 1H, CONHCH₂), 7,24 (dd, J = 1,7 & 8,0 Hz, 1H, H-6), 6,82 (d, J = 8,0 Hz, 1H, H-7), 3,23-3,32 (m, 2H, NCH₂), 2,46-2,55 (m, 6H, 3 × NCH₂), 2,43 (s, 3H, CH₃), 2,42 (s, 3H, CH₃), 0,96 (t, J = 7,2 Hz, 6H, 2 × NCH₂CH₃).
MS-EI m/z 458 und 460 [M⁺ – 1 und M⁺ + 1].
Beispiel 12
5-(5-Brom-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure-(2-pyrrolidin-1-ylethyl)amid
5-Brom-1,3-dihydroindol-2-on (0,09 g, 0,4 mmol) wurde mit 5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-pyrrolidin-1-ylethyl)amid (0,1 g) kondensiert, wodurch 0,14 g (81 %) der Titelverbindung als gelb-orangefarbener Feststoff erhalten wurden.
¹HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,61 (s, br, 1H, NH), 10,98 (s, br, 1H, NH), 8,09 (d, J = 1,9 Hz, 1H, H-4), 7,76 (s, 1H, H-Vinyl), 7,53 (t, J = 5,5 Hz, 1H, CONHCH₂), 7,24 (dd, J = 1,9 & 8,5 Hz, 1H, H-6), 6,81 (d, J = 8,5 Hz, 1H, H-7), 3,29-3,35 (m, 2H, NCH₂), 2,54 (t, J = 6,9 Hz, 2H, NCH₂), 2,47 (m, unter DMSO), 2,42 (s, 3H, CH₃), 2,40 (s, 3H, CH₃), 1,66-1,69 (m, 4H, 2 × CH₂).
MS-EI m/z 456 und 458 [M⁺ – 1 und M⁺ + 1].
Beispiel 13
5-(5-Brom-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure-(3-imidazol-1-ylpropyl)amid
5-Brom-1,3-dihydroindol-2-on (0,09 g, 0,4 mmol) wurde mit 5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(3-imidazol-1-ylpropyl)amid (0,1 g) kondensiert, wodurch 0,1 g (59 %) der Titelverbindung als orangefarbener Feststoff erhalten wurden.
¹HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,63 (s, br, 1H, NH), 10,99 (s, br, 1H, NH), 8,09 (d, J = 2,2 Hz, 1H, H-4), 7,77 (s, 1H, H-Vinyl), 7,71 (t, J = 5,7 Hz, 1H, CONHCH₂), 7,65 (s, 1H, Ar-H), 7,25 (dd, J = 2,2 & 8,4 Hz, 1H, H-6), 7,20 (s, 1H, Ar-H), 6,89 (s, 1H, Ar-H), 6,81 (d, J = 8,4 Hz, l H, H-7), 4,02 (t, J = 6,7 Hz, 2H, NCH₂), 3,18 (q, J = 6,7 Hz, 2H, NCH₂), 2,43 (s, 3H, CH₃), 2,41 (s, 3H, CH₃), 1,93 (m, 2H, CH₂).
MS-EI m/z 467 und 469 [M⁺ – 1 und M⁺ + 1].
Beispiel 14
2,4-Dimethyl-5-(2-oxo-5-phenyl-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-1H-pyrrol-3-carbonsäure-(2-diethylaminoethyl)amid
5-Phenyl-1,3-dihydroindol-2-on (80 mg, 0,4 mmol) wurde mit 5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylaminoethyl)amid (0,1 g) unter Verwendung von Verfahren B kondensiert, wodurch 79 mg (46 %) der Titelverbindung erhalten wurden.
¹HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,66 (s, br, 1H, NH), 10,95 (s, br, 1H, NH), 8,15 (d, J = 1,2 Hz, 1H), 7,81 (s, 1H, H-Vinyl), 7,71 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 7,40-7,47 (m, 4H), 7,31 (m, 1H), 6,95 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 3,2-3,31 (m, 2H, NCH₂), 2,46-2,55 (m, 6H, 3 × NCH₂), 2,44 (s, 6H, 2 × CH₃), 0,96 (t, J = 7,4 Hz, 6H, 2 × NCH₂CH₃).
MS-EI m/z 456 [M⁺].
Beispiel 15
2,4-Dimethyl-5-(2-oxo-5-phenyl-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-1H-pyrrol-3-carbonsäure-(2-pyrrolidin-1-ylethyl)amid
5-Phenyl-1,3-dihydroindol-2-on (0,04 g, 0,2 mmol) wurde mit 5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-pyrrolidin-1-ylethyl)amid (0,04 g) kondensiert, wodurch die Titelverbindung als gelb-orangefarbener Feststoff erhalten wurde.
¹HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,65 (s, br, 1H, NH), 10,96 (s, br, 1H, NH), 8,15 (d, J = 1,0 Hz, 1H), 7,80 (s, 1H, H-Vinyl), 7,71 (d, J = 7,2 Hz, 2H), 7,49 (t, J = 6,3 Hz, 1H, CONHCH₂), 7,41-7,46 (m, 3H), 7,31 (m, 1H), 6,95 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 4,08 (m, 4H, 2 × NCH₂), 3,32 (m, 2H, NCH₂), 2,55 (t, J = 7,1 Hz, 2H, NCH₂), 2,47 (m, unter DMSO), 2,43 (s, 6H, 2 × CH₃), 1,66 (m, 4H, 2 × CH₂).
MS-EI m/z 454 [M⁺].
Beispiel 16
2,4-Dimethyl-5-(2-oxo-5-phenyl-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-1H-pyrrol-3-carbonsäure-(3-imidazol-1-ylpropyl)amid
5-Phenyl-1,3-dihydroindol-2-on (8 mg, 0,04 mmol) wurde mit 5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(3-imidazol-1-ylpropyl)amid (10 mg) kondensiert, wodurch 10 mg (59 %) der Titelverbindung als orangefarbener Feststoff erhalten wurden.
¹HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,67 (s, br, 1H, NH), 10,96 (s, br, 1H, NH), 8,16 (d, J = 1,2 Hz, 1H), 7,81 (s, 1H, H-Vinyl), 7,65-7,72 (m, 4H), 7,44 (m, 3H), 7,31 (m, 1H, CONHCH₂), 7,21 (s, 1H, Ar-H), 4,02 (t, J = 6,5 Hz, 2H, NCH₂), 3,19 (q, J = 6,5 Hz, 2H, CONHCH₂), 2,44 (s, 6H, 2 × CH₃), 1,93 (m, 2H, CH₂CH₂CH₂).
MS-EI m/z 465 [M⁺].
Beispiel 17
2,4-Dimethyl-5-(2-oxo-6-phenyl-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-1H-pyrrol-3-carbonsäure-(2-diethylaminoethyl)amid
6-Phenyl-1,3-dihydroindol-2-on (0,08 g, 0,4 mmol) wurde mit 5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylaminoethyl)amid (0,1 g) kondensiert, wodurch 65 mg (38 %) der Titelverbindung als gelber Feststoff erhalten wurden.
¹HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,61 (s, br, 1H, NH), 10,99 (s, br, 1H, NH), 7,86 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 7,62-7,66 (m, 3H), 7,40-7,47 (m, 3H), 7,28-7,36 (m, 2H), 7,10 (d, J = 1,2 Hz, 1H), 3,26 (m, 2H, NCH₂), 2,46-2,55 (m, 6H, 3 × NCH₂), 2,44 (s, 3H, CH₃), 2,41 (s, 3H, CH₃), 0,97 (t, J = 7,2 Hz, 6H, 2 × NCH₂CH₃).
MS-EI m/z 456 [M⁺].
Beispiel 18
2,4-Dimethyl-5-(2-oxo-6-phenyl-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-1H-pyrrol-3-carbonsäure-(2-pyrrolidin-1-ylethyl)amid
6-Phenyl-1,3-dihydroindol-2-on (30 mg, 0,15 mmol) wurde mit 5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-pyrrolidin-1-ylethyl)amid (40 mg) kondensiert, wodurch 5,9 mg (8,5 %) der Titelverbindung als gelb-orangefarbener Feststoff erhalten wurden.
¹HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,60 (s, br, 1H, NH), 10,99 (s, br, 1H, NH), 7,86 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 7,63-7,66 (m, 3H), 7,51 (m, 1H, CONHCH₂), 7,45 (m, 2H), 7,28-7,36 (m, 2H), 7,10 (d, J = 1,5 Hz, 1H), 3,31 (m, 6H, 3 × NCH₂), 2,55 (t, J = 6,6 Hz, 2H, NCH₂), 2,43 (s, 3H, CH₃), 2,40 (s, 3H, CH₃), 1,67 (m, 4H, 2 × CH₂).
MS-EI m/z 454 [M⁺].
Beispiel 19
2,4-Dimethyl-5-(2-oxo-6-phenyl-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-1H-pyrrol-3-carbonsäure-(3-imidazol-1-ylpropyl)amid
6-Phenyl-1,3-dihydroindol-2-on (8 mg, 0,04 mmol) wurde mit 5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(3-imidazol-1-ylpropyl)amid (10 mg) kondensiert, wodurch 7,3 mg (43 %) der Titelverbindung als orangefarbener Feststoff erhalten wurden.
¹HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,62 (s, br, 1H, NH), 10,99 (s, br, 1H, NH), 7,86 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 7,62-7,70 (m, 5H), 7,45 (m, 2H), 7,35 (m, 1H), 7,30 (dd, J = 1,4 & 8,2 Hz, 1H), 7,21 (s, 1H), 7,10 (d, J = 1,4 Hz, 1H), 6,89 (s, 1H), 4,02 (t, J = 6,9 Hz, 2H, CH₂), 3,19 (m, 2H, NCH₂CH₂), 2,43 (s, 3H, CH₃), 2,41 (s, 3H, CH₃), 1,93 (t, J = 6,9 Hz, 2H, NCH₂).
MS-EI m/z 465 [M⁺].
Beispiel 20
5-[6-(3,5-Dichlorphenyl)-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylaminoethyl)amid
6-(3,5-Dichlorphenyl)-1,3-dihydroindol-2-on (64 mg, 0,23 mmol) wurde mit 5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylaminoethyl)amid (60 mg) kondensiert, wodurch 53 mg (44 %) der Titelverbindung als hellbrauner Feststoff erhalten wurden.
¹HNMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,62 (s, br, 1H, NH), 10,99 (s, 1H, NH), 7,89 (d, J = 7,9 Hz, 1H, H-4), 7,69-7,71 (m, 3H), 7,55 (m, 1H, CONHCH₂), 7,37 (m, 2H), 7,14 (d, J = 1,4 Hz, 1H, H-7), 3,27 (m, 2H, NCH₂), 2,48-2,58 (m, 6H, 3 × NCH₂), 2,45 (s, 3H, CH₃), 2,42 (s, 3H, CH₃), 0,97 (t, J = 6,8 Hz, 6H, 3 × NCH₂CH₃).
MS m/z 526,9 [M⁺ + 1].
Beispiel 21
2,4-Dimethyl-5-(2-oxo-6-pyridin-3-yl-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylaminoethyl)amid
6-Pyridin-3-yl-1,3-dihydroindol-2-on (40 mg, 0,19 mmol) wurde mit 5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylaminoethyl)amid (50 mg) kondensiert, wodurch 29 mg (33 %) der Titelverbindung als hellorangefarbener Feststoff erhalten wurden.
¹HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,62 (s, br, 1H, NH), 11,05 (s, br, 1H, NH), 8,86 (s, br, 1H), 8,53 (d, J = 5,8 Hz, 1H), 8,04 (m, 1H), 7,91 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 7,70 (s, 1H, H-Vinyl), 7,40-7,48 (m, 2H), 7,35 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 7,14 (s, 1H), 3,26 (m, 2H, NCH₂), 2,48-2,55 (m, 3 × NCH₂), 2,42 (s, 3H, CH₃), 2,38 (s, 3H, CH₃), 0,96 (t, J = 6,9 Hz, 6H, 2 × NCH₂CH₃).
MS-EI m/z 457 [M⁺].
Beispiel 22
2,4-Dimethyl-5-(2-oxo-6-pyridin-3-yl-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-1H-Ryrrol-3-carbonsäure(2-pyrrolidin-1-ylethyl)amid
6-Pyridin-3-yl-1,3-dihydroindol-2-on (60 mg, 0,28 mmol) wurde mit 5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-pyrrolidin-1-ylethyl)amid (75 mg) kondensiert, wodurch 90 mg (71 %) der Titelverbindung als hellorangefarbener Feststoff erhalten wurden.
¹HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,61 (s, br, 1H, NH), 11,05 (s, br, 1H, NH), 8,86 (d, J = 1,5 Hz, 1H), 8,54 (dd, J = 1,5 & 4,8 Hz, 1H), 8,05 (m, 1H), 7,91 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 7,70 (s, 1H, H-Vinyl), 7,44-7,53 (m, 2H), 7,36 (dd, J = 1,5 & 8,1 Hz, 1H), 7,15 (d, J = 1,2 Hz, 1H), 3,33 (m, 2H, NCH₂), 2,47-2,57 (m, 6H, 3 × NCH₂), 2,43 (s, 3H, CH₃), 2,41 (s, 3H, CH₃), 1,67 (m, 4H, 2 × CH₂).
MS-EI m/z 455 [M⁺].
Beispiel 23
2,4-Dimethyl-5-(2-oxo-6-pyridin-3-yl-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-1H-pyrrol-3-carbonsäure(3-dimethylaminopropyl)amid
6-Pyridin-3-yl-1,3-dihydroindol-2-on (42 mg, 0,2 mmol) wurde mit 5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(3-dimethylaminopropyl)amid (50 mg) kondensiert, wodurch 67 mg (75 %) der Titelverbindung als gelb-brauner Feststoff erhalten wurden.
¹HNMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,61 (s, br, 1H, NH), 11,00 (s, br, 1H, NH), 8,86 (s, br, 1H), 8,54 (s, br, 1H), 8,04 (m, 1H), 7,90 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,69 (s, 1H, H-Vinyl), 7,63 (m, 1H), 7,45-7,48 (m, 1H), 7,35 (dd, J = 1,7 & 8,0 Hz, 1H), 7,15 (d, J = 1,7 Hz, 1H), 3,21-3,27 (m, 2H, NCH₂), 2,43 (s, 3H, CH₃), 2,41 (s, 3H, CH₃), 2,28 (m, 2H, NCH₂), 2,14 (s, 6H, 2 × NCH₃), 1,64 (m, 2H, CH₂).
MS-EI m/z 443 [M⁺].
Beispiel 24
2,4-Dimethyl-5-(2-oxo-5-phenyl-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-1H-pyrrol-3-carbonsäure-(3-dimethyaminopropyl)amid
5-Phenyl-1,3-dihydroindol-2-on (67 mg, 0,32 mmol) wurde mit 5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(3-dimethylaminopropyl)amid (81 mg) kondensiert, wodurch 40 mg (28 %) der Titelverbindung als orangefarbener Feststoff erhalten wurden.
¹HNMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,66 (s, br, 1H, NH), 10,92 (s, br, 1H, NH), 8,14 (s, 1H), 7,79 (s, 1H), 7,71 (m, 2H), 7,62 (m, 1H), 7,44 (m, 3H), 7,32 (m, 1H), 6,95 (m, 1H), 3,33 (m, 2H, NCH₂), 2,43 (s, 6H, 2 × CH₃), 2,27 (m, 2H, NCH₂), 2,13 (s, 6H, 2 × NCH₃), 1,63 (m, 2H, CH₂).
MS-EI m/z 442 [M⁺].
Beispiel 25
2,4-Dimethyl-5-(2-oxo-5-phenyl-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-1H-pyrrol-3-carbonsäure-(3-diethylaminopropyl)amid
5-Phenyl-1,3-dihydroindol-2-on (1,5 g, 7,16 mmol) wurde mit 5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(3-diethylaminopropyl)amid (2 g) kondensiert, wodurch 1,3 g (40 %) der Titelverbindung als gelb-orangefarbener Feststoff erhalten wurden.
¹HNMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,64 (s, 1H, NH), 10,91 (s, 1H, NH), 8,14 (d, J = 1,4 Hz, 1H, ArH), 7,8 (s, 1H, ArH), 7,7 (dd, J = 1,2 und 8,5 Hz, 2H, ArH), 7,6 (t, J = 5,3 Hz, 1H, CONHCH₂), 7,4 (m, 3H, ArH), 7,3 (t, J = 7,4 Hz, 1H, ArH), 6,9 (d, J = 8,0 Hz, 1H, ArH), 3,2 (m, 2H, CONHCH₂), 2,5 (m, 12H, 3 × NCH₂ und 2 × CH₃), 1,61 (m, 2H, CH₂CH₂CH₂), 0,93 (t, J = 6,7 Hz, 6H, NCH₂CH₃).
MS-EI m/z 470 [M⁺].
Beispiel 26
2,4-Dimethyl-5-(2-oxo-6-phenyl-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-1H-pyrrol-3-carbonsäure-(3-diethylaminopropyl)amid
6-Phenyl-1,3-dihydroindol-2-on (1,5 g, 7,16 mmol) wurde mit 5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(3-diethylaminopropyl)amid (2 g) kondensiert, wodurch 1,9 g (57 %) der Titelverbindung als orangefarbener Feststoff erhalten wurden.
¹HNMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,58 (s, 1H, NH), 10,94 (s, 1H, NH), 7,8 (d, J = 7,9 Hz, 1H, ArH), 7,6 (m, 4H, ArH), 7,4 (t, J = 7,5 Hz, 2H, ArH), 7,3 (m, 2H), 7,1 (d, J = 1,4 Hz, 1H, ArH), 3,2 (m, 2H, CONHCH₂), 2,5 (m, 12H, 3 × NCH₂ und 2 × CH₃), 1,61 (m, 2H, CH₂CH₂CH₂), 0,93 (t, J = 6,7 Hz, 6H, NCH₂CH₃).
MS-EI m/z 470 [M⁺].
Beispiel 27
5-(5-Brom-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure-(3-diethylaminopropyl)amid
5-Brom-1,3-dihydroindol-2-on (0,5 g, 2,36 mmol) wurde mit 5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(3-diethylaminopropyl)amid (0,51 g) kondensiert, wodurch 0,84 g der Titelverbindung als rot-orangefarbener Feststoff erhalten wurden.
¹HNMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,61 (s, 1H, NH), 10,99 (s, 1H, NH), 8,09 (d, J = 1,8 Hz, 1H, ArH), 7, 7 (m, 4H), 7,2 (dd, J = 1, 8 und 8, 3 Hz, 2H, ArH), 6,8 (d, J = 7, 8 Hz, 1H, ArH), 3,3 (br s, 4H, 2 × NCH₂), 3,2 (m, 2H, CONHCH₂), 2,6 (br s, 2H, NCH₂ und 2 × CH₃), 2,4 (s, 6H, 2 × CH₃), 1,66 (m, 2H, CH₂CH₂CH₂), 0,98 (t, J = 7,1 Hz, 6H, NCH₂CH₃).
MS-EI m/z 472 und 474 [M⁺ – 1 und M⁺ + 1].
Beispiel 28
5-(5-Brom-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-diisopropyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylaminoethyl)amid
5-Brom-1,3-dihydroindol-2-on (100 mg, 0,47 mmol) wurde mit 5-Formyl-2,4-diisopropyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylaminoethyl)amid (150 mg) kondensiert, wodurch 0,15 g (62 %) der Titelverbindung als gelb-orangefarbener Feststoff erhalten wurden.
¹HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,97 (s, 1H, NH), 10,95 (s, 1H, NH), 8,09 (d, J = 1,3 Hz, 1H, ArH), 7,84 (m, 1H), 7,79 (s, 1H), 7,23 (dd, J = 1,3 und 8,1 Hz, 1H, ArH), 6,8 (d, J = 8,1 Hz, 1H, ArH), 3,5 (m, 1H, CH), 3,3 (m, 3H, CH und NHCH₂), 2,5 (br m, 6H, 3 × NCH₂), 1,28 (d, J = 6,9 Hz, 6H, 2 × CH₃), 1,23 (d, J = 6,6 Hz, 6H, 2 × CH₃), 0,96 (m, 6H, 2 × CH₂CH₃).
MS-EI m/z 514 und 516 [M⁺ – 1 und M⁺ + 1].
Beispiel 29
5-(5-Brom-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-diisopropyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(3-diethylaminopropyl)amid
5-Brom-1,3-dihydroindol-2-on (90 mg, 0,42 mmol) wurde mit 5-Formyl-2,4-diisopropyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(3-diethylaminopropyl)amid (140 mg) kondensiert, wodurch 54 mg (25 %) der Titelverbindung als rot-brauner Feststoff erhalten wurden.
¹HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,98 (s, 1H, NH), 10,96 (s, 1H, NH), 8,09 (d, J = 1,7 Hz, 2H), 7,78 (s, 1H, H-Vinyl), 7,23 (dd, J = 1,7 und 8,1 Hz, 1H, ArH), 6,82 (d, J = 8,1 Hz, 1H, ArH), 3,5 (m, 1H, CH), 3,25 (m, 2H, NHCH₂), 3,15 (m, 1H, CH), 2,7 (br s, 6H, 3 × NCH₂), 1,7 (br m, 2H, CH₂CH₂CH₂), 1,28 (d, J = 6,9 Hz, 6H, 2 × CH₃), 1,24 (d, J = 5,9 Hz, 6H, 2 × CH₃), 1,06 (m, 6H, 2 × CH₂CH₃).
MS-EI m/z 528 und 530 [M⁺ – 1 und M⁺ + 1].
Beispiel 30
5-(5-Brom-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-diisopropyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(3-pyrrolidin-1-ylpropyl)amid
5-Brom-1,3-dihydroindol-2-on (130 mg, 0,6 mmol) wurde mit 5-Formyl-2,4-diisopropyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(3-pyrrolidin-1-ylpropyl)amid (150 mg, 0,45 mmol) kondensiert, wodurch 36 mg (15 %) der Titelverbindung als bräunlich-orangefarbener Feststoff erhalten wurden.
¹HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,98 (s, 1H, NH), 10,97 (s, 1H, NH), 8,10 (d, J = 1,6 Hz, 2H), 7,78 (s, 1H, H-Vinyl), 7,23 (dd, J = 1,6 und 7,6 Hz, 1H, ArH), 6,82 (d, J = 7,6 Hz, 1H, ArH), 3,5 (m, 1H, CH), 3,25 (m, 2H, NHCH₂), 3,15 (m, 1H, CH), 2,7 (br s, 6H, 3 × NCH₂), 1,7 (br m, 6H, 3 × NCH₂CH₂), 1,28 (d, J = 5,6 Hz, 6H, 2 × CH₃), 1,24 (d, J = 5,7 Hz, 6H, 2 × CH₃).
MS-EI m/z 526 und 528 [M⁺ – 1 und M⁺ + 1].
Beispiel 31
5-(5-Brom-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethl-pyrrol-3-carbonsäure-(pyridin-4-ylmethyl)amid
5-Brom-1,3-dihydroindol-2-on (170 mg, 0,8 mmol) wurde mit 5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(pyridin-4-ylmethyl)amid (200 mg) kondensiert, wodurch 14 mg (4 %) der Titelverbindung als gelber Feststoff erhalten wurden.
¹HNMR (300MHz, DMSO-d6) δ 13,67 (s, 1H, NH), 11,01 (s, br, 1H, NH), 8,51 (dd, J = 1,6 & 4,3 Hz, 2H), 8,23 (t, J = 6,0 Hz, 1H, CONHCH₂), 8,11 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 7,78 (s, 1H, H-Vinyl), 7,31 (d, J = 6,0 Hz, 2H), 7,25 (dd, J = 1,9 & 8,1 Hz, 1H), 6,82 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 4,45 (d, J = 6,0 Hz, 2H, NCH₂), 2,46 (s, 6H, 2 × CH₃).
MS-EI m/z 450 und 452 [M⁺ – 1 und M⁺ + 1].
Beispiel 32
5-[6-(4-Butylphenyl)-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-pyrrolidin-1-ylethyl)amid
5-[6-(4-Butylphenyl)]-1,3-dihydroindol-2-on (50 mg, 0,19 mmol) wurde mit 5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-pyrrolidin-1-ylethyl)amid (50 mg) kondensiert, wodurch 74 mg (76 %) der Titelverbindung als orangefarbener Feststoff erhalten wurden.
¹HNMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,58 (s, 1H, NH), 10,93 (s, br, 1H, NH), 7,82 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 7,63 (s, 1H, H-Vinyl), 7,54 (d, J = 7,9 Hz, 2H), 7,46 (m, 1H, CONH), 7,26 (m, 3H), 7,09 (s, 1H), 3,30 (m, 2H, CH₂), 2,52-2,63 (m, 4H, 2 × CH₂), 2,49 (m, 4H, 2 × CH₂), 2,43 (s, 3H, CH₃), 2,40 (s, 3H, CH₃), 1,68 (m, 4H, 2 × CH₂), 1,58 (m, 2H, CH₂), 1,34 (m, 2H, CH₂), 0,91 (t, J = 7,2 Hz, 3H, CH₂CH₃).
MS-EI m/z 510 [M⁺].
Beispiel 33
5-[6-(4-Ethylphenyl)-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-pyrrolidin-1-ylethyl)amid
6-(4-Ethylphenyl)-1,3-dihydroindol-2-on (45 mg, 0,19 mmol) wurde mit 5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-pyrrolidin-1-ylethyl)amid (50 mg) kondensiert, wodurch 60 mg (65 %) der Titelverbindung als gelb-orangefarbener Feststoff erhalten wurden.
¹HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,59 (s, 1H, NH), 10,96 (s, br, 1H, NH), 7,83 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,64 (s, 1H, H-Vinyl), 7,51-7,56 (m, 3H), 7,25-7,30 (m, 3H), 7,08 (d, J = 1 Hz, 1H), 3,31 (m, 2H, CH₂), 2,63 (m, 2H, CH₂CH₃), 2,55 (m, 2H, CH₂), 2,49 (m, 4H, 2 × CH₂), 2,42 (s, 3H, CH₃), 2,40 (s, 3H, CH₃), 1,67 (m, 4H, 2 × CH₂), 1,20 (t, J = 7,5 Hz, 3H, CH₂CH₃).
MS-EI m/z 482 [M⁺].
Beispiel 34
5-[6-(3-Isopropylphenyl)-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-pyrrolidin-1-ylethyl)amid
6-(3-Isopropylphenyl)-1,3-dihydroindol-2-on (48 mg, 0,19 mmol) wurde mit 5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-pyrrolidin-1-ylethyl)amid (50 mg) kondensiert, wodurch 59 mg (63 %) der Titelverbindung als orangefarbener Feststoff erhalten wurden.
¹HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,63 (s, 1H, NH), 10,97 (s, br, 1H, NH), 7,87 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 7,68 (s, 1H, H-Vinyl), 7,24-7,55 (m, 6H), 7,13 (s, 1H), 3,34 (m, 2H, CH₂), 3,30 (m, 1H, CH(CH₃)₂), 2,60 (m, 2H, CH₂), 2,50 (m, 4H, 2 × CH₂), 2,45 (s, 3H, CH₃), 2,43 (s, 3H, CH₃), 1,70 (m, 4H, 2 × CH₂), 1,27 (d, J = 6,9 Hz, 6H, CH(CH₃)₂).
MS-EI m/z 496 [M⁺].
Beispiel 35
5-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure-(2-diethylaminoethyl)amid
5-Fluor-1,3-dihydroindol-2-on (0,54 g, 3,8 mmol) wurde mit 5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylaminoethyl)amid kondensiert, wodurch 0,83 g (55 %) der Titelverbindung als gelb-grüner Feststoff erhalten wurden.
¹HNMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,66 (s, 1H, NH), 10,83 (s, br, 1H, NH), 7,73 (dd, J = 2,5 & 9,4 Hz, 1H), 7,69 (s, 1H, H-Vinyl), 7,37 (t, 1H, CONHCH₂CH₂), 6,91 (m, 1H), 6,81-6,85 (m, 1H), 3,27 (m, 2H, CH₂), 2,51 (m, 6H, 3 × CH₂), 2,43 (s, 3H, CH₃), 2,41 (s, 3H, CH₃), 0,96 (t, J = 6,9 Hz, 6H, N(CH₂CH₃)₂).
MS-EI m/z 398 [M⁺].
Beispiel 35 (alternative Synthese)
5-[5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylamino-ethyl)amid
Hydrazinhydrat (55 %, 3000 ml) und 5-Fluorisatin (300 g) wurden auf 100 °C erhitzt. Weiteres 5-Fluor-isatin (500 g) wurde in Teilen (100 g) über 120 Minuten unter Rühren zugegeben. Das Gemisch wurde auf 110 °C erhitzt und für 4 Stunden gerührt. Das Gemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und die Feststoffe durch Vakuumfiltration gesammelt, wodurch rohes (2-Amino-5-fluor-phenyl)-essigsäurehydrazid (748 g) erhalten wurde. Das Hydrazid wurde in Wasser (700 ml) suspendiert und der pH des Gemisches mit 12 N Salzsäure auf < pH 3 eingestellt. Das Gemisch wurde für 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Feststoffe wurden durch Vakuumfiltration gesammelt und zweimal mit Wasser gewaschen. Das Produkt wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 5-Fluor-1,3-dihydro-indol-2-on (600 g, 73 % Ausbeute) als braunes Pulver erhalten wurde. ¹H-NMR (Dimethylsulfoxid-d₆) δ 3,46 (s, 2H, CH₂), 6,75, 6,95, 7,05 (3 × m, 3H, aromatisch), 10,35 (s, 1H, NH). MS m/z 152 [M + 1].
3,5-Dimethyl-1H-pyrrol-2,4-dicarbonsäure-2-tert-butylester-4-ethylester (2600 g) und Ethanol (7800 ml) wurden kräftig gerührt, während 10 N Salzsäure (3650 ml) langsam zugegeben wurde. Die Temperatur stieg von 25 °C auf 35 °C und Gasentwicklung begann. Das Gemisch wurde auf 54 °C erwärmt und unter weiterem Erhitzen für eine Stunde gerührt, wobei die Temperatur zu dieser Zeit 67 °C betrug. Das Gemisch wurde auf 5 °C abgekühlt und 321 Eis und Wasser wurden langsam unter Rühren zugegeben. Der Feststoff wurde durch Vakuumfiltration gesammelt und dreimal mit Wasser gewaschen. Der Feststoff wurde auf konstantes Gewicht luftgetrocknet, wodurch 2,4-Dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäureethylester (1418 g, 87 % Ausbeute) als pinkfarbener Feststoff erhalten wurde. ¹H-NMR (Dimethylsulfoxid-d₆) δ 2,10, 2,35 (2 × s, 2 × 3H, 2 × CH₃), 4,13 (q, 2H, CH₂), 6,37 (s, 1H, CH), 10,85 (s, 1H, NH). MS m/z 167 [M + 1].
Dimethylformamid (322 g) und Dichlormethan (3700 ml) wurden in einem Eisbad auf 4 °C abgekühlt, und Phosphor(V)-oxidchlorid (684 g) wurde unter Rühren zugegeben. Fester 2,4-Dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäureethylester (670 g) wurde langsam in aliquoten Teilen über 15 Minuten zugegeben. Die maximale erreichte Temperatur betrug 18 °C. Das Gemisch wurde unter Rückfluß für eine Stunde erhitzt, auf 10 °C in einem Eisbad abgekühlt, und 1,61 Eiswasser wurden schnell unter kräftigem Rühren zugegeben. Die Temperatur stieg auf 15 °C. 10 N Salzsäure (1,61) wurde unter kräftigem Rühren zugegeben. Die Temperatur stieg auf 22 °C. Das Gemisch wurde für 30 Minuten stehen gelassen und die Schichten konnten sich trennen. Die Temperatur stieg auf maximal 40 °C. Die wäßrige Schicht wurde auf pH 12–13 mit 10 N Kaliumhydroxid (3,8 l) bei einer Rate eingestellt, bei der die Temperatur 55 °C erreichen und bei dieser während der Zugabe gehalten werden konnte. Nach der Beendigung der Zugabe wurde das Gemisch auf 10 °C abgekühlt und für 1 Stunde gerührt. Der Feststoff wurde durch Vakuumfiltration gesammelt und viermal mit Wasser gewaschen, wodurch 5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäureethylester (778 g, 100 % Ausbeute) als gelber Feststoff erhalten wurde. ¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 1,25 (t, 3H, CH₃), 2,44, 2,48 (2 × s, 2 × 3H, 2 × CH₃), 4,16 (q, 2H, CH₂), 9,59 (s, 1H, CHO), 12,15 (br s, 1H, NH). MS m/z 195 [M + 1].
5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäureethylester (806 g), Kaliumhydroxid (548 g), Wasser (2400 ml) und Methanol (300 ml) wurden unter Rückfluß unter Rühren für zwei Stunden erhitzt und dann auf 8 °C abgekühlt. Das Gemisch wurde zweimal mit Dichlormethan extrahiert. Die wäßrige Schicht wurde auf pH 4 mit 1000 ml 10 N Salzsäure eingestellt, wobei die Temperatur unter 15 °C gehalten wurde. Wasser wurde zugegeben, um das Rühren zu erleichtern. Der Feststoff wurde durch Vakuumfiltration gesammelt, dreimal mit Wasser gewaschen und unter Vakuum bei 50 °C getrocknet, wodurch 5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure (645 g, 93,5 % Ausbeute) als gelber Feststoff erhalten wurde. NMR (DMSO-d₆) δ 2,40, 2,43 (2 × s, 2 × 3H, 2 × CH₃), 9,57 (s, 1H, CHO), 12,07 (br s, 2H, NH + COOH). MS m/z 168 [M + 1].
5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure (1204 g) und 6020 ml Dimethylformamid wurden bei Raumtemperatur gerührt, während 1-(3-Dimethyl-aminopropyl-3-ethylcarbodiimidhydrochlorid (2071 g), Hydroxybenzotriazol (1460 g), Triethylamin (2016 ml) und Diethylethylendiamin (1215 ml) zugegeben wurden. Das Gemisch wurde für 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wurde mit 3000 ml Wasser verdünnt, 2000 ml Salzlösung und 3000 ml gesättigte Natriumbicarbonatlösung wurden zugegeben und der pH auf mehr als 10 mit 10 N Natriumhydroxid eingestellt. Das Gemisch wurde zweimal mit jeweils 5000 ml 10%igem Methanol in Dichlormethan extrahiert und die Extrakte wurden vereinigt, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und zur Trockne rotationsverdampft. Das Gemisch wurde mit 1950 ml Toluol verdünnt und erneut zur Trockne rotationsverdampft. Der Rest wurde mit 3 : 1 Hexan : Diethylether (4000 ml) verrieben. Die Feststoffe wurden durch Vakuumfiltration gesammelt, zweimal mit 400 ml Ethylacetat gewaschen und unter Vakuum bei 34 °C für 21 Stunden getrocknet, wodurch 5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylamino-ethyl)amid (819 g, 43 % Ausbeute) als hellbrauner Feststoff erhalten wurde. ¹H-NMR (Dimethylsulfoxid-d₆) δ 0,96 (t, 6H, 2 × CH₃), 2,31, 2,38 (2 × s, 2 × CH₃), 2,51 (m, 6H, 3 × CH₂), 3,28 (m, 2H, CH₂), 7,34 (m, 1H, Amid-NH), 9,56 (s, 1H, CHO), 11,86 (s, 1H, Pyrrol-NH). MS m/z 266 [M + 1].
5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylaminoethyl)-amid (809 g), 5-Fluor-1,3-dihydro-indol-2-on (438 g), Ethanol (8000 ml) und Pyrrolidin (13 ml) wurden bei 78 °C für 3 Stunden erhitzt. Das Gemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und die Feststoffe durch Vakuumfiltration gesammelt und mit Ethanol gewaschen. Die Feststoffe wurden mit Ethanol (5900 ml) bei 72 °C für 30 Minuten gerührt. Das Gemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt. Die Feststoffe wurden durch Vakuumfiltration gesammelt, mit Ethanol gewaschen und unter Vakuum bei 54 °C für 130 Stunden getrocknet, wodurch 5-[5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylamino-ethyl)-amid (1013 g, 88 % Ausbeute) als orangefarbener Feststoff erhalten wurde.
¹H-NMR (Dimethylsulfoxid-d₆) δ 0,98 (t, 6H, 2 × CH₃), 2,43, 2,44 (2 × s, 6H, 2 × CH₃), 2,50 (m, 6H, 3 × CH₂), 3,28 (q, 2H, CH₂), 6,84, 6,92, 7,42, 7,71, 7,50 (5 × m, 5H, aromatisch, Vinyl, CONH), 10,88 (s, 1H, CONH), 13,68 (s, 1H, Pyrrol-NH). MS m/z 397 [M – 1].
Beispiel 36
3-[4-(2-Diethylaminoethylcarbamoyl)-3,5-dimethyl-1H-pyrrol-2-ylmethylen]-2-oxo-2,3-dihydro-1H-indol-6-carbonsäure
2-Oxo-2,3-dihydro-1H-indol-6-carbonsäure (80 mg, 0,45 mmol) wurde mit 5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylaminoethyl)amid kondensiert, wodurch 210 mg (92 %) der Titelverbindung als gelb-orangefarbener Feststoff erhalten wurden.
¹HNMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 13,6 (s, 1H, NH), 7,76 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,66 (s, 1H, H-Vinyl), 7,57 (dd, J = 1,5 & 8,0 Hz, 1H), 7,40-7,42 (m, 2H), 3,28 (m, 2H, CH₂), 2,88 (m, H-Piperidin), 2,54 (m, 6H, 3 × CH₂), 2,44 (s, 3H, CH₃), 2,40 (s, 3H, CH₃), 1,56 (m, H-Piperidin), 0,97 (t, J = 6,98 Hz, 6H, N(CH₂CH₃)₂).
MS m/z 424 [M⁺].
Beispiel 37
5-(5-Dimethylsulfamoyl-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-pyrrolidin-1-ylethyl)amid
2-Oxo-2,3-dihydro-1H-indol-5-sulfonsäuredimethylamid (90 mg, 0,38 mmol) wurde mit 5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-pyrrolidin-1-ylethyl)amid (100 mg) kondensiert, wodurch 100 mg (54 %) der Titelverbindung als gelber Feststoff erhalten wurden.
¹HNMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,65 (s, 1H, NH), 11,30 (s, br, 1H, NH), 8,25 (d, 1H), 7,92 (s, 1H, H-Vinyl), 7,48-7,53 (m, 2H), 7,07 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 3,33 (m, 2H, CH₂), 2,61 (s, 6H, N(CH₃)₂), 2,56 (t, 2H, CH₂), 2,49 (m, 4H, 2 × CH₂), 2,45 (s, 3H, CH₃), 2,44 (s, 3H, CH₃), 1,67 (m, 4H, 2 × CH₂).
MS-EI m/z 485 [M⁺].
Beispiel 38
5-[5-(3-Chlorphenylsulfamoyl)-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl]-2,4-dimeth pyrrol-3-carbonsäure(2-pyrrolidin-1-ylethyl)amid
2-Oxo-2,3-dihydro-1H-indol-5-sulfonsäure(3-chlorphenyl)amid (120 mg, 0,38 mmol) wurde mit 5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-pyrrolidin-1-ylethyl)amid (100 mg) kondensiert, wodurch 150 mg (69 %) der Titelverbindung als gelb-orangefarbener Feststoff erhalten wurden.
¹HNMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,55 (s, 1H, NH), 11,26 (br s, 1H, NH), 10,30 (br s, 1H, NH), 8,26 (d, 1H), 7,79 (s, 1H, H-Vinyl), 7,51-7,57 (m, 2H), 7,22 (t, J = 8,1 Hz, 1H), 7,15 (m, 1H), 7,07 (m, 1H), 7,0 (m, 2H), 3,44 (m, 2H, CH₂), 2,57 (t, J = 7,0 Hz, 2H, CH₂), 2,49 (m, 4H, 2 × CH₂), 2,44 (s, 3H, CH₃), 2,43 (s, 3H, CH₃), 1,68 (m, 4H, 2 × CH₂).
MS m/z 568 [M⁺].
Beispiel 39
2,4-Dimethyl-5-[2-oxo-5-(pyridin-3-ylsulfamoyl)-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl]-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-pyrrolidin-1-ylethyl)amid
2-Oxo-2,3-dihydro-1H-indol-5-sulfonsäurepyridin-3-ylamid (110 mg, 0,38 mmol) wurde mit 5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-pyrrolidin-1-ylethyl)amid (100 mg) kondensiert, wodurch 150 mg (74 %) der Titelverbindung als orangefarbener Feststoff erhalten wurden.
¹HNMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,58 (s, 1H, NH), 8,21 (d, J = 2,0 Hz, 2H), 8,04 (m, 1H), 7,76 (s, 1H, H-Vinyl), 7,49-7,54 (m, 2H), 7,41 (m, 1H), 7,14 (m, 1H), 6,94 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 3,33 (m, 2H, CH₂), 2,56 (t, J = 7,06 Hz, 2H, CH₂), 2,49 (m, 4H, 2 × CH₂), 2,43 (s, 6H, 2 × CH₃), 1,68 (m, 4H, 2 × CH₂).
MS m/z 535 [M⁺].
Beispiel 40
3-[3,5-Dimethyl-4-(4-methylpiperazin-1-carbonyl)-1H-pyrrol-2-ylmethylen]-4-(2-hydroxyethyl)-1,3-dihydroindol-2-on
4-(2-Hydroxyethyl)-1,3-dihydroindol-2-on (71 mg, 0,4 mmol) wurde mit 3,5-Dimethyl-4-(4-methyl-piperazin-1-carbonyl)-1H-pyrrol-2-carbaldehyd kondensiert, wodurch 90 mg (55 %) der Titelverbindung als orangefarbener Feststoff erhalten wurden.
¹HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 14,25 (s, 1H, NH), 10,88 (s, 1H, NH), 7,57 (s, 1H, H-Vinyl), 7,03 (m, 1H), 6,75-6,82 (m, 2H), 4,86 (m, 1H, OH), 3,70 (m, 2H, CH₂), 3,04 (m, 2H, CH₂), 2,48 (m, 4H, 2 × CH₂), 2,28 (br s, 7H), 2,19 (s, 3H, CH₃), 2,18 (s, 3H, CH₃).
MS m/z (+ve) 409,3 [M⁺].
Beispiel 41
3-[3,5-Dimethyl-4-(4-methylpiperazin-1-carbonyl)-1H-pyrrol-2-ylmethylen]-2-oxo-2,3-dihydro-1H-indol-5-sulfonsäurephenylamid
2-Oxo-2,3-dihydro-1H-indol-5-sulfonsäurephenylamid (110 mg, 0,4 mmol) wurde mit 3,5-Dimethyl-4-(4-methylpiperazin-1-carbonyl)-1H-pyrrol-2-carbaldehyd (100 mg) kondensiert, wodurch 50 mg (24 %) der Titelverbindung als gelber Feststoff erhalten wurden.
¹HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,52 (s, 1H, NH), 11,26 (s, 1H, NH), 10,08 (s, 1H, NH), 8,21 (d, J = 1,6 Hz, 1H), 7,75 (s, 1H, H-Vinyl), 7,50 (dd, J = 1,6 & 8,3 Hz, 1H), 7,19 (m, 2H), 7,10 (m, 2H), 6,97 (m, 2H), 2,49 (m, 4H, 2 × CH₂), 2,28 (m, 10H, 2 × CH₃ & 2 × CH₂), 2,18 (s, 3H, CH₃).
MS-EI m/z 519 [M⁺].
Beispiel 42
5-(5-Dimethylsulfamoyl-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylaminoethyl)amid
2-Oxo-2,3-dihydro-1H-indol-5-sulfonsäuredimethylamid (90 mg, 0,38 mmol) wurde mit 5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylaminoethyl)amid (100 mg) kondensiert, wodurch 80 mg (43 %) der Titelverbindung als gelber Feststoff erhalten wurden.
¹HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 11,30 (s, 1H, NH), 8,27 (d, J = 1,7 Hz, 1H), 7,94 (s, 1H, H-Vinyl), 7,49 (dd, J = 1,7 & 8,0 Hz, 1H), 7,44 (m, 1H, CONHCH₂CH₂), 7,07 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 3,26 (m, 2H, CH₂), 2,60 (s, 6H, N(CH₃)₂), 2,53 (m, 2H, CH₂), 2,45-2,50 (m, 10H, 2 × CH₃ & N(CH₂CH₃)₂), 0,96 (t, J = 7,2 Hz, 6H, N(CH₂CH₃)₂).
MS-EI m/z 487 [M⁺].
Beispiel 43
5-[5-(3-Chlorphenylsulfamoyl)-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylaminoethyl)amid
2-Oxo-2,3-dihydro-1H-indol-5-sulfonsäure(3-chlorphenyl)amid (120 mg, 3,8 mmol) wurde mit 5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylaminoethyl)amid (100 mg) kondensiert, wodurch 80 mg (37 %) der Titelverbindung als gelber Feststoff erhalten wurden.
¹HNMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,55 (s, 1H, NH), 11,24 (s, 1H, NH), 10,29 (s, 1H, NH), 8,25 (d, J = 1,87 Hz, 1H), 7,79 (s, 1H, H-Vinyl), 7,52 (dd, J = 1,87 & 8,3 Hz, 1H), 7,42 (m, 1H, CONHCH₂CH₂), 7,22 (t, J = 8,02 Hz, 1H), 7,15 (t, J = 2 Hz, 1H), 7,08 (m, 1H), 7,0 (m, 2H), 3,27 (m, 2H, CH₂), 2,48-2,57 (m, 6H, 3 × CH₂), 2,45 (s, 3H, CH₃), 2,44 (s, 3H, CH₃), 0,97 (t, J = 7,0 Hz, 6H, N(CH₂CH₃)₂).
MS m/z 570,1 [M⁺].
Beispiel 44
{[4-Methyl-5-(4-methyl-5-methylsulfamoyl-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-1H-pyrrol-3-carbonyll-amino}-essigsäureethyl
4-Methyl-1H-pyrrol-3-carbonsäureethylester (lit. ref. D. O. Cheng, T. L. Bowman und E. LeGoff; J. Heterocyclic Chem.; 1976; 13; 1145–1147) wurde unter Verwendung von Verfahren A formyliert, unter Verwendung von Verfahren B hydrolysiert, gefolgt von Amidierung (Verfahren C), wodurch [(5-Formyl-4-methyl-1H-pyrrol-3-carbonyl)-amino]-essigsäureethylester erhalten wurde.
4-Methyl-5-methylaminosulfonyl-2-oxindol (50 mg, 0,21 mmol) wurde mit [(5-Formyl-4-methyl-1H-pyrrol-3-carbonyl)-amino]-essigsäureethylester (100 mg, 0,42 mmol) und Pipe ridin (0,1 ml) in Ethanol (2 ml) kondensiert, wodurch 50 mg (52 %) der Titelverbindung erhalten wurden.
¹HNMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,59 (s, 1H, NH), 11,29 (v. br. s, 1N, NH-CO), 8,33 (t, J = 5,8 Hz, 1H, CONHCH₂), 7,83 (d, J = 3,11 Hz, 1H), 7,80 (s, 1H, H-Vinyl), 7,71 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 7,34 (br m, 1H, NHCH₃), 6,89 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 4,11 (q, J = 7,1 Hz, 2H, OCH₂CH₃), 3,92 (d, J = 5,8 Hz, 2H, GlyCH₂), 2,86 (s, 3H, CH₃), 2,48 (s, 3H, CH₃), 2,42 (d, J = 4,71 Hz, 3H, HNCH₃), 1,20 (t, J = 7,1 Hz, 3H, OCH₂CH₃).
MS-EI m/z 460 [M⁺].
Beispiel 45
{[4-Methyl-5-(5-methylsulfamoyl-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidemnethyl)-1H-pyrrol-3-carbonyl]-amino}-essigsäureethylester
Ein Gemisch aus 5-Methylaminosulfonyl-2-oxindol (0,06 g, 0,22 mmol), [(5-Formyl-4-methyl-1H-pyrrol-3-carbonyl)-amino]-essigsäureethylester (0,075 g, 0,27 mmol) und Piperidin (2 Tropfen) in Ethanol (5 ml) wurde in einem Bombenrohr bei 90 °C für 12 Stunden erhitzt. Nach dem Abkühlen wurde der Niederschlag durch Vakuumfiltration gesammelt, mit Ethanol gewaschen, mit Dichlormethan/Ether verrieben und getrocknet, wodurch 0,035 g (36 %) der Titelverbindung als gelblich-brauner Feststoff erhalten wurden.
¹H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,6 (s, 1H, NH), 11 (v. br. s, 1H, NH-CO), 8,30 (t, J = 5,7 Hz, 1H, CONHCH₂), 8,25 (d, J = 1,2 Hz, 1H), 7,88 (s, 1H, H-Vinyl), 7,84 (d, J = 3,3 Hz, 1H), 7,57 (dd, J = 1,9 & 8,5 Hz, 1H), 7,14 (br m, 1H, NHCH₃), 7,04 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 4,11 (q, J = 6,7 Hz, 2H, OCH₂CH₃), 3,92 (d, J = 5,7 Hz, 2H, GlyCH₂), 2,55 (s, 3H, CH₃), 2,41 (m, 3H, NCH₃), 1,20 (t, J = 6,7 Hz, 3H, OCH₂CH₃).
MS m/z 446 [M⁺].
Beispiel 46
{[4-Methyl-5-(5-methylsulfamoyl-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-1H-pyrrol-3-carbonyll-amino}-essigsäure
Ein Gemisch aus [(5-Formyl-4-methyl-1H-pyrrol-3-carbonyl)-amino]-essigsäureethylester (0,142 g, 0,59 mmol) und 1N NaOH (1,2 ml) in Methanol (10 ml) wurde bei Raumtemperatur für 1 Stunde gerührt. Die Reaktion wurde konzentriert und der Rest wurde mit 5-Methylaminosulfonyl-2-oxindol (0,13 g, 0,48 mmol) und Piperidin (0,12 ml) in Ethanol (12 ml) kondensiert, wodurch 0,11 g (52 %) der Titelverbindung erhalten wurden.
¹HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,98 (br s, 1H, NH), 8,17 (s, 1H), 7,80 (s, 1H), 7,75 (d, J = 3,1 Hz, 1H), 7,51 (dd, J = 2 & 8,2 Hz, 1H), 7,21 (m on br s, 2H), 6,97 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 3,41 (d, J = 4,2 Hz, 2H, CH₂NH), 2,54 (s, 3H, Pyrrol-CH₃), 2,39 (s, 3H, ArCH₃).
MS m/z 417 [M – 1]⁺.
Beispiel 48
2,4-Dimethyl-5-(2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylamino-ethyl)-amid
Ein Gemisch aus 1,3-Dihydro-indol-2-on (266 mg, 2 mmol), 5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylamino-ethyl)-amid (530 mg, 2 mmol) und Piperidin (1 Tropfen) in Ethanol wurde bei 90 °C für 2 Stunden erhitzt. Die Reaktion wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, der resultierende Niederschlag wurde durch Vakuumfiltration gesammelt, mit Ethanol gewaschen und getrocknet, wodurch 422 mg (55 %) der Titelverbindung als hellgelber Feststoff erhalten wurden.
¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13,7 (s, 1H, NH), 10,9 (s, 1H, NH), 7,88 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 7,64 (s, 1H, H-Vinyl), 7,41 (t, J = 5,4 Hz, 1H, NH), 7,13 (dt, J = 1,2 & 7,6 Hz, 1H), 6,99 (dt, J = 1,2 & 7,6 Hz, 1H), 6,88 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 3,28 (m, 2H), 2,48-2,55 (m, 6H), 2,44 (s, 3H, CH₃), 2,41 (s, 3H, CH₃), 0,97 (t, J = 7,2 Hz, 6H, N(CH₂CH₃)₂).
MS + ve APCI 381 [M⁺ + 1].
Beispiel 49
5-(5-Chlor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure-(2-diethylamino-ethyl)amid
Ein Gemisch aus 5-Chlor-1,3-dihydro-indol-2-on (335 mg, 2 mmol), 5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylamino-ethyl)-amid (530 mg, 2 mmol) und Piperidin (1 Tropfen) in Ethanol wurde bei 90 °C für 2 Stunden erhitzt. Die Reaktion wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, der resultierende Niederschlag wurde durch Vakuumfiltration gesam melt, mit Ethanol gewaschen und getrocknet, wodurch 565 mg (68 %) der Titelverbindung als orangefarbener Feststoff erhalten wurden.
¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13,65 (s, 1H, NH), 11,0 (s, 1H, NH), 7,98 (d, J = 2,1 Hz, 1H) 7,77 (s, 1H, H-Vinyl), 7,44 (t, NH), 7,13 (dd, J = 2,1 & 8,4 Hz, 1H) 6,87 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 3,28 (g, 2H), 2,48-2,53 (m, 6H), 2,44 (s, 3H, CH₃), 2,43 (s, 3H, CH₃), 0,97 (t, J = 7,0 Hz, 6H, N(CH₂CH₃)₂).
MS + ve APCI 415 [M⁺ + 1].
Beispiel 50
2,4-Dimethyl-5-(2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-1H-pyrrol-3-carbonsäure-(2-pyrrolidin-1-ethyl)-amid
1,3-Dihydro-indol-2-on wurde mit 5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure-(2-pyrrolidin-1-ylethyl)-amid kondensiert, wodurch die Titelverbindung erhalten wurde.
MS + ve APCI 379 [M⁺ + 1].
Beispiel 51
5-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure-pyrrolidin-1-yl-ethyl)-amid
5-Fluor-1,3-dihydro-indol-2-on wurde mit 5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure-(2-pyrrolidin-1-yl-ethyl)-amid kondensiert, wodurch die Titelverbindung erhalten wurde.
MS + ve APCI 397 [M⁺ + 1].
Verfahren im großen Maßstab:
5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure (61 g), 5-Fluor-1,3-dihydro-indol-2-on (79 g), Ethanol (300 ml) und Pyrrolidin (32 ml) wurden unter Rückfluß für 4,5 Stunden erhitzt. Essigsäure (24 ml) wurde zu dem Gemisch zugegeben und das Erhitzen unter Rückfluß wurde für 30 Minuten fortgesetzt. Das Gemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und die Feststoffe durch Vakuumfiltration gesammelt und zweimal mit Ethanol gewaschen. Die Feststoffe wurden für 130 Minuten in 40 % Aceton in Wasser (400 ml), enthaltend 12 N Salzsäure (6,5 ml), gerührt. Die Feststoffe wurden durch Vakuumfiltration gesammelt und zweimal mit 40 % Aceton in Wasser gewaschen. Die Feststoffe wurden unter Vakuum ge trocknet, wodurch 5-[5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure (86 g, 79 % Ausbeute) als orangefarbener Feststoff erhalten wurde.
¹H-NMR (Dimethylsulfoxid-d₆) δ 2,48, 2,50 (2 × s, 6H, 2 × CH₃), 6,80, 6,88, 7,68, 7,72 (4 × m, 4H, aromatisch und Vinyl), 10,88 (s, 1H, CONH), 12,12 (s, 1H, COOH), 1.3,82 (s, 1H, Pyrrol-NH). MS m/z 299 [M – 1].
5-[5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure (100 g) und Dimethylformamid (500 ml) wurden gerührt und Benzotriazol-1-yloxytris-(dimethylamino)phosphoniumhexafluorphosphat (221 g), 1-(2-Aminoethyl)pyrrolidin (45,6 g) und Triethylamin (93 ml) wurden zugegeben. Das Gemisch wurde für 2 Stunden bei Umgebungstemperatur gerührt. Das feste Produkt wurde durch Vakuumfiltration gesammelt und mit Ethanol gewaschen. Die Feststoffe wurden unter Rühren in Ethanol (500 ml) für eine Stunde bei 64 °C durch Aufschlämmung gewaschen und auf Raumtemperatur abgekühlt. Die Feststoffe wurden durch Vakuumfiltration gesammelt, mit Ethanol gewaschen und unter Vakuum getrocknet, wodurch 5-[5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-pyrrolidin-1-yl-ethyl)-amid (101,5 g, 77 % Ausbeute) erhalten wurde. ¹H-NMR (Dimethylsulfoxid-d₆) δ 1,60 (m, 4H, 2 × CH₂), 2,40, 2,44 (2 × s, 6H, 2 × CH₃), 2,50 (m, 4H, 2 × CH₂), 2,57, 3,35 (2 × m, 4H, 2 × CH₂), 7,53, 7,70, 7,73, 7,76 (4 × m, 4H, aromatisch und Vinyl), 10,88 (s, 1H, CONH), 13,67 (s, 1H, Pyrrol-NH). MS m/z 396 [M + 1].
Beispiel 52
5-(5-Chlor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure-(2-pyrrolidin-1-yl-ethyl)-amid
5-Chlor-1,3-dihydro-indol-2-on wurde mit 5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure-(2-pyrrolidin-1-yl-ethyl)-amid kondensiert, wodurch die Titelverbindung erhalten wurde.
MS + ve APCI 413 [M⁺ + 1].
Beispiel 53
2,4-Dimethyl-5-(2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-di-methylaminoethyl)-amid
1,3-Dihydro-indol-2-on wurde mit 5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-di-methylaminoethyl)amid kondensiert, wodurch die Titelverbindung erhalten wurde.
¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13,63 (s, 1H, NH), 10,90 (s, 1H, NH), 7,78 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 7,63 (s, 1H, H-Vinyl), 7,48 (t, 1H, NH), 7,13 (dt, 1H), 6,98 (dt, 1H), 6,88 (d, J = 7,7 Hz, 1H), 3,31 (q, J = 6,6 Hz, 2H), 2,43 (s, 3H, CH₃), 2,40 (s, 3H, CH₃), 2,38 (t, J = 6,6 Hz, 2H), 2,19 (s, 6H, N(CH₂CH₃)₂).
MS + ve APCI 353 [M⁺ + 1].
Beispiel 98
5-[5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-ethylamino-ethyl)-amid
5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-ethylamino-ethyl)-amid (99 g), Ethanol (400 ml), 5-Fluor-2-oxindol (32 g) und Pyrrolidin (1,5 g) wurden unter Rückfluß für 3 Stunden unter Rühren erhitzt. Das Gemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und die Feststoffe durch Vakuumfiltration gesammelt. Die Feststoffe wurden in Ethanol bei 60 °C gerührt, auf Raumtemperatur abgekühlt und durch Vakuumfiltration gesammelt. Das Produkt wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 5-[5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-ethylamino-ethyl)-amid (75 g, 95 % Ausbeute) erhalten wurde. ¹H-NMR (Dimethylsulfoxid-d₆) δ 1,03 (t, 3H, CH₃), 2,42, 2,44 (2 × s, 6H, 2 × CH₃), 2,56 (q, 2H, CH₂), 2,70, 3,30 (2 × t, 4H, 2 × CH₂), 6,85, 6,92, 7,58, 7,72, 7,76 (5 × m, 5H, aromatisch, Vinyl und CONH), 10,90 (br s, 1H, CONH), 13,65 (br s, 1H, Pyrrol-NH). MS m/z 369 [M – 1].
Beispiel 95
5-[5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure[2-(pyridin-1-yl)ethyl]-amid
5-[5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure (120 mg, 0,4 mmol) wurde mit EDC, HCl (96 mg, 0,5 mmol), wasserfreiem 1-Hydroxy-benzotriazol (68 mg, 0,5 mmol) und 2-(2-Aminoethylpyridin, bezogen von Aldrich, in wasserfreiem DMF (3 ml) für 2–3 Tage bei Raumtemperatur geschüttelt. Das Reaktionsgemisch wurde mit 1M NaHCO₃ (1,5 ml), dann mit 8 ml Wasser verdünnt. Das ausgefällte Rohprodukt wurde durch Filtration gesammelt, mit Wasser gewaschen, getrocknet und durch Kristallisation oder Chromatographie gereinigt, wodurch 5-[5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure[2-(pyridin-1-yl)ethyl]amid erhalten wurde.
Beispiel 94
5-[5-Chlor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure[2-(pyridin-1-yl)ethyl]amid
Durch die Verfahrensweise, wie im vorstehenden Beispiel beschrieben, aber unter Ersetzen von 5-[5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure durch 5-[5-Chlor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure (127 mg) wurde 5-[5-Chlor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure[2-(pyridin-1-yl)ethyl]amid bereitgestellt.
Beispiel 97
5-[5-Brom-2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyll-2,4-dimethvl-1H-pyrrol-3-carbonsäure[2-(pyridin-1-yl)ethyl]amid
Durch die Verfahrensweise, wie im obigen Beispiel 95 beschrieben, aber unter Ersetzen von 5-[5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure durch 5-[5-Brom-2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure (145 mg) wurde 5-[5-Brom-2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure[2-(pyridin-1-yl)ethyl]amid bereitgestellt.
Beispiel 96
5-[2-Oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure-[2-(pyridin-1-yl)ethyl]amid
Durch die Verfahrensweise, wie im obigen Beispiel 95 beschrieben, aber unter Ersetzen von 5-[5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure durch 5-[2-Oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure (113 mg) wurde 5-[2-Oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure[2-(pyridin-1-yl)ethyl]amid bereitgestellt.
Beispiele 91, 92, 93 und 101
Durch die Verfahrensweise, wie in den obigen Beispielen 95, 94, 96 und 97 beschrieben, aber unter Ersetzen von 2-(2-Aminoethyl)pyridin durch 1-(2-Aminoethyl)pyrrolidin, bezogen von Aldrich Chemical Company, Inc., wurden die gewünschten Verbindungen bereitgestellt.
Beispiele 62 bis 65
Durch die Verfahrensweise, wie in den obigen Beispielen 95, 94, 96 und 97 beschrieben, aber unter Ersetzen von 2-(2-Aminoethyl)pyridin durch 1-(2-Aminoethyl)imidazolin-2-on (hergestellt durch Erhitzen von Dimethylcarbonat mit Bis(2-aminoethyl)amin (2 Äquivalente) in einem verschlossenen Kolben bei 150 °C für 30 min. gemäß der in US-Patent 2613212 (1950), von Rohm & Haas Co. beschriebenen Verfahrensweise. Das Rohprodukt wurde auf Siliciumdioxid unter Verwendung eines Elutionsgemisches aus Chloroform-Methanolwäßrigem Ammoniak 80 : 25 : 2 gereinigt), wurden die gewünschten Verbindungen bereitgestellt.
Beispiele 66 bis 68 und 89
Durch die Verfahrensweise, wie in den obigen Beispielen 95, 94, 96 und 97 beschrieben, aber unter Ersetzen von 2-(2-Aminoethyl)pyridin durch 4-(2-Aminoethyl)piperazin-1-essigsäureethylester (hergestellt wie folgt: Piperazin-1-essigsäureethylester (11,22 g) wurde mit Iodacetonitril (5,0 ml) in Gegenwart von Kaliumcarbonat (6,9 g) in Ethylacetat (260 ml) bei 0 °C behandelt. Nachdem die Iodacetonitrilzugabe beendet war (45 min), wurde das Reaktionsgemisch anschließend bei Raumtemperatur für 11 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert und die Filtrate eingedampft. Der Rest wurde in Gegenwart von Kobaltborid (hergestellt aus CoCl2 und Natriumborhydrid) bei Raumtemperatur bei 50 psi für 2 Tage in Etha nol hydriert. Filtration, Eindampfen und chromatographische Reinigung unter Verwendung eines Elutionsgemisches aus Chloroform-Methanol-wäßrigem Ammoniak 80 : 25 : 2 ergab das gewünschte Amin (3,306 g) als hellgelbes Öl), wurden die folgenden Verbindungen bereitgestellt.
Beispiel 69 bis 72
Durch die Verfahrensweise, wie in den obigen Beispielen 95, 94, 96 und 97 beschrieben, aber unter Ersetzen von 2-(2-Aminoethyl)pyridin durch 1-(3-Aminopropyl)-azepin-2-on (hergestellt gemäß dem Verfahren in Kraft A.: J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 6, 1999, 705–14, außer, daß die Hydrolyse von DBU bei 145 °C rein in Gegenwart von Lithiumhydroxid durchgeführt wurde (l h, 5 ml DBU, 2 ml Wasser, 420 mg Lithiumhydroxidhydrat), wobei die Reinigung des Rohproduktes auf Siliciumdioxid unter Verwendung eines Elutionsgemisches aus Chloroform-Methanol-wäßrigem Ammoniak 80 : 40 : 4 1-(3-Aminopropyl)azepin-2-on (4,973 g, 87 % Ausbeute) ergab), wurden die gewünschten Verbindungen bereitgestellt.
Beispiele 54 bis 56 und 73
Durch die Verfahrensweise, wie in den obigen Beispielen 95, 94, 96 und 97 beschrieben, aber unter Ersetzen von 2-(2-Aminoethyl)pyridin durch N-Acetylethylendiamin (hergestellt durch Erhitzen eines Gemisches aus Ethylacetat mit Ethylendiamin (1,5 Äquivalente) auf 160 °C für 1 h in einem verschlossenen Behälter. Die Vakuumdestillation ergab das gewünschte Produkt in 56%iger Ausbeute. N-Acetylethylendiamin ist auch von Aldrich erhältlich), wurden die gewünschten Verbindungen bereitgestellt.
Beispiele 57 bis 60
Durch die Verfahrensweise, wie in den obigen Beispielen 95, 94, 96 und 97 beschrieben, aber unter Ersetzen von 2-(2-Aminoethyl)pyridin durch 1-(3-Aminopropyl)-tetrahydro-pyrimidin-2-on (hergestellt in der gleichen Weise, wie 1-(3-Aminopropyl)-azepin-2-on, gemäß der Verfahrensweise in Kraft A.: J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 6, 1999, 705–14: Kurz, 1,3,4,6,7,8-Hexahydro-2H-pyrimido[1,2-a]pyrimidin (4,939 g), Lithiumhydroxidhydrat (918 mg) und 2 ml Wasser wurden ohne Lösungsmittel in einem verschlossenen Behälter auf 145 °C für 1 h erhitzt. Das Rohprodukt wurde auf einer Siliciumdioxidsäule in Chloroform-Methanol-wäßrigem Ammoniak 80 : 40 : 4 gereinigt, wodurch reines Amin (5,265 g, 94 % Ausbeute) erhalten wurde.), wurden die gewünschten Verbindungen bereitgestellt.
Beispiele 61, 74 bis 75 und 90
Durch die Verfahrensweise, wie in den obigen Beispielen 95, 94, 96 und 97 beschrieben, aber unter Ersetzen von 2-(2-Aminoethyl)pyridin durch 1-(2-Aminoethyl)-piperazin-2-on (hergestellt wie folgt: Reines tert-Butyldiphenylsilylchlorid (25 ml, 97,7 mmol) wurde tropfenweise zu einer Lösung aus DBU (19,5 ml, 130 mmol) und Bis(2-aminoethyl)amin (4,32 ml, 40 mmol) in wasserfreiem Dimethylacetamid (80 ml) bei Raumtemperatur unter Kühlung an einem Wasserbad innerhalb von 5 Minuten zugegeben. Das Gemisch wurde für 5 Stunden gerührt. Bromessigsäureethylester (6,70 ml, 60 mmol) wurde rein unter Abkühlen auf Raumtemperatur zugegeben. Die Reaktion wurde für 25 Minuten gerührt, dann bei hohem Vakuum eingedampft. Der Rest wurde in Methanol (200 ml) gelöst, KHCO₃ (10 g) und KF (12 g, 200 mmol) wurden zugegeben, und das Gemisch wurde bei 60 °C für 5 Stunden gerührt. 10 g Na₂CO₃ wurden zugegeben, für 10 Minuten gerührt, abgekühlt und filtriert. Die Filtrate wurden eingedampft. Der Rest wurde mit Hexanen (2 × 250 ml) extrahiert. Das Hexan-unlösliche Material wurde in Ethanol (60 ml) gelöst, filtriert und eingedampft. Der Rest wurde auf einer Siliciumdioxidsäule in Chloroform-Methanol-wäßrigem Ammoniak 80 : 40 : 4 gereinigt, wodurch reines Amin (4,245 g, 74 % Ausbeute) erhalten wurde), wurden die gewünschten Verbindungen bereitgestellt.
Beispiel 77
5-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure-[2-(4-methylpiperazin-1-yl)-ethyl]-amid
Zu einem gerührten, gelben, trüben Gemisch aus 5-[5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure (90 mg), DMF (0,8 ml) und TEA (0,084 ml) in einem 20-ml-Reaktionsröhrchen wurde BOP-Reagens (199 mg) zugegeben. Das Gemisch wurde nach 5 min klar. 2-(4-Methylpiperazin-1-yl)ethylamin¹ (51 mg) wurde zu dem klaren Gemisch zugegeben. Die resultierende Lösung wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Gelbe feste Produkte fielen aus dem Reaktionssystem aus. Dünnschichtchromatographie (10 % Methanol in Methylenchlorid) zeigte, daß das gesamte Ausgangsmaterial zu dem Produkt umgewandelt worden war. Der Feststoff wurde durch Vakuumfiltration isoliert und einmal mit Ethanol (1 ml) gewaschen. Der Feststoff wurde in Diethylether (2 ml) für 20 min mit Ultraschall behandelt und durch Vakuumfiltration gesammelt. Nach dem Trocknen unter Vakuum wurde 5-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-yliden-methyl)-2,4-dimethyl- 1H-pyrrol-3-carbonsäure(4-methylpiperazin-1-yl-ethyl)-amid (79 mg, 62 % Ausbeute) erhalten.
¹H NMR (DMSO-d₆) δ 2,13 (s, 3H, CH₃), 2,40, 2,42 (2 × s, 6H, 2 × CH₃), 2,41 (m, 2H, CH₂), 2,47 (m, 8H, 4 × CH₂), 3,30 (m, 2H, CH₂), 6,82 (dd, J = 4,5, 8,7 Hz, l H), 6,91 (td, ²J = 2,4, ³J 8,8 Hz, 1H), 7,43 (t, J = 5,6 Hz, 1H), 7,70 (s, 1H), 7,75 (dd, J = 2,8, 9,6 Hz, 1H) (aromatisch und Vinyl), 10,88 (s, 1H, CONH), 13,67 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 424,4 (M – 1).
Beispiel 78
5-(5-Chlor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(4-methylpiperazin-1-ylethyl)-amid
Der obigen Verfahrensweise in Beispiel 77 folgend, aber unter Ersetzen von 5-[5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure durch 5-[5-Chlor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure (95 mg, 0,3 mmol) wurde 5-(5-Chlor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(4-methylpiperazin-1-ylethyl)-amid (76 mg, 58 %) erhalten.
¹H NMR (DMSO-d₆) δ 2,13 (s, 3H, CH₃), 2,41, 2,42 (2 × s, 6H, 2 × CH₃), 2,42 (m, 2H, CH₂), 2,48 (m, 8H, 4 × CH₂), 3,30 (m, 2H, CH₂), 6,84 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,11 (dd, J = 2,0, 8,0 Hz, 1H), 7,44 (t, J = 5,6 Hz, 1H), 7,76 (s, 1H), 7,97 (d, J = 2,0 Hz, 1H) (aromatisch und Vinyl), 10,98 (s, 1H, CONH), 13,62 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 440,2 (M-1).
Beispiel 79
5-(5-Brom-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(4-methylpiperazin-1-yl-ethyl)-amid
Der in Beispiel 77 beschriebenen Verfahrenweise folgend, aber unter Ersetzen von 5-(5-Chlor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure durch 5-(5-Brom-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure, wurde 5-(5-Brom-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(4-methylpiperazin-1-yl-ethyl)-amid (39 mg, 54 %) aus SU011670 (54 mg, 0,15 mmol) erhalten.
¹H NMR (DMSO-d₆) δ 2,14 (s, 3H, CH₃), 2,41, 2,42 (2 × s, 6H, 2 × CH₃), 2,42 (m, 2H, CH₂), 2,48 (m, 8H, 4 × CH₂), 3,31 (m, 2H, CH₂), 6,80 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,23 (dd, J = 2,0, 8,0 Hz, 1H), 7,44 (t, J = 5,6 Hz, 1H), 7,76 (s, 1H), 8,09 (d, J = 2,0 Hz, 1H) (aromatisch und Vinyl), 10,99 (s, 1H, CONH), 13,61 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 486,6 (M).
Beispiel 81
5-(2-Oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(4-methylpiperazin-1-yl-ethyl)-amid
Der oben in Beispiel 77 beschriebenen Verfahrensweise folgend, aber unter Ersetzen von 5-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure, SU014900, durch 5-(2-Oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure, wurde 5-(2-Oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(4-methylpiperazin-1-yl-ethyl)-amid, SU014903, (136 mg, 84 %) aus SU012120 (112,8 mg, 0,4 mmol) erhalten.
¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 2,13 (s, 3H, CH₃), 2,39, 2,42 (2 × s, 6H, 2 × CH₃), 2,42 (m, 2H, CH₂), 2,48 (m, 8H, 4 × CH₂), 3,30 (t, 2H, CH₂), 6,86 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 6,96 (t, J = 7,4 Hz, 1H), 7,10 (t, J = 7,8 Hz, 1H), 7,41 (t, J = 5,4 Hz, 1H), 7,62 (s, 1H), 7,76 (d, J = 7,6 Hz, 1H) (aromatisch und Vinyl), 10,88 (s, 1H, CONH), 13,61 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 406,6 (M-1).
Beispiel 80
5-[2-Oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure-[2-(3,5-dimethylpiperazin-1-yl)ethyl)amid
Zu einem gerührten, gelben, trüben Gemisch aus 5-[2-Oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure (112,8 mg, 0,4 mmol), DMF (0,5 ml) und Triethylamin (0,111 ml) in einem 20-ml-Reaktionsröhrchen wurde BOP-Reagens (265 mg) zugegeben. Das Gemisch wurde nach 5 min klar. 2-(2,6-Dimethylpiperazin-1-yl)ethylamin (68,6 mg) (siehe Tapia, L. Alonso-Cires, P. Lopez-Tudanca, R. Mosquera, L. habeaga, A. Innerarity, A. Orjales, J. Med. Chem., 1999, 42, 2870–2880) wurde zu dem klaren Gemisch zugegeben. Die resultierende Lösung wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Dünnschichtchromatographie (10 % Methanol in Methylenchlorid) zeigte, daß das gesamte Aus gangsmaterial zu dem Produkt umgewandelt worden war. Das Reaktionsgemisch wurde zur Trockne eingedampft und dann durch Flashchromatographie (CH₂Cl₂/CH₃OH = 20/1–15/1), gefolgt von Umkristallisation, gereinigt, wodurch 5-[2-Oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure[2-(3,5-dimethylpiperazin-1-yl)ethyl)amid (83 mg, 50 % Ausbeute) erhalten wurde.
¹H NMR (DMSO-d₆) δ 1,15, 1,16 (2 × s, 6H, 2 × CH₃), 1,95 (t, J = 11,6 Hz, 2H, CH₂), 2,41, 2,47 (2 × s, 6H, 2 × CH₃), 2,50 (m, 2H, CH₂), 3,03 (d, J = 10 Hz, 2H), 3,19 (m, 2H), 3,30 (m, 2H, CH₂), 6,86 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 6,97 (t, J = 7,2 Hz, 1H), 7,11 (t, J = 7,8 Hz, 1H), 7,48 (t, J = 5,6 Hz, 1H), 7,61 (s, 1H), 7,75 (d, J = 7,6 Hz, 1H) (aromatisch und Vinyl), 10,88 (s, 1H, CONH), 13,62 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 422,2 (M + 1).
Beispiel 82
5-[5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure[2-(3,5-dimethylpiperazin-1-yl)ethyl)amid
Der oben in Beispiel 77 beschriebenen Verfahrensweise folgend, wurde die gewünschte Verbindung (60 mg, 0,2 mmol) erhalten.
¹H NMR (DMSO-d₆) δ 0,891, 0,907 (2 × s, 6N, 2 × CH₃), 1,49 (t, J = 10,4 Hz, 2H), 2,40, 2,42 (2 × s, 6H, 2 × CH₃), 2,41 (m, 2H, CH₂), 2,74 (m, 4H), 3,30 (m, 2H), 6,82 (dd, J = 4,5, 8,7 Hz, 1H), 6,90 (td, ²J = 2,4, ³J = 8,4 Hz, 1H), 7,42 (t, J = 5,6 Hz, 1H), 7,70 (s, 1H), 7,74 (dd, J = 4,6, 8,4 Hz, 1H) (aromatisch und Vinyl), 10,88 (s, 1H, CONH), 13,65 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 438,4 (M – 1).
Beispiel 83
5-[5-Chlor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure[2-(3,5-dimethylpiperazin-1-yl)ethyl)amid
Der obigen Verfahrensweise von Beispiel 80 folgend, wurde die gewünschte Verbindung (31,2 mg, 34 %) aus 5-[5-Chlor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure (63 mg, 0,2 mmol) erhalten.
¹H NMR (DMSO-d₆) δ 1,15, 1,16 (2 × s, 6H, 2 × CH₃), 1,95 (t, J = 11,6 Hz, 2H, CH₂), 2,40, 2,42 (2 × s, 6H, 2 × CH₃), 2,50 (m, 2H, CH₂), 3,03 (d, J = 11,2 Hz, 2H), 3,19 (m, 2H), 3,30 (m, 2H, CH₂), 6,85 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,11 (dd, J = 2,0, 8,0 Hz, 1H), 7,52 (t, J = 5,6 Hz, 1H), 7,76 (s, 1H), 7,97 (d, J = 2,0 Hz, 1H) (aromatisch und Vinyl), 10,99 (s, 1H, CONH), 13,63 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 456,2 (M + 1).
Beispiel 84
5-[5-Brom-2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-pyrrol-3-carbonsäure[2-(3,5-dimethylpiperazin-1-yl)ethyl)amid
Der in Beispiel 80 beschriebenen Verfahrensweise folgend, wurde die gewünschte Verbindung (40 mg, 40 %) aus 5-[5-Brom-2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure (74 mg, 0,2 mmol) erhalten.
¹H NMR (DMSO-d₆) δ 1,15, 1,16 (2 × s, 6H, 2 × CH₃), 1,95 (t, J = 11,6 Hz, 2H, CH₂), 2,40, 2,42 (2 × s, 6H, 2 × CH₃), 2,50 (m, 2H, CH₂), 3,03 (d, J = 10,4 Hz, 2H), 3,19 (m, 2H), 3,30 (m, 2H, CH₂), 6,81 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,24 (dd, J = 2,0, 8,4 Hz, 1H), 7,51 (t, J = 5,6 Hz, 1H), 7,76 (s, 1H), 8,10 (d, J = 2,0 Hz, 1H) (aromatisch und Vinyl), 10,99 (s, 1H, CONH), 13,62 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 498,4 (M – 1).
Biologische Beispiele
Die folgenden Assays werden eingesetzt, um die Verbindungen zu finden, die den optimalen Grad der gewünschten Aktivität zeigen.
A. Assayverfahren.
Die folgenden Assays können zur Bestimmung des Niveaus der Aktivität und Wirkung der verschiedenen Verbindungen der vorliegenden Erfindung auf eine oder mehrere PKs verwendet werden. Ähnliche Assays können in Übereinstimmung mit denselben Linien für jede PK unter Verwendung von Techniken, die in der Technik allgemein bekannt sind, gestaltet werden.
Mehrere der hierin beschriebenen Assays werden in einem ELISA-Format (heterologer Enzym-Immunassay) durchgeführt (Voller, et. al., 1980, „Enzyme-Linked Immunosorbent Assay", Manual of Clinical Immunology, 2. Aufl., Rose und Friedman, Am. Soc. Of Microbio logy, Washington, D. C., S. 359–371). Das allgemeine Verfahren lautet wie folgt: eine Verbindung wird in Zellen, die die Testkinase entweder natürlich oder rekombinant exprimieren, für einen ausgewählten Zeitraum eingeführt, woraufhin, wenn die Testkinase ein Rezeptor ist, ein Ligand, der bekanntermaßen den Rezeptor aktiviert, zugegeben wird. Die Zellen werden lysiert und das Lysat wird in die Löcher einer ELISA-Platte, die vorher mit einem spezifischen Antikörper, der das Substrat der enzymatischen Phosphorylierungsreaktion erkennt, überzogen wurde, überführt. Nicht-Substrat-Komponenten des Zellysats werden abgewaschen und die Menge der Phosphorylierung auf dem Substrat mit einem Antikörper, der spezifisch Phosphotyrosin erkennt, detektiert und mit Kontrollzellen, die nicht mit einer Testverbindung kontaktiert wurden, verglichen.
Die derzeit bevorzugten Protokolle zur Durchführung der ELISA-Experimenten für spezielle PKs werden nachstehend angegeben. Die Anpassung dieser Protokolle zur Bestimmung der Aktivität von Verbindungen gegen andere RTKs sowie für CTKs und STKs ist einem Fachmann allgemein bekannt. Andere der hierin beschriebenen Assays messen die Menge an DNA, die in Reaktion auf die Aktivierung einer Testkinase erzeugt wurde, was ein allgemeines Maß für eine proliferative Antwort ist. Das allgemeine Verfahren für diesen Assay lautet wie folgt: eine Verbindung wird in Zellen, die die Testkinase entweder natürlich oder rekombinant exprimieren, für einen ausgewählten Zeitraum eingeführt, woraufhin, wenn die Testkinase ein Rezeptor ist, ein Ligand, der bekanntermaßen den Rezeptor aktiviert, zugegeben wird. Nach der Inkubation mindestens über Nacht, wird ein DNA-markierendes Reagens wie 5-Bromdeoxyuridin (BrdU) oder H³-Thymidin zugegeben. Die Menge an markierter DNA wird entweder mit einem Anti-BrdU-Antikörper oder durch Messen der Radioaktivität detektiert und mit Kontrollzellen, die nicht mit einer Testverbindung kontaktiert wurden, verglichen.
GST-FLK-1-BIOASSAY
Dieser Assay analysiert die Tyrosinkinaseaktivität von GST Flk1 auf Poly(glu, tyr)peptiden.
Materialien und Reagenzien:

1. Corning-96-Loch-ELISA-Platten (Corning Katalog-Nr. 5805-96).
2. Poly(glu, tyr) 4 : 1, Lyophilisat (Sigma Katalog # P0275).
3. Herstellung von Poly(glu, tyr)(pEY)-überzogenen Assayplatten: Überzug 2 μg/Loch von Poly(glu, tyr)(pEY) in 100 μl PBS, gehalten bei Raumtemperatur für 2 Stunden oder bei 4 °C über Nacht. Die Platten wurden zur Verhinderung der Eindampfung gut abgedeckt.
4. PBS-Puffer: Für 1 l werden 0,2 g KH₂PO₄, 1,15 g Na₂HPO₄, 0,2 g KCl und 8 g NaCl in ungefähr 900 ml dH₂O gemischt. Nach Auflösung aller Reagenzien wird der pH mit HCl auf 7,2 eingestellt. Das Gesamtvolumen wird mit dH₂O auf 1 l gebracht.
5. PBST-Puffer: Auf 1 l PBS-Puffer wurden 1,0 ml Tween 20 zugegeben.
6. TBB-Blockierungspuffer: Für 1 l werden 1,21 g TRIS, 8,77 g NaCl, 1 ml TWEEN-20 in ungefähr 900 ml dH₂O gemischt. Einstellen des pH auf 7,2 mit HCl. Zugabe von 10 g BSA, Rühren zum Auflösen. Das Gesamtvolumen mit dH₂O auf 1 l bringen. Filtrieren zur Entfernung partikulärer Stoffe.
7. 1 % BSA in PBS: Zur Herstellung einer 1x Arbeitslösung werden 10 g BSA zu ungefähr 990 ml PBS-Puffer gegeben, Rühren zum Auflösen. Einstellen des Gesamtvolumens auf 1 l mit PBS-Puffer, Filtrieren zum Entfernen partikulärer Stoffe.
8. 50 mM Hepes, pH 7,5.
9. GST-Flk1cd, gereinigt aus sf9 rekombinanter Baculovirustransformation (SUGEN, Inc.).
10. 4 % DMSO in dH₂O.
11. 10 mM ATP in dH₂O.
12. 40 mM MnCl₂
13. Kinase-Verdünnungspuffer (KDB): Mischen von 10 ml Hepes (pH 7,5), 1 ml 5M NaCl, 40 μl 100 mM Natriumorthovanadat und 0,4 ml 5 % BSA in dH₂O mit 88,56 ml dH₂O.
14. NUNC-96-Loch-V-Boden-Polypropylenplatten, Applied Scientific Katalog # AS-72092
15. EDTA: Mischen von 14,12 g Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) zu ungefähr 70 ml dH₂O. Zugabe von 10 N NaOH bis sich EDTA auflöst. Einstellen des pH auf 8,0. Einstellen des Gesamtvolumens auf 100 ml mit dH₂O.
16. 1⁰ Antikörper-Verdünnungspuffer: Mischen von 10 ml 5 % BSA in PBS-Puffer mit 89,5 ml TBST.
17. monoklonaler Anti-Phosphotyrosin-Antikörper, konjugiert mit Meerrettichperoxidase (PY99 HRP, Santa Cruz Biotech).
18. 2,2'-Azinobis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure (ABTS, Moss, Kat. Nr. ABST).
19. 10 % SDS.

Verfahren:

1. Überziehen der Corning-96-Loch-ELISA-Platten mit 2 μg PolyEY-Peptid in sterilem PBS, wie in Schritt 3 aus Materialien und Reagenzien beschrieben.
2. Entfernen ungebundener Flüssigkeit aus den Löchern durch Umdrehen der Platte. Einmal Waschen mit TBST. Klopfen der Platte auf ein Papiertuch, um die überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.
3. Zugabe von 100 μl 1 % BSA in PBS in jedes Loch. Inkubieren unter Schütteln für eine Stunde bei Raumtemperatur.
4. Wiederholen von Schritt 2.
5. Tränken der Löcher mit 50 mM HEPES (pH 7,5) (150 μl/Loch).
6. Verdünnen der Testverbindung mit dH₂O/4 % DMSO auf das 4fache der gewünschten endgültigen Assaykonzentration in 96-Loch-Polypropylenplatten.
7. Zugabe von 25 μl der verdünnten Testverbindung in die ELISA-Platte. Geben von 25 ml dH₂O/4 % DMSO in die Kontrollöcher.
8. Zugabe von 25 μg mM MnCl₂ mit 4x ATP (2 μM) in jedes Loch.
9. Zugabe von 25 μl 0,5 M EDTA zu den Negativkontrollöchern.
10. Verdünnen von GST-Flk1 auf 0,005 μg (5 ng)/Loch mit KDB.
11. Zugabe von 50 μl verdünntem Enzym zu jedem Loch.
12. Inkubieren unter Schütteln für 15 Minuten bei Raumtemperatur.
13. Stoppen der Reaktion durch die Zugabe von 50 μl 250 mM EDTA (pH 8,0).
14. Waschen 3x mit TBST und Abtupfen der Platte mit einem Papiertuch, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.
15. Zugabe von 100 μl pro Loch Anti-Phosphotyrosin-HRP-Konjugat, 1 : 5.000 Verdünnung in Antikörper-Verdünnungspuffer. Inkubieren unter Schütteln für 90 min bei Raumtemperatur.
16. Waschen wie in Schritt 14.
17. Zugabe von 100 μl ABTS-Lösung bei Raumtemperatur zu jedem Loch.
18. Inkubieren unter Schütteln für 10 bis 15 Minuten. Entfernen der Blasen.
19. Stoppen der Reaktion durch die Zugabe von 20 μl 10 % SDS zu jedem Loch.
20. Auslesen der Ergebnisse auf einem Dynatech MR7000 ELISA-Leser mit einem Testfilter bei 410 nm und einem Referenzfilter bei 630 nm.

PYK2-BIOASSAY
Dieser Assay wird zur Messung der In-vitro-Kinasesaktivität von HA-Epitop-markiertem Vollängen-pyk2 (FL.pyk2-HA) in einem ELISA-Assay verwendet.
Materialien und Reagenzien:

1. Corning-96-Loch-Elisa-Platten.
2. 12CA5 monoklonaler Anti-HA-Antikörper (SUGEN, Inc.)
3. PBS (Dulbecco's Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (Gibco Katalog # 450-1300EB))
4. TBST-Puffer: Für 1 l werden 8,766 g NaCl, 6,057 g TRIS und 1 ml 0,1 % Triton X-100 ährin ungef 900 ml dH₂O gemischt. Einstellen des pH auf 7,2, das Volumen wird auf 11 gebracht.
5. Blockierungspuffer: Für 1 l werden 100 g 10 % BSA, 12,1 g 100 mM TRIS, 58,44 g 1M NaCl und 10 ml 1 % TWEEN 20 gemischt.
6. FL.pyk2-HA aus sf9 Zellysaten (SUGEN, Inc.).
7. 4 % DMSO in MilliQue H₂O.
8. 10 mM ATP in dH₂O.
9. 1M MnCl₂.
10. 1M MgCl₂.
11. 1M Dithiothreitol (DTT).
12. 10x Kinase-Puffer-Phosphorylierung: Mischen von 5,0 ml 1M Hepes (pH 7,5), 0,2 ml 1M MnCl₂, 1,0 ml 1 MgCl₂, 1,0 ml 10 % Triton X-100 in 2,8 ml dH₂O. Kurz vor der Verwendung werden 0,1 ml 1M DTT zugegeben..
13. NUNC-96-Loch-V-Boden-Polypropylenplatten.
14. 500 mM EDTA in dH₂O.
15. Antikörper-Verdünnungspuffer: Für 100 ml, 1 ml 5 % BSA/PBS und 1 ml 10 % Tween-20 in 88 ml TBS.
16. HRP-konjugiertes Anti-PtyrPY99, Santa Cruz Biotech Kat.-Nr. SC-7020.
17. ABTS, Moss, Kat.-Nr. ABST-2000.
18. 10 % SDS.

Verfahren:

1. Überziehen der Corning-96-Loch-ELISA-Platten mit 0,5 μg 12CA5 Anti-HA-Antikörper in 100 μl PBS pro Loch. Lagerung über Nacht bei 4 °C.
2. Entfernen von nicht gebundenem HA-Antikörper aus den Löchern durch Umdrehen der Platte. Waschen der Platte mit dH₂O. Klopfen der Platte auf ein Papiertuch, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.
3. Zugabe von 150 μl Blockierungspuffer zu jedem Loch. Inkubieren unter Schütteln für 30 min bei Raumtemperatur.
4. Waschen der Platte 4x mit TBS-T.
5. Verdünnen des Lysats in PBS (1,5 μg Lysat/100 μl PBS).
6. Zugab von 100 μl verdünntem Lysat zu jedem Loch. Schütteln bei Raumtemperatur für 1 h.
7. Waschen wie in Schritt 4.
8. Zugabe von 50 μl 2x Kinasepuffer zu der ELISA-Platte, die eingefangenes pyk2-HA enthält.
9. Zugabe von 25 μl 400 μM Testverbindung in 4 % DMSO zu jedem Loch. Für Kontrollöcher wird 4 % DMSO allein verwendet.
10. Zugabe von 25 μl 0,5 M EDTA zu den Negativkontrollöchern.
11. Zugabe von 25 μl 20 μM ATP zu allen Löchern. Inkubieren unter Schütteln für 10 Minuten.
12. Stoppen der Reaktion durch die Zugabe von 25 μl 500 mM EDTA (pH 8,0) zu allen Löchern.
13. Waschen wie in Schritt 4.
14. Zugabe von 100 μl HRP-konjugiertem Anti-Ptyr, 1 : 6000 in Antikörper-Verdünnungspuffer verdünnt, zu jedem Loch. Inkubieren unter Schütteln für 1 h bei Raumtemperatur.
15. Waschen der Platte 3x mit TBST und 1x mit PBS.
16. Zugabe von 100 μl ABST-Lösung zu jedem Loch.
17. Nach Bedarf Stoppen der Entwicklungsreaktion durch die Zugabe von 20 μl 10 % SDS zu jedem Loch.
18. Auslesen der Platte auf einem ELISA-Leser mit einem Testfilter bei 410 nm und einem Referenzfilter bei 630 nm.

FGFR1-BIOASSAY
Dieser Assay wird zur Messung der In-vitro-Kinaseaktivität von FGF1-R in einem ELISA-Assay verwendet.
Materialien und Reagenzien:

1. Costar-96-Loch-Elisa-Platten (Corning Katalog # 3369).
2. Poly(Glu-Tyr) (Sigma Katalog # PO275).
3. PBS (Gibco Katalog # 450-1300EB)
4. 50 mM Hepes-Puffer-Lösung.
5. Blockierungspuffer (5 % BSA/PBS).
6. Gereinigtes GST-FGFR1 (SUGEN, Inc.)
7. Kinase-Verdünnungspuffer. Mischen von 500 μl 1M Hepes (GIBCO), 20 μl 5 % BSA/PBS, 10 μl 100 mM Natriumorthovanadat und 50 μl 5M NaCl.
8. 10 mM ATP
9. ATP/MnCl₂ Phosphorylierungsmischung: Mischen von 20 μl ATP, 400 μl 1M MnCl₂ und 9,56 ml dH₂O.
10. NUNC-96-Loch-V-Boden-Polypropylenplatten (Applied Scientific Katalog # AS-72092).
11. 0,5M EDTA.
12. 0,05 % TBST Zugabe von 500 μl TWEEN zu 1 Liter TBS.
13. Polyklonales Kaninchen-Anti-Phosphotyrosin-Serum (SUGEN, Inc.).
14. Ziege-Anti-Kaninchen-IgG-Peroxidase-Konjugat (Biosource, Katalog # ALI0404).
15. ABTS-Lösung.
16. ABTS/H₂O₂-Lösung.

Verfahren:

1. Überziehen der Costar-96-Loch-ELISA-Platten mit 1 μg Poly(Glu, Tyr) in 100 μl PBS pro Loch. Lagerung bei 4 °C über Nacht.
2. Waschen der überzogenen Platten einmal mit PBS.
3. Zugabe von 150 μl 5 % BSA/PBS-Blockierungspuffer zu jedem Loch. Inkubieren unter Schütteln für 1 h bei Raumtemperatur.
4. Waschen der Platte 2x mit PBS, dann einmal mit 50 mM Hepes. Klopfen der Platten auf ein Papiertuch, um überschüssige Flüssigkeit und Blasen zu entfernen.
5. Zugabe von 25 μl 0,4 mM Testverbindung in 4 % DMSO oder 4 % DMSO allein (Kontrollen) zu der Platte.
6. Verdünnen von gereinigtem GST-FGFR1 in Kinase-Verdünnungspuffer (5 ng Kinase/50 μl KDB/Loch).
7. Zugabe von 50 μl der verdünnten Kinase zu jedem Loch.
8. Starten der Kinasereaktion durch die Zugabe von 25 μl/Loch frisch hergestelltem ATP/Mn++ (0,4 ml 1M MnCl₂, 40 μATP,l 10 mM 9,56 ml dH₂O, frisch hergestellt).
9. Dies ist eine schnelle Kinasereaktion und muß mit 25 μl 0,5 M EDTA ähnlich wie bei der Zugabe von ATP gestoppt werden.
10. Waschen der Platte 4x mit frischem TBST.
11. Auffüllen von Antikörper-Verdünnungspuffer: pro 50 ml: Mischen von 5 ml 5 % BSA, 250 μl 5 % Milch und 50 μl 100 mM Natriumvanadat, mit 0,05 % TBST auf Endvolumen bringen.
12. Zugabe von 100 μl pro Loch Anti-Phosphotyrosin (1 : 10000 Verdünnung in ADB). Inkubieren unter Schütteln für 1 h bei Raumtemperatur.
13. Waschen wie in Schritt 10.
14. Zugabe von 100 μl pro Loch Biosource Ziege-Anti-Kaninchen-IgG-Peroxidase-Konjugat (1 : 6000 Verdünnung in ADB). Inkubieren unter Schütteln für 1 h Raumtemperatur.
15. Waschen wie in Schritt 10 und dann mit PBS, um Blasen und überschüssiges TWEEN zu entfernen.
16. Zugabe von 100 μl ABTS/H₂O₂-Lösung zu jedem Loch.
17. Inkubieren unter Schütteln für 10 bis 20 Minuten. Entfernen der Blasen.
18. Ausleseassay auf einem Dynatech MR7000-Elisa-Leser: Testfilter bei 410 nm, Referenzfilter bei 630 nm.

EGFR-BIOASSAY
Dieser Assay wird zur Messung der In-vitro-Kinaseaktivität von FGF1-R in einem ELISA-Assay verwendet.
Materialien und Reagenzien:

1. Corning-96-Loch-Elisa-Platten.
2. SUMO1 monoklonaler Anti-EGFR-Antikörper (SUGEN, Inc.).
3. PBS
4. TBST-Puffer
5. Blockierungspuffer: Für 100 ml werden 5,0 g Carnation Instant Non-fat Milk^® mit 100 ml PBS gemischt.
6. A431 Zellysat (SUGEN, Inc.).
7. TBS-Puffer:
8. TBS + 10 % DMSO: Für 1 l mischen von 1,514 g TRIS, 2,192 g NaCl und 25 ml DMSO; bringen mit dH₂O auf 1 l Gesamtvolumen.
9. ATP (Adenosin-5'-triphosphat, aus Pferdemuskel, Sigma Kat. Nr. A-5394), 1,0 mM Lösung in dH₂O. Dieses Reagens sollte unmittelbar vor der Verwendung aufgefüllt und auf Eis gehalten werden.
10. 1,0 mM MnCl₂.
11. ATP/MnCl₂300 Phosphorylierungsgemisch: zur Herstellung von 10 ml werden μl 1 mM ATP, 500 μl MnCl₂ und 9,2 ml dH₂O gemischt. Kurz vor der Verwendung herstellen und auf Eis halten.
12. NUNC-96-Loch-V-Boden-Polypropylenplatten.
13. EDTA.
14. Polyklonales Kaninchen-Anti-Phosphotyrosin-Serum (SUGEN, Inc.).
15. Ziege-Anti-Kaninchen-IgG-Peroxidase-Konjugat (Biosource Kat. Nr. ALI0404).
16. ABTS.
17. 30%iges Wasserstoffperoxid.
18. ABTS/H₂O₂.
19. 0,2 M HCl.

Verfahren:

1. Überziehen der Corning-96-Loch-ELISA-Platten mit 0,5 μg SUMO1 in 100 μl PBS pro Loch, Lagerung über Nacht bei 4 °C.
2. Entfernen von nicht gebundenem SUMO1 aus den Löchern durch Umdrehen der Platte, um Flüssigkeit zu entfernen. Waschen 1x mit dH₂O. Klopfen der Platte auf ein Papiertuch, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.
3. Zugabe von 150 μl Blockierungspuffer zu jedem Loch. Inkubieren unter Schütteln für 30 min bei Raumtemperatur.
4. Waschen der Platte 3x mit deionisiertem Wasser, dann einmal mit TBST. Klopfen der Platte auf ein Papiertuch, um überschüssige Flüssigkeit und Blasen zu entfernen.
5. Verdünnung des Lysats in PBS (7 μg Lysat/100 μl PBS).
6. Zugabe von 100 μl des verdünnten Lysats zu jedem Loch. Schütteln bei Raumtemperatur für l. h.
7. Waschen der Platten wie in 4 oben.
8. Geben von 120 μl TBS in die ELISA-Platte, die eingefangenen EGFR enthält.
9. Verdünnung der Testverbindung 1 : 10 in TBS, geben in ein Loch.
10. Zugabe von 13,5 μl der verdünnten Testverbindung in die ELISA-Platte. In die Kontrolllöcher werden 13,5 μl TBS in 10 % DMSO gegeben.
11. Inkubieren unter Schütteln für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
12. Zugabe von 15 μl des Phosphorylierungsgemisches zu allen Löchern, außer zu dem Negativkontrolloch. Das endgültige Lochvolumen sollte ungefähr 150 μl betragen, wobei die Endkonzentration in jedem Loch 3M ATP/5 mM MnCl₂ beträgt. Inkubieren unter Schütteln für 5 Minuten.
13. Stoppen der Reaktion durch die Zugabe von 16,5 μl EDTA-Lösung unter Schütteln. Schütteln für eine weitere Minute.
14. Waschen 4x mit deionisiertem Wasser, 2x mit TBST.
15. Zugabe von 100 μl Anti-Phosphotyrosin (1 : 3000 Verdünnung in TBST) pro Loch. Inkubieren unter Schütteln für 30–45 Minuten bei Raumtemperatur.
16. Waschen wie in 4 oben.
17. Zugabe der 100 μl Biosource Ziege-Anti-Kaninchen-IgG-Peroxidase-Konjugat (1 : 2000 Verdünnung in TBST) zu jedem Loch. Inkubieren unter Schütteln für 30 min bei Raumtemperatur.
18. Waschen wie in 4 oben.
19. Zugabe von 100 μl ABTS/H₂O₂-Lösung zu jedem Loch.
20. Inkubieren für 5 bis 10 Minuten unter Schütteln. Entfernen der Blasen.
21. Nach Bedarf Stoppen der Reaktion durch die Zugabe von 100 μl 0,2 M HCl pro Loch.
22. Ausleseassay auf einem Dynatech MR7000 ELISA-Leser: Testfilter bei 410 nm, Referenzfilter bei 630 nm.

PDGFR-BIOASSAY
Dieser Assay wird für die In-vitro-Kinaseaktivität von FGF1-R in einem ELISA-Assay verwendet.
Materialien und Reagenzien:

1. Corning-96-Loch-Elisa-Platten
2. 28D4C10, monoklonaler Anti-PDGFR-Antikörper (SUGEN, Inc.).
3. PBS.
4. TBST-Puffer.
5. Blockierungspuffer (der gleiche wie im EGFR-Bioassay).
6. PDGFR-β, das NIH 3T3-Zellysat (SUGEN, Inc.) exprimiert.
7. TBS-Puffer.
8. TBS + 10 % DMSO.
9. ATP.
10. MnCl₂.
11. Kinasepuffer-Phosphorylierungsgemisch: Für 10 ml werden 250 μl 1M TRIS, 200 μl 5M NaCl, l 00 μl 1M MnCl₂ und 50 μl 100 mM Triton X-100 in ausreichend dH₂O gemischt, um 10 ml zu erhalten.
12. NUNC-96-Loch-V-Boden-Polypropylenplatten.
13. EDTA.
14. Polyklonales Kaninchen-Anti-Phosphotyrosin-Serum (SUGEN, Inc.).
15. Ziege-Anti-Kaninchen-IgG-Peroxidase-Konjugat (Biosource Kat. Nr. ALI0404).
16. ABTS.
17. Wasserstoffperoxid, 30%ige Lösung.
18. ABTS/H₂O₂.
19. 0,2 M HCl.

Verfahren:

1. Überziehen der Corning-96-Loch-ELISA-Platten mit 0,5 μg 28D4C10 in 100 μl PBS pro Loch, Lagerung über Nacht bei 4 °C.
2. Entfernen von nicht gebundenem 28D4C10 aus den Löchern durch Umdrehen der Platte, um Flüssigkeit zu entfernen. Waschen 1x mit dH₂O. Klopfen der Platte auf ein Papiertuch, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.
3. Zugabe von 150 μl Blockierungspuffer zu jedem Loch. Inkubieren für 30 min bei Raumtemperatur unter Schütteln.
4. Waschen der Platte 3x mit deionisiertem Wasser, dann einmal mit TBST. Klopfen der Platte auf ein Papiertuch, um überschüssige Flüssigkeit und Blasen zu entfernen.
5. Verdünnten des Lysats in HNTG (10 μg Lysat/100 μl HNTG).
6. Zugabe von 100 μl des verdünnten Lysats zu jedem Loch. Schütteln bei Raumtemperatur für 60 min.
7. Waschen der Platten, wie in Schritt 4 beschrieben.
8. Zugabe von 80 μl Arbeits-Kinasepuffergemisch in die ELISA-Platte, die eingefangenes PDGFR enthält.
9. Verdünnen der Testverbindung 1 : 10 in TBS in 96-Loch-Polypropylenplatten.
10. Zugabe von 10 μl der verdünnten Testverbindung in die ELISA-Platte. In die Kontrollöcher werden 10 μl TBS + 10 % DMSO gegeben. Inkubieren unter Schütteln für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
11. Direkte Zugabe von 10 μl ATP zu allen Löcher, außer zu dem Negativkontrolloch (endgültiges Lochvolumen sollte ungefähr 100 μl betragen, wobei in jedem Loch 20 pM ATP vorliegen). Inkubieren für 30 Minuten unter Schütteln.
12. Stoppen der Reaktion durch die Zugabe von 10 μl EDTA-Lösung zu jedem Loch.
13. Waschen 4x mit deionisiertem Wasser, zweimal mit TBST.
14. Zugabe von 100 μl Anti-Phosphotyrosin (1 : 3000 Verdünnung in TBST) pro Loch. Inkubieren unter Schütteln für 30–45 min bei Raumtemperatur.
15. Waschen wie in Schritt 4.
16. Zugabe von 100 μl Biosource Ziege-Anti-Kaninchen-IgG-Peroxidase-Konjugat (1 : 2000 Verdünnung in TBST) in jedes Loch. Inkubieren unter Schütteln für 30 min bei Raumtemperatur.
17. Waschen wie in Schritt 4.
18. Zugabe von 100 μl ABTS/H₂O₂-Lösung zu jedem Loch.
19. Inkubieren für 10 bis 30 Minuten unter Schütteln. Entfernen der Blasen.
20. Nach Bedarf Stoppen der Reaktion durch die Zugabe von 1.00 μl 0,2 M HCl pro Loch.
21. Ausleseassay auf einem Dynatech MR7000 ELISA-Leser mit einem Testfilter bei 410 nm und einem Referenzfilter bei 630 nm.

ZELLULÄRER HER-2-KINASEASSAY
Dieser Assay wird zur Messung der HER-2-Kinaseaktivität in ganzen Zellen im ELISA-Format verwendet.
Materialien und Reagengzien:

1. DMEM (GIBCO Katalog # 11965-092).
2. Fetales Rinderserum (FBS, GIBCO Katalog # 16000-044), wärmeinaktiviert in einem Wasserbad für 30 min bei 56 °C.
3. Trypsin (GIBCO Katalog # 25200-056).
4. L-Glutamin (GIBCO Katalog # 25030-081)
5. HEPES (GIBCO Katalog # 15630-080).
6. Wachstumsmedien. Mischen von 500 ml DMEM, 55 ml wärmeinaktiviertem FBS, 10 ml HEPES und 5,5 ml L-Glutamin.
7. Hungermedien. Mischen von 500 ml DMEM, 2,5 ml wärmeinaktiviertem FBS, 10 ml HEPES und 5,5 ml L-Glutamin.
8. PBS.
9. Flachboden-96-Loch-Gewebekultur-Mikrotiterplatten (Corning Katalog # 25860).
10. 15-cm-Gewebekulturschalen (Corning Katalog # 08757148).
11. Corning-96-Loch-ELISA-Platten.
12. NUNC-96-Loch-V-Boden-Polypropylenplatten.
13. Costar Transfer Cartridges für den Transtar 96 (Costar Katalog # 7610).
14. SUMO 1: monoklonaler Anti-EGFR-Antikörper (SUGEN, Inc.).
15. TBST-Puffer.
16. Blockierungspuffer: 5 % Carnation Instant Milk^® in PBS.
17. EGF-Ligand: EGF-201, Shinko American, Japan. Suspendieren des Pulvers in 100 μl 10 mM HCl. Zugabe von 100 μl 10 mM NaOH. Zugabe von 800 μl PBS und Überführen in ein Eppendorf-Röhrchen, Lagerung bei –20 °C bis zur Verwendung.
18. HNTG-Lysepuffer Für das Ausgangsmaterial 5 × HNTG werden 23,83 g Hepes, 43,83 g NaCl, 500 ml Glycerol und 100 ml Triton X-100 und ausreichend dH₂O gemischt, um 1 l Gesamtlösung zu erhalten. Für 1 × HNTG* werden 2 ml HNTG, 100 μl 0,1 M Na₃VO₄, 250 μl 0,2 M Na₄P₂O₇ und 100 μl EDTA gemischt.
19. EDTA.
20. Na₃VO₄. Für die Ausgangslösung werden 1,84 g Na₃VO₄ mit 90 ml dH₂O gemischt. Einstellen des pH auf 10. Kochen in einer Mikrowelle für eine Minute (die Lösung wird klar). Abkühlen auf Raumtemperatur. Einstellen des pH auf 10. Wiederholen des Erwärmungs-/Abkühlkreislaufes, bis der pH bei 10 stehen bleibt.
21. 200 mM Na₄P₂O₇.
22. Polyklonales Kaninchenantiserum, das für Phosphotyrosin spezifisch ist (Anti-Ptyr-Antikörper, SUGEN, Inc.).
23. Affinitätsgereinigtes Antiserum, Ziege-Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper, Peroxidase-Konjugat (Biosource Kat.-# ALI0404).
24. ABTS-Lösung.
25. 30%ige Wasserstoffperoxid-Lösung.
26. ABTS/H₂O₂.
27. 0,2 M HCl.

Verfahren:

1. Überziehen der Corning-96-Loch-ELISA-Platten mit SUMO1 mit 1,0 μg pro Loch in PBS, 100 μl Endvolumen/Loch. Lagerung über Nacht bei 4 °C.
2. Am Tag der Verwendung wird der Überzugspuffer entfernt und die Platte dreimal mit dH₂O und einmal mit TBST-Puffer gewaschen. Alle Wäschen in diesem Assay sollten auf diese Art und Weise vorgenommen werden, sofern nicht speziell etwas anderes angegeben ist.
3. Zugabe von 100 μl Blockierungspuffer zu jedem Loch. Inkubieren der Platte unter Schütteln für 30 min bei Raumtemperatur. Kurz vor der Verwendung, Waschen der Platte.
4. Verwendung der EGFr/HER-2-Chimäre/3T3-C7-Zellinie für diesen Assay.
5. Auswahl von Schalen mit 80–90 % Konfluenz. Sammeln von Zellen durch Trypsinisierung und Zentrifugieren mit 1000 U/min bei Raumtemperatur für 5 min.
6. Resuspendieren der Zellen in Hungermedium und Zählen mit Tryptanblau. Es ist eine Lebensfähigkeit von über 90 % erforderlich. Impfen von Zellen in Hungermedium bei einer 90Dichte von 2.500 Zellen pro Loch, μikrotiterplatte.l pro Loch, in einer 96-Loch-M Inkubieren der geimpften Zellen über Nacht bei 37 °C unter 5 % CO₂.
7. Starten des Assays zwei Tage nach dem Impfen.
8. Die Testverbindungen werden in 4 % DMSO gelöst. Die Proben werden dann direkt auf den Platten mit Hunger-DMEM weiter verdünnt. Typischerweise wird diese Verdünnung 1 : 10 oder größer sein. Alle Löcher werden dann auf die Zellplatte bei einer weiteren 1 : 10-Verdünnung (10 μ90l Probe und Medien in μl Hungermedium) überführt. Die endgültige DMSO-Konzentration sollte 1 % oder weniger betragen. Eine serielle Standardverdünnung kann auch verwendet werden.
9. Inkubieren unter 5 % CO₂ bei 37 °C für 2 Stunden.
10. Vorbereiten des EGF-Liganden durch Verdünnen des Stamm-EGF (16,5 μM) in warmem DMEM auf 150 nM.
11. Vorbereiten von frischem HNTG*, das für 1 μl pro Loch ausreicht; auf Eis geben.
12. Nach 2stüngier Inkubation mit der Testverbindung, Zugabe des vorbereiteten EGF-Liganden zu den Zellen, 50 μl pro Loch, für eine Endkonzentration von 50 nM. Positivkontrollöcher erhalten die gleiche Menge an EGF. Negativkontrollen erhalten kein EGF. Inkubieren bei 37 °C für l 0 min.
13. Entfernen von Testverbindung, EGF und DMEM. Waschen der Zellen einmal mit PBS.
14. Überführen von HNTG* zu den Zellen, 100 μl pro Loch. Planieren auf Eis für 5 Minuten. Währendessen Entfernen des Blockierungspuffers aus der ELISA-Platte und Waschen.
15. Kratzen der Zellen aus der Platte mit einem Mikropipettor und Homogenisieren des Zellmaterials durch wiederholtes Ansaugen und Dispensieren des HNTG*-Lysepuffers. Überführen des Lysats in eine überzogene, blockierte, gewaschene ELISA-Platte. Oder Verwendung einer Costar-Transferpatrone zum Überführen des Lysats in die Platte.
16. Inkubieren unter Schütteln bei Raumtemperatur für eine Stunde.
17. Entfernen des Lysats, Waschen. Überführen von frisch verdünntem Anti-Ptyr-Antikörper (1 : 3000 in TBST) zu der ELISA-Platte, 100 μl pro Loch.
18. Inkubieren unter Schütteln bei Raumtemperatur für 30 min.
19. Entfernen des Anti-Ptyr-Antikörpers, Waschen. Überführen des frisch verdünnten BIOSOURCE-Antikörpers zu der ELISA-Platte (1 : 8000 in TBST, 100 μl pro Loch).
20. Inkubieren unter Schütteln bei Raumtemperatur für 30 min.
21. Entfernen des BIOSOURCE-Antikörpers, Waschen. Überführen der frisch vorbereiteten ABTS/H₂O₂-Lösung zu der ELISA-Platte, 100 μl pro Loch.
22. Inkubieren unter Schütteln für 5–10 Minuten. Entfernen der Blasen.
23. Stoppen der Reaktion durch die Zugabe von 100 μl 0,2 M HCl pro Loch.
24. Ausleseassay auf einem Dynatech MR7000 ELISA-Leser mit einem Testfilter bei 410 nm und einem Referenzfilter bei 630 nm.

CDK2/CYCLIN-A-ASSAY
Dieser Assay wird zur Messung der In-vitro-Serin/Threonin-Kinase-Aktivität von humanem cdk2/Cyclin-A in einem Scintillation-Proximity-Assay (SPA) verwendet.
Materialien und Reagenzien

1. Wallac-96-Loch-Polyethylenterephthalat (flexi)-Platten (Wallac Katalog # 1450-401).
2. Amersham Redivue [γ³³P] ATP (Amersham Katalog # AH 9968).
3. Amersham Streptavidin-überzogene Polyvinyltoluol-SPA-Kügelchen (Amersham Katalog # RPNQ0007). Die Kügelchen sollten in PBS ohne Magnesium oder Calcium mit 20 mg/ml rekonstituiert werden.
4. Aktivierter cdk2/Cyclin-A-Enzymkomplex, gereinigt aus Sf9-Zellen (SUGEN, Inc.).
5. Biotinyliertes Peptidsubstrat (Debtid). Das Peptid Biotin-X-PKTPKKAKKL wird in dH₂O bei einer Konzentration von 5 mg/ml gelöst.
6. Peptid/ATP-Gemisch: Für 10 ml werden 9,979 ml dH₂O, 0,00125 ml „kaltes" ATP, 0,010 ml Debtid und 0,010 ml γ³³P-ATP gemischt. Die Endkonzentration pro Loch wird 0,5 μM „kaltes" ATP, 0,1 μg Debtid und 0,2 μCi γ³³P-ATP betragen.
7. Kinasepuffer: Für 10 ml werden 8,85 ml dH₂O, 0,625 ml TRIS (pH 7,4), 0,25 ml 1M MgCl₂, 0,25 ml 10 % NP40 und 0,025 ml 1M DTT gemischt, frisch zugeben kurz vor der Verwendung.
8. 10 mM ATP in dH₂O.
9. 1M Tris, pH eingestellt auf 7,4 mit HCl.
10. 1M MgCl₂.
11. 1M DTT.
12. PBS (Gibco Katalog # 14190-144).
13. 0,5 M EDTA.
14. Stopplösung: Für 10 ml werden 9,25 ml PBS, 0,005 ml 100 mM ATP, 0,1 ml 0,5 M undEDTA, 0,1 ml 10 % Triton X-100 1,25 ml von 20 mg/ml SPA-Kügelchen gemischt.

Verfahren:

1. Vorbereiten von Lösungen aus den Testverbindungen bei dem 5fachen der gewünschten Endkonzentration in 5 % DMSO. Zugabe von 10 μl zu jedem Loch. Für Negativkontrollen werden 10 μl 5 % DMSO allein in den Löchern verwendet.
2. Verdünnen von 5 μl der cdk2/Cyclin-A-Lösung mit 2,1 ml 2x Kinasepuffer.
3. Zugabe von 20 μl Enzym zu jedem Loch.
4. Zugabe von 10 μl 0,5 M EDTA zu den Negativkontrollöchern.
5. Zum Starten der Kinasereaktion werden 20 μl Peptid/ATP-Gemisch in jedes Loch gegeben. Inkubieren für 1 h ohne Schütteln.
6. Zugabe von 200 μl Stopplösung zu jedem Loch.
7. Halten für mindestens 10 min.
8. Schleudern der Platte bei ungefähr 2300 U/min für 3–5 min.
9. Zählen der Platte unter Verwendung von Trilux oder einem ähnlichen Lesegerät.

MET-TRANSPHOSPHORYLIERUNGSASSAY
Dieser Assay wird zur Messung der Phosphotyrosinkonzentrationen auf einem Poly(glutaminsäure : Tyrosin (4 : 1))-Substrat als Mittel zur Identifizierung von Agonisten/Antagonisten der Met-Transphosphorylierung des Substrats verwendet.
Materialien und Reagenzien:

1. Corning-96-Loch-Elisa-Platten, Corning Katalog # 25805-96.
2. Poly(glu, tyr) 4 : 1, Sigma, Kat.-Nr. P 0275.
3. PBS, Gibco Katalog # 450-1300EB.
4. 50 mM HEPES.
5. Blockierungspuffer: Auflösen von 25 g Rinderserumalbumin, Sigma Kat. Nr. A-7888, in 500 ml PBS, Filtrieren durch einen 4-μm-Filter.
6. Gereinigtes GST-Fusionsprotein, enthaltend die Met-Kinasedomäne, Sugen, Inc.
7. TBST-Puffer.
8. 10%iges wässeriges (MillQue H₂O) DMSO.
9. 10 mM wässeriges (dH₂O) Adenosin-5'-triphosphat, Sigma Kat.-Nr. A-5394.
10. 2x Kinase-Verdünnungspuffer: Für 100 ml werden 10 ml 1M HEPES bei pH 7,5 mit 0,10,4 ml 5 % BSA/PBS, 0,2 ml M Natriumorthovanadat und 1 ml 5M Natriumchlorid in 88,4 ml dH₂O gemischt.
11. 4x ATP-Reaktionsgemisch: Für 10 ml werden 0,4 ml 1M Manganchlorid und 0,02 ml 0,1 M ATP in 9,56 ml dH₂O gemischt.
12. 4x Negativkontrollgemisch: Für 10 ml werden 0,4 ml 1 M Manganchlorid in 9,6 ml dH₂O gemischt.
13. NUNC-96-Loch-V-Boden-Polypropylenplatten, Applied Scientific Katalog # S-72092.
14. 500 mM EDTA.
15. Antikörper-Verdünnungspuffer: Für 100 ml werden 10 ml 5 % BSA/PBS, 0,5 ml 5 % Carnation Instant Milk^® in PBS und 0,1 ml 0,1 M Natriumorthovanadat in 88,4 ml TBST gemischt.
16. Polyklonaler Kaninchen-Anti-Phosphotyrosin-Antikörper, Sugen, Inc.
17. Ziege-Anti-Kaninchen-Meerrettichperoxidase-konjugierter Antikörper, Biosource, Inc. 9,2118. ABTS-Lösung: Für 1 l werden 1 g Zitronensäure, 35,49 g Na₂HPO₄ und 500 mg ABTS mit ausreichend dH₂O gemischt, um einen Liter zu erhalten.
19. ABTS/H₂O₂: Mischen von 15 ml ABST-Lösung mit 2 μl H₂O₂ fünf Minuten vor der Verwendung.
20. 0,2 M HCl.

Verfahren:

1. Überziehen der ELISA-Platten mit 2 μg Poly(Glu-Tyr) in 100 μl PBS, Lagerung über Nacht bei 4 °C.
2. Blockieren der Platte mit 150 μl von 5 % BSA/PBS für 60 min.
3. Waschen der Platte zweimal mit PBS, einmal mit 50 mM Hepes-Puffer, pH 7,4.
4. Zugabe von 50 μl der verdünnten Kinase zu allen Löchern. (Die gereinigte Kinase wird mit Kinaseverdünnungspuffer verdünnt. Die Endkonzentration sollte 10 ng/Loch betragen.)
5. Zugabe von 25 μl der Testverbindung (in 4 % DMSO) oder DMSO allein (4 % in dH₂O) für Kontrollen in die Platte.
6. Inkubieren des Kinase/Verbindungs-Gemisches für 15 Minuten.
7. Zugabe von 25 μl 40 mM MnCl₂ zu den Negativkontrollöchern.
8. Zugabe von 25 μl ATP/MnCl₂-Gemisch zu allen anderen Löchern (außer den Negativkontrollen). Inkubieren für 5 min.
9. Zugabe von 25 μl 500 mM EDTA, um die Reaktion zu stoppen.
10. Waschen der Platte 3x mit TBST.
11. Zugabe von 100 μl polyklonalem Kaninchen-Anti-Ptyr, verdünnt 1 : 10.000 in Antikörper-Verdünnungspuffer, zu jedem Loch. Inkubieren unter Schütteln bei Raumtemperatur für eine Stunde.
12. Waschen der Platte 3x mit TBST.
13. Verdünnen von Biosource HRP-konjugiertem Anti-Kaninchen-Antikörper 1 : 6.000 in Antikörper-Verdünnungspuffer. Zugabe von 100 μl pro Loch und Inkubieren bei Raumtemperatur unter Schütteln für eine Stunde.
14. Waschen der Platte 1x mit PBS.
15. Zugabe von 100 μl ABTS/H₂O₂-Lösung zu jedem Loch.
16. Nach Bedarf Stoppen der Entwicklung der Reaktion durch die Zugabe von 100 μl 0,2 M HCl pro Loch.
17. Auslesen der Platte auf einem Dynatech MR7000-ELISA-Lesegerät mit dem Testfilter bei 410 nm und dem Referenzfilter bei 630 nm.

IGF-1-TRANSPHOSPHORYLIERUNGSASSAY
Dieser Assay wird zur Messung der Phosphotyrosinkonzentration in Poly(glutaminsäure Tyrosin) (4 : 1) zur Identifizierung von Agonisten/Antagonisten der gst-IGF-1-Transphosphorylierung eines Substrats verwendet.
Materialien und Reagenzien:

1. Corning-96-Loch-Elisa-Platten.
2. Poly(Glu-tyr) (4 : 1), Sigma Kat.-Nr. P 0275.
3. PBS, Gibco Katalog # 450-1300EB.
4. 50 mM HEPES.
5. TBB-Blockierungspuffer: Für 1 l werden 100 g BSA, 12,1 g TRIS (pH 7,5), 58,44 g Natriumchlorid und 10 ml 1 % TWEEN-20 gemischt.
6. Gereinigtes GST-Fusionsprotein, enthaltend die IGF-1-Kinasedomäne (Sugen, Inc.).
7. TBST-Puffer: Für 1 l werden 6,057 g Tris, 8,766 g Natriumchlorid und 0,5 ml TWEEN-20 mit ausreichend dH₂O gemischt, um 1 l zu erhalten.
8. 4 % DMSO in Milli-Q H₂O.
9. 10 mM ATP in dH₂O.
10. 2x Kinase-Verdünnungspuffer: Für 100 ml werden 10 ml 1 M HEPES (pH 7,5), 0,4 ml 5 % BSA in dH₂0,1O, 0,2 ml M Natriumorthovanadat und 1 ml 5 M Natriumchlorid mit ausreichend dH₂O gemischt, um 100 ml zu erhalten.
11. 4x ATP-Reaktionsgemisch: Für 10 ml werden 0,4 ml 1 M MnCl₂0,01 und 0,008 ml M ATP und 9,56 ml dH₂O gemischt.
12. 4x Negativkontrollgemisch: Mischen von 0,4 ml 1 M Manganchlorid in 9,60 ml dH₂O.
13. NUNC-96-Loch-V-Boden-Polypropylenplatten.
14. 500 mM EDTA in dH₂O.
15. Antikörper-Verdünnungspuffer: Für 100 ml werden 10 ml 5 % BSA in PBS, 0,5 ml 5 Carnation Instant Non-fat Milk^® in PBS und 0,1 ml 0,1 M Natriumorthovanadat in 88,4 ml TBST gemischt.
16. Polyklonaler Kaninchen-Anti-Phosphotyrosin-Antikörper, Sugen, Inc.
17. Ziege-Anti-Kaninchen-HRP-konjugierter Antikörper, Biosource.
18. ABTS-Lösung.
20. ABTS/H₂O₂: Mischen von 15 ml ABTS mit 2 μl H₂O₂ 5 Minuten vor der Verwendung.
21. 0,2 M HCl in dH₂O.

Verfahren:

1. Überziehen der ELISA-Platte mit 2,0 μg/Loch Poly(Glu, Tyr) 4 : 1 (Sigma P0275) in 100 μl PBS. Lagerung der Platte über Nacht bei 4 °C.
2. Veraschen der Platte einmal mit PBS.
3. Zugabe von 100 μl TBB-Blockierungspuffer zu jedem Loch. Inkubieren der Platte für 1 Stunde unter Schütteln bei Raumtemperatur.
4. Waschen der Platte einmal mit PBS, dann zweimal mit 50 mM Hepes-Puffer, pH 7,5.
5. Zugabe von 25 μl der Testverbindung in 4 % DMSO (erhalten durch Verdünnen einer Stammlösung aus 10 mM Testverbindung in 100 % DMSO mit dH₂O) zu der Platte.
6. Zugabe von 10,0 ng gst-IGF-1-Kinase in 50 μl Kinase-Verdünnungspuffer zu allen Löchern.
7. Starten der Kinasereaktion durch Zugabe von 25 μl 4x ATP-Reaktionsgemisch zu allen Testlöchern und Positivkontrollöchern. Zugabe von 25 μl 4x Negativkontrollgemisch zu allen Negativkontrollöchern. Inkubieren für 10 Minuten unter Schütteln bei Raumtemperatur.
8. Zugabe von 25 μl 0,5M EDTA (pH 8,0) zu allen Löchern.
9. Waschen der Platte 4x mit TBST-Puffer.
10. Zugabe von polyklonalen Kaninchen-Anti-Phosphotyrosin-Antisera bei einer Verdünnung von 1 : 10.000 in 100 μl Antikörper-Verdünnungspuffer zu allen Löchern. Inkubieren unter Schütteln bei Raumtemperatur für eine Stunde.
11. Waschen der Platte wie in Schritt 9.
12. Zugabe von 100 μl Biosource Anti-Kaninchen-HRP bei einer Verdünnung von 1 : 10.000 in Antikörper-Verdünnungspuffer zu allen Löchern. Inkubieren unter Schütteln bei Raumtemperatur für eine Stunde.
13. Waschen der Platte wie in Schritt 9, gefolgt von einer Wäsche mit PBS, um Blasen und überschüssiges Tween-20 zu reduzieren.
14. Entwickeln durch die Zugabe von 100 μl/Loch ABTS/H₂O₂ zu jedem Loch.
15. Nach etwa 5 Minuten, Auslesen auf einem ELISA-Lesegerät mit dem Testfilter bei 410 nm und dem Referenzfilter bei 630 nm.

BRDU-EINFÜHRUNGS-ASSAYS
Die folgenden Assays nutzen Zellen, die so konstruiert wurden, daß sie einen ausgewählten Rezeptor exprimieren, und bewerten dann die Wirkung einer in Frage stehenden Verbindung hinsichtlich der Aktivität der Liganden-induzierten DNA-Synthese durch die Bestimmung der BrdU-Einführung in die DNA.
Die folgenden Materialien, Reagenzien und Verfahren gelten allgemein für die folgenden BrdU-Einführungsassays. Variationen in speziellen Assays sind nicht angegeben.
Materialien und Reagenzien:

1. Der entsprechende Ligand.
2. Die entsprechend konstruierten Zellen.
3. BrdU-Markierungsreagens: 10 mM, in PBS (pH 7,4) (Boehringer Mannheim, Deutschland).
4. FixDenat: Fixierlösung (gebrauchsfertig) (Boehringer Mannheim, Deutschland).
5. Anti-BrdU-POD: monoklonaler Maus-Antikörper, konjugiert mit Peroxidase (Boehringer Mannheim, Deutschland).
6. TMB-Substratlösung: Tetramethylbenzidin (TMB, Boehringer Mannheim, Deutschland).
7. PBS-Waschlösung: 1X PBS, pH 7,4.
8. Albumin, Rind (BSA), Fraktion V Pulver (Sigma Chemical Co., USA).

Allgemeines Verfahren:

1. Zellen werden mit 8000 Zellen/Loch in 10 % CS, 2 mM Gln in DMEM, in eine 96-Loch-Platte geimpft. Die Zellen werden über Nacht bei 37 °C in 5 % CO₂ inkubiert.
2. Nach 24 Stunden werden die Zellen mit PBS gewaschen und dann in serumfreiem Medium (0 % CS DMEM mit 0,1 % BSA) 24 Stunden serum-abgereichert.
3. An Tag 3 werden der entsprechende Ligand und die Testverbindung gleichzeitig zu den Zellen gegeben. Die Negativkontrollöcher erhalten nur serumfreies DMEM mit 0,1 % BSA; die positiven Kontrollzellen erhalten den Liganden, aber nicht die Testverbindung. Die Testverbindungen werden in serumfreiem DMEM mit Ligand in einer 96-Loch-Platte hergestellt und seriell für 7 Testkonzentrationen verdünnt.
4. Nach 18 Stunden der Ligandenaktivierung wird das verdünnte BrdU-Markierungsreagens (1 : 100 in DMEM, 0,1 % BSA) zugegeben und die Zellen werden mit BrdU (Endkonzentration = 10 μM) 1,5 Stunden inkubiert.
5. Nach der Inkubation mit dem Markierungsreagens wird das Medium durch Dekantieren und Klopfen der umgedrehten Platte auf ein Papiertuch entfernt. FixDenat-Lösung wird zugegeben (50 μl/Loch) und die Platten werden bei Raumtemperatur 45 Minuten auf einem Plattenschüttler inkubiert.
6. Die FixDenat-Lösung wird gründlich durch Dekantieren und Klopfen der umgedrehten Platte auf ein Papiertuch entfernt. Milch wird zugegeben (5 % dehydratisierte Milch in PBS, 200 μl/Loch) als Blockierlösung und die Platte 30 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Plattenschüttler inkubiert.
7. Die Blockierlösung wird durch Dekantieren entfernt und die Löcher einmal mit PBS gewaschen. Anti-BrdU-POD-Lösung (1 : 200 Verdünnung in PBS, 1 % BSA) wird zugegeben (50 μl/Loch) und die Platte 90 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Plattenschüttler inkubiert.
8. Das Antikörperkonjugat wird durch Dekantieren und Spülen der Löcher 5x mit PBS gründlich entfernt und die Platte durch Umdrehen und Klopfen auf ein Papiertuch getrocknet.
9. TMB-Substratlösung wird Zugegeben (100 μl/Loch) und 20 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Plattenschüttler inkubiert, bis die Farbentwicklung für die photometrische Detektion ausreicht.
10. Das Absorptionsvermögen der Proben wird bei 410 nm (im „Doppelwellenlängen"-Modus mit einem Filter, der bei 490 nm liest, als Referenzwellenlänge) auf einem Dynatech ELISA-Plattenlesegerät gemessen.

EGF-induzierter BrdU-Einführungsassay
Materialien und Reagenzien:

1. Maus-EGF, 201 (Toyobo Co., Ltd., Japan).
2. 3T3/EGFRc7.

EGF-induzierter Her-2-gesteuerter BrdU-Einführungsassay
Materialien und Reagenzien:

1. Maus-EGF, 201 (Toyobo Co., Ltd., Japan).
2. 3T3/EGFr/Her2/EGFr (EGFr mit einer Her-2-Kinasedomäne).

EGF-induzierter Her-4-gesteuerter BrdU-Einführungsassay
Materialien und Reagenzien:

1. Maus-EGF, 201 (Toyobo Co., Ltd., Japan).
2. 3T3/EGFr/Her4/EGFr (EGFr mit einer Her-4-Kinasedomäne).

PDGF-induzierter BrdU-Einführungsassay
Materialien und Reagenzien:

1. Humanes PDGF B/B (Boehringer Mannheim, Deutschland).
2. 3T3/EGFRc7.

FGF-induzierter BrdU-Einführungsassay
Materialien und Reagenzien:

1. Humanes FGF2/bFGF (Gibco BRL, USA).
2. 3T3c7/EGFr

IGFI-induzierter BrdU-Einführungsassay
Materialien und Reagenzien:

1. Human, rekombinant (G511, Promega Corp., USA)
2. 3T3/IGF1r.

Insulin-induzierter BrdU-Einführungsassay
Materialien und Reagenzien:

1. Insulin, kristallin, Rind, Zink (13007, Gibco BRL, USA).
2. 3T3/H25.

HGF-induzierter BrdU-Einführungsassay
Materialien und Reagenzien:

1. Rekombinantes humanes HGF (Kat.-Nr. 249-HG, R & D Systems, Inc. USA).
2. BxPC-3-Zellen (ATCC CRL-1687).

Verfahren:

1. Zellen werden mit 9000 Zellen/Loch in RPMI 10 % FBS in eine 96-Loch-Platte geimpft. 37Die Zellen werden über Nacht bei °C in 5 % CO₂ inkubiert.
2. Nach 24 Stunden werden die Zellen mit PBS gewaschen und dann in 100 μl serumfreiem Medium (RPMI mit 0,1 % BSA) 24 Stunden serum-abgereichert.
3. An Tag 3 werden 25 μl, enthaltend Ligand (hergestellt mit 1 μg/ml in RPMI mit 0,1 % BSA; HGF-Endkonz. 200 ng/ml) und Testverbindungen, zu den Zellen gegeben. Die Negativkontrollöcher erhalten nur 25 μl serumfreies RPMI mit 0,1 % BSA; die positiven Kontrollzellen erhalten den Liganden (HGF) aber keine Testverbindung. Die Testverbindungen werden auf das 5fache ihrer Endkonzentration in serumfreiem RPMI mit Ligand in einer 96-Loch-Platte präpariert und seriell verdünnt, wodurch 7 Testkonzentrationen erhalten wurden. Typischerweise beträgt die höchste Endkonzentration der Testverbindung 100 μM und es werden Verdünnungen von 1 : 3 verwendet (d. h. der endgültige Testverbindungskonzentrationsbereich beträgt 0,137–100 μM).
4. Nach 18 Stunden der Ligandenaktivierung werden 12,5 μl des verdünnten BrdU-Markierungsreagens (1 : 100 in RPMI, 0,1 % BSA) zu jedem Loch zugegeben und die Zellen werden mit BrdU (Endkonzentration 10 μM) für 1 Stunde inkubiert.
5. Gleich wie allgemeines Verfahren.
6. Gleich wie allgemeines Verfahren.
7. Die Blockierlösung wird durch Dekantieren entfernt und die Löcher einmal mit PBS gewaschen. Anti-BrdU-POD-Lösung (1 : 100 Verdünnung in PBS, 1 % BSA) wird zugegeben (100 μl/Loch) und die Platte 90 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Plattenschüttler inkubiert.
8. Gleich wie allgemeines Verfahren.
9. Gleich wie allgemeines Verfahren.
10. Gleich wie allgemeines Verfahren.

HUV-EC-C-Assays
Dieser Assay wird zur Messung der Aktivität der Verbindungen gegen PDGF-R, FGF-R, VEGF, aFGF oder Flk-1/KDR, von denen alle natürlich von HUV-EC-Zellen exprimiert werden, verwendet.
Tag 0

1. Waschen und Trypsinisieren der HUV-EC-C-Zellen (humane Endothelzellen aus der Nabelvene), (American Type Culture Collection, Katalog-Nr. 1730 CRL). Waschen mit Dulbecco's Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (D-PBS, erhalten von Gibco BRL, Katalog-Nr. 14190-029) zweimal bei etwa 1 ml/10 cm² eines Gewebekulturkolbens. Trypsinisierung mit 0,05 % Trypsin-EDTA in nicht-enzymatischer Zelldissoziationslösung (Sigma Chemical Company, Katalog-Nr. C-1544). Das 0,05%ige Trypsin wird durch die Verdünnung von 0,25 % Trypsin/1 mM EDTA (Gibco, Katalog-Nr. 25200-049) in der Zelldissoziationslösung hergestellt. Trypsinisierung mit etwa 1 ml/25–30 cm² eines Gewebekulturkolbens für etwa 5 Minuten bei 37 °C. Nachdem die Zellen von dem Kolben abgelöst waren, wurde ein gleiches Volumen an Assaymedium zugegeben und in ein steriles 50-ml-Zentrifugenröhrchen überführt (Fisher Scientific, Katalog-Nr. 05-539-6).
2. Waschen der Zellen mit etwa 35 ml Assaymedium in dem sterilen 50-ml-Zentrifugenröhrchen durch die Zugabe des Assaymediums, Zentrifugieren für 10 Minuten bei ungefähr 200x g, Absaugen des Überstandes und erneut Suspendieren mit 35 ml D-PBS. Zweimal erneut mit D-PBS waschen, die Zellen in etwa 1 ml Assaymedium/15 cm² Gewebekulturkolben wieder suspendieren. Das Assaymedium bestehen aus F12K-Medium (Gibco BRL, Katalog-Nr. 21127-014) und 0,5 % wärmeinaktiviertem fetalem Rinderserum. Zählen der Zellen mit einem CoulterCounter^® (Coulter Electronics, Inc.) und Zugabe von Assaymedium zu den Zellen, um so eine Konzentration von 0,8–1,0 × 10⁵ Zellen/ml zu erhalten.
3. Zugabe der Zellen zu Flachboden-96-Loch-Platten bei 100 ml/Loch oder 0,8–1,0 x 10⁴ Zellen/Loch, inkubieren ∼24 h bei 37 °C, 5 % CO₂

Tag 1

1. Auffüllen zweifacher Testverbindungstitrationen in separaten 96-Loch-Platten, im allgemeinen von 50 μM herunter auf 0 μM. Verwendung desselben Assaymediums wie in Tag 0, 90Schritt 2 oben angegeben. Die Titrationen werden durch die Zugabe von μl/Loch der Testverbindung bei 200 M (4x der Lochendkonzentration) in das obere Loch einer bestimmten Bodensäule hergestellt. Da die Stammtestverbindung üblicherweise 20 mM in DMSO ist, enthält die 200 μM Arzneimittelkonzentration 2 % DMSO.

Ein Verdünnungsmittel, aufgefüllt auf 2 % DMSO in Assaymedium (F12K + 0,5 % fetales Rinderserum), wird als Verdünnungsmittel für die Testverbindungstitrationen verwendet, um die Testverbindung zu verdünnen, die DMSO-Konzentration jedoch konstant zu halten. Zugabe dieses Verdünnungsmittels zu den verbleibenden Löchern in der Säule bei 60 μl/Loch. Entnahme von 60 μl von den 120 μl der 200-μM-Testverbindungsverdünnung im oberen Loch der Säule und Mischen mit 60 μl im zweiten Loch der Säule. Entnahme von 60 μl aus diesem Loch und Mischen mit 60 μl im dritten Loch der Säule, und so weiter, bis die Zweifach-Titrationen komplett sind. Wenn das dem letzten am nächstgelegene Loch gemischt wird, Entnahme von 60 μl von den 120 μl in diesem Loch und verwerfen dieser. Das letzte Loch verbleibt mit 60 μl DMSO/Medien-Verdünnungsmitel als Kontrolle ohne Testverbindung. Bilden von 9 Säulen der titrierten Testverbindung, ausreichend für Dreifach-Löcher, jeweils für: (1) VEGF (erhalten von Pepro Tech Inc., Katalog-Nr. 100–200), (2) Endothelzell-Wachstumsfaktor (ECGF) (auch bekannt als saurer Fibroblasten-Wachstumsfaktor, oder aFGF) (erhalten von Boehringer Mannheim Biochemica, Katalog-Nr. 1439 600), oder (3) humanes PDGF B/B (1276-956, Boehringer Mannheim, Deutschland) und Assaymedienkontrolle. ECGF ist ein Präparat mit Natriumheparin.

2. Überführen von 50 μl/Loch der Testverbindungsverdünnungen in 96-Loch-Assayplatten, enthaltend 0,8–1,0 × 10⁴ Zellen/100 μl/Loch der HUV-EC-C-Zellen von Tag 0 und inkubieren ∼2 h bei 37 °C, 5 % CO₂.
3. Dreimal wurden 50 μl/Loch 80 μg/ml VEGF, 20 ng/ml ECGF oder Medienkontrolle zu jeder Testverbindung gegeben. Was die Testverbindungen angeht, betrugen die Wachstumsfaktorkonzentrationen 4x der gewünschten Endkonzentration. Verwendung der Assaymedien von Tag 0, Schritt 2, zur Bildung der Konzentrationen an Wachstumsfaktoren. Inkubieren für ungefähr 24 Stunden bei 37 °C, 5 % CO₂. Jedes Loch wird 50 μl Testverbindungsverdünnung, 50 μl Wachstumsfaktor oder Medien und 100 μl Zellen aufweisen, wobei man auf 200 μl/Loch insgesamt kommt. Daher werden 4x-Konzentrationen der Testverbindung und Wachstumsfaktoren 1x, wenn alles in die Löcher gegeben worden ist.

TAG 2

1. Zugabe von ³H-Thymidin (Amersham, Katalog-Nr. TRK-686) bei 1 μCi/Loch (10 μl/Loch einer 100 μCi/ml Lösung, gebildet in RPMI-Medien + 10 % wärmeinaktiviertes fetales Rin derserum) und inkubieren –24 h bei 37 °C, 5 % CO₂. RPMI ist von Gibco BRL, Katalog-Nr. 11875-051 erhältlich.

TAG 3

1. Einfrieren der Platten über Nacht bei –20 °C.

TAG 4
Tauen der Platten und Ernten mit einer Erntemaschine für 96-Loch-Platten (Tomtec Harvester 96°) auf Filtermatten (Wallac, Katalog-Nr. 1205-401), Auslesen der Zählungen auf einem Wallac-Betaplate^TM-Flüssigkeitsszintillationszähler.
Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse der biologischen Tests einiger exemplarischer Verbindungen dieser Erfindung. Die Ergebnisse sind hinsichtlich des IC₅₀, der mikromolaren (μM) Konzentration der getesteten Verbindung, die eine 50%ige Veränderung der Aktivität der Ziel-PTK im Vergleich zur Aktivität der PTK in einer Kontrolle, der keine Testverbindung zugegeben worden ist, hervorruft, angegeben. Speziell zeigen die Ergebnisse die Konzentration einer Testverbindung, die erforderlich ist, um eine 50%ige Verringerung der Aktivität der Ziel-PTK hervorzurufen. Bioassays, die zur Bewertung der Verbindungen verwendet worden sind oder verwendet werden, werden nachstehend ausführlich beschrieben. TABELLE 3
IN-VIVO-TIERMODELLE
Xenograft-Tiermodelle
Die Fähigkeit menschlicher Tumore, als Xenografts in athymischen Mäusen zu wachsen (z. B. Balb/c, nu/nu), liefert ein nützliches In-vivo-Modell für die Studie der biologischen Reaktion auf Therapien gegen menschliche Tumore. Seit der ersten erfolgreichen Xenotransplantation menschlicher Tumore in athymische Mäuse (Rygaard und Povlsen, 1969, Ac ta Pathol. Microbial. Scand. 77: 758–760), sind viele verschiedene menschliche Tumorzellinien (z. B. Brust-, Lungen, Urogenital-, Gastrointestinal-, Kopf- und Hals-, Glioblastom-, Knochen- und maligner Melanome) transplantiert und erfolgreich in Nacktmäusen herangezogen worden. Die folgenden Assays können zur Bestimmung des Niveaus der Aktivität, Spezifität und Wirkung der verschiedenen Verbindungen der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Zur Bewertung der Verbindungen sind drei allgemeine Assays nützlich: zellulär/katalytisch, zellulär/biologisch und in-vivo. Ziel der zellulären/katalytischen Assays ist die Bestimmung der Wirkung einer Verbindung auf die Fähigkeit einer TK, Tyrosine auf einem bekannten Substrat in einer Zelle zu phosphorylieren. Das Ziel der zellulären/biolagischen Assays ist die Bestimmung der Wirkung einer Verbindung auf die biologische Antwort, die von einer TK in einer Zelle stimuliert wird. Das Ziel der In-vivo-Assays ist die Bestimmung der Wirkung einer Verbindung in einem Tiermodell mit einer besonderen Erkrankung wie Krebs.
Geeignete Zellinien für subkutane Xenograftexperimente umfassen C6-Zellen (Gliom, ATCC# CCL 107), A375-Zellen (Melanom, ATCC# CRL 1619), A431-Zellen (Epidermoidkarzinom, ATCC# CRL 1555), Calu 6-Zellen (Lunge, ATCC# HTB 56), PC3-Zelle (Prostata, ATCC# CRL 1435), SKOV3TP5-Zellen und NIH 3T3-Fibroblasten, die genetisch so konstruiert wurden, daß sie EGFR, PDGFR, IGF-1R oder irgendeine andere Testkinase überexprimieren. Das folgende Protokoll kann zur Durchführung der Xenograftexperimente verwendet werden:.
Weibliche athymische Mäuse (BALB/c, nu/nu) sind von Simonsen Laboratories (Gilroy, CA) erhältlich. Alle Tiere werden unter Reinraumbedingungen in Mikroisolator-Käfigen mit Alpha-dri-Einstreu gehalten. Sie erhalten steriles Nagerfutter und Wasser nach Bedarf.
Zellinien werden in einem geeigneten Medium (beispielsweise MEM, DMEM, Ham's F10 oder Ham's F12 plus 5 %–10 % fetales Rinderserum (FBS) und 2 mM Glutamin (GLN)) herangezogen. Zellkulturmedien, Glutamin und fetales Rinderserum sind von Gibco Life Technologies (Grand Island, NY) zu erwerben, sofern nicht speziell etwas anderes angegeben ist. Alle Zellen werden in feuchter Atmosphäre von 90–95 % Luft und 5–10 % CO₂ bei 37 °C herangezogen. Alle Zellinien werden routinemäßig zweimal pro Woche subkultiviert, und sind hinsichtlich Mycoplasma negativ, wie durch das Mycotect-Verfahren (Gibco) bestimmt.
Die Zellen werden bei oder nahe der Konfluenz mit 0,05 % Trypsin-EDTA geerntet und bei 450 × g 10 min pelletiert. Die Pellets werden in sterilem PBS oder Medien (ohne FBS) auf eine bestimmte Konzentration resuspendiert und die Zellen werden in die Hinterflanke der Mäuse implantiert (8–10 Mäuse pro Gruppe, 2–10 × 10⁶ Zellen/Tier). Das Tumorwachstum wird über 3 bis 6 Wochen unter Verwendung von Meßschiebern gemessen. Die Tumorvolumen werden als ein Produkt von Länge × Breite × Höhe berechnet, sofern nicht etwas anderes angegeben ist. Die P-Werte werden unter Verwendung des Student-Tests berechnet. Die Testverbindungen in 50–100 μl Trägerstoff (DMSO oder VPD : DSW) können durch IP-Injektion in verschiedenen Konzentrationen, im allgemeinen ausgehend von Tag 1 nach der Implantation verabreicht werden.
TUMORINVASIONSMODELL
Das folgende Tumorinvasionsmodell ist zur Bewertung des therapeutischen Wertes und der Wirksamkeit der Verbindungen, die als den KDR/FLK-1-Rezeptor selektiv inhibierend identifiziert wurden, entwickelt und verwendet worden.
Verfahren
8 Wochen alte Nacktmäuse (weiblich) (Simonsen Inc.) werden als Versuchstiere verwendet. Die Implantation der Tumorzellen kann in einer Laminarbox durchgeführt werden. Für die Anästhesie wird ein Xylazin/Ketamin-Cocktail (100 mg/kg Ketamin und 5 mg/kg Xylazin) intraperitoneal verabreicht. Es wird ein Medianschnitt vorgenommen, um die Bauchhöhle freizulegen (ungefähr 1,5 cm lang), um 10⁷ Tumorzellen in einem Volumen von 100 μl Medium injizieren zu können. Die Zellen werden entweder in den Duodenallappen der Pankreas oder unter die Serosa des Darms injiziert. Das Bauchfell und die Muskeln werden mit einem 6-0 kontinuierlichen Seidenfaden verschlossen und die Haut wird unter Verwendung von Wundkammern verschlossen. Die Tiere werden täglich beobachtet.
Analyse
In Abhängigkeit der Gesamtbeobachtungen der Tiere, werden die Mäuse nach 2–6 Wochen getötet, und die lokalen Tumormetastasen an verschiedenen Organen (Lunge, Leber, Gehirn, Bauch, Milz, Herz, Muskel) werden exzidiert und analysiert (Messung der Tumorgröße, des Grades der Invasion, der Immunchemie, In-situ-Hybridisierungsbestimmung usw.).
C-KIT-ASSAY
Dieser Assay wird zur Detektion des Niveaus der c-kit-Tyrosinphosphorylierung verwendet. MO7E-Zellen (humane akute Myeloidleukämie) wurden über Nacht in 0,1 % Serum serumabgereichert. Die Zellen wurden vor der Ligandenstimulation mit der Verbindung (konkurrierend mit Serumabreicherung) vorbehandelt. Die Zellen wurden mit 250 ng/ml rh-SCF 15 Minuten stimuliert. Nach der Stimulation wurden die Zellen lysiert und mit einem Antic-kit-Antikörper immunopräzipitiert. Die Phosphotyrosin- und Proteinkonzentrationen wurden durch Western-Blot bestimmt.
MTT-PROLIFERATIONSASSAY
MO7E-Zellen wurden serum-abgereichert und mit der Verbindung, wie für die Phosphorylierungsexperimente beschrieben, vorbehandelt. Die Zellen wurden bei 4 × 10⁵ Zellen/Loch in einer 96-Loch-Schale in 100 μl RPMI + 10 % Serum plattiert. rh-SCF (100 ng/ml) wurde zugegeben und die Platte wurde 48 Stunden inkubiert. Nach 48 Stunden wurden 10 μl von 5 mg/ml MTT [3-(4,5-Dimethythiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid) zugegeben und es wurde 4 Stunden inkubiert. Saures Isopropanol (100 ml von 0,04 N HCl in Isopropanol) wurde zugegeben und die optische Dichte wurde bei einer Wellenlänge von 550 nm gemessen.
APOPTOSEASSAY
MO7E-Zellen wurden +/–SCF und +/–Verbindung in 10 % FBS mit rh-GM-CSF (10 ng/ml) und rh-IL-3 (10 ng/ml) inkubiert. Die Proben wurden nach 24 und 48 Stunden analysiert. Zur Messung der aktivierten Caspase-3 wurden die Proben mit PBS gewaschen und mit eiskaltem 70%igem Ethanol permeabilisiert. Die Zellen wurden dann mit PE-konjugierter polyklonaler Kaninchen-Anti-aktive Caspase-3 gefärbt und durch FACS analysiert. Zur Messung der gespaltenen PARP wurden die Proben lysiert und durch Western-Blot mit einem Anti-PARP-Antikörper analysiert.
Zusätzliche Assays
Zusätzliche Assays, die zur Bewertung der Verbindungen dieser Erfindung verwendet werden können, umfassen ohne Einschränkung einen Bio-flk-1-Assay, einen EGF-Rezeptor-HER2-Chimärenrezeptor-Assay in ganzen Zellen, einen Bio-src-Assay, einen Bio-lck-Assay und einen Assay, der die Phosphorylierungsfunktion von raf mißt. Die Protokolle für jeden dieser Assays sind in der US-Anmeldung Ser.-Nr. 09/099,842, die einschließlich aller Zeichnungen hierin durch Verweis aufgenommen ist, zu finden.
Messung der Zelltoxizität
Therapeutische Verbindungen sollten stärker die Rezeptor-Tyrosin-Kinaseaktivität inhibieren als eine zytotoxische Wirkung zeigen. Ein Maß der Wirksamkeit und Zelltoxizität einer Verbindung kann durch die Bestimmung des therapeutischen Index, d. h. IC₅₀/LD₅₀ erhalten werden. Der IC₅ ₀, die Dosis, die zum Erhalt einer 50%igen Inhibierung erforderlich ist, kann unter Verwendung von Standardtechniken, wie den hierin beschriebenen, gemessen werden. Der LD₅₀, die Dosierung, die zu einer 50%igen Toxizität führt, kann auch durch Standardtechniken (Mossman, 1983, J. Immunol. Methods, 65: 55–63), durch die Messung der Menge an freigesetztem LDH (Korzeniewski und Callewaert, 1983, J. Immunol. Methods, 64: 313, Decker und Lohmann-Matthes, 1988, J. Immunol. Methods, 115: 61) oder durch die Messung der Lethaldosis in Tiermodellen gemessen werden. Verbindungen mit einem großen therapeutischen Index sind bevorzugt. Der therapeutische Index sollte größer sein als 2, bevorzugt mindestens 10, stärker bevorzugt mindestens 50.
B. Beispiel für Ergebnisse eines zellulären Assays unter Verwendung von 5-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-vlidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylaminoethyl)amid.
Zur Bestätigung der Potenz von 5-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylamino-ethyl)amid (Verbindung 35), detektiert in biochemischen Assays (vide infra), wurde die Fähigkeit der Verbindung, die Ligandenabhängige RTK-Phosphorylierung zu inhibieren, in Zell-basierenden Assays unter Verwendung von NIH-3T3-Mauszellen, die so konstruiert wurden, daß sie Flk-1 oder humanes PDGFRβ überexprimieren, bewertet. 5-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylamino-ethyl)amid (Verbindung 35) inhibierte die VEGF-abhängige Flk-1-Tyrosin-Phosphorylierung mit einem IC₅₀-Wert von ungefähr 0,03 μM. Dieser Wert ähnelt dem 0,009-μM-Ki-Wert, der für die Inhibierung von Flk-1 durch 5-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylamino-ethyl)amid (Verbindung 35), bestimmt in biochemischen Assays, bestimmt wurde. Dies ist ein Anzeichen dafür, daß 5-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylamino-ethyl)amid (Verbindung 35) ohne weiteres in die Zellen eindringt. In Übereinstimmung mit den biochemischen Daten (vide infra), die anzeigen, daß 5-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylamino-ethyl)amid (Verbindung 35) eine vergleichbare Aktivität gegen Flk-1 und PDGFRβ hatte, ist ebenso herausgefunden worden, daß es die PDGF-abhängige Rezeptor-Phosphorylierung in Zellen mit einem IC₅₀-Wert von ungefähr 0,03 μM inhibierte. Die Fähigkeit von 5-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylamino-ethyl)amid (Verbindung 35) c-kit, ein enger Verwandter der RTK, der den Stammzellenfaktor (SCF) bindet, zu inhibieren, wurde unter Verwendung von MO7E-Zellen, die diesen Rezeptor exprimieren, bestimmt. In diesen Zellen inhibierte 5-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylamino-ethyl)amid (Verbindung 35) die SCF-abhängige c-kit-Phosphorylierung mit einem IC₅₀-Wert von 0,01–0,1 μM. Diese Verbindung inhibierte auch die SCF-stimulierte c-kit-Phosphorylierung bei akuter Myeloblastenleukämie (AML), isoliert aus dem peripheren Blut von Patienten.
Neben dem Test der Fähigkeit von 5-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylamino-ethyl)amid (Verbindung 35), die Liganden-abhängige Rezeptor-Phosphorylierung in Zellen zu inhibieren, wurde auch ihre Wirkung auf die Liganden-abhängige proliferative Antwort von Zellen in-vitro überprüft (siehe Tabelle 4). In diesen Studien wurden Zellen, die durch Übernacht-Serumabreicherung gehemmt wurden, bei der Zugabe des geeigneten mitogenen Liganden der DNA-Synthese unterzogen. Wie in Tabelle 4 gezeigt, inhibierte 5-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylamino-ethyl)amid (Verbindung 35) die PDGF-induzierte Proliferation der NIH-3T3-Zellen, die PDGFRβ oder PDGFRα mit IC₅₀-Werten von 0,031 bzw. 0,069 μM überexprimieren, und die SCF-induzierte Proliferation von MO7E-Zellen mit einem IC₅₀-Wert von 0,007 μM. TABELLE 4
Wie in Tabelle 4 gezeigt, gibt es eine allgemeine Übereinstimmung zwischen den biochemischen und zellulären Aktivitäten von 5-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure-(2-diethylamino-ethyl)amid (Verbindung 35), was die Schlußfolgerung stützt, daß diese Verbindung zelluläre Membranen kreuzt. Ferner kann geschlußfolgert werden, daß die zellulären Antworten ein Ergebnis der Aktivität der Verbindung 35 gegen das angezeigte Ziel sind. Wurde im Gegensatz dazu in Abwesenheit eines kompletten Wachstummediums in-vitro getestet, waren wesentlich höhere Konzentrationen von 5-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure-(2-diethylamino-ethyl)amid (Verbindung 35) (> 10 μM) zur Inhibierung des Wachstums einer Vielzahl von humanen Tumorzellen erforderlich (siehe Tabelle 5). Dies ist ein Anzeichen dafür, daß die Verbindung das Wachstum dieser Zellen bei Konzentrationen, die zur Inhibierung der Liganden-abhängigen Rezeptor-Phosphorylierung und Zellproliferation erforderlich sind, nicht direkt inhibierte. TABELLE 5
Kurz gesagt wurden die in Tabelle 5 gezeigten Ergebnisse durch die Inkubation von Zellen für 48 h in komplettem Wachstumsmedium in Gegenwart serieller Verdünnungen von 5-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylamino-ethyl)amid erhalten. Am Ende der Wachstumsperiode wurde die relative Anzahl von Zellen bestimmt. Die IC₅₀-Werte wurden als die Konzentration an Verbindung, die das Wachstum der Zellen in Bezug auf unbehandelte Zellen um 50 % inhibierte, berechnet. Die LD₅₀-Werte wurden als die Konzentration an Verbindung, die zu einer 50%igen Verringerung der Anzahl an Zellen, bezogen auf die zu Beginn des Experiments, führte.
Ein relevanterer Zell-basierender Assay, der das anti-angiogene Potential von 5-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylamino-ethyl)amid (Verbindung 35) bewertet, ist der In-vitro-Mitogeneseassay unter Verwendung humaner Nabelvenenendothelzellen (HUVECs) als ein Modellsystem für die Endothelzellproliferation, die für den angiogenen Prozeß kritisch ist. In diesem Assay wird eine mitogene Antwort, gemessen als eine Steigerung der DNA-Synthese, in serumabgereicherten HUVECs bei der Zugabe von VEGF oder FGF induziert. In diesen Zellen inhibierte 5-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylamino-ethyl)amid (Verbindung 35) die VEGF- und FGF-induzierte mitogene Antwort dosisabhängig mit IC₅₀-Werten von 0,004 μM bzw. 0,7 μM, wenn die Verbindung über den 48-h-Assay anwesend war.
Kurz gesagt wurden die vorgenannten Ergebnisse unter Verwendung serum-abgereicherter HUVECs, die mit mitogenen Konzentrationen von VEGF (100 ng/ml) oder FGF (30 ng/ml) in Gegenwart serieller Verdünnungen von 5-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylamino-ethyl)amid (Verbindung 35) für 24 Stunden inkubiert wurden, erhalten. Die mitogene Antwort während der folgenden 24 h in Gegenwart von Ligand und Inhibitor wurde durch die Messung der DNA-Synthese, basierend auf der Einführung von Bromdesoxyuridin in zelluläre DNA, quantifiziert.
In separaten Experimenten inhibierte Verbindung 35 die VEGF-abhängige Phosphorylierung von ERK 1/2 (p42/44MAP-Kinase), ein frühes Downstream-Target von Flk-1/KDR, dosisabhängig. Es wurde auch gezeigt, daß die Inhibierungsaktivität der Verbindung 35 in diesem System langanhaltend war; Inihibierung der VEGF-abhängigen Phosphorylierung von ERK 1/2 noch 48 Stunden nach der Entfernung von 5-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylamino-ethyl)amid (Verbindung 35) aus dem Medium, gefolgt von einer kurzen (2 h) Exposition zu mikromolaren Konzentrationen der Verbindung.
Es ist erkannt worden, daß VEGF ein wichtiger Überlebensfaktor für Endothelzellen ist. Da 5-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylamino-ethyl)amid (Verbindung 35) die VEGF-abhängige mitogene Antwort von HUVECs inhibiert, wurde die Wirkung der Verbindung auf das HUVEC-Überleben untersucht. In diesen Experimenten wurde die Spaltung des Caspase-3-Substrats polyADP-Ribosylpolymerase (PARP) als Ablesung für die Apoptose verwendet. HUVECs, kultiviert in serumfreien Bedingungen für 24 Stunden, zeigten erhebliche Niveaus an PARP-Spaltung, wie durch die Akkumulation des 23-kDa-PARP-Spaltfragments detektiert. Diese wurde weitestgehend durch die Zugabe von VEGF zu dem Zellmedium verhindert, was ein Anzeichen dafür ist, daß VEGF als ein Überlebensfaktor in diesem Assay agiert. Es ist gezeigt worden, daß 5-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylamino-ethyl)amid (Verbindung 35) die KDR-Signalgebung inhibiert. Demgemäß inhibierte 5-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylamino-ethyl)amid (Verbindung 35) das VEGF-vermittelte HUVEC-Überleben dosisabhängig. Diese Daten zeigen daher, daß Verbindung 35 die Apoptose in Endothelzellen in Kultur in Gegenwart von VEGF induzierte.
C. In-vivo-Effizienzstudien
i. Effizienz gegenüber etablierten Tumor-Xenografts
Die In-vivo-Effizienz von 5-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylamino-ethyl)amid (Verbindung 35) wurde in subkutanen (SC) Xenograftmodellen unter Verwendung humaner Tumorzellen, die in die Hinterflankenregion athymischer Mäuse implantiert wurden, untersucht. Nach der Implantation konnten sich die Tumore vor Beginn der Behandlung mit der Verbindung bis zu einer Größe von 100–550 mm³ aufbauen.
Eine tägliche orale Verabreichung der Verbindung 35 führte zu einer dosisabhängigen Inhibierung des A431-Tumorwachstums, wenn die Behandlung initiiert wurde, nachdem die Tumore auf eine Größe von 400 mm³ herangewachsen waren. Eine statistisch signifikante (P < 0,05) Inhibierung des Tumorwachstums war bei Dosen von 40 mg/kg/Tag (74%ige Inhibierung) und 80 mg/kg/Tag (84%ige Inhibierung) zu sehen (siehe Tabelle 6). In vorherigen Experimenten war eine höhere Dosis der Verbindung (160 mg/kg/Tag) gegen die aufgebauten A43]-Tumore nicht effizienter als die 80-mg/kg/Tag-Dosis. Überdies verloren Mäuse, die mit der 160-mg/kg/Tag-Dosis der Verbindung behandelt wurden, an Körpergewicht, was ein Anzeichen dafür ist, daß die höhere Dosis nicht so gut toleriert wurde. Ähnliche Ergebnisse wurden in einem Experiment erhalten, in dem A431-Tumore nur eine Größe von 100 mm³ erreichen konnten (siehe Tabelle 5). In diesem zweiten Experiment trat komplette Regression der Tumore bei sechs von acht Tieren, die mit 80 mg/kg/Tag für 21 Tage behandelt wurden, ein. Bei diesen sechs Tieren wuchsen die Tumore über einen 110 tägigen Beobachtungszeitraum nach dem Ende der Behandlung nicht nach. Bei zwei Tieren, bei denen die Tumore auf eine große Größe (2000–3000 mm³) nachwuchsen, bildeten sich die Tumore in Reaktion auf eine zweite Behandlungsrunde mit Verbindung 35 zurück. Wichtig ist, daß in allen Effizienzexperimenten 5-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylamino-ethyl)amid (Verbindung 35) bei 80 mg/kg/Tag gut toleriert worden ist, selbst wenn sie kontinuierlich für mehr als 100 Tage dosiert wurde. TABELLE 6
Kurz gesagt wurden die in Tabelle 6 gezeigten Ergebnisse unter Verwendung von A431-Zellen (0,5 × 10⁶ Zellen/Maus), die SC in die Hinterflankenregion athymischer Mäuse implantiert wurden, erhalten. Eine tägliche Verabreichung von 5-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidemnethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylamino-ethyl)amid (Verbindung 35) in einem Cremophor-basierenden Vehikel oder einer Vehikelkontrolle begann, wenn die Tumore das angezeigte durchschnittliche Volumen erreicht hatten. Die Tumore wurden unter Verwendung von Meßschiebern gemessen und das Tumorvolumen wurde als das Produkt von Länge × Breite × Höhe berechnet. Die P-Werte wurden durch den Vergleich der Größe der Tumore bei Tieren, die mit Verbindung 35 (n = 8) behandelt wurden, mit denen von Tieren, die mit einem Vehikel behandelt wurden (n = 16), am letzten Tag des Experiments unter Verwendung des Zweipunkt-Student-Tests berechnet.
Die Effizienz der Verbindung 35 gegen aufgebaute humane Tumore unterschiedlichen Ursprungs wurde unter Verwendung von Colo205-(Dickdarmkarzinom), SF763T-(Gliom) und NCI-H460-(nicht-kleinzelliges Lungenkarzinom) Xenografts bestimmt (siehe Tabelle 7). Diese Experimente wurden unter Verwendung von 5-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylamino-ethyl)amid (Verbindung 35) durchgeführt, die oral mit 80 mg/kg/Tag verabreicht wurde; eine Dosis, die effektiv war und gut toleriert wurde. TABELLE 7
In den oben genannten Experimenten wurde Verbindung 35 einmal täglich mit 80 mg/kg in einem Cremophor-basierenden Vehikel verabreicht, wenn die Tumore die angezeigte Größe erreicht hatten. Die prozentuale Inhibierung im Vergleich zu der Vehikel-behandelten Kontrollgruppe wurde am Ende der Experimente berechnet. Die P-Werte wurden durch den Vergleich der Größe der Tumorgrößen bei Tieren, die mit der Verbindung behandelt wurden, mit den Tumorgrößen von Tieren, die mit dem Vehikel behandelt wurden, unter Verwendung des Zweipunkt-Student-Tests berechnet.
Obgleich 5-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylamino-ethyl)amid (Verbindung 35) das Wachstum aller Tumorarten, die in "Tabelle 7 gezeigt sind, inhibierte, gab es einen Unterschied hinsichtlich der Antwort auf die verschiedenen Xenograftmodelle. Genauer gesagt, wurde das Wachstum von NCI-H460- und SF763T-Tumoren zum Stehen gebracht oder weitestgehend verlangsamt, wohingegen sich die Colo205-Tumore, wie A431-Tumore, bei der Behandlung mit 5-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure-(2-diethylamino-ethyl)amid zurückbildeten.
Zur Bestimmung der molekularen Basis für den Unterschied hinsichtlich der Antwort zwischen Xenograftmodellen, wurden die SF763T-Tumore untersucht. Hierfür sind SF763T-Tumore, die auf eine Behandlung mit 5-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylamino-ethyl)amid weniger reagierten, auf einem molekularen Niveau unter Verwendung immunohistologischer Techniken zur Bestimmung der Wirkung der Behandlung mit der Verbindung bewertet worden. Diese Studien wurden zu Beginn bei dieser Tumorart durchgeführt, da SF763T-Tumore stark mit Mikrogefäßen, die den Endothelzellenmarker CD31 stark exprimieren, vaskularisiert und daher für die Studien der Tumormikrogefäßdichte (MVD) gut geeignet sind. Die immunohistologische Bewertung der SF763T-Tumore zeigte an, daß Tumore aus behandelten Tieren, bezogen auf Vehikel-behandelte Kontrollen, eine verringerte MVD aufwiesen, was mit einem antiangiogenen Wirkmechanismus für Verbindung 35 übereinstimmt; die MVD betrug 24,2 ± 4,1 bei Tieren, die mit Verbindung 35 behandelt wurden, im Vergleich zu 39,3 ± 5,7 für die, die nur mit dem Vehikel behandelt wurden. Wie aus dem assoziierten Tumorwachstumsstillstand zu erwarten war, war eine ausgeprägte Inhibierung der Tumorzellproliferation in Tumoren, die mit Verbindung 35 behandelt wurden, ersichtlich. Diese Tumore zeigten nur die Hälfte des Mitoseindex vom dem in Vehikel-behandelten Tumoren (Daten sind nicht gezeigt). Die Wirkung der Verbindung 35 auf MVD und die Tumorzellproliferation ist ein Anzeichen dafür, daß die Verbindung starke anti-angiogene und Anti-Tumor-Wirkungen hat, selbst unter Bedingungen, in denen sich Tumore nicht zurückbilden.
Die Fähigkeit der Verbindung 35, die PDGFR-Phosphorylierung und die anschließende In-vivo-Signalgebung zu inhibieren, wurde in den SF763T-Tumoren, die hohe Konzentrationen an PDGFRβ exprimieren, ebenso bewertet. Die Behandlung der SF763T-Tumore mit Verbindung 35 inhibiert stark die PDGFRβ-Tyrosin-Phosphorylierung in aufgebauten SF763T-Tumoren. Verbindung 35 verringerte ebenso die Konzentrationen an phosphorylierter (aktivierter) Phospholipase-C-gamma (PLC-γ), einem unmittelbar nachgelagerten Indikator der PDGFR-Aktivierung. Diese Daten demonstrieren, daß die orale Verabreichung von Verbindung 35 zu einer direkten Wirkung auf die angestrebte (PDGFR-) Aktivität in Tumoren in vivo führt.
Basierend auf der Demonstration, daß die Fähigkeit von Verbindung 35, die VEGF-abhängige Signalgebung in HUVECs in-vitro zu inhibieren, lang andauernd war (siehe oben), wurde die Wirksamkeit der Verbindung bewertet, wenn die Verbindung selten in das Colo205-Tumormodell verabreicht wurde. Wie in Tabelle 8 gezeigt, waren 80 mg/kg (91 %ige Inhibierung) und 40 mg/kg (84%ige Inhibierung) bei einer täglichen Verabreichung, jedoch nicht bei einer Verabreichung zweimal pro Woche wirksam. Im Gegensatz dazu inhibierte eine höhere Dosis der Verbindung 35 (160 mg/kg) das Wachstum aufgebauter Colo205-Tumore (52%ige Inhibierung) bei einer Verabreichung zweimal pro Woche, was darauf schließen läßt, daß diese Verbindung bei einer seltenen Verabreichung in höherer Dosis wirk sam sein kann. Es ist anzumerken, daß die Dosierregime von einem Fachmann ohne unnötige Experimente bestimmt werden können. TABELLE 8
Kurz gesagt, die in Tabelle 8 gezeigten Ergebnisse wurden unter Verwendung von Colo205-Zellen (0,5 × 10⁶ Zellen/Maus), die SC in die Hinterflankenregion athymischer Mäuse implantiert wurden, erhalten. Die orale Verabreichung von Verbindung 35 gemäß dem angezeigten Plan begann, als die Tumore eine Größe von 400 mm³ erreicht hatten. Die Tumore wurden unter Verwendung von Meßschiebern gemessen und das Tumorvolumen wurde als das Produkt von Länge × Breite × Höhe berechnet. Die P-Werte wurden durch den Vergleich der Größe der Tumore von Tieren, die mit Verbindung 35 behandelt wurden, mit denen von Tieren, die mit einem Vehikel behandelt wurden, am letzten Tag des Experimentes unter Verwendung des Zweipunkt-Student-Tests berechnet.
ii. Wirksamkeit von Verbindung 35 in einem Modell einer disseminierten Krankheit
Neben der Förderung des länger anhaltenden Wachstums solider Primärtumore, ist auch die Angiogenese eine wichtige Komponente, die die Entwicklung einer disseminierten Krankheit aufgrund einer Metastasenbildung aus dem Primärtumor fördert. Die Wirkung von Verbindung 35 auf die Entwicklung einer disseminierten Krankheit wurde in dem B16 F1-Maus-Melanom-Lungen-Kolonisationsmodell untersucht. In diesem Modell bevölkern B16-F1-Zellen, die intravenös über die Schwanzvene athymischer Mäuse inokuliert wurden, die Lungen und bilden Tumore. Wie in Tabelle 8 gezeigt, verringert die orale Verabreichung von Verbindung 35 mit 80 mg/kg/Tag wirksam die Belastung der Lunge mit B16-F1-Zellen, was durch Messungen des Gesamtlungengewichts bewertet wurde. Diese Daten lassen darauf schließen, daß Verbindung 35 eine disseminierte Krankheit in vivo inhibieren kann. TABELLE 9
Kurz gesagt, wurden die in Tabelle 9 gezeigten Ergebnisse unter Verwendung athymischer Mäuse, die mit B16-F1-Tumorzellen (5 x 10⁵ Zellen/Maus) über die Schwanzvene inokuliert worden sind, erhalten. Die Mäuse wurden täglich mit der oral verabreichten Verbindung 35 mit 80 mg/kg/Tag (n = 10) oder Vehikel (n = 18) für 24 Tage nach der Tumorzellinokulation behandelt. Am Ende des Behandlungszeitraumes wurden die Mäuse getötet und ihre Lungen wurden entfernt und gewogen. Die prozentuale Inhibierung wurde durch den Vergleich des Lungengewichtes von Tieren, die mit Verbindung 35 behandelt worden sind, mit dem Lungengewicht von Tieren, die nur mit Vehikel behandelt worden sind, berechnet. Die P-Werte wurden unter Verwendung des Zweipunkt-Student-Tests bestimmt.
D. Beispiele für die biologische Aktivität.
Beispiele des In-vitro-Potenzials der Verbindungen dieser Erfindung werden in Tabelle 2 gezeigt.
SCHLUßFOLGERUNG
In Studien zur Untersuchung der pharmakokinetischen Merkmale der Verbindungen aus den bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ist demonstriert worden, daß die orale Verabreichung einer Einzeldosis der Verbindungen bei Mäusen zu einer hohen oralen Bioverfügbarkeit führte. Die gute orale Bioverfügbarkeit und die linearen Pharmakokinetiken sind ein Anzeichen dafür, daß die Verbindungen aus den bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung günstige pharmakokinetische Merkmale haben.
Überdies sind die Verbindungen aus den bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung potente Inhibitoren der Tyrosinkinaseaktivität der Split-Kinasedomäne-RTKs Flk-1/KDR und PDGFR, die in die Angiogenese involviert sind, und der RTK c-kit, ein Rezeptor für den Stammzellenfaktor (SCF), der in bestimmte hämatologische Krebsarten involviert ist. Bei höheren Konzentrationen inhibieren die Verbindungen aus den bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung auch die Tyrosinkinaseaktivität von FGFR-1. einer dritten RTK, die in die Angiogenese involviert ist. In Übereinstimmung mit ihrer biochemischen Aktivität inhibieren die Verbindungen aus den bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung die Liganden-abhängige Tyrosinphosphorylierung der angestrebten RTKs und die mitogene In-vitro-Antwort humaner Nabelvenenendothelzellen (HUVECs), die mit VEGF oder FGF stimuliert werden, PDGFR-exprimierender NIH-3T3-Zellen, die mit PDGF stimuliert werden, und von MO7E-Zellen akuter Myeloidleukämie, die mit SCF stimuliert werden. Im Gegensatz dazu inhibierten die Verbindungen aus den bevorzugten Ausführungsformen der vorliegen Erfindung nicht direkt die Proliferation von Tumorzellen in komplettem Wachstumsmedium, außer bei Konzentrationen, die um das 2-bis 3fache höher waren als die zur Inhibierung der Liganden-abhängigen mitogenen Antworten erforderlichen. In Maus-Xenograft-Studien inhibierten die Verbindungen aus den bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung das Wachstum aufgebauter humaner Tumore unterschiedlichen Ursprungs dosisabhängig und bei Konzentrationen, die selbst bei einer länger dauernden Dosierung (> 100 Tage) gut toleriert wurden. Bei 80 mg/kg/Tag induzierten die Verbindungen aus den bevorzugten Ausführungsformen der vorliegen Erfindung die Zurückbildung großer aufgebauter A431- und Colo205-Tumore, und führten zu einer beträchtlichen Wachstumsinhibierung oder -stase von SF763T- und NCl-H460-Tumoren. Bei SF763T-Tumore-tragenden Mäusen führten die Verbindungen aus den bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung zu Verringerungen der Mikrogefäßdichte, Phosphorylierung von PDGFR in den Tumoren und des Mitoseindex in den Tumorzellen. Bei dieser Dosis inhibierten die Verbindungen aus den bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung auch die Lungenkolonisation durch B16-F1-Tumorzellen in einem Tumormetastase-Modell. Regimestudien demonstrierten, daß die Verbindungen aus den bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung bei täglicher Verabreichung am wirksamsten sind. Ein direkter Nachweis der anti-angiogenen Aktivität der Verbindungen aus den bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wurde in SF763T-Tumoren detektiert, in denen die Mikrogefäßdicht geringer war. Ein direkter Nachweis dafür, daß die Verbindungen aus den bevorzugten Ausführungsformen der vorliegen Erfindung die PDGFR-Phosphorylierung und -signalgebung in-vivo inhibieren, wurde auch in SF763T-Tumoren erhalten.
Alles in allem stützen diese Daten die Ansicht, daß die oral verabreichten Verbindungen aus den bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung anti-angiogene Mittel zur Behandlung von Krebsarten, einschließlich solider Tumore und hämatologischer Malignitäten, in denen Angiogenese und/oder Signalgebung durch c-kit für die Krankheitspathologie wichtig sind, sind.
Es wird zu erkennen sein, daß die Verbindungen, Verfahren und pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegende Erfindung die PK-Aktivität effektiv modulieren und daher erwartungsgemäß als therapeutische Mittel gegen RTK-, CTK- und STK-bedingte Erkrankungen wirksam sein werden.
Alle in der Beschreibung genannten Patente und Veröffentlichungen beziehen sich auf das Niveau eines Fachmannes für die Technik, die diese Erfindung betrifft. Alle Patente und Veröffentlichungen sind hierin durch Verweis in demselben Ausmaß, als wenn jede einzelne Veröffentlichung speziell und einzeln durch Verweis aufgenommen worden wäre, aufgenommen.
Die hierin veranschaulichend beschriebene Erfindung kann geeigneterweise ohne irgendein Element oder Elemente, eine Einschränkung oder Einschränkungen, die hierin nicht speziell offenbart sind, praktiziert werden. Daher können beispielsweise in jedem Beispiel hierin die Ausdrücke „umfassend", „im wesentlichen bestehend aus" und „bestehend aus" durch eines der beiden anderen ersetzt werden. Die Ausdrücke und Äußerungen, die eingesetzt wurden, werden als Ausdrücke zur Beschreibung und nicht zur Einschränkung verwendet, und bei der Verwendung dieser Ausdrücke und Äußerungen sollen jegliche Äquivalente der gezeigten und beschriebenen Merkmale oder Teile davon nicht ausgeschlossen werden, jedoch ist zu erkennen, daß verschiedene Modifikationen innerhalb des Umfangs der beanspruchten Erfindung möglich sind. Es sollte daher selbstverständlich sein, daß, obgleich die vorliegende Erfindung durch bevorzugte Ausführungsformen und optionale Merkmale beschrieben worden ist, ein Fachmann auf Modifikationen und Variationen der hierin offenbarten Konzepte zurückgreifen kann, und daß solche Modifikationen und Variationen im Umfang dieser Erfindung, wie er in den anhängenden Ansprüchen definiert ist, liegen.
Wenn überdies Merkmale oder Aspekte der Erfindung hinsichtlich der Markush-Gruppen beschrieben werden, wird ein Fachmann erkennen, daß die Erfindung dabei auch im Hinblick auf jedes einzelne Mitglied oder eine Untergruppe der Mitglieder der Markush-Gruppe be schrieben wird. Wenn beispielsweise X als ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Brom, Chlor und Iod beschrieben wird, sind Ansprüche für X als Brom und Ansprüche für X als Brom und Chlor vollständig beschrieben.
Andere Ausführungsformen liegen innerhalb der folgenden Ansprüche.

Claims

Verbindung der Formel (I)
oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon, worin: R¹ aus Wasserstoff, (C₁-C₄)-Alkyl, -(CH₂)_rR¹⁶ und -C(O)NR⁸R⁹ ausgewählt ist; R² aus Wasserstoff, Halogen, Aryl und -S(O)₂NR¹³R¹⁴ ausgewählt ist; R³ aus Wasserstoff, (C₁-C₄)-Alkyl, (C₁-C₄)-Alkoxy, Aryl, Heteroaryl und -C(O)R¹⁵ ausgewählt ist; R⁴ Wasserstoff ist; R⁵ aus Wasserstoff und (C₁-C₄)-Alkyl ausgewählt ist; R⁶ -C(O)R¹⁰ ist; R⁷ aus Wasserstoff, (C₁-C₄)-Alkyl und Aryl ausgewählt ist; R⁸ und R⁹ unabhängig aus Wasserstoff, Alkyl und Aryl ausgewählt sind; R¹⁰ -N(R¹¹)(CH₂)_nR¹² ist, worin n 1, 2 oder 3 ist, R" Wasserstoff ist und R¹² aus Hydroxy, (C₁-C₄)-Alkoxy, -C(O)R¹⁵, Heteroaryl und -NR¹³R¹⁴ ausgewählt ist; R¹³ und R¹⁴ unabhängig aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, (C₁-C₄)-Alkyl, Cycloalkyl, Aryl und Heteroaryl, ausgewählt sind; oder R¹³ und R¹⁴ unter Bildung einer Heterocyclogruppe verbunden sein können; R¹⁵ aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, Hydroxy, (C₁-C₄)-Alkoxy und Aryloxy, ausgewählt ist; R¹⁶ aus Hydroxy und -C(O)R¹⁵ ausgewählt ist; und r 2 oder 3 ist; und worin: sich Alkoxy auf O-Alkyl oder O-Cycloalkyl bezieht; sich Aryloxy auf O-Aryl oder O-Cycloaryl bezieht; sich Heteroaryl auf eine monocyclische oder anellierte Ringgruppe mit 5 bis 12 Ringatomen bezieht, enthaltend ein, zwei oder drei Ringheteroatome, ausgewählt aus N, O oder S, wobei die restlichen Ringatome C sind; sich die Heterocyclogruppe auf einen gesättigten, cyclischen Rest mit 3 bis 8 Ringatomen bezieht, in dem ein oder zwei Ringatome Heteroatome sind, ausgewählt aus N, O oder S(O)_n, wobei n eine ganze Zahl von 0 bis 2 ist, wobei die restlichen Ringatome C sind, wo ein oder zwei C-Atome gegebenenfalls durch eine Carbonylgruppe ersetzt sind; die Alkyl-, Alkoxy- und Cycloalkylgruppen unsubstituiert sind; die Aryl- und Heteroarylgruppen gegebenenfalls mit einem oder zwei Substituenten, unabhängig ausgewählt aus Halogen, (C₁-C₄)-Alkyl, Trihalogen(C₁-C₄)-alkyl, Hydroxy, Mercapto, Cyano, N-Amido, Mono- oder Di(C₁-C₄)-alkylamino, Carboxy und N-Sulfonamido, substituiert sind; die Heterocyclogruppe gegebenenfalls mit einem oder zwei Substituenten, unabhängig ausgewählt aus Halogen, -(C₁-C₄)-Alkyl, -(C₁-C₄)-Alkyl-carboxy, -(C₁-C₄)-Alkyl-ester, Hydroxyl und Mono- oder Di(C₁-C₄)-alkylamino, substituiert ist.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei R¹³ und R¹⁴ unabhängig aus Wasserstoff, (C₁-C₄)-Alkyl, Heteroaryl und, verbunden, -(CH₂)₄-, -(CH₂)₅-, -(CH₂)₂-O-(CH₂)₂- und -(CH₂)₂N(CH₃)(CH₂)₂- ausgewählt sind.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei n 2 oder 3 ist und R¹² -NR¹³R¹⁴ ist, worin R¹³ und R¹⁴ unabhängig (C₁-C₄)-Alkyl sind.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei n 2 oder 3 ist und R¹² -NR¹³R¹⁴ ist, worin R¹³ und R¹⁴ unter Bildung einer Gruppe, ausgewählt aus -(CH₂)₄-, -(CH₂)₅-, -(CH₂)₂-O-(CH₂)₂- oder -(CH₂)₂N(CH₃)(CH₂)₂- verbunden sind.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei R¹ -C(O)NR⁸R⁹ ist, worin R⁸ Wasserstoff ist und R⁹ Aryl ist.
Verbindung nach Anspruch 1 mit der Formel
oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon.
Verbindung nach Anspruch 1, die das L-Malatsalz von 5-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure-(2-diethylaminoethyl)amid ist.
Verbindung nach Anspruch 1 mit der Formel
oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine Verbindung nach Anspruch 1 oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger oder ein pharmazeutisch akzeptables Bindemittel.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine Verbindung nach Anspruch 6 oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger oder ein pharmazeutisch akzeptables Bindemittel.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 10, umfassend das L-Malatsalz von 5-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylaminoethyl)amid.
Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1 oder 6 oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes davon bei der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung einer mit der Proteinkinase in Verbindung stehenden Störung in einem Organismus.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei die mit Proteinkinase in Verbindung stehende Störung aus einer mit Rezeptortyrosinkinase in Verbindung stehenden Störung, einer mit Nicht-Rezeptortyrosinkinase in Verbindung stehenden Störung und einer mit Serin-Threoninkinase in Verbindung stehenden Störung ausgewählt ist.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei die mit der Proteinkinase in Verbindung stehende Störung aus einer mit EGFR in Verbindung stehenden Störung, einer mit PDGFR in Verbindung stehenden Störung, einer mit IGFR in Verbindung stehenden Störung und einer mit flk in Verbindung stehenden Störung ausgewählt ist.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei die mit der Proteinkinase in Verbindung stehende Störung Krebs ist, ausgewählt aus Plattenepithelkarzinom, Astrotytom, Kaposi-Sarkom, Glioblastom, Lungenkrebs, Blasenkrebs, Kopf- und Halskrebs, Melanom, Ovarialkarzinom, Prostatakrebs, Brustkrebs, kleinzelligem Karzinom, Gliom, kolorektalem Karzinom, urogenitalem Karzinom und gastrointestinalem Karzinom.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei die mit der Proteinkinase in Verbindung stehende Störung ausgewählt ist aus Diabetes, einer Autoimmunkrankheit, einer Hyperproliferationsstörung, Restenose, Fibrose, Psoriasis, von Heppel-Lindau-Krankheit, Osteoarthritis, Rheumatoidarthritis, Angiogenese, einer entzündlichen Störung, einer immunologischen Störung und einer kardiovaskulären Störung.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei der Organismus ein Mensch ist.