ES2290117T3 - Inhibidores de proteina quinasa 2-indolina sustituida con pirrol. - Google Patents

Inhibidores de proteina quinasa 2-indolina sustituida con pirrol. Download PDF

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Li Sun
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Abstract

Un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la que: R1 se selecciona entre hidrógeno, alquilo (C1-C4), -(CH2)rR16 y -C(O)NR8R9; R2 se selecciona entre hidrógeno, halógeno, arilo y -S(O)2NR13R14; R3 se selecciona entre hidrógeno, alquilo (C1-C4), alcoxi (C1-C4), arilo, heteroarilo, y -C(O)R15; R4 es hidrógeno; R5 se selecciona entre hidrógeno y alquilo (C1-C4); R6 es -C(O)R10; R7 se selecciona entre hidrógeno, alquilo (C1-C4) y arilo; R8 y R9 se seleccionan independientemente entre hidrógeno, alquilo y arilo; R10 es -N(R11)(CH2)nR12, en la que n es 1, 2 ó 3, R11 es hidrógeno y R12 se selecciona entre hidroxi, alcoxi (C1-C4), -C(O)R15, heteroarilo y -NR13R14; R13 y R14 se seleccionan independientemente entre el grupo constituido por hidrógeno. alquilo (C1-C4), cicloalquilo, arilo y heteroarilo; o R13 y R14 pueden combinarse para formar un grupo heterociclo; R15 se selecciona entre el grupo constituido por hidrógeno, hidroxi, alcoxi (C1-C4) y ariloxi; R16 se selecciona entre hidroxi y -C(O)R15; y r es 2 ó 3; y en el que: alcoxi se refiere a O-alquilo u O-cicloalquilo; ariloxi se refiere a O-arilo u O-heteroarilo; heteroarilo se refiere a un grupo de anillo monocíclico o condensado de 5 a 12 átomos en el anillo que contiene uno, dos o tres heteroátomos en el anillo seleccionados entre N, O o S, siendo los restantes átomos en el anillo C; grupo heterociclo se refiere a un radical cíclico saturado de 3 a 8 átomos en el anillo en el que uno o dos átomos en el anillo son heteroátomos seleccionados entre N, O o S(O)n donde n es un número entero de 0 a 2, siendo los restantes átomos en el anillo C, donde uno o dos átomos de C está opcionalmente sustituidos por un grupo carbonilo; los grupos alquilo, alcoxi y cicloalquilo están no sustituidos; los grupos arilo y heteroarilo están opcionalmente sustituidos con uno o dos sustituyentes seleccionados independientemente entre halo, alquilo (C1-C4), trihaloalquilo (C1-C4), hidroxi, mercapto, ciano, N-amido, mono- o dialquil (C1-C4)amino, carboxi y N-sulfonamido; el grupo heterociclo está opcionalmente sustituido con uno o dos sustituyentes seleccionados independientemente entre halo, -alquil (C1-C4), -alquil (C1-C4)-carboxi, -alquil (C1-C4)-éster, hidroxilo y mono- o dialquil (C1-C4)amino.

Description

Inhibidores de proteína quinasa 2-indolinona sustituida con pirrol.
INFORMACIÓN SOBRE REFERENCIAS CRUZADAS
Esta solicitud reivindica prioridad a tenor de 35 U.S.C. 119.(e) para las Solicitudes Provisionales de Estados Unidos con Nº de Serie 60/182.710, presentada el 15 de febrero de 2000, 60/216.422 presentada el 6 de julio de 2000 y Nº de Serie 60/243.532, presentada el 27 de octubre de 2000, cuyas descripciones se incorporan por referencia a este documento en su totalidad.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Campo de la Invención
La presente invención se refiere a ciertos compuestos 2-indolinona sustituidos con 3-pirrol que modulan la actividad de proteínas quinasas ("PK"). Los compuestos de esta invención son por lo tanto útiles para tratar trastornos relacionados con la actividad anormal de PK. Se describen también composiciones farmacéuticas que comprenden estos compuestos, procedimientos para tratar enfermedades utilizando composiciones farmacéuticas que comprenden estos compuestos y procedimientos de preparación de los mismos.
Estado de la Técnica
Lo siguiente se ofrece únicamente como información antecedente y no se admite que sea técnica anterior con relación a la presente invención.
Las PK son enzimas que catalizan la fosforilación de grupos hidroxi en restos tirosina, serina y treonina de proteínas. Las consecuencias de esta actividad aparentemente sencilla son asombrosas; crecimiento, diferenciación y proliferación celular, es decir, prácticamente todos los aspectos de la vida celular de una u otra manera dependen de la actividad de PK. Adicionalmente, la actividad anormal de PK se ha relacionado con una multitud de trastornos, que varían desde enfermedades relativamente amenazantes para la vida tales como psoriasis hasta enfermedades extremadamente virulentas tales como glioblastoma (cáncer cerebral).
Las PK pueden dividirse convenientemente en dos clases, las proteínas tirosina quinasas (PTK) y las serina-treonina quinasas (STK).
Uno de los aspectos fundamentales de la actividad de PTK es su implicación con los receptores del factor de crecimiento. Los receptores del factor de crecimiento son proteínas de la superficie celular. Cuando se unen mediante un ligando del factor de crecimiento, los receptores del factor de crecimiento se convierten en una forma activa que interacciona con proteínas sobre la superficie interna de una membrana celular. Esto conduce a la fosforilación de los restos tirosina del receptor y otras proteínas y a la formación dentro de la célula de complejos con diversas moléculas de señalización citoplásmicas que, a su vez, efectúan numerosas respuestas celulares tales como división celular (proliferación), diferenciación celular, crecimiento celular, expresión de efectos metabólicos hacia el microentorno extracelular, etc. Para un análisis más completo, véase Schlessinger y Ullrich, Neuron, 9:303-391 (1992) que se incorpora por referencia, incluyendo cualquiera de sus dibujos, como se muestra en su totalidad en este documento.
Los receptores del factor de crecimiento con actividad PTK se conocen como tirosina quinasas receptoras ("RTK"). Comprenden una gran familia de receptores transmembrana con actividad biológica diversa. Actualmente, se han identificado al menos diecinueve (19) subfamilias distintas de RTK. Un ejemplo de éstas es la subfamilia denominada RTK "HER", que incluye EGFR (receptor del factor de crecimiento epitelial), HER2, HER3 y HER4. Estas RTK están compuestas por un dominio de unión de ligando glicosilado extracelular, un dominio transmembrana y un dominio catalítico citoplásmico intracelular que puede fosforilar los restos tirosina de las proteínas.
Otra subfamilia de RTK está compuesta por receptor de insulina (IR), receptor del factor de crecimiento de tipo insulina I (IGF-1R) y receptor relacionado con el receptor de insulina (IRR). IR y IGF-1R interaccionan con insulina, IGF-I y IGF-II para formar un heterotetrámero de dos subunidades \alpha glicosiladas enteramente extracelulares y dos subunidades \beta que cruzan la membrana celular y que contienen el dominio tirosina quinasa.
Una tercera subfamilia de RTK se denomina grupo receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas ("PDGFR"), que incluye PDGFR\alpha, PDGFR\beta, CSFIR, c-kit y c-fms. Estos receptores están compuestos por dominios extracelulares glicosilados compuestos de cantidades variables de bucles de tipo inmunoglobina y un dominio intracelular en el que el dominio tirosina quinasa está interrumpido por secuencias de aminoácido no relacionadas.
Otro grupo que, debido a su similitud con la subfamilia PDGFR, en ocasiones se incluye en este último grupo, es la subfamilia del receptor de quinasa del hígado fetal ("flk"). Se cree que este grupo está compuesto por un dominio de inserto de quinasa - receptor de quinasa de hígado fetal-1 (KDR/FLK-1, VEGF-R2), flk-1R, flk-4 y tirosina quinasa 1 de tipo fms (flt-1).
Otros miembros de la familia del receptor del factor de crecimiento de tirosina quinasa es el subgrupo del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos ("FGF"). Este grupo está compuesto por cuatro receptores, FGFR1-4, y siete ligandos, FGF1-7. Aunque aún no está bien definido, parece que los receptores están compuestos por un dominio extracelular glicosilado que contiene una cantidad variable de bucles de tipo inmunoglobina y un dominio intracelular en el que la secuencia de tirosina quinasa está interrumpida por regiones de secuencias de aminoácidos no
relacionadas.
Otros miembros más de la familia del receptor del factor de crecimiento de tirosina quinasa es el subgrupo del receptor del factor de crecimiento endotelial vascular ("VEGF"). VEGF es una glicoproteína dimérica similar a PDGF pero tiene diferentes funciones biológicas y especificidad por células diana in vivo. En particular, actualmente se cree que VEGF desempeña un papel esencial en vasculogénesis y angiogénesis.
Una lista más completa de las subfamilias de RTK conocidas se describe en Plowman et al., DN&P, 7(6):334-339 (1994) que se incorpora por referencia, incluyendo cualquiera de sus dibujos, como se muestra en su totalidad en este documento.
Además de las RTK, existe también una familia de PTK enteramente intracelulares denominada "tirosina quinasas no receptoras" o "tirosina quinasas celulares". Esta última denominación, abreviada "CTK", se usará en este documento. Las CTK no contienen dominios extracelular y transmembrana. Actualmente, se han identificado más de 24 CTK en 11 subfamilias (Src, Frk, Btk, Csk, Abl, Zap70, Fes, Fps, Fak, Jak y Ack).
La subfamilia Src parece ser de lejos el grupo más grande de CTK e incluye Src, Yes, Fyn, Lyn, Lck, Blk, Hck, Fgr e Yrk. Para un análisis más detallado de CTK, véase Bolen, Oncogene, 8:2025-2031 (1993), que se incorpora por referencia, incluyendo cualquiera de sus dibujos, como se muestra en su totalidad en este documento.
Las serina/treonina quinasas, STK, tales como las CTK, son predominantemente intracelulares aunque hay unas pocas quinasas receptoras de tipo STK. Las STK son las quinasas citosólicas más comunes; es decir, quinasas que realizan su función en una parte del citoplasma distinta de los orgánulos citoplásmicos y el citoesqueleto. El citosol es la región dentro de la célula donde ocurre la mayor parte de la actividad metabólica intermediaria y biosintética de la célula; por ejemplo, es en el citosol donde las proteínas se sintetizan sobre los ribosomas.
Las RTK, CTK y STK se han visto implicadas todas ellas en una multitud de afecciones patogénicas incluyendo, de forma significativa, cáncer. Otras afecciones patogénicas que se han asociado con las PTK incluyen, sin limitación, psoriasis, cirrosis hepática, diabetes, angiogénesis, reestenosis, enfermedades oculares, artritis reumatoide y otros trastornos inflamatorios, trastornos inmunológicos tales como enfermedad autoinmune, enfermedad cardiovascular tal como aterosclerosis y diversos trastornos renales.
Con respecto al cáncer, dos de las hipótesis principales se adelantan para explicar que la proliferación celular excesiva que impulsa el desarrollo de tumores está relacionada con funciones que se sabe que están reguladas por PK. Es decir, se ha sugerido que el crecimiento de células malignas resulta de un fallo en los mecanismos que controlan la división y/o diferenciación celular. Se ha demostrado que los productos proteicos de numerosos proto-oncogenes están implicados en las rutas de transducción de señales que regulan el crecimiento y diferenciación celular. Estos productos proteicos de proto-oncogenes incluyen los factores de crecimiento extracelulares, receptores transmembrana del factor de crecimiento de PTK (RTK), PTK citoplásmicas (CTK) y STK citosólicas, analizadas anteriormente.
A la vista de la aparente relación entre actividades celulares relacionadas con PK y una amplia variedad de trastornos humanos, no sorprende que se esté gastando una gran cantidad de esfuerzo en intentar identificar formas de modular la actividad de PK. Parte de este esfuerzo ha implicado enfoques biomiméticos usando grandes moléculas estampadas sobre aquellas implicadas en los procedimientos celulares reales (por ejemplo, ligandos mutantes (Solicitud U.S. Nº 4.966.849); receptores solubles y anticuerpos (Solicitud Nº WO 94/10202, Kendall y Thomas, Proc. Nat'l Acad. Sci., 90:10705-09 (1994), Kim, et al., Nature, 362:841-844 (1993)); ligandos de ARN (Jelinek, et al., Bioquímica, 33:10450-.56); Takano, et al., Mol. Bio. Cell 4:358A (1993): Kinsella, et al., Exp. Cell Res. 199:56-62 (1992); Wright, et al., J. CELULAR Phys., 152:448-57) e inhibidores de tirosina quinasa (documentos WO 94/03427; WO 92/21660; WO 91/15495; WO 94/14808; Patente de Estados Unidos Nº 5.330,992; Mariani, et al., Proc. Am. Assoc. Cancer Res., 35: 2268 (1994)).
Además de lo anterior, se han realizado intentos para identificar moléculas pequeñas que actúan como inhibidores de PK. Por ejemplo, se han descrito compuestos de arilo bis-monocíclicos, bicíclicos y heterocíclicos (PCT WO 92/20642), derivados de vinilenazaindol (PCT WO 94/14808) y 1-ciclopropil-4-piridilquinolonas (Patente de Estados Unidos Nº 5.330.992) como inhibidores de tirosina quinasa. Compuestos de estirilo (Patente de Estados Unidos Nº 5.217.999), compuestos de piridilo sustituidos con estirilo (Patente de Estados Unidos Nº 5.302.606), derivados de quinazolina (Solicitud EP Nº 0 566 266 A1), selenaindoles y selenuros (PCT WO 94/03427), compuestos polihidroxílicos tricíclicos (PCT WO 92/21660) y compuestos de ácido bencilfosfónico (PCT WO 91/15495) se han descrito todos como inhibidores de PTK útiles en el tratamiento de cáncer.
\newpage
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a ciertos compuestos 2-indolinona sustituidos con 3-pirrol que presentan capacidad moduladora de PK y son por lo tanto útiles en el tratamiento de trastornos relacionados con la actividad anormal de PK.
Por consiguiente, en un aspecto, la presente invención se refiere a 2-indolinona sustituida con 3-pirrol de fórmula (I):
\vskip1.000000\baselineskip
1 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que:
R^{1} se selecciona entre hidrógeno, alquilo (C_{1}-C_{4}), -(CH_{2})_{r}R^{16} y -C(O)NR^{8}R^{9};
R^{2} se selecciona entre hidrógeno, halógeno, arilo y -S(O)_{2}NR^{13}R^{14};
R^{3} se selecciona entre hidrógeno, alquilo (C_{1}-C_{4}), alcoxi (C_{1}-C_{4}), arilo, heteroarilo, y -C(O)R^{15};
R^{4} es hidrógeno;
R^{5} se selecciona entre hidrógeno y alquilo (C_{1}-C_{4});
R^{6} es C(O)R^{10};
R^{7} se selecciona entre hidrógeno, alquilo (C_{1}-C_{4}) y arilo;
R^{8} y R^{9} se seleccionan independientemente entre hidrógeno, alquilo y arilo;
R^{10} es -N(R^{11})(CH_{2})_{n}R^{12}, en la que n es 1, 2 ó 3, R^{11} es hidrógeno y R^{12} se selecciona entre hidroxi, alcoxi (C_{1}-C_{4}), -C(O)R^{15}, heteroarilo y -NR^{13}R^{14};
R^{13} y R^{14} se seleccionan independientemente entre el grupo constituido por hidrógeno, alquilo (C_{1}-C_{4}), cicloalquilo, arilo y heteroarilo; o
R^{13} y R^{14} pueden combinarse para formar un grupo heterociclo;
R^{15} se selecciona entre el grupo constituido por hidrógeno, hidroxi, alcoxi (C_{1}-C_{4}) y ariloxi;
R^{16} se selecciona entre hidroxi y -C(O)R^{15}; y
r es 2 ó 3;
o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma.
Los derivados de indolinona y su uso pretendido se mencionan en las siguientes publicaciones: Patente de Estados Unidos 5.886.020; Solicitudes de Patente Internacional WO98/50356, WO99/61422 y WO00/38519 (publicada el 6 de julio de 2000); J. Med. Chem. 1998, 41, 2588-2603. Los derivados de oxindol y su uso pretendido se mencionan en las siguientes publicaciones: WO00/35908 (publicada el 22 de junio de 2000). Las formulaciones para agentes farmacéuticos ionizables en forma de ácidos libres o bases libres se mencionan en la siguiente publicación: WO01/37820 (publicada el 31 de mayo de 2001).
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En un segundo aspecto esta invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende uno o más compuesto o compuestos de Fórmula (1) o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
En un tercer aspecto, esta invención se refiere al uso de un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno relacionado con proteína quinasa, en un organismo, en particular seres humanos, (I). Dichos trastornos incluyen a modo de ejemplo y no como limitación, cáncer, diabetes, cirrosis hepática, enfermedad cardiovascular tal como aterosclerosis, angiogénesis, enfermedad inmunológica tal como enfermedad autoinmune y enfermedad renal.
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DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Definiciones
A menos que se indique otra cosa los siguientes términos usados en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones tienen los significados mostrados a continuación:
"Alquilo" se refiere a un radical hidrocarburo alifático saturado incluyendo grupos de cadena lineal y de cadena ramificada de 1 a 24 átomos de carbono. Los ejemplos de grupos alquilo incluyen metilo, etilo, propilo, 2-propilo, n-butilo, iso-butilo, o terc-butilo, y similares. El grupo alquilo está no sustituido.
"Cicloalquilo" se refiere a un grupo de anillo monocíclico todo de carbono de 3 a 8 miembros, un anillo bicíclico condensado o anillo multicíclico condensado todo de carbono de 5 miembros/6 miembros o de 6 miembros/6 miembros (un sistema de anillo "condensado" significa que cada anillo en el sistema comparte un par de átomos de carbono adyacentes con cada uno de los otros anillos en el sistema) en el que uno o más de los anillos puede contener uno o más dobles enlaces pero ninguno de los anillos tiene un sistema de electrones pi completamente conjugado.
Ejemplos, sin limitación, de grupos cicloalquilo son ciclopropano, ciclobutano, ciclopentano, ciclopenteno, ciclohexano, ciclohexadieno, adamantano, cicloheptano, cicloheptatrieno, y similares. El grupo cicloalquilo está no sustituido.
"Arilo" se refiere a grupos de anillo condensado todo de carbono monocíclico o policíclico (es decir, anillos que comparten pares de átomos de carbono adyacentes) de 1 a 12 átomos de carbono que tienen un sistema de electrones pi completamente conjugado. Los ejemplos, sin limitación, de grupos arilo son fenilo, naftalenilo y antracenilo. El grupo arilo puede estar sustituido o no sustituido. Cuando está sustituido, el grupo arilo está sustituido con uno o dos sustituyentes seleccionados independientemente entre halo, alquilo, trihaloalquilo, hidroxi, mercapto, ciano, N-amido, mono o dialquilamino, carboxi, o N-sulfonamido.
"Heteroarilo" se refiere a un grupo de anillo monocíclico o condensado (es decir, anillos que comparten un par de átomos adyacentes) de 5 a 12 átomos en el anillo que contienen uno, dos, o tres heteroátomos en el anillo seleccionados entre N, O, o S, siendo los restantes átomos en el anillo C, y, además, que tiene un sistema de electrones pi completamente conjugado. Los ejemplos, sin limitación, de grupos heteroarilo no sustituidos son pirrol, furano, tiofeno, imidazol, oxazol, tiazol, pirazol, piridina, pirimidina, quinolina, isoquinolina, purina y carbazol. El grupo heteroarilo puede estar sustituido o no sustituido. Cuando está sustituido, el grupo heteroarilo está sustituido con uno o dos sustituyentes seleccionados independientemente entre halo, alquilo, trihaloalquilo, hidroxi, mercapto, ciano, N-amido, mono o dialquilamino, carboxi, o N-sulfonamido.
"Heterociclo" significa un radical cíclico saturado de 3 a 8 átomos en el anillo en el que uno o dos átomos en el anillo son heteroátomos seleccionados entre N, O, o S(O)_{n} (donde n es un número entero de 0 a 2), siendo los restantes átomos en el anillo C, donde uno o dos átomos de C pueden sustituirse opcionalmente por un grupo carbonilo. Más específicamente, el término heterociclilo incluye, aunque sin limitación, tetrahidropiranilo, 2,2-dimetil-1,3-dioxolano, piperidino, N-metilpiperidin-3-ilo, piperazino, N-metilpirrolidin-3-ilo, 3-pirrolidino, morfolino, tiomorfolino, tiomorfolino-1-óxido, tiomorfolino-1,1-dióxido, 4-etiloxicarbonil-piperazino, 3-oxopiperazino, 2-imidazolidone, 2-pirrolidinona; 2-oxohomopiperazino, tetrahidropirimidin-2-ona, y los derivados de los mismos. El grupo heterociclo está opcionalmente sustituido con uno o dos sustituyentes seleccionados independientemente entre halo, alquilo, alquilo sustituido con carboxi o éster, hidroxi, mono o dialquilamino.
"Hidroxi" se refiere a un grupo -OH.
"Alcoxi" se refiere a ambos grupos -O-(alquilo no sustituido) y -O-(cicloalquilo no sustituido). Los ejemplos representativos incluyen, aunque sin limitación, por ejemplo, metoxi, etoxi, propoxi, butoxi, ciclopropiloxi, ciclobutiloxi, ciclopentiloxi, ciclohexiloxi, y similares.
"Ariloxi" se refiere a ambos grupos -O-arilo y -O-heteroarilo, como se define en este documento. Los ejemplos representativos incluyen, aunque sin limitación, fenoxi, piridiniloxi, furaniloxi, tieniloxi, pirimidiniloxi, piraziniloxi, y similares, y derivados de los mismos.
"Mercapto" se refiere a un grupo -SH.
"Éster" se refiere a un grupo -C(O)O-R'', donde R'' se selecciona entre el grupo constituido por alquilo, trihalometilo, cicloalquilo, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido (unido mediante un carbono del anillo).
El grupo "halo" se refiere a fluoro, cloro, bromo o yodo, preferiblemente fluoro o cloro.
El grupo "trihalometilo" se refiere a un grupo -CX_{3} en el que X es un grupo halo como se define en este documento.
"Ciano" se refiere a un grupo -C\equivN.
"N-sulfonamido" se refiere a un grupo -NR^{18}S(O)_{2}R^{19}, con R^{18} y R^{19} como se define en este documento.
"N-amido" se refiere a un -grupo R^{18}C(O)NR^{19}, con R^{18} y R^{19} como se define en este documento.
R^{18} y R^{19} se seleccionan independientemente entre hidrógeno y alquilo.
Las expresiones "2-indolinona", "indolin-2-ona" y "2-oxindol" se usan de forma intercambiable en este documento para referirse a una molécula que tiene la estructura química:
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2 
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El término "pirrol" se refiere a una molécula que tiene la estructura química:
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3 
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El término "2-indolinona sustituida con pirrol" y "3-pirrolidenil-2-indolinona" se usan de forma intercambiable en este documento para referirse a un compuesto químico que tiene la estructura general mostrada en la Fórmula (I).
Los compuestos que tienen la misma fórmula molecular pero difieren en la naturaleza o secuencia de enlace de sus átomos o la colocación de sus átomos en el espacio se denominan "isómeros". Los isómeros que difieren en la colocación de sus átomos en el espacio se denominan "estereoisómeros". Los estereoisómeros que no son imágenes especulares entre sí se denominan "diastereómeros" y aquellos que no son imágenes especulares superponibles entre sí se denominan "enantiómeros". Cuando un compuesto tiene un centro asimétrico, por ejemplo, se une a cuatro grupos diferentes, es posible un par de enantiómeros. Un enantiómero puede caracterizarse por la configuración absoluta de su centro asimétrico y se describe mediante las reglas de secuenciación R- y S- de Cahn y Prelog, o por la manera en que la molécula hace girar el plano de luz polarizada y se denomina dextro-rotatorio o levo-rotatorio (es decir, como isómeros (+) o (-), respectivamente). Un compuesto quiral puede existir como cualquiera de los enantiómeros individuales o como una mezcla de los mismos. Una mezcla que contiene proporciones iguales de los enantiómeros se denomina "mezcla racémica".
Los compuestos de esta invención pueden poseer uno o más centros asimétricos; dichos compuestos pueden producirse por lo tanto en forma de estereoisómeros individuales (R)- o (S)- o como mezclas de los mismos.
A menos que se indique de otra manera, la descripción o nomenclatura de un compuesto particular en la memoria descriptiva y las reivindicaciones pretende incluir tanto enantiómeros individuales como mezclas, racémicos u otros de los mismos. Los procedimientos para la determinación de la estereoquímica y la separación de estereoisómeros se conocen bien en la técnica (véase el análisis en el capítulo 4 de "Advanced Organic Chemistry", 4ª edición J. March, John Wiley and Sons, Nueva York, 1992).
Los compuestos de Fórmula (I) pueden presentar fenómenos de tautomería e isomería estructural. Por ejemplo, los compuestos descritos en este documento pueden adoptar una configuración E o Z alrededor del doble enlace que conecta el resto 2-indolinona al resto pirrol o pueden ser una mezcla de E y Z. Esta invención engloba cualquier forma tautomérica o isomérica estructural y mezclas de las mismas que posean la capacidad para modular la actividad RTK, CTK y/o STK y no se limita a ninguna forma tautomérica o isomérica estructural.
Una "composición farmacéutica" se refiere a una mezcla de uno o más de los compuestos descritos en este documento, o a sales fisiológicamente/farmacéuticamente aceptables o profármacos de los mismos, con otros componentes químicos, tales como vehículos y excipientes fisiológicamente/farmacéuticamente aceptables. El fin de una composición farmacéutica es facilitar la administración de un compuesto a un organismo.
El compuesto de Fórmula (I) puede actuar también como profármaco. Un "profármaco" se refiere a un agente que se convierte en el fármaco precursor in vivo. Los profármacos a menudo son útiles porque, en algunas situaciones, pueden ser más fáciles de administrar que el fármaco precursor. Pueden, por ejemplo, estar biodisponibles por administración oral mientras que el fármaco precursor no lo está. El profármaco puede tener también una solubilidad mejorada en composiciones farmacéuticas respecto al fármaco precursor. Un ejemplo, sin limitación, de un profármaco sería un compuesto de la presente invención que se administra en forma de éster (el "profármaco") para facilitar la transmisión a través de una membrana celular donde la solubilidad en agua es perjudicial para la movilidad aunque después se hidroliza metabólicamente al ácido carboxílico, la entidad activa, una vez que está dentro de la célula donde la solubilidad en agua es beneficiosa.
Otro ejemplo de profármaco puede ser un polipéptido corto, por ejemplo, sin limitación, un polipéptido de 2-10 aminoácidos, unido mediante un grupo amino terminal a un grupo carboxi de un compuesto de esta invención en el que el polipéptido se hidroliza o metaboliza in vivo para liberar la molécula activa. Los profármacos de un compuesto de Fórmula (I) están dentro del alcance de esta invención.
Además, se contempla que un compuesto de Fórmula (I) sería metabolizado por enzimas en el cuerpo del organismo tal como un ser humano para generar un metabolito que puede modular la actividad de las proteínas quinasas. Dichos metabolitos están dentro del alcance de la presente invención.
Como se usa en este documento, un "vehículo fisiológicamente/farmacéuticamente aceptable" se refiere a un vehículo o diluyente que no provoca irritación significativa a un organismo y no altera la actividad biológica y propiedades del compuesto administrado.
Un "excipiente farmacéuticamente aceptable" se refiere a una sustancia inerte añadida a una composición farmacéutica para facilitar adicionalmente la administración de un compuesto. Los ejemplos, sin limitación, de excipientes incluyen, carbonato cálcico, fosfato cálcico, diversos azúcares y tipos de almidón, derivados de celulosa, gelatina, aceites vegetales y polietilenglicoles.
Como se usa en este documento, el término "sal farmacéuticamente aceptable " se refiere a aquellas sales que retienen la eficacia y propiedades biológicas del compuesto precursor. Dichas sales incluyen:
(i) sal de adición de ácido que se obtiene por reacción de la base libre del compuesto precursor con ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico, y ácido perclórico y similares, o con ácidos orgánicos tales como ácido acético, ácido oxálico, ácido (D) o (L) málico, ácido maleico, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido p-toluenosulfónico, ácido salicílico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido succínico o ácido malónico y similares, preferiblemente ácido clorhídrico o ácido (L)-málico tal como la sal L-malato de (2-dietilaminoetil)amida del ácido 5-(5-fluoro-2-oxo-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico; o
(2) sales formadas cuando un protón ácido presente en el compuesto precursor puede sustituirse por un ión metálico, por ejemplo, un ión de metal alcalino, un ión de metal alcalinotérreo, o un ión de aluminio; o se coordina con una base orgánica tal como etanolamina, dietanolamina, trietanolamina, trometamina, N-metilglucamina, y similares.
"PK" se refiere a proteína tirosina quinasa receptora (RTK), tirosina quinasa no receptora o "celular" (CTK) y serina-treonina quinasas (STK).
"Procedimiento" se refiere a maneras, medios, técnicas y formas para realizar una tarea dada incluyendo, aunque sin limitación, aquellas maneras, medios, técnicas y formas conocidas, o fácilmente desarrolladas a partir de maneras, medios, técnicas y formas conocidas por practicantes de las técnicas química, farmacéutica, biológica, bioquímica y médica.
"Modulación" o "modular" se refieren a la alteración de la actividad catalítica de las RTK, CTK y STK. En particular, modular se refiere a la activación de la actividad catalítica de las RTK, CTK y STK, preferiblemente la activación o inhibición de la actividad catalítica de las RTK, CTK y STK, dependiendo de la concentración del compuesto o sal a la que se expone la RTK, CTK o STK, o más preferiblemente, la inhibición de la actividad catalítica de las RTK, CTK y STK.
"Actividad catalítica" se refiere a la velocidad de fosforilación de tirosina bajo la influencia, directa o indirecta, de las RTK y/o CTK o la fosforilación de serina y treonina bajo la influencia, directa o indirecta, de las STK.
"Poner en contacto" se refiere a poner juntos un compuesto de esta invención y una PK diana de manera que el compuesto puede afectar a la actividad catalítica de la PK, directamente, es decir, interaccionando con la propia quinasa, o indirectamente, es decir, interaccionando con otra molécula de la que depende la actividad catalítica de la quinasa. Dicho "contacto" puede realizarse "in vitro", es decir, en un tubo de ensayo, una placa petri o similares. En un tubo de ensayo, el poner en contacto puede implicar únicamente un compuesto y una PK de interés o puede implicar células enteras. Las células pueden mantenerse también o cultivarse en placas de cultivo celular y ponerse en contacto con un compuesto en este entorno. En este contexto, la capacidad de un compuesto particular para afectar a un trastorno relacionado con PK, es decir, la CI_{50} del compuesto, definida a continuación, puede determinarse antes de intentar usar los compuestos in vivo con organismos vivos más complejos. Para células fuera del organismo, existen múltiples procedimientos, y los conocen bien los especialistas en la técnica, para conseguir que las PK en contacto con los compuestos incluyendo, aunque sin limitación, microinyección celular directa y numerosas técnicas de transporte transmembrana.
"In vitro" se refiere a procedimientos realizados en un entorno artificial tal como, por ejemplo, sin limitación, en un tubo de ensayo o medio de cultivo.
"In vivo" se refiere a procedimientos realizados dentro de un organismo vivo tal como, sin limitación, un ratón, rata o conejo.
Las expresiones "trastorno relacionado con PK", "trastorno accionado por PK", y "actividad anormal de PK" se refieren todas a un estado caracterizado por una actividad catalítica de PK inapropiada, es decir, menor o más habitualmente, mayor, donde la PK particular puede ser una RTK, una CTK o una STK. La actividad catalítica inapropiada puede surgir como resultado de: (1) expresión de PK en células que normalmente no expresan PK, (2) aumento de la expresión de PK que conduce a una proliferación, diferenciación y/o crecimiento celular no deseados, o (3) disminución de la expresión de PK que conduce a reducciones no deseadas en la proliferación, diferenciación y/o crecimiento celular. La sobre-actividad de una PK se refiere a la amplificación del gen que codifica una PK particular o a la producción de un nivel de actividad de PK que puede correlacionarse con un trastorno de proliferación, diferenciación y/o crecimiento celular (es decir, según aumenta el nivel de PK, aumenta la gravedad de uno o más de los síntomas del trastorno celular). La sub-actividad es, por supuesto, lo inverso, en la que la gravedad de uno o más síntomas de un trastorno celular aumentan según disminuye el nivel de la actividad de PK.
"Tratar", "tratando" y "tratamiento" se refieren a un procedimiento para aliviar o mitigar un trastorno celular mediado por PK y/o sus síntomas relacionados. Con respecto particularmente a cáncer, estos términos significan simplemente que la esperanza de vida de un individuo afectado con un cáncer aumentará o que uno o más de los síntomas de la enfermedad se reducirán.
"Organismo" se refiere a cualquier entidad viva compuesta por al menos una célula. Un organismo vivo puede ser tan sencillo como, por ejemplo, una única célula eucariota o tan complejo como un mamífero, incluyendo un ser humano.
"Cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a la cantidad del compuesto que se administra que aliviará en alguna extensión uno o más de los síntomas del trastorno a tratar. Con referencia al tratamiento de cáncer, una cantidad terapéuticamente eficaz se refiere a aquella cantidad que tiene el efecto de:
(1) reducir el tamaño del tumor;
(2) inhibir (es decir, ralentizar en alguna extensión, preferiblemente detener) la metástasis del tumor;
(3) inhibir en alguna extensión (es decir, ralentizar en alguna extensión, preferiblemente detener) el crecimiento del tumor, y/o.
(4) aliviar en alguna extensión (o, preferiblemente, eliminar) uno o más síntomas asociados con el cáncer.
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"Controlar" significa observar o detectar el efecto de poner en contacto un compuesto con una célula que expresa una PK particular. El efecto observado o detectado puede ser un cambio en el fenotipo celular, en la actividad catalítica de una PK o un cambio en la interacción de una PK con una pareja de unión natural. Las técnicas para observar o detectar dichos efectos se conocen bien en la técnica.
El efecto al que se ha hecho referencia anteriormente se selecciona entre un cambio o ausencia de cambio en un fenotipo celular, un cambio o ausencia de cambio en la actividad catalítica de dicha proteína quinasa o un cambio o ausencia de cambio en la interacción de dicha proteína quinasa con una pareja de unión natural en un aspecto final de esta invención.
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"Fenotipo celular" se refiere a la apariencia externa de una célula o tejido o la función biológica de la célula o tejido. Los ejemplos, sin limitación, de un fenotipo celular son el tamaño de célula, crecimiento celular, proliferación celular, diferenciación celular, supervivencia celular, apoptosis, y captación de nutrientes y uso. Dichas características fenotípicas pueden medirse por técnicas bien conocidas en la técnica.
"Pareja de unión natural" se refiere a un polipéptido que se une a una PK particular en una célula. Las parejas de unión naturales pueden desempeñar un papel en la propagación de una señal en un procedimiento de transducción de señales mediado por PK. Un cambio en la interacción de la pareja de unión natural con la PK puede manifestarse como un aumento o disminución de la concentración del complejo PK/pareja de unión natural y, como resultado, en un cambio observable en la capacidad de la PK para mediar en la transducción de señales.
En la Tabla I a continuación se muestran compuestos representativos de la presente invención.
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4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
Los números de los compuestos corresponden a los números de los Ejemplos en la sección de Ejemplos. Es decir, la síntesis del Compuesto 1 en la Tabla 1 se describe en el Ejemplo 1. Los compuestos presentados en la Tabla 1 son únicamente ejemplares y no deben interpretarse como que limitan el alcance de esta invención de ninguna manera.
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REALIZACIONES PREFERIDAS
Aunque la definición más amplia se muestra en el Sumario de la Invención, se prefieren ciertos compuestos de Fórmula (I) mostrados a continuación.
(1) Un grupo preferido de compuestos de Fórmula (I) es aquel en el que R^{1}, R^{3}, y R^{4} son hidrógeno.
(2) Otro grupo preferido de compuestos de Fórmula (I) es aquel en el que R^{1}, R^{2}, y R^{4} son hidrógeno.
(3) Otro grupo preferido de compuestos de Fórmula (I) es aquel en el que R^{1}, R^{2}, y R^{3} son hidrógeno.
(4) Otro grupo preferido de compuestos de Fórmula (I) es aquel en el que R^{2}, R^{3}, y R^{4} son hidrógeno.
(5) Otro grupo preferido de compuestos de Fórmula (I) es aquel en el que R^{1}, R^{2}, R^{3} y R^{4} son hidrógeno.
(6) Otro grupo más preferido de compuestos de Fórmula (I) es aquel en el que:
R^{1} es hidrógeno, alquilo, -C(O)NR^{8}R^{9}, preferiblemente hidrógeno o metilo, particularmente hidrógeno;
R^{2} es hidrógeno, cloro, bromo, fluoro, fenilo, dimetilaminosulfonilo, 3-clorofenil-aminosulfonilo, aminosulfonilo, metilaminosulfonilo, fenilaminosulfonilo, piridin-3-il-aminosulfonilo, dimetilaminosulfonilo, isopropilamino-sulfonilo, preferiblemente hidrógeno, fluoro, o bromo;
R^{3} es hidrógeno, metoxi, carboxi, fenilo, piridin-3-ilo, 3,4-diclorofenilo, 4-n-butilfenilo, 3-isopropilfenilo, preferiblemente hidrógeno o fenilo; y
R^{4} es hidrógeno.
Dentro del grupo preferido (6) anterior un grupo de compuestos más preferido es en el que:
R^{5} es hidrógeno, metilo, etilo, isopropilo, terc-butilo, isobutilo, o n-butilo, preferiblemente hidrógeno o metilo; y
R^{7} es hidrógeno, metilo, etilo, isopropilo, n-, iso o terc-butilo, fenilo, preferiblemente metilo, hidrógeno o fenilo.
(7) Otra realización actualmente preferida de esta invención es un compuesto que tiene una estructura como se ha descrito anteriormente en la que R^{13} y R^{14} se seleccionan independientemente entre el grupo constituido por hidrógeno, alquilo, heteroarilo y, combinados -(CH_{2})_{4}-, -(CH_{2})_{5}-, -(CH_{2})_{2}O(CH_{2})_{2}-, o -(CH_{2})_{2}N(CH_{3})(CH_{2})_{2}-.
Utilidad
Las PK cuya actividad catalítica está modulada por los compuestos de esta invención incluyen proteínas tirosina quinasas de las cuales hay dos tipos, tirosina quinasas receptoras (RTK) y tirosina quinasas celulares (CTK), y serina-treonina quinasas (STK). La transducción de señales mediada por RTK se inicia por interacción extracelular con un factor de crecimiento específico (ligando), seguido de dimerización del receptor, estimulación transitoria de la actividad tirosina quinasa intrínseca de la proteína y fosforilación. Los sitios de unión se crean de esta manera para moléculas de transducción de señales intracelular y conduce a la formación de complejos con un espectro de moléculas de señalización citoplásmicas que facilitan la respuesta celular apropiada (por ejemplo, división celular, efectos metabólicos sobre el microentorno extracelular, etc.). Véase, Schlessinger y Ullrich, 1992, Neuron 9:303-391.
Se ha demostrado que los sitios de fosforilación de tirosina sobre los receptores del factor de crecimiento funcionan como sitios de unión de alta afinidad para los dominios SH2 (homología src) de las moléculas de señalización. Fantl et al., 1992, Cell 69:413-423, Songyang et al., 1994, Mol. Cell. Biol. 14:2777-2785), Songyang et al., 1993, Cell 72:767-778, y Koch et al., 1991, Science 252:668-678. Se han identificado diversas proteínas sustrato intracelulares que se asocian con las RTK. Pueden dividirse en dos grupos principales: (1) sustratos que tienen un dominio catalítico, y (2) sustratos que carecen de dicho dominio pero que sirven como adaptadores y se asocian con moléculas catalíticamente activas. Songyang et al., 1993, Cell 72:767-778. La especificidad de las interacciones entre los receptores y los dominios SH2 de sus sustratos está determinada por los restos aminoacídicos que rodean directamente el resto tirosina fosforilado. Las diferencias en las afinidades de unión entre los dominios SH2 y las secuencias de aminoácidos que rodean los restos fosfotirosina en receptores particulares son consistentes con las diferencias observadas en sus perfiles de fosforilación de sustrato. Songyang et al., 1993, Cell 72:767-778. Estas observaciones sugieren que la función de cada RTK está determinada no sólo por su patrón de expresión y disponibilidad de ligando si no también por la matriz de rutas de transducción de señales cadena abajo que son activadas por un receptor particular. De esta manera, la fosforilación proporciona una importante etapa reguladora que determina la selectividad de las rutas de señalización reclutadas por receptores específicos del factor de crecimiento, así como por receptores del factor de diferenciación.
Las STK, que son principalmente citosólicas, afectan a la bioquímica interna de la célula, a menudo como una respuesta en línea descendente a un suceso PTK. Las STK se han visto implicadas en el procedimiento de señalización que inicia la síntesis de ADN y la posterior mitosis que conduce a la proliferación celular.
De esta manera, la transducción de señales de PK da como resultado, entre otras respuestas, proliferación, diferenciación, crecimiento y metabolismo celular. La proliferación celular anormal puede dar como resultado un amplio abanico de trastornos y enfermedades, incluyendo el desarrollo de neoplasia tal como carcinoma, sarcoma, glioblastoma y hemangioma, trastornos tales como leucemia, psoriasis, arteriosclerosis, artritis y retinopatía diabética y otros trastornos relacionados con angiogénesis y/o vasculogénesis descontroladas.
No se necesita una comprensión precisa del mecanismo por el que los compuestos de esta invención inhiben las PK para la práctica de la presente invención. Sin embargo, aunque este documento no se ciñe a un mecanismo o teoría particular, se cree que los compuestos interaccionan con los aminoácidos en la región catalítica de las PK. Las PK típicamente poseen una estructura bilobular en la que ATP parece unirse en la hendidura entre los dos lóbulos en una región en la que los aminoácidos se conservan entre las PK. Se cree que los inhibidores de las PK se unen mediante interacciones no covalentes tales como uniones de hidrógeno, fuerzas de van der Waals e interacciones iónicas en la misma región general en la que el ATP mencionado anteriormente se une a las PK. Más específicamente, se cree que el componente 2-indolinona de los compuestos de esta invención se une en el espacio general ocupado normalmente por el anillo de adenina del ATP. La especificidad de una molécula particular para una PK particular puede surgir después como resultado de interacciones adicionales entre los diversos sustituyentes en el núcleo de 2-indolinona y los dominios aminoacídicos específicos para las PK particulares. De esta manera, diferentes sustituyentes indolinona pueden contribuir a una unión preferente a las PK particulares. La capacidad para seleccionar compuestos activos en diferentes sitios de unión de ATP (u otro nucleótido) hace a los compuestos de esta invención útiles para fijar como diana cualquier proteína con dicho sitio. Los compuestos descritos en este documento de esta manera tienen utilidad en ensayos in vitro para dichas proteínas y también presentan efectos terapéuticos in vivo mediante interacción con dichas proteínas.
Además, los compuestos de la presente invención proporcionan un procedimiento terapéutico para el tratamiento de muchas clases de tumores sólidos, incluyendo aunque sin limitación carcinomas, sarcomas incluyendo sarcoma de Kaposi, eritroblastoma, glioblastoma, meningioma, astrocitoma, melanoma y mioblastoma. El tratamiento o prevención de cánceres sólidos no tumorales tales como leucemia se contemplan también en esta invención. Las indicaciones pueden incluir, aunque sin limitación, cánceres cerebrales, cánceres de vejiga, cánceres de ovario, cánceres gástricos, cánceres del páncreas, cánceres del colon, cánceres de la sangre, cánceres de pulmón y cánceres óseos.
Otros ejemplos, sin limitación, de los tipos de trastornos relacionados con la actividad inapropiada de PK para los que los compuestos descritos en este documento pueden ser útiles para prevenir, tratar y estudiar, son trastornos proliferativos celulares, trastornos fibróticos y trastornos metabólicos.
Los trastornos proliferativos celulares, que pueden evitarse, tratarse o estudiarse adicionalmente mediante la presente invención incluyen cáncer, trastornos proliferativos de los vasos sanguíneos y trastornos proliferativos celulares mesangiales.
Los trastornos proliferativos de los vasos sanguíneos se refieren a trastornos relacionados con vasculogénesis anormal (formación de vasos sanguíneos) y angiogénesis (propagación de vasos sanguíneos). Aunque vasculogénesis y angiogénesis desempeñan papeles importantes en diversos procedimientos fisiológicos normal tales como desarrollo embrionario, formación del cuerpo lúteo, curación de heridas y regeneración de órganos, desempeñan también un papel fundamental en el desarrollo del cáncer donde dan como resultado la formación de nuevos capilares necesarios para mantener vivo un tumor. Otros ejemplos de trastornos de proliferación de los vasos sanguíneos incluyen artritis, en la que los nuevos vasos sanguíneos capilares invaden la articulación y destruyen el cartílago, y enfermedades oculares, tales como retinopatía diabética, donde los capilares en la retina invaden el cristalino, sangran y provocan ceguera.
Se han identificado dos RTK estructuralmente relacionadas que se unen a VEGF con alta afinidad: el receptor de tirosina de tipo fms 1 (fit-1) (Shibuya et al., 1990, Oncogene, 5:519-524; De Vries et al., 1992, Science, 255:989-991) y el receptor de KDR/FLK-1, conocido también como VEGF-R2. Se ha informado de que el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) es un mitógeno específico para células endoteliales con actividad promotora del crecimiento celular endotelial in vitro. Ferrara y Henzel, 1989, Biochein. Biophys. Res. Comm., 161:851-858; Vaisman et al., 1990, J. Biol. Chem., 265:19461-19566, La información mostrada en las Solicitudes de Estados Unidos con Nº de Serie 08/193.829, 08/038.596 y 07/975.750, sugiere firmemente que VEGF no solo es responsable de la proliferación celular endotelial, si no que también es el regulador principal de la angiogénesis normal y patológica. Véase de forma general, Klags-burn y Soker, 1993, Current Biology, 3(10)699-702; Houck, et al., 1992, J. Biol. Chem., 267:26031-26037.
La vasculogénesis y angiogénesis normales desempeñan papeles importantes en diversos procedimientos fisiológicos tales como desarrollo embrionario, curación de heridas, regeneración de órganos y procedimientos reproductores femeninos tales como desarrollo del folículo en el cuerpo lúteo durante la ovulación y crecimiento de la placenta después del embarazo. Folkman y Shing, 1992, J. Biological Chem., 267(16):10931-34. La vasculogénesis y/o angiogénesis descontroladas se han asociado con enfermedades tales como diabetes así como con tumores sólidos malignos que dependen de la vascularización para el crecimiento. Klagsburn y Soker, 1993, Current Biology, 3 (10): 699-702; Folkham, 1991, J. Natl. Cancer Inst., 82:4-6; Weidner, et al., 1991, New Engl. J. Med., 324:1-5.
El supuesto papel de VEGF en la proliferación celular endotelial y migración durante la angiogénesis y vasculogénesis indica un importante papel para el receptor de KDR/FLK-1 en estos procedimientos. Enfermedades tales como diabetes mellitus (Folkman, 198, en XIth Congress of Thrombosis and Haemostasis (Verstraeta, et al., eds.), pág. 583-596, Leuven University Press, Leuven) y artritis, así como el crecimiento de tumores malignos pueden ser el resultado de angiogénesis descontrolada. Véase, por ejemplo, Folkman, 1971, N. Engl. J. Med., 285:1182-1186. Los receptores a los que VEGF se une específicamente son una diana terapéutica importante y poderosa para la regulación y modulación de vasculogénesis y/o angiogénesis y otras diversas enfermedades graves que implican crecimiento celular anormal provocado por dichos procedimientos. Plowman, et al., 1994, DN&P, 7 (6):334-339. Más particularmente, el papel altamente específico del receptor de KDR/FLK-1 en la neovascularización lo convierte en una diana apropiada para los enfoques terapéuticos al tratamiento de cáncer y otras enfermedades que implican la formación descontrolada de vasos sanguíneos.
De esta manera, la presente invención proporciona compuestos capaces de regular y/o modular la transducción de señales de tirosina quinasa incluyendo transducción de señales del receptor de KDR/FLK-1 para inhibir o promover la angiogénesis y/o vasculogénesis, es decir, compuestos que inhiben, previenen, o interfieren con la señal transducida por KDR/FLK-1 cuando se activa mediante ligandos tales como VEGF. Aunque se cree que los compuestos de la presente invención actúan sobre un receptor u otro componente a lo largo de la ruta de transducción de señales de tirosina quinasa, pueden actuar también directamente sobre las células tumorales que dan como resultado angiogénesis descontrolada.
Aunque la nomenclatura de los homólogos humano y murino del receptor genérico de "flk-1" difiere, son, en muchos respectos, intercambiables. El receptor murino, Flk-1, y su homólogo humano, KDR, comparten una homología de secuencia del 93,4% dentro del dominio intracelular. Análogamente, FLK-1 murino se une a VEGF humano con la misma afinidad que a VEGA de ratón, y por consiguiente, se activa mediante el ligando derivado de cualquiera de las especies. Millauer et al., 1993, Cell, 72: 835-846; Quinn et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:7533-7537. FLK-1 se asocia también con y posteriormente la tirosina fosforila sustratos RTK humanos (por ejemplo, PLC-\gamma o p85) cuando se co-expresa en 293 células (fibroblastos de riñón embrionario humanos).
Los modelos que dependen del receptor de FLK-1 por lo tanto son directamente aplicables para entender el receptor de KDR. Por ejemplo, el uso del receptor de FLK-1 murino en procedimientos que identifican compuestos que regulan la ruta de transducción de señales murina son directamente aplicables a la identificación de compuestos que pueden usarse para regular la ruta de transducción de señales humana, es decir, que regula la actividad relacionada con el receptor de KDR. De esta manera, los compuestos químicos identificados como inhibidores de KDR/FLK-1 in vitro, pueden confirmarse en los modelos in vivo adecuados. Se ha demostrado que ambos modelos animales in vivo de ratón y rata son un excelente valor para el examen del potencial clínico de agentes que actúan sobre la ruta de transducción de señales inducida por KDR/FLK-1.
De esta manera, la presente invención proporciona compuestos que regulan, modulan y/o inhiben la vasculogénesis y/o angiogénesis afectando a la actividad enzimática del receptor de KDR/FLK-1 e interfieren con la señal transducida por KDR/FLK-1. De esta manera la presente invención proporciona un procedimiento terapéutico para el tratamiento de muchas clases de tumores sólidos incluyendo, aunque sin limitación, glioblastoma, melanoma y sarcoma de Kaposi, y carcinoma de ovario, pulmón, de mama, de próstata, pancreático, de colon y epidermoide. Además, los datos sugieren que la administración de compuestos que inhiben la ruta de transducción de señales mediada por KDR/Flk-1 puede usarse también en el tratamiento de hemangioma, reestenosis y retinopatía diabética.
Adicionalmente, esta invención se refiere a la inhibición de vasculogénesis y angiogénesis por otras rutas mediadas por receptor, incluyendo la ruta que comprende el receptor de flt-1.
La transducción de señales mediada por tirosina quinasa receptora se inicia por interacción extracelular con un factor de crecimiento específico (ligando), seguido de dimerización del receptor, estimulación transitoria de la actividad tirosina quinasa intrínseca de la proteína y autofosforilación. Los sitios de unión se crean así para la transducción de señales de moléculas intracelulares que conduce a la formación de complejos con un espectro de moléculas de señalización citoplásmica que facilita la respuesta celular apropiada, por ejemplo, división celular y efectos metabólicos hacia el microentorno extracelular. Véase, Schlessinger y Ullrich, 1992, Neuron, 9:1-20.
La cercana homología de las regiones intracelular de KDR/FLK-1 con la del receptor de PDGF-\beta (homología del 50,3%) y/o el relacionado receptor de flt-1 indica la inducción de rutas de transducción de señales solapantes. Por ejemplo, para el receptor de PDGF-\beta, los miembros de la familia src (Twamley et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:7696-7700), fosfatidilinositol-3'-quinasa (Hu et al., 1992, Mol. Cell. Biol., 12:981-990), fosfolipasa c\gamma (Kashishian y Cooper, 1993, Mol. Cell. Biol., 4:49-51), proteína activadora de ras-GTPasa, (Kashishian et al., 1992, EMBO J., 11:1373-1382), PTP-ID/syp (Kazlauskas et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 10 90:6939-6943), Grb2 (Arvidsson et al., 1994, Mol. Cell. Biol., 14:6715-6726), y las moléculas adaptadoras Shc y Nck (Nishimura et al., 1993, Mol. Cell. Biol., 13:6889-6896), se ha demostrado que se unen a regiones que implican diferentes sitios de autofosforilación. Véase, en general, Claesson-Welsh, 1994, Prog. Growth Factor Res., 5:37-54. De esta manera, es probable que las rutas de transducción de señales activadas por KDR/FLK-1 incluyan la ruta ras (Rozakis et al., 1992, Nature, 360:689-692), las rutas PI-3'-quinasa, mediada por src y mediada por plc\gamma. Cada una de estas rutas puede desempeñar un papel crítico en el efecto angiogénico y/o vasculogénico de KDR/FLK-1 en células endoteliales. Por consiguiente, otro aspecto más de esta invención se refiere al uso de los compuestos orgánicos descritos en este documento para modular la angiogénesis y vasculogénesis puesto que dichos procedimientos están controlados por estas rutas.
Por el contrario, los trastornos relacionados con el encogimiento, contracción o cierre de los vasos sanguíneos, tales como reestenosis, están implicados también y pueden tratarse o prevenirse mediante los procedimientos de esta invención.
Los trastornos fibróticos se refieren a la formación anormal de matrices extracelulares. Los ejemplos de trastornos fibróticos incluyen cirrosis hepática y trastornos proliferativos celulares mesangiales. La cirrosis hepática está caracterizada por el aumento de los constituyentes de la matriz extracelular que da como resultado la formación de una huella hepática. Un aumento de la matriz extracelular que da como resultado una huella hepática puede estar provocado también por una infección vírica tal como hepatitis. Los lipocitos parecen desempeñar un papel principal en la cirrosis hepática. Otros trastornos fibróticos implicados incluyen aterosclerosis.
Los trastornos proliferativos celulares mesangiales se refieren a trastornos provocada por la proliferación anormal de células mesangiales. Los trastornos proliferativos mesangiales incluyen diversas enfermedad renales humanas tales como glomerulonefritis, nefropatía diabética y nefroesclerosis maligna así como trastornos tales como síndromes de microangiopatía, rechazo de transplantes, y glomerulopatías. Las RTK PDGFR se han visto implicadas en el mantenimiento de la proliferación celular mesangial. Floege et al., 1993, Kidney Internacional 43:47S-54S.
Muchos cánceres son trastornos proliferativos celulares y, como se ha indicado anteriormente, las PK se han asociado con trastornos proliferativos celulares. De esta manera, no es sorprendente que las PK tales como, por ejemplo, miembros de la familia RTK se hayan asociado con el desarrollo de cáncer. Algunos d estos receptores, tales como EGFR (Tuzi et al., 1991, Br. J. Cancer 63: 227-233, Torp et al., 1992, APMIS 100:713-719) HER2/neu (Slamon et al., 1989, Science 244:707-712) y PDGF-R (Kumabe et al., 1992, Oncogene, 7:627-633) se sobre-expresan en muchos tumores y/o se activan persistentemente mediante bucles autocrinos. De hecho, en los cánceres más comunes y graves, se han demostrado estas sobre-expresiones del receptor (Akbasak y Suner-Akbasak et al., 1992, J. Neurol. Sci., 111:119-133, Dickson et al., 1992, Cancer Treatment Res. 61:24 9-273, Korc et al., 1992, J. Clin. Invest. 90:1352-1360) y bucles autocrinos (Lee y Donoghue, 1992, J. Cell. Biol., 118:1057-1070, Korc et al., supra, Akbasak y Suner-Akbasak et al., supra). Por ejemplo, EGFR se ha asociado con carcinoma de células escamosas, astrocitoma, glioblastoma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de pulmón y cáncer de vejiga. HER2 se ha asociado con cáncer de mama, de ovario, gástrico, de pulmón, de páncreas y de vejiga. PDGFR se ha asociado con glioblastoma y melanoma así como con cáncer de pulmón, ovario y próstata. El c-met de RTK se ha asociado con la formación de tumores malignos. Por ejemplo, c-met se ha asociado con, entre otros cánceres, carcinomas y linfomas colorectal, de tiroides, pancreático, gástrico y hepatocelular. Además c-met se ha relacionado con leucemia. La sobre-expresión del gen c-met se ha detectado también en pacientes con enfermedad de Hodgkins y enfermedad de Burkitts.
IGF-IR, además de estar implicado en el soporte nutricional y en diabetes de tipo II, se ha asociado también con diversos tipos de cánceres. Por ejemplo, IGF-I se ha visto implicado como un estimulador del crecimiento autocrino para diversos tipos de tumores, por ejemplo células de carcinoma en cáncer de mama humano (Arteaga et al., 1989, J. Clin. Invest. 84:1418-1423) y células tumorales de pulmón pequeñas (Macauley et al., 1990, Cancer Res., 50:2511-2517). Además, IGF-I, aunque está implicado integralmente en el crecimiento y diferenciación normal del sistema nervioso, parece ser también un estimulador autocrino de gliomas humanos. Sandberg-Nordqvist et al., 1993, Cancer Res. 53:2475-2478. La importancia de IGF-IR y sus ligandos en la proliferación celular está soportada adicionalmente por el hecho de que muchos tipos de células en cultivo (fibroblastos, células epiteliales, células de músculo liso, linfocitos T, células mieloides, condrocitos y osteoblastos (las células madre de la médula ósea)) son estimuladas para crecer por IGF-I. Goldring y Goldring, 1991, Eukaryotic Gene Expression, 1:301-326. Baserga y Coppola sugieren que IGF-IR desempeña un papel central en el mecanismo de transformación y, como tal, puede ser una diana preferida para intervenciones terapéuticas para un amplio espectro de malignidades humanas. Baserga, 1995, Cancer Res., 55:249-252, Baserga, 1994, Cell 79:927-930, Coppola et al., 1994, Mol. Cell. Biol., 14:9588-4595.
Las STK se han visto implicadas en muchos tipos de cáncer incluyendo, particularmente, cáncer de mama (Cance, et al., Int. J. Cancer, 54:571-77 (1993)).
La asociación entre actividad anormal de PK y enfermedad no se restringe a cáncer. Por ejemplo, las RTK se han asociado con enfermedades tales como psoriasis, diabetes mellitus, endometriosis, angiogénesis, desarrollo de la placa ateromatosa, enfermedad de Alzheimer, reestenosis, enfermedad de von Hippel-Lindau, hiperproliferación epidérmica, enfermedades neurodegenerativas, degeneración macular relacionada con la edad y hemangiomas. Por ejemplo, EGFR se ha visto implicado en curación de heridas corneanas y dérmicas. Los defectos en Insulina-R e IGF-1R están indicados en diabetes mellitus de tipo II. Una correlación más completa entre las RTK específicas y sus indicaciones terapéuticas se muestra en Plowman et al., 1994, DN&P 7:334-339.
Como se ha indicado anteriormente, no solo las RTK sino también las CTK incluyendo, aunque sin limitación, src, abl, fps, yes, fyn, lyn, lck, blk, hck, fgr y yrk (revisado por Bolen et al., 1992, FASEB J., 6:3403-3409) están implicadas en las ruta de transducción de señales proliferativa y metabólica y de esta manera podría esperarse, y se ha demostrado, que están implicadas en muchos trastornos mediados por PTK a los que se refiere la presente invención. Por ejemplo, se ha demostrado que src mutado (v-src) es una oncoproteína (pp60^{v-src}) en pollo. Además, su homólogo celular, el proto-oncogen pp60^{c-src} transmite señales oncogénesis de muchos receptores. La sobre-expresión de EGFR o HER2/neu en tumores conduce a la activación constitutiva de pp60^{chsrc}, que es característico de células malignas pero está ausente en células normales. Por otro lado, los ratones con expresión deficiente de c-src presentan un fenotipo osteopetrótico, que indica una participación clave de c-src en la función de los osteoclastos y una posible implicación en trastornos relacionados.
Análogamente, Zap70 se ha visto implicado en la señalización de células T que están relacionadas con trastornos autoinmunes.
Las STK se han asociado con inflamación, enfermedad autoinmune, inmunorespuestas, y trastornos de hiperproliferación tales como reestenosis, fibrosis, psoriasis, osteoartritis y artritis reumatoide.
Las PK se han visto implicadas también en el implante de embriones. De esta manera, los compuestos de esta invención pueden proporcionar un procedimiento eficaz para prevenir dicho implante de embriones y, por lo tanto, ser útiles como agentes de control de la natalidad. Los trastornos adicionales que pueden tratarse o prevenirse usando los compuestos de esta invención son trastornos inmunológicos tales como enfermedad autoinmune, SIDA y trastornos cardiovasculares tales como aterosclerosis.
Finalmente, actualmente se sospecha que ambas RTK y CTK están implicadas en trastornos hiperinmunes.
Los ejemplos del efecto de numerosos compuestos ejemplares de esta invención sobre diversas PTK se muestran en la Tabla 2 a continuación. Los compuestos y datos presentados no deben interpretarse como limitantes del alcance de esta invención de ninguna manera.
Administración y Composición Farmacéutica
Un compuesto de la presente invención o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, puede administrarse como tal a un paciente humano o puede administrarse en composiciones farmacéuticas en las que los materiales anteriores se mezclan con los vehículos o excipientes adecuado. Las técnicas para la formulación y administración de fármacos pueden encontrarse en "Remington's Pharmacological Sciences," Mack Publishing Co., Easton, PA., última edición.
Como se usa en este documento, "administrar" o "administración" se refiere a suministrar un compuesto de Fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo o una composición farmacéutica que contiene un compuesto de Fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo de esta invención a un organismo con el fin de prevenir o tratar un trastorno relacionado con PK.
Las vías de administración adecuadas pueden incluir, sin limitación, administración oral, rectal, transmucosa o intestinal o inyección intramuscular, subcutánea, intramedular, intratecal, intraventricular directa, intravenosa, intravitreal, intraperitoneal, intranasal, o intraocular. Las vías de administración preferidas son oral y parenteral.
Como alternativa, puede administrarse el compuesto de una forma local en lugar de sistémica, por ejemplo, inyectando el compuesto directamente a un tumor sólido, a menudo en una formulación de depósito o de liberación sostenida.
Adicionalmente, puede administrarse el fármaco en un sistema de suministro de fármaco dirigido, por ejemplo, en un liposoma recubierto con un anticuerpo específico para el tumor. Los liposomas se dirigirán a y serán absorbidos selectivamente por el tumor.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden fabricarse por procedimientos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, por procedimientos convencionales de mezcla, disolución, granulación, preparación de grageas, levigado, emulsión, encapsulación, atropamiento o liofilización.
Las composiciones farmacéuticas para usar de acuerdo con la presente invención pueden formularse de una manera convencional usando uno o más vehículos fisiológicamente aceptables que comprenden excipientes y auxiliares que facilitan el procesado de los compuestos activos en preparaciones que pueden usarse farmacéuticamente. La formulación apropiada depende de la vía de administración elegida.
Para inyección, los compuestos de la invención pueden formularse en soluciones acuosas, preferiblemente en tampones fisiológicamente compatibles tales como solución de Hanks, solución de Ringer, o tampón salino fisiológico. Para administración transmucosa, en la formulación se usan los penetradores apropiados para la barrera a permear. Dichos penetradores generalmente se conocen en la técnica.
Para administración oral, los compuestos pueden formularse combinando los compuestos activos con vehículos farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica. Dichos vehículos permiten formular los compuestos de la invención como comprimidos, píldoras, pastillas, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, pastas, suspensiones y similares, para ingestión oral por un paciente. Las preparaciones farmacéuticas para uso oral pueden prepararse usando un excipiente sólido, opcionalmente moliendo la mezcla resultante, y procesando la mezcla de gránulos, después de añadir otros auxiliares adecuados si se desea, para obtener comprimidos o núcleos de grageas. Los excipientes útiles son, en particular, cargas tales como azúcares, incluyendo lactosa, sacarosa, manitol, o sorbitol, preparaciones de celulosa tales como, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz y almidón de patata y otros materiales tales como gelatina, goma de tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica, y/o polivinilpirrolidona (PVP). Si se desea, pueden añadirse agentes disgregantes, tales como polivinil pirrolidona reticulada, goma de agar, o ácido algínico. Puede usarse también una sal tal como alginato
sódico.
Los núcleos de gragea están provistos con los recubrimientos adecuados. Con este fin, pueden usarse soluciones de azúcar concentradas que pueden contener opcionalmente goma arábiga, talco, polivinil pirrolidona, gel carbopol, polietilenglicol, y/o dióxido de titanio, soluciones de laca, y disolventes orgánicos adecuados o mezclas de disolventes. Pueden añadirse colorantes o pigmentos a los recubrimientos de comprimidos o grageas para identificar o caracterizar diferentes combinaciones de dosis de compuesto activo.
Las composiciones farmacéuticas que pueden usarse por vía oral incluyen cápsulas enchufables hechas de gelatina, así como cápsulas blandas selladas hechas de gelatina y un plastificante, tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas enchufables pueden contener los ingredientes activos mezclados con una carga tal como lactosa, un aglutinante tal como almidón, y/o un lubricante tal como talco o estearato de magnesio y, opcionalmente, estabilizadores. En las cápsulas blandas, los compuestos activos pueden disolverse o suspenderse en líquidos adecuados, tales como aceite grasos, parafina líquida, o polietilenglicoles líquidos. También pueden añadirse estabilizadores a estas formulaciones.
Las composiciones farmacéuticas que pueden usarse también incluyen cápsulas de gelatina duras. Como ejemplo no limitante, la formulación de producto farmacéutico oral en forma de cápsula que contiene el compuesto activo puede ser de una potencia de dosis de 50 y 200 mg (códigos de formulación J-011248-AA-00 y J-011248-AA-01, respectivamente). Las dos potencias de dosis se preparan a partir de los mismos gránulos llenando cápsulas de gelatina dura de diferente tamaño, tamaño 3 para la cápsula de 50 mg y tamaño 0 para la cápsula de 200 mg. la composición de la formulación puede ser, por ejemplo, como se indica en la Tabla 2.
TABLA 2
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Las cápsulas pueden envasarse en botellas de vidrio o plástico marrón para proteger el compuesto activo de la luz. Los recipientes que contienen la formulación de cápsula con el compuesto activo deben almacenarse a temperatura ambiente controlada (15-30ºC).
Para administración por inhalación, los compuestos para usar de acuerdo con la presente invención se suministran convenientemente en forma de pulverización en aerosol usando un envase presurizado o un nebulizador y un propulsor adecuado, por ejemplo, sin limitación, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano o dióxido de carbono. En el caso de un aerosol presurizado, la dosificación unitaria puede controlarse proporcionando una válvula para suministrar una cantidad medida. Las cápsulas y cartuchos, por ejemplo, de gelatina para usar en un inhalador o insuflador pueden formularse de manera que contienen una mezcla en polvo del compuesto y una base en polvo adecuada tal como lactosa o almidón.
Los compuestos pueden formularse también para administración parenteral, por ejemplo, por inyección en embolada o infusión continua. Las formulaciones para inyección pueden presentarse en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, en ampollas o en recipientes multi-dosis, con un conservante añadido. Las composiciones pueden tomar formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y pueden contener materiales de formulación tales como agentes de suspensión, estabilización y/o dispersión.
Las composiciones farmacéuticas para administración parenteral incluyen soluciones acuosas de una forma soluble en agua, tales como, sin limitación, una sal, del compuesto activo. Además, las suspensiones de los compuestos activos pueden prepararse en un vehículo lipófilo. Los vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos tales como aceite de sésamo, ésteres de ácido graso sintéticos tales como oleato de etilo y triglicéridos, o materiales tales como liposomas. Las suspensiones acuosas para inyección pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, tales como carboximetil celulosa sódica, sorbitol, o dextrano. Opcionalmente, la suspensión puede contener también estabilizadores adecuados y/o agentes que aumentan la solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de soluciones muy concentradas.
Como alternativa, el ingrediente activo puede estar en forma de polvo para constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua estéril, sin pirógenos, antes de su uso.
Los compuestos pueden formularse también en composiciones rectales tales como supositorios o enemas de retención, usando, por ejemplo, bases de supositorio convencionales tales como manteca de cacao u otros glicéridos.
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Además de las formulaciones descritas anteriormente, los compuestos pueden formularse también como preparaciones de depósito. Dichas formulaciones de actuación prolongada pueden administrarse por implante (por ejemplo, subcutánea o intramuscular) o por inyección intramuscular. Un compuesto de esta invención puede formularse para esta vía de administración con materiales poliméricos o hidrófobos adecuados (por ejemplo, en una emulsión con un aceite farmacológicamente aceptable), con resinas de intercambio de iones, o como un derivado apenas soluble tal como, sin limitación, una sal apenas soluble.
Un ejemplo no limitante de un vehículo farmacéutico para los compuestos hidrófobos de la invención es un sistema co-disolvente que comprende alcohol bencílico, un tensioactivo no polar, un polímero orgánico miscible en agua y una fase acuosa tal como el sistema de co-disolvente VPD. VPD es una solución de alcohol bencílico al 3% p/v, tensioactivo no polar Polisorbate 80 al 8% p/v, y polietilenglicol 300 al 65% p/v, y el resto del volumen etanol absoluto. El sistema de co-disolvente VPD (VPD: D5W) está compuesto por VPD diluido 1:1 con dextrosa al 5% en solución acuosa. Este sistema de co-disolvente disuelve bien los compuestos hidrófobos, y produce por sí mismo una baja toxicidad después de administración sistémica. Naturalmente, las proporciones de dicho sistema de co-disolvente pueden variarse considerablemente sin destruir sus características de solubilidad y toxicidad. Adicionalmente, la identidad de los componentes co-disolventes puede variarse: por ejemplo, pueden usarse otros tensioactivos no polares de baja toxicidad en lugar de Polisorbate 80, el tamaño de la fracción de polietilenglicol puede variarse, otros polímeros biocompatibles pueden sustituir al polietilenglicol, por ejemplo, polivinil pirrolidona, y otros azúcares o polisacáridos pueden sustituir a la dextrosa.
Como alternativa, pueden emplearse otros sistemas de suministro para compuestos farmacéuticos hidrófobos. Los liposomas y emulsiones son ejemplos bien conocidos de vehículos de suministro o vehículos para fármacos hidrófobos. Además, pueden emplearse también ciertos disolventes orgánicos tales como dimetilsulfóxido, aunque a menudo al coste de una mayor toxicidad.
Además, los compuestos pueden suministrarse usando un sistema de liberación sostenida, tal como matrices semipermeables de polímeros sólidos hidrófobos que contienen el agente terapéutico. Diversos materiales de liberación sostenida se han establecido y los conocen bien los especialistas en la técnica. Las cápsulas de liberación sostenida pueden, dependiendo de su naturaleza química, liberar los compuestos durante desde unas pocas semanas hasta más de 100 días. Dependiendo de la naturaleza química y la estabilidad biológica del reactivo terapéutico, pueden emplearse estrategias adicionales para la estabilización de proteínas.
Las composiciones farmacéuticas en este documento pueden comprender también vehículos o excipientes en fase sólida o gel adecuados. Los ejemplos de dichos vehículos o excipientes incluyen, aunque sin limitación, carbonato cálcico, fosfato cálcico, diversos azúcares, almidones, derivados de celulosa, gelatina, y polímeros tales como polietilenglicoles.
Muchos de los compuestos moduladores de PK de la invención pueden proporcionarse en forma de sales fisiológicamente aceptables en las que el compuesto reivindicado puede formar la especie cargada negativa o positivamente. Los ejemplos de sales en las que el compuesto forma el resto cargado positivamente incluyen, sin limitación, amonio cuaternario (definido en otra parte de este documento), sales tales como clorhidrato, sulfato, carbonato, lactato, tartrato, malato, maleato, succinato en las que el átomo de nitrógeno del grupo amonio cuaternario es un nitrógeno del compuesto seleccionado de esta invención que se ha hecho reaccionar con el ácido apropiado. Las sales en las que un compuesto de esta invención forma la especie cargada negativamente incluyen, sin limitación, las sales de sodio, potasio, calcio y magnesio formadas por la reacción de un grupo ácido carboxílico en el compuesto con una base apropiada (por ejemplo, hidróxido sódico (NaOH), hidróxido potásico (KOH), hidróxido cálcico (Ca(OH)_{2}), etc.).
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para usar en la presente invención incluyen composiciones en las que los ingredientes activos están contenidos en una cantidad suficiente para conseguir el fin pretendido, por ejemplo, la modulación de la actividad de PK o el tratamiento o prevención de un trastorno relacionado con PK.
Más específicamente, una cantidad terapéuticamente eficaz significa una cantidad de compuesto eficaz para prevenir, aliviar o mejorar los síntomas de enfermedad o prolongar la supervivencia del sujeto que se está tratando.
La determinación de una cantidad terapéuticamente eficaz está dentro de las capacidades de los especialistas en la técnica, especialmente a la luz de la descripción detallada proporcionada en este documento.
Para cualquier compuesto usado en los procedimientos de la invención, la cantidad o dosis terapéuticamente eficaz puede estimarse inicialmente a partir de ensayos de cultivo celular. Después, la dosificación puede formularse para usar en modelos animales para conseguir un intervalo de concentración en circulación que incluye la CI_{50} según se ha determinado en el cultivo celular (es decir, la concentración del compuesto de ensayo que consigue la mitad de la inhibición máxima de la actividad de PK). Dicha información puede usarse después para determinar con más precisión las dosis útiles en seres humanos.
La toxicidad y la eficacia terapéutica de los compuestos descritos en este documento pueden determinarse por procedimientos farmacéuticos convencionales en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, determinando la CI_{50} y la DL_{50} (analizándose ambas en otra parte en este documento) para un compuesto en cuestión. Los datos obtenidos a partir de estos ensayos de cultivo celular y estudios con animales pueden usarse para formular un intervalo de dosificación para usar en seres humanos. La dosificación puede variar dependiendo de la forma de dosificación empleada y de la vía de administración utilizada. La formulación exacta, vía de administración y dosificación puede elegirlas el médico individual según el estado del paciente. (Véase, por ejemplo, Fingl, et al., 1975, en "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Cáp. 1 pág. 1).
La cantidad e intervalo de dosificación pueden ajustarse individualmente proporcionando niveles en plasma de las especies activas que son suficientes para mantener los efectos moduladores de quinasa. Estos niveles en plasma se denominan concentraciones eficaces mínimas (MEC). Las MEC variarán para cada compuesto aunque pueden estimarse a partir de datos in vitro, por ejemplo, la concentración necesaria para conseguir el 50-90% de inhibición de una quinasa puede determinarse usando los ensayos descritos en este documento. Las dosificaciones necesarias para conseguir las MEC dependerán de características individuales y de la vía de administración. Pueden usarse ensayos por HPLC o bioensayos para determinar concentraciones en plasma.
Los intervalos de dosificación pueden determinarse también usando valores de MEC. Los compuestos deben administrarse usando un régimen que mantenga los niveles en plasma por encima de las MEC durante el 10-90% del tiempo, preferiblemente entre 30-90% y aún más preferiblemente entre el 50-90%.
Actualmente, las cantidades terapéuticamente eficaces de los compuestos de Fórmula (I) pueden variar de aproximadamente 25 mg/m^{2} a 1500 mg/m^{2} por día; preferiblemente de aproximadamente 3 mg/m^{2}/día. Aún más preferiblemente de 50 mg/qm hasta 400 mg/qd.
En los casos de administración local o captación selectiva, la concentración local eficaz del fármaco puede no estar relacionada con la concentración en plasma y pueden emplearse otros procedimientos conocidos en la técnica para determinar la cantidad de dosificación e intervalo correctos.
La cantidad de una composición administrada dependerá, por supuesto, del sujeto a tratar, de la gravedad de la aflicción, del modo de administración, del juicio del médico que lo prescribe, etc.
Las composiciones pueden presentarse, si se desea, en un envase o dispositivo dosificador, tal como un kit aprobado por la FDA, que puede contener una o más formas de dosificación unitarias que contienen el ingrediente activo. El envase puede comprender, por ejemplo, una lámina metálica o de plástico, tal como un envase de tipo blíster. El envase o dispositivo dosificador puede llevar instrucciones de administración. El envase o dosificador puede llevar también una notificación asociada con el recipiente en una forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, uso o venta de productos farmacéuticos, reflejando dicha notificación la aprobación por parte de la agencia de la forma de las composiciones o de la administración humana o veterinaria. Dicha notificación, por ejemplo, puede ser la etiqueta aprobada por la U.S. Food and Drug Administration para fármacos de prescripción o de un inserto aprobado en el producto. Las composiciones que comprenden un compuesto de la invención formuladas en un vehículo farmacéutico compatible puede prepararse también, ponerse en un recipiente apropiado, y etiquetarse para tratamiento de un afección indicada. Las afecciones adecuadas indicadas en la etiqueta pueden incluir tratamiento de un tumor, inhibición de angiogénesis, tratamiento de fibrosis, diabetes, y similares.
También es un aspecto de esta invención que un compuesto descrito en este documento, o su sal o profármaco, puede combinarse con otros agentes quimioterapéuticos para el tratamiento de las enfermedades y trastornos analizados anteriormente. Por ejemplo, un compuesto, sal o profármaco de esta invención puede combinarse con agentes de alquilación tales como fluorouracilo (5-FU) solo o combinado con leucovorina; u otros agentes de alquilación tales como, sin limitación, otros análogos de pirimidina tales como UFT, capecitabina, gemcitabina y citarabina, los sulfonatos de alquilo, por ejemplo, busulfan (usado en el tratamiento de leucemia granulocítica crónica), improsulfan y piposulfan; aziridinas, por ejemplo, benzodepa, carboquona, meturedepa y uredepa; etilenoiminas y metilmelaminas, por ejemplo, altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolmelamina; y las mostazas de nitrógeno, por ejemplo, clorambucilo (usado en el tratamiento de leucemia linfocítica crónica, macroglobulinemia primaria y linfoma no Hodgkin), ciclofosfamida (usada en el tratamiento de la enfermedad de Hodgkin, mieloma múltiple, neuroblastoma, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, tumor de Wilm y rabdomiosarcoma), estramustina, ifosfamida, novembriquina, prednimustina y mostazas de uracilo (usadas en el tratamiento de trombocitosis primaria, linfoma no Hodgkin, enfermedad de Hodgkin y cáncer de ovario); y triazinas, por ejemplo, dacarbazina (usada en el tratamiento de sarcoma de tejido blando).
Un compuesto, sal o profármaco de esta invención puede usarse también junto con otros agentes quimioterapéuticos antimetabolito tales como, sin limitación, análogos de ácido fólico, por ejemplo metotrexato (usado en el tratamiento de leucemia linfocítica aguda, coriocarcinoma, micosis fungoide, cáncer de mama, cáncer de cabeza y cuello y sarcoma osteogénico) y pteropterina; y los análogos de purina tales como mercaptopurina y tioguanina que se usan en el tratamiento de leucemias granulocítica aguda, linfocítica aguda y granulocítica crónica.
Se contempla que un compuesto, sal o profármaco de esta invención puede usarse también junto con agentes quimioterapéuticos basados en productos naturales tales como, sin limitación, los acaloides de la vinca, por ejemplo, vinblastina (usada en el tratamiento de cáncer de mama y testicular), vincristina y vindesina; las epipodofilotoxinas, por ejemplo, etopósido y tenipósido, siendo ambos útiles en el tratamiento de cáncer testicular y sarcoma de Kaposi; los agentes quimioterapéuticos, por ejemplo, daunorubicina, doxorubicina, epirubicina, mitomicina (usados para tratar cáncer de estómago, cuello del útero, colon, mama, vejiga y páncreas), dactinomicina, temozolomida, plicamicina, bleomicina (usadas en el tratamiento de cáncer de piel, esófago y tracto genitourinario); y los agentes quimioterapéuticos enzimáticos tales como L-asparaginasa.
Además de lo anterior, un compuesto, sal o profármaco de esta invención podría usarse junto con los complejos de coordinación de platino (cisplatino, etc.); ureas sustituidas tales como hidroxiurea; derivados de metilhidrazina, por ejemplo, procarbazina; supresores adrenocorticales, por ejemplo, mitotano, aminoglutetimida; y hormonas y antagonistas de hormonas tales como los adrenocorticoesteriodes (por ejemplo, prednisona), progestinas (por ejemplo, caproato de hidroxiprogesterona); estrógenos (por ejemplo, dietilstilbesterol); antiestrógenos tales como tamoxifeno; erógenos, por ejemplo, propionato de testosterona; e inhibidores de aromatasa tales como anastrozol.
Finalmente, se contempla también que la combinación de un compuesto de esta invención será eficaz junto con mitoxantrona o paclitaxel para el tratamiento de tumores sólidos, cánceres o leucemias tales como, sin limitación, leucemia mielogenosa aguda (no linfocítica).
Procedimiento Sintético General
Puede emplearse la siguiente metodología general para preparar los compuestos de esta invención: el 2-oxindol apropiadamente sustituido (1 equiv.), el aldehído apropiadamente sustituido (1,2 equiv.) y una base (0,1 equiv.) se mezclan en un disolvente (1-2 ml/mmol de 2-oxindol) y la mezcla se calienta después durante de aproximadamente 2 a aproximadamente 12 horas. Después de enfriar, el precipitado que se forma se filtra, se lava con etanol frío o éter y se seca al vacío dando el producto sólido. Si no se forma precipitado, la mezcla de reacción se concentra y el residuo se tritura con diclorometano/éter, el sólido resultante se recoge por filtración y después se seca. El producto puede purificarse adicionalmente opcionalmente por cromatografía.
La base puede ser una base orgánica o inorgánica. Si se usa una base orgánica, preferiblemente es un base de nitrógeno. Los ejemplos de bases orgánicas de nitrógeno incluyen, aunque sin limitación, diisopropilamina, trimetilamina, trietilamina, anilina, piridina, 1,8-diazabiciclo[5,4,1]undec-7-eno, pirrolidina y piperidina.
Los ejemplos de bases inorgánicas son, sin limitación, amoniaco, hidróxidos de metal alcalino o alcalinotérreo, fosfatos, carbonatos, bicarbonatos, bisulfatos y amidas. Los metales alcalinos incluyen, litio, sodio y potasio mientras que los alcalinotérreos incluyen calcio, magnesio y bario.
En una realización de esta invención actualmente preferida, cuando el disolvente es un disolvente prótico, tal como agua o alcohol, la base es una base inorgánica de metal alcalino o alcalinotérreo, preferiblemente, un hidróxido de metal alcalino o alcalinotérreo.
Estará claro para los especialistas en la técnica, basado en principios generales conocidos de síntesis orgánica y en las descripciones en este documento qué base será la más apropiada para la reacción contemplada.
El disolvente en el que se realiza la reacción puede ser un disolvente prótico o aprótico, preferiblemente es un disolvente prótico. Un "disolvente prótico" es un disolvente que tiene átomo o átomos de hidrógeno unidos covalentemente a átomos de oxígeno o de nitrógeno que hacen a los átomos de hidrógeno sensiblemente ácidos y de esta manera capaces de poder "compartirse" con un soluto mediante enlace con hidrógeno. Los ejemplos de disolventes próticos incluyen, sin limitación, agua y alcoholes.
Un "disolvente aprótico" puede ser polar o no polar pero, en cualquier caso, no contiene hidrógenos ácidos y por lo tanto es capaz de unirse mediante hidrógeno con los solutos. Los ejemplos, sin limitación, de disolventes apróticos no polares, son pentano, hexano, benceno, tolueno, cloruro de metileno y tetracloruro de carbono. Los ejemplos de disolventes apróticos polares son cloroformo, tetrahidrofurano, dimetilsulfóxido y dimetilformamida.
En una realización actualmente preferida de esta invención, el disolvente es un disolvente prótico, preferiblemente agua o un alcohol tal como etanol.
La reacción se realiza a temperaturas mayores que la temperatura ambiente. La temperatura es generalmente de aproximadamente 30ºC a aproximadamente 150ºC, preferiblemente de aproximadamente 80ºC a aproximadamente 100ºC, más preferiblemente de aproximadamente 75ºC a aproximadamente 85ºC, que es aproximadamente el punto de ebullición del etanol. Por "aproximadamente" se entiende que el intervalo de temperatura está preferiblemente en un intervalo de 10 grados centígrados de la temperatura indicada, más preferiblemente en un intervalo de 5 grados centígrados de la temperatura indicada y, aún más preferiblemente, en un intervalo de 2 grados centígrados de la temperatura indicada. De esta manera, por ejemplo, por "aproximadamente 75ºC" se entiende 75ºC \pm 10ºC, preferiblemente 75ºC \pm 5ºC y aún más preferiblemente, 75ºC \pm 2ºC.
Los 2-oxindoles y aldehídos, pueden sintetizarse fácilmente usando técnicas bien conocidas en la técnica química. Los especialistas en la técnica entenderán que están disponibles otras rutas sintéticas para formar los compuestos de la invención y que lo siguiente se ofrece a modo de ejemplo y no como limitación.
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EJEMPLOS
Las siguientes preparaciones y ejemplos se dan para permitir a los especialistas en la técnica entender más claramente y practicar la presente invención. No deben considerarse como que limitan el alcance de la invención, sino simplemente como ilustrativos y representativos de la misma.
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Ejemplos de Síntesis Procedimiento A: Formilación de pirroles
POC_{13} (1,1 equiv.) se añade gota a gota a dimetilformamida (3 equiv.) a -10ºC seguido de la adición del pirrol apropiado disuelto en dimetilformamida. Después de agitar durante dos horas, la mezcla de reacción se diluye con H_{2}O y se basifica a pH 11 con KOH 10 N. El precipitado que se forma se recoge por filtración, se lava con H_{2}O y se seca en un horno de vacío dando el aldehído deseado.
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Procedimiento B: Saponificación de ésteres del ácido pirrolcarboxílico
Una mezcla de un éster del ácido pirrolcarboxílico y KOH (2-4 equiv.) en EtOH se calienta a reflujo hasta que se indica que la reacción se ha completado por cromatografía en capa fina (TLC). La mezcla de reacción enfriada se acidifica a pH 3 con HCl 1 N. El precipitado que se forma se recoge por filtración, se lava con H_{2}O y se seca en un horno de vacío dando el ácido pirrolcarboxílico deseado.
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Procedimiento C: Amidación
A una solución agitada de un ácido pirrolcarboxílico disuelto en dimetilformamida (0,3 M) se le añade 1-etil-3-(3-dimetilamino-propil)carbodiimida (1,2 equiv.), 1-hidroxibenzotriazol (1,2 equiv.), y trietilamina (2 equiv.). Se añade la amina apropiada (1 equiv.) y la reacción se agita hasta que se indica que se ha completado por TLC. Después se añade acetato de etilo a la mezcla de reacción y la solución se lava con NaHCO_{3} saturado y salmuera (con sal extra), se seca sobre MgSO_{4} anhidro y se concentra dando la amida deseada.
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Procedimiento D: Condensación de aldehídos y oxindoles que contienen sustituyentes de ácido carboxílico
Una mezcla del oxindol (1 equivalente), 1 equivalente del aldehído y 1-3 equivalentes de piperidina (o pirrolidina) en etanol (0,4 M) se agita a 90-100ºC hasta que se indica que la reacción se ha completado por TLC. Después, la mezcla se concentra y el residuo se acidifica con HCl 2 N. El precipitado que se forma se lava con H_{2}O y EtOH y después se seca en un horno de vacío dando el producto.
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Procedimiento E: Condensación de aldehídos y oxindoles que no contienen sustituyentes de ácido carboxílico
Una mezcla del oxindol (1 equivalente), 1 equivalente del aldehído y 1-3 equivalentes de piperidina (o pirrolidina) en etanol (0,4 M) se agita a 90-100ºC hasta que se indica que la reacción se ha completado por TLC. La mezcla se enfría a temperatura ambiente y el sólido que se forma se recoge por filtración al vacío, se lava con etanol y se seca dando el producto. Si no se forma un precipitado después de enfriar la mezcla de reacción, la mezcla se concentra y se purifica por cromatografía en columna.
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C. Ejemplos de síntesis de oxindol
Los siguientes ejemplos de la síntesis de oxindoles representativos no deben considerarse limitantes del alcance de esta invención de ninguna manera. Las rutas alternativas para los oxindoles mostradas así como otros oxindoles a usar para preparar los compuestos de esta invención resultarán evidentes para los especialistas en la técnica basándose en las siguientes descripciones. Dichas síntesis y oxindoles están dentro del alcance y espíritu de esta invención.
5-Amino-2-oxindol
5-Nitro-2-oxindol (6,3 g) se hidrogenó en metanol sobre paladio al 10% sobre carbono dando 3,0 g (rendimiento del 60%) del compuesto del título en forma de un sólido blanco.
5-Bromo-2-oxindol
2-Oxindol (1,3 g) en 20 ml de acetonitrilo se enfrió a -10ºC y se añadieron 2,0 g de N-bromosuccinimida lentamente con agitación. La reacción se agitó durante 1 hora a -10ºC y 2 horas a 0ºC. El precipitado se recogió, se lavó con agua y se secó dando 1,9 g (rendimiento del 90%) del compuesto del título.
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4-Metil-2-oxindol
Oxalato de dietilo (30 ml) en 20 ml de éter seco se añadió con agitación a 19 g de etóxido potásico suspendido en 50 ml de éter seco. La mezcla se enfrió en un baño de hielo y se añadieron lentamente 20 ml de 3-nitro-o-xileno en 20 ml de éter seco. La mezcla espesa de color rojo oscuro se calentó a reflujo durante 0,5 h, se concentró hasta un sólido rojo oscuro, y se trató con hidróxido sódico al 10% hasta que se hubo disuelto casi todo el sólido. La mezcla de color rojo oscuro se trató con peróxido de hidrógeno al 30% hasta que el color rojo cambió a amarillo. La mezcla se trató alternativamente con hidróxido sódico al 10% y peróxido de hidrógeno al 30% hasta que el color rojo oscuro ya no estuvo presente. El sólido se retiró por filtración y el filtrado se acidificó con ácido clorhídrico 6 N. El precipitado resultante se recogió por filtración al vacío, se lavó con agua, y se secó al vacío dando 9,8 g (rendimiento del 45%) de ácido 2-metil-6-nitrofenilacético en forma de un sólido blanquecino. El sólido se hidrogenó en metanol sobre paladio al 10% sobre carbono dando 9,04 g del compuesto del título en forma de un sólido blanco.
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7-Bromo-5-cloro-2-oxindol
5-Cloro-2-oxindol (16,8 g) y 19,6 g de N-bromosuccinimida se suspendieron en 140 ml de acetonitrilo y se calentaron a reflujo durante 3 horas. La cromatografía en capa fina (sílice, acetato de etilo) a las 2 horas del reflujo mostró 5-cloro-2-oxindol o N-bromosuccinimida (Rf 0,8), producto (Rf 0,85) y un segundo producto (Rf 0,9) cuyas proporciones no cambiaron después de otra hora de reflujo. La mezcla se enfrió a 10ºC, el precipitado se recogió por filtración al vacío, se lavó con 25 ml de etanol y se aspiró hasta dejarlo seco durante 20 minutos en el embudo dando 14,1 g de producto húmedo (rendimiento del 56%). El sólido se suspendió en 200 ml de etanol desnaturalizado y la suspensión se lavó por agitación y calentamiento a reflujo durante 10 minutos. La mezcla se enfrió en un baño de hielo hasta 10ºC. El producto sólido se recogió por filtración al vacío, se lavó con 25 ml de etanol y se secó al vacío a 40ºC dando 12,7 g (rendimiento del 51%) de 7-bromo-5-cloro-2-oxindol.
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5-Fluoro-2-oxindol
5-Fluoroisatina (8,2 g) se disolvió en 50 ml de hidrazina hidrato y se calentó a reflujo durante 1,0 h. Las mezclas de reacción se vertieron después en agua enfriada con hielo. El precipitado se filtró después, se lavó con agua y se secó en un horno de vacío dando el compuesto del título.
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5-Nitro-2-oxindol
2-Oxindol (6,5 g) se disolvió en 25 ml de ácido sulfúrico concentrado y la mezcla se mantuvo a de -10 a -15ºC mientras 2,1 ml de ácido nítrico fumante se añadían gota a gota. Después de la adición del ácido nítrico la mezcla de reacción se agitó a 0ºC durante 0,5 h y se vertió en agua enfriada con hielo. El precipitado se recogió por filtración, se lavó con agua y cristalizó en ácido acético al 50%. El producto cristalino se filtró después, se lavó con agua y se secó al vacío dando 6,3 g (70%) de 5-nitro-2-oxindol.
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5-Aminosulfonil-2-oxindol
A un matraz de 100 ml cargado con 27 ml de ácido clorosulfónico se le añadieron lentamente 13,3 g de 2-oxindol. La temperatura de reacción se mantuvo por debajo de 30ºC durante la adición. Después de la adición, la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1,5 h, se calentó a 68ºC durante 1 h, se enfrió, y se vertió en agua. El precipitado se lavó con agua y se secó en un horno de vacío dando 11,0 g de 5-clorosulfonil-2-oxindol (rendimiento del 50%) que se usó sin purificación adicional.
5-Clorosulfonil-2-oxindol (2,1 g) se añadió a 10 ml de hidróxido de amonio en 10 ml de etanol y se agitó a temperatura ambiente durante una noche. La mezcla se concentró y el sólido se recogió por filtración al vacío dando 0,4 g (rendimiento del 20%) del compuesto del título en forma de un sólido blanquecino.
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5-Isopropilaminosulfonil-2-oxindol
A un matraz de 100 ml cargado con 27 ml de ácido clorosulfónico se le añadieron lentamente 13,3 g de 2-oxindol. La temperatura de reacción se mantuvo por debajo de 30ºC durante la adición. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1,5 horas, se calentó a 68ºC durante 1 hora, se enfrió, y se vertió en agua. El precipitado que se formó se filtró, se lavó con agua y se secó en un horno de vacío dando 11,0 g (50%) de 5-clorosulfonil-2-oxindol que se usó sin purificación adicional.
Una suspensión de 3 g de 5-clorosulfonil-2-oxindol, 1,15 g de isopropilamina y 1,2 ml de piridina en 50 ml de diclorometano se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas durante las cuales se formó un sólido blanco. El sólido se recogió por filtración al vacío, la suspensión se lavó con etanol caliente, se enfrió, se recogió por filtración al vacío y se secó al vacío a 40ºC durante una noche dando 1,5 g (45%) de 5-isopropilaminosulfonil-2-oxindol.
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^{1}H RMN (360 MHz, DMSO-d6) \delta 10,69 (s, a, 1 H, NH), 7,63 (dd, J = 2 y 8 Hz, 1 H), 7,59 (d, J = 2 Hz, 1 H), 7,32 (d, J = 7 Hz, 1 H, NH-SO_{2}-), 6,93 (d, J = 8 Hz, 1 H), 3,57 (s, 2 H), 3,14-3,23 (m, 1 H, CH-(CH_{3})_{2}), 0,94 (d, J = 7 Hz, 6 H, 2xCH_{3}).
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5-Fenilaminosulfonil-2-oxindol
Una suspensión de 5-clorosulfonil-2-oxindol (1,62 g, 7 mmol), anilina (0,782 ml, 8,4 mmol) y piridina (1 ml) en diclorometano (20 ml) se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas. La mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo (300 ml) y se acidificó con ácido clorhídrico 1 N (16 ml). La capa orgánica se lavó con bicarbonato sódico y salmuera, se secó y se concentró. El residuo se lavó con etanol (3 ml) y después se cromatografió sobre gel de sílice eluyendo con metanol/diclorometano 1:9 dando 5-fenilaminosulfonil-2-oxindol.
^{1}H RMN (360 MHz, DMSO-d6) \delta 10,71 (s, a, 1 H, NH), 10,10 (s, a, 1 H, NH), 7,57-7,61 (m, 2 H), 7,17-7,22 (m, 2 H), 7,06-7,09 (m, 2 H), 6,97-7,0 (m, 1 H), 6,88 (d, J = 8,4 Hz, 1 H), 3,52 (s, 2 H).
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Piridin-3-ilamida del ácido 2-oxo-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfónico
Una solución de 5-clorosufonil-2-oxindol (3 g) y 3-aminopiridina (1,46 g) en piridina (15 ml) se agitó a temperatura ambiente durante una noche y en dicho momento se obtuvo un sólido pardo. El sólido se filtró, se lavó con etanol y se secó al vacío para producir 1,4 g (38%) de piridin-3-ilamida del ácido 2-oxo-2,3-dihidro-1H-indolo-5-sulfónico.
^{1}H RMN (360 MHz, DMSO-d6) \delta 10,74 (s, 1 H, NH), 10,39 (s, 1 H, SO_{2}NH), 8,27-8,28 (d, 1 H), 8,21-8,23 (m, 1 H), 7,59-7,62 (m, 2 H), 7,44-7,68 (m, 1 H), 7,24-7,28 (m, 1 H), 6,69-6,71 (d, 1 H), 3,54 (s, 2 H).
EM m/z (IQPA+) 290,2.
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5-Feniloxindol
5-Bromo-2-oxindol (5 g, 23,5 mmol) se disolvió en 110 ml de tolueno y 110 ml de etanol con agitación y un poco de calor. Se añadió tetraquis(trifenilfosfina)paladio (0) (1,9 g, 1,6 mmol) seguido de 40 ml (80 mmol) de carbonato sódico acuoso 2 M. A esta mezcla se le añadió ácido benceno bórico (3,7 g, 30,6 mmol) y la mezcla se calentó en un baño de aceite a 100ºC durante 12 horas. La reacción se enfrió, se diluyó con acetato de etilo. (500 ml), se lavó con bicarbonato sódico saturado (200 ml), agua (200 ml), HCl 1 N (200 ml) y salmuera (200 ml). La capa orgánica se secó sobre sulfato de magnesio y se concentró dando un sólido pardo. La trituración con diclorometano dio 3,8 g (77%) de 5-fenil-2-oxindol en forma de un sólido tostado.
^{1}H RMN (360 MHz, DMSO-d6) \delta 10,4 (s a, 1 H, NH), 7,57 (dd, J = 1,8 y 7,2 Hz, 1 H), 7,5 a 7,35 (m, 5 H), 7,29 (m, 1 H), 6,89 (d, J = 8,2 Hz, 1 H), 3,51 (s, 2 H, CH_{2}CO).
EM m/z 209 [M^{+}].
De una forma similar, pueden prepararse los siguientes oxindoles:
6-(3,5-Diclorofenil)-1,3-dihidroindol-2-ona
^{1}H RMN (360 MHz, DMSO-d6) \delta 10,46 (a, 1 H, NH), 7,64 (d, J = 1,8 Hz, 2 H), 7,57 (m, 1 H), 7,27 (m, 2 H), 7,05 (d, J = 1,1 Hz, 1 H), 3, 5 (s, 2 H).
EM-EI m/z 277/279 [M] ^{+}.
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6-(4-Butilfenil)-1,3-dihidroindol-2-ona
^{1}H RMN (360 MHz, DMSO-d6) \delta 10,39 (s, 1 H, NH), 7,49 (d, J = 8,0 Hz, 2 H), 7,25 (d, J = 8 Hz, 3 H), 7, 17 (dd, J = 1,5 y 7,8 Hz, 1 H), 6,99 (d, J = 1,5 Hz, 1 H), 3,48 (s, 2 H, CH_{2}CO), 2,60 (t, J = 7,5 Hz, 2 Hz, CH_{2}CH_{3}), 1, 57 (m, 2 H, CH_{2}), 1,32 (m, 2 H, CH_{2}), 0,9 (t, J = 7,5 Hz, 3 H, CH_{3}).
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6-(5-Isopropil-2-metoxifenil)-1,3-dihidroindol-2-ona
^{1}H RMN (360 MHz, DMSO-d6) \delta 10,29 (s a, 1 H, NH), 7,16-7,21 (m, 2 H), 7,08 (d, J = 2,4 Hz, 1 H), 6,97-7,01 (m, 2 H), 6,89 (d, J = 0,8 Hz, 1 H), 3,71 (s, 3 H, OCH_{3}), 3,47 (s, 2 H, CH_{2}CO), 2,86 (m, 1 H, CH(CH_{3})_{2}), 1,19, (d, J = 6,8 Hz, 6 H, CH(CH_{3})_{2}).
EM-EI m/z 281 [M]^{+}.
\vskip1.000000\baselineskip
6-(4-Etilfenil)-1,3-dihidroindol-2-ona
^{1}H RMN (360 MHz, DMSO-d6) \delta 10,39 (s a, 1 H, NH), 7,50 (d, J = 8,2 Hz, 2 H), 7,28 (d, J = 8,2 Hz, 2 H), 7,25 (d, J = 7,5 Hz, 1 H), 7,17 (dd, J = 1,6 y 7,5 Hz, 1 H), 6,99 (d, J = 1,6 Hz, 1 H), 3,48 (s, 2 H, CH_{2}CO), 2,63 (c, J = 7,6 Hz, 2 H, CH_{2}CH_{3}), 1,20 (t, J = 7,6 Hz, 3 H, CH_{2}CH_{3}).
EM-EI m/z 237 [M]^{+}.
\vskip1.000000\baselineskip
6-(3-Isopropilfenil)-1,3-dihidroindol-2-ona
^{1}H RMN (360 MHz, DMSO-d6) \delta 10,37 (s a, 1 H, NH), 7,43 (m, 1 H), 7,35-7,39 (m, 1 H), 7,17-7,27 (m, 3 H), 7,01 (d, J = 1,8 Hz, 1 H), 3, 49 (s, 2 H, CH_{2}CO), 2,95 (m, 1 H, CH(CH_{3})_{2}), 1,24 (d, J = 6,8 Hz, 6 H, CH (CH_{3})_{2}).
EM-EI m/z 251 [M]^{+}.
\vskip1.000000\baselineskip
6-(2,4-Dimetoxifenil)-1,3-dihidroindol-2-ona
^{1}H RMN (360 MHz, DMSO-d6) \delta 10,28 (s a, 1 H, NH), 7,17 (m, 2 H), 6, 93 (dd, J = 1, 6 y 7, 6 Hz, 1 H), 6,86 (d, J = 1, 6 Hz, 1 H), 6,63 (d, J = 2,4 Hz, 1 H), 6,58 (dd, J = 2,4 y 8,5 Hz, 1 H), 3,79 (s, 3 H, OCH_{3}), 3,79 (s, 3 H, OCH_{3}), 3,45 (s, 2 H, CH_{2}CO).
EM-EI m/z 269 [M]^{+}.
\vskip1.000000\baselineskip
6-Piridin-3-il-1,3-dihidroindol-2-ona
^{1}H RMN (360 MHz, DMSO-d6) \delta 10,51 (s, 1 H, NH), 8,81 (d, J = 2,5 Hz, 1 H), 8,55 (dd, J = 1,8 y 5,7 Hz, 1 H), 8 (m, 1 H), 7,45 (dd, J = 5,7 y 9,3 Hz, 1 H), 7,3 (m, 2 H), 7,05 (s, 1 H), 3,51 (s, 2 H, CH_{2}CO).
EM m/z 210 [M]^{+}.
\vskip1.000000\baselineskip
(3-cloro-4-etoxifenil)-amida del ácido 2-oxo-2,3-dihidro-1H-indolo-4-carboxílico
A una solución de 4-carboxi-2-oxindol (200 mg, 1,13 mmol) y 3-cloro-4-metoxifenilamina (178 mg, 1,13 mmol) en dimetilformamida (15 ml) a temperatura ambiente se le añadió hexafluorofosfato de benzotriazol-1-iloxitris(dimetilamino)fosfonio (reactivo BOP, 997 mg, 2,26 mmol) seguido de 4-dimetilaminopiridina (206 mg, 1,69 mmol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 72 horas. La reacción se diluyó después con acetato de etilo (300 ml), se lavó con bicarbonato sódico saturado (100 ml), agua, ácido clorhídrico 2 N (100 ml), agua (3 x 200 ml) y salmuera. Después se secó sobre sulfato de magnesio y se concentró. El residuo se trituró con acetato de etilo dando (3-cloro-4-metoxifenil)-amida del ácido 2-oxo-2,3-dihidro-1H-indolo-4-carboxílico en forma de un sólido rosa.
^{1}H RMN (360 MHz, DMSO-d6) \delta.10,50 (s, a, 1 H, NH), 10,12 (s, a, 1 H, NH), 7,9 (s, J = 2,5 Hz, 1 H), 7,62 (dd, J = 2,5 y 9 Hz, 1 H), 7,38 (d, J = 7,6 Hz, 1 H), 7,32 (t, J = 7,6 Hz, 1 H), 7,13 (d, J = 9 Hz, 1 H), 6,98 (d, J = 7, 6 Hz, 1 H), 3,83 (s, 3 H, OCH_{3}), 3,69 (s, 2 H, CH_{2}).
EM-EI m/z 316 [M]^{+}.
\vskip1.000000\baselineskip
4-Carboxi-2-oxindol
Una solución de trimetilsilildiazometano en hexano (2 M) se añadió gota a gota a una solución de 2,01 g de 2-cloro-3-carboxi-nitrobenceno en 20 ml de metanol a temperatura ambiente hasta que no ocurrió más desprendimiento de gas. Después se añadió ácido acético para inactivar el exceso de trimetilsilildiazometano. La mezcla de reacción se evaporó al vacío y el residuo se secó en un horno durante una noche. El 2-cloro-3-metoxicarbonilnitrobenceno obtenido era suficientemente puro para la siguiente reacción.
Se añadió malonato de dimetilo (6,0 ml) a una suspensión enfriada con hielo de 2,1 g de hidruro sódico en 15 ml de DMSO. La mezcla de reacción se agitó a 100ºC durante 1 hora y después se enfrió a temperatura ambiente. Se añadió 2-cloro-3-metoxicarbonilnitrobenceno (2,15 g) en una porción y la mezcla se calentó a 100ºC durante 1,5 horas. La mezcla de reacción se enfrió después a temperatura ambiente, se vertió en agua enfriada con hielo, se acidificó a pH 5 y se extrajo con acetato de etilo. La capa orgánica se lavó con salmuera, se secó sobre sulfato sódico anhidro y se concentró dando 3,0 g del 2-metoxicarbonil-6-nitrofenil-malonato de dimetilo.
2-Metoxicarbonil-6-nitrofenilmalonato de dimetilo (3,0 g) se calentó a reflujo en 50 ml de ácido clorhídrico 6 N durante una noche. La mezcla se concentró a sequedad, se añadieron 20 ml de etanol y 1,1 g de cloruro de estaño (II) y la mezcla se calentó a reflujo durante 2 horas. La mezcla se filtró a través de Celite, se concentró y se cromatografió sobre gel de sílice usando acetato de etilo:hexano:ácido acético como eluyente dando 0,65 g (37%) de 4-carboxi-2-oxindol en forma de un sólido blanco.
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^{1}H RMN (360 MHz, DMSO-d6) \delta 12,96 (s, a, 1 H, COOH), 10,74 (s, a, 1 H, NH), 7,53 (d, J = 8 Hz, 1 H), 7,39 (t, J = 8 Hz, 1 H), 7,12 (d, J = 8 Hz, 1 H), 3,67 (s, 2 H).
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D. Síntesis de 2-indolinonas sustituidas con pirrol Ejemplo 1
(3-Dietilaminopropil)amida del ácido 5-(5-bromo-2-oxo-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2-isopropil-4-fenil-1H-pi-
rrol-3-carboxílico
Una mezcla de clorhidrato de 2-aminoacetofenona (1' equiv.), isobutirilacetato de etilo (1,2 equiv.) y acetato sódico (2,4 equiv.) en H_{2}O se agitó a 100ºC durante 18 horas y después se enfrió a temperatura ambiente. La capa acuosa se retiró por decantación y el aceite se disolvió en acetato de etilo. Después se lavó con agua y salmuera y después se secó dando (93%) de éster etílico del ácido 2-isopropil-4-fenil-1H-pirrol-3-carboxílico en forma de un aceite pardo rojizo.
^{1}H RMN (300 MHz, DMSO-d6) \delta 11,21 (s, a, 1 H, NH), 7,14-7,27 (m, 5 H), 6,70 (d, J = 2,7 Hz, 1 H), 4,02 (c, J = 7,1 Hz, 2 H, OCH_{2}CH_{3}), 3,65 (m, 1 H, CH(CH_{3})_{2}), 1,22 (d, J = 7,5 Hz, 6 H, CH(CH_{3})_{2}), 1,04 (t, J = 7,1 Hz, 3 H, OCH_{2}CH_{3}).
EM-EI m/z 257 [M^{+}].
El pirrol anterior se formiló usando el procedimiento A dando (41%) de éster etílico del ácido 5-formil-2-isopropil-4-fenil-1H-pirrol-3-carboxílico en forma de un sólido rojizo.
^{1}H RMN (300 MHz; DMSO-d6) \delta 12,35 (s, a, 1 H, NH), 9,14 (s, 1 H, CHO), 7,36 (s, 5 H), 3,96 (c, J = 7,1 Hz, 2 H, OCH_{2}CH_{3}), 3,74 (m, 1 H, CH(CH_{3})_{2}), 1,29 (d, J = 6,9 Hz, 6 H, CH (CH_{3})_{2}), 0,90 (t, J = 7,1 Hz, 3 H, OCH_{2}CH_{3}).
EM-EI m/z 285 [M^{+}].
El éster del ácido pirrolcarboxílico se hidrolizó usando el procedimiento B dando (57%) de ácido 5-formil-2-isopropil-4-fenil-1H-pirrol-3-carboxílico en forma de un sólido beige.
^{1}H RMN (300 MHz, DMSO-d6) \delta 12,28 (s, a, 1 H, COOH), 12,02 (s, a, 1 H, NH), 9, 10 (s, 1 H, CHO), 7,35 (s, 5 H), 3,81 (m, 1 H, CH(CH_{3})_{2}), 1,28 (d, J = 6,9 Hz, 6 H, CH(CH_{3})_{2}.
EM-EI m/z 257 [M^{+}].
5-Bromo-1,3-dihidroindol-2-ona (120 mg, 0,31 mmol) se condensó con ácido 5-formil-2-isopropil-4-fenil-1H-pirrol-3-carboxílico (3-dietilaminopropil)amida (preparado por el procedimiento C) dando 120 mg (71%) del compuesto del título.
^{1}H RMN (300 MHz, DMSO-d6) \delta 14,23 (s, a, 1 H, NH), 11,08 (s, a, 1 H, NH), 7, 38-7,55 (m, 7 H, Ar-H y CONHCH_{2}), 7,30 (s, 1 H, H-vinilo), 7,26 (dd, J = 1,8 y 7,8 Hz, 1 H), 6, 85 (d, J = 8,7 Hz, 1 H), 3, 36 (m, 1 H, CH(CH_{3})_{2}), 3,07 (m, 2 H, CH_{2}), 2, 34 (c, J = 7, 1 Hz, 4 H, N(CH_{2}CH_{3})_{2}), 2,22 (t, J = 6, 9 Hz, 2 H, CH_{2}), 1, 90 (m, 2 H, CH_{2}), 1,31 (d, J = 6, 9 Hz, 6 H, CH(CH_{3})_{2}), 0,86 (t, J = 7,1 Hz, 6 H, N (CH_{2}CH_{3})_{2}).
EM m/z 565,1.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 2
(3-Pirrolidin-1-ilpropil)amida del ácido 5-(5-bromo-2-oxo-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2-isopropil-4-fenil-1H-pi-
rrol-3-carboxílico
Ácido 5-(5-bromo-2-oxo-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2-isopropil-4-fenil-1H-pirrol-3-carboxílico (127 mg,
0,28 mmol) se condensó con 3-pirrolidin-1-il-propilamina (43 mg, 0,336 mmol) dando 140 mg (66%) del compuesto del título.
^{1}H RMN (300 MHz, DMSO-d6) \delta 14,40 (s, a, 1 H, NH), 7,38-7,47 (m, 7 H), 7,23-7,27 (m, 2 H), 6,84 (d, J = 8,1 Hz, 1 H), 3,36 (m, 1 H, CH(CH_{3})_{2}), 3,08 (m, 2 H, CH_{2}), 2,30 (m, 4 H, 2xCH_{2}), 2,20 (t, J = 7,0 Hz, 2 H, CH_{2}), 1,62 (m, 4 H, 2xCH_{2}), 1,42 (t, J = 7,0 Hz, 2 H, CH_{2}), 1,31 (d, J = 7,2 Hz, 6 H, CH(CH_{3})_{2}).
EM-EI m/z 560 y 562 [M^{+}-1 y M^{+}+1].
\global\parskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 3
(2-Dietilaminoetil)amida del ácido 5-(5-bromo-2-oxo-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2-isopropil-4-fenil-1H-pirrol-3-carboxílico
5-Bromo-1,3-dihidroindol-2-ona (57 g. 0,27 mmol) se condensó con (2-dietilaminoetil)amida del ácido 5-formil-2-isopropil-4-fenil-1H-pirrol-3-carboxílico (120 mg) dando 78 mg (53%) del compuesto del título en forma de un sólido amarillo.
^{1}H RMN (300 MHz, DMSO-d6) \delta 14,23 (s, a, 1 H, NH), 11,09 (s, a, 1 H, NH), 7,38-7,51 (m, 6 H), 7,25-7,28 (m, 2 H), 7,19 (t, 1 H, CONHCH_{2}), 6,85 (d, J = 7,8 Hz, 1 H), 3,43 (m, 1 H, CH(CH_{3})_{2}), 3,11 (m, 2 H, CH_{2}), 2,28-2,39 (m, 6 H, N (CH_{2}CH_{3})_{2} y CH_{2}, 1,31 (d, J = 6,9 Hz, CH(CH_{3})_{2}), 0,85 (t, J = 7,0 Hz, 6 H, N(CH_{2}CH_{3})_{2}.
EM-EI m/z 548 y 550 [M^{+} -1 y M^{+}+1].
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 4
[3-(4-Metil-piperazin-1-il)propil]amida del ácido 5-(5-bromo-2-oxo-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2-isopropil-4-fenil-1H-pirrol-3-carboxílico
5-Bromo-1,3-dihidroindol-2-ona (53 mg, 0,25 mmol) se condensó con[3-(4-metilpiperazin-1-il)propil]amida del ácido 5-formil-2-isopropil-4-fenil-1H-pirrol-3-carboxílico (300 mg) dando 65 mg del compuesto del título.
^{1}H RMN (300 MHz, DMSO-d6) \delta 14,22 (s, a, 1 H, NH), 11,08 (s, a, 1 H, NH), 7,23-7,50 (m, 9 H), 6, 85 (d, J = 8:7 Hz, 1 H), 3,37 (m, 1 H, CH(CH_{3})_{2}), 3,05 (m, 2 H, CH_{2}), 2,24 (m, 8 H, 4xCH_{2}), 2,11 (m, 5 H, CH_{2} y CH_{3}), 1,42 (m, 2 H, CH_{2}), 1,31 (d, J = 7,2 Hz, 6 H, CH(CH_{3})_{2}).
EM-EI m/z 589 y 591 [M^{+}-1 y M^{+}+1].
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 5
(2-Pirrolidin-1-iletil)amida del ácido 5-(5-bromo-2-oxo-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2-metil-4-fenil-1H-pirrol-3-carboxílico
5-Bromo-1,3-dihidroindol-2-ona (44 mg, 0,21 mmol) se condensó con (2-pirrolidin-1-iletil)amida del ácido 5-formil-2-metil-4-fenil-1H-pirrol-3-carboxílico (70 mg, preparada de la misma manera que el análogo isopropilo, anterior) dando 0,03 g (27%) del compuesto del título en forma de un sólido amarillo.
^{1}H RMN (300 MHz, DMSO-d6) \delta 13,87 (s, a, 1 H, NH), 11,11 (s, a, 1 H, NH), 7,36-7,51 (m, 6 H), 7,26 (dd, J = 1,8 y 8,1 Hz, 1 H), 7,2 (s, 1 H, H-vinilo), 7,09 (m, 1 H, CONHCH_{2}), 6,83 (d, J = 8,1 1 Hz, 1 H), 3,17 (m, 2 H, NCH_{2}), 2,48 (m, CH_{3}), 2,29-2,35 (m, 6 H, 3xNCH_{2}), 1,59 (m, 4 H, 2xCH_{2}).
EM-EI m/z 518 y 520 [M^{+} -1 y M^{+}+1]. 4H, 2xCH_{2}).
EM-EI m/z 546 [M^{+}].
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 6
(2-Dimetilaminoetil)amida del ácido 5-(5-bromo-2-oxo-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2-metil-4-fenil-1H-pirrol-3-carboxílico
5-Bromo-1,3-dihidroindol-2-ona (46 mg, 0,22 mmol) se condensó con(2-dimetilaminoetil)amida del ácido 5-formil-2-metil-4-fenil-1H-pirrol-3-carboxílico (65 mg) dando 60 mg (55%) del compuesto del título en forma de un sólido amarillo.
^{1}H RMN (360 MHz, DMSO-d6) \delta 13,86 (s, a, 1 H, NH), 11,09 (s, a, 1 H, NH), 7,47-7,49 (m, 2 H), 7,38-7,41 (m, 4 H), 7,26 (dd, J = 2,2 y 8,3 Hz, 1 H), 7,21 (s, 1 H, H-vinilo), 7,04 (m, 1 H, CONHCH_{2}), 6,77 (d, J = 8,3 Hz, 1 H), 3,15 (m, 2 H, NCH_{2}), 2,48 (m, CH_{3}), 2,16 (t, J = 6,8 Hz, 2 H, 3xNCH_{2}), 2,02 (s, 6 H, 2xNCH_{3}).
EM m/z 493 y 494,8 [M^{+} y M^{+}+2].
\newpage
Ejemplo 7
(3-Dietilaminopropil)amida del ácido 5-(5-bromo-2-oxo-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2-metil-4-fenil-1H-pirrol-3-carboxílico
5-bromo-1,3-dihidroindol-2-ona (0,47 g, 2,2 mmol) se condensó con (3-dietilaminopropil)amida del ácido 5-formil-2-metil-4-fenil-1H-pirrol-3-carboxílico (0,75 g) dando 0,11 g (42%) del compuesto del título en forma de un sólido naranja.
^{1}H RMN (300 MHz, DMSO-d6) \delta 13,86 (s, a, 1 H, NH), 7,42-7,46 (m, 3 H), 7,37-7,50 (m, 7 H), 7,24-7,28 (m, 2 H), 6,83 (d, J = 8,1 Hz, 1 H), 3,09 (m, 2 H, NCH_{2}), 2,45 (s, 3 H, CH_{3}), 2, 38 (c, J = 7, 1 Hz, 4 H, 2xNCH_{2}CH_{3}), 2,26 (t, J = 6, 9 Hz, 2 H, NCH_{2}), 1,42 (m, 2 H, NCH_{2}), 0,87 (t, J = 7,1 Hz, 6 H, 2xNCH_{2}CH_{3}).
EM-EI m/z 535,0 y 537 [M^{+} y M^{+}+2].
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Ejemplo 8
(2-Dimetilamino-etil)amida del ácido 5-(5-bromo-2-oxo-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico
Una mezcla de terc-butil 3-oxobutirato y nitrito sódico (1 equiv.) en ácido acético se agitó a temperatura ambiente dando terc-butil-2-hidroximino-3-oxobutirato.
Etil-3-oxobutirato (1 equiv.), polvo de cinc (3,8 equiv.) y el terc-butil-2-hidroximino-3-oxobutirato bruto en ácido acético se agitó a 60ºC durante 1 h. La mezcla de reacción se vertió en H_{2}O y el filtrado se recogió dando (65%) de 2-terc-butiloxicarbonil-3,5-dimetil-4-etoxicarbonilpirrol.
A mezcla de 2-terc-butiloxicarbonil-3,5-dimetil-4-etoxicarbonilpirrol y ortoformiato de trietilo (1,5 equiv.) en ácido trifluoroacético se agitó a 15ºC durante 1 hora. La reacción se concentró y el residuo se purificó dando (64%) de 2,4-dimetil-3-etoxicarbonil-5-formilpirrol en forma de agujas amarillas.
2,4-Dimetil-3-etoxicarbonil-5-formilpirrol se hidrolizó usando el procedimiento B dando (90%) de ácido 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico.
^{1}H RMN (360 MHz, DMSO-d6) \delta 12 (s a, 2 H, NH y CO_{2 H),} 9,58 (s, 1 H, CHO), 2,44 (s, 3 H, CH_{3}), 2,40 (s, 3 H, CH_{3}).
EM m/z 267 [M^{+}].
5-Bromo-1,3-dihidroindol-2-ona (0,17 g, 0,8 mmol) se condensó con (2-dimetilaminoetil)amida del ácido 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (0,2 g, preparada mediante el procedimiento C) usando el procedimiento B dando 0,3 g (83%) del compuesto del título en forma de un sólido amarillo.
^{1}H RMN (360 MHz, DMSO-d6) \delta 13,60 (s, a, 1 H, NH), 10,94 (s, a, 1 H, NH), 8,07 (d, J = 1,8 Hz, 1 H, H-4), 7,75 (s, 1 H, H-vinilo), 7,44 (t, J = 5,2 Hz, 1 H, CONHCH_{2}), 7,24 (dd, J = 1,8 y 8,4 Hz, 1 H, H-6), 6,82 (d, J = 8,4 Hz, 1 H, H-7), 3,26-3,33 (m, 2 H, NCH_{2}), 2,42 (s, 3 H, CH_{3}), 2,41 (s, 3 H, CH_{3}), 2,38 (t, J = 6,7 Hz, 2 H, NCH_{2}), 2,18 (s, 6 H, N(CH_{3})_{2}).
EM-EI m/z 430 y 432 [M^{+}-1 y M^{+}+1].
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Ejemplo 9
(2-Dimetilaminoetil)amida del ácido 2,4-dimetil-5-(2-oxo-6-fenil-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-1H-pirrol-3-carboxílico
6-Fenil-1,3-dihidroindol-2-ona (0,17 g, 0,8 mmol) se condensó con(2-dimetilaminoetil)amida del ácido 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (0,2 g) dando 0,13 g (36%) del compuesto del título en forma de un sólido de color naranja amarillento.
^{1}H RMN (360 MHz, DMSO-d6) \delta 13,59 (s, a, 1 H, NH), 10,93 (, a, 1 H, NH), 7,85 (d, J = 7,92 Hz, 1 H, H-4), 7,63-7,65 (m, 3 H), 7,40-7,47 (m, 3 H), 7,32-7,36 (m, 1 H, Ar-H), 7,30 (dd, J = 1,6 y 7,9 Hz, 1 H, H-5), 7,11 (d, J = 1,6 Hz, 1 H, H-7), 3,28-3,34 (m, 2 H, NCH_{2}), 2,43 (s, 3 H, CH_{3}), 2,41 (s, 3 H, CH_{3}), 2,38 (t, J = 6,8 Hz, 2 H, NCH_{2}), 2,18 (s, 6 H, N (CH_{3})_{2}).
EM-EI m/z 428 [M^{+}].
Ejemplo 10
(2-Dimetilamino-etil)amida del ácido 5-(5-cloro-2-oxo-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,9-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico
5-Cloro-1,3-dihidroindol-2-ona (0,1 g, 0,6 mmol) se condensó con(2-dimetilaminoetil)amida del ácido 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (0,15 g) dando 0,22 g (90%) del compuesto del título en forma de un sólido amarillo.
^{1}H RMN (300 MHz, DMSO-d6) \delta 13,61 (s, a, 1 H, NH), 10,98 (, a, 1 H, NH), 7,96 (d, J = 2, 0 Hz, 1 H, H-4), 7,75 (s, 1 H, H-vinilo), 7,50 (t, J = 5,5 Hz, 1 H, CONHCH_{2}), 7,12 (dd, J = 2,0 y 8,3 Hz, 1 H, H-6), 6,86 (d, J = 8,3 Hz, 1 H, H-7), 3,26-3,31 (m, 2 H, NCH_{2}), 2,42 (s, 3 H, CH_{3}), 2, 40(s, 3 H, CH_{3}), 2,36 (t, J = 6,6 Hz, 2 H, NCH_{2}), 2, 17 (s, 6 H, N(CH_{3})_{2}).
EM-EI m/z 386 [M^{+}].
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Ejemplo 11
(2-Dietilamino-etil)amida del ácido 5-(5-bromo-2-oxo-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico
5-Bromo-1,3-dihidroindol-2-ona (0,17 g, 0,8 mmol) se condensó con (2-dietilaminoetil)amida del ácido 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (0,2 g) dando 0,09 g (26%) del compuesto del título en forma de un sólido amarillo.
^{1}H RMN (360 MHz, DMSO-d6) \delta 13,61 (s, a, 1 H, NH), 10,98 (, a, 1 H, NH), 8,09 (d, J = 1,7 Hz, 1 H, H-4), 7,76 (s, 1 H, H-vinilo), 7,42 (t, J = 5,5 Hz, 1 H, CONHCH_{2}), 7,24 (dd, J = 1,7 y 8,0 Hz, 1 H, H-6), 6,82 (d, J = 8,0 Hz, 1 H, H-7), 3,23-3,32 (m, 2 H, NCH_{2}), 2, 46-2, 55 (m, 6 H, 3xNCH_{2}), 2,43 (s, 3 H, CH_{3}), 2,92 (s, 3 H, CH_{3}), 0,96 (t, J = 7,2 Hz, 6 H, 2xNCH_{2}CH_{3}).
EM-EI m/z 458 y 460 [M^{+}-1 y M^{+}+1].
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Ejemplo 12
(2-Pirrolidin-1-il-etil)amida del ácido 5-(5-bromo-2-oxo-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico
5-Bromo-1,3-dihidroindol-2-ona (0,09 g, 0,4 mmol) se condensó con (2-pirrolidin-1-iletil)amida del ácido 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (0,1 g) dando 0,14 g (81%) del compuesto del título en forma de un sólido de color naranja amarillento.
^{1}H RMN (300 MHz, DMSO-d6) \delta 13,61 (s, a, 1 H, NH), 10,98 (, a, 1 H, NH), 8,09 (d, J = 1,9 Hz, 1 H, H-4), 7,76 (s, 1 H, H-vinilo), 7,53 (t, J = 5,5 Hz, 1 H, CONHCH_{2}), 7,24 (dd, J = 1,9 y 8,5 Hz, 1 H, H-6), 6,81 (d, J = 8,5 Hz, 1 H, H-7), 3,29-3,35 (m, 2 H, NCH_{2}), 2,54 (t, J = 6,9 Hz, 2 H, NCH_{2}), 2,47 (m, bajo DMSO), 2,42 (s, 3 H, CH_{3}), 2,40 (s, 3 H, CH_{3}), 1,66-1,69 (m, 4 H, 2xCH_{2}).
EM-EI m/z 456 y 458 [M^{+}-1 y M^{+}+1].
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Ejemplo 13
(3-Imidazol-1-il-propil)amida del ácido 5-(5-bromo-2-oxo-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-
carboxílico
5-Bromo-1,3-dihidroindol-2-ona (0,09 g, 0,4 mmol) se condensó con (3-imidazol-1-ilpropil)amida del ácido 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (0,1 g) dando 0,1 g (59%) del compuesto del título en forma de un sólido naranja.
^{1}H RMN (300 MHz, DMSO-d6) \delta 13,63 (s, a, 1 H, NH), 10,99 (, a, 1 H, NH), 8,09 (d, J = 2,2 Hz, 1 H, H-9), 7,77 (s, 1 H, H-vinilo), 7,71 (t, J = 5,7 Hz, 1 H, CONHCH_{2}), 7,65 (s, 1 H, Ar-H), 7,25 (dd, J = 2,2 y 8, 4 Hz, 1 H, H-6), 7,20 (s, 1 H, Ar-H), 6, 89 (s, 1 H, Ar-H), 6,81 (d, J = 8,4 Hz, 1 H, H-7), 4,02 (t, J = 6,7 Hz, 2 H, NCH_{2}), 3, 18 (c, J = 6,7 Hz, 2 H, NCH_{2}), 2,43 (s, 3 H, CH_{3}), 2,41 (s, 3 H, CH_{3}), 1,93 (m, 2 H, CH_{2}).
EM-EI m/z 467 y 469 [M^{+}-1 y M^{+}+1].
Ejemplo 14
(2-Dietilaminoetil)amida del ácido 2,4-dimetil-5-(2-oxo-5-fenil-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-1H-pirrol-3-carboxílico
5-Fenil-1,3-dihidroindol-2-ona (80 mg, 0,4 mmol) se condensó con (2-dietilaminoetil)amida del ácido 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (0,1 g) usando el procedimiento B dando 79 mg (46%) del compuesto del título.
^{1}H RMN (300 MHz, DMSO-d6) \delta 13,66 (s, a, 1 H, NH), 10, 95 (, a, 1 H, NH), 8,15 (d, J = 1,2 Hz, 1 H), 7, 81 (s, 1 H, H-vinilo), 7,71 (d, J = 7,5 Hz, 1 H), 7,40-7,47 (m, 4 H), 7,31 (m, 1 H), 6,95 (d, J = 8,1 Hz, 1 H) 3,2-3,31 (m, 2 H, NCH_{2}), 2, 46-2,55 (m, 6 H, 3xNCH_{2}), 2,44 (s, 6 H, 2xCH_{3}), 0,96 (t, J = 7,4 Hz, 6 H, 2xNCH_{2}CH_{3}).
EM-EI m/z 456 [M^{+}].
Ejemplo 15
(2-Pirrolidin-1-iletil)amida del ácido 2,4-dimetil-5-(2-oxo-5-fenil-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-1H-pirrol-3-carboxílico
5-Fenil-1,3-dihidroindol-2-ona (0,04 g, 0,2 mmol) se condensó con (2-pirrolidin-1-iletil)amida del ácido 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (0,04 g) dando el compuesto del título en forma de un sólido de color naranja amarillento.
^{1}H RMN (300 MHz, DMSO-d6) \delta 13,65 (s, a, 1 H, NH), 10,96 (, a, 1 H, NH), 8,15 (d, J = 1,0 Hz, 1 H), 7,80 (s, 1 H, H-vinilo), 7, 71 (d, J = 7. 2 Hz, 2 H), 7,49 (t, J = 6,3 Hz, 1 H, CONHCH_{2}), 7,41-7,96 (m, 3 H), 7,31 (m, 1 H), 6,95 (d, J = 7,8 Hz, 1 H), 4,08 (m, 4 H, 2x NCH_{2}), 3,32 (m, 2 H, NCH_{2}), 2,55 (t, J = 7,1 Hz, 2 H, NCH_{2}), 2,47 (m, bajo DMSO), 2,43 (s, 6 H, 2xCH_{3}), 1,66 (m, 4 H, 2xCH_{2}).
EM-EI m/z 454 [M^{+}].
Ejemplo 16
(3-Imidazol-1-ilpropil)amida del ácido 2,4-dimetil-5-(2-oxo-5-fenil-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-1H-pirrol-3-carboxílico
5-Fenil-1,3-dihidroindol-2-ona (8 mg, 0,04 mmol) se condensó con (3-imidazol-1-ilpropil)amida del ácido 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (10 mg) dando 10 mg (59%) del compuesto del título en forma de un sólido naranja.
^{1}H RMN (300 MHz, DMSO-d6) \delta 13,67 (s, a, 1 H, NH), 10,96 (, a, 1 H, NH), 8,16 (d, J = 1, 2 Hz, 1 H), 7,81 (s, 1 H, H-vinilo), 7,65-7,72 (m, 4 H), 7,44 (m, 3 H), 7,31 (m, 1 H, CONHCH_{2}), 7,21 (s, 1 H, Ar-H), 4,02 (t, J = 6,5 Hz, 2 H, NCH_{2}), 3,19 (c, J = 6,5 Hz, 2 H, CONHCH_{2}), 2,44 (s, 6 H, 2xCH_{3}),1,93 (m, 2 H, CH_{2}CH_{2} CH_{2}).
EM-EI m/z 465 [M^{+}].
Ejemplo 17
(2-Dietilaminoetil)amida del ácido 2,4-dimetil-5-(2-oxo-6-fenil-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-1H-pirrol-3-carboxílico
6-Fenil-1,3-dihidroindol-2-ona (0,08 g, 0,4 mmol) se condensó con (2-dietilaminoetil)amida del ácido 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (0,1 g) dando 65 mg (38%) del compuesto del título en forma de un sólido amarillo.
^{1}H RMN (300 MHz, DMSO-d6) \delta 13,61 (s, a, 1 H, NH), 10,99 (, a, 1 H, NH), 7,86 (d, J = 7,8 Hz, 1 H), 7,62-7,66 (m, 3 H), 7,40-7,47 (m, 3 H), 7,28-7,36 (m, 2 H), 7,10 (d, J = 1,2 Hz, 1 H), 3,26 (m, 2 H, NCH_{2}), 2,46-2,55 (m, 6 H, 3xNCH_{2}), 2,44 (s, 3 H, CH_{3}), 2,41 (s, 3 H, CH_{3}), 0,97 (t, J = 7,2 Hz, 6 H, 2xNCH_{2}CH_{3}).
EM-EI m/z 456 [M^{+}].
Ejemplo 18
(2-Pirrolidin-1-iletil)amida del ácido 2,4-dimetil-5-(2-oxo-6-fenil-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-1H-pirrol-3-carboxílico
6-Fenil-1,3-dihidroindol-2-ona (30 mg, 0,15 mmol) se condensó con(2-pirrolidin-1-iletil)amida del ácido 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (40 mg) dando 5,9 mg (8,5%) del compuesto del título en forma de un sólido de color naranja amarillento.
^{1}H RMN (300 MHz, DMSO-d6) \delta 13,60 (s, a, 1 H, NH), 10,99 (, a, 1 H, NH), 7,86 (d, J = 7,8 Hz, 1 H), 7,63-7,66 (m, 3 H), 7,51 (m, 1 H, CONHCH_{2}), 7,45 (m, 2 H), 7,28-7,36 (m, 2 H), 7,10 (d, J = 1,5 Hz, 1 H), 3,31 (m, 6 H, 3xNCH_{2}), 2,55 (t, J = 6,6 Hz, 2 H, NCH_{2}), 2,43 (s, 3 H, CH_{3}), 2,40 (s, 3 H, CH_{3}), 1,67 (m, 4 H, 2xCH_{2}).
EM-EI m/z 454 [M^{+}].
Ejemplo 19
(3-Imidazol-1-ilpropil)amida del ácido 2,4-dimetil-5-(2-oxo-6-fenil-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-1H-pirrol-3-carboxílico
6-Fenil-1,3-dihidroindol-2-ona (8 mg, 0,04 mmol) se condensó con (3-imidazol-1-ilpropil)amida del ácido 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (10 mg) dando 7,3 mg (43%) del compuesto del título en forma de un sólido naranja.
^{1}H RMN (300 MHz, DMSO-d6) \delta 13,62 (s a, 1 H, NH), 10,99 (, a, 1 H, NH), 7,86 (d, J = 8,2 Hz, 1 H), 7:62-7,70 (m, 5 H), 7,45 (m, 2 H), 7,35 (m, 1 H), 7,30 (dd, J = 1,4 y 8,2 Hz, 1 H), 7,21 (s, 1 H), 7,10 (d, J = 1,4 Hz, 1 H), 6,89 (s, 1 H), 4,02 (t, J = 6, Hz, 2 H, CH_{2}), 3,19 (m, 2 H, NCH_{2} CH_{2}), 2,43 (s, 3 H, CH_{3}), 2,41 (s, 3 H, CH_{3}), 1,93 (t, J = 6,9 Hz, 2 H, NCH_{2}).
EM-EI m/z 465 [M^{+}].
Ejemplo 20
(2-Dietilaminoetil)amida del ácido 5-[6-(3,5-diclorofenil)-2-oxo-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pi-
rrol-3-carboxílico
6-(3,5-Diclorofenil)-1,3-dihidroindol-2-ona (64 mg, 0,23 mmol) se condensó con (2-dietilaminoetil)amida del ácido 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (60 mg) dando 53 mg (44%) del compuesto del título en forma de un sólido pardo claro.
^{1}H RMN (360 MHz, DMSO-d6) \delta 13,62 (s, a, 1 H, NH), 10,99 (s, 1 H, NH), 7,89 (d, J = 7,9 Hz, 1 H, H-4), 7,69-7,71 (m, 3 H), 7,55 (m, 1 H, CONHCH_{2}), 7,37 (m, 2 H), 7,19 (d, J = 1,4 Hz, 1 H, H-7), 3,27 (m, 2 H, NCH_{2}), 2,48-2,58 (m, 6 H, 3xNCH_{2}), 2,45 (s, 3 H, CH_{3}), 2,42 (s, 3 H, CH_{3}), 0,97 (t, J = 6,8 Hz, 6 H, 3xNCH_{2}CH_{3}).
EM m/z 526,9.
Ejemplo 21
(2-Dietilaminoetil)amida del ácido 2,4-dimetil-5-(2-oxo-6-piridin-3-il-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-1H-pirrol-3-
carboxílico
6-Piridin-3-il-1,3-dihidroindol-2-ona (40 mg, 0,19 mmol) se condensó con (2-dietilaminoetil)amida del ácido 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (50 mg) dando 29 mg (33%) del compuesto del título en forma de un sólido naranja claro.
^{1}H RMN (300 MHz, DMSO-d6) \delta 13,62 (s, a, 1 H, NH), 11,05 (s, a, 1 H, NH), 8,86 (s, a, 1 H), 8,53 (d, J = 5,8 Hz, 1 H), 8,04 (m, 1 H), 7,91 (d, J = 8,1 Hz, 1 H), 7,70 (s, 1 H, H-vinilo), 7,40-7,48 (m, 2 H), 7,35 (d, J = 7,5 Hz, 1 H), 7,14 (s, 1 H), 3,26 (m, 2 H, NCH_{2}), 2,48-2,55 (m, 3xNCH_{2}), 2,42 (s, 3 H, CH_{3}), 2,38 (s, 3 H, CH_{3}), 0,96 (t, J = 6,9 Hz, 6 H, 2xNCH_{2}CH_{3}).
EM-EI m/z 457 [M^{+}].
Ejemplo 22
(2-Pirrolidin-1-iletil)amida del ácido 2,4-dimetil-5-(2-oxo-6-piridin-3-il-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-1H-pirrol-3-carboxílico
6-Piridin-3-il-1,3-dihidroindol-2-ona (60 mg, 0,28 mmol) se condensó con (2-pirrolidin-1-iletil)amida del ácido 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (75 mg) dando 90 mg (71%) del compuesto del título en forma de un sólido naranja claro.
^{1}H RMN (300 MHz, DMSO-d6) \delta 13,61 (s, a, 1 H, NH), 11,05 (s, a, 1 H, NH), 8,86 (d, J = 1,5 Hz, 1 H), 8,54 (dd, J = 1, 5 y 4,8 Hz,1 H), 8,05 (m, 1 H), 7,91 (d, J = 7,8 Hz, 1 H), 7,70 (s, 1 H, H-vinilo), 7,44-7,53 (m, 2 H), 7,36 (dd, J = 1,5 y 8,1 Hz, 1 H), 7,15 (d, J = 1,2 Hz, 1 H), 3,33 (m, 2 H, NCH_{2}), 2,47-2,57 (m, 6 H, 3xNCH_{2}), 2,43 (s, 3 H, CH_{3}), 2,41 (s, 3 H, CH_{3}), 1,67 (m, 4 H, 2xCH_{2}).
EM-EI m/z 455 [M^{+}].
Ejemplo 23
(3-Dimetilaminopropil)amida del ácido 2,4-dimetil-5-(2-oxo-6-piridin-3-il-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-1H-pirrol-3-carboxílico
6-Piridin-3-il-1,3-dihidroindol-2-ona (42 mg, 0,2 mmol) se condensó con (3-dimetilaminopropil)amida del ácido 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (50 mg) dando 67 mg (75%) del compuesto del título en forma de un sólido pardo amarillento.
^{1}H RMN (360 MHz, DMSO-d6) \delta 13,61 (s, a, 1 H, NH), 11,00 (s, a, 1 H, NH), 8,86 (s, a, 1 H), 8,54 (s, a, 1 H), 8,04 (m, 1 H), 7,90 (d, J = 8,0 Hz, 1 H), 7,69 (s, 1 H, H-vinilo), 7,63 (m, 1 H), 7,45-7,48 (m, 1 H), 7,35 (dd, J = 1,7 y 8,0 Hz, 1 H), 7,15 (d, J = 1,7 Hz, 1 H), 3,21-3,27 (m, 2 H, NCH_{2}), 2, 43 (s, 3 H, CH_{3}), 2,41 (s, 3 H, CH_{3}), 2,28 (m, 2 H, NCH_{2}), 2,14 (s, 6 H, 2xNCH_{3}), 1,64 (m, 2 H, CH_{2}).
EM-EI m/z 443 [M^{+}].
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Ejemplo 24
(3-Dimetilaminopropil)amida del ácido 2,4-dimetil-5-(2-oxo-5-fenil-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-1H-pirrol-3-carboxílico
5-Fenil-1,3-dihidroindol-2-ona (67 mg, 0,32 mmol) se condensó con (3-dimetilaminopropil)amida del ácido 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (81 mg) dando 40 mg (28%) del compuesto del título en forma de un sólido naranja.
^{1}H RMN (360 MHz, DMSO-d6) \delta 13,66 (s, a, 1 H, NH), 10,92 (s, a, 1 H, NH), 8,14 (s, 1 H), 7,79 (s, 1 H), 7,71 (m, 2 H), 7,62 (m, 1 H), 7,44 (m, 3 H), 7,32 (m, 1 H), 6,95 (m, 1 H), 3,33 (m, 2 H, NCH_{2}), 2,43 (s, 6 H, 2xCH_{3}), 2,27 (m, 2 H, NCH_{2}), 2,13 (s, 6 H, 2xNCH_{3}), 1,63 (m, 2 H, CH_{2}).
EM-EI m/z 442 [M^{+}].
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Ejemplo 25
(3-Dietilaminopropil)amida del ácido 2,4-dimetil-5-(2-oxo-5-fenil-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-1H-pirrol-3-carboxílico
5-Fenil-1,3-dihidroindol-2-ona (1,5 g, 7,16 mmol) se condensó con (3-dietilaminopropil)amida del ácido 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (2 g) dando 1,3 g (40%) del compuesto del título en forma de un sólido de color naranja amarillento.
^{1}H RMN (360 MHz, DMSO-d6) \delta 13,64 (s, 1 H, NH), 10,91 (s, 1 H, NH), 8,14 (d, J = 1, 4 Hz, 1 H, ArH), 7,8 (s, 1 H, ArH), 7,7 (dd, J = 1,2 y 8,5 Hz, 2 H, ArH), 7,6 (t, J = 5,3 Hz, 1 H, CONHCH_{2}), 7,4 (m, 3 H, ArH), 7,3 (t, J = 7,4 Hz, 1 H, ArH), 6,9 (d, J = 8,0 Hz, 1 H, ArH), 3,2 (m, 2 H, CONHCH_{2}), 2,5 (m, 12 H, 3xNCH_{2} y 2xCH_{3}), 1,61 (m, 2 H, CH_{2}CH_{2}CH_{2}), 0,93 (t, J = 6,7 Hz, 6 H, NCH_{2}CH_{3}).
EM-EI m/z 470 [M^{+}].
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Ejemplo 26
(3-Dietilaminopropil)amida del ácido 2,4-dimetil-5-(2-oxo-6-fenil-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-1H-pirrol-3-carboxílico
6-Fenil-1,3-dihidroindol-2-ona (1,5 g, 7,16 mmol) se condensó con (3-dietilaminopropil)amida del ácido 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (2 g) dando 1,9 g (57%) del compuesto del título en forma de un sólido naranja.
^{1}H RMN (360 MHz, DMSO-d6) \delta 13,58 (s, 1 H, NH), 10,94 (s, 1 H, NH), 7,8 (d, J = 7,9 Hz, 1 H, ArH), 7,6 (m, 4 H, ArH), 7,4 (t, J = 7,5 Hz, 2 H, ArH), 7,3 (m, 2 H), 7,1 (d, J = 1,4 Hz, 1 H, ArH), 3,2 (m, 2 H, CONHCH_{2}), 2,5 (m, 12 H, 3xNCH_{2} y 2xCH_{3}), 1,61 (m, 2 H, CH_{2}CH_{2}CH_{2}), 0,93 (t, J = 6,7 Hz, 6 H, NCH_{2}CH_{3}).
EM-EI m/z 470 [M^{+}].
\newpage
Ejemplo 27
(3-Dietilaminopropil)amida del ácido 5-(5-bromo-2-oxo-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico
5-Bromo-1,3-dihidroindol-2-ona (0,5 g, 2,36 mmol) se condensó con (3-dietilaminopropil)amida del ácido 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (0,51 g) dando 0,84 g del compuesto del título en forma de un sólido de color naranja rojizo.
^{1}H RMN (360 MHz, DMSO-d6) \delta 13,61 (s, 1 H, NH), 10,99 (s, 1 H, NH), 8,09 (d, J = 1,8 Hz, 1 H, ArH), 7,7 (m, 4 H), 7,2 (dd, J = 1,8 y 8,3 Hz, 2 H, ArH), 6,8 (d, J = 7,8 Hz, 1 H, ArH), 3,3 (s a, 4 H, 2xNCH_{2}), 3,2 (m, 2 H, CONHCH_{2}), 2,6 (s a, 2 H, NCH_{2} y 2xCH_{3}), 2,4 (s, 6 H, 2xCH_{3}), 1,66 (m, 2 H, CH_{2}CH_{2}CH_{2}), 0,98 (t, J = 7,1 Hz, 6 H, NCH_{2}CH_{3}).
EM-EI m/z 472 y 474 [M^{+}-1 y M^{+}+1].
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Ejemplo 28
(2-Dietilamino-etil)amida del ácido 5-(5-bromo-2-oxo-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-diisopropil-1H-pirrol-3-
carboxílico
5-Bromo-1,3-dihidroindol-2-ona (100 mg, 0,47 mmol) se condensó con (2-dietilaminoetil)amida del ácido 5-formil-2,4-diisopropil-1H-pirrol-3-carboxílico (150 mg) dando 0,15 g (62%) del compuesto del título en forma de un sólido de color naranja amarillento.
^{1}H RMN (300 MHz, DMSO-d6) \delta 13,97 (s, 1 H, NH), 10,95 (s, 1 H, NH), 8,09 (d, J = 1,3 Hz, 1 H, ArH), 7,84 (m, 1 H), 7,79 (s, 1 H), 7,23 (dd, J = 1,3 y 8,1 Hz, 1 H, ArH), 6,8 (d, J = 8,1 Hz, 1 H, ArH), 3,5 (m, 1 H, CH), 3,3 (m, 3 H, CH y NHCH_{2}), 2,5 (m a, 6 H, 3xNCH_{2}), 1,28 (d, J = 6,9 Hz, 6 H, 2xCH_{3}), 1,23 (d, J = 6,6 Hz, 6 H, 2xCH_{3}), 0,96 (m, 6 H, 2xCH_{2}CH_{3}).
EM-EI m/z 514 y 516 [M^{+}-1 y M^{+}+1].
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Ejemplo 29
(3-Dietilaminopropil)amida del ácido 5-(5-bromo-2-oxo-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-diisopropil-1H-pirrol-3-carboxílico
5-Bromo-1,3-dihidroindol-2-ona (90 mg, 0,42 mmol) se condensó con(3-dietilaminopropil)amida del ácido 5-formil-2,4-diisopropil-1H-pirrol-3-carboxílico (140 mg) dando 54 mg (25%) del compuesto del título en forma de un sólido pardo rojizo.
^{1}H RMN (300 MHz, DMSO-d6) \delta 13,98 (s, 1 H, NH), 10,96 (s, 1 H, NH), 8,09 (d, J = 1,7 Hz, 2 H), 7,78 (s, 1 H, H-vinilo), 7,23 (dd, J = 1, y 8,1 Hz, 1 H, ArH), 6,82 (d, J = 8,1 Hz, 1 H, ArH), 3, 5 (m, 1 H, CH), 3,25 (m, 2 H, NHCH_{2}), 3,15 (m, 1 H, CH), 2,7 (s a, 6 H, 3xNCH_{2}), 1,7 (m a, 2 H, CH_{2}CH_{2}CH_{2}), 1,28 (d, J = 6,9 Hz, 6 H, 2xCH_{3}), 1,24 (d, J = 5,9 Hz, 6 H, 2xCH_{3}), 1,06 (m, 6 H, 2xCH_{2}CH_{3}).
EM-EI m/z 528 y 530 [M^{+}-1 y M^{+}+1].
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Ejemplo 30
(3-Pirrolidin-1-il-propil)amida del ácido 5-(5-bromo-2-oxo-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-diisopropil-1H-pirrol-3-carboxílico
5-Bromo-1,3-dihidroindol-2-ona (130 mg, 0,6 mmol) se condensó con (3-pirrolidin-1-ilpropil)amida del ácido 5-formil-2,4-diisopropil-1H-pirrol-3-carboxílico (150 mg, 0,45 mmol) dando 36 mg (15%) del compuesto del título en forma de un sólido de color naranja tostado.
^{1}H RMN (300 MHz, DMSO-d6) \delta 13,98 (s, 1 H, NH), 10,97 (s, 1 H, NH), 8,10 (d, J = 1,6 Hz, 2 H), 7,78 (s, 1 H, H-vinilo), 7,23 (dd, J = 1,6 y 7,6 Hz, 1 H, ArH), 6,82 (d, J = 7,6 Hz, 1 H, ArH), 3,5 (m, 1 H, CH), 3,25 (m, 2 H, NHCH_{2}), 3,15 (m, 1 H, CH), 2,7 (s a, 6 H, 3xNCH_{2}), 1,7 (m a, 6 H, 3xNCH_{2}CH_{2}), 1,28 (d, J = 5,6 Hz, 6 H, 2xCH_{3}), 1,24 (d, J = 5,7 Hz, 6 H, 23CH_{3}).
EM-EI m/z 526 y 528 [M^{+}-1 y M^{+}+1].
Ejemplo 31
(Piridin-4-ilmetil)-amida del ácido 5-(5-bromo-2-oxo-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico
5-Bromo-1,3-dihidroindol-2-ona (170 mg, 0,8 mmol) se condensó con (piridin-4-ilmetil)amida del ácido 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (200 mg) dando 14 mg (4%) del compuesto del título en forma de un sólido amarillo.
^{1}H RMN (300 MHz, DMSO-d6) \delta 13,67 (s, 1 H, NH), 11,01 (s, a, 1 H, NH), 8,51 (dd, J = 1,6 y 4,3 Hz, 2 H), 8,23 (t, J = 6,0 Hz, 1 H, CONHCH_{2}), 8,11 (d, J = 1,9 Hz, 1 H), 7,78 (s, 1 H, H-vinilo), 7,31 (d, J = 6,0 Hz, 2 H), 7,25 (dd, J = 1,9 y 8,1 Hz, 1 H), 6,82 (d, J = 8,1 Hz, 1 H), 4,45 (d, J = 6,0 Hz, 2 H, NCH_{2}), 2,46 (s, 6 H, 2xCH_{3}).
EM-EI m/z 450 y 452 [M^{+}-1 y M^{+}+1].
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Ejemplo 32
(2-Pirrolidin-1-iletil)amida del ácido 5-[6-(4-butilfenil)-2-oxo-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico
5-[6-(4-Butilfenil)]-1,3-dihidroindol-2-ona (50 mg, 0,19 mmol) se condensó con (2-pirrolidin-1-iletil)amida del ácido 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (50 mg) dando 74 mg (76%) del compuesto del título en forma de un sólido naranja.
^{1}H RMN (360 MHz, DMSO-d6) \delta 13,58 (s, 1 H, NH), 10,93 (s, a, 1 H, NH), 7,82 (d, J = 7,9 Hz, 1 H), 7,63 (s, 1 H, H-vinilo), 7,54 (d, J = 7,9 Hz, 2 H), 7,46 (m, 1 H, CONH), 7,26 (m, 3 H), 7,09 (s, 1 H), 3,30 (m, 2 H, CH_{2}), 2,52-2,63 (m, 4 H, 2xCH_{2}), 2,49 (m, 4 H, 2xCH_{2}), 2,43 (s, 3 H, CH_{3}), 2,40 (s, 3 H, CH_{3}), 1,68 (m, 4 H, 2xCH_{2}), 1,58 (m, 2 H, CH_{2}), 1,34 (m, 2 H, CH_{2}), 0,91 (t, J = 7,2 Hz, 3 H, CH_{2}CH_{3}).
EM-EI m/z 510 [M^{+}].
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Ejemplo 33
(2-Pirrolidin-1-iletil)amida del ácido 5-[6-(4-etilfenil)-2-oxo-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico
6-(4-Etilfenil)-1,3-dihidroindol-2-ona (45 mg, 0,19 mmol) se condensó con (2-pirrolidin-1-iletil)amida del ácido 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (50 mg) dando 60 mg (65%) del compuesto del título en forma de un sólido de color naranja amarillento.
^{1}H RMN (300 MHz, DMSO-d6) \delta 13,59 (s, 1 H, NH), 10,96 (s, a, 1 H, NH), 7,83 (d, J = 8,4 Hz, 1 H), 7,64 (s, 1 H, H-vinilo), 7,51-7,56 (m, 3 H), 7,25-7,30 (m, 3 H), 7,08 (d, J = 1 Hz, 1 H), 3,31 (m, 2 H, CH_{2}), 2,63 (m, 2 H, CH_{2}CH_{3}), 2,55 (m, 2 H, CH_{2}), 2,49 (m, 4 H, 2xCH_{2}), 2,42 (s, 3 H, CH_{3}), 2,40 (s, 3 H, CH_{3}), 1,67 (m, 4 H, 2xCH_{2}), 1,20 (t, J = 7,5 Hz, 3 H, CH_{2}CH_{3}).
EM-EI m/z 482 [M^{+}].
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Ejemplo 34
(2-Pirrolidin-1-iletil)amida del ácido 5-[6-(3-isopropilfenil)-2-oxo-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pi-
rrol-3-carboxílico
6-(3-Isopropilfenil)-1,3-dihidroindol-2-ona (48 mg, 0,19 mmol) se condensó con (2-pirrolidin-1-iletil)amida del ácido 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (50 mg) dando 59 mg (63%) del compuesto del título en forma de un sólido naranja.
^{1}H RMN (300 MHz, DMSO-d6) \delta 13,63 (s, 1 H, NH), 10,97 (s, a, 1 H, NH), 7,87 (d, J = 7,8 Hz, 1 H), 7,68 (s, 1 H, H-vinilo), 7,24-7,55 (m, 6 H), 7,13 (s, 1 H), 3,34 (m, 2 H, CH_{2}), 3,30 (m, 1 H, CH(CH_{3})_{2}), 2,60 (m, 2 H, CH_{2}), 2, 50 (m, 4 H, 2xCH_{2}), 2,45 (s, 3 H, CH_{3}), 2, 43 (s, 3 H, CH_{3}), 1, 70 (m, 4 H, 2xCH_{2}), 1,27 (d, J = 6, 9 Hz, 6 H, CH(CH_{3})_{2}).
EM-EI m/z 496 [M^{+}].
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Ejemplo 35
(2-Dietilaminoetil)amida del ácido 5-(5-fluoro-2-oxo-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico
5-Fluoro-1,3-dihidroindol-2-ona (0,54 g, 3,8 mmol) se condensó con (2-dietilaminoetil)amida del ácido 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico dando 0,83 g (55%) del compuesto del título en forma de un sólido de color verde amarillento.
^{1}H RMN (360 MHz, DMSO-d6) \delta 13, 66 (s, 1 H, NH), 10,83 (s, a, 1 H, NH), 7,73 (dd, J = 2,5 y 9,4 Hz, 1 H), 7,69 (s, 1 H, H-vinilo), 7,37 (t, 1 H, CONHCH_{2}CH_{2}), 6,91 (m, 1 H), 6,81-6,85 (m, 1 H), 3,27 (m, 2 H, CH_{2}), 2,51 (m, 6 H, 3xCH_{2}), 2,43 (s, 3 H, CH_{3}), 2,41 (s, 3 H, CH_{3}), 0,96 (t, J = 6,9 Hz, 6 H, N (CH_{2}CH_{3})_{2}).
EM-EI m/z 398 [M^{+}].
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Ejemplo 35 (Síntesis alternativa)
(2-Dietilaminoetil)-amida del ácido 5-[5-fluoro-2-oxo-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-
carboxílico
Hidrazina hidrato (55%, 3000 ml) y 5-fluoroisatina (300 g) se calentaron a 100ºC. Se añadió 5-fluoroisatina adicional (500 g) en porciones (100 g) durante 120 minutos con agitación. La mezcla se calentó a 110ºC y se agitó durante 4 horas. La mezcla se enfrió a temperatura ambiente y los sólidos se recogieron por filtración al vacío dando hidrazida del ácido (2-amino-5-fluoro-fenil)-acético bruta (748 g). La hidrazida se suspendió en agua (700 ml) y el pH de la mezcla se ajustó a < pH 3 con 12 N ácido clorhídrico. La mezcla se agitó durante 12 horas a temperatura ambiente. Los sólidos se recogieron por filtración al vacío y se lavaron dos veces con agua. El producto se secó al vacío dando 5-fluoro-1,3-dihidro-indol-2-ona (600 g, rendimiento del 73%) en forma de un polvo pardo. ^{1}H RMN (dimetilsulfóxido-d_{6}) \delta 3,46 (s, 2 H, CH_{2}), 6,75, 6,95, 7,05 (3 x m, 3 H, aromático), 10,35 (s, 1 H, NH). EM m/z 152 [M+1].
4-Etil éster de 2-terc-butil éster del ácido 3,5-dimetil-1H-pirrol-2,4-dicarboxílico (2600 g) y etanol (7800 ml) se agitaron vigorosamente mientras se añadía lentamente ácido clorhídrico 10 N (3650 ml). La temperatura aumentó de 25ºC a 35ºC y comenzó el desprendimiento de gas. La mezcla se calentó a 54ºC y se agitó con calentamiento adicional durante una hora en cuyo momento la temperatura era de 67ºC. La mezcla se enfrió a 5ºC y 32 l de hielo y agua se añadieron lentamente con agitación. El sólido se recogió por filtración al vacío y se lavó tres veces con agua. El sólido se secó al aire hasta peso constante dando éster etílico del ácido 2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (1418 g, rendimiento del 87%) en forma de un sólido rosáceo. ^{1}H RMN (dimetilsulfóxido-d_{6}) \delta 2,10, 2,35 (2xs, 2x3H, 2xCH_{3}), 4,13 (c, 2 H, CH_{2}), 6,37 (s, 1 H, CH), 10,85 (s, 1 H, NH). EM m/z 167 [M+1].
Dimetilformamida (322 g) y diclorometano (3700 ml) se enfriaron en un baño de hielo a 4ºC y se añadió con agitación oxicloruro de fósforo (684 g). Éster etílico del ácido 2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico sólido (670 g) se añadió lentamente en alícuotas durante 15 minutos. La temperatura máxima alcanzada fue de 18ºC. La mezcla se calentó a reflujo durante una hora, se enfrió a 10ºC en un baño de hielo y se añadieron rápidamente 1,6 l de agua enfriada con hielo con agitación vigorosa. La temperatura aumentó a 15ºC. Se añadió ácido clorhídrico 10 N (1,6 l) con agitación vigorosa. La temperatura aumentó a 22ºC. La mezcla se dejó en reposo durante 30 minutos y se permitió que las fases se separaran. La temperatura alcanzó un máximo de 40ºC. La capa acuosa se ajustó a pH 12-13 con hidróxido potásico 10 N (3,8 l) a una velocidad que permitió que la temperatura alcanzara y permaneciera a 55ºC durante la adición. Una vez completada la adición la mezcla se enfrió a 10ºC y se agitó durante 1 hora. El sólido se recogió por filtración al vacío y se lavó cuatro veces con agua dando éster etílico del ácido 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (778 g, rendimiento del 100%) en forma de un sólido amarillo. ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}) \delta 1,25 (t, 3 H, CH_{3}), 2,44, 2,48 (2xs, 2x3H, 2xCH_{3}), 4,16 (c, 2 H, CH_{2}), 9,59 (s, 1 H, CHO), 12,15 (s a, 1 H, NH). EM m/z 195 [M+1].
Éster etílico del ácido 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (806 g), hidróxido potásico (548 g), agua (2400 ml) y metanol (300 ml) se calentaron a reflujo durante dos horas con agitación y después se enfriaron a 8ºC. La mezcla se extrajo dos veces con diclorometano. La capa acuosa se ajustó a pH 4 con 1000 ml de ácido clorhídrico 10 N manteniendo la temperatura por debajo de 15ºC. Se añadió agua para facilitar la agitación. El sólido se recogió por filtración al vacío, se lavó tres veces con agua y se secó al vacío a 50ºC dando ácido 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (645 g, rendimiento del 93,5%) en forma de un sólido amarillo. RMN (DMSO-d_{6}) \delta 2,40, 2,43 (2xs, 2x3H, 2xCH_{3}), 9,57 (s, 1 H, CHO), 12,07 (s a, 2 H, NH+COOH). EM m/z 168 [M+1].
Ácido 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (1204 g) y 6020 ml de dimetilformamida se agitaron a temperatura ambiente mientras se añadía clorhidrato de 1-(3-dimetil-aminopropil-3-etilcarbodiimida (2071 g), hidroxibenzotriazol (1460 g), trietilamina (2016 ml) y dietiletilendiamina (1215 ml). La mezcla se agitó durante 20 horas a temperatura ambiente. La mezcla se diluyó con 3000 ml de agua, 2000 ml de salmuera y 3000 ml de una solución saturada de bicarbonato sódico y el pH se ajustó por encima de 10 con hidróxido sódico 10 N. La mezcla se extrajo dos veces con 5000 ml cada vez de metanol al 10% en diclorometano y los extractos se combinaron, se secaron sobre sulfato de magnesio anhidro y se evaporaron rotatoriamente a sequedad. La mezcla se diluyó con 1950 ml de tolueno y se evaporó rotatoriamente de nuevo a sequedad. El residuo se trituró con 3:1 de hexano:éter dietílico (4000 ml). Los sólidos se recogieron por filtración al vacío, se lavaron dos veces con 400 ml de acetato de etilo y se secaron al vacío a 34ºC durante 21 horas dando (2-dietilamino-etil)-amida del ácido 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (819 g, rendimiento del 43%) en forma de un sólido pardo claro. ^{1}H RMN (dimetilsulfóxido-d_{6}) \delta 0,96 (t, 6 H, 2xCH_{3}), 2,31, 2,38 (2xs, 2 x CH_{3}), 2, 51 (m, 6 H 3xCH_{2}), 3,28 (m, 2 H, CH_{2}), 7,34 (m, 1 H, amida NH), 9,56 (s, 1 H, CHO), 11,86 (s, 1 H, pirrol NH). EM m/z 266 [M+1].
(2-Dietilaminoetil)-amida del ácido 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (809 g), 5-fluoro-1,3-dihidro-indol-2-ona (438 g), etanol (8000 ml) y pirrolidina (13 ml) se calentaron a 78ºC durante 3 horas. La mezcla se enfrió a temperatura ambiente y los sólidos se recogieron por filtración al vacío y se lavaron con etanol. Los sólidos se agitaron con etanol (5900 ml) a 72ºC durante 30 minutos. La mezcla se enfrió a temperatura ambiente. Los sólidos se recogieron por filtración al vacío, se lavaron con etanol y se secaron al vacío a 54ºC durante 130 horas dando (2-dietilamino-etil)-amida del ácido 5-[5-fluoro-2-oxo-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (1013 g, rendimiento del 88%) en forma de un sólido naranja. ^{1}H RMN (dimetilsulfóxido-d_{6}) \delta 0,98 (t, 6 H, 2xCH_{3}), 2,43, 2,44 (2xs, 6 H, 2xCH_{3}), 2,50 (m, 6 H, 3xCH_{2}), 3,28 (c, 2 H, CH_{2}), 6,84, 6,92, 7,42, 7,71, 7,50 (5xm, 5 H, aromático, vinilo, CONH), 10,88 (s, 1 H, CONH), 13,68 (s, 1 H, pirrol NH). EM m/z 397 [M-1].
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Ejemplo 36
Ácido 3-[4-(2-dietilaminoetilcarbamoil)-3,5-dimetil-1H-pirrol-2-ilmetilen]-2-oxo-2,3-dihidro-1H-indolo-6-carboxílico
Ácido 2-oxo-2,3-dihidro-1H-indolo-6-carboxílico (80 mg, 0,45 mmol) se condensó con (2-dietilaminoetil)amida del ácido 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico dando 210 mg (92%) del compuesto del título en forma de un sólido de color naranja amarillento.
^{1}H RMN (360 MHz, DMSO-d6) \delta 13,6 (s, 1 H, NH), 7,76 (d, J = 8,0 Hz, 1 H), 7,66 (s, 1 H, H-vinilo), 7,57 (dd, J = 1,5 8,0 Hz, 1 H), 7, 90-7, 42 (m, 2 H), 3,28 (m, 2 H, CH_{2}), 2,88 (m, H-piperidina), 2,54 (m, 6 H, 3xCH_{2}), 2,44 (s, 3 H, CH_{3}), 2,40 (s, 3 H, CH_{3}), 1,56 (m, H-piperidina), 0,97 (t, J = 6,98 Hz, 6 H, N (CHZCH_{3})_{2}).
EM m/z 424 [M^{+}].
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Ejemplo 37
(2-Pirrolidin-1-iletil)amida del ácido 5-(5-dimetilsulfamoil-2-oxo-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pi-
rrol-3-carboxílico
Dimetilamida del ácido 2-oxo-2,3-dihidro-1H-indolo-5-sulfónico (90 mg, 0,38 mmol) se condensó con (2-pirrolidin-1-iletil)amida del ácido 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (100 mg) dando 100 mg (54%) del compuesto del título en forma de un sólido amarillo.
^{1}H RMN (360 MHz, DMSO-d6) \delta 13,65 (s, 1 H, NH), 11,30 (s, a, 1 H, NH), 8,25 (d, 1 H), 7,92 (s, 1 H, H-vinilo), 7,48-7,53 (m, 2 H), 7,07 (d, J = 8,2 Hz, 1 H), 3,33 (m, 2 H, CH_{2}), 2,61 (s, 6 H, N(CH_{3})_{2}), 2,56 (t, 2 H, CH_{2}), 2,49 (m, 4 H, 2xCH_{2}), 2,45 (s, 3 H, CH_{3}), 2,44 (s, 3 H, CH_{3}), 1,67 (m, 4 H, 2xCH_{2}).
EM-EI m/z 485 [M^{+}].
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Ejemplo 38
(2-Pirrolidin-1-iletil)amida del ácido 5-[5-(3-clorofenilsulfamoil)-2-oxo-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico
(3-Clorofenil)amida del ácido 2-oxo-2,3-dihidro-1H-indolo-5-sulfónico (120 mg, 0,38 mmol) se condensó con (2-pirrolidin-1-iletil)amida del ácido 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (100 mg) dando 150 mg (69%) del compuesto del título en forma de un sólido de color naranja amarillento.
^{1}H RMN (360 MHz, DMSO-d6) \delta 13,55 (s, 1 H, NH), 11,26 (s a, 1 H, NH), 10,30 (s a,1H, NH), 8,26 (d, 1 H), 7,79 (s, 1 H, H-vinilo), 7,51-7,57 (m, 2 H), 7,22 (t, J = 8,1 Hz, 1 H), 7,15 (m, 1 H), 7,07 (m, 1 H), 7,0 (m, 2 H), 3,44 (m, 2 H, CH_{2}), 2,57 (t, J = 7,0 Hz, 2 H, CH_{2}), 2,49 (m, 4 H, 2xCH_{2}), 2,44 (s, 3 H, CH_{3}), 2,43 (s, 3 H, CH_{3}), 1,68 (m, 4 H, 2xCH_{2}).
EM m/z 568 [M^{+}].
Ejemplo 39
(2-Pirrolidin-1-iletil)amida del ácido 2,4-dimetil-5-[2-oxo-5-(piridin-3-ilsulfamoil)-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil]-
1H-pirrol-3-carboxílico
Piridin-3-ilamida del ácido 2-oxo-2,3-dihidro-1H-indolo-5-sulfónico (110 mg, 0,38 mmol) se condensó con(2-pirrolidin-1-iletil)amida del ácido 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (100 mg) dando 150 mg (74%) del compuesto del título en forma de un sólido naranja.
^{1}H RMN (360 MHz, DMSO-d6) \delta 13,58 (s, 1 H, NH), 8,21 (d, J = 2,0 Hz, 2 H), 8,04 (m, 1 H), 7,76 (s, 1 H, H-vinilo), 7,49-7,54 (m, 2 H), 7,41 (m, 1 H), 7,14 (m, 1 H), 6, 94 (d, J = 8,5 Hz, 1 H), 3, 33 (m, 2 H, CH_{2}), 2,56 (t, J = 7,06 Hz, 2 H, CH_{2}), 2,49 (m, 4 H, 2xCH_{2}), 2,43 (s, 6 H, 2xCH_{3}), 1,68 (m, 4 H, 2xCH_{2}).
EM m/z 535 [M^{+}].
Ejemplo 40
3-[3,5-Dimetil-4-(4-metilpiperazina-1-carbonil)-1H-pirrol-2-ilmetilen]-4-(2-hidroxietil)-1,3-dihidroindol-2-ona
4-(2-Hidroxietil)-1,3-dihidroindol-2-ona (71 mg, 0,4 mmol) se condensó con 3,5-dimetil-4-(4-metil-piperazina-1-carbonil)-1H-pirrol-2-carbaldehído dando 90 mg (55%) del compuesto del título en forma de un sólido naranja.
^{1}H RMN (300 MHz, DMSO-d6) \delta 14,25 (s, 1 H, NH), 10,88 (s, 1 H, NH), 7,57 (s, 1 H, H-vinilo), 7,03 (m, 1 H), 6,75-6,82 (m, 2 H), 9. 86 (m, 1 H, OH), 3,70 (m, 2 H, CH_{2}), 3,04 (m, 2 H, CH_{2}), 2,48 (m, 4 H, 2xCH_{2}), 2,28 (s a, 7 H), 2,19 (s, 3 H, CH_{3}), 2,18 (s, 3 H, CH_{3}).
EM m/z (+ve) 4,09,3 [M^{+}].
Ejemplo 41
Fenilamida del ácido 3-[3,5-dimetil-4-(4-metilpiperazina-1-carbonil)-1H-pirrol-2-ilmetilen]-2-oxo-2,3-dihidro-1H-indolo-5-sulfónico
Fenilamida del ácido 2-oxo-2,3,-dihidro-1H-indolo-5-sulfónico (110 mg, 0,4 mmol) se condensó con 3,5-dimetil-4-(4-metilpiperazina-1-carbonil)-1H-pirrol-2-carbaldehído (100 mg) dando 50 mg (24%) del compuesto del título en forma de un sólido amarillo.
^{1}H RMN (300 MHz, DMSO-d6) \delta 13,52(s, 1 H, NH), 11,26 (s, 1 H, NH), 10,08 (s, 1 H, NH), 8,21 (d, J = 1, 6 Hz, 1 H), 7,75 (s, 1 H, H-vinilo), 7,50 (dd, J = 1,6 y 8,3 Hz, 1 H), 7,19 (m, 2 H), 7,10 (m, 2 H), 6,97 (m, 2 H), 2,49 (m, 4 H, 2xCH_{2}), 2,28 (m, 10 H, 2xCH_{3} y 2xCH_{2}), 2,18 (s, 3 H, CH_{3}).
EM-EI m/z 519 [M^{+}].
Ejemplo 42
(2-Dietil-aminoetil)amida del ácido 5-(5-dimetilsulfamoil-2-oxo-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pi-
rrol-3-carboxílico
Dimetilamida del ácido 2-oxo-2,3-dihidro-1H-indolo-5-sulfónico (90 mg, 0,38 mmol) se condensó con (2-dietilaminoetil)amida del ácido 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (100 mg) dando 80 mg (43%) del compuesto del título en forma de un sólido amarillo.
^{1}H RMN (300 MHz, DMSO-d6) \delta 11,30 (s, 1 H, NH), 8,27 (d, J = 1,7 Hz, 1 H), 7,94 (s, 1 H, H-vinilo), 7,49 (dd, J = 1,7 y 8,0 Hz, 1 H), 7,44 (m, 1 H, CONHCH_{2}CH_{2}), 7,07 (d, J = 8,0 Hz, 1 H), 3,26 (m, 2 H, CH_{2}), 2,60 (s, 6 H, N(CH_{3})_{2}), 2, 53 (m, 2 H, CH_{2}), 2,45-2,50 (m, 10 H, 2xCH_{3} y N (CH_{2}CH_{3})_{2}, 0,96 (t, J = 7,2 Hz, 6 H, N(CH_{2}CH_{3})_{2}).
EM-EI m/z 487 [M^{+}].
Ejemplo 43
(2-Dietilaminoetil)amida del ácido 5-[5-(3-clorofenilsulfamoil)-2-oxo-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico
(3-Clorofenil)amida del ácido 2-oxo-2,3-dihidro-1H-indolo-5-sulfónico (120 mg, 3,8 mmol) se condensó con (2-dietilaminoetil)amida del ácido 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (100 mg) dando 80 mg (37%) del compuesto del título en forma de un sólido amarillo.
\newpage
^{1}H RMN (360 MHz, DMSO-d6) \delta 13,55 (s, 1 H, NH), 11,24 (s, 1 H, NH), 10,29 (s, 1 H, NH), 8,25 (d, J = 1,87 Hz, 1 H), 7,79 (s, 1 H, H-vinilo), 7,52 (dd, J = 1,87 y 8,3 Hz, 1 H), 7,42 (m, 1 H, CONHCH_{2}CH_{2}), 7,22 (t, J = 8,02 Hz, 1 H), 7,15 (t, J = 2 Hz, 1 H), 7,08 (m, 1 H), 7,0 (m, 2 H), 3,27 (m, 2 H, CH_{2}), 2,48-2,57 (m, 6 H, 3xCH_{2}), 2,45 (s, 3 H, CH_{3}), 2,44 (s, 3 H, CH_{3}), 0,97 (t, J = 7,0 Hz, 6 H, N(CH_{2}CH_{3})_{2}).
EM m/z 570,1 [M^{+}].
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 44
Éster etílico del ácido {[4-metil-5-(4-metil-5-metilsulfamoil-2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-1H-pirrol-3-carbonil]-amino}-acético
Éster etílico del ácido 4-metil-1H-pirrol-3-carboxílico (ref. biblio. D.O. Cheng, T. L. Bowman y E. LeGoff; J. Heterocyclic Chem.; 1976; 13; 1145-1147) se formiló usando el procedimiento A, se hidrolizó usando el procedimiento B seguido de amidación (procedimiento C) dando éster etílico del ácido [(5-formil-4-metil-1H-pirrol-3-carbonil)-amino]-acético.
4-Metil-5-metilaminosulfonil-2-oxindol (50 mg, 0,21 mmol) se condensó con éster etílico del ácido [(5-formil-4-metil-1H-pirrol-3-carbonil)-amino)-acético (100 mg, 0,42 mmol) y piperidina (0,1 ml) en etanol (2 ml) dando 50 mg (52%) del compuesto del título.
^{1}H RMN (360 MHz, DMSO-d6) \delta 13,59 (s, 1 H, NH), 11,29 (v.br. s, 1 H, NH-CO), 8,33 (t, J = 5,8 Hz, 1 H, CONHCH_{2}), 7, 83 (d, J = 3,11 Hz, 1 H), 7,80 (s, 1 H, H-vinilo), 7,71 (d, J = 8,5 Hz, 1 H), 7,34 (m a, 1 H, NHCH_{3}), 6,89 (d, J = 8,5 Hz, 1 H), 4,11 ( q, J = 7,1 Hz, 2 H, OCH_{2}CH_{3}), 3,92 ( d, J = 5, 8 Hz, 2 H, GlyCH_{2}), 2, 86 (s, 3 H, CH_{3}), 2, 48 (s, 3 H, CH_{3}), 2,42 (d, J = 4,71 Hz, 3 H, HNCH_{3}), 1,20 (t, J = 7,1 Hz, 3 H, OCH_{2}CH_{3})
EM-EI m/z 460 [M^{+}].
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 45
Éster etílico del ácido {[4-metil-5-(5-metilsulfamoil-2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-1H-pirrol-3-carbonil]-
amino}-acético
Una mezcla de 5-metilaminosulfonil-2-oxindol (0,06 g, 0,22 mmol), éster etílico del ácido [(5-formil-4-metil-1H-pirrol-3-carbonil)-amino]-acético (0,075 g, 0,27 mmol) y piperidina (2 gotas) en etanol (5 ml) se calentó en un tubo cerrado herméticamente a 90ºC durante 12 h. Después de enfriar, el precipitado se recogió por filtración al vacío, se lavó con etanol, se trituró con diclorometano/éter y se secó dando 0,035 g (36%) del compuesto del título en forma de un sólido de color pardo amarillento.
^{1}H RMN (360 MHz, DMSO-d6) \delta 13,6 (s, 1 H, NH), 11 (s a, 1 H, NH-CO), 8,30 (t, J = 5,7 Hz, 1 H, CONRCH_{2}), 8,25 (d, J = 1,2 Hz, 1 H), 7.88 (s, 1 H, H-vinilo), 7, 89 (d, J = 3,3 Hz, 1 H), 7,57 (dd, J = 1,9 y 8,5 Hz, 1 H), 7,14 (m a, 1 H, NHCH_{3}), 7,04 (d, J = 8,5 Hz, 1 H), 4,11 (c, J = 6,7 Hz, 2 H, OCH_{2}CH_{3}), 3,92 (d, J = 5,7 Hz, 2 H, GlyCH_{2}), 2,55 (s, 3 H, CH_{3}), 2, 41 (m, 3 H, NCH_{3}), 1,20 ( t, J = 6,7 Hz, 3 H, OCH_{2}CH_{3}).
EM m/z 446 [M^{+}].
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 46
Ácido ([4-metil-5-(5-metilsulfamoil-2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-1H-pirrol-3-carbonil]-amino}-acético
Una mezcla de éster etílico del ácido [(5-formil-4-metil-1H-pirrol-3-carbonil)-amino]-acético (0,142 g, 0,59 mmol) y NaOH 1 N (1,2 ml) en metanol (10 ml) se agitó a temperatura ambiente durante 1 h. La reacción se concentró y el residuo se condensó con 5-metilaminosulfonil-2-oxindol (0,13 g, 0,48 mmol) y piperidina (0,12 ml) en etanol (12 ml) dando 0,11 g (52%) del compuesto del título.
^{1}H RMN (300 MHz, DMSO-d6) \delta 13,98 (s a, 1 H, NH), 8,17 (s, 1 H), 7,80 (s, 1 H), 7,75 (d, J = 3,1 Hz, 1 H), 7,51 ( dd, J = 2 y 8,2 Hz, 1 H), 7,21 (m sobre s a, 2 H), 6,97 (d, J = 8,1 Hz, 1 H), 3,41 (d, J = 4,2 Hz, 2 H, CH_{2}NH), 2,54 (s, 3 H, pirrol-CH_{3}), 2,39 (s, 3 H, ArCH_{3}).
EM m/z 417 [M-1]^{+}.
\newpage
Ejemplo 48
(2-Dietilamino-etil)-amida del ácido 2,9-dimetil-5-(2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-1H-pirrol-3-carboxílico
Una mezcla de 1,3-dihidro-indol-2-ona (266 mg, 2 mmol), (2-dietilamino-etil)-amida del ácido 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (530 mg, 2 mmol) y piperidina (1 gota) en etanol se calentó a 90ºC durante 2 horas. La reacción se enfrió a temperatura ambiente, el precipitado resultante se recogió por filtración al vacío, se lavó con etanol y se secó dando 422 mg (55%) del compuesto del título en forma de un sólido amarillo claro.
^{1}H RMN (400 MHz, DMSO-d6) \delta 13,7 (s, 1 H, NH), 10,9 (s, 1 H, NH), 7,88 (d, J = 7,6 Hz, 1 H), 7,64 (s, 1 H, H-vinilo), 7,91 (t, J = 5,4 Hz, 1 H, NH), 7,13 (dt, J = 1,2 y 7, 6 Hz, 1 H), 6,99 (dt, J = 1,2 y 7,6 Hz, 1 H), 6,88 (d, J = 7,6 Hz, 1 H), 3,28 (m, 2 H), 2,48-2,55 (m, 6 H), 2,44 (s, 3 H, CH_{3}), 2,41 (s, 3 H, CH_{3}), 0,97 (t, J = 7,2 Hz, 6 H, N(CH_{2}CH_{3})_{2}). EM + ve IQPA 381 [M^{+} + 1].
Ejemplo 49
(2-Dietilamino-etil)-amida del ácido 5-(5-cloro-2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico
Una mezcla de 5-cloro-1,3-dihidro-indol-2-ona (335 mg, 2 mmol), (2-dietilamino-etil)-amida del ácido 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (530 mg, 2 mmol) y piperidina (1 gota) en etanol se calentó a 90ºC durante 2 horas. La reacción se enfrió a temperatura ambiente, el precipitado resultante se recogió por filtración al vacío, se lavó con etanol y se secó dando 565 mg (68%) del compuesto del título en forma de un sólido naranja.
^{1}H RMN (400 MHz, DMSO-d6) \delta 13,65 (s, 1 H, NH), 11,0 (s, 1 H, NH), 7,98 (d, J = 2,1 Hz, 1H) 7,77 (s, 1H H-vinilo), 7,44 (t, NH), 7,13 (dd, J = 2,1 y 8,4 Hz, 1H) 6,87 (d, J = 8,4 Hz, 1 H), 3,28 (g, 2 H), 2,98-2,53 (m, 6 H), 2,49 (s, 3 H, CH_{3}), 2,43 (s, 3 H, CH_{3}), 0,97 (t, J = 7,0 Hz, 6 H, N(CH_{2}CH_{3})_{2}) EM + ve IQPA 415 [M^{+} + 1].
Ejemplo 50
(2-Pirrolidin-1-etil)-amida del ácido 2,4-dimetil-5-(2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-1H-pirrol-3-carboxílico
1,3-Dihidro-indol-2-ona se condensó con (2-pirrolidin-1-il-etil)-amida del ácido 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico dando el compuesto del título. EM + ve IQPA 379 [M^{+} + 1].
Ejemplo 51
(2-Pirrolidin-1-il-etil)-amida del ácido 5-(5-fluoro-2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-2,9-dimetil-1H-pirrol-3-
carboxílico
5-Fluoro-1,3-dihidro-indol-2-ona se condensó con (2-pirrolidin-1-il-etil)-amida del ácido 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico dando el compuesto del título. EM + ve IQPA 397 [M^{+} + 1].
Procedimiento de aumento de escala:
Ácido 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (61 g), 5-fluoro-1,3-dihidro-indol-2-ona (79 g), etanol (300 ml) y pirrolidina (32 ml) se calentaron a reflujo durante 4,5 horas. Se añadió ácido acético (24 ml) a la mezcla y se continuó calentando a reflujo durante 30 minutos. La mezcla se enfrió a temperatura ambiente y los sólidos se recogieron por filtración al vacío y se lavaron dos veces con etanol. Los sólidos se agitaron durante 130 minutos en acetona al 40% en agua (400 ml) que contiene ácido clorhídrico 12 N (6,5 ml). Los sólidos se recogieron por filtración al vacío y se lavaron dos veces con acetona al 40% en agua. Los sólidos se secaron al vacío dando ácido 5-[5-fluoro-2-oxo-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (86 g, rendimiento del 79%) en forma de un sólido naranja. ^{1}H RMN (dimetilsulfóxido-d_{6}) \delta 2,48, 2,50 (2xs, 6 H, 2xCH_{3}), 6,80, 6,88, 7,68, 7,72 (4xm, 4 H, aromático y vinilo), 10,88 (s, 1 H, CONH), 12,12 (s, 1 H, COOH), 13,82 (s, 1 H, pirrol NH). EM m/z 299 [M-1].
Ácido 5-[5-fluoro-2-oxo-1,2-dihidro-indol-(32)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (100 g) y dimetilformamida (500 ml) se agitaron y se añadieron hexafluorofosfato de benzotriazol-1-iloxitris(dimetilamino)fosfonio (221 g), 1-(2-aminoetil)pirrolidina (45,6 g) y trietilamina (93 ml). La mezcla se agitó durante 2 horas a temperatura ambiente. El producto sólido se recogió por filtración al vacío y se lavó con etanol. Los sólidos se lavaron en suspensión agitando en etanol (500 ml) durante una hora a 64ºC y se enfriaron a temperatura ambiente. Los sólidos se recogieron por filtración al vacío, se lavaron con etanol, y se secaron al vacío dando (2-pirrolidin-1-il-etil)-amida del ácido 5-[5-fluoro-2-oxo-1,2-dihidro-indol-(32)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (101,5 g, rendimiento 77%). ^{1}H RMN (dimetilsulfóxido-d_{6}) \delta 1,60 (m, 4 H, 2xCH_{2}), 2,40, 2,44 (2xs, 6 H, 2xCH_{3}), 2,50 (m, 4 H, 2xCH_{2}), 2,57, 3,35 (2xm, 4 H, 2XCH_{2}, 7,53, 7,70, 7,73, 7,76 (4xm, 4 H, aromático y vinilo), 10,88 (s, 1 H, CONH), 13,67 (s, 1 H, pirrol NH). EM m/z 396 [M+1].
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Ejemplo 52
(2-Pirrolidin-1-il-etil)-amida del ácido 5-(5-cloro-2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico
5-Cloro-1,3-dihidro-indol-2-ona se condensó con(2-pirrolidin-1-il-etil)-amida del ácido 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico dando el compuesto del título. EM + ve IQPA 413 [M^{+} + 1].
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Ejemplo 53
(2-Dimetilaminoetil)-amida del ácido 2,4-dimetil-5-(2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-1H-pirrol-3-carboxílico
1,3-Dihidro-indol-2-ona se condensó con (2-dimetil-aminoetil)amida del ácido 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico dando el compuesto del título.
^{1}H RMN (400 MHz, DMSO-d6) \delta 13,63 (s, 1 H, NH), 10,90 (s, 1 H, NH), 7,78 (d, J = 7,8 Hz, 1 H), 7,63 (s, 1H H-vinilo), 7,48 (t, 1 H, NH), 7,13 (dt, 1 H), 6,98 (dt, 1 H), 6,88 (d, J =7,7 Hz, 1 H), 3,31 (c, J = 6,6 Hz, 2 H), 2,43 (s, 3 H, CH_{3}), 2,40 (s, 3 H, CH_{3}), 2,38 (t, J = 6,6 Hz, 2 H), 2,19 (s, 6 H, N(CH_{2}CH_{3})_{2}) EM + ve IQPA 353 [M^{+} + 1].
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 98
(2-Etilamino-etil)-amida del ácido 5-[5-fluoro-2-oxo-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico
(2-Etilamino-etil)-amida del ácido 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (99 g), etanol (400 ml), 5-fluoro-2-oxindol (32 g) y pirrolidina (1,5 g) se calentaron a reflujo durante 3 horas con agitación. La mezcla se enfrió a temperatura ambiente y los sólidos se recogieron por filtración al vacío. Los sólidos se agitaron en etanol a 60ºC, se enfriaron a temperatura ambiente y se recogieron por filtración al vacío. El producto se secó al vacío dando (2-etilamino-etil)-amida del ácido 5-[5-fluoro-2-oxo-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (75 g, rendimiento del 95%). ^{1}H RMN (dimetilsulfóxido-d_{6}) \delta 1,03 (t, 3 H, CH_{3}), 2,42, 2,44 (2xs, 6 H, 2xCH_{3}), 2,56 (c, 2 H, CH_{2}), 2,70, 3,30 (2xt, 4 H, 2xCH_{2}), 6,85, 6,92, 7,58, 7,72, 7,76 (5xm, 5 H, aromático, vinilo y CONH), 10,90 (s a, 1 H, CONH), 13,65 (s a, 1 H, pirrol NH). EM m/z 369 [M-1].
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Ejemplo 95
[2-(Piridin-1-il)etil]-amida del ácido 5-[S-fluoro-2-oxo-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-
carboxílico
Ácido 5-[5-fluoro-2-oxo-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (120 mg, 0,4
mmol) se agitó con EDC, HCl (96 mg, 0,5 mmol), 1-hidroxibenzotriazol anhidro (68 mg, 0,5 mmol), y 2-(2-aminoetilpiridina adquiridos en Aldrich en DMF anhidra (3 ml) durante 2-3 días a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se diluyó con NaHCO_{3} 1 M (1,5 ml), después con 8 ml de agua. El producto bruto precipitado se recogió por filtración, se lavó con agua, se secó y se purificó por cristalización o cromatografía dando [2-(piridin-1-il)-etil]amida del ácido 5-[5-fluoro-2-oxo-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 94
[2-(Piridin-1-il)etil]amida del ácido 5-(5-cloro-2-oxo-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-
carboxílico
Procediendo como en el ejemplo anterior pero sustituyendo ácido 5-[5-fluoro-2-oxo-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico con ácido 5-[5-cloro-2-oxo-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (127 mg) proporcionó [2-(piridin-1-il)etil]amida del ácido 5-[5-cloro-2-oxo-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 97
[2-(Piridin-1-il)etil]amida del ácido 5-[5-bromo-2-oxo-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-
carboxílico
Procediendo como se describe en el Ejemplo 95 anterior pero sustituyendo ácido 5-[5-fluoro-2-oxo-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico con ácido 5-[5-bromo-2-oxo-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (145 mg) proporcionó [2-(piridin-1-il)etil]amida del ácido 5-[5-bromo-2-oxo-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico.
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Ejemplo 96
[2-(Piridin-1-il)etil]amida del ácido 5-[2-oxo-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico
Procediendo como se ha descrito en el Ejemplo 95 anterior pero sustituyendo ácido 5-[5-fluoro-2-oxo-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico con ácido 5-[2-oxo-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (113 mg) proporcionó[2-(piridin-1-il)etil]amida del ácido 5-[2-oxo-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico.
Ejemplos 91, 92, 93, y 101
Procediendo como se ha descrito en los Ejemplos 95, 94, 96 y 97 anteriores, pero sustituyendo 2-(2-aminoetil)piridina con 1-(2-aminoetil)pirrolidina, adquirida en Aldrich Chemical Company, Inc. proporcionó los compuestos deseados.
Ejemplos 62-65
Procediendo como se ha descrito en los Ejemplos 95, 94, 96 y 97 anteriores, pero sustituyendo 2-(2-aminoetil)piridina con 1-(2-aminoetil)imidazolin-2-ona (preparada calentando carbonato de dimetilo con bis(2-aminoetil) amina (2 equivalentes) en un matraz sellado a 150ºC durante 30 min, siguiendo el procedimiento descrito en la Patente de Estados Unidos 2613212 (1950), de Rohm y Haas Co. El producto bruto se purificó sobre sílice usando una mezcla eluyente de cloroformo-metanol-amoniaco acuoso 80:25:2) proporcionó los compuestos deseados.
Ejemplos 66-68 y 89
Procediendo como se ha descrito en los Ejemplos 95, 94, 96 y 97 anteriores, pero sustituyendo 2-(2-aminoetil)piridina con éster etílico del ácido 4-(2-aminoetil)piperazina-1-acético (preparado de la siguiente manera: éster etílico del ácido piperazina-1-acético (11,22 g) se trató con yodoacetonitrilo (5,0 ml) en presencia de carbonato potásico (6,9 g) en acetato de etilo (260 ml) a 0ºC. Una vez completada la adición de yodoacetonitrilo (45 min), la mezcla de reacción se agitó posteriormente a temperatura ambiente durante 11 horas. La mezcla de reacción se filtró y los filtrados se evaporaron. El residuo se hidrogenó en presencia de boruro de cobalto (preparado a partir de CoCl_{2} y borohidruro sódico) a temperatura ambiente a 0,34 MPa (50 psi) durante 2 días en etanol. La filtración, evaporación y purificación cromatográfica usando una mezcla eluyente de cloroformo-metanol-amoniaco acuoso 80:25:2 proporcionaron la amina deseada (3,306 g) en forma de un aceite amarillo pálido) que proporcionó los compuestos deseados.
Ejemplo 69-72
Procediendo como se ha descrito en los Ejemplos 95, 94, 96 y 97 anteriores, pero sustituyendo 2-(2-aminoetil)piridina con 1-(3-aminopropil)-azepin-2-ona (preparada de acuerdo con el procedimiento de Kraft A.: J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 6, 1999, 705-14, excepto que la hidrólisis de DBU se realizó a 145ºC puro en presencia de hidróxido de litio (1 h, 5 ml de DBU, 2 ml de agua, 420 mg de hidróxido de litio hidrato). La purificación del producto bruto sobre sílice usando una mezcla eluyente de cloroformo-metanol-amoniaco acuoso 80:40:4 proporcionó 1-(3-aminopropil)-azepin-2-ona (4,973 g, rendimiento del 87%)) que proporcionó los compuestos deseados.
Ejemplos 54-56 y 73
Procediendo como se ha descrito en los Ejemplos 95, 94, 96 y 97 anteriores, pero sustituyendo 2-(2-aminoetil)piridina con N-acetil etilendiamina, (preparada calentando una mezcla de acetato de etilo con etilendiamina (1,5 equivalentes) a 160ºC durante 1 h en un recipiente sellado. La destilación al vacío proporcionó el producto deseado con un rendimiento del 56%. N-acetiletilendiamina también está disponible en Aldrich) que proporcionó los compuestos deseados.
Ejemplos 57-60
Procediendo como se ha descrito en los Ejemplos 95, 94, 96 y 97 anteriores, pero sustituyendo 2-(2-aminoetil)piridina con 1-(3-aminopropil)-tetrahidro-pirimidin-2-ona (preparada de la misma manera que la 1-(3-aminopropil)-azepin-2-ona de acuerdo con el procedimiento en Kraft A.: J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 6, 1999, 705-14: Brevemente, 1,3,4,6,7,8-hexahidro-2H-pirimido [1,2-a]pirimidina (4,939 g), hidróxido de litio hidrato (918 mg) y 2 ml de agua se calentaron sin un disolvente en un recipiente sellado a 145ºC durante 1 h. El producto bruto se purificó sobre una columna de sílice en cloroformo-metanol-amoniaco acuoso 80:40:4 dando amina pura (5,265 g, rendimiento del 94%).
Ejemplos 61, 74-75 y 90
Procediendo como se ha descrito en los Ejemplos 95, 94, 96 y 97 anteriores, pero sustituyendo 2-(2-aminoetil)piridina con 1-(2-aminoetil)-piperazina-2-ona (preparada de la siguiente manera: cloruro de terc-butildifenilsililo puro (25 ml, 97,7 mmol) se añadió gota a gota a una solución de DBU (19,5 ml, 130 mmol) y bis(2-aminoetil)amina (4,32 ml, 40 mmol) en dimetil acetamida anhidra (80 ml) a temperatura ambiente tras enfriar en un baño de agua durante 5 minutos. La mezcla se agitó durante 5 horas. Se añadió éster etílico del ácido bromoacético (6,70 ml, 60 mmol) puro tras enfriar a temperatura ambiente. La reacción se agitó durante 25 minutos, después se evaporó a alto vacío. El residuo se disolvió en metanol (200 ml), se añadieron KHCO_{3} (10 g) y KF (12 g, 200 mmol) y la mezcla se agitó a 60ºC durante 5 horas. Se añadieron 10 g de Na_{2}CO_{3}, se agitó durante 10 minutos, se enfrió y se filtró. Los filtrados se evaporaron. El residuo se extrajo con hexanos (2 veces, 250 ml). El material insoluble en hexano se disolvió en etanol (60 ml), se filtró y se evaporó. El residuo se purificó en una columna de sílice en cloroformo-metanol-amoniaco acuoso 80:40:4 dando amina pura (4,245 g, rendimiento del 74%)) que proporcionó los compuestos deseados.
Ejemplo 77
(2-(4-Metilpiperazin-1-il)-etil]-amida del ácido 5-(5-fluoro-2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pi-
rrol-3-carboxílico
A una mezcla amarilla turbia agitada de ácido 5-[5-fluoro-2-oxo-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (90 mg), DMF (0,8 ml) y TEA (0,084 ml) en un tubo de reacción de 20 ml, se le añadió reactivo BOP (199 mg). La mezcla se aclaró en 5 min. Se añadió 2-(4-Metilpiperazin-1-il)etilamina^{1} (51 mg) a la mezcla transparente. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante una noche. Precipitaron productos sólidos amarillos en el sistema de reacción. La cromatografía en capa fina (metanol al 10% en cloruro de metileno) mostró que todo el material de partida se había convertido en el producto. El sólido se aisló por filtración al vacío y se lavó una vez con etanol (1 ml). El sólido se sonicó en éter dietílico (2 ml) durante 20 min y se recogió por filtración al vacío. Después se secar al vacío se obtuvo (4-metilpiperazin-1-il-etil)-amida del ácido 5-(5-fluoro-2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (79 mg, rendimiento del 62%) se obtuvo.
^{1}H RMN (DMSO-d_{6}) \delta 2,13 (s, 3 H, CH_{3}), 2,40, 2,42 (2xs, 6 H, 2x CH_{3}), 2,41 (m, 2 H, CH_{2}), 2,47 (m, 8 H, 4xCH_{2}), 3,30 (m, 2 H, CH_{2}), 6,82 (dd, J = 4,5, 8,7 Hz, 1 H), 6,91(td, ^{2}J=2,4, ^{3}J=8,8 Hz, 1 H), 7,43 (t, J = 5,6 Hz, 1 H), 7,70 (s, 1 H), 7,75 (dd, J = 2,8, 9,6 Hz, 1H) (aromático y vinilo), 10,88 (s, 1 H, CONH), 13,67 (s, 1 H, NH). CL-EM (m/z) 424,4 (M-1).
Ejemplo 78
(4-Metilpiperazin-1-il-etil)-amida del ácido 5-(5-cloro-2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico
Siguiendo el procedimiento del Ejemplo 77 anterior pero sustituyendo ácido 5-(5-fluoro-2-oxo-1,2-dihidro-indol-(32)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico con ácido 5-[5-cloro-2-oxo-1,2-dihidro-indol-(32)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (95 mg, 0,3 mmol) dio (4-metilpiperazin-1-il-etil)-amida del ácido 5-(5-cloro-2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (76 mg, 58%).
^{1}H RMN (DMSO-d_{6}) \delta 2,13 (s, 3 H, CH_{3}), 2,41, 2,42 (2xs, 6 H, 2x CH_{3}), 2,42 (m, 2 H, CH_{2}), 2,48 (m, 8 H, 4xCH_{2}), 3,30 (m, 2 H, CH_{2}), 6,84 (d, J = 8,0 Hz, 1 H), 7,11 (dd, J = 2,0, 8,0 Hz, 1 H), 7,44 (t, J = 5,6 Hz, 1 H), 7,76 (s, 1 H), 7,97 (d, J = 2,0 Hz, 1H) (aromático y vinilo), 10,98 (s, 1 H, CONH), 13,62 (s, 1 H, NH). CL-EM (m/z) 440,2 (M-1).
Ejemplo 79
(4-Metilpiperazin-1-il-etil)-amida del ácido 5-(5-bromo-2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico
Siguiendo el procedimiento descrito en el Ejemplo 77, pero sustituyendo ácido 5-(5-cloro-2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico con ácido 5-(5-bromo-2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico dio (4-metilpiperazin-1-il-etil)-amida del ácido 5-(5-bromo-2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (39 mg, 54%) se obtuvo a partir de SU011670 (54 mg, 0,15 mmol).
^{1}H RMN (DMSO-d_{6}) \delta 2,14 (s, 3 H, CH_{3}), 2,41, 2,42 (2xs, 6 H, 2x CH_{3}), 2,42 (m, 2 H, CH_{2}), 2,48 (m, 8 H, 4xCH_{2}), 3,31 (m, 2 H, CH_{2}), 6,80 (d, J = 8,0 Hz, 1 H), 7,23 (dd, J = 2,0, 8,0 Hz, 1 H), 7,44 (t, J = 5,6 Hz, 1 H), 7,76 (s, 1 H), 8,09 (d, J = 2,0 Hz, 1H) (aromático y vinilo), 10,99 (s, 1 H, CONH), 13,61 (s, 1 H, NH). CL-EM (m/z) 486,6 (M).
Ejemplo 81
(4-Metilpiperazin-1-il-etil)-amida del ácido 5-(2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico
Siguiendo el procedimiento descrito en el Ejemplo 77 anterior pero sustituyendo ácido 5-(5-fluoro-2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico cid SU014900 con ácido 5-(2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico dio (4-metilpiperazin-1-il-etil)-amida del ácido 5-(2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico, SU014903 (136 mg, 84%) se obtuvo a partir de SU012120 (112,8 mg, 0,4 mmol). ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}) \delta 2,13 (s, 3 H, CH_{3}), 2,39, 2,42 (2xs, 6 H, 2x CH_{3}), 2,42 (m, 2 H, CH_{2}), 2,48 (m, 8 H, 4xCH_{2}), 3,30 (t, 2 H, CH_{2}), 6,86 (d, J = 8,0 Hz, 1 H), 6,96 (t, J = 7,4 Hz, 1 H), 7,10 (t, J = 7,8 Hz, 1 H), 7,41 (t, J = 5,4 Hz, 1 H), 7,62 (s, 1 H), 7,76 (d, J = 7,6 Hz, 1H) (aromático y vinilo), 10,88 (s, 1 H, CONH), 13,61 (s, 1 H, NH). CL-EM (m/z) 406,6 (M-1).
Ejemplo 80
[2-(3,5-Dimetilpiperazin-1-il)etil)amida del ácido 5-[2-oxo-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico
A una mezcla amarilla turbia agitada de ácido 5-[2-oxo-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (112,8 mg, 0,4 mmol), DMF (0,5 ml) y trietilamina (0,111 ml) en un tubo de reacción de 20 ml, se le añadió reactivo BOP (265 mg). La mezcla se hizo transparente en 5 min. Se añadió 2-(2,6-dimetilpiperazin-1-il)etilamina (68,6 mg) (véase, Tapia, L. Alonso-Cires, P. Lopez-Tudanca, R. Mosquera, L. Labeaga, A. Innerarity, A. Orjales, J. Med. Chem., 1999, 42, 2870-2880) a la mezcla transparente. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante una noche. La cromatografía en capa fina (metanol al 10% en cloruro de metileno) mostró que todo el material de partida se había convertido en el producto. La mezcla de reacción se evaporó a sequedad y después se purificó por cromatografía ultrarrápida (CH_{2}Cl_{2}/CH_{3}OH=20/1-15/1) seguido de recristalización dando [2-(3,5-dimetilpiperazin-1-il)etil)amida del ácido 5-[2-oxo-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (83 mg, rendimiento del 50%). ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}) \delta 1,15, 1,16 (2xs, 6 H, 2xCH_{3}), 1,95 (t, J = 11,6 Hz, 2 H, CH_{2}), 2,41, 2,47 (2xs, 6 H, 2xCH_{3}), 2,50 (m, 2 H, CH_{2}), 3,03 (d, J = 10 Hz, 2 H), 3,19 (m, 2 H), 3,30 (m, 2 H, CH_{2}), 6,86 (d, J = 8,0 Hz, 1 H), 6,97 (t, J = 7,2 Hz, 1 H), 7,11 (t, J = 7,8 Hz, 1 H), 7,48 (t, J = 5,6 Hz, 1 H), 7,61 (s, 1 H), 7,75 (d, J = 7,6 Hz, 1H) (aromático y vinilo), 10,88 (s, 1 H, CONH), 13,62 (s, 1 H, NH). CL-EM (m/z) 422,2 (M+1).
Ejemplo 82
[2-(3,5-Dimetil-piperazin-1-il)etil)amida del ácido 5-[5-fluoro-2-oxo-1,2-dihidro -indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico
Siguiendo el procedimiento descrito en el Ejemplo 77 anterior se obtuvo el compuesto deseado (60 mg, 0,2 mmol). ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}) \delta 0,891, 0,907 (2xs, 6 H, 2xCH_{3}), 1,49 (t, J = 10,4 Hz, 2 H), 2,40, 2,42 (2xs, 6 H, 2x CH_{3}), 2,41 (m, 2 H, CH_{2}), 2,74 (m, 4 H), 3,30 (m, 2 H), 6,82 (dd, J = 4,5, 8,7 Hz, 1 H), 6,90 (td, ^{2}J=2,4, ^{3}J=8,4 Hz, 1 H), 7,42 (t, J = 5,6 Hz, 1 H), 7,70 (s, 1 H), 7,74 (dd, J = 4,6, 8,4 Hz, 1H) (aromático y vinilo), 10,88 (s, 1 H, CONH), 13,65 (s, 1 H, NH). CL-EM (m/z) 438,4(M-1).
Ejemplo 83
[2-(3,5-Dimetil-piperazin-1-il)etil)amida del ácido 5-[5-cloro-2-oxo-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico
Siguiendo el procedimiento del Ejemplo 80 anterior se obtuvo el compuesto deseado (31,2 mg, 34%) a partir de ácido 5-[5-cloro-2-oxo-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (63 mg, 0,2 mmol). ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}) \delta 1,15, 1,16 (2xs, 6 H, 2xCH_{3}), 1,95 (t, J = 11,6 Hz, 2 H, CH_{2}), 2,40, 2. 42 (2xs, 6 H, 2xCH_{3}), 2,50 (m, 2 H, CH_{2}), 3,03 (d, J = 11, 2 Hz, 2 H), 3,19 (m, 2 H), 3, 30 (m, 2 H, CH_{2}), 6,85 (d, J = 8,4 Hz, 1 H), 7,11 (dd, J = 2,0, 8,0 Hz, 1 H), 7,52 (t, J = 5,6 Hz, 1 H), 7,76 (s, 1 H), 7. 97 (d, J = 2,0 Hz, 1H) (aromático y vinilo), 10,99 (s, 1 H, CONH), 13,63 (s, 1 H, NH). CL-EM (m/z) 456,2 (M+1).
Ejemplo 84
[2-(3,5-Dimetil-piperazin-1-il)etil)amida del ácido 5-[5-bromo-2-oxo-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico
Siguiendo el procedimiento descrito en el Ejemplo 80 se obtuvo el compuesto deseado (40 mg, 40%) a partir de ácido 5-[5-bromo-2-oxo-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (74 mg, 0,2 mmol). ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}) \delta 1,15, 1,16 (2xs, 6 H, 2xCH_{3}), 1,95 (t, J = 11,6 Hz, 2 H, CH_{2}), 2,40, 2,42 (2xs, 6 H, 23CH_{3}), 2,50 (m, 2 H, CH_{2}), 3,03 (d, J = 10,4 Hz, 2 H), 3,19 (m, 2 H), 3,30 (m, 2 H, CH_{2}), 6,81 (d, J = 8,4 Hz, 1 H), 7,24 (dd, J = 2,0, 8,4 Hz, 1 H), 7,51 (t, J = 5,6 Hz, 1 H), 7,76 (s, 1 H), 8,10 (d, J = 2,0 Hz, 1H) (aromático y vinilo), 10,99 (s, 1 H, CONH), 13,62 (s, 1 H, NH). CL-EM (m/z) 498,4 (M-1).
Ejemplos Biológicos
Los siguientes ensayos se emplean para encontrar aquellos compuestos que demuestran el grado óptimo de la actividad deseada.
A. Procedimientos de Ensayo
Los siguientes ensayos pueden usarse para determinar el nivel de actividad y efecto de los diferentes compuestos de la presente invención sobre una o más de las PK. Pueden diseñarse ensayos similares a lo largo de las mismas líneas para cualquier PK usando técnicas bien conocidas en la técnica.
Varios de los ensayos descritos en este documento se realizan en un formato ELISA (Ensayo Inmunoabsorbente Ligado a Enzimas) (Voller, et al., 1980, "Enzyme-Linked Immunosorbent Assay", Manual of Clinical Immunology, 2ª ed., Rose y Friedman, Am. Soc. of Microbiology, Washington, D.C., pág. 359-371). El procedimiento general es de la siguiente manera: se introduce un compuesto en células que expresan la quinasa de ensayo, de forma natural o recombinantemente, durante un periodo de tiempo seleccionado después del cual, si la quinasa de ensayo es un receptor, se añade un ligando que se sabe que activa el receptor. Las células se lisan y el lisado se transfiere a los pocillos de una placa de ELISA recubierta previamente con un anticuerpo específico que reconoce el sustrato de la reacción de fosforilación enzimática. Los componentes que no son sustrato del lisado celular se lavan y la cantidad de fosforilación sobre el sustrato se detecta con un anticuerpo que reconoce específicamente fosfotirosina comparado con células de control que no se pusieron en contacto con un compuesto de ensayo.
Los protocolos actualmente preferidos para realizar los experimentos de ELISA para PK específicas se proporcionan a continuación. Sin embargo, la adaptación de estos protocolos para determinar la actividad de los compuestos contra otras RTK, así como para CTK y STK, está dentro del alcance del conocimiento de los especialistas en la técnica. Otros ensayos descritos en este documento miden la cantidad de ADN creado en respuesta a la activación de una quinasa de ensayo, que es una medida general de una respuesta proliferativa. El procedimiento general para este ensayo es de la siguiente manera: se introduce un compuesto a las células que expresan la quinasa de ensayo, de forma natural o recombinantemente, durante un periodo de tiempo seleccionado después del cual, si la quinasa de ensayo es un receptor, se añade un ligando que se sabe que activa el receptor. Después de incubación al menos durante una noche, se añade un reactivo de marcado de ADN tal como 5-bromodesoxiuridina (BrdU) o H^{3}-timidina. La cantidad de ADN marcado se detecta con un anticuerpo anti-BrdU o midiendo la radiactividad y se compara con células de control que no se han puesto en contacto con un compuesto de ensayo.
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BIOENSAYO DE GST-FLK-1
Este ensayo analiza la actividad tirosina quinasa de GST-Flk1 sobre poli(glu, tyr) péptidos.
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Materiales y Reactivos:
1.
Placas Corning de 96 pocillos para ELISA (Corning Nº de Catálogo 5805-96).
2.
poli(glu, tyr) 4:1, liofilizado (Sigma Nº de Catálogo P0275).
3.
Preparación de placas de ensayo recubiertas con poli(glu, tyr) (pEY): recubrir 2 ug/pocillo de poli(glu, tyr) (pEY) en 100 ul de PBS, mantener a temperatura ambiente durante 2 horas o a 4ºC durante una noche. Cubrir bien las placas para evitar la evaporación.
4.
Tampón PBS: para 1 litro, mezclar 0,2 g de KH_{2}PO_{4}, 1,15 g de Na_{2}HPO_{4}, 0,2 g de KCl y 8 g de NaCl en aproximadamente 900 ml de dH_{2}O. Cuando todos los reactivos se hayan disuelto, ajustar el pH a 7,2 con HCl. Llevar el volumen total a 1 l con dH_{2}O.
5.
Tampón PBST: a 1 l de Tampón PBS, añadir 1,0 ml de Tween-20.
6.
TBB - Tampón de Bloqueo: para 1 l, mezclar 1,21 g de TRIS, 8,77 g de NaCl, 1 ml de TWEEN-20 en aproximadamente 900 ml de dH_{2}O. Ajustar el pH a 7,2 con HCl. Añadir 10 g de BSA, agitar hasta disolver. Llevar el volumen total a 1 l con dH_{2}O. Filtrar para retirar la materia particulada.
7.
BSA al 1% en PBS: para preparar una solución de trabajo 1x, añadir 10 g de BSA a aproximadamente 990 ml de tampón PBS, agitar hasta disolver. Ajustar el volumen total a 1 l con tampón PBS, filtrar para retirar la materia particulada.
8.
Hepes 50 mM pH 7,5.
9.
GST-Flk1cd purificado a partir de la transformación del baculovirus recombinante sf9 (SUGEN, Inc.).
10.
DMSO al 4% en dH_{2}O.
11.
ATP 10 mM en dH_{2}O.
12.
MnCl_{2} 40 mM
13.
Tampón de Dilución de Quinasa (KDB): mezclar Hepes 10 ml (pH 7,5), 1 ml de NaCl 5 M, 40 \mul de ortovanadato sódico 100 mM y 0,4 ml de BSA al 5% en dH_{2}O con 88,56 ml de dH_{2}O.
14.
placas NUNC de polipropileno con fondo en V de 96 pocillos, Applied Scientific Nº de Catálogo AS-72092.
\newpage
15.
EDTA: mezclar 14,12 g de ácido etilendiaminatetraacético (EDTA) con aproximadamente 70 ml dH_{2}O. Añadir NaOH 10 N hasta que el EDTA se disuelve. Ajustar el pH a 8,0. Ajustar el volumen total a 100 ml con dH_{2}O.
16.
1^{er} Tampón de Dilución de Anticuerpo: mezclar 10 ml de BSA al 5% en tampón PBS con 89,5 ml de TBST.
17.
Anticuerpo monoclonal anti-fosfotirosina conjugado con peroxidasa de rábano rusticano (PY99 HRP, Santa Cruz Biotech).
18.
ácido 2,2'-azinobis(3-etilbenztiazolin-6-sulfónico (ABTS, Moss, Nº Cat. ABST). 19, SDS al 10%.
\vskip1.000000\baselineskip
Procedimiento:
1.
Recubrir las placas Corning de 96 pocillos para ELISA con 2 mg de péptido poliEY en PBS estéril como se ha descrito en la etapa 3 de Materiales y Reactivos.
2.
Retirar el líquido no unido de los pocillos invirtiendo la placa. Lavar una vez con TBST. Poner la placa en una toallita de papel para retirar el exceso de líquido.
3.
Añadir 100 ml de BSA al 1% en PBS a cada pocillo. Incubar, con agitación, durante 1 h. a temperatura ambiente.
4.
Repetir la etapa 2.
5.
Empapar los pocillos con HEPES 50 mM (pH 7,5) (150 ml/pocillo).
6.
Diluir el compuesto de ensayo con dH_{2}O/DMSO al 4% hasta 4 veces la concentración de ensayo final deseada en placas de polipropileno de 96 pocillos.
7.
Añadir 25 \mul de compuesto de ensayo diluido a una placa para ELISA. En los pocillos de control, poner 25 ml de dH_{2}O/DMSO al 4%.
8.
Añadir 25 \mul de MnCl_{2} 40 mM con 4x ATP (2 \muM) a cada pocillo.
9.
Añadir 25 ml EDTA 0,5 M a los pocillos de control negativo.
10.
Diluir GST-Flk1 a 0,005 \mug (5 ng)/pocillo con KDB.
11.
Añadir 50 \mul de enzima diluida a cada pocillo.
12.
Incubar, con agitación, durante 15 minutos a temperatura ambiente.
13.
Detener la reacción añadiendo 50 \mul de EDTA 250 mM (pH 8,0).
14.
Lavar 3X con TBST y poner la placa sobre una toallita de papel para retirar el exceso de líquido.
15.
Añadir 100 \mul por pocillo de conjugado anti-fosfotirosina HRP, dilución 1:5.000 en tampón de dilución de anticuerpo. Incubar, con agitación, durante 90 min. a temperatura ambiente.
16.
Lavar como en la etapa 14.
17.
Añadir 100 \mul de solución de ABTS a temperatura ambiente a cada pocillo.
18.
Incubar, con agitación, durante 10 a 15 minutos. Retirar las burbujas.
19.
Detener la reacción añadiendo 20 \mul de SDS al 10% a cada pocillo.
20.
Leer los resultados en un lector de ELISA Dynatech MR7000 con filtro de ensayo a 410 nM y filtro de referencia a 630 nM.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
BIOENSAYO DE PYK2
Este ensayo se usa para medir la actividad quinasa in vitro de pyk2 de longitud completa marcado con epítope HA (FL-pyk2-HA) en un ensayo ELISA.
\newpage
\global\parskip0.990000\baselineskip
Materiales y reactivos:
1.
placas Corning de 96 pocillos para Elisa.
2.
anticuerpo anti-HA monoclonal 12CA5 (SUGEN, Inc.).
3.
PBS (Solución Salina de Dulbecco Tamponada con Fosfato (Gibco Nº de Catálogo 450-1300EB).
4.
Tampón TBST: para 1 l, mezclar 8,766 g de NaCl, 6,057 g de TRIS y 1 ml de Triton X-100 al 0,1% en aproximadamente 900 ml de dH_{2}O. Ajustar el pH a 7,2, llevar el volumen a 1 l.
5.
Tampón de Bloqueo: para 1 l, mezclar 100 g de BSA al 10%, 12,1 g de TRIS 100 mM, 58,44 g de NaCl 1 M y 10 ml de TWEEN-20 al 1%.
6.
FL.pyk2-HA de lisados celulares de sf9 (SUGEN, Inc.).
7.
DMSO al 4% en MilliQue H_{2}O.
8.
ATP 10 mM en dH_{2}O.
9.
MnCl_{2} 1 M.
10.
MgCl_{2} 1 M.
11.
Ditiotreitol 1 M (DTT).
12.
tampón fosforilación de quinasa 10X: mezclar 5,0 ml de Hepes 1 M (pH 7,5), 0,2 ml de MnCl_{2} 1 M, 1,0 ml de MgCl_{2} 1 M, 1,0 ml de Triton X-100 al 10% en 2,8 ml de dH_{2}O. Justo antes de usar, añadir 0,1 ml de DTT 1 M.
13.
placas NUNC de polipropileno de 96 pocillos de fondo en V.
14.
EDTA 500 mM en dH_{2}O.
15.
tampón de dilución de anticuerpo: para 100 ml, 1 ml de BSA al 5%/PBS y 1 ml de Tween-20 al 10% en 88 ml de TBS.
16.
anti-Ptyr conjugado con HRP PY99), Santa Cruz Biotech Nº Cat. SC-7020.
17.
ABTS, Moss, Nº Cat. ABST-2000.
18.
SDS al 10%.
\vskip1.000000\baselineskip
Procedimiento:
1.
Recubrir placas Corning de 96 pocillos para ELISA con 0,5 mg por pocillo de anticuerpo anti-HA 12CA5 en 100 ml de PBS. Almacenar durante una noche a 4ºC.
2.
Retirar el anticuerpo HA no unido de los pocillos invirtiendo la placa. Lavar la placa con dH_{2}O. Poner la placa en una toallita de papel para retirar el exceso de líquido.
3.
Añadir 150 \mul de Tampón de Bloqueo a cada pocillo. Incubar, con agitación, durante 30 min a temperatura ambiente.
4.
Lavar la placa 4x con TBS-T.
5.
Diluir el lisado en PBS (1,5 \mug lisado/100 ml de PBS).
6.
Añadir 100 \mul de lisado diluido a cada pocillo. Agitar a temperatura ambiente durante 1 h.
7.
Lavar como en la etapa 4.
8.
Añadir 50 \mul de Tampón quinasa 2X a la placa para ELISA que contiene pyk2-HA capturado.
9.
Añadir 25 \mul de compuesto de ensayo 400 \muM en DMSO al 4% a cada pocillo. Para los pocillos de control usar DMSO al 4% únicamente.
10.
Añadir 25 \mul de EDTA 0,5 M a los pocillos de control negativo.
\global\parskip1.000000\baselineskip
11.
Añadir 25 ml de ATP 20 mM a todos los pocillos. Incubar, con agitación, durante 10 minutos.
12.
Detener la reacción añadiendo 25 \mul de EDTA 500 mM (pH 8,0) a todos los pocillos.
13.
Lavar como en la etapa 4.
14.
Añadir 100 \mul de anti-Ptyr conjugado con HRP diluido 1:6000 en Tampón de Dilución de Anticuerpo a cada pocillo. Incubar, con agitación, durante 1 h. a temperatura ambiente.
15.
Lavar la placa 3X con TBST y 1X con PBS.
16.
Añadir 100 \mul de solución de ABST a cada pocillo.
17.
Si fuera necesario, detener el desarrollo de la reacción añadiendo 20 \mul de SDS al 10% a cada pocillo.
18.
Leer la placa en un lector de ELISA con filtro de ensayo a 410 nM y filtro de referencia a 630 nM.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
BIOENSAYO DE FGFR1
Este ensayo se usa para medir la actividad quinasa in vitro de FGF1-R en un ensayo ELISA.
\vskip1.000000\baselineskip
Materiales y Reactivos:
1.
placas Costar de 96 pocillos para Elisa (Corning Nº de Catálogo 3369).
2.
Poli(Glu-Tyr) (Sigma Nº de Catálogo P0275).
3.
PBS (Gibco Nº de Catálogo 450-1300EB).
4.
Solución Tampón de Hepes 50 mM.
5.
Tampón de Bloqueo (BSA al 5%/PBS).
6.
GST-FGFR1 purificado (SUGEN, Inc.).
7.
Tampón de Dilución de Quinasa.
\quad
Mezclar 500 ml de Hepes 1 M (GIBCO), 20 \mul de BSA al 5%/PBS, 10 \mul de ortovanadato sódico 100 mM y 50 \mul de NaCl 5 M.
8.
ATP 10 mM.
9.
mezcla de fosforilación ATP/MnCl_{2}: mezclar 20 ml de ATP, 400 ml de MnCl_{2} 1 M y 9,56 ml de dH_{2}O.
10.
placas NUNC de polipropileno de 96 pocillos de fondo en V (Applied Scientific Nº de Catálogo AS-72092).
11.
EDTA 0,5 M.
12.
TBST al 0,05%
\quad
Añadir 500 ml de TWEEN a 1 litro de TBS.
13.
suero policlonal de conejo anti-fosfotirosina (SUGEN, Inc.).
14.
conjugado de (anticuerpo) de cabra anti-IgG de conejo con peroxidasa (Biosource, Nº de Catálogo ALI0404).
15.
Solución de ABTS.
16.
Solución de ABTS/H_{2}O_{2}.
\vskip1.000000\baselineskip
Procedimiento:
1.
Recubrir placas Costar de 96 pocillos para ELISA con 1 mg por pocillo de Poli(Glu, Tyr) en 100 ml de PBS. Almacenar durante una noche a 4ºC.
2.
Lavar las placas recubiertas una vez con PBS.
3.
Añadir 150 ml de BSA al 5%/PBS Tampón de Bloqueo a cada pocillo. Incubar, con agitación, durante 1 h a temperatura ambiente.
4.
Lavar la placa 2x con PBS, después una vez con Hepes 50 mM. Poner las placas sobre una toallita de papel para retirar el exceso de líquido y las burbujas.
5.
Añadir 25 \mul de compuesto de ensayo 0,4 mM en DMSO al 4% o DMSO al 4% solo (controles) a la placa.
6.
Diluir GST-FGFR1 purificado en Tampón de Dilución de Quinasa (5 ng quinasa/50 ul KDB/pocillo).
7.
Añadir 50 \mul de quinasa diluida a cada pocillo.
8.
Iniciar la reacción de quinasa añadiendo 25 \mul/pocillo de ATP/Mn++ preparado recientemente (0,4 ml de MnCl_{2} 1 M, 40 \mul de ATP 10 mM, 9,56 ml de dH_{2}O), preparado recientemente).
9.
Esta es una reacción de quinasa rápida y debe detenerse con 25 ml de EDTA 0,5 M de una manera similar a la adición de ATP.
10.
Lavar la placa 4x con TBST reciente.
11.
Preparar Tampón de Dilución de Anticuerpo: por cada 50 ml:
\quad
Mezclar 5 ml de BSA al 5%, 250 \mul de leche al 5% y 50 \mul de vanadato sódico 100 mM, llevar al volumen final con TBST al 0,05%.
12.
Añadir 100 ml por pocillo de anti-fosfotirosina (dilución 1:10000 en ADB). Incubar, con agitación durante 1 h. a temperatura ambiente.
13.
Lavar como en la etapa 10.
14.
Añadir 100 ml por pocillo de conjugado de (anticuerpo) de cabra anti-IgG de conejo con peroxidasa Biosource (dilución 1:6000 en ADB). Incubar, con agitación durante 1 h. a temperatura ambiente.
15.
Lavar como en la etapa 10 y después con PBS para retirar las burbujas y el exceso de TWEEN.
16.
Añadir 100 ml de solución de ABTS/H_{2}O_{2} a cada pocillo.
17.
Incubar, con agitación, durante 10 a 20 minutos. Retirar las burbujas.
18.
Leer el ensayo en un lector de ELISA Dynatech MR7000: filtro de ensayo a 410 nM, filtro de referencia a 630 nM.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
BIOENSAYO DE EGFR
Este ensayo se usa para medir la actividad quinasa in vitro de FGF1-R en un ensayo ELISA.
\vskip1.000000\baselineskip
Materiales y Reactivos:
1.
placas Corning de 96 pocillos para Elisa.
2.
anticuerpo anti-EGFR monoclonal SUMO1 (SUGEN, Inc.).
3.
PBS.
4.
Tampón TBST.
5.
Tampón de Bloqueo: para 100 ml, mezclar 5,0 g de leche Carnation Instant Non-fat Milk® con 100 ml de PBS.
6.
lisado celular de A431 (SUGEN, Inc.).
7.
Tampón TBS:
\newpage
8.
TBS + DMSO al 10%: para 1 l, mezclar 1,514 g TRIS, 2,192 g de NaCl y 25 ml de DMSO; llevar a 1 litro de volumen total con dH_{2}O.
9.
ATP (Adenosina-5'-trifosfato, de músculo Equino, Sigma Nº Cat. A-5394), solución 1,0 mM en dH_{2}O. Este reactivo debe prepararse inmediatamente antes de su uso y mantenerse en hielo.
10.
MnCl_{2} 1,0 mM.
11.
mezcla de fosforilación ATP/MnCl_{2}: para preparar 10 ml, mezclar 300 ml de ATP 1 mM, 500 ml de MnCl_{2} y 9,2 ml de dH_{2}O. Preparar justo antes de usar, mantener en hielo.
12.
placas NUNC de polipropileno de 96 pocillos de fondo en V.
13.
EDTA.
14.
suero policlonal de conejo anti-fosfotirosina (SUGEN, Inc.).
15.
conjugado de (anticuerpo) de cabra anti-IgG de conejo con peroxidasa (Biosource Nº Cat. ALI0404).
16.
ABTS.
17.
peróxido de hidrógeno al 30%.
18.
ABTS/H_{2}O_{2}.
19.
HCl 0,2 M.
\vskip1.000000\baselineskip
Procedimiento:
1.
Recubrir placas Corning de 96 pocillos para ELISA con 0,5 mg de SUMO1 en 100 \mul de PBS por pocillo, almacenar durante una noche a 4ºC.
2.
Retirar el SUMO1 no unido de los pocillos invirtiendo la placa para retirar el líquido. Lavar 1x con dH_{2}O. Poner la placa en una toallita de papel para retirar el exceso de líquido.
3.
Añadir 150 ml de Tampón de Bloqueo a cada pocillo. Incubar, con agitación, durante 30 min. a temperatura ambiente.
4.
Lavar la placa 3x con agua desionizada, después una vez con TBST. Poner la placa sobre una toallita de papel para retirar el exceso de líquido y las burbujas.
5.
Diluir el lisado en PBS (7 \mug lisado/100 ml de PBS).
6.
Añadir 100 \mul de lisado diluido a cada pocillo. Agitar a temperatura ambiente durante 1 h.
7.
Lavar la placas como en la etapa 4, anterior.
8.
Añadir 120 \mul de TBS a la placa para ELISA que contiene EGFR capturado.
9.
Diluir el compuesto de ensayo 1:10 en TBS, poner en el pocillo.
10.
Añadir 13,5 \mul de compuesto de ensayo diluido a la placa para ELISA. A los pocillos de control, añadir 13,5 ml de TBS en DMSO al 10%.
11.
Incubar, con agitación, durante 30 minutos a temperatura ambiente.
12.
Añadir 15 ml de mezcla de fosforilación a todos los pocillos excepto al pocillo de control negativo. El volumen final del pocillo debe ser de aproximadamente 150 \mul con una concentración final ATP 3 mM/MnCl_{2} 5 mM en cada pocillo. Incubar con agitación, durante 5 minutos.
13.
Detener la reacción añadiendo 16,5 ml de solución de EDTA mientras se agita. Agitar durante 1 min. más.
14.
Lavar 4x con agua desionizada, 2x con TBST.
15.
Añadir 100 \mul de anti-fosfotirosina (dilución 1:3000 en TBST) por pocillo. Incubar, con agitación, durante 30-45 min. a temperatura ambiente.
16.
Lavar como en la etapa 4, anterior.
17.
Añadir 100 \mul de conjugado de (anticuerpo) de cabra anti-IgG de conejo con peroxidasa Biosource (dilución en 1:2000 TBST) a cada pocillo. Incubar con agitación durante 30 min. a temperatura ambiente.
18.
Lavar como en la etapa 4, anterior.
19.
Añadir 100 ml de solución de ABTS/H_{2}O_{2} a cada pocillo.
20.
Incubar de 5 a 10 minutos con agitación. Retirar las burbujas.
21.
Si fuera necesario, detener la reacción añadiendo 100 ml de HCl 0,2 M por pocillo.
22.
Leer el ensayo en un lector de ELISA Dynatech MR7000: filtro de ensayo a 410 nM, filtro de referencia a 630 nM.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
BIOENSAYO DE PDGFR
Este ensayo se usa para medir la actividad quinasa in vitro de FGF1-R en un ensayo ELISA.
\vskip1.000000\baselineskip
Materiales y Reactivos:
1.
placas Corning de 96 pocillos para Elisa.
2.
anticuerpo anti-PDGFR monoclonal 28D4C10 (SUGEN, Inc.).
3.
PBS.
4.
Tampón TBST.
5.
Tampón de Bloqueo (igual que para el bioensayo de EGFR).
6.
lisado celular de NIH 3T3 que expresa PDGFR-\beta (SUGEN, Inc.).
7.
Tampón TBS.
8.
TBS + DMSO al 10%.
9.
ATP.
10.
MnCl_{2}.
11.
mezcla de fosforilación de tampón quinasa: para 10 ml, mezclar 250 \mul de TRIS 1 M, 200 \mul de NaCl 5 M, 100 \mul de MnCl_{2} 1 M y 50 \mul de Triton X-100 100 mM en suficiente dH_{2}O para preparar 10 ml.
12.
placas NUNC de polipropileno de 96 pocillos de fondo en V.
13.
EDTA.
14.
suero policlonal de conejo anti-fosfotirosina (SUGEN, Inc.).
15.
conjugado de (anticuerpo) de cabra anti-IgG de conejo con peroxidasa (Biosource Nº Cat. ALI0404).
16.
ABTS.
17.
Peróxido de hidrógeno, solución al 30%.
18.
ABTS/H_{2}O_{2}.
19.
HCl 0,2 M.
\newpage
Procedimiento:
1.
Recubrir placas Corning de 96 pocillos para ELISA con 0,5 mg de 28D4C10 en 100 \mul de PBS por pocillo, almacenar durante una noche a 4ºC.
2.
Retirar el 28D4C10 no unido de los pocillos invirtiendo la placa para retirar el líquido. Lavar 1x con dH_{2}O. Poner la placa en una toallita de papel para retirar el exceso de líquido.
3.
Añadir 150 \mul de Tampón de Bloqueo a cada pocillo. Incubar durante 30 min. a temperatura ambiente con agitación.
4.
Lavar la placa 3x con agua desionizada, después una vez con TBST. Poner la placa sobre una toallita de papel para retirar el exceso de líquido y las burbujas.
5.
Diluir el lisado en HNTG (10 \mug lisado/100 ml HNTG).
6.
Añadir 100 \mul de lisado diluido a cada pocillo. Agitar a temperatura ambiente durante 60 min.
7.
Lavar la placas como se ha descrito en la Etapa 4.
8.
Añadir 80 \mul de mezcla de trabajo con tampón quinasa a la placa para ELISA que contiene PDGFR capturado.
9.
Diluir el compuesto de ensayo 1:10 en TBS en placas de polipropileno de 96 pocillos.
10.
Añadir 10 \mul de compuesto de ensayo diluido a la placa para ELISA. A los pocillos de control, añadir 10 \mul de TBS + DMSO al 10%. Incubar con agitación durante 30 minutos a temperatura ambiente.
11.
Añadir 10 ml de ATP directamente a todos los pocillos excepto al pocillo de control negativo (el volumen final del pocillo debe ser de aproximadamente 100 \mul con ATP 20 \muM en cada pocillo). Incubar 30 minutos con agitación.
12.
Detener la reacción añadiendo 10 ml de solución de EDTA a cada pocillo.
13.
Lavar 4x con agua desionizada, dos veces con TBST.
14.
Añadir 100 \mul de anti-fosfotirosina (dilución 1:3000 en TBST) por pocillo. Incubar con agitación durante 30-45 min. a temperatura ambiente.
15.
Lavar como en la Etapa 4.
16.
Añadir 100 \mul de conjugado de (anticuerpo) de cabra anti-IgG de conejo con peroxidasa Biosource (dilución 1:2000 en TBST) a cada pocillo. Incubar con agitación durante 30 min. a temperatura ambiente.
17.
Lavar como en la Etapa 4.
18.
Añadir 100 \mul de solución de ABTS/H_{2}O_{2} a cada pocillo.
19.
Incubar de 10 a 30 minutos con agitación. Retirar las burbujas.
20.
Si fuera necesario detener la reacción con la adición de 100 ml de HCl 0,2 M por pocillo.
21.
Leer el ensayo en un lector de ELISA Dynatech MR7000 con filtro de ensayo a 410 nM y filtro de referencia a 630 nM.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
ENSAYO DE QUINASA CELULAR HER-2
Este ensayo se usa para medir la actividad quinasa de HER-2 en células enteras en un formato ELISA.
\vskip1.000000\baselineskip
Materiales y Reactivos:
1.
DMEM (GIBCO Nº de Catálogo 11965-092).
2.
Suero Bovino Fetal (FBS, GIBCO Nº de Catálogo 16000-044), inactivado por calor en un baño de agua durante 30 min. a 56ºC.
3.
Tripsina (GIBCO Nº de Catálogo 25200-056).
4.
L-Glutamina (GIBCO Nº de Catálogo 25030-081).
5.
HEPES (GIBCO Nº de Catálogo 15630-080).
6.
Medios de Crecimiento.
\quad
Mezclar 500 ml de DMEM, 55 ml de FBS inactivado por calor, 10 ml de HEPES y 5,5 ml de L-Glutamina.
7.
Medios de Inanición.
\quad
Mezclar 500 ml de DMEM, 2,5 ml de FBS inactivado por calor, 10 ml de HEPES y 5,5 ml de L- Glutamina.
8.
PBS.
9.
Placas de microtitulación de cultivo tisular de 96 pocillos de fondo plano (Corning Nº de Catálogo 25860).
10.
Placas de Cultivo Tisular de 15 cm (Corning Nº de Catálogo 08757148).
11.
Placas Corning de 96 pocillos para ELISA.
12.
placas NUNC de polipropileno de 96 pocillos de fondo en V.
13.
Cartuchos de Transferencia Costar para Transtar 96 (Costar Nº de Catálogo 7610).
14.
SUMO 1: anticuerpo anti-EGFR monoclonal (SUGEN, Inc.).
15.
Tampón TBST.
16.
Tampón de Bloqueo: Carnation Instant Milk® al 5% en PBS.
17.
Ligando EGF: EGF-201, Shinko American, Japón. Suspender el polvo en 10 ul de HCl 10 mM. Añadir 100 ul de NaOH 10 mM. Añadir 800 ul de PBS y transferir a un tubo Eppendorf, almacenar a -20ºC hasta que esté listo para usar.
18.
Tampón de Lisis HNTG.
\quad
Para Reserva 5X HNTG, mezclar 23,83 g de Hepes, 43,83 g de NaCl, 500 ml de glicerol y 100 ml de Triton X-100 y suficiente dH_{2}O para preparar 1 l de solución total. Para 1X HNTG*, mezclar 2 ml de HNTG, 100 ml de Na_{3}VO_{4} 0,1 M, 250 ml de Na_{4}P_{2}O_{7} 0,2 M y 100 ml de EDTA.
19.
EDTA.
20.
Na_{3}VO_{4}. Para preparar solución de reserva, mezclar 1,84 g de Na_{3}VO_{4} con 90 ml de dH_{2}O. Ajustar el pH a 10. Hervir en microondas durante un minuto (la solución se hace transparente). Enfriar a temperatura ambiente. Ajustar el pH a 10. Repetir el ciclo de calentamiento/enfriamiento hasta que el pH permanece a 10.
21.
Na_{4}P_{2}O_{7} 200 mM.
22.
antisuero policlonal de conejo específico para fosfotirosina (anticuerpo anti-Ptyr, SUGEN, Inc.).
23.
antisuero purificado por afinidad, anticuerpo IgG de cabra anti-conejo, conjugado de peroxidasa (Biosource Cat Nº ALI0904).
24.
Solución de ABTS.
25.
peróxido de hidrógeno, solución al 30%.
26.
ABTS/H_{2}O_{2}.
27.
HCl 0,2 M.
\vskip1.000000\baselineskip
Procedimiento:
1.
Recubrir placas Corning de 96 pocillos para ELISA con SUMO1 a 1,0 ug por pocillo en PBS, 100 ul volumen final/pocillo. Almacenar durante una noche a 4ºC.
\newpage
2.
En el día de uso, retirar el tampón de recubrimiento y lavar la placa 3 veces con dH_{2}O y una vez con Tampón TBST. Todos los lavados en este ensayo deben hacerse de esta manera, a menos que se indique otra cosa.
3.
Añadir 100 ul de Tampón de Bloqueo a cada pocillo. Incubar la placa, con agitación, durante 30 min. a temperatura ambiente. Justo antes de usar, lavar la placa.
4.
Usar la línea celular EGFr/HER-2 quimera/3T3-C7 para este ensayo.
5.
Elegir placas que tengan una confluencia del 80-90%. Recoger las células por tripsinización y centrifugar a 1000 rpm a temperatura ambiente durante 5 min.
6.
Resuspender las células en medio de inanición y contar con azul de tripano. Se requiere una viabilidad por encima del 90%. Sembrar las células en el medio de inanición a una densidad de 2.500 células por pocillo, 90 ul por pocillo, en una placa de microtitulación de 96 pocillos. Incubar las células sembradas durante una noche a 37ºC en CO_{2} al 5%.
7.
Iniciar el ensayo dos días después de la siembra.
8.
Los compuestos de ensayo se disuelven en DMSO al 4%. Las muestras se diluyen después adicionalmente directamente sobre placas privadas de DMEM. Típicamente, esta dilución será 1:10 o mayor. Todos los pocillos se transfieren después a la placa celular a una dilución 1:10 adicional (10 \mul de muestra y medios en 90 \mul de medios de inanición. La concentración final de DMSO debe ser del 1% o menor. Puede usarse también una dilución en serie convencional.
9.
Incubar en CO_{2} al 5% a 37ºC durante 2 horas.
10.
Preparar ligando EGF diluyendo el EGF de reserva (16,5 \muM) en DMEM caliente a 150 nM.
11.
Preparar suficiente HNTG* reciente para 100 ul por pocillo; poner en hielo.
12.
Después de 2 horas de incubación con compuesto de ensayo, añadir ligando EGF preparado a las células, 50 ul por pocillo, para una concentración final de 50 nM. Los pocillos de control positivo reciben la misma cantidad de EGF. Los controles negativos no reciben EGF. Incubar a 37ºC durante 10 min.
13.
Retirar el compuesto de ensayo, EGF, y DMEM. Lavar las células una vez con PBS.
14.
Transferir HNTG* a las células, 100 ul por pocillo. Poner en hielo durante 5 minutos. Mientras, retirar el tampón de bloqueo de la placa para ELISA y lavar.
15.
Raspar las células de la placa con una micropipeta y homogeneizar el material celular repetidamente aspirando y dispensando el tampón de lisis HNTG*. Transferir el lisado a una placa para ELISA recubierta, bloqueada, lavada. O, usar un cartucho de transferencia Costar para transferir el lisado a la placa.
16.
Incubar, con agitación, a temperatura ambiente durante 1 h.
17.
Retirar el lisado, lavar. Transferir anticuerpo anti-Ptyr diluido recientemente (1:3000 en TBST) a una placa para ELISA, 100 ul por pocillo.
18.
Incubar, con agitación, a temperatura ambiente, durante 30 min.
19.
Retirar el anticuerpo anti-Ptyr, lavar. Transferir el anticuerpo BIOSOURCE diluido recientemente a una placa para ELISA (1:8000 en TBST, 100 ul por pocillo).
20.
Incubar, con agitación, a temperatura ambiente durante 30 min.
21.
Retirar el anticuerpo BIOSOURCE, lavar. Transferir la solución de ABTS/H_{2}O_{2} preparada recientemente a una placa para ELISA, 100 ul por pocillo.
22.
Incubar, con agitación, durante 5-10 minutos. Retirar las burbujas.
23.
Detener la reacción con la adición de 100 ul de HCl 0,2 M por pocillo.
24.
Leer el ensayo en un lector de ELISA Dynatech MR7000 con filtro de ensayo ajustado a 410 nM y filtro de referencia a 630 nM.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
ENSAYO DE CDK2/CICLINA A
Este ensayo se usa para medir la actividad quinasa de serina/treonina in vitro de cdk2/ciclina A humana en un Ensayo de Proximidad por Centelleo (SPA).
\vskip1.000000\baselineskip
Materiales y Reactivos:
1.
placas Wallac de 96 pocillos de polietilentereftalato (flexi) (Wallac Nº de Catálogo 1450-401).
2.
Amersham Redivue [\gamma^{33}P] ATP (Amersham Nº de catálogo AH 9968).
3.
Amersham perlas SPA de poliviniltolueno recubiertas con estreptavidina (Amersham Nº de catálogo RPNQ0007). Las perlas deben reconstituirse en PBS sin magnesio o calcio, a 20 mg/ml.
4.
complejo enzimático activado de cdk2/ciclina A purificado a partir de células Sf9 (SUGEN, Inc.).
5.
sustrato peptídico biotiniliado (Debtide). Biotina-X-PKTPKKAKKL peptídico se disuelve en dH_{2}O a una concentración de 5 mg/ml.
6.
Mezcla péptido/ATP: para 10 ml, mezclar 9,979 ml de dH_{2}O, 0,00125 ml de ATP "frío", 0,010 ml de Debtide y 0,010 ml de \gamma^{33}P ATP. La concentración final por pocillo será de ATP "frío" 0,5 mM, 0,1 mg de Debtide y 0,2 \muCi de \gamma^{33}P ATP.
7.
Tampón quinasa: para 10 ml, mezclar 8,85 ml de dH_{2}O, 0,625 ml de TRIS(pH 7,4), 0,25 ml de MgCl_{2} 1 M, 0,25 ml de NP40 al 10% y 0,025 ml de DTT 1 M, añadido reciente justo antes de su uso.
8.
ATP 10 mM en dH_{2}O.
9.
Tris 1 M, pH ajustado a 7,4 con HCl.
10.
MgCl_{2} 1 M.
11.
DTT 1 M.
12.
PBS (Gibco Nº de Catálogo 14190-144).
13.
EDTA 0,5 M.
14.
Solución de parada: para 10 ml, mezclar 9,25 ml de PBS, 0,005 ml de ATP 100 mM, 0,1 ml de EDTA 0,5 M, 0,1 ml de Triton X-100 al 10% y 1,25 ml de 20 mg/ml de perlas SPA.
\vskip1.000000\baselineskip
Procedimiento:
1.
Preparar soluciones de compuestos de ensayo a 5x la concentración final deseada en DMSO al 5%. Añadir 10 ul a cada pocillo. Para los controles negativos, usar 10 ul de DMSO al 5% solo en los pocillos.
2.
Diluir 5 ml de solución de cdk2/ciclina A con 2,1 ml de tampón quinasa 2x.
3.
Añadir 20 ul de enzima a cada pocillo.
4.
Añadir 10 \mul de EDTA 0,5 M a los pocillos de control negativo.
5.
Para iniciar la reacción con quinasa, añadir 20 \mul de mezcla péptido/ATP a cada pocillo. Incubar durante 1 h. sin agitar.
6.
Añadir 200 \mul de solución de parada a cada pocillo.
7.
Mantener al menos 10 min.
8.
Hacer girar la placa a aproximadamente 2300 rpm durante 3-5 min.
9.
Contar la placa usando Trilux o un lector similar.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
ENSAYO DE TRANSFOSFORILACIÓN DE MET
Este ensayo se usa para medir los niveles de fosfotirosina en un sustrato de poli(ácido glutámico:tirosina (4:1)) como medio para identificar agonistas/antagonistas de la transfosforilación de met del sustrato.
\vskip1.000000\baselineskip
Materiales y Reactivos:
1.
placas Corning de 96 pocillos para Elisa, Corning Nº de Catálogo 25805-96.
2.
Poli(glu, tyr) 4:1, Sigma, Nº Cat. P 0275.
3.
PBS, Gibco Nº de Catálogo 450-1300EB.
4.
HEPES 50 mM.
5.
Tampón de Bloqueo: Disolver 25 g de Albúmina de Suero Bovina, Sigma Nº Cat. A-7888, en 500 ml de PBS, filtrar a través de un filtro de 4 \mum.
6.
proteína de fusión GST purificada que contiene el dominio de quinasa Met, Sugen, Inc.
7.
Tampón TBST.
8.
DMSO acuoso al 10% (MilliQue H_{2}O).
9.
Adenosina-5'-trifosfato acuoso 10 mM (dH_{2}O), Sigma Nº Cat. A-5394.
10.
Tampón de Dilución de Quinasa 2X: para 100 ml, mezclar 10 ml de HEPES 1 M a pH 7,5 con 0,4 ml de BSA al 5%/PBS, 0,2 ml de ortovanadato sódico 0,1 M y 1 ml de cloruro sódico 5 M en 88,4 ml de dH_{2}O.
11.
Mezcla de Reacción ATP 4X: para 10 ml, mezclar 0,4 ml de cloruro de manganeso 1 M y 0,02 ml de ATP 0,1 M en 9,56 ml de dH_{2}O.
12.
Mezcla de Controles Negativos 4X: para 10 ml, mezclar 0,4 ml de cloruro de manganeso 1 M en 9,6 ml de dH_{2}O.
13.
placas NUNC de polipropileno de 96 pocillos de fondo en V, Applied Scientific Nº de Catálogo S-72092.
14.
EDTA 500 mM.
15.
Tampón de Dilución de Anticuerpo: para 100 ml, mezclar 10 ml de BSA al 5%/PBS, 0,5 ml de Carnation Instant Milk® al 5% en PBS y 0,1 ml de ortovanadato sódico 0,1 M en 88,4 ml de TBST.
16.
anticuerpo antofosfotirosina policlonal de conejo, Sugen, Inc.
17.
anticuerpo conjugado de peroxidasa de rábano rusticano de cabra anti-conejo, Biosource, Inc.
18.
Solución de ABTS: para 1 l, mezclar 19,21 g de ácido cítrico, 35,49 g de Na_{2}HPO_{4} y 500 mg de ABTS con suficiente dH_{2}O para preparar 1 l.
19.
ABTS/H_{2}O_{2}: mezclar 15 ml de solución de ABST con 2 ml de H_{2}O_{2} cinco minutos antes de usarla.
20.
HCl 0,2 M
\vskip1.000000\baselineskip
Procedimiento:
1.
Recubrir placas para ELISA con 2 mg de Poli(Glu-Tyr) en 100 ml de PBS, almacenar durante una noche a 4ºC.
2.
Bloquear la placa con 150 ml de BSA al 5%/PBS durante 60 min.
3.
Lavar la placa dos veces con PBS, una con tampón Hepes 50 mM pH 7,4.
4.
Añadir 50 \mul de la quinasa diluida a todos los pocillos. (La quinasa purificada se diluye con Tampón de Dilución de Quinasa. La concentración final debe ser de 10 ng/pocillo.).
5.
Añadir 25 \mul del compuesto de ensayo (en DMSO al 4%) o DMSO solo (4% en dH_{2}O) para controles a la placa.
\global\parskip0.990000\baselineskip
6.
Incubar la mezcla quinasa/compuesto durante 15 minutos.
7.
Añadir 25 \mul de MnCl_{2} 40 mM a los pocillos de control negativo.
8.
Añadir 25 \mul de mezcla ATP/MnCl_{2} a todos los demás pocillos (excepto los controles negativos). Incubar durante 5 min.
9.
Añadir 25 \mul de EDTA 500 mM para detener la reacción.
10.
Lavar la placa 3x con TBST.
11.
Añadir 100 \mul de (anticuerpo) policlonal de conejo anti-Ptyr diluido 1:10.000 en Tampón de Dilución de Anticuerpo a cada pocillo. Incubar, con agitación, a temperatura ambiente durante una hora.
12.
Lavar la placa 3x con TBST.
13.
Diluir el anticuerpo anti-conejo conjugado HRP de Biosource 1: 6,000 en Tampón de Dilución de Anticuerpo. Añadir 100 ml por pocillo e incubar a temperatura ambiente, con agitación, durante una hora.
14.
Lavar la placa 1X con PBS.
15.
Añadir 100 \mul de solución de ABTS/H_{2}O_{2} a cada pocillo.
16.
Si fuera necesario, detener el desarrollo de la reacción con la adición de 100 \mul de HCl 0,2 M por pocillo.
17.
Leer la placa en un lector de ELISA Dynatech MR7000 con el filtro de ensayo a 410 nM y el filtro de referencia a 630 nM.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
ENSAYO DE TRANSFOSFORILACIÓN DE IGF-1
Este ensayo se usa para medir el nivel de fosfotirosina en poli(ácido glutámico:tirosina) (4:1) para la identificación de agonistas/antagonistas de transfosforilación de gst-IGF-1 de un sustrato.
\vskip1.000000\baselineskip
Materiales y Reactivos:
1.
placas Corning de 96 pocillos para Elisa.
2.
Poli(Glu-tyr) (4:1), Sigma Nº Cat. P 0275.
3.
PBS, Gibco Nº de Catálogo 450-1300EB.
4.
HEPES 50 mM.
5.
Tampón de Bloqueo TBB: para 1 l, mezclar 100 g de BSA, 12,1 g de TRIS (pH 7,5), 58,44 g de cloruro sódico y 10 ml de TWEEN-20 al 1%.
6.
proteína de fusión GST purificada que contiene el dominio IGF-1 de quinasa (Sugen, Inc.).
7.
Tampón TBST: para 1 l, mezclar 6,057 g de Tris, 8,766 g de cloruro sódico y 0,5 ml de TWEEN-20 con suficiente dH_{2}O para preparar 1 litro.
8.
DMSO al 4% en Milli-Q H_{2}O.
9.
ATP 10 mM en dH_{2}O.
10.
Tampón de Dilución de Quinasa 2X: para 100 ml, mezclar 10 ml de HEPES 1 M (pH 7,5), 0,4 ml de BSA al 5% en dH_{2}O, 0,2 ml de ortovanadato sódico 0,1 M y 1 ml de cloruro sódico 5 M con suficiente dH_{2}O para preparar 100 ml.
11.
Mezcla de Reacción ATP 4X: para 10 ml, mezclar 0,4 ml de MnCl_{2} 1 M y 0,008 ml de ATP 0,01 M y 9,56 ml de dH_{2}O.
12.
Mezcla de Controles Negativos 12,4X: mezclar 0,4 ml de cloruro de manganeso 1 M en 9,60 ml de dH_{2}O.
13.
placas NUNC de polipropileno de 96 pocillos de fondo en V.
\global\parskip1.000000\baselineskip
14.
EDTA 500 mM en dH_{2}O.
15.
Tampón de Dilución de Anticuerpo: para 100 ml, mezclar 10 ml de BSA al 5% en PBS, 0,5 ml de Carnation Instant Non-fat Milk® al 5% en PBS y 0,1 ml de ortovanadato sódico 0,1 M en 88,4 ml de TBST.
16.
anticuerpo policlonal de conejo antifosfotirosina, Sugen, Inc.
17.
anticuerpo de cabra anti-conejo conjugado con HRP, Biosource.
18.
Solución de ABTS.
20.
ABTS/H_{2}O_{2}: mezclar 15 ml de ABTS con 2 ml de H_{2}O_{2} 5 minutos antes de la utilización.
21.
HCl 0,2 M en dH_{2}O.
\vskip1.000000\baselineskip
Procedimiento:
1.
Recubrir una placa para ELISA con 2,0 mg/pocillo de Poli(Glu, Tyr) 4:1 (Sigma P0275) en 100 ml de PBS. Almacenar placa durante una noche a 4ºC.
2.
Lavar la placa una vez con PBS.
3.
Añadir 100 \mul de Tampón de Bloqueo TBB a cada pocillo. Incubar la placa durante 1 hora con agitación a temperatura ambiente.
4.
Lavar la placa una vez con PBS, después dos veces con tampón Hepes 50 mM pH 7,5.
5.
Añadir 25 \mul de compuesto de ensayo en DMSO al 4% (obtenido diluyendo una solución de reserva de compuesto de ensayo 10 mM en DMSO al 100% con dH_{2}O) a la placa.
6.
Añadir 10,0 ng de gst-IGF-1 quinasa en 50 ml de Tampón de Dilución de Quinasa) a todos los pocillos.
7.
Iniciar la reacción de quinasa añadiendo 25 ml de Mezcla de Reacción ATP 4X a todos los pocillos de ensayo y pocillos de control positivo. Añadir 25 \mul de Mezcla de Controles Negativos 4X a todos los pocillos de control negativo. Incubar durante 10 minutos con agitación a temperatura ambiente.
8.
Añadir 25 ml de EDTA 0,5 M (pH 8,0) a todos los pocillos.
9.
Lavar la placa 4x con Tampón TBST.
10.
Añadir antisuero policlonal de conejo anti-fosfotirosina a una dilución de 1:10.000 en 100 ml de Tampón de Dilución de Anticuerpo a todos los pocillos. Incubar, con agitación, a temperatura ambiente durante 1 hora.
11.
Lavar la placa como en la Etapa 9.
12.
Añadir 100 \mul de HRP anti-conejo Biosource a una dilución de 1:10.000 en tampón de dilución de anticuerpo a todos los pocillos. Incubar, con agitación, a temperatura ambiente durante 1 hora.
13.
Lavar la placa como en la Etapa 9, seguir con un lavado con PBS para reducir las burbujas y el exceso de Tween-20.
14.
Desarrollar añadiendo 100 \mul/pocillo de ABTS/H_{2}O_{2} a cada pocillo.
15.
Después de aproximadamente 5 minutos, leer en un lector de ELISA con filtro de ensayo a 410 nm y filtro de referencia a 630 nm.
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\vskip1.000000\baselineskip
ENSAYOS DE INCORPORACIÓN DE BRDU
Los siguientes ensayos usan células modificadas genéticamente para expresar un receptor seleccionado y después evaluar el efecto de un compuesto de interés sobre la actividad de síntesis de ADN inducida por ligando determinando la incorporación de BrdU en el ADN.
Los siguientes materiales, reactivos y procedimiento son generales para cada uno de los siguientes ensayos de incorporación de BrdU. Se observan varianzas en ensayos específicos.
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Materiales y Reactivos:
1.
El ligando apropiado.
2.
Las células modificadas genéticamente apropiadas.
3.
Reactivo de Marcado BrdU: 10 mM, en PBS (pH 7,4) (Boehringer Mannheim, Alemania).
4.
FixDenat: solución de fijación (lista para usar) (Boehringer Mannheim, Alemania).
5.
Anti-BrdU-POD: anticuerpo monoclonal de ratón conjugado con peroxidasa (Boehringer Mannheim, Alemania).
6.
Solución de Sustrato TMB: tetrametilbenzidina (TMB, Boehringer Mannheim, Alemania).
7.
Solución de Lavado con PBS: PBS 1X, pH 7,4.
8.
Albúmina, Bovina (BSA), fracción V en polvo (Sigma Chemical Co., EE.UU.).
\vskip1.000000\baselineskip
Procedimiento General:
1.
Las células se siembran a 8000 células/pocillo en CS al 10%, Gln 2 mM en DMEM, en una placa de 96 pocillos. Las células se incuban durante una noche a 37ºC en CO_{2} al 5%.
2.
Después de 24 horas, las células se lavan con PBS, y después se privan de suero en medio sin suero (CS al 0% en DMEM con BSA al 0,1%) durante 24 horas.
3.
En el día 3, el ligando apropiado y el compuesto de ensayo se añaden a las células simultáneamente. Los pocillos de control negativo reciben DMEM sin suero con BSA al 0,1% únicamente; las células de control positivo reciben el ligando pero no el compuesto de ensayo. Los compuestos de ensayo se preparan en DMEM sin suero con ligando en una placa de 96 pocillos, y se diluyen en serie durante 7 concentraciones de ensayo.
4.
Después 18 horas de activación del ligando, se añade reactivo de marcado BrdU diluido (1:100 en DMEM, BSA al 0,1%) y las células se incuban con BrdU (concentración final = 10 mM) durante 1,5 horas.
5.
Después de la incubación con reactivo de marcado, el se retira decantando y golpeando suavemente la placa invertida sobre una toallita de papel. Se añade solución FixDenat (50 \mul/pocillo) y las placas se incuban a temperatura ambiente durante 45 minutos en un agitador de placa.
6.
La solución FixDenat se retira minuciosamente decantando y golpeando suavemente la placa invertida sobre una toallita de papel. Se añade leche (leche deshidratada al 5% en PBS, 200 ml/pocillo) como solución de bloqueo y la placa se incuba durante 30 minutos a temperatura ambiente en un agitador de placa.
7.
La solución de bloqueo se retira por decantación y los pocillos se lavan una vez con PBS. Se añade solución anti-BrdU-POD (dilución 1:200 en PBS, BSA al 1%) (50 ml/pocillo) y la placa se incuba durante 90 minutos a temperatura ambiente en un agitador de placa.
8.
El anticuerpo conjugado se retira minuciosamente decantando y enjuagando los pocillos 5 veces con PBS, y la placa se seca invirtiendo y golpeando suavemente sobre una toallita de papel.
9.
Se añade solución de sustrato TMB (100 \mul/pocillo) y se incuba durante 20 minutos a temperatura ambiente en un agitador de placa hasta que el desarrollo de color es suficiente para la detección fotométrica.
10.
La absorbancia de las muestras se mide a 410 nm (en modo "longitud de onda doble" con una lectura de filtro a 490 nm, como una longitud de onda de referencia) en un lector Dynatech de placa para ELISA.
\vskip1.000000\baselineskip
Ensayo de Incorporación de BrdU Inducida por EGF
Materiales y Reactivos:
1.
ratón EGF, 201 (Toyobo Co., Ltd., Japón).
2.
3T3/EGFRc7.
\vskip1.000000\baselineskip
Ensayo de Incorporación de BrdU Inducida por EGF accionado por Her-2
Materiales y Reactivos:
1.
ratón EGF, 201 (Toyobo Co., Ltd., Japón).
2.
3T3/EGFr/Her2/EGFr (EGFr con un dominio de quinasa Her-2).
\vskip1.000000\baselineskip
Ensayo de Incorporación de BrdU Inducida por EGF accionado por Her-4
Materiales y Reactivos:
1.
ratón EGF, 201 (Toyobo Co., Ltd., Japón).
2.
3T3/EGFr/Her4/EGFr (EGFr con un dominio de quinasa Her-4).
\vskip1.000000\baselineskip
Ensayo de Incorporación de BrdU Inducida por PDGF
Materiales y Reactivos:
1.
PDGF B/B humano (Boehringer Mannheim, Alemania).
2.
3T3/EGFRc7.
\vskip1.000000\baselineskip
Ensayo de Incorporación de BrdU Inducida por FGF
Materiales y Reactivos:
1.
Human FGF2/bFGF (Gibco BRL, EE.UU.).
2.
3T3c7/EGFr
\vskip1.000000\baselineskip
Ensayo de Incorporación de BrdU Inducida por IGF1
Materiales y Reactivos:
1.
Humano, recombinante (G511, Promega Corp., EE.UU.)
2.
3T3/IGFlr.
\vskip1.000000\baselineskip
Ensayo de Incorporación de BrdU Inducida por Insulina
Materiales y Reactivos:
1.
Insulina, cristalina, bovina, Zinc (13007, Gibco BRL, EE.UU.).
2.
3T3/H25.
\vskip1.000000\baselineskip
Ensayo de Incorporación de BrdU Inducida por HGF
Materiales y Reactivos:
1.
HGF humano recombinante (Nº Cat. 249-HG, R&D Systems, Inc. EE.UU.).
2.
células BxPC-3 (ATCC CRL-1687).
\vskip1.000000\baselineskip
Procedimiento:
1.
Las células se siembran a 9000 células/pocillo en RPMI de FBS al 10% en una placa de 96 pocillos. Las células se incuban durante una noche a 37ºC en CO_{2} al 5%.
2.
Después 24 horas, las células se lavan con PBS, y después se les priva de suero en 100 \mul de medio sin suero (RPMI con BSA al 0,1%) durante 24 horas.
3.
En el día 3, 25 \mul que contienen ligando (preparado a 1 \mug/ml en RPMI con BSA al 0,1%; conc. final de HGF es 200 ng/ml) y compuestos de ensayo se añaden a las células. Los pocillos de control negativo reciben 25 ml de RPMI sin suero con BSA al 0,1% únicamente; las células de control positivo reciben el ligando (HGF) pero no el compuesto de ensayo. Los compuestos de ensayo se preparan a 5 veces su concentración final en RPMI sin suero con ligando en una placa de 96 pocillos, y se diluyen en serie dando 7 concentraciones de ensayo. Típicamente, la mayor concentración final del compuesto de ensayo es de 100 mM, y se usan diluciones 1:3 (es decir, intervalo de concentración final del compuesto de ensayo es 0,137-100 mM).
4.
Después 18 horas de activación con ligando, se añaden 12,5 ml de reactivo de marcado BrdU diluido (1:100 en RPMI, BSA al 0,1%) a cada pocillo y las células se incuban con BrdU (concentración final es 10 mM) durante 1 hora.
5.
Igual que el Procedimiento General.
6.
Igual que el Procedimiento General.
7.
La solución de bloqueo se retira decantando y los pocillos se lavan una vez con PBS. Se añade solución anti-BrdU-POD (dilución 1:100 en PBS, BSA al 1%) (100 ml/pocillo) y la placa se incuba durante 90 minutos a temperatura ambiente en un agitador de placa.
8.
Igual que el Procedimiento General.
9.
Igual que el Procedimiento General.
10.
Igual que el Procedimiento General.
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Ensayo de HUV-EC-C
Este ensayo se usa para medir la actividad de un compuesto contra PDGF-R, FGF-R, VEGF, aFGF o Flk-1/KDR, todos los cuales se expresan de forma natural por células HUV-EC.
DÍA 0
1. Lavar y tripsinizar células HUV-EC-C (células endoteliales de la vena umbilical humana, (American Type Culture Collection, Nº de catálogo 1730 CRL). Lavar con solución salina de Dulbecco tamponada con fosfato (D-PBS, obtenida de Gibco BRL, Nº de catálogo 14190-029) 2 veces a aproximadamente 1 ml/10 cm^{2} de matraz de cultivo de tejido. Tripsinizar con tripsina al 0,05%-EDTA en solución de disociación celular no enzimática (Sigma Chemical Company, Nº de catálogo C-1544). La tripsina al 0,05% se prepara diluyendo tripsina al 0,25%/EDTA 1 mM (Gibco, Nº de catálogo 25200-049) en la solución de disociación celular. Tripsinizar con aproximadamente 1 ml/25-30 cm^{2} de matraz de cultivo de tejido durante aproximadamente 5 minutos a 37ºC. Una vez que las células se han separado del matraz, añadir un volumen igual de medio de ensayo y transferir a un tubo de centrífuga estéril de 50 ml (Fisher Scientific, Nº de catálogo 05-539-6).
2. lavar las células con aproximadamente 35 ml de medio de ensayo en el tubo de centrífuga estéril de 50 ml añadiendo el medio de ensayo, centrifugar durante 10 minutos a aproximadamente 200 x g, aspirar el sobrenadante, y resuspender con 35 ml de D-PBS. Repetir el lavado dos veces más con D-PBS, resuspender las células en aproximadamente 1 ml de medio de ensayo/15 cm^{2} de matraz de cultivo de tejido. El medio de ensayo está compuesto por medio F12K (Gibco BRL, Nº de catálogo 21127-014) y 0,5% suero bovina fenal inactivado con calor. Contar las células con un contador Coulter Counter® (Coulter Electronics, Inc.) y añadir medio de ensayo a las células para obtener una concentración de 0,8-1,0 x 10^{5} células/ml.
3. Añadir las células a placas de 96 pocillos de fondo plano a 100 ml/pocillo o 0,8-1,0 x 10^{4} células/pocillo, incubar ~24h a 37ºC, CO_{2} al 5%.
DÍA 1
1. Preparar valoraciones del compuesto de ensayo dos veces en placas de 96 pocillos diferentes, generalmente de 50 mM disminuyendo a 0 mM. Usar el mismo medio de ensayo mencionado para el día 0, etapa 2 anterior. Las valoraciones se preparan añadiendo 90 ml/pocillo de compuesto de ensayo a 200 mM (4X la concentración final del pocillo) al pocillo superior de una columna de placa particular. Como el compuesto de ensayo de reserva es normalmente 20 mM en DMSO, la concentración de fármaco 200 \muM contiene DMSO al 2%.
Se usa un diluyente formado por DMSO al 2% en medio de ensayo (F12K + suero bovino fetal al 0,5%) como diluyente para las valoraciones del compuesto de ensayo para diluir el compuesto de ensayo pero mantener constante la concentración de DMSO. Añadir este diluyente los pocillos restantes en la columna a 60 ml/pocillo. Tomar 60 \mul de los 120 \mul de dilución del compuesto de ensayo 200 \muM en el pocillo superior de la columna y mezclar con los 60 \mul en el segundo pocillo de la columna. Tomar 60 \mul de este pocillo y mezclar con los 60 \mul en el tercer pocillo de la columna, y así sucesivamente hasta que se completan dos valoraciones. Cuando se mezcla el pocillo siguiente con el anterior, tomar 60 \mul de los 120 \mul en este pocillo y desecharlos. Dejar el último pocillo con 60 \mul de diluyente DMSO/medio como un control que contiene compuesto que no es de ensayo. Preparar 9 columnas de compuesto de ensayo valorado, suficiente triplicar los pocillos cada uno para: (1) VEGF (obtenido de Pepro Tech Inc., Nº de catálogo 100-200, (2) factor de crecimiento celular endotelial (ECGF) (conocido también como factor de crecimiento de fibroblastos ácidos, o aFGF) (obtenido de Boehringer Mannheim Bio-chemica, Nº de catálogo 1439 600), o, (3) PDGF B/B humano (1276-956, Boehringer Mannheim, Alemania) y control del medio de ensayo. ECGF viene como una preparación con heparina sódica.
2. Transferir diluciones de 50 \mul/pocillo del compuesto de ensayo a las placas de ensayo de 96 pocillos que contienen 0,8-1,0x10 ^{4} células/100 ml/pocillo de las células HUV-EC-C del día 0 e incubar 2 h a 37ºC, CO_{2} al 5%.
3. Por triplicado, añadir 50 \mul/pocillo de 80 \mug/ml de VEGF, 20 ng/ml de ECGF, o control del media a cada condición del compuesto de ensayo. Como con los compuestos de ensayo, las concentraciones del factor de crecimiento son 4X la concentración final deseada. Usar el medio de ensayo del día 0, etapa 2, para preparar las concentraciones de factores de crecimiento. Incubar aproximadamente 24 horas a 37ºC, CO_{2} al 5%. Cada pocillo tendrá 50 \mul de dilución de compuesto de ensayo, 50 \mul de factor de crecimiento o medio, y 100 \mul de células, que se calcula como 200 \mul/pocillo total. De esta manera las concentraciones 4X de compuesto de ensayo y factores de crecimiento se hacen 1X una vez que se ha añadido todo a los pocillos.
DÍA 2
1. Añadir ^{3}H-timidina (Amersham, Nº de catálogo TRK-686) a 1 \muCi/pocillo (10 \mul/pocillo de solución 100 \muCi/ml formada por medio RPMI + suero bovino fetal al 10% inactivado por calor) e incubar 24 h a 37ºC, CO_{2} al 5%. RPMI se obtiene de Gibco BRL, Nº de catálogo 11875-051.
DÍA 3
1. Congelar las placas durante una noche a -20ºC.
DÍA 4
Descongelar las placas y recuperar con un colector de placa de 96 pocillos (Tomtec Harvester 96®) sobre mallas de filtro (Wallac, Nº de catálogo 1205-401), leer los recuentos en un contador de centelleo líquido Wallac Betaplate^{TM}.
La Tabla 3 muestra los resultados del ensayo biológicos de algunos compuestos ejemplares de esta invención. Los resultados se muestran en términos de CI_{50}, la concentración micromolar (mM) del compuesto a ensayar que provoca un cambio del 50% en la actividad de la PTK diana comparado con la actividad de la PTK en un control al que no se ha añadido compuesto de ensayo. Específicamente, los resultados mostrados indican la concentración de un compuesto de ensayo necesaria para provocar una reducción del 50% de la actividad de la PTK diana. Los bioensayos que se han usado o que pueden usarse para evaluar los compuestos se describen en detalle a continuación.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 3
20
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MODELOS ANIMALES IN VIVO
MODELOS ANIMALES DE XENOINJERTO
La capacidad de los tumores humanos para crecer en forma de xenoinjertos en ratones atímicos (por ejemplo, Balb/c, nu/nu) proporciona un modelo in vivo útil para estudiar la respuesta biológica a terapias para tumores humanos. Desde el primer xenotransplante con éxito de tumores humanos en ratones atímicos, (Rygaard y Poilsen, 1969, Acta Pathol. Microbial. Scand. 77:758-760), se han transplantado muchas líneas celulares humanas de tumores diferentes (por ejemplo, melanomas mamario, de pulmón, genitourinario, gastro-intestinal, de cabeza y cuello, glioblastoma, óseo, y maligno) y se han desarrollado con éxito en ratones desnudos. Los siguientes ensayos pueden usarse para determinar el nivel de actividad, especificidad y efecto de los diferentes compuestos de la presente invención. Tres tipos general de ensayos son útiles para evaluar compuestos: celular/catalítico, celular/biológico e in vivo. El objeto de los ensayos celulares/catalíticos es para determinar el efecto de un compuesto sobre la capacidad de una TK para fosforilar tirosinas en un sustrato conocido en una célula. El objeto de los ensayos celulares/biológicos es determinar el efecto de un compuesto sobre la respuesta biológica estimulada por una TK en una célula. El objeto de los ensayos in vivo es determinar el efecto de un compuesto en un modelo animal de un trastorno particular tal como
cáncer.
Las líneas celulares adecuadas para experimentos de xenoinjerto subcutáneo incluyen células C6 (glioma, ATCC Nº CCL 107), células A375 (melanoma, ATCC Nº CRL 1619), células A431 (carcinoma epidermoide, ATCC Nº CRL 1555), células Calu 6 (pulmón, ATCC Nº HTB 56), células PC3 (próstata, ATCC Nº CRL 1435), células SKOV3TP5 y fibroblastos NIH 3T3 modificados genéticamente para sobreexpresar EGFR, PDGER, IGF-1R o cualquier otra quinasa de ensayo. Puede usarse el siguiente protocolo para realizar experimentos de xenoinjerto:
Ratones atímicos hembra (BALB/c, nu/nu) se obtienen de Simonsen Laboratories (Gilroy, CA). Todos los animales se mantienen en condiciones de alojamiento limpio en jaulas Micro-isolator con camas Alpha-dri. Reciben pienso para roedores estéril y agua a discreción.
Las líneas celulares se desarrollan en el medio apropiado (por ejemplo, MEM, DMEM, F10 de Ham, o F12 de Ham más suero bovino fetal (FBS) al 5%-10% y glutamina 2 mM (GLN)). Todos los medios de cultivo celular, glutamina, y suero bovino fetal se adquirieron en Gibco Life Technologies (Grand Island, NY) a menos que se indique otra cosa. Todas las células se desarrollan en una atmósfera húmeda de 90-95% de aire y 5-10% de CO_{2} a 37ºC. Todas las líneas celulares se subcultivan de forma rutinaria dos veces a la semana y son negativas para micoplasma según se determina por el procedimiento de Mycotect (Gibco).
Las células se recuperan a o cerca de la confluencia con tripsina al 0,05%-EDTA y sedimentan a 450 x g durante 10 min. El sedimento se vuelve a resuspender en PBS estéril o medio (sin FBS) a una concentración particular y las células se implantan en el costado trasero de los ratones (8-10 ratones por grupo, 2-10 x 10^{6} células/animal). El crecimiento del tumor se mide durante 3 a 6 semanas usando calibres Venier. Los volúmenes de tumor se calculan como un producto de longitud x anchura x altura a menos que se indique otra cosa. Los valores P se calculan usando el ensayo de t de Student. Los compuestos de ensayo en 50-100 ml de excipiente (DMSO, o VPD:D5W) pueden suministrarse por inyección IP a diferentes concentraciones generalmente empezando en el día uno después del implante.
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MODELO DE INVASIÓN TUMORAL
El siguiente modelo de invasión tumoral se ha desarrollado y puede usarse para la evaluación del valor y eficacia terapéutica de los compuestos identificados para inhibir selectivamente al receptor de KDR/FLK-1.
Procedimiento
Se usan ratones desnudos de 8 semanas de edad (hembra) (Simonsen Inc.) como animales experimentales. El implante de células tumorales puede realizarse en un campana de flujo laminar. Para la anestesia, se administra un cóctel de xilazina/quetamina (100 mg/kg de quetamina y 5 mg/kg de xilazina) por vía intraperitoneal. Se realiza una incisión media para exponer la cavidad abdominal (aproximadamente de 1,5 cm de longitud) para inyectar 10^{7} células tumorales en un volumen de 100 \mul de medio. Las células se inyectan al lóbulo duodenal del páncreas o bajo la serosa del colon. El peritoneo y los músculos se cierran con sutura de seda 6-0 continua y la piel se cierra usando grapas para heridas. Los animales se observan diariamente.
Análisis
Después de 2-6 semanas, dependiendo de observaciones en bruto de los animales, los ratones se sacrifican, y el tumor local se metastatiza a diversos órganos (pulmón, hígado, cerebro, estómago, bazo, corazón, músculo) se extirpan y analizan (se mide el tamaño del tumor, grado de invasión, inmunoquímica, determinación de hibridación in situ, etc.).
ENSAYO DE C-KIT
Este ensayo se usa para detectar el nivel de fosforilación con tirosina c-kit.
Se privó de suero a células MO7E (leucemia mieloide aguda humana) durante una noche en suero al 0,1%. Las células se pre-trataron con el compuesto (simultáneamente con la privación de suero), antes de la estimulación con ligando. Las células se estimularon con 250 ng/ml de rh-SCF durante 15 minutos. Después de la estimulación, las células se lisaron e inmunoprecipitaron con un anticuerpo anti-c-kit. Se determinaron los niveles de fosfotirosina y proteína por transferencia Western.
ENSAYO DE PROLIFERACIÓN DE MTT
Se privó de suero a células MO7E y se pre-trataron con compuesto como se ha descrito para los experimentos de fosforilación. Las células se colocaron en placas a 4X10^{5} células/pocillo en una placa de 96 pocillos, en 100 \mul de RPMI + suero al 10%. Se añadió rh-SCF (100 ng/ml) y la placa se incubó durante 48 horas. Después de 48 horas, se añadieron 10 \mul de 5 mg/ml de MTT [bromuro de 3-(4, 5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolio) y se dejó incubar durante 4 horas. Se añadió isopropanol ácido (100 \mul de HCl 0,04 N en isopropanol) y la densidad óptica se midió a una longitud de onda de 550 nm.
ENSAYO DE APOPTOSIS
Se incubaron células MO7E +/- SCF y +/- compuesto en FBS al 10% con rh-GM-CSF (10 ng/ml) y rh-IL-3 (10 ng/ml). Las muestras se ensayaron a las 24 y 48 horas. Para medir la caspasa-3 activada, las muestras se lavaron con PBS y se permeabilizaron con etanol al 70% enfriado con hielo. Las células se tiñeron después con (anticuerpo) policlonal de conejo anti-caspasa-3 activa conjugado con PE y se analizaron por FACS. Para medir el PARP escindido, las muestras se lisaron y se analizaron por transferencia western con un anticuerpo anti-PARP.
Ensayos adicionales
Los ensayos adicionales que pueden usarse para evaluar los compuestos de esta invención incluyen, sin limitación, un ensayo bio-flk-1, un ensayo de receptor de EGF-receptor quimérico de HER2 en células enteras, un ensayo bio-src, un ensayo bio-lck y un ensayo que mide la función de fosforilación de raf. Los protocolos para cada uno de estos ensayos puede encontrarse en la Solicitud de Estados Unidos con Nº de Serie 09/099.842, que se incorpora por referencia, incluyendo cualquiera de sus dibujos, en este documento.
Medida de la Toxicidad Celular
Los compuestos terapéuticos deben ser más potentes inhibiendo la actividad tirosina quinasa del receptor que ejerciendo un efecto citotóxico. Una medida de la eficacia y toxicidad celular de un compuesto puede obtenerse determinando el índice terapéutico, es decir, CI_{50}/DL_{50}. CI_{50}, la dosis requerida para conseguir una inhibición del 50%, puede medirse usando técnicas convencionales tales como las descritas en este documento. DL_{50}, la dosificación que da como resultado una toxicidad del 50%, puede medirse también por técnicas convencionales (Mossman, 1983, J. Immunol. Procedimientos, 65:55-63), midiendo la cantidad de LDH liberado (Korzeniewski y Callewaert, 1983, J. Immunol. Procedures, 64:313, Decker y Lohmann-Matthes, 1988, J. Immunol. Procedures, 115:61), o midiendo la dosis letal en modelos animales. Se prefieren los compuestos con un gran índice terapéutico. El índice terapéutico debe ser mayor de 2, preferiblemente al menos 10, más preferiblemente al menos 50.
B. Ejemplo de Resultados del Ensayo Celular Usando (2-Dietilamino-etil)amida del ácido 5-(5-fluoro-2-oxo-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico
Para confirmar la potencia de (2-dietilamino-etil)amida del ácido 5-(5-fluoro-2-oxo-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (Compuesto 35) detectada en ensayos bioquímicos (véase a continuación), la capacidad de dicho compuesto para inhibir la fosforilación de RTK dependiente de ligando se evaluó en ensayos basados en células usando células de ratón NIH-3T3 modificadas genéticamente para sobreexpresar Flk-1 o PDGFR\beta humano. La (2-dietilamino-etil)amida del ácido 5-(5-fluoro-2-oxo-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (Compuesto 35) inhibió la fosforilación de tirosina Flk-1 dependiente de VEGF con un valor de CI_{50} de aproximadamente 0,03 \muM. Este valor es similar al valor de K_{i} de 0,009 \muM determinado para la inhibición de Flk-1 por (2-dietilamino-etil)amida del ácido 5-(5-fluoro-2-oxo-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (Compuesto 35) determinada en ensayos bioquímicos. Esto indica que (2-dietilamino-etil)amida del ácido 5-(5-fluoro-2-oxo-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (Compuesto 35) penetra fácilmente en las células. Consistente con los datos bioquímicos (véase a continuación) indicando que (2-dietilamino-etil)amida del ácido 5-(5-fluoro-2-oxo-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (Compuesto 35) tenía una actividad comparable contra Flk-1 y PDGFR\beta, se encontró también que inhibía la fosforilación del receptor dependiente de PDGF en células con un valor de CI_{50} de aproximadamente 0,03 \muM. La capacidad de (2-dietilamino-etil)amida del ácido 5-(5-fluoro-2-oxo-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (Compuesto 35) para inhibir c-kit, una RTK muy relacionada que se une con el factor de célula madre (SCF), se determinó usando células MO7E que expresan este receptor. En estas células, (2-dietilamino-etil)amida del ácido 5-(5-fluoro-2-oxo-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (Compuesto 35) inhibió la fosforilación de c-kit dependiente de SCF con un valor de CI_{50} de 0,01-0,1 \muM. Este compuesto inhibió también la fosforilación de c-kit estimulada por SCF en blastos de leucemia mieloide aguda (AML) asilados de sangre periférica de pacientes.
Además de ensayar la capacidad de (2-dietilamino-etil)amida del ácido 5-(5-fluoro-2-oxo-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (Compuesto 35) para inhibir la fosforilación del receptor dependiente de ligando en las células, se examinó también su efecto in vitro sobre la respuesta proliferativa dependiente de ligando de las células (véase la Tabla 4). En estos estudios, se indujo a las células inactivadas durante una noche por privación de suero a someterse a síntesis de ADN tras la adición del ligando mitógeno apropiado. Como se muestra en la Tabla 4, (2-dietilamino-etil)amida del ácido 5-(5-fluoro-2-oxo-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (Compuesto 35) inhibió la proliferación de células NIH-3T3 inducida por PDGF que sobreexpresan PDGFR\beta o PDGFR\alpha con valores de CI_{50} de 0,031 y 0,069 \muM, respectivamente, y la proliferación de células MO7E inducida por SCF con un valor de CI_{50} de 0,007 \muM.
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TABLA 4
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Como se muestra en la Tabla 4, hay un acuerdo general entre las actividades bioquímicas y celulares de (2-dietilamino-etil)amida del ácido 5-(5-fluoro-2-oxo-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (Compuesto 35) que respaldan la conclusión de que este compuesto cruza las membranas celulares. Además, puede concluirse que las respuestas celulares son un resultado de la actividad del compuesto 35 contra la diana indicada. En contraste, cuando se ensaya en presencia de medio de crecimiento completo, in vitro, se requirieron concentraciones sustancialmente superiores de (2-dietilamino-etil)amida del ácido 5-(5-fluoro-2-oxo-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (Compuesto 35) (>10 \muM) para inhibir el crecimiento de diversas células tumorales humanas (véase la Tabla 5). Esto indica que el compuesto no inhibía directamente el crecimiento de estas células a las concentraciones requeridas para inhibir la fosforilación del receptor dependiente de ligando y la proliferación celular.
TABLA 5
23
Brevemente, los resultados mostrados en la Tabla 5 se obtuvieron incubando las células durante 48 h en medio de crecimiento completo en presencia de (2-dietilamino-etil)amida del ácido 5-(5-fluoro-2-oxo-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico diluida en serie. Al final del periodo de crecimiento, se determinó la cantidad relativa de células. Los valores de CI_{50} se calcularon como la concentración de compuesto que inhibía el crecimiento de las células en un 50% respecto a las células no tratadas. Los valores de DL_{50} se calcularon como la concentración de compuesto que provocaba una reducción del 50% en la cantidad de células respecto a aquellas que había al comienzo del experimento.
Un ensayo basado en células más pertinente en el que para evaluar el potencial anti-angiogénico de (2-dietilamino-etil)amida del ácido 5-(5-fluoro-2-oxo-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (Compuesto 35) es el ensayo de mitogénesis in vitro usando células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) como un sistema modelo para la proliferación celular endotelial crítica para el procedimiento angiogénico. En este ensayo, una respuesta mitógena, medida como un aumento en la síntesis de ADN, se induce en HUVEC privadas de suero tras la adición de VEGF o FGF. En estas células, (2-dietilamino-etil)amida del ácido 5-(5-fluoro-2-oxo-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (Compuesto 35) inhibió la respuesta mitógena inducida por VEGF y FGF de una manera dependiente de la dosis con valore de CI_{50} de 0,004 mM y 0,7 mM, respectivamente, cuando el compuesto estaba presente durante todas las 48 h del ensayo.
Brevemente, los resultados mencionados anteriormente se obtuvieron usando HUVEC privadas de suero que se incubaron con concentraciones mitógenas de VEGF (100 ng/ml) o FGF (30 ng/ml) en presencia de diluciones en serie de (2-dietilamino-etil)amida del ácido 5-(5-fluoro-2-oxo-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (Compuesto 35) durante 24 h. La respuesta mitógena durante las siguientes 24 h en presencia de ligando e inhibidor se cuantificó midiendo la síntesis de ADN basada en la incorporación de bromodesoxiuridina en el ADN celular.
En experimentos diferentes, el compuesto 35 inhibió la fosforilación de ERK 1/2 (quinasa p42/44MAP) dependiente de VEGF, una diana cadena abajo temprana de Flk-1/KDR, de una manera dependiente de la dosis. Se demostró también que la actividad inhibidora del compuesto 35 era de larga duración en este sistema; inhibiendo la fosforilación de ERK 1/2 dependiente de VEGF durante tanto como 48 horas después de la retirada de (2-dietilamino-etil)amida del ácido 5-(5-fluoro-2-oxo-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (Compuesto 35) del medio después de una corta exposición (2 h) a concentraciones micromolares del compuesto.
Se ha reconocido que VEGF es un factor de supervivencia importante para las células endoteliales. Como (2-dietilamino-etil)amida del ácido 5-(5-fluoro-2-oxo-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (Compuesto 35) inhibe la respuesta mitógena dependiente de VEGF de las HUVEC, se investigó el efecto del compuesto sobre la supervivencia de HUVEC. En estos experimentos, la escisión del sustrato caspasa 3 de poli-ADP-ribosil polimerasa (PARP) se usó como lectura para apoptosis. Las HUVEC cultivadas en condiciones sin suero durante 24 horas presentaron niveles sustanciales de escisión de PARP, detectado por la acumulación del fragmento de escisión de PARP de 23 kDa. Esto se evitó en gran medida mediante la adición de VEGF al medio celular, lo que indicaba que VEGF actúa como factor de supervivencia en este ensayo. Se ha demostrado que (2-dietilamino-etil)amida del ácido 5-(5-fluoro-2-oxo-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (Compuesto 35) inhibe la señalización de KDR. Por consiguiente, (2-dietilamino-etil)amida del ácido 5-(5-fluoro-2-oxo-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (Compuesto 35) inhibía la supervivencia de HUVEC mediada por VEGF de una manera dependiente de la dosis. De esta manera, estos datos indican que el compuesto 35 inducía la apoptosis en células endoteliales en cultivo en presencia de VEGF.
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C. Estudios de Eficacia In vivo i. Eficacia Contra Xenoinjertos de Tumor Establecidos
Se estudió la eficacia in vivo de (2-dietilamino-etil)amida del ácido 5-(5-fluoro-2-oxo-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,9-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (Compuesto 35) en modelos de xenoinjerto subcutáneos (SC) usando células tumorales humanas implantadas en la región del costado trasero de ratones atímicos. Después del implante, se dejó que los tumores se estabilizaran a un tamaño de 100-550 mm^{3} antes de empezar el tratamiento oral con el compuesto.
La administración oral diariamente del compuesto 35 provocó una inhibición dependiente de la dosis del crecimiento de tumores A431 cuando se inició el tratamiento después de que los tumores hubieran crecido hasta un tamaño 400 mm^{3}. La inhibición del crecimiento de tumores estadísticamente significativa (P <0,05) se observó a una dosis de 40 mg/kg/día (inhibición del 74%) y de 80 mg/kg/día (inhibición del 84%) (véase la Tabla 6). En experimentos preliminares, una dosis más alta (160 mg/kg/día) del compuesto no era más eficaz contra los tumores A431 establecidos que la dosis de 80 mg/kg/día. Además, los ratones tratados a la dosis de 160 mg/kg/día del compuesto perdieron peso corporal, lo que indicaba que dosis más altas no se toleraban igual de bien. Se obtuvieron resultados similares en un experimento en el que solo se permitía a los tumores A431 alcanzar un tamaño de 100 mm^{3} (véase la Tabla 5). En este segundo experimento, la regresión completa de los tumores ocurrió en seis de cada ocho animales tratados a la dosis de 80 mg/kg/día durante 21 días. En estos seis animales, los tumores no se desarrollaron durante un periodo de observación de 110 días después del final del tratamiento. En los dos animales en los que los tumores se desarrollaron a un tamaño mayor (2000-3000 mm^{3}), los tumores retrocedieron en respuesta a una segunda vuelta de tratamiento con el compuesto 35. Es importante destacar que en todos los experimentos de eficacia, (2-dietilamino-etil)amida del ácido 5-(5-fluoro-2-oxo-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,9-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (Compuesto 35) a 80 mg/kg/día se toleró bien, incluso cuando se dosificó continuamente durante más de 100 días.
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TABLA 6
24
Brevemente, los resultados mostrados en la Tabla 6 se obtuvieron usando células A431 (0,5 x 106 células/ratón) que se implantaron SC en la región del costado trasero de ratones atímicos. La administración oral diariamente de (2-dietilamino-etil)amida del ácido 5-(5-fluoro-2-oxo-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (Compuesto 35) en un vehículo basado en Cremophor o vehículo de control empezó cuando los tumores alcanzaron el volumen medio indicado. Los tumores ser midieron usando calibres Vernier y el volumen del tumor se calculó como el producto de longitud x anchura x altura. Los valores P se calcularon comparando el tamaño de los tumores para animales que se trataron con el compuesto 35 (n=8) con el de aquellos animales que se trataron con un vehículo (n=16) en el último día del experimento, usando el ensayo de t de Student de dos colas.
La eficacia del compuesto 35 contra tumores humanos establecidos de diferentes orígenes se determinó usando xenoinjertos de Colo205 (carcinoma de colon), SF763T (glioma), y NCI-H460 (carcinoma macrocítico de pulmón) (véase la Tabla 7). Estos experimentos se realizaron usando (2-dietilamino-etil)amida del ácido 5-(5-fluoro-2-oxo-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (Compuesto 35) administrada por vía oral a 80 mg/kg/día; una dosis que era eficaz y se toleraba bien.
TABLA 7
25
En los experimentos mencionados anteriormente, el compuesto 35 se administraba una vez al día a 80 mg/kg en un vehículo basado en Cremophor una vez que los tumores alcanzaron el tamaño indicado. El porcentaje de inhibición comparado con el del grupo de control tratado con vehículo se calculó cuando terminaron los experimentos. Los valores P se calcularon comparando los tamaños del tumor de los animales que se habían tratado con el compuesto con los tamaños del tumor de aquellos animales que se habían tratado con el vehículo, usando el ensayo de t de Student de dos colas.
Aunque (2-dietilamino-etil)amida del ácido 5-(5-fluoro-2-oxo-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pi-
rrol-3-carboxílico (Compuesto 35) inhibía el crecimiento de todos los tipos de tumor mostrados en la Tabla 7, había una diferencia en la respuesta de los diferentes modelos de xenoinjerto. Específicamente, el crecimiento de tumores NCI-H460 y SF763T se detuvo o se ralentizó en gran medida, mientras que los tumores Colo205, tal como los tumores A431, retrocedieron cuando se trataron con (2-dietilamino-etil)amida del ácido 5-(5-fluoro-2-oxo-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico.
Para determinar la base molecular para la diferencia en la respuesta entre modelos de xenoinjerto, se estudiaron los tumores SF763T. Por lo tanto, los tumores SF763T, que eran menos sensibles al tratamiento con (2-dietilamino-etil)amida del ácido 5-(5-fluoro-2-oxo-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico, se han evaluado a nivel molecular usando técnicas inmunohistológicas para determinar el efecto del tratamiento con el compuesto. Estos estudios se realizaron inicialmente en este tipo de tumor porque los tumores SF763T están muy vascularizados con micro-vasos que expresan fuertemente el marcador celular endotelial CD31 y, por lo tanto, son muy adecuados para estudios de densidad de microvasos tumorales (MVD). La evaluación inmunohistológica de tumores SF763T indicaba que los tumores de los animales tratados habían reducido su MVD respecto a los controles tratados con vehículo, lo que es consistente con un mecanismo de acción anti-angiogénico para el compuesto 35; MVD era 24,2 \pm 4,1 en animales tratados con el compuesto 35, comparado con 39,3 \pm 5,7 para aquellos que se trataron sólo con el vehículo. Como se anticipa de la detención del crecimiento de tumores asociada, una inhibición pronunciada de la proliferación celular tumoral era evidente en los tumores que se trataron con el compuesto 35. Estos tumores tenían la mitad del índice mitótico de aquellos en los tumores tratados con vehículo (datos no mostrados). El efecto del compuesto 35 sobre la MVD y la proliferación celular tumoral indica que el compuesto tiene profundos efectos anti-angiogénicos y anti-tumorales, incluso en condiciones en las que los tumores no retroceden.
La capacidad del compuesto 35 para inhibir la fosforilación de PDGFR y posterior señalización in vivo se evaluó también en los tumores SF763T, que expresan altos niveles de PDGFR\beta. El tratamiento de tumores SF763T con el compuesto 35 inhibió fuertemente la fosforilación con tirosina de PDGFR\beta en tumores SF763T establecidos. El compuesto 35 redujo también los niveles de fosfolipasa C gamma (PLC-\gamma) fosforilada (activada), un indicador inmediato cadena debajo de la activación de PDGFR. Estos datos demuestran que la administración oral del compuesto 35 provoca un efecto directo sobre la actividad diana de (PDGFR) en tumores in vivo.
Basado en la demostración de que la capacidad del compuesto 35 para inhibir la señalización en HUVEC dependiente de VEGF in vitro era de larga duración (véase lo anterior), la eficacia del compuesto se evaluó cuando el compuesto se administró con poca frecuencia en el modelo de tumor Colo205. Como se muestra en la Tabla 8, 80 mg/kg (inhibición del 91%) y 40 mg/kg (inhibición del 84%) fueron eficaces cuando se administraron diariamente, pero no cuando se administraron dos veces a la semana. En contraste, una dosis mayor del compuesto 35 (160 mg/kg) inhibía (inhibición del 52%) el crecimiento de tumores Colo205 establecidos cuando se administraba dos veces a la semana, sugiriendo que este compuesto puede demostrar eficacia cuando se administra de forma poco frecuente a una dosis mayor. Debe observarse que los regímenes de dosificación pueden determinarlos los especialistas habituales en la técnica sin excesiva experimentación.
TABLA 8
26
Brevemente, los resultados mostrados en la Tabla 8 se obtuvieron usando células Colo205 (0,5 x 10^{6} células/ratón) que se habían implantado SC en la región del costado trasero de ratones atímicos. La administración oral del compuesto 35 de acuerdo con el programa indicado empezó cuando los tumores alcanzaron 400 mm^{3}. Los tumores se midieron usando calibres Vernier y el volumen del tumor se calculó como el producto de longitud x anchura x altura. Los valores P se calcularon comparando el tamaño de los tumores para animales que se trataron con el compuesto 35 con aquellos de animales que se trataron con un vehículo en el último día del experimento, usando el ensayo de t de Student de dos colas.
ii. Eficacia del Compuesto 35 en un Modelo de Enfermedad Diseminada
Además de soportar el crecimiento sostenido de tumores sólidos primarios, la angiogénesis también es un componente esencial que soporta el desarrollo de la enfermedad diseminada debido a metástasis a partir del tumor primario. El efecto del compuesto 35 sobre el desarrollo de la enfermedad diseminada se examinó en el modelo de colonización de melanoma de pulmón de ratón B16-F1. En este modelo, las células B16-F1 inoculadas por vía intravenosa a través de la vena de la cola de ratones atímicos colonizaron los pulmones y formaron tumores. Como se muestra en la Tabla 8, la administración oral del compuesto 35 a 80 mg/kg/día redujo eficazmente la carga de células B16-F1 en el pulmón como se evalúa midiendo el peso total del pulmón. Estos datos sugieren que el compuesto 35 puede inhibir la enfermedad diseminada in vivo.
TABLA 9
27
Brevemente, los resultados mostrados en la Tabla 9 se obtuvieron usando ratones atímicos que se habían inoculado con células tumorales B16-F1 (5x10^{5} células/ratón) a través de la vena de la cola. Los ratones se trataron diariamente con el compuesto 35 administrado por vía oral a 80 mg/kg/día (n=10) o vehículo (n=18) durante 24 días después de la inoculación de las células tumorales. Al final del periodo de tratamiento, los ratones se sacrificaron y sus pulmones se retiraron y pesaron. El porcentaje de inhibición se calculó comparando el peso del pulmón de aquellos animales que se habían tratado con el compuesto 35, con el peso del pulmón de los animales que sólo se habían tratado con vehículo. Los valores P se determinaron usando el ensayo de t de Student de dos colas.
D. Ejemplos de Actividad Biológica
Los ejemplos de la potencia in vitro de los compuestos de esta invención se muestra en la Tabla 2.
CONCLUSIÓN
En estudios para investigar las características farmacocinéticas de los compuestos de las realizaciones preferidas de la presente invención se ha demostrado que la administración oral de una única dosis de dichos compuestos dio como resultado una alta biodisponibilidad oral en ratones. La buena biodisponibilidad oral y farmacocinética lineal indican que los compuestos de las realizaciones preferidas de las presente invención tienen características farmacocinéticas favorables.
Además, los compuestos de las realizaciones preferidas de la presente invención son potentes inhibidor de la actividad tirosina quinasa de la división del dominio quinasa de las RTK Flk-1/KDR y PDGFR, que están implicadas en angiogénesis, y c-kit de RTK, un receptor para el factor de célula madre (SCF), que está implicado en ciertos cánceres hematológicos. A mayores concentraciones, los compuestos de las realizaciones preferidas de la presente invención inhiben también la actividad tirosina quinasa de FGFR-1, una tercera RTK implicada en la angiogénesis. Consistente con su actividad bioquímica, los compuestos de las realizaciones preferidas de la presente invención inhiben la fosforilación con tirosina dependiente de ligando de las RTK diana y la respuesta mitógena in vitro de células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) estimulada con VEGF o FGF, de células NIH-3T3 que expresan PDGFR estimuladas con PDGF, y de las células MO7E de leucemia mieloide aguda estimuladas con SCF. En contraste, los compuestos de las realizaciones preferidas de la presente invención no inhiben directamente la proliferación de las células tumorales en medio de crecimiento completo excepto a concentraciones de 2 a 3 órdenes de magnitud mayores que las requeridas para inhibir las respuestas mitógenas dependientes de ligando. En estudios de xenoinjerto en ratón, los compuestos de las realizaciones preferidas de la presente invención inhibían el crecimiento de tumores humanos establecidos de diversos orígenes de una manera dependiente de la dosis y a concentraciones que se toleraban bien incluso después de una dosificación prolongada (>100 días). A 80 mg/kg/día, los compuestos de las realizaciones preferidas de la presente invención inducían la regresión de grandes tumores A431 y Colo205 establecidos, y provocaban el la inhibición sustancial del crecimiento o estasis de los tumores SF763T y NCI-H460. En ratones que llevan los tumores SF763T, los compuestos de las realizaciones preferidas de la presente invención provocaban reducciones en la densidad de los microvasos, fosforilación de PDGFR en los tumores, e índice mitótico en las células tumorales. A esta dosis, los compuestos de las realizaciones preferidas de la presente invención inhibían también la colonización del pulmón por células tumorales B16-F1 en un modelo de metástasis tumoral. Los estudios de régimen demostraron que los compuestos de las realizaciones preferidas de la presente invención son más eficaces cuando se administran diariamente. La evidencia directa de la actividad anti-angiogénica de los compuestos de las realizaciones preferidas de la presente invención se detectó en tumores SF763T en los que la densidad de los microvasos se redujo. La evidencia directa de que los compuestos de las realizaciones preferidas de la presente invención inhibían la fosforilación de PDGFR y señalización in vivo se obtuvo también en tumores SF763T.
Tomados conjuntamente, estos datos respaldan la idea de que los compuesto de las realizaciones preferidas de la presente invención administrados por vía oral son agentes anti-angiogénicos para el tratamiento de cánceres, incluyendo tumores sólidos y malignidades hematológicas en las que la angiogénesis y/o señalización mediante c-kit son importantes en la patología de la enfermedad.
Se entenderá que los compuestos, procedimientos y composiciones farmacéuticas de la presente invención son eficaces para modular la actividad de PK y por lo tanto se espera que sean eficaces como agentes terapéuticos contra trastornos relacionados con RTK, CTK y STK.
Todas las patentes y publicaciones mencionadas en la memoria descriptiva son indicativas de los niveles de los especialistas en la técnica a la que pertenece la invención. Todas las patentes y publicaciones se incorporan a este documento por referencia en la misma extensión como si cada publicación individual se indicara específica e individualmente que se incorpora por referencia.
La invención descrita de forma ilustrativa en este documento puede realizarse de forma práctica adecuadamente en ausencia de cualquiera del elemento o elementos, limitación o limitaciones que no se describen específicamente en este documento. De esta manera, por ejemplo, en cada caso en este documento cualquiera de las expresiones "que comprende", "compuesto esencialmente por" y "constituido por" pueden sustituirse por cualquiera de las otras dos expresiones. La expresión y expresiones que se han empleado se usan como términos de descripción y no de limitación, y no hay intención de que el uso de dichos términos y expresiones excluya ningún equivalente de las características mostradas y descritas o partes de las mismas, aunque se reconoce que son posibles diversas modificaciones dentro del alcance de la invención reivindicada. De esta manera, debe entenderse que aunque la presente invención se ha descrito específicamente mediante realizaciones preferidas y características opcionales, los especialistas en la técnica pueden recurrir a la modificación y variación de los conceptos descritos en este documento, y que dichas modificaciones y variaciones se consideran dentro del alcance de esta invención como se define mediante las reivindicaciones adjuntas.
Además, cuando se describen características o aspectos de la invención en términos de grupos de Markush, los especialistas en la técnica entenderán que la invención se describe también, por lo tanto, en términos de cualquier miembro individual o subgrupo de miembros del grupo de Markush. Por ejemplo, si X se describe como seleccionado entre el grupo constituido por bromo, cloro, y yodo, las reivindicaciones para que X sea bromo y las reivindicaciones para que X sea bromo y cloro se describen completamente.
Otras realizaciones están comprendidas en las siguientes reivindicaciones.

Claims (17)

1. Un compuesto de fórmula (I)
28
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la que:
R^{1} se selecciona entre hidrógeno, alquilo (C_{1}-C_{4}), -(CH_{2})_{r}R^{16} y -C(O)NR^{8}R^{9};
R^{2} se selecciona entre hidrógeno, halógeno, arilo y -S(O)_{2}NR^{13}R^{14};
R^{3} se selecciona entre hidrógeno, alquilo (C_{1}-C_{4}), alcoxi (C_{1}-C_{4}), arilo, heteroarilo, y -C(O)R^{15};
R^{4} es hidrógeno;
R^{5} se selecciona entre hidrógeno y alquilo (C_{1}-C_{4});
R^{6} es -C(O)R^{10};
R^{7} se selecciona entre hidrógeno, alquilo (C_{1}-C_{4}) y arilo;
R^{8} y R^{9} se seleccionan independientemente entre hidrógeno, alquilo y arilo;
R^{10} es -N(R^{11})(CH_{2})_{n}R^{12}, en la que n es 1, 2 ó 3, R^{11} es hidrógeno y R^{12} se selecciona entre hidroxi, alcoxi (C_{1}-C_{4}), -C(O)R^{15}, heteroarilo y -NR^{13}R^{14};
R^{13} y R^{14} se seleccionan independientemente entre el grupo constituido por hidrógeno. alquilo (C_{1}-C_{4}), cicloalquilo, arilo y heteroarilo; o
R^{13} y R^{14} pueden combinarse para formar un grupo heterociclo;
R^{15} se selecciona entre el grupo constituido por hidrógeno, hidroxi, alcoxi (C_{1}-C_{4}) y ariloxi;
R^{16} se selecciona entre hidroxi y -C(O)R^{15}; y
r es 2 ó 3;
\vskip1.000000\baselineskip
y en el que:
alcoxi se refiere a O-alquilo u O-cicloalquilo;
ariloxi se refiere a O-arilo u O-heteroarilo;
heteroarilo se refiere a un grupo de anillo monocíclico o condensado de 5 a 12 átomos en el anillo que contiene uno, dos o tres heteroátomos en el anillo seleccionados entre N, O o S, siendo los restantes átomos en el anillo C;
grupo heterociclo se refiere a un radical cíclico saturado de 3 a 8 átomos en el anillo en el que uno o dos átomos en el anillo son heteroátomos seleccionados entre N, O o S(O)_{n} donde n es un número entero de 0 a 2, siendo los restantes átomos en el anillo C,
donde uno o dos átomos de C está opcionalmente sustituidos por un grupo carbonilo;
los grupos alquilo, alcoxi y cicloalquilo están no sustituidos;
los grupos arilo y heteroarilo están opcionalmente sustituidos con uno o dos sustituyentes seleccionados independientemente entre halo, alquilo (C_{1}-C_{4}), trihaloalquilo (C_{1}-C_{4}), hidroxi, mercapto, ciano, N-amido, mono- o dialquil (C_{1}-C_{4})amino, carboxi y N-sulfonamido;
el grupo heterociclo está opcionalmente sustituido con uno o dos sustituyentes seleccionados independientemente entre halo, -alquil (C_{1}-C_{4}), -alquil (C_{1}-C_{4})-carboxi, -alquil (C_{1}-C_{4})-éster, hidroxilo y mono- o dialquil (C_{1}-C_{4})amino.
2. El compuesto de la reivindicación 1, en el que R^{13} y R^{14} se seleccionan independientemente entre hidrógeno, alquilo (C_{1}-C_{4}), heteroarilo y, combinados, -(CH_{2})_{4}-, -(CH_{2})_{5}-, -(CH_{2})_{2}-O-(CH_{2})_{2}- y -(CH_{2})_{2}N(CH_{3})(CH_{2})_{2}-.
3. El compuesto de la reivindicación 1, en el que n es 2 ó 3 y R^{12} es -NR^{13}R^{14} en la que R^{13} y R^{14} son independientemente alquilo (C_{1}-C_{4}).
4. El compuesto de la reivindicación 1, en el que n es 2 ó 3 y R^{12} es -NR^{13}R^{14} en la que R^{13} y R^{14} se combinan para formar un grupo seleccionado entre -(CH_{2})_{4}-, -(CH_{2})_{5}-, -(CH_{2})_{2}-O-(CH_{2})_{2}- o -(CH_{2})_{2}N(CH_{3})(CH_{2})_{2}-.
5. El compuesto de la reivindicación 1, en el que R^{1} es -C(O)NR^{8}R^{9}, en la que R^{8} es hidrógeno y R^{9} es arilo.
6. El compuesto de la reivindicación 1 que tiene por fórmula
29
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
7. El compuesto de la reivindicación 1, que es la sal L-malato de (2-dietilaminoetil)amida del ácido 5-(5-fluoro-2-oxo-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico.
8. El compuesto de la reivindicación 1 que tiene por fórmula
30
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
9. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de la reivindicación 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.
10. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de la reivindicación 6 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.
11. La composición farmacéutica de la reivindicación 10, que comprende la sal L-malato de (2-dietilaminoetil)amida del ácido 5-(5-fluoro-2-oxo-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico.
12. Uso de un compuesto de la reivindicación 1 o 6 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno relacionado con proteína quinasa en un organismo.
13. El uso de la reivindicación 12, en el que dicho trastorno relacionado con proteína quinasa se selecciona entre un trastorno relacionado con una tirosina quinasa receptora, un trastorno relacionado con una tirosina quinasa no receptora y un trastorno relacionado con una serina-treonina quinasa.
14. El uso de la reivindicación 12, en el que dicho trastorno relacionado con proteína quinasa se selecciona entre un trastorno relacionado con EGFR, un trastorno relacionado con PDGFR, un trastorno relacionado con IGFR y un trastorno relacionado con flk.
15. El uso de la reivindicación 12, en el que dicho trastorno relacionado con proteína quinasa es un cáncer seleccionado entre carcinoma de células escamosas, astrocitoma, sarcoma de Kaposi, glioblastoma, cáncer de pulmón, cáncer de vejiga, cáncer de cabeza y cuello, melanoma, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de pulmón microcítico, glioma, cáncer colorectal, cáncer genitourinario y cáncer gastrointestinal.
16. El uso de la reivindicación 12, en el que dicho trastorno relacionado con proteína quinasa se selecciona entre diabetes, un trastorno autoinmune, un trastorno de hiperproliferación, reestenosis, fibrosis, psoriasis, enfermedad de von Heppel-Lindau, osteoartritis, artritis reumatoide, angiogénesis, un trastorno inflamatorio, un trastorno inmunológico y un trastorno cardiovascular.
17. El uso de la reivindicación 12, en el que dicho organismo es un ser humano.
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Families Citing this family (331)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6569868B2 (en) 1998-04-16 2003-05-27 Sugen, Inc. 2-indolinone derivatives as modulators of protein kinase activity
US20040226056A1 (en) * 1998-12-22 2004-11-11 Myriad Genetics, Incorporated Compositions and methods for treating neurological disorders and diseases
JP4865129B2 (ja) 1999-01-13 2012-02-01 ザ・リサーチ・ファウンデーション・オブ・ステイト・ユニバーシティ・オブ・ニューヨーク タンパク質キナーゼ阻害剤を設計するための新規の方法
ME00415B (me) * 2000-02-15 2011-10-10 Pharmacia & Upjohn Co Llc Pirol supstituisani 2-indol protein kinazni inhibitori
US7030219B2 (en) 2000-04-28 2006-04-18 Johns Hopkins University B7-DC, Dendritic cell co-stimulatory molecules
TWI270545B (en) 2000-05-24 2007-01-11 Sugen Inc Mannich base prodrugs of 3-(pyrrol-2-ylmethylidene)-2-indolinone derivatives
AU2001268154A1 (en) 2000-06-02 2001-12-17 Sugen, Inc. Indolinone derivatives as protein kinase/phosphatase inhibitors
WO2002002551A1 (en) * 2000-06-30 2002-01-10 Sugen, Inc. 4-heteroaryl-3-heteroarylidenyl-2-indolinones and their use as protein kinase inhibitors
DE60126997T2 (de) 2000-10-20 2007-10-25 Eisai R&D Management Co., Ltd. Stickstoff-enthaltende aromatische ringverbindungen zur behandlung von tumorerkrankungen
JP2004518669A (ja) * 2000-12-20 2004-06-24 スージェン・インコーポレーテッド ４−アリール置換インドリノン
AR042586A1 (es) * 2001-02-15 2005-06-29 Sugen Inc 3-(4-amidopirrol-2-ilmetiliden)-2-indolinona como inhibidores de la protein quinasa; sus composiciones farmaceuticas; un metodo para la modulacion de la actividad catalitica de la proteinquinasa; un metodo para tratar o prevenir una afeccion relacionada con la proteinquinasa
EP1247809A3 (en) * 2001-03-30 2003-12-17 Pfizer Products Inc. Triazine compounds useful as sorbitol dehydrogenase inhibitors
AU2002303892A1 (en) 2001-05-30 2002-12-09 Jingrong Cui 5-aralkylsulfonyl-3- (pyrrol-2-ylmethylidene)-2-indolinone derivatives as kinase inhibitors
CA2452361A1 (en) * 2001-06-29 2003-01-09 Ab Science Use of tyrosine kinase inhibitors for treating autoimmune diseases
AR038957A1 (es) * 2001-08-15 2005-02-02 Pharmacia Corp Terapia de combinacion para el tratamiento del cancer
EA006445B9 (ru) * 2001-08-15 2017-02-28 Фармация Энд Апджон Компани Кристаллы, содержащие соль яблочной кислоты n-[2-(диэтиламино)этил]-5-[(5-фторо-2-оксо-1,2-дигидро-3h-индол-3-илиден)метил]-2,4-диметил-1h-пиррол-3-карбоксамида, способы их получения и их композиции
BR0212435A (pt) 2001-09-10 2004-08-17 Sugen Inc Derivados de 3-(4,5,6,7-tetraidroindol-2-ilmetilideno)-2-indolinona como inibidores de cinase
WO2003031438A1 (en) * 2001-10-10 2003-04-17 Sugen, Inc. 3-[4-(substituted heterocyclyl)-pyrrol-2-ylmethylidene]-2-indolinone derivatives as kinase inhibitors
US7005445B2 (en) 2001-10-22 2006-02-28 The Research Foundation Of State University Of New York Protein kinase and phosphatase inhibitors and methods for designing them
EP1444204A4 (en) * 2001-10-22 2009-11-04 Univ New York State Res Found INHIBITORS OF PROTEIN KINASES AND PROTEINS PHOSPHATASES, METHODS OF IDENTIFICATION AND METHODS OF USE THEREOF
TWI259081B (en) * 2001-10-26 2006-08-01 Sugen Inc Treatment of acute myeloid leukemia with indolinone compounds
US20030080191A1 (en) * 2001-10-26 2003-05-01 Allen Lubow Method and apparatus for applying bar code information to products during production
US6797825B2 (en) 2001-12-13 2004-09-28 Abbott Laboratories Protein kinase inhibitors
US20030187026A1 (en) 2001-12-13 2003-10-02 Qun Li Kinase inhibitors
AU2002366245A1 (en) * 2001-12-17 2003-06-30 International Barcode Corporation Double-sided bar code doubling as a single bar code
US20050131733A1 (en) * 2001-12-17 2005-06-16 Allen Lubow Sealable individual bar coded packets
EP1458713B1 (en) 2001-12-27 2005-08-24 Theravance, Inc. Indolinone derivatives useful as protein kinase inhibitors
CA2475455A1 (en) * 2002-02-15 2003-08-28 Pharmacia & Upjohn Company Process for preparing indolinone derivatives
WO2003097854A2 (en) * 2002-05-17 2003-11-27 Sugen, Inc. Novel biomarkers of tyrosine kinase inhibitor exposure and activity in mammals
ITMI20021620A1 (it) * 2002-07-23 2004-01-23 Novuspharma Spa Composto ad ativita' antitumorale
WO2004016211A2 (en) * 2002-08-08 2004-02-26 Vanderbilt University Pi3k antagonists as radiosensitizers
AU2003259713A1 (en) * 2002-08-09 2004-02-25 Theravance, Inc. Oncokinase fusion polypeptides associated with hyperproliferative and related disorders, nucleic acids encoding the same and methods for detecting and identifying the same
US20040121407A1 (en) * 2002-09-06 2004-06-24 Elixir Pharmaceuticals, Inc. Regulation of the growth hormone/IGF-1 axis
HN2003000272A (es) * 2002-09-10 2008-07-29 Pharmacia Italia Spa Formulaciones que comprenden un compuesto de indolinona
AR042042A1 (es) * 2002-11-15 2005-06-08 Sugen Inc Administracion combinada de una indolinona con un agente quimioterapeutico para trastornos de proliferacion celular
AU2003302665B2 (en) * 2002-11-15 2009-12-24 Symphony Evolution, Inc. Kinase modulators
US20040209937A1 (en) * 2003-02-24 2004-10-21 Sugen, Inc. Treatment of excessive osteolysis with indolinone compounds
US7452913B2 (en) * 2003-02-24 2008-11-18 Pharmacia & Upjohn Company Polymorphs of pyrrole substituted 2-indolinone protein kinase inhibitors
BRPI0407827B8 (pt) 2003-02-26 2021-05-25 Sugen Inc compostos de aminoeteroarila como inibidores de proteína cinase e respectivos usos
US20040266843A1 (en) * 2003-03-07 2004-12-30 Sugen, Inc. Sulfonamide substituted indolinones as inhibitors of DNA dependent protein kinase (DNA-PK)
US7157577B2 (en) * 2003-03-07 2007-01-02 Sugen Inc. 5-sulfonamido-substituted indolinone compounds as protein kinase inhibitors
JPWO2004080462A1 (ja) * 2003-03-10 2006-06-08 エーザイ株式会社 ｃ−Ｋｉｔキナーゼ阻害剤
US20050043233A1 (en) 2003-04-29 2005-02-24 Boehringer Ingelheim International Gmbh Combinations for the treatment of diseases involving cell proliferation, migration or apoptosis of myeloma cells or angiogenesis
DE10334582A1 (de) * 2003-07-28 2005-02-24 Basf Ag Verfahren zur Herstellung von Maleinsäureanhydrid
WO2005023765A1 (en) * 2003-09-11 2005-03-17 Pharmacia & Upjohn Company Llc Method for catalyzing amidation reactions by the presence of co2
KR20080007520A (ko) * 2003-10-02 2008-01-21 파마시아 앤드 업존 캄파니 엘엘씨 피롤-치환된 인돌리논 화합물의 염 및 다형체
SI1680140T1 (sl) * 2003-10-16 2011-08-31 Imclone Llc Inhibitorji receptorja-1 za fibroblastni rastni faktor in metode za zdravljenje z le-temi
JP4890255B2 (ja) 2003-11-07 2012-03-07 ノバルティス バクシンズ アンド ダイアグノスティックス，インコーポレーテッド 改良された薬物特性を有するキノリノン化合物の薬学的に受容可能な塩
WO2005044788A1 (ja) 2003-11-11 2005-05-19 Eisai Co., Ltd. ウレア誘導体およびその製造方法
EP1686987A4 (en) * 2003-11-26 2009-02-25 Scripps Research Inst ADVANCED PROTEIN KINASE HEMMER ON INDOLINO BASIS
EP1699477A2 (en) * 2003-12-11 2006-09-13 Theravance, Inc. Compositions for use in the treatment of mutant receptor tyrosine kinase driven cellular proliferative diseases
US20050152943A1 (en) * 2003-12-23 2005-07-14 Medtronic Vascular, Inc. Medical devices to treat or inhibit restenosis
WO2005118543A1 (ja) * 2004-06-03 2005-12-15 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. キナーゼ阻害薬およびその用途
WO2006002422A2 (en) 2004-06-24 2006-01-05 Novartis Vaccines And Diagnostics Inc. Compounds for immunopotentiation
SE0401790D0 (sv) * 2004-07-07 2004-07-07 Forskarpatent I Syd Ab Tamoxifen response in pre- and postmenopausal breast cancer patients
US20060009510A1 (en) * 2004-07-09 2006-01-12 Pharmacia & Upjohn Company Llc Method of synthesizing indolinone compounds
PL1786785T3 (pl) * 2004-08-26 2010-08-31 Pfizer Enancjomerycznie czyste związki aminoheteroarylowe jako kinazy białkowe
KR20070053205A (ko) 2004-09-17 2007-05-23 에자이 알앤드디 매니지먼트 가부시키가이샤 의약 조성물
CN100432071C (zh) * 2004-11-05 2008-11-12 中国科学院上海药物研究所 取代1h－吲哚－2－酮类化合物及其制备方法和用途
GT200500321A (es) 2004-11-09 2006-09-04 Compuestos y composiciones como inhibidores de proteina kinase.
BRPI0607579A2 (pt) * 2005-03-23 2009-09-15 Pfizer Prod Inc uso de anticorpo anti-ctla4 e indolinona para a preparação de medicamentos para o tratamento de cáncer
KR100990027B1 (ko) 2005-04-26 2010-10-26 화이자 인코포레이티드 Ｐ-카드헤린 항체
RU2007141654A (ru) * 2005-05-12 2009-05-20 Пфайзер Инк. (US) Противоопухолевая комбинированная терапия, в которой используется сунитиниб-малат
CN102304086B (zh) 2005-05-18 2013-12-04 阵列生物制药公司 Mek的杂环抑制剂及其使用方法
MX2007014782A (es) 2005-05-23 2008-02-19 Novartis Ag Formas cristalinas y otras formas de las sales de acido lactico de 4-amino-5-fluoro-3-[6-(4-metilpiperazin-1-il)-1h-bencimidazol-2 -il]-1h quinolin-2-ona.
JP2008542294A (ja) * 2005-05-26 2008-11-27 ザ スクリプス リサーチ インスティテュート 向上したインドリノン系プロテインキナーゼ阻害剤
US20100105031A1 (en) * 2005-08-01 2010-04-29 Esai R & D Management Co., Ltd. Method for prediction of the efficacy of vascularization inhibitor
WO2007015578A1 (ja) 2005-08-02 2007-02-08 Eisai R & D Management Co., Ltd. 血管新生阻害物質の効果を検定する方法
RS54393B1 (en) 2005-09-07 2016-04-28 Amgen Fremont Inc. HUMAN MONOCLONAL ANTIBODIES ON KINASE-1 SIMILAR TO ACTIVE RECEPTOR
ES2328407T3 (es) * 2005-09-19 2009-11-12 Pfizer Products Incorporated Formas salinas solidas de una 2-indolinona sustituida con pirrol.
US20090053236A1 (en) * 2005-11-07 2009-02-26 Eisai R & D Management Co., Ltd. USE OF COMBINATION OF ANTI-ANGIOGENIC SUBSTANCE AND c-kit KINASE INHIBITOR
UA96139C2 (uk) 2005-11-08 2011-10-10 Дженентек, Інк. Антитіло до нейропіліну-1 (nrp1)
CN101389331A (zh) * 2005-12-29 2009-03-18 斯克里普斯研究学院 基于吲哚满酮的氨基酸衍生物的蛋白激酶抑制剂
JO2660B1 (en) 2006-01-20 2012-06-17 نوفارتيس ايه جي Pi-3 inhibitors and methods of use
CN101007801A (zh) * 2006-01-27 2007-08-01 上海恒瑞医药有限公司 吡咯取代的2－二氢吲哚酮衍生物、其制法与医药上的用途
TW200808739A (en) 2006-04-06 2008-02-16 Novartis Vaccines & Diagnostic Quinazolines for PDK1 inhibition
TW200813091A (en) 2006-04-10 2008-03-16 Amgen Fremont Inc Targeted binding agents directed to uPAR and uses thereof
WO2007124288A1 (en) 2006-04-19 2007-11-01 Novartis Ag Indazole compounds and methods for inhibition of cdc7
JP4383525B2 (ja) 2006-05-09 2009-12-16 ファイザー・プロダクツ・インク シクロアルキルアミノ酸誘導体およびその医薬組成物
RU2448708C3 (ru) * 2006-05-18 2017-09-28 Эйсай Ар Энд Ди Менеджмент Ко., Лтд. Противоопухолевое средство против рака щитовидной железы
DE102006024834B4 (de) * 2006-05-24 2010-07-01 Schebo Biotech Ag Neue Indol-Pyrrol-Derivate und deren Verwendungen
US7838542B2 (en) 2006-06-29 2010-11-23 Kinex Pharmaceuticals, Llc Bicyclic compositions and methods for modulating a kinase cascade
WO2008001956A1 (fr) * 2006-06-29 2008-01-03 Eisai R & D Management Co., Ltd. Agent thérapeutique contre la fibrose hépatique
AU2007272330A1 (en) 2006-07-13 2008-01-17 Zymogenetics, Inc. Interleukin 21 and tyrosine kinase inhibitor combination therapy
CL2007002225A1 (es) 2006-08-03 2008-04-18 Astrazeneca Ab Agente de union especifico para un receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (pdgfr-alfa); molecula de acido nucleico que lo codifica; vector y celula huesped que la comprenden; conjugado que comprende al agente; y uso del agente de un
CL2007002261A1 (es) 2006-08-04 2008-05-02 Takeda Pharmaceutical Compuestos derivados de imidazo[1,2-b]piridazina, inhibidores de quinasa; composicion farmaceutica; y uso en el tratamiento o prevencion del cancer.
PL2057156T3 (pl) 2006-08-23 2017-08-31 Kudos Pharmaceuticals Limited Pochodne 2-metylomorfolinowe pirydo-, pirazo- i pirymido-pirymidyny jako inhibitory mTOR
WO2008026748A1 (fr) 2006-08-28 2008-03-06 Eisai R & D Management Co., Ltd. Agent antitumoral pour cancer gastrique non différencié
ES2565683T3 (es) 2006-09-15 2016-04-06 Xcovery, Inc. Compuestos inhibidores de quinasa
WO2008056634A1 (fr) * 2006-11-06 2008-05-15 Theravalues Corporation Nouveau dérivé d'hydroxyindole
MY146474A (en) 2006-11-06 2012-08-15 Supergen Inc Imidazo[1,2-b]pyridazine and pyrazolo[1,5-a]pyrimidine derivatives and their use as protein kinase inhibitors
WO2008067756A1 (fr) 2006-12-04 2008-06-12 Jiangsu Simcere Pharmaceutical R & D Co., Ltd. Dérivés de 3-pyrrolo-cyclohexylène-2-dihydro-indolinone et utilisations de ceux-ci
CN101600694A (zh) 2007-01-29 2009-12-09 卫材R&D管理有限公司 未分化型胃癌治疗用组合物
JP4523073B2 (ja) 2007-02-06 2010-08-11 ファイザー・インク 癌を治療するためのＨＳＰ−９０阻害剤としての２−アミノ−５，７−ジヒドロ−６Ｈ−ピロロ［３，４−ｄ］ピリミジン誘導体
JPWO2008114819A1 (ja) 2007-03-20 2010-07-08 大日本住友製薬株式会社 新規アデニン化合物
US20090004213A1 (en) * 2007-03-26 2009-01-01 Immatics Biotechnologies Gmbh Combination therapy using active immunotherapy
US20090042906A1 (en) * 2007-04-26 2009-02-12 Massachusetts Institute Of Technology Methods for treating cancers associated with constitutive egfr signaling
WO2008138184A1 (fr) 2007-05-14 2008-11-20 Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co.Ltd. Dérivés de pyrrolo-azacycles, leur procédé de fabrication et leur utilisation en tant qu'inhibiteurs de protéine kinases
WO2008145398A1 (en) * 2007-06-01 2008-12-04 Pfizer Italia S.R.L. 4-arylpyrrole substituted 2-indoline derivatives active as protein kinase inhibitors
CL2008001626A1 (es) 2007-06-05 2009-06-05 Takeda Pharmaceuticals Co Compuestos derivados de heterociclos fusionados, agente farmaceutico que los comprende y su uso en la profilaxis y tratamiento del cancer.
US8324395B2 (en) 2007-08-23 2012-12-04 Takeda Pharmaceutical Company Limited Heterocyclic compound and use thereof
US20090062368A1 (en) * 2007-08-29 2009-03-05 Protia, Llc Deuterium-enriched sunitinib
HUE030774T2 (hu) * 2007-09-06 2017-05-29 Boston Biomedical Inc Kinázinhibitorokból álló készítmények és felhasználásuk a rák és a kinázokhoz kapcsolódó más betegségek kezelésére
KR101494734B1 (ko) 2007-10-11 2015-02-26 아스트라제네카 아베 단백질 키나제 ｂ 억제제로서 피롤로[2,3-ｄ]피리미딘 유도체
JP5638244B2 (ja) 2007-11-09 2014-12-10 エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 血管新生阻害物質と抗腫瘍性白金錯体との併用
US20100256392A1 (en) * 2007-11-21 2010-10-07 Teva Pharmaceutical Industries Ltd. Polymorphs of sunitinib base and processes for preparation thereof
WO2009067686A2 (en) * 2007-11-21 2009-05-28 Teva Pharmaceutical Industries Ltd. Sunitinib hemi-l-malate, polymorphs and preparation thereof, polymorphs of racemic sunitinib malate, compositins containing sunitinib base and malic acid and preparation thereof
CA2709083A1 (en) * 2007-12-12 2009-06-18 Medichem S.A. Polymorphic forms of a 3-pyrrole substituted 2-indolinone
DK2222675T3 (da) 2007-12-19 2013-11-04 Genentech Inc 5-anilinoimidazopyridiner og fremgangsmåder til deres anvendelse
EP2240475B1 (en) 2007-12-20 2013-09-25 Novartis AG Thiazole derivatives used as pi 3 kinase inhibitors
JP5710269B2 (ja) 2007-12-21 2015-04-30 ジェネンテック， インコーポレイテッド アザインドリジン類と使用方法
JP5399926B2 (ja) * 2008-01-29 2014-01-29 エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 血管阻害物質とタキサンとの併用
EP2113248A1 (en) 2008-04-29 2009-11-04 Ratiopharm GmbH Pharmaceutical composition comprising N-[2-(diethylamino)ethyl]-5-[(5-fluoro-1,2-dihydro-2-oxo-3H-indol-3-ylidene)methyl]-2-,4-dimethyl-1H-pyrrole-3-carboxamide
EP2090306A1 (en) 2008-02-13 2009-08-19 Ratiopharm GmbH Pharmaceutical compositions comprising N-[2-(diethylamino)ethyl]-5-[(5-fluoro-1,2-dihydro-2-oxo-3H-indol-3-ylidene)methyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrole-3-carboxamide
US20100310668A1 (en) * 2008-02-13 2010-12-09 Ratiopharm Gmbh Pharmaceutical compositions comprising n-[2-(diethylamino)ethyl]-5-[(5-fluoro-1,2-dihydro-2-oxo-3h-indol-3-ylidene)methyl]-2,4-dimethyl-1h-pyrrole-3-carboxamide
CN101255154B (zh) * 2008-02-18 2011-09-07 靳广毅 一种取代的2-吲哚啉酮衍生物和制备方法及其应用
US20110112164A1 (en) * 2008-02-21 2011-05-12 Generics (Uk) Limited Novel polymorphs and processes for their preparation
EP2098521A1 (en) * 2008-03-06 2009-09-09 Ratiopharm GmbH Crystal forms of N-[2-(diethylamino) ethyl]-5-[fluoro-1,2-dihydro-2-oxo-3H-indol-3-ylidene)methyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrolle-3-carboxamide and methods for their prepparation
ES2391501T3 (es) * 2008-03-31 2012-11-27 Teva Pharmaceutical Industries Ltd. Procedimientos para preparar sunitinib y sales del mismo
WO2009128083A1 (en) * 2008-04-16 2009-10-22 Natco Pharma Limited Novel polymorphic forms of sunitinib base
US8158656B2 (en) * 2008-05-16 2012-04-17 Shenzhen Chipscreen Biosciences Ltd. 2-indolinone derivatives as multi-target protein kinase inhibitors and histone deacetylase inhibitors
CN102066362B (zh) * 2008-05-23 2014-07-30 上海医药工业研究院 二氢吲哚酮衍生物
WO2009154697A2 (en) 2008-05-28 2009-12-23 Massachusetts Institute Of Technology Disc-1 pathway activators in the control of neurogenesis
SI2313371T1 (sl) * 2008-06-13 2013-02-28 Medichem, S.A. Postopek za pripravo soli 3-pirol substituirane 2-indolinonske jabolčne kisline
WO2009157011A1 (en) * 2008-06-23 2009-12-30 Natco Pharma Limited Process for the preparation of high purity sunitinib and its pharmaceutically acceptable salt
EP2138167A1 (en) * 2008-06-24 2009-12-30 ratiopharm GmbH Pharmaceutical composition comprising N-[2-(Diethylamino)ethyl]-5-[(5-fluoro-1,2-dihydro-2-oxo-3H-indol-3-ylidene) methyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrole-3-carboxamide
WO2009156837A2 (en) * 2008-06-26 2009-12-30 Medichem, S.A. Amorphous form of a 3-pyrrole substituted 2-indolinone malate salt
DE102008031038A1 (de) 2008-06-30 2009-12-31 Alexander Priv.-Doz. Dr. Dömling Sutent zur Anwendung in der Organtransplantation
MX2011000150A (es) * 2008-06-30 2011-04-05 Cylene Pharmaceuticals Inc Compuestos de oxoindol.
KR20110036101A (ko) 2008-06-30 2011-04-06 안지오블라스트 시스템스 인코퍼레이티드 조합된 치료를 사용한 안과질환 및 과도한 혈관신생의 치료
AU2009265360A1 (en) * 2008-07-02 2010-01-07 Generics [Uk] Limited Preparation of 3-pyrrole substituted 2-indolinone derivatives
WO2010004339A1 (en) * 2008-07-10 2010-01-14 Generics [Uk] Limited Processes for the preparation of crystalline forms of sunitinib malate
EP2342195B1 (en) 2008-07-24 2014-09-10 Medichem, S.A. Crystalline forms of a 3-pyrrole substituted 2-indolinone malate salt
CA2731605A1 (en) * 2008-07-24 2010-01-28 Teva Pharmaceutical Industries Ltd. Sunitinib and salts thereof and their polymorphs
WO2010017541A2 (en) * 2008-08-08 2010-02-11 The Johns Hopkins University Compositions and methods for treatment of neurodegenerative disease
WO2010027828A2 (en) * 2008-08-25 2010-03-11 Amplimmune, Inc. Pd-1 antagonists and methods of use thereof
PL2350129T3 (pl) 2008-08-25 2015-12-31 Amplimmune Inc Kompozycje antagonistów PD-1 i sposoby stosowania
US20110263670A1 (en) * 2008-08-25 2011-10-27 Vinayak Gore Novel polymorphs of sunitinib and processes for their preparation
WO2010023473A2 (en) * 2008-08-25 2010-03-04 Generics [Uk] Limited Novel crystalline form and processes for its preparation
WO2010026388A1 (en) * 2008-09-05 2010-03-11 Imperial Innovations Limited Isatin derivatives for use as in vivo imaging agents
JP5778577B2 (ja) 2008-09-19 2015-09-16 メディミューン，エルエルシー Ｄｌｌ４に対する抗体およびその使用
AR073807A1 (es) * 2008-10-10 2010-12-01 Medichem Sa Proceso para preparar el malato de sunitinib, sal de un acido mas debil que el malato como compuesto intermediario, y proceso para preparar dicha sal intermediaria.
EP2181991A1 (en) * 2008-10-28 2010-05-05 LEK Pharmaceuticals D.D. Novel salts of sunitinib
EP2186809A1 (en) * 2008-11-13 2010-05-19 LEK Pharmaceuticals D.D. New crystal form of sunitinib malate
US20100222371A1 (en) * 2008-11-20 2010-09-02 Children's Medical Center Corporation Prevention of surgical adhesions
JP5579619B2 (ja) 2008-12-01 2014-08-27 武田薬品工業株式会社 複素環化合物およびその用途
JO3101B1 (ar) 2008-12-02 2017-09-20 Takeda Pharmaceuticals Co مشتقات بنزوثيازول كعوامل مضادة للسرطان
TW201028410A (en) 2008-12-22 2010-08-01 Astrazeneca Ab Chemical compounds 610
CA2748158A1 (en) 2008-12-23 2010-07-01 Astrazeneca Ab Targeted binding agents directed to .alpha.5.beta.1 and uses thereof
EP2373643A4 (en) 2009-01-02 2013-08-07 Hetero Research Foundation NEW SUNITINIB MALATE POLYMORPHS
KR20240011244A (ko) 2009-01-16 2024-01-25 엑셀리시스, 인코포레이티드 암의 치료를 위한 ｎ-（４-｛〔６，７-비스（메틸옥시）퀴놀린-4-일〕옥시｝페닐）-ｎ＇-（４-플루오로페닐）사이클로프로판-1,1-디카르복사미드의 말산염 및 그 결정형
NZ594177A (en) 2009-02-05 2014-02-28 Immunogen Inc Novel benzodiazepine derivatives
EP2393814A1 (en) 2009-02-09 2011-12-14 SuperGen, Inc. Pyrrolopyrimidinyl axl kinase inhibitors
TW201035088A (en) 2009-02-27 2010-10-01 Supergen Inc Cyclopentathiophene/cyclohexathiophene DNA methyltransferase inhibitors
US9265764B2 (en) * 2009-02-27 2016-02-23 Massachusetts Institute Of Technology Uses of chemicals to modulate GSK-3 signaling for treatment of bipolar disorder and other brain disorders
CA2755061A1 (en) 2009-03-13 2010-09-16 Cellzome Limited Pyrimidine derivatives as mtor inhibitors
WO2010108503A1 (en) 2009-03-24 2010-09-30 Life & Brain Gmbh Promotion of neuronal integration in neural stem cell grafts
CA2758614A1 (en) 2009-04-14 2010-10-21 Cellzome Limited Fluoro substituted pyrimidine compounds as jak3 inhibitors
US8530492B2 (en) 2009-04-17 2013-09-10 Nektar Therapeutics Oligomer-protein tyrosine kinase inhibitor conjugates
EP2255792A1 (en) 2009-05-20 2010-12-01 Ratiopharm GmbH Pharmaceutical compositions for N-[2-(Diethylamino)ethyl]5-[(fluoro-1,2-dihydro-2-oxo-3H-indole-3-ylidene) methyl]-2,4-dimenthyl-1H-pyrrole-3-carboxamide
US8211901B2 (en) 2009-05-22 2012-07-03 Shenzhen Chipscreen Biosciences Ltd. Naphthamide derivatives as multi-target protein kinase inhibitors and histone deacetylase inhibitors
EP2264027A1 (en) * 2009-05-27 2010-12-22 Ratiopharm GmbH Process for the preparation of N-[2-(Diethylamino)ethyl]-5-[(5-fluoro-1,2-dihydro-2-oxo-3H-indol-3-ylidene) methyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrole-3-carboxamide
US8389580B2 (en) 2009-06-02 2013-03-05 Duke University Arylcyclopropylamines and methods of use
CN101906076B (zh) 2009-06-04 2013-03-13 深圳微芯生物科技有限责任公司 作为蛋白激酶抑制剂和组蛋白去乙酰化酶抑制剂的萘酰胺衍生物、其制备方法及应用
US8293753B2 (en) 2009-07-02 2012-10-23 Novartis Ag Substituted 2-carboxamide cycloamino ureas
WO2011004200A1 (en) 2009-07-10 2011-01-13 Generics [Uk] Limited Novel pyrrole derivatives
FR2948940B1 (fr) * 2009-08-04 2011-07-22 Servier Lab Nouveaux derives dihydroindolones, leur procede de preparation et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent
WO2011029807A1 (en) 2009-09-11 2011-03-17 Cellzome Limited Ortho substituted pyrimidine compounds as jak inhibitors
AU2010296849A1 (en) 2009-09-16 2012-05-03 Ranbaxy Laboratories Limited Salts of sunitinib
TW201125867A (en) 2009-10-20 2011-08-01 Cellzome Ltd Heterocyclyl pyrazolopyrimidine analogues as JAK inhibitors
EP2499133A2 (en) 2009-11-12 2012-09-19 Ranbaxy Laboratories Limited Process for the preparation of crystalline form i of l-malic acid salt of sunitinib
US8916716B2 (en) 2009-11-19 2014-12-23 Ranbaxy Laboratories Limited Process for the preparation of crystalline form II of L-malic acid salt of sunitinib
CA2778714C (en) 2009-11-24 2018-02-27 Medimmune Limited Targeted binding agents against b7-h1
WO2011068233A1 (en) 2009-12-03 2011-06-09 Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd. Imidazoquinolines which act via toll - like receptors (tlr)
WO2013022801A1 (en) 2011-08-05 2013-02-14 Forsight Vision4, Inc. Small molecule delivery with implantable therapeutic device
WO2011095802A1 (en) 2010-02-02 2011-08-11 Generics [Uk] Limited Hplc method for analyzing sunitinib
WO2011100325A2 (en) * 2010-02-09 2011-08-18 Sicor Inc. Polymorphs of sunitinib salts
AU2011215900A1 (en) 2010-02-10 2012-07-26 Immunogen, Inc. CD20 antibodies and uses thereof
RU2012139182A (ru) 2010-02-22 2014-03-27 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг ПИРИДО[3,2-d]ПИРИМИДИНЫ - ИНГИБИТОРЫ PI3К ДЕЛЬТА И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
WO2011104555A2 (en) 2010-02-25 2011-09-01 Generics [Uk] Limited Novel process
ES2535116T3 (es) 2010-03-04 2015-05-05 Cellzome Limited Derivados de urea sustituida con morfolino como inhibidores de mtor
AU2011222470A1 (en) 2010-03-04 2012-09-27 Ranbaxy Laboratories Limited Process for the direct preparation of malic acid salt of sunitinib
CN102858739A (zh) * 2010-03-10 2013-01-02 斯索恩有限公司 酰胺化吡咯甲酸酯化合物的方法
AU2011228765A1 (en) 2010-03-18 2012-10-11 Ranbaxy Laboratories Limited Process for the preparation of malic acid salt of sunitinib
EP2550263A4 (en) 2010-03-23 2013-07-24 Univ Johns Hopkins COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING NEURODEGENERATIVE DISEASE
WO2011128699A2 (en) * 2010-04-16 2011-10-20 Generics [Uk] Limited Novel process
SG184989A1 (en) 2010-04-30 2012-11-29 Cellzome Ltd Pyrazole compounds as jak inhibitors
WO2011138565A1 (fr) 2010-05-05 2011-11-10 Biorebus Association pharmaceutique contenant l'acide lipoïque, l'acide hydroxycitrique et une somatostatine a titre de principes actifs
EP2392324A1 (en) 2010-06-01 2011-12-07 Societe De Coordination De Recherches Therapeutiques Rhenium complexes and their pharmaceutical use
SA111320519B1 (ar) 2010-06-11 2014-07-02 Astrazeneca Ab مركبات بيريميدينيل للاستخدام كمثبطات atr
CA2802644C (en) 2010-06-25 2017-02-21 Eisai R & D Management Co., Ltd. Antitumor agent using compounds having kinase inhibitory effect in combination
EP2588105A1 (en) 2010-07-01 2013-05-08 Cellzome Limited Triazolopyridines as tyk2 inhibitors
WO2012006503A1 (en) 2010-07-09 2012-01-12 Genentech, Inc. Anti-neuropilin antibodies and methods of use
AR082418A1 (es) 2010-08-02 2012-12-05 Novartis Ag Formas cristalinas de 1-(4-metil-5-[2-(2,2,2-trifluoro-1,1-dimetil-etil)-piridin-4-il]-tiazol-2-il)-amida de 2-amida del acido (s)-pirrolidin-1,2-dicarboxilico
US9040545B2 (en) 2010-08-20 2015-05-26 Cellzome Limited Heterocyclyl pyrazolopyrimidine analogues as selective JAK inhibitors
WO2012027716A1 (en) 2010-08-27 2012-03-01 Collabrx, Inc. Method to treat melanoma in braf inhibitor-resistant subjects
WO2012042421A1 (en) 2010-09-29 2012-04-05 Pfizer Inc. Method of treating abnormal cell growth
EP2635568B1 (en) 2010-11-01 2017-08-16 Scinopharm (Kunshan) Biochemical Technology Co., Ltd. Processes for the preparation of 3-(pyrrol-2-yl)methylene)-2-pyrrolones using 2-silyloxy-pyrroles
WO2012059941A1 (en) * 2010-11-04 2012-05-10 Ind-Swift Laboratories Limited Process for preparation of sunitinib malate and salts thereof
EP2638018A1 (en) 2010-11-09 2013-09-18 Cellzome Limited Pyridine compounds and aza analogues thereof as tyk2 inhibitors
EP2640384A1 (en) 2010-11-18 2013-09-25 Synta Pharmaceuticals Corp. Preselection of subjects for therapeutic treatment with oxygen sensitive agents based on hypoxic status
EP2640360A2 (en) 2010-11-19 2013-09-25 Forsight Vision4, Inc. Therapeutic agent formulations for implanted devices
AR083868A1 (es) 2010-12-03 2013-03-27 Lilly Co Eli Compuestos de oxazol[5,4-b]piridin-5-ilo
JP6009457B2 (ja) 2010-12-23 2016-10-19 ネクター セラピューティクス ポリマー−デスエチルスニチニブコンジュゲート
JP6002149B2 (ja) 2010-12-23 2016-10-05 ネクター セラピューティクス ポリマー−スニチニブコンジュゲート
UY33883A (es) 2011-01-31 2012-08-31 Novartis Ag Novedosos derivados heterocíclicos
US9353127B2 (en) 2011-02-15 2016-05-31 Immunogen, Inc. Methods of preparation of conjugates
JP5937112B2 (ja) 2011-02-17 2016-06-22 カンサー・セラピューティクス・シーアールシー・プロプライエタリー・リミテッドＣａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｃｒｃ Ｐｔｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ 選択的ｆａｋ阻害剤
WO2012110773A1 (en) 2011-02-17 2012-08-23 Cancer Therapeutics Crc Pty Limited Fak inhibitors
GB201103578D0 (en) 2011-03-02 2011-04-13 Sabrepharm Ltd Dipyridinium derivatives
US8630703B2 (en) 2011-03-09 2014-01-14 Technion Research & Development Foundation Limited Treatment utilizing hydrophobic weak bases chemotherapeutic agents and illumination
CN102115469A (zh) * 2011-03-21 2011-07-06 浙江大学 吲哚啉-2-酮类衍生物的制备和用途
JP2014510122A (ja) 2011-04-04 2014-04-24 セルゾーム リミテッド ｍＴＯＲ阻害剤としてのジヒドロピロロピリミジン誘導体
CN103945696B (zh) * 2011-04-08 2016-06-29 贝达医药公司 新颖吲哚啉酮蛋白激酶抑制剂
CA2828946C (en) 2011-04-18 2016-06-21 Eisai R&D Management Co., Ltd. Therapeutic agent for tumor
WO2012143320A1 (en) 2011-04-18 2012-10-26 Cellzome Limited (7h-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-2-yl)amine compounds as jak3 inhibitors
CN102898402B (zh) * 2011-04-26 2016-01-20 北京大学 一种苯并异硒唑酮修饰的吡咯甲酸酯取代的吲哚酮类化合物及其应用
WO2012166899A2 (en) 2011-06-03 2012-12-06 Eisai R&D Management Co., Ltd. Biomarkers for predicting and assessing responsiveness of thyroid and kidney cancer subjects to lenvatinib compounds
PL3409278T3 (pl) 2011-07-21 2021-02-22 Sumitomo Pharma Oncology, Inc. Heterocykliczne inhibitory kinazy białkowej
KR20140047092A (ko) 2011-07-28 2014-04-21 셀좀 리미티드 Jak 억제제로서의 헤테로시클릴 피리미딘 유사체
WO2013017479A1 (en) 2011-07-29 2013-02-07 Cellzome Limited Pyrazolo[4,3-c]pyridine derivatives as jak inhibitors
WO2013017480A1 (en) 2011-07-29 2013-02-07 Cellzome Limited Pyrazolo[4,3-c]pyridine derivatives as jak inhibitors
JP2014531449A (ja) 2011-09-20 2014-11-27 セルゾーム リミティッド キナーゼ阻害剤としてのピラゾロ［４，３―ｃ］ピリジン誘導体
US9175011B2 (en) 2011-09-21 2015-11-03 Cellzone Limited Morpholino substituted urea or carbamate derivatives as MTOR inhibitors
KR20140084130A (ko) 2011-10-07 2014-07-04 셀좀 리미티드 Mtor 억제제로서의 모르폴리노 치환된 바이사이클릭 피리미딘 우레아 또는 카르바메이트 유도체
CN102499917B (zh) 2011-10-25 2014-12-17 澳门大学 吲哚酮类化合物在制备神经保护药物中的应用
AP2014007601A0 (en) 2011-10-28 2014-04-30 Novartis Ag Novel purine derivatives and their use in the treatment of disease
CN103130774B (zh) * 2011-11-22 2016-06-22 齐鲁制药有限公司 具有酪氨酸激酶抑制作用的化合物及其制备方法和应用
CN103127096B (zh) * 2011-12-02 2015-11-25 杨子娇 吡咯基取代的吲哚类化合物在治疗青光眼病的应用
US20130178520A1 (en) 2011-12-23 2013-07-11 Duke University Methods of treatment using arylcyclopropylamine compounds
KR20140114344A (ko) 2011-12-23 2014-09-26 셀좀 리미티드 키나제 억제제로서의 피리미딘-2,4-디아민 유도체
CN102491932A (zh) * 2011-12-26 2012-06-13 天津科技大学 一种3-吲哚啉酮类衍生物及其制备方法及其应用
US9206163B2 (en) 2012-03-23 2015-12-08 Laurus Labs Private Ltd. Process for the preparation of sunitinib and its acid addition salts thereof
EP2838538B1 (en) 2012-04-20 2017-03-15 Annji Pharmaceutical Co., Ltd. Cyclopropanecarboxylate esters of purine analogues
PL399027A1 (pl) 2012-04-27 2013-10-28 Instytut Farmaceutyczny Sposób otrzymywania N-[2-(dietylamino)etylo]-5-formylo-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksyamidu o wysokiej czystosci i jego zastosowanie do wytwarzania sunitynibu
CN102653521B (zh) * 2012-04-27 2014-08-06 首都师范大学 吲哚-2-酮的哌嗪硫代甲酰肼衍生物及其制备方法和用途
WO2013164754A2 (en) 2012-05-04 2013-11-07 Pfizer Inc. Prostate-associated antigens and vaccine-based immunotherapy regimens
US10213432B2 (en) 2012-05-16 2019-02-26 Novartis Ag Dosage regimen for a PI-3 kinase inhibitor
EP3505534A1 (en) 2012-06-08 2019-07-03 Sutro Biopharma, Inc. Antibodies comprising sitespecific nonnatural amino acid residues, methods of their preparation and methods of their use
US9732161B2 (en) 2012-06-26 2017-08-15 Sutro Biopharma, Inc. Modified Fc proteins comprising site-specific non-natural amino acid residues, conjugates of the same, methods of their preparation and methods of their use
WO2014026243A1 (en) 2012-08-17 2014-02-20 Cancer Therapeutics Crc Pty Limited Vegfr3 inhibitors
WO2014031566A1 (en) 2012-08-22 2014-02-27 Immunogen, Inc. Cytotoxic benzodiazepine derivatives
PL3584255T3 (pl) 2012-08-31 2022-05-16 Sutro Biopharma, Inc. Modyfikowane aminokwasy zawierające grupę azydkową
WO2014041349A1 (en) 2012-09-12 2014-03-20 Cancer Therapeutics Crc Pty Ltd Tetrahydropyran-4-ylethylamino- or tetrahydropyranyl-4-ethyloxy-pyrimidines or -pyridazines as isoprenylcysteincarboxymethyl transferase inhibitors
WO2014045101A1 (en) 2012-09-21 2014-03-27 Cellzome Gmbh Tetrazolo quinoxaline derivatives as tankyrase inhibitors
ES2644758T3 (es) 2012-10-16 2017-11-30 Tolero Pharmaceuticals, Inc. Moduladores de PKM2 y métodos para su uso
US9260426B2 (en) 2012-12-14 2016-02-16 Arrien Pharmaceuticals Llc Substituted 1H-pyrrolo [2, 3-b] pyridine and 1H-pyrazolo [3, 4-b] pyridine derivatives as salt inducible kinase 2 (SIK2) inhibitors
BR112015009004A8 (pt) 2012-12-21 2021-07-20 Eisai R&D Man Co Ltd forma amorfa de derivado de quinolina e método de produção da mesma
WO2014134486A2 (en) 2013-02-28 2014-09-04 Immunogen, Inc. Conjugates comprising cell-binding agents and cytotoxic agents
US9999680B2 (en) 2013-02-28 2018-06-19 Immunogen, Inc. Conjugates comprising cell-binding agents and maytansinoids as cytotoxic agents
RU2015143526A (ru) * 2013-03-13 2017-04-19 Бостон Байомедикал, Инк. Производные 3-(арил или гетероарил)метилениндолин-2-она в качестве ингибиторов киназного пути раковых стволовых клеток для лечения рака
EP2968113B8 (en) 2013-03-14 2020-10-28 Forsight Vision4, Inc. Systems for sustained intraocular delivery of low solubility compounds from a port delivery system implant
ES2738493T3 (es) 2013-03-14 2020-01-23 Tolero Pharmaceuticals Inc Inhibidores de JAK2 y ALK2 y métodos para su uso
AR095443A1 (es) 2013-03-15 2015-10-14 Fundación Centro Nac De Investig Oncológicas Carlos Iii Heterociclos condensados con acción sobre atr
US9206188B2 (en) 2013-04-18 2015-12-08 Arrien Pharmaceuticals Llc Substituted pyrrolo[2,3-b]pyridines as ITK and JAK inhibitors
CN104119321B (zh) * 2013-04-28 2017-09-08 齐鲁制药有限公司 二氢吲哚酮衍生物的二马来酸盐及其多晶型物
CA2912219C (en) 2013-05-14 2021-11-16 Eisai R&D Management Co., Ltd. Biomarkers for predicting and assessing responsiveness of endometrial cancer subjects to lenvatinib compounds
WO2014194030A2 (en) 2013-05-31 2014-12-04 Immunogen, Inc. Conjugates comprising cell-binding agents and cytotoxic agents
US9764039B2 (en) 2013-07-10 2017-09-19 Sutro Biopharma, Inc. Antibodies comprising multiple site-specific non-natural amino acid residues, methods of their preparation and methods of their use
FR3008411B1 (fr) * 2013-07-12 2015-07-03 Servier Lab Nouveau sel de la 3-[(3-{[4-(4-morpholinylmethyl)-1h-pyrrol-2-yl]methylene}-2-oxo-2,3-dihydro-1h-indol-5-yl)methyl]-1,3-thiazolidine-2,4-dione, sa preparation, et les formulations qui le contiennent
PT3039424T (pt) 2013-08-28 2020-09-03 Crown Bioscience Inc Taicang Assinaturas de expressão genética que permitem prever a resposta de um sujeito a um inibidor multiquinase e métodos de utilização do mesmo
US9840493B2 (en) 2013-10-11 2017-12-12 Sutro Biopharma, Inc. Modified amino acids comprising tetrazine functional groups, methods of preparation, and methods of their use
CA2838585A1 (en) 2013-10-18 2015-04-18 Hari Babu Matta An ascorbic acid salt of sunitinib
CA2838587A1 (en) 2013-10-18 2015-04-18 Hari Babu Matta Pure crystalline form ii of l-malic acid salt of sunitinib and processes for its preparation
MY182168A (en) 2013-11-01 2021-01-18 Pfizer Vectors for expression of prostate-associated antigens
CN105979947A (zh) 2013-12-06 2016-09-28 诺华股份有限公司 α-同工型选择性磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂的剂量方案
CN104829596B (zh) 2014-02-10 2017-02-01 石家庄以岭药业股份有限公司 吡咯取代吲哚酮类衍生物、其制备方法、包含该衍生物的组合物、及其用途
CN103923014A (zh) * 2014-05-05 2014-07-16 宁夏宝马药业有限公司 环肌酸制备方法
US9474756B2 (en) 2014-08-08 2016-10-25 Forsight Vision4, Inc. Stable and soluble formulations of receptor tyrosine kinase inhibitors, and methods of preparation thereof
KR20230043234A (ko) 2014-08-28 2023-03-30 에자이 알앤드디 매니지먼트 가부시키가이샤 고순도의 퀴놀린 유도체 및 이를 제조하는 방법
TWI595006B (zh) 2014-12-09 2017-08-11 禮納特神經系統科學公司 抗ｐｄ－１抗體類和使用彼等之方法
EP3246046A4 (en) 2015-01-13 2018-12-05 Kyoto University Agent for preventing and/or treating amyotrophic lateral sclerosis
AU2016224583B2 (en) 2015-02-25 2021-06-03 Eisai R&D Management Co., Ltd. Method for suppressing bitterness of quinoline derivative
KR20170122809A (ko) 2015-03-04 2017-11-06 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션 암을 치료하기 위한 pd-1 길항제 및 vegfr/fgfr/ret 티로신 키나제 억제제의 조합
WO2016172214A1 (en) 2015-04-20 2016-10-27 Tolero Pharmaceuticals, Inc. Predicting response to alvocidib by mitochondrial profiling
WO2016184793A1 (en) 2015-05-15 2016-11-24 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for treating a patient with vegfr inhibitor-resistant metastatic renal cell carcinoma
KR102608921B1 (ko) 2015-05-18 2023-12-01 스미토모 파마 온콜로지, 인크. 생체 이용률이 증가된 알보시딥 프로드러그
GB201510019D0 (en) 2015-06-09 2015-07-22 Cancer Therapeutics Crc Pty Ltd Compounds
CA2988707C (en) 2015-06-16 2023-10-10 Eisai R&D Management Co., Ltd. Combination of cbp/catenin inhibitor and immune checkpoint inhibitor for treating cancer
KR20180034538A (ko) 2015-08-03 2018-04-04 톨레로 파마수티컬스, 인크. 암의 치료를 위한 병행 요법
MX2018003462A (es) 2015-09-22 2018-09-06 Graybug Vision Inc Compuestos y composiciones para el tratamiento de trastornos oculares.
GB2543550A (en) 2015-10-21 2017-04-26 Hox Therapeutics Ltd Peptides
CN108472289A (zh) 2015-11-02 2018-08-31 诺华股份有限公司 磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂的给药方案
SG11201803663XA (en) 2015-11-12 2018-05-30 Graybug Vision Inc Aggregating microparticles for therapy
CA3011455A1 (en) 2016-01-27 2017-08-03 Sutro Biopharma, Inc. Anti-cd74 antibody conjugates, compositions comprising anti-cd74 antibody conjugates and methods of using anti-cd74 antibody conjugates
WO2017139417A1 (en) 2016-02-08 2017-08-17 Vitrisa Therapeutics, Inc. Compositions with improved intravitreal half-life and uses thereof
EP3228630A1 (en) 2016-04-07 2017-10-11 IMBA-Institut für Molekulare Biotechnologie GmbH Combination of an apelin antagonist and an angiogenesis inhibitor for the treatment of cancer
CN107459519A (zh) 2016-06-06 2017-12-12 上海艾力斯医药科技有限公司 稠合嘧啶哌啶环衍生物及其制备方法和应用
CA3035081A1 (en) 2016-09-02 2018-03-08 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Composition and methods of treating b cell disorders
WO2018060833A1 (en) 2016-09-27 2018-04-05 Novartis Ag Dosage regimen for alpha-isoform selective phosphatidylinositol 3-kinase inhibitor alpelisib
JP2019537585A (ja) 2016-10-28 2019-12-26 アイカーン スクール オブ メディスン アット マウント シナイ Ｅｚｈ２媒介性がんを治療するための組成物および方法
US11279694B2 (en) 2016-11-18 2022-03-22 Sumitomo Dainippon Pharma Oncology, Inc. Alvocidib prodrugs and their use as protein kinase inhibitors
MX2019006333A (es) 2016-12-05 2019-09-26 Apros Therapeutics Inc Compuestos de pirimidina que contienen grupos ácidos.
US10786502B2 (en) 2016-12-05 2020-09-29 Apros Therapeutics, Inc. Substituted pyrimidines containing acidic groups as TLR7 modulators
WO2018106870A1 (en) 2016-12-08 2018-06-14 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Compositions and methods for treating cdk4/6-mediated cancer
US10132797B2 (en) 2016-12-19 2018-11-20 Tolero Pharmaceuticals, Inc. Profiling peptides and methods for sensitivity profiling
CN106916143B (zh) * 2017-03-14 2019-09-27 哈尔滨医科大学 一种预防和治疗冠心病的药物及其应用
BR112019019452A2 (pt) 2017-03-23 2020-04-14 Graybug Vision Inc composto, e, uso de um composto
CN111201040A (zh) 2017-05-10 2020-05-26 灰色视觉公司 用于医学疗法的缓释微粒及其悬浮液
US20200207859A1 (en) 2017-07-26 2020-07-02 Sutro Biopharma, Inc. Methods of using anti-cd74 antibodies and antibody conjugates in treatment of t-cell lymphoma
US11497756B2 (en) 2017-09-12 2022-11-15 Sumitomo Pharma Oncology, Inc. Treatment regimen for cancers that are insensitive to BCL-2 inhibitors using the MCL-1 inhibitor alvocidib
EP3684814A1 (en) 2017-09-18 2020-07-29 Sutro Biopharma, Inc. Anti-folate receptor alpha antibody conjugates and their uses
WO2019075367A1 (en) 2017-10-13 2019-04-18 Tolero Pharmaceuticals, Inc. PKM2 ACTIVATORS IN COMBINATION WITH OXYGEN REACTIVE SPECIES FOR THE TREATMENT OF CANCER
NL2019801B1 (en) 2017-10-25 2019-05-02 Univ Leiden Delivery vectors
CN112154146A (zh) 2018-03-06 2020-12-29 西奈山伊坎医学院 丝氨酸苏氨酸激酶(akt)降解/破坏化合物和使用方法
EP3539536A1 (en) 2018-03-15 2019-09-18 MH10 Spolka z ograniczona odpowiedzialnoscia A pharmaceutical composition of sunitinib or its salt thereof in its polymorphic form i
EP3802519A1 (en) 2018-06-04 2021-04-14 Apros Therapeutics, Inc. Pyrimidine compounds containing acidic groups useful to treat diseases connected to the modulation of tlr7
GB201810092D0 (en) 2018-06-20 2018-08-08 Ctxt Pty Ltd Compounds
GB201810581D0 (en) 2018-06-28 2018-08-15 Ctxt Pty Ltd Compounds
CA3103995A1 (en) 2018-07-26 2020-01-30 Sumitomo Dainippon Pharma Oncology, Inc. Methods for treating diseases associated with abnormal acvr1 expression and acvr1 inhibitors for use in the same
WO2020060944A1 (en) 2018-09-17 2020-03-26 Sutro Biopharma, Inc. Combination therapies with anti-folate receptor antibody conjugates
EP3890749A4 (en) 2018-12-04 2022-08-03 Sumitomo Dainippon Pharma Oncology, Inc. CDK9 INHIBITORS AND POLYMORPHS THEREOF FOR USE AS CANCER TREATMENT AGENT
JPWO2020130125A1 (ja) 2018-12-21 2021-11-04 第一三共株式会社 抗体−薬物コンジュゲートとキナーゼ阻害剤の組み合わせ
WO2020167990A1 (en) 2019-02-12 2020-08-20 Tolero Pharmaceuticals, Inc. Formulations comprising heterocyclic protein kinase inhibitors
JP2022525149A (ja) 2019-03-20 2022-05-11 スミトモ ダイニッポン ファーマ オンコロジー， インコーポレイテッド ベネトクラクスが失敗した急性骨髄性白血病（ａｍｌ）の処置
CN114364798A (zh) 2019-03-21 2022-04-15 欧恩科斯欧公司 用于治疗癌症的Dbait分子与激酶抑制剂的组合
EP3941463A1 (en) 2019-03-22 2022-01-26 Sumitomo Dainippon Pharma Oncology, Inc. Compositions comprising pkm2 modulators and methods of treatment using the same
EP3958845A1 (en) 2019-04-25 2022-03-02 Synthon B.V. Pharmaceutical composition comprising amorphous sunitinib
US20220362394A1 (en) 2019-05-03 2022-11-17 Sutro Biopharma, Inc. Anti-bcma antibody conjugates
WO2020227325A1 (en) 2019-05-06 2020-11-12 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Heterobifunctional compounds as degraders of hpk1
KR20220054840A (ko) 2019-08-31 2022-05-03 이턴 바이오파마 (상하이) 코., 엘티디. Fgfr 억제제용 피라졸류 유도체 및 이의 제조방법
AU2020378630A1 (en) 2019-11-08 2022-05-26 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for the treatment of cancers that have acquired resistance to kinase inhibitors
WO2021148581A1 (en) 2020-01-22 2021-07-29 Onxeo Novel dbait molecule and its use
EP4114852A1 (en) 2020-03-03 2023-01-11 Sutro Biopharma, Inc. Antibodies comprising site-specific glutamine tags, methods of their preparation and methods of their use
CN111233841A (zh) * 2020-03-17 2020-06-05 湖北扬信医药科技有限公司 一种舒尼替尼有关物质及其制备方法和用途
WO2023278424A1 (en) * 2021-06-28 2023-01-05 The Regents Of The University Of California Methods for treating and ameliorating t cell related diseases
CN113717159A (zh) * 2021-09-16 2021-11-30 中国药科大学 吲哚酮类化合物及其药物组合物、制备方法及用途
WO2023081923A1 (en) 2021-11-08 2023-05-11 Frequency Therapeutics, Inc. Platelet-derived growth factor receptor (pdgfr) alpha inhibitors and uses thereof
WO2023228095A1 (en) 2022-05-24 2023-11-30 Daiichi Sankyo Company, Limited Dosage regimen of an anti-cdh6 antibody-drug conjugate
US20240058465A1 (en) 2022-06-30 2024-02-22 Sutro Biopharma, Inc. Anti-ror1 antibody conjugates, compositions comprising anti ror1 antibody conjugates, and methods of making and using anti-ror1 antibody conjugates
WO2024017372A1 (zh) * 2022-07-22 2024-01-25 成都百裕制药股份有限公司 一种吲哚酮衍生物及其应用

Family Cites Families (101)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL104796C (es) 1957-08-19
DE878539C (de) 1939-08-17 1953-06-05 Hoechst Ag Verfahren zur Herstellung von Methinfarbstoffen
BE507136A (es) 1950-11-18
BE553661A (es) 1955-12-23
NL96047C (es) 1956-06-08
NL251055A (es) 1959-04-29
FR1398224A (fr) 1964-05-06 1965-05-07 Ici Ltd Procédé de teinture de matières textiles de polyacrylonitrile
US3308134A (en) 1965-10-22 1967-03-07 Mcneilab Inc Spiro(indan-2, 3'-indoline)-1, 2'-diones
US3551571A (en) 1967-05-19 1970-12-29 Endo Lab Methods for reducing pain,reducing fever and alleviating inflammatory syndromes with heteroaromatic pyrrol-3-yl ketones
US3564016A (en) 1968-03-07 1971-02-16 Endo Lab Method of decarbonylation
US4070366A (en) 1968-06-12 1978-01-24 Canadian Patents & Development Limited Alkylation process
FR1599772A (es) 1968-09-17 1970-07-20
US3922163A (en) 1970-01-30 1975-11-25 Upjohn Co Organic compounds and process
US3715364A (en) 1970-12-28 1973-02-06 Merck & Co Inc Nitroimidazole carboxamides
DE2159361A1 (de) 1971-11-30 1973-06-14 Bayer Ag Nitrofuranderivate, verfahren zu ihrer herstellung sowie ihre verwendung als arzneimittel
DE2159363A1 (de) 1971-11-30 1973-06-14 Bayer Ag Antimikrobielle mittel
DE2159360A1 (de) 1971-11-30 1973-06-14 Bayer Ag Nitrofuranderivate, verfahren zu ihrer herstellung sowie ihre verwendung als arzneimittel
DE2159362A1 (de) 1971-11-30 1973-06-14 Bayer Ag Nitrofuranderivate, verfahren zu ihrer herstellung sowie ihre verwendung als arzneimittel
GB1384599A (en) 1972-05-04 1975-02-19 Colgate Palmolive Co Coloured detergent compositions
US3880871A (en) 1973-09-27 1975-04-29 Squibb & Sons Inc Isothiocyanophenyl substituted imidazoles
US4002643A (en) 1975-06-27 1977-01-11 Mcneil Laboratories, Inc. Preparation of β-acyl pyrroles
US4002749A (en) 1975-08-12 1977-01-11 E. R. Squibb & Sons, Inc. Substituted indolinones
US4053613A (en) 1975-09-17 1977-10-11 E. R. Squibb & Sons, Inc. 1,3,thiazolinyl and 1,3 thiazinyl substituted indolinones
DE2855306A1 (de) 1978-12-21 1980-07-10 Boehringer Sohn Ingelheim Mittel zur senkung der herzfrequenz
GR73560B (es) 1979-02-24 1984-03-15 Pfizer
US4376110A (en) 1980-08-04 1983-03-08 Hybritech, Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
US4343923A (en) 1980-08-07 1982-08-10 Armstrong World Industries, Inc. Process for reducing the acid dye uptake of polyamide textile materials with N-acylimidazole compound
CH646956A5 (de) 1981-12-15 1984-12-28 Ciba Geigy Ag Imidazolide.
EP0095285A1 (en) 1982-05-21 1983-11-30 Sumitomo Chemical Company, Limited N-acylimidazoles, their production and use
US4493642A (en) 1982-12-27 1985-01-15 Bogdon Glendon J Orthodontic device and associated orthodontic method
DE3310891A1 (de) 1983-03-25 1984-09-27 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Neue indolinon-(2)-derivate, verfahren zu ihrer herstellung, diese verbindungen enthaltende arzneimittel und zwischenprodukte
US4489089A (en) 1983-04-06 1984-12-18 American Cyanamid Company Substituted N-[ω-(1H-imidazol-1-yl)alkyl]-amides
DE3480392D1 (en) 1983-04-29 1989-12-14 Ciba Geigy Ag Imidazolides and their use as curing agents for polyepoxides
DE3415138A1 (de) 1984-04-21 1985-10-31 Basf Ag, 6700 Ludwigshafen N-(azolylcarbamoyl)-hydroxylamine und diese enthaltende fungizide
DE3426419A1 (de) 1984-07-18 1986-01-23 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Neue oxindol-derivate, verfahren zu ihrer herstellung, diese verbindungen enthaltende arzneimittel und zwischenprodukte
US4560700A (en) 1985-02-08 1985-12-24 Merrell Dow Pharmaceuticals Inc. Pyrrole-3-carboxylate cardiotonic agents
JPH078851B2 (ja) 1985-07-29 1995-02-01 鐘淵化学工業株式会社 ３−フエニルチオメチルスチレン誘導体
US4966849A (en) 1985-09-20 1990-10-30 President And Fellows Of Harvard College CDNA and genes for human angiogenin (angiogenesis factor) and methods of expression
WO1993012786A1 (en) 1986-07-10 1993-07-08 Howard Harry R Jr Indolinone derivatives
US4853404A (en) 1986-10-13 1989-08-01 Tanabe Seiyaku Co., Ltd. Phenoxyacetic acid derivatives composition and use
US5202341A (en) 1987-03-11 1993-04-13 Kanegafuchi Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha Hydroxystyrene compounds having tyrosine kinase inhibiting activity
DE3874257T2 (de) 1987-03-11 1993-02-11 Kanegafuchi Chemical Ind Hydroxystyren-derivate.
US5089516A (en) 1987-03-11 1992-02-18 Kanegafuchi Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha 1-phenyl-3,5-pyrazolidinedione hydroxystyrene compounds which have tyrosine kinase inhibiting activity
US5043348A (en) 1987-04-24 1991-08-27 Cassella Aktiengesellschaft Pyrrolealdehydes, their preparation and their use
US5217999A (en) 1987-12-24 1993-06-08 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Styryl compounds which inhibit EGF receptor protein tyrosine kinase
DE3808071A1 (de) 1988-03-11 1989-09-21 Basf Ag Verfahren zur herstellung von acylierten imidazolen
US4868304A (en) 1988-05-27 1989-09-19 Iowa State University Research Foundation, Inc. Synthesis of nitrogen heterocycles
CA1339784C (en) 1988-06-23 1998-03-31 Shinya Inoue Pyrrolecarboxylic acid derivatives
JPH06104658B2 (ja) 1988-06-23 1994-12-21 三菱化成株式会社 ピロールカルボン酸誘導体
DE3824658A1 (de) 1988-07-15 1990-01-18 Schering Ag N-hetaryl-imidazolderivate
GB8816944D0 (en) 1988-07-15 1988-08-17 Sobio Lab Compounds
US5084280A (en) 1988-12-15 1992-01-28 Chapman Chemical Company Wood preservation composition and method
DE3902439A1 (de) 1989-01-27 1990-08-02 Basf Ag Pflanzenschuetzende mittel auf basis von 1-aryl- bzw. 1-hetarylimidazolcarbonsaeureestern
US5047554A (en) 1989-04-18 1991-09-10 Pfizer Inc. 3-substituted-2-oxindole derivatives
WO1991001306A1 (fr) 1989-07-25 1991-02-07 Taiho Pharmaceutical Company, Limited Derive oxoindole
US5258357A (en) 1989-10-07 1993-11-02 Basf Aktiengesellschaft Carboxamides, their preparation and their use as herbicides
CA2032421A1 (en) 1989-12-20 1991-06-21 Mitsubishi Chemical Corporation Pyrrolealdehyde derivative
GB9004483D0 (en) 1990-02-28 1990-04-25 Erba Carlo Spa New aryl-and heteroarylethenylene derivatives and process for their preparation
CA2012634A1 (en) 1990-03-20 1991-09-20 Hassan Salari Tyrphostins for treatment of allergic, inflammatory and cardiovascular diseases
US5196446A (en) 1990-04-16 1993-03-23 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Certain indole compounds which inhibit EGF receptor tyrosine kinase
US5302606A (en) 1990-04-16 1994-04-12 Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals Inc. Styryl-substituted pyridyl compounds which inhibit EGF receptor tyrosine kinase
IT1247509B (it) 1991-04-19 1994-12-17 Univ Cagliari Composti di sintesi atti all'impiego nella terapia delle infezioni da rhinovirus
ATE159009T1 (de) 1991-05-10 1997-10-15 Rhone Poulenc Rorer Int Bis mono- und bicyclische aryl- und heteroarylderivate mit inhibierender wirkung auf die egf und/oder pdgf-rezeptor tyrosinkinase
US5480883A (en) 1991-05-10 1996-01-02 Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals Inc. Bis mono- and bicyclic aryl and heteroaryl compounds which inhibit EGF and/or PDGF receptor tyrosine kinase
GB9115160D0 (en) 1991-07-12 1991-08-28 Erba Carlo Spa Methylen-oxindole derivatives and process for their preparation
US5124347A (en) 1991-07-31 1992-06-23 Warner-Lambert Co. 3-5-ditertiarybutylphenyl-4-hydroxymethylidene derivatives of 1,3-dihydro-2H-indole-2-ones as antiinflammatory agents
AU664392B2 (en) 1991-10-18 1995-11-16 Monsanto Technology Llc Fungicides for the control of take-all disease of plants
US5389661A (en) 1991-12-05 1995-02-14 Warner-Lambert Company Imidazole and 1,2,4-triazole derivatives with angiotensin II antagonist properties
US5322950A (en) 1991-12-05 1994-06-21 Warner-Lambert Company Imidazole with angiotensin II antagonist properties
AU661533B2 (en) 1992-01-20 1995-07-27 Astrazeneca Ab Quinazoline derivatives
FR2689397A1 (fr) 1992-04-01 1993-10-08 Adir Utilisation des dérivés de la 3-(3,5-Ditert-Butyl-4-Hydroxybenzylidenyl) Indoline-2-one pour l'obtention de médicaments.
DE4211531A1 (de) 1992-04-06 1993-10-07 Cassella Ag Verfahren zur Herstellung von Pyrrolderivaten
FR2694004B1 (fr) 1992-07-21 1994-08-26 Adir Nouvelles 3-(Hydroxybenzylidényl)-indoline-2-ones et 3-(hydroxybenzylidényl)-indoline-2-thiones, leurs procédés de préparation, et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent.
US5565324A (en) 1992-10-01 1996-10-15 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Complex combinatorial chemical libraries encoded with tags
US5330992A (en) 1992-10-23 1994-07-19 Sterling Winthrop Inc. 1-cyclopropyl-4-pyridyl-quinolinones
GB9226855D0 (en) 1992-12-23 1993-02-17 Erba Carlo Spa Vinylene-azaindole derivatives and process for their preparation
JP3507124B2 (ja) 1993-05-26 2004-03-15 塩野義製薬株式会社 ベンジリデン誘導体の製造法
DE59402281D1 (de) 1993-06-28 1997-05-07 Bayer Ag Massefärben von Kunststoffen
US5332736A (en) 1993-11-01 1994-07-26 Ortho Pharmaceutical Corporation Anti-convulsant aroyl aminoacylpyrroles
US5610173A (en) 1994-01-07 1997-03-11 Sugen, Inc. Formulations for lipophilic compounds
GB9507298D0 (en) 1995-04-07 1995-05-31 Pharmacia Spa Substituted indolylmethylene-oxindale analogues as tyrosine kinase inhibitors
US5786488A (en) 1996-11-13 1998-07-28 Sugen, Inc. Synthetic methods for the preparation of indolyquinones
US5880141A (en) 1995-06-07 1999-03-09 Sugen, Inc. Benzylidene-Z-indoline compounds for the treatment of disease
JP3246712B2 (ja) 1995-11-15 2002-01-15 株式会社トクヤマ エテニルアミド化合物の製造方法
EP0788890A1 (en) 1996-02-06 1997-08-13 Agfa-Gevaert N.V. Dyes and dye-donor elements for thermal dye transfer recording
CA2206201A1 (en) 1996-05-29 1997-11-29 Yoshiaki Isobe Pyrazole derivatives and their pharmaceutical use
KR100482268B1 (ko) 1996-08-01 2005-04-14 메르클레 게엠베하 세포질 포스포리파제 ａ2의 저해제로서의 아실피롤디카르복실산
JP2002511852A (ja) * 1997-05-07 2002-04-16 スージェン・インコーポレーテッド 蛋白質キナーゼ活性の調節剤としての２−インドリノン誘導体
US6133305A (en) 1997-09-26 2000-10-17 Sugen, Inc. 3-(substituted)-2-indolinones compounds and use thereof as inhibitors of protein kinase activity
TR200003514T2 (tr) * 1998-05-29 2002-05-21 Sugen Inc. Pirol ikame edilmiş 2-indolinon protein kinaz inhibitörleri
US6462072B1 (en) 1998-09-21 2002-10-08 Gpi Nil Holdings, Inc. Cyclic ester or amide derivatives
CN1149983C (zh) 1998-12-14 2004-05-19 赛勒吉药物股份有限公司 用于治疗***直肠病的组合物和方法
JP2002532492A (ja) * 1998-12-17 2002-10-02 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー サイクリン−依存性キナーゼ、特にｃｄｋ２のインヒビターとしての４−アルケニル（及びアルキニル）オキシドール
US6284894B1 (en) 1998-12-18 2001-09-04 Nycomed Imaging As Preparation of allylic aromatic compounds
AU760964B2 (en) * 1998-12-31 2003-05-22 Sugen, Inc. 3-heteroarylidenyl-2-indolinone compounds for modulating protein kinase activityand for use in cancer chemotherapy
ATE514676T1 (de) * 1999-11-24 2011-07-15 Sugen Inc Ionisierbare indolinon derivate und deren verwendung als ptk liganden
MXPA02006263A (es) * 1999-12-22 2004-02-26 Sugen Inc Metodos de modulacion de la funcion de la cinasa de tirosina c-kit de la proteina con compuestos de indolinona.
ME00415B (me) * 2000-02-15 2011-10-10 Pharmacia & Upjohn Co Llc Pirol supstituisani 2-indol protein kinazni inhibitori
TWI270545B (en) 2000-05-24 2007-01-11 Sugen Inc Mannich base prodrugs of 3-(pyrrol-2-ylmethylidene)-2-indolinone derivatives
WO2002002551A1 (en) * 2000-06-30 2002-01-10 Sugen, Inc. 4-heteroaryl-3-heteroarylidenyl-2-indolinones and their use as protein kinase inhibitors
JP2004518669A (ja) * 2000-12-20 2004-06-24 スージェン・インコーポレーテッド ４−アリール置換インドリノン

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