ES2328407T3 - Formas salinas solidas de una 2-indolinona sustituida con pirrol. - Google Patents

Abstract

Formas salinas de una base, en las que la base es la (2-pirrolidin-1-il-etil)-amida del ácido 5-[5-fluoro-2-oxo- 1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenometil]-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico y en las que la forma salina se elige entre el grupo que consiste en las sales de citrato y de fosfato y sus solvatos y polimorfos.

Description

Formas salinas sólidas de una 2-indolinona sustituida con pirrol.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a formas salinas sólidas de un compuesto de 2-indolinona sustituido con 3-pirrol, (2-pirrolidin-1-il-etil)-amida del ácido 5-[5-fluoro-2-oxo-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenometil]-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico. Los compuestos anteriores modulan la actividad de las proteínas cinasas (generalmente abreviadas como "PK" por sus iniciales en inglés: protein kinases). Los compuestos de esta invención son útiles por lo tanto para tratar trastornos relacionados con una actividad PK anormal. Se describen composiciones farmacéuticas que comprenden sales de este compuesto y métodos para prepararlos. La presente invención también se refiere a polimorfos de la forma de sal de fosfato de la amida.

Antecedentes

Lo siguiente se ofrece sólo a modo de información básica y no se admite que sea técnica anterior a la presente invención.

Los sólidos, incluyendo los productos farmacéuticos, presentan a menudo más de una forma cristalina, y esto se conoce como polimorfismo. El polimorfismo ocurre cuando un compuesto cristaliza en varias fases sólidas que se diferencian en el empaquetamiento cristalino. Se citan numerosos ejemplos en las referencias convencionales de las propiedades en estado sólido de los productos farmacéuticos, Byrn, S. R., Solid-State Chemistry of Drugs, Nueva York, Academic Press (1982); Kuhnert-Brandstatter, M., Thermomiscroscopy In The Analysis of Pharmaceuticals, Nueva York, Pergamon Press (1971) y Haleblian, J. K. y McCrone, W. Pharmaceutical applications of polymorphism. J. Pharm. Sci., 58, 911 (1969). Byrn indica que, en general, los polimorfos presentan características físicas diferentes, incluyendo solubilidad y estabilidad física y química. El documento WO 2004/076410 describe polimorfos de inhibidores de la proteína cinasa de 2-indolinona sustituidos con pirrol.

Debido a las diferencias en el empaquetamiento molecular, los polimorfos pueden diferenciarse de forma que influya en la liberación del fármaco, estabilidad en estado sólido y elaboración farmacéutica. La estabilidad relativa y las interconversiones de los polimorfos son particularmente importantes en la selección de un fármaco comercial. Un polimorfo adecuado puede depender de aspectos de estabilidad física. Por ejemplo, la elección de un fármaco comercial puede depender de la disponibilidad y elección de un polimorfo adecuado que tenga las características deseadas, tales como una estabilidad física excelente o la capacidad de poder ser elaborado a gran escala. Las características de la forma de dosificación sólida no deberían estar limitadas por las transformaciones polimórficas durante la durabilidad del producto. Es importante señalar que no hay un método fidedigno para predecir las estructuras cristalinas observables de un fármaco dado o para predecir la existencia de polimorfos con las propiedades físicas
deseables.

Las proteína cinasas (PK) son enzimas que catalizan la fosforilación de los grupos hidroxi de los restos de tirosina, serina y treonina de las proteínas. Las consecuencias de esta actividad aparentemente sencilla son asombrosas, ya que prácticamente todos los aspectos de la vida de las células (por ejemplo, crecimiento, diferenciación y proliferación celular) dependen de una u otra forma de la actividad PK. Además, se ha relacionado la actividad PK anormal con un huésped de trastornos que van desde enfermedades que no ponen relativamente en peligro la vida, tales como la psoriasis, hasta enfermedades extremadamente virulentas tales como el glioblastoma (cáncer de
cerebro).

Las tirosina cinasas receptoras (generalmente denominadas RTK por sus iniciales en inglés: receptor tyrosine kinases), un tipo de PK, son candidatos excelentes para la terapia molecular dirigida porque juegan papeles clave en el control de la proliferación y la supervivencia celular y frecuentemente presentan desarreglos en varias afecciones. Los mecanismos de desregulación incluyen sobre-expresión (Her2/neu en el cáncer de mama, receptor del factor de crecimiento epidérmico en el cáncer de pulmón de células no pequeñas), mutaciones activantes (KIT en tumores estromales gastrointestinales, tirosina cinasa relacionada con fms 3/Flk2 (FLT3) en leucemia mielógena aguda) y bucles de activación de la autocrina (factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF)/receptor del VEGF (VEGF/
VEGFR) en melanoma, factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF)/receptor del PDGF (PDGF/PDGFR) en sarcoma).

Se han descrito RTK reguladas de forma anormal en cánceres humanos y caninos comparables. Por ejemplo, se produce expresión anormal del oncogén Met tanto en el osteosarcoma humano como en el canino. De forma interesante, se observan mutaciones activantes comparables en el dominio yuxtamembranal (JM) del c-kit en 50-90% de los tumores estromales gastrointestinales (GIST) y en 30-50% de los tumores de mastocitos (MCT) caninos avanzados. Aunque las mutaciones en los GIST humanos consisten en deleciones en el dominio JM y en los MCT caninos consisten en duplicaciones en tándem internas (ITD) en el dominio JM, ambos llevan a la fosforilación constitutiva del KIT en ausencia de enlace al ligando. Las RTK y sus ligandos, VEGF, PDGF y FGF intervienen en la neovascularización, conocida como angiogénesis, en tumores sólidos. Consecuentemente, inhibiendo las RTK, se puede inhibir el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos en los tumores.

Los agentes de antiangiogénesis, un tipo de moléculas que inhibe el crecimiento de los vasos sanguíneos en los tumores, tienen mucha menos toxicidad para el cuerpo en comparación con los fármacos anti-cáncer convencionales. La patente estadounidense 6.573.293, incorporada en la presente memoria como referencia, describe, entre otros compuestos, la (2-pirrolidin-1-il-etil)-amida del ácido 5-[5-fluoro-2-oxo-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenometil]-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (denominado en la parte siguiente de este texto "compuesto I"). Tiene la estructura
siguiente:

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El compuesto I es una molécula pequeña que presenta capacidad moduladora de las PK. El compuesto es útil por lo tanto para tratar trastornos relacionados con una actividad PK anormal. Es un inhibidor de las RTK, PDGFR, VEGFR, KIT y FLT3. Se ha demostrado que el compuesto I inhibe la fosforilación de KIT, detiene la proliferación celular e induce la detención del ciclo celular y la apóptosis en líneas de mastocitos malignos in vitro, expresando varias formas de KIT mutante. El compuesto I y moléculas relacionadas son eficaces en modelos preclínicos contra xenoinjertos de tumores obtenidos de líneas celulares con origen en distintos tumores humanos.

El compuesto I es útil para el tratamiento de cánceres en animales de compañía, principalmente perros, y también es útil para el tratamiento, entre otros, de cánceres en humanos. Tales cánceres incluyen, pero sin limitarse a ellos, leucemia, cáncer de cerebro, cáncer pulmonar de células no pequeñas, carcinoma de células escamosas, astrocitoma, sarcoma de Kaposi, glioblastoma, cáncer de pulmón, cáncer de vejiga, cáncer de cabeza y cuello, cáncer pulmonar de células pequeñas, glioma, cáncer colorrectal, cáncer genitourinario y cáncer estromal gastrointestinal. Además, el compuesto I es útil para el tratamiento de enfermedades relacionadas con la sobre-expresión de mastocitos, incluyendo, pero sin limitarse a ellos, mastocitosis en humanos y tumores de mastocitos en
perros.

Recientemente se ha demostrado que el compuesto I es eficaz clínicamente frente varias afecciones espontáneas en perros. En el estudio, 11 de 22 MCT caninos mostraron respuestas objetivas duraderas (respuestas parciales y respuestas totales) frente al tratamiento con el compuesto I; 9 de estos MCT presentaron ITD en el dominio JM del c-kit.

El compuesto I cristaliza fácilmente. Su solubilidad es de aproximadamente 10 \mug/mL en disolución tampón de fostato de pH 6 a 25ºC. Cuando se sintetizó el compuesto, precipitaron partículas muy finas de la disolución durante la última etapa de la síntesis. El aislamiento subsiguiente de estas partículas finas por filtración fue lento y se obtuvo una torta dura después de filtrado. Se necesita una sal del compuesto I que tenga estabilidad física y propiedades físicas deseables.

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Sumario de la invención

Esta invención comprende formas salinas del compuesto I. Se han sintetizado cinco formas salinas diferentes del compuesto I y se describen en la presente memoria. (Véase tabla 1). Estas incluyen las sales de hidrocloruro, fumarato, citrato, fosfato y ascorbato del compuesto I. Basándose en la caracterización de estas sales, se identificó la sal de fosfato 1:1, fosfato del compuesto I, como una forma salina con características muy deseables. El muestreo de los polimorfos reveló la existencia de 10 polimorfos del fosfato del compuesto I, denominados en la presente memoria formas
I a X.

En un aspecto, esta invención proporciona dos formas salinas del compuesto I, en las que la forma salina se elige entre las sales de citrato y de fosfato, y sus solvatos y polimorfos. En un modo de realización, se elige la forma de sal de fosfato con una fórmula molecular de C_{22}H_{25}FN_{4}O_{2}\cdotH_{3}O_{4}P. En otro modo de realización, se elige la forma de sal de fosfato con un punto de fusión de aproximadamente 285 a aproximadamente 290ºC. El fosfato del compuesto I tiene la estructura:

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En otro modo de realización se elige la sal de citrato, citrato del compuesto I, que tiene una fórmula molecular de C_{22}H_{25}FN_{4}O_{2}\cdotC_{6}H_{8}O_{7}. En todavía otro modo de realización, se elige la forma de sal de citrato con un punto de fusión de aproximadamente 178 a aproximadamente 183ºC. El citrato del compuesto I tiene la estructura:

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Un segundo aspecto de la invención es una composición farmacéutica que comprende la sal de fosfato o la sal de citrato del compuesto I, o sus solvatos o polimorfos, y un vehículo o excipiente farmacéuticamente acepta-
ble.

Un tercer aspecto de la invención son las sales de fosfato o citrato del compuesto I, o sus solvatos o polimorfos, para su uso en la modulación de la actividad catalítica de las proteína cinasas. La proteína cinasa se puede elegir entre el grupo que consiste en las tirosina cinasas receptoras, las proteína tirosina cinasas no receptoras y las serina/treonina proteína cinasas.

Un cuarto aspecto de la invención es el uso de una composición farmacéutica que comprende la sal de fosfato o sal de citrato del compuesto I, o de sus solvatos o polimorfos, y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable en la preparación de un medicamento para prevenir o tratar un trastorno relacionado con una proteína cinasa en un organismo, que comprende administrar a dicho organismo una cantidad terapéuticamente eficaz. En un modo de realización, el organismo es un humano. En otro modo de realización, el organismo es un animal de compañía. En todavía otro modo de realización, el animal de compañía es un gato o un perro. El trastorno relacionado con la proteína cinasa se puede elegir entre el grupo que consiste en un trastorno relacionado con una tirosina cinasa receptora, un trastorno relacionado con una proteína tirosina cinasa no receptora y un trastorno relacionado con una serina/treonina proteína cinasa. El trastorno relacionado con la proteína cinasa se puede elegir entre el grupo que consiste en un trastorno relacionado con un EGFR, un trastorno relacionado con un PDGFR, un trastorno relacionado con un IGFR y un trastorno relacionado con un c-kit y un trastorno relacionado con una FLK. Tales trastornos incluyen, a modo de ejemplo y no de limitación, leucemia, cáncer de cerebro, cáncer pulmonar de células no pequeñas, carcinoma de células escamosas, astrocitoma, sarcoma de Kaposi, glioblastoma, cáncer de pulmón, cáncer de vejiga, cáncer de cabeza, cáncer de cuello, melanoma, cáncer de ovarios, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer pulmonar de células pequeñas, glioma, mastocitosis, tumor de mastocitos, cáncer colorrectal, cáncer genitourinario, cáncer gastrointestinal, diabetes, un trastorno autoinmune, un trastorno de hiperproliferación, restenosis, fibrosis, psoriasis, enfermedad de van Heppel-Lindau, osteoartritis, artritis reumatoide, angiogénesis, un trastorno inflamatorio, un trastorno inmunológico y un trastorno cardiovascular.

Un quinto aspecto de la invención es un método para preparar cristales de la sal de fosfato de la base (2-pirrolidin-1-il-etil)-amida del ácido 5-[5-fluoro-2-oxo-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenometil]-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico que comprende añadir una cantidad estequiométrica de ácido fosfórico a la base en una disolución que comprende un disolvente o una mezcla de disolventes, forzar la cristalización de la sal de fosfato en disolución, separar los cristales de la sal de fosfato de la disolución del disolvente y secar los cristales. El ácido fosfórico se puede introducir en una cantidad que está en un exceso molar de 40% con respecto a la base. El disolvente puede contener isopropanol. La etapa de separar los cristales de la disolución de disolvente puede comprender añadir acetonitrilo a la disolución y someter a rotavapor a la disolución. La etapa de separar los cristales de la disolución de disolvente también puede comprender filtración.

Un sexto aspecto de la invención es un método para preparar cristales de la sal de citrato de la base (2-pirrolidin-1-il-etil)-amida del ácido 5-[5-fluoro-2-oxo-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenometil]-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico que comprende añadir una cantidad estequiométrica de ácido cítrico a la base en una disolución que comprende un disolvente o una mezcla de disolventes, forzar la cristalización de la sal de citrato en disolución, separar los cristales de la sal de citrato de la disolución del disolvente y secar los cristales. El ácido cítrico se puede introducir también en una cantidad que está en un exceso molar de aproximadamente 40% con respecto a la base. El disolvente puede contener metanol. La etapa de separar los cristales de la disolución de disolvente puede comprender añadir acetonitrilo a la disolución y someter a rotavapor a la disolución. La etapa de separar los cristales de la disolución de disolvente puede comprender filtración.

En un séptimo aspecto, la invención proporciona los polimorfos formas I-X (como se ha descrito en la presente memoria) de la sal de fosfato del compuesto I. En un modo de realización se proporciona la forma I.

Un octavo aspecto de la invención es una composición farmacéutica que comprende el polimorfo de forma I del fosfato del compuesto I y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

Un noveno aspecto de la invención es el polimorfo de forma I del fosfato del compuesto I para usarlo en la modulación de la actividad catalítica de las proteína cinasas.

Un décimo aspecto de la invención es el uso del polimorfo de forma I del fosfato del compuesto I en la preparación de un medicamento para prevenir o tratar un trastorno relacionado con una proteína cinasa en un organismo. En un modo de realización, el organismo es un humano o un animal de compañía. En otro modo de realización, el animal de compañía es un gato o un perro. Tales trastornos incluyen, a modo de ejemplo y no de limitación, tumor de mastocitos y mastocitosis.

Un undécimo aspecto de la invención es un método para preparar polimorfos del fosfato del compuesto I, que comprende introducir la sal de fosfato en una disolución que comprende un disolvente o una mezcla de disolventes, opcionalmente añadiendo un disolvente puente a la disolución, y separar los cristales del polimorfo de la disolución de disolvente. La disolución puede comprender agua con acetonitrilo. La disolución puede contener metanol. El disolvente puente puede ser metanol.

Un duodécimo aspecto de la invención es la utilización de las sales de fosfato o de citrato del compuesto I o del polimorfo de forma I de la sal de fosfato en la preparación de un medicamento que es útil en el tratamiento de una enfermedad mediada por una actividad PK anormal.

Descripción de los dibujos

Figura 1. Datos de absorción de humedad de las sales del compuesto I.

Figura 2. Patrones de difracción de rayos X en polvo del citrato del compuesto I y del fosfato del compuesto I.

Figura 3. Patrones de difracción de rayos X en polvo de los diez únicos sólidos obtenidos en el estudio de muestreo de polimorfos (véase el ejemplo 5). Se presentan de la forma I a forma X, como se definen en las tablas 5 y
6.

Figura 4. Curvas de TGA de los sólidos en CH_{2}Cl_{2} (forma VI, inmediatamente después de precipitación), hexano (forma VII, después de reposar durante la noche) y acetonitrilo (forma VIII, después de reposar durante 3
días).

Figura 5. Resultados de electroforesis en gel de agarosa de los productos de la PCR de MCT evaluados en el ejemplo 7. Las líneas 1-5 corresponden a los pacientes 1-5 en la tabla 8; las líneas 6-14 corresponden a los pacientes 6-14 en la tabla 8. El control consistió en los productos de PCR generados a partir de la línea de mastocitos caninos C2 que contenían una ITD de 48-bp (banda 15) y de cerebro canino normal (tipo natural; banda 16).

Figura 6. Reducciones en MCT de la KIT fosforilada y la cinasa fosforilada regulada por señal extracelular (ERK)1/2 después de una dosis única de fosfato del compuesto I.

Descripción detallada de la invención

Definiciones. A menos que se indique de otro modo, los siguientes términos usados en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones tienen los significados dados a continuación:

El término "C" cuando se usa con referencia a la temperatura significa centígrado o Celsius.

El término "actividad catalítica" se refiere a la tasa de fosforilación de la tirosina bajo la influencia, directa o indirecta, de las RTK y/o CTK o la fosforilación de la serina y treonina bajo la influencia, directa o indirecta, de los STK.

El término "animal de compañía" se refiere a animales domésticos que ofrecen compañía a los humanos e incluyen, pero sin limitarse a ellos, gatos y perros.

El término "poner en contacto" se refiere a unir un compuesto de la presente invención y una PK diana de forma que el compuesto pueda afectar la actividad catalítica de la PK, bien directamente, es decir interaccionando con la cinasa misma, o indirectamente, es decir interaccionando con otra molécula de la que depende la actividad catalítica de la cinasa.

El término "CI_{50}" significa la concentración de un compuesto de ensayo que logra una inhibición de la mitad del máximo de la actividad PK.

El término "modulación" o "modular" se refiere a la alteración de la actividad catalítica de las RTK, CTK y STK. En particular, la modulación se refiere a la activación de la actividad catalítica de las RTK, CTK y STK, preferiblemente la activación de la actividad catalítica de las RTK, CTK y STK, dependiendo de la concentración del compuesto o de la sal al que se exponen las RTK, CTK o STK o, más preferiblemente, la inhibición de la actividad catalítica de las RTK, CTK y STK.

El término "PK" se refiere a las proteína tirosina cinasas receptoras (RTK), tirosina cinasas no-receptoras o "celulares" (CTK) y serina-treonina cinasas (STK).

El término "polimorfo" se refiere a una fase sólida de una sustancia que existe en varias formas distintas debido a diferentes disposiciones y/o conformaciones de las moléculas en la red cristalina. Los polimorfos tienen típicamente diferentes propiedades físicas y químicas.

El término "excipiente farmacéuticamente aceptable" se refiere a cualquier sustancia distinta del compuesto de la invención que se añade a la composición farmacéutica.

El término "composición farmacéutica" se refiere a una mezcla de una o más sales de la presente invención o de los polimorfos de dichas sales, como se describen en la presente memoria, con otros componentes químicos, tales como vehículos y excipientes fisiológica/farmacéuticamente aceptables. El propósito de una composición farmacéutica es facilitar la administración de un compuesto a un organismo.

El término "vehículo fisiológica/farmacéuticamente aceptable" se refiere a un vehículo o diluyente que no produce una irritación significativa a un organismo y que no anula la actividad biológica y las propiedades del compuesto administrado.

El término "polimorfo" también puede definirse como formas cristalinas no solvatadas de un compuesto. El término también incluye solvatos (es decir, formas que contienen disolvente o agua), formas amorfas (es decir, formas no cristalinas) y solvatos desolvatados (es decir, formas que solo se pueden obtener eliminado el disolvente de un
solvato).

El término "solvato" se usa para describir un complejo molecular que comprende un compuesto de la invención y una o más moléculas de disolvente farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, etanol. El término "hidrato" se usa cuando dicho disolvente es agua.

El término "esencialmente libre" con respecto a la cantidad de un cierto polimorfo en una muestra significa que otros polimorfos están presentes en una cantidad menor que aproximadamente 15 por ciento en peso. En otro modo de realización, "esencialmente libre" significa menos que aproximadamente 10 por ciento en peso. En otro modo de realización, "esencialmente libre" significa menos que aproximadamente 5 por ciento en peso. En todavía otro modo de realización, "esencialmente libre" significa menos que aproximadamente 1 por ciento en peso. Los expertos en la técnica comprenderán que la frase "en una cantidad menor que aproximadamente 15 por ciento en peso" significa que el polimorfo de interés está presente en una cantidad mayor que aproximadamente 85 por ciento en peso. De forma similar, la frase "menos que aproximadamente 10 por ciento en peso" significa que el polimorfo de interés está presente en una cantidad mayor que 90 por ciento en peso, y así sucesivamente.

El término "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a la cantidad del compuesto que se está administrando que prevendrá, aliviará o mejorará uno o más de los síntomas del trastorno que se está tratando, o prolongará la supervivencia del sujeto que está siendo tratado. Con respecto al tratamiento del cáncer, una cantidad terapéuticamente eficaz se refiere a una cantidad que tiene el efecto de:

(1)

reducir el tamaño del tumor;

(2)

inhibir (es decir, ralentizar hasta cierto punto o detener) la metástasis tumoral;

(3)

inhibir (es decir, ralentizar hasta cierto punto o detener) el crecimiento tumoral; y/o

(4)

aliviar hasta cierto punto (o eliminar) uno o más síntomas asociados con el cáncer.

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Se pueden sintetizar diferentes formas salinas del compuesto I para obtener una forma con mejores propiedades físicas. El compuesto base puede estar en disolución. La disolución es generalmente un disolvente. En un modo de realización, la disolución es un alcohol. En otro modo de realización, el disolvente puede ser isopropanol, metanol, acetonitrilo o agua con acetonitrilo. La disolución también puede comprender una mezcla de disolventes.

Las sales pueden cristalizarse utilizando una técnica estequiométrica de adición/cristalización. Se añade una cantidad estequiométrica del contraión de la base en disolución. En un modo de realización, la cantidad de contraión está en una relación 1:1 con la base. En otro modo de realización, la cantidad de contraión está en un exceso molar de 0% a aproximadamente 60% con respecto a la base. En otro modo de realización, la cantidad de contraión está en un exceso molar de aproximadamente 10% a aproximadamente 50% con respecto a la base. En todavía otro modo de realización, la cantidad de contraión está en un exceso molar de aproximadamente 40% con respecto a la base. Los contraiones pueden incluir los iones hidrocloruro, fumarato, citrato, fosfato y ascorbato. En un modo de realización el contraión es el ion fosfato. En otro modo de realización el contraión es el ion citrato.

A continuación se fuerza la cristalización de la sal en disolución mediante varias técnicas comunes, incluyendo enfriamiento, evaporación, inmersión, etc., conocidas por los expertos en la técnica. Los disolventes en exceso se pueden eliminar de las muestras por métodos conocidos por los expertos en la técnica. En un modo de realización, los disolventes se eliminan de la disolución añadiendo acetonitrilo (ACN) y sometiendo la disolución a rotavapor. La disolución se puede poner en el rotavapor de aproximadamente 40ºC a aproximadamente 60ºC. En otro modo de realización, se pueden añadir disolventes adicionales (por ejemplo, isopropanol y metil etil cetona) a la disolución antes de introducirla en el rotavapor. La cristalización se puede realizar en oscuridad para evitar isomerización inducida por la luz. En un modo de realización, los cristales se eliminan por filtración. En otro modo de realización, la filtración se puede realizar a la temperatura ambiente del laboratorio.

Mediante estos métodos se cristalizaron las sales de ascorbato, citrato, fumarato, hidrocloruro y fosfato del compuesto I. A continuación se dan ejemplos específicos de métodos de cristalización. Se puede utilizar análisis por HPLC para determinar la pureza de la muestra resultante. Las propiedades físicas de los compuestos se pueden determinar mediante ensayos conocidos por los expertos en la técnica, incluyendo determinación del punto de fusión, difracción de rayos X en polvo y gravimetría de absorción de humedad dinámica. Los parámetros para estos ensayos se describen a continuación.

Estas cinco formas salinas se describen en la presente memoria (véase la tabla 1). Estas sales del compuesto I son a menudo higroscópicas. Por ejemplo, como se puede ver en la tabla 1, con 80% de humedad, la sal de hidrocloruro era aproximadamente 20 por ciento de agua, la sal de fumarato era aproximadamente 9 por ciento de agua y la sal de ascorbato era aproximadamente 6,5 por ciento de agua. Esta característica puede hacer que el uso de la sal en una formulación farmacéutica sea difícil y puede acortar la durabilidad de una formulación. Sin embargo, se encontró inesperadamente que dos sales, las sales de fosfato y de citrato, tenían una baja absorción de humedad, teniendo aproximadamente 1 por ciento y aproximadamente 3,8 por ciento de agua con 80 por ciento de humedad relativa, respectivamente.

Basándose en la caracterización de estas sales, se identificó la sal de fosfato 1:1, fosfato del compuesto I, como una forma salina con características muy deseables, incluyendo buena cristalinidad, baja absorción de humedad, facilidad de cristalización y falta de hidrato. También se describen diez polimorfos del fosfato del compuesto I, denominados en la presente memoria de forma I a forma X. La sal de citrato también demostró tener características deseables, tales como baja absorción de humedad y buena cristalinidad.

Los polimorfos de los compuestos de la presente invención son adecuados porque un polimorfo particular de un compuesto puede tener mejores propiedades físicas y químicas que otras formas polimórficas del mismo compuesto. Por ejemplo, un polimorfo puede tener una solubilidad aumentada en algunos disolventes. Dicha solubilidad añadida puede facilitar la formulación o la administración de los compuestos de la presente invención. Diferentes polimorfos pueden también tener propiedades mecánicas diferentes (por ejemplo, diferente compresibilidad, compactabilidad o facilidad de fabricación en comprimidos) que pueden influir los resultados de la elaboración de comprimidos del fármaco y, por lo tanto, influir en la formulación del fármaco. Un polimorfo particular también puede presentar una tasa de disolución diferente en el mismo disolvente con respecto a otro polimorfo. Diferentes polimorfos también pueden tener diferente estabilidad física (conversión en estado sólido de un polimorfo metaestable en un polimorfo más estable) y química (reactividad). Un modo de realización de la presente invención contempla el polimorfo de forma I del fosfato del compuesto I, como se describe en la presente memoria.

En los modos de realización de la presente invención, se contemplan polimorfos únicos puros así como mezclas que comprenden dos o más polimorfos diferentes. Un polimorfo único puro puede estar esencialmente libre de otros polimorfos.

Algunos modos de realización de la presente invención contemplan composiciones farmacéuticas que comprenden una o más de las sales del compuesto I o los polimorfos de dichas sales, como se han descrito en la presente memoria, y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

Los polimorfos se generaron a partir de disoluciones concentradas de fosfato del compuesto I. Las disoluciones concentradas pueden estar en el intervalo de 60 a 100 mg de fosfato del compuesto I por mL de disolución. En un modo de realización, se pueden disolver aproximadamente 70 mg del compuesto I en 1 mL de ácido fosfórico.

Los cristales del polimorfo pueden precipitar en un disolvente por varios métodos, incluyendo, por ejemplo, evaporación lenta, enfriamiento de una disolución sobresaturada, precipitación en anti-disolventes, etc., que son conocidos por los expertos en la técnica. En un modo de realización, los cristales de polimorfo se generan añadiendo la disolución a un anti-disolvente. El anti-disolvente puede ser agua con acetonitrilo (ANC), etanol, metanol, acetona, acetonitrilo, THF, acetato de etilo, hexano, cloruro de metileno (CH_{2}Cl_{2}), alcohol isopropílico (IPA), metil etil cetona (MEK) y dioxano. En un modo de realización, se puede añadir un disolvente adicional (por ejemplo, metanol). En otro modo de realización, se dejan reposar las muestras durante la noche antes de retirar los cristales. En otro modo de realización adicional, se dejan reposar las muestras durante tres días antes de retirar los cristales.

Los cristales se pueden caracterizar usando métodos convencionales conocidos por los expertos en la técnica, incluyendo PXRD, gravimetría de absorción de humedad dinámica, calorimetría de barrido diferencial, análisis gravimétrico térmico y microscopía óptica. Estas técnicas se describen a continuación.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para suministrar los compuestos de la presente invención y los métodos para su preparación serán fácilmente evidentes para los expertos en la técnica. Dichas composiciones y métodos para su preparación pueden encontrarse, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, 19ª Edición (Mack Publishing Company, 1995).

La elección de un excipiente farmacéuticamente aceptable dependerá en gran medida de factores tales como el modo de administración particular, el efecto del excipiente en la solubilidad y la estabilidad y la naturaleza de la forma de dosificación. Ejemplos de excipientes incluyen, pero sin limitarse a ellos, carbonato de calcio, fosfato de calcio, varios azúcares y tipos de almidón, derivados de la celulosa, gelatina, aceites vegetales y polietilenglicoles.

Los vehículos y excipientes para la formulación de composiciones farmacéuticamente aceptables que comprenden el compuesto I son bien conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en la patente estadounidense Nº 6.573.293, que se incorpora en la presente memoria en su totalidad. Los métodos de administración para tales composiciones también son conocidas en la técnica y también se describen, por ejemplo, en la patente estadounidense Nº 6.573.293. También se podrían utilizar métodos similares para formular y administrar composiciones farmacéuticamente aceptables de las sales del compuesto I, o los polimorfos de dichas sales, de esta invención.

La formulación apropiada depende de la vía de administración elegida. Para inyección, los compuestos de la presente invención se pueden formular en disoluciones acuosas, preferiblemente en disoluciones tampón fisiológicamente compatibles, tales como disolución de Hanks, disolución de Ringer o tampón de disolución salina fisiológica. Para administración transmucosal, se usan en la formulación fluidos penetrantes apropiados a la barrera que se tiene que permear. Tales fluidos penetrantes se conocen generalmente en la técnica. Para la administración parenteral, por ejemplo por inyección en bolo o infusión continua, las formulaciones se pueden presentar en formas de dosificación unitarias, tales como en ampollas o en contenedores multi-dosis. Las composiciones pueden tomar formas tales como suspensiones, disoluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos y pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilización o dispersión.

Los compuestos de la invención se pueden administrar directamente en el torrente sanguíneo, en el músculo o en un órgano interno. Los medios adecuados para la administración parenteral incluyen vía intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal, intratecal, intraventricular, intrauretral, intraesternal, intracraneal, intramuscular, intrasinovial y subcutánea. Los dispositivos adecuados para la administración parenteral incluyen inyectores de aguja (incluyendo microaguja), inyectores sin aguja y técnicas de infusión. Las formulaciones parenterales típicamente son disoluciones acuosas que pueden contener excipientes tales como sales, carbohidratos y agentes estabilizadores de pH (preferiblemente ajustadas a un pH de 3 a 9), pero para algunas aplicaciones pueden formularse de manera más adecuada como una disolución no acuosa estéril o como una forma seca para usarse junto con un vehículo adecuado tal como agua estéril sin pirógenos. Adicionalmente, se pueden preparar suspensiones de los compuestos de la presente invención en un vehículo lipofílico. Los vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos, tales como aceite de sésamo, ésteres de ácidos grasos sintéticos, tales como el oleato de etilo y triglicéridos, o sustancias tales como los
liposomas.

Los compuestos de la invención se pueden administrar por vía oral. La administración oral puede implicar la deglución, de tal forma que el compuesto entra en el tracto gastrointestinal, y/o la administración bucal, lingual o sublingual por medio de la cual el compuesto entra en la corriente sanguínea directamente desde la boca. Para la administración oral, los compuestos se pueden formular combinando los compuestos de la presente invención con vehículos farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica. Las formulaciones adecuadas para la administración oral incluyen sistemas sólidos, semisólidos y líquidos, tales como comprimidos; cápsulas blandas o duras que contienen multi- o nano-partículas, líquidos o polvos; pastillas (incluyendo las rellenas de líquido); chicles; geles; formas de dosificación de dispersión rápida; películas; óvulos; pulverizadores; y parches bucal/muco-adhesivos.

Los compuestos de la invención también se pueden administrar por vía tópica, de forma (intra)dérmica o transdérmica, a la piel o la mucosa. Las formulaciones típicas para este fin incluyen geles, hidrogeles, lociones, disoluciones, cremas, ungüentos, polvo fino, apósitos, espumas, películas, parches cutáneos, obleas, implantes, esponjas, fibras, vendajes y microemulsiones. También se pueden usar liposomas. Los vehículos típicos incluyen alcohol, agua, aceite mineral, vaselina líquida, vaselina blanca, glicerina, polietilenglicol y propilenglicol. Pueden incorporarse potenciadores de la penetración - véase, por ejemplo, J. Pharm. Sci., 88 (10), 955-958, de Finnin y Morgan (octubre de 1999). Otros medios de administración tópica incluyen el suministro por electroporación, iontoforesis, fonoforesis, sonoforesis e inyección con microagujas o sin agujas (por ejemplo, Powderject^{TM}, Bioject^{TM}, etc.).

Los compuestos de la presente invención se pueden formular para la administración rectal, tales como supositorios o enemas de retención, utilizando, por ejemplo, bases convencionales de supositorios, tales como manteca de cacao u otros glicéridos.

Los compuestos de la presente invención también pueden existir en formas no solvatadas y solvatadas.

Los modos de realización de la presente invención también contemplan una o más sales del compuesto I o los polimorfos de dichas sales de la presente invención para su uso en la modulación de la actividad catalítica de una PK. Este "poner en contacto" se puede llevar a cabo in vitro, es decir en un tubo de ensayo, una placa de Petri o similares. En un tubo de ensayo, poner en contacto puede implicar sólo un compuesto y una PK de interés o puede implicar células enteras. Las células también se pueden mantener o cultivar en placas de cultivo de células y ponerlas en contacto con un compuesto en ese medio. En este contexto, la capacidad de un compuesto particular para afectar un trastorno relacionado con una PK, es decir, la CI_{50} del compuesto, definido a continuación, se puede determinar antes de intentar utilizar los compuestos in vivo con organismos vivos más complejos. Para las células fuera del organismo, existen numerosos métodos, y son bien conocidos por los expertos en la técnica, para poner en contacto las PK con los compuestos que incluyen, pero sin limitarse a ellos, la microinyección celular directa y numerosas técnicas de vehículos transmembranales.

Los modos de realización de la presente invención contemplan el uso de una composición farmacéutica que comprende una o más sales del compuesto I o los polimorfos de dichas sales de la presente invención y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable en la preparación de un medicamento para tratar o prevenir un trastorno relacionado con una proteína cinasa en un organismo (por ejemplo, un animal de compañía o un humano).

En un modo de realización de la presente invención, el trastorno relacionado con la proteína cinasa se elige entre el grupo que consiste en un trastorno relacionado con una tirosina cinasa receptora, un trastorno relacionado con una tirosina cinasa no receptora y un trastorno relacionado con una serina-treonina cinasa. En otro modo de realización de la presente invención, el trastorno relacionado con la proteína cinasa se elige entre el grupo que consiste en un trastorno relacionado con un EGFR, un trastorno relacionado con un PDGFR, un trastorno relacionado con un IGFR y un trastorno relacionado con una FLK.

La proteína cinasa receptora cuya actividad catalítica está modulada por un compuesto de esta invención se elige entre el grupo que consiste en EGF, HER2, HER3, HER4, IR, IGF-IR, IRR, PDGFR\alpha, PDGFR\beta, CSFIR, C-Kit, C-fms, Flk-1R, Flk4, KDR/FIk-1, Flt-1, FGFR-1R, FGFR-2R, FGFR-3R y FGFR-4R. La tirosina cinasa celular cuya actividad catalítica está modulada por un compuesto de esta invención se elige entre el grupo que consiste en Src, Frk, Btk, Csk, Abl, ZAP70, Fes/Fps, Fak, Jak, Ack, Yes, Fyn, Lyn, Lck, Blk, Hck, Fgr e Yrk. La serina-treonina proteína cinasa cuya actividad catalítica está modulada por un compuesto de esta invención se elige entre el grupo que consiste en CDK2 y Raf.

En todavía otro modo de realización de la presente invención, el trastorno relacionado con una proteína cinasa se elige entre el grupo que consiste en carcinoma de células escamosas, astrocitoma, sarcoma de Kaposi, glioblastoma, cáncer de pulmón, cáncer de vejiga, cáncer de cabeza y cuello, melanoma, cáncer de ovarios, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer pulmonar de células pequeñas, glioma, cáncer colorrectal, cáncer genitourinario, cáncer gastrointestinal, mastocitosis y tumores de mastocitos. En un modo de realización de la presente invención, el trastorno relacionado con una proteína cinasa se elige entre el grupo que consiste en diabetes, un trastorno autoinmune, un trastorno de hiperproliferación, restenosis, fibrosis, psoriasis, enfermedad de von Heppel-Lindau, osteoartritis, artritis reumatoide, angiogénesis, un trastorno inflamatorio, un trastorno inmunológico y un trastorno
cardiovascular.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para su uso en la presente invención incluyen composiciones en las que los ingredientes activos están incluidos en una cantidad suficiente para lograr el propósito pretendido, es decir la modulación de la actividad de las PK o el tratamiento o la prevención de un trastorno relacionado con las
PK.

La determinación de una cantidad terapéuticamente eficaz está suficientemente dentro de la capacidad de los expertos en la técnica, sobre todo a la luz de la descripción detallada proporcionada en la presente memoria. Para cualquier compuesto utilizado en los métodos de la invención, la cantidad o la dosis terapéuticamente eficaz se puede estimar inicialmente a partir de los análisis en los cultivos de células. A continuación, se puede formular la dosis para su utilización en modelos animales de forma que se obtenga un intervalo de concentración circulante que incluya la CI_{50} determinada en el cultivo celular. Dicha información se puede utilizar entonces para determinar de forma más precisa las dosis útiles en humanos o en animales de compañía.

En la práctica, la cantidad del compuesto que debe administrarse varía de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 100 mg por kg de peso corporal, administrándose dicha dosis total de una sola vez o en dosis divididas. La cantidad de una composición administrada dependerá, por supuesto, del sujeto que va a ser tratado, de la gravedad de la afección, de la forma de administración, del juicio del médico o el veterinario que prescribe, etc. En los casos de administración local o absorción selectiva, la concentración local eficaz del fármaco puede no estar relacionada con la concentración en plasma y se pueden emplear otros procedimientos conocidos en la técnica para determinar la cantidad e intervalo de dosificación correcta.

Los modos de realización de la presente invención también contemplan el uso de una composición farmacéutica que comprende una o más sales del compuesto I o de los polimorfos de dichas sales de la presente invención y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable en la preparación de un medicamento que es útil en el tratamiento del cáncer en animales de compañía.

Adicionalmente, se contempla que las sales del compuesto I o los polimorfos de dichas sales, como se describe en la presente memoria, se metabolizarían por las enzimas en el cuerpo de un organismo, tal como un animal de compañía o un ser humano, para generar un metabolito que puede modular la actividad de las proteína cinasas. Tales metabolitos se encuentran dentro del alcance de la presente invención.

Los compuestos de la invención se pueden administrar solos o combinados con uno o más compuestos distintos de la invención, o combinados con otro u otros fármacos (o como cualquiera de sus combinaciones). También se contempla que las sales del compuesto I o los polimorfos de dichas sales, como se describe en la presente memoria, se puedan combinar con otros agentes quimioterapéuticos para el tratamiento de las enfermedades y trastornos descritos anteriormente. Por ejemplo, un compuesto de la presente invención se puede combinar con fluorouracilo solo o en combinación adicional con leukovorina u otros agentes alquilantes. También se puede utilizar un compuesto de la presente invención combinado con otros agentes quimioterapéuticos antimetabolitos, tales como, pero sin estar limitados a ellos, análogos del ácido fólico o análogos de la purina. También se puede usar un compuesto combinado con agentes quimioterapéuticos basados en productos naturales, agentes quimioterapéuticos antibióticos, agentes quimioterapéuticos enzimáticos, complejos de coordinación de platino y hormonas y antagonistas de las hormonas. También se contempla que un compuesto de la presente invención se pueda usar combinado con mitoxantrona o paclitaxel para el tratamiento de cánceres de tumor sólido o leucemias.

Sin elaboración adicional, se cree que un experto en la técnica, usando la descripción precedente, puede poner en práctica la presente invención en su total extensión. Los siguientes ejemplos detallados describen cómo preparar los diversos compuestos y/o realizar los diversos procedimientos de la invención, y deben interpretarse como meramente ilustrativos y en absoluto como limitaciones de la descripción precedente en modo alguno. Los expertos en la técnica reconocerán en seguida variaciones apropiadas de los procedimientos tanto para los agentes reaccionantes como para las condiciones y técnicas de reacción.

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Ejemplos Ejemplo 1 Síntesis del compuesto I, es decir (2-pirrolididin-1-il-etil)-amida del ácido 5-(5-fluoro-2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenometil)-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico

Como se describe en patente estadounidense 6.574.293 (ejemplo 129) se condensó 5-fluoro-1,3-dihidro-indol-2-ona con (2-pirrolidin-1-il-etil)-amida del ácido 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico para dar el compuesto
I.

Procedimiento de aumento proporcional. Se mantuvieron a reflujo durante 4,5 horas ácido 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (61 g), 5-fluoro-1,3-dihidro-indol-2-ona (79 g), etanol (300 mL) y pirrolidina (32 mL). Se añadió ácido acético (24 mL) a la mezcla y se continuó el reflujo durante 30 minutos. La mezcla se enfrió a temperatura ambiente y se recogieron los sólidos por filtración a vacío y se lavaron dos veces con etanol. Se agitaron los sólidos durante 130 minutos en acetona al 40% en agua (400 mL) que contenía ácido clorhídrico 12N (6,5 mL). Se recogieron los sólidos por filtración a vacío y se lavaron dos veces con acetona al 40% en agua. Se secaron los sólidos a vacío para dar el ácido 5-[5-fluoro-2-oxo-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenometil]-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (86 g, rendimiento 79%) como un sólido naranja.

Se agitaron el ácido 5-[5-fluoro-2-oxo-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenometil]-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (100 g) y dimetilformamida (500 mL) y se añadieron hexafluorofosfato de benzotriazol-1-iloxitris(dimetilamino)fosfonio (221 g), 1-(2-aminoetil)pirrolidina (45,6 g) y trietilamina (93 mL). La mezcla se agitó durante 2 horas a temperatura ambiente. Se aisló el producto sólido mediante filtración a vacío y se lavó con etanol. Los sólidos se lavaron en lechada por agitación en etanol (500 mL) durante una hora a 64ºC y se enfriaron a temperatura ambiente. Los sólidos se recogieron por filtración a vacío, se lavaron con etanol y se secaron a vacío para dar la (2-pirrolidin-1-il-etil)-amida del ácido 5-[5-fluoro-2-oxo-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenometil)-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (101,5 g, rendimiento 77%).

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Ejemplo 2 Síntesis de las sales del compuesto I

Ejemplo 2A

Fosfato del compuesto I

Se pusieron 2,67 mmoles del compuesto I en un matraz con 40 mL de ácido fosfórico 0,092M (aproximadamente un exceso molar de 40% suponiendo una sal 1:1) y 40 mL de isopropanol. A continuación se añadió de forma continua acetonitrilo a la disolución acuosa en alícuotas de 30 mL a medida que se sometía la disolución a rotavapor a 60ºC para eliminar el agua. En total se utilizaron 120 mL de acetonitrilo para eliminar el agua de la disolución. Los cristales se filtraron y se secaron al aire. Los cristales presentaban fluidez libre y color naranja; se recogieron 1,09 gramos con un rendimiento del 83%.

Ejemplo 2B

Citrato del compuesto I

Se pusieron 2,64 mmoles del compuesto I en un matraz con 34 mL de ácido cítrico 0,1M (3,4 mmoles) y 35 mL de metanol. Esta disolución se sometió a rotavapor a 50ºC. La reducción de volumen de esta disolución produjo cristales de cristalinidad pobre, por lo que se añadieron 20 mL de isopropanol y 10 mL de metil etil cetona para disolver el sólido. Esta mezcla se sometió a rotavapor a 60ºC y se produjeron cristales de color naranja. Los cristales se filtraron y se secaron al aire. El rendimiento de este proceso fue de aproximadamente 60% y se podría haber mejorado reduciendo el volumen de disolvente adicionalmente antes de la filtración.

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Ejemplo 3 Propiedades físicas de las sales del compuesto I

Métodos. Los ensayos para determinar las propiedades físicas de las sales del compuesto I incluyeron la determinación del punto de fusión, pureza por HPLC, difracción de rayos X en polvo y gravimetría de absorción de humedad dinámica.

Difracción de rayos X en polvo (PXRD). La XRD se realizó en polvo utilizando un sistema de difracción avanzado Scintag X2 (lab 259-1088), controlado mediante los programas Scintag DMS/NT 1.30a y Microsoft Windows NT 4.0. El sistema usa una fuente de rayos-X de cobre (45 kV y 40 mA) para proporcionar emisión CuK\alpha_{1} de 1,5406 \ring{A} y un detector de estado sólido Peltier enfriado. La apertura del haz se controló utilizando rendijas de divergencia del tubo y antidispersión de 2 y 4 mm y rendijas antidispersión del detector y del receptor de 0,5 y 0,2 mm de anchura. Los datos se recogieron para ángulos dos-theta de 2 a 35º utilizando un barrido por etapas de 0,03º/etapa con un tiempo de medida de un segundo por etapa. Para los experimentos se utilizaron portamuestras Scintag redondos de carga superior y de acero inoxidable con inserciones de 9 mm de diámetro. Los polvos se empaquetaron en el portamuestras y se presionaron suavemente mediante una lámina de vidrio para asegurar la coplanaridad entre la superficie de la muestra y la superficie del portamuestras.

Gravimetría de absorción de humedad dinámica (DMSG). Se midió la isoterma por DMSG en una microbalanza atmosférica de temperatura controlada. Se colocaron aproximadamente muestras de 10 mg en el contenedor de muestras de la balanza. Se varió secuencialmente la humedad desde humedad relativa normal (RH) a 0% de RH y luego se aumento hasta 90% de RH seguido por una disminución de la RH hasta 0% otra vez en etapas de 3% de RH. A continuación se midió la masa cada dos minutos. La RH se cambió al siguiente valor cuando la variación de masa de la muestra fue menor que 0,5 \mug en 10 minutos. Se utilizó el programa Visual Basic dmsgscn2.exe para controlar la recogida de datos y exportar la información a una hoja de cálculo Excel.

Resultados. La tabla 1 muestra un resumen de los datos para las sales de ascorbato, citrato, fumarato, hidrocloruro y fosfato del compuesto I. Los análisis por HPLC sugirieron que las sales eran de relativamente alta pureza y que no se indujo ningún cambio significativo en la pureza durante el procedimiento de formación de la sal.

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TABLA 1 Resumen de las sales sintetizadas para el compuesto I

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Las sales de hidrocloruro, fumarato y ascorbato fueron muy higroscópicas (véase figura 1). Las otras dos sales (citrato y fosfato) tenían perfiles de absorción de humedad menores, absorbiendo menos de 3% de agua a 70% de humedad relativa.

Los patrones de rayos X en polvo indicaron que las sales de fosfato y citrato presentaban una cristalinidad relativamente alta. (Véanse las tablas 2 y 3; y la figura 2).

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 2 Picos por PXRD del fosfato del compuesto I

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TABLA 3 Picos por PXRD del citrato del compuesto I

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Ejemplo 4 Preparación y caracterización del fosfato del compuesto I

Ejemplo 4A

Preparación del fosfato del compuesto I

Se utilizó la base libre del compuesto I para preparar la sal de fosfato. Se preparó una muestra (número de lote 35282-CS-51) del fosfato del compuesto I como se ha descrito anteriormente. Se añadieron 4 mL de ácido fosfórico 0,977M a 1,095 g de base libre en un matraz, seguido inmediatamente por la adición de 4 mL de acetonitrilo. Se obtuvo una suspensión. La suspensión se calentó suavemente en una placa calefactora. Añadiendo 40 mL de agua y calentado con agitación durante una hora no permitió disolver completamente el sólido. El sólido se filtró y se lavó con 10 mL de acetonitrilo. Los resultados por PXRD demostraron que era la sal de fosfato del compuesto I.

Ejemplo 4B

Caracterización del fosfato del compuesto I

El lote 35282-CS-51 se denominó polimorfo de forma I del fosfato del compuesto I. Tenía cristalinidad elevada, buena fluidez y tamaño cristalino grande. Tanto la ausencia de fusión a la temperatura de fusión de la base libre del compuesto I (polimorfo de la base libre de forma A, 256ºC; polimorfo de la base libre de forma B, 259ºC) y la presencia de puntos de fusión elevados (281-297ºC) de los sólidos sugirieron que los cristales del lote 35282-CS-51 eran una forma salina diferente y no la base libre del compuesto I. La pureza del lote fue de 99,6% por HPLC.

Ejemplo 4C

Cálculo aproximado de la solubilidad del fosfato del compuesto I

Se transfirieron muestras de 1-2 mg del fosfato del compuesto I (lote 35282-CS-51) en viales de vidrio de 10 mL (aforados) y se pesaron (precisión de 0,1 mg). Se añadieron los disolventes a los viales (un disolvente en cada vial) en etapas, añadiendo 0,5 mL de disolvente en cada etapa. Los disolventes utilizados fueron disolución tampón (pH = 2), disolución tampón (pH = 5), agua, metanol, tetrahidrofurano (THF), acetonitrilo y acetona. Después de cada adición, se tapó el vial y se agitó. Se observó visualmente la disolución del sólido. Si no se observó disolución evidente, se añadió más disolvente inmediatamente. Si la disolución fue evidente, el vial se dejó reposar durante al menos 30 minutos antes de la siguiente adición de disolvente. Esta etapa se repitió hasta que no hubo cristales visibles frente a un fondo blanco y uno negro. A continuación, se fijó el intervalo de solubilidad dividiendo el peso del compuesto por el volumen final y el volumen antes de la última adición. Si quedaba sólido después de la primera adición de 10 mL de disolvente, se expresó la solubilidad como menor que el peso dividido por el volumen final. Si el sólido se disolvió completamente después de la primera adición de disolvente, se expresó la solubilidad como mayor que el peso dividido por el volumen de disolvente. Todos los experimentos se realizaron a temperatura
ambiente.

Las solubilidades calculadas del fosfato del compuesto I en varios disolventes se presentan en la tabla 4 junto con las solubilidades de la base libre, expresadas en mg/mL. La solubilidad del fosfato del compuesto I es menor que la de la base libre del compuesto I en el mismo disolvente, excepto en agua (para varios niveles de pH). La solubilidad del fosfato del compuesto I depende del valor del pH de la disolución y se hace considerablemente mayor (> 3 mg/mL) a pH 2 o inferior. El punto de fusión del fosfato del compuesto I (lote 35282-CS-51) es de aproximadamente 281-297ºC, que es esencialmente mayor que el punto de fusión de la base libre del compuesto I (polimorfo de la base libre de forma A, 256ºC; polimorfo de la base libre de forma B, 260ºC). Un resultado importante es que la humectabilidad del fosfato del compuesto I con agua es mucho mejor que la de la base libre del compuesto I.

TABLA 4 Solubilidad calculada de la base libre del compuesto I y del fosfato de la base I en varios disolventes a 23ºC

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70

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Ejemplo 5 Generación de los polimorfos del fosfato del compuesto I.

Las bajas solubilidades del fosfato del compuesto I observadas en el ejemplo 4C indican que las disoluciones de fosfato del compuesto I muy concentradas (60-100 mg/mL, naranja oscuro-rojo) serían buenas para precipitar los polimorfos del fosfato del compuesto I en varios disolventes. Se prepararon dichas disoluciones concentradas disolviendo la base libre del compuesto I en ácido fosfórico aproximadamente 1M. Por ejemplo, se podrían disolver 70 mg de base libre del compuesto I en 1 mL de ácido fosfórico 1M. Sin embargo, la cantidad de la base libre del compuesto I y ácido fosfórico depende de la concentración deseada y del tamaño de lote de la disolución. En el ejemplo en el que el precipitado se filtró a vacío inmediatamente después de la precipitación, aproximadamente 1 mL de la disolución deseada se vertió entonces en aproximadamente 10 mL de diez disolventes para precipitar los cristales de la sal. Estos disolventes fueron agua con acetonitrilo (ANC), etanol, metanol, acetona, acetonitrilo, THF, acetato de etilo, hexano, cloruro de metileno (CH_{2}Cl_{2}) y alcohol isopropílico (IPA). En el ejemplo en el que el precipitado se filtró a vacío después de dejarlo reposar durante la noche o durante tres días, se utilizaron metil etil cetona (MEK) y dioxano como disolventes adicionales. Algunos disolventes orgánicos, por ejemplo acetato de etilo, hexano y CH_{2}Cl_{2}, no son miscibles con el agua y se observaron dos fases de disolventes. Solo se observó una pequeña precipitación en la interfase incluso minutos después de la adición. En estos casos, se añadió 1 mL de metanol como disolvente puente para aumentar la miscibilidad entre las dos fases. Parece que el metanol sirvió para aumentar la miscibilidad porque la fase orgánica incolora se volvió amarilla tan pronto como se añadió el metanol. El vial se agitó entonces vigorosamente a mano durante aproximadamente un minuto. Los sólidos que precipitaron en los disolventes orgánicos se filtraron a vacío bien inmediatamente después de la precipitación (en 20 minutos) o bien después de reposar durante la noche o durante tres días, con el fin de aislar los polimorfos tanto estables como metaestables. A continuación se analizó el polvo. Los diferentes sólidos se numeraron siguiendo el orden de su descubrimiento.

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Ejemplo 6 Caracterización de los polimorfos del fosfato del compuesto I

Ejemplo 6A

Métodos de caracterización

Todos los polvos obtenidos mediante los procedimientos de muestreo de polimorfos anteriores se analizaron por PXRD, como se ha descrito en el ejemplo 3 anterior. Cuando se observó un patrón de PXRD nuevo, se utilizaron también técnicas complementarias para caracterizar los sólidos, incluyendo gravimetría de absorción de humedad dinámica (también descrita en el ejemplo 3), calorimetría de barrido diferencial, análisis térmico gravimétrico (si es necesario) y microscopía óptica.

Calorimetría de barrido diferencial (DSC). Los datos de DSC se obtuvieron utilizando un calorímetro DSC (TA Instruments 2920). Se empaquetó el polvo (1-5 mg) en una cazoleta de aluminio del DSC. Se colocó una tapa de aluminio sobre la cazoleta y se selló. La cazoleta sellada se colocó en el célula de muestra junto con una cazoleta vacía como referencia. Se aumentó la temperatura a 300 o 350ºC desde 30ºC a una tasa de 10ºC/min a menos que se especifique de otro modo.

Termogravimetría (TGA). Los experimentos de TGA se realizaron utilizando un analizador de alta resolución (TA Instruments modelo 2950). Para la recogida de datos se utilizó el programa de TA lnstruments Thermal Solutions^{TM} para NT (versión 1.3L) y se usó el Universal Analysis^{TM} para NT (versión 2.4F) para el análisis de los datos. Se colocaron las muestras (5-10 mg) en una cazoleta de aluminio que se colocó posteriormente sobre un recipiente de pesada de platino antes de calentarlo. Los pesos de los recipientes de aluminio y de platino se determinaron antes de cargar las muestras. Se aumentó la temperatura de 30ºC a 300ºC linealmente a una tasa de 10ºC/min. Se utilizó una purga de nitrógeno.

Microscopía con luz polarizada. El estudio microscópico se realizó usando un microscopio con luz polarizada Olympus BHSP. Se puso en suspensión el polvo en aceite de silicona y se dispersó entre un portamuestras para microscopía y un cubreobjetos. Antes de la observación, el cubreobjetos se frotó suavemente contra el portamuestras para obtener una buena dispersión de las partículas.

Ejemplo 6B

Caracterización inmediatamente después de precipitación

Los resultados se resumen en la tabla 5. La precipitación se produjo tan pronto como la disolución ácida se mezcló con los anti-disolventes. Al principio, los precipitados fueron coloidales. En general los colores fueron amarillo o naranja claro. El sólido resultante era pegajoso. La observación microscópica de esos sólidos mostró que estaban constituidos por partículas cristalinas muy pequeñas con muy buena birrefringencia bajo luz polarizada. Se observaron al menos seis patrones de PXRD diferentes en los sólidos obtenidos a partir de nueve sistemas disolventes. (Véase la figura 3). La cadena lateral amida de esta molécula es flexible y toma diferentes conformaciones en la base libre de forma B y en su sal de hidrocloruro. Por lo tanto, la molécula en las diferentes formas sólidas puede tener polimorfos conformacionales. Los patrones de PXRD de los sólidos precipitados en acetato de etilo, hexano e IPA parecen ser los mismos. Sin embargo, una comparación detallada con otros patrones de PXRD fue difícil de realizar debido a la baja señal de difracción de los sólidos obtenidos en estos tres disolventes. Consecuentemente, no se asignaron como una forma nueva. El precipitado en metanol es el mismo que el del lote de referencia 35282-CS-51 (denominado forma I). Los datos de TGA de todos los precipitados indicaron disolvente residual a un nivel de 1,7-4,7%. De estos sólidos, el de CH_{2}Cl_{2} pareció ser un sólido que retuvo disolvente en los cristales. La curva de TGA mostraba una disminución brusca en el peso de la muestra a una temperatura de aproximadamente 125ºC (véase la figura 4). Este fenómeno se recoge como una endoterma a aproximadamente la misma temperatura por DSC. Además, este polvo estaba constituido por cristales de morfología bien definida y presentaba fluidez libre, una propiedad muy diferente de los otros lotes de precipitados. El polvo presentaba una cristalinidad media por PXRD pero buena cristalinidad cuando se observó con el microscopio con luz polarizada. Otros lotes estaban constituidos por partículas cristalinas muy pequeñas. En la curva de DSC de estos polvos, se observó una endoterma ancha y aplanada tan pronto como se cargó la muestra en la célula portamuestras. Esta observación se refleja por TGA como una pérdida de peso gradual desde el principio del calentamiento en el análisis por TGA. Por lo tanto, para estos lotes, los disolventes residuales eran probablemente disolventes adsorbidos en la superficie y no había disolventes en la red cristalina.

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Ejemplo 6C

Precipitación después de reposo durante tres días en el disolvente

Estos resultados se resumen en la tabla 6. Después de un tiempo de reposo de hasta tres días en el disolvente, apareció una nueva fase sólida de color naranja-rojo y poco esponjosa. Los precipitados esponjosos obtenidos en todos los disolventes orgánicos, excepto el precipitado en metanol, se transformaron. Aparentemente, los sólidos que precipitaron inmediatamente después de la precipitación eran metaestables en estos casos, por lo que se convirtieron en una forma sólida más estable (forma I) a lo largo del tiempo. Parece ser que esta conversión se completó en un par de horas en la mayoría de los sistemas disolventes. Sin embargo, se dejó que reposaran durante un periodo de tiempo mucho mayor para asegurar la finalización del proceso con el fin de evitar recoger una mezcla de dos formas sólidas. La curva de TGA mostró una pérdida brusca de peso a aproximadamente 124ºC y 153ºC para los sólidos obtenidos en hexano y acetonitrilo respectivamente, acoplada con una endoterma a similar temperatura por DSC. Por lo tanto, parece que también contenían disolvente retenido en la red cristalina. Las estequiometrías de los disolventes retenidos son de aproximadamente 0,6 para el acetonitrilo y aproximadamente 0,14 para el hexano. Después de reposar durante tres días en el acetonitrilo crecieron cristales con forma de aguja. Los patrones de PXRD del sólido con acetonitrilo retenido eran únicos, mientras que el patrón de PXRD del solvato con hexano es similar al del sólido que retiene CH_{2}Cl_{2}- que se ha identificado anteriormente (véase figura 3). Ambos sólidos que retienen disolvente (hexano y acetonitrilo) perdieron peso en la cazoleta de TGA. Se observaron patrones de PXRD únicos para ambos sólidos después de que el correspondiente disolvente retenido se eliminara por calentamiento (tabla 7, figura 3), lo que indica que la eliminación de las moléculas de disolvente de los sólidos produjo cambios estructurales en los cristales del solvato (por lo tanto, las moléculas de disolvente estaban en la red cristalina y no simplemente sobre las superficies cristalinas). Sin embargo, el patrón de PXRD del sólido desolvatado obtenido en acetonitrilo tenía una intensidad de señal pequeña. El perfil de DSC del sólido desolvatado obtenido en acetonitrilo presentaba dos fenómenos térmicos adicionales a 74ºC y 174ºC en comparación con el perfil de DSC del solvato con acetonitrilo, mientras que el fenómeno de desolvatación a 153ºC no se observó. El enfriamiento de la muestra después de la desolvatación pudo haber cambiado el sólido que presenta un cambio energético a 174ºC.

Cuando se utilizaron otros disolventes orgánicos, los periodos de reposo más largos de los precipitados produjeron sólidos con el mismo patrón de PXRD que el de la forma I (lote 35282-CS-51) aunque la morfología de los cristales era diferente (tabla 6). El mismo patrón de PXRD indicaba que dichos sólidos tenían la misma estructura de red cristalina. La diferente morfología puede deberse a efectos del disolvente. Es evidente que la forma I es la fase sólida más estable entre todos los polimorfos no solvatados descritos en la presente memoria. Otras formas sin disolvente eran metaestables y se transformaron en la forma I rápidamente cuando se pusieron en contacto con el disolvente. El sólido cristalizado en CH_{2}Cl_{2} parecía fluir más fácilmente que el sólido cristalizado en hexano. La TGA, morfología y fluidez indicaron que eran dos sólidos diferentes.

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TABLA 7 Caracterización física de los sólidos producidos después de desolvatación

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Ejemplo 7 Inhibición de la fosforilación de la KIT en tumores de mastocitos caninos

Objetivo. El desarrollo de terapias dirigidas contra el cáncer ofrece la oportunidad de evaluar directamente los efectos del fármaco sobre la diana molecular y correlacionar estos efectos con la biología del tumor y la farmacocinética del fármaco. Esto puede ser eficaz en el desarrollo de fármacos oncológicos porque establece una relación farmacodinámica/farmacocinética y proporciona información crítica con respecto al impacto terapéutico del agente dirigido. El objetivo de este estudio es evaluar el efecto de una dosis única del inhibidor de la tirosina cinasa receptora, fosfato del compuesto I, sobre la actividad de su diana molecular, KIT, en tumores de mastocitos caninos (MTC), en pacientes caninos con MCT avanzados, usando la fosforilación de la KIT como un marcador de la inhibición de la diana directa. También se estudió la fosforilación de las ERK1/2 (una proteína cinasa mitógeno-activada (MAPK) en dirección 3' a la señalización de la KIT), la concentración plasmática del fosfato del compuesto I y el estado mutacional del c-kit para determinar si estos parámetros se podían correlacionar con el estado de fosforilación de la KIT después del tratamiento con el fosfato del compuesto I.

Fármaco del estudio. El fosfato del compuesto I estuvo disponible en comprimidos marcados de 20 mg.

Diseño del estudio. Este estudio fue una comprobación del estudio de modulación dirigida en perros con MCT de grado II/III recurrente o metaestático. Los pacientes recibieron una dosis oral única del fosfato del compuesto I a razón de 3,25 mg/kg. Usando un instrumento de biopsia con punzón de 6 mm, se obtuvieron muestras del tumor antes de la administración del fosfato del compuesto I y 8 horas (h) después del tratamiento. Cuando fue posible se tomaron varias biopsias. Cada muestra se congeló en nitrógeno líquido y se almacenó a -70º centígrados (C) antes del análisis. Las muestras de sangre para el análisis de los niveles plasmáticos de fosfato del compuesto I se obtuvieron al mismo tiempo que las biopsias del tumor (véase a continuación).

Niveles plasmáticos de fosfato del compuesto I. Se tomaron muestras sanguíneas de la vena yugular y se pusieron en un tubo de vidrio de recogida de suero con la parte superior roja. Se mantuvieron las muestras a temperatura ambiente, se dejó que se coagularan, se centrifugaron a 1.500 rpm a 4ºC durante 10 minutos, se transfirieron a viales de criogenización y se congeló el plasma a -70ºC hasta el análisis. Brevemente, las muestras de plasma (20 \mul) o patrones de fosfato del compuesto I en plasma canino se mezclaron con metanol (200 \mul) que contenía hidrocloruro de DL-propranolol (patrón interno) en una placa de polipropileno de 96 pozos (Orochem Technology, Westmont, IL). La placa se mezcló con movimiento rotatorio durante 1 minuto y las muestras se centrifugaron durante 10 minutos a 4.000 rpm. Se inyectaron 10 microliltros del sobrenadante en un sistema LC/MS/MS en el que se realizó la separación en una columna de cromatografía de líquidos de alta resolución en fase inversa BataBasic C-18 (5 \mum, 100 X 4,6 mm) (Keystone Scientific, Foster City, CA). La cantidad de fosfato del compuesto I y el patrón interno de cada muestra de plasma canino se cuantificaron en función de las curvas de calibrado generadas utilizando cantidades conocidas del compuestos que iban de 0,2 a 500 ng/ml.

Análisis de la mutación del c-kit . En la mayoría de las muestras, se extrajo el ARN usando TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA) según las especificaciones del fabricante. A continuación se generó el ADN-c a partir del ARN usando dNTPs, iniciadores aleatorios, disolución tampón 5X First Strand Buffer, DTT 0,1M y Taq polimerasa (todo ello de Promega, Madison, WI). Se cuantificó el ADN-c para cada muestra. Para las muestras restantes, se preparó el ADN genómico como se ha descrito previamente (Downing, S., Chien, M. B., Kass, P. H., Moore, P. F. y London, C. A. Prevalence and importance of internal tandem duplications in exons 11 and 12 of c-kit in mast cell tumors of dogs. Am. J. Vet. Res., 63: 1718-1723, 2002; que se incorpora como referencia en su totalidad). Para ambas reacciones se realizó la PCR durante 40 ciclos que consistían en 94ºC (1 min), 59ºC (1 min) y 72ºC (1 min), con una extensión de 5 minutos a 72ºC al final de la reacción. Como controles se usaron un ADN-c c-kit generado a partir de la línea de mastocitos caninos C2 y un ADN-c generado a partir de cerebelo canino normal.

Los productos de la PCR se separaron por electroforesis en gel de agarosa al 4%; el producto esperado de la PCR del c-kit de fenotipo natural tiene un tamaño de 196 bp para la PCR del ADN-c y un tamaño de 190 bp para la PCR del ADN genómico. En aquellos casos en los que la ITD no era evidente (solo había un banda única), los productos de la PCR se purificaron sobre gel utilizando el kit Promega PCR Wizard Clean-Up (Promega) y se secuenciaron usando bien iniciadores P1 (directo) y P5 o P2 (inverso) en las instalaciones de secuenciación de la Universidad de California-Davis para descartar la presencia de ITDs muy pequeñas, deleciones o mutaciones puntuales. El alineamiento de las secuencias y la comparación se realizaron utilizando el programa de análisis de secuencias DNASIS.

Análisis de la fosforilación de la KIT y la ERK. Se congelaron las biopsias de tumor en nitrógeno líquido y se pulverizaron posteriormente utilizando un criomortero y mano enfriados por nitrógeno líquido, luego se almacenaron a -70ºC hasta su utilización. Para el análisis de la KIT, los tumores pulverizados se homogeneizaron, se lisaron y se inmunoprecipitaron a partir de 1 mg de lisato de tumor inicial, como se ha descrito previamente (Abrams, T. J., Lee, L. B., Murray, L. J., Pryer, N. K., Cherrington, J. M. SU11248 inhibits KIT and platelet-derived growth factor receptor beta in preclinical models of human small cell lung cancer. Mol. Cancer Ther. 2: 471-478, 2003; que se incorpora como referencia en su totalidad) utilizando un anticuerpo conjugado con agarosa para KIT (SC-1493AC; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Cuando se disponía de varias biopsias, la inmunoprecipitación repetida/análisis de transferencia de Western se realizaron en biopsias separadas. La cantidad de KIT fosforilada en cada muestra se determinó por transferencia de Western utilizando un anticuerpo para la fofotirosina 719 de KIT murina (3391; Cell Signaling Technology, Beverly, MA), que corresponde a la tirosina 721 de la KIT canina y es un sitio de autofosforilación y, por lo tanto, un sustituto para la actividad cinasa de la KIT. Para el análisis total de la KIT, se pusieron en bandas las manchas, se volvieron a colocar en bloques y se volvieron a ensayar con anticuerpo para KIT (A-4542; DAKO Corp., Carpinteria, CA). Para el análisis de p42/44 ERK, los mismos lisatos de tumor utilizados para el análisis de la KIT se ensayaron por transferencia de Western con un anticuerpo para fosfo-Thr 202/Tyr 204 ERK1/2 (9101B; Cell Signaling Technology) y luego se pusieron en bandas y se volvieron a ensayar con un anticuerpo para la ERK total ERK (9102; Cell Signaling Technology). Se consideraron pares de biopsias de tumor evaluables tanto para la KIT como para la ERK1/2 aquellos en los que había proteína total detectable en ambas biopsias del par. Se midió ocularmente la modulación dirigida por tres observadores independientemente (ensayo ciego) y se relacionó con el estado del JM y la concentración plasmática. Una reducción \geq 50% en la señal de la fosfo-proteína con respecto a la señal de la proteína total en la muestra de biopsia tomada después del tratamiento en comparación con la biopsia antes del tratamiento se consideró como positiva para la modulación dirigida, mientras que una reducción <50% se consideró negativa.

Resultados. En este estudio clínico se utilizaron catorce perros con el objetivo principal de determinar si se produjo una reducción en la fosforilación de la KIT tirosina después de la administración oral de una dosis única de fosfato del compuesto I. Se evaluó la fosforilación de la KIT tirosina utilizando un anticuerpo fosfo-específico dirigido contra un sitio de autofosforilación en la KIT, sirviendo como sustituto para la actividad cinasa de la KIT. Además, se determinó el estado mutacional JM del c-kit (ITD+ o ITD-) a partir de la biopsia del tumor de base y se midieron las concentraciones plasmáticas del fosfato del compuesto I 8 horas después de la dosificación para correlacionar estos parámetros con la inhibición de la fosforilación de la KIT. Once de los 14 perros fueron evaluables con respecto a la modulación dirigida de la KIT. Los tres perros considerados no evaluables presentaban una proteína KIT total no detectable o disminuida de forma importante en una o ambas biopsias, por lo que no se pudo determinar la modulación dirigida. Los datos para todos los perros utilizados en este estudio se resumen en la tabla 8.

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TABLA 8 Sumario de los datos para todos los pacientes

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De los 14 perros analizados, 5 (36%) presentaban ITD por análisis de PCR (Fig. 5, Líneas 1-5); los cinco tumores presentaban evidencia de una ITD. De forma interesante, el paciente 2 había perdido aparentemente el alelo c-kit de fenotipo salvaje. Los productos de la PCR de los nueve perros restantes que no presentaban evidencia de ITD (Fig. 5, Líneas 6-14) se secuenciaron directamente y ninguno presentó ningún tipo de mutación (inserción, deleción o mutación puntual). Para las líneas 3, 6, 8 y 9 se utilizó ADN genómico para la reacción de PCR lo que produjo un producto de fenotipo salvaje ligeramente menor (190 bp).

El nivel de KIT total y fosforilada expresado en los MCT en la línea base varió de un animal a otro. Una mayor expresión de la KIT se correlacionó con una grado tumoral más elevado. Cuatro de los ocho tumores de grado III presentaban una expresión de la KIT alta, en comparación con uno de los seis tumores de grado II (Fig. 6). Por ejemplo, la expresión de la KIT total en el tumor del paciente 2 (grado III) fue considerablemente superior que la del tumor del paciente 11 (grado II). Los perros con tumores de grado III también tenían una mayor incidencia de niveles altos de KIT fosforilada en la línea base que aquellos con tumores de grado II, lo que es consistente con la frecuencia aumentada de mutaciones ITD del c-kit en tumores avanzados y, consecuentemente, niveles elevados de KIT fosforilada independientemente del ligando. Cinco de los siete perros evaluables con tumores de grado III tenían niveles elevados de KIT fosforilada en la línea base; cuatro de estos dieron positivo para la presencia de una ITD en el c-kit. Sólo 1 tumor de grado II presentaba una KIT fosforilada significativa; este animal también expresó c-kit con mutación ITD.

Ocho de los 11 perros evaluables dieron positivo para la modulación dirigida usando el criterio de una reducción \geq 50% en la KIT fosforilada con respecto a la KIT total en la muestra de biopsia tomada después del tratamiento con fosfato del compuesto I en comparación con la muestra antes del tratamiento. En la figura 6 se muestran ejemplos de KIT fosforilada y KIT total en inmunoprecipitados de biopsias de tumor tomadas antes y después del tratamiento con el fosfato del compuesto I. Cinco tumores (Fig. 6, izquierda) dieron positivo para la modulación dirigida, mientras que dos tumores (Fig. 6, derecha) dieron negativo. Todos los pares de biopsia que dieron negativo para la inhibición de la fosforilación de la KIT después del tratamiento con fosfato del compuesto I presentaban marcadamente menos KIT fosforilada en la línea base que los que dieron positivo (Fig. 6).

Para evaluar los efectos de inhibición del fosfato del compuesto I en las vías de señalización en dirección 3' reguladas por la fosforilación de la KIT, se evaluaron los niveles de MAPK ERK1/2 fosforilada por análisis de transferencia de Western de los mismos pares de biopsia utilizados para el análisis de la KIT. Once de los 14 tumores fueron evaluables para la modulación dirigida a la fosfo-ERK1/2 (dos de ellos no eran evaluables para la modulación dirigida a la KIT). De los 11 evaluables, 7 mostraron una reducción en la relación entre la fosfo-ERK1/2 y la ERK1/2 total en muestras de tumores tomadas después de la administración de fosfato del compuesto I, en comparación con muestras de tumor de la línea base (véase Fig. 6). La modulación dirigida a la ERK fue se detectó más frecuentemente en los MCT con expresión en la línea base y fosforilación de la ERK relativamente altas que en aquellos con ERK
baja.

Basándose en el trabajo preclínico en modelos de roedores, el intervalo terapéutico del compuesto I para la inhibición dirigida se consideró que era de 50-100 ng/ml para un periodo de dosificación de 12 h o 24 h. La concentración en plasma del fosfato del compuesto I, 8 horas después de una dosis única (aproximadamente Cmax) de 3,25 mg/kg varió de 33,2 a 186 ng/ml, con una media de 105 \pm 9 ng/mL (tabla 8). En un animal, la concentración en plasma de fosfato del compuesto I estaba fuera del intervalo de las otras muestras (0,3 ng/ml). Doce de los 14 perros tenían niveles plasmáticos que se consideran dentro del intervalo terapéutico establecido en el estudio clínico en fase I del compuesto I. (London, C. A., Hannah, A. L., Zadovoskaya, R., Chien M. B., Kollias-Baker, C., Rosenberg, M., Downing, S., Post, G., Boucher, J., Shenoy, N., Mendel, D. B. y Cherrington, J. M. Phase I dose-escalating study of SU11654, a small molecule receptor tyrosine kinase inhibitor, in dogs with spontaneous malignancies. Clin. Cancer Res., 2755-2768, 2003). La concentración plasmática media para perros con evidencia de modulación dirigida a la KIT (79,2 \pm 41 ng/ml) y de aquellos que se consideró que no presentaban modulación dirigida a la KIT (137 \pm 36 ng/ml) no fue significativamente diferente (P = 0,08).

Discusión. Este estudio correlativo se diseñó para investigar la modulación dirigida en una población clínica comparable mediante el estudio de los efectos de una dosis única clínicamente eficaz de fosfato de compuesto I sobre la fosforilación de la KIT en MCT caninos y el consiguiente impacto de la señalización a través de MAPK. Las concentraciones plasmáticas de fosfato del compuesto I obtenidas en este estudio se midieron cerca de la Cmax esperada, basándose en estudios farmacológicos preclínicos, y fueron consistentes con los niveles de fármaco medidos en el estudio clínico en fase I que investiga la dosis eficaz y el régimen del compuesto I (Tabla 8).

Ocho de las 11 (73%) pares de biopsias de MCT evaluables presentaban inhibición detectable de la activación de la KIT medida por una reducción de la KIT fosforilada después de una dosis oral única de fosfato de compuesto I. Los tres pacientes que no mostraron modulación dirigida a la KIT detectable después del tratamiento tenían MCT que habían expresado niveles bajos de KIT y fosfo-KIT en la línea base. La falta de una modulación dirigida significativa en estos pacientes se puede atribuir a límites técnicos en el método de detección; la sensibilidad del anticuerpo fosfo-específico para la KIT fosforilada con respecto a la KIT no fosforilada puede ser insuficiente en muestras con expresión de la KIT baja en la línea base. La inhibición de la actividad de la KIT se correlaciona más cercanamente con la fosforilación de la KIT en la línea base que con el genotipo ITD del c-kit. Basándose en ensayos celulares, se podría predecir que tanto la KIT de fenotipo salvaje como la KIT con mutación ITD serían inhibidas por el fosfato del compuesto I in vivo, porque el compuesto I in vitro bloqueó la fosforilación de la KIT con fenotipo salvaje y de la KIT con mutación ITD con una potencia similar.

El fosfato del compuesto I también afectó a una vía de señalización en dirección 3' de la KIT. Se ha informado de mutaciones en el c-kit en GIST y afecciones hematopoyéticas que activan diferentes vías de señalización entre ellas y en la KIT de fenotipo salvaje. En los MCT caninos, todos los tumores excepto uno tenían ERK1/2 fosforilada detectable en la línea base. En 7 de los 11 pares de biopsias de tumor evaluables, se inhibió la ERK1/2, medido por una reducción en la ERK1/2 fosforilada después del tratamiento. No todos los tumores que dieron positivo para la inhibición de la ERK1/2 fueron también positivos para la fosforilación de la KIT. La modulación dirigida a la ERK1/2 no se correlacionó con el grado del tumor ni con la presencia o ausencia de mutación ITD en el c-kit. Con respecto a la modulación dirigida a la KIT, la modulación dirigida a la ERK1/2 se detectó más frecuentemente en tumores que expresaban niveles altos de ERK1/2 y ERK1/2 fosforilada en la línea base.

La detección de la inhibición de una diana molecular del fosfato del compuesto I después del tratamiento de MCT sirve como prueba de la modulación dirigida del fosfato del compuesto I en este experimento. La relevancia clínica de este descubrimiento se apoya en la correlación entre la inhibición de la diana molecular y las concentraciones plasmáticas de fármaco en el intervalo terapéutico, y las respuestas clínicas objetivas de las que se ha informado previamente del compuesto I en pacientes caninos con MCT que expresaban mutaciones activantes en el gen diana, lo que proporciona una prueba de concepto para el fosfato del compuesto I en esta población de pacientes. Debido a que perros con otras afecciones (incluyendo carcinoma de mama, sarcoma de tejidos blandos y mieloma múltiple) también presentaron respuestas objetivas duraderas frente al tratamiento con el compuesto I, la inhibición de la KIT en esta concentración plasmática puede extrapolarse razonablemente a la inhibición con éxito de las otras dianas relacionadas de forma cercana con la tirosina cinasa receptora para el compuesto I expresadas por estos tumores, basándose en la potencia in vitro e in vivo del compuesto I, proporcionando una base lógica molecular para respuestas objetivas en estos tumores. Por ejemplo, los tumores de mama caninos expresan el VEGFR que es inhibido por inhibidores de la indolinona tirosina cinasa a concentraciones similares a las de la KIT en ensayos celulares in vitro. (Liao, A. T., Chien, M. B., Shenoy, N., Mendel, D. B., McMahon, G., Cherrington, J. M. y London, C. A. Inhibition of constitutively active forms of mutant kit by multitargeted indolinone tyrosine kinase inhibitors. Blood, 100: 585-593, 2002). La inhibición del fosfato del compuesto I bien en fenotipos salvajes o bien en c-kit con mutación ITD en MCT puede, por lo tanto, servir como sustituto para la inhibición de las RTK relacionadas dianas del fosfato del compuesto I, VEGFR y PDGFR, que se expresan y/o se regulan de forma anormal en muchos tipos diferentes de tumor. Finalmente, la inhibición de la diana molecular, acoplada con respuestas objetivas clínicas en tumores caninos, dirige el desarrollo de compuestos relacionados en cáncer humano hacia poblaciones clínicas que expresan activación de KIT, VEGFR o PDGFR.

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Ejemplo 8 Estudio de varios centros, controlado con placebo, doble ciego, aleatorio de la administración oral del fosfato del compuesto I en el tratamiento de perros con tumores de mastocitos recurrentes

Objetivo. La eficacia de comprimidos orales del fosfato del compuesto I para el tratamiento de tumores de mastocitos en animales que tenían la enfermedad de forma mesurable y recurrente se evaluó después de cirugía en un estudio enmascarado controlado negativamente. El estudió evaluó la dosificación en días alternos del fosfato del compuesto I a 3,25 mg equivalentes de la base libre (FBE)/kg de peso corporal sobre la respuesta de la enfermedad utilizando criterios de respuesta modificados (RECIST). La presencia o ausencia de mutación en el c-kit en los tumores de mastocitos se evaluó como un covariante en este estudio. Con el objetivo de toma de decisiones, la duración de este estudio fue de 6 semanas.

Ciento cincuenta y tres (153) perros se dispusieron aleatoriamente en una relación de 4:3 en uno de los dos grupos de tratamiento: T01 (Placebo en el que n = 65) y T02 (fosfato del compuesto I en el que n = 88). Se eligieron diez oncólogos veterinarios en Estados Unidos y suministraron casos. Para la admisión los perros debían tener tumor de mastocitos recurrente (al menos una lesión diana debía tener un diámetro mínimo mayor que 20 mm) \pm implicación de ganglios linfáticos regionales. En la línea base se identificaron por dos evaluadores un máximo de tres lesiones diana (tumores de mastocitos mesurables) y todas las lesiones no diana (todo el resto de lesiones, mesurables y no mesurables). La eficacia se basó en la respuesta objetiva (respuesta total o respuesta parcial) en la visita de la 6ª semana en la que la media de la suma para los dos evaluadores del diámetro mayor de las lesiones diana (Suma Media LD) se comparó con la media de la suma de línea base para el cálculo del porcentaje de reducción o aumento. La evaluación de las lesiones no diana fue subjetiva. Se definió una respuesta completa (CR) como la desaparición de todas las lesiones diana y no diana y la no aparición de nuevas lesiones; se definió una respuesta parcial (RP) como al menos una disminución de 30% en la Suma Media LD de las lesiones diana en comparación con la Suma Media LD en la línea base y no progresión de las lesiones no diana y no aparición de nuevas lesiones. Se recogieron muestras de tejido del tumor y de la piel normal distante antes de la distribución aleatoria y se sometieron a evaluación del estado de la mutación del c-kit.

Se incluyeron ochenta y seis (86) animales de T02 y 65 de T01 en el análisis de la eficacia. El análisis de los datos indicó una mejora estadísticamente significativa en el punto final principal (respuesta objetiva) para el fosfato del compuesto I (T02) en comparación con el placebo (T01). Los animales del grupo T02 tenían una tasa de respuesta objetiva significativamente mayor (38,3%; 33/86) en comparación con los animales del grupo T01 (7,9%; 5/63) (p < 0,001). Casi el doble de los animales del grupo T01 (66,7%; 42/63) presentaron enfermedad progresiva en comparación con los animales del grupo T02 (33,7%; 29/86). Casi en el doble de los perros del grupo T02 que dieron positivo para la mutación del c-kit era probable que tuvieran una respuesta objetiva de casi el doble en comparación con los que dieron negativo para la mutación del c-kit (60%, 12/20 vs. 32,8, 21/64, respectivamente).

En conclusión, este estudio demostró la eficacia de los comprimidos orales de fosfato del compuesto I para el tratamiento de tumores de mastocitos recurrentes en perros mascotas.

Se espera que los expertos en la técnica encuentren numerosas modificaciones y variaciones de la invención como se ha descrito en los ejemplos ilustrativos anteriores. Consecuentemente, sólo se deben considerar las limitaciones de la invención que aparecen en las siguientes reivindicaciones.

Claims (17)

1. Formas salinas de una base, en las que la base es la (2-pirrolidin-1-il-etil)-amida del ácido 5-[5-fluoro-2-oxo-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenometil]-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico y en las que la forma salina se elige entre el grupo que consiste en las sales de citrato y de fosfato y sus solvatos y polimorfos.

2. Una forma salina según la reivindicación 1, en la que la sal es la sal de fosfato con la estructura:

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y sus solvatos y polimorfos.

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3. La forma salina según la reivindicación 2, con una fórmula molecular de C_{22}H_{25}FN_{4}O_{2}H_{3}PO_{4} y un punto de fusión de aproximadamente 285 a aproximadamente 290ºC.

4. Un polimorfo (forma I) de la sal de fosfato según la reivindicación 2, en el que dicho polimorfo tiene un espectro de difracción de rayos X en polvo que comprende picos expresados en grados (\pm0,1 grado) del ángulo dos theta de 20,8, 24,5, 25,9 y 27,0 obtenidos usando la emisión CuK\alpha_{1} (longitud de onda = 1,5406 Angstroms).

5. Una forma salina según la reivindicación 1, en la que la sal es la sal de citrato con la estructura:

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y sus solvatos y polimorfos.

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6. La forma salina según la reivindicación 5, con una fórmula molecular de C_{22}H_{25}FN_{4}O_{2}C_{6}H_{8}O_{7} y un punto de fusión de aproximadamente 178 a aproximadamente 183ºC.

7. La forma salina según la reivindicación 5, que tiene un patrón de difracción de rayos X en polvo que comprende picos expresados en grados (\pm0,1 grado) del ángulo dos theta de 9,1, 9,4, 14,2 25,4 y 26,8 obtenidos usando la emisión CuK\alpha_{1} (longitud de onda = 1,5406 Angstroms).

8. Una composición farmacéutica que comprende la sal de fosfato según la reivindicación 2, la sal de citrato según la reivindicación 5 o uno de sus solvatos o polimorfos, y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

9. La sal de fosfato según la reivindicación 2, la sal de citrato según la reivindicación 5 o uno de sus solvatos o polimorfos, para su uso en la modulación de la actividad catalítica de las proteína cinasas.

10. Una sal, solvato o polimorfo según la reivindicación 9, en la que la proteína cinasa se elige entre el grupo que consiste en las tirosina cinasas receptoras, las proteína tirosina cinasas no receptoras y las serina/treonina proteína cinasas.

11. Una composición farmacéutica según la reivindicación 8 para su uso para prevenir o tratar un trastorno relacionado con una proteína cinasa en un organismo.

12. La composición según la reivindicación 11, en la que el trastorno relacionado con la proteína cinasa es un tumor de mastocitos o mastocitosis.

13. Un método para preparar cristales de la sal de fosfato de la base según la reivindicación 1 que comprende:

(a)

añadir una cantidad esteoquiométrica de ácido fosfórico a la base en una disolución que comprende un disolvente o una mezcla de disolventes;

(b)

cristalizar la sal de fosfato de la disolución; y

(c)

separar los cristales de la sal de fosfato de la disolución de disolvente.

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14. Un método para preparar polimorfos de la sal de fosfato según la reivindicación 2 que comprende:

(a)

introducir la sal de fosfato en una disolución que comprende un disolvente o una mezcla de disolventes;

(b)

opcionalmente, añadir un disolvente puente a la disolución;

(c)

cristalizar los cristales del polimorfo de la disolución; y

(d)

separar los cristales del polimorfo de la disolución de disolvente.

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15. El método según la reivindicación 14 en el que el disolvente de la etapa (a) comprende metanol.

16. Un método para preparar cristales de la sal de citrato de la base según la reivindicación 1 que comprende:

(a)

añadir una cantidad esteoquiométrica de ácido cítrico a la base en una disolución que comprende un disolvente o una mezcla de disolventes;

(b)

cristalizar los cristales de la sal de citrato de la disolución; y

(c)

separar los cristales de la sal de citrato de la disolución de disolvente.

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17. Un uso de la sal de fosfato según la reivindicación 2, la sal de citrato según la reivindicación 5, o uno de sus solvatos o polimorfos, en la preparación de un medicamento que es útil en el tratamiento de una enfermedad mediada por una actividad PK anormal.