JP2002511852A - 蛋白質キナーゼ活性の調節剤としての２−インドリノン誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、蛋白質キナーゼの活性を調節し、このことにより蛋白質キナーゼ関連細胞性疾患、例えば癌の予防および治療に有用であることが予測される、新規２−インドリノンおよびその生理学的に許容しうる塩およびプロドラッグに関する。

Description

【発明の詳細な説明】 蛋白質キナーセ活性の調節剤としての２−インドリノン誘導体序 本発明は、一般に有機化学、生化学、薬理学および医薬に関する。より詳細に は、本発明は、蛋白質キナーゼ（”ＰＫ”）の活性を調節し、このことにより異 常なＰＫ活性に関連する疾患に対して有益な効果を示すことが予測される新規な ２−インドリノン誘導体およびその生理学的に許容しうる塩およびプロドラッグ に関する。発明の背景 以下は、背景情報としてのみ提供されるものであり、本発明に対する先行技術 であると認めるものではない。 ＰＫは、蛋白質のチロシン、セリンおよびトレオニン残基上のヒドロキシ基の リン酸化を触媒する酵素である。この外観上は単純な活性の結果は圧倒的である 。細胞成長、分化および増殖、すなわち、細胞生命のほぼすべての観点が種々の 仕方でＰＫ活性に依存する。さらに、異常なＰＫ活性は、比較的生命を脅かさな い疾患（例えば乾癬）から、非常に悪性の疾患（例えば神経膠細胞腫（脳癌）） までの範囲の疾患のホストと関連づけられてきた。 ＰＫは、慣用的に２種類に分類することができる：蛋白質チロシンキナーゼ( ＰＴＫ)およびセリン−トレオニンキナーゼ（ＳＴＫ）。 ＰＴＫ活性の主な観点は、成長因子レセプターへのその関与である。成長因子 レセプターは、細胞表面蛋白質である。成長因子リガンドが結合すると、成長因 子レセプターは活性型に変換され、これが細胞膜の内表面上の蛋白質と相互作用 する。これは、レセプターおよび他の蛋白質上のチロシン残基のリン酸化を引き 起こし、細胞内部で種々の細胞質シグナリング分子との複合体を形成し、次にこ れは多くの細胞性応答、例えば、細胞***（増殖）、細胞分化、細胞成長、細胞 外微細環境への代謝的効果の発現等に影響する。さらに詳しい議論については、 Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｕｌｌｒｉｃｈ，Ｎｅｕｒｏｎ，９：３０ ３−３９１（１９９２）（図面を含め本明細書の一部としてここに引用する）を 参照されたい。 ＰＫ活性を有する成長因子レセプターは、レセプターチロシンキナーゼ（”Ｒ ＴＫ”）として知られている。これらは、多様な生物学的活性を有する膜貫通レ セプターの大きなファミリーを含む。現在のところ、ＲＴＫの少なくとも１９個 の異なるサブファミリーが同定されている。これらのサブファミリーの例は、” ＨＥＲ”ＲＴＫと称されるサブファミリーであり、これにはＥＧＦＲ（上皮成長 因子レセプター）、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４が含まれる。これらのＲ ＴＫは、細胞外グリコシル化リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および蛋 白質上のチロシン残基をリン酸化しうる細胞内細胞質触媒ドメインから構成され る。 別のＲＴＫサブファミリーは、インスリンレセプター（ＩＲ）、インスリン様 成長因子Ｉレセプター（ＩＧＦ−ＩＲ）およびインスリンレセプター関連レセプ ター（ＩＲＲ）を含む。ＩＲおよびＩＧＦ−ＩＲはインスリン、ＩＧＦ−Ｉおよ びＩＧＦ−ＩＩと相互作用して、２つの完全に細胞外グリコシル化されたαサブ ユニットと２つのβサブユニットのヘテロ４量体を形成し、これは細胞膜を横切 り、チロシンキナーゼドメインを含有する。 第３のＲＴＫサブファミリーは、血小板由来成長因子レセプター（”ＰＤＧＦ Ｒ”）群として表され、これにはＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、ＣＳＦＩＲ、ｃ −ｋｉｔおよびｃ−ｆｍｓが含まれる。これらのレセプターは、可変数のイムノ グロビン様ループおよび細胞内ドメインからなるグリコシル化された細胞外ドメ インから構成され、ここでチロシンキナーゼドメインは関連のないアミノ酸配列 により分断されている。 別の群は、そのＰＤＧＦＲサブファミリーとの類似性のため、しばしばＰＤＧ ＦＲサブファミリーに包摂される、胎児肝臓キナーゼ（”ｆｌｋ”）レセプター サブファミリーである。この群は、キナーゼ挿入ドメイン−レセプター胎児肝臓 キナーゼ−１（ＫＤＲ／ＦＬＫ−１）、ｆｌｋ−１Ｒ、ｆｌｋ−４およびｆｍｓ 様チロシンキナーセ１（ｆｌｔ−１）からなると考えられている。 チロシンキナーゼ成長因子レセプターファミリーの別の１つのメンバーは、繊 維芽細胞成長因子（”ＦＧＦ”）レセプター群である。この群は、４つのレセプ ター、ＦＧＦＲＩ−４、および７つのリガンド、ＦＧＦＩ−７から構成される。 まだあまり明確にされていないが、レセプターは、可変数のイムノグロビン様ル ープおよび細胞内ドメインを含有するグリコシル化された細胞外ドメインから構 成されるようであり、ここでＰＴＫ配列は関係のないアミノ酸配列の領域により 分断されている。 既知のＲＴＫサブファミリーのより完全なリストは、Ｐｌｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．，ＤＮ＆Ｐ，７（６）：３３４−３３９（１９９４）（図面を含め本明細 書の一部としてここに引用する）に記載されている。 ＲＴＫに加え、”非レセプターチロシンキナーゼ”または”細胞性チロシンキ ナーゼ”と称される、完全に細胞内のＰＴＫのファミリーが存在する。本明細書 においては、”ＣＴＫ”と略されるこの後者の呼称を使用する。ＣＴＫは細胞外 および膜貫通ドメインを含有しない。現在のところ、１１個のサブファミリー（ Ｓｒｃ、Ｆｒｋ、Ｂｔｋ，Ｃｓｋ、Ａｂｌ、Ｚａｐ７０、Ｆｅｓ／Ｆｐｓ、Ｆａ ｋ、ＪａｋおよびＡｃｋ）の２４個を越えるＣＴＫが同定されている。Ｓｒｃサ ブファミリーは、これまでのところ、ＣＴＫのもっとも大きい群であるようであ り、Ｓｒｃ、Ｙｅｓ、Ｆｙｎ、Ｌｙｎ、Ｌｃｋ、Ｂｌｋ、Ｈｃｋ、Ｆｇｒおよび Ｙｒｋを含む。ＣＴＫのより詳細な議論については、Ｂｏｌｅｎ，Ｏｎｃｏｇｅ ｎｅ，８：２０２３−２０３１（１９９３）（図面を含め本明細書の一部として ここに引用する）を参照されたい。 セリン−トレオニンキナーゼもしくはＳＴＫは、ＣＴＫと同様に、主として細 胞内にあるが、ＳＴＫタイプのレセプターキナーゼは少ない。ＳＴＫはもっとも 一般的なサイトゾルキナーゼである。すなわち、細胞質オルガネラおよび細胞骨 格以外の、細胞質のその部分でその機能を行うキナーゼである。サイトゾルは、 細胞の中間代謝および生合成活性のほとんどが生ずる細胞中の領域である。例え ば、蛋白質がリボソーム上で合成されるのはサイトゾル内である。 ＲＴＫ、ＣＴＫおよびＳＴＫはすべて、病原性状態、特に多数の種々の癌を含 む状態のホストであることが示唆されてきた。ＰＴＫと関連づけられてきた他の 病原性状態には、限定されるものではないが、乾癬、肝硬変、糖尿病、アテロー ム性動脈硬化、脈管形成、再狭窄、眼疾患、慢性関節リウマチおよび他の炎症性 疾患、自己免疫疾患および種々の腎臓疾患が含まれる。 癌に関しては、腫瘍の発達を推進する過剰な細胞増殖を説明する主要な仮説の ２つは、ＰＫにより制御されることが知られている機能に関連する。すなわち、 悪性細胞成長は細胞***および／または分化を調節するメカニズムの故障に起因 することが示唆されている。多数のプロトオンコジンの蛋白質産物は、細胞成長 および分化を制御するシグナル伝達経路に関与することが示されている。これら のプロトオンコジンの蛋白質産物には、上で議論した、細胞外成長因子、膜貫通 成長因子ＰＴＫレセプター（ＲＴＫ）、細胞質ＰＴＫ（ＣＴＫ）およびサイトゾ ルＳＴＫが含まれる。 ＰＫ関連細胞活性と多くのヒト疾患との間の見かけ上の連結の観点から、ＰＫ 活性を調節する方法を同定しようとする試みに多大な努力が払われていることは 驚くべきことではない。これらのいくつかには、実際の細胞プロセスに関与する 分子を模倣する大きな分子を用いるバイオミメティック方法が含まれる(例えば 、変異体リガンド（米国特許４，９６６，８４９）；可溶性レセプターおよび抗 体（ＷＯ９４／１０２０２，Ｋｅｎｄａｌｌ ａｎｄ Ｔｈｏｍａｓ，Ｐｒｏｃ ．Ｎａｔ'ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９０：１０７０５−０９（１９９４），Ｋ ｉｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：８４１−８４４（１９９３））； ＲＮＡリガンド（Ｊｅｌｉｎｅｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ３３：１０４５０−５６）；Ｔａｋａｎｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．Ｃ ｅｌｌ ４：３５８Ａ（１９９３）；Ｋｉｎｓｅｌｌａ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．１９９：５６６−６２（１９９２）；Ｗｒｉｇｈｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈｙｓ．，１５２：４４８−５７）および チロシンキナーゼ阻害剤（ＷＯ９４／０３４２７；ＷＯ９２／２１６６０；ＷＯ ９１／１５４９５；ＷＯ９４／１４８０８；米国特許５，３３０，９９２；Ｍａ ｒｉａｎｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅ ｓ．，３５：２２６８（１９９４））。 最近、ＰＫ阻害剤として作用する小分子を同定する試みがなされている。例え ば、ビス単環、二環およびヘテロ環アリール化台物（ＰＣＴ ＷＯ９２／２０６ ４２）、ビニレンアザインドール誘導体（ＰＣＴ ＷＯ９４／１４８０８）およ び１−シクロプロピル−４−ピリジルキノロン類（米国特許５，３３０，９９２ ）が、ＰＴＫ阻害剤として記載されている。スチリル化合物（米国特許５，２１ ７，９９９）、スチリル置換ピリジル化合物（米国特許５，３０２，６０６）、 キナゾリン誘導体（欧州特許出願０５６６２６６Ａ１）、セレナインドール類お よびセレニド類（ＰＣＴ ＷＯ９４／０３４２７）、三環ポリヒドロキシル化合 物（ＰＣＴ ＷＯ９２／２１６６０）およびベンジルホスホン酸化合物（ＰＣＴ ＷＯ９１／１５４９５）はすべて、癌の治療において有用なＰＴＫ阻害剤とし て記載されている。 ＰＫ活性を調節し、したがって、異常なＰＫ活性により推進される疾患の治療 および予防に有用であるはずの小有機分子を同定しようとする我々自身の努力に より、優れたＰＫ調節能力を示す新規２−インドリノン誘導体のファミリーが発 見され、これらが本発明の主題である。発明の概要 本発明は、一般に、レセプター蛋白質チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）、非レセプ ター蛋白質チロシンキナーゼ（ＣＴＫ）およびセリン／トレオニン蛋白質キナー ゼ（ＳＴＫ）の活性を調節する新規２−インドリノン誘導体およびその塩および プロドラッグに関する。さらに、本発明は、開示される化合物およびその生理学 的に許容しうる塩およびプロドラッグの医薬組成物の製造、およびＰＫ誘導性疾 患、例えば、限定されないが、癌、糖尿病、肝硬変、アテローム性動脈硬化症、 脈管形成およびおよび腎臓疾患の治療および予防におけるその使用に関する。 ”２−インドリノン”および”２−オキシインドール”との用語は、本明細書 において互換的に用いられ、両方とも、次の一般構造： を有する化学化合物を表す。 式中、Ａ¹、Ａ²、Ａ³およびＡ⁴は、炭素であり、Ｚは、酸素である。しかし、 理解されるように、本発明はまた、Ｚがイオウであり、および／またはＡ¹、Ａ² 、Ａ³および／またはＡ⁴が窒素である化合物を特徴とする。したがって、本明細 書においては、”２−インドリノン”または”２−オキシインドール”との用語 は、イオウおよび窒素類似体をも含むと解釈すべきである。 ”医薬組成物”とは、１またはそれ以上の本明細書に記載される化合物、また はその生理学的に許容しうる塩と、他の化学成分、例えば生理学的に許容しうる 担体および／または賦形剤との混合物を表す。医薬組成物の目的は、化合物の生 物への投与を容易にすることである。 本明細書において用いる場合、”生理学的に許容しうる担体”とは、生物に顕 著な刺激をもたらさず、投与される化合物の生物学的活性および特性を排除しな い担体または希釈剤を表す。 ”賦形剤”とは、医薬組成物に加えて化合物の投与をさらに容易にする不活性 の物質を表す。賦形剤の例には、限定されないが、炭酸カルシウム、リン酸カル シウム、種々の糖および各種のでんぷん、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油 、およびポリエチレングリコールがある。 ”プロドラッグ”とは、インビボで親薬剤に転換される薬剤を表す。プロドラ ッグは、場合により、親薬剤より投与が容易であるかもしれないため、しばしば 有用である。例えば、プロドラッグは経口投与により生物学的に利用可能である が、親薬剤はそうではないかもしれない。プロドラッグはまた、親薬剤よりも医 薬組成物中で改良された溶解性を有するかもしれない。プロドラッグの例は、限 定されるものではないが、エステル（”プロドラッグ”）として投与されて、水 溶性であることが移動に不利である細胞膜の通過を容易にし、次に、水溶性であ ることが有利である細胞内に入った後、代謝的に加水分解されて活性種のカルボ ン酸となるような、本発明の化合物であろう。 本明細書において用いる場合、”エステル”とは、本明細書において定義され るカルボキシ基であって、Ｒ”が水素以外の記載される任意の基であるものを表 す。１．化合物 一般的構造の特徴 本発明の１つの観点においては、本発明は、次の一般化学構造： を有する化合物を特徴とする。 本発明の化合物の生理学的に許容しうる塩およびプロドラッグ、ならびに化合 物、塩およびプロドラッグの医薬組成物も本発明の範囲内である。 Ａ¹、Ａ²、Ａ³およびＡ⁴は、独立して、炭素および窒素からなる群より選択さ れ、ただし、理解されるように、形成される９員の二環は化学の技術分野におい て知られるものであり；さらに理解されるように、Ａ¹、Ａ²、Ａ³またはＡ⁴が窒 素である場合、Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵またはＲ⁶はそれぞれ存在しない。 Ｒ¹は、水素、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリー ル、ヒドロキシ、アルコキシ、カルボニル、Ｃ−カルボキシ、Ｏ−カルボキシ、 Ｃ−アミド、Ｃ−チオアミド、グアニル、グアニジニル、ウレイジル、スルホニ ルおよびトリハロメタンスルホニルからなる群より選択される。 Ｒ²は、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテ ロ脂環式およびハロからなる群より選択される。 Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵およびＲ⁶は、独立して、水素、アルキル、トリハロメチル、シ クロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロ脂 環式、ヒドロキシ、チオヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、チオヒドロ キシ、チオアルコキシ、チオアリールオキシ、スルフィニル、スルホニル、Ｓ− スルホンアミド、Ｎ−スルホンアミド、Ｎ−トリハロメタンスルホンアミド、カ ルボニル、アルデヒド、トリハロメチル−カルボニル、Ｃ−カルボキシ、Ｏ−カ ルボキシ、シアノ、ニトロ、ハロ、シアナト、イソシアナト、チオシアナト、イ ソチオシアナト、Ｏ−カルバミル、Ｎ−カルバミル、Ｏ−チオカルバミル、Ｎ− チオカルバミル、ホスホニル、グアニル、グアニジノ、ウレイド、Ｃ−アミド、 Ｎ−アミド、アミノ、−ＮＲ¹⁸Ｒ¹⁹、−Ｗ（ＣＨ₂）_mＮＲ¹⁸Ｒ¹⁹、−Ｗ（ＣＨ₂ ）_mＣ（＝Ｙ）Ｔ、−Ｎ＝ＣＮＲ¹⁸Ｒ¹⁹、−ＮＨＲ²⁰および−（ａｌｋ₁）_rＭか らなる群より選択される。 Ｒ¹⁸およびＲ¹⁹は、独立して、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、 カルボニル、トリハロメチルカルボニル、Ｃ−カルボキシ、トリハロメタンスル ホニル、スルホニル、Ｃ−ペプチジルからなる群より選択され、または一緒にな って５員または６員のヘテロ脂環式環である。 Ｗは、窒素、酸素およびイオウからなる群より選択される。 基（ａｌｋ₁）は、場合により置換されていてもよいアルキル（−ＣＲＲ’− ）、場合により置換されていてもよいエチレン（−ＣＲ＝ＣＲ’−）およびアセ チレン（−Ｃ≡Ｃ−）からなる群より選択される。 ＲおよびＲ’は、独立して、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、ア ルコキシ、チオアルコキシ、アリールオキシおよびハロからなる群より選択され る。 ｒについては、ｒは１−１０でありうる。 Ｍは極性基である。 Ｔは、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アミノ、Ｎ−ヒドロキシル アミノ、Ｏ−カルボキシ、−ＮＲ¹⁸Ｒ¹⁹および−Ｎ−ペプチジルからなる群より 選択される。 ｍについては、ｍは０、１、２または３でありうる。 Ｙは、酸素およびイオウからなる群より選択される。 Ｒ²⁰はポリヒドロキシアルキル基である。 Ｒ³およびＲ⁴またはＲ⁴およびＲ⁵またはＲ⁵およびＲ⁶は、一緒になって、メチ レンジオキシまたはエチレンジオキシ基を形成してもよい。 Ｑは、以下の基からなる群より選択される： Ｂ¹およびＢ²は、５員のヘテロアリール環Ｑ¹が化学の技術分野において知ら れるものであるように、炭素、窒素、酸素およびイオウからなる群より選択され る。 Ｒ⁷、Ｒ⁸、Ｒ⁸'、Ｒ⁸"、Ｒ⁹、Ｒ⁹'、Ｒ¹⁰、Ｒ¹⁰'、Ｒ¹¹、Ｒ¹¹'、Ｒ¹²、Ｒ¹²' 、Ｒ¹³、Ｒ¹⁴、Ｒ¹⁵、Ｒ¹⁶およびＲ¹⁷は、独立して、水素、アルキル、トリハロ メチル、シクロアルキル、トリハロメチルカルボニル、アルケニル、アルキニル 、アリール、ヘテロアリール、ヘテロ脂環式、アルコキシ、アリールオキシ、チ オアルコキシ、チオアリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、ヘテロ脂環オキシ 、スルフィニル、スルホニル、Ｓ−スルホンアミド、Ｎ−スルホンアミド、 カルボニル、Ｃ−カルボキシ、Ｏ−カルボキシ、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、シア ノ、ニトロ、ハロ、Ｏ−カルバミル、Ｎ−カルバミル、Ｏ−チオカルバミル、Ｎ −チオカルバミル、ホスホニル、グアニル、グアニジン、ウレイド、トリハロメ タンスルホニル、トリハロメタンスルホンアミド、アミノ、−ＮＲ¹⁸Ｒ¹⁹、−Ｗ （ＣＨ₂）_mＮＲ¹⁸Ｒ¹⁹、−Ｗ（ＣＨ₂）_mＣ（＝Ｙ）Ｔ、−Ｎ＝ＣＮＲ¹⁸Ｒ¹⁹、− ＮＨＲ²⁰および−（ａｌｋ₁）_rＭからなる群より選択される。 Ｒ⁷およびＲ⁸、Ｒ⁸およびＲ⁸'、またはＲ⁸'およびＲ^8"は、一緒になって、５ 員のシクロアルキル、ヘテロアリールまたはヘテロ脂環式環または６員のシクロ アルキル、アリール、ヘテロアリールまたはヘテロ脂環式環を形成してもよい。 Ｒ⁷およびＲ⁸、およびＲ⁹、Ｒ¹⁰、Ｒ¹¹またはＲ¹²が水素である場合にはＲ⁹' 、Ｒ¹⁰'、Ｒ¹¹'またはＲ¹²'はそれぞれ、上記の群より選択される他、独立して 、ヒドロキシおよびチオヒドロキシからなる群より選択されてもよい。 さらに、Ｒ⁹およびＲ⁹'、Ｒ¹⁰およびＲ¹⁰'、Ｒ¹¹およびＲ¹¹'、またはＲ¹²お よびＲ¹²'は、一緒になって、ケト、５員のスピロシクロアルキル、５員のスピ ロヘテロ脂環式、６員のスピロシクロアルキルまたは６員のスピロヘテロ脂環式 基を形成してもよい。 Ｄ¹は、炭素および窒素からなる群より選択される。 Ｄ²は、窒素、酸素およびイオウからなる群より選択される。 理解されるように、Ｄ¹が窒素でありかつＤ²が酸素またはイオウである場合、 Ｒ⁷は存在しない。 Ｅ¹は、炭素および窒素からなる群より選択される。 Ｅ²は、窒素、酸素およびイオウからなる群より選択される。 理解されるように、Ｅ¹が窒素でありかつＥ²が酸素またはイオウである場合、 Ｒ⁸は存在しない。 Ｊ¹は、酸素、窒素およびイオウからなる群より選択される。 Ｊ²、Ｊ³およびＪ⁴は、独立して、５員のヘテロアリール環Ｑ⁴が化学の技術分 野において知られるものであるように、炭素、窒素、酸素およびイオウからなる 群より選択される。さらに、理解されるように、Ｊ²、Ｊ³またはＪ⁴が窒素、酸 素またはイオウである場合、Ｒ⁸、Ｒ⁸'またはＲ⁸"は、それぞれ存在せず、同様 に、Ｊ¹が酸素またはイオウである場合、Ｒ⁷は存在しない。 Ｌ¹、Ｌ²、Ｌ³、Ｌ⁴およびＬ⁵は、独立して、形成される６員の窒素含有ヘテ ロアリール環Ｑ⁵が化学の技術分野において知られるものであるように、炭素お よび窒素からなる群より選択され、ただし、Ｌ¹、Ｌ²、Ｌ³、Ｌ⁴またはＬ⁵が窒 素である場合、Ｒ¹³、Ｒ¹⁴、Ｒ¹⁵、Ｒ¹⁶またはＲ¹⁷は、それぞれ存在しない。 本明細書において用いる場合、”アルキル”との用語は、飽和脂肪族炭化水素 を表し、直鎖または分枝鎖の基を含む。好ましくは、アルキル基は１−２０個の 炭素原子（本明細書において表される場合、”１−２０”との数値範囲は、所定 の範囲の各整数を表す。例えば”１−２０個の炭素原子”は、アルキル基が１の 個炭素原子、２個の炭素原子、３個の炭素原子、そして２０個までの炭素原子か ら構成されうることを意味する）。より詳細には、これは１−１０個の炭素原子 を有する中程度のサイズのアルキルである。もっとも好ましくは、これは１−４ 個の炭素原子を有する低級アルキルである。アルキル基は、置換されていてもさ れていなくてもよい。置換されている場合、置換基は、好ましくは、シクロアル キル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロ脂環式、ヒドロキシ、アルコキシ、ア リールオキシ、チオヒドロキシ、チオアルコキシ、チオアリールオキシ、シアノ 、ハロ、カルボニル、チオカルボニル、Ｏ−カルバミル、Ｎ−カルバミル、Ｏ− チオカルバミル、Ｎ−チオカルバミル、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、Ｃ−カルボキ シ、Ｏ−カルボキシ、シアナト、イソシアナト、チオシアナト、イソチオシアナ ト、ニトロ、シリル、アミノおよび−ＮＲ¹⁸Ｒ¹⁹（Ｒ¹⁸およびＲ¹⁹は上で定義し たとおりである）から独立して選択される１またはそれ以上の基である。 ”シクロアルキル”基は、すべて炭素の単環または縮合環（すなわち、隣接す る１対の炭素原子を共有する複数の環）基を表し、ここで１つまたはそれ以上の 環は完全に共役したパイ電子系を有しない。シクロアルキル基の例は、限定され るものではないが、シクロプロパン、シタロブタン、シクロペンタン、、シクロ ペンテン、シクロヘキサン、アダマンタン、シクロヘキサジエン、シクロヘプタ ンおよびシクロヘプタトリエンがある。シクロアルキル基は置換されていてもさ れていなくてもよい。置換されている場合、置換基は、好ましくは、アルキル、 アリール、ヘテロアリール、ヘテロ脂環式、ヒドロキシ、アルコキシ、アリール オキシ、チオヒドロキシ、チオアルコキシ、チオアリールオキシ、シアノ、ハロ 、カルボニル、チオカルボニル、カルボキシ、Ｏ−カルバミル、Ｎ−カルバミル 、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、ニトロ、アミノおよび−ＮＲ¹⁸Ｒ¹⁹（Ｒ¹⁸およびＲ¹⁹ は上で定義したとおりである）から独立して選択される１つまたはそれ以上の 基である。 ”アルケニル”基は、少なくとも２個の炭素原子および少なくとも１個の炭素 −炭素二重結合から構成される、本明細書において定義されるアルキル基を表す 。 ”アルキニル”基は、少なくとも２個の炭素原子および少なくとも１個の炭素 −炭素三重結合から構成される、本明細書において定義されるアルキル基を表す 。 ”アリール”基は、完全に共役したパイ電子系を有する、すべて炭素の単環ま たは縮合多環（すなわち、隣接する１対の炭素原子を共有する複数の環）基を表 す。アリール基の例は、限定されるものではないが、フェニル、ナフタレニル、 およびアントラセニルがある。アリール基は置換されていてもされていなくても よい。置換されている場合、置換基は、好ましくは、ハロ、トリハロメチル、ア ルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロ脂環式、ヒドロキシ、アルコキシ、 アリールオキシ、チオヒドロキシ、チオアルコキシ、チオアリールオキシ、シア ノ、ニトロ、カルボニル、チオカルボニル、Ｃ−カルボキシ、Ｏ−カルボキシ、 Ｏ−カルバミル、Ｎ−カルバミル、Ｏ−チオカルバミル、Ｎ−チオカルバミル、 Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、スルフィニル、スルホニル、Ｓ−スルホンアミド、Ｎ −スルホンアミド、トリハロメタンスルホンアミド、アミノおよび−ＮＲ¹⁸Ｒ¹⁹ （Ｒ¹⁸およびＲ¹⁹は上で定義したとおりである）から選択される１つまたはそれ 以上の基である。 本明細書において用いる場合、”ヘテロアリール”基は、環内に窒素、酸素お よびイオウからなる群より選択される１つまたはそれ以上の原子を含み、かつ、 完全に共役したパイ電子系を有する単環式または縮合環（すなわち、隣接する１ 対の原子を共有する複数の環）基を表す。ヘテロアリール基の例は、限定される ものではないが、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、オキサゾール 、チアゾール、ピラゾール、ピリジン、ピリミジン、キノリン、イソキノリン、 プリンおよびカルバゾールがある。ヘテロアリール基は、置換されていてもされ て いなくてもよい。置換されている場合、置換基は、好ましくは、アルキル、シク ロアルキル、アリール、ハロ、トリハロメチル、ヒドロキシ、アルコキシ、アリ ールオキシ、チオヒドロキシ、チオアルコキシ、チオアリールオキシ、シアノ、 ニトロ、カルボニル、チオカルボニル、スルホンアミド、カルボキシ、スルフィ ニル、スルホニル、Ｏ−カルバミル、Ｎ−カルバミル、Ｏ−チオカルバミル、Ｎ −チオカルバミル、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、アミノおよび−ＮＲ¹⁸Ｒ¹⁹（Ｒ¹⁸ およびＲ¹⁹は上で定義したとおりである）から選択される１つまたはそれ以上の 基である。 ”ヘテロ脂環式”基は、環中に窒素、酸素およびイオウからなる群より選択さ れる１つまたはそれ以上の原子を有する単環式または縮合環基を表す。環はまた 、１つまたはそれ以上の二重結合を有していてもよい。しかし、環は完全に共役 したパイ電子系を有しない。ヘテロ脂環式基の例は、限定されるものではないが 、ピペリジン、モルホリン、ピペラジン、ピロリン、ピロリジン、ジヒドロチオ フェン、テトラヒドロフラン等がある。ヘテロ脂環式環は、置換されていてもさ れていなくてもよい。置換されている場合、置換基は、好ましくは、アルキル、 シクロアルキル、ハロ、トリハロメチル、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオ キシ、チオヒドロキシ、チオアルコキシ、チオアリールオキシ、シアノ、ニトロ 、カルボニル、チオカルボニル、カルボキシ、Ｏ−カルバミル、Ｎ−カルバミル 、Ｏ−チオカルバミル、Ｎ−チオカルバミル、スルフィニル、スルホニル、Ｃ− アミド、Ｎ−アミド、アミノおよび−ＮＲ¹⁸Ｒ¹⁹（Ｒ¹⁸およびＲ¹⁹は上で定義し たとおりである）から選択される１つまたはそれ以上の基である。 ”ヒドロキシ”基は−ＯＨ基を表す。 ”アルコキシ”基は、本明細書において定義される−Ｏ−アルキルおよび−Ｏ −シクロアルキル基の両方を表す。 ”アリールオキシ”基は、本明細書において定義される−Ｏ−アリールおよび −Ｏ−ヘテロアリール基の両方を表す。 ”ヘテロ脂環オキシ”基は、−Ｏ−ヘテロ脂環式基を表す。 ”チオヒドロキシ”基は−ＳＨ基を表す。 ”チオアルコキシ”基は、本明細書において定義されるＳ−アルキルおよび− Ｓ−シクロアルキル基の両方を表す。 ”チオアリールオキシ”基は、本明細書において定義される−Ｓ−アリールお よび−Ｓ−ヘテロアリール基の両方を表す。 ”カルボニル”基は、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ”基を表し、ここでＲ”は、本明細書 において定義される、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリ ール（環炭素を介して結合）およびヘテロ脂環式（環炭素を介して結合）からな る群より選択される。 ”トリハロメチルカルボニル”基は、Ｘ₃ＣＣ（＝Ｏ）−基を表し、ここで、 Ｘは本明細書において定義されるハロ基である。 ”アルデヒド”基は、Ｒ”が水素であるカルボニル基を表す。 ”チオカルボニル”基は−Ｃ（＝Ｓ）−Ｒ”基を表し、Ｒ”は本明細書におい て定義される。 ”Ｏ−カルボキシ”基はＲ”Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−基を表し、Ｒ”は本明細書におい て定義される。 ”Ｃ−カルボキシ”基は−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ”基を表し、Ｒ”は本明細書におい て定義される。 ”アセチル”基は−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ₃基を表す。 ”カルボキシアルキル”基は、−（ＣＨ₂）_sＣ（Ｏ）ＯＲ”を表し、ここでｓ は１−６であり、Ｒ”は上で定義したとおりである。 ”カルボン酸”基は、Ｒ”が水素であるＣ−カルボキシ基を表す。 Ａ”ハロ”基は、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素を表す。 ”トリハロメチル”基は−ＣＸ₃基を表し、Ｘは本明細書において定義される ハロ基である。 ”トリハロメタンスルホニル”基はＸ₃ＣＳ（＝Ｏ）₂基を表し、Ｘは上で定義 したとおりである。 ”シアノ”基は−Ｃ≡Ｎ基を表す。 ”シアナト”基は−ＣＮＯ基を表す。 ”イソシアナト”基は−ＮＣＯ基を表す。 ”チオシアナト”基は−ＣＮＳ基を表す。 ”イソチオシアナト”基ｒは−ＮＣＳ基を表す。 ”スルフィニル”基は−Ｓ（＝Ｏ）−Ｒ”基を表し、Ｒ”は本明細書において 定義される。 ”スルホニル”基は−Ｓ（＝Ｏ）₂Ｒ”基を表し、Ｒ”は本明細書において定 義される。 ”スルホンアミド”基は−Ｓ（＝Ｏ）₂−ＮＲ¹⁸Ｒ¹⁹を表し、Ｒ¹⁸およびＲ¹⁹ は本明細書において定義される。 ”トリハロメタンスルホンアミド”基はＸ₃ＣＳ（＝Ｏ）₂Ｎ（Ｒ¹⁸）−基を表 し、ＸおよびＲ¹⁸は本明細書において定義される。 ”Ｏ−カルバミル”基は−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ¹⁸Ｒ¹⁹基を表し、Ｒ¹⁸およびＲ¹⁹ は本明細書において定義される。 ”Ｎ−カルバミル”基はＲ¹⁹ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ¹⁸−基を表し、Ｒ¹⁸およびＲ¹⁹ は本明細書において定義される。 ”Ｏ−チオカルバミル”基は−ＯＣ（＝Ｓ）−ＮＲ¹⁸Ｒ¹⁹基を表し、Ｒ¹⁸およ びＲ¹⁹は本明細書において定義される。 ”Ｎ−チオカルバミル”基はＲ¹⁹ＯＣ（＝Ｓ）ＮＲ¹⁸−基を表し、Ｒ¹⁸および Ｒ¹⁹は本明細書において定義される。 ”アミノ”基は−ＮＲ¹⁸Ｒ¹⁹基を表し、Ｒ¹⁸およびＲ¹⁹は両方とも水素である 。 ”４級アンモニウム”基は−＋ＮＲ¹⁸Ｒ¹⁸'Ｒ¹⁹を表し、Ｒ¹⁸およびＲ¹⁹は本 明細書において定義され、Ｒ¹⁸'はＲ¹⁸およびＲ¹⁹と同じく定義される。 ”Ｃ−アミド”基は−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ¹⁸Ｒ¹⁹基を表し、Ｒ¹⁸およびＲ¹⁹は本 明細書において定義される。 “Ｎ−アミド”基はＲ¹⁸Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ¹⁹−基を表し、Ｒ¹⁸およびＲ¹⁹は本明 細書において定義される。 ”Ｃ−チオアミド”基は−Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ¹⁸Ｒ¹⁹基を表し、Ｒ¹⁸およびＲ¹⁹は 本明細書において定義される。 ”ニトロ”基は−ＮＯ₂基を表す。 ”メチレンジオキシ”基は、−ＯＣＨ₂Ｏ−基を表し、ここで酸素原子は隣接 する環の炭素原子に結合している。 ”エチレンジオキシ”基は、−ＯＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ−基を表し、ここで酸素原子は 隣接する環の炭素原子に結合している。 ”グアニル”基は、Ｒ¹⁸Ｒ¹⁹ＮＣ（＝Ｎ）−基を表し、Ｒ¹⁸およびＲ¹⁹は本明 細書において定義される。 ”グアニジニル”基は、−Ｒ¹⁸ＮＣ（＝Ｎ）ＮＲ¹⁸'Ｒ¹⁹基を表し、Ｒ¹⁸およ びＲ¹⁹は本明細書において定義され、Ｒ¹⁸'はＲ¹⁸およびＲ¹⁹と同じく定義され る。 ”ウレイジル”基は、−ＮＲ¹⁸Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ¹⁸'Ｒ¹⁹基を表し、Ｒ¹⁸および Ｒ¹⁹は本明細書において定義され、Ｒ¹⁸'はＲ¹⁸およびＲ¹⁹と同じく定義される 。 ”ホスホニル”基は、−ＯＰ（＝Ｏ）₂ＯＲ”基を表し、Ｒ”は本明細書にお いて定義される． ”Ｃ−ペプチジル”基は、アミノ酸の２−アミノ基と他のアミノ酸のカルボキ シ基との反応により形成される基を表す。すなわち、ペプチジル基は、一般構造 −（ＮＣＨＲＣ（＝Ｏ）_n−を有し、ここでＲ基は、ペプチジル基を形成するの にどのアミノ酸が用いられたかにより、同一でも異なっていてもよい。”Ｃ−ペ プチジル”との名称は、ペプチジル基がＣ（＝Ｏ）炭素を介して非アミノ酸分子 に結合している状態を表す。 ”極性基”は、互いに共有結合して基を形成する原子の核がこれらを結合する 共有結合の電子を等分に共有していない基を表す。すなわち、電子雲が一方の原 子について他方の原子より密度が濃い。このことにより、共有結合の一方の端は 比較的負に、他方の端は比較的正になる。すなわち、負の極と正の極が存在する 。極性基の例には、限定されるものではないが、ヒドロキシ、アルコキシ、カル ボキシ、ニトロ、シアノ、アミノ、４級アンモニウム、アミド、ウレイジル、ス ルホンアミド、スルフィニル、スルホニル、ホスホノ、モルホリノ、ピペラジニ ルおよびテトラゾリルがある。 ”スピロシクロアルキル”基は、環の炭素原子を他の環と共有するシクロアル キル基を表す。 ”スピロヘテロ脂環式”基は、環の炭素原子を他の環と共有するヘテロ脂環式 基を表す。 ”Ｎ−ヒドロキシルアミノ基は、Ｒ”ＯＮＲ¹⁸−基を表し、Ｒ”およびＲ¹⁹は 本明細書において定義される。 Ａ”ポリヒドロキシアルキル”基は、１−８個の炭素、好ましくは１−４個の 炭素を有する、２またはそれ以上、好ましくは３またはそれ以上のヒドロキシル 基のみで置換された、分枝鎖のないアルキル基を表す。 ”モルホリニル”基は、次の化学構造： を有する基を表す。 ”テトラゾリル”基は、次の化学構造： を有する基を表す。 ”アミノトリアゾリル”基は、次の化学構造：を有する基を表す。 ”１−ピペラジニル”基は、次の化学構造： を有する基を表す。 式中、Ｒ²¹、Ｒ²¹'、Ｒ²²、Ｒ²²'、Ｒ²³、Ｒ²³'、Ｒ²⁴、Ｒ²⁴'、Ｒ²⁵およびＲ²⁵ 'は、独立して、水素、非置換低級アルキル、トリハロメチル、非置換シクロ アルキル、非置換アルケニル、非置換アルキニル、非置換アリール、非置換ヘテ ロアリール、非置換ヘテロ脂環式、ヒドロキシ、非置換低級アルキルアルコキシ 、非置換アリールオキシ、チオヒドロキシ、非置換低級アルキルチオアルコキシ 、非置換チオアリールオキシ、非置換低級アルキルで置換されたスルフィニル、 水素または非置換低級アルキルで置換されたスルホニル、Ｎ−スルホンアミド、 Ｓ−スルホンアミド、水素または非置換低級アルキルで置換されたカルボニル、 トリハロメチルカルボニル、水素または非置換低級アルキルで置換されたＣ−カ ルボキシ、非置換低級アルキルで置換されたＯ−カルボキシ、シアノ、ニトロ、 ハロ、Ｏ−カルバミル、Ｎ−カルバミル、Ｏ−チオカルバミル、Ｎ−チオカルバ ミル、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、アミノおよび−ＮＲ¹⁸Ｒ¹⁹（Ｒ¹⁸およびＲ¹⁹は 、独立して、水素および非置換低級アルキルからなる群より選択される）からな る群より選択される。 例示のためであり、限定するものではないが、化学の技術分野において知られ る９員の二環には以下のものがある。 同様に、さらに例示のためであり、限定するものではないが、化学の技術分野 において知られる５員のヘテロアリール環Ｑ¹には以下のものがある。 同様に、化学の技術分野において知られる５員のヘテロアリール環Ｑ⁴の非限 定的例には以下のものがある。 さらに、化学の技術分野において知られる窒素を含有する６員のヘテロアリー ル環Ｑ⁵の非限定的例には以下のものがある。 Ｂ．好ましい構造的特徴 本発明の化合物の好ましい構造的特徴においては、Ｚは酸素である。 同様に、本発明の好ましい特徴においては、Ｒ¹およびＲ²およびＲ⁷は水素で ある。 本発明の別の好ましい特徴においては、Ａ¹、Ａ²、Ａ³およびＡ⁴は炭素である 。 また本発明の好ましい特徴においては、Ａ¹またはＡ²またはＡ³またはＡ⁴は窒 素であり、形成されるヘテロ芳香族環の残りの位置は炭素である。 同様に好ましくは、Ａ²およびＡ⁴は窒素であり、一方Ａ¹およびＡ³は炭素であ る。 本発明の別の好ましい特徴においては、該分子において、Ｚは酸素であり、Ｒ¹ 、Ｒ²およびＲ⁷は水素であり、およびＡ¹、Ａ²、Ａ³およびＡ⁴は炭素である。 本発明の好ましい特徴においては、Ａ¹、Ａ²、Ａ³またはＡ⁴の１つは窒素であ り、Ｚは酸素であり、および、Ｒ¹、Ｒ²およびＲ⁷は水素である。 本発明の別の好ましい特徴においては、Ａ¹およびＡ³は炭素であり、Ａ²およ びＡ⁴は窒素であり、Ｚは酸素であり、および、Ｒ¹、Ｒ²およびＲ⁷は水素である 。 Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵およびＲ⁶に関しては、本発明の好ましい特徴においては、これ らは、独立して、水素、非置換低級アルキル、以下の群：非置換シクロアルキル 、ハロ、ヒドロキシ、非置換低級アルコキシ、Ｃ−カルボキシ、非置換アリール 、非置換ヘテロアリール、非置換ヘテロ脂環式、アミノ、４級アンモニウムまた は−ＮＲ¹⁸Ｒ¹⁹より選択される基で置換されている低級アルキル、非置換シクロ アルキル、ヒドロキシ、非置換低級アルキルアルコキシ、以下の群：１またはそ れ以上のハロ基、非置換アリールまたは非置換ヘテロアリールより選択される基 で置換されている低級アルキルアルコキシ、トリハロメチル、ハロ、非置換アリ ール、独立して、以下の群：非置換低級アルキル、１またはそれ以上のハロ基で 置換されている低級アルキル、トリハロメチル、ハロ、ヒドロキシ、非置換低級 アルキルアルコキシより選択される１またはそれ以上の基で置換されているアリ ール、非置換アリールオキシ、独立して、以下の群：ハロ、非置換低級アルキル 、１またはそれ以上のハロ基で置換されている低級アルキル、非置換アリール、 ヒドロキシ、非置換低級アルキルアルコキシ、アミノまたは−ＮＲ¹⁸Ｒ¹⁹より選 択される１またはそれ以上の基で置換されているアリールオキシ、アミノ、Ｓ− スルホンアミド、−ＮＲ¹⁸Ｒ¹⁹、非置換アリールオキシ、非置換ヘテロアリール 、独立して、以下の群：水素、非置換低級アルキル、１またはそれ以上のハロ基 で置換されている低級アルキル、トリハロメチル、ハロ、ヒドロキシ、非置換低 級アルキルアルコキシ、非置換アリールオキシ；アミノ、Ｓ−スルホンアミドま たは−ＮＲ¹⁸Ｒ¹⁹より選択される１またはそれ以上の基で置換されているヘテロ アリール、非置換ヘテロ脂環式、独立して、以下の群：非置換低級アルキル、１ またはそれ以上のハロ基で置換されている低級アルキル、非置換低級アルキルア ルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、Ｓ−スルホンアミドまたは−ＮＲ¹⁸Ｒ¹⁹より選 択される１またはそれ以上の基で置換されているヘテロ脂環式、非置換低級アル キルＣ−カルボキシ、カルボン酸、非置換低級アルキルカルボニル、アルデヒド 、非置換アリールカルボニル、アセチル、Ｓ−スルホンアミド、Ｎ−スルホンア ミド、アミノおよび−ＮＲ¹⁸Ｒ¹⁹からなる群より選択される。 本発明のさらに別の好ましい特徴においては、Ｒ⁸、Ｒ⁸'およびＲ⁸"は、独立 して、水素、非置換低級アルキル、ハロ、シアノ、ニトロ、Ｃ−カルボキシ、非 置換シクロアルキル、非置換アリール、非置換ヘテロアリール、非置換ヘテロ脂 環式、トリハロメチル、非置換低級アルケニル、非置換低級アルキニル、ヒドロ キシ、非置換低級アルキルアルコキシ、非置換アリールオキシ、スルフィニル、 スルホニル、Ｓ−スルホンアミド、Ｎ−スルホンアミド、カルボニル、Ｃ−カル ボキシ、Ｏ−カルボキシ、シアノ、ニトロ、ハロ、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、Ｏ −カルバミル、Ｎ−カルバミル、Ｏ−チオカルバミル、Ｎ−チオカルバミル、グ アニル、グアニジニル、ウレイジルおよび−ＮＲ¹⁸Ｒ¹⁹からなる群より選択され る。 Ｑは一般構造２を有し、Ｂ¹は窒素であり、Ｂ²は、イオウまたは酸素であり、 ｎは０または１であり、および、Ｒ⁹、Ｒ⁹'、Ｒ¹⁰、Ｒ¹⁰'、Ｒ¹¹、Ｒ¹¹'、Ｒ¹² およびＲ¹²'は水素である。 Ｑは一般構造２を有し、Ｂ¹およびＢ²は窒素であり、ｎは０または１であり、 および、Ｒ⁷、Ｒ⁹、Ｒ⁹'Ｒ¹⁰、Ｒ¹⁰'、Ｒ¹¹、Ｒ¹¹'、Ｒ¹²およびＲ¹²'は水素で ある。 Ｑは一般構造３を有し、Ｄ¹およびＤ²は窒素であり、Ｒ⁷は水素または非置換 低級アルキルであり、Ｒ⁸またはＲ⁸'の１つは、−ＮＲ¹⁸Ｒ¹⁹、−Ｗ（ＣＨ₂）_m ＮＲ¹⁸Ｒ¹⁹、−Ｗ（ＣＨ₂）_mＣ（＝Ｙ）Ｔ、−Ｎ＝ＣＮＲ¹⁸Ｒ¹⁹および−ＮＨＲ²⁰ からなる群より選択され、Ｗは酸素またはイオウであり、Ｙは酸素またはイオ ウであり、Ｔは、ヒドロキシ、アミノ、Ｎ−ヒドロキシルアミノまたはＮ−ペプ チジルであり、Ｒ¹⁸およびＲ¹⁹は、独立して、水素および非置換低級アルキルか らなる群より選択され、および、Ｒ²⁰は低級ポリヒドロキシアルキル基である。 Ｑは一般構造３を有し、Ｄ¹は窒素であり、Ｄ²は炭素であり、Ｒ⁷は水素であ り、Ｒ⁷は水素または非置換低級アルキルであり、Ｒ⁸およびＲ⁸'は、独立して、 水素または非置換低級アルキルであり、Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵またはＲ⁶の１つは、−Ｎ Ｒ¹⁸Ｒ¹⁹、−（ＣＨ₂）_mＮＲ¹⁸Ｒ¹⁹、−Ｗ（ＣＨ₂）_mＣ（＝Ｙ）Ｔ、−Ｎ＝ＣＮ Ｒ¹⁸Ｒ¹⁹および−ＮＨＲ²⁰からなる群より選択され、Ｗは酸素またはイオウであ り、Ｙは酸素またはイオウであり、Ｔはヒドロキシ、アミノ、Ｎ−ヒドロキシル アミノまたはＮ−ペプチジルであり、Ｒ¹⁸およびＲ¹⁹は、独立して、水素および 非置換低級アルキルからなる群より選択され、および、Ｒ²⁰は低級ポリヒドロキ シアルキル基である。 Ｑは一般構造３を有し、Ｄ¹はイオウであり、Ｒ⁸およびＲ⁸'は、一緒になって 、非置換の６員のシクロアルキル、アリール、ヘテロアリールまたはヘテロ脂環 式環を形成し、Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵またはＲ⁶の１つは、−ＮＲ¹⁸Ｒ¹⁹、−（ＣＨ₂）_m ＮＲ¹⁸Ｒ¹⁹、−Ｗ（ＣＨ₂）_mＣ（＝Ｙ）Ｔ、−Ｎ＝ＣＮＲ¹⁸Ｒ¹⁹および−ＮＨＲ²⁰ からなる群より選択され、Ｗは、酸素またはイオウであり、Ｙは、酸素または イオウであり、Ｔは、ヒドロキシ、アミノ、Ｎ−ヒドロキシルアミノまたはＮ− ペプチジルであり、Ｒ¹⁸およびＲ¹⁹は、独立して、水素および非置換低級アルキ ルからなる群より選択され、および、Ｒ²⁰は低級ポリヒドロキシアルキル基であ る。 Ｑは一般構造３を有し、Ｄ¹は窒素であり、Ｄ²は炭素であり、Ｒ⁷は水素また は非置換低級アルキルであり、Ｒ⁸、Ｒ⁸'およびＲ⁸"は、独立して、水素、非置 換低級アルキル、または水素または非置換低級アルキルで置換されているＣ−カ ルボキシである。 Ｑは一般構造３を有し、Ｄ¹はイオウであり、Ｄ²は炭素または窒素であり、Ｒ⁸ 、Ｒ⁸'およびＲ⁸"は（Ｄ²が炭素である場合）、独立して、水素、非置換低級ア ルキル、非置換低級アルケニル、非置換低級アルキニル、非置換シクロアルキル 、非置換アリール、非置換ヘテロアリール、ハロ、非置換低級アルキルカルボニ ル、ヒドロキシ、非置換低級アルキルアルコキシ、非置換アリールオキシ、非置 換低級アルキルチオアルコキシ、非置換チオアリールオキシ、ニトロ、トリハロ メタンカルボニルからなる群より選択され、またはＲ⁸およびＲ⁸'は一緒になっ て５員の非置換シクロアルキル、非置換ヘテロアリールまたは非置換ヘテロ脂環 式基または６員の非置換シクロアルキル、非置換アリール、非置換ヘテロアリー ルま たは非置換ヘテロ脂環式基を形成する。 Ｑは一般構造３を有し、Ａ¹、Ａ²、Ａ³またはＡ⁴の１つは窒素である。 Ｑは一般構造３を有し、Ａ¹およびＡ³は炭素であり、Ａ²およびＡ⁴は窒素であ る。 Ｑは一般構造４を有し、Ｅ¹は窒素であり、Ｅ²は炭素であり、Ｒ⁷は水素であ り、Ｒ⁸は水素、非置換低級アルキル、１またはそれ以上のハロゲンからなる群 より選択される基で置換された低級アルキル、水素または非置換低級アルキルで 置換されたＣ−カルボキシ、非置換ヘテロアリールまたは非置換ヘテロ脂環式、 非置換アリールまたは非置換ヘテロアリールであり、Ｒ⁹、Ｒ⁹'、Ｒ¹⁰、Ｒ¹⁰'、 Ｒ¹¹、Ｒ¹¹'、Ｒ¹²およびＲ¹²'は水素である。 Ｑは一般構造４を有し、Ｅ¹はイオウであり、Ｅ²は炭素であり、Ｒ⁸は、水素 、非置換低級アルキル、非置換シクロアルキル、非置換アルケニル、水素または 非置換低級アルキルで置換されたＣ−カルボキシ、ヒドロキシ、非置換低級アル コキシ、非置換シクロアルキルオキシおよび非置換アリールオキシからなる群よ り選択され、Ｒ⁹、Ｒ⁹'、Ｒ¹⁰、Ｒ¹⁰'、Ｒ¹¹、Ｒ¹¹'、Ｒ¹²およびＲ¹²'は水素で ある。 Ｑは、一般構造４を有し、Ｅ¹は酸素であり、Ｅ²は炭素であり、Ｒ⁸は、水素 、非置換低級アルキル、非置換シクロアルキル、非置換アリール、シアノ、また は水素または非置換低級アルキルで置換されたＣ−カルボキシからなる群より選 択される。 Ｑは、一般構造５を有し、Ｊ¹は窒素または酸素であり、Ｊ²、Ｊ³およびＪ⁴は 炭素であり、Ｒ⁸、Ｒ⁸'またはＲ⁸"の１つは−（ａｌｋ₁）_rＭであり、（ａｌｋ₁ ）は−ＣＨ₂−であり、ｒは１−３であり、Ｍは、ヒドロキシ、非置換低級アル キルアルコキシ、アミノ、水素または非置換低級アルキルで置換されたカルボキ シ、Ｏ−カルバミル、Ｎ−カルバミル、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、非置換モルホ リノ、非置換ピペラジニル、非置換テトラゾロ、ヒドロキシまたは非置換低級ア ルキルで置換されたスルホニル、Ｓ−スルホンアミド、ウレイド、グアニジニル 、グアニルまたは水素または非置換低級アルキルで置換されたホスホニルであり 、Ｒ¹⁸およびＲ¹⁹は、独立して、水素および非置換低級アルキルからなる群よ り選択される。 Ｑは一般構造５を有し、Ｊ¹は窒素または酸素であり、Ｒ⁷（Ｊ¹が窒素である 場合、Ｊ¹が酸素である場合にはＲ⁷は存在しない）は水素であり、Ａ¹、Ａ²、Ａ³ およびＡ⁴は炭素であり、Ｒ⁸、Ｒ⁸'またはＲ⁸"の１つは−（ａｌｋ₁）_rＭであ り、（ａｌｋ₁）はＣＨ₂であり、ｒは１−３であり、Ｍはヒドロキシまたは非置 換低級アルキルで置換されたＣ−カルボキシであり、Ｒ⁸、Ｒ⁸'およびＲ⁸"の残 りの２つは、独立して、水素および非置換低級アルキルからなる群より選択され 、または、Ｒ⁸およびＲ⁸'またはＲ⁸'およびＲ⁸"は一緒になって６員の非置換シ クロアルキル、非置換アリール、非置換ヘテロアリールまたは非置換ヘテロ脂環 式基を形成する。 Ｑは一般構造５を有し、Ｊ¹およびＪ³は窒素であり、Ｊ²およびＪ⁴は炭素であ り、Ｒ⁸またはＲ⁸"の１つは−（ａｌｋ₁）_rＭであり、（ａｌｋ₁）はＣＨ₂であ り、ｒは１−３であり、Ｍは水素または非置換低級アルキルで置換されたカルボ キシである。 Ｑは一般構造６を有し、Ｌ¹、Ｌ²、Ｌ³、Ｌ⁴およびＬ⁵は炭素であり、Ｒ¹³、 Ｒ¹⁴、Ｒ¹⁵Ｒ¹⁶およびＲ¹⁷の１つは１−ピペラジニルであり、Ｒ²¹、Ｒ²¹'、Ｒ^{2 2} 、Ｒ²²'、Ｒ²⁴、Ｒ²⁴'、Ｒ²⁵およびＲ²⁵'は水素であり、Ｒ²³は、水素、非置換 低級アルキル、非置換シクロアルキル、非置換アミノトリアゾロ、非置換Ｃ−チ オアミド、水素または非置換低級アルキルで置換されたカルボニル、水素または 非置換低級アルキルで置換されたＣ−カルボキシ、Ｃ−アミド、ヒドロキシルま たは非置換低級アルキルで置換されたＳ−スルホニル、トリハロメタンスルホニ ルまたはＳ−スルホンアミドからなる群より選択され、Ｒ¹⁸およびＲ¹⁹は、独立 して、水素および非置換低級アルキルからなる群より選択され、残りのＲ¹³、Ｒ¹⁴ 、Ｒ¹⁵およびＲ¹⁶およびＲ¹⁷は、独立して、水素、非置換低級アルキル、トリ ハロメチル、ハロ、ヒドロキシ、非置換低級アルコキシ、非置換アリールオキシ 、非置換低級アルキルチオアルコキシまたは非置換チオアリールオキシからなる 群より選択される。 Ｑは一般構造６を有し、Ａ¹、Ａ²、Ａ³、Ａ⁴、Ｌ¹、Ｌ²、Ｌ³、Ｌ⁴およびＬ⁵ は炭素であり、Ｒ¹⁵は１−ピペラジニルであり；Ｒ¹³、Ｒ¹⁴、Ｒ¹⁶、Ｒ¹⁷、Ｒ^{2 1} 、Ｒ²¹'、Ｒ²²、Ｒ²²'、Ｒ²⁴、Ｒ²⁴'、Ｒ²⁵およびＲ²⁵'は、独立して、水素で あり、および、Ｒ²³は、水素、非置換低級アルキルおよび水素で置換されたカル ボニルからなる群より選択される。 本発明の特定の化合物の例は、以下の表１、２、３および４に示される。表１ 、２、３および４の化合物は、例示のために示されるものであり、いかなる意味 においても、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。表１ ３−［３−（２−カルボキシエチル−４−メチルピロール）−２−メチリデニル ］−２−インドリノン ３−（２−アセチル−３，４−ジメチルピロール−５−メチリデニル）−２−イ ンドリノン ３−［４−（２−メトキシカルボニルエチル−３−メチルピロール−２−メチリ デニル］−２−インドリノン ３−（２，４−ジメチル−３−エトキシカルボニルピロール−５−メチリデニル ）−２−インドリノン ３−［２−エトキシカルボニル−３−（２−エトキシカルボニルエチル）−４− エトキシカルボニルメチル）ピロール−５−メチリデニル）］−２−インドリノ ン ３−（２−カルボキシ−４−エチル−３−メチルピロール−５−メチリデニル） −２−インドリノン ３−（２−クロロ−４−メトキシカルボニル−３−メトキシカルボニルメチルピ ロール−５−メチリデニル）−２−インドリノン ３−（４−アセチル−２−エトキシカルボニル−３−メチルピロール−５−メチ リデニル）−２−インドリノン ３−（４−エトキシカルボニル−３−メチルピロール−２−メチリデニル）−２ −インドリノン ３−［４−（２−メトキシカルボニルエチル）−３−メチルピロール−２−メチ リデニル］−５，６−ジメトキシ−２−インドリノン ３−（２，４−ジメチル−３−エトキシカルボニルピロール−５−メチリデニル ） ５−（４−メトキシカルボニルベンズアミド）−２−インドリノン ３−（２，４−ジメチル−３−エトキシカルボニルピロール−５−メチリデニル ）５−ブロモ−２−インドリノン ３−［４−（２−カルボキシエチル）−３，５−ジメチルピロール−２−メチリ デニル］−２−インドリノン ３−［４−（２−カルボキシエチル）−４−メチルピロール−２−メチリデニル ］−２−インドリノン ２．生化学 また別の実施形態では、本発明は、本発明の化合物又はその生理学的に許容さ れる塩又はプロドラッグとＰＫを接触させることによりＰＫの触媒活性をモジュ レートする方法に関する。 「ＰＫ」とはＲＴＫ、ＣＴＫ及びＳＴＫを意味し、ＲＴＫ、ＣＴＫ及びＳＴＫ のモジュレーシヨンによって触媒されるシグナルプロセスが本発明に考慮される 。 「方法」という用語は、限定しないが、化学、薬理学、生物学、生化学及び医 学の技術の実施者によって知られている又は既存の手法、手段、技術及び方法か ら容易に開発される手法、手段、技術及び方法を含む、ある一定の課題を達成す るための手法、手段、技術及び方法に言及する。 本明細書に使用されているように、「モジュレーション」又は「モジュレート する」という用語は、ＲＴＫ、ＣＴＫ及びＳＴＫの触媒活性を変えることに言及 する。特に、モジュレートすることは、ＲＴＫ、ＣＴＫ及びＳＴＫの触媒活性の 活性化、好ましくはＲＴＫ、ＣＴＫ又はＳＴＫが接している化合物又は塩の濃度 に依存したＲＴＫ、ＣＴＫ及びＳＴＫの触媒活性の活性化又は阻害、又はより好 ましくは、ＲＴＫ、ＣＴＫ及びＳＴＫの触媒活性の阻害に言及する。 本明細書で使用する「触媒活性」という用語は、ＲＴＫ及び／又はＣＴＫの直 接的又は間接的な影響下でのチロシンのリン酸化速度、又はＳＴＫの直接的又は 間接的な影響下でのセリン及びスレオニンのリン酸化に言及する。 本明細書で使用する「接触」という用語は、本発明の化合物及びターゲットＰ Ｋをその化合物が直接的に（即ち、キナーゼそのものと相互作用することによっ て）又は間接的に（即ち、キナーゼの触媒活性が依存している別の分子と相互作 用することによって）ＰＫの触媒活性に影響を及ぼし得るように、一緒にするこ とに言及する。そのような「接触」は、試験管、ペトリ皿又はその同類において 達成され得る。試験管では、接触は、化合物及び関心対象のＰＫのみに関わり得 るか、又は細胞全体に関わり得る。細胞はまた細胞培養皿において維持又は増殖 され、その環境で本発明の化合物と接触され得る。この文脈では、ＰＫが関連す る障害に影響を及ぼすある特定の化合物の能力、即ち、以下に定義される化合物 のＩＣ５０は、より複雑な生きた生物体に対して化合物がインビボで試用される 前に決定され得る。生物体の外にある細胞に対しては、限定しないが、直接的な 細胞へのマイクロインジェクション及び多くの膜貫通キャリアー技術を含む、Ｐ Ｋを化合物と接触させるためのいくつかの方法が存在し、当業者に知られている 。 ＲＴＫ介在性シグナル伝達は、特定の成長因子（リガンド）との細胞外相互作 用によって開始され、次いで受容体のダイマー化、内因性タンパク質チロシンキ ナーゼ活性の瞬間的な刺激及びリン酸化が続く。それによって細胞内シグナル伝 達分子に対する結合部位が創出され、適切な細胞応答（例えば、細胞***、細胞 外のマイクロ環境に対する代謝的な効果）を促進する広範囲の細胞質シグナル分 子との複合体が形成される。Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ及びＵｌｌｒｉｃｈ、１ ９９２，Ｎｅｕｒｏｎ ９：３０３〜３９１を参照のこと。 成長因子受容体のチロシンリン酸化部位が、シグナル分子のＳＨ２（ｓｒｃと 相同）ドメインに対する高親和性の結合部位として機能することが示されている （Ｆａｎｔｌ等、１９９２，Ｃｅｌｌ ６９：４１３〜４２３；Ｓｏｎｇｙａｎ ｇ等、１９９４，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：２７７７〜２７８５；Ｓ ｏｎｇｙａｎｇ等、１９９３，Ｃｅｌｌ ７２：７６８〜７７８；及びＫｏｃｈ 等、１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：６６８〜６７８）。ＲＴＫと結合する 細胞内基質タンパク質がいくつか同定された。それらは主に２つのグループに分 けられ得る： (１)触媒ドメインを有する基質；及び(２)そのようなドメインを 欠くがアダプターとして機能し、触媒的な活性のある分子と結合する基質（Ｓｏ ｎｇｙａｎｇ等、１９９３，Ｃｅｌｌ ７２：７６８〜７７８）。受容体とその 基質のＳＨ２ドメインとの相互作用の特異性は、リン酸化チロシン残基のごく周 囲にあるアミノ酸残基によって決定される。ＳＨ２ドメインと特定の受容体上の リン酸チロシン残基の周囲にあるアミノ酸配列との結合親和性の違いは、それら の基質リン酸化プロフィールに認められる違いに一致している（Ｓｏｎｇｙａｎ ｇ等、１９９３，Ｃｅｌｌ ７２：７６８〜７７８）。上記の観察結果は、各Ｒ ＴＫの機能が、その発現パターン及びリガンドの利用可能性だけでなく、特定の 受容体によって活性化される一連の下流へのシグナル伝達経路によっても決定さ れていることを示唆する。従って、リン酸化は、特定の成長因子受容体並びに分 化因子受容体が参画するシグナル経路の選択性を決定する重要な調節ステップ をもたらす。 主に細胞質ゾルに存在するＳＴＫは、しばしばＰＴＫ事象に対する下位の応答 物として細胞内の生化学に影響を及ぼす。ＳＴＫは、ＤＮＡ合成と細胞増殖を導 くその後の有糸***を開始させるシグナルプロセスとの関連が示唆されてきた。 従って、ＰＫシグナル伝達は、他の反応にまして、細胞の増殖、分化、成長及 び代謝をもたらす。異常な細胞増殖が、癌腫のような新生物、肉腫、白血病、膠 芽腫、血管腫、乾癬、動脈硬化、関節炎及び糖尿病性網膜障害（又は無制御の血 管形成及び／又は脈管形成に関連した他の障害）の発達を含む、広範囲の障害及 び疾患をもたらし得る。 本発明の化合物がＰＫを阻害する機構を正確に理解することは本発明を実施す るために必要ではない。しかしながら、本明細書ではある特定の機構又は理論に 拘泥しないが、本発明の化合物はＰＫ触媒領域のアミノ酸と相互作用すると信じ られている。ＰＫは典型的には二葉構造を保有し、ＰＫの間でアミノ酸が保存さ れている領域に存在するこの二葉間の裂溝にＡＴＰが結合するらしい。ＰＫ阻害 剤は、上記のＡＴＰがＰＫに結合するのと同じ一般的な領域で、水素結合、ファ ンデルワールスカ及びイオン相互作用のような非共有的相互作用によって結合す ると信じられている。より特定すると、本発明の化合物の２−インドリノン成分 は、ＡＴＰのアデニン環によって通常は占められている一般的な空間に結合する と考えられている。特定のＰＫに対する特定の分子の特異性は、特定のＰＫに特 異的なアミノ酸ドメインと２−インドリノン骨格上の様々な置換基との追加的な 相互作用の結果として生じ得る。従って、様々なインドリノン置換基が、特定の ＰＫに対する選好性の結合に貢献し得る。様々なＡＴＰ（又は他のヌクレオチド ）結合部位で活性である化合物を選別する能力によって、その化合物はそのよう な部位を有する任意のタンパク質、即ちＰＫだけでなくタンパク質ホスファター ゼをもターゲッティングするために有用になる。従って、本明細書に開示される 化合物は、そのようなタンパク質に対するインビトロのアッセイ及びそのような タンパク質を介したインビボの治療効果に対する有用性を有する。 他の態様では、本発明の化合物との接触によって触媒活性がモジュレートされ るタンパク質キナーゼはタンパク質チロシンキナーゼであり、より特定すれば、 受容体タンパク質チロシンキナーゼである。本発明の化合物又はその塩で触媒活 性がモジュレートされ得る受容体タンパク質チロシンキナーゼには、限定しない が、ＥＧＦ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＩＲ、ＩＧＦ−ＩＲ、ＩＲＲ、Ｐ ＤＧＦＲ□、ＰＤＧＦＲ□、ＣＳＦＩＲ、Ｃ−Ｋｉｔ、Ｃ−ｆｍｓ、Ｆｌｋ−１ Ｒ、Ｆｌｋ４、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１、Ｆｌｔ−１、ＦＧＦＲ−ＩＲ、ＦＧＦＲ− ２Ｒ、ＦＧＦＲ−３Ｒ及びＦＧＦＲ−４Ｒがある。 本発明の化合物又はその塩又はプロドラッグとの接触によって触媒活性がモジ ュレートされるタンパク質チロシンキナーゼはまた、非受容体又は細胞性のタン パク質チロシンキナーゼ（ＣＴＫ）でもあり得る。従って、限定しないが、Ｓｒ ｃ、Ｆｒｋ、Ｂｔｋ、Ｃｓｋ、Ａｂ１、ＺＡＰ７０、Ｆｅｓ／Ｆｐｓ、Ｆａｋ、 Ｊａｋ、Ａｃｋ、Ｙｅｓ、Ｆｙｎ、Ｌｙｎ、Ｌｃｋ、Ｂｌｋ、Ｈｃｋ、Ｆｇｒ及 びＹｒｋのようなＣＴＫの触媒活性が、本発明の化合物又は塩との接触によって モジュレートされ得る。 本発明の化合物との接触によってその触媒活性がモジュレートされ得るＰＫの さらに別のグループは、限定しないが、ＣＤＫ２及びＲａｆのようなセリン−ス レオニンタンパク質キナーゼである。 別の態様では、本発明は、本発明の化合物又はその塩又はプロドラッグの薬理 組成物の治療有効量を生物体に投与することによってＰＫに関連した障害を治療 又は予防するための方法に関する。 本明細書で使用する「ＰＫに関連した障害」「ＰＫに促進される障害」及び「 異常なＰＫ活性」という用語は、いずれも不適当な、即ち特定のＰＫがＲＴＫ、 ＣＴＫ又はＳＴＫである場合、より低い、又はより一般的には、より高いＰＫ触 媒活性によって特徴付けられる病態に言及する。不適当な触媒活性は、（１）通 常はＰＫを発現しない細胞におけるＰＫの発現；（２）所望されない細胞増殖、 分化及び／又は成長につながる増加したＰＫ発現；又は（３）細胞増殖、分化及 び／又は所望されない成長減退につながる低下したＰＫ発現、のいずれかの結果 として生じ得る。ＰＫの過剰な活性は、特定のＰＫをコードしている遺伝子の増 幅又は細胞増殖、分化及び／又は成長異常に相関し得る（即ち、ＰＫレベルが上 昇するにつれて細胞異常の１つ又はそれ以上の症状の重症度が増加する）ＰＫ活 性 レベルの産生のいずれかに関連する。過少活性は、当然ながら、逆のことであり 、細胞異常の１つ又はそれ以上の症状の重症度がＰＫレベルの減少につれて増加 するものである． 本明細書で使用する「予防する」「予防すること」及び「予防」という用語は 、ＰＫ介在性の細胞異常を生物体に初めから獲得させないようにするための方法 に言及する。 本明細書で使用する「治療する」「治療すること」及び「治療」という用語は 、ＰＫ介在性の細胞異常及び／又はその随伴症状を軽減する又は排除する方法に 言及する。特に癌について言えば、上記の用語は、癌に罹患した個体の期待寿命 を延ばすこと又はその疾患の１つ又はそれ以上の症状を減らすことを明解に意味 する。 「生物体」という用語は、少なくとも１つの細胞からなる任意の生きた実体に 言及する。生きている生物体は、例えば、単一の真核生物細胞と同じくらい単純 であるか又はヒトを含む哺乳類と同じくらい複雑であり得る。 本明細書で使用する「治療有効量」という用語は、治療される障害の１つ又は それ以上の症状をある程度軽減し得る投与化合物の量に言及する。癌の治療に関 連すれば、治療有効量は、（１）腫瘍のサイズを減少させる；（２）腫瘍の転移 を阻害する（つまり、ある程度遅らせる、好ましくは止める）；（３）腫瘍の成 長をある程度阻害する（つまり、ある程度遅らせる、好ましくは止める）；及び ／又は（４）癌に関連した１つ又はそれ以上の症状をある程度軽減する（好まし くは一掃する）効果を及ぼす量に言及する。 従って、本発明は、ＲＴＫ、ＣＴＫ及び／又はＳＴＫの酵素活性に影響を及ぼ し、それによりそのようなタンパク質によって伝達されるシグナルに干渉するこ とによってＰＫシグナル伝達をモジュレートする化合物に向けられている。より 特定すると、本発明は、限定しないが、癌腫、カポシ肉腫を含む肉腫、白血病、 赤芽球腫、膠芽腫、髄膜腫、星芽腫、黒色腫及び骨髄腫を含む多くの種類の固形 腫瘍に対する治療アプローチとしてＲＴＫ、ＣＴＫ及び／又はＳＴＫ介在性のシ グナル伝達経路をモジュレートする化合物に向けられている。適応症は、限定し ないが、脳の癌、膀胱癌、卵巣癌、胃癌、膵臓癌、結腸癌、血液癌、肺癌、骨の 癌及び白血病を含み得る。 本明細書に記載される化合物が予防、治療及び研究に有用であり得る非調節性 のＰＫ活性に関連した障害のタイプの更なる例は、限定しないが、細胞の増殖異 常、線維異常及び代謝異常である。 本発明によって予防、治療又はさらに研究され得る細胞の増殖異常は、癌、血 管の増殖異常及び間質細胞の増殖異常を含む。 血管の増殖異常は、血管の異常増殖をもたらす血管形成及び脈管形成異常に一 般に言及する。血管の形成及び拡張、又は脈管形成及び血管形成は、それぞれ、 胚の発生、黄体形成、創傷治癒及び臓器再生のような多様な生理学的プロセスに おいて重要な役割を担っている。それらはまた、癌の発達にも枢要な役割を演じ ている。血管の増殖異常の他の例は、新生の毛細血管が関節に侵入して軟骨を破 壊する関節炎、及び網膜の新生毛細管が硝子体に侵入し、出血し、失明を引き起 こす糖尿病性網膜障害のような眼疾患を含む。逆に、再狭窄のような血管の縮小 、収縮又は閉鎖に関連した障害も含まれる。 線維異常は、細胞外マトリックスの異常形成に言及する。線維異常の例は、肝 硬変および間質細胞の増殖異常を含む。肝硬変は、肝瘢痕の形成をもたらす細胞 外マトリックス構成成分の異常によって特徴づけられる。肝硬変は肝臓の硬変の ような疾患を引き起こし得る。肝瘢痕をもたらす細胞外マトリックスの増加はま た肝炎のようなウイルス感染によっても引き起こされ得る。脂肪細胞は肝硬変に おいて主要な役割を担っているらしい。他の関連する線維異常は、動脈硬化を含 む。 間質細胞の増殖異常は、間質細胞の異常増殖によって引き起こされる障害に言 及する。間質性の増殖異常は、糸球体腎炎、糖尿病性腎障害、悪性腎硬化症、血 栓性微小血管障害症候群、移植拒否及び腎糸球体症のような様々なヒトの腎疾患 を含む。ＰＤＧＦ−Ｒは、間質細胞の増殖維持との関連が示唆されている（Ｆｌ ｏｅｇｅ等、１９９３，Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ４３：４ ７Ｓ〜５４Ｓ）。 すでに述べたように、ＰＫはそのような細胞の増殖異常と関連づけられてきた 。例えば、いくつかのＲＴＫファミリーメンバーは、癌の発達と関連づけられて い る。これら受容体のいくつかは、ＥＧＦＲ（Ｔｕｚｉ等、１９９１、Ｂｒ．Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ６３：２２７〜２３３；Ｔｏｒｐ等、１９９２，ＡＰＭＩＳ １ ００：７１３〜７１９）、ＨＥＲ２／ｎｅｕ（Ｓｌａｍｏｎ等、１９８９，Ｓｃ ｉｅｎｃｅ ２４４：７０７〜７１２）及びＰＤＧＦ−Ｒ（Ｋｕｍａｂｅ等、１ ９９２，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，７：６２７〜６３３）のように、多くの腫瘍で過剰 に発現されている及び／又はオートクリンループによって常に活性化されている 。事実、最も一般的で重篤な癌では、これら受容体の過剰発現（Ａｋｂａｓａｋ とＳｕｎｅｒ−Ａｋｂａｓａｋ等、１９９２，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．，１ １１：１１９〜１３３；Ｄｉｃｋｓｏｎ等、１９９２，Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａ ｔｍｅｎｔ Ｒｅｓ． ６１：２４９〜２７３；Ｋｏｒｃ等、１９９２，Ｊ．Ｃｌ ｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ． ９０：１３５２〜１３６０）及びオートクリンループ（Ｌ ｅｅとＤｏｎｏｇｈｕｅ、１９９２，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１１８：１０ ５７〜１０７０；Ｋｏｒｃ等、同上；ＡｋｂａｓａｋとＳｕｎｅｒ−Ａｋｂａｓ ａｋ等、同上）が証明されている。例えば、ＥＧＦＲ受容体は、扁平上皮細胞癌 、星芽腫、膠芽腫、頭頚部癌、肺癌及び膀胱癌と関連づけられている。ＨＥＲ２ は、乳癌、卵巣癌、胃癌、肺癌、膵臓癌及び膀胱癌と関連づけられている。ＰＤ ＧＦＲは、膠芽腫、肺癌、卵巣癌、黒色腫及び前立腺癌と関連づけられている。 ＲＴＫｃ−ｍｅｔは一般に肝の発癌、従って肝細胞癌に関連づけられている。Ｃ −ｍｅｔは、悪性の腫瘍形成に結びつけられている。より特定すると、ＲＴＫｃ −ｍｅｔは、他の癌にまして、結腸直腸癌、甲状腺癌、膵臓癌及び胃癌、白血病 及びリンパ腫と関連づけられている。さらに、ｃ−ｍｅｔ遺伝子の過剰発現が、 ホジキン病、バーキット病及びリンパ腫の細胞系を有する患者で検出されている 。 Ｆｌｋは、膠芽腫のような神経膠腫だけでなく乳癌、卵巣癌及び肺癌を限定せ ずに含む広範囲の腫瘍と関連づけられている。 ＩＧＦ−ＩＲは、栄養補助及びＩＩ型糖尿病との関連が示唆されていることに 加えて、数タイプの癌とも関連づけられている。例えば、ＩＧＦ−ＩＲは、例え ばヒト乳癌の癌細胞（Ａｒｔｅａｇａ等、１９８９，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓ ｔ ．８４：１４１８〜１４２３）及び小胞性肺癌細胞（Ｍａｃａｕｌｅｙ等、１ ９９０，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５０，２５１１〜２５１７）のような、いく つかの腫瘍タイプに対するオートクリン増殖刺激剤として示唆されている。さら に、神経系の正常な成長及び分化に統合的に関与しているＩＧＦ−Ｉは、ヒト神 経膠腫のオートクリン刺激剤であるらしい（Ｓａｎｄｂｅｒｇ−Ｎｏｒｄｑｖｉ ｓｔ等、１９９３，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：２４７５〜２４７８）。ＩＧ Ｆ−ＩＲとそのリガンドの細胞増殖における重要性をさらに指示するのは、多く の培養細胞のタイプ（線維芽細胞、上皮細胞、平滑筋細胞、Ｔ−リンパ球、骨髄 細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、骨髄の幹細胞）が、ＩＧＦ−Ｉによって成長を刺激 されるという事実である（ＧｏｌｄｒｉｎｇとＧｏｌｄｒｉｎｇ、１９９１，Ｅ ｕｃａｒｙｏｔｉｃ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ，１：３０１〜３２６） 。一連の最新公表物で、Ｂａｓｅｒｇａは、ＩＧＦ−ＩＲが形質転換の機構にお いて中心的な役割を果たしているので、広範囲のヒト悪性腫瘍に対する治療的介 入の好ましいターゲットになり得るとさえ示唆している（Ｂａｓｅｒｇａ、１９ ９５，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，５５：２４９〜２５２；Ｂａｓｅｒｇａ、１９９ ４，Ｃｅｌｌ ７９：９２７〜９３０；Ｃｏｐｐｏｌａ等、１９９４，Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． ，１４：４５８８〜４５９５）。 ＳＴＫは、特に乳癌を含む、多くのタイプの癌との関連が示唆されている（Ｃ ａｎｃｅ等、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５４：５７１〜７７（１９９３））。 しかしながら、異常なＰＫ活性と疾患との関連性は、癌に限らない。例えば、 ＲＴＫは、乾癬、糖尿病、子宮内膜症、血管形成、アテローム斑形成、アルツハ イマー病、表皮増殖亢進及び加齢に関連した斑変性のような神経変性疾患、血管 腫のような疾患と関連づけられている。例えば、ＥＧＦ−Ｒは、角膜及び皮膚の 創傷治癒に必要とされる。ＩＩ型糖尿病ではインスリン−Ｒ及びＩＧＦ−１Ｒの 欠損が指摘されている。特定のＲＴＫとその治療適応症とのより完全な相関性に ついては、Ｐｌｏｗｍａｎ等、１９９４，ＤＮ＆Ｐ ７：３３４〜３３９に述べ られている。 すでに述べたように、ＲＴＫだけでなく、限定しないが、ｓｒｃ、ａｂｌ、ｆ ｐｓ、ｙｅｓ、ｆｙｎ、ｌｙｎ、ｌｃｋ、ｂｌｋ，．ｈｃｋ、ｆｇｒ及びｙｒｋ を含むＣＴＫもまた増殖性及び代謝性のシグナル伝達経路に関わっているので、 本発明が指向されている多くのＰＴＫ介在性の障害に関わっていることが予期さ れ、 示されてきた。例えば、突然変異したｓｒｃ（ｖ−ｓｒｃ）は、ニワトリでは癌 タンパク質（ｐｐ６０^v-src）として実証された。さらに、その細胞性の相同体 である癌原遺伝子ｐｐ６０^c-srcは、多くの受容体の腫瘍原性シグナルを伝達す る。例えば、腫瘍におけるＥＧＦＲ及びＨＥＲ２／ｎｅｕの過剰発現は、ｐｐ６ ０^c-srcの構成的活性化をもたらし、このことは悪性腫瘍細胞には特徴的である が正常細胞にはない。一方、ｃ−ｓｒｃの発現が欠損しているマウスは、骨化石 症のような表現型を表すので、そのことはｃ−ｓｒｃが破骨細胞の機能に必須な 役割を演じていること及び関連する疾患にも恐らくは関わっていることを示して いる。同様に、Ｚａｐ７０はＴ細胞のシグナル伝達に関係している。 ＳＴＫは、炎症、自己免疫疾患、免疫応答及び、再発狭窄症、線維症、乾癬、 骨関節炎及び慢性関節リウマチのような増殖亢進性の障害と関連づけられている 。 ＰＫはまた胚の着床との関連が示唆されているので、本発明の化合物は胚の着 床を予防する有効な手段を提供し得る。 最後に、ＲＴＫとＣＴＫはいずれも免疫亢進性の障害に関わっているのではな いかと現在考えられている。３．薬理組成物及び治療応用 本発明の化合物、そのプロドラッグ、又はその塩又はプロドラッグのいずれか の生理学的に許容される塩は、そのまま又は適切なキャリアー又は賦形剤と混合 した薬理組成物にしてヒト患者へ投与され得る。薬物の製剤化及び投与の技術は 、「レミントンの製薬科学」、マックパブリッシング社、イーストン、ＰＡ、最 新版に見出し得る。Ａ．投与経路 本明細書で使用する「投与する」又は「投与」は、本発明の化合物、塩又はプ ロドラッグ又は本発明の化合物、塩又はプロドラッグを含む薬理組成物を、ＰＫ に関連した障害の予防又は治療を目的として生物体へデリバリーすることに言及 する。 好適な投与経路は、限定しないが、経口、直腸、経粘膜又は小腸投与、又は、 筋肉内、皮下、髄内、鞘内、直接心室内、静脈内、腹腔内、鼻孔内又は眼球内注 射を含み得る。 別のやり方では、全身的ではなく局所的に、例えば、しばしばデポー製剤又は 持続性放出製剤での化合物の注射を介して直接固形癌へ化合物を投与し得る。 さらに、例えば、腫瘍特異的な抗体で被覆されたリポソームのようなターゲッ ティングされた薬物デリバリーシステムにおいて薬物を投与し得る。リポソーム は、腫瘍にターゲッティングされ、選択的に取込まれる可能性がある。Ｂ．組成物／製剤 本発明の薬理組成物は、当技術分野でよく知られている方法、例えば、従来の 混合、溶解、造粒、糖剤調製、粉砕、乳化、被胞、捕捉又は凍結乾燥法によって 、製造され得る。 従って、本発明に拠って使用される薬理組成物は、医薬品として使用され得る 調製物中への活性化合物の処理工程を促進する賦形剤及び補助剤を含む１つ又は それ以上の生理学的に許容されるキャリアーを使用する従来の方法において製剤 化され得る。適切な製剤は、選択される投与経路に依存する。 注射のためには、本発明の化合物は、水溶液、好ましくはハンク液、リンゲル 液又は生理食塩緩衝液のような生理学的適合性のある緩衝液において製剤化され 得る。経粘膜投与のためには、浸透されるバリアに対して適切な浸透剤が製剤に 使用される。そのような浸透剤は当技術分野で一般に知られている。 経口投与のためには、化合物は、当技術分野でよく知られている医薬品として 許容されるキャリアーと活性化合物を一緒にすることによって容易に製剤化され 得る。そのようなキャリアーは、本発明の化合物が治療される患者に経口摂取さ れるための、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル、シロップ、スラリ ー、懸濁液といったものとして製剤化されることを可能にする。経口使用のため の医薬調製物は、錠剤又は糖衣剤の核部分を得るために所望ならば適切な補助剤 を加えた後に、得られる混合物を所望により摩砕し、細粒の混合物を加工し、固 体の賦形剤を使用して作られ得る。適切な賦形剤は、特に、乳糖、ショ糖、マン ニトール又はソルビトールを含む糖のような充填剤、又は、例えばトウモロコシ デンプン、小麦デンプン、米デンプン、ポテトデンプン、ゼラチン、ゴムトラガ カント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシ メチルセルロースナトリウム及び／又はポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）のよう なセルロース調製物である。所望ならば、架橋結合性ポリビニルピロリドン、寒 天又はアルギン酸又はアルギン酸ナトリウムのようなその塩、といった崩壊剤が 追加され得る。 糖衣錠の核部分には好適なコーティング剤が施される。この目的のために、所 望ならばアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポル（ｃａｒｂ ｏｐｏｌ）ゲル、ポリエチレングリコール及び／又は二酸化チタン、ラッカー溶 液及び好適な有機溶媒又は溶媒混合物を所望により含み得る濃縮された糖溶液が 使用され得る。錠剤又は糖衣錠のコーティング部分に、確認のために又は様々な 組み合わせの活性化合物用量を特徴づけるために、染料又は色素が追加され得る 。 経口的に使用され得る薬理組成物は、ゼラチン製のプッシュフィット（ｐｕｓ ｈ−ｆｉｔ）カプセル、並びにゼラチン製の密封軟カプセル及びグリセロール又 はソルビトールのような可塑剤を含む。プッシュフィットカプセルは、乳糖のよ うな充填剤、デンプンのような結合剤、及び／又はタルク又はステアリン酸マグ ネシウムのような滑沢剤及び、所望ならば、安定化剤と混和した活性成分を含み 得る。軟カプセルでは、活性化合物は、脂肪酸、流動パラフィン又は液体ポリエ チレングリコールのような好適な液体に溶解又は懸濁され得る。さらに、安定化 剤を加える場合がある。 経口投与用の製剤は、すべてその投与に適した用量であるべきである。 舌下投与のためには、組成物は、従来の方法で製剤化される錠剤又はトローチ 剤の形態をとり得る。 吸入による投与のためには、本発明により使用される化合物は、例えばジクロ ロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタ ン、二酸化炭素又は他の適切なガスのような好適な噴射剤を使用して、加圧式パ ック又は噴霧器に代表されるエアゾールスプレーの形態で簡便にデリバリーされ る。加圧式エアゾールの場合、用量単位は、目盛り量をデリバリーするバルブを 装備することにより決定され得る。吸入剤又は吸入器に使用される、例えばゼラ チン製のカプセル及びカートリッジは、化合物と乳糖又はデンプンのような好適 な粉末基剤との混合粉末を含むように製剤化され得る。 本発明の化合物は、例えばボーラス注射又は連続注入のような注射による非経 口投与のために製剤化され得る。注射用製剤は、例えば、保存剤入りのアンプル 又は多用量容器のような単位投与量の形態で提示され得る。この組成物は、油状 又は水性担体の懸濁液、溶液又は乳濁液のような形態をとり得て、懸濁剤、安定 化剤及び／又は分散剤のような製剤用の薬剤を含み得る。 非経口投与のための薬理組成物は、活性化合物が水に溶けた形態の水溶液を含 む。さらに、活性化合物の懸濁液は、適切な油状の注射懸濁液として調製され得 る。好適な脂溶性の溶媒又は担体は、ゴマ油のような脂肪油又はオレイン酸エチ ル又はトリグリセリドのような合成の脂肪酸エステル、又はリポソームを含む。 水性の注射懸濁液は、カルボキシメチルナトリウムセルロース、ソルビトール又 はデキストランのような、懸濁剤の粘度を高める物質を含み得る。所望により、 懸濁剤はまた、好適な安定化剤又は化合物の溶解度を高め、ごく濃縮された溶液 の調製を可能にする薬剤を含み得る。 別のやり方では、活性成分は、例えば発熱物質の無い滅菌水のような好適な担 体との構成のために、使用前には粉末の形態であり得る。 化合物はまた、坐剤又は停留浣腸剤のような、例えばカカオ脂又は他のグリセ リドのような従来の坐薬基剤を含む、直腸内組成物の形で製剤化され得る。 すでに記載した製剤に加えて、化合物はまたデポー調製物としても製剤化され 得る。そのような長時間作用性の製剤は、埋め込み（例えば、皮下又は筋肉内） 又は筋肉内注射によって投与され得る。従って、例えば化合物は、適切な高分子 又は疎水性材料（例えば、許容される油の乳濁液として）又はイオン交換樹脂と ともに、また例えばほとんど溶けない塩のような不溶性の誘導体として、製剤化 され得る。 本明細書の薬理組成物はまた、好適な固相又はゲル相のキャリアー又は賦形剤 を含み得る。そのようなキャリアー又は賦形剤の例は、限定しないが、炭酸カル シウム、リン酸カルシウム、様々な糖類、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチ ン及びポリエチレングリコールのようなポリマーを含む。 本発明のＰＫモジュレート化合物の多くは、特許請求される化合物が負又は正 の電荷の分子種を形成しうる生理学的に許容される塩として提供され得る。本発 明の化合物が正電荷の成分を含む塩の例は、限定しないが、適切な酸とアミノ基 の反応によって形成される、４価アンモニウム（本明細書の別のところで定義さ れている）の塩酸、硫酸、炭酸、乳酸、酒石酸、マレイン酸、コハク酸等の塩を 含む。本発明の化合物が負電荷の成分を含む塩の例は、限定しないが、適切な塩 基（例、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、水酸化カリウム（ＫＯＨ）、水酸化カ ルシウム（Ｃａ（ＯＨ）₂）等）と化合物分子内のカルボン酸基との反応によっ て形成される、ナトリウム、カリウム、カルシウム及びマグネシウム塩を含む。Ｃ．投与量 本発明の使用に適した薬理組成物は、活性成分がその意図された目的を達成す るのに有効である量だけ含まれている組成物を含む。 より特定すると、治療有効量とは、治療される患者の疾患症状を予防、軽減又 は改善する又はその生存を引き伸ばすのに有効な化合物の量を意味する。治療有 効量の決定は、特に本明細書に提供される詳細な開示に照らせば、十分当業者の 能力の範囲内にある。 本発明の方法に使用される任意の化合物に対しては、治療有効量又は用量は、 最初は細胞培養アッセイから評価され得る。次いで、細胞培養で決定されるＩＣ₅₀ （即ち、ＰＫ活性の最大阻害の半分を達成する試験化合物の濃度）を含む循環 濃度範囲に達するように、動物モデルでの使用のための用量が定式化され得る。 そのような情報は、ヒトでの有用な用量をより正確に決定するために使用され得 る。 本発明に記載される化合物の毒性及び治療効果は、細胞培養又は実験動物を用 いた標準的な医薬品の方法、例えば、ＬＤ₅₀（実験集団の５０％に対して致死的 な用量）及びＥＤ₅₀（実験集団の５０％に治療効果がある用量）を決定する方法 によって決定され得る。毒性効果と治療効果との用量比が治療インデックスであ り、それはＬＤ₅₀とＥＤ₅₀との比として表現され得る。高い治療インデックスを 示す化合物が好ましい。このような細胞培養アッセイ及び動物試験から得られる データは、ヒトに使用するための投与量の範囲を定式化するときに使用され得る 。そのような化合物の投与量は、好ましくは、毒性がほとんど又は全くないＥＤ₅₀ を含む循環濃度の範囲内にある。投与量は、利用される投与形態及び利用され る投与経路に依存してこの範囲内を変動し得る。的確な製剤、投与経路及び投与 量は、患者の状態を考慮するそれぞれの医師によって選択され得る（Ｆｉｎｇｌ 等、１９７５，「治療薬の薬理学的基礎」第１章、１頁を参照のこと）。 投与量及び間隔は、キナーゼモジュレート効果を維持するのに十分な活性成分 の血漿レベル又は最少有効濃度（ＭＥＣ）をもたらすように各個人ごとに調整さ れ得る。ＭＥＣは各化合物で異なるものだが、例えば本明細書に記載されるアッ セイを用いてキナーゼの５０〜９０％阻害を達成するのに必要な濃度、といった インビトロのデータから推定され得る。ＭＥＣを達成するのに必要な投与量は各 個人の特性及び投与経路に依存するものである。しかしながら、血漿濃度を決定 するためには、ＨＰＬＣアッセイ又はバイオアッセイが使用され得る。 投与間隔はまた、ＭＥＣ値を用いて決定され得る。化合物は、この時間の１０ 〜９０％、好ましくは３０〜９０％、及び最も好ましくは５０〜９０％の間ＭＥ Ｃより上の血漿レベルを維持する処方を使用して投与されるべきである。 局所投与又は選択的取込みの場合は、薬物の有効局所濃度は、血漿濃度に関連 しない可能性がある。 投与される組成物の量は、勿論、治療される患者、患者の体重、病気の重症度 、投与の方法及び処方医の判断に依存するだろう。Ｄ．包装 薬理組成物は、ＦＤＡ承認キットのような、活性成分を含む１つ又はそれ以上 の単位投与形態を含み得る、パック又はディスペンサー器具において、所望なら ば、提示され得る。パックは、例えばブリスターパックのような、金属又はプラ スチックの箔を含み得る。パック又はディスペンサー器具には投与の指示書が付 き得る。パック又はディスペンサーにはまた、医薬品の製造、使用又は販売を規 制する政府当局による、処方される形態の容器に関連した通知が付き得るが、そ の通知はその組成物の形態又はヒト又は家畜への投与に関する規制当局の承認を 反映している。そのような通知は、例えば、処方薬に対して米国食品医薬品が承 認したラベル又は承認された製品説明書であり得る。適合性のある医薬品用キャ リアーで製剤化された本発明の化合物を含む組成物はまた製造され、適切な容器 に入れられ、適応症の治療のためにラベルを表示され得る。ラベルに示される好 適な条件は、腫瘍の治療、血管形成の阻害、線維症、糖尿病等の治療を含み得る 。 ４．合成 本発明の化合物並びに前駆体の２−オキシインドール及びアルデヒドは、化学 技術の分野でよく知られている技術を用いて容易に合成され得る。当業者は、本 発明の化合物を形成するために他の合成経路が利用可能であること、及び以下の 経路が提供されるのは例示のためであって限定のためではないことを理解されよ う。Ａ．一般的な合成法 以下の一般的な方法論を使用して本発明の化合物を調製してもよい： 適切に置換された２−オキシインドール（１当量）、適切に置換されたアルデ ヒド（１．２当量）、およびピペリジン（０．１当量）をエタノールと混合し（ １〜２ｍｌ／ｍｍｏｌ ２−オキシインドール）、次いで混合液を９０℃で３〜 ５時間加熱する。冷却後、反応混液を濃縮し、酸性化してｐＨ３とする。生成す る沈殿を濾過し、水で洗浄してｐＨ７とした後、冷エタノール、酢酸エチル、お よび／またはヘキサンで洗浄し、真空乾燥して標記の化合物を得る。必要により 、生成物をクロマトグラフィーで更に精製してもよい。Ｂ．２−オキシインドール 以下の実施例は、本発明の化合物の２−オキシインドール前駆体のいくつかの 代表的な合成法を示す。これらの２−オキシインドールは、本発明の他の物質と 同様、適切に置換されたアルデヒドと上記の条件下で反応させることによって本 発明の化合物を生成する。以下の合成は単に例としてのみ提供するものであり、 合成法または記載する化合物についての制限としてみなされるものではないこと は理解されるところである。５−アミノ−２−オキシインドール ５−ニトロ−２−オキシインドール（６．３ｇ）をメタノール中、１０％パラ ジウム／炭素で水素添加し、３．０ｇ（収率６０％）の標記化合物の白色固体を 得た。５−ブロモ−２−オキシインドール ２０ｍＬのアセトニトリル中の２−オキシインドール（１．３ｇ）を−１０℃ に冷却し、２．０ｇのＮ−ブロモスクシンイミドを撹拌しながら徐々に添加した 。反応液を−１０℃で１時間、および０℃で２時間撹拌した。沈殿を回収し、水 で洗浄して乾燥し、１．９ｇ（収率９０％）の標記化合物を得た。４−メチル−２−オキシインドール ２０ｍＬの乾燥エーテル中のシュウ酸ジエチル（３０ｍＬ）を、５０ｍＬの乾 燥エーテルに懸濁した１９ｇのカリウムエトキシドに撹拌しながら添加した。混 合液を氷浴中で冷却し、２０ｍＬの乾燥エーテル中の２０ｍＬの３−ニトロ−ｏ −キシレンを徐々に添加した。濃暗赤色の混合液を０．５時間加熱還流し、濃縮 して暗赤色の固体を得、１０％水酸化ナトリウムで、ほとんどの固体が溶解する まで処理した。暗赤色の混合液を３０％過酸化水素で、赤色が黄色に変化するま で処理した。混合液を１０％水酸化ナトリウムおよび３０％の過酸化水素で、暗 赤色がもはや存在しなくなるまで交互に処理した。固体を濾過して除去し、濾液 を６Ｎ塩酸で酸性化した。生じた沈殿を吸引濾過で回収し、水で洗浄し、真空下 で乾燥して９．８ｇ（収率４５％）の２−メチル−６−ニトロフェニル酢酸のオ フホワイト色の固体を得た。固体をメタノール中、１０％パラジウム／炭素で水 素添加し、９．０４ｇの標記化合物の白色固体を得た。７−ブロモ−５−クロロ−２−オキシインドール ５−クロロ−２−オキシインドール（１６．８ｇ）および１９．６ｇのＮ−ブ ロモスクシンイミドを１４０ｍＬのアセトニトリルに懸濁し、３時間還流した。 薄層クロマトグラフィー（シリカ、酢酸エチル）は、還流２時間の時点で５−ク ロロ−２−オキシインドールまたはＮ−ブロモスクシンイミド（Ｒｆ ０．８） 、生成物（Ｒｆ ０．８５）、および第二の生成物（Ｒｆ ０．９）を示し、そ の比率は更に１時間の還流後も変化しなかった。混合液を１０℃に冷却し、吸引 濾過で沈殿を回収し、２５ｍＬのエタノールで洗浄し、漏斗で２０分間、吸引乾 燥し、１４．１ｇの湿生成物（収率５６％）を得た。固体を２００ｍＬの変性エ タノールに懸濁し、撹拌して懸濁液を洗浄し、１０分間還流した。混合液を氷浴 中で１０℃に冷却した。固体生成物を吸引濾過で回収し、２５ｍＬのエタノール で洗浄し、真空下において４０℃で乾燥して１２．７ｇ（収率５１％）の７−ブ ロモ−５−クロロ−２−オキシインドールを得た。５−フルオロ−２−オキシインドール ５−フルオロイサチン（８．２ｇ）を５０ｍＬのヒドラジン一水和物に溶解し 、１．０時間還流した。次いで反応混液を氷水に注入した。その後沈殿を濾過し 、水で洗浄し、真空オーブンで乾燥して標記の化合物を得た。５−ニトロ−２−オキシインドール ２−オキシインドール（６．５ｇ）を２５ｍＬの濃硫酸に溶解し、混合液を− １０〜−１５℃に保持しつつ２．１ｍＬの発煙硝酸を滴加した。硝酸の添加後、 反応混液を０℃で０．５時間撹拌し、氷水に注入した。沈殿を濾過して回収し、 水で洗浄して５０％酢酸から結晶化した。次いで結晶生成物を濾過し、水で洗浄 し、真空下で乾燥して６．３ｇ（７０％）の５−ニトロ−２−オキシインドール を得た。５−ヨード−２−オキシインドール ２−オキシインドール（８２．９ｇ）を自動撹拌機で撹拌しつつ６３０ｍＬの 酢酸に懸濁し、混合液を氷水浴中で１０℃に冷却した。Ｎ−ヨードスクシンイミ ドの固体（１７５ｇ）を数回に分けて１０分間にわたって添加した。添加が完了 した後、混合液を１０℃で１時間撹拌した。懸濁した固体が常に存在していたが 、この時点で非常に濃厚になった。固体を吸引濾過で回収し、１００ｍＬの５０ ％酢酸／水、次いで２００ｍＬの水で洗浄し、漏斗で２０分間吸引乾燥した。生 成物を真空下で乾燥して９３．５ｇ（３６％）の５−ヨード−２−オキシインド ールを得たが、これはプロトンＮＭＲで測定したところ、約５％の２−オキシイ ンドールを含有していた。５−メチル−２−オキシインドール ５−メチルイサチン（１５．０ｇ）と６０ｍＬのヒドラジン一水和物を１４０ 〜１６０℃で４時間加熱した。薄層クロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン １：２、シリカゲル）は、開始物質が残存していないことを示した。反応混液を 室温まで冷却し、３００ｍＬの氷水に注入し、６Ｎ塩酸でｐＨ２まで酸性化した 。室温で２日間静置した後、吸引濾過で沈殿を回収して水で洗浄し、真空下で乾 燥 して６．５ｇ（収率４７％）の５−メチル−２−オキシインドールを得た。５−ブロモ−４−メチルオキシインドールおよび５，７−ジブロモ−４−メチル オキシインドール ４０ｍＬのアセトニトリル中の４−メチル−２−オキシインドール（５ｇ）を ７．２６ｇのＮ−ブロモスクシンイミドで処理し、室温で４時間撹拌した。薄層 クロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン １：２、シリカゲル）は、５−ブ ロモ（Ｒｆ ０．３）および５，７−ジブロモ（Ｒｆ ０．５）生成物が混合し ていることを示した。更に７．２６ｇのＮ−ブロモスクシンイミドを添加し、混 合液を更に４時間撹拌した。固体を吸引濾過で回収し、２０ｍＬのアセトニトリ ルで洗浄して乾燥し、モノおよびジブロモ化合物の１：１混合物を得た。濾液を 濃縮してシリカゲルクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン （１：２）） に適用し、１．６７ｇの５−ブロモ−４−メチル−２−オキシインドールのベー ジュ色の固体を得た。残存する１：１混合物の固体を氷酢酸から２回再結晶し、 ３．２ｇの５，７−ジブロモ−４−メチル−２−オキシインドールの淡橙色固体 を得た。この物質の濾液を上記のようにクロマトグラフィーに適用し、０．６ｇ の５−ブロモ−４−メチル−２−オキシインドールおよび０．５ｇの５，７−ジ ブロモ−４−メチル−２−オキシインドールを得た。６−フルオロ−２−オキシインドール 水素化ナトリウム（２．６ｇ）と１４．５ｇのマロン酸ジメチルを撹拌し、１ ６０ｍＬのジメチルスルホキシド中で１００℃まで１時間加熱した。混合液を室 温まで冷却し、７．９５ｇの２，５−ジフルオロニトロベンゼンを添加して混合 液を３０分間撹拌した。次いで混合液を１００℃まで１時間加熱し、室温まで冷 却して４００ｍＬの飽和塩化アンモニウム溶液に注入した。混合液を２００ｍＬ の酢酸エチルで抽出し、有機相を食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し て真空下で濃縮した。残渣をメタノールから結晶化させ、２４．４ｇ(収率８０ ％)の４−フルオロ−２−ニトロフェニルマロン酸ジメチルの白色固体を得た。 薄層クロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン １：６、シリカゲル）でのＲ ｆは ０．２であった。濾液を濃縮してシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エ チル：ヘキサン １：８）に適用し、更に５．０３ｇの４−フルオロ−２−ニト ロフェニルマロン酸ジメチルを得、総量は２９．５ｇ（収率９６％）であった。 ４−フルオロ−２−ニトロフェニルマロン酸ジメチル（５．０ｇ）を２０ｍＬ の６Ｎ塩酸中で２４時間還流した。反応液を冷却し、吸引濾過で白色固体を回収 し、水で洗浄し、乾燥して３．３ｇ（収率８７％）の４−フルオロ−２−ニトロ フェニル酢酸を得た。薄層クロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン １：２ 、シリカゲル）でのＲｆは０．６であった。 ４−フルオロ−２−ニトロフェニル酢酸（３．３ｇ）を１５ｍＬの酢酸に溶解 し、０．４５ｇの１０％パラジウム／炭素で、６０ｐｓｉのＨ₂で２時間水素添 加した。濾過して触媒を除去し、１５ｍＬのメタノールで洗浄した。合一した濾 液を濃縮し、水で希釈した。吸引濾過で沈殿を回収し、水で洗浄して乾燥し、１ ．６ｇ（収率７０％）の６−フルオロ−２−オキシインドールを得た。薄層クロ マトグラフィーでのＲｆは０．２４であった。濾液を濃縮して紫色の固体を得た が、これは最初の生成物と同様のＮＮＭスペクトルを示した。紫色の固体をクロ マトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン １：２、シリカゲル）に適用し、第二 の生成物、６−フルオロ−２−オキシインドールの白色固体を得た。５−アミノスルホニル−２−オキシインドール ２７ｍＬのクロロスルホン酸を充填した１００ｍＬのフラスコに１３．３ｇの ２−オキシインドールを徐々に添加した。添加の間、反応液の温度は３０℃未満 に保持した。添加後、反応混液を室温で１．５時間撹拌し、６８℃で１時間加熱 し、冷却し、水に注入した。沈殿を水で洗浄して真空オーブンで乾燥し、１１． ０ｇの５−クロロスルホニル−２−オキシインドール（収率５０％）を得、更な る精製をせずに使用した。 ５−クロロスルホニル−２−オキシインドール（２．１ｇ）を１０ｍＬのエタ ノール中の１０ｍＬの水酸化アンモニウムに添加し、室温で一晩撹拌した。混合 液を濃縮し、固体を吸引濾過で回収して、０．４ｇ（収率２０％）の標記化合物 のオフホワイト色の固体を得た。５−メチルアミノスルホニル−２−オキシインドール １０ｍＬの２Ｍメチルアミン／テトラヒドロフラン中の３．３８ｇの５−クロ ロスルホニル−２−オキシインドールの懸濁液を室温で４時間撹拌し、その間に 白色固体が生成した。吸引濾過で沈殿を回収し、５ｍＬの水で２回洗浄し、真空 下、４０℃で一晩乾燥して３．０ｇ（収率８８％）の５−メチルアミノスルホニ ル−２−オキシインドールを得た。５−（４−トリフルオロメチルフェニルアミノスルホニル）−２−オキシインド ール ２０ｍＬのジクロロメタン中の２．１ｇの５−クロロスルホニル−２−オキシ インドール、１．６ｇの４−トリフルオロメチルアニリン、および１．４ｇのピ リジンの懸濁液を室温で４時間撹拌した。生成した沈殿を吸引濾過で回収し、５ ｍＬの水で２回洗浄し、真空下、４０℃で一晩乾燥して２．４ｇの粗生成物を得 たが、これは薄層クロマトグラフィーで分析したところ、不純物を含有していた 。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィーに適用して酢酸エチル:ヘキサン(１ ：２）で溶出し、１．２ｇ（収率３７％）の５−（４−トリフルオロメチルフェ ニルアミノスルホニル）−２−オキシインドールを得た。５−（モルホリノスルホニル）−２−オキシインドール ５０ｍＬのジクロロメタン中の２．３ｇの５−クロロスルホニル−２−オキシ インドールおよび２．２ｇのモルホリンの懸濁液を室温で３時間撹拌した。吸引 濾過で白色の沈殿を回収し、酢酸エチルおよびヘキサンで洗浄し、真空下、４０ ℃で一晩乾燥して２．１ｇ（収率７４％）の５−（モルホリノスルホニル）−２ −オキシインドールを得た。６−トリフルオロメチル−２−オキシインドール ジメチルスルホキシド（３３０ｍＬ）を７．９ｇの水素化ナトリウムに添加し た後、４３．６ｇのシュウ酸ジエチルを滴加した。混合液を１００℃まで１時間 加熱し、室温まで冷却した。２−ニトロ−４−トリフルオロメチルトルエン（３ １．３ｇ）を添加し、反応液を室温で３０分間撹拌し、その後１００℃まで１時 間加熱した。反応液を冷却し、飽和塩化アンモニウム水溶液、酢酸エチル、およ びヘキサンの混合液に注入した。有機相を飽和塩化アンモニウム、水、および食 塩水で洗浄し、乾燥し、濃縮して２−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフ ェニル）マロン酸ジメチルを得た。 ジエステルを１００ｍＬのジメチルスルホキシド中の６．４ｇの塩化リチウム および２．７ｍＬの水の混合液に溶解し、１００℃まで３時間加熱した。反応液 を冷却し、酢酸エチルと食塩水の混合液に注入した。有機相を食塩水で洗浄し、 硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮してシリカゲルクロマトグラフィーに適用した( １０％酢酸エチル／ヘキサン)。生成物を含有する画分をエバポレートして２５ ．７ｇの２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル酢酸メチルを得た。 ２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル酢酸メチル(２６ｍｇ)を１０％ パラジウム／炭素で水素添加した後、１００℃で３時間加熱した。濾過して触媒 を除去し、溶媒をエバポレートして標記化合物を得た。５−（２−クロロエチル）オキシインドール 氷浴に入れた３０ｍＬのトリフルオロ酢酸中の５−クロロアセチル−２−オキ シインドール（４．１８ｇ）を４．６５ｇのトリエチルシランで処理し、室温で ３時間撹拌した。混合液を１５０ｍＬの水に注入し、吸引濾過で沈殿を回収し、 ５０ｍＬの水で洗浄して乾燥し、２．５３ｇ（収率６５％）の５−（２クロロエ チル）−２−オキシインドールの赤褐色固体を得た。５−メトキシカルボニル−２−オキシインドール ５−ヨード−２−オキシインドール（１７ｇ）を、２ｇのパラジウムジアセタ ート、１８．２ｇのトリエチルアミン、１５０ｍＬのメタノール、１５ｍＬのジ メチルスルホキシド、および２．６ｇのＤＰＰＰと共に、一酸化炭素で飽和した 雰囲気下で還流した。２４時間後、反応液を濾過して触媒を除去し、濾液を濃縮 した。濃縮物をシリカゲルクロマトグラフィー（３０％酢酸エチル／ヘキサン） に適用した。生成物を含有する画分を濃縮して静置した。沈殿した生成物を吸引 濾過で回収し、０．８ｇ（７％）の標記化合物のオフホワイト色の固体を得た。４−カルボキシ−２−オキシインドール トリメチルシリルジアゾメタンのヘキサン溶液（２Ｍ）を、２０ｍＬのメタノ ール中の２．０１ｇの２−クロロ−３−カルボキシニトロベンゼンに、室温でそ れ以上ガスが発生しなくなるまで滴加した。過剰のトリメチルシリルジアゾメタ ンを酢酸でクエンチングした。反応混液をロータリーポンプで乾燥し、残渣を更 に真空オーブンで一晩乾燥した。生成物（２−クロロ−３−メトキシカルボニル ニトロベンゼン）は以下の反応に十分な純度であった。 マロン酸ジメチル（６．０ｍＬ）を、１５ｍＬのＤＭＳＯ中の２．１ｇの水素 化ナトリウムの氷冷懸濁液に添加した。次いで反応混液を１００℃で１時間撹拌 した後、室温まで冷却した。２−クロロ−３−メトキシカルボニルニトロベンゼ ン（２．１５ｇ）を上記の混合液に一度に添加し、混合液を１００℃まで１．５ 時間加熱した。次いで反応混液を室温まで冷却して氷水に注入し、ｐＨ５まで酸 性化し、酢酸エチルで抽出した。有機相を食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウム で乾燥し、濃縮して３．０ｇの２−メトキシカルボニル−６−ニトロフェニルマ ロン酸ジメチルを得た。 ２−メトキシカルボニル−６−ニトロフェニルマロン酸ジメチル（３．０ｇ） を５０ｍＬの６Ｎ塩酸中で一晩還流した。混合液を濃縮乾固して、２０ｍＬのエ タノール中の１．１ｇの塩化スズ（ＩＩ）と共に２時間還流した。混合液をセラ イトを通して濾過し、濃縮してシリカゲルクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘ キサン：酢酸）に適用して０．６５ｇ（収率３７％）の４−カルボキシ−２−オ キシインドールの白色固体を得た。５−カルボキシ−２−オキシインドール ２−オキシインドール（６．７ｇ）を、氷浴に入れた３０ｍＬのジクロロエタ ン中の２３ｇの塩化アルミニウムの撹拌懸濁液に添加した。塩化クロロアセチル （１１．３ｇ）を徐々に添加し、塩化水素ガスが発生した。１０分間撹拌した後 、 反応液を４０〜５０℃で１．５時間加温した。薄層クロマトグラフィー（酢酸エ チル、シリカゲル）は、開始物質が残存していないことを示した。混合液を室温 まで冷却し、氷水に注入した。吸引濾過で沈殿を回収し、水で洗浄し、真空下で 乾燥して１０．３ｇ（９８％）の５−クロロアセチル−２−オキシインドールの オフホワイト色の固体を得た。 ９．３ｇの５−クロロアセチル−２−オキシインドールの懸濁液を９０ｍＬの ピリジン中で、８０〜９０℃で３時間撹拌した後、室温まで冷却した。吸引濾過 で沈殿を回収し、２０ｍＬのエタノールで洗浄した。固体を９０ｍＬの２．５Ｎ 水酸化ナトリウムに溶解し、７０〜８０℃で３時間撹拌した。混合液を室温まで 冷却し、０．５Ｎ塩酸でｐＨ２に酸性化した。吸引濾過で沈殿を回収し、水で完 全に洗浄し、粗製の５−カルボキシ−２−オキシインドールの暗褐色の固体を得 た。一晩静置した後、濾液から２ｇの５−カルボキシ−２−オキシインドールの 黄色固体を得た。暗褐色の粗生成物を熱メタノールに溶解し、不溶性物質を濾過 して除去し、濾液を濃縮して５．６ｇの５−カルボキシ−２−オキシインドール の褐色固体を得た。総収率は９７％であった。５−カルボキシエチル−２−オキシインドール ２５ｍＬの濃塩酸を含有する１０ｍＬの水中の５−シアノエチル−２−オキシ インドール（４．０２ｇ）を４時間還流した。混合液を冷却し、水を添加して、 吸引濾過で生成した固体を回収し、水で洗浄し、乾燥して１．９ｇ（収率４４％ ）の標記化合物の黄色固体を得た。５−ヨード−４−メチル−２−オキシインドール 氷浴に入れた４０ｍＬの水酢酸中の２ｇの４−メチル−２−オキシインドール に３．６７ｇのＮ−ヨードスクシンイミドを添加した。混合液を１時間撹拌し、 １００ｍＬの５０％酢酸／水で希釈し、濾過した。生成した白色固体を高真空下 で乾燥し、３．２７ｇ（収率８８％）の標記化合物のオフホワイト色の固体を得 た。５−クロロ−４−メチル−２−オキシインドール ３．０ｇの４−メチル−２−オキシインドールの懸濁液を５０ｍＬのアセトニ トリル中で、室温で撹拌しつつ、３．３ｇのＮ−クロロスクシンイミドを数回に 分けて添加した。次いでトリフルオロ酢酸（１ｍＬ）を添加した。懸濁液を室温 で３日間撹拌したが、その間、常に固体が存在した。吸引濾過で白色固体を回収 し、少量の冷アセトンで洗浄し、真空オーブンで４０℃で一晩乾燥し、２．５ｇ （６８％）の５−クロロ−４−メチル−２−オキシインドールを得た。５−ブチル−２−オキシインドール トリエチルシラン（２．３ｇ）を、２０ｍＬのトリフルオロ酢酸中の２ｇの４ −ブタノイル−２−オキシインドールに室温で添加し、溶液を３時間撹拌した。 反応液を氷水に注入して赤色油を得、静置して凝固させた。吸引濾過で固体を回 収し、水およびヘキサンで洗浄し、乾燥して１．７ｇ（収率９１％）の標記化合 物のオフホワイト色の固体を得た。５−エチル−２−オキシインドール 氷浴に入れた１５ｍＬトリフルオロ酢酸中の５−アセチル−２−オキシインド ール（２ｇ）に１．８ｇのトリエチルシランを徐々に添加した；次いで反応液を 室温で５時間撹拌した。１ｍＬのトリエチルシランを添加し、撹拌を一晩継続し た。反応混液を氷水に注入し、生成した沈殿を吸引濾過で回収し、水で十分洗浄 し、真空下で乾燥して１．３ｇ（収率７１％）の標記化合物の黄色固体を得た。５−（モルホリン−４−エチル）−２−オキシインドール ５−クロロエチル−２−オキシインドール（２．３ｇ）、１．２ｍＬのモルホ リン、および１．２ｍＬのジイソプロピルエチルアミンを、１０ｍＬのジメチル スルホキシド中で、１００℃で一晩加熱した。混合液を冷却し、水に注入して酢 酸エチルで抽出した。有機相を食塩水で洗浄し、乾燥し、エバポレートした。残 渣をシリカゲルクロマトグラフィー（５％メタノール／クロロホルム）に適用し 、０．９ｇ（３１％）の標記化合物の白色固体を得た。５−（４−メトキシカルボニルベンズアミド）−２−オキシインドール ピリジン中の８２.０ｍｇの５−アミノ−２−オキシインドールおよび１３１ ．０ｍｇの４−メトキシカルボニル塩化ベンゾイルの混合液を室温で３時間撹拌 し、氷水に注入した。沈殿を濾過し、水で洗浄して真空オーブンで乾燥し、１３ ８．０ｍｇの５−（４−メトキシカルボニルベンズアミド）−２−オキシインド ールを得た（収率８１％）。５−（４−カルボキシベンズアミド）−２−オキシインドール ２５ｍＬのメタノール中の５−（４−メトキシカルボニルベンズアミド）−２ −オキシインドール（０．９ｇ）および０．４ｇの水酸化ナトリウムを３時間還 流した。混合液を濃縮し、水を添加し、６Ｎ塩酸で酸性化した。吸引濾過で沈殿 を回収し、０．７５ｇ（８７％）の標記化合物の白色固体を得た。５−メトキシ−２−オキシインドール 抱水クロラール（９．６ｇ）を、８３ｇの硫酸ナトリウムを含有する２００ｍ Ｌの水に溶解した。溶液を６０℃に加温し、５０ｍＬの水中の１１．４ｇの塩酸 ヒドロキシルアミンの溶液を添加し、混合液を６０℃に保持した。別のフラスコ で、８０ｍＬの水中の６．４ｇの４−アニシジンおよび４．３ｍＬの濃塩酸を８ ０℃に加温した。第一の溶液を第二の溶液に添加し、混合液を２分間還流した後 、室温まで徐々に冷却し、その後、氷浴中で冷却した。吸引濾過で黄褐色の沈殿 を回収し、水で洗浄して真空下で乾燥し、８．６ｇ（収率８５％）のＮ−（２− ヒドロキシイミノアセチル）アニシジンを得た。 ５ｍＬの水を含有する濃硫酸（４５ｍＬ）を６０℃に加温し、８．６ｇのＮ− （２−ヒドロキシイミノアセチル）アニシジンを一度に添加した。撹拌した混合 液を９３℃まで１０分間加熱し、その後室温まで冷却させた。混合液を５００ｇ の氷に注入し、酢酸エチルで３回抽出した。合一した抽出液を無水硫酸ナトリウ ムで乾燥し、濃縮して５．１ｇ（収率６５％）の５−メトキシイサチンの暗赤色 固体を得た。５−メトキシイサチン（５．０ｇ）および３０ｍＬのヒドラジン一 水和物を加熱して１５分間還流した。反応混液を室温まで冷却し、５０ｍＬの水 を添加した。混合液を、毎回２５ｍＬの酢酸エチルで３回抽出し、有機相を合一 し、無水硫酸ナトリウムで乾燥して濃縮し、黄色固体を得た。固体を酢酸エチル 中で撹拌し、吸引濾過で１．１ｇの不溶性物質を除去して保存した。この物質は ２−ヒドラジノカルボニルメチル−４−アニシジンであることが判明した。濾液 を濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーに適用して酢酸エチル:へキサン(１： １)で溶出し、０．７ｇの５−メトキシ−２−オキシインドールの黄色固体を得 た。１．１ｇの２−ヒドラジノカルボニルメチル−４−アニシジンを２０ｍＬの １Ｎ水酸化ナトリウム中で１時間還流した。混合液を冷却し、濃塩酸でｐＨ２ま で酸性化し、毎回２５ｍＬの酢酸エチルで３回抽出した。有機抽出液を合一し、 食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥して濃縮し、０．８ｇの５−メトキ シ−２−オキシインドールの黄色固体を得た。総収量は１．５ｇまたは３３％で あった。７−アザオキシインドール ３，３−ジブロモ−７−アザオキシインドール（２．９ｇ）を２０ｍＬの酢酸 および３０ｍＬのアセトニトリルの混合液に溶解した。溶液に６．５ｇの亜鉛末 を添加した。混合液を室温で２時間撹拌した。混合液から固体を濾過し、溶媒を エバポレートした。残渣を酢酸エチルに懸濁した。不溶性の固体を含有する酢酸 エチル溶液をシリカゲルのショートカラムに通した。回収した酢酸エチル溶液を エバポレートし、残渣を真空下で乾燥して１．８ｇ（収率９１％）の７−アザオ キシインドール酢酸塩を得た。５−ジメチルアミノスルホニル−２−オキシインドール １０ｍＬの２Ｍジメチルアミン／メタノール中の２．３ｇの５−クロロスルホ ニル−２−オキシインドールの懸濁液を室温で４時間撹拌したが、その際、白色 固体が生成した。吸引濾過で沈殿を回収し、５ｍＬの１Ｎ水酸化ナトリウムおよ び５ｍＬの１Ｎ塩酸で洗浄し、真空下、４０℃で一晩乾燥し、１．９ｇ（収率７ ９％）の５−ジメチルアミノスルホニル−２−オキシインドールを得た。６−フェニル−２−オキシインドール ２５ｍＬのジメチルスルホキシド中のマロン酸ジメチル（１０ｍＬ）を、２５ ｍＬのジメチルスルホキシドに懸濁した３．５ｇの水素化ナトリウムに滴加し、 混合液を１００℃で１０分間加熱した。混合液を室温まで冷却し、２５ｍＬのジ メチルスルホキシド中の４．７ｇの４−フルオロ−３−ニトロビフェニルを添加 した。混合液を１００℃で２時間加熱し、冷却して３００ｍＬの飽和塩化アンモ ニウム溶液でクエンチングした。混合液を酢酸エチルで３回抽出し、合一した有 機相を水および食塩水で洗浄し、エバポレートして粗製のジメチル−３−ニトロ ビフェニル−４−マロン酸の黄色の油を得た。 粗製のジメチル−３−ニトロビフェニル−４−マロン酸を３０ｍＬの６Ｎ塩酸 中で２４時間還流した。沈殿を濾過して回収し、水で洗浄して乾燥し、４．５ｇ の３−ニトロビフェニル−４−酢酸のクリーム色の固体を得た。 鉄粉（２．６ｇ）を４０ｍＬの酢酸中の４．５ｇの３−ニトロビフェニル−４ −酢酸に一度に添加した。混合液を２時間還流し、濃縮乾固し、酢酸エチルに溶 解した。固体を濾過して除去し、濾液を１Ｎ塩酸および食塩水で２回洗浄し、無 水硫酸ナトリウムで乾燥した。濾液を濃縮して３．４ｇ（収率９３％）の６−フ ェニル−２−オキシインドールの淡褐色固体を得た。６−（２−メトキシフェニル）−２−オキシインドール テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（１ｇ）を、５０ｍＬのト ルエンおよび５０ｍＬのエタノール中の５ｇの２−メトキシフェニルボロン酸、 ６．６ｇの５−ブロモ−２−フルオロニトロベンゼンおよび３０ｍＬの２Ｍ炭酸 ナトリウム溶液の混合液に添加した。混合液を２時間還流して濃縮し、残渣を酢 酸エチルで２回抽出した。酢酸エチル相を水および食塩水で洗浄し、次いで乾燥 し、濃縮して暗緑色の油を得たが、これは静置すると凝固して粗製の４−フルオ ロ−２’−メトキシ−３−ニトロビフェニルとなった。 マロン酸ジメチル（１４ｍＬ）を５０ｍＬのジメチルスルホキシドに懸濁した ２．９ｇの水素化ナトリウムに滴加した。混合液を１００℃で１５分間加熱し、 室温まで冷却した。６０ｍＬのジメチルスルホキシド中の粗製の４−フルオロ− ２’−メトキシ−３−ニトロビフェニルを添加し、混合液を１００℃で２時間加 熱した。反応混液を冷却し、３００ｍＬの飽和塩化ナトリウム溶液でクエンチン グし、酢酸エチルで２回抽出した。抽出液を合一し、飽和塩化アンモニウム、水 、および食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥して濃縮し、粗製の２’− メトキシ−３−ニトロビフェニル−４−マロン酸ジメチルの黄色の油を得た。 粗製の２’−メトキシ−３−ニトロビフェニル−４−マロン酸ジメチルを５０ ｍＬの６Ｎ塩酸中で１００℃で２４時間加熱し、冷却した。濾過して沈殿を回収 し、水およびヘキサンで洗浄し、乾燥して９．８の２’−メトキシ−２−ニトロ ビフェニル−４−酢酸の淡黄褐色の固体を得た。 鉄粉（５ｇ）を５０ｍＬの氷酢酸中の９．８ｇの２’−メトキシ−３−ニトロ ビフェニル−４−酢酸に一度に添加し、１００℃で３時間加熱した。反応混液を 濃縮乾固し、酢酸エチル中で音波処理し、濾過して不溶性物質を除去した。濾液 を１Ｎ塩酸、水、および食塩水で２回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥して濃 縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィーに適用して酢酸エチル：ヘキサン （１：２）で溶出し、５．４ｇの６−（２−メトキシフェニル）−２−オキシイ ンドールのバラ色の固体を得た。６−（３−メトキシフェニル）−２−オキシインドール テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０．８ｇ）を１００ｍＬ のトルエン中の５ｇの３−メトキシフェニルボロン酸、５ｇの５−ブロモ−２− フルオロニトロベンゼン、および１１ｍＬの２Ｍ炭酸ナトリウム溶液の混合液に 添加した。混合液を２時間還流して水で希釈し、酢酸エチルで抽出した。酢酸エ チルを飽和重炭酸ナトリウムおよび食塩水で洗浄し、次いで乾燥して濃縮し、油 性の固体を得た。固体をシリカゲルクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン （１：６））に適用し、４．３ｇ（収率７７％）の４−フルオロ−３’−メトキ シ−３−ニトロビフェニルを得た。 マロン酸ジメチル（９．７ｍＬ）を５０ｍＬのジメチルスルホキシドに懸濁し た２．０ｇの水素化ナトリウムに滴加した。混合液を１００℃で３５分間加熱し 、 室温まで冷却した。５０ｍＬのジメチルスルホキシド中の４−フルオロ−２’− メトキシ−３−ニトロビフェニル（４．２ｇ）を添加し、混合液を１００℃で１ 時間加熱した。反応混液を冷却し、３００ｍＬの飽和塩化アンモニウム溶液でク エンチングし、酢酸エチルで２回抽出した。抽出液を合一し、食塩水で洗浄し、 無水硫酸ナトリウムで乾燥して濃縮し、粗製の３’−メトキシ−３−ニトロビフ ェニル−４−マロン酸ジメチルの薄黄色の固体を得た。 粗製の３’−メトキシ−３−ニトロビフェニル−４−マロン酸ジメチルを４５ ｍＬの６Ｎ塩酸中で１１０℃で４日間加熱した後、冷却した。濾過して沈殿を回 収し、水およびヘキサンで洗浄し、乾燥して５．３ｇの３’−メトキシ−２−ニ トロビフェニル−４−酢酸の淡黄褐色固体を得た。 ３’−メトキシ−３−ニトロビフェニル−４−酢酸（５．２ｇ）をメタノール に溶解し、０．８ｇの１０％パラジウム／炭素で、室温で３時間水素添加した。 濾過して触媒を除去し、メタノールで洗浄し、濾液を合一して濃縮し、茶色の固 体を得た。固体をシリカゲルクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン：酢酸 （３３：６６：１））に適用して３．０ｇの６−（３−メトキシフェニル）−２ −オキシインドールのピンク色の固体を得た。６−（４−メトキシフェニル）−２−オキシインドール テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（１ｇ）を、５０ｍＬのト ルエンおよび５０ｍＬのエタノール中の５ｇの４−メトキシフェニルボロン酸、 ６．６ｇの５−ブロモ−２−フルオロニトロベンゼン、および３０ｍＬの２Ｍ炭 酸ナトリウム溶液の混合液に添加した。混合液を２時間還流して濃縮し、残渣を 酢酸エチルで２回抽出した。酢酸エチル相を水および食塩水で洗浄し、乾燥し、 濃縮して褐色の油性の固体を得た。固体をシリカゲルクロマトグラフィー（５％ 酢酸エチル／ヘキサン）に適用し、粗製の４−フルオロ−４’−メトキシ−３− ニトロビフェニルの薄黄色の固体を得た。 マロン酸ジメチル（１０ｍＬ）を６０ｍＬのジメチルスルホキシドに懸濁した ２．０ｇの水素化ナトリウムに滴加した。混合液を１００℃で１０分間加熱し、 室温まで冷却した。５０ｍＬのジメチルスルホキシド中の粗製の４−フルオロ− ２’−メトキシ−３−ニトロビフェニル（５．２ｇ）を添加し、混合液を１００ ℃で２時間加熱した。反応混液を冷却し、３００ｍＬの飽和塩化ナトリウム溶液 でクエンチングし、酢酸エチルで３回抽出した。抽出液を合一し、飽和塩化アン モニウム、水、および食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥して濃縮し、 粗製の４’−メトキシ−３−ニトロビフェニル−４−マロン酸ジメチルの黄色の 油を得た。 粗製の４’−メトキシ−３−ニトロビフェニル−４−マロン酸ジメチルを６０ ｍＬの６Ｎ塩酸中で１００℃で１５時間加熱し、冷却した。濾過して沈殿を回収 し、水およびヘキサンで洗浄し、乾燥して７．２ｇの粗製の４’−メトキシ−３ −ニトロビフェニル−４−酢酸の淡黄褐色の固体を得た。 鉄粉（３．６ｇ）を５０ｍＬの氷酢酸中の７．２ｇの４’−メトキシ−３−ニ トロビフェニル−４−酢酸に一度に添加し、１００℃で一晩加熱した。反応混液 を濃縮乾固し、酢酸エチル中で音波処理し、濾過して不溶性物質を除去した。濾 液を１Ｎ塩酸および食塩水で２回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥して濃縮し 、２．７ｇの６−（４−メトキシフェニル）−２−オキシインドールのバラ色の 固体を得た。６−（３−エトキシフェニル）−２−オキシインドール テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０．８ｇ）を、５０ｍＬ のトルエンおよび５０ｍＬのエタノール中の４．２ｇの３−エトキシフェニルボ ロン酸、５．０ｇの５−ブロモ−２−フルオロニトロベンゼン、および２２ｍＬ の２Ｍ炭酸ナトリウム溶液の混合液に添加した。混合液を２時間還流し、濃縮し 、水を添加し、混合液を酢酸エチルで２回抽出した。酢酸エチル相を水および食 塩水で洗浄した後、乾燥して濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ ５％酢酸／ヘキサン）に適用し、５．３ｇ（収率９０％）の粗製の４−フルオロ −３’−エトキシ−３−ニトロビフェニルの黄色油を得た。 マロン酸ジメチル（１１．４ｍＬ）を２０ｍＬのジメチルスルホキシドに懸濁 した４．０ｇの水素化ナトリウムに滴加した。混合液を１００℃で１０分間加熱 した後、室温まで冷却した。２５ｍＬのジメチルスルホキシド中の粗製の４−フ ルオロ−３’−エトキシ−３−ニトロビフェニル（５．３ｇ）を添加し、混合液 を１００℃で２時間加熱した。反応混液を冷却し、３００ｍＬの飽和塩化アンモ ニウム溶液でクエンチングし、酢酸エチルで３回抽出した。抽出液を合一し、水 および食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥して濃縮し、粗製の３’ −エトキシ−３−ニトロビフェニル−４−マロン酸ジメチルの黄色油を得た。 粗製の３’−エトキシ−３−ニトロビフェニル−４−マロン酸ジメチルを６０ ｍＬの６Ｎ塩酸中で１００℃で４日間加熱した後、冷却した。沈殿を濾過して回 収し、水およびヘキサンで洗浄し、乾燥して４．７ｇの粗製の３’−エトキシ− ３−ニトロビフェニル−４−酢酸の淡黄褐色固体を得た。 鉄粉（２．４ｇ）を４０ｍＬの氷酢酸中の４．６ｇの３’−エトキシ−３−ニ トロビフェニル−４−酢酸に一度に添加し２時間還流した。反応混液を濃縮乾固 し、酢酸エチルで繰り返し処理し、濾過して不溶性物質を除去した。濾液を１Ｎ 塩酸および食塩水で２回洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥して濃縮し、３ ．５ｇ（収率９１％）の６−（３−エトキシフェニル）−２−オキシインドール の淡褐色固体を得た。６−ブロモ−２−オキシインドール マロン酸ジメチル（１３ｍＬ）を２０ｍＬのジメチルスルホキシドに懸濁した ２．７ｇの水素化ナトリウムに滴加した。混合液を１００℃で１０分間加熱し、 室温まで冷却した。２５ｍＬのジメチルスルホキシド中の５−ブロモ−２−フル オロニトロベンセン（５．０ｇ）を添加し、混合液を１００℃で２時間加熱した 。反応混液を冷却し、３００ｍＬの飽和塩化アンモニウム溶液でクエンチングし 、酢酸エチルで３回抽出した。抽出液を合一し、飽和塩化アンモニウム、水、お よび食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮して粗製の４−ブロモ −２−ニトロフェニルマロン酸ジメチルの薄黄色油を得た。 粗製の４−ブロモ−２−ニトロフェニルマロン酸ジメチルを４０ｍＬの６Ｎ塩 酸中で１１０℃で２４時間加熱した後、冷却した。沈殿を濾過して回収し、水で 洗浄し、乾燥して５．３ｇ（収率８９％）の４−ブロモ−２−ニトロフェニル酢 酸のオフホワイト色の固体を得た。 ５ｍＬのエタノール中の４−ブロモ−２−ニトロフェニル酢酸（０．２６ｇ） 、０．２６ｇの亜鉛末、および３ｍＬの５０％硫酸を１００℃で一晩加熱した。 反応混液を濾過し、少量の酢酸で希釈し、濃縮してエタノールを除去し、水で希 釈し、酢酸エチルで２回抽出した。合一した抽出液を食塩水で洗浄し、無水硫酸 ナトリウムで乾燥し、濃縮して０．１９ｇ（収率９０％）の６−ブロモ−２−オ キシインドールの黄色固体を得た。５−アセチル−２−オキシインドール ２−オキシインドール（３ｇ）を１，２−ジクロロエタンに懸濁し、３．２ｍ Ｌの塩化アセチルを徐々に添加した。得られた懸濁液を５０℃で５時間加熱し、 冷却し、水に注入した。生成した沈殿を吸引濾過で回収し、水で十分洗浄し、真 空下で乾燥して２．９ｇ（収率７３％）の標記化合物の褐色固体を得た。５−ブタノイル−２−オキシインドール 氷浴に入れた３０ｍＬの１，２−ジクロロエタンに懸濁した１５ｇの塩化アル ミニウムに７．５ｇの２−オキシインドール、次いで１２ｇの塩化ブタノイルを 添加した。得られた懸濁液を５０℃で一晩加熱した。混合液を氷水に注入し、酢 酸エチルで３回抽出した。合一した酢酸エチル相を食塩水で洗浄し、硫酸ナトリ ウムで乾燥し、濃縮乾固して褐色固体を得た。固体をシリカゲルクロマトグラフ ィー（５０％酢酸エチル／ヘキサン）に適用し、３ｇ（２５％）の標記化合物の 黄色固体を得た。５−シアノエチル−２−オキシインドール シアン化カリウム（２．０ｇ）を１５ｍＬのジメチルスルホキシドに添加して ９０℃まで加熱した。５ｍＬのジメチルスルホキシドに溶解した５−クロロエチ ル−２−オキシインドール（３．０ｇ）を撹拌しながら徐々に添加し、反応液を １５０℃まで２時間加熱した。混合液を冷却し、氷水に注入し、吸引濾過で沈殿 を回収し、水で洗浄し、乾燥した後シリカゲルクロマトグラフィー（５％メタノ ール／クロロホルム）に適用し、１．２ｇ（収率４２％）の標記化合物を得た。６−（モルホリン−４−イル）−２−オキシインドール ６−アミノ−２−オキシインドール（２．２ｇ）、４．０ｇの２，２’−ジブ ロモエチルエーテル、および７．９ｇの炭酸ナトリウムを２０ｍｌのエタノール 中で一晩還流し、濃縮して５０ｍｌの水で希釈した。混合液を５０ｍｌの酢酸エ チルで３回抽出し、有機相を合一し、２０ｍｌの食塩水で洗浄し、無水硫酸ナト リウムで乾燥して濃縮乾固した。固体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー( 酢酸エチル：ヘキサン（１：１）、０．７％酢酸を含有)に適用し、１．２ｇ（ 収率３７％）の標記化合物のベージュ色固体を得た。６−（３−トリフルオロアセチルフェニル）−２−オキシインドール ５０ｍＬのトルエン中の３−アミノフェニルボロン酸（３．９ｇ）、５ｇの５ −ブロモ−２−フルオロニトロベンセン、０．８ｇのテトラキス（トリフェニル ホスフィン）パラジウム、および２３ｍＬの２Ｍ 重炭酸ナトリウム溶液を窒素 下で２．５時間還流した。反応混液を２００ｍＬの氷水に注入し、混合液を５０ ｍＬの酢酸エチルで３回抽出した。合一した有機相を５０ｍＬの水および２０ｍ Ｌの食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮して９．７ｇ（収率９ ２％）の２−フルオロ−５−（３−アミノフェニル）ニトロベンゼンの暗褐色油 を得た。 トリフルオロ酢酸無水物（５．４ｍＬ）を、５０ｍＬのジクロロメタン中の９ ．７ｇの２−フルオロ−５−（３−アミノフェニル）ニトロベンゼンおよび５． ３ｍＬのトリエチルアミンの撹拌溶液に０℃で徐々に添加し、混合液を更に２０ 分間撹拌した。混合液を濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ １０％酢酸エチル／ヘキサン）に適用して８．６ｇ（収率６５％）の２−フルオ ロ−５−（３−トリフルオロアセトアミドフェニル）ニトロベンゼンの薄橙色油 を得、静置して凝固させた。 マロン酸ジメチル（９．６ｍＬ）を４０ｍＬの無水ジメチルスルホキシド中の ３．２ｇの６０％水素化ナトリウム／鉱油の撹拌懸濁液に窒素下で滴加した。混 合液を１０分間撹拌し、２０ｍＬのジメチルスルホキシド中の２−フルオロ−５ −（３−トリフルオロアセトアミドフェニル）ニトロベンゼンを添加した。得ら れた暗赤色の混合液を１００℃で２時間加熱した。反応液をクエンチングするた めに１００ｍＬの飽和塩化アンモニウム溶液に注入し、５０ｍＬの酢酸エチルで ２回抽出した。有機相を５０ｍＬずつの飽和塩化アンモニウム溶液、水、および 食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮して黄色油を得た。油をシ リカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン（１：４））に適用 し、４．４ｇ（収率５０％）の２−［２−ニトロ−４−（３−トリフルオロアセ トアミドフェニル）フェニル］−マロン酸ジメチルの薄黄色固体を得た。 ２−［２−ニトロ−４−（３−トリフルオロアセトアミドフェニル）フェニル ］−マロン酸ジメチル（４．４ｇ）を５０ｍｌの６Ｎ塩酸中で一晩還流した。反 応混液を室温まで冷却し、吸引濾過で固体を回収し、水で洗浄し、真空下で乾燥 して２．７ｇ（収率７３％）の２−［２−ニトロ−４−（３−トリフルオロアセ トアミドフェニル）フェニル］−酢酸を得た。 ３ｍＬの酢酸中の２−［２−ニトロ−４−（３−トリフルオロアセトアミドフ ェニル）フェニル］一酢酸（１００ｍｇ）および５０ｍｇの鉄粉を１００℃で２ 時間加熱した。反応混液を濃縮し、残渣を５ｍＬの酢酸エチル中で音波処理した 。不溶性の固体を吸引濾過で除去し、濾液を１Ｎ塩酸、水、および食塩水で洗浄 し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮して１０ｍｇ（収率１４％）の標記化合 物のバラ色の固体を得た。 上記の方法、並びに化学分野で知られる他の方法によって調製でき、本発明の 化合物を調製するのに有用なオキシインドールの一覧を表−５に示す。表−５の オキシインドールは単に例として示すものであり、本発明の範囲をいかなる点で も制限するものと解釈されるべきではない。Ｃ．アルデヒド 本発明の化合物の合成に有用なアルデヒドは、当業者に周知の多くの合成法に よって調製できる。例えば（非限定的に）、以下の出版物（その全体を本明細書 の一部としてここに引用する）に記載される方法を使用して本発明のアルデヒド を得ることができる： J.Med.Chem.,1993,36(23),3674-3685； Chem.Commun.,1966,393； Chem.Heterocyl.Compd.(EN),1974,10,50-52；および J.Chem.Soc.Perkin Trans.,1:EN,1974,1237-1243 表−６は本発明の化合物を合成するのに使用できる更なるアルデヒドの一覧で ある。表−６中のオキシインドールは単に例として示すものであり、本発明の範 囲をいかなる点でも制限するものと解釈されるべきではない。５．生物学的評価 所定の一連の化合物において、ある範囲の生物学的活性が得られるのが好まし い。好ましい態様では、本発明はＲＴＫ、ＣＴＫ、およびＳＴＫ活性の調節能を 示す新規の２−インドリノンに関する。以下のアッセイを使用して、最適な程度 の所望の活性を示す化合物を選択する。Ａ．表の説明 表−１は、本発明の化合物のいくつかの一覧である。一覧中の化合物は単に例 として示すものであり、決して本発明の範囲を制限するものとみなされるべきで はない。 表−２は、本発明の化合物のいくつかの一覧である。一覧中の化合物は単に例 として示すものであり、決して本発明の範囲を制限するものとみなされるべきで はない。 表−３は、本発明の化合物のいくつかの一覧である。一覧中の化合物は単に例 として示すものであり、決して本発明の範囲を制限するものとみなされるべきで はない。 表−４は、本発明の化合物のいくつかの一覧である。一覧中の化合物は単に例 として示すものであり、決して本発明の範囲を制限するものとみなされるべきで はない。 表−５は、本発明の化合物を調製するのに使用してもよいオキシインドールの 一覧である。一覧中のオキシインドールは単に例として示すものであり、決して 本発明の範囲を制限するものとみなされるべきではない。 表−６は、本発明の化合物を調製するのに使用してもよいアルデヒドの一覧で ある。一覧中のオキシインドールは単に例として示すものであり、決して本発明 の範囲を制限するものとみなされるべきではない。 表−７は、代表的な（しかし決して制限的ではない）例の本発明の化合物を使 用した生物学的アッセイの結果を示す。ＩＣ₅₀とは、本発明の化合物が存在しな いコントロールについて示される試験においてＰＴＫの活性に５０％の変化を与 えるのに必要な試験化合物の量をいう。表中の試験に関しては、５０％の変化と して評価したのは、コントロールに対するＰＴＫ活性の５０％の阻害である。使 用したアッセイ法については以下に詳細を記載する。 表−８は、代表的な（しかし決して制限的ではない）例の本発明の化合物を使 用した更なる生物学的アッセイの結果を示す。この場合も、 ＩＣ₅₀とは、本発 明の化合物が存在しないコントロールについて示される試験においてＰＴＫの活 性に５０％の変化を与えるのに必要な試験化合物の量をいう。表中の試験に関し ては、５０％の変化として評価したのは、コントロールに対するＰＴＫ活性の５ ０％の阻害である。上記のように、使用したアッセイ法については以下に詳細を 記載する。 表−９も同様に、代表的な（しかし決して制限的ではない）例の本発明の化合 物を使用した更なる生物学的アッセイの結果を示す。この場合も、ＩＣ₅₀とは、 本発明の化合物が存在しないコントロールについて示される試験においてＰＴＫ の活性に５０％の変化を与えるのに必要な試験化合物の量をいう。表中の試験に 関しては、５０％の変化として評価したのは、コントロールに対するＰＴＫ活性 の５０％の阻害である。上記のように、使用したアッセイ法については以下に詳 細を記載する。 表−１０もまた、代表的な（しかし決して制限的ではない）例の本発明の化合 物を使用した更なる生物学的アッセイの結果を示す。この場合、試験した化合物 は表−３に示すものである。この試験では、未処理のスタンダードに比較したＰ Ｋの阻害のパーセントを示す。前記のように、使用したアッセイ法については以 下に詳細を記載する。 Ｃ．アッセイ法 以下のインビトロアッセイは一つまたはそれ以上のＰＫに対する本発明の異な った化合物の活性および効果のレベルを決定するために使用される。同様なアッ セイが本分野で既知の技術を用いてＰＫのために同じ手法で設計できる。 本明細書に記載されている細胞／触媒的アッセイはＥＬＩＳＡ様式で実施され る。その一般的方法は以下のようである：試験キナーゼ（天然または組換え）を 発現している細胞へ化合物が導入され、いくらかの時間の後に、もし試験キナー ゼがレセプターであるならば、レセプターを活性化することが知られているリガ ンドが添加される。細胞を溶解し、溶解物は酵素的リン酸化反応の基質を認識す る特異的抗体で前もって被覆したＥＬＩＳＡプレートのウェルへ移す。細胞溶解 物の非基質成分は洗い流し、基質に対するリン酸化の量をホスホチロシンを特異 的に認識する抗体を検出し、試験化合物と接触させなかった対照細胞と比較する 。 本明細書に記載した細胞／生物学的アッセイは、増殖性応答の一般的尺度であ る、試験キナーゼの活性化に応答して作られたＤＮＡ量を測定している。このア ッセイの一般的方法は以下のようである：天然または組換えによる試験キナーゼ を発現している細胞へ化合物が導入され、いくらかの時間が経過した後、もし試 験キナーゼがレセプターであるならば、レセプターを活性化することが知られて いるリガンドが加えられる。少なくとも一夜インキュベーションした後、ブロモ デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）または³Ｈ−チミジンのようなＤＮＡ標識試薬を 加える。標識されたＤＮＡ量は抗ＢｒｄＵ抗体または放射活性を測定することに より検出され、試験化合物と接触していない対照細胞と比較される。１．細胞／触媒的アッセイ 酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）がＰＫ活性の存在を検出および測定 するために使用される。ＥＬＩＳＡは例えば、Ｖｏｌｌｅｒら，１９８０，”酵 素結合免疫吸着アッセイ”，Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕ ｎｏｌｏｇｙ ，第２版，ＲｏｓｅおよびＦｒｉｅｄｍａｎ編，ｐｐ３５９−３７ １，Ａｍ．Ｓｏｃ．ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ．に記載されている既知のプロトコールに従って実施される。 記載されているプロトコールは特定のＰＫに関する活性を決定するために適用 できる。例えば、特定のＰＫに対してＥＬＩＳＡ実験を実施するための好適なプ ロトコールは以下に提供されている。ＰＴＫファミリーの他の仲間、ならびにＣ ＴＫおよびＳＴＫに対する化合物の活性を決定するためのこれらのプロトコール の適用は当業者の知識を持ってすれば容易である。ａ．ＦＬＫ−１ ＥＬＩＳＡアッセイは、ＦＬＫ−１レセプターのキナーゼ活性、特にＦＬＫ− １レセプターに対するプロテインチロシンキナーゼの阻害または活性化を測定す るために実施された。特に、ＦＬＫ−１／ＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるＦＬＫ−１ レセプターのキナーゼ活性を測定するために以下のアッセイが実施された。材料および方法 材料 以下の試薬および器具が使用された： ａ． Ｃｏｒｎｉｎｇ ９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇカタ ログ番号２５８０５−９６）； ｂ． Ｃａｐｐｅｌヤギ抗ウサギＩｇＧ（カタログ番号５５６４１）； ｃ． ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏカタログ番号４５０−１３００ＥＢ）； ｄ． ＴＢＳＷ緩衝液（５０ｍＭトリス（ｐＨ７．２）、１５０ｍＭ ＮａＣ ｌおよび０．１％トウィーン−２０）； ｅ． エタノールアミン保存液（１０％エタノールアミン(ｐＨ７．０)、４℃ で保存）； ｆ． ＨＮＴＧ緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）、１５０ ｍＭ ＮａＣｌ、０．２％トリトンＸ−１００および１０％グリセロール）； ｇ． ＥＤＴＡ（１００Ｘ保存液として０．５Ｍ（ｐＨ７．０））； ｈ． オルトバナジン酸ナトリウム（１００Ｘ保存液として０．５Ｍ）； ｉ． ピロリン酸ナトリウム（１００Ｘ保存液として０．２Ｍ）； ｊ． ＮＵＮＣ ９６ウェルＶ底ポリプロピレンプレート（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号ＡＳ−７２０９２）； ｋ． ＮＩＨ３Ｔ３ Ｃ７＃３細胞（ＦＬＫ−１発現細胞）； ｌ． １Ｘ高グルコースＬ−グルタミンを含むＤＭＥＭ（カタログ番号１１９ ６５−０５０）； ｍ． ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ（カタログ番号１６０００−０２８）； ｎ． Ｌ−グルタミン、Ｇｉｂｃｏ（カタログ番号２５０３０−０１６）； ｏ． ＶＥＧＦ、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，Ｉｎｃ．(カタログ番号１００−２０) （Ｍｉｌｌｉ−Ｑ ｄＨ₂Ｏ中１μｇ／１００μｌ保存液として保ち、−２０℃ で保存）； ｐ． アフィニティー精製抗ＦＬＫ−１抗血清： ｑ． ホスホチロシンに特異的なＵＢ４０モノクローナル抗体（Ｆｅｎｄｌｙ ｅｔ．ａｌ．，１９９０，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５０：１５５０ −１５５８を参照されたい）； ｒ． ＥＩＡ用ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＰＯＤ（ＢｉｏＲａｄカタログ番号１７ ２−１０１１）； ｓ． ２，２−アジノ−ビス（３−エチルベンズ−チアゾリン−６−スルホン 酸（ＡＢＴＳ）溶液（１００ｍＭクエン酸（無水）、２５０ｍＭ Ｎａ₂ＨＰＯ₄ （ｐＨ４．０）、０．５ｍｇ／ｍｌ ＡＢＴＳ（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ａ−１ ８８８））、溶液は使用するまで４℃、暗所で保存しなければならない； ｔ． Ｈ₂Ｏ₂（３０％溶液）（Ｆｉｓｈｅｒカタログ番号Ｈ３２５）； ｕ． ＡＢＴＳ／Ｈ₂Ｏ₂（１５ｍｌ ＡＢＴＳ溶液、２μｌ Ｈ₂Ｏ₂）、使用 ５分前に調製して室温で放置； ｖ． ０．２Ｍ ＨＣｌ Ｈ₂Ｏ保存液 ｗ． ジメチルスルホキシド（１００％）（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｄ−８４ １８）；および ｘ． トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬカタログ番号２５２００− ０４９）。 プロトコール アッセイを実施するために以下のプロトコールが使用された： １． ウェル当たり１．０μｇの０．１Ｍ Ｎａ₂ＣＯ₃ ｐＨ９．６に溶解し たＣａｐｐｅｌヤギ抗ウサギＩｇＧでＣｏｒｎｉｎｇ ９６ウェルＥＬＩＳＡ プレートを被覆する。ウェル当たり１５０μｌの最終容量とする。プレートは４ ℃で一夜被覆する。４℃で保存した場合、プレートは２週間までは使用できる。 ２． 適した培養皿を用い、増殖培地（２．０ｍＭ Ｌ−グルタミンを補給し たＤＭＥＭ）中でコンフルエントになるまで３７℃、５％ＣＯ₂で細胞を増殖さ せる。 ３． トリプシン処理により細胞を採取し、Ｃｏｒｎｉｎｇ２５８５０ポリス チレン９６ウェル丸底細胞プレートに、２００μｌの増殖培地を含むウェル当た り２５，０００の細胞で播種する。 ４． ３７℃、５％ＣＯ₂で少なくとも１日、細胞を増殖させる。 ５． 細胞をＤ−ＰＢＳ ＩＸで洗浄する。 ６． ２００μｌ／ウェルの飢餓培地（ＤＭＥＭ、２．０ｍＭ Ｌ−グルタミ ン、０．１％ＦＢＳ）を加える。３７℃、５％ＣＯ₂で一夜インキュベートする 。 ７． ポリプロピレン９６ウェルプレート中、飢餓培地を用いて化合物を１： ２０に希釈する。対照ウェルで使用するためジメチルスルホキシドを１：２０に 希釈する。 ８． ９６ウェル細胞培養プレートから飢餓培地を除去し、各々のウェルに１ ６２μｌの新鮮な飢餓培地を加える。 ９． 細胞刺激後の最終希釈が１：２００になるように、各々のウェルに１８ μｌの１：２０に希釈した化合物希釈液（工程７から）および対照ウェル（＋／ −ＶＥＧＦ）に１：２０ジメチルスルホキシド希釈液を加える。最終ジメチルス ルホキシドは０．５％である。３７℃、５％ＣＯ₂で２時間プレートをインキュ ベートする。 １０．液体を除去するためにプレートを逆さにし、ＥＬＩＳＡプレートから非 結合抗体を除去する。ＴＢＳＷ＋０．５％エタノールアミン（ｐＨ７．０）で３ 回洗浄する。紙タオル上でプレートを軽くたたいて余分な液体および泡を除去す る。 １１．ウェル当たり１５０μｌのＴＢＳＷ＋０．５％エタノールアミン（ｐＨ ７．０）でプレートを遮断する。マイクロタイタープレート振盪機上で振盪しな がらプレートを３０分間インキュベートする。 １２．工程１０で説明したようにプレートを３回洗浄する。 １３．０．５μｇ／ウェルのアフィニティー精製抗ＦＬＫ−１ポリクローナル ウサギ抗血清を加える。ＴＢＳＷ＋０．５％エタノールアミン（ｐＨ７．０）で １５０μｌ／ウェルの最終容量とする。振盪しながら３０分間プレートをインキ ュベートする。 １４．細胞に１８０μｌの飢餓培地を加え、２０μｌ／ウェルの１０．０ｍＭ オルトバナジン酸ナトリウムおよび５００ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ（各々の最終濃 度はウェル当たり１．０ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウムおよび５０ｎｇ／ｍ ｌのＶＥＧＦとなる）、３７℃、５％ＣＯ₂で８分間細胞を刺激する。陰性対照 ウェルには飢餓培地のみを加える。 １５．８分後に培地を細胞から除去すべきであり、２００μｌ／ウェルのＰＢ Ｓで１度洗浄する。 １６．室温で振盪しながら５分間、１５０μｌ／ウェルのＨＮＴＧ中で細胞を 溶解する。ＨＮＴＧ処方には、オルトバナジン酸ナトリウム、ピロリン酸ナトリ ウムおよびＥＤＴＡが含まれている。 １７．工程１０で説明したようにＥＬＩＳＡプレートを３回洗浄する。 １８．細胞プレートからＥＬＩＳＡプレートへ細胞溶解液を移し、振盪しなが ら２時間インキュベートする。細胞溶解液を移すためには、ウェルをこすりなが らピペットの吸引および排出を繰り返す。 １９．工程１０で説明したようにプレートを３回洗浄する。 ２０．０．０２μｇ／ウェルを含むＴＢＳＷ＋０．５％エタノールアミンでＥ ＬＩＳＡプレートをインキュベートする。最終容量を１５０μｌ／ウェルとする 。 振盪しながら３０分間インキュベートする。 ２１．工程１０で説明したようにプレートを３回洗浄する。 ２２．１：１０，０００希釈ＥＩＡ用ヤギ抗マウスＩｇＧ結合西洋ワサビペル オキシダーゼのＴＢＳＷ＋０．５％エタノールアミン（ｐＨ７．０）溶液でＥＬ ＩＳＡプレートをインキュベートする。最終容量を１５０μｌ／ウェルとする。 振盪しながら３０分間インキュベートする。 ２３．工程１０で説明したようにプレートを洗浄する。 ２４．ウェルに１００μｌのＡＢＴＳ／Ｈ₂Ｏ₂溶液を加える。振盪しながら１ ０分間インキュベートする。 ２５．発色反応を停止させるため、０．１Ｍ ＨＣｌとなるように１００μｌ の０．２Ｍ ＨＣｌを加える。室温で１分間振盪する。ゆっくりと通気して泡を 除去し、ＥＬＩＳＡプレートリーダー中、４１０ｎｍでＥＬＩＳＡプレートを読 みとる。ｂ．ＨＥＲ−２ ＥＬＩＳＡ アッセイ１：全細胞でのＥＧＦレセプター−ＨＥＲ２キメラレセプターアッセイ 全ＥＧＦＲ−ＮＩＨ３Ｔ３細胞中のＨＥＲ２キナーゼ活性は以下のように測定 された： 材料および試薬。アッセイを実施するために以下の材料および試薬が使用され た： ａ． ＥＧＦ：保存濃度：１６．５ ＩＬＭ；ＥＧＦ２０１，ＴＯＹＯＢＯ， Ｃｏ．，Ｌｔｄ．Ｊａｐａｎ。 ｂ． ０５−１０１（ＵＢＩ）（ＥＧＦＲ細胞外ドメインを認識するモノクロ ーナル抗体）。 ｃ． 抗ホスホチロシン抗体（抗Ｐｔｙｒ）（ポリクローナル）（Ｆｅｎｄｌ ｅｙ ｅｔ．ａｌ．，上記文献参照）。 ｄ． 検出抗体：ヤギ抗ウサギＩｇＧ西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体、Ｔ ＡＧＯ，Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ。 ｅ． ＴＢＳＴ緩衝液： トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．２ ５０ｍＭ ＮａＣｌ １５０ｍＭ トリトンＸ−１００ ０．１ ｆ． ＨＮＴＧ ５Ｘ保存液 ＨＥＰＥＳ ０．１Ｍ ＮａＣｌ ０．７５Ｍ グリセロール ５０％ トリトンＸ−１００ １．０％ ｇ． ＡＢＴＳ保存液 クエン酸 １００ｍＭ Ｎａ₂ＨＰＯ₄ ２５０ｍＭ 濃ＨＣｌ ０．５ｐＭ ＡＢＴＳ^* ０．５ｍｇ／ｍｌ ^*（２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリンスルホン酸） ）。 溶液は使用するまで暗所で４℃に保つ。 ｈ． 保存試薬： ＥＤＴＡ １００ｍＭ ｐＨ７．０ Ｎａ₃ＶＯ₄ ０．５Ｍ Ｎａ₄（Ｐ₂Ｏ₇） ０．２Ｍ 方法。以下のプロトコールが使用された：Ａ． ＥＬＩＳＡプレートの前被覆 １．ＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、９６ウェル、カタログ番号２５８ ０５−９６）をウェル当たり０．５ｇの０５−１０１抗体ＰＢＳ溶液で被覆し（ １００μｌ最終容量／ウェル）、４℃で一夜保存する。被覆されたプレートは４ ℃で保存された場合、１０日まで使用できる。 ２．使用日に被覆緩衝液を除き、１００μｌの遮断緩衝液（５％Ｃａｒｎａｔ ｉｏｎインスタント脱脂粉乳のＰＢＳ溶液）で置き換える。室温で（約２３℃か ら２５℃）３０分間振盪してプレートをインキュベートする。使用直前に遮断緩 衝液を除き、ＴＢＳＴ緩衝液でプレートを４回洗浄する。Ｂ． 細胞の播種 １． ＥＧＦＲ細胞外ドメインおよび細胞内ＨＥＲ２キナーゼドメインを含ん でいるキメラレセプターを過剰発現しているＮＩＨ３Ｔ３細胞がこのアッセイに 使用できる。 ２． 実験には８０−９０％コンフルエントの皿を選ぶ。細胞をトリプシン処 理し、１０％ウシ胎児血清を加えることにより反応を停止させる。ＤＭＥＭ培地 （１０％ＣＳ ＤＭＥＭ培地）に細胞を懸濁し、室温で５分間、１５００ｒｐｍ で一度遠心分離する。 ３． 播種培地（ＤＭＥＭ、０．５％ウシ血清）に細胞を再懸濁し、トリパン ブルーを使用して細胞を計数する。９０％以上の生存度が受容可能である。９６ ウェルマイクロタイタープレートを用い、ウェル当たり１０，０００細胞の密度 でＤＭＥＭ培地（０．５％ウシ血清）に細胞を播種する。播種した細胞は５％Ｃ Ｏ₂雰囲気下、３７℃で約４０時間インキュベートする。Ｃ． アッセイ法 １． 播種した細胞の汚染を傾立顕微鏡を用いて検査する。薬剤保存液（１０ ｍｇ／ｍｌ ＤＭＳＯ溶液）をＤＭＥＭ培地で１：１０に希釈し、最終薬剤希釈 が１：２００および最終ＤＭＳＯ濃度が１％になるようにＴＢＳＴウェルに５μ ｌを移す。対照ウェルにはＤＭＳＯのみを加える。５％ＣＯ₂雰囲気下、３７℃ で２時間インキュベートする。 ２． ＥＧＦリガンドを調製：１０μｌの希釈ＥＧＦを移すことにより１００ ｎＭの最終濃度が達成されるようにＥＧＦの保存ＤＭＥＭ溶液を希釈する（１： １２希釈）。 ３． ウェル当たり１００μｌの量に十分な新らしいＨＮＴＧ^*を調製し；氷 上に置く。 ＨＮＴＧ^*（１０ｍｌ）： ＨＮＴＧ保存液 ２．０ｍｌ ＭｉｌｌｉＱ Ｈ₂Ｏ ７．３ｍｌ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ、ｐＨ７．０ ０．５ｍｌ Ｎａ₃ＶＯ₄ 、０．５Ｍ ０．１ｍｌ Ｎａ₄（Ｐ₂Ｏ₇）０．２Ｍ ０．１ｍｌ ４． 薬剤と１２０分インキュベーション後、調製したＳＧＦリガンドを１０ ０ｎＭの最終濃度で細胞に加える（ウェル当たり１０μｌ）。対照ウェルはＤＭ ＥＭのみを加える。室温で振盪しながら５分間インキュベートする。 ５． 薬剤、ＥＧＦおよびＤＭＥＭを除去する。細胞を２回ＰＢＳで洗う。Ｈ ＮＴＧ^*を細胞に移す（ウェル当たり１００μｌ）。氷上に５分置く。その間、 他のＥＬＩＳＡプレートから遮断緩衝液を除き、前記のようにＴＢＳＴで洗浄す る。 ６． マイクロピペッターに安全に固定したピペットチップを用い、細胞をプ レートからはがしおよびＨＮＴＧ^*溶解緩衝液の吸引および排出を繰り返すこと により細胞物質を均一化する。被覆し、遮断しおよび洗浄したＥＬＩＳＡプレー トに溶解物を移す。室温で振盪しながら１時間インキュベートする。 ７． 溶解物を除き、ＴＢＳＴで４回洗う。新しく希釈した抗Ｐｔｙｒ抗体を ＥＬＩＳＡプレートへ移す（ウェル当たり１００μｌ）。抗Ｐｔｙｒ抗血清存在 下（ＴＢＳＴで１：３０００に希釈）、室温で振盪しながら３０分間インキュベ ートする。 ８． 抗Ｐｔｙｒ抗体を除去し、ＴＢＳＴで４回洗う。新しく希釈したＴＡＧ Ｏ抗ウサギＩｇＧ抗体をＥＬＩＳＡプレートへ移す（ウェル当たり１００μｌ） 。室温で振盪しながら３０分間インキュベートする（抗ウサギＩｇＧ抗体：ＴＢ ＳＴで１：３０００に希釈）。 ９． ＴＡＧＯ検出抗体を除去し、ＴＢＳＴで４回洗う。新しく調製したＡＢ ＴＳ／Ｈ₂Ｏ₂溶液をＥＬＩＳＡプレートへ移す（ウェル当たり１００μｌ）。室 温で振盪しながら２０分間インキュベートする（ＡＢＴＳ／Ｈ₂Ｏ₂溶液：１μｌ ３０％Ｈ₂Ｏ₂を１０ｍｌのＡＢＴＳ保存液に加える）。 １０． ５０μｌの５Ｎ Ｈ₂ＳＯ₄（随意）を加えることにより反応を停止さ せ、４１０ｎｍでＯ．Ｄ．を決定する。 １１． 最大のホスホチロシン信号は陽性対照から陰性対照の値を引くことに より決定される。抽出物含有ウェルのホスホチロシン含量のパーセント阻害が、 陰性対照を差し引いた後に計算される。ｃ． ＰＤＧＦ−Ｒ ＥＬＩＳＡ すべての細胞培養培地、グルタミンおよびウシ胎児血清は特に指示しない限り Ｇｉｂｃｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ(Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ ， ＮＹ)から購入された。すべての細胞は９０−９５％空気および５−１０％ＣＯ₂ の加湿した雰囲気中、３７℃で増殖させた。すべての細胞は週２回定期的に継代 培養され、Ｍｙｃｏｔｅｃｔ法（Ｇｉｂｃｏ）によりマイコプラズマ陰性である と判定された。 ＥＬＩＳＡアッセイのため、細胞（Ｕ１２１４、Ｊｏｓｅｐｈ Ｓｃｈｌｅｓ ｓｉｎｇｅｒ，ＮＹＵから入手）は増殖培地（１０％ＦＢＳを含むＭＥＭ、Ｎ ＥＡＡ、１ｍＭ ＮａＰｙｒおよび２ｍＭ ＧＬＮ）中で８０−９０％コンフル エントまで増殖させ、９６ウェル組織培養プレートにウェル当たり２５，０００ から３０，０００細胞でまく（０．５％血清）。０．５％血清含有培地中で一夜 インキュベーション後、細胞を無血清培地に変え、試験化合物を加え５％ＣＯ₂ 雰囲気下、３７℃で２時間インキュベーターで処理する。細胞は次に５−１０分 リガンドで刺激し、続いてＨＮＴＧ（２０ｍＭヘペス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、 １０％グリセロール、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ Ｎａ₃ＶＯ₄、０．２％トリト ンＸ−１００および２ｍＭ ＮａＰｙｒ）で溶解させる。細胞溶解液（０．５ｍ ｇ／ウェルＰＢＳ溶液）は、レセプター特異的抗体で前もって被覆されおよび５ ％ミルクを含むＴＢＳＴ溶液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ７．２、１５０ｍ ＭＮａＣｌおよび０．１％トリトンＸ−１００）を用いて室温で３０分遮断され ているＥＬＩＳＡプレートへ移した。溶解物は室温で１時間振盪しながらインキ ュベートした。プレートはＴＢＳＴで４回洗浄した後、ポリクローナル抗ホスホ チロシン抗体と室温で３０分インキュベートした。過剰の抗ホスホチロシン抗体 はプレートをＴＢＳＴで４回すすぐことにより除去された。ＥＬＩＳＡプレート には室温で３０分間ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体を加え、続いてＴＢＳＴでさらに４ 回すすいだ。ＡＢＴＳ（１００ｍＭクエン酸、２５０ｍＭ Ｎａ₂ＨＰＯ₄および ０．５ｍｇ／ｍＬ ２,２'−アジノビス(３−エチルベンゾチアゾリンスルホン 酸)）にＨ₂Ｏ₂（１．２ｍｌの３０％Ｈ₂Ｏ₂を１０ｍｌのＡＢＴＳへ）を加えた ものをＥＬＩＳＡプレートに加えて発色を開始させた。６３０ｎｍを対照として ４１０ｎｍでの吸光度をＡＢＴＳ添加して約１５から３０分後に記録した。ｄ． ＩＧＦ−ＩレセプターＥＬＩＳＡ 以下のプロトコールがＩＧＦ−Ｉレセプターチロシンキナーゼ活性を示すＩＧ Ｆ−Ｉレセプター上のホスホチロシンレベルを測定するために使用される。 材料および試薬。以下の材料および試薬が使用された： ａ． この研究で使用された細胞株は３Ｔ３／ＩＧＦ−ＩＲであり、細胞株は ＩＧＦ−１レセプターを過剰発現するように遺伝子操作されている。 ｂ． ＮＩＨ３Ｔ３／ＩＧＦ−Ｒは３７℃および５％ＣＯ₂でインキュベータ ー内で増殖させる。増殖培地はＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ（熱不活性化）＋２ｍＭ Ｌ−グルタミンである。 ｃ． アフィニティー精製抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体１７−６９。 ｄ． Ｄ−ＰＢＳ： ＫＨ₂ＰＯ₄ ０．２０ｇ／ｌ Ｋ₂ＨＰＯ₄ ２．１６ｇ／ｌ ＫＣｌ ０．２０ｇ／ｌ ＮａＣｌ ８．００ｇ／ｌ（ｐＨ７．２） ｅ． 遮断緩衝液：ＴＢＳＴ＋５％ミルク（Ｃａｒｎａｔｉｏｎインスタント 脱脂粉乳） ｆ． ＴＢＳＴ緩衝液： トリス−ＨＣｌ ５０ｍＭ ＮａＣｌ １５０ｍＭ（ｐＨ７．２／ＨＣｌ１０Ｎ） トリトンＸ−１００ ０．１％ ＴＢＳ（１０Ｘ）の保存溶液が調製され、希釈の間に緩衝液にトリトンＸ−１０ ０が加えられる。 ｇ． ＨＮＴＧ緩衝液： ＨＥＰＥＳ ２０ｍＭ ＮａＣｌ １５０ｍＭ（ｐＨ７．２／ＨＣｌ１０Ｎ） グリセロール １０％ トリトンＸ−１００ ０．２％ 保存溶液（５Ｘ）が調製され、４℃に保たれる。 ｈ． ＥＤＴＡ／ＨＣｌ：０．５Ｍ ｐＨ７．０（ＮａＯＨ） １００Ｘ保存 液として。 ｉ． Ｎａ₃ＶＯ₄：０．５Ｍ １００Ｘ保存液として、および一部は−８０℃ に保たれる。 ｊ． Ｎａ₄Ｐ₂Ｏ₇：０．２Ｍ １００Ｘ保存液として。 ｋ． Ｐｒｏｍｅｇａからのインシュリン様増殖因子−１（カタログ番号Ｇ５ １１１） ｌ． ウサギポリクローナル抗ホスホチロシン抗血清 ｍ． ヤギ抗ウサギＩｇＧ、ＰＯＤ結合体（検出抗体）、Ｔａｇｏ（カタログ 番号４５２０、ロット番号１８０２）：Ｔａｇｏ，Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇａ ｍｅ，ＣＡ。 ｎ． ＡＢＴＳ（２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリンスルホ ン酸））溶液： クエン酸 １００ｍＭ Ｎａ₂ＨＰＯ₄ ２５０ｍＭ（ｐＨ４．０／１Ｎ ＨＣｌ） ＡＢＴＳ ０．５ｍｇ／ｍｌ ＡＢＴＳ溶液は使用するまで暗所で４℃に保たなければならない。本溶 液は緑色に変わったら捨てるべきである。 ｏ． 過酸化水素：３０％溶液は暗所で４℃に保たなければならない。 方法． 特に指示しない限り、以下のすべての工程は室温で実施される。すべ てのＥＬＩＳＡプレート洗浄は、プレートを水道水で３回すすぎ、続いてＴＢＳ Ｔで１回すすぐことにより行われる。プレートを紙タオルで軽くたたいて乾燥さ せる。Ａ．細胞播種 ： １． 組織培養皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ ２５０２０−１００）中、８０−９０％ コンフルエントに増殖させた細胞をトリプシン−ＥＤＴＡ（０．２５％，０．５ ｍｌ／Ｄ−１００，ＧＩＢＣＯ）で採取する。 ２． 新しいＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋２ｍＭ Ｌ−グルタミンに再懸濁し、 ２０，０００細胞／ウェル（１００μｌ／ウェル）で９６ウェル組織培養プレー トに移す。１日インキュベートした後、培地を無血清培地（９０μｌ）に置き換 え５％ＣＯ₂および３７℃で一夜インキュベートする。Ｂ．ＥＬＩＳＡプレート被覆および遮断 １． ＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ２５８０５−９６）を０．５μｇ ／ウェルの抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体（１００μｌＰＢＳ溶液）で少なくとも２時間被 覆する。 ２． 被覆溶液を除去し、１００μｌの遮断緩衝液で置き換え、３０分間振盪 する。遮断緩衝液を除去し、溶解物を加える直前にプレートを洗浄する。Ｃ．アッセイ法： １． 薬剤は無血清条件で試験される。 ２． 薬剤保存液（１００％ＤＭＳＯ）を９６ウェルポリプロピレンプレート においてＤＭＥＭで１：１０に希釈し、この溶液の１０μｌ／ウェルを細胞に移 すことにより最終薬剤希釈１：１００および最終ＤＭＳＯ濃度１．０％を達成す る。５％ＣＯ₂および３７℃で２時間、細胞をインキュベートする。 ３． 新しい細胞溶解緩衝液（ＨＮＴＧ^*）を調製する ＨＮＴＧ保存液 ２．０ｍｌ ＥＤＴＡ ０．１ｍｌ Ｎａ₃ＶＯ₄ ０．１ｍｌ Ｎａ₄（Ｐ₂Ｏ₇） ０．１ｍｌ Ｈ₂Ｏ ７．３ｍｌ ４． ２時間の薬剤インキュベーション後、１０μｌ／ウェルの２００ｎＭ ＩＧＦ−１リガンドのＰＢＳ溶液を細胞に加え（最終濃度＝２０ｎＭ）、５％Ｃ Ｏ₂および３７℃で１０分間インキュベートする。 ５． 培地を除き、１００μｌ／ウェルのＨＮＴＧ^*を加え１０分間振盪する 。適切に溶解されているかどうかを顕微鏡下で細胞を観察する。 ６． １２チャンネルピペットを使用してプレートから細胞をはがし、吸引お よび排出を繰り返すことにより溶解物を均一化する。すべての溶解物を抗体被覆 ＥＬＩＳＡプレートに移し、１時間振盪する。 ７． 溶解物を除き、プレートを洗浄し、１００μｌ／ウェルの抗ｐＴｙｒ（ １：３，０００ ＴＢＳＴ溶液）を加え、３０分間振盪する。 ８． 抗ｐＴｙｒを除き、プレートを洗浄し、１００μｌ／ウェルのＴＡＧＯ （１：３，０００ ＴＢＳＴ溶液）を加え、３０分間振盪する。 ９． 検出抗体を除き、プレートを洗浄し、１００μｌ／ウェルの新しいＡＢ ＴＳ／Ｈ₂Ｏ₂（１．２μｌのＨ₂Ｏ₂を１０ｍｌのＡＢＴＳに）をプレートに加え て発色を開始させる。 １０． Ｄｙｎａｔｅｃ ＭＲ５０００を使用し６３０ｎｍの波長を対照とし て４１０ｎｍでのＯＤを測定する。ｅ． ＥＧＦレセプターＥＬＩＳＡ ヒトＥＧＦ−Ｒを発現するように遺伝子操作された細胞のＥＧＦレセプターキ ナーゼ活性は以下のように測定された： 材料および試薬。以下の材料および試薬が使用された： ａ． ＥＧＦリガンド：保存濃度＝１６．５μＭ；ＥＧＦ２０１，ＴＯＹＯＢ Ｏ，Ｃｏ．，Ｌｔｄ．Ｊａｐａｎ。 ｂ． ０５−１０１（ＵＢＩ）（ＥＧＦＲ細胞外ドメインを認識するモノクロ ーナル抗体）。 ｃ． 抗ホスホチロシン抗体（抗Ｐｔｙｒ）（ポリクローナル） ｄ． 検出抗体：ヤギ抗ウサギＩｇＧ西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体、Ｔ ＡＧＯ，Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ。 ｅ． ＴＢＳＴ緩衝液： トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．２ ５０ｍＭ ＮａＣｌ １５０ｍＭ トリトンＸ−１００ ０．１ ｆ． ＨＮＴＧ ５Ｘ保存液 ＨＥＰＥＳ ０．１Ｍ ＮａＣｌ ０．７５Ｍ グリセロール ５０％ トリトンＸ−１００ １．０％ ｇ． ＡＢＴＳ保存液 クエン酸 １００ｍＭ Ｎａ₂ＨＰＯ₄ ２５０ｍＭ 濃ＨＣｌ ４．０ｐＨ ＡＢＴＳ^* ０．５ｍｇ／ｍｌ 溶液は使用するまで暗所で４℃に保つ。 ｈ． 保存試薬： ＥＤＴＡ １００ｍＭ ｐＨ７．０ Ｎａ₃ＶＯ₄ ０．５Ｍ Ｎａ₄（Ｐ₂Ｏ₇） ０．２Ｍ 方法。以下のプロトコールが使用された：Ａ． ＥＬＩＳＡプレートの前被覆 １．ＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、９６ウェル、カタログ番号２５８ ０５−９６）をウェル当たり０．５μｇの０５−１０１抗体ＰＢＳ溶液で被覆し （１００μｌ最終容量／ウェル）、４℃で一夜保存する。被覆されたプレートは ４℃で保存された場合、１０日まで使用できる。 ２．使用日に被覆緩衝液を除き、１００μｌの遮断緩衝液（５％Ｃａｒｎａｔ ｉｏｎインスタント脱脂粉乳のＰＢＳ溶液）で置き換える。室温で（約２３℃か ら２５℃）３０分間振盪してプレートをインキュベートする。使用直前に遮断緩 衝液を除き、ＴＢＳＴ緩衝液でプレートを４回洗浄する。Ｂ． 細胞の播種 １． ＮＩＨ ３Ｔ３／Ｃ７細胞株（Ｈｏｎｅｇｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅ ｌｌ ５１：１９９−２０９，１９８７）がこのアッセイに使用できる。 ２． 実験には８０−９０％コンフルエントの皿を選ぶ。細胞をトリプシン処 理し、１０％ＣＳ ＤＭＥＭ培地を加えることにより反応を停止させる。ＤＭＥ Ｍ培地（１０％ＣＳ ＤＭＥＭ培地）に細胞を懸濁し、室温で５分間、１０００ ｒｐｍで一度遠心分離する。 ３． 播種培地（ＤＭＥＭ、０．５％ウシ血清）に細胞を再懸濁し、トリパン ブルーを使用して細胞を計数する。９０％以上の生存度が受容可能である。９６ ウェルマイクロタイタープレートを用い、ウェル当たり１０，０００細胞の密度 でＤＭＥＭ培地（０．５％ウシ血清）に細胞を播種する。播種した細胞は５％Ｃ Ｏ₂中、３７℃で約４０時間インキュベートする。Ｃ． アッセイ法 １． 播種した細胞の汚染を傾立顕微鏡を用いて検査する。薬剤保存液（１０ ｍｇ／ｍｌ ＤＭＳＯ溶液）をＤＭＥＭ培地に１：１０で希釈し、最終薬剤希釈 が１：２００および最終ＤＭＳＯ濃度が１％になるようにＴＢＳＴウェルに５μ ｌを移す。対照ウェルにはＤＭＳＯのみを加える。５％ＣＯ₂雰囲気下、３７℃ で２時間インキュベートする。 ２． ＥＧＦリガンドを調製：１０μｌの希釈ＥＧＦを移すことで１００ｎＭ の最終濃度が達成されるようにＥＧＦの保存ＤＭＥＭ溶液を希釈する（１：１２ 希釈）。 ３． ウェル当たり１００μｌの量に十分な新らしい１０ｍｌのＨＮＴＧ^*を 調製する、ここでＨＮＴＧ^*は以下のものから成る：ＨＮＴＧ保存液（２．０ｍ ｌ）、ＭｉｌｌｉＱ Ｈ₂Ｏ（７．３ｍｌ）、ＥＤＴＡ １００ｍＭ ｐＨ７． ０（０．５ｍｌ）、Ｎａ₃ＶＯ₄ ０．５Ｍ（０．１ｍｌ）、Ｎａ₄（Ｐ₂Ｏ₇）０ ．２Ｍ（０．１ｍｌ）。 ４． 氷上に置く。 ５． 薬剤と２時間インキュベーション後、調製したＥＧＦリガンドを２５ｎ Ｍの最終濃度で細胞に加える（ウェル当たり１０μｌ）。対照ウェルはＤＭＥＭ のみを加える。室温で振盪しながら５分間インキュベートする。 ６． 薬剤、ＥＧＦおよびＤＭＥＭを除去する。細胞を２回ＰＢＳで洗う。Ｈ ＮＴＧ^*を細胞に移す（ウェル当たり１００μｌ）。氷上に５分置く。その間、 他のＥＬＩＳＡプレートから遮断緩衝液を除き、前記のようにＴＢＳＴで洗浄す る。 ７． マイクロピペッターに安全に固定したピペットチップを用い、細胞をプ レートからはがしおよびＨＮＴＧ^*溶解緩衝液の吸引および排出を繰り返すこと により細胞物質を均一化する。被覆し、遮断しおよび洗浄したＥＬＩＳＡプレー トに溶解物を移す。室温で振盪しながら１時間インキュベートする。 ８． 溶解物を除き、ＴＢＳＴで４回洗う。新しく希釈した抗Ｐｔｙｒ抗体を ＥＬＩＳＡプレートへ移す（ウェル当たり１００μｌ）。抗Ｐｔｙｒ抗血清存在 下（ＴＢＳＴで１：３０００に希釈）、室温で振盪しながら３０分間インキュベ ートする。 ９． 抗Ｐｔｙｒ抗体を除去し、ＴＢＳＴで４回洗う。ウェル当たり１００μ ｌで新しく希釈したＴＡＧＯ３０抗ウサギＩｇＧ抗体をＥＬＩＳＡプレートへ移 す。室温で振盪しながら３０分間インキュベートする（抗ウサギＩｇＧ抗体：Ｔ ＢＳＴで１：３０００に希釈）。 １０． 検出抗体を除去し、ＴＢＳＴで４回洗う。新しく調製したＡＢＴＳ／ Ｈ₂Ｏ₂溶液をＥＬＩＳＡプレートへ移す（ウェル当たり１００μｌ）。室温で２ ０分間インキュベートする（ＡＢＴＳ／Ｈ₂Ｏ₂溶液：１μｌ３０％Ｈ₂Ｏ₂を１０ ｍｌのＡＢＴＳ保存液に加える）。 １１． ５０μｌの５Ｎ Ｈ₂ＳＯ₄（随意）を加えることにより反応を停止さ せ、４１０ｎｍでＯ．Ｄ．を決定する。 １２． 最大のホスホチロシン信号は陽性対照から陰性対照の値を引くことに より決定される。抽出物含有ウェルのホスホチロシン含量のパーセント阻害が、 陰性対照を差し引いた後に計算される。ｆ． Ｍｅｔ自己リン酸化アッセイ−ＥＬＩＳＡ このアッセイはＭｅｔレセプター上のＭｅｔタンパタ質チロシンキナーゼレベ ルを分析することによりＭｅｔチロシンキナーゼ活性を決定する。 １． 試薬 ａ． ＨＮＴＧ（５Ｘ保存液）：２３．８３ｇのヘペスおよび４３．８３ｇの ＮａＣｌを約３５０ｍｌのｄＨ₂Ｏに溶解する。ＨＣｌまたはＮａＯＨでｐＨを ７．２に調整し、５００ｍｌのグリセロールおよび１０ｍｌのトリトンＸ−１０ ０を加え、混合し、ｄＨ₂Ｏを加えて総量を１Ｌとする。１Ｌの１Ｘ作業溶液を 作るため、２００ｍｌの５Ｘ保存溶液を８００ｍｌのｄＨ₂Ｏに加え、必要に応 じてｐＨを試験および調整し、４℃で保存する。 ｂ． ＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝化塩溶液）、Ｇｉｂｃｏカタログ番号４ ５０−１３００ＥＢ（１Ｘ溶液） ｃ． 遮断緩衝液：５００ｍｌのｄＨ₂Ｏに１００ｇＢＳＡ、１２．１ｇのト リス−ｐＨ７．５、５８．４４ｇのＮａＣｌおよび１０ｍｌのトゥイーン−２０ を加え、総量１Ｌに希釈する。 ｄ． キナーゼ緩衝液：５００ｍｌのｄＨ₂Ｏに１２．１ｇのトリス−ｐＨ７ ．５、５８．４ｇのＮａＣｌ、４０．７ｇのＭｇＣｌ₂および１．９ｇのＥＧＴ Ａを加え；ｄＨ₂Ｏを加えて総量を１Ｌとする。 ｅ． ＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオリド）、Ｓｉｇｍａカタロ グ番号Ｐ−７６２６、４３５．５ｍｇに１００％エタノールを加えて総量を２５ ｍｌとし、ボルテックスする。 ｆ． ＡＴＰ（細菌起源）、Ｓｉｇｍａカタログ番号Ａ−７６９９、粉末を− ２０℃で保存する；使用の際に溶液にする、３．３１ｍｇを１ｍｌのｄＨ₂Ｏに 溶解する。 ｇ． ＲＣ−２０Ｈ ＨＲＰＯ結合抗ホスホチロシン、Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉ ｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓカタログ番号Ｅ１２０Ｈ。 ｈ． Ｐｉｅｒｃｅ １−Ｓｔｅｐ（ＴＭ）Ｔｕｒｂｏ ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ （３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）、Ｐｉｅｒｃｅカタログ番号 ３４０２２。 ｉ． Ｈ₂ＳＯ₄、１ｍｌの濃硫酸（１８Ｎ）を３５ｍｌのｄＨ₂Ｏに加える。 ｊ． トリスＨＣｌ、Ｆｉｓｃｈｅｒカタログ番号ＢＰ１５２−５；１２１． １４ｇの物質に６００ｍｌのＭｉｌｌｉＱ Ｈ₂Ｏを加え、ＨＣｌでｐＨを７． ５（または７．２）に調整する、ＭｉｌｌｉＱ Ｈ₂Ｏで総量を１Ｌとする。 ｋ． ＮａＣｌ、Ｆｉｓｃｈｅｒカタログ番号Ｓ２７１−１０、５Ｍ溶液を作 製する。 ｌ． トゥイーン−２０、Ｆｉｓｃｈｅｒカタログ番号Ｓ３３７−５００。 ｍ． Ｎａ₃ＶＯ₄、Ｆｉｓｃｈｅｒカタログ番号Ｓ４５４−５０、１．８ｇの 物質に８０ｍｌのＭｉｌｌｉＱ Ｈ₂Ｏを加え、ＨＣｌまたはＮａＯＨでｐＨを １０．０に調整し、電子レンジで沸騰させ、冷却し、ｐＨを検査し、ｐＨが１０ ．０で安定になるまでこの過程を繰り返し、ＭｉｌｌｉＱ Ｈ₂Ｏを加えて総量 を１００ｍＬとし、１ｍｌに分注して−８０℃で保存する。 ｎ． ＭｇＣｌ₂、Ｆｉｓｃｈｅｒカタログ番号Ｍ３３−５００、１Ｍ溶液を 作製する。 ｏ． ヘペス、Ｆｉｓｃｈｅｒカタログ番号ＢＰ３１０−５００、２００ｍｌ のＭｉｌｌｉＱ Ｈ₂Ｏに５９．６ｇの物質を加え、ｐＨを７．５に調整し、総 量を３００ｍｌとし、滅菌濾過する。 ｐ． アルブミン、ウシ（ＢＳＡ）、Ｓｉｇｍａカタログ番号Ａ−４５０３、 ３０グラムの物質に滅菌蒸留水を加えて総量を３００ｍｌとする、４℃で保存。 ｑ． ＴＢＳＴ緩衝液：１Ｌの目盛りのついたシリンダー中の約９００ｍｌの ｄＨ₂Ｏに６．０５７ｇのトリスおよび８．７６６ｇのＮａＣｌを加え、溶解し たらＨＣｌでｐＨを７．２に調整し、１．０ｍｌのトリトンＸ−１００を加えて ｄＨ₂Ｏで総量を１Ｌとする。 ｒ． ヤギアフィニティー精製抗体ウサギＩｇＧ（全分子）、Ｃａｐｐｅｌカ タログ番号５５６４１。 ｓ． 抗ｈ−Ｍｅｔ（Ｃ−２８）ウサギポリクローナルＩｇＧ抗体、Ｓａｎｔ ａ Ｃｒｕｚ Ｃｈｅｍｉｃａｌカタログ番号ＳＣ−１６１。 ｔ． 過渡的にトランスフェクトされたＥＧＦＲ／Ｍｅｔキメラ細胞（ＥＭＲ ）（Ｋｏｍａｄａ，ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，８：２３８１−２３９０ （１９９３）。 ｕ． 炭酸ナトリウム緩衝液（Ｎａ₂ＣＯ₄、、Ｆｉｓｃｈｅｒカタログ番号Ｓ ４９５）：１０．６ｇの物質に８００ｍｌのＭｉｌｌｉＱ Ｈ₂Ｏを加え、溶解 したらＮａＯＨでｐＨを９．６に調整し、ＭｉｌｌｉＱ Ｈ₂Ｏで総量を１Ｌと し、濾過して４℃で保存する。２．方法 特に指示されない限り、以下のすべての工程は室温で実施される。すべてのＥ ＬＩＳＡプレート洗浄は、４回ＴＢＳＴですすぐことにより行われる。Ａ．ＥＭＲ溶解 この方法はレセプター捕捉開始の一夜前または直前に行われる。 １． ３７℃の水浴中、最後の結晶が消滅するまで回しながら溶解物をすばや く融解させる。 ２． １ｍＭ ＰＭＳＦ含有１ＸＨＮＴＧで細胞ペレットを溶解する。細胞の １５ｃｍ皿当たり３ｍｌのＨＮＴＧを使用する。計算されたＨＮＴＧ量の１／□ を加え、チューブを１分間ボルテックスし、残りの量のＨＮＴＧを加えてさらに １分間ボルテックスする。 ３． チューブの平衡をとり、１０，０００ｘｇで１０分間４℃で遠心分離す る。 ４． 上清を集め、一部をタンパタ質決定のために除く。 ５． ドライアイス／エタノール浴中で集めた試料を急速に凍らせる。この工 程は溶解物が一夜保存されるか、または以下のタンパク質決定にすぐに使用され るかに関係なく実施される。 ６． 標準ビシンコニニン酸（ＢＣＡ）法（ＢＣＡアッセイ試薬キット、Ｐｉ ｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌカタログ番号２３２２５）を用いてタンパク質決定 を実施する。Ｂ．ＥＬＩＳＡ法 １． ウェル当たり５μｇのヤギ抗ウサギ抗体（炭酸緩衝液、総ウェル容量５ ０μｌ）でＣｏｒｎｉｎｇ ９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを被覆する。４℃で 一夜保存。 ２． プレートを逆さにして液体を除くことにより非結合ヤギ抗ウサギ抗体を 除去する。 ３． １５０μｌの遮断緩衝液を各々のウェルに加える。振盪しながら室温で ３０分インキュベートする。 ４． ＴＢＳＴで４回洗浄する。紙タオル上でプレートを軽くたたき、過剰の 液体および泡を除く。 ５． １００μｌの総ウェル容量にＴＢＳＴで希釈されたウサギ抗Ｍｅｔ抗体 をウェル当たり１μｇで加える。 ６． 溶解物をＨＮＴＧに希釈する（９０μｇ溶解物／１００μｌ）。 ７． １００μｌの希釈溶解物を各々のウェルに加える。室温で６０分振盪す る。 ８． ＴＢＳＴで４回洗浄する。紙タオル上で軽くたたき、過剰の液体および 泡を除く。 ９． ウェル当たり５０μｌの１Ｘ溶解物緩衝液を加える。 １０． ポリプロピレン９６ウェルプレート中で化合物／抽出物を１Ｘキナー ゼ緩衝液で１：１０に希釈する。 １１． ５．５μｌの希釈薬剤をＥＬＩＳＡプレートへ移す。振盪しながら室 温で２０分インキュベートする。 １２． ウェル当たり５．５μｌの６０μＭ ＡＴＰ溶液を加える。陰性対照 にはＡＴＰを加えない。振盪しながら室温で９０分インキュベートする。 １３． ＴＢＳＴで４回洗浄する。紙タオル上でプレートを軽くたたき、過剰 の液体および泡を除く。 １４． ウェル当たり１００μｌのＲＣ２０（１：３０００遮断緩衝液で希釈 ）を加える。振盪しながら室温で３０分インキュベートする。 １５． ＴＢＳＴで４回洗浄する。紙タオル上でプレートを軽くたたき、過剰 の液体および泡を除く。 １６． ウェル当たり１００μｌのＴｕｒｂｏ−ＴＭＢを加える。振盪しなが ら３０−６０分インキュベートする。 １７． 反応を停止させるため、ウェル当たり１００μｌの１Ｍ Ｈ₂ＳＯ₄を 加える。 １８． Ｄｙｎａｔｅｃｈ ＭＲ７０００ ＥＬＩＳＡリーダーでアッセイを 読みとる。試験フィルター＝４５０ｎｍ、対照フィルター＝４１０ｎｍ。ｇ．生化学的ｓｒｃアッセイ−ＥＬＩＳＡ このアッセイは読み出しとしてビオチニル化ペプチドのリン酸化を測定してｓ ｒｃタンパク質キナーゼ活性を決定するために使用される。１．材料および試薬 ： ａ． Ｃｏｕｒｔｎｅｉｄｇｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｓｕｇｅｎ，Ｉｎｃ ．，Ｒｅｄｗｏｏｄ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）からのｓｒｃで形質転 換した酵母。 ｂ． 細胞溶解物：ｓｒｃを発現している酵母細胞をペレット化し、水で一度 洗浄し、再ペレット化して使用するまで−８０℃で保存。 ｃ． Ｎ−末端ビオチニル化ＥＥＥＹＥＥＹＥＥＥＹＥＥＥＹＥＥＥＹは当業 者には良く知られた標準法により調製される。 ｄ． ＤＭＳＯ：Ｓｉｇｍａ，ＳＴ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ。 ｅ． ９６ウェルＥＬＩＳＡプレート：Ｃｏｒｎｉｎｇ ９６ウェル洗浄が容 易な改良平底プレート、Ｃｏｒｎｉｎｇカタログ番号２５８０５−９６。 ｆ． 化合物希釈のためのＮＵＮＣ ９６ウェルＶ底ポリプロピレンプレート ：Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号Ａ−７２０９２。 ｇ． Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ ＥＬＩＴＥ ＡＢＣ試薬：Ｖｅｃｔｏｒ，Ｂｕ ｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ。 ｈ． 抗ｓｒｃ（３２７）ｍａｂ：シゾサッカロミセス ポムベが組換えＳｒ ｃを発現させるために使用された（Ｓｕｐｅｒｔｉ−Ｆｕｒｇａ，ｅｔ ａｌ． ，ＥＭＢＯ Ｊ．，１２：２６２５−２６３４；Ｓｕｐｅｒｔｉ−Ｆｕｒｇａ， ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１４：６００−６０５）。Ｓ ．ポムベ株ＳＰ２００（ｈ−ｓ ｌｅｕｌ．３２ ｕｒａ４ ａｄｅ２１０）を 記載されているように増殖させ、ｐＲＳＰ発現プラスミドによる形質転換は酢酸 リチウム法（Ｓｕｐｅｒｔｉ−Ｆｕｒｇａ，前記文献）により行われた。細胞は ｎｍｔ１プロモーターからの発現を抑制するために１μＭチアミン存在下、また は発現を誘導するためのチアミン不在下で増殖させた。 ｉ． モノクローナル抗ホスホチロシン、ＵＢＩ０５−３２１（代わりにＵＢ ４０を使用してもよい）。 ｊ． Ｔｕｒｂｏ ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡペルオキシダーゼ基質：Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ。２．緩衝液 ａ． ＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝化塩溶液）、ＧＩＢＣＯ ＰＢＳ、ＧＩ ＢＣＯカタログ番号４５０−１３００ＥＢ ｂ． 遮断緩衝液：５％脱脂ミルク（Ｃａｒｎａｔｉｏｎ）ＰＢＳ溶液。 ｃ． 炭酸緩衝液：ＦｉｓｃｈｅｒからのＮａ₂ＣＯ₄、カタログ番号Ｓ４９５ 、１００ｍＭ保存溶液作製。 ｄ． キナーゼ緩衝液：１．０ｍｌ（１Ｍ保存溶液から）ＭｇＣｌ₂；０．２ ｍｌ（１Ｍ保存溶液から）ＭｎＣｌ₂；０．２ｍｌ（１Ｍ保存溶液から）ＤＴＴ ；５．０ｍｌ（１Ｍ保存溶液から）ヘペス；０．１ｍｌ ＴＸ−１００；Ｍｉｌ ｌｉＱＨ₂Ｏで総量を１０ｍｌとする。 ｅ． 溶解緩衝液：５．０ｍｌヘペス（１Ｍ保存溶液から）；２．７４ｍｌ ＮａＣｌ（５Ｍ保存溶液から）；１０ｍｌグリセロール；１．０ｍｌ ＴＸ−１ ００；０．４ｍｌ ＥＤＴＡ（１００ｍＭ保存溶液から）；１．０ｍｌ ＰＭＳ Ｆ(１００ｍＭ保存溶液から)；０．１ｍｌ Ｎａ₃ＶＯ₄(０．１Ｍ保存溶液から) ；ＭｉｌｌｉＱＨ₂Ｏで総量を１００ｍｌとする。 ｆ． ＡＴＰ：Ｓｉｇｍａカタログ番号Ａ−７６９９、１０ｍＭ保存溶液を作 製（５．５１ｍｇ／ｍｌ）。 ｇ． トリス−ＨＣｌ、Ｆｉｓｃｈｅｒカタログ番号ＢＰ１５２−５、６００ ｍｌのＭｉｌｌｉＱ Ｈ₂Ｏに１２１．１４ｇの物質を加え、ＨＣｌでｐＨを７ ．５に調整する、ＭｉｌｌｉＱ Ｈ₂Ｏで総量を１Ｌとする。 ｈ． ＮａＣｌ、Ｆｉｓｃｈｅｒカタログ番号Ｓ２７１−１０、ＭｉｌｌｉＱ Ｈ₂Ｏで５Ｍ溶液を作製する。 ｉ． Ｎａ₃ＶＯ₄：Ｆｉｓｃｈｅｒカタログ番号Ｓ４５４−５０、８０ｍｌの ＭｉｌｌｉＱ Ｈ₂Ｏに１．８ｇの物質を加え；ＨＣｌまたはＮａＯＨでｐＨを １０．０に調整し；電子レンジで沸騰させ；冷却し；ｐＨを検査し、加熱／冷却 サイクル後にｐＨが１０．０で安定になるまでｐＨ調整を繰り返し；Ｍｉｌｌｉ Ｑ Ｈ₂Ｏを加えて総量を１００ｍｌとし；１ｍｌに分注して−８０℃で保存す る。 ｊ． ＭｇＣｌ₂、Ｆｉｓｃｈｅｒカタログ番号Ｍ３３−５００、Ｍｉｌｌｉ Ｑ Ｈ₂Ｏで１Ｍ保存溶液を作製する。 ｋ． ヘペス：Ｆｉｓｃｈｅｒカタログ番号ＢＰ３１０−５００、２００ｍｌ のＭｉｌｌｉＱ Ｈ₂Ｏに５９．６ｇの物質を加え、ｐＨを７．５に調整し、Ｍ ｉｌｌｉＱ Ｈ₂Ｏで総量を２５０ｍｌとし、滅菌濾過する（１Ｍ保存溶液）。 ｌ． ＴＢＳＴ緩衝液：９００ｍｌのｄＨ₂Ｏに６．０５７ｇのトリスおよび ８．７６６ｇのＮａＣｌを加え；ＨＣｌでｐＨを７．２に調整し、１．０ｍｌの トリトンＸ−１００を加え；ｄＨ₂Ｏで総量を１Ｌとする。 ｍ． ＭｎＣｌ₂、Ｆｉｓｃｈｅｒカタログ番号Ｍ８７−１００、Ｍｉｌｌｉ Ｑ Ｈ₂Ｏで１Ｍ保存溶液を作製する。 ｎ． ＤＴＴ：、Ｆｉｓｃｈｅｒカタログ番号ＢＰ１７２−５。 ｏ． ＴＢＳ（トリス緩衝化塩溶液）：９００ｍｌのＭｉｌｌｉＱ Ｈ₂Ｏに ６．０５７ｇのトリスおよび８．７７７ｇのＮａＣｌを加え；ＭｉｌｌｉＱ Ｈ₂ Ｏで総量を１Ｌとする。 ｐ． キナーゼ反応混合物：アッセイプレート（１００ウェル）当たりの量： １．０ｍｌキナーゼ緩衝液、２００μｇ ＧＳＴ−□、ＭｉｌｌｉＱ Ｈ₂Ｏで 最終容量を８．０ｍｌとする。 ｑ． ビオチン標識ＥＥＥＹＥＥＹＥＥＥＹＥＥＥＹＥＥＥＹ：使用直前に新 鮮なペプチド保存水溶液（１ｍＭ，２．９８ｍｇ／ｍｌ）を作製する。 ｒ． Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ ＥＬＩＳＡ ＡＢＣ試薬：１４ｍｌの作業溶液 を調製するためには、１５ｍｌのＴＢＳＴに試薬Ａを１滴加え、チューブを数回 逆さにして混合する。次に試薬Ｂを１滴加える。チューブをオービタル振盪機に 乗せ、室温で３０分混合する。３．方法： ａ．ｓｒｃ被覆ＥＬＩＳＡプレートの作製 １． ＥＬＩＳＡプレートを１００μｌのｐＨ９．６炭酸ナトリウム緩衝液に 溶解した０．５μｇ／ウェルの抗ｓｒｃ ｍａｂで一夜４℃にて被覆する。 ２． ウェルを一回ＰＢＳで洗浄する。 ３． プレートを０．１５ｍｌの５％ミルクＰＢＳ溶液で３０分、室温にて遮 断する。 ４． プレートをＰＢＳで４回洗浄する。 ５． 溶解緩衝液に希釈したｓｒｃ形質転換酵母溶解物１０μｇ／ウェル（ウ ェル当たり総量で０．１ｍｌ）を加える。（溶解物の量はバッチ間で変化するで あろう。）プレートを室温で２０分振盪する。ｂ．ホスホチロシン抗体被覆ＥＬＩＳＡプレートの調製 １． ４Ｇ１０プレート：１００μｌのＰＢＳに溶解した０．５μｇ／ウェル の４Ｇ１０を用いて一夜４℃で被覆し、１５０μｌの５％ミルクＰＢＳ溶液で３ ０分、室温にて遮断する。ｃ． キナーゼアッセイ法 １． 上記工程１−７の非結合タンパク質を除去し、プレートを５回ＰＢＳで 洗浄する。 ２． ウェル当たり０．０８ｍｌのキナーゼ反応混合物（１０μｌの１０Ｘキ ナーゼ緩衝液を含んでいる）およびウェル当たり１０μＭ（最終濃度）の水で希 釈したビオチン−ＥＥＥＹＥＥＹＥＥＥＹＥＥＥＹＥＥＥＹを加える。 ３． １０μｌの水（１０％のＤＭＳＯを含んでいる）で希釈した化合物を加 え、室温で１５分、前もってインキュベートする。 ４． １０μｌ／ウェルの０．０５ｍＭ ＡＴＰ水溶液を加えることにより（ ５μＭの最終ＡＴＰ濃度）キナーゼ反応を開始する。 ５． ＥＬＩＳＡプレートを室温で１５分振盪する。 ６． ウェル当たり１０μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡを加えることによりキナー ゼ反応を停止させる。 ７． ９０μｌの上清を、前記Ｂ項の遮断された４Ｇ１０被覆ＥＬＩＳＡプレ ートへ移す。 ８． 振盪しながら室温で３０分インキュベートする。 ９． ＴＢＳＴで５回プレートを洗浄する。 １０． Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ ＥＬＩＳＡ ＡＢＣ試薬（１００μｌ／ウェ ル）と室温で３０分インキュベートする。 １１． ＴＢＳＴで５回プレートを洗浄する。 １２． Ｔｕｒｂｏ ＴＭＢで発色させる。ｈ．生化学的ｌｃｋアッセイ−ＥＬＩＳＡ このアッセイは読み出しとしてＧＳＴ−□のリン酸化を測定してｌｃｋタンパ タ質キナーゼ活性を決定するために使用される。１．材料および方法 ａ． ｌｃｋで形質転換された酵母。シゾサッカロミセス ポムベが組換えＬ ｃｋを発現させるために使用された（Ｓｕｐｅｒｔｉ−Ｆｕｒｇａ，ｅｔ ａｌ ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１２：２６２５−２６３４；Ｓｕｐｅｒｔｉ−Ｆｕｒｇａ ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１４：６００−６０５）。 Ｓ．ポムベ株ＳＰ２００（ｈ−ｓ ｌｅｕｌ．３２ ｕｒａ４ ａｄｅ２１０） を記載されているように増殖させ、ｐＲＳＰ発現プラスミドによる形質転換は酢 酸リチウム法（Ｓｕｐｅｒｔｉ−Ｆｕｒｇａ，前記文献）により行われた。細胞 は発現を誘導するために１μＭチアミン存在下で増殖させた。 ｂ． 細胞溶解物：ｌｃｋを発現している酵母細胞をペレット化し、水で一度 洗浄し、再ペレット化して使用するまで−８０℃で保存。 ｃ． ＧＳＴ−□：細菌での発現のためのＧＳＴ−□融合タンパク質をコード しているＤＮＡはサンフランシスコ、カリフォルニア大学Ｈｏｗａｒｄ Ｈｕｇ ｈｅｓ Ｍｅｄｉｃａｌ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＡｒｔｈｕｒ Ｗｅｉｓｓから 入手した。形質転換した細菌は振盪しながら一夜２５℃で増殖させた。ＧＳＴ− □はグルタチオンアフィニティークロマトグラフイー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ａ ｌａｍｅｄａ，ＣＡ）により精製された。 ｄ． ＤＭＳＯ：Ｓｉｇｍａ，ＳＴ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ。 ｅ． ９６ウェルＥＬＩＳＡプレート：Ｃｏｒｎｉｎｇ ９６ウェル洗浄が容 易な改良平底プレート、Ｃｏｒｎｉｎｇカタログ番号２５８０５−９６。 ｆ． 化合物希釈のためのＮＵＮＣ ９６ウェルＶ底ポリプロピレンプレート ：Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号Ａ−７２０９２。 ｇ． 精製されたウサギ抗ＧＳＴ抗血清：Ａｍｒａｄ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏ ｎ（Ａｕｓｔｒａｌｉａ）カタログ番号９０００１６０５。 ｈ． ヤギ抗ウサギ−ＩｇＧ−ＨＲＰ：Ａｍｅｒｓｈａｍカタログ番号Ｖ０１ ０３０１。 ｉ． ヒツジ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）：Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓカタログ 番号５２１５−００５−００３。 ｊ． 抗Ｌｃｋ（３Ａ５）ｍａｂ：Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎ ｏｌｉｇｙカタログ番号ｓｃ−４３３。 ｋ． モノクローナル抗ホスホチロシンＵＢ１０５−３２１（代わりにＵＢ４ ０を使用してもよい）。２．緩衝液 ａ． ＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝化塩溶液）１Ｘ溶液、ＧＩＢＣＯ ＰＢ Ｓ、ＧＩＢＣＯカタログ番号４５０−１３００ＥＢ ｂ． 遮断緩衝液：１００ｇ ＢＳＡ、１２．１ｇトリス−ＰＨ７．５、５８ ．４４ｇ ＮａＣｌ、１０ｍｌトゥイーン−２０，ＭｉｌｌｉＱ Ｈ₂Ｏで総量 を１Ｌとする。 ｃ． 炭酸緩衝液：ＦｉｓｃｈｅｒからのＮａ₂ＣＯ₄、カタログ番号Ｓ４９５ 、１００ｍＭ保存溶液作製。 ｄ． キナーゼ緩衝液：１．０ｍｌ（１Ｍ保存溶液から）ＭｇＣｌ₂；０．２ ｍｌ（１Ｍ保存溶液から）ＭｎＣｌ₂；０．２ｍｌ（１Ｍ保存溶液から）ＤＴＴ ；５．０ｍｌ（１Ｍ保存溶液から）ヘペス；０．１ｍｌ ＴＸ−１００；Ｍｉｌ ｌｉＱＨ₂Ｏで総量を１０ｍｌとする。 ｅ． 溶解緩衝液：５．０ｍｌヘペス（１Ｍ保存溶液から）；２．７４ｍｌ ＮａＣｌ（５Ｍ保存溶液から）；１０ｍｌグリセロール；１．０ｍｌ ＴＸ−１ ００；０．４ｍｌ ＥＤＴＡ（１００ｍＭ保存溶液から）；１．０ｍｌ ＰＭＳ Ｆ(１００ｍＭ保存溶液から)；０．１ｍｌ Ｎａ₃ＶＯ₄(０．１Ｍ保存溶液から) ； ＭｉｌｌｉＱＨ₂Ｏで総量を１００ｍｌとする。 ｆ． ＡＴＰ：Ｓｉｇｍａカタログ番号Ａ−７６９９、１０ｍＭ保存溶液を作 製（５．５１ｍｇ／ｍｌ）。 ｇ． トリス−ＨＣｌ、Ｆｉｓｃｈｅｒカタログ番号ＢＰ１５２−５、６００ ｍｌのＭｉｌｌｉＱ Ｈ₂Ｏに１２１．１４ｇの物質を加え、ＨＣｌでｐＨを７ ．５に調整する、ＭｉｌｌｉＱ Ｈ₂Ｏで総量をＩＬとする。 ｈ． ＮａＣｌ、Ｆｉｓｃｈｅｒカタログ番号Ｓ２７１−１０、ＭｉＩｌｉＱ Ｈ₂Ｏで５Ｍ溶液を作製する。 ｉ． Ｎａ₃ＶＯ₄：Ｆｉｓｃｈｅｒカタログ番号Ｓ４５４−５０、８０ｍｌの ＭｉｌｌｉＱ Ｈ₂Ｏに１．８ｇの物質を加え；ＨＣｌまたはＮａＯＨでｐＨを １０．０に調整し；電子レンジで沸騰させ；冷却し；ｐＨを検査し、加熱／冷却 サイクル後にｐＨが１０．０で安定になるまでｐＨ調整を繰り返し；Ｍｉｌｌｉ Ｑ Ｈ₂Ｏを加えて総量を１００ｍｌとし；１ｍｌに分注して−８０℃で保存す る。 ｊ． ＭｇＣｌ₂、Ｆｉｓｃｈｅｒカタログ番号Ｍ３３−５００、Ｍｉｌｌｉ Ｑ Ｈ₂Ｏで１Ｍ保存溶液を作製する。 ｋ． ヘペス：Ｆｉｓｃｈｅｒカタログ番号ＢＰ３１０−５００、２００ｍｌ のＭｉｌｌｉＱ Ｈ₂Ｏに５９．６ｇの物質を加え、ｐＨを７．５に調整し、Ｍ ｉｌｌｉＱ Ｈ₂Ｏで総量を２５０ｍｌとし、滅菌濾過する（１Ｍ保存溶液）。 ｌ． アルブミン、ウシ（ＢＳＡ）、Ｓｉｇｍａカタログ番号Ａ４５０３；１ ５０ｍｌのＭｉｌ１ｉＱ Ｈ₂Ｏに３０ｇの物質を加え、ＭｉｌｌｉＱ Ｈ₂Ｏで 総量を３００ｍｌとし、０．２２μｍフィルターを通し、４℃で保存する。 ｍ． ＴＢＳＴ緩衝液：９００ｍｌのｄＨ₂Ｏに６．０５７ｇのトリスおよび ８．７６６ｇのＮａＣｌを加え；ＨＣｌでｐＨを７．２に調整し、１．０ｍｌの トリトンＸ−１００を加え；ｄＨ₂Ｏで総量を１Ｌとする。 ｎ． ＭｎＣｌ₂、Ｆｉｓｃｈｅｒカタログ番号Ｍ８７−１００、Ｍｉｌｌｉ Ｑ Ｈ₂Ｏで１Ｍ保存溶液を作製する。 ｏ． ＤＴＴ：、Ｆｉｓｃｈｅｒカタログ番号ＢＰ１７２−５。 ｐ． ＴＢＳ（トリス緩衝化塩溶液）：９００ｍｌのＭｉｌｌｉＱ Ｈ₂Ｏに ６．０５７ｇのトリスおよび８．７７７ｇのＮａＣｌを加え；ＭｉｌｌｉＱ Ｈ₂ Ｏで総量をＩＬとする。 ｑ． キナーゼ反応混合物：アッセイプレート（１００ウェル）当たりの量： １．０ｍｌキナーゼ緩衝液、２００μｇ ＧＳＴ−□、ＭｉｌｌｉＱ Ｈ₂Ｏで 最終容量を８．０ｍｌとする。２．方法： ａ．Ｌｃｋ被覆ＥＬＩＳＡプレートの作製 １． １００μｌのｐＨ９．６炭酸ナトリウム緩衝液に溶解した２．０μｇ／ ウェルのヒツジ抗マウスＩｇＧで一夜４℃にて被覆する。 ２． ウェルを一回ＰＢＳで洗浄する。 ３． プレートを０．１５ｍｌの遮断緩衝液で３０分、室温にて遮断する。 ４． プレートをＰＢＳで５回洗浄する。 ５． ０．１ｍｌのＰＢＳに溶解した０．５μｇ／ウェルの抗ｌｃｋ(ｍａｂ ３Ａ５)を室温で１−２時間加える。 ６． プレートをＰＢＳで５回洗浄する。 ７． 溶解緩衝液に希釈したｌｃｋ形質転換酵母溶解物２０μｇ／ウェル（ウ ェル当たり総量で０．１ｍｌ）を加える。（溶解物の量はバッチ間で変化するで あろう。）活性の損失を防ぐために４℃で一夜プレートを振盪する。ｂ．ホスホチロシン抗体被覆ＥＬＩＳＡプレートの調製 １． ＵＢ４０プレート：１００μｌのＰＢＳに溶解した１．０μｇ／ウェル のＵＢ４０を用いて一夜４℃で被覆し、１５０μｌの遮断緩衝液で少なくとも１ 時間遮断する。ｃ． キナーゼアッセイ法 １． 上記工程１−７の非結合タンパク質を除去し、プレートを５回ＰＢＳで 洗浄する。 ２． ウェル当たり０．０８ｍｌのキナーゼ反応混合物（１０μｌの１０Ｘキ ナーゼ緩衝液およびウェル当たり２μｇの水希釈ＧＳＴ−□を含んでいる）を加 える。 ３． １０μｌの水（１０％のＤＭＳＯを含んでいる）で希釈した化合物を加 え、室温で１５分、前もってインキュベートする。 ４． １０μｌ／ウェルの０．１ｍＭ ＡＴＰ水溶液を加えることにより（１ ０μＭの最終ＡＴＰ濃度）キナーゼ反応を開始する。 ５． ＥＬＩＳＡプレートを室温で６０分振盪する。 ６． ウェル当たり１０μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡを加えることによりキナー ゼ反応を停止させる。 ７． ９０μｌの上清を、前記Ｂ項の遮断された４Ｇ１０被覆ＥＬＩＳＡプレ ートへ移す。 ８． 振盪しながら室温で３０分インキュベートする。 ９． ＴＢＳＴで５回プレートを洗浄する。 １０． １００μｌのＴＢＳＴで１：５０００希釈したウサギ抗ＧＳＴ抗体と 室温で３０分インキュベートする。 １１． ＴＢＳＴで５回プレートを洗浄する。 １２． １００μｌのＴＢＳＴに１：２０，０００希釈したヤギ抗ウサギ−Ｉ ｇＧ−ＨＲＰと室温で３０分インキュベートする。 １３． ＴＢＳＴで５回プレートを洗浄する。 １４． Ｔｕｒｂｏ ＴＭＢで発色させる。ｉ．Ｒａｆのリン酸化機能を測定するアッセイ 以下のアッセイは、標的タンパク質ＭＥＫならびにＭＥＫが標的とするＭＡＰ ＫのＲＡＦ−触媒リン酸化の量を報告している。ＲＡＦ遺伝子配列はＢｏｎｎｅ ｒ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１４００ −１４０７、に記載されており、集合的遺伝子配列データバンタで容易に利用可 能である。本発明のこの部分で利用される核酸ベクターの構築および細胞株はＭ ｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ ｃｉ．ＵＳＡ ８５：８８５５−８８５９、において十分に説明されている。材料および試薬 １． Ｓｆ９（スポドプテラ フルギペルダ）細胞；ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ，Ｇ ａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ。 ２． ＲＩＰＡ緩衝液：２０ｍＭトリス／ＨＣｌ ｐＨ７．４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、１ｍＭ ＰＭＳＦ、５ｍｇ／Ｌ アプロテニン 、０．５％トリトンＸ−１００； ３． チオレドキシン−ＭＥＫ融合タンパク質（Ｔ−ＭＥＫ）：Ｔ−ＭＥＫ発 現およびアフィニティー クロマトグラフィーは製造元が指示する方法に従って 実施された。カタログ番号 Ｋ３５０−０１およびＲ３５０−４０、Ｉｎｖｉｔ ｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ。 ４．Ｈｉｓ−ＭＡＰＫ（ＥＲＫ２）；Ｈｉｓ−タグ化ＭＡＰＫは、Ｈｉｓ−Ｍ ＡＰＫをコードしているｐＵＣ１８ベクターで形質転換したＸＬ１ブルー細胞で 発現された。Ｈｉｓ−ＭＡＰＫはＮｉ−アフィニティークロマトグラフィーによ り精製された。カタログ番号２７−４９４９−０１、Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ａｌ ａｍｅｄａ，ＣＡ、本明細書に記載されているように。 ５． ヒツジ抗マウスＩｇＧ：Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ、カタログ番号５１５−００６−００８、ロット番 号２８５６３。 ６． ＲＡＦ−１プロテインキナーゼ特異的抗体：ＵＢＩからのＵＲＰ２６５ ３。 ７． 被覆緩衝液：ＰＢＳ；リン酸緩衝化塩溶液、ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ，Ｇａ ｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ。 ８． 洗浄緩衝液：ＴＢＳＴ−５０ｍＭトリス／ＨＣｌ ｐＨ７．２、１５０ ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％トリトンＸ−１００。 ９． 遮断緩衝液：ＴＢＳＴ、０．１％エタノールアミン ｐＨ７．４。 １０．ＤＭＳＯ、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ。 １１．キナーゼ緩衝液（ＫＢ）：２０ｍＭ ヘペス／ＨＣｌ ｐＨ７．２、１ ５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％トリトンＸ−１００、１ｍＭ ＰＭＳＦ、５ｍｇ ／Ｌアプロテニン、７５ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、０．５ｍＭ ＤＴＴ および１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂。 １２．ＡＴＰ混合物：１００ｍＭ ＭｇＣｌ₂、３００ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍ Ｃｉ γ−³³Ｐ ＡＴＰ（Ｄｕｐｏｎｔ−ＮＥＮ）／ｍＬ。 １３．停止溶液：１％リン酸；Ｆｉｓｈｅｒ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ。 １４．Ｗａｌｌａｃセルロースリン酸フィルターマット；Ｗａｌｌａｃ，Ｔｕ ｒｋｕ，Ｆｉｎｌａｎｄ。 １５．フィルター洗浄溶液：１％リン酸；Ｆｉｓｈｅｒ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇ ｈ，ＰＡ。 １６．Ｔｏｍｔｅｃプレートハーベスター、Ｗａｌｌａｃ，Ｔｕｒｋｕ，Ｆｉ ｎｌａｎｄ。 １７．Ｗａｌｌａｃベータプレートリーダー ＃１２０５、Ｗａｌｌａｃ，Ｔ ｕｒｋｕ，Ｆｉｎｌａｎｄ。 １８．化合物のためのＮＵＮＣ ９６ウェルＶ底ポリプロピレンプレート、Ａ ｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ カタログ番号ＡＳ−７２０９２。方法 特に指示しない限り、以下のすべての工程は室温で実施された。 １． ＥＬＩＳＡプレート被覆：ＥＬＩＳＡウェルは１００μＬのヒツジ抗マ ウスアフィニティー精製抗血清（１ｍｇ／１００ｍＬコーティング緩衝液）によ り４℃で一夜被覆する。 ２． 液体を除くためにプレートを逆さにする。１００μＬの遮断溶液を加え 、３０分間インキュベートする。 ３． 遮断溶液を除き、洗浄緩衝液で４回洗浄する。紙タオル上でプレートを 軽くたたいて余分の液体を除去する。 ４． 各々のウェルに１ｍｇのＲＡＦ−１に特異的な抗体を加え、１時間イン キュベートする。工程３に説明したように洗浄する。 ５． ＲＡＳ／ＲＡＦ感染Ｓｆ９細胞からの細胞溶解液を融解し、ＴＢＳＴで １０ｍｇ／１００ｍＬに希釈する。ウェルに１０ｍｇの希釈溶解液を加えて１時 間インキュベートする。インキュベーションの間、プレートを振盪する。陰性対 照には溶解液を添加しない。ＲＡＳ／ＲＡＦ感染Ｓｆ９昆虫細胞からの細胞溶解 液は、細胞を組換え体バキュロウイルス（各々のウイルスに対し５のＭＯＩで） で感染させ、４８時間後に採取して調製される。細胞はＰＢＳで一度洗浄し、Ｒ ＩＰＡ緩衝液中で溶解する。不溶性物質は遠心分離により除去する（１００００ ｘｇで５分）。細胞溶解液を小分けし、ドライアイス／エタノールで凍結し、使 用するまで−８０℃で保存する。 ６． 非結合物質を除去し、前（工程３）に説明したように洗浄する。 ７． 各ウェルに２ｍｇのＴ−ＭＥＫおよび２ｍｇのＨｉｓ−ＭＡＰＫを加え 、キナーゼ緩衝液で４０ｍＬに容量を調節する。細胞抽出物からＴ−ＭＥＫおよ びＭＡＰＫを精製する方法は本明細書の実施例に提供されている。 ８． 化合物（保存液１０ｍｇ／ｍＬ ＤＭＳＯ）または抽出物を１％ＤＭＳ Ｏを加えたＴＢＳＴで２０倍に前もって希釈する。工程６で説明したウェルに５ ｍＬの前もって希釈した化合物／抽出物を加える。２０分インキュベートする。 対照には薬剤を添加しない。 ９． ５μＬのＡＴＰ混合物を加えることによりキナーゼ反応を開始させる； インキュベーションの間、ＥＬＩＳＡプレート振盪機上でプレートを振盪する。 １０．６０分後、各々のウェルに３０ｍＬの停止溶液を添加することによりキ ナーゼ反応を停止させる。 １１．ホスホセルロースマットおよびＥＬＩＳＡプレートをＴｏｍｔｅｃプレ ートハーベスターに置く。使用説明書に従って採取し、フィルターをフィルター 洗浄溶液で洗浄する。フィルターマットを乾燥する。フィルターマットを封じ、 それらをホルダーに入れる。ホルダーを放射活性検出装置内へ挿入し、フィルタ ーマット上の放射活性リンを定量する。 もしくは、アッセイプレートの個々のウェルからの４０μＬをホスホセルロー スフィルターマットの対応する位置へ移すことができる。フィルターを風乾後、 フィルターをトレー内へ入れる。トレーを穏やかに揺り動かし、１時間の間１５ 分間隔で洗浄溶液を交換する。フィルターを風乾する。フィルターマットを封じ 、それらを試料中の放射活性リンの測定に適したホルダーに入れる。ホルダーを 検 出装置内へ挿入し、フィルターマット上の放射活性リンを定量する。ｊ．ＣＤＫ２／サイタリンＡ−阻害アッセイ このアッセイは外因性基質中のＣＤＫ２タンパク質キナーゼ活性を分析する。試薬 ： Ａ． 緩衝液Ａ（８０ｍＭトリス（ｐＨ７．２）、４０ｍＭ ＭｇＣｌ₂）： ５００ｍｌのＨ₂Ｏに溶解した４．８４ｇトリス（Ｆ．Ｗ．＝１２１．１ｇ／ｍ ｏｌ）、４．０７ｇ ＭｇＣｌ₂（Ｆ．Ｗ．＝２０３．３１ｇ／ｍｏｌ）。ＨＣ ｌでｐＨ７．２に調整する。 Ｂ． ヒストンＨ１溶液（０．４５ｍｇ／ｍｌヒストンＨ１および２０ｍＭヘ ペスｐＨ７．２（ｐＨ７．４はＯＫである）：５ｍｇヒストンＨ１（Ｂｏｅｈｒ ｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を１１．１１１ｍｌの２０ｍＭヘペスｐＨ７． ２（４７７ｍｇのヘペス（Ｆ．Ｗ．＝２３８．３ｇ／ｍｏｌ）を１００ｍｌのＨ₂ Ｏに溶解）に溶解し、１ｍｌずつ−８０℃で保存する。 Ｃ． ＡＴＰ溶液（６０μＭ ＡＴＰ、３００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ、３ｍＭ ＤＴＴ）：１２０μｌの１０ｍＭ ＡＴＰ、６００μｌの１０ｍｇ／ｍｌのＢＳ Ａを２０ｍｌに、１ｍｌずつ−８０℃で保存する。 Ｄ． ＣＤＫ２溶液：１０ｍＭヘペスｐＨ７．２、２５ｍＭ ＮａＣｌ、０． ５ｍＭ ＤＴＴ、１０％グリセロールに溶解したＣＤＫ２／サイクリンＡ、９μ ｌずつ−８０℃で保存する。アッセイの説明 ： １． ｄｄＨ₂Ｏ／１５容量％ＤＭＳＯを用い所望の最終アッセイ濃度の３倍 で阻害剤の溶液を調製する。 ２． ２０μｌの阻害剤をポリプロピレン９６ウェルプレートのウェルに分配 する（または２０μｌの１５％ＤＭＳＯを陽性および陰性対照に）。 ３． ヒストンＨ１溶液（１ｍｌ／プレート）、ＡＴＰ溶液（１ｍｌ／プレー トおよび１ｍを陰性対照に）、およびＣＤＫ２溶液（９μｌ／プレート）を融解 する。ＣＤＫ２は使用するまで氷上に保つ。ＣＤＫ２溶液の一部は繰り返しの凍 結−融解サイクルを避けるのが賢明である。 ４． ９μｌのＣＤＫ２溶液を２ｍｌの緩衝液Ａで希釈する(プレート当たり) 。混合する。各々のウェルに２０μｌを分配する。 ５． １０ｍｌのねじ蓋を持つチューブ中で１ｍｌのヒストンＨ１溶液を１ｍ ｌのＡＴＰ溶液と混合する。０．１５μＣｉ／２０μｌの濃度でγ³³P−ＡＴＰ を加える（アッセイでは０．１５μＣｉ／ウェル）。ＢＳＡの泡立ちを避けるた めに注意深く混合する。適切なウェルへ２０μｌを加える。プレート振盪機上で プレートを混合する。陰性対照のためには、ＡＴＰ溶液を等量の２０ｍＭヘペス ｐＨ７．２、と混合し、０．１５μＣｉ／２０μｌの濃度でγ³³Ｐ−ＡＴＰを加 える。適切なウェルに２０μｌを加える。 ６． 反応を６０分間進行させる。 ７． 各々のウェルに３５μｌの１０％ＴＣＡを加える。プレート振盪機上で プレートを混合する。 ８． 各々の試料の４０μｌをＰ３０フィルターマットの区画にスポットする 。マットを乾燥させる（約１０−２０分）。 ９． フィルターマットを２５０ｍｌの１％リン酸（ｄｄＨ₂Ｏリットル当た り１０ｍｌのリン酸）で１０分間、４回洗浄する。 １０． ベータプレートリーダーでフィルターマットを計数する。２．細胞／生物学的アッセイ アッセイ１：ＰＤＧＦ誘導ＢｒｄＵ取り込みアッセイ 材料および試薬 （１）ＰＤＧＦ：ヒトＰＤＧＦ Ｂ／Ｂ；１２７６−９５６，Ｂｏｅｈｒｉｎ ｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ。 （２）ＢｒｄＵ標識試薬：１０ｍＭ、ＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）、カタログ番 号１ ６４７ ２２９、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａ ｎｙ。 （３）ＦｉｘＤｅｎａｔ：固定溶液（調製済）、カタログ番号１ ６４７ ２ ２９、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ。 （４）抗ＢｒｄＵ−ＰＯＤ：ペルオキシダーゼと結合されたマウスモノクロー ナル抗体、カタログ番号１ ６４７ ２２９、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎ ｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ。 （５）ＴＭＢ基質溶液：テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、調製済、カタロ グ番号１ ６４７ ２２９、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒ ｍａｎｙ。 （６）ＰＢＳ洗浄溶液：１ＸＰＢＳ、ｐＨ７．４、会社で作製（Ｓｕｇｅｎ， Ｉｎｃ．，Ｒｅｄｗｏｏｄ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）。 （７）アルブミン、ウシ（ＢＳＡ）:分画Ｖ粉末;Ａ−８５５１、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，ＵＳＡ。 （８）ヒトＰＤＧＦ−Ｒを発現するように遺伝子操作されている３Ｔ３細胞株 。プロトコール （１）９６ウェルプレートにＤＭＥＭ、１０％ＣＳ、２ｍＭＧｌｎ溶液として ８０００細胞／ウェルで細胞を播種する。細胞は５％ＣＯ₂雰囲気下、３７℃で 一夜インキュベートする。 （２）２４時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、無血清培地（０．１％ＢＳＡを含 む０％ＣＳ ＤＭＥＭ）で２４時間血清飢餓状態にする。 （３）３日目、リガンド（ＰＤＧＦ、３．８ｎＭ、０．１％ＢＳＡを含む０％ ＣＳ ＤＭＥＭで調製）および試験化合物を細胞に同時に加える。陰性対照ウェ ルは０．１％ＢＳＡを含む無血清ＤＭＥＭのみを与え；陽性対照細胞にはリガン ド（ＰＤＧＦ）を与えるが試験化合物は与えない。試験化合物は９６ウェルプレ ート中、リガンドを含む無血清ＤＭＥＭで調製され、７試験濃度に連続的に希釈 される。 （４）リガンド活性化２０時間後、希釈されたＢｒｄＵ標識試薬（０．１％Ｂ ＳＡを含むＤＭＥＭで１：１００に）を加え、細胞をＢｒｄＵ（最終濃度＝１０ μＭ）と１．５時間インキュベートする。 （５）標識試薬とのインキュベーション後、デカントおよび紙タオル上に逆に したプレートを軽くたたくことにより培地を除去する。ＦｉｘＤｅｎａｔ溶液を 加え（５０μｌ／ウェル）、プレート振盪機上、室温で４５分間プレートをイン キュベートする。 （６）ＦｉｘＤｅｎａｔ溶液はデカントおよび紙タオル上に逆にしたプレート を軽くたたくことにより完全に除去する。遮断溶液としてミルク（５％脱水ミル クＰＢＳ溶液、２００ｕｌ／ウェル）を加え、プレート振盪機上、室温で３０分 間プレートをインキュベートする。 （７）デカントすることにより遮断溶液を除き、ＰＢＳで１回洗浄する。抗Ｂ ｒｄＵ−ＰＯＤ溶液（１％ＢＳＡを含むＰＢＳで１：１００希釈）を加え（１０ ０μｌ／ウェル）、プレート振盪機上、室温で９０分間プレートをインキュベー トする。 （８）デカントし、ＰＢＳで５回すすぐことにより抗体結合物を完全に除去し 、紙タオル上で軽くたたくことによりプレートを乾燥させる。 （９）ＴＭＢ基質溶液を加え（１００μｌ／ウェル）、発色が吸光光度検出に 十分になるまでプレート振盪機上、室温で２０分間プレートをインキュベートす る。 （１０）試料の吸光度はＤｙｎａｔｅｃｈ ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用 い４１０ｎｍで測定される（対照波長として４９０ｎｍでのフィルター読み取り を行う”二波長”モードで）。アッセイ２：ＥＧＦ誘導ＢｒｄＵ取り込みアッセイ 材料および試薬 （１）ＥＧＦ：マウスＥＧＦ、２０１；Ｔｏｙｏｂｏ，Ｃｏ．，Ｌｔｄ．Ｊａ ｐａｎ。 （２）ＢｒｄＵ標識試薬：１０ｍＭ、ＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）、カタログ番 号１ ６４７ ２２９、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａ ｎｙ。 （３）ＦｉｘＤｅｎａｔ：固定溶液（調製済）、カタログ番号１ ６４７ ２ ２９、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ。 （４）抗ＢｒｄＵ−ＰＯＤ：ペルオキシダーゼと結合されたマウスモノクロー ナル抗体、カタログ番号１ ６４７ ２２９、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎ ｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ。 （５）ＴＭＢ基質溶液：テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、調製済、カタロ グ番号１ ６４７ ２２９、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒ ｍａｎｙ。 （６）ＰＢＳ洗浄溶液：１ＸＰＢＳ、ｐＨ７．４、会社で作製（Ｓｕｇｅｎ， Ｉｎｃ．，Ｒｅｄｗｏｏｄ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）。 （７）アルブミン、ウシ（ＢＳＡ）:分画Ｖ粉末;Ａ−８５５１、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，ＵＳＡ。 （８）ヒトＥＧＦ−Ｒを発現するように遺伝子操作されている３Ｔ３細胞株。プロトコール （１）９６ウェルプレートにＤＭＥＭ、１０％ＣＳ、２ｍＭＧｌｎ溶液として ８０００細胞／ウェルで細胞を播種する。細胞は５％ＣＯ₂雰囲気下、３７℃で 一夜インキュベートする。 （２）２４時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、無血清培地（０．１％ＢＳＡを含 む０％ＣＳ ＤＭＥＭ）で２４時間血清飢餓状態にする。 （３）３日目、リガンド（ＥＧＦ、２ｎＭ、０．１％ＢＳＡを含む０％ＣＳ ＤＭＥＭで調製）および試験化合物を細胞に同時に加える。陰性対照ウェルは０ ．１％ＢＳＡを含む無血清ＤＭＥＭのみを与え；陽性対照細胞にはリガンド（Ｅ ＧＦ）を与えるが試験化合物は与えない。試験化合物は９６ウェルプレート中、 リガンドを含む無血清ＤＭＥＭで調製され、７試験濃度に連続的に希釈される。 （４）リガンド活性化２０時間後、希釈されたＢｒｄＵ標識試薬（０．１％Ｂ ＳＡを含むＤＭＥＭで１：１００に）を加え、細胞をＢｒｄＵ（最終濃度＝１０ μＭ）と１．５時間インキュベートする。 （５）標識試薬とのインキュベーション後、デカントおよび紙タオル上に逆に したプレートを軽くたたくことにより培地を除去する。ＦｉｘＤｅｎａｔ溶液を 加え（５０μｌ／ウェル）、プレート振盪機上、室温で４５分間プレートをイン キュベートする。 （６）ＦｉｘＤｅｎａｔ溶液はデカントおよび紙タオル上に逆にしたプレート を軽くたたくことにより完全に除去する。遮断溶液としてミルタ（５％脱水ミル クＰＢＳ溶液、２００μｌ／ウェル）を加え、プレート振盪機上、室温で３０分 間プレートをインキュベートする。 （７）デカントすることにより遮断溶液を除き、ＰＢＳで１回洗浄する。抗Ｂ ｒｄＵ−ＰＯＤ溶液（１％ＢＳＡを含むＰＢＳで１：１００希釈）を加え（１０ ０μｌ／ウェル）、プレート振盪機上、室温で９０分間プレートをインキュベー トする。 （８）デカントし、ＰＢＳで５回すすぐことにより抗体結合物を完全に除去し 、紙タオル上で軽くたたくことによりプレートを乾燥させる。 （９）ＴＭＢ基質溶液を加え（１００μｌ／ウェル）、発色が吸光光度検出に 十分になるまでプレート振盪機上、室温で２０分間プレートをインキュベートす る。 （１０）試料の吸光度はＤｙｎａｔｅｃｈ ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用 い４１０ｎｍで測定される（対照波長として４９０ｎｍでのフィルター読み取り を行う”二波長”モードで）。アッセイ３：ＥＧＦ誘導Ｈｅｒ２−由来ＢｒｄＵ取り込み 材料および試薬 （１）ＥＧＦ：マウスＥＧＦ、２０１；Ｔｏｙｏｂｏ，Ｃｏ．，Ｌｔｄ．Ｊａ ｐａｎ。 （２）ＢｒｄＵ標識試薬：１０ｍＭ、ＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）、カタログ番 号１ ６４７ ２２９、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａ ｎｙ。 （３）ＦｉｘＤｅｎａｔ：固定溶液（調製済）、カタログ番号１ ６４７ ２ ２９、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ。 （４）抗ＢｒｄＵ−ＰＯＤ：ペルオキシダーゼと結合されたマウスモノクロー ナル抗体、カタログ番号１ ６４７ ２２９、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎ ｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ。 （５）ＴＭＢ基質溶液：テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、調製済、カタロ グ番号１ ６４７ ２２９、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒ ｍａｎｙ。 （６）ＰＢＳ洗浄溶液：１ＸＰＢＳ、ｐＨ７．４、会社で作製。 （７）アルブミン、ウシ（ＢＳＡ）：分画Ｖ粉末;Ａ−８５５１、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，ＵＳＡ。 （８）ＥＧＦ−Ｒの細胞外ドメインおよびＨｅｒ２の細胞内ドメインを持って いるキメラレセプターを発現するように遺伝子操作されている３Ｔ３細胞株。プロトコール （１）９６ウェルプレートにＤＭＥＭ、１０％ＣＳ、２ｍＭＧｌｎ溶液として ８０００細胞／ウェルで細胞を播種する。細胞は５％ＣＯ₂雰囲気下、３７℃で 一夜インキュベートする。 （２）２４時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、無血清培地（０．１％ＢＳＡを含 む０％ＣＳ ＤＭＥＭ）で２４時間血清飢餓状態にする。 （３）３日目、リガンド（ＥＧＦ、２ｎＭ、０．１％ＢＳＡを含む０％ＣＳ ＤＭＥＭで調製）および試験化合物を細胞に同時に加える。陰性対照ウェルは０ ．１％ＢＳＡを含む無血清ＤＭＥＭのみを与え；陽性対照細胞にはリガンド（Ｅ ＧＦ）を与えるが試験化合物は与えない。試験化合物は９６ウェルプレート中、 リガンドを含む無血清ＤＭＥＭで調製され、７試験濃度に連続的に希釈される。 （４）リガンド活性化２０時間後、希釈されたＢｒｄＵ標識試薬（０．１％Ｂ ＳＡを含むＤＭＥＭで１：１００に）を加え、細胞をＢｒｄＵ（最終濃度＝１０ μＭ）と１．５時間インキュベートする。 （５）標識試薬とのインキュベーション後、デカントおよび紙タオル上に逆に したプレートを軽くたたくことにより培地を除去する。ＦｉｘＤｅｎａｔ溶液を 加え（５０μｌ／ウェル）、プレート振盪機上、室温で４５分間プレートをイン キュベートする。 （６）ＦｉｘＤｅｎａｔ溶液はデカントおよび紙タオル上に逆にしたプレート を軽くたたくことにより完全に除去する。遮断溶液としてミルク（５％脱水ミル クＰＢＳ溶液、２００μｌ／ウェル）を加え、プレート振盪機上、室温で３０分 間プレートをインキュベートする。 （７）デカントすることにより遮断溶液を除き、ＰＢＳで１回洗浄する。抗Ｂ ｒｄＵ−ＰＯＤ溶液（１％ＢＳＡを含むＰＢＳで１：１００希釈）を加え（１０ ０μｌ／ウェル）、プレート振盪機上、室温で９０分間プレートをインキュベー トする。 （８）デカントし、ＰＢＳで５回すすぐことにより抗体結合物を完全に除去し 、紙タオル上で軽くたたくことによりプレートを乾燥させる。 （９）ＴＭＢ基質溶液を加え（１００μｌ／ウェル）、発色が吸光光度検出に 十分になるまでプレート振盪機上、室温で２０分間プレートをインキュベートす る。 （１０）試料の吸光度はＤｙｎａｔｅｃｈ ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用 い４１０ｎｍで測定される（対照波長として４９０ｎｍでのフィルター読み取り を行う”二波長”モードで）。アッセイ４：ＩＧＦ１誘導ＢｒｄＵ取り込みアッセイ 材料および試薬 （１）ＩＧＦＩリガンド：ヒト、組換え体；Ｇ５１１、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏ ｒｐ．，ＵＳＡ。 （２）ＢｒｄＵ標識試薬：１０ｍＭ、ＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）、カタログ番 号１ ６４７ ２２９、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａ ｎｙ。 （３）ＦｉｘＤｅｎａｔ：固定溶液（調製済）、カタログ番号１ ６４７ ２ ２９、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ。 （４）抗ＢｒｄＵ−ＰＯＤ：ペルオキシダーゼと結合されたマウスモノクロー ナル抗体、カタログ番号１ ６４７ ２２９、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎ ｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ。 （５）ＴＭＢ基質溶液：テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、調製済、カタロ グ番号１ ６４７ ２２９、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒ ｍａｎｙ。 （６）ＰＢＳ洗浄溶液：１ＸＰＢＳ，ｐＨ７．４、会社で作製（Ｓｕｇｅｎ， Ｉｎｃ．，Ｒｅｄｗｏｏｄ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）。 （７）アルブミン、ウシ（ＢＳＡ）：分画Ｖ粉末;Ａ−８５５１、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，ＵＳＡ。 （８）ヒトＩＧＦ−１レセプターを発現するように遺伝子操作されている３Ｔ ３細胞株。プロトコール （１）９６ウェルプレートにＤＭＥＭ、１０％ＣＳ、２ｍＭＧｌｎ溶液として ８０００細胞／ウェルで細胞を播種する。細胞は５％ＣＯ₂雰囲気下、３７℃で 一夜インキュベートする。 （２）２４時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、無血清培地（０．１％ＢＳＡを含 む０％ＣＳ ＤＭＥＭ）で２４時間血清飢餓状態にする。 （３）３日目、リガンド（ＩＧＦ１＝３．３ｎＭ、０．１％ＢＳＡを含む０％ ＣＳ ＤＭＥＭで調製）および試験化合物を細胞に同時に加える。陰性対照ウェ ルは０．１％ＢＳＡを含む無血清ＤＭＥＭのみを与え；陽性対照細胞にはリガン ド（ＩＧＦ１）を与えるが試験化合物は与えない。試験化合物は９６ウェルプレ ート中、リガンドを含む無血清ＤＭＥＭで調製され、７試験濃度に連続的に希釈 される。 （４）リガンド活性化１６時間後、希釈されたＢｒｄＵ標識試薬（０．１％Ｂ ＳＡを含むＤＭＥＭで１：１００に）を加え、細胞をＢｒｄＵ（最終濃度＝１０ μＭ）と１．５時間インキュベートする。 （５）標識試薬とのインキュベーション後、デカントおよび紙タオル上に逆に したプレートを軽くたたくことにより培地を除去する。ＦｉｘＤｅｎａｔ溶液を 加え（５０μｌ／ウェル）、プレート振盪機上、室温で４５分間プレートをイン キュベートする。 （６）ＦｉｘＤｅｎａｔ溶液はデカントおよび紙タオル上に逆にしたプレート を軽くたたくことにより完全に除去する。遮断溶液としてミルク（５％脱水ミル クＰＢＳ溶液、２００μｌ／ウェル）を加え、プレート振盪機上、室温で３０分 間プレートをインキュベートする。 （７）デカントすることにより遮断溶液を除き、ＰＢＳで１回洗浄する。抗Ｂ ｒｄＵ−ＰＯＤ溶液（１％ＢＳＡを含むＰＢＳで１：１００希釈）を加え（１０ ０μｌ／ウェル）、プレート振盪機上、室温で９０分間プレートをインキュベー トする。 （８）デカントし、ＰＢＳで５回すすぐことにより抗体結合物を完全に除去し 、紙タオル上で軽くたたくことによりプレートを乾燥させる。 （９）ＴＭＢ基質溶液を加え（１００μｌ／ウェル）、発色が吸光光度検出に 十分になるまでプレート振盪機上、室温で２０分間プレートをインキュベートす る。 （１０）試料の吸光度はＤｙｎａｔｅｃｈ ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用 い４１０ｎｍで測定される（対照波長として４９０ｎｍでのフィルター読み取り を行う”二波長”モードで）。ｇ．ＨＵＶ−ＥＣ−Ｃアッセイ 以下のプロトコールがＰＤＧＦ−Ｒ、ＦＧＦ−Ｒ、ＶＥＧＦ、ａＦＧＦまたは Ｆｌｋ−１／ＫＤＲ（これらはすべてＨＵＶ−ＥＣ細胞により天然に発現されて いる）に対する化合物の活性を測定するために使用された。０日目 １．ＨＵＶ−ＥＣ−Ｃ細胞（ヒト臍帯静脈内皮細胞、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙ ｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ;カタログ番号１７３０ ＣＲＬ ） を洗浄し、トリプシン処理する。約１ｍｌ／１０ｃｍ²組織培養フラスコで２回 、ダルベッコリン酸緩衝塩溶液(Ｄ−ＰＢＳ;Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬから入手された ；カタログ番号１４１９０−０２９)を用いて洗浄する。非酵素的細胞解離溶液 （Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ；カタログ番号Ｃ−１５４４ ）中、０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡでトリプシン処理する。０．０５％トリ プシンは０．２５％トリプシン／１ｍＭ ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ；カタログ番号 ２５２００−０４９）を細胞解離溶液で希釈することにより作製される。約１ｍ ｌ／２５−３０ｃｍ²組織培養フラスコで５分間、３７℃にてトリプシン処理す る。細胞がフラスコから離れた後、等量のアッセイ培地を加えて５０ｍｌの滅菌 遠心分離管（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；カタログ番号０５−５３９ −６）に移す。 ２．アッセイ培地を加えることにより５０ｍｌの滅菌遠心分離管中、約３５ｍ ｌのアッセイ培地で細胞を洗浄し、約２００ｇで１０分遠心分離し、上清を吸引 し、３５ｍｌのＤ−ＰＢＳに再懸濁する。Ｄ−ＰＢＳでさらに２回洗浄を繰り返 し、約１ｍｌアッセイ培地／１５ｃｍ²組織培養フラスコに細胞を再懸濁する。 アッセイ培地はＦ１２Ｋ培地（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ；カタログ番号２１１２７− ０１４）＋０．５％熱不活性化ウシ胎児血清から成っている。タールターカウン ター（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．）で細胞を計数し、 ０．８−１．０ｘ１０⁵細胞／ｍｌの濃度が得られるようにアッセイ培地を加え る。 ３．細胞を９６ウェル平底プレートに１００μｌ／ウェルまたは０．８−１． ０ｘ１０⁵細胞／ウェルで加える；３７℃、５％ＣＯ₂で約２４時間インキュベー トする。１日目 １．別の９６ウェルプレートに２倍薬剤タイトレーションを用意する、一般に ５０μＭから０μＭへ。前記０日目工程２で説明したアッセイ培地と同じものを 使用する。２００μＭ（４Ｘ最終ウェル濃度）の薬剤を９０μｌ／ウェルで特定 のプレートカラムへ加えることによりタイトレーションを行う。保存薬剤濃度は 通常２０ｍＭ ＤＭＳＯ溶液であるので、２００μＭ薬剤濃度では２％のＤＭＳ Ｏを含んでいる。従って、薬剤を希釈する一方でＤＭＳＯ濃度を一定に保つため 、アッセイ培地（Ｆｌ２Ｋ＋０．５％ウシ胎児血清）で２％ＤＭＳＯに調製され た希釈液が薬剤タイトレーションの希釈液として使用される。この希釈液を６０ μｌ／ウェルでカラムの残りのウェルに加える。カラムの一番上のウェルにある ２００μＭ薬剤希釈液１２０μｌから６０μｌをとり、カラムの第二のウェル中 の６０μｌと混合する。このウェルから６０μｌをとり、カラムの第三のウェル 中の６０μｌと混合し、以下２倍タイトレーションが完了するまで続ける。最後 の一つ前のウェルが混合された時、このウェル中にある１２０μｌから６０μｌ をとって捨てる。６０μｌのＤＭＳＯ／培地希釈液を含む最後のウェルは、非薬 剤含有対照として残す。１）ＶＥＧＦ（Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ Ｉｎｃ．より入 手した、カタログ番号１００−２００）、２）内皮細胞増殖因子（ＥＣＧＦ）（ 酸性繊維芽細胞増殖因子、ａＦＧＦとしても知られている）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇ ｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａから入手された、カタログ番号 １４３９ ６００）、または３）ヒトＰＤＧＦ Ｂ／Ｂ（１２７６−９５６、Ｂ ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）およびアッセイ培地 対照のための各々に３重のウェルを作るのに十分なように、９カラムのタイトレ ーとされた薬剤を作製する。ＥＣＧＦはヘパリンナトリウムで調製される。 ２． ０日目のＨＵＶ−ＥＣ−Ｃ細胞の０．８−１．０ｘ１０⁴細胞／１００ μｌ／ウェルを含む９６ウェルアッセイプレートへ薬剤希釈液を５０μｌ／ウェ ルで加え、３７℃、５％ＣＯ₂で約２時間インキュベートする。 ３． ３重に、８０μｇ／ｍｌ ＶＥＧＦを５０μｌ／ウェル、２０ｎｇ／ｍ ｌのＥＣＧＦまたは培地対照を各々の薬剤条件に加える。薬剤と同じように、増 殖因子濃度は４Ｘ所望の最終濃度である。増殖因子の濃度を調整するためには０ 日目工程２のアッセイ培地を使用する。３７℃、５％ＣＯ₂で約２４時間インキ ュベートする。各々のウェルは５０μｌの薬剤希釈液、５０μｌの増殖因子また は培地および１００μｌの細胞を含んでおり、総計で２００μｌ／ウェルであろ う。従って、薬剤および増殖因子の４Ｘ濃度は、すべてのものがウェルに加えら れたら１Ｘになる。２日目 １． １μＣｉ／ウェルで³Ｈ−チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ；カタログ番号 ＴＲＫ−６８６）を加え（ＲＰＭＩ培地＋１０％熱不活性化ウシ胎児血清で調製 した１００μＣｉ／ｍｌ溶液を１０μｌ／ウェル）、３７℃、５％ＣＯ₂で約２ ４時間インキュベートする。注：³Ｈ−チミジンを使用するすべての他の応用で はＲＰＭＩで行われる実験が含まれているので、³Ｈ−チミジンはＲＰＭＩ培地 で調製される。この工程での培地変化はおそらく重要なことではないであろう。 ＲＰＭＩはＧｉｂｃｏ ＢＲＬ（カタログ番号１１８７５−０５１）から入手さ れた。３日目 １． −２０℃で一夜プレートを凍結させる。４日目 １． プレートを融解し、フィルターマット（Ｗａｌｌａｃ；カタログ番号１ ２０５−４０１）上に９６ウェルプレートハーベスター（Ｔｏｍｔｅｃ Ｈａｒ ｖｅｓｔｅｒ ９６Ｒ）を用いて採取し；Ｗａｌｌａｃ ＢｅｔａｐｌａｔｅＴ Ｍ液体シンチレーションカウンターでカウントを読みとる。３．インビボ動物モデル Ａ．異種移植片動物モデル 無胸腺マウス（例えば、Ｂａｌｂ／ｃ、ｎｕ／ｎｕ）内で異種移植片として増 殖するヒト腫瘍の能力は、ヒト腫瘍治療に対する生物学的応答を研究するための 有用なインビボモデルとなる。ヒト腫瘍の無胸腺マウス内への異物移植術が最初 に成功して以来（Ｒｙｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｏｖｌｓｅｎ，１９６９，Ａｃｔ ａ Ｐａｔｈｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｓｃａｎｄ ．７７：７５８−７６０） 、多くの異なったヒト腫瘍細胞株（例えば、乳腺、肺、泌尿生殖器、胃腸、頭部 および頸部、グリア芽腫、骨および悪性メラノーマ）が移植され、ヌードマウス で うまく増殖された。以下のアッセイが本発明の異なった化合物の活性、特異性お よび効果を決定するために使用される。三つの一般的な型のアッセイが化合物を 評価するために有用である：細胞／触媒的、細胞／生物学的およびインビボ。細 胞／触媒的アッセイの目的は細胞中の既知の基質上のチロシンをリン酸化するＴ Ｋの能力に及ぼす化合物の影響を決定することである。細胞／生物学的アッセイ の目的は細胞中のＴＫにより刺激される生物学的応答に及ぼす化合物の影響を決 定することである。インビボアッセイの目的は、癌のような特定の障害の動物モ デルにおける化合物の効果を決定することである。 皮下異種移植片実験に適した細胞株にはＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＩＧＦ−ＩＲ または他の試験キナーゼを過剰発現するように遺伝子操作されたＣ６細胞（グリ オーマ、ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ１０７）、Ａ３７５細胞（メラノーマ、ＡＴＣＣ＃Ｃ ＲＬ１６１９）、Ａ４３１細胞（表皮癌、ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１５５５）、Ｃａｌ ｕ６細胞（肺、ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ５６）、ＰＣ３細胞（前立腺、ＡＴＣＣ＃ＣＲ Ｌ１４３５）、ＳＫＯＶ３ＴＰ５細胞およびＮＩＨ ３Ｔ３繊維芽細胞が含まれ る。以下のプロトコールが異種移植片実験を実施するために使用できる： メス無胸腺マウス（Ｂａｌｂ／ｃ、ｎｕ／ｎｕ）はＳｉｍｏｎｓｅｎ Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｇｉｌｒｏｙ，ＣＡ）から入手した。すべての動物はＡｌ ｐｈａ−ｄｒｉ床のＭｉｃｒｏ−ｉｓｏｌａｔｏｒケージ中でクリーンルーム条 件下で維持された。動物には滅菌齧歯動物食物および水が自由に与えられた。 細胞株は適切な培地（例えば、５％−１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）および ２ｍＭグルタミン（ＧＬＮ）を加えたＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ハムＦ１０またはハム Ｆ１２）で増殖させる。すべての細胞培養培地、グルタミンおよびウシ胎児血清 は特に指示しない限りＧｉｂｃｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇｒ ａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）から購入された。すべての細胞は９０−９５％空 気および５−１０％ＣＯ₂の加湿した雰囲気中、３７℃で増殖させた。すべての 細胞は週２回定期的に継代培養され、Ｍｙｃｏｔｅｃｔ法（Ｇｉｂｃｏ）により マイコプラズマ陰性であると判定された。 細胞はコンフルエントでまたはそれ近くで０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡに より採取され、４５０ｘｇ、１０分でペレット化された。ペレットは滅菌ＰＢＳ または培地（ＦＢＳを含まない）で特定の濃度に再懸濁され、細胞はマウスの後 脚内へ移植された（群当たり８−１０匹のマウス、２−１０ｘ１０⁶細胞／動物 ）。腫瘍増殖はベニアーカリパスを用いて３から６週にわたって測定された。腫 瘍容量は特に指示しない限り長さｘ幅ｘ高さの積として計算された。Ｐ値はスチ ューデントｔ−テストを用いて計算された。５０−１００μＬの賦形剤（ＤＭＳ ＯまたはＶＰＤ：Ｄ５Ｗ）に溶解した試験化合物は異なった濃度のＩＰ注射によ り送達され、一般的には移植１日後から始める。Ｂ．腫瘍侵襲モデル 以下の腫瘍侵襲モデルが開発され、ＫＤＲ／ＦＬＫ−１レセプターを特異的に 阻害することが同定された化合物の治療的価値および効能の評価に使用される。方法 ８週齢ヌードマウス（メス）（Ｓｉｍｏｎｓｅｎ Ｉｎｃ．）が実験動物とし て使用された。腫瘍細胞の移植は層流フードで行われた。麻酔のためキシラジン ／ケタミンカタテル(１００ｍｇ／ｋｇケタミンおよび５ｍｇ／ｋｇキシラジン) が腹腔内へ投与された。腹部腔を露出させるために正中線切開が行われ（約１． ５ｃｍの長さ）、１００μｌの培地に含まれた１０⁷腫瘍細胞が注入された。細 胞は膵臓の十二指腸小葉内または結腸の漿膜下に注入された。腹膜および筋肉は ６−０絹糸連続縫合で閉じられ、皮膚は創傷クリップで閉じられた。動物は毎日 観察された。分析 ２−６週間後（動物の肉眼的観察に依存して）、マウスを殺し、種々の器官（ 肺、肝臓、脳、胃、脾臓、心臓、筋肉）への局所腫瘍転移が切り出され、分析さ れた（腫瘍サイズの測定、侵襲の程度、免疫化学およびインシチュハイブリダイ ゼーション）。Ｄ．細胞毒性の測定 治療的化合物は毒性効果を働かせるよりもプロテインキナーゼ活性を阻害する ことにより強力でなければならない。化合物の有効性および細胞毒性の尺度は治 療的指標：ＩＣ₅₀／ＬＤ₅₀を決定することにより得ることができる。５０％阻害 を達成するのに必要とされる量であるＩＣ₅₀は本明細書に記載されているような 標準技術を用いて測定できる。５０％毒性を生じるＬＤ₅₀は標準技術（Ｍｏｓｓ ｍａｎ，１９８３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，６５：５５−６３） により、放出されたＬＤＨ量を測定することにより（Ｋｏｒｚｅｎｉｅｗｓｋｉ ａｎｄ Ｃａｌｌｅｗａｅｒｔ，１９８３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏ ｄｓ ，６４：３１３；Ｄｅｃｋｅｒ ａｎｄ Ｌｏｈｍａｎｎ−Ｍａｔｔｈｅｓ ，１９８８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１１５：６１）、または動 物モデルの致死量を測定することにより測定できる。大きな治療的指標を持つ化 合物が好適である。治療的指標は２よりも大きくなければならず、好適には少な くとも１０、より好適には少なくとも５０である。結論 従って、本発明の化合物、方法および医薬組成物はＰＫ活性を調節するのに有 効であり、それ故ＲＴＫ、ＣＴＫおよびＳＴＫ関連障害に対する治療薬として有 効であることが期待される。 ある種の態様および実施例が本発明を説明するために使用されてきたが、示さ れた態様および実施例の変更が本発明の範囲および精神から離れることなく行え るであろうことを当業者は理解するであろう。 他の態様は以下の請求の範囲内に含まれる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 31/423 Ａ６１Ｋ 31/423 31/428 31/428 31/4365 31/4365 31/437 31/437 31/454 31/454 31/4709 31/4709 31/4725 31/4725 31/513 31/513 31/519 31/519 31/5377 31/5377 Ａ６１Ｐ 1/16 Ａ６１Ｐ 1/16 3/10 3/10 9/00 9/00 9/10 １０１ 9/10 １０１ 13/12 13/12 35/00 35/00 43/00 １１１ 43/00 １１１ Ｃ０７Ｄ 209/36 Ｃ０７Ｄ 209/36 209/42 209/42 401/14 401/14 403/06 403/06 405/06 405/06 409/06 409/06 409/14 409/14 413/06 413/06 417/06 417/06 471/04 １０４ 471/04 １０４Ｚ 487/04 １４０ 487/04 １４０ 495/04 １０５ 495/04 １０５Ａ (31)優先権主張番号 ６０／０４９，３２４ (32)優先日 平成９年６月11日(1997．6．11) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／０５０，４１２ (32)優先日 平成９年６月20日(1997．6．20) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／０５０，４１３ (32)優先日 平成９年６月20日(1997．6．20) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／０５０，９７７ (32)優先日 平成９年６月20日(1997．6．20) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／０５９，３３６ (32)優先日 平成９年９月19日(1997．9．19) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／０５９，３８１ (32)優先日 平成９年９月19日(1997．9．19) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／０５９，３８４ (32)優先日 平成９年９月19日(1997．9．19) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／０５９，５４４ (32)優先日 平成９年９月19日(1997．9．19) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／０５９，６７７ (32)優先日 平成９年９月19日(1997．9．19) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／０５９，９７１ (32)優先日 平成９年９月25日(1997．9．25) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／０６０，１９４ (32)優先日 平成９年９月26日(1997．9．26) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 マクマホン，ジェラルド アメリカ合衆国カリフォルニア州95452, ケンウッド，シュルツ・ロード 1800 (72)発明者 ショーバー，ローラ・ケイ アメリカ合衆国カリフォルニア州94112, サンフランシスコ，コッター・ストリート 216 (72)発明者 ハース，クラウス・ピーター アメリカ合衆国カリフォルニア州94114, サンフランシスコ，コリングスウッド・ス トリート 334

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 次の化学構造： ［式中、 Ａ¹、Ａ²、Ａ³およびＡ⁴は、独立して、炭素および窒素からなる群より選択され 、ただし、理解されるように、形成される９員の二環は化学の技術分野において 知られるものであり；さらに理解されるように、Ａ¹、Ａ²、Ａ³またはＡ⁴が窒素 である場合、Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵またはＲ⁶はそれぞれ存在せず； Ｒ¹は、水素、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール 、ヘテロアリール、トリハロメタンカルボニル、ヘテロ脂環式、ヒドロキシ、ア ルコキシ、カルボニル、Ｃ−カルボキシ、Ｏ−カルボキシ、Ｃ−アミド、Ｃ−チ オアミド、グアニル、グアニジニル、ウレイジル、スルホニルおよびトリハロメ タンスルホニルからなる群より選択され； Ｒ²は、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロ 脂環式およびハロからなる群より選択され； Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵およびＲ⁶は、独立して、水素、アルキル、トリハロメチル、シク ロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロ脂環 式、ヒドロキシ、チオヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、チオヒドロキ シ、チオアルコキシ、チオアリールオキシ、スルフィニル、スルホニル、Ｓ−ス ルホンアミド、Ｎ−スルホンアミド、Ｎ−トリハロメタンスルホンアミド、カル ボニル、アルデヒド、トリハロメチル−カルボニル、Ｃ−カルボキシ、Ｏ−カル ボキシ、シアノ、ニトロ、ハロ、シアナト、イソシアナト、チオシアナト、イソ チオシアナト、Ｏ−カルバミル、Ｎ−カルバミル、Ｏ−チオカルバミル、Ｎ−チ オカルバミル、ホスホニル、グアニル、グアニジニル、ウレイジル、Ｃ−アミド 、Ｎ−アミド、アミノ、４級アンモニウム、−ＮＲ¹⁸Ｒ¹⁹、−Ｗ（ＣＨ₂）_mＮＲ¹⁸ Ｒ¹⁹、−Ｗ（ＣＨ₂）_mＣ（＝Ｙ）Ｔ、−Ｎ＝ＣＮＲ¹⁸Ｒ¹⁹、−ＮＨＲ²⁰および −（ａｌｋ₁）_rＭからなる群より選択され； Ｒ¹⁸およびＲ¹⁹は、独立して、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、カ ルボニル、アセチル、トリハロメチルカルボニル、Ｃ−カルボキシ、トリハロメ タンスルホニル、スルホニル、Ｃ−ペプチジルからなる群より選択され、または 一緒になって５員または６員のヘテロ脂環式環であり； Ｗは、窒素、酸素およびイオウからなる群より選択され； （ａｌｋ１）は、−ＣＲＲ’−、−ＣＲ＝ＣＲ’−および−Ｃ≡Ｃ−からなる群 より選択され； ＲおよびＲ’は、独立して、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、アル コキシ、チオアルコキシ、アリールオキシおよびハロからなる群より選択され； ｒは１−１０であり； Ｍは極性基であり； Ｔは、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アミノ、Ｎ−ヒドロキシルア ミノ、Ｏ−カルボキシ、−ＮＲ¹⁸Ｒ¹⁹および−Ｎ−ペプチジルからなる群より選 択され； ｍは、０、１、２または３であり； Ｙは、酸素およびイオウからなる群より選択され； Ｒ²⁰はポリヒドロキシアルキル基であり； Ｒ³およびＲ⁴またはＲ⁴およびＲ⁵またはＲ⁵およびＲ⁶は、一緒になって、シクロ アルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロ脂環式、メチレンジオキシまたは エチレンジオキシ基を形成してもよく； Ｑは、以下の基からなる群より選択され：Ｂ¹およびＢ²は、ヘテロアリール環Ｑ¹が化学の技術分野において知られるもの であるように炭素、窒素、酸素およびイオウからなる群より選択され； Ｄ¹は、炭素および窒素からなる群より選択され； Ｄ²は、窒素、酸素およびイオウからなる群より選択され、ただし、理解される ように、Ｄ¹が窒素でありかつＤ²が酸素またはイオウである場合、Ｒ⁷またはＲ⁸ はそれぞれ存在せず； Ｅ¹は、炭素および窒素からなる群より選択され； Ｅ²は、窒素、酸素およびイオウからなる群より選択され、ただし、理解される ように、Ｅ¹が窒素でありかつＥ²が酸素またはイオウである場合、Ｒ⁸は存在せ ず； Ｊ¹は、酸素、窒素およびイオウからなる群より選択され； Ｊ²、Ｊ³およびＪ⁴は、独立して、５員のヘテロアリール環Ｑ⁴が化学の技術分野 において知られるものであるように、炭素、窒素、酸素およびイオウからなる群 より選択され、ただし、理解されるように、Ｊ²、Ｊ³またはＪ⁴が窒素、酸素ま たはイオウである場合、Ｒ⁸、Ｒ⁸'またはＲ⁸"は、それぞれ存在せず、同様に、 Ｊ¹が酸素またはイオウである場合、Ｒ⁷は存在せず； Ｌ¹、Ｌ²、Ｌ³、Ｌ⁴およびＬ⁵は、独立して、形成される任意の６員の窒素含有 ヘテロアリール環Ｑ⁵が化学の技術分野において知られるものであるように、炭 素および窒素からなる群より選択され、ただし、理解されるように、Ｌ¹、Ｌ²、 Ｌ³、Ｌ⁴またはＬ⁵が窒素である場合、Ｒ¹³、Ｒ¹⁴、Ｒ¹⁵、Ｒ¹⁶またはＲ¹⁷は、 それぞれ存在せず； Ｒ⁷、Ｒ⁸、Ｒ⁸'、Ｒ⁸"、Ｒ⁹、Ｒ⁹'、Ｒ¹⁰、Ｒ¹⁰'、Ｒ¹¹、Ｒ¹¹、Ｒ¹²、Ｒ¹²'、 Ｒ¹³、Ｒ¹⁴、Ｒ¹⁵、Ｒ¹⁶およびＲ¹⁷は、独立して、水素、アルキル、トリハロメ チル、シクロアルキル、トリハロメチルカルボニル、アルケニル、アルキニル、 アリール、ヘテロアリール、ヘテロ脂環式、アルコキシ、アリールオキシ、チオ アルコキシ、チオアリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリシクロオ キシ、スルフィニル、スルホニル、Ｓ−スルホンアミド、Ｎ−スルホンアミド、 カルボニル、トリハロメチルカルボニル、Ｃ−カルボキシ、Ｏ−カルボキシ、Ｃ −アミド、Ｎ−アミド、シアノ、ニトロ、ハロ、Ｏ−カルバミル、Ｎ−カルバミ ル、Ｏ−チオカルバミル、１−ピペラジニル、Ｎ−チオカルバミル、ホスホニル 、グアニル、グアニジニル、ウレイジル、トリハロメタンスルホニル、トリハロ メタンスルホンアミド、アミノ、−ＮＲ¹⁸Ｒ¹⁹、４級アンモニウム、−Ｗ（ＣＨ₂ ）_mＮＲ¹⁸Ｒ¹⁹、−Ｗ（ＣＨ₂）_mＣ（＝Ｙ）Ｔ、−Ｎ＝ＣＮＲ¹⁸Ｒ¹⁹、−ＮＨＲ²⁰ および−（ａｌｋ₁）_rＭからなる群より選択され； Ｒ⁷およびＲ⁸、Ｒ⁸およびＲ⁸'、またはＲ⁸'およびＲ⁸"は、一緒になって、５員 のシクロアルキル、ヘテロアリールまたはヘテロ脂環式環または６員のシクロア ルキル、アリール、ヘテロアリールまたはヘテロ脂環式環を形成してもよく； Ｒ⁷およびＲ⁸、およびＲ⁹、Ｒ¹⁰、Ｒ¹¹またはＲ¹²が水素である場合にはＲ⁹'、 Ｒ¹⁰'、Ｒ¹¹'またはＲ¹²'はそれぞれ、上記の群より選択される他、独立して、 ヒドロキシおよびチオヒドロキシからなる群より選択されてもよく；および、 Ｒ⁹およびＲ⁹'、Ｒ¹⁰およびＲ¹⁰'、Ｒ¹¹およびＲ¹¹'、Ｒ¹²およびＲ¹²'、Ｒ²¹お よびＲ²¹'、Ｒ²²およびＲ²²'、Ｒ²⁴およびＲ²⁴'、またはＲ²⁵およびＲ²⁵' は、一緒になって、ケト、５員のスピロシクロアルキル、５員のスピロヘテロ脂 環式、６員のスピロシクロアルキルまたは６員のスピロヘテロ脂環式基を形成し てもよい］ を有する２−インドリノンおよびその生理学的塩およびプロドラッグ。 ２． Ｚは酸素である、請求項１記載の化合物、塩またはプロドラッグ。 ３． Ｒ¹は水素である、請求項１記載の化合物、塩またはプロドラッグ。 ４． Ｒ²は水素である、請求項１記載の化合物、塩またはプロドラッグ。 ５． Ｒ⁷は水素である、請求項１記載の化合物、塩またはプロドラッグ。 ６． Ａ¹、Ａ²、Ａ³およびＡ⁴は炭素である、請求項１記載の化合物、塩または プロドラッグ。 ７． Ａ¹、Ａ²またはＡ³またはＡ⁴の１つは窒素であり、残りは炭素である、請 求項１記載の化合物、塩またはプロドラッグ。 ８． Ａ²およびＡ⁴は窒素であり、一方Ａ¹およびＡ³は炭素である、請求項１記 載の化合物、塩またはプロドラッグ。 ９． Ｚは酸素であり； Ｒ¹、Ｒ²およびＲ⁷は水素であり；および、 Ａ¹、Ａ²、Ａ³およびＡ⁴は炭素である、請求項１記載の化合物、塩またはプロド ラッグ。 １０． Ａ¹、Ａ²、Ａ³またはＡ⁴の１つは窒素であり、残りは炭素であり； Ｚは酸素であり；および、 Ｒ¹、Ｒ²およびＲ⁷は水素である、請求項１記載の化合物、塩またはプロドラッ グ。 １１． Ａ¹およびＡ³は炭素であり； Ａ²およびＡ⁴は窒素であり； Ｚは酸素であり；および、 Ｒ¹、Ｒ²およびＲ⁷は水素である、請求項１記載の化合物、塩またはプロドラッ グ。 １２． Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵およびＲ⁶は、独立して、 水素； 非置換低級アルキル； 以下の群： 非置換シクロアルキル； ハロ； ヒドロキシ； 非置換低級アルコキシ、 Ｃ−カルボキシ； 非置換アリール； 非置換ヘテロアリール； 非置換ヘテロ脂環式； アミノ； ４級アンモニウム；または、 −ＮＲ¹⁸Ｒ¹⁹； より選択される基で置換されている低級アルキル； 非置換シクロアルキル； ヒドロキシ； 非置換低級アルキルアルコキシ； 以下の群： １またはそれ以上のハロ基； 非置換アリール；または、 非置換ヘテロアリール； より選択される基で置換されている低級アルキルアルコキシ； トリハロメチル； ハロ； 非置換アリール； 独立して、以下の群： 非置換低級アルキル； １またはそれ以上のハロ基で置換されている低級アルキル； トリハロメチル； ハロ； ヒドロキシ； 非置換低級アルキルアルコキシ； より選択される１またはそれ以上の基で置換されているアリール； 非置換アリールオキシ； 独立して、以下の群： ハロ； 非置換低級アルキル； １またはそれ以上のハロ基で置換されている低級アルキル； 非置換アリール； ヒドロキシ； 非置換低級アルキルアルコキシ； アミノ；または、 −ＮＲ¹⁸Ｒ¹⁹； より選択される１またはそれ以上の基で置換されているアリールオキシ； アミノ； Ｓ−スルホンアミド； −ＮＲ¹⁸Ｒ¹⁹； 非置換アリールオキシ； 非置換ヘテロアリール； 独立して、以下の群： 水素； 非置換低級アルキル； １またはそれ以上のハロ基で置換されている低級アルキル； トリハロメチル； ハロ； ヒドロキシ； 非置換低級アルキルアルコキシ； 非置換アリールオキシ；アミノ； Ｓ−スルホンアミド；または、 −ＮＲ¹⁸Ｒ¹⁹； より選択される１またはそれ以上の基で置換されているヘテロアリール； 非置換ヘテロ脂環式； 独立して、以下の群： 非置換低級アルキル； １またはそれ以上のハロ基で置換されている低級アルキル； 非置換低級アルキルアルコキシ； ヒドロキシ； アミノ； Ｓ−スルホンアミド；または、 −ＮＲ¹⁸Ｒ¹⁹； より選択される１またはそれ以上の基で置換されているヘテロ脂環式； 非置換低級アルキルＣ−カルボキシ； カルボン酸； 非置換低級アルキルカルボニル； アルデヒド； 非置換アリールカルボニル； アセチル； Ｓ−スルホンアミド； Ｎ−スルホンアミド； アミノ；および、 −ＮＲ¹⁸Ｒ¹⁹； からなる群より選択され： Ｒ⁸、Ｒ⁸'およびＲ⁸"は、独立して、水素、非置換低級アルキル、ハロ、シアノ 、ニトロ、Ｃ−カルボキシ、非置換シクロアルキル、非置換アリール、非置換ヘ テロアリール、非置換ヘテロ脂環式、トリハロメチル、非置換低級アルケニル、 非置換低級アルキニル、ヒドロキシ、非置換低級アルキルアルコキシ、非置換ア リールオキシ、スルフィニル、スルホニル、Ｓ−スルホンアミド、Ｎ−スルホン ア ミド、カルボニル、Ｃ−カルボキシ、Ｏ−カルボキシ、シアノ、ニトロ、ハロ、 Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、Ｏ−カルバミル、Ｎ−カルバミル、Ｏ−チオカルバミ ル、Ｎ−チオカルバミル、グアニル、グアニジニル、ウレイジルおよび−ＮＲ¹⁸ Ｒ¹⁹からなる群より選択され； Ｒ⁹、Ｒ⁹'、Ｒ¹⁰、Ｒ¹⁰'、Ｒ¹¹、Ｒ¹¹'、Ｒ¹²、Ｒ¹²'、Ｒ¹³、Ｒ¹⁴、Ｒ¹⁵、Ｒ¹⁶ およびＲ¹⁷は、独立して、 水素； 非置換低級アルキル； トリハロメチル； 非置換シクロアルキル； トリハロメチルカルボニル； 非置換低級アルケニル； 非置換低級アルキニル； 非置換アリール； 以下の群： 非置換低級アルキル； 非置換低級アルキルアルコキシ； 非置換アリール； 非置換アリールオキシ、 非置換ヘテロアリール； 非置換ヘテロ脂環式； ハロ； ヒドロキシ； アミノ； −Ｎ¹⁸Ｎ¹⁹；または、 Ｓ−スルホンアミド； より選択される１またはそれ以上の基で置換されているアリール； 非置換ヘテロアリール； 以下の群： 非置換低級アルキル； 非置換低級アルキルアルコキシ、 非置換アリール、 非置換ヘテロアリール、 非置換ヘテロ脂環式； ハロ、 ヒドロキシ、アミノ； −Ｎ¹⁸Ｎ¹⁹；または、 Ｓ−スルホンアミド； より選択される１またはそれ以上の基で置換されているヘテロアリール； 非置換ヘテロ脂環式； 以下の群： 非置換低級アルキル； 非置換低級アルキルアルコキシ； 非置換アリール； 非置換ヘテロアリール； ハロ； ヒドロキシ； アミノ；または、 Ｓ−スルホンアミド； より選択される１またはそれ以上の基で置換されているヘテロ脂環式； １−ピペラジニル； 非置換低級アルコキシ； 非置換アリールオキシ； スルフィニル； スルホニル； Ｓ−スルホンアミド； Ｎ−スルホンアミド； カルボニル； Ｃ−カルボキシ； Ｏ−カルボキシ； Ｃ−アミド； Ｎ−アミド； シアノ； ニトロ； ハロ； トリハロメタンスルホニル； トリハロメタンスルホンアミド； アミノ；または、 −ＮＲ¹⁸Ｒ¹⁹； からなる群より選択され、および、 Ｒ¹⁸、Ｒ¹⁹およびＲ”は、水素および非置換低級アルキルからなる群より選択さ れる、請求項１記載の化合物、塩またはプロドラッグ。 １３． Ａ¹、Ａ²、Ａ³およびＡ⁴は炭素であり； Ｒ¹、Ｒ²およびＲ⁷は水素であり；および、 Ｚは酸素である、請求項１２記載の化合物、塩またはプロドラッグ。 １４． Ａ¹、Ａ²、Ａ³またはＡ⁴の１つは窒素であり、および残りは炭素であり ； Ｒ¹、Ｒ²およびＲ⁷は水素であり；および、 Ｚは酸素である、請求項１２記載の化合物、塩またはプロドラッグ。 １５． Ａ¹およびＡ³は炭素であり； Ａ²およびＡ⁴は窒素であり； Ｒ¹、Ｒ²およびＲ⁷は水素であり；および、 Ｚは酸素である、請求項１２記載の化合物、塩またはプロドラッグ。 １６． Ｑは以下の基であり； Ｂ¹は窒素であり； Ｂ²は、イオウおよび酸素からなる群より選択され； ｎは０または１であり；および、 Ｒ⁹、Ｒ⁹'、Ｒ¹⁰、Ｒ¹⁰'、Ｒ¹¹、Ｒ¹¹'、Ｒ¹²およびＲ¹²'は水素である、請求項 １３記載の化合物、塩またはプロドラッグ。 １７． Ｑは以下の基であり； Ｂ¹およびＢ²は窒素であり； ｎは０または１であり；および、 Ｒ⁹、Ｒ⁹'Ｒ¹⁰、Ｒ¹⁰'、Ｒ¹¹、Ｒ¹¹'、Ｒ¹²およびＲ¹²'は水素である、請求項１ ３記載の化合物、塩またはプロドラッグ。 １８． Ｑは以下の基であり；Ｒ⁸またはＲ⁸'の１つは、−ＮＲ¹⁸Ｒ¹⁹、−Ｗ（ＣＨ₂）_mＮＲ¹⁸Ｒ¹⁹、−Ｗ（Ｃ Ｈ₂）_mＣ（＝Ｙ）Ｔ、−Ｎ＝ＣＮＲ¹⁸Ｒ¹⁹および−ＮＨＲ²⁰からなる群より選択 され； ＷおよびＹは、独立して、酸素およびイオウからなる群より選択され； ｍは１または２であり； Ｔは、ヒドロキシ、アミノ、Ｎ−ヒドロキシルアミノまたはＮ−ペプチジルから なる群より選択され； Ｒ¹⁸およびＲ¹⁹は、独立して、水素および非置換低級アルキルからなる群より選 択され；および、 Ｒ²⁰は低級ポリヒドロキシアルキル基である、請求項１３記載の化合物、塩また はプロドラッグ。 １９． Ｄ¹は窒素であり；および、 Ｄ²は炭素である、請求項１８記載の化合物、塩またはプロドラッグ。 ２０． Ｄ¹は窒素であり；および、 Ｄ²はイオウである、請求項１８記載の化合物、塩またはプロドラッグ。 ２１． Ｄ¹およびＤ²は窒素である、請求項１８記載の化合物、塩またはプロド ラッグ。 ２２． Ｄ¹は、酸素およびイオウからなる群より選択され；および、 Ｄ²は炭素である、請求項１８記載の化合物、塩またはプロドラッグ。 ２３． Ｑは以下の基であり；Ｄ¹はイオウであり； Ｄ²は炭素であり； Ｒ⁸およびＲ⁸'は、一緒になって、非置換の６員のシクロアルキル、アリール、 ヘテロアリールまたはヘテロ脂環式環を形成し； Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵またはＲ⁶の１つは、−ＮＲ¹⁸Ｒ¹⁹、−（ＣＨ₂）_mＮＲ¹⁸Ｒ¹⁹、− Ｗ（ＣＨ₂）_mＣ（＝Ｙ）Ｔ、−Ｎ＝ＣＮＲ¹⁸Ｒ¹⁹および−ＮＨＲ²⁰からなる群よ り選択され； ＷおよびＹは、独立して、酸素およびイオウからなる群より選択され； ｍは１または２であり； Ｔは、ヒドロキシ、アミノ、Ｎ−ヒドロキシルアミノおよびＮ−ペプチジルから なる群より選択され； Ｒ¹⁸およびＲ¹⁹は、独立して、水素および非置換低級アルキルからなる群より選 択され；および、 Ｒ²⁰は低級ポリヒドロキシアルキル基である、請求項１３記載の化合物、塩また はプロドラッグ。 ２４． Ｑは以下の基であり； Ｄ¹は窒素であり； Ｄ²は炭素であり； Ｒ⁷は水素または非置換低級アルキルであり； Ｒ⁸、Ｒ⁸'およびＲ⁸"は、独立して、 水素； 非置換低級アルキル； Ｃ−カルボキシからなる群より選択され；または、 Ｒ⁸およびＲ⁸'は一緒になって６員のシクロアルキル環を形成し； Ｒ”は、水素および非置換低級アルキルからなる群より選択される、請求項１４ 記載の化合物、塩またはプロドラッグ。 ２５． Ｑは以下の基であり； Ｄ¹は窒素であり； Ｄ²は炭素であり； Ｒ⁷は水素または非置換低級アルキルであり； Ｒ⁸、Ｒ⁸’およびＲ⁸"は、独立して、 水素； 非置換低級アルキル； Ｃ−カルボキシからなる群より選択され；または Ｒ⁸およびＲ⁸'は、一緒になって６員のシクロアルキル環を形成する、請求項１ ５記載の化合物、塩またはプロドラッグ。 ２６． Ｑは以下の基であり；Ｄ¹は窒素であり； Ｄ²は炭素であり；および、 Ｒ⁸およびＲ⁸”は、非置換低級アルキル；または、 カルボキシ基で置換されている低級アルキルからなる群より選択される、請求項 １４記載の化合物、塩またはプロドラッグ。 ２７． Ｑは以下の基であり； Ｄ¹は窒素であり； Ｄ²は炭素であり；および、 Ｒ⁸およびＲ⁸"は、非置換低級アルキル；または、 カルボキシ基で置換されている低級アルキルからなる群より選択される、請求項 １５記載の化合物、塩またはプロドラッグ。 ２８． Ｑは以下の基であり； Ｄ¹はイオウであり； Ｄ²は炭素であり；および、 Ｒ⁸、Ｒ⁸'およびＲ⁸"は、独立して、水素、非置換低級アルキル、カルボキシ基 により置換されている低級アルキル、非置換低級アルケニル、非置換低級アルキ ニル、非置換ヘテロアリール、非置換アリールオキシ、非置換低級アルキルチオ アルコキシ、ハロ、ニトロ、トリハロメチルカルボニルからなる群より選択され 、またはＲ⁸およびＲ⁸'が一緒になって形成されるアリールまたはヘテロアリー ル環である、請求項１４記載の化合物、塩またはプロドラッグ。 ２９． Ｑは以下の基であり； Ｄ¹はイオウであり； Ｄ²は炭素であり；および、 Ｒ⁸、Ｒ⁸'およびＲ⁸"は、独立して、水素、非置換低級アルキル、カルボキシ基 により置換されている低級アルキル、非置換低級アルケニル、非置換低級アルキ ニル、非置換ヘテロアリール、非置換アリールオキシ、非置換低級アルキルチオ アルコキシ、ハロ、ニトロ、トリハロメチルカルボニルからなる群より選択され 、または一緒になって６員のアリールまたは５または６員のヘテロアリール環を 形成する、請求項１５記載の化合物、塩またはプロドラッグ。 ３０． Ｑは以下の基であり；Ｅ¹は窒素であり； Ｅ²は炭素であり； Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵およびＲ⁶は、独立して、水素、非置換低級アルキル、トリハロメ チル、非置換低級アルコキシ、アミノ、ハロ、ニトロ、Ｃ−カルボキシ、Ｃ−ア ミド、Ｏ−カルバミルおよびＳ−スルホンアミドからなる群より選択され； Ｒ⁸'は、水素、非置換低級アルキル、非置換低級シクロアルキル、非置換アリー ル、Ｃ−カルボキシ、シアノ、非置換アルケニル、ヒドロキシ、非置換低級アル コキシおよび非置換アリールオキシからなる群より選択され；および、 Ｒ⁹、Ｒ⁹'、Ｒ¹⁰、Ｒ¹⁰'、Ｒ¹¹、Ｒ¹¹'、Ｒ¹²およびＲ¹²'は水素である、請求項 ９記載の化合物、塩またはプロドラッグ。 ３１． Ｑは以下の基であり； Ｅ¹は、酸素およびイオウからなる群より選択され；および、 Ｅ²は炭素である、請求項１３記載の化合物、塩またはプロドラッグ。 ３２． Ｑは以下の基であり；Ｅ¹は窒素であり；および、 Ｅ²は、酸素およびイオウからなる群より選択される、請求項１３記載の化合物 、塩またはプロドラッグ。 ３３． Ｑは以下の基であり； Ｒ⁸、Ｒ⁸またはＲ⁸"の１つは−（ａｌｋ₁）_rＭ基であり； （ａｌｋ₁）はＣＨ₂であり； ｒは１−３であり；および、 Ｍは、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ、非置換モルホリニル、非置換ピペラジ ニル、非置換テトラゾリル、Ｎ−カルバミル、Ｏ−カルバミル、Ｓ−スルホンア ミド、Ｎ−スルホンアミド、スルホニル、−Ｓ（Ｏ）₂ＯＨおよびホスホニルか らなる群より選択され； Ｒ⁸、Ｒ⁸'およびＲ⁸"の残りの２つは、独立して、 水素； 非置換低級アルキル； 以下の群： ハロ； ヒドロキシル； 非置換低級アルコキシ； アミノ； Ｓ−スルホンアミド； −ＮＲ¹⁸Ｒ¹⁹；または、 カルボキシ； より選択される１またはそれ以上の基で置換されている低級アルキル； 非置換低級アルコキシ、 １またはそれ以上のハロゲンで置換されている低級アルコキシ； 非置換アリール； 以下の群： 非置換低級アルキル； 非置換低級アルコキシ； ハロ、 トリハロメチル； アミノ； −ＮＲ¹⁸Ｒ¹⁹、 ヒドロキシ；または、 Ｓ−スルホンアミド； より選択される１またはそれ以上の基で置換されているアリール； 非置換ヘテロアリール； 以下の群： 非置換低級アルキル； 非置換低級アルコキシ； ハロ、 トリハロメチル； アミノ； −ＮＲ¹⁸Ｒ¹⁹； ヒドロキシ；または、 Ｓ−スルホンアミド； より選択される１またはそれ以上の基で置換されているヘテロアリール； 非置換ヘテロ脂環式； 以下の群： 非置換低級アルキル； ハロ； ヒドロキシ； 非置換アルコキシ； アミノ；または、 −ＮＲ¹⁸Ｒ¹⁹； より選択される１またはそれ以上の基で置換されているヘテロ脂環式； ハロ； シアノ； カルボキシ；および、 Ｒ⁸およびＲ⁸'またはＲ⁸'およびＲ⁸"を一緒に組み合わせることにより形成され る６員のシクロアルキル、アリール、ヘテロアリールまたはヘテロ脂環式環； からなる群より選択される、請求項１３記載の化合物、塩またはプロドラッグ。 ３４． Ｒ⁸、Ｒ⁸'およびＲ⁸"の任意の２つが（ａｌｋ₁）_rＭである、請求項３ ３記載の化合物、塩またはプロドラッグ。 ３５． Ｊ¹は、窒素、酸素およびイオウからなる群より選択され；および、 Ｊ²、Ｊ³およびＪ⁴は炭素である、請求項３３記載の化合物、塩またはプロドラ ッグ。 ３６． Ｊ¹は、窒素、酸素およびイオウからなる群より選択され；および、 Ｊ²、Ｊ³およびＪ⁴は炭素である、請求項３４記載の化合物、塩またはプロドラ ッグ。 ３７． Ｊ¹およびＪ³は窒素であり；および、 Ｊ²およびＪ⁴は炭素である、請求項３３記載の化合物、塩またはプロドラッグ。 ３８． Ｊ¹およびＪ³は窒素であり；および、 Ｊ²およびＪ⁴は炭素である、請求項３４記載の化合物、塩またはプロドラッグ。 ３９． Ｑは以下の基であり； Ｌ¹、Ｌ²、Ｌ³、Ｌ⁴およびＬ⁵は炭素であり； Ｒ¹³、Ｒ¹⁴、Ｒ¹⁵Ｒ¹⁶およびＲ¹⁷の１つは１−ピペラジニルであり； Ｒ²¹、Ｒ²¹'、Ｒ²²、Ｒ²²'、Ｒ²⁴、Ｒ²⁴'、Ｒ²⁵およびＲ²⁵'は水素であり； および、 残りのＲ¹³、Ｒ¹⁴、Ｒ¹⁵およびＲ¹⁶およびＲ¹⁷は、独立して、水素、非置換低級 アルキル、トリハロメチル、ハロ、ヒドロキシ、非置換低級アルコキシ、非置換 アリールオキシ、非置換低級アルキルチオアルコキシまたは非置換チオアリール オキシからなる群より選択される、請求項１３記載の化合物、塩またはプロドラ ッグ。 ４０． Ｒ¹⁵は１−ピペラジニルであり； Ｒ¹³、Ｒ¹⁴、Ｒ¹⁶、Ｒ¹⁷、Ｒ²¹、Ｒ²¹'、Ｒ²²、Ｒ²²'、Ｒ²⁴、Ｒ²⁴'、Ｒ²⁵およ びＲ²⁵'は、独立して、水素、非置換低級アルキル、トリハロメチル、非置換低 級アルコキシ、ハロ、Ｃ−カルボキシ、Ｏ−カルボキシ、ニトロ、アミノおよび Ｓ−スルホンアミドからなる群より選択され；および、 Ｒ²³は、水素、非置換低級アルキルおよびアルデヒドからなる群より選択される 、請求項３９記載の化合物、塩またはプロドラッグ。 ４１． Ｑは以下の基であり；Ｒ¹³、Ｒ¹⁴、Ｒ¹⁵、Ｒ¹⁶およびＲ¹⁷は、独立して、非置換低級アルキル；１また はそれ以上のハロ基で置換されている低級アルキル；非置換アリール、非置換ヘ テロアリール、ヒドロキシ、非置換低級アルキルアルコキシ、非置換アリールオ キシ、非置換ヘテロアリールオキシ、ハロ、ニトロ、シアノ、カルボニル、Ｃ −カルボキシ、Ｏ−カルボキシ、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、トリハロメチル、Ｓ −スルホンアミド、Ｎ−スルホンアミド、アルデヒド、カルボン酸、アミノおよ び−ＮＲ¹⁸Ｒ¹⁹からなる群より選択される、請求項１３記載の化合物、塩または プロドラッグ。 ４２． 蛋白質キナーゼの触媒活性を調節する方法であって、前記蛋白質キナー ゼを請求項１−４１のいずれかに記載の前記化合物、塩またはプロドラッグと接 触させることを含む方法。 ４３． 前記蛋白質キナーゼが蛋白質チロシンキナーゼを含む、請求項４２記載 の方法。 ４４． 前記蛋白質チロシンキナーゼがレセプター蛋白質チロシンキナーゼを含 む、請求項４３記載の方法。 ４５． 前記レセプター蛋白質チロシンキナーゼが、ＥＧＦ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ ３、ＨＥＲ４、ＩＲ、ＩＧＦ−ＩＲ、ＩＲＲ、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、Ｃ ＳＦＩＲ、Ｃ−Ｋｉｔ、Ｃ−ｆｍｓ、Ｆｌｋ−１Ｒ、Ｆｌｋ４、ＫＤＲ／Ｆｌｋ −１、Ｆｌｔ−１、ＦＧＦＲ−ＩＲ、ＦＧＦＲ−２Ｒ、ＦＧＦＲ−３ＲおよびＦ ＧＦＲ−４Ｒからなる群より選択される、請求項４４記載の方法。 ４６． 前記蛋白質チロシンキナーゼが非レセプター蛋白質チロシンキナーゼを 含む、請求項４３記載の方法。 ４７． 前記非レセプター蛋白質チロシンキナーゼが、Ｓｒｃ、Ｆｒｋ、Ｂｔｋ 、Ｃｓｋ、Ａｂｌ、ＺＡＰ７０、Ｆｅｓ／Ｆｐｓ、Ｆａｋ、Ｊａｋ、Ａｃｋ、Ｙ ｅｓ、Ｆｙｎ、Ｌｙｎ、Ｌｃｋ、Ｂｌｋ、Ｈｃｋ、ＦｇｒおよびＹｒｋからなる 群より選択される、請求項４６記載の方法。 ４８． 前記蛋白質キナーゼがセリン−トレオニン蛋白質キナーセを含む、請求 項４２記載の方法。 ４９． 前記セリン−トレオニン蛋白質キナーゼがＣＤＫ２およびＲａｆからな る群より選択される、請求項４８記載の方法。 ５０． 請求項１−４１のいずれかに記載の前記化台物、塩またはプロドラッグ の医薬組成物。 ５１． 生物において、蛋白質キナーゼ関連疾患を治療または予防する方法であ って、治療上有効量の請求項５０記載の前記医薬組成物を前記生物に投与する事 を含む方法。 ５２． 前記蛋白質キナーセ関連疾患がレセプター蛋白質チロシンキナーゼ関連 疾患を含む、請求項５１記載の方法。 ５３． 前記レセプターチロシンキナーゼ関連疾患がＥＧＦＲ関連疾患を含む、 請求項５２記載の方法。 ５４． 前記ＥＧＦＲ関連疾患が、扁平上皮癌、星状細胞腫、神経膠細胞腫、肺 癌、膀胱癌、脳および首癌からなる群より選択される癌である、請求項５３記載 の方法。 ５５． 前記レセプター蛋白質チロシンキナーゼ関連疾患がＰＤＧＦＲ関連疾患 を含む、請求項５２記載の方法。 ５６． 前記ＰＤＧＦＲ関連疾患が、神経膠細胞腫、黒腫、肺癌、卵巣癌または 前立腺癌からなる群より選択される癌である、請求項５５記載の方法。 ５７． 前記レセプター蛋白質チロシンキナーゼ関連疾患がＩＧＦＲ関連疾患を 含む、請求項５２記載の方法。 ５８． 前記ＩＧＦＲ関連疾患が、乳癌、小細胞肺癌または神経膠腫からなる群 より選択される癌である、請求項５７記載の方法。 ５９． 前記ＩＧＦＲ関連疾患が糖尿病を含む、請求項５８記載の方法。 ６０． 前記蛋白質チロシンキナーゼ関連疾患がｆｌｋ関連疾患を含む、請求項 ５２記載の方法。 ６１． 前記ｆｌｋ関連疾患が、乳癌、卵巣癌、肺癌および神経膠細胞腫からな る群より選択される癌である、請求項６０記載の方法。 ６２． 前記蛋白質キナーゼ関連疾患がセリン−トレオニンキナーゼ関連疾患を 含む、請求項５１記載の方法。 ６３． 前記セリン−トレオニンキナーゼ関連疾患が自己免疫疾患を含む、請求 項６２記載の方法。 ６４． 前記セリン−トレオニンキナーゼ関連疾患が、過増殖性疾患を含む、請 求項６３記載の方法。 ６５． 前記過増殖性疾患が、再狭窄、繊維症、乾癬、変形性関節症および慢性 関節リウマチからなる群より選択される、請求項６４記載の方法。 ６６． 前記蛋白質キナーゼ関連疾患が炎症性疾患を含む、請求項５１記載の方 法。 ６７． 前記蛋白質キナーゼ関連疾患が脈管形成を含む、請求項５１記載の方法 。 ６８． 前記生物が哺乳動物である、請求項５１記載の方法。 ６９． 前記哺乳動物がヒトである、請求項６８記載の方法。