ES2535116T3

ES2535116T3 - Derivados de urea sustituida con morfolino como inhibidores de mtor

Info

Publication number: ES2535116T3
Application number: ES11706815.5T
Authority: ES
Inventors: Rosemary Lynch; Andrew David Cansfield; Helen Sarah Niblock; Daniel Paul Hardy; Jessica Taylor
Original assignee: Cellzome Ltd
Current assignee: Cellzome Ltd
Priority date: 2010-03-04
Filing date: 2011-03-04
Publication date: 2015-05-05
Anticipated expiration: 2031-03-04
Also published as: US20130196982A1; EP2542536B1; EP2542536A1; US9249129B2; WO2011107585A1

Abstract

Un compuesto de fórmula (I)**Fórmula** o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, en la que R1 es H; T1; o alquilo C1-6; en el que el alquilo C1-6 está opcionalmente sustituido con uno o más R5, que son iguales o diferentes; R5 es halógeno; CN; OR6; o N(R6R6a); T1 es fenilo; heterociclilo de 4 a 7 miembros; o cicloalquilo C3-7, en el que T1 está opcionalmente sustituido con uno o más R5a, que son iguales o diferentes; R5a es halógeno; CN; OR6; N(R6R6a); o alquilo C1-6, en el que alquilo C1-6 está opcionalmente sustituido con uno o más halógenos, que son iguales o diferentes; R6, R6a son seleccionados independientemente entre el grupo que consiste en H; y alquilo C1-6, en el que alquilo C1-6 está opcionalmente sustituido con uno o más halógenos, que son iguales o diferentes; R2 es H; o T2; T2 es fenilo o heterociclilo aromático de 5 a 6 miembros, en el que T2 está opcionalmente sustituido con 1, 2 o 3 R7, que son iguales o diferentes; R7 es halógeno; CN; OR8; CO(O)R8; C(O)N(R8R8a); S(O)2N(R8R8a); S(O)N(R8R8a); S(O)2R8; S(O)R8; N(R8R8a); N(R8)C(O)R8a; N(R8)S(O)2R8a; N(R8)S(O)R8a; N(R8)C(O)N(R8aR8b); N(R8)C(O)OR8a; OC(O)N(R8R8a); o alquilo C1-6; en el que el alquilo C1-6 está opcionalmente 20 sustituido con uno o más R9, que son iguales o diferentes; R8, R8a, R8b son seleccionados independientemente entre el grupo que consiste en H; alquilo C1-6; y heterociclilo de 5 a 6 miembros, en el que el alquilo C1-6 está opcionalmente sustituido con uno o más R9, que son iguales o diferentes y en los que el heterociclilo de 5 a 6 miembros está opcionalmente sustituido con uno o más R9a, que son iguales o diferentes; R9 es halógeno; CN; OR10; C(O)OR10; C(O)R10; C(O)N(R10R10a); S(O)2N(R10R10a). S(O)N(R10R10a); S(O)2R10; N(R10R10a); OC(O)R10; N(R10)C(O)R10a; N(R10)S(O)2R10a; N(R10)S(O)R10a; N(R10)C(O)N(R10aR10b); N(R10)C(O)OR10a; OC(O)N(R10R10a); o heterociclilo de 5 a 6 miembros, en el que el heterociclilo de 5 a 6 miembros está opcionalmente sustituido con uno o más R11, que son iguales o diferentes; R9a es halógeno; CN; C(O)OR10; OR10; oxo (>=O), en el que el anillo está al menos parcialmente saturado; C(O)R10; C(O)N(R10R10a); S(O)2N(R10R10a); S(O)N(R10R10a); S(O)2R10; N(R10R10a); OC(O)R10; N(R10)C(O)R10a; N(R10)SO)2R10a; N(R10)(O)R10a; N(R10)C(O)N(R10aR10b); N(R10)C(O)OR10a; OC(O)N(R10R10a); o alquilo, en el que alquilo C1-6 está opcionalmente sustituido con uno o más R11a, que son iguales o diferentes; R10, R10a, R10b son seleccionados independientemente entre el grupo que consiste en H; y alquilo C1-6, en el que alquilo C1-6 está opcionalmente sustituido con uno o más halógenos, que son iguales o diferentes; R11, R11a son seleccionados independientemente entre el grupo que consiste en halógeno; y alquilo C1-6, en el que alquilo C1-6 está opcionalmente sustituido con uno o más halógenos, que son iguales o diferentes; cada R3 es independientemente alquilo C1-6, en el que R3 está opcionalmente sustituido con uno o más halógenos, que son iguales o diferentes; cada R4 es independientemente halógeno; m es 0, 1 o 2 n es 0, 1 o 2 uno de X1, X2 es C(R12) y el otro es N; R12 es H; halógeno; CN; o alquilo C1-6, en el que alquilo C1-6 está opcionalmente sustituido con uno o más halógenos, que son iguales o diferentes.

Description

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DESCRIPCIÓN

Derivados de urea sustituida con morfolino como inhibidores de mTOR

La presente invención se refiere a una clase novedosa de inhibidores de quinasa, incluyendo sales farmacéuticamente aceptables, profármacos y metabolitos de los mismos, que son útiles para modular la actividad de la proteína quinasa 5 para modular actividades celulares, tales como la transducción de señales, la proliferación, y la secreción de citocinas. Más específicamente, la invención proporciona compuestos que inhiben, regulan y/o modulan la actividad quinasa, en particular, la actividad de mTOR, y las rutas de transducción de señales relacionadas con las actividades celulares que se han mencionado anteriormente. Además, la presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden dichos compuestos, por ejemplo, para el tratamiento de enfermedades, tales como trastornos

10 inmunológicos, inflamatoria, autoinmune, alérgicos, o enfermedades proliferativas, tales como el cáncer, y a los procedimientos para preparar dichos compuestos.

Las quinasas catalizan la fosforilación de proteínas, lípidos, azúcares, nucleósidos y otros metabolitos celulares y desempeñan papeles clave en todos los aspectos de la fisiología de las células eucariotas. Especialmente, las proteínas quinasas y las quinasas lipídicas participan en acontecimientos de señalización que controlan la activación,

15 crecimiento, diferenciación y supervivencia de las células en respuesta a mediadores extracelulares o estímulos, tales como factores de crecimiento, citoquinas o quimioquinas. En general, las proteínas quinasas se clasifican en dos grupos, las que fosforilan preferentemente restos de tirosina y las que fosforilan preferentemente restos de serina y/o treonina.

Una actividad inapropiadamente elevada de la proteína quinasa está implicada en muchas enfermedades, incluyendo

20 cáncer, enfermedades metabólicas y enfermedades autoinmunes/inflamatorias. Esto se puede producir tanto directa como indirectamente por fallos en los mecanismos de control debidos a mutaciones, la sobreexpresión o la activación inadecuada de la enzima. En todos estos casos, se espera que la inhibición selectiva de la quinasa tenga un efecto beneficioso.

mTOR ("diana de rapamicina en mamíferos", conocida también como FRAP o RAFT1) se ha convertido recientemente

25 en el centro de atención de esfuerzos destinados al descubrimiento de fármacos (Tsang y col., 2007, Drug Discovery Today 12, 112-124). Se ha descubierto que la proteína mTOR es la diana farmacológica del efecto inmunosupresor de la rapamicina, un fármaco que se usa para evitar el rechazo de trasplantes. La rapamicina trabaja a través de un mecanismo de función de ganancia mediante la unión a la proteína intracelular "Proteína de unión a FK-506 de 12 kDA" (FKBP12) para generar un complejo fármaco-receptor que a continuación se une, e inhibe, mTOR. Por lo tanto, la

30 rapamicina induce la formación del complejo ternario que consiste en rapamicina y las dos proteínas FKBP12 y mTOR.

La proteína mTOR es una quinasa grande de 289 kDA que se encuentra en todos los organismos eucariotas secuenciados hasta ahora (Schmelzle y Hall, 2000, Cell 103, 253-262). La secuencia del dominio del extremo carboxi "quinasa relacionada con (PI3K) de la fosfatidilinositol 3-quinasa" (PIKK) está muy conservada entre especies y presenta actividad serina y treonina quinasa, pero no actividad detectable de la quinasa lípida. El dominio PIKK intacto 35 es necesario para todas las funciones conocidas de mTOR. El dominio de unión FKBP12-rapamicina (FRB) se localiza cerca del dominio PIKK y forma un bolsillo hidrófobo que se une a la rapamicina unida a FKBP12. El dominio FRB no parece inhibir la actividad enzimática del dominio de la quinasa directamente. Una explicación es que FKBP12-rapamicina evita la interacción de mTOR con sus sustratos debido al impedimento estérico. El extremo N de mTOR consiste en aproximadamente 20 repeticiones en tándem de 37 a 43 aminoácidos denominadas repeticiones

40 HEAT. Las repeticiones HEAT interaccionan con ligandos de proteínas tales como Raptor.

mTOR puede formar al menos dos complejos de proteínas distintos, mTORC1 y mTORC2. En el complejo de proteína mTORC1, mTOR interactúa con las proteínas Raptor y mLST8/GβL y regula el crecimiento celular fosforilando efectores tales como p70S6K y 4E-BP1 para promover la traducción del ARNm y la síntesis de proteínas. El complejo mTORC1 es responsable de las señales de sensibilización de los nutrientes (por ejemplo, la disponibilidad de

45 aminoácidos) junto con la señalización de la insulina. Se puede inhibir la actividad de mTOR en mTORC1 mediante la rapamicina.

El segundo complejo de proteínas, mTORC2, consiste en las proteínas mTOR, Rictor, mLST8/GβL y Sin1, y está implicado en la organización de la actina. mTORC2 se describió originalmente como insensible a rapamicina. Una publicación reciente ha demostrado que rapamicina afecta a la función de mTORC2 tras un tratamiento prolongado a

50 través de un mecanismo indirecto interfiriendo el ensamblaje del complejo de proteínas mTORC2 (Sarbassov y col., 2006, Molecular Cell 22, 159-168).

La función biológica de mTOR es la de un regulador central de varias señales extracelulares e intracelulares, incluyendo factores de crecimiento, nutrientes, energía y estrés. La activación de mTOR inducida por factores de crecimiento y hormonas (por ejemplo, insulina) está mediada por las quinasas PI3, Akt, y el complejo de proteínas de la 55 esclerosis tuberosa (TSC). Por ejemplo, mTOR actúa como un regulador central de la proliferación celular, la angiogénesis, y el metabolismo celular (Tsang y col., 2007, Drug Discovery Today 12, 112-124). Además de sus efectos inmunosupresores, rapamicina (Sirolimus) es un potente inhibidor de la proliferación de las células vasculares de la musculatura lisa y ha recibido autorización de la FDA como fármaco anti-restenosis utilizado en prótesis

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Especialmente, compuestos de fórmula (I), en la que el anillo morfolino está sustituido con un R3 en la posición 3 están abarcados por la presente invención como isómeros o enantiómeros o mezclas de los mismos en relación al centro de carbono quiral respectivo.

Si se desea, pueden separarse isómeros por procedimientos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, por cromatografía líquida. Lo mismo se aplica para enantiómeros usando, por ejemplo, fases estacionarias quirales. Además, pueden aislarse enantiómeros convirtiéndolos en diastereoisómeros, es decir, acoplando con un compuesto auxiliar enantioméricamente puro, separación posterior de los diastereoisómeros resultantes y escisión del residuo auxiliar. Como alternativa, cualquier enantiómero de un compuesto de fórmula (I) puede obtenerse a partir de síntesis estereoselectiva usando materiales de partida ópticamente puros.

Los compuestos de fórmula (I) pueden existir en forma cristalina o amorfa. Además, algunas de las formas cristalinas de los compuestos de fórmula (I) pueden existir como polimorfos, que están incluidos dentro del alcance de la presente invención. Pueden caracterizarse y diferenciarse formas polimórficas de los compuestos de fórmula (I) usando una diversidad de técnicas analíticas convencionales, incluyendo, pero sin limitación, patrones de difracción de polvo de rayos X (XRPD), espectros infrarrojos (IR), espectros de Raman, calorimetría de barrido diferencial (DSC), análisis termogravimétrico (TGA) y resonancia magnética nuclear de estado sólido (RMNes).

En caso de que los compuestos de acuerdo con la fórmula (I) contengan uno o más grupos ácidos o básicos, la invención también comprende sus sales farmacéutica o toxicológicamente aceptables, en particular sus sales utilizables farmacéuticamente. Por lo tanto, los compuestos de la fórmula (I) que contienen grupos ácidos pueden usarse de acuerdo con la invención, por ejemplo, en forma de sales de metal alcalino, sales de metal alcalinotérreo o sales de amonio. Ejemplos más precisos de tales sales incluyen sales de sodio, sales de potasio, sales de calcio, sales de magnesio o sales con amoniaco o aminas orgánicas, tales como, por ejemplo, etilamina, etanolamina, trietanolamina o aminoácidos. Los compuestos de la fórmula (I) que contienen uno o más grupos básicos, es decir, grupos que pueden estar protonados, pueden presentarse y pueden usarse de acuerdo con la invención en forma de sus sales de adición con ácidos inorgánicos u orgánicos. Los ejemplos de ácidos adecuados incluyen cloruro de hidrógeno, bromuro de hidrógeno, ácido fosfórico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido metanosulfónico, ácido p-toluenosulfónico, ácidos naftalenodisulfónicos, ácido oxálico, ácido acético, ácido tartárico, ácido láctico, ácido salicílico, ácido benzoico, ácido fórmico, ácido propiónico, ácido piválico, ácido dietilacético, ácido malónico, ácido succínico, ácido pimélico, ácido fumárico, ácido maléico, ácido málico, ácido sulfamínico, ácido fenilpropiónico, ácido glucónico, ácido ascórbico, ácido isonicotínico, ácido cítrico, ácido adípico, y otros ácidos conocidos para el experto en la materia. Si los compuestos de la fórmula (I) contienen simultáneamente grupos ácidos y básicos en la molécula, la invención también incluye, además de las formas de sal mencionadas, sales internas o betaínas (zwitteriones). Las sales respectivas de acuerdo con la fórmula (I) pueden obtenerse por procedimientos habituales que son conocidos para el experto en la materia, como, por ejemplo, poniendo en contacto estos con un ácido o base orgánica o inorgánica en un disolvente o dispersante, o por intercambio aniónico o intercambio catiónico con otras sales. La presente invención también incluye todas las sales de los compuestos de la fórmula (I) que, debido a baja compatibilidad fisiológica, no nos directamente adecuadas para su uso en productos farmacéuticos pero que pueden usarse, por ejemplo, como intermedios para reacciones químicas o para la preparación de sales farmacéuticamente aceptables.

A lo largo de la invención, la expresión "farmacéuticamente aceptable" significa que el correspondiente compuesto, vehículo o molécula es adecuada para su administración a seres humanos. Preferentemente, este término significa que ha recibido autorización de un organismo regulador como la EMA (Europa) y/o la FDA (EE.UU.) y/o cualquier otro organismo regulador nacional para uso en animales, preferentemente en seres humanos.

La presente invención incluye además todos los solvatos de los compuestos de acuerdo con la invención.

Si se desea, se pueden ensayar los efectos de los compuestos reivindicados sobre la actividad de mTOR, por ejemplo usando mTOR etiquetado con un epítopo expresado transitoriamente en una línea de células de mamíferos tal como HEK293 que se hace inmunoprecipitar con un anticuerpo monoclonal dirigido contra la etiqueta del epítopo (Knight y col. 2004, Bioorganic and Medicinal Chemistry 12, 4749-4759). Otro ensayo emplea la proteína mTOR enriquecida a partir de células o lisados tisulares usando métodos convencionales de purificación de proteínas. En este ensayo, se usa una proteína de fusión con GST de la quinasa P70 S6 como sustrato. Se detecta la fosforilación de P70 S6 usando un anticuerpo fosfoespecífico primario (dirigido contra la treonina 389 fosforilada) y un anticuerpo secundario unido a enzima en un ensayo ELISA (documento US-A 2004/0191836).

De acuerdo con la presente invención, la expresión "mTOR" o "quinasa mTOR" significa la proteína mTOR (Tsang y col., 2007, Drug Discovery Today 12, 112-124). El gen que codifica mTOR se encuentra en el locus 1p36.2 del mapa del cromosoma humano y se expresa ampliamente en tejidos humanos.

Como se muestra en los ejemplos, se ensayaron los compuestos de la invención para su establecer su selectividad para mTOR en comparación con otras quinasas. Tal como se muestra, los compuestos ensayados se unen a mTOR de manera más selectiva que las quinasas PI3Kdelta o ADN-PK (véase la tabla 2 siguiente). En consecuencia, se considera que los compuestos de la presente invención son útiles para la prevención o el tratamiento de las enfermedades y trastornos asociados con mTOR, por ejemplo, trastornos inmunológicos, inflamatoria, autoinmune, o

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alérgicos, o enfermedades proliferativas, rechazo al trasplante, enfermedad de hospedador frente a injerto, enfermedades cardiovasculares, enfermedades metabólicas o enfermedades neurodegenerativas.

Por lo tanto, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto de fórmula (I) o una de sus sales farmacéuticamente aceptables como principio activo con un portador farmacéuticamente aceptable, opcionalmente en combinación con una o más composiciones farmacéuticas diferentes.

"Composición farmacéutica" significa uno o más principios activos, y uno o más principios inertes que constituyen el portador, así como cualquier producto que sea el resultado, directa o indirectamente, de la combinación, complejación

o agregación de cualesquiera dos o más de los ingredientes, o de la disociación de uno o más de los ingredientes, o de otros tipos de reacciones o interacciones de uno o más de los ingredientes. Por consiguiente, las composiciones farmacéuticas de la presente invención abarcan cualquier composición preparada premezclando un compuesto de la presente invención y un portador farmacéuticamente aceptable.

El término "portador" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente, o el vehículo con el que se administra el agente terapéutico. Dichos portadores farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluyendo los de origen de petróleo, animal, vegetal o sintético, incluyendo pero sin limitarse a aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. El agua es un portador preferido cuando la composición farmacéutica se administra por vía oral. Una solución salina y una disolución acuosa de dextrosa son portadores preferidos cuando la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa. Las soluciones salinas y las disoluciones acuosas de dextrosa y las disoluciones de glicerol se emplean preferentemente como portadores líquidos para disoluciones inyectables. Los excipientes farmacéuticos adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sílice, estearato de sodio, monoesterato de glicerol, talco, cloruro sódico, leche en polvo desnatada, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares. La composición, si se desea, también pueden incluir cantidades pequeñas de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes tamponantes del pH. Estas composiciones pueden tomar la forma de disoluciones, suspensiones, emulsiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación sostenida y similares. La composición puede formularse como un supositorio, con aglutinantes y portadores tradicionales tales como triglicéridos. La formulación oral puede incluir portadores normalizados tales como calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio, etc. Los ejemplos de portadores farmacéuticos adecuados se describen en "Remington’s Pharmaceutical Sciences" por E.W. Martin. Dichas composiciones contendrán una cantidad terapéuticamente eficaz del agente terapéutico, preferentemente en forma purificada, junto con una cantidad adecuada de portador con el fin de proporcionar la forma para la administración adecuada al paciente. La formulación debe adecuarse al modo de administración.

Una composición farmacéutica de la presente invención puede comprender uno o más compuestos adicionales como principios activos similares a uno o más compuestos de fórmula (I) no siendo son el primer compuesto en la composición o los inhibidores de mTOR. Los compuestos bioactivos adicionales pueden ser esteroides, antagonistas del leucotrieno, ciclosporina o rapamicina.

Los compuestos de la presente invención o sus sal(es) farmacéuticamente aceptables y el resto de agente(s) farmacéuticamente activos se pueden administrar juntos o por separado y, cuando se administran por separado, esto puede tener lugar por separado o secuencialmente en cualquier orden. Cuando se combinan en la misma formulación se apreciará que los dos compuestos deben ser estables y compatibles entre sí y con el resto de componentes de la formulación. Cuando se formulan por separado, se pueden proporcionar en cualquier formulación conveniente, convenientemente de la manera conocida para dichos compuestos en la técnica.

Se incluye además en la presente invención que el compuesto de fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, o una composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula (I) se administra junto con otro fármaco o agente farmacéuticamente activo y/o que la composición farmacéutica de la invención comprende además dicho fármaco o agente farmacéuticamente activo.

En este contexto, el término "fármaco o agente farmacéuticamente activo" incluye un fármaco o agente farmacéutico que estimulará la respuesta biológica o médica de un tejido, sistema, animal o humano que está siendo investigado, por ejemplo, por un investigador o especialista clínico.

"Combinada" o "en combinación" o "combinación" debe entenderse como una administración simultánea funcional, donde alguno o todos los compuestos se pueden administrar por separado, en diferentes formulaciones, diferentes modos de administración (por ejemplo, subcutánea, intravenosa u oral) y diferentes tiempos de administración. Los compuestos individuales de dichas combinaciones se pueden administrar tanto de manera secuencial en composiciones farmacéuticas separadas así como en composiciones farmacéuticas combinadas.

Por ejemplo, en el tratamiento de la artritis reumatoide, se contempla la combinación con otros agentes quimioterapéuticos o anticuerpos. Los ejemplos adecuados de agentes farmacéuticamente activos que se pueden emplear en combinación con los compuestos de la presente invención y sus sales para el tratamiento contra la artritis reumatoide incluyen: inmunosupresores tales como amtolmetin guacilo, mizoribina y rimexolona; agentes anti-TNFα tales como etanorcept, infliximab, Adalimumab, Anakinra, Abatacept, Rituximab; inhibidores de la tirosina quinasa

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(viii) soluciones de tratamiento génico, incluyendo soluciones para sustituir genes anómalos tales como p53 anómalo BRCA1 o BRCA2 anómalos, soluciones GDEPT (tratamiento de profármaco enzimático dirigido contra gen) tales como usando la citosina desaminasa, enzima timidina quinasa o una enzima nitroreductasa bacteriana y soluciones para aumentar la tolerancia del paciente a la quimioterapia o radioterapia tal como un tratamiento génico de resistencia multifármacos; y (ix) soluciones inmunoterapéuticas, que incluyen soluciones ex-vivo e in-vivo para aumentar la inmunogenicidad de las células tumorales del paciente, tales como la transfección con citoquinas tales como interleuquina 2, interleuquina 4 o factor estimulador de colonias de granulocitos-macrófagos, soluciones para disminuir la energía de los linfocitos T, soluciones usando células inmunes transfectadas tales como células dendríticas transfectadas con citoquinas, soluciones usando líneas de células tumorales transfectadas con citoquinas y soluciones usando anticuerpos antiidiotípicos.

Se describen tratamientos combinados adicionales en el documento WO-A 2009/008992.

Por consiguiente, los compuestos individuales de dichas combinaciones se pueden administrar en composiciones farmacéuticas tanto secuencialmente como en forma separada así como de forma simultánea en composiciones farmacéuticas combinadas.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención incluyen composiciones adecuadas para la administración oral, rectal, tópica, parenteral (que incluye subcutánea, intramuscular, e intravenosa), ocular (oftálmica), pulmonar (inhalación nasal o bucal), o nasal, aunque la ruta más adecuada en cualquier caso dado dependerá de la naturaleza y de la gravedad de las dolencias que se están tratando y de la naturaleza del principio activo. Se pueden presentar convenientemente en una forma farmacéutica unitaria y prepararse mediante cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica farmacéutica.

En el uso práctico, los compuestos de fórmula (I) se pueden combinar como el principio activo en una premezcla íntima con un portador farmacéutico de acuerdo con las técnicas de composición farmacéutica convencionales. El portador puede tomar una amplia variedad de formas dependiendo de la forma de preparación deseada para la administración, por ejemplo, oral o parenteral (incluyendo la intravenosa). En la preparación de las composiciones para una forma farmacéutica oral, se puede emplear cualquiera de los medios farmacéuticos usuales, tales como agua, glicoles, aceites, alcoholes, agentes aromatizantes, conservantes, agentes colorantes y similares en el caso de preparaciones líquidas orales, tales como, por ejemplo, suspensiones, elixires y soluciones; o portadores tales como almidones, azúcares, celulosa microcristalina, diluyentes, agentes de granulación, lubricantes, aglutinantes, agentes desintegrantes y similares en el caso de preparaciones sólidas orales tales como polvos, cápsulas duras y blandas y comprimidos, prefiriéndose las preparaciones sólidas sobre las preparaciones líquidas.

Debido a la facilidad de administración, los comprimidos y cápsulas representan la forma farmacéutica unitaria más ventajosa, en cuyo caso, se emplean obviamente los portadores farmacéuticos sólidos. Si se desea, los comprimidos se pueden recubrir mediante técnicas acuosas o no acuosas normalizadas. Dichas composiciones y preparaciones deben contener al menos un 0,1 por ciento de compuesto activo. El porcentaje del compuesto activo en estas composiciones puede, por supuesto, variarse y puede estar convenientemente entre aproximadamente un 2 por ciento y aproximadamente un 60 por ciento del peso de la unidad. La cantidad de compuesto activo en dichas composiciones terapéuticamente útiles es tal que se obtendrá una dosificación eficaz. Los compuestos activos se pueden administrar también por vía intranasal, por ejemplo, como gotas líquidas o pulverizaciones.

Los comprimidos, píldoras, cápsulas, y similares pueden contener también un aglutinante tal como goma tragacanto, acacia, almidón de maíz o gelatina; excipientes tales como fosfato dicálcico; un agente desintegrante tal como almidón de maíz, almidón de patata, ácido algínico; un lubricante tal como estearato de magnesio; y un agente edulcorante tal como sacarosa, lactosa o sacarina. Cuando una forma farmacéutica unitaria es una cápsula, esta puede contener, además de los materiales del tipo anterior, un portador líquido tal como un aceite graso.

Pueden estar presentes otros materiales diversos como revestimientos o para modificar la forma física de la unidad de dosificación. Por ejemplo, los comprimidos se pueden revestir con shellac, azúcar o ambos. Un jarabe o elixir puede contener, además del principio activo, sacarosa como agente endulzante, metil y propilparabenos como conservantes, un colorante y un aromatizante tal como aroma de cereza o naranja.

Los compuestos de fórmula (I) pueden administrarse también por vía parenteral. Se pueden preparar disoluciones o suspensiones de estos compuestos activos en agua mezclados adecuadamente con un tensioactivo tal como hidroxipropilcelulosa. Se pueden preparar también dispersiones en glicerol, polietilenglicoles líquidos y sus mezclas en aceites. En condiciones de almacenamiento y uso ordinarias, estas preparaciones contienen un conservante para evitar el crecimiento de microorganismos.

Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen disoluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación en otro momento de disoluciones o dispersiones inyectables estériles. En todos los casos, la forma debe ser estéril y debe ser fluida en la medida que se pueda administrar fácilmente mediante una jeringuilla. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y tiene que conservarse contra la acción contaminante de microorganismos como bacterias y hongos. El portador puede ser un disolvente o un medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido),

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La enfermedad inflamatoria del intestino (EII) se caracteriza por una recaída crónica de la inflamación intestinal. La EII se subdivide en fenotipos de enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa. La enfermedad de Crohn implica de forma más frecuente el íleon y el colon terminal, es transmural y discontinua. Por el contrario, en la colitis ulcerosa, la inflamación es continua y limitada a las capas de la mucosa rectal y colónica. En aproximadamente el 10 % de los casos circunscritos al recto y al colon, no se puede hacer una clasificación definitiva de la enfermedad de Crohn o de la colitis ulcerosa y se designan como ’colitis indeterminadas’. Ambas enfermedades incluyen la inflamación extraintestinal de la piel, los ojos, o las articulaciones. Las lesiones inducidas por neutrófilos se pueden prevenir mediante el uso de inhibidores de la migración de neutrófilos (Asakura y col., 2007, World J Gastroenterol. 13(15): 2145-9).

La psoriasis es una dermatosis inflamatoria crónica que afecta aproximadamente al 2 % de la población. Se caracteriza por ronchas en la piel con costras rojas, que se encuentran usualmente en el cuello cabelludo, los codos, y las rodillas, y puede estar asociada con artritis grave. Las lesiones se producen por una proliferación e infiltración anómala de células inflamatorias en la dermis y la epidermis (Schon y col., 2005, New Engl. J. Med. 352:1899-1912).

El lupus sistémico eritematoso (LSE) es una enfermedad inflamatoria crónica generada por la activación de linfocitos B mediada por linfocitos T, que da como resultado glomerulonefritis e insuficiencia renal. El LSE se caracteriza en sus etapas iniciales por la expansión de células con memoria aurorreactivas dureaderas (D’Cruz y col., 2007, Lancet 369(9561):587-596).

La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad neurológica inflamatoria y desmielinante. Se ha considerado como un trastorno autoinmune mediado por linfocitos T auxiliares CD4+ de tipo 1, pero recientes estudios han indicado un papel de otras células inmunes (Hemmer y col., 2002, Nat. Rev. Neuroscience 3, 291-301).

La enfermedad de hospedador frente a injerto (GVDH) es una complicación mayor en el trasplante alogénico de médula ósea. GVDH está producido por linfocitos T del donante que reconocen y reaccionan a diferencias de los receptores en el sistema del complejo de histocompatibilidad, dando como resultado una morbilidad y mortalidad significativas.

El rechazo al trasplante (rechazo al trasplante del aloinjerto) incluye, sin limitación, rechazo al aloinjerto agudo y crónico posterior a, por ejemplo, trasplante de riñón, corazón, hígado, pulmón, médula ósea, piel y córnea. Se sabe que los linfocitos T juegan un papel central en la respuesta inmune específica de rechazo del aloinjerto.

En una realización preferida adicional, la enfermedad o trastorno asociado con mTOR es una enfermedad proliferativa, especialmente cáncer.

Las enfermedades y trastornos asociados especialmente con mTOR son trastornos o enfermedades proliferativas, especialmente cáncer.

Por lo tanto, otro aspecto de la presente invención es un compuesto o una de sus sales farmacéuticamente aceptables de la presente invención para su uso en un procedimiento de tratamiento o prevención de una enfermedad proliferativa, especialmente cáncer.

El cáncer comprende un grupo de enfermedades caracterizadas por el crecimiento y la diseminación incontroladas de células anómalas. Todos los tipos de cánceres implican generalmente alguna anomalía en el control del crecimiento, la división y la supervivencia celular, dando como resultado el crecimiento de células malignas. Los factores clave que contribuyen a dicho crecimiento de células malignas son la independencia de las señales del crecimiento, insensibilidad a las señales anticrecimiento, elusión de la apoptosis, potencial replicativo ilimitado, angiogénesis sostenida, invasión y metástasis de tejidos, e inestabilidad del genoma (Hanahan y Weinberg, 2000. The Hallmarks of Cancer. Cell 100, 57-70).

Normalmente, los cánceres se dividen en cánceres hematológicos (por ejemplo leucemias y linfomas) y cánceres sólidos tales como sarcomas y carcinomas (por ejemplo cánceres del cerebro, mama, pulmón, colon, estómago, hígado, páncreas, próstata, ovario).

Especialmente, se espera que para los cánceres en los que la ruta de transducción de señales PI3K/Akt está activada, por ejemplo, debido a la inactivación del supresor tumoral PTEN o a la activación de mutaciones en PIK3A, el gen que codifica la subunidad p110α (p110alfa) de la fosfoinositida-3 quinasa catalítica, respondan al tratamiento con inhibidores de mTOR (Garcia-Echeverria y Sellers, 2008, Oncogene 27, 5511-5526). Los ejemplos de cánceres con una elevada incidencia de mutaciones PTEN y/o activación de PI3K/Akt son el carcinoma endometrial, glioblastoma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de colon, cáncer de páncreas, cáncer gástrico, hepatocarcinoma, cáncer de ovarios, carcinoma de tiroides, cáncer de células renales, cáncer de mama, cáncer de próstata y tumores estromales gastrointestinales (GIST). Los resultados más prometedores con los inhibidores de mTOR se han obtenido en el carcinoma de células renales (CCR), linfoma de células del manto y cánceres endometriales (Faivre y col., 2006. Nat. Rev. Drug. Discov. 5(8): 671-688). Además, los inhibidores de mTOR pueden ser útiles para el tratamiento de leucemias que incluyen la LLA y la LMC, mieloma múltiple y linfomas.

Además, cánceres que guardan la activación de mutaciones de mTOR, por ejemplo cambios de un sólo aminoácido que confieren activación constitutiva de mTOR, tales como S2215Y o R2505P, pueden tratarse con inhibidores de

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mTOR (Sato y col., 2010, Oncogene 29(18): 2746-2752).

mTOR juega un importante papel en la angiogénesis, la formación de nuevos vasos sanguíneos para proporcionar oxígeno y nutrientes a las células en crecimiento y división. En este contexto, mTOR controla la producción de proteínas HIF1-α e HIF1-β, que son subunidades del factor inducible por hipoxia (HIF), un factor de transcripción que controla la expresión de genes cuyos productos juegan un papel en la angiogénesis, la proliferación celular, la motilidad y la supervivencia. Dos importantes proteínas inducidas por HIF son los factores de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y la angiopoyetina-2. Se ha notificado recientemente que un inhibidor de mTOR de molécula pequeña puede reducir el crecimiento tumoral, la angiogénesis tumoral y la permeabilidad vascular (Xue y col., 2008. Cancer Research 68(22): 9551-9557).

Además de la tumorigénesis, existe evidencia de que mTOR juega un papel en los síndromes de harmatoma. Recientes estudios han demostrado que las proteínas supresoras tumorales tales como TSC1, TSC2, PTEN y LKB1 controlan estrechamente la señalización de mTOR. La pérdida de estas proteínas supresoras tumorales conduce a un conjunto de dolencias de hamartoma como resultado de una elevada señalización de mTOR (Rosner y col., 2008. Mutation Research 659(3):284-292). Los síndromes con un vínculo molecular establecido para la desregulación de mTOR incluyen el síndrome de Peutz-Jeghers (PJS), enfermedad de Cowden, síndrome de Bannayan-Riley-Ruvalcaba (BRRS), síndrome de Proteus, enfermedad de Lhermitte-Duclos y esclerosis tuberosa (TSC). Los pacientes con estos síndromes desarrollan característicamente tumores hamartomatosos benignos en múltiples órganos. Otras proteínas supresoras tumorales que afectan la actividad de mTOR son VHL, NF1 y PKD cuya pérdida puede estimular la enfermedad de von Hippel-Lindau, la neurofibromatosis de tipo 1, y la enfermedad del riñón poliquístico, respectivamente.

Las enfermedades o trastornos proliferativos comprenden un grupo de enfermedades caracterizadas por un aumento de la multiplicación celular. Un ejemplo es la restenosis producida por el sobrecrecimiento de las células vasculares de la musculatura lisa (VSM) tras la angioplastia coronaria con prótesis endovasculares. Para evitar este problema, se han desarrollado prótesis endovasculares que eluyen un fármaco que inhibe el crecimiento de las células VSM. Las prótesis endovasculares revestidas de rapamicina reducen eficazmente la restenosis y han recibido la aprobación de la FDA (Serruys y col., 2006. N. Engl. J. Med. 354(5): 483-95).

En una realización preferida adicional, la enfermedad o trastorno asociado con mTOR es un enfermedad cardiovascular, una enfermedad metabólica o una enfermedad neurodegenerativa.

Por lo tanto, otro aspecto de la presente invención es un compuesto o una de sus sales farmacéuticamente aceptables de la presente invención para su uso en un procedimiento de tratamiento o prevención de una enfermedad cardiovascular, una enfermedad metabólica o una enfermedad neurodegenerativa.

Recientes estudios han desvelado un papel de mTOR en las enfermedades cardiovasculares, por ejemplo, se ha asociado una elevada actividad de la quinasa mTOR con la hipertrofia cardiaca (agrandamiento del corazón), que es un factor de riesgo principal para la insuficiencia cardiaca. Al nivel celular, la hipertrofia cardiaca se caracteriza por un aumento en el tamaño celular y una síntesis de proteínas potenciada. Aunque existen varios estímulos hipertróficos, tales como neurohormonas y factores de crecimiento peptídicos, y varias cascadas de proteínas quinasas están implicadas en la hipertrofia cardiaca, es probable que todas las fórmulas de estímulos hipertróficos activen la maquinaria general de traducción de proteínas de una manera dependiente de mTOR. De manera remarcable, la inhibición de mTOR por la rapamicina previene la hipertrofia cardiaca en numerosos modelos de ratones transgénicos. Además, la hipertrofia cardiaca inducida por estrés es dependiente de mTOR en ratones. Estos resultados indican que mTOR es crucial para el sobrecrecimiento cardiaco en exceso anómalo, y que los inhibidores de mTOR pueden ser útiles para el tratamiento de la hipertrofia cardiaca humana (Tsang y col., 2007, Drug Discovery Today 12, 112-124).

Las enfermedades metabólicas que se pueden tratar con los inhibidores de mTOR comprenden la diabetes de tipo 1, la diabetes de tipo 2, y la obesidad (Tsang y col., 2007, Drug Discovery Today 12, 112-124). La diabetes de tipo 1 está producida por la pérdida de la producción de insulina debida a la destrucción de las células β pancreáticas. Los estudios clínicos que utilizan un régimen inmunosupresor que contiene rapamicina para evitar el rechazo de los trasplantes de islotes han mostrado una eficacia significativa en pacientes diabéticos de tipo 1. La diabetes de tipo 2 surge cuando la secreción de insulina de las células β pancreáticas es insuficiente para compensar la resistencia periférica de la insulina (o insensibilidad a la insulina) en el músculo esquelético, hígado y adipocitos. Los datos recientes indican que la activación sostenida de la señalización de mTOR es un acontecimiento crucial que vuelve al sustrato de los receptores de la insulina (IRS) insensible a la insulina. Además, se ha demostrados que la rapamicina restaura la sensibilidad de IRS a la insulina (Shah y col., 2004. Curr. Biol. 14(18): 1650-1656). Por lo tanto, los inhibidores de mTOR son potencialmente útiles en la gestión de la diabetes de tipo 2. La obesidad es una enfermedad metabólica con un riesgo para la salud que aumenta sostenidamente a nivel mundial. Recientes evidencias sugieren que mTOR juega un papel en el metabolismo de los lípidos. Durante la adipogénesis, la expresión de mTOR aumenta drásticamente desde apenas detectable en preadipocitos hasta muy diferenciada en adipocitos completamente diferenciados, y la rapamicina inhibe la diferenciación de los adipocitos (Yeh y col., 1995. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92(24): 11086-90).

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Recientes informes sugieren que se pueden usar inhibidores de mTOR para tratar enfermedades neurodegenerativas tales como la enfermedad de Huntington, de Alzheimer y de Parkinson. La enfermedad de Huntington es un trastorno neurodegenerativo producido por una forma mutante de la proteína huntingtina con repeticiones de glutamina anómalamente largas en el extremo amino. La proteína mutante se agrega en las células neuronales y puede producir daño y toxicidad en las células nerviosas. La rapamicina atenúa la acumulación de huntingtina y la muerte celular, y protege contra la degeneración en modelos animales de la enfermedad de Huntington (Ravikumar y col., 2004. Nat Genet. 36(6): 585-95). Además, la rapamicina induce una respuesta autofágica que se ha sugerido que juega un papel en el aclaramiento de los agregados de huntingtina.

Se producen también agregados de proteínas intracelulares en otras enfermedades neurodegenerativas, por ejemplo, la enfermedad de Alzheimer. La proteína Tau se encuentra frecuentemente en cerebros de pacientes con Alzheimer y se cree que contribuye a la formación de ovillos neurofibrilares (por ejemplo en taupatías tales como demencia fronto-temporal). En un modelo de mosca, la rapamicina reduce la concentración de la proteína tau y disminuye la toxicidad producida por la acumulación de tau (Berger y col., 2006. Hum Mol Genet. 2006 Feb 1; 15(3): 433-42). Por lo tanto, los inhibidores de mTOR pueden ser útiles en la prevención de la acumulación de proteína tau tóxica en pacientes con Alzheimer.

La enfermedad de Parkinson (EP) es una enfermedad neurodegenerativa asociada con la acumulación y la agregación de proteínas plegadas de manera incorrecta. La prevención de la agregación o la desagregación de proteínas mal plegadas puede proporcionar un beneficio terapéutico retrasando o previniendo la progresión de la EP. El sistema ubiquitina-proteasoma (UPS) es un mecanismo de degradación importante que actúa sobre proteínas agregadas. Se ha notificado que rapamicina proporciona neuroprotección contra la muerte celular neuronal dopaminérgica inducida por el inhibidor del proteasoma lactacistina. Se ha sugerido que el efecto de la rapamicina está parcialmente mediado por la potenciación de la autofagia a través de la degradación potenciada de las proteínas incorrectamente plegadas (Pan y col., 2008. Neurobiol. Dis. 32(1): 16-25). Por tanto, los compuestos que pueden mejorar la autofagia pueden representar una estrategia prometedora para tratar pacientes con la EP.

En una realización preferida adicional, la enfermedad o el trastorno asociados con mTOR es una enfermedad asociada a autofagia.

Por lo tanto, otro aspecto de la presente invención es un compuesto o una de sus sales farmacéuticamente aceptables de la presente invención para su uso en un procedimiento de tratamiento o prevención de una enfermedad asociada a autofagia.

La autofagia es un proceso dependiente de lisosomas mediante el cual las proteínas o los orgánulos dañados en una célula se degradan (Mizushima y col., 2008. Nature 451(7182):1069-75). Durante este proceso, un autofagosoma con una doble membrana encierra el componente de la célula que se va a degradar. A continuación, el autofagosoma se fusiona con un lisosoma que, por ejemplo, degrada proteínas que conducen a una recirculación de los de aminoácidos. La autofagia está principalmente implicada en la degradación de proteínas de larga duración, agregados de proteínas, y orgánulos celulares y otros componentes celulares. Además de su función fisiológica, la autofagia podría aprovecharse para el tratamiento de una variedad de enfermedades producidas por agregados de proteínas plegadas de manera incorrecta, por ejemplo, enfermedades neurodegenerativas tales como la enfermedad de Huntington, Alzheimer o Parkinson. Se describe autofagias adicionales asociadas a enfermedades en el documento WO-A2009/049242, incorporado en el presente documento como referencia.

Un compuesto que induce la autofagia se refiere a un compuesto que induce la autofagia en una célula. Una enfermedad asociada a autofagia en una célula se refiere a una enfermedad que se puede tratar mediante la inducción de la autofagia. Se ha mostrado recientemente que un inhibidor de la quinasa mTOR competitivo para ATP puede inducir la autofagia (Thoreen y col., 2009. J. Biol. Chem. 284(12): 8023-32). De manera interesante, inhibidores de la quinasa mTOR competitivos para ATP parece que inducen la autofagia más eficazmente que rapamicina en células de mamíferos. En su conjunto, los compuestos de la presente invención pueden ser útiles para inducir la autofagia en células y para tratar enfermedades asociadas con autofagia.

En una realización preferida adicional, la enfermedad o el trastorno es una infección vírica.

Por lo tanto, otro aspecto de la presente invención es un compuesto o una de sus sales farmacéuticamente aceptables de la presente invención para su uso en un procedimiento de tratamiento o prevención de una infección vírica.

Todos los virus requieren ribosomas celulares para traducir sus ARNm. Por ejemplo, se ha mostrado que el citomegalovirus humano (HCMV) activa la ruta de señalización de mTORC1. El tratamiento de células infectadas con Torin1, un inhibidor de mTOR que señala el sitio catalítico de quinasa de mTOR, bloquea la producción de progenie del virus. Además, se demostró que Torin1 inhibe la replicación miembros representativos de las familias de alfa-, beta-y gamma-herpesvirus, demostrando el potencial de inhibidores de quinasa de mTOR como agentes antivirales de amplio espectro (Moorman y Shenk, 2010. J. Virol. 84(10): 5260-9). En el documento WO-A 2011/011716, incorporado en el presente documento por referencia, se describen infecciones víricas adicionales que pueden tratarse o prevenirse mediante inhibidores de mTOR.

Otro aspecto adicional de la presente invención es el uso de un compuesto de la presente invención o de una de sus

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En general, pueden prepararse compuestos de la presente invención de acuerdo con un procedimiento que comprende las etapas de

(a) hacer reaccionar un compuesto de fórmula (II)

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en la que R3, n, X1, X2 tienen el significado que se ha indicado anteriormente y R2' es H cuando R2 es H, o R2 es Cl cuando R2 es T2, con un compuesto de fórmula (III)

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en la que R1, R4, m tienen el significado que se ha indicado anteriormente y X es un éster o ácido borónico en una reacción de Suzuki para producir un compuesto de fórmula (I), en la que R2 es H; o cuando R2 es T2

(a') hacer reaccionar el compuesto de fórmula (II) en dos reacciones de Suzuki con un compuesto de fórmula R2-X, en la que X es un ácido borónico o éster borónico, y posteriormente con un compuesto de fórmula (III) para producir un compuesto de fórmula (I), en el que R2 es T2.

Ejemplos

Abreviaturas:

uma: Unidades de masa atómica

Boc: Carboxilato de terc-butilo

a: Ancho

salmuera: Solución acuosa saturada de cloruro sódico

CPME: Ciclopentil metil éter

d: Doblete

d6-DMSO: Dimetilsulfóxido

DCM: Diclorometano

dd: Doblete doble

DIPEA: Diisopropiletilamina

DME: 1,2-Dimetoxietano

DMF: N,N-Dimetilformamida

DMSO: Dimetilsulfóxido

EDC: Clorhidrato de N-etil-N’-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida

Et: Etilo

Et3N: Trietilamina

EtOAc: Acetato de etilo

EtOH: Etanol

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(Continuación)

g: Gramos

h: Hora(s)

H2O: Agua

HCl: Cloruro de hidrógeno

HOBt: 1-Hidroxibenzotriazol

HPLC: Cromatografía líquida de alto rendimiento

iPr: Isopropilo

CLEM: Cromatografía líquida con espectrometría de masas

m: Multiplete

MeCN: Acetonitrilo

MeOH: Metanol

min: Minuto(s)

ml: Mililitros

mm: Milímetros

mmol: Milimoles

mp-TsOH: Ácido p-toluenosulfónico soportado por resina de poliestireno

Na2CO3: Carbonato sódico

Na2SO4: Sulfato sódico

NaHCO3: Hidrogenocarbonato sódico

NH3: Amoniaco

RMN: Resonancia magnética nuclear

ºC: Grados Celsius

Pd(PPh3)2(Cl)2: Cloruro de bis(trifenilfosfina)paladio (II)

prep.: Preparativa

PTFE: Poli(tetrafluoroeteno)

c: Cuadruplete

qn: Quintuplete

Tr: Tiempo de retención

TA: Temperatura ambiente

s: Singlete

sat: Saturado

spec: Espectrometría

t: Triplete

TFA: Ácido trifluoroacético

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Detección y cuantificación de quinasas eluidas

Las quinasas de los eluatos se detectaron y cuantificaron por salpicado sobre membranas de nitrocelulosa y usando un primer anticuerpo dirigido contra la quinasa de interés y un anticuerpo secundario marcado de forma fluorescente (anticuerpos IRDye™ o dirigidos contra Ig de ratón o dirigidos contra Ig de conejo, de Rockland). El sistema de imagen

5 por infrarrojos de LI-COR Biosciences (Lincoln, Nebraska, USA) se hizo funcionar de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante (Schutz-Geschwendener y col., 2004. Quantitative, two-color Western blot detection with infrared fluorescence. Publicado en mayo de 2004 por LI-COR Biosciences, www.licor.com).

Tras el salpicado con los eluatos, la membrana de nitrocelulosa (BioTrace NT; PALL, Nº BTNT30R) se bloqueó en primer lugar mediante incubación con tampón de bloqueo Odyssey (LICOR, 927-40000) durante una hora a 10 temperatura ambiente. A continuación las membranas bloqueadas se incubaron durante 16 horas a 25 ºC con el primer anticuerpo diluido en tampón de bloqueo Odyssey (LICOR Nº 927-40000). Posteriormente, la membrana se lavó tres veces durante 10 minutos con tampón PBS que contenía Tween 20 al 0,1 % a temperatura ambiente. A continuación, la membrana se incubó durante 60 minutos a temperatura ambiente con el anticuerpo de detección (anticuerpo IRDye™ marcado de Rockland) diluido en tampón de bloqueo Odyssey (LICOR Nº 927-40000). Posteriormente, la 15 membrana se lavó tres veces durante 10 minutos, cada una con un tampón 1 x PBS que contenía Tween 20 al 0,1 % a temperatura ambiente. A continuación, la membrana se enjuagó una vez con tampón PBS para eliminar el Tween 20 residual. La membrana se mantuvo en tampón PBS a 4 ºC y a continuación se sometió a exploración con el equipo Odyssey. Se registraron las señales de fluorescencia y se analizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Tabla 1: Fuentes y diluciones de anticuerpos

Quinasa diana: Anticuerpo primario (dilución) Temperatura de la incubación primaria Anticuerpo secundario (dilución)

mTOR: Señalización celular Nº 2972 (1:500) Temperatura ambiente Licor contra inmunoglobulina de conejo 800 (1:5000)

PI3Kdelta: Santa Cruz Nº sc-7176 (1:1000) 4 ºC Licor contra inmunoglobulina de conejo 800 (1:2500)

ADNPK: Calbiochem Nº NA57 (1:1000) 4 ºC Licor contra inmunoglobulina de ratón 800 (1:5000)

Resultados

Tabla 2: Valores de inhibición (CI50 en μM) tal como se ha determinado en el ensayo de cinoperlas (nivel de actividad: A <0,1μM; 0,1μM ≤ B < 1μM; 1μM ≤ C < 10μM; D ≥ 10μM).

Ejemplo Número: mTor PI3Kd ADNPK

1: C D D

2: B D D

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5: C D D

6: B D D

7: C D D

8: C D D

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10: C D D

11: C D D

12: C D D

13: C D D

75 (Continuación)

Ejemplo Número: mTor PI3Kd ADNPK

14: B D D

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16: C D D

17: C D D

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23: B D D

24: B D D

25: B D D

26: B D C

27: C C C

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29: C D C

30: C C C

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33: C C C

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36: C D C

37: C D D

38: C D D

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41: A D D

42: B D D

43: B D D

44: B D D

45: A C D

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76 (Continuación)

Ejemplo Número: mTor PI3Kd ADNPK

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48: B D C

49: B D C

50: A D C

51: B D C

52: B D C

53: B D D

54: B D D

55: B D D

56: C D D

57: C D D

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Tabla 3: Fuentes y diluciones de anticuerpos

PI3K alfa: Tecnologías de señalización celular 4255 (1 en 100) 25 ºC Contra inmunoglobulina de conejo (1 en 2500)

PI3K beta: Millipore 04-400 (1 en 1000) 25 ºC Contra inmunoglobulina de conejo (1 en 2500)

77 (Continuación)

PI3K delta: Santa Cruz SC7176 (1 en 1000) 4 ºC Contra inmunoglobulina de conejo (1 en 2500)

PI3K gamma: Jena Bioscience ABD-026L (1 en 100) 25 ºC Contra inmunoglobulina de ratón (1 en 2500)

mTOR: Tecnologías de señalización celular 2972 (1 en 500) 25 ºC Contra inmunoglobulina de conejo (1 en 5000)

ADNPK: Calbiochem NA57 (1 en 1000) 4 ºC Contra inmunoglobulina de ratón (1 en 5000)

Tal como se muestra en la Tabla 4, la selectividad de compuestos de la invención se determinó adicionalmente frente a proteína quinasa dependiente de ADN (ADN-PK), PI3Kα, PI3Kβ, PI3Kδ, y PI3Kγ.

Tabla 4: Valores de inhibición (CI50 en μM) tal como se ha determinado en el ensayo de cinoperlas (nivel de actividad: A <0,1μM; 0,1μM ≤ B < 1μM; 1μM ≤ C < 10μM; D ≥ 10μM).

Ejemplo Número.: mTOR ADNPK PI3Ka PI3Kb PI3Kd PI3Kg

1: C D - - D -

2: B D D D D D

3: B D D D D D

4: B D D D D D

5: C D - - D -

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18: C D - - D -

19: C D - - D -

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78 (Continuación)

Ejemplo Número.: mTOR ADNPK PI3Ka PI3Kb PI3Kd PI3Kg

22: C D - - D -

23: B D D D D D

24: B D D D D D

25: B D D D D D

26: B C D C D D

27: C C - - C -

28: C D D D D D

29: B C C C D D

30: C C C C C D

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35: B D D D D D

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46: B D D D D D

47: B D D D D D

48: B C D D D D

49: B C D D D D

50: A C D D D D

51: B C D D D D

52: B C D D D D

53: B D C D D D

79 (Continuación)

Ejemplo Número.: mTOR ADNPK PI3Ka PI3Kb PI3Kd PI3Kg

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56: C D D D D D

57: C D D D D D

58: C D D D D D

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73: B D D D D D

74: B D D D D D

75: B D D D D D

76: B D D D D D

77: B D D D D D

78: A D D D D D

79: C D D D D D

80: A D D D D D

81: B D D D D D

82: C D D D D D

83: B D D D D D

84: B D D D D D

85: C D D D D D

86: B D D D D D

80 (Continuación)

Ejemplo Número.: mTOR ADNPK PI3Ka PI3Kb PI3Kd PI3Kg

87: B D D D D D

88: C D D D D D

Tal como se muestra en la Tabla 5, el perfil de selectividad de quinasa de compuestos seleccionados de la invención se determinó en ensayos de cinoperlas con detección de espectrometría de masas de quinasas como se ha descrito anteriormente (Bantscheff y col., 2007. Nat Biotechnol. 25(9):1035-1044; WO-A 2006/134056; WO-A 2009/098021). El

5 complemento de proteína quinasa del genoma humano (el quinoma) se ha descrito previamente (Manning y col., 2002. Science 298(5600):1912-1934). Los números de acceso a secuencia se definen mediante el índice internacional de proteínas (IPI) (Kersey y col., 2004. Proteomics 4(7): 1985-1988).

Tabla 5: Valores de inhibición (CI50 en μM) según se determinaron en el ensayo de cinoperlas con detección de espectrometría de masas de quinasas (Los niveles de actividad se dan en intervalos de 0,1 μM)

10

Ejemplo Número

Subclase de quinasa: Nombre de quinasa Número de acceso IPI 8 4 6 40 43 46 76

MSK2 IPI00022536: n.d. n.d. n.d. > 10 > 10 > 10 n.d.

PDK1 IPI00002538: > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

PKCa IPI00385449: > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

PKCb IPI00219628: > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

PKCd IPI00329236: n.d. > 10 n.d. > 10 > 10 > 10 > 10

AGC: PKCt IPI00029196 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

PKN1 IPI00412672: > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

PKN2 IPI00002804: n.d. n.d. n.d. > 10 > 10 n.d. n.d.

RSK2 IPI00020898: n.d. > 10 n.d. > 10 n.d. n.d. n.d.

RSK3 IPI00477982: > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

ADCK1 IPI00787836: n.d. n.d. n.d. > 10 n.d. n.d. n.d.

ADCK3 IPI00176469: > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

ATM IPI00298306: > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

ATR IPI00412298: n.d. > 10 n.d. 1,1 -1,2 > 10 > 10 > 10

BRD2 IPI00440502: > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

Atípico: BRD3 IPI00014266 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

BRD4 IPI00440727: > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

ADNPK IPI00296337: > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

mTOR IPI00031410: 0,1-0,2 0,3-0,4 0,1-0,2 0,1-0,2 0,1-0,2 0,2-0,3 0,1-0,2

RIOK2 IPI00306406: > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

81 (Continuación)

Ejemplo Número

AMPKa1 IPI00410287: > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

CaMK1d IPI00170508: > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

CaMK2a IPI00550056: > 10 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.

CaMK2b IPI00221305: > 10 n.d. > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

CaMK2d IPI00828081: > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

CaMK2g IPI00908444: > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

CaMK4 IPI00430411: > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 n.d. n.d.

DRAK2 IPI00916930: n.d. > 10 n.d. > 10 n.d. > 10 n.d.

CAMK: MARK2 IPI00555838 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

MARK3 IPI00183118: > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

MARK4 IPI00064797: > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

MELK IPI00006471: > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

PHKg2 IPI00012891: n.d. > 10 n.d. > 10 n.d. n.d. n.d.

PKD2 IPI00009334: n.d. > 10 n.d. > 10 n.d. n.d. n.d.

QIK IPI00465291: > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

QSK IPI00657720: > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

STK33 IPI00302351: n.d. > 10 n.d. > 10 n.d. > 10 n.d.

CK1a IPI00448798: > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

CK1a2 IPI00167096: n.d. n.d. n.d. > 10 n.d. n.d. n.d.

CK1d IPI00011102: > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 n.d.

CK1: CK1e IPI00027729 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

CK1g1 IPI00791893: > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

CK1g2 IPI00297767: n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. > 10 n.d.

CK1g3 IPI00218437: > 10 > 10 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.

CMGC: CDC2 IPI00026689 CDK2 IPI00031681 CDK5 IPI00023530 n.d. > 10 n.d. > 10 n.d. > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

CDK6 IPI00023529: n.d. > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

CDK7 IPI00000685: > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

CDK9 IPI00552413: > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

CDK10 IPI00014873: n.d. > 10 n.d. > 10 > 10 n.d. n.d.

CLK1 IPI00915761: > 10 n.d. n.d. > 10 > 10 > 10 n.d.

82 (Continuación)

Ejemplo Número

CLK2 IPI00028071: > 10 n.d. n.d. n.d. > 10 > 10 n.d.

DYRK1A IPI00014344: n.d. > 10 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.

Erkl IPI00018195: > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

Erk2 IPI00003479: > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

Erk5 IPI00910923: n.d. > 10 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.

GSK3A IPI00292228: > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

GSK3B IPI00216190: > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

JNK1 IPI00220306: > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

JNK2 IPI00303550: > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

NLK IPI00008237: > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

p38a IPI00221141: > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

p38b IPI00019473: n.d. > 10 > 10 n.d. > 10 n.d. n.d.

PIK3C3 IPI00873758: n.d. > 10 n.d. > 10 > 10 > 10 > 10

PIK3Ca IPI00031386: > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

PIK3Cb IPI00031388: > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

PIK3Cd IPI00384817: > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

Quinasa de: PIK3Cg IPI00292690 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

lípidos: PIK4C2B IPI00291068 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

PIK4Ca IPI00070943: > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

PIK4Cb IPI00641770: > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

PIP5K2A IPI00009688: n.d. n.d. n.d. > 10 n.d. n.d. n.d.

PIP5K2C IPI00152303: n.d. n.d. n.d. > 10 > 10 > 10 > 10

AAK1 IPI00916402: > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

AurA IPI00298940: > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

AurB IPI00796914: > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

BIKE IPI00337426: > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

CaMKKI IPI00792960: n.d. > 10 n.d. > 10 > 10 > 10 > 10

CaMKK2 IPI00290239: > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

CK2a1 IPI00016613: > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

CK2a2 IPI00020602: > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

GAK IPI00298949: n.d. > 10 n.d. > 10 > 10 > 10 > 10

GCN2 IPI00163851: n.d. > 10 > 10 n.d. > 10 > 10 n.d.

83 (Continuación)

Ejemplo Número

Otra: HRI IPI00328149 > 10 > 10 n.d. > 10 > 10 > 10 > 10

IKKe: IPI00029045 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

MPSK1: IPI00915837 n.d. > 10 > 10 n.d. n.d. n.d. > 10

MYT1: IP100909627 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

NEK2: IPI00021331 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

NEK9: IPI00301609 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

PIK3R4: IPI00024006 n.d. > 10 n.d. > 10 > 10 > 10 > 10

PLK4: IPI00410344 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

SgK223: IPI00739386 > 10 n.d. > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

TBK1: IPI00293613 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

ULK3: IPI00910978 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

Weel: IPI00025830 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

GCK: IPI00149094 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

HPK1: IPI00020258 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

KHS1: IPI00294842 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

MAP2K1: IPI00219604 n.d. > 10 n.d. > 10 > 10 > 10 > 10

MAP2K2: IPI00003783 n.d. > 10 n.d. > 10 > 10 > 10 > 10

MAP2K5: IPI00158248 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

MAP3K1: IPI00855985 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

MAP3K2: IPI00513803 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

STE: MAP3K3 IPI00181703 n.d. n.d. n.d. > 10 n.d. n.d. > 10

MAP3K4: IPI00386260 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

MAP3K5: IPI00412433 n.d. > 10 n.d. > 10 n.d. n.d. > 10

MST1: IPI00011488 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

MST2: IPI00411984 n.d. n.d. n.d. > 10 > 10 > 10 n.d.

PAK4: IPI00014068 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

SLK: IPI00022827 n.d. > 10 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.

TAO2: IPI00006283 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

TAO3: IPI00410485 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

ABL IPI00221171 ACK IPI00552750 ARG IPI00329488: n.d. > 10 n.d. > 10 n.d. n.d. > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

84 (Continuación)

Ejemplo Número

BLK IPI00554756: > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

BTK IPI00029132: > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

CSK IPI00013212: > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

DDR1 IPI00657861: n.d. > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

EphA3 IPI00298105: > 10 > 10 n.d. > 10 > 10 > 10 n.d.

EphB2 IPI00021275: > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

EphB6 IPI00005222: n.d. > 10 > 10 > 10 n.d. > 10 n.d.

FAK IPI00413961: > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

FER IPI00029263: > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

FGR IPI00016871: > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

FYN IPI00219012: > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

TK: INSR IPI00025803 n.d. > 10 n.d. > 10 n.d. n.d. n.d.

ITK IPI00004566: > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

JAK1 IPI00784013: > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

JAK2 IPI00031016: n.d. n.d. n.d. > 10 n.d. > 10 n.d.

JAK3 IPI00219418: n.d. n.d. > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

KIT IPI00022296: n.d. n.d. n.d. > 10 > 10 > 10 n.d.

LCK IPI00515097: n.d. > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

LYN IPI00298625: > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

PYK2 IPI00029702: > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

SRC IPI00328867: > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

SYK IPI00018597: > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

TEC IPI00000878: > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

TYK2 IPI00022353: > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

YES IPI00013981: > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

ZAP70 IPI00329789: n.d. > 10 n.d. > 10 > 10 > 10 n.d.

TKL: ACTR2B IPI00437565 ALK2 IPI00029219 ALK4 IPI00005732 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 n.d. > 10 > 10

ARAF IPI00020578 BMPR1A IPI00005731 BMPR2 IPI00783156: > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 n.d. > 10 > 10 n.d. > 10 > 10 n.d. n.d. n.d. > 10 n.d. n.d. n.d.

85 (Continuación)

Ejemplo Número

BRAF: IPI00303797 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

ILK: IPI00013219 > 10 > 10 n.d. > 10 > 10 n.d. > 10

IRAK1: IPI00293652 n.d. > 10 n.d. > 10 > 10 > 10 > 10

LIMK1: IPI00291702 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

LIMK2: IPI00025698 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

MLK3: IPI00000977 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 n.d. n.d.

RIPK2: IPI00021917 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

RIPK3: IPI00847572 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

TESK1: IPI00018182 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 n.d.

TESK2: IPI00102677 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

TGFbRI: IPI00005733 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

TGFbR2: IPI00164934 n.d. > 10 > 10 > 10 n.d. > 10 > 10

ZAK: IPI00329638 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10

Ensayo celular in vitro fosfo-S6 y fosfo-Akt

La activación de la señalización de mTOR da como resultado la fosforilación de algunas dianas corriente abajo. En las células, mTOR aparece en dos complejos de proteínas diferentes. El complejo-1 de mTOR (mTORC1) fosforila y

5 activa la quinasa 1 de S6 (S6K1) y la quinasa 2 de S6 (S6K2) (conocida también como p70S6K) que fosforila a continuación la proteína ribosómica S6 (S6RP) (conocida también como RPS6). S6RP se fosforila en la serina 235, serina 236, serina 240 y serina 244 en pS6K1 y pS6K2. El complejo-2 de mTOR (mTORC2) fosforila AKT en la serina 473 que activa la ruta de señalización de AKT.

El ensayo mide la inhibición del compuesto de ensayo de la fosforilación de serina-240/244 de S6RP y la inhibición de

10 la fosforilación de la serina 473 de Akt en células procedentes de riñón embriónico humano HEK293T/17 (ATCC CRL-11268).

La línea de células HEK293T/17 se mantiene en medio DMEM (número de catálogo de Invitrogen 41965-039) suplementado con FCS al 10% a 37 ºC en una incubadora humidificada con CO2 al 5 %.

Se sembraron las células en placas de 96 pocillos a 40.000 células/pocillo (ensayo pS6RP S240/244) u 80.000

15 células/pocillo (ensayo pAkt S473) en 90 μl de medio de crecimiento (DMEM, 2 % FCS). Las placas se incubaron durante 1 hora en una incubadora humidificada para permitir la adhesión de las células. Las células se trataron con 8 concentraciones de compuestos de ensayo o DMSO solo para los controles (concentración final de DMSO 0,1 %) y se incubaron a 37 ºC durante 2 horas. A continuación se añadieron 20 μl de tampón de lisis concentrado 5x (NaCl 750 mM, Tris 100 mM pH 7,4, EDTA 5 mM, EGTA 5 mM, Triton X-100 al 5 %), las placas se precintaron y se incubaron

20 durante 15 minutos a 4 ºC con agitación suave. Tras la lisis celular, 25 μl del lisado celular se transfirió a una placa MesoScale revestida con un anticuerpo dirigido contra pS6RP Ser240/244 (MesoScale Discovery K150DGD-3) o un anticuerpo dirigido contra pAkt Ser 473 (MesoScale Discovery K151DGD-3). Las placas se habían bloqueado previamente por incubación con 150 μl de solución de bloqueo MesoScale Discovery-A durante 1 hora a temperatura ambiente seguido por lavado con 150 μl de tampón de lavado 1x Tris por pocillo. Tras la transferencia del lisado celular

25 a la placa de MSD, la proteína pS6RP (o pAkt) se capturó en el anticuerpo revestido mediante incubación a temperatura ambiente durante 1 hora con agitación suave. Tras la etapa de captura, la placa se lavó tres veces con 150 μl de tampón de lavado 1x Tris por pocillo. A continuación se añadieron 25 μl de anticuerpo de detección conjugado con Sulfo-Tag y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación suave. Posteriormente, se retiró la solución del anticuerpo y la placa se lavó 3 veces con 150 μl 1x de tampón Tris de lavado por pocillo y se

30 añadieron 150 μl de tampón de lectura. Las placas se analizaron en un lector de placas MSD 2400 (MesoScale Discovery). Se llevó a cabo el análisis de datos usando regresión no lineal para determinar una dosis-respuesta sigmoidal con una pendiente variable.

86 Tabla 6: Datos del ensayo celular fosfo-Akt y fosfo-S6 (nivel de actividad: A <0,1 μM; 0,1 μM ≤ B < 1 μM; 1 μM ≤ C < 10 μM; D ≥ 10μM).

Ejemplo Número.: pAKT pS6

2: A A

3: - A

4: - A

6: A A

7: - B

14: - B

15: - B

21: B A

22: - B

23: A B

24: - B

25: - B

26: - B

28: - C

29: - B

30: - C

34: - B

35: - B

37: - B

38: - B

39: - B

40: A A

41: A A

42: A B

43: A A

44: A A

45: B

46: A A

47: A A

48: B

49: B

50: B

51: B

87 (Continuación)

Ejemplo Número.: pAKT pS6

52: B

53: B

54: B

55: B

56: B

57: B

58: B

59: B

60: A A

61: A A

62: A B

63: B

64: A A

65: - B

66: - B

67: - B

68: - B

69: - A

70: - B

71: - A

72: - B

73: - A

74: A A

75: - B

76: A A

77: A A

78: A A

79: - B

80: - A

81: - A

82: - A

83: - A

84: - C

88

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Claims

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