KR0184860B1 - 단일영역 리간드와 이를 포함하는 수용체 및 이들의 제조방법과 이용(법) - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

단일 도메인 리간드와 이를 포함하는 수용체 및 이들의 제조방법과 이용(법)

본 발명은 면역글로불린(Ig) 슈퍼훼밀리 중의 분자로부터 유도된 단일도메인리간드와 적어도 하나의 리간드를 포함하는 수용체, 이들 리간드를 코팅하는 DNA 서열을 클로니아고 증폭하고 발현하는 방법, 상술한 DNA 서열을 이용하여 Ig 타입의 분자 및 상술한 리간드 또는 수용체를 제조하는 방법, 그리고 상술한 리간드나 수용체들을 치료와 진단 또는 촉매의 용도로 이용하는 것에 관한 것이다.

참고 문헌 목록은 명세서 말미에 언급되어 있으며 참고문헌 목록번호는 사각 괄호[ ]안에 표시되어 있다.

Ig슈퍼훼밀리는 Ig자체 뿐만 아니라 T-임파구와 같은 임파세포 표면에 존재하는 수용체 등의분자들도 포함한다. 면역글로불린은 서로 공유결합된 적어도 하나의 무거운 사슬(heavy chain; 이하 'H사슬'이라 함)과 적어도 하나의 가벼운 사슬(light chain; 이하 'L사슬'이라 함)로 이루어 진다. 각각의 사슬은 수많은 도메인으로 구분되며 각 사슬의 N-말단은 가변도메인(variable domain)이다. H사슬의 가변도메인과 L사슬의 가변도메인이 조화를 이루어 특별한 표적분자를 수용하는 결합부위를 형성한다. Ig들의 경우 표적분자는 항원이다. T-세포 수용체는 각각 두개의 도메인으로 구성된 동일한 크기의 α와 β사슬을 가진다. 각 사슬의 N-말단에는 가변도메인이 있으며, α사슬의 가변도메인과 β사슬의 가변도메인은 표적분자, 즉 조직 적합성 항원(histocompatibility antigen)의 역할을 하는 펩티드에 대한 결합 부위를 형성하는 것으로 생각된다. 각 사슬의 가변도메인은 아미노산 서열이 분자에 따라 특이적기 때문에 극히 다양한 표적분자를 인지할 수 있도록 한다.

가변도메인이 어떻게 만들어지는가를 밝히기 위하여 Ig분자에 관한 많은 연구가 수행되었던 바, 각각의 가변도메인은 다수의 상대적 보존서열 부위와 세 개의 초가변 서열 부위로 구성되었다는 것이 알려졌다. 세 개의 초가변도메인 각각은 통상 상보성 결정부위(complementarity determining region; CDR)로 지칭된다.

결정학 연구에 의하면 각각의 Ig분자 가변도메인에서의 CDR은 보존서열 부위에 의해 형성된 프레임부위(framework areas)상에 지지되어 있음을 보여준다. 프레임 부위에 의해 함께 모여진 세 개의 CDR은 다른 사슬에 있는 CDR들과 함께 표적분자를 수용할 공간(pocket)을 형성한다.

재조합 DNA기술의 출현으로 Ig분자와 그 유도체를 클로닝하고 발현하는 것에 많은 관심을 갖게 되었다. 이 주제에 관한 특허출원의 건수와 다른 공보물들은 이러한 관심을 반영하는 것이다.

전체 Ig의 클로닝과 발현에 대한 최초의 연구는 EP-A-O 120 694(Boss)에 기술되어 있다. 보스의 출원은 또한 키메릭 항체(chimeric antibodies)의 클로닝과 발현에 관한 것이다. 키메릭 항체는 한 Ig의 가변도메인과 다른 Ig의 불변도메인이 융합된 Ig 타입의 분자이다. 대개 가변도메인은 한 종(species)의 Ig(보통 쥐의 Ig)로부터 유도되며 불변도메인은 다른 종의 Ig(보통 인간의 Ig)로부터 유도된다.

이후의 유럽특허출원 EP-A-O 125 023(Genentech)는 보스 출원과 거의 동일한 주제에 관한 것일 뿐만 아니라 재조합 DNA 기술에 의한 다양한 Ig타입 분자의 제조에 관한 것이다.

EP-A-O 194 276(Neuberger)는 보스출원에 개시된 타입의 키메릭 항체 뿐만 아니라, 불변도메인의 일부 또는 전부가 비-Ig성 단백질 서열에 의해 치환된 키메릭항체에 관한 것이다. 예를 들어 H사슬 CH2와 CH3 도메인은 효소나 단백질 독소로부터 유도된 단백질 서열에 의해 치환될 수도 있다.

EP-A-O 239 400(Winter)은 Ig분자의 제조에 관한 다른 접근을 개시한다. 이 접근에서 첫번째 타입 Ig의 CDR 부분만이 두번째 타입 Ig의 CDR을 대신하여 이식·융합된다. CDR은 전체 Ig에서 상대적으로 작기 때문에, 생성된 Ig분자의 대부분은 두번째 타입에서 유래하게 된다. 그러나 CDR은 Ig의 특이성을 결정하는 부분이어서 생성된 Ig분자는 첫번째 Ig로부터 유도된 특이성을 지닌다.

이하에는 Gentech의 출원에 기술된 키메릭 항체, CDR-이식 Ig, 변형된 항체, 그리고 F(ab')₂와 Fv 단편같은 Ig의 단편들을 '변형된 항체'로 취급하기로 한다.

재조합 DNA 기술을 사용하는 Ig 분야에서의 연구활동의 중요한 목표 중의 하나가 Ig를 치료용도로 사용하고자 하는 것이다. Kohler와 Milstein에 의해 개발된 하이브리도마(hybridoma)기술을 사용하는 것은 잘 알려져 있으며 거의 모든 특이성에 대한 모노크로날 항체(MAb)를 제조하는 것이 가능하다. 그러므로 암 항원에 대항하는 MAb도 이미 생산된 바 있다. 이들 MAb를 독소에 공유적으로 결합시키거나 융합시킨 마술의 총알(magic bullets)을 제조하여 암치료용으로 이용하는 것도 생각할 수 있다. 또한 정상적인 조직이나 세포 표면 항원에 대한 MAb도 제조되고 있다. 이들에 표지(label)를 붙여서 생체 이미지화(imaging)에 사용할 수도 있다.

대부분의 MAb가 설치류, 특히 쥐에서 제조되기 때문에 이러한 MAb를 치료나 생체 진단에 사용하는데 가장 큰 장애가 되고 있다. 인간의 MAb를 제조하기는 매우 어렵다. 대부분의 MAb는 인간 이외의 종에서 유도되기 때문에 인간에게는 항원으로 작용한다. 따라서 인간에게 이들 MAb를 투여하면 일반적으로 인간에 의해 개시된 항-Ig 반응이 나타나게 된다. 그런 반응에 의해, 투여된 항체가 빨리 파괴되거나 제거되어 치료나 진단이 방해될 수 있으며, 환자에게 역효과를 주는 앨러지 반응이나 면역 복합 과민증을 야기할 수도 있다.

가능한 한 인간의 Ig와 동일하면서도 여전히 고유한 특이성을 보유하는 변형된 Ig의 제조가 제안되었다. 따라서 변형된 Ig는 자신의 특이성이 유래된 MAb에 버금가는 효과를 나타내면서도 동시에 항원성이 적을 것으로 예상된다. 그러므로 치료나 진단을 위해서 변형된 Ig를 합리적인 횟수 만큼 사용하는 것이 가능할 것이다.

유전자 수준에서 H사슬의 가변도메인은 다음과 같은 세개의 유전자 단편으로부터 재배열된 유전자에 의해서 코딩된다: ① 재배열되지 않은 VH유전자(N-말단의 세개의 구조 영역 중 첫번째 두개의 완전한 CDR과 세번째 CDR의 첫번째 부분을 코딩 함), ② 다양성구획(diversity segment; DH)(세번째 CDR의 중심 부분을 코팅함) 및 ③ 연결구획(joining segment; JH)(세번째 CDR의 마지막 부분과 네번째 프레임부위를 코딩함). B-세포가 성숙하는 과정에서 유전자들이 재배열 되어, 각각의 재배열되지 않은 VH유전자는 하나의 DH유전자 및 하나의 JH유전자와 연결된다. 재배열된 유전자는 VH-DH-JH에 해당한다. 이 재배열된 유전자는 Ig사슬의 불변부를 코딩하는 유전자에 연결된다.

다양성구획이 없다는 점을 제외하고는 L사슬의 경우도 비슷하다. 즉, L사슬의 가변도메인은 재배열되지 않은 VL유전자와 JL유전자에 의해서 코딩된다. L사슬에는 재배열되지 않은 V_κ유전자와 J_κ단편으로부터 재배열된 카파(κ)와 재배열되지 않은 V_λ유전자와 J_λ단편으로부터 재배열된 람다(λ) 등 두 타입이 있다. 종래의 연구에 의하면 효과적인 결합을 위해서는 서로 결합된 두개의 가변도메인이 필요하다. 예를 들면 결합된 H사슬의 가변도메인과 L사슬의 가변도메인에 항원 결합부위가 있음을 나타낸다[1]. 이 가정은 결정화된 항체/항원 복합체의 X-선 결정구조 연구[2-6]로 확증되었는데, 이에 의하면 항체의 H사슬과 L사슬의 가변도메인들이 항원과 접촉하고 있다는 것을 보여준다. 효과적인 항원결합을 위해 H사슬과 L사슬의 가변도메인의 결합이 필요하다는 가정은, 박테리아로부터 이들 도메인들을 함께 분비하는 연구[1]와 단일 사슬 항체에서와 같이 이들 도메인들을 짧은 폴리펩타이드로 함께 연결하는 연구[8,9]의 기초가 된다.

분리된 H사슬과 L사슬의 결합 또한 알려졌다. 그러나 증거에 의하면 이는 H사슬 또는 L사슬 다이머의 특성이라는 것이 입증되었다. 주로 폴리클로날 항체의 H사슬과 L사슬은 변성조건하에서 분리된다는 초기의 연구[10]는 분리된 항체의 H사슬은 단백질 항원[11]이나 합텐[12]과 결합할 수 있다는 것을 암시한다. 단백질 항원과의 결합특성은 밝혀지지 않았지만, H사슬 단편의 합텐-결합 친화도는 10^-2배 수준으로 감소하였고[12], 결합된 합텐 분자의 수는 분리된 H사슬 당 0.14, 0.37[13] 또는 0.26[14]으로 다양하게 측정되었다. 더욱이 합텐-결합은 H사슬 다이머나 L사슬 다이머의 특징인 것으로 나타났다. 실제로 L사슬 다이머가 결정화되었는데, 다이머에서 두개의 사슬은 합텐의 단일분자와 결합할 수 있는 공동(cavity)을 형성한다[15].

이는 효율적인 결합을 위하여는 다이머, 더 바람직하게는 각각이 가변도메인을 가지는 H사슬/L사슬 다이머가 필요하다는 가정을 옳음을 확신시켜 준다. 이 가정은 또한 상기 인용된 특허 참증에서 다이머, 더 바람직하게는 H사슬/L사슬 다이머 분자를 제조하고자 하는 시도의 근거가 된다.

예상과는 달리, 분리된 Ig H사슬의 가변도메인은 완전한 항체분자의 결합상수와 동등한 크기의 결합상수로 항원과 1:1의 비율로 결합할 수 있다는 것이 발견되었다. 현재까지의 공지와 당업자에 의한 가정의 측면에서 보면 이러한 발견은 매우 놀랍다.

그러므로 본 발명의 첫 번째 측면에 의하면 최소한 Ig 슈퍼훼밀리 분자 중 한 사슬 가변도메인의 일부분으로 구성되는 단일 도메인 리간드가 제공된다.

리간드는, 바람직하게는 Ig 의 L사슬의 가변도메인, 또는 가장 바람직하게는 H사슬의 가변도메인으로 구성되는 것이 바람직하다.

리간드는 예컨데 Ig 수퍼훼밀리 분자의 조절된 절단 또는 펩타이드 합성과 같은 공지된 기술에 의해 제조될 수 있으나, DNA 재조합기술에 의해 제조되는 것이 바람직하다. 예를 들어 재배열된 사슬의 가변도메인 유전자를 코팅하는 유전자를 클로닝, 또는 유전자 합성으로 제조한 뒤 이를과 적합한 발현벡터에 삽입할 수 있다 상기 발현벡터로 적절한 숙주세포를 형질전환시키고, 리간드가 발현되고 바람직하게는 상기 리간드가 발현되도록 이 숙주세포를 배양한다.

필요하다면, 발현되는 도메인의 특성을 향상시키기 위해, 예를 들면 발현의 수율이나 리간드의 용해성을 증가시키기 위하여, 리간드가 더 잘 결합할 수 있도록 하기 위하여, 또는 다른 분자의 공유부착(시스테인과 히스티딘 같은 화학적으로 반응성인 잔기를 도입함으로써) 또는 비공유 결합을 위한 제2의 부위를 형성하기 위하여, 리간드의 유전자를 돌연변이시킬 수 있다. 특히 혈청내에서의 도메인들의 체류 시간을 연장시키기 위해 혈청성분과 결합하거나 또는 상보체 성분이나 세포표면의 수용체와 같은 효과기(effector) 기능을 가진 분자와 결합할 수 있도록 제2부위를 도입하는 것이 바람직할 것이다.

용해성을 향상시키기 위해, 보통 L사슬 가변도메인과 접촉하는 H사슬 가변도메인의 경계면에 있는 소수성 잔기들은 친수성 잔기로 돌연변이 될 수 있다; CDR루프에 있는 잔기들은 항원 결합성을 향상시키기 위해 돌연변이 될 수 있다; 다른 루프나 β-쉬트(β-sheet) 부분에 있는 잔기들은 새로운 결합활성을 유도하기 위해 돌연변이 될 수 있다. 돌연변이는 단일점 돌연변이, 다중점 돌연변이 또는 좀더 광범위한 변화를 포함하며, 예를 들어 유전자 합성, 부위특이적 돌연변이 또는 PCR(polymerase chain reaction)과 같은 다양한 재조합 DNA방법에 의해 유도될 수 있다.

본 발명의 리간드는 완전한 Ig분자의 리간드와 동등한 결합 친화도를 지니기 때문에 리간드는 Ig분자나 단편들처럼 다양한 용도로 사용될 수 있다. 예를 들면 Ig분자는 치료(예; 암, 박테리아성, 바이러스성 질병의 치료 등), 진단(예; 임신진단 등), 백신제조(예; 항원 처럼 작용하는 항-이디오타입항체의 생성 등), 호르몬이나 성장인자의 활성조절, 탐지, 바이오센서 및 촉매에 사용된다.

본 발명의 리간드는 크기가 작기 때문에 완전한 항체에 비하여 예를 들면 다음과 같은 우수성이 있을 수 있다; 저분자량의 약물(예컨데 디곡신;digoxin)의 활성을 중화하고, 약물이 부착된 상태로 이들을 신장에서 여과되게 하는 점; 조직과 종양에 침투할 수 있는 점; 바이러스의 캐뇬(canyon) 영역과 같은 바이러스의 표면에 있는 작은 보존 영역에 결합함으로써 바이러스를 중화시킨다는 점[16]; 단백질의 에피토프 매핑(epitope mapping)의 해상도가 높다는 점; 항원 처럼 작용하는 리간드에 의한 백신화가 가능한 점.

본 발명은 또한 하나 이상의 효과기 분자, 표지, 표면 또는 하나 이상의 동일하거나 다른 특이성을 지닌 리간드와 연결된 본 발명의 리간드를 포함하는 수용체를 제공한다.

단일의 효과기 분자에 연결된 단일의 리간드로 구성된 수용체는 치료에 사용된다. 효과기 분자는 리신(ricin) 또는 슈도모나스 엑소톡신 같은 독소, 프로약물(prodrug)을 활성화시킬 수 있는 효고, 결합 파트너 또는 방사성 동위소일 수 있다. 방사성 동위원소는 리간드에 직접 연결되거나 리간드에 직접 연결된 킬레이트 구조에 의해서 부착될 수도 있다. 동위원소가 부착된 리간드는 동위원소가 부착된 Fv단편 보다 훨씬 작고, 조직을 통과하여 좀더 쉽게 종양에 접근할 수 있다.

단일의 표지에 연결된 단일의 리간드로 구성된 수용체는 진단에 사용된다. 표지는 중금속 원자 또는 방사성 동위원소이고, 이 경우 수용체는 X-선이나 다른 스캐닝 기구를 사용하는 생체 이미지화에 사용될 수 있다. 금속 원자나 방사성 동위원소는 직접 리간드에 부착되거나 리간드에 직접 연결된 킬레이트 구조를 통하여 부착된다. 실험관 진단 실험에서는, 중금속 원자, 방사성 동위원소, 효소, 형광분자나 착색분자 또는 항체, 항체단편이나 다른 단백쪽질에 의해 탐지될 수 있는 단백질이나 펩타이드 태그(peptide tag) 등이 표지로 사용될 수 있다. 이와 같은 수용체는 ELISA나 형광-연결 분석(fluorescence-linked assay) 같은 공지된 어떤 진단 실험에 사용될 수 있다.

크로마토그래피 매체 등의 표면에 연결된 리간드로 이루어진 수용체는 친화성 크로마토그래피에 의해서 다른 분자를 정제하는데 사용될 수 있다. 예를 들어 세포막에 분포시키는 대장균의 외막 단백질이나 소수성 꼬리(tail) 등 세포부위와 결합할 수 있는 리간드를 사용하면(상기 단백질이나 꼬리는 복수개의 리간드-결합 자리를 가지고 있기 때문에) 박테리아나 세포가 접합(agglutinate)하게 되므로 진단시험을 간단하게 수행할 수 있다.

최소한 두 개의 리간드로 구성된 수용체들이 예를 들어 진단 시험에 사용될 수 있다. 첫 번째 리간드는 시험 항원에 결합하고 두 번째 리간드는 효소, 형광염료, 염색제, 방사성 동위원소 또는 착색, 형광되거나 방사성 표지된 단백질과 같은 표지분자에 결합할 것이다.

이들 수용체들은 항원에 대한 결합성을 증가시키는데 유용할 수 있다. 첫 번째 리간드는 항원의 첫 번째 에피토프에, 두 번째 리간드는 두번째 에피토프에 결합할 것이다. 이들 수용체들은 또한 인근의 다른 항원에 대한 결합 친화도 및 결합 특이성을 증가시키는데 이용될 수 있다. 첫 번째 리간드는 첫번째 항원에 결합하고 두번째 리간드는 두 번째 항원에 결합할 것이다; 세포 표면의 에피토프들이 함께 발현된 정도에 따라 결합의 강도가 결정된다. 이것은 표면 마커(marker)들의 발현을 상승시키는 속성을 갖는 종양의 치료에 유용할 수 있다. 또한 리간드는 결합성이나 특이성을 더 향상시키기 위해 사용될 수 있다. 무엇보다도, 동일하거나 다양한 특이성을 지닌 리간드연쇄(strings of ligands; 단일 리간드에 대응하여 '다중 리간드'로 지칭될 수 있음)을 사용하면 신장에 의해서 순환계로부터 쉽게 여과되지 않는 거대 분자를 생성이 가능하다.

항원을 모방한 리간드로 된 백신에 있어서, 에피토프를 반복적으로 면역화하기 때문에 리간드연쇄들을 사용하는 것이 단일 리간드를 사용하는 것보다 더 효과적일 것이다.

필요하다면, 다중 리간드로 이루어진 수용체들은 상기한 치료나 진단에 사용될 수 있도록 효과가 분자나 표지를 추가로 함유할 수 있다.

리간드는, 공유 또는 비공유결합 등과 같은 적절한 방법에 의해서 수용체의 다른 부분에 연결될 수 있다. 그러나 리간드와 다른 단백질 분자로 이루어진 수용체인 경우에는 재조합 DNA 기술에 의한 융합 생성물 형태로 제조하는 것이 바람직하다. 필요하다면, 유연성을 제공하기 위하여 리간드와 다른 단백질 분자 사이에 연결 펩타이드 서열을 도입할 수 있다.

재조합 DNA 기술에 의해 Ig 분자를 조작하는 기초적인 기술은 위에 인용된 특허 문헌들에 기술되어 있다. 이들은 재조합 DNA 기술을 이용한 본 발명에 따른 리간드와 수용체의 제조를 위해 채택될 수 있다.

리간드가 인체의 진단이나 치료에 사용되는 경우에, 리간드는 예를 들어 EP-A-O 239 400에 기술된 바와 같이 CDR치환에 의해 인간화(humanised)되는 것이 바람직하다.

리간드를 코딩하는 DNA 서열을 얻기 위해서는 일반적으로 적당한 MAb를 분비하는 하이브리도마를 먼저 제조해야 한다. 이는 매우 많은 시간을 소모하는 방법이다. 즉, 일단 동물을 면역시키고, 면역된 동물에서 분리된 비장 세포를 적당한 골수종세포계와 융합하고, 융합세포들을 배양하고, 적당한 세포계를 선별하고, 선별한 세표계를 재클론(reclone)하고 재선별하는 것이 필요하다. 이러한 문제점은 또한 변형된 Ig의 생산에서도 나타난다.

본 발명에 따른 리간드와 수용체 그리고 변형 Ig를 재조합 DNA 기술로 제조하는데 있어서, 선택될 특이성을 나타내는 MAb를 생산하는 하이브리도마로부터 가변도메인을 코딩하는 서열을 클로닝해야 하는 것이 또 다른 문제점이다. 이는 적당한 프로브의 제조, cDNA나 게놈 DNA로부터 클론 라이브러리 구축, 클론 라이브러리의 광범위한 탐색, 적합한 발현벡터로의 클로닝을 가능케 하는 클론들의 조작 등을 수반하는 비교적 오랜 시간이 걸리는 방법일 수도 있다. Ig 가변도메인을 코딩하는 DNA서열 특유의 다양성 때문에 종래 기술에 의하면 오랜 시간의 소모를 피할 수 없었다. 그러므로 본 발명의 또 다른 목적은 적절한 시간 내에 Ig 슈퍼훼밀리 분자의 가변도메인(리간드)을 코딩하는 서열을 실질적으로 클로닝할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

그러므로 본 발명의 다른 측면에 의하면, Ig 슈퍼훼밀리 분자의 가변도메인의 적어도 일부를 코딩하는 서열, 즉 표적서열을 클로닝하는 방법이 제공되며, 그 방법은 다음 단계를 포함한다.

(a) 표적서열을 포함하는 이중 사슬(ds)핵산의 샘플을 준비하는 단계;

(b) 두 개의 단일사슬(ss)로 분리하기 위한 샘플 변성단계;

(c) 프라이머가 표적서열에 또는 그 가까이에서 혼성화될 수 있도록 하는 조건하에서 전방 올리고뉴클레오티드 프라이머와 후방 올리고뉴클레오티드프라이머를 샘플에 어닐링(annealing) 시키는 단계 [여기에서 전방 프라이머는 표적서열의 센스 사슬 3'말단이나 그 가까이에 있는 서열에 특이적이며, 후방 프라이머는 표적서열의 안티센스 사슬의 3'말단이나 그 가까이에 있는 서열에 특이적이다];

(d) 프라이머 신장(伸長;extention)을 유발하는 조건하에서 디옥시뉴클레오시드 트리포스테이트의 존재하에 DNA 폴리머라제 효소를 이용하여 어닐링된 샘플을 처리하는 단계;

(e) 신장된 프라이머가 표적서열로부터 분리되는 조건하에서 샘플을 변성시키는 단계.

바람직한 본 발명의 방법은 변성 혼합물에 대해 (c)부터 (e)까지의 단계를 여러번 반복하는 (f)단계를 더 포함한다.

바람직하게는, 본 발명의 방법은 Ig분자, 더욱 바람직하게는 Ig의 H사슬로부터 완전한 가변도메인을 클로닝하는데 이용된다. 가장 바람직한 예에서 본 발명의 방법은 본 발명에 따른 리간드를 코딩하는 DNA서열을 생산할 것이다.

상기 (c)단계에서, 전방 프라이머는 표적서열의 센스 사슬의 3'말단 또는 그 가까이에 어닐링된다. 또한 후방 프라이머는 표적서열의 안티센스 사슬의 3'말단 또는 그 가까이에 어닐링된다. 그러므로 전방 프라이머는 가변부위 또는 가변도메인의 C 말단을 코딩하는 ss핵산 부위 또는 그 가까이에 어닐링된다. 또한 후방 프라이머는 가변도메인의 N-말단을 코딩하는 ss핵산 부위 또는 그 가까이에 어닐링된다.

(d)단계에서 프라이머들이 어닐링된 사슬의 서열에 따라 전방 프라이머와 후방 프라이머의 3'말단에 뉴클레오티드가 부가된다. 프라이머의 신장은 변성단계 (e)의 개시에 의해 멈출 때까지 이러한 방법으로 계속될 것이다. 따라서 (d)단계는 프라이머가 신장되어 신장된 사슬이 서로 완전히 겹쳐질 정도로 즉, 표적서열이 완전히 복사될 정도로 충분히 긴 시간동안 수행되어야 한다.

(e)단계에서 신장된 프라이머는 샘플핵산과 분리된다. 분리된 샘플 ss핵산은 그후 다른 프라이머가 어닐링할 수 있는 기질로서 다시 제공될 수 있다. 또한 신장된 플라이머 자체는 새로운 프라이머가 어닐링 할 수 있는 상보서열을 갖게 된다.

(f)단계가 진행된다면 반복되는 싸이클동안 신장된 프라이머의 양은 지수적으로 증가하여 싸이클의 마지막 단계에서 표적서열의 센스 사슬과 안티센스 사슬에 상보적인 서열의 cDNA가 많이 생성될 것이다. 따라서 본 발명에 의하면 적어도 가변도메인의 일부분을 코딩하는 ds cDNA를 형성할 수 있는 많은 양의 cDNA를 축적하게 될 것이다.

숙련자에게는 명백한 바와 같이, 이 방법의 몇몇 단계는 필요에 따라 동시에 또는 순차적으로 수행될 수 있다.

전방 프라이머와 후방 프라이머는 순수한 즉, 뉴클레오티드의 서열이 동일한 올리고뉴클레오티드로 제공될 수 있는데, 이 경우에는 단지 두 종류의 올리고뉴클레오티드가 사용될 것이다. 그러나 선택적으로 전방 프라이머와 후방 프라이머 각각은 매우 유사한 서열의 올리고뉴클레오티드들의 혼합물 형태로 제공될 수 있다. 예를 들어 프라이머가 어닐링되는 서열의 특별한 지점에서 뉴클레오티드의 변이 가능성이 있을 수 있다. 이 경우 각각 가능한 뉴클레오티드 변이에 대하여 하나의 프라이머가 사용될 수 있다. 또한 가변도메인 유전자들을 특이적으로 클로닝하기 위한 방법에서 둘 또는 그 이상의 중첩된(nested) 프라이머들의 세트를 사용할 수도 있을 것이다.

위에 언급된 방법은 사이키 등[17]의 방법 및 EP-A-O 200 362에 기술된 방법과 유사하다. 양자 모두에 언급된 방법은 특이적인 뉴클레오티드 서열에 효과적으로 어닐링하는 것으로 알려진 프라이머를 사용해서 수행된다. 그러나 상기 두 문헌은 가변도메인에 해당하는 Ig부분을 코딩하는 서열 즉, 본래 고도의 가변부위를 포함하는 표적서열을 클로닝하는데 문헌상의 방법이 사용될 수 있다는 것을 제시하지 못했다.

본 발명의 방법에서 사용된 ds핵산 서열은 mRNA로부터 유도될 수 있다. 예를 들어, RNA는 Ig를 생산한다고 알려진 세포나 세포계로부터 공지의 방법으로 분리될 수 있다.

mRNA는 올리고-dT 크로마토그래피에 의해서 다른 RNA로부터 분리될 수 있다. mRNA주형으로 하고 역전사 효소와 적당한 프라이머를 사용해서 상보적인 cDNA를 합성하여 RNA/DNA 헤테로중복체를 얻을 수 있다. DNA의 두번째 사슬은 RNA/DNA 헤테로중복체를 RNase H로 처리하여 얻은 mRNA사슬의 RNA 단편(프라이머로 이용된다)과 DNA 폴리머라아제를 사용하는 방법 또는 첫번째 사슬의 3'말단에 어닐링되는 합성올리고데옥시뉴클레오티드 프라이머와 DNA 폴리머라제를 사용하는 방법 등 몇 가지 방법으로 만들 수 있다. 본 발명에 의한 방법은 이러한 방법으로 만들어진 ds cDNA를 사용하여 수행될 수 있다.

이러한 ds cDNA를 제조할때, CH1 도메인(H사슬 가변도메인의 경우)이나 C_λ또는 C_κ도메인(L사슬 가변도메인의 경우)을 코딩하는 서열에 어닐링되는 전방 프라이머를 사용하는 것은 가능하다. 이들은 표적서열이 클로닝될 수 있도록 표적서열에 매우 근접하여 위치하게 될 것이다.

후방 프라이머는 VH1, V_κ또는 V_λ도메인의 N-말단 서열에 어닐링되는 것일 수 있다. 후방 프라이머는 알려진 VH1, V_κ또는 V_λ서열의 다양한 훼밀리에 상보적으로 디자인된 다양한 서열을 가진 복수의 프라이머들로 구성될 수 있다. 또는, 후방 프라이머는 모든 훼밀리의 가변도메인 유전자로부터 유도된 콘센서스(consensus) 서열을 가진 단일 프라이머일 수 있다.

놀랍게도 본 발명의 방법은 게놈 DNA를 사용하여 실행될 수 있다는 것이 발견되었다. 게놈 DNA는 실질적인 코딩 서열, 인트론, 유전자 사이의 번역되지 않는 서열을 포함하여 매우 많은 양의 DNA로 이루어져 있다. 그러므로 실험조건에 따라서 상당한 범위의 비특이적 어닐링이 예상 된다. 그러나 놀랍게도 실제로 비특이적 어닐링은 거의 없으며, 따라서 게놈 DNA로부터 Ig-가변도메인의 유전자를 클로닝하는 것이 가능하다는 사실을 밝혀졌다.

mRNA는 쉽게 분해되고 특히 인간 조직의 임상 샘플로부터 분리하기 어렵기 때문에, 어떤 조건하에서는 mRNA보다는 게놈 DNA를 사용하는 것이 유리할 수 있다.

그러므로 본 발명의 (a)단계에서는 게놈 DNA를 핵산으로 사용한다.

그러나 게놈 DNA에서 불변도메인 유전자는 일반적으로 상당한 수의 염기쌍에 의하여 가변도메인 유전자와 분리되어 있어 어닐링되는 부위와 클로닝될 서열이 너무 멀리 떨어져 있게 된다. 따라서 게놈 DNA를 ds핵산 원료로 사용할 때 불변도메인의 서열에 상보적인 서열의 올리고뉴클레오티드를 전방 프라이머로 사용하는 것은 불가능할 것이다.

본 발명의 방법에 의하면 Ig 유전자가 재밸열된 게놈 DNA 뿐 아니라 재배열되지 않은 게놈 DNA로부터도 가변도메인의 서열을 클로닝할 수 있다. 생식세포계(germ line)의 게놈 DNA에서 VH, DH와 JH를 각기 코딩하는 세 개의 유전자는 상당한 수의 염기쌍에 의해서 서로 분리되어 있다. 면역반응이 진행되면서 VH, DH 그리고 JH 유전자들이 연결되도록 재배열됨으로써 전체 가변도메인을 코딩하는 유전자가 완성된다(제1도 참조). 게놈의 재배열되지 않은 VH유전자의 센스사슬의 3'말단 또는 그 가까이에 있는 서열에 특이적인 전방 프라이머를 사용하면 DH와 JH유전자를 제외한 재배열되지 않은 VH유전자만을 클로닝하는 것이 가능하다. 이는 이미 클로닝되거나 합성된 DH와 DH 유전자에 상기 VH 유전자를 융합시키는 것이 가능하다는 점에서 유용하다. 이러한 방식으로, 가변도메인 유전자의 재배열은 in vitro에서 수행될 수 있다.

(c)단계에서 사용되는 올리고뉴클레오티드 프라이머는 특별한 표적서열에 대해 사용되도록 특별히 디자인될 수 있다. 이 경우에, 적당한 올리고뉴클레오티드를 합성하기 위하여 적어도 표적서열의 5'와 3'말단을 서열분석하는 것이 필요하다. 그러나 본 발명자들은 이렇게 특별히 디자인된 프라이머를 사용할 필요가 없다는 것을 발견했다. 대신에 표적서열의 각 말단에 어닐링하기 위한 종 특이적인 일반(general) 프라이머나 그런 프라이머들의 혼합물을 사용하는 것이 가능하다. 표적서열의 3'말단을 고려할때 이것은 특별히 놀랍지 않다. 가변도메인을 코딩하는 서열의 3'말단은 상대적으로 보존적인 것으로 알려진 JH를 코딩하는 단편에 연결되는 것으로 알려져 있다. 그러나 놀랍게도 단일종 내에서 표적서열의 5'말단에 있는 서열은 충분히 잘 보존되어 있어서 5'말단에 어닐링할 수 있는 종 특이적 일반 프라이머나 그 혼합물의 사용이 가능하다는 것이 발견되었다.

그러므로 본 발명의 좀더 바람직한 측면에 따르면, (c)단계에서 사용된 두 종류의 프라이머는 종 특이적 일반 프라이머나 그 혼합물이다. 이는 표적서열-특이적 프라이머를 제조하기 위해서 표적서열을 서열분석할 필요가 전혀 없기 때문에, 서열이 분석되지 않은 표적서열의 클닝을 매우 용이하게 한다. 그러므로 본 발명은 특정 종의 가변도메인을 코딩하는 서열을 클로닝하는 일반적인 방법을 제공한다.

일단 가변도메인 유전자가 위에 기술된 방법에 따라 클로닝되면, 유전자를 벡터에 삽입하기 위한 PCR을 이용하는 등의 방법으로 클로닝된 유전자를 발현벡터 내로 직접 삽입할 수 있다.

그러나 각각의 프라이머는 제한효소 인지서열(제한부위)을 지니는 것이 좋다.

프라이머에서 제한부위는 샘플 ss핵산에 어닐링될 부분에 있을 필요가 없으므로 어닐링되지 않는 부분에 위치할 수도 있다. 제한부위를 지닌 프라이머의 사용함으로써 3' 또는 5'점착말단(cohesive end) 뉴클레오티드가 만들어지도록 적어도 하나의 제한효소로 DNA를 절단할 수 있게 된다. 점착말단을 갖는 DNA는 단면말단(blunt end) 단편에 비하여 벡터의 상응하는 부위로 좀더 쉽게 클로닝된다. 싸이클의 마지막에서 제조되는 ds cDNA는 적절한 제한효소를 사용하여 쉽게 클로닝벡터 내로 삽입된다. ds cDNA가 발현벡터 내로 직접 클로닝되고 유전자에 의해 코딩된 리간드가 발현될 수 있도록 제한부위를 선택하는 것이 바람직하다. 이 경우에 제한부위는 ss핵산에 어닐링되는 서열에 위치하는 것이 바람직하다.

뉴클레오티드의 변이 혹은 제한효소 인지부위의 도입 등의 이유로 프라이머의 서열이 어닐링될 표적서열에 정확하게 상보적이지 않을 수도 있기 때문에 프라이머가 ss핵산에 어닐링될 수 있도록 어닐링 조건을 조절하는 것이 필요할 수 있다. 어닐링 조건의 조절은 이 분야의 기술자에게 잘 알려져 있어서 더 이상의 설명은 생략한다.

(d)단계에서는, 어떤 종류의 DNA 폴리머라제라도 사용될 수 있다. 그러한 폴리머라제는 당해 기술 분야에 공지되어 있고 상업적으로 구입가능하며, 각 폴리머라제의 반응조건 역시 잘 알려져 있다. 폴리머라제 반응을 위해 네 종류의 뉴클레오시드 트리포스페이트들이 필요하며, 이들과 폴리머라제 효소는 이미 샘플에 존재하거나 각 싸이클에서 새로이 공급된다.

변성단계 (e)는 예를 들어 샘플을 가열하거나, 우레아나 구아니딘 같은 카오트로픽 시료의 사용에 의해서 또는 이온강도(ionic strength)나 pH의 변화를 이용하여 실행될 수 있다. 쉽게 가역될 수 있는 가열변성 방법이 바람직한데, 이 경우 싸이클 마다 보충할 필요가 없는 Taq 폴리머라제 같은 열안정성 DNA 폴리머라제를 사용하는 것이 일반적이다.

가열변성법에서는 약 95℃에서 1분간 변성시킨 뒤, 30℃ 내지 65℃에서 약 1분간 어닐링시키고, 약 75℃에서 약 2분간 프라이머를 신장시키는 가열 싸이클이 적절하다. 신장과 어닐링이 확실히 완결되도록, 마지막 싸이클을 거친 후 혼합물을 약 60℃에서 약 5분간 정치하는 것이 바람직하다.

ds cDNA 생성물은 예를 들면 아가로스겔 전기영동에 의해서 혼합물로부터 분리될 수 있다. 그러나 필요하다면, 정제하지 않은 ds cDNA를 통상의 방법으로 적절한 클로닝벡터나 발현벡터 내로 직접 삽입할 수 있다. 이는 만약 프라이머가 제한효소 인지서열을 가지고 있다면 특히 쉽게 실행될 것이다.

본 발명의 방법은 가변도메인을 코딩하는 서열을 변이시키기 위해 사용될 수 있다. 서열의 변이는, 예를 들면 프라이머로서 동족의(同族의; related) 올리고뉴클레오티드 프라이머들의 혼합물을 사용하여 이루어질 수 있다. 프라이머는 프라이머의 중간부위가 특히 가변적이고 5'와 3'말단이 비교적 보존적인 것이 바람직하다. 프라이머의 말단은 가변도메인의 프레임부위에 상보적이고, 프라이머 중간의 가변도메인은 CDR 전체 또는 일부분을 커버(cover)하는 것이 바람직하다. 세번째 CDR을 형성하게되는 부위 내에서는 한 종류의 전방 프라이머를 사용하는 것이 바람직하다. 만약 올리고뉴클레오티드의 혼합물을 사용한다면 가변도메인을 코딩하는 서열들의 혼합물이 생성될 것이다. 또한 점-돌연변이(point mutation)가 표적영역전체에 걸쳐 분산되도록 (d)단계에서 소량의 변이유발성(mutagenic) 뉴클레오티드 트리포스페이트를 가하면 서열의 변이가 유발될 수 있다. 또, 특히 고농도의 뉴클레오시드 트리포스페이트를 사용할 때 DNA폴리머라제의 자연발생적인 에러 비율에 기인한 에러가 증폭하기 때문에 PCR 싸이클을 여러번 반복하는 경우에도 이러한 점-돌연변이가 유발될 수 있다.

본 발명의 이러한 측면에 있어서, 본 방법은 mRNA 또는 게놈 DNA로부터 가변도메인을 코딩하는 서열을 상당히 용이하게 직접 클로닝할 수 있게 한다. 따라서 위에서 언급한 선행기술 방법 중 어느 하나에 의한 변형된 Ig-타입 분자의 생산역시 용이하게 할 것이다. 나아가, 표적 유전자는 항체를 생성하는 세포가 들어있는 조직 샘플으로부터 클로닝되고, 서열분석될 수 있다. 이 방법에 의해 환자의 면역 레퍼토리를 직접적으로 조사하는 것이 가능하다. 이러한 환자의 면역 레퍼토리의 지문화(fingerprinting)는, 예를 들어 자가-면역 질병같은 진단에서 사용될 수 있다.

가변도메인을 코딩하는 유전자의 양을 증폭시키는 방법에 있어서, PCR을 통한 복제의 몇몇 싸이클에서 단일 세트의 프라이머가 사용된다. 덜 바람직하지만 위에 언급된 (a)에서 (d)까지의 단계에 다음의 단계들이 추가된 두 번째 방법도 가능하다:

(g)DNA의 닉 번역(nick translation)이 가능하도록 DNA 폴리머라제 I의 존재하에 ds cDNA의 샘플을 소량의 DNAse로 처리하는 단계;

(h)ds cDNA를 벡터 내로 클로닝하는 단계.

필요하다면 두번째 방법은 다음의 단계가 추가될 수 있다:

(i)가변도메인을 코딩하는 유전자를 포함하는 DNA 단편을 분리해내기 dln해 재조합 플라스미드의 DNA를 분해하는 단계;

(j)일련의(c) 내지 (h)단계를 한번 더 적용하여 상기 단편을 처리하는 단계.

상기 단편들은 겔 전기영동에 의해서 벡터와 정확하지 않은 크기의 다른 단편들로부터 분리되는 것이 바람직하다.

(a)∼(d)단계 및 (g)∼(h)단계를 한번만 거칠수도 있지만, (c)∼(d) 및 (g)∼(j)의 싸이클이 최소한 한번 더 반복되는 것이 바람직하다. 이런 방식으로 유전자가 특이적으로 복제되는 프라이밍 단계(priming step) 다음에 유전자의 양이 증가되는 클로닝 단계가 뒤따른다.

(a)단계에서 ds cDNA는 mRNA로부터 유도된다. Ig 유래의 가변도메인에 대한 mRNA는 mRNA의 생성을 증가시키도록 자극된 임파구에서 분리하는 것이 바람직하다.

복제의 특이성을 증진시키기 위하여, 각 사이클의 (c)단계에서는 이전 사이클의 (c)단계에서와는 다른 세트의 프라이머를 사용하는 것이 바람직하다. 이 경우 프라이머 세트들은 하나의 중첩된 세트를 형성한다. 예를 들면, Ig H사슬 가변도메인의 클로닝에 있어서, 첫 번째 프라이머 세트는 래릭 등[18]에 의해 기술된 바와 같이 신호서열과 불변도메인 사이에 위치하고, 두 번째 프라이머 세트는 올란디 등[19]에 기술된 것처럼 완전히 가변도메인 내에 위치할 수 있다. (c)단계에서의 프라이머들은 이후에 진행될 클로닝을 용이하게 하는 제한부위를 가지고 있는 것이 바람직하다. 바람직하기로는, 마지막 싸이클의 (c)단계에서 사용된 프라이머의 세트는 발현벡터로의 도입을 위한 제한부위를 반드시 가지고 있어야 한다. (g)단계에서, 프라이머와 주형사슬 간의 잘못된 어닐링(mismatches)은 닉 번역에 의해서 수정된다. (h)단계에서, 클로닝을 용이하게 하기 위해 ds cDNA에 제한효소를 처리함으로써 프라이머 내에 도입된 제한부위가 절단되도록 하는 것이 바람직하다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, ds cDNA 생성물은 발현벡터 내로 직접 클로닝 된다. 숙주는 진핵생물 또는 원핵생물일 수 있으나 박테리아가 바람직하다. 바람직하게는, 프라이머와 벡터내에서의 제한부위의 선택과 벡터의 다른 특징들은 리간드의 전형적인 아미노산 서열의 모든 특징들이 보존되는 완전한 리간드의 발현을 가능하게 할 것이다. 예를 들어 재배열된 가변 유전자들의 발현에 있어서 프라이머는 적어도 세 개의 CDR 서열을 모두 포함하는 표적서열을 클로닝할 수 있도록 선택될 것이다. 이 경우 클로닝벡터는 신호서열(리간드의 분비를 위한)과 첫 번째 프레임 부위의 N-말단, 클로닝을 위한 제한부위 및 마지막(네번째) 프레임부위의 C-말단을 코딩하는 서열을 포함하게 될 것이다.

완전한 리간드의 일부로서 재배열되지 않은 VH 유전자의 발현에 있어서, 프라이머는 적어도 앞부분의 두 개의 DCR을 포함하는 표적서열을 클로닝할 수 있도록 선택될 것이다. 이 경우 클로닝벡터는 신호서열과 첫 번째 프레임부위의 N-말단, 클로닝을 위한 제한부위, 세 번째 프레임부위의 C-말단, 세 번째 CDR 및 네 번째 프레임부위를 코딩하는 서열을 포함할 수 있을 것이다.

프라이머와 클로닝벡터는 완전한 리간드의 일부분으로서 하나의 CDR, 특히 세번째 CDR의 발현을 위해 조작될 수 있다. 단일 CDR 레퍼토리의 클로닝은 용해성과 같은 바람직한 특성이 추가된 프레임부위의 보편적인 세트를 디자인하는 것을 가능케 한다.

단일 리간드는 단독으로 또는 상보적인 가변도메인과 결합하여 발현될 수 있다. 예를 들어 H사슬 가변도메인은 개별적인 도메인 형태로 발현될 수도 있고, 상보적인 L사슬의 가변도메인과 함께 발현된다면 항원결합부위 형태로서 발현될 수도 있다. 후자의 경우 두 파트너는 동일 세포에서 발현되거나 동일 세포에서 분비되는 것이 바람직하며, 발현 또는 분비된 단백질들이 비공유적으로 결합하여 Fv단편을 형성하게 될 것이다. 이때 상보적인 파트너(H사슬 가변도메인과 L사슬 가변도메인)를 코딩하는 두개의 유전자는 일렬로 위치될 수 있으며, 두 세트의 제한부위를 가진 하나의 벡터에서 발현될 수 있다.

유전자들은 순서대로 도입되는 것이 바람직하다. 예를 들어 H사슬 가변도메인이 먼저 클로닝되고, 그런 다음 L사슬 가변도메인이 클로닝될 수 있다. 경우에 따라서는 예를 들어, 욘과 프리드[29]에 기본적으로 기술된 바와 같이, 필요한 개재서열(intervening sequence)을 각각의 유전자와 함께 연결하는 폴리머라제 연쇄 반응을 사용하면 두 유전자는 단일 단계에서 벡터내로 도입된다. 위에 기술된 유사한 벡터를 사용하면 두 파트너는 연결된 단백질 즉, 단일 사슬 Fv단편으로 발현될 수도 있다. 또 다른 방법으로서, 두 유전자를 서로 다른 벡터에, 예를 들어 하나의 벡터는 파지 벡터에 다른 하나는 플라스미드 벡터에 도입할 수도 있다.

더우기 벡터가 Ig 타입 사슬을 발현할 수 있도록, 이미 하나 이상의 불변도메인을 코딩하는 서열을 지니고 있는 발현벡터내로 클로닝된 ds cDNA가 삽입될 수 있다. Fab단편의 발현은, 예를 들어 H사슬과 L사슬이 가변도메인 및 불변도메인에서 결합하는 경향이 있는 Fv단편보다 잇점을 갖는다. 최정적인 발현산물은 위에 언급된 어떤 형태의 변형된 Ig타입 분자가 될 수 있다.

클로닝된 서열은 발현벡터에 삽입되어 융합 단백질 형태로 발현될 수도 있다. 가변도메인을 코딩하는 서열은 독소, 효소, 표지, 또는 다른 리간드같은 단백질 효과기 분자를 코딩하는 DNA서열에 직접적으로 또는 링커 서열을 통하여 연결된다. 가변도메인은 또한 박테리아나 파지의 외부 측면에 있는 단백질에 연결될 수도 있다. 따라서 본 발명에 따른 방법은 수용체를 제조하는데 이용될 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 의하면, 직접 발현을 위한 ds cDNA의 클로닝은 결합활성으로 스크리닝될 수 있는 발현 라이브러리를 신속하게 구축할 수 있게 한다. Ig의 H사슬과 L사슬의 가변 유전자의 ds cDNA는 동물에서 분리한 재배열이 완료된 유가변 유전자들로 이루어지거나, 또는 예를 들어 DH 및 JH유전자의 합성 레퍼토리와 결합한 재배열되지 않은 VH유전자의 레퍼토리처럼 근원이 다른 가변 유전자들로 이루어질 수 있다. Ig H사슬의 가변도메인을 코딩하는 유전자 레퍼토리는 항원으로 면역된 동물의 임파구에서 얻는 것이 바람직하다.

스크리닝 방법은 당기술분야에서 잘 알려진 형태의 범위로 실시된다. 예를 들어 박테리아에서 분비된 Ig H사슬의 가변도메인을 고체상(solid phase)에서 항원과 결합시키고, 부착된 도메인을 항체로 탐지함으로써 스크리닝된다. 그러므로 도메인들은 박테리아를 액체 배양에서 성장시키고 ELISA판의 표명에 코딩된 항원에 결합시킴으로써 스크리닝될 수 있다. 그러나 리간드(또는 변형된 리간드, 또는 단백질과 융합된 리간드)를 분비하는 박테리아 콜로니(또는 파지 플라그)는 막에 결합하는 항원으로 스크리닝되는 것이 바람직하다. 리간드들은 막에 직접(예를 들어 표지된 항원으로 탐지됨) 부착되거나 항원이 코팅된 막에 부착된다(리간드에 특이한 시약으로 탐지됨). 막의 사용은 많은 클론을 스크리닝하는데 매우 편리하며 이러한 기술은 이 분야에서 잘 알려졌다.

리간드와 단백질의 융합체를 제조하는 경우 스크리닝을 매우 용이하게 할 수 있다: 예를 들어 리간드의 N-말단이나 C-말단에 항체에 의해 인지되는 펩타이드 태그를 도입하거나, 무색물질의 발색반응을 촉매하는 효소를 리간드에 결합시키는 방법으로 스크리닝될 수 있다. 후자의 경우서 항원의 결합 여부는 상기 무색물질을 첨가함으로써 간단히 탐지된다. 선택적으로, 진핵세포 내부에서 발현되고 정확하게 폴딩된(folded) 리간드에 있어서, 리간드 및 효모 GAL4 단백질과 같은 전사 활성제상의 한 도메인의 결합, 그리고 항원 및 GAL4 단백질상의 다른 도메인의 결합은 필즈와 송[21]에 기술된 바와 같이 결합활성을 스크린하는데 기초가 될 수 있다.

단백질 혹은 다중 리간드들의 카피수(copies)가 많은 단백질 또는 세포가 제조된다면 고정된 항원에 대한 리간드의 결합력을 향상시키고 따라서 스크리닝 방법의 민감성을 증진시킬 수 있을 것이다. 예를 들어 리간드는 다중합체 단백질의 단백질 서브유니트, 파아지 외피 단백질이나 ompA 또는 lamB 등 대장균의 외피막 단백질에 결합될 수 있다. 그러한 파아지나 박테리아 단백질과의 융합은 항원 결합활성을 지닌 리간드를 발현하는 박테리아의 선택을 가능하게 한다. 예를 들어 이들 박테리아는 고체 지지체에 결합된 항원과 함께 침전되거나 친화도 크로마토그래피 처리되거나 항원으로 코팅된 더 큰 세포나 입자에 결합할 수 있고, 형광 활성 세포 분류기(FACS)를 사용하여 분리될 수 있다. 리간드에 융합된 단백질이나 펩타이드는 벡터에 의해 코딩되는 것이 바람직하며, 그 결과 ds cDNA 레퍼토리의 클로닝에 의해 융합 생성물이 만들어진다.

단일 리간드의 결합활성 스크리닝 이외에, 연관된(associated) Ig H사슬과 L사슬의 가변도메인 등의 연관된 리간드의 결합활성이나 촉매 활서을 위한 스크리닝도 필요하다. 예를 들면 두 도메인이 함께 발현되도록 H사슬이나 L사슬 가변 유전자의 레퍼토리를 클로닝할 수 있다. 단지 몇쌍의 도메인만이 함께 연관되고, 연관된 쌍들 중에서 일부만이 항원에 결합된다. 각각의 도메인이 무작위로 쌍을 이루도록 H사슬과 L사슬의 가변도메인의 레퍼토리를 클로닝할 수도 있다. 이러한 방법은 간극(cleft)을 형성하거나 합텐의 결합을 가능케하기 위하여 두개의 파트너의 존재가 요구되는 연관된 도메인들의 분리에 가장 적합하다. 한편 L사슬 서열의 레퍼토리는 H사슬의 레퍼토리에 비해 다양하지 못하므로, 예를 들어 도메인들의 각 훼밀리의 대표적인 멤버들을 포함하는 L사슬 가변도메인의 작은 레퍼토리는 H사슬 가변도메인의 큰 레퍼토리와 결합될 수 있다.

그러나 H사슬 가변도메인의 레퍼토리는 우선 L사슬 파트너의 부재하에 항원결합에 의해 스크리닝된 후 항원에 결합한 H사슬 가변도메인만이 L사슬 가변도메인의 레퍼토리와 결합되도록하는 것이 바람직하다. 예를 들면 다른 MAb들에 의해 특이적으로 인지되는 서로 다른 C-말단 펩타이드 태그를 각 도메인에 융합시키면 연관된 H사슬과 L사슬의 가변도메인들의 결합과 단일 도메인들의 결합은 쉽게 구분될 수 있다.

H사슬의 기질과의 결합여부가 먼저 스크리닝될 수 있기 때문에, 결합활성을 갖는 H사슬 가변도메인을 먼저 클로닝한 다음에 짝이 되는 L사슬 가변도메인을 클로닝하는 계층적인 접근 방법이 촉매성 항체의 제조에 특히 적당하다. 그 다음 L사슬 가변도메인이 H사슬가 연관될 수 있는 지가 확인되고, 전이상태를 안정화하거나 기질을 공격하기 위해 시스테인이나 히스티딘(또는 보결분자단)과 같은 촉매성 잔기들이 발드윈과 술츠[22]에 기술된 바와 같이 CDR에 도입될 수 있다.

비록 비공유적으로 연관된 H사슬과 L사슬의 가변도메인들(Fv단편)의 결합활성이 나타나더라도 적당한 융합 단백질들이 가변도메인 파트너들의 연관을 더욱 효과적으로 유도할 수 있다. 따라서, H사슬 가변도메인은 하나으 H사슬 불변도메인에 연결되어 있고, L사슬 가변도메인은 하나의 L사슬 가변도메인에 연결되며, 두 불변도메인 부분이 연관되기 때문에 Fab단편이 Fv단편보다 쉽게 연관된다.

다른 방법으로서, H사슬과 L사슬의 가변도메인은 단일 사슬 항체에서처럼 하나의 펩타이드를 매개로 하여 공유적으로 연결되거나, 펩타이드 서열들과 함께 공유적으로 연결될 수 있다. 이때 후자인 펩타이드 서열은 류신 지퍼 모티브의 도입처럼 시스테인 결합형성이나 비공유적인 상호작용을 통하여 연관되는 C-말단에 부착되어 있는 것이 바람직하다. 그러나 강하게 결합된 가변도메인의 쌍을 분리하기 위해서는 Fv단편이 사용되는 것이 바람직하다.

가변도메인 유전자의 레퍼토리로부터 분리된 Fv단편의 제조는 완전한 항체의 구축방법과 하이브리도마 기술에 대한 대안책을 제공한다. 예켄데 가변도메인 유전자를 적절한 L사슬이나 H사슬의 불변도메인 유전자에 연결하여 포유동물 세포에서 발현시키면 완전한 용해(lysis)와 같은 작연적 효과기 기능을 지닌 완전한 항체가 생성될 수 있다. 하이브리도마 기술이 어렵다는 것이 판명되었고, 또한 예를 들어 인간 말초 혈액 임파구가 엡스테인 바 바아러스에 의해 불멸화될 수 있지만 이러한 하이브리도마는 낮은 친화도의 Igm 항체를 분비하는 경향이 있기 때문에 상기와 같은 방식은 특히 인간 MAb의 제조에 유용하다.

더욱이 면역학적 메카니즘에 의하면 일반적으로 임파구는 숙주단백질에 대한 항체를 분비하지 않는 것으로 알려졌다. 그러나, 경우에 따라서는 인간 단백질에 대한 인간 항체를 제조하는 것은 바람직하다. 즉, 예를 들면 암을 치료하기 위해서는 인간 세포 표면 마커에 대한 인간 항체가, 자가면역 질병을 치료하기 위해서는 조직 적합성 항원에 대한 항체가 필요하다. H사슬과 L사슬 가변도메인 레퍼토리의 조합으로부터 구축된 인간 항체는 정상적인 상황이라면 제거되었을 친화도와 특이성을 그대로 지니고 있으므로, 상기 문제를 극복할 수 있다.

이러한 방법은 또한 이중특이성인(bispecific) 항체를 제조하는 새로운 방법을 제공한다. 이중특이성을 지닌 항체는, 첫 번째 특이성을 지닌 하나의 Fab 아암(arm)과 두 번째 특이성을 지닌 또다른 Fab 아암의 혼성항체를 제조하기 위해, 특이성이 다른 두개의 하이브리도마를 융합함으로써 만들 수 있다. 그러나 H사슬과 L사슬이 잘못된 파트너를 찾기 때문에 이중특이성인 항체의 수율은 낮다. 강하게 연관된 Fv단편들의 제조는 정확한 쌍의 L사슬과 H사슬의 결합을 유도하게 될 것이다.

(그러나 H사슬간의 정확한 짝짓기에는 도움을 주지 않을 것이다.) 이중특이성인 항체는 아려진 바와 같이 진단과 치료 분야에 다양하게 적용할 수 있을 것이다.

그러므로 본 발명은 어떤 종의 동물에서 가변도메인을 코딩하는 서열을 클로닝하는데 유용한 그 종 특이적 일반 올리고뉴클레오티드 프라이머나 일반 프라이머들의 혼합물을 제공한다. 본 발명의 방법은 어떤 종으로부터 원하는 특이성을 가진 항체를 클로닝하는데 사용되는 종 특이적 일반 프라이머의 단일쌍이나 혼합물쌍을 제공한다. 따라서 본 발명에 의하면 클로닝될 표적서열의 서열분석이 전혀 필요없고 또한 얻고자 하는 각 특이성에 대한 특이적 프라이머를 일일이 디자인할 필요도 없게 된다.

나아가 본 발명은 가변 유전자 레퍼토리의 제조, 클로닝에 의한 가변 유전자의 직접적인 발현, 코딩된 도메인의 결합활성 스크리닝 및 상기 도메인과 상기 레퍼토리로부터 유도된 다른 가변도메인을 조립하는 것 등을 제공한다.

그러므로 본 발명의 방법에 의하여 결합활성을 지닌 H사슬 가변도메인 및 이도메인들의 변이를 제조할 수 있다. 또한 본 발명은 모노클로날 항체와 이중특이성의 항체 생산을 가능케 하고, 하이브리도마 기술에 대한 대안책을 제공할 것이다. 예를 들면, 쥐 비장의 mRNA나 게놈 ds DNA는 고도로 면역된 쥐로부터 얻을 수 있지만, 그보다는 본 발명의 방법을 사용하여 간단하게 클로닝된 후 클로닝된 ds DNA는 적당한 발현벡터 내로 삽입될 것이다. 발현벡터는 Fv단편이나 Fab단편을 제조하도록 에를들어 박테리아 세포와 같은 숙주세포를 형질전환하는데 사용된다. Fv 또는 Fab단편은 그 후에 불변도메인이 부착되고 포유동물 세포 내에서 발현됨으로써 모노클로날 항체로 조립된다.

이하 첨부된 도면을 참조하여 본 발명을 설명하는 바 이는 오로지 예시적일 뿐이다.

제1도는 재배열되지 않은 것과 재배열된 H사슬과 L사슬의 가변 유전자 및 프라이머들의 위치에 대한 개략도이다.

제2도는 M13-VHPCR1벡터와 증폭된 H사슬 가변도메인에 대한 클로닝 체계의 개략도이다.

제3도는 M13-VHPCR1 내에 들어있는 Ig 가변도메인의 유도 서열이다.

제4도는 M13-VHPCR1벡터와 L사슬 가변도메인에 대한 클로닝 체계의 개략도이다.

제5도는 M13-VHPCR1 내에 들어있는 또다른 Ig 가변도메인의 유도 서열이다.

제6도는 MAb MBr1의 H사슬과 L사슬 가변도메인을 코딩하는 서열의 뉴클레오티드 서열이다.

제7도는 HindIII-BamH I 단편으로서 클로닝된 가변도메인(이는 새로운 가변도메인의 도입시 절단됨)을 포함하는 pSV-gpt 벡터(α-Lys으로서도 알려진)의 개략도를 나타내는데, 벡터 내의 BamH I 부위가 하나만 남도록 인간 IgG1 유전자의 BamH I부위가 제거된다.

제8도는 pSV-hygro 벡터(α-Lys 17로 알려짐)의 개략도이다. 이것은 하이그로 마이신 내성을 코딩하는 유전자에 의해 치환된 마이코페놀산을 코딩하는 유전자를 지닌 pSV 벡터로부터 유도된다. 그 구조는 새로운 가변부위의 도입시 절단되는 HindIII-BamH I 단편형태로 클로닝된 가변 유전자를 포함한다. 벡터 내의 BamH I부위가 하나만 남도록 인간 C_κ유전자 역시 BamH I부위가 제거된다.

제9도는 쥐:인간 MBr1 키메릭 항체의 어셈블리이다.

제10도는 쥐(48마리)의 재배열된 VH 유전자에 코딩된 아미노산 서열이다.

제11도는 인간의 재배열된 VH 유전자에 코딩된 아미노산 서열이다.

제12도는 인간이 재배열되지 않은 VH 유전자에 코딩된 아미노산 서열이다.

제13도는 플라스미드 pSW1의 일부분의 서열이다. pSW1 내의 VHLYS에 연결되어 있고, Sph i-EcoR I 단편형태로 pUC19에서 클로닝된 펙테이트 리아제의 리더서열 및 펙테이트 리아제 리더-VHLYS 폴리펩타이드를 코딩하는 오픈 리딩 프레임의 번역이 도시되어 있다.

제14도는 플라스미드 pSW2의 일부분의 서열이다. VHLYS와 VKLYS에 연결되어 있고, Sph I-EcoR I-EcoR I 단편형태로 pUC19에서 클로닝된 펙테이트 리아제의 리더서열 및 펙테이트 리아제 리더-VHLYS와 펙테이트 리아제 리더-VKLYS폴리펩타이드를 코딩하는 오픈 리딩 프레임의 번역이 도시되어 있다.

제15도는 pSW1에서 유도된 플라스미드 pSW1HPOLYMYC의 일부분의 서열이다. 이 플라스미드에서 폴리링커 서열은 VHLYS의 가변도메인을 치환하고 증폭된 VH 유전자에 대한 클로닝 부위로서 작용을 하며, 펩타이드 태그가 C-말단에 도입된다.

제16도는 쥐의 비장에서 유도되고 라이소자임 결합활성을 지니며 D1, D3항체의 VH도메인에 비교되는 두개의 VH 도메인의 코딩된 아미노산 서열이다. 화살표는 두 VH도메인 간의 서로 다른 부위를 나타낸다.

제17도는 인간의 말초혈액 임파구로부터 유도되고 라이소자임 결합활성을 지닌 VH도메인의 코딩된 아미노산 서열이다.

제18도는 VHLYS 유전자의 돌연변이를 생성하고 클로닝하기 위한 체계이다. 이는 VH유전자의 천연 레퍼토리를 클로닝하기 위한 체계와 비교된다.

제19도는 벡터 pSW2HPOLY의 일부분의 서열이다.

제20도는 두개의 연결된 VHLYS 도메인을 코딩하는 벡터 pSW3의 일부분의 서열이다.

제21도는 VHLYS 도메인의 서열과 알카린 포스파타제 유전자에 융합된 pelB 리더서열이다.

제22도는 VHLYS 도메인과 연관되는 L사슬의 V_κ가변도메인의 레퍼토리 발현을 위한 벡터 pSW1VHLYSVKPOLYMYC의 서열이다.

제23도는 대장균에서 높은 수준으로 분비되는 VH 도메인의 서열이다. VHLYS도메인과 상이한 부위가 표시되어 있다.

프라이머

하기 실시예에서 다음의 올리고뉴클레오티드 프라이머나 프라이머의 혼합물이 사용된다. 그들의 위치는 제1도에 표시되어 있고 서열은 다음과 같다.

[서열식1a]

[서열식1b]

[서열식1c]

[서열식1d]

[서열식1e]

[서열식1f]

[서열식1g]

[서열식1h]

[서열식1i]

[서열식1j]

[서열식1k]

[서열식1l]

[서열식1m]

(여기서, N은 T,C,G 그리고 A의 동등 몰의 혼합물(equimolar mixture)이다.)

하이브리도마로부터 쥐의 재배열된 가변도메인 유전자의 클로닝, 키메릭 항체를 코딩하는 유전자의 조립과 골수종세포로부터의 항체의 발현

VH1FOR은 쥐의 모든 H사슬 가변도메인을 코딩하는 서열의 센스 사슬의 3'말단과 어닐링되도록 디자인되며 BstEII 인식부위를 지니고 있다. VK1FOR은 쥐의 모든 카파-타입 L사슬 가변도메인을 코딩하는 서열의 센스 사슬의 3'말단과 어닐링되도록 디자인되며 BglII 인식부위를 지니고 있다. VH1BACK는 쥐의 모든 H사슬 가변도메인을 코딩하는 서열의 항센스 사슬의 3'말단과 어닐링되도록 디자인 되며 PstI 인식부위를 지닌다. VK1BACK는 쥐의 모든 카파-타입 L사슬 가변도메인을 코딩하는 서열의 항센서 사슬의 3'말단과 어닐링되도록 디자인되며 PvuII 인식부윌르 지니고 있다.

이 실시예에서 다섯 개의 쥐 하이브리도마에서 샘플 ds핵산을 얻었다. 하이브리도마는 각각 MBr1[23], BW431/26[24], BW494/32[25], BW250/183[24,26] 및 BW704/152[27]이라는 명칭의 모노클로날항체(MAb)를 생산한다. MAb MBr1은 특히 인간 유방암 세포계(human mamary carcinoma line)인 MCF-7[28] 표면의 당류 에피토프에 대하여 특이적이라고 알려진 점에서 흥미롭다.

mRNA를 이용한 클로닝

위에 언급된 다섯개의 하이브리도마 각각은 롤러병에서 배양하였고, RNA를 분리하기 위해 각 하이브리도마 마다 약 5×10⁸세포를 사용하였다. mRNA는 올리고 dT 셀룰로즈를 사용하여 분리된 RNA로부터 분리하였다[29]. 첫번째 사슬 cDNA는 하기한 바와 같이 마니아티스 등[30]의 방법에 따라 합성하였다.

H사슬 가변도메인을 코딩하는 서열을 클로닝하기 위하여 10㎍ mRNA, 20 pmole VH1FOR 프라이머, dATP, dTTP, dCTP 및 dGTP 각각 250㎛, 10mM 디티오트레이톨(DTT), 100mM 트리스·HC1, 10mM mgCl₂및 140mM KCl이 함유되고 pH가 8.3인 반응용액 50㎕를 제조하였다. 반응용액을 70℃에서 10분동안 가열한 다음 mRNA의 가변도메인 코딩 서열의 3'말단에 프라이머가 어닐링되도록 냉각하였다. 그 다음 반응용액에 역전사 효소(Anglian Biotec) 46유니트를 첨가한 후 첫 번째 cDNA나선을 합성하기 위해 42℃에서 1시간 동안 배양하였다.

L사슬 가변도메인을 코딩하는 서열을 클로닝하기 위해 VH1FOR 프라이머 대신에 VK1FOR 프라이머를 사용한 것을 제외하고는 위와 동일한 방법을 적용하였다.

RNA/DNA 하이브리드로부터의 증폭

일단 ds RNA/DNA 하이브리드가 생성되면 가변도메인을 코딩하는 서열은 다음과 같이 증폭된다. H사슬 가변도메인을 코딩하는 서열을 증폭시키기 위해 5㎕ ds RNA/DNA 하이브리드-함유 용액, VH1FOR 및 VH1BACK 프라이머 각각 25pmole, dATP, dTTP, dCTP 및 dGTP 각각 250μM, 67mM의 트리스·HC1, 17mM(NH₄)₂SO₄, 10mM mgCl₂, 200㎍/㎖ 젤라틴과 2유니트의 Taq 폴리머라제(Cetus)로 된 반응용액 50㎕를 준비하였다. 반응용액위에 파라핀 오일을 덮어서, 히팅 블록(테큰 PHC-1 프로그래머블 히팅 블록)을 사용한 온도 싸이클을 25회 반복하였다. 각 싸이클은 95℃에서 1분(핵산을 변성), 30℃에서 1분(프라이머를 핵산에 어닐링), 72℃에서 2분(프라이머의 신장)으로 이루어져 있다.

25 싸이클 반복 후에 반응용액과 오일을 에테르로 2회, 페놀로 1회 그리고 페놀/CHCl₃로 1회 추출한 후 ds cDNA를 에탄올로 침전시켰다. 침전된 ds cDNA를 50㎕의물에 용해시켜 냉동하였다.

L사슬 증폭을 위한 방법은 VH1FOR와 VH1BACK 프라이머 대신 각각 VH1FOR와 VH1BACK 프라이머를 사용한 것을 제외하고는 위 방법과 동일하였다.

증폭된 cDNA의 각각의 샘플 5㎕를 2% 아가로스겔상에서 전기영동하여 분획하고 에티디윰 브로마이드로 착색하였다. 그 결과 증폭된 ds cDNA(DIR 330bp)가 두꺼운 밴드를 형성함을 확인할 수 있었다.(그러나 MBr1의 VK DNA밴드는 매우 약했기 때문에 겔에서 잘라내어 재차 증폭시켰다. 이 단순한 방법에 의해서 다섯 종류의 MAb에 대한 L사슬과 H사슬 가변도메인을 코딩하는 ds DNA를 상당량 얻었다.

H사슬 벡터의 제조

위치특정 돌연번이법(site directed mutagenesis)[32, 33]으로 BstEII 인지부 위를 벡터 M13-HuVHNP[31]에 도입하여 벡터 M13-VHPCR1(제2도와 제3도)를 제조하였다.

증폭된 H사슬 가변도메인 코딩 서열 각각을 제한효소 PstI과 BstEII로 처리하였다. 발생한 단편들을 페놀로 추출하고, 2%의 저융점 아가로스겔에서 정제한 후 사전에 PstI과 BstEII로 처리한 후 0.8% 아가로스겔로 정제한 벡터 M13-VHPCR1로 클로닝하였다. 가변도메인 삽입체를 함유하는 클론은 M13-VHPCR1 벡터 내에 있는 3'비코딩 가변 유전자를 기초로 하는 프라이머를 사용한 서열분석[34]에 의해 직접 확인하였다.

BW431/26의 H사슬 가변도메인을 코딩하는 서열의 내부에 PstI 부위가 있다. 따라서 이러한 가변도메인을 코딩하는 서열을 두 단계로 조합하였다. 즉, 먼저 3'PstI-BstEII 단편을 M13-VHPCR1내로 클로닝한 다음 두 번째 단계로 5' PstI 단편을 클로닝하였다.

L사슬 벡터의 제조

벡터 M13mp18[35]를 PvuII로 절단하였고, 벡터 골격(backbone)은 합성 HindIII-BamHI 폴리링커로 단면(blunt) 연결하였다. HuVKLYS 유전자를 분리하기 위해 벡터 M13-HuVKLYS[36]를 HindIII와 BamHI로 처리하였다. 이 HindIII-BamHI 단편을 HindII-BamHI 폴리링커 부위에 삽입하여, 벡터 골격 내에 PvuII부위(제4도, 제5도)가 전혀 없는 벡터 M13-VHPCR1을 제조하였다. BclI부위에서의 담 메틸화(dam methylation)를 방지하기 위하여 이 벡터를 대장균 JM110[22] 내에서 제조하였다.

증폭된 L사슬 가변도메인 코딩 서열 각각을 제한효소 PvuII와 BalII로 처리하였다. 발생한 단편들을 페놀로 추출하고, 2%의 저융점 아가로스겔에서 정제한 후, 사전에 PvuII와 BclI로 처리하고 0.8% 아가로스겔로 정제한 뒤 송아지 장의 포스파타제로 처리한 벡터 M13-VHPCR1 내로 클로닝하였다. L사슬 가변도메인 삽입체를 함유하는 클론은 M13-VHPCR1 벡터 내에 있는 3'비코딩 가변 유전자를 기초로 하는 프라이머를 사용한 서열분석[34]에 의해 직접 확인하였다.

MBr1의 H사슬과 L사슬 도메인의 뉴클레오티드 서열 및 M13-VHPCR1과 M13-VHPCR1 벡터의 일부서열을 제6도에 나타내었다.

항체발현

M13-VHPCR1에서 MBr1의 H사슬 가변도메인을 코딩하는 서열을 운반하는 HindIII-BamHI 단편을 인간 γ1 불변도메인[37](제7도)을 지닌 pSV-gpt벡터 내로 재클로닝하였다. M13-VHPCR1 내의 MBr1 L사슬 가변도메인을 코딩하는 서열을 운반하는 HindIII-BamHI 단편을 하이그로마이신 내성 마커와 인간 카파 불변도메인을 지닌 pSV-hyg-HuCK 즉, pSV벡터 내로 재클로닝하였다(제8도). 유전자의 조합을 제9도에 요약하였다.

이와같이 생성된 벡터들을 PvuI로 처리하여 (pSV-hygro 벡터의 경우 PvuI로 부분처리하였다.) 선형화하한 후, 일렉트로포레이션법[39]에 의해 비분비성 쥐 골수종세포계 NSO[38] 내로 함께 공동형질전환(cotransfection)하였다. 공동형질전환 1일 및 7일 후에 각각 0.3㎍/㎖ 및 1㎍/㎖의 마이코페놀릭산(MPA)에서 선별하였다. 14일 후, 각각 하나 또는 두개의 큰 콜로니가 들어있는 네 개의 웰(well)에¹⁴C-리신을 가하여 스크리닝하고[40], 분비된 하체는 SDS-PAGE상에서 단백질-A 세파로스(Pharmacia)로 침전시킨 후에 탐지하였다[14]. 겔을 착색, 고정, 형광사진 시약인 암플리파이(Amersham)에 침지, 건조 및 -70℃ 조건에서 프리후레쉬된 필름상에서 2일간 오토래디오그래프하였다.

머나드 등[23]이 기술한 바와 같이, 세포 현탁액의 간접 면역형광 시험법(형광-표지된 산양 항-인간 IgG(Amersham)을 사용) 또는 고정된 세포의 단일츠에서의 고체상 RIA(¹²⁵I-단백질 A(Amersham)을 사용)에 의해서 상등액의 유방암세포계 MCF-7과 대장암 세포계 HT-29에 대한 결합을 시험하였다.

네 개의 웰(well)중 하나의 상등액에 항체가 분비되었음이 확인되었다. 상등액에 있는 키메릭 항체는 본래의 쥐 MBrI 항체처럼 MCF-7 세포에는 결합하지만 HT-29세포에는 결합하지 않는다는 것과, 그러므로 특이성은 제대로 클로닝되고 발현되었다는 것이 밝혀졌다.

[실시예 2]

쥐의 비장 게놈 DNA로부터 재배열된 가변 유전자의 클로닝 비장으로부터의 DNA의 제조

쥐의 비장으로부터의 DNA는 두가지 방법중 한가지 방법으로 제조하였다. 그러나 당업계에 공지된 다른 방법이 사용될 수도 있을 것이다.

[방법 1]

쥐의 비장을 두조각으로 절단하여 인산으로 완충된 생리식염수(phosphate buffered saline; PBS)이 각각 200㎕ 들어있는 표준 에펜도르프 튜브에 넣었다. 1㎖의 분리 피펫의 끝을 봉하고 분센 버너의 푸른 불꽃으로 멸균하였다. 이 피펫으로 각 튜브내의 비장조각을 으깬 다음 생성된 세포를 깨끗한 에펜도르프 튜브에 옮겨담았다. 비장의 결합조직이 하얗게 될 때까지 상기 방법을 3회 반복하였다. 세포와 함께 딸려온 결합 조직들을 드론-아웃 파스퇴르 피펫(drawn-out Pasteur pipette)으로 제거하였다. 세포를 PBS로 세척하고 4개의 튜브로 분산시켰다.

이어서 비장세포를 저속 원심분리기(Microcentaur centrifuge)로 2분간 침전시키고 상등액은 드론-아웃 파스퇴르 피펫으로 제거하였다. 필요하다면, 이 단계에서 세포 샘플을 동결시켜 -20℃에서 보관할 수도 있을 것이다.

세포 샘플(만약 동결된 것이면 일단 해동시킴)에 500㎕의 물과 비이온성 세제인 NP-40의 10% 용액 5㎕를 첨가하였다. 튜브를 봉하고 뚜껑에 구멍을 뚫었다. 세포를 파괴하기 위해 튜브를 끊는 물에 5분간 담그었다가 얼음에서 5분동안 냉각하였다. 그리고 세포파편 제거를 위하여 튜브를 고속으로 2분동안 원심불리하였다.

상등액을 새로운 튜브로 옮긴 다음 5M NaCl 125㎕와 pH 7.0인 1M MOPS 30㎕를 첨가하였다. 상등액에 있는 DNA를 콰이젠 5 팁(Quigen 5 tip)로 분리한 후 람다 DNA를 정제하는 것과 같은 방법으로 정제하였다. DNA를 이소프로판올로 침전시킨 후, 물 500㎕에 재현탁하였다.

[방법 2]

이 방법은 마니아티스 등[30]의 기술에 기초를 둔다. 쥐의 비장을 아주 미세하게 절단하여 2㎖ 유리 호모게나이저(glass homogeniser)에 넣었다. 피스톤을 천천히 여러번 상하로 움직여서 세포를 조직에서 분리하였다. PBS 500㎕에 세포를 현탁하여 에펜도르프 튜브로 옮긴 후 저속 원심분리기로 2분간 침전시켰다. 이 결과 백색세포와 적색세포가 확실하게 분리되었다. 즉, 침전이 느린 백색세포는 적색세포 상부에 층을 형성하였다. 상등액을 조심스레 꺼내어 혹시 침전되지 않은 백색세포가 모두 침전되도록 재차 원심분리하였다. 백색세포층을 500㎕ PBS에 재현탁한 후 다른 튜브로 옮겨졌다.

백색세포를 1분동안 저속 원심불리기로 침전시켰다. 세포를 500μ PBS로 2회 세척하고 마지막으로 200㎕ PBS에 재현탁하였다. 백색세포 현탁액에 25mM EDTA 2.5㎖와 pH 7.4인 트리스·HCl 10mM를 첨가하여 천천히 볼텍싱하였다. 볼텍싱 중간에 20% SDS 25㎕를 첨가하였다. 세포는 즉시 용해되고 용액은 투명한 점액질이 되었다. 20㎎/㎖를 첨가하였다. 세포는 즉시 용해되고 용액은 투명한 점액질이 되었다. 20㎎/㎖ 농도의 단백질 분해효소 K를 100㎕ 첨가하고 50℃에서 1∼3시간 정치하였다.

샘플은 동량의 페놀과 클로로포름으로 추출하고 볼텍싱하였다. 원심분리 후 수상(aqueous phase)을 제거하고 1/10 부피의 3M 암모늄 아세테이트를 첨가하였다. 그 위에 세 배 부피의 냉 에탄올을 가하고 DNA사슬이 육안으로 보일 때까지 조심스럽게 흔들었다. DNA를 파스퇴르 피펫으로 조심스럽게 감아올린 후 묻어나온 에탄올을 방울방울 떨어뜨려 제거하여 pH 7.4인 10mM 트리스·HCl와 0.1mM EDTA의 혼합액 1㎖가 들어있는 에펜도르프 튜브로 옮겼다. 차가운 조건의 롤러상에 밤새 정치하여 DNA를 용해시켰다.

게놈 DNA로부터의 증폭

폴리머라제 사슬 반응(PCR)을 사용하기 전에 DNA용액을 물로 1/10 희석하고 5분 동안 끊였다. 각 PCR반응 마다 보통 50∼200ng의 DNA를 사용하였다.

인간 PBL이나 쥐의 비장세포로부터 분리된 게놈 DNA에서, H사슬과 L사슬 가변도메인을 코딩하는 서열들을 실시예 1에서 RNA/DNA 하이브리드로부터의 증폭이라는 표제가 있는 부분의 처음 두 단락에 기술된 일반적인 프로토콜에 따라 증폭하고 클로닝하였다. 단. 실시예 1의 경우와 달리 각 싸이클의 어닐링 단계에서 온도를 65℃로 유지하였고, 싸이클을 30회 반복하였다. 나아가 두 프라이머의 3'말단 사이의 어닐링을 최소화하기 위하여 샘플을 우선 95℃로 가열하였다가 65℃에서 어닐링한 다음에 Taq 폴리머라제를 첨가하였다. 증폭된 단편의 신장과 어닐링이 확실히 완결되도록 30회 싸이클 마지막에서 반응 혼합물을 60℃로 5분동안 유지하였다.

쥐의 비장 게놈 DNA의 H사슬 가변도메인을 증폭하기 위해서 VH1FOR와 VH1BACK을, L사슬 가변도메인을 증폭하기 위해서 VK2FOR와 VK1BACK을 프라이머로 사용하였다. (VK2FOR는 5'말단에 잉여의 C잔기를 갖는다는 점에 있어서만 VK1FOR와 다르다.)

쥐의 VH 및 V_κ유전자의 다른 훼밀리들과 어닐링을 최적화하기 위해 디자인된 또 다른 프라이머 세트들을 고안하여 상기한 프라이머들과의 혼합물 형태로 사용하였다. 예를 들면 V_κ유전자를 증폭하기 위해 VK1FOR, MOJK1FOR, MOJK3FOR 및 MOJK4FOR의 혼합물을 전방 프라이머로, VK1BACK, MOVKIIABACK 및 MOVKIIBBACK의 혼합물을 후방 프라이머로 사용하였다. 마찬가지로, VH 유전자를 증폭하기 위해 VH1FOR, MOJH1FOR, MOJH2FOR, MOJH3FOR 및 MOJH4FOR의 혼합물을 전방 프라이머로, VH1BACK, MOVHIBACK, MOVHIIABACK, MOVHIIBBACK 및 MOVHIIIBACK의 혼합물을 후방프라이머로 사용하였다.

상술된 모든 H사슬 FOR 프라이머들 및 BACK 프라이머들은 각각 BstEII부위 및 PstI부위를 가지고 있으며, 상술한 L사슬 FOR 및 BACK 프라이머들은 각각 BglII부위 및 PvuII부위를 가지고 있다. 또한 L사슬 프라이머들인 VK3FOR 및 VK2BACK은 각각 SacI부위 및 XhoI부위를 가지고 있다.

다른 밴드 또한 존재함에도 불구하고, 전형적으로 모든 상기 프라이머들은 겔전기영동에서 정확한 크기의 증폭된 DNA를 만들었다. 그러나 문제는 VH 유전자의 전방 그리고 후방 프라이머의 5'와 3'말단이 부분적으로 상보적이라는 것이 확인되었고, 따라서 두 올리고뉴클레오티드 프라이머들이 서로에게 프라이머로 작용하여 커다란 프라이머-다이머밴드를 생성할 수 있다는 것이다. 이 문제를 해결하기 위하여 VH1FOR에서 두 개의 3'뉴클레오티드를 제거한 개선된 전방 프라이머인 VH1FOR-2를 고안하였다.

그러므로 쥐의 VH유전자의 증폭을 위한 바람직한 조건은 다음과 같다: 샘플은 50∼100ng DNA, VH1FOR-2와 VH1BACK 프라이머(각각 25pmole), 각각의 디옥시뉴클레오티드 트리포스페이트 250μM, 10mM 트리스·HC1, 50mM KC1, 1.5mM mgCl₂, 그리고 100㎍/㎖ 젤라틴으로 만들어지며, pH8.8이고 부피는 50~100㎕이다. 샘플을 파라핀 오일층으로 덮고 95℃에서 2분, 65℃에서 2분동안 가열한 후 72℃로 가열하였다. 샘플이 신장 온도에 도달한 후에 Taq 폴리머라제를 첨가하고 계속해서 72℃에서 2분동안 반응을 진행하였다. 히팅 블록(테큰 PHC-1 프로그래머블 히팅 블록)을 사용한 온도 싸이클을 29회 더 반복하였다.

게놈 DNA로부터 쥐 V_κ유전자를 증폭시키는 바람직한 조건은 다음과 같다: V_κ프라이머로 예를 들어 VK3FOR 및 VK2BACK를 사용하였고, 94℃에서 1분, 60℃에서 1분, 그리고 72℃에 1분의 가열 싸이클을 반복한 것 이외에는 위와 동일하게 샘플을 처리하였다.

게놈 DNA를 위해 고안된 상기 조건들은 쥐의 비장이나 하이브리도마의 mRNA로 부터 유도된 cDNA를 증폭하는데에도 적당하다.

가변도메인 유전자의 클로닝과 분석

계속해서, 반응 혼합물을 물로 포화된 디에틸 에테르 40㎕로 2회 추출한 다음 실시예 1에 기술된 것과 같이 표준 페놀 추출과 에탄올 침전처리를 진행하였다. 형성된 DNA 펠릿을 10mM 트리스·HCl와 0.1mM EDTA의 용액 100㎕에 용해시켰다.

L사슬 도메인을 코딩하는 서열을 지닌 각 반응 혼합물을 SacI와 XhoI (또는 PvuII와 BglII)로 처리하여 적합한 발현벡터에 연결될 수 있도록 하였다. H사슬 도메인을 코딩하는 서열을 지닌 각 반응 혼합물로 동일한 목적을 위해 PstI와 BstEII로 처리하였다.

라이소자임으로 초면역된(hyperimmunized) 쥐로부터 상기와 같이 분리한 h사슬 가변 유전자를 M13VHPCR1벡터 내로 클로닝한 후 서열분석하였다. 48개의 VH 유전자 클론의 서열이 완전하게 결정되었다(제10도). 그러나 다음과 같은 빈도를 갖는 단지 두 개의 쥐 VH 유전자 훼밀리만을 나타내었다. VA(1), IIIC(1), IIIB(8), IIIA(3), IIB(17), IIA(2), IB(12), IA(4). 30개의 클론에서, D구획은 훼밀리 SP2(14), FL16(11)과 Q52(5)로, 38개의 클론에서 JH 미니유전자(minigenes)는 훼밀리 JHl(3), JH2(7), JH3(14)와 JH4(14)로 할당될 수 있을 것이다. CDR3의 서열이 모두 다르다는 면에서 48개의 클론 각각이 독특하게 구별되었다. 9개의 가(假)유저자(psudogene)와 16개의 비발현성의 재밸열체가 확인되었다. 서열분석된 클론 중에서 27개가 오픈 리딩 프레임을 지니고 있었다.

따라서 이 방법으로 쥐의 비장 DNA로부터의 H사슬 가변 유전자의 다양한 레퍼토리를 제조할 수 있다.

[실시예 3]

인간 말초 혈액 임파구의 mRNA로부터의 재배열된 가변 유전자의 클로닝 mRNA의 제조

인간 말초 혈액 임파구를 정제하고 mRNA를 직접적으로 제조하거나(방법1), 엡스테인 바 바이러스의 첨가 후에 mRNA를 제조하였다(방법2).

[방법1]

건강한 사람의 헤파린 처리된 혈액 20㎖를 같은 부피의 PBS로 희석하여 50㎖ 팔콘 튜브에 똑같이 분배하고 각각 15㎖DLM 피콜 하이파크(Ficoll Hypaque; 파마시아 10-A-001-07)로 덮었다. 적혈구로부터 임파구를 분리하기 위해 튜브를 원심분리기(IEC Centra 3E table centrifuge)에서 상온에서 1800rpm으로 10분동안 원심분리하였다. 경계면에 위치한 말초혈액 임파구(PBL)를 파스퇴르 피펫으로 수집한 후 동일한 부피의 PBS로 희석하고 15분동안 1500rpm으로 다시 원심분리하였다. 상등액을 제거하고 세포 펠릿을 1㎖ PBS에 재현탁하여 두개의 에펜도르프 튜브에 분배하였다.

[방법2]

pre-AIDS 상태에 있는 HIV 감염 환자의 혈액 40㎖를 피콜상에서 처리하여(상기 방법 1참고) 백색 세포를 분리한 후 조직배양 배지에서 백색 세포를 4-5일동안 배양하였다. 3일째 되는 날, 백색 세포를 엡스테인 바 바이러스로 감염시켰다. 배양 종료 후 세포를 펠릿(약 2×10⁷세포)화 하여 PBS에서 세척하였다.

세포를 재차 펠릿화하여 5M 구아니딘 이소티오시아네트 7㎖, 50mM 트리스, 10mM EDTA, 0.1mM 디티오트레이톨로 용해(lysis)하였다. 세포를 격렬하게 볼텍싱하고 7배 부피의 4M LiCl를 첨가하여 그 혼합물을 4℃에서 15∼20시간 배양하였다. 현탁액을 원심분리하여 상등액을 수집하고, 상등액을 3M의 LiCl에서 재현탁한 다음 다시 원심분리하였다. 형성된 펠릿을 0.1% SDS 2㎖, 10mM의 트리스·HC1과 1mM의 EDTA에 용해시켰다. 현탁액을 -20℃에서 동결시키고, 45분동안 매 10분마다 20초씩 볼텍싱하여 해동하였다. 백색 펠릿은 제거하고 투명한 상등액을 페놀 클로로포름과 클로로포름으로 연속해서 추출하였다. 1/10 부피의 3M 아세트산나트륨과 2부피의 에탄올을 가하고 -20℃에서 밤새 정치하여 RNA를 침전시켰다. RNA 펠릿을 0.2㎖ 물에 현탁했다가 다시 에탄올로 재침전시켰다. 에탄올 침전물을 볼텍싱하여 미세 현탁액을 만들어 cDNA 합성에 필요한 만큼의 RNA를 얻었다.

cDNA 합성을 위해, 현탁액 100㎕를 침전시켰다가 다시 20㎕ 물에 용해시킨 후 10pmole의 HUFOR 프라이머(아래 참조)를 사용하여 최종 부피가 50㎕가 되도록 하였다. 인간 VH유전자 훼밀리의 프라이머를 사용한다는 것(아래 참조)과 95℃, 60℃ 및 72℃의 가열 싸이클을 사용한다는 것을 제외하고는 실시예 2와 같이 5㎕의 cDNA 샘플을 증폭시켰다.

유용한 인간의 H사슬과 L사슬 서열에 일치되도록 인간 DNA의 증폭을 위한 후방 프라이머를 디자인하였는데, 여기에서 H사슬과 L사슬 서열의 훼밀리들은 5'말단의 뉴클레오티드 서열이 다소 다르다. 그러므로 인간 VH 유전자 증폭에 있어서, 가변 유전자 전체 기초하여, 프라이머 Hu2VHIBACK, HuVHIIBACK Hu2VHIIIBACK 및 HuVH1VBACK는 후방 프라이머로, HUJH1FOR, HUJH2FOR 및 HUJH4FOR는 전방 프라이머로 디자인되었다. 또다른 세트의 전방 프라이머인 Hu1VHFOR, Hu2VHFOR, Hu3VHFOR, Hu4VHFOR도 사용하였는데, 이들은 인간 J-도메인 및 인간 아이소토포(isotope)의 불변도메인의 5'말단에 일치되도록 디자인된 것이다.

이들 프라이머의 세트들을 사용함으로써 겔 전기영도에 의한 증폭된 ds cDNA 밴드를 설명할 수 있었다.

HIV 감염 환자의 체내에 다양한 레퍼토리가 존재하는지 여부를 확인하기 위하여 상기 실험(결과)을 상세히 분석하였다. AIDS가 진행되는 동안 혈액내의 T-세포와 항체가 현저히 감소된다는 것이 알려져 있다. 아마도 임파구의 레퍼토리 역시 감소할 것이다. 이 실험에서는 전방 프라이밍의 경우, 동일한 몰수의 프라이머 Hu1VHFOR, Hu2VHFOR, Hu3VHFOR 및 Hu4VHFOR의 혼합물을 사용(PCR에서 프라이머 5'말단 25pmole)하였다. 후방 프라이밍의 경우, 프라이머 Hu2VHIBACK, HuVHIIBACK, Hu2VHIIIBACK 및 HuVH1VBACK를 각각 4개의 독립적인 프라이밍 단계에서 따로따로 사용하였다. 독립적인 프라이밍 단계에서 증폭된 DNA의 풀(pool)이 형성되는데, 이를 상기한 제한효소 PstI와 BsteII로 처리한 후 서열분석을 위해 벡터 M13VHPCR1 내로 클로닝하였다. 서열들은 질병의 현재 단계에서 레퍼토리의 다양성을 나타낸다(제11도).

인간 V_κ유전자의 경우, 프라이머 HuJK1FOR, HuJK3FOR, HuJK4FOR 및 HuJK5FOR,를 전방 프라이머로, VK1BACK를 후방 프라이머로 사용하였다. 이러한 프라이머를 사용함으로써 겔 전기영동에 의해 정확한 크기의 증폭된 ds cDNA의 밴드를 확인할 수 있었다.

[실시예 4]

인간 말초 혈액 임파구로부터 재배열되지 않은 가변 유전자 게놈 DNA의 클로닝

비(非)허킨스 임파종 환자의 인간 말초 혈액 임파구를 실시예 3의 방법 1에 따라 제조하였다. 실시예 2의 방법 2에 따라 말초 혈액 임파구로부터 게놈 DNA를 준비하였다. 분리된 게놈 DNA로부터 상기 실시예 1의 RNA/DNA 하이브리드로부터의 증폭 부분의 처음 두 단락에 기술된 일반적인 프로토콜에 따라 VH도메인을 증폭·클로닝하였다. 다만 각 싸이클의 어닐링 단계의 온도를 55℃로 유지하였고, 싸이클을 30회 반복하였다. 30번째 싸이클의 마지막 단계에서, 증폭된 단편의 신장과 어닐링이 확실히 완결되도록 30회 싸이클 마지막에서 반응 혼합물을 60℃로 5분동안 유지하였다.

사용된 전방 프라이머로는 SacI부위를 지닌 HuHEP1FOR를 사용하였다. 이 프라이머는 재배열되지 않은 인간 VH도메인 유전자의 3'말단에 어닐링되도록 디자인되며, 특히 VH도메인 유전자의 마지막 세개의 코돈에 상보적인 서열과 이들 세개의 코돈 아래로 아홉개의 뉴클레오티드을 포함하고 있다.

후방 프라이머로는 동일한 몰수의 HuOcta1BACK, HuOcta2BACK 및 HuOcta3BACK의 혼합물을 사용하였는데 이 프라이머들은 게놈 DNA VH유전자의 프로모터 도메인에 있는 서열에 어닐링된다(제1도 참조). 5㎕의 증폭된 DNA를 TBE 완충액 내의 2% 아가로스겔상에서 전기영동한 후 에티디윰 브로마이드로 착색하였다. 재배열되지 않은 VH 유전자로 생각되는 크기에 일치하는 약 620 뉴클레오티드의 이중 밴드가 나타났다. dc cDNA를 SacI로 한 후 서열분석을 위해 M13 벡터내로 클로닝하였다. 몇몇 개의 동일한 서열이 존재함에도 불구하고 다른 재배열되지 않은 인간 VH 유전자가 상당한 정도로 확인되었다(제12도).

[실시예 5]

하이브리도마로부터 결합활성을 지닌 가변도메인의 클로닝

VHLYS 도메인의 외질(periplasm)로의 이송을 위한 pelB 리더서열의 부착되도록 D1.3 항체(항-라이소자임)의 H사슬 가변도메인(VHLYS)을 전술한 것과 유사한(그러나 1ac z 프로모터에 의해 조절되는 점이 상이한) 벡터 내로 클로닝하였다[42]. 상기 벡터 pSW1은 오버래핑 올리고뉴클레오티드의 사용과 pUC19 벡터로의 클로닝을 [35] 통하여 pe1B 리더서열을 합성[43]함으로써 제조하였다. D1.3 항체의 VHLTS 도메인은 cDNA 클론[44]과 서열분석된 상기 pSW1 벡터로부터 유도하였다(제13도).

H사슬과 L사슬 가변도메인을 함께 발현시키기 위하여, D1.3항체의 L사슬 가변도메인(VKLYS)을 pelB 신호서열과 함께 pSW1 벡터 내로 도입하여 pSW2 벡터를 얻었다(제14도).

상기 플라스미드 pSW1이나 pSW2로 대장균 균주(BMH71-18)[45]를 형질전환시키고[46,47], 이화생성물 억제(catabolite repression)로 가변도메인의 발현을 방해할 수 있는 포도당이 소량(1%) 함유된 영양배지(2×TY; 물 1리터당 16g 박토-트립톤, 10g 이스트 추출물, 5g NaCl) 플레이트상에서 암피실린(100㎍/㎖)에 대한 저항성 콜로니를 선별하였다.

상기 콜로니를 플라스크에 들어있는 50㎖의 2×TY(1% 글루코즈와 100㎕/㎖ 암피실린이 추가된)배지에 접종한 후 37℃에서 교반하면서 12∼16시간 배양하였다. 세포 배양액을 원심분리하여 펠릿을 50mM의 염화나타륨으로 2회 세척한 후, 100㎍/㎖ 암피실린과 유도체인 IPTG(1mM)을 함유한 2×TY배지에 재현탁하여 37℃에서 30시간 더 배양하였다. 배양액을 원심분리하여 상등액을 날젠 여과기(0.45㎛)로 여과한 후, 1∼5㎖ 부피의 라이소자임-세파로스 친화도컬럼(lysozyme-sepharose affinity column: 10㎎/㎖의 라이소자임을 CNBr로 활성화된 세파로스에 커플링시켜 준비함)에 통과시켰다. 이후 컬럼을 먼저 인산 완충 생리식염수(PBS)로 세척한 뒤 50mM 디에틸아민으로 VHLYS 도메인(pSW1으로부터 유래) 또는 VKLYS(pSW2로부터 유래)와 결합된 VHLYS 도메인을 용출하였다.

VHLYS와 VKLYS 도에민은 SDS 폴리아클릴아미드 전기영동 결과 정확한 크기인 것으로 확인되었다. 또한 폴리아크릴아미드 겔로부터 VHLYS와 VKLYS를 분리하여 각각의 N-말단 서열을 분석한 결과 신호 펩타이드가 정확하게 만들어졌다는 것이 밝혀졌다. 따라서 Fv단편과 VHLYS 도메인 모두 라이소자임 친화도컬럼에 결합할 수 있는 바, 이는 Fv단편과 VHLYS 도메인이 본래항체의 친화도 특성의 적어도 일부를 가지고 있음을 암시한다.

수퍼로즈 12(Superose 12)상에서의 Fv단편의 크기와 FPLC에 의한 VHLYS 도메인의 크기를 비교하여 VHLYS 도메인이 모노머인 것을 알 수 있었다. ELISA에 의해 라이소자임에 대한 VHLYS와 Fv단편의 결합을 확인하였고, 형광소광법(fluorescence quench)을 사용하여 평형 및 반응속도를 연구하였다.

라이소자임 결합에 대한 ELISA는 다음과 같이 이루어졌다:

(1) 플레이트(Dynatech Immulon)를 웰당 200㎕씩의 라이소자임액(pH 9.6, 50mM NaHCO₃에 용해된 300㎍/㎖ 농도의 것)으로 상온에서 하룻밤 동안 코팅하였다.

(2) 웰을 PBS로 3회 세척한 후, PBS에 용해된 1%의 세인스베리의 즉석 건조 탈지분유(Sainsbury's instant dried skimmed milk powder)로 웰당 300㎕씩 가하여 37℃에서 2시간동안 블록화하였다.

(3) 웰을 PBS로 3회 세척한 후, 웰당 200㎕의 VHLYS 또는 Fv단편(VKLYS와 연고나된 VHLYS)를 가하여 실온에서 2시간동안 정치하였다.

(4) 웰을 PBS에 현탁된 0.05%의 트윈 20(Tween 20)으로 3회 세척 후, PBS로 3회 세척하여 잔류 트윈 20을 제거하였다.

(5) 상기 Fv단편에 대한 토끼의 폴리클로날 항혈청을 PBS에 현탁된 2% 탈지분유 현탁액에 적당하게 희석(1:1000)한 것 200㎕씩을 각 웰에 첨가하고 2시간 동안 실온에 정치하였다.

(6) (4)의 방법에 따라 세척하였다.

(7) 말무(horse radish) 페록시다제에 커플된 염소의 항-토끼항체(ICN Immunochemicals)를 PBS에 현탁된 2% 탈지분유 현탁액에 적당하게 희석(1:1000)한 것 200㎕씩을 각 웰에 첨가하고 1시간 동안 실온에 정치하였다.

(8) (4)의 방법에 따라 세척하였다.

(9) 0.55㎎/㎖ 농도의 2,2'아지노-비스(3-에틸벤즈티아졸린술폰산)(시그마)(용매는 물 10㎖당 20%의 과산화수소 1㎕가 첨가된 액)200㎕ 씩을 각 웰에 첨가하여 실온에서 10분간 정치하여 발색시켰다.

pH 4.3인 50mM 구연산에 용해된 0.05% 아지드화 나트륨을 첨가하여 반응을 중지시킨 후, 티테르텍 멀티스캔 플레이트 해독기로 ELISA 플레이트를 해독하였다. 그 결과, pSW1(VHLYS 도메인)이나 pSW2(Fv단편)로 형질전환된 박테리아 배양액의 상등액은 ELISA에서 라이소자임에 결합한다는 것이 밝혀졌다.

결합의 화학양론과 라이소자임의 친화도 상수를 측정하기 위하여[48, 49] 형광소광(퍼킨 엘머 LS5B 인광 스펙트로미터)을 사용하여 정제된 VHLYS와 Fv단편을 라이소자임으로 적정하였다. 30nM 농도의 Fv단편을 적정하여 스카트챠드(Scatchard) 분석한 결과 해리상수는 2.8nM로 나타났다.

형광소광과 스카트챠드 그래프(plot)를 이용하여 유사한 방법으로 100nM의 VHLYS에 대해 수분석하였다. 그래프 분석결과 항원결합의 화학양론은 1몰의 VHLYS당 약 1몰의 라이소자임이었다. (VH 도메인의 농도는 원형 면역 글로불린의 전형적인 흡광계수(extinction coefficient)를 사용해서 280nM에서의 광학 밀도로부터 계산하였다.) 낮은 광학밀도 측정에 있어서의 가능한 오차와 흡광계수의 추측에 의한 오차 때문에 좀더 주의 깊게 화학양론을 재차 측정하였다. 형광소광법을 이용하여 위와 같이 VHLYS를 라이소자임으로 적정하였다. VHLYS의 농도를 결정하기 위해서, 스톡 용액의 샘플을 제거하고 일정양의 노르리신을 첨가한 후, 샘플을 정량 아미노산 분석하였다. 그 결과 VHLYS 도메인 1몰당 라이소자임 1.2몰의 화학양론을 나타내었고, 해리상수는 약 12nM로 계산되었다.

라이소자임의 10배 농도의 단편을 이용한 유사-1차 지수 반응조건하에서의 신속유동법(stopped-flow method)(HI Tech Stop Flow SHU 기계)으로 라이소자임에 대한 VHLYS와 Fv단편의 on-rate를 측정하였다[50]. 먼저 상기와 같이 형광소광법을 이용하여 라이소자임으로 적정하여 라이소자임 결합부위의 농도를 측정하였다. on-rate는 (VHLYS 단백질의 양보다는) 결합부위의 몰수를 기준으로 계산하였다. Fv단편의 on-rate는 25℃에서 2.2×10⁶M^-1s^-1이며, VHLYS 단편의 on-rate는 3.8×10⁶M^-1s^-1이고 off-rate는 2-℃에서 0.075s^-1이었다. 친화도 상수값은 19nM인 것으로 계산되었다. 따라서 라이소자임 결합에 대한 VHLYS와 Fv는 각각 19nM와 3nM의 해리 상수를 가지고 라이소자임과 결합한다.

[실시예 6]

항체-분비 세포의 mRNA나 DNA로부터의 결합활성을 지닌 완전한 가변도메인의 클로닝

암탉의 달걀 백색 라이소자임(완전한 Freunds 보조제에 용해된 라이소자임 100㎍을 복강내 주사)으로 쥐를 면역시키고, 14일 째에 불완전-Freunds 보호제에 용해된 라이소자임 100㎍을 다시 복강내 주사하고, 35일 째에 생리식염수에 용해된 라이소자임 50㎍을 정맥주사하였다. 39일 째에 비장을 회수하였다. 유사한 방법으로 다른 쥐를 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet haemocyanin; KLH)으로 면역시켰다. 실시예 2의 방법 2에 따라 비장으로부터 DNA을 얻었고, 실시예 2에 따라 VH 유전자를 증폭하였다.

실시예 3의 방법 2에 기재된 대로, HIV 감염환자의 인간 말초 혈액 임파구를 얻고 mRNA를 준비하였다. 실시예 3에 기술된 방법에 따라 인간 VH 유전자 훼밀리에 적합하게 디자인된 프라이머를 사용하여 VH유전자를 증폭하였다.

PCR 후에, 반응 혼합물과 오일을 에테르로 2회, 페놀로 1회, 페놀/CHCL₃로 1회 추출하였다. dsDNA를 50㎕의 물에 용해시켜 동결하였다. dsDNA 용액 5㎕를 PstI와 BstEII(증폭된 프라이머내에서 인식부위가 코딩되어 있음)로 처리한 뒤, 아가로스겔에서 전기영동하고 350bp 크기의 DNA 밴드를 추출하였다.

항-라이소자임 활성의 발현

증폭된 H사슬 가변도메인의 레퍼토리(라이소자임으로 면역된 쥐와 인간 PBLs로 부터 유래된 것)를 발현벡터 pSW1HPOLYMYC내로 직접 클로닝하였다. 이 벡터는 pSW1에서 VHLYS유전자가 폴리링커 제한부위에 의해 치환된 것이다. 펩타이드 태그를 코딩하는 서열을 삽입하였다(제5도). 콜로니들을 따서 1㎖ 배양액으로 옮겼다. 유도후에(자세한 것은 실시예 5 참조), 14개의 1㎖ 배양색의 상등액 10㎕을 SDS-PAGE 겔상에 로딩(load)하고, 전기영동적인 방법으로 단백질을 니트로셀룰로스로 옮겼다. 블로팅(blot)는 펩타이드 태그에 대한 항체 9E10으로 프로브되었다.

프로브는 다음과 같이 행해졌다. 니트로셀룰로즈 필터를 3% 소 혈청 알부민(BSA)/TBS 완충용액에서 20분동안 배양하였다(10×TBS 완충용액은 100mM 트리스·HCl과 9% w/v NaCl로 이루어진 pH 7.4인 용액). 상기 필터를 3%BSA/TBS에 적당히 희석(약 1/500)된 항체 9E10 희석액에서 1-4시간 동안 배양하였다. 상기 필터를 TBS(100㎖를 가하고 10분간 세척)로 3회 세척한 후에 3% BSA/TBS에 1：500로 희석된 항-쥐항체(항-쥐Ig(다코파츠)에 결합된 페록시다제) 희석액에서 1∼2시간 동안 배양하였다. 상기 필터를 TBS와 0.1% 트리톤 X-100(각 세척시 100㎖씩 10분간)으로 3회 세척한 후에 10㎖ 클로로나프톨(메탄올에 3mg/㎖농도로 용해된 것). 40㎖의 TBS 및 50㎕ 과산화수소로 된 용액을 블로팅 위에 첨가하고 10분 이상 반응시킨 뒤 과량의 물로 세척하였다. 블로팅 결과, 웨스턴 블로팅에서의 VHLYSMYC과 유사한 이동성을 보이는 밴드가 나타난 바, 이는 다른 VH도 메인들이 발현될 수 있음을 보여준다.

콜로니들(H사슬 가변도메인의 레퍼토리로 클로닝 된 것) 각각을 따서 ELISA 플레이트(200㎕)의 웰로 옮겨 성장 및 유도실험을 실시하였다. 콜로니들에 대하여 9E10항체에 대한 라이소자임의 결합성을 분석하였다(실시예 5와 7의 방법에 의함). 그 결과 라이소자임-결합활성을 지닌 웰이 확인되었다. 200개의 웰 중 두 개의 양성 웰이 증폭된 쥐와 비장 DNA로부터 유래되었고, 하나의 웰이 인간 cDNA로부터 유래되었음이 확인되었다. 라이소자임-세파로스의 컬럼으로 H사슬 가변도메인을 정제하였다. 50nM 이상의 형광소광 적정법에 의해 클론들의 라이소자임에 대한 친화도를 측정하였다. 신속유동법에 의한 쥐 유전자 유래의 두 클론(VH3와 VH8)에 대한 친화도(K_on/K_off의 비)는 각각 12nM와 27nM로 측정되었다. 즉, 이들 클론들은 VHLYS 도메인과 유사한 정도의 친화도를 가지고 있는 것이다. 코딩된 VH3와 VH8의 아미노산 서열을 제16도에, 코딩된 인간 가변도메인의 아미노산 서열을 제17도에 각각 나타내었다.

라이소자임으로 면역된 쥐로부터 생성된 VH도메인의 라이브러리에 있어서 라이소자임 및 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)에 대한 결합활성을 스크리닝하였다. 이천개의 콜로니를 다섯 그룹으로 나누어 ELISA 플레이트의 웰로 옮기고, 상등액을 분리하여 라이소자임이 코팅된 플레이트 및 KLH가 코팅된 플레이트에 대한 결합성을 실험하였다. 21개의 상등액이 라이소자임 결합활성을, 2개의 상등액이 KLH 결합활성을 나타내었다. KLH로 면역된 쥐로부터 제조된 두 번째 발현 라이브러리를 위와 같은 방법으로 스크리닝하였다. 그 결과 14개의 상등액이 KLH 결합활성을, 하나의 상등액이 라이소자임 결합활성을 나타냈다.

이러한 실험 결과는 항원 결합활성이 단일 VH 도메인으로도 나타날 수 있으며, 면역처리가 이들 도메인의 분리를 용이하게 한다는 것을 보여준다.

[실시예 7]

돌연변이에 의한 결합활성이 있는 가변도메인의 클로닝

하나의 재배열된 VH유전자의 CDR을 광범위하게 돌연변이시킴으로써 완전히 새로운 항원 결합활성을 유도하는 것이 가능할 것이다. 돌연변이는 완전히 무작위거나 사전에 준비된 CDR들의 레퍼토리로부터 유도될 수 있다. 그러므로 CDR3의 레퍼토리는 측면서열에 기초한 보편적인 프라이머의 사용에 의해 전술된 실시예에 따라 제조될 수 있으며, 다른 CDR들의 레퍼토리(단일 또는 조합 형태)도 비슷하게 제조될 수 있다. CDR레퍼토리는 다양한 재조합 DNA기술에 의하여 측면 프레임부위에 삽입될 수 있다.

CDR3의 크기와 서열이 CDR1 및 2보다 더 다양하게 때문에 CDR3가 돌연변이에 있어서 가장 유망한 부위인 것으로 보인다. 또한 이 부위는 항원결합에 중요한 기여를 할 것으로 기대된다. 항-라이소자임항체 D1.3의 H사슬 가변도메인(VHLYS)은 CDR3 도메인 내의 몇 군데에서 중요한 접촉을 한다고 알려져 있다.

폴리머라제 연쇄 반응(PCR)과 고도로 퇴화한(degernerate) 프라이머를 이용하여 CDR3에 다중 돌연변이를 유도하였다. 이 방법에 의하여 CDR3의 원서열이 파괴되었다.(혼합된 올리고뉴클레오티드 이중사슬을 CDR3의 측면에 있는 제한부위로 클로닝시키거나 위치-특이적 돌연변이시키는 방법에 의하여 돌연변이를 일으키는 것 또한 가능하다). 라이소자임 친화성 H사슬 가변도메인을 발현하는 돌연변이를 스크리닝하고, 친화도가 증가되었거나 새로운 특이성을 지닌 콜로니를 동정하였다.

H사슬 가변도메인의 출처로서 VHLYS유전자를 함유한 M13벡터를 사용하였다. 가변도메인을 코딩하는 서열의 본체는 CDR3에 기초한 돌연변이 프라이머 VHMUT1과 M13벡터의 골격에 기초한 M13프라이머를 사용하고 폴리머라제 연쇄반응(PCR)을 이용하여 증폭하였다. 돌연변이성 프라이머 VHMUT1는 CDR3 중앙의 4개의 잔기(Arg-Asp-Tyr-Arg)를 고도로 돌연변이시켰다. VHMUT1 및 M13 프라이머 각각 25pmole, dNTP 각각 0.5mMμM, 67mM의 트리스·HCl, 10mM의 mgCl₂, 17mM의 (NH₄)₂SO₄, 200μg/ml의 젤라틴과 2.5유니트의 Taq 폴리머라제(Cetus)로 된 반응용액 50μl과 100ng의 단일 사슬 M13mp19SWO을 주형으로 하여 히팅 블록(테큰 PHC-1 프로그래머블 허팅 블록)에서 온도 싸이클을 25회 반복하였다. 온도 사이클은 95℃에서 1.5분, 25℃에서 1.5분 및 72℃에서 3분이었다(그러나 PCR의 온도 사이클을 사용할 수도 있다). 반응 생성물을 페놀/클로로포름으로 추출하고 에탄올로 침전시킨 다음 pH 8.0인 10mM 트리스·HCl와 0.1mM EDTA 혼합액에 재현탁하였다.

PCR 생성물을 PstI과 BstEII로 처리한 후, 젠클린(Bio 101, LaJolla)을 사용하여 트리스 아세테이트 완충용액에서 1.5% LGT 아가로스겔상에서 정제하였다. 겔로 정제된 밴드의 생성물을 추출하여 pSW2HPOLY에 연결하였다(제19도).(이 벡터는 pSW2의 VHLYS 유전자 본체를 폴리링커로 치환한 것이다.) 먼저 상기 벡터를 BstEII과 PstI으로 처리한 후 송아지의 장 포스파타제로 처리하였다. 반응물로 암피실린 저항성 대장균 BMH 71-18을 형질전환하였다. 콜로니들을 암피실린(100μg/ml)이 하유된 0.8(w/v)% 포도당 영양배지 플레이트상에서 선택배양하였다.

형질전환된 콜로니들을 다섯 그룹으로 나누어 200μl의 2×TY 배지와 100μl의 TY 배지, 100μg/ml의 암피실린 및 1% 포도당을 함유한 2개의 96웰 미세적정-플레이트(Corning microtitre plate)에 옮겼다. 콜로니들을 37℃에서 24시간 동안 증식시킨 후, 세포를 50mM NaCl 200μl로 2회 세척하고, 상기 플레이트 뚜껑을 닫고 원심 분리기(IEC centra-3 bench top centrifuge)로 상온에서 12,500rpm으로 10분동안 회전시켜 세포 펠릿을 얻었다. 발현을 유도하기 위하여 세포를 200μl의 2×TY, 100μg/ml 암피실린과 1mM IPTG(시그마) 용액에 재현탁한 후 24시간 증식시켰다.

상기 세포배양을 원심분리하고 그 상등액을 라이소자임이 코팅된 플레이트 및 항-이디오타입혈청(D1.3항체의 Fv단편에 대한 토끼의 혈청)과 함께 ELISA에 사용하였다. 항-토끼혈청에 결합된 말무(horse radish) 페록시다제(ICN Immunochemical s)를 사용하여 결합된 항-이디오타입혈청을 검출하였다. 7개의 웰이 ELISA에서 양성반응을 나타냈다. 상기 7개의 웰을 다시 스트리킹하여 단일 콜로니로 분리·증식시킨 후, 이와 같은 방법으로 미세적정-플레이트에서 발현을 유도하고 ELISA에서 재스크리닝하였다. 양성 클론을 50ml 배지에 배양하고 발현을 유도하였다. 배양 상등액은 실시예 5에서처럼 라이소자임-세파로스 칼럼으로 정제하고, 용출액을 SDS-PAGE에서 전기영동하고 Page Blue 90(BDH)으로 착색하여 분석하였다. 디에틸아민으로 칼럼을 용출할 때 VHLYS 돌연변이 도메인에 상응하는 밴드는 확인되었지만, VKLYS도메인에 상응하는 밴드는 발견되지 않았다. 이는 돌연변이 도메인이 라이소자임과 결합할 수 있을지라도 더 이상 VKLYS 도메인에 연관되지 않음을 암시한다.

ELISA에서 양성 반응을 나타내는 일곱 개의 클론에서 분리된 플라스미드를 EcoRI로 절단하여 VKLYS 유전자를 잘라 제거한 다음 재연결시켜서 VHLYS 돌연변이체만을 발현하도록 조작하였다. 상기 프라스미드로 형질전환된 세포를 1.5ml 배양액에 증식시키고 위와 같은 방법으로 발현으로 유도하였다. 배양액의 상등액은 위에서와 같이 라이소자임 결합을 나타내었다.(한편 VKLYS의 부재하에 돌연변이의 활성발현을 유도하기 위해 증폭된 돌연변이 VKLYS 유전자는 pSW1HPOLY벡터 내로 직접 클로닝할 수도 있다.)

ELISA 방법은 박테리아 배양 상등액의 라이소자임(또는 KLH)에 대한 결합활성을 비교하기 위해 고안되었다. 먼저 모노클로날 항체 9E10에 의해 인지되는 c-myc 단백질로 벡터의 C-말단부위에 VH 도메인이 연결되도록 벡터를 제작하였다. 상기 벡터는 pSW1를 BstEII과 SmaI로 처리하고, 올리고뉴클레오티드 이중사슬 5'GTC ACC GTC TCC TCA GAA CAA AAA CTC ATC TCA GAA GAG GAT CTG AAT TAA TAA 3' 및 5'TTA TTA ATT CAG ATC CTC TTC TGA GAT GAG TTT TTG TTC TGA GGA GAC G 3'을 연결시켜 유도하였다. 유도 후에 발현된 VHLYSMYC 단백질 도메인이 라이소자임 및 9E10 항체에 결합한다는 것을 다음과 같이 밝혔다.

(1) 바닥이 평평한 Falcon(3912)웰을 pH 9.6인 50mM NaHCO에 용해된 라이소자임(3mg/ml)이나 KLH(50μg/ml) 용액으로 웰당 180μl 씩 코팅하고 실온에서 하룻밤 정치하였다.

(2) 웰을 PBS로 세척한 후, PBS에 용해된 25%의 세인스베리의 즉석 건조 탈지분유(블록킹액)로 웰당 200μl씩 가하여 37℃에서 2시간동안 블록화하였다.

(3) 블록킹액을 버리고 웰을 PBS로 3회 세척한 후, 150μl의 테스트 용액(상등액이나 정제된 태그 도메인)을 각 웰에 넣었다. 샘플을 37℃에서 2시간동안 정치하였다.

(4) 테스트 용액을 버리고 웰 PBS로 3회 세척하였다. 4μg/ml의 정제 9E10항체가 용해된 상기 블록킹액을 100μl씩 가하여 37℃에서 2시간동안 배양하였다.

(5) 9E10 항체를 버리고 웰 PBS로 3회 세척하였다. 항-쥐항체(항-쥐Ig(다코파츠)에 결합된 페록시다제)의 1/500 희석액 100μl를 첨가하고 37℃에서 2시간 배양하였다.

(6) 두번째 항체를 버리고 웰을 PBS로 세번 세척하였다.

(7) 0.55mg/ml 농도의 2, 2'아지노-비스(3-에틸벤즈티아졸린술폰산)(시그마)(용매는 물 10ml당 20%의 과산화수소 1μl이 첨가된 액) 100μl 씩을 각 웰에 첨가하여 실온에서 10분간 정치하여 발색시켰다.

pH 4.3인 50mM 구연산에 용해된 0.05% 아지드화 나트륨을 첨가하여 반응을 중지시킨 후, 티테르텍 멀티스캔 플레이트 해독기로 ELISA 플레이트를 해독하였다.

라이소자임에 결합하는 VHLYSMYC 도메인과 경쟁시킴으로써 돌연변이체 상등액과 VHLYS 상등액의 활성을 비교하였다. 그 결과, VHLYSMYC와 경쟁하는데 있어서 클론 VHLYSMUT59의 상등액이 야생형 VHLYS 상등액보다 더 효과적으로 나타났다. 더욱이 VHLYS와 VHLYSMUT59의 상등액을 SDS-PAGA 웨스턴 블로팅(항-Fv 항혈청을 사용)에 의하여 양자가 비슷한 함량임을 확인하였다. 그러므로 VHLYS와 VHLYSMUT59가 동일한 양인 것으로 가정한다면, 돌연변이체의 친화도는 VHLYS 도메인의 친화도보다 크다는 것을 보여준다.

VHLYSMUT59 도메인의 친화도를 직접 조사하기 위하여, 클론을 1l 배양액에서 증식시킨 후, 실시예 5의 방법과 같이 라이소자임-세파로스로 정제하여 VHLYSMUT59 도메인 200∼300μg을 얻었다. VHLYS와 VHLYSMUT59 샘플에 대해 형광소광 적정법을 실행하여 라이소자임에 대한 결합자리의 수를 분석하였다. 그리고나서 ELISA 분석시 VHLYS와 VHLYSMYC의 샘플을 2지수배(즉, 수 백배)이상 농도의 VHLYSMYC와 경쟁시켜 비교하였다. 경쟁분석에서 각각의 미세적정 웰에는 일정양(대략 0.6μg)의 VHLYSMYC를 담고, 다양한 양(0.166-25μl)의 VHLYS나 VHLYSMUT59(라이소자임 결합부위를 기준으로 3.8μM 농도의 것)를 첨가하였다. 모든 웰에서 최종부피와 완충제 농도는 일정하였다. 각각의 분석 웰에서 결합된 VHLYSMYC를 정량하기 위하여 9E10(항-myc)항체를 사용하였다. 백그라운드결합(background binding)에 의한 영향을 뺀 후에 VHLYS나 VHLYSMUT59 각각의 첨가에 의한 VHLYSMYC 결합의 % 방해율을 계산하였다. 분석은 2중을 수행하였다. 그 결과는 VHLYSMUT59가 VHLYS보다 라이소자임에 대해 더 높은 친화도를 갖는다는 것이 밝혀졌다.

(M13으로 재클로닝 후에) VHLYSMUT59유전자를 서열분석하였는데 CDR3의 중앙잔기(Arg-Asp-Tyr-Arg)를 제외하면 VHLYS 유전자와 동일한 것으로 나타났다. 중앙잔기들은 Thr-Gln-Arg-Pro(ACACAAAGGCCA로 코딩됨)로 치환되어 있었다.

이천개의 돌연변이 VH 클론의 라이브러리를 라이소자임과 KLH 결합에 대해 스크리닝하였다(실시예 6에 기술된 바와 같은 웰당 5개의 콜로니를 넣음). 19개 상등액에서 라이소자임 결합활성이, 4개에서 KLH 결합활성이 확인되었다. 이는 무작위의 CDR3 레퍼토리 제조에 의해 새로운 특이성과 향상된 친화도가 유도될 수 있음을 나타낸다.

[실시예 8]

라이소자임 결합하는 이중 도메인의 제조 및 발현

단일 도메인들이 우수한 결합활성을 지닌다는 사실은 도메인-연쇄(도메인들이 일렬로 연결된 것)들의 제조를 가능하게 한다. 따라서, 도메인들 사이의 거리만큼 떨어진 서로 다른 에피토프에 결합할 수 있는 다중 특이성이 단일분자 내에 부여될 수 있다. 도메인-연쇄 분자내의 도메인의 간격을 일정하게 유지하기 위하여 도메인 사이에 링커부위를 삽입시킬 수도 있다. 원칙적으로 이러한 분자들은 예외적인 특이성과 친화도를 위해 고안될 수 있을 것이다.

클로닝된 D1.3항체의 H사슬 가변 유전자 두 개를 유연성 있는 링커(Gly-Gly-Gly-Ala-Pro-Ala-Ala-Pro-Ala-Gly-Gly-Gly-)를 코팅하는 뉴클레오티드 서열로 연결(절단, 연결 및 위치-특이적 돌연변이 등의 단계를 거침)시켜 플라스미드 pSW3를 제조하였다(제20도). lac z 프로모터를 이용하여 발현을 유도하였고, pelB 리더서열을 삽입하여 단백질이 외질로 분비되도록 하였다(실시예 5의 pSW1과 pSW2의 발현방법과 동일). 단백질을 라이소자임 친화성 칼럼으로 정제하고 SDS 폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동하여 밴드를 확인하였다(분자량 약 26,000). 단백질을 탐지하기 위해 D1.3항체의 Fv단편에 대한 항-이디오타입 항혈청을 사용한 ELISA(실시예 5 참조) 실험에서 알 수 있듯이 상기 발현된 단백질은 라이소자임과 강하게 결합하였다. 그러므로 이같은 구조체(도메인-연쇄)드른 쉽게 만들어져 분비되며, 구조체 내의 최소한 하나의 도메인이 라이소자임에 결합한다.

[실시예 9]

VHLYS의 C말단에 시스테인 잔기 도입

다음과 같은 방법으로 벡터 pSW2내의 VHLYS도메인의 C-말단에 시스테인 잔기를 도입하였다：벡터 pSW2를 제한효소 BstI와 SmaI(J구획의 C-말단 부분을 절단함)로 절단하고, 짧은 올리고뉴클레오티드 이중사슬 5'GTC ACC GTC TCC TCA TGT TAA TAA 3' 및 5' TTA TTA ACA TGA GGA GAC G 3'로 연결하였다. 라이소자임 세파로스 친화도 칼럼으로 정제하였는데, VHLYS-Cys도메인은 VKLYS 가변도메인과 함께 발현되었으나, 전체적인 수율은 야생형 Fv단편보다 훨씬 낮았다. 정제된 Fv-Cys 단백질을 비환원 및 환원 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 비교한 바, 두 개의 VH-Cys도메인이 도입된 시스테인 잔기를 통하여 결합하고 있었다.

[실시예 10]

VH 도메인과 효소의 연결

VH 도메인의 N-말단이나 C-말단 측면에 효소를 클로닝시킴으로써 VH 도메인과 효소활성의 연결이 가능할 것이다. 양자 모두 활성이 유지되어야 하므로 두 도메인 사이에 적당한 링커(실시예 8 참조)를 삽입할 필요가 있다. VH-효소 융합체가 분비되도록 하기 위해서, 효소는 분비형 효소인 것이 바람직하다. 제21도에 VH 도메인과 알카린 포스파타제의 융합체의 서열을 도시하였다. 알카린 포스파타제 유전자는 대장균 알카린 포스파타제 유전자를 코딩하고 있는 플라스미드 pEk48[51]로부터 PCR로 클로닝하여 얻었다. 프라이머로는 5' CAC CAC GGT CAC CGT CTC CTC ACG GAC ACC AGA AAT GCC TGT TCT G 3' 및 5'GCG AAA ATT CAC TCC CGG GCG CGG TTT TAT TTC 3'를 사용하였다. 벡터 pSW1을 BstEII과 SmaI로 절단한 뒤 상기 클로닝된 유전자를 도입하였다. 이렇게 제조된 구조체(제21도)를 실시예 5에서와 같이 대장균 균주 BMH71-18에서 발현시켰고, pH가 0.5인 10mM 디에탄올아민과 0.5mM mgCl₂에 용해된 1mg/ml p-니트로페닐포스페이트를 기질로하여 포스파타제 활성을 측정하는 방법 및 SDS 폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동한 후 웨스턴 블로팅(항-이디오타입 항혈청으로 검지함)하는 방법으로 스크리닝하였다. 웨스턴 블로팅(실시예 5 참조)에 의해 탐지된 바로는 VHLYS-알카린 포스파타제 융합체의 분비나 포스파타제 활성의 분비에 대한 어떠한 증거도 없었다.

그러나 구조체를 프로티아제가 결핍된 박테리아 균주 BL21DE3[52]에 형질감염시키면 정확한 크기의 밴드(분해된 생성물 뿐만이 아니라)가 웨스턴 블로팅에서 탐지되었다. 나아가 박테리아 상등액에서 포스파타제 활성을 확인할 수 있었다. 이같은 활성은 구조체로 형질감염되지 않은 균주의 상등액에서는 볼 수 없다.

두 두메인 사이의 간격을 개선하기 위하여 다양한 링커 서열을 BstEII부위에 도입할 수 있을 것이다.

[실시예 11]

VH 도메인과 V_k레퍼토리의 공동-발현

V_k유전자의 레퍼토리를 실시예 2에 기술된 프라이머들을 이용하여 쥐의 비장에서 추출한 DNA로부터, 그리고 프라이머 VK3FOR 및 VK2BACK를 이용하여 쥐의 비장 mRNA로부터 PCR로 유도하였는데, 이때 94℃ 1분. 60℃ 1분 및 72℃ 2분의 온도 싸이클을 적용하였다. PCR로 증폭된 DNA를 아가로스겔에서 분획하고, 밴드를 절취하여 VHLYS 도메인(D1.3 항체의 것) 및 myc이 붙은 L사슬 가변도메인의 클로닝을 위한 클로닝 부위(SacI 및 XhoI)를 가지고 있는 벡터(pSW1VHLYS-VKPOLYMYC, 제22도)에 클로닝하였다.

실시예 5와 7에서 기술된 바와 같이 L사슬 가변도메인에 붙은 myc태그를 통해 클론들의 라이소자임 결합활성을 스크리닝하였는데, 이러한 방식에 의해 다음과 같은 종류의 V_k도메인을 확인할 수 있다：

(1) VHLYS 도메인의 부재하에 라이소자임에 결합하는 도메인들;

(2) H사슬과 결합하고 라이소자임 결합에 (긍정적으로나 부정적으로) 기여하지 못하는 도메인들;

(3) H사슬과 결합하고 라이소자임 결합에 기여하는 도메인들.

VHLYS 도메인과 결합하고 라이소자임에 대한 결합특성이 상실된 V_k도메인은 나타나지 않았다.

추가 실험에서, VHLYS 도메인을 레퍼토리로부터(실시예 6 참조) 분리한 H사슬 가변도메인 VH3로 치환한 후, V_k도메인을 벡터로 클로닝하였다.(VH3도메인은 내부에 SacI부위를 가지고 있으며, 이는 SacI-XhoI 단편으로서의 V_k레퍼토리의 클로닝을 가능하게 하기 위해서 먼저 제거된다는 점에 주목).

실시예 6에 기술된 ELISA 방법을 이용하여 상등액을 스크리닝하면 라이소자임에 결합하는 박테리아 상등액을 확인할 수 있을 것이다.

[실시예 12]

VH 도메인의 고도 발현

펩타이드 태그에 대한 항체인 9E10항체를 사용한 웨스턴 블로팅을 통해서, 라이소자임으로 면역된 쥐에서 유도된 VH 라이브러리의 클론들을 스크리닝한 결과, 하나의 클론이 매우 높은 수준(25∼50mg/l로 측정)으로 도메인을 발현한다는 것을 확인하였다. 이 클론의 서열 특성을 결정하기 위해 서열분석하였는데, 몇 개의 아미노산이 다른 것(제23도) 이외에는 VHLYS 도메인의 서열과 매우 유사함이 밝혀졌다. 이같은 결과는 기대밖으로서, 제한된 수의 아미노산 변화로, 경우에 따라서는 하나의 아미노산 치환으로도, 발현 수준을 상당히 증대시킬 수 있음을 보여준다.

이들 잔기들이 변이된 고도의 발현 도메인의 돌연변이체를 제조함으로써, VHLYS 도메인에서 하나의 아미노산 변화(35번째 Asn이 His으로)만으로도 도메인을 높은 수준으로 발현시키기에 충분하다는 것이 발견되었다.

결론

본 발명은 종래보다 훨씬 더 단순한 방법으로 H사슬과 L사슬을 코딩하는 서열의 클로닝, 증폭 그리고 발현을 가능하게 한다. 또한 분리된 가변도메인이나 효과기 분자에 연결된 가변도메인들이 매우 유용하다는 것을 보여준다.

상기에서 본 발명은 단지 예시적으로 기술되었으며, 다양한 변형이 본 발명의 범위를 벗어남이 없이 당분야 기술자에 의해 수행될 수 있을 것이다.

참고문헌 목록

[1] Inbar et al., PNAS-USA, 69, 2659-2662, 1972.

[2] Amit et al., Science, 233, 747, 1986.

[3] Satow et al., J. Mol. Biol., 190, 593, 1986.

[4] Colman et al., Nature, 326, 358, 1987.

[5] Sheriff et al., PNAS-USA, 84, 8075-8079, 1987.

[6] Paslan et al., PNAS-USA, 86, 5938-5942, 1989.

[7] Skerra and Pluckthun, Science, 240, 1038-1041, 1988.

[8] Bird et al., Science, 242, 423-426, 1988.

[9] Huston et al., PNAS-USA, 85, 5879-5833, 1988.

[10] Fleischman, Arch. Biochem. Biophys. Sulli., 1, 174, 1966.

[11] Porter and Weir, J. Cell. Physiol. Suppl., 1, 174, 1966.

[12] Jaton et al., Biochemistry, 7, 4158, 1968.

[13] Rockey, J. Exp. Med., 125, 249, 1967.

[14] Stevenson, Biochem. J., 133, 827-836, 1973.

[15] Edmundson et al., Biochemistry, 14, 3953, 1975.

[16] Rossman et al., Nature, 317, 145-153, 1985.

[17] Saiki et al., Sciencs, 230, 1350-1354, 1985.

[18] Larrick et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 160, 1250, 1989.

[19] Orlandi et al., PNAS-USA, 86, 3833, 1989.

[20] Yon and Fried, Nuc. Acids Res., 17, 4895, 1989.

[21] Fields and Song, Nature, 340, 245-246, 1989.

[22] Baldwin and Schultz, Science, 245, 1104-1107, 1989.

[23] Menard et al., Cancer Res., 43, 1295-1300, 1983.

[24] Bosslet et al., Eur. J. Nuc. Med., 14, 523-528, 1988.

[25] Bosslet et al., Cancer Immunol. Immunother., 23, 185-191, 1986.

[26] Bosslet et al., Int. J. Cancer, 36, 75-84, 1985.

[27]

[28] Bremer et al., J. Biol. Chem., 259, 14773-14777, 1984.

[29] Griffiths Milstein, Hybridoma Technology in the Biosciences and Medicine, 103-115, 1985.

[30] Maniatis et al., Molecular Cloning：a Laboratory Manual, Cold Spring Habour Laboratory, 1982.

[31] Jones et al., Nature, 321, 522-525, 1986.

[32] Zoller Smith, Nuc. Acids Res., 10, 6457-6500, 1982.

[33] Carter et al., Nuc. Acids Res., 13, 4431-4443, 1985.

[34] Sanger et al., PNAS-USA, 74, 5463-5467, 1977.

[35] Yannisch-Perron et al., Gene, 33, 103-119, 1985.

[36]

[37] Riechmann et al., Nature, 332, 323-327, 1988.

[38] Kearney et al., J. Immunol., 123, 1548-1550, 1979.

[39] Potter et al., PNAS-USA, 81, 7161-7163, 1984.

[40] Galfre Milstein, Meth. Enzyme., 73, 1-46, 1981.

[41] Laemmli, Nature, 227, 680-685, 1970.

[42] Better et al., Science, 240, 1041, 1988.

[43] Lei et al., J. bACTERIOL., 169, 4379, 1987.

[44] Verhoeyen et al., Science, 239, 1534, 1988.

[45] Gronenborn, Mol, Gen. Genet, 148, 243, 1976.

[46] Dagert et al., Gene, 6, 23, 1974.

[47] Hanahan, J. Mol. Biol., 166, 557, 1983.

[48] Jones et al., Nature, 321, 522, 1986.

[49] Segal, Enzyme Kinetics, 73, Wiley, New York, 1975.

[50] Gutfreund, Enzymes, Physical Principles, Wiley Interscience, London, 1972.

[51] Chaidaroglou, Biochem., 27, 8338, 1988.

[52] Grodberg and Dunn, J. Bacteriol., 170, 1245-1253, 1988.

Claims (33)

1. 면역글로블린의 가변도메인의 적어도 일부를 코딩하는 서열을 포함하는 서열(표적서열)들의 클로닝 방법으로서; (a) 표적 가변도메인 서열을 포함하는 핵산의 샘플 레퍼토리를 제공하는 단계; (b) 면역글로블린의 가변도메인의 적어도 일부를 포함하는 단백질들의 레퍼토리를 발현시키기 위해 상기 표적 가변도메인 서열의 클로닝과 복사과정에서 전방 및 후방 프라이머를 사용하는 단계; (c) 복사된 표적 가변도메인 서열을 발현백터내로 클로닝하는 단계; 를 포함하며 상기 전방 프라이머는 각 표적 가변도메인 서열 중 센스사슬의 3'말단 또는 그 부근의 보존서열에 대해 특이적이고, 상기 후방 프라이머는 각 표적 가변도메인 서열 중 안티센스사슬의 3'말단 또는 그 부근의 보존서열에 대해 특히적인 것을 특징으로 하는 클로닝 방법.
2. 제1항에 있어서, 하기 (a)-(f)를 포함하는 클로닝 방법; (a) 표적서열들을 포함하는 이중가닥 핵산의 샘플 레퍼토리를 제공하는 단계; (b) 이중가닥 핵산의 두 사슬을 분리시키는 단계; (c) 프라이머가 핵산에 특이적으로 혼성화될 수 있는 조건하에서, 각 표적서열중 센스사슬의 3'말단 또는 그 부근의 서열에 대해 특이적인 전방 올리고뉴클레오티드 프라이머와, 각 표적서열 중 안티센스사슬의 3'말단 또는 그 부근의 서열에 대해 특이적인 후방 올리고뉴클레오티드 프라이머를 샘플에 어닐링하는 단계; (d) 프라이머 신장을 일으키는 조건하에서 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트의 존재하에, 어닐링된 샘플을 DNA 폴리머라제 효소로 처리하여 이중 가닥 핵산을 제조하는 단계; (e) 단계 (b) 내지 (d)를 반복 실시하여, 표적서열만을 포함하는 이중가닥 DNA(생성물 DNA)를 제조하는 단계; (f) 면역글로블린의 가변도메인의 적어도 일부를 포함하는 단백질들의 레퍼토리를 발현시키기 위해 생성물 DNA를 발현벡터내로 클로닝하는 단계.
3. 제2항에 있어서, 단계 (f) 이전에 단계 (b)-(d)를 수회 반복하는 것을 특징으로 하는 클로닝 방법.
4. 제1항에 있어서, 하기 (a)-(f)를 포함하는 클로닝 방법： (a) mRNA의 레퍼토리를 제공하는 단계; (b) 프라이머가 핵산에 특이적으로 혼성화될 수 있는 조건하에서, 각 표적서열중 센스사슬의 3'말단 또는 그 부근의 서열에 대해 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머를 mRNA에 어닐링하는 단계; (c) 프라이머 신장을 일으키는 조건하에서 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트의 존재하에, 프라이머-어닐링된 mRNA를 폴리머라제 효소로 처리하여 안티센스 cDNA를 제조하는 단계; (d) 프라이머가 핵산에 특이적으로 혼성화될 수 있는 조건하에서, 각 표적서열중 안티센스사슬의 3'말단 또는 그 부근의 서열에 대해 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머를 cDNA에 어닐링하는 단계; (e) 프라이머 신장을 일으키는 조건하에서 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트의 존재하에, 프라이머-어닐링된 cDNA를 폴리머라제 효소로 처리하여 이중가닥 DNA(생성물 DAN)를 제조하는 단계; (f) 면역글로블린의 가변도메인의 적어도 일부를 포함하는 단백질들의 레퍼토리를 발현시키기 위해 생성물 DNA를 발현벡터 내로 클로닝하는 단계.
5. 제4항에 있어서, 단계 (e)이후, 단계 (f) 이전에 하기의 단계들을 실시하는 것을 특징으로 하는 클로닝 방법： (i) 생성물 DNA의 두 사슬을 분리시키는 단계; (ii) 프라이머가 핵산에 특이적으로 혼성화될 수 있는 조건하에서, 각 표적서열 중 센스사슬의 3'말단 또는 그 부근의 서열에 대해 특이적인 전방 올리고뉴클레오티드 프라이머와, 각 표적서열 중 안티센스사슬의 3'말단 또는 그 부근의 서열에 대해 특이적인 후방 올리고뉴클레오티드 프라이머를 분리된 사슬들에 어닐링하는 단계; (iii) 프라이머 신장을 일으키는 조건하에서 데옥시 뉴클레오시드 트리포스페이트의 존재하에, 어닐링된 샘플을 DNA 폴리머라제 효소로 처리하여 이중가닥 핵산을 제조하는 단계.
6. 제1항에 있어서, 상기 후방 프라이머는 표적서열 내에 포함된, 면역글로블린의 가변도메인의 적어도 일부를 코딩하는 서열 중 안티센스사슬의 3'말단 또는 그 부근의 서열에 대해 특이적인 것을 특징으로 하는 클로닝 방법.
7. 제1항에 있어서, 이중가닥 핵산의 샘플 레퍼토리는 임파구로부터 유도되는 것을 특징으로 하는 클로닝 방법.
8. 제7항에 있어서, 임파구는 항원에 대한 면역반응을 개시한 동물 또는 인간으로부터 유도되는 것을 특징으로 하는 클로닝 방법.
9. 제7항에 있어서, 임파구는 자가면역질환 환자로부터 유도되는 것을 특징으로 하는 클로닝 방법.
10. 제1항에 있어서, 핵산의 샘플 레퍼토리는 재배열된 면역 글로블린 가변부위의 유전자들로부터 유도되는 것을 특징으로 하는 클로닝 방법.
11. 제1항에 있어서, 핵산의 샘플 레퍼토리는 게놈 DNA인 것을 특징으로 하는 클로닝 방법.
12. 제1항에 있어서, 핵산의 샘플 레퍼토리는 재배열되지 않은 면역 글로블린 가변 부위의 유전자들로부터 유도되는 것을 특징으로 하는 클로닝 방법.
13. 제1항에 있어서, 표적서열은 면역 글로블린 H사슬의 가변도메인을 코딩하는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 클로닝 방법.
14. 제13항에 있어서, 생성물 DNA는 항원에 대한 결합 친화도에 의해 선택될 수 있는 단일 도메인 리간드들의 발현을 위해 발현벡터 내로 삽입되는 것을 특징으로 하는 클로닝 방법.
15. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 생성물 DNA는 항원에 대한 결합 친화도에 의해 선택될 수 있는 항체들 또는 항체단편들의 발현을 위해 발현벡터 내로 삽입되는 것을 특징으로 하는 클로닝 방법.
16. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 생성물 DNA는 단독으로 발현되도록 발현벡터 내로 삽입되는 것을 특징으로 하는 클로닝 방법.
17. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 생성물 DNA는 상보적인 가변도메인과 함께 발현되도록 발현벡터 내로 삽입되는 것을 특징으로 하는 클로닝 방법.
18. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 생성물 DNA는 발현을 위해 하나 이상의 불변도메인을 코딩하는 서열을 이미 포함하는 발현벡터 내로 삽입되는 것을 특징으로 하는 클로닝 방법.
19. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 생성물 DNA는 융합단백질로서 발현되도록 발현벡터 내로 삽입되는 것을 특징으로 하는 클로닝 방법.
20. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 생성물 DNA는 펩티드 태그와 함께 발현되도록 발현벡터 내로 삽입되는 것을 특징으로 하는 클로닝 방법.
21. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 면역글로블린 H사슬의 가변도메인을 코딩하는 서열을포함하는 생성물 DNA와, 적어도 면역글로블린 L사슬의 가변도메인을 코딩하는 서열을 포함하는 생성물 DNA가 상보적인 가변도메인들의 결합 레퍼토리의 발현을 위해 발현벡터 내로 삽입되는 것을 특징으로 하는 클로닝 방법.
22. 제21항에 있어서, 생성물 DNA는 발현을 위해 하나 이상의 불변도메인을 코딩하는 서열을 이미 포함하는 발현벡터 내로 삽입되는 것을 특징으로 하는 클로닝 방법.
23. 제21항에 있어서, 생성물 DNA는 융합단백질로서 발현되도록 발현벡터 내로 삽입되는 것을 특징으로 하는 클로닝 방법.
24. 제21항에 있어서, 생성물 DNA는 펩티드 태그와 함께 발현되도록 발현벡터 내로 삽입되는 것을 특징으로 하는 클로닝 방법.
25. 제1항 내지 제13항중 어느 한항에 있어서, 전방 프라이머와 후방 프라이머는 단일의 올리고뉴클레오티드로서 제공되는 것을 특징으로 하는 클로닝 방법.
26. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 전방 프라이머는 올리고뉴클레오티드 혼합물로서 제공되는 것을 특징으로 하는 클로닝 방법.
27. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 후방 프라이머는 올리고뉴클레오티드 혼합물로서 제공되는 것을 특징으로 하는 클로닝 방법.
28. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 각각 프라이머는 제한효소 인식부위를 코딩하는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 클로닝 방법.
29. 제28항에 있어서, 제한효소 인식부위는 핵산에 어닐링될 서열 내에 위치하는 것을 특징으로 하는 클로닝 방법.
30. 제1항에 있어서, 후방 프라이머는 특정 종(species)로부터 목적하는 항체 특이성을 클로닝하는데 유용한 일반적인 프라이머인 것을 특징으로 하는 클로닝 방법.
31. 제1항에 있어서, 후방 프라이머는 VH, VK 또는 V 서열의 다양한 훼밀리에 상보적이 되도록 디자인된 다양한 서열들을 갖는 프라이머들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 클로닝 방법.
32. 면역글로블린 가변도메인의 적어도 일부를 코딩하는 핵산서열들의 레퍼토리를 포함하는 발현 라이브러리.
33. 제32항에 있어서, 각각 면역글로블린 가변도메인을 포함하는 단백질들의 레퍼토리의 발현을 위한 발현 라이브러리.