JP7221379B2 - 抗ｆａｐクローン２１２を含む二重特異性抗原結合分子 - Google Patents

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Description

本発明は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合可能な少なくとも１つの抗原結合ドメイン、ＣＤ４０に特異的に結合可能な少なくとも１つの抗原結合ドメイン、及び安定した会合が可能な第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む、新しい二重特異性抗原結合分子に関する。本発明は更に、新しい抗ＦＡＰクローン２１２に関する。本発明の更なる態様は、これらの分子を製造する方法及びこれらの分子を使用する方法である。
強力な適応免疫応答の生成中には、複数の分子信号が必要である。シグナル１は、Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）が、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面に提示された同族の抗原に結合することに関与する。シグナル２は、共刺激受容体とＴ細胞とＡＰＣの間のそれぞれのリガンドとの結合で構成されている。最もよく研究され、最も重要な共刺激エフェクターの１つは、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）ファミリーメンバーＣＤ４０及びそのリガンドＣＤ４０Ｌである（Ｅｌｇｕｅｔａ Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．２００９；２２９（１）：１５２－７２）。ＣＤ４０を含むＴＮＦＲファミリーのいくつかのメンバーは、最初のＴ細胞活性化後に機能してＡＰＣ及びＴ細胞応答を維持し、そのために免疫系の組織化及び機能において極めて重要な役割を果たす（Ｗａｔｔｓ Ｔ．Ｈ．（２００５）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３，２３－６８）。異なる共刺激ＴＮＦＲファミリーメンバーの組み合わせにより、ＡＰＣ及びＴ細胞の活性化と生存の連続的かつ一過性の調節が可能になり、ＡＰＣ及びＴ細胞機能の厳密な制御を維持しながら免疫応答が増加する。疾患症状に応じて、共刺激性ＴＮＦファミリーメンバーを介した刺激は、疾患を悪化又は改善する可能性がある。ＴＮＦＲファミリー共刺激因子の活性化又は遮断は、癌、疾患、移植、及び自己免疫を含む複数の分野でのいくつかの治療への応用の可能性を示す。
いくつかの共刺激分子の中で、ＴＮＦＲファミリーメンバーＣＤ４０は、成熟、生存、抗原提示、サイトカイン産生、及びＡＰＣの共刺激分子の発現を誘導することにより免疫応答を誘発する重要な役割を果たし、炎症性サイトカインによる抗原特異的Ｔ細胞応答とＮＫ細胞活性化を促進する。ＣＤ４０は、感染症、腫瘍、自己抗原に対する免疫応答を調節し、その発現は、血小板だけでなく、Ｂ細胞、樹状細胞（ＤＣ）、単球、マクロファージなどのＡＰＣ、筋線維芽細胞、線維芽細胞、上皮細胞、及び内皮細胞などの非造血起源の細胞の表面で実証されている（Ｅｌｇｕｅｔａ Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．２００９；２２９（１）：１５２－７２）。ＣＤ４０リガンドＣＤ４０Ｌは、活性化ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、血小板、単球細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、及び好塩基球に発現する（Ｃａｒｂｏｎｅ Ｅ．ｅｔ．ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１９９７；１８５（１２）：２０５３－２０６０又はＥｌｇｕｅｔａ Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．２００９；２２９（１）：１５２－７２）。ＣＤ４０及びＣＤ４０Ｌの発現は、さまざまな免疫刺激シグナルに応答して強くアップレギュレートされ、ＡＰＣとＣＤ４＋Ｔ細胞間のＣＤ４０－ＣＤ４０Ｌ相互作用は、ＡＰＣ活性化及び抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の増加に寄与する（Ｂｅｖａｎ ＭＪ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１４；４（８）：５９５－６０２）。同様の免疫刺激の結果は、ＣＤ４０アゴニスト抗体を使用することによって観察された（Ｖｏｎｄｅｒｈｅｉｄｅ ＲＨ ａｎｄ Ｇｌｅｎｎｉｅ ＭＪ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１３；１９（５）：１０３５－４３）。
天然リガンドＣＤ４０Ｌ、ＩＩ型膜貫通タンパク質又はアゴニスト抗体によるＩ型膜貫通受容体ＣＤ４０の関与は、ＣＤ４０クラスター化を促進し、細胞質受容体ドメインへのアダプタータンパク質の動員を誘導する。ＴＮＦ受容体関連因子（ＴＲＡＦ）として知られるこれらのアダプタータンパク質の動員は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）、ホスホイノシチド３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）、及びカノニカル及び非カノニカル核因子κＢ（ＮＦκＢ）シグナル伝達経路の相乗的活性化につながる（Ｅｌｇｕｅｔａ Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．２００９；２２９（１）：１５２－７２）。次に、これによりＡＰＣの成熟と活性化が起こり、抗原特異的Ｔ細胞応答が最大化される。最近の研究では、抗腫瘍免疫を利用する際のアゴニストＣＤ４０抗体の２つの異なる作用機序が示されている。適応免疫系の活性化を介した媒介腫瘍細胞殺傷によるその間接的な作用機序に加えて、アゴニストＣＤ４０抗体は、ＣＤ４０発現固形腫瘍細胞のアポトーシスを誘導することにより直接腫瘍細胞死滅を誘導することができる（Ｅｌｉｏｐｏｕｌｏｓ ＡＧ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２０００；２０（１５）：５５０３－１５）。ＣＤ４０抗体を介した腫瘍細胞の直接死滅は、抗ＣＤ４０抗体を介したＣＤ４０関与によって同時に活性化されるＡＰＣによって処理及び提示できる腫瘍抗原の供給源を提供し、腫瘍抗原特異的Ｔ細胞を、内因性ワクチン接種として知られている仮定されたメカニズムを誘導することができる。ＣＤ４０関与が効率的な抗がん免疫応答につながることを考えると、アゴニストＣＤ４０抗体は、単剤として、又は化学療法と組み合わせて、さまざまな前臨床腫瘍モデルで順調に使用されている（Ｖｏｎｄｅｒｈｅｉｄｅ ＲＨ ａｎｄ Ｇｌｅｎｎｉｅ ＭＪ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１３；１９（５）：１０３５－４３）。
現在までに、６つのＣＤ４０ ｍＡｂが臨床試験で調査中である。Ｃｈｉ Ｌｏｂ ７／４（ＣＤ４０ ａｇｏｎｉｓｔｉｃ ＩｇＧ１ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｍＡｂ；Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＵＫ；Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ．２０１３；２：２２９－４０）、ＡＤＣ１０１３（完全ヒト、ＣＤ４０アゴニストＩｇＧ１抗体；Ａｌｌｉｇａｔｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ；Ｍａｎｇｓｂｏ ＳＭ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１５ Ｍａｒ １；２１（５）：１１１５－２６）、ＡＰＸ－００５（完全ヒト化、ＣＤ４０アゴニストＩｇＧ１ ｍＡｂ；Ａｐｅｘｉｇｅｎ；Ｂｊｏｒｃｋ Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ Ｃａｎｃｅｒ．２０１５；３（Ｓｕｐｐｌ ２）：Ｐ１９８）、ＳＥＡ－ＣＤ４０（ＣＤ４０アゴニストＩｇＧ１キメラｍＡｂ；Ｓｅａｔｔｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ；Ｇａｒｄａｉ ＳＪ．ｅｔ ａｌ．ＡＡＣＲ １０６ｔｈ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ２０１５；Ａｐｒｉｌ １８－２２，ａｂｓｔｒａｃｔ ２４７２）、及びＲＯ７００９７８９（完全ヒト、ＣＤ４０スーパーアゴニストＩｇＧ２ ｍＡｂ）は、臨床第Ｉ相試験で調査され、ダセツズマブ（ＣＤ４０部分アゴニストＩｇＧ１キメラｍＡｂ；Ｓｅａｔｔｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ；Ｋｈｕｂｃｈａｎｄａｎｉ Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ Ｄｒｕｇｓ．２００９；１０，５７９－８７）は、臨床第ＩＩ相研究で調査されている。これらの研究の対象となる患者は、固形腫瘍、古典的ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、又は無痛性リンパ腫（濾胞性リンパ腫を含む）を有する。補体媒介性細胞傷害（ＣＭＣ）又は抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を介したＣＤ４０＋腫瘍細胞のＦｃ依存性細胞傷害から、抗腫瘍Ｔ細胞応答を誘導するＡＰＣ活性化、及び腫瘍と腫瘍ストロマを枯渇させるマクロファージ活性化に至るまでの多様な活性が、これらのＣＤ４０アゴニスト抗体について示されている。これまでのところ、この観察された不均一性についての決定的な説明はない。しかし、最近の研究では、この作用機序の多様性は、少なくとも部分的には、エピトープ特異性、アイソタイプ、又はＦｃ：ＦｃγＲ相互作用における抗ＣＤ４０抗体の違いによって説明できることが示されている。例えば、インビボでのＣＤ４０アゴニスト抗体は、ＴＮＦＲスーパーファミリーの他のアポトーシス誘導又は免疫調節剤メンバーに特異的なアゴニスト抗体について記載されているように、標的細胞上のそのＦａｂフラグメントによって結合されたＣＤ４０を、標的細胞以外の細胞上のそのＦｃフラグメントによって結合されたＦｃγ受容体に架橋することを必要とするようである。（Ｄａｈａｎ Ｒ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ．２０１６ Ｊｕｎ １３；２９（６）：８２０－３１；Ｌｉ Ｆ．ａｎｄ Ｒａｖｅｔｃｈ Ｊ．Ｖ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１１；３３３，１０３０－１０３４；Ｔｅｎｇ Ｍ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９；１８３，１９１１－１９２０）。提案されたメカニズムには、標的細胞上のＣＤ４０膜貫通分子のＦｃγ受容体を介したクラスター化と、それに続く強力なインビボでの有効性を達成するためのＣＤ４０シグナル伝達の強化が含まれる。
アゴニストＣＤ４０抗体の臨床開発は、有望な初期結果を提供している。最初の臨床試験で、ＣＰ－８７０，８９３は進行がん患者に臨床有効性を示した。進行がんの２９人の患者のうち４人は、ＣＰ－８７０，８９３の単回静脈内注入を受けた後に部分的な反応を示した（Ｖｏｎｄｅｒｈｅｉｄｅ ＲＨ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２００７ Ｍａｒ １；２５（７）：８７６－８３）。１年半にわたってＣＰ－８７０，８９３の９回のその後の投与で処置されたこれらの４人の患者のうちの１人は５年以上の間、完全寛解を維持した。但し、ＣＰ－８７０，８９３の最も一般的な副作用は、サイトカイン放出症候群と血栓塞栓性イベントであるため、１４０人を超える患者を対象とした第１相臨床試験のデータを組み合わせた投与スケジュールと投与経路では、限られた臨床有効性しか示されておらず、抗体の局所投与が提案された（Ｖｏｎｄｅｒｈｅｉｄｅ ＲＨ，Ｇｌｅｎｎｉｅ Ｍ，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１３，１９（５），１０３５－１０４３）。単剤反応の欠如は、部分的には、広範なＣＤ４０発現によって引き起こされる標的上／腫瘍外への深刻な影響が原因で発生し、その結果、用量制限毒性（サイトカイン放出症候群など）が生じる。ＣＤ４０が腫瘍特異的標的によって架橋されたときにＡＰＣを特異的に活性化するアゴニストＣＤ４０抗体の開発は、副作用を減らし、用量制限を減らし、効率的で長期的な抗癌免疫を生み出す可能性のある新しい治療オプションを提供する。
入手可能な前臨床及び臨床データは、癌に対する効果的な内因性免疫応答を誘導及び増強することができるＣＤ４０の効果的なアゴニストに対する高い臨床的必要性があることを明確に示している。しかし、効果が単一のタイプの細胞に限定されたり、単一のメカニズムを介して作用したりすることはほとんどなく、また細胞間及び細胞内のシグナル伝達メカニズムを解明するために設計された研究により、複雑さのレベルが高まっていることが明らかになった。既知のＣＤ４０抗体は、サイトカイン放出症候群や血小板／内皮細胞の活性化などの用量制限毒性のため、比較的低用量でしか投与できず、標的ＡＰＣの経路の活性化が不十分で治療指数が狭くなる。したがって、好ましくは単一のタイプの細胞に作用する「標的化された」アゴニストが必要である。
本発明は、ＣＤ４０及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合可能なことができ、したがってＦＡＰに結合することができる部分をＣＤ４０にアゴニスト結合することができる部分と組み合わせる新しい二重特異性抗原結合分子に関し、ＣＤ４０を介したＡＰＣの活性化は、腫瘍間質細胞に発現するＦＡＰを介した架橋によって提供され、また二次リンパ組織に中間的に発現するＦＡＰを介して提供される可能性もある。ＣＤ４０及びＣＴＬＡ－４やＰＤ－１などの活性化Ｔ細胞上の免疫チェックポイント受容体に特異的に結合可能な二重特異性抗原結合分子とは対照的に、ＦＡＰなどの腫瘍標的を標的とすることで、主に腫瘍間質及び線維芽細胞が他の組織と比較して増加したレベルのＦＡＰを発現する腫瘍排出リンパ節において、ＣＤ４０を介したＡＰＣ活性化が可能になる。したがって、本発明の抗原結合分子は、ＣＤ４０受容体を効果的に誘発するだけでなく、ＦｃγＲ架橋の必要性を克服し、それによって副作用を低減しながら、所望の部位で非常に選択的に誘発することができる。新しい二重特異性抗原結合分子は、ＦｃドメインのＣ末端に融合したときにその優れた結合特性を失わない新しいＦＡＰ抗原結合ドメインを含むことによって更に特徴付けられる。
本発明は、共刺激性ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーＣＤ４０に特異的に結合可能な少なくとも１つの抗原結合ドメインと、新しいマウス抗ヒトＦＡＰクローン２１２及びそのヒト化変異体を含む線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）を標的とする少なくとも１つの抗原結合ドメインとを組み合わせる二重特異性抗原結合分子に関する。これらの二重特異性抗原結合分子は、ＦＡＰに高い親和性で結合可能なため、ＦＡＰが発現する腫瘍関連部位で共刺激ＣＤ４０受容体を活性化することが好ましいため、有利である。
一つの態様において、本発明は、
（ａ）ＣＤ４０に特異的に結合可能な少なくとも１つの抗原結合ドメインと、
（ｂ）（ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４、配列番号１１及び配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号６、配列番号１３及び配列番号１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合可能な少なくとも１つの抗原結合ドメインと、
を含む、二重特異性抗原結合分子を提供する。
特定の態様において、二重特異性抗原結合分子は、（ａ）ＣＤ４０に特異的に結合可能な少なくとも１つの抗原結合ドメインと、（ｂ）（ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４、配列番号１１及び配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに、（ｉｖ）配列番号６、配列番号１３及び配列番号１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含むＦＡＰに特異的に結合可能な少なくとも１つの抗原結合ドメインと、（ｃ）安定した会合が可能な第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと、を含む。より具体的には、安定した会合が可能な第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインは、エフェクター機能を低下させる突然変異を含む。
一つの態様において、ＦＡＰに特異的に結合可能な少なくとも１つの抗原結合ドメインが、（ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに、（ｉｖ）配列番号６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む。一つの態様において、ＦＡＰに特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号９のアミノ酸配列に少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び、配列番号１０のアミノ酸配列に少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む。特定の態様において、ＦＡＰに特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む。
別の態様において、ＦＡＰに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９及び配列番号２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５及び配列番号２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）と、を含む。より具体的には、ＦＡＰに特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、（ａ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は、（ｂ）配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は、（ｃ）配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は、（ｄ）配列番号１９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む。より具体的には、ＦＡＰに特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、（ａ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む。
一つの態様において、ＣＤ４０に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号１のアミノ酸配列を含む、又はそれからなる、ポリペプチドに結合する。
更なる態様において、提供されるのは、少なくとも１つのＣＤ４０に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、（ｉ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）、並びに、（ｉｖ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）を含む、二重特異性抗原結合分子である。
一つの態様において、提供されるのは、本明細書で以前に定義された二重特異性抗原結合分子であって、ＣＤ４０に特異的に結合可能な少なくとも１つの抗原結合ドメインが、
（ｉ）配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９及び配列番号４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）と、
（ｉｉ）配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、及び配列番号４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）と、を含む、本明細書で以前に定義された二重特異性抗原結合分子である。
別の態様において、提供されるのは、二重特異性抗原結合分子であって、ＣＤ４０に特異的に結合可能な少なくとも１つの抗原結合ドメインが、（ｉ）配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９及び配列番号５０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）と、
（ｉｉ）配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、及び配列番号５４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）と、を含む、前に本明細書で定義された二重特異性抗原結合分子である。
更に、提供されるのは、本明細書で以前に定義された二重特異性抗原結合分子であって、ＣＤ４０に特異的に結合可能な少なくとも１つの抗原結合ドメインが、
（ａ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４１のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｂ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４２のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｃ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４３のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｄ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４４のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｅ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４１のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｆ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４２のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｇ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４３のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｈ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４４のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｉ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４１のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｊ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４２のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｋ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４３のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｌ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４４のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｍ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４１のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｎ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４２のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｏ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４３のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｐ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４４のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、本明細書で以前に定義された二重特異性抗原結合分子である。
特定の態様において、二重特異性抗原結合分子が提供され、ＣＤ４０に特異的に結合可能な少なくとも１つの抗原結合ドメインが、配列番号３７のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号４１のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。
更なる態様において、提供されるのは、二重特異性抗原結合分子であって、ＣＤ４０に特異的に結合可能な少なくとも１つの抗原結合ドメインが、
（ａ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号５１のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｂ）配列番号４６のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号５１のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｃ）配列番号４７のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号５１のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｄ）配列番号４８のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号５１のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｅ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号５２のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｆ）配列番号４６のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号５２のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｇ）配列番号４７のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号５２のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｈ）配列番号４８のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号５２のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｉ）配列番号４９のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号５３のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｊ）配列番号５０のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号５３のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｋ）配列番号４９のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号５４のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｌ）配列番号５０のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号５４のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、二重特異性抗原結合分子である。
更なる具体的な態様において、二重特異性抗原結合分子が提供され、少なくとも１つのＣＤ４０に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号４５のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号５１のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、又はＣＤ４０に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号４８のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号５１のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
より具体的には、提供されるのは、二重特異性抗原結合分子であり、
（ｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）及び配列番号４１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）を含む、ＣＤ４０に特異的に結合可能な少なくとも１つの抗原結合ドメインと、
（ｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、ＦＡＰに特異的に結合可能な少なくとも１つの抗原結合ドメインと、を含む。
一つの態様において、二重特異性抗原結合分子は、ヒト化抗体又はキメラ抗体である。更なる態様において、二重特異性抗原結合分子は、ＩｇＧ Ｆｃ領域、特にＩｇＧ１ Ｆｃ領域又はＩｇＧ４ Ｆｃ領域を含む。具体的には、Ｆｃ領域は、Ｆｃ受容体及び／又はエフェクター機能に対する抗体の結合親和性を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む。特定の態様において、提供されるのは、二重特異性抗原結合分子であって、Ｆｃ領域が、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）を有するヒトＩｇＧ１サブクラスのＦｃ領域である、二重特異性抗原結合分子である。
別の態様において、提供されるのは、二重特異性抗原結合分子であって、Ｆｃ領域の第１のサブユニットが、ノブを含み、Ｆｃ領域の第２のサブユニットが、ノブからホールへの方法によるホールを含む、二重特異性抗原結合分子である。具体的には、提供されるのは、二重特異性抗原結合分子であって、（ｉ）Ｆｃ領域の第１のサブユニットが、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）を含み、Ｆｃ領域の第２のサブユニットが、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ及びＹ４０７Ｖ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）を含み、又は（ｉｉ）Ｆｃ領域の第１のサブユニットが、アミノ酸置換Ｋ３９２Ｄ及びＫ４０９Ｄ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）を含み、及びＦｃ領域の第２のサブユニットが、アミノ酸置換Ｅ３５６Ｋ及びＤ３９９Ｋ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）を含む、二重特異性抗原結合分子である。より具体的には、提供されるのは、二重特異性抗原結合分子であって、Ｆｃ領域の第１のサブユニットが、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）を含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットが、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ及びＹ４０７Ｖ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）を含む、二重特異性抗原結合分子である。
更なる態様において、提供されるのは、二重特異性抗原結合分子であって、二重特異性抗原結合分子は、
（ａ）Ｆｃ領域に連結したＣＤ４０に特異的に結合可能な少なくとも２つのＦａｂフラグメントと、
（ｂ）Ｆｃ領域のＣ末端に連結したＦＡＰに特異的に結合可能な１つの抗原結合ドメインと、を含む、二重特異性抗原結合分子である。
したがって、提供されるのは、ＣＤ４０に対する二価の結合及びＦＡＰに対する一価の結合を提供する二重特異性抗原結合分子である。
別の態様において、提供されるのは、二重特異性抗原結合分子であって、二重特異性抗原結合分子は、
（ａ）Ｆｃ領域に融合したＣＤ４０に特異的に結合可能な少なくとも２つのＦａｂフラグメントと、
（ｂ）Ｆｃ領域のＣ末端に融合したＦＡＰに特異的に結合可能な１つの抗原結合ドメインと、を含む、二重特異性抗原結合分子である。
特定の態様において、Ｆｃ領域のＣ末端に連結したＦＡＰに特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、クロスＦａｂフラグメントである。したがって、提供されるのは、二重特異性抗原結合分子であって、二重特異性抗原結合分子は、
（ａ）Ｆｃ領域に融合したＣＤ４０に特異的に結合可能な少なくとも２つのＦａｂフラグメントと、
（ｂ）Ｆｃ領域のＣ末端に融合したＦＡＰに特異的に結合可能なクロスＦａｂフラグメントと、を含む、二重特異性抗原結合分子である。
更なる態様において、二重特異性抗原結合分子は、ＣＤ４０に特異的に結合可能な４つのＦａｂフラグメントを含む。したがって、提供されるのは、ＣＤ４０に対する四価の結合及びＦＡＰに対する一価の結合を提供する二重特異性抗原結合分子である。
したがって、一つの態様において、提供されるのは、二重特異性抗原結合分子であって、
（ａ）ＣＤ４０に特異的に結合可能な２つのＦａｂフラグメントとＦｃ領域を含む抗体の２つの軽鎖と２つの重鎖と、
（ｂ）ＦＡＰに特異的に結合可能な抗原結合ドメインのＶＨ及びＶＬであって、ＶＨは（ａ）の２つの重鎖の１つのＣ末端に融合し、ＶＬは（ａ）の２つの重鎖のもう一方のＣ末端に融合する、ＶＨ及びＶＬと、を含む、二重特異性抗原結合分子である。
別の態様において、提供されるのは、二重特異性抗原結合分子であって、
（ａ）ＣＤ４０に特異的に結合可能な２つのＦａｂフラグメントとＦｃ領域を含む抗体の２つの軽鎖と２つの重鎖と、
（ｂ）ＦＡＰに特異的に結合可能なクロスＦａｂフラグメントであって、ＶＨ－Ｃカッパ鎖は（ａ）の２つの重鎖の１つのＣ末端に融合した、クロスＦａｂフラグメントと、を含む、二重特異性抗原結合分子である。
更に別の態様において、提供されるのは、二重特異性抗原結合分子であって、
（ａ）ＣＤ４０に特異的に結合可能な２つのＦａｂフラグメントとＦｃ領域を含む抗体の２つの軽鎖と２つの重鎖と、
（ｂ）ＦＡＰに特異的に結合可能なクロスＦａｂフラグメントであって、ＶＬ－ＣＨ１鎖が、（ａ）の２つの重鎖の１つのＣ末端に融合した、クロスＦａｂフラグメントと、を含む、二重特異性抗原結合分子である。
更に、提供されるのは、二重特異性抗原結合分子であって、
（ａ）ＣＤ４０に特異的に結合可能な２つのＦａｂフラグメントとＦｃ領域を含む抗体の２つの軽鎖と２つの重鎖と、
（ｂ）ＦＡＰに特異的に結合可能な２つのＦａｂフラグメントであって、１つのＦａｂフラグメントが、（ａ）の２つの重鎖の１つのＣ末端に連結し、もう１つのＦａｂフラグメントが、（ａ）の２つの重鎖のもう一方のＣ末端に連結した、Ｆａｂフラグメントと、を含む、二重特異性抗原結合分子である。
別の態様において、提供されるのは、二重特異性抗原結合分子であって、二重特異性抗原結合分子は、
（ａ）２つの重鎖であって、各重鎖が、ＣＤ４０に特異的に結合可能なＦａｂフラグメントのＶＨ及びＣＨ１ドメイン、及びＦｃ領域サブユニットを含む、２つの重鎖と、
（ｂ）２つの軽鎖であって、各軽鎖が、ＣＤ４０に特異的に結合可能なＦａｂフラグメントのＶＬ及びＣＬドメインを含む、２つの軽鎖と、
（ｃ）ＦＡＰに特異的に結合可能な１つのＦａｂフラグメントであって、Ｆａｂフラグメントが、（ａ）の２つの重鎖の１つのＣ末端に連結した、Ｆａｂフラグメントと、を含む、二重特異性抗原結合分子である。
別の態様において、ＦＡＰに特異的に結合可能なＦａｂフラグメントは、ＶＬ－ＣＨ１鎖及びＶＨ－Ｃカッパ鎖を含み、ＶＨ－Ｃカッパ鎖又はＶＬ－ＣＨ１鎖が、（ａ）の２つの重鎖のうちの１つのＣ末端に連結したクロスＦａｂフラグメントである。
一つの態様において、提供されるのは、二重特異性抗原結合分子であって、二重特異性抗原結合分子が、ＣＤ４０に特異的に結合可能な４つのＦａｂフラグメントを含む、二重特異性抗原結合分子である。特定の態様において、提供されるのは、本明細書で以前に定義された二重特異性抗原結合分子であって、（ａ）の２つの重鎖のそれぞれが、互いに、必要に応じてペプチドリンカーによって、連結したＣＤ４０に特異的に結合可能なＦａｂフラグメントの２つのＶＨ－ＣＨ１鎖を含む、二重特異性抗原結合分子である。
したがって、一つの態様において、本発明は、
（ａ）２つの重鎖であって、各重鎖は、ＣＤ４０に特異的に結合可能なＦａｂフラグメントの２つのＶＨ－ＣＨ１鎖を含み、これらは、必要に応じてペプチドリンカー、及びＦｃ領域サブユニットによって互いに連結されている、２つの重鎖と、
（ｂ）４つの軽鎖であって、各軽鎖が、ＣＤ４０に特異的に結合可能なＦａｂフラグメントのＶＬ及びＣカッパドメインを含む、４つの軽鎖と、
（ｃ）ＶＬ－ＣＨ１鎖及びＶＨ－Ｃカッパ鎖を含むＦＡＰに特異的に結合可能なクロスＦａｂフラグメントであって、ＶＨ－Ｃカッパ鎖又はＶＬ－ＣＨ１鎖が、（ａ）の２つの重鎖のうちの１つのＣ末端に、必要に応じてペプチドリンカーによって連結した、クロスＦａｂフラグメントと、を含む、二重特異性抗原結合分子を提供する。
別の態様において、提供されるのは、二重特異性抗原結合分子であって、
（ａ）２つの重鎖であって、各重鎖は、ＣＤ４０に特異的に結合可能なＦａｂフラグメントの２つのＶＨ－ＣＨ１鎖を含み、これらは、必要に応じてペプチドリンカー、及びＦｃ領域サブユニットによって互いに連結されている、２つの重鎖と、
（ｂ）４つの軽鎖であって、各軽鎖が、ＣＤ４０に特異的に結合可能なＦａｂフラグメントのＶＬ及びＣＬドメインを含む、４つの軽鎖と、
（ｃ）ＦＡＰに特異的に結合可能なクロスＦａｂフラグメントであって、上記クロスＦａｂフラグメントのＶＨ－ＣＬ鎖が、（ａ）の２つの重鎖の１つのＣ末端に連結した、クロスＦａｂフラグメントと、を含む、二重特異性抗原結合分子である。
更に別の態様において、提供されるのは、二重特異性抗原結合分子であって、
（ａ）２つの重鎖であって、各重鎖は、ＣＤ４０に特異的に結合可能なＦａｂフラグメントの２つのＶＨ－ＣＨ１鎖を含み、これらは、必要に応じてペプチドリンカー、及びＦｃ領域サブユニットによって互いに連結されている、２つの重鎖と、
（ｂ）４つの軽鎖であって、各軽鎖が、ＣＤ４０に特異的に結合可能なＦａｂフラグメントのＶＬ及びＣＬドメインを含む、４つの軽鎖と、
（ｃ）ＦＡＰに特異的に結合可能なクロスＦａｂフラグメントであって、上記クロスＦａｂフラグメントのＶＬ－ＣＨ１鎖が、（ａ）の２つの重鎖の１つのＣ末端に連結した、クロスＦａｂフラグメントと、を含む、二重特異性抗原結合分子である。
別の態様において、提供されるのは、ＦＡＰに特異的に結合する抗体であって、（ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４、配列番号１１及び配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに、（ｉｖ）配列番号６、配列番号１３及び配列番号１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、抗体である。ある特定の態様において、提供されるのは、ＦＡＰに特異的に結合する抗体であって、（ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに、（ｉｖ）配列番号６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、抗体である。
更なる態様において、提供されるのは、（ａ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は、（ｂ）配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は、（ｃ）配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は、（ｄ）配列番号１９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、抗体である。
本発明の別の態様に従うと、本明細書にて上述した二重特異性抗原結合分子をコードする単離核酸が提供される。また、本明細書で上述したように、抗体をコードする単離核酸も提供される。本発明は更に、ベクター、特に、本発明の単離核酸と、単離核酸又は本発明のベクターを含む宿主細胞とを含む発現ベクターを提供する。いくつかの態様では、宿主細胞は真核細胞、特に哺乳動物細胞である。別の態様において、提供されるのは、本明細書で上述の二重特異性抗原結合分子又は抗体を産生する方法であって、二重特異性抗原結合分子又は抗体の発現に適した条件下で上記のように宿主細胞を培養すること、及び二重特異性抗原結合分子又は抗体を単離することを含む、二重特異性抗原結合分子又は抗体を製造する方法である。本発明はまた、ＣＤ４０及びＦＡＰに特異的に結合する二重特異性抗原結合分子、又は本発明の方法によって製造されたＦＡＰに特異的に結合する抗体を包含する。
本発明は更に、本明細書で上述した二重特異性抗原結合分子又は本明細書で上述した抗体及び薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物を提供する。一つの態様において、医薬組成物は、追加の治療薬剤を含む。
医薬として使用するための、本明細書で上述した二重特異性抗原結合分子又は抗体、並びに、二重特異性抗原結合分子を含む医薬組成物もまた、本発明に包含されている。
一つの態様において、提供されるのは、本明細書にて上述した二重特異性抗原結合分子、又は、本発明の医薬組成物であり、
（ｉ）ＣＤ４０発現抗原提示細胞（ＡＰＣ）による免疫刺激の誘導において、
（ｉｉ）腫瘍特異的Ｔ細胞応答の刺激において、
（ｉｉｉ）腫瘍細胞のアポトーシスを引き起こすことにおいて、
（ｉｖ）癌の処置において、
（ｖ）癌の進行を遅らせることにおいて、
（ｖｉ）癌を患う患者の生存を延長することにおいて、
（ｖｉｉ）感染症の処置において、
使用するための、二重特異性抗原結合分子、又は、医薬組成物である。
一つの態様において、癌の処置で使用するための、本明細書にて上述した二重特異性抗原結合分子、又は本発明の医薬組成物を提供する。別の態様においては、本発明は、化学療法剤、放射線及び／又は癌免疫療法で使用する他の剤と組み合わせて投与される、癌の処置で使用するための、本明細書にて上述した二重特異性抗原結合分子を提供する。一つの態様において、本明細書に記載の二重特異性抗原結合分子は、癌の処置に使用するためのものであり、二重特異性抗原結合分子は、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用を遮断する薬剤と組み合わせて投与するためのものである。別の態様において、提供されるのは、細胞傷害性Ｔ細胞活性をアップレギュレート又は延長する際に使用するための、本明細書で上述したような二重特異性抗原結合分子又は本発明の医薬組成物である。更なる態様において、提供されるのは、癌の処置に使用するための、本明細書で上述したような抗体である。
更なる態様において、本発明は、個体における腫瘍細胞の増殖の阻害方法であって、当該個体に有効量の、本明細書にて上述した二重特異性抗原結合分子、又は本発明の医薬組成物を投与して、当該腫瘍細胞の増殖を阻害することを含む、方法を提供する。別の態様において、本発明は、本明細書で上述した有効量の二重特異性抗原結合分子又は本発明の医薬組成物を個体に投与することを含む、個体の癌を処置又は遅延させる方法を提供する。
疾患の処置を必要とする個体での、疾患の処置のための医薬を作製するための、具体的には、癌の処置のための医薬の製造のための、本明細書にて上述した二重特異性抗原結合分子の使用、及び、個体における疾患の処置方法であって、個体に、治療有効量の、本発明の二重特異性抗原結合分子を薬学的に許容され得る形態で含む組成物を投与することを含む、方法もまた提供する。特定の態様において、疾患は、癌である。上記態様のいずれかにおいて、個体は哺乳類、特にヒトである。
ヒトＣＤ４０及びＦＡＰに特異的に結合する二重特異性抗原結合分子の概略図を示す。図１Ａは、クロスオーバーＦａｂフラグメントとして１つのＦＡＰ（２１２）結合部分と組み合わされた２つのＣＤ４０結合部分からなる２＋１フォーマットの二重特異性ＦＡＰ－ＣＤ４０抗体の概略図を示し、ＶＬ－ＣＨ１鎖は、Ｆｃノブ鎖のＣ末端（ＣＤ４０では二価、ＦＡＰでは一価）で融合される。図１Ｂは、クロスオーバーＦａｂフラグメントとして１つのＦＡＰ（４Ｂ９）結合部分と組み合わされた２つのＣＤ４０結合部分からなる２＋１フォーマットの二重特異性ＦＡＰ－ＣＤ４０抗体の概略図を示し、ＶＨ－Ｃカッパ鎖は、Ｆｃノブ鎖のＣ末端（ＣＤ４０では二価、ＦＡＰでは一価）で融合される。図１Ｃは、クロスオーバーＦａｂフラグメントとして１つのＦＡＰ（２８Ｈ１）結合部分と組み合わされた２つのＣＤ４０結合部分からなる２＋１フォーマットの二重特異性ＦＡＰ－ＣＤ４０抗体の概略図を示し、ＶＬ－ＣＨ１鎖は、Ｆｃノブ鎖のＣ末端（ＣＤ４０では二価、ＦＡＰでは一価）で融合される。図１Ｄは、クロスオーバーＦａｂフラグメントとして１つのＦＡＰ（２１２）結合部分と組み合わされた４つのＣＤ４０結合部分からなる４＋１フォーマットの二重特異性ＦＡＰ－ＣＤ４０抗体の概略図を示し、ＶＬ－ＣＨ１鎖は、Ｆｃノブ鎖のＣ末端（ＣＤ４０では四価、ＦＡＰでは一価）で融合される。図１Ｅは、クロスオーバーＦａｂフラグメントとして１つのＦＡＰ（４Ｂ９）結合部分と組み合わされた４つのＣＤ４０結合部分からなる４＋１フォーマットの二重特異性ＦＡＰ－ＣＤ４０抗体の概略図を示し、ＶＬ－ＣＨ１鎖は、Ｆｃノブ鎖のＣ末端（ＣＤ４０では四価、ＦＡＰでは一価）で融合される。図１Ｆは、クロスオーバーＦａｂフラグメントとして１つのＦＡＰ（２８Ｈ１）結合部分と組み合わされた４つのＣＤ４０結合部分からなる４＋１フォーマットの二重特異性ＦＡＰ－ＣＤ４０抗体の概略図を示し、ＶＬ－ＣＨ１鎖は、Ｆｃノブ鎖のＣ末端（ＣＤ４０では四価、ＦＡＰでは一価）で融合される。黒い点は、ノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ）突然変異を表している。あるいは、全ての分子において、クロスＦａｂのＶＨ－Ｃカッパ鎖は、Ｆｃノブ鎖のＣ末端で融合され得る。 ＦＡＰクローン４Ｂ９及び２８Ｈ１と競合してトランスフェクトされたＨＥＫ細胞上で発現されたヒトＦＡＰへの免疫由来ＦＡＰクローンの細胞結合を示す。図２Ａは、試験した全てのハイブリドーマ由来のマウスクローン（２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７及び２１８という名前）が抗ＦＡＰ抗体４Ｂ９との結合について競合しなかったことを示す。図２Ｂは、同じクローンが抗ＦＡＰ抗体２８Ｈ１との結合について競合しなかったことを示す。ＭＦＩは、フローサイトメトリーによって測定した。ｘ軸は、ＦＡＰ抗体の濃度を示す。 抗ＦＡＰクローンがＣ末端でＦｃドメインに融合したときに、抗ＦＡＰクローンの結合特性が失われないかどうかを判断するために作製された抗体コンストラクトの概略図を示す。図３Ａは、ＶＨドメインがＦｃノブ鎖のＣ末端に融合され、ＶＬドメインがＦｃホール鎖のＣ末端に融合されている、Ｆｃノブ鎖及びＦｃホール鎖を含むコンストラクトを示す（Ｃ末端ＶＨ／ＶＬ融合）。図３Ｂは、Ｆｃノブ鎖及びＦｃホール鎖を含むコンストラクトを示し、Ｆａｂ全体がそのＶＨドメインとＦｃノブ鎖のＣ末端に融合されている（Ｃ末端Ｆａｂ融合）。は、図３Ｃは、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器（実施例１．９を参照）で表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）ベースのアッセイを使用して実行されたエピトープビニングのセットアップを示す。 ＦＡＰ（２１２）、ＦＡＰ（４Ｂ９）又はＦＡＰ（２８Ｈ１）を標的とした一価フォーマットのヒト四価又は二価抗ＣＤ４０抗体のヒトＦＡＰ陽性ＮＩＨ／３Ｔ３細胞への結合を示す。トランスジェニック改変マウス胚性線維芽細胞ＮＩＨ／３Ｔ３－ｈＦＡＰ細胞株は、高レベルのヒト線維芽細胞活性化タンパク質（ｈｕＦＡＰ）を発現する。ＦＡＰ結合部分を有する図示された全ての抗ＣＤ４０抗原結合分子は、ＮＩＨ／３Ｔ３－ｈＦＡＰ細胞に効率的に結合するが、ＮＩＨ／３Ｔ３－ｈＦＡＰ細胞への結合強度（ＥＣ５０値及びシグナル強度）が異なる。Ｃ末端ＦＡＰ（２１２）又はＦＡＰ（４Ｂ９）結合ドメインを有するＦＡＰ－ＣＤ４０コンストラクトは、Ｃ末端ＦＡＰ（２８Ｈ１）結合ドメインを有するＦＡＰ－ＣＤ４０コンストラクトよりも強く結合する。二次検出抗体として使用されるフィコエリトリン（ＰＥ）標識抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ－特異的ヤギＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２フラグメントの蛍光強度（ＭＦＩ）の中央値としての結合が示されている。ＭＦＩは、フローサイトメトリーで測定し、ベースラインはブランクコントロールのＭＦＩを差し引くことで補正した。ｘ軸は、抗体コンストラクトの濃度を示す。 ＦＡＰ（２１２）又はＦＡＰ（４Ｂ９）を標的とした一価フォーマットのヒト四価又は二価抗ＣＤ４０抗体の、ヒトＣＤ４０の表面発現レベルが高い初代ヒトＢ細胞への結合を示す。描かれている全てのコンストラクトはＣＤ４０に結合するが、ＣＤ４０陽性Ｂ細胞への結合強度（ＥＣ５０値及びシグナル強度）が異なる。二価の抗ＣＤ４０抗体は、ＦＡＰ結合部分に関係なく、四価の抗ＣＤ４０抗体と比較して、より高いＥＣ５０レベルを示し、より高い結合プラトーに達する。細胞表面タンパク質への抗ＣＤ４０抗体の結合は、ＦＡＣＳ分析を使用して、フィコエリトリン（ＰＥ）に結合した抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ－特異的ヤギＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２フラグメントで検出された。ＭＦＩは、フローサイトメトリーで測定し、ベースラインはブランクコントロールのＭＦＩを差し引くことで補正した。ｘ軸は、抗体コンストラクトの濃度を示す。 ２日間のインキュベーション後のＦＡＰコーティング（図６Ａ）又は非コーティングＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（図６Ｂ）の存在下での一価ＦＡＰ（２１２）、ＦＡＰ（４Ｂ９）又はＦＡＰ（２８Ｈ１）標的ヒト抗ＣＤ４０コンストラクトによるヒトＤａｕｄｉ細胞のインビトロ活性化を示す。ＦＡＰでコーティングされたビーズでは、ＦＡＰに対して一価の二重特異性抗体が全て、Ｂ細胞活性化マーカーの発現ＣＤ７０の増加を誘導した。ＦＡＰ（２１２）又はＦＡＰ（４Ｂ９）結合ドメインを有する２＋１フォーマットの二重特異性ＦＡＰ－ＣＤ４０抗体によるＢ細胞活性化マーカーのアップレギュレーションは、２＋１フォーマットの二重特異性ＦＡＰ－ＣＤ４０抗体、ＦＡＰ（２８Ｈ１）結合ドメインを含むフォーマット、ＦＡＰ（２１２）、ＦＡＰ（４Ｂ９）又はＦＡＰ（２８Ｈ１）結合ドメインを含む４＋１フォーマットの二重特異性ＦＡＰ－ＣＤ４０抗体、又はＦＡＰ非依存性陽性コントロール抗体によって誘導されるアップレギュレーションと比較して高かった。ＦＡＰ（非コーティングビーズ）の非存在下では、ＣＤ４０に対して二価の描かれたＦＡＰ標的二重特異性抗体ではＣＤ７０の増加は観察されなかったが、四価のＣＤ４０結合分子はＣＤ７０のアップレギュレーションを誘導したが、ＦＡＰの存在下よりも程度は小さかった。示された滴定抗体との２日間のインキュベーション後のＣＤ７０陽性の重要なＤａｕｄｉ細胞のパーセンテージを示す。ｘ軸は、抗体コンストラクトの濃度を示す。 ２日間のインキュベーション後のＦＡＰコーティング（図７Ａ）又は非コーティングＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（図７Ｂ）の存在下での一価ＦＡＰ（２１２）、ＦＡＰ（４Ｂ９）又はＦＡＰ（２８Ｈ１）標的ヒト抗ＣＤ４０コンストラクトによるＢ細胞のインビトロ活性化を示す。ＦＡＰでコーティングされたビーズでは、ＦＡＰに対して一価の二重特異性抗体が全て、Ｂ細胞活性化マーカーの発現ＣＤ８６の増加を誘導した。架橋抗ＣＤ４０抗体（Ｐ１ＡＤ４４７０）によって誘導されるＣＤ８６のＦＡＰ非依存性アップレギュレーションと比較して、ＦＡＰ依存性二重特異性抗原結合分子によって誘導されるＣＤ８６アップレギュレーションは、類似していたかわずかに低かった。より低い抗体濃度では、ＦＡＰ（２１２）又はＦＡＰ（４Ｂ９）結合ドメインを有する２＋１フォーマットの二重特異性ＦＡＰ－ＣＤ４０抗体によるＢ細胞活性化マーカーのアップレギュレーションは、２＋１フォーマットの二重特異性ＦＡＰ－ＣＤ４０抗体、ＦＡＰ（２８Ｈ１）結合ドメインを含むフォーマット、ＦＡＰ（２１２）、ＦＡＰ（４Ｂ９）又はＦＡＰ（２８Ｈ１）結合ドメインを含む４＋１フォーマットの二重特異性ＦＡＰ－ＣＤ４０抗体、又はＦＡＰ非依存性陽性コントロール抗体によって誘導されるアップレギュレーションと比較して低かった。ＦＡＰ（非コーティングビーズ）がない場合、二重特異性抗原結合分子ではＣＤ８６発現の増加は観察されなかったが、陽性コントロール抗体はＣＤ８６のアップレギュレーションを誘導した。示された滴定抗体との２日間のインキュベーション後のＣＤ８６陽性の重要なＢ細胞のパーセンテージを示す。ｘ軸は、抗体コンストラクトの濃度を示す。 ＦＡＰの存在下（図８Ａ）又は非存在下（図８Ｂ）で、ＦＡＰ標的抗ＣＤ４０結合分子によって活性化されたＯＶＡパルスＤＣのＴ細胞プライミングを示す。ｈｕＣＤ４０トランスジェニックマウスから単離され、ＤＥＣ２０５－ＯＶＡコンジュゲートで処置され、ＦＡＰ依存性二重特異性抗ＣＤ４０抗体及びＦＡＰコーティングビーズで刺激されたＤＣは、抗原特異的Ｔ細胞の強力な増殖を誘導した。対照的に、ＦＡＰ（非コーティングビーズ）がない場合、ＦＡＰ標的抗ＣＤ４０抗体で刺激されたＤＣによってＴ細胞の増殖は誘導されなかった。２つ又は４つのＣＤ４０及び１つのＦＡＰ（２１２）又はＦＡＰ（４Ｂ９）結合部分を有するヒト二重特異性抗原結合分子で刺激されたＤＣによって誘導されたＴ細胞増殖は同等だった。ＤＥＣ２０５－ＯＶＡコンジュゲートの代わりに大量のＳＩＩＮＦＥＫＬでパルスされたＤＣは、強力なＴ細胞増殖を誘導した。示されているのは、ＯＶＡの存在下で示された滴定抗体とプレインキュベートされたｈｕＣＤ４０ ｔｇ ＤＣと共培養された増殖中（ＣＦＳＥ低）の重要なＣＦＳＥ標識マウスＣＤ３＋ＣＤ８＋ＯＴ－１ Ｔ細胞のパーセンテージである（図８Ａ及び８Ｂ）。ｘ軸は、抗体コンストラクトの濃度を示す。 実施例５．３に記載されているように、２細胞株架橋アッセイにおける二重特異性ＦＡＰｘＣＤ４０抗体の同時結合の効果を示す。示されているのは、異なるフォーマットの二重特異性抗体の濃度に対する光学密度（ＯＤ）である。 ＣＤ４０受容体（ＦＡＰとは独立）を活性化するさまざまなフォーマットのＦＡＰｘＣＤ４０抗体の可能性を示す。レポーター細胞株アッセイでは、シグナル伝達により、分泌された胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）のＮＦκＢ－依存性産生が誘導され、ＳＥＡＰの活性が測定される。ｎ＝６及び３ｘＳＴＤＥＶの光学密度（ＯＤ）の平均が、分子に対してプロットされる。 皮下ＭＣ３８－ＦＡＰ腫瘍モデルにおける非標的抗ＣＤ４０抗体と比較した、ＦＡＰ標的抗ＣＤ４０結合分子の安全性、薬物動態、及び薬力学的プロファイルを評価するためのインビボマウス研究の研究デザインを示す。 示された単一又は組み合わせの抗体療法で処置されたマウスの１回目及び２回目の（再チャレンジ）ＭＣ３８－ＦＡＰ腫瘍細胞注射時の腫瘍増殖を示す。矢印は、治療の注射と再チャレンジの日を示す。ｙ軸は腫瘍体積をｍｍ３で表し、ｘ軸は最初のＭＣ３８－ＦＡＰ腫瘍細胞注射の日数を表す。フォーマット及び抗ＰＤ－Ｌ１抗体の同時注射とは無関係に、ＦＡＰ－ＣＤ４０抗体処置時のＭＣ３８－ＦＡＰ腫瘍の完全な腫瘍退縮が観察された。対照的に、抗ＰＤ－Ｌ１抗体のみ、抗ＣＤ４０抗体のみ、又は抗ＣＤ４０と抗ＰＤ－Ｌ１抗体の組み合わせで処置したマウスでは、腫瘍増殖はビヒクルコントロールで処置したマウスと同等だった。更に、再チャレンジすると、以前にＦＡＰ－ＣＤ４０抗体で処置した群ではＭＣ３８－ＦＡＰ腫瘍は成長しなかったが、ナイーブマウスでは腫瘍の１００％が成長した。 ２８日目（治療後６日）の全ての処置群を比較した統計表である。 ３１日目（治療後９日目）以降の全ての処置を比較した統計表である。 ＦＡＰ発現マウス結腸腺癌腫瘍細胞株を注射したマウスにおける４＋１及び２＋１ ＦＡＰ標的抗ＣＤ４０結合分子と非標的親抗ＣＤ４０抗体の薬物動態プロファイルを示す（ＭＣ３８－ＦＡＰ）。ｙ軸は、血清中の用量正規化濃度を表し、ｘ軸は、抗体注射時の時間を表す。最高のクリアランス率は、非標的抗ＣＤ４０抗体で観察された。４＋１フォーマットのＦＡＰ標的抗ＣＤ４０結合分子のクリアランス速度は、非標的抗ＣＤ４０分子と比較して低く、最低のクリアランス速度は、２＋１フォーマットのＦＡＰ標的抗ＣＤ４０結合分子で観察された。 流入領域リンパ節（ＬＮ、図１５Ａ、図１６Ａ、及び図１７Ａ）、非流入領域リンパ節（図１５Ｂ、図１６Ｂ、及び図１７Ｂ）、ＦＡＰ発現マウス結腸腺癌腫瘍細胞株（ＭＣ３８－ＦＡＰ）を注射した及び非標的抗ＣＤ４０（Ｐ１ＡＥ２３０１）、抗ＣＤ４０－ＦＡＰ ４＋１（Ｐ１ＡＥ２０２４）、抗ＣＤ４０－ＦＡＰ ２＋１（Ｐ１ＡＥ２３０２）、又はビヒクルのみのいずれかで処置した、マウスの脾臓（図１５Ｃ、図１６Ｃ及び図１７Ｃ）及び腫瘍（図１５Ｄ、図１６Ｄ及び図１７Ｄ）におけるＤＣ、Ｔ細胞、及びＢ細胞の活性化を示す。治療注射の４日後の腫瘍におけるＤＣ及びＴ細胞の活性化（図１５Ｄ及び図１６Ｄ）は、ビヒクルで処置した動物と比較して、抗ＣＤ４０－ＦＡＰ ２＋１（Ｐ１ＡＥ２３０２）で処置した動物で有意に増加した。他の全ての分析された組織（排出ＬＮ、非排出ＬＮ及び脾臓）において、非標的化抗ＣＤ４０、抗ＣＤ４０－ＦＡＰ ４＋１及び抗ＣＤ４０－ＦＡＰ ２＋１は、ビヒクル群と比較して有意なＤＣ及びＴ細胞の活性化を誘導した。対照的に、非標的抗ＣＤ４０のみが、ビヒクルコントロール群と比較して、分析された全ての組織において有意なＢ細胞活性化を媒介した（図１７Ａ－図１７Ｄ、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、対になっていない、両側のスチューデントの検定）。 ＦＡＰ発現マウス結腸腺癌腫瘍細胞株（ＭＣ３８－ＦＡＰ）を注射し、非標的抗ＣＤ４０（Ｐ１ＡＥ２３０１）、抗ＣＤ４０－ＦＡＰ ４＋１（Ｐ１ＡＥ２０２４）、抗ＣＤ４０－ＦＡＰ ２＋１（Ｐ１ＡＥ２３０２）又はビヒクルのいずれかで処置したマウスの、抗ＰＤ－Ｌ１抗体（Ｐ１ＡＥ００９９）の同時注射の有り無しでの体重を示す。ｙ軸は、処置前の体重のパーセントで体重を示し、ｘ軸は、治療注射後の日数を示す。非標的抗ＣＤ４０抗体を単独で、又は抗ＰＤ－Ｌ１と組み合わせて処置したマウスでのみ、明らかな体重減少が観察された。
定義
他の意味であると定義されない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野で一般的に使用されるのと同じ意味を有する。本明細書を解釈する目的で、以下の定義が適用され、適切な場合にはいつでも、単数形で使用される用語は、複数形も含み、その逆に、複数系で使用される用語は、単数形も含む。
本明細書で使用される場合、「抗原結合分子」との用語は、最も広い意味で、抗原決定基に特異的に結合する分子を指す。抗原結合分子の例は、抗体、抗体フラグメント及び足場抗原結合タンパク質である。
本明細書で使用する場合、用語「標的細胞抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメイン」、又は「標的細胞抗原に特異的に結合可能な部分」とは、抗原に特異的に結合するポリペプチド分子を意味する。一つの態様において、抗原結合ドメインは、その標的細胞抗原を介してシグナル伝達を活性化することが可能である。特定の態様において、抗原結合ドメインは、標的部位、例えば、特定の種類の腫瘍細胞、又は抗原決定基を有する腫瘍間質に結合する構成要素（例えばＣＤ４０アゴニスト）を指令することができる。標的細胞抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、本明細書で更に定義される抗体及びそのフラグメントを含む。更に、標的細胞抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、本明細書で更に定義されるスキャフォールド抗原結合タンパク質、例えば、設計された反復タンパク質又は設計された反復ドメインに基づく結合ドメイン（例えば、国際公開第２００２／０２０５６５号を参照のこと）を含む。
抗体又はそのフラグメントに関連して、用語「標的細胞抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメイン」とは、抗原の一部又は全てに特異的に結合し、かつ相補性である領域を含む分子の一部を意味する。特異的抗原結合が可能な抗原結合ドメインは例えば、１つ以上の抗体可変ドメイン（抗体可変領域とも呼ばれる）により、提供されることができる。具体的には、特異的抗原結合が可能な抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）、及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。別の態様において、「標的細胞抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメイン」は、Ｆａｂフラグメント又はクロスＦａｂフラグメントでもあり得る。
本明細書の「抗体」との用語は、最も広い意味で使用され、種々の抗体構造を包含し、限定されないが、所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単一特異性抗体及び多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体フラグメントを含む。
用語「モノクローナル抗体」とは、本明細書で使用される場合、実質的に均一な抗体の集合から得られる抗体を指す。すなわち、集合に含まれる個々の抗体が、同一であり、及び／又は同じエピトープに結合するが、但し、例えば、天然に存在する突然変異又はモノクローナル抗体製剤の製造中に生じる変異を含む、可能な変異体抗体は除く。このような変異体は、一般的に、少量存在する。典型的には異なる決定基（エピトープ）に対して指向する異なる抗体を含むポリクローナル抗体製剤とは対照的に、モノクローナル抗体製剤のそれぞれのモノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して指向する。
「単一特異性」抗体との用語は、本明細書で使用される場合、同じ抗原の同じエピトープにそれぞれ結合する１つ以上の結合部位を有する抗体を示す。「二重特異性」との用語は、抗原結合分子が、少なくとも２つの別個の抗原決定基に特異的に結合することができることを意味する。典型的には、二重特異性抗原結合分子は、２つの抗原結合部位を含み、それぞれが異なる抗原決定基に対して特異的である。特定の実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、２つの抗原決定基（特に、２つの別個の細胞で発現する２つの抗原決定基）に同時に結合することができる。本明細書に記載の二重特異性抗原結合分子はまた、多特異性抗体の一部を形成することができる。
本出願の中で用いられる用語「－価」とは、１つの異なる抗原決定基に対して特異的である抗原結合分子内で、１つの異なる抗原決定基に対して特異的な結合部位が特定の数、存在することを意味する。そのため、用語「二価」、「四価」、及び「六価」とは、抗原結合分子においてそれぞれ、特定の抗原決定基に対して特異的な、２つの結合部位、４つの結合部位、及び６つの結合部位が存在することを意味する。本発明の具体的な態様において、本発明に従った二重特異性抗原結合分子は、特定の抗原決定基に対して一価であることができ、このことは、これらが、上記抗原決定基に対して１つのみの結合部位を有することを意味する。又は、これらは特定の抗原決定基に対して二価若しくは四価であることができ、このことは、これらが、上記抗原決定基に対してそれぞれ、２つの結合部位、若しくは４つの結合部位を有することを意味する。
「全長抗体」、「インタクト抗体」及び「全抗体」との用語は、ネイティブ抗体構造に実質的に類似した構造を有する抗体を指すために、本明細書で相互に置き換え可能に用いられる。「ネイティブ抗体」は、さまざまな構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子を指す。例えば、ネイティブＩｇＧクラス抗体は、約１５０，０００ダルトンのヘテロテトラマー糖タンパク質であり、ジスルフィド結合した２つの軽鎖と２つの重鎖から構成される。Ｎ末端からＣ末端まで、それぞれの重鎖は、可変ドメイン（ＶＨ）（可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる）と、その後に３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）（重鎖定常領域とも呼ばれる）を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端まで、それぞれの軽鎖は、可変ドメイン（ＶＬ）（可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる）と、その後に軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）（軽鎖定常領域とも呼ばれる）を有する。抗体の重鎖は、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）又はμ（ＩｇＭ）と呼ばれる５種類の１つに分けられてもよく、このいくつかは、例えば、γ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）、γ４（ＩｇＧ４）、α１（ＩｇＡ１）及びα２（ＩｇＡ２）などのサブタイプに更に分けられてもよい。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２種類の１つに分けられてもよい。
「抗体フラグメント」は、インタクト抗体が結合する抗原に結合するインタクト抗体の一部を含むインタクト抗体以外の分子を指す。抗体フラグメントの例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、クロスＦａｂフラグメント；直鎖抗体；一本鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）；及び単一ドメイン抗体が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の抗体フラグメントの総説としては、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ９，１２９－１３４（２００３）を参照されたい。ｓｃＦｖフラグメントの総説としては、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）を参照。また、国際公開第９３／１６１８５号及び米国特許第５，５７１，８９４号及び第５，５８７，４５８号を参照。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、インビボでの半減期が長くなったＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２フラグメントの説明については、米国特許第５，８６９，０４６号を参照。ダイアボディは、二価又は二重特異性であってもよい２つの抗原結合ドメインを含む抗体フラグメントであり、例えば、ＥＰ ４０４，０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号；Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ９，１２９－１３４（２００３）、及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０，６４４４－６４４８（１９９３）を参照。トリアボディ及びテトラボディも、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ９，１２９－１３４（２００３）に説明されている。シングルドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全て又は一部又は軽鎖可変ドメインの全て又は一部を含む抗体フラグメントである。特定の実施形態では、シングルドメイン抗体は、ヒトシングルドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ。例えば、米国特許第６，２４８，５１６Ｂ１号を参照）。抗体フラグメントは、限定されないが、本明細書に記載されるように、インタクト抗体のタンパク質分解による消化、及び組換え宿主細胞（例えば、大腸菌又はファージ）による産生を含め、種々の技術によって作られてもよい。
インタクト抗体のパパイン消化により、２つの同一の抗原結合フラグメントが得られ、これは、それぞれ重鎖及び軽鎖可変ドメインと、更に、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれる。したがって、本明細書で使用される場合、「Ｆａｂフラグメント」との用語は、軽鎖（ＣＬ）のＶＬドメイン及び定常ドメインを含む軽鎖フラグメントと、重鎖のＶＨドメイン及び第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む抗体フラグメントを指す。Ｆａｂ’フラグメントは、抗体ヒンジ領域由来の１つ以上のシステインを含め、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端での数個の残基の付加によって、Ｆａｂフラグメントとは異なる。Ｆａｂ’－ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が有機チオール基を有するＦａｂ’フラグメントである。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位（２つのＦａｂフラグメント）と、Ｆｃ領域の一部とを含む、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントが得られる。本発明に従うと、用語「Ｆａｂフラグメント」は、以下で定義する「クロスＦａｂフラグメント」又は「クロスオーバーＦａｂフラグメント」もまた含む。
「クロスＦａｂフラグメント」又は「ｘＦａｂフラグメント」又は「クロスオーバーＦａｂフラグメント」との用語は、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のいずれかが交換されたＦａｂフラグメントを指す。クロスオーバーＦａｂ分子の２つの可能な鎖組成が可能であり、本発明の二重特異性抗体に含まれる。一方、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変領域は、置き換わっており、すなわち、クロスオーバーＦａｂ分子は、軽鎖可変領域（ＶＬ）と重鎖定常領域（ＣＨ１）とで構成されるペプチド鎖と、重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）とで構成されるペプチド鎖とを含む。このクロスオーバーＦａｂ分子は、クロスＦａｂ（ＶＬＶＨ）とも呼ばれる。一方、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の定常領域が置き換わっている場合、クロスオーバーＦａｂ分子は、重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）とで構成されるペプチド鎖と、軽鎖可変領域（ＶＬ）と重鎖定常領域（ＣＨ１）とで構成されるペプチド鎖とを含む。このクロスオーバーＦａｂ分子は、クロスＦａｂ（ＣＬＣＨ１）とも呼ばれる。
「一本鎖Ｆａｂフラグメント」又は「ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及びリンカーからなるポリペプチドであり、上記抗体ドメイン及び上記リンカーは、Ｎ末端からＣ末端への方向で、以下の順序の１つを有する：（ａ）ＶＨ－ＣＨ１－リンカー－ＶＬ－ＣＬ、（ｂ）ＶＬ－ＣＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＨ１、（ｃ）ＶＨ－ＣＬ－リンカー－ＶＬ－ＣＨ１、又は（ｄ）ＶＬ－ＣＨ１－リンカー－ＶＨ－ＣＬ。また、上記リンカーは、少なくとも３０アミノ酸、好ましくは３２～５０アミノ酸のポリペプチドである。上記一本鎖Ｆａｂフラグメントは、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの間の天然ジスルフィド結合によって安定化される。更に、これらの一本鎖Ｆａｂ分子は、システイン残基の挿入（例えば、Ｋａｂａｔ番号付けによれば、可変重鎖の４４位及び可変軽鎖の１００位）による鎖間ジスルフィド結合の生成によって、更に安定化されるだろう。
「クロスオーバー一本鎖Ｆａｂフラグメント」又は「ｘ－ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及びリンカーからなるポリペプチドであり、上記抗体ドメイン及び上記リンカーは、Ｎ末端からＣ末端への方向で、以下の順序の１つを有する。（ａ）ＶＨ－ＣＬ－リンカー－ＶＬ－ＣＨ１及び（ｂ）ＶＬ－ＣＨ１－リンカー－ＶＨ－ＣＬ。ＶＨとＶＬは一緒になって、ある抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、また上記リンカーは、少なくとも３０アミノ酸のポリペプチドである。更に、これらのｘ－ｓｃＦａｂ分子は、システイン残基の挿入（例えば、Ｋａｂａｔ番号付けによれば、可変重鎖の４４位及び可変軽鎖の１００位）による鎖間ジスルフィド結合の生成によって、更に安定化されるだろう。
「一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）」は、１０～約２５アミノ酸の短いリンカーペプチドを用いて連結された、抗体の重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質である。リンカーは、通常、可撓性のためにグリシンが豊富であり、溶解度のためにセリン又はトレオニンが豊富であり、ＶＨのＮ末端とＶＬのＣ末端とを、又はその逆で接続することができる。このタンパク質は、定常領域が除去され、リンカーが導入されているが、元々の抗体の特異性を保持している。ｓｃＦｖ抗体は、例えば、Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０３（１９９１）４６－９６）に記載されている。これに加え、抗体フラグメントは、ＶＨドメインに特徴的な（すなわち、ＶＬドメインと共に集合させることが可能な）、又はＶＬドメインに特徴的な（すなわち、機能的抗原結合部位にＶＨドメインと共に集合させることが可能な）一本鎖ポリペプチドを含み、それによって、全長抗体の抗原結合特性を与える。
「足場抗原結合タンパク質」は、当該技術分野で既知であり、例えば、フィブロネクチン及び設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）は、抗原結合ドメインの代替的な足場として使用されてきた。例えば、Ｇｅｂａｕｅｒ ａｎｄ Ｓｋｅｒｒａ，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｃａｆｆｏｌｄｓ ａｓ ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ １３：２４５－２５５（２００９）及びＳｔｕｍｐｐ ｅｔ ａｌ．，Ｄａｒｐｉｎｓ：Ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ １３：６９５－７０１（２００８）を参照。本発明の一つの態様において、スキャフォールド抗原結合タンパク質は、ＣＴＬＡ－４（エビボディ）、リポカリン（アンチカリン）、プロテインＡ由来分子、例えば、プロテインＡのＺ－ドメイン（アフィボディ）、Ａ－ドメイン（アビマー／マキシボディ）、血清トランスフェリン（トランスボディ）；設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）、抗体軽鎖又は重鎖の可変ドメイン（単一ドメイン抗体、ｓｄＡｂ）、抗体重鎖の可変ドメイン（ナノボディ、ａＶＨ）、ＶＮＡＲフラグメント、フィブロネクチン（アドネクチン）、Ｃ型レクチンドメイン（テトラネクチン）；新規抗原受容体β－ラクタマーゼの可変ドメイン（ＶＮＡＲフラグメント）、ヒトγ－クリスタリン又はユビキチン（アフィリン分子）；ヒトプロテアーゼ阻害剤のクニッツ型ドメイン、ミクロボディ、例えば、ノッチンファミリー由来のタンパク質、ペプチドアプタマー及びフィブロネクチン（アドネクチン）からなる群から選択される。ＣＴＬＡ－４（細胞毒性Ｔリンパ球関連抗原４）は、主にＣＤ４＋Ｔ細胞で発現するＣＤ２８ファミリー受容体である。その細胞外ドメインは、可変ドメイン様のＩｇ折りたたみを有する。抗体のＣＤＲに対応するループは、異なる結合特性を与えるために、異種配列と置換されてもよい。異なる結合特異性を有するように操作されたＣＴＬＡ－４分子も、エビボディとして知られている（例えば、米国特許第７１６６６９７Ｂ１号）。エビボディは、抗体（例えば、ドメイン抗体）の単離された可変領域とほぼ同じ大きさである。更なる詳細については、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８（１－２）、３１－４５（２００１）を参照。リポカリンは、ステロイド、ビリン、レチノイド及び脂質などの小さな疎水性分子を運ぶ細胞外タンパク質のファミリーである。リポカリンは、剛性βシート二次構造を有し、円錐構造の開放端に多くのループがあり、このループは、異なる標的抗原に結合するように操作することができる。アンチカリンは、１６０～１８０アミノ酸の大きさであり、リポカリンから誘導される。更なる詳細については、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １４８２：３３７－３５０（２０００）、米国特許第７２５０２９７Ｂ１号及び米国特許出願公開第２００７０２２４６３３号を参照。アフィボディは、抗原に結合するように操作することが可能な、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓのプロテインＡに由来する足場である。ドメインは、約５８アミノ酸の３つのラセン形の束からなる。ライブラリーは、表面残基のランダム化によって作られている。更なる詳細について、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．２００４，１７，４５５－４６２及びＥＰ １６４１８１８Ａ１号を参照。アビマーは、Ａドメイン足場ファミリーに由来する複数ドメインタンパク質である。約３５アミノ酸のネイティブドメインは、規定のジスルフィド結合した構造に適合する。多様性は、Ａ－ドメインのファミリーによって示される天然の変動のシャッフリングによって作られる。更なる詳細については、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３（１２）、１５５６－１５６１（２００５）及びＥｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ Ｄｒｕｇｓ １６（６）、９０９－９１７（２００７年６月）を参照。トランスフェリンは、単量体血清輸送糖タンパク質である。トランスフェリンは、許容状態の表面ループへのペプチド配列の挿入によって異なる標的抗原に結合するように操作可能である。操作されたトランスフェリン足場の例としては、トランスボディが挙げられる。更なる詳細については、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７４、２４０６６－２４０７３（１９９９）を参照。設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）は、細胞骨格の内在性膜タンパク質の接着に介在するタンパク質のファミリーであるアンキリンに由来する。単一のアンキリンリピートは、２つのαらせんとβターンとからなる３３残基のモチーフである。単一のアンキリンリピートは、各反復の第１のαらせん及びβターンの中の残基をランダム化することによって異なる標的抗原に結合するように操作することができる。その結合界面は、モジュールの数を増やすことによって、増加させることができる（親和性成熟方法）。更なる詳細については、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３２、４８９－５０３（２００３）、ＰＮＡＳ １００（４）、１７００－１７０５（２００３）及びＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３６９、１０１５－１０２８（２００７）及び米国特許出願公開第２００４０１３２０２８Ａ１号を参照。一本鎖ドメイン抗体は、一本の単量体可変抗体ドメインからなる抗体フラグメントである。第１の単一ドメインは、ラクダ由来の抗体重鎖の可変ドメインに由来した（ナノボディ又はＶＨＨフラグメント）。更に、単一ドメイン抗体との用語は、自律的なヒト重鎖可変ドメイン（ａＶＨ）又はサメ由来ＶＮＡＲフラグメントを含む。フィブロネクチンは、抗原に結合するように操作可能な足場である。アドネクチンは、ヒトフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）の１５反復単位の１０番目のドメインの天然アミノ酸配列を有する骨格からなる。βサンドイッチの片方の端にある３つのループを、アドネクチンが目的の治療標的を特異的に認識することができるように操作することができる。更なる詳細については、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．１８，４３５－４４４（２００５）、米国特許出願公開第２００８０１３９７９１号、国際公開第２００５０５６７６４号及び米国特許第６８１８４１８Ｂ１号を参照。ペプチドアプタマーは、定常足場タンパク質、典型的には、活性部位に挿入される拘束された可変ペプチドループを含むチオレドキシン（ＴｒｘＡ）からなるコンビナトリアル認識分子である。更なる詳細について、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．５、７８３－７９７（２００５）を参照。ミクロボディは、３～４のシステイン架橋を含む、２５～５０アミノ酸長の天然に存在するミクロタンパク質に由来し、ミクロタンパク質の例としては、ＫａｌａｔａＢＩ、コノトキシン及びノッチンが挙げられる。ミクロタンパク質は、ミクロタンパク質の全体的な折りたたみに影響を与えることなく、２５アミノ酸までを含むように操作することができるループを有する。操作されたノッチンドメインの更なる詳細については、国際公開第２００８０９８７９６号を参照。
参照分子と「同じエピトープに結合する抗原結合分子」は、競争アッセイにおいて、参照分子のその抗原に対する結合を５０％以上ブロックする抗原結合分子を指し、逆に、参照分子は、競争アッセイにおいて、抗原結合分子のその抗原に対する結合を５０％以上ブロックする。参照分子と「同じエピトープに結合しない抗原結合分子」は、競争アッセイにおいて、参照分子のその抗原に対する結合を５０％以上ブロックしない抗原結合分子を指し、逆に、参照分子は、競争アッセイにおいて、抗原結合分子のその抗原に対する結合を５０％以上ブロックしない。
用語「抗原結合ドメイン」又は「抗原結合部位」とは、抗原の一部又は全てに特異的に結合し、かつ相補性である領域を含む抗原結合分子の一部を意味する。抗原が大きい場合、抗原結合分子は、抗原の特定の部分のみに結合してもよく、この部分は、エピトープと呼ばれる。抗原結合ドメインは、例えば、１つ以上の可変ドメイン（可変領域とも呼ばれる）によって与えられてもよい。特に、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）と、抗体重鎖可変領域（ＶＨ）とを含む。
本明細書で使用される場合、「抗原決定基」との用語は、「抗原」及び「エピトープ」と同義であり、抗原結合部分－抗原複合体を形成する、抗原結合部分が結合するポリペプチド高分子上の部位（例えば、アミノ酸の連続伸長部又は異なる領域の非連続アミノ酸から構成される配座構成）を指す。有用な抗原決定基は、例えば、腫瘍細胞の表面上に、ウイルス感染した細胞の表面上に、他の疾患細胞の表面上に、免疫細胞の表面上に、血清中で遊離して、及び／又は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）内に認めることができる。本発明の抗原として有用なタンパク質は、哺乳動物、例えば、霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含め、任意の脊椎動物源由来の任意のネイティブ形態のタンパク質であってもよい。特定の実施形態では、抗原は、ヒトタンパク質である。本発明の特定のタンパク質について言及される場合、この用語は、「全長」の未処理のタンパク質、及び細胞の処理から得られるタンパク質の任意の形態を包含する。この用語は、タンパク質の天然に存在する変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体も包含する。
「特異的に結合する」とは、その結合が抗原選択性であり、望ましくない相互作用又は非特異的な相互作用とは判別できることを意味する。抗原結合分子が特定の抗原に結合する能力は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）又は当該技術分野で知られた他の技術、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（ＢＩＡｃｏｒｅ装置で分析される）（Ｌｉｌｊｅｂｌａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏ Ｊ １７、３２３－３２９（２０００））、及び従来の結合アッセイ（Ｈｅｅｌｅｙ、Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｓ ２８、２１７－２２９（２００２））によって測定することができる。一実施形態では、無関係なタンパク質に対する抗原結合分子の結合度は、例えばＳＰＲによって測定される抗原に対する抗原結合分子の結合の約１０％未満である。特定の実施形態では、抗原に結合する分子は、解離定数（Ｋｄ）が、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０－８Ｍ以下、例えば、１０－８Ｍ～１０－１３Ｍ、例えば、１０－９Ｍ～１０－１３Ｍ）である。
「親和性」又は「結合親和性」は、分子の単一の結合部位（例えば、抗体）と、その結合対（例えば、抗原）との間の非共有結合性相互作用の合計強度を指す。特に示されない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗体と抗原）のメンバー間の１：１相互作用を反映する特異的結合親和性を指す。分子Ｘのその結合対Ｙに対する親和性は、一般的に、解離定数（Ｋｄ）によって表すことができ、脱離速度定数と会合速度定数（それぞれｋｏｆｆ及びｋｏｎ）の比である。したがって、速度定数の比率が同じままである限り、等価の親和性は、異なる速度定数を含むことができる。親和性は、本明細書に記載するものを含め、当該技術分野で一般的な方法によって測定することができる。親和性を測定する特定の方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である。
「親和性成熟した」抗体は、１つ以上の超可変領域（ＨＶＲ）に１つ以上の変更を有する抗体を指し、これに対して、親抗体は、そのような変更を有しておらず、そのような変更によって、抗原に対する抗体の親和性が向上する。
「標的細胞抗原」とは、本明細書で使用する場合、標的細胞、具体的には、癌細胞又は腫瘍間質細胞等の腫瘍内の標的細胞の表面に提示された抗原決定基を意味する。したがって、標的細胞抗原は腫瘍関連抗原である。具体的には、腫瘍標的細胞抗原は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）である。
プロリルエンドペプチダーゼＦＡＰ又はセプラーゼ（ＥＣ ３．４．２１）としても知られている、用語「線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）」とは、特に断りのない限り、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）、並びに齧歯類（例えばマウス及びラット）などの哺乳類を含む、任意の脊椎動物源に由来する、任意の天然ＦＡＰを意味する。この用語は、「全長」のプロセシングされていないＦＡＰ、及び細胞におけるプロセシングから生じるＦＡＰの任意の形態を包含する。この用語は、ＦＡＰの天然に存在する変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体も包含する。一実施形態では、本発明の抗原結合分子は、ヒト、マウス、及び／又はカニクイザルＦＡＰに特異的に結合可能である。ヒトＦＡＰのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）寄託番号Ｑ１２８８４（バージョン１４９、配列番号２）、又はＮＣＢＩ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００４４５１．２にて示されている。ヒトＦＡＰの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、アミノ酸位置２６から７６０まで伸びている。Ｈｉｓタグ化したヒトＦＡＰ ＥＣＤのアミノ酸配列は、配列番号７８に示されている。マウスＦＡＰのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｐ９７３２１（バージョン１２６、配列番号７９）、又はＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿０３２０１２．１に示されている。マウスＦＡＰの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、アミノ酸位置２６から７６１まで伸びている。配列番号８０は、Ｈｉｓタグ化されたマウスＦＡＰ ＥＣＤのアミノ酸配列を示す。配列番号８１は、Ｈｉｓタグ化されたカニクイザルＦＡＰ ＥＣＤのアミノ酸配列を示す。好ましくは、抗本発明のＦＡＰ結合分子はＦＡＰの細胞外ドメインに結合する。
「可変領域」又は「可変ドメイン」との用語は、抗原に対する抗原結合分子の結合に関与する抗体重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然の抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）は、概して、類似の構造を有しており、各ドメインは、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と、３つの超可変領域（ＨＶＲ）とを含む。例えば、Ｋｉｎｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ Ｅｄ．Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，９１ページ（２００７）を参照。抗原結合特異性を与えるために、単一のＶＨ又はＶＬドメインで十分な場合がある。
本明細書で使用する場合、用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」とは、配列内で超可変可能であり、抗原結合特異性を決定する、抗体可変ドメインの領域、例えば「相補性決定領域」（ＣＤＲ）のそれぞれを意味する。
一般に、抗体は６つのＣＤＲを含み、３つがＶＨ（ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３）にあり、３つがＶＬ（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３）にある。本明細書における例示的なＣＤＲは、
（ａ）アミノ酸残基２６－３２（Ｌ１）、５０－５２（Ｌ２）、９１－９６（Ｌ３）、２６－３２（Ｈ１）、５３－５５（Ｈ２）及び９６－１０１（Ｈ３）で生じる超可変ループ（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７））；
（ｂ）アミノ酸残基２４－３４（Ｌ１）、５０－５６（Ｌ２）、８９－９７（Ｌ３）、３１－３５ｂ（Ｈ１）、５０－６５（Ｈ２）及び９５－１０２（Ｈ３）に存在するＣＤＲ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１））；並びに
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ－３６（Ｌ１）、４６－５５（Ｌ２）、８９－９６（Ｌ３）、３０－３５ｂ（Ｈ１）、４７－５８（Ｈ２）及び９３－１０１（Ｈ３）で生じる抗原接触（ＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２－７４５（１９９６））が挙げられる。
特に指示がない限り、ＣＤＲは、上記Ｋａｂａｔらに従い決定される。当業者は、ＣＤＲの表記は、上記Ｃｈｏｔｈｉａ、上記ＭｃＣａｌｌｕｍ、又は、任意の他の、科学的に認可された命名システムに従い決定することができることを理解するであろう。
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、相補性決定領域（ＣＤＲ）以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、概して、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４の４つのＦＲドメインからなる。したがって、ＣＤＲ及びＦＲ配列は、一般に、ＶＨ（又はＶＬ）において次の配列：ＦＲ１－ＣＤＲ－Ｈ１（ＣＤＲ－Ｌ１）－ＦＲ２－ＣＤＲ－Ｈ２（ＣＤＲ－Ｌ２）－ＦＲ３－ＣＤＲ－Ｈ３（ＣＤＲ－Ｌ３）－ＦＲ４。
「キメラ」抗体との用語は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の供給源又は種に由来する抗体を指し、一方、重鎖及び／又は軽鎖の残りは、異なる供給源又は種に由来する。
抗体の「クラス」は、その重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域の種類を指す。抗体の５種類の主要なクラスがあり、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭであり、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２に更に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基と、ヒトＦＲ由来のアミノ酸残基とを含むキメラ抗体を指す。ある特定の実施形態では、ヒト化抗体は、少なくとも１つの、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むものであり、それにおいて、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全て又は実質的に全てが非ヒト抗体のものに相当し、ＦＲの全て又は実質的に全てがヒト抗体のものに相当する。ヒト化抗体は、必要に応じて、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含んでいてもよい。ある抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化形態」は、ヒト化を受けた抗体を指す。本発明に包含される「ヒト化抗体」の他の形態は、特に、Ｃ１ｑ結合及び／又はＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合という観点で、本発明に係る特性を作り出すために、定常領域が、元々の抗体の定常領域から更に修飾されるか、又は変更されているものである。
「Ｆｃドメイン」又は「Ｆｃ領域」との用語は、本明細書において、定常領域の少なくとも一部を含む抗体重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。本用語は、天然配列Ｆｃ領域と変異体Ｆｃ領域とを含む。ＩｇＧ Ｆｃ領域は、ＩｇＧ ＣＨ２ドメインと、ＩｇＧ ＣＨ３ドメインとを含む。ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」は、通常、おおよその２３１位のアミノ酸残基から、おおよその３４０位のアミノ酸残基まで延びている。一実施形態では、炭水化物鎖は、ＣＨ２ドメインに接続している。本発明のＣＨ２ドメインは、ネイティブ配列ＣＨ２ドメイン又は変異体ＣＨ２ドメインであってもよい。「ＣＨ３ドメイン」は、Ｆｃ領域中のＣＨ２ドメインに対してＣ末端に残基の伸長部を含む（すなわち、ＩｇＧのおおよその３４１位のアミノ酸残基から、おおよその４４７位のアミノ酸残基まで）。本発明のＣＨ３領域は、ネイティブ配列ＣＨ３ドメイン又は変異体ＣＨ３ドメインであってもよい（例えば、その１つの鎖に導入された「突起部」（「ノブ」）を有し、その他の鎖に対応する導入された「空洞」（「ホール」）を有するＣＨ３ドメイン、本明細書に参考として明確に組み込まれる米国特許第５，８２１，３３３号を参照）。そのような変異体ＣＨ３ドメインを使用して、本明細書に記載される２つの同一ではない抗体重鎖のヘテロ二量体化を促進してもよい。一実施形態では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６から、又はＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端までに及ぶ。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在していてもよく、又は存在していなくてもよい。本明細書で特に明記されない限り、Ｆｃ領域又は定常領域におけるアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１に記載されるＥＵ番号付けシステム（ＥＵインデックスとも呼ばれる）に従う。
「ノブ・イントゥ・ホール」技術は、例えば、米国特許第５，７３１，１６８号明細書、米国特許第７，６９５，９３６号明細書、Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ ９，６１７－６２１（１９９６）及びＣａｒｔｅｒ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ ２４８，７－１５（２００１）に記載されている。一般的に、この方法は、第１のポリペプチドの界面にある突起（「ノブ」）と、第２のポリペプチドの界面にある空洞（「ホール」）とを導入することを含み、その結果、突起が、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨害するように空洞内に位置することができる。突起は、第１のポリペプチドの界面からの小さなアミノ酸側鎖を、より大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）と交換することによって構築される。突起と同一又は同様の大きさの相補性空洞が、大きなアミノ酸側鎖を、より小さなアミノ酸側鎖（例えば、アラニン又はトレオニン）と置き換えることによって、第２のポリペプチドの界面に作られる。突起及び空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を変えることによって、例えば、部位特異的変異導入法によって、又はペプチド合成によって作り出すことができる。具体的な実施形態では、ノブ修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットのうち１つにアミノ酸置換Ｔ３６６Ｗを含み、ホール修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットのうち他方の１つにアミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含む。更に具体的な実施形態では、ノブ修飾を含むＦｃドメインのサブユニットは、更に、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃを含み、ホール修飾を含むＦｃドメインのサブユニットは、更に、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃを含む。これら２つのシステイン残基の導入によって、Ｆｃ領域の２つのサブユニット間にジスルフィド架橋が生成し、それにより、二量体を更に安定化する（Ｃａｒｔｅｒ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８，７－１５（２００１））。
「免疫グロブリンのＦｃ領域に等価な領域」は、天然に存在する免疫グロブリンのＦｃ領域の対立遺伝子変異体及び置換、付加又は欠失を生じるが、エフェクター機能（例えば、抗体依存性細胞毒性）に介在する免疫グロブリンの能力を実質的に低下させない変更を有する変異体を含むことが意図される。例えば、１種以上のアミノ酸は、生体機能を実質的に失うことなく、免疫グロブリンのＦｃ領域のＮ末端又はＣ末端から欠失されていてもよい。そのような変異体は、活性に対して最小限の影響を有するように、当該技術分野で知られた一般的な規則に従って選択することができる（例えば、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６－１０（１９９０）を参照）。
「エフェクター機能」との用語は、抗体のＦｃ領域に帰属可能な生体活性を指し、抗体アイソタイプによって変わる。抗体エフェクター機能の例としては、以下のものが挙げられる。Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介障害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、サイトカイン分泌、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込み、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）のダウンレギュレーション、及びＢ細胞活性化。
Ｆｃ受容体結合依存性エフェクター機能は、抗体のＦｃ領域と、造血細胞における専用の細胞表面受容体である、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）との相互作用により媒介されることができる。Ｆｃ受容体は免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、免疫複合体のファゴサイトーシスによる、抗体で覆われた病原体の除去、並びに、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）による、赤血球、及び対応する抗体で覆われた他の細胞標的（例えば腫瘍細胞）の溶解の両方を媒介することが示されている（例えば、Ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ，Ｊ．Ｇ．ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｃ．Ｌ．，Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．４９（１９９１）５１１－５２４を参照のこと）。ＦｃＲは、免疫グロブリンアイソタイプに対するその特異性により定義される：ＩｇＧ抗体に対するＦｃ受容体は、ＦｃγＲと呼ばれる。Ｆｃ受容体結合は、例えばＲａｖｅｔｃｈ，Ｊ．Ｖ．ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ｊ．Ｐ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９（１９９１）４５７－４９２；Ｃａｐｅｌ，Ｐ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ ４（１９９４）２５－３４；ｄｅ Ｈａａｓ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６（１９９５）３３０－３４１；ａｎｄ Ｇｅｓｓｎｅｒ，Ｊ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．７６（１９９８）２３１－２４８に記載されている。
ＩｇＧ抗体（ＦｃγＲ）のＦｃ領域に対する受容体の架橋は、ファゴサイトーシス、抗体依存性細胞傷害、及び炎症性メディエータの放出、並びに、免疫複合体のクリアランス及び抗体産生の制御を含む、多種多様のエフェクター機能を誘発する。ヒトにおいて、３クラスのＦｃγＲが特性決定されており、これらは以下のとおりである。
－ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）は、単量体ＩｇＧに高い親和性で結合し、マクロファージ、単球、好中球、及び好酸球にて発現する。アミノ酸残基Ｅ２３３～Ｇ２３６、Ｐ２３８、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ａ３２７、及びＰ３２９（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従った番号付け）の少なくとも１つにおける、Ｆｃ領域内での修飾によって、ＦｃγＲＩへの結合が低下する。ＩｇＧ１及びＩｇＧ４に置換された、位置２３３～２３６におけるＩｇＧ２残基は、ＦｃγＲＩへの結合を１０３倍低下させ、抗体により感作される赤血球に対するヒト単核細胞応答を取り除いた（Ａｒｍｏｕｒ，Ｋ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９（１９９９）２６１３－２６２４）。
－ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）は、複合体化ＩｇＧに中程度から低度の親和性で結合し、幅広く発現する。受容体は、２つのサブタイプ：ＦｃγＲＩＩＡ及びＦｃγＲＩＩＢに分けることができる。ＦｃγＲＩＩＡは主に、殺傷に関与する多くの細胞（例えばマクロファージ、単球、好中球）にて発見され、殺傷プロセスを活性化可能であるようである。ＦｃγＲＩＩＢは、阻害プロセスで役割を果たすようであり、Ｂ細胞、マクロファージ、並びに肥満細胞及び好酸球で発見されている。Ｂ細胞上では、ＦｃγＲＩＩＢは、免疫グロブリン産生、及び、例えばＩｇＥクラスへのアイソタイプ切り替えを更に抑制する機能を有するようである。マクロファージ上では、ＦｃγＲＩＩＢは、ＦｃγＲＩＩＡによって媒介されるように、ファゴサイトーシスを阻害する役割を果たす。好酸球及び肥満細胞上において、Ｂ形態は、ＩｇＥの、その個別の受容体への結合による、これらの細胞の活性化の抑制を補助し得る。ＦｃγＲＩＩＡに対する結合の低下は、例えば、少なくとも、アミノ酸残基Ｅ２３３～Ｇ２３６、Ｐ２３８、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ａ３２７、Ｐ３２９、Ｄ２７０、Ｑ２９５、Ａ３２７、Ｒ２９２、及びＫ４１４（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従った番号付け）の１つにおいて突然変異を有するＩｇＧ Ｆｃ領域を含む抗体に対して発見されている。
－ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）はＩｇＧに、中程度～低度の親和性で結合し、２つの種類として存在する。ＦｃγＲＩＩＩＡはＮＫ細胞、マクロファージ、好酸球、並びにいくつかの単球及びＴ細胞上で発見されており、ＡＤＣＣを媒介する。ＦｃγＲＩＩＩＢは、好中球上で非常に発現する。ＦｃγＲＩＩＩＡに対する結合の低下は、例えば、少なくとも、アミノ酸残基Ｅ２３３～Ｇ２３６、Ｐ２３８、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ａ３２７、Ｐ３２９、Ｄ２７０、Ｑ２９５、Ａ３２７、Ｓ２３９、Ｅ２６９、Ｅ２９３、Ｙ２９６、Ｖ３０３、Ａ３２７、Ｋ３３８、及びＤ３７６（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従った番号付け）の１つにおいて突然変異を有するＩｇＧ Ｆｃ領域を含む抗体に対して発見されている。
Ｆｃ受容体に対する、ヒトＩｇＧ１上での結合部位のマッピング、上述した突然変異部位、並びにＦｃγＲＩ及びＦｃγＲＩＩＡへの結合を測定する方法は、Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（２００１）６５９１－６６０４に記載されている。
用語「ＡＤＣＣ」又は「抗体依存性細胞傷害」とは、Ｆｃ受容体結合により媒介される機能であり、エフェクター細胞の存在下における、本明細書で報告される抗体による、標的細胞の溶解を意味する。ＡＤＣＣを媒介する初期工程を誘発する抗体の能力は、ＦｃγＲＩ及び／若しくはＦｃγＲＩＩＡ又は（本質的にＦｃγＲＩＩＩＡを発現する）ＮＫ細胞を組み換えにより発現する細胞といった、Ｆｃγ受容体を発現する細胞への、抗体の結合を測定することにより調査される。具体的には、ＮＫ細胞上でのＦｃγＲへの結合が測定される。
「活性化Ｆｃ受容体」は、抗体のＦｃ領域による結合の後に、エフェクター機能を発揮するために受容体を含む細胞を刺激するシグナル伝達事象を誘発するＦｃ受容体である。活性化Ｆｃ受容体として、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）及びＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）が挙げられる。特定の活性化Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃγＲＩＩＩａである（ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｐ０８６３７，ｖｅｒｓｉｏｎ １４１を参照）。
本明細書で使用される「ＣＤ４０」という用語は、別途示されない限り、霊長類（例えば、ヒト）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）等の哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来の任意の天然ＣＤ４０を指す。この用語は、「全長」のプロセシングされていないＣＤ４０、及び細胞におけるプロセシングから生じるＣＤ４０の任意の形態を包含する。この用語は、ＣＤ４０の天然に存在する変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体も包含する。例示的なヒトＣＤ４０のアミノ酸配列は、配列番号１（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ２５９４２、バージョン２００）に示され、例示的なマウスＣＤ４０のアミノ酸配列は、配列番号１４６（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ２７５１２、バージョン１６０）に示される。ＣＤ４０抗原は、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦ－Ｒ）ファミリーに属する５０ｋＤａの細胞表面糖タンパク質である（Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．（１９８９），ＥＭＢＯ Ｊ．８：１４０３－１０）。ＣＤ４０は、Ｂリンパ球、樹状細胞、単球、マクロファージ、胸腺上皮、内皮細胞、線維芽細胞、平滑筋細胞などを含む、多くの正常細胞及び腫瘍細胞タイプで発現している。ＣＤ４０は、全てのＢリンパ腫及び全ての固形腫瘍の７０％で発現し、ＩＦＮ－γやＧＭ－ＣＳＦなどの成熟シグナルによって抗原提示細胞（ＡＰＣ）でアップレギュレートされる。ＣＤ４０の活性化はまた、単球の機能的樹状細胞（ＤＣ）への分化を誘導し、ＡＰＣ－ＣＤ４０誘導サイトカインを介してＮＫ細胞の細胞溶解活性を増強する。したがって、ＣＤ４０は、ＡＰＣの成熟、ヘルパーサイトカインの分泌、共刺激分子のアップレギュレーション、及びエフェクター機能の増強を誘導することにより、免疫応答の開始と増強に重要な役割を果たす。
本明細書で使用される「ＣＤ４０アゴニスト」という用語は、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ相互作用をアゴニストする任意の部分を含む。この文脈で使用されるＣＤ４０は、好ましくはヒトＣＤ４０を指し、したがって、ＣＤ４０アゴニストは好ましくはヒトＣＤ４０のアゴニストである。通常、この部分はアゴニストＣＤ４０抗体又は抗体フラグメントになる。
用語「抗ＣＤ４０抗体」「抗ＣＤ４０」、「ＣＤ４０抗体」及び「ＣＤ４０に特異的に結合する抗体」とは、抗体がＣＤ４０の標的化において診断及び／又は治療薬剤として有用であるような充分な親和性を有して、ＣＤ４０に結合可能である抗体を指す。一つの態様において、抗ＣＤ４０抗体が無関係の、非ＣＤ４０タンパク質に結合する程度は、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又はフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により測定すると、ＣＤ４０に対する抗体の結合の約１０％未満である。特定の実施形態において、ＣＤ４０に結合する抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば１０－６Ｍ以下、例えば１０－６８～１０－１３Ｍ、例えば１０－８Ｍ～１０－１０Ｍ）の解離定数（ＫＤ）を有する。
「ペプチドリンカー」との用語は、１種以上のアミノ酸、典型的には、約２～２０のアミノ酸を含むペプチドを指す。ペプチドリンカーは、当該技術分野で知られているか、又は本明細書に記載される。好適な、非免疫原性リンカーペプチドは例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎ、（ＳＧ４）ｎ、又はＧ４（ＳＧ４）ｎペプチドリンカーであり、式中、「ｎ」は一般に、１～１０、典型的には２～４、特に２の数字である。即ち、ペプチドは、ＧＧＧＧＳ（配列番号８２）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８３）、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号８４）、及びＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号８５）からなる群から選択されるが、配列ＧＳＰＧＳＳＳＳＧＳ（配列番号８６）、（Ｇ４Ｓ）３（配列番号８７）、（Ｇ４Ｓ）４（配列番号８８）、ＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号８９）、ＧＳＧＳＧＮＧＳ（配列番号９０）、ＧＧＳＧＳＧＳＧ（配列番号９１）、ＧＧＳＧＳＧ（配列番号９２）、ＧＧＳＧ（配列番号９３）、ＧＧＳＧＮＧＳＧ（配列番号９４）、ＧＧＮＧＳＧＳＧ（配列番号９５）、及びＧＧＮＧＳＧ（配列番号９６）もまた含む。特に興味深いペプチドリンカーは、（Ｇ４Ｓ）（配列番号８２）、（Ｇ４Ｓ）２又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８３）、（Ｇ４Ｓ）３（配列番号８７）及び（Ｇ４Ｓ）４（配列番号８８）である。
「アミノ酸」との用語は、本明細書中で使用される場合、アラニン（三文字コード：ａｌａ、一文字コード）Ａ）、アルギニン（ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐ、Ｄ）、システイン（ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ、Ｌ）、リシン（ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（ｓｅｒ、Ｓ）、トレオニン（ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ、Ｙ）及びバリン（ｖａｌ、Ｖ）を含む天然に存在するカルボキシα－アミノ酸の一群を示す。
「融合した」、又は「連結した」とは、構成成分（例えば、抗体の重鎖及びＦａｂフラグメント）が直接、又は１つ以上のペプチドリンカーを介してのいずれかで、ペプチド結合により結合されていることを意味する。
参照ポリペプチド配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、最大パーセントの配列同一性を達成するために配列をアラインメントし、必要に応じてギャップを導入した後、保存的置換を配列同一性の一部として考慮しないで、参照ポリペプチド配列のアミノ酸残基と同一である候補配列のアミノ酸残基の割合として定義される。アミノ酸配列同一性率を決定するためのアラインメントは、当該技術分野の技術の範囲内にある種々の様式で、例えば、公的に入手可能なコンピュータソフトウェア、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ。ＳＡＷＩ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを用いて達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大整列度を達成するのに必要とされる任意のアルゴリズムを含め、配列を整列させるのに適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、本明細書では目的のために、アミノ酸配列同一％値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ－２を用いて生じる。ＡＬＩＧＮ－２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．によって作成されており、ソースコードは、Ｕ．Ｓ．Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ Ｏｆｆｉｃｅ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，２０５５９）のユーザドキュメンテーションにファイルされており、Ｕ．Ｓ．Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ Ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ Ｎｏ．ＴＸＵ５１００８７の下に登録されている。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から公的に入手可能であり、又はそのソースコードからコンパイルされてもよい。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ Ｖ４．０Ｄを含め、ＵＮＩＸオペレーティングシステムで使用するためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ－２プログラムによって設定されており、かつ変わらない。ＡＬＩＧＮ－２がアミノ酸配列比較に採用されている状況においては、（あるいは所与のアミノ酸配列Ｂに対する、配列Ｂとの、又は配列Ｂに対向するある特定のアミノ酸配列同一％を有するか又は含む所与のアミノ酸配列Ａとして購入することができる）所与のアミノ酸配列Ａの、所与のアミノ酸配列Ｂに対する、配列Ｂとの、又は配列Ｂに対向するアミノ酸配列同一％は、次のように計算される。
分数Ｘ／Ｙの１００倍
式中、Ｘは、Ａ及びＢのこのプログラムのアラインメントにおいて、配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ－２によって同一性マッチとしてスコアリングされたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂにおけるアミノ酸残基の合計数である。アミノ酸配列Ａの長さが、アミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、Ｂに対するＡのアミノ酸配列同一性％は、Ａに対するＢのアミノ酸配列同一性％に等しくないことが理解されるだろう。他の意味であると具体的に述べられていない限り、本明細書で使用されるアミノ酸配列同一性％の値は全て、ＡＬＩＧＮ－２コンピュータプログラムを用いる直前の段落に記載されるように得られる。
特定の実施形態において、本明細書において提供する、二重特異性抗原結合分子のアミノ酸配列変異体が想到される。例えば、ＴＮＦリガンド三量体含有抗原結合分子の結合親和性、及び／又は他の生物学的性質を改善するのが望ましい場合がある。適切な改変を、分子をコードするヌクレオチド配列に導入することにより、又はペプチド合成により、ＴＮＦリガンド三量体含有抗原結合分子のアミノ酸配列変異体を調製することができる。そのような修飾は、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基の欠失、及び／又は挿入、及び／又は置換を含む。欠失、挿入及び置換の任意の組合せは、最終コンストラクトが、所望の特徴（例えば、抗原結合）を有する限り、最終コンストラクトに到達するように行うことができる。置換による突然変異生成のための目的部位として、ＨＶＲ及びフレームワーク（ＦＲ）が挙げられる。保存的置換は、「好ましい置換」の見出しで表Ｂに与えられており、アミノ酸側鎖クラス（１）～（６）を参照しつつ、以下に更に記載される。アミノ酸置換は、目的の分子及び所望の活性（例えば、抗原結合の保持／向上、免疫原性の低下、又はＡＤＣＣ又はＣＤＣの向上）についてスクリーニングされた産物に導入されていてもよい。
Figure 0007221379000001
アミノ酸は、共通の側鎖特性に従って群分けされてもよい。
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ，Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ，Ｌｙｓ，Ａｒｇ；
（５）鎖の配向に影響を与える残基：Ｇｌｙ，Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ，Ｔｙｒ，Ｐｈｅ。
非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーを別のクラスと交換することを伴うだろう。
「アミノ酸配列変異体」との用語は、親抗原結合分子（例えば、ヒト化抗体又はヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基中にアミノ酸置換が存在する実質的な変異体を含む。一般的に、更なる研究のために選択され、得られた変異体は、親抗原結合分子と比較して、特定の生物学的特性の修飾（例えば、改良）（例えば、親和性の増加、免疫原性の低下）を有し、及び／又は親抗原結合分子の特定の生物学的特性を実質的に保持しているだろう。例示的な置換変異体は、親和性成熟した抗体であり、例えば、本明細書に記載されるようなファージディスプレイに基づく親和性成熟技術を用い、簡便に生成されてもよい。簡単に言うと、１つ以上のＨＶＲ残基は、変異しており、ファージディスプレイされ、特定の生体活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされた変異体抗原結合分子である。特定の実施形態では、置換、挿入又は欠失は、そのような変更が、抗原結合分子が抗原に結合する能力を実質的に減らさない限り、１つ以上のＨＶＲ内で起こってもよい。例えば、結合親和性を実質的に低下させない保存的変更（例えば、本明細書に提供される保存的置換）が、ＨＶＲ中に作られてもよい。変異を標的とし得る抗体の残基又は領域の同定のための有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：１０８１－１０８５によって記載されるように、「アラニンスキャンニング突然変異生成」と呼ばれる。この方法では、抗体と抗原との相互作用が影響を受けるかどうかを決定するために、残基又は標的残基群（例えば、荷電残基、例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ及びＧｌｕ）が同定され、中性又は負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニン又はポリアラニン）によって置き換えられる。更なる置換が、初期置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸位置に導入されてもよい。これに代えて、又は更に、抗体と抗原との間の接触点を同定するための、抗原－抗原結合分子複合体の結晶構造。そのような接触残基及び隣接残基は、置換の候補として標的とされるか、又は除去されてもよい。変異体は、所望の特性を有するか否かを判定するためにスクリーニングされてもよい。
アミノ酸配列挿入として、１個の残基から１００個以上の残基を含むポリペプチドまでの長さ範囲のアミノ末端及び／又はカルボキシル末端の融合、並びに１個又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入が挙げられる。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する、本発明の二重特異性抗原結合分子が挙げられる。分子の他の挿入変異体としては、二重特異性抗原結合分子の血清半減期を増加させる、Ｎ又はＣ末端の、ポリペプチドへの融合が挙げられる。
特定の実施形態において、本明細書において提供する二重特異性抗原結合分子が改変され、抗体がグリコシル化される程度が増加又は低下される。１つ以上のグリコシル化部位が作製される、又は取り除かれるように、アミノ酸配列を改変することにより、分子のグリコシル化変異体を便利に入手することができる。ＴＮＦリガンド三量体含有抗原結合分子がＦｃ領域を含む場合において、Ｆｃ領域に付着した炭水化物を改変することができる。哺乳動物細胞によって産生される天然抗体は、典型的には、一般にＮ結合によってＦｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７に結合される分岐状の二分岐オリゴ糖を含む。例えば、Ｗｒｉｇｈｔら、「ＴＩＢＴＥＣＨ」、第１５巻、第２６～３２頁（１９９７年）を参照されたい。オリゴ糖には、さまざまな炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、及びシアル酸、並びに二分岐型オリゴ糖構造の「幹」のＧｌｃＮＡｃに結合したフコースが含まれ得る。いくつかの実施形態では、特定の改善された性質を有する変異体を作製するために、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子内でオリゴ糖の修飾を行うことができる。一つの態様において、Ｆｃ領域に（直接又は間接的に）結合したフコースを欠く炭水化物構造を有する、本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体の変異体が提供される。このようなフコシル化変異体は、改良されたＡＤＣＣ機能を有していてもよい。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）又は米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号（Ｋｙｏｗａ Ｈａｋｋｏ Ｋｏｇｙｏ Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を参照。別の態様において、バイセクトオリゴ糖を含む、例えば、Ｆｃ領域に結合した二分枝オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃにより二分割されている、本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体の変異体が提供される。このような変異体は、フコシル化の低下及び／又はＡＤＣＣ機能の向上を有していてもよく、例えば、国際公開第２００３／０１１８７８号（Ｊｅａｎ－Ｍａｉｒｅｔ ｅｔ ａｌ．）、米国特許第６，６０２，６８４号（Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．）及び米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号（Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ）を参照のこと。Ｆｃ領域に接続したオリゴ糖中に少なくとも１つのガラクトース残基を有する変異体も提供される。このような抗体変異体は、改良されたＣＤＣ機能を有する場合があり、例えば、国際公開第１９９７／３００８７号（Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．）、国際公開第１９９８／５８９６４号（Ｒａｊｕ、Ｓ．）及び国際公開第１９９９／２２７６４号（Ｒａｊｕ、Ｓ．）に記載される。
特定の態様において、本発明の二重特異性抗原結合分子のシステイン操作された変異体、例えば、分子の１つ以上の残基がシステイン残基で置換されている「ｔｈｉｏＭＡｂ」を作製することが望ましい場合がある。具体的な態様において、置換された残基は、分子の利用しやすい部位で生じる。これらの残基をシステインと置換することによって、反応性チオール基は、抗体の接近可能な部位に位置しており、これを使用し、抗体を他の部分（例えば、薬物部分又はリンカー－薬物部分）に対して抱合させ、免疫抱合体を作製してもよい。特定の態様において、任意の１つ以上の以下の残基をシステインで置換してよい：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔ番号付け）、重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）、及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）。システイン操作された抗原結合分子は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号に記載されるように作製されてもよい。
「核酸」又は「ポリヌクレオチド」との用語は、ヌクレオチドのポリマーを含む任意の化合物及び／又は物質を含む。各ヌクレオチドは、塩基で構成され、具体的には、プリン塩基又はピリミジン塩基（すなわち、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ））、糖（すなわち、デオキシリボース又はリボース）、及びホスフェート基で構成される。多くは、核酸分子は、塩基配列によって記述され、ここで、上記塩基は、核酸分子の一次構造（線形構造）を表す。塩基の配列は、典型的には、５’から３’へと表される。ここで、核酸分子との用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、例えば、相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）及びゲノムＤＮＡ、リボ核酸（ＲＮＡ）、特に、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＤＮＡ又はＲＮＡの合成形態、及びこれらの分子の２つ以上を含む混合ポリマーを包含する。核酸分子は、線形又は環状であってもよい。これに加え、核酸分子との用語は、センス鎖及びアンチセンス鎖、及び一本鎖形態及び二本鎖形態の両方を含む。更に、本明細書で記載される核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド又は天然に存在しないヌクレオチドを含んでいてもよい。誘導体化された糖又はホスフェート骨格結合又は化学修飾された残基を含む、天然に存在しないヌクレオチドの例として、修飾されたヌクレオチド塩基が挙げられる。核酸分子は、例えば、宿主又は患者において、インビトロ及び／又はインビボで本発明の抗体の直接的な発現のためのベクターとして適したＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子も包含する。このようなＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）又はＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ベクターは、改変されていなくてもよく、又は改変されていてもよい。例えば、ｍＲＮＡは、インビボで抗体を産生するために対象にｍＲＮＡを注入することができるように、ＲＮＡベクターの安定性及び／又はコードされた分子の発現を高めるように化学修飾されてもよい。（例えば、Ｓｔａｄｌｅｒ ｅｒｔ ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１７、２０１７年６月１２日にオンラインで公開、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ．４３５６又はＥＰ ２ １０１ ８２３ Ｂ１号を参照。）
「単離」核酸とは、核酸分子が自然環境の構成要素から分離されたものを指す。単離核酸は、元々その核酸分子を含む細胞に含まれているが、その核酸分子が、染色体外に存在するか、又はその天然の染色***置とは異なる染色***置に存在する核酸分子を含む。
「二重特異性抗原結合分子又は抗体をコードする単離核酸」とは、単一ベクター又は個別のベクター内の核酸分子を含む、二重特異性抗原結合分子又は抗体の重鎖及び軽鎖（又はそのフラグメント）をコードする１つ以上の核酸分子を指し、そのような核酸分子は、宿主細胞内の１つ以上の場所に存在する。
本発明の参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも、例えば９５％「同一の」ヌクレオチド配列を有する核酸又はポリヌクレオチドとは、このポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、ポリヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチド配列の１００ヌクレオチドあたり５個までの点突然変異を含んでいてもよいことを除けば、参照配列に対して同一であることを意図している。言い換えると、参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列内のヌクレオチドの５％までが、欠失していてもよく、若しくは別のヌクレオチドで置換されていてもよく、又は参照配列内の全ヌクレオチドの５％までが、参照配列内へと挿入されていてもよい。参照配列のこれらの変更は、参照ヌクレオチド配列の５’末端位置若しくは３’末端位置で、又は、それらの末端位置の間の、参照配列内の残基間で個々の若しくは参照配列内での１つ以上の連続した基においてかのいずれかに点在しているどこかで起こってもよい。実際の様式として、任意の特定のポリヌクレオチド配列が、本発明のヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるかどうかは、既知のコンピュータプログラム、例えば、ポリペプチドについて上に記載したもの（例えば、ＡＬＩＧＮ－２）を用いて、従来通りに決定することができる。
「発現カセット」との用語は、組換えによって、又は合成によって作られるポリヌクレオチドを指し、標的細胞内の特定の核酸の転写が可能な特定の一連の核酸要素を含む。組換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルス、又は核酸フラグメントへと組み込むことができる。典型的には、発現ベクターの組換え発現カセット部分は、配列の中でも特に、転写される核酸配列と、プロモーターとを含む。特定の実施形態では、本発明の発現カセットは、本発明の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列又はそのフラグメントを含む。
用語「ベクター」又は「発現ベクター」は「発現コンストラクト」と同義であり、標的細胞中で作用可能に会合した特異的遺伝子の発現を導入及び誘導するのに使用されるＤＮＡ分子を意味する。本用語は、自己複製する核酸構造としてのベクター、及びベクターが導入された宿主細胞のゲノム内へと組み込まれたベクターを含む。本発明の発現ベクターは、発現カセットを含む。発現ベクターによって、安定したｍＲＮＡの多量の転写が可能となる。いったん発現ベクターが標的細胞内に入ると、リボ核酸分子又は遺伝子によってコードされたタンパク質は、細胞の転写機構及び／又は翻訳機構によって産生される。一実施形態では、本発明の発現ベクターは、本発明の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列又はそのフラグメントを含む発現カセットを含む。
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」、及び「宿主細胞培養」は同じ意味で用いられ、外因性核酸が導入された細胞を意味し、そのような細胞の後代を含む。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換された細胞」を含み、これらは、継代数に関わらず、初代の形質転換された細胞、及び初代の形質転換された細胞から誘導された子孫を含む。後代は、核酸含有量が親細胞と完全に同一でなくてもよいが、突然変異を含有していてもよい。元々の形質転換された細胞についてスクリーニングされるか又は選択されるのと同じ機能又は生物活性を有する突然変異体の後代は、本発明に含まれる。宿主細胞は、本発明の二重特異性抗原結合分子を生成するために使用可能な任意の種類の細胞系である。宿主細胞としては、培養細胞、例えば、哺乳動物培養細胞、例えば、ほんの数例を挙げると、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞又はハイブリドーマ細胞、酵母細胞、昆虫細胞及び植物細胞が挙げられるが、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養植物又は動物組織に含まれる細胞も含まれる。
ある薬剤の「有効量」は、その薬剤が投与される細胞又は組織において、ある生理学的変化を引き起こすのに必要な量を指す。
ある薬剤（例えば、医薬組成物）の「治療有効量」は、所望の治療結果又は予防結果を達成するのに有効な量、必要な投薬量及び必要な期間を指す。治療有効量の作用剤は、例えば、疾患の副作用を除去し、低下させ、遅延させ、最小限にし、又は予防する。
「個体」又は「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物としては、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、げっ歯類（例えば、マウス及びラット）が挙げられる。特に、個体又は対象は、ヒトである。
「医薬組成物」又は「医薬製剤」という用語は、調製物の中に含有される活性成分の生物活性が有効になるような形態であり、医薬組成物が投与されるであろう対象にとって許容できないほど有毒である追加の成分を何ら含有しない、調製物を指す。
「薬学的に許容され得る担体」は、有効成分以外の医薬組成物又は製剤中の成分であって、対象にとって非毒性である成分を指す。薬学的に許容され得る担体としては、緩衝剤、賦形剤、安定剤、又は防腐剤が挙げられるが、これらに限定されない。
「パッケージ添付文書」との用語は、治療製品の市販パッケージに通常含まれる指示を指すために用いられ、そのような治療製品に関する適応症、使用、投薬量、投与、併用療法、禁忌及び／又は警告に関する情報を含む。
本明細書で使用される場合、「処置」（及びその文法的な変形語、例えば、「処置する」又は「処置すること」）は、処置される個体において本来の経過を変える試みにおける臨床的介入を指し、予防のために、又は臨床病理の経過の間に行うことができる。処置の所望の効果としては、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の軽減、疾患の任意の直接的又は間接的な病理学的結果の減弱、転移を予防すること、疾患進行率を低下させること、病状の寛解又は緩和、及び回復又は改良された予後が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明の分子を使用して、疾患の発生を遅らせるか、又は疾患の進行を遅らせる。
「癌」との用語は、本明細書で使用される場合、増殖性疾患、例えば、リンパ腫、リンパ性白血病、肺癌、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）癌、肺胞細胞性肺癌、骨腫瘍、膵臓癌、皮膚癌、頭部又は頸部の癌、皮膚又は眼内黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門領域の癌、胃癌、消化器癌、結腸癌、乳癌、子宮癌、卵管癌腫、子宮内膜癌腫、頸部の癌腫、膣の癌腫、陰門の癌腫、ホジキン病、食道の癌、小腸癌、内分泌系の癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織の肉腫尿道の癌、陰茎癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓又は尿管の癌、腎細胞癌腫、腎盂癌腫、中皮腫、肝細胞癌、胆管癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、多形性膠芽腫、星状細胞腫、神経鞘腫、上衣腫、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮癌腫、下垂体腺腫及びユーイング肉腫（上述のいずれかの癌の難治性態様を含む）、又は上述の癌の１つ以上の組合せを指す。
「化学療法剤」とは、癌の処置において有用な化学物質を指す。一つの態様において、化学療法剤は代謝拮抗剤である。一つの態様において、代謝拮抗剤は、アミノプテリン、メトトレキセド、ペメトレキセド、ラルチトレキセド、クラドリビン、クロファラビン、フルダラビン、メルカプトプリン、ペントスタチン、チオグアニン、カペシタビン、シタラビン、フルオロウラシル、フロクスウリジン、及びゲムシタビンからなる群から選択される。１つの特定の態様において、代謝拮抗剤は、カペシタビン又はゲムシタビンである。別の態様において、代謝拮抗剤は、パクリタキセルである。一つの態様において、化学療法剤は、微小管形成に影響を与える薬剤である。一つの態様において、微小管形成に影響を与える薬剤は、パクリタキセル、ドセタキセル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン、タキソテール、エトポシド、及びテニポシドからなる群から選択される。別の態様において、化学療法剤は、シクロホスファミドなどのアルキル化剤である。一つの態様において、化学療法剤は、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤などの細胞毒性抗生物質である。一つの態様において、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤は、ドキソルビシンである。
本発明の二重特異性抗体
本発明は、新しい抗ＦＡＰ抗体（クローン２１２）を含む新規の二重特異性抗原結合分子を提供する。この新しい抗ＦＡＰ抗体を含む二重特異性抗原結合分子は、生産性、安定性、結合親和性、生物活性、標的化効率、内在化の低下、優れた薬物動態（ＰＫ）特性、毒性の低下、患者に与えられ得る投与量範囲の拡大、それによっておそらく増強された有効性など、特に有利な特性を備えている。
例示的な二重特異性抗原結合分子
一つの態様において、本発明は、ＣＤ４０への標的化されたアゴニスト結合を特徴とする二重特異性抗原結合分子を提供する。特に、二重特異性抗原結合分子は、ＦＡＰを標的とするＣＤ４０アゴニストである。別の特定の態様において、本発明の二重特異性抗原結合分子は、エフェクター機能を低下させる突然変異を含む安定した会合が可能な第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃ領域を含む。エフェクター機能を低下又は無効にする突然変異を含むＦｃ領域の使用は、Ｆｃ受容体を介した架橋による非特異的アゴニズムを防ぎ、ＣＤ４０＋細胞のＡＤＣＣを防ぐ。本明細書に記載の二重特異性抗原結合分子は、典型的には癌細胞又は腫瘍間質である標的細胞で免疫応答を選択的に誘導するという点で、ＣＤ４０に特異的に結合可能な従来の抗体に勝る利点を有する。
したがって、二重特異性抗原結合分子は、ＣＤ４０へのＦＡＰ標的アゴニスト結合によって特徴付けられる。ＦＡＰ発現細胞の存在下で、二重特異性抗原結合分子は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を活性化し、ヒトＢ細胞（実施例５．１．２）、ヒトＤａｕｄｉ細胞（実施例５．１．１）及びヒト単球由来樹状細胞（ｍｏＤＣ）を活性化することができる。
したがって、一つの態様において、提供されるのは、二重特異性抗原結合分子であって、
（ａ）ＣＤ４０に特異的に結合可能な少なくとも１つの抗原結合ドメインと、
（ｂ）（ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４、配列番号１１及び配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号６、配列番号１３及び配列番号１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合可能な少なくとも１つの抗原結合ドメインと、を含む、二重特異性抗原結合分子を提供する。
特定の態様において、提供されるのは、二重特異性抗原結合分子であって、ａ）ＣＤ４０に特異的に結合可能な少なくとも１つの抗原結合ドメインと、（ｂ）（ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに、（ｉｖ）配列番号６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合可能な少なくとも１つの抗原結合ドメインと、を含む、二重特異性抗原結合分子である。
一つの態様において、提供されるのは、二重特異性抗原結合分子であって、ＦＡＰに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、二重特異性抗原結合分子である。
別の態様において、提供されるのは、二重特異性抗原結合分子であって、ＦＡＰに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、
配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９及び配列番号２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と、
配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５及び配列番号２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）と、を含む、二重特異性抗原結合分子である。
一つの態様において、二重特異性抗原結合分子が、
（ａ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、
（ｂ）配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、
（ｃ）配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は
（ｄ）配列番号１９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む。
特定の態様において、二重特異性抗原結合分子は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む。
別の態様において、提供されるのは、ＣＤ４０に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、（ｉ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）、並びに、（ｉｖ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）を含む、二重特異性抗原結合分子である。
更なる態様において、提供されるのは、二重特異性抗原結合分子であって、ＣＤ４０に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、
（ｉ）配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９及び配列番号４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）と、
（ｉｉ）配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、及び配列番号４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）と、を含む、二重特異性抗原結合分子である。
一つの態様において、提供されるのは、二重特異性抗原結合分子であって、ＣＤ４０に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、
（ａ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４１のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｂ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４２のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｃ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４３のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｄ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４４のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｅ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４１のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｆ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４２のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｇ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４３のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｈ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４４のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｉ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４１のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｊ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４２のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｋ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４３のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｌ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４４のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｍ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４１のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｎ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４２のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｏ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４３のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｐ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４４のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、本明細書で以前に定義された二重特異性抗原結合分子である。
特定の態様において、二重特異性抗原結合分子が、ＣＤ４０に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号３７のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４１のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
更なる態様において、提供されるのは、二重特異性抗原結合分子であって、ＣＤ４０に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、
（ｉ）配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９及び配列番号５０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）と、
（ｉｉ）配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、及び配列番号５４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）と、を含む、前に本明細書で定義された二重特異性抗原結合分子である。
一つの態様において、提供されるのは、二重特異性抗原結合分子であって、ＣＤ４０に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、
（ａ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号５１のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｂ）配列番号４６のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号５１のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｃ）配列番号４７のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号５１のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｄ）配列番号４８のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号５１のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｅ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号５２のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｆ）配列番号４６のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号５２のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｇ）配列番号４７のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号５２のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｈ）配列番号４８のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号５２のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｉ）配列番号４９のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号５３のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｊ）配列番号５０のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号５３のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｋ）配列番号４９のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号５４のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｌ）配列番号５０のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号５４のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、二重特異性抗原結合分子である。
特定の態様において、提供されるのは、二重特異性抗原結合分子であって、（ｉ）少なくとも１つのＣＤ４０に特異的に結合可能な抗原結合ドメインであり、配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）及び配列番号４１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）を含む抗原結合ドメインと、（ｉｉ）ＦＡＰに特異的に結合可能な少なくとも１つの抗原結合ドメインであり、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む抗原結合ドメインと、を含む、二重特異性抗原結合分子である。
ＣＤ４０及びＦＡＰに結合する二重特異性抗原結合分子
別の態様において、提供されるのは、二重特異性抗原結合分子であって、
（ｉ）ＣＤ４０に特異的に結合可能な少なくとも１つの抗原結合ドメインであり、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９及び配列番号４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）、及び配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、及び配列番号４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）を含む、抗原結合ドメインと、
（ｉｉ）ＦＡＰに特異的に結合可能な少なくとも１つの抗原結合ドメインであり、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９及び配列番号２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号１９及び配列番号２０、並びに配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５及び配列番号２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む抗原結合ドメインと、を含む、二重特異性抗原結合分子である。
更なる態様において、提供されるのは、二重特異性抗原結合分子であって、
（ｉ）ＣＤ４０に特異的に結合可能な少なくとも１つの抗原結合ドメインであり、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９及び配列番号５０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）、及び配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、及び配列番号５４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）を含む抗原結合ドメインと、
（ｉｉ）ＦＡＰに特異的に結合可能な少なくとも１つの抗原結合ドメインであり、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９及び配列番号２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号１９及び配列番号２０、並びに配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５及び配列番号２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む抗原結合ドメインと、を含む、二重特異性抗原結合分子である。
特定の態様において、提供されるのは、二重特異性抗原結合分子であって、
（ｉ）ＣＤ４０に特異的に結合可能な少なくとも１つの抗原結合ドメインであり、配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）及び配列番号４１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）を含む抗原結合ドメインと、
（ｉｉ）ＦＡＰに特異的に結合可能な少なくとも１つの抗原結合ドメインであり、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９及び配列番号２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５及び配列番号２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む抗原結合ドメインと、を含む、二重特異性抗原結合分子である。
別の態様において、提供されるのは、二重特異性抗原結合分子であって、
（ｉ）ＣＤ４０に特異的に結合可能な少なくとも１つの抗原結合ドメインであり、配列番号４５及び配列番号４８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）及び配列番号５１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）を含む抗原結合ドメインと、
（ｉｉ）ＦＡＰに特異的に結合可能な少なくとも１つの抗原結合ドメインであり、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９及び配列番号２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５及び配列番号２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む抗原結合ドメインと、を含む、二重特異性抗原結合分子である。
更なる態様において、提供されるのは、二重特異性抗原結合分子であって、
（ｉ）ＣＤ４０に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９及び配列番号４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）、及び配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、及び配列番号４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）を含み、
（ｉｉ）ＦＡＰに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号１５アミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ、及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、二重特異性抗原結合分子である。
更に、提供されるのは、二重特異性抗原結合分子であって、
（ｉ）ＣＤ４０に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９及び配列番号５０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）、及び配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、及び配列番号５４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）を含み、
（ｉｉ）ＦＡＰに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号１５アミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ、及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、二重特異性抗原結合分子である。
特定の態様において、提供されるのは、二重特異性抗原結合分子であって、（ｉ）少なくとも１つのＣＤ４０に特異的に結合可能な抗原結合ドメインであり、配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）及び配列番号４１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）を含む抗原結合ドメインと、（ｉｉ）ＦＡＰに特異的に結合可能な少なくとも１つの抗原結合ドメインであり、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む抗原結合ドメインと、を含む、二重特異性抗原結合分子である。
二重特異性の一価抗原結合分子（１＋１フォーマット）
一つの態様において、本発明は、
（ａ）ＣＤ４０に特異的に結合可能な１つの抗原結合ドメインと、
（ｂ）（ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４、配列番号１１及び配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号６、配列番号１３及び配列番号１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合可能な１つの抗原結合ドメインと、
（ｃ）安定した会合が可能な第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと、を含む、二重特異性抗原結合分子に関する。
１つの特定の態様において、提供されるのは、二重特異性抗原結合分子であって、上記分子が、（ａ）ＣＤ４０に特異的に結合可能な第１のＦａｂフラグメントと、（ｂ）（ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４、配列番号１１及び配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに、（ｉｖ）配列番号６、配列番号１３及び配列番号１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、ＦＡＰに特異的に結合可能な第２のＦａｂフラグメントと、（ｃ）安定した会合が可能な第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと、を含む分子である、二重特異性抗原結合分子である。
１つの特定の態様において、本発明は、（ａ）配列番号６３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号９８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、配列番号６１のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号６２のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む、二重特異性抗原結合分子を提供する。
ＣＤ４０に結合するために二価であり、標的細胞抗原に結合するために一価である二重特異性抗原結合分子（２＋１フォーマット）
別の態様において、本発明は、
（ａ）ＣＤ４０に特異的に結合可能な２つの抗原結合ドメインと、
（ｂ）ＦＡＰに特異的に結合可能な１つの抗原結合ドメインであって、（ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４、配列番号１１及び配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに、（ｉｖ）配列番号６、配列番号１３及び配列番号１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む１つの抗原結合ドメインと、
（ｃ）安定した会合が可能な第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと、を含む、二重特異性抗原結合分子を提供する。
したがって、提供されるのは二重特異性抗原結合分子であり、二重特異性抗原結合分子は、ＣＤ４０に二価で結合し、ＦＡＰに一価で結合する。
一つの態様において、二重特異性抗原結合分子が、
（ａ）ＣＤ４０及びＦｃドメインに特異的に結合可能な２つのＦａｂフラグメントを含む抗体の２つの軽鎖と２つの重鎖と、
（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合可能なＶＨ及びＶＬドメインであって、ＶＨドメイン及びＶＬドメインが、それぞれ、ペプチドリンカーを介して２つの重鎖のＣ末端の１つに連結されている、ＶＨ及びＶＬドメインと、を含む。
更なる態様において、提供されるのは、二重特異性抗原結合分子であって、
（ａ）２つの重鎖であって、各重鎖が、ＣＤ４０に特異的に結合可能なＦａｂフラグメントのＶＨ及びＣＨ１ドメイン、及びＦｃ領域サブユニットを含む、２つの重鎖と、
（ｂ）２つの軽鎖であって、各軽鎖が、ＣＤ４０に特異的に結合可能なＦａｂフラグメントのＶＬ及びＣＬドメインを含む、２つの軽鎖と、
（ｃ）ＦＡＰに特異的に結合可能なクロスＦａｂフラグメントであって、ＶＬ－ＣＨ１鎖及びＶＨ－ＣＬ鎖を含み、ＶＨ－ＣＬ鎖が、（ａ）の２つの重鎖のうちの１つのＣ末端に連結したクロスＦａｂフラグメントと、を含む、二重特異性抗原結合分子を提供する。
一つの態様において、ＶＨ－ＣＬ（ＶＨ－Ｃカッパ）鎖は、Ｆｃノブ重鎖のＣ末端に連結している。
別の態様において、提供されるのは、二重特異性抗原結合分子であって、
（ａ）２つの重鎖であって、各重鎖が、ＣＤ４０に特異的に結合可能なＦａｂフラグメントのＶＨ及びＣＨ１ドメイン、及びＦｃ領域サブユニットを含む、２つの重鎖と、
（ｂ）２つの軽鎖であって、各軽鎖が、ＣＤ４０に特異的に結合可能なＦａｂフラグメントのＶＬ及びＣＬドメインを含む、２つの軽鎖と、
（ｃ）ＦＡＰに特異的に結合可能なクロスＦａｂフラグメントであって、ＶＬ－ＣＨ１鎖及びＶＨ－ＣＬ鎖を含み、ＶＬ－ＣＨ１鎖が、（ａ）の２つの重鎖のうちの１つのＣ末端に連結したクロスＦａｂフラグメントと、を含む、二重特異性抗原結合分子である。
一つの態様において、ＶＬ－ＣＨ１鎖は、Ｆｃノブ重鎖のＣ末端に連結している。
一つの態様において、本発明は、
（ａ）それぞれが配列番号６２のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号６１のアミノ酸配列を含む１つの軽鎖、配列番号６３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号６４のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、又は
（ｂ）それぞれが配列番号６６のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号６５のアミノ酸配列を含む１つの軽鎖、配列番号６７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号６８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む、二重特異性抗原結合分子を提供する。
一つの態様において、本発明は、
（ａ）それぞれが配列番号６２のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号６１のアミノ酸配列を含む１つの軽鎖、配列番号６３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号６４のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、を含む、二重特異性抗原結合分子を提供する。
ヘッドトゥーテールフォーマットの二重特異性抗原結合分子（２＋１）
別の態様において、提供されるのは、二重特異性抗原結合分子であって、
（ａ）ＣＤ４０に特異的に結合可能なＦａｂフラグメントのＶＨ及びＣＨ１ドメイン、及びＦｃ領域サブユニットを含む、重鎖と、
（ｂ）ＣＤ４０に特異的に結合可能なＦａｂフラグメントのＶＨ及びＣＨ１ドメイン、並びにＦＡＰ及びＦｃ領域サブユニットに特異的に結合可能なＦａｂフラグメントのＶＬ及びＣＨ１ドメインを含む、重鎖と、
（ｃ）各軽鎖が、ＣＤ４０に特異的に結合可能なＦａｂフラグメントのＶＬ及びＣＬドメインを含む、２つの軽鎖と、
（ｄ）ＦＡＰに特異的に結合可能なＦａｂフラグメントのＶＨ及びＣＬドメインを含む軽鎖と、を含む、二重特異性抗原結合分子である。
ＣＤ４０に結合するために二価であり、標的細胞抗原に結合するために二価である二重特異性抗原結合分子（２＋２フォーマット）
別の態様において、本発明は、
（ａ）ＣＤ４０に特異的に結合可能な２つの抗原結合ドメインと、
（ｂ）ＦＡＰに特異的に結合可能な２つの抗原結合ドメインであって、（ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４、配列番号１１及び配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、並びに、（ｉｖ）配列番号６、配列番号１３及び配列番号１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む２つの抗原結合ドメインと、
（ｃ）安定した会合が可能な第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと、を含む、二重特異性抗原結合分子を提供する。
したがって、提供されるのは二重特異性抗原結合分子であり、二重特異性抗原結合分子は、ＣＤ４０に二価で結合し、ＦＡＰに二価で結合する。
一つの態様において、提供されるのは、二重特異性抗原結合分子であって、二重特異性抗原結合分子は、
（ａ）２つの重鎖であって、各重鎖が、ＣＤ４０に特異的に結合可能なＦａｂフラグメントのＶＨ及びＣＨ１ドメイン、及びＦｃ領域サブユニットを含む、２つの重鎖と、
（ｂ）２つの軽鎖であって、各軽鎖が、ＣＤ４０に特異的に結合可能なＦａｂフラグメントのＶＬ及びＣＬドメインを含む、２つの軽鎖と、
（ｃ）ＦＡＰに特異的に結合可能な２つのＦａｂフラグメントであって、１つのＦａｂフラグメントが、（ａ）の２つの重鎖の１つのＣ末端に連結し、もう１つのＦａｂフラグメントが、（ａ）の２つの重鎖のもう一方のＣ末端に連結している、Ｆａｂフラグメントと、を含む、二重特異性抗原結合分子である。
ＣＤ４０に結合するために四価であり、標的細胞抗原に結合するために一価である二重特異性抗原結合分子（４＋１フォーマット）
別の態様において、本発明は、
（ａ）ＣＤ４０に特異的に結合可能な４つの抗原結合ドメインと、
（ｂ）ＦＡＰに特異的に結合可能な１つの抗原結合ドメインであって、（ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４、配列番号１１及び配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、並びに、（ｉｖ）配列番号６、配列番号１３及び配列番号１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む２つの抗原結合ドメインと、
（ｃ）安定した会合が可能な第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと、を含む、二重特異性抗原結合分子を提供する。
したがって、提供されるのは二重特異性抗原結合分子であり、二重特異性抗原結合分子は、ＣＤ４０に四価で結合し、ＦＡＰに一価で結合する。
一つの態様において、提供されるのは、二重特異性抗原結合分子であって、ＣＤ４０に特異的に結合可能な４つの抗原結合ドメインがＦａｂフラグメントであり、それらの各２つが、必要に応じてペプチドリンカーを介して重鎖で互いに融合される二重特異性抗原結合分子である。特定の態様において、ペプチドリンカーは配列番号８３のアミノ酸配列を含む。より具体的には、抗原結合分子は、それぞれＶＨＣＨ１－ペプチドリンカー－ＶＨＣＨ１フラグメントを含む２つの重鎖を含む。特定の態様において、ペプチドリンカーは配列番号８３のアミノ酸配列を有する。
特定の態様において、二重特異性抗原結合分子が、
（ａ）４つの軽鎖であって、各軽鎖が、ＣＤ４０に特異的に結合可能なＦａｂフラグメントのＶＬ及びＣＬドメインを含む、４つの軽鎖と、
（ｂ）２つの重鎖であって、各重鎖が、ＣＤ４０に特異的に結合可能な第２のＦａｂフラグメントのＶＨ及びＣＨ１ドメインに融合したＣＤ４０に特異的に結合できるＦａｂフラグメントのＶＨ及びＣＨ１ドメイン、及びＦｃ領域サブユニットを含む重鎖と、
（ｃ）ＦＡＰに特異的に結合可能なクロスＦａｂフラグメントであって、ＶＨドメインが、ペプチドリンカーを介して重鎖の１つのＣ末端に連結している、クロスＦａｂフラグメントと、を含む。
別の態様において、二重特異性抗原結合分子が、
（ａ）４つの軽鎖であって、各軽鎖が、ＣＤ４０に特異的に結合可能なＦａｂフラグメントのＶＬ及びＣＬドメインを含む、４つの軽鎖と、
（ｂ）２つの重鎖であって、各重鎖が、ＣＤ４０に特異的に結合可能な第２のＦａｂフラグメントのＶＨ及びＣＨ１ドメインに融合したＣＤ４０に特異的に結合できるＦａｂフラグメントのＶＨ及びＣＨ１ドメイン、及びＦｃ領域サブユニットを含む重鎖と、
（ｃ）ＦＡＰに特異的に結合可能なクロスＦａｂフラグメントであって、ＶＬドメインが、ペプチドリンカーを介して重鎖の１つのＣ末端に連結している、クロスＦａｂフラグメントと、を含む。
特定の態様において、ペプチドリンカーは、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８７及び配列番号８８から選択されるアミノ酸配列を含む。より具体的には、ペプチドリンカーは、配列番号８３を含む。
特定の態様において、本発明は、
（ａ）それぞれが配列番号６２のアミノ酸配列を含む４つの軽鎖、配列番号６１のアミノ酸配列を含む１つの軽鎖、配列番号６９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号７０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む、二重特異性抗原結合分子を提供する。
ＣＤ４０に結合するための四価であり、標的細胞抗原に結合するために二価である二重特異性抗原結合分子（４＋２フォーマット）
別の態様において、本発明は、
（ａ）ＣＤ４０に特異的に結合可能な４つの抗原結合ドメインと、
（ｂ）ＦＡＰに特異的に結合可能な２つの抗原結合ドメインであって、
（ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４、配列番号１１及び配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、並びに、（ｉｖ）配列番号６、配列番号１３及び配列番号１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む２つの抗原結合ドメインと、
（ｃ）安定した会合が可能な第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと、を含む、二重特異性抗原結合分子を提供する。
したがって、提供されるのは二重特異性抗原結合分子であり、二重特異性抗原結合分子は、ＣＤ４０に四価で結合し、ＦＡＰに二価で結合する。
一つの態様において、提供されるのは、二重特異性抗原結合分子であって、ＣＤ４０に特異的に結合可能な４つの抗原結合ドメインがＦａｂフラグメントであり、それらの各２つが、必要に応じてペプチドリンカーを介して、互いに融合される二重特異性抗原結合分子である。特定の態様において、ペプチドリンカーは配列番号８３のアミノ酸配列を含む。より具体的には、抗原結合分子は、それぞれＶＨＣＨ１－ペプチドリンカー－ＶＨＣＨ１フラグメントを含む２つの重鎖を含む。特定の態様において、ペプチドリンカーは配列番号８３のアミノ酸配列を有する。
別の態様において、二重特異性抗原結合分子が提供され、標的細胞抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、Ｆａｂフラグメントであり、第１のＦａｂフラグメントが、ペプチドリンカーを介して第１のサブユニットのＣ末端に連結し、第２のＦａｂフラグメントが、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣ末端に連結している。一つの態様において、標的細胞抗原に特異的に結合可能な２つのＦａｂフラグメントは、それぞれがＶＬ－ＣＨ１鎖及びＶＨ－ＣＬ鎖を含み、ＶＬ－ＣＨ１鎖が、２つの重鎖のうちの１つのＣ末端に連結したクロスオーバーＦａｂフラグメントである。
Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能を下げるＦｃドメイン改変
本発明の二重特異性抗原結合分子は、安定した会合が可能な、第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを更に含む。
特定の態様において、１つ以上のアミノ酸改変は、本明細書で提示される抗体のＦｃ領域に導入されてもよく、それにより、Ｆｃ領域変異体を作製する。Ｆｃ領域変異体は、１つ以上のアミノ酸位置にアミノ酸修飾（例えば、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４ Ｆｃ領域）を含み得る。
Ｆｃドメインは、本発明の二重特異性抗体に、標的組織への良好な蓄積に寄与する長い血清半減期、望ましい組織－血液分布比を含め、望ましい薬物動態特性を与える。しかし、同時に、好ましい抗原を含む細胞ではなく、Ｆｃ受容体を発現する細胞に対する本発明の二重特異性抗体の望ましくない標的化を引き起こす場合がある。したがって、具体的な実施形態では、本発明の二重特異性抗体のＦｃドメインは、ネイティブＩｇＧ Ｆｃドメイン、特に、ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４ ドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低下及び／又はエフェクター機能の低下を示す。より具体的には、ＦｃドメインはＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。
１つのこのような態様において、Ｆｃドメイン（又は上記Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子）は、ネイティブＩｇＧ１ Ｆｃドメイン（又はネイティブＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子）と比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の５０％未満、好ましくは２０％未満、より好ましくは１０％未満、最も好ましくは５％未満の結合親和性を示し、及び／又はネイティブＩｇＧ１ Ｆｃドメイン（又はネイティブＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子）と比較して、５０％未満、好ましくは２０％未満、より好ましくは１０％未満、最も好ましくは５％未満のエフェクター機能を示す。一つの態様において、Ｆｃドメイン（又は上記Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子）は、Ｆｃ受容体に実質的に結合せず、及び／又はエフェクター機能を誘発しない。特定の態様において、Ｆｃ受容体は、Ｆｃγ受容体である。一つの態様において、Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃ受容体である。一つの態様において、Ｆｃ受容体は、活性化Ｆｃ受容体である。具体的な態様において、Ｆｃ受容体は、活性化ヒトＦｃγ受容体であり、より特定的には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａであり、最も特定的には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａである。一つの態様において、Ｆｃ受容体は、阻害性Ｆｃ受容体である。具体的な態様では、Ｆｃ受容体は、阻害性ヒトＦｃγ受容体、より特定的には、ヒトＦｃγＲＩＩＢである。一つの態様において、エフェクター機能は、１つ以上のＣＤＣ、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ及びサイトカイン分泌である。特定の態様において、エフェクター機能は、ＡＤＣＣである。一つの態様において、Ｆｃドメインのドメインは、ネイティブＩｇＧ１ Ｆｃドメインと比較して、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対して実質的に同様の結合親和性を示す。ＦｃＲｎに対する実質的に同様の結合は、Ｆｃドメイン（又は上記Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子）が、ネイティブＩｇＧ１ Ｆｃドメイン（又はネイティブＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子）と比較して、ＦｃＲｎに対して約７０％より大きく、特に約８０％より大きく、より具体的には約９０％より大きい結合親和性を示す場合に達成される。
特定の態様において、Ｆｃドメインは、操作されていないＦｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性が低下し、及び／又はエフェクター機能が低下するように操作される。特定の態様において、本発明の二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性及び／又はエフェクター機能を下げる１つ以上のアミノ酸変異を含む。典型的には、Ｆｃドメインの２つのサブユニットそれぞれに、同じ１つ以上のアミノ酸変異が存在する。一つの態様において、アミノ酸変異は、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性を下げる。別の態様において、アミノ酸変異は、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性を、少なくとも２分の１、少なくとも５分の１、又は少なくとも１０分の１に下げる。一つの態様において、操作されたＦｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子は、操作されていないＦｃドメインを含む本発明の二重特異性抗体と比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の２０％未満、特に１０％未満、より具体的には５％未満を示す。特定の態様において、Ｆｃ受容体は、Ｆｃγ受容体である。別の態様において、Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃ受容体である。一つの態様において、Ｆｃ受容体は、阻害性Ｆｃ受容体である。具体的な態様において、Ｆｃ受容体は、阻害性ヒトＦｃγ受容体、より特定的には、ヒトＦｃγＲＩＩＢである。いくつかの態様において、Ｆｃ受容体は、活性化Ｆｃ受容体である。具体的な態様において、Ｆｃ受容体は、活性化ヒトＦｃγ受容体であり、より特定的には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａであり、最も特定的には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａである。好ましくは、これらそれぞれの受容体に対する結合が低下する。いくつかの態様において、相補性構成要素に対する結合親和性（特定的にはＣ１ｑに対する結合親和性）も低下する。一つの態様において、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する結合親和性は、低下しない。ＦｃＲｎに対する実質的に同様の結合（すなわち、上記受容体に対するＦｃドメインの結合親和性の保護）は、Ｆｃドメイン（又は上記Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子）が、ＦｃＲｎに対するＦｃドメインの操作されていない形態（又はＦｃのこの操作されていない形態を含む本発明の二重特異性抗原結合分子）の結合親和性の約７０％を超える結合親和性を示す場合に達成される。Ｆｃドメイン、又は上記Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子は、このような親和性の約８０％より大きく、更に約９０％より大きい親和性を示してもよい。特定の実施形態では、本発明の二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、操作されていないＦｃドメインと比較して、エフェクター機能が低下するように操作される。エフェクター機能の低下としては、限定されないが、以下のうちの１つ以上が挙げられる：補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の低下、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の低下、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＰ）の低下、サイトカイン分泌の低下、抗原提示細胞による免疫複合体を介した抗原取り込みの低下、ＮＫ細胞への結合の低下、マクロファージへの結合の低下、単球への結合の低下、多形核細胞への結合の低下、アポトーシスを誘導する直接シグナル伝達の低下、樹状細胞の成熟の低下、又は減少したＴ細胞プライミング。
エフェクター機能が低下した抗体としては、Ｆｃ領域の残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９の１つ以上の置換を有するものが挙げられる（米国特許第６，７３７，０５６号）。このようなＦｃ変異体としては、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７のうち２つ以上での置換を有するＦｃ変異体が挙げられ、残基２６５及び２９７がアラニンに置換されている、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含む（米国特許第７，３３２，５８１号）。ＦｃＲに対する結合が向上又は減少した特定の抗体変異体が記載される。（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号、国際公開第２００４／０５６３１２号及びＳｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（２００１）６５９１－６６０４。）
本発明の一つの態様において、Ｆｃドメインは、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、Ｐ３３１及びＰ３２９の位置にアミノ酸置換を含む。いくつかの態様において、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（「ＬＡＬＡ」）を含む。１つのこのような実施形態では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。一つの態様において、Ｆｃドメインは、位置Ｐ３２９にアミノ酸置換を含む。より具体的な態様において、アミノ酸置換は、Ｐ３２９Ａ又はＰ３２９Ｇ、特にＰ３２９Ｇである。一実施形態では、Ｆｃドメインは、位置Ｐ３２９にアミノ酸置換を含み、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ又はＰ３３１Ｓからなる群から選択される更なるアミノ酸置換を含む。より特定的な実施形態では、Ｆｃドメインは、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含む（「Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」）。アミノ酸置換の「Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」の組み合わせは、ＰＣＴ特許出願国際公開第２０１２／１３０８３１Ａ１号に記載されるように、ヒトＩｇＧ１ ＦｃドメインのＦｃγ受容体の結合をほとんど完全になくす。文書はまた、このような変異体Ｆｃドメインを調製する方法及びＦｃ受容体の結合又はエフェクター機能などの特性を決定する方法も記載する。このような抗体は、突然変異Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ、又は突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを有するＩｇＧ１である（ＥＵ ｉｎｄｅｘ ｏｆ Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ，Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１による番号付け）。
一つの態様において、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。より具体的な実施形態では、Ｆｃドメインは、位置Ｓ２２８にアミノ酸置換、特にアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含むＩｇＧ４ Ｆｃドメインである（Ｋａｂａｔ番号付け）。より具体的な実施形態では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３５Ｅ及びＳ２２８Ｐ及びＰ３２９Ｇを含む、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。このアミノ酸置換は、インビボでのＩｇＧ４抗体のＦａｂアーム交換を減らす（Ｓｔｕｂｅｎｒａｕｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ ３８，８４－９１（２０１０）を参照）。
半減期が長くなり、新生児Ｆｃ受容体に対する結合が向上した抗体は、胎児に対する成熟ＩｇＧの移動を担い（Ｇｕｙｅｒ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７（１９７６）５８７－５９３及びＫｉｍ，Ｊ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４（１９９４）２４２９－２４３４）、米国特許出願公開第２００５／００１４９３４号に記載されている。これらの抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を向上する１つ以上の置換基を有するＦｃ領域を含む。かかるＦｃ変異体は、１つ以上のＦｃ領域残基：２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４又は４３４のうち１つ以上における置換、例えばＦｃ領域残基４３４の置換を伴うものを含む（米国特許第７，３７１，８２６号）。Ｆｃ領域変異体の他の例に関して、Ｄｕｎｃａｎ，Ａ．Ｒ．及びＷｉｎｔｅｒ，Ｇ．、Ｎａｔｕｒｅ ３２２（１９８８）７３８－７４０；米国特許第５，６４８，２６０号；米国特許第５，６２４，８２１号；及び国際公開第９４／２９３５１号も参照。
Ｆｃ受容体に対する結合は、例えば、ＥＬＩＳＡによって、又はＢＩＡｃｏｒｅ装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などの標準的な装置と組換え発現によって得られ得るＦｃ受容体を用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、容易に決定することができる。適切なこのような結合アッセイを本明細書に記載する。又は、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメイン又はＦｃドメインを含む細胞活性化二重特異性抗原結合分子の結合親和性は、特定のＦｃ受容体を発現することが知られている細胞株（例えば、ＦｃγＩＩＩａ受容体を発現するヒトＮＫ細胞）を用いて評価されてもよい。Ｆｃドメイン、又はＦｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子のエフェクター機能は、当該技術分野において既知の方法により測定することができる。ＡＤＣＣを測定するのに適したアッセイを本明細書に記載する。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの他の例は、米国特許第５，５００，３６２号、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８３，７０５９－７０６３（１９８６）及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８２，１４９９－１５０２（１９８５）、米国特許第５，８２１，３３７号、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １６６，１３５１－１３６１（１９８７）に記載される。あるいは、非放射性アッセイ方法を使用してもよい（例えば、フローサイトメトリー（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）のためのＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞毒性アッセイ、及びＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞毒性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ））。かかるアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核球（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ：ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ：ＮＫ）細胞が挙げられる。これに代えて、又は更に、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、インビボで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５，６５２－６５６（１９９８）に開示されるような動物モデルにおいて評価されてもよい。
以下の章は、Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能を低下させるＦｃドメイン改変を含む、本発明の二重特異性抗原結合分子の好ましい態様を記載する。一つの態様において、本発明は、二重特異性抗原結合分子（ａ）ＣＤ４０に特異的に結合可能な少なくとも１つの抗原結合ドメイン、（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合可能な少なくとも１つの抗原結合ドメイン、（ｃ）安定した会合が可能な、第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインであって、Ｆｃドメインが、Ｆｃ受容体、特にＦｃγ受容体に対する抗体の結合親和性を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む、Ｆｃドメイン、に関する。別の態様において、本発明は、（ａ）ＣＤ４０に特異的に結合可能な少なくとも１つの抗原結合ドメイン、（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合可能な少なくとも１つの抗原結合ドメイン、及び（ｃ）安定した会合が可能な、第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを含み、Ｆｃドメインが、エフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む、二重特異性抗原結合分子に関する。特定の態様において、Ｆｃドメインは、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）を有する、ヒトＩｇＧ１サブクラスのＦｃドメインである。
ヘテロ二量体化を促進するＦｃドメイン改変
本発明の二重特異性抗原結合分子は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの片方又はもう一方に融合した異なる抗原結合部位を含み、そのため、Ｆｃドメインの２つのサブユニットは、２つの非同一ポリペプチド鎖に含まれていてもよい。これらのポリペプチドの組換え同時発現及びその後の二量化によって、２つのポリペプチドのいくつかの可能な組み合わせが生じる。組換え産生における本発明の二重特異性抗原結合分子の収率及び純度を高めるために、本発明の二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインに、所望なポリペプチドの会合を促進する改変を導入することが有利である。
したがって、具体的な態様において、本発明は、（ａ）ＣＤ４０に特異的に結合可能な少なくとも１つの抗原結合ドメイン、（ｂ）ＦＡＰに特異的に結合可能な少なくとも１つの抗原結合ドメイン、及び（ｃ）安定した会合が可能な、第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを含み、Ｆｃドメインが、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾を含む、二重特異性抗原結合分子に関する。ヒトＩｇＧ Ｆｃドメインの２つのサブユニット間の最も長いタンパク質－タンパク質相互作用の部位は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメイン内にある。したがって、一つの態様において、上記改変は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインの中にある。
具体的な態様において、上記改変は、いわゆる「ノブ・イントゥ・ホール」改変であり、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの１つに「ノブ」改変と、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの他の１つに「ホール」改変とを含む。したがって、本発明は、（ａ）ＣＤ４０に特異的に結合可能な少なくとも１つの抗原結合ドメインと、（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合可能な少なくとも１つの抗原結合ドメインと、（ｃ）安定した会合が可能な第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインであって、Ｆｃドメインの第１のサブユニットはノブを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、ノブから穴への方法によるホールを含む、Ｆｃドメインと、を含む、二重特異性抗原結合分子に関する。特定の態様において、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ（ＥＵ番号付け）を含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ及びＹ４０７Ｖを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
ノブ・イントゥ・ホール技術は、例えば、米国特許第５，７３１，１６８号、米国特許第７，６９５，９３６号、Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ ９，６１７－６２１（１９９６）及びＣａｒｔｅｒ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ ２４８，７－１５（２００１）に記載される。一般的に、この方法は、第１のポリペプチドの界面にある突起（「ノブ」）と、第２のポリペプチドの界面にある空洞（「ホール」）とを導入することを含み、その結果、突起が、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨害するように空洞内に位置することができる。突起は、第１のポリペプチドの界面からの小さなアミノ酸側鎖を、より大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）と交換することによって構築される。突起と同一又は同様の大きさの相補性空洞が、大きなアミノ酸側鎖を、より小さなアミノ酸側鎖（例えば、アラニン又はトレオニン）と置き換えることによって、第２のポリペプチドの界面に作られる。
したがって、一つの態様において、本発明の二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基は、より大きな側鎖容積を有するアミノ酸残基と置き換わり、それによって、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の空洞内で位置換え可能な第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に突起を生成し、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基は、より小さな側鎖容積を有するアミノ酸残基と置き換わり、それによって、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に空洞を生成し、その中で、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の突起が位置換え可能である。突起及び空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を変えることによって、例えば、部位特異的変異導入法によって、又はペプチド合成によって作り出すことができる。具体的な態様において、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、位置３６６のトレオニン残基が、トリプトファン残基と置き換わっており（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニット（のＣＨ３ドメイン）において、位置４０７のチロシン残基は、バリン残基と置き換わっている（Ｙ４０７Ｖ）。一つの態様において、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、更に、位置３６６のトレオニン残基が、セリン残基と置き換わっており（Ｔ３６６Ｓ）、位置３６８のロイシン残基が、アラニン残基と置き換わっている（Ｌ３６８Ａ）。
なお更なる態様において、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、更に、位置３５４のセリン残基が、システイン残基と置き換わっており（Ｓ３５４Ｃ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、更に、位置３４９のチロシン残基が、システイン残基と置き換わっている（Ｙ３４９Ｃ）。これら２つのシステイン残基の導入によって、Ｆｃドメインの２つのサブユニット間にジスルフィド架橋が生成し、二量体を更に安定化する（Ｃａｒｔｅｒ（２００１），Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８，７－１５）。特定の態様において、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ（ＥＵ番号付け）を含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ及びＹ４０７Ｖを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
代替的な態様において、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する改変は、例えば、ＰＣＴ出願国際公開第２００９／０８９００４号に記載されるように、静電操縦効果に介在する改変を含む。一般的に、この方法は、２つのＦｃドメインサブユニットの界面に、ホモ二量体生成が静電的に望ましくないが、ヘテロ二量化が静電的に望ましいように、帯電したアミノ酸残基による１つ以上のアミノ酸残基の置き換えを含む。
本明細書に報告されるような二重特異性抗体の重鎖のＣ末端は、アミノ酸残基ＰＧＫで終わる完全なＣ末端であってもよい。重鎖のＣ末端は、Ｃ末端アミノ酸残基のうち１つ又は２つが除去された、短くなったＣ末端であってもよい。好ましい一つの態様において、重鎖のＣ末端は、ＰＧで終わる短くなったＣ末端である。一つの態様において、本明細書に報告される全ての態様のうちの１つの態様において、本明細書に明記されるＣ末端のＣＨ３ドメインを含む重鎖を含む二重特異性抗体は、Ｃ末端グリシン－リシンジペプチドを含む（Ｇ４４６及びＫ４４７、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。本明細書に報告される全ての態様のうちの１つの態様において、本明細書に明記されるＣ末端のＣＨ３ドメインを含む重鎖を含む二重特異性抗体は、Ｃ末端グリシン残基を含む（Ｇ４４６、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
Ｆａｂドメイン内の改変
一つの態様において、本発明は、（ａ）ＣＤ４０に特異的に結合可能な第１のＦａｂフラグメントと、（ｂ）ＦＡＰに特異的に結合可能な第２のＦａｂフラグメントと、（ｃ）安定した会合が可能な第１及び第２のサブユニットで構成されたＦｃドメインとを含み、Ｆａｂフラグメントの１つにおいて、可変ドメインＶＨ及びＶＬ又は定常ドメインＣＨ１及びＣＬのいずれかが交換される、二重特異性抗原結合分子に関する。二重特異性抗体は、Ｃｒｏｓｓｍａｂ技術に従って調製される。
１つの結合アームにドメインの置き換え／交換を有する多特異性抗体（ＣｒｏｓｓＭａｂＶＨ－ＶＬ又はＣｒｏｓｓＭａｂＣＨ－ＣＬ）は、国際公開第２００９／０８０２５２号及びＳｃｈａｅｆｅｒ，Ｗ．ｅｔ ａｌ、ＰＮＡＳ、１０８（２０１１）１１１８７－１１９１に記載される。これらの多特異性抗体は、明確に、第１の抗原に対する軽鎖と、第２の抗原に対する誤った重鎖のミスマッチにより生じる副産物を減らす（このようなドメインの置き換えがない手法と比較した場合）。
一つの態様において、本発明は、（ａ）ＣＤ４０に特異的に結合可能な第１のＦａｂフラグメントと、（ｂ）ＦＡＰに特異的に結合可能な第２のＦａｂフラグメントと、（ｃ）安定した会合が可能な第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインとを含み、Ｆａｂフラグメントの１つにおいて、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が、ＣＨ１ドメインが軽鎖の一部であり、ＣＬドメインが重鎖の一部であるように、互いに置き換えられている、二重特異性抗原結合分子に関する。より具体的には、標的細胞抗原に特異的に結合可能な第２のＦａｂフラグメントにおいて、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が、ＣＨ１ドメインが軽鎖の一部であり、ＣＬドメインが、重鎖の一部であるように、互いに置き換えられる。
特定の態様において、本発明は、（ａ）ＣＤ４０に特異的に結合可能な第１のＦａｂフラグメント、（ｂ）ＦＡＰに特異的に結合可能な第２のＦａｂフラグメントであって、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が、ＣＨ１ドメインが軽鎖の一部であり、ＣＬドメインが重鎖の一部であるように、互いに置き換えられている、第２のＦａｂフラグメント、を含む、二重特異性抗原結合分子に関する。このような分子は、ＣＤ４０とＦＡＰの両方に一価で結合する。
別の態様において、本発明は、（ａ）ＣＤ４０及びＦｃドメインに特異的に結合可能な２つのＦａｂフラグメントを含む抗体の２つの軽鎖及び２つの重鎖、及び（ｂ）ＦＡＰに特異的に結合可能な２つの追加のＦａｂフラグメントであって、上記追加のＦａｂフラグメントはそれぞれ、ペプチドリンカーを介して（ａ）の重鎖のＣ末端に連結している、Ｆａｂフラグメントを含む、二重特異性抗原結合分子に関する。特定の態様において、追加のＦａｂフラグメントが、Ｆａｂフラグメントであって、可変ドメインＶＬ及びＶＨは、ＶＨドメインが軽鎖の一部であり、ＶＬドメインが重鎖の一部であるように互いに置き換わっている。
したがって、特定の態様において、本発明は、（ａ）ＣＤ４０及びＦｃドメインに特異的に結合できる２つのＦａｂフラグメントを含む抗体の２つの軽鎖及び２つの重鎖と、（ｂ）ＦＡＰに特異的に結合できる２つの追加のＦａｂフラグメントであって、標的細胞抗原に特異的に結合可能な２つの追加の上記Ｆａｂフラグメントは、可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置換され、ＶＬ－ＣＨ鎖がそれぞれペプチドリンカーを介して（ａ）の重鎖のＣ末端に連結しているクロスオーバーＦａｂフラグメントである、Ｆａｂフラグメントと、を含む、二重特異性抗原結合分子を含む。
別の態様において、そして正しい対形成を更に改善するために、（ａ）ＣＤ４０に特異的に結合可能な第１のＦａｂフラグメントと、（ｂ）ＦＡＰに特異的に結合可能な第２のＦａｂフラグメントと、（ｃ）安定した会合が可能な第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインとを含む二重特異性抗原結合分子が、異なる荷電アミノ酸置換（いわゆる「荷電残基」）を含み得る。これらの改変は、クロスしているか、又はクロスしていないＣＨ１ドメイン及びＣＬドメインに導入される。特定の態様において、本発明は、ＣＬドメインの１つにおいて、位置１２３（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がアルギニン（Ｒ）で置換されており、位置１２４（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がリジン（Ｋ）で置換されており、ＣＨ１ドメインの１つにおいて、位置１４７（ＥＵ番号付け）、及び／又は位置２１３（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）で置換されている、二重特異性抗原結合分子に関する。
本発明の例示的な抗体
一つの態様において、本発明は、ＦＡＰに特異的に結合する新しい抗体及び抗体フラグメントを提供する。これらの抗体は、既知のＦＡＰ抗体４Ｂ）又は２８Ｈ１とは異なるエピトープに結合するため、他のＦＡＰ標的分子と組み合わせて使用され得る二重特異性抗原結合分子への組み込みに特に適している。新しい抗体は、大量かつ高力価で生産可能であり、優れたＰＫ特性を有すると考えられる高い熱安定性（凝集温度Ｔａｇｇで測定）を示し、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイで測定した場合にヒトＦＡＰに高い親和性で結合することを更に特徴としている。
一つの態様において、提供されるのは、ＦＡＰ（クローン２１２）に特異的に結合する抗体であって、（ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４、配列番号１１及び配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに、（ｉｖ）配列番号６、配列番号１３及び配列番号１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、抗体である。
一つの態様において、提供されるのは、ＦＡＰに特異的に結合するヒト化抗体であって、（ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４、配列番号１１及び配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに、（ｉｖ）配列番号６、配列番号１３及び配列番号１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、ヒト化抗体である。
別の態様において、提供されるのは、ＦＡＰに特異的に結合する抗体と結合について競合する抗体であって、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９及び配列番号２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むいずれかの重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５及び配列番号２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、いずれかの軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）のいずれかを含む、抗体である。
一つの態様において、提供されるのは、ＦＡＰに特異的に結合する抗体と結合について競合する抗体であって、上記抗体は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬを含む、抗体である。
更なる態様において、提供されるのは、ＦＡＰに特異的に結合する抗体であって、
（ａ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、
（ｂ）配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、
（ｃ）配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は
（ｄ）配列番号１９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、抗体である。
更なる態様において、提供されるのは、ＦＡＰに特異的に結合可能な抗体であって、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、抗体である。
ポリヌクレオチド
本発明は更に、本明細書に記載の二重特異性抗原結合分子又はそのフラグメントをコードする単離核酸、又は本明細書に記載の抗体をコードする単離核酸を提供する。
本発明の二重特異性抗原結合分子をコードする単離ポリヌクレオチドは、完全な抗原結合分子をコードする単一のポリヌクレオチドとして発現されてもよく、又は同時発現される複数の（例えば、２つ以上の）ポリヌクレオチドとして発現されてもよい。一緒に発現するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、例えば、ジスルフィド結合又は他の手段を介して会合し、機能的な抗原結合分子を形成してもよい。例えば、免疫グロブリンの軽鎖部分は、免疫グロブリンの重鎖部分由来の別個のポリヌクレオチドによってコードされてもよい。同時発現する場合、重鎖ポリペプチドは、軽鎖ポリペプチドと会合し、免疫グロブリンを形成する。
いくつかの態様において、単離ポリヌクレオチドは、本明細書に記載する本発明に係る二重特異性分子に含まれるポリペプチドをコードする。
一つの態様において、本発明は、（ａ）ＣＤ４０に特異的に結合可能な少なくとも１つの抗原結合ドメインと、（ｂ）（ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４、配列番号１１及び配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに、（ｉｖ）配列番号６、配列番号１３及び配列番号１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含むＦＡＰに特異的に結合可能な少なくとも１つの抗原結合ドメインと、（ｃ）安定した会合が可能な第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと、を含む、二重特異性抗原結合分子をコードする、単離ポリヌクレオチドに関する。
特定の実施形態では、ポリヌクレオチド又は核酸は、ＤＮＡである。他の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡであり、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態である。本発明のＲＮＡは、一本鎖又は二本鎖であってもよい。
組換え方法
本発明の二重特異性抗原結合分子は例えば、組換え産生により入手することができる。組換え産生のために、二重特異性抗原結合分子又はそのポリペプチドフラグメントをコードする１種以上のポリヌクレオチドを提供する。二重特異性抗原結合分子をコードする１種以上のポリヌクレオチドを単離して、宿主細胞で更にクローニング及び／又は発現するために、１種以上のベクターに挿入する。このようなポリヌクレオチドは、従来の手順を用い、容易に単離され、配列決定されてもよい。本発明の一つの態様において、本発明の１種以上のポリヌクレオチドを含む、ベクター、好ましくは発現ベクターを提供する。当業者に周知の方法を用いて、適切な転写／翻訳制御シグナルに従い、二重特異性抗原結合分子（フラグメント）のコード配列を含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法としては、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術及びインビボ組換え／遺伝子組換えが挙げられる。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）；及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）に記載されている手法を参照。発現ベクターは、プラスミド、ウイルスの一部であってもよく、又は核酸フラグメントであってもよい。発現ベクターは、二重特異性抗原結合分子又はそのポリペプチドフラグメント（即ちコード領域）をコードするポリヌクレオチドが、プロモーター、及び／又は他の転写若しくは翻訳調節要素と作動可能に会合してクローニングされる発現カセットを含む。本明細書で使用される場合、「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の一部である。「停止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ又はＴＡＡ）は、アミノ酸に翻訳されないが、コード領域の一部であると考えられてもよいが、存在する場合、任意のフランキング配列、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、５’及び３’未翻訳領域などは、コード領域の一部ではない。２つ以上のコード領域が、単一のポリヌクレオチドコンストラクト中に例えば、単一のベクター上に存在していてもよく、又は別個のポリヌクレオチドコンストラクト中に例えば別個の（異なる）ベクター上に存在していてもよい。更に、任意のベクターは、単一のコード領域を含んでいてもよく、又は２つ以上のコード領域を含んでいてもよく、例えば本発明のベクターは、１種以上のポリペプチドをコードしてもよく、翻訳後又は翻訳と同時に、タンパク質分解による開裂によって、最終的なタンパク質へと分離される。更に、本発明のベクター、ポリヌクレオチド、又は核酸は、本発明の二重特異性抗原結合分子、若しくはそのポリペプチドフラグメントをコードするポリヌクレオチド、又はその変異体若しくは誘導体に融合している、又は非融合であるいずれかの、異種コード領域をコードすることができる。異種コード領域としては、限定されないが、特殊な要素又はモチーフ、例えば、分泌シグナルペプチド又は異種機能性ドメインが挙げられる。作動可能な会合は、ある遺伝子産物（例えばポリペプチド）のコード領域が、制御配列の影響下又は制御下で、遺伝子産物の発現を行うような様式で、１つ以上の制御配列と会合する。２つのＤＮＡフラグメント（例えば、ポリペプチドコード領域及びこれに関連するプロモーター）は、プロモーター機能の導入によって、所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写が起こる場合、２つのＤＮＡフラグメント間の結合の性質が、遺伝子産物の発現を試行する発現制御配列の能力を妨害しないか、又はＤＮＡテンプレートを転写する能力卯を妨害しない場合、「作動可能に会合する」。したがって、プロモーター領域は、プロモーターが核酸の転写を行うことが可能な場合、ポリペプチドをコードする核酸と作動可能に会合していてもよい。プロモーターは、所定の細胞内でのＤＮＡの実質的な転写のみに指向する細胞特異的なプロモーターであってもよい。プロモーター以外の他の転写制御要素、例えば、エンハンサー、オペレーター、転写停止シグナルは、細胞特異的な転写に指向するために、ポリヌクレオチドに作動可能に会合してもよい。
適切なプロモーター及び他の転写制御領域は、本明細書に開示される。種々の転写制御領域が当業者に知られている。これらとしては、限定されないが、脊椎動物細胞内で機能する転写制御領域、例えば、限定されないが、サイトメガロウイルス由来のプロモーター及びエンハンサーセグメント（例えば最初期プロモーター、イントロン－Ａと組み合わせる）、シミアンウイルス４０（例えば初期プロモーター）及びレトロウイルス（例えばラウス肉腫ウイルス）が挙げられる。他の転写制御領域としては、脊椎動物遺伝子から誘導されるもの、例えば、アクチン、ヒートショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギａ－グロビン、及び真核細胞において遺伝子発現を制御することが可能な他の配列が挙げられる。追加の適切な転写制御領域としては、組織特異的なプロモーター及びエンハンサー、及び誘発性プロモーター（例えばプロモーター誘発性テトラサイクリン）が挙げられる。同様に、種々の翻訳制御要素は、当業者に知られている。これらとしては、限定されないが、リボソーム結合部位、翻訳開始及び停止コドン、ウイルス系から誘導される要素（特に、内部リボソーム侵入部位、すなわちＩＲＥＳ、ＣＩＴＥ配列とも呼ばれる）が挙げられる。発現カセットは、例えば、複製の起源及び／又は染色体組み込み要素、例えば、レトロウイルスの長い末端反復（ＬＴＲ）、又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）末端逆位配列（ＩＴＲ）などの他の特徴も含んでいてもよい。
本発明のポリヌクレオチド及び核酸コード領域は、分泌又はシグナルペプチドをコードする追加のコード領域と会合してもよく、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を指向する。例えば、二重特異性抗原結合分子又はそのポリペプチドフラグメントの分泌が所望される場合、シグナル配列をコードするＤＮＡを、本発明の二重特異性抗原結合分子、又はそのポリペプチドフラグメントをコードする核酸の上流に配置することができる。シグナル仮説によれば、哺乳動物細胞によって分泌されるタンパク質は、シグナルペプチド又は分泌リーダー配列を有しており、これらは、粗い小胞体を通って成長したタンパク質鎖が外に出始めると、成熟タンパク質から切断される。当業者は、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドが、一般的に、ポリペプチドのＮ末端に融合するシグナルペプチドを有しており、ポリペプチドの分泌した形態又は「成熟」形態を生成するために、翻訳されたポリペプチドから切断されることを知っている。特定の実施形態では、ネイティブシグナルペプチド、例えば免疫グロブリン重鎖又は軽鎖シグナルペプチドが使用されるか、又は作動可能に会合するポリペプチドの***を指向する能力を保持する配列の機能性誘導体が使用される。又は、異種哺乳動物シグナルペプチド、又はその機能性誘導体を使用してもよい。例えば、野生型リーダー配列は、ヒト組織プラスミノーゲンアクティベーター（ＴＰＡ）又はマウスβ－グルクロニダーゼのリーダー配列で置換されてもよい。
後での精製（例えばヒスチジンタグ）を容易にする、又は、融合タンパク質の標識を補助するために使用可能な、短いタンパク質配列をコードするＤＮＡを、本発明の二重特異性抗原結合分子、又はそのポリペプチドフラグメントをコードするポリヌクレオチドの中に、又はその末端に含めることができる。
本発明の更なる態様において、本発明の１種以上のポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する。特定の態様において、本発明の１種以上のベクターを含む宿主細胞を提供する。ポリヌクレオチド及びベクターは、それぞれポリヌクレオチド及びベクターに関連して本明細書に記載する特徴のいずれかを単独で、又は組み合わせて組み込んでもよい。一つの態様において、宿主細胞は、本発明の本発明の二重特異性抗原結合分子（の一部）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む（例えば、これにより形質転換されている、又はこれがトランスフェクションされている）。本明細書で使用される場合、「宿主細胞」との用語は、本発明の融合タンパク質又はそのフラグメントを生成するように操作することが可能な任意の種類の細胞系を指す。抗原結合分子を複製し、発現を補助するのに適した宿主細胞は、当該技術分野で周知である。このような細胞は、適切な場合、特定の発現ベクターを用いてトランスフェクトされるか、又は形質導入されてもよく、大規模発酵機に接種するために大量のベクターを含む細胞を成長させ、臨床用途に十分な量の抗原結合分子を得ることができる。適切な宿主細胞としては、原核微生物（例えば大腸菌）又は種々の真核生物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、昆虫細胞などが挙げられる。例えば、ポリペプチドは、特にグリコシル化が必要とされない場合には、細菌内で産生されてもよい。発現後、ポリペプチドは、適切なフラクション中の細菌細胞ペーストから単離されてもよく、更に精製されてもよい。原核生物に加え、真核生物の微生物、例えば、糸状菌又は酵母は、ポリペプチドをコードするベクターに適切なクローニング又は発現の宿主であり、グリコシル化経路が「ヒト化」された真菌株及び酵母株を含み、部分的又は完全にヒトグリコシル化パターンを有するポリペプチドを産生する。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２２，１４０９－１４１４（２００４）及びＬｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２４，２１０－２１５（２００６）を参照。
（グリコシル化）ポリペプチドの発現に適した宿主細胞も、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては、植物細胞及び昆虫細胞が挙げられる。昆虫細胞と併せて（特にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションに）使用することができる、多数のバキュロウイルス株が特定されている。植物細胞培養物も、宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、同第６，０４０，４９８号、同第６，４２０，５４８号、同第７，１２５，９７８号、及び同第６，４１７，４２９号（トランスジェニック植物で抗体を産生するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術を記載している）を参照されたい。脊椎動物細胞も、宿主として使用されてもよい。例えば、懸濁物中で成長するように適合した哺乳動物細胞株が有用な場合がある。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ－７）によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株、ヒト胚腎臓株（例えば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ３６、５９（１９７７）に記載されるような２９３細胞又は２９３Ｔ細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ ２３、２４３－２５１（１９８０）に記載されるようなＴＭ４細胞）、サル腎臓細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリサル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６）、ヒト頸部癌腫細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）、マウス***腫瘍細胞（ＭＭＴ ０６０５６２）、ＴＲＩ細胞（例えば、Ａｃａｄ Ｓｃｉ ３８３，４４－６８（１９８２）に記載されるもの）、ＭＲＣ ５細胞、及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株としては、ｄｈｆｒ－ＣＨＯ細胞を含む、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７７，４２１６（１９８０））、骨髄腫細胞株、例えば、ＹＯ、ＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３及びＳｐ２／０が挙げられる。タンパク質産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞の総説としては、例えば、Ｙａｚａｋｉ ａｎｄ Ｗｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ），ｐｐ．２５５－２６８（２００３）を参照。宿主細胞としては、培養細胞、例えば、ほんの数例を挙げると、哺乳動物培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、細菌細胞及び植物細胞が挙げられるが、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養植物又は動物組織に含まれる細胞も含まれる。一実施形態では、宿主細胞は、真核細胞であり、好ましくは、哺乳動物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞又はリンパ球細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。これらの系において外来遺伝子を発現させる標準的な技術は、当該技術分野で既知である。免疫グロブリンの重鎖又は軽鎖のいずれかを含むポリペプチドを発現する細胞を組み換えて、他方の免疫グロブリン鎖を発現して、発現した生成物が、重鎖及び軽鎖の両方を有する免疫グロブリンとなるようにすることができる。
一つの態様において、本発明の二重特異性抗原結合分子、又はそのポリペプチドフラグメントを製造する方法であって、本発明の二重特異性抗原結合分子、又はそのポリペプチドフラグメントを発現するのに好適な条件下にて、本明細書において提供するように、本発明の二重特異性抗原結合分子、又はそのポリペプチドフラグメントをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養することと、本発明の二重特異性抗原結合分子、又はそのポリペプチドフラグメントを、宿主細胞（又は宿主細胞培養培地）から回収することとを含む、方法を提供する。
本明細書に記載のとおりに調製される本発明の二重特異的分子は、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、親和性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなどの、当該技術分野にて周知の技術により精製することができる。特定のタンパク質を精製するために使用される実際の条件は、一部には、正味の電荷、疎水性、親水性などの因子に依存し、当業者には明らかである。親和性クロマトグラフィー精製のために、二重特異性抗原結合分子が結合する抗体、リガンド、受容体、又は抗原を使用することができる。例えば、本発明の融合タンパク質を親和性クロマトグラフィー精製するために、プロテインＡ又はプロテインＧを含むマトリックスを使用することができる。連続したプロテインＡ又はＧの親和性クロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーを用いて、実施例にて本質的に記載しているように、抗原結合分子を単離することができる。二重特異性抗原結合分子又はそのフラグメントの純度は、ゲル電気泳動、高圧液体クロマトグラフィーなどを含む、多種多様の周知の分析技術のいずれかにより測定することができる。例えば、実施例にて記載のとおりに発現する二重特異性抗原結合分子は、還元型、及び非還元型ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより示されるように、インタクトであり、適切にアセンブルしたことが示された。
アッセイ
本明細書において提供する二重特異性抗原結合分子は、それらの結合特性及び／又は生物活性について、当該技術分野において公知のさまざまなアッセイによって特性決定することができる。特に、それらは、実施例でより詳細に記載されているアッセイによって特徴付けられる。
１．結合アッセイ
本明細書で提供される二重特異性抗原結合分子の対応する標的発現細胞への結合は、例えば、ヒト線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）及びフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）分析を発現するマウス線維芽細胞株を使用することによって評価することができる。本明細書で提供される二重特異性抗原結合分子のＣＤ４０への結合は、実施例４．２に記載されているように初代Ｂ細胞を使用することによって決定し得る。
２．活性アッセイ
本発明の二重特異性抗原結合分子は、生物学的活性について試験される。生物学的活性には、二重特異性抗原結合分子の有効性及び特異性が含まれ得る。有効性及び特異性は、標的抗原の結合時にＣＤ４０受容体を介したアゴニストシグナル伝達を示すアッセイによって示される。更に、インビトロでＴ細胞プライミングアッセイは、二重特異性抗原結合分子とインキュベートされてきた樹状細胞（ＤＣ）を使用して実施される。
Ｆ．医薬組成物、製剤及び投与経路
更なる態様において、本発明は、例えば、以下の治療方法のいずれかで使用するための、本明細書において提供する二重特異性抗原結合分子のいずれかを含む医薬組成物を提供する。一実施形態では、医薬組成物は、本明細書に提示されるいずれかの二重特異性抗原結合分子及び少なくとも１種の薬学的に許容され得る賦形剤を含む。別の実施形態では、医薬組成物は、本明細書において提供する二重特異性抗原結合分子のいずれか、及び、例えば後述する少なくとも１種の追加の治療薬剤を含む。
本発明の医薬組成物は、薬学的に許容され得る担体に溶解又は分散した、治療有効量の１種以上の二重特異性抗原結合分子を含む。「薬学的又は薬理学的に許容され得る」との句は、一般的に、使用する投薬量及び濃度でレシピエントに非毒性であり、すなわち、適切な場合、動物（例えばヒト）に投与したときに、有害なアレルギー反応又は他の不都合な反応を引き起こさない分子部分及び組成物を指す。本発明に従った少なくとも１種の二重特異性抗原結合分子、及び必要に応じて追加の有効成分を含有する医薬組成物の調製は、参照により本明細書に組み込まれているＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０により例示されているように、本開示の見地から当業者に既知であろう。特に、組成物は、凍結乾燥された製剤又は水溶液である。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容され得る賦形剤」としては、当業者には知られているだろうが、任意及び全ての溶媒、バッファー、分散媒体、コーティング、界面活性剤、酸化防止剤、防腐剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張性剤、塩類、安定化剤及びこれらの組み合わせが挙げられる。
非経口組成物としては、注射による（例えば、皮下、皮内、病変内、静脈内、動脈内、筋肉内、髄腔内又は腹腔内注射による）投与のために設計されたものが挙げられる。注射のために、本発明の二重特異性抗原結合分子は、水溶液中で配合されてもよく、好ましくは、生理学的に適合するバッファー、例えば、Ｈａｎｋｓ溶液、Ｒｉｎｇｅｒ溶液又は生理食塩水バッファー中で配合されてもよい。溶液は、配合剤、例えば、懸濁剤、安定化剤及び分散剤を含有していてもよい。あるいは、二重特異性抗原結合分子は使用前に、好適なビヒクル、例えば発熱性物質除去水と共に構成するための、粉末形態であることができる。滅菌注射可能溶液は、必要な場合には以下に列挙する種々の他の成分と共に、本発明の抗原結合分子を必要な量で、適切な溶媒に組み込むことによって調製される。滅菌性は、例えば、滅菌ろ過膜を通したろ過によって容易に達成され得る。一般的に、分散物は、種々の滅菌した有効成分を、塩基性分散媒体及び／又は他の成分を含む滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射可能溶液、懸濁物又は乳化物を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、既に滅菌フィルターにかけた液体媒体から有効成分と任意の追加の所望の成分の粉末が得られる減圧乾燥又は凍結乾燥技術である。液体媒体は、必要な場合には適切に緩衝化されているべきであり、注射する前に、十分な食塩水又はグルコースで液体希釈剤をまず等張性にする。組成物は、製造条件及び保存条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌などの微生物の混入作用から保護されなければならない。内毒素の混入は、安全なレベルで、例えば、０．５ｎｇ／ｍｇのタンパク質未満で最小限に維持されるべきであることが理解される。適切な薬学的に許容され得る賦形剤としては、限定されないが、バッファー、例えば、ホスフェート、シトレート及び他の有機酸；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド；ベンゼトニウムクロリド；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルパラベン又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾール）；低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリシン；単糖類、二糖類及び他の炭水化物、グルコース、マンノース又はデキストリンを含む；キレート化剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖類、例えば、ショ糖、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩を形成する対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。水性注射懸濁物は、懸濁物の粘度を上げる化合物（例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、デキストランなど）を含んでいてもよい。必要に応じて、懸濁物は、適切な安定化剤、又は高度に濃縮した溶液の調製を可能にするために、化合物の溶解度を高める薬剤も含んでいてもよい。更に、活性化合物の懸濁物は、適切な油注射懸濁物として調製されてもよい。適切な親油性溶媒又はビヒクルとしては、脂肪族油（例えば、ゴマ油）、又は合成脂肪酸エステル（例えば、エチルクリート（ｅｔｈｙｌ ｃｌｅａｔ）又はトリグリセリド）又はリポソームが挙げられる。
活性成分はまた、例えば、コアセルベーション技術によって、又は界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロース若しくはゼラチンマイクロカプセル及びポリ－（メチルメタクリレート）マイクロカプセルにより、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロ乳濁液、ナノ粒子、及びナノカプセル）内、又はマクロ乳濁液中にも取り込まれ得る。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１８ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）に開示されている。徐放性調製物を調製してもよい。徐放性製剤の適切な例としては、ポリペプチドを含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは、例えば、フィルム又はマイクロカプセルなどの成型物品の形態である。具体的な実施形態では、注射可能組成物の持続性吸収は、吸収を遅らせる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン、又はこれらの組み合わせ）の組成物での使用によってもたらされてもよい。
本発明の例示的な薬学的に許容され得る賦形剤は、更に、間質性薬物分散剤、例えば、可溶性中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ヒト可溶性ＰＨ－２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えば、ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）を含む。特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用方法は、ｒＨｕＰＨ２０を含め、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号及び第２００６／０１０４９６８号に記載される。一つの態様において、ｓＨＡＳＥＧＰを、１種以上の追加のグリコサミノグリカナーゼ（例えば、コンドロイチナーゼ）と合わせる。
例示的な凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第６，２６７，９５８号に記載されている。水性抗体製剤としては、米国特許第６，１７１，５８６号及び国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されるものが挙げられ、後者の製剤は、酢酸ヒスチジン緩衝液を含む。
上述した組成物に加えて、抗原結合分子をデポー調製物として製剤化することも可能である。このような長く作用する製剤は、移植によって（例えば、皮下又は筋肉内）、又は筋肉内注射によって投与されてもよい。それゆえに、例えば融合タンパク質は、好適なポリマー若しくは疎水性材料（例えば、許容され得るオイルの乳剤エマルションとして）又はイオン交換樹脂と共に、又は例えば、低溶解性の塩等の難溶性誘導体として製剤化してよい。
本発明の二重特異性抗原結合分子を含む医薬組成物は、従来の混合、溶解、乳化、カプセル化、封入、又は凍結乾燥プロセスにより製造することができる。医薬組成物は、１種以上の生理学的に許容され得る担体、希釈剤、賦形剤又はタンパク質を医薬として使用可能な製剤へと加工するのを容易にする補助剤を用い、従来の様式で配合されてもよい。適切な製剤は、選択する投与経路によって変わる。
二重特異性抗原結合分子は、遊離酸又は塩基、中性又は塩形態で、組成物に配合されることができる。薬学的に許容され得る塩は、遊離酸又は遊離塩基の生体活性を実質的に保持する塩である。薬学的に許容され得る塩としては、酸付加塩、例えば、タンパク質性組成物の遊離アミノ基と形成される酸付加塩、又は塩酸又はリン酸などの無機酸と形成されるか、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸又はマンデル酸などの有機酸と形成されるものが挙げられる。遊離カルボキシル基と形成される塩も、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムの水酸化物又は水酸化第二鉄などの無機塩基から誘導されてもよく、又はイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン又はプロカインなどの有機塩基から誘導されてもよい。医薬塩は、対応する遊離塩基形態よりも、水及び他のプロトン性溶媒に溶けやすい傾向がある。
本発明の組成物は、処置される特定の徴候に必要な１種類より多い有効成分も含んでいてもよく、好ましくは、互いに有害な影響を与えない相補的な活性を有するものを含んでいてもよい。かかる活性成分は、意図される目的に有効な量で組み合わせて好適に存在する。
インビボ投与に使用される製剤は、一般に、滅菌のものである。滅菌性は、例えば、滅菌ろ過膜を通したろ過によって容易に達成され得る。
Ｇ．治療方法及び組成物
本明細書において提供する二重特異性抗原結合分子のいずれかを、治療方法にて使用することができる。治療方法で使用するために、本発明の二重特異性抗原結合分子を、良好な医事に一致する様式で製剤化、用量化、及び投与することができる。この観点で考慮する因子としては、処置されている具体的な障害、処置されている具体的な哺乳動物、個々の患者の臨床症状、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与のスケジュール及び医学実務家には既知の他の因子が挙げられる。
一つの態様において、医薬として使用するための、本発明の二重特異性抗原結合分子を提供する。
更なる態様において、（ｉ）ＣＤ４０＋抗原提示細胞（ＡＰＣ）による免疫刺激の誘導において、（ｉｉ）腫瘍特異的Ｔ細胞応答の刺激において、（ｉｉｉ）腫瘍細胞のアポトーシスを引き起こすことにおいて、細胞は、（ｉｖ）癌の処置において、（ｖ）癌の進行を遅らせることにおいて、（ｖｉ）癌を患う患者の生存を延長することにおいて、（ｖｉｉ）感染症の処置において、使用するための本発明の二重特異性抗原結合分子が提供される。特定の態様において、疾患の処置で使用するための、特に、癌の処置で使用するための、本発明の二重特異性抗原結合分子を提供する。
特定の態様において、処置方法で使用するための、本発明の二重特異性抗原結合分子を提供する。一つの態様において、本発明は、疾患の処置を必要とする個体における、疾患の処置で使用するための、本明細書に記載した二重特異性抗原結合分子を提供する。特定の態様において、本発明は、疾患を有する個体の処置方法であって、治療有効量の二重特異性抗原結合分子を個体に投与することを含む方法で使用するための二重特異性抗原結合分子を提供する。特定の態様において、処置される疾患は癌である。処置が必要な対象、患者又は個体は、典型的には、哺乳動物であり、より特定的には、ヒトである。
一つの態様において、提供されるのは、（ｉ）ＣＤ４０＋抗原提示細胞（ＡＰＣ）による免疫刺激を誘導する、（ｉｉ）腫瘍特異的Ｔ細胞応答を刺激する、（ｉｉｉ）腫瘍細胞のアポトーシスを引き起こす、（ｉｖ）癌を処置するための方法が提供される、（ｖ）癌の進行を遅らせる、（ｖｉ）癌を患う患者の生存を延長する、又は（ｖｉｉ）感染症の処置のための方法であって、この方法は、治療有効量の本発明の二重特異性抗原結合分子を、それを必要とする個体に投与することを含む、方法である。
更なる態様において、本発明は、疾患の処置を必要とする個体における、疾患の処置のための医薬の製造又は調製における、本発明の二重特異性抗原結合分子の使用を提供する。一つの態様において、医薬は、疾患を有する個体に、治療有効量の医薬を投与することを含む疾患の処置方法で使用するためのものである。特定の態様において、処置される疾患は、増殖性障害、特に癌である。癌の例としては、膀胱癌、脳腫瘍、頭頸部癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、食道癌、結腸癌、結腸直腸癌、肛門癌、胃癌、前立腺癌、血液がん、皮膚癌、扁平細胞癌腫、骨がん及び腎臓癌が挙げられるが、これらに限定されない。癌の他の例としては、癌、リンパ腫（例えばホジキン及び非ホジキンリンパ腫）、芽腫、肉腫、及び白血病が挙げられる。本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体を使用して処置可能な、その他の細胞増殖性障害としては、腹部、骨、***、消化系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、脳下垂体、睾丸、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭頸部、神経系（中枢及び末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部領域及び泌尿生殖器系に位置する新生物が挙げられるが、これらに限定されない。前癌症状又は病変及び癌転移も含まれる。特定の実施形態では、癌は、腎細胞癌、皮膚癌、肺癌、結腸直腸癌、乳癌、脳腫瘍、頭頸部癌からなる群から選択される。多くの場合において、本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体は治癒をもたらし得ないが、効果をもたらし得ることを当業者は速やかに理解する。いくつかの態様において、いくらかの効果を有する生理学的変化もまた、治療上有益であるとみなされる。したがって、いくつかの態様において、生理学的変化をもたらす本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体量を、「有効量」、又は「治療有効量」とみなす。
疾患の予防又は処置に関して、（単独で、又は、１種以上の他の追加の治療薬剤と組み合わせて使用する場合の）本発明の二重特異性抗原結合分子の適切な用量は、処置される疾患のタイプ、疾患の重症度及び経過、本発明の二重特異性抗原結合分子が予防又は治療目的で投与されるかどうか、以前又は同時の治療的介入、患者の病歴及び二重特異性抗原結合分子に対する応答、並びに主治医の裁量に依存するであろう。投与の責任を担う医師は、いずれにしても、組成物中の有効成分の濃度、個々の対象に適切な投薬量を決定する。単回又はさまざまな時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、及びパルス注入を含むが、これらに限定されないさまざまな投薬スケジュールが、本明細書では企図される。
本発明の二重特異性抗原結合分子は患者に１回、又は連続処置にわたって好適に投与される。疾患の種類及び重症度に応じ、例えば、１回又は複数回の個別投与、又は連続点滴に関わらず、約１μｇ／ｋｇ～１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ）の二重特異性抗原結合分子が、患者への投与への最初の候補投与量となることができる。１つの典型的な日用量は、上で言及した因子に応じて、約１μｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であってもよい。数日間又はそれ以上にわたる反復投与において、状態に応じ、処置は通常、疾患症状の所望の抑制が生じるまで続けられる。本発明の二重特異性抗原結合分子の１つの例示的な用量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。他の例では、投薬量はまた、投与あたり、約１μｇ／ｋｇ体重、約５μｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ／ｋｇ体重、約１００μｇ／ｋｇ体重、約２００μｇ／ｋｇ体重、約３５０μｇ／ｋｇ体重、約５００μｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ／ｋｇ体重、約５ｍｇ／ｋｇ体重、約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約２００ｍｇ／ｋｇ体重、約３５０ｍｇ／ｋｇ体重、約５００ｍｇ／ｋｇ体重から約１０００ｍｇ／ｋｇ体重まで、又はもっと多く、又はその間の誘導可能な任意の範囲を含んでいてもよい。本明細書に列挙される数から誘導可能な範囲の例では、約０．１ｍｇ／ｋｇ／体重～約２０ｍｇ／ｋｇ／体重、約５μｇ／ｋｇ／体重～約１ｍｇ／ｋｇ／体重などが、上述の数に基づいて投与されてもよい。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ、又は１０ｍｇ／ｋｇ（又はこれらの任意の組合せ）のうちの１つ以上の用量が、患者に投与され得る。このような投薬量を、断続的に、例えば、毎週、又は３週間毎に投与してもよい（例えば、患者は、約２～約２０回、又は例えば約６回の融合タンパク質の投薬を受ける）。特定の態様において、二重特異性抗原結合分子は３週間毎に投与される。最初の多めの投与量、それに続く１回又は複数回の量の少ない用量を投与してよい。しかしながら、他の投薬レジメンが有用であってもよい。この療法の進行は、従来の技術及びアッセイによって容易に監視される。
本発明の二重特異性抗原結合分子は一般に、意図する目的を達成するのに有効な量で使用される。疾患症状を処置又は予防するのに使用するため、本発明の二重特異性抗原結合分子、又はその医薬組成物は、治療有効量で投与される、又は適用される。治療有効量の決定は、特に、本明細書に与えられる詳細な開示の観点で、十分に当業者の能力の範囲内である。全身投与の場合、治療有効投薬量は、インビトロアッセイ、例えば、細胞培養アッセイから最初に概算することができる。次いで、細胞培養物で決定されるようなＩＣ５０を含む血中濃度範囲を達成するために、用量を動物モデルで配合してもよい。このような情報を使用し、ヒトにおける有用な用量を更に正確に決定することができる。初期投薬量も、インビボデータから、例えば、動物モデルから、当該技術分野で周知の技術を用いて概算することができる。当業者は、動物データに基づき、ヒトへの投与を容易に最適化することができる。
投与量及び感覚を個別に調節して、治療効果を維持するのに十分な、本発明の二重特異性抗原結合分子の血漿濃度を提供することができる。注射による投与に有用な患者投薬量は、約０．１～５０ｍｇ／ｋｇ／日、典型的には約０．１～１ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。治療に有効な血漿濃度は、各日に複数回投薬量を投与することによって達成されてもよい。血漿中の量は、例えば、ＨＰＬＣによって測定されてもよい。局所投与又は選択的な取り込みの場合、本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体の効果的な局所濃度は、血漿濃度のとは関係し得ない。当業者は、過度な実験を行うことなく、治療に有効な局所投薬量を最適化することができる。
本明細書で記載される、本発明の二重特異性抗原結合分子の治療に有効な用量は一般に、実質的な毒性を引き起こすことなく治療効果を提供する。融合タンパク質の毒性及び治療有効性は、細胞培養物又は実験動物における標準的な医薬手順によって決定することができる。細胞培養アッセイ及び動物実験を使用し、ＬＤ５０（集団の５０％が致死に至る用量）及びＥＤ５０（集団の５０％が治療に有効である用量）を決定することができる。毒性と治療効果との間の投薬比は、治療指数であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。大きな治療指数を示す二重特異性抗原結合分子が好ましい。一つの態様において、本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体は、高い治療指数を示す。細胞培養アッセイ及び動物実験から得られるデータを、ヒトでの使用に適した投薬範囲を配合する際に使用することができる。投薬量は、好ましくは、毒性がほとんどないか、全くない状態で、ＥＤ５０を含む血中濃度の範囲内にある。投薬量は、例えば、使用される投薬量、利用される投与経路、対象の症状などの種々の因子に依存して、この範囲内で変動してもよい。実際の製剤、投与経路及び負う薬量は、患者の症状という観点で個々の医師によって選択されてもよい（例えば、その全体が本明細書に参考として組み込まれる、Ｆｉｎｇｌ ｅｔ ａｌ．，１９７５，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｃｈ．１，ｐ．１を参照）。
本発明の融合タンパク質で処置される患者の主治医は、毒性、臓器不全などに起因して、どのように、いつ投与を中止するか、中断するか、又は調整するかを知っている。逆に、主治医は、臨床応答が十分ではない場合（毒性を生じずに）、処置をもっと高レベルにするように調整することも知っている。目的の障害の管理において投与される投薬量の大きさは、処置される症状の重篤度、投与経路などに伴って変動する。症状の重篤度は、例えば、部分的には、標準的な診断評価方法によって評価されてもよい。更に、投薬量と、おそらく投薬頻度は、個々の患者の年齢、体重及び応答によっても変わる。
他の薬剤及び処置
本発明の二重特異性抗原結合分子は、１種以上の他の薬剤と組み合わせて投与され得る。例えば、本発明の本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体は、少なくとも１種の追加の治療薬剤と同時に投与することができる。「治療薬剤」との用語は、このような処置が必要な個体において、症状又は疾患を処置するために投与することが可能な任意の薬剤を包含する。このような更なる治療薬剤は、処置される特定の徴候に適した任意の有効成分を含んでいてもよく、好ましくは、互いに有害な影響を与えない相補的な活性を有するものを含んでいてもよい。特定の実施形態において、更なる治療薬剤は、別の抗癌剤、例えば、微小管破壊剤、代謝拮抗剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ＤＮＡインターカレーター、アルキル化剤、ホルモン治療、キナーゼ阻害剤、受容体アンタゴニスト、腫瘍細胞アポトーシスの活性化剤、又は抗血管形成剤である。特定の態様において、更なる治療薬剤は、免疫調節剤、細胞増殖抑制剤、細胞接着の阻害剤、細胞毒性剤若しくは細胞増殖抑制、細胞アポトーシスの活性化剤、又はアポトーシス誘発因子に対する細胞の感度を高める薬剤である。
したがって、提供されるのは、癌の処置に使用するための本発明の二重特異性抗原結合分子又はそれらを含む医薬組成物であり、二重特異性抗原結合分子が、癌免疫療法に使用するための化学療法剤、放射線及び／又は他の薬剤と組み合わせて投与される、二重特異性抗原結合分子である。
このような他の薬剤は、適切には、意図する目的にとって有効な量で組み合わせた状態で存在する。有効量のこのような他の薬剤は、使用される融合タンパク質の量、障害又は処置の種類、上述の他の因子に依存する。本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体は通常、本明細書に記載される同一用量及び投与経路、若しくは本明細書で記載される１～９９％の用量、又は実験的／臨床的に適切と測定される任意の用量及び任意の経路で使用される。
上記のそのような併用療法は、併用投与（２つ以上の治療薬剤が同じ又は別個の組成物に含まれる場合）、及び別個の投与を含み、その場合、本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体の投与は、追加の治療薬及び／又はアジュバントの投与の前、同時、及び／又は後に、起こり得る。
更なる態様において、提供されるのは、癌の処置に使用するための、本明細書で上述した二重特異性抗原結合分子であり、二重特異性抗原結合分子は、別の免疫調節剤と組み合わせて投与される。
「免疫調節剤」という用語は、免疫系に影響を与えるモノクローナル抗体を含む任意の物質を指す。本発明の分子は、免疫調節剤と見なすことができる。免疫調節剤は、癌の処置のための抗腫瘍剤として使用することができる。一つの態様において、免疫調節剤には、抗ＣＴＬＡ４抗体（例えば、イピリムマブ）、抗ＰＤ１抗体（例えば、ニボルマブ又はペンブロリズマブ）、ＰＤ－Ｌ１抗体（例えば、アテゾリズマブ、アベルマブ又はデュルバルマブ）、ＯＸ－４０抗体、４－１ＢＢ抗体及びＧＩＴＲ抗体が挙げられる。更なる態様において、提供されるのは、癌の処置に使用するための、本明細書で上述した二重特異性抗原結合分子であり、二重特異性抗原結合分子は、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用を遮断する薬剤と組み合わせて投与される。一つの態様において、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用を遮断する薬剤は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体又は抗ＰＤ１抗体である。より具体的には、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用を遮断する薬剤は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、特にアテゾリズマブ、デュルバルマブ、ペンブロリズマブ及びニボルマブからなる群から選択される抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。１つの特定の態様では、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用を遮断する薬剤はアテゾリズマブ（ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＲＧ７４４６）である。別の態様において、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用を遮断する薬剤は、配列番号１０７の重鎖可変ドメインＶＨ（ＰＤＬ－１）及び配列番号１０８の軽鎖可変ドメインＶＬ（ＰＤＬ－１）を含む抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。別の態様において、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用を遮断する薬剤は、配列番号１０９の重鎖可変ドメインＶＨ（ＰＤＬ－１）及び配列番号１１０の軽鎖可変ドメインＶＬ（ＰＤＬ－１）を含む抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。別の態様において、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用を遮断する薬剤は、抗ＰＤ１抗体、具体的にはペンブロリズマブ又はニボルマブから選択される抗ＰＤ１抗体である。このような他の薬剤は、適切には、意図する目的にとって有効な量で組み合わせた状態で存在する。有効量のこのような他の薬剤は、使用される二重特異性抗原結合分子の量、障害又は処置の種類、上述の他の因子に依存する。本明細書で上述したような二重特異性抗原結合分子体は、通常、本明細書に記載される同一用量及び投与経路、若しくは本明細書で記載される１～９９％の用量、又は実験的／臨床的に適切と測定される任意の用量及び任意の経路で使用される。
上述のこのような併用療法は、組み合わせた投与（２つ以上の治療薬剤が、同じ又は別個の組成物に含まれる）、及び別個の投与を包含し、この場合、二重特異性抗原結合分子の投与は、更なる治療薬剤及び／又はアジュバントの投与前、投与と同時及び／又は投与後に行われてもよい。
製造物品
本発明の別の態様において、上述の障害の処置、予防、及び／又は診断に有用な材料を含有する製造物品が提供される。製造物品は、容器と、容器に挿入されるか、又は容器に付随するラベル若しくはパッケージ添付文書とを備えている。適切な容器としては、例えば、瓶、バイアル、シリンジ、静注溶液袋などが挙げられる。容器は、ガラス又はプラスチックなどの種々の材料から作られてもよい。容器は、組成物をそれ自身で、又は症状を処置し、予防し、及び／又は診断するのに有効な別の組成物と組み合わせて保持しており、滅菌アクセス口を有していてもよい（例えば、容器は、皮下注射針によって穿孔可能なストッパーを有する静脈用溶液袋又はバイアルであってもよい）。組成物中の少なくとも１種の活性剤は、本発明の二重特異性抗原結合分子である。
ラベル又は添付文書は、組成物が、選択される症状を処置するために使用されることを示す。更に、製造物品は、（ａ）製造物品中に含有され、本発明の二重特異性抗原結合分子を含む組成物を含む第１の容器、及び、（ｂ）製造物品中に含有され、更なる細胞毒性又は別の治療薬剤を含む組成物を含む第２の容器を含んでよい。本発明のこの実施形態における製造品は、組成物が特定の症状を処置するために使用され得ることを示す添付文書を更に含み得る。
あるいは、又は加えて、製造物品は、薬学的に許容され得る緩衝液、例えば、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝化生理食塩水、リンゲル溶液及びデキストロース溶液を含む第２の（又は第３の）容器を更に備えていてもよい。他の緩衝液、希釈剤、フィルター、ニードル、及びシリンジを含め、商業的及びユーザの観点から望ましい他の材料を更に含んでいてもよい。
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以下の番号付けされた項は、本発明の態様を記載する。
１．二重特異性抗原結合分子であって、
（ａ）ＣＤ４０に特異的に結合可能な少なくとも１つの抗原結合ドメインと、
（ｂ）（ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４、配列番号１１及び配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号６、配列番号１３及び配列番号１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合可能な少なくとも１つの抗原結合ドメインと、を含む、二重特異性抗原結合分子。
２．項１に記載の二重特異性抗原結合分子であって、
（ｃ）安定した会合が可能な第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃ領域をさらに含む、二重特異性抗原結合分子。
３．ＦＡＰに特異的に結合可能な上記抗原結合ドメインが、配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、項１又は２に記載の二重特異性抗原結合分子。
４．上記ＦＡＰに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、
配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９及び配列番号２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と、
配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５及び配列番号２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）と、を含む、項１～３のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
５．上記ＦＡＰに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、
（ａ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、
（ｂ）配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は
（ｃ）配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は
（ｄ）配列番号１９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、項１～４のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
６．ＣＤ４０に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、（ｉ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）と、（ｉｖ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）と、を含む、項１～５のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
７．ＣＤ４０に特異的に結合可能な前記抗原結合ドメインが、
（ｉ）配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９及び配列番号４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）と、
（ｉｉ）配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、及び配列番号４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）と、を含む、項１～６のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
８．ＣＤ４０に特異的に結合可能な上記抗原結合ドメインが、
（ｉ）配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９及び配列番号５０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）と、
（ｉｉ）配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、及び配列番号５４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）と、を含む、項１～６のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
９．ＣＤ４０に特異的に結合可能な上記抗原結合ドメインが、
（ａ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４１のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｂ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４２のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｃ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４３のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｄ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４４のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｅ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４１のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｆ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４２のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｇ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４３のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｈ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４４のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｉ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４１のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｊ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４２のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｋ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４３のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｌ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４４のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｍ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４１のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｎ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４２のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｏ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４３のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｐ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４４のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、項１～５又は７のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
１０．ＣＤ４０に特異的に結合可能な前記抗原結合ドメインが、配列番号３７のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４１のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、項１～５又は７又は９のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
１１．ＣＤ４０に特異的に結合可能な上記抗原結合ドメインが、
（ａ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号５１のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｂ）配列番号４６のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号５１のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｃ）配列番号４７のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号５１のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｄ）配列番号４８のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号５１のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｅ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号５２のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｆ）配列番号４６のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号５２のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｇ）配列番号４７のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号５２のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｈ）配列番号４８のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号５２のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｉ）配列番号４９のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号５３のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｊ）配列番号５０のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号５３のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｋ）配列番号４９のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号５４のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｌ）配列番号５０のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号５４のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、項１～５又は８のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
１２．ＣＤ４０に特異的に結合可能な前記抗原結合ドメインが、配列番号４５のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号５１のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、又はＣＤ４０に特異的に結合可能な前記抗原結合ドメインが、配列番号４８のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号５１のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、項１～５又は８又は１１のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
１３．項１～７のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子であって、
（ｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）及び配列番号４１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）を含む、ＣＤ４０に特異的に結合可能な少なくとも１つの抗原結合ドメインと、
（ｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、ＦＡＰに特異的に結合可能な少なくとも１つの抗原結合ドメインと、を含む、項１～７のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
１４．上記Ｆｃ領域が、ＩｇＧ、特にＩｇＧ１ Ｆｃ領域又はＩｇＧ４ Ｆｃ領域であり、かつ上記Ｆｃ領域が、Ｆｃ受容体及び／又はエフェクター機能に対する抗体の結合親和性を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む、項２～１３のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
１５．上記Ｆｃ領域が、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）を有するヒトＩｇＧ１サブクラスのＦｃ領域である、項２～１４のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
１６．上記二重特異性抗原結合分子が、
（ａ）Ｆｃ領域に連結したＣＤ４０に特異的に結合可能な少なくとも２つのＦａｂフラグメントと、
（ｂ）Ｆｃ領域のＣ末端に連結したＦＡＰに特異的に結合可能な１つの抗原結合ドメインと、を含む項１～１５のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
１７．上記二重特異性抗原結合分子が、
（ａ）Ｆｃ領域に融合したＣＤ４０に特異的に結合可能な少なくとも２つのＦａｂフラグメントと、
（ｂ）Ｆｃ領域のＣ末端に融合したＦＡＰに特異的に結合可能なクロスＦａｂフラグメントと、を含む項１～１６のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
１８．ＦＡＰに特異的に結合可能な前記クロスＦａｂフラグメントのＶＨ－Ｃカッパ鎖がＦｃ領域のＣ末端に融合した、項１７に記載の二重特異性抗原結合分子。
１９．上記二重特異性抗原結合分子が、ＣＤ４０に特異的に結合可能な４つのＦａｂフラグメントを含む、項１～１８のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
２０．ＦＡＰに特異的に結合する抗体であって、（ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４、配列番号１１及び配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と、（ｉｖ）配列番号６、配列番号１３及び配列番号１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）と、を含む、抗体。
２１．上記抗体が、
（ａ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、
（ｂ）配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は
（ｃ）配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は
（ｄ）配列番号１９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、項２０に記載の抗体。
２２．項１～１９のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子、又は項２０若しくは２１に記載の抗体をコードする、単離核酸。
２３．項２２に記載の単離核酸を含む、発現ベクター。
２４．項２２に記載の単離核酸、又は項２３に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
２５．上記二重特異性抗原結合分子の発現に適した条件下で項２４に記載の宿主細胞を培養すること、及び前記二重特異性抗原結合分子を単離することを含む、二重特異性抗原結合分子を製造する方法。
２６．項１～１９のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子又は項２０又は２１に記載の抗体と、薬学的に許容され得る担体とを含む、医薬組成物。
２５．追加の治療薬剤をさらに含む、項２４に記載の医薬組成物。
２６．医薬として使用するための、項１～１９のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子、又は、項２４に記載の医薬組成物。
２７．
（ｉ）ＣＤ４０発現抗原提示細胞（ＡＰＣ）による免疫刺激の誘導において、
（ｉｉ）腫瘍特異的Ｔ細胞応答の刺激において、
（ｉｉｉ）腫瘍細胞のアポトーシスを引き起こすことにおいて、
（ｉｖ）癌の処置において、
（ｖ）癌の進行を遅らせることにおいて、
（ｖｉ）癌を患う患者の生存を延長することにおいて、
（ｖｉｉ）感染症の処置において、使用するための、項１～１９のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子又は項２４に記載の医薬組成物。
２８．癌の処置に使用するための、項１～１９のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子、又は項２４に記載の医薬組成物。
２９．癌の処置に使用するための医薬の製造における、項１～１９のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子、又は項２４に記載の医薬組成物の使用。
３０．癌を有する個体を処置する方法であって、個体に、有効量の項１～１９のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子又は項２４に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
３１．上記二重特異性抗原結合分子又は医薬組成物が、癌免疫療法で使用するために化学療法剤、放射線及び／又は他の薬剤と組み合わせた投与のためのものである、癌の処置に使用するための項１～１９のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子又は項２４に記載の医薬組成物。
以下は、本発明の方法及び組成物の例である。先に提供した一般的な説明を考慮すると、種々の他の実施形態が実施されてもよいことは理解される。
組換えＤＮＡ技術
標準的な方法を使用して、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９において説明されるように、ＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬は、製造元の説明書によって使用した。ヒト免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は、以下に与えられる：Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄ．，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ ９１－３２４２に示されている。
ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列は、二本鎖配列決定によって決定した。
遺伝子合成
所望の遺伝子セグメントは、適切なテンプレートを使用したＰＣＲによって生成されたか、又はＧｅｎｅａｒｔ ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，ドイツ）によって、合成オリゴヌクレオチド及びＰＣＲ産物から自動遺伝子合成によって合成した。正確な遺伝子配列が利用できない場合においては、最も近い相同体の配列に基づきオリゴヌクレオチドプライマーを設計し、適切な組織に由来するＲＮＡから、ＲＴ－ＰＣＲにより遺伝子を単離した。単一の制限エンドヌクレアーゼ開裂部位に隣接する遺伝子セグメントを、標準的なクローニング／配列決定ベクター内へとクローニングした。プラスミドＤＮＡを形質転換細菌から精製し、濃度をＵＶ分光法によって測定した。サブクローニングした遺伝子フラグメントのＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列決定によって確認した。遺伝子セグメントは、それぞれの発現ベクター内へのサブクローニングを可能にする適切な制限部位を用いて設計した。全てのコンストラクトは、真核細胞における分泌のためのタンパク質を標的とするリーダー配列についてコードする５’末端ＤＮＡ配列を用いて設計した。
タンパク質精製
タンパク質は、標準プロトコルに言及される、フィルタにかけた細胞培養物上清から精製した。簡潔に述べると、抗体を、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用し、ＰＢＳで洗浄した。抗体の溶離は、ｐＨ２．８で達成され、その後、試料を即時中和した。凝集したタンパク質は、ＰＢＳ中での、又は２０ｍＭ ヒスチジン、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）中でのサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって、単量体抗体から分離した。単量体抗体フラクションをプールし、例えば、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ（３０ ＭＷＣＯ）遠心分離濃縮器を用いて濃縮し（必要な場合）、凍結させ、－２０℃又は－８０℃で保存した。サンプルの一部を、例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）又は質量分析法によるその後のタンパク質分析及び分析による特性決定のために提供した。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ
ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｐｒｅ－Ｃａｓｔゲルシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、製造元の説明書により使用した。特に、１０％又は４～１２％のＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）Ｂｉｓ－ＴＲＩＳ Ｐｒｅ－Ｃａｓｔゲル（ｐＨ６．４）、及びＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＭＥＳ（還元型ゲル、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）酸化防止剤ランニングバッファー助剤を添加）又はＭＯＰＳ（非還元型ゲル）ランニングバッファーを使用した。
ＣＥ－ＳＤＳ
二重特異性抗体とコントロール抗体の純度、抗体の完全性、分子量を、マイクロ流体Ｌａｂｃｈｉｐテクノロジー（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＳＡ）を使用したＣＥ－ＳＤＳで分析した。ＨＴ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ試薬キットを製造元の指示に従って使用してＣＥ－ＳＤＳ分析用に５μｌのタンパク質溶液を調製し、ＨＴ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓチップを使用してＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩシステムで分析した。ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸソフトウェアバージョン３．０．６１８．０を使用してデータを分析した。
分析用サイズ排除クロマトグラフィー
抗体の凝集及びオリゴマー状態を決定するためのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、ＨＰＬＣクロマトグラフィーによって行った。簡潔に述べると、プロテインＡ精製抗体を、Ａｇｉｌｅｎｔ ＨＰＬＣ １１００システムの３００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４／Ｋ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．５）におけるＴｏｓｏｈ ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷカラムに、又はＤｉｏｎｅｘ ＨＰＬＣ－Ｓｙｓｔｅｍの２×ＰＢＳにおけるＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用した。溶離したタンパク質をＵＶ吸光度及びピーク面積の積分によって定量した。ＢｉｏＲａｄ Ｇｅｌ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ １５１－１９０１を標準物質として供した。
質量分析法
この章は、その正しいアセンブリに重点をおいて、ＶＨ／ＶＬ又はＣＨ／ＣＬ交換（ＣｒｏｓｓＭａｂ）を有する多特異性抗体の特性決定を記載する。予想される一次構造を、脱グリコシル化したインタクトなＣｒｏｓｓＭａｂ及び脱グリコシル化した／ＦａｂＡＬＡＣＴＩＣＡ、又は脱グリコシル化した／ＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮ消化したＣｒｏｓｓＭａｂのエレクトロスプレーイオン化質量分析法（ＥＳＩ－ＭＳ）によって分析した。
ＣｒｏｓｓＭａｂを、リン酸緩衝液又はＴｒｉｓ緩衝液中、タンパク質濃度１ｍｇ／ｍＬで、３７℃で１７時間までの時間、Ｎ－グリコシダーゼＦを用いて脱グリコシル化した。ＦａｂＡＬＡＣＴＩＣＡ又はＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮ（Ｇｅｎｏｖｉｓ ＡＢ；スウェーデン）消化は、１００μｇの脱グリコシル化ＣｒｏｓｓＭａｂｓを使用してベンダーから提供されたバッファーで行った。質量分析の前に、サンプルを、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのＨＰＬＣによって脱塩した。合計質量は、ＴｒｉＶｅｒｓａ ＮａｎｏＭａｔｅ ｓｏｕｒｃｅ（Ａｄｖｉｏｎ）が取り付けられたｍａＸｉｓ ４Ｇ ＵＨＲ－ＱＴＯＦ ＭＳシステム（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｋ）でのＥＳＩ－ＭＳによって決定された。
実施例１
線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に対する新しい抗体の生成
１．１ マウスの免疫付与
Ｂａｌｂ／ｃ及びＮＭＲＩマウスを免疫に使用した。動物は、付録Ａ「動物の収容と世話に関するガイドライン」に従ってＡＡＡＬＡＣｉ認定の動物施設に収容された。全ての動物予防接種プロトコルと実験は、オーバーバイエルン政府（許可番号５５．２－１－５４－２５３１－１９－１０）によって承認され、ドイツの動物福祉法と欧州議会及び理事会の指令２０１０／６３に従って実施された。６～８週齢のＢａｌｂ／ｃ及びＮＭＲＩマウス（ｎ＝５）は、Ｈｉｓタグ（配列番号７８）に共有結合したヒト線維芽細胞活性化タンパク質アルファ（アミノ酸２７－７５９；アクセッション番号ＮＰ＿００４４５１）の組換え産生細胞外ドメインで４ラウンドの免疫を受けた。各免疫化の前に、マウスを酸素とイソフルランの混合ガスで麻酔した。最初の免疫では、ＰＢＳ、ｐＨ７．４に溶解した３０μｇのタンパク質を等量のＣＦＡ（ＢＤ Ｄｉｆｃｏ、＃２６３８１０）と混合し、腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。アビスコアジュバントに乳化した別の１０μｇのタンパク質を６週目に皮下（ｓ．ｃ．）投与した。アジュバントなしの５μｇタンパク質の３回目の用量を１０週目に腹腔内投与した。最後に、ハイブリドーマ技術を使用して抗体開発のための脾細胞を調製する３日前に、マウスを５０μｇのタンパク質で静脈内（ｉ．ｖ．）追加免疫に供した。血清は、ＥＬＩＳＡによって抗原特異的総ＩｇＧ抗体産生について試験された。最終免疫の３日後、マウスを安楽死させ、脾臓を無菌的に単離し、ハイブリドーマ生成のために準備した。マウスリンパ球を単離し、ＰＥＧベースの標準プロトコルを使用してマウス骨髄腫細胞株と融合させてハイブリドーマを生成した。得られたハイブリドーマ細胞を平底９６ウェルマイクロ力価プレートに約１０４でプレーティングし、続いて選択培地で約２週間インキュベートし、抗原特異的抗体の産生についてスクリーニングした。広範なハイブリドーマの増殖が起こると、抗体分泌ハイブリドーマが再播種される。ハイブリドーマ上清を、ＥＬＩＳＡによって組換えヒト線維芽細胞活性化タンパク質アルファ（ｈｕＦＡＰ）への特異的結合についてスクリーニングし、続いて、Ｂｉａｃｏｒｅ測定を使用して組換えｈｕＦＡＰへの動的結合パラメータを評価した。
ハイブリドーマの培養：生成されたｍｕＭＡｂハイブリドーマは、２ｍＭ Ｌ－グルタミン（ＧＩＢＣＯ－カタログ番号３５０５０－０３８）、１ｍＭ Ｎａ－ピルビン酸（ＧＩＢＣＯ－カタログ番号１１３６０－０３９）、１ｘＮＥＡＡ（ＧＩＢＣＯ－カタログ番号１１１４０－０３５）、１０％ＦＣＳ（ＰＡＡ－カタログ番号Ａ１５－６４９）、１ｘＰｅｎ Ｓｔｒｅｐ（Ｒｏｃｈｅ－カタログ番号１０７４４４０）、１ｘＮｕｔｒｉｄｏｍａ ＣＳ（Ｒｏｃｈｅ－カタログ番号１３６３７４３）、５０μＭメルカプトエタノール（ＧＩＢＣＯ－カタログ番号３１３５０－０１０）及び５０Ｕ／ｍｌ ＩＬ ６マウス（Ｒｏｃｈｅ－カタログ番号１ ４４４ ５８１）を添加したＲＰＭＩ １６４０（ＰＡＮ－カタログ番号（カタログ番号）ＰＯ４－１７５００）で、３７℃及び５％ＣＯ２で、培養した。
１．２ ＦＡＰクローン４Ｂ９及び２８Ｈ１への抗ｈｕＦＡＰ抗体の競合的細胞結合
得られたクローンを、ＦＡＰクローン４Ｂ９と比較してそれらの結合挙動について試験した。ＦＡＰバインダー４Ｂ９及び２８Ｈ１の生成及び調製は、国際公開第２０１２／０２０００６Ａ２号に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。マウスＦＡＰクローンが異なるエピトープをクローン４Ｂ９及び２８Ｈ１として認識するかどうかを決定するために、トランスフェクトされたＨＥＫ細胞で発現されたヒトＦＡＰに結合する競合を実施した。
簡単に説明すると、標的細胞をＣｅｌｌ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒで回収し、ＦＡＣＳ Ｂｕｆｆｅｒ（ＰＢＳ＋２％ＦＣＳ＋５ｍＭ ＥＤＴＡ＋０．２５％ナトリウム酸）で洗浄し、９６－Ｕボトムプレートに播種した（１ｘ１０５個の細胞／ウェル）。非標識一次抗ヒトＦＡＰ抗体（ｍｕ ＩｇＧ１）を細胞に添加し（最終濃度６０μｇ／ｍｌ～０．２μｇ／ｍｌ；１：３希釈）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７標識抗ＦＡＰ抗体４Ｂ９又は２８Ｈ１（最終濃度２０μｇ／ｍｌ）を添加する前に４℃で２０分間インキュベートした。４℃で３０分間インキュベートした後、細胞を洗浄、固定し、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＭＡＣＳＱｕａｎｔを使用してＡＦ６４７標識クローン４Ｂ９及び２８Ｈ１の蛍光シグナル強度を測定した。
図２Ａ及び図２Ｂに見られるように、抗ＦＡＰ抗体４Ｂ９又は２８Ｈ１との結合をめぐって競合しなかった１０個のハイブリドーマ由来のマウス抗体（クローン２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７及び２１８と名付けられた）が同定された。
１．３ 抗ｈｕＦＡＰマウス抗体の標的結合特異性
線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ、ＦＡＰ－α、セプラーゼ）は、プロリルオリゴペプチダーゼファミリーに属するＩＩ型膜貫通型セリンプロテアーゼである。このファミリーは、プロリン残基の後に優先的にペプチドを切断するセリンプロテアーゼを含む。ヒトプロテオームで発現されるこのファミリーの他の重要なメンバーは、プロリルオリゴペプチダーゼ（ＰＲＥＰ）及びジペプチジルペプチダーゼ（ＤＰＰ）である。ＤＰＰ－ＩＶは、ＦＡＰの最も近い相同体である。ＦＡＰとは対照的に、ＤＰＰ－ＩＶは遍在的に発現し、Ｔ細胞共刺激、ケモカイン生物学、糖代謝、腫瘍形成などのさまざまな生物学的プロセスで役割を果たすため、所望の抗ヒトＦＡＰ抗体はヒトＤＰＰ－ＩＶに結合しないはずである。
ヒトＦＡＰ及びヒトＤＰＰ－ＩＶへの結合は、ヒトＦＡＰ又はヒトＤＰＰＩＶをトランスフェクトしたＨＥＫ細胞を使用したフローサイトメトリーによって決定された。簡単に説明すると、標的細胞をＣｅｌｌ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒで回収し、ＦＡＣＳ Ｂｕｆｆｅｒ（ＰＢＳ＋２％ＦＣＳ＋５ｍＭ ＥＤＴＡ＋０．２５％ナトリウム酸）で洗浄し、９６－Ｕボトムプレートに播種した（１ｘ１０５個の細胞／ウェル）。標識されていない一次抗体を細胞に添加し（最終濃度１０μｇ／ｍｌ）、４℃で３０分間インキュベートした。洗浄後、細胞をヤギ抗マウスＩｇＧ－ＰＥ Ｆ（ａｂ’）２（Ｓｅｒｏｔｅｃ）とともに、暗所で４℃で３０分間インキュベートした。その後、細胞を洗浄し、固定し、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ（商標）ＩＩを使用して測定した。ヒトＤＰＰ－ＩＶへの非特異的結合は、１０個のハイブリドーマ由来の抗ヒトＦＡＰ抗体のいずれについても検出されなかった。
１．４ ｈｕＩｇＧ１＿ＬＡＬＡ＿ＰＧフォーマットでの抗ｈｕＦＡＰ抗体の生成
新しい抗ｈｕＦＡＰ抗体のＤＮＡ配列は、標準的な配列決定法で決定された。ＶＨ及びＶＬドメインに基づいて、新しい抗ＦＡＰ抗体は、国際公開第２０１２／１３０８３１Ａ１号に記載されている方法に従って、Ｆｃ受容体への結合を無効にするエフェクターサイレントＦｃγ（Ｐ３２９Ｇ；Ｌ２３４、Ｌ２３５Ａ）を備えたｈｕＩｇＧ１抗体として発現された。詳細には、抗体は、異なるペプチド鎖をコードする発現ベクターを用いて、懸濁液中で増殖させたＨＥＫ２９３－Ｆ細胞の一過性トランスフェクションによって発現された。ＨＥＫ２９３－Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）へのトランスフェクションは、抗体ベクターのＭａｘｉｐｒｅｐ（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）調製物、Ｆ１７ベースの培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）、ＰＥＩｐｒｏ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ）、及び無血清ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）での初期細胞密度が１００～２００万生細胞／ｍｌを使用して、細胞供給業者の指示に従って実施した。振とうフラスコ又は撹拌発酵槽で７日間培養した後、１４０００ｇで３０分間遠心分離して細胞培養上清を回収し、０．２２μｍフィルターにかけた。
抗体は、ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、スウェーデン）クロマトグラフィーを使用した親和性クロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製された。簡単に説明すると、滅菌フィルターにかけた細胞培養上清を、ＰＢＳバッファー（１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ及び２．７ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．４）で平衡化したＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ樹脂で捕捉し、平衡化バッファーで洗浄し、２５ｍＭクエン酸塩、ｐＨ３．０で溶出した。１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ９．０で中和した後、２０ｍＭ ヒスチジン、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０でサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、凝集タンパク質を単量体抗体種から分離した。単量体タンパク質画分をプールし、必要に応じて、例えば、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ（３０ＫＤ ＭＷＣＯ）遠心分離濃縮器を用いて濃縮し、－８０℃で保存した。サンプルの一定分量は、ＣＥ－ＳＤＳ、サイズ排除クロマトグラフィー、質量分析、及びエンドトキシン測定によるその後の分析特性評価に使用された。
１．５ 抗ｈｕＦＡＰ抗体の細胞間結合
抗ＦＡＰ抗体とヒトＩｇＧ１ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ ＦｃのヒトＦＡＰへの結合は、ヒトＦＡＰをトランスフェクトしたＨＥＫ細胞を使用したフローサイトメトリーによって決定した。簡単に説明すると、標的細胞をＣｅｌｌ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒで回収し、ＦＡＣＳ Ｂｕｆｆｅｒ（ＰＢＳ＋２％ＦＣＳ＋５ｍＭ ＥＤＴＡ＋０．２５％ナトリウム酸）で洗浄し、９６－Ｕボトムプレートに播種した（１ｘ１０５個の細胞／ウェル）。標識されていない一次抗体を細胞に添加し（最終濃度１０μｇ／ｍｌ～０．６４ｎｇ／ｍｌ；１：５希釈）、４℃で３０分間インキュベートした。洗浄後、細胞をＰＥ結合ＡｆｆｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ）２フラグメントヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）とともに、暗所で４℃で３０分間インキュベートした。その後、細胞を洗浄し、固定し、ＢＤ ＦＡＣＳ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（商標）を使用して測定した。
全ての抗ＦＡＰ抗体は、以前に見られたように、ヒトＦＡＰへの同様の結合を示した。選択したバインダーのＥＣ５０値を以下の表１に示す。
Figure 0007221379000011
１．６ 抗ｈｕＦＡＰ抗体の細胞内在化
ＦＡＰバインダーの内在化は、ヒトＦＡＰをトランスフェクトしたＨＥＫ細胞を標的として使用して決定された。簡単に説明すると、標的細胞を細胞解離バッファーで回収し、冷ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ＋２％ＦＣＳ＋５ｍＭ ＥＤＴＡ＋０．２５％ナトリウム酸）で洗浄し、冷ＦＡＣＳバッファーに１．５ｘ１０６個の細胞／ｍｌで再懸濁した。細胞を１５ｍｌチューブに分配した（各チューブは２ｍｌに３ｘ１０６個の細胞を含む）。２ｍｌの抗ヒトＦＡＰ抗体溶液を細胞に添加し（最終濃度２０μｇ／ｍｌ）、４℃で４５分間インキュベートした。その後、細胞を洗浄し、冷ＦＡＣＳバッファーに再懸濁し、時点「０」の細胞を直ちに９６－Ｕボトムプレートに播種し（１．５ｘ１０５個の細胞／ウェル）、４℃で維持したが、他の全ての細胞は、遠心分離し、１０％ＦＣＳ及び１％Ｇｌｕｔａｍａｘ（１．５ｘ１０６個の細胞／ｍｌ）を含み、加湿インキュベーター（５％ＣＯ２）で３７℃にシフトした温ＲＰＭＩ１６４０培地中に、再懸濁した。示された各時点の後、１００μｌ／チューブの細胞懸濁液をプレートに移し、すぐに冷ＦＡＣＳバッファーで冷却し、全ての時点が収集されるまで冷蔵庫に保存した。全ての時点を収集した後、細胞を冷ＦＡＣＳバッファーで洗浄し、ＰＥ標識二次抗体とともに４℃で３０分間インキュベートした。その後、細胞を洗浄、固定し、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ（商標）ＩＩを使用して測定した。
標識された二次抗体によって引き起こされるシグナルは、時間の経過とともにほぼ一定のままだった。つまり、時間の経過とともに抗体の喪失は観察されず、テストされた抗ｈｕ ＦＡＰ抗体はいずれも内在化されなかった。
１．７ 抗ｈｕＦＡＰ抗体の結合速度論
ヒトＦＡＰ結合動態を評価するために、ビオチン化ヒトＦＡＰをシリーズＳ Ｂｉａｃｏｒｅ ＣＡＰｔｕｒｅチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ２８－９２０２－３４）に製造元の指示に従って固定化し、表面密度を約２０共鳴単位（ＲＵ）にした。ランニング及び希釈バッファーとして、ＨＢＳ－Ｐ＋（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．４、０．０５％界面活性剤Ｐ２０）を使用した。一連の抗ｈｕＦＡＰ Ｆａｂの希釈液（３．７～３００ｎＭ、１：３希釈）をそれぞれ１２０秒間連続して注入し、３０μｌ／ｍｉｎの流速で１８００秒間解離をモニターした（シングルサイクル動態）。６Ｍ グアニジン－ＨＣｌ、０．２５Ｍ ＮａＯＨを１２０秒間注入することにより、表面を再生成した。バルク屈折率の差は、ブランク注入を差し引くことによって、及び捕捉されたヒトＦＡＰなしで制御フローセルから得られた応答を差し引くことで補正した。カーブフィッティングは、Ｂｉａｃｏｒｅ評価ソフトウェア内の１：１ラングミュア結合モデルを使用して実行された。親和性データを以下の表２に示す。
Figure 0007221379000012
１．８ 抗ｈｕＦＡＰクローンのフォーマット依存結合
抗ＦＡＰクローンが、ＦｃドメインにＣ末端で融合したときに結合特性が失われないかどうかを判断するために、ＶＨドメインがＣ末端に融合したＦｃノブ鎖とＦｃホール鎖を含むコンストラクトＦｃノブ鎖の末端及びＶＬドメインが、Ｆｃホール鎖のＣ末端に融合され（図３Ａ、Ｃ末端ＶＨ／ＶＬ融合）、Ｆｃノブ鎖及びＦｃホール鎖を含むコンストラクトが、Ｆａｂ全体がＶＨドメインとＦｃノブ鎖のＣ末端に融合している（図３Ｂ、Ｃ末端Ｆａｂ融合）。Ｆｃノブ鎖は配列番号９７のアミノ酸配列を有し、Ｆｃホール鎖は配列番号９８のアミノ酸配列を有する。
抗体と比較した、ビオチン化組換えヒトＦＡＰ及びビオチン化組換えカニクイザルＦＡＰに対するコンストラクトの親和性を以下の表３に示す。
Figure 0007221379000013
コンストラクトのＦＡＰトランスフェクトＨＥＫ細胞への細胞間結合もまた、本明細書で以前に記載されたように決定されている。ＥＣ５０値を表４に示す。全ての抗ＦＡＰ抗体のＣ末端融合コンストラクトはヒト及びカニクイザルＦＡＰに結合可能だったが、Ｆａｂ全体がＶＨドメインとＦｃノブ鎖のＣ末端に融合しているコンストラクトは、ＶＨドメインが、Ｆｃノブ鎖のＣ末端に融合し、ＶＬドメインはＦｃホール鎖のＣ末端に融合しているものよりも、優れていた。
Figure 0007221379000014
１．９ Ｂｉａｃｏｒｅによって決定された抗ヒトＦＡＰクローンの競合的結合
エピトープビニングを、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器で表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に基づくアッセイを用いて行った。ＦＡＰ抗原は固定化された抗Ｈｉｓ抗体によって捕捉された。最初のステップでは、ＦＡＰバインダーが飽和するまで注入された。続いて、第２のＦＡＰバインダーが注入された。アッセイの設計を図３Ｃに模式的に示す。二次抗体の添加後の結合シグナルの増加は、一次抗体とは異なるエピトープへの結合を示す。追加の結合は、一次抗体と二次抗体が同じエピトープ領域を認識することを示していない。
２０μｇ／ｍｌの濃度の抗Ｈｉｓ抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｋｉｔ ２８－９９５０－５６）は、ＣＭ５センサーチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＢＲ－１００５－３０）の表面へのアミンカップリング（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｋｉｔ ＢＲ－１０００－５０）によって固定化された。注入時間は１０μｌ／ｍｉｎの流量で６００秒で、２つのフローセルで１２０００応答ユニット（ＲＵ）が得られ、１つはリファレンスとして使用し、もう１つはアクティブフローセルとして使用した。ランニングバッファーはＨＢＳ－Ｎ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＢＲ－１００６－７０）だった。測定には、ＰＢＳ－Ｐ＋（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ２８－９９５０－８４）をランニング及び希釈バッファーとして使用した。フローセル温度は２５℃、サンプルコンパートメントは１２℃に設定した。流量は、ラン全体で１０μｌ／ｍｉｎに設定した。
Ｈｉｓタグ付きＦＡＰ抗原は、２０μｇ／ｍｌの濃度で１８０秒間アクティブフローセルに捕捉された。一次抗体と二次抗体（ＦＡＰバインダー）を、両方のフローセルに１０μｇ／ｍｌの濃度でそれぞれ１２０秒間連続して注入した。各サイクルの後、表面を１０ｍＭ グリシン ｐＨ１．５で６０秒間再生成した（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＢＲ－１００３－５４）。
結果を、以下の表５に示す。
Figure 0007221379000015
したがって、３つのエピトープビンが同定された。要求に応じて、どの抗ＦＡＰ抗体も抗体４Ｂ９（エピトープビン１）との結合をめぐって競合しなかった。抗体２１０、２１１、２１２、及び２１４は、結合について互いに競合し、従って１つの群を形成する（エピトープビン３）が、抗体２０９は、他の抗体との結合について競合しなかった（エピトープビン２）。
１．９ 抗ＦＡＰ抗体の熱安定性評価
試料を、２０ｍＭ ヒスチジン／ヒスチジンクロリド、１４０ｍＭ ＮａＣｌ中、ｐＨ６．０で１ｍｇ／ｍＬの濃度にて調製し、０．４μｍフィルタープレートで遠心分離して光学３８４ウェルプレートに移し、パラフィンオイルで覆った。流体力学的半径は、サンプルを２５℃～８０℃まで０．０５℃／分の速度で加熱しながら、ＤｙｎａＰｒｏプレートリーダー（ワイアット）で動的光散乱法によって繰り返し測定される。あるいは、サンプルを１０μＬのマイクロキュベットアレイに移し、静的光散乱データと２６６ｎｍレーザーで励起したときの蛍光データを、それらが２５℃～９０℃まで０．１℃／分の速度で加熱されている間、Ｏｐｔｉｍ１０００装置（Ａｖａｃｔａ Ｉｎｃ．）で記録した。凝集開始温度（Ｔａｇｇ）は、流体力学的半径（ＤＬＳ）又は散乱光強度（Ｏｐｔｉｍ１０００）が増加し始める温度として定義される。融点は、蛍光強度対波長を示すグラフの変曲点として定義される。選択した抗ＦＡＰ抗体の凝集開始温度を表６に示す。
Figure 0007221379000016
抗ＦＡＰクローン２１２は、抗体４Ｂ９と同等の高い親和性でヒトＦＡＰに結合し、開発に有利な特性を示したため、ヒト化のために選択された。その配列のコンピュータ分析は、１つの予測される分解ホットスポット（位置４０１のＴｒｐ）のみを示した。マウスクローン２１２の配列を表７に示す。
Figure 0007221379000017
１．１０ 抗ＦＡＰクローン２１２のヒト化
１．１０．１ 方法論
適切なヒトアクセプターフレームワークは、ヒトＶ及びＪ領域配列のＢＬＡＳＴｐデータベースにマウス入力配列（可変部分に植え付けられた）を照会することによって特定された。ヒトアクセプターフレームワークを選択するための選択基準は、配列相同性、同じ又は類似のＣＤＲ長、及びヒト生殖系列の推定頻度だったが、ＶＨ－ＶＬドメインインターフェースでの特定のアミノ酸の保存でもあった。生殖系列の同定ステップに続いて、マウス入力配列のＣＤＲをヒトアクセプターフレームワーク領域に移植した。これらの最初のＣＤＲ移植片と親抗体の間の各アミノ酸の違いは、それぞれの可変領域の構造的完全性への影響の可能性について評価され、親配列に対する「逆突然変異」が適切と思われる場合はいつでも導入された。構造評価は、Ｂｉｏｖｉａ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ、バージョン１７Ｒ２を使用して実装した、社内で抗体構造相同性モデリングプロトコルにより作製し、親抗体とヒト化変異体の両方のＦｖ領域相同性モデルに基づいた。いくつかのヒト化変異体には、「順突然変異」、すなわち、親バインダーの所与のＣＤＲ位置で発生する元のアミノ酸をヒト受容体生殖系列の同等の位置で見られるアミノ酸に変更するアミノ酸交換が含まれていた。目的は、免疫原性のリスクを更に低減するために、（フレームワーク領域を超えて）ヒト化変異体の全体的な人間性を高めることである。
社内で開発されたコンピュータツールを使用して、対になったＶＨ及びＶＬヒト化変異体のＶＨ－ＶＬドメイン配向を予測した（国際公開第２０１６／０６２７３４号を参照）。結果を親バインダーの予測されたＶＨ－ＶＬドメイン配向と比較して、元の抗体に形状が近いフレームワークの組み合わせを選択した。理論的根拠は、バインディングプロパティに悪影響を与える可能性がある２つのドメインのペアリングに破壊的な変化をもたらす可能性のあるＶＨ－ＶＬインターフェース領域でのアミノ酸交換の可能性を検出することである。
１．１０．２ アクセプターフレームワークの選択及びその適合
次のアクセプターフレームワークを選択した。
Figure 0007221379000018
ポストＣＤＲ３フレームワーク領域は、ヒトＩＧＨＪ生殖系列ＩＧＨＪ６＊０１／０２（ＹＹＹＹＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ）及びヒトＩＧＫＪ生殖系列ＩＧＫＪ４＊０１／０２（ＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ）から適合された。アクセプターフレームワークに関連する部分は太字で示されている。
構造上の考慮事項に基づいて、ヒトアクセプターフレームワークから親バインダーのアミノ酸への逆突然変異が、Ｈ４３（Ｑ＞Ｋ）、Ｈ４４（Ｇ＞Ｓ）、Ｈ４８（Ｍ＞Ｉ）、Ｈ７１（Ｒ＞Ｉ）、Ｈ７３（Ｔ＞Ｋ）、Ｈ９３（Ａ＞Ｔ）［ＶＨ１］、Ｈ４９（Ｓ＞Ｇ）、Ｈ７１（Ｒ＞Ｉ）、Ｈ７３（Ｎ＞Ｋ）、Ｈ７８（Ｌ＞Ａ）、Ｈ９３（Ａ＞Ｔ）、Ｈ９４（Ｋ＞Ｒ）［ＶＨ２］、Ｌ３６（Ｙ＞Ｆ）、Ｌ４３（Ａ＞Ｐ）、Ｌ８７（Ｙ＞Ｆ）［ＶＬ１］及びＬ３６（Ｙ＞Ｆ）、Ｌ４２（Ｋ＞Ｑ）、Ｌ４３（Ａ＞Ｐ）、Ｌ８５（Ｔ＞Ｍ）、Ｌ８７（Ｙ＞Ｆ）［ＶＬ２］の位置に導入された。
更に、位置Ｈ６０（Ｎ＞Ａ）、Ｈ６４（Ｋ＞Ｑ）［ＶＨ１］、Ｈ６０（Ｎ＞Ａ）、Ｈ６１（Ｑ＞Ｄ）、Ｈ６２（Ｋ＞Ｓ）、Ｈ６３（Ｆ＞Ｖ）［ＶＨ２］、Ｌ３３（Ｉ＞Ｌ）、Ｌ３４（Ｎ＞Ａ）［ＶＬ１］及びＬ２７ｂ（Ｖ＞Ｉ）、Ｌ３３（Ｉ＞Ｌ）［ＶＬ２］は、順突然変異の有望な候補として同定された。全ての位置は、Ｋａｂａｔ ＥＵの番号付けスキームで与えられる。
Figure 0007221379000019
注：逆突然変異の前にはｂが付いており、順突然変異にはｆが付いている。例えば、ｂＭ４８Ｉは、４８位（Ｋａｂａｔ）のメチオニンからイソロイシンへの逆突然変異（ヒト生殖系列アミノ酸から親抗体アミノ酸）を指す。
アクセプターフレームワークに基づいて得られたヒト化ＦＡＰ抗体のＶＨ及びＶＬドメインは、以下の表１０に見出すことができる。
Figure 0007221379000020
Figure 0007221379000021
１．１０．３ 新しいヒト化抗ＦＡＰ Ｆａｂ
ＶＨ及びＶＬの新しいヒト化変異体に基づいて、新しい抗ＦＡＰ Ｆａｂが発現された。
Figure 0007221379000022
クローン２１２に基づく新しいヒト化抗ＦＡＰ変異体の親和性を、抗ＦＡＰ抗体４Ｂ９と比較して分析した。更に、ヒト化変異体のヒト性を計算し、その凝集開始温度を測定した。
Figure 0007221379000023
１．１１ ＦｃＲｎ／ヘパリン結合とコンピュータ電荷分布
ＰＢＳ、ｐＨ ７．４における抗体４Ｂ９及びＰ１ＡＥ１６８９の電荷分布は、コンピュータモデルで計算された。モデルによると、４Ｂ９には大きな陽性パッチがあり、ヘパリン結合の増加と相関することがある。一方、Ｐ１ＡＥ１６８９は、ヘパリンの相互作用が弱いことを示す可能性のある大きな負電荷パッチを示す。
これらの予測は、ＦｃＲｎ親和性カラム及びｐＨ勾配、並びにヘパリン親和性カラム及びｐＨ勾配を使用した両方の抗体のクロマトグラフィーによって確認された。国際公開第２０１５／１４０１２６号は、ＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムで決定された保持時間に基づいて抗体のインビボ半減期を予測する方法を開示しているが、ヘパリン結合は細胞表面構造との非特異的相互作用と相関している。
実施例２
抗ＣＤ４０抗体Ｓ２Ｃ６のヒト化変異体の生成と産生
２．１ 抗ＣＤ４０抗体Ｓ２Ｃ６のヒト化変異体の生成
２．２．１ 方法論
抗ＣＤ４０バインダーＳ２Ｃ６のヒト化中の適切なヒトアクセプターフレームワークの同定のために、２つの方法論の組み合わせが使用された。一方では、高い配列相同性を備えたアクセプターフレームワークを検索し、このフレームワークにＣＤＲを移植し、どの逆突然変異を想定できるかを評価することにより、古典的なアプローチが採用された。より明示的には、親抗体に対する、識別したフレームワークの各アミノ酸の違いの、バインダーに対する構造的完全性の影響を判断し、適切な場合はいつでも、親配列に対する逆突然変異を導入した。構造評価は、親抗体、及び、Ｂｉｏｖｉａ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，バージョン４．５を使用して実装した、社内で抗体構造相同性モデリングツールにより作製したそのヒト化版の両方のＦｖ領域相同性モデルに基いた。
他方、社内で開発されたコンピュータツールを使用して、ヒト化バージョンのＶＨ及びＶＬドメインの互いに対する方向を予測した（参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１６０６２７３４号を参照）。結果を親バインダーの予測されたＶＨ－ＶＬドメイン配向と比較して、開始抗体に形状が近いフレームワークの組み合わせを選択した。理論的根拠は、２つのドメインのペアリングに破壊的な変化をもたらす可能性のあるＶＨ－ＶＬインターフェース領域でのアミノ酸交換の可能性を検出することである。
２．２．２ アクセプターフレームワークの選択及びその適合
以下の表１６及び表１８に記載されているように、２つの異なるアクセプターフレームワークが選択された。
Figure 0007221379000024
ポストＣＤＲ３フレームワーク領域は、ヒトＩＧＨＪ生殖系列ＩＧＨＪ６＊０１／０２（ＹＹＹＹＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ）及びヒトＩＧＫＪ生殖系列ＩＧＫＪ４＊０１／０２（ＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ）から適合された。アクセプターフレームワークに関連する部分は太字で示されている。
構造上の考慮事項に基づいて、ヒトアクセプターフレームワークから親バインダーのアミノ酸への逆突然変異が、ＶＨ領域の位置Ｈ４３（Ｑ＞Ｋ）、Ｈ４４（Ｇ＞Ｓ）、Ｈ６９（Ｍ＞Ｌ）、Ｈ７１（Ｒ＞Ｖ）、Ｈ７３（Ｔ＞Ｋ）、Ｈ８８（Ｖ＞Ａ）及びＨ１０５（Ｑ＞Ｈ）、ＶＬ領域の位置Ｌ２（Ｉ＞Ｖ）、Ｌ４（Ｍ＞Ｖ）、Ｌ８７（Ｙ＞Ｆ）及びＬ１０４（Ｖ＞Ｌ）に導入された。１つの変異体では、この位置でわずかに親水性の高い残基の効果を研究するために、突然変異Ｔ７０Ｓ（ＶＨ）が含まれていた。
全ての変異体には、推定される開発可能性のホットスポット（アスパラギンの脱アミド化）に対処するためのＮ５４Ａ突然変異（ＶＨ）が含まれている。全ての位置は、Ｋａｂａｔ ＥＵの番号付けスキームで与えられる。
次の表１４に、ヒト化変異体のＶＨ－ＶＬペアリングマトリックスを示す。
Figure 0007221379000025
突然変異Ｎ５４Ａは、全てのＶＨ変異体に適用され、明示的には言及されていない。接頭辞ｂが付いたものが、逆突然変異、接頭辞ｆが付いたものが、順突然変異、及び接頭辞ｘが付いたものが、その他の突然変異
Figure 0007221379000026
ポストＣＤＲ３フレームワーク領域は、ヒトＩＧＨＪ生殖系列ＩＧＨＪ６＊０１／０２（ＹＹＹＹＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ）及びヒトＩＧＫＪ生殖系列ＩＧＫＪ４＊０１／０２（ＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ）から適合された。アクセプターフレームワークに関連する部分は太字で示されている。
構造上の考慮事項に基づいて、ヒトアクセプターフレームワークから親バインダーのアミノ酸への逆突然変異が、ＶＨ領域の位置Ｈ４４（Ｇ＞Ｓ）、Ｈ４９（Ｓ＞Ｇ）、Ｈ７１（Ｒ＞Ｖ）、Ｈ７８（Ｌ＞Ａ）、Ｈ９４（Ｋ＞Ｒ）及びＨ１０５（Ｑ＞Ｈ）、並びにＶＬ領域の位置Ｌ４２（Ｋ＞Ｑ）、Ｌ４３（Ａ＞Ｓ）及びＬ８７（Ｙ＞Ｆ）に導入された。更に、ＣＤＲ－Ｈ２の４つの位置、すなわち、Ｈ６０（Ｎ＞Ｇ）、Ｈ６１（Ｑ＞Ｄ）、Ｈ６２（Ｋ＞Ｓ）及びＨ６３（Ｆ＞Ｖ）は、全体的な人間の特性を高めるための、親バインダーからヒトアクセプター生殖系列へのアミノ酸交換などの順突然変異の有望な候補として特定された。
全ての変異体には、推定される開発可能性のホットスポット（アスパラギンの脱アミド化）に対処するためのＮ５４Ａ突然変異（ＶＨ）が含まれている。全ての位置は、Ｋａｂａｔ ＥＵの番号付けスキームで与えられる。
次の表１６に、ヒト化変異体のＶＨ－ＶＬペアリングマトリックスを示す。
Figure 0007221379000027
接頭辞ｂが付いたものが、逆突然変異、接頭辞ｆが付いたものが、順突然変異
２．２．３ 得られるヒト化ＣＤ４０抗体のＶＨ及びＶＬドメイン
アクセプターフレームワーク１に基づくヒト化ＣＤ４０抗体の結果のＶＨ及びＶＬドメインは、以下の表１７に見出すことができ、アクセプターフレームワーク２に基づくヒト化ＣＤ４０抗体の結果のＶＨ及びＶＬドメインを以下の表１８に示す。
Figure 0007221379000028
Figure 0007221379000029
２．２．４ ｈｕＩｇＧ１＿ＬＡＬＡ＿ＰＧフォーマットの新しいヒト化ＣＤ４０抗体
ＶＨ及びＶＬの新しいヒト化変異体に基づいて、新しいＣＤ４０抗体は、国際公開第２０１２／１３０８３１Ａ１号に記載されている方法に従って、Ｆｃγ受容体への結合を無効にするエフェクターサイレントＦｃ（Ｐ３２９Ｇ；Ｌ２３４、Ｌ２３５Ａ）を備えたｈｕＩｇＧ１抗体として発現された。
Figure 0007221379000030
ヒトＩｇＧ１＿ＬＡＬＡＰＧ抗体としてのヒト化ＣＤ４０抗体の例示的な完全長配列は、表２０に見出すことができる。
Figure 0007221379000031
Figure 0007221379000032
２．２．５ ｈｕＩｇＧ１＿ＬＡＬＡ＿ＰＧフォーマットでの新しいヒト化ＣＤ４０抗体の産生
抗体は、異なるペプチド鎖をコードする発現ベクターを用いて、懸濁液中で増殖させたＨＥＫ２９３－Ｆ細胞の一過性トランスフェクションによって発現された。ＨＥＫ２９３－Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）へのトランスフェクションは、抗体ベクターのＭａｘｉｐｒｅｐ（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）調製物、Ｆ１７ベースの培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）、ＰＥＩｐｒｏ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ）、及び無血清ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）での初期細胞密度が１００～２００万生細胞／ｍｌを使用して、細胞供給業者の指示に従って実施した。振とうフラスコ又は撹拌発酵槽で７日間培養した後、１４０００ｇで３０分間遠心分離して細胞培養上清を回収し、０．２２μｍフィルターにかけた。
抗体は、ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、スウェーデン）クロマトグラフィーを使用した親和性クロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製された。簡単に説明すると、滅菌フィルターにかけた細胞培養上清を、ＰＢＳバッファー（１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ及び２．７ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．４）で平衡化したＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ樹脂で捕捉し、平衡化バッファーで洗浄し、２５ｍＭクエン酸塩、ｐＨ３．０、続いて１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ９．０で中和することにより、溶出した。ＰｒｏｔｅｉｎＡ精製後に受け取った製品の品質に応じて、ブチルセファロース４ＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、スウェーデン）樹脂を使用した疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）精製ステップが含まれていた。ＨＩＣ精製の前に、タンパク質をＨＩＣ平衡バッファーに対して透析した。ＨＩＣ精製は、平衡化／洗浄バッファーとして４０ｍＭ酢酸塩、１．５Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ５．５、溶出バッファーとして４０ｍＭ酢酸塩 ｐＨ５．５を使用して行い、直線勾配を適用して精製した。続いて、凝集したタンパク質は、２０ｍＭ ヒスチジン、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０でのサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって、単量体抗体種から分離した。単量体タンパク質画分をプールし、必要に応じて、例えば、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ（３０ＫＤ ＭＷＣＯ）遠心分離濃縮器を用いて濃縮し、－８０℃で保存した。サンプルの一定分量は、ＣＥ－ＳＤＳ、サイズ排除クロマトグラフィー、質量分析、及びエンドトキシン測定によるその後の分析特性評価に使用された。
さまざまなヒト化ＣＤ４０抗体の産生収量を、ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）クロマトグラフィーを使用した分取親和性クロマトグラフィー後の収量から計算された力価として表２１に示す。
最終精製ステップ後の分子の純度と分子量は、還元剤の存在下と非存在下でＣＥ－ＳＤＳ分析によって分析された。Ｃａｌｉｐｅｒ ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩシステム（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ）が、製造元の指示に従って使用された。
分子の凝集体含有量は、２５ｍＭ リン酸カリウム、１２５ｍＭ 塩化ナトリウム、２００ｍＭ Ｌ－アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３、２５℃でのｐＨ６．７ランニングバッファーで、ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ ＸＬ分析サイズ排除カラム（東ソー）を使用して分析した。
全ての抗体を直接比較するために、静的光散乱（ＳＬＳ）と、加えられた温度ストレスに応答した固有のタンパク質蛍光を測定することにより、熱安定性をモニターした。タンパク質濃度が１ｍｇ／ｍｌのフィルターにかけたタンパク質サンプル３０μｇを、Ｏｐｔｉｍ ２機器（Ａｖａｃｔａ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｌｔｄ）に２回ずつ適用した。温度は０．１℃／分で２５～８５℃に上昇し、半径と総散乱強度が収集された。固有のタンパク質蛍光を測定するために、サンプルを２６６ｎｍで励起し、２７５ｎｍ～４６０ｎｍでの発光を収集した。全ての抗体について、凝集温度（Ｔａｇｇ）は６４℃～６９℃の間であり、以下の表２１又は表２２に示されている。
異なるフレームワークを用いたヒト化ＣＤ４０抗体の産生収率を以下の表２１又は表２２に提供する。
Figure 0007221379000033
Figure 0007221379000034
２．２．６組換えヒト及びカニクイザルＣＤ４０細胞外ドメインタンパク質の生成
以下のコンストラクトがクローン化され、ＨＥＫ２９３細胞での一過性発現によって発現された。
１）Ｃ末端Ｈｉｓ－ＡｖｉＴａｇ（商標）タグ（配列番号２６６）を有するヒトＣＤ４０細胞外ドメイン（配列番号１のアミノ酸２１－１９３、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００１２４１）
２）Ｃ末端Ｈｉｓ－ＡｖｉＴａｇ（商標）タグ（配列番号２６７）を有するカニクイザル（ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＣＤ４０細胞外ドメイン（アミノ酸２１－１９３、カニクイザルＣＤ４０細胞外ドメイン配列はＲｏｃｈｅ ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｃＤＮＡデータベース、未発表データから取得）
結合分析用のＣＤ４０細胞外ドメイン抗原は、遺伝子合成（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ＧｍｂＨサービス、ドイツ）によって生成され、標準のクローニング手順を使用して、独自の制限部位を介してＲｏｃｈｅの社内発現ベクターにクローニングされた。全てのコンストラクトのクローニングは、シーケンシングによって検証された。全ての抗原は、ＣＭＶプロモーターの制御下で発現された。ＣＤ４０細胞外ドメインコンストラクトを一過性に発現させるために、懸濁液に適応したＨＥＫ２９３－Ｆ細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）にそれぞれのプラスミドをトランスフェクトした。一般に、約２ｘ１０６個の細胞／ｍｌの１ＬのＨＥＫ２９３－Ｆ細胞に、ＰＥＩｐｒｏトランスフェクション試薬（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ、ドイツ）によって複合体を形成した合計５００μｇのプラスミドＤＮＡを製造元の指示に従ってトランスフェクトした。トランスフェクション後、ＨＥＫ２９３－Ｆ細胞を６日間インキュベートした。続いて、細胞を遠心分離によって収集し、タンパク質を含む上清を、０．２２μｍの真空濾過システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用してフィルターにかけた。Ｈｉｓ－ＡｖｉＴａｇ（商標）タグ付きタンパク質は、完全なＨｉｓ－Ｔａｇ樹脂（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用したＩＭＡＣ親和性クロマトグラフィーによって精製された。５０ｍＭ Ｎａ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０で洗浄した後、Ｈｉｓ－ＡｖｉＴａｇ（商標）融合タンパク質を、ｐＨ７．０の５００ｍＭイミダゾールを添加した洗浄バッファーを使用して溶出した。凝集タンパク質は、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４でのサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって単量体融合タンパク質から分離された。単量体タンパク質画分をプールし、必要に応じて、例えば、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ（１０ＫＤ ＭＷＣＯ）遠心分離濃縮器を用いて濃縮し、－８０℃で保存した。試料の一定分量を、例えば、ＣＥ－ＳＤＳ、サイズ排除クロマトグラフィー又は質量分析法によるその後のタンパク質分析及び分析による特性決定のために使用した。
ＣＤ４０細胞外ドメインのビオチン化：
Ｃ末端ＡｖｉＴａｇ（商標）を含むヒト又はカニクイザルＣＤ４０細胞外ドメインコンストラクトの酵素部位特異的ビオチン化は、製造元の指示に従ってＢｉｒＡビオチン－タンパク質リガーゼキット（Ａｖｉｄｉｔｙ ＬＬＣ、ＵＳＡ）を使用して実行された。簡単に説明すると、１／１０容量のＢｉｏｍｉｘＡ（１０Ｘ濃度：０．５Ｍ ビシンバッファー、ｐＨ８．３）及びＢｉｏｍｉｘＢ（１０Ｘ濃度：１００ｍＭ ＡＴＰ、１００ｍＭ ＭｇＯＡｃ、５００μＭ ｄ－ビオチン）をＡｖｉＴａｇ（商標）含有タンパク質に添加し、続いて１０ｎｍｏｌタンパク質あたり２．５μｇのＢｉｒＡリガーゼを添加した。反応混合物を３０℃で１時間インキュベートし、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５プレップグレードのプレパックＨｉＬｏａｄカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、スウェーデン）でサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。
２．２．７ ヒト／カニクイザルＣＤ４０結合表面プラズモン共鳴分光法アッセイ
キャプチャシステムの約１２０００共鳴ユニット（ＲＵ）（１０μｇ／ｍｌヤギ抗ヒトＦ（ａｂ）’２；注文コード：２８９５８３２５；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ、スウェーデン）を、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅが提供するアミンカップリングキットを使用して、ＣＭ５チップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＢＲ－１００５－３０）にｐＨ５．０でカップリングした。サンプル及びシステムバッファーは、ＰＢＳ－Ｔ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１０ｍＭのリン酸緩衝生理食塩水）ｐＨ７．４だった。フローセルを２５℃に設定し、サンプルブロックを１２℃に設定し、ランニングバッファーで２回プライミングした。抗体は、５０ｎＭの溶液を５μｌ／ｍｉｎの流量で３０秒間注入することによって捕捉された。会合は、ヒトＣＤ４０細胞外ドメイン又はカニクイザルＣＤ４０細胞外ドメインを、溶液中のさまざまな濃度で、１：３希釈の３００ｎＭから開始して３０μｌ／ｍｉｎの流量で３００秒間注入することによって測定した。解離段階は最大１２００秒間監視され、サンプル溶液からランニングバッファーに切り替えることで誘発された。グリシン ｐＨ２．１溶液で３０μｌ／ｍｉｎの流速で６０秒間洗浄することにより、表面を再生成した。ヤギの抗ヒトＦ（ａｂ’）２表面から得られた応答を差し引くことにより、バルク屈折率の差を補正した。ブランク注入も差し引いた（二重参照）。見かけのＫＤ及びその他の速度論的パラメータの計算には、Ｌａｎｇｍｕｉｒ １：１モデルを使用した。見かけのＫｄは、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ｂ４０００評価ソフトウェア（バージョン１．１）を使用して計算された。
２．２．８ ＣＤ４０特異的ヒト化抗体の特性評価のための細胞間結合アッセイ
ＣＤ４０陽性細胞（Ｒａｊｉ細胞）をトリプシンを使用して培養ボトルから切り離し、Ｃａｓｙセルカウンターを使用してカウントした。４℃でペレット化した後、細胞をＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ中２．５％ＦＣＳ）に再懸濁し、２．０Ｅ＋０６細胞／ｍＬに調整し、９６ウェルＰＰ Ｖ底プレート（２５ μＬ／ウェル＝５．０Ｅ＋０４ゼレン／ウェル）に分注した。
ＣＤ４０特異的抗体はＦＡＣＳバッファーで２０μｇ／ｍＬに調整され、最終濃度は１０μｇ／ｍＬになった。２０μｌを２５μｌの細胞懸濁液に加え、４℃で１時間インキュベートした。次に、細胞をＦＡＣＳバッファーで２回洗浄した。洗浄後、細胞を二次抗体を含む５０μＬのＦＡＣＳバッファー（＜ｈｕＩｇＧ＞－Ａｌｅｘａ４８８、ｃ＝１０μｇ／ｍＬ）に再懸濁し、４℃で１時間インキュベートした。次に、細胞をＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ（ＢＤ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用して測定するために、７０μｌ／ウェルのＦＡＣＳバッファーに再懸濁した。
表２３に、ヒト化ＣＤ４０抗体（Ｂｉａｃｏｒｅで測定）の親和性とＣＤ４０発現細胞（Ｒａｊｉ細胞）への細胞結合を示す。
Figure 0007221379000035
２．２．９ ＵＨＲ－ＥＳＩ－ＱＴＯＦ質量分析による抗体の特性評価
サンプルは、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５ ５ｘ２５０ｍｍカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、フライブルク、ドイツ）で、４０％アセトニトリルと２％ギ酸（ｖ／ｖ）を使用したＨＰＬＣで脱塩した。合計質量は、ＴｒｉＶｅｒｓａ ＮａｎｏＭａｔｅ ｓｏｕｒｃｅ（Ａｄｖｉｏｎ、Ｉｔｈａｃａ、ＮＹ）が装備されたｍａＸｉｓ ４Ｇ ＵＨＲ－ＱＴＯＦ ＭＳシステム（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｋ、ブレーメン、ドイツ）でのＥＳＩ－ＭＳによって測定した。データ収集は９００－４０００ｍ／ｚ（ＩＳＣＩＤ：０．０ｅＶ）で行われた。社内で開発されたソフトウェアツールを使用して、生の質量スペクトルを評価し、個々の相対モル質量に変換した。
２．２．１０ 抗体の熱安定性評価
試料を、２０ｍＭ ヒスチジン／ヒスチジンクロリド、１４０ｍＭ ＮａＣｌ中、ｐＨ６．０で１ｍｇ／ｍＬの濃度にて調製し、０．４μｍフィルタープレートで遠心分離して光学３８４ウェルプレートに移し、パラフィンオイルで覆った。流体力学的半径は、サンプルを２５℃から８０℃まで０．０５℃／分の速度で加熱しながら、ＤｙｎａＰｒｏプレートリーダー（ワイアット）で動的光散乱法によって繰り返し測定される。あるいは、サンプルを１０μＬのマイクロキュベットアレイに移し、静的光散乱データと２６６ｎｍレーザーで励起したときの蛍光データを、それらが２５℃～９０℃まで０．１℃／分の速度で加熱されている間、Ｏｐｔｉｍ１０００装置（Ａｖａｃｔａ Ｉｎｃ．）で記録した。凝集開始温度は、流体力学的半径（ＤＬＳ）又は散乱光強度（Ｏｐｔｉｍ１０００）が増加し始める温度として定義される。融点は、蛍光強度対波長を示すグラフの変曲点として定義される。
実施例３
新しい抗ＦＡＰクローン２１２及びそのヒト化変異体を用いた二重特異性コンストラクトの生成及び産生
３．１ 線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）及びＣＤ４０を標的とする二重特異性抗原結合分子の生成
二重特異性ＣＤ４０－ＦＡＰ抗体は、ＦｃのＣ末端にある１つのＦＡＰ結合部分と組み合わされた２つのＣＤ４０結合部分からなる２＋１フォーマット（図１Ａ～図１ｃ）又はＦｃのＣ末端にある１つのＦＡＰ結合部分と組み合わされた４つのＣＤ４０結合部分からなる４＋１フォーマットで調製した（図１Ｄ～図１Ｆ）。二重特異性ＣＤ４０－ＦＡＰ抗体には新しい抗ＦＡＰクローン２１２（図１Ａ及び図１Ｄ）が含まれていたが、比較のために、ＦＡＰクローン４Ｂ９（図１Ｂ及び図１Ｅ）及び２８Ｈ１（図１Ｃ及び図１Ｆ）と対応する分子を調製した。ＦＡＰ結合剤２８Ｈ１及び４Ｂ９の生成及び調製は、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１２／０２０００６Ａ２号に記載されている。４＋１及び２＋１分子を生成するために、ノブ・イントゥ・ホール技術を使用してヘテロ二量体化を実現した。Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ突然変異は第１の重鎖ＨＣ１（Ｆｃノブ重鎖）に導入され、Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ突然変異は第２の重鎖ＨＣ２（Ｆｃホール重鎖）に導入された。二重特異性フォーマットとは無関係に、全ての場合において、エフェクターサイレントＦｃ（Ｐ３２９Ｇ；Ｌ２３４、２３４Ａ）を使用して、国際公開第２０１２／１３０８３１Ａ１号に記載されている方法に従ってＦｃγ受容体への結合を無効にした。二重特異性分子の配列を表２４に示す。
全ての遺伝子は、ＣＭＶプロモーターエンハンサーフラグメントと組み合わされたＭＰＳＶコアプロモーターからなるキメラＭＰＳＶプロモーターの制御下で一過性に発現される。発現カセットには、ｃＤＮＡの３’末端に合成ポリＡシグナルも含まれている。発現ベクターには、宿主細胞を含むＥＢＮＡ（エプスタイン・バーウイルス由来核抗原）におけるエピソーム複製のためのｏｒｉＰ領域も含まれている。
Figure 0007221379000036
Figure 0007221379000037
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Figure 0007221379000048
Figure 0007221379000049
３．２ ＦＡＰ及びＣＤ４０を標的とする二重特異性抗原結合分子の産生
線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）とＣＤ４０を標的とする二重特異性抗原結合分子は、４つの異なるペプチド鎖をコードする発現ベクターを用いて懸濁液中で増殖させたＨＥＫ細胞の一過性トランスフェクションによって発現された。ＨＥＫ２９３－Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へのトランスフェクションは、抗体ベクターのＭａｘｉｐｒｅｐ（Ｑｉａｇｅｎ）調製物、Ｆ１７の培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）、Ｐｅｉｐｒｏ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ）、及び無血清ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）での初期細胞密度が１００～２００万生細胞／ｍｌを使用して、細胞供給業者の指示に従って実施した。振とうフラスコ又は撹拌発酵槽で７日間培養した後、１４０００ｇで３０分間遠心分離して細胞培養上清を回収し、０．２２μｍフィルターにかけた。
二重特異性抗体は、ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、スウェーデン）クロマトグラフィーを使用したプロテインＡ親和性クロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製された。簡単に説明すると、滅菌フィルターにかけた細胞培養上清を、ＰＢＳバッファー（１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ及び２．７ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．４）で平衡化したＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ樹脂で捕捉し、平衡化バッファーで洗浄し、２５ｍＭクエン酸塩、ｐＨ３．０で溶出した。１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ９．０で中和した後、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０でサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、凝集タンパク質を単量体抗体種から分離した。単量体タンパク質画分をプールし、必要に応じて、例えば、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ（３０ＫＤ ＭＷＣＯ）遠心分離濃縮器を用いて濃縮し、－８０℃で保存した。サンプルの一定分量は、ＣＥ－ＳＤＳ、サイズ排除クロマトグラフィー、質量分析、及びエンドトキシン測定によるその後の分析特性評価に使用された。
Figure 0007221379000050
Ｐ１ＡＥ２７３４は、クロスＦａｂのＶＨ－Ｃカッパ鎖がＦｃドメイン重鎖の１つのＣ末端に融合している二重特異性抗体である。この二重特異性抗体は、クロスＦａｂのＶＬ－ＣＨ１鎖がＦｃドメイン重鎖の１つのＣ末端に融合している二重特異性抗体Ｐ１ＡＥ２４２３よりも、製造及び精製がはるかに困難だった。更なる精製ステップを適用する必要があり、つまり、イオン交換クロマトグラフィーと追加のＣＥ－ＳＤＳにより、１ｍｇの物質が得られた。
３．３ 二重特異性抗ｈｕＦＡＰ抗体の結合速度論
二重特異性ＦＡＰ標的抗体のヒトＦＡＰ結合速度式を評価するために、結合動態を実施例１．７に記載されているように測定したが、リガンドとしてＨＩＳタグ付きヒトＦＡＰ外部ドメインを使用した。クロスＦａｂの異なる融合を伴う二重特異性２＋１ ＣＤ４０ ｘ ＦＡＰ抗体の親和性データを以下の表２５Ａに示す。
Figure 0007221379000051
Ｃ末端Ｆａｂ融合としての二重特異性抗体のＦＡＰ結合親和性は、２つのクロス変異体間で同様の範囲にある（ＳＰＲで測定）。
実施例４
ＣＤ４０及びＦＡＰを標的とする二重特異性コンストラクトの特性評価
４．１ ヒトＦＡＰ発現マウス線維芽細胞への結合
細胞表面ＦＡＰへの結合は、ＮＩＨ／３Ｔ３－ｈＦＡＰクローン１９を発現するヒト線維芽細胞活性化タンパク質（ｈｕＦＡＰ）を使用してテストされた。ＮＩＨ／３Ｔ３－ｈｕＦＡＰクローン１９は、マウス胚性線維芽細胞ＮＩＨ／３Ｔ３細胞株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６５８）に発現ベクターｐＥＴＲ４９２１をトランスフェクトして、１．５μｇ／ｍＬのピューロマイシン選択ｈｕＦＡＰで発現させることにより生成された。
ＮＩＨ／３Ｔ３－ｈｕＦＡＰ細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１６１４０、ロット番号１７９７３０６Ａ）を添加した１ｘダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ｇｉｂｃｏ、カタログ番号４２４３０－０２５）で培養した。１．５μｇ／ｍＬ ピューロマイシン（ｇｉｂｃｏ、カタログ番号Ａ１１１３８－０３）を、ＦＡＰ発現細胞を選択するために培地に添加した。ＮＩＨ／３Ｔ３－ｈｕＦＡＰ細胞は、酵素を含まないＣｅｌｌ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１３１５１０１４）を使用して培養フラスコから取り出した。０．３ｘ１０５個のＮＩＨ／３Ｔ３－ｈＦＡＰクローン１９細胞を、１０％ＦＢＳを含む２００μｌの１ｘＤＭＥＭで、丸底９６ウェルプレート（ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ－ｏｎｅ、ｃｅｌｌｓｔａｒ、カタログ番号６５０１８５）の各ウェルに添加した。プレートを１７００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清をはじき飛ばした。細胞を２００μＬの４℃冷ＦＡＣＳバッファー（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号００－４２２２－２６）で１回洗浄した。全てのサンプルを、二重特異性抗原結合分子（一次抗体）又はアイソタイプコントロール抗体ＤＰ４７を指定範囲の濃度（２回）で含む４℃の冷ＦＡＣＳバッファー５０μＬ／ウェルに再懸濁し、４℃で１２０分間インキュベートした。その後、細胞を２００μＬの４℃の冷ＦＡＣＳバッファーで３回洗浄した。細胞は、Ｒ－フィコエリトリン（ＰＥ）結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２フラグメントヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγフラグメント特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９－１１６－０９８）二次抗体を含む２５μＬ／ウェルの４℃の冷二次抗体溶液（二次抗体の１：５０希釈）で更に染色され、暗所で４℃で６０分間インキュベートした。細胞を２００μｌのＦＡＣＳバッファーで洗浄し、０．２μｇ／ｍＬのＤＡＰＩ（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１０２３６２７６００１）を含む８５μＬ／ウェルのＦＡＣＳバッファーに再懸濁し、５レーザーＬＳＲ－Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ｗｉｔｈ ＤＩＶＡ ソフトウェア）を使用して同日に取得した。ＦｌｏｗＪｏ バージョン１０ ソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ ＬＬＣ）を使用してデータ分析を実行した。
図４に示すように、ＦＡＰに対して一価の二重特異性抗体は、ヒトＦＡＰ発現標的細胞に結合する。したがって、ＦＡＰ標的抗ＣＤ４０抗原結合分子は、直接的な腫瘍標的特性を示す。Ｃ末端ＦＡＰ（２１２（Ｐ１ＡＥ１６８９））又はＦＡＰ（４Ｂ９）結合ドメインを有するＦＡＰコンストラクトは、Ｃ末端ＦＡＰ（２８Ｈ１）結合ドメインを有するＦＡＰコンストラクトよりも強く結合し、これは、ＦＡＰ（２８Ｈ１）バインダーと比較して、ＦＡＰ（２１２）のＦＡＰ（４Ｂ９）バインダーのヒトＦＡＰに対する結合親和性が高いことで説明される。最強のＦＡＰ結合は、ＦＡＰ（４Ｂ９）結合部分（Ｐ１ＡＥ２４８７）を有する２＋１コンストラクトで観察された。アイソタイプコントロール抗体ＤＰ４７（ヒト生殖系列コントロール）のＮＩＨ／３Ｔ３－ｈＦＡＰ細胞への結合は検出されなかった。異なる二重特異性抗体について測定されたＥＣ５０値を以下の表２６に示す。
Figure 0007221379000052
４．２ ヒトＣＤ４０発現初代Ｂ細胞への結合
細胞表面ＣＤ４０への結合は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から分離されたヒト初代Ｂ細胞を使用してテストされた。ＰＢＭＣを分離するために、Ｓｔｉｆｔｕｎｇ Ｚｕｒｃｈｅｒ Ｂｌｕｔｓｐｅｎｄｅｄｉｅｎｓｔ ＳＲＫからバフィーコートを入手した。５０ｍＬのバフィーコートを同量のＰＢＳ（ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１００１００２３）で希釈した。５０ｍＬポリプロピレン遠心チューブ（ＴＰＰ、カタログ番号９１０５０）には１５ｍＬのＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号０７８５１）が付属し、チューブあたり２５ｍＬのバフィーコート／ＰＢＳ溶液をＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）の上に注意深く重ねた。チューブを２０００ｒｐｍで２４分間、室温で低加速で破損することなく遠心分離した。その後、ＰＢＭＣを界面から収集し、ＰＢＳで３回洗浄し、１０ｍＬのＰＢＳに再懸濁し、Ｂｅｃｋｍａｎ ＣｏｕｌｔｅｒセルカウンターＡｃ・Ｔ（商標）５ｄｉｆｆ ＯＶ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、カタログ番号６６０５５８０）を使用して細胞の種類と数を分析した。ＰＢＭＣからＢ細胞を分離する前に、ＣＤ１４マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０－０５０－２０１）でＣＤ１４陽性細胞を磁気標識し、続いてａｕｔｏＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏセパレーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０－０９２－５４５）で分離することにより、ＣＤ１４陽性画分を除去した。ＣＤ１４陰性画分は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂ細胞分離キットＩＩ（カタログ番号１３０－０９１－１５１）及びａｕｔｏＭＡＣＳ（登録商標）分離を用いて、その後のＢ細胞分離に使用された。０．３ｘ１０５個のＢ細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、１％（ｖ／ｖ）ペニシリンストレプトマイシン（ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１５０７０－０６３）、１％（ｖ／ｖ）Ｌ－グルタミン（ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２５０３０－０２４）、１％（ｖ／ｖ）ピルビン酸ナトリウム（ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１１３６０－０３９）、１％（ｖ／ｖ）ＭＥＭ非必須アミノ酸（ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１１１４０－０３５）及び５０μＭ β－メルカプトエタノール（ｇｉｂｃｏ、カタログ番号３１３５０－０１０）を含むＲｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ培地（ＲＰＭＩ）１６４０（ｇｉｂｃｏ、カタログ番号３１８７０－０２５）からなる２００μｌのＲ１０培地中に、丸底９６ウェルプレート（ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ－ｏｎｅ、ｃｅｌｌｓｔａｒ、カタログ番号６５０１８５）の各ウェルに添加した。プレートを１７００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清をはじき飛ばした。細胞を２００μＬの４℃冷ＦＡＣＳバッファー（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号００－４２２２－２６）で１回洗浄した。全てのサンプルを、二重特異性抗原結合分子（一次抗体）又はアイソタイプコントロール抗体ＤＰ４７を指定範囲の濃度（２回）で含む４℃の冷ＦＡＣＳバッファー５０μＬ／ウェルに再懸濁し、４℃で１２０分間インキュベートした。その後、細胞を２００μＬの４℃の冷ＦＡＣＳバッファーで３回洗浄した。細胞は、Ｒ－フィコエリトリン（ＰＥ）結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２フラグメントヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγフラグメント特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９－１１６－０９８）二次抗体を含む２５μＬ／ウェルの４℃の冷二次抗体溶液（二次抗体の１：５０希釈）で更に染色され、暗所で４℃で６０分間インキュベートした。細胞を２００μｌのＦＡＣＳバッファーで洗浄し、０．２μｇ／ｍＬのＤＡＰＩ（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１０２３６２７６００１）を含む８５μＬ／ウェルのＦＡＣＳバッファーに再懸濁し、５レーザーＬＳＲ－Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ｗｉｔｈ ＤＩＶＡ ソフトウェア）を使用して同日に取得した。ＦｌｏｗＪｏ バージョン１０ ソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ ＬＬＣ）を使用してデータ分析を実行した。
図５に示すように、描かれている全てのクローンはＣＤ４０に結合するが、ＣＤ４０陽性Ｂ細胞への結合強度（ＥＣ５０値及びシグナル強度）が異なる。それらのＦＡＰ結合部分に関係なく、二価抗ＣＤ４０抗体は、抗体あたりのより多くの占有ＣＤ４０結合部位及び二価ＣＤ４０フォーマットと比較した四価の結合力の獲得によって説明される四価抗ＣＤ４０抗体と比較して、より高いＥＣ５０レベルを示し、より高い結合プラトーに達する。陰性コントロール抗体のＢ細胞への結合は検出されなかった。異なる二重特異性抗体について測定されたＥＣ５０値を以下の表２７に示す。
Figure 0007221379000053
実施例５
ＦＡＰ標的抗ヒトＣＤ４０結合分子の機能特性
５．１ ＦＡＰ標的抗ヒトＣＤ４０結合分子によるヒトＢ細胞のＣＤ４０を介した活性化
ＣＤ４０のライゲーションは、Ｂ細胞及び樹状細胞（ＤＣ）の成熟と活性化を誘導し、これらの細胞タイプの生存を促進する。ＣＤ４０シグナル伝達により、Ｂ細胞及びＤＣの表面でのサイトカイン産生及び共刺激分子発現が増加する（Ｓ．Ｑｕｅｚａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ ＲｅｖＩｍｍｕｎｏｌ．２００４，２２，３０７－３２８；Ｓ．Ｄａｎｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｕｔ．２００４，５３，１０３５－１０４３；Ｇ．Ｂｉｓｈｏｐ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ Ｅｘｐ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ．２００７，５９７，１３１－１５１）。
異なるＦＡＰ依存性抗ＣＤ４０抗体のアゴニスト特性及びＦＡＰ特異性をテストするために、ヒトバフィーコートから得られたＤａｕｄｉ細胞又は初代Ｂ細胞を、ＦＡＰコーティングビーズの存在下でＦＡＰ依存性アゴニスト抗ヒトＣＤ４０抗体とインキュベートし、Ｂ細胞の活性化をＦＡＣＳで測定した。
５．１．１．抗原源としてＦＡＰコーティングされたＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）を使用した、ＦＡＰ標的抗ヒトＣＤ４０結合分子によるヒトＤａｕｄｉ細胞の活性化
ヒトＣＤ４０（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－２１３）の発現レベルが高いヒトＢリンパ芽球細胞株である１ｘ１０５個のＤａｕｄｉ細胞を、９６ウェル平底プレートのウェルあたり１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１６１４０、ロット番号１７９７３０６Ａ）を添加した１００μｌの１ｘダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ｇｉｂｃｏ、カタログ番号４２４３０－０２５）に添加した。ストレプトアビジンＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号：１１２０５Ｄ）は、ビオチン化ヒトＦＡＰ（社内で生産）で、製造元の指示に従って、コーティングされ（６．５ｘ１０４ビーズの結合容量：０．０１μｇのタンパク質）、１０％ＦＢＳを含む５０μｌの１ｘＤＭＥＭで２：１のビーズ対細胞比でＤａｕｄｉ細胞に添加した。コントロールとして、非コーティングビーズをＤａｕｄｉ細胞に加えた。ＦＡＰ標的抗ヒトＣＤ４０抗体を、１０％ＦＢＳ培地を含む５０μｌの１ｘＤＭＥＭで、６．７ｎＭから０．００３ｎＭの範囲の濃度でＤａｕｄｉ細胞に添加した（３ｘ希釈系列）。陽性コントロールとして、ＦＡＰ非依存性アゴニスト抗ヒトＣＤ４０抗体ＳＧＮ－４０（ＩｇＧ１、ＩＮＮ：ダセツズマブ）を使用した。抗体はＣＤ４０に対して二価である。ＳＧＮ－４０抗体は生物活性のためにＦｃ受容体の架橋を必要とすることが文献に記載されているため（Ｃ．Ｌａｗ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００５，６５，８３３１－８３３８）、抗体をＤａｕｄｉ細胞に添加する前に、架橋ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγフラグメント特異的Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９－００６－００８）とともに３０分間インキュベートした。４８時間後、細胞を９６ウェル丸底プレートに移し、ＰＢＳで１回洗浄し、ＰＢＳ中でマウスＩｇＧアイソタイプコントロール（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１０４００Ｃ）をブロックする３μｇ／ｍＬのＦｃ受容体５０μｌとインキュベートした。４℃で１５分間インキュベートした後、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中の蛍光標識抗体の混合物５０μｌを細胞に添加した。以下の蛍光標識抗体を使用した：抗ヒトＣＤ８３ ＢＶ４２１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローンＨＢ１５ｅ、カタログ番号３０５３２４）、抗ヒトＣＤ８０ ＢＶ６０５（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、クローンＬ３０７．４、カタログ番号５６３３１５）、抗ＨＬＡ－ＡＢＣ ＦＩＴＣ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、クローンＧ４６－２．６、カタログ番号５５５５５２）、抗ヒトＣＤ１４ ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローンＨＣＤ１４、カタログ番号３２５６２２）、抗ヒトＣＤ３ ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローンＵＣＨＴ１、カタログ番号３００４３０）、抗ヒトＣＤ７０ ＰＥ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローン１１３－１６、カタログ番号３５５１０４）、抗ヒトＣＤ８６ ＰＥ－ＣＦ５９４（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、クローンＦＵＮ－１、カタログ番号５６２３９０）、抗ＨＬＡ－ＤＲ ＡＰＣ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、クローンＧ４６－６、カタログ番号５５９８６６）及び抗ヒトＣＤ１９ ＡＰＣ－Ｈ７（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、クローンＳＪ２５Ｃ１、カタログ番号５６０１７７）。生細胞と死細胞を区別するために、生存率色素Ｚｏｍｂｉｅ Ａｑｕａ（商標）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４２３１０２）を抗体混合物に添加した。４℃で３０分間インキュベートした後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、２００μｌのＰＢＳに再懸濁した。細胞は、５レーザーＬＳＲ－Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ｗｉｔｈ ＤＩＶＡソフトウェア）を使用して同日に分析した。ＦｌｏｗＪｏ バージョン１０ ソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ ＬＬＣ）を使用してデータ分析を実行した。ＣＤ１４及びＣＤ３が陰性で、ＣＤ１９が陽性の生（アクア陰性）細胞を、ＣＤ７０、ＣＤ８０、ＣＤ８３、及びＣＤ８６の発現について分析した。
アゴニスト抗ＣＤ４０抗体との２日間のインキュベーション後に分析されたＤａｕｄｉ細胞は、描写された全ての抗体のＣＤ７０発現の増加を示した（図６Ａ及び図６Ｂを参照）。この活性化マーカーのアップレギュレーションは、異なるＦＡＰ標的抗体の場合はＦＡＰに依存していた。より低い抗体濃度では、これらのＦＡＰ依存性抗体によって誘導される発現の増加は、架橋ＣＤ４０抗体（Ｐ１ＡＤ４４７０）によって誘導される増加と比較して高かった。更に、ＦＡＰ（２１２）又はＦＡＰ（４Ｂ９）結合ドメインを有する２＋１フォーマットの二重特異性ＦＡＰ－ＣＤ４０抗体によるＣＤ７０のアップレギュレーションは、２＋１フォーマットの二重特異性ＦＡＰ－ＣＤ４０抗体、ＦＡＰ（２８Ｈ１）結合ドメインを含むフォーマット、ＦＡＰ（２１２）、ＦＡＰ（４Ｂ９）又はＦＡＰ（２８Ｈ１）結合ドメインを含む４＋１フォーマットの二重特異性ＦＡＰ－ＣＤ４０抗体、又はＦＡＰ非依存性陽性コントロール抗体によって誘導されるアップレギュレーションと比較して高かった。ＦＡＰ（非コーティングビーズ）の非存在下では、ＣＤ４０に対して二価の描写された二重特異性抗体ではＣＤ７０の増加は観察されなかったが、四価のＣＤ４０結合分子はＣＤ７０のアップレギュレーションを誘導したが、ＦＡＰの存在下よりも程度は低く、Ｄａｕｄｉ細胞における四価ＣＤ４０バインダーの低いが検出可能なＦＡＰ非依存性ＣＤ４０活性化を示す。
５．１．２ 抗原源としてＦＡＰコーティングされたＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）を使用した、ＦＡＰ標的抗ヒトＣＤ４０結合分子によるヒトＢ細胞の活性化
実施例４．２に記載されているようにＢ細胞をバフィーコートから単離し、１００μｌのＲ１０培地中の１ｘ１０５個のＢ細胞を９６ウェル平底プレートのウェルごとに添加した。ストレプトアビジンＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号：１１２０５Ｄ）は、ビオチン化ヒトＦＡＰ（社内で生産）で、製造元の指示に従って、コーティングされ（６．５ｘ１０４ビーズの結合容量：０．０１μｇのタンパク質）、５０μｌのＲ１０培地で２：１のビーズ対細胞比でＢ細胞に添加した。コントロールとして、非コーティングビーズをＢ細胞に添加した。ＦＡＰ標的抗ヒトＣＤ４０抗体又は陽性コントロール抗体（実施例５．１．１に記載）を５０μｌのＲ１０培地でＢ細胞に添加した。２日後、実施例５．１．１で指定された染色及び分析手順に従って、Ｂ細胞をＦＡＣＳによって分析した。
アゴニスト抗ＣＤ４０抗体との２日間のインキュベーション後に分析されたＢ細胞は、描写された全ての抗体のＣＤ８６発現の増加を示した（図７Ａ及び図７Ｂを参照）。ＣＤ８６のアップレギュレーションは、異なるＦＡＰ標的抗体の場合、ＦＡＰに依存し、これらのＦＡＰ依存性抗体によって誘導される発現の増加は、架橋抗ＣＤ４０抗体Ｐ１ＡＤ４４７０によって誘導される増加と同等又はわずかに低かった。１つのＦＡＰ（２１２）結合ドメインを有するＦＡＰに対して一価の二重特異性抗体は、１つのＦＡＰ（４Ｂ９）結合部分を有する分子と同様の活性化マーカー発現の増加を誘導した。より低い抗体濃度では、ＦＡＰ結合部分に関係なく、４＋１フォーマットは、ＦＡＰ（２１２）又はＦＡＰ（４Ｂ９）結合部分を有する２＋１フォーマットと比較してより高いＢ細胞活性化を誘導した。
５．２ ＦＡＰ標的抗ＣＤ４０結合分子によるＤＣのＣＤ４０を介した活性化及びそれに続くＴ細胞のプライミング
ＦＡＰ依存性抗ヒトＣＤ４０抗体によって活性化されたＤＣがＴ細胞を効率的にプライミングする能力を実証するために、インビトロＴ細胞プライミングアッセイを確立した。これらのアッセイでは、ヒトＣＤ４０受容体を発現するトランスジェニックマウス（ｈｕＣＤ４０ｔｇマウス；類似のヒト及びマウスＣＤ４０受容体発現パターンを有するマウス；Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンド；Ｔａｃｏｎｉｃによって生成）の脾臓からＤＣを単離し、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド又はオバルブミン（ＯＶＡ；ＤＥＣ－２０５受容体を介した抗原取り込み）のいずれかでパルスし、また異なるアゴニスト抗ヒトＣＤ４０抗体とインキュベートした。ＦＡＰは、二重特異性抗原結合分子のＦＡＰ依存性を示すために、ＦＡＰコーティングされたＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）を用いて提供された。２４時間後、ＣＤ８陽性Ｔ細胞が、ＯＴ１マウスの脾臓から分離された（これらのマウスのＣＤ８陽性Ｔ細胞は全て、Ｈ２－ＫｂのコンテキストでＳＩＩＮＦＥＫＬを認識するトランスジェニックＴＣＲを有する；Ｃ５７ＢＬ／６－Ｔｇ（ＴｃｒａＴｃｒｂ）１１００Ｍｊｂ／Ｃｒｌ、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識され、パルスＤＣに添加された。実験の４日目に、Ｔ細胞増殖をＦＡＣＳによって分析した。
５．２．１ ＦＡＰ標的抗ＣＤ４０結合分子によって活性化されたＯＶＡパルスＤＣを用いたＴ細胞プライミング
ＤＣはｈｕＣＤ４０ｔｇマウスの脾臓から分離された。脾臓ＤＣを分離するために、ｈｕＣＤ４０ｔｇマウスの脾臓を、カルシウム２＋（ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１４０２５－０５）、Ｈａｎｋ平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）２．２５ｍＬ、コラゲナーゼＤの１０ｍｇ／ｍＬ溶液（最終濃度１ｍｇ／ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号１１０８８８６６００１）２５０μＬ及び１０ｍｇ／ｍＬ ＤＮａｓｅ溶液（最終濃度０．０５ｍｇ／ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｄ５０２５－１５０ＫＵ、ロット番号ＳＬＢＲ０５３５Ｖ）１２．５μｌを含む６ウェルプレートの１つのウェルに入れた。脾臓は、２１Ｇ針（ブラウン、カタログ番号４６５７５２７）を備えた３ｍＬシリンジ（ＢＤ、カタログ番号３０９６５８）を使用して膨らませ、その後、はさみを使用して細かく裂いた。３７℃で２５分間インキュベートした後、５０μＬの０．５Ｍエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）（Ａｐｐｌｉｃｈｅｍ、カタログ番号Ａ４８９２．１０００）を添加し、３７℃で５分間の２回目のインキュベーションステップを行った。脾臓細胞と脾臓組織の小片を含む溶液を、４０μｍフィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３５２３４０）でフィルターにかけて５０ｍＬポリプロピレン遠心チューブに入れた。残りの脾臓組織片は、３ｍＬシリンジプラグの端でフィルターを通して粉砕された。次のステップでは、５０ｍＬチューブを１５００ｒｐｍで５分間、室温で遠心分離し、上清を廃棄し、１ｍＬの１ｘ細胞溶解バッファー（蒸留水で１：１０に希釈）（ＢＤ、カタログ番号５５５８９９）を、赤血球を溶解するために脾細胞に加えた。室温で４分間インキュベートした後、Ｒ１０を２０ｍＬ添加し、続いて室温で５分間１５００ｒｐｍで遠心分離した。上清を除去し、脾細胞を３０ｍＬのＲ１０に再懸濁し、自動ＥＶＥセルカウンター（ＶＷＲ、カタログ番号７３４－２６７５）を使用して細胞数と生存率を測定した。マウスＣＤ１１ｃ ＵｌｔｒａＰｕｒｅマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０－１０８－３３８）を製造元の指示に従って使用し、ａｕｔｏＭＡＣＳ（登録商標）分離によってＤＣを分離した。続いて、０．２５ｘ１０５のＤＣを９６ウェル平底プレートのウェルあたり５０μｌのＲ１０に播種した。
次に、ＤＣに１ｎｇ／ｍＬ ＳＩＩＮＦＥＫＬ（卵アルブミン残基２５７－２６４、Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ、カタログ番号ＡＳ－６０１９３－５、ロットＮｏ．１３６０６１８）でパルスした。これは、陽性コントロールとして、又は抗原としてＯＶＡタンパク質をロードした、ＤＣによる取り込み及び処理を必要としない。Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）刺激に依存しない方法でＯＶＡの取り込みを促進するために（追加のＴＬＲ刺激は、ＤＣの全体的な活性化を高め、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体による刺激によるさまざまな活性化状態の検出を不可能にする可能性があります）ＯＶＡ抗原送達試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０－０９４－６６３）をビオチン化抗マウスＤＥＣ２０５抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、クローンＮＬＤＣ－１４５、カタログ番号１３０－１０１－８５４）と組み合わせて、製造元のプロトコルに従って使用した。簡単に説明すると、ＤＣは、ＣＤ８陽性クロス提示ＤＣで高度に発現するＤＥＣ２０５受容体に結合するビオチン化抗体とともにインキュベートされた（Ｍ．Ｌａｈｏｕｄ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００，１２（５），７３１－７３５）。その後、ＦＩＴＣ及びＯＶＡに結合した抗ビオチン抗体であるＯＶＡ送達試薬を細胞に添加し、ＤＥＣ２０５受容体を介したＯＶＡの取り込みをもたらした。陰性コントロールを提供するために、ＤＣはＯＶＡを添加せずに抗ＤＥＣ２０５抗体でのみ標識された。更に、例５．１．１で説明したように、ヒトＦＡＰコーティング又は非コーティングのＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）を５０μＬのＲ１０で２：１のビーズ対細胞比でＤＣに添加した。次のステップでは、さまざまなアゴニスト抗ＣＤ４０抗体を５０μＬのＲ１０に、６．７ｎＭから０．０１ｎＭの範囲の濃度で添加した（１０倍希釈系列）。この実験設定では、１つのＦＡＰ（２１２）又はＦＡＰ（４Ｂ９）ＦＡＰ結合部位を含む二重特異性２＋１及び４＋１抗ヒトＣＤ４０抗体を、架橋ＳＧＮ－４０抗体と比較した。
翌日、ＯＴ１マウスから脾臓ＣＤ８陽性細胞が分離された。そのために、ＯＴ１マウスの脾臓を４０μｍのフィルターに通し、３ｍＬのシリンジプラグの端を５０ｍＬのチューブに差し込んだ。フィルターをＲ１０で洗浄し、脾細胞を１５００ｒｐｍで５分間室温で遠心分離した。１ｍＬの１ｘ細胞溶解バッファー（蒸留水で１：１０に希釈）を細胞に添加し、室温で４分間インキュベートした後、Ｒ１０を２０ｍＬ添加した。チューブを１５００ｒｐｍで５分間、室温で遠心分離し、上清を捨てた。脾細胞を３０ｍＬのＲ１０に再懸濁し、自動ＥＶＥセルカウンターを使用して細胞数と生存率を測定した。ＣＤ８陽性細胞は、マウスＣＤ８ａ＋Ｔ細胞分離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０－１０４－０７５）を使用し、製造元の指示に従ってａｕｔｏＭＡＣＳ（登録商標）分離を使用して、陰性セレクションプロセスで分離した。次に、分離後に陰性画分に見られたＣＤ８陽性細胞を、予熱したＰＢＳで洗浄し、ＥＶＥセルカウンターでカウントし、細胞数を予熱したＰＢＳで２ｘ１０７細胞／ｍＬに調整した。１０ｍＭ ＣＦＳＥ溶液（ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）ＣＦＳＥ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ｃ３４５５４）を予熱したＰＢＳで５０００倍に希釈し、ＰＢＳに１：１の比率で再懸濁した細胞に添加した（ＣＦＳＥ最終濃度１μＭ）。短いボルテックスの後、細胞を室温で５分間インキュベートした。細胞に４０ｍＬの予熱したＲ１０培地を加えることにより、標識反応を停止した。ＰＢＳで２回洗浄した後、ＣＤ８陽性細胞をＲ１０に再懸濁し、０．５ｘ１０５個の細胞を１００μｌのＲ１０でパルスＤＣに添加した。実験の４日目に、Ｔ細胞増殖をフローサイトメトリーによって分析した。したがって、細胞を９６ウェル平底プレートから９６ウェル丸底プレートに移し、ＰＢＳで１回洗浄し、ＰＢＳ中のマウスＩｇＧアイソタイプコントロールをブロックする３μｇ／ｍＬのＦｃ受容体５０μｌとインキュベートした。４℃で１５分間インキュベートした後、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中の蛍光標識抗体の混合物５０μｌを細胞に添加した。以下の抗体を使用した：抗マウスＣＤ４ ＢＶ４２１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローンＧＫ１．５、カタログ番号１００４３８）、抗マウスＣＤ８６ ＢＶ７８５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローンＧＬ－１、カタログ番号１０５０４３）、抗Ｉ－Ａ／Ｉ－Ｅ ＰｅｒＣｐ－Ｃｙ５．５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローンＭ５／１１４．１５．２、カタログ番号１０７６２６）、抗マウスＣＤ７０ ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、クローンＦＲ７０、カタログ番号１２－０７０１－８２）、抗マウスＣＤ３ ＰＥ－ＣＦ５９４（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、クローン１４５－２Ｃ１１、カタログ番号５６２２８６）、抗マウスＣＤ２５ ＰＥ－Ｃｙ７（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、クローンＰＣ６１．５、カタログ番号２５－０２５１－８２）、抗マウスＣＤ１１ｃ ＡＰＣ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、クローンＨＬ３、カタログ番号５６１１１９）、抗マウスＣＤ４４ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、クローンＩＭ７、カタログ番号５６０５６７）及び抗マウスＣＤ８ ＡＰＣ－Ｃｙ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローン５３－６．７、カタログ番号１００７１４）。生細胞と死細胞を区別するために、生存率色素Ｚｏｍｂｉｅ Ａｑｕａ（商標）を抗体混合物に添加した。細胞を５０μｌの染色抗体ミックスとともに４℃で３０分間インキュベートした。その後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、２００μｌのＰＢＳに再懸濁し、５レーザーＬＳＲ－Ｆｏｒｔｅｓｓａを使用して分析した。ＦｌｏｗＪｏ バージョン１０ ソフトウェアを使用してデータ分析を実行した。生存可能なＣＤ３及びＣＤ８陽性細胞をＣＦＳＥシグナル並びにＣＤ２５及びＣＤ４４発現について分析した。
図８Ａ及び図８Ｂは、ＯＶＡ送達試薬とインキュベートし、ヒトＣＤ４０及びＦＡＰを標的とする二重特異性抗原結合分子で刺激したＤＣが、ＣＤ８陽性ＯＴ１ Ｔ細胞の増殖を高度に増強することを示す。これらの効果はＦＡＰ依存性であった。描写されたＦＡＰ依存性抗体によって誘導されたＴ細胞増殖の増加は、架橋ＣＤ４０抗体（Ｐ１ＡＤ４４７０）によって誘導された増加と比較してわずかに低かった。１つのＦＡＰ（２１２）又はＦＡＰ（４Ｂ９）結合部分を有する２＋１又は４＋１二重特異性抗ＣＤ４０抗体で刺激されたＤＣによって誘発された増殖のレベルは同等だった。
５．３ ＦＡＰ結合及びＣＤ４０シグナル伝達のための２つの細胞株ブリッジングアッセイ
二重特異性抗体の作用機序は、２つの細胞株ブリッジングアッセイに反映されている。抗体は、ＦＡＰ発現細胞株のＦＡＰとレポーター遺伝子細胞株のＣＤ４０受容体に結合する。ＣＤ４０受容体のクラスター化の場合、シグナル伝達により、分泌された胚性アルカリホスファターゼのＮＦκＢ依存性産生が誘導される。
簡単に言うと：レポーター細胞株ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＣＤ４０Ｌ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、ヒトＣＤ４０受容体及びＮＦｋＢ誘導性分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）をコードするプラスミドでトランスフェクトされた）をＡｃｃｕｔａｓｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で分離し、６．８ｘ１０６個の細胞を滅菌５０ｍＬ遠心チューブ（Ｇｒｅｉｎｅｒ）に移し、使用するまでローラーミキサー（Ｈｅｉｄｏｌｐｈ）に置いた。
表面にＦＡＰを発現するネイティブ標的細胞（ＷＭ－２６６－４、ＡＴＣＣ）をすぐに使用できる凍結細胞として使用した。各バイアルには、２ｘ１０７個の細胞／２ｍＬ ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、及び５％ＤＭＳＯが含まれていた。細胞の維持培養は、高グルコース及びＨＥＰＥＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むＤＭＥＭで行う必要がある。標的細胞は、３７℃の予熱した水浴で２分間解凍した。２ｍＬの細胞懸濁液を、３０ｍＬのＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む５０ｍＬの遠心チューブに直ちに移した。１３．６ｘ１０６個の細胞の一定分量を５０ｍＬの遠心チューブに移し、使用するまでローラーミキサーに置いた。細胞の解凍は、抗体希釈系列の調製後に行われた。
ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）検出培地（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を細胞懸濁液及び抗体希釈液の調製に使用した。３つのポーチを１５０ｍＬの蒸留水（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に溶解し、０．２２μｍのメンブラン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）でフィルターにかけて滅菌ガラス瓶（Ｓｃｈｏｔｔ）に入れた。１５０μｌのゲンタマイシン（５０ｍｇ／ｍＬ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を追加した。
抗体希釈液は、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）検出培地で２倍に濃縮した。連続希釈系列（１：４）の８つの濃度により、最終アッセイ濃度は５１８ｐＭ～０．０３１６ｐＭになった。各抗体濃度１００μＬを透明な９６ウェルマイクロ力価組織培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）に移した。分子あたり３枚のプレート上の複製を評価した。
両方の細胞株（レポーター及び標的細胞株）を、室温で１８０ｘｇで４分間遠心分離した。上清を除去し、各細胞株を１７ｍＬのＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）検出培地に再懸濁した。両方の細胞株を組み合わせることにより、最終的に混合物には１ｍＬあたり２ｘ１０５個のＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＣＤ４０Ｌ細胞と１ｍＬあたり４ｘ１０５個のＷＭ－２６６ ４細胞が含まれていた。１００μＬの細胞混合物をアッセイプレートの各ウェルに添加した。最後に、２０．０００個のＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＣＤ４０Ｌ細胞と４０．０００個のＷＭ－２６６－４細胞が各ウェルに存在した。プレートを室温で１５分間プレインキュベートして細胞の分布と定着を可能にし、次に３７℃及び５％ＣＯ２（セルインキュベーター）で２０時間インキュベートした。ＳＥＡＰの活性は、６５０ｎｍのＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）検出培地（Ｖｉｃｔｏｒ Ｘ４、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で測定した。光学密度（ＯＤ）を抗体の濃度に対してプロットした（図９を参照）。ＥＣ５０値を、以下の表２８に示す。
Figure 0007221379000054
ＥＣ５０値は、２つのＣＤ４０結合ＦａｂフラグメントとＦＡＰ結合クロスＦａｂフラグメントを含む２＋１分子Ｐ１ＡＥ２４２３とＰ１ＡＥ２３０２で非常に似ている。ＥＣ５０は、１＋１クロスＦａｂコンストラクトＰ１ＡＦ０８７３及び２＋２コンストラクトＰ１ＡＡ９６６３で有意に高くなっている。更に、１＋１コンストラクトＰ１ＡＦ０８７３は、有意に目立たない高い漸近線を示し、有効性が低いことを意味する。
５．４ ＦＡＰに依存しないＣＤ４０特異的アッセイ
ＦＡＰを介したクラスター化なしのＣＤ４０経路の潜在的な活性化を評価した。ＣＤ４０受容体の活性化の場合、シグナル伝達により、分泌された胚性アルカリホスファターゼのＮＦκＢ依存性産生が誘導される。
簡単に説明すると、レポーター細胞株ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＣＤ４０Ｌ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、ヒトＣＤ４０受容体及びＮＦκＢ誘導性分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）をコードするプラスミドでトランスフェクトされた）をＡｃｃｕｔａｓｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で分離し、３．４ｘ１０６個の細胞を滅菌５０ｍＬ遠心チューブ（Ｇｒｅｉｎｅｒ）に移し、使用するまでローラーミキサー（Ｈｅｉｄｏｌｐｈ）に置いた。ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）検出培地（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）は、「ＦＡＰ結合とＣＤ４０シグナル伝達のための２つの細胞株ブリッジングアッセイ」から使用された。抗体希釈液をＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）検出培地で２倍に濃縮した。最終アッセイ濃度は５１８ｐＭだった。「ＦＡＰ結合及びＣＤ４０シグナル伝達のための２つの細胞株ブリッジングアッセイ」の３つの独立した希釈シリーズのうち、１００μＬの最高抗体濃度を２回ずつ透明な９６ウェルマイクロ力価組織培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）に移した。これにより、１つのプレートで分子あたり６つの値が評価された。
レポーター細胞株を１８０ｘｇ、室温で４分間遠心分離した。上清を除去し、細胞を１７ｍＬのＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）検出培地に再懸濁した。２０．０００個のＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＣＤ４０Ｌ細胞を含む１００μＬがウェルに存在した。プレートを室温で１５分間プレインキュベートして細胞の分布と定着を可能にし、次に３７℃及び５％ＣＯ２（セルインキュベーター）で２０時間インキュベートした。ＳＥＡＰの活性は、６５０ｎｍのＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）検出培地（Ｖｉｃｔｏｒ Ｘ４、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で測定した。ｎ＝６及び３ｘＳＴＤＥＶの光学密度（ＯＤ）の平均を、分子に対してプロットした（図１０を参照）。
ＦＡＰ依存性アッセイで使用された最高濃度は、ＣＤ４０特異的レポーター細胞を分子とインキュベートするために使用された。ＦＡＰ結合を介したクラスター化がなければ、ＣＤ４０受容体の活性化とそれに続くシグナル伝達は非常に低かった。Ｐ１ＡＦ０８７３（１＋１クロスマブ）及びＰ１ＡＡ９６６３（２＋２クロスマブ）の方が、２＋１分子Ｐ１ＡＥ２４２３及びＰ１ＡＥ２３０２（エラーバーの重複）よりも更に低かった。
実施例６
ＰＤ－Ｌ１と組み合わせたＦＡＰ標的抗ヒトＣＤ４０結合分子の抗腫瘍有効性の評価
免疫担当マウスのＦＡＰ発現腫瘍細胞に対するアゴニスト抗ＦＡＰ ｘ ＣＤ４０抗体の効果を決定するために、インビボ研究が設計された（図１１）。特に、マウスＦＡＰに結合する２８Ｈ１ ＦＡＰ結合ドメインを有する４＋１フォーマットの二重特異性ＦＡＰ－ＣＤ４０抗体と、２８Ｈ１ ＦＡＰ結合ドメインと独立したＦＡＰ－ＣＤ４０コントロール抗体を有する２＋１フォーマットの二重特異性ＦＡＰ－ＣＤ４０抗体の違いを、ａＰＤ－Ｌ１処理の有無に関わらず、評価した。
合計９７＋９（再チャレンジ実験に必要）ｈｕＣＤ４０ ｔｇ ＨＯ雌マウス、実験開始時６～９週齢（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒｓ、フランスから購入）、もともとはタコニックから入手したもので、特定病原体除去条件下で、コミットされたガイドライン（ＧＶ－Ｓｏｌａｓ；Ｆｅｌａｓａ；ＴｉｅｒｓｃｈＧ）に従って、毎日１２時間の明期／１２時間の暗期のサイクルで維持された。実験的研究プロトコルは、地方自治体（ＺＨ２２５－１７）によってレビューされ、承認された。到着した後、動物を、新しい環境に慣れさせ、観察するために１週間維持した。その後、マウスの背中の右側にトランスポンダーを皮下移植して識別し、回復のために更に１週間維持した。連続的な健康モニタリングは、定期的に行われた。動物は、臨床症状及び有害作用の検出のために毎日管理された。
ＭＣ３８－ｍｕＦＡＰ ｉｎｖｉｐａ細胞（ＣＲＣ）は、Ｒｏｃｈｅ Ｇｌｙｃａｒｔ ＡＧで実施された生体内継代から得られ、増殖後にＧｌｙｃａｒｔ内部細胞バンクに沈着した。ＭＣ３８－ｍｕＦＡＰ ｉｎｖｉｐａ細胞は、１０％ＦＣＳ（ＰＡＡ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、オーストリア）、１ｍＭ ピルビン酸、１ｘＮＥＡＡ、及び６μｇ／ｍｌ ピューロマイシンを含むＤＭＥＭで培養した。５％ＣＯ２で、水飽和した雰囲気中、３７℃で細胞を培養した。細胞は、１０のインビトロ継代及び９４．５％の生存率で注入された。
腫瘍細胞接種のために、マウスを麻酔し、５０％ＲＰＭＩ＋５０％マトリゲル培地中の２ｘ１０６個のＭＣ３８－ｍｕＦＡＰ単一細胞懸濁液を含む１００μｌの溶液を含む２９Ｇ針（ＢＤ）を左脇腹に皮下注射した。同じ腫瘍細胞株での再チャレンジのために、４５匹のマウスを最初の治療の９３日後に同じ手順に従って右側腹部に注射した。
腫瘍の平均が２００ｍｍ３に達した２２日目に、マウスは、それぞれが同様の平均腫瘍サイズを有する９匹のマウスからなる８つの異なる群にランダム化された。（表２９）。ランダム化後、研究群（表３１）に従って、マウスに異なる化合物（表３０）を含む２９Ｇ針を腹腔内注射した。１回目の治療の７日後と１４日後に、群Ｂ、Ｆ、Ｇ及びＨに２回目と３回目の抗ＰＤ－Ｌ１腹腔内注射を行った。
ランダム化と治療注射の後、腫瘍サイズを週に３回キャリパー測定で追跡した。動物の福祉の遵守を確実にするために、毎日のモニタリングが行われた。ライセンス基準（ＺＨ２２５－１７）の中で、潰瘍性腫瘍、腫瘍体積が３０００ｍｍ３を超える腫瘍、又は元の体重の２０％を超える体重減少（０日目）のマウスの場合、マウスを犠牲にした。終了が必要な場合、マウスをイソフルランで麻酔し、機械的な頸椎脱臼を行った。
Figure 0007221379000055
Figure 0007221379000056
Figure 0007221379000057
除外された動物から、１２匹の動物を選択し、群Ａ、Ｃ、Ｄ、及びＥの治療法（治療ごとに３匹）で処置し、最初の治療注射の４日目に免疫薬物力学的効果を分析するスカウトとして犠牲にした。
６．１ ＦＡＰ標的抗ＣＤ４０結合分子は、完全な腫瘍寛解と効率的な抗腫瘍免疫記憶応答を誘導する
キャリパー測定により、腫瘍サイズを週に３回モニターした。ＪＭＰ１２ソフトウェアは、腫瘍増殖データの統計分析に使用された。多重比較のグループ平均の有意差をテストするために、Ｔｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ法を使用した標準分散分析（ＡＮＯＶＡ）を適用した。Ｔｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒは、平均間の全てのペアワイズ差の検定を行う。サンプルサイズが同じである場合、これは正確なアルファレベルのテストである。
最初の治療の９３日後、完全な腫瘍退縮を示したマウスに、この腫瘍細胞株に対する免疫細胞記憶の形成を決定するために、ＭＣ３８－ＦＡＰ腫瘍細胞を反対側の側面に皮下注射した。コントロールとして、９匹のナイーブＣ５７ｂｌ／６－ｈｕＣＤ４０ ｔｇマウスに同じＭＣ３８－ＦＡＰ腫瘍細胞を注射し、獣医免許に従って週に２～３回キャリパー測定を行った。
図１２に示すように、両方のＦＡＰ－ＣＤ４０二重特異性分子（２＋１及び４＋１）は、ＰＤ－Ｌ１処置の有無に関わらず完全な腫瘍寛解を誘導した。非標的ＣＤ４０、ＰＤ－Ｌ１、又はその両方を組み合わせて処置したマウスでは、ビヒクル群と比較して腫瘍増殖は遅延しなかった。その上、再チャレンジすると、以前にＦＡＰ－ＣＤ４０抗体で処置した群ではＭＣ３８－ＦＡＰ腫瘍は成長しなかったが、ナイーブマウスでは腫瘍の１００％が成長した。これらの結果は、非標的ＣＤ４０療法とは対照的に、標的ＣＤ４０療法の強力なＭＣ３８－ＦＡＰ抗腫瘍有効性及び腫瘍増殖の退縮を示す。抗ＦＡＰ－ＣＤ４０抗体で処置された全てのマウスは１００％の腫瘍寛解を示したので、これらのマウスには明らかな抗ＰＤ－Ｌ１アドオン効果はなかった。更に、腫瘍増殖阻害に関して、２＋１フォーマットと４－１フォーマットの間に実証された違いはなかった。再チャレンジデータは、ＦＡＰ－ＣＤ４０抗体で処置された全てのマウスにおけるＭＣ３８－ＦＡＰ腫瘍細胞に対する効率的な免疫記憶応答の形成を示す。
統計分析は、２＋１ ＦＡＰ－ＣＤ４０抗体処置群では２８日目（治療後６日）から（図１３Ａ、２８日目の全ての群を比較する統計分析）、４＋１ ＦＡＰ－ＣＤ４０抗体処置群では３１日目（治療後９日）から（図１３Ｂ、３１日目の全ての群を比較する統計分析）、ビヒクルと比較してデータが有意に異なり始めることを示した。
６．２ ４＋１ ＦＡＰ標的抗ＣＤ４０結合分子は、２＋１ＦＡＰ標的抗ＣＤ４０結合分子と比較して高い血清クリアランスを示す。
腹腔内注射時の薬物の薬物動態プロファイルを追跡するために、群あたり３～４匹のマウスから血液を採取した。血清サンプルは、血中抗ＣＤ４０レベルを分析するための最初の抗体療法の６時間後、２４時間後、４８時間後、７２時間後、９６時間後、８日後、及び１５日後に収集された。時点ごとに最大１００μｌの血液が収集された。マウスの体温は、血管の良好な拡張を確実にするために、３９℃に温められた箱によってわずかに上昇された。尾静脈の穿刺は２２Ｇ針で行った。血液を１．１ｍｌのＺ－Ｇｅｌマイクロチューブ（ＳＡＲＳＴＥＤＴ）に収集し、遠心分離後に上清を収集して血清を抽出した。サンプルは－２０℃で保存され、後でキャリブレーション用のそれぞれの抗体を使用して抗ＣＤ４０レベルについて分析された。
血清中の抗ＣＤ４０濃度は、プロトコル（Ｒｏｃｈｅ－Ｇｌｙｃａｒｔ、スイス）に従って、抗ＣＤ４０ｈｕＩｇＧの定量化のためにＣＤ４０／Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ、１４９３－ＣＤ－０５０）ＥＬＩＳＡを使用してテストされた。試薬はタンパク質を捕捉する：ヒトＩｇＧ－Ｆｃビオチン（Ａｂｃａｍ、ａｂ９８５６１）及びＣＤ４０／Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ、１４９３－ＣＤ－０５０）、検出抗体：抗マウスＩｇＧ（ＨＲＰ）（Ａｂｃａｍ、ａｂ９７０４０）又は抗ｈｕＣＨ１－ＤＩＧ（Ｒｏｃｈｅ－Ｐｅｎｚｂｅｒｇ、ドイツ）及びａｎｔｉ－ＤＩＧ－ＰＯＤ（Ｒｏｃｈｅ、１１６３３７１６００１）を使用した。血清サンプルは、注射された投与量（ｍｇ／ｋｇ）及び抗ＣＤ４０注射後の収集時間（６時間、２４時間、４８時間、９６時間）に応じて段階希釈で分析された。４０５ｎｍの測定波長と４９０ｎｍの参照波長（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉ３マイクロプレートリーダー、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して吸収を測定した。
ＰＫ分析では、Ｐｈｏｅｎｉｘ６４、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ６．４ソフトウェアを使用して、曲線下面積とＣｍａｘを計算した。薬物動態は９６時間までしかモニターされなかったため、クリアランスや半減期などのＰＫパラメータは示されていない。
図１４及び表３２に示すように、２＋１フォーマットと比較して４＋１フォーマットの方が高いクリアランスが観察された。この高いクリアランスは、二価のＣＤ４０バインダー（２＋１フォーマット）よりも四価のＣＤ４０バインダー（４＋１フォーマット）の方が顕著であるＣＤ４０固有のＴａｒｇｅｔ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ－Ｄｒｕｇ－Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ（ＴＭＤＤ）によって説明できる。
また、非標的ＣＤ４０は、両方のＦＡＰ－ＣＤ４０分子と比較して高いクリアランスを示した。このクリアランスはＴＭＤＤ仮説では説明できないが、ＣＤ４０療法での抗薬物抗体（ＡＤＡ）の形成が原因であり得る。
Figure 0007221379000058
６．３ 処置後９６時間のＦＡＰ標的抗ＣＤ４０結合分子によるＤＣ、Ｂ細胞及びＴ細胞のＣＤ４０媒介活性化
最初の治療の９６時間後、群あたり３匹のマウスを犠牲にし、フローサイトメトリー分析のために次の臓器をＰＢＳ中に収集した：腫瘍、脾臓、鼠径部排出リンパ節、鼠径部、軸性及び上腕の非排出リンパ節。
フローサイトメーター分析のために、収集された全ての臓器の単一細胞懸濁液を、実施例５．２．１に記載されているように調製し、蛍光標識抗体で染色した。この目的のために、調製した単細胞懸濁液を９６ウェル平底プレートに移し、ＰＢＳで洗浄し、３μｇ／ｍｌのＦｃ受容体ブロッキングマウスＩｇＧアイソタイプコントロール（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１０４００Ｃ）５０μｌとＰＢＳ中でインキュベートした。４℃で１５分間インキュベートした後、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中の蛍光標識抗体の混合物５０μｌを細胞に添加した。以下の抗体を使用した：抗マウスＣＤ３ Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、クローン５００Ａ２、カタログ番号５５８２１４）、抗マウスＣＤ８６ ＢＶ６０５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローンＧＬ－１、カタログ番号１０５０３７）、ＣＤ４５ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、クローン３０－Ｆ１１、カタログ番号５６－０４５１－８２）、抗マウスＣＤ１９ ＢＵＶ３９５（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、クローン１Ｄ３、カタログ番号５６３５５７）、抗マウスＣＤ１１ｃ ＢＶ７８５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローンＮ４１８、カタログ番号１１７３３６）、抗マウスＢ２２０ ＡＰＣ－Ｃｙ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローンＲＡ３－６Ｂ２、カタログ番号１０３２２４）、抗マウスＣＤ６９ ＢＵＶ７３７（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、クローンＨ１．２Ｆ３、カタログ番号６１２７９３）、抗Ｉ－Ａ／Ｉ－Ｅ ＰｅｒＣｐ－Ｃｙ５．５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローンＭ５／１１４．１５．２、カタログ番号１０７６２６）。生細胞と死細胞を区別するために、生存率色素Ｚｏｍｂｉｅ Ａｑｕａ（商標）又はＦｉｘａｂｌｅ ｂｌｕｅ（両方ともＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を抗体混合物に添加した。細胞を細胞外染色抗体溶液とともに４℃で３０分間インキュベートした。その後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、透過処理し、Ｆｏｘｐ３／転写因子を含む抗マウスＫｉ－６７ ＰＥ－Ｃｙ７（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、クローンＳｏｌＡ１５、カタログ番号２５－５６９８－８２）を使用して、染色バッファーセット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号００－５５２３－００）を用いて、製造元のプロトコルに従って、Ｋｉ－６７の細胞内染色を行った。細胞を２００μｌのＰＢＳに再懸濁し、５レーザーＬＳＲ－Ｆｏｒｔｅｓｓａを使用して同じ日に分析した。ＦｌｏｗＪｏ バージョン１０ ソフトウェアを使用してデータ分析を実行した。生存可能なＣＤ４５＋、ＣＤ３＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞をＫｉ－６７発現について分析した。生存樹状細胞（ＣＤ４５＋、ＭＨＣＩＩ＋、ＣＤ１１ｃ＋）をＤＣ活性化マーカーＣＤ８６の発現について分析し、生存Ｂ細胞（ＣＤ４５＋、ＣＤ１９＋、Ｂ２２０＋）をＢ細胞活性化マーカーＣＤ６９の発現について分析した。
図１５に示すように、ＦＡＰ標的抗ＣＤ４０抗体フォーマット（２＋１及び４＋１）は両方とも、腫瘍排出リンパ節、非排出リンパ節、及び脾臓で、処置の４日後に非標的抗ＣＤ４０抗体よりも程度は低いが、ＤＣ活性化（ＣＤ８６発現）の有意な増加を誘導した。対照的に、２＋１フォーマットのＦＡＰ標的抗ＣＤ４０抗体のみが、ビヒクル群と比較して腫瘍において有意なＤＣ活性化を誘導した。図１６に示すように、Ｔ細胞の活性化（Ｋｉ－６７発現）についても同じパターンが観察された。ビヒクル群と比較して、分析された全ての組織サンプルにおける有意なＢ細胞活性化（ＣＤ６９発現）は、非標的抗ＣＤ４０抗体で処置されたマウスでのみ観察された（図１７）。
６．４ ＦＡＰ標的抗ＣＤ４０結合分子は、マウスの非標的ＣＤ４０抗体と比較して副作用が少ない
６．４．１ ＦＡＰ標的抗ＣＤ４０抗体で処置されたマウスは、非標的抗ＣＤ４０抗体で処置されたマウスとは対照的に体重減少を示さない
治療注射後、各マウスの体重を１５日間毎日測定した。元の体重の２０％を超える体重減少（０日目）のマウスを犠牲にした（ここでは、マウスを犠牲にする必要はなかった）。
図１８に示すように、非標的抗ＣＤ４０抗体で処置したマウスは、抗体注射時に明らかな体重減少を示し、抗ＣＤ４０と抗ＰＤ－Ｌ１抗体を併用注射した場合、この体重減少はより長く続いた。４＋１又は２＋１ ＦＡＰ－ＣＤ４０単剤、ＰＤ－Ｌ１単剤を注射した群、及びＦＡＰ－ＣＤ４０（４＋１又は２＋１）＋ＰＤ－Ｌ１の組み合わせた群では体重減少は観察されなかった。この結果は、非標的抗ＣＤ４０抗体と比較して、ＦＡＰ標的抗ＣＤ４０結合分子の安全なプロファイルを示す。
６．４．１ ＦＡＰ標的抗ＣＤ４０抗体で処置したマウスは、非標的の抗ＣＤ４０抗体で処置したマウスと比較して、抗ＰＤ－Ｌ１を介した有害事象が少ないことを示す。
抗ＰＤ－Ｌ１抗体の３回目の注射でいくつかの有害事象が観察された。マウスを犠牲にする必要はなかったが、症状は、治療注射後５分以内にマウスの活動が低下し、背中が反り返り、毛皮がだらしないと説明した。表３３は、３回目の治療でこれらの症状を示したマウスの割合を示す。
Figure 0007221379000059
結果は、ＰＤ－Ｌ１＋ＣＤ４０の併用群で有害事象が明らかに増加したのに対し、抗ＰＤ－Ｌ１＋ＦＡＰ－ＣＤ４０群（４＋１及び２＋１）で観察された有害事象の割合は、抗ＰＤ－Ｌ１単剤処置群と比較して、わずかに増加しただけであることを示す。
観察された有害事象は、抗ＰＤ－Ｌ１に対するＡＤＡ形成による強力な免疫反応（サイトカインストーム）の結果である可能性がある。これは、非標的抗ＣＤ４０抗体の存在下で更に増加する。この観察結果は、両方の分子を抗ＰＤ－Ｌ１抗体療法と組み合わせた場合、非標的抗ＣＤ４０抗体と比較して標的ＦＡＰ－ＣＤ４０分子の安全性プロファイルが優れていることを示す。
要約すると、４＋１及び２＋１フォーマットのＣＤ４０のＦＡＰ依存性活性化を伴うＦＡＰ標的抗ＣＤ４０分子は、非標的抗ＣＤ４０親抗体と比較して、全身毒性が低下した、腫瘍を有するマウスにおいて強力な抗腫瘍免疫応答を誘導する。

Claims (38)

  1. （ａ）ＣＤ４０に特異的に結合可能な少なくとも１つの抗原結合ドメインと、
    （ｂ）（ｉ）配列番号３のアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４、配列番号１１及び配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号６、配列番号１３及び配列番号１４からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号８のアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合可能な少なくとも１つの抗原結合ドメインと、を含む、二重特異性抗原結合分子。
  2. （ｃ）ノブ・イントゥ・ホール技術に基づく改変、又は静電操縦効果に介在する改変により会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成されるＦｃ領域をさらに含む、請求項１に記載の二重特異性抗原結合分子。
  3. ＦＡＰに特異的に結合可能な前記抗原結合ドメインが、配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、請求項１又は２に記載の二重特異性抗原結合分子。
  4. ＦＡＰに特異的に結合可能な前記抗原結合ドメインが、
    配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９及び配列番号２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と、
    配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５及び配列番号２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）と、を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
  5. ＦＡＰに特異的に結合可能な前記抗原結合ドメインが、
    （ａ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、
    （ｂ）配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、
    （ｃ）配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は
    （ｄ）配列番号１９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
  6. ＣＤ４０に特異的に結合可能な前記抗原結合ドメインが、（ｉ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）と、（ｉｖ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）と、を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
  7. ＣＤ４０に特異的に結合可能な前記抗原結合ドメインが、
    （ｉ）配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９及び配列番号４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）と、
    （ｉｉ）配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、及び配列番号４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）と、を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
  8. ＣＤ４０に特異的に結合可能な前記抗原結合ドメインが、
    （ｉ）配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９及び配列番号５０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）と、
    （ｉｉ）配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、及び配列番号５４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）と、を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
  9. ＣＤ４０に特異的に結合可能な前記抗原結合ドメインが、
    （ａ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４１のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
    （ｂ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４２のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
    （ｃ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４３のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
    （ｄ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４４のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
    （ｅ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４１のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
    （ｆ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４２のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
    （ｇ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４３のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
    （ｈ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４４のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
    （ｉ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４１のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
    （ｊ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４２のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
    （ｋ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４３のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
    （ｌ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４４のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
    （ｍ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４１のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
    （ｎ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４２のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
    （ｏ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４３のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
    （ｐ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４４のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、請求項１～５又は７のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
  10. ＣＤ４０に特異的に結合可能な前記抗原結合ドメインが、配列番号３７のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４１のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、請求項１～５又は７又は９のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
  11. ＣＤ４０に特異的に結合可能な前記抗原結合ドメインが、
    （ａ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号５１のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
    （ｂ）配列番号４６のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号５１のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
    （ｃ）配列番号４７のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号５１のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
    （ｄ）配列番号４８のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号５１のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
    （ｅ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号５２のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
    （ｆ）配列番号４６のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号５２のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
    （ｇ）配列番号４７のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号５２のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
    （ｈ）配列番号４８のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号５２のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
    （ｉ）配列番号４９のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号５３のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
    （ｊ）配列番号５０のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号５３のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
    （ｋ）配列番号４９のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号５４のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
    （ｌ）配列番号５０のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号５４のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、請求項１～５又は８のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
  12. ＣＤ４０に特異的に結合可能な前記抗原結合ドメインが、配列番号４５のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号５１のアミノ酸配列を含むＶＬを含むか、又はＣＤ４０に特異的に結合可能な前記抗原結合ドメインが、配列番号４８のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号５１のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、請求項１～５又は８又は１１のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
  13. （ｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）及び配列番号４１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）を含む、ＣＤ４０に特異的に結合可能な少なくとも１つの抗原結合ドメインと、
    （ｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、ＦＡＰに特異的に結合可能な少なくとも１つの抗原結合ドメインと、を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
  14. 前記Ｆｃ領域が、ＩｇＧであり、かつ前記Ｆｃ領域が、Ｆｃ受容体及び／又はエフェクター機能に対する抗体の結合親和性を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項２～１３のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
  15. ＩｇＧが、ＩｇＧ１Ｆｃ領域又はＩｇＧ４ Ｆｃ領域である、請求項１４に記載の二重特異性抗原結合分子。
  16. 前記Ｆｃ領域が、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）を有するヒトＩｇＧ１サブクラスのＦｃ領域である、請求項２～１５のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
  17. 前記二重特異性抗原結合分子が、
    （ａ）Ｆｃ領域に連結したＣＤ４０に特異的に結合可能な少なくとも２つのＦａｂフラグメントと、
    （ｂ）前記Ｆｃ領域のＣ末端に連結したＦＡＰに特異的に結合可能な１つの抗原結合ドメインと、を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
  18. 前記二重特異性抗原結合分子が、
    （ａ）Ｆｃ領域に融合したＣＤ４０に特異的に結合可能な少なくとも２つのＦａｂフラグメントと、
    （ｂ）前記Ｆｃ領域のＣ末端に融合したＦＡＰに特異的に結合可能なクロスＦａｂフラグメントと、を含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
  19. ＦＡＰに特異的に結合可能な前記クロスＦａｂフラグメントのＶＨ－Ｃカッパ鎖が前記Ｆｃ領域の前記Ｃ末端に融合した、請求項１８に記載の二重特異性抗原結合分子。
  20. （ａ）ＣＤ４０に特異的に結合可能な２つのＦａｂフラグメント、及びＦｃ領域を含む抗体の２つの軽鎖及び２つの重鎖と、
    （ｂ）ＶＬ－ＣＨ１鎖が（ａ）の２つの重鎖の１つのＣ末端に融合する、ＦＡＰに特異的に結合可能なクロスＦａｂフラグメントと、を含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
  21. （ａ）各々が配列番号６２のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号６１のアミノ酸配列を含む１つの軽鎖、配列番号６３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号６４のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、又は
    （ｂ）各々が配列番号６６のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号６５のアミノ酸配列を含む１つの軽鎖、配列番号６７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号６８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、を含む、請求項１に記載の二重特異性抗原結合分子。
  22. 各々が配列番号６２のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号６１のアミノ酸配列を含む１つの軽鎖、配列番号６３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号６４のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、を含む、請求項１に記載の二重特異性抗原結合分子。
  23. 前記二重特異性抗原結合分子が、ＣＤ４０に特異的に結合可能な４つのＦａｂフラグメントを含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
  24. ＦＡＰに特異的に結合する抗体であって、（ｉ）配列番号３のアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４、配列番号１１及び配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と、（ｉｖ）配列番号６、配列番号１３及び配列番号１４からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号８のアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）と、を含む、抗体。
  25. 前記抗体が、
    （ａ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、
    （ｂ）配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、
    （ｃ）配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は
    （ｄ）配列番号１９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、請求項２４に記載の抗体。
  26. 請求項１～２３のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子、又は請求項２４若しくは２５に記載の抗体をコードする、単離核酸。
  27. 請求項２６に記載の単離核酸を含む、発現ベクター。
  28. 請求項２６に記載の単離核酸、又は請求項２７に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
  29. 前記二重特異性抗原結合分子の発現に適した条件下で請求項２８に記載の宿主細胞を培養すること、及び前記二重特異性抗原結合分子を単離することを含む、二重特異性抗原結合分子を製造する方法。
  30. 請求項１～２３のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子又は請求項２４若しくは２５に記載の抗体と、薬学的に許容され得る担体とを含む、医薬組成物。
  31. 追加の治療薬剤をさらに含む、請求項３０に記載の医薬組成物。
  32. 医薬として使用するための、請求項１～２３のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子、又は、請求項３０に記載の医薬組成物。
  33. （ｉ）ＣＤ４０発現抗原提示細胞（ＡＰＣ）による免疫刺激の誘導において、
    （ｉｉ）腫瘍特異的Ｔ細胞応答の刺激において、
    （ｉｉｉ）腫瘍細胞のアポトーシスを引き起こすことにおいて、
    （ｉｖ）癌の処置において、
    （ｖ）癌の進行を遅らせることにおいて、
    （ｖｉ）癌を患う患者の生存を延長することにおいて、
    （ｖｉｉ）感染症の処置において、
    使用するための、請求項１～２３のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子又は請求項３０に記載の医薬組成物。
  34. 癌の処置に使用するための、請求項１～２３のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子又は請求項３０に記載の医薬組成物。
  35. 前記二重特異性抗原結合分子又は前記医薬組成物が、癌免疫療法で使用するための化学療法剤、放射線及び／又は他の薬剤と組み合わせた投与のためのものである、癌の処置に使用するための、請求項１～２３のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子、又は請求項３０に記載の医薬組成物。
  36. 前記二重特異性抗原結合分子が、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用を遮断する薬剤と組み合わせた投与のためのものである、癌の処置に使用するための、請求項１～２３のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子又は請求項３０に記載の医薬組成物。
  37. 癌の処置のための医薬の製造における、請求項１～２３のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子又は請求項３０に記載の医薬組成物の使用。
  38. 請求項１～２３のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子又は請求項３０に記載の医薬組成物を含む、癌を有する個体を処置するための医薬。
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