CN111247429A

CN111247429A - 用于新颖抗原结合模块的特异性测试的通用报告细胞测定法

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Publication number: CN111247429A
Application number: CN201880067764.9A
Authority: CN
Inventors: D·达罗斯基; C·L·S·德隆; L·J·哈尼施; C·约斯特; C·克莱因; E·莫斯纳; V·普尔科; W·徐
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2017-12-21
Filing date: 2018-12-20
Publication date: 2020-06-05
Also published as: US20200316128A1; JP7394058B2; JP2021508043A; EP3729080B1; EP3729080A1; WO2019122046A1

Abstract

本发明一般性涉及使用细胞培养物的特异性测定法,特别是用于测试不同型式的新颖抗原结合模块的嵌合抗原受体(CAR)表达性报告T(CAR‑T)细胞测定法。而且,本发明涉及用包含靶抗原结合模块的改造的嵌合抗原受体(CAR)转染/转导的CAR‑T细胞的用途,该靶抗原结合模块能够特异性结合抗原结合分子的识别域。本发明还涉及用于特异性测试候选抗原结合模块和/或表达改造的CAR的核酸分子和载体的方法和试剂盒。

Description

用于新颖抗原结合模块的特异性测试的通用报告细胞测定法

发明领域

本发明一般性涉及使用细胞培养物的特异性测定法,特别是用于测试不同型式的新颖抗原结合模块的嵌合抗原受体(CAR)表达性报告T(CAR-T)细胞测定法。而且,本发明涉及用包含靶抗原结合模块的改造的嵌合抗原受体(CAR)转染/转导的CAR-T细胞的用途,该靶抗原结合模块能够特异性结合抗原结合分子的识别域。本发明还涉及用于特异性测试候选抗原结合模块和/或表达改造的CAR的核酸分子和载体的方法和试剂盒。

发明背景

化疗直到现在仍然是癌症的最常用治疗之一。另外,基于抗体的疗法在过去15年里得到发展,现在在血液学恶性和实体瘤的治疗中代表化疗办法的有价值组合或备选。与化疗不一样,抗体疗法靶向癌细胞上的特定抗原,因而容许更加定点的治疗,由此降低对健康组织的副作用。在开发基于抗体的治疗性试剂的过程中,需要各种测定法来鉴定最好的候选,带入临床试验中并最终推向市场。在第一个早期临床前阶段中,不得不生成抗体并分析它们的靶物特异性,以及它们对靶物的亲和力。

可以使用各种蛋白质-蛋白质相互作用测定法来分析结合特性,诸如基于FRET的方法,表面等离振子共振(SPR)或荧光激活细胞分选(FACS)。然而,可用的测定法型式可能并不总是全面且综合地再现体内情况。例如,用结合细胞表面受体的治疗性抗体靶向癌细胞可能在多个水平上具有影响,例如经由结合和交联表面分子的细胞内信号传导以及标记肿瘤细胞以啮合免疫细胞。而且,自抗原结合至建立效应器功能(例如T细胞细胞毒性)的识别级联需要一系列精心编排的细胞表面相互作用,其中抗原结合模块的结合亲和力是数个因素中的一个。因此,虽然这些测定法对于早期候选开发是非常有价值的工具,但是单纯的蛋白质-蛋白质亲和相互作用测定法可能并不产生完整图片。

最终,仍然需要开发确实在更加全面的设置中更加密切地模拟体内情况,尽可能将对靶物-抗体结合的非特异性影响最小化的结合测定法。而且,设计容许在抗体治疗性分子的开发过程的早期阶段评估结合和功能性的组合测定法会是大大有益的。

本发明的发明人开发了一种新颖的测定法,其适用于极其多种不同癌细胞类型以评估抗体对它们的靶物的结合。该创新的测定法包括经修饰的T细胞作为报告细胞,组合直截了当的读出与全面且包容的结果。

而且,本发明提供组合抗体和抗体样构建物(例如配体)的结合和功能性的评估的测定法。该新颖的测定法例如对于治疗性抗体药物候选的筛选或表征目的是有用的,即以高通量型式。

这种新的测定法代表一种有价值的工具,用于结合天然靶物的抗体的早期和晚期阶段筛选和表征和评估功能性,会容许在药物候选的开发中的早期阶段鉴定最好的结合物。

发明概述

本发明一般性涉及一种用于选择新颖抗原结合模块的方法,特别是在药物开发过程中,而且组合对(例如肿瘤细胞上的)靶抗原的结合的评估与T细胞响应抗体-靶物结合的激活。提供的是一种用于评估抗原结合模块的特异性的方法,其包含下述步骤:

a)提供包含抗原结合域和识别域的抗原结合分子,其中该抗原结合域包含该抗原结合模块,其中该抗原结合模块是对靶抗原特异性的；

b)使该抗原结合分子与在表面上包含该靶抗原的靶细胞接触,特别是其中该靶细胞是癌细胞；

c)使该抗原结合分子与嵌合抗原受体(CAR)表达性报告T(CAR-T)细胞接触,其中该报告CAR-T细胞包含:

i.能够特异性结合该识别域的CAR,其中该抗原结合模块与应答元件可操作偶联；

ii.在该应答元件控制下的报告基因；和

d)通过测定该报告基因的表达来测定T细胞激活以建立该抗原结合模块的特异性。

在一个实施方案中,该识别域是免疫球蛋白域。

在一个实施方案中,该识别域是Fc域。

在一个实施方案中,该Fc域是人Fc域,特别是人IgG1 Fc域。

在一个实施方案中,该Fc域是突变型Fc域,其中该突变型Fc域与非突变型亲本Fc域相比包含至少一处氨基酸替代,其中该CAR能够特异性结合该突变型Fc域但不能够特异性结合该非突变型亲本Fc域。

在一个实施方案中,该突变型Fc域包含选自由依照EU编号方式的L234,L235,I253,H310,P331,P329和H435组成的组的位置处的至少一处氨基酸突变,特别是其中该氨基酸突变是L234A,L235A,I253A,N297A,H310A,P329G和/或H435A。

在一个实施方案中,该突变型Fc域包含依照EU编号方式的氨基酸突变P329G。

在一个实施方案中,该突变型Fc域包含选由依照EU编号方式的I253,H310和H435自组成的组的位置处的至少一处氨基酸突变,特别是氨基酸突变I253A,H310A和H435A(“AAA”)。

在一个实施方案中,该抗原结合模块是Fab片段,特别是自噬菌体展示文库筛选衍生的Fab片段。

在一个实施方案中,该CAR包含至少一个细胞内刺激性信号传导和/或共刺激性信号传导域。

在一个实施方案中,该抗原结合模块对该靶抗原的结合和该报告CAR-T细胞对包含该抗原结合模块的抗原结合分子的结合导致该细胞内信号传导和/或共信号传导域的激活。

在一个实施方案中,该细胞内信号传导和/或共信号传导域的激活导致该应答元件的激活。

在一个实施方案中,该应答元件控制该报告基因的表达。

在一个实施方案中,该应答元件的激活导致该报告基因的表达。

在一个实施方案中,该应答元件是NFAT途径,NF-κB途径或AP-1途径的一部分。

在一个实施方案中,该报告基因是编码发光蛋白,特别是荧光蛋白。

在一个实施方案中,该报告基因编码绿色荧光蛋白(GFP)或萤光素酶。

在一个实施方案中,该靶抗原是细胞表面受体。

在一个实施方案中,该靶抗原选自由CD20,CEA,HER2,TYRP,EGFR,MCSP,STEAP1,WT1和FolR1组成的组。

在一个实施方案中,该靶抗原是与人主要组织相容性复合物(MHC)的分子结合的肽。

在一个实施方案中,该抗原结合模块是T细胞受体样(TCRL)抗原结合模块。

在一个实施方案中,该方法另外包含下述步骤:

e)将该报告基因的表达与参照比较。

在一个实施方案中,该参照是在该靶细胞缺失下该报告基因的表达。

在一个实施方案中,在该靶细胞存在下该报告基因的表达与在该靶细胞缺失下该报告基因的表达相比要高至少2倍,3倍,4倍,5倍,10倍,100倍,1000倍,或10000倍。

在一个实施方案中,该方法另外包含下述步骤:

f)如果在该靶细胞存在下该报告基因的表达相对于在该靶细胞缺失下该报告基因的表达比预先确定的阈值要高的话,选择该新颖抗原结合模块。

在一个实施方案中,该阈值是2,3,4,5,10,100,1000,或10000。

在一个实施方案中,在该靶细胞存在下高水平的该报告基因的表达和在该靶细胞缺失下低水平的该报告基因的表达指示该抗原结合模块的高特异性。在一个实施方案中,在该靶细胞存在下高水平的该报告基因的表达和在该靶细胞缺失下低水平的该报告基因的表达指示包含该抗原结合模块的T细胞双特异性(TCB)抗体的高特异性。

在一个实施方案中,该方法是体外方法

在一个实施方案中,提供的是一种用于生成TCB抗体的方法,其中该TCB抗体型式包含对靶抗原特异性的第一抗原结合模块和能够特异性结合T细胞激活性受体的第二抗原结合模块,其中该第一抗原结合模块是依照如本文中描述的方法选择的。

在一个实施方案中,该T细胞激活性受体是CD3。

附图简述

图1描绘依照本发明使用的例示性CAR的构造。图1A显示抗P329G-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD型式和抗P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD型式的构造。描绘的是包含能够特异性结合包含P329G突变的突变型Fc域的抗原结合模块的胞外域。抗原结合模块由可变重和可变轻链组成。二者通过(Gly₄Ser)₄接头连接。附着于可变轻链,Gly₄Ser接头连接抗原识别域与CD28跨膜域(TM),其融合至CD28的细胞内共刺激性信号传导域(CSD),其继而融合至CD3z的刺激性信号传导域(SSD)。图1B显示抗P329G-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD和抗P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD型式的构造。描绘的是包含能够特异性结合包含P329G突变的突变型Fc域的抗原结合模块的胞外域。抗原结合模块由Ig重链片段和Ig轻链组成。附着于重链,Gly₄Ser接头连接抗原识别域与CD28跨膜域,其融合至CD28的细胞内共刺激性信号传导域,其继而融合至CD3z的刺激性信号传导域。

图2描绘示意图,图示编码依照本发明使用的CAR的例示性表达构建物的模块构成。图2A描绘P392G靶向性scFv型式。图2B描绘P392G靶向性Fab型式。

图3描绘在Fc域中包含P329G突变的例示性IgG1分子,其受到依照本发明使用的抗P329G CAR识别。

图4描绘肿瘤相关抗原(TAA)结合的包含P329G突变的IgG的示意图。这种抗体继而能受到抗P329G CAR表达性T细胞识别,由此T细胞得到激活。

图5显示Jurkat NFAT报告CAR-T细胞测定法的示意图。TAA结合的包含P329G突变的IgG能受到抗P329G CAR表达性Jurkat NFAT报告T细胞识别。这种识别导致细胞激活,其可以通过测量发光(cps)来检测。

图6描绘使用CD20表达性SUDHDL4肿瘤细胞作为靶细胞的Jurkat NFAT报告CAR-T细胞报告测定法。使用包含P329G突变的抗CD20 IgG抗体(GA101),其一方面识别肿瘤相关抗原且另一方面受到Jurkat NFAT报告CAR-T细胞识别。在图6A中使用抗P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD表达性Jurkat NFAT报告CAR-T细胞的分选集合作为报告细胞。在图6B中使用抗P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD表达性Jurkat NFAT报告CAR-T细胞的分选集合作为报告细胞。

图7描绘使用CD20肿瘤细胞作为靶细胞的Jurkat NFAT报告CAR-T细胞测定法。使用包含P329G突变的抗CD20 IgG抗体(GA101),其识别肿瘤相关抗原且受到依照本发明使用的Jurkat NFAT报告CAR-T细胞识别。在图7A中使用抗P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD表达性Jurkat NFAT报告CAR-T细胞的单一克隆5作为报告细胞且使用WSUDLCL2细胞作为肿瘤细胞。在图7B中使用抗P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD表达性JurkatNFAT报告CAR-T细胞的单一克隆2作为报告细胞且使用WSUDLCL2细胞作为肿瘤细胞。在图7C中使用抗P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD表达性Jurkat NFAT报告CAR-T细胞的单一克隆5作为报告细胞且使用SUDHL4细胞作为肿瘤细胞。在图7D中使用抗P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD表达性Jurkat NFAT报告CAR-T细胞的单一克隆2作为报告细胞且使用SUDHL4作为肿瘤细胞。

图8描绘使用贴壁FAP表达性NIH/3T3-huFAP cl 19肿瘤细胞作为靶细胞实施的Jurkat NFAT报告CAR-T细胞测定法。使用包含P329G突变的抗FAP IgG抗体克隆4B9,其识别肿瘤相关抗原且受到Jurkat NFAT报告CAR-T细胞识别。包括包含P329G突变的IgG DP47/vk3作为同种型对照。在图8A中使用抗P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD表达性Jurkat NFAT报告CAR-T细胞的分选集合作为报告细胞。在图8B中使用抗P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD表达性Jurkat NFAT报告CAR-T细胞的分选集合作为报告细胞。在图8C中使用抗P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD表达性Jurkat NFAT报告CAR-T细胞的分选集合作为报告细胞。在图8D中使用抗P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD表达性Jurkat NFAT报告CAR-T细胞的分选集合作为报告细胞

图9描绘使用贴壁CEA表达性MKN45肿瘤细胞作为靶细胞的Jurkat NFAT报告CAR-T细胞测定法。使用均包含P329G突变的抗CEA IgG克隆A5B7或抗CEA IgG克隆T84 LCHA,其识别肿瘤相关抗原且受到Jurkat NFAT报告CAR-T细胞识别。包括别的包含P329G突变的IgGDP47/vk3作为同种型对照。在图9A中和在图9B中使用抗P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD表达性NFAT T细胞的分选集合作为报告细胞。在图9C中和在图9D中使用抗P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD表达性NFAT T细胞的分选集合作为报告细胞。

图10描绘使用贴壁CEA表达性MKN45肿瘤细胞作为靶细胞的Jurkat NFAT报告CAR-T细胞测定法。使用均包含P329G突变的抗CEA克隆CH1A1A 98 99或抗CEA IgG克隆hMN14IgG,其识别肿瘤相关抗原且受到Jurkat NFAT报告CAR-T细胞识别。包括别的包含P329G突变的IgG DP47/vk3作为同种型对照。在图10A中和在图10B中使用抗P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD表达性NFAT T细胞的分选集合作为报告细胞。在图10C中和在图10D中使用抗P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD表达性NFAT T细胞的分选集合作为报告细胞。

图11描绘使用贴壁TNC表达性CT26TNC cl 19肿瘤细胞作为靶细胞的Jurkat NFAT报告CAR-T细胞测定法。使用包含P329G突变的抗TNC IgG克隆A2B10作为IgG抗体,其识别肿瘤相关抗原且受到Jurkat NFAT报告CAR-T细胞识别。包括别的包含P329G突变的IgG DP47/vk3作为同种型对照。在图11A中和在图11B中使用抗P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD表达性NFAT T细胞的分选集合作为报告细胞。在图11C中和在图11D中使用抗P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD表达性NFAT T细胞的分选集合作为报告细胞。

图12A和图12B描绘使用贴壁TNC表达性CT26TNC cl 19肿瘤细胞作为靶细胞的Jurkat NFAT报告CAR-T细胞测定法。使用包含P329G突变的抗TNC IgG克隆A2B10,其识别肿瘤相关抗原且受到Jurkat NFAT报告CAR-T细胞识别。包括别的包含P329G突变的IgG DP47/vk3作为同种型对照。使用抗P329G-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD表达性Jurkat NFAT报告CAR-T细胞的分选集合作为报告细胞。

图13A和图13B描绘用经RMF肽或VLD肽脉冲的T2细胞通过FACS评估WT1/HLA结合物5E11和33H09的特异性。

图14A至图14D描绘Jurkat NFAT报告CAR-T细胞中对经RMF或VLD肽脉冲的T2细胞HLA-A2/WT1肽结合性PGLALA IgG变体对CAR-NFAT信号传导的激活。作为报告细胞,使用抗P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD表达性Jurkat NFAT报告CAR-T细胞的分选集合。每幅子图代表特定结合物(33F05,11D06,33H09和5E11)的稀释液。RMF肽(靶)对VLD肽(脱靶)上的信号的比较有助于评估激活的特异性。

图15A至图15F描绘HLA-A2/WT1 D43 PGLALA IgG变体对经RMF肽脉冲的T2细胞的结合。每幅子图代表单一氨基酸(E754,S561,S571,G712,G711,E353和I352)变体的组,与原始D43 PGLALA IgG比较。图的y轴中的值指示识别PGLALA的Jurkat NFAT报告CAR-T细胞中萤光素酶的相对发光检测。

图16描绘Jurkat NFAT报告CAR-T细胞中CAR-NFAT-信号传导的激活,用于评估与经RMF肽或VLD肽脉冲的T2细胞一起温育后所选择的WT1/HLA-A2结合物33F05,33H09,11D06和5E11的特异性。包括阴性对照,使用Jurkat NFAT报告CAR-T细胞及未脉冲的T2细胞,没有T2细胞或没有IgG。之后通过添加萤光素酶底物和测量发光来测量激活(来自Jurkat NFAT报告CAR-T细胞的萤光素酶信号)。

发明详述

定义

除非在下文另外定义,术语在本文中如本领域中一般使用的那样使用。

“激活Fc受体”是一种在抗体的Fc域衔接后,引发刺激携带该受体的细胞实施效应器功能的信号传导事件的Fc受体。人激活Fc受体包括FcγRIIIa(CD16a),FcγRI(CD64),FcγRIIa(CD32)和FcαRI(CD89)。

抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(“ADCC”)是一种导致通过免疫效应器细胞对抗体包被的靶细胞裂解的免疫机制。靶细胞是包含Fc区的抗体或其衍生物一般经由Fc区的N端的蛋白质部分特异性结合的细胞。如本文中使用的,术语“降低的ADCC”定义为通过上文定义的ADCC机制,以靶细胞周围介质中给定浓度的抗体,在给定的时间内裂解的靶细胞数目的降低,和/或通过ADCC机制,实现给定时间内给定数目的靶细胞裂解需要的靶细胞周围介质中抗体浓度的增加。ADCC的降低相对于使用相同的标准生产,纯化,配制和贮存方法(其是本领域技术人员已知的),由同一类型的宿主细胞生成但尚未突变的相同抗体介导的ADCC。例如,由在其Fc域中包含降低ADCC的氨基酸突变的抗体所介导的ADCC中的降低,是相对于由在Fc域中无此氨基酸突变的相同抗体介导的ADCC而言。测量ADCC的合适测定法是本领域中公知的(参见例如PCT公开文本no.WO 2006/082515或PCT公开文本no.WO 2012/130831)。

药剂(例如抗体)的“有效量”指引起接受其施用的细胞或组织中的生理学变化必需的量。

“亲和力”指分子(例如受体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如配体)之间非共价相互作用总和的强度。除非另外指示,如本文中使用的,“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗原结合模块和抗原和/或受体及其配体)之间1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以以解离常数(K_D)来表述,其为解离与结合速率常数(分别为K_解离和K_结合)的比率。如此,相等的亲和力可能包含不同的速率常数,只要速率常数的比率保持相同。亲和力可以通过本领域知道的确立方法来测量,包括本文中描述的那些方法。用于测量亲和力的一种优选方法是表面等离振子共振(SPR)且用于测量的优选温度是25℃。

术语“氨基酸”(“aa”)指天然发生的和合成的氨基酸,以及以与天然发生氨基酸相似的方式发挥功能的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然发生氨基酸是那些由遗传密码编码的,以及那些稍后修饰的氨基酸,例如羟脯氨酸,γ-羧基谷氨酸,和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物指具有与天然发生氨基酸相同的基础化学结构(即结合氢,羧基基团,氨基基团,和R基团的α-碳)的化合物,例如高丝氨酸,正亮氨酸,甲硫氨酸亚砜,甲硫氨酸甲基锍。此类类似物具有经过修饰的R基团(例如正亮氨酸)或经过修饰的肽主链,但是保留与天然发生氨基酸相同的基础化学结构。氨基酸模拟物指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构,但以与天然发生氨基酸相似的方式发挥功能的化学化合物。氨基酸在本文中可以通过由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的它们的公知的三字母符号或一字母符号来提及。

如本文中使用的,术语“氨基酸突变”意为涵盖氨基酸替代,缺失,***和修饰。可以进行取代,缺失,***和修饰的任意组合来实现最终构建体,只要最终构建体拥有期望的特性,例如降低的对Fc受体的结合。氨基酸序列缺失和***包括氨基和/或羧基端缺失和氨基酸***。具体的氨基酸突变是氨基酸替代。为了改变例如Fc区的结合特征,特别优选非保守性的氨基酸替代,即将一个氨基酸用具有不同结构和/或化学特性的另一种氨基酸替换。氨基酸替代包括由非天然存在的氨基酸或由20种标准氨基酸的天然存在的氨基酸衍生物(例如4-羟脯氨酸,3-甲基组氨酸,鸟氨酸,高丝氨酸,5-羟赖氨酸)替换。可以使用本领域中公知的遗传或化学方法生成氨基酸突变。遗传方法可以包括定点诱变,PCR,基因合成等。涵盖的是通过与遗传工程化不同的方法如化学修饰来改变氨基酸侧链基团的方法也可能可用。本文中可使用各种名称来指示同一氨基酸突变。例如,从Fc域第329位脯氨酸到甘氨酸的取代可指示为329G,G329,G₃₂₉,P329G或Pro329Gly。

术语“抗体”在本文中以最广义使用且涵盖各种抗体结构,包括但不限于单克隆抗体,多克隆抗体和抗体片段,只要它们展现出期望的抗原结合活性。因而,在本发明的语境中,术语抗体涉及完整免疫球蛋白分子以及此类免疫球蛋白分子的部分。而且,如本文中讨论的,该术语涉及经过修饰和/或改变的抗体分子,特别是突变型抗体分子。该术语还涉及重组或合成生成的/合成的抗体。在本发明的语境中,术语抗体与术语免疫球蛋白可互换使用。

“抗体片段”指完整抗体外的分子,其包含完整抗体中结合与完整抗体结合的抗原的一部分。抗体片段的例子包括但不限于Fv,Fab,Fab’,Fab’-SH,F(ab’)₂,双抗体,线性抗体,单链抗体分子(例如scFv),和单域抗体。对于某些抗体片段的综述,参见Hudson等,NatMed 9,129-134(2003)。对于scFv片段的综述,参见例如Plückthun,于The Pharmacologyof Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg和Moore编,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994)；亦参见WO 93/16185；和美国专利No.5,571,894和5,587,458。双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段,其可以是二价或双特异性的。参见例如EP 404,097；WO1993/01161；Hudson等,Nat Med 9,129-134(2003)；和Hollinger等,Proc Natl Acad SciUSA 90,6444-6448(1993)。三抗体和四抗体也记载于Hudson等,Nat Med 9,129-134(2003)。单域抗体是包含抗体的整个或部分重链可变域,或整个或部分轻链可变域的抗体片段(Domantis,Inc.,Waltham,MA；参见例如美国专利No.6,248,516 B1)。可以通过各种技术来制备抗体片段,包括但不限于对完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)产生,如本文中描述的。

如本文中使用的,术语“抗原结合分子”和缩写“ABM”在其最广义上指特异性结合抗原性决定簇的分子。ABM的例子是抗体/免疫球蛋白及其衍生物,例如其片段。而且,如本文中讨论的,该术语涉及经过修饰和/或改变的ABM,特别是突变型抗体分子。该术语还涉及重组或合成生成的/合成的抗体。在本发明的语境中,ABM优选是抗体或其片段。

如本文中使用的,术语“抗原结合模块”指特异性结合抗原性决定簇的多肽分子。在一个实施方案中,抗原结合模块能够将与其附接的实体(例如免疫球蛋白或CAR)引导至靶部位,例如至特定类型的肿瘤细胞或携有抗原性决定簇的肿瘤基质或至结合肿瘤细胞上的抗原性决定簇的免疫球蛋白。在另一个实施方案中,抗原结合模块能够经由其靶抗原来激活信号传导,例如在抗原性决定簇结合T细胞上的CAR后激活信号传导。在本发明的语境中,抗原结合模块可以包括在如本文中另外定义的抗体及其片段以及抗原结合受体(例如CAR)及其片段中。抗原结合模块包括抗原结合域,例如包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区。“候选抗原结合模块”或“CABM”是依照如本文中描述的方法评估的抗原结合模块。

在本发明的语境中,术语“抗原结合受体”涉及包含锚定跨膜域和包含至少一个抗原结合模块的胞外域的抗原结合分子。抗原结合受体(例如CAR)可以由来自不同来源的各多肽部分构成。因而,它还可以理解为“融合蛋白”和/或“嵌合蛋白”。通常,融合蛋白是经由连接最初编码分开的蛋白质的两个或更多个基因(或优选cDNA)创建的蛋白质。这种融合基因(或融合cDNA)的翻译产生单一多肽,优选具有自每种原始蛋白质衍生的功能特性。重组融合蛋白是为了在生物学研究或治疗中使用通过重组DNA技术人工创建的。在本发明的语境中,CAR(嵌合抗原受体)理解为如下抗原结合受体,其包含包含抗原结合模块的胞外部分,胞外部分通过间隔物序列融合锚定跨膜域,锚定跨膜域自身融合CD3z和CD28的胞内信号传导域。

“抗原结合位点”指抗原结合分子上提供与抗原相互作用的位点,即一个或多个氨基酸残基。例如,抗体或CAR的抗原结合位点包含来自互补性决定区(CDR)的氨基酸残基。天然的免疫球蛋白分子通常具有两个抗原结合位点,Fab或scFv分子通常具有单个抗原结合位点。

术语“抗原结合域”指包含特异性结合部分或整个抗原且与其互补的区域的抗体或抗原结合受体(例如CAR)部分。抗原结合域可由例如一个或多个免疫球蛋白可变域(也称为可变区)提供。具体地,抗原结合域包含免疫球蛋白轻链可变区(VL)和免疫球蛋白重链可变区(VH)。

术语“可变区”或“可变域”指免疫球蛋白重链或轻链中牵涉结合抗原的域。天然抗体的重链和轻链的可变域(分别为VH和VL)一般具有类似的结构,每个域包含4个保守的框架区(FR)和3个高变区(HVR)。参见例如Kindt等,Kuby Immunology,第6版,W.H.Freemanand Co.,第91页(2007)。单个VH或VL域通常足以赋予抗原结合特异性。

如本文中使用,术语“ATD”指“锚定跨膜域”,其定义能够在细胞的细胞膜中整合的多肽段。ATD可以融合别的胞外和/或胞内多肽域,其中这些胞外和/或胞内多肽域也会约束于细胞膜。在如本发明中使用的抗原结合受体的语境中,ATD对抗原结合受体,例如依照本发明使用的CAR赋予膜附着和约束。

如依照本发明使用的抗原结合受体(例如CAR)的语境中使用的,术语“结合”限定“抗原相互作用位点”和抗原彼此的结合(相互作用)。术语“抗原相互作用位点”限定多肽中显示与一种或一组特定抗原(即突变型Fc域)的特异性相互作用能力的基序。所述结合/相互作用还理解为限定“特异性识别”。依照此发明的术语“特异性识别”意味着抗原结合受体能够与如本文中限定的识别域,即修饰分子特异性相互作用和/或结合,而不识别该非修饰分子。抗原结合受体(例如CAR)的抗原结合模块能识别,相互作用和/或结合相同分子上的不同表位。此术语涉及抗原结合受体的特异性,即它在如本文中限定的修饰分子,即突变型Fc域的特定区域之间区分的能力。抗原相互作用位点与它的特定抗原的特异性相互作用可导致信号的启动,例如由于诱导包含抗原的多肽的构象的变化,包含抗原的多肽的寡聚化,抗原结合受体的寡聚化,等。如此,作为它们的一级,二级或三级结构的结果以及所述结构的二级修饰的结果,抗原相互作用位点和抗原的氨基酸序列中的特定基序彼此结合。因而,术语结合不仅涉及线性表位而且还可涉及由靶分子或其部分的两个区域组成的构象表位,结构表位或不连续表位。在此发明的语境中,构象表位通过在一级序列中分开的,当多肽折叠成天然蛋白质时在分子的表面上来到一起的两个或更多个离散氨基酸序列来定义(Sela,Science 166(1969),1365和Laver,Cell 61(1990),553-536)。而且,术语“结合”在本发明的语境中与术语“相互作用”可互换使用。CAR的抗原结合模块(例如Fab或scFv域)或抗体结合特定靶抗原性决定簇的能力可以经由酶联免疫吸附测定法(ELISA)或本领域技术人员熟悉的其它技术,例如表面等离振子共振(SPR)技术(在BIAcore仪器上分析)(Liljeblad et al.,Glyco J 17,323-329(2000))和传统的结合测定法(Heeley,EndocrRes 28,217-229(2002))测量。在一个实施方案中,抗原结合模块结合无关蛋白质的程度小于抗原结合模块对靶抗原的结合的约10％,如特别通过SPR测量的。在某些实施方案中,结合靶抗原的抗原结合模块具有≤1μM,≤100nM,≤10nM,≤1nM,≤0.1nM,≤0.01nM,或≤0.001nM(例如10^-8M或更小,例如10^-8M至10^-13M,例如10^-9M至10^-13M)的解离常数(K_D)。如依照本发明使用的,术语“特异性结合”意味着在本发明中使用的分子并不与相似结构的(多)肽,即非突变型亲本Fc域交叉反应或实质***叉反应。因而,依照本发明使用的抗原结合受体(例如该CAR)与识别域,例如Fc域,优选突变型Fc域特异性结合/相互作用。可测试一组处于调查中的构建物的交叉反应性,例如通过评估一组抗原结合模块在常规条件(见例如Harlow and Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,(1988)和Using Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press,(1999))下对感兴趣识别域,例如Fc域以及亲本非突变型Fc域的结合。只有那些结合感兴趣域但并不或本质上并不结合结构密切相关的域,例如非突变型亲本Fc域的构建物(即Fab片段,scFv等等)认为是对感兴趣识别域特异性的且选择用于依照本文中提供的方法的别的研究。这些方法可格外包含结合研究,与结构上和/或功能上密切相关的域的阻断和竞争研究。结合结合研究还包含FACS分析,表面等离振子共振(SPR,例如用

),分析性超速离心,等温滴定热量测定术,荧光各向异性,荧光光谱术或放射性标记的配体结合测定法。

如本文中采用的,术语“CDR”涉及“互补决定区”,其是本领域公知的。CDR是免疫球蛋白或抗原结合受体中决定所述分子的特异性且与特定配体接触的部分。CDR是分子中最可变的部分且对这些分子的抗原结合多样性有贡献。每个V域中有三个CDR区,CDR1,CDR2和CDR3。CDR-H描绘可变重链的CDR区,而CDR-L涉及可变轻链的CDR区。VH意味着可变重链而VL意味着可变轻链。Ig衍生区的CDR区可以如“Kabat”(Sequences of Proteins ofImmunological Interest”,5th edit.NIH Publication no.91-3242U.S.Department ofHealth and Human Services(1991)；Chothia J.Mol.Biol.196(1987),901-917)或“Chothia”(Nature 342(1989),877-883)中所述确定。

术语“CD3z”指T细胞表面糖蛋白CD3泽塔(ζ)链,还称作“T-细胞受体T3泽塔链”和“CD247”。

术语“嵌合抗原受体”或“嵌合受体”或“CAR”指如下构成的抗原结合受体:抗原结合模块(例如scFv或Fab)的胞外部分,通过间隔物序列融合至胞内信号传导域(例如CD3z的和CD28)。术语“CAR”以其最广义形式理解且包含如下构成的抗原结合受体:包含抗原结合模块的胞外部分,融合至CD3z和其片段和CD28和其片段,任选经由一个或数个肽接头。

抗体或免疫球蛋白的“类”指其重链拥有的恒定域或恒定区的类型。抗体有5种主要的类:IgA,IgD,IgE,IgG和IgM,并且这些中数种可以进一步分成亚类(同种型),例如IgG₁,IgG₂,IgG₃,IgG₄,IgA₁和IgA₂。对应于不同免疫球蛋白类的重链恒定域分别称为α,δ,ε,γ和μ。

“交换”Fab分子(亦称为“交叉Fab”或“交换Fab片段”)意指其中交换Fab重链和轻链的可变区或恒定区的Fab分子,即交叉Fab片段包含由轻链可变区和重链恒定区构成的肽链,和由重链可变区和轻链恒定区构成的肽链。为了清楚,在其中交换Fab轻链和Fab重链的可变区的交叉Fab片段中,包含重链恒定区的肽链在本文中称为交换Fab分子的重链。相反,在其中交换Fab轻链和Fab重链的恒定区的交叉Fab片段中,包含重链可变区的肽链在本文中称为交叉Fab片段的重链。因而,交叉Fab片段包含由重链可变和轻链恒定区构成的重或轻链(VH-CL),和由轻链可变和重链恒定区构成的重或轻链(VL-CH1)。与之相反,“Fab”或“常规Fab分子”意指处于它的天然型式的Fab分子,即包含由重链可变和恒定区构成的重链(VH-CH1),和由轻链可变和恒定区构成的轻链(VL-CL)。

如本文中使用的,术语“CSD”指共刺激性信号传导域。

术语“效应器功能”指那些可归于抗体Fc区且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应器功能的例子包括:C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC),Fc受体结合,抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC),抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP),细胞因子分泌,免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取,细胞表面受体(例如B细胞受体)下调和B细胞活化。

如本文中使用的,术语“工程化”或“改造”视为包括对肽主链的任何操作或对天然存在或重组的多肽或其片段的翻译后修饰。工程化或改造包括对氨基酸序列,糖基化模式或各氨基酸侧链基团的修饰,以及这些办法的组合。

术语“表达盒”指重组或合成生成的,具有一系列允许特定核酸在靶细胞中转录的指定核酸元件的多核苷酸。可以将重组表达盒掺入质粒,染色体,线粒体DNA,质体DNA,病毒或核酸片段中。通常,表达载体的重组表达盒部分包含要转录的核酸序列和启动子等序列。

“Fab分子”指由抗原结合分子的重链VH和CH1域(“Fab重链”)和轻链VL和CL域(“Fab轻链”)组成的蛋白质。

本文中术语“Fc域”或“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链中至少含有恒定区的一部分的C端区域。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。虽然IgG重链的Fc区的边界可以略微变化,但是人IgG重链Fc区通常定义为自Cys226或Pro230延伸至重链的羧基端。然而,可以存在或不存在Fc区的C端赖氨酸(Lys447)。除非本文中另外指定,Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号方式依照“EU编号***”,也称为EU索引,如记载于Kabat等,Sequences ofProteins of Immunological Interest,第5版Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,MD,1991的。如本文中使用的,Fc域的亚基指形成二聚体Fc域的两个多肽之一,即包含免疫球蛋白重链中能够稳定自身联合的C端恒定区的多肽。例如,IgG Fc域的亚基包含IgG CH2和IgG CH3恒定域。

“框架”或“FR”指除高变区(HVR)残基外的可变域残基。可变域的FR一般由4个FR域组成:FR1,FR2,FR3和FR4。因而,HVR和FR序列一般以下列顺序出现在VH(或VL)中:FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。

术语“全长抗体”表示由两条“全长抗体重链”和两条“全长抗体轻链”组成的抗体。“全长抗体重链”是以N端至C端方向由抗体重链可变域(VH),抗体恒定重链域1(CH1),抗体铰链区(HR),抗体重链恒定域2(CH2),和抗体重链恒定域3(CH3)(缩写为VH-CH1-HR-CH2-CH3)；和在亚类IgE的抗体的情况中任选的抗体重链恒定域4(CH4)组成的多肽。优选地,“全长抗体重链”是以N端至C端方向由VH,CH1,HR,CH2和CH3组成的多肽。“全长抗体轻链”是以N端至C端方向由抗体轻链可变域(VL)和抗体轻链恒定域(CL)(缩写为VL-CL)组成的多肽。抗体轻链恒定域(CL)可以是κ(卡帕)或λ(拉姆达)。两条全长抗体链经由CL域和CH1域之间的和全长抗体重链的铰链区之间的多肽间二硫键连接到一起。典型的全长抗体的例子是天然抗体,像IgG(例如IgG1和IgG2),IgM,IgA,IgD,和IgE)。依照本发明使用的全长抗体可来自单一物种,例如人,或者它们可以是嵌合化或人源化抗体。在一些实施方案中,依照本发明使用的全长抗体,即包含突变型Fc域的抗体包含两个抗原结合位点,每个由一对VH和VL形成,均特异性结合相同抗原。在又一些实施方案中,依照本发明使用的全长抗体包含两个抗原结合位点,每个由一对VH和VL形成,其中两个抗原结合位点结合不同抗原,例如其中抗体是双特异性的。所述全长抗体的重或轻链的C端表示所述重或轻链的C端处的最后一个氨基酸。

“融合”意指组分(例如Fab和跨膜域)直接地或经由一种或多种肽接头通过肽键连接。

术语“宿主细胞”,“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可交换使用并指已引入外源核酸的细胞,包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“经转化的细胞”,其包括初始转化的细胞和自其衍生的后代(不考虑传代数)。后代在核酸内含物上可能与亲本细胞不完全相同,但可以含有突变。本文中包括具有如原始转化细胞中筛选或选择的相同的功能或生物学活性的突变体后代。宿主细胞是能用于生成依照本发明使用的抗体的任何类型的细胞***。宿主细胞包括培养的细胞,例如哺乳动物培养细胞如CHO细胞,BHK细胞,NS0细胞,SP2/0细胞,YO骨髓瘤细胞,P3X63小鼠骨髓瘤细胞,PER细胞,PER.C6细胞或杂交瘤细胞,酵母细胞,昆虫细胞和植物细胞等,而且还包括在转基因动物,转基因植物或培养的植物或动物组织中包含的细胞。

如本文中使用的,术语“高变区”或“HVR”指抗体可变域中序列中高度可变和/或形成结构上定义的环(“高变环”)的每个区域。通常,天然的四链抗体包含六个HVR；三个在VH中(H1,H2,H3),三个在VL中(L1,L2,L3)。HVR一般包含来自高变环和/或来自互补性决定区(CDR)的氨基酸残基,后者具有最高序列变异性和/或涉及抗原识别。除了VH中CDR1外,CDR一般包含形成高变环的氨基酸残基。高变区(HVR)也称为互补性决定区(CDR),并且在述及形成抗原结合区的可变区部分时,这些术语在本文中可交换使用。此特定区域已由Kabat等,U.S.Dept.of Health and Human Services,Sequences of Proteins ofImmunological Interest(1983)及由Chothia等,J Mol Biol 196:901-917(1987)描述,其中定义包括在彼此比较时氨基酸残基的重叠或子集。然而,应用任一种定义来指抗体和/或抗原结合受体或其变体的CDR意图在如本文中定义和使用的术语的范围内。涵盖如由上文引用的每篇参考文献定义的CDR的适宜的氨基酸残基在下表1中列出作为比较。涵盖特定CDR的确切残基数将随着CDR的序列和大小而变化。鉴于抗体的可变区氨基酸序列,本领域技术人员可以常规确定哪些残基构成特定CDR。

表1:CDR定义¹

CDR	Kabat	Chothia	AbM<sup>2</sup>
				V<sub>H</sub> CDR1	31-35	26-32	26-35
V<sub>H</sub> CDR2	50-65	52-58	50-58
				V<sub>H</sub> CDR3	95-102	95-102	95-102
V<sub>L</sub> CDR1	24-34	26-32	24-34
				V<sub>L</sub> CDR2	50-56	50-52	50-56
V<sub>L</sub> CDR3	89-97	91-96	89-97

¹表1中所有CDR定义的编号方式依照由Kabat等提出的编号惯例(见下文)。

²如表1中使用的具有小写字母“b”的“AbM”指由Oxford Molecular的“AbM”抗体建模软件定义的CDR。

Kabat等还定义针对可变区序列的编号***,其可应用于任何抗体。本领域的普通技术人员可以明确地将此Kabat编号***归入任何可变区序列,不依赖于序列本身外的任何实验数据。如本文中使用的,“Kabat编号方式”指由Kabat等,U.S.Dept.of Health andHuman Services,“Sequence of Proteins of Immunological Interest”(1983)提出的编号***。除非另外说明,提及抗原结合模块可变区中特定氨基酸残基位置的编号方式依照Kabat编号***。序列表的多肽序列并不依照Kabat编号***编号。然而,本领域中普通技术人员完全能将序列表的序列编号方式转变成Kabat编号方式。

“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛,绵羊,猫,犬和马),灵长类(例如人和非人灵长类如猴),家兔和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。具体地,所述个体或受试者是人。

“分离的核酸”分子或多核苷酸意指已从其天然环境取出的核酸分子,DNA或RNA。例如,就本发明目的而言,包含在载体中的编码多肽的重组多核苷酸被视为分离的。分离的多核苷酸的别的例子包括在异源宿主细胞中保持的重组多核苷酸或溶液中的(部分或基本上)纯化的多核苷酸。分离的多核苷酸包括在普遍含有该多核苷酸分子的细胞中含有的多核苷酸分子,但该多核苷酸分子存在于染色体外或在不同于其天然染色***置的染色***置处。分离的RNA分子包括本发明的体内或体外RNA转录本,以及正链和负链形式,和双链形式。依照本发明的分离的多核苷酸或核酸还包括合成生成的此类分子。另外,多核苷酸或核酸可以为或可以包括调节元件如启动子,核糖体结合位点或转录终止子。

与本发明的参照核苷酸序列具有至少例如95％“相同的”核苷酸序列的核酸或多核苷酸意指该多核苷酸的核苷酸序列与参照序列相同,只不过按照参照核苷酸序列的每100个核苷酸,该多核苷酸序列可以包含多达5处点突变。换言之,为了获得与参照核苷酸序列具有至少95％相同的核苷酸序列的多核苷酸,可以删除或用另一种核苷酸取代参照序列中高达5％的核苷酸,或者可以将占参照序列中总核苷酸的高达5％的数目的核苷酸***到参照序列中。参照序列的这些变更可以发生在参照核苷酸序列的5’或3’端位置或那些末端位置之间的任何地方,个别分散在参照序列中的残基间或分散在参照序列内的一或多个连续组中。作为一个实际问题,可以使用已知的计算机程序,如下文针对多肽论述的程序(例如ALIGN-2)来常规确定任何特定的多核苷酸序列是否与本发明的核苷酸序列为至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98％或99％相同。

“分离的多肽”或其变体或衍生物意图为不处于其天然环境中的多肽。不需要特定水平的纯化。例如,分离的多肽可以是从其天然或自然环境中取出。就本发明目的而言,在宿主细胞中表达的重组生成的多肽和蛋白质被视为分离的,已通过任何合适的技术分开,分级,或部分或基本上纯化的天然的或重组的多肽也是如此。

关于参照多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为在比对序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后,且不将任何保守性取代视为序列同一性的一部分时,候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。为测定百分比氨基酸序列同一性目的比对可以以本领域技术范围内的多种方式进行,例如使用公众可得到的计算机软件,如BLAST,BLAST-2,ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可决定用于比对序列的适宜参数,包括在比较序列的全长里获得最大比对需要的任何算法。然而,就本文中目的而言,使用序列比较计算机程序ALIGN-2来生成％氨基酸序列同一性值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech,Inc.创作,并且源代码已与用户文档一起提交到美国版权局(U.S.Copyright Office),Washington D.C.,20559,其在美国版权注册No.TXU510087下注册。ALIGN-2程序可从Genentech,Inc.,South San Francisco,California公开获得,或可从源代码汇编。ALIGN-2程序应当汇编用于UNIX操作***,包括数字UNIX V4.0D。所有序列比较参数均由ALIGN-2程序设定且不改变。在采用ALIGN-2进行氨基酸序列比较的情况下,给定的氨基酸序列A对/与/相对给定的氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或其可以用短语表示为对/与/相对给定的氨基酸序列B具有或包含特定％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)如下计算:

分数X/Y的100倍

其中X是由序列比对程序ALIGN-2在所述程序对A和B的比对中评为相同匹配的氨基酸残基数,而其中Y是B中氨基酸残基的总数。会领会的是,当氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时,A对B的％氨基酸序列同一性将不等于B对A的％氨基酸序列同一性。除非另外明确说明,本文中使用的所有％氨基酸序列同一性值如在上一段中描述的那样使用ALIGN-2计算机程序获得。

术语“核酸分子”涉及多核苷酸包含的包含嘌呤和嘧啶碱基的碱基序列,由此所述碱基代表核酸分子的主要结构。在本文中,术语核酸分子包括DNA,cDNA,基因组DNA,RNA,合成形式的DNA和包含两种或更多种这些分子的混合聚合物。另外,术语核酸分子包括有义和反义链二者。而且,本文中描述的核酸分子可以含有非天然的或衍生化的核苷酸碱基,正如本领域技术人员会容易领会的。

如本文中使用的,“NFAT”指“激活的T细胞的核因子”且是在大多数免疫细胞中表达的一个转录因子家族。NFAT家族的转录因子的激活依赖于钙信号传导。例如,经由T细胞突触的T细胞激活导致钙流入。升高的细胞内钙水平激活钙敏感性磷酸酶,钙依赖磷酸酶,其迅速使NFAT蛋白的氨基端中的富丝氨酸区(SRR)和SP重复脱磷酸化。这导致暴露核定位信号的构象变化,促进NFAT核输入和靶基因激活。

如本文中使用的,“NFAT途径”指导致对NFAT转录因子家族的成员的活性的调控的刺激。NFAT DNA元件是本领域已知的且在本文中还称作“NFAT途径的应答元件”。因此,“NFAT途径的受体”指能触发对NFAT的活性的调控的受体。“NFAT途径的受体”的例子是例如T细胞受体和B细胞受体。

如本文中使用的,“NF-κB”指“激活的B细胞的核因子卡帕轻链增强子”且是牵涉调节编码凋亡,病毒复制,肿瘤发生,各种自身免疫性疾病和炎症应答的介导物的许多基因的转录因子。NFκB存在于几乎所有真核细胞中。一般地,它以无活性状态位于胞质溶胶中,因为它与抑制性κB(IκB)蛋白形成复合物。经由配体与整合膜受体(还称作“NF-κB途径的受体”)的结合,IκB激酶(IKK)得到激活。IKK是由两个激酶和一个调节亚基组成的酶复合物。这种复合物磷酸化IκB蛋白,其导致那些蛋白质遍在蛋白化和因此被蛋白酶体降解。最后,游离的NFκB处于活性状态,易位至核并结合κB DNA元件并诱导靶基因转录。

如本文中使用的,“NF-κB途径”指导致对NF-κB的活性的调控的刺激。例如,Toll样受体信号传导,TNF受体信号传导,T细胞受体和B细胞受体信号传导经由配体或抗体的结合的激活导致NF-κB的激活。随后,磷酸化的NF-κB二聚体结合κB DNA元件并诱导靶基因转录。κB DNA元件是本领域已知的且在本文中还称作“NF-κB途径的应答元件”。因此,“NF-κB途径的受体”指能触发对NF-κB的活性的调控的受体。“NF-κB途径的受体”的例子是Toll样受体,TNF受体,T细胞受体和B细胞受体。

如本文中使用的,“AP-1”指“激活蛋白1”且是牵涉包括分化,增殖,和凋亡在内的一些细胞过程的转录因子。AP-1功能依赖于对AP-1二聚体有贡献的特定Fos和Jun亚基。AP-1结合回文DNA基序(5’-TGA G/C TCA-3’)以调节基因表达。

术语“药物组合物”指其形式使得容许其中含有的活性成分的生物学活性有效,且不含对会接受配制剂施用的受试者有不可接受的毒性的别的成分的制剂。药物组合物通常包含一种或多种药学可接受载体。

“药学可接受载体”指药物组合物中活性成分以外对受试者无毒的成分。药学可接受载体包括但不限于缓冲剂,赋形剂,稳定剂或防腐剂。

如本文中使用的,术语“多肽”指由通过酰胺键(也称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)构成的分子。术语多肽指具有两个或更多个氨基酸的任何链,并且不指特定长度的产物。如此,肽,二肽,三肽,寡肽,蛋白质,氨基酸链或任何其它用于指具有两个或更多个氨基酸的链的术语均包括在多肽的定义中,而且术语多肽可以代替这些术语中任一个或与其交换使用。术语多肽还意图指多肽的表达后修饰的产物,包括但不限于糖基化,乙酰化,磷酸化,酰化,通过已知的保护性/封闭性基团衍生化,蛋白水解切割,或通过非天然存在的氨基酸的修饰。多肽可以自天然的生物学来源衍生或通过重组技术生成,但不必从指定的核酸序列翻译。它可以以任何方式来生成,包括通过化学合成。本发明的多肽大小可以是约3个或更多,5个或更多,10个或更多,20个或更多,25个或更多,50个或更多,75个或更多,100个或更多,200个或更多,500个或更多,1,000个或更多,或2,000个或更多氨基酸。多肽可以具有限定的三维结构,尽管它们不必具有此类结构。具有限定的三维结构的多肽被称为折叠的,而不具有限定的三维结构而可以采用大量不同构象的多肽被称为未折叠的。

术语“多核苷酸”指分离的核酸分子或构建体,例如信使RNA(mRNA),病毒衍生的RNA或质粒DNA(pDNA)。多核苷酸可以包含常规的磷酸二酯键或非常规的键(例如酰胺键,如在肽核酸(PNA)中发现的)。术语核酸分子指任何一种或多种存在于多核苷酸中的核酸区段,例如DNA或RNA片段。

术语“具有固有荧光的蛋白质”指能够经由蛋白质内的内部氨基酸的环化和氧化或经由酶促添加荧光辅因子而形成高度发荧光的,固有发色团的蛋白质。术语“具有固有荧光的蛋白质”包括野生型荧光蛋白和展现改变的光谱或物理特性的突变体。该术语不包括仅仅凭借蛋白质内的非修饰的酪氨酸,色氨酸,组氨酸和苯丙氨酸基团的荧光贡献而展现弱荧光的蛋白质。具有固有荧光的蛋白质是本领域已知的,例如绿色荧光蛋白(GFP),红色荧光蛋白(RFP),蓝色荧光蛋白(BFP,Heim et al.1994,1996),称作CFP的青色荧光变体(Heim et al.1996；Tsien 1998)；称作YFP的黄色荧光变体(Ormo et al.1996；Wachter etal.1998)；称作Sapphire的紫色可激发绿色荧光变体(Tsien 1998；Zapata-Hommer etal.2003)；和称作增强型绿色荧光蛋白或EGFP的青色可激发绿色荧光变体(Yang etal.1996),而且可以例如通过活细胞成像(例如Incucyte)或荧光分光光度法来测量。

“降低的结合”,例如降低的对Fc受体的结合,指相应相互作用的亲和力降低,如例如通过SPR测量的。为了清楚,该术语还包括亲和力降低至0(或低于分析方法的检测限),即完全消除相互作用。相反,“升高的结合”指相应相互作用的结合亲和力升高。

术语“调节序列”指实现与它们连接的编码序列表达所必需的DNA序列。此类控制序列的性质随生物体而不同。在原核生物中,控制序列一般包括启动子,核糖体结合位点,和终止子。在真核生物中,控制序列一般包括启动子,终止子和一些情况中的增强子,反式激活子(transactivator)或转录因子。术语“控制序列”意图最低限度包括其存在是表达所必需的所有成分,而且还可以包括另外的有利成分。

如本文中使用的,“报告基因”意味着其表达可以测定的基因。在一个优选的实施方案中,“报告基因”是编码使用其生成和检测作为替代品来间接检测要测试的抗体或配体的活性的蛋白质的基因。报告蛋白是由报告基因编码的蛋白质。优选地,报告基因编码其催化活性可以通过简单的测定方法来检测的酶或具有诸如固有荧光或发光等特性,使得报告基因的表达可以在需要最低限度的样品制备的简单且快速的测定法中检测的蛋白质。其催化活性可以检测的酶的非限制性例子是萤光素酶,β-半乳糖苷酶,碱性磷酸酶。萤光素酶是具有61kDa的分子量(MW)的单体酶。它起催化剂的作用且能够在三磷酸腺苷(ATP)和Mg²⁺存在下将D-萤光素转变成萤光素腺苷酸。另外,作为副产物生成焦磷酸(PPi)和腺苷单磷酸(AMP)。然后将中间体萤光素腺苷酸氧化成氧化萤光素,二氧化碳(CO₂)和光。氧化萤光素是生物发光产物,能通过自反应释放的光在发光计中定量测量。萤光素酶报告测定法可商购且是本领域已知的,例如萤光素酶1000测定***和ONE-Glo^TM萤光素酶测定***。

“应答元件”指在某种转录因子结合时激活或沉默的特定转录因子结合元件,或顺式作用元件。在一个实施方案中,应答元件是位于在转录因子结合时驱动报告基因表达的最小限度启动子(例如TATA盒启动子)上游的顺式作用增强子元件。

如本文中使用的,术语“单链”指包含通过肽键线性连接的氨基酸单体的分子。在某些实施方案中,抗原结合模块之一是scFv片段,即通过肽接头连接的VH域和VL域。在某些实施方案中,抗原结合模块之一是单链Fab分子,即其中通过肽接头连接Fab轻链和Fab重链以形成单一肽链的Fab分子。在一个具体的此类实施方案中,在单链Fab分子中Fab轻链的C端连接于Fab重链的N端。

如本文中使用的,术语“SSD”指刺激性信号传导域。

如本文中使用的,“治疗/处理”(及其语法变体)指试图改变治疗个体中疾病的自然进程,并且可以是为了预防或在临床病理学的过程期间实施的临床干预。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发,缓解症状,降低疾病的任何直接或间接病理学后果,预防转移,减缓疾病进展率,改善或减轻疾病状态,及消退或改善的预后。

如本文中使用的,术语“靶抗原性决定簇”与“靶抗原”,“靶表位”和“靶细胞抗原”同义,并且指多肽大分子上与抗体结合,从而形成抗原结合模块-抗原复合物的位点(例如氨基酸的连续区段或由不连续氨基酸的不同区构成的构象性构造)。可用的抗原性决定簇可以在例如肿瘤细胞表面上,病毒感染的细胞的表面上,其它患病细胞的表面上,免疫细胞的表面上,游离在血液血清中和/或在胞外基质(ECM)中找到。除非另外指示,本文中称为抗原的蛋白质(例如CD20,CEA,FAP,TNC)可以是来自任何脊椎动物来源,包括哺乳动物如灵长类(例如人)和啮齿类(例如小鼠和大鼠)的任何天然形式的蛋白质。在一个具体的实施方案中,靶抗原是人蛋白。在对本文中的特定靶蛋白质进行提述的情况下,该术语涵盖“全长”,未加工的靶蛋白质以及起因于靶细胞中加工的靶蛋白质的任何形式。该术语还涵盖靶蛋白质的天然存在变体,例如剪接变体或等位变体。可用作抗原的例示性人靶蛋白包括但不限于:CD20,CEA,FAP,TNC,MSLN,FolR1,HER1和HER2。

包含突变型Fc域的抗体可以具有一个,两个,三个或更多个结合域且可以是单特异性的,双特异性的或多特异性的。抗体可以是来自单一物种的全长,或是嵌合化的或人源化的。对于具有多于两个抗原结合域的抗体,一些结合域可以是相同的和/或具有相同的特异性。

如本文中使用的,“T细胞活化”指T淋巴细胞,特别是细胞毒性T淋巴细胞的一种或多种细胞应答,其选自:增殖,分化,细胞因子分泌,细胞毒性效应分子释放,细胞毒性活性和活化标志物的表达。合适的测量T细胞活化的测定法是本文中所述技术领域中已知的。

依照本发明,术语“T细胞受体”或“TCR”是本领域普遍知道的。特别是,本文中术语“T细胞受体”指任何T细胞受体,前提是满足下面的三项标准:(i)肿瘤特异性,(ii)识别(大多数)肿瘤细胞,这意味着抗原或靶物应当在(大多数)肿瘤细胞中表达,和(iii)TCR与要治疗的受试者的HLA型匹配。在此语境中,满足上文所述三项标准的合适的T细胞受体是本领域已知的,诸如识别NY-ESO-1(序列信息见例如PCT/GB2005/001924)和/或HER2neu(序列信息见WO-A1 2011/0280894)的受体。主要组织相容性复合物(MHC)I类分子将来自内源抗原的肽呈递至CD8+细胞毒性T细胞,而且因此,MHC肽复合物是免疫治疗办法的合适靶物。可以通过重组T细胞受体(TCR)靶向MHC肽复合物。然而,大多数TCR可能具有对于免疫疗法而言太低的亲和力,而具有TCR特异性的高亲和力结合模块会是有益的。为此目的,可以例如通过生成噬菌体展示文库(例如组合文库)和筛选此类文库来生成具有TCR样特异性的高亲和力可溶性抗体分子,如本文中进一步描述的。具有TCR样特异性的这些可溶性抗原结合模块(例如scFv或Fab)在本文中称作“T细胞受体样抗原结合模块”或“TCRL抗原结合模块”。

药剂例如药物组合物的“治疗有效量”指有效实现期望的治疗或预防结果的量(以必要的剂量且持续必要的时间)。治疗有效量的药剂例如消除,降低,延迟,最小化或预防疾病的不良作用。

术语“载体”或“表达载体”与“表达构建体”同义,并指用于在靶细胞中导入与其可操作联合的特定基因及其指导表达的DNA分子。该术语包括作为自主复制核酸结构的载体以及掺入到已经接受其导入的宿主细胞的基因组中的载体。本发明的表达载体包含表达盒。表达载体允许转录大量稳定的mRNA。一旦表达载体在靶细胞内,就通过细胞转录和/或翻译装置生成基因编码的核糖核酸分子或蛋白质。在一个实施方案中,本发明的表达载体包含表达盒,其包含编码本发明的抗原结合受体或其片段的多核苷酸序列。

在此语境中,本文中提供的是用于选择新颖抗原结合模块的方法,特别是体外方法,用于进一步的开发,其依照它们的特异性,特别是关于接触靶细胞后报告细胞(例如T细胞)的激活。在本文中描述的方法和测定法中,抗原结合模块介导靶细胞(特别是癌细胞)和报告细胞(特别是T细胞)之间的接触。在此语境中,如本文中描述的方法对于选择具有卓越特异性的候选抗原结合模块(CABM)是有用的。因而,在一个实施方案中,提供的是用于评估抗原结合模块的特异性的方法,其包含下述步骤:

i)能够特异性结合该识别域的CAR,其中该抗原结合模块与应答元件可操作偶联；

ii)在该应答元件控制下的报告基因；和

在此语境中,关于如本文中描述的方法进一步描述和使用的是能够特异性结合包含候选抗原结合模块的ABM的识别域的抗原结合受体(例如CAR)。该识别域可以是能够稳定折叠成能受到抗原结合模块识别的蛋白域的任何多肽域。在某些实施方案中,该识别域是免疫球蛋白域。免疫球蛋白典型地包含能够稳定折叠的可变和恒定域,其中该可变域赋予该免疫球蛋白分子针对靶抗原的特异性。因而,该可变域是免疫球蛋白中具有最高程度的序列变异性的部分。另一方面,该恒定域是相同类的免疫球蛋白中最小变异的部分,因此可以在本发明的背景中作为本发明的测定法型式的识别域使用。

本发明进一步描述用如本文中描述的CAR转导T细胞,诸如CD8+T细胞,CD4+T细胞,CD3+T细胞,γδT细胞或天然杀伤(NK)T细胞和永生化细胞系,例如Jurkat细胞,和抗原结合分子,例如包含识别域,优选Fc域,例如如本文中描述的突变型Fc域的候选治疗性抗体对它们的靶向募集的用途。在一个实施方案中,该抗体能够特异性结合在肿瘤细胞的表面上天然发生的肿瘤特异性抗原。

本发明的办法具有胜过常规结合测定法的显著优点,因为不受理论束缚,如本文中描述的基于T细胞的体外方法更加密切地类似例如啮合T细胞的治疗性抗体(例如T细胞双特异性抗体)遭遇的体内情况。

因而,本发明提供一种通用筛选平台,其中可以使用包含抗原结合模块的抗体,特别是IgG型抗体来标记或标示靶细胞(例如肿瘤细胞)作为免疫细胞(例如T细胞)的指导,特别是其中通过包含抗原结合模块的抗体将T细胞特异性靶向肿瘤细胞。在CAR结合识别域和包含抗原结合模块的抗原结合模块结合肿瘤细胞的表面上的靶抗原之后,报告T细胞变成激活的,其中可以例如通过荧光或发光信号的读出来测量激活。通过容许使用多种多样新开发的抗原结合模块或共应用具有不同抗原特异性但包含相同识别域的多种抗体,该平台具有灵活性和特异性。

依照本发明,ABM包含抗原结合域和识别域。识别域可以受到能够特异性结合识别域的抗原结合模块特异性识别。在一个优选的实施方案中,识别域是可结晶片段(Fc)区。在具体的实施方案中,识别域是IgG1或IgG4 Fc域。在一个实施方案中,识别域是人IgG1 Fc域。在又一个实施方案中,识别域是突变型Fc域,例如包含选自由依照EU编号方式的L234,L235,I253,H310,P331,P329和H435组成的组的位置处的突变。在此类实施方案中,如本文中提供的抗原结合模块能够特异性结合突变型Fc域但不能够特异性结合亲本非突变型Fc域,由此区分突变型和非突变型Fc域。

在本发明的语境中,CAR包含并不在T细胞中或上天然发生的胞外域。如此,CAR能够提供特制的对识别域,例如用于依照本发明的筛选的治疗性抗体型式的Fc域的结合特异性。用CAR转导且依照本发明使用的细胞(例如T细胞)变成能够特异性结合识别域。通过CAR的胞外域的抗原结合模块提供对识别域的特异性。

因而,本发明还涉及包含包含至少一个能够特异性结合突变型Fc域的抗原结合模块的胞外域的CAR的用途,其中该至少一个抗原结合模块并不能够特异性结合亲本非突变型Fc域。在此类实施方案中,CAR能够特异性结合抗原结合分子,例如抗体的突变型Fc域。在一个优选的实施方案中,突变型Fc域与非突变型亲本Fc域相比包含至少一处氨基酸替代。在一些实施方案中,突变型Fc域的Fc受体结合与非突变型Fc域的Fc受体结合相比降低。

因而,CAR能够特异性结合突变型Fc域但不能够特异性结合非突变型亲本Fc域,其中突变型Fc域与非突变型亲本Fc域相比包含至少一处氨基酸替代。

可以通过例如哺乳动物免疫***的免疫接种来生成能够特异性结合识别域,例如突变型Fc域的抗原结合模块。此类方法是本领域已知的且例如描述于Burns,Methods inMolecular Biology 295:1-12(2005)。或者,可以通过对组合文库筛选具有一种或多种期望活性的抗体来分离有期望活性的抗原结合模块。用于筛选组合文库的方法综述于例如Lerner et al.,Nature Reviews 16:498-508(2016)。例如,多种方法是本领域已知的,用于生成噬菌体展示文库和对此类文库筛选拥有期望结合特征的抗原结合模块。此类方法综述于例如Frenzel et al.,mAbs 8:1177-1194(2016)；Bazan et al.,Human Vaccines andImmunotherapeutics 8:1817-1828(2012)和Zhao et al.,Critical Reviews inBiotechnology 36:276-289(2016)以及Hoogenboom et al.,Methods in MolecularBiology 178:1-37(O’Brien et al.,ed.,Human Press,Totowa,NJ,2001)且进一步描述于例如McCafferty et al.,Nature 348:552-554；Clackson et al.,Nature 352:624-628(1991)；Marks et al.,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)和Marks and Bradbury inMethods in Molecular Biology 248:161-175(Lo,ed.,Human Press,Totowa,NJ,2003)；Sidhu et al.,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee et al.,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；和Lee et al.,J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004)。在某些噬菌体展示方法中,通过聚合酶链式反应(PCR)分开克隆VH和VL基因的全集并在噬菌体文库中随机重组,然后能对其筛选抗原结合噬菌体,如描述于Winter et al.,Annual Review of Immunology 12:433-455(1994)。噬菌体典型地或是作为单链Fv(scFv)片段或是作为Fab片段展示抗体片段。来自经免疫来源的文库提供针对免疫原的高亲和力抗原结合模块,不需要构建杂交瘤。或者,可以(例如自人)克隆未免疫全集以提供针对广泛非自身,还有自身抗原的抗原结合模块的单一来源,无需任何免疫接种,如描述于Griffiths et al.,EMBO Journal 12:725-734(1993)。最后,还可以通过克隆来自干细胞的未重排V基因区段,和使用含有随机序列以编码高度可变CDR3区和实现体外重排的PCR引物来合成生成未免疫文库,如描述于Hoogenboom and Winter,Journal of Molecular Biology 227:381-388(1992)。描述人抗体噬菌体文库的专利公开文本包括例如美国专利No.5,750,373；7,985,840；7,785,903和8,679,490以及美国专利公开文本No.2005/0079574,2007/0117126,2007/0237764和2007/0292936,和2009/0002360。本领域已知的用于对组合文库筛选具有一种或多种期望活性的抗原结合模块的方法的别的例子包括核糖体和mRNA展示,以及用于细菌,哺乳动物细胞,昆虫细胞或酵母细胞上的抗体展示和选择的方法。用于酵母表面展示的方法综述于例如Scholler et al.,Methods in Molecular Biology 503:135-56(2012)和Cherf et al.,Methods in Molecular biology 1319:155-175(2015)以及Zhao et al.,Methods inMolecular Biology 889:73-84(2012)。用于核糖体展示的方法描述于例如He et al.,Nucleic Acids Research 25:5132-5134(1997)和Hanes et al.,PNAS 94:4937-4942(1997)。

在本发明的一个方面,本文中提供的是包含至少一个能够特异性结合突变型Fc域的抗原结合模块的CAR的用途。表达此类CAR的转导细胞,例如T细胞能够特异性结合抗原结合分子,即治疗性抗体的突变型Fc域。Fc域赋予抗原结合分子,例如治疗性抗体以有利的药动学特性,包括长血清半衰期,其归于较好的靶组织中的积累和有利的组织-血液分布比。然而,同时,它可能导致不想要的治疗性抗体对表达Fc受体的细胞而非优选的携带抗原的细胞的靶向。而且,Fc受体信号传导途径的共激活可导致细胞因子释放,其导致***性施用治疗性抗体后过度的细胞因子受体的激活和严重的副作用。由于对免疫细胞的潜在破坏,除了T细胞以外的(携带Fc受体的)免疫细胞的激活甚至可能降低治疗性抗体的功效。因而,可以改造或突变本领域已知的抗体型式以展现与例如天然IgG1 Fc域相比降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应器功能。本发明格外提供一种直截了当的筛选平台来评估治疗上有意义的抗原结合分子型式的新颖抗原结合模块的特异性。依照本发明的方法在一种高通量测定法型式中整合已知的或潜在的效应细胞的激活级联的有关细胞和分子成分。

在本发明的一个例示性实施方案中,作为概念证明,提供的是能够特异性结合包含氨基酸突变P329G的突变型Fc域的CAR和表达所述CAR的报告细胞(Jurkat NFAT报告CAR-T细胞)的用途。P329G突变降低对Fcγ受体的结合和相关效应器功能。因而,包含P329G突变的突变型Fc域以与非突变型Fc域相比降低的或消除的亲和力结合Fcγ受体。

然而,本领域广泛使用具有降低的具有改善的或消除的对Fc受体(FcR)的结合和/或效应器功能的包含突变型Fc域的抗体。因而,本文中描述的是能够特异性结合包含突变型Fc域的抗体的CAR,此类抗体在本文中还称作靶抗体。因而,在一个实施方案中,本发明中使用的CAR能够特异性结合包含具有降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应器功能的突变型Fc域的靶抗体。具有降低的效应器功能的靶抗体包括那些具有Fc区残基238,265,269,270,297,327和329(美国专利No.6,737,056)中的一个或多个的突变的。此类Fc突变体包括具有氨基酸位置265,269,270,297和327中的两个或更多个处的突变的Fc突变体,包括具有残基265和297变成丙氨酸的突变的所谓的“DANA”Fc突变体(美国专利No.7,332,581)。在某些实施方案中,提供能够特异性结合包含具有改善ADCC的一处或多处氨基酸突变,例如Fc区的位置298,333,和/或334(EU残基编号方式)处的突变的Fc区的抗体变体的CAR。在某些实施方案中,靶抗体变体包含具有降低或消除FcRn结合的一处或多处氨基酸突变,例如Fc区的位置253,和/或310,和/或435(EU残基编号方式)处的突变的Fc区。在某些实施方案中,靶抗体变体包含具有位置253,310和435处的氨基酸突变的Fc区。在一个实施方案中,突变是自人IgG1 Fc区衍生的Fc区中的I253A,H310A和H435A。见例如Grevys,A.etal.,J.Immunol.194(2015)5497-5508。

在某些实施方案中,使用能够特异性结合包含具有降低或消除FcRn结合的一处或多处氨基酸突变,例如Fc区的位置310和/或,433和/或436(EU残基编号方式)之一处的突变的Fc区的抗体变体的CAR。在某些实施方案中,靶抗体变体包含具有位置310,433和436处的氨基酸突变的Fc区。在一个实施方案中,突变是自人IgG1 Fc区衍生的Fc区中的H310A,H433A和Y436A。在某些实施方案中,靶抗体变体包含具有提高FcRn结合的一处或多处氨基酸突变,例如Fc区的位置252和/或,254和/或256(EU残基编号方式)处的突变的Fc区。在某些实施方案中,靶抗体变体包含具有位置252,254,和256处的氨基酸突变的Fc区。在一个实施方案中,突变是自人IgG1 Fc区衍生的Fc区中的M252Y,S254T和T256E。在某些实施方案中,使用能够特异性结合包含具有消除FcγR结合的氨基酸突变,例如Fc区的位置234,235和329(EU残基编号方式)处的突变的Fc区的抗体变体的CAR。在一个实施方案中,突变是L234A和L235A(LALA)。在某些实施方案中,靶抗体变体进一步包含自人IgG1 Fc区衍生的Fc区中的D265A和/或P329G。在一个实施方案中,突变是自人IgG1 Fc区衍生的Fc区中的P329G(“PG”)。在另一个实施方案中,突变是自人IgG1 Fc区衍生的Fc区中的I253A,H310A和H435A(“AAA”)。

在一个实施方案中,CAR能够特异性结合由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的突变型Fc域。在一个实施方案中,Fc域是IgG,具体是IgG1或IgG4,Fc域。在一个实施方案中,Fc域是人Fc域。在一个实施方案中,突变型Fc域展现与天然IgG1 Fc域相比降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应器功能。在一个实施方案中,Fc域包含降低对Fc受体的结合和/或效应器功能的一处或多处氨基酸突变。

在一个优选的实施方案中,一处或多处氨基酸突变在选自L234,L235,和P329(Kabat编号方式)的组的一个或多个位置处。在一个特定的实施方案中,Fc域的每个亚基包含降低对激活性Fc受体的结合和/或效应器功能的三处氨基酸突变,其中所述氨基酸突变是L234A,L235A和P329G。在一个特定的实施方案中,Fc受体是Fcγ受体。在一个实施方案中,效应器功能是抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。

在特定的实施方案中,CAR包含胞外域,其包含至少一个能够特异性结合突变型Fc域的抗原结合模块,其中该至少一个抗原结合模块不能够特异性结合亲本非突变型Fc域,其中突变型Fc域与非突变型亲本Fc域相比包含至少一处选自由L234,L235,I253,H310,P331,P329和H435组成的组的氨基酸替代,特别是其中氨基酸突变是L234A,L235A,I253A,N297A,H310A,P329G和/或H435A。在一个实施方案中,突变型Fc域的Fc受体结合与非突变型Fc域的Fc受体结合相比降低。在一个优选的实施方案中,氨基酸突变是P329G,其中对Fcγ受体的结合降低,如于25℃通过SPR测量的。在又一个实施方案中,氨基酸突变是I253A,H310A和H435A,其中对新生儿Fc受体(FcRn)的结合降低,如于25℃通过SPR测量的。

在一个特定的实施方案中,突变型Fc域包含P329G突变。包含P329G突变的突变型Fc域以与非突变型Fc域相比降低的或消除的亲和力结合Fcγ受体。

在一个实施方案中,能够特异性结合包含P329G突变的Fc域的CAR包含至少一个包含与选自由SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3组成的组的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的重链互补决定区(CDR)和至少一个选自SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的组的轻链CDR。

在一个实施方案中,能够特异性结合包含P329G突变的Fc域的CAR包含SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的重链互补决定区(CDR)和SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5和SEQID NO:6的轻链CDR。

在一个优选的实施方案中,能够特异性结合包含P329G突变的Fc域的CAR包含重链可变区,其包含:

(a)重链互补决定区(CDR H)1氨基酸序列RYWMN(SEQ ID NO:1)；

(b)CDR H2氨基酸序列EITPDSSTINYTPSLKD(SEQ ID NO:2)；

(c)CDR H3氨基酸序列PYDYGAWFAS(SEQ ID NO:3)；

和轻链可变区,其包含:

(d)轻链(CDR L)1氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:4)；

(e)CDR L2氨基酸序列GTNKRAP(SEQ ID NO:5)；和

(f)CDR L3氨基酸序列ALWYSNHWV(SEQ ID NO:6)。

在一个实施方案中能够特异性结合包含P329G突变的Fc域的CAR包含包含与选自SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:32的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的重链可变区(VH)和包含与选自SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:33的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。

在一个实施方案中,能够特异性结合包含P329G突变的Fc域的CAR包含包含选自SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:32的氨基酸序列的重链可变区(VH),和包含选自SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:33的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。

在一个实施方案中,能够特异性结合包含P329G突变的Fc域的CAR包含包含SEQ IDNO:32的氨基酸序列的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。

在一个优选的实施方案中,能够特异性结合包含P329G突变的Fc域的CAR包含包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。

在一个实施方案中,至少一个抗原结合模块是scFv,Fab,交叉Fab或scFab片段。在一个实施方案中,能够特异性结合包含P329G突变的Fc域的CAR包含Fab片段。在一个优选的实施方案中,能够特异性结合包含P329G突变的Fc域的CAR包含包含SEQ ID NO:40的重链和SEQ ID NO:41的轻链的Fab片段。

在一个实施方案中,能够特异性结合包含P329G突变的Fc域的CAR包含scFv片段,其是由重链可变域(VH),轻链可变域(VL)和接头组成的多肽,其中所述可变域和所述接头以N端至C端方向具有下面的构造之一:a)VH-接头-VL或b)VL-接头-VH。在一个优选的实施方案中,scFv片段具有构造VH-接头-VL。

在一个优选的实施方案中,能够特异性结合包含P329G突变的Fc域的CAR包含包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的scFv片段。

在备选的特定的实施方案中,突变型Fc域包含I253A,H310A和H435A(“AAA”)突变。AAA突变降低对新生儿Fc受体(FcRn)的结合。因而,包含AAA突变的突变型Fc域以与非突变型Fc域相比降低的或消除的亲和力结合FcRn。

在一个实施方案中,能够特异性结合包含I253A,H310A和H435A突变的Fc域的CAR包含至少一个包含与选自由SEQ ID NO:53,SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:55组成的组的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的重链互补决定区(CDR)和至少一个选自SEQ ID NO:56,SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:58的组的轻链CDR。

在一个实施方案中,能够特异性结合包含P329G突变的Fc域的CAR包含SEQ ID NO:53,SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:55的重链互补决定区(CDR)和该SEQ ID NO:56,SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:58的轻链CDR。

在一个优选的实施方案中,能够特异性结合包含I253A,H310A和H435A突变的Fc域的CAR包含重链可变区,其包含:

(a)重链互补决定区(CDR H)1氨基酸序列SYGMS(SEQ ID NO:53)；

(b)CDR H2氨基酸序列SSGGSY(SEQ ID NO:54)；

(c)CDR H3氨基酸序列LGMITTGYAMDY(SEQ ID NO:55)；

和轻链可变区,其包含:

(d)轻链(CDR L)1氨基酸序列RSSQTIVHSTGHTYLE(SEQ ID NO:56)；

(e)CDR L2氨基酸序列KVSNRFS(SEQ ID NO:57)；和

(f)CDR L3氨基酸序列FQGSHVPYT(SEQ ID NO:58)。

在一个实施方案中,能够特异性结合包含I253A,H310A和H435A突变的Fc域的CAR包含包含与SEQ ID NO:61的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的重链可变区(VH)和包含与SEQ ID NO:62的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。

在一个实施方案中,能够特异性结合包含I253A,H310A和H435A突变的Fc域的CAR包含包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的重链可变区(VH),和包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。

在一个实施方案中,至少一个抗原结合模块是scFv,Fab,交叉Fab或scFab片段。在一个实施方案中,能够特异性结合包含I253A,H310A和H435A突变的Fc域的CAR包含Fab片段。在一个特定的实施方案中,抗原结合受体的胞外域包含能够特异性结合包含I253A,H310A和H435A突变的Fc域的抗原结合模块,其中Fab片段包含SEQ ID NO:64的重链和SEQID NO:65的轻链。

在一个实施方案中,能够特异性结合包含I253A,H310A和H435A突变的Fc域的CAR包含scFv片段。在一个特定的实施方案中,能够特异性结合包含I253A,H310A和H435A突变的Fc域的CAR包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列。

在依照本发明的又一个实施方案中,胞外域中包含的抗原结合模块是单链Fab片段或scFab。

经由CL域和CH1域之间的天然二硫键稳定Fab和scFab片段。可以通过引入VH和VL域之间的链间二硫桥来进一步稳定包含重链可变域(VH)和轻链可变域(VL)的抗原结合模块,诸如如本文中描述的Fab,交叉Fab,scFv和scFab片段。因而,在一个实施方案中,可以经由***半胱氨酸残基(例如依照Kabat编号方式可变重链中的位置44和可变轻链中的位置100)通过生成链间二硫键来进一步稳定依照本发明的抗原结合受体中包含的Fab片段,交叉Fab片段,scFv片段和/或scFab片段。在所附实施例和图内通过术语“ds”来提及此类稳定化抗原结合模块。

在本发明的一个例示性实施方案中,作为概念证明,提供包含包含至少一个抗原结合模块的胞外域的CAR,其中至少一个抗原结合模块能够特异性结合突变型Fc域但不能够特异性结合非突变型亲本Fc域,其中突变型Fc域与非突变型亲本Fc相比包含至少一处氨基酸替代。在某些实施方案中,抗原结合模块中至少一个是常规Fab片段,即由Fab轻链和Fab重链组成的Fab分子。这种抗原结合受体型式的一项特定优点是直截了当整合文库衍生抗原结合模块,无需改变型式,例如,可以以如本文中描述的Fab和/或交叉Fab型式包括自筛选噬菌体展示文库衍生的Fab抗原结合物。因而,可以在本发明的抗原结合受体中包括自Fab展示噬菌体文库衍生抗原结合模块,无需将型式改变成例如可能负面影响文库衍生结合物的结合特性的scFv型式。在一个优选的实施方案中,抗原结合模块是Fab片段,特别是自噬菌体展示文库筛选衍生的Fab片段。

在又一个实施方案中,抗原结合模块中至少一个是交叉Fab片段,即由Fab轻链和Fab重链组成的Fab分子,其中Fab重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的。

在又一个实施方案中,抗原结合模块中至少一个是scFv片段。在一个中特定的此类实施方案,在scFv分子中可变重链(VH)的C端连接至可变轻链(VL)的N端,任选经由肽接头。

在某些实施方案中,如本文中使用的CAR包含包含能够特异性结合识别域的抗原结合模块的胞外域,锚定跨膜域和至少一个细胞内信号传导和/或至少一个共刺激性信号传导域。CAR的锚定跨膜域可以特征在于并不具有哺乳动物蛋白酶的切割位点。蛋白酶指能够水解包含蛋白酶的切割位点的跨膜域的氨基酸序列的蛋白水解酶。术语蛋白酶包括内肽酶和外肽酶二者。在本发明的语境中,可以使用如通过CD命名法等等规定的跨膜蛋白的任何锚定跨膜域来生成依照本发明合适的CAR,其在结合如本文中定义的识别域,例如突变型Fc域后激活T细胞,。

因而,在本发明的语境中,锚定跨膜域可以包含鼠/小鼠或优选人跨膜域的一部分。此类锚定跨膜域的一个例子是CD28的跨膜域,例如具有如本文中在SEQ ID NO:11中显示的氨基酸序列(如由在SEQ ID NO:24中显示的DNA序列编码的)。在本发明的语境中,CAR的跨膜域可以包含如SEQ ID NO:11中显示的氨基酸序列(如由SEQ ID NO:24中显示的DNA序列编码的)/由其组成。

在本发明的一个例示性实施方案中,作为概念证明,使用包含包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列(如由SEQ ID NO:22中显示的DNA序列编码的)的抗原结合模块,和如本文中作为SEQ ID NO:71(如由SEQ ID NO:70中显示的DNA序列编码的)显示的CD28的片段/多肽部分(人CD28的Uniprot条目号是P10747(该序列的版本号173和版本1))的CAR。或者,可以使用具有如通过CD命名法等等提供的跨膜域的任何蛋白作为本发明的抗原结合受体蛋白的锚定跨膜域。如上文描述的,本文中描述的抗原结合受体可以包含CD28的锚定跨膜域,其位于如SEQ ID NO:71中显示的人全长CD28蛋白(如由SEQ ID NO:70中显示的cDNA编码的)的氨基酸153至179,154至179,155至179,156至179,157至179,158至179,159至179,160至179,161至179,162至179,163至179,164至179,165至179,166至179,167至179,168至179,169至179,170至179,171至179,172至179,173至179,174至179,175至179,176至179,177至179或178至179。因而,在本发明的语境中,锚定跨膜域可以包含如SEQ ID NO:11中显示的氨基酸序列(如由SEQ ID NO:24中显示的DNA序列编码的)或由其组成。

如本文中描述的,依照本发明使用的CAR包含至少一个刺激性信号传导和/或共刺激性信号传导域。刺激性信号传导和/或共刺激性信号传导域将包含抗原结合模块的抗原结合分子的结合转导至报告CAR-T细胞中的细胞内信号。因而,本文中描述的CAR优选包含刺激性信号传导域,其提供T细胞激活。在一个优选的实施方案中,抗原结合模块对靶抗原的结合和报告CAR-T细胞对包含抗原结合模块的抗原结合分子的结合导致细胞内信号传导和/或共信号传导域的激活。在某些实施方案中,本文中描述的CAR包含刺激性信号传导域,其是鼠/小鼠或人CD3z(人CD3z的UniProt条目是P20963(版本号177及序列号2；鼠/小鼠CD3z的UniProt条目是P24161(主要可引用登录号)或Q9D3G3(次要可引用登录号)版本号143和序列号1)),FCGR3A(人FCGR3A的UniProt条目是P08637(版本号178及序列号2)),或NKG2D(人NKG2D的UniProt条目是P26718(版本号151及序列号1)；鼠/小鼠NKG2D的UniProt条目是O54709(版本号132及序列号2))的片段/多肽部分。如此,本文中描述的CAR中包含的刺激性信号传导域可以是全长CD3z,FCGR3A或NKG2D的片段/多肽部分。鼠/小鼠全长CD3z的氨基酸序列在本文中作为SEQ ID NO:68显示(鼠/小鼠,如由SEQ ID NO:69中显示的DNA序列编码的)。人全长CD3z的氨基酸序列在本文中作为SEQ ID NO:66显示(人,如由SEQ IDNO:67中显示的DNA序列编码的)。依照本发明使用的CAR可以包含CD3z,FCGR3A或NKG2D的片段作为刺激域,前提是包含至少一个信号传导域。特别是,CD3z,FCGR3A,或NKG2D的任何部分/片段作为刺激域是合适的,只要包含至少一个信号传导基序。然而,更加优选地,CAR包含自人起源衍生的多肽。优选地,CAR包含如本文中作为SEQ ID NO:66(CD3z)显示的氨基酸序列(人,如由SEQ ID NO:67(CD3z)中显示的DNA序列编码的)。例如,可以在依照本发明使用的CAR中包含的人CD3z的片段/多肽部分可以包含在SEQ ID NO:7中显示的氨基酸序列(如由SEQ ID NO:19中显示的DNA序列编码的)或由其组成。因而,在一个实施方案中,CAR包含如SEQ ID NO:7中显示的序列或与SEQ ID NO:7相比具有多至1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,23,24,25,26,27,28,29或30处替代,删除或***且特征在于具有刺激性信号传导活性的序列。在本文中下文和在实施例和图中提供包含刺激性信号传导域的CAR的具体构造。可以测定刺激性信号传导活性；例如通过增强的细胞因子释放(如通过ELISA测量的(IL-2,IFNγ,TNFα)),增强的增殖活性(如通过升高的细胞数目测量的),或增强的裂解活性(如通过LDH释放测定法测量的)。

本文中描述的CAR优选包含至少一个共刺激性信号传导域,其对报告CAR-T细胞提供另外的活性。本文中描述的CAR可以包含共刺激性信号传导域,其是鼠/小鼠或人CD28(人CD28的UniProt条目是P10747(版本号173及序列号1)；鼠/小鼠CD28的UniProt条目是P31041(版本号134及序列号2)),CD137(人CD137的UniProt条目是Q07011(版本号145及序列号1)；鼠/小鼠CD137的UniProt条目是P20334(版本号139及序列号1)),OX40(人OX40的UniProt条目是P23510(版本号138及序列号1)；鼠/小鼠OX40的UniProt条目是P43488(版本号119及序列号1)),ICOS(人ICOS的UniProt条目是Q9Y6W8(版本号126及序列号1))；鼠/小鼠ICOS的UniProt条目是Q9WV40(主要可引用登录号)或Q9JL17(次要可引用登录号)版本号102和序列版本2)),CD27(人CD27的UniProt条目是P26842(版本号160及序列号2)；鼠/小鼠CD27的UniProt条目是P41272(版本号137及序列版本1)),4-1-BB(鼠/小鼠4-1-BB的UniProt条目是P20334(版本号140及序列版本1)；人4-1-BB的UniProt条目是Q07011(版本号146及序列版本)),DAP10(人DAP10的UniProt条目是Q9UBJ5(版本号25及序列号1)；鼠/小鼠DAP10的UniProt条目是Q9QUJ0(主要可引用登录号)或Q9R1E7(次要可引用登录号)版本号101和序列号1))或DAP12(人DAP12的UniProt条目是O43914(版本号146和序列号1)；鼠/小鼠DAP12的UniProt条目是O054885(主要可引用登录号)或Q9R1E7(次要可引用登录号)版本号123和该序列号1)的片段/多肽部分。在本发明的某些实施方案中,依照本发明使用的CAR可以包含一个或多个,即1,2,3,4,5,6或7个本文中定义的共刺激性信号传导域。因而,在本发明的语境中,CAR可以包含鼠/小鼠或优选人CD28的片段/多肽部分作为第一共刺激性信号传导域且第二共刺激性信号传导域选自由鼠/小鼠或优选人CD27,CD28,CD137,OX40,ICOS,DAP10和DAP12,或其片段组成的组。优选,CAR包含自人起源衍生的共刺激性信号传导域。如此,更加优选地,依照本发明使用的CAR中包含的共刺激性信号传导域可以包含如SEQ ID NO:12中显示的氨基酸序列(如由SEQ ID NO:25中显示的DNA序列编码的)或由其组成。

如此,可以任选地在本文中描述的CAR中包含的共刺激性信号传导域是全长CD27,CD28,CD137,OX40,ICOS,DAP10和DAP12的片段/多肽部分。鼠/小鼠全长CD28的氨基酸序列在本文中作为SEQ ID NO:73显示(鼠/小鼠,如由SEQ ID NO:72中显示的DNA序列编码的)。然而,因为在本发明的语境中最优选人序列,所以可以任选地在本文中描述的CAR蛋白中包含的共刺激性信号传导域是人全长CD27,CD28,CD137,OX40,ICOS,DAP10或DAP12的片段/多肽部分。人全长CD28的氨基酸序列在本文中作为SEQ ID NO:71显示(人,如由SEQ ID NO:70中显示的DNA序列编码的)。

在一个优选的实施方案中,CAR包含CD28或其片段作为共刺激性信号传导域。本文中描述的CAR可以包含CD28的片段作为共刺激性信号传导域,前提是包含至少一个CD28的信号传导域。特别是,CD28的任何部分/片段对于如本文中描述的CAR是合适的,只要包含至少一个CD28的信号传导基序。例如,依照本发明使用的CAR中包含的CD28多肽可以包含SEQID NO:12中显示的氨基酸序列(如由SEQ ID NO:25中显示的DNA序列编码的)或由其组成。在本发明中,作为共刺激性信号传导域发挥功能的CD28的胞内域可以包含具有序列YMNM(SEQ ID NO:74)和/或PYAP(SEQ ID NO:75)的自CD28多肽的胞内域衍生的序列。优选地,CAR包含自人起源衍生的多肽。例如,在CAR中可以包含的人CD28的片段/多肽部分可以包含SEQ ID NO:12中显示的氨基酸序列(如由SEQ ID NO:25中显示的DNA序列编码的)或由其组成。因而,在一个实施方案中,CAR包含如SEQ ID NO:12中显示的序列或与SEQ ID NO:12相比具有多至1,2,3,4,5,6,7,8,9或10处替代,删除或***且特征在于具有共刺激性信号传导活性的序列。在本文中下文和在实施例和图中提供包含共刺激性信号传导域(CSD)的CAR的具体构造。可以测定共刺激性信号传导活性；例如通过增强的细胞因子释放(如通过ELISA测量的(IL-2,IFNγ,TNFα)),增强的增殖活性(如通过升高的细胞数目测量的),或增强的裂解活性(如通过LDH释放测定法测量的)。

如上文提到的,在本发明的一个实施方案中,CAR的共刺激性信号传导域可以衍生自人CD28基因(UniProt条目号:P10747(登录号及该序列的条目版本:173和版本1))且提供CD28活性,定义为本文中描述的转导细胞,像转导T细胞的细胞因子生成,增殖和裂解活性。可以如下测量CD28活性,即通过细胞因子的释放,通过细胞因子,诸如干扰素伽马(IFN-γ)或白介素2(IL-2)的ELISA或流式细胞术,T细胞的增殖,例如通过ki67测量来测量,细胞量化,通过流式细胞术,或裂解活性,如通过靶细胞的实时阻抗测量评估的(通过使用例如ICELLligence仪器,如描述于例如Thakur et al.,Biosens Bioelectron.35(1)(2012),503-506；Krutzik et al.,Methods Mol Biol.699(2011),179-202；Ekkens et al.,Infect Immun.75(5)(2007),2291-2296；Ge et al.,Proc Natl Acad Sci U S A.99(5)(2002),2983-2988；Düwell et al.,Cell Death Differ.21(12)(2014),1825-1837；Erratum,Cell Death Differ.21(12)(2014),161)。共刺激性信号传导域PYAP和YMNM对于CD28多肽的功能和上文列举的功能效果是有益的。YMNM域的氨基酸序列在SEQ ID NO:74中显示；PYAP域的氨基酸序列在SEQ ID NO:75中显示。因而,在本发明的抗原结合受体中,CD28多肽优选包含具有序列YMNM(SEQ ID NO:74)和/或PYAP(SEQ ID NO:75)的自CD28多肽的胞内域衍生的序列。这些信号传导基序可以存在于所描述CAR的胞内域内的任何位点。

而且,本文中描述的CAR可以包含至少一个接头(或“间隔物”)。接头通常是具有多至20个氨基酸的长度的肽。因而,在本发明的语境中,接头可以具有1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19或20个氨基酸的长度。例如,本文中描述的CAR可以包含包含至少一个能够特异性结合识别域的抗原结合模块的胞外域,锚定跨膜域,共刺激性信号传导域和/或刺激性信号传导域之间的接头。此类接头具有它们提高CAR的不同多肽(即包含至少一个能够特异性结合识别域的抗原结合模块的胞外域,锚定跨膜域,共刺激性信号传导域和/或刺激性信号传导域)独立折叠且如预期表现的概率的优势。如此,在本发明的语境中,包含至少一个能够特异性结合识别域的抗原结合模块的胞外域,并不具有哺乳动物蛋白酶的切割位点的锚定跨膜域,共刺激性信号传导域和刺激性信号传导域可以包含在单链多功能多肽中。单链融合构建物可以例如由一种或多种多肽组成,其包含包含至少一个能够特异性结合突变型Fc域的抗原结合模块的一个或多个胞外域,一个或多个锚定跨膜域,一个或多个共刺激性信号传导域和/或一个或多个刺激性信号传导域。在备选的实施方案中,CAR包含并非单链融合构建物的抗原结合模块,即抗原结合模块是Fab或交叉Fab片段。在此类实施方案中,并非单链融合构建物的CAR包含仅仅一条多肽链。优选地,此类构建物会包含如本文中描述的与免疫球蛋白轻链组合的单链重链融合多肽,例如重链融合多肽包含一个或多个免疫球蛋白重链,一个或多个锚定跨膜域,一个或多个共刺激性信号传导域和/或一个或多个刺激性信号传导域且与一个或多个免疫球蛋白轻链组合。因而,抗原结合模块,锚定跨膜域,共刺激性信号传导域和刺激性信号传导域可以通过一个或多个相同或不同的如本文中描述的肽接头连接。例如,在本文中描述的CAR中,包含至少一个能够特异性结合识别域的抗原结合模块的胞外域和锚定跨膜域之间的接头可以包含如SEQ IDNO:17中显示的氨基酸序列或由其组成。因而,锚定跨膜域,共刺激性信号传导域和/或刺激域可以通过肽接头或通过域的直接融合而彼此连接。

在一些实施方案中,胞外域中包含的抗原结合模块是单链可变片段(scFv),其是用10至约25个氨基酸的短接头肽连接的抗体的重(VH)和轻链(VL)的可变区的融合蛋白。接头通常富含甘氨酸(为了柔性),以及丝氨酸或苏氨酸(为了溶解度),而且可以连接VH的N端与VL的C端,或反之。例如,在本文中描述的CAR中,接头可以具有如SEQ ID NO:16中显示的氨基酸序列。如本文中描述的scFv抗原结合模块保留原始抗体的特异性,尽管去除恒定区和引入接头。scFv抗体例如描述于Houston,J.S.,Methods in Enzymol.203(1991)46-96。

在一些实施方案中,胞外域中包含的抗原结合模块是单链Fab片段或scFab,其是由重链可变域(VH),抗体恒定域1(CH1),抗体轻链可变域(VL),抗体轻链恒定域(CL)和接头组成的多肽,其中所述抗体域和所述接头以N端至C端方向具有下面的次序之一:a)VH-CH1-接头-VL-CL,b)VL-CL-接头-VH-CH1,c)VH-CL-接头-VL-CH1或d)VL-CH1-接头-VH-CL；且其中所述接头是至少30个氨基酸,优选介于32个和50个之间氨基酸的多肽。经由CL域和CH1域之间的天然二硫键稳定所述单链Fab片段。

在一些实施方案中,胞外域中包含的抗原结合模块是交换单链Fab片段,其是由抗体重链可变域(VH),抗体恒定域1(CH1),抗体轻链可变域(VL),抗体轻链恒定域(CL)和接头组成的多肽,其中所述抗体域和所述接头以N端至C端方向具有下面的次序之一:a)VH-CL-接头-VL-CH1和b)VL-CH1-接头-VH-CL；其中VH和VL一起形成特异性结合抗原的抗原结合位点且其中所述接头是至少30个氨基酸的多肽。

本文中描述的CAR或其部分可以包含信号肽。此类信号肽会将蛋白质带至T细胞膜的表面。例如,在本文中描述的抗原结合受体中,信号肽可以具有如SEQ ID NO:76中显示的氨基酸序列(如由SEQ ID NO:77中显示的DNA序列编码的)。

如本文中描述的CAR的各成分可以以多种构造彼此融合以生成T细胞激活性CAR。

在一些实施方案中,CAR包含由与锚定跨膜域连接的重链可变域(VH)和轻链可变域(VL)构成的胞外域。在一些实施方案中,VH域在C端融合至VL域的N端,任选经由肽接头。在其它实施方案中,CAR进一步包含刺激性信号传导域和/或共刺激性信号传导域。在一个具体的此类实施方案中,CAR本质上由通过一个或多个肽接头连接的VH域和VL域,锚定跨膜域,和任选的刺激性信号传导域组成,其中VH域在C端融合至VL域的N端,且VL域在C端融合至锚定跨膜域的N端,其中锚定跨膜域在C端融合至刺激性信号传导域的N端。任选地,CAR进一步包含共刺激性信号传导域。在一个此类具体的实施方案中,抗原结合受体本质上由通过一个或多个肽接头连接的VH域和VL域,锚定跨膜域,刺激性信号传导域和共刺激性信号传导域组成,其中VH域在C端融合至VL域的N端,且VL域在C端融合至锚定跨膜域的N端,其中锚定跨膜域在C端融合至刺激性信号传导域的N端,其中刺激性信号传导域在C端融合至共刺激性信号传导域的N端。在一个备选的实施方案中,共刺激性信号传导域连接锚定跨膜域代替刺激性信号传导域。在一个优选的实施方案中,CAR本质上由通过一个或多个肽接头连接的VH域和VL域,锚定跨膜域,共刺激性信号传导域和刺激性信号传导域组成,其中VH域在C端融合至VL域的N端,且VL域在C端融合至锚定跨膜域的N端,其中锚定跨膜域在C端融合至共刺激性信号传导域的N端,其中共刺激性信号传导域在C端融合至刺激性信号传导域的N端。

在优选的实施方案中,抗原结合模块之一是Fab片段或交叉Fab片段。在一个优选的实施方案中,抗原结合模块在Fab或交叉Fab重链的C端融合至锚定跨膜域的N端,任选地经由肽接头。在一个备选的实施方案,抗原结合模块在Fab或交叉Fab轻链的C端融合至锚定跨膜域的N端,任选地经由肽接头。在其它实施方案中,CAR进一步包含刺激性信号传导域和/或共刺激性信号传导域。在一个具体的此类实施方案中,CAR本质上由通过一个或多个肽接头连接的Fab或交叉Fab片段,锚定跨膜域,和任选地刺激性信号传导域组成,其中Fab或交叉Fab片段在重或轻链的C端融合至锚定跨膜域的N端,其中锚定跨膜域在C端融合至刺激性信号传导域的N端。优选地,CAR进一步包含共刺激性信号传导域。在一个此类实施方案中,CAR本质上由通过一个或多个肽接头连接的Fab或交叉Fab片段,锚定跨膜域,刺激性信号传导域和共刺激性信号传导域组成,其中Fab或交叉Fab片段在重或轻链的C端融合至锚定跨膜域的N端,其中刺激性信号传导域在C端融合至共刺激性信号传导域的N端。在一个优选的实施方案中,共刺激性信号传导域连接锚定跨膜域代替刺激性信号传导域。在一个最优选的实施方案中,CAR本质上由Fab或交叉Fab片段,锚定跨膜域,共刺激性信号传导域和刺激性信号传导域组成,其中Fab或交叉Fab片段经由肽接头在重链的C端融合至锚定跨膜域的N端,其中锚定跨膜域在C端融合至共刺激性信号传导域的N端,其中共刺激性信号传导域在C端融合至刺激性信号传导域的N端。

抗原结合模块,锚定跨膜域和刺激性信号传导和/或共刺激性信号传导域可以直接地或经由包含一个或多个氨基酸,典型地约2-20个氨基酸的一个或多个肽接头彼此融合。肽接头是本领域已知的且在本文中有描述。合适的非免疫原性肽接头包括例如(G₄S)_n,(SG₄)_n,(G₄S)_n或G₄(SG₄)_n肽接头,其中“n”一般是1和10之间,典型地2和4之间的数目。用于连接抗原结合模块和锚定跨膜模块的一种优选肽接头是依照SEQ ID NO 17的GGGGS(G₄S)。适合于连接可变重链(VH)和可变轻链(VL)的一种例示性肽接头是依照SEQ ID NO 16的GGGSGGGSGGGSGGGS(G₄S)₄。

另外,接头可以包含免疫球蛋白铰链区(的一部分)。特别是在抗原结合模块融合至锚定跨膜域的N端的情况中,它可以是经由免疫球蛋白铰链区或其部分融合的,有或没有另外的肽接头。

如本文中描述的,依照本发明使用的CAR包含包含至少一个抗原结合模块的胞外域。具有一个能够特异性结合识别域的抗原结合模块的CAR是有用的且优选的,特别是在需要抗原结合受体的高表达的情况中。在此类情况中,多于一个对靶细胞抗原特异性的抗原结合模块的存在可能限制抗原结合受体的表达效率。然而,在其它情况中,具有包含对靶细胞抗原特异性的两个或更多个抗原结合模块的CAR会是有利的,例如为了优化对靶位点的靶向或容许靶细胞抗原的交联。

在某些实施方案中,CAR包含如下多肽,其中抗原结合模块的Fab轻链可变区与抗原结合模块的Fab重链恒定区分享羧基端肽键(即抗原结合模块包含交叉Fab重链,其中该重链可变区用轻链可变区替换),其继而与锚定跨膜域分享羧基端肽键(VL₍₁₎-CH1₍₁₎-ATD)。在一些实施方案中,CAR进一步包含如下多肽,其中第一抗原结合模块的Fab重链可变区与第一抗原结合模块的Fab轻链恒定区分享羧基端肽键(VH₍₁₎-CL₍₁₎)。在某些实施方案中,多肽共价连接,例如通过二硫键。在备选的实施方案中,CAR包含如下多肽,其中抗原结合模块的Fab重链可变区与抗原结合模块的Fab轻链恒定区分享羧基端肽键(即抗原结合模块包含交叉Fab重链,其中重链恒定区用轻链恒定区替换),其继而与锚定跨膜域分享羧基端肽键(VH₍₁₎-CL₍₁₎-ATD)。在一些实施方案中,CAR进一步包含如下多肽,其中抗原结合模块的Fab轻链可变区与抗原结合模块的Fab重链恒定区分享羧基端肽键(VL₍₁₎-CH1₍₁₎)。在某些实施方案中,多肽共价连接,例如通过二硫键。

在依照本发明的方法的语境中,使ABM与在表面上包含靶抗原的靶细胞接触和使ABM与包含能够特异性结合识别域的抗原结合模块的CAR接触导致如本文中描述的报告基因的表达。因而,在一个实施方案中,如本文中描述的细胞内信号传导和/或共信号传导域的激活导致如本文中描述的应答元件的激活。在一个优选的实施方案中,应答元件控制报告基因的表达。在一个实施方案中,在抗原结合模块结合靶抗原之时或之后,CAR结合识别域,例如突变型Fc域,其中应答元件激活如本文中描述的报告基因的表达。在一个优选的实施方案中,应答元件的激活导致报告基因的表达。因而,在抗原结合模块结合靶抗原且CAR结合包含候选抗原结合模块的抗体的识别域时报告细胞(例如报告CAR-T细胞)中的报告基因表达。在一个实施方案中,报告基因的表达指示抗原结合模块对靶抗原的结合。在此语境中,抗体对CAR的结合引发细胞应答,其导致对应答元件的活性的调控,或是直接地或是经由细胞信号传导的级联。应答元件是能受到转录因子等等沉默或激活的DNA元件。应答元件是本领域已知的且可商购的,例如在报告载体中。通常,应答元件包含DNA重复元件且是位于在转录因子结合时驱动报告基因表达的最小限度启动子上游的顺式作用增强子元件。

CAR对识别域,例如突变型Fc域的结合激活应答元件。在一个实施方案中,应答元件是位于细胞核中的核应答元件。在另一个实施方案中,所述应答元件位于报告细胞中的质粒上。在一个实施方案中,测定法包含用包含编码在应答元件控制下的报告基因的DNA序列的表达载体转染报告细胞,例如CAR-T细胞的预备步骤。另外,可以用包含编码CAR的DNA序列的表达载体转染报告细胞。可以用包含信号传导级联的所有元件的表达载体或用分别表达不同成分的不同载体转染报告细胞。在一个实施方案中,报告细胞包含编码在应答元件控制下的报告基因的DNA序列,和编码抗原结合受体的DNA序列。

因而,如本文中描述的,CAR功能性连接应答元件。在一个实施方案中,应答元件控制报告基因的表达。在一个实施方案中,是NFAT途径,NF-κB途径或AP-1途径,优选NFAT途径的一部分。

在一个实施方案中,报告基因选自编码荧光蛋白的基因或编码其催化活性能检测的酶的基因。在一个实施方案中,报告基因编码发光蛋白,特别是荧光蛋白。在一个实施方案中,报告基因编码绿色荧光蛋白(GFP)或萤光素酶。在又一个实施方案中,荧光蛋白选自由绿色荧光蛋白(GFP),黄色荧光蛋白(YFP),红色荧光蛋白(RFP),蓝色荧光蛋白(BFP,Heimet al.1994,1996),称作CFP的青色荧光变体(Heim et al.1996；Tsien 1998)；称作YFP的黄色荧光变体(Ormo et al.1996；Wachter et al.1998)；称作Sapphire的紫色可激发绿色荧光变体(Tsien 1998；Zapata-Hommer et al.2003)；和称作增强型绿色荧光蛋白或EGFP的青色可激发绿色荧光变体(Yang et al.1996)增强型绿色荧光蛋白(EGFP)组成的组且可以例如通过活细胞成像(例如Incucyte)或荧光分光光度法来测量。在一个实施方案中,其催化活性能检测的酶选自由萤光素酶,β-半乳糖苷酶和碱性磷酸酶组成的组。在一个实施方案中,报告基因编码GFP。在一个优选的实施方案中,报告基因编码萤光素酶。可以通过可商购的测定法,例如通过萤光素酶1000测定***或ONE-Glo^TM萤光素酶测定***(均来自Promega)来检测萤光素酶的活性。在作为底物的萤光素以外,萤光素酶1000测定***含有辅酶A(CoA),导致持续至少一分钟的强光强度。对于测定细胞内萤光素酶,必须在检测前裂解细胞。通过发光计自整个可见光谱收集作为反应的副产物生成的光。在本文中显示的实施例中,信号与所生成的萤光素酶的量成比例且因此与NFAT启动子的激活的强度成比例。在另一个实施方案中,使用萤光素酶测定法,其中萤光素酶是自细胞分泌的。因此,可以在不裂解细胞的情况下实施测定法。

如本文中描述的,可以直接关联报告基因的表达与要测试的抗原结合模块的结合和所得T细胞,例如报告CAR-T细胞的激活。例如,当使用编码荧光蛋白的基因或编码萤光素酶的基因作为报告基因时,直接关联自细胞检测光的量与要测试的抗原结合模块的靶抗原结合和特异性。在一个实施方案中,以不同浓度应用包含抗原结合模块的抗原结合分子并确定报告基因激活的半最大有效浓度(EC50)。EC50指在规定暴露时间之后抗体或配体将报告基因激活或抑制到介于基线和最大值之间的半途时抗体或配体的浓度。因此,剂量响应曲线的EC50代表观察到对靶抗原的最大激活性或抑制性效果的50％时抗原结合模块的浓度。

在一个实施方案中,靶抗原是细胞表面受体。在一个实施方案中,靶抗原选自由CD20,CEA,HER2,TYRP,EGFR,MCSP,STEAP1,WT1和FolR1组成的组。然而,靶抗原不限于位于细胞表面上的蛋白质,而且还可以衍生自暂时或永久位于细胞内的多肽或蛋白质。在此类情况中,衍生自细胞内多肽或蛋白质的靶抗原可以由主要组织相容性复合物(MHC)的一种或数种分子呈递在细胞表面上。在一个实施方案中,靶抗原是MHC的分子结合的肽。在一个实施方案中,MHC是人MHC。在一个实施方案中,MHC的分子结合的肽具有介于8和100个之间,优选介于8和30个之间,更加优选介于8和16个之间氨基酸的总体长度。在一个实施方案中,靶抗原衍生自唯独或主要在肿瘤组织中表达的蛋白质。在一个实施方案中,蛋白质是细胞内蛋白质且肽是通过MHC-I或MHC-II途径生成并由MHC I类或MHC II类复合物呈递的。在一个实施方案中,肽是通过MHC-I途径生成并由MHC I类复合物呈递的。在一个实施方案中,抗原结合模块是T细胞受体样(TCRL)抗原结合模块。TCRL抗原结合模块能够特异性结合唯独或主要在肿瘤组织中表达的肽抗原,其中肽抗原结合位于细胞,特别是癌细胞的表面上的MHC的分子。在此语境中,本发明的方法适合于以高通量测定法型式评估已建立的或新颖的TCRL抗原结合模块的特异性。

可以定性或定量,即通过报告基因的表达的存在或缺失测定抗原结合模块对靶抗原的结合；任何荧光或发光的缺失指示没有结合。对于结合和激活的定量测量,可以与参照比较报告基因激活的量。因而,如本文中描述的方法可以另外包含比较报告基因的表达的水平与参照的步骤。合适的参照通常包含阴性对照,其与参考测定法实质性相同,省略测定法或方法的一种本质成分。对于本发明的方法,省略的成分可以是例如省略添加ABM或省略靶细胞。或者,可以使用包含不能结合ABM识别域的抗原结合模块的报告CAR-T细胞。在一个优选的实施方案中,参照是在靶细胞缺失下报告基因的表达。在具体的实施方案中,报告基因的表达与在靶细胞缺失下报告基因的表达相比要高至少2倍,3倍,4倍,5倍,10倍,100倍,1000x,或10000倍。

或者,可以通过某个阈来定义报告基因表达的缺失,即在扣除背景信号之后。通常通过用除了要测试的ABM以外的所有试剂或在靶细胞缺失下实施测定法来测定背景信号。可以例如依照本发明的方法选择新颖抗原结合模块,其通过为报告基因表达的基线激活定义阈并如果在靶细胞存在下报告基因的表达的水平相对于在靶细胞缺失下报告基因的表达比预先确定的阈值要高的话选择新颖抗原结合模块。因而,如本文中描述的方法可以另外包含如果在靶细胞存在下报告基因的表达的水平相对于在靶细胞缺失下报告基因的表达比预先确定的阈值要高的话选择新颖抗原结合模块的步骤。在具体的实施方案中,阈值是2,3,4,5,10,100,1000,或10000。

如本文中描述的新颖测定法是稳健的,适合于以高通量型式使用且就完成测定法需要的动手时间而言是有效的。而且,本发明的测定法耐受要分析的样品中死细胞的存在。这与其中通过测量细胞存活力或细胞死亡来测定抗体的结合和功能性的细胞测定法,例如杀伤测定法形成对比。

本文中描述的新测定法的一项别的优点是不需要清洗步骤。可以以任一次序或在相同时间将要测试的抗体和报告细胞添加至靶细胞,例如肿瘤细胞。在一个实施方案中,在细胞培养培养基中稀释抗体并在合适的细胞培养型式中,例如在24孔板的孔中或在96孔板的孔中将肿瘤样品添加至含有稀释的抗体的细胞培养培养基。优选地,测试培养基是为细胞提供可存活长至48小时的条件的培养基。合适的培养基是例如Jurkat培养基,如实施例中概述的。在一个实施方案中,在微量滴定板中实施测定法。在一个实施方案中,微量滴定板适合于高通量筛选。可以以容许快速制备,加工,和分析多个反应的任何型式实施本发明的测定法。这可以是例如在多孔测定法板中(例如24孔,96孔或386孔)。可以手工或以机器人生成各种药剂的储液,并且可以使用可商购的分析软件,机器人,和能够检测荧光和/或发光信号的检测仪器以机器人进行所有后续移液,稀释,混合,分配,清洗,温育,样品读出,数据收集和分析。

在一个实施方案中,在步骤c)中提供约100000至约1000000个报告CAR-T细胞每个24孔板的孔。在一个优选的实施方案中,提供约300000至约700000个细胞或约400000至约600000个报告CAR-T细胞每个24孔板的孔。在一个实施方案中,在步骤c)中提供约500000个报告CAR-T细胞每个24孔板的孔。在一个实施方案中,在步骤c)中提供约10000至约100000个报告CAR-T每个96孔板的孔。在一个优选的实施方案中,提供约30000至约70000个报告CAR-T或约40000至约60000个报告CAR-T每个96孔板的孔。在一个实施方案中在步骤c)中提供约50000个报告CAR-T每个96孔板的孔。在一个实施方案中,在步骤c)中提供约3000至约30000个报告CAR-T细胞每个384孔板的孔。在一个优选的实施方案中,提供约5000至约15000个细胞或约8000至约12000个报告CAR-T细胞每个384孔板的孔。在一个实施方案中,在步骤c)中提供约10000个报告CAR-T细胞每个384孔板的孔。在一个实施方案中,在步骤c)中提供约200000至约2000000个报告CAR-T每ml细胞培养培养基。在一个优选的实施方案中,提供约600000至约1400000个报告CAR-T或约800000至约1200000个报告CAR-T每ml细胞培养培养基。在一个实施方案中,在步骤c)中提供约1000000个报告CAR-T每ml细胞培养培养基。

在一个实施方案中,在步骤b)中提供ABM以实现约0.001μg/ml至10μg/ml的最终浓度。在又一个实施方案中,在步骤b)中提供ABM以实现约0.05μg/ml至约2μg/ml或约0.1μg/ml至约1μg/ml的最终浓度。在又一个实施方案中,在步骤b)中提供ABM以实现约0.5μg/ml的最终浓度。在一个实施方案中,在步骤b)中提供ABM以实现约1nM至约1000nM的最终浓度。在又一个实施方案中,在步骤b)中提供ABM以实现约5nM至约200nM或约10nM至约100nM的最终浓度。在又一个实施方案中,在步骤b)中提供ABM以实现约50nM的最终浓度。可以在细胞培养培养基中,例如在Jurkat培养基中稀释ABM,如实施例部分中描述。在添加报告细胞之前或之后将稀释至如本文中描述的最终浓度的ABM添加至肿瘤样品。在一个实施方案中,在添加报告细胞之前将稀释至如本文中描述的最终浓度的ABM添加至肿瘤样品。在一个实施方案中,在细胞培养物***物中提供肿瘤样品。在一个实施方案中,在Matrigel中包埋肿瘤样品。

在某些实施方案中,可以使用本发明的方法来评估要在T细胞双特异性(TCB)型式中包括的新颖抗原结合模块的特异性。依照本发明的方法特别适合于为TCB评估和选择新颖抗原结合模块,因为本发明的方法测量T细胞激活。本领域已知的测定法(例如结合测定法)的一项缺点是测量的亲和力并不总是反映TCB型式的特异性。TCB是高度有力的分子,早就能够经由微摩尔范围中的结合亲和力介导T细胞激活和杀伤。因此,包含新颖靶抗原结合模块的TCB需要是高度选择性的以避免非特异性反应性,例如杀伤靶细胞或同种异体反应性。如本发明中描述的方法满足此类型式的高要求,因为测定法基于T细胞激活和相当的作用机制。因而,提供的是一种如本文中描述的方法,其中在靶细胞存在下高水平的报告基因的表达和在靶细胞缺失下低水平的报告基因的表达指示抗原结合模块的高特异性,特别是当将抗原结合模块转移入T细胞双特异性(TCB)抗体型式时。而且,提供的是一种用于生成TCB抗体的方法,其中TCB抗体型式包含对靶抗原特异性的第一抗原结合模块和能够特异性结合T细胞激活性受体的第二抗原结合模块,其中第一抗原结合模块是依照如本文中描述的方法选择的,即在本发明的方法中作为候选抗原结合模块测定和选择第一抗原结合模块。在优选的实施方案中,T细胞激活性受体是CD3。

在一个此类实施方案中,TCB抗体包含

(a)第一抗原结合模块,其是能够特异性结合靶细胞抗原的Fab分子；

(b)第二抗原结合模块,其是能够特异性结合CD3的Fab分子。

在一个具体的实施方案中,TCB抗体包含

(b)第二抗原结合模块,其是能够特异性结合CD3的Fab分子,且其包含SEQ ID NO:104,SEQ ID NO:105和SEQ ID NO:106的重链互补决定区(CDR)和SEQ ID NO:107,SEQ IDNO:108,SEQ ID NO:109的轻链CDR。

具有一个能够特异性结合靶细胞抗原的抗原结合模块的TCB抗体是有用的,特别是在其中在高亲和力抗原结合模块的结合后预期靶细胞抗原的内在化的情况中。在此类情况中,多于一个对靶细胞抗原特异性的抗原结合模块的存在可能增强靶细胞抗原的内在化,由此降低它的可用度。

然而,在许多其它情况中,具有包含两个或更多个对靶细胞抗原特异性的抗原结合模块的双特异性抗体会是有利的,例如为了优化对靶位点的靶向。

因而,在某些实施方案中,TCB抗体包含能够特异性结合靶细胞抗原的第三抗原结合模块。在又一个实施方案中,第三抗原结合模块是常规Fab分子,或交换Fab分子,其中Fab轻链和Fab重链的可变或恒定区任一是交换的。在一个实施方案中,第三抗原结合模块能够与第一抗原结合模块特异性结合相同靶细胞抗原。在一个特定的实施方案中,第二抗原结合模块能够特异性结合CD3,且第一和第三抗原结合模块能够特异性结合靶细胞抗原。在一个特定的实施方案中,第一和该第三抗原结合模块是相同的(即它们包含相同的氨基酸序列)且是依照如本文中描述的方法选择的。

本公开的又一个方面是能够表达如本文中描述的CAR的转导T细胞,即报告CAR-T细胞。CAR涉及一种分子,其并不天然包含在T细胞中和/或表面上且其并不在正常(非转导)T细胞中或上(内源)表达。如此,将T细胞中和/或上如本文中描述的CAR人工引入T细胞。因而,人工引入且随后呈递在所述T细胞,例如报告CAR-T细胞中和/或表面上的如本文中描述的CAR包含如下域,其包含(Ig衍生的)免疫球蛋白,优选抗体,特别是抗体的Fc域可及(体外或体内)的一个或多个抗原结合模块。在本发明的语境中,这些人工引入的分子在如本文中下文描述的转导之后呈递在所述T细胞中和/或表面上。因而,在转导之后,依照本公开的T细胞可以被免疫球蛋白,优选包含如本文中描述的Fc域中的具体突变的(治疗性)抗体激活。

本公开还涉及表达由编码如本文中描述的CAR的一种或多种核酸分子编码的CAR的转导T细胞。因而,在本发明的语境中,转导细胞可以包含编码如本文中描述的CAR的核酸分子。

在本发明的语境中,术语“转导T细胞”涉及遗传修饰的T细胞(即其中已经有意引入核酸分子的T细胞)。特别是,可以通过使用逆转录病毒或慢病毒转导将编码如本文中描述的CAR的核酸分子稳定整合入T细胞的基因组。CAR的这个胞外域可以包含如本文中描述的抗原结合模块的整个胞外域,但是也可以是其部分。所需要的最小大小是CAR中的抗原结合模块的抗原结合位点。在细胞表面上能检测到CAR的胞外部分(即抗原结合受体的胞外域),同时在细胞表面上检测不到细胞内部分(即共刺激性信号传导域和刺激性信号传导域)。可以通过使用特异性结合这种胞外域的抗体或通过胞外域能够结合的识别域,例如突变型Fc域来进行CAR的胞外域的检测。可以使用这些抗体或识别域通过流式细胞术或显微术来检测胞外域。

转导细胞可以是任何免疫细胞。这些包括但不限于B细胞,T细胞,天然杀伤(NK)细胞,天然杀伤(NK)T细胞,γδT细胞,先天性淋巴样细胞,巨噬细胞,单核细胞,树突细胞,或嗜中性细胞及其永生化细胞系。优选地,所述免疫细胞会是淋巴细胞,优选NK或T细胞。所述T细胞包括CD4 T细胞和CD8 T细胞。联合包含识别域,例如突变型Fc域的抗体,例如治疗性抗体,触发白细胞的表面上的CAR会使得细胞针对靶细胞是响应性的,不管细胞起源的谱系。会发生激活,不管为CAR选择的刺激性信号传导域或共刺激性信号传导域且不依赖于另外的细胞因子的外源供应。

可以用别的核酸分子,例如编码如本文中描述的应答元件的核酸分子共转导转导细胞。

具体地,本公开涉及一种用于生成表达一种或多种CAR和一种或多种应答元件和报告基因的报告CAR-T细胞的方法,其包含用一种或数种如本文中描述的载体转导T细胞和在容许在所述转导细胞中或上表达抗原结合受体的条件下培养转导T细胞的步骤。

用于转导细胞(例如T细胞)的方法是本领域已知的且包括但不限于(在转导核酸或重组核酸的情况中)例如电穿孔方法,磷酸钙方法,阳离子脂质方法或脂质体方法。可以通过使用可商购的转染试剂,例如Lipofectamine(由Invitrogen制造,目录号:11668027)常规和高度有效地转导要转导的核酸。在使用载体的情况中,可以以与上文所述核酸相同的方式转导载体,只要载体是质粒载体(即不是病毒载体的载体)。

优选转导T细胞在受控条件下,在它们的天然环境之外生长。特别是,术语“培养”意味着在体外的细胞(例如转导细胞)。培养细胞是保持与它们的原始组织来源分开的细胞活着的实验室技术。在本文中,在容许CAR在所述转导细胞中或上表达的条件下培养依照本发明使用的转导细胞。容许表达或转基因(即CAR和/或报告基因的)的条件是本领域普通知道的。

本公开的又一个方面是编码依照本发明使用的一种或数种CAR的核酸和载体。核酸分子可以在调节序列控制下。例如,可以采用启动子,转录增强子和/或容许CAR的诱导表达的序列。在本发明的语境中,核酸分子在组成性或可诱导启动子控制下表达。合适的启动子是例如CMV启动子(Qin et al.,PLoS One 5(5)(2010),e10611),UBC启动子(Qin etal.,PLoS One 5(5)(2010),e10611),PGK(Qin et al.,PLoS One 5(5)(2010),e10611),EF1A启动子(Qin et al.,PLoS One 5(5)(2010),e10611),CAGG启动子(Qin et al.,PLoSOne 5(5)(2010),e10611),SV40启动子(Qin et al.,PLoS One 5(5)(2010),e10611),COPIA启动子(Qin et al.,PLoS One 5(5)(2010),e10611),ACT5C启动子(Qin et al.,PLoS One 5(5)(2010),e10611),TRE启动子(Qin et al.,PLoS One 5(5)(2010),e10611),Oct3/4启动子(Chang et al.,Molecular Therapy 9(2004),S367-S367(doi:10.1016/j.ymthe.2004.06.904)),或Nanog启动子(Wu et al.,Cell Res.15(5)(2005),317-24)。在本文中,术语载体涉及能在它所引入的细胞中(即在转导细胞中)自主复制的环状或线性核酸分子。分子生物学的技术人员知道许多合适的载体,其选择会取决于想要的功能且包括质粒,粘粒,病毒,噬菌体和遗传工程中常规使用的其它载体。可以使用本领域技术人员公知的方法来构建各种质粒和载体；见例如Sambrook et al.(同上)和Ausubel,CurrentProtocols in Molecular Biology,Green Publishing Associates and WileyInterscience,N.Y.(1989),(1994)中描述的技术。或者,可以将本发明的多核苷酸和载体重建入脂质体用于投递至靶细胞。如下文更为详细讨论的,使用克隆载体来分离DNA的各个序列。在需要特定多肽的表达的情况中,可以将有关序列转移入表达载体。典型的克隆载体包括pBluescript SK,pGEM,pUC9,pBR322,pGA18和pGBT9。典型的表达载体包括pTRE,pCAL-n-EK,pESP-1,pOP13CAT。

在本发明的语境中,载体可以是多顺反子。此类调节序列(控制元件)是技术人员已知的且可以包括启动子,剪接盒,翻译起始密码子,用于将***物引入载体的翻译和***位点。在本发明的语境中,所述核酸分子可操作连接所述表达控制序列,容许在真核或原核细胞中表达。涵盖的是所述载体是包含编码如本文中定义的CAR的核酸分子的表达载体。可操作连接指其中所描述的成分处于允许它们以它们的预定方式发挥功能的相互关系的并列。控制序列可操作连接编码序列是如下方式的连接,使得在与控制序列相容的条件下实现编码序列的表达。在控制序列是启动子的情况中,对技术人员显而易见的是优选使用双链核酸。

在本发明的语境中,所述载体是表达载体。表达载体是可用于转化选定的细胞并在选定的细胞中提供编码序列的表达的构建物。例如,表达载体可以是克隆载体,二元载体或整合载体。表达包含核酸分子的转录,优选转录成可翻译mRNA。确保在原核生物和/或真核细胞中表达的调节元件是本领域技术人员公知的。在真核细胞的情况中,它们在正常情况下包含确保起始转录的启动子和任选地确保终止转录和稳定转录物的polyA信号。允许在原核宿主细胞中表达的可能的调节元件包含例如大肠杆菌中的PL,lac,trp或tac启动子,而允许在真核宿主细胞中表达的调节元件的例子是酵母中的AOX1或GAL1启动子或哺乳动物和其它动物细胞中的CMV,SV40,RSV启动子(劳斯肉瘤病毒),CMV增强子,SV40增强子或珠蛋白内含子。

在负责起始转录的元件之外,此类调节元件还可以包含多核苷酸下游的转录终止信号,诸如SV40-polyA位点或tk-polyA位点。而且,取决于使用的表达***,可以将编码能够将多肽指导至细胞隔室或将它分泌入培养基的信号肽的前导序列添加至所述核酸序列的编码序列且是本领域公知的t；还见例如所附实施例。

将前导序列以适宜状态与翻译起始和终止序列组装在一起,而且优选地,前导序列能够指导翻译的蛋白质或其部分分泌入周质空间或胞外培养基。任选地,异源序列可以编码CAR,其包括赋予期望特征的N端鉴定肽,例如稳定表达的重组产物或简化其纯化；见上文。在此语境中,合适的表达载体是本领域已知的,诸如Okayama-Berg cDNA表达载体pcDV1(Pharmacia),pCDM8,pRc/CMV,pcDNA1,pcDNA3(In-vitrogene),pEF-DHFR,pEF-ADA或pEF-neo(Raum et al.Cancer Immunol Immunother 50(2001),141-150)或pSPORT1(GIBCOBRL)。

在T细胞或它的前体细胞中引入的所描述的核酸分子或载体可以或是整合入细胞的基因组或是可以在染色体外维持。

例示性实施方案

1.一种用于评估抗原结合模块的特异性的方法,其包含下述步骤:

i.能够特异性结合该识别域的CAR,其中该CAR与应答元件可操作偶联；

ii.在该应答元件控制下的报告基因；和

2.实施方案1的方法,其中该识别域是免疫球蛋白域。

3.实施方案1或2任一项的方法,其中该识别域是Fc域。

4.实施方案3的方法,其中该Fc域是人Fc域,特别是人IgG1 Fc域。

5.实施方案3或4任一项的方法,其中该Fc域是突变型Fc域,其中该突变型Fc域与非突变型亲本Fc域相比包含至少一处氨基酸替代,其中该CAR能够特异性结合该突变型Fc域但不能够特异性结合该非突变型亲本Fc域。

6.实施方案5的方法,其中该突变型Fc域包含选自由依照EU编号方式的L234,L235,I253,H310,P331,P329和H435组成的组的位置处的至少一处氨基酸突变,特别是其中该氨基酸突变是L234A,L235A,I253A,N297A,H310A,P329G和/或H435A。

7.实施方案5或6任一项的方法,其中该突变型Fc域包含依照EU编号方式的氨基酸突变P329G。

8.实施方案5至7任一项的方法,其中该突变型Fc域包含选自由依照EU编号方式的I253,H310和H435组成的组的位置处的至少一处氨基酸突变,特别是该氨基酸突变I253A,H310A和H435A(“AAA”)。

9.实施方案1至8任一项的方法,其中该抗原结合模块是Fab片段,特别是自噬菌体展示文库筛选衍生的Fab片段。

10.实施方案1至9任一项的方法,其中该CAR包含至少一个细胞内刺激性信号传导和/或共刺激性信号传导域。

11.实施方案10的方法,其中该抗原结合模块对该靶抗原的结合和该报告CAR-T细胞对包含该抗原结合模块的抗原结合分子的结合导致该细胞内信号传导和/或共信号传导域的激活。

12.实施方案10或11任一项的方法,其中该细胞内信号传导和/或共信号传导域的激活导致该应答元件的激活。

13.依照实施方案1至12任一项的方法,其中该应答元件控制该报告基因的表达。

14.依照实施方案1至13任一项的方法,其中该应答元件的激活导致该报告基因的表达。

15.依照实施方案1至14任一项的方法,其中该应答元件是NFAT途径,NF-κB途径或AP-1途径的一部分。

16.依照实施方案1至15任一项的方法,其中该报告基因编码发光蛋白,特别是荧光蛋白。

17.依照实施方案1至16任一项的方法,其中该报告基因编码绿色荧光蛋白(GFP)或萤光素酶。

18.依照实施方案1至17任一项的方法,其中该靶抗原是细胞表面受体。

19.依照实施方案1至18任一项的方法,其中该靶抗原选自由CD20,CEA,HER2,TYRP,EGFR,MCSP,STEAP1,WT1和FolR1,或其片段组成的组。

20.依照实施方案1至19任一项的方法,其中该靶抗原是与人主要组织相容性复合物(MHC)的分子结合的肽。

21.依照实施方案20的方法,其中该抗原结合模块是T细胞受体样(TCRL)抗原结合模块。

22.依照实施方案1至21任一项的方法,其另外包含下述步骤:

e)将该报告基因的表达与参照比较。

23.依照实施方案22的方法,其中该参照是在该靶细胞缺失下该报告基因的表达。

24.依照实施方案23的方法,其中在该靶细胞存在下该报告基因的表达与在该靶细胞缺失下该报告基因的表达相比要高至少2倍,3倍,4倍,5倍,10倍,100倍,1000倍,或10000倍。

25.依照实施方案22的方法,其另外包含下述步骤:

f)如果在该靶细胞存在下该报告基因的表达相对于在该靶细胞缺失下该报告基因的表达比预先确定的阈值要高的话,选择该抗原结合模块。

26.依照实施方案25的方法,其中该阈值是2,3,4,5,10,100,1000,或10000。

27.依照实施方案1至26任一项的方法,其中在该靶细胞存在下高水平的该报告基因的表达和在该靶细胞缺失下低水平的该报告基因的表达指示该抗原结合模块的高特异性。

28.依照实施方案1至27任一项的方法,其中在该靶细胞存在下高水平的该报告基因的表达和在该靶细胞缺失下低水平的该报告基因的表达指示包含该抗原结合模块的T细胞双特异性(TCB)抗体的高特异性。

29.依照实施方案1至28任一项的方法,其中该方法是体外方法。

30.一种用于生成TCB抗体的方法,其中该TCB抗体包含对靶抗原特异性的第一抗原结合模块和能够特异性结合T细胞激活性受体的第二抗原结合模块,其中该第一抗原结合模块是依照实施方案1至29任一项的方法选择的。

31.实施方案30的方法,其中该T细胞激活性受体是CD3。

32.如本文中之前描述的方法。

实施例

下面是本发明的方法和组合物的实施例。理解的是,鉴于上文提供的一般性描述,可以实践多种其它实施方案。

重组DNA技术

使用标准方法来操作DNA,如Sambrook et al.,Molecular cloning:Alaboratory manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NewYork,1989中描述的。依照制造商的说明书使用分子生物学试剂。关于人免疫球蛋白轻和重链的核苷酸序列的一般信息在Kabat,E.A.et al.,(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest,Fifth Ed.,NIH Publication No 91-3242中给出。

DNA测序

通过双链测序来测定DNA序列。

基因合成

想要的基因区段或是使用适宜的模板通过PCR来生成或是由Geneart AG(Regensburg,Germany)自合成的寡核苷酸和PCR产物通过自动化基因合成来合成。将侧翼为单一限制性内切核酸酶切割位点的基因区段克隆入标准克隆/测序载体。自转化细菌纯化质粒DNA并通过UV光谱术测定浓度。通过DNA测序确认亚克隆基因片段的DNA序列。基因区段设计成具有合适的限制性位点以容许亚克隆入相应的表达载体。所有构建物均设计成具有编码在真核细胞中将蛋白质靶向分泌的前导肽的5’端DNA序列。

蛋白质纯化

参考标准方案,自经过过滤的细胞培养物上清液纯化蛋白质。简言之,将抗体应用于蛋白A Sepharose柱(GE Healthcare)并用PBS清洗。于pH 2.8实现抗体的洗脱,继以立即中和样品。在PBS中或在20mM组氨酸,150mM NaCl,pH 6.0中通过大小排阻层析术(Superdex200,GE Healthcare)将聚集的蛋白质与单体抗体分开。合并单体抗体级分,使用例如MILLIPORE Amicon Ultra(30 MWCO)离心浓缩机浓缩(在需要时),冷冻并贮存于-20℃或-80℃。提供部分样品用于后续蛋白质分析和分析性表征,例如通过SDS-PAGE和大小排阻层析术(SEC)。

SDS-PAGE

依照制造商的说明书使用

预制凝胶***(Invitrogen)。特别地,使用10％或4-12％

Bis-TRIS预制凝胶(pH 6.4)和

MES(还原凝胶,具有

抗氧化剂运行缓冲液添加剂)或MOPS(非还原凝胶)运行缓冲液。

分析性大小排阻层析术

通过HPLC层析术实施大小排阻层析术(SEC),用于测定抗体的聚集和寡聚状态。简言之,将经过蛋白A纯化的抗体应用于Agilent HPLC 1100***上的300mM NaCl,50mMKH₂PO₄/K₂HPO₄,pH 7.5中的Tosoh TSKgel G3000SW柱或Dionex HPLC***上的2x PBS中的Superdex 200柱(GE Healthcare)。通过UV吸光度和峰面积积分量化洗脱的蛋白质。BioRad凝胶过滤标准品151-1901充当标准品。

抗体生成

依照国际专利申请公开号WO2012/130831A1中描述的方法在恒定区中引入Pro329Gly,Leu234Ala和Leu235Ala突变以消除对Fcγ受体的结合。相应地,在恒定区中引入I253A,H310A和H435A(“AAA”)突变以消除对FcRn的结合。使用聚乙撑亚胺通过用哺乳动物表达载体共转染HEK293-EBNA细胞来生成相应的抗体。以1:1比用重和轻链的相应表达载体转染细胞。

Jurkat NFAT CAR-T细胞的慢病毒转导

为了生成慢病毒载体,在慢病毒多核苷酸载体中在组成性有活性的人巨细胞病毒立即早期启动子(CMV)下同框克隆抗原结合受体的正确装配体的相应DNA序列。逆转录病毒载体含有旱獭肝炎病毒转录后调节元件(WPRE),中央多聚嘌呤束(cPPT)元件,pUC复制起点和编码用于推进细菌中的繁殖和选择的抗生素抗性的基因。

为了生成功能性病毒颗粒,使用60-70％汇合的Hek293T细胞(ATCC CRL3216)和含有CAR的载体以及pCMV-VSV-G:pRSV-REV:pCgpV转移载体以3:1:1:1比实施基于Lipofectamine LTX^TM的转染。48小时后收集上清液,以250g离心5分钟以去除细胞碎片并穿过0.45或0.22μm聚醚砜滤器过滤。使用浓缩的病毒颗粒(Lenti-x-Concentrator,Takara)来转导Jurkat NFAT细胞(Signosis)。使用FACS-ARIA分选仪(BD Bioscience)作为集合或单一克隆分选阳性转导细胞。在细胞扩充至适宜密度之后将Jurkat NFAT报告CAR-T细胞用于实验。

实施例1

本文中描述的是Jurkat NFAT报告CAR-T细胞测定法,使用CD20表达性SUDHDL4肿瘤细胞作为靶细胞和抗P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD表达性Jurkat NFAT报告CAR-T细胞的分选集合(图6A)或抗P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD表达性Jurkat NFAT报告CAR-T细胞的集合(图6B)作为报告细胞。使用具有P329G LALA突变的GA101 IgG作为IgG,其一方面识别肿瘤抗原且另一方面受到经转导的Jurkat NFAT报告CAR-T细胞识别。作为阳性对照,将96孔板(Cellstar Greiner-bio-one,目录号655185)在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中用10μg/ml CD3抗体(来自

)或是于4℃包被过夜或是于37℃包被至少1小时。将CD3包被的孔用PBS清洗两次,在最终的清洗步骤之后完全去除PBS。对报告细胞或Jurkat NFAT野生型细胞计数并使用Cedex HiRes检查它们的存活力。将细胞数目调节至1x10⁶个可存活细胞/ml。因此将细胞悬浮液的适宜小份于室温(RT)以210g成团粒5分钟并在新鲜的RPMI-160+10％FCS+1％Glutamax(生长培养基)中重悬浮。对表达感兴趣抗原的靶细胞计数并同样检查它们的存活力。与关于报告细胞所述类似地在生长培养基中将细胞数目调节至1x10⁶个可存活细胞/ml。在96孔悬浮培养板(Greiner-bio-one)中一式三份以5:1或1:1E:T比(总共110,000个细胞每孔)分配靶细胞和报告细胞。作为下一步,使用2ml深孔板(

)在生长培养基中制备靶向感兴趣抗原的具有P329G LALA突变的GA101的连续稀释液。为了获得200μl每孔的最终体积中范围为1μg/ml至0.0001μg/ml的最终浓度,将不同稀释液的50μl小份移液至相应的孔。将96孔板以190g于室温离心2分钟。用

密封,将板在5％CO₂潮湿气氛中于37℃温育。在20小时温育之后通过使用多通道移液器上下移液10次来混合每个孔的内容。将100μl细胞悬浮液转移至新的白色透明平底96孔板(Greiner-bio-one)并添加100μl ONE-Glo^TM萤光素酶测定法(Promega)。在黑暗中以300rpm在旋转摇床上于室温温育15分钟之后使用

Spark10M读板仪测量发光,1秒/孔作为检测时间。

在靶和报告细胞以5:1(点)或1:1(方形)的比共培养20小时后,图显示当使用具有P329G LALA突变的GA101 IgG作为抗体时抗P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD表达性Jurkat NFAT报告CAR-T细胞以及抗P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD表达性Jurkat NFAT报告CAR-T细胞的剂量依赖性激活(图6A和B,以黑色描绘)。如果使用没有P329G LALA突变的GA101 IgG(图6A和B,以灰色描绘)的话,检测不到经转导的Jurkat NFAT报告CAR-T细胞的激活。每个点代表生物学上的一式两份的均值,每个作为技术上的一式两份实施。在基线修正后描绘所有值。通过误差棒指示标准偏差。

实施例2

本文中描述的是Jurkat NFAT报告CAR-T细胞测定法,使用CD20表达性SUDHDL4(图7C和7D)或WSUDLCL2(图7A和7B)肿瘤细胞作为靶细胞和单一克隆Jurkat NFAT细胞表达性抗P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD作为报告细胞。使用具有P329G LALA突变的GA101 IgG作为IgG,其一方面识别该肿瘤抗原且另一方面受到Jurkat NFAT报告CAR-T细胞识别。对报告细胞或Jurkat NFAT野生型细胞计数并使用Cedex HiRes检查它们的存活力。将细胞数目调节至1x10⁶个可存活细胞/ml。因此将细胞悬浮液的适宜小份于室温(RT)以210g成团粒5分钟并在新鲜的RPMI-160+10％FCS+1％Glutamax(生长培养基)中重悬浮。对表达感兴趣抗原的靶细胞计数并同样检查它们的存活力。与关于报告细胞所述类似地在生长培养基中将细胞数目调节至1x10⁶个可存活细胞/ml。在96孔悬浮培养板(Greiner-bio-one)中一式三份以10:1,5:1或1:1E:T比(总共110,000个细胞每孔)分配靶细胞和报告细胞。作为下一步,使用2ml深孔板(

Spark10M读板仪测量发光,1秒/孔作为检测时间。

在靶和报告细胞以10:1(点),5:1(方形)或1:1(三角形)的比共培养20小时后,图显示抗P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD表达性Jurkat NFAT报告CAR-T细胞的具有P329G LALA的GA101 IgG剂量依赖性激活(图7A-D,以黑色描绘)。如果使用没有P329GLALA突变的GA101 IgG(图7A-D,以灰色描绘)的话,只能在1μg/ml的最高抗体浓度检测到经转导的Jurkat NFAT报告CAR-T细胞的很少激活。每个点代表技术上的一式两份的均值。在基线修正后描绘所有值。通过误差棒指示标准偏差。

实施例3

本文中描述的是Jurkat NFAT报告CAR-T细胞测定法,使用贴壁FAP表达性NIH/3T3-huFAP cl 19肿瘤细胞作为靶细胞实施。作为报告细胞,使用抗P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD表达性Jurkat NFAT报告CAR-T细胞(图8A)或抗P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD表达性Jurkat NFAT报告CAR-T细胞(图8C)的分选集合。使用具有P329G LALA突变的FAP4B9 IgG作为IgG,其一方面识别该肿瘤抗原且另一方面受到Jurkat NFAT报告CAR-T细胞识别。包括包含P329G LALA突变的IgG DP47/vk3作为同种型对照。作为阳性对照,将96孔板(Greiner-bio-one,目录号655185)的孔在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中用10μg/ml CD3抗体(来自

)于37℃包被至少1小时。将CD3包被的孔用PBS清洗两次,在最终的清洗步骤之后完全去除PBS。将贴壁NIH/3T3-huFAP cl 19靶细胞用PBS清洗一次并使用胰蛋白酶脱离。在DMEM+4.5g LD-葡萄糖+L-谷氨酰胺+25mM HEPES+10％FCS和1％Glutamax中重悬浮脱离的细胞。对报告细胞或Jurkat NFAT野生型T细胞计数并使用Cedex HiRes检查它们的存活力。将细胞数目调节至1x10⁶个可存活细胞/ml。因此将细胞悬浮液的适宜小份于室温(RT)以210g成团粒5分钟并在新鲜的RPMI-160+10％FCS+1％Glutamax(生长培养基)中重悬浮。对表达感兴趣抗原的靶细胞计数并同样检查它们的存活力。与关于报告细胞所述类似地在生长培养基中将细胞数目调节至1x10⁶个可存活细胞/ml。在96孔悬浮培养板(Greiner-bio-one)中一式三份以5:1E:T比(总共110,000个细胞每孔)分配靶细胞和报告细胞。作为下一步,使用2ml深孔板(

)在生长培养基中制备靶向感兴趣抗原的具有P329G LALA突变的抗体的连续稀释液。为了获得200μl每孔的最终体积中范围为1μg/ml至0.0001μg/ml的最终浓度,将不同稀释液的50μl小份移液至相应的孔。将96孔板以190g于室温离心2分钟。用

Spark10M读板仪测量发光,1秒/孔作为检测时间。

图8B和8D呈现抗P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD表达性Jurkat NFAT报告CAR-T细胞(图8D)或抗P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD表达性Jurkat NFAT报告CAR-T细胞(图8B)的数据,均与靶细胞和1μg/ml FAP 4B9抗体一起共培养,与不同对照条件比较。

在与1μg/ml FAP 4B9 P329G LALA一起温育后,Jurkat NFAT报告CAR-T细胞(图8B和8D黑色三角形)以及仅靶细胞(图8B和8D黑色倒三角形)并不显示任何可检测的发光信号。

Jurkat NFAT报告CAR-T细胞在与靶细胞和1μg/ml FAP 4B9抗体一起共培养后也不显示发光信号(图8B和图8D黑色菱形)。而与靶细胞和1μg/ml FAP4B9抗体一起共培养的Jurkat NFAT细胞的CD3依赖性激活经由可检测的发光信号证明了它们的功能性(枝条点)。

与靶细胞和1μg/ml FAP 4B9抗体一起共培养,抗P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD表达性Jurkat NFAT报告CAR-T细胞的CD3依赖性激活(图8B白色方形)和抗P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD表达性Jurkat NFAT报告CAR-T细胞的激活(图8D,以白色方形描绘)显示所有之中最高的发光信号,因为它组合CAR介导的激活与CD3介导的激活。当CAR与靶细胞和1μg/ml DP47/vk3抗体一起温育时CD3介导的发光信号也是可见的(图8B和图8D白色倒三角形)。每个点代表技术上的一式三份的均值。在基线修正后描绘所有值。通过误差棒指示标准偏差。

实施例4

本文中描述的是Jurkat NFAT报告CAR-T细胞测定法,使用贴壁CEA表达性MKN45肿瘤细胞作为靶细胞。作为报告细胞,使用抗P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD表达性Jurkat NFAT报告CAR-T细胞(图9A)或抗P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD表达性Jurkat NFAT报告CAR-T细胞(图9C)的分选集合。使用均具有P329G LALA突变的CEAA5B7IgG或CEA T84 LCHA IgG。包括别的包含P329G LALA突变的IgG DP47/vk3作为同种型对照。

作为阳性对照,将96孔板(Greiner-bio-one,目录号655185)的孔在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中用10μg/ml CD3抗体(来自

)于37℃包被1小时。将CD3包被的孔用PBS清洗两次,在最终的清洗步骤之后,完全去除PBS。

将贴壁MKN45靶细胞用PBS清洗一次并使用胰蛋白酶脱离。在DMEM+4.5g LD-葡萄糖+L-谷氨酰胺+25mM HEPES+10％FCS和1％Glutamax中重悬浮脱离的细胞。

对报告细胞或Jurkat NFAT野生型细胞计数并使用Cedex HiRes检查它们的存活力。将细胞数目调节至1x10⁶个可存活细胞/ml。因此将细胞悬浮液的适宜小份于室温(RT)以210g成团粒5分钟并在新鲜的RPMI-160+10％FCS+1％Glutamax(生长培养基)中重悬浮。

对表达感兴趣抗原的靶细胞计数并同样检查它们的存活力。与关于报告细胞所述类似地在RPMI-1640+10％FCS+1％Glutamax中将细胞数目调节至1x10⁶个可存活细胞/ml。

在96孔悬浮培养板(Greiner-bio-one)中一式三份以5:1E:T比(总共110,000个细胞每孔)分配靶细胞和报告细胞。

作为下一步,使用2ml深孔板(

密封,将板在5％CO₂潮湿气氛中于37℃温育。

在20小时温育之后通过使用多通道移液器上下移液10次来混合每个孔的内容。将100μl细胞悬浮液转移至新的白色透明平底96孔板(Greiner-bio-one)并添加100μl ONE-Glo^TM萤光素酶测定法(Promega)。在黑暗中以300rpm在旋转摇床上于室温温育15分钟之后使用

Spark10M读板仪测量发光,1秒/孔作为检测时间。

在靶和报告细胞以5:1的比共培养20小时后(图9A和C,点),当使用具有P329GLALA突变的CEA A5B7作为抗体时,图显示抗P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD表达性Jurkat NFAT报告CAR-T细胞以及抗P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD表达性Jurkat NFAT报告CAR-T细胞的剂量依赖性激活(图9A和C灰色点)。使用具有P329G LALA突变的CEA T84 LCHA仅仅对抗P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD表达性Jurkat NFAT报告CAR-T细胞显示剂量依赖性激活(图9A黑色点)。而当使用具有P329G LALA突变的抗体时仅仅在1μg/ml的最高抗体浓度检测到抗P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD表达性Jurkat NFAT报告CAR-T细胞的激活。

如果使用具有P329G LALA突变的对照抗体DP47/vk3 IgG(图9A和C,黑色三角形)的话,检测不到抗P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD Jurkat NFAT报告CAR-T细胞或抗P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD表达性Jurkat NFAT报告CAR-T细胞的激活。每个点代表技术上的一式三份的均值。通过误差棒指示标准偏差。

图9B和9D呈现抗P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD表达性Jurkat NFAT报告CAR-T细胞(图9B)或抗P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD表达性Jurkat NFAT报告CAR-T细胞(图9D)的数据,均与靶细胞和1μg/ml CEA T8 LCHA P329G LALA或CEA A5B7P329G LALA抗体一起共培养,与不同对照条件比较。

在与1μg/ml CEA T8 LCHA P329G LALA一起温育后,单独的Jurkat NFAT CAR T细胞(图9B和9D黑色菱形)以及单独的靶细胞(图9B和9D白色圆形)并不显示任何可检测的发光信号。

Jurkat NFAT报告CAR-T细胞在与靶细胞和1μg/ml IgG一起共培养后也不显示可检测的发光信号(图9B和图9D白色方形和白色菱形)。而与靶细胞和1μg/ml IgG一起共培养的Jurkat NFAT报告CAR-T细胞的CD3依赖性激活经由可检测的发光信号证明了它们的功能性(图9B和D灰色十字)。

与靶细胞和1μg/ml IgG一起共培养,抗P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSDJurkat NFAT报告CAR-T细胞的CD3依赖性激活(图9B黑色星形和灰色星形)和抗P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD表达性NFAT T细胞的激活(图9D黑色星形和灰色星形)显示所有之中最高的发光信号,因为组合CAR介导的激活和CD3介导的激活。当CAR与靶细胞和1μg/ml DP47/vk3抗体一起温育时CD3介导的发光信号也是可见的(图9B和图9D,灰色加号)。每个点代表技术上的一式三份的均值。通过误差棒指示标准偏差。

实施例5

本文中描述的是Jurkat NFAT报告CAR-T细胞报告,使用贴壁CEA表达性MKN45肿瘤细胞作为靶细胞。作为报告细胞,使用抗P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD表达性Jukat NFAT T细胞(图10C)或抗P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD表达性JurkatNFAT报告CAR-T细胞(图10A)的分选集合。使用均具有P329G LALA突变的CH1A1A 98 99或CEA hMN14 IgG。包括别的包含P329G LALA突变的IgG DP47/vk3作为同种型对照。

作为下一步,使用2ml深孔板(

密封,将板在5％CO₂潮湿气氛中于37℃温育。

Spark10M读板仪测量发光,1秒/孔作为检测时间。

在靶细胞和抗P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD表达性Jurkat NFAT报告CAR-T细胞以5:1的比共培养20小时后(图10A黑色和灰色点),当使用CEA hMN14抗体或CH1A1A 98 99抗体时检测不到激活(图9A和B,灰色点)。抗P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD表达性Jurkat NFAT报告CAR-T细胞于0.1和1μg/ml CEA hMN14抗体或CH1A1A 98 99抗体二者显示很少的激活(图10C黑色和灰色点)。

如果使用具有P329G LALA突变的对照抗体DP47/vk3 IgG(图10A和C,黑色三角形)的话,检测不到抗P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD表达性Jurkat NFAT报告CAR-T细胞或抗P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD表达性Jurkat NFAT报告CAR-T细胞的激活。每个点代表技术上的一式三份的均值。在基线修正后描绘所有值。通过误差棒指示标准偏差。

图10B和10D呈现抗P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD表达性Jurkat NFAT报告CAR-T细胞(图D)或抗P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD表达性NFAT T细胞(图9D)的数据,均与靶细胞和1μg/ml CEA hMN14抗体或CH1A1A 98 99抗体一起共培养,与不同对照条件比较。

所有实施的对照试验均不显示任何可检测的发光信号,除了使用CD3作为激活性刺激以外。每个点代表技术上的一式三份的均值。通过误差棒指示标准偏差。

实施例6

本文中描述的是Jurkat NFAT报告CAR-T细胞测定法,使用贴壁TNC表达性CT26TNCcl 19肿瘤细胞作为靶细胞。作为报告细胞,使用抗P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD表达性Jurkat NFAT报告CAR-T细胞(图11C)或抗P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD表达性Jurkat NFAT报告CAR-T细胞(图11A)的分选集合。使用具有P329GLALA突变的TNCA2B10作为IgG。包括别的包含P329G LALA突变的IgG DP47/vk3作为同种型对照。

将贴壁CT26TNC cl 19靶细胞用PBS清洗一次并使用胰蛋白酶脱离。在RPMI-1630+10％FCS和1％Glutamax+15μg/ml嘌呤霉素中重悬浮脱离的细胞。

对报告细胞或Jurkat NFAT野生型T细胞计数并使用Cedex HiRes检查它们的存活力。将细胞数目调节至1x10⁶个可存活细胞/ml。因此将细胞悬浮液的适宜小份于室温(RT)以210g成团粒5分钟并在新鲜的RPMI-160+10％FCS+1％Glutamax(生长培养基)中重悬浮。

作为下一步,使用2ml深孔板(

密封,将板在5％CO₂潮湿气氛中于37℃温育。

Spark10M读板仪测量发光,1秒/孔作为检测时间。

在靶和报告细胞以5:1的比共培养20小时后(图11A和C黑色点),当使用具有P329GLALA突变的TNC A2B10作为抗体时,图显示抗P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD表达性Jurkat NFAT报告CAR-T细胞以及抗P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD表达性Jurkat NFAT报告CAR-T细胞的剂量依赖性激活。如果使用具有P329G LALA突变的对照抗体DP47/vk3 IgG的话(图11A和C黑色点),检测不到抗P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD表达性Jurkat NFAT报告CAR-T细胞或抗P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD表达性Jurkat NFAT报告CAR-T细胞的激活。每个点代表技术上的一式三份的均值。在基线修正后描绘所有值。通过误差棒指示标准偏差。

图11B和11D呈现抗P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD表达性Jurkat NFAT报告CAR-T细胞(图11D)或抗P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD表达性JurkatNFAT报告CAR-T细胞(图11B)的数据,均与靶细胞和1μg/ml TNC A2B10一起共培养,与不同对照条件比较。

在与靶细胞和1μg/ml IgG一起共培养后,Jurkat NFAT报告CAR-T细胞并不显示任何可检测的发光信号(图11B和图11D白色三角形)。而与靶细胞和1μg/ml IgG一起共培养的Jurkat NFAT细胞的CD3依赖性激活经由可检测的发光信号证明了它们的功能性(图11B和图11D白色方形)。

与靶细胞和1μg/ml IgG一起共培养,抗P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD表达性Jurkat NFAT报告CAR-T细胞的CD3依赖性激活(图11B白色圆形)和抗P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD表达性Jurkat NFAT报告CAR-T细胞的激活(图11D白色圆形)显示所有之中最高的发光信号,因为组合CAR介导的激活和CD3介导的激活。当CAR与靶细胞和1μg/ml DP47/vk3抗体一起温育时,CD3介导的发光信号也是可见的(图11B和图11D,黑色菱形)。每个点代表技术上的一式三份的均值。通过误差棒指示标准偏差。

实施例7

本文中描述的是Jurkat NFAT报告CAR-T细胞测定法,使用贴壁TNC表达性CT26TNCcl 19肿瘤细胞作为靶细胞。作为报告细胞,使用抗P329G-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD表达性Jurkat NFAT报告CAR-T细胞的分选集合(图12A)。使用具有P329G LALA突变的TNCA2B10作为IgG。包括别的包含P329G LALA突变的IgG DP47/vk3作为同种型对照。

作为下一步,使用2ml深孔板(

密封,将板在5％CO₂潮湿气氛中于37℃温育。

Spark10M读板仪测量发光,1秒/孔作为检测时间。

在靶和报告细胞以5:1的比共培养20小时后(图12A黑色点),图显示抗P329G-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD表达性Jurkat NFAT报告CAR-T细胞的剂量依赖性激活,始于0.01μg/ml具有P329G LALA突变的TNC A2B10。如果使用具有P329G LALA突变的对照抗体DP47/vk3 IgG的话(图12A和C灰色点),检测不到抗P329G-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD表达性Jurkat NFAT报告CAR-T细胞的激活。每个点代表技术上的一式三份的均值。在基线修正后描绘所有值。通过误差棒指示标准偏差。

图12B呈现抗P329G-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD表达性Jurkat NFAT报告CAR-T细胞的数据,与靶细胞和1μg/ml TNC A2B10抗体一起共培养,与不同对照条件比较。

与靶细胞但不与抗体一起温育的抗P329G-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD表达性Jurkat NFAT报告CAR-T细胞(图12B黑色方形)以及与靶细胞和1μg/ml TNC A2B10抗体一起温育的Jurkat NFAT细胞(图12B白色点)并不显示可检测的发光信号。而在CD3包被的孔中分配的与靶细胞和1μg/ml TNC A2B10一起共培养的Jurkat NFAT细胞显示清楚的发光信号。

在CD3包被的孔中与靶细胞和1μg/ml TNC A2B10或1μg/ml DP47/vk3抗体一起温育的别的抗P329G--CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD Fab表达性Jurkat NFAT报告CAR-T细胞显示高发光信号。每个点代表技术上的一式三份的均值。通过误差棒指示标准偏差。

实施例8

本文中描述的是用经RMF肽或VLD肽脉冲的T2细胞通过流式细胞术评估HLA-A2/WT1肽结合物5E11(SEQ ID NO:102和103)和33H09(SEQ ID NO:100和101)的特异性。在与HLA-A2/WT1肽结合抗体一起温育之前,将T2细胞以10^-5M用相应的肽于37℃脉冲2小时,或留置不脉冲。在冰上于不同浓度的所讨论抗体容许相应的IgG对每100,000个细胞的细胞小份结合1小时,继以两个PBS清洗步骤,并在Fortessa分析仪(BD Biosciences)上在流式细胞术中以90nM的浓度经由抗huFc检测(抗人F(ab)2_AF647,来自Jackson ImmunoResearch)评估。两种结合物5E11和33H09均对经RMF肽脉冲,但非经VLD肽脉冲的T2细胞给出清楚的浓度依赖性结合信号(图13A和B)。依照这种基于流式细胞术的评估,两种抗体候选均表现出特异性结合经RMF肽脉冲,但非经VLD肽脉冲的T2细胞。

实施例9

本文中描述的是Jurkat NFAT报告CAR-T细胞测定法,使用经肽脉冲的T2细胞作为靶细胞,为了评估HLA-A2/WT1肽结合物33F05(SEQ ID NO:96和97),11D06(SEQ ID NO:98和99),33H09(SEQ ID NO:100和101)和5E11(SEQ ID NO:102和103)的特异性。作为报告细胞,使用抗P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD表达性Jurkat NFAT报告CAR-T细胞的分选集合。使用具有P329G LALA突变的HLA-A2/WT1肽结合物作为IgG。在与HLA-A2/WT1肽结合抗体和报告细胞一起温育之前,将T2细胞以10^-5M用相应的肽于37℃脉冲2小时,或留置不脉冲。在384孔白色透明平底板(Greiner-bio-one)中一式三份以5:1E:T比(10,000个效应细胞每2000个靶细胞每孔)分配靶细胞和报告细胞。作为下一步,在生长培养基中制备所讨论IgG的连续稀释液。容许报告细胞,T2细胞和IgG于37℃温育16小时,继以添加6μl每孔ONE-Glo^TM萤光素酶底物(Promega)和使用TECAN infinite M1000Pro读板仪直接测量发光。

所得图(图14A至图14D)显示抗P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD表达性Jurkat NFAT报告CAR-T细胞的剂量依赖性激活。重要的是,这种激活表现为对于结合物11D06和33H09对经RMF肽脉冲的T2细胞是选择性的,但是对于结合物33F05和5E11对经RMF和VLD肽脉冲的T2细胞是非特异性的,指示T细胞激活对于这后两种抗体的非选择性性质。

实施例10

本文中描述的是Jurkat NFAT报告CAR-T细胞测定法,使用肽脉冲的T2细胞作为靶细胞,为了评估HLA-A2/WT1肽结合物11D06/D43的变体的特异性。作为报告细胞,使用抗P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD表达性Jurkat NFAT报告CAR-T细胞的分选集合。使用具有P329G LALA突变的HLA-A2/WT1肽结合物作为IgG。在与HLA-A2/WT1肽结合抗体和报告细胞一起温育之前,将T2细胞以10^-5M用RMF肽于37℃脉冲2小时,或留置不脉冲。在384孔白色透明平底板(Greiner-bio-one)中一式三份以5:1E:T比(10,000个效应细胞每2000个靶细胞每孔)分配靶细胞和报告细胞。作为下一步,在生长培养基中制备所讨论IgG的连续稀释液。容许报告细胞,T2细胞和IgG于37℃温育16小时,继以添加6μl每孔ONE-Glo^TM萤光素酶底物(Promega)和使用TECAN infinite M1000Pro读板仪直接测量发光。

所得图(图15A至图15F)显示抗P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD表达性Jurkat NFAT报告CAR-T细胞的剂量依赖性激活。所有抗体变体显示清楚的特异性和对经RMF脉冲的T2细胞的激活,胜过对未脉冲的T2细胞没有激活,然而无一抗体变体优于亲本结合物11D06/D43。

实施例11

本文中描述的是Jurkat NFAT报告CAR-T细胞测定法,以抗P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD表达性Jurkat NFAT CAR-T细胞的分选集合作为报告细胞。报告细胞结合具有P329G LALA突变的IgG型式的HLA-A2/WT1肽结合物,其继而确实以不同程度识别所测试的HLA-A2/WT1肽(分别是RMF或VLD)。

所讨论的四种不同抗体(分别是33F05(SEQ ID NO:96和97),11D06(SEQ ID NO:98和99),33H09(SEQ ID NO:100和101)和5E11(SEQ ID NO:102和103))以10nM存在。在与Jurkat NFAT报告细胞和IgG一起共温育之前,像实施例9中描述的,将T2细胞分别用RMF或VLD肽脉冲,或留置没有肽。在384孔板(白色透明平底384孔板(Greiner-bio-one))中在20μl每孔中将Jurkat NFAT报告细胞和靶细胞以5:1的E:T比以10000对2000个细胞于37℃共温育6小时,IgG浓度10nM,继以添加6μl每孔ONE-Glo^TM萤光素酶底物(Promega)和使用TECANinfinite M1000Pro读板仪直接测量发光。作为柱形图表述CAR-NFAT信号传导的激活,其来自相应实验设置的一式三份测量(图16),用误差棒指示标准偏差。对RMF肽(靶)的信号较之对VLD肽(脱靶)的信号的比较有助于评估相应的结合物的激活的特异性。没有肽的T2细胞上的信号强度指示候选结合物35F05和05E11的非特异性结合。候选结合物33H09和11D06证明仅仅是对HLA-A2/WT1肽RMF特异性和选择性的,因为脱靶肽VLD上的信号低,尤其是就所评估的背景(“无肽的T2”,“无T2”的效应细胞和和“不添加IgG”的效应和靶细胞共温育)而言。

例示性序列

表2:抗P329G-ds-scFv氨基酸序列:

表3:抗P329G-ds-scFv DNA序列:

表4:抗P329G-scFv氨基酸序列:

表5:抗P329G-scFv DNA序列:

表6:抗P329G-ds-Fab氨基酸序列

表7:抗P329G-ds-Fab DNA序列:

表8:抗P329G-Fab氨基酸序列:

表9:抗P329G-Fab DNA序列:

表10:抗AAA-scFv氨基酸序列

表11:抗AAA-Fab氨基酸序列

表12

序列表

<110> 豪夫迈·罗氏有限公司（F. Hoffmann-La Roche Ltd）

<120> 用于新颖抗原结合模块的特异性测试的通用报告细胞测定法

<130> P34477

<160> 109

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗P329G CDR H1 Kabat

<400> 1

Arg Tyr Trp Met Asn

1 5

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗P329G CDR H2 Kabat

<400> 2

Glu Ile Thr Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Pro Ser Leu Lys

1 5 10 15

Asp

<210> 3

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗P329G CDR H3 Kabat

<400> 3

Pro Tyr Asp Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Ser

1 5 10

<210> 4

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗P329G CDR L1 Kabat

<400> 4

Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn

1 5 10

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗P329G CDR L2 Kabat

<400> 5

Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗P329G CDR L3 Kabat

<400> 6

Ala Leu Trp Tyr Ser Asn His Trp Val

1 5

<210> 7

<211> 433

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗P329G-ds-scFv-CD28ATM-CD28CSD-CD3zSSD融合物pETR17096

<400> 7

Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Thr Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ile Lys Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Arg Pro Tyr Asp Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Ser Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Thr

130 135 140

Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu Thr Val Thr Leu Thr

145 150 155 160

Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp

165 170 175

Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly Leu Ile Gly Gly Thr

180 185 190

Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Ile

195 200 205

Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Thr Glu Asp Glu

210 215 220

Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn His Trp Val Phe Gly

225 230 235 240

Cys Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Ser Phe Trp Val

245 250 255

Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr

260 265 270

Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu

275 280 285

His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg

290 295 300

Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg

305 310 315 320

Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln

325 330 335

Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu

340 345 350

Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly

355 360 365

Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln

370 375 380

Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu

385 390 395 400

Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr

405 410 415

Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro

420 425 430

Arg

<210> 8

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗P329G-ds VH

<400> 8

Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Thr Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ile Lys Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Arg Pro Tyr Asp Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Ser Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 9

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗P329G-ds VL

<400> 9

Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser

20 25 30

Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly

35 40 45

Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala

65 70 75 80

Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn

85 90 95

His Trp Val Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 10

<211> 248

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗P329G-ds-scFv

<400> 10

Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Thr Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ile Lys Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Arg Pro Tyr Asp Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Ser Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Thr

130 135 140

Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu Thr Val Thr Leu Thr

145 150 155 160

Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp

165 170 175

Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly Leu Ile Gly Gly Thr

180 185 190

Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Ile

195 200 205

Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Thr Glu Asp Glu

210 215 220

Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn His Trp Val Phe Gly

225 230 235 240

Cys Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

245

<210> 11

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD28ATM

<400> 11

Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu

1 5 10 15

Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val

20 25

<210> 12

<211> 41

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD28CSD

<400> 12

Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr

1 5 10 15

Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro

20 25 30

Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

35 40

<210> 13

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD3zSSD

<400> 13

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 14

<211> 180

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD28ATM-CD28-CD3z

<400> 14

Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu

1 5 10 15

Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser

20 25 30

Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly

35 40 45

Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala

50 55 60

Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala

65 70 75 80

Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg

85 90 95

Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu

100 105 110

Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn

115 120 125

Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met

130 135 140

Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly

145 150 155 160

Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala

165 170 175

Leu Pro Pro Arg

180

<210> 15

<211> 238

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> eGFP

<400> 15

Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val

1 5 10 15

Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu

20 25 30

Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys

35 40 45

Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu

50 55 60

Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln

65 70 75 80

His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg

85 90 95

Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val

100 105 110

Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile

115 120 125

Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn

130 135 140

Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly

145 150 155 160

Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val

165 170 175

Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro

180 185 190

Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser

195 200 205

Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val

210 215 220

Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys

225 230 235

<210> 16

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> (G4S)4接头

<400> 16

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser

20

<210> 17

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> G4S接头

<400> 17

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 18

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> T2A接头

<400> 18

Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn

1 5 10 15

Pro Gly Pro

<210> 19

<211> 1356

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗P329G-ds-scFv-CD28ATM-CD28CSD-CD3zSSD融合物pETR17096

<400> 19

atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggtgt gcattccgag 60

gtgaagctgc tggagagcgg cggcggcctg gtgcagcccg gcggcagcct gaagctgagc 120

tgcgccgcca gcggcttcga cttcagcagg tactggatga actgggtgag gcaggccccc 180

ggcaagtgtc tggagtggat cggcgagatc acccccgaca gcagcaccat caactacacc 240

cccagcctga aggacaagtt catcatcagc agggacaacg ccaagaacac cctgtacctg 300

cagatgatca aggtgaggag cgaggacacc gccctgtact actgcgtgag gccctacgac 360

tacggcgcct ggttcgccag ctggggccag ggcaccctgg tgaccgtgag cgccggaggg 420

ggcggaagtg gtggcggggg aagcggcggg ggtggcagcg gagggggcgg atctcaggcc 480

gtggtgaccc aggagagcgc cctgaccacc agccccggcg agaccgtgac cctgacctgc 540

aggagcagca ccggcgccgt gaccaccagc aactacgcca actgggtgca ggagaagccc 600

gaccacctgt tcaccggcct gatcggcggc accaacaaga gggcccccgg cgtgcccgcc 660

aggttcagcg gcagcctgat cggcgacaag gccgccctga ccatcaccgg cgcccagacc 720

gaggacgagg ccatctactt ctgcgccctg tggtacagca accactgggt gttcggctgt 780

ggcaccaagc tgaccgtgct gggagggggc ggatccttct gggtgctggt ggtggtgggc 840

ggcgtgctgg cctgctacag cctgctggtg accgtggcct tcatcatctt ctgggtgagg 900

agcaagagga gcaggctgct gcacagcgac tacatgaaca tgacccccag gaggcccggc 960

cccaccagga agcactacca gccctacgcc ccccccaggg acttcgccgc ctacaggagc 1020

agggtgaagt tcagcaggag cgccgacgcc cccgcctacc agcagggcca gaaccagctg 1080

tataacgagc tgaacctggg caggagggag gagtacgacg tgctggacaa gaggaggggc 1140

agggaccccg agatgggcgg caagcccagg aggaagaacc cccaggaggg cctgtataac 1200

gagctgcaga aggacaagat ggccgaggcc tacagcgaga tcggcatgaa gggcgagagg 1260

aggaggggca agggccacga cggcctgtac cagggcctga gcaccgccac caaggacacc 1320

tacgacgccc tgcacatgca ggccctgccc cccagg 1356

<210> 20

<211> 357

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗P329G-ds VH

<400> 20

gaggtgaagc tgctggagag cggcggcggc ctggtgcagc ccggcggcag cctgaagctg 60

agctgcgccg ccagcggctt cgacttcagc aggtactgga tgaactgggt gaggcaggcc 120

cccggcaagt gtctggagtg gatcggcgag atcacccccg acagcagcac catcaactac 180

acccccagcc tgaaggacaa gttcatcatc agcagggaca acgccaagaa caccctgtac 240

ctgcagatga tcaaggtgag gagcgaggac accgccctgt actactgcgt gaggccctac 300

gactacggcg cctggttcgc cagctggggc cagggcaccc tggtgaccgt gagcgcc 357

<210> 21

<211> 327

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗P329G-ds VL

<400> 21

caggccgtgg tgacccagga gagcgccctg accaccagcc ccggcgagac cgtgaccctg 60

acctgcagga gcagcaccgg cgccgtgacc accagcaact acgccaactg ggtgcaggag 120

aagcccgacc acctgttcac cggcctgatc ggcggcacca acaagagggc ccccggcgtg 180

cccgccaggt tcagcggcag cctgatcggc gacaaggccg ccctgaccat caccggcgcc 240

cagaccgagg acgaggccat ctacttctgc gccctgtggt acagcaacca ctgggtgttc 300

ggctgtggca ccaagctgac cgtgctg 327

<210> 22

<211> 799

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗P329G-ds-scFv

<400> 22

atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggtgt gcattccgag 60

gtgaagctgc tggagagcgg cggcggcctg gtgcagcccg gcggcagcct gaagctgagc 120

tgcgccgcca gcggcttcga cttcagcagg tactggatga actgggtgag gcaggccccc 180

ggcaagtgtc tggagtggat cggcgagatc acccccgaca gcagcaccat caactacacc 240

cccagcctga aggacaagtt catcatcagc agggacaacg ccaagaacac cctgtacctg 300

cagatgatca aggtgaggag cgaggacacc gccctgtact actgcgtgag gccctacgac 360

tacggcgcct ggttcgccag ctggggccag ggcaccctgg tgaccgtgag cgccggaggg 420

ggcggaagtg gtggcggggg aagcggcggg ggtggcagcg gagggggcgg atctcaggcc 480

gtggtgaccc aggagagcgc cctgaccacc agccccggcg agaccgtgac cctgacctgc 540

aggagcagca ccggcgccgt gaccaccagc aactacgcca actgggtgca ggagaagccc 600

gaccacctgt tcaccggcct gatcggcggc accaacaaga gggcccccgg cgtgcccgcc 660

aggttcagcg gcagcctgat cggcgacaag gccgccctga ccatcaccgg cgcccagacc 720

gaggacgagg ccatctactt ctgcgccctg tggtacagca accactgggt gttcggctgt 780

ggcaccaagc tgaccgtgc 799

<210> 23

<211> 647

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IRES EV71, 内部核糖体进入位点

<400> 23

cccgaagtaa cttagaagct gtaaatcaac gatcaatagc aggtgtggca caccagtcat 60

accttgatca agcacttctg tttccccgga ctgagtatca ataggctgct cgcgcggctg 120

aaggagaaaa cgttcgttac ccgaccaact acttcgagaa gcttagtacc accatgaacg 180

aggcagggtg tttcgctcag cacaacccca gtgtagatca ggctgatgag tcactgcaac 240

ccccatgggc gaccatggca gtggctgcgt tggcggcctg cccatggaga aatccatggg 300

acgctctaat tctgacatgg tgtgaagtgc ctattgagct aactggtagt cctccggccc 360

ctgattgcgg ctaatcctaa ctgcggagca catgctcaca aaccagtggg tggtgtgtcg 420

taacgggcaa ctctgcagcg gaaccgacta ctttgggtgt ccgtgtttcc ttttattcct 480

atattggctg cttatggtga caatcaaaaa gttgttacca tatagctatt ggattggcca 540

tccggtgtgc aacagggcaa ctgtttacct atttattggt tttgtaccat tatcactgaa 600

gtctgtgatc actctcaaat tcattttgac cctcaacaca atcaaac 647

<210> 24

<211> 81

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CD28ATM

<400> 24

ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 60

gcctttatta ttttctgggt g 81

<210> 25

<211> 123

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CD28CSD

<400> 25

aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60

gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120

tcc 123

<210> 26

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CD3z SSD

<400> 26

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120

cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240

cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300

tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336

<210> 27

<211> 540

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CD28ATM-CD28-CD3z

<400> 27

ttctgggtgc tggtggtggt gggcggcgtg ctggcctgct acagcctgct ggtgaccgtg 60

gccttcatca tcttctgggt gaggagcaag aggagcaggc tgctgcacag cgactacatg 120

aacatgaccc ccaggaggcc cggccccacc aggaagcact accagcccta cgcccccccc 180

agggacttcg ccgcctacag gagcagggtg aagttcagca ggagcgccga cgcccccgcc 240

taccagcagg gccagaacca gctgtataac gagctgaacc tgggcaggag ggaggagtac 300

gacgtgctgg acaagaggag gggcagggac cccgagatgg gcggcaagcc caggaggaag 360

aacccccagg agggcctgta taacgagctg cagaaggaca agatggccga ggcctacagc 420

gagatcggca tgaagggcga gaggaggagg ggcaagggcc acgacggcct gtaccagggc 480

ctgagcaccg ccaccaagga cacctacgac gccctgcaca tgcaggccct gccccccagg 540

<210> 28

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> T2A元件

<400> 28

tccggagagg gcagaggaag tcttctaaca tgcggtgacg tggaggagaa tcccggccct 60

agg 63

<210> 29

<211> 717

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> eGFP

<400> 29

gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg gtggtgccca tcctggtcga gctggacggc 60

gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgtcc ggcgagggcg agggcgatgc cacctacggc 120

aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc ccgtgccctg gcccaccctc 180

gtgaccaccc tgacctacgg cgtgcagtgc ttcagccgct accccgacca catgaagcag 240

cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc aggagcgcac catcttcttc 300

aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc gaggtgaagt tcgagggcga caccctggtg 360

aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg gcaacatcct ggggcacaag 420

ctggagtaca actacaacag ccacaacgtc tatatcatgg ccgacaagca gaagaacggc 480

atcaaggtga acttcaagat ccgccacaac atcgaggacg gcagcgtgca gctcgccgac 540

cactaccagc agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc tgctgcccga caaccactac 600

ctgagcaccc agtccgccct gagcaaagac cccaacgaga agcgcgatca catggtcctg 660

ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact ctcggcatgg acgagctgta caagtga 717

<210> 30

<211> 2136

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗P329G-ds-scFv-CD28ATM-CD28CSD-CD3zSSD-eGFP融合物pETR17096

<400> 30

atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggtgt gcattccgag 60

gtgaagctgc tggagagcgg cggcggcctg gtgcagcccg gcggcagcct gaagctgagc 120

tgcgccgcca gcggcttcga cttcagcagg tactggatga actgggtgag gcaggccccc 180

ggcaagtgtc tggagtggat cggcgagatc acccccgaca gcagcaccat caactacacc 240

cccagcctga aggacaagtt catcatcagc agggacaacg ccaagaacac cctgtacctg 300

cagatgatca aggtgaggag cgaggacacc gccctgtact actgcgtgag gccctacgac 360

tacggcgcct ggttcgccag ctggggccag ggcaccctgg tgaccgtgag cgccggaggg 420

ggcggaagtg gtggcggggg aagcggcggg ggtggcagcg gagggggcgg atctcaggcc 480

gtggtgaccc aggagagcgc cctgaccacc agccccggcg agaccgtgac cctgacctgc 540

aggagcagca ccggcgccgt gaccaccagc aactacgcca actgggtgca ggagaagccc 600

gaccacctgt tcaccggcct gatcggcggc accaacaaga gggcccccgg cgtgcccgcc 660

aggttcagcg gcagcctgat cggcgacaag gccgccctga ccatcaccgg cgcccagacc 720

gaggacgagg ccatctactt ctgcgccctg tggtacagca accactgggt gttcggctgt 780

ggcaccaagc tgaccgtgct gggagggggc ggatccttct gggtgctggt ggtggtgggc 840

ggcgtgctgg cctgctacag cctgctggtg accgtggcct tcatcatctt ctgggtgagg 900

agcaagagga gcaggctgct gcacagcgac tacatgaaca tgacccccag gaggcccggc 960

cccaccagga agcactacca gccctacgcc ccccccaggg acttcgccgc ctacaggagc 1020

agggtgaagt tcagcaggag cgccgacgcc cccgcctacc agcagggcca gaaccagctg 1080

tataacgagc tgaacctggg caggagggag gagtacgacg tgctggacaa gaggaggggc 1140

agggaccccg agatgggcgg caagcccagg aggaagaacc cccaggaggg cctgtataac 1200

gagctgcaga aggacaagat ggccgaggcc tacagcgaga tcggcatgaa gggcgagagg 1260

aggaggggca agggccacga cggcctgtac cagggcctga gcaccgccac caaggacacc 1320

tacgacgccc tgcacatgca ggccctgccc cccaggtccg gagagggcag aggaagtctt 1380

ctaacatgcg gtgacgtgga ggagaatccc ggccctaggg tgagcaaggg cgaggagctg 1440

ttcaccgggg tggtgcccat cctggtcgag ctggacggcg acgtaaacgg ccacaagttc 1500

agcgtgtccg gcgagggcga gggcgatgcc acctacggca agctgaccct gaagttcatc 1560

tgcaccaccg gcaagctgcc cgtgccctgg cccaccctcg tgaccaccct gacctacggc 1620

gtgcagtgct tcagccgcta ccccgaccac atgaagcagc acgacttctt caagtccgcc 1680

atgcccgaag gctacgtcca ggagcgcacc atcttcttca aggacgacgg caactacaag 1740

acccgcgccg aggtgaagtt cgagggcgac accctggtga accgcatcga gctgaagggc 1800

atcgacttca aggaggacgg caacatcctg gggcacaagc tggagtacaa ctacaacagc 1860

cacaacgtct atatcatggc cgacaagcag aagaacggca tcaaggtgaa cttcaagatc 1920

cgccacaaca tcgaggacgg cagcgtgcag ctcgccgacc actaccagca gaacaccccc 1980

atcggcgacg gccccgtgct gctgcccgac aaccactacc tgagcaccca gtccgccctg 2040

agcaaagacc ccaacgagaa gcgcgatcac atggtcctgc tggagttcgt gaccgccgcc 2100

gggatcactc tcggcatgga cgagctgtac aagtga 2136

<210> 31

<211> 433

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗P329G-scFv-CD28ATM-CD28CSD-CD3zSSD融合物

<400> 31

Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Thr Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ile Lys Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Arg Pro Tyr Asp Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Ser Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Thr

130 135 140

Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu Thr Val Thr Leu Thr

145 150 155 160

Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp

165 170 175

Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly Leu Ile Gly Gly Thr

180 185 190

Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Ile

195 200 205

Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Thr Glu Asp Glu

210 215 220

Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn His Trp Val Phe Gly

225 230 235 240

Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Ser Phe Trp Val

245 250 255

Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr

260 265 270

Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu

275 280 285

His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg

290 295 300

Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg

305 310 315 320

Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln

325 330 335

Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu

340 345 350

Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly

355 360 365

Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln

370 375 380

Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu

385 390 395 400

Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr

405 410 415

Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro

420 425 430

Arg

<210> 32

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗P329G VH

<400> 32

Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Thr Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ile Lys Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Arg Pro Tyr Asp Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Ser Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 33

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗P329G VL

<400> 33

Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser

20 25 30

Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly

35 40 45

Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala

65 70 75 80

Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn

85 90 95

His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 34

<211> 248

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗P329G-scFv

<400> 34

Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Thr Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ile Lys Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Arg Pro Tyr Asp Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Ser Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Thr

130 135 140

Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu Thr Val Thr Leu Thr

145 150 155 160

Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp

165 170 175

Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly Leu Ile Gly Gly Thr

180 185 190

Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Ile

195 200 205

Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Thr Glu Asp Glu

210 215 220

Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn His Trp Val Phe Gly

225 230 235 240

Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

245

<210> 35

<211> 1356

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗P329G-scFv-CD28ATM-CD28CSD-CD3zSSD融合物

<400> 35

atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggtgt gcattccgag 60

gtgaagctgc tggagagcgg cggcggcctg gtgcagcccg gcggcagcct gaagctgagc 120

tgcgccgcca gcggcttcga cttcagcagg tactggatga actgggtgag gcaggccccc 180

ggcaagggtc tggagtggat cggcgagatc acccccgaca gcagcaccat caactacacc 240

cccagcctga aggacaagtt catcatcagc agggacaacg ccaagaacac cctgtacctg 300

cagatgatca aggtgaggag cgaggacacc gccctgtact actgcgtgag gccctacgac 360

tacggcgcct ggttcgccag ctggggccag ggcaccctgg tgaccgtgag cgccggaggg 420

ggcggaagtg gtggcggggg aagcggcggg ggtggcagcg gagggggcgg atctcaggcc 480

gtggtgaccc aggagagcgc cctgaccacc agccccggcg agaccgtgac cctgacctgc 540

aggagcagca ccggcgccgt gaccaccagc aactacgcca actgggtgca ggagaagccc 600

gaccacctgt tcaccggcct gatcggcggc accaacaaga gggcccccgg cgtgcccgcc 660

aggttcagcg gcagcctgat cggcgacaag gccgccctga ccatcaccgg cgcccagacc 720

gaggacgagg ccatctactt ctgcgccctg tggtacagca accactgggt gttcggcggt 780

ggcaccaagc tgaccgtgct gggagggggc ggatccttct gggtgctggt ggtggtgggc 840

ggcgtgctgg cctgctacag cctgctggtg accgtggcct tcatcatctt ctgggtgagg 900

agcaagagga gcaggctgct gcacagcgac tacatgaaca tgacccccag gaggcccggc 960

cccaccagga agcactacca gccctacgcc ccccccaggg acttcgccgc ctacaggagc 1020

agggtgaagt tcagcaggag cgccgacgcc cccgcctacc agcagggcca gaaccagctg 1080

tataacgagc tgaacctggg caggagggag gagtacgacg tgctggacaa gaggaggggc 1140

agggaccccg agatgggcgg caagcccagg aggaagaacc cccaggaggg cctgtataac 1200

gagctgcaga aggacaagat ggccgaggcc tacagcgaga tcggcatgaa gggcgagagg 1260

aggaggggca agggccacga cggcctgtac cagggcctga gcaccgccac caaggacacc 1320

tacgacgccc tgcacatgca ggccctgccc cccagg 1356

<210> 36

<211> 357

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗P329G VH

<400> 36

gaggtgaagc tgctggagag cggcggcggc ctggtgcagc ccggcggcag cctgaagctg 60

agctgcgccg ccagcggctt cgacttcagc aggtactgga tgaactgggt gaggcaggcc 120

cccggcaagg gtctggagtg gatcggcgag atcacccccg acagcagcac catcaactac 180

acccccagcc tgaaggacaa gttcatcatc agcagggaca acgccaagaa caccctgtac 240

ctgcagatga tcaaggtgag gagcgaggac accgccctgt actactgcgt gaggccctac 300

gactacggcg cctggttcgc cagctggggc cagggcaccc tggtgaccgt gagcgcc 357

<210> 37

<211> 327

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗P329G VL

<400> 37

caggccgtgg tgacccagga gagcgccctg accaccagcc ccggcgagac cgtgaccctg 60

acctgcagga gcagcaccgg cgccgtgacc accagcaact acgccaactg ggtgcaggag 120

aagcccgacc acctgttcac cggcctgatc ggcggcacca acaagagggc ccccggcgtg 180

cccgccaggt tcagcggcag cctgatcggc gacaaggccg ccctgaccat caccggcgcc 240

cagaccgagg acgaggccat ctacttctgc gccctgtggt acagcaacca ctgggtgttc 300

ggcggtggca ccaagctgac cgtgctg 327

<210> 38

<211> 2136

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗P329G-scFv-CD28ATM-CD28CSD-CD3zSSD-eGFP融合物

<400> 38

atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggtgt gcattccgag 60

gtgaagctgc tggagagcgg cggcggcctg gtgcagcccg gcggcagcct gaagctgagc 120

tgcgccgcca gcggcttcga cttcagcagg tactggatga actgggtgag gcaggccccc 180

ggcaagggtc tggagtggat cggcgagatc acccccgaca gcagcaccat caactacacc 240

cccagcctga aggacaagtt catcatcagc agggacaacg ccaagaacac cctgtacctg 300

cagatgatca aggtgaggag cgaggacacc gccctgtact actgcgtgag gccctacgac 360

tacggcgcct ggttcgccag ctggggccag ggcaccctgg tgaccgtgag cgccggaggg 420

ggcggaagtg gtggcggggg aagcggcggg ggtggcagcg gagggggcgg atctcaggcc 480

gtggtgaccc aggagagcgc cctgaccacc agccccggcg agaccgtgac cctgacctgc 540

aggagcagca ccggcgccgt gaccaccagc aactacgcca actgggtgca ggagaagccc 600

gaccacctgt tcaccggcct gatcggcggc accaacaaga gggcccccgg cgtgcccgcc 660

aggttcagcg gcagcctgat cggcgacaag gccgccctga ccatcaccgg cgcccagacc 720

gaggacgagg ccatctactt ctgcgccctg tggtacagca accactgggt gttcggcggt 780

ggcaccaagc tgaccgtgct gggagggggc ggatccttct gggtgctggt ggtggtgggc 840

ggcgtgctgg cctgctacag cctgctggtg accgtggcct tcatcatctt ctgggtgagg 900

agcaagagga gcaggctgct gcacagcgac tacatgaaca tgacccccag gaggcccggc 960

cccaccagga agcactacca gccctacgcc ccccccaggg acttcgccgc ctacaggagc 1020

agggtgaagt tcagcaggag cgccgacgcc cccgcctacc agcagggcca gaaccagctg 1080

tataacgagc tgaacctggg caggagggag gagtacgacg tgctggacaa gaggaggggc 1140

agggaccccg agatgggcgg caagcccagg aggaagaacc cccaggaggg cctgtataac 1200

gagctgcaga aggacaagat ggccgaggcc tacagcgaga tcggcatgaa gggcgagagg 1260

aggaggggca agggccacga cggcctgtac cagggcctga gcaccgccac caaggacacc 1320

tacgacgccc tgcacatgca ggccctgccc cccaggtccg gagagggcag aggaagtctt 1380

ctaacatgcg gtgacgtgga ggagaatccc ggccctaggg tgagcaaggg cgaggagctg 1440

ttcaccgggg tggtgcccat cctggtcgag ctggacggcg acgtaaacgg ccacaagttc 1500

agcgtgtccg gcgagggcga gggcgatgcc acctacggca agctgaccct gaagttcatc 1560

tgcaccaccg gcaagctgcc cgtgccctgg cccaccctcg tgaccaccct gacctacggc 1620

gtgcagtgct tcagccgcta ccccgaccac atgaagcagc acgacttctt caagtccgcc 1680

atgcccgaag gctacgtcca ggagcgcacc atcttcttca aggacgacgg caactacaag 1740

acccgcgccg aggtgaagtt cgagggcgac accctggtga accgcatcga gctgaagggc 1800

atcgacttca aggaggacgg caacatcctg gggcacaagc tggagtacaa ctacaacagc 1860

cacaacgtct atatcatggc cgacaagcag aagaacggca tcaaggtgaa cttcaagatc 1920

cgccacaaca tcgaggacgg cagcgtgcag ctcgccgacc actaccagca gaacaccccc 1980

atcggcgacg gccccgtgct gctgcccgac aaccactacc tgagcaccca gtccgccctg 2040

agcaaagacc ccaacgagaa gcgcgatcac atggtcctgc tggagttcgt gaccgccgcc 2100

gggatcactc tcggcatgga cgagctgtac aagtga 2136

<210> 39

<211> 407

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗P329G-ds-Fab-重链-CD28ATM-CD28CSD-CD3zSSD融合物pETR17100

<400> 39

Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Thr Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ile Lys Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Arg Pro Tyr Asp Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Ser Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly

210 215 220

Gly Gly Ser Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys

225 230 235 240

Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser

245 250 255

Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg

260 265 270

Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg

275 280 285

Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp

290 295 300

Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn

305 310 315 320

Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg

325 330 335

Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly

340 345 350

Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu

355 360 365

Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu

370 375 380

Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His

385 390 395 400

Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

405

<210> 40

<211> 222

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗P329G-ds-Fab重链

<400> 40

Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Thr Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ile Lys Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Arg Pro Tyr Asp Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Ser Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

<210> 41

<211> 216

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗P329G-ds-Fab轻链

<400> 41

Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser

20 25 30

Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly

35 40 45

Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala

65 70 75 80

Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn

85 90 95

His Trp Val Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Arg Thr Val

100 105 110

Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys

115 120 125

Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg

130 135 140

Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn

145 150 155 160

Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser

165 170 175

Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys

180 185 190

Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr

195 200 205

Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 42

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CL

<400> 42

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 43

<211> 103

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CH1

<400> 43

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

100

<210> 44

<211> 2645

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗P329G-ds-Fab-重链-CD28ATM-CD28CSD-CD3zSSD融合物pETR17100

<400> 44

atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacgggtgt gcattcccag 60

gccgtggtga cccaggagag cgccctgacc accagccccg gcgagaccgt gaccctgacc 120

tgcaggagca gcaccggcgc cgtgaccacc agcaactacg ccaactgggt gcaggagaag 180

cccgaccacc tgttcaccgg cctgatcggc ggcaccaaca agagggcccc cggcgtgccc 240

gccaggttca gcggcagcct gatcggcgac aaggccgccc tgaccatcac cggcgcccag 300

accgaggacg aggccatcta cttctgcgcc ctgtggtaca gcaaccactg ggtgttcggc 360

tgtggcacca agctgaccgt gctgcgtacg gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 420

ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 480

tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 540

caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 600

acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 660

ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgttagga attccccgaa 720

gtaacttaga agctgtaaat caacgatcaa tagcaggtgt ggcacaccag tcataccttg 780

atcaagcact tctgtttccc cggactgagt atcaataggc tgctcgcgcg gctgaaggag 840

aaaacgttcg ttacccgacc aactacttcg agaagcttag taccaccatg aacgaggcag 900

ggtgtttcgc tcagcacaac cccagtgtag atcaggctga tgagtcactg caacccccat 960

gggcgaccat ggcagtggct gcgttggcgg cctgcccatg gagaaatcca tgggacgctc 1020

taattctgac atggtgtgaa gtgcctattg agctaactgg tagtcctccg gcccctgatt 1080

gcggctaatc ctaactgcgg agcacatgct cacaaaccag tgggtggtgt gtcgtaacgg 1140

gcaactctgc agcggaaccg actactttgg gtgtccgtgt ttccttttat tcctatattg 1200

gctgcttatg gtgacaatca aaaagttgtt accatatagc tattggattg gccatccggt 1260

gtgcaacagg gcaactgttt acctatttat tggttttgta ccattatcac tgaagtctgt 1320

gatcactctc aaattcattt tgaccctcaa cacaatcaaa cgccaccatg ggatggagct 1380

gtatcatcct cttcttggta gcaacagcta ccggtgtgca ctccgaggtg aagctgctgg 1440

agagcggcgg cggcctggtg cagcccggcg gcagcctgaa gctgagctgc gccgccagcg 1500

gcttcgactt cagcaggtac tggatgaact gggtgaggca ggcccccggc aagtgtctgg 1560

agtggatcgg cgagatcacc cccgacagca gcaccatcaa ctacaccccc agcctgaagg 1620

acaagttcat catcagcagg gacaacgcca agaacaccct gtacctgcag atgatcaagg 1680

tgaggagcga ggacaccgcc ctgtactact gcgtgaggcc ctacgactac ggcgcctggt 1740

tcgccagctg gggccagggc accctggtga ccgtgagcgc cgctagcacc aagggcccct 1800

ccgtgttccc cctggccccc agcagcaaga gcaccagcgg cggcacagcc gctctgggct 1860

gcctggtcaa ggactacttc cccgagcccg tgaccgtgtc ctggaacagc ggagccctga 1920

cctccggcgt gcacaccttc cccgccgtgc tgcagagttc tggcctgtat agcctgagca 1980

gcgtggtcac cgtgccttct agcagcctgg gcacccagac ctacatctgc aacgtgaacc 2040

acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aggtggagcc caagagctgc ggagggggcg 2100

gatccttctg ggtgctggtg gtggtgggcg gcgtgctggc ctgctacagc ctgctggtga 2160

ccgtggcctt catcatcttc tgggtgagga gcaagaggag caggctgctg cacagcgact 2220

acatgaacat gacccccagg aggcccggcc ccaccaggaa gcactaccag ccctacgccc 2280

cccccaggga cttcgccgcc tacaggagca gggtgaagtt cagcaggagc gccgacgccc 2340

ccgcctacca gcagggccag aaccagctgt ataacgagct gaacctgggc aggagggagg 2400

agtacgacgt gctggacaag aggaggggca gggaccccga gatgggcggc aagcccagga 2460

ggaagaaccc ccaggagggc ctgtataacg agctgcagaa ggacaagatg gccgaggcct 2520

acagcgagat cggcatgaag ggcgagagga ggaggggcaa gggccacgac ggcctgtacc 2580

agggcctgag caccgccacc aaggacacct acgacgccct gcacatgcag gccctgcccc 2640

ccagg 2645

<210> 45

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CL

<400> 45

cgtacggtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60

ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120

tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180

agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240

aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag 300

agcttcaaca ggggagagtg ttag 324

<210> 46

<211> 309

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CH1

<400> 46

gctagcacca agggcccctc cgtgttcccc ctggccccca gcagcaagag caccagcggc 60

ggcacagccg ctctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgagcccgt gaccgtgtcc 120

tggaacagcg gagccctgac ctccggcgtg cacaccttcc ccgccgtgct gcagagttct 180

ggcctgtata gcctgagcag cgtggtcacc gtgccttcta gcagcctggg cacccagacc 240

tacatctgca acgtgaacca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa ggtggagccc 300

aagagctgc 309

<210> 47

<211> 3425

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗P329G-ds-Fab-重链-CD28TM-CD28CSD-CD3ZSSD-eGFP融合物pETR17100

<400> 47

atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacgggtgt gcattcccag 60

gccgtggtga cccaggagag cgccctgacc accagccccg gcgagaccgt gaccctgacc 120

tgcaggagca gcaccggcgc cgtgaccacc agcaactacg ccaactgggt gcaggagaag 180

cccgaccacc tgttcaccgg cctgatcggc ggcaccaaca agagggcccc cggcgtgccc 240

gccaggttca gcggcagcct gatcggcgac aaggccgccc tgaccatcac cggcgcccag 300

accgaggacg aggccatcta cttctgcgcc ctgtggtaca gcaaccactg ggtgttcggc 360

tgtggcacca agctgaccgt gctgcgtacg gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 420

ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 480

tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 540

caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 600

acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 660

ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgttagga attccccgaa 720

gtaacttaga agctgtaaat caacgatcaa tagcaggtgt ggcacaccag tcataccttg 780

atcaagcact tctgtttccc cggactgagt atcaataggc tgctcgcgcg gctgaaggag 840

aaaacgttcg ttacccgacc aactacttcg agaagcttag taccaccatg aacgaggcag 900

ggtgtttcgc tcagcacaac cccagtgtag atcaggctga tgagtcactg caacccccat 960

gggcgaccat ggcagtggct gcgttggcgg cctgcccatg gagaaatcca tgggacgctc 1020

taattctgac atggtgtgaa gtgcctattg agctaactgg tagtcctccg gcccctgatt 1080

gcggctaatc ctaactgcgg agcacatgct cacaaaccag tgggtggtgt gtcgtaacgg 1140

gcaactctgc agcggaaccg actactttgg gtgtccgtgt ttccttttat tcctatattg 1200

gctgcttatg gtgacaatca aaaagttgtt accatatagc tattggattg gccatccggt 1260

gtgcaacagg gcaactgttt acctatttat tggttttgta ccattatcac tgaagtctgt 1320

gatcactctc aaattcattt tgaccctcaa cacaatcaaa cgccaccatg ggatggagct 1380

gtatcatcct cttcttggta gcaacagcta ccggtgtgca ctccgaggtg aagctgctgg 1440

agagcggcgg cggcctggtg cagcccggcg gcagcctgaa gctgagctgc gccgccagcg 1500

gcttcgactt cagcaggtac tggatgaact gggtgaggca ggcccccggc aagtgtctgg 1560

agtggatcgg cgagatcacc cccgacagca gcaccatcaa ctacaccccc agcctgaagg 1620

acaagttcat catcagcagg gacaacgcca agaacaccct gtacctgcag atgatcaagg 1680

tgaggagcga ggacaccgcc ctgtactact gcgtgaggcc ctacgactac ggcgcctggt 1740

tcgccagctg gggccagggc accctggtga ccgtgagcgc cgctagcacc aagggcccct 1800

ccgtgttccc cctggccccc agcagcaaga gcaccagcgg cggcacagcc gctctgggct 1860

gcctggtcaa ggactacttc cccgagcccg tgaccgtgtc ctggaacagc ggagccctga 1920

cctccggcgt gcacaccttc cccgccgtgc tgcagagttc tggcctgtat agcctgagca 1980

gcgtggtcac cgtgccttct agcagcctgg gcacccagac ctacatctgc aacgtgaacc 2040

acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aggtggagcc caagagctgc ggagggggcg 2100

gatccttctg ggtgctggtg gtggtgggcg gcgtgctggc ctgctacagc ctgctggtga 2160

ccgtggcctt catcatcttc tgggtgagga gcaagaggag caggctgctg cacagcgact 2220

acatgaacat gacccccagg aggcccggcc ccaccaggaa gcactaccag ccctacgccc 2280

cccccaggga cttcgccgcc tacaggagca gggtgaagtt cagcaggagc gccgacgccc 2340

ccgcctacca gcagggccag aaccagctgt ataacgagct gaacctgggc aggagggagg 2400

agtacgacgt gctggacaag aggaggggca gggaccccga gatgggcggc aagcccagga 2460

ggaagaaccc ccaggagggc ctgtataacg agctgcagaa ggacaagatg gccgaggcct 2520

acagcgagat cggcatgaag ggcgagagga ggaggggcaa gggccacgac ggcctgtacc 2580

agggcctgag caccgccacc aaggacacct acgacgccct gcacatgcag gccctgcccc 2640

ccaggtccgg agagggcaga ggaagtcttc taacatgcgg tgacgtggag gagaatcccg 2700

gccctagggt gagcaagggc gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc ctggtcgagc 2760

tggacggcga cgtaaacggc cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag ggcgatgcca 2820

cctacggcaa gctgaccctg aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc gtgccctggc 2880

ccaccctcgt gaccaccctg acctacggcg tgcagtgctt cagccgctac cccgaccaca 2940

tgaagcagca cgacttcttc aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag gagcgcacca 3000

tcttcttcaa ggacgacggc aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc gagggcgaca 3060

ccctggtgaa ccgcatcgag ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc aacatcctgg 3120

ggcacaagct ggagtacaac tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc gacaagcaga 3180

agaacggcat caaggtgaac ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc agcgtgcagc 3240

tcgccgacca ctaccagcag aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg ctgcccgaca 3300

accactacct gagcacccag tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag cgcgatcaca 3360

tggtcctgct ggagttcgtg accgccgccg ggatcactct cggcatggac gagctgtaca 3420

agtga 3425

<210> 48

<211> 407

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗P329G-Fab-重链-CD28ATM-CD28CSD-CD3zSSD融合物pETR17594

<400> 48

Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Thr Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ile Lys Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Arg Pro Tyr Asp Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Ser Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly

210 215 220

Gly Gly Ser Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys

225 230 235 240

Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser

245 250 255

Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg

260 265 270

Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg

275 280 285

Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp

290 295 300

Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn

305 310 315 320

Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg

325 330 335

Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly

340 345 350

Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu

355 360 365

Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu

370 375 380

Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His

385 390 395 400

Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

405

<210> 49

<211> 222

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗P329G-Fab重链

<400> 49

Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Thr Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ile Lys Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Arg Pro Tyr Asp Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Ser Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

<210> 50

<211> 216

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗P329G-Fab轻链

<400> 50

Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser

20 25 30

Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly

35 40 45

Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala

65 70 75 80

Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn

85 90 95

His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Arg Thr Val

100 105 110

Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys

115 120 125

Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg

130 135 140

Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn

145 150 155 160

Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser

165 170 175

Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys

180 185 190

Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr

195 200 205

Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 51

<211> 2645

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗P329G-Fab-重链-CD28ATM-CD28CSD-CD3zSSD融合物pETR17594

<400> 51

atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacgggtgt gcattcccag 60

gccgtggtga cccaggagag cgccctgacc accagccccg gcgagaccgt gaccctgacc 120

tgcaggagca gcaccggcgc cgtgaccacc agcaactacg ccaactgggt gcaggagaag 180

cccgaccacc tgttcaccgg cctgatcggc ggcaccaaca agagggcccc cggcgtgccc 240

gccaggttca gcggcagcct gatcggcgac aaggccgccc tgaccatcac cggcgcccag 300

accgaggacg aggccatcta cttctgcgcc ctgtggtaca gcaaccactg ggtgttcggc 360

ggtggcacca agctgaccgt gctgcgtacg gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 420

ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 480

tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 540

caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 600

acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 660

ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgttagga attccccgaa 720

gtaacttaga agctgtaaat caacgatcaa tagcaggtgt ggcacaccag tcataccttg 780

atcaagcact tctgtttccc cggactgagt atcaataggc tgctcgcgcg gctgaaggag 840

aaaacgttcg ttacccgacc aactacttcg agaagcttag taccaccatg aacgaggcag 900

ggtgtttcgc tcagcacaac cccagtgtag atcaggctga tgagtcactg caacccccat 960

gggcgaccat ggcagtggct gcgttggcgg cctgcccatg gagaaatcca tgggacgctc 1020

taattctgac atggtgtgaa gtgcctattg agctaactgg tagtcctccg gcccctgatt 1080

gcggctaatc ctaactgcgg agcacatgct cacaaaccag tgggtggtgt gtcgtaacgg 1140

gcaactctgc agcggaaccg actactttgg gtgtccgtgt ttccttttat tcctatattg 1200

gctgcttatg gtgacaatca aaaagttgtt accatatagc tattggattg gccatccggt 1260

gtgcaacagg gcaactgttt acctatttat tggttttgta ccattatcac tgaagtctgt 1320

gatcactctc aaattcattt tgaccctcaa cacaatcaaa cgccaccatg ggatggagct 1380

gtatcatcct cttcttggta gcaacagcta ccggtgtgca ctccgaggtg aagctgctgg 1440

agagcggcgg cggcctggtg cagcccggcg gcagcctgaa gctgagctgc gccgccagcg 1500

gcttcgactt cagcaggtac tggatgaact gggtgaggca ggcccccggc aagggtctgg 1560

agtggatcgg cgagatcacc cccgacagca gcaccatcaa ctacaccccc agcctgaagg 1620

acaagttcat catcagcagg gacaacgcca agaacaccct gtacctgcag atgatcaagg 1680

tgaggagcga ggacaccgcc ctgtactact gcgtgaggcc ctacgactac ggcgcctggt 1740

tcgccagctg gggccagggc accctggtga ccgtgagcgc cgctagcacc aagggcccct 1800

ccgtgttccc cctggccccc agcagcaaga gcaccagcgg cggcacagcc gctctgggct 1860

gcctggtcaa ggactacttc cccgagcccg tgaccgtgtc ctggaacagc ggagccctga 1920

cctccggcgt gcacaccttc cccgccgtgc tgcagagttc tggcctgtat agcctgagca 1980

gcgtggtcac cgtgccttct agcagcctgg gcacccagac ctacatctgc aacgtgaacc 2040

acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aggtggagcc caagagctgc ggagggggcg 2100

gatccttctg ggtgctggtg gtggtgggcg gcgtgctggc ctgctacagc ctgctggtga 2160

ccgtggcctt catcatcttc tgggtgagga gcaagaggag caggctgctg cacagcgact 2220

acatgaacat gacccccagg aggcccggcc ccaccaggaa gcactaccag ccctacgccc 2280

cccccaggga cttcgccgcc tacaggagca gggtgaagtt cagcaggagc gccgacgccc 2340

ccgcctacca gcagggccag aaccagctgt ataacgagct gaacctgggc aggagggagg 2400

agtacgacgt gctggacaag aggaggggca gggaccccga gatgggcggc aagcccagga 2460

ggaagaaccc ccaggagggc ctgtataacg agctgcagaa ggacaagatg gccgaggcct 2520

acagcgagat cggcatgaag ggcgagagga ggaggggcaa gggccacgac ggcctgtacc 2580

agggcctgag caccgccacc aaggacacct acgacgccct gcacatgcag gccctgcccc 2640

ccagg 2645

<210> 52

<211> 3425

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗P329G-Fab-重链-CD28ATM-CD28CSD-CD3zSSD-eGFP融合物pETR17594

<400> 52

atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacgggtgt gcattcccag 60

gccgtggtga cccaggagag cgccctgacc accagccccg gcgagaccgt gaccctgacc 120

tgcaggagca gcaccggcgc cgtgaccacc agcaactacg ccaactgggt gcaggagaag 180

cccgaccacc tgttcaccgg cctgatcggc ggcaccaaca agagggcccc cggcgtgccc 240

gccaggttca gcggcagcct gatcggcgac aaggccgccc tgaccatcac cggcgcccag 300

accgaggacg aggccatcta cttctgcgcc ctgtggtaca gcaaccactg ggtgttcggc 360

ggtggcacca agctgaccgt gctgcgtacg gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 420

ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 480

tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 540

caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 600

acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 660

ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgttagga attccccgaa 720

gtaacttaga agctgtaaat caacgatcaa tagcaggtgt ggcacaccag tcataccttg 780

atcaagcact tctgtttccc cggactgagt atcaataggc tgctcgcgcg gctgaaggag 840

aaaacgttcg ttacccgacc aactacttcg agaagcttag taccaccatg aacgaggcag 900

ggtgtttcgc tcagcacaac cccagtgtag atcaggctga tgagtcactg caacccccat 960

gggcgaccat ggcagtggct gcgttggcgg cctgcccatg gagaaatcca tgggacgctc 1020

taattctgac atggtgtgaa gtgcctattg agctaactgg tagtcctccg gcccctgatt 1080

gcggctaatc ctaactgcgg agcacatgct cacaaaccag tgggtggtgt gtcgtaacgg 1140

gcaactctgc agcggaaccg actactttgg gtgtccgtgt ttccttttat tcctatattg 1200

gctgcttatg gtgacaatca aaaagttgtt accatatagc tattggattg gccatccggt 1260

gtgcaacagg gcaactgttt acctatttat tggttttgta ccattatcac tgaagtctgt 1320

gatcactctc aaattcattt tgaccctcaa cacaatcaaa cgccaccatg ggatggagct 1380

gtatcatcct cttcttggta gcaacagcta ccggtgtgca ctccgaggtg aagctgctgg 1440

agagcggcgg cggcctggtg cagcccggcg gcagcctgaa gctgagctgc gccgccagcg 1500

gcttcgactt cagcaggtac tggatgaact gggtgaggca ggcccccggc aagggtctgg 1560

agtggatcgg cgagatcacc cccgacagca gcaccatcaa ctacaccccc agcctgaagg 1620

acaagttcat catcagcagg gacaacgcca agaacaccct gtacctgcag atgatcaagg 1680

tgaggagcga ggacaccgcc ctgtactact gcgtgaggcc ctacgactac ggcgcctggt 1740

tcgccagctg gggccagggc accctggtga ccgtgagcgc cgctagcacc aagggcccct 1800

ccgtgttccc cctggccccc agcagcaaga gcaccagcgg cggcacagcc gctctgggct 1860

gcctggtcaa ggactacttc cccgagcccg tgaccgtgtc ctggaacagc ggagccctga 1920

cctccggcgt gcacaccttc cccgccgtgc tgcagagttc tggcctgtat agcctgagca 1980

gcgtggtcac cgtgccttct agcagcctgg gcacccagac ctacatctgc aacgtgaacc 2040

acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aggtggagcc caagagctgc ggagggggcg 2100

gatccttctg ggtgctggtg gtggtgggcg gcgtgctggc ctgctacagc ctgctggtga 2160

ccgtggcctt catcatcttc tgggtgagga gcaagaggag caggctgctg cacagcgact 2220

acatgaacat gacccccagg aggcccggcc ccaccaggaa gcactaccag ccctacgccc 2280

cccccaggga cttcgccgcc tacaggagca gggtgaagtt cagcaggagc gccgacgccc 2340

ccgcctacca gcagggccag aaccagctgt ataacgagct gaacctgggc aggagggagg 2400

agtacgacgt gctggacaag aggaggggca gggaccccga gatgggcggc aagcccagga 2460

ggaagaaccc ccaggagggc ctgtataacg agctgcagaa ggacaagatg gccgaggcct 2520

acagcgagat cggcatgaag ggcgagagga ggaggggcaa gggccacgac ggcctgtacc 2580

agggcctgag caccgccacc aaggacacct acgacgccct gcacatgcag gccctgcccc 2640

ccaggtccgg agagggcaga ggaagtcttc taacatgcgg tgacgtggag gagaatcccg 2700

gccctagggt gagcaagggc gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc ctggtcgagc 2760

tggacggcga cgtaaacggc cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag ggcgatgcca 2820

cctacggcaa gctgaccctg aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc gtgccctggc 2880

ccaccctcgt gaccaccctg acctacggcg tgcagtgctt cagccgctac cccgaccaca 2940

tgaagcagca cgacttcttc aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag gagcgcacca 3000

tcttcttcaa ggacgacggc aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc gagggcgaca 3060

ccctggtgaa ccgcatcgag ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc aacatcctgg 3120

ggcacaagct ggagtacaac tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc gacaagcaga 3180

agaacggcat caaggtgaac ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc agcgtgcagc 3240

tcgccgacca ctaccagcag aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg ctgcccgaca 3300

accactacct gagcacccag tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag cgcgatcaca 3360

tggtcctgct ggagttcgtg accgccgccg ggatcactct cggcatggac gagctgtaca 3420

agtga 3425

<210> 53

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗AAA CDR H1 Kabat

<400> 53

Ser Tyr Gly Met Ser

1 5

<210> 54

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗AAA CDR H2 Kabat

<400> 54

Ser Ser Gly Gly Ser Tyr

1 5

<210> 55

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗AAA CDR H3 Kabat

<400> 55

Leu Gly Met Ile Thr Thr Gly Tyr Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 56

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗AAA CDR L1 Kabat

<400> 56

Arg Ser Ser Gln Thr Ile Val His Ser Thr Gly His Thr Tyr Leu Glu

1 5 10 15

<210> 57

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗AAA CDR L2 Kabat

<400> 57

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser

1 5

<210> 58

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗AAA CDR L3 Kabat

<400> 58

Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr

1 5

<210> 59

<211> 457

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗AAA-scFv-CD28ATM-CD28CSD-CD3zSSD融合物

<400> 59

Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu Val Phe Leu Ala Leu Ile Leu Lys Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys

20 25 30

Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

35 40 45

Ser Ser Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu

50 55 60

Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Ile Tyr Tyr Pro

65 70 75 80

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn

85 90 95

Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Gly Met Ile Thr Thr Gly Tyr Ala Met Asp

115 120 125

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

130 135 140

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

145 150 155 160

Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

165 170 175

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Thr Ile Val His Ser

180 185 190

Thr Gly His Thr Tyr Leu Glu Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

195 200 205

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

210 215 220

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

225 230 235 240

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

245 250 255

Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

260 265 270

Gly Gly Gly Gly Ser Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu

275 280 285

Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val

290 295 300

Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr

305 310 315 320

Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro

325 330 335

Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser

340 345 350

Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu

355 360 365

Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg

370 375 380

Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln

385 390 395 400

Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr

405 410 415

Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp

420 425 430

Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala

435 440 445

Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

450 455

<210> 60

<211> 272

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗AAA-scFv

<400> 60

Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu Val Phe Leu Ala Leu Ile Leu Lys Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys

20 25 30

Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

35 40 45

Ser Ser Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu

50 55 60

Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Ile Tyr Tyr Pro

65 70 75 80

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn

85 90 95

Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Gly Met Ile Thr Thr Gly Tyr Ala Met Asp

115 120 125

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

130 135 140

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

145 150 155 160

Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

165 170 175

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Thr Ile Val His Ser

180 185 190

Thr Gly His Thr Tyr Leu Glu Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

195 200 205

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

210 215 220

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

225 230 235 240

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

245 250 255

Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

260 265 270

<210> 61

<211> 140

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗AAA VH

<400> 61

Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu Val Phe Leu Ala Leu Ile Leu Lys Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys

20 25 30

Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

35 40 45

Ser Ser Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu

50 55 60

Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Ile Tyr Tyr Pro

65 70 75 80

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn

85 90 95

Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Gly Met Ile Thr Thr Gly Tyr Ala Met Asp

115 120 125

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

130 135 140

<210> 62

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗AAA VL

<400> 62

Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Thr Ile Val His Ser

20 25 30

Thr Gly His Thr Tyr Leu Glu Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 63

<211> 428

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗AAA-Fab-重链-CD28ATM-CD28CSD-CD3zSSD融合物

<400> 63

Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu Val Phe Leu Ala Leu Ile Leu Lys Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys

20 25 30

Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

35 40 45

Ser Ser Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu

50 55 60

Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Ile Tyr Tyr Pro

65 70 75 80

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn

85 90 95

Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Gly Met Ile Thr Thr Gly Tyr Ala Met Asp

115 120 125

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys

130 135 140

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly

145 150 155 160

Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

165 170 175

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

180 185 190

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

195 200 205

Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn

210 215 220

Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro

225 230 235 240

Lys Ser Cys Gly Gly Gly Gly Ser Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly

245 250 255

Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile

260 265 270

Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met

275 280 285

Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro

290 295 300

Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe

305 310 315 320

Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu

325 330 335

Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp

340 345 350

Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys

355 360 365

Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala

370 375 380

Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys

385 390 395 400

Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr

405 410 415

Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

420 425

<210> 64

<211> 243

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗AAA-Fab重链

<400> 64

Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu Val Phe Leu Ala Leu Ile Leu Lys Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys

20 25 30

Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

35 40 45

Ser Ser Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu

50 55 60

Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Ile Tyr Tyr Pro

65 70 75 80

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn

85 90 95

Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Gly Met Ile Thr Thr Gly Tyr Ala Met Asp

115 120 125

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys

130 135 140

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly

145 150 155 160

Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

165 170 175

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

180 185 190

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

195 200 205

Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn

210 215 220

Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro

225 230 235 240

Lys Ser Cys

<210> 65

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗AAA-Fab轻链

<400> 65

Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Thr Ile Val His Ser

20 25 30

Thr Gly His Thr Tyr Leu Glu Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 66

<211> 164

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 66

Met Lys Trp Lys Ala Leu Phe Thr Ala Ala Ile Leu Gln Ala Gln Leu

1 5 10 15

Pro Ile Thr Glu Ala Gln Ser Phe Gly Leu Leu Asp Pro Lys Leu Cys

20 25 30

Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Leu Thr Ala

35 40 45

Leu Phe Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr

50 55 60

Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg

65 70 75 80

Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met

85 90 95

Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn

100 105 110

Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met

115 120 125

Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly

130 135 140

Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala

145 150 155 160

Leu Pro Pro Arg

<210> 67

<211> 492

<212> DNA

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 67

atgaagtgga aggcgctttt caccgcggcc atcctgcagg cacagttgcc gattacagag 60

gcacagagct ttggcctgct ggatcccaaa ctctgctacc tgctggatgg aatcctcttc 120

atctatggtg tcattctcac tgccttgttc ctgagagtga agttcagcag gagcgcagag 180

ccccccgcgt accagcaggg ccagaaccag ctctataacg agctcaatct aggacgaaga 240

gaggagtacg atgttttgga caagagacgt ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg 300

agaaggaaga accctcagga aggcctgtac aatgaactgc agaaagataa gatggcggag 360

gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt 420

taccagggtc tcagtacagc caccaaggac acctacgacg cccttcacat gcaggccctg 480

ccccctcgct aa 492

<210> 68

<211> 164

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 68

Met Lys Trp Lys Val Ser Val Leu Ala Cys Ile Leu His Val Arg Phe

1 5 10 15

Pro Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Gly Leu Leu Asp Pro Lys Leu Cys

20 25 30

Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Ile Thr Ala

35 40 45

Leu Tyr Leu Arg Ala Lys Phe Ser Arg Ser Ala Glu Thr Ala Ala Asn

50 55 60

Leu Gln Asp Pro Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg

65 70 75 80

Glu Glu Tyr Asp Val Leu Glu Lys Lys Arg Ala Arg Asp Pro Glu Met

85 90 95

Gly Gly Lys Gln Gln Arg Arg Arg Asn Pro Gln Glu Gly Val Tyr Asn

100 105 110

Ala Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Thr

115 120 125

Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly

130 135 140

Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Thr

145 150 155 160

Leu Ala Pro Arg

<210> 69

<211> 495

<212> DNA

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 69

atgaagtgga aagtgtctgt tctcgcctgc atcctccacg tgcggttccc aggagcagag 60

gcacagagct ttggtctgct ggatcccaaa ctctgctact tgctagatgg aatcctcttc 120

atctacggag tcatcatcac agccctgtac ctgagagcaa aattcagcag gagtgcagag 180

actgctgcca acctgcagga ccccaaccag ctctacaatg agctcaatct agggcgaaga 240

gaggaatatg acgtcttgga gaagaagcgg gctcgggatc cagagatggg aggcaaacag 300

cagaggagga ggaaccccca ggaaggcgta tacaatgcac tgcagaaaga caagatggca 360

gaagcctaca gtgagatcgg cacaaaaggc gagaggcgga gaggcaaggg gcacgatggc 420

ctttaccagg gtctcagcac tgccaccaag gacacctatg atgccctgca tatgcagacc 480

ctggcccctc gctaa 495

<210> 70

<211> 660

<212> DNA

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 70

atgctgcgcc tgctgctggc gctgaacctg tttccgagca ttcaggtgac cggcaacaaa 60

attctggtga aacagagccc gatgctggtg gcgtatgata acgcggtgaa cctgagctgc 120

aaatatagct ataacctgtt tagccgcgaa tttcgcgcga gcctgcataa aggcctggat 180

agcgcggtgg aagtgtgcgt ggtgtatggc aactatagcc agcagctgca ggtgtatagc 240

aaaaccggct ttaactgcga tggcaaactg ggcaacgaaa gcgtgacctt ttatctgcag 300

aacctgtatg tgaaccagac cgatatttat ttttgcaaaa ttgaagtgat gtatccgccg 360

ccgtatctgg ataacgaaaa aagcaacggc accattattc atgtgaaagg caaacatctg 420

tgcccgagcc cgctgtttcc gggcccgagc aaaccgtttt gggtgctggt ggtggtgggc 480

ggcgtgctgg cgtgctatag cctgctggtg accgtggcgt ttattatttt ttgggtgcgc 540

agcaaacgca gccgcctgct gcatagcgat tatatgaaca tgaccccgcg ccgcccgggc 600

ccgacccgca aacattatca gccgtatgcg ccgccgcgcg attttgcggc gtatcgcagc 660

<210> 71

<211> 220

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 71

Met Leu Arg Leu Leu Leu Ala Leu Asn Leu Phe Pro Ser Ile Gln Val

1 5 10 15

Thr Gly Asn Lys Ile Leu Val Lys Gln Ser Pro Met Leu Val Ala Tyr

20 25 30

Asp Asn Ala Val Asn Leu Ser Cys Lys Tyr Ser Tyr Asn Leu Phe Ser

35 40 45

Arg Glu Phe Arg Ala Ser Leu His Lys Gly Leu Asp Ser Ala Val Glu

50 55 60

Val Cys Val Val Tyr Gly Asn Tyr Ser Gln Gln Leu Gln Val Tyr Ser

65 70 75 80

Lys Thr Gly Phe Asn Cys Asp Gly Lys Leu Gly Asn Glu Ser Val Thr

85 90 95

Phe Tyr Leu Gln Asn Leu Tyr Val Asn Gln Thr Asp Ile Tyr Phe Cys

100 105 110

Lys Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser

115 120 125

Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro

130 135 140

Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly

145 150 155 160

Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile

165 170 175

Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met

180 185 190

Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro

195 200 205

Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

210 215 220

<210> 72

<211> 654

<212> DNA

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 72

atgaccctgc gcctgctgtt tctggcgctg aactttttta gcgtgcaggt gaccgaaaac 60

aaaattctgg tgaaacagag cccgctgctg gtggtggata gcaacgaagt gagcctgagc 120

tgccgctata gctataacct gctggcgaaa gaatttcgcg cgagcctgta taaaggcgtg 180

aacagcgatg tggaagtgtg cgtgggcaac ggcaacttta cctatcagcc gcagtttcgc 240

agcaacgcgg aatttaactg cgatggcgat tttgataacg aaaccgtgac ctttcgcctg 300

tggaacctgc atgtgaacca taccgatatt tatttttgca aaattgaatt tatgtatccg 360

ccgccgtatc tggataacga acgcagcaac ggcaccatta ttcatattaa agaaaaacat 420

ctgtgccata cccagagcag cccgaaactg ttttgggcgc tggtggtggt ggcgggcgtg 480

ctgttttgct atggcctgct ggtgaccgtg gcgctgtgcg tgatttggac caacagccgc 540

cgcaaccgcc tgctgcagag cgattatatg aacatgaccc cgcgccgccc gggcctgacc 600

cgcaaaccgt atcagccgta tgcgccggcg cgcgattttg cggcgtatcg cccg 654

<210> 73

<211> 218

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 73

Met Thr Leu Arg Leu Leu Phe Leu Ala Leu Asn Phe Phe Ser Val Gln

1 5 10 15

Val Thr Glu Asn Lys Ile Leu Val Lys Gln Ser Pro Leu Leu Val Val

20 25 30

Asp Ser Asn Glu Val Ser Leu Ser Cys Arg Tyr Ser Tyr Asn Leu Leu

35 40 45

Ala Lys Glu Phe Arg Ala Ser Leu Tyr Lys Gly Val Asn Ser Asp Val

50 55 60

Glu Val Cys Val Gly Asn Gly Asn Phe Thr Tyr Gln Pro Gln Phe Arg

65 70 75 80

Ser Asn Ala Glu Phe Asn Cys Asp Gly Asp Phe Asp Asn Glu Thr Val

85 90 95

Thr Phe Arg Leu Trp Asn Leu His Val Asn His Thr Asp Ile Tyr Phe

100 105 110

Cys Lys Ile Glu Phe Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Arg

115 120 125

Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Ile Lys Glu Lys His Leu Cys His Thr

130 135 140

Gln Ser Ser Pro Lys Leu Phe Trp Ala Leu Val Val Val Ala Gly Val

145 150 155 160

Leu Phe Cys Tyr Gly Leu Leu Val Thr Val Ala Leu Cys Val Ile Trp

165 170 175

Thr Asn Ser Arg Arg Asn Arg Leu Leu Gln Ser Asp Tyr Met Asn Met

180 185 190

Thr Pro Arg Arg Pro Gly Leu Thr Arg Lys Pro Tyr Gln Pro Tyr Ala

195 200 205

Pro Ala Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Pro

210 215

<210> 74

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD28 YMNM

<400> 74

Tyr Met Asn Met

1

<210> 75

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD28 PYAP

<400> 75

Pro Tyr Ala Pro

1

<210> 76

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 信号肽

<400> 76

Ala Thr Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala

1 5 10 15

Thr Gly Val His Ser

20

<210> 77

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 信号肽DNA序列

<400> 77

atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggtgt gcactcc 57

<210> 78

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗CD20 (GA101)重链

<400> 78

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser

20 25 30

Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

Lys

<210> 79

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗CD20 (GA101)轻链

<400> 79

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Val Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn

85 90 95

Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 80

<211> 447

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗FAP(4B9) PGLALA重链

<400> 80

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

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Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

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His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗FAP (4B9)轻链

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Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

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Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly

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115 120 125

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Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

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165 170 175

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325 330 335

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450

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Leu Leu Arg Tyr Lys Ser Asp Ser Asp Lys Gln Gln Gly Ser Gly Val

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Ser Ser Arg Phe Ser Ala Ser Lys Asp Ala Ser Ala Asn Ala Gly Ile

65 70 75 80

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65 70 75 80

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Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

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355 360 365

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

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385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

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Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly Lys

450

<210> 85

<211> 218

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗CEA (T84.66LCHA)轻链

<400> 85

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<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗CEA (CH1A1A98/992F1) PGLALA重链

<400> 86

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Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

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Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

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Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

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Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly Lys

450

<210> 87

<211> 215

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗CEA (CH1A1A98/992F1)轻链

<400> 87

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr

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Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

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Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Lys Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

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100 105 110

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115 120 125

Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu

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Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val

180 185 190

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195 200 205

Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

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<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗CEA (hMN14) PGLALA重链

<400> 88

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

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Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

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Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

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Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

Lys

<210> 89

<211> 213

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗CEA (hMN14)轻链

<400> 89

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ser

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Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Leu Tyr Arg Ser

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100 105 110

Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr

115 120 125

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Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu

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Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

165 170 175

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala

180 185 190

Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe

195 200 205

Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 90

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗TNC (2B10) PGLALA重链

<400> 90

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

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Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly Lys

450

<210> 91

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗TNC (2B10)轻链

<400> 91

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp

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Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile

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Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asn Gly Leu Gln Pro Ala

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

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210

<210> 92

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<213> 人工序列

<220>

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Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

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Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys

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Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

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Lys

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗HER2 (PER)轻链1

<400> 93

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Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

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65 70 75 80

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Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys

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Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

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Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

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435 440 445

Lys

<210> 95

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗HER2 (PER)轻链2

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<212> PRT

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210

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<213> 人工序列

<220>

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<213> 人工序列

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210

<210> 100

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

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Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

370 375

<210> 101

<211> 213

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗WT1 (33H09)轻链

<400> 101

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

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195 200 205

Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 102

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗WT1 (5E11) PGLALA重链

<400> 102

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

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Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

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370 375

<210> 103

<211> 215

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗WT1 (5E11)轻链

<400> 103

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp

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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

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130 135 140

Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser

145 150 155 160

Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu

165 170 175

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val

180 185 190

Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

195 200 205

Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 104

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗CD3 HCDR1 Kabat

<400> 104

Thr Tyr Ala Met Asn

1 5

<210> 105

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗CD3 HCDR2 Kabat

<400> 105

Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser

1 5 10 15

Val Lys Gly

<210> 106

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗CD3 HCDR3 Kabat

<400> 106

His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 107

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗CD3 LCDR1 Kabat

<400> 107

Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn

1 5 10

<210> 108

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗CD3 LCDR2 Kabat

<400> 108

Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro

1 5

<210> 109

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗CD3 LCDR3 Kabat

<400> 109

Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val

1 5

Claims

ii.在该应答元件控制下的报告基因；和

2.权利要求1的方法,其中该识别域是免疫球蛋白域。

3.权利要求1或2任一项的方法,其中该识别域是Fc域。

4.权利要求3的方法,其中该Fc域是突变型Fc域,其中该突变型Fc域与非突变型亲本Fc域相比包含至少一处氨基酸替代,其中该CAR能够特异性结合该突变型Fc域但不能够特异性结合该非突变型亲本Fc域。

5.权利要求4的方法,其中该突变型Fc域包含选自由依照EU编号方式的L234,L235,I253,H310,P331,P329和H435组成的组的位置处的至少一处氨基酸突变,特别是其中该氨基酸突变是L234A,L235A,I253A,N297A,H310A,P329G和/或H435A。

6.权利要求4或5任一项的方法,其中该突变型Fc域包含依照EU编号方式的氨基酸突变P329G。

7.权利要求1至6任一项的方法,其中该抗原结合模块是Fab片段,特别是自噬菌体展示文库筛选衍生的Fab片段。

8.依照权利要求1至7任一项的方法,其中该应答元件的激活导致该报告基因的表达。

9.依照权利要求1至8任一项的方法,其中该报告基因编码绿色荧光蛋白(GFP)或萤光素酶。

10.依照权利要求1至9任一项的方法,其中该靶抗原选自由CD20,CEA,HER2,TYRP,EGFR,MCSP,STEAP1,WT1和FolR1,或其片段组成的组。

11.依照权利要求1至10任一项的方法,其中该靶抗原是与人主要组织相容性复合物(MHC)的分子结合的肽。

12.依照权利要求11的方法,其中该抗原结合模块是T细胞受体样(TCRL)抗原结合模块。

13.依照权利要求1至12任一项的方法,其中在该靶细胞存在下高水平的该报告基因的表达和在该靶细胞缺失下低水平的该报告基因的表达指示该抗原结合模块的高特异性。

14.依照权利要求1至13任一项的方法,其中在该靶细胞存在下高水平的该报告基因的表达和在该靶细胞缺失下低水平的该报告基因的表达指示包含该抗原结合模块的T细胞双特异性(TCB)抗体的高特异性。

15.一种用于生成TCB抗体的方法,其中该TCB抗体包含对靶抗原特异性的第一抗原结合模块和能够特异性结合T细胞激活性受体的第二抗原结合模块,其中该第一抗原结合模块是依照权利要求1至14任一项的方法选择的。