CN103215293B - Nogo受体拮抗剂 - Google Patents

Nogo受体拮抗剂 Download PDF

Info

Publication number
CN103215293B
CN103215293B CN201210593895.5A CN201210593895A CN103215293B CN 103215293 B CN103215293 B CN 103215293B CN 201210593895 A CN201210593895 A CN 201210593895A CN 103215293 B CN103215293 B CN 103215293B
Authority
CN
China
Prior art keywords
polypeptide
amino acid
antibody
seq
people
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201210593895.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103215293A (zh
Inventor
丹尼尔·H·S·李
文丁一
R·布莱克·佩平斯凯
K·简·雷尔顿
王辛中
阿列克谢·卢戈夫斯科伊
沃纳·迈尔
埃伦·A·加伯
劳拉·西尔维安
保罗·H·魏因雷布
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biogen MA Inc
Original Assignee
Biogen MA Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biogen MA Inc filed Critical Biogen MA Inc
Publication of CN103215293A publication Critical patent/CN103215293A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103215293B publication Critical patent/CN103215293B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/179—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/06—Antiglaucoma agents or miotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/16—Otologicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/38—Drugs for disorders of the endocrine system of the suprarenal hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1136—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against growth factors, growth regulators, cytokines, lymphokines or hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A01K2217/054—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic) inducing loss of function
    • A01K2217/058—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic) inducing loss of function due to expression of inhibitory nucleic acid, e.g. siRNA, antisense
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
    • A01K2267/0356—Animal model for processes and diseases of the central nervous system, e.g. stress, learning, schizophrenia, pain, epilepsy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/32—Fusion polypeptide fusions with soluble part of a cell surface receptor, "decoy receptors"
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C12N2310/111—Antisense spanning the whole gene, or a large part of it
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)

Abstract

本发明披露了免疫原性Nogo受体-1多肽，Nogo受体-1抗体，其抗原结合片段，可溶性Nogo受体及其融合蛋白以及编码它们的核酸。本发明还披露了Nogo受体拮抗剂多聚核苷酸。本发明还披露了包含该种Nogo受体抗体，其抗原结合片段，可溶性Nogo受体及其融合蛋白，编码它们的核酸以及拮抗剂多聚核苷酸的组合物，以及这些成分的制备和使用方法。

Description

NOGO受体拮抗剂
本申请是申请号为200780010338.3，申请日为2007年1月26日，申请人为比奥根艾迪克MA公司，发明创造名称为“NOGO受体拮抗剂”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及神经生物学和分子生物学。本发明更具体涉及免疫原性Nogo受体-1(NgRl)多肽，Nogo受体-1抗体，其抗原结合片段，可溶性Nogo受体及其融合蛋白以及编码它们的核酸。本发明进一步涉及Nogo受体-1拮抗剂多聚核苷酸。本发明进一步涉及包含该种Nogo受体抗体，其抗原结合片段，免疫原性Nogo受体-1多肽，可溶性Nogo受体及其融合蛋白，编码它们的核酸以及拮抗剂多聚核苷酸的组合物，以及这些成分的制备和使用方法。
背景技术
神经元的轴突和树突是由神经元向外延伸的长细胞突起。伸展的轴突或神经突的尖端包含了一个专化的区域，该区域被称作生长锥。生长锥感受局部环境并引导轴突向神经元靶细胞生长。生长锥可响应表面粘性，生长因子，神经传递素和电场等多个环境线索。锥的生长引导涉及多类吸附分子，胞间信号以及刺激和抑制生长锥的因素。生长神经突的生长锥可以不同的速率生长，但其速度通常为每天一至两毫米。
生长锥呈手形，具有可差异吸附至胚胎表面的扁平突起（微端丝或丝状伪足）。丝状伪足具有持续的活性，部分丝状伪足可缩回生长锥，而其它的丝状伪足可持续延长透过基质。不同丝状伪足之间的延长形成了片状伪足。
生长锥通过片状伪足和丝状伪足探索其前方和两侧的区域。当延长物接触到不适宜的表面时，它将缩回当延长物接触到适宜的生长表面时，它将继续延伸并将生长锥导向该方向。生长锥可受到基质表面属性的细微变化所引导。生长锥到达合适的靶细胞后将建立突触联系。
神经细胞的功能受神经元与其直接环境中的其它细胞的接触所影响(U.Rutishauser,T.M.Jessell,Physiol.Rev.68:819(1988))。这些细胞包括中枢神经***(CNS)中的特殊神经胶质细胞，少突细胞以及以髓磷脂（多层膜的隔离结构）包覆神经元轴突的周围神经***(PNS)的施万细胞(G.Lemke,in AnIntroduction to Molecular Neurobiology,Z.Hall,Ed.(Sinauer,Sunderland,Mass.),p.281(1992))。
尽管CNS神经元具有在损伤后再生的能力，该种能力可由于髓磷脂中抑制蛋白的存在，或者也可能由于在其局部环境中常发现的其它类型的分子的存在而受到抑制(Brittis和Flanagan,Neuron50:11-14(2001);Jones等人,J.Neurosc.22:2792-2803(2002);Grimpe等人,J.Neurosci.22:3144-3160(2002))。
在少突细胞上发现的多种髓磷脂抑制蛋白已得到鉴定，例如，NogoA(Chen等人,Nature403:434-439(2000);Grandpre等人,Nature403:439-444(2000)),髓鞘相关糖蛋白(MAG,McKerracher等人,Neuron13:805-811(1994);Mukhopadhyay等人,Neuron13:151-161(1994))以及少突细胞糖蛋白(OM-gp,Mikol和Stefansson,J.Cell.Biol.106:1213-1219(1988))。这些蛋白各自显示为神经元Nogo受体-1的配体(Wang等人,Nature417:941-944(2002);Liu等人,Science297:1190-93(2002);Grandpre等人,Nature403:439-444(2000);Chen等人,Nature403:434-439(2000);Domeniconi等人,Neuron35:283-90(2002))。
Nogo受体-1是一种包含了含8个富亮氨酸重复序列的GPI锚定的膜蛋白(Foumier等人,Nature409:341-346(2001))。在与抑制蛋白(例如，NogoA，MAG和OM-gp)相互作用后，该Nogo受体-1复合物转导了可导致生长锥萎缩和神经突生长抑制的信号。
对抑制Nogo受体-1与其配体结合以及减少髓磷脂-介导的生长锥萎缩和神经突生长抑制的分子存在着迫切的需求。
发明概述
本发明涉及Nogo受体-1拮抗剂在促进神经突生长，神经元存活，以及CNS神经元中轴突再生中的应用。本发明的特征在于可用于抑制神经突生长抑制，促进神经元存活，和/或促进CNS神经元中轴突再生的分子和方法。
本发明还涉及可溶性Nogo受体-1多肽及包含其的融合蛋白，以及针对Nogo受体-1特异性免疫原区的抗体及其抗原片段。本发明还涉及与本发明的抗体结合的免疫原性Nogo受体-1多肽。本发明还涉及可与Nogo受体-1结合的单克隆抗体结合的Nogo受体-1多肽。该种多肽可特别用作免疫原或用于筛选抗体以鉴定与本发明的抗体具有类似特异性的抗体。本发明进一步涉及编码本发明多肽的核酸，包含该种核酸的载体和宿主细胞以及制备该种肽的方法。本发明的抗体，可溶性受体和受体融合蛋白对抗或阻断Nogo受体-1并可用于抑制Nogo受体-1与其配体的结合，抑制神经元内生长锥萎缩并减少神经元内神经突生长或抽芽。
在部分实施方式中，本发明提供了选自如下组合的多肽：AAAFTGLTLLEQLDLSDNAQLR(SEQ ID NO:26);LDLSDNAQLR(SEQID NO:27);LDLSDDAELR(SEQ ID NO:29);LDLASDNAQLR(SEQ IDNO:30);LDLASDDAELR(SEQ ID NO:31);LDALSDNAQLR(SEQ ID NO:32);LD ALSDDAELR(SEQ ID NO:33);LDLSSDNAQLR(SEQ ID NO:34);LDLSSDEAELR(SEQ ID NO:35);DNAQLRWDPTT(SEQ ID NO:36);DNAQLR(SEQ ID NO:37);ADLSDNAQLRVVDPTT(SEQ ID NO:41);ALSDNAQLRWDPTT(SEQ ID NO:42);LDLSDNAALRVVDPTT(SEQ ID NO:43);LDLSDNAQLHVVDPTT(SEQ ID NO:44);以及LDLSDNAQLAVVDPTT(SEQ ID NO:45)。
在部分实施方式中，本发明提供了编码本发明多肽的核酸。在部分实施方式中，该核酸可操作地连接至表达控制序列。在部分实施方式中，本发明提供了包含本发明核酸的载体。
在部分实施方式中，本发明提供了包含本发明核酸或载体的宿主细胞。在部分实施方式中，本发明提供了生产本发明多肽的方法，其包括培养包含本发明核酸或载体的宿主细胞，然后从该宿主细胞或培养基回收该多肽。
在部分实施方式中，本发明提供了生产抗体的方法，其包括以本发明的多肽或包含本发明的核酸或载体的宿主细胞对宿主免疫接种，然后回收抗体。本发明还提供了由该方法生产的抗体及其抗原结合片段。
在部分实施方式中，本发明提供了特异性结合本发明多肽的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体不是由杂交瘤细胞系HB7E11编号PTA-4587-HB7E11)生产的单克隆抗体。
在本发明的部分实施方式中，该抗体或其抗原结合片段(a)抑制神经元的生长锥萎缩；(b)减少对神经元神经突生长和抽芽的抑制；以及(c)抑制Nogo受体-1与配体的结合。在部分实施方式中，该神经突生长和抽芽为轴突生长。在部分实施方式中，该神经元为中枢神经***神经元。
在部分实施方式中，本发明的抗体为单克隆抗体。在部分实施方式中，本发明的抗体为鼠抗体。在部分实施方式中，本发明的抗体选自由人源化抗体，嵌合抗体以及单链抗体构成的组合。
在部分实施方式中，本发明提供了抑制Nogo受体-1与配体结合的方法，其包括将Nogo受体-1与本发明的抗体或其抗原结合片段相接触。在部分实施方式中该配体选自由NogoA,NogoB,NogoC,MAG和OM-gp构成的组合。
在部分实施方式中，本发明提供了抑制神经元中生长锥萎缩的方法，其包括将神经元与本发明的抗体或其抗原结合片段相接触。
在部分实施方式中，本发明提供了减少神经元中神经突生长或抽芽抑制的方法，其包括将神经元与本发明的抗体或其抗原结合片段相接触。在部分实施方式中，该神经突生长或抽芽为轴突生长。在部分实施方式中，该神经元为中枢神经***神经元。
在部分实施方式中，本发明提供了包含药学可接受载体以及本发明的抗体或其抗原结合片段的组合物。在部分实施方式中，该组合物进一步包括一种或多种附加治疗剂。
在部分实施方式中，本发明提供了促进具有死亡风险的神经元存活的方法，其包括将该神经元与有效量的本发明的抗-Nogo受体-1抗体或其抗原结合片段相接触。在部分实施方式中，该神经元处于体外。在部分实施方式中，该神经元在哺乳动物体内。在部分实施方式中，该哺乳动物显示了多发性硬化症，ALS，亨廷顿病，阿尔茨海默病，帕金森氏病，糖尿病神经病变，中风，外伤性脑损伤或脊髓损伤的信号或症状。
在部分实施方式中，本发明提供了在哺乳动物中促进具有死亡风险的神经元存活的方法，其包括(a)提供表达本发明抗-Nogo受体-1抗体或其抗原结合片段的培养后的宿主细胞；以及(b)在该神经元的位点或附近将该宿主细胞导入该哺乳动物。
在部分实施方式中，本发明提供了促进具有死亡风险的神经元存活的基因治疗方法，其中该神经元处于哺乳动物体内，其包括在该神经元位点或附近施用包含了编码本发明抗-Nogo受体-1抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列的病毒载体，其中该抗-Nogo受体-1抗体或其抗原结合片段的表达量足以促进该神经元的存活。
在部分实施方式中，本发明提供了包含除了最多三个氨基酸替换外选自如下组合的氨基酸序列的具有60个残基或少于60个残基的分离多肽：SEQ ID NO:49的氨基酸309-335;SEQ IDNO:49的氨基酸309-336;SEQ ID NO:49的氨基酸309-337;SEQ IDNO:49的氨基酸309-338;SEQ ID NO:49的氨基酸309-339;SEQ IDNO:49的氨基酸309-340;SEQ ID NO:49的氨基酸309-341;SEQ IDNO:49的氨基酸309-342;SEQ ID NO:49的氨基酸309-343;SEQ IDNO:49的氨基酸309-344;SEQ ID NO:49的氨基酸309-345;SEQ IDNO:49的氨基酸309-346;SEQ ID NO:49的氨基酸309-347;SEQ IDNO:49的氨基酸309-348;SEQ ID NO:49的氨基酸309-349;SEQ IDNO:49的氨基酸309-350;SEQ ID NO:49的氨基酸300-344;SEQ IDNO:49的氨基酸301-344;SEQ ID NO:49的氨基酸302-344;SEQ IDNO:49的氨基酸303-344;SEQ ID NO:49的氨基酸304-344;SEQ IDNO:49的氨基酸305-344;SEQ ID NO:49的氨基酸306-344;SEQ IDNO:49的氨基酸307-344;SEQ ID NO:49的氨基酸308-344;SEQ IDNO:49的氨基酸336-344;SEQ ID NO:49的氨基酸335-344;SEQ IDNO:49的氨基酸334-344;SEQ ID NO:49的氨基酸333-344;SEQ IDNO:49的氨基酸332-344;SEQ ID NO:49的氨基酸331-344;SEQ IDNO:49的氨基酸330-344;SEQ ID NO:49的氨基酸329-344;SEQ EONO:49的氨基酸328-344;SEQ ID NO:49的氨基酸327-344;SEQ IDNO:49的氨基酸326-344;SEQ ID NO:49的氨基酸325-344;SEQ IDNO:49的氨基酸324-344;SEQ ID NO:49的氨基酸323-344;SEQ IDNO:49的氨基酸322-344;SEQ ID NO:49的氨基酸321-344;SEQ IDNO:49的氨基酸320-344;SEQ ID NO:49的氨基酸319-344;SEQ IDNO:49的氨基酸318-344;SEQ ID NO:49的氨基酸317-344;SEQ IDNO:49的氨基酸316-344;SEQ ID NO:49的氨基酸315-344;SEQ IDNO:49的氨基酸314-344;SEQ ID NO:49的氨基酸313-344;SEQ IDNO:49的氨基酸312-344;SEQ ID NO:49的氨基酸311-344;SEQ IDNO:49的氨基酸310-344;SEQ ID NO:49的氨基酸336-344;SEQ IDNO:49的氨基酸336-345;SEQ ID NO:49的氨基酸336-346;SEQ IDNO:49的氨基酸336-347;SEQ ID NO:49的氨基酸336-348;SEQ IDNO:49的氨基酸336-349;SEQ ID NO:49的氨基酸336-350;任意所述多肽片段的变体或衍生物，以及至少两个任意所述多肽片段的组合。
在部分实施方式中，本发明提供了包含选自如下组合的氨基酸序列的具有60个残基或少于60个残基的分离多肽：SEQ IDNO:49的氨基酸311-344;SEQ ID NO:49的氨基酸310-348;SEQ IDNO:49的氨基酸323-328;SEQ ID NO:49的氨基酸339-348;SEQ IDNO:49的氨基酸378-414;SEQ ID NO:49的氨基酸27-38;SEQ IDNO:49的氨基酸39-61;SEQ ID NO:49的氨基酸257-267;SEQ IDNO:49的氨基酸280-292;SEQ ID NO:49的氨基酸301-323;SEQ IDNO:49的氨基酸335-343;SEQ ID NO:49的氨基酸310-335;SEQ IDNO:49的氨基酸326-328;任意所述多肽片段的变体或衍生物，以及至少两个任意所述多肽片段的组合。
在部分实施方式中，本发明提供了具有60个残基或少于60个残基的分离多肽片段，其包含除了最多三个单独氨基酸替换外与参考氨基酸序列一致的氨基酸序列，其中所述的参考氨基酸序列选自如下组合：(a)SEQ ID NO:49的氨基酸x-344，(b)SEQ IDNO:49的氨基酸309-y，以及(c)SEQ ID NO:49的氨基酸x-y，其中x为由305至326的任意整数，而y是由328至350的任意整数；并且其中所述的多肽片段抑制Nogo-受体介导的神经突生长抑制。在部分实施方式中，本发明提供了具有60个残基或少于60个残基的分离多肽片段，其包含除了最多三个单独氨基酸替换外与参考氨基酸序列一致的氨基酸序列，其中所述的参考氨基酸序列选自如下组合：(a)SEQ ID NO:49的氨基酸x'-344，(b)SEQ ID NO:49的氨基酸309-y'，以及(c)SEQ ID NO:49的氨基酸x'-y'，其中x'为由300至326的任意整数，而y'是由328至360的任意整数；并且其中所述的多肽片段抑制Nogo-受体介导的神经突生长抑制。在部分实施方式中，本发明提供了具有60个残基或少于60个残基的分离多肽片段，其包含除了最多三个单独氨基酸替换外与参考氨基酸序列一致的氨基酸序列，其中所述的参考氨基酸序列选自如下组合：SEQ ID NO:49的氨基酸309-335;SEQ ID NO:49的氨基酸309-344;SEQ ID NO:49的氨基酸310-335;SEQ ID NO:49的氨基酸310-344;SEQ ID NO:49的氨基酸309-350;SEQ ID NO:49的氨基酸300-344;以及SEQ ID NO:49的氨基酸315-344。在部分实施方式中，本发明提供了具有60个残基或少于60个残基的分离多肽片段，其包含除了最多三个单独氨基酸替换外与参考氨基酸序列一致的氨基酸序列，其中所述的参考氨基酸序列为SEQ ID NO:49的氨基酸309-335。
在部分实施方式中，本发明所提供的多肽为环状。在部分实施方式中，该环状多肽进一步包含连接在N-末端的第一分子和连接在C-末端的第二分子；其中所述的第一分子和所述的第二分子彼此连接形成所述的环状分子。在部分实施方式中，该第一和第二分子选自如下组合：生物素分子，半胱氨酸残基，以及乙酰化半胱氨酸残基。在部分实施方式中，该第一分子为连接至本发明多肽N-末端的生物素分子而该第二分子为连接至本发明多肽C-末端的半胱氨酸残基。在部分实施方式中，该第一分子为连接至本发明多肽N-末端的乙酰化半胱氨酸残基而该第二分子为连接至本发明多肽C-末端的半胱氨酸残基。在部分实施方式中，该第一分子为连接至本发明多肽N-末端的乙酰化半胱氨酸残基而该第二分子为连接至本发明多肽C-末端的半胱氨酸残基。在部分实施方式中，该C-末端半胱氨酸连接了NH2部分。
在部分实施方式中，本发明提供了包含第一多肽片段和第二多肽片段的分离多肽，其中所述的第一多肽片段包含了除了最多二十个单独氨基酸替换外与第一参考氨基酸序列一致的氨基酸序列，其中所述的第一参考氨基酸序列选自如下组合：(a)SEQ IDNO:49的氨基酸a-445，(b)SEQ ID NO:49的氨基酸27-b，以及(c)SEQID NO:49的氨基酸a-b，其中a为由25至35的任意整数，而b是由300至450的任意整数；其中所述的第二多肽片段包含了除了最多二十个单独氨基酸替换外与第二参考氨基酸序列一致的氨基酸序列，其中所述的第二参考氨基酸序列选自如下组合：(a)SEQ IDNO:49的氨基酸c-445，(b)SEQ ID NO:49的氨基酸27-d，以及(c)SEQID NO:49的氨基酸c-d，其中c为由25至35的任意整数，而d是由300至450的任意整数；并且其中所述的多肽抑制Nogo-受体介导的神经突生长抑制。在部分实施方式中，本发明进一步提供了包含第一多肽片段和第二多肽片段的分离多肽，其中该第一多肽片段包含了除了最多二十个单独氨基酸替换外与第一参考氨基酸序列一致的氨基酸序列，其中该第一参考氨基酸序列选自如下组合：(a)SEQ ID NO:49的氨基酸27-310，以及(b)SEQ ID NO:49的氨基酸27-344。在部分实施方式中，本发明进一步提供了包含第一多肽片段和第二多肽片段的分离多肽，其中该第二多肽片段包含了除了最多二十个单独氨基酸替换外与第二参考氨基酸序列一致的氨基酸序列，其中该第二参考氨基酸序列选自如下组合：(a)SEQ ID NO:49的氨基酸27-310，以及(b)SEQ ID NO:49的氨基酸27-344。在部分实施方式中，本发明进一步提供了包含第一多肽片段和第二多肽片段的分离多肽，其中该第二多肽片段包含了除了最多二十个单独氨基酸替换外与第一参考氨基酸序列一致的氨基酸序列，其中该第一参考氨基酸序列包含SEQ ID NO:49的氨基酸27-310而该第二参考氨基酸序列包含SEQ ID NO:49的氨基酸27-310，或其中其中该第一参考氨基酸序列包含SEQ ID NO:49的氨基酸27-344而该第二参考氨基酸序列包含SEQ ID NO:49的氨基酸27-310，或其中该第一参考氨基酸序列包含SEQ ID NO:49的氨基酸27-344而该第二参考氨基酸序列包含SEQ ID NO:49的氨基酸27-344。在部分实施方式中，本发明进一步提供了该第一多肽片段位于该第二多肽片段的上游。在部分实施方式中，本发明进一步提供了在第一多肽片段和第二多肽片段之间的肽接头。在部分实施方式中，本发明进一步提供了该肽接头包含SEQ ID NO:65(G4S)3。在部分实施方式中，本发明进一步提供了该肽接头包含SEQ ID NO:66(G4S)2。
在部分实施方式中，本发明提供了本发明的多肽，其中至少一个半胱氨酸残基被外源氨基酸替换。在部分实施方式中，该至少一个半胱氨酸残基为C266。在部分实施方式中，该至少一个半胱氨酸残基为C309。在部分实施方式中，该至少一个半胱氨酸残基为C335。在部分实施方式中，该至少一个半胱氨酸残基位于C336。在部分实施方式中，该至少一个半胱氨酸残基被选自丙氨酸，丝氨酸和苏氨酸的氨基酸替换。在部分实施方式中，该替换氨基酸为丙氨酸。
在部分实施方式中，本发明提供了分离多肽，其包含：(a)除了参考氨基酸序列中至少一个半胱氨酸残基被不同氨基酸替换外，与所述参考序列一致的氨基酸序列，其中所述的参考氨基酸序列选自如下组合：(i)SEQ ID NO:49的氨基酸a-445，(ii)SEQ IDNO:49的氨基酸27-b，以及(iii)SEQ ID NO:49的氨基酸a-b，其中a为由25至35的任意整数，而b是由300至450的任意整数；以及(b)外源多肽；其中所述的多肽抑制Nogo-受体介导的神经突生长抑制。在部分实施方式中，本发明进一步提供了所述的参考氨基酸序列的C266被不同氨基酸替换。在部分实施方式中，本发明进一步提供了所述的参考氨基酸序列的C309被不同氨基酸替换。在部分实施方式中，本发明进一步提供了所述的参考氨基酸序列的C335被不同氨基酸替换。在部分实施方式中，本发明进一步提供了所述的参考氨基酸序列的C266和C309被不同氨基酸替换。在部分实施方式中，本发明进一步提供了所述的参考氨基酸序列的C309和C335被不同氨基酸替换。在部分实施方式中，本发明进一步提供了该不同的氨基酸为丙氨酸。
在部分实施方式中，本发明提供了分离多肽，其包含：(a)除了最多二十个单独氨基酸替换外与参考序列一致的氨基酸序列，其中所述的参考氨基酸序列选自如下组合：(i)SEQ ID NO:49的氨基酸a-445，(ii)SEQ ID NO:49的氨基酸27-b，以及(iii)SEQID NO:49的氨基酸a-b，其中a为由25至35的任意整数，而b是由300至450的任意整数；以及(b)外源多肽；其中所述的多肽抑制Nogo-受体介导的神经突生长抑制。
在部分实施方式中，本发明提供了包含第一多肽片段和第二多肽片段的分离多肽，其中所述的第一多肽片段包含除了最多二十个单独氨基酸替换外与第一参考氨基酸序列一致的氨基酸序列，其中所述的第一参考氨基酸序列选自如下组合：(a)SEQ IDNO:60的氨基酸a-305，(b)SEQ ID NO:60的氨基酸1-b，以及(c)SEQID NO:60的氨基酸a-b，其中a为由1至27的任意整数，而b是由264至309的任意整数；并且其中所述的第二多肽片段包含了除了最多二十个单独氨基酸替换外与第二参考氨基酸序列一致的氨基酸序列，其中所述的第二参考氨基酸序列选自如下组合：(a)SEQID NO:49的氨基酸c-332，(b)SEQ ID NO:49的氨基酸275-d，以及(c)SEQ ID NO:49的氨基酸c-d，其中c为由265至306的任意整数，而d是由308至340的任意整数；并且其中所述的多肽抑制Nogo-受体介导的神经突生长抑制。在特定的实施方式中，该第一参考氨基酸序列选自如下组合：(a)SEQ ID NO:49的氨基酸1-274；以及(b)SEQ ID NO:49的氨基酸1-305。在特定的实施方式中，该第二参考氨基酸序列选自如下组合：(a)SEQ ID NO:60的氨基酸275-311；(b)SEQ ID NO:60的氨基酸275-332；(c)SEQ ID NO:60的氨基酸306-311；(d)SEQ ID NO:60的氨基酸306-308；以及(e)SEQID NO:60的氨基酸306-309。在一种实施方式中，该第一多肽片段序列包含SEQ ID NO:49的氨基酸1-274而该第二多肽片段包含SEQID NO:60的氨基酸275-311。在部分实施方式中，该第一多肽片段序列包含SEQ ID NO:49的氨基酸1-274而该第二多肽片段包含SEQID NO:60的氨基酸275-332。在部分实施方式中，该第一多肽片段序列包含SEQ ID NO:49的氨基酸1-305而该第二多肽片段包含SEQID NO:60的氨基酸306-308。在部分实施方式中，该第一多肽片段序列包含SEQ ID NO:49的氨基酸1-305而该第二多肽片段包含SEQID NO:60的氨基酸306-309。在部分实施方式中，至少一个附加氨基酸被添加至第二多肽片段的C-末端。在一种实施方式中，该至少一个附加氨基酸为色氨酸。在部分实施方式中，该第一多肽片段的A269被不同的氨基酸替换。在一种实施方式中，该不同的氨基酸为色氨酸。
在部分实施方式中本发明提供了包含第一多肽片段和第二多肽片段的分离多肽，其中所述的第一多肽片段除了不超过二十个单独氨基酸替换外由SEQ ID NO:49的氨基酸1-310组成；且其中所述的第二多肽片段除了不超过五个单独氨基酸替换外由SEQID NO:60的氨基酸311-318组成；并且其中所述的多肽抑制nogo-受体-介导的神经突生长抑制。
在部分实施方式中本发明进一步提供了该外源多肽选自以下组合：(a)血清白蛋白，(b)Fc区，(c)信号肽，(d)多肽标记，以及(e)两种或多种所述外源多肽的组合。在部分实施方式中，本发明进一步提供了该Fc区选自如下组合：IgA Fc区；IgD Fc区；IgG Fc区；IgE Fc区以及IgM Fc区。在一种实施方式中，该Fc区为IgG Fc区。在部分实施方式中，本发明进一步提供了介于该氨基酸序列和IgG Fc区之间的肽接头。在部分实施方式中，该肽接头包含了SEQ ID NO:66(G4S)2。在部分实施方式中，本发明进一步提供了该多肽标记选自如下组合：FLAG标记；Strep标记；聚组氨酸标记；VSV-G标记；流感病毒血凝素(HA)标记；以及c-Myc标记。
在部分实施方式中，本发明提供了与一种或多种聚烷撑二醇部分连接的本发明多肽。在部分实施方式中，本发明进一步提供了该一种或多种聚烷撑二醇部分为聚乙二醇(PEG)部分。在部分实施方式中，本发明进一步提供了与1-5PEG部分连接的本发明多肽。
在部分实施方式中，本发明提供了编码本发明多肽的分离多聚核苷酸。在部分实施方式中，本发明进一步提供了该核苷酸序列被可操作地连接至表达控制元件（例如，可诱导启动子，组成型启动子，或分泌信号）。附加的实施方式包括包含本发明分离多聚核苷酸的载体以及包含所述载体的宿主细胞。
在部分实施方式中，本发明提供了选自如下组合的分离多聚核苷酸：(i)反义多聚核苷酸；(ii)核酶；(iii)小干扰RNA(siRNA)；以及(iv)小发夹RNA(shRNA)。
在部分实施方式中，多聚核苷酸为包含了与NgRl mRNA编码部分互补的至少10个碱基的反义多聚核苷酸。在部分实施方式中，该多聚核苷酸为核酶。
在更进一步的实施方式中，该多聚核苷酸为siRNA或shRNA。在部分实施方式中，本发明提供了该siRNA或shRNA抑制NgRl表达。在部分实施方式中，本发明进一步提供了该siRNA或shRNA与包含了CUACUUCUCCCGCAGGCG或CCCGGACCGACGUCUUCAA或CUGACCACUGAGUCUUCCG的核苷酸序列至少有90％的一致性。在另一实施方式中，该siRNA或shRNA核苷酸序列为CUACUUCUCCCGCAGGCG或CCCGGACCGACGUCUUCAA或CUGACCACUGAGUCUUCCG。
在部分实施方式中，本发明进一步提供了该siRNA或shRNA核苷酸序列与多聚核苷酸序列GATGAAGAGGGCGTCCGCT或GGGCCTGGCTGCAGAAGTT或GACTGGTGACTCAGAG AAGGC生成的mRNA互补。
本发明的附加实施方式包括药物组合物，其包括本发明的多肽，多聚核苷酸，载体或宿主细胞并在特定的实施方式中包括药学可接受的载体。在特定的实施方式中，该组合物包含SEQ IDNO:7的氨基酸27-310以及抗炎剂。在另一实施方式中，该组合物包含SEQ ID NO:9的氨基酸27-310以及抗炎剂。在部分实施方式中，本发明进一步提供了该抗炎剂选自由甾体抗炎剂和非甾体抗炎剂构成的组合。在特定的实施方式中，该甾体抗炎剂选自如下组合：氢化可的松，21-醋酸基娠烯醇酮，阿氯米松，阿尔孕酮，安西奈德，丙酸倍氯米松，倍他米松，倍他米松戊酸，布***，氯***，丙酸氯倍他索，丙酸氯倍他索，氯倍他松，氯倍他松丁酸盐，氯可托龙，氯泼尼醇，皮质酮，可的松，可的伐唑，deflazacon，***，去羟米松，***，二氟拉松，二氟可龙，二氟泼尼酯，甘草次酸，氟扎可特，氟氯奈德，氟美松，新戊酸氟米松，氟尼缩松，氟轻松曲安缩松，醋酸氟轻松，氟氢松醋酸酯曲安缩松，氟可丁丁酯，氟考龙，氟考龙己酸盐，二氟可龙戊酸盐，氟米龙，氟培龙醋酸盐，醋酸氟泼尼定，氟泼尼龙，氟氢缩松，氟甲酰龙，哈西奈德，卤美他松，卤***醋酸盐，氢可他酯，氢化可的松，醋酸氢化可的松，丁酸氢化可的松，氢化可的松磷酸盐，氢化可的松，21-琥珀酸钠，氢化可的松叔丁乙酸盐，马泼尼酮，甲羟松，甲基强的松，甲泼尼龙，糠酸莫米松，帕拉米松，泼尼卡酯，强的松，强的松龙21-diedryaminoacetate，***龙磷酸钠，醋酸***龙琥珀酸钠，强的松龙钠21-m-苯磺酸，强的松龙钠21-硬脂酸乙醇酸酯，叔丁乙酸盐强的松，强的松龙21-三甲基乙酸盐，***，***龙戊酸酯，泼尼立定，泼尼立定21-二乙氨基醋酸盐，替可的松，曲安西龙，曲安西龙曲安缩松，苯曲安奈德和己曲安奈德。在特定的实施方式中，该甾体抗炎剂为甲泼尼龙。在另一实施方式中，该非甾体抗炎剂选自如下组合：阿明洛芬，苯恶洛芬，布氯酸，卡布洛芬，芬布芬，非诺洛芬，氟洛芬，氟比洛芬，布洛芬，吲哚洛芬，酮洛芬，咪洛芬，萘普生，奥沙普秦，吡洛芬，普拉洛芬，舒洛芬，噻洛芬酸，硫恶洛芬，吲哚美辛，阿西美辛，阿氯芬酸，环氯茚酸，双氯芬酸，芬氯酸，芬克洛酸，芬替酸，呋罗芬酸，异丁芬酸，伊索克酸，oxpinac，舒林酸，硫平酸，托美汀，齐多美辛，佐美酸，氟芬那酸，甲氯芬那酸酸，甲芬那酸，尼氟灭酸，托芬那酸，二氟尼柳，氟苯沙酸，伊索昔康，吡罗昔康，舒多昔康，替诺昔康，乙酰水杨酸，柳氮磺胺吡啶，阿扎丙宗，bezpiperylon，非普拉宗，莫非布宗，羟基保泰松和苯乙丁氮酮。
附加的实施方式包括组合物，其中SEQ ID NO:7或9的氨基酸27-310被融合至外源多肽。在部分实施方式中，该外源多肽为Fc。
本发明的实施方式还包括促进神经突生长的方法，其包括将神经元与包含本发明的多肽，多聚核苷酸或组合物的药剂相接触，其中所述的药剂抑制Nogo受体1介导的神经突生长抑制。
附加实施方式包括抑制NgRl信号转导复合物的信号转导的方法，其包括将神经元与有效量的包含本发明的多肽，多聚核苷酸或组合物的药剂相接触，其中所述的药剂抑制NgRl信号转导复合物的信号转导。
其它实施方式包括在哺乳动物中治疗中枢神经***(CNS)疾病，紊乱或损伤的方法，其包括向需要该种治疗的哺乳动物施用有效量的包含本发明的多肽，多聚核苷酸或组合物的药剂相接触，其中所述的药剂抑制Nogo受体1介导的神经突生长抑制。在特定的实施方式中，该疾病，紊乱或损伤选自如下组合：多发性硬化症，ALS，亨廷顿病，阿尔茨海默病，帕金森氏病，糖尿病神经病变，中风，外伤性脑损伤，脊髓损伤，视神经炎，青光眼，听力丧失以及肾上腺脑白质营养不良。
在部分实施方式中本发明进一步提供了该多肽被融合至外源多肽。在部分实施方式中，该外源多肽为血清白蛋白。在部分实施方式中，该外源多肽为Fc区。在部分实施方式中，该外源多肽为信号肽。在部分实施方式中，该外源多肽为多肽标记。在部分实施方式中，本发明进一步提供了该Fc区选自如下组合：IgA Fc区；IgD Fc区；IgG Fc区；IgE Fc区以及IgM Fc区。在部分实施方式中，本发明进一步提供了该多肽标记选自如下组合：Flag标记；Strep标记；聚组氨酸标记；VSV-G标记；流感病毒血凝素(HA)标记；以及c-Myc标记。
附图说明
图1为Nogo受体-1的结构示意图。人sNogoR310包含SEQ ID NO:7的残基26-310而sNogoR344包含SEQ ID NO:6的残基26-344。大鼠sNogoR310包含SEQ ID NO:9的残基27-310而sNogoR344包含SEQ ID NO:8的残基27-344。
图2显示了通过Vector Nti　软件获得的Nogo受体-1蛋白的抗原性图。大鼠P-617为SEQ ID NO:10而大鼠P-618为SEQID NO:11。人P-617为SEQ ID NO:47而人P-618为SEQ ID NO:48。
图3A显示了抗-Nogo受体-1抗体7E11的结合活性。该图显示了7E11浓度对Nogo66与Nogo受体-1结合的影响。图3B显示了抗-Nogo受体-1抗体1H2的结合活性。该图显示了1H2浓度对Nogo66与sNogoR344-Fc（在此处和美国专利申请60/402,866中也称为Fc-sNogoR344或Ig-sNogoR344）结合的影响。Fc-MAG不与Nogo66竞争结合sNogoR344-Fc。
图4显示了抗Nogo-R-1抗体1H2,3G5和2F7的ELISA结果。抗体在固定化抗原存在下对OD450的作用得到了检测。该固定化抗原为sNogoR310-Fc（在此处和美国专利申请60/402,866中也称为Fc-sNogoR310或Ig-sNogoR310）,sNogoR344-Fc，p-617，p-618，p-4，p-5和卵白蛋白以及BSA。
图5显示了单克隆抗体7E11在不同数量的髓磷脂存在下对大鼠DRG神经突生长的作用。
图6A显示了在如下竞争者存在下sNogoR310与l25I-Nogo66或125I-Nogo40的结合作用：Nogo66，Nogo40以及抗-Nogo受体-1单克隆抗体上清液。图6B显示了125I-Nogo66与sNogoR310的结合活性。
图7显示了sNogoR310-Fc对125I-Nogo40与sNogoR310结合的作用。
图8显示了sNogoR310-Fc与125I-Nogo40的结合活性。
图9A显示了sNogoR310在髓磷脂存在或缺失的情况下对神经突生长/细胞的作用。图9B显示了sNogoR310在髓磷脂存在或缺失的情况下对神经突生长的作用。
图10A显示了sNogoR310-Fc在持续增多的髓磷脂的存在或缺失下对大鼠DRG神经突生长的作用。图10B显示了在以PBS，PBS+sNogoR310-Fc,20ng髓磷脂和髓磷脂+sNogoR310-Fc处理后的神经突/细胞数。
图11显示了单克隆抗体5B10在持续增多的髓磷脂存在下对DRG神经突生长/细胞的作用。
图12显示了在大鼠脊髓横切模型中直至诱导损伤后30日内sNogoR310-Fc对BBB评分的作用。
图13A和13B报导了WT或转基因小鼠品系08或品系01进行脊髓半切后运动BBB评分随时间的变化。图13C显示了WT和转基因小鼠损伤后最大容忍倾斜角度随时间的变化。图13D显示了倾斜网格爬升过程中后肢错误随损伤后时间的变化。在所有的图中均报导了每组7-9只小鼠的平均±s.e.m.。转基因组的值与WT小鼠的值具有统计学差异（双星号，P<0.01；学生t检验）。
图14A显示了在溶媒或sNogoR310-Fc处理动物进行脊髓半切后运动BBB评分随时间的变化。图14B显示了网格行走过程中后肢错误随损伤后时间的变化。图14C显示的足迹分析揭示了对照小鼠比未损伤或损伤+sNogoR310-Fc大鼠具有更短的步长和更大的步幅。在所有的图中均报导了每组7-9只大鼠的平均±s.e.m.。sNogoR310-Fc组的值与对照的值具有统计学差异（图14A-B）。在图14C中的对照值和无SCI或SCI+sNogoR310-Fc大鼠的值具有统计学差异。（星号，p<0.05；双星号，p<0.01；学生t检验）。
图15显示了抗-rNgRl抗体1D9与大鼠NgRl的可溶性片段(srNgR310)的结合模型。
图16A显示了人Nogo受体cDNA的核苷酸序列。在起始和终止密码子下添加了下划线。选定的RNAi靶区以斜体表示。RNAi-1和RNAi-3特异性靶向人NgR基因，所设计的RNAi-2靶向人，小鼠和大鼠NgR基因。图16B显示了用于将NgR RNAi构建进入表达载体pU6的DNA寡聚核苷酸的核苷酸序列。
图17显示了在小鼠L细胞中RNAi阻抑的瞬时转染测试的结果。
图18显示了人NgR表达载体对SKN和293细胞的转染。
图19显示了人SKN细胞中RNAi阻抑的瞬时转染测试。
图20显示了RNAi慢病毒载体的示意图。该RNAi表达盒可***PacI位点或EcoRI位点。LTR-长末端重复；RRE-Rev应答元件；cPPT-中央聚嘌呤通道；CBA-鸡β肌动蛋白；WPRE-旱獭肝炎转录后调节元件；SIN LTR-自我失活型LTR。
图21显示了以7E11抗体验证克隆Neuroscreen细胞中NgRl阻抑的western印迹分析。
图22显示了以LV(克隆#3G9，1E51E91E10)，LV-NgRRNAi或原态细胞转导的克隆NeuroScreen细胞中NgR表达的概括。Western印迹中的NgR和GAPDH信号通过光密度扫描进行定量。
图23显示了通过不同的NgR阻抑水平构建的四种NeuroScreen细胞克隆。NgR表达表示为原态NeuroScreen细胞中NgR:GAPDH信号比例的百分比。
图24A-B显示了融合至大鼠IgG[NgR(310)ecto-Fc]的大鼠NgRl(27-310)胞外区结构域和甲泼尼龙(MP)在体外对髓磷脂诱导的鸡背根神经节(DRGs)中神经突生长抑制的作用。(A)将分离胚胎13天的鸡背根神经节神经元在NgR(310)ecto-Fc或NgR(310)ecto-Fc存在下置于磷酸盐缓冲液(PBS)或髓磷脂(400ng/微孔)中。(B)以PBS对照±SEM(η-3)百分比表示的每个细胞(η-3)神经突生长的定量。比例尺，200μm。与PBS对照比较P<0.05。
图25A-E显示了融合至大鼠IgG[NgR(310)ecto-Fc]的大鼠NgRl(27-310)胞外区结构域和甲泼尼龙(MP)对脊髓损伤(SCI)后功能性恢复的作用。(A)在4周内每周记录BBB评分。(B)SCI后两天MP-处理大鼠中的BBB评分。(C)对单独动物的BBB评分归一化至第二日。(D)一致性脚掌行走频率和后肢-前肢协调性，显示了SCI后3和4周获得14或更高评分的各组中的大鼠比例。(E)NgR(310)ecto-Fc-和MP+NgR(310)ecto-Fc-处理组的平均步长与对照的比较。
图26A-B显示了融合至大鼠IgG[NgR(310)ecto-Fc]的大鼠NgRl(27-310)胞外区结构域和甲泼尼龙(MP)处理对尾部至脊髓损伤后轴突数量的作用。
图27显示了融合至大鼠IgG[NgR(310)ecto-Fc]的大鼠NgRl(27-310)胞外区结构域和甲泼尼龙(MP)处理对接触腹角运动神经元的生物素葡聚糖胺(BDA)-标记的轴突数量的作用。
发明详述
定义及通用技术
除非另行说明，此处所用的技术和科学术语的含义等同于本发明所属领域普通技术人员的普遍理解。在产生冲突的情况下，将受本申请包括定义所支配。此外，除非上下文另行指明，单数形式的术语可包括复数形式，而复数形式的术语可包括单数形式。此处涉及的所有出版物，专利及其它参考文献均以全部目的在此全文引用作为参考。
尽管其它与此处所述类似或等同的方法和材料也可用于对本发明的实施或测试，下文描述了适用的方法和材料。该材料，方法和实施例仅作阐释目的，并非意在限制。从具体描述和权利要求中可显而易见地得到本发明的其它特征和优势。
在整个说明书和权利要求中，术语“包含”及其变体应理解为包括了任何所列举的整体或整体组合，但排除了任何其它整体或整体组合。
为进一步明确本发明，此处提供了下列术语和定义。
应当注意术语“一个”或“一种”实体指一个或多个该种实体；例如，“一种免疫球蛋白分子”应理解为代表一个或多个免疫球蛋白分子。因此，术语“一个”（或“一种”），“一个或多个”以及“至少一个”在此处可进行互换。
在整个说明书和权利要求中，术语“由…组成”及其变体指包括了任何所列举的整体或整体组合，但该特定的方法，结构或组合物中不可加入其它的整体或整体组合。
在整个说明书和权利要求中，术语“基本由…组成”及其变体指包括了任何所列举的整体或整体组合，且选择性地包含了不会实质改变特定的方法，结构或组合物的基础或新颖性能的整体或整体组合。”
此处所用的“抗体”指完整的免疫球蛋白，或其抗原结合片段。本发明的抗体可属于任何同型或类别（例如，M，D，G，E和A）或任何亚类（例如，Gl-4,Al-2），并可具有kappa(K)或lambda(λ)轻链。
此处所用的“Fc”指包含一种或多种重链恒定区CH1，CH2和CH3的免疫球蛋白重链部分。例如，抗体的重链恒定区的一部分可通过木瓜蛋白酶获得。
此处所述的“NogoR融合蛋白”指包含融合至外源多肽的可溶性Nogo受体-1部分的蛋白。
此处所用的“人源化抗体”指至少部分非人源序列被人源序列替换的抗体。如何制备人源化抗体的范例可参见美国专利6,054,297,5,886,152以及5,877,293。
此处所用的“嵌合抗体”指包含了一个或多个来自第一抗体的区域并包含了一个或多个来自另一抗体的区域的抗体。该第一抗体和附加抗体可来自相同或不同物种。
如此处和美国专利申请60/402,866所用，“Nogo受体”，“NogoR”，“NogoR-1”，“NgR”，“NgR-1”，“NgRl”以及“NGRl”均指Nogo受体-1。
此处所用的术语“多肽”同时包括了单数和复数的“多肽”，并指由酰胺键（也称作肽键）线性连接的单体（氨基酸）所组成的一种分子。术语“多肽”指任何两个或多个氨基酸的链，且不指定产物的具体长度。因此，肽，二肽，三肽，寡肽，“蛋白”，“氨基酸链”或任何其它指代两个或多个氨基酸链的术语都包含在“多肽”的定义之内，且术语“多肽”可取代任何上述术语或与之互换。术语“多肽”还指多肽表达后修饰的产物，该种修饰包括但不限于糖基化，乙酰化，磷酸化，酰胺化，通过已知的保护/阻断基团进行衍生化，蛋白水解裂解，或通过非天然存在的氨基酸进行修饰。多肽可衍生自天然的生物来源或通过重组技术生产，但不一定需要翻译自指定的核酸序列。它可通过任何方式生成，包括化学合成。
本发明的多肽的大小约为3个或更多，5个或更多，10个或更多，20个或更多，25个或更多，50个或更多，75个或更多，100个或更多，200个或更多，500个或更多，1000个或更多，或者2000个或更多的氨基酸。多肽可具有一种指定的三维结构，但并非必须具有该种结构。具有指定三维结构的多肽被称为折叠结构，而不具有指定三维结构，但可采用多种构型的多肽被称为未折叠结构。此处所用的术语糖蛋白指一种至少与一个糖部分连接的蛋白，该糖部分通过一种氨基酸残基（例如丝氨酸残基或天冬氨酸残基）的含氧或含氮侧链与蛋白连接。
“分离的”多肽或其片段，变体或衍生物指一种不存在于其天然环境中的多肽。不要求达到特定的纯化水平。例如，一种分离的多肽可取自其自然的或天然的环境中。在宿主细胞中表达的重组生产的多肽和蛋白被认为对于本发明的目的而言是分离的，因为它们是通过任何合适的技术分离，分割，或者部分或充分纯化的天然或重组多肽。
在本发明中，“多肽片段”指更大多肽的短氨基酸序列。蛋白片段可以是“独立式的”或是包含在更大的多肽中（该片段作为其部分）。本发明的多肽片段的代表性范例包括，例如，包含约5个氨基酸，约10个氨基酸，约15个氨基酸，约20个氨基酸，约30个氨基酸，约40个氨基酸，约50个氨基酸，约60个氨基酸，约70个氨基酸，约80个氨基酸，约90个氨基酸，以及约100个氨基酸或长度更长的片段。
术语“片段”，“变体”，“衍生物”及“类似物”在指本发明的多肽时包括任何至少保留了部分生物活性的任意多肽。只要该多肽仍然能发挥功能，此处所述的多肽可不受限制地包括其片段，变体或衍生物。本发明的可溶性NgRl多肽可包括水解片段，删除片段并特别包括传递至动物时更容易到达作用位点的片段。多肽片段进一步包括包含了天然多肽抗原性或免疫原性表位（包括线性和三维表位）的任意多肽部分。本发明的可溶性NgRl多肽和多肽片段包括变体区，包括如上所述的片段，以及具有由氨基酸替换，缺失或***所得的变更氨基酸序列的多肽。变体可天然产生，例如等位基因变体。“等位基因”指占据了有机体的染色体上给定位点的基因的副本。Genes II,Lewin,B.,ed.,John Wiley&Sons,New York(1985).非天然存在的变体可通过本领域已知的突变技术制备。本发明的NgRl多肽和多肽片段可包含保守或非保守氨基酸替换，缺失或添加。本发明的NgRl多肽和多肽片段还可包含衍生分子。变体多肽在此也可称为“多肽类似物”。此处所用的多肽或多肽片段“衍生物”指具有一个或多个经过功能性侧基团反应化学衍生得到的残基的主体多肽。“衍生物”还包括包含了二十个标准氨基酸的一个或多个天然存在的氨基酸衍生物的肽。例如，4-羟基脯氨酸可取代脯氨酸；5-羟基赖氨酸可取代赖氨酸；3-甲基组氨酸可取代组氨酸；高丝氨酸可取代丝氨酸；以及鸟氨酸可取代赖氨酸。
此处所用的术语“二硫键”包括了两个硫分子间形成的共价键。氨基酸半胱氨酸包含了能与另一硫醇基团形成二硫键或桥的硫醇基团。
此处所用的“融合蛋白”指包含了通过肽键可操作地连接至第二多肽的第一多肽的蛋白。该第一多肽和第二多肽可相同或不同，且它们可直接连接或通过肽接头进行连接（见下文）。
术语“多聚核苷酸”包括了单数或复数的核酸，并指分离的核酸分子或构建体，例如，信使RNA(mRNA)或质粒DNA(pDNA)。多聚核苷酸和包含全长cDNA序列的核苷酸序列，包括未翻译的5'和3'序列，编码序列。多聚核苷酸可包括常规的磷酸二酯键或非常规的键（例如，于肽核酸(PNA)等发现的酰胺键）。多聚核苷酸可由可以是未修饰RNA或DNA或是修饰后的RNA或DNA的任何多聚核糖核苷酸或多聚脱氧核苷酸组成。例如，多聚核苷酸可由单链和双链DNA，由单链和双链区混合得到的DNA，单链和双链RNA，以及由单链和双链区混合得到的RNA，包含了可能是单链，或者更典型为双链或单链和双链区混合物的DNA和RNA的杂交分子所组成。此外，该多聚核苷酸可由包含RNA或DNA或者同时包含RNA和DNA的三链区所组成。多聚核苷酸还可包含为稳定或为其它目的进行修饰的一个或多个修饰碱基或者DNA或RNA骨架。“修饰的”碱基包括，例如，三苯甲基化碱基和异常碱基如肌苷。DNA和RNA可进行多种修饰；因此，“多聚核苷酸”包括了化学，酶或代谢修饰的形式。
术语“核酸”指在多聚核苷酸中存在的任何一个或多个核酸片段，例如DNA或RNA片段。“分离的”核酸或多聚核苷酸指从其天然环境中分离的核酸分子，DNA或RNA。例如，包含在载体中的一种编码NgR多肽或多肽片段的重组多聚核苷酸被认为对于本发明的目的而言是分离的。分离多聚核苷酸的进一步范例包括存在于外源宿主细胞中的重组多聚核苷酸或在溶液中（部分或完全）纯化的多聚核苷酸。分离的RNA分子包括对本发明多聚核苷酸的体内或体外RNA转录物。如本发明所述的分离的多聚核苷酸或核酸进一步包括合成制备的该种分子。此外，多聚核苷酸或核酸可以是启动子，核糖体结合位点或转录终止子等调节元件或是包含该种调节元件。
此处所用的“编码区”指由翻译氨基酸的密码子组成的一部分核酸。尽管“终止密码子”(TAG,TGA,或TAA)不翻译成氨基酸，它仍可被认为是编码区的一部分，但如启动子，核糖体结合位点，转录终止子等侧翼序列不是编码区的一部分。本发明的两个或多个编码序列可存在于一个单独的多聚核苷酸构建体（例如，单独的载体）中或分离的多聚核苷酸构建体（例如，分离的（不同）载体）中。此外，任何载体可包含一个单独的编码区，或包含两个或多个编码区，例如，一种单独载体可分别编码一种免疫球蛋白的重链可变区和一种免疫球蛋白的轻链可变区。此外，本发明的载体，多聚核苷酸或核酸可编码与编码本发明NgR多肽或多肽片段的核酸融和或未融合的外源编码区。外源编码区包括但不限于专门的元件或基序，例如分泌信号肽或外源功能性区域。
在特定的实施例中，该多聚核苷酸或核酸为DNA。当为DNA时，一种包含了编码多肽的核酸的多聚核苷酸通常包括与一个或多个编码区域可操作连接的一个启动子和/或其它转录或翻译控制元件。可操作的连接指当某种基因产物（例如，多肽）的编码区域与一个或多个调节序列以一种特定方式连接时，基因产物的表达受到调节序列的影响或控制。如启动子功能的诱导可使mRNA的转录编码目标基因产物，并且如果两个DNA片段之间的接头的性质不干扰表达调节序列引导基因产物表达的能力或干扰DNA模板被转录的能力，则两个DNA片段（例如一个多肽编码区域和与之连接的启动子）被“可操作地连接”。因此，如果一个启动子能够影响一种编码多肽的核酸的转录，则该启动子区域将被可操作地连接至该核酸。该启动子可以是一种仅能在预定细胞中引导DNA的充分转录的细胞特异性启动子。除启动子外的其它转录控制元件，如增强子，操作子，阻遏子以及转录终止信号可与多聚核苷酸进行可操作连接以引导细胞特异性转录。此处披露了合适的启动子和其它转录控制区。
各种转录控制区域已为本领域技术人员所熟知。其包括，但不限于，在脊椎动物细胞中起作用的转录控制区域，例如，但不限于，来自细胞巨化病毒的启动子和增强子片段（立即早期启动子，与内含子-A相连接），猿病毒40（早期启动子）以及逆转录酶病毒（例如禽劳斯肉瘤病毒）。其它的转录控制区域包括衍生自肌动蛋白，热休克蛋白，牛生长激素和兔β-球蛋白的脊椎动物基因的区域以及其它能够在真核细胞中控制基因表达的序列。其它合适的转录控制区域包括组织特异性启动子和增强子以及淋巴因子-诱导型启动子（例如，受干扰素或白介素诱导的启动子）。
类似地，各种翻译控制元件已为本领域的普通技术人员所熟知。其包括，但不限于核糖体结合位点，翻译启动和终止密码子以及衍生自小核糖核酸病毒的元件（特别是内部核糖体进入位点，或是IRES，也被称为CITE序列）。
在其它的实施方式中，本发明的多聚核苷酸为RNA，例如，以信使RNA(mRNA)的形式存在。
本发明的多聚核苷酸和核酸编码区可与编码分泌或信号肽的附加编码区（引导本发明的多聚核苷酸编码的多肽的分泌）相连接。根据信号假设，由哺乳动物细胞分泌的蛋白具有一种信号肽或分泌型前导序列，后者在生长蛋白链向粗面内质网的输出被启动时从成熟蛋白上被裂解。本领域的普通技术人员均了解由脊椎动物分泌的多肽通常具有融合到多肽N末端的信号肽，它从完整或“全长”多肽序列裂解以生产分泌或“成熟”型多肽。在特定实施例中采用了如免疫球蛋白重链或轻链信号肽等天然信号肽，或保留了引导与之可操作连接的多肽分泌能力的该序列的功能性衍生物。此外还可以使用外源哺乳动物信号肽或其功能性衍生物。例如，野生型前导序列可被人组织型纤溶酶原激活剂(TPA)或小鼠β-葡萄糖醛酸酶的前导序列替换。
此处所用的术语“工程改造的”包括通过人工方法（例如，通过重组技术，体外肽合成，肽的酶催化或化学偶合或是这些技术的组合）处理核酸或多肽分子。
此处所用的术语“连接的”，“融合的”或“融合”可相互替换。这些术语指通过化学连接或重组技术等任何方法连接两个或多个元件或成分。“框内融合”指以能够维持原始开放阅读框架(ORFs)的正确翻译阅读框的方式连接两个或多个多聚核苷酸ORFs以形成一个更长的连续ORF。因此，重组融合蛋白是一种含有两个或更多与原始ORFs所编码的多肽相应的片段的单独蛋白（该片段一般在天然状态下不进行该种连接）。尽管该阅读框架在融合片段中彼此连续，该片段可被框内接头序列等序列物理或空间分隔。
“接头”序列指在融合蛋白中分割两个多肽编码区的一种或多种氨基酸的系列。典型的接头至少包含5个氨基酸。其它的接头包含至少10个或至少15个氨基酸。在特定的实施方式中，可对肽接头的氨基酸进行选择以使该接头具有亲水性。接头(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3(G4S)3(SEQ ID NO:65)为一种优选接头，它由于可提供足够的灵活性而广泛应用于多种抗体。其它接头包括(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2(G4S)2(SEQ ID NO:66)，Glu Ser Gly ArgSer Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser(SEQ ID NO:67)，Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr(SEQID NO:68)，Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser LysSer Thr Gln(SEQ ID NO:69)，Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser GlySer Glu Ser Lys Val Asp(SEQ ID NO:70)，Gly Ser Thr Ser GlySer Gly Lys Ser Ser Glu Gly Lys Gly(SEQ ID NO:71)，Lys GluSer Gly Ser Val Ser Ser Glu Gln Leu Ala Gln Phe Arg Ser LeuAsp(SEQ ID NO:72)以及Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser Glu Glu LeuAla Phe Arg Ser Leu Asp(SEQ ID NO:73)。更短接头的范例包括上述接头的片段，而更长接头的范例包括上述接头的组合，上述接头片段的组合，以及上述接头与上述接头片段的组合。
在有关多肽的上下文中，“线性序列”或“序列”指多肽中的由氨基向羧基末端方向排列的氨基酸，其中序列内彼此相邻的残基在多肽的一级结构内邻近。
此处所用的术语“表达”指通过基因生产RNA或多肽等生化物质的过程。该过程包括任何该基因的功能存在的显现，包括但不限于，基因阻抑以及瞬时表达和稳定表达。它包括但不限于将基因转录为信使RNA(mRNA)，转移RNA(tRNA)，小发夹RNA(shRNA)，小干扰RNA(siRNA)或任何其它RNA产物，和将mRNA翻译为多肽，以及调节转录或翻译的任何过程。如果该最终产物是一种生化产物，则表达包括了该种生化产物和任何前体的生成。基因的表达产生了“基因产物”。此处所用的基因产物既可以是核酸（例如，由基因转录生成的信使RNA），也可以是通过转录物翻译得到的多肽。此处所述的基因产物进一步包括经过转录后修饰（例如，多聚腺苷酸化）的核酸，或是经翻译后修饰（例如，甲基化，糖基化，以及脂质的添加，与其它蛋白亚基的结合，蛋白水解裂解等）的多肽。
术语“RNA干扰”或“RNAi”指通过siRNAs来沉默或减少基因表达。双相区对沉默基因序列具有同源性的siRNA启动了动物和植物的序列特异性，转录后基因沉默过程。该基因可以是该有机体的内源或外源基因，整合于染色体或存在于未整合入基因组的转染载体。该基因的表达被完全或部分抑制。也有人认为RNAi可抑制靶RNA的功能；该靶RNA的功能可以是完全或部分的。
此处所用的术语“治疗”指治疗性或预防性措施，其目的为预防或延缓（减轻）有害的生理变化或紊乱，例如多发性硬化症的发展。有益或目标临床结果包括，但不限于，可测或不可测的症状的缓和，疾病程度的减轻，疾病状态的稳定（即，不恶化），疾病进展的延迟或减缓，疾病状态的改善或减轻，以及（部分或完全）消除。“治疗”还指与未接受治疗的预计存活相比更长的存活时间。需要接受治疗的对象包括已经患有疾病或紊乱以及容易患该疾病或紊乱的对象或是需要预防该疾病或紊乱的对象。
“对象”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”指需要进行诊断，预后或治疗的任何对象，特别是哺乳动物对象。哺乳动物对象包括，但不限于，人类，驯养动物，畜牧动物以及动物园，运动，宠物动物，例如狗，猫，豚鼠，兔子，大鼠，小鼠，马，家畜，牛等；灵长类动物，例如猴，猿，以及黑猩猩；犬科动物，如狗和狼；猫科动物，如猫，狮以及虎；马科动物，如马，驴以及斑马；食用动物，如牛，猪以及羊；有蹄动物，如鹿和长颈鹿；啮齿动物，如小鼠，大鼠，仓鼠以及豚鼠等。在特定的实施方式中，该哺乳动物为人类对象。
此处所用的“治疗有效量”指在必要的剂量和时间周期下其效果足以达到所需的治疗结果的数量。治疗结果可以是，例如，症状的减轻，延长存活时间，改善活动性等等。治疗结果不必要“治愈”。
此处所用的“预防有效量”指在必要的剂量和时间周期下其效果足以达到所需的预防结果的数量。由于预防剂量通常在疾病发生前或疾病早期施用，预防有效量将小于治疗有效量。
本发明涉及促进CNS神经元等神经元存活，神经元的神经突生长和轴突再生的特定NgRl拮抗剂。例如，本发明提供了在通常轴突生长被抑制的条件下刺激轴突生长的NgRl多肽和多肽片段，抗体及其片段，以及多聚核苷酸。因此，本发明的NgRl拮抗剂可用于治疗能够通过促进神经元存活，或通过刺激CNS中轴突生长或再生得到缓和的损伤，疾病或紊乱。
示范性的CNS疾病，紊乱或损伤包括，但不限于，多发性硬化症(MS)，进行性多灶性脑白质病(PML)，脑脊髓炎(EPL)，桥脑中央髓鞘溶解症(CPM)，脑白质营养不良，亚历山大病以及佩-梅病(PMZ)，球形细胞脑白质营养不良(克拉伯病)以及华勒氏变性，视神经炎，横贯性脊髓炎，肌萎缩性侧索硬化症(ALS)，亨廷顿舞蹈病，阿尔茨海默病，帕金森氏病，脊髓损伤，颅脑损伤，辐射后损伤，化疗后的神经***并发症，中风，急性缺血性视神经病变，维生素E缺乏症，单独的维生素E缺乏综合症，AR，巴康氏综合症，Marchiafava-Bignami综合症，异染性脑白质营养不良症，三叉神经痛和贝尔麻痹症。MS是这些疾病中传播最广的一种，在全世界约有250万患者。
Nogo受体-1多肽
一方面，本发明涉及具有免疫原性的Nogo受体-1多肽。在本发明的部分实施方式中，该免疫原性多肽主要由选自以下组合的氨基酸序列组成：LDLSDNAQLRVVDPTT(大鼠)(SEQ ID NO:1)；LDLSDNAQLRSVDPAT(人)(SEQ ID NO:2)；AVASGPFRPFQTNQLTDEELLGLPKCCQPDAADKA(大鼠)(SEQ ID NO:3)；AVATGPYHPIWTGRATDEEPLGLPKCCQPDAADKA(人)(SEQ ID NO:4)；以及CRLGQAGSGA(小鼠)(SEQ ID NO:5)。
在部分实施方式中，本发明涉及被结合Nogo受体-1的单克隆抗体结合的Nogo受体-1多肽。在部分实施方式中，该多肽被单克隆7E11抗体识别。在部分实施方式中，该多肽选自如下组合：LDLSDNAQLR(SEQ ID NO:27)；LDLSDDAELR(SEQ ID NO:29)；LDLASDNAQLR(SEQ ID NO:30)；LDLASDDAELR(SEQ ID NO:31)；LDALSDNAQLR(SEQ ID NO:32)；LDALSDDAELR(SEQ ID NO:33)；LDLSSDNAQLR(SEQ ID NO:34)；LDLSSDEAELR(SEQ ID NO:35)；DNAQLRVVDPTT(SEQ ID NO:36)；DNAQLR(SEQ ID NO:37)；ADLSDNAQLRVVDPTT(SEQ ID NO:41)；LALSDNAQLRVVDPTT(SEQ IDNO:42)；LDLSDNAALRVVDPTT(SEQ ID NO:43)；LDLSDNAQLHVVDPTT(SEQ ID NO:44)；以及LDLSDNAQLAVVDPTT(SEQ ID NO:46)。
在部分实施方式中，本发明涉及编码SEQ ID NOs:1-5,26-27,29-37和41-45的多肽的核酸。在本发明的部分实施方式中，该核酸分子被连接至表达控制序列（例如，pCDNA(I)）。
本发明还涉及了包含编码本发明多肽的核酸的载体。在本发明的部分实施方式中，该载体为克隆载体。在本发明的部分实施方式中，该载体为表达载体。在本发明的部分实施方式中，该载体包含至少一个选择性标记。
本发明还涉及包含上述核酸或载体的宿主细胞。
本发明还涉及包含培养宿主细胞步骤的生产本发明免疫原性多肽的方法。在部分实施方式中，该宿主细胞为原核细胞。在部分实施方式中，该宿主细胞为真核细胞。在部分实施方式中，该宿主细胞为酵母。
本发明还涉及可用于，例如，促进神经突生长，促进神经元存活，促进轴突存活，或抑制NgR1信号转导复合物的信号转导的特定Nogo受体-1多肽和多肽片段。本发明的多肽和多肽片段通常通过阻断NgR1-介导的神经元存活，中枢神经***(CNS)神经元的神经突生长或轴突再生的抑制来产生作用。人NgR1多肽显示为下文的SEQID NO：49。
全长人NgR1(SEQ ID NO：49)：
MKRASAGGSRLLAWVLWLQAWQVAAPCPGACVCYNEPKVTTSCPQQGLQAVPVGIPA
ASQRIFLHGNRISHVPAASFRACRNLTILWLHSNVLARIDAAAFTGLALLEQLDLSDNAQ
LRSVDPATFHGLGRLHTLHLDRCGLQELGPGLFRGLAALQYLYLQDNALQALPDDTFR
DLGNLTHLFLHGNRISSVPERAFRGLHSLDRLLLHQNRVAHVHPHAFRDLGRLMTLYLF
ANNLSALPTEALAPLRALQYLRLNDNPWVCDCRARPLWAWLQKFRGSSSEVPCSLPQR
LAGRDLKRLAANDLQGCAVATGPYHPIWTGRATDEEPLGLPKCCQPDAADKASVLEPG
RPASAGNALKGRVPPGDSPPGNGSGPRHINDSPFGTLPGSAEPPLTAVRPEGSEPPGFPTS
GPRRRPGCSRKNRTRSHCRLGQAGSGGGGTGDSEGSGALPSLTCSLTPLGLALVLWTVL
GPC
大鼠NgR1多肽显示为下文的SEQ ID NO：50。
全长大鼠NgR1(SEQ ID NO：50)：
MKRASSGGSRLLAWVLWLQAWRVATPCPGACVCYNEPKVTTSCPQQGLQAVP
TGIPASSQRIFLHGNRISHVPAASFQSCRNLTILWLHSNALARIDAAAFTGLTLLEQLDLSDNAQL
HVVDPTTFHGLGHLHTLHLDRCGLRELGPGLFRGLAALQYLYLQDNNLQALPDNTFRDLGNLT
HLFLHGNRIPSVPEHAFRGLHSLDRLLLHQNHVARVHPHAFRDLGRLMTLYLFANNLSMLPAEV
LMPLRSLQYLRLNDNPWVCDCRARPLWAWLQKFRGSSSEVPCNLPQRLADRDLKRLAASDLEG
CAVASGPFRPIQTSQLTDEELLSLPKCCQPDAADKASVLEPGRPASAGNALKGRVPPGDTPPGNG
SGPRHINDSPFGTLPSSAEPPLTALRPGGSEPPGLPTTGPRRRPGCSRKNRTRSHCRLGQAGSGAS
GTGDAEGSGALPALACSLAPLGLALVLWTVLGPC
小鼠NgR1多肽显示为下文的SEQ ID NO：51。
全长小鼠NgR1(SEQ ID NO：51)：
MKRASSGGSRLLAWVLWLQAWRVATPCPGACVCYNEPKVTTSCPQQGLQAVP
TGIPASSQRIFLHGNRISHVPAASFQSCRNLTILWLHSNALARIDAAAFTGLTLLEQLDLSDNAQL
HVVDPTTFHGLGHLHTLHLDRCGLRELGPGLFRGLAALQYLYLQDNNLQALPDNTFRDLGNLT
HLFLHGNRIPSVPEHAFRGLHSLDRLLLHQNHVARVHPHAFRDLGRLMTLYLFANNLSMLPAEV
LMPLRSLQYLRLNDNPWVCDCRARPLWAWLQKFRGSSSEVPCNLPQRLADRDLKRLAASDLEG
CAVASGPFRPIQTSQLTDEELLSLPKCCQPDAADKASVLEPGRPASAGNALKGRVPPGDTPPGNG
SGPRHINDSPFGTLPSSAEPPLTALRPGGSEPPGLPTTGPRRRPGCSRKNRTRSHCRLGQAGSGAS
GTGDAEGSGALPALACSLAPLGLALVLWTVLGPC
抗体
本发明进一步涉及特异性结合本发明的Nogo受体-1多肽的抗体或其抗原结合片段。在部分实施方式中该抗原或抗原结合片段与主要由选自SEQ I D NO s：1-5，26-27，29-37和41-45的氨基酸序列组成多肽相结合。本发明的抗体或抗原结合片段可在体内或体外生产。下文讨论了抗体或抗原结合片段的生产。
本发明的抗体或其抗原结合片段抑制Nogo受体-1与配体(例如，NogoA，NogoB，NogoC，MAG，OM-gp)的结合并减少髓磷脂介导的对神经突生长和抽芽，特别是轴突生长的抑制，还可减少髓磷脂介导的生长锥萎缩。
在部分实施方式中，该抗-Nogo受体-1抗体或其抗原结合片段来自鼠科动物。在部分实施方式中，该Nogo受体-1来自大鼠。在其它实施方式中，该Nogo受体-1来自人。在部分实施方式中，该抗-Nogo受体-1抗体或其抗原结合片段为重组，工程改造，人源化和/或嵌合。
在部分实施方式中，该抗体选自组合：单克隆7E11编号PTA-4587-HB7E11)；单克隆1H2编号PTA-4584-HB1H2)；单克隆2F7编号PTA-4585-HB2F7)；单克隆3G5编号PTA-4586-HB3G5)；以及单克隆5B10编号PTA-4588-HB5B10)。在部分实施方式中，该抗体为多克隆抗体46。
示范性的抗原结合片段为Fab，Fab'，F(ab')2，Fv，Fd，dAb，以及包含决定簇互补区(CDR)片段的片段，单链抗体(scFv)，嵌合抗体，双价抗体以及至少包含免疫球蛋白部分的多肽，其中该部分足以使该多肽进行特异性抗原结合（例如，免疫粘附素）。
此处所用的Fd指由VH和CH1区组成的片段；Fv指由抗体单臂的VL和VH区组成的片段；而dAb指由VH区组成的片段（Ward等人,Nature341:544-546(1989)）。此处所用的单链抗体(scFv)指VL区和VH区通过可使其形成单蛋白链的合成接头配对形成单价分子的抗体(Bird等人,Science242:423-426(1988)and Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA55:5879-5883(1988))。此处所用的双价抗体指双特异性抗体，其中VH和VL区表达在单个多肽链上，但所采用的接头太短以至于不能使同一链上的两个区域配对，因而迫使该区域与另一条链上的互补区配对并产生两个抗原结合位点（例如，参见Holliger,P.,等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993)以及Poljak,R.J.,等人,Structure2:1121-1123(1994)。）此处所用的特异性结合目标抗原的免疫粘附素指一种共价或非共价整合了一个或多个CDRs的分子。
在部分实施方式中，本发明提供了本发明Nogo受体-1抗体的亚基多肽，其中该亚基多肽选自如下组合：(a)重链或其可变区；以及(b)轻链或其可变区。
在部分实施方式中，本发明提供了本发明的Nogo受体-1抗体的亚基多肽的编码重链或其可变区，或是轻链和其可变区的核酸。
在部分实施方式中，本发明提供了本发明的Nogo受体-1抗体的高变区(CDR)或编码CDR的核酸。
免疫
本发明的抗体可通过免疫接种适当的宿主（例如，包括人，小鼠，大鼠，绵羊，山羊，猪，牛，马，爬行动物，鱼，两栖动物等脊椎动物，以及在鸟，爬行动物和鱼的卵中）生成。该种抗体可以是多克隆或单克隆抗体。
在部分实施方式中，该宿主通过本发明的免疫原性Nogo受体-1多肽进行免疫接种。在其它实施方式中，该宿主以与完整或破碎细胞的细胞膜相关的Nogo受体-1进行免疫接种且本发明的抗体通过与本发明的Nogo受体-1多肽进行鉴定。
在部分实施方式中，该Nogo受体-1抗原与佐剂施用以刺激免疫应答。通常需要伴随抗原施用佐剂以引发该抗原的免疫应答。该种佐剂通常为可促进非特异性发炎，并在免疫位点募集单核噬菌细胞的不溶或不可降解物质。佐剂的范例包括，但不限于，弗氏试剂，RIBI(胞壁酰二肽)，ISCOM(免疫刺激复合物)或其片段。
对抗体制备方法的综述可参见，例如，Harlow和Lane,Antibodies,A Laboratory Manual(1988);Yelton,D.E.等人,Ann.Rev.of Biochem.50:657-80.(1981);以及Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology(New York:John Wiley&Sons)(1989)。以本发明的免疫原性Nogo受体-1多肽对免疫反应性的测定可通过本领域公知的多种方法中的任意一种进行，包括，例如，免疫印迹测定和ELISA。
抗体生产及生产抗体的细胞系
本发明的单克隆抗体可通过上文例如Harlow和Lane,Antibodies,A Laboratory Manual(1988)中描述的标准方法进行制备。
简言之，在适当的时间处死动物，并采用例如EBV或与永生化细胞系（例如骨髓瘤细胞）的融合产物通过本领域公知的多种方法（包括但不限于转化）中的任意一种永生化***和/或B-细胞。然后，将细胞克隆分离并测试各克隆的上清液中对本发明的免疫原性Nogo受体-1多肽具有特异性的抗体的生成。选择，克隆和扩增杂交瘤的方法已为本领公知。类似地，鉴定免疫球蛋白基因的核苷酸和氨基酸序列的方法已为本领域所知。
生产本发明抗体的其它适用技术包括在体外将淋巴细胞暴露至本发明的Nogo受体-1或免疫原性多肽，或替代性地，在噬菌体或类似的载体中选择抗体库。参见Huse等人,Science,246:1275-81(1989)。可用于本发明的抗体可修饰或未修饰状态下使用。
抗原（此处为本发明的Nogo受体-1或免疫原性多肽）和抗体可通过共价或非共价连接能提供可测信号的物质进行标记。各种标记和结合技术已为本领域所知，并可用于实施本发明。适用的标记包括，但不限于，核素，酶，底物，辅因子，抑制剂，荧光剂，化学发光剂，磁性颗粒等。揭示该种标记使用的专利包括美国专利3,817,837;3,850,752;3,939,350;3,996,345;4,277,437;4,275,149和4,366,241。此外还可生产重组免疫球蛋白（参见美国专利4,816,567）。
在本发明的部分实施方式中，抗体具有多重结合特异性，例如通过本领域技术人员已知的一系列技术中的任意一种制备的双功能抗体，该种技术包括生产杂交杂交瘤，二硫键取代，化学交联，在两个单克隆抗体间添加肽接头，向特定细胞系导入两组免疫球蛋白重和轻链等等（参见下文更具体的讨论）。
本发明的抗体还可以是人单克隆抗体，例如，通过永生化人细胞，通过SCID-hu小鼠或其它能生成“人”抗体的非人动物生产的抗体。
噬菌体展示库
本发明的抗-Nogo受体-1抗体可通过筛选重组组合抗体库分离得到。示范性组合可结合本发明的免疫原性Nogo受体-1多肽，例如通过本发明的免疫原性Nogo受体-1多肽免疫化的动物的mRNA制备的VL和VH cDNAs制备的scFv噬菌体展示库。制备和筛选该种库的方法已为本领域所知。可通过商业的方法和材料生成噬菌体展示库（例如，Pharmacia重组噬菌体抗体***，目录编号27-9400-01；Stratagene SurfZAP　噬菌体展示试剂盒，目录编号240612；以及MorphoSys的其它产品）。还存在其它可用于生成和筛选抗体展示库的方法和试剂（例如，参见Ladner等人.美国专利号5,223,409;Kang等人.PCT公开号WO92/18619；Dower等人.PCT公开号WO91/17271；Winter等人PCT公开号WO92/20791；Markland等人.PCT公开号WO92/15679;Breitling等人.PCT公开号WO93/01288;McCafferty等人.PCT公开号WO92/01047;Garrard等人.PCT公开号WO92/09690；Fuchs等人,Bio/Technology P:1370-1372(1991);Hay等人,Hum.Antibod.Hybridomas3:81-85;(1992)Huse等人,Science246:1275-1281(1989)；McCafferty等人,Nature348:552-554(1990);Griffiths等人,EMBO J.12:725-734(1993);Hawkins等人,J.MoI.Biol.226:889-896(1992);Clackson等人,Nature352:624-628(1991);Gram等人,Proc.Natl Acad.Sci.USA89:3576-3580(1992)；Garrad等人,Bio/Technology9:1373-1377(1991);Hoogenboom等人,Nucl.Acids Res.7P:4133-4137(1991)；以及Barbas等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA55:7978-7982(1991)。
从重组免疫球蛋白展示库筛选和分离本发明的抗-Nogo受体-1抗体后，可从展示包（例如，从噬菌体基因组）中获得编码选定抗体的核酸，并通过标准的重组DNA技术亚克隆进入其它的表达载体。该核酸可根据需要进行进一步操作以生成下文所述的本发明其它抗体形式。如上所述，为表达通过筛选组合库分离得到的抗体，可将编码该抗体重链和轻链或其可变区的DNA克隆进入重组表达载体并导入哺乳动物宿主细胞。
类型转换
本发明的抗-Nogo受体-1抗体可以是任意同型。任意目标同型的抗体均可通过类型转换生成。为进行类型转换，可采用本领域公知技术分离不包括编码CL或CH的核苷酸序列的编码VL或VH的核酸。然后该编码VL或VH的核酸被可操作地连接至来自目标免疫球蛋白分子类别的编码CL或CH的核苷酸序列。如上所述，这可以通过采用包含CL或CH链的载体或核酸实现。例如，最初为IgM的本发明的抗-Nogo受体-1抗体可被转换为IgG。此外，类型转换可用于将一种IgG亚类转化为另一种亚类，例如，由IgG1至IgG2。
突变抗体
在其它实施方式中，本发明的抗体或抗原结合片段可在重链和/或轻链的可变区进行突变以改变抗体的结合属性。例如，可在一个或多个CDR区进行突变以提高或降低抗体对Nogo受体-1的Kd，提高或降低Koff，或改变该抗体的结合特异性。定点突变的技术已为本领域公知。例如，参见Sambrook等人,MolecularCloning-A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor LaboratoryPress(1989)和Ausubel等人,Current Protocols in MolecularBiology(New York:John Wiley&Sons)(1989)。在优选的实施方式中，可在已知与本发明的抗-Nogo受体-1抗体的可变区中的胚系不同的氨基酸残基进行突变。在部分实施方式中，可在已知与本发明的抗-Nogo受体-1抗体的可变区中的胚系不同的一个或多个氨基酸残基进行突变。在另一实施方式中，在编码抗体重链或轻链可变区的核酸中的一个或多个框架区发生突变。可在恒定区或框架区进行突变以提高半衰期。还可通过框架区或恒定区的突变来改变抗体的免疫原性，提供与另一分子的共价或非共价结合位点，或改变补体固定等特性。可在单个突变抗体的框架区，恒定区和可变区分别进行突变。此外，可仅在单个突变抗体的框架区，恒定区和可变区中的一个进行突变。
融合抗体和免疫粘附素
在其它实施方式中，可制备包含了完全或部分连接至另一多肽的本发明抗-Nogo受体-1抗体的融合抗体或免疫粘附素。在部分实施方式中，仅抗-Nogo受体-1抗体的可变区被连接至该多肽。在其它实施方式中，本发明抗-Nogo受体-1抗体的VH区被连接至第一多肽，而该抗体的VL区被连接至第二多肽，且该第一多肽和第二多肽彼此关联的方式使得VH和VL可以相互作用以形成抗体结合位点。在其它实施方式中，该VH区和VL区由允许VH和VL区相互作用的接头隔离（参见下文单链抗体部分）。然后将该VH-接头-VL抗体连接至目标多肽。该融合抗体可用于将多肽导向表达Nogo受体-1配体的细胞或组织。该目标多肽可以是治疗剂（例如毒素），或可以是诊断剂（例如可以进行简单可视化的酶，例如，辣根过氧化酶），此外，可生成其中两个（或多个）彼此连接的单链抗体的融合蛋白。当想要在单个多肽链上生成双价或多价抗体，或想要生成双特异性抗体时，这便非常有用。
单链抗体
本发明包括了可结合本发明Nogo受体-1多肽的单链抗体(scFv)。欲制备该ScFv，可将VH-和VL-编码DNA可操作地连接至编码柔性接头（例如，编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3(SEQ ID NO:10)）的DNA，从而在VL和VH区被柔性接头连接时使VH和VL序列表达为相邻单链蛋白（例如，参见Bird等人,Science242:423-426(1988);Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA55:5879-5883(1988);McCafferty等人,Nature348:552-554(1990)）。该单链抗体可在仅使用单个VH和VL时为单价，在使用两个VH和VL时为双价，或在使用两个以上VH和VL时为多价。
嵌合抗体
本发明进一步包括了双特异性抗体或其抗原结合片段，其中一种特异性针对本发明的Nogo受体-1多肽。在一个实施方式中生成了通过一个结合域特异性结合本发明的Nogo受体-1多肽并通过第二结合域特异性结合第二分子的嵌合抗体。该嵌合抗体可通过重组分子生物技术生成，也可通过物理方法结合在一起。此外，可生成包含一个以上VH和VL的单链抗体，该抗体可特异性结合本发明的多肽以及与减少髓磷脂介导的生长锥萎缩和神经突生长和抽芽抑制相关的其它分子。该中双特异性抗体可通过本领域公知技术生成，例如，Fanger等人.,Immunol Methods4:72-81(1994)以及Wright和Harris,见上文,连同(iii)例如参见,Traunecker等人.Int.J.Cancer(Suppl.)7:51-52(1992)。
在部分实施方式中，该嵌合抗体采用来自本发明抗体的一个或多个可变区进行制备。在另一实施方式中，该嵌合抗体采用来自所述抗体的一个或多个CDR区进行制备。
衍生化和标记的抗体
本发明的抗体或抗原结合片段可被衍生化或连接至另一分子（例如，另一肽或蛋白）。一般而言，该抗体或抗原结合片段以对本发明多肽的结合不受衍生化或标记的不良影响的方式进行衍生化。例如，本发明的抗体或抗体部分可功能性连接（通过化学偶合，遗传融合，非共价结合或其他方式）至一个或多个其它分子实体，例如其它抗体（例如，双特异性抗体或双价抗体），检测剂，细胞毒性剂，药物剂，和/或可介导抗体或抗原结合片段与其它分子结合的蛋白或肽。（例如链霉亲和素核心区或聚组氨酸标记）。
在部分实施方式中，可通过交联两种或多种抗体（相同类型或不同类型，例如，生成双特异性抗体）生成衍生化抗体。适用的交联剂包括具有被间隔基适当隔离的两个不同反应基团的异型双功能交联剂（例如，m-顺丁烯酰胺苯甲酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯），或是同型双功能交联剂（例如，二琥珀酰亚胺辛二酸酯）。该类接头可从Pierce Chemical Company,Rockford,111购买。
在部分实施方式中，该衍生化抗体为标记的抗体。可对本发明的抗体或抗体部分进行衍生化的示范性检测剂为荧光化合物，包括荧光素，异硫氰酸萤光素，丹磺酰，5-二甲胺-l-萘磺酰氯，藻红蛋白，镧系荧光粉等。还可采用能用于检测的酶（例如，辣根过氧化酶，β-半乳糖苷酶，荧光素酶，碱性磷酸酶，葡萄糖氧化酶等）标记抗体。在以可测酶进行标记的实施方式中，可通过添加该酶用于生成可测反应产物的附加试剂检测该抗体。例如，对于辣根过氧化酶可添加过氧化氢和二氨基联苯胺。还可以采用生物素标记抗体，并通过间接测量抗生物素蛋白或链霉亲和素的结合进行检测。还可采用由二级报导基因识别的预定多肽表位（例如，亮氨酸拉链对序列，第二抗体的结合位点，金属结合域，表位标记）标记抗体。
还可采用放射标记的氨基酸来标记抗-Nogo受体-1抗体或其抗原结合片段。该放射标记还可用于诊断和治疗目的。该放射标记的抗-Nogo受体-1抗体可用于诊断，例如，用于测定对象中的Nogo受体-1水平。此外，该放射标记的抗-Nogo受体-1抗体还可用于治疗脊髓损伤等治疗目的。用于多肽标记的范例包括，但不限于，下列放射性同位素或核素-3H，14C，15N，35S，90Y，99Tc，111In，125I，131I。
还可采用聚乙二醇(PEG)，甲基或乙基基团，或糖部分等化学基团衍生化抗-Nogo受体-1抗体或其抗原片段。这些基团可用于改善抗体的生物特性，例如，提高血清半衰期或增加组织结合。
抗-Nogo受体-1抗体的表征
抗-Nogo受体-1抗体的类别和亚类
抗-Nogo受体-1抗体的类别和亚类可通过任何本领域已知的方法进行确定。一般而言，可采用对特定抗体类别和亚类具有特异性的抗体来测定抗体的类别和亚类。该种抗体可从市场购得。类别和亚类可通过ELISA，Western印迹以及其它技术进行测定。替代性地，可对该抗体的重和/或轻链的恒定区的全部或部分进行测序，并将其氨基酸序列与各免疫球蛋白类别和亚类的已知氨基酸序列进行比较，从而确定该抗体的类别和亚类。
抗-Nogo受体-1抗体对Nogo受体-1的结合亲和力。
本发明的抗-Nogo受体-1抗体对本发明的Nogo受体-1多肽的结合亲和力和解离速率可通过任何本领域已知的方法进行测定。例如，可通过竞争性ELISAs，RIAs，BIAcore或KinExA技术测定该结合亲和力。该解离速率还可通过BIAcore或KinExA技术进行测定。结合亲和力和解离速率可通过BIAcore等表面等离子共振进行测定。经测定7E11和1H2的Kd分别为1x10-7M和2x10-8M。
抗-Nogo受体-1抗体对Nogo受体活性的抑制
在部分实施方式中，本发明的抗-Nogo受体-1抗体或其抗原结合片段可抑制Nogo受体-1与配体的结合。该抑制的IC50可通过任何本领域已知的方法（例如，ELISA，RIA或功能性拮抗作用）进行测定。在部分实施方式中，该IC50介于0.1和500nM。在部分实施方式中，该IC50介于10和400nM。在其它实施方式中，该抗体或其部分的IC50介于60nM和400nM。通过结合测定测得7E11和1H2的IC50分别为400nM和60nM。还可参见下文表3。
在部分实施方式中，本发明还包括作为NgRl活性拮抗剂的NgRl-特异性抗体或抗原结合片段，变体或衍生物。例如，特定NgRl抗体与NgRl的结合阻断NgRl-介导的神经元存活，中枢神经***(CNS)神经元的神经突生长或轴突再生的抑制。
在其它实施方式中，本发明包括特异性或优先结合NgRl的至少一个表位的抗体，或其抗原结合片段，变体或衍生物，其中该表位包含SEQ ID NO:49的至少四至五个，至少七个，至少九个，或介于至少约15至约30个氨基酸，主要由其组成或由其组成。所述的SEQ ID NO:49的给定表位的氨基酸可以是（但并非必需）邻近或线性的。在特定的实施方式中，NgRl的至少一个表位包括在细胞表面表达的或作为可溶性片段的NgRl胞外区形成的（例如，融合至IgG Fc区）非线性表位，主要由其组成，或由其组成。因此，在特定的实施方式中，NgRl的至少一个表位包括SEQ ID NO:49的至少4个，至少5个，至少6个，至少7个，至少8个，至少9个，至少10个，至少15个，至少30个，介于约15至约30个，或至少10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95或100个邻近或非邻近氨基酸，主要由其组成，或由其组成，其中非邻近氨基酸通过蛋白折叠形成表位。
在其他实施方式中，本发明包括特异性或优先结合NgRl至少一个表位的抗体，或其抗原结合片段，变体或衍生物，其中该表位在上述的一个，两个，三个，四个，五个，六个或更多个SEQ ID NO:49的邻近或非邻近氨基酸的基础上包括修饰蛋白的附加部分（例如，可包括糖部分，从而使NgRl抗体能够对修饰目标蛋白以高于未修饰蛋白的亲和性进行结合），主要由其组成或由其组成。替代性地，该NgRl抗体完全不与未经修饰的该目标蛋白相结合。
在特定的实施方式中，本发明的抗体，或其抗原结合片段，变体或衍生物可特异性结合上述NgRl或片段或变体的至少一个表位（即，与不相关的或随机表位相比更轻易地与该表位结合）；优先结合上述NgRl或片段或变体的至少一个表位（即，与不相关的，相近的，同源的，或类似表位相比更轻易地与该表位结合）；竞争性抑制本身与上述NgRl或片段或变体的至少一个表位或片段或变体的特定表位结合的参考抗体的结合；或以解离常数KD小于约5x10-2M，约10-2M，约5x10-3M，约10-3M，约5x10-4M，约10-4M，约5x10-5M，约10-5M，约5x10-6M，约10-6M，约5x10-7M，约10-7M，约5x10-8M，约10-8M，约5x10-9M，约10-9M，约5x10-10M，约10-10M，约5x10-11M，约10-11M，约5x10-12M，约10-12M，约5x10-13M，约10-13M，约5x10-14M，约10-14M，约5x10-15M，约10-15M表征的亲和性结合上述NgRl或片段或变体的至少一个表位。在一个特定的方面，该抗体或其片段相对鼠NgRl多肽或其片段优先结合人NgRl多肽或其片段。
在抗体结合解离常数上下文所用的术语“约”允许了用于测量抗体亲和性的方法的内在变差程度。例如，依据所用仪器的精度，基于所测样本的样本数的标准误差，以及常规误差，术语约“10-2M可包括，如从0.05M至0.005M。
在特定实施方式中，本发明的抗体，或其抗原结合片段，变体或衍生物以小于或等于5X10-2/秒,10-2/秒,5X10-3/秒或10-3/秒的解离速率(k(off))与NgRl多肽或其片段或变体相结合。此外，本发明的抗体，或其抗原结合片段，变体或衍生物以小于或等于5X10-4/秒,10-4/秒,5X10-5/秒,或10-5/秒5X10-6/秒,10-6/秒,5X10-7/秒或10-7/秒的解离速率(k(off))与NgRl多肽或其片段或变体相结合。
在其它实施方式中，本发明的抗体，或其抗原结合片段，变体或衍生物以大于或等于103M-1/秒,5X103M-1/秒,104M-1/秒或5X104M-1/秒的结合速率(k(on))与NgRl多肽或其片段或变体相结合。此外，本发明的抗体，或其抗原结合片段，变体或衍生物以大于或等于105M-1/秒,5X105M-1/秒,106M-1/秒或5X106M-1/秒或107M-1/秒的结合速率(k(on))与NgRl多肽或其片段或变体相结合。
在一个实施方式中，本发明的方法中采用的NgRl拮抗剂为抗体分子，或其免疫特异性片段。除非特别注明，此处所用的“抗体的片段”指免疫特异性片段，即，抗原特异性片段。在一个实施方式中，本发明的抗体为双特异性结合分子，结合多肽或抗体，例如对超过一个表位（例如，一个以上抗原或在相同抗原中的一个以上表位）具有结合特异性的双特异性抗体，微抗体，区域缺失抗体或融合蛋白。在一个实施方式中，双特异性抗体至少具有一个针对NgRl上至少一个表位的结合区。双特异性抗体可以是具有两个特异性针对NgRl表位的目标结合区和两个针对其它目标的目标结合区的四价抗体。因此，四价双特异性抗体可以对各特异性为双价。
本发明特定的实施方式包括施用NgRl拮抗剂抗体，或其免疫特异性片段，其中至少一个或多个恒定区域的至少一个部分被删除或以其它方式改造从而提供所需的生化性质，例如下降的效应功能，非共价二聚化的能力，提高的肿瘤位点定位能力，下降的血清半衰期，或是与具有大致相同免疫原性的完整，未改造的抗体相比具有提高的血清半衰期。例如，此处所述的治疗方法中采用的特定抗体为包含了与免疫球蛋白重链类似的多肽链，但缺失了一个或多个重链区的至少一部分的区域缺失抗体。例如，在特定的抗体中，修饰抗体的恒定区中的一个完整区域将被删除，例如，CH2区的全部或部分将被删除。
在此处所述的治疗方法中采用的特定NgRl拮抗剂抗体或其免疫特异性片段中，可采用本领域已知技术对Fc部分进行突变以改变（例如，提高，降低或调节）效应功能。例如，（通过点突变或其它方法）对恒定区域的删除或灭活可降低或改变Fc受体结合与循环修饰抗体的结合从而提高肿瘤定位。在其它情况下恒定区修饰与本发明的适度互补结合相一致从而减少了血清半衰期以及与结合细胞毒素的非特异性结合。恒定区的另一种修饰可用于修饰二硫键或寡糖部分从而通过提高抗原特异性或抗体灵活性来增强定位。通过修饰得到的生理功能，生物相容性以及其它生化作用（例如肿瘤定位，生物分布以及血清半衰期）可通过公知的免疫技术在不采取附加试验的情况下进行检测和定量。
此处描述的诊断和治疗方法采用的抗体或其免疫特异性片段的修饰形式可采用本领域已知的技术由完整的前体或父代抗体制备。本文对示范性的技术进行了更具体的讨论。
在特定的实施方式中此处描述的治疗方法采用的NgRl拮抗剂抗体或其免疫特异性片段的可变和恒定区均为完全人源。全人源抗体可通过本领域已知的以及此处描述的技术进行制备。例如，针对特异性抗原的全人源抗体可通过向经修饰在应答抗原性攻击时生产该种抗体同时其内源性基因座被灭活的转基因动物施用抗原进行制备。可用于制备该种抗体的示范性技术参见美国专利6,150,584;6,458,592;6,420,140。其它的技术已为本领域所知。如本文其它部分将作更具体讨论，全人源抗体还可通过各种展示技术进行制备，例如噬菌体展示或其它病毒展示***。
此处披露的诊断和治疗方法中采用的NgRl拮抗剂抗体或其免疫特异性片段可通过本领域已知的技术进行制备或生产。在特定的实施方式中，抗体分子或其片段可进行“重组生产”，即，采用重组DNA技术进行生产。制备抗体分子或其片段的示范性技术将在本文其它部分作更详细的讨论。
此处披露的治疗方法中采用的NgRl拮抗剂抗体或其免疫特异性片段包括修饰（例如，通过向该抗体共价连接任何类型的分子，且该种共价连接不阻止抗体特异性结合其同源表位）后的衍生物。例如，但非限制，该抗体衍生物包括通过糖基化，乙酰化，聚乙二醇化，磷酰化，酰胺化，通过已知的保护/阻断基团进行衍生化，蛋白水解裂解，与细胞配体或其它蛋白连接等方法修饰得到的抗体。各种化学修饰中的任意一种均可通过已知技术实现，包括，但不限于特异性化学裂解，乙酰化，甲酰化，衣霉素代谢合成等。此外，该衍生物可能包含一个或多个非传统氨基酸。
在优选的实施方式中，此处披露的治疗方法中采用的NgRl拮抗剂抗体或其免疫特异性片段不会引起待治疗动物（例如，人）体内的有害免疫应答。在一种实施方式中，此处披露的治疗方法中采用的NgRl拮抗剂抗体或其免疫特异性片段可通过本领域认可的技术进行修饰以降低其免疫原性。例如，可对抗体进行人源化，灵长源化，去免疫化，或可制备嵌合抗体。这些抗体类型来自于非人源抗体，通常为保留或充分保留了父代抗体的抗原结合功能，但在人体内具有更低免疫原性的鼠或灵长动物抗体。这可通过多种方法实现，包括(a)将完整非人类可变区嫁接至人恒定区以生成嵌合抗体；(b)将一个或多个非人类决定簇互补区(CDRs)的至少部分嫁接至保留或未保留关键框架残基的人框架和恒定区；或(c)移植整个非人类可变区，但通过替换表面残基以类人切片将其“包覆”。该类方法参见Morrison等人.,Proc.Natl.Acad.Sci.81:6851-6855(1984);Morrison等人,Adv.Immunol.44:65-92(1988);Verhoeyen等人,Science232:1534-1536(1988);Padlan,Molec.Immun.25:489-498(1991);Padlan,Molec.Immun.31:169-217(1994),以及美国专利5,585,089,5,693,761,5,693,762和6,190,370,其全文在此引用作为参考。
去免疫化还可用于降低一种抗体的免疫原性。此处所用的术语“去免疫化”包括对抗体进行改造以修饰T细胞表位(例如，参见WO9852976A1,WO0034317A2)。例如，对来自起始抗体的VH和VL序列进行分析，由各V区“定位”的人T细胞表位显示了与序列内的决定簇互补区(CDRs)和其它关键残基相关的表位定位。对来自于T细胞表位图谱的单独T细胞表位进行分析，以在不轻易改变终抗体活性的情况下鉴定选择性的氨基酸替代物。经设计得到了一系列包括氨基酸替代物组合物的的VH和VL序列，随后这些序列被整合进入一系列的结合多肽（例如，NgRl拮抗剂抗体或其免疫特异性片段）以用于此处所述的诊断和治疗方法，并对功能进行测验。通常可生成和测验12-24个变体抗体。然后将包含修饰后的V区和人C区的完整重链和轻链基因克隆进入表达载体，将该后续质粒导入细胞系进行全抗体生产。对该类抗体通过适当的生化和生物测定进行比较，并鉴定得到最佳变体。
本发明的方法中采用的NgRl拮抗剂抗体或其片段可通过本领域的任何适用技术生成。多克隆抗体可通过本领域公知的多种方法进行制备。例如，可向多种宿主动物包括，但不限于，兔子，小鼠，大鼠等施用NgRl免疫特异性片段以诱导针对该抗原的含血清多克隆抗体的制备。依据宿主种类不同，各种佐剂可用于提高免疫应答，其包括但不限于，弗氏试剂（完全或不完全），矿物凝胶（如氢氧化铝），表面活性物质如溶血卵磷脂，pluronic多元醇，聚阴离子，肽，油乳剂，匙孔血蓝蛋白，二硝基酚以及潜在有用的人佐剂如BCG（卡介苗）和短小棒状杆菌。该类佐剂已为本领域熟知。
单克隆抗体可通过本领域已知的多种技术进行制备，包括杂交瘤，重组和噬菌体展示技术的应用及其组合。例如，单克隆抗体可通过本领域已知的杂交瘤技术进行生产，该技术还在许多文献中得到描述，例如，Harlow等人,Antibodies:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,2nd ed.(1988);Hammerling等人,in:Monoclonal Antibodies and T-CeIlHybridomas Elsevier,N.Y.,563-681(1981)（所述文献在此全文引用作为参考）。此处所用的术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术生产的抗体。术语“单克隆抗体”指由单个克隆（包括真核，原核或噬菌体克隆）得到的抗体，而非它的生产方法。因此，术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术生产的抗体。单克隆抗体可通过本领域已知的多种技术进行制备，包括杂交瘤，重组和噬菌体展示技术的应用。
在一个实施方式中，采用本领域认可的方案，可通过多次皮下或腹腔注射相关抗原（例如，纯化的NgRl抗原，如包含该种抗原的细胞或细胞萃取物）和佐剂在哺乳动物体内产生抗体。该免疫作用通常可引发包含了从激活的脾细胞或淋巴细胞产生抗原反应抗体的免疫应答。尽管可从动物血浆获取所得的抗体以进行多克隆制备，通常可从脾，***或外周血分离单独的淋巴细胞以进行单克隆抗体(MAbs)的均一制备。该淋巴细胞优选从脾获取。
在该公知方法中（Kohler等人,Nature255:495(1975)），该取自注射了抗原的哺乳动物的相对短命或死亡的淋巴细胞与一个永生肿瘤细胞系（例如，骨髓瘤细胞系）相融合，从而得到了永生的并能生产B细胞的转基因编码抗体的杂交细胞或杂交瘤摂。所得的杂交物通过挑选和稀释分离得到单独遗传株系，对包含了能够形成单独抗体的特定基因的单独株系进行再生。它们可生产针对目标抗原的相似抗体，并由于其单纯的遗传亲缘而被称为“单克隆”。
将由此制备的杂交瘤细胞接种和培养至适当的培养基中，该培养基优选包含一种或多种抑制未融合的，亲代骨髓瘤细胞生长或存活的物质。本领域的技术人员均了解用于杂交瘤形成，挑选和培养的试剂，细胞系和介质可从多个来源购买，且已充分建立了标准化的方案。通常对杂交瘤细胞生长的培养基进行分析以测定针对目标抗原的单克隆抗体的生产。优选地，由杂交瘤细胞生产的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀，放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸收分析(ELISA)等体外分析进行测定。当杂交瘤经鉴定能够生产具有所需特异性，亲和性和/或活性的抗体后，该克隆可通过有限稀释法进行亚克隆并以标准方法培养(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,AcademicPress,pp59-103(1986))。由亚克隆分泌的单克隆抗体可从培养基，腹水或血浆中通过蛋白-A，羟基磷灰石层析，凝胶电泳，透析或亲和层析等传统方法进行纯化。
识别特定表位的抗体片段可通过已知技术生成。例如，可采用木瓜蛋白酶（生产Fab片段）或胃蛋白酶（生产F(ab')2片段）等酶通过蛋白水解裂解免疫球蛋白分子获得Fab和F(ab')2片段。F(ab')2片段包含了可变区，轻链恒定区和重链CH1区。
本领域技术人员还可理解编码抗体或抗体片段（例如，抗原结合位点）的DNA还可以从抗体噬菌体库获得。该种噬菌体可特别用于展示由抗体库或组合抗体库（例如，人或鼠）表达的抗原结合区。表达能够结合目标抗原的抗原结合区的噬菌体可通过抗原（例如，采用标记抗原或者固体表面或珠子结合或捕获的抗原）进行选择和鉴别。这些方法中常用的噬菌体通常为丝状噬菌体，包括带有重组融合至噬菌体基因III或基因VIII蛋白的Fab，Fv或二硫键稳定的Fv抗体区域的噬菌体表达的fd和M13。示范性方法可参见，例如，EP368 684 Bl；美国专利5,969,108，Hoogenboom,H.R.以及Chames,Immunol.Today21:371(2000);Nagy等人.Nat.Med.5:801(2002);Huie等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA98:2682(2001);Lui等人.,J.MoI.Biol.315:1063(2002)，分别在此引用作为参考。许多文献（例如，Marks等人,Bio/Technology10:779-783(1992))均已描述了通过链替换，以及作为构建大型噬菌体库的策略的组合感染和体内重组对高亲和性人抗体的生产。在另一实施方式中，可采用核糖体展示替代噬菌体作为展示平台（例如，参见Hanes等人,Nat.Biotechnol18:1287(2000);Wilson等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA98:3750(2001);或Irving等人,J.Immunol Methods248:31(2001)）。在另一实施方式中，可通过细胞表面库筛选抗体(Boder等人.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:10701(2000);Daugherty等人.,J.Immunol.Methods243:211(2000))。该类方法可为用于单克隆抗体的分离和后续克隆的传统杂交瘤技术提供替代方法。
在噬菌体展示方法中，功能性抗体区被展示在携带了对其编码的多聚核苷酸序列的噬菌体颗粒的表面上。特别地，可从cDNA库（例如，人或鼠淋巴组织cDNA库）或合成cDNA库扩增编码VH和VL区的DNA序列。在特定实施方式中，该编码VH和VL区的DNA在PCR中通过scFv接头相连接并被克隆进入一个噬菌粒载体（例如，p CANTAB或pComb3HSS）。将该载体导入E.coli并以辅助噬菌体感染E.coli。这些方法中常用的噬菌体通常为丝状噬菌体，包括通常重组融合至噬菌体基因III或基因VIII的fd和M13以及VH或VL区。表达能够结合目标抗原（即，NgRl多肽或其片段）的抗原结合区的噬菌体可通过抗原（例如，采用标记抗原或者固体表面或珠子结合或捕获的抗原）进行选择和鉴别。
可用于制备该抗体的噬菌体展示方法的附加示范可参见Brinkman等人,J.Immunol.Methods752:41-50(1995);Ames等人,J.Immunol.Methods184:177-186(1995);Kettleborough等人,Eur.J.Immunol.24:952-958(1994);Persic等人,Gene187:9-18(1997);Burton等人,Advances in Immunology57:191-280(1994);PCT公布PCT/GB91/01134;PCT公布WO90/02809;WO91/10737;WO92/01047;WO92/18619;WO93/11236;WO95/15982;WO95/20401;以及U.S.Pat.Nos.5,698,426;5,223,409;5,403,484;5,580,717;5,427,908;5,750,753;5,821,047;5,571,698;5,427,908;5,516,637;5,780,225;5,658,727;5,733,743和5,969,108；其全文在此引用作为参考。
如上述参考文献所述，在噬菌体筛选后，可从该噬菌体分离该抗体编码区并用于生成包括人抗体或任何其它目标抗原结合片段的完整抗体，并在包括哺乳动物细胞，昆虫细胞，植物细胞，酵母和细菌的目标宿主中表达。例如，用于重组生产Fab,Fab'和F(ab')2片段的技术也可采用本领域已知的技术，例如参见PCTpublication WO92/22324;Mullinax等人,BioTechniques12(6):864-869(1992);以及Sawai等人,AJRI34:26-34(1995);和Better等人,Science240:1041-1043(1988)（所述参考文献全文引用作为参考）。
可用于生产单链Fvs和抗体的技术示范可参见U.S.Pat.Nos.4,946,778和5,258,498;Huston等人,Methods inEnzymology205:46-88(1991);Shu等人,PNAS90:7995-7999(1993)；以及Skerra等人,Science240:1038-1040(1988)。对于某些用途，包括抗体在人体的体内应用和体外检测分析，优选使用嵌合，人源化或人抗体。嵌合抗体是一种抗体的不同部分来自不同动物种类的分子，例如一种包含了鼠单克隆抗体可变区和人免疫球蛋白恒定区的抗体。生产嵌合抗体的方法在已为本领域所知。例如，参见Morrison,Science229:1202(1985);Oi等人,BioTechniques4:214(1986);Gillies等人,J.Immunol.Methods125:191-202(1989);美国专利5,807,715;4,816,567;和4,816397，其全文在此引用作为参考。人源化抗体指能够与具有一个或多个来自非人类决定簇互补区(CDRs)和人免疫球蛋白分子框架区的目标抗原相结合的由非人类抗体衍生的抗体分子。人框架区的框架残基通常可被CDR供体抗体的相应残基所替代从而改变，优选提高抗原结合。这些框架替换可通过本领域公知的方法进行鉴定，例如，可通过对CDR和框架残基的相互作用建模以鉴定对抗原结合重要的框架残基，可通过序列比较鉴定在特定位点的反常框架残基。（例如，参见Queen等人.,美国专利5,585,089;Riechmann等人,Nature332:323(1988)，其全文在此引用作为参考）。抗体可通过多种本领域已知的技术进行人源化，例如，CDR-嫁接（EP239,400;PCT公布WO91/09967;美国专利5,225,539;5,530,101;和5,585,089），镶饰或重塑(EP592,106;EP519,596;Padlan,Molecular Immunology28(4/5):489-498(1991);Studnicka等人.,Protein Engineering7(6):805-814(1994);Roguska等人.,PNAS91:969-973,1994），以及链替换（美国专利5,565,332）。
完整人类抗体可特别用于人类患者的治疗。人类抗体可通过本领域已知的多种方法制备，包括上述采用来自人免疫球蛋白序列的抗体库进行的噬菌体展示方法。还可参见美国专利4,444,887和4,716,111;以及PCT公布WO98/46645,WO98/50433,WO98/24893,WO98/16654,WO96/34096,WO96/33735,和WO91/10741；分别全文引用作为参考。
人类抗体还可采用不能表达功能性内源免疫球蛋白，但能表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠进行生产。例如，人重链和轻链免疫球蛋白基因复合物可随机导入或通过同源重组进入小鼠胚胎干细胞。除人重链和轻链基因外，还可将人可变区，恒定区和多样区导入鼠胚胎干细胞。鼠重链和轻链免疫球蛋白基因可通过同源重组导入的人免疫球蛋白基因座进行单独或同时的非功能性修饰。特别地，JH区纯合子的删除防止了内源抗体的生产。扩增该修饰后的胚胎干细胞并注射进入胚泡以生产亲和小鼠。饲养该嵌合小鼠以生产表达人抗体的纯合子型后代。该转基因小鼠以选择抗原（例如，所需目标多肽的全部或部分）通过常规方式进行免疫。针对该抗原的单克隆抗体可采用常规杂交瘤技术从免疫后的转基因小鼠获取。转基因小鼠包含的人免疫球蛋白转基因在B-细胞分化时重排，随后进行类型转换和体细胞突变。因此，通过该种技术可生产治疗有效的IgG,IgA,IgM和IgE抗体。该技术生产人类抗体的综述可参见Lonberg和Huszar Int.Rev.Immunol.13:65-93(1995)。对技术用于生产人类抗体和人类单克隆抗体以及生产该类抗体的方案的具体讨论可参见PCT公布WO98/24893;WO96/34096;WO96/33735;美国专利5,413,923;5,625,126;5,633,425;5,569,825;5,661,016;5,545,806;5,814,318和5,939,598等，其全文在此引用作为参考。此外，可委托Abgenix,Inc.(Freemont,Calif.)和GenPharm(San Jose,Calif.)等公司通过与上述类似的技术提供针对选定抗原的人类抗体。
识别选定表位的完整人类抗体可通过一种称为“定向选择”的技术进行生产。在该方法中采用一种选定的非人类单克隆抗体（例如，小鼠抗体）引导识别相同表位的完整人类抗体的筛选。(Jespers等人,Bio/Technology72:899-903(1988))。还可参见，美国专利5,565,332。
在另一实施方式中，编码所需单克隆抗体的DNA可采用常规方法简单分离和测序（例如，可采用能够特异性结合编码鼠抗体重链和轻链基因的寡核苷酸探针）。分离的亚克隆杂交瘤细胞可用作该DNA的优选来源。该DNA在分离后可导入表达载体，随后将后者转染进入不生产免疫球蛋白的原核或真核宿主细胞，例如大肠杆菌细胞，猿COS细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞。更具体的说，如1995年1月25日Newman等人提交的美国专利5,658,570所述（在此引用作为参考），该分离DNA（如此处所述，可为合成DNA）可用于为制备抗体克隆恒定和可变区序列。简要而言，将来自该选定细胞的RNA遗传提取物转化为cDNA，然后以Ig特异性引物进行PCR扩增。能够完成该目的的合适引物还可参见美国专利5,658,570。如下文所将详述，可相对大量培养该表达所需抗体的转化细胞以提供临床或商业所需的免疫球蛋白。
在特定的实施方式中，该重链和/或轻链可变区的氨基酸序列可通过本领域公知的方法检查以确定决定簇互补区(CDRs)的序列，例如，可通过比较已知氨基酸序列和其它重链和轻链可变区以确定高可变序列区。可采用常规重组DNA技术将一个或多个CDRs***框架区，例如，***人框架区以将非人类抗体人源化。该框架区可以是天然存在的或为共有框架区，且优选人框架区（例如，参见Chothia等人.,J.Mol.Biol.278:457-479(1998)的人框架区列表）。由框架区和CDRs的组合生成的多聚核苷酸优选编码一种能与所需多肽（例如，NgRl）的至少一个表位特异性结合的抗体。在框架区内可优选进行一个或多个氨基酸替换，该氨基酸替换优选能够提高抗体与其抗原的结合。此外，该类方法可用于对参与链间二硫键的半胱氨酸残基的一个或多个可变区进行氨基酸替换或删除，从而生成缺失一个或多个链间二硫键的抗体分子。其它对多聚核苷酸的改造在本发明和本领域的现有技术范围内。
此外，可采用通过拼接具有适当抗原特异性的小鼠抗体分子基因和具有适当生物活性的人类抗体分子基因生产“嵌合抗体”的技术(Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci81:851-855(1984);Neuberger等人,Nature372:604-608(1984);Takeda等人,Nature374:452-454(1985))。此处所用的嵌合抗体是一种抗体的不同部分来自不同动物种类的分子，例如包含了鼠单克隆抗体可变区和人免疫球蛋白恒定区的抗体，如人源化抗体。
替代性的，根据描述用于生产单链抗体的技术（U.S.Pat.No.4,694,778;Bird,Science242:423-442(1988);Huston等人.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883(1988)以及Ward等人,Nature334:544-554(1989)）也可用于生成单链抗体。可通过氨基酸桥连接Fv区的重链和轻链片段生成单链抗体。也可采用在大肠杆菌内组装功能性Fv片段的技术(Skerra等人,Science242:1038-1041(1988))。
NgRl拮抗剂抗体还可以是在不能生成内源免疫球蛋白的转基因动物（例如，小鼠）体内生成人源或实质人源抗体（例如，参见美国专利6,075,181,5,939,598,5,591,669和5,589,369，分别在此引用作为参考）。例如，据描述在嵌合和胚系突变小鼠中的抗体重链结合区的纯合子缺失可导致内源抗体生产的完全抑制。人免疫球蛋白基因阵列向该胚系突变小鼠的转移可导致在抗原攻击下的人抗体生产。另一使用SCID小鼠生成人抗体的优选方法可参见美国专利5,811,524，该文献在此引用作为参考。应当可以理解与这些人抗体相关的遗传材料也可以依照此处所述进行分离和操作。
用于生成重组抗体的另一高效方法可参见Newman,Biotechnology10:1455-1460(1992)。该技术可特别生成包含了猴可变区和人恒定区的灵长动物源化抗体。该参考文献在此全文引用作为参考。此外，该技术还可参见共同受让的美国专利5,658,570,5,693,780和5,756,096，该文献在此引用作为参考。
在另一实施方式中，可通过显微操作选择淋巴细胞并分离可变基因。例如，可从免疫哺乳动物分离外周血单核细胞并在体外培养7天。筛选该培养物以获得达到筛选标准的IgGs。可对positive wells的细胞进行分离。可通过FACS或补体介导的溶血空斑检测的鉴定分离得到生产Ig的单独B细胞。可通过显微操作将生成Ig的B细胞转移至试管，并可采用RT-PCR等方法扩增VH和VL基因。将VH和VL基因克隆至抗体表达载体并转染进入细胞（例如，真核或原核细胞）以进行表达。
替代性地，可采用本领域技术人员公知的技术筛选抗体生成细胞系并进行培养。该类技术可从各种试验手册和出版物中得到描述。在此方面，适用于本发明的技术的描述可见下文，并可参见Current Protocols in Immunology,Coligan等人.,Eds.,Green Publishing Associates and Wiley-Interscience,JohnWiley and Sons,New York(1991)，其内容全文（包括附录）在此引用作为参考。
用于此处披露的治疗方法的抗体可通过本领域已知的任何抗体合成方法，特别是化学合成方法或是优选此处所述的重组表达技术进行制备。
应当进一步理解本发明的范围进一步包括抗原结合DNA序列所有的等位基因，变体及突变体。
众所周知，RNA可通过标准技术（例如在异硫氰酸胍萃取和沉淀后进行离心或层析）从原始杂交瘤细胞或其它转化细胞分离。在需要时可通过oligo dT纤维素层析等标准技术从总RNA分离mRNA。适用的技术已为本领域熟知。
在一个实施例中，编码该抗体轻链和重链的cDNAs可参照公知的方法采用逆转录酶和DNA聚合酶同时或单独制备。可通过共有恒定区引物或基于公开的重链和轻链DNA和氨基酸序列的更具特异性的引物启动PCR。如上文讨论，PCR还可用于分离编码该抗体轻链和重链的DNA克隆。在此处可用共有引物或更具同源性探针如鼠恒定区探针筛选该库。
DNA，通常是质粒DNA，可采用本领域已知技术从细胞分离，并参考标准的，公知技术（例如，其具体内容可参见前述有关重组DNA技术的参考文献）获得限制性酶图谱和测序。当然，该DNA可在分离过程或后续分析中参照本发明在任意点进行合成。
抗体，或其片段，衍生物或类似物，例如作为NgRl拮抗剂的的抗体重或轻链的重组表达需要构建一种包含了编码该抗体的多聚核苷酸的表达载体。在获得编码本发明抗体分子或者抗体的重链或轻链，或其部分（优选包含该重链或轻链可变区）的多聚核苷酸后，可通过本领域公知的重组DNA技术制备生产该抗体分子的载体。因此，此处描述了通过表达包含抗体编码核苷酸序列的多聚核苷酸制备一种蛋白的方法。可采用本领域技术人员公知的方法构建包含抗体编码序列和适当的转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括，例如，体内重组DNA技术，合成技术，以及体内遗传重组。因此，本发明提供了包含可操作地连接至启动子的编码本发明抗体分子，或其重链或轻链，或重链或轻链可变区的核苷酸序列的可复制载体。该类载体可包含编码该抗体分子恒定区的核苷酸序列（例如，参见PCT公布WO86/05807;PCT公布WO89/01036以及美国专利5,122,464），且该抗体的可变区可被克隆进入该种载体以表达完整的重或轻链。
该表达载体通过常规技术转入宿主细胞，然后以常规技术培养该转染细胞以生产用于此处所述方法的抗体。因此，本发明包括了包含可操作地连接至一种外源启动子的编码本发明抗体，或其重或轻链的多聚核苷酸的宿主细胞。在针对表达双链抗体的优选实施例中，如下文详述，同时编码重和轻链的载体可在宿主细胞中共表达以表达完整免疫球蛋白分子。
可采用多种宿主表达载体***来表达用于此处所述方法的抗体分子。该种宿主表达***代表了可生产和后续纯化目标编码序列的载体，还代表了在以适当核苷酸编码序列进行转化或转染后原位表达本发明抗体分子的细胞。其包括但不限于微生物，如以包含了抗体编码序列的重组噬菌体DNA，质粒DNA或粘粒DNA表达载体转染的细菌（例如，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌）；以包含抗体编码序列的重组酵母表达载体转染的酵母（例如，毕赤酵母）；以包含抗体编码序列的重组病毒表达载体（杆状病毒）感染的昆虫细胞***；以包含抗体编码序列的重组病毒表达载体（例如，花椰菜花叶病毒,CaMV；烟草花叶病毒，TMV）感染或重组质粒表达载体（例如，Ti质粒）转染的植物细胞***；或包含了带有哺乳动物细胞基因组启动子（例如，金属硫蛋白启动子）或哺乳动物病毒启动子（例如，腺病毒晚期启动子；牛痘病毒7.5k启动子）的重组表达构建体的哺乳动物细胞***（例如，COS,CHO,BLK,293,3T3细胞）。优选地，可使用细菌细胞如大肠杆菌，更优选使用真核细胞表达重组抗体分子，特别是完整重组抗体分子。例如，结合来自人细胞巨化病毒的中间早期基因启动子元件等载体的哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)是一种有效的抗体表达***(Foecking等人.,Gene45:101(1986);Cockett等人.,Bio/Technology8:2(1990))。
在细菌***中，根据被表达的抗体分子的目标用途，可选择使用多种表达载体。例如，当需要生产大量该种蛋白，以得到一种抗体分子的药物组合物时，可采用能够引导高水平表达易纯化融和蛋白产物的载体。该类载体包括，但不限于，大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther等人,EMBO J.2:1791(1983))，其中该抗体克隆序列可在与lacZ编码区同框的情况下单独连接至该载体从而生产融和蛋白；pIN载体(Inouye和Inouye,Nucleic Acids Res.73:3101-3109(1985);Van Heeke和Schuster,J.Biol.Chem.24:5503-5509(1989))；pGEX载体也可用于将外源多肽以谷胱甘肽S转移酶(GST)融和蛋白的形式进行表达。一般而言，该种融和蛋白具有可溶性，并能通过吸附，结合至基质谷胱甘肽-琼脂糖珠，然后在自由谷胱甘肽存在下洗脱进行简单的纯化。通过设计该pGEX载体包括了凝血酶或Xa因子蛋白酶裂解位点，从而使该克隆的目标基因产物可以从GST部分释放。
在昆虫***中，通常使用苜蓿尺蠖核多角体病毒(AcNPV)作为表达外源基因的载体。该病毒生长于草地夜蛾细胞。该抗体编码序列可单独克隆进入该病毒的非必须区（例如多角体蛋白基因）并位于AcNPV启动子（例如该多角体蛋白启动子）的控制下。
在哺乳动物宿主细胞中，可采用一系列基于病毒的表达***。当采用人腺病毒作为表达载体时，可将目标抗体编码序列连接至腺病毒转录/翻译控制复合物如晚期启动子和三联先导序列。然后可通过体外或体内重组将该嵌合基因***腺病毒基因组。
***病毒基因组的非必须区（例如，E1或E3区）将形成有活力的并能在感染宿主中表达抗体分子的重组病毒。（例如，参见Logan&Shenk,Proc.Natl.Acad.Sci.USA57:355-359(1984)）。***抗体编码序列的有效翻译还将需要特定的启动信号。这些信号包括ATG起动密码子和邻近序列。此外，该起动密码子应当与目标编码序列的阅读框架同期以确保整个***物的翻译。这些外源翻译控制信号和起动密码子可来自于多种天然和合成来源。表达的效率可通过包含适当的转录增强原件，转录终止子等得到增强（参见Bittner等人.,Methods in Enzymol.755:51-544(1987))。
此外，还可选择以特定形式调节***序列表达，或修饰和处理基因产物的宿主细胞株。对该蛋白产物的该种修饰（例如，糖基化）和处理（例如，裂解）可对该蛋白的功能非常重要。不同的宿主细胞可对蛋白和基因产物的翻译后处理和修饰均有不同的特性和特殊的机制。可选择适当的细胞系或宿主***以确保表达的外源蛋白的正确修饰和处理。为此，可使用具有正确处理基因产物的初级转录，糖基化和磷酸化的细胞机制的真核宿主细胞。该种哺乳动物宿主细胞包括但不限于CHO，VERY，BHK，HeLa，COS，293，3T3，WI387，并特别包括例如BT483，Hs578T，HTB2，BT20以及T47D等乳腺癌细胞系以及例如CRL7030和Hs578Bst等正常乳腺细胞系。
优选稳定表达以进行重组蛋白的长期高产量生产。例如，可通过工程改造得到稳定表达该抗体分子的细胞系。宿主细胞可通过由适当表达控制元件（例如，启动子，增强子，序列，转录终止子，聚腺苷酸化位点等）和选择性标记控制的进行转化，而非使用包含病毒复制起始区的表达载体。在导入外源DNA后，将工程细胞在富集培养基中培养1-2天，然后转入选择性培养基。重组质粒中的选择性标记可带来对选择因素的耐受并使细胞将该质粒稳定整合进入其染色体，然后生长得到可进行后续克隆并扩展入细胞系的病灶。该方法可用于工程改造可稳定表达抗体分子的细胞系。
多种选择***可供使用，包括但不限于可分别应用于tk-,hgprt-或aprt-细胞的单纯疱疹病毒胸苷激酶（Wigler等人,Cell11:223(1977)），次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Szybalska和Szybalski,Proc.Natl.Acad.Sci USA48:202(1992))，以及腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy等人.,Cell22:8171980)基因。此外，抗代谢物抗性可用作下列基因选择的基础：具有对氨甲喋呤的抗性的dhfr(Wigler等人.,Natl.Acad.Sci USA77:357(1980);O'Hare等人,Proc.Natl.Acad.Sci USA78:1527(1981));具有对麦考酚酸的抗性的gpt(Mulligan&Berg,Proc.Natl.Acad.Sci USA78:2072(1981));具有对氨基糖苷G-418的抗性的neo（Clinical Pharmacy2:488-505;Wu和Wu,Biotherapy3:87-95(1991);Tolstoshev,Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32:573-596(1993);Mulligan,Science260:926-932(1993);以及Morgan和Anderson,Ann.Rev.Biochem.(62:191-211(1993);,TIB TECH11(5):155-215(1993年5月);具有对潮霉素的抗性的hygro(Santerre等人.,Gene30:147(1984)。本领域公知的可供使用的重组DNA技术可参见Ausubel等人.(eds.),CurrentProtocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,NY(1993);Kriegler,Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manual,Stockton Press,NY(1990);以及在Dracopoli等人.(eds),Current Prolocols in Human Genetics,第12和13章，John Wiley&Sons,NY(1994);Colberre-Garapin等人,J.MoI.Biol.150:1(1981),其全文在此引用作为参考。
抗体分子的表达水平可通过载体扩增得到提高(其综述参见Bebbington和Hentschel,The use of vectors based ongene amplification for the expression of cloned genes inmammalian cells in DNA cloning,Academic Press,New York,Vol.3.(1987))。当表达抗体的载体***中的标记可进行扩增时，宿主细胞培养中抑制剂水平的提升可提高标记基因拷贝数。由于扩增区与抗体基因关联，因而抗体的产量也会得到提高(Grouse等人,Mol.Cell.Biol.3:257(1983))。
该宿主细胞可被两个本发明的表达载体共转染，该第一载体编码一种重链衍生多肽，该第二载体编码一种轻链衍生多肽。这两种载体可包含相同的能使重和轻链多肽同等表达的可选择标记。替代性地，也可使用一种同时编码重和轻链多肽的单独载体。在该种情况下，该轻链被优先放置在重链之前以防止过量的无毒重链(Proudfoot,Nature322:52(1986);Kohler,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:2197(1980))。该重和轻链的编码序列可包含cDNA或基因组DNA。
当本发明的抗体分子被重组表达后，可通过本领域已知的任意免疫球蛋白分子纯化方法对其进行纯化，例如，层析（例如，离子交换层析，亲和层析，特别是对蛋白A特异性抗原的亲和层析，筛分柱层析），离心，微分溶出，或通过任何其它蛋白纯化标准技术。替代性地，提高本发明抗体亲和性的优选方法参见US2002 0123057Al。
在一个实施方式中，本发明的方法中采用的结合分子或抗原结合分子包含了一种其中一个或多个区域被部分或全部删除的合成恒定区（“区域缺失抗体”）。在特定实施例中的相容性修饰抗体包含了整个CH2区被去除的区域缺失构建体或变体（ΔCH2构建体）。在其它实施方式中可采用短连接肽替换缺失区域以提供可变区的灵活性和自由移动性。本领域的技术人员将可以理解由于CH2区对抗体分解率的调节属性，因而特别优选该构建体。
在特定的实施方式中，本发明披露的方法中采用的修饰抗体为微抗体。微抗体可通过本领域已描述的方法进行制备（例如，参见，美国专利5,837,821或WO94/09817A1）。
在另一实施方式中，本发明披露的方法中采用的修饰抗体为本领域已知的CH2区缺失抗体。区域缺失构建体可通过编码IgG1人源恒定区的载体（例如，来自Biogen IDEC公司）获得（例如，参见WO02/060955A2和WO02/096948A2）。这些示范性载体经工程改造缺失了CH2区并提供了表达区域缺失IgG1恒定区的合成载体。
在一个实施方式中，本发明所披露的治疗方法中采用的NgRl拮抗剂抗体或其片段含了一种具有能支持单体亚基间结合的数个或者甚至单个氨基酸缺失或替换的免疫球蛋白重链。例如，在CH2区选定部位的单个氨基酸突变可足以降低Fc结合并从而增强肿瘤定位。类似地，可能仅需要删除控制带调节效应功能（例如，补体结合）的一个或多个恒定区。该恒定区的部分缺失可能提高该抗体的选定特性（血浆半衰期），同时保留其它与对象恒定区相关的所需功能的完整性。此外，如上文指出，所披露抗体的恒定区可通过对增强所得构建体作用的一个或多个氨基酸的突变或替换进行合成。就此而言，可以在破坏保守结合位点（例如，Fc结合）的活性的同时充分保留修饰抗体的构型和免疫原性作用。另一实施例包含了向恒定区添加一个或多个氨基酸以增强所需的特性（例如效应功能）或者提供更多细胞毒素或糖附着。在该类实施例中可能需要***或复制来自选定恒定区的特定序列。
本发明还提供了包含此处所述的抗体分子（例如，VH区和或VL区）的变体（包括衍生物），主要由其组成，或由其组成的抗体的用途，该抗体或其片段免疫特异性结合NgRl多肽。本领域技术人员已知的标准技术可用于在编码结合分子的核苷酸序列引入突变，包括但不限于，可导致氨基酸替换的定点突变和PCR介导的突变。优选地，该变体（包括衍生物）相对参考VH区，VHCDR1,VHCDR2,VHCDR3,VL区,VLCDR1,VLCDR2或VLCDR3编码少于50个氨基酸替换，少于40个氨基酸替换，少于30个氨基酸替换，少于25个氨基酸替换，少于20个氨基酸替换，少于15个氨基酸替换，少于10个氨基酸替换，少于5个氨基酸替换，少于4个氨基酸替换，少于3个氨基酸替换，或少于2个氨基酸替换。“保守氨基酸替换”是以具有类似电荷侧链的氨基酸残基替换其中一个氨基酸残基。本领域内已经定义了有类似电荷侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链（例如，赖氨酸，精氨酸，组氨酸），酸性侧链（例如，天冬氨酸，谷氨酸），未带电极性侧链（例如，甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酸，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，半胱氨酸），无极性侧链（例如，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，蛋氨酸，色氨酸），β-分支侧链（例如，苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸）和芳香侧链（例如，酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，组氨酸）的氨基酸。此外，该突变可沿全部或部分编码序列进行（例如饱和突变），对所得的突变进行生物活性筛选以鉴定保留活性的突变体。
例如，可以仅在抗体分子的框架区或CDR区引入突变。所引入的突变可以是同义或中性错义突变，即对抗体结合抗原的能力没有或具有很少的影响。这些类型的突变可能对优化密码子用途或提高杂交瘤的抗体生产非常有用。然而非中性错义突变可改变一种抗体结合抗原的能力。多数同义或中性错义突变的位点可能在框架区中，而多数非中性错义突变的位点可能在CDR中，尽管这并非绝对。本领域的技术人员均能设计和测试具有所需属性（例如未改变抗原结合活性或改变了结合活性（例如，提高了抗原结合活性或改变了抗体特异性））的突变分子。突变后可对编码蛋白进行常规表达，编码蛋白的功能性和/或生物活性可通过此处所述的技术或本领域已知的常规修饰技术进行测定。
总而言之，本领域的技术人员在本发明的启示下可得到多种可用于改变本发明抗体的生物属性的方法，包括可以提高或降低给定抗体稳定性或半衰期，免疫原性，毒性，亲和性或产率的方法，或通过任何其它方式改变它，以使它更适合特定应用的方法。
下文描述了包含本发明抗体的组合物及其用途
可溶性Nogo受体-1多肽蛋白
全长Nogo受体-1由信号序列，N-末端区(NT)，八个亮氨酸富集重复序列(LRR)，LRRCT区（八个亮氨酸富集重复序列的亮氨酸富集重复区C-末端），C-末端区(CT)和锚组成（参见图1）。
此处所用的NgR区如下定义：
表1.NgR区范例
本发明的部分实施方式提供了可溶性Nogo受体-1多肽。本发明的可溶性Nogo受体-1多肽包含了NT区；8LRRs和LRRCT区并缺失信号序列和功能性GPI锚（即，没有GPI锚或该GPI锚失去了有效附着至细胞膜的能力）。
在部分实施方式中，可溶性Nogo受体-1多肽包含了外源LRR。在部分实施方式中，可溶性Nogo受体-1多肽包含了2，3，4，5，6，7或8个外源LRRs。外源LRR指从非Nogo受体-1蛋白中获得的LRR。可获得外源LRR的示范性蛋白为toll样受体(TLR1.2)；T-细胞激活亮氨酸重复富蛋白；deceorin；OM-gp；类胰岛素生长因子结合蛋白酸性不稳定亚基slit和robo；以及toll-样受体4。
在部分实施方式中，本发明提供了319氨基酸的可溶性Nogo受体-1多肽（可溶性Nogo受体-1 344，sNogoRl-1 344，或sNogoR344）（SEQ ID NOs:6的残基26-344和SEQ ID NO:8的残基27-344）。在部分实施方式中，本发明提供了285氨基酸的可溶性Nogo受体-1多肽（可溶性Nogo受体-1,310，sNogoRl-1 310，或sNogoR310）（SEQ ID NOs:7的残基26-310和SEQ ID NO:9的残基27-310）。见图1。
表1人和大鼠Nogo受体-1多肽序列
在本发明的部分实施方式中，本发明的可溶性Nogo受体-1多肽被用于抑制配体与Nogo受体-1的结合，并用作Nogo受体-1配体的拮抗剂。在本发明的部分实施方式中，本发明的可溶性Nogo受体-1多肽被用于减少神经元中的神经突生长和抽芽（例如轴突生长）抑制，并用于抑制神经元中髓磷脂介导的生长锥萎缩。在部分实施方式中，该神经元为CNS神经元。
令人惊奇的是，sNogoR310和sNogoR344阻断Nogo A，NogoB，NogoC，MAG和OM-gp与Nogo受体-1的结合。
在其它实施方式中，本发明提供了具有60个残基或少于60个残基的分离多肽片段，其包含除了最多一个，两个，三个，四个，十个或二十个单独氨基酸替换外与参考氨基酸序列一致的氨基酸序列，其中所述的参考氨基酸序列选自如下组合：(a)SEQ IDNO:49的氨基酸x-344，(b)SEQ ID NO:49的氨基酸309-y，以及(c)SEQ ID NO:49的氨基酸x-y，其中x为由306至326的任意整数，而y是由328至350的任意整数；并且其中所述的多肽片段抑制Nogo-受体介导的神经突生长抑制。在部分实施方式中，本发明提供了具有60个残基或少于60个残基的分离多肽片段，其包含除了最多一个，两个，三个，四个，十个或二十个单独氨基酸替换外与参考氨基酸序列一致的氨基酸序列，其中所述的参考氨基酸序列选自如下组合：(a)SEQ ID NO:49的氨基酸x'-344，(b)SEQ ID NO:49的氨基酸309-y'，以及(c)SEQ ID NO:49的氨基酸x'-y'，其中x'为由300至326的任意整数，而y'是由328至360的任意整数；并且其中所述的多肽片段抑制Nogo-受体介导的神经突生长抑制。
“NgRl参考氨基酸序列”或“参考氨基酸序列”指不进行任何氨基酸替换的特定序列。本领域普通技术人员将能理解如果没有替换，本发明的“分离多肽”包含了与参考氨基酸序列一致的氨基酸序列。
在部分实施方式中，本发明提供了具有60个残基或少于60个残基的分离多肽片段，其包含除了最多一个，两个或三个单独氨基酸替换外与参考氨基酸序列一致的氨基酸序列，其中所述的参考氨基酸序列选自如下组合：SEQ ID NO:49的氨基酸309-335；SEQ ID NO:49的氨基酸309-344；SEQ ID NO:49的氨基酸310-335；SEQ ID NO:49的氨基酸310-344；SEQ ID NO:49的氨基酸309-350；SEQ ID NO:49的氨基酸300-344；以及SEQ ID NO:49的氨基酸315-344。
在一种实施方式中，本发明提供了具有60个残基或少于60个残基的分离多肽片段，其包含除了最多三个单独氨基酸替换外与参考氨基酸序列一致的氨基酸序列，其中所述的参考氨基酸序列为SEQ ID NO:49的氨基酸309-344。
在一种实施方式中，本发明提供了具有60个残基或少于60个残基的分离多肽片段，其包含除了最多三个单独氨基酸替换外与参考氨基酸序列一致的氨基酸序列，其中所述的参考氨基酸序列为SEQ ID NO:49的氨基酸309-335。
在一种实施方式中，本发明分离多肽，其包含：(a)除了参考氨基酸序列中至少一个半胱氨酸残基被不同氨基酸替换外，与所述参考一致的氨基酸序列，其中所述的参考氨基酸序列选自如下组合：(i)SEQ ID NO:49的氨基酸a-445，(ii)SEQ ID NO:49的氨基酸27-b，以及(iii)SEQ ID NO:49的氨基酸a-b，其中a为由25至35的任意整数，而b是由300至450的任意整数；以及(b)外源多肽；其中所述的多肽抑制Nogo-受体介导的神经突生长抑制。
如本实施方式所述的对多肽片段的示范性氨基酸替换包括以不同的氨基酸替换本发明多肽中的单独半胱氨酸残基。任意不同的氨基酸均可替换本发明多肽的半胱氨酸。采用哪一种不同的氨基酸取决于一系列标准，令人，替换对多肽片段构型的作用，多肽片段的电荷，或是多肽片段的亲水性。用于本发明的多肽和参考氨基酸序列的氨基酸替换的氨基酸包括具有碱性侧链（例如，赖氨酸，精氨酸，组氨酸），酸性侧链（例如，天冬氨酸，谷氨酸），未带电极性侧链（例如，甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酸，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，半胱氨酸），无极性侧链（例如，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，蛋氨酸，色氨酸），β-分支侧链（例如，苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸）和芳香侧链（例如，酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，组氨酸）的氨基酸。在参考氨基酸中替换半胱氨酸的典型氨基酸包括丙氨酸，丝氨酸，苏氨酸，特别是丙氨酸。通过工程改造编码该多肽片段的多聚核苷酸来进行该种替换术语本领域普通技术人员常规的专业知识。
在另一实施方式中，本发明提供了本发明的分离多肽，其中至少至少一个半胱氨酸残基被不同的氨基酸替换。在人NgRl中可替换的半胱氨酸残基包括C27，C31，C33，C43，C80，C140，C264，C266，C287，C309，C335，C336，C419，C429，C455和C473。在大鼠NgRl中可替换的半胱氨酸残基包括C27，C31，C33，C80，C140，C264，C266，C287，C309，C335，C336，C419，C429，C455和C473。在小鼠NgRl中可替换的半胱氨酸残基包括C27，C31，C33，C43，C80，C140，C264，C266，C287，C309，C335，C336，C419，C429，C455和C473。
本发明进一步提供了具有40个残基或少于40个残基的分离多肽片段，其中该多肽片段除了C309被替换，C335被替换，C336被替换，C309和C335被替换，C309和C336被替换，C335和C336被替换，或C309，C335和C336被替换外，包含了与SEQ ID NO:49的氨基酸309-344一致的氨基酸序列。
本发明的多肽中的半胱氨酸残基可以任何外源氨基酸替换。在特定的实施方式中，该半胱氨酸被最不可能改变该多肽的三维构型的小型不带电氨基酸（例如，丙氨酸，丝氨酸，苏氨酸，优选丙氨酸）替换。
在部分实施方式中，本发明的可溶性Nogo受体-1多肽是进一步包含外源多肽的融合蛋白中的成分。在部分实施方式中，该外源多肽为免疫球蛋白恒定区。在部分实施方式中，该免疫球蛋白恒定区为重链恒定区。在部分实施方式中，该外源多肽为Fc片段。在部分实施方式中，该Fc被连接至本发明的可溶性Nogo受体-1多肽的C-末端。在部分实施方式中该融合Nogo受体-1蛋白为二聚物。本发明进一步包括了上述多肽片段的变体，类似物，或衍生物。
在部分实施方式中，本发明提供了分离多肽，其包含：(a)除了最多二十个单独氨基酸替换外与参考序列一致的氨基酸序列，其中所述的参考氨基酸序列选自如下组合：(i)SEQ ID NO:49的氨基酸a-445，(ii)SEQ ID NO:49的氨基酸27-b，以及(iii)SEQID NO:49的氨基酸a-b，其中a为由1至35的任意整数，而b是由300至450的任意整数；以及(b)外源多肽；其中所述的多肽抑制Nogo-受体介导的神经突生长抑制。在部分实施方式中，该分离多肽SEQ ID NO:49的氨基酸1-310，其中R269和A310被不同的氨基酸替换。用于该多肽中进行替换的示范性氨基酸包括具有碱性侧链（例如，赖氨酸，精氨酸，组氨酸），酸性侧链（例如，天冬氨酸，谷氨酸），未带电极性侧链（例如，甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酸，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，半胱氨酸），无极性侧链（例如，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，蛋氨酸，色氨酸），β-分支侧链（例如，苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸）和芳香侧链（例如，酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，组氨酸）的氨基酸。在一种实施方式中，该不同的氨基酸为色氨酸。
示范性可溶NgR-Fc融合蛋白为人NgRl(319)-Fc，其包含与SEQ ID NO:49的氨基酸1-319的C-末端结合的Fc。
具有半胱氨酸替换的示范性可溶性NgR-Fc融合蛋白为Ala-Ala-人(h)NgRl(310)-Fc（其包括了与具有SEQ ID NO:58的氨基酸的可溶性多肽C-末端结合的Fc），Ala-Ala-大鼠(r)NgRl(310)-Fc（其包括了与具有SEQ ID NO:59的氨基酸的可溶性多肽C-末端结合的Fc）以及Ala-Ala-人(h)NgRl(344)-Fc（其包括了与具有SEQ ID NO:64的氨基酸的可溶性多肽C-末端结合的Fc）。
在本发明中，“多肽”可由通过肽键或修饰肽键（即，肽等排物）结合的氨基酸组成，并可包含20个基因编码氨基酸以外的氨基酸（例如，非天然存在的氨基酸）。本发明的多肽可通过翻译后作用等自然作用，或通过本领域公知的化学修饰技术进行修饰。该修饰在基本文本和更具体的专著，以及大量的研究文献中得到了具体的描述。修饰可在多肽的任何部分发生，包括肽骨架，氨基酸侧链以及氨基或羧基末端。应当可以理解在给定多肽的多个位点可出现相同或不同程度的相同类型的修饰。此外，一种给定多肽可包含多种类型的修饰。多肽可因为泛素化等原因而带有分支，它们也可呈带或不带分支的环状。环状，分支和带分支的环状多肽可通过自然作用或合成方法形成。修饰包括,但不限于,乙酰化，酰化，ADP-核糖基化，酰胺化，黄素的共价结合，亚铁血红素部分的共价结合，核苷酸或核苷酸衍生物的共价结合，脂质或脂质衍生物的共价结合，磷脂酰肌醇的共价结合，交联，环化，形成二硫键，脱甲基，共价交联的形成，半胱氨酸的形成，焦谷氨酸的形成，甲酰化，γ-羧化，糖基化，GPI锚形成，羟基化，碘处理，甲基化，豆蔻酰化，氧化，聚乙二醇化，蛋白水解作用，磷酸化，异戊烯化，外消旋，硒化，硫酸盐化，如精胺酰化等经转移RNA介导向蛋白添加氨基酸，泛素化。（例如，参见Proteins-Structure And MolecularProperties,T.E.Creighton,W.H.Freeman and Company,NewYork 2nd Ed.,(1993);Posttranslational CovalentModification Of Proteins,B.C.Johnson,Ed.,Academic Press,New York,pgs1-12(1983);Seifter等人.,MethEnzymo1182:626-646(1990);Rattan等人.,Ann NY Acad Sci663:48-62(1992))。
此处所述的多肽可呈环状。多肽的环化减少了线性肽的构型自由度并形成了更具结构约束性的分子。本领域已知多种肽环化方法，例如，通过肽的N末端和C末端氨基酸残基之间的氨键的形成进行骨架至骨架摂环化。骨架至骨架摂环化法包括在两个α-硫氨基酸残基（例如，半胱氨酸，高半胱氨酸）之间二硫桥的形成。本发明的特定肽包括在肽的N和C末端进行修饰以形成环状多肽。该种修饰包括，但不限于，半胱氨酸残基，乙酰化半胱氨酸残基，具有NH2部分和生物素的半胱氨酸残基。肽环化的其它方法可参见Li及Roller.Curr.Top.Med.Chem.3:325-341(2002)以及美国专利公布U.S.2005-0260626Al，其全文在此引用作为参考。
在本发明的方法中，本发明的NgRl多肽或多肽片段可作为预制备多肽直接施用，或是通过核酸载体间接施用。在本发明的部分实施方式中，在治疗方法中施用NgRl多肽或多肽片段的方法包括:(1)转化或转染具有表达本发明NgRl多肽或多肽片段的核酸（例如，载体）的可移植宿主细胞；以及(2)将转化宿主细胞在疾病，紊乱或损伤的位点移植进入哺乳动物。例如，该转化宿主细胞可植入MS的慢性病灶位点。在本发明的部分实施方式中，该可移植宿主细胞被取出哺乳动物，临时培养，以编码本发明NgRl多肽或多肽片段的分离核酸转化或转染，并重新移植进入其来自的同一哺乳动物。该细胞可以是（但不要求）从其移植的同一位点取出。该类实施方式（有时被称为间接体内基因治疗）可于短时间内在作用位点提供连续的本发明NgRl多肽或多肽片段。
下文讨论了本发明的NgR多肽的附加范例以及获取这些分子以实施本发明的方法和材料。
融合蛋白和结合多肽
本发明的部分实施方式包括了不是全长NgRl蛋白的NgRl多肽的使用，例如，融合至外源多肽部分以形成融合蛋白的NgRl多肽片段。该种融合蛋白可用于实现多种目的，例如，提高血清半衰期，改善生物相容性，体内靶向特定器官或组织类型，提高重组表达效率，提高宿主细胞分泌，简化纯化，以及获得更高的亲和性。根据待实现的目标不同，该外源部分可呈惰性或具有生物活性。另外，它可选择稳定融合至本发明的NgR1多肽部分或者在体外或体内裂解。实现这些目标的外源性部分已为本领域所知。
在本发明的部分实施方式中，NgR1多肽片段可融合至另一NgR1多肽片段，例如除Fc外的NgR2或NgR3多肽片段。
人NgR2多肽显示为下文的SEQ ID NO:60。
全长人NgR2(SEQ ID NO:60)：
MLPGLRRLLQ APASACLLLM LLALPLAAPS CPMLCTCYSS PPTVSCQANN
FSSVPLSLPP STQRLFLQNN LIRTLRPGTF GSNLLTLWLF SNNLSTIYPG TFRHLQALEE
LDLGDNRHLR SLEPDTFQGL ERLQSLHLYR CQLSSLPGNI FRGLVSLQYL
YLQENSLLHL QDDLFADLAN LSHLFLHGNR LRLLTEHVFR GLGSLDRLLL
HGNRLQGVHR AAFRGLSRLT ILYLFNNSLA SLPGEALADL PSLEFLRLNA
NPWACDCRAR PLWAWFQRAR VSSSDVTCAT PPERQGRDLR ALREADFQAC
PPAAPTRPGS RARGNSSSNH LYGVAEAGAP PADPSTLYRD LPAEDSRGRQ
GGDAPTEDDY WGGYGGEDQR GEQMCPGAAC QAPPDSRGPA LSAGLPSPLL
CLLLLVPHHL
小鼠NgR2多肽显示为下文的SEQ ID NO：61。
全长小鼠NgR2(SEQ ID NO：61)：
MLPGLRRLLQ GPASACLLLT LLALPSVTPS CPMLCTCYSS PPTVSCQANN
FSSVPLSLPP STQRLFLQNN LIRSLRPGTF GPNLLTLWLF SNNLSTIHPG TFRHLQALEE
LDLGDNRHLR SLEPDTFQGL ERLQSLHLYR CQLSSLPGNI FRGLVSLQYL
YLQENSLLHL QDDLFADLAN LSHLFLHGNR LRLLTEHVFR GLGSLDRLLL
HGNRLQGVHR AAFHGLSRLT ILYLFNNSLA SLPGEALADL PALEFLRLNA
NPWACDCRAR PLWAWFQRAR VSSSDVTCAT PPERQGRDLR ALRDSDFQAC
PPPTPTRPGS RARGNSSSNH LYGVAEAGAP PADPSTLYRD LPAEDSRGRQ
GGDAPTEDDY WGGYGGEDQR GEQTCPGAAC QAPADSRGPA LSAGLRTPLL
CLLPLALHHL
人NgR3多肽显示为下文的SEQ ID NO：62。
全长人NgR3(SEQ ID NO：62)：
MLRKGCCVEL LLLLVAAELP LGGGCPRDCV CYPAPMTVSC QAHNFAAIPE
GIPVDSERVF LQNNRIGLLQ PGHFSPAMVT LWIYSNNITY IHPSTFEGFV
HLEELDLGDN RQLRTLAPET FQGLVKLHAL YLYKCGLSAL PAGVFGGLHS
LQYLYLQDNH IEYLQDDIFV DLVNLSHLFL HGNKLWSLGP GTFRGLVNLD
RLLLHENQLQ WVHHKAFHDL RRLTTLFLFN NSLSELQGEC LAPLGALEFL
RLNGNPWDCG CRARSLWEWL QRFRGSSSAV PCVSPGLRHG QDLKLLRAED
FRNCTGPASP HQIKSHTLTT TDRAARKEHH SPHGPTRSKG HPHGPRPGHR
KPGKNCTNPR NRNQISKAGA GKQAPELPDY APDYQHKFSF DIMPTARPKR
KGKCARRTPI RAPSGVQQAS SASSLGASLL AWTLGLAVTL R
小鼠NgR3多肽显示为下文的SEQ ID NO：63。
全长小鼠NgR3(SEQ ID NO：63)：
MLRKGCCVEL LLLLLAGELP LGGGCPRDCV CYPAPMTVSC QAHNFAAIPE
GIPEDSERIF LQNNRITFLQ QGHFSPAMVT LWIYSNNITF IAPNTFEGFV HLEELDLGDN
RQLRTLAPET FQGLVKLHAL YLYKCGLSAL PAGIFGGLHS LQYLYLQDNH
IEYLQDDIFV DLVNLSHLFL HGNKLWSLGQ GIFRGLVNLD RLLLHENQLQ
WVHHKAFHDL HRLTTLFLFN NSLTELQGDC LAPLVALEFL RLNGNAWDCG
CRARSLWEWL RRFRGSSSAV PCATPELRQG QDLKLLPVED FRNCTGPVSP
HQIKSHTLTT SDRAARKEHH PSHGASRDKG HPHGHPPGSR SGYKKAGKNC
TSHRNRNQIS KVSSGKELTE LQDYAPDYQH KFSFDIMPTA RPKRKGKCAR
RTPIRAPSGV QQASSGTALG APLLAWILGL AVTLR
在部分实施方式中，本发明提供了包含第一多肽片段和第二多肽片段的分离多肽，其中所述的第一多肽片段包含了除了最多一个，两个，三个，四个，十个，或二十个单独氨基酸替换外与第一参考氨基酸序列一致的氨基酸序列，其中所述的第一参考氨基酸序列选自如下组合：(a)SEQ ID NO：49的氨基酸a-305，(b)SEQID NO：49的氨基酸1-b，以及(c)SEQ I D NO：49的氨基酸a-b，其中a为由1至27的任意整数，而b是由264至309的任意整数；并且其中所述的第二多肽片段包含了除了最多一个，两个，三个，四个，十个，或二十个单独氨基酸替换外与第二参考氨基酸序列一致的氨基酸序列，其中所述的第二参考氨基酸序列选自如下组合：(a)SEQ ID NO:60的氨基酸c-332，(b)SEQ ID NO:60的氨基酸275-d，以及(c)SEQ ID NO:60的氨基酸c-d，其中c为由265至306的任意整数，而d是由308至340的任意整数；并且其中所述的多肽抑制nogo-受体介导的神经突生长抑制。
在一个实施方式中，本发明提供了包含第一多肽片段和第二多肽片段的分离多肽，其中所述的第一多肽片段包含了除了最多一个，两个，三个，四个，十个，或二十个单独氨基酸替换外与第一参考氨基酸序列一致的氨基酸序列，其中所述的第一参考氨基酸序列为SEQ ID NO:49的氨基酸1-274，且其中所述的第二多肽片段包含了除了最多一个，两个，三个，四个，十个，或二十个单独氨基酸替换外与第二参考氨基酸序列一致的氨基酸序列，其中所述的第二参考氨基酸序列为SEQ ID NO:60的氨基酸275-311；并且其中所述的多肽抑制nogo-受体介导的神经突生长抑制。
在一个实施方式中，本发明提供了包含第一多肽片段和第二多肽片段的分离多肽，其中所述的第一多肽片段包含了除了最多一个，两个，三个，四个，十个，或二十个单独氨基酸替换外与第一参考氨基酸序列一致的氨基酸序列，其中所述的第一参考氨基酸序列为SEQ ID NO:49的氨基酸1-274，且其中所述的第二多肽片段包含了除了最多一个，两个，三个，四个，十个，或二十个单独氨基酸替换外与第二参考氨基酸序列一致的氨基酸序列，其中所述的第二参考氨基酸序列为SEQ ID NO:60的氨基酸275-332；并且其中所述的多肽抑制nogo-受体介导的神经突生长抑制。
在一个实施方式中，本发明提供了包含第一多肽片段和第二多肽片段的分离多肽，其中所述的第一多肽片段包含了除了最多一个，两个，三个，四个，十个，或二十个单独氨基酸替换外与第一参考氨基酸序列一致的氨基酸序列，其中所述的第一参考氨基酸序列为SEQ ID NO:49的氨基酸1-305，且其中所述的第二多肽片段包含了除了最多一个，两个，三个，四个，十个，或二十个单独氨基酸替换外与第二参考氨基酸序列一致的氨基酸序列，其中所述的第二参考氨基酸序列为SEQ ID NO:60的氨基酸306-311；并且其中所述的多肽抑制nogo-受体介导的神经突生长抑制。
在一个实施方式中，本发明提供了包含第一多肽片段和第二多肽片段的分离多肽，其中所述的第一多肽片段包含了除了最多一个，两个，三个，四个，十个，或二十个单独氨基酸替换外与第一参考氨基酸序列一致的氨基酸序列，其中所述的第一参考氨基酸序列为SEQ ID NO:49的氨基酸1-305，且其中所述的第二多肽片段包含了除了最多一个，两个，三个，四个，十个，或二十个单独氨基酸替换外与第二参考氨基酸序列一致的氨基酸序列，其中所述的第二参考氨基酸序列为SEQ ID NO:60的氨基酸306-309；并且其中所述的多肽抑制nogo-受体介导的神经突生长抑制。在另一实施方式中，至少一个附加氨基酸被添加至该第二多肽片段的C-末端。可被添加至该多肽的示范性氨基酸包括具有碱性侧链（例如，赖氨酸，精氨酸，组氨酸），酸性侧链（例如，天冬氨酸，谷氨酸），未带电极性侧链（例如，甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酸，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，半胱氨酸），无极性侧链（例如，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，蛋氨酸，色氨酸），β-分支侧链（例如，苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸）和芳香侧链（例如，酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，组氨酸）的氨基酸。在一种实施方式中，该添加的氨基酸为色氨酸。在附加的实施方式中，在SEQ IDNO:49的269位的精氨酸被色氨酸替换。
在一个实施方式中本发明提供了包含第一多肽片段和第二多肽片段的分离多肽，其中所述的第一多肽片段除了不超过一个，两个，三个，四个，十个，或二十个单独氨基酸替换外由SEQ IDNO:49的氨基酸1-310组成；且其中所述的第二多肽片段除了不超过超过一个，两个，三个，四个，或五个单独氨基酸替换外由SEQ IDNO:60的氨基酸311-318组成；并且；其中所述的多肽抑制nogo-受体-介导的神经突生长抑制。
在部分实施方式中，本发明的多肽进一步包含外源多肽。在部分实施方式中，该外源多肽为免疫球蛋白恒定区。在部分实施方式中，该免疫球蛋白恒定区为重链恒定区。在部分实施方式中，该外源多肽为Fc片段。在部分实施方式中，该Fc被连接至本发明多肽的C-末端。在部分实施方式中，该融合物为二聚物。本发明进一步包括了上述多肽片段的变体，类似物，或衍生物。
作为融合蛋白的替代，选定的外源部分可预先制备并化学结合至本发明的NgR多肽部分。在多数情况下，选定的外源部分不管是否融合或结合至NgR多肽部分时均具有类似的功能。因此，在下列对外源氨基酸序列的讨论中，除非另行指明，应当理解该外源序列可作为融合蛋白或化学结合物的形式与NgR多肽部分结合。
此处披露的治疗方法采用的NgRl适体和抗体及其片段还可在N-或C-末端重组融合至外源多肽或化学结合（包括共价或非共价结合）至多肽或其它组合物。例如，NgRl拮抗剂适体和抗体及其片段可重组融合或结合至可用于检测测定标记的分子或外源多肽，药物，放射性核素，或毒素等效应分子。例如，参见PCT公布WO92/08495;WO91/14438;WO89/12624;美国专利5,314,995和EP396,387。
此处披露的治疗方法采用的NgRl拮抗剂多肽，适体和抗体及其片段包括修饰后的衍生物，即，通过向该抗体共价连接任何类型的分子，且该种共价连接不阻止该NgRl拮抗剂多肽，适体或抗体抑制NgRl的生物功能。例如，但非限制，本发明的NgRl拮抗剂多肽，适体和抗体及其片段可通过糖基化，乙酰化，聚乙二醇化，磷酰化，磷酸化，酰胺化，通过已知的保护/阻断基团进行衍生化，蛋白水解裂解，与细胞配体或其它蛋白连接等方法进行修饰。各种化学修饰中的任意一种均可通过已知技术实现，包括，但不限于特异性化学裂解，乙酰化，甲酰化，衣霉素代谢合成等。此外，该衍生物可能包含一个或多个非传统氨基酸。
此处披露的治疗方法采用的NgRl拮抗剂多肽，适体和抗体及其片段可由通过肽键或修饰肽键（即，肽等排物）彼此连接的氨基酸所组成，并可包含20个基因编码氨基酸以外的氨基酸。NgRl拮抗剂多肽，适体和抗体及其片段可通过翻译后作用等自然作用，或通过本领域公知的化学修饰技术进行修饰。该修饰在基本文本和更具体的专著，以及大量的研究文献中得到了具体的描述。NgRl拮抗剂多肽，适体或抗体或其片段的任何部位均可进行修饰，包括肽骨架，氨基酸侧链以及氨基或羧基终端，或在糖等部分上。应当可以理解在给定NgRl拮抗剂多肽，适体或抗体或其片段的多个位点可出现相同或不同程度的相同类型的修饰。此外，一种给定NgRl拮抗剂多肽，适体或抗体或其片段可包含多种类型的修饰。NgRl拮抗剂多肽，适体或抗体或其片段可因为泛素化等原因而带有分支，它们也可呈带或不带分支的环状。环状，分支和带分支的环状NgRl拮抗剂多肽，适体和抗体或其片段可通过翻译后自然作用或合成方法形成。修饰包括乙酰化，酰化，ADP-核糖基化，酰胺化，黄素的共价结合，亚铁血红素部分的共价结合，核苷酸或核苷酸衍生物的共价结合，脂质或脂质衍生物的共价结合，磷脂酰肌醇的共价结合，交联，环化，形成二硫键，脱甲基，共价交联的形成，半胱氨酸的形成，焦谷氨酸的形成，甲酰化，γ-羧化，糖基化，GPI锚形成，羟基化，碘处理，甲基化，豆蔻酰化，氧化，聚乙二醇化，蛋白水解作用，磷酸化，异戊烯化，外消旋，硒化，硫酸盐化，如精胺酰化等经转移RNA介导向蛋白添加氨基酸，泛素化。（例如，参见Proteins-Structure And Molecular Properties,T.E.Creighton,W.H.Freeman and Company,New York2nd Ed.,(1993);Posttranslational Covalent Modification Of Proteins,B.C.Johnson,Ed.,Academic Press,New York,pgs1-12(1983);Seifter等人.,Meth Enzymo1182:626-646(1990);Rattan等人.,Ann NY Acad Sci663:48-62(1992))。
该NgRl拮抗剂多肽，适体或抗体或其片段融合的外源多肽为具有治疗剂用途并可用于靶向该NgRl拮抗剂多肽，适体或抗体或其片段。NgRl拮抗剂融合蛋白，适体和抗体或其片段可用于实现多种目的，例如，提高血清半衰期，改善生物相容性，体内靶向特定器官或组织类型，提高重组表达效率，提高宿主细胞分泌，
简化纯化，以及获得更高的亲和性。根据待实现的目标不同，该外源部分可呈惰性或具有生物活性。另外，它可选择稳定融合至NgRl拮抗剂多肽，适体或抗体或其片段或者在体外或体内裂解。实现这些目标的外源性部分已为本领域所知。
作为NgRl拮抗剂融合多肽，适体或抗体或其片段表达的替代，也可选择外源性部分并化学结合至该拮抗剂多肽，适体和抗体。在多数情况下，选定的外源部分在融合或未结合NgRl拮抗剂多肽，适体或抗体或其片段时均具有类似的功能。因此，在下列对外源氨基酸序列的讨论中，除非另行指明，应当理解该外源序列可作为融合蛋白或化学结合物的形式与NgRl拮抗剂多肽，适体或抗体或其片段结合。
具有药理活性的多肽如NgRl拮抗剂多肽，适体或抗体或其片段通常在体内显示出快速的清除，从而需要大剂量以在体内实现治疗有效浓度。此外，小于约60KDa的多肽有可能被肾小球滤过，这有时可导致肾毒性。可通过融合或结合相对小的多肽如NgR信号转导区的多肽片段以减少或避免该种肾毒性的风险。已知有多种外源性氨基酸序列（即，多肽部分或载体摂）可提高治疗性多肽的体内稳定性（即，血清半衰期）。范例包括血清白蛋白，例如，牛血清白蛋白(BSA)或人血清白蛋白(HSA)。
基本全长人血清白蛋白(HSA)或HSA片段由于其半衰期长，体内分布广，且不具有酶或免疫功能而常被用作外源部分。通过采用如Yeh等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,59:1904-08(1992)和Syed等人,Blood59:3243-52(1997)所启示的方法和材料，HAS可用于形成通过NgR多肽部分而显示药理活性并能显示明显提高的体内稳定性（例如，高10倍或100倍）的融合蛋白或多肽结合物。HSA的C-末端可被融合至NgR多肽部分的N-末端。由于HSA是一种天然分泌的蛋白，可开发HSA信号序列以当融合蛋白在真核（例如，哺乳动物）表达***生成时将融合蛋白分泌进入细胞培养基。
在特定的实施方式中，本发明的方法中采用的NgRl拮抗剂多肽，适体，抗体及其抗体片段进一步包含靶向部分。靶向部分包括引导定位至身体特定部位（如脑部或其分区）的肽。在特定的实施方式中，本发明的方法中采用的NgRl拮抗剂多肽，适体，抗体及其抗体片段与脑靶向部分结合或融合。该脑部靶向部分被共价连接（例如，引导，翻译融合，或者直接或通过可选择性裂解的间隔分子进行化学连接）或非共价连接（例如，通过抗生物素蛋白:生物素:蛋白A:IgG等进行可逆相互作用）。在特定的实施方式中，本发明的方法中采用的NgRl拮抗剂多肽，适体，抗体及其抗体片段与另一脑部靶向部分结合。在附加的实施方式中，该脑部靶向部分与多个本发明的方法中采用的NgRl拮抗剂多肽，适体，抗体及其抗体片段相结合。
与NgRl拮抗剂多肽，适体，抗体或其抗体片段连接的脑部靶向部分增强了该NgRl拮抗剂多肽，适体，抗体或其抗体片段的脑部传递。据描述多种多肽在融合至蛋白或治疗剂时可将该蛋白或治疗剂传递通过血脑屏障(BBB)。非限制范例包括单域抗体FC5(Abulrob等人.(2005)J.Neurochem.95,1201-1214)；mAB83-14，一种针对人胰岛素受体的单克隆抗体(Pardridge等人.(1995)Pharmacol.Res.12,807-816)；结合至人铁传递蛋白受体(hTfR)的B2,B6和B8肽(Xia等人.(2000)J.Virol.74,11359-11366)；结合至人铁传递蛋白受体的OX26单克隆抗体(Pardridge等人.(1991)J.Pharmacol.Exp.Ther.259,66-70)；白喉毒素结合物（例如，参见Gaillard等人.,International Congress Series7277:185-198(2005)；以及美国专利6,306,365的SEQ ID NOs:1-18。上述参考文献的全文在此引用作为参考。
NgRl组合物增强的脑部传递可通过本领域所建立的多种方法进行测定。例如，向动物施用连接至脑部靶向部分的一种放射标记的NgRl拮抗剂多肽，适体，抗体或其抗体片段；检测脑部定位；与未连接脑部靶向部分的同等放射性标记的NgRl拮抗剂多肽，适体，抗体或其抗体片段比较定位。其它检测增强靶向的方法参见上述参考文献。
本发明的部分实施方式将NgR多肽部分融合至铰链区和Fc区，即，Ig重链恒定区的C末端部分。在部分实施方式中，铰链区的氨基酸可以不同的氨基酸替换。参照这些方式进行的铰链区示范性氨基酸替换包括以不同的氨基酸替换铰链区中的单独半胱氨酸残基。任意不同的氨基酸均可替换铰链区中的半胱氨酸。用于本发明的多肽和参考氨基酸序列的氨基酸替换的氨基酸包括具有碱性侧链（例如，赖氨酸，精氨酸，组氨酸），酸性侧链（例如，天冬氨酸，谷氨酸），未带电极性侧链（例如，甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酸，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，半胱氨酸），无极性侧链（例如，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，蛋氨酸，色氨酸），β-分支侧链（例如，苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸）和芳香侧链（例如，酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，组氨酸）的氨基酸。在参考氨基酸中替换半胱氨酸的典型氨基酸包括丙氨酸，丝氨酸，苏氨酸，特别是丝氨酸和丙氨酸。通过工程改造编码该多肽片段的多聚核苷酸来进行该种替换术语本领域普通技术人员常规的专业知识。
NgR-多肽-Fc融合的潜在优点包括可溶性，体内稳定性，以及多价性，例如，二聚化。所采用的Fc区可以是IgA,IgD或IgG Fc区（铰链-CH2-CH3）。替代性地，它可以是IgE或IgM Fc区（铰链-CH2-CH3-CH4）。通常可采用IgG Fc区，例如，IgG1Fc区或IgG4Fc区。构建和表达编码Fc融合物的DNA的材料和方法已为本领域所知，并可不经其它试验进行采用以获得融合物。本发明的一些实施方式采用如Capon等人的美国专利5,428,130和5,565,335所述的融合蛋白。
该信号序列为编码启动蛋白跨越内质网膜的运输的氨基酸序列的多聚核苷酸。可用于构建免疫融合素的信号序列包括抗体轻链信号序列，例如抗体14.18(Gillies等人.,J.Immunol.Meth.125:191-202(1989))，抗体重链信号序列，例如MOPC141抗体重链信号序列(Sakano等人.,Nature286:5774(1980))。替代性的，也可采用其它信号序列。例如，参见Watson,Nuch AcidsRes.12:5145(1984)。该信号肽通常在内质网内腔中被信号肽酶裂解。由此可获得含Fc区和NgR多肽部分的免疫融合素蛋白分泌物。
在一些实施方式中，该DNA序列可在分泌表达单元和NgR多肽部分之间编码蛋白水解裂解位点。该裂解位点可提供，例如编码融合蛋白的蛋白水解裂解，从而将Fc区从目标蛋白中分离。有用的蛋白水解裂解位点包括包括被胰蛋白酶，血浆酶，凝血酶，Xa因子或是肠激酶K等蛋白水解酶识别的氨基酸序列。
该分泌表达单元可被整合进入可复制表达载体。有用的载体包括线性核酸，质粒，噬菌粒，粘粒等。示范性的表达载体为pdC，其中免疫融合素DNA的转录受人细胞巨化病毒增强子和启动子的控制。例如，参见Lo等人.,Biochim.Biophys.Acta1088:112(1991);以及Lo等人,Protein Engineering11:495-500(1998)。可通过编码本发明的NgRl多肽或多肽片段的DNA转化或转染适当的宿主细胞并用于多肽的表达和分泌。通常采用的宿主细胞包括永生杂交瘤细胞，骨髓瘤细胞，293细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，HeLa细胞，以及COS细胞。
完整的野生型Fc区显示了通常不必要且在本发明的方法采用的Fc融合蛋白所不需要的效应功能。因此，通常在该分泌表达单元构建过程中从Fc区删除特定的结合位点。例如，由于不需要与轻链共表达，可从IgE的Fc区的CH2区中删除重链结合蛋白的结合位点Bip（Hendershot等人,Immunol.Today5:111-14(1987)），从而使该位点不干扰免疫融合素的有效分泌。跨膜区序列（例如存在于IgM的该序列）也通常被删除。
IgG1Fc区最为常用。替代性地，免疫球蛋白gamma的其它小类(gamma-2,gamma-3以及gamma-4)的Fc区可用于分泌表达单元。免疫球蛋白gamma-1的IgG1Fc区通常用于分泌表达单元并包括至少部分铰链区，CH2区以及CH3区。在一些实施方式中，免疫球蛋白gamma-1的IgG1Fc区为CH2-缺失-Fc，其包括部分的铰链区和CH3区，但不包括CH2区。对CH2-缺失-Fc的描述可参见Gillies等人.Hum.Antibod.Hybridomas1:47(1990)。在一些实施方式中采用了IgA,IgD,IgE或IgM之一的Fc区。
NgR-多肽-部分-Fc融合蛋白可构建为多种不同的构型。在一种构型中NgR多肽部分的C末端被直接融合至Fc铰链部分的N末端。在一个略微不同的构型中，在融合物中NgR多肽部分的N末端和Fc部分的C末端之间整合了短多肽如2-10个氨基酸。在替代性的构型中，该短多肽整合在融合物中NgR多肽部分的C末端和Fc部分的N末端之间。该构型的示范性实施例为NgRl(310)-2XG4S-Fc，其中SEQ ID NO:49的氨基酸26-310被连接至与Fc连接的(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2(SEQ ID NO:66)。该种接头提供了构型灵活性，从而在某些情况下可提高生物活性。如果Fc部分保留了充分的铰链区部分，NgR-多肽-部分-Fc融合物将二聚化，从而形成二价分子。单体Fc融合物的均一群将带来单特异性，二价二聚体。两种具有不同特异性的单体Fc融合物的混合物将带来双特异性，二价二聚体。
多种包含相应氨基反应性基团和硫醇反应性基团的交联接头中的任意一种均可用于连接本发明的NgR1多肽或多肽片段和血清白蛋白。适用接头的范例包括***硫醇反应性马来酰亚胺（例如，SMCC，AMAS，BMPS，MBS，EMCS，SMPB，SMPH，KMUS以及GMBS）的胺反应***联接头其它使用的接头***硫醇反应性卤乙酸基团，例如，SBAP，SIA，SIAB。可对与巯基基团的反应提供保护或非保护硫醇的以生成可还原键的接头包括SPDP，SMPT，SATA以及SATP。该种试剂可从市场上购得（例如Pierce ChemicalCompany,Rockford,IL）。
结合物不一定需要包含本发明的NgR1多肽或多肽片段的N末端或血清白蛋白的硫醇部分。例如，NgR-多肽-白蛋白融合物可通过遗传工程技术获得，其中NgR多肽部分被融合至血清白蛋白的N末端，C末端，或同时融合至两个末端。
本发明的NgR多肽可被融合至多肽标记。此处所用的术语“多肽标记”指任何能够附着，结合或连接至NgR多肽并可用于鉴定，纯化，浓缩或分离该NgR多肽的任意氨基酸序列。多肽标记可通过，例如，构建包含(a)编码多肽标记的核酸序列，以及(b)编码NgR多肽的核酸序列的核酸分子附着至NgR多肽。示范性多肽标记包括，例如，能进行翻译后修饰的氨基酸序列，例如，生物素化的氨基酸序列。其它的示范性多肽标记包括，例如，能够被抗体（或其片段）或其它特异性结合试剂识别和/或结合的氨基酸序列。能够被抗体（或其片段）或其它特异性结合试剂识别的多肽标记包括，例如，本领域已知的“表位标记”。表位标记可以是天然的或是人工的表位标记。天然和人工的表位标记已为本领域所知，包括，例如，FLAG，Strep或聚组氨酸肽等人工表位。FLAG肽包括序列Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(SEQ ID NO:74)或Asp-Tyr-Lys-Asp-Glu-Asp-Asp-Lys(SEQ ID NO:75)(Einhauer,A.和Jungbauer,A.,J.Biochem.Biophys.Methods49:1-3:455-465(2001))。Strep表位具有序列Ala-Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly(SEQ ID NO:76)。也可采用VSV-G表位，其具有序列Tyr-Thr-Asp-He-Glu-Met-Asn-Arg-Leu-Gly-Lys(SEQ ID NO:77)。另一人工表位为聚-His序列，其具有六个组氨酸残基(His-His-His-His-His-His(SEQ ID NO:78)。天然存在的表位包括被单克隆抗体12CA5识别的流感病毒血凝素(HA)序列Tyr-Pro-Tyr-Asp-Val-Pro-Asp-Tyr-Ala-He-Glu-Gly-Arg(SEQ ID NO:79)(Murray等人,Anal.Biochem.229:170-179(1995))以及被单克隆抗体9E10识别的来自人c-myc(Myc)的十一个氨基酸序列(Glu-Gln-Lys-Leu-Leu-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu-Asn(SEQ ID NO:80)(Manstein等人,Gene162:129-134(1995))。另一有用的表位为被单克隆抗体YL1/2识别的三肽Glu-Glu-Phe(Stammers等人.FEBSLett.255:298-302(1991))。
在特定的实施方式中，该NgR多肽和该多肽标记可通过连接氨基酸序列相结合。此处所用的“连接氨基酸序列”可以是能够被一种或多种蛋白酶识别和/或裂解的氨基酸序列。能够被一种或多种蛋白酶识别和/或裂解的氨基酸序列已为本领域所知。示范性的氨基酸序列为被以下蛋白酶识别的氨基酸序列：VIIa因子，IXa因子，Xa因子，APC，t-PA，u-PA，胰蛋白酶，糜蛋白酶，肠激酶，胃蛋白酶，组织蛋白酶B,H,L,S,D，组织蛋白酶G，高血压蛋白原酶，血管紧张素转换酶，基质金属蛋白酶（胶原酶，间质溶解素，明胶酶），巨噬细胞弹性蛋白酶，Cir以及Cis。可被前述蛋白酶识别的氨基酸序列已为本领域所知。可被特定酶识别的示范性序列可参见美国专利5,811,252。
多肽标记可促进通过商用色谱介质进行的纯化。
在本发明的一些实施方式中，NgR多肽融合物构建体可用于增强NgR多肽部分在细菌中的生成。在该构建体中，在本发明的NgRl多肽或多肽片段的N末端融合伙伴上通常采用高水平表达和/或分泌的细菌蛋白。例如，参见Smith等人,Gene67:31(1988);Hopp等人,Biotechnology6:1204(1988);La Vallie等人,Biotechnology77:187(1993)。
通过在适当的融合伙伴的氨基和羧基末端融合NgR多肽部分可得到本发明的NgR1多肽或多肽片段的双价或四价形式。例如，可将NgR多肽部分融合至Ig部分的氨基和羧基末端以生成含有两个NgR多肽部分的二价单体多肽。在这些单体的二聚化后，可通过Ig部分获得NgR多肽蛋白的四价形式。该种多价形式可用于提高对目标的结合亲和性。本发明的NgR1多肽或多肽片段的多价形式还可通过串联NgR多肽部分形成串联体（可单独采用或融合至Ig或HAS等融合伙伴）获得。
结合的聚合体（多肽除外）
本发明的部分实施方式涉及本发明的NgR1多肽或多肽片段，其中一种或多种聚合体被结合（共价连接）至NgR多肽。适用于该种结合物的聚合体的范例包括多肽（已在上文讨论），糖聚合体以及聚烷撑二醇链。通常，但不尽然，可通过将聚合物结合至本发明的NgR1多肽或多肽片段以改善下列一种或多种性质：可溶性，稳定性，或生物相容性。
聚烷撑二醇为常用于结合至本发明的NgR1多肽或多肽片段的聚合物类型。最为常用的是聚乙二醇(PEG)。可将PEG部分（例如，1，2，3，4或5PEG聚合物）结合至各NgR多肽，从而相对单独的NgR多肽提高血清半衰期。PEG部分无抗原性，且基本呈生物惰性。本发明实施中采用的PEG部分可以带分支或不带分支。
与NgR多肽结合的PEG部分的数量以及单独PEG的分子量不尽相同。总体而言，聚合物的分子量越高，与多肽结合的聚合物链越少。与NgR多肽或多肽片段结合的总聚合体量通常介于20kDa至40kDa。因此，当一个聚合体链被结合时，该链的分子量通常为20-40kDa。如果结合了两条链时，各链的分子量通常为10-20kDa。如果结合了三条链，该分子量通常为7-14kDa。
如PEG等聚合体可通过多肽上的任何适用的，暴露的反应性基团连接至NgR多肽。该种暴露的反应性基团可以是，例如，内部赖氨酸残基的N末端氨基基团或epsilon氨基基团中的一种或两种。活化的聚合体可与NgR多肽上任何自由氨基基团进行反应和共价连接。NgR多肽（如有）的自由羧基基团，适当活化的羰基基团，羟基，胍基，咪唑，氧化糖部分以及巯基基团也可用作聚合体结合的反应基团。
根据多肽浓度的不同，在结合反应中每摩尔的多肽通常可采用约1.0至约10摩尔活化聚合体。该比例的选择通常代表了在最大化反应的同时最小化能损害该NgR多肽部分目标药理活性的副反应（通常为非特异性的）之间的平衡优选地，至少保留NgR多肽50％的生物活性（例如，在本领域已知或本文所述的任意测定所证实），最优选保留接近100％的活性。
该聚合体可通过常规化学方法结合至NgR多肽。例如，聚烷撑二醇部分可被偶合至NgR多肽的赖氨酸epsilon氨基基团。可通过如PEG琥珀酰亚胺丁二酸酯(SS-PEG)和琥珀酰亚胺丙酸酯(SPA-PEG)等N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化酯与赖氨酸侧链进行连接。适用的聚烷撑二醇部分包括，例如，羧甲基-NHS和正亮氨酸-NHS，SC。这些试剂可从市场上购得。其它的胺-反应性PEG接头可用于替代琥珀酰亚胺部分。其中包括，例如，异硫氰酸，硝基苯基碳酸盐(PNP)，环氧化物，苯***碳酸盐，SC-PEG，磺酸酯，醛，环氧化物，羰基咪唑以及碳酸PNP。通常可对条件进行优化以最大化反应的选择性和程度。该种反应条件的优化属于本领域的普通技术。
可通过本领域已知的任何聚乙二醇化反应进行聚乙二醇化。例如，参见，Focus on Growth Factors3:4-10(1992)，以及欧洲专利申请EP0 154 316和EP0 401 384。可通过与反应性聚乙二醇分子（或类似的反应性水溶性聚合体）的酰化反应或烷化反应进行聚乙二醇化。
通过酰化进行的聚乙二醇化通常包括与聚乙二醇的活性酯衍生物进行反应。任何反应性PEG分子均可用于进行聚乙二醇化。PEG酯化的N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)是一种常用的活化PEG酯。此处所用的“酰化”包括但不限于下列治疗性蛋白和水溶性聚合体（如PEG）之间的连接类型：酰胺，氨基甲酸酯，聚氨酯等。例如，参见Bioconjugate Chem.5:133-140,1994。可对反应参数进行一般选择以避免损伤或灭活NgR多肽的温度，溶剂以及pH条件。
一般而言，该连接键为酰胺，且通常至少95％的所得产物被单-，双-或三-聚乙二醇化。然而还可形成具有更高聚乙二醇化程度的种类，其数量取决于所采用的特异性反应条件。纯化的聚乙二醇化种类可才采用常规的纯化方法（例如，透析，盐析，超滤，离子交换层析，凝胶过滤层析，疏水交换层析以及电泳）选择性地从混合物（特别是未反应的种类）中分离。
通过酰化进行的聚乙二醇化通常包括在还原剂存在下PEG的末端醛衍生物与本发明的NgR1多肽或多肽片段的反应。此外，人们可对反应条件进行调节使得实际上仅在NgR多肽的N末端氨基基团进行聚乙二醇化，即，得到单-聚乙二醇化蛋白。对于单-聚乙二醇化或多-聚乙二醇化，PEG组通常通过-CH2-NH-基团与蛋白结合。特别对于-CH2-基团，该种类型的键被称为“烷”键。
通过还原性烷化反应进行衍生化以生成N末端靶向单-聚乙二醇化产物可利用可供衍生化的不同类型伯胺基基团（N末端赖氨酸）的不同反应性。该反应可在特定pH下进行，该pH可允许人们利用赖氨酸残基的epsilon-氨基基团和蛋白的N末端氨基基团之间的pKa差异。通过该种选择性衍生化可控制包含反应性基团（例如，醛）的水溶性聚合体与蛋白的结合：与聚合体的结合主要发生在蛋白的N末端，且未发生对其它反应性基团（例如，赖氨酸侧链氨基基团）的明显修饰。
该用于酰化和烷化过程的聚合体分子可选自水溶性聚合体。所选的聚合体通常可经过修饰以具有单独的反应性基团（例如用于酰化的活性酯或用于烷化的醛），从而可如同本方法一样控制聚合程度。PEG醛的范例之一为水中稳定的聚乙二醇丙醛，或单C1-C10烷氧基或其烷氧基衍生物（例如，参见Harris等人.,美国专利5,252,714）。该聚合体可带有或不带有分支。对于酰化反应，所选的聚合体通常具有单独反应性酯基团。对于烷化反应，所选的聚合体通常具有单独反应性醛基团。一般而言，水溶性聚合体不会选自天然存在的糖基残基，因为它们更方便由哺乳动物重组表达***生成。
制备聚乙二醇化本发明的NgR多肽的方法通常包括下列步骤:(a)将本发明的NgR1多肽或多肽片段与聚乙二醇(例如PEG的反应性酯或醛衍生物)反应,在该反应条件下该分子可与一个或多个PEG基团连接,以及(b)获取反应产物。一般而言，酰化反应的最佳反应条件将根据已知参数和目标结果进行个别确定。例如，PEG与蛋白的比例越大通常可生成更大比例的聚-聚乙二醇化产物。
通过还原性烷化生成充分均匀的单-聚合体/NgR多肽通常包括以下步骤：(a)将本发明的NgR1多肽或多肽片段与反应性PEG分子在还原性烷化条件下反应，反应pH适于对NgR的N-末端氨基基团进行选择性修饰；以及(b)获得反应产物。
对于充分均匀的单-聚合体/NgR多肽，还原性烷化反应条件为允许水溶性聚合体部分与本发明的NgRl多肽或多肽片段的N末端选择性结合的条件。该反应条件通常提供了赖氨酸侧链氨基基团和N-末端氨基基团之间的pKa差异。为达成本发明的目的，该pH通常在3-9的范围内，典型在3-6的范围内。
本发明的NgRl多肽可包括标签，例如，可通过蛋白水解充分释放的部分。因此，该赖氨酸部分可进行如下选择性修饰：首先与以低分子量接头（例如可同时与赖氨酸和N末端反应的Traut试剂(Pierce Chemical Company,Rockford,IL)）修饰的His-tag反应，然后释放该His-tag。然后该多肽将包含可用含硫醇-反应性头基（例如马来酰亚胺基团，乙烯砜基团，卤乙酸基团，或者自由或保护SH）的PEG选择性修饰的自由SH基团。
Traut试剂可通过能建立PEG连接特定位点的任何接头进行替代。例如，Traut试剂可用SPDP,SMPT,SATA或SATP(PierceChemical Company,Rockford,IL)进行替代。类似地，可将蛋白与***马来酰亚胺（例如，SMCC，AMAS，BMPS，MBS，EMCS，SMPB，SMPH，KMUS或GMBS），卤乙酸(SBAP，SIA，SIAB)，或乙烯砜基团的胺-反应性接头反应，并将所得的产物与包含自由SH的PEG反应。
在一些实施方式中，该聚烷撑二醇部分被偶合至NgR多肽的半胱氨酸基团。可通过如马来酰亚胺基团，乙烯砜基团，卤乙酸基团或硫醇基团等基团形成该偶合。
该NgR多肽可选择性地通过易分解的键与聚烷撑二醇部分结合。该易分解的键可在如生化水解，蛋白水解或是巯基裂解中断裂。例如，该键可在体内（生理）条件下被断裂。
该反应在任何用于将生物活性材料与惰性聚合体反应的方法中发生，通常pH约为5-8，例如，当反应性基团在N末端的alpha氨基基团上时pH为5，6，7或8。通常该过程包括制备活化的聚合体，然而使蛋白与该活化聚合体反应以生成适用于制剂的可溶性蛋白。
在特定的实施方式中，本发明的NgR多肽为可溶性多肽。使多肽可溶或提高多肽可溶性的方法已为本领域公知。
本发明的核酸分子
本发明提供了编码本发明多肽（包括SEQ ID NOs:1-9,26-27,29-37和41-45中任意一个的多肽）的核酸。在部分实施方式中，该核酸编码选自如SEQ ID NOs:6和8所示Nogo受体-1的氨基酸残基26-344或是如SEQ ID NOs:8所示Nogo受体-1的氨基酸残基27-344的多肽。在部分实施方式中，该核酸编码选自如SEQID NOs:7和9所示Nogo受体-1的氨基酸残基26-310或是如SEQ IDNOs:9所示Nogo受体-1的氨基酸残基27-310的多肽。此处所用的“核酸”指基因组DNA，cDNA，mRNA和反义分子，以及基于替代骨架或包括了天然或合成来源的替代碱基的核酸。在部分实施方式中，该核酸进一步包含转录启动子并选择性包含信号序列，其分别可操作地连接至编码本发明多肽的核苷酸序列。
在部分实施方式中，本发明提供了编码本发明Nogo受体-1融合蛋白核酸，其包括包含了选自如SEQ ID NOs:6和8所示Nogo受体-1的氨基酸残基26-344或是如SEQ ID NOs:8所示Nogo受体-1的氨基酸残基27-344以及如SEQ ID NOs:7和9所示Nogo受体-1的氨基酸残基26-310或是如SEQ ID NOs:9所示Nogo受体-1的氨基酸残基27-310的多肽的融合蛋白。在部分实施方式中，该核酸编码包含选自SEQ ID NOs:26-27,29-37和41-45的多肽的Nogo受体-1融合蛋白。在部分实施方式中，该核酸编码进一步包含转录启动子并选择性包含信号序列的Nogo受体-1融合蛋白。在部分实施方式中，该核苷酸序列进一步编码免疫球蛋白恒定区。在部分实施方式中，该免疫球蛋白恒定区为重链恒定区。在部分实施方式中，该核苷酸序列进一步编码与铰链区连接的免疫球蛋白重链恒定区。在部分实施方式中，该核酸进一步编码Fc。在部分实施方式中，该Nogo受体-1融合蛋白包含Fc片段。
本发明的编码核酸可进一步修饰以包含用于诊断和探测目的的可测标记。各种该类标记已为本领域所知并可简单用于此处所述的编码分子。适用的标记包括，但不限于，生物素，放射标记的核苷酸等。技术人员可采用任何本领域已知的标记来获得带标记的编码核酸分子。
本发明还包括了在中度严格或高度严格条件下与非编码链，或编码本发明任意一个多肽的多聚核苷酸的补体杂交的多聚核苷酸。严格条件已为本领域技术人员所知并可参见CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,John Wiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6。
人Nogo受体-1多肽多聚核苷酸显示为下文的SEQ IDNO:81。
全长人Nogo受体-1由SEQ I D NO：81的核苷酸166至核苷酸1587进行编码：
agcccagcca gagccgggcg gagcggagcg cgccgagcct cgtcccgcgg
ccgggccggg gccgggccgt agcggcggcg cctggatgcg gacccggccg
cggggagacg ggcgcccgcc ccgaaacgac tttcagtccc cgacgcgccc
cgcccaaccc ctacgatgaa gagggcgtcc gctggaggga gccggctgct
ggcatgggtg ctgtggctgc aggcctggca ggtggcagcc ccatgcccag
gtgcctgcgt atgctacaat gagcccaagg tgacgacaag ctgcccccag
cagggcctgc aggctgtgcc cgtgggcatc cctgctgcca gccagcgcat
cttcctgcac ggcaaccgca tctcgcatgt gccagctgcc agcttccgtg
cctgccgcaa cctcaccatc ctgtggctgc actcgaatgt gctggcccga
attgatgcgg ctgccttcac tggcctggcc ctcctggagc agctggacct
cagcgataat gcacagctcc ggtctgtgga ccctgccaca ttccacggcc
tgggccgcct acacacgctg cacctggacc gctgcggcct gcaggagctg
ggcccggggc tgttccgcgg cctggctgcc ctgcagtacc tctacctgca
ggacaacgcg ctgcaggcac tgcctgatga caccttccgc gacctgggca
acctcacaca cctcttcctg cacggcaacc gcatctccag cgtgcccgag
cgcgccttcc gtgggctgca cagcctcgac cgtctcctac tgcaccagaa
ccgcgtggcc catgtgcacc cgcatgcctt ccgtgacctt ggccgcctca
tgacactcta tctgtttgcc aacaatctat cagcgctgcc cactgaggcc
ctggcccccc tgcgtgccct gcagtacctg aggctcaacg acaacccctg
ggtgtgtgac tgccgggcac gcccactctg ggcctggctg cagaagttcc
gcggctcctc ctccgaggtg ccctgcagcc tcccgcaacg cctggctggc
cgtgacctca aacgcctagc tgccaatgac ctgcagggct gcgctgtggc
caccggccct taccatccca tctggaccgg cagggccacc gatgaggagc
cgctggggct tcccaagtgc tgccagccag atgccgctga caaggcctca
gtactggagc ctggaagacc agcttcggca ggcaatgcgc tgaagggacg
cgtgccgccc ggtgacagcc cgccgggcaa cggctctggc ccacggcaca
tcaatgactc accctttggg actctgcctg gctctgctga gcccccgctc
actgcagtgc ggcccgaggg ctccgagcca ccagggttcc ccacctcggg
ccctcgccgg aggccaggct gttcacgcaa gaaccgcacc cgcagccact
gccgtctggg ccaggcaggc agcgggggtg gcgggactgg tgactcagaa
ggctcaggtg ccctacccag cctcacctgc agcctcaccc ccctgggcct
ggcgctggtg ctgtggacag tgcttgggcc ctgctgaccc ccagcggaca
caagagcgtg ctcagcagcc aggtgtgtgt acatacgggg tctctctcca
cgccgccaag ccagccgggc ggccgacccg tggggcaggc caggccaggt
cctccctgat ggacgcctg
大鼠Nogo受体-1多肽多聚核苷酸显示为下文的SEQ IDNO：82且在Genbank中的索取号为NM_053613。
atgaagaggg cgtcctccgg aggaagccgg ctgccgacat gggtgttatg
gctacaggcc tggagggtag caacgccctg ccctggtgcc tgtgtgtgct
acaatgagcc caaggtcaca acaagccgcc cccagcaggg cctgcaggct
gtacccgctg gcatcccagc ctccagccag agaatcttcc tgcacggcaa
ccgaatctct tacgtgccag ccgccagctt ccagtcatgc cggaatctca
ccatcctgtg gctgcactca aatgcgctgg ccgggattga tgccgcggcc
ttcactggtc tgaccctcct ggagcaacta gatcttagtg acaatgcaca
gctccgtgtc gtggacccca ccacgttccg tggcctgggc cacctgcaca
cgctgcacct agaccgatgc ggcctgcagg agctggggcc tggcctattc
cgtgggctgg cagctctgca gtacctctac ctacaagaca acaacctgca
ggcacttccc gacaacacct tccgagacct gggcaacctc acgcatctct
ttctgcatgg caaccgtatc cccagtgttc ctgagcacgc tttccgtggc
ttgcacagtc ttgaccgtct cctcttgcac cagaaccatg tggctcgtgt
gcacccacat gccttccggg accttggccg actcatgacc ctctacctgt
ttgccaacaa cctctccatg ctccccgcag aggtcctagt gcccctgagg
tctctgcagt acctgcgact caatgacaac ccctgggtgt gtgactgcag
ggcacgtccg ctctgggcct ggctgcagaa gttccgaggt tcctcatccg
gggtgcccag caacctaccc caacgcctgg caggccgtga tctgaagcgc
ctggctacca gtgacttaga gggttgtgct gtggcttcgg ggcccttccg
tcccttccag accaatcagc tcactgatga ggagctgctg ggcctcccca
agtgctgcca gccggatgct gcagacaagg cctcagtact ggaacccggg
aggccggcgt ctgttggaaa tgcactcaag ggacgtgtgc ctcccggtga
cactccacca ggcaatggct caggcccacg gcacatcaat gactctccat
ttgggacttt gcccggctct gcagagcccc cactgactgc cctgcggcct
gggggttccg agcccccggg actgcccacc acgggccccc gcaggaggcc
aggttgttcc agaaagaacc gcacccgtag ccactgccgt ctgggccagg
caggaagtgg gagcagtgga actggggatg cagaaggttc gggggccctg
cctgccctgg cctgcagcct tgctcctctg ggccttgcac tggtactttg
gacagtgctt gggccctgct ga
小鼠Nogo受体-1多肽多聚核苷酸显示为下文的SEQ IDNO：83且在Genbank中的索取号为NM_022982。
agccgcagcc cgcgagccca gcccggcccg gtagagcgga gcgccggagc
ctcgtcccgc ggccgggccg ggaccgggcc ggagcagcgg cgcctggatg
cggacccggc cgcgcgcaga cgggcgcccg ccccgaagcc gcttccagtg
cccgacgcgc cccgctcgac cccgaagatg aagagggcgt cctccggagg
aagcaggctg ctggcatggg tgttatggct acaggcctgg agggtagcaa
caccatgccc tggtgcttgt gtgtgctaca atgagcccaa ggtaacaaca
agctgccccc agcagggtct gcaggctgtg cccactggca tcccagcctc
tagccagcga atcttcctgc atggcaaccg aatctctcac gtgccagctg
cgagcttcca gtcatgccga aatctcacta tcctgtggct gcactctaat
gcgctggctc ggatcgatgc tgctgccttc actggtctga ccctcctgga
gcaactagat cttagtgata atgcacagct tcatgtcgtg gaccctacca
cgttccacgg cctgggccac ctgcacacac tgcacctaga ccgatgtggc
ctgcgggagc tgggtcccgg cctattccgt ggactagcag ctctgcagta
cctctaccta caagacaaca atctgcaggc actccctgac aacacctttc
gagacctggg caacctcacg catctctttc tgcatggcaa ccgtatcccc
agtgtgcctg agcacgcttt ccgtggcctg cacagtcttg accgcctcct
cttgcaccag aaccatgtgg ctcgtgtgca cccacatgcc ttccgggacc
ttggccgcct catgaccctc tacctgtttg ccaacaacct ctccatgctg
cctgcagagg tcctaatgcc cctgaggtct ctgcagtacc tgcgactcaa
tgacaacccc tgggtgtgtg actgccgggc acgtccactc tgggcctggc
tgcagaagtt ccgaggttcc tcatcagagg tgccctgcaa cctgccccaa
cgcctggcag accgtgatct taagcgcctc gctgccagtg acctagaggg
ctgtgctgtg gcttcaggac ccttccgtcc catccagacc agtcagctca
ctgatgagga gctgctgagc ctccccaagt gctgccagcc agatgctgca
gacaaagcct cagtactgga acccgggagg ccagcttctg ccggaaacgc
cctcaaggga cgtgtgcctc ccggtgacac tccaccaggc aatggctcag
gccctcggca catcaatgac tctccatttg gaactttgcc cagctctgca
gagcccccac tgactgccct gcggcctggg ggttccgagc caccaggact
tcccaccact ggtccccgca ggaggccagg ttgttcccgg aagaatcgca
cccgcagcca ctgccgtctg ggccaggcgg gaagtggggc cagtggaaca
ggggacgcag agggttcagg ggctctgcct gctctggcct gcagccttgc
tcctctgggc cttgcactgg tactttggac agtgcttggg ccctgctgac
cagccaccag ccaccaggtg tgtgtacata tggggtctcc ctccacgccg
ccagccagag ccagggacag gctctgaggg gcaggccagg ccctccctga
cagatgcctc cccaccagcc cacccccatc tccaccccat catgtttaca
gggttccggg ggtggcgttt gttccagaac gccacctccc acccggatcg
cggtatatag agatatgaat tttattttac ttgtgtaaaa tatcggatga
cgtggaataa agagctcttt tcttaaaaaa aaaaaaaaaa aa
人Nogo受体-2多肽多聚核苷酸显示为下文的SEQ IDNO：84且在Genbank中的索取号为BK001302。
atgctgcccg ggctcaggcg cctgctgcaa gctcccgcct cggcctgcct
cctgctgatg ctcctggccc tgcccctggc ggcccccagc tgccccatgc
tctgcacctg ctactcatcc ccgcccaccg tgagctgcca ggccaacaac
ttctcctctg tgccgctgtc cctgccaccc agcactcagc gactcttcct
gcagaacaac ctcatccgca cgctgcggcc aggcaccttt gggtccaacc
tgctcaccct gtggctcttc tccaacaacc tctccaccat ctacccgggc
actttccgcc acttgcaagc cctggaggag ctggacctcg gtgacaaccg
gcacctgcgc tcgctggagc ccgacacctt ccagggcctg gagcggctgc
agtcgctgca tttgtaccgc tgccagctca gcagcctgcc cggcaacatc
ttccgaggcc tggtcagcct gcagtacctc tacctccagg agaacagcct
gctccaccta caggatgact tgttcgcgga cctggccaac ctgagccacc
tcttcctcca cgggaaccgc ctgcggctgc tcacagagca cgtgtttcgc
ggcctgggca gcctggaccg gctgctgctg cacgggaacc ggctgcaggg
cgtgcaccgc gcggccttcc gcggcctcag ccgcctcacc atcctctacc
tgttcaacaa cagcctggcc tcgctgcccg gcgaggcgct cgccgacctg
ccctcgctcg agttcctgcg gctcaacgct aacccctggg cgtgcgactg
ccgcgcgcgg ccgctctggg cctggttcca gcgcgcgcgc gtgtccagct
ccgacgtgac ctgcgccacc cccccggagc gccagggccg agacctgcgc
gcgctccgcg aggccgactt ccaggcgtgt ccgcccgcgg cacccacgcg
gccgggcagc cgcgcccgcg gcaacagctc ctccaaccac ctgtacgggg
tggccgaggc cggggcgccc ccagccgatc cctccaccct ctaccgagat
ctgcctgccg aagactcgcg ggggcgccag ggcggggacg cgcctactga
ggacgactac tgggggggct acgggggtga ggaccagcga ggggagcaga
tgtgccccgg cgctgcctgc caggcgcccc cggactcccg aggccctgcg
ctctcggccg ggctccccag ccctctgctt tgcctcctgc tcctggtgcc
ccaccacctc tga
小鼠Nogo受体-2多肽多聚核苷酸显示为下文的SEQ IDNO：85且在Genbank中的索取号为NM_199223。
atgctgcccg ggctccggcg cctgctgcaa ggtcctgcct cagcctgcct
actgctgaca ctcctggccc ttccttccgt gacccccagc tgtcctatgc
tctgcacctg ctactcctcc ccgcccaccg tgagctgcca ggccaacaac
ttctcctcag tgccgctgtc cttgccaccc agtacacaga gactcttctt
gcagaacaac ctcatccgct cactgcggcc aggcaccttt gggcccaacc
tgctcaccct gtggctcttc tccaacaacc tctccaccat ccaccctggc
accttccgcc acctgcaggc cctagaagaa ctggacctcg gtgacaaccg
gcacctgcgc tccctggagc ccgacacctt ccagggtctg gagaggctgc
agtcactaca cctgtatcgt tgccagctca gcagcctgcc tggcaacatt
ttccgaggct tggtcagcct acagtacctc tacctccagg agaacagcct
gctccatcta caggatgact tgttcgcgga cctggccaac ctgagccacc
tcttcctcca cgggaaccgc ctgcggctgc tcacggagca cgtgttccgc
ggcttgggca gcctggaccg gctgttgctg cacgggaacc ggctgcaggg
cgtgcaccgc gcggctttcc acggcctcag ccgcctcacc atcctctacc
tgttcaacaa cagcctggcc tcgctgccgg gagaggcgct ggccgacctg
ccggcgctcg agttcctgcg gctcaacgcc aacccctggg cgtgcgactg
ccgcgctcgg ccgctctggg cttggttcca gcgcgcgcgg gtgtccagct
ccgacgtgac ctgcgccacc ccgcccgagc gccagggccg ggacctgcgc
gcgctgcgcg actccgattt ccaagcgtgc ccgccgccca cgcccacgcg
gccgggcagc cgcgcccgcg gcaacagctc ttccaaccac ctgtacggcg
tggccgaggc tggcgctccc cccgcagacc cgtccacgct ctaccgagat
ctgcccgccg aggactcgcg ggggcgccag ggcggggacg cgcccaccga
ggacgactac tgggggggct acggcggcga ggatcagcgg ggcgagcaga
cgtgtcccgg ggccgcgtgc caggcgcccg cagactcgcg tggccccgcg
ctctcggccg ggctgcgcac ccctctgctc tgcctcttgc ccctggcgct
ccatcacctctga
人Nogo受体-3多肽多聚核苷酸显示为下文的SEQ IDNO：86且在Genbank中的索取号为BK001305。
atgcttcgca aagggtgctg tgtggagttg ctgctgctgt tggtagctgc
ggagctgccc ctgggtggtg gctgcccacg ggactgtgtg tgctacccgg
cgcccatgac ggtcagctgc caggcgcaca actttgcagc catcccggag
ggcatccccg tggacagcga gcgcgtcttc ctgcagaaca accgcatcgg
cctcctccag cccggccact tcagccccgc catggtcacc ctgtggatct
actcgaacaa catcacctac atccacccca gcaccttcga gggcttcgtg
cacctggagg agctggacct cggcgacaac cggcagctgc ggacgctggc
acccgagacc ttccagggcc tggtgaagct tcacgccctc tacctctaca
agtgtgggct cagcgccttg ccggccggcg tctttggcgg cctgcacagc
ctgcagtacc tctacctgca ggacaaccac atcgagtacc tccaggacga
catcttcgtg gacctggtca acctcagcea cctgtttctc caeggcaaca
agctgtggag tctgggcccg ggcaccttcc ggggcctggt gaacctggac
cgtcttttgc tgcacgagaa ccagctgcag tgggtccacc acaaggcatt
ccacgacctc cgcaggctga ccaccctctt cctcttcaac aacaqcctct
cggagctgca gggtgagtgc ctggccccgc tgggggccct ggagttcctc
cgcctcaatg gcaacccctg ggactgtggt tgtcgcgcgc gctccctgtg
ggaatggctg cagaggttcc ggggctccag ctccgctgtc ccctgtgtgt
cccctgggct gcggcacggc caggacctga agctgctgag ggccgaggac
ttccggaact gcacgggacc agcgtccccg caccagatca agtcacacac
gctcaccacc accgacaggg ccgcccgcaa ggaacaccac tcaccccacq
gccccaccag gagcaagggc cacccgcacg gcccccggcc cggccaoagg
aagccgggga agaactgcae caaccccagg aaccgcaatc agatctctaa
ggcgggcgcc gggaaacagg cccccgagct gccagactat gccccagact
accagcacaa gttcagtttt gacatcatgc ctacggcccg gcccaagagg
aagggcaagt gtgcccgcag gacccccatc cgtgccccca gcggggtgca
gcaggcctcc tcggccagtt ccctgggggc ctccctcctg gcctggacac
tggggctggc ggtcactctc cgctga
小鼠Nogo受体-3多肽多聚核苷酸显示为下文的SEQ IDNO：87且在Genbank中的索取号为BK00l304。
atgcttcgca aagggtgctg tgtggaattg ctgctgttgc tgctcgctgg
agagctacct ctgggtggtg gttgtcctcg agactgtgtg tgctaccotg
cgcccatgac tgtcagctgc caggcacaca actttgctgc catcccggag
ggcatcccag aggacagtga gcgcatcttc ctgcagaaca atcgcatcac
cttcctccag cagggccact tcagccccgc catggtcacc ctctggatct
actccaacaa catcactttc attgctccca acaccttcga gggctttgtq
catctggagg agctagacct tggagacaac cgacagctgc gaacgctggc
acccgagacc ttccaaggcc tggtgaagct tcacgccctc tacctctata
agtgtggact gagcgccctg cccgcaggca tctttggtgg cctgcacagc
ctgcagtatc tctacttgca ggacaaccat atcgagtacc tccaagatga
catctttgtg gacctggtca atctcagtca cttgtttctc catggtaaca
agctatggag cctgggccaa ggcatcttcc ggggcctggt gaacctggac
cggttgctgc tgcatgagaa ccagctacag tgggttcacc acaaggcttt
ccatgacctc cacaggctaa ccaccctctt tctcttcaac aacagcctca
ctgagctgca gggtgactgt ctggcccccc tggtggcctt ggagttcctt
cgcctcaatg ggaatgcttg ggactgtggc tgccgggcac gttccctgtg
ggaatggctg cgaaggttcc gtggctctag ctctgctgtc ccctgcgcga
cccccgagct gcggcaaggc caggatctga agctgctgag ggtggaggac
ttccggaact gcacaggacc agtgtctcct caccagatca agtctcacac
gcttaccacc tctgacaggg ctgcccgcaa ggagcaccat ccgtcccatg
gggcctccag ggacaaaggc cacccacatg gccatccgcc tggctccagg
tcaggttaca agaaggcagg caagaactgc accagccaca ggaaccggaa
ccagatctct aaggtgagct ctgggaaaga gcttaccgaa ctgcaggact
atgcccccga ctatcagcac aagttcagct ttgacatcat gcccaccgca
cgacccaaga ggaagggcaa gtgtgctcgc aggaccccca tccgtgcccc
cagtggggtg cagcaggcat cctcaggcac ggcccttggg gccccactcc
tggcctggat actggggctg gcagtcactc tccgctga
NgR1多聚核苷酸拮抗剂
特定的实施方式中包含了防止NgR1表达(阻抑)的NgR1多聚核苷酸拮抗剂。NgR1多聚核苷酸拮抗剂包括，但不限于，反义分子，核酶，siRNA，shRNA以及RNAi。该种结合分子通常单独向动物施用(例如，参见O’Connor，J.Neurochem．56：560(1991))，但该种结合分子也可在体内通过被宿主细胞摄取的多聚核苷酸表达并在体内表达。也可参加Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression，CRC Press，Boca Raton，FL(1988)。
在部分实施方式中，NgR基因的表达可通过RNA干扰(”RNAi”)进行抑制。RNAi指干扰目标mRNA表达的RNA的表达。RNAi是向细胞导入双链RNA(dsRNA)引起同源mRNA降解的现象。在线虫Caenorhabditis elegans中首次发现后，又发现RNAi可在多种有机体内作用。此处所用的“RNAi核酸”为长度通常短于50个核苷酸，在mRNA水平引起基因沉默的核酸序列，
例如，在哺乳动物中导入长dsRNA(＞30核苷酸)可引发示例为蛋白合成和RNA降解的非特异性抑制的潜在抗病毒应答。RNA干扰提供了在mRNA水平引起基因沉默的机制。近些年来，RNAi已成为采用双链RNAs(dsRNA)标记特定转录物以进行体内降解的内源性的潜在基因特异性沉默技术。它提供了有效的广泛适用的基因敲除方法。此外，RNAi技术可用于治疗目的。例如，RNAi靶向Fas-介导的凋亡显示可保护小鼠免受重型肝炎。RNAi技术已在众多出版物中披露，例如美国专利5,919,619,6,506,559以及PCT公开WO99/14346，WO01/70949，WO01/36646，WO00/63364，WO00/44895，WO01/75164，WO01/92513，WO01/68836以及WO01/29058。
该RNAi可特别通过siRNA（短干扰RNA）与特定mRNA（例如，NgRl）相互作用沉默目标基因。然后可靶向该ds RNA复合物以通过细胞降解。其它的RNAi分子包括短发夹RNA(shRNA)；以及短干扰发夹。shRNA分子包含了来自目标基因并由环连接的正义和反义序列。该shRNA由细胞核被运输至细胞质，并随mRNA被降解。Pol III或U6启动子可用于为RNAi表达RNAs。能够通过RNA干扰抑制基因表达的序列可具有任意长度。例如，该序列可具有至少10，15，20，25，30，35，40，45，50，100或更多个连续的核苷酸。假设该序列可形成功能性沉默复合物以降解目标mRNA转录物，该序列可以是dsRNA或任何其它类型的多聚核苷酸。
RNAi可通过对其“目标”mRNAs具有序列特异性同源性的双链RNA（dsRNA）分子进行介导(Caplen等人,Proc Natl AcadSci USA P5:9742-9747,2001)。对果蝇无细胞溶解物的生化研究显示RNA依赖性基因沉默的介导物为18-25核苷酸“小干扰”RNA复制物（siRNAs）。相应地，siRNA分子可方便地在本发明的方法中采用。siRNAs可通过以成为Dicer的RNase III-相关的核酸酶降解更长的dsRNA分子进行外部制备。(Bernstein等人.,Nature409:363-366,2001)。siRNAs还可外部导入细胞，或通过表达构建体的转录。siRNAs形成后可与蛋白元件组装形成被称为RNA-诱导的沉默复合物(RISCs)的含核糖核酸内切酶的复合物。ATP生成的siRNA解链激活RISCs，后者因而通过Watson-Crick碱基配对靶向互补mRNA转录物。不希望受限于特定的理论，据认为RISC被导向目标mRNA，其中的siRNA双链体进行序列特异性相互反应以通过催化方式介导裂解(Bernstein等人,Nature409:363-366,2001;Boutla等人,CurrBiol1:1776-1780,2001)。mRNA的裂解发生于siRNA链结合区的中部附近。该种序列特异性mRNA降解导致了基因沉默。
RNAi已被用于通过非限制性样本神经元等途径(Krichevsky等人,Proc Natl Acad Sci USA99:11926-11929,2002)分析基因功能以及鉴定哺乳动物细胞中的必要基因(Elbashir等人,Methods26:199-213,2002;Harborth等人,J Cell SciUSA114:4557--4565,2001)。人们评价了RNAi的治疗形态，例如对病毒（包括但不限于脊髓灰质炎病毒(Gitlin等人,Nature418:379-380,2002)和HIV(Capodici等人,J Immunol169:5196--5201,2002)）的感染，复制和/或生长的抑制和阻断，以及减少致癌基因的表达（例如，bcr-abl基因；Scherr等人,Blood9月26印刷前的电子公开,2002）。RNAi已被用于调节哺乳动物（小鼠）和两栖动物（爪蟾）胚胎（分别为Calegari等人,Proc NatlAcad Sci USA99:14236--14240,2002；以及Zhou,等人,NucleicAcids Res30:1664-1669,2002）以及出生后小鼠中的基因表达，并用于诱导成年转基因小鼠中的转基因表达(McCaffrey等人,Nature418:38-39,2002)。在细胞培养和体内检测siRNAs效力和特异性的方法已有描述（例如，参见Bertrand等人,BiochemBiophys Res Commun296:1000--1004,2002;Lassus等人,SciSTKE2002(147):PL13,2002;以及Leirdal等人,Biochem BiophysRes Commun295:744-74%,2002）。
介导RNAi的分子（包括但不限于siRNA）可通过化学合成(Hohjoh,FEBS Lett527:195-199,2002)，dsRNA水解(Yang等人,Proc Natl Acad Sci USA99:9942-9947,2002)，以T7RNA聚合酶体外转录(Donzeet等人,Nucleic Acids Res30:e46,2002;Yu等人,Proc Natl Acad Sci USA99:6047-6052,2002)，以及采用如大肠杆菌RNA酶III等核酸酶水解双链RNA(Yang等人,Proc Natl Acad Sci USA99:9942-9947,2002)进行体外制备。
siRNA分子还可通过对两个寡聚核苷酸相互退火形成，通常具有下列一般结构，其中同时包括了双链和单链部分：
其中N，X和Y为核苷酸，X与Y通过氢键连接；“：”表示两个碱基之间的氢键；x为介于1和约100之间的自然数；而m和n为介于0和约100之间的相互独立的整数。在部分实施方式中，N，X和Y各自为A，G，C和T或U。特别对于合成siRNA（即，两个寡聚核苷酸的退火产物），可能存在非天然存在的碱基和核苷酸。该双链中心区被称为“核心”并以碱基对(bp)作为测量单位；该双链部分悬挂，并以核苷酸(nt)作为测量单位。所示的悬挂为3'悬端，但具有5'悬端的分子同样在本发明的范围之内。没有悬挂的siRNA分子（即，m=0且n=0）,以及仅在核心一侧具有悬挂的分子（例如，m=0且n>1，或与之相反）同样在本发明的范围之内。
RNAi技术最初并未显示出可方便地应用于哺乳动物***。这是因为在哺乳动物中，dsRNA激活的dsRNA-活化蛋白激酶(PKR)可导致凋亡和细胞死亡(Der等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:3279-3283,1997)。此外，人们很久以前便知道dsRNA可在哺乳动物细胞中激活干扰素级联，从而还可导致细胞生理学的改变(Colby等人,Annu.Rev.Microbiol.25:333,1971;Kleinschmidt等人.,Annu.Rev.Biochem.41:517,1972;Lampson等人.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA58L782,1967;Lomniczi等人.,J.Gen.Virol.8:55,1970;以及Younger等人.,J.Bacteriol.92:862,1966)。然而，dsRNA介导的PKR激活和干扰素级联需要长度超过约30个碱基对的dsRNA。相对地，据证明长度小于30个碱基对的dsRNA可引起哺乳动物细胞中的RNAi(Caplen等人.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA98:9742--9747,2001)。因此，可期待通过制备基本没有更长dsRNAs的短RNA来避免更长dsRNA分子带来的有害的，非特异性的作用。
有关siRNA的参考文献：Bernstein等人.,Nature409:363-366,2001;Boutla等人,Curr Biol11:1776-1780,2001;Cullen,Nat Immunol.3:597-599,2002;Caplen等人,Proc NatlAcad Sci USA98:9742-9747,2001;Hamilton等人,Science286:950-952,1999;Nagase等人,DNA Res.6:63-70,1999;Napoli等人,Plant Cell2:279-289,1990;Nicholson等人,Mamm.Genome13:67-73,2002;Parrish等人,Mol Cell6:1077-1087,2000;Romano等人,MoI Microbiol6:3343-3353,1992;Tabara等人,Cell99:123-132,1999;以及Tuschl,Chembiochem.2:239-245,2001。
Paddison等人(Genes&Dev.16:948-958,2002)曾将小RNA分子折叠发夹以引起RNAi。相应地，该短发夹RNA(shRNA)分子同样可被本发明的方法方便采用。功能性shRNAs的主干和环的长度各不相同；在不影响沉默活性的前提下，主干长度可介于约25至约30nt，而环的大小可介于4至约25nt。不希望受特定理论之束缚，据认为这些shRNAs类似于DICER RNA酶的dsRNA产物，且在任意情况下具有相同的抑制特定基因表达的能力。
在部分实施方式中，本发明提供了该siRNA或shRNA抑制NgRl表达。在部分实施方式中，本发明进一步提供了至少与包含CUACUUCUCCCGCAGGCG(SEQ ID NO:52)或CCCGGACCGACGUCUUCAA(SEQ ID NO:54)或CUGACCACUGAGUCUUCCG(SEQ ID NO:56)的核苷酸序列具有80％，90％或95％一致性的siRNA或shRNA。在其它实施方式中，该siRNA或shRNA核苷酸序列为CUACUUCUCCCGCAGGCG(SEQID NO:52)或CCCGGACCGACGUCUUCAA(SEQ ID NO:54)或CUGACCACUGAGUCUUCCG(SEQ ID NO:56)。
在部分实施方式中，本发明进一步提供了该siRNA或shRNA核苷酸序列与多聚核苷酸序列GATGAAGAGGGCGTCCGCT(SEQ IDNO:53)或GGGCCTGGCTGCAGAAGTT(SEQ ID NO:55)或GACTGGTGACTCAGAG AAGGC(SEQ ID NO:57)生成的mRNA互补。
在本发明的一些实施方式中，该shRNA从实施例26所述的慢病毒载体中表达。
经过修饰（碱基，糖和/或磷酸盐）的化学合成核酸分子可防止其被核糖核酸酶降级，这可以提高它们的效力(例如，参见,Eckstein等人,国际公布WO92/07065;Perrault等人,Nature344:565(1990);Pieken等人,Science253:314(1991);Usman和Cedergren,Trends in Biochem.Sci.77:334(1992);Usman等人,国际公布WO93/15187;以及Rossi等人,国际公布WO91/03162;Sproat,美国专利5,334,711;Gold等人,美国专利6,300,074;以及Burgin等人,同上文;全部文献在此引用作为参考)。上述的各参考文献描述了可对此处所述的核酸分子的碱基，磷酸盐和/或糖部分进行的各种化学修饰。预期的修饰和增强其在细胞中的效力，从核酸分子去除碱基以寡核苷酸合成时间并减少化学需求。
本领域有众多实施例描述了可对核酸分子进行的并可明显增强其核酸酶稳定性和效力的糖，碱基和磷酸盐修饰。例如，可修饰寡核苷酸以通过对核酸酶耐受基团的修饰（例如，2'-氨基，2'-C-烯丙基，2'-氟，2'-O-甲基，2'-O-烯丙基，2'-H核苷酸碱基修饰）来增强稳定性和/或增强生物活性（综述可参见Usman和Cedergren,TIBS.77:34(1992);Usman等人,Nucleic Acids Symp.Ser.37:163(1994);Burgin等人,Biochemistry35:14090(1996))。核酸分子的糖修饰已在本领域得到广泛的描述（参见，Eckstein等人,国际申请PCT No.WO92/07065;Perrault等人,Nature344:565-568(1990);Pieken等人,Science253:314-317(1991);Usman和Cedergren,Trends in Biochem.Sci.17:334-339(1992);Usman等人,国际申请PCT No.WO93/15187;Sproat,美国专利5,334,711以及Beigelman等人,J.Biol.Chem.270:25702(1995);Beigelman等人,国际PCT公开号WO97/26270;Beigelman等人,美国专利5,716,824;Usman等人,美国专利5,627,053;Woolf等人,国际PCT公开号WO98/13526;Karpeisky等人,1998,Tetrahedron Lett.3.9:1131(1998);Earnshaw和Gait,Biopolymers(Nucleic Acid Sciences)48:39-55(1998);Verma和Eckstein,Annu.Rev.Biochem.67:99-134(1998);以及Burlina等人,Bioorg.Med.Chem.5:1999-2010(1997);所有文献在此全文引用作为参考)。该类出版物描述了在不调节催化作用的情况下在核酸分子中进行糖，碱基和/或磷酸盐等修饰的位置确定的一般方法和策略，且它们在此引用作为参考。考虑到这些启示，只要siRNA在细胞中促进RNAi的能力未受抑制，如此处所述的类似的修饰可用于修饰本发明的siRNA核酸分子。
本发明的特征在于具有包含一个或多个磷硫酰，二硫代磷酸酯，甲基膦酸酯，磷酸三酯，吗啉，酰胺化氨基甲酸酯，羧甲基，乙酰胺酸酯，聚酰胺，磺酸盐，磺酰胺，氨基磺酸酯，甲缩醛，硫甲缩醛，和/或烷基矽取代的磷酸盐骨架修饰的修饰siRNA分子。寡核苷酸骨架修饰的综述可参见Hunziker和Leumann,Nucleic Acid Analogues:Synthesis and Properties,in ModernSynthetic Methods,VCH,331-417(1995)以及Mesmaeker等人,Novel Backbone Replacements for Oligonucleotides,inCarbohydrate Modifications in Antisense Research,ACS,24-39(1994)。
尽管通过与硫代磷酸酯，硫代磷酸酯，和/或5'-甲基磷酸连锁的寡核苷酸核苷酸间连锁的化学修饰可提高稳定性，过度修饰可引起一些毒性或活性下降。因此，在设计核酸分子时，应使核苷酸间连锁的数量最小化。这些连锁浓度的下降可降低毒性，从而使这些分子具有更高的效力和更高的特异性。
此处提供了具有维持或增强活性的化学修饰的siRNA分子。该种核酸通常比未修饰的核酸对核酸酶更具耐受性。相应地，体外和/或体内活性不应被显著降低。在以调节为目标的情况下，外部传递的治疗性核酸分子最宜在细胞内稳定至目标RNA的反义得到足够长的调节，以降低不良蛋白的水平的下降。根据疾病的状态，该时间范围可在数小时至数日内变化。RNA和DNA化学合成的改善(Wincott等人,Nucleic Acids Res.23:2677(1995);Caruthers等人,Methods in Enzymotogy211:2-19(1992)（在此引用作为参考）)拓展了通过导入核苷酸修饰修饰核酸分子来增强前述的核酸酶稳定性的能力。
本发明的多聚核苷酸可包括一个或多个（例如，约1,2,3,4,5,6,7,8,9,10或更多）G-嵌核苷酸。G-嵌核苷酸为修饰的半胱氨酸类似物，其中该修饰可产生同时在双链体中互补鸟嘌呤的Watson-Crick和Hoogsteen平面氢键结合的能力，例如，参见Lin和Matteucci,J.Am.Chem.Soc.120:8531-8532(1998)。在寡核苷酸内的单个G-嵌类似物替换可导致与互补性寡核苷酸杂交时的螺旋热稳定性和错配识别的增强。本发明的多聚核苷酸中对该种核苷酸的包含可同时导致对核酸靶标，互补性序列或模板链的增强的亲和力和特异性。本发明的多聚核苷酸还可包括一个或多个（例如，约1,2,3,4,5,6,7,8,9,10或更多个）LNA“锁核酸”核苷酸，例如2',4'-C亚甲基双环核苷酸(例如，参见Wengel等人,国际PCT公开号WO00/66604和WO99/14226)。
本发明的特征还在于本发明的siRNA分子的结合物和/或复合物。该种结合物和/或复合物可用于促进siRNA分子传递进入生物***，例如细胞。本发明提供的结合物和复合物可通过传递治疗化合物通过细胞膜，改变药代动力学，和/或调节本发明核酸分子的定位来产生治疗活性。本发明包含了用于传递分子（包括，但不限于，小分子，脂质，磷脂，核苷，核苷酸，核酸，抗体，毒素，带负电荷的聚合物以及其它聚合物，例如蛋白，肽，激素，糖，聚乙二醇或聚胺）通过细胞膜的新型结合物和复合物的设计和合成。一般而言，此处所述的转运体经设计可在具有或不具有可降解接头的情况下单独或作为多成分***的一部分进行使用。这些化合物预期可以在存在或不存在血清的情况下提高本发明的分子向一系列来自不同组织的细胞类型中的传递和/或定位（参见Sullenger和Cech,美国专利号5,854,038）。此处所述分子的结合物可通过可生物降解的接头（例如可生物降解的核酸接头分子）连接至生物活性分子。
外部施用的治疗性多聚核苷酸（例如，siRNA分子）优选在细胞内稳定，直至所调节的RNA的逆转录足以降低RNA转录的水平。该核酸分子对核酸酶具有耐性，从而可以用作有效的胞内治疗剂。本领域和本发明所述的核酸分子的化学合成的改进通过引入核苷酸修饰增强其如上所述的核酸酶稳定性的拓展了修饰核酸分子的能力。
本发明还提供了经过化学修饰的siRNA分子，其保持或增强了RNAi中设计的蛋白的酶活性。该种核酸通常比未修饰的核酸对核酸酶更具耐受性。因此，体外和/或体内活性不应被显著降低。
本发明的基于核苷酸的分子的使用将通过提供联合疗法（例如，靶向不同基因的多siRNA分子；与已知小分子调节剂偶合的核酸分子；或以包括不同基序和/或其它化学或生物分子等分子组合进行的间歇治疗）的可能性对疾病进展形成更好的治疗。以siRNA分子治疗对象还可包括不同类型的核酸分子的组合，例如酶核酸分子（核酶），异型酶，反义，2,5-A寡腺苷酸，诱饵，适体等。
在另一方面，本发明的siRNA分子可包含例如仅在正义siRNA链，反义siRNA链或两种siRNA链上的一个或多个5'和/或3'-帽子结构。“帽子结构”指被整合在寡核苷酸任意末端的化学修饰（参见，例如，Adamic等人,美国专利号5,998,203，在此引用作为参考）。该末端修饰可保护核酸分子免受核酸外切酶降解，并可帮助在细胞内传递和/或定位。该帽子可存在于5'-末端（5'-帽子）或在3'-末端（3'-帽子）或同时在两个末端。在非限制性范例中，该5'-帽子选自如下组合：反转非碱性残基（部分）；4',5'-亚甲基核苷酸；1-(β-D-赤式呋喃糖)核苷酸；4'-硫代核苷酸；碳环核苷酸；1,5-失水己糖醇核苷酸；L-核苷酸；α-核苷酸；修饰碱基核苷酸；二硫代磷酸酯连锁；苏式-五呋喃糖核苷酸；无环3',4'-seco核苷酸；无环3,4-二羟丁基核苷酸；无环3,5-二羟戊基；3'-3'-反转核苷酸部分；3'-2'-反转非碱性部分；1,4-磷酸丁二醇；3'-磷酰胺；磷酸己酯；磷酸氨己基酯；3'-磷酸酯；3'-硫代磷酸酯；二硫代磷酸酯；或桥连或非桥连甲基磷酸酯部分。
该3'帽子可选自如下组合：4',5'-亚甲基核苷酸；l-(β-D-赤式呋喃糖)核苷酸；4'-硫代核苷酸，碳环核苷酸；5'-氨基-烷基磷酸酯；1,3-二氨基-2-丙基磷酸酯；3-氨丙基磷酸酯；6-氨己基磷酸酯；1,2-氨基十二烷基磷酸酯；羟丙基磷酸酯；1,5-失水己糖醇核苷酸；L-核苷酸；α-核苷酸；修饰的碱基核苷酸；二硫代磷酸酯；苏式-五呋喃糖核苷酸；无环3',4'-seco核苷酸；3,4-二羟丁基核苷酸；3,5-二羟戊基核苷酸；5'-5'-反转核苷酸部分；5'-5'-反转非碱性部分；5'-磷酰胺；5'-硫代磷酸酯；1,4丁二醇磷酸酯；5'-氨基；桥连或非桥连5'-磷酰胺，硫代磷酸酯和/或二硫代磷酸酯，桥连或非桥连甲基磷酸酯和5'-巯基部分（更多详细信息参见Beaucage和Iyer,Tetrahedron49:1925(1993);在此引用作为参考）。
可对siRNA结构进行各种修饰以增强这些分子的实用性。该种修饰将增强保存期限，体外半衰期，稳定性，以及将该种寡核苷酸导入目标位点的容易度，例如，增强对细胞膜的穿透性，并赋予识别和结合目标细胞的能力。
反义技术可通过反义DNA或RNA，或通过三螺旋构型控制基因表达。反义技术的讨论可参见，例如，Okano,J.Neurochem.56:560(1991);Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitorsof Gene Expression,CRC Press,Boca Raton,FL(1988)。三螺旋构型的讨论可参见，例如，Lee等人.,Nucleic Acids Research6:3073(1979);Cooney等人,Science241:456(1988);以及Dervan等人,Science257:1300(1991)。该方法基于多核苷酸与互补DNA或RNA的结合。
例如，编码NgRl的多核苷酸的5'编码部分可用于设计长度介于约10至40碱基对的反义RNA寡聚核苷酸。DNA寡聚核苷酸经设计与涉及转录的基因区域互补，从而可以阻止转录和目标蛋白的生产。反义RNA寡聚核苷酸在体内与mRNA杂交并阻断mRNA分子翻译成为目标多肽。
在一个实施方式中，针对NgRl基因的反义核酸可通过由外源序列转录在胞内生成。例如，通过转录载体或其部分生成反义核酸(RNA)。只要该载体可通过转录生成目标反义RNA，它可呈游离态或与染色体整合。该载体可通过本领域重组DNA技术的标准方法进行构建。载体可以是可用于在脊椎动物细胞中复制和表达的质粒，病毒或其它本领域已知物质。该反义分子可通过本领域已知的任何作用于脊椎动物，优选人类细胞的启动子（例如见本文其它部分的描述）进行表达。
尽管优选反义分子的绝对互补，但对此不作要求。至少与编码NgRl的RNA中的一部分互补的指其互补性足以与RNA进行杂交，形成稳定双链体的序列；或可检测到三股螺旋构型。杂交的能力将取决于互补的程度以及反义核酸的长度。一般而言，杂交核酸越大，它可在包含更多碱基错配的情况下依然形成稳定的双链体（或在某些情况下形成三链体）。本领域的技术人员可通过标准步骤确定错配的容忍度以确定杂交复合物的熔点。
与信使RNA的5'端（例如至AUG起动密码子或包括AUG起动密码子的5'未翻译序列）互补的寡聚核苷酸在抑制翻译方面具有最高的效率。然而，据显示与mRNAs的3'未翻译序列互补的序列也能有效抑制mRNAs的翻译。一般可参见Wagner,R.,Nature372:333-335(1994)。因此，与5'-或3'-非翻译，非编码区互补的寡聚核苷酸可用于抑制NgRl翻译的反义过程。与mRNA的5'非翻译区互补的寡聚核苷酸应当包括AUG起始密码子的补体。与mRNA编码区互补的反义寡聚核苷酸在抑制翻译方面的效率较低，但可参照本发明进行使用。反义核酸的长度至少应为六个核苷酸，优选长度介于6至约50个核苷酸的寡聚核苷酸。在某些方面该寡聚核苷酸至少具有10个核苷酸，至少17个核苷酸，至少25个核苷酸或至少50个核苷酸。
此处披露的治疗性方法采用的多聚核苷酸（包括下文描述的适体）可以是单链或双链的DNA或RNA或其嵌合混合物或衍生物或修饰形式。该多聚核苷酸可在碱基部分，糖部分，或磷酸盐骨架进行修饰，从而提高如分子，杂交物稳定性等。该多聚核苷酸可包括其它附加基团，例如肽（例如，为在体内靶向宿主细胞受体），或是促进跨域细胞膜运输的试剂（例如，参见Letsinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86:6553-6556(1989);Lemaitre等人,Proc.Natl.Acad.Sci84:648-652(1987));于1988年12月15日公布的PCT公布WO88/09810）或是血脑屏障（例如，参见于1988年4月25日公布的PCT公布WO89/10134）进行运输的试剂，杂交触发裂解试剂。（例如，参见Krol等人,BioTechniques6:958-976(1988)）或是嵌入剂（例如，参见Zon,Pharm.Res.5:539-549(1988)）。为实现该目标，可将该寡聚核苷酸结合至另一分子，例如，肽，杂交触发交联剂，运输剂，杂交触发裂解剂等。
此处披露的治疗性方法采用的反义寡聚核苷酸可包括至少一个选自以下组合的修饰碱基部分，该组合包括，但不限于，5-氟尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-氯尿嘧啶，5-碘尿嘧啶，次黄嘌呤，黄嘌呤，4-乙酰胞嘧啶，5-（羧基羟基甲基）尿嘧啶，5-羧基甲基氨基甲基-2-硫尿核苷，5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶，二羟尿嘧啶，β-D-半乳糖Q核苷，肌苷，N-6-异戊烯腺嘌呤，1-甲基鸟嘌呤，1-甲基肌苷，2,2-二甲基鸟嘌呤，2-甲基腺嘌呤，2-甲基鸟嘌呤，3-甲基胞嘧啶，5-甲基胞嘧啶，N-6-腺嘌呤，7-甲基鸟嘌呤，5-甲基氨基甲基尿嘧啶，5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶，β-D-甘露糖Q核苷，5'甲氧基羧基甲基尿嘧啶，5-甲氧基尿嘧啶，2-甲基硫-N-6-异戊烯腺嘌呤，尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)，wybutoxosine，假尿嘧啶，Q核苷，2-硫胞嘧啶，5-甲基-2-硫尿嘧啶，2-硫尿嘧啶，4-硫尿嘧啶，5-甲基尿嘧啶，尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯，尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)，5-甲基-2-硫尿嘧啶，3（3-氨基-3-N2-羧基丙基）尿嘧啶，(acp3)w，以及2,6-二氨基嘌呤。
此处披露的治疗性方法采用的反义寡聚核苷酸还可包括至少一个选自包括，但不限于，***糖，2-氟***糖，木酮糖以及己糖的组合的修饰糖部分。
在另一实施方式中，此处披露的治疗性方法采用的反义寡聚核苷酸至少包含一个选自以下组合的修饰磷酸盐骨架，该组合包括，但不限于，硫代磷酸盐，二硫代磷酸盐，氨基硫代磷酸盐，氨基磷酸盐，二氨基磷酸盐，甲基磷酸盐，烷基磷酸三酯，以及缩醛键或其类似物。
在另一实施方式中，此处披露的治疗性方法中采用的反义寡聚核苷酸为α-异头寡聚核苷酸。α-异头寡聚核苷酸可与互补RNA形成特定的双链杂交体，并且与通常的情况相反，其中链相互平行（Gautier等人.,Nucl.Acids Res.75:6625-6641(1987))。该寡聚核苷酸为2'-0-甲基核糖核苷酸（Inoue等人.,Nucl.AcidsRes.15:6131-6148(1987)），或嵌合RNA-DNA类似物（Inoue等人.,FEBS Lett.275:327-330(1987))。
本发明的多聚核苷酸（包括适体）可通过本领域已知的标准方法合成，例如，可采用自动化DNA合成器（可从Biosearch,Applied Biosystems等公司购得）。例如，硫代磷酸寡聚核苷酸的合成方法可参见Stein等人.,Nucl.Acids Res.16:3209(1988)，甲基磷酸寡聚核苷酸可采用可控孔度玻璃高分子载体进行制备（Sarin等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.55:7448-7451(1988)）。
此处披露的治疗性方法采用的多聚核苷酸组合物进一步包括催化性RNA，或核酶（例如，参见PCT国际申请WO90/11364，于1990年10月4日公布；Sarver等人,Science247:1222-1225(1990)）。优选采用锤头状核酶。锤头状核酶可在与目标mRNA形成互补碱基对的侧翼区决定的位点裂解mRNAs。唯一的要求是具有下列两个碱基（5'-UG-3'）的序列的目标mRNA。锤头状核酶的构建体和产物已为本领域公知并在Haseloff和Gerlach,Nature3.34:585-591(1988)有更为完全的描述。优选地，可对该核酶进行改造从而使裂解识别位点接近目标RNA的5'端；即，提高效率并最小化非功能性mRNA转录物的胞内积累。
在反义过程中，本发明披露的诊断和治疗性方法中采用的核酶可由修饰后的寡聚核苷酸（例如，为提高稳定性，可进行靶向等）组成并传递至体内表达NgRl的细胞。编码核酶的DNA构建体可以与上述导入反义编码DNA同样的方式导入细胞。优选的传递方法包括采用在编码摂受强构建型启动子（例如，pol III或polII启动子）控制的核酶的DNA构建体，从而使转染细胞生成足够数量的核酶以破坏内源性NgRl信息并抑制翻译。与反义分子不同，由于核酶具有催化性，其产生效果所需的胞内浓度也更低。
适体
在另一实施方式中，本发明的方法采用的NgRl拮抗剂为适体。适体可以是具有独特序列的，具有对所需靶标（例如，多肽）具有结合特异性的并且是给定靶标的特异性配体的核苷酸或多肽。本发明的核苷酸适体包括结合NgRl的双链DNA和单链RNA分子。
核酸适体可通过本领域已知的方法进行选自，例如，可通过指数富集的配体***进化(SELEX)过程进行选择。SELEX是一种能高度特异性结合目标分子的核酸分子的体外进化方法，其描述可参见，例如U.S.Pat.Nos.5,475,096,5,580,737,5,567,588,5,707,796,5,763,177,6,011,577以及6,699,843，其全文在此引用作为参考。另一鉴定适体的筛选方法可参见美国专利5,270,163（同样在此引用作为参考）。SELEX过程基于核酸形成一系列二和三维结构的能力，以及核苷酸单体实际上能作为任何单体或聚合形式的化合物（包括其它核酸分子和多肽）的配体（形成特异性结合对）的多功能性。任何大小的分子或组合物可用作靶标。
SELEX法包括从候选寡聚核苷酸混合物中进行选择，并采用相同的选择方案逐步循环结合，分配和扩增以获得所需的结合亲和性和选择性。该SELEX法以核酸混合物（优选包含随机序列的片段）起始，包括以下步骤：将混合物和靶标在利于结合的条件下相接触；区分未结合核酸和与靶标分子特异性结合的核酸；分离核酸-靶标复合物；扩增从核酸-靶标复合物分离的核酸以获得核酸的配体富集混合物。根据需要重复结合，区分，分离和扩增步骤以获得针对靶标分子的高特异性高亲和性核酸配体。
核苷酸适体可用作诊断工具或作为抑制剂来分析胞内信号转导和运输途径（James(2001)Curr.Opin.Pharmacol.1:540-546）。核苷酸适体的高亲和性和特异性使它们成为药物研发的良好候选物。例如，毒素蓖麻毒素的适体拮抗剂已被分离并具有纳摩尔级的IC50值（Hesselberth JR等人.(2000)J Biol Chem275:4937-4942）。核苷酸适体还可针对传染性疾病，恶性肿瘤以及病毒表面蛋白使用以降低细胞传染性。
本发明的方法采用的核苷酸适体可按此处所述的对其它多聚核苷酸的修饰方法进行修饰（例如，修饰骨架或碱基或与肽结合）。
采用SELEX过程通过NgRl的蛋白结构筛选作用于NgRl的适体可对抑制NgRl-介导的过程（例如，NgRl-介导的轴突再生抑制）的适体进行鉴别。
本发明的方法采用的多肽适体为根据其结合并因此阻断NgRl作用的能力选择的任意肽。多肽适体可包括在两端与蛋白支架连接的短可变肽区。这种双结构限制大大提升了肽适体的结合亲和性，达到了与抗体相当的水平（纳摩尔级）。例如，参见Hoppe-Seyler F等人.(2000)J Mol Med78(8):426-430。短可变肽的长度通常约为10至20个氨基酸，该支架可以是任何具有良好溶解性和相容性的蛋白。支架蛋白的一个非限制性范例为细菌蛋白硫氧还蛋白-A。例如，参见Cohen BA等人.(1998)PNAS95(24):14272-14277。
多肽适体为可作为蛋白功能显性抑制剂的肽或小多肽。肽适体特异性结合目标蛋白，阻断其功能（Kolonin等人.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.95:14,266-14,271)。以高亲和性和特异性结合目标蛋白的肽适体可通过本领域已知的多种技术进行分离。肽适体可通过酵母双杂交筛选从随机肽库中分离得到（Xu,C.W.,等人.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.94:12,473-12,478）或通过核糖体展示（Hanes等人.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.94:4937-4942)。它们还可从噬菌体库（Hoogenboom,H.R.,等人.(1998)Immunotechnology4:1-20)或是化学生成肽库中分离得到。此外，多肽适体还可通过选择配体调节肽适体(LiRPA)的进行选择。例如，参见Binkowski BF等人.,(2005)Chem&Biol12(7):847-855，在此引用作为参考。尽管由于肽适体合成较为困难，其使用比多聚核苷酸适体更为复杂，但它们具有无限的化学多样性。多聚核苷酸适体由于仅使用四种核苷酸碱基而受到限制，而肽适体则具有大得多的谱系（即，20个氨基酸）。
本发明的方法采用的肽适体可参照本文别处描述的其它多肽的修饰方法进行修饰（例如，与聚合体结合或与蛋白融合）。
组合物
在部分实施方式中，本发明提供了包含选自SEQ ID NOs:1-5,26-27,29-37和41-45的多肽的组合物。
在部分实施方式中，本发明提供了包含本发明的抗-Nogo受体-1或其抗原结合片段，或可溶性Nogo受体-1多肽或融合蛋白的组合物。
在部分实施方式中，本发明提供了包含本发明多聚核苷酸的组合物。
在部分实施方式中，本发明提供了包含了本发明的多肽和抗炎剂的组合物。
在部分实施方式中，本发明可包含适当的药学可接受的载体，包括可促进活性化合物制备成为可传递至作用位点的制剂的赋形剂和辅剂。用于肠胃外施用的适用剂型包括水溶形式（例如，水溶性盐）的活性化合物的水溶液。此外，可施用作为适当的油性注射悬浮剂的活性化合物的悬浮剂。适用的亲脂性溶剂或溶媒包括脂肪油，例如，芝麻油，或合成脂肪酸酯，例如，乙基油酸酯或甘油三酸酯。水相注射悬浮剂可包含提高悬浮剂粘度的物质，包括，例如，羧甲基纤维素钠，山梨糖醇和右旋糖苷。该悬浮剂还可选择性地包含稳定剂。脂质体也可用于包封本发明的分子以传递进入细胞。示范性的“药学可接受的载体”为任意的或全部的生理相容的溶剂，分散介质，涂层，抗菌剂和抗真菌剂，等张剂和吸收延缓剂等，水，盐水，磷酸盐缓冲液，右旋糖，甘油，乙醇等，及其组合。在部分实施方式中，该组合物包含了等张剂，多元醇（例如甘露醇，山梨糖醇），或氯化钠。在部分实施方式中，该组合物包含了药学可接受的的物质，例如，润湿剂或微量的辅助物质如润湿或乳化剂，防腐剂或缓冲液，其可提高本发明的抗体，抗原结合片段，可溶性Nogo受体或融合蛋白的保存期限或效力。
本发明的组合物可呈多种形式，包括，例如，液体，半固体和固体剂型，例如，液体溶液（例如，可注射和可输注的溶液），分散剂或悬浮剂。优选形式取决于目标给药模式和治疗应用。在一种实施方式中，组合物呈可注射或可输注的溶液形式，例如用于通过其它抗体被动免疫人体的类似组合物。
该组合物可制成溶液，微乳剂，分散剂，脂质体或其它适合高药物浓度的有序结构。无菌注射溶液可通过将含于适当溶剂的所需量的抗-Nogo受体-1抗体根据需要与一种或多种上述列举的成分结合，并通过无菌过滤进行制备。一般而言，分散剂可通过将活性化合物与包含了基础分散介质和所需其它上述成分的无菌载体结合得到。对于可用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末，其优选制备方法为真空干燥和冷冻干燥，通过制备得到的粉末包含活性成分和从其无菌过滤溶液得到的任何附加所需成分。溶液的适当流动性可通过多种方式维持，例如，通过适用卵磷脂等覆层，对于分散剂通过保持所需的颗粒尺寸以及通过表面活性剂的使用。可注射组合物的长期吸收可通过在组合物中包含一种延缓吸收的试剂（例如，单硬脂酸盐和白明胶）来实现。
在部分实施方式中，该活性化合物可与保护该化合物免于迅速释放的载体共同制备成如控释制剂，包括移植物，透皮斑贴，乙基微胶囊化传递***。可采用可生物降解，生物相容的聚合物，例如乙烯醋酸乙烯，聚酸酐，聚乙醇酸，胶原质，聚原磷酯以及聚乳酸。制备该种剂型的多种方法已得到专利保护或为本领域技术人员所公知。例如，参见Sustained and Controlled Release DrugDelivery Systems,J.R.Robinson,ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York(1978)。
补充活性化合物也可包含在组合物中。在部分实施方式中，本发明的Nogo受体-1抗体或其抗原结合片段，或可溶性Nogo受体-1多肽或融合蛋白可与一种或多种附加的治疗剂（包括，例如，抗炎剂）共同制剂和/或共同施用。在一种实施方式中，该抗炎剂为非甾体抗炎剂。在另一实施方式中，该抗炎剂为甾体抗炎剂。在特定的实施方式中，该抗炎剂为甲泼尼龙。
在一个实施方式中，本发明涉及Nogo受体拮抗剂与非甾体抗炎剂(NSAID)，前药酯或其药学可接受的盐的联合使用。NSAIDs的范例已为本领域公知，包括丙酸衍生物（例如，阿明洛芬，苯恶洛芬，布氯酸，卡布洛芬，芬布芬，非诺洛芬，氟洛芬，氟比洛芬，布洛芬，吲哚洛芬，酮洛芬，咪洛芬，萘普生，奥沙普秦，吡洛芬，普拉洛芬，舒洛芬，噻洛芬酸和硫恶洛芬），乙酸衍生物（例如，吲哚美辛，阿西美辛，阿氯芬酸，环氯茚酸，双氯芬酸，芬氯酸，芬克洛酸，芬替酸，呋罗芬酸，异丁芬酸，伊索克酸，oxpinac，舒林酸，硫平酸，托美汀，齐多美辛和佐美酸），灭酸衍生物（例如，氟芬那酸，甲氯芬那酸酸，甲芬那酸和尼氟灭酸，托芬那酸），苯基苯甲酸衍生物（二氟尼柳和氟苯沙酸），氧昔康类（例如，伊索昔康，吡罗昔康，舒多昔康和替诺昔康），水杨酸类（例如，乙酰水杨酸和柳氮磺胺吡啶）以及吡唑酮类（例如，阿扎丙宗，bezpiperylon，非普拉宗，莫非布宗，羟基保泰松和苯乙丁氮酮）；与NSAIDs具有类似的止痛和抗炎属性的结构相关的NSAIDs也包含在本组合中。
在另一实施方式中，本发明涉及Nogo受体拮抗剂与任意一种或多种甾体抗炎剂，例如皮质类固醇，前药酯或其药学可接受的盐中的联合使用。该类甾体药剂的非限制性范例包括氢化可的松和衍生自氢化可的松的化合物，21-醋酸基娠烯醇酮，阿氯米松，阿尔孕酮，安西奈德，丙酸倍氯米松，倍他米松，倍他米松戊酸，布***，氯***，丙酸氯倍他索，丙酸氯倍他索，氯倍他松，氯倍他松丁酸盐，氯可托龙，氯泼尼醇，皮质酮，可的松，可的伐唑，deflazacon，***，去羟米松，***，二氟拉松，二氟可龙，二氟泼尼酯，甘草次酸，氟扎可特，氟氯奈德，氟美松，新戊酸氟米松，氟尼缩松，氟轻松曲安缩松，醋酸氟轻松，氟氢松醋酸酯曲安缩松，氟可丁丁酯，氟考龙，氟考龙己酸盐，二氟可龙戊酸盐，氟米龙，氟培龙醋酸盐，醋酸氟泼尼定，氟泼尼龙，氟氢缩松，氟甲酰龙，哈西奈德，卤美他松，卤***醋酸盐，氢可他酯，氢化可的松，醋酸氢化可的松，丁酸氢化可的松，氢化可的松磷酸盐，氢化可的松，21-琥珀酸钠，氢化可的松叔丁乙酸盐，马泼尼酮，甲羟松，甲基强的松，甲泼尼龙，糠酸莫米松，帕拉米松，泼尼卡酯，强的松，强的松龙21-diedryaminoacetate，***龙磷酸钠，醋酸***龙琥珀酸钠，强的松龙钠21-m-苯磺酸，强的松龙钠21-硬脂酸乙醇酸酯，叔丁乙酸盐强的松，强的松龙21-三甲基乙酸盐，***，***龙戊酸酯，泼尼立定，泼尼立定21-二乙氨基醋酸盐，替可的松，曲安西龙，曲安西龙曲安缩松，苯曲安奈德和己曲安奈德。具有类似的止痛和抗炎属性的结构相关的皮质类固醇也包含在本组合中。在一个特定的实施方式中，该Nogo受体拮抗剂与甲泼尼龙联合使用。
本发明的药物组合物可包括“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明的抗体，抗原结合片段，多肽，或融合蛋白。“治疗有效量”指在必要的剂量和时间周期下其效果足以达到所需的治疗结果的数量。Nogo受体-1抗体或其抗原结合片段，可溶性Nogo受体-1多肽或Nogo受体融合蛋白的治疗有效量可根据个体的疾病状态，年龄，性别以及体重等因素而改变。治疗或预防有效量还可以是治疗有益效果超越抗体，抗原结合片段，可溶性Nogo受体-1多肽或Nogo受体融合蛋白的毒性或有害效果的量。“预防有效量”指在必要的剂量和时间周期下其效果足以达到所需的预防结果的数量。由于预防剂量通常在疾病发生前或疾病早期施用，预防有效量将小于治疗有效量。
可对给药方案进行调整以获得最佳的目标响应（例如，治疗或预防响应）。例如，可施用单独丸剂，在一定时间内多次施用分次剂量或根据治疗状况的迫切性的指示按比例减少或提高剂量。将肠胃外组合物制成单位剂型将特别有利于施用，此处所用的单位剂型的一致性指待治疗哺乳动物对象的单位剂量的物理分散单位。每一个单位包含结合了所需药物载体的预定数量的活性化合物化合物（通过计算可产生预期治疗效果）。本发明的剂量单位形式的规范可直接依据(a)抗体，抗原结合片段，以及可溶性受体-1多肽或Nogo受体融合蛋白的独特性质以及待达到的特定治疗或预防效果，以及(b)复合该种用于治疗个体灵敏性的抗体，抗原结合片段，以及可溶性受体-1多肽或Nogo受体融合蛋白的领域的固有限制所决定。在部分实施方式中Nogo受体-1或其抗原结合片段的治疗有效计量范围为每天0.1-4mg/Kg。在部分实施方式中Nogo受体-1或其抗原结合片段的治疗有效计量范围为每天0.2-4mg/Kg。在部分实施方式中Nogo受体-1或其抗原结合片段的治疗有效计量范围为每天0.2mg/Kg。
在本发明的方法中该NgRl拮抗剂通常经脑室或鞘内直接施用于神经***，例如施用至MS的慢性病灶。根据本发明的方法施用的组合物可制成制剂，从而可以0.001-10mg/kg体重/天的剂量施用NgRl拮抗剂。在本发明的一些实施方式中，该剂量为0.01-1.0mg/kg体重/天。在一些实施方式中，该剂量为0.001-0.5mg/kg体重/天。
在采用本发明NgRl拮抗剂进行治疗时，该剂量相对宿主体重可以为，例如，从约0.0001至100mg/kg，更通常为0.01至5mg/kg（例如，0.02mg/kg，0.25mg/kg，0.5mg/kg，0.75mg/kg，1mg/kg，2mg/kg等）。例如该剂量可以是1mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg范围内，优选至少1mg/kg。上述范围的中间剂量在本发明的范围之内。对象给药可采取每天给药，隔日给药，每周给药或根据任何其它通过实证分析得到的进度给药。一种示范性的治疗需要在较长的期限内（例如，至少六个月）进行多剂量给药。一种示范性的治疗需要在较长的期限内（例如，至少六个月）进行多剂量给药。示范性的剂量给法包括连续每天1-10mg/kg或15mg/kg，隔日30mg/kg或每周60mg/kg。
在一些方法中同时施用两种或多种NgRl拮抗剂，其中各拮抗剂的施用剂量均在指示的范围之内。本发明的方法采用的组合物还可结合辅助活性化合物。例如，NgRl拮抗剂可与一种或多种附加治疗剂（例如抗炎剂，例如，甲泼尼龙）共同制剂或共同施用。
本发明包含了向选定目标组织传递本发明NgRl拮抗剂的任意适用传递方法，包括水溶液的弹丸注射或控释***的植入。控制植入减少了重复注射的需求。
本发明的方法采用的NgRl拮抗剂可直接灌输入脑部。已知有多种直接向脑部灌输化合物的方法，且这些方法对于向患有神经紊乱的人类患者传递治疗化合物非常有效。这些方法包括适用泵向脑部慢性灌输，立体定向灌输，临时间质导管，永久颅内导管灌输，以及外科手术植入的可生物降解的灌输。例如，参见Gill等人,同前文;Scharfen等人,"High Activity Iodine-125Interstitial Implant For Gliomas,"Int.J.Radiation OncologyBiol.Phys.24(4):583-91(1992);Gaspar等人,"Permanent1251Implants for Recurrent Malignant Gliomas,"Int.J.RadiationOncology Biol.Phys.43(5):977--82(1999);chapter66,pages577-580,Bellezza等人,"Stereotactic InterstitialBrachytherapy,"in Gilderiberg等人,Textbook of Stereotacticand Functional Neurosurgery,McGraw-Hill(1998);以及Brem等人,"The Safety of Interstitial Chemotherapy with BCNU-LoadedPolymer Followed by Radiation Therapy in the Treatment ofNewly Diagnosed Malignant Gliomas:Phase I Trial,"J.Neuro-Oncology26:lll-23(1995)。
该组合物还可包括一种分散于作为该化合物适当传递或支持***的生物相容载体材料的本发明的NgRl拮抗剂。缓释载体的适当范例包括成形（例如栓剂或胶囊）的半透性聚合物基质。可植入的或是微胶囊状的缓释基质包括具乳酸(U.S.Patent No.3,773,319;EP58,481)，L-谷氨酸和gamma-乙基-L-谷氨酸酯共聚物(Sidman等人,Biopolymers22:547-56(1985))；聚（2-羟乙基-异丁烯酸酯），乙烯醋酸乙烯(Langer等人,J.Biomed.Mater.Res.15:167-277(1981)；Langer,Chem.Tech.72:98-105(1982))或聚-D-(-)-3羟基丁酸(EP133,988)。
在本发明的部分实施方式中，NgRl拮抗剂通过直接灌输至脑部适当区域的方式施用至患者。例如，参见Gill等人.,"Direct brain infusion of glial cell line derivedneurotrophic factor in Parkinson disease,"Nature Med.9:589-95(2003)。此外还存在其它技术并可用于施用本发明所述的NgR拮抗剂。例如，可采用Riechert-Mundinger设备和ZD(Zamorano-Dujovny)多用途定位设备实现立体定向安置导管或植入物。一种对比增强计算机断层摄影术(CT)扫描（注射120ml欧乃派克，350mg碘酒/ml，层厚2mm）可支持三维多层治疗计划(STP,Fischer,Freiburg,Germany)。该技术支持在磁共振影像研究的基础上进行计划，融合CT和MRI目标信息以进行明确的目标确认。
经改造后可配合使用GE CT扫描仪(General ElectricCompany,Milwaukee,WI)的Leksell立体定向***(DownsSurgical,Inc.,Decatur,GA)以及Brown-Roberts-Wells(BRW)立体定向***(Radionics,Burlington,MA)可用于该种用途。因此，在灌输初期，可将BRW立体定向框架的环状底座圈可附着在患者的头骨上。可以3mm的间隔对带有夹在底盘上的石墨棒定位框的（目标组织）区域获取连续CT层。计算机治疗计划程序可以在采用石墨棒成像的CT坐标在CT空间和BRW空间之间绘图的VAX11/780计算机(Digital Equipment Corporation,Maynard,Mass.)上运行。抗体，抗原结合片段，可溶性受体，融合蛋白，多聚核苷酸和组合物的使用
在部分实施方式中，本发明提供了通过向有此需要的哺乳动物施用抗-Nogo受体-1抗体，该种抗体的抗原结合片段，可溶性Nogo受体-1多肽，或包含该种多肽的融合蛋白来抑制Nogo受体-1活性的方法。
在部分实施方式中，本发明提供了抑制Nogo受体-1与配体结合的方法，其包括将Nogo受体-1与本发明的抗体或抗原结合片段相接触。在部分实施方式中该配体选自由NogoA,NogoB,NogoC,MAG和OM-gp构成的组合。
在部分实施方式中，本发明提供了抑制神经元中生长锥萎缩的方法，其包括将神经元与本发明的抗体或其抗原结合片段相接触。在部分实施方式中，本发明提供了减少神经元中神经突生长或抽芽抑制的方法，其包括将神经元与本发明的抗体或抗原结合片段相接触。在部分实施方式中，该神经元为CNS神经元。在部分该方法中，该神经突生长或抽芽为轴突生长。
在部分实施方式中，本发明提供了在哺乳动物中促进具有死亡风险的神经元存活的方法，其包括(a)提供表达(i)抗-Nogo受体-1抗体或其抗原结合片段；或(ii)可溶性Nogo受体-1多肽的培养后的宿主细胞；以及(b)在该神经元的位点或附近将该宿主细胞导入该哺乳动物。Almudena Ramon-Cueto,M IsabelCordero,Fernando F Santos-Benito和Jesus Avila(2000)Functional recovery of paralegic rats and motor axonregeneration in their spinal cords by olfactory ensheathingcells.Neuron25,425-435。
在部分实施方式中，本发明提供了促进哺乳动物中具有死亡风险的神经元存活的基因治疗方法，其包括在该神经元位点或附近施用包含了编码(a)抗-Nogo受体-1抗体或其抗原结合片段；或(b)可溶性Nogo受体-1多肽的核苷酸序列的病毒载体，其中该抗-Nogo受体-1抗体，抗原结合片段或可溶性Nogo受体-1多肽在哺乳动物中由该核苷酸序列表达的量足以促进该神经元的存活。可用于该种实施方式的病毒载体和方法描述于，例如等人,HumanGene Therapy,73:1483-93(2002)。
在部分实施方式中，本发明提供了抑制Nogo受体-1与配体结合的方法，其包括将配体与本发明的可溶性Nogo受体-1多肽或Nogo受体-1融合蛋白相接触。
在部分实施方式中，本发明提供了调节Nogo受体-1配体活性的方法，其包括将Nogo受体-1配体与本发明的可溶性Nogo受体-1多肽或Nogo受体-1融合蛋白相接触。
在部分实施方式中，本发明提供了抑制神经元中生长锥萎缩的方法，其包括将Nogo受体-1配体与本发明的可溶性Nogo受体-1多肽或Nogo受体-1融合蛋白相接触。在部分实施方式中，本发明提供了减少神经元中神经突生长或抽芽抑制的方法，其包括将Nogo受体-1配体与本发明的可溶性Nogo受体-1多肽或Nogo受体-1融合蛋白相接触。在部分实施方式中，该神经元为CNS神经元。在部分实施方式中该配体选自由NogoA,NogoB,NogoC,MAG和OM-gp构成的组合。在部分实施方式中，该神经突生长或抽芽为轴突生长。
在部分实施方式中，本发明提供了促进神经突生长的方法，其包括将神经元与本发明的多肽，多聚核苷酸或组合物相接触。在部分实施方式中，该多肽，多聚核苷酸或组合物抑制神经突生长抑制。在部分实施方式中，该神经元在哺乳动物体内。在部分实施方式中，该哺乳动物为人类。
在部分实施方式中，本发明提供了抑制NgRl信号转导复合物的信号转导的方法，其包括将神经元与有效量的本发明多肽，多聚核苷酸或组合物相接触。在部分实施方式中，该神经元在哺乳动物体内。在部分实施方式中，该哺乳动物为人类。
在部分实施方式中，本发明提供了在哺乳动物中治疗中枢神经***(CNS)疾病，紊乱或损伤的方法，其包括向需要该种治疗的哺乳动物施用有效量的本发明多肽，多聚核苷酸或组合物。在部分实施方式中，该疾病，紊乱或损伤为多发性硬化症，ALS，亨廷顿病，阿尔茨海默病，帕金森氏病，糖尿病神经病变，中风，外伤性脑损伤，脊髓损伤，视神经炎，青光眼，听力丧失以及肾上腺脑白质营养不良。
此处所述的任意类型的抗体或受体可进行治疗性应用。在部分实施方式中，该抗-Nogo受体-1抗体为人源抗体。在部分实施方式中，该哺乳动物为人类患者。在部分实施方式中，为进行兽用或作为人类疾病的动物模型，该抗体或其抗原结合片段被施用至表达Nogo受体-1的非人类哺乳动物（例如，灵长动物，食蟹猴或恒河猴），其中该Nogo受体-1与该抗体交叉反应。该种动物模型可用于评估本发明的抗体的治疗效果。
在部分实施方式中，抗-Nogo受体-1抗体或其抗原结合片段，或可溶性Nogo受体-1多肽或融合蛋白的施用被用于治疗脊髓损伤以促进损伤位点的轴突生长。
本发明的抗-Nogo受体-1抗体或其抗原结合片段，或可溶性Nogo受体-1多肽或融合蛋白可单独提供，或与其它调节特定病理作用的其它药剂联合或顺序联合提供。例如，可在中风后联合施用抗炎剂，以作为阻断进一步神经元损伤并抑制轴突再生的手段如此处所用，当Nogo受体-1抗体，抗原结合片段，可溶性Nogo受体-1多肽或Nogo受体融合蛋白与一种或多种附加治疗剂同时，连续或独立施用时，可认为这两者联合施用。
本发明的抗-Nogo受体-1抗体，抗原结合片段，可溶性Nogo受体-1多肽，Nogo受体-1融合蛋白可通过肠胃外，皮下，静脉内，肌肉，透皮，吸入或口腔途径进行施用。例如，通过微量注射向损伤位点局部施用药剂。典型的位点包括，但不限于，由损伤引起的脊柱中受损区域。施用的剂量将取决于受体的年龄，健康和体重，同时存在的治疗（如有）类型，治疗频率，以及预期作用的性质。
本发明的化合物通常可在哺乳动物（例如人，羊，马，牛，猪，狗，猫，大鼠和小鼠）体内，或在体外使用。
本发明的载体
在部分实施方式中，本发明提供了包含编码序列的重组DNA分子(rDNA)。此处所用的rDNA分子为经过分子操作的DNA分子。用于生成rDNA分子的方法以为本领域公知，参见Sambrook等人.,Molecular Cloning-A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory Press(1989)。在部分rDNA分子中，编码DNA序列被可操作地连接至表达控制序列和载体序列。
在部分实施方式中，本发明提供了包含编码本发明多肽的核酸的载体。如本领域公知，与本发明的核酸可操作连接的载体和表达控制序列的选择直接依赖于所需的功能（例如，蛋白表达）以及待转化的宿主细胞。本发明的载体至少能够引导包括该rDNA分子的结构基因的复制或***宿主染色体，并优选还能表达该结构基因。
用于调节可操作连接的蛋白编码序列表达的表达控制元件已为本领域所知并包括，但不限于，诱导型启动子，组成性启动子，分泌信号以及其它调节元件。优选地，该诱导型启动子易于控制，氯对宿主细胞培养基的营养成分产生响应。
在一种实施方式中，该包含编码核酸分子的载体将包括原核复制子，即，能够在原核宿主细胞（例如，细菌宿主细胞，其转化细胞）中引导染色体外的重组DNA分子的自主复制和维持的DNA序列。该种复制子已为本领域公知。此外，包含原核复制子的载体还可含括其表达可带来可测或可选择标记（例如耐药性）的基因。典型的细菌耐药性基因为可对氨比西林或四环素形成抗性的基因。
包含原核复制子的载体还可包括原核或噬菌体启动子，其能够引导编码基因序列在细菌宿主细胞（例如E.coli.）中的表达（转录和翻译）。启动子是由能够允许结合RNA聚合酶和转录产生的DNA序列形成的表达控制元件。与细菌宿主相容的启动子通常可提供为含有可***本发明的DNA片段的常规限制性位点的质粒载体。该种载体质粒的范例为pUC8，pUC9，pBR322以及pBR329(Bio-Laboratories)，pPL和pKK223(Pharmacia)。任何适用的原核宿主均可用于表达编码本发明的蛋白的重组DNA分子。
与真核细胞相容（优选与脊椎动物细胞相容）的表达载体，还可用于形成包含编码序列的rDNA分子。真核细胞表达载体以为本领域公知并可从多个公司购得。该种载体通常包含可***目标DNA片段的常规限制性位点。该种载体的范例为pSVL和pKSV-10(Pharmacia),pBPV-1,pML2d(InternationalBiotechnologies),pTDTl31255)以及其它真核表达载体。
用于构建本发明的rDNA分子的原核细胞表达载体可进一步包括在真核细胞中有效的选择性标记，优选耐药选择性标记。优选的耐药标记为其表达可导致新霉素耐药性的基因，即，新霉素磷酸转移酶(neo)基因。(Southern等人.,J.Mol.Anal.Genet.7:327-341(1982))。替代性地，该选择性标记可出现在单独的质粒上，该两种载体可通过共转染导入宿主细胞，并通过在以适当的药物作为选择性标记的培养中选择转染体。
为表达本发明的抗体或抗体部分，编码部分或全长轻和重链的DNAs被***表达载体以使基因被可操作地连接至转录和翻译控制序列。表达载体包括质粒，逆转录病毒，粘粒，YACs，EBV-衍生的游离基因等。该抗体基因被连接至载体，从而使载体内的转录和翻译控制序列可发挥其预期的调节抗体基因转录和翻译的功能。选定的表达载体和表达控制序列与所用的表达宿主细胞相容。抗体轻链基因和抗体重链基因可***单独的载体。在部分实施方式中，两种基因被***同一表达载体。该抗体基因可通过标准方法***表达载体（例如，抗体基因片段的互补限制性位点与载体连接，或当没有限制性位点时进行平头末端连接）。
如上所述，实用的载体为编码功能完整的人CH或CL免疫球蛋白序列，具有适当的改造限制性位点以使任意VH或VL序列可以简单地***和表达的载体。在该种载体中，通常可在***的J区的剪接供***点和人C区前的剪接受***点之间，或者在人CH外显子内的剪接区产生剪接。多聚腺苷酸化和转录终止出现在编码区下游的天然染色***点。该重组表达载体还可编码促进抗体链从宿主细胞分泌的信号肽。抗体链基因可被克隆进入载体，从而使信号肽被框内连接至抗体链基因的氨基末端。该信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或外源信号肽（即，来自非免疫球蛋白的信号肽）。
除了本发明的免疫原性多肽，Nogo受体-1抗体，抗原结合片段，可溶性Nogo受体-1多肽以及可溶性Nogo受体-1融合蛋白以外，本发明的重组表达甾体携带了控制其在宿主细胞内表达的调节序列。本领域的技术人员将能理解表达载体的设计，包括调节序列的选择将依赖于诸如待转化宿主细胞的选择，预期的蛋白表达水平等因素。针对哺乳动物宿主细胞表达的优选调节序列包括在哺乳动物细胞中引导高水平蛋白表达的病毒元件，例如，例如来自于逆转录LRTs，细胞巨化病毒(CMV)（例如CMV启动子/增强子），猿病毒40(SV40)（例如SV40启动子/增强子），腺病毒（例如，腺病毒主晚期启动子(AdmlP)），多瘤的启动子和/或增强子以及天然免疫球蛋白和肌动蛋白启动子等强哺乳动物启动子。有关病毒调节元件及其序列的进一步描述参见，例如，Stinski的美国专利5,168,062,Bell等人的美国专利4,510,245以及Schaffher等人的美国专利4,968,615。
在一个实施方式中可采用称为NEOSPLA(美国专利6,159,730)的Biogen IDEC,Inc.的专有表达载体。该载体包含了细胞巨化病毒启动子/增强子，小鼠beta球蛋白主启动子，SV40复制起始区，牛生长激素多聚腺苷酸化序列，新霉素磷酸转移酶外显子1和外显子2，二氢叶酸还原酶基因和前导序列。据发现该载体可在转染进入CHO细胞，并经过含G418培养基中选择和甲氨蝶呤扩增后可导致极高水平的表达。当然，任何能在真核细胞引发表达的表达载体均可用于本发明。适用载体的范例包括，但不限于质粒pcDNA3,pHCMV/Zeo,pCR3.1,pEF1/His,pIND/GS,pRc/HCMV2,pSV40/Zeo2,pTRACER-HCMV,pUB6/V5-His,pVAXl和pZeoSV2(可从Invitrogen,San Diego,CA购买),以及质粒pCI(可从Promega,Madison,WI购买)。其它的真核细胞表达载体已为本领域所知并可在市场上购得。该种载体通常包含可***目标DNA片段的常规限制性位点。示范性载体包括pSVL和pKSV-10(Pharmacia)，pBPV-1，pml2d(International Biotechnologies),pTDTl(ATCC31255)，逆转录表达载体pMIG和pLL3.7，腺病毒穿梭载体pDC315以及AAV载体。其它示范性载体***可参见美国专利6,413,777。
本发明的其它实施方式中采用慢病毒载体表达本发明的多聚核苷酸，例如，NgR拮抗剂多聚核苷酸，例如，siRNA分子。慢病毒可以感染非周期细胞和有丝***后细胞，并可提供在发育过程中不被沉默的优势，从而可通过感染胚胎干细胞来生成转基因动物。Milhavet等人.,Pharmacological Rev.55:629-648(2003)。其它的多聚核苷酸表达病毒载体可基于，但不限于，腺相关病毒，逆转录病毒，腺病毒或甲病毒进行构建。
本发明的额多聚核苷酸（例如，siRNA分子序列）的转录可通过针对真核RNA聚合酶I(pol I)，RNA聚合酶II(pol II)或RNA聚合酶III(pol III)的启动子进行启动。由pol II或pol III启动子进行的转录在所有的细胞中均有高水平表达；给定pol II启动子在给定细胞类型中的水平依赖于附近存在的基因调节序列的性质（增强，沉默等）。只要原核RNA聚合酶在适当的细胞中表达，同样可以采用原核RNA聚合酶启动子(Elroy-Stein和Moss,Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:6743-7(1990);Gao和Huang,Nucleic Acids Res.21:2867-72(1993);Lieber等人,MethodsEnzymol.217:47-66(1993);Zhou等人,Mol.Cell.Biol.10:4529-37(1990))。许多研究者已经证实了由该种启动子表达的多聚核苷酸可作用于哺乳动物细胞中（例如，Kashani-Sabet等人,Antisense Res.Dev.2:3-15(1992);Ojwang等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10802-6(1992);Chen等人,Nucleic AcidsRes.20:4581-9(1992);Yu等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6340-4(1993);L'Ηuillier等人,EMBO J.11:4411-8(1992);Lisziewicz等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A90:8000-4(1993);Thompson等人,Nucleic Acids Res.23:2259(1995);Sullenger&Cech,Science262:1566(1993))。更具体而言，转录单位（例如来自于编码U6小核RNA(snRNA)，转移RNA(tRNA)和腺病毒VA RNA的基因的转录单位）可用于在细胞中生成高浓度的目标RNA分子，如siRNA(Thompson等人,同上文;Couture和Stinchcomb,1996,同上文;Noonberg等人,Nucleic Acid Res.22:2830(1994);Noonberg等人,美国专利5,624,803;Good等人,Gene Ther.4:45(1997);Beigelman等人,国际PCT公开WO96/18736。siRNA转录单位可被整合如多种载体以导入哺乳动物细胞，该种载体包括但不限于，质粒DNA载体，病毒DNA载体（例如腺病毒或腺相关病毒载体），或是病毒RNA载体（例如逆转录病毒或甲病毒载体）（其综述参见Couture和Stinchcomb，1996，同上文）。
除了外源基因和调节序列外，本发明的重组表达载体可携带其它序列，例如调节载体在宿主细胞中复制（例如，复制起始区）的序列以及选择性标记基因。选择性标记可帮助选择未导入载体的宿主细胞（例如，参见Axel等人的美国专利4,399,216;4,634,665以及5,179,017）。例如，该选择性标记基因通常可赋予导入了该载体的宿主细胞对药物（例如G418，潮霉素或氨甲喋呤）的耐受性。优选的选择性标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因（针对dhfr-宿主细胞在氨甲喋呤选择/扩增中的使用）和neo基因（针对G418选择）。宿主细胞和重组生产本发明的蛋白的方法
编码本发明的抗-Nogo受体-1抗体，免疫原性肽，可溶性Nogo受体-1多肽，可溶性Nogo受体-1融合蛋白的核酸分子和包含这些核酸分子的载体可用于适当宿主细胞的转化。转化可以是用于向宿主细胞导入多聚核苷酸的任何已知方法。将外源性多聚核苷酸导入哺乳动物细胞的方法已为本领域公知并包括葡萄糖介导转染，磷酸钙沉淀，聚凝胺介导转染，原生质体融合，电穿孔，通过在脂质体中包封多聚核苷酸进行转染，以及直接将DNA显微注射进入细胞核。此外，还可通过病毒载体将核酸分子导入哺乳动物细胞。
本发明的rDNA分子可通过通常与所用载体和所用宿主***类型有关的公知方法转化适当细胞宿主。对于转化原核宿主细胞，可采用电穿孔和盐处理法（参见，例如，Sambrook等人.,Molecular Cloning-A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press(1989);Cohen等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA69:2110-2114(1972)）。对于用含rDNA载体转化脊椎动物细胞，可采用阳离子脂质体或盐处理法（参见，例如，Graham等人.,Virology52:456-467(1973);Wigler等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA7(5:1373-1376(1979)）。
成功转化的细胞（即，包含本发明rDNA分子的细胞）可通过包括选择性标记选择在内的公知技术进行鉴定。例如，通过导入本发明rDNA所得的细胞可通过克隆生成单独克隆。从该种克隆所得的细胞可进行采集，溶解，并采用如Southern,J.MoI.Biol.98:503-517(1975)所述的方法检测其DNA成分中rDNA的存在或通过免疫学方法测定细胞生成的蛋白。
用于表达本发明的方法中采用的本发明的多肽或抗体的宿主细胞可以是原核或真核细胞。可作为表达宿主的哺乳动物细胞系已为本领域公知并包括许多可从美国菌种保藏中心获得的永生化细胞系。其中包括，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，NSO，SP2细胞，HeLa细胞，幼仓鼠肾(BHK)细胞，猴肾细胞(COS)，人肝细胞癌细胞（例如，Hep G2），A549细胞，以及多种其它细胞系。特别优选的细胞系为通过测定那种细胞系具有最高表达水平所选择的细胞系。其它有用的真核宿主细胞包括植物细胞。其它可供使用的细胞系为昆虫细胞系，例如Sf9细胞。示范性的原核宿主细胞为大肠杆菌和链霉菌。
当编码本发明的免疫原性多肽，Nogo受体-1抗体或抗原结合片段，可溶性Nogo受体-1多肽和可溶性Nogo受体-1融合蛋白的重组表达载体被导入哺乳动物宿主细胞，它们可通过将宿主细胞培养一定时间进行生产，其中该培养时间足以允许宿主细胞中抗体，多肽和融合多肽的表达，或者更优选允许向宿主细胞生长的培养基中分泌本发明的免疫原性多肽，Nogo受体-1抗体或抗体结合片段，可溶性Nogo受体-1多肽和可溶性Nogo受体-1融合蛋白。本发明的免疫原性多肽，Nogo受体-1抗体或抗体结合片段，可溶性Nogo受体-1多肽和可溶性Nogo受体-1融合蛋白可通过标准蛋白纯化技术从培养基中回收。
此外，本发明的免疫原性多肽，Nogo受体-1抗体或抗体结合片段，可溶性Nogo受体-1多肽和可溶性Nogo受体-1融合蛋白在生产细胞系中的表达可通过一系列已知技术得到增强。例如，谷氨酰胺合成酶基因表达***（GS***）为增强特性条件下的表达的常用方法。有关GS***的完全或部分的讨论可参见欧洲专利0 216 846,0 256 055和0 323 997以及欧洲专利申请89303964.4。
宿主细胞
本发明进一步提供了以编码本发明Nogo受体-1抗体，抗原结合片段，可溶性Nogo受体-1多肽和/或可溶性Nogo受体-1融合蛋白的核酸分子转染的宿主细胞。该宿主细胞可以是原核或真核细胞。只要细胞系能够与细胞培养方法相容，与表达载体的增殖以及与基因产物的表达相容，用于表达本发明的蛋白的真核细胞不受限制。优选的真核宿主细胞包括，但不限于，酵母，昆虫和哺乳动物细胞，优选来自于如小鼠，大鼠，猴或人细胞系的脊椎动物细胞。有用的真核细胞的范例包括可作为CCL61从获得的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，可作为CRL1658从ATCC获得的NIH瑞士小鼠胚胎细胞NIH-3T3，幼仓鼠肾细胞(BHK)，以及类似的真核组织培养细胞系。
其它有用的真核宿主细胞包括植物细胞。其它可供使用的细胞系为昆虫细胞系，例如Sf9细胞。示范性的原核宿主细胞为大肠杆菌和链霉菌。
使用rDNA分子生产重组蛋白
本发明进一步提供了使用此处所述的核酸分子生产本发明Nogo受体-1抗体或抗原结合片段，可溶性Nogo受体-1多肽和/或可溶性Nogo受体-1融合蛋白的方法。一般而言，蛋白的重组形式的生产通常包含以下步骤：
首先，获得编码本发明蛋白的核酸分子。如果该编码序列没有被内含子中断，它直接适用于在任何宿主中表达。
然后该核酸分子被选择性地与适当的控制序列（如上所述）进行可操作的键合，以形成包含该蛋白开放阅读框架的表达单元。该表达单元可用于转化适当的宿主，而该转化的宿主在允许该重组蛋白生产的条件下培养。该重组蛋白可选择性地从该培养基或细胞分离；在某些可以容忍杂质的情况下不需要对该蛋白进行回收和纯化。
前述每一个步骤均可通过多种途径实现。例如，该目标编码序列可从基因组片段获得并可直接用于适当的宿主。在多种宿主中可操作的表达载体可采用如上列举的适当的复制和控制序列实现构建。控制序列，表达载体和转化方法依赖于用于表达该基因的宿主细胞的类型并在之前进行了详细的讨论。如正常情况下不存在，适当的限制性位点可被添加至编码序列的末端从而提供可***这些载体的可删除基因。技术人员可简单地采用本领域已知的任何宿主/表达***结合本发明的核酸分子生成重组蛋白。
对相关领域的普通技术人员而言，对此处所述的方法和应用进行的其它适当的修饰和更改可以显而易见的，且该种和更改可不脱离本发明或其任意实施方式的范围。为更好理解本发明，陈述了以下的实施例。这些实施例仅供阐述目的，不可解释为以任何方式对本发明的范围进行限制。
具体实施方式
实施例1
小鼠单克隆抗-NOGO受体-1抗体的生产
特异性结合本发明的免疫原性Nogo受体-1多肽的抗Nogo受体-1抗体可通过以下方法和步骤进行制备。
免疫
采用了两种免疫步骤：
1.以COS-7细胞或含Nogo受体-1(NogoR-1)的细胞膜作为免疫原
将大鼠Nogo受体-1基因(GenBank　No.AF462390)亚克隆进入含有CMV启动子和用于药物选择的遗传霉素（geneticin）抗性基因的哺乳动物表达载体pEAG1256通过Superfect将重组质粒转染进入COS-7细胞。使用遗传霉素(Gibco　,2mg/ml)选择转染体，克隆并通过FACS验证Nogo受体-1蛋白的表面表达。COS-7膜可参照[Wang等人.,J.Neurochem.75:1155-1161(2000)]所述的方法通过两次洗涤由这些细胞制备得到，并以1mg/ml[蛋白浓度]于-70°C贮存在10%甘油中。
使用含有50μg大鼠Nogo受体-1-COS-7膜或者含有在表面上表达Nogo受体-1的全COS-7细胞和50μl RJBIMPL+TDM+CWS佐剂的乳剂每两周一次腹腔免疫八周大的雌性RBF小鼠(Jackson Labs,Bar Harbor,ME)。在首次免疫前，第二和第三次免疫7天后，以及第三次免疫38天后采集免疫小鼠的血清，并参照下文描述使用ELISA检测抗-Nogo受体-1抗体效价。
2.以特异性Nogo受体-1肽作为免疫原
使用载体NTi　软件对大鼠Nogo受体-1基因序列进行抗原性分析（图2）。通过标准的戊二醛法将分析中鉴定得到的抗原性肽结合至匙孔血蓝蛋白(KLH)。
使用含有50μg KLH-结合肽和50μl完全Freund佐剂Chemical Co.,St.Louis,MO)的乳剂每两周一次腹腔免疫八周大的雌性RBF小鼠(Jackson Labs,Bar Harbor,ME)。在首次免疫前，第二和第三次免疫1周后收集免疫小鼠的血清，并检测抗-Nogo受体-1抗体效价。第三次免疫后给用加强剂量。该加强剂量免疫三天后，启动融合实验。
杂交瘤生产和筛选
通过ELISA筛选以抗原性Nogo受体-1肽免疫的小鼠的血清，并通过流式细胞仪筛选以表达Nogo受体-1的COS-7细胞免疫的小鼠的血清。通过流式细胞仪鉴定对特异性结合Nogo受体-1-COS-7细胞的抗体呈阳性的小鼠并将其处死。根据描述(Kennett等人,Monoclonal Antibodies:A New Dimension in BiologicalAnalysis,Plenum Press,New York(1993))从该小鼠分离脾细胞并融合至FL653骨髓瘤（一种Ig-/HGPRT-Balb/c小鼠脾细胞APRT-衍生物，保存在含10%FBS,4500mg/L葡萄糖,4mM L-谷胺酰胺,和20mg/ml8-氮鸟嘌呤的DMEM中）。将融和细胞涂布于24-或48-孔板(Corning Glass Works,Corning,NY)，并以含有腺嘌呤，氨喋呤和胸苷的培养基进行培养。按照下述方法以ELISA或流式细胞仪通过对Nogo受体-1-COS-7细胞或Nogo受体-1抗原性肽的结合筛选抗AAT培养。通过有限稀释法进一步亚克隆阳性微孔中的细胞。
为了筛选与Nogo受体-1抗原性肽结合的抗体，该种用作免疫原的肽被结合至BSA。向96孔MaxiSorp　平板(Nunc　)的每一个微孔添加0.5μg溶于50μl pH9.0的0.1M重碳酸钠缓冲液中的结合肽。将该平板在37℃下孵育1小时或在4℃下孵育16小时，并采用25mM HEPES（pH7.4，含有0.1％BSA，0.1％卵白蛋白，0.1％blotto和0.001％叠氮化物）阻断非特异性结合位点。添加杂交瘤上清液并在25℃下孵育1小时。以PBS洗涤三次后，向每个微孔添加50μl的一种辣根过氧化酶结合的山羊抗小鼠二级抗体(Jackson ImmunoResearch Inc.)的1:10,000稀释液并继续培养1小时。三次洗涤后，以TMB(Pierce)显色并以2M硫酸终止。以分光光度计在450nm下监测色彩强度。
通过如下所述筛选结合全长Nogo受体-1的抗体。参照销售商描述以0.1μM CellTracker　绿色CMFDA(分子探针,Eugene,OR)标记COS-7细胞。在以抗-Nogo受体-1测试血清孵育前将等量的CellTracker　标记的对照细胞与洗涤后的Nogo受体-1-COS-7细胞相混合。将50微升的细胞混合物分布到96孔V形底聚苯乙烯板3877,Corning,NY)上，并添加100μl的杂交瘤上清液或对照抗-Nogo受体-1抗体。在4℃下培养30分钟后，洗涤细胞并与50μl含于PBS中的R-藻红蛋白结合亲和性纯F(ab')2片段山羊抗小鼠IgG Fc gamma特异性二级抗体(1:200,Jackson ImmunoResearch Laboratory,West Grove,PA)进行孵育。在孵育末期，以PBS洗涤细胞两次并悬浮于含1％FBS的200μl PBS中，然后进行FACS分析。或者将Nogo受体-1-COS-7细胞与杂交瘤上清液混合并以R-藻红蛋白-结合山羊抗-小鼠二级抗体处理，然后直接进行标准FACS分析。
我们通过多种免疫原生成了25种抗-Nogo受体-1抗体。我们以对应大鼠Nogo受体-1残基110-125的肽序列作为免疫原生成了两种抗体，7E11和5B10。我们通过从全长大鼠Nogo受体-1转染的COS7细胞制备的膜作为免疫原生成了三种抗体，1H2，3G5和2F7。我们以sNogoR310-Fc作为免疫原生成了13种抗体(1D9.3,1E4.7,1B4.3,2C4.3,1F10.3,2Hl.4,1H3.3,1G4.1.1E4.1,2G7.1,2C4.1,2F11.1和1H4.1)并以对应大鼠Nogo受体-1残基423-434的肽序列作为免疫原生成了7种抗体(2E8.1,2Gl1.2和1B5.1)。
单克隆抗体7E11和5B10的序列分析
我们采用 微型试剂盒萃取总RNA，并从分离的RNA生成cDNA。我们通过PCR以引物5'-TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCAG-3'(SEQ ID NO:12)和5'-AGGTSMARCTGCAGS AGTCWGG-3'(SEQ ID NO:25)扩增轻链序列。我们通过PCR以引物5'-GGGGATATCCACCATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTG-S'(SEQ IDNO:13)和5'-GGGGATATCCACCATGAGGKCCCCWGCTCAGYTYCTKGGA-3'(SEQ ID NO:14)扩增重链序列。这些引物包含如下简并核苷酸：S代表G或C；M代表A或C，R代表G或A；W代表A或T；K代表G或T；且Y代表T或C。我们将PCR片段克隆进入测序载体并采用特异性针对该测序载体的引物通过双脱氧链终止法测定CDRs的DNA序列。我们概念性翻译了DNA序列，表2显示了单克隆抗体7E11和5B10的重和轻链的CDR区的部分氨基酸序列。单抗的重和轻链的3个CDRs在表2中下划线表示。7E11和5B10的轻链具有94％的氨基酸序列一致性而重链具有91％的氨基酸序列一致性。单抗7E11,5B10和1H2属于IgG1同型，单抗3G5和2F7属于IgG2a同型。该五个单抗每一个都带有kappa同型的轻链。我们通过该方法分析了其它单克隆抗体的序列。
表2.单抗7E11和5B10的氨基酸序列
单克隆抗体7E11的表位定位
单抗7E11可以结合大鼠和人NgR1。为确定负责7E11结合的表位，我们生成了大鼠NgR1的片段和合成肽并测试其与7E11的结合。
以酸或溴化氰(CNBr)处理包含所有8个LRR区和N-和C-末端帽子(sNgR310)的大鼠NgR1的重组片段并通过凝胶电泳分离该片段。未处理sNgR310迁移的表观分子量为42kDa。sNgR310的酸处理生成15kDa(aa27-aa122)和30kDa(aa123-aa310)两个主要的裂解产物。CNBr处理生成三个片段，33/35kDa双重线(aa27-aa229)（可能代表了具有外源糖基化的片段），10kDa产物(aa241-aa310)，以及11-氨基酸片段(aa230-aa240)（未保留在凝胶上）。以7E11探测凝胶的western印迹证实它与完整大鼠NgR1(aa27-aa310)，15kDa酸片段(aa27-aa122)以及35kDa CNBr片段(aa27-aa229)结合。7E11不结合30kDa酸片段(aa123-aa310)或10kDa CNBr片段(aa241-aa310)。15kDa酸片段和35kDa CNBr片段均包含序列LDLSDNAQLRWDPTT(SEQ ID NO:1)，这与7E11结合NgR1上的单个表位相一致。
7E11结合位点可通过测试sNgR310的胰蛋白酶肽消化进一步分析。HPLC分析显示了多个片段，提示NgR1序列中具有多个胰蛋白酶敏感型赖氨酸和精氨酸残基。7E11仅结合单个胰蛋白酶消化肽，这为7E11结合NgR1上的单个表位提供了其它证据。后续的质谱(MS)和序列分析鉴定该结合肽为AAAFTGLTLLEQLDLSDNAQLR(SEQ ID NO:26)。
对LDLSDNAQLRWDPTT肽(SEQ ID NO:1)进行进一步的定位分析。以胰蛋白酶消化该肽得到两个主要的片段LDLSDNAQLR(SEQ ID NO:27)和WDPTT(SEQ ID NO:28)，并测试7E11与它们的结合能力。MS分析揭示该抗体结合肽LDLSDNAQLR(SEQ ID NO:27)，因此该肽包含针对7E11的结合表位。在该肽片段中，具体的MS分析鉴定了多个同样结合7E11的乱序的（scrambled）肽，包括在Asn115和Gln117处脱氨基，在112或113位添加丙氨酸，或者在114位添加丝氨酸的肽（表3）。这些数据显示该肽片段中的一些氨基酸残基对于7E11结合可能并不重要。
表3.7E11结合的突变肽
该LDLSDNAQLRVVDPTT(SEQ ID NO:1)肽还以内切蛋白酶Asp-N进行消化并测试了与7E11的结合。内切蛋白酶Asp-N将该肽裂解为3个肽片段，L,DLS和DNAQLRWDPTT(SEQ ID NO:36)。在这些产物中，7E11结合DNAQLRWDPTT(SEQ ID NO:36)肽。综上，胰蛋白酶和Asp-N裂解数据进一步将7E11结合表位定位至两者共享的序列DNAQLR(SEQ ID NO:37)。
对来自不同物种的氨基酸序列NgR1，NgR2和NgR3进行分析，以根据7E11结合大鼠和人NgR1但不结合小鼠NgR1，人NgR2或小鼠NgR3这一观察预测7E11结合表位中的关键残基。序列比对显示大鼠NgR1的氨基酸110-125与人NgR1的相应序列一致且小鼠NgR1序列仅在位置119上有一个氨基酸的区别（在大鼠和人NgR1中为Arg119，而在小鼠NgR1中为His119；表4）。
表4.来自不同物种的NGRS的序列比对
蛋白 aa110至aa119的序列 SEQ ID NO:
大鼠及人NgR1 LDLSDNAQLR 27
小鼠NgR1 LDLSDNAQLH 38
大鼠及人NgR2 LDLGDNRHLR 39
大鼠，人及小鼠NgR3 LDLGDNRQLR 40
NgR1上的Arg119可促成7E11结合，因为它与大鼠和人NgR1能很好地结合，但与小鼠NgR1结合很差。类似地，由于7E11与NgR3未能很好结合，且由于DNAQLR序列(SEQ ID NO:37)中NgR3与NgR1的相应序列仅有一个精氨酸的区别，因此Ala116包含在该表位中。在DNAQLR(SEQ ID NO:37)序列中，NgR2的六个残基中有4个与大鼠NgR1一致。Ala116和Gln117分别被精氨酸和组氨酸替换。这确认了Ala116是促成7E11结合的重要氨基酸残基，但不一定排除Gln117的参与。
为了验证这些接触点，生成了多个在LDLSDNAQLR序列(SEQ ID NO:27)中具有点突变的肽并进行了7E11结合测试。该肽被固定化至MaxiSorp　平板(Nunc　)，并添加系列稀释的7E11。表5显示了所得的EC50值。7E11以和原始肽类似的EC50值与Leu110Ala和Asp111Ala结合。在测试Gln117Ala时，EC50上升了30倍，在测试Arg119His时，EC50上升了25倍。当Arg119突变为丙氨酸时可观察到EC50最明显的变化。
表5.7E11以不同的EC50结合至突变肽
肽中的变化 序列 EC50 SEQ ID NO：
无变化 LDLSDNAQLRVVDPTT 0.55 1
L110A ADLSDNAQLRVVDPTT 0.62 41
D111A LALSDNAQLRVVDPTT 0.31 42
Q117A LDLSDNAALRVVDPTT 16 43
R119H LDLSDNAQLHVVDPTT 12 44
R119A LDLSDNAQLAVVDPTT 88 45
7E11结合表位的位置还可在sNgR310的新溶解的晶体结构中测定。如同预期，该结构显示7E11表位暴露在分子的表面。残基Arg119,Gln117，Ala116和Asp114从结构中向外突出，而Leu118和Asn115位于内部。该表位位于该结构凹陷表面中的酸性斑块以及面对其中一侧的碱性表面的顶部。
单克隆抗-Nogo受体-1抗体对配体与可溶性Nogo受体-1结合的抑制
测定了上述生成的抗-Nogo受体-1单克隆抗体是否抑制配体与Nogo受体-1的结合。
将0.5μg如下述生成的包含大鼠Nogo受体-1的氨基酸残基26-334以及大鼠IgG1分子(sNogoR344-Fc)的铰链和Fc区的可溶性Nogo受体-1融合蛋白在250μg结合了蛋白-A-或麦胚凝集素的SPA珠上在25℃下固定2小时。向每个样本微孔添加含于50μl的HEPES-缓冲孵育培养基(10mM HEPES,pH7.4,0.1%牛血清白蛋白,0.1%卵白蛋白,2mM MgCl2,2mM CaCl2和蛋白酶抑制剂)的偶合了Fc-sNogoR-1，抗-Nogo受体-1单抗和lμl125I-Nogo66(Amersham,2000Ci/mmol,1nM)的SPA珠。16小时后，通过(Packard)在一式四份的样本中检测放射活性。从曲线拟合分析计算得到IC50值(PRISM,GraphPad软件,NJ)（图3）。在部分实验中，我们还采用了AP-配体结合物（例如，AP-Nogo66）并通过监测碱性磷酸酶活性来检测结合。我们还测定了该单抗阻断配体MAG-Fc和AP-OM-gp结合Nogo受体-1的能力。
单克隆抗体7E11,5B10,1H2,3G5和2F7均抑制Nogo66,MAG和OM-gp与sNogoR344-Fc的结合。经计算Nogo66对7E11和1H2的IC50分别为400nM和60nM。表6总结了通过ELISAs监测的单抗介导的对三种配体与Nogo受体-1结合的抑制。
表6.单抗抑制NOGO66，MAG和OM-GP与NOGO受体-1的结合
替换百分比在30nM抗体和根据描述从曲线拟合分析测得的特定单抗的EC50下显示，“—”表示没有可测的活性，“ND”表示未测定。
实施例2
FAB-噬菌体抗-NOGO受体-1抗体的生产
特异性结合本发明免疫原性Nogo受体-1多肽的抗-Nogo受体-1Fab-噬菌体抗体还可通过以如下方式在Fab-噬菌体库中筛选进行制备。
通过大鼠可溶性sNogoR310-Fc蛋白和表达大鼠Nogo受体-1的COS7细胞筛选MorphoSys Fab噬菌体库GOLD。纯化并鉴定特异性结合Nogo受体-1的Fab-噬菌体。14D5的重链来自于VH2基因而轻链来自于VK1基因。表7显示了这些Fab-噬菌体之一，14D5的重链和轻链的CDRs的氨基酸序列。
表7.14D5的CDRS的氨基酸序列
氨基酸序列 SEQ ID NO：
重链CDR1 GFSLSTSGGSVG 19
重链CDR2 LIYSNDTKYYSTSLKY 20
重链CDR3 SRFWTGEYDV 21
轻链CDR1 RASQNIAITLN 22
轻链CDR2 LASSLQS 23
轻链CDR3 QQYDNYPL 24
14D5可结合单价和双价形式的大鼠Nogo受体-1。此外，14D5可结合小鼠和人Nogo受体-1和人Nogo受体-2，但不结合小鼠Nogo受体-3。
实施例3
抗-NOGO受体-1单克隆抗体对NOGO受体-1的免疫沉淀。
为进行免疫沉淀，分别在30μl蛋白A或G和1-2μg抗体的存在下将100μl溶解细胞或50μl PiPLC处理的细胞与400或450μl萃取缓冲液[10mM Tris-HCl,pH7.2,0.5%Tween-20,0.2mM PMSF]或RIPA缓冲液混合。将混合物在振荡器上于4℃下孵育16小时。
轻柔转动样本，使蛋白A或G偶合珠聚集成球。以1ml洗涤缓冲液(10mM Tris-HCl,pH7.2,0.1%Tween-20　)洗涤珠子三次。使用10％原始洗涤缓冲液进行最终的洗涤。
将珠子重新悬浮于100μl含有10%β-巯基乙醇的2X SDS中。在4-20％Tris-甘氨酸凝胶上进行SDS-PAGE前在室温下孵育样本。通过SDS-PAGE凝胶分析测定单克隆抗体3G5和2F7可免疫沉淀Nogo受体-1。
实施例4
通过ELISA测定抗体特异性
为测定实施例1和2中生产的单克隆和Fab-噬菌体抗体的特异性，我们采用一组Nogo受体-1多肽进行了ELISA。该多肽组由sNogoR310-Fc(包含大鼠Nogo受体-1的氨基酸26-310以及大鼠Fc片段的融合蛋白),sNogoR344-Fc(见上文),多肽p-617(SEQ ID NO:1),多肽p-618(来自于大鼠Nogo受体-1LRR7区的19-氨基酸多肽；图2；SEQ ID NO:11)以及多肽p-4和p-5(分别来自于Nogo受体-1的LRR5和LRRCT区的多肽)组成。卵白蛋白和BSA被用作对照。如图4所示，单抗1H2,3G5和2F7均特异性结合sNogoR344-Fc。在类似的实验中，这些抗体同样特异性结合由大鼠Nogo受体-1的氨基酸310-344组成的多肽(SEQ ID NO:3)，而单抗7E11和5B10结合多肽p-617(SEQ ID NO:1)。
来自sNogoR310-Fc免疫的10个抗体(1D9.3,1E4.7,1B4.3,2C4.3,1F10.3,2Hl.4,1H3.3,1G4.1,1E4.1和2G711)可在结合中彼此替换，表明它们识别sNogoR310-Fc上类似或重叠的表位。来自sNogoR310-Fc免疫的其它三个抗体(2C4.1,2Fl1.1,和1H4.1)识别氨基酸残基26-310中的不同表位。
我们还使用Fab-噬菌体14D5进行了ELISA结合测定。AP-Nogo66,AP-OM-gp和MAG-Fc配体能够结合固定化sNogoR344-Fc，而1μM14D5完全抑制了Nogo和MAG结合。完全抑制OM-gp与sNogoR344-Fc的结合需要10μM的14D5。
实施例5
神经突生长测定
为检测上述制备的单克隆和Fab-噬菌体减少CNS髓磷脂对神经元的抑制的能力，使用0.1mg/ml聚-D-赖氨酸涂布培养玻片（4孔）。CNS髓磷脂或PBS作为3μl微滴点上玻片。向髓磷脂/PBS添加荧光微球(Polysciences)以便随后鉴别该微滴(Grandpre等人,Nature403:439-444(2000))。然后以10μg/ml层粘蛋白(Gibco　)洗涤和涂布Lab-玻片。以1mg/ml1型胶原酶(Worthington)解离P3-4Sprague Dawley大鼠幼鼠的背根神经节(DRG's)，用预涂布的火抛光巴斯德移液管进行粉碎以富集神经元细胞并最终以23,000细胞/孔在预涂层Lab-培养玻片上进行涂布。采用含有5％热灭活供体马血清，5％热灭活胎牛血清以及50ng/ml mNGF的F12培养基，在37℃5％CO2存在下培养6小时。涂布后立即加入15μg/ml的单抗7E11。
以含20％蔗糖的4％多聚甲醛固定玻片，并在20分钟后以1:500稀释的神经元标记抗-βIII-微管蛋白(Covance TUJl)进行染色。以1:300稀释二级抗体抗-小鼠Alexa594(Molecular Probes)并以Gel/Mount覆盖玻片。使用OpenLab　软件获取5x数字图象，并使用MetaMorph软件分析对图象进行神经突生长定量分析。
单抗7E11保护DRG神经元不受髓磷脂介导的神经突生长抑制。(图5)。在单抗1H2和3G5中可观察到类似的结果。
在CNS髓磷脂基质上培养大鼠P7DRG神经元的神经突生长保护测定中，双价14D5同样能有效促进神经突生长。
实施例6
在以NOGO受体-1转染的细胞上以7E11进行的免疫组化
为了进一步表征如实施例1制备的抗-Nogo受体-1单抗的结合属性，我们比较了与表达大鼠或人Nogo受体-1的固定和游离COS-7或293细胞的结合。
固定细胞：
将Nogo受体-1转染和未转染的细胞涂布于8-孔Lab-培养玻片，以4％多聚甲醛固定15分钟，以含于PBS的10％普通山羊血清，0.1%Triton X-100封闭1小时。向封闭溶液添加15μg/ml和1.5μg/ml的单抗7E11并在室温下孵育2小时；以1:300的比例将-结合的二级抗体抗小鼠(MolecularProbes)稀释于封闭溶液并孵育1小时；向二级抗体添加5μg/ml的DAPI以标记所有的细胞核。
游离细胞：
将转染和非转染细胞涂布于8孔Lab-Tek培养玻片，在4℃下以FACS缓冲液（含4％供体马血清）封闭30分钟，与含于FACS缓冲液的15μg/ml和1.5μg/ml的7E11在4℃下孵育1小时，洗涤并与二级抗体抗-小鼠-(1:300含于FACS缓冲液)在4℃下孵育30分钟。
免疫组化染色实验证明了所有的单抗结合表达大鼠Nogo受体-1的细胞。单抗7E11，2G7.1和2C4.1同时结合表达人Nogo受体-1的固定和游离细胞。
实施例7
脊髓挫伤损伤的小鼠模型
为了测试实施例1中所制备的抗-Nogo受体-1单抗在体内对神经元的作用，我们采用了小鼠脊髓挫伤损伤模型。
以止痛和抗菌剂预防处理雌性小鼠（18-22g）。麻醉小鼠并置于立体定向装置并将脊柱固定于立体显微镜下。采用改良的重量打击法(M.Li等人,Neuroscience PP:333-342(2000)引发脊髓的外伤。
简单而言，进行T9和T10椎板切除术并采用一对支持从T9-T10两侧横向处理的小鼠横向钳固定脊柱。将直径1.4mm且重量为2g的不锈钢冲击棒升至硬脑膜上2.5cm并坠落至T10水平的脊髓。在手术过程中，将小鼠置于37℃温暖的毯子中并在术后向各只小鼠皮下施用1ml的无菌温盐水以避免脱水。每天人工挤压膀胱一次，直至恢复反射性膀胱控制。
所有的动物在术后8-12小时接受术后止痛，并在此后7天每天两次接受抗生素处理。在研究期间动物自由获取食物和水。抗-Nogo受体-1抗体参照下文大鼠脊髓横切模型的描述在28天中通过鞘内注射传递至损伤位点。
实施例8
可溶性NOGO受体-1融合蛋白的表征
为了表征可溶性Nogo受体-1多肽(sNogoR-1)和融合蛋白(Fc-sNogoR-1)，我们进行了以下实验。
将3μg可溶性Nogo受体(sNogoR310-Fc和sNogoR344-Fc)固定至250μg WGA-SPA珠并接受含于终体积为100μL的结合缓冲液(20mM HEPES,pH7.4,2mM Ca,2mM Mg,0.1%BSA,0.1%卵白蛋白和蛋白酶抑制剂)的放射活性配体（终浓度0.5nM）。配体包括10μM Nogo66,10μM125I-Nogo40（Nogo A的氨基酸1-40）以及针对每个配体组的10μL抗-Nogo受体-1抗体上清液。在Nogo40上的三个酪氨酸被单独碘化并分别命名为Nogo40-A，-B和-C。三次重复的平均值被表示为归一化的％结合放射活性（图6,7和8）。误差棒表示SEM。抑制剂缺失时的结合放射活性定为100％，并将10μM Nogo40存在下的最低结合放射活性定为0％，以进行数据归一化。
实施例9
配体与可溶性NOGO受体-1融合蛋白结合的抑制
可采用与实施例8的结合测定类似的结合测定来测试实施例1中制备的两种单抗抑制125I-Nogo66与sNogoR344-Fc结合的能力。单抗2F7和3G5抑制125I-Nogo66结合sNogoR344-Fc。
实施例10
神经突生长测定
以0.1mg/ml聚-D-赖氨酸涂覆培养玻片（4孔）。将单独的CNS髓磷脂或与sNogoR310，sNogoR310-Fc融合蛋白，单抗5B10或对照PBS的混合物分别作为3μl微滴点上玻片。向髓磷脂/PBS添加荧光微球(Polysciences)以便随后鉴别该微滴(Grandpre等人,Nature403:439-444(2000))。然后以10μg/ml层粘蛋白(Gibco　)洗涤和涂布Lab-玻片。
以1mg/ml1型胶原酶(Worthington)解离P3-4Sprague Dawley大鼠幼鼠的背根神经节(DRG's)，用预涂布的火抛光巴斯德移液管进行粉碎以富集神经元细胞并最终以23,000细胞/孔在预涂层LabTek培养玻片上进行涂布。采用含有5％热灭活供体马血清，5％热灭活胎牛血清以及50ng/ml mNGF的F12培养基，在37℃5％CO2存在下培养6小时。
以含20％蔗糖的4％多聚甲醛固定玻片，并在20分钟后以1:500稀释的神经元标记抗-βIII-微管蛋白(Covance TUJl)进行染色。以1:300稀释二级抗体抗-小鼠Alexa594(Molecular Probes)并以Gel/Mount覆盖玻片。使用OpenLab　软件获取5x数字图象，并使用软件分析对图象进行神经突生长定量分析。
sNogoR310，sNogoR310-Fc和单抗5B10均保护DRG神经元不受髓磷脂-介导的神经突生长抑制（图9-11)。在采用鸡神经元的类似测定使用sNogoR310并发现其具有保护性。
我们还通过层粘蛋白存在或缺失时的细胞生长实验测定了可溶性Nogo受体的神经元保护作用。在层粘蛋白缺失的培养基中的神经元细胞生长较差且模拟了神经元应力条件。
从新生6-7日大鼠幼鼠(P6-7)切开得到DRG，分解为单细胞并涂布如上所述以聚-D-赖氨酸预涂的96-孔板。在部分微孔中添加2μg/ml层粘蛋白2-3小时，并在涂布细胞前清洗。孵育18-20小时后，以4％多聚甲醛固定该平板，以1:500稀释的兔抗-β-III-微管蛋白抗体和1:100稀释的抗-HuC/D(MolecularProbes)染色，并添加1:200稀释的荧光二级抗体(MolecularProbes)。II用于通过采用神经突生长应用捕获5x数字图象并以平均神经突生长/每微孔神经元对神经突生长定量。分析来自3微孔/条件的9个5x图象。
在部分实验中采用了PC12细胞(Neuroscreen　)的亚克隆以200ng/ml NGF将Neuroscreen　细胞预分化7日，脱附并重新涂布于以聚-D-赖氨酸预涂的96-孔板。在部分微孔中在5-3小时内添加2μg/ml层粘蛋白并在涂布细胞前清洗。孵育2日后，以4％多聚甲醛固定该平板，以1:500稀释的兔抗-β-III-微管蛋白抗体和Hoechst染色（核染色）。如同在DRG细胞中一样采用II对神经突生长定量。
在涂布时将含于溶液的sNogoR344-Fc或大鼠IgG添加至P6-7DRG神经元和分化的Neuroscreen　细胞。
当P6DRG神经元在层粘蛋白缺失下生长时可观察到1μM和10μM的sNogoR344-Fc具有神经元保护作用。神经突生长的定量显示其随sNogoR344-Fc的添加呈剂量依赖性上升。向生长于层粘蛋白底物的DRG神经元添加相同浓度的sNogoR344-Fc未产生任何异常作用，表明sNogoR344-Fc仅对应激细胞具有活性。还可在Neuroscreen　细胞中发现层粘蛋白缺失时相同浓度的sNogoR344-Fc的神经元保护作用。
实施例11
FC-SNOGOR-l融合蛋白的生产和纯化
将编码大鼠Nogo受体-1的氨基酸1-310的cDNA构建体融合至包含在哺乳动物表达载体的大鼠IgG1Fc，并将该载体电穿孔进入中国仓鼠卵巢(CHO)(DG44)细胞。将细胞维持在添加了10％透析胎牛血清，2mM谷氨酰胺和抗生素-抗真菌药剂的α-MEM。转染后两天，采集该条件培养基并在还原条件下用Western印迹分析。通过多克隆兔抗-Nogo受体-1抗体检测到一条约60kDa的蛋白条带。扩增细胞并采用R-PE结合的山羊抗-大鼠IgG抗体分选。第二次分选后，以1细胞/微孔的密度将细胞涂布在96-孔板上。检测由单个微孔分泌的可溶性Nogo受体-1蛋白水平并与夹心ELISA法进行比较。ELISA平板以山羊抗-大鼠IgG FCκ特异性抗体涂布。应用条件培养基。通过HRP结合的驴抗-大鼠IgG Fab，Fc特异性抗体检测结合可溶性Nogo受体-1蛋白。克隆4C12具有最高的分泌水平。扩增4C12并在转瓶内生长于CHO-M7培养基中。在37℃下的分泌水平约为10mg/L。
大规模培养表达sNogoR310-Fc融合蛋白的CHO细胞。从10L的生物反应器中获取1.7L的浓缩条件培养基。通过添加十分之一体积的1.0M Tris-HCl,pH8.9提高pH。分别添加固体氯化钠和甘氨酸至3.0M和1.5M。用3M氯化钠，1.5M甘氨酸的10mMTris-Hcl，pH8.9，平衡60mL蛋白A-Sepharose　制备柱。使用蠕动泵将浓缩的条件培养基以1.5mL/min的速度上柱。先后以300mL含3M氯化钠，1.5M甘氨酸的10mM Tris-Hcl，pH8.9和120mL含3M氯化钠的5mM Tris-Hcl，pH8.9洗柱。以25mM磷酸钠，100mM氯化钠，pH2.8洗脱蛋白。将10mL的组分收集于含1.0mL的1.0MHEPES,pH8.5的管中。汇集蛋白组分并对3X2L的5mM磷酸钠，300mMNaCl，pH7.4透析。
实施例12
脊髓横切测定
为了测试sNogoR-1融合蛋白促进功能性恢复的能力，在脊髓横切测定中对其进行测定。
将当日新鲜配制的测试溶液（含于PBS的sNogoR310-Fc）加载至渗透泵。经计算加载浓度为5和50μM。在移植进入动物之前在37℃下将泵准备>40小时。对雌性LongEvans大鼠给用术前止痛和镇静剂并使用异氟醚（3％含于O2）麻醉。
将大鼠置于立体定向仪并将运动皮层双面暴露于通路（tract）示踪剂BDA(10,000MW)的灌注中。然后在脊髓的T5-T6处对大鼠进行脊髓半切，然后植入鞘内导管和泵***以传递测试化合物（n=11每组）。
使大鼠恢复并存活至术后28天。记录BBB***的行为评分至导入损伤后28天，研究的存活期终止之前。灌注和固定之后，去除脊髓，冷冻保存，切片，染色并进行轴突计数。
监测损伤后的大鼠和小鼠的Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)运动评分(Basso等人.,Neurotrauma13:343-359(1996))，斜板试验和倾斜网格爬升试验（Li and Strittmatter,J Neurosci.23:4219-27(2003))。对于斜板试验，我们检测了小鼠在5秒钟内不滑落的50cm x60cm板最大倾斜角度。对于倾斜网格爬升，我们训练小鼠爬上斜度为45度的网格（35cm长x2.54cm宽）。记录在每次从底部到顶部的爬升中后足跌落网格板的案例数。对于大鼠行为，采用BBB运动评分，网格爬行和足迹分析。对于网格爬行，我们训练大鼠在网格上爬行（70cm长x2.54cm宽），并记录后足跌落网格下的案例数。对于足迹分析，以墨水记录在90cm的跑道上连续运动中大鼠后足的行走模式，并计算每一侧的步长和步宽(Metz等人,Brain Res.883:165-177(2000))。所有这些行为测试均至少对两个个体进行。在整个手术，行为测试和组织学分析过程中，研究者均不了解微型泵中的化合物的信息。
sNogoR310-Fc促进功能恢复（图12）。
实施例13
大鼠脊髓挫伤测定
在大鼠脊髓挫伤测定中检测了可溶性Nogo受体-1多肽和融合蛋白在体内对神经元的作用。
以止痛和抗菌剂预防处理带头罩的雌性Long Evans大鼠（170-190g）。手术前10分钟，通过2.5mg/kg咪达***腹腔止痛并以含于O2的2-3％异氟醚麻醉。然后将大鼠剃毛，以酒精和优碘处理，并对其眼部采用润眼剂。然后在中线和T7至T12椎骨切开。
在T91/2和T10进行背侧椎板切除术以暴露脊髓。将大鼠固定至冲击器。首先夹钳T7和T8体节，然后将T11和T12体节连接至尾钳。在大鼠的胸腔下置入软材料。将冲击棒设置为零位置，并将电接地线夹连接至伤口边缘。然后将冲击棒提升至25.0mm并适当调节至暴露脊髓的直接上方的位置。接着释放冲击棒以击中暴露的脊髓，并将冲击棒立即提升。
解除大鼠的固定，并将置于伤口。将伤口的肌肉缝合，并通过手术钉住切口。将动物置于培养器直至它们从麻醉中苏醒。根据需要向大鼠给用抗生素，止痛剂和盐水。此后每天早晚挤压膀胱直至功能恢复。
如上文的大鼠脊髓横切模型所述，鞘内施用可溶性Nogo受体-1融合蛋白（例如，sNogoR310-Fc）。在手术后一天，以及在4至6周内每周进行BBB评分。
实施例14
转基因小鼠中SNOGOR310的表达
我们构建了表达可溶性Nogo受体-1蛋白的转基因小鼠以测试其在体内表达时的作用。
我们将小鼠sNogoR310cDNA（对应Nogo受体-1的氨基酸1-310）克隆进入C-3123载体的NotI位点。在该载体中，sNogoR310表达受胶质纤维酸性蛋白(gfap)基因调节元件的控制，这使得损伤位点的反应活性星形细胞可以进行分泌提高的高水平表达。我们依次以AatII和SfiI消化了所得的载体并在3.4kb片段分离了gfap::sNogoR310构建体。我们将该片段显微注射进入胚胎以生成转基因小鼠。我们通过PCR验证了该转基因已经整合，并鉴定了五个建立者系。我们将具有最高表达水平的两个建立者系的雄性杂合子与雌性C57BL/6J小鼠杂交。我们通过Western印迹分析采用针对Nogo受体-1的抗体确认了杂合子转基因小鼠中GFAR-阳性细胞表达和分泌sNogoR310。
我们在添加了蛋白酶抑制剂(Roche)的Tris-缓冲盐溶液中将皮层和脊髓匀浆化并将匀浆物在4℃下40,000rpm离心20分钟。我们以4％的多聚甲醛处理上清液20分钟以提高抗体特异性并在免疫印迹之间进行透析。我们在RIPA缓冲液（1%X-100,0.5%脱氧胆酸钠,0.1%SDS含于PBS）中超声匀浆化微粒组分，将所得匀浆物离心并按如上所述处理该上清液（清洗液-可溶性微粒组分）。我们通过免疫印迹采用1:2000稀释的针对Nogo受体-1的兔抗血清分析了20μg脑或脊髓蛋白。我们通过与AP-结合的抗-兔IgG和NBT/BCIP AP底物孵育显示免疫反应性。
我们检测了来自两个转基因系Tg08和Tg01的皮层和脊髓的无清洗液可溶萃取物中分泌的37kDa sNogoR310，但在同胎仔畜野生型(WT)小鼠中仅存在（如有）极少的37或81kDa的可溶性Nogo受体-1蛋白。对微粒组分的检测证明了在WT和转基因小鼠中有类似水平的内源性Nogo受体-1。
实施例15
损伤后转基因小鼠中SNOGOR310的表达
我们通过进行脊髓半切测试了CNS损伤对转基因小鼠中sNogoR310表达的作用。我们参照实施例14的描述通过杂合子雄性与C57/BL6雌性的交配获得了sNogoR310转基因和非转基因对照动物。
我们深度麻醉了成熟雌性杂合子转基因或同胎仔畜WT小鼠（10-16周大）并进行了完全椎板切除术，完全暴露T6和T7水平的脊髓的背侧部分。我们以30号针在T6进行了背侧半切并以微型剪刀完全断绝背侧和背外侧皮质脊髓束(CSTs)。我们用带标记的针多次穿过脊髓的背侧以确认损伤的深度为1.0mm。我们在椎板切除处缝合肌肉层并用手术缝钉闭合背侧皮肤。为了追踪皮质脊髓束，我们在脊髓损伤后14日在颅骨上右侧的大脑皮质上方制作了一个钻孔。我们在距离皮质表面0.7mm深的4个注射位点应用了示踪剂BDA(MW10,000,10%含于PBS)(Molecular Probes,Eugene,OR)。损伤后四周，对小鼠灌流PBS，然后为4％多聚甲醛。用于sNogoR310表达试验的小鼠不接受任何示踪剂注射。
对于用于western印迹分析的小鼠，收集未在损伤后14日进行灌流的T3和L3水平之间的脊髓。用于Nogo受体-1免疫组化染色的小鼠在半切后10天以4％多聚甲醛灌流，去除损伤脊髓进行切片。为了检测转基因和WT小鼠受损脑部的sNogoR310表达，以立体定向装置(David Kopf,Tujunga,CA)中的11号手术刀片进行皮质刺伤。得到4mm矢状窦旁切口，距前囱背面0.5mm，中线侧面1.5mm，3.5mm深。
我们检测了转基因小鼠（未检测WT小鼠）中损伤后10天可溶性脊髓萃取物中上升的sNogoR310水平，该水平与损伤周围的GFAR上调相一致。为了确认这不是由于Nogo-A的补偿性上调引起的，我们测试了它的表达并发现它在WT和转基因小鼠的完好或损伤皮层和脊髓中都比较类似。
我们以针对Nogo受体-1和GFAP抗体对含有损伤区域的受损脑部和脊髓进行免疫染色，检测了损伤CNS中sNogoR310的细胞表达。反应性星形胶质细胞的一般形态在WT和转基因小鼠之间并无区别，但gfap::sNogoR310转基因小鼠中的胞内和胞外空间的Nogo受体-1染色密度明显高于WT小鼠，说明在转基因小鼠的损伤周围的sNogoR310表达上升。Nogo受体-1蛋白仅在转基因小鼠中与星形细胞标记GFAP共定位。在转基因样本中还存在非细胞染色的大幅扩散，这与胞外空间中的sNogoR310相一致。在WT和转基因小鼠中均检测到神经元细胞体Nogo受体-1染色。
实施例16
分泌的SNOGOR310在转基因小鼠中诱导CST抽芽
我们测试了损伤周围sNogoR310的表达上升是否会导致损伤轴突的再生。
我们通过如Li和Strittmatter,J.Neurosci.23:4219-27(2003)所述在右运动皮层注射顺行示踪剂生物素葡萄糖胺(BDA)考察了下行皮质脊髓束(CST)的完整性。在同胎仔畜WT小鼠中，突出背部CST(dCST)紧密结合至损伤吻侧，且少部分背侧CST纤维在同侧可见。少量的BDA-标记的短侧芽伸入灰色物质，特别是在腹线处，但抽芽大部分限制在示踪剂注射的相对侧。然而，从损伤sNogoR310转基因小鼠吻侧至背侧半切的切片显示了非常不同的BDA标记模式。在所有来自Tg08系或Tg01系的转基因小鼠中突出dCST外侧均观察到了高密度的BDA-标记的CST纤维。异位纤维在整个灰质区域延伸，部分纤维达到了侧面和背侧白质。在脊髓的相对侧（示踪剂注射位点的同侧）观察到较多纤维（每个横向切片4-12萌芽）。对侧芽的微密度测量显示在sNogoR310转基因小鼠中发芽密度大约提高了10倍。与同胎仔畜WT动物不同，对从吻侧至损伤处1至4mm矢状窦旁纵侧切片的检测显示dCST纤维向sNogoR310转基因小鼠的腹侧灰质延伸了大量的侧芽。一般而言，转基因小鼠中从吻侧到损伤处抽芽的模式和程度与使用Nogo受体-1拮抗剂肽NEP1-40全身处理的小鼠中观察到的结果类似(Li和Strittmatter,J.Neurosci,23:4219-27(2003))。
这些结果证明了分泌的sNogoR310在转基因小鼠中诱导了CST抽芽。
实施例17
再生CST轴突绕过损伤位点进入SNOGOR310转基因小鼠的末梢脊髓
我们分离了转基因小鼠至损伤位点吻侧4mm和尾侧4mm（总长8mm）的脊髓并将其埋在戊二醛-聚合白蛋白基质中，并在振动切片机上纵切（厚30μm）。我们采集了损伤位点吻侧5-7mm和尾侧5-7mm的脊髓的横向切片（50μm）。对于大鼠sNogoR310-Fc注射实验，在振动切片机上纵切(50μm)损伤位点吻侧10mm和尾侧10mm的脊髓。采集损伤位点吻侧11-16mm和尾侧11-16mm的脊髓的横向切片。我们将切片与抗生物素蛋白-生物素-过氧化酶复合物孵育并通过镍增强的二氨基联苯HPR反应显示示踪剂(Grandpre,Nature417:547-551(2002))。我们通过间接免疫荧光对部分切片进行了血清素免疫组化（抗-5-HT抗体）。为了显示损伤区域，我们用针对GFAP,St.Louis,MO)的抗体对部分切片进行了双重染色。我们将切片封固，脱水并用封固剂覆盖。
我们测试了由损伤后的转基因小鼠（参见实施例16）中表达的sNogoR310诱导的纤维是否通过损伤区域进入尾侧脊髓以提供功能性恢复。
在显像器中显示的跨过损伤位点的连续纵向切片展示了距损伤数毫米处的再生CST纤维的分布模式。从WT小鼠获得的切片显示没有跨过损伤位点的CST纤维。来自sNogoR310转基因小鼠的类似切片显示了以高度分支模式穿过横切区域并进入末梢灰和白质区域的大量CST纤维。在半切的近吻侧，来自突出dCST的高密度的BDA-标记的CST抽芽深入损伤区域，但大部分CST抽芽未能穿越形成伤疤且组织空化突出的横切区域。再生轴突中一个微小但非常明显的部分绕过损伤位点进入剩余的腹侧组织桥和腹外侧灰和白质。此外，少量CST纤维经损伤的腹侧和腹外侧脊髓穿过横切区域本身进入末梢区域。在损伤的附近，再生纤维的路线通常呈弯曲状，与吻侧CST常见的直纤维截然不同。侧面和分支纤维在末梢脊髓的灰质中极为常见。该改造证明了5-15BDA-标记的再生纤维经过各转基因小鼠的损伤尾侧1-4mm的吻侧-尾侧轴上的任意水平。对于5-7mm尾侧至背侧半切的横向切片，在各转基因小鼠的灰质和白质区域均可见到BDA-标记的CST轴突。转基因小鼠的纤维数显示在矢状切片中的近侧水平具有类似数量的BDA-标记的CST纤维。
除了CST纤维，其它下行束（例如，中缝纤维）同样有助于小鼠的运动功能。在小鼠背侧外-半切模型中，横切损伤了大部分血清素激性纤维，在前角中减少了大约80％的该种纤维。在尾侧脊髓的前角中的血清素纤维的总长分析显示转基因组小鼠中该种纤维的数量远大于WT组，揭示sNogoR310在转基因小鼠中的生长促进作用不限于一种轴突下行途径。
实施例18
SNOGOR310的转基因表达促进运动恢复
CST轴突跟踪和血清素激性纤维分析显示从转基因小鼠的星形细胞释放的sNogoR310刺激脊髓中损伤的下行轴突的伸展结构再生。我们进行了多个如实施例12所示的行为测试以测定这些再生纤维是否有益于功能恢复。
由BBB测试的评估可见，WT小鼠在4周的存活中部分恢复了运动功能。损伤后4周，大部分WT小鼠恢复至以具有一致性减重的一致性脚掌行走为特征的水平，但它们仅显示了偶然的前肢-后肢协调性，且在首次与表面接触时会有主导爪轮换。与之相反，Tg08和Tg10系sNogoR310转基因小鼠的BBB评分在整个7-28天的观察期中明显高于对照组（图13A和13B）。损伤后28天，大部分转基因小鼠显示了一致性前足-后足协调性，且主导爪位置与身体平行。
我们另外采用了两个行为测试以进一步表征sNogoR310转基因小鼠的表现。首先，我们检测了小鼠不会在5秒钟内脱手的最大平板倾角。在背侧半切损伤前，转基因和WT小鼠均能在角度为55度的板上保持姿势。损伤后27日，所有小鼠可维持的角度均有所下降，但转基因小鼠可维持的角度明显大于对照组（图13C）。在另一行为测试中，小鼠爬升与垂直方向呈45度角的网格，并对爬升中后足跌落网格平面以下的次数进行计数（Metz等人.,Brain Res.883:165-177(2000))。在损伤前训练中未有小鼠在该测试中出错。在损伤后2-6周内WT小鼠出现了多次脚步错误且仅有极小的改善。与此相反，sNogoR310转基因小鼠在该阶段的网格爬行中显示了渐进的改善，大部分改善出现在损伤后1-3周（图13D）。因此，从星形细胞分泌SnogoR310的转基因小鼠在胸椎半切后显示了CST再生，中缝抽芽和运动功能改善。
实施例19
鞘内施用SNOGOR310-Fc蛋白诱导CST抽芽
作为对可溶性Nogo受体-1在脊椎外伤后的生长促进作用的另一种检测，我们鞘内施用了纯化的蛋白。
我们将大鼠Nogo受体-1的配体结合区(27-310)融合至大鼠IgG1Fc区以促进稳定性和纯化。我们从稳定转染的CHO细胞纯化蛋白。与小鼠sNogoR310-Myc His相同，该蛋白在体外阻断Nogo-66，MAG和髓磷脂作用(Fournier等人.,J Neurosci.22:8876-8883(2002);Liu等人,Science297:1190-1193(2002))。我们通过微型蠕动泵将sNogoR310-Fc蛋白鞘内传递至具有中胸背侧半切损伤的大鼠。在损伤后的四周存活期中，向每只大鼠局部施用1.2mg sNogoR310-Fc蛋白。在接受载体治疗的大鼠中（1.2mg大鼠IgG），半切吻侧的切片在损伤位点上显示了紧密结合的突出背侧CST和极少的异位BDA-标记的CST纤维。来自接受了sNogoR310-Fc蛋白的损伤大鼠的损伤吻侧切片显示了较为不同的标记模式。从横切和矢状窦旁切片观察到众多由BDA-标记的CST产生的异位纤维抽芽。在部分案例中，突出穿越接近脊索圆周的中线的dCST区域，与背外侧CST混合。抽芽轴突延伸通过灰质的程度远大于白质。对临近dCST的异位抽芽纤维(在横向切片中≥100μm，在矢状切片中≥200μm)的检测显示在sNogoR310-Fc-处理的大鼠中有更大的提高。
实施例20
在SNOGOR310-FC处理的大鼠中CST轴突再生进入末梢脊髓
我们深度麻醉了雌性Sprague-Dawley大鼠(190-250g)并在T6-7椎板水平进行椎板切除术，暴露脊髓。我们以30号针在脊髓背半部切口，用一对微型剪刀断绝CSGT束的背侧部分，并通过11号刀片横切脊髓背半部以确保损伤的深度(1.8mm)(Grandpre等人,Nature417:547-551(2002))。将填充了含于PBS的1.2mg大鼠IgG或含于PBS的1.2mg sNogoR310-Fc融合蛋白的微型蠕动泵2ML4,2ml体积,2.5μl/h,28天传递)缝合于动物背部皮肤下的肌肉中。将连接微型泵出口的导管从硬脑膜上的小孔在T7-8水平***脊髓的鞘内空间。
Nogo受体-1拮抗剂蛋白输注诱导大鼠半切吻侧的延伸抽芽，但更关键的问题是该抽芽CST纤维是否***末梢脊髓并促成运动恢复。跨越溶媒处理大鼠的损伤位点的纵向切片在损伤水平下未显示出可测的或是仅显示极少量的BDA-标记的腹侧CST纤维(Grandpre等人,Nature417:547-551(2002);Weidner等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA98:3513-3518(2001))。来自sNogoR310-Fc处理的大鼠的类似切片证明了许多BDA-标记的纤维绕过横切位点并主要通过腹侧桥接组织进入尾侧脊髓和腹外侧脊髓。星形细胞标记GFAP的免疫染色显示横切所达的程度深于中心管区域。与突出背侧CST中吻侧纤维的线性剖面不同，再生CST纤维在末梢脊髓中通常具有高度分支的轨迹，特别是在灰质区域。这些纤维可在脊髓的许多区域检测到，但它们更容易在整个脊髓的中央部分和脊髓背半部看见。矢状切片的CST纤维计数显示每只sNogoR310-Fc-处理大鼠在损伤尾侧1-2mm约有20个BDA-标记的轴突，且在损伤末梢7-8mm处有15个跟踪轴突。
一般而言，这些纤维的分支模式与在局部NEP1-40肽处理的动物中所观察到的类似，但在以sNogoR310-Fc蛋白处理的切片的每个抽芽中可见到更多的侧枝。对末梢脊髓抽芽的检测证明了在sNogoR310-Fc-处理的大鼠中各个抽芽的总侧枝长度是NEP1-40-处理的动物的两倍。在Nogo受体-1拮抗剂-处理组的脊髓尾侧1-10mm的抽芽（长度≥200μm）数均为对照组的约20-40倍。sNogoR310-Fc处理大鼠中可见到比局部NEP1-40处理更多的抽芽（-50对25抽芽/大鼠），但该差异不具有统计显著性(p=0.1713,t-检验)。
在接受sNogoR310-Fc处理的大鼠脊髓的半切尾侧11-15mm处的横向切片中可观察到再生CST轴突。在脊髓的灰质和白质中均可检测到该种纤维。在灰质中检测到的纤维通常比白质区域显示出更多的侧枝。与之相反，在溶媒-处理组的横向切片中，在腹侧白质区域仅偶尔发现BDA-标记，这与未损伤腹侧CST轴突一致。在该末梢脊髓水平，Nogo受体-1拮抗剂-处理组[sNogoR310-Fc和NEP1-40]中BDA-标记的CST纤维的平均数是溶媒-处理大鼠的约20倍。综上，Nogo受体拮抗剂，sNogoR310-Fc蛋白和NEP1-40肽均导致末梢脊髓中显著的CST轴突再生，但前者诱导的抽芽显示了更高的分支模式。
实施例21
局部SNOGOR310-FC诱导损伤的大鼠脊髓中红核脊髓和血清素激性纤维轴突的抽芽
半切后十四日，在下肢的感觉运动皮层上的颅骨上制作小钻孔以追踪CST纤维。在各侧距硬脑膜深度为1.5mm的七个注射位点采用顺行神经元示踪剂BDA（10%含于PBS,每个皮层3.5μl）。为了在大鼠中追踪红核脊髓束，将示踪剂BDA(1μl;MW10,000;10%含于PBS)注射进入左侧的红核（前囱背面5.8mm，颅骨表面的侧面0.7mm，腹侧7.0mm）。BDA注射后两周，以PBS灌注这些动物，然后灌注4％多聚甲醛，并采集用于组织学的组织。
对损伤的红核脊髓束(RST)纤维的修复可促进脊髓损伤后的功能提升(Liu等人.,J.Neurosd.,19:4370-4387(1999))。Nogo受体-1在CNS神经元中的广泛分布(Wang等人.,J.Neurosd.22:5505-5515(2002))使得通过拮抗剂抑制Nogo受体-1并导致RST轴突在损伤后再生成为可能。为了测试sNogoR310-Fc对损伤RST的作用，向左侧红核注射BDA以对该途径的完整性进行追踪。在脊髓水平，RST纤维通常位于脊髓的背外侧白质区域，并被本研究的背侧半切所横切。在对照大鼠损伤的吻侧11-15mm的横向切片中，在突出RST和背侧角灰质之间发现了少量的短BDA-标记的纤维。与sNogoR310-Fc处理在相同水平的切片在主RST和背侧角灰质之间显示了多个连接纤维。对于SCI末梢11-15mm的横向切片，在溶媒-处理的大鼠中未见BDA-标记的RST纤维。与之相反，在接受sNogoR310-Fc处理的相同水平的切片在示踪剂注射的相对侧的灰和白质中均显示了大量BDA-标记的RST纤维。BDA注射同侧灰质中可看到部分抽芽具有分支模式。
还检查了sNogoR310-Fc处理的脊髓损伤大鼠中的中缝（ruphespinal）脊髓纤维。免疫染色证明溶媒和sNogoR310-Fc处理组之间的损伤吻侧11-15mm处的血清素激性纤维密度相类似。在损伤下11-15mm的切片中，在sNogoR310-Fc处理的大鼠中的血清素（seroton）纤维是对照组的两倍。这些结果证明对由sNogoR310-Fc蛋白引起的Nogo受体-1抑制的响应不限于CST纤维，其它的下行束（例如红核脊髓和血清素激性轴突）同样对Nogo受体-1拮抗作用进行响应。
实施例22
以SNOGOR310-FC局部处理提高大鼠的功能性恢复
鞘内施用sNogoR310-Fc蛋白可刺激外伤性脊髓损伤后的多个下行途径中的轴突再生。我们测试了该蛋白是否还改善损伤脊髓的功能恢复。
在半切2周后，溶媒处理大鼠的运动BBB评分达到12的稳定水平(图14A)。损伤后4周，大部分对照（7只中的6只）具有频繁的一致性减重足底行走和频繁一致性前足-后足协调性，但它们首次与表面接触时会有主导爪轮换。相反地，在接受sNogoR310-Fc蛋白处理的大鼠中，运动评分在外伤后2-4周继续提升。损伤后4周，所有9只sNogoR310-Fc处理动物具有一致的前足-后足协调性并在首次接触测试平面时具有平行的爪位置。
网格爬行被用于评估在脊髓损伤后的下行精细运动控制缺陷(Metz等人,Brain Res.883:165-177(2000))。该性能要求由腹外侧，皮质脊髓和红核脊髓纤维介导的前足-后足协调性和自发运动控制。在损伤前训练中，所有的大鼠将其后足精确地放在网格条上。损伤后2-4周，对照大鼠每次过程中可产生8-9次错误，且随时间进展中仅有极小的改善。相反地，以sNogoR310-Fc处理的大鼠在网格爬行中显示出渐进的改善并具有明显更少的错误（4-7次/评价每个过程）。主要的改善出现在损伤后2-3周。与未损伤大鼠或接受sNogoR310-Fc处理的损伤动物相比，在半切后4周的对照组后足足迹分析显示步长明显下降而步宽有所上升。因此，该多重行为测试证明通过局部注射拮抗剂蛋白对Nogo受体-1功能的阻断改善了损伤后的运动恢复。
实施例23
单克隆抗-NGR1抗体1D9与可溶性大鼠NOGO受体310(SNGR310)的结合
对1D9Fab和大鼠NgRl的可溶性片段(srNgR310)的共结晶复合物的结构分析显示该抗体的结合位置靠近大鼠NgR1的N-末端帽和富亮氨酸重复区域的结合部。图15。1D9仅结合至大鼠NgR1且不识别人或小鼠NgR1，NgR2和NgR3。对于大鼠srNgR310-Fc与1D9Fab的结晶化，每个大分子都由木瓜蛋白酶裂解，从Fc部分纯化，并贮存于10mM Hepes pH7,50mM NaCl。该复合物均制备为80μM并以2:1的体积比与14%Peg3350,0.4M醋酸锌,0.1M氯化镁组成的汇集溶液相混合。在20℃下将该溶液孵育1小时，并12,000x g离心3分钟以去除沉淀。在20℃下向含有50％至100％汇集溶液的液体中添加3-5μL的上清液以生成结晶。在20℃下1周内可生成薄板状的晶体。将该晶体迅速转移至0.2M醋酸锌，8％Peg3350，25％乙烯乙二醇进行冷冻保护，并迅速转移至液氮进行冷冻。
约10μm厚的晶体在国家同步光源(Upton,NY)的光束线X25下衍射至3.2A。以HKL程序包v.1.97(Otwinowski,Z.,和Minor,W.,Methods Enzymol276:307-326(1997))处理数据揭示该晶体属于P21212空间群，大概的晶胞尺寸为a=90.6A,b=188.6A,c=125.5A，且α=β=γ=90，这与每个不对称单元的2Fab-NgRI复合物一致。
该晶体结构可采用对润湿晶体的多重同晶型置换实验的信息进行揭示，以此可以鉴定分子置换时结合至NgR的普通水银位点。空间群可通过检查水银和金同晶型差异帕特森图（在W＝0哈克截面鉴定到一致性5sigma峰）得到鉴定。与MOLREP的分子置换(Vagin,A.,和Teplyakov,A.,J.Appl.Cryst.30:1022-1025(1997))采用基于人NgR1结构（pdb代码10ZN）的大鼠NgR同源性模型(He,X.L.等人,Neuron38:111(2003))而针对1D9Fab的同源性模型可促成NgR1，一个Fab和另一个NgR1分子的置换，并得到48％的R-因子和Fab的CDR区的确定密度。模型的安置可通过在接近Asp138和His182的NgR1分子的同等位置上的差异帕特森图鉴定的水银位点得到确认。该密度下未明确鉴定到其它的Fab片段。采用CNX对两个NgR1和1个Fab以42％的R-因子和46％的自由剩余值精制(Brunger,A.T.等人.,Acta Crystattogr D BiolCrystallogr54:905-921(1998))至3.2A。
表8显示了1D9Fab和大鼠NgR1之间的接触。表中列举了Fab的原子距离大鼠NgR1的原子3.9A之内的接触，且能与主链或侧链形成氢键的接触带有星号(*)。
Table8.
*显示H-键相互作用
实施例24
通过瞬时转染筛选NGR RNAI
针对人NogoR1（图16A）转录物设计三个RNAi构建体。RNAi-1和RNAi-3分别针对人NgR基因。RNAi-2设计针对人，小鼠和大鼠NgR基因。合成DNA寡聚核苷酸对并构建进入基于PolIII启动子的RNAi表达载体pU6（含人U6启动子，kar耐受基因和PacI克隆位点）。Nogor2m设计携带两个针对目标序列的错配并用作阴性对照。图16B显示了这些寡聚核苷酸的核苷酸序列。
RNAi构建体首先通过在小鼠L细胞中共转染人NgR表达载体和RNAi表达质粒(phU6NgR-RNAi-l,2和3)进行筛选。将小鼠L细胞涂布于6孔培养板，然后单独以GFP报告质粒或结合针对GFP的RNAi载体pU6GFPRNAi（泳道2和3）进行转染。监测GFP表达作为GFP基因沉默的对照。以0.5，1或2μg的hNgR表达载体（泳道4-6）转染小鼠L细胞。通过加入pUC19质粒将每个微孔中的DNA数量调整为总计4μg DNA。RNAi:目标比例为4:1。5μg的hNgR载体与2μg NgR RNAi-1，2，3或2m质粒共转染（泳道7-10）。转染后四十八小时，在SDS上样缓冲液采集细胞并进行SDS-PAGE。采用针对多克隆hNgR抗体R150的兔血清（图A）或单克隆抗体7E11（图B）通过western印迹分析hNgR表达。
在采用NgR抗体7E11（单克隆）和R150（兔多克隆）的Western印迹上可观察到phU6NgR-RNAi-l和-2转染细胞中的有效NgR表达沉默。结果显示于图17。在NgR RNAi-1和-2转染细胞中NgR的表达被降低至基准水平。相反地，NgR RNAi-3未显示任何明显的NgR下降，这与对照突变体NgR RNAi-2m类似。因此，NgRRNAi-1和-2对hNgR基因沉默有效。瞬时转染结果证实NgR表达抑制>90%。
实施例25
人NGR沉默确认
尽管以两种抗体类型测得的信号对hNgR具有特异性（仅存在于hNgR cDNA转染细胞）（图17），测得条带的表观MW(-50kD)低于预期。不希望受限于理论，这可能是由于小鼠L细胞中人NgR的糖基化的改变所引起。为了对NgR MW差异的现象进行确认，通过Lipofectin再次在人SKN细胞和293细胞中进行hNgRcDNA转染。转染后四十八小时，在SDS上样缓冲液采集细胞并进行SDS-PAGE。通过如上所述采用7E11和R150的Western印迹检测NgR的表达。在亲本SKN或293细胞中未检测到hNgR特异性信号，且以R150检测到的hNgR的表观MW（>65kD）在SKN和293细胞中均在预期之内（图18）。
RNAi介导的hNgR沉默在SKN细胞中得到了确认。将SKN细胞涂布于6孔培养板，然后单独以GFP报告质粒或结合针对GFP的RNAi载体pU6GFPRNAi（泳道2和3）进行转染。监测GFP表达作为GFP基因沉默的对照。以2μg的hNgR表达载体转染SKN细胞（泳道4）。通过加入pUC19质粒DNA将每个微孔中的DNA数量调整为总计4μg DNA。0.5μg hNgR载体与2μg NgR RNAi-1,2,3或2m质粒共转染（泳道5-8）。转染后四十八小时，在SDS上样缓冲液采集细胞并进行SDS-PAGE。通过采用针对hNgR R150的兔血清的western印迹分析hNgR的表达。在所有NgR RNAi-1和-2中再次证实了大于90％的NgR阻抑，但在NgRRNAi-3和-2m中效率有所下降（图19）。
实施例26
NEUROSCREEN细胞中的NGR阻抑
由Cellomics Inc.获取表达NgR的NeuroScreen细胞以进行NgR功能分析。为了在NeuroScreen细胞中实现稳定的NgR阻抑，所有的RNAi构建体均被转化成为β-gal或GFP骨架的慢病毒载体。图20显示了慢病毒载体的示意图。慢病毒载体可通过用包装质粒(Invitrogen)转染293细胞生成。为了构建稳定表达NgR1RNAi的慢病毒载体，该（即，Nogo-1，Nogo-2m，和Nogo-3）启动发夹表达的hU6启动子RNAi盒通过PacI消化从phU6载体分离（如实施例24所述）并克隆进入SSM007质粒独特的PacI位点。参见，例如，Robinson等人,Nature Genetics3.3:401-406(2003)中所述的方法。为了追踪慢病毒载体转导，CBA-GFP表达盒或CMV-LacZ表达盒被***SSM007质粒的XbaI位点，所得的构建体分别被命名为SSM007-BFGW和SSM007-BFZW。
将所有的NgR1RNAi构建体转化入SSM007-BFGW和SSM007-BFZW骨架之后，将该载体与包装质粒，pLP1,pLP2和pLP/VSVG共转染进入FT293细胞以进行慢病毒生产（Viropower试剂盒，Invitrogen）。pLP1是包含了HIV-1gag/pol序列和由CMV启动子表达得到的rev应答元件(RRE)并具有b-球蛋白poly A的8889bp构建体；pLP2是表达来自RSV启动子的Rev并具有HIV-1poly A以终止转录的4180bp构建体；pLP/VSVG是5821bp的质粒，并表达来自CMV启动子的水疱性口炎病毒糖蛋白G以及β球蛋白poly A。
由于RNAi干扰对慢病毒效价的自我限制作用，所有的病毒悬液效价均表现为低于普通慢病毒载体，在培养基中的转导单位介于4-5x105的范围内。NgR RNAi慢病毒(LV-NgR RNAi)被用于以moi（感染复数）1转导NeuroScreen细胞。通过GFP表达或β-半乳糖苷酶染色显示转导效率约为1％。
由于NgR RNAi-2被证明在NgR沉默中有效，且它靶向所有的人，小鼠和大鼠NgR，因而选择LV-NgR RNAi-2转导NeuroScreen细胞。转导细胞通过有限稀释在96-孔板上被克隆。鉴定β-半乳糖苷酶阳性或GFP阳性克隆并进行扩增以进行进一步的NgR表达分析。
通过采用7E11单克隆抗体进行Western印迹分析了约20个用于NgR表达的克隆细胞系。图21显示了典型的western印迹结果。GAPDH被用作加载归一化的对照。所有克隆中的NgR表达通过对western印迹上的NgR条带光密度扫描并归一化至GAPDH水平得到定量。NgR与GAPDH的比例被用于测量NgR表达水平。在筛选的12个克隆中，其中11个具有下降的NgR表达（采用LV-GFP转导细胞中的最低NgR表达克隆1E9作为参考）。相反地，所有4个LV-GFP转导克隆具有与原态NeuroScreen细胞相当的NgR水平。图22。这些结果证实通过减少NgR表达建立了稳定细胞系。
实施例27
LV-NGR RNAI细胞的功能性分析
我们选择了来自LV-NgR RNAi转导细胞的四个克隆进行功能性分析。以原态NeuroScreen细胞的NgR水平作为参考，这四个克隆的NgR水平与原态细胞相比分别为：3c12b约10％，3c4b约20％，5d12约30％，4a12约为60％（图23）。
实施例28
单克隆抗-NGR1抗体1D9的突变支持识别人NGR1
通过计算机模拟显示在1D9抗体中的突变支持识别人NgR1。通过计算机模拟，1D9重链的N56可被突变为丝氨酸，谷氨酸，天冬氨酸或谷氨酰胺以与人NgR1的R78相互作用。此外，轻链的R33可通过计算机模拟突变为丙氨酸或丝氨酸以避免与人NgR1的R95的静电和空间冲突。
实施例29
融合至大鼠IGG的大鼠NGR1的ECTO-结构域(27-310)而非甲泼尼龙逆转了背根神经节细胞中髓磷脂的神经突生长抑制作用
在甲泼尼龙(MP)和NgR(310)ecto-Fc联合治疗脊髓损伤(SCI)的考察中，力图验证这些试剂具有独立的作用机制。简单而言，将髓磷脂在预涂布了80或400ng/微孔（分别为2.5和12.7ng/mm2）的聚-L-赖氨酸的平板(Becton Dickinson,Bedford,MA,USA)上干燥过夜。然后以10μg/ml层粘蛋白(Calbiochem,LaJolla,CA,USA)在室温下（22-24℃）覆盖1小时。分离胚芽期13日鸡背根神经节神经元并按前述涂布6-8小时（GrandPre等人.,2000;Fournier等人.,2001）。以8μM NgR(310)ecto-Fc在10μg/nl MP(Pharmacia,Kalamazoo,MI,USA)存在或缺失的情况下在整个生长期处理神经元。然后固定神经元并以βIII微管蛋白抗体(Covance,Princeton,NJ,USA)染色，采用自动化细胞成像和分析***(Axon Instrument,Union City,CA,USA)对神经突生长进行定量。每个微孔的神经生长归一化至每个试验(n=3)中两个对照微孔的平均值。NgR(310)ecto-Fc的活性基于其逆转髓磷脂的轴突生长抑制的能力。图24A-B。相反地，单用MP对髓磷脂底物上背根神经节神经元的神经突生长没有作用，且MP的存在不改变NgR(310)ecto-Fc的轴突生长刺激。这些数据显示MP不直接影响髓磷脂-诱导的神经突生长抑制，且MP和NgR(310)ecto-Fc具有独立的作用。这些体外数据支持了MP和NgR(310)ecto-Fc可以顺序有效方式增强SCI恢复的假设。
实施例30
融合至大鼠IGG的大鼠NGR ECTO-结构域(27-310)与甲泼尼龙处理对脊髓横切后的功能性恢复具有时间显著作用
MP和NgR(310)ecto-Fc治疗对脊髓横切后的功能性恢复均具有时间显著作用。简单而言，将雌性Long Evans大鼠（7周大;Charles River,Wilmington,MA,USA）用25mg/kg咪达***i.p.(Abort Laboratories,Chicago,IL,USA)和含于O2的2-3％氟烷(Baxter,Deerfield,IL,USA)进行麻醉，并在T6和T7脊椎水平进行背侧椎板切除术。通过含于O2的1.5-2％氟烷维持全身麻醉。进行背侧半切以完全阻断主背内侧和次背外侧皮质脊髓束(CST)成分。采用微波刀（microscapel）在距离脊髓表面1.8mm的深度立体定向横切脊髓。在CST横切后立即向蛛网膜下空间的T7***一个鞘内导管，并连接至***皮下空间的预充微型渗透泵。该微型渗透泵以0.25μL/h的速率传递大鼠IgG同型对照蛋白或磷酸盐缓冲液(PBS)(5mg/ml,n=8)或NgR(310)ecto-Fc(50μM,n=19)。在损伤后当时以及4和8小时，NgR(310)ecto-Fc处理大鼠群组还以MP(Pharmacia;30mg/kg iv)处理，而独立群组以单独的MP处理(30mg/kg iv)。在其后几天和数周中采用BBB旷场（openfield）评分法(Basso等人,J.Neurotrauma12:1-21(1995))评估功能性恢复。对照动物在研究过程中恢复了后肢功能，在4周后平均BBB评分达到12±0.87。在同一时间点的治疗组的平均BBB评分为：MP,14.9±0.23;NgR(310)ecto-Fc,14.8±0.24以及NgR(310)ecto-Fc加MP,15.63±0.18。AH处理组在研究过程中显示出比对照组更佳的BBB评分。相对对照P<0.05，Tukey事后检验的双因素重复检测方差分析。（图25A）。与对照动物或单用NgR(310)ecto-Fc处理的动物相比，以MP-和MP加NgR(310)ecto-Fc-处理的大鼠中观察到了统计学显著提高的BBB评分。SCI后2天MP-处理大鼠中的BBB评分明显提高。相对对照P<0.05，Tukey事后检验的双因素重复检测方差分析。（图25B）。这一观察揭示了MP处理对恢复的早期作用。考虑到这一非常早期的MP作用，BBB评分被归一化至第2日以减去MP早期作用（图25C）从而显示作用在较为后期产生的NgR(310)ecto-Fc的作用。对单独动物归一化至第2天的BBB评分显示了在SCI后2，3和4周±MP的NgR(310)ecto-Fc-处理大鼠中功能性恢复的显著提高。相对对照P<0.05，Tukey事后检验的双因素重复检测方差分析。（图25C）。在联合处理组减去了MP对NgR(310)(ecto)-Fc处理的增强作用的归一化BBB评分显示(i)在联合处理组中MP的作用在SCI后早期出现，且(ii)通过减去该作用，联合处理组和NgR(310)ecto-Fc组的功能性恢复的速率和程度一致，且比单用MP更为明显。
在BBB评分上的判别点为14分，对应于一致性减重足底行走和一致性前足-后足协调性。一致性脚掌行走频率和后肢-前肢协调性，显示了SCI后3和4周获得14或更高评分的各组中的大鼠比例。相应地，结果被表示为大鼠获得14分或更高分的频率；50％的对照大鼠在损伤后4周达到14或更高的分数（图25D）。以NgR(310)ecto-Fc和MP联合处理显著提高了功能性恢复的速率。相对对照P<0.05,Fischer确切检验。所有(100%)以NgR(310)ecto-Fc或MP或联合治疗的大鼠在4周中表现出一致性足底行走和一致性运动。联合治疗提高了协调功能恢复的速率，与对照或单用NgR(310)ecto-Fc或单用MP相比，该处理组中显著更高比例的动物在3周内达到了14分或更高评分（图25D）。改善的功能性恢复还可通过NgR(310)ecto-Fc和NgR(310)ecto-Fc加MP-处理组与对照组相比显著提高的平均步长得到证实（图25E）。单用MP并未显著提升SCI后4周测得的步长。P<0.05,单因素方差分析和Dunnett事后检测。
实施例31
融合至大鼠IGG的大鼠NGR1ECTO-结构域(27-310)与甲泼尼龙处理增强脊髓横切后的轴突可塑性/再生
以NgR(310)ecto-Fc处理或以MP和NgR(310)ecto-Fc联合处理增强脊髓横切后的轴突可塑性/再生。简单而言，为了对CSTs进行组织学追踪，在CST横切后2周将动物再次麻醉并在头皮切口。对皮肤切口周围区域进行局部麻醉注射，通过破颅术暴露左侧感觉运动皮层，并使用纳升注射器和micro4控制器在前囱背面0-3.5mm和中线侧面0-2.5mm以皮层表面1mm以下的深度在12个点上注射含于PBS的7μL10%生物素葡萄糖胺(BDA;10,000MW;Molcular Probes,Eugene,OR,USA)。在部分范例中，该CST通过相同的步骤双面标记。
在CST横切后28日以仲丁硫巴比妥(100-110mg/kgi.p.)麻醉大鼠并依次以肝素化盐水（100ml，10iu肝素）和4％多聚甲醛(150ml)灌流。取出脊髓，在4％多聚甲醛中固定，然后以30％的蔗糖浸渍48小时，将距横切位点吻侧10mm和尾侧15mm的25mm长的脊髓与距离损伤吻侧10-15mm和尾侧15-20mm的脊髓包埋于最佳切削温度化合物(OCT)中。
对冷冻切片(50μm)进行连续切割并以链霉亲和素结合的AlexaFluor-594(1:200;Molecular Probes)染色以显示标记的CST轴突。在横切位点尾侧10和15mm处所取的横切切片上进行轴突计数。所有的检测均为盲测。对每只动物在每个脊椎水平上每八个切片（即，相距400μm的切片）进行计数并将值表示为每个切片上的平均轴突数量。
以NgR(310)ecto-Fc处理或以MP和NgR(310)ecto-Fc联合处理可促使损伤位点尾侧15mm的生物素葡聚糖胺(BDA)-标记的轴突计数明显上升（图26A）。可看到BDA-标记的轴突由背侧柱抽芽进入背侧角灰质，而剩余的腹侧CST进入腹侧灰质。在脊髓离散区域的轴突计数揭示在灰质中的轴突数量上升最大。与腹侧白质(vWM)和背侧白质(dWM)比较在灰质中观察到最大的轴突数量上升（图26B）。P<0.05,单因素方差分析和Dunnett事后检测。这些数据提示结合或不结合MP进行的NgR(310)ecto-Fc处理促进损伤后脊髓中的可塑性。
实施例32
融合至大鼠IGG的大鼠NGR ECTO-结构域(27-310)与甲泼尼龙联合处理增强生物素葡聚糖胺-标记的皮质脊髓束纤维和腰椎运动神经元之间的轴突连接数
抗-囊泡谷氨酸转运体1(vGLUTl)抗体（1:2500稀释）被用于对神经元细胞体进行染色，在薄片9中的α-和γ-运动神经元可通过其大小和形态进行鉴定。与对照动物相比MP+NgR(310)ecto-Fc-处理组中与α-和γ-运动神经元接触的轴突数量显著上升，且在接受NgR(310)ecto-Fc和MP联合处理的动物中观察到最显著的作用（图27）。P<0.05,单因素方差分析和Dunnett事后检测。
生物保藏
杂交瘤HB7E11编号PTA-4587-HB7E11),HB1H2编号PTA-4584-HB1H2),HB3G5编号PTA-4586-HB3G5),HB5B10编号PTA-4588-HB5B10)以及HB2F7编号PTA-4585-HB2F7)已于2002年8月9日保藏于美国菌种保藏中心("")（10801UniversityBoulevard,Manassas,VA20110-2209,USA）。
如同本领域技术人员所能理解，本发明的优选实施方式可在不脱离本发明精神的前提下进行多种修改和修饰。所有这些变化均意在落入本发明的范围之内。

Claims (8)

1.制备方法，其包括
表达编码NogoR变体的核苷酸，该NogoR变体的氨基酸包含：
除了参考氨基酸序列中C266和C309被丙氨酸替换外，与SEQID NO:49的氨基酸27-310的参考氨基酸序列一致的氨基酸序列,
进行所述表达以便产生该NogoR变体。
2.权利要求1所述的方法，其中所述NogoR变体进一步包含Fc区。
3.权利要求2所述的方法，其中所述Fc区选自IgA Fc区、IgD Fc区、IgG Fc区、IgE Fc区以及IgM Fc区。
4.权利要求3所述的方法，其中所述Fc区是IgG Fc区。
5.权利要求4所述的方法，其中Fc区位于NogoR变体的c-末端。
6.权利要求1所述的方法，其中所述表达包含在细胞内表达。
7.权利要求1所述的方法，其中所述多核苷酸包含RNA。
8.权利要求7所述的方法，其中所述表达包含从载体表达RNA。
CN201210593895.5A 2006-01-27 2007-01-26 Nogo受体拮抗剂 Active CN103215293B (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US76248706P 2006-01-27 2006-01-27
US60/762,487 2006-01-27
US83165906P 2006-07-19 2006-07-19
US60/831,659 2006-07-19
CN200780010338.3A CN101420977B (zh) 2006-01-27 2007-01-26 Nogo受体拮抗剂

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200780010338.3A Division CN101420977B (zh) 2006-01-27 2007-01-26 Nogo受体拮抗剂

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103215293A CN103215293A (zh) 2013-07-24
CN103215293B true CN103215293B (zh) 2015-10-28

Family

ID=38327911

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201210593895.5A Active CN103215293B (zh) 2006-01-27 2007-01-26 Nogo受体拮抗剂
CN200780010338.3A Active CN101420977B (zh) 2006-01-27 2007-01-26 Nogo受体拮抗剂

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200780010338.3A Active CN101420977B (zh) 2006-01-27 2007-01-26 Nogo受体拮抗剂

Country Status (11)

Country Link
US (3) US8669345B2 (zh)
EP (2) EP1981902B1 (zh)
JP (4) JP5829373B2 (zh)
CN (2) CN103215293B (zh)
BR (1) BRPI0707276B1 (zh)
CA (2) CA2913655A1 (zh)
DK (1) DK1981902T3 (zh)
ES (1) ES2550099T3 (zh)
HR (1) HRP20151108T1 (zh)
PT (1) PT1981902E (zh)
WO (1) WO2007089601A2 (zh)

Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2550099T3 (es) * 2006-01-27 2015-11-04 Biogen Ma Inc. Antagonistas del receptor Nogo
WO2009114197A2 (en) 2008-03-13 2009-09-17 Yale University Reactivation of axon growth and recovery in chronic spinal cord injury
ES2732929T3 (es) * 2010-10-22 2019-11-26 Olix Pharmaceuticals Inc Moléculas de ácido nucleico que inducen interferencia de ARN y usos de las mismas
MX2014007233A (es) * 2011-12-16 2015-02-04 Moderna Therapeutics Inc Composiciones de nucleosidos, nucleotidos y acidos nucleicos modificados.
EP2834259A4 (en) 2012-04-02 2016-08-24 Moderna Therapeutics Inc MODIFIED POLYNUCLEOTIDES
US10501512B2 (en) 2012-04-02 2019-12-10 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
ES2716818T3 (es) 2012-05-22 2019-06-17 Olix Pharmaceuticals Inc Molécula de ácido nucleico inductora de interferencias de arn capaz de penetrar en las células y uso de la misma
US10033029B2 (en) 2012-11-27 2018-07-24 Apple Inc. Battery with increased energy density and method of manufacturing the same
US10211433B2 (en) 2012-11-27 2019-02-19 Apple Inc. Battery packaging
US9711770B2 (en) 2012-11-27 2017-07-18 Apple Inc. Laminar battery system
US9899661B2 (en) 2013-03-13 2018-02-20 Apple Inc. Method to improve LiCoO2 morphology in thin film batteries
US10258698B2 (en) 2013-03-14 2019-04-16 Modernatx, Inc. Formulation and delivery of modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
US9570775B2 (en) 2013-03-15 2017-02-14 Apple Inc. Thin film transfer battery systems
US9601751B2 (en) 2013-03-15 2017-03-21 Apple Inc. Annealing method for thin film electrodes
US10141600B2 (en) 2013-03-15 2018-11-27 Apple Inc. Thin film pattern layer battery systems
US9887403B2 (en) 2013-03-15 2018-02-06 Apple Inc. Thin film encapsulation battery systems
US10930915B2 (en) 2014-09-02 2021-02-23 Apple Inc. Coupling tolerance accommodating contacts or leads for batteries
KR20180071362A (ko) 2015-11-16 2018-06-27 올릭스 주식회사 MyD88 또는 TLR3을 타겟팅하는 RNA 복합체를 이용한 연령-관련 황반 변성의 치료
KR20180104692A (ko) 2016-02-02 2018-09-21 올릭스 주식회사 Angpt2 및 pdgfb를 표적화하는 rna 복합체를 사용하는 혈관신생 관련 질환의 치료
KR20180104075A (ko) 2016-02-02 2018-09-19 올릭스 주식회사 IL4Rα, TRPA1, 또는 F2RL1을 표적화하는 RNA 복합체를 사용한 아토피 피부염 및 천식의 치료
US10301628B2 (en) 2016-04-11 2019-05-28 Olix Pharmaceuticals, Inc. Treatment of idiopathic pulmonary fibrosis using RNA complexes that target connective tissue growth factor
KR101916652B1 (ko) 2016-06-29 2018-11-08 올릭스 주식회사 작은 간섭 rna의 rna 간섭효과 증진용 화합물 및 이의 용도
CN110770343A (zh) 2017-02-10 2020-02-07 成均馆大学校产学协力团 用于rna干扰的长双链rna
CN108359011B (zh) * 2017-07-21 2019-06-25 华博生物医药技术（上海）有限公司 靶向于白介素17a的抗体、其制备方法和应用
CN107522783B (zh) * 2017-09-30 2020-07-07 华博生物医药技术（上海）有限公司 一种抗白介素17a的抗体、其制备方法和应用
SG11202001224WA (en) * 2017-11-22 2020-03-30 Firmenich & Cie Method of identifying laundry malodor, moldy malodor and/or sweat malodor modulating compounds
JP2022553300A (ja) 2019-10-24 2022-12-22 ノヴァゴー セラピューティクス アーゲー 新規抗Ｎｏｇｏ－Ａ抗体
US11824220B2 (en) 2020-09-03 2023-11-21 Apple Inc. Electronic device having a vented battery barrier

Family Cites Families (160)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL154598B (nl) 1970-11-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking.
US3817837A (en) 1971-05-14 1974-06-18 Syva Corp Enzyme amplification assay
US3773319A (en) 1971-12-16 1973-11-20 Fabcor Ind Inc Corrugated sheet inverting machine
US3939350A (en) 1974-04-29 1976-02-17 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Fluorescent immunoassay employing total reflection for activation
US3996345A (en) 1974-08-12 1976-12-07 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
US4275149A (en) 1978-11-24 1981-06-23 Syva Company Macromolecular environment control in specific receptor assays
US4277437A (en) 1978-04-05 1981-07-07 Syva Company Kit for carrying out chemically induced fluorescence immunoassay
US4444887A (en) 1979-12-10 1984-04-24 Sloan-Kettering Institute Process for making human antibody producing B-lymphocytes
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4366241A (en) 1980-08-07 1982-12-28 Syva Company Concentrating zone method in heterogeneous immunoassays
IE52535B1 (en) 1981-02-16 1987-12-09 Ici Plc Continuous release pharmaceutical compositions
ATE75483T1 (de) 1981-10-23 1992-05-15 Molecular Biosystems Inc Oligonukleotides heilmittel und dessen herstellungsverfahren.
US4716111A (en) 1982-08-11 1987-12-29 Trustees Of Boston University Process for producing human antibodies
US4510245A (en) 1982-11-18 1985-04-09 Chiron Corporation Adenovirus promoter system
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
HUT35524A (en) 1983-08-02 1985-07-29 Hoechst Ag Process for preparing pharmaceutical compositions containing regulatory /regulative/ peptides providing for the retarded release of the active substance
EP0154316B1 (en) 1984-03-06 1989-09-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified lymphokine and production thereof
US4694778A (en) 1984-05-04 1987-09-22 Anicon, Inc. Chemical vapor deposition wafer boat
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
DE3668186D1 (de) 1985-04-01 1990-02-15 Celltech Ltd Transformierte myeloma-zell-linie und dieselbe verwendendes verfahren zur expression eines gens, das ein eukaryontisches polypeptid kodiert.
US4968615A (en) 1985-12-18 1990-11-06 Ciba-Geigy Corporation Deoxyribonucleic acid segment from a virus
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4902505A (en) 1986-07-30 1990-02-20 Alkermes Chimeric peptides for neuropeptide delivery through the blood-brain barrier
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5116742A (en) 1986-12-03 1992-05-26 University Patents, Inc. RNA ribozyme restriction endoribonucleases and methods
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
US4904582A (en) 1987-06-11 1990-02-27 Synthetic Genetics Novel amphiphilic nucleic acid conjugates
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
US5336603A (en) 1987-10-02 1994-08-09 Genentech, Inc. CD4 adheson variants
AU631802B2 (en) 1988-06-14 1992-12-10 Cetus Oncology Corporation Coupling agents and sterically hindered disulfide linked conjugates prepared therefrom
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
JP3771253B2 (ja) 1988-09-02 2006-04-26 ダイアックス コープ． 新規な結合タンパク質の生成と選択
JP2919890B2 (ja) 1988-11-11 1999-07-19 メディカル リサーチ カウンスル 単一ドメインリガンド、そのリガンドからなる受容体、その製造方法、ならびにそのリガンドおよび受容体の使用
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
DE68925966T2 (de) 1988-12-22 1996-08-29 Kirin Amgen Inc Chemisch modifizierte granulocytenkolonie erregender faktor
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5225538A (en) 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
IE63847B1 (en) 1989-05-05 1995-06-14 Res Dev Foundation A novel antibody delivery system for biological response modifiers
US5413923A (en) 1989-07-25 1995-05-09 Cell Genesys, Inc. Homologous recombination for universal donor cells and chimeric mammalian hosts
EP0451221B1 (en) 1989-08-31 1994-10-12 City Of Hope Chimeric dna-rna catalytic sequences
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
US5780225A (en) 1990-01-12 1998-07-14 Stratagene Method for generating libaries of antibody genes comprising amplification of diverse antibody DNAs and methods for using these libraries for the production of diverse antigen combining molecules
AU7247191A (en) 1990-01-11 1991-08-05 Molecular Affinities Corporation Production of antibodies using gene libraries
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
DK0710719T3 (da) 1990-01-12 2007-07-09 Amgen Fremont Inc Frembringelse af xenogene antistoffer
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5314995A (en) 1990-01-22 1994-05-24 Oncogen Therapeutic interleukin-2-antibody based fusion proteins
WO1991014438A1 (en) 1990-03-20 1991-10-03 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Chimeric antibodies with receptor binding ligands in place of their constant region
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
US5567588A (en) 1990-06-11 1996-10-22 University Research Corporation Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: Solution SELEX
DK0786469T3 (da) 1990-06-11 2006-07-10 Gilead Sciences Inc Nukleinsyreligander
US5707796A (en) 1990-06-11 1998-01-13 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Method for selecting nucleic acids on the basis of structure
US5962219A (en) 1990-06-11 1999-10-05 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: chemi-selex
US5580737A (en) 1990-06-11 1996-12-03 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High-affinity nucleic acid ligands that discriminate between theophylline and caffeine
US5270163A (en) 1990-06-11 1993-12-14 University Research Corporation Methods for identifying nucleic acid ligands
US5763177A (en) 1990-06-11 1998-06-09 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: photoselection of nucleic acid ligands and solution selex
GB9014932D0 (en) 1990-07-05 1990-08-22 Celltech Ltd Recombinant dna product and method
EP0585287B1 (en) 1990-07-10 1999-10-13 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
EP0814159B1 (en) 1990-08-29 2005-07-27 GenPharm International, Inc. Transgenic mice capable of producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5698426A (en) 1990-09-28 1997-12-16 Ixsys, Incorporated Surface expression libraries of heteromeric receptors
PL169576B1 (pl) 1990-10-12 1996-08-30 Max Planck Gesellschaft Sposób wytwarzania czasteczki RNA o aktywnosci katalitycznej PL PL
AU660297B2 (en) 1990-11-09 1995-06-22 Stephen D. Gillies Cytokine immunoconjugates
US5252714A (en) 1990-11-28 1993-10-12 The University Of Alabama In Huntsville Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde
DK0564531T3 (da) 1990-12-03 1998-09-28 Genentech Inc Berigelsesfremgangsmåde for variantproteiner med ændrede bindingsegenskaber
CA2105300C (en) 1991-03-01 2008-12-23 Robert C. Ladner Process for the development of binding mini-proteins
PT100379B (pt) 1991-04-10 1999-01-29 Scripps Research Inst Bibliotecas de receptores heterodimericos usando fagomideos
EP0519596B1 (en) 1991-05-17 2005-02-23 Merck & Co. Inc. A method for reducing the immunogenicity of antibody variable domains
WO1992022324A1 (en) 1991-06-14 1992-12-23 Xoma Corporation Microbially-produced antibody fragments and their conjugates
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
DE4216134A1 (de) 1991-06-20 1992-12-24 Europ Lab Molekularbiolog Synthetische katalytische oligonukleotidstrukturen
DE4122599C2 (de) 1991-07-08 1993-11-11 Deutsches Krebsforsch Phagemid zum Screenen von Antikörpern
US5756096A (en) 1991-07-25 1998-05-26 Idec Pharmaceuticals Corporation Recombinant antibodies for human therapy
MX9204374A (es) 1991-07-25 1993-03-01 Idec Pharma Corp Anticuerpo recombinante y metodo para su produccion.
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
PT1024191E (pt) 1991-12-02 2008-12-22 Medical Res Council Produção de auto-anticorpos a partir de reportórios de segmentos de anticorpo e exibidos em fagos
JPH05244982A (ja) 1991-12-06 1993-09-24 Sumitomo Chem Co Ltd 擬人化ｂ−ｂ１０
US5652094A (en) 1992-01-31 1997-07-29 University Of Montreal Nucleozymes
JP3571337B2 (ja) 1992-02-11 2004-09-29 セル ジェネシス，インコーポレーテッド 遺伝子標的現象による同型遺伝子接合
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
US5837821A (en) 1992-11-04 1998-11-17 City Of Hope Antibody construct
ATE236987T1 (de) 1992-11-13 2003-04-15 Idec Pharma Corp Konsensus-kozak-sequenzen zur säugetier- exprimierung
JPH08505872A (ja) 1993-01-22 1996-06-25 ユニバーシティ・リサーチ・コーポレイション 治療剤の局所化
US5624803A (en) 1993-10-14 1997-04-29 The Regents Of The University Of California In vivo oligonucleotide generator, and methods of testing the binding affinity of triplex forming oligonucleotides derived therefrom
JPH09506262A (ja) 1993-12-08 1997-06-24 ジェンザイム・コーポレイション 特異的抗体の製造方法
AU1736495A (en) 1994-01-31 1995-08-15 Trustees Of Boston University Polyclonal antibody libraries
US5627053A (en) 1994-03-29 1997-05-06 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. 2'deoxy-2'-alkylnucleotide containing nucleic acid
US5516637A (en) 1994-06-10 1996-05-14 Dade International Inc. Method involving display of protein binding pairs on the surface of bacterial pili and bacteriophage
US5811252A (en) 1994-07-07 1998-09-22 Nederlandse Organisatie Voor Toegepast-Natuurwetenschappelijk Onderzoek Tno Modified proenzymes as substrates for proteolytic enzymes
WO1996018736A2 (en) 1994-12-13 1996-06-20 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Method and reagent for treatment of arthritic conditions, induction of graft tolerance and reversal of immune responses
US5716824A (en) 1995-04-20 1998-02-10 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. 2'-O-alkylthioalkyl and 2-C-alkylthioalkyl-containing enzymatic nucleic acids (ribozymes)
US6130364A (en) 1995-03-29 2000-10-10 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
ATE390933T1 (de) 1995-04-27 2008-04-15 Amgen Fremont Inc Aus immunisierten xenomäusen stammende menschliche antikörper gegen il-8
EP0823941A4 (en) 1995-04-28 2001-09-19 Abgenix Inc HUMAN ANTIBODIES DERIVED FROM IMMUNIZED XENO MOUSES
US5811524A (en) 1995-06-07 1998-09-22 Idec Pharmaceuticals Corporation Neutralizing high affinity human monoclonal antibodies specific to RSV F-protein and methods for their manufacture and therapeutic use thereof
US6699843B2 (en) 1995-06-07 2004-03-02 Gilead Sciences, Inc. Method for treatment of tumors using nucleic acid ligands to PDGF
US6068829A (en) 1995-09-11 2000-05-30 The Burnham Institute Method of identifying molecules that home to a selected organ in vivo
US5998203A (en) 1996-04-16 1999-12-07 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Enzymatic nucleic acids containing 5'-and/or 3'-cap structures
ATE373672T1 (de) 1996-01-16 2007-10-15 Sirna Therapeutics Inc Synthese von methoxynukleoside und enzymatische nukleisäure moleküle
JP2978435B2 (ja) 1996-01-24 1999-11-15 チッソ株式会社 アクリロキシプロピルシランの製造方法
US5849902A (en) 1996-09-26 1998-12-15 Oligos Etc. Inc. Three component chimeric antisense oligonucleotides
US5916771A (en) 1996-10-11 1999-06-29 Abgenix, Inc. Production of a multimeric protein by cell fusion method
US6420140B1 (en) 1996-10-11 2002-07-16 Abgenix, Inc. Production of multimeric protein by cell fusion method
EP0942968B1 (en) 1996-12-03 2008-02-27 Amgen Fremont Inc. Fully human antibodies that bind EGFR
PT981637E (pt) 1997-03-14 2005-09-30 Biogen Idec Inc Metodo para integrar genes em sitios especificos em celulas de mamifero atraves de recombinacao homologa e vectores para a realizacao do mesmo
PL193780B1 (pl) 1997-04-14 2007-03-30 Micromet Ag Sposób wytwarzania receptora przeciw ludzkim antygenom, ludzkie przeciwciało i środek farmaceutyczny
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
ES2258817T3 (es) 1997-05-21 2006-09-01 Biovation Limited Metodo para la produccion de proteinas no inmunogenas.
US6011577A (en) 1997-06-30 2000-01-04 Polaroid Corporation Modular optical print head assembly
WO1999004705A1 (en) 1997-07-25 1999-02-04 Tsui Ban C H Devices, systems and methods for determining proper placement of epidural catheters
IL135000A0 (en) 1997-09-12 2001-05-20 Exiqon As Bi- and tri-cyclic nucleoside, nucleotide and oligonucleotide analogues
US20030083272A1 (en) 1997-09-19 2003-05-01 Lahive & Cockfield, Llp Sense mrna therapy
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
US20020072493A1 (en) 1998-05-19 2002-06-13 Yeda Research And Development Co. Ltd. Activated T cells, nervous system-specific antigens and their uses
AU4682999A (en) 1998-06-16 2000-01-05 Human Genome Sciences, Inc. 94 human secreted proteins
ATE352559T1 (de) 1998-12-08 2007-02-15 Biovation Ltd Verfahren zur verminderung der immunogenität von proteinen
US7041474B2 (en) 1998-12-30 2006-05-09 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid encoding human tango 509
DE19956568A1 (de) 1999-01-30 2000-08-17 Roland Kreutzer Verfahren und Medikament zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Gens
WO2000063364A2 (en) 1999-04-21 2000-10-26 American Home Products Corporation Methods and compositions for inhibiting the function of polynucleotide sequences
US7053207B2 (en) 1999-05-04 2006-05-30 Exiqon A/S L-ribo-LNA analogues
CA2386270A1 (en) 1999-10-15 2001-04-26 University Of Massachusetts Rna interference pathway genes as tools for targeted genetic interference
GB9927444D0 (en) 1999-11-19 2000-01-19 Cancer Res Campaign Tech Inhibiting gene expression
US7119165B2 (en) 2000-01-12 2006-10-10 Yale University Nogo receptor-mediated blockade of axonal growth
CZ20022438A3 (cs) 2000-01-12 2002-10-16 Yale University Nukleová kyselina kódující receptor Nogo, izolovaný polypeptid a farmaceutický přípravek pro stimulaci růstu axonů
US7378248B2 (en) 2000-03-06 2008-05-27 Rigel Pharmaceuticals, Inc. In vivo production of cyclic peptides for inhibiting protein-protein interaction
EP1272630A2 (en) 2000-03-16 2003-01-08 Genetica, Inc. Methods and compositions for rna interference
WO2001070949A1 (en) 2000-03-17 2001-09-27 Benitec Australia Ltd Genetic silencing
ES2336887T5 (es) 2000-03-30 2019-03-06 Whitehead Inst Biomedical Res Mediadores de interferencia por ARN específicos de secuencias de ARN
JP4901051B2 (ja) 2000-05-30 2012-03-21 ジョンソン アンド ジョンソン リサーチ プロプライアトリー リミテッド ＲＮＡｉを増強する因子を使用することによって遺伝子抑制を媒介する方法
DK1325130T3 (da) 2000-10-06 2010-05-25 Univ Yale Nogo-Receptorhomologer
CN1306272C (zh) 2000-11-17 2007-03-21 罗切斯特大学 筛选编码抗原特异性免疫球蛋白分子或其抗原特异性片段的方法
IL157142A0 (en) 2001-01-29 2004-02-08 Idec Pharma Corp Modified antibodies and methods of use
WO2002096948A2 (en) 2001-01-29 2002-12-05 Idec Pharmaceuticals Corporation Engineered tetravalent antibodies and methods of use
EP1423427A2 (en) 2001-08-27 2004-06-02 Novartis AG Nogo receptor homologues and their use
US7129085B2 (en) * 2001-10-11 2006-10-31 Bristol-Myers Squibb Company Polynucleotides encoding a human leucine-rich repeat domain containing protein, HLLRCR-1
JP2005519584A (ja) 2001-10-22 2005-07-07 ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト Ｎｏｇｏレセプターホモログおよびそれらの使用
US7309485B2 (en) 2001-12-03 2007-12-18 Children's Medical Center Corporation Reducing myelin-mediated inhibition of axon regeneration
US20030113325A1 (en) 2001-12-03 2003-06-19 Zhigang He Reducing myelin-mediated inhibition of axon regeneration
EP1354892A1 (en) 2002-04-19 2003-10-22 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Peptides capable of inducing attraction of the axonal growth and their use for treating neurodegenerative diseases
US7745151B2 (en) 2002-08-02 2010-06-29 Children's Medical Center Corporation Methods of determining binding between Nogo receptor and p75 neurotrophin receptor
BR0313331A (pt) 2002-08-10 2007-07-24 Univ Yale antagonistas de receptor de nogo
US20070065429A1 (en) 2003-04-16 2007-03-22 Biogen Idec Ma Inc. Nogo-receptor antagonists for the treatment of conditions involving amyloid plaques
MXPA06001444A (es) 2003-08-07 2006-05-15 Biogen Idec Inc Antagonistas del receptor nogo.
WO2005044981A2 (en) 2003-10-23 2005-05-19 Sirna Therapeutics, Inc. Rna interference mediated inhibition of gene expression using short interfering nucleic acid (sina)
US20080274077A1 (en) 2003-12-16 2008-11-06 Children's Medical Center Corporation Method for Treating Neurological Disorders
US20090053229A1 (en) 2005-05-12 2009-02-26 Lee Daniel H S Methods of Treating Conditions Involving Neuronal Degeneration
CA2619406A1 (en) 2005-08-25 2007-03-01 Biogen Idec Ma Inc. Nogo receptor polypeptides and polypeptide fragments and uses thereof
ES2550099T3 (es) * 2006-01-27 2015-11-04 Biogen Ma Inc. Antagonistas del receptor Nogo

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A soluble Nogo receptor differentially affects plasticity of spinally projecting axons;V.E.MacDermid et al;《European Journal of Neuroscience》;20041230;全文 *
Disulfide structure of the Leucine-Rich repeat C-terminal Cap and C-terminal stalk region of Nogo-66 receptor;Dingyi Wen et al;《Biochemistry》;20051231;全文 *
Nogo receptor antagonism promotes stroke recovery by enhancing axonal plasticity;Jung-Kil Lee et al;《The Journal of Neuroscience》;20041231;全文 *
Structure and axon outgrowth inhibitor binding of the Nogo-66 receptor and related proteins;William A.Barton et al;《The EMBO Journal》;20031231;全文 *
Truncated soluble Nogo receptor binds Nogo-66 and blocks inhibition of Axon growth by myelin;Alyson E.Fournier et al;《The Journal of Neuroscience》;20011015;全文 *

Also Published As

Publication number Publication date
US9228015B2 (en) 2016-01-05
JP2014221076A (ja) 2014-11-27
DK1981902T3 (en) 2015-10-05
WO2007089601A8 (en) 2008-10-02
EP2526968A2 (en) 2012-11-28
US20140227266A1 (en) 2014-08-14
WO2007089601A2 (en) 2007-08-09
EP1981902A4 (en) 2009-12-23
CN103215293A (zh) 2013-07-24
BRPI0707276B1 (pt) 2021-08-31
PT1981902E (pt) 2015-11-02
EP2526968A3 (en) 2013-05-22
US20160159878A1 (en) 2016-06-09
JP2009524429A (ja) 2009-07-02
US20090099078A1 (en) 2009-04-16
CA2640423C (en) 2016-03-15
CA2640423A1 (en) 2007-08-09
BRPI0707276A2 (pt) 2011-04-26
HRP20151108T1 (en) 2015-11-20
CN101420977A (zh) 2009-04-29
CA2913655A1 (en) 2007-08-09
JP2016104821A (ja) 2016-06-09
EP1981902B1 (en) 2015-07-29
EP1981902A2 (en) 2008-10-22
ES2550099T3 (es) 2015-11-04
CN101420977B (zh) 2016-08-10
US8669345B2 (en) 2014-03-11
WO2007089601A9 (en) 2008-12-18
JP5829373B2 (ja) 2015-12-09
WO2007089601A3 (en) 2008-11-06
JP2013048638A (ja) 2013-03-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103215293B (zh) Nogo受体拮抗剂
ES2395094T3 (es) Tratamiento de afecciones que implican la desmielinización
US8894999B2 (en) Use of DR6 and p75 antagonists to promote survival of cells of the nervous system
JP5060293B2 (ja) 神経機能におけるｔａｊ
JP2013166795A (ja) ドーパミン作動性ニューロンの神経突起成長および生存を促進するための方法
US20110117094A1 (en) Reactivation of Axon Growth and Recovery in Chronic Spinal Cord Injury
JP6306768B2 (ja) 疼痛抑制物質のスクリーニング方法および疼痛の予防または治療用医薬組成物
JP2009538282A (ja) 乏突起膠細胞の生存を促進させるためのＮｏｇｏ受容体−１（ＮｇＲ１）アンタゴニストの使用
MX2008009620A (es) Antagonistas de receptores de nogo

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C53 Correction of patent for invention or patent application
CB02 Change of applicant information

Address after: Massachusetts, USA

Applicant after: Than Ao Gen MA company

Address before: Massachusetts, USA

Applicant before: Biogen Idec MA Inc.

COR Change of bibliographic data

Free format text: CORRECT: APPLICANT; FROM: BIOGEN IDEC MA TO: BIOGEN MA INC.

Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM:

C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant