ES2702181T3 - Filtración con carbono activado para la purificación de ADC de benzodiazepina - Google Patents

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Abstract

Un método para eliminar las impurezas relacionadas con un fármaco de benzodiazepina de una mezcla que comprende conjugados anticuerpo-fármaco (ADC) de benzodiazepina e impurezas relacionadas con un fármaco de benzodiazepina que comprende pasar la mezcla a través de un filtro de carbón activado mediante múltiples pases discretos o por recirculación a través de un solo filtro de carbón activado.

Description

DESCRIPCIÓN
Filtración con carbono activado para la purificación de ADC de benzodiazepina
ANTECEDENTES
Los conjugados anticuerpo-fármaco (ADC) pueden proporcionar un medio eficaz para administrar un fármaco a un sitio dirigido en un tejido u organismo. El reconocimiento de una diana, tal como un tumor, por el anticuerpo minimiza la exposición de tejidos no diana a agentes quimioterapéuticos tóxicos y limita los efectos adversos asociados con la toxicidad de los fármacos "libres" (es decir, sin unir a un portador tal como un anticuerpo). Los ADC pueden prepararse mediante varias técnicas. Antes de la administración a un sujeto humano u otro sujeto, el conjugado se purifica para eliminar los fármacos libres y otras impurezas.
Debido a la potencia muy alta de los fármacos que contienen benzodiazepina, la eliminación de impurezas relacionadas con el fármaco libre de una mezcla que comprende ADC de benzodiazepina y las impurezas relacionadas con un fármaco de benzodiazepina debe ser altamente eficaz. La presente invención aborda esta y otras necesidades.
Los documentos EP1473301, EP0665020, WO2007/105027, y WO2011/130613 divulgan la preparación de conjugados de anticuerpo-fármaco. El documento WO2013/028330 divulga la purificación de anticuerpos usando filtración con carbono activado.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La Figura 1 proporciona un gráfico que muestra la concentración fármaco de PBD-enlazador inactivado en la mezcla de reacción de conjugación inactivada después de la filtración a través de un filtro de carbón activado con purificación 3M de grado 5. Los datos demuestran una reducción de aproximadamente 60 veces en el nivel de fármaco-enlazador inactivado, y no se alcanza la capacidad máxima del filtro. Los rombos de color negro representan el fármaco-enlazador inactivado y los cuadrados de color blanco representan la recuperación de ADC.
La Figura 2 proporciona un gráfico que muestra la concentración de fármaco de PBD-enlazador inactivado en la mezcla de QCR después de la filtración a través de uno (cuadrados de color negro) o dos (triángulos de color negro) filtros de carbón activado de purificación 3M de grado 3. El paso a través de un segundo filtro proporciona depuración adicional. El cuadrado de color blanco indica la concentración de ADC después de la primera filtración y los triángulos de color blanco indican la concentración de ADC después de la segunda filtración. Una fracción del ADC se pierde con cada etapa de filtración.
La Figura 3 ilustra la pérdida de ADC durante la recirculación a través del filtro de carbono. Esencialmente, toda la pérdida de ADC se produjo durante el contacto inicial de la mezcla de QCR con el filtro de carbón activado. Los datos se indican como mg de ADC extraído/cm2 de área superficial del filtro.
La Figura 4 proporciona un gráfico que muestra la depuración del fármaco de PBD-enlazador inactivado durante la recirculación en un filtro de carbón activado a diferentes flujos. Los datos indican que para un número determinado de pasos, un flujo más bajo proporciona una mejor depuración.
La Figura 5 proporciona un gráfico que muestra la depuración del fármaco de PBD-enlazador inactivado de la mezcla de reacción de conjugación inactivada utilizando diferentes filtros y concentraciones de carga de proteínas.
La Figura 6 proporciona un esquema de purificación ejemplar para los ADC de benzodiazepina.
La Figura 7 proporciona un esquema de purificación ejemplar para los ADC de benzodiazepina.
General
La invención se define en las reivindicaciones.
La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de que muchos de los métodos comúnmente empleados para separar las impurezas relacionadas con un fármaco de las mezclas de conjugado anticuerpofármaco (por ejemplo, filtración de flujo tangencial) no pueden eliminar las impurezas relacionadas con un fármaco de benzodiazepina de mezclas que comprenden ADC de benzodiazepina e impurezas relacionadas con un fármaco de benzodiazepina a un nivel bajo aceptable. Se descubrió sorprendentemente que las impurezas relacionadas con un fármaco de benzodiazepina podían eliminarse eficazmente por filtración con carbón activado. Además, se descubrió que la recirculación sobre un filtro de carbón activado o múltiples filtraciones discretas utilizando el mismo filtro podría reducir aún más las impurezas relacionadas con un fármaco de benzodiazepina sin tener un impacto negativo en la recuperación de ADC de benzodiazepina.
Resumen
En el presente documento se proporcionan métodos para eliminar las impurezas relacionadas con un fármaco de benzodiazepina de mezclas que comprenden ADC de benzodiazepina y las impurezas relacionadas con un fármaco de benzodiazepina por filtración con carbón activado. La filtración de carbón activado se puede realizar pasando una mezcla que comprende ADC de benzodiazepina e impurezas relacionadas con un fármaco de benzodiazepina a través de un filtro de carbón activado. Por consiguiente, en algunos aspectos, la presente divulgación proporciona un método para eliminar las impurezas relacionadas con un fármaco de benzodiazepina de mezclas que comprenden ADC de benzodiazepina y las impurezas relacionadas con un fármaco de benzodiazepina que comprenden la etapa de pasar la mezcla a través de un filtro de carbón activado (por ejemplo, un filtro en el que el carbón activado se impregna sobre un soporte sólido de celulosa u otro tipo de soporte sólido). La filtración de carbono también se puede realizar, por ejemplo, añadiendo carbón activo a granel, ya sea como un polvo, o como una suspensión, a la mezcla a purificar, mezclando y/o incubando la mezcla, y después eliminando el carbón activado en el que se absorbe la impureza. Por consiguiente, en algunos aspectos, la presente divulgación proporciona un método para eliminar las impurezas relacionadas con un fármaco de benzodiazepina de mezclas que comprenden ADC de benzodiazepina y las impurezas relacionadas con un fármaco de benzodiazepina que comprenden la etapa de poner en contacto la mezcla que comprende ADC de benzodiazepina y las impurezas relacionadas con un fármaco de benzodiazepina con carbón activado en volumen y pasar la mezcla a través de un filtro. En algunos aspectos, el carbón activado a granel está en forma de polvo. En otros aspectos, el carbón activado a granel es una suspensión. En todos los métodos anteriores, la filtración puede ser a través de filtración de una sola pasada, múltiples filtraciones discretas a través de un solo filtro, o recirculación a través de un solo filtro. En formas de realización en las que la filtración es a través de múltiples filtraciones discretas a través de un solo filtro, se pueden realizar 2 o más filtraciones discretas. Por ejemplo, se pueden realizar 2 filtraciones discretas, se pueden realizar 3 filtraciones discretas, o se pueden realizar 3 o más filtraciones discretas. En formas de realización en las que la filtración es a través de recirculación, la recirculación puede ser continua. En algunos aspectos, la mezcla que comprende los ADC y las impurezas se recircula de 3 a aproximadamente 20 veces a través del filtro.
En el presente documento se proporcionan métodos para eliminar las impurezas relacionadas con un fármaco de benzodiazepina de mezclas que comprenden ADC de benzodiazepina y las impurezas relacionadas con un fármaco de benzodiazepina que comprenden pasar una mezcla que comprende a Dc de benzodiazepina e impurezas relacionadas con un fármaco de benzodiazepina a través de un solo filtro de carbón activado varias veces para producir una solución purificada de ADC de benzodiazepina. La mezcla se puede recircular a través del filtro. Como alternativa, los pases múltiples a través del filtro pueden ser múltiples pasos discretos a través del filtro. En el presente documento también se proporcionan métodos para eliminar las impurezas relacionadas con un fármaco de benzodiazepina de mezclas que comprenden ADC de benzodiazepina e impurezas relacionadas con un fármaco de benzodiazepina poniendo en contacto una mezcla que comprende ADC de benzodiazepina e impurezas relacionadas con un fármaco de benzodiazepina con carbón activado y pasando la mezcla a través de un solo filtro varias veces para producir una solución purificada de ADC de benzodiazepina. La mezcla se puede recircular a través del filtro. Como alternativa, los pases múltiples a través del filtro pueden ser múltiples pasos discretos a través del filtro. En formas de realización preferidas, la solución purificada de ADC de benzodiazepina tendrá una concentración de impurezas relacionadas con un fármaco de benzodiazepina de aproximadamente 1 pM o menos, preferiblemente 0,2 pM, o incluso 0,1 pM o menos. En formas de realización preferidas, la solución purificada de ADC de benzodiazepina tendrá una concentración de conjugados fármaco-enlazador inactivados de aproximadamente 1 pM o menos, preferiblemente 0,2 pM, o incluso 0,1 pM o menos.
En aspectos preferidos, las impurezas relacionadas con un fármaco de benzodiazepina que se eliminan de la mezcla son conjugados fármaco-enlazador inactivados.
Definiciones
A menos que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la técnica pertinente para los métodos y composiciones descritos. Como se usa en el presente documento, los siguientes términos y frases tienen el significado que se les asigna, a menos que se especifique otra cosa.
El término "heterociclo" se refiere a un sistema anular monocíclico, bicíclico o policíclico que tiene de 3 a 14 átomos de anillo (también denominados miembros del anillo) en el que al menos un átomo de anillo en al menos un anillo es un heteroátomo seleccionado de N, O, P o S (y todas las combinaciones y subcombinaciones de rangos y números específicos de átomos de carbono y heteroátomos en el mismo). El heterociclo puede tener de 1 a 4 heteroátomos en el anillo seleccionados independientemente de N, O, P o S. Uno o más átomos de N, C o S en un heterociclo pueden oxidarse. Un heterociclo monocíclico tiene preferiblemente de 3 a 7 miembros en el anillo (por ejemplo, de 2 a 6 átomos de carbono y de 1 a 3 heteroátomos seleccionados independientemente de N, O, P o S), y un heterociclo bicíclico tiene preferiblemente de 5 a 10 miembros de anillo (por ejemplo, de 4 a 9 átomos de carbono y de 1 a 3 heteroátomos seleccionados independientemente de N, O, P o S). El anillo que incluye el heteroátomo puede ser aromático o no aromático.
El término "carbociclo" se refiere a un sistema anular monocíclico, bicíclico o policíclico no aromático saturado o insaturado que tiene de 3 a 14 átomos en el anillo (y todas las combinaciones y subcombinaciones de intervalos y números específicos de átomos de carbono en el mismo), en el que todos los átomos del anillo son átomos de carbono. Los carbociclos monocíclicos tienen preferiblemente de 3 a 6 átomos en el anillo, aún más preferiblemente de 5 o 6 átomos en el anillo. Los carbociclos tienen preferiblemente de 3 a 8 átomos de anillo de carbono.
La frase "sal farmacéuticamente aceptable", como se usa en el presente documento, se refiere a sales orgánicas o inorgánicas farmacéuticamente aceptables de un compuesto. El compuesto puede contener al menos un grupo amino y, por consiguiente, pueden formarse sales de adición de ácidos con el grupo amino. Las sales ejemplares incluyen, pero sin limitación, sales sulfato, trifluoroacetato, citrato, acetato, oxalato, cloruro, bromuro, yoduro, nitrato, bisulfato, fosfato, fosfato de ácido, isonicotinato, lactato, salicilato, citrato de ácido, tartrato, oleato, tanato, pantotenato, bitartrato, ascorbato, succinato, maleato, gentisinato, fumarato, glucononato, sacarato, formiato, benzoato, glutamato, metanosulfonato, etanosulfonato, bencenosulfonato, p-toluenosulfonato y pamoato (es decir, 1,1'-metilen-bis-(2-hidroxi-3-naftoato)). Una sal farmacéuticamente aceptable puede implicar la inclusión de otra molécula, tal como un ión acetato, un ión succinato u otro contraión. El contraión puede ser cualquier resto orgánico o inorgánico que estabiliza la carga en el precursor. Además, una sal farmacéuticamente aceptable puede tener más de un átomo cargado en su estructura. Los casos en los que múltiples átomos cargados son parte de la sal farmacéuticamente aceptable pueden tener múltiples contraiones. Por lo tanto, una sal farmacéuticamente aceptable puede tener uno o más átomos cargados y/o uno o más contraiones.
El término "anticuerpo" se usa en el presente documento para representar proteínas de inmunoglobulina producidas por el cuerpo en respuesta a la presencia de un antígeno y que se unen al antígeno, así como a los fragmentos de unión a antígeno y sus variantes modificadas. Por lo tanto, el término "anticuerpo" incluye, por ejemplo, anticuerpos monoclonales intactos que comprenden cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina de longitud completa (por ejemplo, anticuerpos producidos utilizando tecnología de hibridoma) y fragmentos de anticuerpos de unión a antígeno, tales como fragmentos F(ab')2 y Fab. También se incluyen anticuerpos y fragmentos intactos genéticamente modificados, tales como anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, fragmentos Fv monocatenarios, anticuerpos monocatenarios, diacuerpos, minicuerpos, anticuerpos lineales, anticuerpos híbridos multivalentes o multiespecíficos (por ejemplo, biespecíficos), y similares. Por lo tanto, el término "anticuerpo" se usa de manera expansiva para incluir cualquier proteína que comprenda un sitio de unión a antígeno de un anticuerpo y sea capaz de unirse específicamente a su antígeno.
El término "anticuerpos modificados genéticamente" o "anticuerpo modificado" significa anticuerpos en los que la secuencia de aminoácidos se ha variado de la de un anticuerpo nativo. Debido a la relevancia de las técnicas de ADN recombinante en la generación de anticuerpos, no es necesario limitarse a las secuencias de aminoácidos que se encuentran en los anticuerpos naturales; los anticuerpos pueden ser rediseñados para obtener las características deseadas. Las posibles variaciones son muchas y van desde el cambio de uno o unos pocos aminoácidos hasta el rediseño completo de, por ejemplo, la región variable o constante. Los cambios en la región constante, en general, se harán para mejorar o alterar características como, por ejemplo, la fijación del complemento, la interacción con las células, y otras funciones efectoras. Típicamente, los cambios en la región variable se harán para mejorar las características de unión al antígeno, mejorar la estabilidad de la región variable o reducir el riesgo de inmunogenicidad.
Un "sitio de unión a antígeno de un anticuerpo" es la porción de un anticuerpo que es suficiente para unirse a su antígeno. El mínimo de dicha región es típicamente un dominio variable o una variante modificada genéticamente del mismo. Los sitios de unión de dominio único pueden generarse a partir de anticuerpos de camélidos (véanse Muyldermans y Lauwereys, J. Mol. Recog. 12:131-140, 1999; Nguyen et al., EMBO J. 19:921-930, 2000) o a partir de dominios VH de otras especies para producir anticuerpos de un solo dominio ("dAbs"; véanse Ward et al., Nature 341:544-546, 1989; Patente de Estados Unidos N.° 6.248.516 de Winter et al.). En ciertas variaciones, un sitio de unión a antígeno es una región polipeptídica que tiene solo 2 regiones determinantes de complementariedad (CDR) de un dominio variable de cadena pesada o dominio variable de cadena ligera de origen natural o no natural (por ejemplo, mutagenizada), o una combinación de los mismos (véanse, por ejemplo, Pessi et al., Nature 362:367-369, 1993; Qiu et al., Nature Biotechnol. 25:921-929, 2007). Más comúnmente, un sitio de unión a antígeno de un anticuerpo comprende tanto un dominio variable de cadena pesada (VH) como un dominio variable de cadena ligera (VL) que se unen a un epítopo común. En el contexto de la presente invención, un anticuerpo puede incluir uno o más componentes además de un sitio de unión a antígeno, tal como, por ejemplo, un segundo sitio de unión a antígeno de un anticuerpo (que puede unirse al mismo o un epítopo diferente, o al mismo o un antígeno diferente), un enlazador peptídico, una región constante de inmunoglobulina, una bisagra de inmunoglobulina, una hélice anfipática (véanse Pack y Pluckthun, Biochem. 31:1579-1584, 1992), un enlazador no peptídico, un oligonucleótido (véase Chaudri et al., fEbS Letters 450:23-26, 1999), un fármaco citostático o citotóxico, y similares, y puede ser una proteína monomérica o multimérica. Los ejemplos de moléculas que comprenden un sitio de unión a antígeno de un anticuerpo se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, Fv, Fv monocatenario (scFv), Fab, Fab', F(ab')2 , F(ab)c, diacuerpos, dAbs, minicuerpos, nanocuerpos, fusiones Fab-scFv, (scFv)4-IgG biespecífico, y (scFv)2-Fab biespecífico. (Véanse, por ejemplo, Hu et al., Cancer Res. 56:3055-3061, 1996; Atwell et al., Molecular Immunology 33:1301-1312, 1996; Carter y Merchant, Curr. Opin. Biotechnol. 8:449-454, 1997; Zuo et al., Protein Engineering 13:361-367, 2000; y Lu et al., J. Immunol. Methods 267:213-226, 2002.)
Como se usa en el presente documento, el término "inmunoglobulina" se refiere a una proteína que consiste en uno o más polipéptidos sustancialmente codificados por uno o más genes de inmunoglobulina. Una forma de inmunoglobulina constituye la unidad estructural básica de anticuerpos nativos (es decir, naturales) en vertebrados. Esta forma es un tetrámero y consiste en dos pares idénticos de cadenas de inmunoglobulina, teniendo cada par una cadena ligera y una cadena pesada. En cada par, las regiones variables de cadena ligera y pesada (VL y VH) juntas son las principales responsables de unirse al antígeno, y las regiones constantes son las principales responsables de las funciones efectoras del anticuerpo. Se han identificado cinco clases de proteínas de inmunoglobulina (IgG, IgA, IgM, IgD e IgE) en vertebrados superiores. IgG comprende la clase principal; normalmente existe como la segunda proteína más abundante que se encuentra en el plasma. En los seres humanos, la IgG consiste en cuatro subclases, denominadas IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Las regiones constantes de cadena pesada de la clase IgG se identifican con el símbolo griego y. Por ejemplo, las inmunoglobulinas de la subclase IgG1 contienen una región constante de cadena pesada y1. Cada cadena pesada de inmunoglobulina posee una región constante que consiste en dominios de proteínas de región constante (CH1, bisagra, CH2 y CH3; IgG3 también contiene un dominio CH4) que son esencialmente invariantes para una subclase dada en una especie. Las secuencias de ADN que codifican cadenas de inmunoglobulina humanas y no humanas se conocen en la técnica. (Véanse, por ejemplo, Ellison et al., DNA 1:11-18, 1981; Ellison et al., Nucleic Acids Res. 10:4071-4079, 1982; Kenten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6661-6665, 1982; Seno et al., Nuc. Acids Res. 11:719-726, 1983; Riechmann et al., Nature 332:323-327, 1988; Amster et al., Nuc. Acids Res. 8:2055-2065, 1980; Rusconi and Kohler, Nature 314:330-334, 1985; Boss et al., Nuc. Acids Res. 12:3791-3806, 1984; Bothwell et al., Nature 298:380-382, 1982; van der Loo et al., Immunogenetics 42:333-341, 1995; Karlin et al., J. Mol. Evol. 22:195-208, 1985; Kindsvogel et al., DNA 1:335-343, 1982; Breiner et al., Gene 18:165-174, 1982; Kondo et al., Eur. J. Immunol. 23:245-249, 1993; y Acceso al GenBank N.° J00228.) Para una revisión de la estructura y función de las inmunoglobulinas, véanse Putnam, The Plasma Proteins, Vol V, Academic Press, Inc., 49-140, 1987; y Padlan, Mol. Immunol. 31:169-217, 1994. El término "inmunoglobulina" se usa en el presente documento por su significado común, que representa un anticuerpo intacto, sus cadenas componentes, o fragmentos de cadenas, según el contexto.
Las "cadenas ligeras" de inmunoglobulina de longitud completa (aproximadamente 25 Kd o 214 aminoácidos) están codificadas por un gen de región variable en el extremo amino (que codifica aproximadamente 110 aminoácidos) y por un gen de región constante kappa o lambda en el extremo carboxilo. Las "cadenas pesadas" de inmunoglobulina de longitud completa (aproximadamente 50 Kd o 446 aminoácidos) están codificadas por un gen de región variable (que codifica aproximadamente 116 aminoácidos) y un gen de región constante gamma, mu, alfa, delta o épsilon (que codifica aproximadamente 330 aminoácidos), definiendo este último el isotipo del anticuerpo como IgG, IgM, IgA, IgD o IgE, respectivamente. Dentro de las cadenas ligeras y pesadas de longitud completa, las regiones variables y constantes se unen por una región "J" de aproximadamente 12 o más aminoácidos, incluyendo también la cadena pesada una región "D" de aproximadamente 10 aminoácidos más. (Véanse generalmente Fundamental Immunology (Paul, ed., Raven Press, N.Y., 2a ed. 1989), Cap. 7).
Una región variable de cadena ligera o pesada de inmunoglobulina (también denominada en el presente documento un "dominio variable de cadena ligera" ("dominio VL") o "dominio variable de cadena pesada" ("dominio VH"), respectivamente) consiste en una región "marco" interrumpida por tres regiones hipervariables, también llamadas "regiones determinantes de la complementariedad" o "CDR". Las regiones marco sirven para alinear las CDR para la unión específica a un epítopo de un antígeno. Por lo tanto, el término "región hipervariable" o "CDR" se refiere a los residuos de aminoácidos de un anticuerpo que son los principales responsables de la unión al antígeno. Desde el término amino hasta el extremo carboxilo, los dominios VL y VH comprenden las siguientes regiones marco (FR) y CDR: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. La asignación de aminoácidos a cada dominio es según las definiciones de Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 y 1991), o Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917, 1987; Chothia et al., Nature 342:878-883, 1989. Kabat también proporciona una convención de numeración ampliamente utilizada (numeración de Kabat) en la que los residuos correspondientes entre diferentes cadenas pesadas o entre diferentes cadenas ligeras tienen asignado el mismo número. Las CDR 1, 2 y 3 de un dominio VL también se denominan en el presente documento, respectivamente, como CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3; las CDR 1, 2 y 3 de un dominio VH también se denominan en el presente documento, respectivamente, como CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3.
A menos que el contexto indique otra cosa, el término "anticuerpo monoclonal", como se usa en el presente documento, no se limita a los anticuerpos producidos mediante tecnología de hibridoma. El término "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo que se deriva de un solo clon, incluido cualquier clon eucariota, procariota o fago, y no el método por el cual se produce.
El término "anticuerpo quimérico" se refiere a un anticuerpo que tiene dominios variables derivados de una primera especie y regiones constantes derivadas de una segunda especie. Pueden construirse inmunoglobulinas o anticuerpos quiméricos, por ejemplo, mediante ingeniería genética, a partir de segmentos de genes de inmunoglobulinas que pertenecen a diferentes especies. El término "anticuerpo humanizado", como se define más adelante, no pretende incluir anticuerpos quiméricos. Aunque los anticuerpos humanizados son quiméricos en su construcción (es decir, comprenden regiones de más de una especie de proteína), incluyen características adicionales (es decir, regiones variables que comprenden residuos de CDR donante y residuos del marco aceptor) que no se encuentran en las inmunoglobulinas o anticuerpos quiméricos, como se define en el presente documento. El término "dominio VH humanizado" o "dominio VL humanizado" se refiere a un dominio VH o VL de inmunoglobulina que comprende algunas o todas las CDR de una inmunoglobulina donante no humana (por ejemplo, un ratón o una rata) y secuencias marco de región variable completa o sustancialmente de secuencias de inmunoglobulina humana. La inmunoglobulina no humana que proporciona las CDR se denomina el "donante", y la inmunoglobulina humana que proporciona el marco se denomina el "aceptor". En algunos casos, los anticuerpos humanizados pueden conservar residuos no humanos dentro de las regiones marco del dominio variable humano para mejorar las características de unión apropiadas (por ejemplo, las mutaciones en los marcos pueden ser necesarias para preservar la afinidad de unión cuando se humaniza un anticuerpo).
Un "anticuerpo humanizado" es un anticuerpo que comprende uno o ambos de un dominio VH humanizado y un dominio VL humanizado. La región o regiones constantes de inmunoglobulina no necesitan estar presentes, pero si lo están, son total o sustancialmente de regiones constantes de inmunoglobulina humana.
Una CDR en un anticuerpo humanizado es "sustancialmente de" una CDR correspondiente en un anticuerpo no humano cuando al menos el 60 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 % o el 100 % de los residuos correspondientes (según se define por Kabat) son idénticos entre las respectivas CDR. En particular, las variaciones de un dominio VH o VL humanizado en el que las CDR son sustancialmente de una inmunoglobulina no humana, las CDR del dominio VH o VL humanizado no tienen más de seis (por ejemplo, no más de cinco, no más de cuatro, no más de tres, no más de dos o ni más de una) sustituciones de aminoácidos en las tres CDR con respecto a correspondientes CDR de VH o VL no humanas. Las secuencias marco de región variable de un dominio VH o VL de anticuerpo o, si está presente, una secuencia de una región constante de inmunoglobulina, son "sustancialmente de" una secuencia marco VH o VL humana o región constante humana, respectivamente, cuando al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 % o el 100 % de los residuos correspondientes definidos por Kabat son idénticos. Por lo tanto, todas las partes de un anticuerpo humanizado, excepto posiblemente las CDR, son total o sustancialmente de las partes correspondientes de las secuencias de inmunoglobulina humana natural.
La unión específica de un anticuerpo a su antígeno diana significa una afinidad de al menos 106, 107, 108, 109, o 1010 M-1. La unión específica es detectable de mayor magnitud y se distingue de la unión no específica que se produce en al menos una diana no relacionada. La unión específica puede ser el resultado de la formación de enlaces entre grupos funcionales particulares o un ajuste espacial particular (por ejemplo, tipo cerradura y llave), mientras que la unión no específica suele ser el resultado de las fuerzas de van der Waals. Sin embargo, la unión específica no implica necesariamente que un anticuerpo monoclonal se una a una y solo una diana.
Con respecto a las proteínas como se describe en el presente documento, la referencia a los residuos de aminoácidos correspondientes a los especificados por la SEQ ID NO incluye modificaciones postraduccionales de dichos residuos.
Un conjugado anticuerpo-fármaco (ADC) es un anticuerpo conjugado con un fármaco citotóxico, típicamente a través de un enlazador. El enlazador puede comprender una unidad escindible o puede no ser escindible. Las unidades escindibles incluyen, por ejemplo, enlazadores que contienen disulfuro que se pueden escindir a través de intercambio de disulfuro, enlazadores de ácido-lábiles que se pueden escindir a pH ácido, y enlazadores que se pueden escindir por hidrolasas, esterasas, peptidasas y glucoronidasas (por ejemplo, enlazadores peptídicos y enlazadores de glucorónido). Se cree que los enlazadores no escindibles liberan el fármaco a través de un mecanismo de degradación de anticuerpos proteolíticos.
El término "diluyente", como se usa en el presente documento, se refiere a una solución adecuada para alterar o lograr una concentración o concentraciones ejemplares o apropiadas como se describe en el presente documento. El término "contenedor" se refiere a algo en el que se puede colocar o contener un objeto o líquido, por ejemplo, para su almacenamiento (por ejemplo, un soporte, receptáculo, recipiente o similares).
El término "vía de administración" incluye rutas de administración reconocidas en la técnica para administrar una proteína terapéutica tal como, por ejemplo, por vía parenteral, intravenosa, intramuscular o subcutánea. Para la administración de un ADC para el tratamiento del cáncer, puede desearse la administración en la circulación sistémica por administración intravenosa o subcutánea. Para el tratamiento de un cáncer caracterizado por un tumor sólido, la administración se puede localizar directamente en el tumor.
Las dos secuencias de aminoácidos tienen una "identidad de secuencia de aminoácidos del 100 %" si los residuos de aminoácidos de las dos secuencias de aminoácidos son iguales cuando se alinean para la correspondencia máxima. Las comparaciones de secuencias se pueden realizar utilizando programas de software estándar, tales como los que se incluyen en la suite de computación bioinformática lAs ERGENE, producida por DNASTAR (Madison, Wisconsin). Otros métodos para comparar dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos mediante la determinación del alineamiento óptimo se conocen bien por los expertos en la técnica. (Véanse, por ejemplo, Peruski y Peruski, The Internet and the New Biology: Tools for Genomic and Molecular Research (ASM Press, Inc. 1997); Wu et al. (eds.), "Information Superhighway and Computer Databases of Nucleic Acids and Proteins", en Methods in Gene Biotechnology 123-151 (CRC Press, Inc. 1997); Bishop (ed.), Guide to Human Genome Computing (2a ed., Academic Press, Inc. 1998).) Se considera que dos secuencias de aminoácidos tienen una "identidad de secuencia sustancial" si las dos secuencias tienen al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 % o al menos un 95 % de identidad de secuencia entre sí.
El porcentaje de identidades de secuencia se determina con secuencias de anticuerpos alineadas al máximo por la convención de numeración de Kabat. Después del alineamiento, si una región de anticuerpo objeto (por ejemplo, el dominio variable completo de una cadena pesada o ligera) se compara con la misma región de un anticuerpo de referencia, el porcentaje de identidad de secuencia entre las regiones de anticuerpo objeto y de referencia es el número de posiciones ocupadas por el mismo aminoácido tanto en la región de anticuerpo objeto como de referencia, dividido por el número total de posiciones alineadas de las dos regiones, sin contar los huecos, multiplicado por 100 para convertir en porcentaje.
Las composiciones o métodos "que comprenden" uno o más elementos mencionados pueden incluir otros elementos no mencionados específicamente.
La referencia a un intervalo numérico en el presente documento (por ejemplo, "X a Y" o "X a Y") incluye los puntos finales que definen el intervalo y todos los valores que están dentro del intervalo.
A menos que sea evidente de otro modo en el contexto, cuando un valor se expresa como "aproximadamente" X, se entenderá que el valor indicado de X es exacto a ± 10 %.
Conjugados anticuerpo-fármaco de benzodiazepina
Un conjugado anticuerpo-fármaco de benzodiazepina se refiere a un anticuerpo conjugado con un dímero de benzodiazepina típicamente, aunque no necesariamente, a través de un enlazador. Un fármaco de benzodiazepinaenlazador se refiere a un dímero de benzodiazepina unido a un enlazador. Un compuesto de benzodiazepina tiene en su núcleo un anillo de benceno fusionado con un anillo de diazepina. Las estructuras anulares ejemplares para el anillo de benceno fusionado con un anillo de diazepina son las siguientes:
3,4-dihidro-1 H-benzo[e][1,4]diazepin-5(2H)-ona 3H-benzo[e][1,4]diazepin-5(4H)-ona
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Los compuestos de benzodiazepina difieren en el número, tipo y posición de los sustituyentes en ambos anillos y en el grado de saturación del anillo de diazepina. También difieren en el número de anillos adicionales fusionados con el anillo de benceno y/o diazepina. En la definición de compuestos de benzodiazepina se incluyen aquellos en los que el anillo de benceno o diazepina se fusiona con uno o más anillos carbocíclicos o heterocíclicos aromáticos o no aromáticos. Un dímero de benzodiazepina es un compuesto que se ha formado uniendo dos unidades de benzodiazepina juntas, a través de una unión.
El componente de anticuerpo del conjugado anticuerpo-fármaco de benzodiazepina puede conjugarse con uno o más conjugados fármacos de benzodiazepina-enlazador, por ejemplo, 1 a 20 conjugados fármaco-enlazador. En algunos aspectos, el componente de anticuerpo del conjugado anticuerpo-fármaco de benzodiazepina se conjugará con 1, 2, 3 o 4 conjugados fármaco-enlazador. La conjugación puede ser a través de diferentes posiciones en el anticuerpo. En algunos aspectos, la conjugación se realizará a través de un átomo de azufre de un residuo de cisteína. En algunos aspectos, el residuo de cisteína es un residuo de cisteína de los disulfuros intercatenarios del anticuerpo. En otros aspectos, el residuo de cisteína se modifica en el anticuerpo. En algunos aspectos, el residuo de cisteína se modifica en el anticuerpo en la posición 239 (IgG1 humana) según lo determinado por el índice de la UE (Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 y 1991)). En algunos aspectos, habrá un promedio de 2 conjugados fármaco-enlazador por anticuerpo en una mezcla o formulación de ADC de benzodiazepina y los conjugados fármaco-enlazador se conjugarán con un residuo de cisteína introducido en el anticuerpo en la posición 239 (IgG1 humana) según lo determinado en el índice de la UE (Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 y 1991)).
En un aspecto, el dímero de benzodiazepina es un dímero de pirrolobenzodiazepina (PBD). Las PBD son de la estructura general:
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Los PBD difieren en el número, tipo y posición de los sustituyentes, tanto en sus anillos A aromáticos como en sus anillos C pirrolo, y en el grado de saturación del anillo C. En el anillo B hay una imina (N=C), una carbinolamina (NH-CH(OH)) o un éter de carbinolamina (NH-CH(OR)) en la posición N10-C11, que es el centro electrófilo responsable de la alquilación del ADN. Todos los productos naturales conocidos tienen una configuración (S) en la posición quiral C11a que les proporciona un giro hacia la derecha cuando se ven desde el anillo C hacia el anillo A. Esto les da la forma tridimensional apropiada para la isohelicidad con el surco menor del ADN en forma de B, lo que conduce a un ajuste perfecto en el sitio de unión. La capacidad de las PBD para formar un aducto en el surco menor les permite interferir con el procesamiento del ADN, por lo tanto, su uso como agentes antitumorales. La actividad biológica de estas moléculas puede potenciarse uniendo dos unidades de PBD juntas (por ejemplo, a través de funcionalidades C8/C'-hidroxilo a través de un enlazador de alquileno flexible). Se cree que los dímeros de PBD forman lesiones de ADN selectivas de secuencia, tales como el entrecruzamiento intercatenario palindrómico 5'-Pu-GATC-Py-3', que se cree que es el principal responsable de su actividad biológica.
Los dímeros de PBD ejemplares a usar como conjugados son los siguientes:
Ċ
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o una sal de los mismos (por ejemplo, una sal farmacéuticamente aceptable).
El dímero de PBD se puede unir al anticuerpo en cualquier posición adecuada para la conjugación con un enlazador. Por ejemplo, en algunas formas de realización, el dímero de PBD tendrá un sustituyente en la posición C2 (por ejemplo, una amina primaria o secundaria) que proporciona un anclaje para unir el compuesto al anticuerpo. La posición C2 está marcada por una flecha en las estructuras ejemplares que se han mostrado anteriormente. En formas de realización alternativas, la posición N10 del dímero de PBD proporcionará el anclaje para unir el compuesto al anticuerpo.
En otro aspecto, el fármaco de dímero de benzodiazepina es un dímero de indolinobenzodiazepina o un dímero de oxazolidinobenzodiazepina. Las indolinobenzodiazepinas (IBD) y las oxazolidinobenzodiazepinas (OBD) son de la estructura general:
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Las indolinobenzodiazepinas y las oxazolidinobenzodiazepinas difieren en el número, tipo y posición de los sustituyentes en sus anillos. Al igual que con las PBD, se pueden unir dos unidades de indolinobenzodiazepinas o dos unidades oxazolidinobenzodiazepinas para formar dímeros, por ejemplo, a través de funcionalidades de éter entre los anillos A de dos unidades monoméricas. Al igual que con las PBD, un dímero de indolinobenzodiazepina o un dímero de oxazolidinobenzodiazepina se puede unir a un anticuerpo en cualquier posición adecuada para la conjugación con un enlazador.
Un ADC de benzodiazepina que comprende un dímero de PBD como componente del fármaco también se puede denominar ADC de PBD. De manera similar, un ADC de benzodiazepina que comprende un dímero de indolinobenzodiazepina como componente del fármaco se puede denominar ADC de IBD, y un ADC que comprende un dímero de oxazolidinobenzodiazepina como el componente del fármaco se puede denominar ADC de OBD. Típicamente, los ADC de benzodiazepina, incluidos los ADC de PBD, los ADC de IBD y los ADC de OBD, comprenden un enlazador entre el fármaco de benzodiazepina y el anticuerpo. El enlazador puede comprender una unidad escindible (por ejemplo, un aminoácido o una secuencia contigua de aminoácidos que es un sustrato diana para una enzima) o un enlazador no escindible (por ejemplo, un enlazador liberado por la degradación del anticuerpo). El enlazador puede comprender además un grupo maleimida para el enlace con el anticuerpo, por ejemplo, maleimidocaproílo. Los dímeros de PBD, dímeros de IBD, dímeros de OBD, enlazadores y conjugados de los mismos se conocen en la técnica. Véanse, por ejemplo, los documentos WO 2010/091150, WO 2012/112708, WO 2012/128868, WO 2011/023883, y WO 2009/016516.
Un enlazador ejemplar para su uso con los fármacos de benzodiazepina, incluyendo cualquiera de los descritos en el presente documento, es el siguiente en el que la línea ondulada indica el sitio de unión al fármaco y el anticuerpo está unido a través del grupo maleimida.
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Los conjugados anticuerpo-fármaco a base de PBD ejemplares incluyen conjugados anticuerpo-fármaco como se muestra a continuación:
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o una sal de los mismos (por ejemplo, una sal farmacéuticamente aceptable), en los que Ab es un anticuerpo y la carga del fármaco se representa por p, el número de moléculas fármaco-enlazador por anticuerpo. Dependiendo del contexto, p puede representar el número promedio de moléculas fármaco-enlazador por anticuerpo, también denominado la carga promedio de fármaco. P varía de 1 a 20 y es preferiblemente de 1 a 8. En algunos aspectos, cuando p representa la carga promedio del fármaco, p varía de aproximadamente 2 a aproximadamente 5. En algunos aspectos, p es aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, o aproximadamente 5. En algunos aspectos, el anticuerpo se conjuga con el fármaco-enlazador a través de un átomo de azufre de un residuo de cisteína. En algunos aspectos, el residuo de cisteína es un residuo de cisteína de los disulfuros intercatenarios del anticuerpo. En otros aspectos, el residuo de cisteína se modifica en el anticuerpo. En algunos aspectos, el residuo de cisteína se modifica en el anticuerpo en la posición 239 (IgG1) según lo determinado por el índice de la UE (Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 y 1991)). Los métodos para hacer dichos ADC se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, la Publicación Internacional N.° WO2011/130613).
Proceso de conjugación
La presente invención está dirigida, entre otros, a métodos para la eliminación de impurezas relacionadas con un fármaco de benzodiazepina de una mezcla que comprende ADC de benzodiazepina e impurezas relacionadas con benzodiazepina. Una impureza relacionada con un fármaco de benzodiazepina es cualquier impureza relacionada con un fármaco que surge de la reacción de conjugación (incluida la etapa de inactivación) de un anticuerpo contra un fármaco de benzodiazepina o un fármaco-enlazador. Las impurezas relacionadas con un fármaco de benzodiazepina incluyen, por ejemplo, fármacos libres de dímeros de benzodiazepina (incluido el fármaco inactivado), conjugados fármaco de benzodiazepina-enlazador, conjugados fármaco de benzodiazepina-enlazador inactivados, o productos de degradación de fármaco de benzodiazepina-enlazador. Las impurezas relacionadas con un fármaco de benzodiazepina no incluyen fármacos de benzodiazepina o conjugados fármaco-enlazador conjugados con anticuerpos (incluidos los fragmentos que contienen anticuerpos de los mismos).
En algunos aspectos de la presente invención, un anticuerpo (desnudo o conjugado con un enlazador) se pone en contacto con un fármaco de benzodiazepina-enlazador en condiciones suficientes para formar una mezcla de reacción de conjugación que comprende ADC de benzodiazepina e impurezas relacionadas con un fármaco de benzodiazepina. En otros aspectos, un anticuerpo (por ejemplo, anticuerpo-enlazador) se pone en contacto con un fármaco libre de benzodiazepina en condiciones suficientes para formar una mezcla de reacción de conjugación que comprende ADC de benzodiazepina e impurezas relacionadas con un fármaco de benzodiazepina. Los métodos generales de conjugación de anticuerpos con enlazadores o conjugados fármaco-enlazador se conocen en la técnica y no se describen en el presente documento en detalle. En algunos aspectos, la conjugación será con los residuos de lisina del anticuerpo. En otros aspectos, la conjugación será con una cisteína nativa o modificada presente en el anticuerpo (por ejemplo, cisteína de un disulfuro intercatenario o residuo de cisteína introducido en la cadena pesada o ligera del anticuerpo). En algunos aspectos, el anticuerpo de cisteína modificado se reducirá antes del contacto con el fármaco de benzodiazepina-enlazador, el anticuerpo se reoxidará parcialmente (es decir, se reoxidará con respecto a los disulfuros intercatenarios, pero no con la cisteína introducida), y el fármaco de benzodiazepina-enlazador se conjugará con la cisteína modificada en el anticuerpo parcialmente reoxidado. En algunos de estos aspectos, la cisteína modificada estará en la posición 239 (IgG1, numeración del índice de la UE según lo expuesto en Kabat).
Un experto en la técnica apreciará que las condiciones usadas para conjugar el anticuerpo con el fármaco o el fármaco-enlazador dependerán, en parte, de la identidad del fármaco y el enlazador. En general, las reacciones de conjugación se realizan a una temperatura de aproximadamente 0 °C a aproximadamente 40 °C. En algunas formas de realización, la reacción de conjugación se realiza a aproximadamente 4 °C. En algunas formas de realización, la reacción de conjugación se realiza a aproximadamente 25 °C. En algunas formas de realización, la reacción de conjugación se realiza a aproximadamente 37 °C. Las reacciones de conjugación pueden realizarse durante cualquier periodo de tiempo adecuado. En general, las mezclas de reacción de conjugación se incuban en condiciones adecuadas en cualquier lugar entre unos pocos minutos y varias horas. Las reacciones pueden realizarse, por ejemplo, durante aproximadamente 1 minuto, o aproximadamente 5 minutos, o aproximadamente 30 minutos, o aproximadamente 1 hora y media, o aproximadamente 4 horas, o aproximadamente 12 horas, o aproximadamente 24 horas. En general, las mezclas de reacción de conjugación se forman con un pH que varía de aproximadamente 6 a aproximadamente 9. En algunas formas de realización, la mezcla de reacción se forma con un pH de aproximadamente 7 a aproximadamente 8. Se pueden usar diversos agentes de tamponamiento para mantener un pH particular. Los ejemplos de agentes tamponantes adecuados incluyen, pero sin limitación, ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES), ácido 2-[4-(2-hidroxietil)piperazin-1-il]etanosulfónico (HEPES), ácido 3-morfolinopropano-1-sulfónico (MOPS), 2-amino-2-hidroximetil-propano-1,3-diol (TRIS), citrato de sodio, acetato de sodio y borato de sodio. También pueden incluirse, según sea necesario, codisolventes (por ejemplo, dimetil acetamida, propilenglicol, dimetilsulfóxido, dimetilformamida etanol, metanol, tetrahidrofurano, acetona y ácido acético), sales (por ejemplo, NaCl, KCl, CaCh y sales de Mn2+ y Mg2+), y quelantes (por ejemplo, ácido etilenglicolbis(2-aminoetiléter)-N,N,N',N'-tetraacético (EGTA), ácido 2-({2-[bis(carboximetil)amino]etil}(carboximetil)amino)acético (EDTA), y ácido 1,2-bis(o-aminofenoxi)etano-N,N,N ',N '-tetraacético (BAPTA). Los tampones, codisolventes, sales y quelantes pueden usarse a cualquier concentración adecuada, que puede ser determinada fácilmente por un experto en la técnica. En general, se pueden incluir tampones, codisolventes, sales y quelantes en las mezclas de reacción a concentraciones que varían de aproximadamente 1 pM y aproximadamente 1 M o incluso más (por ejemplo, 0-50 % v/v según el codisolvente). Se puede usar cualquier cantidad adecuada de fármaco de benzodiazepina o fármaco-enlazador para la conjugación.
En algunos aspectos, después de la conjugación del anticuerpo con el fármaco o fármaco-enlazador, y antes de la filtración con carbón activado, se utilizará un agente de inactivación para inactivar cualquier exceso de fármaco o fármaco-enlazador (por ejemplo, fármaco no conjugado o fármaco-enlazador). Un agente de inactivación es un reactivo, distinto de un anticuerpo, que es capaz de suprimir la reactividad de un resto reactivo mediante la unión covalente al resto reactivo. Un experto en la técnica apreciará que el agente de inactivación se elegirá en función de la naturaleza del fármaco o el enlazador. Por ejemplo, se puede usar un tiol como p-mercapto etanol o N-acetilcisteína para inactivar el exceso de compuestos fármaco-enlazador que contienen un grupo maleimido. Se puede usar una amina, tal como glicina, para inactivar el exceso de compuestos fármaco-enlazador que contienen un éster de N-hidroxisuccinimidilo. Típicamente, el agente de inactivación se usa en exceso con respecto al anticuerpo y al fármaco-enlazador. En algunos aspectos, el exceso de fármaco de benzodiazepina-enlazador está presente en la mezcla de reacción y se inactivará. En dichos aspectos, la impureza relacionada con un fármaco de benzodiazepina será un fármaco de benzodiazepina-enlazador inactivado. Una mezcla de reacción de conjugación inactivada se refiere a una mezcla de reacción después de la conjugación del anticuerpo con el fármaco-enlazador y la introducción del agente de inactivación.
Como ejemplo de una síntesis de fármaco de PBD-enlazador, el documento WO 2011/130613 describe un método para sintetizar un fármaco de PBD-enlazador seguido de la conjugación fármaco de PBD-enlazador con un anticuerpo. Brevemente, los anticuerpos en PBS que contienen borato de sodio 50 mM a pH 7,4 se reducen con clorhidrato de tris(carboxietil)fosfina (TCEP) a 37 °C. Los disulfuros intercatenarios de anticuerpos se reforman por oxidación con ácido deshidroascórbico, dejando las cisteínas modificadas en forma de tiol disponibles para la alquilación con el fármaco-enlazador. El anticuerpo reducido se alquila entonces con ~1,5 equivalentes de fármaco de maleimida-enlazador por anticuerpo tiol, en presencia de suficiente co-disolvente para solubilizar el fármacoenlazador. Después de aproximadamente 90 minutos, la reacción se inactiva mediante la adición de ~3 equivalentes de N-acetil cisteína con respecto al fármaco-enlazador.
Con independencia de los métodos de conjugación utilizados, las impurezas relacionadas con un fármaco de benzodiazepina estarán presentes en la mezcla. En general, las impurezas relacionadas con un fármaco de benzodiazepina estarán presentes en la mezcla a niveles de aproximadamente 10 a 100 pM. Se contemplan concentraciones superiores o inferiores de impurezas relacionadas con un fármaco de benzodiazepina. En algunos aspectos, la impureza del proceso de las benzodiazepinas será un fármaco-enlazador inactivado o no inactivado, por ejemplo, un fármaco-enlazador inactivado de N-acetil cisteína. En otros aspectos, la impureza del proceso de las benzodiazepinas será un fármaco de benzodiazepina libre (es decir, un dímero de benzodiazepina no unido a un enlazador o anticuerpo). En otros aspectos, la impureza relacionada con un fármaco de benzodiazepina será un producto de degradación de fármaco de benzodiazepina-enlazador, tal como, por ejemplo, un derivado oxidado o hidrolizado del fármaco-enlazador.
En algunos aspectos, después de la conjugación del anticuerpo o del anticuerpo-enlazador con el fármaco-enlazador o el fármaco, según sea el caso, y la inactivación opcional de los intermedios del proceso de la benzodiazepina, pero antes de la filtración con carbón activado, la mezcla comprende ADC de benzodiazepina e impurezas relacionadas con un fármaco de benzodiazepina se filtrará para reducir la turbidez presente en la mezcla de reacción intermedia del proceso. La filtración puede ser a través de una filtración en línea (por ejemplo, usando filtros con un tamaño de poro de 1 micrómetro o más pequeño) u otros métodos de filtración, incluyendo, por ejemplo, filtración profunda. En otros aspectos, la filtración con carbón activado seguirá inmediatamente a la conjugación, por ejemplo, la filtración con carbón será la primera etapa de purificación después de la conjugación y la inactivación opcional.
Filtración con carbón activado
El carbón activado, también conocido como carbono activado, es carbón vegetal que ha sido activado química o térmicamente. El carbón activado tiene una relación área superficial/masa muy alta que permite la adsorción física del soluto. El carbón activado puede venir en forma de polvo a granel o unido a un soporte sólido. En algunas formas de realización preferidas, el carbón activado usado en la presente invención está unido a un soporte sólido. Un soporte sólido se refiere a un material funcionalizado insoluble al que se puede unir el carbón activado. Los ejemplos de soportes sólidos incluyen, por ejemplo, materiales poliméricos funcionalizados tales como celulosa (por ejemplo, fibras de celulosa). El proceso de filtrar una mezcla de reacción de conjugación a través de un filtro de carbón activado se denomina en el presente documento filtración con carbón activado. Los ejemplos de filtros de carbón que se pueden usar en la presente invención incluyen filtros impregnados de carbón. Los filtros ejemplares incluyen los cartuchos y cápsulas de carbón activado vendidos por 3M (por ejemplo, los filtros Zeta Plus™), Pall y Millipore. El paso de la mezcla que comprende las impurezas relacionadas con un fármaco de benzodiazepina a través del filtro de carbón activado se realiza para eliminar las impurezas relacionadas con un fármaco de benzodiapina de la preparación de ADC.
Como alternativa, el carbón activado usado en la presente invención está en forma de polvo a granel y se añade, como un polvo, o suspensión, a la mezcla a purificar. El paso de la mezcla que comprende los ADC de benzodiazepina, las impurezas relacionadas con un fármaco de benzodiazepina y el carbón activado a través de un filtro elimina las impurezas relacionadas con un fármaco de la benzodiazepina de la preparación de ADC.
Los presentes inventores descubrieron sorprendentemente que la pérdida de ADC durante la filtración con carbón activado se produjo durante el contacto inicial entre la mezcla de reacción y el filtro de carbón activado, y la recirculación continua o múltiples pasos discretos a través del mismo filtro no dieron como resultado una pérdida adicional de ADC. En contraste, la filtración a través de dos filtros separados dio como resultado una mayor pérdida de ADC en comparación con la filtración a través de un solo filtro. La filtración con carbón activado de la invención reivindicada se realiza mediante múltiples filtraciones discretas a través de un solo filtro, o la recirculación a través de un solo filtro. La filtración de una sola pasada a través de un solo filtro no es suficiente para reducir la concentración de impurezas relacionadas con un fármaco de benzodiazepina. La filtración con carbón activado de la invención se realiza mediante múltiples filtraciones discretas a través de un solo filtro o recirculación a través de un solo filtro. Por consiguiente, en formas de realización preferidas de la presente invención, la filtración a través de dos o más filtros separados no se realiza. En general, la recirculación se refiere a pasar una mezcla a través de un filtro canalizando la corriente de salida desde el filtro directamente a la entrada del mismo filtro, o a un depósito, en el que la mezcla de reacción está contenida hasta que se completa el proceso de filtración. La corriente se puede canalizar a través de un aparato apropiado, tal como un tubo o tubería. En algunos aspectos, cuando hay 10 g o menos de proteína (es decir, ADC de benzodiazepina) presente en la mezcla que comprende ADC de benzodiazepina e impurezas relacionadas con un fármaco de benzodiazepina (por ejemplo, aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, o 9 g de ADC de benzodiazepina en la mezcla de ADC), se prefiere la recirculación a través de un solo filtro en comparación con la filtración de una sola pasada. En otros aspectos, cuando hay más de 10 g de ADC de benzodiazepina, o más de 20 g de ADC de benzodiazepina en la mezcla que comprende ADC de benzodiazepina e impurezas relacionadas con un fármaco de benzodiazepina, se prefiere la filtración de una sola pasada. En algunos aspectos, cuando hay más de 10 g de ADC de benzodiazepina, o más de 20 g de ADC de benzodiazepina en la mezcla que comprende ADC de benzodiazepina e impurezas relacionadas con un fármaco de benzodiazepina, se prefiere la filtración discreta múltiple o la recirculación en comparación con la filtración de una sola pasada.
Los parámetros de selección pueden variarse para alterar el nivel de impurezas relacionadas con un fármaco de benzodiazepina que pueden eliminarse de una mezcla que los comprende. Se sabe que la adsorción de solutos por filtración con carbono generalmente depende del tiempo de contacto, por lo que la eficiencia de extracción depende del flujo. El caudal de la mezcla a través del filtro de carbón activado se puede aumentar o disminuir según sea necesario para lograr un nivel de pureza deseado. En algunos aspectos, el caudal a través del filtro de carbón activado será un flujo de aproximadamente 10 l/min/m2 o inferior, aproximadamente 8 l/min/m2 o inferior, o aproximadamente 6 l/min/m2. En algunos aspectos, el flujo estará entre aproximadamente 3 l/min/m2, o de aproximadamente 6 l/min/m2 a aproximadamente 10 l/min/m2 o aproximadamente 20 l/min/m2. En algunos aspectos, el flujo será de aproximadamente 6 l/min/m2 a aproximadamente 10 l/min/m2. En algunos aspectos, el flujo será de aproximadamente 6 l/min/m2 a aproximadamente 8 l/min/m2.
Aunque un mayor caudal (por ejemplo, un caudal superior a aproximadamente 6 l/min/m2) podría dar como resultado una menor depuración de los intermedios del proceso de reacción durante la filtración con carbón activado, el aumento en el flujo se puede compensar aumentando el número de ciclos de recirculación. Por ejemplo, mientras que se puede lograr un nivel de depuración deseado a un caudal de 6 l/min/m2 y 3 pasos completos a través de un solo filtro, un caudal de 12 l/min/m2 puede requerir 6 o más pasos completos a través de un solo filtro. En algunos aspectos, la mezcla de reacción se recirculará de 2 a aproximadamente 20 veces sobre el filtro de carbón activado, preferiblemente de 5 a aproximadamente 15 veces sobre el filtro de carbón activado. En algunos aspectos, el proceso de filtración durará de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 5 horas, preferiblemente de aproximadamente 2 horas a aproximadamente 4 horas para reducir los intermedios del proceso de benzodiazepinas a un nivel aceptable. En algunos aspectos, el proceso de filtración se completará cuando la concentración de impurezas relacionadas con un fármaco de benzodiazepina haya alcanzado un nivel objetivo. En algunos aspectos, el nivel de depuración objetivo es de aproximadamente 1 pM o menos, preferiblemente 0,2 pM, o incluso 0,1 pM o menos.
En algunos aspectos, la filtración con carbón activado reducirá los niveles de impurezas relacionadas con un fármaco de benzodiazepina (por ejemplo, conjugados fármaco-enlazador inactivados) en la mezcla de reacción final a aproximadamente 1 pM o menos, preferiblemente 0,2 pM, o incluso 0,1 pM o menos.
En algunos aspectos, la presente invención proporciona formulaciones de ADC de benzodiazepina que comprenden 0,2 pM o menos, 0,1 pM o menos o 0,05 pM o menos impurezas relacionadas con un fármaco de benzodiazepina. Los presentes métodos pueden usarse tanto para esfuerzos de fabricación a pequeña escala como para esfuerzos a gran escala. Por ejemplo, los presentes métodos son aplicables a un rango de escalas de miligramos a kilogramos. Después de la filtración con carbón activado, pueden usarse métodos de purificación adicionales, incluida la filtración por flujo tangencial, para eliminar impurezas adicionales relacionadas con el proceso, incluidas las impurezas del proceso no relacionadas con el fármaco, por ejemplo, quelantes, disolventes, agentes de inactivación y similares. Ejemplos
Los experimentos en las Figuras 1, 2 y 3 se realizaron utilizando discos de carbón activado de 13.5 cm2 de 3M Purificación Zeta Plus grados 3 o 5 montados en un soporte de acero inoxidable. Los experimentos en la Tabla 1 y la Figura 4 se realizaron usando filtros de cápsulas de carbón activado 3M Purificación Zeta Plus BC25 de grado 5. Los experimentos en la Figura 5 se realizaron utilizando filtros de cápsulas de carbón activado Zeta Plus, BC25 o BC1000 (650 cm2) como se indica en la leyenda del gráfico. La carga de proteínas está en el intervalo de 700 g/m2 o menos, y el flujo fue ~6 LMM o como según lo indicado.
Los filtros de carbón se usaron de acuerdo con las instrucciones del vendedor. Los filtros de carbón se lavaron abundantemente con un chorro de agua antes de usarlos para limpiar el polvo de carbono no secuestrado, luego se equilibraron con el medio de tampón QCR (Tris 50 mM/EDTA 5 mM, pH 7,5). El flujo de QCR se mantuvo mediante una bomba peristáltica. Se tomaron muestras del efluente del flujo inmediatamente después de pasar a través del filtro.
Las impurezas relacionadas con un fármaco de benzodiazepina se cuantificaron mediante RP-HPLC. Los picos relacionados con el fármaco se detectaron y cuantificaron por UV.
La contrapresión creada por el filtro se controló para asegurar que la presión no excediera la presión diferencial recomendada por el fabricante de 35 psi.
Los dímeros de PBD 1-4 y la síntesis de los mismos se describen en el documento WO2011/130613. Los dímeros de PBD 5-10 y 16 pueden sintetizarse usando los métodos descritos en el documento WO2011/130613 A1. Brevemente, los dímeros de PBD 9 y 16 son accesibles a través del intermedio bis-triflato unido en C3 8a en el documento WO2011/130613 A1. Los grupos arilo C2 deseados como ácidos borónicos o boronatos de pinacol se introducen en acoplamientos de Suzuki secuenciales seguidos de una reducción con dilactama SEM para revelar los grupos funcionales imina. Los dímeros de PBD 5-8 y 10 se preparan de la misma manera que el intermedio bistriflato unido en C5 8b en el documento WO2011/130613 A1. Se puede acceder a los dímeros de PBD 11-15 que contenían ésteres o ácidos carboxílicos en los grupos arilo C2 usando los métodos descritos en el documento WO2011/130613 A1 con pocas modificaciones. El dímero de PBD 13 puede prepararse a partir del intermedio bistriflato unido en C38a en el documento WO2011/130613 A1. El bis triflato se desimetriza a través del acoplamiento de Suzuki con un ácido borónico funcionalmente apropiado o boroato de pinacol para instalar el grupo arilo C2 que lleva el grupo funcional amino. El monotriflato resultante se reduce entonces con trietilborohidruro de litio en el carbinol SEM, que después se lleva al segundo acoplamiento de Suzuki para instalar el grupo arilo C2 que contiene el éster metílico. Finalmente, los carbinoles SEM se convierten en iminas a través de agitación en gel de sílice durante 3 días, como se describe en el documento WO2011/130613 A1. Los dímeros de PBD 12 y 14 pueden prepararse de la misma manera comenzando con bis triflato unido en C58b en el documento WO2011/130613 A1. La conversión de los ésteres de PBD en los ácidos carboxílicos libres (11 y 15) podría lograrse a través de saponificación.
El fármaco-enlazador denominado al que se hace referencia en los ejemplos y la síntesis de los mismos se describe en el documento WO2011/130613 y tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000017_0001
El fármaco-enlazador inactivado al que se hace referencia en los siguientes ejemplos tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000017_0002
El anticuerpo 2H12 es un anticuerpo IgG1 modificado que tiene una sustitución de residuo de cisteína en la posición 239 de la cadena pesada. La secuencia de las regiones variables y las regiones constantes de cadena pesada y li r l 2H12 r r i n n n l E ID N : 1-4.
Figure imgf000017_0003
Figure imgf000018_0001
La mezcla de reacción de conjugación inactivada (QCR) utilizada en los siguientes experimentos de filtración se preparó de la siguiente manera: El anticuerpo anti-CD33, h2H12 IgG1, que tenía una cisteína introducida en la posición 239 (numeración del índice de UE) se redujo, se reoxidó parcialmente (es decir, se reoxidó como disulfuros intercatenarios), y se conjugó con el fármaco de PBD-enlazador usando los métodos descritos en el documento WO 2011/130613 para formar un ADC. El fármaco de PBD-enlazador se conjugó con el anticuerpo parcialmente reoxidado a través de los residuos de cisteína introducidos (promedio de 2 conjugados fármaco-enlazador por anticuerpo). Después de la conjugación, la mezcla de reacción se inactivó mediante la adición de N-acetil cisteína y se filtró usando una filtración en línea.
Ejemplo 1 - Purificación de ADC de benzodiazepina usando filtración de flujo tangencial
El fármaco-enlazador inactivado se purificó a partir de QCR usando diafiltración a volumen constante. La mezcla de reacción de conjugación inactivada se introdujo en el dispositivo de filtración de flujo tangencial. La mezcla de reacción de conjugación inactivada comprende Tris, NaCl y propilenglicol al 50 %. El tampón de filtración de flujo tangencial también comprende Tris, NaCl y propilenglicol al 50 %. Después de la secuencia de ultrafiltración/diafiltración, quedaron en la mezcla 1,1 uM de impureza relacionada con el fármaco de benzodiazepina, quedando la depuración detenida después de cuatro diavolúmenes (datos no mostrados).
Ejemplo 2: Filtración de una sola pasada de ADC de benzodiazepina a través de un filtro de carbón activado 3M Purification de grado 5
Los filtros de carbón activado (filtro de cápsulas de carbón activado de 25 cm 3M Purification Zeta Plus BC25 Grado 5) se investigaron para determinar la eficacia de la eliminación de impurezas relacionadas con el fármaco de benzodiazepina y la recuperación de proteínas. Antes de la filtración, el filtro se equilibró y se purgó con aire. La concentración del fármaco-enlazador inactivado se mantuvo constante a lo largo de la filtración (Figura 1). La QCR contenía 35,9 ^M de fármaco-enlazador inactivado, lo que demuestra que la filtración con carbono redujo el nivel de fármaco-enlazador inactivado en aproximadamente un 98 %. La determinación de la concentración de proteínas al comienzo y al final de esta filtración indicó una pérdida de aproximadamente el 7 % del ADC.
Ejemplo 3: Filtración de una sola pasada de ADC de benzodiazepina a través de un filtro de carbón activado 3M Purification de grado 3
Se pasó una alícuota de QCR a través de un filtro de carbono de Grado 3 (Figura 2, Filtración 1, cuadrados de color negro). En este caso, el filtro no se purgó con aire después del equilibrado. La dilución por el tampón de equilibrio residual se observó en las primeras 4 muestras, pero las muestras posteriores retuvieron un fármaco-enlazador inactivado de ~1,2 ^M relativamente constante. La recuperación no mejoró dejando el tampón de equilibrio en el filtro antes de la filtración. Los filtros de carbono de grado 5 mostraron una mejor adsorción de PBD que los filtros de carbono de grado 3.
El flujo a través de esta filtración con carbono de grado 3 se pasó luego a través de un 2° filtro de carbono de grado 3 en condiciones idénticas. El resultado (Figura 3, Filtración 2, triángulos de color negro) indicó que la refiltración adsorbió el fármaco-enlazador inactivado adicional, reduciendo su concentración a aproximadamente 0,4 ^M, pero el 2° filtro también adsorbió ADC adicional. Aproximadamente el 7 % del ADC se perdió con el paso a través de cada filtro de carbono de grado 3.
Ejemplo 4 - Filtración de una sola pasada, múltiples filtraciones discretas y recirculación de ADC de benzodiazepina a través de un filtro de carbón activado de 3M Purification de grado 5

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un método para eliminar las impurezas relacionadas con un fármaco de benzodiazepina de una mezcla que comprende conjugados anticuerpo-fármaco (ADC) de benzodiazepina e impurezas relacionadas con un fármaco de benzodiazepina que comprende pasar la mezcla a través de un filtro de carbón activado mediante múltiples pases discretos o por recirculación a través de un solo filtro de carbón activado.
2. El método de la reivindicación 1, que comprende además las etapas de (i) poner en contacto un anticuerpo con un fármaco de benzodiazepina-enlazador en condiciones suficientes para formar una mezcla que comprende ADC de benzodiazepina, y (ii) poner en contacto la mezcla con un agente de inactivación para formar conjugados fármacos de benzodiazepina-enlazador inactivados,
o que comprende además las etapas de (i) poner en contacto un anticuerpo conjugado con un enlazador con un fármaco de benzodiazepina en condiciones suficientes para formar una mezcla que comprende ADC de benzodiazepina e impurezas relacionadas con un fármaco de benzodiazepina.
3. El método de la reivindicación 1, en el que las impurezas relacionadas con un fármaco de benzodiazepina son conjugados fármaco-enlazador inactivados, o en el que las impurezas relacionadas con un fármaco de benzodiazepina son fármacos no conjugados.
4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el carbón activado está unido a un soporte sólido.
5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la filtración es a través de recirculación a través de un solo filtro cuando hay 10 g o menos de ADC de benzodiazepina en la mezcla, y la filtración es a través de filtración de una sola pasada cuando hay más de 10 g de ADC de benzodiazepina en la mezcla, en el que hay más de 20 g de ADC de benzodiazepina en la mezcla y la filtración es a través de mediante filtración de una sola pasada.
6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el flujo está entre 3 l/min/m2 y 20 l/min/m2, particularmente en el que el flujo está entre 6 l/min/m2 y 20 l/min/m2 particularmente en el que el flujo es 6 l/min/m2.
7. El método de cualquier reivindicación anterior, en el que la mezcla que comprende ADC de benzodiazepina e impurezas relacionadas con un fármaco de benzodiazepina se recircula de 3 a 20 veces a través de un único filtro.
8. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las impurezas relacionadas con un fármaco de benzodiazepina se reducen a un nivel de 0,2 pM o menos, particularmente 0,1 pM o menos, sin pérdida adicional de ADC de benzodiazepina del contacto inicial con el filtro.
9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el filtro de carbón activado es un cartucho o cápsula de carbón activado.
10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que antes de la filtración con carbón activado, la mezcla se filtra a través de filtración en línea o por filtración profunda.
11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que, después de la filtración con carbón activado, la mezcla resultante se somete a uno o más procesos de purificación adicionales.
12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que los ADC de benzodiazepina comprenden dímeros de pirrolobenzodiazepina, o en el que los ADC de benzodiazepina comprenden dímeros de indolinobenzodiazepina, o en el que los ADC de benzodiazepina comprenden dímeros de oxazolidinobenzodiazepina.
13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo se conjuga con el fármaco de benzodiazepina a través de un residuo de cisteína que se diseña en el anticuerpo, en el que el residuo de cisteína está en la posición 239 de la cadena IgG1 de acuerdo con la numeración del índice de la UE.
14. El método de la reivindicación 13, en el que hay un promedio de 2 conjugados fármaco-enlazadores por anticuerpo en la mezcla.
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