JPS63152984A - 抗緑膿菌ヒト型抗体のｌ鎖をコ−ドするｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は抗緑膿菌ヒト型モノクローナル抗体のし鎖をコ
ードするＤＮＡコード領域を含んで成るＤＮＡに関する
。

〔従来の技術〕

シュードモナス・エルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓａｅｒｕｇｌｌ’１０５ａｓ以下「緑膿菌」というこ
とがある）は、湿潤な環境には比較的普遍的に存在する
ダラム陰性桿菌であり、人が健康な状態では何ら問題と
ならない菌であるが、白血病、広範囲熱傷、慢性呼吸器
疾患など人体の感染防御機構に破綻をきたした場合には
、しばしば致命的な感染症を引きおこす。

このため、緑膿菌を抑制する医薬として抗生物質を含む
種々の化学療法剤が使用されている。しかしながら、緑
膿菌は、本来、抗生物質に対して比較的抵抗性があると
ころから化学療法にも限界があり、今日では化学療法剤
の他に抗緑膿菌抗体を患者に投与してやることにより、
低下している免疫能を補う方法も行われている。

現在、ヒト型の抗緑膿菌抗体を得る方法としては、緑膿
菌感染既往歴のある者の血液から抗血清を得る方法、及
び細胞融合技術（Ｎａｔｕｒｅ　、　　２５６　＋４９
５〜４９７（１９７５）　）によってモノクローナル抗
体を得る方法（例えば、特開昭５９−２９６２２）が提
案されている。しかしながら、これらの方法にはそれぞ
れ難点があるため、これらとは全く異る方法として、緑
膿菌に対する抗体を生産することができるヒト細胞をエ
プスタインパールウィルス（ＥＢ■）によって形質転換
して不滅化し、この形質転換体を培養して抗緑膿菌モノ
クローナル抗体を製造する方法が提案されている（特開
昭６１−９１１３４号公！り。

しかしながら、この方法においては、抗原に対する特異
性を決定する可変領域と抗体のクラス及びサブクラスを
決定する定常令員域と任意に組合わせた抗体を製造する
ことは困難であり、またこれらの方法によって抗体の任
意の断片部分を製造することも困難であった。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかしながら、緑ｌｌｌ菌に対する抗体を使用して、緑
膿菌感染に対する予防、緑膿菌のタイプの決定等を行お
うとする場合、所望の特異性を有する種々のクラス又は
サブクラスの抗体を得、あるいは所望の特異性を有する
種々の抗体断片を得るのが有利である。このような任意
の種類の抗体又は抗体断片を得るには遺伝子組換技法を
用いるのが便利である。

従って、本発明は、遺伝子組換技法により緑膿菌に対す
る抗体を製造する前提として、緑膿菌に対する抗体のし
鎖をコードするコード領域を含んで成るＤＮＡ、及び該
り鎖の可変領域をコード領域を含んで成るコードするＤ
ＮＡを提供しようとするものである。

〔問題点を解決するための手段〕

前記の目的は、抗緑膿菌抗体のし鎖をコードするＤＮＡ
をコードする領域を含んで成るＤＮＡ、及び該り鎖の可
変領域をコードするＤ　Ｎ　Ａを提供することにより解
決される。

〔具体的な説明〕

本発明のＤＮＡは抗緑膿菌抗体のＬ鎖（軽鎖）の可変領
域をコードするコード領域及び定常領域（Ｃ領域）をコ
ードするコード領域（Ｃ−コード領域）を含んで成る。

前記可変領域をコードするコード領域は、■−コード領
域、Ｊ−コード領域からなり、そして特定の特異性を示
すアミノ酸配列をコードするように再構成（ＶＪ再構成
）が完成していなければならない。再構成されたこのＤ
　Ｎ　Ａ　９Ｍ域を本発明においてはＶＪ−コード領域
と称する。しかしながら、このＶＪ−コード領域とＣ−
コード領域とは一体化していてもよく、また両者間に非
コード領域が介在していてもよい。

前者のＤＮＡはｍ−ＲＮＡに由来するｃＤＮＡとして調
製することができ、他方後者のＤＮＡは所望の抗体を産
生ずる細胞のゲノムＤＮＡから得ることができる。

本発明のＤＮＡの１つの具体例においては、第２図に示
すようにＶＪ−コード領域とＣ−コード領域との間に非
コード領域が介在している。

ＶＪ−コード領域は緑膿菌のいずれかのタイプ、例えば
フィシャータイプＦ１〜Ｆ？、又は本間タイプＨ１””
Ｈ１？のいずれかに対して特異的な可変領域をコードす
るＤ　Ｎ　Ａ　９Ｍ域である。本発明においては、フィ
シャータイプＦ４、及び本間血清分類夏型（ＨＩ）に対
する抗体をコードするＤＮＡを例にとって具体的に説明
する。

Ｃ−コード領域はに鎖をコードする領域（Ｃに一コード
領域）、又はλ鎖をコードする領域（Ｃλ−コード領域
）のいずれかである。本発明においては具体例としてＣ
に一コード領域を有するＤＮＡを例にとって具体的に説
明する。

Ｃ−コード領域の構造はすでに種々検討され解明されて
いる。

本発明のＤＮＡの１例のＶＪ−コード領域によりコード
されるアミノ酸配列は、フィッシャータイプＦ４に対す
る抗体においては、塩基配列から次のように推定される
。

Ｇｌｕ　ｌｉｅ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　Ｓ
ｅｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　ＴｈｒＬｅｕ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ
　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ａｌａ　
ＴｈｒＬｅｕ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｓｅ
ｒ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　５ｅｒＳｅｒ　Ａｓｎ　
Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｔｒｐ　Ｔｙｒ　Ｇｉｎ　Ｇ
ｉｎ　ＬｙｓＰｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ａｌａ　Ｐｒｏ
　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　ｌｉｅ　ＴｙｒＡｌａ　Ａ
ｌａ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｇｌ
ｙ　Ｉｔｓ　Ｐｒ。

Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇ
ｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ａｌａ＾ｓｐ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ
　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　
ＧｌｕＰｒｏ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｖａ
ｌ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　ＧｌｎＧｉｎ　Ｔｙｒ　
Ａｓｐ　Ａｌａ　　Ｌｅｕまた、本発明のＤＮＡの１例
のＶＪ−コード領域によりコードされるアミノ酸配列は
、本間血清分ｌｔ型（ＨＩ）に対する抗体においては、
塩基配列から次のように推定される。

Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ｇｉｎ　Ｍｅｔ　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　Ｓ
ｅｒ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒしｅ’ｕ　　Ｓｅｒ　　
Ａｌａ　　Ｓｅｒ　　Ｖａｌ　　Ｇｌｙ　　Ａｓｐ　　
Ａｒｇ　　Ｖａｌ　　Ｔｈｒｌｉｅ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　
Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ａｓｐ　ｌｉｅ　Ｓ
ｅｒ＾ｓｎ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｔｒｐ　Ｐｈｅ
　Ｇｌｎ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　Ｐｒ。

Ｇｌｙ　　Ｌｙｓ　　Ａｌａ　　Ｐｒｏ　　Ｌｙｓ　　
Ｓｅｒ　　Ｌｅｕ　　ｌｉｅ　　Ｇｌｎ　　Ａｌａ＾１
ａ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ
　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　５ｅｒＬｙｓ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｇ
ｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ａｓ
ｐＰｈｅ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　ｌｉｅ　Ｓｅｒ　
Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ｐｒ。

Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｔ
ｙｒ　Ｃｙｓ　Ｇｌｎ　ＧｉｎＴｙｒ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ
　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　
ＧｉｎＧｌｙ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｉｌ
ｅ　Ｌｙｓ　Ａｒｇただし、上記記号は当業界でアミノ
酸の略号として認証されているものであって、各々、Ａ
ｓ口＝アスパラギン、　　Ｓｅｒ：セリンＡｓｐ：アス
パラギン酸、Ｇｌｕ：グルタミン酸Ｃｙｓニジスティン
、　　　ＰｒｏニブロリンＬｅａ：ロイシン、　　　Ｈ
ｉｓ：ヒスチジンＧｌｙニゲリシン、　　　Ｔｙｒ：チ
ロシンＶａｌ　：バリン、　　　　Ｍｅｔ　：メチオニ
ンｌｉｅ：イソロイシン、　Ａｌａ：アラニンＬｙｓ：
リジン、　　　　　Ｇｌｎ：グルタミンＡｒｇ、：アル
ギニン、　　ＴｒｐニトリブトファンＰｈｅ：フェニル
アラニンを示す。

また、この領域の塩基配列は、フィッシャータイプＦ、
に対する抗体については、次のように決定された。

ＧＡＡ　ＡＴＴ　ＧＴＴ　ＴＴＧ　ＡＣＧ　ＣＡＧ　Ｔ
ＣＴ　ＣＣＡ　ＧＧＣＡＣＣＣＴＧ　ＴＣＴ　ＴＴＧ　
ＴＣＴ　ＣＣＡ　ＧＧＧ　ＧＧＡ　ＡＧＡ　ＧＣＣＡＣ
ＣＣＴＣＴＣＣＴＧＣＡＧＧ　　ＧＣＣＡＧＴ　ＣＡＧ
　　ＡＧＴ　ＧＴＴ　　ＡＧＣＡＧＣ＾＾Ｔ　ＴＣＣＴ
ＴＡ　　ＧＣＣＴＧＧ　　ＴＡＣＣＡＡ　　ＣＡＧ　　
ＡＡＡＣＣＴ　　ＧＧＣＣＡＧ　　ＧＣＴ　　ＣＣＣＡ
ＧＧ　　ＣＴＣＣＴＣＡＴＣＴＡＴＧＣＴ　　ＧＣＧ　
　ＴＣＣＡＧＣＡＧＧ　　ＧＣＣＡＣＴ　ＧＧＣＡＴＣ
ＣＣＡＧＡＣＡＧＧ　　ＴＴＣＡＧＴ　　ＧＧＣＡＧＴ
　　ＧＧＧ　　ＴＣＴ　　ＧＧＧ　　ＧＣＡＧＡＣＴＴ
ＣＡＣＴ　　ＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＴ　　ＡＧＡ　　
ＣＴＧ　　ＧＡＡＣＣＴ　　ＧＡＡ　　ＧＡＴ　　ＴＣ
Ｔ　　ＧＣＡ　　ＧＴＧ　　ＴＡＴ　　ＴＡＣＴＧＴ　
　ＣＡＧＣＡＧ　　ＴＡＣＧＡＣＧＣＣＣＴＧ 他方、本間血清分ＭＩ型（ＨＩ）に対する抗体について
は、次の様に決定された。

ＧＡＣＡＴＣＣＡＧ　　ＡＴＧ　　ＡＣＣＣＡＧ　　Ｔ
ＣＴ　　ＣＣＡ　　ＴＣＣＴＣＡＣＴＧ　　ＴＣＴ　　
ＧＣＡ　　ＴＣＴ　　ＧＴＡ　　ＧＧＡ　　ＧＡＣＡＧ
Ａ　　ＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＴ　　ＴＧＴ　　ＣＧＧ
　　ＧＣＧ　　ＡＧＴ　　ＣＡＧ　　ＧＡＣＡＴＴ　　
ＡＧＣＡＣＴ　　ＴＡＴ　　ＴＴＡ　　ＧＣＣＴＧＧ　
　ＴＴＴ　　ＣＡＧ　　ＣＡＧ　　ＡＡＧ　　ＣＣＡＧ
ＧＧ　　ＡＡＡ　　ＧＣＣＣＣＣＡＡＧ　　ＴＣＣＣＴ
Ｇ　　ＡＴＣＣＡＧ　　ＧＣＴＧＣＡ　ＴＣＣＡＧＴ　
ＴＴＧ　ＣＡＡ　ＡＧＴ　ＧＧＧ　ＧＴＣＣＣＡ　ＴＣ
ＡＡＡＧ　ＴＴＣＡＧＣＧＧＣＡＧＴ　ＧＧＡ　ＴＣＴ
　ＧＧＧ　ＡＣＡ　ＧＡＴＴＴＣＡＣＴ　ＣＴＣＡＣＣ
ＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧ　ＣＡＧ　ＣＣＴＧＡＡ　Ｇ
ＡＴ　ＴＴＴ　ＧＣＡ　ＡＣＴ　ＴＡＴ　ＴＡＣＴＧＣ
ＣＡＡ　ＣＡＧＴＡＴ　　ＴＡＴ　　ＡＡＴ　　ＴＡＣ
ＣＣＴ　　ＣＧＧ　　ＡＣＴ　　ＴＴＴ　　ＧＧＣＣＡ
ＧＧＧＧ　　ＡＣＣＡＡＧ　　ＣＴＧ　　ＧＡＧ　　Ａ
ＴＣＡＡＡ　　ＣＧＴ本発明のＤＮＡは、所望の抗体を
産生ずる細胞からゲノムＤＮＡを抽出し、これを制限酵
素、剪断力等常用の手段により切断し、これを常法に従
ってクローニング用ベクター、例えばプラスミドｐＢＲ
３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵｃ１３等に挿入し、これら
のプラスミドにより常用の宿主、例えば大腸菌の形質転
換して遺伝子ライブラリーを造成する。次に、このライ
ブラリーを、常用の手段、例えばコロニーハイブリダイ
ゼーションによりスクリーニングする。この場合、Ｃ−
コード領域は、同一のタイプでは共通する塩基配列を含
んでいるので、すでにクローニングされているＣ−コー
ド令頁域ＤＮＡを、例えば３２Ｐにより標識してプロー
ブとして使用することができる。また、すでに知られて
いる配列を有するオリゴヌクレオチドを合成してこれを
用いることもできる。例えば、選択しようとするＤＮＡ
がにタイプの抗体を生産するヒト細胞に由来する場合に
は、３Ｚｐ標識化ヒトＣに遺伝子を使用することにより
、Ｃに一コード領域を含有するゲノムＤＮＡ挿入部を含
むプラスミドを選択することができる。

他の方法においては、所望の抗体を産生ずる細胞からＲ
ＮＡを抽出し、この抽出物をオリゴ−ｄＴカラムで処理
することによりポリＡ”　　ＲＮＡを濃縮する。次に、
常法に従って、このポリＡ（°）ＲＮＡを鋳型として、
これに相補的な第一のｃＤＮＡを合成し、次に鋳型ＲＮ
Ａを分解除去した後前記第−のｃＤＮＡを鋳型として第
二のｃ　ＤＮＡを合成し、２本９ｆｉ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ
を含有するプラスミドを得る。このプラスミドにより、
例えば大腸菌を形質転換することによって遺伝子ライブ
ラリーを作成する。次に、前記の様にしてこのライブラ
リーをスクリーニングすることにより所望のｃＤＮＡ挿
入部を含有するプラスミドを選択することができる。

〔発明の効果〕

本発明により、抗緑膿菌ヒト型抗体のし鎖をコードする
Ｄ　Ｎ　Ａが提供される。このＤＮＡは抗緑膿菌ヒト型
抗体のＨｔＪｆをコードするＤＮＡと組み合わせること
によって、抗緑膿菌ヒト型抗体を製造するために使用す
ることができる。

また、本発明のＤＮＡのＣ−コード領域を除去した後Ｖ
Ｊ−コード領域を他のタイプのＣ−コード領域と連結し
て、これを発現せしめることにより特定の特異性を有す
る任意のタイプのし鎖を調製することができ、さらに、
同様に操作したＨ鎖と共に使用することにより、特定の
特異性を存する任意のクラス及びサブクラスの抗体を製
造することができる。

さらには、本発明のＤＮＡを切断して所望のＤＮＡ部分
のみを発現せしめることにより、任意の抗体断片を得る
ことができる。

次に実施例により、この発明をさらに具体的に説明する
。

特開昭６１−９１１３４号公報に開示された方法に従っ
て緑膿菌Ｆ４に対するモノクローナル抗体産生細胞Ｇ３
　１　　（ＩｇＧｚ／に）を得た。

Ｇ３−１細胞ｌＸｌ０”個をｌＱｍｆの緩衝液中（０，
５Ｍ　ＥＤＴＡ（ｐｉ（８，０）、（００ｔｔｇ／ｍｌ
プロテアーゼＫ（ベーリンガーマンハイム社）、０．５
％サルコシルで５０℃にて３時間処理した後、等量の水
飽和フェノールを加えた。ついで遠心（８０００ｘ　ｇ
、１０分間）により水相を分離し、これを５０ｍＭ）リ
ス塩酸緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）（ｐＨ８，０）　、
１０ｍＭ　ＥＤＴＡ　Ｓｌ　０ｍＭ　ＮａＣ１に対して
透析した。これに加熱処理したりボヌクレアーゼＡ（ベ
ーリンガーマンハイム社）を終濃度が１００μｇ７ｍｌ
になるように加え、３７℃で３時間処理したのち、再度
上記と同様にフェノール抽出、透析を行って７１２μｇ
／ｍ１の染色体ＤＮＡ　（Ｇ３−ＩＤＮＡ）を得た。

（２）　Ｌ　ｆ　’　Ｄ　Ｎ　Ａ　（Ｄ上記Ｇ３−ＩＤ
ＮＡｌ０μｇを、制限酵素ＥｃｏＲＩ、又はＢａｍＨＥ
　　（ニアボンジーン社）のいずれかを用いて３７℃で
２時間消化を行った。

消化後、０．８％アガロースゲル電気泳動を行いＤＮＡ
断片を分離した。ついでここで得られたゲルを０．２５
Ｎ　ＨＣｌ　′ｃ１５分間、０．５ＮＮａＯＨ１，５Ｍ
　Ｎａ（１１で３０分間、Ｏｙ５Ｍ　ＴｒＩｓ　−ＨＣ
ｌ　　（ｐＨ７，４）　−１，５Ｍ　Ｎａｃｌで３０分
間処理した。ライで２０　Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ（０，３Ｍク
エン酸ナトリウム、３ＭＮａＣ１）　’ｆｔ用い、ニト
ロセルロースフィルター（ＳＡＳ社）へＤＮＡをトラン
スファーした。

一方、染色体ＤＮＡ上のヒトに鎖の定常領域（Ｃに）を
コードするコード領域については、塩基配列および制限
酵素ＥｃｏＲＩで消化した場合、約２．５　ｋ　ｂの断
片にＣにコード領域が含まれていることが知られている
（Ｃｅｌｌ、２２．　１９７−２０７（１９８０）　）
。従って、このＣにコード領域を含むＥｃｏＲＩ消化Ｄ
ＮＡ断片を得、２．５　ｋ　ｂ断片０．５μｇをプロー
ブとして使用するためにニックトランスレーションキッ
ト（Ｂ　ＲＬ社）で３２Ｐ標識化した。

そして、これと上記フィルターとのサザンハイブリダイ
ゼーションを行った。このときの結果を第１図に示す、
同図中、薮値は、塩基対の長さを示し、ＥｃｏＲＩおよ
びＢａ５ＨＩは、この制限酵素を用いて消化したことを
意味する。この結果よりＥｃｏＲｌ及びＢａｍＨＩで消
化したＤＮＡ遺伝子については各々、約２．５　ｋｂｐ
および８．５　ｋｂｐにバンドが確認できた。なお、Ｖ
Ｊ再構成していない場合の染色体ＤＮＡはＢａｍＨＩ消
化によれば約１０ｋｂｐにバンドを与えることが知られ
ている〔↑ｈｅＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉ
ｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　ＪＭｌ、　１５１６−
１５２２（１９８２））　、従って、Ｂａａ＋ＨＩ処理
により得られた８、　５　ｋ　ｂのＤＮＡ断片は再構成
されたＶＪ−コード領域及びＣ−コード領域を含むＬ鎖
コード領域を含有するＤＮＡ断片であることが確認され
た。

Ｇ３−ｌＤＮＡ２０．ｃｚｇをＢａｍＨＩで消化したの
ち、１０−４０％シー！糖密度勾配遠心（日立ＲＰＳ　
−４０Ｔ　、　３５ｋｒｐｒａ、１４時間）によりサイ
ズ分画を行った。ついでアガロースゲル電気泳動および
ＤＮＡドットハイフ″リダイゼーションによって目的と
するＤＮＡ画分（ＢａｍＨＩ消化した？、〜９ｋｂ断片
）を回収した（４μｇ／ｍｊり。

他方、プラスミドｐＵｃ１３（ファルマシア社から市販
されている）をＢａｍＨＩで消化し、アルカリ性ホスフ
ァターゼで処理して線状プラスミドを調製した。

次に、これと、上記ＤＮＡ画分との反応をＴ４ＤＮＡリ
ガーゼ（宝酒造）を用い、４℃、−晩行い、得られた組
換えＤＮＡを用いて大腸菌に１２Ｃ６００（ＦＥＲＭ　
ＢＰ−１１５）の形質転換を行ってＧ３−１遺伝子ライ
ブラリー（３Ｘ　Ｉ　Ｏ’ＣＦＵ／μｇ　ＤＮＡ）を作
成した。

Ｌ゛′ＤＮＡのス　１−ニック 形質転換された上記大腸菌５Ｘ１０’個をコロニーハイ
ブリダイゼーション法〔底置ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣ１ｏ
ｎｉｎｇ　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｎｕａｌ
）に従って、前記の３２ｐ標識化ヒトＣに遺伝子をプロ
ーブとして用いて、Ｌ鎖をコードするＤＮＡ断片が挿入
されたプラスミドを選択し、このプラスミドをｐＧ３１
Ｖにと命名した。

Ｍ　　　　　　　　　Ｇ３１ＶＫ−ｔ（７）ｉ。＋Ｉｐ
ＳＶ２−ｇｐｔ　（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓ
ｃｉ、、ＵＳＡ、７８．２０７２（１９８１）　；ボー
ルバーブ氏より入手〕をＢａｍＨＩで消化した断片と、
Ｉ）Ｇ３１ＶＫをＢａｍＨＩで消化した断片とを常法に
従って連結し、Ｌ鎖遺伝子を含むプラスミドｐＧ３１Ｖ
Ｋ−ｇＰｔを得た。そしてこのプラスミドは実施例１と
同様な方法でＬ鎖遺伝子が入っていることを確認した。

このプラスミドを含有する大腸菌ニジエリシャ’コリ（
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）Ｋ１２Ｃ６００（
ｐＧ３１ＶＫ−ｇ＋）ｔ）は工業技術院微生物工業技術
研究所に微工研菌寄第８９０５号（ＦＥＲＭ　Ｐ−８９
０５）として寄託されている。

実流■１ＭＭｆｌＪ３Ｊｌ！　”ｔ　’；Ｚ　（７）１
戊上記プラスミドｐＧ３１ＶＫを制限酵素ＥｃｏＲＩ　
。

ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄ　ＩＩＩにソボンジーン社）
で消化し、切断パターンの解析を行った。また、可変領
域（ＶＪ）を含むＨｉｎｄＩ［［断片（約２．９ｋｂ）
をプラスミドｐ［Ｉｃ１３（ファルマシア社）のＨｉｎ
ｄＩ［ｒサイトへクローニングした（以下ここで得られ
たプラスミドはｐＧ３１ＶＫ　−Ｈ２とする）　、　ｐ
Ｇ３１ＶＫ−Ｈ２を制限酵素５ｓｔＩ、ＰｓｔＩ、又は
ＮｃｏＩ　にソポンジーン社）で消化し、制限酵素切断
点地図を作成した。そのときの結果を第２図に示す。こ
の図中、ＶＪは可変領域をコードするコード領域を示し
、Ｃには定常領域をコードするコード領域を示す。

最上段の数値はＤＮＡ断片の長さを示す。

この図から明らかな様に、このＤＮＡ断片は完全なＶＪ
ココー領域及びＣにコード領域を含んで成る。

ｐＧ３１ＶＫ　−Ｈ２を制限酵素Ｐｓｔｌで消化して得
られる断片を、プラスミドｐＵｃ１３のＰｓｔ１部位ヘ
リクローニングした。このリクローニングで得られるプ
ラスミドの制限酵素ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄ［［部位
、またｐＧ３１Ｖに−Ｈ２の制限酵素Ｎｃｏ１部位を３
２ｐ標識したのち、マキサム・ギルバート法ＣＭｅ　ｔ
ｈｏｄｓｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、６５．４９９−
５６０（１９８０））により、塩基配列の決定を行った
。

（２）デー　−の” 塩基配列決定の結果を第３図に示す。第３−１図及び３
−２図はＶＪ−コード領域及びその近傍の塩基配列を示
す。この配列は５′非コ一ド頭域、リーダー配列（して
示す）、■−コード領域（Ｖで示す）、Ｊ−コード領域
（Ｊで示す）、及びそれに続く３′−非コード領域を含
む。

塩基配列下段の一文字のアルファヘットは、アミノ酸の
略号であって下記を音吐する。

Ｎ：Ａｓｎ　　　　５ｉｓｅｒ Ｄ　：　Ａｓｐ　　　　Ｅ　：　ＧｌｕＣ：　Ｃｙｓ　
　　　Ｐ　：　Ｐｒ。

Ｌ：Ｌｅｕ　　　　Ｈ：Ｈｉｓ Ｇ：ＧＩｙ　　　　Ｙ：Ｔｙｒ Ｖ　：　Ｖａｌ　　　　Ｍ　：　Ｍｅｔｌ：ＩＩｅ　　
　　　　Ａ：ＡＩａ Ｋ：Ｌｙｓ　　　　Ｑ：ＧＩｎ Ｒ：Ａｒｇ　　　　Ｗ：Ｔｒｐ Ｆ：Ｐｈｅ また、アミノ酸配列中、二重下線を付された部分は、抗
原の結合に必要とされる領域である。

ヒト免疫グロブリンに鎖のｙ　％ｉ域は、大きく４つの
サブグループに分類されている〔たとえば、日本生化学
会編、生化学データブックＵ　ｐ１０２２）。

そして、本発明により決定された領域は、サブグループ
ＩＩＩに属することが示唆される。そして塩基配列の下
のアルファベット中口で囲んでいるものは、サブグルー
プＩＩＩに特徴的なアミノ酸である。

なお、塩基配列の上には塩基階を示しており、８２１位
のＳｅｒは、本来のサブグループ■ではＰｈｅであるこ
と以外は全てサブグループ■と同一である。

特開昭６１−９１１３４号公ｔａａこ開示された方法に
従って緑膿菌本間血清分ＩＩ型（ＨＩ）に対するモノク
ローナル抗体産生細胞Ｈ７２（ＩｇＧｚ／に）を得た。

Ｈ７−２細胞１×１０８個をｌＱｍｊ！の緩衝液中（０
，５Ｍ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８，０）、１００μｇ／ｍｆｆ
プロテアーゼＫ（ベーリンガーマンハイム社）、０．５
％サルコシルで５０℃にて３時間処理した後、等量の水
飽和フェノールを加えた。ついで遠心（８０００Ｘ　ｇ
、１０分間）により水相を分離し、これを５０ｍＭトリ
ス塩酸緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）（ｐＨ８，０）　、
１０ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　１０ｍＭ　ＮａＣ１に対して
透析した。これに加熱処理したりボヌクレアーゼＡ（ベ
ーリンガーマンハイム社）を終濃度が１００μｇ／ｍｌ
になるように加え、３７℃で３時間処理したのち、再度
上記と同様にフェノール抽出、透析を行って７１０μｇ
７ｍｌの染色体ＤＮＡ　（Ｈ７−２ＤＮＡ）を得た。

（２Ｌｔ”ＤＮＡの 上記Ｈ７−２ＤＮＡ１０μｇを、制限酵素Ｅｃ。

Ｒ１、又はＢａｍＨＩ　　にッポンジーン社）のいずれ
かを用いて３７℃で２時間消化を行った。消化後、０．
８％アガロースゲル電気泳動を行いＤＮＡ断片を分離し
た。ついでここで得られたゲルを０．２５Ｎ　ＨＣｌで
１５分間、０．５　Ｎ　ＮａＯＨ−１，５ＭＮａＣｌで
３０分間、０．５　Ｍ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣｊ！　　（ｐ
Ｈ７，４）−１，５Ｍ　ＮａＣ１で３０分間処理した。

ついで２０Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ（０，３Ｍクエン酸ナトリウ
ム、３　Ｍ　Ｎａ１Ｊ　）ヲ用い、ニトロセルロースフ
ィルター （Ｓ＆Ｓ社）へＤＮＡをトランスファーした。

一方、染色体ＤＮＡ上のヒトに鎖の定常領域（Ｃに）を
コードするコード領域については、塩基配列および制限
酵素ＥｃｏＲＩで消化した場合、約２．５　ｋ　ｂの断
片にＣにコード領域が含まれていることが知られている
（Ｃｅ１１　、２２　、　１９７−２０７（１９８０）
　）。従って、このＣにコード領域を含むＥｃｏＲＩ消
化ＤＮＡ断片を得、２．５　ｋ　ｂ断片０．５μｇをプ
ローブとして使用するためにニックト、ランスレーショ
ンキフト（Ｂ　ＲＬ社）で３２ｐ標識化した。

そして、これと上記フィルターとのサザンハイブリダイ
ゼーションを行った。このときの結果を第４図に示す。

同図中、数値は、塩基対の長さを示し、ＥｃｏＲＩおよ
びＢａｍＨＩは、この制限酵素を用いて消化したことを
意味する。この結果よりＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで消
化したＤＮＡ遺伝子については各々、約２．５ｋｂｐお
よび８．５　ｋｂｐにバンドが確認できた。なお、ＶＪ
再構成していない場合の染色体ＤＮＡはＢａｍＨＩ消化
によれば約１０ｋｂｐにバンドを与えることが知られて
いる（ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃ
ａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＋　２５７＋　１５１６−１
５２２（１９８２））　、従って、Ｂ、ａｍＨＩ処理に
より得られた８、　５　ｋ　ｂのＤＮＡ断片は再構成さ
れたＶＪ−コード領域及びＣ−コード領域を含むＬ鎖コ
ード領域を含有するＤＮＡ断片であることが確認された
。

Ｒ７２ＤＮＡ１０μｇをＢａｍＨＩで消化したのち、０
．８％アガロースゲル電気泳動を行い、目的とするＩ）
ＮＡ画分（ＢａｍＨＩで消化した７〜９Ｋｂ断片）を回
収した（１．１　Ａｌ　ｇ／ｍｌ　）。

他方、プラスミドｐＵｃ１３（ファルマシア社から市販
されている）をＢａｍＨＴで消化し、アルカリ性ホスフ
ァターゼで処理して線状プラスミドを調製した。

次に、これと、上記Ｄ　Ｎ　Ａ画分との反応をＴ４ＤＮ
Ａリガーゼ（宝酒造）を用い、４℃、−晩行い、得られ
た組換えＤＮＡを用いて大腸菌に１２Ｃ６００（ＦＥＲ
Ｍ　ＢＰ−１１５）の形質転換を行ってＲ７−２遺伝子
ライブラリー　（２，５Ｘ　１０　’ＣＦＩＪ／μｇＤ
ＮＡ）を作成した。

（２）Ｌｆ”ＤＮＡのスクリーニング 形質転換された上記大腸菌５ｘｔｏ’個をコロニーハイ
ブリダイゼーション法〔成１ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣ１ｏ
ｎｉｎｇ　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｎｕａｌ
）に従って、前記の３２ｐ標識化ヒトＣに遺伝子をプロ
ーブとして用いて、Ｌ鎖をコードするＤＮＡ断片が挿入
されたプラスミドを選択し、このプラスミドをｐＨ７２
３２Ｌと命名した。

実見±１Ｈ７２３２Ｌ−ｎｅｏのＪ！ＬＩ１１′！ｐＳ
Ｖ２−ｎｅｏ　（Ｊ、Ｍｏ１．＾ｐｐ１．Ｇｅｎｅｔ、
　、土、３２７（１９Ｂ２）　；ボールバーブ氏より入
手〕をＢａｍＨＩで消化した断片と、ｐＩ（７２３２Ｌ
をＢａｍＨＩで消化した断片とを常法に従って連結し、
Ｌ鎖遺伝子を含むプラスミドｐＨ７２３２Ｌ−ｎｅｏを
得た。そしてこのプラスミドは実施例１と同様な方法で
Ｌ鎖遺伝子が入っていることを６’ｌ　Ｌ’ｌした。こ
のプラスミドを含有する大腸菌ニジエリシャ・コリ　（
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　Ｃｏ１１）Ｋ１２Ｃ６００（
ｐｔ（７２３２Ｌ−ｎｅｏ）は工業技術院微生物工業技
術研究所に微工研菌寄第９２８６号（ＦＥＲＭ　Ｐ−９
２８６）として寄託されている。

≦５！ｌ紅ｄり１１−ｆコニ　１　　−　　占ｌ　・・
の上記プラスミドｐｌ＋７２３２Ｌを制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉ　。

ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄ　ｍ　　にソボンジーン社）
で消化し、切断パターンの解析を行った。また、可変領
域（ＶＪ）を含むＨｉｎｄＩＩ［断片（約２．９ｋｂ）
をプラスミドｐＵｃ１３（ファルマシア社）のＨｉｎｄ
ＩＩｌサイトへクローニングした（以下ここで得られた
プラスミドはｐＨ７２３２Ｌ−６とする）。ｐＨ７２３
２Ｌ−６を制限酵素５ｓｔＩ、Ｐｓｔ　Ｉ　、　Ｂｓｔ
Ｅ　Ｕ又はＮｃｏｌ（二、ポンジーン社）で消化し、制
限酵素切断点地図を作成した。そのときの結果を第５図
に示す。

この図中、ＶＪは可変領域をコードするコード領域を示
し、Ｃには定常領域をコードするコード領域を示す。最
上段の数値はＤＮＡ断片の長さを示す。

この図から明らかな様に、このＤＮＡ断片は完全なＶＪ
ココー領域及びＣにコード領域を含んで成る。

ｐＨ７２３２Ｌ−６を制限酵素ＰｓｔＩで消化して得ら
れる断片を、プラスミドｐＨｃ１３のＰｓ口部位ヘリク
ローニングした。このリクローニングで得られるプラス
ミドの制限酵素ＢａｍＨＩおよびＨ４ｎｄＩｆｆ部位、
またｐＨ７２３２Ｌ−６の制限酵素ＮｃｏＩ部位を３２
ｐ標識したのち、マキサム・ギルバート法ＣＭｅｔｈｏ
ｄｓｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、６５，４９９−５６
０（１９８０））により、塩基配列の決定を行った。

（２）デー　−の７ 塩基配列決定の結果を第６図に示す。この配列は５′非
コード領域、リーダー配列、■−コード領域、Ｊ−コー
ド領域、及びそれに続く３′−非コード領域を含む。

第６図中の記号は第３図中のそれと同し意味を存する。

このアミノ酸配列よりこの可変領域は日本生化学全編、
生化学データブックｎ　ｐｐ１０２２やＥ、＾、Ｋａｂ
ａｔ等の編集した５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅ
ｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌ−ｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔ
ｅｒｅｓｔ（１９８３）（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔ
ｉｔｕｔｅｓ　ｏｆＨｅａｌｔハ、　Ｂｅｔｈｅｓｄａ
）よりグループＩに属する。

【図面の簡単な説明】 第１図は、フィッシャータイプＦ４に対する抗体をコー
ドする遺伝子のスクリーニングにおけるサザンハイプリ
ダイゼーションのオートラジオダラム結果を示す。 第２図は、フィソンヤータイプＦ、に対する抗体のし鎖
をコードするＤＮＡを含むＤＮＡ断片の制限酵素切断地
図を示す。 第３−１図及び第３−２図は、フィッシャータイプＦ４
に対する抗体の可変領域をコードするＤＮＡ及びその近
傍の塩基配列を示す。 第４図は、本間血清分頚Ｉ型（ＨＩ）に対する抗体をコ
ートする遺伝子のスクリーニングにおけるサザンハイプ
リダイゼーションのオートラジオダラム結果を示す。 第５図は、木間血清分ｉｌ型（ＨＩ）に対する抗体のし
鎖をコードするＤＮＡを含むＤ　Ｎ　Ａ断片の制限酵素
切断地図を示す。 第６図は、木間血清分類Ｉ型（ＨＩ）に対する抗体の可
変領域をコードするＤＮＡ及びその近傍の塩基配列を示
す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、抗緑膿菌ヒト型抗体のＬ鎖をコードするコード領域
   を含んで成るＤＮＡ。 ２、前記コード領域が可変領域をコードするコード領域
   及び定常領域をコードするコード領域から成る、特許請
   求の範囲第１項に記載のＤＮＡ。 ３、前記定常領域がκタイプ又はλタイプである、特許
   請求の範囲第２項に記載のＤＮＡ。 ４、前記可変領域が緑膿菌Ｆ＿４タイプを認識する領域
   である、特許請求の範囲第２項に記載のＤＮＡ。 ５、前記可変領域が次のアミノ酸配列： 【アミノ酸配列があります】 を有する、特許請求の範囲第４項に記載のＤＮＡ。 ６、前記アミノ酸配列が次の塩基配列： 【アミノ酸配列があります】 によりコードされている特許請求の範囲第５項に記載の
   ＤＮＡ。 ７、前記可変領域が緑膿菌本間血清型分類 I 型（Ｈ I
   タイプ）を認識する領域である、特許請求の範囲第２
   項に記載のＤＮＡ。 ８、前記可変領域が次のアミノ酸配列： 【アミノ酸配列があります】 を有する、特許請求の範囲第７項に記載のＤＮＡ。 ９、前記アミノ酸配列が次の塩基配列： 【アミノ酸配列があります】 によりコードされている特許請求の範囲第８項に記載の
   ＤＮＡ。 １０、抗緑膿菌ヒト型抗体のＬ鎖の可変領域をコードす
   るコード領域を含んで成るＤＮＡ。 １１、前記可変領域が緑膿菌Ｆ＿４タイプを認識する領
   域である特許請求の範囲第１０項に記載のＤＮＡ。 １２、前記可変領域が次のアミノ酸配列： 【アミノ酸配列があります】 を有する、特許請求の範囲第１１項に記載のＤＮＡ。 １３、前記アミノ酸配列が次の塩基配列： 【アミノ酸配列があります】 によりコードされている、特許請求の範囲第１２項に記
   載のＤＮＡ。 １４、前記可変領域がグループIIIに属する特許請求の
   範囲第１０項に記載のＤＮＡ。 １５、前記可変領域が緑膿菌本間血清型分類 I 型（Ｈ
   I タイプ）を認識する領域である特許請求の範囲第１
   ０項に記載のＤＮＡ。 １６、前記可変領域が次のアミノ酸配列： 【アミノ酸配列があります】 を有する、特許請求の範囲第１５項に記載のＤＮＡ。 １７、前記アミノ酸配列が次の塩基配列： 【アミノ酸配列があります】 によりコードされている、特許請求の範囲第１６項に記
   載のＤＮＡ。 １８、前記可変領域がグループ I に属する特許請求範
   囲第１５項に記載のＤＮＡ。