JP2022543551A - Ｇｐｒｃ５ｄに結合する抗体 - Google Patents

Ｇｐｒｃ５ｄに結合する抗体 Download PDF

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ウェイ シュイ，
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エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト
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Abstract

本発明は、全般的に、例えば、Ｔ細胞を活性化するための、二重特異性抗原結合分子を含む、ＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体に関する。加えて、本発明は、そのような抗体をコードするポリヌクレオチド、並びにそのようなポリヌクレオチドを含むベクター及び宿主細胞に関する。本発明は、さらに、同抗体を生成するための方法、及び同抗体を疾患の治療に使用する方法に関する。【選択図】なし

Description

発明の分野
本発明は一般に、強力な抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）／抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）を媒介するように糖鎖工学Ｆｃ部分を有するＩｇＧ分子を含む、ＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体に関する。加えて、本発明は、そのような抗体をコードするポリヌクレオチド、並びにそのようなポリヌクレオチドを含むベクター及び宿主細胞に関する。本発明は、更に、同抗体を産生するための方法、及び同抗体を疾患の治療に使用する方法に関する。
背景
自己免疫疾患は、形質細胞によって分泌される自己抗体を特徴とする。自己抗体は、診断基準及び予後基準を提供し、疾患の病因において必要な役割を果たし、疾患活性の代理マーカーとして役立つ（Ｍａｒｔｉｎ ａｎｄ Ｃｈａｎ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２００４，２０（５））。したがって、自己反応性形質細胞の効果的な枯渇は、これらの疾患の治癒的治療の鍵となり得る。
ＧＰＲＣ５Ｄ（Ｇタンパク質共役受容体、クラスＣグループ５メンバーＤ）は、多発性骨髄腫の形質細胞によって発現される特異的表面タンパク質であり、自己免疫における形質細胞上の関連標的でもあり得る。ＧＰＲＣ５Ｄは、多発性骨髄腫患者の予後及び腫瘍量に関連することが報告されている（Ａｔａｍａｎｉｕｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ５Ｄ ｉｎ ｔｈｅ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐｏｏｒ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ．Ｅｕｒ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，２０１２．４２（９）：ｐ．９５３－６０；及びＣｏｈｅｎ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，ＧＰＲＣ５Ｄ ｉｓ ａ ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｔｈｅ ｔｕｍｏｒ ｌｏａｄ ａｎｄ ｔｏ ｔａｒｇｅｔ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ ｃｅｌｌｓ．Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，２０１３．１８（６）：ｐ．３４８－５１）。
ＧＰＲＣ５Ｄは、ヒト及びヒトのがんにおいて既知のリガンド又は機能を有しないオーファン受容体である。染色体１２ｐ１３．３にマッピングされるＧＰＲＣ５Ｄコード遺伝子は、３つのエクソンを含み、約９．６ｋｂに及ぶ（Ｂｒａｕｎｅｒ－Ｏｓｂｏｒｎｅ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｕｍａｎ ｏｒｐｈａｎ ｆａｍｉｌｙ Ｃ Ｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＧＰＲＣ５Ｄ．Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ，２００１．１５１８（３）：ｐ．２３７－４８）。大きな第１のエクソンは、７回膜貫通ドメインをコードする。しかし、ＧＰＲＣ５Ｄの生物学はほとんど知られていない。ＧＰＲＣ５Ｄは、動物の毛包のケラチン形成に関与することが示されている（Ｇａｏ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｆｅｔａｌ Ｓｋｉｎ Ｒｅｖｅａｌｓ Ｋｅｙ Ｇｅｎｅｓ Ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ Ｈａｉｒ Ｆｏｌｌｉｃｌｅ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ Ｃａｓｈｍｅｒｅ Ｇｏａｔｓ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，２０１６．１１（３）：ｐ．ｅ０１５１１１８；及びＩｎｏｕｅ，Ｓ．，Ｔ．Ｎａｍｂｕ，ａｎｄ Ｔ．Ｓｈｉｍｏｍｕｒａ，Ｔｈｅ ＲＡＩＧ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ，ＧＰＲＣ５Ｄ，ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｈａｒｄ－ｋｅｒａｔｉｎｉｚｅｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ．Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ，２００４．１２２（３）：ｐ．５６５－７３）。国際公開第２０１８／０１７７８６号Ａ２は、ＧＰＲＣ５Ｄ特異的抗体又は抗原結合断片を開示している。
がん、特に多発性骨髄腫及び自己免疫疾患を治療するための更なる薬物が必要とされている。この目的のために特に有用な薬物には、ＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体が含まれる。本発明は、ヒトＧＰＲＣ５Ｄに特異的に結合し、自己免疫疾患に関連してＧＰＲＣ５Ｄ陽性（形質又はＢ）細胞及びがんに関連してＧＰＲＣ５Ｄ発現悪性多発性骨髄腫形質細胞のＡＤＣＣ／ＡＤＣＰ媒介性枯渇を誘導することができる新規抗体を提供する。
発明の概要
本発明者らは、ＧＰＲＣ５Ｄに結合する予想外の改善された特性を有する新規抗体を開発した。更に、本発明者らは、ＧＰＲＣ５Ｄに結合する糖鎖工学抗体を開発した。
第１の態様において、本発明は、ＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体であって、（ｉ）（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、並びに（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｅ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；又は、（ｉｉ）（ａ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、並びに（ｄ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｅ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｆ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む、抗体を提供する。
一実施形態では、抗体は、（ｉ）（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、並びに（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｅ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；又は、（ｉｉ）（ａ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、並びに（ｄ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｅ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｆ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。
別の実施形態では、抗体は、ＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体断片である。
別の実施形態では、抗体は、（ｉ）配列番号１３の重鎖可変ドメインフレームワーク配列及び／若しくは配列番号１４の軽鎖可変ドメインフレームワーク配列；又は、（ｉｉ）配列番号１５の重鎖可変ドメインフレームワーク配列及び／若しくは配列番号１６の軽鎖可変ドメインフレームワーク配列を更に含む。
別の実施形態では、抗体は、（ａ）配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨ配列、（ｂ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬ配列、並びに（ｃ）（ａ）に定義されるＶＨ配列及び（ｂ）に定義されるＶＬ配列からなる群から選択される配列を含む。
別の実施形態では、抗体は、（ａ）配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨ配列、（ｂ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬ配列、並びに（ｃ）（ａ）に定義されるＶＨ配列及び（ｂ）に定義されるＶＬ配列からなる群から選択される配列を含む。
別の実施形態では、抗体は、配列番号１３のＶＨ配列及び配列番号１４のＶＬ配列；又は配列番号１５のＶＨ配列及び配列番号１６のＶＬ配列を含む。
更なる態様において、本発明は、配列番号１３のＶＨ配列及び配列番号１４のＶＬ配列を含むか、又は配列番号１５のＶＨ配列及び配列番号１６のＶＬ配列を含む、ＧＰＲＣ５Ｄに特異的に結合する抗体を提供する。
別の実施形態では、抗体は、ＩｇＧ抗体である。別の実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１抗体である。別の実施形態では、抗体は、全長抗体である。別の実施形態では、抗体は、多重特異性抗体である。
別の実施形態では、抗体は、配列番号９８の軽鎖及び配列番号９９の重鎖を含むか、又は配列番号１００の軽鎖及び配列番号１０１の重鎖を含む。
更なる態様では、本発明は、本明細書に開示される抗体と、細胞傷害剤とを含むイムノコンジュゲートを提供する。
更なる態様では、本発明は、本明細書に開示される抗体又はイムノコンジュゲートをコードする１つ又は複数の単離された核酸を提供する。更なる態様では、本発明は、本明細書に記載の１つ又は複数の核酸を含む宿主細胞を提供する。別の態様では、本発明は、ＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又はイムノコンジュゲートを産生する方法であって、抗体の発現に適した条件下で本明細書に記載の宿主細胞を培養することを含む、方法を提供する。別の実施形態では、本方法は、抗体又はイムノコンジュゲートを宿主細胞から回収することを更に含む。
別の態様では、本発明は、本明細書に開示される方法によって産生される抗体又はイムノコンジュゲートを提供する。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の抗体又はイムノコンジュゲート及び薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物を提供する。
別の実施形態では、医薬組成物は、追加の治療剤を更に含む。別の態様では、本発明は、医薬としての使用のための本明細書に記載の抗体又は医薬組成物を提供する。別の態様では、本発明は、疾患の治療での使用のための本明細書に記載の抗体又は医薬組成物を提供する。疾患はがんであり得る。がんは多発性骨髄腫であり得る。疾患は自己免疫疾患であり得る。自己免疫疾患は、全身性エリテマトーデス及び／又は関節リウマチなどの自己免疫疾患及びその他であり得る。
更なる態様では、本発明は、疾患、特にがん又は自己免疫疾患の治療のための医薬の製造における本明細書に記載の抗体若しくはイムノコンジュゲート又は医薬組成物の使用を提供する。がんは多発性骨髄腫であり得る。自己免疫疾患は、全身性エリテマトーデス及び／又は関節リウマチ及びその他によって起こり得る。
更なる態様では、本発明は、ＧＰＲＣ５Ｄ陽性細胞のＡＤＣＣ／ＡＤＣＰ媒介性枯渇を誘導するための医薬の製造における本明細書に記載の抗体若しくはイムノコンジュゲート又は医薬組成物の使用を提供する。
更なる態様では、本発明は、がん又は自己免疫疾患を有する個体を治療する方法であって、有効量の本明細書に記載の抗体若しくはイムノコンジュゲート又は医薬組成物を個体に投与することを含む、方法を提供する。
更なる態様では、本発明は、個体におけるＧＰＲＣ５Ｄ陽性細胞のＡＤＣＣ／ＡＤＣＰ媒介性枯渇の方法であって、有効量の本明細書に記載の抗体若しくはイムノコンジュゲート又は医薬組成物を個体に投与して、ＧＰＲＣ５Ｄ陽性細胞のＡＤＣＣ／ＡＤＣＰ媒介性枯渇を誘導することを含む、方法を提供する。
上記の態様及び実施形態のいずれかにおいて、個体は、好ましくは哺乳動物であり、特にヒトである。
本発明の二重特異性抗原結合分子の例示的構成。（図１Ａ、図２Ｄ）「１＋１ ＣｒｏｓｓＭａｂ」分子の図である。（図１Ｂ、図１Ｅ）Ｃｒｏｓｓｆａｂ成分とＦａｂ成分の順序が異なる（「反転型」）「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図である。（図１Ｃ、図１Ｆ）「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図である。（図１Ｇ、図１Ｋ）Ｃｒｏｓｓｆａｂ成分とＦａｂ成分の順序が異なる（「反転型」）「１＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図である。（図１Ｈ、図１Ｌ）「１＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図である。（図１Ｉ、図１Ｍ）２個のＣｒｏｓｓＦａｂを有する「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図である。（図１Ｊ、図１Ｎ）２個のＣｒｏｓｓＦａｂ並びに順序が異なるＣｒｏｓｓｆａｂ成分及びＦａｂ成分（「反転型」）を有する「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図である。（図１Ｏ、図１Ｓ）「Ｆａｂ－Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図である。（図１Ｐ、図１Ｔ）「Ｃｒｏｓｓｆａｂ－Ｆａｂ」分子の図である。（図１Ｑ、図１Ｕ）「（Ｆａｂ）２－Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図である。（図１Ｒ、図１Ｖ）「Ｃｒｏｓｓｆａｂ－（Ｆａｂ）２」分子の図である。（図１Ｗ、図１Ｙ）「Ｆａｂ－（Ｃｒｏｓｓｆａｂ）２」分子の図である。（図１Ｘ、図１Ｚ）「（Ｃｒｏｓｓｆａｂ）２－Ｆａｂ」分子の図である。黒点：ヘテロ二量体化を促進するＦｃドメインにおける任意の修飾。＋＋、－－：ＣＨ１及びＣＬドメインにおいて任意に導入される反対の電荷のアミノ酸。Ｃｒｏｓｓｆａｂ分子は、ＶＨ領域とＶＬ領域の交換を含むものとして示されるが、ＣＨ１ドメイン及びＣＬドメインに電荷修飾が導入されていない実施形態では、代替的にＣＨ１ドメインとＣＬドメインの交換を含む。 ＲＮＡｓｅｑによる形質細胞及びＢ細胞上の腫瘍標的の遺伝子発現の分析。 本発明の５Ｅ１１二重特異性抗原結合分子の例示的構成。黒点：ヘテロ二量体化を促進するＦｃドメインにおける任意の修飾。＋＋、－－：ＣＨ１及びＣＬドメインにおいて任意に導入される反対の電荷のアミノ酸。 ＧＰＲＣ５Ｄ発現多発性骨髄腫細胞株ＡＭＯ－１、Ｌ６３６、ＮＣＩ－Ｈ９２９、ＲＰＭＩ－８２２６、ＯＰＭ－２及び対照細胞ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２に対する二重特異性抗原結合分子５Ｆ１１－ＴＣＢ（図４Ａ）及び５Ｅ１１－ＴＣＢ（図４Ｂ）及び対照抗体ＥＴ１５０－５－ＴＣＢ（図４Ｃ）の結合分析。 多発性骨髄腫細胞株ＡＭＯ－１（図５Ａ）、ＮＣＩ－Ｈ９２９（図５Ｂ）、ＲＰＭＩ－８２２６（図５Ｃ）及びＬ３６３（図５Ｄ）に対するＧＰＲＣ５Ｄ－ＴＣＢ媒介Ｔ細胞細胞傷害性の分析。対照細胞株は、ＷＳＵ－ＤＬ ＣＬ２（図５Ｅ）である。試験分子：５Ｅ１１－ＴＣＢ、５Ｆ１１－ＴＣＢ。対照分子：ＤＰ４７－ＴＣＢ（非標的化）及びＥＴ１５０－５－ＴＣＢ。 ＧＰＲＣ５Ｄ－ＴＣＢ活性化Ｔ細胞の、ＣＤ２５及びＣＤ６９を上方制御する多発性骨髄腫細胞株ＮＣＩ－Ｈ９２９及び陰性対照細胞株ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２との結合の分析。 Ｔ細胞活性化は、ＡＭＯ－１（図７Ａ）、ＮＣＩ－Ｈ９２９（図７Ｂ）、ＲＰＭＩ－８２２６（図７Ｃ）、Ｌ３６３（図７Ｄ）及びＷＳＵ－ＤＬＣＬ２（図７Ｅ）の存在下でのＴ細胞の漸増濃度のＧＰＲＣ５Ｄ－ＴＣＢ又は陰性対照ＤＰ４７－ＴＣＢとのインキュベーション時に、ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＤ２５の上方制御によって決定され、ＡＭＯ－１（図７Ｆ）、ＮＣＩ－Ｈ９２９（図７Ｇ）、ＲＰＭＩ－８２２６（図７Ｈ）、Ｌ３６３（図７Ｉ）及びＷＳＵ－ＤＬＣＬ２（図７Ｊ）のいずれかの存在下での漸増濃度のＧＰＲＣ５Ｄ－ＴＣＢ又は陰性対照ＤＰ４７－ＴＣＢとのＴ細胞のインキュベーション時に、ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＤ６９の上方制御によって決定される。 蛍光共焦点顕微鏡法（図８Ａ）による抗体局在化及び内在化の可視化並びに膜対細胞質のシグナル強度の分析（図８Ｂ）。 ヒトＧＰＲＣ５Ｄ（クローン１２）又はカニクイザルＧＰＲＣ５Ｄ（クローン１３）、マウスＧＰＲＣ５Ｄ（クローン４）又はヒトＧＰＲＣ５Ａ（クローン３０）のいずれかを発現する安定にトランスフェクトされたＣＨＯクローンを使用して、ヒト、カニクイザル及びマウスＧＰＲＣ５Ｄに対する異なる抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体の結合をＥＬＩＳＡによって評価した。 ２０時間のコインキュベーション中に異なるＧＰＲＣ５Ｄ又はＢＣＭＡ標的化Ｔ細胞二重特異性分子によって誘導された様々な多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞株のＴ細胞媒介性溶解（Ｅ：Ｔ＝１０：１、ヒトｐａｎ Ｔ細胞）。ＳＤと共に二連が示されている。 同種異系ｐａｎヒトＴ細胞と健常ドナー由来の未処理骨髄細胞（Ｅ：Ｔ＝１０：１、ヒトｐａｎ Ｔ細胞）との約２０時間の共インキュベーション中に、異なるＧＰＲＣ５Ｄ又はＢＣＭＡ標的化Ｔ細胞二重特異性分子（図１１Ａの５Ｅ１１－ＴＣＢ；図１１Ｂの５Ｆ１１－ＴＣＢ；図１１Ｃの１０Ｂ１０－ＴＣＢ；図１１ＤのＢＣＭＡ－ＴＣＢ；図１１ＥのＢ７２－ＴＣＢ；図１１ＦのＤＰ４７－ＴＣＢ）によって誘導されるＴ細胞活性化。ＣＤ４ Ｔ細胞（上段）又はＣＤ８ Ｔ細胞（下段）上の活性化マーカーＣＤ６９の上方制御を、全てのＣＤ４それぞれのＣＤ８ Ｔ細胞の中の陽性細胞のパーセントとして示す、１人の代表的なドナーからのＦＡＣＳドットプロットが示されている。 同種異系ｐａｎヒトＴ細胞と健常ドナー由来の未処理骨髄細胞（Ｅ：Ｔ＝１０：１、ヒトｐａｎ Ｔ細胞）との約２０時間の共インキュベーション中に、異なるＧＰＲＣ５Ｄ又はＢＣＭＡ標的化Ｔ細胞二重特異性分子によって誘導されるＴ細胞活性化。５０ｎＭのＴＣＢ（図１２Ａ）又は５ｎＭ（図１２Ｂ）のいずれかの選択された固定用量でＣＤ８ Ｔ細胞上の活性化マーカーＣＤ６９の上方制御を示す、４人の評価されたドナー全ての要約が示されている。 ＮＣＩ－Ｈ９２９腫瘍細胞を移植したヒト化ＮＳＧマウスのモデルにおける経時的な腫瘍増殖速度論によって示されるように、異なるＧＰＲＣ５Ｄ標的化Ｔ細胞二重特異性分子（図１３Ａの５Ｆ１１－ＴＣＢ；図１３ＢのＢＣＭＡ－ＴＣＢ；図１３ＣのＢ７２－ＴＣＢ；図１３Ｄのビヒクル）によって誘導されるインビボ有効性。スパイダーグラフがプロットされ、各線は１匹のマウスを指している。 ＯＰＭ－２腫瘍細胞を移植したヒト化ＮＳＧマウスのモデルにおける経時的な腫瘍増殖速度論によって示されるように、異なるＧＰＲＣ５Ｄ標的化Ｔ細胞二重特異性分子（図１４Ａの５Ｆ１１－ＴＣＢ；図１４Ｂの５Ｅ１１－ＴＣＢ；図１４ＣのＢ７２－ＴＣＢ；図１４Ｄのビヒクル）によって誘導されるインビボ有効性。スパイダーグラフがプロットされ、各線は１匹のマウスを指している。 発光によって決定される、約１６時間のインキュベーション後のＰＧＬＡＬＡ－ＣＡＲ－Ｊ活性化。後者は、ＧＰＲＣ５Ｄ発現多発性骨髄腫細胞株Ｌ－３６３へのＧＰＲＣ５Ｄ ＩｇＧ（図１５Ａの５Ｆ１１－ＩｇＧ；図１５Ｂの５Ｅ１１－ＩｇＧ）、及びＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーター細胞へのＰＧＬＡＬＡ修飾Ｆｃドメインの同時結合時に誘導され、これらは、これらのＩｇＧ分子のＦｃ部分におけるＰＧＬＡＬＡ突然変異に対するＴＣＲを発現するように遺伝子操作された。ＳＤと共に二連が示されている。 ＮＣＩ－Ｈ９２９腫瘍細胞上に発現されたヒトＧＰＲＣ５Ｄに対する異なるＧＰＲＣ５Ｄ ＩｇＧ分子の結合。ＳＤと共に技術的三連からの相対蛍光中央値（ＭＦＩ）を示す。結合のＥＣ５０値をＧｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍによって計算し、表１４に含めた。 腫瘍細胞（図１７Ａ：ＡＭＯ－１細胞、図１７Ｂ：ＮＣＩ－Ｈ９２９細胞）が、示される糖鎖工学ＧＰＲＣ５Ｄ標的化ＩｇＧとＰＢＭＣエフェクタ及び腫瘍標的細胞とを２５：１のエフェクタ対標的細胞比で４時間共インキュベートしたときに決定された場合のＡＤＣＣ媒介性溶解。壊死細胞又はアポトーシス細胞から上清に放出された乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の検出に基づく腫瘍細胞溶解の割合を示す。ＳＤと共に技術的三連が示されている。
発明の詳細な説明
定義
用語は、以下に他の意味であると定義されていない限り、当該技術分野で一般的に使用されるように本明細書で使用される。
本明細書で使用される場合、「抗原結合分子」との用語は、最も広い意味で、抗原決定基に特異的に結合する分子を指す。抗原結合分子の例は、免疫グロブリン及びその誘導体（例えば断片）である。
「二重特異性」との用語は、抗原結合分子が、少なくとも２つの別個の抗原決定基に特異的に結合することができることを意味する。典型的には、二重特異性抗原結合分子は、２つの抗原結合部位を含み、それぞれが異なる抗原決定基に対して特異的である。特定の実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、２つの抗原決定基（特に、２つの別個の細胞で発現する２つの抗原決定基）に同時に結合することができる。
用語「価数」は、本明細書で使用される場合、抗原結合分子内の特定数の抗原結合部位の存在を示す。したがって、用語「抗原に対する一価の結合」は、抗原結合分子内の抗原に特異的な１つ（及び１つを超えない）抗原結合部位の存在を示す。
「抗原結合部位」は、抗原との相互作用を与える抗原結合分子の部位、すなわち１つ又は複数のアミノ酸残基を指す。例えば、抗体の抗原結合部位は、相補性決定領域（ＣＤＲ）からのアミノ酸残基を含む。ネイティブ免疫グロブリン分子は、典型的には、２つの抗原結合部位を含み；Ｆａｂ分子は、典型的には、１つの抗原結合部位を有する。
本明細書で使用される場合、「抗原結合部分」との用語は、抗原決定基に特異的に結合するポリペプチド分子を指す。一実施形態では、抗原結合部分は、標的部位に、例えば、抗原決定基を有する特定の種類の腫瘍細胞に結合する部分（例えば、第２の抗原結合部分）に指向することができる。別の実施形態では、抗原結合部分は、その標的抗原、例えばＴ細胞受容体複合抗原を通してシグナル伝達を活性化することができる。抗原結合部分は、本明細書に更に定義される抗体及びその断片を含む。特定の抗原結合部分は、抗体重鎖可変領域と抗体軽鎖可変領域とを含む、抗体の抗原結合ドメインを含む。特定の実施形態では、抗原結合部分は、本明細書で更に定義され、当該技術分野で知られているような抗体定常領域を含んでいてもよい。有用な重鎖定常領域は、α、δ、ε、γ又はμの５つのアイソタイプのいずれかを含む。有用な軽鎖定常領域は、κ及びλの２つのアイソタイプのいずれかを含む。
本明細書で使用される場合、「抗原決定基」との用語は、「抗原」及び「エピトープ」と同義であり、抗原結合部分－抗原複合体を形成する、抗原結合部分が結合するポリペプチド高分子上の部位（例えば、アミノ酸の連続伸長部又は異なる領域の非連続アミノ酸から構成される配座構成）を指す。有用な抗原決定基は、例えば、腫瘍細胞の表面上に、ウイルス感染した細胞の表面上に、他の罹患した細胞の表面上に、免疫細胞の表面上に、血清中で遊離して、及び／又は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）内に認めることができる。本明細書で抗原と呼ばれるタンパク質（例えば、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＤ３）は、特に明記しない限り、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物供給源からのタンパク質の任意の天然形態であり得る。特定の実施形態では、抗原は、ヒトタンパク質である。本発明の特定のタンパク質について言及される場合、この用語は、「全長」の未処理のタンパク質、及び細胞の処理から得られるタンパク質の任意の形態を包含する。この用語は、タンパク質の天然に存在するバリアント、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントも包含する。抗原として有用な例示的なヒトタンパク質は、ＣＤ３、特にＣＤ３のイプシロンサブユニット（ヒト配列についてはＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｐ０７７６６（バージョン１８５）、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ番号ＮＰ＿０００７２４．１、配列番号４０；又は、カニクイザル［Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ］配列についてはＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｑ９５ＬＩ５（バージョン６９）、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ番号ＢＡＢ７１８４９．１、配列番号４１を参照）、又はＧＰＲＣ５Ｄ（ヒト配列についてはＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｑ９ＮＺＤ１（バージョン１１５）；ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ番号ＮＰ＿０６１１２４．１、配列番号４５を参照）である。特定の実施形態では、本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子は、異なる種由来のＣＤ３又はＧＰＲＣ５Ｄ抗原の間で保存されているＣＤ３又はＧＰＲＣ５Ｄのエピトープに結合する。特定の実施形態では、本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子は、ヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する。
「特異的に結合する」とは、その結合が抗原選択性であり、望ましくない相互作用又は非特異的な相互作用とは判別することができることを意味する。抗原結合部分が特定の抗原決定基に結合する能力は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）又は当業者には知られている他の技術、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ機器で分析される）（Ｌｉｌｊｅｂｌａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏ Ｊ １７，３２３－３２９（２０００））、及び従来の結合アッセイ（Ｈｅｅｌｅｙ，Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｓ ２８，２１７－２２９（２００２））のいずれかによって測定することができる。一実施形態では、無関係なタンパク質に対する抗原結合部分の結合度は、例えばＳＰＲによって測定される抗原に対する抗原結合部分の結合の約１０％未満である。特定の実施形態では、抗原に結合する抗原結合部分、又はこの抗原結合部分を含む抗原結合分子は、解離定数（ＫＤ）が、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０－８Ｍ以下、例えば、１０－８Ｍ～１０－１３Ｍ、例えば、１０－９Ｍ～１０－１３Ｍ）である。
「親和性」は、分子の単一の結合部位（例えば、受容体）と、その結合対（例えば、リガンド）との間の非共有結合性相互作用の合計強度を指す。特に示されない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗原結合部分と抗原、又は受容体とそのリガンド）のメンバー間の１：１相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子Ｘの結合対Ｙに対する分子Ｘの親和性は概して、解離定数（ＫＤ）によって表すことができ、解離速度定数と結合速度定数（それぞれｋｏｆｆ及びｋｏｎ）の比である。したがって、速度定数の比率が同じままである限り、等価の親和性は、異なる速度定数を含み得る。親和性は、本明細書に説明するものを含め、当該技術分野で公知の十分に確立された方法によって測定することができる。親和性を測定する特定の方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である。
「結合の低減」、例えば、Ｆｃ受容体に対する結合の低減は、例えば、ＳＰＲによって測定される場合、それぞれの相互作用についての親和性の低下を指す。明確性のために、この用語は、親和性がゼロまで低下する（又は分析方法の検出限界未満になる）こと、すなわち、相互作用が完全に失われることも含む。逆に、「結合上昇」は、個々の相互作用に対する結合親和性における上昇を指す。
本明細書で使用される「Ｔ細胞活性化抗原」は、抗原結合分子との相互作用によりＴ細胞の活性化を誘導することのできる、Ｔリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球の表面上に発現される抗原決定基を指す。具体的には、抗原結合分子のＴ細胞活性化抗原との相互作用は、Ｔ細胞受容体複合体のシグナル伝達のカスケードをトリガーすることによりＴ細胞活性化を誘導することができる。特定の実施形態では、活性化Ｔ細胞抗原は、ＣＤ３、特にＣＤ３のイプシロンサブユニット（ヒト配列についてはＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｐ０７７６６（バージョン１４４）、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ番号ＮＰ＿０００７２４．１、配列番号４０；又は、カニクイザル）［Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ］配列についてはＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｑ９５ＬＩ５（バージョン４９）、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ番号ＢＡＢ７１８４９．１、配列番号４１を参照）である。
本明細書で使用する「Ｔ細胞活性化」は、増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクタ分子の放出、細胞傷害性活性、及び活性化マーカーの発現から選択される、Ｔリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球の１つ又は複数の細胞応答を指す。Ｔ細胞活性化を測定するために適したアッセイは、本技術分野で既知であり、本明細書に記載されている。
「標的細胞抗原」とは、本明細書で使用する場合、標的細胞、例えばがん細胞又は腫瘍間質細胞等の腫瘍内の細胞の表面に提示された抗原決定基を意味する。特定の実施形態では、標的細胞抗原は、ＧＰＲＣ５Ｄ、特に配列番号４５によるヒトＧＰＲＣ５Ｄである。
本明細書で使用される場合、Ｆａｂ分子などに関する「第１」、「第２」又は「第３」という用語は、各タイプの部分が２つ以上存在する場合の区別の便宜のために使用される。これらの用語の使用は、そのように明示的に示されていない限り、二重特異性抗原結合分子の特定の順序又は向きを与えることを意図していない。
「融合した」が意味するのは、構成要素（例えばＦａｂ分子及びＦｃドメインサブユニット）が、ペプチド結合によって直接的に又は１つ若しくは複数のペプチドリンカーを介して連結されていることである。
「Ｆａｂ分子」は、免疫グロブリンの重鎖（「Ｆａｂ重鎖」）のＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインと、免疫グロブリンの軽鎖（「Ｆａｂ軽鎖」）のＶＬドメイン及びＣＬドメインとからなるタンパク質を指す。
「クロスオーバー」Ｆａｂ分子（「Ｃｒｏｓｓｆａｂ」とも呼ばれる）は、Ｆａｂ重鎖と軽鎖の可変ドメイン又は定常ドメインが交換された（すなわち、互いに置き換わった）Ｆａｂ分子を意味し、すなわち、クロスオーバーＦａｂ分子は、軽鎖可変ドメインＶＬ及び重鎖定常ドメイン１ ＣＨ１（ＶＬ－ＣＨ１、Ｎ末端からＣ末端方向に）で構成されるペプチド鎖と、重鎖可変ドメインＶＨ及び軽鎖定常ドメインＣＬ（ＶＨ－ＣＬ、Ｎ末端からＣ末端方向に）で構成されるペプチド鎖とを含む。明確性のために、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインが交換されているクロスオーバーＦａｂ分子において、重鎖定常ドメイン１ ＣＨ１を含むペプチド鎖は、本明細書では（クロスオーバー）Ｆａｂ分子の「重鎖」と呼ばれる。逆に、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の定常ドメインが交換されているクロスオーバーＦａｂ分子において、重鎖可変ドメインＶＨを含むペプチド鎖は、本明細書では（クロスオーバー）Ｆａｂ分子の「重鎖」と呼ばれる。
これとは対照的に、「従来の」Ｆａｂ分子は、その天然のフォーマットのＦａｂ分子、すなわち、重鎖可変ドメイン及び定常ドメインで構成される重鎖（ＶＨ－ＣＨ１、Ｎ末端からＣ末端方向に）と、軽鎖可変ドメイン及び定常ドメインで構成される軽鎖（ＶＬ－ＣＬ、Ｎ末端からＣ末端方向に）とを含むＦａｂ分子を意味する。
「免疫グロブリン分子」という用語は、天然に存在する抗体の構造を有するタンパク質を指す。例えば、ＩｇＧクラスの免疫グロブリンは、約１５０，０００ダルトンのヘテロテトラマー糖タンパク質であり、ジスルフィド結合した２つの軽鎖と２つの重鎖で構成される。Ｎ末端からＣ末端に向かって、それぞれの重鎖は、可変重鎖ドメイン又は重鎖可変領域とも呼ばれる可変ドメイン（ＶＨ）と、その後に重鎖定常領域とも呼ばれる３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）と、を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端に向かって、それぞれの軽鎖は、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変領域とも呼ばれる可変ドメイン（ＶＬ）と、その後に軽鎖定常領域とも呼ばれる定常軽鎖（ＣＬ）ドメインと、を有する。免疫グロブリンの重鎖は、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）又はμ（ＩｇＭ）と呼ばれる５種類の１つに割り当てられてもよく、このいくつかは、例えば、γ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）、γ４（ＩｇＧ４）、α１（ＩｇＡ１）及びα２（ＩｇＡ２）等の更なるサブタイプに分けられてもよい。免疫グロブリンの軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２種類のうちの１つに割り当てられてもよい。免疫グロブリンは、免疫グロブリンヒンジ領域を介して接続する、２つのＦａｂ分子とＦｃドメインとから本質的になる。
「抗体」という用語は、本明細書では最も広い意味で使用され、限定されるものではないが、それらが所望の抗原結合活性を呈する限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び抗体断片を含めた、様々な抗体構造を包含する。
本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集合から得られる抗体を指し、すなわち、集合に含まれる個々の抗体が、同一である、及び／又は同じエピトープに結合するが、但し、例えば、天然に存在する突然変異又はモノクローナル抗体調製物の製造中に生じる突然変異を含む、可能なバリアント抗体は除く。かかるバリアントは、一般的に、少量存在する。典型的には、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。したがって、修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集合から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするように解釈すべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全て又は一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法を含めた（これらに限定されない）多様な技法によって作製することができ、モノクローナル抗体を作製するためのかかる方法及び他の例示的な方法が、本明細書に記載されている。
「単離された」抗体は、その天然環境の構成要素から分離された（すなわち、その天然環境にはない）ものである。特定のレベルの精製は、必要とされない。例えば、単離された抗体は、そのネイティブ環境又は天然環境から取り出すことができる。宿主細胞内で発現する組換え産生された抗体は、任意の適切な技術によって、分離され、分画され、又は部分的に若しくは実質的に精製された、ネイティブ又は組換え抗体と同様に、本発明の目的のために単離されると考えられる。したがって、本発明の抗体及び二重特異性抗原結合分子が単離される。いくつかの実施形態では、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィ（例えば、イオン交換若しくは逆相ＨＰＬＣ）法によって決定される場合、純度が９５％より大きく、又は９９％より大きくなるまで精製される。抗体精製の試験方法の総説としては、例えば、Ｆｌａｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ ８４８：７９－８７（２００７）を参照されたい。
「完全長抗体」、「インタクト抗体」及び「全抗体」との用語は、ネイティブ抗体構造に実質的に類似した構造を有する抗体を指すために、本明細書で相互に置き換え可能に用いられる。
「抗体断片」は、インタクト抗体が結合する抗原を結合するインタクト抗体の一部を含むインタクト抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、直鎖抗体、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）、及びシングルドメイン抗体が挙げられる。ある特定の抗体断片の総説としては、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ９，１２９－１３４（２００３）を参照されたい。ｓｃＦｖ断片の総説としては、例えば、Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）を参照されたい。また、国際公開第９３／１６１８５号及び米国特許第５，５７１，８９４号及び同第５，５８７，４５８号を参照されたい。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、インビボ半減期が長くなったＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の説明については、米国特許第５，８６９，０４６号を参照のこと。ダイアボディは、二価又は二重特異性であり得る２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、欧州特許第４０４，０９７号、国際公開第１９９３／０１１６１号、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ９，１２９－１３４（２００３）、及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０，６４４４－６４４８（１９９３）を参照されたい。トリアボディ及びテトラボディも、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ９，１２９－１３４（２００３）に説明されている。シングルドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全て又は一部又は軽鎖可変ドメインの全て又は一部を含む抗体断片である。特定の実施形態では、シングルドメイン抗体は、ヒトシングルドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ；例えば、米国特許第６，２４８，５１６号Ｂ１を参照されたい）。抗体断片は、限定されないが、本明細書に記載されるように、インタクト抗体のタンパク質分解による消化、及び組換え宿主細胞（例えば、大腸菌又はファージ）による産生を含め、種々の技術によって作られてもよい。
「抗原結合ドメイン」という用語は、ある抗原の一部又は全てに特異的に結合し、ある抗原の一部又は全てに対して相補的な抗体の一部を指す。抗原結合ドメインは、例えば、１つ又は複数の抗体可変ドメイン（抗体可変領域とも呼ばれる）によって与えられてもよい。特に、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）とを含む。
「可変領域」又は「可変ドメイン」という用語は、抗原に対する抗体の結合に関与する抗体重鎖又は抗体軽鎖のドメインを指す。天然の抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）は、一般に、類似の構造を有しており、各ドメインは、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と、３つの超可変領域（ＨＶＲ）とを含む。例えば、Ｋｉｎｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．、９１頁（２００７）を参照されたい。単一のＶＨ又はＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するために充分であり得る。可変領域配列と組み合わせて本明細書で使用される場合、「Ｋａｂａｔナンバリング」は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）によって記載されるナンバリングシステムを指す。
本明細書で使用される場合、重鎖及び軽鎖の全ての定常領域及びドメインのアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）に記載されるＫａｂａｔナンバリングシステムに従ってナンバリングされ、本明細書では「Ｋａｂａｔによるナンバリング」又は「Ｋａｂａｔナンバリング」と呼ばれる。特定的には、Ｋａｂａｔナンバリングシステム（Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ ｅｄ．、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１）の６４７～６６０頁を参照されたい）を、κ及びλアイソタイプの軽鎖定常ドメインＣＬに使用し、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスナンバリングシステム（６６１～７２３頁を参照されたい）を、重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３）に使用し、この場合には、「Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング」と言及することによって更に明確にしている。
本明細書で使用される「超可変領域」又は「ＨＶＲ」という用語は、配列が超可変である（「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」；重鎖可変領域／ドメインのＣＤＲは、例えばＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３と略され、軽鎖可変領域／ドメインのＣＤＲは、例えばＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３と略される）及び／又は構造的に明確なループを形成する（「超可変ループ」）及び／又は抗原接触残基を含む（「抗原接触」）抗体可変ドメインの各領域を指す。一般に、抗体は、６つのＨＶＲを含み、３つがＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）にあり、３つがＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）にある。本発明の例示的なＨＶＲとして、以下のものが挙げられる：
（ａ）アミノ酸残基２６～３２（Ｌ１）、５０～５２（Ｌ２）、９１～９６（Ｌ３）、２６～３２（Ｈ１）、５３～５５（Ｈ２）、及び９６～１０１（Ｈ３）で生じる超可変ループ（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７））、
（ｂ）アミノ酸残基２４～３４（Ｌ１）、５０～５６（Ｌ２）、８９～９７（Ｌ３）、３１～３５ｂ（Ｈ１）、５０－６５（Ｈ２）及び９５～１０２（Ｈ３）で生じるＣＤＲ（Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１））；
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ～３６（Ｌ１）、４６～５５（Ｌ２）、８９～９６（Ｌ３）、３０～３５ｂ（Ｈ１）、４７～５８（Ｈ２）、及び９３～１０１（Ｈ３）で生じる抗原接触（ＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２－７４５（１９９６））；並びに、
（ｄ）ＨＶＲアミノ酸残基４６～５６（Ｌ２）、４７～５６（Ｌ２）、４８～５６（Ｌ２）、４９～５６（Ｌ２）、２６～３５（Ｈ１）、２６～３５ｂ（Ｈ１）、４９～６５（Ｈ２）、９３～１０２（Ｈ３）及び９４～１０２（Ｈ３）を含む、（ａ）、（ｂ）及び／又は（ｃ）の組合せ。
別段の指示がない限り、ＨＶＲ残基及び可変ドメイン内の他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、本明細書において、上記のＫａｂａｔらに従ってナンバリングされている。
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般的に、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４の４つのＦＲドメインからなる。したがって、ＨＶＲ配列及びＦＲ配列は、一般的に、ＶＨ（又はＶＬ）中で以下の順序で現れる。ＦＲ１－Ｈ１（Ｌ１）－ＦＲ２－Ｈ２（Ｌ２）－ＦＲ３－Ｈ３（Ｌ３）－ＦＲ４。
「ヒト化」抗体とは、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基、及びヒトＦＲ由来のアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。特定の実施形態では、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ＨＶＲ（例えばＣＤＲ）の全て又は実質的に全てが、非ヒト抗体に対応し、ＦＲの全て又は実質的に全てが、ヒト抗体に対応する。かかる可変ドメインは、本明細書では「ヒト化可変領域」と呼ばれる。ヒト化抗体は、任意に、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体のいくつかのＦＲ残基は、例えば、抗体特異性又は親和性を回復するか、又は改善するために、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基が由来する抗体）由来の対応する残基で置換されている。ある抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化形態」は、ヒト化を受けた抗体を指す。本発明に包含される「ヒト化抗体」の他の形態は、特に、Ｃ１ｑ結合及び／又はＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合という観点で、本発明に係る特性を作り出すために、定常領域が、元々の抗体の定常領域から更に修飾されるか、又は変更されているものである。
「ヒト抗体」とは、ヒト若しくはヒト細胞により産生された抗体、又はヒト抗体レパートリーなどのヒト抗体をコードする配列を利用した非ヒト由来の抗体に対応するアミノ酸配列を有する抗体である。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を明確に除外する。特定の実施形態では、ヒト抗体は、非ヒトトランスジェニック哺乳動物、例えば、マウス、ラット又はウサギに由来する。特定の実施形態では、ヒト抗体は、ハイブリドーマ細胞株に由来する。ヒト抗体ライブラリから単離された抗体又は抗体断片もまた、本発明のヒト抗体又はヒト抗体断片であると考えられる。
抗体又は免疫グロブリンの「クラス」は、抗体又は免疫グロブリンの重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域の種類を指す。抗体には、次の５種類の主要なクラスがある：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭであり、これらのいくつかは、更にサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２に分かれてもよい。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
「Ｆｃドメイン」又は「Ｆｃ領域」という用語は、本明細書において、定常領域の少なくとも一部を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を規定するために使用される。この用語は、天然配列Ｆｃ領域及びバリアントＦｃ領域を含む。ＩｇＧ重鎖のＦｃ領域の境界は、わずかに変動してもよいが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は通常、Ｃｙｓ２２６から、又はＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシ末端まで伸長するよう規定されている。しかしながら、宿主細胞によって産生される抗体は、重鎖のＣ末端から１つ又は複数、特に１つ又は２つのアミノ酸の翻訳後開裂を受けてもよい。したがって、全長重鎖をコードする特定の核酸分子の発現によって、宿主細胞によって産生する抗体は、全長重鎖を含んでいてもよく、又は全長重鎖の開裂したバリアントを含んでいてもよい（本明細書で「開裂したバリアント重鎖」とも呼ばれる）。これは、重鎖の最終的な２つのＣ末端アミノ酸がグリシン（Ｇ４４６）及びリジン（Ｋ４４７、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）である場合であってもよい。したがって、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）、又はＣ末端グリシン（Ｇｌｙ４４６）及びリジン（Ｋ４４７）が存在してもよく、又は存在していなくてもよい。Ｆｃドメイン（又は本明細書に定義されるＦｃドメインのサブユニット）を含む重鎖のアミノ酸配列は、特に示されていない場合には、本明細書では、Ｃ末端グリシン－リジンジペプチドを含まずに示される。本発明の一実施形態では、本発明に係る抗体又は二重特異性抗原結合分子に含まれる本明細書で特定されるＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖は、更なるＣ末端グリシン－リジンジペプチド（Ｇ４４６及びＫ４４７、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによるナンバリング）を含む。本発明の一実施形態では、本発明に係る抗体又は二重特異性抗原結合分子に含まれる本明細書で特定されるＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖は、更なるＣ末端グリシン残基（Ｇ４４６、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによるナンバリング）を含む。本発明の組成物、例えば、本明細書に記載の医薬組成物は、本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子の集合を含む。抗体又は二重特異性抗原結合分子の集合は、全長重鎖を含む分子と、開裂したバリアント重鎖を含む分子とを含んでいてもよい。抗体又は二重特異性抗原結合分子の集合は、全長重鎖を有する分子と、開裂したバリアント重鎖を有する分子との混合物からなっていてもよく、抗体又は二重特異性抗原結合分子の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％又は少なくとも９０％は、開裂したバリアント重鎖を有する。本発明の一実施形態では、本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子の集合を含む組成物は、更なるＣ末端グリシン－リジンジペプチド（Ｇ４４６及びＫ４４７、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによるナンバリング）を含む、本明細書で特定されるＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖を含む抗体又は二重特異性抗原結合分子を含む。本発明の一実施形態では、本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子の集合を含む組成物は、更なるＣ末端グリシン残基（Ｇ４４６、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによるナンバリング）を含む、本明細書で特定されるＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖を含む抗体又は二重特異性抗原結合分子を含む。本発明の一実施形態では、かかる組成物は、本明細書で特定されるＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖を含む分子、更なるＣ末端グリシン残基（Ｇ４４６、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによるナンバリング）を含む本明細書で特定されるＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖を含む分子、更なるＣ末端グリシン－リジンジペプチド（Ｇ４４６及びＫ４４７、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによるナンバリング）を含む本明細書で特定されるＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖を含む分子で構成される抗体又は二重特異性抗原結合分子の集合を含む。本明細書で特に明記されない限り、Ｆｃ領域又は定常領域におけるアミノ酸残基のナンバリングは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１（上も参照されたい）に記載されるような、ＥＵナンバリングシステム（ＥＵインデックスとも呼ばれる）に従う。本明細書で使用される場合、Ｆｃドメインの「サブユニット」とは、二量体のＦｃドメインを形成する２つのポリペプチドの１つ、すなわち、免疫グロブリン重鎖のＣ末端定常領域を含み、安定した自己会合が可能なポリペプチドを意味する。例えば、ＩｇＧ Ｆｃドメインのサブユニットは、ＩｇＧ ＣＨ２及びＩｇＧ ＣＨ３定常ドメインを含む。
「Ｆｃドメインの第１のサブユニット及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾」は、ホモ二量体を形成するためのＦｃドメインサブユニットを含むペプチドと同一のポリペプチドとの会合を減らすか又は防ぐ、ペプチド骨格の操作又はＦｃドメインサブユニットの翻訳後修飾である。会合を促進する修飾は、本明細書で使用される場合、特に、会合することが望ましい２つのＦｃドメインサブユニット（すなわち、Ｆｃドメインの第１のサブユニット及び第２のサブユニット）それぞれに対し、別個の修飾を含み、修飾は、２つのＦｃドメインサブユニットの会合を促進するように、互いに相補性である。例えば、会合を促進する修飾は、それぞれ立体的又は静電的に望ましい会合を行うように、Ｆｃドメインサブユニットの片方又は両方の構造又は電荷を変えてもよい。したがって、（ヘテロ）二量化は、第１のＦｃドメインサブユニットを含むポリペプチドと、第２のＦｃドメインサブユニットを含むポリペプチドとの間で起こり、それぞれのサブユニットに融合する更なる構成要素（例えば、抗原結合部分）が同じではないという意味で、同一ではない場合がある。いくつかの実施形態では、会合を促進する修飾は、Ｆｃドメイン内のアミノ酸突然変異、具体的には、アミノ酸置換を含む。特定の実施形態では、会合を促進する修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットそれぞれに、別個のアミノ酸突然変異、特定的にはアミノ酸置換を含む。
「エフェクタ機能」という用語は、抗体のＦｃ領域に帰属可能な生体活性を指し、抗体アイソタイプによって変わる。抗体エフェクタ機能の例としては、以下のものが挙げられる：Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、サイトカイン分泌、抗原提示細胞によるイムノコンジュゲート媒介性抗原取り込み、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御、及びＢ細胞活性化。
本明細書で使用される場合、「操作する、操作される、操作すること」という用語は、天然に存在するか、又は組換えポリペプチド又はこれらの断片のペプチド骨格の任意の操作又は翻訳後修飾を含むと考えられる。操作することは、アミノ酸配列の修飾、グリコシル化パターンの修飾、又は個々のアミノ酸の側鎖基の修飾、及びこれらのアプローチの組合せを含む。
本明細書で使用される場合、「アミノ酸突然変異」という用語は、アミノ酸の置換、欠失、挿入、及び修飾を包含することを意味する。置換、欠失、挿入及び修飾の任意の組み合わせは、最終構築物が、所望の特徴、例えば、Ｆｃ受容体に対する結合の低減、又は別のペプチドとの会合の増加を有する限り、最終構築物に到達するように行うことができる。アミノ酸配列の欠失及び挿入は、アミノ末端及び／又はカルボキシ末端のアミノ酸の欠失及び挿入を含む。特定のアミノ酸突然変異は、アミノ酸の置換である。例えば、Ｆｃ領域の結合特性を変更する目的のために、非保存的アミノ酸置換、すなわち、１つのアミノ酸を、構造特性及び／又は化学特性が異なる別のアミノ酸と置き換えることが特に好ましい。アミノ酸の置換には、非天然アミノ酸による置き換え、又は２０種類の標準的なアミノ酸の天然アミノ酸誘導体（例えば、４－ヒドロキシプロリン、３－メチルヒスチジン、オルニチン、ホモセリン、５－ヒドロキシリジン）による置き換えが含まれる。アミノ酸突然変異は、当該技術分野で周知の遺伝的方法又は化学的方法を用いて生じさせることができる。遺伝的方法には、特定部位の突然変異誘発、ＰＣＲ、遺伝子合成等が含まれ得る。遺伝子工学以外の方法によってアミノ酸の側鎖基を変える方法、例えば、化学修飾も有用な場合があることが想定される。同じアミノ酸突然変異を示すために、本明細書で様々な名称を使用することができる。例えば、Ｆｃドメインの位置３２９のプロリンからグリシンへの置換は、３２９Ｇ、Ｇ３２９、Ｇ３２９、Ｐ３２９Ｇ又はＰｒｏ３２９Ｇｌｙと示すことができる。
参照ポリペプチド配列に対する「アミノ酸配列の同一性パーセント（％）」は、配列をアラインメントし、最大の配列同一性パーセントを達成するために、必要ならばギャップを導入した後、配列同一性の一部として任意の保存的置換を考慮せずに、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である、候補配列におけるアミノ酸残基の割合であると定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアラインメントは、当該技術分野の技術の範囲内にある種々の様式で、例えば、公的に入手可能なコンピュータソフトウェア、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ、Ｍｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア又はＦＡＳＴＡプログラムパッケージを用いて達成することができる。当業者であれば、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列のアラインメントのための適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、本発明の目的のために、アミノ酸配列同一性％の値は、ＦＡＳＴＡパッケージバージョン３６．３．８ｃのｇｇｓｅａｒｃｈプログラム用い、又はその後のＢＬＯＳＵＭ５０比較マトリックスを用いて作成される。ＦＡＳＴＡプログラムパッケージは、Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｄ．Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）、「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ」、ＰＮＡＳ ８５：２４４４－２４４８；Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９６）「Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ」Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：２２７－２５８；及びＰｅａｒｓｏｎ ｅｔ．ａｌ．（１９９７）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４６：２４－３６）によるものであり、ｈｔｔｐ：／／ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ２／ｆａｓｔａ＿ｄｏｗｎ．ｓｈｔｍｌから公的に入手可能である。或いは、ｈｔｔｐ：／／ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ２／ｉｎｄｅｘ．ｃｇｉでアクセス可能な公開サーバを使用して、ｇｇｓｅａｒｃｈ（グローバル・タンパク質：タンパク質）プログラム及びデフォルト・オプション（ＢＬＯＳＵＭ５０；ｏｐｅｎ：－１０；ｅｘｔ：－２；Ｋｔｕｐ＝２）を使用して配列を比較し、ローカルではなくグローバルなアライメントを確実に実行することができる。アミノ酸同一性パーセントは、アウトプットアラインメントヘッダーで与えられる。
「ポリヌクレオチド」という用語は、単離された核酸分子又は構築物、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ウイルス由来のＲＮＡ、又はプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、従来のホスホジエステル結合又は従来の結合以外の結合（例えば、アミド結合、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）中に見出されるもの）を含んでいてもよい。「核酸分子」という用語は、任意の１つ又は複数の核酸セグメント、例えば、ポリヌクレオチド中に存在するＤＮＡ又はＲＮＡ断片を指す。
「単離された」核酸分子又はポリヌクレオチドとは、その天然環境から取り出された、核酸分子、ＤＮＡ又はＲＮＡを意図している。例えば、ベクターにおいて含有されるポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドは、本発明の目的のために単離されていると考えられる。単離されたポリヌクレオチドの更なる例としては、異種性宿主細胞において維持された組換えポリヌクレオチド、又は溶液中の精製された（部分的に又は実質的に）、ポリヌクレオチドが挙げられる。単離されたポリヌクレオチドは、元々ポリヌクレオチド分子を含有する細胞において含有されているポリヌクレオチド分子を含むが、ポリヌクレオチド分子は、染色体外に存在するか、又はその天然の染色***置とは異なる染色***置に存在する。単離されたＲＮＡ分子は、本発明のインビボ又はインビトロＲＮＡ転写産物と、陽性及び陰性の鎖形態と、二本鎖形態とを含む。本発明による単離されたポリヌクレオチド又は核酸は、合成によって産生されるかかる分子を更に含む。加えて、ポリヌクレオチド又は核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、又は転写ターミネーター等の調節要素であってもよく、又は調節要素を含んでいてもよい。
「［例えば、本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子］をコードする単離されたポリヌクレオチド（又は核酸）」は、抗体重鎖及び軽鎖（又はその断片）をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド分子を指し、単一のベクター又は別個のベクターにおいて、かかる核酸分子（単数又は複数）が宿主細胞の１つ又は複数の位置に存在するかかるポリヌクレオチド分子（単数又は複数）を含む。
「発現カセット」という用語は、組換えによって、又は合成によって作られるポリヌクレオチドを指し、標的細胞内の特定の核酸の転写が可能な特定の一連の核酸要素を含む。組換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルス、又は核酸断片へと組み込むことができる。典型的には、発現ベクターの組換え発現カセット部分は、配列の中でも特に、転写される核酸配列と、プロモーターとを含む。特定の実施形態では、発現カセットは、本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む。
「ベクター」又は「発現ベクター」という用語は、細胞に作動可能に会合する特定の遺伝子の発現を導入し、指令するために使用されるＤＮＡ分子を指す。この用語には、自己複製する核酸構造としてのベクターだけでなく、ベクターが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターも含まれる。本発明の発現ベクターは、発現カセットを含む。発現ベクターによって、安定したｍＲＮＡの多量の転写が可能となる。発現ベクターが細胞内に入ると、遺伝子によってコードされるリボ核酸分子又はタンパク質は、細胞内転写及び／又は翻訳機構によって産生される。一実施形態において、本発明の発現ベクターは、本発明の抗体若しくは二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む発現カセットを含む。
「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養」という用語は、互換的に使用され、外因性核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含む。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換された細胞」を含み、これらは、継代数にかかわらず、初代の形質転換された細胞と、初代の形質転換された細胞から誘導された子孫を含む。子孫は、親細胞と核酸含有量の点で完全に同一でない場合があるが、突然変異を含んでもよい。本明細書では、最初に形質転換された細胞においてスクリーニング又は選択されたものと同じ機能又は生物学的活性を有する突然変異体の子孫が、含まれる。宿主細胞は、本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子を生成するために使用可能な任意の種類の細胞系である。宿主細胞としては、培養細胞、例えば、哺乳動物培養細胞、例えば、ほんの数例を挙げると、ＨＥＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞又はハイブリドーマ細胞、酵母細胞、昆虫細胞及び植物細胞が挙げられるが、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物若しくは培養植物、又は動物組織に含まれる細胞も含まれる。
「活性化Ｆｃ受容体」は、抗体のＦｃドメインによる連結の後に、エフェクタ機能を発揮するために受容体を含む細胞を刺激するシグナル伝達事象を誘発するＦｃ受容体である。ヒト活性化Ｆｃ受容体としては、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）及びＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）が挙げられる。
抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）は、免疫エフェクタ細胞による、抗体で被覆された標的細胞の溶解を引き起こす免疫機構である。標的細胞は、Ｆｃ領域を含む抗体又はその誘導体が、一般的にＦｃ領域に対してＮ末端であるタンパク質部分を介して、特異的に結合する細胞である。本明細書で使用される場合、「減少したＡＤＣＣ」という用語は、上記で定義されたＡＤＣＣの機構による、標的細胞を取り囲む培地中の所与の濃度の抗体で所与の時間に溶解される標的細胞の数の減少、及び／又はＡＤＣＣの機構による、所与の時間に所与の数の標的細胞の溶解を達成するために必要な、標的細胞を取り囲む培地中の抗体の濃度の増加のいずれかとして定義される。ＡＤＣＣの減少は、同じ標準的な産生、精製、製剤化及び保存方法（当業者に知られている）を使用して、同じ種類の宿主細胞によって産生される同じ抗体によって媒介されるが、操作されていないＡＤＣＣと比較している。例えば、そのＦｃドメインに、ＡＤＣＣを低下させるアミノ酸置換を含む抗体によって媒介されるＡＤＣＣの低下は、Ｆｃドメイン中にこのアミノ酸置換を含まない同じ抗体によって媒介されるＡＤＣＣに対するものである。ＡＤＣＣを測定するのに適したアッセイは、当該技術分野で周知である（例えば、ＰＣＴ国際公開第２００６／０８２５１５号又は同第２０１２／１３０８３１号を参照されたい）。
ある薬剤の「有効量」は、その薬剤が投与される細胞又は組織において、ある生理学的変化を引き起こすのに必要な量を指す。
ある薬剤（例えば、医薬組成物）の「治療有効量」は、所望な治療結果又は予防結果を達成するのに有効な量、必要な投薬量及び必要な期間を指す。薬剤の治療有効量は、例えば、疾患の副作用を除去し、低下させ、遅延させ、最小限にし、又は予防する。
「個体」又は「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物としては、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト及びサル等の非ヒト霊長類）、ウサギ、齧歯（例えば、マウス及びラット）が挙げられる。特に、個体又は対象は、ヒトである。
「医薬組成物」という用語は、その中に含まれる有効成分の生体活性を有効にし、組成物が投与される対象に対して受け入れられないほど毒性である更なる構成要素を含まないような形態での調製物を指す。
「薬学的に許容され得る担体」は、医薬組成物中の成分であって、有効成分以外であり、対象にとって毒性ではない成分を指す。薬学的に許容され得る担体には、緩衝剤、賦形剤、安定剤、又は防腐剤が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」（及びその文法的な変化形、例えば、「治療（ｔｒｅａｔ）する」又は「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）すること」）は、治療される個体において疾患の本来の経過を変える試行における臨床的介入を指し、予防のために、又は臨床病理の経過の間に行うことができる。治療の所望の効果としては、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の軽減、疾患の任意の直接的又は間接的な病理学的結果の減弱、転移を予防すること、疾患進行率を低下させること、病状の寛解又は緩和、及び回復又は改良された予後が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子は、疾患の発症を遅延させるために、又は疾患の進行を遅らせるために使用される。
「パッケージ添付文書」という用語は、そのような治療製品の適応症、使用法、投薬量、投与、併用療法、禁忌症、及び／又はその使用に関する警告についての情報を含有する、治療製品の商業用パッケージに通例含まれる指示書を指すために使用される。
実施形態の詳細な説明
本発明は、ＧＰＲＣ５Ｄ、特にヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体及び二重特異性抗原結合分子を提供する。更に、分子は、例えば有効性及び／又は安全性並びに生産性に関して、治療用途にとって他の好ましい特性を有する。
ＧＰＲＣ５Ｄ抗体
第１の態様では、本発明は、ＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体であって、（ｉ）配列番号８３の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８４のＨＣＤＲ２、及び配列番号８６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び、配列番号８７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号８８のＬＣＤＲ２及び配列番号８９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；（ｉｉ）配列番号８３の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８５のＨＣＤＲ２、及び配列番号８６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び、配列番号８７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号８８のＬＣＤＲ２及び配列番号８９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；（ｉｉｉ）配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９１のＨＣＤＲ２、及び配列番号９３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び、配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９５のＬＣＤＲ２及び配列番号９７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；（ｉｖ）配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９１のＨＣＤＲ２、及び配列番号９３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び、配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９６のＬＣＤＲ２及び配列番号９７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；（ｖ）配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９２のＨＣＤＲ２、及び配列番号９３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び、配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９５のＬＣＤＲ２及び配列番号９７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；（ｖｉ）配列番号１の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号２のＨＣＤＲ２、及び配列番号３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び、配列番号４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号５のＬＣＤＲ２及び配列番号６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；又は、（ｖｉｉ）配列番号７の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８のＨＣＤＲ２、及び配列番号９のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び、配列番号１０の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１１のＬＣＤＲ２及び配列番号１２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、抗体を提供する。
いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト化抗体である。一実施形態では、ＶＨは、ヒト化ＶＨであり、及び／又はＶＬは、ヒト化ＶＬである。一実施形態では、抗体は、上述の実施形態のうちのいずれかにあるようなＣＤＲを含み、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークを更に含む。
特定の実施形態では、（ｉ）ＶＨは、配列番号１３の配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む；又は、（ｉｉ）ＶＨは、配列番号１５の配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む；又は、（ｉｉｉ）ＶＨは、配列番号４８の配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号５３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む；又は、（ｉｖ）ＶＨは、配列番号４９の配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号５２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む；又は、（ｖ）ＶＨは、配列番号５７の配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号６４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む；又は、（ｖｉ）ＶＨは、配列番号５８の配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号６３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、抗体は、（ｉ）配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるＶＨ、及び配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるＶＬ；又は、（ｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるＶＨ、及び配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるＶＬ；又は、（ｉｉｉ）配列番号４８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるＶＨ、及びＶＬが配列番号５３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一である；又は、（ｉｖ）ＶＨが配列番号４９の配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であり、ＶＬが配列番号５２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一である；又は、（ｖ）ＶＨが配列番号５７の配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であり、ＶＬが配列番号６４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一である；又は、（ｖｉ）ＶＨが配列番号５８の配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であり、ＶＬが配列番号６３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一である、を含む。
別の実施形態では、抗体はＩｇＧ、特にＩｇＧ１抗体である。一実施形態では、抗体は全長抗体である。別の実施形態では、抗体は、Ｆｖ分子、ｓｃＦｖ分子、Ｆａｂ分子、及びＦ（ａｂ’）２分子の群から選択される抗体断片である。一実施形態では、抗体は多重特異性抗体である。
特定の実施形態において、少なくとも約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％の同一性を有するＶＨ又はＶＬ配列は、基準配列と比べて、置換（例えば、保存的置換）、挿入又は欠失を含有するが、その配列を含む抗体はＧＰＲＣ５Ｄに結合する能力を保持する。特定の実施形態では、配列番号１３において合計１～１０個のアミノ酸が置換、挿入及び／若しくは欠失されており、並びに／又は配列番号１４において合計１～１０個のアミノ酸が置換、挿入及び／若しくは欠失されており、並びに／又は配列番号１５において合計１～１０個のアミノ酸が置換、挿入及び／若しくは欠失されており、並びに／又は配列番号１６において合計１～１０個のアミノ酸が置換、挿入及び／若しくは欠失されており、並びに／又は配列番号４８において合計１～１０個のアミノ酸が置換、挿入及び／若しくは欠失されており、並びに／又は配列番号５３において合計１～１０個のアミノ酸が置換、挿入及び／若しくは欠失されており、並びに／又は配列番号４９において合計１～１０個のアミノ酸が置換、挿入及び／若しくは欠失されており、並びに／又は配列番号５２において合計１～１０個のアミノ酸が置換、挿入及び／若しくは欠失されており、並びに／又は配列番号５７において合計１～１０個のアミノ酸が置換、挿入及び／若しくは欠失されており、並びに／又は配列番号６４において合計１～１０個のアミノ酸が置換、挿入及び／若しくは欠失されており、並びに／又は配列番号５８において合計１～１０個のアミノ酸が置換、挿入及び／若しくは欠失されており、並びに／又は配列番号６３において合計１～１０個のアミノ酸が置換、挿入及び／若しくは欠失されている。
特定の実施形態では、置換、挿入、又は欠失は、ＨＶＲの外側の領域で（すなわち、ＦＲで）生じる。任意に、抗体は、配列の翻訳後修飾を含む、配列番号１３のＶＨ配列及び／又は配列番号１４のＶＬ配列を含む。任意に、抗体は、配列の翻訳後修飾を含む、配列番号１５のＶＨ配列及び／又は配列番号１６のＶＬ配列を含む。任意に、抗体は、配列の翻訳後修飾を含む、配列番号４４８のＶＨ配列及び／又は配列番号５３のＶＬ配列を含む。任意に、抗体は、配列の翻訳後修飾を含む、配列番号４９のＶＨ配列及び／又は配列番号５２のＶＬ配列を含む。任意に、抗体は、配列の翻訳後修飾を含む、配列番号５７のＶＨ配列及び／又は配列番号６４のＶＬ配列を含む。任意に、抗体は、配列の翻訳後修飾を含む、配列番号５８のＶＨ配列及び／又は配列番号６３のＶＬ配列を含む。
一実施形態では、抗体は、配列番号１３及び配列番号１５の群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＨ、並びに配列番号１４のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
一実施形態では、抗体は、配列番号１３及び配列番号１５の群から選択されるＶＨ配列、並びに配列番号１６のＶＬ配列を含む。
特定の実施形態では、抗体は、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号１４のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。特定の実施形態では、抗体は、配列番号１３のＶＨ配列、及び配列番号１４のＶＬ配列を含む。
特定の実施形態では、抗体は、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号１６のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。特定の実施形態では、抗体は、配列番号１５のＶＨ配列、及び配列番号１６のＶＬ配列を含む。
特定の実施形態では、抗体は、配列番号４８のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号５３のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。特定の実施形態では、抗体は、配列番号４８のＶＨ配列、及び配列番号５３のＶＬ配列を含む。
特定の実施形態では、抗体は、配列番号４９のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号５２のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。特定の実施形態では、抗体は、配列番号４９のＶＨ配列、及び配列番号５２のＶＬ配列を含む。
特定の実施形態では、抗体は、配列番号５７のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号６４のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。特定の実施形態では、抗体は、配列番号５７のＶＨ配列、及び配列番号６４のＶＬ配列を含む。
特定の実施形態では、抗体は、配列番号５８のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号６３のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。特定の実施形態では、抗体は、配列番号５８のＶＨ配列、及び配列番号６３のＶＬ配列を含む。
一実施形態では、抗体はヒト定常領域を含む。一実施形態では、抗体は、ヒト定常領域を含む免疫グロブリン分子、特にヒトＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及び／又はＣＬドメインを含むＩｇＧクラス免疫グロブリン分子である。ヒト定常ドメインの例示的な配列は、配列番号３７及び３８（それぞれ、ヒトカッパ及びラムダＣＬドメイン）、並びに配列番号３９（ヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメインＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）で与えられる。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号３７又は配列番号３９のアミノ酸配列、特に配列番号３８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号３９のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む。特に、重鎖定常領域は、本明細書に記載されたようなＦｃドメインにおけるアミノ酸突然変異を含んでもよい。
一実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。
一実施形態では、抗体はＩｇＧ、特にＩｇＧ１抗体である。一実施形態では、抗体は全長抗体である。
一実施形態では、抗体は、Ｆｃドメイン、特にＩｇＧ Ｆｃドメイン、更に詳細にはＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む。一実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒトＦｃドメインである。抗体のＦｃドメインは、本発明の二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインに関して本明細書に記載される特徴のいずれかを、単独で又は組み合わせて組み込むことができる。
別の実施形態では、抗体は、Ｆｖ分子、ｓｃＦｖ分子、Ｆａｂ分子、及びＦ（ａｂ’）２分子の群から選択される抗体断片、特にＦａｂ分子である。別の実施形態では、抗体断片は、ダイアボディ、トリアボディ、又はテトラボディである。
更なる態様では、上記実施形態のうちのいずれかによる抗体は、以下のセクションに記載される特徴のうちのいずれかを、単独で又は組み合わせで組み込んでもよい。
グリコシル化バリアント
特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、抗体がグリコシル化されている程度を増加又は減少させるように変化する。抗体へのグリコシル化部位の付加又は欠失は、１つ又は複数のグリコシル化部位が作り出されるか、又は除去されるようにアミノ酸配列を改変させることにより好都合に達成され得る。
抗体がＦｃ領域を含む場合、抗体に付着しているオリゴ糖を変更してもよい。哺乳動物細胞によって産生された天然抗体は、典型的には、Ｎ結合によってＦｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７に一般に結合される分岐状の二分岐オリゴ糖を含む。例えば、Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．ＴＩＢＴＥＣＨ １５：２６－３２（１９９７）を参照されたい。オリゴ糖には、様々な炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、及びシアル酸、並びに二分岐オリゴ糖構造の「幹」のＧｌｃＮＡｃに結合したフコースが含まれ得る。いくつかの実施形態では、本発明の抗体中のオリゴ糖の改変は、特定の改良された特性を有する抗体バリアントを作成するために行われてもよい。
一実施形態では、非フコシル化オリゴ糖、すなわちＦｃ領域へのフコース結合（直接又は間接）を欠くオリゴ糖構造を有する抗体バリアントが提供される。このような非フコシル化オリゴ糖（「アフコシル化」オリゴ糖とも呼ばれる）は特に、二分岐オリゴ糖構造の幹に第１のＧｌｃＮＡｃが結合したフコース残基を欠く、Ｎ結合オリゴ糖である。一実施形態では、内在性又は親抗体と比較して、Ｆｃ領域における非フコシル化オリゴ糖の比率が増加した抗体バリアントを提供する。例えば、非フコシル化オリゴ糖の割合は、少なくとも約２０％、少なくとも約４０％、少なくとも約６０％、少なくとも約８０％、又は場合によっては約１００％（すなわち、フコシル化オリゴ糖が存在しない）であってもよい。非フコシル化オリゴ糖の割合は、例えば、国際公開第２００６／０８２５１５号に記載のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析法により測定した、Ａｓｎ２９７に結合した全てのオリゴ糖の合計（例えば、複合体、ハイブリッド、及びハイマンノース構造）に対する、フコース残基を欠くオリゴ糖の（平均）量である。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域の約２９７位に位置するアスパラギン残基を指す（Ｆｃ領域残基のＥＵナンバリング）；しかしながら、Ａｓｎ２９７は、抗体のマイナーな配列変化のために、位置２９７の上流又は下流、すなわち位置２９４と３００の間の約±３個のアミノ酸に位置していてもよい。Ｆｃ領域における非フコシル化オリゴ糖の割合が増加したこのような抗体は、改善されたＦｃγＲＩＩＩａ受容体結合、及び／又は改善されたエフェクタ機能、特に改善されたＡＤＣＣ機能を有することができる。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号；同第２００４／００９３６２１号を参照されたい。
フコシル化が低下した抗体を産生可能な細胞株の例としては、タンパク質フコシル化が不足しているＬｅｃ１３ＣＨＯ細胞（Ｒｉｐｋａら Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４９：５３３－５４５（１９８６）；米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号；及び国際公開第２００４／０５６３１２号、特に実施例１１）、及びノックアウト細胞株、例えばアルファ－１，６－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子のＦＵＴ８ノックアウトＣＨＯ細胞（例えば、Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉら Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４－６２２（２００４）；Ｋａｎｄａ，Ｙ．ら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９４（４）：６８０－６８８（２００６）；及び国際公開第２００３／０８５１０７号を参照されたい）、又はＧＤＰ－フコース合成若しくはトランスポータータンパク質の活性が低下若しくは消滅した細胞（例えば、米国特許出願公開第２００４２５９１５０号、同第２００５０３１６１３号、同第２００４１３２１４０号、同第２００４１１０２８２号を参照されたい）が挙げられる。
更なる実施形態では、抗体バリアントは、例えば、抗体のＦｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃにより二分されている二分されたオリゴ糖と共に提供される。そのような抗体バリアントは、上述のように、低下したフコシル化及び／又は改善されたＡＤＣＣ機能を有してもよい。そのような抗体バリアントの例は、例えば、Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １７，１７６－１８０（１９９９）；Ｆｅｒｒａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎ Ｂｉｏｅｎｇ ９３，８５１－８６１（２００６）；国際公開第９９／５４３４２号；同第２００４／０６５５４０号、同第２００３／０１１８７８号に記載されている。
Ｆｃ領域に付着したオリゴ糖の少なくとも１つのガラクトース残基を有する抗体バリアントも提供される。そのような抗体バリアントは、改善されたＣＤＣ機能を有し得る。このような抗体バリアントは、例えば、国際公開第１９９７／３００８７号、同第１９９８／５８９６４号、及び同第１９９９／２２７６４号に記載されている。
一実施形態において、第２の抗体は、Ｆｃ領域における１つ又は複数のアミノ酸突然変異の導入によって改変される。具体的な実施形態では、アミノ酸突然変異はアミノ酸置換である。一実施形態において、第２の抗体は、Ｆｃ領域におけるグリコシル化の修飾によって改変される。具体的な実施形態では、Ｆｃ領域におけるグリコシル化の修飾は、非改変抗体と比較して、Ｆｃ領域における非フコシル化オリゴ糖の割合の増加である。更により具体的な実施形態では、Ｆｃ領域中の非フコシル化オリゴ糖の増加した割合は、Ｆｃ領域中の非フコシル化オリゴ糖の少なくとも２０％、好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも７０％である。別の具体的な実施形態では、Ｆｃ領域におけるグリコシル化の修飾は、非改変抗体と比較して、Ｆｃ領域における二分化されたオリゴ糖の割合の増加である。更により具体的な実施形態では、Ｆｃ領域中の二分化されたオリゴ糖の増加した割合は、Ｆｃ領域中の二分化されたオリゴ糖の少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも７０％である。更に別の具体的な実施形態では、Ｆｃ領域におけるグリコシル化の修飾は、非改変抗体と比較して、Ｆｃ領域における二分化された非フコシル化オリゴ糖の割合の増加である。好ましくは、第２の抗体は、Ｆｃ領域中に少なくとも約２５％、少なくとも約３５％、又は少なくとも約５０％の二分化された非フコシル化オリゴ糖を有する。特定の実施形態では、第２の抗体は、非改変抗体と比較して、Ｆｃ領域における非フコシル化オリゴ糖の割合が増加するように改変される。抗体のＦｃ領域中の非フコシル化オリゴ糖の割合の増加は、エフェクタ機能の増加、特にＡＤＣＣの増加を有する抗体をもたらす。特定の実施形態では、非フコシル化オリゴ糖は、二分化された非フコシル化オリゴ糖である。
特定の実施形態では、抗体は、配列番号９８の配列を含む軽鎖と、配列番号９９の配列を含む重鎖とを含む。特定の実施形態では、抗体は、配列番号９８の軽鎖と、配列番号９９の重鎖とを含む。特定の実施形態では、抗体は、配列番号１００の配列を含む軽鎖と、配列番号１０１の配列を含む重鎖とを含む。特定の実施形態では、抗体は、配列番号１００の軽鎖と、配列番号１０１の重鎖とを含む。
特定の実施形態では、抗体は、配列番号９８の配列を含む軽鎖と、配列番号９９の配列を含む重鎖とを含み、抗体は糖鎖工学抗体である。特定の実施形態では、抗体は、配列番号９８の軽鎖と、配列番号９９の重鎖とを含み、抗体は糖鎖工学抗体である。特定の実施形態では、抗体は、配列番号１００の配列を含む軽鎖と、配列番号１０１の配列を含む重鎖とを含み、抗体は糖鎖工学抗体である。特定の実施形態では、抗体は、配列番号１００の軽鎖と、配列番号１０１の重鎖とを含み、抗体は糖鎖工学抗体である。
特定の実施形態では、抗体は、配列番号９８の配列を含む軽鎖と、配列番号９９の配列を含む重鎖とを含み、抗体は、非改変抗体と比較して、Ｆｃ領域中に増加した割合の非フコシル化オリゴ糖を有するように改変されている。特定の実施形態では、抗体は、配列番号９８の軽鎖と、配列番号９９の重鎖とを含み、抗体は、非改変抗体と比較して、Ｆｃ領域中に増加した割合の非フコシル化オリゴ糖を有するように改変されている。特定の実施形態では、抗体は、配列番号１００の配列を含む軽鎖と、配列番号１０１の配列を含む重鎖とを含み、抗体は、非改変抗体と比較して、Ｆｃ領域中に増加した割合の非フコシル化オリゴ糖を有するように改変されている。特定の実施形態では、抗体は、配列番号１００の軽鎖と、配列番号１０１の重鎖とを含み、抗体は、非改変抗体と比較して、Ｆｃ領域中に増加した割合の非フコシル化オリゴ糖を有するように改変されている。
システイン改変抗体バリアント
ある特定の実施形態では、抗体の１つ又は複数の残基がシステイン残基で置換されているシステイン改変抗体、例えば、「チオマブ（ｔｈｉｏＭＡｂ）」を作成することが望ましい場合がある。特定の実施形態では、置換された残基は、抗体のアクセス可能な部位に存在する。これらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基は、それによって抗体のアクセス可能な部位に配置され、本明細書に更に記載されるように、抗体を薬物部位又はリンカー薬物部位等のような他の部位に複合してイムノコンジュゲートを作成するために使用することができる。システイン改変抗体は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号、同第８，３０，９３０号、同第７，８５５，２７５号、同第９，０００，１３０号、又は国際公開第２０１６０４０８５６号に記載のように生成することができる。
抗体誘導体
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、当該技術分野で公知であり、容易に入手可能な更なる非タンパク質性部分を含有するように更に改変され得る。抗体の誘導体化に適した部位としては、水溶性ポリマーが挙げられるが、これらに限定されるものではない。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ－１，３－ジオキソラン、ポリ－１，３，６－トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマー又はランダムコポリマーのいずれか）、及びデキストラン又はポリ（ｎ－ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、及びこれらの混合物が挙げられる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性のため、製造時に有利であり得る。ポリマーは、任意の分子量であってもよく、分岐していても、分岐していなくてもよい。抗体に接続するポリマーの数は、様々であってもよく、１つより多いポリマーが接続する場合、ポリマーは、同じ分子であってもよく、又は異なる分子であってもよい。一般に、誘導体化のために使用されるポリマーの数及び／又はタイプは、限定するものではないが、改良される抗体の特定の特性又は機能、抗体誘導体が定義された条件下で治療に使用されるかどうか等の考慮事項に基づいて決定することができる。
別の実施形態では、放射線への曝露によって選択的に加熱され得る抗体及び非保護性部位の複合体が提供される。一実施形態では、非保護性部分はカーボンナノチューブである（Ｋａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０２：１１６００－１１６０５（２００５））。放射線は、任意の波長であってもよく、通常の細胞に害を与えないが、抗体非保護性部位に近位の細胞が死滅する温度まで非保護性部位を加熱する波長を含むが、これらに限定されない。
イムノコンジュゲート
本発明はまた、細胞傷害剤、化学療法剤、薬物、成長阻害剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、若しくは動物起源の酵素活性毒素、又はそれらの断片）、又は放射性同位体などの１つ又は複数の治療剤と複合された本明細書中に記載の抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体を含む、イムノコンジュゲートを提供する。
一実施形態では、イムノコンジュゲートは、抗体が、前述の治療剤の１つ又は複数にコンジュゲートしている、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）である。抗体は、典型的には、リンカーを使用して、治療剤の１つ又は複数に接続される。治療剤及び治療薬及びリンカーの例を含む、ＡＤＣ技術の概説は、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｒｅｖｉｅｗ ６８：３－１９（２０１６）に記載されている。
別の実施形態では、イムノコンジュゲートは、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ－サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンシン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ－Ｓ）、ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ阻害剤、クルシン、クロチン、ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）、並びにトリコテセン（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅ）を含むがこれらに限定されない酵素活性毒素又はその断片にコンジュゲートされた本明細書に記載される抗体を含む。
別の実施形態では、イムノコンジュゲートは、放射性原子にコンジュゲートされて放射性複合体を形成する、本明細書に記載される抗体を含む。放射性複合体の産生には、様々な放射性同位体が利用可能である。例としては、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２、及びＬｕの放射性同位元素が挙げられる。放射性複合体が検出のために使用される場合、それは、シンチグラフィ研究のための放射性原子、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、又は核磁気共鳴（ｎｕｃｌｅａｒ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ：ＮＭＲ）イメージング（別名、磁気共鳴イメージング、ＭＲＩ）のためのスピンラベル、例えば再びヨウ素１２３、ヨウ素１３１、インジウム１１１、フッ素１９、炭素１３、窒素１５、酸素１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含んでいてもよい。
抗体と細胞傷害剤との複合体は、例えば、各種の二官能性タンパク質カップリング剤を用いて作製することができる：Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピミデートＨＣｌ等）、活性エステル（スベリン酸ジスクシンイミジル等）、アルデヒド（グルタルアルデヒド等）、ビスアジド化合物（ビス（ｐ－アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン等）、ビス－ジアゾニウム誘導体（ビス－（ｐ－ジアゾニウムベンゾイル）－エチレンジアミン等）、ジイソシアネート（トルエン２，６－ジイソシアネート等）、及び二活性フッ素化合物（１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼン等）。例えば、Ｖｉｔｅｔｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１０９８（１９８７）に記載されているように、リシン免疫毒素を調製することができる。炭素－１４標識１－イソチオシアナトベンジル－３－メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ－ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドを抗体にコンジュゲートするための例示的なキレート剤である。国際公開第９４／１１０２６号を参照されたい。リンカーは、細胞内において細胞傷害性薬物の放出を容易にする「切断可能リンカー」であってもよい。例えば、酸に不安定なリンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、感光性リンカー、ジメチルリンカー、又はジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：１２７－１３１（１９９２）；米国特許第５，２０８，０２０号）を使用してもよい。
本明細書のイムノコンジュゲート又はＡＤＣは、市販されている（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ．、Ｕ．Ｓ．Ａから）、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ－ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ－ＥＭＣＳ、スルホ－ＧＭＢＳ、スルホ－ＫＭＵＳ、スルホ－ＭＢＳ、スルホ－ＳＩＡＢ、スルホ－ＳＭＣＣ、及びスルホ－ＳＭＰＢ、並びにＳＶＳＢ（スクシンイミジル－（４－ビニルスルホン）ベンゾエート）を含むが、これらに限定されない架橋剤試薬で調製される、このような複合体を明示的に企図するが、これらに限定されない。
多重特異性抗体
特定の実施形態において、本明細書で提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる部位、すなわち、異なる抗原上の異なるエピトープ又は同じ抗原上の異なるエピトープに対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。特定の実施形態では、多重特異性抗体は、３つ又はそれより多くの結合特異性を有する。特定の実施形態では、結合特異性の１つはＧＰＲＣ５Ｄに対するものであり、他の（２つ又はそれより多くの）特異性は他の任意の抗原に対するものである。特定の実施形態では、二重特異性抗体は、ＧＰＲＣ５Ｄの２つ（又はそれより多く）の異なるエピトープに結合し得る。多重特異性（例えば、二重特異性）抗体は、細胞傷害剤又は細胞を、ＧＰＲＣ５Ｄを発現する細胞に局在化するために使用することもできる。多重特異性抗体は、完全長抗体又は抗体断片として調製できる。
多重特異性抗体を作製するための技術には、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖対の組換え共発現（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ ３０５：５３７（１９８３）参照）及び「ノブ・イン・ホール」操作（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号及びＡｔｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７０：２６（１９９７）参照）が含まれるが、これらに限定されない。多重特異性抗体は、また、抗体Ｆｃヘテロ二量体分子を作製するための静電ステアリング効果の操作（例えば、国際公開第２００９／０８９００４号参照）；２つ又はそれより多くの抗体若しくは断片の架橋（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号及びＢｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）参照）；ロイシンジッパーを使用した二重特異性抗体の産生（例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８（５）：１５４７－１５５３（１９９２）及び国際公開第２０１１／０３４６０５号参照）；軽鎖の誤対合問題を回避するための一般的な軽鎖技術の使用（例えば、国際公開第９８／５０４３１号参照）；二重特異性抗体断片を作製するための「ダイアボディ」技術の使用（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４－６４４８（１９９３）参照）；及び一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用（例えば、Ｇｒｕｂｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：５３６８（１９９４）参照）；並びに例えばＴｕｔｔ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）に記載されている三重特異性抗体の調製によって作製することができる。
例えば、「オクトパス抗体」を含め、３つ又はそれより多くの抗原結合部位を有する操作抗体、又はＤＶＤ－Ｉｇもまたここに含まれる（例えば、国際公開第２００１／７７３４２号及び国際公開第２００８／０２４７１５号を参照）。３つ又はそれより多くの抗原結合部位を有する多重特異性抗体の他の例は、国際公開第２０１０／１１５５８９号、国際公開第２０１０／１１２１９３号、国際公開第２０１０／１３６１７２号、国際公開第２０１０／１４５７９２号、及び国際公開第２０１３／０２６８３１号に見出され得る。二重特異性抗体又はその抗原結合断片には、ＧＰＲＣ５Ｄと別の異なる抗原、又はＧＰＲＣ５Ｄの２つの異なるエピトープに結合する抗原結合部位を含む「二重作用ＦＡｂ」又は「ＤＡＦ」も含まれる（例えば、米国特許出願公開第２００８／００６９８２０号明細書及び国際公開第２０１５／０９５５３９号を参照）。
多重特異性抗体はまた、同じ抗原特異性の１つ又は複数の結合アームにドメインクロスオーバーを持つ非対称の形で、すなわちＶＨ／ＶＬドメイン（例えば、国際公開第２００９／０８０２５２号及び国際公開第２０１５／１５０４４７号を参照）、ＣＨ１／ＣＬドメイン（国際公開第２００９／０８０２５３号を参照）又は完全なＦａｂアーム（国際公開第２００９／０８０２５１号、国際公開第２０１６／０１６２９９号を参照、Ｓｃｈａｅｆｅｒ等のＰＮＡＳ，１０８（２０１１）１１８７－１１９１、及びＫｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ ８（２０１６）１０１０－２０も参照）を交換することによっても提供され得る。非対称Ｆａｂアームは、荷電又は非荷電アミノ酸突然変異をドメインインターフェースに導入して正しいＦａｂペアリングを指示することによって操作することもできる。例えば、国際公開第２０１６／１７２４８５号を参照。
多重特異性抗体の様々な更なる分子フォーマットが当該技術分野で知られており、本明細書に含まれる（例えば、Ｓｐｉｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６７（２０１５）９５－１０６参照）。
本明細書に同様に含まれる特定の種類の多重特異性抗体は、標的細胞、例えば腫瘍細胞上の表面抗原、及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体の活性化インバリアント構成成分、例えばＴ細胞を再標的化して標的細胞を死滅させるためのＣＤ３に同時に結合するように設計された二重特異性抗体である。したがって、特定の実施形態では、本明細書に提供される抗体は、結合特異性のうちの一方がＧＰＲＣ５Ｄへのものであり、他方がＣＤ３へのものである多重特異性抗体、特に二重特異性抗体である。
この目的に役立ち得る二重特異性抗体フォーマットの例として、限定されないが、２つのｓｃＦｖ分子が柔軟なリンカーによって融合されている、いわゆる「ＢｉＴＥ」（二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー）分子（例えば、国際公開第２００４／１０６３８１号、国際公開第２００５／０６１５４７号、国際公開第２００７／０４２２６１号、及び国際公開第２００８／１１９５６７号、Ｎａｇｏｒｓｅｎ ａｎｄ Ｂａｅｕｅｒｌｅ，Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ３１７，１２５５－１２６０（２０１１）を参照）；ダイアボディ（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ ９，２９９－３０５（１９９６））及びその誘導体、例えばタンデムダイアボディ（「ＴａｎｄＡｂ」；Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９３，４１－５６（１９９９））；ダイアボディフォーマットに基づくが、更なる安定化のためにＣ末端ジスルフィド架橋を特徴とする「ＤＡＲＴ」（二重親和性再標的化）分子（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３９９，４３６－４４９（２０１０））、並びにいわゆるトリオマブ（これはマウス／ラットＩｇＧハイブリッド分子全体である（Ｓｅｉｍｅｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ Ｒｅｖ ３６，４５８－４６７（２０１０）に概説）が挙げられる。本明細書に含まれる特定のＴ細胞二重特異性抗体フォーマットは、国際公開第２０１３／０２６８３３号、国際公開第２０１３／０２６８３９号、国際公開第２０１６／０２０３０９号；Ｂａｃａｃ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５（８）（２０１６）ｅ１２０３４９８に記載されている。
ＧＰＲＣ５Ｄ及び第２の抗原に結合する二重特異性抗原結合分子
本発明はまた、二重特異性抗原結合分子、すなわち、２つの別個の抗原決定基（第１及び第２の抗原）に対して特異的に結合可能な少なくとも２つの抗原結合部分を含む抗原結合分子を提供する。
本発明の特定の実施形態によれば、二重特異性抗原結合分子に含まれる抗原結合部分は、Ｆａｂ分子である（すなわち、重鎖及び軽鎖で構成される抗原結合ドメイン、それぞれが可変ドメインと定常ドメインを含む）。一実施形態では、第１及び／又は第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ分子である。一実施形態では、上記Ｆａｂ分子は、ヒトである。特定の実施形態では、上記Ｆａｂ分子は、ヒト化されている。更に別の実施形態では、上記Ｆａｂ分子は、ヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインを含む。
好ましくは、抗原結合部分の少なくとも１つは、クロスオーバーＦａｂ分子である。このような改変は、異なるＦａｂ分子からの重鎖と軽鎖のミスマッチを減らし、それによって、組換え産生における本発明の二重特異性抗原結合分子の収率及び純度を高める。本発明の二重特異性抗原結合分子にとって有用な特定のクロスオーバーＦａｂ分子では、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメイン（それぞれＶＬとＶＨ）が置き換わっている。しかし、このドメイン交換を用いても、二重特異性抗原結合分子の調製は、うまく対にならなかった重鎖と軽鎖との間のいわゆるＢｅｎｃｅ Ｊｏｎｅｓ型の相互作用に起因して特定の副生成物を含む場合がある（Ｓｃｈａｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ，ＰＮＡＳ、１０８（２０１１）１１１８７－１１１９１を参照）。異なるＦａｂ分子の重鎖及び軽鎖の誤対合を更に減少し、これにより望ましい二重特異性抗原結合分子の純度及び収率を増加するため、反対の電荷を有する荷電アミノ酸を、第１の抗原（ＧＰＲＣ５Ｄ）に結合するＦａｂ分子又は第２の抗原（例えば、ＣＤ３などの活性化Ｔ細胞抗原）に結合するＦａｂ分子のいずれかのＣＨ１及びＣＬドメインにおける特定のアミノ酸位置に導入することができ、本明細書に更に記載される。電荷修飾は、二重特異性抗原結合分子 に含まれる従来のＦａｂ分子（例えば、図１Ａ～Ｃ、Ｇ～Ｊに示されるもの）、又は二重特異性抗原結合分子に含まれるＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子（例えば、図１Ｄ～Ｆ、Ｋ～Ｎに示されるもの）のいずれかでなされる（しかし、両方ではない）。特定の実施形態では、電荷修飾は、二重特異性抗原結合分子（特定の実施形態では、第１の抗原、すなわちＧＰＲＣ５Ｄに結合する）に含まれる従来のＦａｂ分子においてなされる。
本発明による特定の実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、第１の抗原（すなわちＧＰＲＣ５Ｄ）及び第２の抗原（例えば、活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３）に同時に結合することができる。一実施形態において、二重特異性抗原結合分子は、ＧＰＲＣ５Ｄと活性化Ｔ細胞抗原とを同時に結合させることによって、Ｔ細胞と標的細胞とを架橋することができる。更により特定の実施形態では、そのような同時結合は、標的細胞、特にＧＰＲＣ５Ｄ発現腫瘍細胞の溶解をもたらす。一実施形態では、そのような同時結合はＴ細胞の活性化を生じる。別の実施形態では、そのような同時結合は、増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクタ分子の放出、細胞傷害活性及び活性化マーカーの発現の群から選択されるＴリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球の細胞応答を生じる。一実施形態において、ＧＰＲＣ５Ｄへの同時結合を伴わない、活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３への二重特異性抗原結合分子の結合は、Ｔ細胞活性化をもたらさない。
一実施形態において、二重特異性抗原結合分子は、Ｔ細胞の細胞傷害活性を標的細胞に向け直すことができる。特定の実施形態では、前記向け直しは、標的細胞によるＭＨＣ媒介ペプチド抗原提示及び／又はＴ細胞の特異性と無関係である。
特に、本発明のいずれかの実施形態によるＴ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞、特にＣＤ８＋Ｔ細胞である。
第１の抗原結合部分
本発明の二重特異性抗原結合分子は、ＧＰＲＣ５Ｄ（第１の抗原）に結合する少なくとも１つの抗原結合部分、特にＦａｂ分子を含む。特定の実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、ＧＰＲＣ５Ｄに結合する２つの抗原結合部分、特にＦａｂ分子を含む。特定のそのような実施形態において、これらの抗原結合部分の各々は、同じ抗原決定基に結合する。更により特定の実施形態では、これらの抗原結合部分の全ては、同一であり、すなわち、（存在する場合）本明細書に記載されるＣＨ１及びＣＬドメインに同じアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含む。一実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、ＧＰＲＣ５Ｄに結合する２個以下の抗原結合部分、特にＦａｂ分子を含む。
特定の実施形態では、ＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗原結合部分（単数又は複数）は、従来のＦａｂ分子である。そのような実施形態では、第２の抗原に結合する抗原結合部分（単数又は複数）は、本明細書に記載するクロスオーバーＦａｂ分子（すなわち、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨ及びＶＬ又は定常ドメインＣＨ１及びＣＬが交換されている／互いに置き換わっているＦａｂ分子）である。
代替的な実施形態では、ＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗原結合部分（単数又は複数）は、本明細書に記載するクロスオーバーＦａｂ分子（すなわち、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨ及びＶＬ又は定常ドメインＣＨ１及びＣＬが交換されている／互いに置き換わっているＦａｂ分子）である。そのような実施形態では、第２の抗原に結合する抗原結合部分（単数又は複数）は、従来のＦａｂ分子である。
ＧＰＲＣ５Ｄ結合部分は、二重特異性抗原結合分子を標的部位、例えばＧＰＲＣ５Ｄを発現する特定のタイプの腫瘍細胞に向けることができる。
二重特異性抗原結合分子の第１の抗原結合部分は、科学的に明らかに不合理又は不可能でない限り、ＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体に関して本明細書に記載される特徴のいずれかを単独で又は組み合わせて組み込むことができる。
したがって、一態様において、本発明は、（ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、該第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、該第１の抗原結合部分が、配列番号８３の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８４のＨＣＤＲ２、及び配列番号８６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号８７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号８８のＬＣＤＲ２、及び配列番号８９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、第１の抗原結合部分と、（ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分と、を含む二重特異性抗原結合分子を提供する。別の態様では、本発明は、（ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、該第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、該第１の抗原結合部分が、配列番号８３の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８５のＨＣＤＲ２、及び配列番号８６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号８７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号８８のＬＣＤＲ２、及び配列番号８９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、第１の抗原結合部分と、（ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分と、を含む二重特異性抗原結合分子を提供する。別の態様では、本発明は、（ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、該第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、該第１の抗原結合部分が、配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９１のＨＣＤＲ２、及び配列番号９３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９５のＬＣＤＲ２、及び配列番号９７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、第１の抗原結合部分と、（ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分と、を含む二重特異性抗原結合分子を提供する。別の態様では、本発明は、（ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、該第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、該第１の抗原結合部分が、配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９１のＨＣＤＲ２、及び配列番号９３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９６のＬＣＤＲ２、及び配列番号９７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、第１の抗原結合部分と、（ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分と、を含む二重特異性抗原結合分子を提供する。別の態様では、本発明は、（ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、該第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、該第１の抗原結合部分が、配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９２のＨＣＤＲ２、及び配列番号９３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９５のＬＣＤＲ２、及び配列番号９７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、第１の抗原結合部分と、（ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分と、を含む二重特異性抗原結合分子を提供する。別の態様では、本発明は、（ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、該第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、該第１の抗原結合部分が、配列番号１の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号２のＨＣＤＲ２、及び配列番号３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号５のＬＣＤＲ２、及び配列番号６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、第１の抗原結合部分と、（ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分、とを含む二重特異性抗原結合分子を提供する。別の態様では、本発明は、（ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、該第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、該第１の抗原結合部分が、配列番号７の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８のＨＣＤＲ２、及び配列番号９のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号１０の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１１のＬＣＤＲ２、及び配列番号１２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、第１の抗原結合部分と、（ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分と、を含む二重特異性抗原結合分子を提供する。
いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、ヒト化抗体である（ヒト化抗体から誘導される）。一実施形態では、ＶＨは、ヒト化ＶＨであり、及び／又はＶＬは、ヒト化ＶＬである。一実施形態では、第１の抗原結合部分は、上のいずれかの実施形態と同じＣＤＲを含み、更に、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークを含む。
一実施形態では、第１の抗原結合部分のＶＨは、配列番号１３、配列番号１５、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５７及び配列番号５８の群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み、第１の抗原結合部分のＶＬは、配列番号１４、配列番号１６、配列番号５２、配列番号５３、配列番号６３及び配列番号６４の群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、第１の抗原結合部分は、配列番号１３、配列番号１５配列番号４８、配列番号４９、配列番号５７及び配列番号５８の群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるＶＨ配列、並びに、配列番号１４、配列番号１６、配列番号５２、配列番号５３、配列番号６３及び配列番号６４の群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるＶＬ配列を含む。
一実施形態では、第１の抗原結合部分は、配列番号１３、配列番号１５、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５７及び配列番号５８の群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＨ、並びに配列番号１４、配列番号１６、配列番号５２、配列番号５３、配列番号６３及び配列番号６４の群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
一実施形態では、第１の抗原結合部分は、配列番号１３、配列番号１５、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５７及び配列番号５８の群から選択されるＶＨ配列、並びに配列番号１４、配列番号１６、配列番号５２、配列番号５３、配列番号６３及び配列番号６４の群から選択されるＶＬ配列を含む。
特定の実施形態では、第１の抗原結合部分は、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号１４のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。特定の実施形態では、第１の抗原結合部分は、配列番号１３のＶＨ配列、及び配列番号１４のＶＬ配列を含む。
特定の実施形態では、第１の抗原結合部分は、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号１６のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。特定の実施形態では、第１の抗原結合部分は、配列番号１５のＶＨ配列、及び配列番号１６のＶＬ配列を含む。
特定の実施形態では、第１の抗原結合部分は、配列番号４８のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号５３のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。特定の実施形態では、第１の抗原結合部分は、配列番号４８のＶＨ配列、及び配列番号５３のＶＬ配列を含む。
特定の実施形態では、第１の抗原結合部分は、配列番号４９のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号５２のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。特定の実施形態では、第１の抗原結合部分は、配列番号４９のＶＨ配列、及び配列番号５２のＶＬ配列を含む。
特定の実施形態では、第１の抗原結合部分は、配列番号５７のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号６４のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。特定の実施形態では、第１の抗原結合部分は、配列番号５７のＶＨ配列、及び配列番号６４のＶＬ配列を含む。
特定の実施形態では、第１の抗原結合部分は、配列番号５８のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号６３のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。特定の実施形態では、第１の抗原結合部分は、配列番号５８のＶＨ配列、及び配列番号６３のＶＬ配列を含む。一実施形態では、第１の抗原結合部分は、ヒト定常領域を含む。一実施形態では、第１の抗原結合部分は、ヒト定常領域、特に、ヒトＣＨ１及び／又はＣＬドメインを含むＦａｂ分子である。ヒト定常ドメインの例示的な配列は、配列番号３７及び３８（それぞれ、ヒトカッパ及びラムダＣＬドメイン）、並びに配列番号３９（ヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメインＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）で与えられる。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、配列番号３７又は配列番号３８のアミノ酸配列、特に配列番号３７のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む。特に、軽鎖定常領域は、「電荷修飾」の状態で本明細書に記載のアミノ酸突然変異を含んでいてもよい、及び／又は、クロスオーバーＦａｂ分子での場合、１つ又は複数の（特に２つの）Ｎ末端アミノ酸の欠失又は置換を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、配列番号３９のアミノ酸配列に含まれるＣＨ１ドメイン配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む。特に、重鎖定常領域（具体的にはＣＨ１ドメイン）は、「電荷修飾」状態において本明細書に記載のアミノ酸突然変異を含んでいてもよい。
第２の抗原結合部分
本発明の二重特異性抗原結合分子は、少なくとも１つの抗原結合部分、特に第２の抗原（ＧＰＲＣ５Ｄとは異なる）に結合するＦａｂ分子を含む。
特定の実施形態では、第２の抗原に結合する抗原結合部分は、本明細書に記載するクロスオーバーＦａｂ分子（すなわち、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨ及びＶＬ又は定常ドメインＣＨ１及びＣＬが交換されている／互いに置き換わっているＦａｂ分子）である。そのような実施形態では、第１の抗原（すなわちＧＰＲＣ５Ｄ）に結合する抗原結合部分は、好ましくは従来のＦａｂ分子である。二重特異性抗原結合分子に含まれるＧＰＲＣ５Ｄに結合する２つ以上の抗原結合部分、特にＦａｂ分子が存在する実施形態では、第２の抗原に結合する抗原結合部分は、好ましくはクロスオーバーＦａｂ分子であり、ＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗原結合部分は従来のＦａｂ分子である。
代替的な実施形態では、第２の抗原に結合する抗原結合部分は、従来のＦａｂ分子である。そのような実施形態では、第１の抗原（すなわちＧＰＲＣ５Ｄ）に結合する抗原結合部分（単数又は複数）は、本明細書に記載するクロスオーバーＦａｂ分子（すなわち、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨ及びＶＬ又は定常ドメインＣＨ１及びＣＬが交換されている／互いに置き換わっているＦａｂ分子）である。二重特異性抗原結合分子に含まれる第２の抗原に結合する２つ以上の抗原結合部分、特にＦａｂ分子が存在する実施形態では、ＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗原結合部分は、好ましくはクロスオーバーＦａｂ分子であり、第２の抗原に結合する抗原結合部分は従来のＦａｂ分子である。
いくつかの実施形態において、第２の抗原は活性化Ｔ細胞抗原（本明細書では「活性化Ｔ細胞抗原結合部分、又は活性化Ｔ細胞抗原結合Ｆａｂ分子」とも呼ばれる）である。特定の実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、活性化Ｔ細胞抗原への特異的結合能を有する１つ以下の抗原結合部分を含む。一実施形態では、二重特異性抗原結合分子は活性化Ｔ細胞抗原への一価結合を提供する。
特定の実施形態では、第２の抗原は、ＣＤ３、特にヒトＣＤ３（配列番号４０）又はカニクイザルＣＤ３（配列番号４１）であり、最も具体的にはヒトＣＤ３である。一実施形態では、第２の抗原結合部分は、ヒト及びカニクイザルＣＤ３と交差反応性である（すなわち、それらに特異的に結合する）。いくつかの実施形態では、第２の抗原はＣＤ３のイプシロンサブユニット（ＣＤ３イプシロン）である。
一実施形態では、第２の抗原結合部分は配列番号２９のＨＣＤＲ１、配列番号３０のＨＣＤＲ２、配列番号３１のＨＣＤＲ３、配列番号３２のＬＣＤＲ１、配列番号３３のＬＣＤＲ２及び配列番号３４のＬＣＤＲ３を含む。
一実施形態では、第２の抗原結合部分は配列番号２９のＨＣＤＲ１、配列番号３０のＨＣＤＲ２、配列番号３１のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号３２のＬＣＤＲ１、配列番号３３のＬＣＤＲ２及び配列番号３４のＬＣＤＲ３を含むＶＬとを含む。
いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、ヒト化抗体である（ヒト化抗体から誘導される）。一実施形態では、ＶＨは、ヒト化ＶＨであり、及び／又はＶＬは、ヒト化ＶＬである。一実施形態では、第２の抗原結合部分は、上のいずれかの実施形態と同じＣＤＲを含み、更に、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークを含む。
一実施形態では、第２の抗原結合部分は、配列番号３５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるＶＨ配列を含む。一実施形態では、第２の抗原結合部分は、配列番号３６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるＶＬ配列を含む。
一実施形態では、第２の抗原結合部分は、配列番号３５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のＶＨ配列、及び配列番号３６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のＶＬ配列を含む。
一実施形態では、第２の抗原結合部分のＶＨは、配列番号３５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み、第２の抗原結合部分のＶＬは、配列番号３６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、第２の抗原結合部分は、配列番号３５のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号３６のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
一実施形態では、第２の抗原結合部分は、配列番号３５のＶＨ配列、及び配列番号３６のＶＬ配列を含む。
一実施形態では、第２の抗原結合部分は、ヒト定常領域を含む。一実施形態では、第２の抗原結合部分は、ヒト定常領域、特に、ヒトＣＨ１及び／又はＣＬドメインを含むＦａｂ分子である。ヒト定常ドメインの例示的な配列は、配列番号３７及び３８（それぞれ、ヒトカッパ及びラムダＣＬドメイン）、並びに配列番号３９（ヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメインＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）で与えられる。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、配列番号３７又は配列番号３８のアミノ酸配列、特に配列番号３７のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む。特に、軽鎖定常領域は、「電荷修飾」の状態で本明細書に記載のアミノ酸突然変異を含んでいてもよい、及び／又は、クロスオーバーＦａｂ分子での場合、１つ又は複数の（特に２つの）Ｎ末端アミノ酸の欠失又は置換を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、配列番号３９のアミノ酸配列に含まれるＣＨ１ドメイン配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む。特に、重鎖定常領域（具体的にはＣＨ１ドメイン）は、「電荷修飾」状態において本明細書に記載のアミノ酸突然変異を含んでいてもよい。
いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨ又は定常ドメインＣＬとＣＨ１、特に可変ドメインＶＬとＶＨが、互いに置き換わっているＦａｂ分子である（すなわち、そのような実施形態によれば、第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変又は定常ドメインが交換されているクロスオーバーＦａｂ分子である）。１つのそのような実施形態では、第１（及び存在する場合、第３）の抗原結合部分は、従来のＦａｂ分子である。
一実施形態では、第２の抗原（例えば、ＣＤ３などの活性化Ｔ細胞抗原）に結合する１つ以下の抗原結合部分は、二重特異性抗原結合分子中に存在する（すなわち、二重特異性抗原結合分子は、第２の抗原に対する一価の結合を提供する）。
電荷修飾
本発明の二重特異性抗原結合分子は、それに含まれるＦａｂ分子に、１つ（又は２つより多い抗原結合Ｆａｂ分子を含む分子の場合には更に多い）結合アーム中にＶＨ／ＶＬ交換を有するＦａｂ由来の二重／多重特異性抗原結合分子の産生で生じ得るマッチしない重鎖との軽鎖の間違った対形成（Ｂｅｎｃｅ－Ｊｏｎｅｓ型副生成物）を減らすのに特に効果的であるアミノ酸置換を含んでいてもよい。（その全体が本明細書に参考として組み込まれるＰＣＴ国際公開第２０１５／１５０４４７号、特に、その中の実施例も参照）。所望ではない副生成物（特に、結合アームの１つにあるＶＨ／ＶＬドメインの交換を伴う二重特異性抗原結合分子中に存在するＢｅｎｃｅ Ｊｏｎｅｓ型副生成物）と比較した場合の、所望な二重特異性抗原結合分子の比率は、帯電したアミノ酸に、ＣＨ１及びＣＬドメインの特定のアミノ酸位置に反対の電荷を導入することによって向上させることができる（本明細書では、「電荷修飾」と呼ばれることがある）。
したがって、二重特異性抗原結合分子の第１及び第２の抗原結合部分が両方ともＦａｂ分子であり、抗原結合部分の１つ（特に、第２の抗原結合部分）において、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換わっている、いくつかの実施形態では、
ｉ）第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸は、正に帯電したアミノ酸によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸又は位置２１３のアミノ酸は、負に帯電したアミノ酸によって置換されているか（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、又は
ｉｉ）第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸は、正に帯電したアミノ酸によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸又は位置２１３のアミノ酸は、負に帯電したアミノ酸によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
二重特異性抗原結合分子は、（ｉ）及び（ｉｉ）で述べられる両方の改変を含まない。ＶＨ／ＶＬが置き換わっている抗原結合部分の定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は、互いに置き換わっていない（すなわち、交換されていないままである）。
より具体的な実施形態では、
ｉ）第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸は、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸又は位置２１３のアミノ酸は、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されているか（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、又は
ｉｉ）第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸は、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸又は位置２１３のアミノ酸は、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されているか（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
そのような一実施形態では、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸は、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸又は位置２１３のアミノ酸は、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されているか（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
更なる実施形態では、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸は、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸は、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
特定の実施形態では、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、位置１２３のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、位置２１３のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
更に特定の実施形態では、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、リジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、位置１２３のアミノ酸が、リジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、位置２１３のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
更に特定の実施形態では、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、リジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、位置１２３のアミノ酸が、アルギニン（Ｒ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、位置２１３のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
特定の実施形態では、上の実施形態に係るアミノ酸置換が、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１でなされる場合、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬは、カッパアイソタイプである。
又は、上の実施形態に係るアミノ酸置換が、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１の代わりに、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１でなされていてもよい。特定のこのような実施形態では、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬは、カッパアイソタイプである。
したがって、一実施形態では、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸は、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸又は位置２１３のアミノ酸は、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
更なる実施形態では、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸は、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸は、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
更に別の実施形態では、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、位置１２３のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、位置２１３のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
一実施形態では、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、リジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、位置１２３のアミノ酸が、リジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、位置２１３のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
別の実施形態では、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、リジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、位置１２３のアミノ酸が、アルギニン（Ｒ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、位置２１３のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
特定の実施形態では、本発明の二重特異性抗原結合分子は、
（ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、該第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、該第１の抗原結合部分が、配列番号８３の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８４のＨＣＤＲ２、及び配列番号８６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号８７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号８８のＬＣＤＲ２、及び配列番号８９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分と、
（ｂ）第２の抗原に結合し、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換わったＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分と
を含み；
第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって（特定の実施形態では、独立して、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、位置１２３のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって（特定の実施形態では、独立して、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、位置２１３のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
特定の実施形態では、本発明の二重特異性抗原結合分子は、
（ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、該第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、該第１の抗原結合部分が、配列番号８３の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８５のＨＣＤＲ２、及び配列番号８６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号８７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号８８のＬＣＤＲ２、及び配列番号８９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分と、
（ｂ）第２の抗原に結合し、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換わったＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分と
を含み；
第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって（特定の実施形態では、独立して、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、位置１２３のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって（特定の実施形態では、独立して、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、位置２１３のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
特定の実施形態では、本発明の二重特異性抗原結合分子は、
（ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、該第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、該第１の抗原結合部分が、配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９１のＨＣＤＲ２、及び配列番号９３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９５のＬＣＤＲ２、及び配列番号９７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分と、
（ｂ）第２の抗原に結合し、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換わったＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分と
を含み；
第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって（特定の実施形態では、独立して、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、位置１２３のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって（特定の実施形態では、独立して、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、位置２１３のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
特定の実施形態では、本発明の二重特異性抗原結合分子は、
（ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、該第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、該第１の抗原結合部分が、配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９１のＨＣＤＲ２、及び配列番号９３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９６のＬＣＤＲ２、及び配列番号９７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分と、
（ｂ）第２の抗原に結合し、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換わったＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分と
を含み；
第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって（特定の実施形態では、独立して、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、位置１２３のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって（特定の実施形態では、独立して、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、位置２１３のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
特定の実施形態では、本発明の二重特異性抗原結合分子は、
（ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、該第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、該第１の抗原結合部分が、配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９２のＨＣＤＲ２、及び配列番号９３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９５のＬＣＤＲ２、及び配列番号９７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分と、
（ｂ）第２の抗原に結合し、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換わったＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分と
を含み；
第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって（特定の実施形態では、独立して、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、位置１２３のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって（特定の実施形態では、独立して、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、位置２１３のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
特定の実施形態では、本発明の二重特異性抗原結合分子は、
（ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、該第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、該第１の抗原結合部分が、配列番号１の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号２のＨＣＤＲ２、及び配列番号３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号５のＬＣＤＲ２、及び配列番号６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分と、
（ｂ）第２の抗原に結合し、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換わったＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分と
を含み；
第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって（特定の実施形態では、独立して、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、位置１２３のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって（特定の実施形態では、独立して、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、位置２１３のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
特定の実施形態では、本発明の二重特異性抗原結合分子は、
（ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、該第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、該第１の抗原結合部分が、配列番号７の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８のＨＣＤＲ２、及び配列番号９のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号１０の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１１のＬＣＤＲ２、及び配列番号１２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分と、
（ｂ）第２の抗原に結合し、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換わったＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分と
を含み；
第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって（特定の実施形態では、独立して、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、位置１２３のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって（特定の実施形態では、独立して、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、位置２１３のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
二重特異性抗原結合分子フォーマット
本発明に係る二重特異性抗原結合分子の構成要素は、種々の構成で互いに融合していてもよい。例示的な構造が図１Ａ－Ｚに描写されている。
特定の実施形態では、二重特異性抗原結合分子に含まれる抗原結合部分は、Ｆａｂ分子である。このような実施形態では、第１、第２、第３などの抗原結合部分は、それぞれ、本明細書では、第１、第２、第３などのＦａｂ分子と呼ばれる場合がある。
一実施形態において、二重特異性抗原結合分子の第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分は、任意にペプチドリンカーを介して、互いに融合される。特定の実施形態では、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分はそれぞれＦａｂ分子である。１つのそのような実施形態において、第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。別のそのような実施形態において、第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。（ｉ）第２の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端で第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しているか、又は（ｉｉ）第１の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端で第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している実施形態では、追加的に、第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖及び第２の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖は、任意にペプチドリンカーを介して、互いに融合していてもよい。
ＧＰＲＣ５Ｄなどの標的細胞抗原に特異的に結合することができる単一の抗原結合部分（Ｆａｂ分子など）を有する二重特異性抗原結合分子（例えば、図１Ａ、図１Ｄ、図１Ｇ、図１Ｈ、図１Ｋ、図１Ｌに示される）は、特に高親和性抗原結合部分の結合後に標的細胞抗原の内在化が予想される場合に有用である。そのような場合、標的細胞抗原に特異的な１つより多い抗原結合部分の存在は、標的細胞抗原の内部移行を増強し、それによって第２の抗原の利用能を低減し得る。
しかし他の場合において、標的細胞抗原に特異的な２つ又はそれより多くの抗原結合部分（例えば、Ｆａｂ分子）を、例えば、標的部位への標的化を最適化するため又は標的細胞抗原の架橋を可能にするために含むに二重特異性抗原結合分子（例えば、図１Ｂ、１Ｃ、１Ｅ、１Ｆ、１Ｉ、１Ｊ，１Ｍ又は１Ｎに示されているものを参照されたい）を有することが有利である。
したがって、特定の実施形態では、本発明による二重特異性抗原結合分子は、第３の抗原結合部分を含む。
一実施形態において、第３の抗原結合部分は、第１の抗原すなわちＧＰＲＣ５Ｄに結合する。一実施形態において、第３の抗原結合部分はＦａｂ分子である。
一実施形態において、第３の抗原部分は第１の抗原結合部分と同一である。
二重特異性抗原結合分子の第３の抗原結合部分は、科学的に明らかに不合理又は不可能でない限り、第１の抗原結合部分及び／又はＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体に関して本明細書に記載される特徴のいずれかを単独で又は組み合わせて組み込むことができる。
一実施形態において、第３の抗原結合部分は、配列番号８３の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８４のＨＣＤＲ２及び配列番号８６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号８７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号８８のＬＣＤＲ２及び配列番号８９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
一実施形態において、第３の抗原結合部分は、配列番号８３の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８５のＨＣＤＲ２及び配列番号８６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号８７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号８８のＬＣＤＲ２及び配列番号８９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
一実施形態において、第３の抗原結合部分は、配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９１のＨＣＤＲ２及び配列番号９３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９５のＬＣＤＲ２及び配列番号９７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
一実施形態において、第３の抗原結合部分は、配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９１のＨＣＤＲ２及び配列番号９３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９６のＬＣＤＲ２及び配列番号９７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
一実施形態において、第３の抗原結合部分は、配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９２のＨＣＤＲ２及び配列番号９３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９５のＬＣＤＲ２及び配列番号９７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
一実施形態において、第３の抗原結合部分は、配列番号１の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号２のＨＣＤＲ２及び配列番号４のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号５の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号６のＬＣＤＲ２及び配列番号７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
一実施形態において、第３の抗原結合部分は、配列番号７の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８のＨＣＤＲ２及び配列番号９のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号１０の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１１のＬＣＤＲ２及び配列番号１２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
いくつかの実施形態では、第３の抗原結合部分は、ヒト化抗体である（ヒト化抗体から誘導される）。一実施形態では、ＶＨは、ヒト化ＶＨであり、及び／又はＶＬは、ヒト化ＶＬである。一実施形態では、第３の抗原結合部分は、上のいずれかの実施形態と同じＣＤＲを含み、更に、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークを含む。
一実施形態では、第３の抗原結合部分のＶＨは、配列番号１３、配列番号１５、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５７及び配列番号５８の群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み、第３の抗原結合部分のＶＬは、配列番号１４、配列番号１６、配列番号５２、配列番号５３、配列番号６３及び配列番号６４の群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、第３の抗原結合部分は、配列番号１３、配列番号１５、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５７及び配列番号５８の群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるＶＨ配列、並びに配列番号１４、配列番号１６、配列番号５２、配列番号５３、配列番号６３及び配列番号６４の群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるＶＬ配列を含む。
一実施形態では、第３の抗原結合部分は、配列番号１３、配列番号１５、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５７及び配列番号５８の群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＨ、並びに配列番号１４、配列番号１６、配列番号５２、配列番号５３、配列番号６３及び配列番号６４の群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
一実施形態では、第３の抗原結合部分は、配列番号１３、配列番号１５、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５７及び配列番号５８の群から選択されるＶＨ配列、並びに配列番号１４、配列番号１６、配列番号５２、配列番号５３、配列番号６３及び配列番号６４の群から選択されるＶＬ配列を含む。
特定の実施形態では、第３の抗原結合部分は、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号１４のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。特定の実施形態では、第３の抗原結合部分は、配列番号１３のＶＨ配列、及び配列番号１４のＶＬ配列を含む。
特定の実施形態では、第３の抗原結合部分は、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号１６のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。特定の実施形態では、第３の抗原結合部分は、配列番号１５のＶＨ配列、及び配列番号１６のＶＬ配列を含む。
特定の実施形態では、第３の抗原結合部分は、配列番号４８のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号５３のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。特定の実施形態では、第３の抗原結合部分は、配列番号４８のＶＨ配列、及び配列番号５３のＶＬ配列を含む。
特定の実施形態では、第３の抗原結合部分は、配列番号４９のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号５２のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。特定の実施形態では、第３の抗原結合部分は、配列番号４９のＶＨ配列、及び配列番号５２のＶＬ配列を含む。
特定の実施形態では、第３の抗原結合部分は、配列番号５７のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号６４のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。特定の実施形態では、第３の抗原結合部分は、配列番号５７のＶＨ配列、及び配列番号６４のＶＬ配列を含む。
特定の実施形態では、第３の抗原結合部分は、配列番号５８のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号６３のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。特定の実施形態では、第３の抗原結合部分は、配列番号５８のＶＨ配列、及び配列番号６３のＶＬ配列を含む。
一実施形態では、第３の抗原結合部分は、ヒト定常領域を含む。一実施形態では、第３の抗原結合部分は、ヒト定常領域、特に、ヒトＣＨ１及び／又はＣＬドメインを含むＦａｂ分子である。ヒト定常ドメインの例示的な配列は、配列番号３７及び３８（それぞれ、ヒトカッパ及びラムダＣＬドメイン）、並びに配列番号３９（ヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメインＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）で与えられる。いくつかの実施形態では、第３の抗原結合部分は、配列番号３７又は配列番号３８のアミノ酸配列、特に配列番号３７のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む。特に、軽鎖定常領域は、「電荷修飾」の状態で本明細書に記載のアミノ酸突然変異を含んでいてもよい、及び／又は、クロスオーバーＦａｂ分子での場合、１つ又は複数の（特に２つの）Ｎ末端アミノ酸の欠失又は置換を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、第３の抗原結合部分は、配列番号３９のアミノ酸配列に含まれるＣＨ１ドメイン配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む。特に、重鎖定常領域（具体的にはＣＨ１ドメイン）は、「電荷修飾」状態において本明細書に記載のアミノ酸突然変異を含んでいてもよい。
特定の実施形態では、第３の抗原結合部分及び第１の抗原結合部分はそれぞれＦａｂ分子であり、第３の抗原結合部分は第１の抗原結合部分と同一である。したがって、これらの実施形態では、第１及び第３の抗原結合部分は、同じ重鎖及び軽鎖アミノ酸配列を含み、同じドメイン配置（すなわち、従来の又はクロスオーバーの）を有する。更に、これらの実施形態において、第３の抗原結合部分は、存在する場合、第１の抗原結合部分と同じアミノ酸置換を含む。例えば、本明細書において「電荷修飾」と記載されるアミノ酸置換は、第１の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分の各々の定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１において行われる。代替的に、前記アミノ酸置換は、第２の抗原結合部分（特定の実施形態ではＦａｂ分子でもある）の定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１において行われてもよく、第１の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分の定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１では行われない。
第１の抗原結合部分と同様に、第３の抗原結合部分は、特に、従来のＦａｂ分子である。しかしながら、第１及び第３の抗原結合部分がクロスオーバーＦａｂ分子である（且つ第２の抗原結合部分が従来のＦａｂ分子である）実施形態も考慮される。したがって、特定の実施形態では、第１及び第３の抗原結合部分は、各々が従来のＦａｂ分子であり、第２の抗原結合部分は、本明細書に記載されるクロスオーバーＦａｂ分子、すなわち、Ｆａｂ重鎖と軽鎖の可変ドメインＶＨとＶＬ又は定常ドメインＣＬとＣＨ１が交換されている／互いに置き換わっているＦａｂ分子である。他の実施形態では、第１及び第３の抗原結合部分は、各々がクロスオーバーＦａｂ分子であり、第２の抗原結合部分は従来のＦａｂ分子である。
第３の抗原結合部分が存在する場合、特定の実施形態では、第１及び第３の抗原部分はＧＰＲＣ５Ｄに結合し、第２の抗原結合部分は第２の抗原、特に活性化Ｔ細胞抗原、より具体的にはＣＤ３、最も具体的にはＣＤ３イプシロンに結合する。
特定の実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを含む。Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットは、安定な会合が可能である。
本発明による二重特異性抗原結合分子抗体は、異なる構造を有することができ、すなわち、第１、第２（及び任意に第３）の抗原結合部分は、互いに、異なる様式でＦｃドメインに融合していてもよい。構成要素は、直接的に、又は好ましくは１つ又は複数の適切なペプチドリンカーを介して、互いに融合していてもよい。Ｆａｂ分子の融合が、ＦｃドメインのサブユニットのＮ末端へのものである場合、それは典型的には免疫グロブリンヒンジ領域を介するものである。
いくつかの実施形態において、第１及び第２の抗原結合部分は、各々がＦａｂ分子であり、第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合している。そのような実施形態では、第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端又はＦｃドメインの他方のサブユニットのＮ末端に融合していてもよい。特定のこのような実施形態では、上記第１の抗原結合部分は、従来のＦａｂ分子であり、第２の抗原結合部分は、明細書に記載するクロスオーバーＦａｂ分子（すなわち、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨ及びＶＬ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が交換されている／互いに置き換わっているＦａｂ分子）である。他のこのような実施形態では、上記第１のＦａｂ分子が、クロスオーバーＦａｂ分子であり、第２のＦａｂ分子は、従来のＦａｂ分子である。
一実施形態において、第１及び第２の抗原結合部分は、各々がＦａｂ分子であり、第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合しており、第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。具体的な実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、第１及び第２のＦａｂ分子と、第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと、任意に１つ又は複数のペプチドリンカーとから本質的になり、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合している。そのような構造は、図１Ｇ及び１Ｋに概略的に描写されている（これらの実施例における第２の抗原結合ドメインは、ＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子である）。任意に、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は、追加的に互いに融合していてもよい。
別の実施形態において、第１及び第２の抗原結合部分は、各々がＦａｂ分子であり、第１及び第２の抗原結合部分は、各々がＦａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している。具体的な実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、第１及び第２のＦａｂ分子から本質的になり、Ｆｃドメインは、第１及び第２のサブユニットと、任意に１つ又は複数のペプチドリンカーで構成され、第１及び第２のＦａｂ分子は、それぞれ、Ｆａｂ重鎖のＣ末端をＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合する。そのような構造は、図１Ａ及び１Ｄに概略的に描写されている（これらの実施例において、第２の抗原結合ドメインはＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第１の抗原結合部分は従来のＦａｂ分子である）。第１及び第２のＦａｂ分子は、Ｆｃドメインに直接的に又はペプチドリンカーを介して融合していてもよい。特定の実施形態では、第１及び第２のＦａｂ分子は、免疫グロブリンヒンジ領域によって、それぞれＦｃドメインに融合する。具体的な実施形態では、免疫グロブリンヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域であり、特に、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１Ｆｃドメインである。
いくつかの実施形態において、第１及び第２の抗原結合部分は、各々がＦａｂ分子であり、第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合している。そのような実施形態では、第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端又は（上述のように）Ｆｃドメインの他方のサブユニットのＮ末端に融合していてもよい。特定のこのような実施形態では、上記第１の抗原結合部分は、従来のＦａｂ分子であり、第２の抗原結合部分は、明細書に記載するクロスオーバーＦａｂ分子（すなわち、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨ及びＶＬ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が交換されている／互いに置き換わっているＦａｂ分子）である。他のこのような実施形態では、上記第１のＦａｂ分子が、クロスオーバーＦａｂ分子であり、第２のＦａｂ分子は、従来のＦａｂ分子である。
一実施形態において、第１及び第２の抗原結合部分は、各々がＦａｂ分子であり、第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合しており、第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。具体的な実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、第１及び第２のＦａｂ分子と、第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと、任意に１つ又は複数のペプチドリンカーとから本質的になり、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合している。このような構造は、図１Ｈ及び１Ｌに概略的に描写されている（これらの実施例において、第２の抗原結合部分はＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第１の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子である）。任意に、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は、追加的に互いに融合していてもよい。
いくつかの実施形態において、第３の抗原結合部分、特に第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合している。特定のこのような実施形態では、上記第１及び第３のＦａｂ分子はそれぞれ従来のＦａｂ分子であり、第２のＦａｂ分子は、明細書に記載するクロスオーバーＦａｂ分子（すなわち、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨ及びＶＬ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が交換されている／互いに置き換わっているＦａｂ分子）である。他のこのような実施形態では、上記第１及び第３のＦａｂ分子はそれぞれクロスオーバーＦａｂ分子であり、第２のＦａｂ分子は、従来のＦａｂ分子である。
特定のこのような実施形態では、第２及び第３の抗原結合部分は、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合しており、第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。具体的な実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、第１、第２及び第３のＦａｂ分子と、第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと、任意に１つ又は複数のペプチドリンカーとから本質的になり、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合しており、第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合している。そのような構造は、図１Ｂ及び１Ｅ（これらの実施例において、第２の抗原結合部分はＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第１及び第３の抗原結合部分は従来のＦａｂ分子である）と、図１Ｊ及び１Ｎ（これらの実施例において、第２の抗原結合部分は従来のＦａｂ分子であり、第１及び第３の抗原結合ドメインはＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子である）に概略的に描写されている。第２及び第３のＦａｂ分子は、Ｆｃドメインに直接的に又はペプチドリンカーを介して融合していてもよい。特定の実施形態では、第２及び第３のＦａｂ分子は、免疫グロブリンヒンジ領域を介して、それぞれＦｃドメインに融合している。具体的な実施形態では、免疫グロブリンヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域であり、特に、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１Ｆｃドメインである。任意に、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は、追加的に互いに融合していてもよい。
別のこのような実施形態では、第１及び第３の抗原結合部分は、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合しており、第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。具体的な実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、第１、第２及び第３のＦａｂ分子と、第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと、任意に、１つ又は複数のペプチドリンカーとから本質的になり、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合しており、第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合している。そのような構造は、図１Ｃ及び１Ｆ（これらの実施例において、第２の抗原結合部分はＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第１及び第３の抗原結合部分は従来のＦａｂ分子である）と、図１Ｉ及び１Ｍ（これらの実施例において、第２の抗原結合部分は従来のＦａｂ分子であり、第１及び第３の抗原結合ドメインはＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子である）に概略的に描写されている。第１及び第３のＦａｂ分子は、Ｆｃドメインに直接的に又はペプチドリンカーを介して融合していてもよい。特定の実施形態では、第１及び第３のＦａｂ分子は、免疫グロブリンヒンジ領域によって、それぞれＦｃドメインに融合する。具体的な実施形態では、免疫グロブリンヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域であり、特に、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１Ｆｃドメインである。任意に、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は、追加的に互いに融合していてもよい。
Ｆａｂ分子が、免疫グロブリンヒンジ領域を介してＦａｂ重鎖のＣ末端をＦｃドメインのそれぞれのサブユニットのＮ末端に融合する二重特異性抗原結合分子の構成において、２つのＦａｂ分子、ヒンジ領域及びＦｃドメインは、本質的に免疫グロブリン分子を形成する。特定の実施形態では、免疫グロブリン分子は、ＩｇＧクラス免疫グロブリンである。なお更なる特定の実施形態では、免疫グロブリンは、ＩｇＧ１サブクラス免疫グロブリンである。別の実施形態では、免疫グロブリンは、ＩｇＧ４サブクラス免疫グロブリンである。更に特定の実施形態では、免疫グロブリンは、ヒト免疫グロブリンである。他の実施形態では、免疫グロブリンは、キメラ免疫グロブリン又はヒト化免疫グロブリンである。一実施形態では、免疫グロブリンは、ヒト定常領域、特に、ヒトＦｃ領域を含む。
本発明の二重特異性抗原結合分子のいくつかにおいて、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は、任意にペプチドリンカーを介して、互いに融合している。第１及び第２のＦａｂ分子の構造に応じて、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は、そのＣ末端で第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖のＮ末端に融合していてもよく、又は第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は、そのＣ末端で第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖のＮ末端に融合していてもよい。第１及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖の融合は、適合しないＦａｂ重鎖及び軽鎖の誤対合をさらに低減し、本発明の二重特異性抗原結合分子の一部の発現に必要なプラスミドの数も低減する。
抗原結合部分は、Ｆｃドメインに又は互いに、直接的に又は１個又は複数個のアミノ酸、典型的には約２～２０個のアミノ酸を含むペプチドリンカーを介して融合していてもよい。ペプチドリンカーは、当該技術分野に知られており、本明細書に説明されている。適切な非免疫原性ペプチドリンカーには、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎ、（ＳＧ４）ｎ、（Ｇ４Ｓ）ｎ又はＧ４（ＳＧ４）ｎペプチドリンカーが挙げられる。「ｎ」は、一般的に、１～１０、典型的には２～４の整数である。一実施形態では、上記ペプチドリンカーは、少なくとも５アミノ酸長を有し、一実施形態では、５～１００アミノ酸長、更なる実施形態では、１０～５０アミノ酸長を有する。一実施形態では、前記リンカーペプチドは、（ＧｘＳ）ｎ又は（ＧｘＳ）ｎＧｍであり、Ｇ＝グリシン、Ｓ＝セリン、及び（ｘ＝３、ｎ＝３、４、５又は６、ｍ＝０、１、２又は３）、又は（ｘ＝４、ｎ＝２、３、４又は５、ｍ＝０、１、２又は３）であり、一実施形態では、ｘ＝４、ｎ＝２又は３、更なる実施形態では、ｘ＝４、ｎ＝２である。一実施形態では、前記ペプチドリンカーは（Ｇ４Ｓ）２である。第１及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖を互いに融合するのに特に適したペプチドリンカーは、（Ｇ４Ｓ）２である。第１及び第２のＦａｂ断片のＦａｂ重鎖を接続するために適した例示的なペプチドリンカーは、配列（Ｄ）－（Ｇ４Ｓ）２（配列番号４３及び４４）を含む。別の適切なそのようなリンカーは、配列（Ｇ４Ｓ）４を含む。加えて、リンカーは、免疫グロブリンヒンジ領域（の一部）を含んでいてもよい。特に、Ｆａｂ分子がＦｃドメインサブユニットのＮ末端に融合する場合、免疫グロブリンヒンジ領域又はその一部を介して、さらなるペプチドリンカーを伴い又は伴うことなく融合していてもよい。
特定の実施形態では、本発明による二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と、カルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち、第２のＦａｂ分子が、クロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖可変領域が軽鎖可変領域と置き換わっている）、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域が、Ｆｃドメインサブユニット（ＶＬ（２）－ＣＨ１（２）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））と、カルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドと、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、Ｆｃドメインサブユニット（ＶＨ（１）－ＣＨ１（１）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））と、カルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、更に、ポリペプチドを含み、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域（ＶＨ（２）－ＣＬ（２））及び第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＬ（１））と、カルボキシ末端ペプチド結合を共有する。特定の実施形態では、ポリペプチドは、例えば、ジスルフィド結合によって共有結合している。
特定の実施形態では、本発明による二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と、カルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち、第２のＦａｂ分子が、クロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖定常領域が軽鎖定常領域と置き換わっている）、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域が、Ｆｃドメインサブユニット（ＶＨ（２）－ＣＬ（２）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））と、カルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドと、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、Ｆｃドメインサブユニット（ＶＨ（１）－ＣＨ１（１）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））と、カルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、更に、ポリペプチドを含み、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域（ＶＬ（２）－ＣＨ１（２）））及び第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＬ（１））と、カルボキシ末端ペプチド結合を共有する。特定の実施形態では、ポリペプチドは、例えば、ジスルフィド結合によって共有結合している。
いくつかの実施形態において、二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有し（すなわち、第２のＦａｂ分子が、クロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖可変領域が軽鎖可変領域により置き換えられている）、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖と共有し、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、カルボキシ末端ペプチド結合を、Ｆｃドメインサブユニットと共有するポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＨ１（２）－ＶＨ（１）－ＣＨ１（１）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））を含む。他の実施形態において、二重特異性抗原結合分子は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域と共有し、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有し（すなわち、第２のＦａｂ分子が、クロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖可変領域が軽鎖可変領域により置き換えられている）、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、Ｆｃドメインサブユニットと共有するポリペプチド（ＶＨ（１）－ＣＨ１（１）－ＶＬ（２）－ＣＨ１（２）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））を含む。
これらの実施形態のいくつかにおいて、二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有する第２のＦａｂ分子のクロスオーバーＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＨ（２）－ＣＬ（２））及び第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＬ（１））をさらに含む。これらの実施形態の他のいくつかにおいて、適切であれば、二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有し、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチドと共有するポリペプチド（ＶＨ（２）－ＣＬ（２）－ＶＬ（１）－ＣＬ（１））、又は第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチドが、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域と共有し、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＬ（１）－ＶＨ（２）－ＣＬ（２））をさらに含む。
これらの実施形態による二重特異性抗原結合分子は、（ｉ）Ｆｃドメインサブユニットポリペプチド（ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））、又は（ｉｉ）第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖がカルボキシ末端ペプチド結合をＦｃドメインサブユニットと共有するポリペプチド（ＶＨ（３）－ＣＨ１（３）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））及び第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（３）－ＣＬ（３））をさらに含むことができる。特定の実施形態では、ポリペプチドは、例えば、ジスルフィド結合によって共有結合している。
いくつかの実施形態において、二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有し（すなわち、第２のＦａｂ分子が、クロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖定常領域が軽鎖定常領域により置き換えられている）、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖と共有し、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、カルボキシ末端ペプチド結合を、Ｆｃドメインサブユニットと共有するポリペプチド（ＶＨ（２）－ＣＬ（２）－ＶＨ（１）－ＣＨ１（１）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））を含む。他の実施形態において、二重特異性抗原結合分子は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域と共有し、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有し（すなわち、第２のＦａｂ分子が、クロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖定常領域が軽鎖定常領域により置き換えられている）、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、Ｆｃドメインサブユニットと共有するポリペプチド（ＶＨ（１）－ＣＨ１（１）－ＶＨ（２）－ＣＬ（２）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））を含む。
これらの実施形態のいくつかにおいて、二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有する第２のＦａｂ分子のクロスオーバーＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＨ１（２））及び第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＬ（１））をさらに含む。これらの実施形態の他のいくつかにおいて、適切であれば、二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有し、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチドと共有するポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＨ１（２）－ＶＬ（１）－ＣＬ（１））、又は第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチドが、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域と共有し、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＬ（１）－ＶＬ（２）－ＣＨ１（２））をさらに含む。
これらの実施形態による二重特異性抗原結合分子は、（ｉ）Ｆｃドメインサブユニットポリペプチド（ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））、又は（ｉｉ）第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖がカルボキシ末端ペプチド結合をＦｃドメインサブユニットと共有するポリペプチド（ＶＨ（３）－ＣＨ１（３）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））及び第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（３）－ＣＬ（３））をさらに含むことができる。特定の実施形態では、ポリペプチドは、例えば、ジスルフィド結合によって共有結合している。
特定の実施形態では、二重特異性抗原結合分子はＦｃドメインを含まない。特定のこのような実施形態では、上記第１及び存在する場合は第３のＦａｂ分子はそれぞれ従来のＦａｂ分子であり、第２のＦａｂ分子は、明細書に記載するクロスオーバーＦａｂ分子（すなわち、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨ及びＶＬ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が交換されている／互いに置き換わっているＦａｂ分子）である。他のこのような実施形態では、上記第１及び存在する場合は第３のＦａｂ分子はそれぞれクロスオーバーＦａｂ分子であり、第２のＦａｂ分子は、従来のＦａｂ分子である。
１つのそのような実施形態において、二重特異性抗原結合分子は、第１及び第２の抗原結合部分、並びに任意に１つ又は複数のペプチドリンカーから本質的になり、第１及び第２の抗原結合部分は、両方ともＦａｂ分子であり、第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。そのような構造は、図１Ｏ及び１Ｓに概略的に描写されている（これらの実施例において、第２の抗原結合ドメインはＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第１の抗原結合部分は従来のＦａｂ分子である）。
別のそのような実施形態において、二重特異性抗原結合分子は、第１及び第２の抗原結合部分、並びに任意に１つ又は複数のペプチドリンカーから本質的になり、第１及び第２の抗原結合部分は、両方ともＦａｂ分子であり、第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。そのような構造は、図１Ｐ及び１Ｔに概略的に描写されている（これらの実施例において、第２の抗原結合ドメインはＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第１の抗原結合部分は従来のＦａｂ分子である）。
いくつかの実施形態において、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、二重特異性抗原結合分子は、第３の抗原結合部分、特に第３のＦａｂ分子をさらに含み、前記第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。特定のそのような実施形態において、二重特異性抗原結合分子は、第１、第２及び第３のＦａｂ分子、並びに任意に１つ又は複数のペプチドリンカーから本質的になり、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。そのような構造は、図１Ｑ及び１Ｕ（これらの実施例において、第２の抗原結合ドメインはＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第１及び抗原結合部分は各々が従来のＦａｂ分子である）、又は図１Ｘ及び１Ｚ（これらの実施例において、第２の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子であり、第１及び第３の抗原結合部分は各々がＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子である）に概略的に描写されている。
いくつかの実施形態において、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、二重特異性抗原結合分子は、第３の抗原結合部分、特に第３のＦａｂ分子をさらに含み、前記第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＮ末端で第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＣ末端に融合している。特定のそのような実施形態において、二重特異性抗原結合分子は、第１、第２及び第３のＦａｂ分子、並びに任意に１つ又は複数のペプチドリンカーから本質的になり、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＮ末端で第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＣ末端に融合している。そのような構造は、図１Ｒ及び１Ｖ（これらの実施例において、第２の抗原結合ドメインはＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第１及び抗原結合部分は各々が従来のＦａｂ分子である）、又は図１Ｗ及び１Ｙ（これらの実施例において、第２の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子であり、第１及び第３の抗原結合部分は各々がＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子である）に概略的に描写されている。
特定の実施形態において、本発明による二重特異性抗原結合分子は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域と共有し、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有する（すなわち、第２のＦａｂ分子がクロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられている）ポリペプチド（ＶＨ（１）－ＣＨ１（１）－ＶＬ（２）－ＣＨ１（２））を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、更に、ポリペプチドを含み、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域（ＶＨ（２）－ＣＬ（２））及び第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＬ（１））と、カルボキシ末端ペプチド結合を共有する。
特定の実施形態において、本発明による二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有し（すなわち、第２のＦａｂ分子がクロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられている）、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖と共有するポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＨ１（２）－ＶＨ（１）－ＣＨ１（１））を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、更に、ポリペプチドを含み、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域（ＶＨ（２）－ＣＬ（２））及び第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＬ（１））と、カルボキシ末端ペプチド結合を共有する。
特定の実施形態において、本発明による二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有し（すなわち、第２のＦａｂ分子がクロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖定常領域が軽鎖定常領域によって置き換えられている）、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖と共有するポリペプチド（ＶＨ（２）－ＣＬ（２）－ＶＨ（１）－ＣＨ１（１））を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、更に、ポリペプチドを含み、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域（ＶＬ（２）－ＣＨ１（２）））及び第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＬ（１））と、カルボキシ末端ペプチド結合を共有する。
特定の実施形態において、本発明による二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有し（すなわち、第２のＦａｂ分子がクロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられている）、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖と共有するポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＨ１（２）－ＶＨ（１）－ＣＨ１（１））を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、更に、ポリペプチドを含み、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域（ＶＨ（２）－ＣＬ（２））及び第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＬ（１））と、カルボキシ末端ペプチド結合を共有する。
特定の実施形態では、本発明による二重特異性抗原結合分子は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖と共有し、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域と共有し、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有する（すなわち、第２のＦａｂ分子がクロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられている）ポリペプチド（ＶＨ（３）－ＣＨ１（３）－ＶＨ（１）－ＣＨ１（１）－ＶＬ（２）－ＣＨ１（２））を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、更に、ポリペプチドを含み、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域（ＶＨ（２）－ＣＬ（２））及び第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＬ（１））と、カルボキシ末端ペプチド結合を共有する。いくつかの実施形態において、二重特異性抗原結合分子は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（３）－ＣＬ（３））をさらに含む。
特定の実施形態では、本発明による二重特異性抗原結合分子は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖と共有し、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域と共有し、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有する（すなわち、第２のＦａｂ分子がクロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖定常領域が軽鎖定常領域によって置き換えられている）ポリペプチド（ＶＨ（３）－ＣＨ１（３）－ＶＨ（１）－ＣＨ１（１）－ＶＨ（２）－ＣＬ（２））を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、更に、ポリペプチドを含み、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域（ＶＬ（２）－ＣＨ１（２）））及び第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＬ（１））と、カルボキシ末端ペプチド結合を共有する。いくつかの実施形態において、二重特異性抗原結合分子は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（３）－ＣＬ（３））をさらに含む。
特定の実施形態では、本発明による二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有し（すなわち、第２のＦａｂ分子が、クロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖可変領域が、軽鎖可変領域によって置き換えられている）、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖と共有し、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖と共有するポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＨ１（２）－ＶＨ（１）－ＣＨ１（１）－ＶＨ（３）－ＣＨ１（３））を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、更に、ポリペプチドを含み、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域（ＶＨ（２）－ＣＬ（２））及び第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＬ（１））と、カルボキシ末端ペプチド結合を共有する。いくつかの実施形態において、二重特異性抗原結合分子は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（３）－ＣＬ（３））をさらに含む。
特定の実施形態では、本発明による二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有し（すなわち、第２のＦａｂ分子が、クロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖定常領域が、軽鎖定常領域によって置き換えられている）、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖と共有し、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖と共有するポリペプチド（ＶＨ（２）－ＣＬ（２）－ＶＨ（１）－ＣＨ１（１）－ＶＨ（３）－ＣＨ１（３））を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、更に、ポリペプチドを含み、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域（ＶＬ（２）－ＣＨ１（２）））及び第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＬ（１））と、カルボキシ末端ペプチド結合を共有する。いくつかの実施形態において、二重特異性抗原結合分子は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（３）－ＣＬ（３））をさらに含む。
特定の実施形態では、本発明による二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域と共有し、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有し（すなわち、第１のＦａｂ分子が、クロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖可変領域が、軽鎖可変領域によって置き換えられている）、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域と共有し、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有する（すなわち、第３のＦａｂ分子がクロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられている）ポリペプチド（ＶＨ（２）－ＣＨ１（２）－ＶＬ（１）－ＣＨ１（１）－ＶＬ（３）－ＣＨ１（３））を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、更に、ポリペプチドを含み、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域（ＶＨ（１）－ＣＬ（１））及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＬ（２））と、カルボキシ末端ペプチド結合を共有する。いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＨ（３）－ＣＬ（３））をさらに含む。
特定の実施形態では、本発明による二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域と共有し、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有し（すなわち、第１のＦａｂ分子が、クロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖定常領域が、軽鎖定常領域によって置き換えられている）、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域と共有し、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有する（すなわち、第３のＦａｂ分子がクロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖定常領域が、軽鎖定常領域によって置き換えられている）ポリペプチド（ＶＨ（２）－ＣＨ１（２）－ＶＨ（１）－ＣＬ（１）－ＶＨ（３）－ＣＬ（３））を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、更に、ポリペプチドを含み、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域（ＶＬ（１）－ＣＨ１（１））及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＬ（２））と、カルボキシ末端ペプチド結合を共有する。いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＬ（３）－ＣＨ１（３））をさらに含む。
特定の実施形態では、本発明による二重特異性抗原結合分子は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有し（すなわち、第３のＦａｂ分子が、クロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖可変領域が、軽鎖可変領域によって置き換えられている）、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域と共有し、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有し（すなわち、第１のＦａｂ分子がクロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられている）、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖と共有するポリペプチド（ＶＬ（３）－ＣＨ１（３）－ＶＬ（１）－ＣＨ１（１）－ＶＨ（２）－ＣＨ１（２））を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、更に、ポリペプチドを含み、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域（ＶＨ（１）－ＣＬ（１））及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＬ（２））と、カルボキシ末端ペプチド結合を共有する。いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＨ（３）－ＣＬ（３））をさらに含む。
特定の実施形態では、本発明による二重特異性抗原結合分子は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有し（すなわち、第３のＦａｂ分子が、クロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖定常領域が軽鎖定常領域と置き換わっている）、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域と共有し、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有し（すなわち、第１のＦａｂ分子がクロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖定常領域が軽鎖定常領域に置き換えられている）、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖と共有するポリペプチド（ＶＨ（３）－ＣＬ（３）－ＶＨ（１）－ＣＬ（１）－ＶＨ（２）－ＣＨ１（２））を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、更に、ポリペプチドを含み、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域（ＶＬ（１）－ＣＨ１（１））及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＬ（２））と、カルボキシ末端ペプチド結合を共有する。いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＬ（３）－ＣＨ１（３））をさらに含む。
特定の実施形態において、本発明は、二重特異性抗原結合分子であって、
ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、該第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、該第１の抗原結合部分が、配列番号８３の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８４のＨＣＤＲ２、及び配列番号８６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号８７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号８８のＬＣＤＲ２、及び配列番号８９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分と、
ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、該第２の抗原が活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３、より具体的にはＣＤ３イプシロンであり、該第２の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに置き換わっている、第２の抗原結合部分と、
ｃ）第１の抗原に結合し、第１の抗原結合部分と同一である第３の抗原結合部分と、
ｄ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと
を含む、二重特異性抗原結合分子を提供し；
（ｉ）ａ）の第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でｂ）の第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、ｂ）の第２の抗原結合部分及びＣ）の第３の抗原結合部分が、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でｄ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合しているか、又は
（ｉｉ）ｂ）の第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でａ）の第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、ａ）の第１の抗原結合部分及びｃ）の第３の抗原結合部分が、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でｄ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している。
特定の実施形態において、本発明は、二重特異性抗原結合分子であって、
ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、該第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、該第１の抗原結合部分が、配列番号８３の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８５のＨＣＤＲ２、及び配列番号８６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号８７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号８８のＬＣＤＲ２、及び配列番号８９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分と、
ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、該第２の抗原が活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３、より具体的にはＣＤ３イプシロンであり、該第２の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに置き換わっている、第２の抗原結合部分と、
ｃ）第１の抗原に結合し、第１の抗原結合部分と同一である第３の抗原結合部分と、
ｄ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと
を含む、二重特異性抗原結合分子を提供し；
（ｉ）ａ）の第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でｂ）の第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、ｂ）の第２の抗原結合部分及びＣ）の第３の抗原結合部分が、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でｄ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合しているか、又は
（ｉｉ）ｂ）の第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でａ）の第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、ａ）の第１の抗原結合部分及びｃ）の第３の抗原結合部分が、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でｄ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している。
特定の実施形態において、本発明は、二重特異性抗原結合分子であって、
ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、該第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、該第１の抗原結合部分が、配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９１のＨＣＤＲ２、及び配列番号９３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９５のＬＣＤＲ２、及び配列番号９７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分と、
ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、該第２の抗原が活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３、より具体的にはＣＤ３イプシロンであり、該第２の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに置き換わっている、第２の抗原結合部分と、
ｃ）第１の抗原に結合し、第１の抗原結合部分と同一である第３の抗原結合部分と、
ｄ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと
を含む、二重特異性抗原結合分子を提供し；
（ｉ）ａ）の第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でｂ）の第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、ｂ）の第２の抗原結合部分及びＣ）の第３の抗原結合部分が、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でｄ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合しているか、又は
（ｉｉ）ｂ）の第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でａ）の第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、ａ）の第１の抗原結合部分及びｃ）の第３の抗原結合部分が、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でｄ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している。
特定の実施形態において、本発明は、二重特異性抗原結合分子であって、
ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、該第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、該第１の抗原結合部分が、配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９１のＨＣＤＲ２、及び配列番号９３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９６のＬＣＤＲ２、及び配列番号９７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分と、
ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、該第２の抗原が活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３、より具体的にはＣＤ３イプシロンであり、該第２の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに置き換わっている、第２の抗原結合部分と、
ｃ）第１の抗原に結合し、第１の抗原結合部分と同一である第３の抗原結合部分と、
ｄ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと
を含む、二重特異性抗原結合分子を提供し；
（ｉ）ａ）の第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でｂ）の第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、ｂ）の第２の抗原結合部分及びＣ）の第３の抗原結合部分が、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でｄ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合しているか、又は
（ｉｉ）ｂ）の第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でａ）の第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、ａ）の第１の抗原結合部分及びｃ）の第３の抗原結合部分が、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でｄ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している。
特定の実施形態において、本発明は、二重特異性抗原結合分子であって、
ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、該第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、該第１の抗原結合部分が、配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９２のＨＣＤＲ２、及び配列番号９３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９５のＬＣＤＲ２、及び配列番号９７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分と、
ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、該第２の抗原が活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３、より具体的にはＣＤ３イプシロンであり、該第２の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに置き換わっている、第２の抗原結合部分と、
ｃ）第１の抗原に結合し、第１の抗原結合部分と同一である第３の抗原結合部分と、
ｄ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと
を含む、二重特異性抗原結合分子を提供し；
（ｉ）ａ）の第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でｂ）の第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、ｂ）の第２の抗原結合部分及びＣ）の第３の抗原結合部分が、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でｄ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合しているか、又は
（ｉｉ）ｂ）の第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でａ）の第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、ａ）の第１の抗原結合部分及びｃ）の第３の抗原結合部分が、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でｄ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している。
特定の実施形態において、本発明は、二重特異性抗原結合分子であって、
ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、該第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、該第１の抗原結合部分が、配列番号１の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号２のＨＣＤＲ２、及び配列番号３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号５のＬＣＤＲ２、及び配列番号６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分と、
ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、該第２の抗原が活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３、より具体的にはＣＤ３イプシロンであり、該第２の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに置き換わっている、第２の抗原結合部分と、
ｃ）第１の抗原に結合し、第１の抗原結合部分と同一である第３の抗原結合部分と、
ｄ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと
を含む、二重特異性抗原結合分子を提供し；
（ｉ）ａ）の第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でｂ）の第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、ｂ）の第２の抗原結合部分及びＣ）の第３の抗原結合部分が、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でｄ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合しているか、又は
（ｉｉ）ｂ）の第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でａ）の第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、ａ）の第１の抗原結合部分及びｃ）の第３の抗原結合部分が、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でｄ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している。
特定の実施形態において、本発明は、二重特異性抗原結合分子であって、
ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、該第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、該第１の抗原結合部分が、配列番号７の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８のＨＣＤＲ２、及び配列番号９のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号１０の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１１のＬＣＤＲ２、及び配列番号１２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分と、
ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、該第２の抗原が活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３、より具体的にはＣＤ３イプシロンであり、該第２の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに置き換わっている、第２の抗原結合部分と、
ｃ）第１の抗原に結合し、第１の抗原結合部分と同一である第３の抗原結合部分と、
ｄ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと
を含む、二重特異性抗原結合分子を提供し；
（ｉ）ａ）の第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でｂ）の第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、ｂ）の第２の抗原結合部分及びＣ）の第３の抗原結合部分が、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でｄ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合しているか、又は
（ｉｉ）ｂ）の第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でａ）の第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、ａ）の第１の抗原結合部分及びｃ）の第３の抗原結合部分が、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でｄ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している。
別の実施形態において、本発明は、二重特異性抗原結合分子であって、
ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、該第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、該第１の抗原結合部分が、配列番号８３の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８４のＨＣＤＲ２、及び配列番号８６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号８７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号８８のＬＣＤＲ２、及び配列番号８９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分と、
ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、該第２の抗原が活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３、より具体的にはＣＤ３イプシロンであり、該第２の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに置き換わっている、第２の抗原結合部分と、
ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと
を含む、二重特異性抗原結合分子を提供し；
（ｉ）（ａ）の第１の抗原結合部分及び（ｂ）の第２の抗原結合部分は、各々がＦａｂ重鎖のＣ末端で（ｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している。
別の実施形態において、本発明は、二重特異性抗原結合分子であって、
ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、該第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、該第１の抗原結合部分が、配列番号８３の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８５のＨＣＤＲ２、及び配列番号８６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号８７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号８８のＬＣＤＲ２、及び配列番号８９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分と、
ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、該第２の抗原が活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３、より具体的にはＣＤ３イプシロンであり、該第２の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに置き換わっている、第２の抗原結合部分と、
ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと
を含む、二重特異性抗原結合分子を提供し；
（ｉ）（ａ）の第１の抗原結合部分及び（ｂ）の第２の抗原結合部分は、各々がＦａｂ重鎖のＣ末端で（ｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している。
別の実施形態において、本発明は、二重特異性抗原結合分子であって、
ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、該第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、該第１の抗原結合部分が、配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９１のＨＣＤＲ２、及び配列番号９３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９５のＬＣＤＲ２、及び配列番号９７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分と、
ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、該第２の抗原が活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３、より具体的にはＣＤ３イプシロンであり、該第２の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに置き換わっている、第２の抗原結合部分と、
ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと
を含む、二重特異性抗原結合分子を提供し；
（ｉ）（ａ）の第１の抗原結合部分及び（ｂ）の第２の抗原結合部分は、各々がＦａｂ重鎖のＣ末端で（ｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している。
別の実施形態において、本発明は、二重特異性抗原結合分子であって、
ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、該第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、該第１の抗原結合部分が、配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９１のＨＣＤＲ２、及び配列番号９３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９６のＬＣＤＲ２、及び配列番号９７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分と、
ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、該第２の抗原が活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３、より具体的にはＣＤ３イプシロンであり、該第２の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに置き換わっている、第２の抗原結合部分と、
ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと
を含む、二重特異性抗原結合分子を提供し；
（ｉ）（ａ）の第１の抗原結合部分及び（ｂ）の第２の抗原結合部分は、各々がＦａｂ重鎖のＣ末端で（ｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している。
別の実施形態において、本発明は、二重特異性抗原結合分子であって、
ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、該第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、該第１の抗原結合部分が、配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９２のＨＣＤＲ２、及び配列番号９３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９５のＬＣＤＲ２、及び配列番号９７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分と、
ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、該第２の抗原が活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３、より具体的にはＣＤ３イプシロンであり、該第２の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに置き換わっている、第２の抗原結合部分と、
ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと
を含む、二重特異性抗原結合分子を提供し；
（ｉ）（ａ）の第１の抗原結合部分及び（ｂ）の第２の抗原結合部分は、各々がＦａｂ重鎖のＣ末端で（ｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している。
別の実施形態において、本発明は、二重特異性抗原結合分子であって、
ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、該第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、該第１の抗原結合部分が、配列番号１の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号２のＨＣＤＲ２、及び配列番号３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号５のＬＣＤＲ２、及び配列番号６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分と、
ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、該第２の抗原が活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３、より具体的にはＣＤ３イプシロンであり、該第２の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに置き換わっている、第２の抗原結合部分と、
ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと
を含む、二重特異性抗原結合分子を提供し；
（ｉ）（ａ）の第１の抗原結合部分及び（ｂ）の第２の抗原結合部分は、各々がＦａｂ重鎖のＣ末端で（ｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している。
別の実施形態において、本発明は、二重特異性抗原結合分子であって、
ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、該第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、該第１の抗原結合部分が、配列番号７の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８のＨＣＤＲ２、及び配列番号９のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号１０の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１１のＬＣＤＲ２、及び配列番号１２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分と、
ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、該第２の抗原が活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３、より具体的にはＣＤ３イプシロンであり、該第２の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに置き換わっている、第２の抗原結合部分と、
ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと
を含む、二重特異性抗原結合分子を提供し；
（ｉ）（ａ）の第１の抗原結合部分及び（ｂ）の第２の抗原結合部分は、各々がＦａｂ重鎖のＣ末端で（ｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している。
本発明による二重特異性抗原結合分子の異なる構成の全てにおいて、本明細書に記載するアミノ酸置換は、存在する場合、第１及び（存在する場合は）第３の抗原結合部分／Ｆａｂ分子のＣＨ１及びＣＬドメイン、又は第２の抗原結合部分／Ｆａｂ分子のＣＨ１又はＣＬドメインのいずれかにあってもよい。好ましくは、それらは、第１及び（存在する場合）第３の抗原結合部分／Ｆａｂ分子のＣＨ１ドメイン及びＣＬドメインにおけるものである。本発明の概念によれば、本明細書に記載されるアミノ酸置換が、第１（及び存在する場合、第３）の抗原結合部分／Ｆａｂ分子において行われる場合、このようなアミノ酸置換は、第２の抗原結合部分／Ｆａｂ分子において行われない。逆に、本明細書に記載されるアミノ酸置換が、第２の抗原結合部分／Ｆａｂ分子において行われる場合、このようなアミノ酸置換は、第１（及び存在する場合、第３）の抗原結合部分／Ｆａｂ分子において行われない。アミノ酸置換は、特定的には、Ｆａｂ分子を含む二重特異性抗原結合分子でなされ、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨ１が互いに置き換わっている。
本発明による二重特異性抗原結合分子の特定の実施形態において、特に、本明細書に記載されるアミノ酸置換が第１（及び存在する場合、第３）の抗原結合部分／Ｆａｂ分子において行われる場合、第１（及び存在する場合、第３）のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬは、カッパアイソタイプのものである。本発明による二重特異性抗原結合分子の他の実施形態では、特に、本明細書に記載のアミノ酸置換が、第２の抗原結合部分／Ｆａｂ分子内で行われる実施形態では、第２の抗原結合部分／Ｆａｂ分子の定常ドメインＣＬは、カッパアイソタイプである。いくつかの実施形態では、第１（及び存在する場合、第３）の抗原結合部分／Ｆａｂ分子の定常ドメインＣＬと、第２の抗原結合部分／Ｆａｂ分子の定常ドメインＣＬは、カッパアイソタイプである。
一実施形態において、本発明は、二重特異性抗原結合分子であって、
ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、該第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、該第１の抗原結合部分が、配列番号８３の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８４のＨＣＤＲ２、及び配列番号８６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号８７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号８８のＬＣＤＲ２、及び配列番号８９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分と、
ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、該第２の抗原が活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３、より具体的にはＣＤ３イプシロンであり、該第２の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換わっている、第２の抗原結合部分と、
ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと
を含む、二重特異性抗原結合分子を提供し；
ａ）での第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、リジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、位置１２３のアミノ酸が、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって（最も特定的にはアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、ａ）での第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、位置２１３のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、
（ｉ）ａ）の第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でｂ）の第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、ｂ）の第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合しているか、又は
（ｉｉ）（ｂ）の第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で（ａ）の第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、（ａ）の第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で（ｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している。
一実施形態において、本発明は、二重特異性抗原結合分子であって、
ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、該第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、該第１の抗原結合部分が、配列番号８３の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８５のＨＣＤＲ２、及び配列番号８６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号８７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号８８のＬＣＤＲ２、及び配列番号８９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分と、
ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、該第２の抗原が活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３、より具体的にはＣＤ３イプシロンであり、該第２の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換わっている、第２の抗原結合部分と、
ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと
を含む、二重特異性抗原結合分子を提供し；
ａ）での第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、リジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、位置１２３のアミノ酸が、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって（最も特定的にはアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、ａ）での第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、位置２１３のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、
（ｉ）ａ）の第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でｂ）の第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、ｂ）の第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合しているか、又は
（ｉｉ）（ｂ）の第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で（ａ）の第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、（ａ）の第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で（ｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している。
一実施形態において、本発明は、二重特異性抗原結合分子であって、
ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、該第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、該第１の抗原結合部分が、配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９１のＨＣＤＲ２、及び配列番号９３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９５のＬＣＤＲ２、及び配列番号９７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分と、
ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、該第２の抗原が活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３、より具体的にはＣＤ３イプシロンであり、該第２の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換わっている、第２の抗原結合部分と、
ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと
を含む、二重特異性抗原結合分子を提供し；
ａ）での第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、リジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、位置１２３のアミノ酸が、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって（最も特定的にはアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、ａ）での第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、位置２１３のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、
（ｉ）ａ）の第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でｂ）の第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、ｂ）の第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合しているか、又は
（ｉｉ）（ｂ）の第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で（ａ）の第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、（ａ）の第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で（ｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している。
一実施形態において、本発明は、二重特異性抗原結合分子であって、
ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、該第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、該第１の抗原結合部分が、配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９１のＨＣＤＲ２、及び配列番号９３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９６のＬＣＤＲ２、及び配列番号９７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分と、
ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、該第２の抗原が活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３、より具体的にはＣＤ３イプシロンであり、該第２の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換わっている、第２の抗原結合部分と、
ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと
を含む、二重特異性抗原結合分子を提供し；
ａ）での第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、リジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、位置１２３のアミノ酸が、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって（最も特定的にはアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、ａ）での第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、位置２１３のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、
（ｉ）ａ）の第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でｂ）の第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、ｂ）の第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合しているか、又は
（ｉｉ）（ｂ）の第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で（ａ）の第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、（ａ）の第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で（ｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している。
一実施形態において、本発明は、二重特異性抗原結合分子であって、
ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、該第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、該第１の抗原結合部分が、配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９２のＨＣＤＲ２、及び配列番号９３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９５のＬＣＤＲ２、及び配列番号９７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分と、
ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、該第２の抗原が活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３、より具体的にはＣＤ３イプシロンであり、該第２の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換わっている、第２の抗原結合部分と、
ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと
を含む、二重特異性抗原結合分子を提供し；
ａ）での第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、リジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、位置１２３のアミノ酸が、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって（最も特定的にはアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、ａ）での第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、位置２１３のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、
（ｉ）ａ）の第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でｂ）の第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、ｂ）の第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合しているか、又は
（ｉｉ）（ｂ）の第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で（ａ）の第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、（ａ）の第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で（ｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している。
一実施形態において、本発明は、二重特異性抗原結合分子であって、
ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、該第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、該第１の抗原結合部分が、配列番号１の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号２のＨＣＤＲ２、及び配列番号３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号５のＬＣＤＲ２、及び配列番号６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分と、
ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、該第２の抗原が活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３、より具体的にはＣＤ３イプシロンであり、該第２の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換わっている、第２の抗原結合部分と、
ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと
を含む、二重特異性抗原結合分子を提供し；
ａ）での第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、リジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、位置１２３のアミノ酸が、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって（最も特定的にはアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、ａ）での第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、位置２１３のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、
（ｉ）ａ）の第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でｂ）の第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、ｂ）の第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合しているか、又は
（ｉｉ）（ｂ）の第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で（ａ）の第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、（ａ）の第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で（ｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している。
一実施形態において、本発明は、二重特異性抗原結合分子であって、
ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、該第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、該第１の抗原結合部分が、配列番号７の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８のＨＣＤＲ２、及び配列番号９のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号１０の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１１のＬＣＤＲ２、及び配列番号１２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分と、
ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、該第２の抗原が活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３、より具体的にはＣＤ３イプシロンであり、該第２の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換わっている、第２の抗原結合部分と、
ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと
を含む、二重特異性抗原結合分子を提供し；
ａ）での第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、リジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、位置１２３のアミノ酸が、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって（最も特定的にはアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、ａ）での第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、位置２１３のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、
（ｉ）ａ）の第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でｂ）の第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、ｂ）の第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合しているか、又は
（ｉｉ）（ｂ）の第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で（ａ）の第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、（ａ）の第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で（ｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している。
特定の実施形態において、本発明は、二重特異性抗原結合分子であって、
ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、該第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、該第１の抗原結合部分が、配列番号８３の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８４のＨＣＤＲ２、及び配列番号８６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号８７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号８８のＬＣＤＲ２、及び配列番号８９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分と、
ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、該第２の抗原が活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３、より具体的にはＣＤ３イプシロンであり、該第２の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換わっている、第２の抗原結合部分と、
ｃ）第１の抗原に結合し、第１の抗原結合部分と同一である第３の抗原結合部分と、
ｄ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと
を含む、二重特異性抗原結合分子を提供し；
ａ）での第１の抗原結合部分及びｃ）での第３の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、リジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、位置１２３のアミノ酸が、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって（最も特定的にはアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、ａ）での第１の抗原結合部分及びｃ）での第３の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、位置２１３のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、
（ｉ）ａ）の第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でｂ）の第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、ｂ）の第２の抗原結合部分及びＣ）の第３の抗原結合部分が、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でｄ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合しているか、又は
（ｉｉ）ｂ）の第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でａ）の第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、ａ）の第１の抗原結合部分及びｃ）の第３の抗原結合部分が、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でｄ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している。
特定の実施形態において、本発明は、二重特異性抗原結合分子であって、
ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、該第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、該第１の抗原結合部分が、配列番号８３の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８５のＨＣＤＲ２、及び配列番号８６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号８７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号８８のＬＣＤＲ２、及び配列番号８９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分と、
ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、該第２の抗原が活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３、より具体的にはＣＤ３イプシロンであり、該第２の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換わっている、第２の抗原結合部分と、
ｃ）第１の抗原に結合し、第１の抗原結合部分と同一である第３の抗原結合部分と、
ｄ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと
を含む、二重特異性抗原結合分子を提供し；
ａ）での第１の抗原結合部分及びｃ）での第３の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、リジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、位置１２３のアミノ酸が、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって（最も特定的にはアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、ａ）での第１の抗原結合部分及びｃ）での第３の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、位置２１３のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、
（ｉ）ａ）の第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でｂ）の第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、ｂ）の第２の抗原結合部分及びＣ）の第３の抗原結合部分が、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でｄ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合しているか、又は
（ｉｉ）ｂ）の第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でａ）の第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、ａ）の第１の抗原結合部分及びｃ）の第３の抗原結合部分が、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でｄ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している。
特定の実施形態において、本発明は、二重特異性抗原結合分子であって、
ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、該第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、該第１の抗原結合部分が、配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９１のＨＣＤＲ２、及び配列番号９３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９５のＬＣＤＲ２、及び配列番号９７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分と、
ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、該第２の抗原が活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３、より具体的にはＣＤ３イプシロンであり、該第２の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換わっている、第２の抗原結合部分と、
ｃ）第１の抗原に結合し、第１の抗原結合部分と同一である第３の抗原結合部分と、
ｄ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと
を含む、二重特異性抗原結合分子を提供し；
ａ）での第１の抗原結合部分及びｃ）での第３の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、リジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、位置１２３のアミノ酸が、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって（最も特定的にはアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、ａ）での第１の抗原結合部分及びｃ）での第３の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、位置２１３のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、
（ｉ）ａ）の第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でｂ）の第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、ｂ）の第２の抗原結合部分及びＣ）の第３の抗原結合部分が、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でｄ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合しているか、又は
（ｉｉ）ｂ）の第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でａ）の第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、ａ）の第１の抗原結合部分及びｃ）の第３の抗原結合部分が、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でｄ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している。
特定の実施形態において、本発明は、二重特異性抗原結合分子であって、
ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、該第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、該第１の抗原結合部分が、配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９１のＨＣＤＲ２、及び配列番号９３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９６のＬＣＤＲ２、及び配列番号９７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分と、
ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、該第２の抗原が活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３、より具体的にはＣＤ３イプシロンであり、該第２の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換わっている、第２の抗原結合部分と、
ｃ）第１の抗原に結合し、第１の抗原結合部分と同一である第３の抗原結合部分と、
ｄ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと
を含む、二重特異性抗原結合分子を提供し；
ａ）での第１の抗原結合部分及びｃ）での第３の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、リジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、位置１２３のアミノ酸が、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって（最も特定的にはアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、ａ）での第１の抗原結合部分及びｃ）での第３の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、位置２１３のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、
（ｉ）ａ）の第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でｂ）の第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、ｂ）の第２の抗原結合部分及びＣ）の第３の抗原結合部分が、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でｄ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合しているか、又は
（ｉｉ）ｂ）の第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でａ）の第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、ａ）の第１の抗原結合部分及びｃ）の第３の抗原結合部分が、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でｄ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している。
特定の実施形態において、本発明は、二重特異性抗原結合分子であって、
ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、該第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、該第１の抗原結合部分が、配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９２のＨＣＤＲ２、及び配列番号９３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９５のＬＣＤＲ２、及び配列番号９７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分と、
ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、該第２の抗原が活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３、より具体的にはＣＤ３イプシロンであり、該第２の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換わっている、第２の抗原結合部分と、
ｃ）第１の抗原に結合し、第１の抗原結合部分と同一である第３の抗原結合部分と、
ｄ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと
を含む、二重特異性抗原結合分子を提供し；
ａ）での第１の抗原結合部分及びｃ）での第３の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、リジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、位置１２３のアミノ酸が、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって（最も特定的にはアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、ａ）での第１の抗原結合部分及びｃ）での第３の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、位置２１３のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、
（ｉ）ａ）の第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でｂ）の第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、ｂ）の第２の抗原結合部分及びＣ）の第３の抗原結合部分が、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でｄ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合しているか、又は
（ｉｉ）ｂ）の第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でａ）の第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、ａ）の第１の抗原結合部分及びｃ）の第３の抗原結合部分が、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でｄ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している。
特定の実施形態において、本発明は、二重特異性抗原結合分子であって、
ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、該第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、該第１の抗原結合部分が、配列番号１の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号２のＨＣＤＲ２、及び配列番号３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号５のＬＣＤＲ２、及び配列番号６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分と、
ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、該第２の抗原が活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３、より具体的にはＣＤ３イプシロンであり、該第２の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換わっている、第２の抗原結合部分と、
ｃ）第１の抗原に結合し、第１の抗原結合部分と同一である第３の抗原結合部分と、
ｄ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと
を含む、二重特異性抗原結合分子を提供し；
ａ）での第１の抗原結合部分及びｃ）での第３の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、リジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、位置１２３のアミノ酸が、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって（最も特定的にはアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、ａ）での第１の抗原結合部分及びｃ）での第３の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、位置２１３のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、
（ｉ）ａ）の第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でｂ）の第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、ｂ）の第２の抗原結合部分及びＣ）の第３の抗原結合部分が、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でｄ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合しているか、又は
（ｉｉ）ｂ）の第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でａ）の第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、ａ）の第１の抗原結合部分及びｃ）の第３の抗原結合部分が、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でｄ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している。
特定の実施形態において、本発明は、二重特異性抗原結合分子であって、
ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、該第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、該第１の抗原結合部分が、配列番号７の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８のＨＣＤＲ２、及び配列番号９のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号１０の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１１のＬＣＤＲ２、及び配列番号１２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分と、
ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、該第２の抗原が活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３、より具体的にはＣＤ３イプシロンであり、該第２の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換わっている、第２の抗原結合部分と、
ｃ）第１の抗原に結合し、第１の抗原結合部分と同一である第３の抗原結合部分と、
ｄ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと
を含む、二重特異性抗原結合分子を提供し；
ａ）での第１の抗原結合部分及びｃ）での第３の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、リジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、位置１２３のアミノ酸が、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって（最も特定的にはアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、ａ）での第１の抗原結合部分及びｃ）での第３の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、位置２１３のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、
（ｉ）ａ）の第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でｂ）の第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、ｂ）の第２の抗原結合部分及びＣ）の第３の抗原結合部分が、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でｄ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合しているか、又は
（ｉｉ）ｂ）の第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でａ）の第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、ａ）の第１の抗原結合部分及びｃ）の第３の抗原結合部分が、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でｄ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している。
別の実施形態において、本発明は、二重特異性抗原結合分子であって、
ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、該第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、該第１の抗原結合部分が、配列番号８３の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８４のＨＣＤＲ２、及び配列番号８６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号８７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号８８のＬＣＤＲ２、及び配列番号８９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分と、
ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、該第２の抗原が活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３、より具体的にはＣＤ３イプシロンであり、該第２の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換わっている、第２の抗原結合部分と、
ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと
を含む、二重特異性抗原結合分子を提供し；
ａ）での第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、リジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、位置１２３のアミノ酸が、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって（最も特定的にはアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、ａ）での第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、位置２１３のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、
（ａ）の第１の抗原結合部分及び（ｂ）の第２の抗原結合部分は、各々がＦａｂ重鎖のＣ末端で（ｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している。
別の実施形態において、本発明は、二重特異性抗原結合分子であって、
ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、該第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、該第１の抗原結合部分が、配列番号８３の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８５のＨＣＤＲ２、及び配列番号８６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号８７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号８８のＬＣＤＲ２、及び配列番号８９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分と、
ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、該第２の抗原が活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３、より具体的にはＣＤ３イプシロンであり、該第２の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換わっている、第２の抗原結合部分と、
ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと
を含む、二重特異性抗原結合分子を提供し；
ａ）での第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、リジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、位置１２３のアミノ酸が、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって（最も特定的にはアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、ａ）での第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、位置２１３のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、
（ａ）の第１の抗原結合部分及び（ｂ）の第２の抗原結合部分は、各々がＦａｂ重鎖のＣ末端で（ｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している。
別の実施形態において、本発明は、二重特異性抗原結合分子であって、
ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、該第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、該第１の抗原結合部分が、配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９１のＨＣＤＲ２、及び配列番号９３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９５のＬＣＤＲ２、及び配列番号９７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分と、
ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、該第２の抗原が活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３、より具体的にはＣＤ３イプシロンであり、該第２の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換わっている、第２の抗原結合部分と、
ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと
を含む、二重特異性抗原結合分子を提供し；
ａ）での第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、リジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、位置１２３のアミノ酸が、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって（最も特定的にはアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、ａ）での第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、位置２１３のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、
（ａ）の第１の抗原結合部分及び（ｂ）の第２の抗原結合部分は、各々がＦａｂ重鎖のＣ末端で（ｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している。
別の実施形態において、本発明は、二重特異性抗原結合分子であって、
ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、該第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、該第１の抗原結合部分が、配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９１のＨＣＤＲ２、及び配列番号９３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９６のＬＣＤＲ２、及び配列番号９７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分と、
ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、該第２の抗原が活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３、より具体的にはＣＤ３イプシロンであり、該第２の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換わっている、第２の抗原結合部分と、
ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと
を含む、二重特異性抗原結合分子を提供し；
ａ）での第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、リジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、位置１２３のアミノ酸が、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって（最も特定的にはアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、ａ）での第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、位置２１３のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、
（ａ）の第１の抗原結合部分及び（ｂ）の第２の抗原結合部分は、各々がＦａｂ重鎖のＣ末端で（ｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している。
別の実施形態において、本発明は、二重特異性抗原結合分子であって、
ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、該第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、該第１の抗原結合部分が、配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９２のＨＣＤＲ２、及び配列番号９３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９５のＬＣＤＲ２、及び配列番号９７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分と、
ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、該第２の抗原が活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３、より具体的にはＣＤ３イプシロンであり、該第２の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換わっている、第２の抗原結合部分と、
ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと
を含む、二重特異性抗原結合分子を提供し；
ａ）での第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、リジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、位置１２３のアミノ酸が、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって（最も特定的にはアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、ａ）での第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、位置２１３のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、
（ａ）の第１の抗原結合部分及び（ｂ）の第２の抗原結合部分は、各々がＦａｂ重鎖のＣ末端で（ｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している。
別の実施形態において、本発明は、二重特異性抗原結合分子であって、
ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、該第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、該第１の抗原結合部分が、配列番号１の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号２のＨＣＤＲ２、及び配列番号３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号５のＬＣＤＲ２、及び配列番号６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分と、
ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、該第２の抗原が活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３、より具体的にはＣＤ３イプシロンであり、該第２の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換わっている、第２の抗原結合部分と、
ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと
を含む、二重特異性抗原結合分子を提供し；
ａ）での第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、リジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、位置１２３のアミノ酸が、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって（最も特定的にはアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、ａ）での第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、位置２１３のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、
（ａ）の第１の抗原結合部分及び（ｂ）の第２の抗原結合部分は、各々がＦａｂ重鎖のＣ末端で（ｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している。
別の実施形態において、本発明は、二重特異性抗原結合分子であって、
ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、該第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、該第１の抗原結合部分が、配列番号７の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８のＨＣＤＲ２、及び配列番号９のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号１０の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１１のＬＣＤＲ２、及び配列番号１２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分と、
ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、該第２の抗原が活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３、より具体的にはＣＤ３イプシロンであり、該第２の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換わっている、第２の抗原結合部分と、
ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと
を含む、二重特異性抗原結合分子を提供し；
ａ）での第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、リジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、位置１２３のアミノ酸が、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって（最も特定的にはアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、ａ）での第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、位置２１３のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、
（ａ）の第１の抗原結合部分及び（ｂ）の第２の抗原結合部分は、各々がＦａｂ重鎖のＣ末端で（ｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している。
上記の実施形態のいずれかによると、二重特異性抗原結合分子の構成要素（例えば、Ｆａｂ分子、Ｆｃドメイン）は、直接的に又は様々なリンカーを介して、特に本明細書に記載される又は当該技術分野において知られている、１個又は複数個のアミノ酸、典型的には約２～２０個のアミノ酸を含むペプチドリンカーを介して融合されていてもよい。適切な非免疫原性ペプチドリンカーには、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎ、（ＳＧ４）ｎ、（Ｇ４Ｓ）ｎ又はＧ４（ＳＧ４）ｎペプチドリンカーが含まれ、「ｎ」は通常１～１０、典型的には２～４の整数である。
特定の態様において、本発明は、
ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分がそれぞれ、配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む（従来の）Ｆａｂ分子である、第１の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分と、
ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、第２の抗原がＣＤ３であり、第２の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換わっており、配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号３６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、第２の抗原結合部分と、
ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと
を含む、二重特異性抗原結合分子を提供し；
ａ）での第１及び第３の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、リジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、位置１２３のアミノ酸が、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって（最も特定的にはアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、ａ）での第１及び第３の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、位置２１３のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、
さらに、
ａ）の第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でｂ）の第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、ｂ）の第２の抗原結合部分及びａ）の第３の抗原結合部分が、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している。
特定の態様において、本発明は、二重特異性抗原結合分子であって、
ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分がそれぞれ、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む（従来の）Ｆａｂ分子である、第１の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分と、
ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、第２の抗原がＣＤ３であり、第２の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換わっており、配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号３６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、第２の抗原結合部分と、
ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと
を含む、二重特異性抗原結合分子を提供し；
ａ）での第１及び第３の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、リジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、位置１２３のアミノ酸が、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって（最も特定的にはアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、ａ）での第１及び第３の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、位置２１３のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、
さらに、
ａ）の第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でｂ）の第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、ｂ）の第２の抗原結合部分及びａ）の第３の抗原結合部分が、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している。
本発明のこの態様による一実施形態では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、位置３６６のトレオニン残基がトリプトファン残基で置き換えられており（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、位置４０７のチロシン残基がバリン残基で置き換えられており（Ｙ４０７Ｖ）、任意に位置３６６のトレオニン残基がセリン残基で置き換えられており（Ｔ３６６Ｓ）、位置３６８のロイシン残基がアラニン残基で置き換えられている（Ｌ３６８Ａ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
本発明のこの態様によるさらなる実施形態では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、追加的に、位置３５４のセリン残基がシステイン残基で置き換えられている（Ｓ３５４Ｃ）か又は位置３５６のグルタミン酸残基がシステイン残基で置き換えられており（Ｅ３５６Ｃ）（特に、位置３５４のセリン残基がシステイン残基で置き換えられており）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、追加的に、位置３４９のチロシン残基がシステイン残基と置により置き換えられて（Ｙ３４９Ｃ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
本発明のこの態様によるさらなる実施形態では、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの各々において、位置２３４のロイシン残基がアラニン残基（Ｌ２３４Ａ）と置き換わっており、位置２３５のロイシン残基がアラニン残基と置き換わっており（Ｌ２３５Ａ）、位置３２９のプロリン残基がグリシン残基により置き換えられている（Ｐ３２９Ｇ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
本発明のこの態様によるさらなる実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。
特定の具体的な実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、配列番号１７の配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１８の配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１９の配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号２０の配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。更に特定の具体的な実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、配列番号１７のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１８のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１９のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号２０のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
別の具体的な実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、配列番号２１の配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号２２の配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号２３の配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号２４の配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。更に具体的な実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、配列番号２１のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号２２のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号２３のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号２４のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
Ｆｃドメイン
特定の実施形態では、本発明の二重特異性抗原結合分子は、第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを含む。二重特異性抗原結合分子に関連して本明細書中に記載されるＦｃドメインの特徴は、本発明の抗体に含まれるＦｃドメインに等しく適用され得ることが理解される。
二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、免疫グロブリン分子の重鎖ドメインを含む一対のポリペプチド鎖からなる。例えば、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子のＦｃドメインは、ダイマーであり、それぞれのサブユニットは、ＣＨ２及びＣＨ３ ＩｇＧ重鎖定常ドメインを含む。Ｆｃドメインの２つのサブユニットは、互いに安定な会合が可能である。一実施形態では、本発明の二重特異性抗原結合分子は、１つを超えないＦｃ分子を含む。
一実施形態では、二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、ＩｇＧ Ｆｃドメインである。特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。別の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。より具体的な実施形態では、Ｆｃドメインは、位置Ｓ２２８にアミノ酸置換、特にアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含むＩｇＧ４ Ｆｃドメインである（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスナンバリング）。このアミノ酸置換は、インビボでのＩｇＧ４抗体のＦａｂアーム交換を低減する（Ｓｔｕｂｅｎｒａｕｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ ３８，８４－９１（２０１０）を参照されたい）。更に特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒトＦｃドメインである。更により特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。ヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域の例示的な配列は、配列番号４２で与えられる。
ヘテロ二量体化を促進するＦｃドメイン修飾
本発明による二重特異性抗原結合分子は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方又は他方に融合し得る異なる抗原結合部分を含み、したがってＦｃドメインの２つのサブユニットは、典型的には２つの非同一ポリペプチド鎖に含まれる。これらのポリペプチドの組換え同時発現及びその後の二量体化が、２つのポリペプチドのいくつかの可能な組合せをもたらす。組換え産生における二重特異性抗原結合分子の収率及び純度を高めるために、二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインに、所望なポリペプチドの会合を促進する改変を導入することが有利である。
したがって、特定の実施形態では、本発明に係る二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する改変を含む。ヒトＩｇＧ Ｆｃドメインの２つのサブユニット間の最も長いタンパク質－タンパク質相互作用の部位は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメイン内にある。したがって、一実施形態では、当該修飾は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインの中にある。
ヘテロ二量体化を強化するために、ＦｃドメインのＣＨ３ドメイン中の修飾にいくつかの手法が存在し、例えば、国際公開第９６／２７０１１号、国際公開第９８／０５０４３１号、欧州特許第１８７０４５９号、国際公開第２００７／１１０２０５号、国際公開第２００７／１４７９０１号、国際公開第２００９／０８９００４号、国際公開第２０１０／１２９３０４号、国際公開第２０１１／９０７５４号、国際公開第２０１１／１４３５４５号、国際公開第２０１２０５８７６８号、国際公開第２０１３１５７９５４号、国際公開第２０１３０９６２９１号に十分に記載されている。典型的には、全てのかかる手法において、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインと、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインが、両方とも、各ＣＨ３ドメイン（又はそれを含む重鎖）が、自身とホモ二量化せず、相補的に操作された他のＣＨ３ドメインとヘテロ二量化するように仕向けられている相補的な様式で操作されている（その結果、第１のＣＨ３ドメイン及び第２のＣＨ３ドメインがヘテロ二量化し、２つの第１のＣＨ３ドメイン又は２つの第２のＣＨ３ドメインの間のホモ二量体は形成されない）。改良された重鎖ヘテロ二量化のためのこれらの異なる手法は、重鎖／軽鎖の誤った対形成と、Ｂｅｎｃｅ Ｊｏｎｅｓ型副生成物が低下した二重特異性抗原結合分子において、重鎖－軽鎖改変と組み合わせた異なる代替例として想定される（例えば、１つの結合アームでのＶＨ及びＶＬの交換／置き換えと、ＣＨ１／ＣＬ界面で、帯電したアミノ酸を反対の電荷で置換したものの導入）。
具体的な実施形態では、Ｆｃドメインの第１のサブユニット及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾は、いわゆる「ノブ・イントゥ・ホール」修飾であり、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの１つに「ノブ」修飾と、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの他の１つに「ホール」修飾とを含む。
ノブ・イントゥ・ホール技術は、例えば、米国特許第５，７３１，１６８号、米国特許第７，６９５，９３６号、Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ ９，６１７－６２１（１９９６）及びＣａｒｔｅｒ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ ２４８，７－１５（２００１）に記載される。一般的に、この方法は、第１のポリペプチドの界面にある突起（「ノブ」）と、第２のポリペプチドの界面にある対応する空洞（「ホール」）とを導入することを含み、その結果、突起が、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨害するように空洞内に位置することができる。突起は、第１のポリペプチドの界面からの小さなアミノ酸側鎖を、より大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）と交換することによって構築される。突起と同一又は同様のサイズの代償的空洞が、大きなアミノ酸側鎖をより小さなアミノ酸側鎖（例えば、アラニン又はトレオニン）と置き換えることによって、第２のポリペプチドの界面に作られる。
したがって、特定の実施形態では、二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基は、より大きな側鎖容積を有するアミノ酸残基と置き換わり、それによって、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の空洞内で位置換え可能な第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に突起を生成し、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基は、より小さな側鎖容積を有するアミノ酸残基と置き換わり、それによって、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に空洞を生成し、その中で、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の突起が位置換え可能である。
好ましくは、より大きな側鎖体積を有する当該アミノ酸残基は、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）及びトリプトファン（Ｗ）からなる群から選択される。
好ましくは、より小さな側鎖体積を有する当該アミノ酸残基は、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）及びバリン（Ｖ）からなる群から選択される。
突起及び空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を変えることによって、例えば、部位特異的突然変異誘発によって、又はペプチド合成によって作成することができる。
具体的な実施形態では、Ｆｃドメインの第１のサブユニット（「ノブ」サブユニット）（のＣＨ３ドメイン）において、位置３６６のトレオニン残基が、トリプトファン残基と置き換わっており（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメイン（「ホール」サブユニット）の第２のサブユニット（のＣＨ３ドメイン）において、位置４０７のチロシン残基は、バリン残基と置き換わっている（Ｙ４０７Ｖ）。一実施形態では、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、更に、位置３６６のトレオニン残基が、セリン残基と置き換わっており（Ｔ３６６Ｓ）、位置３６８のロイシン残基が、アラニン残基と置き換わっている（Ｌ３６８Ａ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
なお更なる実施形態では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、更に、位置３５４のセリン残基が、システイン残基と置き換わっている（Ｓ３５４Ｃ）か、又は位置３５６のグルタミン酸残基が、システイン残基と置き換わっており（Ｅ３５６Ｃ）（特に、位置３５４のセリン残基がシステイン残基と置き換わっており）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、更に、位置３４９のチロシン残基が、システイン残基と置き換わっている（Ｙ３４９Ｃ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。これら２つのシステイン残基の導入によって、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの間にジスルフィド架橋の形成を生じ、二量体を更に安定化する（Ｃａｒｔｅｒ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８，７－１５（２００１））。
特定の実施形態では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
特定の実施形態では、第２の抗原（例えば、活性化Ｔ細胞抗原）に結合する抗原結合部分は、（任意に、ＧＰＲＣ５Ｄに結合する第１の抗原結合部分及び／又はペプチドリンカーを介して）Ｆｃドメインの第１サブユニット（「ノブ」修飾を含む）に融合される。理論に拘束されることを望まないが、第２の抗原（例えば、活性化Ｔ細胞抗原）に結合する抗原結合部分の、Ｆｃドメインのノブ含有サブユニットへの融合は、活性化Ｔ細胞抗原に結合する２つの抗原結合部分を含む抗原結合分子の生成（２つのノブ含有ポリペプチドの立体衝突）を（更に）最小限に抑える。
ヘテロ二量体化を強化するＣＨ３修飾についての他の技術が本発明の代替例として考慮され、例えば、国際公開第９６／２７０１１号、国際公開第９８／０５０４３１号、欧州特許第１８７０４５９号、国際公開第２００７／１１０２０５号、国際公開第２００７／１４７９０１号、国際公開第２００９／０８９００４号、国際公開第２０１０／１２９３０４号、国際公開第２０１１／９０７５４号、国際公開第２０１１／１４３５４５号、国際公開第２０１２／０５８７６８号、国際公開第２０１３／１５７９５４号、国際公開第２０１３／０９６２９１号に記載されている。
一実施形態では、欧州特許第１８７０４５９号に記載されるヘテロ二量体化手法を代わりに使用する。この手法は、Ｆｃドメインの２つのサブユニット間のＣＨ３／ＣＨ３ドメイン界面における特定のアミノ酸位置への反対の電荷を有する荷電アミノ酸の導入に基づく。本発明の二重特異性抗原結合分子の１つの好ましい実施形態は、アミノ酸突然変異Ｒ４０９Ｄ；（Ｆｃドメインの）２つのＣＨ３ドメインの１つにおけるＫ３７０Ｅ及びアミノ酸突然変異Ｄ３９９Ｋ；ＦｃドメインのＣＨ３ドメインの他の１つにおけるＥ３５７Ｋ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）である。
別の実施形態では、本発明の二重特異性抗原結合分子は、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにアミノ酸突然変異Ｔ３６６Ｗを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにアミノ酸突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを含み、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインに更なるアミノ酸突然変異Ｒ４０９Ｄ；Ｋ３７０Ｅ、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにアミノ酸突然変異Ｄ３９９Ｋ；Ｅ３５７Ｋを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
別の実施形態では、本発明の二重特異性抗原結合分子は、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにアミノ酸突然変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにアミノ酸突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを含むか、又は前記二重特異性抗原結合分子は、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにアミノ酸突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにアミノ酸突然変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを含み、更に、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにアミノ酸突然変異Ｒ４０９Ｄ；Ｋ３７０Ｅを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにアミノ酸突然変異Ｄ３９９Ｋ；Ｅ３５７Ｋを含む（全てＫａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
一実施形態では、国際公開第２０１３／１５７９５３号に記載されるヘテロ二量体化手法を代わりに使用する。一実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸突然変異Ｔ３６６Ｋを含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸突然変異Ｌ３５１Ｄを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。更なる実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、更なるアミノ酸突然変異Ｌ３５１Ｋを含む。更なる実施形態では、第２のＣＨ３ドメインは、更に、Ｙ３４９Ｅ、Ｙ３４９Ｄ及びＬ３６８Ｅ（好ましくはＬ３６８Ｅ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）から選択されるアミノ酸突然変異を含む。
一実施形態では、国際公開第２０１２／０５８７６８号に記載されるヘテロ二量体化手法を代わりに使用する。一実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸突然変異Ｌ３５１Ｙ、Ｙ４０７Ａを含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸突然変異Ｔ３６６Ａ、Ｋ４０９Ｆを含む。更なる実施形態では、第２のＣＨ３ドメインは、位置Ｔ４１１、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｆ４０５、Ｎ３９０又はＫ３９２にある更なるアミノ酸突然変異、例えば、（ａ）Ｔ４１１Ｎ、Ｔ４１１Ｒ、Ｔ４１１Ｑ、Ｔ４１１Ｋ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１Ｅ又はＴ４１１Ｗ、（ｂ）Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｗ、Ｄ３９９Ｙ又はＤ３９９Ｋ、（ｃ）Ｓ４００Ｅ、Ｓ４００Ｄ、Ｓ４００Ｒ又はＳ４００Ｋ、（ｄ）Ｆ４０５Ｉ、Ｆ４０５Ｍ、Ｆ４０５Ｔ、Ｆ４０５Ｓ、Ｆ４０５Ｖ又はＦ４０５Ｗ、（ｅ）Ｎ３９０Ｒ、Ｎ３９０Ｋ又はＮ３９０Ｄ、（ｆ）Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｒ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｆ又はＫ３９２Ｅ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）を含む。更なる実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸突然変異Ｌ３５１Ｙ、Ｙ４０７Ａを含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸突然変異Ｔ３６６Ｖ、Ｋ４０９Ｆを含む。更なる実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸突然変異Ｙ４０７Ａを含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸突然変異Ｔ３６６Ａ、Ｋ４０９Ｆを含む。更なる実施形態では、第２のＣＨ３ドメインは、更に、アミノ酸突然変異Ｋ３９２Ｅ、Ｔ４１１Ｅ、Ｄ３９９Ｒ及びＳ４００Ｒを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
一実施形態では、国際公開第２０１１／１４３５４５号に記載されるヘテロ二量化手法が代わりに使用され、例えば、３６８及び４０９からなる群から選択される位置にアミノ酸改変を有する（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
一実施形態では、上に記載するホールにノブを入れる技術も使用する、国際公開第２０１１／０９０７６２号に記載されるヘテロ二量化手法が、代わりに使用される。一実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸突然変異Ｔ３６６Ｗを含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸突然変異Ｙ４０７Ａを含む。一実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸突然変異Ｔ３６６Ｙを含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸突然変異Ｙ４０７Ｔを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
一実施形態では、二重特異性抗原結合分子又はそのＦｃドメインは、ＩｇＧ２サブクラスであり、国際公開第２０１０／１２９３０４号に記載されるヘテロ二量体化手法を代わりに使用する。
代替的な実施形態では、Ｆｃドメインの第１のサブユニット及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾は、例えば、ＰＣＴ国際公開第２００９／０８９００４号に記載されるように、静電操縦効果に介在する修飾を含む。一般に、この方法は、ホモ二量体形成が静電的に望ましくないが、ヘテロ二量化が静電的に望ましくなるように、荷電アミノ酸残基による２つのＦｃドメインサブユニットの界面での１つ又は複数のアミノ酸残基の置き換えを伴う。かかる一実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、Ｋ３９２又はＮ３９２の負に帯電したアミノ酸（例えば、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）、好ましくはＫ３９２Ｄ又はＮ３９２Ｄ）によるアミノ酸置換を含み、第２のＣＨ３ドメインは、Ｄ３９９、Ｅ３５６、Ｄ３５６又はＥ３５７の正に帯電したアミノ酸によるアミノ酸置換（例えば、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）、好ましくはＤ３９９Ｋ、Ｅ３５６Ｋ、Ｄ３５６Ｋ又はＥ３５７Ｋ、より好ましくはＤ３９９Ｋ及びＥ３５６Ｋ）を含む。更なる実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、更に、Ｋ４０９又はＲ４０９の負に帯電したアミノ酸によるアミノ酸置換（例えば、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）、好ましくはＫ４０９Ｄ又はＲ４０９Ｄ）を含む。更なる実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、更に、又はこれに代えて、Ｋ４３９及び／又はＫ３７０の負に帯電したアミノ酸（例えば、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ））（全てＫａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）によるアミノ酸置換を含む。
なお更なる実施形態では、国際公開第２００７／１４７９０１号に記載されるヘテロ二量体化手法を代わりに使用する。一実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸突然変異Ｋ２５３Ｅ、Ｄ２８２Ｋ及びＫ３２２Ｄを含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸突然変異Ｄ２３９Ｋ、Ｅ２４０Ｋ及びＫ２９２Ｄを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
更に別の実施形態では、国際公開第２００７／１１０２０５号に記載されるヘテロ二量体化手法を代わりに使用してもよい。
一実施形態では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｋ３９２Ｄ及びＫ４０９Ｄを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｄ３５６Ｋ及びＤ３９９Ｋを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクタ機能を低下させるＦｃドメイン修飾
Ｆｃドメインは、二重特異性抗原結合分子（又は抗体）に、標的組織への良好な蓄積に寄与する長い血清半減期、望ましい組織－血液分布比を含め、望ましい薬物動態特性を与える。しかし、同時に、好ましい抗原を含む細胞ではなく、Ｆｃ受容体を発現する細胞に対する二重特異性抗原結合分子（又は抗体）の望ましくない標的化を引き起こす場合がある。更に、Ｆｃ受容体シグナル伝達経路の共活性化は、Ｔ細胞活性化特性（例えば、第２の抗原結合部分が活性化Ｔ細胞抗原に結合する二重特異性抗原結合分子の実施形態において）及び二重特異性抗原結合分子の長い半減期と組み合わせて、全身投与時にサイトカイン受容体の過剰活性化及び重度の副作用をもたらすサイトカイン放出をもたらし得る。Ｔ細胞以外の（Ｆｃ受容体を有する）免疫細胞の活性化は、例えばＮＫ細胞によるＴ細胞の潜在的破壊に起因して、二重特異性抗原結合分子（特に、第２の抗原結合部分が活性化Ｔ細胞抗原に結合する二重特異性抗原結合分子）の有効性を低下させることさえある。
したがって、特定の実施形態では、本発明による二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、天然ＩｇＧ１Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低下及び／又はエフェクタ機能の低下を示す。１つのこのような実施形態では、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子）は、ネイティブＩｇＧ１Ｆｃドメイン（又はネイティブＩｇＧ１Ｆｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子）と比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の５０％未満、好ましくは２０％未満、より好ましくは１０％未満、最も好ましくは５％未満の結合親和性を示し、及び／又はネイティブＩｇＧ１Ｆｃドメイン（又はネイティブＩｇＧ１Ｆｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子）と比較して、５０％未満、好ましくは２０％未満、より好ましくは１０％未満、最も好ましくは５％未満のエフェクタ機能を示す。一実施形態では、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子）は、Ｆｃ受容体に実質的に結合せず、及び／又はエフェクタ機能を誘発しない。特定の実施形態では、Ｆｃ受容体は、Ｆｃγ受容体である。一実施形態では、Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃ受容体である。一実施形態では、Ｆｃ受容体は、活性化Ｆｃ受容体である。具体的な実施形態では、Ｆｃ受容体は、活性化ヒトＦｃγ受容体であり、より特定的には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａであり、最も特定的には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａである。一実施形態では、エフェクタ機能は、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ及びサイトカイン分泌の群から選択される１つ又は複数である。特定の実施形態では、エフェクタ機能はＡＤＣＣである。一実施形態では、Ｆｃドメインは、ネイティブＩｇＧ１Ｆｃドメインと比較して、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に実質的に同様の結合親和性を示す。ＦｃＲｎに対する実質的に同様の結合は、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子）が、ネイティブＩｇＧ１Ｆｃドメイン（又はネイティブＩｇＧ１Ｆｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子と比較して、ＦｃＲｎに対して約７０％より大きく、特に約８０％より大きく、より特定的には約９０％より大きい結合親和性を示す場合に達成される。
特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、操作されていないＦｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性が低下し、及び／又はエフェクタ機能が低下するように操作される。特定の実施形態では、二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性及び／又はエフェクタ機能を下げる１つ又は複数のアミノ酸突然変異を含む。典型的には、Ｆｃドメインの２つのサブユニットそれぞれに、同じ１つ又は複数のアミノ酸突然変異が存在する。一実施形態では、アミノ酸突然変異は、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性を下げる。一実施形態では、アミノ酸突然変異は、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性を、少なくとも２分の１、少なくとも５分の１、又は少なくとも１０分の１に下げる。Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性を下げる１つより多いアミノ酸突然変異が存在する実施形態では、これらのアミノ酸突然変異の組合せが、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性を少なくとも１０分の１、少なくとも２０分の１、又は更に少なくとも５０分の１まで下げてもよい。一実施形態では、操作されたＦｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子は、操作されていないＦｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子と比較して、Ｆｃ受容体の結合親和性の２０％未満、特に１０％未満、より特定的には５％未満を示す。特定の実施形態では、Ｆｃ受容体は、Ｆｃγ受容体である。いくつかの実施形態では、Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃ受容体である。いくつかの実施形態では、Ｆｃ受容体は、活性化Ｆｃ受容体である。具体的な実施形態では、Ｆｃ受容体は、活性化ヒトＦｃγ受容体であり、より特定的には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａであり、最も特定的には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａである。好ましくは、これらの受容体のそれぞれへの結合が低減される。いくつかの実施形態では、相補性構成要素に対する結合親和性（特定的にはＣ１ｑに対する結合親和性）も低下する。一実施形態では、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する結合親和性は、低下しない。ＦｃＲｎに対する実質的に同様の結合（すなわち、前記受容体に対するＦｃドメインの結合親和性の保護）は、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子）が、ＦｃＲｎに対するＦｃドメインの操作されていない形態（又はＦｃのこの操作されていない形態を含む二重特異性抗原結合分子）の結合親和性の約７０％を超える結合親和性を示す場合に達成される。Ｆｃドメイン、又はＦｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子は、このような親和性の約８０％より大きく、更に約９０％より大きい親和性を示してもよい。特定の実施形態では、二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、操作されていないＦｃドメインと比較して、エフェクタ機能が低下するように操作される。エフェクタ機能の低減には、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の低減、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の低減、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）の低減、サイトカイン分泌の低減、抗原提示細胞によるイムノコンジュゲート媒介性抗原取り込みの低減、ＮＫ細胞への結合の低減、マクロファージへの結合の低減、単球への結合の低減、多形核細胞への結合の低減、直接的なシグナル伝達誘導性アポトーシスの低減、標的結合抗体との架橋の低減、樹状細胞成熟の低減、又はＴ細胞プライミングの低減の１つ又は複数が挙げられ得るが、これらに限定されない。一実施形態では、エフェクタ機能の低下は、ＣＤＣの低下、ＡＤＣＣの低下、ＡＤＣＰの低下及びサイトカイン分泌の低下の群から選択される１つ又は複数である。特定の実施形態では、低下したエフェクタ機能は低下したＡＤＣＣである。一実施形態では、ＡＤＣＣの低下は、操作されていないＦｃドメイン（又は操作されていないＦｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子）によって誘発されるＡＤＣＣの２０％未満である。
一実施形態では、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性及び／又はエフェクタ機能を下げるアミノ酸突然変異は、アミノ酸置換である。一実施形態では、Ｆｃドメインは、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、Ｐ３３１及びＰ３２９の群から選択される位置にアミノ酸置換を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。より具体的な実施形態では、Ｆｃドメインは、Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＰ３２９の群から選択される位置にアミノ酸置換を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）を含む。かかる一実施形態では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。一実施形態では、Ｆｃドメインは、位置Ｐ３２９にアミノ酸置換を含む。より具体的な実施形態では、アミノ酸置換は、Ｐ３２９Ａ又はＰ３２９Ｇ、特にＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）である。一実施形態では、Ｆｃドメインは、位置Ｐ３２９にアミノ酸置換を含み、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７及びＰ３３１から選択される位置に更なるアミノ酸置換を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。より具体的な実施形態では、更なるアミノ酸置換は、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ又はＰ３３１Ｓである。特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、位置Ｐ３２９、Ｌ２３４及びＬ２３５のアミノ酸置換（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）を含む。より特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、アミノ酸突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含む（「Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」、「ＰＧＬＡＬＡ」又は「ＬＡＬＡＰＧ」）。特定的には、特定の実施形態では、Ｆｃドメインのそれぞれのサブユニットは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスナンバリング）を含み、すなわち、Ｆｃドメインの第１のサブユニット及び第２のサブユニットそれぞれにおいて、位置２３４のロイシン残基が、アラニン残基（Ｌ２３４Ａ）と置き換わっており、位置２３５のロイシン残基が、アラニン残基（Ｌ２３５Ａ）と置き換わっており、位置３２９のプロリン残基が、グリシン残基（Ｐ３２９Ｇ）と置き換わっている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
かかる一実施形態では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。アミノ酸置換の「Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」の組合せは、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載されているように、ヒトＩｇＧ１ ＦｃドメインのＦｃγ受容体（同様に、補体）結合をほとんど完全に消滅させる。国際公開第２０１２／１３０８３１号は、かかる突然変異Ｆｃドメインの調製方法及びその特性、例えばＦｃ受容体結合又はエフェクタ機能の決定方法も記載する。
ＩｇＧ４抗体は、ＩｇＧ１抗体と比較して、Ｆｃ受容体への結合親和性の低減及びエフェクタ機能の低減を示す。したがって、いくつかの実施形態では、本発明の二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、ＩｇＧ４Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ４Ｆｃドメインである。一実施形態では、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインは、位置Ｓ２２８にアミノ酸置換を含み、具体的にはアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。Ｆｃ受容体及び／又はそのエフェクタ機能に対する結合親和性を更に低下させるために、一実施形態では、ＩｇＧ４Ｆｃドメインは、位置Ｌ２３５にアミノ酸置換を含み、特定的には、アミノ酸置換Ｌ２３５Ｅを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。別の実施形態では、ＩｇＧ４Ｆｃドメインは、位置Ｐ３２９にアミノ酸置換を含み、特定的には、アミノ酸置換Ｐ３２９Ｇを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。特定の実施形態では、ＩｇＧ４Ｆｃドメインは、位置Ｓ２２８、Ｌ２３５及びＰ３２９にアミノ酸置換を含み、特異的には、アミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３２９Ｇを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。かかるＩｇＧ４ Ｆｃドメイン突然変異体及びこれらのＦｃγ受容体結合特性は、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載されている。
特定の実施形態では、ネイティブＩｇＧ１Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低下及び／又はエフェクタ機能の低下を示すＦｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及び任意にＰ３２９Ｇを含むヒトＩｇＧ１Ｆｃドメイン、又はアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及び任意にＰ３２９Ｇを含むヒトＩｇＧ４Ｆｃドメインである（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
特定の実施形態では、ＦｃドメインのＮ－グリコシル化は、除去されている。かかる一実施形態では、Ｆｃドメインは、位置Ｎ２９７にアミノ酸突然変異、特定的には、アスパラギンをアラニンに置き換えるアミノ酸置換（Ｎ２９７Ａ）又はアスパラギン酸に置き換えるアミノ酸置換（Ｎ２９７Ｄ）を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
本明細書上記及びＰＣＴ国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載されているＦｃドメインに加え、Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクタ機能が低減されたＦｃドメインには、Ｆｃドメイン残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９の１つ又は複数の置換を有するものも挙げられる（米国特許第６，７３７，０５６号）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。このようなＦｃ突然変異体としては、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７のうち２つ又はそれより多くの位置での置換を有するＦｃ突然変異体が挙げられ、残基２６５及び２９７がアラニンに置換されている、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ突然変異体を含む（米国特許第７，３３２，５８１号）。
突然変異Ｆｃドメインは、当該技術分野で周知の遺伝的方法又は化学的方法を用い、アミノ酸の欠失、置換、挿入又は修飾によって調製することができる。遺伝的方法は、コードＤＮＡ配列の部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ、遺伝子合成等を含んでいてもよい。正しいヌクレオチド変化は、例えば、スクリーニングによって確認することができる。
Ｆｃ受容体に対する結合は、例えば、ＥＬＩＳＡによって、又はＢＩＡｃｏｒｅ装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）等の標準的な装置と組換え発現によって得られ得るＦｃ受容体を用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、容易に決定することができる。又は、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメイン又はＦｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子の結合親和性は、特定のＦｃ受容体を発現することが知られている細胞株（例えば、ＦｃγＩＩＩａ受容体を発現するヒトＮＫ細胞）を用いて評価されてもよい。
Ｆｃドメイン、又はＦｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子のエフェクタ機能は、当該技術分野で既知の方法によって測定することができる。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの例は、米国特許第５，５００，３６２号、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８３，７０５９－７０６３（１９８６）及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８２，１４９９－１５０２（１９８５）、米国特許第５，８２１，３３７号、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １６６，１３５１－１３６１（１９８７）に記載されている。或いは、非放射性アッセイ方法を使用してもよい（例えば、フローサイトメトリ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）のためのＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞傷害性アッセイ、及びＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ））。かかるアッセイに有用なエフェクタ細胞には、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。これに代えて、又は更に、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、インビボで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５，６５２－６５６（１９９８）に開示されるような動物モデルにおいて評価されてもよい。
いくつかの実施形態では、相補性構成要素に対する（特定的にはＣ１ｑに対する）Ｆｃドメインの結合が低下する。したがって、Ｆｃドメインが低減されたエフェクタ機能を有するように改変されるいくつかの実施形態では、上記低減されたエフェクタ機能は、低減されたＣＤＣを含む。Ｃ１ｑ結合アッセイは、Ｆｃドメイン又はＦｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子がＣ１ｑに結合することができ、したがってＣＤＣ活性を有するかどうかを決定するために行われ得る。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照されたい。補体活性化を評定するために、ＣＤＣアッセイを行ってもよい（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２、１６３（１９９６）；Ｃｒａｇｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １０１、１０４５－１０５２（２００３）；及びＣｒａｇｇ ａｎｄ Ｇｌｅｎｎｉｅ、Ｂｌｏｏｄ １０３、２７３８－２７４３（２００４）を参照されたい）。
ＦｃＲｎ結合及びインビボクリアランス／半減期の決定は、当該技術分野に既知の方法を使用して実施することもできる（例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ，Ｓ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ’ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８（１２）：１７５９－１７６９（２００６）；国際公開第２０１３／１２０９２９号を参照されたい）。
ポリヌクレオチド
本発明は更に、本明細書に記載した抗体又は二重特異性抗原結合分子、又はその断片をコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、当該断片は、抗原結合断片である。
本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドは、完全な抗体又は二重特異性抗原結合分子をコードする単一のポリヌクレオチドとして発現されてもよく、又は同時発現される複数の（例えば、２つ又はそれより多くの）ポリヌクレオチドとして発現されてもよい。同時発現するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドは、例えばジスルフィド結合、又は他の手段により会合し、機能性抗体又は二重特異性抗原結合分子を形成することができる。例えば、抗体又は二重特異性抗原結合分子の軽鎖部分は、抗体又は二重特異性抗原結合分子の重鎖を含む抗体又は二重特異性抗原結合分子の部分とは別個のポリヌクレオチドによってコードされ得る。同時発現する際、重鎖ポリペプチドは軽鎖ポリペプチドと会合して、抗体又は二重特異性抗原結合分子を形成する。別の例では、２つのＦｃドメインサブユニットのうち一方と、任意に１つ又は複数のＦａｂ分子（の一部）とを含む抗体又は二重特異性抗原結合分子の一部分は、２つのＦｃドメインサブユニットの他方と、任意にＦａｂ分子（の一部）とを含む抗体又は二重特異性抗原結合分子の一部分に由来する別個のポリヌクレオチドによってコードされてもよい。同時発現する場合、Ｆｃドメインサブユニットが会合し、Ｆｃドメインを形成する。
いくつかの実施形態では、単離ポリヌクレオチドは、本明細書に記載する本発明に係る抗体又は二重特異性抗原結合分子全体をコードする。他の実施形態では、単離されたポリヌクレオチドは、本明細書中に記載される本発明による抗体又は二重特異性抗原結合分子に含まれるポリペプチドをコードする。
特定の実施形態では、ポリヌクレオチド又は核酸は、ＤＮＡである。他の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡであり、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態である。本発明のＲＮＡは、一本鎖又は二本鎖であってもよい。
組換え方法
本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子は、例えば、固体状態ペプチド合成（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相合成）又は組換え産生によって得られてもよい。組換え産生のために、抗体又は二重特異性抗原結合分子（断片）をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを、例えば上記のように単離し、宿主細胞における更なるクローニング及び／又は発現のために１つ又は複数のベクターに挿入する。かかるポリヌクレオチドは、従来の手順を用い、容易に単離され、配列決定されてもよい。一実施形態では、本発明の１つ又は複数のポリヌクレオチドを含むベクター、好ましくは発現ベクターが提供される。当業者に周知の方法を用いて、適切な転写／翻訳制御シグナルに従い、抗体又は二重特異性抗原結合分子（断片）のコード配列を含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法としては、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術及びインビボ組換え／遺伝子組換えが挙げられる。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）；及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ（１９８９）に記載される技術を参照されたい。発現ベクターは、プラスミド、ウイルスの一部であってもよく、又は核酸断片であってもよい。発現ベクターは、抗体又は二重特異性抗原結合分子（断片）（すなわち、コード領域）をコードするポリヌクレオチドが、プロモーター、及び／又は他の転写若しくは翻訳調節要素と作動可能に会合してクローニングされる発現カセットを含む。本明細書で使用される場合、「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の一部である。「停止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ又はＴＡＡ）は、アミノ酸に翻訳されないが、コード領域の一部であると考えられてもよいが、存在する場合、任意のフランキング配列、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、５’及び３’未翻訳領域等は、コード領域の一部ではない。２つ又はそれより多くのコード領域が、単一のポリヌクレオチド構築物中に、例えば、単一のベクター上に、存在していてもよく、又は別個のポリヌクレオチド構築物中に、例えば別個の（異なる）ベクター上に、存在していてもよい。更に、任意のベクターは、単一のコード領域を含んでいてもよく、又は２つ若しくはそれより多くのコード領域を含んでいてもよく、例えば本発明のベクターは、１つ又は複数のポリペプチドをコードしてもよく、翻訳後又は翻訳と同時に、タンパク質分解による開裂によって、最終的なタンパク質へと分離される。これに加え、本発明のベクター、ポリヌクレオチド又は核酸は、本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子（断片）をコードするポリヌクレオチド、又はそのバリアント若しくは誘導体に融合するか、又は融合しない、異種コード領域をコードしうる。異種コード領域としては、限定されないが、特殊な要素又はモチーフ、例えば、分泌シグナルペプチド又は異種機能性ドメインが挙げられる。作動可能な会合は、ある遺伝子産物（例えばポリペプチド）のコード領域が、制御配列（複数可）の影響下又は制御下で、遺伝子産物の発現を行うような様式で、１つ又は複数の制御配列と会合する。２つのＤＮＡ断片（例えば、ポリペプチドコード領域及びこれに関連するプロモーター）は、プロモーター機能の導入によって、所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写が起こる場合、２つのＤＮＡ断片間の結合の性質が、遺伝子産物の発現を試行する発現制御配列の能力を妨害しないか、又はＤＮＡテンプレートを転写する能力を妨害しない場合、「作動可能に会合する」。したがって、プロモーター領域は、プロモーターが核酸の転写を行うことが可能な場合、ポリペプチドをコードする核酸と作動可能に会合していてもよい。プロモーターは、所定の細胞内でのＤＮＡの実質的な転写のみに指向する細胞特異的なプロモーターであってもよい。プロモーター以外の他の転写制御要素、例えば、エンハンサー、オペレーター、リプレッサ、転写停止シグナルは、細胞特異的な転写に指向するために、ポリヌクレオチドに作動可能に会合してもよい。適切なプロモーター及び他の転写制御領域は、本明細書に開示される。種々の転写制御領域が当業者に知られている。これらとしては、限定されないが、脊椎動物細胞内で機能する転写制御領域、例えば、限定されないが、サイトメガロウイルス由来のプロモーター及びエンハンサーセグメント（例えば最初期プロモーター、イントロン－Ａと組み合わせる）、シミアンウイルス４０（例えば初期プロモーター）及びレトロウイルス（例えばラウス肉腫ウイルス）が挙げられる。他の転写制御領域としては、脊椎動物遺伝子から誘導されるもの、例えば、アクチン、ヒートショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギβ－グロビン、及び真核細胞において遺伝子発現を制御することが可能な他の配列が挙げられる。更なる適切な転写制御領域としては、組織特異的なプロモーター及びエンハンサー、及び誘発性プロモーター（例えばプロモーター誘発性テトラサイクリン）が挙げられる。同様に、種々の翻訳制御要素は、当業者に知られている。これらとしては、限定されないが、リボソーム結合部位、翻訳開始及び停止コドン、ウイルス系から誘導される要素（特に、内部リボソーム侵入部位、すなわちＩＲＥＳ、ＣＩＴＥ配列とも呼ばれる）が挙げられる。発現カセットは、例えば、複製の起源及び／又は染色体組み込み要素、例えば、レトロウイルスの長い末端反復（ＬＴＲ）、又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）末端逆位配列（ＩＴＲ）等の他の特徴も含んでいてもよい。
本発明のポリヌクレオチド及び核酸コード領域は、分泌又はシグナルペプチドをコードする更なるコード領域と会合してもよく、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を指向する。例えば、抗体又は二重特異性抗原結合分子の分泌が所望される場合、シグナル配列をコードするＤＮＡを、本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子、又はその断片をコードする核酸の上流に配置することができる。シグナル仮説によれば、哺乳動物細胞によって分泌されるタンパク質は、シグナルペプチド又は分泌リーダー配列を有しており、これらは、粗い小胞体を通って成長したタンパク質鎖が外に出始めると、成熟タンパク質からは開裂する。当業者は、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドが、一般的に、ポリペプチドのＮ末端に融合するシグナルペプチドを有しており、ポリペプチドの分泌した形態又は「成熟」形態を生成するために、翻訳されたポリペプチドから開裂することを知っている。特定の実施形態では、天然シグナルペプチド、例えば免疫グロブリン重鎖又は軽鎖シグナルペプチドが使用されるか、又は作動可能に会合するポリペプチドの***を指向する能力を保持する配列の機能性誘導体が使用される。或いは、異種哺乳動物シグナルペプチド、又はその機能性誘導体を使用してもよい。例えば、野生型リーダー配列は、ヒト組織プラスミノーゲンアクティベーター（ＴＰＡ）又はマウスβ－グルクロニダーゼのリーダー配列で置換されてもよい。
後の精製を容易にするため又は抗体又は二重特異性抗原結合分子を標識するのに役立てるために使用可能な短いタンパク質配列（例えば、ヒスチジンタグ）をコードするＤＮＡが、ポリヌクレオチドをコードする抗体又は二重特異性抗原結合分子（断片）の中に、又はその末端に含まれていてもよい。
更なる実施形態では、本発明の１つ又は複数のポリヌクレオチドを含む宿主細胞が提供される。特定の実施形態では、本発明の１つ又は複数のベクターを含む宿主細胞が提供される。ポリヌクレオチド及びベクターは、それぞれポリヌクレオチド及びベクターに関連して本明細書に記載する特徴のいずれかを単独で、又は組み合わせて組み込んでもよい。１つのこのような実施形態では、宿主細胞は、本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子（の一部）をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを含む１つ又は複数のベクターを含む（例えば、それらで形質転換又はトランスフェクトされている）。本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、本発明の抗体若しくは二重特異性抗原結合分子又はその断片を生成するように操作することが可能な任意の種類の細胞系を指す。抗体又は二重特異性抗原結合分子を複製し、発現を補助するのに適した宿主細胞は、当該技術分野で周知である。かかる細胞は、適切な場合、特定の発現ベクターを用いてトランスフェクトされるか、又は形質導入されてもよく、大規模発酵機に接種するために大量のベクターを含む細胞を成長させ、臨床用途に十分な量の抗体又は二重特異性抗原結合分子を得ることができる。適切な宿主細胞としては、原核微生物（例えば大腸菌）又は種々の真核生物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、昆虫細胞等が挙げられる。例えば、ポリペプチドは、特にグリコシル化が必要とされない場合には、細菌内で産生されてもよい。発現後、ポリペプチドは、適切なフラクション中の細菌細胞ペーストから単離されてもよく、更に精製されてもよい。原核生物に加え、真核生物の微生物、例えば、糸状菌又は酵母は、ポリペプチドをコードするベクターに適切なクローニング又は発現の宿主であり、グリコシル化経路が「ヒト化」された真菌株及び酵母株を含み、部分的又は完全にヒトグリコシル化パターンを有するポリペプチドを産生する。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２２，１４０９－１４１４（２００４）及びＬｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２４，２１０－２１５（２００６）を参照されたい。（グリコシル化）ポリペプチドの発現に適した宿主細胞も、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては、植物細胞及び昆虫細胞が挙げられる。数多くのバキュロウイルス株が同定されており、特に、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために、これを昆虫細胞と組合せて使用してもよい。植物細胞培養物も、宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、同第６，０４０，４９８号、同第６，４２０，５４８号、同第７，１２５，９７８号、及び同第６，４１７，４２９号（トランスジェニック植物で抗体を製造するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術を記載している）を参照されたい。脊椎動物細胞も、宿主として使用され得る。例えば、懸濁物中で成長するように適合した哺乳動物細胞株が有用な場合がある。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ－７）によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株、ヒト胚腎臓株（例えばＧｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ３６，５９（１９７７）に、記載されるような２９３細胞又は２９３Ｔ細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ細胞（例えばＭａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ ２３、２４３－２５１（１９８０）に、記載されるようなＴＭ４細胞）、サル腎臓細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリサル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６）、ヒト頸部癌腫細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）、マウス***腫瘍細胞（ＭＭＴ ０６０５６２）、ＴＲＩ細胞（例えばＭａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ ３８３，４４－６８（１９８２）），ＭＲＣ ５ ｃｅｌｌｓ，ａｎｄ ＦＳ４ ｃｅｌｌｓ。他の有用な哺乳動物宿主細胞株としては、ｄｈｆｒ－ＣＨＯ細胞を含む、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７７，４２１６（１９８０））、骨髄腫細胞株、例えば、ＹＯ、ＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３及びＳｐ２／０が挙げられる。タンパク質産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞の総説としては、例えば、Ｙａｚａｋｉ ａｎｄ Ｗｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ），ｐｐ．２５５－２６８（２００３）を参照されたい。宿主細胞としては、培養細胞、例えば、ほんの数例を挙げると、哺乳動物培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、細菌細胞及び植物細胞が挙げられるが、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養植物又は動物組織に含まれる細胞も挙げられる。一実施形態では、宿主細胞は、真核細胞であり、好ましくは、哺乳動物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞又はリンパ球細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。
これらの系において外来遺伝子を発現させる標準的な技術は、当該技術分野で既知である。抗体などの抗原結合ドメインの重鎖又は軽鎖を含むポリペプチドを発現する細胞を操作して他方の抗体鎖も発現させ、発現した産生物が、重鎖及び軽鎖の両方を有する抗体となるようにすることができる。
一実施形態では、本発明による抗体又は二重特異性抗原結合分子を産生する方法が提供され、この方法は、抗体又は二重特異性抗原結合分子の発現に適した条件下で、本明細書に提供される抗体又は二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養すること、及び任意に、宿主細胞（又は宿主細胞培地）から抗体又は二重特異性抗原結合分子を回収することを含む。
本発明の二重特異性抗原結合分子（又は抗体）の成分は、互いに遺伝子的に融合していてよい。二重特異性抗原結合分子は、その構成要素が、互いに直接的に又はリンカー配列を通して間接的に融合されるように設計することができる。リンカーの組成及び長さは、当該技術分野で周知の方法に従って決定されてもよく、有効性について試験されてもよい。二重特異性抗原結合分子の異なる構成要素の間のリンカー配列の例が、本明細書で提供される。また、望ましい場合、更なる配列が、開裂部位を組み込み、融合の個々の構成要素を分離するために含まれていてもよい（例えば、エンドペプチダーゼ認識配列）。
本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子は、一般に、抗原決定基に結合することができる少なくとも１つの抗体可変領域を含む。可変領域は、天然又は非天然に存在する抗体及びその断片の一部を形成することができ、それらに由来し得る。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を産生する方法は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ」，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８を参照されたい）。天然に存在しない抗体は、固相ペプチド合成を用いて構築することができ、組換えによって産生することができ（例えば、米国特許第４，１８６，５６７号に記載されるように）、又は例えば、可変重鎖及び可変軽鎖を含むコンビナトリアルライブラリをスクリーニングすることによって（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙによる米国特許第５，９６９，１０８号を参照）。
任意の動物種の抗体、抗体断片、抗原結合ドメイン又は可変領域を、本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子で使用してもよい。本発明で有用な非限定的な抗体、抗体断片、抗原結合ドメイン又は可変領域は、マウス、霊長類又はヒト由来であってもよい。抗体又は二重特異性抗原結合分子がヒトへの使用を意図したものである場合、抗体の定常領域がヒト由来であるキメラ形態の抗体を使用してもよい。抗体のヒト化形態又は完全なヒト形態は、当該技術分野で周知の方法に従って調製することもできる（例えば、Ｗｉｎｔｅｒに対する米国特許第５，５６５，３３２号を参照されたい）。ヒト化は、限定されないが、（ａ）重要なフレームワーク残基（例えば、良好な抗原結合親和性又は抗体機能を維持するのに重要なもの）を保持しつつ、又は保持せずに、非ヒト（例えば、ドナー抗体）のＣＤＲをヒト（例えば、レシピエント抗体）のフレームワーク領域及び定常領域に接合すること、（ｂ）非ヒト特異性決定領域（ＳＤＲ又はａ－ＣＤＲ；抗体－抗原相互作用にとって重要な残基）のみをヒトフレームワーク及び定常領域にグラフト接合すること、又は（ｃ）全非ヒト可変ドメインを翻訳するが、表面残基を置き換えることによって、これらとヒト様部分とを「クローキング」することを含め、種々の方法によって達成されてもよい。ヒト化された抗体及びその作製方法については、Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９－１６３３（２００８）で総説され、更に以下に記載されている：Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２９（１９８８）；Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１００２９－１００３３（１９８９）；米国特許第５，８２１，３３７号、同第７，５２７，７９１号、同第６，９８２，３２１号、及び同第７，０８７，４０９号；Ｋａｓｈｍｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：２５－３４（２００５）（特異性決定領域（ＳＤＲ）グラフトを記載する）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９－４９８（１９９１）（リサーフェシングを記載する）；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：４３－６０（２００５）（「ＦＲシャッフリング」を記載する）；並びにＯｓｂｏｕｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：６１－６８（２００５）及びＫｌｉｍｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８３：２５２－２６０（２０００）（ＦＲシャッフルの「ガイド付き選択アプローチを記載する）。ヒト化に用い得るヒトフレームワーク領域としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：「ベストフィット」法を用いて選択したフレームワーク領域（例えば、Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）を参照されたい）；重鎖又は軽鎖可変領域の特定の亜型のヒト抗体コンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（例えば、Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）；及びＰｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３（１９９３）を参照されたい）；ヒト成熟（体細胞突然変異）フレームワーク領域又はヒト生殖系列フレームワーク領域（例えば、Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９－１６３３（２００８）を参照されたい）；並びにＦＲライブラリのスクリーニングに由来するフレームワーク領域（例えば、Ｂａｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１０６７８－１０６８４（１９９７）及びＲｏｓｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２２６１１－２２６１８（１９９６）を参照されたい）。
ヒト抗体は、当該技術分野で公知の様々な技術を使用して作製され得る。ヒト抗体は、一般的に、ｖａｎ Ｄｉｊｋ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ５、３６８－７４（２００１）及びＬｏｎｂｅｒｇ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０、４５０－４５９（２００８）に記載される。ヒト抗体は、免疫原を、インタクトなヒト抗体又は抗原性チャレンジに応答してヒト可変領域を有するインタクト抗体を産生するように修飾されたトランスジェニック動物に投与することによって調製されてもよい。かかる動物は、典型的には、内因性免疫グロブリン遺伝子座に取って代わるか、又は染色体外に存在するか、又は動物の染色体にランダムに組み込まれるヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含有する。そのようなトランスジェニックマウスでは、内因性免疫グロブリン遺伝子座は、一般的に不活性化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の総説については、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：１１１７－１１２５（２００５）を参照されたい。また、例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術を記載する米国特許第６，０７５，１８１号及び同第６，１５０，５８４号；ＨｕＭａｂ（登録商標）技術を記載する米国特許第５，７７０，４２９号；Ｋ－Ｍ ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載する米国特許第７，０４１，８７０号；及び、ＶｅｌｏｃｉＭｏｕｓｅ（登録商標）技術を記載する米国特許出願公開第２００７／００６１９００号も参照されたい。かかる動物によって産生されたインタクトな抗体からのヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることによって、更に修飾されてもよい。
ヒト抗体は、ハイブリドーマに基づく方法によっても作製することができる。ヒトモノクローナル抗体を産生するためのヒト骨髄腫細胞株及びマウス－ヒト異種骨髄腫細胞株が記載されている。（例えば、Ｋｏｚｂｏｒ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１－６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７）；及びＢｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：８６（１９９１）を参照されたい）。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して産生されたヒト抗体もまた、Ｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３：３５５７－３５６２（２００６）に記載されている。更なる方法としては、例えば、米国特許第７，１８９，８２６号（ハイブリドーマ細胞株由来のモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生を記載する）、及びＮｉ，Ｘｉａｎｄａｉ Ｍｉａｎｙｉｘｕｅ，２６（４）：２６５－２６８（２００６）（ヒト－ヒトハイブリドーマを記載する）が挙げられる。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）はまた、Ｖｏｌｌｍｅｒｓ ａｎｄ Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０（３）：９２７－９３７（２００５）及びＶｏｌｌｍｅｒｓ ａｎｄ Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｆｉｎｄｉｎｇｓ ｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２７（３）：１８５－９１（２００５）にも記載されている。
ヒト抗体はまた、本明細書に記載されるように、ヒト抗体ライブラリからの単離によって作られてもよい。
本発明に有用な抗体は、所望の活性を有する抗体に関するコンビナトリアルライブラリをスクリーニングすることによって単離されてもよい。コンビナトリアルライブラリをスクリーニングするための方法は、例えば、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ １６：４９８－５０８（２０１６）におけるＬｅｒｎｅｒらにおいて総説されている。例えば、ファージディスプレイライブラリを産生し、所望の結合特性を有する抗体についてかかるライブラリをスクリーニングするための様々な方法が当該技術分野で知られている。かかる方法は、例えば、ＦｒｅｎｚｅｌらのｍＡｂｓ ８：１１７７－１１９４（２０１６）；Ｂａｚａｎ ｅｔ ａｌ．のＨｕｍａｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ８：１８１７－１８２８（２０１２）、及びＺｈａｏらのＣｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３６：２７６－２８９（２０１６）、並びに、ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍらのＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７８：１－３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００１）、及びＭａｒｋｓ ａｎｄ ＢｒａｄｂｕｒｙのＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２４８：１６１－１７５（Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３）に見られる。
ある特定のファージディスプレイ法において、ＶＨ遺伝子及びＶＬ遺伝子のレパートリーは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって個別にクローニングされ、ファージライブラリにおいて無作為に組換えられており、次いで、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １２：４３３－４５５（１９９４）におけるＷｉｎｔｅｒらにおいて説明されたように、抗原結合ファージについてスクリーニングすることができる。ファージは、典型的には、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片として、又はＦａｂ断片としてのいずれかで、抗体断片を提示する。免疫化源からのライブラリは、ハイブリドーマを構築する必要なく、免疫原に対する高親和性抗体を与える。或いはまた、ナイーブなレパートリーをクローン化し（例えば、ヒトから）、ＧｒｉｆｆｉｔｈｓらのＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ１２：７２５－７３４（１９９３）に記載されるように、免疫化することなく、非自己から自己抗原までの広範囲に対する単一の抗体源を得ることができる。最終的に、生来のライブラリはまた、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ ＷｉｎｔｅｒのＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２２７：３８１－３８８（１９９２）によって説明されるように、再整列していないＶ遺伝子セグメントを幹細胞からクローニングすること、及びランダム配列を含有するＰＣＲプライマーを用いて、高度に可変性のＣＤＲ３領域をコードし、インビトロ再整列を達成することによって、合成により作成することができる。ヒト抗体ファージライブラリを説明する特許刊行物には、例えば、以下が含まれる：米国特許第５，７５０，３７３号、同第７，９８５，８４０号、同第７，７８５，９０３号及び同第８，６７９，４９０号、並びに米国特許出願公開第２００５／００７９５７４号、同第２００７／０１１７１２６号、同第２００７／０２３７７６４号及び同第２００７／０２９２９３６号。所望の活性又は複数の活性を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリをスクリーニングするための当該技術分野で知られている方法の更なる例には、リボソーム及びｍＲＮＡディスプレイ、並びに細菌、哺乳動物細胞、昆虫細胞又は酵母細胞における抗体ディスプレイ及び選択のための方法が含まれる。酵母表面ディスプレイの方法は、例えば、ＳｃｈｏｌｌｅｒらのＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５０３：１３５－５６（２０１２）において、及びＣｈｅｒｆらのＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ １３１９：１５５－１７５（２０１５）において、並びにＺｈａｏらのＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ８８９：７３－８４（２０１２）において見られる。リボソームディスプレイのための方法は、例えば、ＨｅらのＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２５：５１３２－５１３４（１９９７）及びＨａｎｅｓらのＰＮＡＳ ９４：４９３７－４９４２（１９９７）に記載されている。
本明細書に記載のとおりに調製される抗体又は二重特異性抗原結合分子は、高速液体クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、ゲル電気泳動、親和性クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィなどの、当該技術分野にて周知の技術により精製することができる。特定のタンパク質を精製するために使用される実際の条件は、一部には、正味の電荷、疎水性、親水性等の因子に依存し、当業者には明らかである。親和性クロマトグラフィ精製のために、抗体又は二重特異性抗原結合分子が結合する抗体、リガンド、受容体、又は抗原を使用することができる。例えば、本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子を親和性クロマトグラフィ精製するために、プロテインＡ又はプロテインＧを含むマトリックスを使用することができる。連続したプロテインＡ又はＧの親和性クロマトグラフィ及びサイズ排除クロマトグラフィを用いて、実施例にて本質的に記載しているように、抗体又は二重特異性抗原結合分子を単離することができる。抗体又は二重特異性抗原結合分子の純度は、ゲル電気泳動、高圧液体クロマトグラフィ等を含む、多種多様の周知の分析技術のいずれかにより測定することができる。
アッセイ
本明細書において提供する抗体又は二重特異性抗原結合分子の物理的／化学的性質、及び／又は生物活性を、当該技術分野において公知の様々なアッセイにより識別、スクリーニング、又は特性決定することができる。
親和性アッセイ
Ｆｃ受容体又は標的抗原に関する抗体又は二重特異性抗原結合分子の親和性は例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などの標準的な計装、及び、例えば組換え発現により入手可能である、受容体又は標的タンパク質を使用する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定することができる。代替的に、異なる受容体又は標的抗原に関する抗体又は二重特異性抗原結合分子の結合が、特定の受容体又は標的抗原を発現する細胞株を使用して、例えばフローサイトメトリ（ＦＡＣＳ）により、評価されてもよい。結合親和性を測定するための具体的な例証的説明及び例示的な実施形態が以下に記載される。
一実施形態によれば、ＫＤは、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ１００機（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用い、２５℃で表面プラズモン共鳴によって測定される。
Ｆｃ部分とＦｃ受容体との間の相互作用を分析するために、Ｈｉｓタグ化組換えＦｃ受容体をＣＭ５チップに固定化した抗Ｐｅｎｔａ Ｈｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎ）によって捕捉し、二重特異性構築物を分析物として使用する。簡潔には、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、供給業者の指示に従って、Ｎ－エチル－Ｎ’－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化する。抗ペンタ－Ｈｉｓ抗体を１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）で４０μｇ／ｍｌに希釈した後、５μｌ／分の流速で注射して、約６５００応答単位（ＲＵ）のカップリングされたタンパク質を得る。リガンドの注入後、１Ｍのエタノールアミンを注入して未反応基を遮断する。その後、Ｆｃ受容体を４ｎＭ又は１０ｎＭで６０秒間捕捉する。速度論的測定のために、抗体又は二重特異性抗原結合分子の４倍連続希釈物（５００ｎＭ～４０００ｎＭの範囲）をＨＢＳ－ＥＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ ７．４）に２５℃で３０μｌ／分の流速で１２０秒間注入する。
標的抗原に対する親和性を決定するために、抗体又は二重特異性抗原結合分子を、抗Ｐｅｎｔａ－Ｈｉｓ抗体について記載したとおりに活性化ＣＭ５センサーチップ表面に固定化された抗ヒトＦａｂ特異的抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって捕捉する。結合タンパク質の最終量は約１２０００ＲＵである。抗体又は二重特異性抗原結合分子を３００ｎＭで９０秒間捕捉する。標的抗原を、２５０ｎＭ～１０００ｎＭの濃度範囲で３０μｌ／分の流速で１８０秒間フローセルに通過させる。解離を１８０秒間監視する。
バルク屈折率差を、参照フローセルで得られた応答を差し引くことによって補正する。定常状態応答を使用して、ラングミュア結合等温線の非線形曲線フィッティングによって解離定数ＫＤを導出した。会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）を、単純な１対１ラングミュア結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ１００評価ソフトウェアバージョン１．１．１）を使用して、会合及び解離センサーグラムを同時にフィッティングすることによって、計算する。平衡解離定数（ＫＤ）は、ｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出される。例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９３，８６５－８８１（１９９９）を参照されたい。
活性アッセイ
本発明の二重特異性抗原結合分子（又は抗体）の生物活性は、実施例に記載されるように、様々なアッセイによって測定することができる。生物活性には、例えばＴ細胞の増殖の誘導、Ｔ細胞内のシグナル伝達の誘導、Ｔ細胞内の活性化マーカーの発現の誘導、Ｔ細胞によるサイトカイン分泌の誘導、腫瘍細胞などの標的細胞の溶解の誘導、並びに腫瘍退縮及び／又は生存の向上の誘導が含まれうる。
組成物、製剤及び投与経路
更なる態様では、本発明は、例えば、以下の治療方法のいずれかで使用するための、本明細書において提供する抗体又は二重特異性抗原結合分子のいずれかを含む医薬組成物を提供する。一実施形態では、医薬組成物は、本明細書で与えられるいずれかの抗体又は二重特異性抗原結合分子と、薬学的に許容され得る担体とを含む。別の実施形態では、医薬組成物は、本明細書において提供する抗体又は二重特異性抗原結合分子のいずれか、及び例えば後述する少なくとも１種の追加の治療剤を含む。
更には、インビボでの投与に適した形態で本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子を産生する方法が提供され、この方法は、（ａ）本発明による抗体又は二重特異性抗原結合分子を得ること、及び（ｂ）抗体又は二重特異性抗原結合分子と、少なくとも１つの薬学的に許容され得る担体とを配合し、それによって、抗体又は二重特異性抗原結合分子の調製物を、インビボでの投与のために配合することとを含む。
本発明の医薬組成物は、薬学的に許容され得る担体に溶解又は分散した、治療有効量の抗体又は二重特異性抗原結合分子を含む。「薬学的又は薬理学的に許容され得る」との句は、一般的に、使用する投薬量及び濃度でレシピエントに非毒性であり、すなわち、適切な場合、動物（例えばヒト）に投与したときに、有害なアレルギー反応又は他の不都合な反応を引き起こさない分子部分及び組成物を指す。抗体又は二重特異性抗原結合分子、及び任意に追加の有効成分を含有する医薬組成物の調製は、参照により本明細書に組み込まれているＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０により例示されているように、本開示に照らして当業者に既知であろう。更に、動物（例えば、ヒト）投与の場合、調製物が、ＦＤＡ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ又は他の国の対応する機関によって必要とされるような滅菌性、発熱原性、一般的安全性及び純度基準を満たすべきであることが理解されるであろう。好ましい組成物は、凍結乾燥された製剤又は水溶液である。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容され得る担体」は、当業者には知られているように（例えば、本明細書に参照により組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０，ｐｐ．１２８９－１３２９を参照されたい）、任意及び全ての溶媒、緩衝液、分散媒体、コーティング、界面活性剤、酸化防止剤、防腐剤（例えば抗菌剤、抗真菌剤）、等張化剤、吸収遅延剤、塩、防腐剤、酸化防止剤、タンパク質、薬物、薬物安定化剤、ポリマー、ゲル、バインダ、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、香味剤、染料、かかる類似の材料及びこれらの組合せを含む。任意の従来の担体が、有効成分と不適合である場合を除き、治療組成物又は医薬組成物における使用が想定される。
本発明のイムノコンジュゲート（及び任意の追加の治療剤）は、非経口、肺内、鼻内を含む任意の適切な手段によって投与されてもよく、所望な場合、局所治療では、病変内投与によって投与されてもよい。非経口注入としては、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与が挙げられる。投薬は、投与が短時間であるか、又は慢性的であるかに部分的に応じて、任意の好適な経路によるもの、例えば、静脈内注射又は皮下注射等の注射によるものであり得る。
非経口組成物としては、注射による（例えば、皮下、皮内、病変内、静脈内、動脈内、筋肉内、髄腔内又は腹腔内注射による）投与のために設計されたものが挙げられる。注射のために、本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子は、水溶液中で配合されてもよく、好ましくは、生理学的に適合するバッファー、例えば、Ｈａｎｋｓ溶液、Ｒｉｎｇｅｒ溶液又は生理食塩水バッファー中で配合されてもよい。溶液は、配合剤、例えば、懸濁剤、安定化剤及び分散剤を含有していてもよい。或いは、抗体又は二重特異性抗原結合分子は使用前に、好適なビヒクル、例えば発熱性物質除去水と共に構成するための、粉末形態であることができる。滅菌注射可能溶液は、必要な場合には以下に列挙する種々の他の成分と共に、本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子を必要な量で、適切な溶媒に組み込むことによって調製される。滅菌性は、例えば、滅菌濾過膜を通した濾過によって容易に達成され得る。一般的に、分散物は、種々の滅菌した有効成分を、塩基性分散媒体及び／又は他の成分を含む滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射可能溶液、懸濁物又は乳化物を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、既に滅菌濾過した液体媒体から有効成分と任意の更なる所望な成分の粉末が得られる減圧乾燥又は凍結乾燥技術である。液体媒体は、必要な場合には適切に緩衝化されているべきであり、注射する前に、十分な食塩水又はグルコースで液体希釈剤をまず等張性にする。組成物は、製造条件及び保存条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌等の微生物の混入作用から保護されなければならない。エンドトキシン汚染を安全なレベルに最小限に、例えば、０．５ｎｇ／ｍｇタンパク質未満に維持すべきであることが認識されるだろう。適切な薬学的に許容され得る担体としては、限定されないが、緩衝液、例えば、ホスフェート、シトレート及び他の有機酸；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド；ベンゼトニウムクロリド；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルパラベン又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾール）；低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン；単糖類、二糖類及び他の炭水化物（グルコース、マンノース又はデキストリンを含む）；キレート化剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖類、例えば、ショ糖、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩を形成する対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。水性注射懸濁物は、懸濁物の粘度を上げる化合物（例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、デキストラン等）を含んでいてもよい。任意に、懸濁物は、適切な安定化剤、又は高度に濃縮した溶液の調製を可能にするために、化合物の溶解度を高める薬剤も含んでいてもよい。更に、活性化合物の懸濁物は、適切な油注射懸濁物として調製されてもよい。適切な親油性溶媒又はビヒクルとしては、脂肪族油（例えば、ゴマ油）、又は合成脂肪酸エステル（例えば、エチルクリート（ｅｔｈｙｌ ｃｌｅａｔ）又はトリグリセリド）又はリポソームが挙げられる。
有効成分は、例えば、コアセルベーション技術によって、又は界面重合によって調製されたマイクロカプセル中に封入されてもよく（例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル）、コロイド状薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミン微小球、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）又はマクロエマルションに封入されてもよい。かかる技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１８ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）に開示されている。徐放性調製物を調製してもよい。徐放性調製物の適切な例としては、ポリペプチドを含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは、例えば、フィルム又はマイクロカプセル等の成型物品の形態である。特定の実施形態では、注射可能組成物の持続性吸収は、吸収を遅らせる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン、又はこれらの組合せ）の組成物での使用によってもたらされてもよい。
上述した組成物に加えて、抗体又は二重特異性抗原結合分子をデポー調製物として製剤化することも可能である。かかる長く作用する製剤は、移植によって（例えば、皮下又は筋肉内）、又は筋肉内注射によって投与されてもよい。したがって、例えば、抗体又は二重特異性抗原結合分子は、適切なポリマー又は疎水性材料（例えば、許容され得る油中のエマルションとして）又はイオン交換樹脂を用いて、又はやや難溶性の誘導体として、例えば、やや難溶性の塩として配合されてもよい。
本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子を含む医薬組成物は、従来の混合、溶解、乳化、カプセル化、封入、又は凍結乾燥プロセスにより製造することができる。医薬組成物は、１つ又は複数の生理学的に許容され得る担体、希釈剤、賦形剤又はタンパク質を医薬として使用可能な調製物へと加工するのを容易にする補助剤を用い、従来の様式で配合されてもよい。適切な製剤は、選択する投与経路によって変わる。
抗体又は二重特異性抗原結合分子は、遊離酸又は塩基、中性又は塩形態で、組成物に配合されることができる。薬学的に許容され得る塩は、遊離酸又は遊離塩基の生体活性を実質的に保持する塩である。これらには、酸付加塩、例えば、タンパク質組成物の遊離アミノ基と形成されるもの、又は例えば塩酸若しくはリン酸等の無機酸と形成されるか、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸若しくはマンデル酸等の有機酸と形成されるものが挙げられる。遊離カルボキシル基と形成される塩も、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムの水酸化物又は水酸化第２鉄等の無機塩基から誘導されてもよく、又はイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン又はプロカイン等の有機塩基から誘導されてもよい。医薬塩は、対応する遊離塩基形態よりも、水及び他のプロトン性溶媒に溶けやすい傾向がある。
治療方法及び組成物
本明細書において提供する抗体又は二重特異性抗原結合分子のいずれかを、治療方法にて使用することができる。本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子は、例えばがんの治療において、免疫治療剤として使用されうる。
治療方法で使用するために、本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子は、良好な医事に一致する様式で製剤化、用量化、及び投与される。これに関連して考慮すべき要因としては、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床症状、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、及び医療従事者に既知である他の要因が挙げられる。
一態様において、医薬として使用するための、本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子を提供する。更なる態様では、疾患の治療における使用のための本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子が提供される。特定の実施形態では、治療方法で使用するための、本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子を提供する。一実施形態では、本発明は、疾患の治療を必要とする個体における、疾患の治療で使用するための、本明細書に記載した抗体又は二重特異性抗原結合分子を提供する。特定の実施形態では、本発明は、疾患を有する個体の治療方法であって、治療有効量の抗体又は二重特異性抗原結合分子を個体に投与することを含む方法で使用するための抗体又は二重特異性抗原結合分子を提供する。特定の実施形態では、治療される疾患は、増殖性障害である。特定の実施形態では、疾患は、がんである。特定の実施形態では、この方法は、更に、個体に、治療有効量の少なくとも１つの追加の治療剤（例えば、治療される疾患ががんである場合、抗がん剤）を投与することを含む。更なる実施形態では、本発明は、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導するのに使用するための本明細書に記載の抗体又は二重特異性抗原結合分子を提供する。特定の実施形態では、本発明は、標的細胞の溶解を誘導するために個体に有効量の抗体又は二重特異性抗原結合分子を投与することを含む、個体において、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導する方法における使用のための本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子を提供する。上のいずれかの実施形態に係る「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトである。特定の実施形態では、治療される疾患は、自己免疫疾患、特に全身性エリテマトーデス及び／又は関節リウマチである。自己反応性形質細胞による病原性自己抗体の産生は、自己免疫疾患の顕著な特徴である。したがって、ＧＰＲＣ５Ｄは、自己免疫疾患において自己反応性形質細胞を標的化するために使用することができる。
更なる態様では、本発明は、医薬の製造又は調製における本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子の使用を提供する。一実施形態では、医薬は、疾患の治療を必要とする個体において、疾患の治療のためのものである。更なる実施形態では、医薬は、疾患を有する個体に、治療有効量の医薬を投与することを含む、疾患を治療する方法で使用するためのものである。特定の実施形態では、治療される疾患は、増殖性障害である。特定の実施形態では、疾患は、がんである。一実施形態では、この方法は、更に、個体に、治療有効量の少なくとも１つの追加の治療剤（例えば、治療される疾患ががんである場合、抗がん剤）を投与することを含む。更なる実施形態では、医薬は、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導するためのものである。また更なる実施形態では、医薬は、標的細胞の溶解を誘導するために個体に対して有効量の医薬を投与することを含む、個体において、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導する方法における使用のためのものである。上のいずれかの実施形態に係る「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトであってもよい。
更なる態様において、本発明は、疾患を治療するための方法を提供する。一実施形態では、この方法は、かかる疾患を有する個体に、治療有効量の本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子を投与することを含む。一実施形態では、本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子を薬学的に許容され得る形態で含む組成物が上記個体に投与される。特定の実施形態では、治療される疾患は、増殖性障害である。特定の実施形態では、疾患は、がんである。特定の実施形態では、この方法は、更に、個体に、治療有効量の少なくとも１つの追加の治療剤（例えば、治療される疾患ががんである場合、抗がん剤）を投与することを含む。上のいずれかの実施形態に係る「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトであってもよい。
さらなる態様では、本発明は、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導するための方法を提供する。一実施形態では、この方法は、Ｔ細胞、特に細胞傷害性Ｔ細胞の存在下において、標的細胞を本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子と接触させることを含む。さらなる態様では、個体において、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導するための方法が提供される。１つのこのような実施形態では、方法は、個体に対し、標的細胞の溶解を誘導するために、有効量の抗体又は二重特異性抗原結合分子を投与することを含む。一実施形態では、「個体」は、ヒトである。
特定の実施形態では、治療される疾患は、増殖性障害、特にがんである。がんの非限定的な例としては、膀胱がん、脳腫瘍、頭頸部がん、膵臓がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、食道がん、結腸がん、結腸直腸がん、直腸がん、胃がん、前立腺がん、血液がん、皮膚がん、扁平細胞癌腫、骨がん及び腎臓がんが挙げられる。本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子を使用して治療され得る、その他の細胞増殖性障害としては、腹部、骨、***、消化系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、脳下垂体、睾丸、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭頸部、神経系（中枢及び末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部領域及び泌尿生殖器系に位置する新生物が挙げられるが、これらに限定されない。前がん状態又は病変及びがん転移も含まれる。特定の実施形態では、がんは、腎臓がん、膀胱がん、皮膚がん、肺がん、結腸直腸がん、乳がん、脳腫瘍、頭頸部がん及び前立腺がんからなる群から選択される。一実施形態では、がんは前立腺がんである。当業者であれば、いくつかの場合、二重特異性抗原結合分子は、硬化を提供し得ないが、部分的な利益しか提供し得ないことを認識し得る。いくつかの実施形態では、いくつかの利益を有する生理学的変化も、治療利益であると考えられる。したがって、いくつかの実施形態では、生理学的変化をもたらす抗体又は二重特異性抗原結合分子の量を、「有効量」、又は「治療有効量」とみなす。治療が必要な対象、患者又は個体は、典型的には、哺乳動物であり、より具体的には、ヒトである。
いくつかの実施形態では、有効量の本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子が細胞に投与される。他の実施形態では、治療有効量の本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子が、疾患を治療するために個体に投与される。
疾患の予防又は治療のために、本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子の適切な投与量（単独で又は１つ又は複数の他の追加の治療剤と組み合わせて使用される場合）は、治療される疾患のタイプ、投与経路、患者の体重、抗体又は二重特異性抗原結合分子のタイプ、疾患の重症度及び経過、抗体又は二重特異性抗原結合分子が予防目的又は治療目的のために投与されるかどうか、以前の又は同時の治療的介入、患者の病歴及び抗体又は二重特異性抗原結合分子に対する応答、並びに主治医の裁量に依存する。投与の責任を担う医師は、いずれにしても、組成物中の有効成分（単数又は複数）の濃度、個々の対象に適切な用量（単数又は複数）を決定する。単回又は様々な時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、及びパルス輸注を含むが、これらに限定されない様々な投薬スケジュールが、本明細書では企図される。
抗体又は二重特異性抗原結合分子は、一度に、又は一連の治療にまたがり、患者に好適に投与される。疾患の種類及び重症度に応じ、例えば、１回又は複数回の個別投与、又は連続点滴にかかわらず、約１μｇ／ｋｇ～１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ）の抗体又は二重特異性抗原結合分子が、患者への投与への最初の候補投与量となることができる。典型的な１日投薬量は、上述の因子に依存して、約１μｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇの範囲であってもよい。数日間又はそれより長期にわたる反復投与において、状態に応じ、治療は通常、疾患症状の所望の抑制が生じるまで続けられる。抗体又は二重特異性抗原結合分子の１つの例示的な用量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。他の非限定的な例では、用量は、１回の投与当たり、約１μｇ／ｋｇ体重、約５μｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ／ｋｇ体重、約１００μｇ／ｋｇ体重、約２００μｇ／ｋｇ体重、約３５０μｇ／ｋｇ体重、約５００μｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ／ｋｇ体重、約５ｍｇ／ｋｇ体重、約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約２００ｍｇ／ｋｇ体重、約３５０ｍｇ／ｋｇ体重、約５００ｍｇ／ｋｇ体重から、約１０００ｍｇ／ｋｇ体重、又はそれよりも多く、及びこれらから誘導される任意の範囲を含んでもよい。本明細書に列挙される数から誘導可能な範囲の非限定的な例では、約５ｍｇ／ｋｇ体重～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約５μｇ／ｋｇ体重～約５００ｍｇ／ｋｇ体重などの範囲を、上述の数に基づいて投与することができる。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ若しくは１０ｍｇ／ｋｇ（又はこれらの任意の組合せ）の１つ又は複数の用量を患者に投与してもよい。かかる用量は、断続的に、例えば毎週又は３週間毎（例えば、患者が約２～約２０回、又は例えば約６回の用量の抗体又は二重特異性抗原結合分子を受容するように）投与されてもよい。最初の多めの投与量、それに続く１回又は複数回の量の少ない用量を投与してよい。しかしながら、他の投薬レジメンが有用であってもよい。この治療の進行は、従来の技術及びアッセイによって容易にモニタリングされる。
本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子は一般に、意図する目的を達成するのに有効な量で使用される。疾患症状を治療又は予防するのに使用するため、本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子、又はその医薬組成物は、治療有効量で投与されるか、又は適用される。治療有効量の決定は、特に、本明細書に与えられる詳細な開示の観点で、十分に当業者の能力の範囲内である。
全身投与の場合、治療有効投薬量は、インビトロアッセイ、例えば、細胞培養アッセイから最初に概算することができる。次いで、細胞培養物で決定されるようなＩＣ５０を含む血中濃度範囲を達成するために、用量を動物モデルで配合してもよい。かかる情報を使用し、ヒトにおける有用な用量を更に正確に決定することができる。
初期投薬量も、インビボデータから、例えば、動物モデルから、当該技術分野で周知の技術を用いて概算することができる。当業者は、動物データに基づき、ヒトへの投与を容易に最適化することができる。
投与量及び感覚を個別に調節して、治療効果を維持するのに十分な、抗体又は二重特異性抗原結合分子の血漿濃度を提供することができる。注射による投与のための通常の患者投薬量は、約０．１～５０ｍｇ／ｋｇ／日、典型的には約０．５～１ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。治療に有効な血漿濃度は、各日に複数回用量を投与することによって達成されてもよい。血漿中のレベルは、例えばＨＰＬＣによって測定することができる。
局所投与又は選択的取り込みの場合、抗体又は二重特異性抗原結合分子の有効局所濃度は血漿濃度に関連しないことがある。当業者は、過度な実験を行うことなく、治療に有効な局所投薬量を最適化することができる。
本明細書で記載される、抗体又は二重特異性抗原結合分子の治療に有効な用量は一般に、実質的な毒性を引き起こすことなく治療効果を提供する。抗体又は二重特異性抗原結合分子の毒性及び治療有効性は、細胞培養物又は実験動物における標準的な医薬手順によって決定することができる。細胞培養アッセイ及び動物実験を使用し、ＬＤ５０（集団の５０％が致死に至る用量）及びＥＤ５０（集団の５０％が治療に有効である用量）を決定することができる。毒性と治療効果との間の用量比は、治療指数であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。大きな治療指数を示す抗体又は二重特異性抗原結合分子が好ましい。一実施形態では、本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子は、高い治療指数を示す。細胞培養アッセイ及び動物実験から得られるデータを、ヒトでの使用に適した投薬範囲を決定する際に使用することができる。投薬量は、好ましくは、毒性がほとんどないか、全くない状態で、ＥＤ５０を含む血中濃度の範囲内にある。投薬量は、例えば、使用される剤形、利用される投与経路、対象の状態等の種々の因子に依存して、この範囲内で変動してもよい。正確な製剤、投与経路及び投薬量は、患者の状態という観点で個々の医師によって選択されてもよい（例えば、その全体が本明細書に参照により組み込まれる、Ｆｉｎｇｌ ｅｔ ａｌ．，１９７５，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｃｈ．１，ｐ．１を参照）。
本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子で治療される患者の主治医は、毒性、臓器不全などに起因して、どのように、いつ投与を中止するか、中断するか、又は調整するかを知っている。逆に、主治医は、臨床応答が十分ではない場合（毒性を生じずに）、治療をより高レベルにするように調整することも知っているであろう。関心のある障害の管理において投与される用量の大きさは、治療される状態の重篤度、投与経路等に伴って変動する。状態の重篤度は、例えば、部分的には、標準的な予後評価方法によって評価されてもよい。さらに、用量と、おそらく投薬頻度は、個々の患者の年齢、体重及び応答によっても変わる。
他の薬剤及び治療
本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子は、１種又は複数の他の薬剤と組み合わせて投与され得る。例えば、本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子は、少なくとも１つの追加の治療剤と同時投与されてもよい。「治療剤」という用語は、かかる治療が必要な個体において、症状又は疾患を治療するために投与される任意の薬剤を包含する。かかる追加の治療剤は、治療される特定の徴候に適した任意の有効成分を含んでいてもよく、好ましくは、互いに有害な影響を与えない相補的な活性を有するものを含んでいてもよい。特定の実施形態では、追加の治療剤は、免疫制御剤、細胞増殖抑制剤、細胞接着の阻害剤、細胞傷害剤、細胞アポトーシスの活性化剤、又はアポトーシス誘発因子に対する細胞の感度を高める薬剤である。特定の実施形態では、追加の治療剤は、抗がん剤、例えば、微小管破壊剤、代謝拮抗物質、トポイソメラーゼ阻害剤、ＤＮＡインターカレーター、アルキル化剤、ホルモン治療、キナーゼ阻害剤、受容体アンタゴニスト、腫瘍細胞アポトーシスの活性化剤、又は抗血管形成剤である。
かかる他の薬剤は、適切には、意図する目的にとって有効な量で組み合わせた状態で存在する。有効量のこのような他の薬剤は、使用される抗体又は二重特異性抗原結合分子の量、障害又は治療の種類、上述の他の因子に依存する。抗体又は二重特異性抗原結合分子は、一般的に、同じ投薬量で、本明細書に記載の投与経路で使用されるか、又は約１～９９％の本明細書に記載の投薬量で、又は経験的／臨床的に適切であると決定される任意の投薬量及び任意の経路で使用される。
上記のかかる併用療法は、併用投与（２つ又はそれより多くの治療剤が同じ又は別個の組成物に含まれる場合）、及び別個の投与を含み、その場合、本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子の投与は、追加の治療剤及び／又はアジュバントの投与の前、同時、及び／又は後に、起こり得る。本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子は、放射線療法と組み合わせて使用されてもよい。
製造物品
本発明の別の態様では、上述の障害の治療、予防及び／又は診断に有用な材料を含む製造物品が提供される。製造物品は、容器と、容器に挿入されるか、又は容器に付随するラベル又はパッケージ添付文書とを備えている。適切な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ溶液バッグなどが挙げられる。容器は、ガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成されてもよい。容器は、それ自体で、又は別の組成物との組み合わせで、状態の治療、予防、及び／又は診断に有効である組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、静注溶液袋又は皮下注射針によって穿孔可能な栓を有するバイアルであり得る）。組成物中の少なくとも１種の活性剤は、本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子である。ラベル又はパッケージ添付文書は、その組成物が、選択した条件を治療するために使用されることを示す。更に、製造物品は、（ａ）製造物品中に含有され、本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子を含む組成物を含む第１の容器、及び、（ｂ）製造物品中に含有され、更なる細胞傷害剤又は別の治療剤を含む組成物を含む第２の容器を含んでよい。製造物品は、本発明のこの実施形態では、その組成物を特定の状態を治療するために使用可能であることを示すパッケージ添付文書を更に備えていてもよい。これに代えて、又はこれに加えて、製造物品は、薬学的に許容され得るバッファー、例えば、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝化生理食塩水、Ｒｉｎｇｅｒ溶液及びデキストロース溶液を含む第２の（又は第３の）容器を更に備えていてもよい。他のバッファー、希釈剤、フィルタ、ニードル及びシリンジを含め、商業的及びユーザの観点から望ましい他の材料を更に含んでいてもよい。
診断及び検出のための方法及び組成物
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体はいずれも、生体試料中のＧＰＲＣ５Ｄの存在の検出に有用である。本明細書で使用される場合、「検出」という用語は、定量的又は定性的な検出を包含する。特定の実施形態において、生体試料は、細胞又は組織、例えば前立腺組織を含む。
一実施形態では、診断又は検出方法において使用するための抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体が提供される。更なる態様では、生体試料中のＧＰＲＣ５Ｄの存在を検出する方法が提供される。ある特定の実施形態では、本方法は、ＧＰＲＣ５Ｄへの抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体の結合を許容する条件下で、生体試料を本明細書に記載される抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体と接触させることと、抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体とＧＰＲＣ５Ｄとの間で複合体が形成されるかどうかを検出することと、を含む。このような方法は、インビトロ法又はインビボ法であってもよい。一実施形態では、例えば、ＧＰＲＣ５Ｄが患者の選択のためのバイオマーカーである場合、抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体を使用して、抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体での療法に適格な対象を選択する。
本発明の抗体を使用して診断され得る例示的な障害には、がん、特に多発性骨髄腫が含まれる。
ある特定の実施形態では、標識された抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体が提供される。標識としては、限定されないが、直接的に検出される標識又は部分（例えば、蛍光、色素体、電子密度の高い、化学発光及び放射性標識）、及び例えば酵素反応又は分子相互作用によって、間接的に検出される部分（例えば、酵素又はリガンド）が挙げられる。例示的な標識としては、限定されないが、放射性同位体３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ及び１３１Ｉ、フルオロフォア、例えば、希土類キレート又はフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルセリフェラーゼ（ｌｕｃｅｒｉｆｅｒａｓｅｓ）、例えば、ホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ（米国特許第４，７３７，４５６号）、ルシフェリン、２，３－ジヒドロフタラジンジオン、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリ性ホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖オキシダーゼ、例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ及びグルコース－６－ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘテロ環オキシダーゼ、例えば、ウリカーゼ及び過酸化水素を使用する酵素と連結し、染料前駆体を酸化するキサンチンオキシダーゼ、例えば、ＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼ、又はミクロペルオキシダーゼ、ビオチン／アビジン、スピン標識、バクテリオファージ標識、安定な遊離ラジカル等が挙げられる。
本発明のさらなる態様は、可変重鎖領域（ＶＬ）を含むＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体（１０Ｂ１０）に関し、ＶＬは、配列番号８１の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。抗体は、軽鎖可変領域（ＶＬ）を含んでよく、ＶＬは、配列番号８２の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。抗体は、ＶＨ及びＶＬを含んでよく、ＶＬは、配列番号８１の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含んでよく、ＶＬは、配列番号８２の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。好ましくは、抗体は、配列番号８１のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号８２のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。
本発明のさらなる態様は、抗体（１０Ｂ１０－ＴＣＢ）に関する。抗体は、配列番号６７の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む第１の軽鎖を含んでよい。抗体は、配列番号６８の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含んでよい。抗体は、配列番号６９の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む第１の重鎖を含んでよい。抗体は、配列番号７０の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含んでよい。好ましい実施形態では、抗体は、配列番号６７のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号６８のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖と、配列番号６９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号７０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖とを含む。
［表］
Figure 2022543551000001
Figure 2022543551000002
Figure 2022543551000003
Figure 2022543551000004
Figure 2022543551000005
Figure 2022543551000006
Figure 2022543551000007
Figure 2022543551000008
Figure 2022543551000009
Figure 2022543551000010
Figure 2022543551000011
Figure 2022543551000012
以下は、本発明の方法及び組成物の例である。先に提供した一般的な説明を考慮すると、種々の他の実施形態が実施されてもよいことが理解される。
実施例１
腫瘍標的の発現
正常な形質細胞よりも多発性骨髄腫によって発現される差次的遺伝子を同定するために、多発性骨髄腫（ＭＭ）患者由来の１０個の試料及び健康なドナーの骨髄由来の１０個の形質細胞（ＰＣ）について、ＲＮＡｓｅｑを行った。ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｃｒｏキット（Ｑｉａｇｅｎ）を製造者の説明書に従って使用してＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ抽出中にＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅセット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してゲノムＤＮＡを除去した。抽出されたＲＮＡの品質は、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｅｕｋａｒｙｏｔｅ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｐｉｃｏ ｃｈｉｐｓ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で制御した。Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシング用ＳＭＡＲＴｅｒ超低ＲＮＡキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して、製造者の指示に従って１．６ｎｇの全ＲＮＡからｃＤＮＡを調製及び増幅した。次いで、１ｎｇの増幅ｃＤＮＡを製造者の指示に従ってＮｅｘｔｅｒａ ＸＴライブラリ調製（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）に供した。シーケンシング・ライブラリを、Ｋａｐａライブラリ定量キット（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して定量し、高感度チップ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用したＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒでのキャピラリー電気泳動によって品質管理した。ライブラリを、バージョン４のクラスター生成キット及びバージョン４のシーケンシング試薬（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して、ＨｉＳｅｑ２５００シーケンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）で２×５０サイクルについて配列決定した。
Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）は、悪性形質細胞上に発現され、したがって多発性骨髄腫標的として認識される細胞表面タンパク質である（Ｔａｉ ＹＴ＆Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＫＣ，Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｂ－ｃｅｌｌ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ ｉｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ，Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．２０１５ Ｎｏｖ；７（１１）：１１８７－１１９９）。ＲＮＡｓｅｑ技術を使用して、詳細な分析により、ＧＰＲＣ５Ｄが多発性骨髄腫患者由来の形質細胞においてＢＣＭＡと同じくらい高度に発現されることが示された（図２）。より重要なことには、多発性骨髄腫患者由来の形質細胞と健康な形質細胞との間のＧＰＲＣ５Ｄの差次的発現は、約２０倍である。対照的に、多発性骨髄腫患者由来の形質細胞と健康な形質細胞との間のＢＣＭＡの差次的発現はわずか２倍である。ＧＰＲＣ５Ｄの全体的な発現は、ＳＬＡＭ７、ＣＤ１３８及びＣＤ３８などの他の既知の多発性骨髄腫標的分子の発現よりもはるかに高い。さらに、ＧＰＲＣ５Ｄは、健康なナイーブＢ細胞又はメモリーＢ細胞によってほとんど発現されない。
実施例２
ＧＰＲＣ５Ｄ結合剤の作製及びＴ細胞二重特異性（ＴＣＢ）抗体の調製
ＧＰＲＣ５Ｄ結合剤を、ラットのＤＮＡ免疫化、続いてハイブリドーマ作製、ハイブリドーマのスクリーニング及び配列決定によって作製した。特異的結合についてのスクリーニングを、ＧＰＲＣ５Ｄ発現トランスフェクタントへのその結合によってＥＬＩＳＡによって測定した。以下では、５Ｅ１１（配列番号１３及び１４）及び５Ｆ１１（配列番号１５及び１６）と呼ばれる２つのＧＰＲＣ５Ｄ結合剤を同定した。特異的結合剤が同定された時点で、ＩｇＧはＴ細胞二重特異性抗体に変換された。結合剤をＴ細胞二重特異性抗体に変換する原理は、当該技術分野、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＰＣＴ国際公開第２０１４／１３１７１２号Ａ１に例示及び記載されている。Ｔ細胞二重特異性抗体は、図３に示すように、２つのＧＰＲＣ５Ｄ結合部分及び１つのＣＤ３結合部分（抗ＧＰＲＣ５Ｄ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体）を含む。以下の抗ＧＰＲＣ５Ｄ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体を調製した：ｉ）５Ｅ１１－ＴＣＢ（配列番号１７、１８、１９及び２０）；ｉｉ）５Ｆ１１－ＴＣＢ（配列番号２１、２２、２３及び２４）；ｉｉｉ）ＥＴ１５０－５－ＴＣＢ（配列番号２５、２６、２７及び２８）；ｉｖ）Ｂ７２－ＴＣＢ（配列番号７３、７４、７５及び７６）；及びｖ）ＢＣＭＡ－ＴＣＢ（配列番号７７、７８、７９及び８０）。ＥＴ１５０－５ ＧＰＲＣ５Ｄ結合部分は、ＰＣＴ国際公開第２０１６／０９０３２９号Ａ２に記載されている。「ＥＴ－１５０－５」という用語は、本明細書では「ＥＴ１５０－５」という用語と同義に使用され、その逆も同様である。陰性対照として、非標的ＤＰ４７－ＴＣＢを調製した。ＤＰ４７－ＴＣＢは、ＣＤ３にのみ結合し、ＧＰＲＣ５Ｄには結合しない非標的Ｔ細胞二重特異性抗体である。ＤＰ４７－ＴＣＢは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＰＣＴ国際公開第２０１４／１３１７１２号Ａ１に記載されている。Ｂ７２－ＴＣＢは、国際公開第２０１８／０１１７７８６号Ａ２の表２３に開示されているＧＣＤＢ７２抗体に由来し、ＧＣＤＢ７２のＧＰＲＣ５Ｄ結合部分を含む。Ｂ７２－ＴＣＢをｃｒｏｓｓｍａｂ １＋１フォーマットで生成した（配列番号７３、７４、７５及び７６）。ＢＣＭＡ－ＴＣＢは、国際公開第２０１６／１６６６２９号Ａ１に由来し、そこに開示されているＡ０２＿Ｒｄ４＿６ｎＭ＿Ｃ０１のＧＰＲＣ５Ｄ結合部分を含む。ＢＣＭＡ－ＴＣＢは、ｃｒｏｓｓｍａｂ ２＋１フォーマットで生成された（配列番号７７、７８、７９及び８０）。
実施例３
多発性骨髄腫細胞株に対するＴ細胞二重特異性抗体の結合
ＧＰＲＣ５Ｄへの結合を測定するために、本発明者らは、報告された多発性骨髄腫細胞株（Ｌｏｍｂａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｂｙ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ ｇｅｎｏｍｉｃｓ：ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ｄｉｓｅａｓｅ；Ｇｅｎｅｓ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ Ｃａｎｃｅｒ．２００７ Ｍａｒ；４６（３）：２２６－３８．）に対してＦＡＣＳに基づく結合アッセイを行った。細胞株ＡＭＯ－１、Ｌ３６３及びＯＰＭ－２を、２０％熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ）及び１％ペニシリン－ストレプトマイシン１００Ｘ（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＲＰＭＩ １６４０＋Ｇｌｕｔａｍａｘ培地（Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。細胞株ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２（陰性対照）を、１０％のＦＢＳのみを補充した同じ培地で培養した。細胞株ＮＣＩ－Ｈ９２９及びＲＰＭＩ－８２２６もまた、５０μＭメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）及び１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）を補充した同じ培地で培養した。細胞株を７５ｃｍ２フラスコ（ＴＰＰ）中で週に２回継代して培養した。
異なる抗ヒトＧＰＲＣ５Ｄ－ＴＣＢ抗体（５Ｅ１１－ＴＣＢ、５Ｆ１１－ＴＣＢ及びＥＴ１５０－５ ＴＣＢ）の結合を、間接染色を使用して評価した。細胞を、１０μｇ／ｍｌ～０．０００６４μｇ／ｍｌの範囲の抗ヒトＧＰＲＣ５Ｄ－ＴＣＢ構築物５Ｅ１１－ＴＣＢ、５Ｆ１１－ＴＣＢ又はＥＴ１５０－５ ＴＣＢと共に、０．２倍の段階希釈を使用して、又は構築物なしで、１００μＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；Ｇｉｂｃｏ）中、４℃で１時間インキュベートした。細胞を、ＰＢＳ中に１：８００希釈したＬｉｖｅ ｂｌｕｅ色素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で４℃にて２０分間染色した後、フローサイトメトリ染色緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）中に１／３００希釈したＰＥコンジュゲート化ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ断片特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で染色し、４℃で３０分間インキュベートした。フローサイトメトリ取得を、特注設計のＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｆｏｒｔｅｓｓａで実施し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ，Ａｓｈｌａｎｄ；ＯＲ）及びＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して分析した。
図４Ａ～図４Ｃは、５Ｅ１１－ＴＣＢ及び５Ｆ１１－ＴＣＢの両方が試験した多発性骨髄腫細胞株の全てに用量依存的に結合することを示す。対照的に、ＥＴ１５０－５－ＴＣＢは、試験した細胞株に対してはるかに弱く結合する。抗ＧＰＲＣ５Ｄ－ＴＣＢによって観察されたＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞（非ホジキンリンパ腫のＧＰＲＣ５Ｄ－細胞株）への結合はなかった。
実施例４
抗ＧＰＲＣ５Ｄ－ＴＣＢ媒介Ｔ細胞傷害性
抗ＧＰＲＣ５Ｄ－ＴＣＢ抗体の機能性を測定するために、インビトロＴ細胞細胞傷害性アッセイを行った。簡潔には、ＡＭＯ－１、Ｌ３６３及びＯＰＭ－２細胞株を、２０％熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；Ｇｉｂｃｏ）及び１％ペニシリン－ストレプトマイシン１００Ｘ（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＲＰＭＩ １６４０＋Ｇｌｕｔａｍａｘ培地（ＰＳ；Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。細胞株ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２を、１０％のＦＢＳのみを補充した同じ培地で培養した。細胞株ＮＣＩ－Ｈ９２９及びＲＰＭＩ－８２２６を、５０μＭメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）及び１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）を補充した同じ培地で培養した。細胞株を７５ｃｍ２フラスコ（ＴＰＰ）中で週に２回継代して培養した。
細胞株を、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）＋１％ＰＳ（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＩＭＤＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）中、ヒトＰａｎ Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）（Ｂｌｕｔｓｐｅｎｄｅ Ｓｃｈｌｉｅｒｅｎ製のＢｕｆｆｙ ｃｏａｔ）から単離した３．１０５個の同種異系Ｔ細胞と１：１０のＴａｒｇｅｔ：Ｅｆｆｅｃｔｏｒ比で共培養した。抗ヒトＧＰＲＣ５Ｄ－ＴＣＢ抗体（５Ｅ１１－ＴＣＢ、５Ｆ１１－ＴＣＢ、ＥＴ１５０－５ ＴＣＢ又はＤＰ４７－ＴＣＢ）を、１μｇ／ｍｌ～０．０００００１μｇ／ｍｌの範囲の異なる濃度で、０．１倍又は０μｇ／ｍｌの段階希釈により共培養物に添加した。５％ＣＯ２を含む３７℃での２０時間のインキュベーションの後、ウェルあたり７５μｌの上清を、ウェルあたり２５μｌのＣｙｔｏＴｏｘ－Ｇｌｏ細胞毒性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を含む９６ウェル白色プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ－ｏｎｅ）に移した。室温で１５分間インキュベートした後、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＥｎＶｉｓｉｏｎでルミネセンス取得を行い、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ及びＸＬフィット・ソフトウェアを使用して分析した。データをＬＤＨ放出の発光シグナルとしてプロットする。
図５Ａ～図５Ｅは、５Ｅ１１－ＴＣＢ及び５Ｆ１１－ＴＣＢの両方が、多発性骨髄腫細胞株、特にＮＣＩ－Ｈ９２９（図５Ｂ）、ＲＰＭＩ－８２２６（図５Ｃ）、Ｌ３６３及び（図５Ｄ）ＡＭＯ－１（図５Ａ）に対して強いＴ細胞細胞傷害性を媒介したが、陰性対照株ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２（図５Ｅ）では死滅は観察されなかったことを示す。対照的に、ＥＴ１５０－５－ＴＣＢは、試験した多発性骨髄腫細胞株に対して有意に低い死滅を媒介し、又はほとんど媒介しなかった。表１は、図５Ａ～Ｅに示されるデータから得られたＥＣ５０値をまとめたものである。ＥＣ５０値は、滴定したＴＣＢに対してシグナルの生データをプロットすることによって、ＥｘｃｅｌのＸＬフィット・アドオン機能を使用して計算した。
Figure 2022543551000013
実施例５
抗ＧＰＲＣ５Ｄ－ＴＣＢ媒介のＴ細胞活性化
抗ＧＰＲＣ５Ｄ－ＴＣＢの作用様式に機構的に対処するために、抗ＧＰＲＣ５Ｄ－ＴＣＢの存在下で標的多発性骨髄腫細胞株と共培養した後のＴ細胞の活性化を測定した。実施例４及び図５Ａ～図５Ｅに記載される実験と同様に、細胞株を、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）＋１％ＰＳ（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＩＭＤＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）中、ヒトＰａｎ Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、ＰＢＭＣ（Ｂｌｕｔｓｐｅｎｄｅ Ｓｃｈｌｉｅｒｅｎ製のＢｕｆｆｙ ｃｏａｔ）から単離した３．１０５個の同種異系Ｔ細胞と１：１０のＴａｒｇｅｔ：Ｅｆｆｅｃｔｏｒ比で共培養した。抗ヒトＧＰＲＣ５Ｄ－ＴＣＢ抗体（５Ｅ１１－ＴＣＢ、５Ｆ１１－ＴＣＢ、ＥＴ１５０－５－ＴＣＢ又はＤＰ４７－ＴＣＢ）を、１μｇ／ｍｌ～０．０００００１μｇ／ｍｌの範囲の異なる濃度で、０．１倍又は０μｇ／ｍｌの段階希釈により共培養物に添加した。３７℃、５％ＣＯ２で２０時間インキュベートした後、細胞を染色してＴ細胞活性化を評価した。細胞を最初に、ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）中１：８００に希釈したＬｉｖｅ ｂｌｕｅ色素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で４℃にて２０分間染色した。その後、細胞を、フローサイトメトリ染色緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）中、ＡＦ７００抗ヒトＣＤ４（クローンＯＫＴ４）、ＢＶ７１１抗ヒトＣＤ８（クローンＳＫ１）、ＢＶ６０５抗ヒトＣＤ２５（クローンＢＣ９６）、ＡＰＣ－Ｃｙ７抗ヒトＣＤ６９（クローンＦＮ５０）（全てＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）及びＰＥ－Ｃｙ５．５抗ヒトＣＤ３（クローンＳＫ７；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で４℃で３０分間染色した。フローサイトメトリ取得を、特注設計のＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｆｏｒｔｅｓｓａで実施し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ，Ａｓｈｌａｎｄ；ＯＲ）及びＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して分析した。
図６は、５Ｆ１１－ＴＣＢが、活性化マーカーＣＤ２５及びＣＤ６９を上方制御することによって、ＮＣＩ－Ｈ９２９細胞との共培養物においてＴ細胞活性化を誘導する一方で、対照、例えば非標的ＤＰ４７－ＴＣＢ、及びＴＣＢを含まない対照は、Ｔ細胞活性化を誘導しなかったことを示す。別の陰性対照として、５Ｆ１１－ＴＣＢ処理Ｔ細胞をＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞と共培養し、これもまた、Ｔ細胞は活性化されなかった。これらの活性化プロファイルは、本発明者らが研究した複数の細胞株、例えばＡＭＯ－１、ＮＣＩ－Ｈ９２９、ＲＰＭＩ－８２２６、Ｌ３６３にわたって一貫していた（図７Ａ～Ｊ）。低い死滅化効力と一致して、ＥＴ１５０－５－ＴＣＢは、１ｍｇ／ｋｇの最高試験濃度を除いて、Ｔ細胞活性化を誘導しなかった。
実施例６
抗ＧＰＲＣ５Ｄ－ＴＣＢの局在化及び内在化
ＮＣＩ－Ｈ９２９細胞をＣＭＦＤＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色し、２４ウェルプレート中のポリ－Ｌ－リジン（Ｓｉｇｍａ）被覆円形カバースリップ上に播種した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７スクシンイミジルエステル（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ａ２０１１０６）をモル比２．５で抗体（５Ｅ１１－ＩｇＧ、５Ｅ１１－ＴＣＢ、５Ｆ１１－ＩｇＧ、５Ｆ１１－ＴＣＢ）を標識した。細胞を３７℃で一晩接着させた後、蛍光タグ付き抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７標識５Ｅ１１－ＩｇＧ、－５Ｅ１１－ＴＣＢ、－５Ｆ１１－ＩｇＧ、－５Ｆ１１－ＴＣＢ）を異なる持続時間及び温度（氷上で３０分間、３７℃で１時間及び３７℃で３時間）で増殖培地に直接添加した。冷ＰＢＳ（Ｌｏｎｚａ）を使用して反応を停止させ、各時点後に未結合抗体を洗い流した。次いで、細胞を、Ｃｙｔｏｆｉｘ（ＢＤ）を用いて４℃で２０分間固定し、ＰＢＳで２回洗浄した。次いで、カバースリップを移し、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ Ｇ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いてガラススライドに取り付け、イメージングの前に、暗状態で、４℃で一晩保持した。Ｚｅｉｓｓ製の倒立ＬＳＭ ７００に６０倍の油浸対物レンズを取り付け、蛍光共焦点顕微鏡法を実施した。顕微鏡に連結されたＺｅｎソフトウェア（Ｚｅｉｓｓ）を使用して画像を収集し、ＩＭＡＲＩＳソフトウェア（Ｂｉｔｐｌａｎｅ）で視覚化した。図８Ａは、全ての抗体が４℃又は３７℃で多発性骨髄腫細胞株の表面（原形質膜）を染色したことを示す。抗体が細胞によって内在化される場合、蛍光染色は、３７℃で培養したときに細胞質に現れるであろう。ＧＰＲＣ５Ｄ結合ＩｇＧ又はＧＰＲＣ５Ｄ結合ＴＣＢのＧＰＲＣ５Ｄ＋細胞株による内部移行は観察されなかった。これは、細胞の膜及び細胞質で定義された関心領域からの強度和を適用することによってさらに確認された（３時間）。ＩＭＡＲＩＳソフトウェアを、膜対細胞質のシグナル比の分析及び定量に使用した。図８Ｂは、異なる抗体とのインキュベーションの３時間後、膜対細胞質強度の比が約４で変化しなかったことを示し、これは、蛍光シグナルが細胞質ではなく表面に集中することを意味する。
実施例７
ＧＰＲＣ５Ｄ結合剤の特性評価：ＥＬＩＳＡによる組換え細胞結合
ヒトＧＰＲＣ５Ｄ又はカニクイザルＧＰＲＣ５Ｄ又はマウスＧＰＲＣ５Ｄ又はヒトＧＰＲＣ５Ａのいずれかを発現する安定トランスフェクトＣＨＯクローンを使用して、ＩｇＧとしての潜在的なリード候補抗体の結合を分析した。詳細には、１０４個の細胞（生存率≧９８％）を、新鮮な培養培地を使用して３８４ウェルマイクロタイタープレート（ＢＤポリＤ－リシン、＃３５６６６２、容量：２５μｌ／ウェル）に播種した。３７℃で一晩インキュベートした後、抗体の２５μｌ／ウェル希釈物を４℃で２時間、細胞に添加した（１×ＰＢＳ中、１５×１：３希釈、アッセイ濃度３０μｇ／ｍｌで開始）。９０μｌ／ウェルのＰＢＳＴ（１０×ＰＢＳ、Ｒｏｃｈｅ、＃１１６６６７８９００１＋０，１％Ｔｗｅｅｎ２０）を使用する１回の洗浄工程の後、続いて、室温（ＲＴ）で１０分間、５０μｌ／ウェルの０．０５％グルタルアルデヒド（Ｓｉｇｍａカタログ番号：Ｇ５８８２、１ｘＰＢＳ中）の添加によって細胞を固定した。９０μｌ／ウェルのＰＢＳＴを使用する３回のさらなる洗浄工程の後、検出のために二次抗体を添加した：ヒト抗体については、ブロッキング緩衝液（１×ＰＢＳ（Ｒｏｃｈｅ＃１１６６６７８９００１）＋２％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン画分Ｖ、脂肪酸フリー、Ｒｏｃｈｅ、＃１０７３５０８６００１）＋０，０５％Ｔｗｅｅｎ２０）中、１：２０００に希釈したヤギ抗ヒトＩｇ κ鎖抗体ＨＲＰ複合体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ番号ＡＰ５０２Ｐ）を使用した（２５μｌ／ウェル）。ラット抗体については、ヤギ抗ラットＩｇＧ１抗体ＨＲＰ複合体（Ｂｅｔｈｙｌ＃Ａ１１０－１０６ Ｐ）、ヤギ抗ラットＩｇＧ２ａ抗体ＨＲＰ複合体（Ｂｅｔｈｙｌ＃Ａ１１０－１０９Ｐ）及びヤギ抗ラットＩｇＧ２ｂ抗体ＨＲＰ複合体（Ｂｅｔｈｙｌ＃Ａ１１０－１１１Ｐ）の混合物を、ブロッキング緩衝液（２５μｌ／ウェル）中の各抗体の１：１００００希釈で使用した。ＲＴで１時間インキュベートし、９０μｌ／ウェルのＰＢＳＴを使用して３回のさらなる洗浄工程を行った後、２５μｌ／ウェルのＴＭＢ基質を１０分間添加し（Ｒｏｃｈｅ注文番号１１８３５０３３００１）、３７０ｎｍ／４９２ｎｍでの測定によって最終ＯＤへの発色を決定した。
試験した全ての抗体は、ｐＭ範囲のＥＣ５０値（結合活性を反映する）でヒトＧＰＲＣ５Ｄへの正の結合を示した。ラットＩｇＧ １０Ｂ１０及び０７Ａ０４のみが、カニクイザルＧＰＲＣ５Ｄを発現するＣＨＯ細胞に対して、ヒト型の受容体に匹敵するＥＣ５０値で交差反応性を示した（図９）。カニクイザル交差反応性は、他の全ての抗体についても検出されたが、１０Ｂ１０及び０７Ａ０４と比較してより低いレベルであった（図９）。マウスＧＰＲＣ５Ｄを発現するＣＨＯ細胞への有意な結合は検出されず、ＧＰＲＣ５Ａのヒト型を発現するＣＨＯ細胞への結合は検出されなかった（図９）。結合のＥＣ５０値を表２に要約する。
Figure 2022543551000014
実施例８
ＧＰＲＣ５Ｄ結合剤：組換えＧＰＲＣ５Ｄ－ＴＣＢは、ＭＭ細胞株に対するＴ細胞細胞傷害性を媒介する
ＧＰＲＣ５Ｄ－ＴＣＢ又は他の標的化ＴＣＢの機能性を比較するために、本発明者らは、複数のＭＭ細胞株に対してインビトロＴ細胞細胞傷害性アッセイを行った：ＭＯＬＰ－２（図１０Ｂ）、ＡＭＯ－１（図１０Ｃ）、ＥＪＭ（図１０Ｄ）及びＮＣＩ－Ｈ９２９（図１０Ｇ）。簡潔には、細胞株を、２０％熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；Ｇｉｂｃｏ）及び１％ペニシリン－ストレプトマイシン１００Ｘ（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＲＰＭＩ １６４０＋Ｇｌｕｔａｍａｘ培地（ＰＳ；Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。ＧｌｕｔａＭａｘ １Ｘ（Ｇｉｂｃｏ）を添加したこの培地でＭＯＬＰ－２を培養した。ＯＰＭ－２（図１０Ａ）、ＲＰＭＩ－８２２６（図１０Ｅ）及びＬ－３６３（図１０Ｆ）細胞株を、１０％ＦＢＳのみを補充したこの培地で培養した。ＮＣＩ－Ｈ９２９を、５０μＭメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）及びＧｌｕｔａＭａｘ １Ｘ（Ｇｉｂｃｏ）を補充したこの培地で培養した。ＥＪＭをＩＭＤＭ（Ｇｉｂｃｏ）＋１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）及び１％ＰＳ（Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。全ての細胞株を７５ｃｍ２フラスコ（ＴＰＰ）中で週に２回継代して培養した。
細胞株を、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）＋１％ＰＳ（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ）中ヒトＰａｎ Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用してＰＢＭＣ（Ｂｌｕｔｓｐｅｎｄｅ Ｓｃｈｌｉｅｒｅｎ製のＢｕｆｆｙコート）から単離した３０万個の同種異系Ｔ細胞を使用して、１０対１のエフェクタ対標的比で共培養した。抗ヒトＧＰＲＣ５Ｄ ＴＣＢ構築物（５Ｅ１１－ＴＣＢ、５Ｆ１１－ＴＣＢ、１０Ｂ１０－ＴＣＢ、Ｂ７２－ＴＣＢ、ＢＣＭＡ－ＴＣＢ及びＤＰ４７－ＴＣＢ）を、段階希釈１／１０で１２．５ｎＭ～０．００００１２５ｎＭの異なる濃度で共培養物に添加し、未処理試料と比較した。５％ＣＯ２を含む３７℃での２０時間のインキュベーションの後、ウェルあたり７５μｌの上清を、ウェルあたり２５μｌのＣｙｔｏＴｏｘ－Ｇｌｏ細胞毒性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を含む９６ウェル白色プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ－ｏｎｅ）に移した。室温で１５分間インキュベートした後、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＥｎＶｉｓｉｏｎでルミネセンス取得を行い、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ及びＸＬフィット・ソフトウェアを使用して分析した。データをＬＤＨ放出の発光シグナルとしてプロットした（図１０）。図１０Ａ～Ｇは、５Ｅ１１－ＴＣＢ及び５Ｆ１１－ＴＣＢの両方が、ＭＭ細胞株に対して、ＢＣＭＡ－ＴＣＢ、１０Ｂ１０－ＴＣＢ及びＢ７２－ＴＣＢよりも強いＴ細胞傷害性を媒介したことを示すデータをまとめたものである。ＴＣＢ媒介死滅化のＥＣ５０を表３に示し、異なるドナーＴ細胞を用いた異なる実験からの平均として計算する（ｎ＝２又はｎ＝３）。
Figure 2022543551000015
実施例９
健康なヒト骨髄細胞におけるインビトロＴ細胞活性化
４人の異なる健常ドナー（Ｌｏｎｚａ＃１Ｍ－１０５、ロット００００７３９２５４；００００７３９２５５；００００７３９２５６及び００００７３４００８）の新鮮な未処理骨髄を、サンプリングの１又は２日後に処理した。室温で５分間、ＢＤ Ｐｈａｒｍ Ｌｙｓｉｓ緩衝液（ＢＤ＃５５５８９９；滅菌水中で１Ｘ）を用いた迅速な赤血球溶解後；細胞を遠心分離によって２回洗浄し、それぞれ１２６ｇ及び４４３ｇで緩衝液交換した。細胞を計数し、ＲＰＭＩ １６４０ Ｇｌｕｔａｍａｘ＋２０％ ＨＩウシ胎児血清＋２％ヒト血清＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン（全てＧｉｂｃｏ製）中３００ ０００細胞／ｍＬで再懸濁し、１００μＬの細胞懸濁液を９６ウェルプレート丸底（ＴＰＰ）にウェルあたり播種した。５０μＬの培地又は２００ｎＭ（４Ｘ）から２０ｐＭまでのＢ７２－ＴＣＢ、５Ｆ１１－ＴＣＢ、５Ｅ１１－ＴＣＢ、ＢＣＭＡ－ＴＣＢ、１０Ｂ１０－ＴＣＢ若しくはＤＰ４７－ＴＣＢを１／１０段階希釈で補充した培地をウェルあたり添加した。最後に、健常ドナーＰＢＭＣからＰａｎ Ｔ細胞（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，＃１３０－０９６－５３５）を使用して単離された５０μＬの同種異系Ｔ細胞を６ Ｍｉｏ／ｍＬ（エフェクタＴ対健康な骨髄標的細胞の比１０：１）で添加した。加湿インキュベーター内で３７℃で一晩インキュベートした後、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、ＰＢＳ中、１／８００希釈した５０μＬのＬｉｖｅ ｂｌｕｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃Ｌ２３１０５）で４℃で２０分間染色した。洗浄後、細胞を、ＦＡＣ緩衝液（ＰＢＳ １Ｘ、２％ウシ胎仔血清；１％０．５ｍ ＥＤＴＡ ＰＨ ８；０．２５％ＮａＮ３アジ化ナトリウム（２０％））で希釈した抗体の以下の混合物と共に４℃で３０分間インキュベートした：ＣＤ２５ ＢＶ６０５、ＣＤ６９ ＡＰＣ－Ｃｙ７、ＢＣＭＡ ＢＶ４２１、ＣＤ３８ ＢＶ５１０、ＣＤ１３８ ＦＩＴＣ、ＦｃＲＨ５ ＰＥ希釈１／１００及びＣＤ８ ＢＶ７１１、ＣＤ３ ＰＥ－Ｃｙ５及びＣＤ４ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ７００希釈１／３００（全てＢｉｏＬｅｇｅｎｄ製）及びＧＰＲＣ５Ｄ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６４７（社内、クローン５Ｅ１１ ＩｇＧ）。洗浄後、細胞を１００μＬのＦＡＣ緩衝液に再懸濁し、Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で取得した。
図１１Ａ～Ｆに示されるデータは、Ｂ７２－ＴＣＢが健康な骨髄においてＴ細胞の非特異的活性化（ＣＤ６９の上方制御によって測定される）を誘導したが、他の試験されたＴＣＢのいずれによっても誘導しなかったことを示す。示されるように、Ｂ７２－ＴＣＢによって誘導される非特異的活性化は濃度依存的効果であり、５ｎｍよりも５０ｎｍでより顕著であった（図１２Ａ及び図１２Ｂ）。
実施例１０
ＴＣＢのインビボ有効性
有効性試験では、異なるＴＣＢ構築物（ＧＰＲＣ５Ｄ ５Ｆ１１０－ＴＣＢ、５Ｅ１１－ＴＣＢ、ＢＣＭＡ－ＴＣＢ及びＢ７２－ＴＣＢ）を、多発性骨髄腫を有する完全ヒト化ＮＳＧマウスにおける腫瘍退縮に関して比較した。ＮＣＩ－Ｈ９２９細胞は最初にＡＴＣＣから得られ、ＯＰＭ－２細胞はＤＳＭＺから得られた。両方の細胞株を増殖させた。細胞を、１０％のＦＣＳ及び２ｍＭのＬ－グルタミン、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを含有するＲＰＭＩ中で培養した。５％ＣＯ２で、水飽和した雰囲気中、３７℃で細胞を培養した。動物あたり２．５×１０６個のＮＣＩ－Ｈ９２９及び５×１０６個のＯＰＭ－２細胞を、ＲＰＭＩ細胞培養培地（Ｇｉｂｃｏ）及びＧＦＲマトリゲル（１：１、総体積１００μｌ）中で動物の右側腹部に９５．０％超の生存率で皮下注射した。
実験開始時に４～５週齢の雌ＮＳＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）マウス（フランス、リヨンのＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒで飼育）を、特定の病原体のいない条件に維持し、１日のサイクルは、関連するガイドライン（ＧＶ－Ｓｏｌａｓ；Ｆｅｌａｓａ；ＴｉｅｒｓｃｈＧ）に従って、１２時間明状態／１２時間暗状態であった。この実験研究プロトコルは、地方政府によってまとめられ、承認された（ＲＯＢ－５５．２－２５３２．Ｖｅｔ＿０３－１６－１０）。到着した後、動物を、新しい環境に慣れさせ、観察するために１週間維持した。継続的な健康モニタリングは、定期的に行われた。
プロトコルに従って、雌ＮＳＧマウスに１５ｍｇ／ｋｇのブスルファンをｉ．ｐ．（腹腔内）注射し、１日後、臍帯血から単離した１ｘ１０５のヒト造血幹細胞を静脈注射した。幹細胞注入から１６～２０週後、マウスを出血させ、首尾良いヒト化のために、血液をフローサイトメトリによって分析した。効率的に移植されたマウスを、そのヒトＴ細胞の頻度に従って、異なる治療群（ｎ＝１０／群）に無作為に分けた。その時点で、マウスに腫瘍細胞を上記のように皮下注射し、腫瘍サイズが約２００ｍｍ３に達したときに化合物又はＰＢＳ（ビヒクル）で週に１回治療した。全てのマウスに、異なる用量のＴＣＢ分子を静脈内注射した（図１３Ａ～Ｄ及び図１４Ａ～Ｄを参照のこと）。
適切な量の化合物を得るために、ストック溶液をヒスチジン緩衝液（２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０）で希釈した。ノギスを用いて腫瘍増殖を週２回測定し、腫瘍体積を以下のように計算した：
Ｔｖ：（Ｗ２／２）×Ｌ（Ｗ：幅、Ｌ：長さ）
試験を終了し、化合物の４回の注射後に全てのマウスを屠殺し、腫瘍を外植し、秤量した。
図１３Ａ～Ｄは、ＮＣｌ－Ｈ９２９注射を受けた全ての動物における、治療後の腫瘍成長速度論を示す。５Ｆ１１－ＴＣＢは、１ｍｇ／ｋｇ又は０．１ｍｇ／ｋｇのいずれかで全ての動物において完全な腫瘍寛解を誘導したが（図１３Ａ）、Ｂ７２－ＴＣＢは、１ｍｇ／ｋｇで使用した場合にのみ部分的な腫瘍寛解を誘導し、０．１ｍｇ／ｋｇでは効果がなかった（図１３Ｃ）。ＢＣＭＡ－ＴＣＢはまた、１ｍｇ／ｋｇで部分的な腫瘍寛解を誘導した（図１３Ｂ）。
図１４Ａ～Ｄは、ＯＰＭ－２注射を受けた全ての動物における、治療後の腫瘍成長速度論を示す。５Ｆ１１－ＴＣＢ（図１４Ａ、上部パネル）及び５Ｅ１１－ＴＣＢ（図１４Ｂ、上部パネル）は、０．１ｍｇ／ｋｇで大部分の動物において完全な腫瘍寛解を誘導したが、０．１ｍｇ／ｋｇのＢ７２－ＴＣＢ（図１４Ｃ、上部パネル）は、腫瘍成長の制御においてそれほど強力ではなかった。０．０１ｍｇ／ｋｇにおいて、５Ｆ１１－ＴＣＢ（図１４Ａ、底部パネル）及び５Ｅ１１－ＴＣＢ（図１４Ｂ、底部パネル）は、Ｂ７２－ＴＣＢ（図１４Ｃ、底部パネル）と比較して、腫瘍成長の阻害においてより強力であった。
実施例１１
抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体のヒト化
適切なヒトアクセプターフレームワークは、ヒトＶ及びＪ領域配列のＢＬＡＳＴｐデータベースにマウス入力配列（可変部分に植え付けられた）を照会することによって特定された。ヒトアクセプターフレームワークを選択するための選択基準は、配列相同性、同じ又は類似のＣＤＲ長、及びヒト生殖系列の推定頻度だったが、ＶＨ－ＶＬドメインインターフェースでの特定のアミノ酸の保存でもあった。生殖系列の同定ステップに続いて、マウス入力配列のＣＤＲをヒトアクセプターフレームワーク領域に移植した。これらの最初のＣＤＲ移植片と親抗体の間の各アミノ酸の違いは、それぞれの可変領域の構造的完全性への影響の可能性について評価され、親配列に対する「逆突然変異」が適切と思われる場合はいつでも導入された。構造評価は、ＢＩＯＶＩＡ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ、バージョン１７Ｒ２を使用して実装した、社内で抗体構造相同性モデリングプロトコルにより作製し、親抗体とヒト化バリアントの両方のＦｖ領域相同性モデルに基づいた。いくつかのヒト化バリアントには、「順突然変異」、すなわち、親バインダの所与のＣＤＲ位置で発生する元のアミノ酸をヒトアクセプター生殖系列の同等の位置で見られるアミノ酸に変更するアミノ酸交換が含まれていた。目的は、免疫原性のリスクを更に低減するために、（フレームワーク領域を超えて）ヒト化バリアントの全体的な人間性を高めることである。
社内で開発されたｉｎ ｓｉｌｉｃｏツールを使用して、対になったＶＨ及びＶＬヒト化バリアントのＶＨ－ＶＬドメイン配向を予測した（その全体が参照により組み込まれる国際公開第２０１６／０６２７３４号Ａ１）。結果を親結合剤の予測されたＶＨ－ＶＬドメイン配向と比較して、元の抗体に形状が近いフレームワークの組合せを選択した。理論的根拠は、結合特性に悪影響を与える可能性がある２つのドメインの対合に破壊的な変化をもたらす可能性のあるＶＨ－ＶＬインターフェース領域でのアミノ酸交換の可能性を検出することである。
ＧＰＲＣ５Ｄ結合剤５Ｅ１１についてのアクセプターフレームワークの選択及びその適合
アクセプターフレームワークは、以下の表４に従って選択した。
Figure 2022543551000016
ポストＣＤＲ３フレームワーク領域は、ヒトＩＧＨＪ生殖系列ＩＧＨＪ３＊０２（ＤＡＦＤＩＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ）及びヒトＩＧＫＪ生殖系列ＩＧＫＪ５＊０１（ＩＴＦＧＱＧＴＲＬＥＩＫ）から適合された。アクセプターフレームワークに関連する部分は太字で示されている。
構造的考察に基づいて、ヒトアクセプターフレームワークから親結合剤中のアミノ酸への逆突然変異を５Ｅ１１ヒト化バリアントの特定の位置に導入した（表５及び６）。さらに、いくつかの位置は、親結合剤のＣＤＲ中のアミノ酸がヒトアクセプター生殖系列に見られるアミノ酸で置換されている、順突然変異の有望な候補として同定された。変更の詳細を以下の表に示す。
注：逆突然変異の前にはｂが付いており、順突然変異にはｆが付いている。例えば、ｂＳ４９Ａは、４９位においてセリンからアラニンへの逆突然変異（ヒト生殖系列アミノ酸から親抗体アミノ酸）を指す。全ての残基インデックスをＫａｂａｔナンバリングで示す。
Figure 2022543551000017
Figure 2022543551000018
ＧＰＲＣ５Ｄ結合剤５Ｆ１１についてのアクセプターフレームワークの選択及びその適合
アクセプターフレームワークは、以下の表７に従って選択した。
Figure 2022543551000019
ポストＣＤＲ３フレームワーク領域は、ヒトＩＧＨＪ生殖系列ＩＧＨＪ３＊０２（ＤＡＦＤＩＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ）及びヒトＩＧＫＪ生殖系列ＩＧＫＪ２＊０１（ＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ）から適合された。アクセプターフレームワークに関連する部分は太字で示されている。
構造的考察に基づいて、ヒトアクセプターフレームワークから親結合剤中のアミノ酸への逆突然変異を５Ｆ１１ヒト化バリアントの特定の位置に導入した（表８及び９）。さらに、いくつかの位置は、親結合剤のＣＤＲ中のアミノ酸がヒトアクセプター生殖系列に見られるアミノ酸で置換されている、順突然変異の有望な候補として同定された。変更の詳細を以下の表に示す。
注：逆突然変異の前にはｂが付いており、順突然変異にはｆが付いている。例えば、ｂＡ９３Ｔは、９３位においてアラニンからトレオニンへの逆突然変異（ヒト生殖系列アミノ酸から親抗体アミノ酸）を指す。全ての残基インデックスをＫａｂａｔナンバリングで示す。
Figure 2022543551000020
Figure 2022543551000021
ＥＬＩＳＡによるヒト化バリアントの特徴付け
ＧＰＲＣ５Ｄ結合剤のＶＨドメイン及びＶＬドメインのヒト化バリアントの特徴付けのために、上記のＥＬＩＳＡプロトコルを使用した（実施例７参照）。データを、５Ｅ１１のヒト化バリアントについては表１０に、５Ｆ１１のヒト化バリアントについては表１１に要約する。表１２は、親５Ｅ１１及び親５Ｅ１１並びに選択されたヒト化バリアントのＣＤＲ配列を示す。
Figure 2022543551000022
Figure 2022543551000023
Figure 2022543551000024
Figure 2022543551000025
Figure 2022543551000026
Figure 2022543551000027
Figure 2022543551000028
実施例１２
選択された抗ＧＰＲＣ５Ｄ ＩｇＧの異なるヒト化バリアントの存在下でのＣＡＲ－Ｊ細胞のインビトロ活性化
異なるヒト化抗ＧＰＲＣ５Ｄ ＩｇＧのＰＧＬＡＬＡ－ＣＡＲ－Ｊエフェクタ細胞活性化能を、以下に記載のように評価した。ＧＰＲＣ５Ｄ発現多発性骨髄腫標的細胞Ｌ３６３（Ｄｉｅｈｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｕｔ ３６：３３１－３３８（１９７８））を、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＥＰ２０１８／０８６０３８及びＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＥＰ２０１８／０８６０６７に開示されているように、ＩｇＧ分子のＦｃ部分にＰＧＬＡＬＡ（Ｐ３２９Ｇ Ｌ２３４Ａ Ｌ２３５Ａ）突然変異に対するＴＣＲを発現し、ＮＦＡＴプロモーターを含有する抗ＰＧＬＡＬＡ－ＣＡＲ－Ｊエフェクタ細胞（Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴヒト急性リンパ性白血病レポーター細胞株）と共培養した。ＩｇＧ分子がＬ３６３細胞及びＰＧＬＡＬＡ－ＣＡＲ－Ｊ細胞上のＧＰＲＣ５Ｄに同時に結合すると、ＮＦＡＴプロモーターが活性化され、活性ホタルルシフェラーゼの発現をもたらす。
アッセイのために、ヒト化ＩｇＧバリアントをＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｌｕｔａｍａｘ、１５％ ＨＩウシ胎仔血清、１％ペニシリン－ストレプトマイシン含有；全てＧＩＢＣＯ製）中に希釈し、丸底９６ウェルプレートに移した（１０μｇ／ｍｌ～０．２ ｐｇ／ｍｌの最終濃度範囲）。ウェルあたり２０ ０００個のＬ３６３細胞及び抗ＰＧＬＡＬＡ－ＣＡＲ－Ｊエフェクタ細胞を添加して、５：１の最終エフェクタ（抗ＰＧＬＡＬＡ－ＣＡＲ－Ｊ）対標的（Ｌ３６３）細胞比及びウェルあたり２００μｌの最終体積を得た。細胞を、加湿したインキュベーター内において３７℃で約１６時間インキュベートした。インキュベーション時間の終わりに、１００μｌ／ウェルの上清を白色平底９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）に移し、別の１００μｌ／ウェルのＯＮＥ－Ｇｌｏルシフェラーゼ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共に５分間インキュベートした後、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｅｎｖｉｓｉｏｎを使用して発光を読み取った。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用してＩｇＧ濃度に対する相対発光シグナル（ＲＬＵ）として生データをプロットし、ＸＬ－フィット・ソフトウェアを使用してＥＣ５０を計算した。
図１５Ａ～Ｂ及び表１３に示されるように、評価された全てのＧＰＲＣ５Ｄ ＩｇＧは、ＧＰＲＣ５Ｄ発現標的細胞及び抗ＰＧＬＡＬＡ－ＣＡＲ－Ｊ細胞への同時結合時にＣＡＲ－Ｊ活性化を誘導する。抗ＧＰＲＣ５Ｄ結合剤５Ｆ１１及び５Ｅ１１の両方について、ヒト化前の親抗体と比較して、類似又はさらに改善されたＥＣ５０値でヒト化バリアントを同定することができた。結合剤５Ｆ１１については、分子Ｐ１ＡＥ５７４１によって最も強い活性化を誘導することができた（図１５Ａ）。結合剤５Ｅ１１については、分子Ｐ１ＡＥ５７３０及びＰ１ＡＥ５７２３によって最も強い活性化を誘導することができた（図１５Ｂ）。
Figure 2022543551000029
実施例１３
糖鎖工学ＩｇＧのクローニング及び産生
対応するｃＤＮＡを、従来の（非ＰＣＲ系）クローニング技術を用いてＥｖｉｔｒｉａのベクター系にクローニングした。ｅｖｉｔｒｉａベクタープラスミドを遺伝子合成した。プラスミドＤＮＡを、陰イオン交換クロマトグラフィに基づく低エンドトキシン条件下で調製した。ＤＮＡ濃度は、波長２６０ ｎｍでの吸収を測定することによって決定した。配列の正確さは、サンガーシーケンシング（ｃＤＮＡのサイズに応じてプラスミドあたり最大２つのシーケンシング反応）で検証した。懸濁液適合ＣＨＯ Ｋ１細胞（元々はＡＴＣＣから受け取り、Ｅｖｉｔｒｉａにおいて懸濁培養での無血清増殖に適合させた）を産生に使用した。種子を、化学的に定義された動物成分を含まない無血清培地であるｅｖｉＧｒｏｗ培地中で成長させた。細胞をｅｖｉＦｅｃｔ（ｅｖｉｔｒｉａの特注の独自のトランスフェクション試薬）でトランスフェクトし、トランスフェクション後、動物成分を含まない無血清培地であるｅｖｉＭａｋｅ２で細胞を増殖させた。Ｍａｎ ＩＩ及びＧＮＴｉｉｉに対応する重鎖、軽鎖及び２つのプラスミドのプラスミド比は９：９：１：１（ＧｌｙｃｏＭａｂ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）であった。遠心分離、及びその後フィルタにかける（０．２μｍフィルタ）ことにより上清を回収した。５Ｅ１１ｇ２（配列番号９８及び９９）及び５Ｆ１１ｇ２（配列番号１００及び１０１）を作製した。
抗体を、洗浄緩衝液としてダルベッコＰＢＳ（Ｌｏｎｚａ ＢＥ１７－５１２Ｑ）、溶出緩衝液として０．１ＭグリシンｐＨ３．５及び中和緩衝液として１ＭトリスＨＣｌ（ｐＨ９）を用いて、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ＳｕＲｅ（商標）を使用して精製した。その後のサイズ排除クロマトグラフィを、最終緩衝液をランニング緩衝液として使用してＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇカラムで行った。透析（必要な場合）は、２Ｋ分子量カットオフでＰｉｅｒｃｅ Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ（商標）Ｇ２ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｃａｓｓｅｔｔｅｓを用いて行った。抗体濃度（必要な場合）は、３０ｋＤ分子量カットオフでＡｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒを用いて行った。
濃度は、波長２８０ｎｍでの吸収を測定することによって決定した。吸光係数は、ｅｖｉｔｒｉａでの独自のアルゴリズムを使用して計算した。純度は、Ａｇｉｌｅｎｔ ＡｄｖａｎｃｅＢｉｏ ＳＥＣカラム（３００Ａ ２．７ｕｍ ７．８×３００ｍｍ）及びランニング緩衝液としてＤＰＢＳを０．８ｍｌ／分で用いた分析用サイズ排除クロマトグラフィによって決定した。内毒素
含有量を、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｅｎｄｏｓａｆｅ ＰＴＳシステムを用いて測定した。
糖鎖工学抗体の脱フコシル化度を以下のように決定した。２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０中、０．００５ＵのＰＮＧａｓｅ Ｆ（ＱＡｂｉｏ、米国）及びＥｎｄｏＨ（ＱＡｂｉｏ、米国）と、３７℃で１６時間インキュベートすることによって、Ｎ結合型オリゴ糖を精製ＩｇＧから切断した。これにより遊離オリゴ糖が得られ、これをＰａｐａｃら（Ｄ．Ｉ．Ｐａｐａｃ，Ａ．Ｗｏｎｇ，Ａ．Ｊ．Ｊｏｎｅｓ，Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｃｉｄｉｃ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ａｎｄ ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅｓ ｂｙ ｍａｔｒｉｘ－ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ－ｏｆ－ｆｌｉｇｈｔ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６８（１９９６）３２１５－３２２３）に従って正イオンモードで質量分析（Ａｕｔｏｆｌｅｘ、Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ ＧｍｂＨ）によって分析した。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ法は、精製されたＩｇＧ抗体の非フコース含有量の測定に使用されている。糖鎖工学抗体の許容され得るカットオフは、一般に５０％に設定され、すなわち、少なくとも５０％のフコシル化を有する抗体は、許容され得る糖鎖が改変されたＩｇＧ抗体であると考えられる。両方の抗体は、少なくとも５０％のフコシル化含有量を有するという閾値を満たした。５Ｅ１１ｇ２の脱フコシル化度は５９．１％であると決定された。５Ｆ１１ｇ２の脱フコシル化度は５０．０％であると決定された。
実施例１４
ＧＰＲＣ５Ｄ ＩｇＧの多発性骨髄腫細胞株への結合
ＧＰＲＣ５Ｄへの結合を測定するために、本発明者らは、報告された多発性骨髄腫細胞株（Ｌｏｍｂａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｂｙ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ ｇｅｎｏｍｉｃｓ：ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ｄｉｓｅａｓｅ；Ｇｅｎｅｓ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ Ｃａｎｃｅｒ．２００７ Ｍａｒ；４６（３）：２２６－３８．）に対してフローサイトメトリに基づく結合アッセイを行った。細胞株ＮＣＩ－Ｈ９２９（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－９０６８）を、１０％ＦＢＳ、１×ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）、１×ピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）及び５０μＭのβ－メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＧｌｕｔａｍａｘ培地（Ｇｉｂｃｏ）を含むＲＰＭＩ １６４０中で培養した。
９６丸底ウェルプレートのウェルあたり０．１ Ｍｉｏ細胞を、１５０ｎＭ～１５ｆＭ（１：１０の連続希釈）の示されたＧＰＲＣ５Ｄ ＩｇＧ構築物５Ｅ１１ｇ２及び５Ｆ１１ｇ２と共に、又は構築物なしで、４℃で３０分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、２％ウシ胎児血清；１％０．５ｍ ＥＤＴＡ ｐＨ８；０．２５％ ＮａＮ３アジ化ナトリウム（２０％））で２回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液中に１／１００希釈したＰＥコンジュゲート化ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ断片特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，１０９－６０６－００８）を用いて４℃でさらに３０分間染色した。２回の最終洗浄工程の後、特注のＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｆｏｒｔｅｓｓａでフローサイトメトリ取得を行い、ＢＤ Ｄｉｖａを用いて分析した。ＥＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して計算した。
図１６は、両方のＩｇＧが濃度依存的にヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合し、５Ｆ１１ｇ２が５Ｅ１１ｇ２よりも有意に強い結合を示すことを示す。評価した濃度範囲では、いずれの抗体も飽和に達しない。
Figure 2022543551000030
実施例１５
異なるＧＰＲＣ５Ｄ ＩｇＧによって媒介されるＡＤＣＣ
例えばＮＫ細胞による腫瘍標的の抗体媒介性腫瘍細胞溶解を試験するために、ＧＰＲＣ５Ｄ ＩｇＧの糖鎖工学バージョンを以下のＰＢＭＣ共培養アッセイで試験した。アッセイの原理は以下の通りである：
ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞の表面上のＦｃγＲＩＩＩ受容体への抗体のＦｃ部分の結合と、腫瘍標的（この場合、ＡＭＯ－１又はＮＣＩ－Ｈ９２９細胞上で発現されるＧＰＲＣ５Ｄ）への抗体の抗原標的化部分の結合とを同時に行うことによって架橋される。架橋すると、ＮＫ細胞が活性化されて脱顆粒し、分泌されたグランザイム、パーフォリン及びプロテアーゼによる付着した腫瘍標的細胞の溶解をもたらす。
簡潔には、標準的なヒストパック密度勾配によって健常ドナーの新鮮血液からヒトＰＢＭＣを単離し、ＡＩＭ Ｖ培地に再懸濁し、９６丸底ウェルプレートのウェルあたり０．７５ Ｍｉｏ細胞を播種した。標的懸濁細胞を回収して添加し、２５：１の最終ＰＢＭＣエフェクタ対腫瘍標的比を得た。５Ｅ１１ｇ２それぞれの５Ｆ１１ｇ２ ＩｇＧを５０ｎＭ～０．０５ｐＭの最終濃度範囲で添加した。最大細胞溶解を決定するための陽性参照として、ＡＩＭ－Ｖ培地中の４％のトリトン－ｘを添加して、１％のトリトン－ｘ－１００の最終濃度を得た。陰性参照として、ＰＢＭＣエフェクタ及び腫瘍標的細胞を抗体なしでインキュベートした。加湿インキュベーター中３７℃で４時間インキュベートした後、ＬＤＨ細胞毒性アッセイキット（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、製造者の提案に従ってＬＤＨを定量した。
陽性（ＭＲ、最大放出）及び陰性（ＳＲ、自然放出）の参照値並びに以下の式を参照して、細胞溶解の割合を決定した：％ａｂ依存性の死滅化＝（（平均Ｖｍａｘサンプル－平均Ｖｍａｘ自発放出）／（平均Ｖｍａｘ最大放出－平均Ｖｍａｘ自発放出））＊１００。偏差は、以下の式に基づいて計算した：％偏差＝（ＡＢＳ（１／（平均ＭＲ－ＳＲ）＊ＳＱＲＴ（（平均サンプル－平均ＭＲ）＾２／（平均ＭＲ－ＳＲ）＾２＊標準偏差ＳＲ＾２＋標準偏差サンプル＾２＋（平均サンプル－平均ＳＲ）＾２／平均ＭＲ＾２＊標準偏差ＭＲ＾２）））＊１００。図Ｘは、ＳＤとともに、技術的な三連に基づく溶解のパーセントを示す。ＥＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍによって計算した。
両分子は濃度依存的様式で効率的な腫瘍細胞溶解を誘導し、５Ｆ１１ｇ２がより強力な分子である（図１７Ａ及び図１７Ｂ、並びに表１５を参照）。
Figure 2022543551000031
上述の発明を、理解を明確にする目的で、説明及び実施例によって、ある程度詳細に説明してきたが、説明及び実施例は、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。本明細書に引用される全ての特許及び科学文献の開示は、参照によりその全体が明示的に組み込まれる。

Claims (30)

  1. ＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体であって、
    （Ａ）（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、並びに（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｅ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；又は
    （Ｂ）（ａ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、並びに（ｄ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｅ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｆ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）
    を含む、抗体。
  2. （Ａ）（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、並びに（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｅ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；又は
    （Ｂ）（ａ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、並びに（ｄ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｅ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｆ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）
    を含む、請求項１に記載の抗体。
  3. ＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体断片である、請求項１又は２に記載の抗体。
  4. （Ａ）配列番号１３の重鎖可変ドメインフレームワーク配列及び／又は配列番号１４の軽鎖可変ドメインフレームワーク配列；又は
    （Ｂ）配列番号１５の重鎖可変ドメインフレームワーク配列及び／又は配列番号１６の軽鎖可変ドメインフレームワーク配列
    をさらに含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の抗体。
  5. （ａ）配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨ配列、（ｂ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬ配列、及び（ｃ）（ａ）に定義されるＶＨ配列及び（ｂ）に定義されるＶＬ配列からなる群より選択される配列を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の抗体。
  6. （ａ）配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨ配列、（ｂ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬ配列、及び（ｃ）（ａ）に定義されるＶＨ配列及び（ｂ）に定義されるＶＬ配列からなる群より選択される配列を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の抗体。
  7. 配列番号１３のＶＨ配列及び配列番号１４のＶＬ配列を含むか、又は配列番号１５のＶＨ配列及び配列番号１６のＶＬ配列を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の抗体。
  8. 配列番号１３のＶＨ配列及び配列番号１４のＶＬ配列を含むか、又は配列番号１５のＶＨ配列及び配列番号１６のＶＬ配列を含む、ＧＰＲＣ５Ｄに特異的に結合する、抗体。
  9. 前記抗体がＩｇＧ抗体である、請求項１から８のいずれか一項に記載の抗体。
  10. 前記抗体がＩｇＧ１抗体である、請求項９に記載の抗体。
  11. 前記抗体が完全長抗体である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の抗体。
  12. 前記抗体が多重特異性抗体である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の抗体。
  13. 配列番号９８の軽鎖及び配列番号９９の重鎖を含むか、又は配列番号１００の軽鎖及び配列番号１０１の重鎖を含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の抗体。
  14. 請求項１から１３のいずれか一項に記載の抗体及び細胞傷害性薬剤を含む、イムノコンジュゲート。
  15. 請求項１から１４のいずれか一項に記載の抗体又はイムノコンジュゲートをコードする、１又は複数の単離された核酸。
  16. 請求項１５に記載の１又は複数の核酸を含む宿主細胞。
  17. ＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又はイムノコンジュゲートを産生する方法であって、請求項１６に記載の宿主細胞を、前記抗体の発現に適した条件下で培養することを含む、方法。
  18. 前記抗体又はイムノコンジュゲートを前記宿主細胞から回収することをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
  19. 請求項１８に記載の方法によって産生される、抗体又はイムノコンジュゲート。
  20. 請求項１から１４、又は１９のいずれか一項に記載の抗体又はイムノコンジュゲートと、薬学的に許容され得る担体とを含む、医薬組成物。
  21. 追加の治療剤をさらに含む、請求項２０に記載の医薬組成物。
  22. 医薬としての使用のための、請求項１から１４、若しくは１９のいずれか一項に記載の抗体又は請求項２０若しくは２１に記載の医薬組成物。
  23. 疾患の治療における使用のための、請求項１から１４、若しくは１９のいずれか一項に記載の抗体又は請求項２０若しくは２１に記載の医薬組成物。
  24. 疾患の治療における使用のための、請求項１から１４、若しくは１９のいずれか一項に記載の抗体又は請求項２０若しくは２１に記載の医薬組成物であって、前記疾患ががん又は自己免疫疾患である、抗体又は医薬組成物。
  25. がんの治療における使用のための、請求項１から１４、若しくは１９のいずれか一項に記載の抗体又は請求項２０若しくは２１に記載の医薬組成物であって、前記がんが多発性骨髄腫である、抗体又は医薬組成物。
  26. 疾患、特にがん又は自己免疫疾患の治療のための医薬の製造における、請求項１から１４のいずれか一項に記載の抗体若しくはイムノコンジュゲート又は請求項２０若しくは２１に記載の医薬組成物の使用。
  27. ＧＰＲＣ５Ｄ陽性細胞のＡＤＣＣ／ＡＤＣＰ媒介性枯渇を誘導するための医薬の製造における、請求項１から１４のいずれか一項に記載の抗体若しくはイムノコンジュゲート又は請求項２０若しくは２１に記載の医薬組成物の使用。
  28. がん又は自己免疫疾患を有する個体を治療する方法であって、前記個体に、有効量の請求項１から１４のいずれか一項に記載の抗体若しくはイムノコンジュゲート又は請求項２０若しくは２１に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
  29. 個体におけるＧＰＲＣ５Ｄ陽性細胞のＡＤＣＣ／ＡＤＣＰ媒介性枯渇の方法であって、前記個体に、有効量の請求項１から１４のいずれか一項に記載の抗体若しくはイムノコンジュゲート又は請求項２０若しくは２１に記載の医薬組成物を投与して、ＧＰＲＣ５Ｄ陽性細胞のＡＤＣＣ／ＡＤＣＰ媒介性枯渇を誘導することを含む、方法。
  30. 本明細書に記載の発明。
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