CN107709364A - 具有激动剂活性的抗原结合复合体及使用方法 - Google Patents

具有激动剂活性的抗原结合复合体及使用方法 Download PDF

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Abstract

本文中提供具有激动剂活性的抗原结合多肽及其复合体。还提供用于筛选具有激动剂活性的复合体或多肽、增强多肽的激动剂活性和使用本文所述的复合体和多肽激动细胞表面受体的方法。

Description

具有激动剂活性的抗原结合复合体及使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2015年4月7日提交的美国临时申请系列号62/144,237；2015年8月19日提交的美国临时申请系列号62/207,315和2015年12月23日提交的美国临时申请系列号62/387,485的优先权益；所述文献的每一篇通过引用方式完整地并入本文。
序列表
ASCII文本文件上以下提交的内容通过引用方式完整并入本文：序列表的计算机可读取形式(CRF)(文件名称：146392033540SEQLIST.txt、记录日期：2016年4月6日，大小：187KB)。
发明领域
本发明涉及具有激动剂活性的抗原结合复合体及使用其的方法。
背景
功能性抗体是治疗多种类型疾病的重要治疗选项。本领域需要从候选分子的库中鉴定功能性抗体、尤其具有激动活性的抗体的更好手段。本发明涉及这种需求和其他需求。
概述
本发明提供具有激动剂活性的抗原结合多肽和复合体及使用其的方法。
在一个方面，本申请提供一种包含六个亚单位的具有激动剂活性的六聚抗原结合复合体，其中每个亚单位包含至少一条抗原结合多肽，所述抗原结合多肽包含至少一个针对细胞表面受体的抗原结合区和增强六聚体形成的修饰的Fc区，并且其中复合体具有针对所述复合体结合的细胞表面受体的激动剂活性。
在某些实施方案中，抗原结合复合体中的每条抗原结合多肽与相同的细胞表面受体结合。
在某些实施方案中，抗原结合区与细胞表面受体结合，所述细胞表面受体是选自肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族和G-蛋白偶联受体(GPCR)超家族的受体家族成员。
在某些实施方案中，抗原结合区与选自OX40、死亡受体5(DR5)、CD27、GITR、CD137和Tie2的细胞表面受体结合。
在某些实施方案中，抗原结合多肽包含抗体的抗原结合区。在某些实施方案中，抗体的抗原结合区选自Fv、Fab、Fab'、F(ab')2、单链抗体分子(例如，scFv)和抗体可变区。
在某些实施方案中，修饰的Fc区是修饰的人IgG1Fc区。
在某些实施方案中，Fc区还包含削弱C1q结合作用和/或补体依赖细胞毒性(CDC)的修饰。在示例性实施方案中，削弱C1q结合作用和/或CDC的修饰包含人IgG1Fc区内的K322A氨基酸置换(EU编号)。
在某些实施方案中，修饰的Fc区包含选自以下的一个或多个氨基酸修饰：
(i)P247A、P247C、P247D、P247F、P247G、P247H、P247I、P247K、P247L、P247M、P247N、P247R、P247S、P247T、P247V或者P247W；
(ii)I253A、I253D、I253K、I253L、I253M、I253N、I253R、I253S、I253V、I253E、I253Q或者I253T；
(iii)S254E、S254F、S254G、S254H、S254I、S254K、S254L、S254P、S254T、S254V或者S254W；
(iv)H310A、H310G、H310F、H310K、H310L、H310P、H310R、H310T、H310V、H310W、H310N、H310Q或者H310Y；
(v)Q311A、Q311C、Q311E、Q311G、Q311H、Q311F、Q311I、Q311K、Q311L、Q311N、Q311P、Q311R、Q311S、Q311T、Q311W或者Q311Y；
(vi)E345A、E345C、E345D、E345G、E345H、E345F、E345I、E345K、E345L、E345M、E345N、E345P、E345Q、E345R、E345S、E345T、E345V、E345W或者E345Y；
(vii)D/E356G、D/E356I、D/E356L、D/E356R、D/E356T或者D/E356V；
(viii)T359G、T359N、T359P或者T359R；
(ix)E382F、E382K、E382L、E382M、E382P、E382V、E382W、E382D、E382H、E382N、E382Q、E382S、E382T或者E382Y；
(x)G385A、G385D、G385H、G385I、G385L、G385N、G385P、G385Q、G385R、G385S、G385T、G385V、G385E、G385K、G385W或者G385Y；
(xi)Q386A、Q386C、Q386D、Q386E、Q386G、Q386H、Q386F、Q386I、Q386K、Q386L、Q386N、Q386P、Q386R、Q386S、Q386T、Q386V、Q386W或者Q386Y；
(xii)E430A、E430C、E430D、E430F、E430G、E430H、E430I、E430K、E430L、E430M、E430N、E430P、E430Q、E430R、E430S、E430T、E430V、E430W或者E430Y；
(xiii)H433R；
(xiv)N434D、N434E、N434G、N434K、N434R、N434S、N434V、N434W、N434H、N434Q、N434T或者N434Y；
(xv)Y436I、Y436K、Y436L、Y436R、Y436S、Y436T、Y436V、Y436W、Y436A、Y436E、Y436F、Y436H、Y436M、Y436N或者Y436Q；
(xvi)Q438C、Q438E、Q438I、Q438K、Q438L、Q438S、Q438T、Q438V、Q438W、Q438Y、Q438A、Q438G、Q438H、Q438N、Q438Q或者Q438R；
(xvii)K439A、K439D、K439E、K439H、K439L、K439P、K439R、K439T、K439Y、K439Q或者K439W；
(xviii)S440A、S440C、S440D、S440E、S440G、S440H、S440F、S440I、S440K、S440L、S440M、S440N、S440P、S440Q、S440R、S440T、S440V、S440W或者S440Y；以及
(xix)K447D、K447E、K447N、K447Q或者K447缺失。
在某些实施方案中，修饰的Fc区包含选自以下的一个或多个氨基酸修饰：
(i)P247G；
(ii)I253L、I253N、I253V或者I253Q；
(iii)S254L；
(iv)H310P、H310W或者H310Q；
(v)Q311E、Q311L、Q311R或者Q311W；
(vi)E345A、E345D、E345G、E345H、E345F、E345I、E345K、E345L、E345M、E345N、E345P、E345Q、E345R、E345S、E345T、E345V、E345W或者E345Y；
(vii)D/E356R；
(viii)T359R；
(ix)E382K、E382L、E382V、E382D、E382Q或者E382S；
(x)G385D、G385N、G385R、G385E或者G385K；
(xi)Q386K；
(xii)E430A、E430D、E430F、E430G、E430H、E430I、E430K、E430L、E430M、E430N、E430P、E430Q、E430R、E430S、E430T、E430V、E430W或者E430Y；
(xiii)H433R；
(xiv)N434K、N434R、N434W、N434H或者N434Q；
(xv)Y436I、Y436S、Y436T、Y436V、Y436N或者Y436Q；
(xvi)Q438C、Q438L、Q438S、Q438T或者Q438N；
(xvii)K439D、K439E、K439H、K439R或者K439Q；
(xviii)S440D、S440E、S440Q、S440W或者S440Y；以及
(xix)K447D、K447E、K447N、K447Q或者K447缺失。
在某些实施方案中，修饰的Fc区包含选自以下的一个或多个氨基酸修饰：
(i)P247D、P247F、P247G、P247K、P247R或者P247S；
(ii)I253V；
(iii)S254G、S254I或者S254L；
(iv)Q311I、Q311K、Q311L、Q311P或者Q311W；
(v)E345A、E345C、E345F、E345I、E345K、E345L、E345M、E345N、E345P、E345S、E345T、E345V、E345W或者E345Y；
(vi)D/E356I、D/E356L、D/E356R、D/E356T或者D/E356V；
(vii)T359N；
(viii)E382L或者E382V；
(ix)G385A、G385D、G385H、G385I、G385L、G385N、G385P、G385Q、G385R、G385S、G385T、G385V、G385E、G385K、G385W或者G385Y；
(x)Q386K；
(xi)E430A、E430F、E430H、E430L、E430P、E430R、E430S、E430V、E430W或者E430Y；
(xii)N434W；
(xiii)Y436I；以及
(xiv)S440D。
在某些实施方案中，修饰的Fc区包含人IgG1Fc区内选自E345R、E430G和S440Y的一个或多个氨基酸置换(EU编号)。在某些实施方案中，修饰的Fc区包含人IgG1Fc区内选自E345R、E430G和S440Y的单氨基酸置换(EU编号)。在某些实施方案中，修饰的Fc区包含选自(a)E345R和E430G、(b)E345R和S440Y、(c)E430G和S440Y的氨基酸置换组，其中置换在人IgG1Fc区内(EU编号)。在某些实施方案中，修饰的Fc区包含人IgG1Fc区内的氨基酸置换E345R、E430G和S440Y(EU编号)。
在某些实施方案中，抗原结合区包含来自单特异性抗体、双特异性抗体或多特异性抗体的抗原结合区。
在某些实施方案中，每个抗原结合区来自与相同细胞表面受体结合的单特异性抗体。
在某些实施方案中，每个抗原结合区来自与OX40结合的单特异性抗体。在示例性实施方案中，复合体包含至少一个下述亚单位，所述亚单位包含(a)VH结构域和(b)VL结构域，所述VH结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ IDNO:3的氨基酸序列的HVR-H2和(iii)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-H3；所述VL结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L2和(iii)包含选自SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HVR-L3。在某些实施方案中，六个亚单位中的每一个包含(a)VH结构域和(b)VL结构域，所述VH结构域包含了(i)包含SEQID NO:2的氨基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HVR-H2、(iii)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-H3；所述VL结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L2和(iii)包含选自SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HVR-L3。在其他示例性实施方案中，复合体包含至少一个下述亚单位，所述亚单位包含(a)VH结构域和(b)VL结构域，所述VH结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HVR-H2和(iii)包含SEQ IDNO:33的氨基酸序列的HVR-H3；所述VL结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的HVR-L2和(iii)包含选自SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HVR-L3。在某些实施方案中，六个亚单位中的每一个包含(a)VH结构域和(b)VL结构域，所述VH结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HVR-H2和(iii)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HVR-H3；所述VL结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的HVR-L2和(iii)包含选自SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HVR-L3。
在某些实施方案中，复合体包含与相同细胞表面受体上的不同表位结合的至少两种单特异性抗体的混合物。
在某些实施方案中，复合体包含(a)结合OX40的第一表位的至少第一亚单位；和(b)结合OX40的第二表位的至少第二亚单位，其中OX40的第一表位与OX40的第二表位不同。在示例性实施方案中，第一亚单位包含(a)VH结构域和(b)VL结构域，所述VH结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HVR-H2、(iii)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-H3；所述VL结构域包含了(i)包含SEQ IDNO:5的氨基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L2和(iii)包含选自SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HVR-L3；并且其中第二亚单位包含(a)VH结构域和(b)VL结构域，所述VH结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ IDNO:30的氨基酸序列的HVR-H2和(iii)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HVR-H3；所述VL结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的HVR-L2和(iii)包含选自SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HVR-L3。
在某些实施方案中，抗原结合区包含双特异性抗体的双臂，并且其中双特异性抗体的每条臂与相同细胞表面受体上的不同表位结合。
在某些实施方案中，双特异性抗体包含(a)结合OX40的第一表位的至少第一臂和(b)结合OX40的第二表位的至少第二臂，其中OX40的第一表位与OX40的第二表位不同。在示例性实施方案中，第一臂包含(a)VH结构域和(b)VL结构域，所述VH结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HVR-H2、(iii)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-H3；所述VL结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L2和(iii)包含选自SEQ IDNO:7的氨基酸序列的HVR-L3；并且其中第二臂包含(a)VH结构域和(b)VL结构域，所述VH结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HVR-H2和(iii)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HVR-H3；所述VL结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的HVR-L2和(iii)包含选自SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HVR-L3。
在某些实施方案中，Fc区还包含减弱效应子功能的修饰。在示例性实施方案中，减弱效应子功能的修饰包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基(EU编号)处的氨基酸置换：
(a)人IgG1Fc区内的297氨基酸残基，
(b)人IgG1Fc区内的234和235氨基酸残基，
(c)人IgG1Fc区内的234、235和329氨基酸残基，
(d)人IgG2Fc区内的234和237氨基酸残基，
(e)人IgG4Fc区内的235、237和318氨基酸残基，
(f)人IgG4Fc区内的228和236氨基酸残基，
(g)人IgG2Fc区内的268、309、330和331氨基酸残基，
(h)人IgG1Fc区内的220、226、229和238氨基酸残基，
(i)人IgG1Fc区内的226、229、233、234和235氨基酸残基，
(j)人IgG1Fc区内的234、235和331氨基酸残基，
(k)人IgG1Fc区内的226和230氨基酸残基和
(l)人IgG1Fc区内的267和328氨基酸残基。
在某些实施方案中，减弱效应子功能的修饰包含选自以下的一个或多个氨基酸置换(EU编号)：
(a)人IgG1Fc区内的N297A，
(b)人IgG1Fc区内的L234A和L235A，
(c)人IgG1Fc区内的L234A、L235A和P329G，
(d)人IgG2Fc区内的V234A和G237A，
(e)人IgG4Fc区内的L235A、G237A和E318A，
(f)人IgG4Fc区内的S228P和L236E，
(g)人IgG2Fc区内的118至260或人IgG4的Fc区内的261至447，
(h)人IgG2Fc区内的H268Q、V309L、A330S和A331S，
(i)人IgG1Fc区内的C220S、C226S、C229S和P238S，
(j)人IgG1Fc区内的C226S、C229S、E233P、L234V和L235A，
(k)人IgG1Fc区内的L234F、L235E和P331S，
(l)人IgG1Fc区内的C226S和P230S，和
(m)人IgG1Fc区内的S267E和L328F。
在某些实施方案中，减弱效应子功能的修饰不导致Fc区的糖基化模式修饰。
在某些实施方案中，抗原结合复合体增强由所述复合体结合的细胞表面受体介导的信号转导。
在另一个方面，本申请提供一种包含六个亚单位的具有激动剂活性的六聚抗原结合复合体，其中每个亚单位包含至少一条抗原结合多肽，所述抗原结合多肽包含至少一个针对细胞表面受体的抗原结合区和增强六聚体形成的修饰的Fc区，其中修饰的Fc区还包含削弱C1q结合作用和/或补体依赖细胞毒性(CDC)的修饰，并且其中复合体具有针对所述复合体结合的细胞表面受体的激动剂活性。
在某些实施方案中，抗原结合复合体中的每条抗原结合多肽与相同的细胞表面受体结合。
在某些实施方案中，抗原结合区与细胞表面受体结合，所述细胞表面受体是选自肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族和G-蛋白偶联受体(GPCR)超家族的受体家族成员。
在某些实施方案中，抗原结合区与选自OX40、死亡受体5(DR5)、CD27、GITR、CD137和Tie2的细胞表面受体结合。
在某些实施方案中，抗原结合多肽包含抗体的抗原结合区。在某些实施方案中，抗体的抗原结合区选自Fv、Fab、Fab'、F(ab')2、单链抗体分子(例如，scFv)和抗体可变区。
在某些实施方案中，修饰的Fc区是修饰的人IgG1Fc区。
。在某些实施方案中，削弱C1q结合作用和/或CDC的修饰包含人IgG1Fc区内的K322A氨基酸置换(EU编号)。
在某些实施方案中，修饰的Fc区包含选自以下的一个或多个氨基酸修饰：
(i)P247A、P247C、P247D、P247F、P247G、P247H、P247I、P247K、P247L、P247M、P247N、P247R、P247S、P247T、P247V或者P247W；
(ii)I253A、I253D、I253K、I253L、I253M、I253N、I253R、I253S、I253V、I253E、I253Q或者I253T；
(iii)S254E、S254F、S254G、S254H、S254I、S254K、S254L、S254P、S254T、S254V或者S254W；
(iv)H310A、H310G、H310F、H310K、H310L、H310P、H310R、H310T、H310V、H310W、H310N、H310Q或者H310Y；
(v)Q311A、Q311C、Q311E、Q311G、Q311H、Q311F、Q311I、Q311K、Q311L、Q311N、Q311P、Q311R、Q311S、Q311T、Q311W或者Q311Y；
(vi)E345A、E345C、E345D、E345G、E345H、E345F、E345I、E345K、E345L、E345M、E345N、E345P、E345Q、E345R、E345S、E345T、E345V、E345W或者E345Y；
(vii)D/E356G、D/E356I、D/E356L、D/E356R、D/E356T或者D/E356V；
(viii)T359G、T359N、T359P或者T359R；
(ix)E382F、E382K、E382L、E382M、E382P、E382V、E382W、E382D、E382H、E382N、E382Q、E382S、E382T或者E382Y；
(x)G385A、G385D、G385H、G385I、G385L、G385N、G385P、G385Q、G385R、G385S、G385T、G385V、G385E、G385K、G385W或者G385Y；
(xi)Q386A、Q386C、Q386D、Q386E、Q386G、Q386H、Q386F、Q386I、Q386K、Q386L、Q386N、Q386P、Q386R、Q386S、Q386T、Q386V、Q386W或者Q386Y；
(xii)E430A、E430C、E430D、E430F、E430G、E430H、E430I、E430K、E430L、E430M、E430N、E430P、E430Q、E430R、E430S、E430T、E430V、E430W或者E430Y；
(xiii)H433R；
(xiv)N434D、N434E、N434G、N434K、N434R、N434S、N434V、N434W、N434H、N434Q、N434T或者N434Y；
(xv)Y436I、Y436K、Y436L、Y436R、Y436S、Y436T、Y436V、Y436W、Y436A、Y436E、Y436F、Y436H、Y436M、Y436N或者Y436Q；
(xvi)Q438C、Q438E、Q438I、Q438K、Q438L、Q438S、Q438T、Q438V、Q438W、Q438Y、Q438A、Q438G、Q438H、Q438N、Q438Q或者Q438R；
(xvii)K439A、K439D、K439E、K439H、K439L、K439P、K439R、K439T、K439Y、K439Q或者K439W；
(xviii)S440A、S440C、S440D、S440E、S440G、S440H、S440F、S440I、S440K、S440L、S440M、S440N、S440P、S440Q、S440R、S440T、S440V、S440W或者S440Y；以及
(xix)K447D、K447E、K447N、K447Q或者K447缺失。
在某些实施方案中，修饰的Fc区包含选自以下的一个或多个氨基酸修饰：
(i)P247G；
(ii)I253L、I253N、I253V或者I253Q；
(iii)S254L；
(iv)H310P、H310W或者H310Q；
(v)Q311E、Q311L、Q311R或者Q311W；
(vi)E345A、E345D、E345G、E345H、E345F、E345I、E345K、E345L、E345M、E345N、E345P、E345Q、E345R、E345S、E345T、E345V、E345W或者E345Y；
(vii)D/E356R；
(viii)T359R；
(ix)E382K、E382L、E382V、E382D、E382Q或者E382S；
(x)G385D、G385N、G385R、G385E或者G385K；
(xi)Q386K；
(xii)E430A、E430D、E430F、E430G、E430H、E430I、E430K、E430L、E430M、E430N、E430P、E430Q、E430R、E430S、E430T、E430V、E430W或者E430Y；
(xiii)H433R；
(xiv)N434K、N434R、N434W、N434H或者N434Q；
(xv)Y436I、Y436S、Y436T、Y436V、Y436N或者Y436Q；
(xvi)Q438C、Q438L、Q438S、Q438T或者Q438N；
(xvii)K439D、K439E、K439H、K439R或者K439Q；
(xviii)S440D、S440E、S440Q、S440W或者S440Y；以及
(xix)K447D、K447E、K447N、K447Q或者K447缺失。
在某些实施方案中，修饰的Fc区包含选自以下的一个或多个氨基酸修饰：
(i)P247D、P247F、P247G、P247K、P247R或者P247S；
(ii)I253V；
(iii)S254G、S254I或者S254L；
(iv)Q311I、Q311K、Q311L、Q311P或者Q311W；
(v)E345A、E345C、E345F、E345I、E345K、E345L、E345M、E345N、E345P、E345S、E345T、E345V、E345W或者E345Y；
(vi)D/E356I、D/E356L、D/E356R、D/E356T或者D/E356V；
(vii)T359N；
(viii)E382L或者E382V；
(ix)G385A、G385D、G385H、G385I、G385L、G385N、G385P、G385Q、G385R、G385S、G385T、G385V、G385E、G385K、G385W或者G385Y；
(x)Q386K；
(xi)E430A、E430F、E430H、E430L、E430P、E430R、E430S、E430V、E430W或者E430Y；
(xii)N434W；
(xiii)Y436I；以及
(xiv)S440D。
在某些实施方案中，修饰的Fc区包含人IgG1Fc区内选自E345R、E430G和S440Y的一个或多个氨基酸置换(EU编号)。在某些实施方案中，修饰的Fc区包含人IgG1Fc区内选自E345R、E430G和S440Y的单氨基酸置换(EU编号)。在某些实施方案中，修饰的Fc区包含选自(a)E345R和E430G、(b)E345R和S440Y、(c)E430G和S440Y的氨基酸置换组，其中置换在人IgG1Fc区内(EU编号)。在某些实施方案中，修饰的Fc区包含人IgG1Fc区内的氨基酸置换E345R、E430G和S440Y(EU编号)。
在某些实施方案中，抗原结合区包含来自单特异性抗体、双特异性抗体或多特异性抗体的抗原结合区。
在某些实施方案中，每个抗原结合区来自与相同细胞表面受体结合的单特异性抗体。
在某些实施方案中，每个抗原结合区来自与OX40结合的单特异性抗体。在示例性实施方案中，复合体包含至少一个下述亚单位，所述亚单位包含(a)VH结构域和(b)VL结构域，所述VH结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ IDNO:3的氨基酸序列的HVR-H2和(iii)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-H3；所述VL结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L2和(iii)包含选自SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HVR-L3。在某些实施方案中，六个亚单位中的每一个包含(a)VH结构域和(b)VL结构域，所述VH结构域包含了(i)包含SEQID NO:2的氨基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HVR-H2、(iii)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-H3；所述VL结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L2和(iii)包含选自SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HVR-L3。在其他示例性实施方案中，复合体包含至少一个下述亚单位，所述亚单位包含(a)VH结构域和(b)VL结构域，所述VH结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HVR-H2和(iii)包含SEQ IDNO:33的氨基酸序列的HVR-H3；所述VL结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的HVR-L2和(iii)包含选自SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HVR-L3。在某些实施方案中，六个亚单位中的每一个包含(a)VH结构域和(b)VL结构域，所述VH结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HVR-H2和(iii)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HVR-H3；所述VL结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的HVR-L2和(iii)包含选自SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HVR-L3。
在某些实施方案中，复合体包含与相同细胞表面受体上的不同表位结合的至少两种单特异性抗体的混合物。
在某些实施方案中，复合体包含(a)结合OX40的第一表位的至少第一亚单位；和(b)结合OX40的第二表位的至少第二亚单位，其中OX40的第一表位与OX40的第二表位不同。在示例性实施方案中，第一亚单位包含(a)VH结构域和(b)VL结构域，所述VH结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HVR-H2、(iii)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-H3；所述VL结构域包含了(i)包含SEQ IDNO:5的氨基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L2和(iii)包含选自SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HVR-L3；并且其中第二亚单位包含(a)VH结构域和(b)VL结构域，所述VH结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ IDNO:30的氨基酸序列的HVR-H2和(iii)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HVR-H3；所述VL结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的HVR-L2和(iii)包含选自SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HVR-L3。
在某些实施方案中，抗原结合区包含双特异性抗体的双臂，并且其中双特异性抗体的每条臂与相同细胞表面受体上的不同表位结合。
在某些实施方案中，双特异性抗体包含(a)结合OX40的第一表位的至少第一臂和(b)结合OX40的第二表位的至少第二臂，其中OX40的第一表位与OX40的第二表位不同。在示例性实施方案中，第一臂包含(a)VH结构域和(b)VL结构域，所述VH结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HVR-H2、(iii)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-H3；所述VL结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L2和(iii)包含选自SEQ IDNO:7的氨基酸序列的HVR-L3；并且其中第二臂包含(a)VH结构域和(b)VL结构域，所述VH结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HVR-H2和(iii)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HVR-H3；所述VL结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的HVR-L2和(iii)包含选自SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HVR-L3。
在某些实施方案中，Fc区还包含减弱效应子功能的修饰。在示例性实施方案中，减弱效应子功能的修饰包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基(EU编号)处的氨基酸置换：
(a)人IgG1Fc区内的297氨基酸残基，
(b)人IgG1Fc区内的234和235氨基酸残基，
(c)人IgG1Fc区内的234、235和329氨基酸残基，
(d)人IgG2Fc区内的234和237氨基酸残基，
(e)人IgG4Fc区内的235、237和318氨基酸残基，
(f)人IgG4Fc区内的228和236氨基酸残基，
(g)人IgG2Fc区内的268、309、330和331氨基酸残基，
(h)人IgG1Fc区内的220、226、229和238氨基酸残基，
(i)人IgG1Fc区内的226、229、233、234和235氨基酸残基，
(j)人IgG1Fc区内的234、235和331氨基酸残基，
(k)人IgG1Fc区内的226和230氨基酸残基和
(l)人IgG1Fc区内的267和328氨基酸残基。
在某些实施方案中，减弱效应子功能的修饰包含选自以下的一个或多个氨基酸置换(EU编号)：
(a)人IgG1Fc区内的N297A，
(b)人IgG1Fc区内的L234A和L235A，
(c)人IgG1Fc区内的L234A、L235A和P329G，
(d)人IgG2Fc区内的V234A和G237A，
(e)人IgG4Fc区内的L235A、G237A和E318A，
(f)人IgG4Fc区内的S228P和L236E，
(g)人IgG2Fc区内的118至260或人IgG4的Fc区内的261至447，
(h)人IgG2Fc区内的H268Q、V309L、A330S和A331S，
(i)人IgG1Fc区内的C220S、C226S、C229S和P238S，
(j)人IgG1Fc区内的C226S、C229S、E233P、L234V和L235A，
(k)人IgG1Fc区内的L234F、L235E和P331S，
(l)人IgG1Fc区内的C226S和P230S，和
(m)人IgG1Fc区内的S267E和L328F。
在某些实施方案中，减弱效应子功能的修饰不导致Fc区的糖基化模式修饰。
在某些实施方案中，抗原结合复合体增强由所述复合体结合的细胞表面受体介导的信号转导。
在另一个方面，本申请提供一种抗原结合多肽，其包含针对细胞表面受体的抗原结合区和修饰的Fc区，其中修饰的Fc区包含(i)增强抗原结合多肽的六聚体形成的修饰和(ii)减弱效应子功能的修饰。
在某些实施方案中，抗原结合多肽与细胞表面受体结合，所述细胞表面受体是选自肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族和G-蛋白偶联受体(GPCR)超家族的受体家族成员。
在某些实施方案中，抗原结合多肽与选自OX40、DR5、GITR、CD27、CD137和Tie2的细胞表面受体结合。
在某些实施方案中，抗原结合多肽包含抗体的抗原结合区。在某些实施方案中，抗体的抗原结合区选自Fv、Fab、Fab'、F(ab')2、单链抗体分子(例如，scFv)和抗体可变区。
在某些实施方案中，修饰的Fc区是修饰的人IgG1Fc区。
在某些实施方案中，修饰的Fc区包含选自以下的一个或多个氨基酸修饰：
(i)P247A、P247C、P247D、P247F、P247G、P247H、P247I、P247K、P247L、P247M、P247N、P247R、P247S、P247T、P247V或者P247W；
(ii)I253A、I253D、I253K、I253L、I253M、I253N、I253R、I253S、I253V、I253E、I253Q或者I253T；
(iii)S254E、S254F、S254G、S254H、S254I、S254K、S254L、S254P、S254T、S254V或者S254W；
(iv)H310A、H310G、H310F、H310K、H310L、H310P、H310R、H310T、H310V、H310W、H310N、H310Q或者H310Y；
(v)Q311A、Q311C、Q311E、Q311G、Q311H、Q311F、Q311I、Q311K、Q311L、Q311N、Q311P、Q311R、Q311S、Q311T、Q311W或者Q311Y；
(vi)E345A、E345C、E345D、E345G、E345H、E345F、E345I、E345K、E345L、E345M、E345N、E345P、E345Q、E345R、E345S、E345T、E345V、E345W或者E345Y；
(vii)D/E356G、D/E356I、D/E356L、D/E356R、D/E356T或者D/E356V；
(viii)T359G、T359N、T359P或者T359R；
(ix)E382F、E382K、E382L、E382M、E382P、E382V、E382W、E382D、E382H、E382N、E382Q、E382S、E382T或者E382Y；
(x)G385A、G385D、G385H、G385I、G385L、G385N、G385P、G385Q、G385R、G385S、G385T、G385V、G385E、G385K、G385W或者G385Y；
(xi)Q386A、Q386C、Q386D、Q386E、Q386G、Q386H、Q386F、Q386I、Q386K、Q386L、Q386N、Q386P、Q386R、Q386S、Q386T、Q386V、Q386W或者Q386Y；
(xii)E430A、E430C、E430D、E430F、E430G、E430H、E430I、E430K、E430L、E430M、E430N、E430P、E430Q、E430R、E430S、E430T、E430V、E430W或者E430Y；
(xiii)H433R；
(xiv)N434D、N434E、N434G、N434K、N434R、N434S、N434V、N434W、N434H、N434Q、N434T或者N434Y；
(xv)Y436I、Y436K、Y436L、Y436R、Y436S、Y436T、Y436V、Y436W、Y436A、Y436E、Y436F、Y436H、Y436M、Y436N或者Y436Q；
(xvi)Q438C、Q438E、Q438I、Q438K、Q438L、Q438S、Q438T、Q438V、Q438W、Q438Y、Q438A、Q438G、Q438H、Q438N、Q438Q或者Q438R；
(xvii)K439A、K439D、K439E、K439H、K439L、K439P、K439R、K439T、K439Y、K439Q或者K439W；
(xviii)S440A、S440C、S440D、S440E、S440G、S440H、S440F、S440I、S440K、S440L、S440M、S440N、S440P、S440Q、S440R、S440T、S440V、S440W或者S440Y；以及
(xix)K447D、K447E、K447N、K447Q或者K447缺失。
在某些实施方案中，修饰的Fc区包含选自以下的一个或多个氨基酸修饰：
(i)P247G；
(ii)I253L、I253N、I253V或者I253Q；
(iii)S254L；
(iv)H310P、H310W或者H310Q；
(v)Q311E、Q311L、Q311R或者Q311W；
(vi)E345A、E345D、E345G、E345H、E345F、E345I、E345K、E345L、E345M、E345N、E345P、E345Q、E345R、E345S、E345T、E345V、E345W或者E345Y；
(vii)D/E356R；
(viii)T359R；
(ix)E382K、E382L、E382V、E382D、E382Q或者E382S；
(x)G385D、G385N、G385R、G385E或者G385K；
(xi)Q386K；
(xii)E430A、E430D、E430F、E430G、E430H、E430I、E430K、E430L、E430M、E430N、E430P、E430Q、E430R、E430S、E430T、E430V、E430W或者E430Y；
(xiii)H433R；
(xiv)N434K、N434R、N434W、N434H或者N434Q；
(xv)Y436I、Y436S、Y436T、Y436V、Y436N或者Y436Q；
(xvi)Q438C、Q438L、Q438S、Q438T或者Q438N；
(xvii)K439D、K439E、K439H、K439R或者K439Q；
(xviii)S440D、S440E、S440Q、S440W或者S440Y；以及
(xix)K447D、K447E、K447N、K447Q或者K447缺失。
在某些实施方案中，修饰的Fc区包含选自以下的一个或多个氨基酸修饰：
(i)P247D、P247F、P247G、P247K、P247R或者P247S；
(ii)I253V；
(iii)S254G、S254I或者S254L；
(iv)Q311I、Q311K、Q311L、Q311P或者Q311W；
(v)E345A、E345C、E345F、E345I、E345K、E345L、E345M、E345N、E345P、E345S、E345T、E345V、E345W或者E345Y；
(vi)D/E356I、D/E356L、D/E356R、D/E356T或者D/E356V；
(vii)T359N；
(viii)E382L或者E382V；
(ix)G385A、G385D、G385H、G385I、G385L、G385N、G385P、G385Q、G385R、G385S、G385T、G385V、G385E、G385K、G385W或者G385Y；
(x)Q386K；
(xi)E430A、E430F、E430H、E430L、E430P、E430R、E430S、E430V、E430W或者E430Y；
(xii)N434W；
(xiii)Y436I；以及
(xiv)S440D。
在示例性的实施方案中，修饰的Fc区包含人IgG1Fc区内选自E345R、E430G和S440Y的一个或多个氨基酸置换(EU编号)。在示例性的实施方案中，修饰的Fc区包含人IgG1Fc区内选自E345R、E430G和S440Y的单氨基酸置换(EU编号)。在示例性的实施方案中，修饰的Fc区包含选自(a)E345R和E430G、(b)E345R和S440Y、(c)E430G和S440Y的氨基酸置换组，其中置换在人IgG1Fc区内(EU编号)。在示例性的实施方案中，修饰的Fc区包含人IgG1Fc区内的氨基酸置换E345R、E430G和S440Y(EU编号)。
在某些实施方案中，抗原结合多肽包含来自单特异性抗体、双特异性抗体或多特异性抗体的抗原结合区。
在某些实施方案中，抗原结合区结合OX40。在示例性实施方案中，抗原结合区包含(a)VH结构域和(b)VL结构域，所述VH结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HVR-H2和(iii)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-H3；所述VL结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L2和(iii)包含选自SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HVR-L3。在示例性实施方案中，抗原结合区包含(a)VH结构域和(b)VL结构域，所述VH结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HVR-H2和(iii)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HVR-H3；所述VL结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的HVR-L2和(iii)包含选自SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HVR-L3。
在某些实施方案中，抗原结合区包含双特异性抗体的双臂，并且其中双特异性抗体的每条臂与相同细胞表面受体上的不同表位结合。
在某些实施方案中，双特异性抗体包含(a)结合OX40的第一表位的至少第一臂和(b)结合OX40的第二表位的至少第二臂，其中OX40的第一表位与OX40的第二表位不同。在示例性实施方案中，第一臂包含(a)VH结构域和(b)VL结构域，所述VH结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HVR-H2、(iii)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-H3；所述VL结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L2和(iii)包含选自SEQ IDNO:7的氨基酸序列的HVR-L3；并且第二臂包含(a)VH结构域和(b)VL结构域，所述VH结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HVR-H2和(iii)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HVR-H3；所述VL结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的HVR-L2和(iii)包含选自SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HVR-L3。
在示例性实施方案中，减弱效应子功能的修饰包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基(EU编号)处的氨基酸置换：
(a)人IgG1Fc区内的297氨基酸残基，
(b)人IgG1Fc区内的234和235氨基酸残基，
(c)人IgG1Fc区内的234、235和329氨基酸残基，
(d)人IgG2Fc区内的234和237氨基酸残基，
(e)人IgG4Fc区内的235、237和318氨基酸残基，
(f)人IgG4Fc区内的228和236氨基酸残基，
(g)人IgG2Fc区内的268、309、330和331氨基酸残基，
(h)人IgG1Fc区内的220、226、229和238氨基酸残基，
(i)人IgG1Fc区内的226、229、233、234和235氨基酸残基，
(j)人IgG1Fc区内的234、235和331氨基酸残基(EU编号)，
(k)人IgG1Fc区内的226和230氨基酸残基和
(l)人IgG1Fc区内的267和328氨基酸残基。
在某些实施方案中，减弱效应子功能的修饰包含选自以下的一个或多个氨基酸置换(EU编号)：
(a)人IgG1Fc区内的N297A，
(b)人IgG1Fc区内的L234A和L235A，
(c)人IgG1Fc区内的L234A、L235A和P329G，
(d)人IgG2Fc区内的V234A和G237A，
(e)人IgG4Fc区内的L235A、G237A和E318A，
(f)人IgG4Fc区内的S228P和L236E，
(g)人IgG2Fc区内的118至260或人IgG4的Fc区内的261至447，
(h)人IgG2Fc区内的H268Q、V309L、A330S和A331S，
(i)人IgG1Fc区内的C220S、C226S、C229S和P238S，
(j)人Fc区内的C226S、C229S、E233P、L234V和L235A，
(k)人IgG1Fc区内的L234F、L235E和P331S，
(l)人IgG1Fc区内的C226S和P230S，和
(m)人IgG1Fc区内的S267E和L328F。
在某些实施方案中，减弱效应子功能的修饰不导致Fc区的糖基化模式修饰。
在另一个方面，本申请提供一种六聚体，其包含根据本文所述的任一个实施方案的六条抗原结合多肽。
在另一个方面，本申请提供了一种用于激动受试者中细胞表面受体的方法，所述方法包括向受试者施用根据本文所述的任一实施方案的复合体或抗原结合多肽。
在某些实施方案中，六聚体增强由所述复合体、六聚体或抗原结合多肽结合的细胞表面受体介导的信号转导。
在另一个方面，本申请提供了一种增加抗原结合多肽的激动剂活性的方法，所述方法包括：(a)提供抗原结合多肽，所述抗原结合多肽包含针对细胞表面受体的抗原结合区和Fc区，并且(b)向Fc区引入修饰，其中修饰增强抗原结合多肽的六聚体形成，并且其中如与六聚体的单个亚单位相比，六聚体具有增加的针对抗原结合多肽结合的细胞表面受体的激动剂活性。
在某些实施方案中，细胞表面受体是选自肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族和G-蛋白偶联受体(GPCR)超家族的受体家族成员。在一个示例性实施方案中，细胞表面受体选自OX40、DR5、GITR、CD27、CD137和Tie2。
在某些实施方案中，抗原结合多肽包含抗体的抗原结合区。在示例性实施方案中，抗体的抗原结合区选自Fv、Fab、Fab'、F(ab')2、单链抗体分子(例如，scFv)和抗体可变区。
在某些实施方案中，修饰的Fc区是修饰的人IgG1Fc区。
在某些实施方案中，Fc区还包含削弱C1q结合作用和/或补体依赖细胞毒性(CDC)的修饰。在示例性实施方案中，削弱C1q结合作用和/或CDC的修饰包含人IgG1Fc区内的K322A氨基酸置换(EU编号)。
在某些实施方案中，修饰的Fc区包含选自以下的一个或多个氨基酸修饰：
(i)P247A、P247C、P247D、P247F、P247G、P247H、P247I、P247K、P247L、P247M、P247N、P247R、P247S、P247T、P247V或者P247W；
(ii)I253A、I253D、I253K、I253L、I253M、I253N、I253R、I253S、I253V、I253E、I253Q或者I253T；
(iii)S254E、S254F、S254G、S254H、S254I、S254K、S254L、S254P、S254T、S254V或者S254W；
(iv)H310A、H310G、H310F、H310K、H310L、H310P、H310R、H310T、H310V、H310W、H310N、H310Q或者H310Y；
(v)Q311A、Q311C、Q311E、Q311G、Q311H、Q311F、Q311I、Q311K、Q311L、Q311N、Q311P、Q311R、Q311S、Q311T、Q311W或者Q311Y；
(vi)E345A、E345C、E345D、E345G、E345H、E345F、E345I、E345K、E345L、E345M、E345N、E345P、E345Q、E345R、E345S、E345T、E345V、E345W或者E345Y；
(vii)D/E356G、D/E356I、D/E356L、D/E356R、D/E356T或者D/E356V；
(viii)T359G、T359N、T359P或者T359R；
(ix)E382F、E382K、E382L、E382M、E382P、E382V、E382W、E382D、E382H、E382N、E382Q、E382S、E382T或者E382Y；
(x)G385A、G385D、G385H、G385I、G385L、G385N、G385P、G385Q、G385R、G385S、G385T、G385V、G385E、G385K、G385W或者G385Y；
(xi)Q386A、Q386C、Q386D、Q386E、Q386G、Q386H、Q386F、Q386I、Q386K、Q386L、Q386N、Q386P、Q386R、Q386S、Q386T、Q386V、Q386W或者Q386Y；
(xii)E430A、E430C、E430D、E430F、E430G、E430H、E430I、E430K、E430L、E430M、E430N、E430P、E430Q、E430R、E430S、E430T、E430V、E430W或者E430Y；
(xiii)H433R；
(xiv)N434D、N434E、N434G、N434K、N434R、N434S、N434V、N434W、N434H、N434Q、N434T或者N434Y；
(xv)Y436I、Y436K、Y436L、Y436R、Y436S、Y436T、Y436V、Y436W、Y436A、Y436E、Y436F、Y436H、Y436M、Y436N或者Y436Q；
(xvi)Q438C、Q438E、Q438I、Q438K、Q438L、Q438S、Q438T、Q438V、Q438W、Q438Y、Q438A、Q438G、Q438H、Q438N、Q438Q或者Q438R；
(xvii)K439A、K439D、K439E、K439H、K439L、K439P、K439R、K439T、K439Y、K439Q或者K439W；
(xviii)S440A、S440C、S440D、S440E、S440G、S440H、S440F、S440I、S440K、S440L、S440M、S440N、S440P、S440Q、S440R、S440T、S440V、S440W或者S440Y；以及
(xix)K447D、K447E、K447N、K447Q或者K447缺失。
在某些实施方案中，修饰的Fc区包含选自以下的一个或多个氨基酸修饰：
(i)P247G；
(ii)I253L、I253N、I253V或者I253Q；
(iii)S254L；
(iv)H310P、H310W或者H310Q；
(v)Q311E、Q311L、Q311R或者Q311W；
(vi)E345A、E345D、E345G、E345H、E345F、E345I、E345K、E345L、E345M、E345N、E345P、E345Q、E345R、E345S、E345T、E345V、E345W或者E345Y；
(vii)D/E356R；
(viii)T359R；
(ix)E382K、E382L、E382V、E382D、E382Q或者E382S；
(x)G385D、G385N、G385R、G385E或者G385K；
(xi)Q386K；
(xii)E430A、E430D、E430F、E430G、E430H、E430I、E430K、E430L、E430M、E430N、E430P、E430Q、E430R、E430S、E430T、E430V、E430W或者E430Y；
(xiii)H433R；
(xiv)N434K、N434R、N434W、N434H或者N434Q；
(xv)Y436I、Y436S、Y436T、Y436V、Y436N或者Y436Q；
(xvi)Q438C、Q438L、Q438S、Q438T或者Q438N；
(xvii)K439D、K439E、K439H、K439R或者K439Q；
(xviii)S440D、S440E、S440Q、S440W或者S440Y；以及
(xix)K447D、K447E、K447N、K447Q或者K447缺失。
在某些实施方案中，修饰的Fc区包含选自以下的一个或多个氨基酸修饰：
(i)P247D、P247F、P247G、P247K、P247R或者P247S；
(ii)I253V；
(iii)S254G、S254I或者S254L；
(iv)Q311I、Q311K、Q311L、Q311P或者Q311W；
(v)E345A、E345C、E345F、E345I、E345K、E345L、E345M、E345N、E345P、E345S、E345T、E345V、E345W或者E345Y；
(vi)D/E356I、D/E356L、D/E356R、D/E356T或者D/E356V；
(vii)T359N；
(viii)E382L或者E382V；
(ix)G385A、G385D、G385H、G385I、G385L、G385N、G385P、G385Q、G385R、G385S、G385T、G385V、G385E、G385K、G385W或者G385Y；
(x)Q386K；
(xi)E430A、E430F、E430H、E430L、E430P、E430R、E430S、E430V、E430W或者E430Y；
(xii)N434W；
(xiii)Y436I；以及
(xiv)S440D。
在某些实施方案中，修饰的Fc区包含人IgG1Fc区内选自E345R、E430G和S440Y的一个或多个氨基酸置换(EU编号)。在示例性的实施方案中，修饰的Fc区包含人IgG1Fc区内选自E345R、E430G和S440Y的单氨基酸置换(EU编号)。在示例性的实施方案中，修饰的Fc区包含选自(a)E345R和E430G、(b)E345R和S440Y、(c)E430G和S440Y的氨基酸置换组，其中置换在人IgG1Fc区内(EU编号)。在示例性的实施方案中，修饰的Fc区包含人IgG1Fc区内的氨基酸置换E345R、E430G和S440Y(EU编号)。
在某些实施方案中，抗原结合区包含来自单特异性抗体、双特异性抗体或多特异性抗体的抗原结合区。
在某些实施方案中，抗原结合区结合OX40。在示例性实施方案中，抗原结合区包含(a)VH结构域和(b)VL结构域，所述VH结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HVR-H2和(iii)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-H3；所述VL结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L2和(iii)包含选自SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HVR-L3。在示例性实施方案中，抗原结合区包含(a)VH结构域和(b)VL结构域，所述VH结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HVR-H2和(iii)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HVR-H3；所述VL结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的HVR-L2和(iii)包含选自SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HVR-L3。
在某些实施方案中，Fc区还包含减弱效应子功能的修饰。在示例性实施方案中，减弱效应子功能的修饰包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基(EU编号)处的氨基酸置换：
(a)人IgG1Fc区内的297氨基酸残基，
(b)人IgG1Fc区内的234和235氨基酸残基，
(c)人IgG1Fc区内的234、235和329氨基酸残基，
(d)人IgG2Fc区内的234和237氨基酸残基，
(e)人IgG4Fc区内的235、237和318氨基酸残基，
(f)人IgG4Fc区内的228和236氨基酸残基，
(g)人IgG2Fc区内的268、309、330和331氨基酸残基，
(h)人IgG1Fc区内的220、226、229和238氨基酸残基，
(i)人IgG1Fc区内的226、229、233、234和235氨基酸残基，
(j)人IgG1Fc区内的234、235和331氨基酸残基，
(k)人IgG1Fc区内的226和230氨基酸残基和
(l)人IgG1Fc区内的267和328氨基酸残基。
在某些实施方案中，减弱效应子功能的修饰包含选自以下的一个或多个氨基酸置换(EU编号)：
(a)人IgG1Fc区内的N297A，
(b)人IgG1Fc区内的L234A和L235A，
(c)人IgG1Fc区内的L234A、L235A和P329G，
(d)人IgG2Fc区内的V234A和G237A，
(e)人IgG4Fc区内的L235A、G237A和E318A，
(f)人IgG4Fc区内的S228P和L236E，
(g)人IgG2Fc区内的118至260或人IgG4的Fc区内的261至447，
(h)人IgG2Fc区内的H268Q、V309L、A330S和A331S，
(i)人IgG1Fc区内的C220S、C226S、C229S和P238S，
(j)人IgG1Fc区内的C226S、C229S、E233P、L234V和L235A，
(k)人IgG1Fc区内的L234F、L235E和P331S，
(l)人IgG1Fc区内的C226S和P230S，和
(m)人IgG1Fc区内的S267E和L328F。
在某些实施方案中，减弱效应子功能的修饰不导致Fc区的糖基化模式修饰。
在某些实施方案中，六聚体增强由该六聚体结合的细胞表面受体介导的信号转导。
在另一个方面，本申请提供了一种鉴定对细胞表面受体具有激动剂活性的抗原结合多肽的方法，所述方法包括：(a)提供多种六聚抗原结合复合体，其中每复合体包含六个亚单位，所述亚单位各自包含抗原结合多肽，所述抗原结合多肽包含至少一个抗原结合区和增强六聚体形成的修饰的Fc区，(b)针对细胞表面受体筛选抗原结合复合体，并且(c)选择对细胞表面受体具有激动剂活性的抗原结合复合体。
在某些实施方案中，Fc区还包含减弱效应子功能的修饰。
在另一个方面，本申请提供了编码本文所述的任何复合体或抗原结合多肽的核酸。
在另一个方面，本申请提供一种载体，其包含编码本文所述的任何复合体或抗原结合多肽的核酸。在某些实施方案中，载体是表达载体。
在另一个方面，本申请提供一种包含载体的宿主细胞，所述载体包含编码本文所述的任何复合体或抗原结合多肽的核酸。在某些实施方案中，宿主细胞是原核或真核的。
在另一个方面，本申请提供了一种用于产生具有激动剂活性的抗原结合多肽的方法，所述方法包括在适于表达编码复合体或抗原结合多肽的核酸条件下培养包含载体的宿主细胞，所述载体包含编码本文所述的任何复合体或抗原结合多肽的核酸。在某些实施方案中，该方法还可以包括从宿主细胞回收复合体、六聚体或多肽。
在另一个方面，本申请提供了一种药物组合物，其包含本文所述的任何复合体或抗原结合多肽和可药用载体。
应该理解，本文所述的各个实施方案的一个、一些或全部性质可以组合以形成本发明的其它实施方案。本发明的这些方面和其他方面将相对于本领域技术人员变得显而易见。本发明的这些和其他实施方案由随后的详细描述进一步描述。
附图简述
图1显示分析性大小排阻色谱(SEC)色谱图，所述色谱图显示相对于天然IgG1标准对照，hu1A7和hu4D5的RGY变体形式构成六聚体种类和单体种类。
图2显示RGY hu4D5抗体的大小排阻色谱-多角度光散射(SEC-MALS)数据，证实存在优势六聚体(865kDa)种类。还观测到更小的单体(157kDa)抗体群体。
图3显示分析性SEC色谱图，其显示全部三个RGY置换均是溶液中促进六聚体形成需要的。全部抗体均在hu4D5IgG1的背景下构建、产生和受测。WT＝天然IgG1，RGY＝E345R/E430G/S440Y，R＝E345R，G＝E430G，Y＝S440Y，RG＝E345R/E430G，RY＝E345R/S440Y并且GY＝E430G/S440Y。
图4显示hu4D5抗体的分析性SEC色谱图，所述抗体含有促进六聚体的置换RGY与效应子减弱置换N297G或LALAPG的组合。数据显示，使用N297G以减弱效应子未允许六聚化，而LALAPG则允许。
图5显示hu1A7抗体的分析性SEC色谱图，所述抗体含有促进六聚体的置换RGY与效应子减弱置换N297G或LALAPG的组合。数据显示，使用N297G以减弱效应子未允许六聚化，而LALAPG则允许。
图6显示抗OX40抗体或对照抗体在抗CD3抗体和CD80+FcγRIIa+L细胞存在下对CD4+记忆T细胞增殖的共刺激。通过细胞滴度仪glo(Promega)监测T细胞增殖。抗体如下：1A7＝人源化1A7天然IgG1，1A7RGY＝人源化1A7RGY IgG1，4D5＝人源化4D5天然IgG1，4D5RGY＝人源化4D5RGY IgG1。
图7显示抗OX40抗体或对照抗体对CD4+记忆T细胞活化的共刺激，如通过释放IL-13和IL-5所度量。抗体如图6中所述。
图8显示抗OX40抗体或对照抗体在抗CD3抗体和CD80+和FcγRIIa+L细胞存在下对CD4+记忆T细胞的共刺激。依据细胞滴度仪glo(上图)和IL-13的释放(下图)监测T细胞增殖和活化。
图9显示酶联免疫吸附测定(ELISA)数据，其显示混合的RGY变体抗体彼此交换以形成多特异性六聚体复合体。将所示的抗OX40(1A7)抗体和抗Her2(4D5)抗体混合并且在携带OX40抗原的平板上捕获。在洗涤后，用生物素化的Her2和HRP-链霉亲和素检测抗体复合体。
图10显示来自同基因EMT6小鼠癌症模型的药代动力学(PK)数据，所述数据显示，RGY变体抗体(空心符号和点线)相对于天然人IgG1抗体(实心符号和实线)快速清除。PKELISA使用羊抗人IgG抗体捕获来自血清的供试品并使用山羊抗人IgG-HRP检测。一些供试品不存在第7日和第14日时间点表示数据低于检测限。
图11显示来自同基因EMT6小鼠癌症模型的肿瘤体积数据，其显示，尽管其清除快速，RGY变体抗体仍相对于其亲本抗体增强抗肿瘤活性，并且还在Fc受体介导的交联不存在的情况下促进OX40受体的激动剂活性。
图12显示分析性SEC色谱图，其显示全部三个RGY置换均是溶液中促进六聚体形成需要的。全部抗体均在hu1A7IgG1的背景下构建、产生和受测。WT＝天然IgG1，RGY＝E345R/E430G/S440Y，R＝E345R，G＝E430G，Y＝S440Y，RG＝E345R/E430G，RY＝E345R/S440Y并且GY＝E430G/S440Y。
图13显示抗OX40抗体或对照抗体在抗CD3抗体和CD80+FcγRIIa+L细胞存在下对CD4+记忆T细胞增殖的共刺激。通过细胞滴度仪glo(Promega)监测T细胞增殖。上方曲线显示hu1A7抗体的数据，而下方曲线显示hu3C8抗体的数据。两条曲线中的hIgG1(实心菱形)为hu1A7_hIgG1抗体。两条曲线中的阴性对照抗体(Neg Cntrl Ab)为抗Her24D5hIgG1(RGY/LALAPG)。
图14显示来自同基因EMT6小鼠癌症模型的肿瘤体积数据，其显示，RG变体抗体和RY变体抗体相对于其亲本抗体增强抗肿瘤活性并且在Fc受体介导的交联不存在的情况下促进OX40受体的激动剂活性。
图15显示单独受测和作为1:1混合物受测的h1A7和h3C8的RY LALAPG变体的T细胞增殖(上方曲线)数据和细胞因子释放(下方曲线)数据。x轴上的抗体浓度表示总抗体，并且因此每种组分抗体的混合物(h1A7RY LALAPG+h3C8RY LALAPG)相对于单独受测的点而言在其浓度的50％。细胞+aCD3表示细胞仅联合抗CD3，即没有h1A7或h3C8抗体(阴性对照)。
图16显示细胞活力数据，所述数据比较了针对非六聚体hIgG1对照的抗DR5抗体的RGY和RGY/LALAPG变体。
图17显示变异抗DR5抗体促进HEK293细胞凋亡的能力。活性数据代表细胞滴度仪glo测定法中抗体重链和轻链DNA转染24小时后的发光。
图18显示在变异抗DR5抗体相对于未转染细胞的细胞活力倍数(从图17计算)和h1A7抗OX40抗体针对相同单一、双重和三重RGY变体的T细胞活化倍数之间的相关性。
图19显示抗Tie2抗体的分析性SEC色谱图。
图20显示RGY抗Tie2的激动剂活性超过天然配体Ang1。
图21表明RGY抗Tie2相对于双价抗Tie2抗体显示强力的激动剂活性。使用商业均相时间解析荧光(HTRF)测定法(Cisbio)测量大鼠主动脉内皮细胞(RAEC)中的AKT(pAKT)磷酸化活性。
图22A和图22B显示Fc工程化的针对293细胞的抗DR5抗体的抗增殖活性。数据代表在转染后48小时(图22A)或22小时(图22B)的细胞活力。黑色线突出显示未转染变体、天然IgG1变体、IgG1LALAPG变体、RGY变体和RGY LALAPG变体的数据。22B中未转染细胞的标度表示0小时处的细胞活力。
图23显示ELISA数据，其显示LALAPG和LALAPG/K322A变体消除RGY六聚体抗体与人C1q的结合。
图24A和图24B显示Fc变异抗OX40抗体在Fc受体阻断抗体存在时(图24A)或不存在(图24B)对T细胞的活化。
图25A和图25B显示变异hu1A7抗OX40抗体在表达FcγRIIa和B7-1二者(图25A)或仅表达FcγRIIa(图25B)的L细胞存在下对T细胞的共活化。
图26A和图26B显示变异hu3C8抗OX40抗体在表达FcγRIIa和B7-1二者(图26A)或仅表达FcγRIIa(图26B)的L细胞存在下对T细胞的共活化。
图27显示变异hu1A7抗OX40抗体在仅表达FcγRIIa的L细胞存在下对T细胞的共活化。采用抗体进行的全部组均包括使用抗CD3抗体刺激CD3。
本发明实施方案的详细描述
I.定义
术语“多肽”或“蛋白质”在本文中互换地使用以指任意长度的氨基酸聚合物。该聚合物可以是线形或分支的，它可以包含修饰的氨基酸，并且它可以由非氨基酸隔断。该术语也包括已经天然地修饰或通过干预(例如，二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰，如与标记组分或毒素缀合)而修饰的氨基酸聚合物。在该定义范围内还包括例如这样的多肽，它们含有氨基酸的一个或多个类似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本领域已知的其他修饰。如本文所用的术语“多肽”和“蛋白质”特别涵盖抗体。
术语“抗体”在本文中以最广意义使用并且涵盖多种抗体结构物，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们显示出所需的抗原结合活性即可。术语“免疫球蛋白”(Ig)在本文中与抗体可互换使用。
抗体是天然存在的免疫球蛋白分子，其具有全部基于免疫球蛋白折叠的变动结构。例如，IgG抗体具有经二硫键结合以形成功能抗体的两条重链和两条轻链。每条重链和轻链本身包含“恒定”(C)区和“可变”(V)区。V区决定抗体的抗原结合特异性，而C区提供结构性支撑及在与免疫效应子的非抗原特异性相互作用时提供功能。抗体或抗体的抗原结合片段的抗原结合特异性是抗体与特定抗原特异性结合的能力。
术语“可变的”指这样的事实：可变结构域的某些部分在序列方面在抗体之间明显不同并且用于每个特殊抗体对其特殊抗原的结合作用和特异性中。然而，变异性并不在抗体的可变结构域范围内均匀分布。它集中于轻链可变结构域和重链可变结构域的三个区段(称作超变区)中。可变结构域的更高度保守部分称作构架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包括由三个高变区连接的大体上采取β折叠构型的四个FR，所述FR形成环，所述环连接该β折叠结构和在一些情况下形成该β折叠结构的部分。每条链中的高变区由FR密切接近地固定在一起，并且在高变区来自其他链的情况下，对形成抗体的抗原-结合部位作出贡献(参见Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))。恒定结构域不直接参与抗体与抗原结合，但是展示出多种效应子功能，如使抗体参与抗体依赖的细胞毒作用(ADCC)。
如本文所用，术语“高变区”或“HVR”指抗体可变结域的下述每个区域，所述区域在序列上高变(“互补决定区”或“CDR”)和/或形成结构上确定的环(“高变环”)，和/或含有抗原接触残基(“抗原触点”)。通常，抗体包含六个HVR：VH中三个(H1、H2、H3)和VL中三个(L1、L2、L3)。本文中的示例性HVR包括：
(a)出现在第26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)氨基酸残基处的高变环(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))；
(b)出现在第24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)氨基酸残基处的CDR(Kabat等人,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))；
(c)出现在氨基酸残基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)和93-101(H3)处的抗原触点(MacCallum等人,J.Mol.Biol.262:732-745(1996))；和
(d)(a)、(b)和/或(c)的组合，包括HVR氨基酸残基46-56(L2)、47-56(L2)、48-56(L2)、49-56(L2)、26-35(H1)、26-35b(H1)、49-65(H2)、93-102(H3)和94-102(H3)。
“构架”或“FR”指除高变区(HVR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由以下四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR序列和FR序列通常按以下序列出现在VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选地包含其抗原结合区。抗体片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双体抗体；串联双体抗体(taDb)、线性抗体(例如，美国专利号5,641,870，实施例2；Zapata等人,Protein Eng.8(10):1057-1062(1995))；单臂抗体，单一可变结构域抗体、微型抗体、单链抗体分子；从抗体片段形成的多特异性抗体(例如，包括但不限于Db-Fc、taDb-Fc、taDb-CH3、(scFV)4-Fc，二-scFv、双-scFv或串联(二、三)-scFv)；和双特异性T细胞衔接体(BiTE)。
木瓜蛋白酶消化抗体产生了两个相同的抗原结合片段，称作“Fab”片段，各自具有单个抗原结合位点，和一个残余“Fc”片段，该片段的名称反映其轻易结晶的能力。胃蛋白酶处理产生了具有两个抗原结合位点并且仍能够交联抗原的F(ab')2片段。
“Fv”是含有完整抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。这个区域由紧密、非共价缔合的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体组成。正是在这种格局中每个可变结构域的三个高变区相互作用以限定VH-VL二聚体表面上的抗原结合位点。总体上，这六个高变区向抗体赋予抗原结合特异性。然而，甚至单个可变结构域(或仅包含抗原特异的三个高变区的半个Fv)具有识别并结合抗原的能力，虽然以比完整结合位点更低的亲和力进行。
Fab片段还含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab’片段因在重链CH1结构域的羧基端处附加额外几个残基(包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸)而与Fab片段不同。Fab'-SH在本文是Fab'的名称，其中恒定结构域的半胱氨酸残基携带至少一个游离巯基。F(ab')2抗体片段最初作为成对的Fab片段产生，所述成对的Fab片段在它们之间具有铰合半胱氨酸。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。
来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可以基于其恒定域的氨基酸序列划分成两个明显不同类型(称作κ(κ)和λ(λ))之一。
取决于抗体重链恒定结构域的氨基酸序列，可以将抗体划分成不同的“类别”。存在五个大类的完整抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些类别中的几种可以进一步划分成亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。对应于不同类别抗体的重链恒定结构域分别称作α、δ、ε、γ和μ。不同类别的免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是熟知的。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包括抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单一多肽链中。在一些实施方案中，Fv多肽还包含在VH结构域和VL结构域之间的多肽接头，所述多肽接头能够使scFv形成用于抗原结合的所需结构。关于scFv的综述，参见Plückthun,引自Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编著,Springer-Verlag,New York,第269-315页(1994)。
术语“双体抗体”指具有两个抗原结合位点的抗体小片段，所述片段包括在相同的多肽链(VH-VL)中与轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)。通过使用太短以至于不能引起相同链上两个结构域之间配对的接头，这些结构域被迫与另一条链的互补性结构域配对并且产生两个抗原结合位点。在例如EP 404,097；WO 93/11161；和Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)中更充分地描述双体抗体。
术语“多特异性抗体”以最广意义使用并且特别地涵盖具有多表位特异性的抗体。这类多特异性抗体包括，但不限于包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的抗体，其中所述VHVL单元具有多表位特异性；具有两个或更多个VL结构域和VH结构域的其中每个VHVL单元与不同表位结合的抗体、具有两个或更多个单一可变结构域的其中每个单一可变结构域与不同表位结合的抗体；全长抗体；抗体片段如Fab、Fv、dsFv、scFv、双体抗体、双特异性双体抗体、三体抗体、三功能性抗体、已经共价或非共价连接的抗体片段。“多表位特异性”指与相同靶或不同靶上两个或更多个不同表位特异性结合的能力。“单特异性”指仅结合一个表位的能力。根据一个实施方案，所述多特异性抗体是以5μM至0.001pM、3μM至0.001pM、1μM至0.001pM、0.5μM至0.001pM或0.1μM至0.001pM的亲和力与每个表位结合的IgG抗体。
表述“单结构域抗体”(sdAb)或“单一可变结构域(SVD)抗体”通常指其中单一可变结构域(VH或VL)可以赋予抗原结合作用的抗体。换而言之，单一可变结构域不需要与另一个可变结构域相互作用以识别靶抗原。单结构域抗体的例子包括源自骆驼科(美洲驼和骆驼)和软骨鱼(例如，铰口鲨)的那些和源自来自人和小鼠抗体的重组方法的那些((Nature(1989)341:544-546；Dev Comp Immunol(2006)30:43-56；Trend Biochem Sci(2001)26:230-235；Trends Biotechnol(2003):21:484-490；WO2005/035572；WO 03/035694；FebsLett(1994)339:285-290；WO00/29004；WO 02/051870))。
如本文中所用的术语“单克隆抗体”指从基本上均一的抗体群体获得的抗体，即，构成该群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位，除了在产生该单克隆抗体期间可能出现的可能变体之外，此类变体通常以微小的量存在。与一般包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗体也有优势，在于它们不被其他免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆的”指示该抗体的特征为从基本上同质的抗体群体获得，并且不得解释为要求通过任何特殊方法产生该抗体。例如，根据本文提供的方法待使用的单克隆抗体可以通过由Kohler等人,Nature 256:495(1975)首次描述的杂交瘤方法产生，或可以通过重组DNA方法产生(参见例如，美国专利号4,816,567)。“单克隆抗体”也可以使用例如在Clackson等人,Nature352:624-628(1991)和Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1991)中描述的技术从噬菌体抗体文库分离。
本文中的“单克隆抗体”特别包括这些“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的部分与源自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体以及这种抗体的片段中的相应序列相同或同源，同时所述链的其余部分与源自另一个物种或属于另一个抗体类别或亚类的抗体以及这种抗体的片段中的相应序列相同或同源，只要它们显示所需的生物学活性(美国专利号4,816,567；Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984))。本文的目的嵌合抗体包括灵长类化抗体，所述灵长类化抗体包含源自非人灵长类(例如，例如旧世界猴，如狒狒、恒河猴或食蟹猴)的可变结构域抗原结合序列和人恒定区序列(美国专利号5,693,780)。
出于本文目的，“接纳体人类构架”是这样的构架，其包含从如下文定义的人免疫球蛋白构架或人共有序列构架衍生的轻链可变结构域(VL)构架或重链可变结构域(VH)构架的氨基酸序列。“衍生自”人免疫球蛋白构架或人共有构架的接纳体人类构架可以包含其相同的氨基酸序列，或它可以含有氨基酸序列变化。在一些实施方案中，氨基酸变化的数目是10或更小、9或更小、8或更小、7或更小、6或更小、5或更小、4或更小、3或更小、或2或更小。在一些实施方案中，VL接纳体人类构架在序列上与VL人免疫球蛋白构架序列或人类共有构架序列相同。
“人类共有构架”是这样的构架，它代表在人免疫球蛋白VL或VH构架序列的选项中最常出现的氨基酸残基。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列的选项来自可变结构域序列的亚组。通常，所述的序列亚组是如Kabat等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,Fifth Edition,NIH Publication 91-3242,Bethesda MD(1991),卷1-3中那样的亚组。在一个实施方案中，对于VL，该亚组是如Kabat等人(如上)中描述的亚组κI。在一个实施方案中，对于VH，该亚组是如Kabat等人(如上)中描述的亚组III。
非人(例如，小鼠)抗体的“人源化”形式是含有从非人免疫球蛋白衍生的最少序列的嵌合抗体。对大部分情况而言，人源化抗体是这些人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自所述受体的高变区中的残基由来自非人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物的具有所需特异性、亲和力和能力的高变区中的残基替换。在一些情况下，人免疫球蛋白的构架区(FR)残基由相应的非人残基替换。另外，人源化抗体可以包含在受体抗体中或在供体抗体中不存在的残基。作出这些修饰以进一步完善抗体性能。通常，人源化抗体将包含基本上全部的至少一个和一般两个可变结构域，其中全部或基本上全部的高变环与非人免疫球蛋白的那些高变环对应并且全部或基本上全部的FR区是人免疫球蛋白序列的那些FR，例外是如上所示的一个或多个FR取代。人源化抗体任选地还将包含免疫球蛋白恒定区的至少部分、通常人免疫球蛋白的恒定区的至少部分。对于进一步细节，参见Jones等人,Nature321:522-525(1986)；Reichmann等人,Nature 332:323-329(1988)；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。
“人抗体”是这样一种抗体，其拥有对应于人或人细胞产生的抗体的氨基酸序列或从利用人抗体库或其他编码人抗体的序列的非人来源衍生。人抗体的这种定义特别排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
在一些实施方案中，抗体“效应子功能”指归因于抗体Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的那些生物活性，并随抗体同种型而变动。抗体效应子功能的例子包括：C1q结合和补体依赖细胞毒性(CDC)；Fc受体结合作用和抗体依赖的细胞介导细胞毒性(ADCC)；吞噬；下调细胞表面受体。
“依赖抗体的细胞介导细胞毒性”或“ADCC”指细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒细胞(例如，天然杀伤(NK)细胞、中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上结合的抗体并且随后造成靶细胞的裂解。用于介导ADCC的主要细胞即NK细胞，仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达在Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol 9:457-92(1991)第464页的表3中总结。为了评估目的分子的ADCC活性，可以进行体外ADCC测定法，如美国专利号5,500,362或5,821,337中描述的那种测定法。用于此类测定法的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。备选或另外，可以在体内，例如，在动物模型中，如在Clynes等人,Proc.Natl.Acad.Set(USA)95:652-656(1998)公开中的那种动物模型中评估目的分子的ADCC活性。
“人效应细胞”是表达一种或多种FcR并执行效应子功能的白细胞。在一些实施方案中，细胞至少表达FcγRIII并且进行ADCC效应子功能。介导ADCC的人白细胞的实例包括外周血单核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒T细胞和中性粒细胞，优选的PMBC和NK细胞。
“补体依赖细胞毒性”或“CDC”指分子在补体存在下裂解靶的能力。补体激活途径始于补体***的第一组分(C1q)与复合于同族抗原的分子(例如，多肽(例如，抗体)的结合。为评估补体激活，可以进行CDC测定法，例如，如Gazzano-Santoro等人,J.Immunol.Methods202:163(1996)中所述。
术语“Fc受体”或“FcR”用来描述与抗体的Fc区结合的受体。在一些实施方案中，FcR是天然序列人FcR。
另外，优选的FcR是结合IgG抗体的一种受体(γ受体)并且包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位变体和可变剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(激活性受体)和FcγRIIB(抑制性受体)，它们具有主要在其胞质域内不同的相似氨基酸序列。激活性受体FcγRIIA在其胞质域中含有基于酪氨酸的免疫受体激活基序(ITAM)。抑制性受体FcγRIIB在其胞质域中含有基于酪氨酸的免疫受体抑制基序(ITIM)(参见Daeron,Annu.Rev.Immunol.15:203-234(1997))。FcR在Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol 9:457-92(1991)；Capel等人,Immunomethods 4:25-34(1994)；和deHaas等人,J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)中综述。本文中的术语“FcR”涵盖其他FcR，包括将来待鉴定的那些。该术语还包括负责母体IgG转移至胎儿的新生儿受体FcRn(Guyer等人,J.Immunol.117:587(1976)和Kim等人,J.Immunol.24:249(1994))。
如本文所用，术语“Fc区”通常指包含免疫球蛋白重链C末端多肽序列的二聚体复合体，其中C末端多肽序列是通过木瓜蛋白酶消化完整抗体可获得的多肽序列。Fc区可以包含天然或变体Fc序列。虽然免疫球蛋白重链的Fc序列的界限可能变动，但是通常将人IgG重链Fc序列限定为从大约位置Cys226或从大约位置Pro230处的氨基酸残基延伸至Fc序列的羧基端。除非本文中另外说明，否则Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号根据如Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interes,第5版,Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中所述的EU编号体系，也称作EU index。免疫球蛋白的Fc序列总体上包含2个恒定结构域、CH2结构域和CH3结构域，和任选地包含CH4结构域。本文中“Fc多肽”意指构成Fc区(例如，单聚Fc)的多肽之一。Fc区可以从任何合适的免疫球蛋白如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型、IgA、IgE、IgD或IgM获得。Fc区包含由二硫键结合在一起的两条H链的羧基末端部分。抗体的效应子功能由Fc区中的序列决定；该区域还是由某些类型细胞上存在的Fc受体(FcR)识别的部分。在一些实施方案中，Fc多肽包含部分或全部的野生型铰链序列(通常在其N末端)。在一些实施方案中，Fc多肽不包含有功能的或野生型铰链序列。
“修饰的Fc区”或“Fc变体”包含因至少一个氨基酸修饰、优选地一个或多个氨基酸置换而不同于天然序列Fc区的氨基酸序列。优选地，与天然序列Fc区或与亲本多肽的Fc区相比，修饰的Fc区在天然序列Fc区中或在亲本多肽的Fc区中具有至少一个氨基酸置换，例如约一个至约十个氨基酸置换，并且优选地，约一个至约五个氨基酸置换。本文中修饰的Fc区将优选地与天然序列Fc区和/或与亲本多肽的Fc区具有至少约80％同源性，并最优选地与之具有至少约90％同源性，更优选地与之具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同源性。
如本文所用的术语“激动剂”、“激动性”、“激动作用”或“激动”通常指这样的结合分子(例如，抗原结合多肽或抗原结合复合体)，所述结合分子与细胞表面上的受体结合并能够启动/模拟/刺激与受体的天然配体引发/模拟/刺激的反应或活性相似或相同的反应或活性。在示例性实施方案中，如本文所述的激动剂能够诱导/增进/增强/刺激与受体相关信号转导途径的激活。
除非另外说明，否则如本文所用，术语“细胞表面受体”指来自任何脊椎动物来源的任何天然的细胞表面受体，所述脊椎动物来源包括哺乳动物如灵长类(例如，人类)和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。术语涵盖“全长”、未加工的细胞表面受体以及因细胞中加工而产生的任何形式的细胞表面受体。本术语还涵盖细胞表面受体的天然存在变体，例如，剪接变体或等位变体。
术语“癌症”和“癌性的”指或描述哺乳动物中一般以失调的细胞生长为特征的生理状况。这个定义中包括良性癌和恶性癌。癌症的例子包括但不限于癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病。这类癌的更具体例子包括上皮卵巢癌、输卵管癌、原发性腹膜癌、鳞状细胞癌、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(gastric cancer)或胃癌(stomach cancer)(包括胃肠道癌)、胰腺癌、成胶质细胞瘤、***、卵巢癌(包括铂敏感性和铂耐药性卵巢癌)、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、输卵管、腹膜、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾(kidney)或肾(renal)癌、肝癌、***癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌和各种类型的头颈癌、以及B细胞淋巴瘤(包含低级别/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞(SL)NHL；中间级别/滤泡性NHL；中间级别弥漫性NHL；高级别成免疫细胞的NHL；高级别成淋巴细胞NHL；高级别小无核裂细胞NHL；块性病变NHL；外套细胞淋巴瘤；AIDS相关淋巴瘤；和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症)；慢性淋巴细胞白血病(CLL)；成急性淋巴细胞性白血病(ALL)；多毛细胞白血病；慢性成髓细胞白血病；和移植后淋巴细胞增生性疾病(PTLD)、以及与斑痣性错构瘤病相关的异常血管增生、水肿(如与脑肿瘤相关的水肿)和梅格斯综合征。
“亲和力成熟的”抗体指在一个或多个高变区(HVR)中存在一个或多个改变的抗体，其中与不拥有这些改变的亲本抗体相比，这类改变导致抗体对抗原的亲和力改善。
活性剂(例如，药物制剂)的“有效量”指有效实现所需治疗性或预防性结果的量，以实现前述结果的剂量和持续实现前述结果所需要的时间段。
术语“全长抗体”、“完好抗体”和“完整抗体”在本文中可互换地用来指一种抗体，所述抗体具有基本上与天然抗体结构相似的结构或具有含有如本文定义的Fc区的重链。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”互换使用并且指已经向其中引入外源核酸的细胞，包括这类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，其包括原代转化细胞和从其衍生的后代，而无论传代次数是多少。后代可以在核酸内容方面不与亲本细胞完全相同，反而可以含有突变。本文包括具有与在最初转化细胞中筛选或选择所针对的相同功能或生物学活性的突变后代。
除非另外说明，否则HVR残基和可变结构域中的其他残基(例如，FR残基)在本文中根据上文Kabat等人编号。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯化动物(例如，奶牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类(例如，人和非人灵长类如猴)、兔和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或受试者是人。
“分离的”抗体是已经与其自然环境的组分分离的一种抗体。在一些实施方案中，将抗体纯化至大于95％或99％纯度，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳法)或色谱(例如，离子交换或反相HPLC)所确定。关于评估抗体纯度的方法的综述，参见例如Flatman等人,J.Chromatogr.B848:79-87(2007)。
“分离的”核酸指已经与其自然环境的组分分离的核酸分子。分离的核酸包括含于细胞内的核酸分子，所述细胞通常含有该核酸分子，但是该核酸分子存在于染色体外或与其天然染色***置不同的染色***置处。
“天然抗体”是指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异四聚糖蛋白，包含二硫键键合的两个相同的轻链和两个相同的重链。每一重链从N-至C-末端具有可变区(VH)，也称为可变重结构域或重链可变结构域，随后是三个恒定结构域(CHI、CH2和CH3)。类似地，从N至C末端，每一轻链具有可变区(VL)，也称为可变轻结构域或轻链可变结构域，其后是恒定轻结构域(CL)。基于抗体轻链恒定结构域的氨基酸序列，抗体的轻链可以分配为称为κ(κ)和λ(λ)的两种之一。
相对于参考多肽序列，将“氨基酸序列同一性百分数(％)”定义为比对序列并根据需要引入空位以实现最大序列同源性百分数并且不考虑任何保守性置换作为序列同一性的部分之后，候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分数。为了确定氨基酸序列同一性百分数的比对可以按本领域能力范围内的多种方式实现，例如，使用可公开获得的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适宜参数，包括为实现正在比较的全长序列范围内最大比对所需要的任何算法。然而，出于本文目的，使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生氨基酸序列同一性％值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech,Inc.授权，并且源代码已经随用户文档提交至华盛顿特区20559的美国版权局，在那里它以美国版权登记号TXU510087登记。ALIGN-2程序从Genentech,Inc.,South San Francisco,加利福尼亚州可公开获得或可以从源代码汇编。应当将ALIGN-2程序汇编在UNIX操作***(包括数字式UNIX V4.0D)上使用。全部序列比较参数由ALIGN-2程序设定并且不变动。
在使用ALIGN-2比较氨基酸序列的情况下，如下计算给定氨基酸序列A与给定氨基酸序列B、同给定氨基酸序列B或针对给定氨基酸序列B(这可以备选地描述为与给定氨基酸序列B、同给定氨基酸序列B或针对给定氨基酸序列B具有或包含某个氨基酸序列同一性％的给定氨基酸序列A)的氨基酸序列同一性％：
100乘以分数X/Y
其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对结果中评定为相同匹配的氨基酸残基的数目，并且其中Y是B中氨基酸残基的总数。将可以理解在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A相对于B的氨基酸序列同一性％将不等于B相对于A的氨基酸序列同一性％。除非另外特别声明，否则本文所用的全部氨基酸序列同一性值％如紧接前段中所述那样使用ALIGN-2计算机程序获得。
术语“药物组合物”或“药物制剂”指一种制备物，所述制备物处于这类形式从而允许其中所含的有效成分的生物学活性有效，并且不含有对于将会施用该制剂的受试者不可接受地有毒的额外组分。
“可药用载体”指药物制剂中除有效成分之外的对受试者无毒的成分。可药用载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
如本文所用，术语“载体”指能够增殖与其连接的另一种核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制型核酸结构的载体以及并入宿主细胞基因组的载体，其中已经在宿主细胞中导入了该载体。某些载体能够指导与它们有效连接的核酸表达。此类载体在本文中称作“表达载体”。
II.具有激动剂活性的抗原结合复合体
本文中提供与至少一种细胞表面受体结合并具有激动活性的抗原结合复合体(例如，激动剂抗原结合复合体)。该复合体可以包含二、三、四、五、六或更多条抗原结合多肽。在示例性实施方案中，抗原结合复合体包含六条抗原结合多肽，因而形成六聚体。
在某些实施方案中，形成复合体的抗原结合多肽不在复合体中时具有激动剂活性(例如，处于其天然双价形式的抗体可以具有激动剂活性)。在这类实施方案中，抗原结合多肽的激动剂活性可以在复合体的背景下增加，例如，包含六种抗体亚单位的复合体可以具有比天然双价抗体更大的激动剂活性。在其它实施方案中，形成复合体的抗原结合多肽在未复合的形式下不具有激动剂活性(例如，处于其天然双价形式的抗体不具有激动剂活性)，但当形成复合体时具有激动剂活性。
在某些实施方案中，形成复合体的全部抗原结合多肽可以是相同的，例如，由相同单特异性抗体、相同双特异性抗体、相同多特异性抗体、相同DAF等的六个亚单位组成的六聚体。在某些实施方案中，复合体可以由两个或更多个不同的抗原结合多肽组成。例如，复合体可以由至少两种与相同靶上不同表位结合的不同抗体、二种与不同靶结合的不同抗体、至少两种不同的双特异性抗体(双特异性抗体的每条臂可以与相同靶上的不同表位或二种不同靶结合)、至少两种不同的DAF等组成。在一个实施方案中，复合体包含与相同细胞表面受体上不同表位结合的至少两种不同抗体。在另一个实施方案中，复合体包含双特异性抗体，其中双特异性抗体的每条臂与相同细胞表面受体上的不同表位结合。
在一个实施方案中，抗原结合复合体包含均与相同靶结合的六种抗体。
在另一个实施方案中，抗原结合复合体包含六种抗体，其中所述抗体至少之一与第一靶结合并且所述抗体至少之一与第二靶结合。在这类实施方案中，复合体中抗体1/抗体2的比率可以是任何可能的组合，例如，1个抗体亚单位与靶1结合并且5个抗体亚单位与靶2结合、2个抗体亚单位与靶1结合并且4个抗体亚单位与靶2结合，3个抗体亚单位与靶1结合并且3个抗体亚单位与靶2结合，4个抗体亚单位与靶1结合并且2个抗体亚单位与靶2结合或5个抗体亚单位与靶1结合并且1个抗体亚单位与靶2结合。可以通过混合所需比率的抗体1/抗体2(例如，1:1以形成具有相等份数抗体1和抗体2的复合体)并且允许复合体自我装配，控制构成复合体的抗体的比率。备选地，可以通过使用不同抗体中这样的Fc突变，控制构成复合体的抗体的比率，所述Fc突变不促进自我装配，而仅促进与具有不同Fc突变(这类突变在下文进一步描述)的抗体装配。在一个示例性实施方案中，抗体1和抗体2与异二聚化的细胞表面受体结合。
在另一个实施方案中，抗原结合复合体包含六种抗体，其中所述抗体的至少三种、四种、五种或全部六种与不同的靶结合。在一个实施方案中，抗原结合复合体包含各自与不同靶结合的六种抗体或亚单位。
在另一个实施方案中，抗原结合复合体包含与相同的靶集合结合的六个双特异性抗体(或DAF)。
在另一个实施方案中，抗原结合复合体包含六个双特异性抗体(或DAF)，其中所述双特异性抗体至少之一与抗原1和2结合并且所述双特异性抗体至少之一与抗原3和4结合。如上文对单特异性抗体复合体所述，本文中构思复合体内双特异性1/双特异性2的任何比率。
在另一个实施方案中，抗原结合复合体包含六个双特异性抗体，其中所述双特异性抗体的至少三个、四个、五个或全部六个与不同的靶集合结合。在一个实施方案中，抗原结合复合体包含各自与不同的靶集合结合的六个双特异性抗体(例如，复合体与12种不同靶结合)。
在一些实施方案中，抗原结合复合体包含六个亚单位，其中每个亚单位包含具有两条重链和两条轻链的抗体。在一些实施方案中，每条重链包含重链可变结构域(VH)和一组重链恒定域，例如，CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域并且任选地(例如，对于IgM或IgE抗体)CH4结构域。在一些实施方案中，每条轻链包含轻链可变结构域(VL)和轻链恒定(CL)结构域(例如，κ或λ)。在一些实施方案中，每个亚单位的重链包含一个或多个促进六聚体形成的修饰，例如，如下文描述。在一些实施方案中，每个亚单位的重链包含一个或多个减少效应子功能的修饰，例如，如下文描述。
在示例性实施方案中，本申请提供一种包含六个抗体的激动剂抗原结合复合体，其中抗体包含人IgG1Fc区，所述Fc区包含促进六聚体形成的E345R、E430G和S440Y修饰。
在另一个示例性实施方案中，本申请提供一种包含六个抗体的激动剂抗原结合复合体，其中抗体包含人IgG1Fc区，所述Fc区包含促进六聚体形成的E345R、E430G和S440Y修饰和一个或多个减少效应子功能的修饰。
在另一个示例性实施方案中，本申请提供一种包含六个抗体的激动剂抗原结合复合体，其中抗体包含人IgG1Fc区，所述Fc区包含促进六聚体形成的E345R、E430G和S440Y修饰和减少效应子功能的L234A、L235A和P329G修饰。
抗原结合多肽
适于形成本文所述复合体的抗原结合多肽至少包含针对细胞表面受体的抗原结合区和增强Fc区之间分子间相互作用(例如，复合体形成如六聚体形成)的修饰的Fc区。本文所述的抗原结合多肽可以包含抗体、抗体的与Fc区融合的抗原结合区(例如，抗体片段)、或与Fc区融合的非抗体的抗原结合区蛋白。在示例性实施方案中，抗原结合多肽是与细胞表面受体结合并具有修饰的Fc区的抗体。
本文所述的抗原结合多肽一般各自含有至少两条多肽。特别地，每条抗原结合多肽的Fc区是在两条多肽之间形成的二聚体(如下文进一步所述的同型二聚体或异二聚体)。类似地，与Fc区的多肽之一连接的抗原结合区可以含有两条多肽，例如，当抗原结合区是抗体片段时，它可以含有重链可变区和轻链可变区。因此，在一个实施方案中，作为抗体的抗原结合多肽包含4条多肽链，例如，两条重链(包含重链可变区和Fc结构域)和两条轻链(包含轻链可变区)。包含六个这类抗原结合多肽的复合体因此含有24条多肽(例如，6个亚单位各自包含2条重链和2条轻链)。
抗体
在某些实施方案中，本文提供的抗原结合多肽是嵌合抗体。某些嵌合抗体例如在美国专利号4,816,567；和Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))中描述。在一个例子中，嵌合抗体包含非人类可变区(例如，源自小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人灵长类如猴的可变区)和人类恒定区。在又一个例子中，嵌合抗体是“类转换”抗体，其中类或亚类已经相对亲本抗体发生改变。
在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。一般地，将非人抗体人源化以降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含其中HVR例如CDR(或其部分)源自非人抗体并且FR(或其部分)源自人抗体序列的一个或多个可变结构域。人源化抗体任选地也将包含人恒定区的至少一部分。在一些实施方案中，将人源化抗体中的一些FR残基置换为来自非人类抗体(例如，从中衍生HVR残基的抗体)的相应残基，例如，以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
人源化抗体和制造它们的方法综述于例如Almagro和Fransson，Front.Biosci.13:1619-1633(2008)中，并且例如还在Riechmann等人,Nature332:323-329(1988)；Queen等人,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 86:10029-10033(1989)；美国专利号5,821,337,7,527,791,6,982,321,和7,087,409；Kashmiri等人,Methods 36:25-34(2005)(描述特异性决定区(SDR)移植)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述“表面重塑(resurfacing)”)；Dall'Acqua等人,Methods 36:43-60(2005)(描述“FR改组”)；和Osbourn等人,Methods36:61-68(2005)和Klimka等人,Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述针对FR改组的“导向选择”方案)中描述。
可以用于人源化的人构架区包括但不限于：使用“最佳配合”法选择的构架区(参见例如Sims等人,J.Immunol.151:2296(1993))；从具有特定亚组的轻链可变区或重链可变区的人抗体的共有序列衍生的构架区(参见例如Carter等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89:4285(1992)；和Presta等人,J.Immunol.,151:2623(1993))；人成熟(体细胞突变)构架区或人种系构架区(参见例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；和从筛选FR文库衍生的构架区(参见例如Baca等人,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)和Rosok等人,J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。
在某些实施方案中，本文提供的抗原结合多肽是人抗体。可以使用本领域已知的多种技术产生人抗体。人抗体总体上在van Dijk和van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)和Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)中描述。
可以通过施用免疫原至转基因动物制备人抗体，其中所述转基因动物已经被修饰成响应于抗原攻击而产生完整人抗体或具有人可变区的完整抗体。这类动物一般含有替换内源免疫球蛋白基因座或在染色体外存在或随机整合入动物染色体的全部或部分人免疫球蛋白基因座。在这类转基因小鼠中，内源免疫球蛋白基因座通常已经失活。关于从转基因动物获得人抗体的方法的综述，见Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。还参见例如描述XENOMOUSETM技术的美国专利号6,075,181和6,150,584；描述技术的美国专利号5,770,429；描述K-M技术的美国专利号7,041,870，和描述VELOCI技术的美国专利申请公开号US2007/0061900)。可以进一步修饰来自这类动物产生的完整抗体的人可变区，例如，通过与不同的人类恒定区组合。
也可以通过基于杂交瘤的方法产生人抗体。已经描述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤细胞系和小鼠-人杂合骨髓瘤细胞系。(参见例如Kozbor J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等人,Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications,第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；和Boerner等人,J.Immunol.,147:86(1991))。借助人B-细胞杂交瘤技术产生的人抗体也在Li等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA，103:3557-3562(2006)中描述。额外的方法包括例如在美国专利号7,189,826(描述从杂交瘤细胞系产生单克隆人IgM抗体)和Ni,Xiandai Mianyixue,26(4):265-268(2006)(描述人-人杂交瘤)中描述的那些。人杂交瘤技术(三体瘤技术)还在Vollmers和Brandlein,Histology and Histopathology,20(3):927-937(2005)以及Vollmers和Brandlein,Methods and Findings in Experimental and ClinicalPharmacology,27(3):185-91(2005)中描述。
也可以通过分离从人衍生的噬菌体展示文库中选择的Fv克隆可变结构域序列产生人抗体。这类可变结构域序列随后可以与所需的人恒定结构域组合。下文描述用于从抗体文库选出人抗体的技术。
在某些实施方案中，本文提供的抗原结合多肽是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，结合特异性之一是用于细胞表面受体，其他结合特异性是任何其他抗原。在某些实施方案中，双特异性抗体可以结合至相同或不同细胞表面受体的两个不同表位。双特异性抗体也可用于将细胞毒性剂定位至表达细胞表面受体的细胞。
用于制备多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两种免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(参见Milstein和Cuello,Nature 305:537(1983)),WO 93/08829,和Traunecker等人,EMBO J.10:3655(1991))和“结入扣(knob-in-hole)”工程技术(参见例如美国专利号5,731,168)。也可以通过用于制备抗体Fc异二聚体分子的工程静电转向效应制备多特异性抗体(WO 2009/089004A1)；交联两个或多个抗体或片段(参见例如美国专利号4,676,980和Brennan等人，Science，229：81(1985))；使用亮氨酸拉链产生双特异性抗体(参见例如Kostelny等人,J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992))；使用“双体抗体”技术制备双特异性抗体片段(参见例如Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993))；和使用单链Fv(sFv)二聚体(参见例如Gruber等人,J.Immunol.,152:5368(1994))；和制备如Tutt等人J.Immunol.147:60(1991)所述的三特异性抗体。
具有三个或更多个功能性抗原结合位点(包括“章鱼抗体(Octopusantibodies)”)的工程抗体也包括在本文中(参见例如US 2006/0025576A1)。
本文的抗体或片段还包括包含与细胞表面受体和另一不同抗原结合的抗原结合位点的“双作用FAb”或“DAF”(参见例如US 2008/0069820)。
可以通过对组合文库筛选具有所需活性或多种活性的多肽，分离适合作为如本文所述的抗原结合多肽的抗体。例如，本领域已知用于产生噬菌体展示文库并对这类文库筛选拥有所需结合特征的抗体的多种方法。这类方法例如综述于Hoogenboom等人，引自Methods in Molecular Biology178:1-37(O'Brien等人编著,Human Press,Totowa,NJ,2001)中并且例如还在McCafferty等人,Nature 348:552-554；Clackson等人,Nature 352:624-628(1991)；Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks和Bradbury,引自Methods in Molecular Biology 248:161-175(Lo编著,Human Press,Totowa,NJ,2003)；Sidhu等人,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等人,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；和Lee等人,J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004)中描述。
在某些噬菌体展示法中，VH基因和VL基因的库分别由聚合酶链反应(PCR)克隆并且在噬菌体文库中随机重组，其中随后可以对所述噬菌体文库筛选结合抗原的噬菌体，如Winter等人,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)中所述。噬菌体一般将抗体片段展示为单链Fv(scFv)片段或展示为Fab片段。来自已免疫来源的文库提供针对免疫原的高亲和力抗体，无需构建杂交瘤。备选地，可以(例如，从人)克隆天然库以在不进行任何免疫的情况下，提供针对广泛类型非自身抗原的抗体和还针对自身抗原的抗体的单一来源，如Griffiths等人,EMBO J,12:725-734(1993)所述。最后，也可以通过从干细胞克隆未重排的V-基因区段并使用含有随机序列以编码高度可变的CDR3区并实现体外重排的PCR引物，合成地产生天然文库，如Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)所述。描述人抗体噬菌体文库的专利公布例如包括：美国专利号5,750,373和美国专利公开号2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936和2009/0002360。将从人抗体文库分离的抗体或抗体片段视为是本文中的人抗体或人抗体片段。
抗体的抗原结合区
在某些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽包含与细胞表面受体结合的抗原结合区和Fc区。在一个示例性实施方案中，本文所述的抗原结合多肽包含与融合于Fc区的细胞表面受体结合的抗体的抗原结合区。在示例性实施方案中，抗体的抗原结合区涉及抗体片段，例如，Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、Fv和scFv片段和下文描述的其他片段。有关某些抗体片段的综述，参阅Hudson等人，Nat.Med.9:129-134(2003)。关于scFv片段的综述，参见例如Pluckthün，在The Pharmacology of Monoclonal Antibodies中,113卷,Rosenburg和Moore编著(Springer-Verlag,New York),pp.269-315(1994)；也见WO 93/16185；和美国专利号5,571,894和5,587,458。关于包含补救受体结合表位残基和具有增加的体内半寿期的Fab和F(ab')2片段的讨论，参见美国专利号5,869,046。
双体抗体(diabodies)是可能为二价或双特异性的具有两个抗原结合位点的抗体片段。参见例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人,Nat.Med.9:129-134(2003)；和Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)。Hudson等人,Nat.Med.9:129-134(2003)中也描述了三体抗体(triabodies)和四体抗体(tetrabodies)。
单结构域抗体是包含抗体的全部或部分重链可变结构域或者全部或部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA；参见例如美国专利号6,248,516B1)。
可以通过多种技术制备抗体片段，包括但不限于完好抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞(例如，大肠杆菌或噬菌体)产生，如本文所述。抗体片段可以从本文所述的任何抗体产生，所述抗体例如包括单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、DAF抗体等抗体样式。
本文所述的抗原结合区可以包含一个或多个多肽。在某些实施方案中，抗原结合区包含一个多肽，例如其中抗体的重链可变区和轻链可变区经接头连接的单链Fv(scFv)。在其他实施方案中，抗原结合区包含两个多肽，例如其中重链可变区和轻链可变区由多肽链分隔的Fab抗体片段，其中所述的多肽链天然地缔合以形成具有6个CDR的抗原结合区。
非抗体抗原结合区
在某些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽包含与细胞表面受体结合的抗原结合区和Fc区。在一个示例性实施方案中，本文所述的抗原结合多肽包含与融合于Fc区的细胞表面受体结合的非抗体的抗原结合区。非抗体抗原结合区的例子例如包括与细胞表面受体结合的配体、配体片段或其多聚体。下文描述与OX40结合的非抗体抗原结合区的例子。与Tie2结合的非抗体结合区的例子在WO 2008/049227中描述。
抗原结合区与Fc区的接合
本文所述的抗原结合区(抗体衍生的抗原结合区和非抗体抗原结合区)可以与如本文所述的变异Fc区融合。用于共价接合两种多肽的任何方法可以用来将抗原结合区与Fc结构域融合在一起，所述方法例如包括表达为单一多肽(在具有或没有间插性多肽接头的情况下)、化学键或借助聚合物基团(如，例如，单一或分枝的聚乙二醇(PEG)接头)的键。在某些实施方案中，接头可以是可切割接头。
在某些实施方案中，接头可以是多肽接头。在一个实施方案中，多肽接头是来自抗体的铰链序列或其变体。例如，铰链序列可以包含抗体(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体)的氨基酸残基216-238(EU编号)或其片段或衍生物。在一个示例性实施方案中，基于铰链的接头包含序列CDKTHTCPPCPAPELLGGP(SEQ ID NO:219)或其片段或衍生物。在某些实施方案中，多肽接头可以是长度不同(例如，5、10、15、20、25、30、35、40、45、50或更多个氨基酸)的柔性接头。合适的接头是本领域已知的，参见例如Protein Engineering,9(3),299-305,1996。示例性肽接头例如包括：
Ser
Gly-Ser
Gly-Gly-Ser
Ser-Gly-Gly
Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:220)
Ser-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO:221)
Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:222)
Ser-Gly-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO:223)
Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:224)
Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO:225)
Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:226)
Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO:227)
(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n(SEQ ID NO:228)和
(Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)n(SEQ ID NO:229)
其中n是不小于1的整数。在某些实施方案中，n可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20。
在某些实施方案中，接头可以是化学接头。合适的化学接头是本领域已知和市售的。示例性化学接头例如包括N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、辛二酸二琥珀酰亚胺酯(DSS)、双(磺基琥珀酰亚胺)辛二酸酯(BS3)、二硫代双(琥珀酰亚胺丙酸酯))(DSP)、二硫代双(磺基琥珀酰亚胺丙酸酯)(DTSSP)、乙二醇双(琥珀酰亚胺琥珀酸酯)(EGS)、乙二醇双(磺基琥珀酰亚胺琥珀酸酯)(磺基-EGS)、二琥珀酰亚胺酒石酸酯(DST)、二磺基琥珀酰亚胺酒石酸酯(磺基-DST)、双[2-(琥珀酰亚胺氧羰基氧基)乙基]砜(BSOCOES)和双[2-(磺基琥珀酰亚胺氧羰基氧基)乙基]砜(磺基-BSOCOES)。
在某些实施方案中，抗体的抗原结合区作为具有Fc结构域的单一多肽表达。由于Fc结构域是二聚体，Fc二聚体中所含的每条多肽可以与抗体的抗原结合区融合(例如，如此融合，从而六聚体复合体含有12个抗原结合区)，或仅Fc二聚体中所含的多肽之一可以与抗体的抗原结合区融合(例如，如此融合，从而六聚体复合体含有6个抗原结合区)。在一个示例性实施方案中，Fc二聚体中的每条多肽与Fab片段融合，从而六聚体复合体含有12个Fab片段。在一个示例性实施方案中，仅Fc二聚体中的多肽之一与Fab片段融合，从而六聚体复合体含有6个Fab片段。在一个示例性实施方案中，Fc二聚体中的每条多肽与F(ab’)2片段融合，从而六聚体复合体含有12个F(ab’)2片段。在一个示例性实施方案中，仅Fc二聚体中的多肽之一与F(ab’)2片段融合，从而六聚体复合体含有6个F(ab’)2片段。
在某些实施方案中，非抗体抗原结合区作为具有Fc结构域的单一多肽表达。由于Fc结构域是二聚体，Fc二聚体中所含的每条多肽可以与非抗体抗原结合区融合(例如，如此融合，从而六聚体复合体含有12个非抗体抗原结合区)，或仅Fc二聚体中所含的多肽之一可以与非抗体抗原结合区融合(例如，如此融合，从而六聚体复合体含有6个非抗体抗原结合区)。
包含OX40激动剂的抗原结合区
在一个实施方案中，本文所述的抗原结合多肽包含结合于并且激动人OX40的抗原结合区。在某些实施方案中，抗原结合多肽包含抗人OX40激动剂抗体的抗原结合区。在某些实施方案中，抗原结合多肽包含作为非抗体OX40激动剂的抗原结合区。
OX40激动剂抗体
本文中提供结合OX40的激动剂抗原结合复合体。在一些实施方案中，激动剂抗原结合复合体包含六个OX40激动剂抗体(例如，包含六个OX40激动剂抗体亚单位的六聚抗原结合复合体)。下文描述示例性抗体亚单位及其示例性特征。在一些实施方案中，六聚抗原结合复合体是激动剂抗原结合复合体，所述激动剂抗原结合复合体激活它结合的抗原(例如，OX40)的生物学活性。在不希望受理论约束的情况下，认为激动剂抗原结合复合体(例如，六聚体激动剂抗原结合复合体)可以对以下场景特别有利：其中效应细胞的抗体交联可能对激动剂活性重要(例如，通过诱导靶簇集及靶的后续信号传导)，但是效应细胞可能在作用部位处不丰富(例如，在伴有低水平效应细胞的肿瘤中)。在这些场景中，激动剂抗原结合复合体如六聚体激动剂抗原结合复合体可以在丰富效应细胞不存在的情况下允许和/或增强激动剂活性。
在一些实施方案中，抗原结合复合体包含抗人OX40激动剂抗体，所述抗人OX40激动剂抗体包含如下表A中所列相同抗体的至少一个、二个、三个、四个、五个或全部六个HVR。例如，在某些实施方案中，复合体中所含的OX40抗体含有来自表A中所列相同抗体的全部六个HVR。在其他实施方案中，复合体包含抗人OX40激动剂抗体，所述抗人OX40激动剂抗体包含如下表A中所列相同抗体的重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)。然而，将领会的是，如表A中参考特定抗体所列的HVR、VH和/或VL序列不限于这些特定抗体；反而，这些序列可以适当地由本领域技术人员以表A中未明确列出的多种布局组合。
在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个HVR：(a)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L2和(f)包含选自SEQID NO:7的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-H3。在一个实施方案中，抗体包含包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-H3。在另一个实施方案中，抗体包含了包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-H3和包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HVR-L3。在又一个实施方案中，抗体包含了包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-H3、包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HVR-L3和包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HVR-H2。在又一个实施方案中，抗体包含了(a)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-H3。
在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL HVR序列：(a)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HVR-L3。在一个实施方案中，抗体包含了(a)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含了(a)VH结构域，所述VH结构域包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VH HVR序列：(i)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HVR-H2和(iii)包含选自SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-H3；和(b)VL结构域，所述VL结构域包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VL HVR序列：(i)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ IDNO:6的氨基酸序列的HVR-L2和(c)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HVR-L3。
在一个实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含了(a)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L2和(f)包含选自SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个HVR：(a)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L2和(f)包含SEQ IDNO:26的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含了包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-H3和包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的HVR-L3。在又一个实施方案中，抗体包含了包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-H3、包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的HVR-L3和包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HVR-H2。
在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含了(a)VH结构域，所述VH结构域包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VH HVR序列：(i)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HVR-H2和(iii)包含选自SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-H3；和(b)VL结构域，所述VL结构域包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VL HVR序列：(i)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ IDNO:6的氨基酸序列的HVR-L2和(c)包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的HVR-L3。
在一个实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含了(a)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L2和(f)包含选自SEQ ID NO:26的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个HVR：(a)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L2和(f)包含SEQ IDNO:27的氨基酸序列的HVR-L3。
在一个实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含了包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-H3和包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的HVR-L3。在又一个实施方案中，抗体包含了包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-H3、包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的HVR-L3和包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HVR-H2。
在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含了(a)VH结构域，所述VH结构域包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VH HVR序列：(i)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HVR-H2和(iii)包含选自SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-H3；和(b)VL结构域，所述VL结构域包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VL HVR序列：(i)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ IDNO:6的氨基酸序列的HVR-L2和(c)包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的HVR-L3。
在一个实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含了(a)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L2和(f)包含选自SEQ ID NO:27的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个HVR：(a)包含SEQ ID NO:2、8或9的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ IDNO:3、10、11、12、13或14的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:4、15或19的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L2和(f)包含SEQ ID NO:7、22、23、24、25、26、27或28的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO:2、8或9的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ IDNO:3、10、11、12、13或14的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ ID NO:4、15或19的氨基酸序列的HVR-H3。在一个实施方案中，抗体包含包含SEQ ID NO:4、15或19的氨基酸序列的HVR-H3。在另一个实施方案中，抗体包含了包含SEQ ID NO:4、15或19的氨基酸序列的HVR-H3和包含SEQ ID NO:7、22、23、24、25、26、27或28的氨基酸序列的HVR-L3。在又一个实施方案中，抗体包含了包含SEQ ID NO:4、15或19的氨基酸序列的HVR-H3、包含SEQ ID NO:7、22、23、24、25、26、27或28的氨基酸序列的HVR-L3和包含SEQ ID NO:3、10、11、12、13或14的氨基酸序列的HVR-H2。在又一个实施方案中，抗体包含了(a)包含SEQ ID NO:2、8或9的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:3、10、11、12、13或14的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ ID NO:4、15或19的氨基酸序列的HVR-H3。
在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL HVR序列：(a)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO:7、22、23、24、25、26、27或28的氨基酸序列的HVR-L3。在一个实施方案中，抗体包含了(a)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO:7、22、23、24、25、26、27或28的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含了(a)VH结构域，所述VH结构域包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VH HVR序列：(i)包含SEQ ID NO:2、8或9的氨基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO:3、10、11、12、13或14的氨基酸序列的HVR-H2和(iii)包含选自SEQ ID NO:4、15或19的氨基酸序列的HVR-H3；和(b)VL结构域，所述VL结构域包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VL HVR序列：(i)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L2和(c)包含SEQ ID NO:7、22、23、24、25、26、27或28的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含了(a)包含SEQ ID NO:2、8或9的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:3、10、11、12、13或14的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:4、15或19的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L2和(f)包含选自SEQ ID NO:7、22、23、24、25、26、27或28的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个HVR：(a)包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:173的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:174的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L2和(f)包含SEQ ID NO:175的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，HVR-H2不是DMYPDAAAASYNQKFRE(SEQ ID NO:216)。在一些实施方案中，HVR-H3不是APRWAAAA(SEQ IDNO:217)。在一些实施方案中，HVR-L3不是QAAAAAAAT(SEQ ID NO:218)。
在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:173的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ ID NO:174的氨基酸序列的HVR-H3。在一个实施方案中，抗体包含了包含SEQ ID NO:174的氨基酸序列的HVR-H3。在另一个实施方案中，抗体包含了包含SEQ ID NO:174的氨基酸序列的HVR-H3和包含SEQ ID NO:175的氨基酸序列的HVR-L3。在又一个实施方案中，抗体包含了包含SEQ ID NO:174的氨基酸序列的HVR-H3、包含SEQ ID NO:175的氨基酸序列的HVR-L3和包含SEQ ID NO:173的氨基酸序列的HVR-H2。在又一个实施方案中，抗体包含了(a)包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:173的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ ID NO:174的氨基酸序列的HVR-H3。在一些实施方案中，HVR-H2不是DMYPDAAAASYNQKFRE(SEQ ID NO:216)。在一些实施方案中，HVR-H3不是APRWAAAA(SEQ ID NO:217)。在一些实施方案中，HVR-L3不是QAAAAAAAT(SEQ IDNO:218)。
在一个实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含了(a)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO:175的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，HVR-L3不是QAAAAAAAT(SEQ ID NO:218)。
在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VH HVR序列：(i)包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ IDNO:173的氨基酸序列的HVR-H2和(iii)包含选自SEQ ID NO:174的氨基酸序列的HVR-H3；和(b)VL结构域，所述VL结构域包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VL HVR序列：(i)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L2和(c)包含SEQ ID NO:175的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含了(a)包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:173的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:174的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L2和(f)包含选自SEQ ID NO:175的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，HVR-H2不是DMYPDAAAASYNQKFRE(SEQ ID NO:216)。在一些实施方案中，HVR-H3不是APRWAAAA(SEQ ID NO:217)。在一些实施方案中，HVR-L3不是QAAAAAAAT(SEQ ID NO:218)。
上述置换的全部可能组合由SEQ ID NO:172、173、174和175的共有序列涵盖。
在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个HVR：(a)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ IDNO:37的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的HVR-L2和(f)包含SEQID NO:42的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HVR-H3。在一个实施方案中，抗体包含了包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HVR-H3。在另一个实施方案中，抗体包含了包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HVR-H3和包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HVR-L3。在又一个实施方案中，抗体包含了包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HVR-H3、包含SEQID NO:42的氨基酸序列的HVR-L3和包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HVR-H2。在又一个实施方案中，抗体包含了(a)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HVR-H3。
在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL HVR序列：(a)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HVR-L3。在一个实施方案中，抗体包含了(a)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HVR-H3。在一个实施方案中，抗体包含了(a)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HVR-H3。
在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含(a)VH结构域，所述VH结构域包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VH HVR序列：(i)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HVR-H2和(iii)包含选自SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HVR-H3；和(b)VL结构域，所述VL结构域包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VL HVR序列：(i)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ IDNO:39的氨基酸序列的HVR-L2和(c)包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HVR-L3。
在一个实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含了(a)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含选自SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL HVR序列：(a)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HVR-L3。在一个实施方案中，抗体包含了(a)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HVR-H3。在一个实施方案中，抗体包含了(a)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HVR-H3。
在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含(a)VH结构域，所述VH结构域包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VH HVR序列：(i)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HVR-H2和(iii)包含选自SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HVR-H3；和(b)VL结构域，所述VL结构域包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VL HVR序列：(i)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ IDNO:38的氨基酸序列的HVR-L2和(c)包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个HVR(a)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ IDNO:37的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL HVR序列：(a)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HVR-L3。在一个实施方案中，抗体包含了(a)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含(a)VH结构域，所述VH结构域包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VH HVR序列：(i)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HVR-H2和(iii)包含选自SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HVR-H3；和(b)VL结构域，所述VL结构域包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VL HVR序列：(i)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ IDNO:40的氨基酸序列的HVR-L2和(c)包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HVR-L3。
在一个实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含了(a)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含选自SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个HVR：(a)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:30、31或32的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:39、40或41的氨基酸序列的HVR-L2和(f)包含SEQ ID NO:42、43或44的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:30、31或32的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HVR-H3。在另一个实施方案中，抗体包含了包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HVR-H3和包含SEQ ID NO:42、43或44的氨基酸序列的HVR-L3。在又一个实施方案中，抗体包含了包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HVR-H3、包含SEQ ID NO:42、43或44的氨基酸序列的HVR-L3和包含SEQ IDNO:39、40或41的氨基酸序列的HVR-H2。在又一个实施方案中，抗体包含了(a)包含SEQ IDNO:29的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:30、31或32的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HVR-H3。
在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL HVR序列：(a)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:39、40或41的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO:42、43或44的氨基酸序列的HVR-L3。在一个实施方案中，抗体包含了(a)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:39、40或41的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO:42、43或44的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含(a)VH结构域，所述VH结构域包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VH HVR序列：(i)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO:30、31或32的氨基酸序列的HVR-H2和(iii)包含选自SEQ IDNO:33的氨基酸序列的HVR-H3；和(b)VL结构域，所述VL结构域包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VL HVR序列：(i)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO:39、40或41的氨基酸序列的HVR-L2和(c)包含SEQ ID NO:42、43或44的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含了(a)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:30、31或32的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ IDNO:39、40或41的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含选自SEQ ID NO:42、43或44的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:175的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HVR-H3。在另一个实施方案中，抗体包含了包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HVR-H3和包含SEQ ID NO:177的氨基酸序列的HVR-L3。在又一个实施方案中，抗体包含了包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HVR-H3、包含SEQ ID NO:178的氨基酸序列的HVR-L3和包含SEQ ID NO:176的氨基酸序列的HVR-H2。在又一个实施方案中，抗体包含了(a)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:176的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HVR-H3。
在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL HVR序列：(a)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:177的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO:177的氨基酸序列的HVR-L3。在一个实施方案中，抗体包含了(a)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:177的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO:178的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含(a)VH结构域，所述VH结构域包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VH HVR序列：(i)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO:176的氨基酸序列的HVR-H2和(iii)包含选自SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HVR-H3；和(b)VL结构域，所述VL结构域包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VL HVR序列：(i)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ IDNO:177的氨基酸序列的HVR-L2和(c)包含SEQ ID NO:178的氨基酸序列的HVR-L3。
在一个实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含了(a)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:176的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:177的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含选自SEQ ID NO:178的氨基酸序列的HVR-L3。
在以上实施方案的任一项中，抗OX40激动剂抗体是人源化的。在一个实施方案中，抗OX40抗体包含如以上实施方案的任一项中的HVR，并且还包含接纳体人类构架，例如人免疫球蛋白构架或人共有构架。
在另一个实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含与SEQ ID NO:56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、108、114、116、183或184的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列相对于参考序列含有置换(例如，保守性置换)、***或缺失，但是包含该序列的抗人OX40激动剂抗体保留与OX40结合的能力。在某些实施方案中，已经在SEQ ID NO:56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、108、114、116、183或184中置换、***和/或缺失总计1至10个氨基酸。在某些实施方案中，置换、***或缺失出现在HVR之外的区域内(即，在FR中)。任选地，抗人OX40激动剂抗体包含SEQ ID NO:56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、108、114、116、183或184中的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。在具体实施方案中，VH包含选自以下的一个、两个或三个HVR：(a)包含SEQID NO:2的氨基酸序列的HVR-H1、(b)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HVR-H2和(c)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-H3。
在另一个实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含与SEQ ID NO:57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、109、115或117的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域(VL)。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列相对于参考序列含有置换(例如，保守性置换)、***或缺失，但是包含该序列的抗人OX40激动剂抗体保留与OX40结合的能力。在某些实施方案中，已经在SEQ ID NO:57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、109、115或117中置换、***和/或缺失总计1至10个氨基酸。在某些实施方案中，置换、***或缺失出现在HVR外部的之外内(即，在FR中)。任选地，抗人OX40激动剂抗体包含SEQ ID NO:57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、109、115或117中的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。在具体实施方案中，VL包含选自以下的一个、两个或三个HVR：(a)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含与SEQ ID NO:56的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列相对于参考序列含有置换(例如，保守性置换)、***或缺失，但是包含该序列的抗人OX40激动剂抗体保留与OX40结合的能力。在某些实施方案中，已经在SEQ ID NO:56中置换、***和/或缺失总计1至10个氨基酸。在某些实施方案中，置换、***或缺失出现在HVR之外的区域内(即，在FR中)。任选地，抗人OX40激动剂抗体包含SEQ ID NO:56中的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。在具体实施方案中，VH包含选自以下的一个、两个或三个HVR：(a)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H1、(b)包含SEQ IDNO:3的氨基酸序列的HVR-H2和(c)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-H3。
在另一个实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含与SEQ ID NO:57的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域(VL)。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列相对于参考序列含有置换(例如，保守性置换)、***或缺失，但是包含该序列的抗人OX40激动剂抗体保留与OX40结合的能力。在某些实施方案中，已经在SEQ ID NO:57中置换、***和/或缺失总计1至10个氨基酸。在某些实施方案中，置换、***或缺失出现在HVR外部的之外内(即，在FR中)。任选地，抗人OX40激动剂抗体包含SEQID NO:57中的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。在具体实施方案中，VL包含选自以下的一个、两个或三个HVR：(a)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含与SEQ ID NO:180的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列相对于参考序列含有置换(例如，保守性置换)、***或缺失，但是包含该序列的抗人OX40激动剂抗体保留与OX40结合的能力。在某些实施方案中，已经在SEQ ID NO:180中置换、***和/或缺失总计1至10个氨基酸。在某些实施方案中，置换、***或缺失出现在HVR之外的区域内(即，在FR中)。任选地，抗人OX40激动剂抗体包含SEQ ID NO:180中的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。在具体实施方案中，VH包含选自以下的一个、两个或三个HVR：(a)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H1、(b)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HVR-H2和(c)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-H3。
在另一个实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含与SEQ ID NO:179的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域(VL)。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列相对于参考序列含有置换(例如，保守性置换)、***或缺失，但是包含该序列的抗人OX40激动剂抗体保留与OX40结合的能力。在某些实施方案中，已经在SEQ ID NO:179中置换、***和/或缺失总计1至10个氨基酸。在某些实施方案中，置换、***或缺失出现在HVR外部的之外内(即，在FR中)。任选地，抗人OX40激动剂抗体包含SEQ ID NO:179中的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。在具体实施方案中，VL包含选自以下的一个、两个或三个HVR：(a)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQID NO:6的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含与SEQ ID NO:94的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列相对于参考序列含有置换(例如，保守性置换)、***或缺失，但是包含该序列的抗人OX40激动剂抗体保留与OX40结合的能力。在某些实施方案中，已经在SEQ ID NO:94中置换、***和/或缺失总计1至10个氨基酸。在某些实施方案中，置换、***或缺失出现在HVR之外的区域内(即，在FR中)。任选地，抗人OX40激动剂抗体包含SEQ ID NO:94中的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。在具体实施方案中，VH包含选自以下的一个、两个或三个HVR：(a)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H1、(b)包含SEQ IDNO:3的氨基酸序列的HVR-H2和(c)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-H3。
在另一个实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含与SEQ ID NO:95的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域(VL)。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列相对于参考序列含有置换(例如，保守性置换)、***或缺失，但是包含该序列的抗人OX40激动剂抗体保留与OX40结合的能力。在某些实施方案中，已经在SEQ ID NO:95中置换、***和/或缺失总计1至10个氨基酸。在某些实施方案中，置换、***或缺失出现在HVR外部的之外内(即，在FR中)。任选地，抗人OX40激动剂抗体包含SEQID NO:95中的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。在具体实施方案中，VL包含选自以下的一个、两个或三个HVR：(a)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含与SEQ ID NO:96的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列相对于参考序列含有置换(例如，保守性置换)、***或缺失，但是包含该序列的抗人OX40激动剂抗体保留与OX40结合的能力。在某些实施方案中，已经在SEQ ID NO:96中置换、***和/或缺失总计1至10个氨基酸。在某些实施方案中，置换、***或缺失出现在HVR之外的区域内(即，在FR中)。任选地，抗人OX40激动剂抗体包含SEQ ID NO:96中的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。在具体实施方案中，VH包含选自以下的一个、两个或三个HVR：(a)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H1、(b)包含SEQ IDNO:3的氨基酸序列的HVR-H2和(c)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-H3。
在另一个实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含与SEQ ID NO:97的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域(VL)。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列相对于参考序列含有置换(例如，保守性置换)、***或缺失，但是包含该序列的抗人OX40激动剂抗体保留与OX40结合的能力。在某些实施方案中，已经在SEQ ID NO:97中置换、***和/或缺失总计1至10个氨基酸。在某些实施方案中，置换、***或缺失出现在HVR外部的之外内(即，在FR中)。任选地，抗人OX40激动剂抗体包含SEQID NO:97中的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。在具体实施方案中，VL包含选自以下的一个、两个或三个HVR：(a)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含与SEQ ID NO:118,120,122,124,126,128,130,132,134,136,138,140,142,144,146,或148的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列相对于参考序列含有置换(例如，保守性置换)、***或缺失，但是包含该序列的抗人OX40激动剂抗体保留与OX40结合的能力。在某些实施方案中，已经在SEQ ID NO:118,120,122,124,126,128,130,132,134,136,138,140,142,144,146或148中置换、***和/或缺失总计1至10个氨基酸。在某些实施方案中，置换、***或缺失出现在HVR之外的区域内(即，在FR中)。任选地，抗人OX40激动剂抗体包含SEQ ID NO:118,120,122,124,126,128,130,132,134,136,138,140,142,144,146或148中的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。在具体实施方案中，VH包含选自以下的一个、两个或三个HVR：(a)包含SEQ IDNO:29的氨基酸序列的HVR-H1、(b)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HVR-H2和(c)包含SEQID NO:33的氨基酸序列的HVR-H3。
在另一个实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含与SEQ ID NO:119,121,123,125,127,129,131,133,135,137,139,141,143,145,147,或149的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域(VL)。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列相对于参考序列含有置换(例如，保守性置换)、***或缺失，但是包含该序列的抗人OX40激动剂抗体保留与OX40结合的能力。在某些实施方案中，已经在SEQ IDNO:119,121,123,125,127,129,131,133,135,137,139,141,143,145,147,或149中置换、***和/或缺失总计1至10个氨基酸。在某些实施方案中，置换、***或缺失出现在HVR外部的之外内(即，在FR中)。任选地，抗人OX40激动剂抗体包含SEQ ID NO:119,121,123,125,127,129,131,133,135,137,139,141,143,145,147,或149中的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。在具体实施方案中，VL包含选自以下的一个、两个或三个HVR：(a)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ IDNO:42的氨基酸序列的HVR-L3。
在某些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含分别在SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:57中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含分别在SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:59中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含分别在SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:61中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含分别在SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:63中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含分别在SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:65中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含分别在SEQID NO:66和SEQ ID NO:67中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含分别在SEQ ID NO:68和SEQ ID NO:69中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含分别在SEQ ID NO:70和SEQ ID NO:71中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含分别在SEQ ID NO:72和SEQ ID NO:73中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含分别在SEQ ID NO:74和SEQID NO:75中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含分别在SEQ ID NO:76和SEQ ID NO:77中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含分别在SEQ ID NO:78和SEQ ID NO:79中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含分别在SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:81中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含分别在SEQ ID NO:82和SEQ ID NO:83中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含分别在SEQ ID NO:84和SEQ ID NO:85中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含分别在SEQ ID NO:86和SEQ ID NO:87中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含分别在SEQ IDNO:88和SEQ ID NO:89中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含分别在SEQ ID NO:90和SEQ ID NO:91中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含分别在SEQ ID NO:92和SEQ ID NO:93中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含分别在SEQ ID NO:94和SEQ ID NO:95中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含分别在SEQ ID NO:96和SEQ IDNO:97中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含分别在SEQ ID NO:98和SEQ ID NO:99中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含分别在SEQ ID NO:100和SEQ ID NO:101中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含分别在SEQ ID NO:108和SEQ ID NO:109中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含分别在SEQ ID NO:114和SEQ ID NO:115中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含分别在SEQ ID NO:116和SEQ ID NO:117中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，抗体包含分别在SEQ ID NO:183和SEQ ID NO:65中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，抗体包含分别在SEQ ID NO:184和SEQ ID NO:69中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。
在一个实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含分别在SEQ ID NO:118和SEQ IDNO:119中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含分别在SEQ ID NO:120和SEQ ID NO:121中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含分别在SEQ ID NO:122和SEQ ID NO:123中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含分别在SEQ ID NO:124和SEQ ID NO:125中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含分别在SEQ ID NO:126和SEQ ID NO:127中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含分别在SEQ ID NO:128和SEQ ID NO:129中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含分别在SEQ ID NO:130和SEQ ID NO:131中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含分别在SEQ ID NO:132和SEQ ID NO:133中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含分别在SEQ ID NO:134和SEQ ID NO:135中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含分别在SEQ ID NO:136和SEQ ID NO:137中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含分别在SEQ ID NO:138和SEQ ID NO:139中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含分别在SEQID NO:140和SEQ ID NO:141中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含分别在SEQ ID NO:142和SEQ ID NO:143中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含分别在SEQ IDNO:144和SEQ ID NO:145中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含分别在SEQ ID NO:146和SEQ ID NO:147中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。
将可以理解，本文公开的HVR、VH和VL序列可以按任何数目或组合方式与本文公开的任何Fc变体组合。在一些实施方案中，本文所述的OX40激动剂抗体包含表A中描述的任何HVR序列或其组合、VH序列和/或VL序列及Fc区。在一些实施方案中，OX40激动剂抗体包含表A中描述的任何HVR、VH和/或VL序列和本公开的变异Fc区。例如，在一些实施方案中，OX40激动剂抗体包含表A中描述的任何HVR、VH和/或VL序列和人IgG1Fc区内的K322A修饰(残基的EU编号)。在一些实施方案中，OX40激动剂抗体包含表A中描述的任何HVR、VH和/或VL序列和人IgG1Fc区内选自E345R、E430G和S440Y的一个或多个氨基酸置换(EU编号)。在一些实施方案中，OX40激动剂抗体包含表A中描述的任何HVR、VH和/或VL序列和人IgG1Fc区内选自E345R、E430G和S440Y的单氨基酸置换(EU编号)。在一些实施方案中，OX40激动剂抗体包含表A中描述的任何HVR、VH和/或VL序列和选自(a)E345R和E430G、(b)E345R和S440Y、(c)E430G和S440Y的氨基酸置换组，其中置换在人IgG1Fc区内(EU编号)。在一些实施方案中，OX40激动剂抗体包含表A中描述的任何HVR、VH和/或VL序列和人IgG1Fc区内的氨基酸置换E345R、E430G和S440Y(EU编号)。在一些实施方案中，OX40激动剂抗体包含表A中描述的任何HVR、VH和/或VL序列和人IgG1Fc区内一个或多个选自表4的氨基酸置换(残基的EU编号)。在一些实施方案中，OX40激动剂抗体包含表A中描述的任何HVR、VH和/或VL序列、人IgG1Fc区内一个或多个选自表4的氨基酸置换(残基的EU编号)和Fc区内导致削弱的C1q结合作用和/或补体依赖细胞毒性(CDC)的一个或多个修饰，例如，人IgG1Fc区内的K322A(残基的EU编号)。
表4.额外的促进六聚体变体
在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含了(a)人IgG1Fc区内的K322A修饰(残基的EU编号)；(b)VH结构域，所述VH结构域包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VH HVR序列：(i)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HVR-H2和(iii)包含选自SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-H3；和(c)VL结构域，所述VL结构域包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VL HVR序列：(i)包含SEQ IDNO:5的氨基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L2和(iii)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含(a)人IgG1Fc区内选自表4的一个或多个氨基酸置换(残基的EU编号)；(b)VH结构域，所述VH结构域包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VH HVR序列：(i)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HVR-H2和(iii)包含选自SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-H3；和(c)VL结构域，所述VL结构域包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VL HVR序列：(i)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L2和(iii)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含(a)选自人IgG1Fc区内E345R、E430G和S440Y的一个或多个氨基酸置换(EU编号)；(b)VH结构域，所述VH结构域包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VH HVR序列：(i)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HVR-H2和(iii)包含选自SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-H3；和(c)VL结构域，所述VL结构域包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VL HVR序列：(i)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L2和(iii)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含(a)人IgG1Fc区内的K322A修饰(残基的EU编号)；(b)选自人IgG1Fc区内E345R、E430G和S440Y的一个或多个氨基酸置换(EU编号)；(c)VH结构域，所述VH结构域包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VH HVR序列：(i)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HVR-H2和(iii)包含选自SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-H3；和(d)VL结构域，所述VL结构域包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VL HVR序列：(i)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L2和(iii)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含(a)选自人IgG1Fc区内E345R、E430G和S440Y的单氨基酸置换(EU编号)；(b)VH结构域，所述VH结构域包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VH HVR序列：(i)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HVR-H2和(iii)包含选自SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-H3；和(c)VL结构域，所述VL结构域包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VL HVR序列：(i)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L2和(iii)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含(a)选自人IgG1Fc区内(i)E345R和E430G、(ii)E345R和S440Y和(iii)E430G和S440Y的氨基酸置换组(EU编号)；(b)VH结构域，所述VH结构域包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VH HVR序列：(i)包含SEQ IDNO:2的氨基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HVR-H2和(iii)包含选自SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-H3；和(c)VL结构域，所述VL结构域包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VL HVR序列：(i)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L2和(iii)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含了(a)人IgG1Fc区内的E345R、E430G和S440Y置换(残基的EU编号)；(b)VH结构域，所述VH结构域包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VH HVR序列：(i)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQID NO:3的氨基酸序列的HVR-H2和(iii)包含选自SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-H3；和(c)VL结构域，所述VL结构域包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VL HVR序列：(i)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L2和(iii)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含(a)人IgG1Fc区内的K322A修饰(残基的EU编号)；(b)包含SEQ ID NO:56的VH序列的VH结构域；和(c)包含SEQ ID NO:57的VL序列的VL结构域。
在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含(a)人IgG1Fc区内选自表4的一个或多个氨基酸置换(残基的EU编号)；(b)包含SEQ ID NO:56的VH序列的VH结构域；和(c)包含SEQ ID NO:57的VL序列的VL结构域。
在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含(a)选自人IgG1Fc区内E345R、E430G和S440Y的一个或多个氨基酸置换(EU编号)；(b)包含SEQ ID NO:56的VH序列的VH结构域；和(c)包含SEQ ID NO:57的VL序列的VL结构域。
在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含(a)人IgG1Fc区内的K322A修饰(残基的EU编号)；(b)选自人IgG1Fc区内E345R、E430G和S440Y的一个或多个氨基酸置换(EU编号)；(c)包含SEQ ID NO:56的VH序列的VH结构域；和(d)包含SEQ ID NO:57的VL序列的VL结构域。
在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含(a)选自人IgG1Fc区内E345R、E430G和S440Y的单氨基酸置换(EU编号)；(b)包含SEQ ID NO:56的VH序列的VH结构域；和(c)包含SEQ ID NO:57的VL序列的VL结构域。
在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含(a)选自人IgG1Fc区内(i)E345R和E430G、(ii)E345R和S440Y和(iii)E430G和S440Y的氨基酸置换组(EU编号)；(b)包含SEQ IDNO:56的VH序列的VH结构域；和(c)包含SEQ ID NO:57的VL序列的VL结构域。
在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含(a)人IgG1Fc区内的E345R、E430G和S440Y置换(残基的EU编号)；(b)包含SEQ ID NO:56的VH序列的VH结构域；和(c)包含SEQ IDNO:57的VL序列的VL结构域。
在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含(a)人IgG1Fc区内的K322A修饰(残基的EU编号)；(b)VH结构域，所述VH结构域包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VH HVR序列：(i)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HVR-H2和(iii)包含选自SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HVR-H3；和(c)VL结构域，所述VL结构域包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VL HVR序列：(i)包含SEQ IDNO:37的氨基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的HVR-L2和(iii)包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含(a)人IgG1Fc区内选自表4的一个或多个氨基酸置换(残基的EU编号)；(b)VH结构域，所述VH结构域包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VH HVR序列：(i)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HVR-H2和(iii)包含选自SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HVR-H3；和(c)VL结构域，所述VL结构域包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VL HVR序列：(i)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的HVR-L2和(iii)包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含(a)选自人IgG1Fc区内E345R、E430G和S440Y的一个或多个氨基酸置换(EU编号)；(b)VH结构域，所述VH结构域包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VH HVR序列：(i)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HVR-H2和(iii)包含选自SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HVR-H3；和(c)VL结构域，所述VL结构域包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VL HVR序列：(i)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的HVR-L2和(iii)包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含(a)人IgG1Fc区内的K322A修饰(残基的EU编号)；(b)选自人IgG1Fc区内E345R、E430G和S440Y的一个或多个氨基酸置换(EU编号)；(c)VH结构域，所述VH结构域包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VH HVR序列：(i)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HVR-H2和(iii)包含选自SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HVR-H3；和(d)VL结构域，所述VL结构域包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VL HVR序列：(i)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的HVR-L2和(iii)包含SEQ IDNO:42的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含(a)选自人IgG1Fc区内E345R、E430G和S440Y的单氨基酸置换(EU编号)；(b)VH结构域，所述VH结构域包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VH HVR序列：(i)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HVR-H2和(iii)包含选自SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HVR-H3；和(c)VL结构域，所述VL结构域包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VL HVR序列：(i)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的HVR-L2和(iii)包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含(a)选自人IgG1Fc区内(i)E345R和E430G、(ii)E345R和S440Y和(iii)E430G和S440Y的氨基酸置换组(EU编号)；(b)VH结构域，所述VH结构域包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VH HVR序列：(i)包含SEQ IDNO:29的氨基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HVR-H2和(iii)包含选自SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HVR-H3；和(c)VL结构域，所述VL结构域包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VL HVR序列：(i)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的HVR-L2和(iii)包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含(a)人IgG1Fc区内的E345R、E430G和S440Y置换(残基的EU编号)；(b)VH结构域，所述VH结构域包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VH HVR序列：(i)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ IDNO:30的氨基酸序列的HVR-H2和(iii)包含选自SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HVR-H3；和(c)VL结构域，所述VL结构域包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VL HVR序列：(i)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的HVR-L2和(iii)包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含(a)人IgG1Fc区内的K322A修饰(残基的EU编号)；(b)包含SEQ ID NO:118的VH序列的VH结构域；和(c)包含SEQ ID NO:119的VL序列的VL结构域。
在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含(a)人IgG1Fc区内选自表4的一个或多个氨基酸置换(残基的EU编号)；(b)包含SEQ ID NO:118的VH序列的VH结构域；和(c)包含SEQ ID NO:119的VL序列的VL结构域。
在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含(a)选自人IgG1Fc区内E345R、E430G和S440Y的一个或多个氨基酸置换(EU编号)；(b)包含SEQ ID NO:118的VH序列的VH结构域；和(c)包含SEQ ID NO:119的VL序列的VL结构域。
在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含(a)人IgG1Fc区内的K322A修饰(残基的EU编号)；(b)选自人IgG1Fc区内E345R、E430G和S440Y的一个或多个氨基酸置换(EU编号)；(c)包含SEQ ID NO:118的VH序列的VH结构域；和(d)包含SEQ ID NO:119的VL序列的VL结构域。
在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含(a)选自人IgG1Fc区内E345R、E430G和S440Y的单氨基酸置换(EU编号)；(b)包含SEQ ID NO:118的VH序列的VH结构域；和(c)包含SEQ ID NO:119的VL序列的VL结构域。
在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含(a)选自人IgG1Fc区内(i)E345R和E430G、(ii)E345R和S440Y和(iii)E430G和S440Y的氨基酸置换组(EU编号)；(b)包含SEQ IDNO:118的VH序列的VH结构域；和(c)包含SEQ ID NO:119的VL序列的VL结构域。
在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含(a)人IgG1Fc区内的E345R、E430G和S440Y置换(残基的EU编号)；(b)包含SEQ ID NO:118的VH序列的VH结构域；和(c)包含SEQID NO:119的VL序列的VL结构域。
如前所述，本公开的某些方面涉及复合体如六聚体。应当理解，结合OX40的任何示例性抗体、抗原结合结构域和/或抗体片段(例如，本文所述的任何OX40激动剂抗体的HVR、VH和/或VL结构域)可以在本公开的复合体或六聚体中按任何组合或布局组合。例如，在一些实施方案中，六聚体可以由相同OX40激动剂抗体的六个亚单位形成。在一些实施方案中，六聚体可以包含两个或更多个与OX40的相同表位结合的不同OX40激动剂抗体。在一些实施方案中，六聚体可以包含两个或更多个与OX40的不同表位(例如，OX40多肽(如人OX40)的部分非重叠或完全非重叠表位)结合的不同OX40激动剂抗体。在一些实施方案中，六聚体可以包含两种或更多种不同抗体，其中之一结合OX40并且其中另一者结合本文所述或否则本领域已知的不同多肽。
本文中还构思了双特异性或多特异性抗体，其中抗体的至少一条臂结合OX40(例如，本文所述的任何OX40激动剂抗体或包含本文所述的任何OX40激动剂抗体的任何HVR、VH和/或VL结构域的任何抗体)。在一些实施方案中，双特异性或多特异性抗体的每条臂与相同的细胞表面受体(例如，OX40)结合。在一些实施方案中，双特异性或多特异性抗体的每条臂与相同细胞表面受体(例如，OX40)的不同表位结合。例如，在某些实施方案中，双特异性抗体可以包含两条臂，其中每条臂结合OX40的不同表位。应当理解，结合OX40的任何示例性抗体、抗原结合结构域和/或抗体片段(例如，本文所述的任何OX40激动剂抗体的HVR、VH和/或VL结构域)可以在双特异性或多特异性抗体中按任何组合方式组合。
在一些实施方案中，OX40激动剂抗体以小于或等于约0.45nM的亲和力结合人OX40。在一些实施方案中，OX40激动剂抗体以小于或等于约1nM的亲和力结合人OX40。在一些实施方案中，OX40抗体以小于或等于约0.4nM的亲和力结合人OX40。在一些实施方案中，OX40抗体以小于或等于约0.5nM的亲和力结合人OX40。在一些实施方案中，使用放射免疫测定法，测定结合亲和力。
在一些实施方案中，OX40激动剂抗体结合人OX40和食蟹猴OX40。在一些实施方案中，使用FACS测定法，测定结合。在一些实施方案中，与人OX40的结合具有约0.2ug/ml的EC50。在一些实施方案中，与人OX40的结合具有约0.3ug/ml或更低的EC50。在一些实施方案中，与食蟹猴OX40的结合具有约1.5ug/ml的EC50。在一些实施方案中，与食蟹猴OX40的结合具有约1.4ug/ml的EC50。
在一些实施方案中，OX40激动剂抗体不与大鼠OX40或小鼠OX40结合。
在一些实施方案中，OX40激动剂抗体不在表达OX40的细胞(例如，Treg)中诱导凋亡。在一些实施方案中，使用30ug/ml的抗体浓度，测定凋亡，例如，通过利用膜联蛋白V和碘化丙啶染色的Treg，确定凋亡是否已经出现。
在一些实施方案中，OX40激动剂抗体增加记忆T细胞增殖和/或增加记忆细胞产生细胞因子。在一些实施方案中，细胞因子是IFN-γ。在一些实施方案中，OX40激动剂抗体增强记忆T细胞功能，例如通过增加记忆T细胞增殖和/或增加记忆细胞产生细胞因子。在一些实施方案中，细胞因子是γ干扰素。
在一些实施方案中，如与OX40激动剂抗体处理之前的增殖和/或细胞因子产生相比，OX40激动剂抗体增加CD4+效应T细胞增殖和/或增加CD4+效应T细胞产生细胞因子。在一些实施方案中，细胞因子是IFN-γ。
在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体增强CD4+效应T细胞功能，例如通过增加CD4+效应T细胞增殖和/或增加CD4+效应T细胞产生γ干扰素(例如，如相比于抗人OX40激动剂抗体处理之前的增殖和/或细胞因子产生)。在一些实施方案中，细胞因子是γ干扰素。在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体增加瘤内(浸润性)CD4+效应T细胞的数目(例如，CD4+效应T细胞的总数，或例如，CD45+细胞中CD4+细胞的百分数)，例如，如相比于抗人OX40激动剂抗体处理之前瘤内(浸润性)CD4+效应T细胞的数目。在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体增加表达γ干扰素的瘤内(浸润性)CD4+效应T细胞的数目(例如，表达γ干扰素的总CD4+细胞，或例如，总CD4+细胞中表达γ干扰素的CD4+细胞的百分数)，例如，如相比于抗人OX40激动剂抗体处理之前表达γ干扰素的瘤内(浸润性)CD4+T细胞的数目。
在一些实施方案中，CD4+效应T细胞的数目相对于施用OX40激动剂抗体之前升高。在一些实施方案中，CD4+效应T细胞的细胞因子分泌相对于施用OX40激动剂抗体之前升高。在任何方法的一些实施方案中，相对于施用OX40激动剂抗体之前，个体中的CD8+效应T细胞具有增强的增殖、细胞因子分泌和/或细胞裂解活性。在一些实施方案中，CD8+效应T细胞的数目相对于施用OX40激动剂抗体之前升高。在一些实施方案中，CD8+效应T细胞的细胞因子分泌相对于施用OX40激动剂抗体之前升高。
在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体增加瘤内(浸润性)CD8+效应T细胞的数目(例如，CD8+效应T细胞的总数，或例如，CD45+细胞中CD8+的百分数)，例如，如相比于抗人OX40激动剂抗体处理之前瘤内(浸润性)CD8+T效应细胞的数目。在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体增加表达γ干扰素的瘤内(浸润性)CD8+效应T细胞的数目(例如，总CD8+细胞中表达γ干扰素的CD8+细胞的百分数)，例如，相比于抗人OX40激动剂抗体处理之前表达γ干扰素的瘤内(浸润性)CD8+T细胞的数目。
在一些实施方案中，瘤内(浸润性)CD8+效应T细胞的数目(例如，CD8+效应T细胞的总数，或例如，CD45+细胞中CD8+的百分数)相对于施用OX40激动剂抗体之前升高。在本发明任何方法的一些实施方案中，表达γ干扰素的瘤内(浸润性)CD8+效应T细胞(例如，总CD8+细胞中表达γ干扰素的CD8+细胞的百分数)的数目相对于施用OX40激动剂抗体之前增加。
在一些实施方案中，相对于施用OX40激动剂抗体之前，个体中的记忆T细胞具有增强的增殖和/或细胞因子分泌。在一些实施方案中，记忆T细胞的数目相对于施用OX40激动剂抗体之前升高。在一些实施方案中，记忆T细胞的细胞因子分泌(水平)相对于施用OX40激动剂抗体之前升高。在任何方法的一些实施方案中，相对于施用OX40激动剂抗体之前，个体中的Treg具有降低的效应T细胞功能(例如，增殖和/或细胞因子分泌)抑制作用。在一些实施方案中，效应T细胞的数目相对于施用OX40激动剂抗体之前升高。在一些实施方案中，效应T细胞的细胞因子分泌(水平)相对于施用OX40激动剂抗体之前升高。
在一些实施方案中，OX40激动剂抗体抑制效应T细胞功能的Treg抑制作用。在一些实施方案中，效应T细胞功能是效应T细胞增殖和/或细胞因子产生。在一些实施方案中，效应T细胞是CD4+效应T细胞。
在一些实施方案中，OX40激动剂抗体抑制Treg功能，例如，通过减少Treg对T细胞功能(例如，效应T细胞增殖和/或效应T细胞分泌细胞因子)的抑制。在一些实施方案中，效应T细胞是CD4+效应T细胞。在一些实施方案中，OX40激动剂抗体减少瘤内(浸润性)Treg的数目(例如，Treg总数或例如CD4+细胞中Fox3p+细胞的百分数)。
在一些实施方案中，瘤内(浸润性)Treg的数目(例如，Treg总数或例如CD4+细胞中Fox3p+细胞的百分数)相对于施用OX40激动剂抗体之前减少。
在一些实施方案中，瘤内(浸润性)CD4+效应T细胞的数目(例如，CD4+效应T细胞的总数，或例如，CD45+细胞中CD4+细胞的百分数)相对于施用OX40激动剂抗体之前升高。在本发明任何方法的一些实施方案中，表达γ干扰素的瘤内(浸润性)CD4+效应T细胞的数目(例如，表达γ干扰素的总CD4+细胞，或例如，总CD4+细胞中表达γ干扰素的CD4+细胞的百分数)相对于施用OX40激动剂抗体之前升高。
在一些实施方案中，OX40激动剂抗体增加表达OX40的靶细胞中的OX40信号转导。在一些实施方案中，通过监测NFkB下游信号传导检测OX40信号转导。
在一些实施方案中，OX40激动剂抗体在40℃处理2周后稳定。
在一些实施方案中，OX40激动剂抗体与OX40L竞争结合人OX40。在一些实施方案中，添加OX40L不在体外测定法中增强OX40抗体功能。
根据另一个实施方案，OX40激动剂抗体包括以下特性的任一个、任何组合或全部：(1)以小于或等于约0.45nM的亲和力结合人OX40；在一些实施方案中，以小于或等于约0.4nM的亲和力结合人OX40；在一些实施方案中，以小于或等于约0.5nM的亲和力结合人OX40；在一些实施方案中，使用放射免疫测定测定结合亲和力；(2)结合人OX40和食蟹猴OX40，在一些实施方案中，使用FACS测定法测定结合作用，(3)以约0.2ug/ml的EC50结合人OX40；在一些实施方案中，以约0.3ug/ml或更低的EC50与人OX40结合；在一些实施方案中，以约1.5ug/ml的EC50与食蟹猴OX40结合；在一些实施方案中，以约1.4ug/ml的EC50与食蟹猴OX40结合；(4)基本上不与大鼠OX40或小鼠OX40结合；(5)增强CD4+效应T细胞功能，例如，通过增加CD4+效应T细胞增殖和/或增加CD4+效应T细胞产生γ干扰素(例如，如相比于抗人OX40激动剂抗体处理之前的增殖和/或细胞因子产生)；(6)增强记忆T细胞功能，例如通过增加记忆T细胞增殖和/或增加记忆细胞产生细胞因子；(7)抑制Treg功能，例如，通过减少Treg对效应T细胞功能(例如，效应T细胞增殖和/或效应T细胞分泌细胞因子)的抑制。在一些实施方案中，效应T细胞是CD4+效应T细胞，(8)增加表达OX40的靶细胞中的OX40信号转导(在一些实施方案中，通过监测NFkB下游信号传导检测OX40信号转导)和(9)在40℃处理2周后稳定。
表A.OX40抗体序列
在一些实施方案中，OX40激动剂抗体是美国专利号7,550,140中描述的抗人OX40激动剂抗体。在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含重链，所述重链包含以下序列：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYTMNWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDRYSQVHYALDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:185)，和/或轻链，所述轻链包含以下序列：DIVMTQSPDSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKAGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQYYNHPTTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:186)。在一些实施方案中，抗体包含如美国专利号7,550,140中所述的抗体008的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列。在一些实施方案中，抗体包含如美国专利号7,550,140中所述的抗体008的重链可变区序列和/或轻链可变区序列。
在一些实施方案中，OX40激动剂抗体是美国专利号7,550,140中描述的抗人OX40激动剂抗体。在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含
DIQMTQSPDSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKAGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQYYNHPTTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:187)的序列。在一些实施方案中，抗体包含如美国专利号7,550,140中所述的抗体SC02008的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列。在一些实施方案中，抗体包含如美国专利号7,550,140中所述的抗体SC02008的重链可变区序列和/或轻链可变区序列。
在一些实施方案中，OX40激动剂抗体是美国专利号7,550,140中描述的抗人OX40激动剂抗体。在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含重链，所述重链包含以下序列：EVQLVESGGGLVHPGGSLRLSCAGSGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVSAIGTGGGTYYADSVMGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYDNVMGLYWFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:188)，和/或轻链，所述轻链包含以下序列：EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPAFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:189)。在一些实施方案中，抗体包含如美国专利号7,550,140中所述的抗体023的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列。在一些实施方案中，抗体包含如美国专利号7,550,140中所述的抗体023的重链可变区序列和/或轻链可变区序列。
在一些实施方案中，OX40激动剂抗体是美国专利号7,960,515中描述的抗人OX40激动剂抗体。在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含以下序列：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSYISSSSSTIDYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYYCARESGWYLFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:190)，和/或轻链可变区，所述轻链可变区包含以下序列：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPEKAPKSLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYPPTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:191)。在一些实施方案中，抗体包含如美国专利号7,960,515中所述的抗体11D4的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列。在一些实施方案中，抗体包含如美国专利号7,960,515中所述的抗体11D4的重链可变区序列和/或轻链可变区序列。
在一些实施方案中，OX40激动剂抗体是美国专利号7,960,515中描述的抗人OX40激动剂抗体。在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含以下序列：EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDQSTADYYFYYGMDVWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:192)，和/或轻链可变区，所述轻链可变区包含以下序列：EIVVTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPTFGQGTKVEIK(SEQ IDNO:193)。在一些实施方案中，抗体包含如美国专利号7,960,515中所述的抗体18D8的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列。在一些实施方案中，抗体包含如美国专利号7,960,515中所述的抗体18D8的重链可变区序列和/或轻链可变区序列。
在一些实施方案中，OX40激动剂抗体是WO 2012/027328中描述的抗人OX40激动剂抗体。在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含以下序列：QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTDYSMHWVRQAPGQGLKWMGWINTETGEPTYADDFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCANPYYDYVSYYAMDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:194)，和/或轻链可变区，所述轻链可变区包含以下序列：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYLYTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQHYSTPRTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO:195)。在一些实施方案中，抗体包含如WO 2012/027328中所述的抗体hu106-222的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列。在一些实施方案中，抗体包含如WO2012/027328中所述的抗体hu106-222的重链可变区序列和/或轻链可变区序列。
在一些实施方案中，OX40激动剂抗体是WO 2012/027328中描述的抗人OX40激动剂抗体。在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含以下序列：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASEYEFPSHDMSWVRQAPGKGLELVAAINSDGGSTYYPDTMERRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHYDDYYAWFAYWGQGTMVTVSS(SEQ ID NO:196)，和/或轻链可变区，所述轻链可变区包含以下序列：EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGQAPRLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRELPLTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:197)。在一些实施方案中，抗体包含如WO 2012/027328中所述的抗体Hu119-122的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列。在一些实施方案中，抗体包含如WO2012/027328中所述的抗体Hu119-122的重链可变区序列和/或轻链可变区序列。
在一些实施方案中，OX40激动剂抗体是WO 2013/028231中描述的抗人OX40激动剂抗体。在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含重链，所述重链包含以下序列：
MYLGLNYVFIVFLLNGVQSEVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCAASGFTFSDAWMDWVRQSPEKGLEWVAEIRSKANNHATYYAESVNGRFTISRDDSKSSVYLQMNSLRAEDTGIYYCTWGEVFYFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYITCNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:198)，和/或轻链，所述轻链包含以下序列：MRPSIQFLGLLLFWLHGAQCDIQMTQSPSSLSASLGGKVTITCKSSQDINKYIAWYQHKPGKGPRLLIHYTSTLQPGIPSRFSGSGSGRDYSFSISNLEPEDIATYYCLQYDNLLTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:199)。在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含以下序列：MYLGLNYVFIVFLLNGVQSEVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCAASGFTFSDAWMDWVRQSPEKGLEWVAEIRSKANNHATYYAESVNGRFTISRDDSKSSVYLQMNSLRAEDTGIYYCTWGEVFYFDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:214)，和/或轻链可变区，所述轻链可变区包含以下序列：MRPSIQFLGLLLFWLHGAQCDIQMTQSPSSLSASLGGKVTITCKSSQDINKYIAWYQHKPGKGPRLLIHYTSTLQPGIPSRFSGSGSGRDYSFSISNLEPEDIATYYCLQYDNLLTFGAGTKLELK(SEQ ID NO:215)。在一些实施方案中，抗体包含如WO 2013/028231中所述的抗体Mab CH119-43-1的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列。在一些实施方案中，抗体包含如WO 2013/028231中所述的抗体Mab CH 119-43-1的重链可变区序列和/或轻链可变区序列。
在一些实施方案中，OX40激动剂抗体是WO 2013/038191中描述的抗人OX40激动剂抗体。在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含以下序列：EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYVMHWVKQKPGQGLEWIGYINPYNDGTKYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCANYYGSSLSMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:200)，和/或轻链可变区，所述轻链可变区包含以下序列：DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPWTFGGGTKLEIKR(SEQ ID NO:201)。在一些实施方案中，抗体包含如WO 2013/038191中所述的抗体克隆20E5的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列。在一些实施方案中，抗体包含如WO2013/038191中所述的抗体克隆20E5的重链可变区序列和/或轻链可变区序列。
在一些实施方案中，OX40激动剂抗体是WO 2013/038191中描述的抗人OX40激动剂抗体。在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含以下序列：EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKTSGYTFKDYTMHWVKQSHGKSLEWIGGIYPNNGGSTYNQNFKDKATLTVDKSSSTAYMEFRSLTSEDSAVYYCARMGYHGPHLDFDVWGAGTTVTVSP(SEQ ID NO:202)，和/或轻链可变区，所述轻链可变区包含以下序列：DIVMTQSHKFMSTSLGDRVSITCKASQDVGAAVAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRHTGVPDRFTGGGSGTDFTLTISNVQSEDLTDYFCQQYINYPLTFGGGTKLEIKR(SEQ ID NO:203)。在一些实施方案中，抗体包含如WO 2013/038191中所述的抗体克隆12H3的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列。在一些实施方案中，抗体包含如WO 2013/038191中所述的抗体克隆12H3的重链可变区序列和/或轻链可变区序列。
在一些实施方案中，OX40激动剂抗体是WO 2014/148895A1中描述的抗人OX40激动剂抗体。在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含以下序列：QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYVMHWVRQAPGQRLEWMGYINPYNDGTKYNEKFKGRVTITSDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCANYYGSSLSMDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:204)，和/或轻链可变区，所述轻链可变区包含以下序列：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO:205)。在一些实施方案中，抗体包含如WO 2014/148895A1中所述的抗体克隆20E5的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列。在一些实施方案中，抗体包含如WO2014/148895A1中所述的抗体克隆20E5的重链可变区序列和/或轻链可变区序列。
在一些实施方案中，OX40激动剂抗体是WO 2014/148895A1中描述的抗人OX40激动剂抗体。在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含以下序列：QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYVMHWVRQAPGQRLEWMGYINPYNDGTKYNEKFKGRVTITSDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCANYYGSSLSMDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:204)，和/或轻链可变区，所述轻链可变区包含以下序列：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYFCQQGNTLPWTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO:206)。在一些实施方案中，抗体包含如WO 2014/148895A1中所述的抗体克隆20E5的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列。在一些实施方案中，抗体包含如WO2014/148895A1中所述的抗体克隆20E5的重链可变区序列和/或轻链可变区序列。
在一些实施方案中OX40激动剂抗体是WO 2014/148895A1中描述的抗人OX40激动剂抗体。在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含以下序列：QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYVMHWVRQAPGQRLEWIGYINPYNDGTKYNEKFKGRATITSDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCANYYGSSLSMDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:207)，和/或轻链可变区，所述轻链可变区包含以下序列：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO:205)。在一些实施方案中，抗体包含如WO 2014/148895A1中所述的抗体克隆20E5的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列。在一些实施方案中，抗体包含如WO2014/148895A1中所述的抗体克隆20E5的重链可变区序列和/或轻链可变区序列。
在一些实施方案中，OX40激动剂抗体是WO 2014/148895A1中描述的抗人OX40激动剂抗体。在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含以下序列：QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYVMHWVRQAPGQRLEWIGYINPYNDGTKYNEKFKGRATITSDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCANYYGSSLSMDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:207)，和/或轻链可变区，所述轻链可变区包含以下序列：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYFCQQGNTLPWTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO:206)。在一些实施方案中，抗体包含如WO 2014/148895A1中所述的抗体克隆20E5的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列。在一些实施方案中，抗体包含如WO2014/148895A1中所述的抗体克隆20E5的重链可变区序列和/或轻链可变区序列。
在一些实施方案中，OX40激动剂抗体是WO 2014/148895A1中描述的抗人OX40激动剂抗体。在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含以下序列：QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYVMHWVRQAPGQRLEWIGYINPYNDGTKYNEKFKGRATLTSDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCANYYGSSLSMDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:208)，和/或轻链可变区，所述轻链可变区包含以下序列：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO:205)。在一些实施方案中，抗体包含如WO 2014/148895A1中所述的抗体克隆20E5的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列。在一些实施方案中，抗体包含如WO2014/148895A1中所述的抗体克隆20E5的重链可变区序列和/或轻链可变区序列。
在一些实施方案中，OX40激动剂抗体是WO 2014/148895A1中描述的抗人OX40激动剂抗体。在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含以下序列：QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYVMHWVRQAPGQRLEWIGYINPYNDGTKYNEKFKGRATLTSDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCANYYGSSLSMDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:208)，和/或轻链可变区，所述轻链可变区包含以下序列：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYFCQQGNTLPWTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO:206)。在一些实施方案中，抗体包含如WO 2014/148895A1中所述的抗体克隆20E5的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列。在一些实施方案中，抗体包含如WO2014/148895A1中所述的抗体克隆20E5的重链可变区序列和/或轻链可变区序列。
在一些实施方案中，OX40激动剂抗体是WO 2014/148895A1中描述的抗人OX40激动剂抗体。在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含以下序列：QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFKDYTMHWVRQAPGQGLEWMGGIYPNNGGSTYNQNFKDRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARMGYHGPHLDFDVWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:209)，和/或轻链可变区，所述轻链可变区包含以下序列：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVGAAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYINYPLTFGGGTKVEIKR(SEQ ID NO:210)。在一些实施方案中，抗体包含如WO 2014/148895A1中所述的抗体克隆12H3的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列。在一些实施方案中，抗体包含如WO2014/148895A1中所述的抗体克隆12H3的重链可变区序列和/或轻链可变区序列。
在一些实施方案中，OX40激动剂抗体是WO 2014/148895A1中描述的抗人OX40激动剂抗体。在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含以下序列：QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFKDYTMHWVRQAPGQGLEWMGGIYPNNGGSTYNQNFKDRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARMGYHGPHLDFDVWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:209)，和/或轻链可变区，所述轻链可变区包含以下序列：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVGAAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPDRFSGGGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYINYPLTFGGGTKVEIKR(SEQ ID NO:211)。在一些实施方案中，抗体包含如WO 2014/148895A1中所述的抗体克隆12H3的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列。在一些实施方案中，抗体包含如WO2014/148895A1中所述的抗体克隆12H3的重链可变区序列和/或轻链可变区序列。
在一些实施方案中，OX40激动剂抗体是WO 2014/148895A1中描述的抗人OX40激动剂抗体。在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含以下序列：QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFKDYTMHWVRQAPGQGLEWIGGIYPNNGGSTYNQNFKDRVTLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARMGYHGPHLDFDVWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:212)，和/或轻链可变区，所述轻链可变区包含以下序列：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVGAAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYINYPLTFGGGTKVEIKR(SEQ ID NO:210)。在一些实施方案中，抗体包含如WO 2014/148895A1中所述的抗体克隆12H3的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列。在一些实施方案中，抗体包含如WO2014/148895A1中所述的抗体克隆12H3的重链可变区序列和/或轻链可变区序列。
在一些实施方案中，OX40激动剂抗体是WO 2014/148895A1中描述的抗人OX40激动剂抗体。在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含以下序列：QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFKDYTMHWVRQAPGQGLEWIGGIYPNNGGSTYNQNFKDRVTLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARMGYHGPHLDFDVWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:212)，和/或轻链可变区，所述轻链可变区包含以下序列：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVGAAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPDRFSGGGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYINYPLTFGGGTKVEIKR(SEQ ID NO:211)。在一些实施方案中，抗体包含如WO 2014/148895A1中所述的抗体克隆12H3的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列。在一些实施方案中，抗体包含如WO2014/148895A1中所述的抗体克隆12H3的重链可变区序列和/或轻链可变区序列。
在一些实施方案中，OX40激动剂抗体是WO 2014/148895A1中描述的抗人OX40激动剂抗体。在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含以下序列：QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFKDYTMHWVRQAPGQGLEWIGGIYPNNGGSTYNQNFKDRATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARMGYHGPHLDFDVWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:213)，和/或轻链可变区，所述轻链可变区包含以下序列：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVGAAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYINYPLTFGGGTKVEIKR(SEQ ID NO:210)。在一些实施方案中，抗体包含如WO 2014/148895A1中所述的抗体克隆12H3的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列。在一些实施方案中，抗体包含如WO2014/148895A1中所述的抗体克隆12H3的重链可变区序列和/或轻链可变区序列。
在一些实施方案中，OX40激动剂抗体是WO 2014/148895A1中描述的抗人OX40激动剂抗体。在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含以下序列：QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFKDYTMHWVRQAPGQGLEWIGGIYPNNGGSTYNQNFKDRATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARMGYHGPHLDFDVWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:213)，和/或轻链可变区，所述轻链可变区包含以下序列：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVGAAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPDRFSGGGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYINYPLTFGGGTKVEIKR(SEQ ID NO:211)。在一些实施方案中，抗体包含如WO 2014/148895A1中所述的抗体克隆12H3的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列。在一些实施方案中，抗体包含如WO2014/148895A1中所述的抗体克隆12H3的重链可变区序列和/或轻链可变区序列。
在一些实施方案中，激动剂抗人OX40抗体是L106BD(Pharmingen产品号340420)。在一些实施方案中，抗体包含抗体L106(BD Pharmingen产品编号340420)的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列。在一些实施方案中，抗体包含抗体L106(BDPharmingen产品号340420)的重链可变区序列和/或轻链可变区序列。
在一些实施方案中，激动剂抗人OX40抗体是ACT35(Santa Cruz Biotechnology，目录号20073)。在一些实施方案中，抗体包含抗体ACT35(Santa Cruz Biotechnology,目录号20073)的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列。在一些实施方案中，抗体包含抗体ACT35(Santa Cruz Biotechnology，目录号20073)的重链可变区序列和/或轻链可变区序列。
在一些实施方案中，OX40激动剂抗体是MEDI6469。在一些实施方案中，抗体包含抗体MEDI6469的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列。在一些实施方案中，抗体包含抗体MEDI6469的重链可变区序列和/或轻链可变区序列。
在一些实施方案中，OX40激动剂抗体是MEDI0562。在一些实施方案中，抗体包含抗体MEDI0562的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列。在一些实施方案中，抗体包含抗体MEDI0562的重链可变区序列和/或轻链可变区序列。
非抗体OX40激动剂
在某些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽包含了含有非抗体OX40激动剂的抗原结合区。非抗体OX40激动剂是本领域熟知的。
OX40L(也称作CD134L)充当OX40的配体。从而，存在部分或全部OX40L的激动剂可以充当OX40激动剂。在一些实施方案中，OX40激动剂可以包含OX40L的一个或多个胞外结构域。OX40L的胞外结构域的例子可以包括OX40结合结构域。在一些实施方案中，OX40激动剂可以是可溶性形式的OX40L，其包含OX40L的一个或多个胞外结构域，但缺少该蛋白质的其他不溶性结构域，例如，跨膜结构域。在一些实施方案中，OX40激动剂是能够结合OX40L的包含OX40L的一个或多个胞外结构域的可溶性蛋白。
在一些实施方案中，OX40激动剂可以是在美国专利号7,696,175或欧洲专利号EP0672141B1中描述的任一种OX40激动剂。在一些实施方案中，OX40激动剂可以是在国际公开号WO2006/121810中描述的任一种OX40激动剂，如OX40免疫黏附素。在一些实施方案中，OX40激动剂是MEDI6383。
促进Fc结构域之间分子间相互作用的Fc变体
在某些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽包含增强Fc结构域之间分子间相互作用以形成本文提供的激动剂结合复合体的变异Fc区。在示例性实施方案中，本文所述的抗原结合多肽包含增强六聚体形成以产生本文中提供的激动剂抗原结合复合体的变异Fc区。变异Fc区可以包含来自多个物种的Fc区的变体，所述物种例如包括人、啮齿类(例如，小鼠、大鼠、仓鼠、兔、等)、犬、或非人灵长类(例如，旧世界猴如猕猴(例如，食蟹猴或恒河猴)、狒狒和黑猩猩、或新世界猴猴如狨猴、绢毛猴、吼猴、绒毛猴、蜘蛛猴、枭猴、卷尾猴或松鼠猴)。Fc变体可以是任何抗体同种型的变体，包括来自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2或IgE抗体的Fc区。在一个示例性实施方案中，Fc区是人Fc区序列(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)的变体，所述的人Fc区序列在一个或多个氨基酸位置处包含氨基酸修饰(例如，置换、缺失或***)。
本文所述的氨基酸修饰可以直接或间接地促进Fc结构域之间分子间相互作用。例如，氨基酸修饰可以本身造成影响，涉及直接接触另一个分子的Fc结构域，或可以经修饰以与另一个Fc结构域直接相互作用，或可以间接地影响分子间Fc:Fc相互作用。在某些实施方案中，本文所述的氨基酸修饰可以直接或间接地增强复合体形式下Fc结构域之间的结合强度，例如，增强复合体结构(例如，六聚体结构、五聚体结构、四聚体结构、三聚体结构或二聚体结构)的稳定性。在某些实施方案中，本文所述的氨基酸修饰可以促进或增强新的分子间Fc:Fc键(如，但不限于、范德瓦尔斯相互作用、氢键形成、电荷-电荷相互作用、或芳族堆叠相互作用)形成，或通过释放水分子，促进Fc:Fc相互作用时熵增加。在某些实施方案中，可以基于尺寸和参与或促进分子间Fc:Fc相互作用或分子内相互作用(变构突变)的物理化学特性，选择用于产生本文所述的Fc变体的示例性置换。
可以使用本领域熟知的测定法，例如，通过使用如本文实施例部分中进一步描述的大小排阻色谱(SEC)，确定Fc复合体或抗原结合复合体的分子量，确定用于确定Fc变体是否促进Fc结构域之间分子间相互作用和/或促进复合体形成(例如，二聚体、三聚体、四聚体、五聚物或六聚体形成)的方法。
在某些实施方案中，促进Fc结构域之间分子间相互作用的Fc变体在选自E345、E430和S440(EU编号)一个或多个Fc区残基处包含置换。在某些实施方案中，Fc变体在氨基酸位置E345、E430和E440(EU编号)的两个或更多位置处包含置换。在一个示例性实施方案中，Fc变体包含以下三个修饰：E345R、E430G和S440Y(EU编号)。
在其他实施方案中，Fc变体可以包含在WO 2013/004842、WO2014/108198、WO2014/006217、或Diebolder等人.SCIENCE,卷434,1260-1263(2014)中描述的任何修饰。
在某些实施方案中，Fc变体可以在下表1中描述的1、2、3、4、5、6个或更多个氨基酸位置处包含修饰。修饰可以是缺失、***或置换一个或多个氨基酸或其组合。这种氨基酸置换可以用任何天然存在的或非天然的氨基酸。
这类修饰可用于促进Fc结构域之间的分子间相互作用和复合体形成(例如，六聚体形成)。
表1.促进Fc结构域之间分子间相互作用和六聚体形成的示例性修饰位点和氨基酸置换。每个氨基酸残基根据人IgG1抗体的EU index编号列出并且显示在IgG2、IgG3和IgG4亲本抗体的相应位置中的氨基酸。
*在IgG1中，位置356可以是亲本抗体中的D或E。在本发明语境下，对“D/E356”的称谓指在人IgG1的序列中的同种异型变体。在人IgG1的IgG1m(za)同种异型中，在位置356的氨基酸是D，而在人IgG1的IgG1m(f)同种异型中，在位置356的氨基酸是E。
在某些实施方案中，Fc变体包含在选自对应于人IgG1重链Fc区内E345、E430、S440、Q386、P247、I253、S254、Q311、D/E356、T359、E382、Y436和K447的那些氨基酸残基中至少一个氨基酸残基处的修饰。在某些实施方案中，Fc变体包含在选自对应于人IgG1重链Fc区内H310、G385、H433、N434、Q438和K439的那些氨基酸残基中至少一个氨基酸残基处的修饰。
在一个实施方案中，Fc包含在选自对应于人IgG1重链Fc区内E345X、E430X、S440W/Y、Q386K、P247G、I253V、S254L、Q311I7W、D/E356R、E382V、Y436I和K447D/E/缺失的那些氨基酸残基中至少一个氨基酸残基处的修饰，其中X是任何氨基酸(例如，天然出现的氨基酸)。
在一个实施方案中，Fc变体包含在选自人IgG1重链Fc区内E345、E430、S440和Q386中至少一个氨基酸残基处的修饰。
在另一个实施方案中，Fc变体包含在选自人IgG1重链Fc区内E345X、E430X、S440W/Y、Q386K中至少一个氨基酸残基处的修饰，其中X是任何氨基酸(例如，天然出现的氨基酸)。
在某些实施方案中，Fc变体包含在选自人IgG1重链Fc区内E345R、Q、N、K、A、C、D、F、G、H、I、L、M、P、S、T、V、W、Y；E430T、S、G、A、C、D、F、H、I、L、K、M、N、P、Q、R、V、W、Y；S440W、Y和Q386K中至少一个氨基酸残基处的修饰。
在某些实施方案中，Fc变体包含在选自人IgG1重链Fc区内E345R/Q/N/K、E430T/S/G、S440Y/W和Q386K中至少一个氨基酸残基处的修饰。
在某些实施方案中，Fc变体包含在选自人IgG1重链Fc区内E345R、E430G和S440Y中至少一个氨基酸残基处的修饰。在一个实施方案中，Fc变体包含在人IgG1重链Fc区内的E345R修饰。在一个实施方案中，Fc变体包含在人IgG1重链Fc区内的E430G修饰。在一个实施方案中，Fc变体包含在人IgG1重链Fc区内的S440Y修饰。
在某些实施方案中，Fc变体包含在选自E382和H433中至少一个氨基酸残基处的修饰，包括例如E345Y、D、W；E430F、H；E382D、Q、K、R；和H433R。
在另一个实施方案中，Fc变体包含以下置换：E345R。
在另一个实施方案中，Fc变体包含以下氨基酸残基置换中的至少一种：I253至E、N、Q、S或T；H310至N、Q、W或Y；Q311至E或R；E382至D、H、K、R、N、Q、S、T、W或Y；G385至E、H、K、N、Q、R、S、T、W或Y；H433至R；N434至D、E、H、K、Q、R、S、T、W或Y；Y436至A、E、F、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T或V；Q438至A、E、G、H、K、N、Q、R、S、T、W或Y；K439至D、H、Q、R、W或Y；或S440至D、E、H、F、N、Q、W或Y。
在另一个实施方案中，Fc变体包含以下氨基酸残基置换中的至少一种：I253至N或Q；H310至Q；Q311至E或R；E382至D、Q、K、或R；G385至D、E、K或R；H433至R；N434至H、K、Q或R；Y436至N、Q、S或T；Q438至N、S或T；K439至Q；或S440至D、E或Q。
在另一个实施方案中，Fc变体包含以下氨基酸残基置换中的至少一种：E382至D、Q、K或R；或H433至R。
在另一个实施方案中，Fc变体包含以下置换：E382R。
在另一个实施方案中，Fc变体包含以下置换：H433R。
在另一个实施方案中，Fc变体包含以下氨基酸残基置换中的至少一种：P247G、I253V、S254L、Q311L、Q311W、E345A、E345C、E345D、E345F、E345G、E345H、E345I、E345K、E345L、E345M、E345N、E345P、E345Q、E345R、E345S、E345T、E345V、E345W、E345Y、D/E356G、D/E356R、T359R、E382L、E382V、Q386K、E430A、E430C、E430D、E430F、E430G、E430H、E430I、E430K、E430L、E430M、E430N、E430P、E430Q、E430R、E430S、E430T、E430V、E430W、E430Y、Y436I、S440Y或S440W。
在另一个实施方案中，Fc变体包含以下氨基酸残基置换中的至少一种：E382R、H433R、H435R或H435A。
在另一个实施方案中，Fc变体包含在人IgG1重链Fc区内以下氨基酸残基E345、E382或Q386中至少两者处的修饰，其中至少两个氨基酸修饰是不同的。
在某些实施方案中，其中Fc变体在两个或更多个氨基酸残基处包含修饰的情况下，这些修饰可以存在于Fc变体的每条重链中，或一个氨基酸修饰可以存在于Fc结构域的一个重链中并且其他氨基酸修饰可以分别存在于Fc结构域的另一条重链中，或反之亦然。
在一个实施方案中，Fc变体包含在选自对应于人IgG1重链Fc区内E345、E430、S440、Q386、P247、I253、S254、Q311、D/E356、T359、E382、Y436和K447的那些氨基酸残基中至少两个氨基酸残基处的修饰。在一个实施方案中，Fc变体包含在选自对应于H310、G385、H433、N434、Q438和K439的那些氨基酸残基中至少两个氨基酸残基处的修饰。在一个示例性实施方案中，Fc变体包含以下一个或多个修饰：S440Y或S440W。
在一个实施方案中，Fc变体包含在选自对应于人IgG1重链Fc区内E345X、E430X、S440W/Y、Q386K、P247G、I253V、S254L、Q311L/W、D/E356R、E382V和Y436I的那些氨基酸残基中至少两个氨基酸残基处的修饰，其中X是任何氨基酸(例如，天然出现的氨基酸)。
在一个实施方案中，Fc变体包含在E345、E430、S440和Q386中至少一处的修饰，如E345、E430、S440和Q386中二者或全部处的修饰。在另一个实施方案中，Fc变体包含在E382和H433中至少一者或E382和H433二者处的修饰。在某些实施方案中，这类变体可以任选地包含在表1中所列的一个或多个其他氨基酸处的其他修饰。在一个示例性实施方案中，Fc变体包含在选自对应于人IgG1重链Fc区内E345X、E430X、S440W/Y和Q386K的组中至少两个氨基酸残基处的修饰，其中X是任何氨基酸(例如，天然出现的氨基酸)。
至少两个氨基酸残基处的示例性修饰组合是E345X/E430X、E345X/S440Y或W、E345X/Q386K、E430X/S440Y或W和E430X/Q386K。
在某些实施方案中，Fc变体包含在选自以下的至少两个氨基酸残基处的修饰：P247G、I253V、S254L、Q311L、Q311W、E345A、E345C、E345D、E345F、E345G、E345H、E345I、E345K、E345L、E345M、E345N、E345P、E345Q、E345R、E345S、E345T、E345V、E345W、E345Y、D/E356G、D/E356R、T359R、E382L、E382V、Q386K、E430A、E430C、E430D、E430F、E430G、E430H、E430I、E430K E430L、E430M、E430N、E430P、E430Q、E430R、E430S、E430T、E430V、E430W、E430Y、Y436I、S440Y和S440W。
在示例性实施方案中，Fc变体包含在至少两个氨基酸残基处的修饰，其中修饰是选自人IgG1重链Fc区内以下的置换：E345R、Q、N、K、A、C、D、F、G、H、I、L、M、P、S、T、V、W、Y；E430T、S、G、A、C、D、F、H、I、L、K、M、N、P、Q、R、V、W、Y；S440W、Y；和Q386K。
在示例性实施方案中，Fc变体包含在至少两个氨基酸残基处的修饰，其中修饰是选自人IgG1重链Fc区内以下的置换：I253E、N、Q、S、T；H310N、Q、W、Y；Q311E、R；E382D、H、K、R、N、Q、S、T、W、Y；G385E、H、K、N、Q、R、S、T、W、Y；H433R；N434D、E、H、K、Q、R、S、T、W、Y；Y436、A、E、F、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V；Q438A、E、G、H、K、N、Q、R、S、T、W、Y；K439D、H、Q、R、W、Y；和S440D、E、H、F、N、Q。
在示例性实施方案中，Fc变体包含在至少两个氨基酸残基处的修饰，其中修饰是选自人IgG1重链Fc区内以下的氨基酸置换：E345R/Q/N/K、E430T/S/G、S440Y/W和Q386K。
在一个示例性实施方案中，Fc变体包含在至少两个氨基酸残基处的修饰，其中修饰是选自人IgG1重链Fc区内以下的氨基酸置换：I253N、Q；H310Q；Q311E、R；E382D、Q、K、R；G385D、E、K、R；H433R；N434H、K、Q、R；Y436N、Q、S、T；Q438N、S、T；K439Q；和S440D、E、Q。
至少两个氨基酸残基处的示例性修饰组合是E345R/E430T、E345R/S440Y、E345R/S440W、E345R/Q386K、E345R/E430G、E345Q/E430T、E345Q/S440Y、E345Q/S440W、E430T/S440Y、E430G/S440Y、E430T/S440W、E430T/Q386K和S440Y/Q386K。
在另一个实施方案中，Fc变体包含在选自人IgG1重链Fc区内E345、E382或Q386中至少两个氨基酸残基处的修饰，其中至少三个氨基酸修饰是不同的。
在示例性实施方案中，Fc变体包含在至少三个氨基酸残基处的修饰，其中修饰是以下氨基酸置换：E345R、Q396K和E430G，所述置换可以在Fc变体的一条或两条重链中。
至少三个氨基酸残基处的修饰可以单独选自表1中列出的置换。至少三个氨基酸残基处的示例性修饰组合是：E345R/E430G/S440Y、E345R/E430G/S440W、E345K/E430G/S440Y、E345K/E430G/S440W、E345Q/E430G/S440Y、E345Q/E430G/S440W、E345N/E430G/S440Y、E345N/E430G/S440W、E345R/E430T/S440Y、E345R/E430T/S440W、E345K/E430T/S440Y、E345K/E430T/S440W、E345Q/E430T/S440Y、E345Q/E430T/S440W、E345N/E430T/S440Y、E345N/E430T/S440W、E345R/E430S/S440Y、E345R/E430S/S440W、E345K/E430S/S440Y、E345K/E430S/S440W、E345Q/E430S/S440Y、E345Q/E430S/S440W、E345N/E430S/S440Y、E345N/E430S/S440W、E345R/E430F/S440Y、E345R/E430F/S440W、E345K/E430F/S440Y、E345K/E430F/S440W、E345Q/E430F/S440Y、E345Q/E430F/S440W、E345N/E430F/S440Y和E345N/E430F/S440W。
在另一个实施方案中，Fc变体可以包含在特定氨基酸残基相互作用对K439和S440中的二个修饰，如下文表2中所述。
表2.Fc变体的示例性双重修饰。
在一个实施方案中，本申请提供Fc变体，其中该变体包含以下的修饰：
(i)在选自对应于人IgG1重链Fc区内K439和S440的那些氨基酸残基中至少一个氨基酸残基处的修饰，条件是S440中的修饰不是S440Y或S440W，如，例如，其中对应于人IgG1重链Fc区中K439的位置处的修饰是K439D/E和/或对应于人IgG1重链Fc区中S440的位置处的修饰是S440K/H/R；
(ii)在对应于人IgG1重链Fc区内K447D/E或对应于人IgG1重链Fc区内K447K/R/H和448P中至少一个氨基酸残基处的修饰；或
(iii)在对应于人IgG1重链Fc区内K447D/E或对应于人IgG1重链Fc区内K447K/R/H和448K/R/H及449P中至少一个氨基酸残基处的修饰。
在一个实施方案中，其中Fc变体包含处于除S440和/或K447之外位置的修饰情况下，该变体还可以包含以下的修饰：
(i)在对应于人IgG1重链Fc区内K439和S440的至少一个氨基酸残基处的修饰，条件是S440中的修饰不是S440W或S440Y；
(ii)在对应于人IgG1重链Fc区内K447D/E或对应于人IgG1重链Fc区内K447K/R/H和448P中至少一个氨基酸残基处的修饰；或
(iii)在对应于人IgG1重链Fc区内K447D/E或对应于人IgG1重链Fc区内K447K/R/H和448K/R/H及449P中至少一个氨基酸残基处的修饰。
在某些实施方案中，Fc变体还可以包含仅一个氨基酸残基置换，如K439E或S440K，例如，该变体可以包含在K439处的修饰，任选地在S440处无修饰。
在一个实施方案中，Fc变体包含在氨基酸残基K439处的修饰，其中该修饰是选自E和D的氨基酸置换，如K439E或K439D。
在另一个实施方案中，Fc变体包含在S440处的修饰，任选地在K439处无修饰。
在一个实施方案中，Fc变体包含在氨基酸残基S440处的修饰，其中该修饰是选自K、R和H的氨基酸置换，如S440K、S440R或S440H。
在一个实施方案中，Fc变体包含在K439和S440二者处的修饰。
在另一个实施方案中，Fc变体包含在K439处的修饰，其中该修饰是选自K439至D、E或R的氨基酸置换，并且在S440处的修饰选自S440至D、E、K、H或R。
在另一个实施方案中，Fc变体包含在K439处选自K439D和K439E的修饰和在S440处选自S440K、S440R和S440H的修饰。
在另一个实施方案中，Fc变体包含K439E和S440K修饰。
在另一个实施方案中，Fc变体包含修饰组合，其中该组合包含(i)与人IgG1重链Fc区内E345、E382或Q386相对应的氨基酸残基和选自以下的其他修饰：
(a)在对应于人IgG1重链Fc区内K439和S440的至少一个氨基酸残基处的修饰，条件是S440中的修饰不是S440W或S440Y；
(b)在对应于人IgG1重链Fc区内K447D/E或对应于人IgG1重链Fc区内K447K/R/H和448P中至少一个氨基酸残基处的修饰；和
(c)在对应于人IgG1重链Fc区内K447D/E或对应于人IgG1重链Fc区内K447K/R/H和448K/R/H及449P中至少一个氨基酸残基处的修饰。
在另一个实施方案中，Fc变体包含修饰组合，其中该组合包含(i)与人IgG1重链Fc区内E345、E382或Q386相对应的氨基酸残基和选自以下的其他修饰：
(a)在对应于人IgG1重链Fc区内K439和S440的至少一个氨基酸残基处的修饰，条件是S440中的修饰不是S440W或S440Y；
(b)在对应于人IgG1重链Fc区内K447D/E或对应于人IgG1重链Fc区内K447K/R/H和448P中至少一个氨基酸残基处的修饰；和
(c)在对应于人IgG1重链Fc区内K447D/E或对应于人IgG1重链Fc区内K447K/R/H和448K/R/H及449P中至少一个氨基酸残基处的修饰。
在另一个实施方案中，Fc变体包含修饰的组合，其中所述组合包含(i)在选自对应于人IgG1重链Fc区内E345、E430、S440、Q386、P247、I253、S254、Q311、D/E356、T359、E382、Y436和K447的那些氨基酸残基中至少一个氨基酸残基处的修饰，和(ii)在对应于人IgG1重链Fc区内K439或S440的至少一个氨基酸残基处的其他修饰。
在另一个实施方案中，Fc变体包含修饰的组合，其中所述组合包含(i)选自与人IgG1重链Fc区内E345X、E430X、S440W/Y、Q386K相对应的那些氨基酸置换中的氨基酸置换，其中X是任何氨基酸(例如天然出现的氨基酸)，和(ii)对应于人IgG1重链Fc区内K439或S440的至少一个氨基酸残基处的其他修饰，条件是S440中的修饰不是S440W或S440Y。
在一个实施方案中，Fc变体包含在对应于IgG1重链Fc区内K439和S440的两个位置处的氨基酸修饰。
在某些实施方案中，对应于人IgG1重链Fc区中K439的位置处的修饰是K439D/E和/或对应于人IgG1重链Fc区中S440的位置处的修饰是S440K/H/R。
在某些实施方案中，Fc变体包含修饰的组合，其中第一修饰在选自与人IgG1重链Fc区内E345、E430、Q386和S440的那些氨基酸残基对应的氨基酸残基处，条件是S440中的修饰不是S440Y或S440W；并且第二和第三修饰是在位置K439E或S440K中的氨基酸置换。
在又一个实施方案中，Fc变体包含修饰的组合，其中第一修饰选自E345R、Q、N、K、A、F、G、H、I、L、M、P、S、T、V、W、Y、C、D；E430T、S、G、A、F、H、L、P、R、V、C、D、I、K、M、N、Q、W、Y；和S440W、Y、D；并且第二和第三修饰各自是在位置K439E或S440K中的氨基酸置换。
在另一个实施方案中，Fc变体包含修饰的组合，其中第一修饰选自E345R、Q、N、K、Y；E430T、S、G、F、H；S440W、Y；和Q386K。
在另一个实施方案中，Fc变体包含E345R、K439E和S440K氨基酸置换。
在一个实施方案中，Fc变体包含在选自对应于人IgG1重链Fc区内E345、E430、S440、Q386、P247、I253、S254、Q311、D/E356、T359、E382、Y436和K447的那些氨基酸残基中至少两个氨基酸残基处的修饰，条件S440处的修饰不是S440Y或S440W，并且Fc变体包含在对应于人IgG1重链Fc区内K439或S440的至少一个氨基酸残基处的其他修饰，条件是S440处的修饰不是S440W或S440Y。
在又一个实施方案中，Fc变体包含在至少两个氨基酸残基处的修饰，其中这些修饰是选自与人IgG1重链Fc区内E345X、E430X、S440W/Y和Q386K相对应的那些氨基酸置换中的氨基酸置换(其中X是任何氨基酸(例如天然出现的氨基酸))，并且Fc变体包含对应于人IgG1重链Fc区内K439或S440的至少一个氨基酸残基处的其他修饰，条件是S440中的修饰不是S440W或S440Y。
在一个实施方案中，Fc变体包含在对应于IgG1重链Fc区内K439和S440的两个位置处的氨基酸修饰，条件是S440中的修饰不是S440Y或S440W。
在又一个实施方案中，对应于人IgG1重链Fc区中K439的位置处的修饰是K439D/E和/或对应于人IgG1重链Fc区中S440的位置处的修饰是S440K/H/R。
在又一个实施方案中，Fc变体包含修饰的组合，其中第一和第二修饰是选自人IgG1重链Fc区内E345、E430、Q386和S440的氨基酸置换，条件是S440中的修饰不是S440Y或S440W；并且第三和第四修饰是在位置K439E或S440K中的氨基酸置换。
在另一个实施方案中，本文所述的复合体可以含有Fc变体的混合物，其中任何给定的Fc变体不促进与具有相同突变的另一个Fc变体的分子间相互作用，但是在各自在Fc区内具有不同修饰的两个或更多个Fc变体之间分子间相互作用得以促进。例如，第一抗原结合蛋白包含了包含氨基酸残基K439处修饰的Fc变体并且第二抗原结合蛋白包含了包含氨基酸残基S440处修饰的Fc变体。这类实施方案一般导致相同Fc-分子之间降低或大幅降低的Fc:Fc相互作用并且可以用来确保二个不同的抗原结合蛋白配对。例如，在K439或S440处均具有修饰的抗原结合蛋白可以不形成分子间相互作用，但是具有K439修饰的第一抗原结合蛋白和具有S440修饰的第二抗原结合蛋白将形成分子间相互作用。下表3中显示Fc变体混合物的示例性修饰位点。
表3.示例性混合的修饰。
减少效应子功能的Fc修饰
在某些实施方案中，本文所述的Fc变体还包含减弱效应子功能(如CDC和/或ADCC)的一个或多个氨基酸修饰。在示例性实施方案中，减弱效应子功能的修饰是不改变Fc区的糖基化模式的修饰。在某些实施方案中，减弱效应子功能的修饰减少或消除与人效应细胞结合、与一个或多个Fc受体结合和/或与表达Fc受体的细胞结合。在一个示例性实施方案中，本文所述的Fc变体包含人IgG1Fc区内的以下修饰：L234A、L235A和P329G，这些修饰导致减弱的效应子功能。
在多种实施方案中，具有降低的效应子功能的Fc变体指这样的Fc变体，所述Fc变体与野生型Fc区(例如，不具有减少效应子功能的突变的Fc区，不过它可以具有其他突变)实现的效应子功能相比，减少效应子功能(例如，CDC、ADCC和/或与FcR结合等活性)至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％或更多。在某些实施方案中，具有降低的效应子功能的Fc变体指如与野生型Fc区相比，消除全部可检测效应子功能的Fc变体。测量效应子功能的测定法是本领域已知的且在下文描述。
可以进行体外和/或体内细胞毒性测定以确认CDC和/或ADCC活性的减少/消耗。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定以确保抗体缺乏FcγR结合(因此可能缺乏ADCC活性)。介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492总结了造血细胞上的FcR表达。评估目的分子的ADCC活性的体外测定法的非限制性实例描述于美国专利号5,500,362(参见例如Hellstrom,I.等人Proc.Nat’l Acad.Sci.USA83:7059-7063(1986))和Hellstrom,I等人,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA82:1499-1502(1985)；5,821,337(参见Bruggemann,M.等人,J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))。备选地，可以使用非放射性测定法(参见例如ACTITM非放射性细胞毒性测定法用于流式细胞术(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA；和CytoTox非放射性细胞毒性测定法(Promega,Madison,WI)。用于这类测定法的有用的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。备选地或额外地，可以在体内评估目的分子的ADCC活性，例如在动物模型中，例如Clynes等人Proc.Nat’lAcad.Sci.USA 95:652-656(1998)中所公开。还可以实施C1q结合测定法以确认抗体不能结合C1q，因此缺乏CDC活性。参见例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可以实施CDC测定法(参见例如Gazzano-Santoro等人,J.Immunol.Methods202:163(1996)；Cragg,M.S.等人,Blood 101:1045-1052(2003)；和Cragg,M.S.和M.J.Glennie,Blood 103:2738-2743(2004))。
具有减少的效应子功能的Fc变体包括在以下一个或多个氨基酸残基处具有氨基酸置换的那些：238、265、269、270、297、327和329(美国专利号6,737,056)。这类Fc变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327的两个或更多个位置处具有置换的Fc变体，包括残基265和297置换成丙氨酸的所谓“DANA”Fc变体(美国专利号7,332,581)。
描述了具有改善或削弱的FcR结合作用的某些抗体变体(参见，例如，美国专利号6,737,056；WO 2004/056312和Shields等人,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001))。
在某些实施方案中，本文所述的Fc变体可以在Fc区内包含一个或多个导致削弱C1q结合和/或补体依赖细胞毒性(CDC)的修饰，例如，如美国专利号6,194,551、WO 99/51642和Idusogie等人,J.Immunol.164:4178-4184(2000)中所述。在示例性实施方案中，本文所述的Fc变体包含在人IgG1Fc区内赖氨酸322(残基的EU编号)处的修饰。在一些实施方案中，修饰导致削弱的C1q结合和/或CDC，例如，如与无修饰的Fc区相比。例如，在某些实施方案中，本文所述的Fc变体包含人IgG1Fc区内的K322A修饰(残基的EU编号)，例如，如美国专利号6,194,551、WO 99/51642和Idusogie等人,J.Immunol.164:4178-4184(2000)中所述。其他的这类示例性修饰(人IgG1Fc区内和根据残基的EU编号)包括但不限于D270K、D270V、P329A和P331A。
在一些实施方案中，本文所述的任何Fc变体可以包含人IgG1Fc区内的K322A修饰(残基的EU编号)和选自人IgG1Fc区内E345R、E430G和S440Y的一个或多个氨基酸置换(EU编号)。例如，在一些实施方案中，本文所述的任何Fc变体可以包含人IgG1Fc区内的K322A修饰(残基的EU编号)和选自人IgG1Fc区内E345R、E430G和S440Y的单氨基酸置换(EU编号)。在一些实施方案中，本文所述的任何Fc变体可以包含人IgG1Fc区内的K322A修饰(残基的EU编号)和选自人IgG1Fc区内(a)E345R和E430G、(b)E345R和S440Y和(c)E430G和S440Y的氨基酸置换组(EU编号)。在一些实施方案中，本文所述的任何Fc变体可以包含人IgG1Fc区内的K322A、E345R、E430G和S440Y置换(残基的EU编号)。
在一些实施方案中，本文所述的任何Fc变体可以包含人IgG1Fc区内选自表4的一个或多个氨基酸置换(残基的EU编号)。在一些实施方案中，本文所述的任何Fc变体可以包含人IgG1Fc区内K322A修饰和选自表4的一个或多个氨基酸置换(残基的EU编号)。
在某些实施方案中，本文涵盖的Fc变体(包含增强六聚体形成的修饰的Fc区的Fc变体，其中形成六聚抗原结合复合体具有激动剂活性，所述激动剂活性与Fc区内无修饰的亲本抗体的激动剂活性相比增强)是包含在国际专利公开号WO 2013/004842、WO 2014/108198和/或WO 2014/006217中所述Fc修饰种任一者或多者的Fc变体。在某些实施方案中，包含一个或多个Fc修饰的Fc变体进一步经修饰以具有降低(包括消除)的CDC。例如并且不限于，在一些实施方案中，Fc变体包含K322A修饰。
在某些实施方案中，本文所述的Fc变体包含对Fc区的修饰，所述修饰减少效应子功能，如Strohl,Current Opinion in Biotechnology,20；685-691(2009)中所述。在示例性实施方案中，本文所述的Fc变体包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰(残基的EU编号)：
(a)人IgG1Fc区内的N297A；
(b)人IgG1Fc区内的234和235氨基酸残基，
(c)人IgG1Fc区内的234、235和329氨基酸残基，
(d)人IgG2Fc区内的234和237氨基酸残基，
(e)人IgG4Fc区内的235、237和318氨基酸残基，
(f)人IgG4Fc区内的228和236氨基酸残基，
(g)人IgG2Fc区内的268、309、330和331氨基酸残基，
(h)人IgG1Fc区内的220、226、229和238氨基酸残基，
(i)人IgG1Fc区内的226、229、233、234和235氨基酸残基，
(j)人IgG1Fc区内的234、235和331氨基酸残基，
(k)人IgG1Fc区内的226和230氨基酸残基，和
(l)人IgG1Fc区内的267和328氨基酸残基，
其中修饰减少Fc结构域的效应子功能。
在其他示例性实施方案中，本文所述的Fc变体包含选自以下的减弱效应子功能的修饰(残基的EU编号)：
(a)人IgG1Fc区内的N297A；
(b)人IgG1Fc区内的L234A和L235A，
(c)人IgG1Fc区内的L234A、L235A和P329G，
(d)人IgG2Fc区内的V234A和G237A，
(e)人IgG4Fc区内的L235A、G237A和E318A，
(f)人IgG4Fc区内的S228P和L236E，
(g)人IgG2Fc区内的118至260氨基酸残基或人IgG4Fc区内的261至447氨基酸残基，
(h)人IgG2Fc区内的H268Q、V309L、A330S和A331S，
(i)人IgG1Fc区内的C220S、C226S、C229S和P238S，
(j)人IgG1Fc区内的C226S、C229S、E233P、L234V和L235A，
(k)人IgG1Fc区内的L234F、L235E和P331S，
(l)人IgG1Fc区内的C226S和P230S，和
(m)人IgG1Fc区内的S267E和L328F。
在某些实施方案中，本文所述的Fc变体不包含减弱效应子功能的N297A修饰。
在示例性实施方案中，本文中提供的激动剂抗原结合复合体在不存在FcR结合的情况下结合至并激动OX40。在示例性实施方案中，本文中提供的激动剂抗原结合复合体结合至并激动OX40，同时如与Fc区内不含有减弱效应子功能的突变的等同抗原结合复合体相比，具有降低的FcR结合作用。在多种实施方案中，本文中提供的激动剂抗原结合复合体结合至并激动OX40，同时如与Fc区内不含有减弱效应子功能的突变的等同抗原结合复合体相比，具有降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多的FcR结合作用。在某些实施方案中，本文中提供的激动剂抗原结合复合体结合至并激动OX40，同时如与Fc区内不含有减弱效应子功能的突变的等同抗原结合复合体相比，具有降低至少50％、75％、80％、85％、90、95％、97％、98％或更多的FcR结合作用。
载体、宿主细胞和重组方法
为了重组产生本文中提供的抗原结合多肽，将编码它的核酸分离并***复制型载体中用于进一步克隆(扩增DNA)或用于表达。使用常规方法(例如，通过使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)，轻易地分离出编码该抗原结合多肽的DNA。许多载体是可获得的。载体的选择部分地取决于待使用的宿主细胞。通常，优选的宿主细胞是原核来源或真核来源的(通常为哺乳动物细胞，还包括真菌(例如，酵母)、昆虫、植物和来自其他多细胞生物的有核细胞)。在一些实施方案中，宿主细胞是分离的宿主细胞，例如，作为分离的细胞培育的衍生自多细胞生物的宿主细胞，如在细胞培养中培育的衍生自无脊椎动物(例如，昆虫)或脊椎动物(例如，小鼠、人、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞等)的细胞系。在抗原结合多肽是抗体的情况下，将可以理解，任何同种型的恒定区可以用于这个目的，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE恒定区，并且这类恒定区可以从任何人或动物物种获得。
a.使用原核宿主细胞产生抗原结合多肽
i.载体构建
可以使用标准重组技术，获得编码本文中提供的抗原结合多肽(如，例如，抗体)的多肽组分的多核苷酸序列。想要的多核苷酸序列可以例如从产生抗体的细胞如杂交瘤细胞分离并测序。备选地，可以使用核苷酸合成仪或PCR技术，合成多核苷酸。一旦获得，将编码多肽的序列***能够在原核宿主中复制并表达异源多核苷酸的重组载体。可获得并且本领域已知的许多载体可以用于本发明的目的。适宜载体的选择将主要取决于待***载体的核酸的大小和待用载体转化的特定宿主细胞。每种载体含有各种组件，这取决于其功能(扩增或表达异源多核苷酸或这两种情况)和其与它在其中驻留的特定宿主细胞的相容性。载体组件通常包括但不限于：复制起点、选择标记基因、启动子、核糖体结合位点(RBS)、信号序列、异源核酸***和转录终止序列。
通常，将含有复制子和衍生自与宿主细胞相容的物种的控制序列的质粒载体与这些宿主联合使用。载体一般携带复制位点以及能够在转化的细胞中提供表型选择的标记序列。例如，一般使用衍生自大肠杆菌物种的质粒pBR322转化大肠杆菌。pBR322含有编码氨苄青霉素(Amp)和四环素(Tet)耐药性的基因并且因此提供鉴定已转化细胞的简易手段。pBR322、其衍生物或其他微生物质粒或噬菌体还可以含有或经修饰以含有可以由微生物用于表达内源蛋白的启动子。用于表达特定抗体的pBR322衍生物的例子在Carter等人美国专利号5,648,237中详述。
此外，含有复制子和与宿主微生物相容的控制序列的噬菌体载体可以作用与这些宿主有关的转化载体。例如，噬菌体如λGΕΜ.ΤΜ.-11可以用于产生重组载体，所述重组载体可以用来转化易感的宿主细胞如大肠杆菌LE392。
本发明的表达载体可以包含各自编码每种多肽组分的两个或更多个启动子-顺反子对。启动子是位于调节其表达的顺反子上游(5')的非翻译调节序列。原核启动子一般划分成二类：诱导型和组成型。诱导型启动子是响应于培养条件变化(例如，养分存在或不存在或温度变化)而启动在其控制下的顺反子转录的水平增加的启动子。
由多种潜在宿主细胞识别的众多启动子是熟知的。通过从源DNA借助限制性酶消化取出启动子并将分离的启动子序列***本发明的载体，选择的启动子可以与编码例如轻链或重链的顺反子DNA有效连接。天然启动子序列和许多异源启动子均可以用来指导靶基因的扩增和/或表达。在一些实施方案中，利用异源启动子，因为如与天然靶多肽启动子相比，它们通常允许所表达靶基因的更大转录和更高产率。
随原核宿主一起使用的适合启动子包括PhoA启动子、β-内酰胺酶和乳糖启动子***、色氨酸(trp)启动子***和杂合启动子如tac或trc启动子。但是，在细菌中有功能的其他启动子(如其他已知的细菌启动子或噬菌体启动子)也是适合的。它们的核苷酸序列已经公开，因而使得技术人员能够利用供应任何所需限制性位点的接头或衔接子，将它们有效连接至编码抗原结合多肽蛋白(例如，目标轻链和重链)的基因的顺反子(Siebenlist等人,(1980)Cell 20:269)。
在一个实施方案中，重组载体内部的每个顺反子包含指导表达的多肽跨膜转运的分泌信号序列组件。通常，信号序列可以是载体的组件，或它可以是***载体的靶多肽DNA的部分。选择的信号序列应当是一个由宿主细胞识别并加工(即，由信号肽酶切割)的序列。对于不识别并加工对异源多肽为天然的信号序列的原核宿主细胞，将信号序列置换为例如选择自碱性磷酸酶、青霉素酶、Ipp、或耐热肠毒素II(STII)前导序列、LamB、PhoE、PelB、OmpA和MBP的原核信号序列。在本发明的一个实施方案中，在表达***的两个顺反子中使用的信号序列是STII信号序列或其变体。
在另一个实施方案中，免疫球蛋白的产生可以在宿主细胞的细胞质中出现并且因此不需要在每个顺反子内部存在分泌信号序列。在这个方面，表达、折叠并装配免疫球蛋白轻链和重链以在细胞质内部形成有功能的免疫球蛋白。某些宿主菌株(例如，大肠杆菌trxB-菌株)提供有利于二硫键形成的细胞质条件，因而允许表达的蛋白质亚基正确折叠和装配。参见Proba和Pluckthun Gene,159:203(1995)。
适于表达抗原结合多肽(例如，本发明的抗体)的原核宿主细胞包括古细菌和真细菌，如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物。有用细菌的例子包括埃希氏菌(Escherichia)(例如，大肠杆菌(E.coli))、芽孢杆菌(Bacilli)(例如，枯草芽孢杆菌(B.subtilis))、肠杆菌(Enterobacteria)、假单胞菌属物种(例如，铜绿假单胞菌(P.aeruginosa))、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、粘质沙雷菌(Serratia marcescans)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形菌属(Proteus)、志贺氏菌(Shigella)、根瘤菌属(Rhizobia)、透明颤菌属(Vitreoscilla)或副球菌属(Paracoccus)。在一个实施方案中，使用革兰氏阴性细胞。在一个实施方案中，使用大肠杆菌细胞作为本发明的宿主。大肠杆菌菌株的例子包括菌株W3110(Bachmann,Cellular and Molecular Biology,第2卷(Washington,D.C.:AmericanSociety for Microbiology,1987),第1190-1219页；ATCC保藏号27,325))及其衍生物，包括具有基因型W31 10AfhuA(AtonA)ptr3lac Iq lacL8AompTA(nmpc-fepE)degP41kanR的菌株33D3(美国专利号5,639,635)。其他菌株及其衍生物如大肠杆菌294(ATCC 31,446)、大肠杆菌B、大肠杆菌1776(ATCC 31,537)和大肠杆菌RV308(ATCC 31,608)也是合适的。在一个实施方案中，特别使用大肠杆菌Alpp。这些例子是说明性的而非限制的。用于构建具有限定基因型的上文所提到任一种细菌的衍生物的方法是本领域已知的并且在例如Bass等人,Proteins,8:309-314(1990)中描述。通常需要考虑复制子在细菌细胞中的复制力，选择适宜的细菌。例如，当熟知的质粒如pBR322、pBR325、pACYC177或pKN410用来供应复制子时，可以适当地使用大肠杆菌、沙雷菌属或沙门氏菌属物种作为宿主。一般，宿主细胞应当分泌最小量的蛋白水解酶并且可以将额外的蛋白酶抑制剂合乎需要地掺入细胞培养物中。
ii.多肽产生
将宿主细胞用上文所述的表达载体转化并且在常规营养培养基中培养，如果适宜，调整所述常规营养培养基以诱导启动子、选择转化体或扩增编码所需序列的基因。
转化意指将DNA引入原核宿主，从而DNA作为染色体外元件或借助染色体整合体可复制。取决于所用的宿主细胞，使用适于这类细胞的标准技术进行转化。使用氯化钙的钙处理法通常用于含有牢固细胞壁屏障的细菌细胞。另一种转化方法利用聚乙二醇/DMSO。使用的又一种技术是电穿孔法。
用来产生本发明多肽的原核细胞在本领域已知且适于培养所选择宿主细胞的培养基中培育。合适培养基的例子包括添加必需营养补充物的Luria培养液(LB)。在一些实施方案中，培养基还含有选择剂，所述选择剂基于表达载体构建而选择，以选择性允许含有表达载体的原核细胞生长。例如，添加氨苄青霉素至培养基供表达氨苄青霉素耐药性基因的细胞生长。
除碳源、氮源和无机磷酸盐源之外的任何必需补充物也可以按适宜的浓度纳入，所述补充物单独引入或作为与另一种补充物或培养基的混合物(如复杂氮源)引入。任选地，培养基可以含有选自谷胱甘肽、半胱氨酸、胱胺、硫乙醇酸盐、二硫代赤藓醇和二巯基丁二醇的一种或多种还原剂。
在合适的温度培养原核宿主细胞。对于大肠杆菌生长，例如，优选的温度范围从约20℃至约39℃、更优选地从约25℃至约37℃、甚至更优选地在约30℃。培养基的pH可以是范围从约5至约9的任何pH，这主要取决于宿主生物。对于大肠杆菌，pH优选地是约6.8至约7.4并且更优选地为约7.0。
如果诱导型启动子用于本发明的表达载体中，则在适于激活该启动子的条件下诱导蛋白质表达。在本发明的一个实施方案中，PhoA启动子用于控制多肽的转录。因此，在限制磷酸盐的培养基中培养转化的宿主细胞供诱导。优选地，限制磷酸盐的培养基是C.R.A.P培养基(参见，例如，Simmons等人,J.Immunol.Methods(2002),263:133-147)。如本领域已知，根据所用的载体构建体，可以使用多种其他诱导物。
在本发明的一个实施方案中，通过发酵过程实施抗原结合多肽(如，例如，抗体)的大量产生。各种大规模补料分批发酵法可用于产生重组蛋白。大规模发酵具有至少1000升容量，优选地约1,000至100,000升容量。这些发酵罐使用搅拌器叶轮以散布氧和养分，尤其葡萄糖(优选的碳/能量源)。小规模发酵通常指在不多于大约100升容积能力的发酵罐中并且可以范围从约1升至约100升的发酵。
在发酵过程中，一般在细胞已经在合适条件下培育至所需密度，例如，OD550约180-220后启动蛋白质表达的诱导，在此阶段，细胞处于稳定早期。根据所用的载体构建体，可以使用多种诱导物。可以将细胞在诱导之前培育更短的时间。通常诱导细胞约12-50小时，不过可以使用更长或更短的诱导时间。
为了最小化已表达的抗原结合多肽(尤其对蛋白酶解敏感的那些)的蛋白酶解，缺少蛋白水解酶的某些宿主菌株可以用于本发明。例如，可以修饰宿主细胞菌株以在编码已知细菌蛋白酶如蛋白酶III、OmpT、DegP、Tsp、蛋白酶I、蛋白酶Mi、蛋白酶V、蛋白酶VI及其组合的基因中实现遗传突变。一些蛋白酶缺陷型大肠杆菌菌株是可获得的并且例如在Joly等人(1998),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:2773-2777；Georgiou等人，美国专利号5,264,365；Georgiou等人，美国专利号5,508,192；Hara等人,Microbial Drug Resistance,2:63-72(1996)中描述。
在一个实施方案中，使用蛋白水解酶缺损且用过量表达一个或多个伴侣蛋白的质粒转化的大肠杆菌菌株作为本发明表达***中的宿主细胞。在第二实施方案中，大肠杆菌菌株为外膜脂蛋白(ΔΙρρ)缺陷的。
iii.抗原结合多肽纯化
在一个实施方案中，进一步纯化本文中产生的抗原结合多肽以获得基本上均匀的制备物供其他测定法和用途。可以使用本领域已知的标准蛋白质纯化方法。以下方法是示例性的合适纯化方法：在亲和色谱柱或离子交换柱上分级分离、乙醇沉淀、反相HPLC、在硅胶或阳离子树脂(例如DEAE)上色谱、色谱聚焦、SDS-PAGE、硫酸铵沉淀和例如使用SephadexG-75的凝胶过滤。
在一个实施方案中，固相上固定的蛋白A用于免疫亲和纯化、例如本发明的抗原结合多肽。蛋白A是来自黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的41kD胞壁蛋白，其以高亲和力与抗原结合多肽的Fc区结合。Lindmark等人,(1983)J.Immunol.Meth.62:1-13。固定有蛋白A的固相优选地是包含玻璃或二氧化硅表面的柱，更优选地是可控孔度玻璃柱或硅酸柱。在一些应用中，所述柱已经用试剂如甘油涂敷，试图防止污染物的非特异性黏附。
作为纯化的第一步骤，将源自如上文所述的细胞培养物的制备物施加到蛋白A固定的固相上，以允许抗原结合目的多肽与蛋白A特异性结合。随后洗涤该固相以除去与固相非特异性结合的污染物。通过洗脱从固相回收抗原结合多肽(如，例如，抗体)。
b.使用真核宿主细胞产生抗原结合多肽
载体组件通常包括但不限于以下一者或多者：信号序列、复制起点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。
i.信号序列组件
用于真核宿主细胞中的载体还可以含有在目的成熟蛋白或多肽的N末端具有特定切割位点的信号序列或其他多肽。选择的异源信号序列优选地是一个由宿主细胞识别并加工(即，由信号肽酶切割)的序列。在哺乳动物细胞表达时，哺乳动物信号序列以及病毒分泌性前导序列，例如，单纯疱疹gD信号，是可用的。这类前体区域的DNA符合可读框地连接至编码所需抗原结合多肽(例如，抗体)的DNA。
ii.复制起点
通常，复制起点组件不是哺乳动物表达载体需要的。例如，一般可以使用SV40复制起点，但是仅因为它含有早期启动子。
iii.选择基因组件
表达载体和克隆载体可以含有选择基因，又称作选择标记。常见的选择基因编码这样的蛋白质，所述蛋白质(a)赋予针对抗生素或其他毒素，例如，氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素的抗性，(b)在有意义的情况下，互补性营养缺陷型，或(c)供应从复合培养基不可获得的关键养分。
选择方案的一个例子利用阻滞宿主细胞生长的药物。用异源基因成功转化的那些细胞产生赋予耐药性的蛋白质并且因此幸免于选择方案。这类优势选择的例子使用药物新霉素、麦考酚酸和潮霉素。
用于哺乳动物细胞的合适选择标记的另一个例子是能够实现鉴定有能力摄取抗体核酸的细胞的那些，如DHFR、胸苷激酶、金属硫蛋白-l和-II、优选地灵长类金属硫蛋白基因、腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等。
例如，首先通过在含有甲氨蝶呤(Mtx)(DHFR的竞争性拮抗剂)的培养基中培养全部转化体，鉴定用DHFR选择基因转化的细胞。当使用野生型DHFR时，适宜宿主细胞是DHFR活性缺损的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系(例如，ATCC CRL-9096)。
备选地，可以通过以下方式选择用编码抗体、野生型DHFR蛋白质和另一个选择标记如氨基糖苷3'-磷酸转移酶(APH)的DNA序列转化或共转化的宿主细胞(尤其含有内源DHFR的野生型宿主)：在含有选择标记的选择剂如氨基糖苷类抗生素(例如，卡那霉素、新霉素或G418)的培养基中培育细胞。参见，例如，美国专利号4,965,199。
iv.启动子组件
表达载体和克隆载体通常含有启动子，所述启动子由宿主生物识别并与所需的编码含有Fc的多肽(例如，抗体)的核酸有效连接。启动子序列是相对于真核生物已知的。实际上，全部真核基因均具有位于从其中启动转录的位点起上游大约25至30个碱基的AT丰富区。从许多基因的转录起点起上游70至80个碱基存在的另一个序列是CNCAAT区域，其中N可以是任何核苷酸。在3'末端，大部分真核基因是AATAAA序列，该序列可以是添加聚腺苷酸尾至编码序列3’末端的信号。全部的这些序列均适当地***真核表达载体。
为了产生含有Fc的多肽(如，例如，抗体)，哺乳动物宿主细胞中来自载体的转录例如受以下启动子控制，所述启动子从病毒(例如，多瘤病毒、禽痘病毒病毒、腺病毒(如腺病毒2)、牛***瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒和猴病毒40(SV40))的基因组获得、从异源哺乳动物启动子例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子获得或从热休克启动子获得，条件是这类启动子与宿主细胞***相容。
SV40病毒的早期启动子和晚期启动子便利地作为还含有SV40病毒复制起点的SV40限制性片段获得。人巨细胞病毒的立即早期启动子便利地作为Hind III E限制性片段获得。在哺乳动物宿主中使用牛***瘤病毒作为载体表达DNA的***在美国专利号4,419,446公开。这个***的修改形式在美国专利号4,601,978中描述。关于在小鼠细胞中来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子控制下表达人β-干扰素cDNA，还参见Reyes等人,Nature297:598-601(1982)。备选地，劳斯肉瘤病毒长末端重复序列可以用作启动子。
v.增强子元件组件
可以通过将增强子序列***载体，增加编码抗原结合多肽(如，例如，抗体)的DNA由高等真核生物转录。现在已知许多增强子序列来自哺乳动物基因(例如，珠蛋白基因、弹性蛋白酶基因、白蛋白基因、甲胎蛋白基因和胰岛素基因)。另外，可以使用来自真核细胞病毒的增强子。例子包括在复制起点晚期侧(bp 100-270)的SV40增强子、细胞巨化病毒早期启动子增强子、在复制起点晚期侧上的多瘤增强子和腺病毒增强子。对于增强真核启动子激活过程的元件的描述，还参见Yaniv,Nature 297:17-18(1982)。增强子可以在编码抗体多肽的序列的5'或3'位置被剪接入载体，前提是实现增强作用，但是其通常位于距启动子5'的位点处。
vi.转录终止组件
在真核宿主细胞中使用的表达载体一般也将含有为终止转录和为稳定mRNA必需的序列。这类序列常从真核DNA或cDNA或者病毒DNA或cDNA的5'非翻译区和偶尔从其3'非翻译区可获得。这些区域含有转录为编码抗体的mRNA的非翻译部分中聚腺苷酸化片段的核苷酸区段。一种有用的转录终止组件是牛生长激素多聚腺苷化区。参见W094/11026和其中公开的表达载体。
vii.宿主细胞的选择和转化
用于克隆达本文载体中DNA的合适宿主细胞包括本文所述的高等真核生物细胞，包括脊椎动物宿主细胞。以培养方式(组织培养)增殖脊椎动物细胞已经变成例行方法。可用哺乳动物宿主细胞系的例子是由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚肾系(293细胞或经亚克隆用于悬浮培养生长的293细胞，Graham等人,J.Gen Virol.,36:59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub和Chasin,Proc Natl Acad Sci USA,77:4216(1980))；小鼠支持细胞(TM4，Mather,Biol.Reprod.,23:243-251(1980))；猴肾细胞(CV1，ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人***细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(HepG2，HB 8065)；小鼠乳腺瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等人,AnnalsN.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982))；MRC 5细胞；FS4细胞；和人肝瘤系(Hep G2)。
将宿主细胞用上文所述的用于产生所需抗原结合多肽)(如，例如，抗体)的表达载体或克隆载体转化并且在常规营养培养基中培养，如果适宜，调整所述常规营养培养基以诱导启动子、选择转化体或扩增编码所需序列的基因。
viii.宿主细胞的培养
可以在多种培养基中培养用来产生本发明的所需抗原结合多肽)(如，例如，抗体)的宿主细胞。市售培养基如Ham's F10(Sigma)、极限基本培养基((MEM)，(Sigma)，RPMI-1640(Sigma)和Dulbecco改良Eagle培养基((DMEM)，Sigma)适于培养宿主细胞。此外，可以使用Ham等人,Meth.Enz.58:44(1979)；Barnes等人,Anal.Biochem.102:255(1980)；美国专利号4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；或美国专利复审30,985中描述的任何培养基作为宿主细胞的培养基。这些培养基中任一者可以根据需要补充激素和/或其他生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(如HEPES)、核苷(如腺苷和胸苷)、抗生素(如GENTAMYCINTM药物)、微量元素(定义为通常以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物)和葡萄糖或同等能源。也可以按本领域技术人员已知的适宜浓度包括任何其他的必需补充物。培养条件如温度、pH等是先前随被选择用于表达的宿主细胞所用的那些培养条件，并且将对普通技术人员是显而易见的。
ix.抗原结合多肽的纯化
当使用重组技术时，抗原结合多肽可以在胞内产生或直接分泌入培养基。如果抗原结合多肽在胞内产生，则作为第一步骤，移除颗粒状残片(宿主细胞或裂解的片段)，例如，通过离心或超滤移除。在抗原结合多肽分泌入培养基的情况下，首先通常使用市售的蛋白质浓缩滤器，例如，Amicon或Millipore Pellicon超滤装置，浓缩来自这类表达***的上清液。可以在前述任意步骤中包含蛋白酶抑制剂如PMSF以抑制蛋白酶解，并且可以包含抗生素以防止偶发污染物生长。
可以使用，例如，羟基磷灰石色谱、凝胶电泳、透析和亲和色谱纯化从细胞制备的抗原结合多肽组合物，其中亲和色谱是优选的纯化技术。蛋白A作为亲和力配体的适用性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型。蛋白A可以用来纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的抗体(参见，例如，Lindmark等人,J.Immunol.Meth.,62:1-13(1983))。推荐蛋白G用于全部小鼠同种型和用于人γ3(Guss等人,EMBO J.5:1567-1575(1986))。亲和力配体与之连接的基质最经常是琼脂糖，但是其他基质是可用的。力学稳定的基质如可控孔玻璃或聚(苯乙烯-二乙烯)苯允许比可以用琼脂糖所实现的更快的流速和更短的处理时间。在抗体包含CH3结构域的情况下，Bakerbond ABXTM树脂(J.T.Baker；Phillipsburg,NJ)可用于纯化。取决于待回收的抗体，也可用其他纯化蛋白的技术，如离子交换柱上分级分离、乙醇沉淀、反相HPLC、二氧化硅上色谱、肝素SEPHAROSETM上色谱、阴离子或阳离子交换树脂(如聚天冬氨酸柱)上色谱、色谱聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀。
在任何初步纯化步骤后，包含目的抗体和污染物的混合物可以经历低pH疏水相互作用色谱，所述低pH疏水相互作用色谱使用pH在约2.5-4.5之间的洗脱缓冲液，优选地以低盐浓度(例如，从约0-0.25M盐)进行。抗原结合多肽的产生可以备选地或额外地(相对于前述任一者特定方法)包括透析包含多肽混合物的溶液。
x.使用杆状病毒产生抗原结合多肽
可以通过使用例如lipofectin(从GIBCO-BRL可商业获得)，将编码抗原结合多肽的质粒和BaculoGoldTM病毒DNA(Pharmingen)共转染入昆虫细胞如草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞(例如，Sf9细胞；ATCC CRL 1711)或黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)S2细胞，产生重组杆状病毒。在一个具体例子中，抗原结合多肽序列在杆状病毒表达载体内部所含的表位标签上游融合。这类表位标签包括多聚His标签。可以使用多种质粒，包括衍生自市售质粒如pVL1393(Novagen)或pAcGP67B(Pharmingen)的质粒。简而言之，编码抗原结合多肽的序列，可以通过PCR用与5'和3'区域互补的引物扩增。5'引物可以并入侧翼(选择)的限制性酶位点。随后可以将产物用选择的限制性酶消化并亚克隆入表达载体。
在用表达载体转染后，将宿主细胞(例如，Sf9细胞)在28℃温育4-5天并且收获释放的病毒并用于进一步扩增。病毒感染和蛋白质表达可以例如O'Reilley等人所述那样进行(Baculovirus expression vectors:A Laboratory Manual.Oxford:OxfordUniversity Press(1994))。
随后可以纯化表达的加多聚His标签的抗原结合多肽，例如，通过Ni2+-螯合物亲和色谱如下纯化。提取物可以如Rupert等人(Nature362:175-179(1993))所描述，从重组病毒感染的Sf9细胞制备。简而言之，将Sf9细胞洗涤，重悬于超声处理缓冲液(25mL HEPES pH7.9；12.5mM MgCl2；0.1mM EDTA；10％甘油；0.1％NP-40；0.4M KCl)中并在冰上超声处理两次20秒。通过离心澄清超声处理物并且将上清液在上样缓冲液(50mM磷酸盐；300mM NaCl；10％甘油pH 7.8)中50倍稀释并经0.45μm滤器过滤。将Ni2+-NTA琼脂糖柱(从Qiagen可商业获得)用5mL床体积准备，用25mL水洗涤和用25mL上样缓冲液平衡。将过滤的细胞提取物按0.5mL每分钟加载于柱上。将柱用上样缓冲液洗涤至基线A280，此时级开始收集级分。接着，将柱用洗涤次级洗涤缓冲液(50mM磷酸盐；300mM Nal；10％甘油pH 6.0)，这洗脱非特异性结合的蛋白质。在再次达到A280基线后，将柱用次级洗涤缓冲液中的0至500mM咪唑梯度展开。收集1mL级分并将其通过SDS-PAGE和银染法或采用碱性磷酸酶缀合的Ni2+-NTA(Qiagen)的蛋白质印迹法分析。汇集含有洗脱的加His10标签的抗原结合多肽级分并且对上样缓冲液透析。
备选地，可以使用已知的色谱技术(包括例如，蛋白A或蛋白G柱色谱)进行抗原结合多肽的纯化。在一个实施方案中，可以通过洗脱入含有离液剂或温和去垢剂的溶液从柱的固相回收抗原结合性目的多肽。示例性离液剂和温和去垢剂包括但不限于盐酸胍、脲、高氯酸锂、精氨酸、组氨酸、SDS(十二烷基硫酸钠)、Tween、Triton和NP-40，它们全部均是市售的。
靶分子和使用方法
本公开的抗原结合多肽或抗原结合复合体可以用来与靶相互作用以激活信号转导途径。在某些实施方案中，靶可以是激活、启动、调节和/或调控信号转导途径的任何靶。可以被如本文所述的抗原结合多肽或抗原结合复合体靶向的分子的例子包括但不限于细胞表面受体。在某些实施方案中，细胞表面受体可以是通过与配体组合并因而转导信号进入细胞来寡聚化(例如，二聚化(同型二聚化或异二聚化))的受体。
在某些实施方案中，靶可以是(例如与其配体相互作用时)寡聚化以激活信号转导途径的任何靶。在某些实施方案中，靶可以是多聚体受体。如本文所用，术语“多聚体受体”指对于信号传导活性需要两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个或六个或更多个(例如，相同类型和/或来自相同家族的)受体寡聚化的受体。参见，例如，Heidin(1995)Cell80:213-223。
在某些实施方案中，靶受体可以是“二聚体的”并且其活性需要二个受体的寡聚化。二聚体受体的非限制性例子包括神经营养受体、神经生长因子、生长因子、丝氨酸/苏氨酸激酶受体和受体酪氨酸激酶(RTK)。参见，例如，Li和Hristova(2010)Cell Adhesion andMigration 4(2):249-254。
在某些实施方案中，靶受体可以是“三聚体的”并且其活性需要三个受体的寡聚化。三聚体受体的非限制性例子包括肿瘤坏死因子受体(TNFR)。参见，例如，Brazil(2006)Nature Reviews Drug Discovery 5:20。
在某些实施方案中，靶可以是与本公开的抗原结合多肽或抗原结合复合体相互作用时，导致如上文定义的“激动作用”的任何靶，其中增强激动作用超过单体亲本抗体。
细胞表面受体例如包括属于受体家族如造血因子受体家族、细胞因子受体家族、酪氨酸激酶受体家族、丝氨酸/苏氨酸激酶受体家族、TNF受体家族、G蛋白偶联受体家族、GPI锚定受体家族、酪氨酸磷酸酶受体家族、黏附因子家族和激素受体家族的受体。涉及属于这些受体家族的受体及特征的多种参考文献是可获得的并且例如包括Cooke B A.,KingR J B.,van der Molen H J.编著,New Comprehensive Biochemistry第18B卷"Hormonesand their Actions Part II"第1-46页(1988)Elsevier Science Publishers BV.,NewYork,USA；Patthy L.(1990)Cell,61:13-14；Ullrich A.等人(1990)Cell,61:203-212；Massagul J.(1992)Cell,69:1067-1070；Miyajima A.等人(1992)Annu.Rev.Immunol.,10:295-331；Taga T.和Kishimoto T.(1992)FASEB J.,7:3387-3396；Fantl W I.等人(1993)Annu.Rev.Biochem.,62:453-481；Smith C A.等人(1994)Cell,76:959-962；Flower D R.(1999)Biochim.Biophys.Acta,1422:207-234；和M.Miyasaka编著,Cell Technology,补充卷,Handbook系列,"Handbook for Adhesion Factors"(1994)(Shujunsha,Tokyo,Japan)。
在某些实施方案中，细胞表面受体例如包括激素受体和细胞因子受体。示例性激素受体例如包括***受体。示例性细胞因子受体例如包括造血因子受体、淋巴因子受体、生长因子受体、分化控制因子受体等。细胞因子受体的例子是***(EPO)受体、促血小板生成素(TPO)受体、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)受体、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)受体、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)受体、肿瘤坏死因子(TNF)受体、白介素-1(IL-1)受体、白介素-2(IL-2)受体、白介素-3(IL-3)受体、白介素-4(IL-4)受体、白介素-5(IL-5)受体、白介素-6(IL-6)受体、白介素-7(IL-7)受体、白介素-9(IL-9)受体、白介素-10(IL-10)受体、白介素-11(IL-11)受体、白介素-12(IL-12)受体、白介素-13(IL-13)受体、白介素-15(IL-15)受体、干扰素-α(IFN-α)受体、干扰素-β(IFN-β)受体、干扰素-γ(IFN-γ)受体、生长激素(GH)受体、胰岛素受体、血液干细胞增殖因子(SCF)受体、血管的表皮生长因子(VEGF)受体、表皮细胞生长因子(EGF)受体、神经生长因子(NGF)受体、成纤维细胞生长因子(FGF)受体、血小板衍生生长因子(PDGF)受体、转化生长因子β(TGF-β)受体、白细胞移行抑制因子(LIF)受体、睫状神经营养因子(CNTF)受体、抑瘤素M(OSM)受体和Notch家族受体。细胞因子受体的额外非限制性例子在Wang等人(2009)Ann.Rev.Immunol.27:29-60中公开。
在某些实施方案中，靶可以包括肿瘤坏死因子受体(TNFR)家族的成员。TNFR的非限制性例子包括TNFR1、TNFR2、淋巴毒素β受体、OX40、CD40、Fas、诱饵受体3、CD27、CD70、CD226、CD137、ICOS、2B4、CD30、4-1BB、死亡受体3(DR3)、死亡受体4(DR4)、死亡受体5(DR5)、死亡受体6(DR6)、诱饵受体1、诱饵受体2、NF-κB的受体激活蛋白(RANK)、骨保护素(OPG)、TWEAK受体、TACI、BAFF受体(BAFF-R)、HVEM(疱疹病毒进入介体、神经生长因子受体、B细胞成熟抗原(BCMA)、糖皮质激素诱导的TNF受体(GITR)、毒性和JNK诱导蛋白(TAJ)、RELT、TNFRSF22、TNFRSF23、外胚层发育异常蛋白A2同工型受体和外胚层发育异常蛋白1、无汗受体。TNFR的额外非限制性例子在Naismith和Sprang(1998)Trends in BiochemicalSciences 23(2):74-79中公开。
在某些实施方案中，靶可以包括低密度脂蛋白受体(LDLR)家族的成员。LDLR的非限制性例子包括LDLR、低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)1、LRP10、LRP1B、LRP2、LRP4、LRP5、LRP5L、LRP6、LRP8、Nidogen(NID)-1、NID2、分拣蛋白(Sortilin)相关受体、L(SORL1)和极低密度脂蛋白受体(VLDLR)。
在某些实施方案中，靶可以包括受体酪氨酸激酶(RTK)家族的成员。RTK的非限制性例子包括白细胞受体酪氨酸激酶(LTK)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体(RORs)、肝配蛋白受体(Eph)、Trk受体、胰岛素受体(IR)和Tie2。RTK的额外非限制性例子在Alexander等人(2013)The Concise Guide to Pharmacology 2013/14:Enzymes.Br.J.Pharmacol.170:1797-1867；Li和Hristova(2010)；和Lemmon和Schlessinger(2010)Cell141(7):1117-1134中公开。
在其他实施方案中，细胞表面受体可以是生长激素受体、胰岛素受体、瘦蛋白受体、Flt-3配体受体或***(IGF)-I受体。示例性受体例如包括hEPOR(Simon,S.等人(1990)Blood 76,31-3)；mEPOR(D'Andrea,AD.等人(1989)Cell 57,277-285)；hG-CSFR(Fukunaga,R.等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.87,8702-8706)；mG-CSFR(Fukunaga,R.等人(1990)Cell 61,341-350)；hTPOR(Vigon,I.等人(1992)89,5640-5644)；mTPOR(Skoda,RC.等人(1993)12,2645-2653)；hInsR(Ullrich,A.等人(1985)Nature 313,756-761)；hFlt-3(Small,D.等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.91,459-463)；hPDGFR(Gronwald,R GK.等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.85,3435-3439)；hIFNa/b R(Uze,G.等人(1990)Cell 60,225-234；和Novick,D.等人(1994)Cell 77,391-400)。
在某些实施方案中，靶可以包括神经生长因子受体家族和/或神经营养因子受体家族的成员。神经生长因子受体和神经营养因子受体的非限制性例子包括p75(也称作低亲和力神经生长因子受体(LNGFR))、TrkA、TrkB和TrkC。神经生长因子受体和神经营养因子受体的额外非限制性例子在Lotz等人(1996)J.of Leukocyte Biology 60(1):1-7中公开。
在某些实施方案中，靶可以包括生长因子受体家族的成员。例如并且不按照限制的方式，生长因子受体可以是通过JAK/STAT途径、MAP激酶途径和PI3激酶途径发送信号的受体。生长因子受体的非限制性例子包括成纤维细胞生长因子受体(FGFR)、ErbB家族受体(例如，表皮生长因子受体(EGFR))、血管内皮生长因子受体(VEGFR)和血小板衍生生长因子受体(PDGFR)。
在某些实施方案中，靶可以包括形成异二聚体或异三聚体以诱导细胞信号的受体。例如并且不按照限制的方式，靶可以是丝氨酸/苏氨酸激酶受体家族的成员。丝氨酸/苏氨酸激酶受体的非限制性例子包括激活蛋白A受体II型样1(ALK1)、激活蛋白A受体I型(ALK2)、骨形态发生蛋白受体IA型(BMPR1A)、激活蛋白A受体IB型(ALK4)、激活蛋白A受体IC型(ALK7)、转化生长因子β受体1(TGFBR1)、骨形态发生蛋白受体IB型(BMPR1B)、转化生长因子β受体II(TGFBR2)、骨形态发生蛋白受体II型(BMPR2)、抗苗勒管激素受体II型(MISR2)、激活蛋白A受体、IIA型(ActR2)、激活蛋白A受体IIB型(ActR2B)和转化生长因子β受体III(TGFBR3)。
在某些实施方案中，潜在的靶排除以下：5T4；ADAM-10；ADAM-12；ADAM17；AFP；AXL；ANGPT2炭疽抗原；BSG；CAIX；CAXII；CA72-4；癌相关抗原CTAA16.88；CCL11；CCL2；CCR4；CCR5；CCR6；CD2；CD3E；CD4；CD5；CD6；CD15；CD18；CD19；CD20；CD22；CD24；CD25；CD29；CD30；CD32B；CD33；CD37；CD38；CD40；CD40LG；CD44；CD47；CD52；CD56；CD66E；CD72；CD74；CD79a；CD79b；CD80；CD86；CD98；CD137；CD147；CD138；CD168；CD200；CD248；CD254；CD257；CDH3；CEA；CEACAM5；CEACAM6；CEACAM8；密蛋白4；CS-1；CSF2RA；CSPG-4；CTLA4；Cripto；DLL4；ED-B；EFNA2；EGFR；内皮素b受体；ENPP3；EPCAM；ERBB2；ERBB3；FAPα；FcγRI；FCER2；FGFR3；纤维蛋白IIβ链；FLT1；FOLH1；FOLR1；FRP-1；GD3神经节苷脂；GDF2；GLP1R；磷脂酰基醇蛋白聚糖-3；GPNM B；HBV(乙型肝炎病毒)；HCMV(人巨细胞病毒)；热休克蛋白90同源物[白假丝酵母(Candida albicans)]；单纯疱疹病毒gD糖蛋白；HGF；HIV-1；HIV-1IIIB gpl20V3环；HLA-DRB(HLA-DRβ)；人呼吸道合胞体病毒、糖蛋白F；ICAM 1；IFNA1；IFNA1；IFNB1双特异性；IgEFc；IGF1R；IGHE连接区；IL12B；IL13；IL15；IL17A；ILIA；IL1B；IL2RA；IL4；IL5；IL5RA；IL6；IL6R；IL9；白介素-2受体β亚基；ITGA2；ITGA2B ITGB3；ITGA4ITGB7；ITGA5；ITGAL；ITGAV_ITGB3；ITGB2；KDR；L1CAM；Lewis-y；脂多糖LPS的结构域脂质A；LTA；MET；MM P14；MMpl5；MST1R；MSTN；MUC1；MUC4；MUC16；MUC5AC；NCA-90粒细胞细胞抗原；结合素4；NGF；NRP；NY-ESO-1；OX40L；PLAC-1；PLGF；PDGFRA；PD1；PDL1；PSCA；磷脂酰丝氨酸；PTK-7；铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)血清型IATS Oil；RSV(人呼吸道合胞体病毒，糖蛋白F)；ROR1；RTN4；SELL；SELP；STEAP1；志贺样毒素II B亚单位[大肠杆菌(Escherichia coli)]；SLAM7；SLC44A4；SOST；表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)脂磷壁酸；T细胞受体α_β；TF；TGFB1；TGFB2；TMEFF2；TNC；TNF；TNFRSF10A；TNFRSF10B；TNFRSF12A；TNFSF13；TNFSF14；TNFSF2；TNFSF7；TRAILR2；TROP2；TYRP1；VAP-1和波形纤维蛋白。
在一个示例性实施方案中，细胞表面受体是OX40。
在另一个示例性实施方案中，细胞表面受体是DR5。
在另一个示例性实施方案中，细胞表面受体是Tie2。
在某些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽或抗原结合复合体可以用于激动受试者中的细胞表面受体，包括向受试者施用本文所述的复合体或抗原结合多肽。
在某些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽或抗原结合复合体可以用于治疗或预防将从受体激动作用获益的多种疾病或病症，例如包括肿瘤，包含癌前、非转移性、转移性和癌性肿瘤(例如，早期癌)、癌、过敏性或炎性疾病、自身免疫疾病、激素紊乱，或治疗面临形成癌症(例如，乳腺癌、结直肠癌、肺癌、肾细胞癌、胶质瘤或卵巢癌)、过敏性或炎性疾病或自身免疫疾病之风险的受试者。
OX40激动剂的用途
在某些实施方案中，如本文所述的与OX40结合的激动剂抗原结合复合体可以用于增强免疫应答、治疗癌症、预防癌症、增强其他癌疗法的功效、增强疫苗功效、治疗病毒性或细菌性疾病或病症、或调节受试者中的T细胞应答。
在一个方面，提供了用于增强患有癌症的个体中免疫功能(例如，通过上调细胞介导的免疫应答)的方法，包括向该个体施用有效量的如本文所述的与OX40结合的激动剂抗原结合复合体。在一个方面，提供了用于增强患有癌症的个体中T细胞功能的方法，包括向该个体施用有效量的如本文所述的与OX40结合的激动剂抗原结合复合体。
在一些实施方案中，“增强T细胞功能”包括诱导、引起或刺激效应器或记忆T细胞具有重建、持久或放大的生物学功能。增强T细胞功能的例子包括：增加γ-干扰素从CD8+效应T细胞分泌、增加γ-干扰素从CD4+记忆和/或效应T细胞分泌、增加CD4+效应和/或记忆T细胞增殖、增加CD8+效应T细胞增殖、增加抗原应答性(例如，清除)，这相对于在干预之前的这类水平而言。在一个实施方案中，增强的水平是至少50％，备选地60％、70％、80％、90％、100％、120％、150％、200％。测量这种增强作用的方式是本领域普通技术人员已知的。
在一个方面，提供了用于增强患有癌症的个体中免疫功能(例如，通过减少免疫失调和/或机能不良的免疫应答或免疫细胞)的方法，包括向该个体施用有效量的如本文所述的与OX40结合的激动剂抗原结合复合体。在一些实施方案中，“机能不良”在免疫失调的背景下指减少针对抗原性刺激的免疫反应性的状态。在一些实施方案中，“机能不良”还包括耐受或不响应于抗原识别过程，尤其，将抗原识别过程转换成下游T细胞效应子功能(如增殖、细胞因子产生(例如，γ干扰素)和/或靶细胞杀伤)的能力受损。
在一个方面，提供了用于患有癌症的个体中***免疫力和/或增强肿瘤免疫原性的方法，包括向该个体施用有效量的如本文所述的与OX40结合的激动剂抗原结合复合体。在一些实施方案中，“肿瘤免疫力”指其中肿瘤逃避免疫识别和清除的过程。因此，在一些实施方案中，作为治疗性构思，当这类逃避过程减弱并肿瘤由免疫***识别和攻击时，肿瘤免疫力得到“治疗”。肿瘤识别的例子包括肿瘤结合、肿瘤收缩和肿瘤清除。在一些实施方案中，“免疫原性”指特定物质诱发免疫应答的能力。肿瘤具有免疫原性并且增强肿瘤免疫原性有助于通过免疫应答清除肿瘤细胞。
在一些实施方案中，如本文所述的与OX40结合的激动剂抗原结合复合体增强CD4+效应T细胞功能，例如通过增加CD4+效应T细胞增殖和/或增加CD4+效应T细胞产生γ干扰素做到这点(例如，如相比于与OX40结合的激动剂抗原结合复合体处理之前的增殖和/或细胞因子产生)。在一些实施方案中，细胞因子是γ干扰素。在一些实施方案中，如本文所述的与OX40结合的激动剂抗原结合复合体增加瘤内(浸润性)CD4+效应T细胞的数目(例如，CD4+效应T细胞的总数，或例如，CD45+细胞中CD4+细胞的百分数)，例如，如相比于与OX40结合的激动剂抗原结合复合体处理之前的瘤内(浸润性)CD4+T细胞的数目。在一些实施方案中，如本文所述的与OX40结合的激动剂抗原结合复合体增加表达γ干扰素的瘤内(浸润性)CD4+效应T细胞的数目(例如，表达γ干扰素的总CD4+细胞，或例如，总CD4+细胞中表达γ干扰素的CD4+细胞的百分数)，例如，如相比于与OX40结合的激动剂抗原结合复合体处理之前表达γ干扰素的瘤内(浸润性)CD4+T细胞的数目。
在一些实施方案中，如本文所述的与OX40结合的激动剂抗原结合复合体增加瘤内(浸润性)CD8+效应T细胞的数目(例如，CD8+效应T细胞的总数，或例如，CD45+细胞中CD8+的百分数)，例如，如相比于抗人OX40激动剂抗体处理之前瘤内(浸润性)CD8+T效应细胞的数目。在一些实施方案中，如本文所述的与OX40结合的激动剂抗原结合复合体增加表达γ干扰素的瘤内(浸润性)CD8+效应T细胞的数目(例如，总CD8+细胞中表达γ干扰素的CD8+细胞的百分数)，例如，相比于与OX40结合的激动剂抗原结合复合体处理之前表达γ干扰素的瘤内(浸润性)CD8+T细胞的数目。
在一些实施方案中，与本文所述的OX40结合的激动剂抗原结合复合体增强记忆T细胞功能，例如通过增加记忆T细胞增殖和/或增加记忆细胞产生细胞因子做到这点。在一些实施方案中，细胞因子是γ干扰素。
在一些实施方案中，如本文所述的与OX40结合的激动剂抗原结合复合体抑制Treg功能，例如，通过减少Treg对效应T细胞功能(例如，效应T细胞增殖和/或效应T细胞细胞因子分泌)的抑制做到这点。在一些实施方案中，效应T细胞是CD4+效应T细胞。在一些实施方案中，抗人OX40激动剂抗体减少瘤内(浸润性)Treg的数目(例如，Treg总数或例如CD4+细胞中Fox3p+细胞的百分数)。
在一个实施方案中，本申请提供用于增强哺乳动物中免疫应答的方法，所述方法包含向哺乳动物施用治疗有效量的与OX40结合的激动剂抗原结合复合体。在某些实施方案中，这些方法包括刺激、激发、增加、改善或增进哺乳动物免疫***的任何应答。免疫应答可以是细胞反应(即细胞介导的应答，如细胞毒T淋巴细胞介导的应答)或体液应答(即抗体介导的应答)，并且可以是初次或再次免疫应答。增强免疫应答的例子包括CD4+辅助T细胞活性增加及溶细胞性T细胞的产生。可以使用本领域技术人员已知的多种体外或体内测量法评估免疫应答增强，所述测量法包括但不限于细胞毒T淋巴细胞测定法、释放细胞因子(例如产生IL-2)、肿瘤消退、携瘤动物的存活、抗体产生、免疫细胞增殖、细胞表面标记物表达和细胞毒性。一般，与未处理的哺乳动物或未使用要求保护的方法处理的动物的免疫应答相比时，本公开的方法增强哺乳动物的免疫应答。在一个实施方案中，该方法增强细胞免疫应答，尤其细胞毒T细胞应答。在另一个实施方案中，细胞免疫应答是T辅助细胞应答。在又一个实施方案中，免疫应答是产生细胞因子，尤其产生IL-2。
在另一实施方案中，本申请提供治疗哺乳动物中癌症的方法，所述方法包含向哺乳动物施用治疗有效量的与OX40结合的激动剂抗原结合复合体。在某些实施方案中，这些方法包括在经诊断患有癌症的哺乳动物中引起合乎需要或有益的作用。合乎需要或有益的作用可以包括抑制癌细胞进一步生长或扩散、癌细胞死亡、抑制癌复现、减少与癌相关的疼痛或改善动物存活。抑制癌复现构思了具有先前已经通过辐射、化疗、手术或其他技术事先治疗的癌部位和周围组织。该作用可以是主观或客观的。例如，如果动物是人，则人可以将精力或活力改善或疼痛减少记录为改善或疗法反应的主观症状。备选地，临床医师可以基于体格检查、实验室参数、肿瘤标记或放射摄影结果注意到肿瘤尺寸或肿瘤负荷下降。临床医生可以对治疗反应观察到的一些实验室体征包括检验法的归一化，如白细胞计数、红细胞计数、血小板计数、红细胞沉降率和多种酶水平。另外，临床医生可能观察到可检测肿瘤标记的下降。备选地，其他检验法可以用来评价客观改善，如超声图、核磁共振检验法和正电子发射检验法。
在一个实施方案中，本申请提供用于阻止哺乳动物中癌症的方法，所述方法包含向哺乳动物施用治疗有效量的与OX40结合的激动剂抗原结合复合体。在某些实施方案中，该方法包括延迟、抑制或阻止哺乳动物中癌症发作，其中肿瘤形成或肿瘤形成的发作未经证实，但是鉴定了癌症的素质，无论通过遗传筛查或其他方式确定。本术语还涵盖治疗具有癌变前状况哺乳动物以终止癌变前状况向恶性肿瘤进展或引起其消退。癌变前状况的例子包括增生、发育不良和化生。
在某些实施方案中，通过如本文所述的与OX40结合的激动剂抗原结合复合体可治疗的癌包括乳腺癌、结直肠癌、直肠癌、非小细胞肺癌、胶质母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、肾细胞癌、***癌、肝癌、胰腺癌、软组织肉瘤、卡波西肉瘤、良性肿瘤癌、头颈癌、卵巢癌、间皮瘤和多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，癌选自：非小细胞肺癌、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、黑素瘤、乳腺癌(例如，三阴性乳腺癌)、胃癌、结直肠癌(CRC)和肝细胞癌。然而，在一些实施方案中，癌选自：非小细胞肺癌、结直肠癌、胶质母细胞瘤和乳腺癌(例如，三阴性乳腺癌)，包括这些癌的转移形式。
在一些实施方案中，癌的例子还包括但不限于B细胞淋巴瘤(包含低级别/滤泡型非霍奇金淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞(SL)NHL；中间级别/滤泡性NHL；中间级别弥漫性NHL；高级别免疫母细胞的NHL；高级别淋巴母细胞NHL；高级别小非裂核细胞NHL；肿块性病变NHL；套细胞淋巴瘤；AIDS相关淋巴瘤；和Waldenstrom巨球蛋白血症)；慢性淋巴细胞白血病(CLL)；急性淋巴母细胞性白血病(ALL)；多毛细胞白血病；慢性髓细胞性白血病；和移植后淋巴细胞增生性疾病(PTLD)、以及与斑痣性错构瘤病相关的异常血管增生、水肿(如与脑肿瘤相关的水肿)、B细胞增殖性疾病和Meig综合征。更具体的例子包括但不限于复发性或难治性NHL、一线低级别NHL、III/IV期NHL、化疗抵抗性NHL、前体B原始淋巴细胞白血病和/或淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞白血病和/或幼淋巴细胞白血病和/或小淋巴细胞淋巴瘤、B细胞幼淋巴细胞淋巴瘤、免疫细胞瘤和/或淋巴浆细胞性淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤、结外边缘区-MALT淋巴瘤、***边缘区淋巴瘤、毛细胞白血病、浆细胞瘤和/或浆细胞骨髓瘤、低级别/滤泡性淋巴瘤、中间级别/滤泡性NHL、套细胞淋巴瘤、滤泡中心细胞淋巴瘤(滤泡)、中间级别弥漫NHL、弥漫性大B细胞淋巴瘤、侵袭性NHL(包括侵袭性一线NHL和侵袭性复发性NHL)、自体干细胞移植后复发或难治的NHL、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤、原发渗出性淋巴瘤、高级别免疫母细胞性NHL、高级别原始淋巴细胞NHL、高级别小无裂核细胞NHL、巨大肿块病NHL、伯基特淋巴瘤、前体(外周)大颗粒淋巴细胞白血病、蕈样肉芽肿病和/或Sezary综合征、皮肤(皮肤型)淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤、血管中心性淋巴瘤。
在一些实施方案中，癌症的例子还包括但不限于B细胞增殖性疾病，后者还包括但不限于淋巴瘤(例如，B细胞非霍奇金淋巴瘤(NHL))和淋巴细胞白血病。这类淋巴瘤和淋巴细胞白血病例如包括a)滤泡淋巴瘤、b)小非裂核细胞淋巴瘤/伯基特淋巴瘤(包括地方性伯基特淋巴瘤、散发性伯基特淋巴瘤和非伯基特淋巴瘤)、c)边缘区淋巴瘤(包括结外边缘区B细胞淋巴瘤(粘膜相关淋巴组织淋巴瘤，MALT)、***边缘区B细胞淋巴瘤和脾边缘区淋巴瘤)、d)外套细胞淋巴瘤(MCL)、e)大细胞淋巴瘤(包括B细胞弥漫性大细胞淋巴瘤(DLCL)、弥漫性混合型细胞淋巴瘤、免疫母细胞淋巴瘤、原发性纵隔B细胞淋巴瘤、血管中心淋巴瘤-肺B细胞淋巴瘤)、f)多毛细胞白血病、g)淋巴细胞性淋巴瘤、Waldenstrom巨球蛋白血症、h)急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)/小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、B细胞幼淋巴细胞白血病、i)浆细胞瘤、浆细胞骨髓瘤、多发性骨髓瘤、浆细胞瘤和/或j)霍奇金病。
在任何方法的一些实施方案中，癌是B细胞增殖性疾病。在一些实施方案中，B细胞增殖性疾病是淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、侵入性NHL、复发性侵入性NHL、复发性惰性NHL、难治性NHL、难治性惰性NHL、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、小淋巴细胞淋巴瘤、白血病、多毛细胞白血病(HCL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)或套细胞淋巴瘤。在一些实施方案中，B细胞增殖性疾病是NHL，如惰性NHL和/或侵入性NHL。在一些实施方案中，B细胞增殖性疾病是惰性滤泡淋巴瘤或弥漫性大B细胞淋巴瘤。
在本发明任何方法的一些实施方案中，癌显示人效应细胞(例如，受人效应细胞浸润)。用于检测人效应细胞的方法是本领域熟知的，例如包含通过IHC检测。在一些实施方案中，癌显示高水平的人效应细胞。在一些实施方案中，人效应细胞是NK细胞、巨噬细胞、单核细胞中的一种或多种。在一些实施方案中，癌是本文所述的任何癌。在一些实施方案中，癌是非小细胞肺癌(NSCLC)、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、黑素瘤、乳腺癌(例如，三阴性乳腺癌)、胃癌、结直肠癌(CRC)或肝细胞癌。
本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以在疗法中单独或与其他药物组合使用。例如，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以与至少一种额外治疗剂共同施用。
上文所示的这类联合疗法涵盖联合施用(其中在相同或独立的制剂中包含两种或更多种治疗剂)，和独立施用，在这种情况下，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体的施用可以在施用额外的一种或多种治疗剂之前、同时和/或之后进行。在一个实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体的施用和额外治疗剂的施用彼此相隔约一个月内，或约一周、两周或三周内，或约一、两、三、四、五或六日内进行。本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体也可以与放射治疗组合使用。
在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合化疗或化疗剂一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合放射治疗或放疗剂一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合靶向疗法或靶向治疗剂一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合免疫治疗或免疫治疗剂(例如单克隆抗体)一起施用。
“化疗剂”包括用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的例子包括厄洛替尼(Genentech/OSI Pharm.)、硼替佐米(MillenniumPharm.)、双硫仑、没食子酸表没食子儿茶素、salinosporamide A、卡非佐米、17-AAG(格尔德霉素)、根赤壳菌素(radicicol)、乳酸脱氢酶A(LDH-A)、氟维司群(AstraZeneca)、舒尼替尼(sunitib)(Pfizer/Sugen)、来曲唑(Novartis)、甲磺酸伊马替尼(Novartis)、finasunate(Novartis)、奥沙利铂(Sanofi)、5-FU(5-氟尿嘧啶)、甲酰四氢叶酸(leucovovin)、雷帕霉素(Rapamycin)(西罗莫司(Sirolimus),Wyeth)、拉帕替尼(GSK572016,Glaxo Smith Kline)、Lonafamib(SCH 66336)、索拉非尼(Bayer Labs)、吉非替尼(AstraZeneca)、AG1478、烷基化剂如塞替派和环磷酰胺；烷基磺酸酯类诸如白消安(busulfan)，英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类(aziridines)，诸如苯佐替派(benzodopa)，卡波醌(carboquone)，美妥替派(meturedopa)，和乌瑞替派(uredopa)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)，三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)，三乙撑磷酰胺(triethylenephosphoramide)，三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylomelamine)；番荔枝内酯类(acetogenins)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；喜树碱(camptothecin)(包括托泊替康(topotecan)和伊立替康(irinotecan))；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)，卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；隐藻素类(cryptophycins)(特别是隐藻素1和隐藻素8)；肾上腺皮质类固醇类(adrenocorticosteroids)，包括***(prednisone)和***龙(prednisolone)；醋酸环丙孕酮(cyproterone acetate)；5α-还原酶，包括非那雄胺(finasteride)和度他雄胺(dutasteride)；vorinostat，romidepsin，panobinostat，丙戊酸(valproic acid),mocetinostat多拉司他汀(dolastatin)；阿地白介素(aldesleukin),滑石(talc)duocarmycin(包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海绵抑素(spongistatin)；氮芥类(nitrogen mustards)，诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)，萘氮芥(chlomaphazine)，胆磷酰胺(chlorophosphamide)，雌莫司汀(estramustine)，异环磷酰胺(ifosfamide)，双氯乙基甲胺(mechlorethamine)，盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)，美法仑(melphalan)，新氮芥(novembichin)，苯芥胆甾醇(phenesterine)，泼尼莫司汀(prednimustine)，曲磷胺(trofosfamide)，尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝脲类(nitrosoureas)，诸如卡莫司汀(carmustine)，氯脲菌素(chlorozotocin)，福莫司汀(fotemustine)，洛莫司汀(lomustine)，尼莫司汀(nimustine)，和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素类，诸如烯二炔类抗生素(例如加利车霉素(calicheamicin)，尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ω1I(Angew Chem.Intl.Ed.Engl.1994,33:183-186)；蒽环类抗生素(dynemicin)，包括dynemicin A；二膦酸盐类(bisphosphonates)，诸如氯膦酸盐(clodronate)；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团)，阿克拉霉素(aclacinomysins)，放线菌素(actinomycin)，氨茴霉素(authramycin)，偶氮丝氨酸(azaserine)，博来霉素(bleomycin)，放线菌素C(cactinomycin)，carabicin，洋红霉素(caminomycin)，嗜癌霉素(carzinophilin)，色霉素(chromomycinis)，放线菌素D(dactinomycin)，柔红霉素(daunorubicin)，地托比星(detorubicin)，6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸，(多柔比星(doxorubicin))，吗啉代多柔比星，氰基吗啉代多柔比星，2-吡咯代多柔比星和脱氧多柔比星)，表柔比星(epirubicin)，依索比星(esorubicin)，伊达比星(idarubicin)，麻西罗霉素(marcellomycin)，丝裂霉素(mitomycin)诸如丝裂霉素C，霉酚酸(mycophenolic acid)，诺拉霉素(nogalamycin)，橄榄霉素(olivomycin)，培洛霉素(peplomycin)，泊非霉素(porfiromycin)，嘌呤霉素(puromycin)，三铁阿霉素(quelamycin)，罗多比星(rodorubicin)，链黑菌素(streptonigrin)，链佐星(streptozocin)，杀结核菌素(tubercidin)，乌苯美司(ubenimex)，净司他丁(zinostatin)，佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，诸如甲氨蝶呤(methotrexate)和5-氟尿嘧啶(fluorouracil)(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)，甲氨蝶呤，蝶酰三谷氨酸(pteropterin)，三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)，6-巯基嘌呤(mercaptopurine)，硫咪嘌呤(thiamiprine)，硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)，阿扎胞苷(azacitidine)，6-氮尿苷，卡莫氟(carmofur)，阿糖胞苷(cytarabine)，双脱氧尿苷(dideoxyuridine)，去氧氟尿苷(doxifluridine)，依诺他滨(enocitabine)，氟尿苷(floxuridine)；雄激素类，诸如卡鲁睾酮(calusterone)，丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)，表硫雄醇(epitiostanol)，美雄烷(mepitiostane)，睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)，米托坦(mitotane)，曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfomithine；依利醋铵(elliptinium acetate)；epothilone；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidainine)；美登木素生物碱类(maytansinoids)，诸如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamnol)；二胺硝吖啶(nitraerine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼(ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；多糖复合物(JHS Natural Products,Eugene,Oreg.)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西索菲兰(sizofuran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2”-三氯三乙胺；单端孢菌素类(trichothecenes)(尤其是T-2毒素，疣孢菌素(verracurin)A，杆孢菌素(roridin)A和蛇行菌素(anguidine))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；环磷酰胺(cyclophosphamide)；塞替派(thiotepa)；类紫杉醇(taxoids)，例如泰素(TAXOL)(帕利他赛(paclitaxel)；Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.)，(无克列莫佛(Cremophor)的)，帕利他赛的清蛋白改造的纳米颗粒剂型(American Pharmaceutical Partners,Schaumberg,Ill.)和泰索帝(多西他赛(docetaxel，doxetaxel)；Sanofi-Aventis)；苯丁酸氮芥(chloranmbucil)；(吉西他滨(gemcitabine))；6-硫鸟嘌呤(thioguanine)；巯基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤(methotrexate)；铂类似物，诸如顺铂(cisplatin)和卡铂(carboplatin)；长春碱(vinblastine)；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)；(长春瑞滨(vinorelbine))；能灭瘤(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；卡培他滨(capecitabine)伊本膦酸盐(ibandronate)；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄酸(retinoids)，诸如视黄酸(retinoic acid)；及任何上述各项的药学可接受盐，酸或衍生物。
化疗剂还包括(i)起调节或抑制激素对肿瘤作用的作用的抗激素剂，诸如抗***类和选择性***受体调控物类(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括柠檬酸他莫昔芬)，雷洛昔芬(raloxifene)，屈洛昔芬(droloxifene)，iodoxyfene，4-羟基他莫昔芬，曲沃昔芬(trioxifene)，那洛昔芬(keoxifene)，LY117018，奥那司酮(onapristone)，和(柠檬酸托瑞米芬(toremifine citrate))；(ii)抑制在肾上腺中调节***生成的芳香酶的芳香酶抑制剂，诸如例如4(5)-咪唑，氨鲁米特(aminoglutethimide)，(醋酸甲地孕酮(megestrol acetate))，(依西美坦(exemestane)；Pfizer)，福美坦(formestanie)，法倔唑(fadrozole)，(伏罗唑(vorozole))，(来曲唑(letrozole)；Novartis)，和(阿那曲唑(anastrozole)；AstraZeneca)；(iii)抗雄激素类，诸如氟他米特(flutamide)，尼鲁米特(nilutamide)，比卡米特(bicalutamide)，亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；布舍瑞林(buserelin)，曲普瑞林(tripterelin)，醋酸甲羟孕酮(medroxyprogesterone acetate)，己烯雌酚(diethylstilbestrol)，倍美力(premarin)，氟***(fluoxymesterone)，全反式视黄酸，芬维A胺(fenretinide)，以及曲沙他滨(troxacitabine)(1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；(iv)蛋白质激酶抑制剂；(v)脂质激酶抑制剂；(vi)反义寡核苷酸，特别是抑制牵涉异常细胞增殖的信号传导途经中的基因表达的反义寡核苷酸，诸如例如PKC-α，Ralf和H-Ras；(vii)核酶，诸如VEGF表达抑制剂(例如)和HER2表达抑制剂；(viii)疫苗，诸如基因疗法疫苗，例如和 rIL-2；拓扑异构酶1抑制剂，诸如和(ix)及任何上述药剂的药学可接受盐，酸和衍生物。
化疗剂还包括抗体，诸如阿仑珠单抗(alemtuzumab)(Campath)，贝伐珠单抗(bevacizumab)(Genentech)，西妥昔单抗(cetuximab)((Imclone)；帕尼单抗(panitumumab)(Amgen)，利妥昔单抗(rituximab)(Genentech/Biogen Idec)，帕妥珠单抗(pertuzumab)(2C4，Genentech)，曲妥珠单抗(Genentech)，托西莫单抗(tositumomab)(Bexxar，Corixia)，和抗体药物缀合物，吉妥珠单抗奥佐米星(gemtuzumab ozogamicin)(Wyeth)。具有作为与本发明化合物组合的药剂的治疗潜力的别的人源化单克隆抗体包括：阿泊珠单抗(apolizumab)，阿塞珠单抗(aselizumab)，atlizumab，巴匹珠单抗(bapineuzumab)，bivatuzumab mertansine，莫坎妥珠单抗(cantuzumabmertansine)，西利珠单抗(cedelizumab)，培舍珠单抗(certolizumab pegol)，cidfusituzumab，cidtuzumab，达克珠单抗(daclizumab)，依库珠单抗(eculizumab)，依法珠单抗(efalizumab)，依帕珠单抗(epratuzumab)，厄利珠单抗(erlizumab)，非维珠单抗(felvizumab)，芳妥珠单抗(fontolizumab)，吉妥珠单抗奥佐米星(gemtuzumabozogamicin)，英妥珠单抗奥佐米星(inotuzumab ozogamicin)，伊匹木单抗(ipilimumab)，拉贝珠单抗(labetuzumab)，林妥珠单抗(lintuzumab)，马妥珠单抗(matuzumab)，美泊利单抗(mepolizumab)，莫维珠单抗(motavizumab)，motovizumab，那他珠单抗(natalizumab)，尼妥珠单抗(nimotuzumab)，nolovizumab，numavizumab，ocrelizumab，奥马珠单抗(omalizumab)，帕利珠单抗(palivizumab)，帕考珠单抗(pascolizumab)，pecfusituzumab，pectuzumab，培克珠单抗(pexelizumab)，ralivizumab，雷珠单抗(ranibizumab)，reslivizumab，瑞利珠单抗(reslizumab)，resyvizumab，罗维珠单抗(rovelizumab)，卢利珠单抗(ruplizumab)，西罗珠单抗(sibrotuzumab)，西利珠单抗(siplizumab)，索土珠单抗(sontuzumab)，tacatuzumab tetraxetan，tadocizumab，他利珠单抗(talizumab)，特非珠单抗(tefibazumab)，托珠单抗(tocilizumab)，托利珠单抗(toralizumab)，tucotuzumab西莫白介素(celmoleukin)，tucusituzumab，umavizumab，乌珠单抗(urtoxazumab)，优特克单抗(ustekinumab)，维西珠单抗(visilizumab)，和抗白介素-12(ABT-874/J695，WyethResearch and Abbott Laboratories)，其为经遗传修饰以识别白介素-12p40蛋白的重组专有人序列全长IgG1λ抗体。
化疗剂还包括“EGFR抑制剂”，其指结合EGFR或以其它方式直接与EGFR相互作用并阻止或降低其信号传导活性的化合物，其另外还称作“EGFR拮抗剂”。此类药剂的例子包括结合EGFR的抗体和小分子。结合EGFR的抗体的例子包括MAb 579(ATCC CRL HB8506)，MAb455(ATCC CRL HB8507)，MAb 225(ATCC CRL 8508)，MAb 528(ATCC CRL 8509)(参见美国专利No.4,943,533，Mendelsohn等人)及其变体，诸如嵌合化的225(C225或西妥昔单抗；)和重构的人225(H225)(参见WO96/40210，Imclone Systerms Inc.)；IMC-11F8，一种完全人的EGFR靶向抗体(Imclone)；结合II型突变体EGFR的抗体(美国专利No.5,212,290)；结合EGFR的人源化和嵌合抗体，如美国专利No.5,891,996中所述；和结合EGFR的人抗体，诸如ABX-EGF或帕尼单抗(Panitumumab)(参见WO98/50433，Abgenix/Amgen)；EMD55900(Stragliotto et al.,Eur.J.Cancer 32A:636-640(1996))；EMD7200(matuzumab)，一种针对EGFR且与EGF和TGF-α二者竞争EGFR结合的人源化EGFR抗体(EMD/Merck)；人EGFR抗体，HuMax-EGFR(GenMab)；称作E1.1，E2.4，E2.5，E6.2，E6.4，E2.11，E6.3和E7.6.3且描述在US 6,235,883中的完全人抗体；MDX-447(Medarex Inc)；和mAb 806或人源化mAb 806(Johns et al.,J.Biol.Chem.279(29):30375-30384(2004))。抗EGFR抗体可与细胞毒剂缀合，由此产生免疫缀合物(参见例如EP 659,439A2，Merck Patent GmbH)。EGFR拮抗剂包括小分子，诸如美国专利No.5,616,582，5,457,105，5,475,001，5,654,307，5,679,683，6,084,095，6,265,410，6,455,534，6,521,620，6,596,726，6,713,484，5,770,599，6,140,332，5,866,572，6,399,602，6,344,459，6,602,863，6,391,874，6,344,455，5,760,041，6,002,008，和5,747,498，以及PCT公开文本WO98/14451，WO98/50038，WO99/09016，和WO99/24037中描述的化合物。具体的小分子EGFR拮抗剂包括OSI-774(CP-358774，厄洛替尼(erlotinib)，Genentech/OSI Pharmaceuticals)；PD 183805(CI 1033，2-丙烯酰胺，N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-7-[3-(4-吗啉基)丙氧基]-6-喹唑啉基]-，二氢氯化物，Pfizer Inc.)；ZD1839，吉非替尼(gefitinib)4-(3’-氯-4’-氟苯胺基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉代丙氧基)喹唑啉，AstraZeneca)；ZM 105180((6-氨基-4-(3-甲基苯基-氨基)-喹唑啉，Zeneca)；BIBX-1382(N8-(3-氯-4-氟-苯基)-N2-(1-甲基-哌啶-4-基)-嘧啶并[5,4-d]嘧啶-2,8-二胺，Boehringer Ingelheim)；PKI-166((R)-4-[4-[(1-苯基乙基)氨基]-1H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基]-苯酚)；(R)-6-(4-羟基苯基)-4-[(1-苯基乙基)氨基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶)；CL-387785(N-[4-[(3-溴苯基)氨基]-6-喹唑啉基]-2-丁炔酰胺)；EKB-569(N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-3-氰基-7-乙氧基-6-喹啉基]-4-(二甲基氨基)-2-丁烯酰胺)(Wyeth)；AG1478(Pfizer)；AG1571(SU 5271；Pfizer)；双重EGFR/HER2酪氨酸激酶抑制剂，诸如拉帕替尼(lapatinib)GSK572016或N-[3-氯4-[(3氟苯基)甲氧基]苯基]-6[5[[[2甲基磺酰基)乙基]氨基]甲基]-2-呋喃基]-4-喹唑啉胺)。
化疗剂还包括“酪氨酸激酶抑制剂”，包括前一段中提到的EGFR靶向药物；小分子HER2酪氨酸激酶抑制剂，诸如可从Takeda获得的TAK165；CP-724,714，一种口服ErbB2受体酪氨酸激酶选择性抑制剂(Pfizer和OSI)；优先结合EGFR但抑制HER2和EGFR过表达细胞二者的双重HER抑制剂，诸如EKB-569(可从Wyeth获得)；拉帕替尼(lapatinib)(GSK572016；可从Glaxo-SmithKline获得)，一种口服HER2和EGFR酪氨酸激酶抑制剂；PKI-166(可从Novartis获得)；泛HER抑制剂，诸如卡奈替尼(canertinib)(CI-1033；Pharmacia)；Raf-1抑制剂，诸如可从ISIS Pharmaceuticals获得的，抑制Raf-1信号传导的反义药剂ISIS-5132；非HER靶向TK抑制剂，诸如甲磺酸伊马替尼(可得自Glaxo SmithKline)；多靶向酪氨酸激酶抑制剂，诸如舒尼替尼(sunitinib)((可从Pfizer获得)；VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂，诸如瓦他拉尼(vatalanib)(PTK787/ZK222584，可从Novartis/Schering AG获得)；MAPK胞外调控激酶I抑制剂CI-1040(可从Pharmacia获得)；喹唑啉类，诸如PD 153035，4-(3-氯苯胺基)喹唑啉；吡啶并嘧啶类；嘧啶并嘧啶类；吡咯并嘧啶类，诸如CGP 59326，CGP 60261和CGP 62706；吡唑并嘧啶类，4-(苯基氨基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶类；姜黄素(二阿魏酰甲烷，4,5-双(4-氟苯胺基)-酞酰亚胺)；含有硝基噻吩模块的tyrphostine；PD-0183805(Warner-Lamber)；反义分子(例如那些与编码HER的核酸结合的反义分子)；喹喔啉类(美国专利No.5,804,396)；tryphostins(美国专利No.5,804,396)；ZD6474(AstraZeneca)；PTK-787(Novartis/Schering AG)；泛HER抑制剂，诸如CI-1033(Pfizer)；Affinitac(ISIS 3521；Isis/Lilly)；甲磺酸伊马替尼PKI 166(Novartis)；GW2016(Glaxo SmithKline)；CI-1033(Pfizer)；EKB-569(Wyeth)；Semaxinib(Pfizer)；ZD6474(AstraZeneca)；PTK-787(Novartis/Schering AG)；INC-1C11(Imclone)，雷帕霉素(西罗莫司，)；或任何下列专利公开文本中描述的：美国专利No.5,804,396；WO1999/09016(American Cyanamid)；WO1998/43960(AmericanCyanamid)；WO1997/38983(Warner Lambert)；WO1999/06378(Warner Lambert)；WO1999/06396(WarnerLambert)；WO1996/30347(Pfizer,Inc)；WO1996/33978(Zeneca)；WO1996/3397(Zeneca)和WO1996/33980(Zeneca)。
化疗剂还包括***(dexamethasone)，干扰素，秋水仙素(colchicine)，氯苯氨啶(metoprine)，环孢霉素(cyclosporine)，两性霉素(amphotericin)，甲硝唑(metronidazole)，阿仑单抗(alemtuzumab)，阿利维A酸(alitretinoin)，别嘌醇(allopurinol)，氨磷汀(amifostine)，三氧化二砷(arsenic trioxide)，天冬酰胺酶(asparaginase)，活的BCG，贝伐珠单抗(bevacuzimab)，贝沙罗汀(bexarotene)，克拉屈滨(cladribine)，里本灵(clofarabine)，darbepoetin alfa，地尼白介素(denileukin)，右雷佐生(dexrazoxane)，阿法依伯汀(epoetin alfa)，厄洛替尼(elotinib)，非格司亭(filgrastim)，醋酸组氨瑞林(histrelin acetate)，ibritumomab，干扰素α-2a，干扰素α-2b，lenalidomide，左旋咪唑(levamisole)，美司钠(mesna)，甲氧沙林(methoxsalen)，诺龙(nandrolone)，奈拉滨(nelarabine)，诺非单抗(nofetumomab)，奥普瑞白介素(oprelvekin)，palifermin，帕米膦酸盐(pamidronate)，培加酶(pegademase)，培门冬酶(pegaspargase)，PEG非格司亭(pegfilgrastim)，培美曲塞二钠(pemetrexed disodium)，普卡霉素(plicamycin)，卟吩姆钠(porfimer sodium)，喹纳克林(quinacrine)，拉布立酶(rasburicase)，沙格司亭(sargramostim)，替莫唑胺(temozolomide)，VM-26，6-TG，托瑞米芬(toremifene)，tretinoin，ATRA，戊柔比星(valrubicin)，唑来膦酸盐(zoledronate)，和唑来膦酸(zoledronic acid)，及其药学可接受盐。
化疗剂还包括氢化可的松(hydrocortisone)，醋酸氢化可的松(hydrocortisoneacetate)，醋酸可的松(cortisone acetate)，替可的松匹伐酯(tixocortol pivalate)，曲安奈德(triamcinolone acetonide)，曲安西龙醇(triamcinolone alcohol)，莫米松(mometasone)，安西奈德(amcinonide)，布***(budesonide)，***(desonide)，fluocinonide，fluocinolone acetonide，倍他米松(betamethasone)，倍他米松磷酸钠(betamethasone sodium phosphate)，***(dexamethasone)，***磷酸钠(dexamethasone sodium phosphate)，氟可龙(fluocortolone)，氢化可的松-17-丁酸盐(hydrocortisone-17-butyrate)，氢化可的松-17-戊酸盐(hydrocortisone-17-valerate)，aclometasone dipropionate，戊酸倍他米松(betamethasone valerate)，二丙酸倍他米松(betamethasone dipropionate)，泼尼卡酯(prednicarbate)，氯倍他松-17-丁酸盐(clobetasone-17-butyrate)，氯倍他松-17-丙酸盐(clobetasol-17-propionate)，己酸氟考龙(fluocortolone caproate)，特戊酸氟考龙(fluocortolone pivalate)和醋酸氟甲叉龙(fluprednidene acetate)；免疫选择性抗炎肽(ImSAID)，诸如苯丙氨酸-谷氨酰胺-甘氨酸(FEG)及其D-异构体形式(feG)(IMULAN BioTherapeutics,LLC)；抗风湿药物，诸如硫唑嘌呤(azathioprine)，环孢素(ciclosporin)(环孢霉素(cyclosporine)A)，D-青霉胺，金盐，羟氯喹，来氟米特(leflunomide)米诺环素(minocycline)，柳氮磺吡啶(sulfasalazine)，肿瘤坏死因子α(TNFα)阻断剂，诸如依那西普(etanercept)(Enbrel)，英夫利昔单抗(infliximab)(Remicade)，阿达木单抗(adalimumab)(Humira)，certolizumabpegol(Cimzia)，golimumab(Simponi)，白介素-1(IL-1)阻断剂，诸如阿那白滞素(anakinra)(Kineret)，T细胞共刺激阻断剂，诸如abatacept(Orencia)，白介素-6(IL-6)阻断剂，诸如tocilizumab白介素-13(IL-13)阻断剂，诸如lebrikizumab；干扰素α(IFN)阻断剂，诸如Rontalizumab；β7-整联蛋白阻断剂，诸如rhuMAbBeta7；IgE途径阻断剂，诸如抗M1prime；分泌型同三聚LTa3和膜结合型异三聚LTa1/β2阻断剂，诸如抗淋巴毒素α(LTa)；放射性同位素，例如At211，I131，I125，Y90，Re186，Re188，Sm153，Bi212，P32，Pb212和Lu放射性同位素；混杂调查性药剂，诸如thioplatin，PS-341，丁酸苯酯，ET-18-OCH3，或法尼基转移酶抑制剂(L-739749，L-744832；多酚，诸如槲皮素(quercetin)，白藜芦醇(resveratrol)，piceatannol，没食子酸表没食子儿茶精(epigallocatechinegallate)，茶黄素(theaflavin)，黄烷醇(flavanol)，原花青素(procyanidins)，白桦脂酸(betulinic acid)及其衍生物；自噬抑制剂，诸如氯喹；δ-9-四氢***酚(tetrahydrocannabinol)(屈***酚(dronabinol)，)；β-拉帕醌(lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙素类(colchicines)；白桦脂酸(betulinicacid)；乙酰喜树碱，东莨菪亭(scopolectin)，和9-氨基喜树碱)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；替加氟(tegafur)贝沙罗汀(bexarotene)二膦酸盐类(bisphosphonates)，诸如氯膦酸盐(clodronate)(例如或)，依替膦酸钠(etidronate)NE-58095，唑来膦酸/唑来膦酸盐(zoledronic acid/zoledronate)阿伦膦酸盐(alendronate)帕米膦酸盐(pamidronate)替鲁膦酸盐(tiludronate)或利塞膦酸盐(risedronate)和表皮生长因子受体(EGF-R)；疫苗，诸如疫苗；哌立福辛(perifosine)，COX-2抑制剂(例如塞来考昔(celecoxib)或艾托考昔(etoricoxib))，蛋白体抑制剂(例如PS341)；CCI-779；tipifarnib(R11577)；orafenib，ABT510；Bcl-2抑制剂，诸如oblimersensodiumpixantrone；法尼基转移酶抑制剂，诸如lonafarnib(SCH6636，SARASARTM)；及任何上述各项的药学可接受盐，酸或衍生物；以及两种或更多种上述各项的组合，诸如CHOP(环磷酰胺，多柔比星，长春新碱，和***龙联合疗法的缩写)和FOLFOX(奥沙利铂(ELOXATINTM)联合5-FU和亚叶酸的治疗方案的缩写)。
化疗剂还包括具有止痛，退热和消炎效果的非类固醇消炎药。NSAID包括酶环氧合酶的非选择性抑制剂。NSAID的具体例子包括阿司匹林(aspirin)，丙酸衍生物诸如布洛芬(ibuprofen)，非诺洛芬(fenoprofen)，酮洛芬(ketoprofen)，氟比洛芬(flurbiprofen)，奥沙普秦(oxaprozin)和荼普生(naproxen)，乙酸衍生物诸如吲哚美辛(indomethacin)，舒林酸(sulindac)，依托度酸(etodolac)，双氯芬酸(diclofenac)，烯醇酸衍生物诸如吡罗昔康(piroxicam)，美洛昔康(meloxicam)，替诺昔康(tenoxicam)，屈恶昔康(droxicam)，氯诺昔康(lornoxicam)和伊索昔康(isoxicam)，灭酸衍生物诸如甲灭酸(mefenamic acid)，甲氯芬那酸(meclofenamic acid)，氟芬那酸(flufenamic acid)，托芬那酸(tolfenamicacid)，和COX-2抑制剂诸如塞来考昔(celecoxib)，依托考昔(etoricoxib)，罗美考昔(lumiracoxib)，帕瑞考昔(parecoxib)，罗非考昔(rofecoxib)，罗非昔布(rofecoxib)，和伐地考昔(valdecoxib)。NSAID可被指示用于诸如类风湿性关节炎，骨关节炎，炎性关节病，强直性脊柱炎，银屑病关节炎，莱特尔氏综合征，急性痛风，痛经，骨转移疼痛，头痛和偏头痛，手术后疼痛，由于炎症和组织损伤引起的轻至中度疼痛，发热，肠梗阻，和肾绞痛等疾患的症状缓解。
在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以与PARP抑制剂(例如，Olaparanib、Rucaparib、Niraparib、西地尼布(Cediranib)、BMN673、Veliparib)、曲贝替定(Trabectedin)、nab-紫杉醇(白蛋白结合型紫杉醇、ABRAXANE)、Trebananib、帕唑帕尼、西地尼布、Palbociclib、依维莫司、氟嘧啶(例如，FOLFOX、FOLFIRI)、IFL、瑞格非尼、Reolysin、Alimta、Zykadia、Sutent、Torisel(坦罗莫司)、英立达(阿昔替尼，Pfizer)、Afinitor(依维莫司，Novartis)、多吉美(Nexavar)(索拉非尼，Onyx/Bayer)、Votrient、帕唑帕尼、阿昔替尼、IMA-901、AGS-003、卡博替尼(cabozantinib)、长春氟宁(Vinflunine)、Hsp90抑制剂(例如，apatorsin)、d-GM-CSF(CT-0070)、替莫唑胺(Temazolomide)、IL-2、IFNa、长春碱、沙利度胺(Thalomid)、达卡巴嗪、环磷酰胺、来那度胺、氮胞苷、来那度胺、硼替佐米(VELCADE)、氨柔比星、卡非佐米、普拉曲沙和/或enzastaurin联合施用。
在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合PD-1轴结合拮抗剂一起施用。PD-1轴结合拮抗剂包括但不限于PD-1结合拮抗剂，PD-L1结合拮抗剂和PD-L2结合拮抗剂。"PD-1"的备选名称包括CD279和SLEB2。"PD-L1"的备选名称包括B7-H1，B7-4，CD274，和B7-H。"PD-L2"的备选名称包括B7-DC，Btdc，和CD273。在一些实施方案中，PD-1，PD-L1，和PD-L2是人PD-1，PD-L1和PD-L2。在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是抑制PD-1结合其配体结合配偶的分子。在一个具体方面，PD-1配体结合配偶是PD-L1和/或PD-L2。在另一个实施方案中，PD-L1结合拮抗剂是抑制PD-L1结合其结合配偶的分子。在一个具体方面，PD-L1结合配偶是PD-1和/或B7-1。在另一个实施方案中，PD-L2结合拮抗剂是抑制PD-L2结合其结合配偶的分子。在一个具体方面，PD-L2结合配偶是PD-1。拮抗剂可以是抗体，其抗原结合片段，免疫粘附素，融合蛋白，或寡肽。在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是抗PD-1抗体(例如人抗体，人源化抗体，或嵌合抗体)。在一些实施方案中，抗PD-1抗体选自下组：MDX-1106(nivolumab，OPDIVO)，Merck3475(MK-3475，pembrolizumab，KEYTRUDA)，CT-011(Pidilizumab)、MEDI-0680(AMP-514)、PDR001、REGN2810、BGB-108和BGB-A317。在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是免疫粘附素(例如包含融合至恒定区(例如免疫球蛋白序列的Fc区)的，PD-L1或PD-L2的胞外或PD-1结合部分的免疫粘附素)。在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是AMP-224。在一些实施方案中，PD-L1结合拮抗剂是抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，抗PD-Ll结合拮抗剂选自下组：YW243.55.S70、MPDL3280A(阿特朱单抗)、MEDI4736(durvalumab)、MDX-1105和MSB0010718C(avelumab)。MDX-1105，也称作BMS-936559，是WO2007/005874中记载的抗PD-L1抗体。抗体YW243.55.S70(重和轻链可变区序列分别显示于SEQ ID No.20和21)是WO 2010/077634A1中记载的抗PD-L1。MDX-1106，也称作MDX-1106-04，ONO-4538，BMS-936558或nivolumab，是WO2006/121168中记载的抗PD-1抗体。Merck 3475，也称作MK-3475，SCH-900475或pembrolizumab，是WO2009/114335中记载的抗PD-1抗体。CT-011，也称作hBAT，hBAT-1或pidilizumab，是WO2009/101611中记载的抗PD-1抗体。AMP-224，也称作B7-DCIg，是WO2010/027827和WO2011/066342中记载的PD-L2-Fc融合可溶性受体。在一些实施方案中，抗PD-1抗体是MDX-1106。"MDX-1106"的备选名称包括MDX-1106-04，ONO-4538，BMS-936558或nivolumab。在一些实施方案中，抗PD-1抗体是nivolumab(CAS注册号：946414-94-4)。
在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以与针对活化性共刺激分子的激动剂联合施用。在一些实施方案中，活化性共刺激分子可包括CD40，CD226，CD28，GITR，CD137，CD27，HVEM，或CD127。在一些实施方案中，针对活化性共刺激分子的激动剂是结合CD40，CD226，CD28，OX40，GITR，CD137，CD27，HVEM，或CD127的激动性抗体。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以与针对抑制性共刺激分子的拮抗剂联合施用。在一些实施方案中，抑制性共刺激分子可包括CTLA-4(也称作CD152)，PD-1，TIM-3，BTLA，VISTA，LAG-3，B7-H3，B7-H4，IDO，TIGIT，MICA/B，或精氨酸酶。在一些实施方案中，针对抑制性共刺激分子的拮抗剂是结合CTLA-4，PD-1，TIM-3，BTLA，VISTA，LAG-3(例如LAG-3-IgG融合蛋白(IMP321))，B7-H3，B7-H4，IDO，TIGIT，MICA/B，或精氨酸酶的拮抗性抗体。
在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合针对CTLA-4(也称作CD152)的拮抗剂(例如，阻断性抗体)一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合伊匹木单抗(也称作MDX-010、MDX-101或)一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合曲美木单抗(tremelimumab)(也称作ticilimumab或CP-675,206)一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合针对B7-H3(也称作CD276)的拮抗剂(例如，阻断性抗体)一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合MGA271一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合针对TGFβ的拮抗剂(例如，美替木单抗(metelimumab)(也称作CAT-192)、fresolimumab(也称作GC1008)或LY2157299)一起施用。
在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合包含过继转移表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞(例如，细胞毒T细胞或CTL)的治疗一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合UCART19一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合WT128z一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合KTE-C19(Kite)一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合CTL019(Novartis)一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合包括过继转移T细胞的治疗一起施用，所述的T细胞包含显性阴性TGFβ受体，例如，显性阴性TGFβII型受体。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合包括HERCREEM方案(参见，例如，ClinicalTrials.gov标示符NCT00889954)的治疗一起施用。
在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合针对CD19的拮抗剂一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合MOR00208一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合针对CD38的拮抗剂一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合达雷木单抗(daratumumab)一起施用。
在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合针对CD137(也称作TNFRSF9、4-1BB或ILA)的激动剂(例如，活化性抗体)一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合urelumab(也称作BMS-663513)一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合针对CD40的激动剂(例如，活化性抗体)一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合CP-870893一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合针对OX40(也称作CD134)的激动剂(例如，活化性抗体)一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合不同的抗OX40抗体(例如，AgonOX)一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合针对CD27的激动剂(例如，活化性抗体)一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合CDX-1127一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合针对吲哚胺-2,3-双加氧酶(IDO)的拮抗剂一起施用。在一些实施方案中，IDO拮抗剂是1-甲基-D-色氨酸(也称作1-D-MT)。
在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合针对CD137(也称作TNFRSF9、4-1BB或ILA)的激动剂(例如，活化性抗体)一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合urelumab(也称作BMS-663513)一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合针对CD40的激动剂(例如，活化性抗体)一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合CP-870893或RO7009789一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合针对OX40(也称作CD134)的激动剂(例如，活化性抗体)一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合针对CD27的激动剂(例如，活化性抗体)一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合CDX-1127(也称作varlilumab)一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合针对吲哚胺-2,3-双加氧酶(IDO)的拮抗剂一起施用。在一些实施方案中，IDO拮抗剂是1-甲基-D-色氨酸(也称作1-D-MT)。在一些实施方案中，IDO拮抗剂是WO2010/005958(所述文献的内容通过其中的记录明确地并入)中所示的IDO拮抗剂。在一些实施方案中，IDO拮抗剂是4-({2-[(苯基氨磺酰基)氨基]乙基}氨基)-N-(3-溴-4-氟苯基)-N’-羟基-1,2,5-噁二唑-3-甲脒(例如，如WO2010/005958的实施例23中所述)。在一些实施方案中，IDO拮抗剂是
在一些实施方案中，IDO拮抗剂是INCB24360。在一些实施方案中，IDO拮抗剂是Indoximod(1-甲基-色氨酸的D异构体)。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合抗体-药物缀合物一起施用。在一些实施方案中，抗体-药物缀合物包含美登素或单甲基澳瑞司他汀E(MMAE)。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合抗NaPi2b抗体-MMAE缀合物(也称作DNIB0600A、RG7599或利法珠单抗维多汀)一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合曲妥珠单抗emtansine(也称作T-DM1、ado-曲妥珠单抗emtansine或Genentech)一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合抗MUC16抗体-MMAE缀合物DMUC5754A一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合抗MUC16抗体-MMAE缀合物DMUC4064A一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合靶向内皮素B受体(EDNBR)的抗体-药物缀合物(例如，与MMAE缀合的针对EDNBR的抗体)一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合靶向淋巴细胞抗原6复合体基因座E(Ly6E)的抗体-药物缀合物(例如，与MMAE缀合的针对Ly6E的抗体(也称作DLYE5953A))一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合polatuzumab维多汀一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合靶向CD30的抗体-药物缀合物一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合ADCETRIS(也称作贝伦妥单抗维多汀(brentuximab vedotin))一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合polatuzumab维多汀一起施用。
在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合血管生成抑制剂一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合针对VEGF(例如，VEGF-A)的抗体一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合贝伐单抗(也称作Genentech)一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合针对血管生成素2(也称作Ang2)的抗体一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合MEDI3617一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合针对VEGFR2的抗体一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合礼来单抗(ramucirumab)一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合VEGF受体融合蛋白一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合阿柏西普(Aflibercept)一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合ziv-阿柏西普(Aflibercept)(也称作VEGF Trap或)一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合针对VEGF和Ang2的双特异性抗体一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合RG7221(也称作vanucizumab)一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合血管生成抑制剂并联合PD-1轴结合拮抗剂(例如，PD-1结合拮抗剂如抗PD-1抗体、PD-L1结合拮抗剂如抗PD-L1抗体和PD-L2结合拮抗剂如抗PD-L2抗体)一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合贝伐单抗和PD-1轴结合拮抗剂(例如，PD-1结合拮抗剂如抗PD-1抗体、PD-L1结合拮抗剂如抗PD-L1抗体和PD-L2结合拮抗剂如抗PD-L2抗体)一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合贝伐单抗和MDX-1106(纳武单抗(nivolumab)、OPDIVO)一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合贝伐单抗和Merck 3475(MK-3475、派姆单抗(pembrolizumab)、KEYTRUDA)一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合贝伐单抗和CT-011(Pidilizumab)一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合贝伐单抗和MEDI-0680(AMP-514)一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合贝伐单抗和PDR001一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合贝伐单抗和REGN2810一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合贝伐单抗和BGB-108一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合贝伐单抗和BGB-A317一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合贝伐单抗和YW243.55.S70一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合贝伐单抗和MPDL3280A一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合贝伐单抗和MEDI4736一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合贝伐单抗和MDX-1105一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合贝伐单抗和MSB0010718C(avelumab)一起施用。
在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合抗肿瘤剂一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合靶向CSF-1R(也称作M-CSFR或CD115)的药物一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合抗CSF-1R抗体(也称作IMC-CS4或LY3022855)施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合抗CSF-1R抗体RG7155(也称作RO5509554或emactuzumab)一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合干扰素例如干扰素α或干扰素γ一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合Roferon-A(也称作重组干扰素α-2a)一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合GM-CSF(也称作重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、rhu GM-CSF、沙格司亭或)一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合IL-2(也称作阿地白介素或一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合IL-12一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合IL27一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合IL-15一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合ALT-803一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合靶向CD20的抗体一起施用。在一些实施方案中，靶向CD20的抗体是阿托珠单抗(也称作GA101或)或利妥昔单抗。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合靶向GITR的抗体一起施用。在一些实施方案中，靶向GITR的抗体是TRX518。在一些实施方案中，靶向GITR的抗体是MK04166(Merck)。
在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合Bruton's酪氨酸激酶(BTK)的抑制剂一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合依鲁替尼一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合异柠檬酸脱氢酶1(IDH1)抑制剂和/或异柠檬酸脱氢酶2(IDH2)抑制剂一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合AG-120(Agios)一起施用。
在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合阿托珠单抗和PD-1轴结合拮抗剂(例如，PD-1结合拮抗剂如抗PD-1抗体、PD-L1结合拮抗剂如抗PD-L1抗体和PD-L2结合拮抗剂如抗PD-L2抗体)一起施用。
在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合癌疫苗一起施用。在一些实施方案中，癌疫苗是肽癌疫苗，所述肽癌疫苗在一些实施方案中是个性化肽疫苗。在一些实施方案中，肽癌疫苗是多价长肽、多重肽、肽混合物、杂合肽、或肽脉冲标记的树状细胞疫苗(参见，例如，Yamada等人,Cancer Sci,104:14-21,2013)。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合佐剂一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合包含TLR激动剂(例如，聚ICLC(也称作)、LPS、MPL或CpG ODN)的治疗一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合肿瘤坏死因子(TNF)α一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合IL-1一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合HMGB1一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合IL-10拮抗剂一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合IL-4拮抗剂一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合IL-13拮抗剂一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合IL-17拮抗剂一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合HVEM拮抗剂一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合ICOS激动剂(例如，通过施用ICOS-L)或针对ICOS的激动性抗体一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合靶向CX3CL1的治疗一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合靶向CXCL9的治疗一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合靶向CXCL10的治疗一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合靶向CCL5的治疗一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合LFA-1或ICAM1激动剂一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合选凝素激动剂一起施用。
在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合B-Raf的抑制剂一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合威罗菲尼(也称作)一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合达拉菲尼(也称作)一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合encorafenib(LGX818)一起施用。
在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合EGFR抑制剂一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合埃罗替尼(也称作)一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合EGFR-T790M的抑制剂一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合吉非替尼一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合阿法替尼一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合西妥昔单抗(也称作)一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合帕尼单抗(也称作)一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合诺司替尼(rociletinib)一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合AZD9291一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合MEK，如MEK1(也称作MAP2K1)和/或MEK2(也称作MAP2K2))的抑制剂一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合卡比替尼(也称作GDC-0973或XL-518)一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合曲美替尼(也称作)一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合binimetinib一起施用。
在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合B-Raf的抑制剂(例如，威罗菲尼或达拉菲尼)和MEK(例如，MEK1和/或MEK2)的抑制剂(例如，卡比替尼或曲美替尼)一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合ERK(例如，ERK1/2)的抑制剂一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合GDC-0994一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合B-Raf的抑制剂、MEK的抑制剂和ERK1/2的抑制剂一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合EGFR的抑制剂、MEK的抑制剂和ERK1/2的抑制剂一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合一种或多种MAP激酶途径抑制剂一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合CK127一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合K-Ras的抑制剂一起施用。
在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合c-Met的抑制剂一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合onartuzumab(也称作MetMAb)一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合间变性淋巴瘤激酶(ALK)的抑制剂一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合AF802(也称作CH5424802或艾乐替尼)一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合克唑替尼一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合色瑞替尼一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)的抑制剂一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合buparlisib(BKM-120)一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合pictilisib(也称作GDC-0941)一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合buparlisib(也称作BKM-120)一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合哌立福辛(也称作KRX-0401)一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)的δ-选择性抑制剂一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合idelalisib(也称作GS-1101或CAL-101)一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合taselisib(也称作GDC-0032)一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合BYL-719一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合Akt的抑制剂一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合MK2206一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合GSK690693一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合ipatasertib(也称作GDC-0068)一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合mTOR的抑制剂一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合西罗莫司(sirolimus)(也称作雷帕霉素)一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合坦罗莫司(也称作CCI-779或)一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合依维莫司(也称作RAD001)一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合地磷莫司(也称作AP-23573、MK-8669或deforolimus)一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合OSI-027一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合AZD8055一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合INK128一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合PI3K/mTOR双重抑制剂一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合XL765一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合GDC-0980一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合BEZ235(也称作NVP-BEZ235)一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合BGT226一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合GSK2126458一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合PF-04691502一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合PF-05212384(也称作PKI-587)一起施用。
在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合选择性降解***受体的药物一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合GDC-0927一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合HER3的抑制剂一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合duligotuzumab一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合LSD1的抑制剂一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合MDM2的抑制剂一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合BCL2的抑制剂一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合venetoclax一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合CHK1的抑制剂一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合GDC-0575一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合激活的hedgehog信号传导途径的抑制剂一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合ERIVEDGE一起施用。
在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合放射治疗一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合吉西他滨一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合nab-紫杉醇(ABRAXANE)一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合曲妥珠单抗一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合TVEC一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合IL27一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合环磷酰胺一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合募集T细胞至肿瘤的药剂一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合lirilumab(IPH2102/BMS-986015)一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合Idelalisib一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合靶向CD3和CD20的抗体一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合REGN1979一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合靶向CD3和CD19的抗体一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合兰妥莫单抗(blinatumomab)一起施用。
在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合溶瘤性病毒一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合卡铂和nab-紫杉醇一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合卡铂和紫杉醇一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合顺铂和培美曲塞一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合顺铂和吉西他滨一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合FOLFOX一起施用。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体可以联合FOLFIRI一起施用。
上文记录的此类组合疗法涵盖组合施用(其中两种或更多种治疗剂包含在同一配制剂或分开的配制剂中)，和分开施用，在该情况中，可以在施用别的治疗剂和/或佐剂之前，同时，和/或之后发生本文所述的抗原结合多肽(例如，抗体)或复合体的施用。也可以与放射疗法组合使用本发明抗体或复合体。
可以通过任何合适的手段(包括胃肠外，肺内，和鼻内，及若期望用于局部治疗的话，损伤内施用)来施用本发明抗体或复合体(和任何别的治疗剂)。胃肠外输注包括肌肉内，静脉内，动脉内，腹膜内，或皮下施用。部分根据施用是短暂的还是长期的，剂量给药可以通过任何合适的路径(例如通过注射，诸如静脉内或皮下注射)来进行。本文中涵盖各种剂量给药日程表，包括但不限于单次施用或在多个时间点里的多次施用，推注施用，和脉冲输注。
本发明抗体或复合体会以一种符合优秀的医学实践的方式配制，定剂量和施用。在此背景中考虑的因素包括所治疗的特定病症，所治疗的特定哺乳动物，患者个体的临床状况，病症的起因，药剂投递部位，施用方法，施用日程表及医学从业人员知道的其它因素。抗体或复合体无需但任选与一种或多种目前用于预防或治疗所讨论病症的药剂一起配制。此类其它药物的有效量取决于配制剂中存在的抗体的量，病症或治疗的类型，及上文所述其它因素。这些通常以本文所述相同的剂量和施用途径使用，或以约1-99％的本文所述剂量使用，或以凭经验/临床上确定为适宜的任何剂量和任何途径使用。
为了预防或治疗疾病，本发明抗体或复合体(当单独或与一种或多种其它别的治疗剂组合使用时)的适宜剂量会取决于要治疗的疾病的类型，抗体的类型，疾病的严重性和病程，施用抗体是预防还是治疗目的，之前的疗法，患者的临床史和对抗体的响应，及主治医师的斟酌。抗体或复合体适合于在一次或一系列的治疗中施用于患者。根据疾病的类型和严重性，约1μg/kg至40mg/kg的抗体或复合体可以作为初始候选剂量施用于患者，无论是例如通过一次或多次分开的施用或者是通过连续输注。根据上文所述因素，一种典型的日剂量可以在约1μg/kg至100mg/kg或更多的范围中。对于几天或更长时间上的重复施用，根据状况，治疗通常会持续直至疾病症状发生期望的阻抑。此类剂量可间歇施用，例如每周或每三周(例如使得患者接受约2至约20剂，或例如约6剂抗体)。可以施用较高的初始加载剂，接着是较低的一或多剂。然而，其它剂量方案可能是有用的。此疗法的进展易于通过常规技术和测定法来监测。
Tie2激动剂的用途
在某些实施方案中，本申请提供用于治疗或预防哺乳动物中疾病或病症的方法，所述方法包括向哺乳动物施用治疗有效量的与Tie2结合的激动剂抗原结合复合体。在某些实施方案中，如本文所述的Tie2激动剂可以用来刺激血管生成，并且可以在其中需要促进血管生成的多种临床场景下使用。这类适应症的非限制性实例包括再生性组织的血管化、缺血性肢体病、脑缺血、血管炎症疾病(包括动脉硬化)、缺血性坏死、刺激毛发生长和***功能障碍。在某些实施方案中，如本文所述的Tie2激动剂可以用于降低血管通透性，例如，在泄漏性血管部位。这种方法可以用于多种临床场景，其非限制性例子包括中风、黄斑变性、黄斑水肿、淋巴水肿、血-视网膜屏障破坏、血-脑屏障破坏(例如，在化疗治疗期间)和肿瘤血管***归一化以促进药物输送并增加辐射敏感性。在某些实施方案中，如本文所述的Tie2激动剂可以用来抑制内皮细胞凋亡。这种方法可以用于多种临床场景，其非限制性例子包括肾纤维化、中风、黄斑变性和(例如，肾、眼、皮肤和/或肢体中的)糖尿病并发症。在其他实施方案中，如本文所述的Tie2激动剂可以用于刺激伤口愈合。
筛选测定法
本文中还提供用于鉴定具有激动剂活性的多肽的方法。特别地，抗原结合多肽可以在作为独立多肽(例如，独立抗体、抗体片段、配体、等)表达时没有激动剂活性，然而，当同一种多肽在如本文所述的多聚体复合体背景下呈现时，该复合体可以显示出激动剂活性。因此，通过筛选各个多肽的激动剂活性，可能存在作为假阴性弃去的众多候选物，例如，具有下述能力的多肽：在复合体中包含时充当激动剂，但是以分离的形式呈现时不显示这种活性。因此，如本文所述的抗原结合复合体可以用于初始筛选候选多肽以鉴定具有激动剂活性的那些。
因此，在某些实施方案中，本申请提供用于鉴定具有激动剂活性的抗原结合多肽(或抗原结合复合体)的新方法。该方法包括提供多种如本文所述的抗原结合复合体，针对细胞表面受体筛选抗原结合复合体并且选择对细胞表面受体具有激动剂活性的抗原结合复合体。在某些实施方案中，抗原结合复合体可以作为其氨基酸序列彼此不同的抗原结合复合体的文库提供。这类文库提供了非常有用的资源供鉴定与细胞表面受体结合并且对细胞表面受体具有激动剂活性的抗原结合复合体。
在某些实施方案中，可用于这种筛选测定法中的抗原结合复合体可以是这样的文库，其中每种抗原结合复合体包含单特异性双价抗体的六聚体，其中所给定复合体内的每种抗体是相同的并且每种六聚体复合体含有与相同靶结合的不同抗体，例如，基本上针对给定细胞表面靶产生的单特异性抗体的六聚体复合体文库。这类文库将例如可用于鉴定与细胞表面受体结合并激动该受体的抗体(或抗原结合复合体)。
在某些实施方案中，可用于这种筛选测定法中的抗原结合复合体可以是这样的文库，其中每种抗原结合复合体包含双价抗体的六聚体，其中每种复合体包含至少两种与二种不同靶结合的不同抗体并且每种复合体含有与相同两个靶结合的不同抗体。例如，这种文库可能含有与细胞表面受体1结合的抗体的混合物和与细胞表面受体2结合的抗体的混合物。筛选这种类型的文库将例如可用于鉴定抗体的组合，其将激动异二聚体细胞表面受体并且可告知将激动受体对的双特异性抗体的形成。
在其他实施方案中，本申请提供一种用于增加抗原结合多肽的激动剂活性的方法。在某些实施方案中，该方法包括提供抗原结合多肽，所述抗原结合多肽包含针对细胞表面受体的抗原结合区和Fc区，并且向Fc区引入修饰，其中修饰增强抗原结合多肽的复合体形成(例如，包括六聚体形成)，并且其中如与复合体的单个亚基相比，复合体具有增加的针对抗原结合多肽结合的细胞表面受体的激动剂活性。
可以通过本领域已知的各种测定法，对本文所述的抗原结合复合体或抗原结合多肽表征其物理/化学特性和生物学功能。例如，作为本文中例举，可以例如使用大小排阻色谱(SEC)监测单体和多聚体(例如，六聚体)复合体的差异性保留时间，测定六聚体形成。
在一些实施方案中，本公开的包含抗原结合多肽的组合物可以包含单体形式和多聚体(例如，六聚体)形式的抗原结合多肽。如本文所述，某些修饰的抗原结合多肽可以在溶液中包含某个百分数的多聚体种类(例如，六聚体)。但是，如本文中例举，某些修饰的抗原结合多肽可以在FcR介导的交联不存在情况下，促进强烈的T细胞增殖(例如，如与对照如无修饰的抗原结合多肽相比，更强烈的增殖应答)，即便在溶液中形成主要的或排他性单体种类。
在某些实施方案中，抗原结合复合体或抗原结合多肽可以通过一系列测定法表征，所述测定法包括但不限于N端测序、氨基酸分析、非变性大小排阻高压液相色谱(HPLC)、质谱法、离子交换色谱和木瓜蛋白酶消化。
在某些实施方案中，可以分析抗原结合复合体或抗原结合多肽的生物学活性，例如，抗原结合活性。抗原结合测定法是本领域已知的并且可以在本发明中使用，例如包括，使用多项技术如蛋白质印迹、放射免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、“夹心”免疫测定、免疫沉淀测定、荧光免疫测定和蛋白A免疫测定的任何直接或竞争性结合测定法。
在其他实施方案中，可以分析本文所述的抗原结合复合体或抗原结合多肽的激动剂活性。在某些实施方案中，可以通过以下方式确定本文所述的抗原结合复合体或抗原结合多肽的激动剂活性：分析如与添加配体时相比时，依赖于配体而生长的细胞是否将在细胞培养期间添加抗原结合复合体或多肽时以相同方式生长。如果细胞以相同或相似方式生长，则确定抗原结合复合体或多肽具有激动活性。在某些实施方案中，可以通过以下方式确定本文所述的抗原结合复合体或抗原结合多肽的激动剂活性：分析如与添加配体时相比时，具有内在配体依赖性活性(不限于生长)的细胞系是否将在细胞培养期间添加抗原结合复合体或多肽时显示相同反应。如果细胞系对配体显示相同或相似的反应，则确定抗原结合复合体或多肽具有激动活性。
在某些实施方案中，能够转导上文提到的细胞生长信号的细胞在细胞表面上表达响应于该配体的受体。当配体(或激动剂抗原结合复合体或多肽)与受体结合时，这些细胞转换细胞生长信号。在某些实施方案中，当配体与细胞上的细胞表面受体结合时，可用于筛选激动剂活性的细胞扩散或转导信号。在其他实施方案中，当细胞表面受体是不转导信号进入细胞的受体时，则通过非转导性受体的胞外结构域(例如，配体结合结构域)与转导信号进入细胞的受体的胞内结构域融合，产生嵌合受体。适于通过与配体结合性受体融合而构建嵌合受体的受体包括任何转导信号的受体，例如包括G-CSF受体、mpl、neu、GM-CSF受体、EPO受体、c-Kit和FLT-3受体。用来表达这类受体的细胞例如包括BaF3、NFS60、FDCP-1、FDCP-2、CTLL-2、DA-1和KT-3。
在某些实施方案中，激动活性涉及由配体(或抗原结合复合体或多肽)结合过程引起的任何活性，所述活性在细胞中诱导特定反应(如，例如，通过传输信号进入细胞诱导某些生理活性的变化)。这类生理活性例如包括生长活性、生长诱导活性、生存活性、分化活性、分化诱导活性、转录活性、膜转运活性、结合活性、蛋白酶解活性、磷酸化/去磷酸化活性、氧化-还原活性、转移活性、溶核活性、脱水活性、细胞死亡诱导活性和凋亡诱导活性。
可以通过本领域技术人员已知的方法确定本文所述的激动活性。例如，可以通过使用细胞生长作为指标的方法评价激动活性。更具体地，将待确定其激动活性的抗原结合复合体或多肽添加至显示激动剂依赖性生长的细胞并且将细胞培养。接着，添加取决于活细胞计数在特定波长显示颜色反应的试剂如WST-8并且测量吸光度。可以使用测量的吸光度作为指标确定激动活性。
在某些实施方案中，使用暴露于配体(或抗原结合复合体或多肽)时可以监测细胞的定量和/或定性变化的指标，确定激动剂活性。例如，可以使用无细胞的分析指标、基于细胞的分析指标、基于组织的分析指标和体内分析指标。可以在无细胞的测定法中使用的指标包括酶促反应、蛋白质、DNAs或RNA的定量和/或定性变化。这类酶促反应例如包括氨基酸转移、糖转移、脱水、脱氢和底物切割。备选地，可以使用蛋白质磷酸化、去磷酸化、二聚化、多聚化、水解和解离；DNA或RNA扩增、裂解和延长作为无细胞的测定法中的指标。例如，信号转导途径下游的蛋白质磷酸化可以用作检测指标。可以使用细胞表型的改变，例如，产物的定量和/或定性改变、生长活性改变、细胞数目改变、形态学改变或细胞特性改变，作为基于细胞的测定法中的指标。例如，产物包括分泌性蛋白、表面抗原、胞内蛋白和mRNA。形态学改变例如包括树突形成和/或树突数目的改变、细胞平整性的改变、细胞伸长/轴比的改变、细胞大小的改变、细胞群体的胞内结构、异质性/均匀性改变和细胞密度的改变。可以在显微镜下观察到这类形态学改变。待作为指标使用的细胞特性包括锚依赖性、细胞因子依赖性反应、激素依赖性、耐药性、细胞运动性、细胞移行活性、脉动活性和胞内物质的改变。细胞运动性包括细胞浸润活性和细胞移行活性。胞内物质的改变例如包括酶活性、mRNA水平、胞内信号传导分子(如Ca2+和cAMP)水平和胞内蛋白水平的改变。当使用细胞膜受体时，以使用受体刺激诱导的细胞增殖活性改变作为指标。在基于组织的测定法中待使用的指标包括对主题组织而言充分的功能性改变。在体内测定法中，组织重量的改变、血液***的改变(例如，血细胞计数、蛋白质含量或酶活性的改变)、电解质水平的改变和循环***的改变(例如，血压或心率的改变)。
用于测量这类检测指标的任何合适方法可以联合本文所述的方法使用。例如，可以使用吸光度、发光、显色、荧光、放射性、荧光偏振、表面等离子体共振信号、时间解析荧光、质量、吸收光谱、光散射和荧光共振能量转移。这些测量方法是本领域技术人员已知的并且可以根据目的适当地选择。例如，可以通过使用常规光度计、平板读数仪或这类仪器获得吸收光谱；可以用光度计或这类仪器测量发光；并且可以用荧光计或这类仪器测量荧光。可以用质谱仪确定质量。根据辐射的类型，可以用装置如γ计数器确定放射性。可以用BEACON(TaKaRa)测量荧光偏振。可以用BIACORE获得表面等离子体共振信号。可以用ARVO或这类仪器测量时间解析荧光、荧光共振能量转移或这类指标。另外，流式细胞仪也可以用于测量。可以使用上述方法之一测量两个或更多个不同类型的检测指标。也可以通过同时和/或连续使用两种或更多种测量方法检查更多数目的检测指标。例如，可以用荧光计同时测量荧光和荧光共振能量转移。
OX40测定法
如上所述，本公开的某些方面涉及针对细胞表面受体的激动剂活性。如本领域技术人员将认识到，用来确定针对细胞表面受体的激动剂活性的具体测定法可以取决于具体的细胞表面受体。下文提供与确定OX40活性相关的示例性测定法。基于这种指导和本领域的共同知识，本领域技术人员可以适当地为本文所述的其他细胞表面受体确定测定法。
在一个方面，测定法是提供鉴定具有生物学活性的与OX40结合的激动剂抗原结合复合体。生物学活性可以例如包括结合OX40(例如，结合人和/或食蟹猴OX40)、增加OX40介导的信号转导(例如，增加NFkB介导的转录)、耗尽表达人OX40(例如，T细胞)的细胞、通过ADCC和/或吞噬耗尽表达人OX40的细胞、增强T效应细胞功能(例如，CD4+效应T细胞)，例如，通过增加效应T细胞增殖和/或增加效应T细胞产生细胞因子(例如，γ干扰素)、增强记忆T细胞功能(例如，CD4+记忆T细胞)，例如，通过增加记忆T细胞增殖和/或增加记忆T细胞产生细胞因子(例如，γ干扰素)、或抑制调节性T细胞功能(例如，通过减少Treg抑制效应T细胞功能(例如，CD4+效应T细胞功能)。在某些实施方案中，与OX40结合的激动剂抗原结合复合体在与人效应细胞不结合的情况下具有一种或多种所列出的生物学活性。在某些实施方案中，与OX40结合的激动剂抗原结合复合体具有一种或多种所列出的生物学活性并且与人效应细胞结合。还提供在体内和/或在体外具有这类生物学活性的抗体。
在某些实施方案中，对本发明的抗体测试这种生物学活性。
可以使用本领域已知的方法测定T细胞共刺激作用并且本文公开了示例性方法。例如，T细胞(例如，记忆或效应T细胞)可以从外周白细胞获得(例如，使用Ficoll梯度离心从人全血分离)。可以使用本领域已知的方法从PBMC分离记忆T细胞(例如，CD4+记忆T细胞)或效应T细胞(例如，CD4+Teff细胞)。例如，可以使用Miltenyi CD4+记忆T细胞分离试剂盒或MiltenyiCD4+T细胞分离试剂盒。将分离的T细胞在抗原呈递细胞(例如，照射的表达CD32和CD80的L细胞)存在下培养并且在与OX40结合的激动剂抗原结合复合体存在或不存在下通过添加抗CD3抗体来激活。可以使用本领域熟知的方法测量与OX40抗体结合的激动剂抗原结合复合体对T细胞增殖的影响。例如，可以使用CellTiter Glo试剂盒(Promega)并且在多标记读数仪(Perkin Elmer)上读取结果。也可以通过分析T细胞产生的细胞因子，测量与OX40抗体结合的激动剂抗原结合复合体对T细胞功能的影响。在一个实施方案中，例如，通过测量细胞培养上清液中的干扰素γ确定CD4+T细胞的干扰素γ产生。用于测量干扰素γ的方法是本领域熟知。
可以使用本领域已知的方法测定Treg细胞功能并且本文公开了示例性方法。在一个例子中，分析Treg抑制效应T细胞增殖的能力。使用本领域已知的方法(例如，分离记忆T细胞或初始T细胞)，从人全血分离T细胞。将纯化的CD4+初始T细胞(例如，用CFSE)标记并且将纯化的Treg细胞用不同试剂标记。将照射的抗原呈递细胞(例如，表达CD32和CD80的L细胞)与标记的纯化的初始CD4+T细胞和纯化的Treg共培养。使用抗CD3抗体激活共培养物并在与OX40结合的激动剂抗原结合复合体存在或不存在下测试之。在合适的时间(例如，6天共培养)后，使用FACS分析，在还原型标记物染色(例如，还原型CFSE标记物染色)中依据染料稀释度追踪CD4+初始T细胞增殖的水平。
可以使用本领域熟知的方法测定OX40信号传导并且本文公开了示例性方法。在一个实施方案中，生成表达人OX40和报道基因的转基因细胞，所述报道基因包含与报道基因(例如，β萤光素酶)融合的NFkB启动子。向细胞添加与OX40结合的激动剂抗原结合复合体导致NFkB转录增加，这使用针对报道基因的测定法检测。
可以例如通过使用单核细胞衍生的巨噬细胞或U937细胞(具有成熟巨噬细胞形态和特征的人组织细胞淋巴瘤细胞系)，测定吞噬作用。在与OX40结合的激动剂抗原结合复合体存在或不存在下，将表达OX40的细胞添加至单核细胞衍生的巨噬细胞或U937细胞。将细胞培养合适时间段后，通过以下方式确定吞噬百分数：检查对1)巨噬细胞或U937细胞的标志物和2)表达OX40的细胞的标志物双重染色的细胞的百分数，并且将该百分数除以显示表达OX40的细胞之标志物(例如，GFP)的细胞总数。可以通过流式细胞术进行分析。在另一个实施方案中，通过荧光显微术分析法进行分析。
用于前述任一体外测定法中的细胞包括天然表达OX40或已经过工程化以表达OX40的细胞或细胞系。这类细胞包括天然表达OX40的活化的T细胞、Treg细胞和活化的记忆T细胞。这类细胞还包括表达OX40的细胞系和正常情况下不表达OX40但是已经用编码OX40的核酸转染的细胞系。本文中提供用于前述任一体外测定法中的示例性细胞系包括表达人OX40的转基因BT474细胞(人乳腺癌细胞系)。
III.药物组合物
如本文所述的抗原结合复合体和多肽可以按照符合良好医学实践的方式配制、定剂量和施用。在这种情况下考虑的因素包括正在治疗的具体病症、正在治疗的具体哺乳动物、个体受试者的临床状况、病症原因、送递药物的部位、施用方法，施用计划和医疗执业者已知的其他因素。待施用的复合体或蛋白质的“治疗有效量”将由此类考虑事项决定，并且是为了防止、改善或治疗特定的病症(例如，癌症、过敏性或炎性疾病或自身免疫疾病)必需的最小量。在某些实施方案中，本文所述的复合体和蛋白质可以任选地与目前用来防止或治疗病症的一种或多种药物一起配制。这类其他药物的有效量取决于该制剂中存在的复合体或蛋白质的量、疾病的类型或治疗和上文讨论的其他因素。
使用本领域已知的标准方法，通过具有所需纯度的活性成分与任选的生理可接受载体、赋形剂或稳定剂混合，制备治疗性制剂(Remington's Pharmaceutical Sciences(第20版).A.Gennaro,2000,Lippincott,Williams&Wilkins,Philadelphia,PA)。可接受的载体包括盐水或缓冲剂如磷酸、柠檬酸和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮、氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他糖，包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂如EDTA；糖醇如甘露醇或山梨醇；成盐抗衡离子如钠；和/或非离子表面活性剂如TWEENTM、PLURONICSTM或PEG。
在某些实施方案中，制剂含有可药用盐、优选地氯化钠，并且优选地以约生理学浓度含有之。任选地，本发明的制剂可以含有可药用的防腐剂。在一些实施方案中，防腐剂浓度是从0.1至2.0％，一般按v/v计。合适的防腐剂包括制药领域已知的那些。苄醇、苯酚、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯和对羟苯甲酸丙酯是优选的防腐剂。任选地，本发明的制剂可以按0.005％至0.02％的浓度包含可药用的表面活性剂。
本文中的制剂也可以根据正在治疗的特定适应症需要而含有多于一种活性化合物，优选地是具有并未不利相互影响的互补活性的那些活性化合物。此类分子适当地以有效用于预期目的的量组合存在。
有效成分也可以包埋于例如分别通过凝聚技术或界面聚合制备的微胶囊(例如，羟甲基纤维素微胶囊或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、胶态药物递送***(例如，脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)或粗乳状液中。这类技术在上文Remington's Pharmaceutical Sciences中公开。
可以制备持续释放制品。持续释放制品的合适例子包括含有抗原结合复合体或抗原结合多肽的固态疏水性聚合物的半通透性基质，所述基质处于成型制品(例如，薄膜或微胶囊)形式。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如，聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)或聚(乙烯醇)、聚交酯(美国专利号3,773,919)、L-谷氨酸和γ-乙基-谷氨酸酯的共聚物、不可降解性乙烯-乙酸乙烯酯、可降解性乳酸-乙醇酸共聚物如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球体)和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。尽管聚合物如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸能够释放分子超过100日，但是某些水凝胶释放蛋白质持续较短的时间。当包封的抗原结合复合体或抗原结合多肽长时间留在体内时，它们可能因在37℃暴露于水分而变性或聚集，导致生物学活性丧失和免疫原性可能改变。可以根据所涉及的机制构思用于稳定的合理策略。例如，如果发现聚集机制是因巯基-二硫键互换所致的分子间S-S键，可以通过修饰硫氢基残基、从酸性溶液冻干、控制含湿量、使用适宜的添加物和开发特定聚合物母体组合物实现稳定作用。
本文所述的复合体或多肽可以根据已知的方法施用至人类受试者，如作为推注的静脉内施用或通过在一段时间范围内连续输注，通过肌内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、局部或吸入途径。如果广泛副作用或毒性与针对蛋白质识别的目标分子的拮抗作用相关，则可能特别需要局部施用。离体策略也可以用于治疗性应用。离体策略包括用编码本发明蛋白质或复合体的多核苷酸转染或转导从受试者获得的细胞。随后将转染或转导的细胞返回这位受试者。细胞可以是广泛类型细胞的任一种，包括而不限于造血细胞(例如，骨髓细胞、巨噬细胞、单核细胞、树突细胞、T细胞或B细胞)、成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞、角质形成细胞或肌细胞。
IV.制成品
本发明的另一个实施方案是制成品，其含有如本文所述的一种或多种抗原结合复合体或多肽和可用于治疗或诊断病症(例如，自身免疫疾病或癌症)的材料。该制成品包括容器和在该容器上或与之结合的标签或包装插页。合适的容器例如包括瓶、小药瓶、注射器等。容器可以从多种材料如玻璃或塑料中形成。该容器容纳了有效治疗所述病症的组合物并且可以具有无菌接入口(例如该容器可以是静脉内输液袋或是具有皮下注射针头可穿透的瓶塞的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是如本文所述的抗原结合复合体或多肽。标签或包装插页说明该组合物用于治疗特定的病状。该标签或包装插页会进一步包含用于施用该抗原结合复合体或多肽组合物至受试者的说明书。还构思了包含本文所述的组合疗法的制成品和药盒。
包装插页指治疗产品的商业包装中通常包含的说明书，所述说明书含有关于涉及使用此类治疗产品的适应症、用法、剂量、施用、禁忌症和/或警告的信息。
额外地，制成品还可以包含第二容器，所述容器包含可药用缓冲液，如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、Ringer溶液和葡萄糖溶液。它可以还包括从商业和用户观点考虑的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、滤器、针头和注射器。
认为前面的书面说明书足以使本领域技术人员实施本发明成为可能。以下的实施例仅出于说明目的而提供并且不意在以任何方式限制本发明的范围。实际上，除了本文显示和描述的那些修改之外，本发明的各种修改将因前面的描述而对本领域技术人员是显而易见的并且落于所附权利要求的范围内。
实施例
实施例1.变体六聚抗体的工程化和表征
在发现介导针对靶受体的激动剂活性的抗体方面，兴趣日益增长。激动剂抗体以产生信号传导的方式衔接受体，实际上起到代用配体的作用。对于某些靶，借助受体的二价衔接，抗体介导的激动作用是可能的，这利用了IgG的同型二聚体性质。但是一些受体***要求多价交联以引发活性，而将受体牵拉在一起成簇以激发最佳信号传导。对于这些受体，一般通过抗体Fc与Fc受体衔接令抗体体内交联成为可能(Wilson等人,2011,Cancer Cell19:101-13；Kim&Ashkenazi,2013,J Exp Med 210:1647-51；Stewart等人,2014Journalfor ImmunoTherapy of Cancer 2:1-10)。
我们探索抗体六聚化是否可能1)促进抗体激动剂活性和2)能够在效应子介导的交联不存在的情况下实现激动剂活性。最新工作已经提出，Fc间相互作用介导了天然人IgG抗体六聚化的布置(Diebolder等人,2014,Science 343:1260-1263；Davies et al,2014,Molecular Immunology 62:46-53)并且工程化的变体可以促进六聚体形成(Diebolder等人,2014,Science343:1260-1263；PCT/EP2012/063339)。在这项工作中，描述了三重置换变体，E345R/E430G/S440Y，本文中称作RGY，其在溶液中促进抗体六聚化。
将RGY置换工程化入抗OX40人源化抗体(hu1A7)的Fc区(SEQ ID NOS:56和57)。OX40是在T细胞表面上的TNFRSF，并且已经显示针对OX40的激动剂抗体以交联依赖性方式提供了类似于天然配体OX40L的共刺激活性(Voo等人,2013,J.Immunol,191:3641-50)。还将RGY置换工程化入抗Her2抗体曲妥珠单抗(本文中称作hu4D5或4D5)的Fc区中作为对比物。
使用标准分子生物学技术，在pRK哺乳动物表达载体(Eaton等人,1986,Biochemistry 25:8343-8347)中将RGY置换工程化入抗OX40hu1A7IgG1和抗Her2曲妥珠单抗IgG1的重链。将编码每种抗体的重链和轻链的pRK载体DNA共转染入HEK293细胞用于表达，并且使用蛋白A亲和色谱，从上清液纯化所得的蛋白质。将纯化的抗体在分析性大小排阻柱(SEC)上运行以表征其表观分子量。图1中显示数据。而IgG标准品在柱上按近似单体的保留时间(约150kDa)运行，hu1A7和hu4D5的RGY变体形式均展示出单体(约150kDa)种类和六聚体(约900kDa)种类之间的平衡，六聚体为优势群体。使用大小排阻色谱偶联多角度光散射(SEC-MALS)，获得了变体抗体大小的更精确量值。图2中显示的数据证实存在六聚体(865kDa)种类和更小的单体(157kDa)抗体群体。
构建了一系列变体以探索各个RGY置换对抗体六聚体形成的贡献。使用标准分子生物学方法在hu4D5的Fc区内构建单一和双重置换变体。将编码重链和轻链的pRK载体DNA共转染入HEK293细胞以表达，并且使用蛋白A亲和色谱，从上清液纯化所得的蛋白质。将纯化的抗体在分析性SEC上运行以表征其表观分子量。图3中显示的数据显示仅三重置换变体RGY(E345R/E430G/S440Y)导致可评估的六聚体形成。全部单一变体R(E345R)、G(E430G)和Y(S440Y)以及双重变体RG(E345R/E430G)、RY(E345R/S440Y)和GY(E430G/S440Y)均产生具有仅抗体单体保留时间的色谱峰。
实施例2.效应子衔接减弱的变异六聚抗体的工程化
对RGY变体的先前表征完全集中在六聚化在促进补体活性时的作用方面(Diebolder等人,2014,Science 343:1260-1263；PCT/EP2012/063339)。相反，当前工作探索了Fc工程化的六聚化增强抗体激动作用或可能能够在效应子介导的交联不存在的情况下实现受体激动活性的实用性。Fc受体衔接对体内抗体交联的依赖(一般称作“交联依赖性活性”)可能与所需的治疗效果事与愿违，原因是Fc受体或补体衔接可能导致被激动的相同靶细胞的效应子介导的耗尽。
已经描述了减少特性单克隆抗体的效应子功能的多种突变策略(Strohl,2009,Curr Opin in Biotech 20:685-691)。两种方法用来工程化效应子减弱形式的六聚抗体。首先，在无糖基化Fc区的背景下通过以下方式构建多个RGY置换：将这些置换与置换N297G组合，置换N297G在Fc区的297位置处移除保守的N-连接的糖基化。第二种方法将RGY置换与置换L234A、L235A和P329G组合(L234A/L235A/P329G三重变体被称作LALAPG)，先前已经显示这种组合减少与Fc受体和补体的结合(参见，例如，美国公开号2012/0251531)。使用诱变技术在hu4D5和hu1A7中构建变体，并且如上文所述表达和纯化抗体。将纯化的抗体在分析性SEC上运行以表征其表观分子量。图4中显示hu4D5的数据并且图5中显示hu1A7的数据。令人惊讶地，尽管RGY/LALAPG变体以可比于单一RGY的方式六聚化，RGY/N297G变体并不六聚化。尽管不希望受理论约束，这些数据表明糖基化对形成六聚体是重要的。这个结果与去糖基化人IgG4Fc的晶体结构中通过晶体堆积观测到的六聚体排列相反(Davies等人,2014,Molecular Immunology 62:46-53)。然而，RGY/LALAPG组合变体的结果首次展示了效应子减弱的六聚抗体的成功工程化。
实施例3.六聚抗OX40抗体的激动剂活性
OX40是小鼠肿瘤和人肿瘤中经历过抗原的效应T(Teff)细胞和调节T(Treg)细胞(包括浸润细胞)上表达的TNFRSF成员共刺激分子。已经显示激动剂抗体对OX40的激活通过增强Teff活化并抑制Treg介导的抑制作用而促进抗肿瘤免疫力(Voo等人,2013,J.Immunol,191:3641-50)。OX40是TNFRSF成员，并且已经展示借助抗OX40抗体的激动作用需要交联并且依赖于在体内与FcγRs的相互作用。
测试了变异抗OX40抗体激动OX40受体的能力。从血沉棕黄层分选CD4+记忆T细胞(CD4+CD45RO+)，并且使用表达CD80(B7-1)和CD32a(FcγRIIa)的L细胞作为替代抗原呈递细胞(APC)。将CD4+记忆T细胞与L细胞温育，用可溶性抗CD3抗体(小鼠抗人CD3克隆SP34)及渐增浓度的作为对照的抗OX40抗体或抗Her2抗体刺激。将细胞培养7天，收获并通过celltiter glow(Promega)分析T细胞增殖及通过ELISA分析细胞因子释放。
图6中显示T细胞增殖数据。相对于天然IgG1，hu1A7抗OX40抗体的六聚体RGY变体提供了增强水平的T细胞共刺激。抗Her2抗体，无论RGY或天然IgG1，均未显示活性。通过测量IL-13和IL-5的释放观测到T细胞活化的更明显水平的增强(图7)。
因为这个实验中两种抗OX40抗体均具有未受损的Fc受体衔接，图6和图7中的数据显示，六聚抗体可以在FcγR介导的交联(由L细胞上的FcγRIIa提供)存在下增强T细胞活化及增殖。在相同的测定法中测试通过LALAPG置换工程化的效应子减弱的抗体。图8显示这个实验的T细胞增殖和细胞因子释放数据。与hu1A7天然IgG1相反，效应子减弱的变体(LALAPG)未提供T细胞增殖或细胞因子释放的共刺激作用。这与显示交联为抗OX40抗体活性所必需的先前工作一致(Voo等人,2013,J.Immunol,191:3641-50)。惊人地，效应子减弱的六聚体hu1A7(RGY LALAPG)介导了强力共刺激活性，如通过T细胞增殖和细胞因子释放所监测。六聚体RGY LALAPG的活性可比于或略小于单一的六聚体RGY且大于天然IgG1hu1A7。这些结果显示，针对高级寡聚体结构工程化抗OX40抗体可以在不依赖借助Fc受体衔接的交联情况下能够实现OX40激动剂活性。因为RGY变体抗体似乎存在单体种类和六聚体种类之间的平衡，我们研究了不同RGY变体将会彼此交换的可能性。将hu1A7_hIgG1(RGY)、hu4D5_hIgG1(RGY)和对照抗体按1:1比率混合并在4℃温育数日。将Ni-NTA HisSorb strips用1ug/ml人his-OX40抗原包被。洗涤后，添加不同浓度的混合抗体。洗涤后，添加1ug/ml生物素化的-Her2-ECD，添加HRP-链霉亲和素并且用Envision平板读数仪读取平板。结果(图9)显示，RGY抗体选择性地彼此交换以形成具有双重特异性的混合型六聚体。构思了这种交换平衡可以用来产生具有双重或更多特异性的六聚体复合体。例如，可以生成靶向两种不同抗原或相同抗原内部二个不同表位的混合型六聚体。
实施例4.六聚体抗OX40抗体的体内抗肿瘤活性
希望在体内测试六聚体抗OX40抗体的活性，我们首先测试RGY六聚体抗体复合体是否将受血清竞争。结果显示，RGY六聚体复合体未受10mg/ml重组IgG或人牛血清竞争(数据未显示)。使用分析性SEC，我们还展示RGY变体未使小鼠IgG2a六聚化(数据未显示)。因此，我们将RGY变体工程化成包含大鼠抗小鼠OX40(mOX40)可变区(在本文中称作2D2)和天然或变异人Ckappa和人IgG1(hIgG1)恒定区的嵌合抗体。分析性SEC数据证实，全部RGY变体和RGY/LALAPG变体均在溶液中形成六聚体(数据未显示)。
在Balb/c小鼠的同基因EMT6/Luc乳腺癌模型中测试六聚体变体抗体的抗肿瘤活性。将小鼠用100微升HBSS+matrigel中10万个EMT6/Luc细胞接种至第4乳腺脂肪垫。允许小鼠生长肿瘤直至它们实现平均肿瘤体积约150mm3(接种后约7天)。在此时(第0日)，将小鼠招募入以下组：1.抗gD_hIgG1；2.抗gD_hIgG1(RGY)；3.抗gD_hIgG1(RGY/LALAPG)；4.抗mOX40_hIgG1；5.抗mOX40_hIgG1(RGY)；6.抗mOX40_hIgG1(LALAPG)；7.抗mOX40_hIgG1(RGY/LALAPG)。全部组n＝10。抗gD与单纯疱疹病毒的糖蛋白D结合并充当阴性对照。将抗体稀释于无菌PBS中并且剂量体积是100ul。全部组均在第0日静脉内给予单次10mg/kg剂量。给药后24小时和给药后13天从5只小鼠/组/时间点采集血液。在各时间点之间轮替各眼。给药后6天从其他5只小鼠/组采集血液。在异氟烷诱导的麻醉(吸入到起效)下通过眼窝采血(采集体积不超过100ul)采集血液。从血液收获血清供PK分析。每周2次收集量值和体重。显示体重减轻>15％的动物每日称重，并且如果它们丧失>20％体重，使其安乐死。更频繁地(直至每日，取决于严重程度)观测显示不良临床问题的动物，并且若濒死，则使其安乐死。如果肿瘤体积超过3,000mm3或3个月后如果肿瘤未形成，使小鼠安乐死。每周1次测量这些剩余的肿瘤并称重。对于8周后存在的任何巨大或侵入性生长的肿瘤，每周2次收集这些特定小鼠的量值和体重。在整个整个研究期间，每周2次对全部小鼠进行临床观察。
使用标准ELISA，以绵羊抗人IgG抗体捕获并以山羊抗人IgG-HRP检测，测试抗体的药代动力学。图10中显示药代动力学数据。结果显示，RGY和RGY/LALAPG变体清除比天然的人IgG1抗体快得多。
图11中显示肿瘤体积数据。尽管其清除快速，RGY变体抗体仍相对于其亲本抗体增强抗肿瘤活性。相对于天然hIgG1，hIgG1(RGY)变体增强肿瘤杀伤作用。另外，相对于不显示抗肿瘤活性的hIgG1(LALAPG)，hIgG1(RGY/LALAPG)变体提供某种抗肿瘤活性。这些结果显示，六聚体抗体可以在Fc受体介导的交联不存在的情况下促进OX40受体的激动剂活性。
实施例5.非溶液六聚体变体
我们假设，RGY变体体内快速清除归因于其大小并且因此其行为类似于抗体免疫复合物。我们探索了RGY变体的各个置换组分是否可能提供更有利的溶液特性，然而仍能够实现增强和/或Fc独立的交联。在天然hIgG1和LALAPG hIgG1二者的背景下，在如上文所述的抗hOX40抗体hu1A7中构建并产生单一和双重置换变体。此外，还在相对于hu1A7而言靶向人OX40上单独表位的不同抗体hu3C8中构建并产生变体。BIAcore数据(未显示)显示，这些抗体的结合亲和力相似。hu1A7KD＝0.5nM，而hu3C8KD＝1.4nm。将纯化的抗体在分析性SEC上运行以表征其表观分子量。图12中显示的数据证实了使用hu4D5抗体(图3)的先前数据，即仅三重置换变体RGY(E345R/E430G/S440Y)导致可评估的六聚体形成。全部单一变体R(E345R)、G(E430G)和Y(S440Y)以及双重变体RG(E345R/E430G)、RY(E345R/S440Y)和GY(E430G/S440Y)均产生具有仅抗体单体保留时间的色谱峰。观测到hu3C8抗hOX40抗体的类似结果(数据未显示)。
在上文描述的体外人原代T细胞测定法中测试单一和双重变异hIgG1(LALAPG)抗体的T细胞活化活性。图13中显示T细胞增殖数据。结果显示，尽管在溶液中仅形成单体种类，三种双重变体(RG、RY和GY)和单一R变体在FcR介导的交联不存在的情况下引发了强烈的T细胞增殖。还测试了G变体和Y变体，但是它们未显示活性增强(数据未显示)。在hu1A7和hu3C8抗体的背景下均观察到FcR独立的活性，这表明人OX40上的至少两个独立表位可以由这些抗体靶向以促进T细胞活化。这个测定法中的阴性对照Ab是抗Her2曲妥珠单抗hIgG1(RGY/LALAPG)。
如上文所述，在Balb/c小鼠的同基因EMT6/Luc乳腺癌模型中测试变体抗体的抗肿瘤活性。各组为：1.抗gD_hIgG1；2.抗mOX40_hIgG1(LALAPG)；3.抗mOX40_hIgG1(RG/LALAPG)；4.抗mOX40_hIgG1(RY/LALAPG)；5.抗mOX40_hIgG1(GY/LALAPG)；6.抗mOX40_hIgG1(R/LALAPG)；7.抗mOX40_hIgG1(RG)；8.抗mOX40_hIgG1(RGY/LALAPG)。全部组n＝10只小鼠。全部组均一周两次给药10mg/kg，在第1日静脉内给药并且此后腹膜内给药。将抗体稀释于无菌PBS中并且给药体积是100-200ul/小鼠。首次给药后24小时和首次给药后14天(研究的第2日和第15日)从5只小鼠/组/时间点采集血液。从血液收获血清供PK分析并且如上文所述获得肿瘤量值。
图14中显示肿瘤体积数据。RY LALAPG变体和RG LALAPG变体显示某种抗肿瘤活性，而其他双重变体和单一变体(GY LALAPG和R LALAPG)则否。值得注意地，不包含LALAPG变体并且因此仍可以衔接Fc受体的RG的hIgG1形式显示强烈活性。这些数据表明，hIgG1RY变体应当具有甚至更大的抗肿瘤效力。总之，体外和体内数据显示，在FcR介导的交联不存在的情况下，溶液六聚体的形成不是增强的T细胞活化必需的。不希望受理论约束，假设作为溶液中单体IgG种类表现的单一变体和双重变体在衔接靶受体时形成六聚体复合体。
实施例6.六聚体抗体的交换和混合型和双表位六聚体抗体的概念
上文描述的交换实验(图9)提出混合型六聚体复合体可以从两种或更多种不同的抗体产生。为了检验这对抗OX40激动剂活性的影响，对h1A7和h3C8的RY LALAPG变体单独或作为混合物测试T细胞活化活性。图15显示来自这个实验的T细胞增殖和细胞因子释放数据。结果显示，混合的h1A7/h3C8RY LALAPG变体抗体相对于单独的任一抗体增强活性。这些数据表明，混合型六聚体复合体在OX40受体衔接时形成，因此在FcR介导的交联不存在的情况下提供多价激动作用和T细胞活化。本文中构思，可以将六聚体变体工程化成双特异性抗体以利用这种表位协同作用。例如，如本领域已知(例如，Spiess等人,NatureBiotechnology)，双特异性抗体可以工程化，其中一条臂是h1A7并且另一条臂是包含RY、RG、RGY的h3C8或其他促进六聚体的变体。
实施例7.六聚体变异抗DR5抗体的激动剂活性
死亡受体5(DR5)，又称作TNF相关的凋亡诱导配体受体2(TRAIL-R2)，是由其配体TNF相关的凋亡诱导配体(TNFSF10/TRAIL/APO-2L)结合并激活时转导凋亡信号的细胞表面受体。DR5已经成为癌疗法的有前景靶，因为它通过独立于p53的细胞外在途径启动凋亡并且相对于正常细胞对肿瘤细胞具有选择性。已经充分确立DR5的抗体激动剂依赖FcR介导的交联(Wilson等人,2011,Cancer Cell19:101-13)。
在包含Apomab的(一种已经推进至临床开发的抗DR5抗体)可变区的hIgG1背景下构建了RGY变体和RGY/LALAPG变体(Camidge 2008,Expert Opin.Biol.Ther.8(8))。将编码重链和轻链的pRK载体DNA共转染入HEK293细胞用于表达。表达RGY变异Apomab抗体的细胞生长不良并产生很少量蛋白质。HEK293细胞表达DR5，并且因此有可能六聚体RGY抗体通过激动DR5促进凋亡。转染后使用细胞计数器测量细胞活力。图16中显示数据。结果证实，RGY和RGY/LALAPG变体抗体相对于hIgG1对照降低了细胞活力。
将单一和双重RGY变体额外地构建入抗DR5Apomab hIgG1抗体。将编码重链和轻链的DNA共转染入HEK293细胞，并且使用细胞滴度仪glo(Promega)监测细胞增殖。通过使用细胞滴度仪glo监测细胞增殖，测试变体抗体降低HEK293细胞活力的能力。图17中显示转染后24小时的发光。结果显示，全部变体均减少细胞增殖，其中RGY三重变体激发最大凋亡，三种双重变体GY、RY和RG介导略微较少的活性并且三种单一变体R、G和Y显示更适中水平的活性，R是三者中最强的抗DR5激动剂。
DR5和OX40均是TNFR超家族的成员。相对于未转染细胞的细胞活力倍数从图17中的数据计算并且作为h1A7抗OX40抗体针对相同的单一、双重和三重RGY变体的T细胞活化倍数的函数作图。图18中显示结果。抗DR5和抗OX40数据的相关性提示促进六聚体的变体的抗体介导的激动作用的可一般化的机制。构思应用这些变体以增强靶向TNFR超家族其他成员(尤其包括GITR、CD27和CD137)的抗体的激动剂活性。
实施例8.其他促进六聚体的变体的工程化
E345R、E430G和S440Y置换位于抗体重链恒定CH2结构域和CH3结构域之间的拐角区域处。在这个界面工程化一系列的额外置换以探索其他置换是否将促进六聚体形成并且能够实现增强的和/或FcR独立的激动剂活性。上文4表中列出这些置换。在抗DR5ApomabhIgG1抗体的重链中构建了变体。
在抗DR5Apomab hIgG1的抗增殖活性的背景下筛选变体。将Expi293F细胞培育直至细胞密度是约1.7x106个细胞/ml。将100μl Opti-MEM I减少血清培养基等分入24孔培养块的每个单孔，随后将1μg DNA/链等分入每种变体的单孔。使用2.7μl DNA-ExpiFectamine293试剂及50μl Opti-MEM I减少血清培养基配制主混合物溶液供每次转染，随后将其温和混合并且在室温温育5分钟。5分钟后，将稀释的ExpiFectamine 293试剂添加入稀释的DNA。允许混合物在室温温育20–30分钟。将2mL 293细胞添加至含DNA混合物的每个孔。将培养块覆以无菌透气密封器并将样品转移至37℃培养箱。在转染后22小时，取出300μl转染的细胞并与300μl Expi293表达培养基混合。用Vi-CELL XR Cell计数器(Beckman Coulter)测量细胞活力。图22A和图22B显示了相对于天然及变异Apomab抗体而言转染后48小时和22小时(分别)的细胞活力。
实施例9.六聚体抗Tie2抗体的激动剂活性
Tie2是在形成血管(血管生成)中发挥关键作用的细胞表面受体。Tie2由称作血管生成素(Ang1、g2、g3、g4)的蛋白质生长因子结合。Ang1和Ang4作为Tie2的激动性或激活性配体发挥功能，而Ang2和Ang3作为竞争性拮抗剂发挥功能。Ang1是多聚体配体，并且已知Tie2的交联是有效信号传导和激活需要的(Barton等人,2006,Nat Struct&Mol Biol)。
通过噬菌体展示产生一系列抗Tie2单克隆抗体。将人抗Tie2抗体之一亚克隆入编码人天然IgG1和RGY IgG1的恒定区。将编码每种抗体的重链和轻链的pRK载体DNA共转染入HEK293细胞用于表达，并且使用蛋白A亲和色谱，从上清液纯化所得的蛋白质。将纯化的抗体在分析性大小排阻柱(SEC)上运行以表征其表观分子量。图19中显示数据。与来自含有其他的人可变区的抗体的结果一致，Tie2RGY IgG1抗体形成六聚体。
通过使用商业均相时间解析荧光(HTRF)测定法(Cisbio)测量大鼠主动脉内皮细胞(RAECs)中AKT(pAKT)的磷酸化，测试Tie2RGY IgG1抗体的拮抗剂活性。RGY抗Tie2的激动剂活性超过天然配体Ang1(图20)，并且RGY抗Tie2相对于双价抗Tie2Ab显示强力的活性(图21)。
实施例10.补体和Fc受体结合作用对六聚体激动剂抗体活性的贡献
为了进一步研究Fc变体抗体的增强的激动剂活性的机制，将置换K322A与RGYLALAPG变体在hu1A7抗OX40抗体的背景下组合。K322A是消除与补体蛋白C1q的结合作用和补体依赖的细胞毒性(CDC)的置换。
通过ELISA结合测定法(Idusogie等人,2000,J Immunol164:4178-4184中所述的)评估变体与人C1q蛋白的结合。将高结合性Costar 96孔板(Corning,NY)在4℃用包被缓冲液(0.05M碳酸钠缓冲液，pH 9)中不同浓度的抗OX40抗体包被过夜。将平板在每个温育步骤后用PBS/0.05％Tween 20，pH 7.4洗涤，并且包被后温育在室温进行。在包被后，将平板用200μl ELISA稀释液(0.1M NaPO4/0.1M NaCl/0.1％明胶/0.05％Tween 20/0.05％ProClin300)封闭1小时，并且用ELISA稀释液中的100μl 2μg/ml人C1q(Abcam,ab96363)温育2小时。随后，添加ELISA稀释中的100μl 1:1000稀释度的绵羊抗人C1q过氧化物酶缀合抗体(Abcam ab46191)并温育1小时。平板用100μl TMB过氧化物酶底物(KPL50-65)显色。通过添加100μl 4.5N H2SO4终止反应，并且使用微量平板读数仪(Thermo LabsystemsMultiskan Ascent)在450nm测量OD。使用抗人IgG/Fc过氧化物酶缀合的抗体作为探针，检查每种变体对平板的结合效率(Jackson ImmunoResearch)。ELISA数据(图23)显示RGY变体相对于人IgG1提供对人C1q增强的结合，并且表明，LALAPG和LALAPG/K322A均消除RGY六聚体抗体与C1q的结合。
在Fc受体阻断抗体存在或不存在下使用上文描述的人原代T细胞测定法测试Fc变异抗OX40抗体活化T细胞的能力。如上文所述在按终浓度1μg/mL添加或不添加抗FcγRIIa抗体(R&D Systems，目录号AF1875)的情况下实施T细胞测定法。图24A和图24B中显示T细胞增殖数据。数据显示，尽管hu1A7抗OX40抗体的天然人IgG1形式在不存在Fc与L细胞上FcγRIIa(CD32a)的衔接的情况下没有活性，但是RGY和RY变体形式(RGY、RGY/LALAPG、RGY/LALAPG/K322A、RY和RY/LALAPG)均显示强活性，与Fc受体是否被阻断无关。连同图23中的C1q结合数据一起，结果显示，RGY变体和RY变体的激动剂活性不依赖于Fc与附属L细胞上的Fc受体或培养基中存在的C1q的衔接。
实施例11.进一步表征工程化的抗OX40激动剂抗体
迄今使用的T细胞测定法已经利用表达FcγRIIa(CD32a)和B7-1(CD80)的附属L细胞。测试人原代T细胞测定法中抗OX40激动剂活性对B7-1的依赖性。显示了在表达FcγRIIa和B7-1二者或仅表达FcγRIIa的L细胞存在下变体hu1A7(图25A和图25B)和变体hu3C8(图26A和图26B)的T细胞增殖数据。数据显示尽管天然人IgG1抗OX40抗体在B7-1共刺激作用不存在的情况下显示边际的T细胞活化作用，但Fc变体抗体(RGY和RGY/LALAPG)在不依赖B7配体对T细胞上的CD28共激活作用情况下显示强烈的T细胞活化作用。此外，数据还显示RGY变体抗体在CD3刺激不存在的情况下不活化T细胞。在这个测定法中，使用抗CD3抗体激活CD3，但是更广义地，这些结果表明，T细胞受体与载肽的MHC衔接将是变异抗OX40抗体共激活T细胞所必要的。
在FcγRIIa+L细胞(缺少B7-1表达)中测试一组三重(RGY)、双重(RG和RY)和单一(R)Fc变异抗OX40抗体。图27中所示的数据表明，在不存在T细胞上CD28的B7-1衔接的情况下，全部Fc变体抗体均共刺激T细胞，无论Fc变体是否在溶液中形成六聚体。
本文中引用的全部专利和科学文献的公开内容通过引用明确地完整并入。

Claims (164)

1.包含六个亚单位的具有激动剂活性的六聚抗原结合复合体，其中每个亚单位包含至少一条抗原结合多肽，所述抗原结合多肽包含至少一个针对细胞表面受体的抗原结合区和增强六聚体形成的修饰的Fc区，并且其中复合体具有针对所述复合体结合的细胞表面受体的激动剂活性。
2.根据权利要求1所述的复合体，其中每条抗原结合多肽与相同的细胞表面受体结合。
3.根据权利要求2所述的复合体，其中每条抗原结合多肽与相同细胞表面受体上的相同表位结合。
4.根据权利要求2所述的复合体，其中复合体包含与相同细胞表面受体上的不同表位结合的两条或更多条抗原结合多肽。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的复合体，其中细胞表面受体是选自肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族和G-蛋白偶联受体(GPCR)超家族的受体家族成员。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的复合体，其中细胞表面受体选自OX40、CD137和Tie2。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的复合体，其中抗原结合多肽包含抗体的抗原结合区。
8.根据权利要求7所述的复合体，其中抗体的抗原结合区选自Fv、Fab、Fab'、F(ab')2、单链抗体分子(例如，scFv)和抗体可变区。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的复合体，其中修饰的Fc区是修饰的人IgG1Fc区。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的复合体，其中Fc区还包含削弱C1q结合作用和/或补体依赖细胞毒性(CDC)的修饰。
11.根据权利要求10所述的复合体，其中削弱C1q结合作用和/或CDC的修饰包含人IgG1Fc区内的K322A氨基酸置换(EU编号)。
12.根据权利要求7-11中任一项所述的复合体，其中抗原结合区包含来自单特异性抗体、双特异性抗体或多特异性抗体的抗原结合区。
13.根据权利要求12所述的复合体，其中每个抗原结合区来自与相同细胞表面受体结合的单特异性抗体。
14.根据权利要求12所述的复合体，其中每个抗原结合区来自与OX40结合的单特异性抗体。
15.根据权利要求14所述的复合体，其中复合体包含至少一个亚单位，所述亚单位包含(a)VH结构域和/或(b)VL结构域，所述VH结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HVR-H2，(iii)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-H3；所述VL结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L2和(iii)包含选自SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HVR-L3。
16.根据权利要求15所述的复合体，其中六个亚单位各自包含(a)VH结构域和/或(b)VL结构域，所述VH结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQID NO:3的氨基酸序列的HVR-H2、(iii)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-H3；所述VL结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L2和(iii)包含选自SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HVR-L3。
17.根据权利要求14所述的复合体，其中复合体包含至少一个亚单位，所述亚单位包含(a)VH结构域和/或(b)VL结构域，所述VH结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HVR-H2和(iii)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HVR-H3；所述VL结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的HVR-L2和(iii)包含选自SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HVR-L3。
18.根据权利要求17所述的复合体，其中六个亚单位各自包含(a)VH结构域和/或(b)VL结构域，所述VH结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQID NO:30的氨基酸序列的HVR-H2和(iii)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HVR-H3；所述VL结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的HVR-L2和(iii)包含选自SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HVR-L3。
19.根据权利要求13-15和17中任一项所述的复合体，其中复合体包含与相同细胞表面受体上的不同表位结合的至少两种单特异性抗体的混合物。
20.根据权利要求19所述的复合体，其中复合体包含(a)结合OX40的第一表位的至少第一亚单位；和(b)结合OX40的第二表位的至少第二亚单位，其中OX40的第一表位与OX40的第二表位不同。
21.根据权利要求20所述的复合体，其中第一亚单位包含(a)VH结构域和/或(b)VL结构域，所述VH结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ IDNO:3的氨基酸序列的HVR-H2、(iii)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-H3；所述VL结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L2和(c)包含选自SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HVR-L3；并且
其中第二亚单位包含(a)VH结构域和/或(b)VL结构域，所述VH结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HVR-H2和(iii)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HVR-H3；所述VL结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的HVR-L2和(c)包含选自SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HVR-L3。
22.根据权利要求7-12中任一项所述的复合体，其中抗原结合区包含双特异性抗体的双臂，并且其中双特异性抗体的每条臂与相同细胞表面受体上的不同表位结合。
23.根据权利要求22所述的复合体，其中双特异性抗体包含(a)结合OX40的第一表位的至少第一臂和(b)结合OX40的第二表位的至少第二臂，其中OX40的第一表位与OX40的第二表位不同。
24.根据权利要求23所述的复合体，其中第一臂包含(a)VH结构域和/或(b)VL结构域，所述VH结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HVR-H2、(iii)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-H3；所述VL结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L2和(iii)包含选自SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HVR-L3；并且
其中第二臂包含(a)VH结构域和/或(b)VL结构域，所述VH结构域包含了(i)包含SEQ IDNO:29的氨基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HVR-H2和(iii)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HVR-H3；所述VL结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的HVR-L2和(iii)包含选自SEQ IDNO:42的氨基酸序列的HVR-L3。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的复合体，其中修饰的Fc区包含选自以下的一个或多个氨基酸修饰：
(i)P247A、P247C、P247D、P247F、P247G、P247H、P247I、P247K、P247L、P247M、P247N、P247R、P247S、P247T、P247V或P247W；
(ii)I253A、I253D、I253K、I253L、I253M、I253N、I253R、I253S、I253V、I253E、I253Q或I253T；
(iii)S254E、S254F、S254G、S254H、S254I、S254K、S254L、S254P、S254T、S254V或S254W；
(iv)H310A、H310G、H310F、H310K、H310L、H310P、H310R、H310T、H310V、H310W、H310N、H310Q或H310Y；
(v)Q311A、Q311C、Q311E、Q311G、Q311H、Q311F、Q311I、Q311K、Q311L、Q311N、Q311P、Q311R、Q311S、Q311T、Q311W或Q311Y；
(vi)E345A、E345C、E345D、E345G、E345H、E345F、E345I、E345K、E345L、E345M、E345N、E345P、E345Q、E345R、E345S、E345T、E345V、E345W或E345Y；
(vii)D/E356G、D/E356I、D/E356L、D/E356R、D/E356T或D/E356V；
(viii)T359G、T359N、T359P或T359R；
(ix)E382F、E382K、E382L、E382M、E382P、E382V、E382W、E382D、E382H、E382N、E382Q、E382S、E382T或E382Y；
(x)G385A、G385D、G385H、G385I、G385L、G385N、G385P、G385Q、G385R、G385S、G385T、G385V、G385E、G385K、G385W或G385Y；
(xi)Q386A、Q386C、Q386D、Q386E、Q386G、Q386H、Q386F、Q386I、Q386K、Q386L、Q386N、Q386P、Q386R、Q386S、Q386T、Q386V、Q386W或Q386Y；
(xii)E430A、E430C、E430D、E430F、E430G、E430H、E430I、E430K、E430L、E430M、E430N、E430P、E430Q、E430R、E430S、E430T、E430V、E430W或E430Y；
(xiii)H433R；
(xiv)N434D、N434E、N434G、N434K、N434R、N434S、N434V、N434W、N434H、N434Q、N434T或N434Y；
(xv)Y436I、Y436K、Y436L、Y436R、Y436S、Y436T、Y436V、Y436W、Y436A、Y436E、Y436F、Y436H、Y436M、Y436N或Y436Q；
(xvi)Q438C、Q438E、Q438I、Q438K、Q438L、Q438S、Q438T、Q438V、Q438W、Q438Y、Q438A、Q438G、Q438H、Q438N、Q438Q或Q438R；
(xvii)K439A、K439D、K439E、K439H、K439L、K439P、K439R、K439T、K439Y、K439Q或K439W；
(xviii)S440A、S440C、S440D、S440E、S440G、S440H、S440F、S440I、S440K、S440L、S440M、S440N、S440P、S440Q、S440R、S440T、S440V、S440W或S440Y；和
(xix)K447D、K447E、K447N、K447Q或K447缺失。
26.根据权利要求25所述的复合体，其中修饰的Fc区包含选自以下的一个或多个氨基酸修饰：
(i)P247G；
(ii)I253L、I253N、I253V或I253Q；
(iii)S254L；
(iv)H310P、H310W或H310Q；
(v)Q311E、Q311L、Q311R或Q311W；
(vi)E345A、E345D、E345G、E345H、E345F、E345I、E345K、E345L、E345M、E345N、E345P、E345Q、E345R、E345S、E345T、E345V、E345W或E345Y；
(vii)D/E356R；
(viii)T359R；
(ix)E382K、E382L、E382V、E382D、E382Q或E382S；
(x)G385D、G385N、G385R、G385E或G385K；
(xi)Q386K；
(xii)E430A、E430D、E430F、E430G、E430H、E430I、E430K、E430L、E430M、E430N、E430P、E430Q、E430R、E430S、E430T、E430V、E430W或E430Y；
(xiii)H433R；
(xiv)N434K、N434R、N434W、N434H或N434Q；
(xv)Y436I、Y436S、Y436T、Y436V、Y436N或Y436Q；
(xvi)Q438C、Q438L、Q438S、Q438T或Q438N；
(xvii)K439D、K439E、K439H、K439R或K439Q；
(xviii)S440D、S440E、S440Q、S440W或S440Y；和
(xix)K447D、K447E、K447N、K447Q或K447缺失。
27.根据权利要求25所述的复合体，其中修饰的Fc区包含选自以下的一个或多个氨基酸修饰：
(i)P247D、P247F、P247G、P247K、P247R或P247S；
(ii)I253V；
(iii)S254G、S254I或S254L；
(iv)Q311I、Q311K、Q311L、Q311P或Q311W；
(v)E345A、E345C、E345F、E345I、E345K、E345L、E345M、E345N、E345P、E345S、E345T、E345V、E345W或E345Y；
(vi)D/E356I、D/E356L、D/E356R、D/E356T或D/E356V；
(vii)T359N；
(viii)E382L或E382V；
(ix)G385A、G385D、G385H、G385I、G385L、G385N、G385P、G385Q、G385R、G385S、G385T、G385V、G385E、G385K、G385W或G385Y；
(x)Q386K；
(xi)E430A、E430F、E430H、E430L、E430P、E430R、E430S、E430V、E430W或E430Y；
(xii)N434W；
(xiii)Y436I；和
(xiv)S440D。
28.根据权利要求25或26所述的复合体，其中修饰的Fc区包含人IgG1Fc区内选自E345R、E430G和S440Y的一个或多个氨基酸置换(EU编号)。
29.根据权利要求28所述的复合体，其中修饰的Fc区包含人IgG1Fc区内选自E345R、E430G和S440Y的单氨基酸置换(EU编号)。
30.根据权利要求28所述的复合体，其中修饰的Fc区包含选自(a)E345R和E430G、(b)E345R和S440Y、(c)E430G和S440Y的氨基酸置换组，其中置换在人IgG1Fc区内(EU编号)。
31.根据权利要求28所述的复合体，其中修饰的Fc区包含人IgG1Fc区内的氨基酸置换E345R、E430G和S440Y(EU编号)。
32.根据权利要求1-31中任一项所述的复合体，其中Fc区还包含减弱效应子功能的修饰。
33.根据权利要求32所述的复合体，其中减弱效应子功能的修饰包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基(EU编号)处的氨基酸置换：
(a)人IgG1Fc区内的氨基酸残基297，
(b)人IgG1Fc区内的氨基酸残基234和235，
(c)人IgG1Fc区内的氨基酸残基234、235和329，
(d)人IgG2Fc区内的氨基酸残基234和237，
(e)人IgG4Fc区内的氨基酸残基235、237和318，
(f)人IgG4Fc区内的氨基酸残基228和236，
(g)人IgG2Fc区内的氨基酸残基268、309、330和331，
(h)人IgG1Fc区内的氨基酸残基220、226、229和238，
(i)人IgG1Fc区内的氨基酸残基226、229、233、234和235，
(j)人IgG1Fc区内的氨基酸残基234、235和331，
(k)人IgG1Fc区内的氨基酸残基226和230和
(l)人IgG1Fc区内的氨基酸残基267和328。
34.根据权利要求32或33所述的复合体，其中减弱效应子功能的修饰包含选自以下的一个或多个氨基酸置换(EU编号)：
(a)人IgG1Fc区内的N297A，
(b)人IgG1Fc区内的L234A和L235A，
(c)人IgG1Fc区内的L234A、L235A和P329G，
(d)人IgG2Fc区内的V234A和G237A，
(e)人IgG4Fc区内的L235A、G237A和E318A，
(f)人IgG4Fc区内的S228P和L236E，
(g)人IgG2Fc区内的118至260或人IgG4的Fc区内的261至447，
(h)人IgG2Fc区内的H268Q、V309L、A330S和A331S，
(j)人IgG1Fc区内的C220S、C226S、C229S和P238S，
(j)人IgG1Fc区内的C226S、C229S、E233P、L234V和L235A，
(k)人IgG1Fc区内的L234F、L235E和P331S，
(l)人IgG1Fc区内的C226S和P230S，和
(m)人IgG1Fc区内的S267E和L328F。
35.根据权利要求32-34中任一项所述的复合体，其中减弱效应子功能的修饰不导致修饰Fc区的糖基化模式。
36.根据权利要求1-35中任一项所述的复合体，其中复合体增强由所述复合体结合的细胞表面受体介导的信号转导。
37.抗原结合多肽，其包含针对细胞表面受体的抗原结合区和修饰的Fc区，其中修饰的Fc区包含(i)增强抗原结合多肽的六聚体形成的修饰和(ii)减弱效应子功能的修饰。
38.根据权利要求37所述的抗原结合多肽，其中细胞表面受体是选自肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族和G-蛋白偶联受体(GPCR)超家族的受体家族成员。
39.根据权利要求37或38所述的抗原结合多肽，其中细胞表面受体选自OX40、CD137和Tie2。
40.根据权利要求37-39中任一项所述的抗原结合多肽，其中抗原结合多肽包含抗体的抗原结合区。
41.根据权利要求40所述的抗原结合多肽，其中抗体的抗原结合区选自Fv、Fab、Fab'、F(ab')2、单链抗体分子(例如，scFv)和抗体可变区。
42.根据权利要求37-41中任一项所述的抗原结合多肽，其中修饰的Fc区是修饰的人IgG1Fc区。
43.根据权利要求37-42中任一项所述的抗原结合多肽，其中Fc区还包含削弱C1q结合作用和/或补体依赖细胞毒性(CDC)的修饰。
44.根据权利要求43所述的抗原结合多肽，其中削弱C1q结合作用和/或CDC的修饰包含人IgG1Fc区内的K322A氨基酸置换(EU编号)。
45.根据权利要求40-44中任一项所述的抗原结合多肽，其中抗原结合区包含来自单特异性抗体、双特异性抗体或多特异性抗体的抗原结合区。
46.根据权利要求45所述的抗原结合多肽，其中抗原结合区与OX40结合。
47.根据权利要求46所述的抗原结合多肽，其中抗原结合区包含(a)VH结构域和/或(b)VL结构域，所述VH结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQID NO:3的氨基酸序列的HVR-H2、(iii)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-H3；所述VL结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L2和(iii)包含选自SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HVR-L3。
48.根据权利要求46所述的抗原结合多肽，其中抗原结合区包含(a)VH结构域和/或(b)VL结构域，所述VH结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HVR-H2和(iii)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HVR-H3；所述VL结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的HVR-L2和(iii)包含选自SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HVR-L3。
49.根据权利要求45所述的抗原结合多肽，其中抗原结合区包含双特异性抗体的双臂，并且其中双特异性抗体的每条臂与相同细胞表面受体上的不同表位结合。
50.根据权利要求49所述的抗原结合多肽，其中双特异性抗体包含(a)结合OX40的第一表位的至少第一臂和(b)结合OX40的第二表位的至少第二臂，其中OX40的第一表位与OX40的第二表位不同。
51.根据权利要求50所述的抗原结合多肽，其中第一臂包含(a)VH结构域和/或(b)VL结构域，所述VH结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ IDNO:3的氨基酸序列的HVR-H2、(iii)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-H3；所述VL结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L2和(iii)包含选自SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HVR-L3；并且
其中第二臂包含(a)VH结构域和/或(b)VL结构域，所述VH结构域包含了(i)包含SEQ IDNO:29的氨基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HVR-H2和(iii)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HVR-H3；所述VL结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的HVR-L2和(iii)包含选自SEQ IDNO:42的氨基酸序列的HVR-L3。
52.根据权利要求37-51中任一项所述的抗原结合多肽，其中修饰的Fc区包含选自以下的一个或多个氨基酸修饰：
(i)P247A、P247C、P247D、P247F、P247G、P247H、P247I、P247K、P247L、P247M、P247N、P247R、P247S、P247T、P247V或P247W；
(ii)I253A、I253D、I253K、I253L、I253M、I253N、I253R、I253S、I253V、I253E、I253Q或I253T；
(iii)S254E、S254F、S254G、S254H、S254I、S254K、S254L、S254P、S254T、S254V或S254W；
(iv)H310A、H310G、H310F、H310K、H310L、H310P、H310R、H310T、H310V、H310W、H310N、H310Q或H310Y；
(v)Q311A、Q311C、Q311E、Q311G、Q311H、Q311F、Q311I、Q311K、Q311L、Q311N、Q311P、Q311R、Q311S、Q311T、Q311W或Q311Y；
(vi)E345A、E345C、E345D、E345G、E345H、E345F、E345I、E345K、E345L、E345M、E345N、E345P、E345Q、E345R、E345S、E345T、E345V、E345W或E345Y；
(vii)D/E356G、D/E356I、D/E356L、D/E356R、D/E356T或D/E356V；
(viii)T359G、T359N、T359P或T359R；
(ix)E382F、E382K、E382L、E382M、E382P、E382V、E382W、E382D、E382H、E382N、E382Q、E382S、E382T或E382Y；
(x)G385A、G385D、G385H、G385I、G385L、G385N、G385P、G385Q、G385R、G385S、G385T、G385V、G385E、G385K、G385W或G385Y；
(xi)Q386A、Q386C、Q386D、Q386E、Q386G、Q386H、Q386F、Q386I、Q386K、Q386L、Q386N、Q386P、Q386R、Q386S、Q386T、Q386V、Q386W或Q386Y；
(xii)E430A、E430C、E430D、E430F、E430G、E430H、E430I、E430K、E430L、E430M、E430N、E430P、E430Q、E430R、E430S、E430T、E430V、E430W或E430Y；
(xiii)H433R；
(xiv)N434D、N434E、N434G、N434K、N434R、N434S、N434V、N434W、N434H、N434Q、N434T或N434Y；
(xv)Y436I、Y436K、Y436L、Y436R、Y436S、Y436T、Y436V、Y436W、Y436A、Y436E、Y436F、Y436H、Y436M、Y436N或Y436Q；
(xvi)Q438C、Q438E、Q438I、Q438K、Q438L、Q438S、Q438T、Q438V、Q438W、Q438Y、Q438A、Q438G、Q438H、Q438N、Q438Q或Q438R；
(xvii)K439A、K439D、K439E、K439H、K439L、K439P、K439R、K439T、K439Y、K439Q或K439W；
(xviii)S440A、S440C、S440D、S440E、S440G、S440H、S440F、S440I、S440K、S440L、S440M、S440N、S440P、S440Q、S440R、S440T、S440V、S440W或S440Y；和
(xix)K447D、K447E、K447N、K447Q或K447缺失。
53.根据权利要求52所述的抗原结合多肽，其中修饰的Fc区包含选自以下的一个或多个氨基酸修饰：
(i)P247G；
(ii)I253L、I253N、I253V或I253Q；
(iii)S254L；
(iv)H310P、H310W或H310Q；
(v)Q311E、Q311L、Q311R或Q311W；
(vi)E345A、E345D、E345G、E345H、E345F、E345I、E345K、E345L、E345M、E345N、E345P、E345Q、E345R、E345S、E345T、E345V、E345W或E345Y；
(vii)D/E356R；
(viii)T359R；
(ix)E382K、E382L、E382V、E382D、E382Q或E382S；
(x)G385D、G385N、G385R、G385E或G385K；
(xi)Q386K；
(xii)E430A、E430D、E430F、E430G、E430H、E430I、E430K、E430L、E430M、E430N、E430P、E430Q、E430R、E430S、E430T、E430V、E430W或E430Y；
(xiii)H433R；
(xiv)N434K、N434R、N434W、N434H或N434Q；
(xv)Y436I、Y436S、Y436T、Y436V、Y436N或Y436Q；
(xvi)Q438C、Q438L、Q438S、Q438T或Q438N；
(xvii)K439D、K439E、K439H、K439R或K439Q；
(xviii)S440D、S440E、S440Q、S440W或S440Y；和
(xix)K447D、K447E、K447N、K447Q或K447缺失。
54.根据权利要求52所述的抗原结合多肽，其中修饰的Fc区包含选自以下的一个或多个氨基酸修饰：
(i)P247D、P247F、P247G、P247K、P247R或P247S；
(ii)I253V；
(iii)S254G、S254I或S254L；
(iv)Q311I、Q311K、Q311L、Q311P或Q311W；
(v)E345A、E345C、E345F、E345I、E345K、E345L、E345M、E345N、E345P、E345S、E345T、E345V、E345W或E345Y；
(vi)D/E356I、D/E356L、D/E356R、D/E356T或D/E356V；
(vii)T359N；
(viii)E382L或E382V；
(ix)G385A、G385D、G385H、G385I、G385L、G385N、G385P、G385Q、G385R、G385S、G385T、G385V、G385E、G385K、G385W或G385Y；
(x)Q386K；
(xi)E430A、E430F、E430H、E430L、E430P、E430R、E430S、E430V、E430W或E430Y；
(xii)N434W；
(xiii)Y436I；和
(xiv)S440D。
55.根据权利要求52或53所述的抗原结合多肽，其中修饰的Fc区包含人IgG1Fc区内选自E345R、E430G和S440Y的一个或多个氨基酸置换(EU编号)。
56.根据权利要求55所述的抗原结合多肽，其中修饰的Fc区包含人IgG1Fc区内选自E345R、E430G和S440Y的单氨基酸置换(EU编号)。
57.根据权利要求55所述的抗原结合多肽，其中修饰的Fc区包含选自(a)E345R和E430G、(b)E345R和S440Y、(c)E430G和S440Y的氨基酸置换组，其中置换在人IgG1Fc区内(EU编号)。
58.根据权利要求55所述的抗原结合多肽，其中修饰的Fc区包含人IgG1Fc区内的氨基酸置换E345R、E430G和S440Y(EU编号)。
59.根据权利要求37-58中任一项所述的抗原结合多肽，其中减弱效应子功能的修饰包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基(EU编号)处的氨基酸置换：
(a)人IgG1Fc区内的氨基酸残基297，
(b)人IgG1Fc区内的氨基酸残基234和235，
(c)人IgG1Fc区内的氨基酸残基234、235和329，
(d)人IgG2Fc区内的氨基酸残基234和237，
(e)人IgG4Fc区内的氨基酸残基235、237和318，
(f)人IgG4Fc区内的氨基酸残基228和236，
(g)人IgG2Fc区内的氨基酸残基268、309、330和331，
(h)人IgG1Fc区内的氨基酸残基220、226、229和238，
(i)人IgG1Fc区内的氨基酸残基226、229、233、234和235，
(j)人IgG1Fc区内的氨基酸残基234、235和331(EU编号)，
(k)人IgG1Fc区内的氨基酸残基226和230和
(l)人IgG1Fc区内的氨基酸残基267和328。
60.根据权利要求59所述的抗原结合多肽，其中减弱效应子功能的修饰包含选自以下的一个或多个氨基酸置换(EU编号)：
(a)人IgG1Fc区内的N297A，
(b)人IgG1Fc区内的L234A和L235A，
(c)人IgG1Fc区内的L234A、L235A和P329G，
(d)人IgG2Fc区内的V234A和G237A，
(e)人IgG4Fc区内的L235A、G237A和E318A，
(f)人IgG4Fc区内的S228P和L236E，
(g)人IgG2Fc区内的118至260或人IgG4的Fc区内的261至447，
(h)人IgG2Fc区内的H268Q、V309L、A330S和A331S，
(j)人IgG1Fc区内的C220S、C226S、C229S和P238S，
(j)人Fc区内的C226S、C229S、E233P、L234V和L235A，
(k)人IgG1Fc区内的L234F、L235E和P331S，
(l)人IgG1Fc区内的C226S和P230S，和
(m)人IgG1Fc区内的S267E和L328F。
61.根据权利要求37-60中任一项所述的抗原结合多肽，其中减弱效应子功能的修饰不导致修饰Fc区的糖基化模式。
62.抗原结合多肽，包含针对细胞表面受体的抗原结合区和修饰的Fc区，其中修饰的Fc区包含增强与细胞表面受体结合时Fc结构域之间分子间相互作用的修饰。
63.根据权利要求62所述的抗原结合多肽，其中如与不具有Fc区修饰的相同抗原结合多肽相比，所述多肽增强与细胞表面受体结合时的受体激动作用。
64.根据权利要求62或63所述的抗原结合多肽，其中细胞表面受体是选自肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族和G-蛋白偶联受体(GPCR)超家族的受体家族成员。
65.根据权利要求62-64中任一项所述的抗原结合多肽，其中细胞表面受体选自OX40、CD137和Tie2。
66.根据权利要求62-65中任一项所述的抗原结合多肽，其中抗原结合多肽包含抗体的抗原结合区。
67.根据权利要求66所述的抗原结合多肽，其中抗体的抗原结合区选自Fv、Fab、Fab'、F(ab')2、单链抗体分子(例如，scFv)和抗体可变区。
68.根据权利要求62-67中任一项所述的抗原结合多肽，其中修饰的Fc区是修饰的人IgG1Fc区。
69.根据权利要求62-68中任一项所述的抗原结合多肽，其中Fc区还包含削弱C1q结合作用和/或补体依赖细胞毒性(CDC)的修饰。
70.根据权利要求69所述的抗原结合多肽，其中削弱C1q结合作用和/或CDC的修饰包含人IgG1Fc区内的K322A氨基酸置换(EU编号)。
71.根据权利要求66-70中任一项所述的抗原结合多肽，其中抗原结合区来自单特异性抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。
72.根据权利要求71所述的抗原结合多肽，其中抗原结合区与OX40结合。
73.根据权利要求72所述的抗原结合多肽，其中抗原结合区包含(a)VH结构域和/或(b)VL结构域，所述VH结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQID NO:3的氨基酸序列的HVR-H2、(iii)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-H3；所述VL结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L2和(iii)包含选自SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HVR-L3。
74.根据权利要求72所述的抗原结合多肽，其中抗原结合区包含(a)VH结构域和/或(b)VL结构域，所述VH结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HVR-H2和(iii)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HVR-H3；所述VL结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的HVR-L2和(iii)包含选自SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HVR-L3。
75.根据权利要求71所述的抗原结合多肽，其中抗原结合区包含双特异性抗体的双臂，并且其中双特异性抗体的每条臂与相同细胞表面受体上的不同表位结合。
76.根据权利要求75所述的抗原结合多肽，其中双特异性抗体包含(a)结合OX40的第一表位的至少第一臂和(b)结合OX40的第二表位的至少第二臂，其中OX40的第一表位与OX40的第二表位不同。
77.根据权利要求76所述的抗原结合多肽，其中第一臂包含(a)VH结构域和/或(b)VL结构域，所述VH结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ IDNO:3的氨基酸序列的HVR-H2、(iii)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-H3；所述VL结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L2和(iii)包含选自SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HVR-L3；并且
其中第二臂包含(a)VH结构域和/或(b)VL结构域，所述VH结构域包含了(i)包含SEQ IDNO:29的氨基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HVR-H2和(iii)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HVR-H3；所述VL结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的HVR-L2和(iii)包含选自SEQ IDNO:42的氨基酸序列的HVR-L3。
78.根据权利要求62-77中任一项所述的抗原结合多肽，其中修饰的Fc区包含选自以下的一个或多个氨基酸修饰：
(i)P247A、P247C、P247D、P247F、P247G、P247H、P247I、P247K、P247L、P247M、P247N、P247R、P247S、P247T、P247V或P247W；
(ii)I253A、I253D、I253K、I253L、I253M、I253N、I253R、I253S、I253V、I253E、I253Q或I253T；
(iii)S254E、S254F、S254G、S254H、S254I、S254K、S254L、S254P、S254T、S254V或S254W；
(iv)H310A、H310G、H310F、H310K、H310L、H310P、H310R、H310T、H310V、H310W、H310N、H310Q或H310Y；
(v)Q311A、Q311C、Q311E、Q311G、Q311H、Q311F、Q311I、Q311K、Q311L、Q311N、Q311P、Q311R、Q311S、Q311T、Q311W或Q311Y；
(vi)E345A、E345C、E345D、E345G、E345H、E345F、E345I、E345K、E345L、E345M、E345N、E345P、E345Q、E345R、E345S、E345T、E345V、E345W或E345Y；
(vii)D/E356G、D/E356I、D/E356L、D/E356R、D/E356T或D/E356V；
(viii)T359G、T359N、T359P或T359R；
(ix)E382F、E382K、E382L、E382M、E382P、E382V、E382W、E382D、E382H、E382N、E382Q、E382S、E382T或E382Y；
(x)G385A、G385D、G385H、G385I、G385L、G385N、G385P、G385Q、G385R、G385S、G385T、G385V、G385E、G385K、G385W或G385Y；
(xi)Q386A、Q386C、Q386D、Q386E、Q386G、Q386H、Q386F、Q386I、Q386K、Q386L、Q386N、Q386P、Q386R、Q386S、Q386T、Q386V、Q386W或Q386Y；
(xii)E430A、E430C、E430D、E430F、E430G、E430H、E430I、E430K、E430L、E430M、E430N、E430P、E430Q、E430R、E430S、E430T、E430V、E430W或E430Y；
(xiii)H433R；
(xiv)N434D、N434E、N434G、N434K、N434R、N434S、N434V、N434W、N434H、N434Q、N434T或N434Y；
(xv)Y436I、Y436K、Y436L、Y436R、Y436S、Y436T、Y436V、Y436W、Y436A、Y436E、Y436F、Y436H、Y436M、Y436N或Y436Q；
(xvi)Q438C、Q438E、Q438I、Q438K、Q438L、Q438S、Q438T、Q438V、Q438W、Q438Y、Q438A、Q438G、Q438H、Q438N、Q438Q或Q438R；
(xvii)K439A、K439D、K439E、K439H、K439L、K439P、K439R、K439T、K439Y、K439Q或K439W；
(xviii)S440A、S440C、S440D、S440E、S440G、S440H、S440F、S440I、S440K、S440L、S440M、S440N、S440P、S440Q、S440R、S440T、S440V、S440W或S440Y；和
(xix)K447D、K447E、K447N、K447Q或K447缺失。
79.根据权利要求78所述的抗原结合多肽，其中修饰的Fc区包含选自以下的一个或多个氨基酸修饰：
(i)P247G；
(ii)I253L、I253N、I253V或I253Q；
(iii)S254L；
(iv)H310P、H310W或H310Q；
(v)Q311E、Q311L、Q311R或Q311W；
(vi)E345A、E345D、E345G、E345H、E345F、E345I、E345K、E345L、E345M、E345N、E345P、E345Q、E345R、E345S、E345T、E345V、E345W或E345Y；
(vii)D/E356R；
(viii)T359R；
(ix)E382K、E382L、E382V、E382D、E382Q或E382S；
(x)G385D、G385N、G385R、G385E或G385K；
(xi)Q386K；
(xii)E430A、E430D、E430F、E430G、E430H、E430I、E430K、E430L、E430M、E430N、E430P、E430Q、E430R、E430S、E430T、E430V、E430W或E430Y；
(xiii)H433R；
(xiv)N434K、N434R、N434W、N434H或N434Q；
(xv)Y436I、Y436S、Y436T、Y436V、Y436N或Y436Q；
(xvi)Q438C、Q438L、Q438S、Q438T或Q438N；
(xvii)K439D、K439E、K439H、K439R或K439Q；
(xviii)S440D、S440E、S440Q、S440W或S440Y；和
(xix)K447D、K447E、K447N、K447Q或K447缺失。
80.根据权利要求78所述的抗原结合多肽，其中修饰的Fc区包含选自以下的一个或多个氨基酸修饰：
(i)P247D、P247F、P247G、P247K、P247R或P247S；
(ii)I253V；
(iii)S254G、S254I或S254L；
(iv)Q311I、Q311K、Q311L、Q311P或Q311W；
(v)E345A、E345C、E345F、E345I、E345K、E345L、E345M、E345N、E345P、E345S、E345T、E345V、E345W或E345Y；
(vi)D/E356I、D/E356L、D/E356R、D/E356T或D/E356V；
(vii)T359N；
(viii)E382L或E382V；
(ix)G385A、G385D、G385H、G385I、G385L、G385N、G385P、G385Q、G385R、G385S、G385T、G385V、G385E、G385K、G385W或G385Y；
(x)Q386K；
(xi)E430A、E430F、E430H、E430L、E430P、E430R、E430S、E430V、E430W或E430Y；
(xii)N434W；
(xiii)Y436I；和
(xiv)S440D。
81.根据权利要求78或79所述的抗原结合多肽，其中修饰的Fc区包含人IgG1Fc区内选自E345R、E430G和S440Y的一个或多个氨基酸置换(EU编号)。
82.根据权利要求81所述的抗原结合多肽，其中修饰的Fc区包含人IgG1Fc区内选自E345R、E430G和S440Y的单氨基酸置换(EU编号)。
83.根据权利要求81所述的抗原结合多肽，其中修饰的Fc区包含选自(a)E345R和E430G、(b)E345R和S440Y、(c)E430G和S440Y的氨基酸置换组，其中置换在人IgG1Fc区内(EU编号)。
84.根据权利要求81所述的抗原结合多肽，其中修饰的Fc区包含人IgG1Fc区内的氨基酸置换E345R、E430G和S440Y(EU编号)。
85.根据权利要求62-84中任一项所述的抗原结合多肽，其中修饰的Fc区还包含减弱效应子功能的修饰。
86.根据权利要求85所述的抗原结合多肽，其中减弱效应子功能的修饰包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基(EU编号)处的氨基酸置换：
(a)人IgG1Fc区内的氨基酸残基297，
(b)人IgG1Fc区内的氨基酸残基234和235，
(c)人IgG1Fc区内的氨基酸残基234、235和329，
(d)人IgG2Fc区内的氨基酸残基234和237，
(e)人IgG4Fc区内的氨基酸残基235、237和318，
(f)人IgG4Fc区内的氨基酸残基228和236，
(g)人IgG2Fc区内的氨基酸残基268、309、330和331，
(h)人IgG1Fc区内的氨基酸残基220、226、229和238，
(i)人IgG1Fc区内的氨基酸残基226、229、233、234和235，
(j)人IgG1Fc区内的氨基酸残基234、235和331(EU编号)，
(k)人IgG1Fc区内的氨基酸残基226和230和
(l)人IgG1Fc区内的氨基酸残基267和328。
87.根据权利要求85或86所述的抗原结合多肽，其中减弱效应子功能的修饰包含选自以下的一个或多个氨基酸置换(EU编号)：
(a)人IgG1Fc区内的N297A，
(b)人IgG1Fc区内的L234A和L235A，
(c)人IgG1Fc区内的L234A、L235A和P329G，
(d)人IgG2Fc区内的V234A和G237A，
(e)人IgG4Fc区内的L235A、G237A和E318A，
(f)人IgG4Fc区内的S228P和L236E，
(g)人IgG2Fc区内的118至260或人IgG4的Fc区内的261至447，
(h)人IgG2Fc区内的H268Q、V309L、A330S和A331S，
(j)人IgG1Fc区内的C220S、C226S、C229S和P238S，
(j)人Fc区内的C226S、C229S、E233P、L234V和L235A，
(k)人IgG1Fc区内的L234F、L235E和P331S，
(l)人IgG1Fc区内的C226S和P230S，和
(m)人IgG1Fc区内的S267E和L328F。
88.根据权利要求85-87中任一项所述的抗原结合多肽，其中减弱效应子功能的修饰不导致修饰Fc区的糖基化模式。
89.六聚体，包含根据权利要求37至88中任一项所述的六条抗原结合多肽。
90.用于激动受试者中细胞表面受体的方法，包括向受试者施用根据权利要求1至36中任一项所述的复合体、根据权利要求89所述的六聚体或根据权利要求37至88中任一项所述的抗原结合多肽。
91.根据权利要求90所述的方法，其中六聚体增强由所述复合体、六聚体或抗原结合多肽结合的细胞表面受体介导的信号转导。
92.增加抗原结合多肽的激动剂活性的方法，包括：
(a)提供抗原结合多肽，所述抗原结合多肽包含针对细胞表面受体的抗原结合区和Fc区，并且
(b)向Fc区引入修饰，其中所述修饰增强与细胞表面受体结合时Fc结构域之间的分子间相互作用，并且其中如与不具有Fc区修饰的相同抗原结合多肽相比，抗原结合多肽具有增加的针对抗原结合多肽结合的细胞表面受体的激动剂活性。
93.增加抗原结合多肽的激动剂活性的方法，包括：
(a)提供抗原结合多肽，所述抗原结合多肽包含针对细胞表面受体的抗原结合区和Fc区，并且
(b)向Fc区引入修饰，其中修饰增强抗原结合多肽的六聚体形成，并且其中如与六聚体的单个亚单位相比，六聚体具有增加的针对抗原结合多肽结合的细胞表面受体的激动剂活性。
94.根据权利要求92或93所述的方法，其中细胞表面受体是选自肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族和G-蛋白偶联受体(GPCR)超家族的受体家族成员。
95.根据权利要求92-94中任一项所述的方法，其中细胞表面受体选自OX40、CD137和Tie2。
96.根据权利要求92-95中任一项所述的方法，其中抗原结合多肽包含抗体的抗原结合区。
97.根据权利要求96所述的方法，其中抗体的抗原结合区选自Fv、Fab、Fab'、F(ab')2、单链抗体分子(例如，scFv)和抗体可变区。
98.根据权利要求92-97中任一项所述的方法，其中修饰的Fc区是修饰的人IgG1Fc区。
99.根据权利要求92-98中任一项所述的方法，其中Fc区还包含削弱C1q结合作用和/或补体依赖细胞毒性(CDC)的修饰。
100.根据权利要求99所述的方法，其中削弱C1q结合作用和/或CDC的修饰包含人IgG1Fc区内的K322A氨基酸置换(EU编号)。
101.根据权利要求96-100中任一项所述的方法，其中抗原结合区包含来自单特异性抗体、双特异性抗体或多特异性抗体的抗原结合区。
102.根据权利要求96-101中任一项所述的方法，其中抗原结合区与OX40结合。
103.根据权利要求102所述的方法，其中抗原结合区包含(a)VH结构域和/或(b)VL结构域，所述VH结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ IDNO:3的氨基酸序列的HVR-H2、(iii)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-H3；所述VL结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L2和(iii)包含选自SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HVR-L3。
104.根据权利要求102所述的方法，其中抗原结合区包含(a)VH结构域和/或(b)VL结构域，所述VH结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ IDNO:30的氨基酸序列的HVR-H2和(iii)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HVR-H3；所述VL结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的HVR-L2和(iii)包含选自SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HVR-L3。
105.根据权利要求92-104中任一项所述的方法，其中修饰的Fc区包含选自以下的一个或多个氨基酸修饰：
(i)P247A、P247C、P247D、P247F、P247G、P247H、P247I、P247K、P247L、P247M、P247N、P247R、P247S、P247T、P247V或P247W；
(ii)I253A、I253D、I253K、I253L、I253M、I253N、I253R、I253S、I253V、I253E、I253Q或I253T；
(iii)S254E、S254F、S254G、S254H、S254I、S254K、S254L、S254P、S254T、S254V或S254W；
(iv)H310A、H310G、H310F、H310K、H310L、H310P、H310R、H310T、H310V、H310W、H310N、H310Q或H310Y；
(v)Q311A、Q311C、Q311E、Q311G、Q311H、Q311F、Q311I、Q311K、Q311L、Q311N、Q311P、Q311R、Q311S、Q311T、Q311W或Q311Y；
(vi)E345A、E345C、E345D、E345G、E345H、E345F、E345I、E345K、E345L、E345M、E345N、E345P、E345Q、E345R、E345S、E345T、E345V、E345W或E345Y；
(vii)D/E356G、D/E356I、D/E356L、D/E356R、D/E356T或D/E356V；
(viii)T359G、T359N、T359P或T359R；
(ix)E382F、E382K、E382L、E382M、E382P、E382V、E382W、E382D、E382H、E382N、E382Q、E382S、E382T或E382Y；
(x)G385A、G385D、G385H、G385I、G385L、G385N、G385P、G385Q、G385R、G385S、G385T、G385V、G385E、G385K、G385W或G385Y；
(xi)Q386A、Q386C、Q386D、Q386E、Q386G、Q386H、Q386F、Q386I、Q386K、Q386L、Q386N、Q386P、Q386R、Q386S、Q386T、Q386V、Q386W或Q386Y；
(xii)E430A、E430C、E430D、E430F、E430G、E430H、E430I、E430K、E430L、E430M、E430N、E430P、E430Q、E430R、E430S、E430T、E430V、E430W或E430Y；
(xiii)H433R；
(xiv)N434D、N434E、N434G、N434K、N434R、N434S、N434V、N434W、N434H、N434Q、N434T或N434Y；
(xv)Y436I、Y436K、Y436L、Y436R、Y436S、Y436T、Y436V、Y436W、Y436A、Y436E、Y436F、Y436H、Y436M、Y436N或Y436Q；
(xvi)Q438C、Q438E、Q438I、Q438K、Q438L、Q438S、Q438T、Q438V、Q438W、Q438Y、Q438A、Q438G、Q438H、Q438N、Q438Q或Q438R；
(xvii)K439A、K439D、K439E、K439H、K439L、K439P、K439R、K439T、K439Y、K439Q或K439W；
(xviii)S440A、S440C、S440D、S440E、S440G、S440H、S440F、S440I、S440K、S440L、S440M、S440N、S440P、S440Q、S440R、S440T、S440V、S440W或S440Y；和
(xix)K447D、K447E、K447N、K447Q或K447缺失。
106.根据权利要求105所述的方法，其中修饰的Fc区包含选自以下的一个或多个氨基酸修饰：
(i)P247G；
(ii)I253L、I253N、I253V或I253Q；
(iii)S254L；
(iv)H310P、H310W或H310Q；
(v)Q311E、Q311L、Q311R或Q311W；
(vi)E345A、E345D、E345G、E345H、E345F、E345I、E345K、E345L、E345M、E345N、E345P、E345Q、E345R、E345S、E345T、E345V、E345W或E345Y；
(vii)D/E356R；
(viii)T359R；
(ix)E382K、E382L、E382V、E382D、E382Q或E382S；
(x)G385D、G385N、G385R、G385E或G385K；
(xi)Q386K；
(xii)E430A、E430D、E430F、E430G、E430H、E430I、E430K、E430L、E430M、E430N、E430P、E430Q、E430R、E430S、E430T、E430V、E430W或E430Y；
(xiii)H433R；
(xiv)N434K、N434R、N434W、N434H或N434Q；
(xv)Y436I、Y436S、Y436T、Y436V、Y436N或Y436Q；
(xvi)Q438C、Q438L、Q438S、Q438T或Q438N；
(xvii)K439D、K439E、K439H、K439R或K439Q；
(xviii)S440D、S440E、S440Q、S440W或S440Y；和
(xix)K447D、K447E、K447N、K447Q或K447缺失。
107.根据权利要求105所述的方法，其中修饰的Fc区包含选自以下的一个或多个氨基酸修饰：
(i)P247D、P247F、P247G、P247K、P247R或P247S；
(ii)I253V；
(iii)S254G、S254I或S254L；
(iv)Q311I、Q311K、Q311L、Q311P或Q311W；
(v)E345A、E345C、E345F、E345I、E345K、E345L、E345M、E345N、E345P、E345S、E345T、E345V、E345W或E345Y；
(vi)D/E356I、D/E356L、D/E356R、D/E356T或D/E356V；
(vii)T359N；
(viii)E382L或E382V；
(ix)G385A、G385D、G385H、G385I、G385L、G385N、G385P、G385Q、G385R、G385S、G385T、G385V、G385E、G385K、G385W或G385Y；
(x)Q386K；
(xi)E430A、E430F、E430H、E430L、E430P、E430R、E430S、E430V、E430W或E430Y；
(xii)N434W；
(xiii)Y436I；和
(xiv)S440D。
108.根据权利要求105或106所述的方法，其中修饰的Fc区包含人IgG1Fc区内选自E345R、E430G和S440Y的一个或多个氨基酸置换(EU编号)。
109.根据权利要求108所述的方法，其中修饰的Fc区包含人IgG1Fc区内选自E345R、E430G和S440Y的单氨基酸置换(EU编号)。
110.根据权利要求108所述的方法，其中修饰的Fc区包含选自(a)E345R和E430G、(b)E345R和S440Y、(c)E430G和S440Y的氨基酸置换组，其中置换在人IgG1Fc区内(EU编号)。
111.根据权利要求108所述的方法，其中修饰的Fc区包含人IgG1Fc区内的氨基酸置换E345R、E430G和S440Y(EU编号)。
112.根据权利要求92-111中任一项所述的方法，其中Fc区还包含减弱效应子功能的修饰。
113.根据权利要求112所述的方法，其中减弱效应子功能的修饰包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基(EU编号)处的氨基酸置换：
(a)人IgG1Fc区内的氨基酸残基297，
(b)人IgG1Fc区内的氨基酸残基234和235，
(c)人IgG1Fc区内的氨基酸残基234、235和329，
(d)人IgG2Fc区内的氨基酸残基234和237，
(e)人IgG4Fc区内的氨基酸残基235、237和318，
(f)人IgG4Fc区内的氨基酸残基228和236，
(g)人IgG2Fc区内的氨基酸残基268、309、330和331，
(h)人IgG1Fc区内的氨基酸残基220、226、229和238，
(i)人IgG1Fc区内的氨基酸残基226、229、233、234和235，
(j)人IgG1Fc区内的氨基酸残基234、235和331，
(k)人IgG1Fc区内的氨基酸残基226和230和
(l)人IgG1Fc区内的氨基酸残基267和328。
114.根据权利要求112或113所述的方法，其中减弱效应子功能的修饰包含选自以下的一个或多个氨基酸置换(EU编号)：
(a)人IgG1Fc区内的N297A，
(b)人IgG1Fc区内的L234A和L235A，
(c)人IgG1Fc区内的L234A、L235A和P329G，
(d)人IgG2Fc区内的V234A和G237A，
(e)人IgG4Fc区内的L235A、G237A和E318A，
(f)人IgG4Fc区内的S228P和L236E，
(g)人IgG2Fc区内的118至260或人IgG4的Fc区内的261至447，
(h)人IgG2Fc区内的H268Q、V309L、A330S和A331S，
(j)人IgG1Fc区内的C220S、C226S、C229S和P238S，
(j)人IgG1Fc区内的C226S、C229S、E233P、L234V和L235A，
(k)人IgG1Fc区内的L234F、L235E和P331S，
(l)人IgG1Fc区内的C226S和P230S，和
(m)人IgG1Fc区内的S267E和L328F。
115.根据权利要求112-114中任一项所述的方法，其中减弱效应子功能的修饰不导致修饰Fc区的糖基化模式。
116.根据权利要求93-115中任一项所述的方法，其中六聚体增强由所述六聚体结合的细胞表面受体介导的信号转导。
117.鉴定对细胞表面受体具有激动剂活性的抗原结合多肽的方法，包括：
(a)提供多个抗原结合多肽，其中每条抗原结合多肽包含至少一个抗原结合区和增强与细胞表面受体结合时Fc结构域之间分子间相互作用的修饰的Fc区，
(b)针对细胞表面受体筛选抗原结合复合体，并且
(c)选择对细胞表面受体具有激动剂活性的抗原结合复合体。
118.鉴定对细胞表面受体具有激动剂活性的抗原结合多肽的方法，包括：
(a)提供多种六聚抗原结合复合体，其中每复合体包含六个亚单位，所述亚单位各自包含抗原结合多肽，所述抗原结合多肽包含至少一个抗原结合区和增强六聚体形成的修饰的Fc区，
(b)针对细胞表面受体筛选抗原结合复合体，并且
(c)选择对细胞表面受体具有激动剂活性的抗原结合复合体。
119.根据权利要求117或118所述的方法，其中Fc区还包含减弱效应子功能的修饰。
120.根据权利要求117-119中任一项所述的方法，其中Fc区还包含削弱C1q结合作用和/或补体依赖细胞毒性(CDC)的修饰。
121.包含六个亚单位的具有激动剂活性的六聚抗原结合复合体，其中每个亚单位包含至少一条抗原结合多肽，所述抗原结合多肽包含至少一个针对细胞表面受体的抗原结合区和增强六聚体形成的修饰的Fc区，其中修饰的Fc区还包含削弱C1q结合作用和/或补体依赖细胞毒性(CDC)的修饰，并且其中复合体具有针对所述复合体结合的细胞表面受体的激动剂活性。
122.根据权利要求121所述的复合体，其中每条抗原结合多肽与相同的细胞表面受体结合。
123.根据权利要求122所述的复合体，其中每条抗原结合多肽与相同细胞表面受体上的相同表位结合。
124.根据权利要求122所述的复合体，其中复合体包含与相同细胞表面受体上的不同表位结合的两条或更多条抗原结合多肽。
125.根据权利要求121-124中任一项所述的复合体，其中细胞表面受体是选自肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族和G-蛋白偶联受体(GPCR)超家族的受体家族成员。
126.根据权利要求121-125中任一项所述的复合体，其中细胞表面受体选自OX40、CD137和Tie2。
127.根据权利要求121-126中任一项所述的复合体，其中抗原结合多肽包含抗体的抗原结合区。
128.根据权利要求127所述的复合体，其中抗体的抗原结合区选自Fv、Fab、Fab'、F(ab')2、单链抗体分子(例如，scFv)和抗体可变区。
129.根据权利要求121-128中任一项所述的复合体，其中修饰的Fc区是修饰的人IgG1Fc区。
130.根据权利要求121-129中任一项所述的复合体，其中削弱C1q结合作用和/或CDC的修饰包含人IgG1Fc区内的K322A氨基酸置换(EU编号)。
131.根据权利要求127-130中任一项所述的复合体，其中抗原结合区包含来自单特异性抗体、双特异性抗体或多特异性抗体的抗原结合区。
132.根据权利要求131所述的复合体，其中每个抗原结合区来自与相同细胞表面受体结合的单特异性抗体。
133.根据权利要求131所述的复合体，其中每个抗原结合区来自与OX40结合的单特异性抗体。
134.根据权利要求133所述的复合体，其中复合体包含至少一个亚单位，所述亚单位包含(a)VH结构域和/或(b)VL结构域，所述VH结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HVR-H2，(iii)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-H3；所述VL结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L2和(iii)包含选自SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HVR-L3。
135.根据权利要求134所述的复合体，其中六个亚单位各自包含(a)VH结构域和/或(b)VL结构域，所述VH结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQID NO:3的氨基酸序列的HVR-H2、(iii)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-H3；所述VL结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L2和(iii)包含选自SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HVR-L3。
136.根据权利要求133所述的复合体，其中复合体包含至少一个亚单位，所述亚单位包含(a)VH结构域和/或(b)VL结构域，所述VH结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HVR-H2和(iii)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HVR-H3；所述VL结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的HVR-L2和(iii)包含选自SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HVR-L3。
137.根据权利要求136所述的复合体，其中六个亚单位各自包含(a)VH结构域和/或(b)VL结构域，所述VH结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HVR-H2和(iii)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HVR-H3；所述VL结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的HVR-L2和(iii)包含选自SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HVR-L3。
138.根据权利要求132-134和136中任一项所述的复合体，其中复合体包含与相同细胞表面受体上的不同表位结合的至少两种单特异性抗体的混合物。
139.根据权利要求138所述的复合体，其中复合体包含(a)结合OX40的第一表位的至少第一亚单位；和(b)结合OX40的第二表位的至少第二亚单位，其中OX40的第一表位与OX40的第二表位不同。
140.根据权利要求139所述的复合体，其中第一亚单位包含(a)VH结构域和/或(b)VL结构域，所述VH结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ IDNO:3的氨基酸序列的HVR-H2、(iii)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-H3；所述VL结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L2和(c)包含选自SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HVR-L3；并且
其中第二亚单位包含(a)VH结构域和/或(b)VL结构域，所述VH结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HVR-H2和(iii)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HVR-H3；所述VL结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的HVR-L2和(c)包含选自SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HVR-L3。
141.根据权利要求127-131中任一项所述的复合体，其中抗原结合区包含双特异性抗体的双臂，并且其中双特异性抗体的每条臂与相同细胞表面受体上的不同表位结合。
142.根据权利要求141所述的复合体，其中双特异性抗体包含(a)结合OX40的第一表位的至少第一臂和(b)结合OX40的第二表位的至少第二臂，其中OX40的第一表位与OX40的第二表位不同。
143.根据权利要求142所述的复合体，其中第一臂包含(a)VH结构域和/或(b)VL结构域，所述VH结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ IDNO:3的氨基酸序列的HVR-H2、(iii)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-H3；所述VL结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L2和(iii)包含选自SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HVR-L3；并且
其中第二臂包含(a)VH结构域和/或(b)VL结构域，所述VH结构域包含了(i)包含SEQ IDNO:29的氨基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HVR-H2和(iii)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HVR-H3；所述VL结构域包含了(i)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的HVR-L2和(iii)包含选自SEQ IDNO:42的氨基酸序列的HVR-L3。
144.根据权利要求121-143中任一项所述的复合体，其中修饰的Fc区包含选自以下的一个或多个氨基酸修饰：
(i)P247A、P247C、P247D、P247F、P247G、P247H、P247I、P247K、P247L、P247M、P247N、P247R、P247S、P247T、P247V或P247W；
(ii)I253A、I253D、I253K、I253L、I253M、I253N、I253R、I253S、I253V、I253E、I253Q或I253T；
(iii)S254E、S254F、S254G、S254H、S254I、S254K、S254L、S254P、S254T、S254V或S254W；
(iv)H310A、H310G、H310F、H310K、H310L、H310P、H310R、H310T、H310V、H310W、H310N、H310Q或H310Y；
(v)Q311A、Q311C、Q311E、Q311G、Q311H、Q311F、Q311I、Q311K、Q311L、Q311N、Q311P、Q311R、Q311S、Q311T、Q311W或Q311Y；
(vi)E345A、E345C、E345D、E345G、E345H、E345F、E345I、E345K、E345L、E345M、E345N、E345P、E345Q、E345R、E345S、E345T、E345V、E345W或E345Y；
(vii)D/E356G、D/E356I、D/E356L、D/E356R、D/E356T或D/E356V；
(viii)T359G、T359N、T359P或T359R；
(ix)E382F、E382K、E382L、E382M、E382P、E382V、E382W、E382D、E382H、E382N、E382Q、E382S、E382T或E382Y；
(x)G385A、G385D、G385H、G385I、G385L、G385N、G385P、G385Q、G385R、G385S、G385T、G385V、G385E、G385K、G385W或G385Y；
(xi)Q386A、Q386C、Q386D、Q386E、Q386G、Q386H、Q386F、Q386I、Q386K、Q386L、Q386N、Q386P、Q386R、Q386S、Q386T、Q386V、Q386W或Q386Y；
(xii)E430A、E430C、E430D、E430F、E430G、E430H、E430I、E430K、E430L、E430M、E430N、E430P、E430Q、E430R、E430S、E430T、E430V、E430W或E430Y；
(xiii)H433R；
(xiv)N434D、N434E、N434G、N434K、N434R、N434S、N434V、N434W、N434H、N434Q、N434T或N434Y；
(xv)Y436I、Y436K、Y436L、Y436R、Y436S、Y436T、Y436V、Y436W、Y436A、Y436E、Y436F、Y436H、Y436M、Y436N或Y436Q；
(xvi)Q438C、Q438E、Q438I、Q438K、Q438L、Q438S、Q438T、Q438V、Q438W、Q438Y、Q438A、Q438G、Q438H、Q438N、Q438Q或Q438R；
(xvii)K439A、K439D、K439E、K439H、K439L、K439P、K439R、K439T、K439Y、K439Q或K439W；
(xviii)S440A、S440C、S440D、S440E、S440G、S440H、S440F、S440I、S440K、S440L、S440M、S440N、S440P、S440Q、S440R、S440T、S440V、S440W或S440Y；和
(xix)K447D、K447E、K447N、K447Q或K447缺失。
145.根据权利要求144所述的复合体，其中修饰的Fc区包含选自以下的一个或多个氨基酸修饰：
(i)P247G；
(ii)I253L、I253N、I253V或I253Q；
(iii)S254L；
(iv)H310P、H310W或H310Q；
(v)Q311E、Q311L、Q311R或Q311W；
(vi)E345A、E345D、E345G、E345H、E345F、E345I、E345K、E345L、E345M、E345N、E345P、E345Q、E345R、E345S、E345T、E345V、E345W或E345Y；
(vii)D/E356R；
(viii)T359R；
(ix)E382K、E382L、E382V、E382D、E382Q或E382S；
(x)G385D、G385N、G385R、G385E或G385K；
(xi)Q386K；
(xii)E430A、E430D、E430F、E430G、E430H、E430I、E430K、E430L、E430M、E430N、E430P、E430Q、E430R、E430S、E430T、E430V、E430W或E430Y；
(xiii)H433R；
(xiv)N434K、N434R、N434W、N434H或N434Q；
(xv)Y436I、Y436S、Y436T、Y436V、Y436N或Y436Q；
(xvi)Q438C、Q438L、Q438S、Q438T或Q438N；
(xvii)K439D、K439E、K439H、K439R或K439Q；
(xviii)S440D、S440E、S440Q、S440W或S440Y；和
(xix)K447D、K447E、K447N、K447Q或K447缺失。
146.根据权利要求144所述的复合体，其中修饰的Fc区包含选自以下的一个或多个氨基酸修饰：
(i)P247D、P247F、P247G、P247K、P247R或P247S；
(ii)I253V；
(iii)S254G、S254I或S254L；
(iv)Q311I、Q311K、Q311L、Q311P或Q311W；
(v)E345A、E345C、E345F、E345I、E345K、E345L、E345M、E345N、E345P、E345S、E345T、E345V、E345W或E345Y；
(vi)D/E356I、D/E356L、D/E356R、D/E356T或D/E356V；
(vii)T359N；
(viii)E382L或E382V；
(ix)G385A、G385D、G385H、G385I、G385L、G385N、G385P、G385Q、G385R、G385S、G385T、G385V、G385E、G385K、G385W或G385Y；
(x)Q386K；
(xi)E430A、E430F、E430H、E430L、E430P、E430R、E430S、E430V、E430W或E430Y；
(xii)N434W；
(xiii)Y436I；和
(xiv)S440D。
147.根据权利要求144或145所述的复合体，其中修饰的Fc区包含人IgG1Fc区内选自E345R、E430G和S440Y的一个或多个氨基酸置换(EU编号)。
148.根据权利要求147所述的复合体，其中修饰的Fc区包含人IgG1Fc区内选自E345R、E430G和S440Y的单氨基酸置换(EU编号)。
149.根据权利要求147所述的复合体，其中修饰的Fc区包含选自(a)E345R和E430G、(b)E345R和S440Y、(c)E430G和S440Y的氨基酸置换组，其中置换在人IgG1Fc区内(EU编号)。
150.根据权利要求147所述的复合体，其中修饰的Fc区包含人IgG1Fc区内的氨基酸置换E345R、E430G和S440Y(EU编号)。
151.根据权利要求121-150中任一项所述的复合体，其中Fc区还包含减弱效应子功能的修饰。
152.根据权利要求151所述的复合体，其中减弱效应子功能的修饰包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基(EU编号)处的氨基酸置换：
(a)人IgG1Fc区内的氨基酸残基297，
(b)人IgG1Fc区内的氨基酸残基234和235，
(c)人IgG1Fc区内的氨基酸残基234、235和329，
(d)人IgG2Fc区内的氨基酸残基234和237，
(e)人IgG4Fc区内的氨基酸残基235、237和318，
(f)人IgG4Fc区内的氨基酸残基228和236，
(g)人IgG2Fc区内的氨基酸残基268、309、330和331，
(h)人IgG1Fc区内的氨基酸残基220、226、229和238，
(i)人IgG1Fc区内的氨基酸残基226、229、233、234和235，
(j)人IgG1Fc区内的氨基酸残基234、235和331，
(k)人IgG1Fc区内的氨基酸残基226和230和
(l)人IgG1Fc区内的氨基酸残基267和328。
153.根据权利要求151或152所述的复合体，其中减弱效应子功能的修饰包含选自以下的一个或多个氨基酸置换(EU编号)：
(a)人IgG1Fc区内的N297A，
(b)人IgG1Fc区内的L234A和L235A，
(c)人IgG1Fc区内的L234A、L235A和P329G，
(d)人IgG2Fc区内的V234A和G237A，
(e)人IgG4Fc区内的L235A、G237A和E318A，
(f)人IgG4Fc区内的S228P和L236E，
(g)人IgG2Fc区内的118至260或人IgG4的Fc区内的261至447，
(h)人IgG2Fc区内的H268Q、V309L、A330S和A331S，
(j)人IgG1Fc区内的C220S、C226S、C229S和P238S，
(j)人IgG1Fc区内的C226S、C229S、E233P、L234V和L235A，
(k)人IgG1Fc区内的L234F、L235E和P331S，
(l)人IgG1Fc区内的C226S和P230S，和
(m)人IgG1Fc区内的S267E和L328F。
154.根据权利要求151-153中任一项所述的复合体，其中减弱效应子功能的修饰不导致修饰Fc区的糖基化模式。
155.根据权利要求121-154中任一项所述的复合体，其中复合体增强由所述复合体结合的细胞表面受体介导的信号转导。
156.核酸，其编码根据权利要求1至36或121至155中任一项所述的复合体、根据权利要求89所述的六聚体或根据权利要求37至88中任一项所述的抗原结合多肽。
157.载体，其包含根据权利要求156所述的核酸。
158.根据权利要求157所述的载体，其中载体是表达载体。
159.宿主细胞，其包含根据权利要求157或158所述的载体。
160.根据权利要求159所述的宿主细胞，其中宿主细胞是原核的。
161.根据权利要求159所述的宿主细胞，其中宿主细胞是真核的。
162.产生具有激动剂活性的抗原结合多肽的方法，包括在适于表达核酸的条件下培养根据权利要求159-161中任一项所述的宿主细胞，所述核酸编码根据权利要求1至36或121至155中任一项所述的复合体、根据权利要求89所述的六聚体或根据权利要求37至88中任一项所述的抗原结合多肽。
163.根据权利要求162所述的方法，还包括从宿主细胞回收所述复合体、六聚体或多肽。
164.药物组合物，其包含根据权利要求1至36或121至155中任一项所述的复合体、根据权利要求89所述的六聚体或根据权利要求37至88中任一项所述的抗原结合多肽和可药用载体。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111426845A (zh) * 2020-04-07 2020-07-17 中拓生物有限公司 一种血清载脂蛋白b测定试剂盒及其制备方法和应用
CN112839958A (zh) * 2018-05-03 2021-05-25 根马布私人有限公司 抗体变体组合及其用途

Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG10201708048XA (en) 2013-03-18 2017-10-30 Biocerox Prod Bv Humanized anti-cd134 (ox40) antibodies and uses thereof
WO2015153514A1 (en) 2014-03-31 2015-10-08 Genentech, Inc. Combination therapy comprising anti-angiogenesis agents and ox40 binding agonists
MA41460A (fr) 2015-02-03 2017-12-12 Oncomed Pharm Inc Agents de liaison à la tnfrsf et leurs utilisations
AU2016329120B2 (en) 2015-10-02 2023-04-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antibodies specific for a costimulatory TNF receptor
AU2017325654A1 (en) * 2016-08-02 2019-02-14 Visterra, Inc. Engineered polypeptides and uses thereof
EP3494139B1 (en) 2016-08-05 2022-01-12 F. Hoffmann-La Roche AG Multivalent and multiepitopic anitibodies having agonistic activity and methods of use
SG11201900744SA (en) * 2016-08-12 2019-02-27 Janssen Biotech Inc Fc engineered anti-tnfr superfamily member antibodies having enhanced agonistic activity and methods of using them
BR112019005895A2 (pt) 2016-09-23 2019-06-11 Merus N.V. moléculas de ligação que modulam uma atividade biológica expressa por uma célula
JP7277363B2 (ja) * 2016-11-01 2023-05-18 ジェンマブ ビー．ブイ． ポリペプチド変異体およびその使用
EP3555134A2 (en) * 2016-12-19 2019-10-23 Glenmark Pharmaceuticals S.A. Novel tnfr agonists and uses thereof
BR112019013940A2 (pt) * 2017-01-06 2020-02-11 Iovance Biotherapeutics, Inc. Método de tratar um câncer com uma população de linfócitos infiltrantes de tumor, processo para preparação de uma população de linfócitos infiltrantes de tumor, população de linfócitos infiltrantes de tumor, e, composição farmacêutica.
US20220213206A1 (en) * 2017-02-06 2022-07-07 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Compositions and methods for augmenting antibody mediated receptor signaling
SG11201906961UA (en) 2017-02-10 2019-08-27 Genmab Bv Polypeptide variants and uses thereof
EP3601358B1 (en) 2017-08-03 2023-05-17 Alector LLC Anti-trem2 antibodies and methods of use thereof
CN111247171A (zh) 2017-10-14 2020-06-05 西托姆克斯治疗公司 抗体、可活化抗体、双特异性抗体和双特异性可活化抗体及其使用方法
EP3712180A4 (en) * 2017-11-16 2021-08-11 Orum Therapeutics Inc. RAS INHIBITOR ANTIBODIES ACTIVATED IN A CELL BY INTERNALIZATION IN CYTOSOL OF THE CELL, AND ITS USE
US20210107988A1 (en) * 2018-01-24 2021-04-15 Genmab B.V. Polypeptide variants and uses thereof
AU2019240247A1 (en) * 2018-03-21 2020-10-15 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Fc variant compositions and methods of use thereof
US20220195045A1 (en) 2018-08-03 2022-06-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule containing two antigen-binding domains that are linked to each other
EP3946423A1 (en) * 2019-03-29 2022-02-09 Universität Zürich Fc-modified biologicals for local delivery to compartments, in particular to the cns
WO2021154046A1 (ko) * 2020-01-29 2021-08-05 고려대학교 산학협력단 pH-감응성 FC 변이체
EP4110389A1 (en) * 2020-02-28 2023-01-04 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Selective modulation of transforming growth factor beta superfamily signaling via multi-specific antibodies
US20230140384A1 (en) 2020-03-09 2023-05-04 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies to cd40 with enhanced agonist activity
CN115515975A (zh) * 2020-05-21 2022-12-23 兹杜斯生命科学有限公司 Fc变体及其制备

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103476795A (zh) * 2011-03-29 2013-12-25 罗切格利卡特公司 抗体Fc 变体
WO2014006217A1 (en) * 2012-07-06 2014-01-09 Genmab B.V. Dimeric protein with triple mutations

Family Cites Families (123)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
CU22545A1 (es) 1994-11-18 1999-03-31 Centro Inmunologia Molecular Obtención de un anticuerpo quimérico y humanizado contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico para uso diagnóstico y terapéutico
USRE30985E (en) 1978-01-01 1982-06-29 Serum-free cell culture media
US4419446A (en) 1980-12-31 1983-12-06 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant DNA process utilizing a papilloma virus DNA as a vector
US4601978A (en) 1982-11-24 1986-07-22 The Regents Of The University Of California Mammalian metallothionein promoter system
US4560655A (en) 1982-12-16 1985-12-24 Immunex Corporation Serum-free cell culture medium and process for making same
US4657866A (en) 1982-12-21 1987-04-14 Sudhir Kumar Serum-free, synthetic, completely chemically defined tissue culture media
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4767704A (en) 1983-10-07 1988-08-30 Columbia University In The City Of New York Protein-free culture medium
US4943533A (en) 1984-03-01 1990-07-24 The Regents Of The University Of California Hybrid cell lines that produce monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
US4965199A (en) 1984-04-20 1990-10-23 Genentech, Inc. Preparation of functional human factor VIII in mammalian cells using methotrexate based selection
GB8516415D0 (en) 1985-06-28 1985-07-31 Celltech Ltd Culture of animal cells
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
US4927762A (en) 1986-04-01 1990-05-22 Cell Enterprises, Inc. Cell culture medium with antioxidant
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
ATE135397T1 (de) 1988-09-23 1996-03-15 Cetus Oncology Corp Zellenzuchtmedium für erhöhtes zellenwachstum, zur erhöhung der langlebigkeit und expression der produkte
JP2919890B2 (ja) 1988-11-11 1999-07-19 メディカル リサーチ カウンスル 単一ドメインリガンド、そのリガンドからなる受容体、その製造方法、ならびにそのリガンドおよび受容体の使用
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
ATE135373T1 (de) 1989-09-08 1996-03-15 Univ Johns Hopkins Modifikationen der struktur des egf-rezeptor-gens in menschlichen glioma
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5122469A (en) 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
US5264365A (en) 1990-11-09 1993-11-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Protease-deficient bacterial strains for production of proteolytically sensitive polypeptides
US5508192A (en) 1990-11-09 1996-04-16 Board Of Regents, The University Of Texas System Bacterial host strains for producing proteolytically sensitive polypeptides
ATE164395T1 (de) 1990-12-03 1998-04-15 Genentech Inc Verfahren zur anreicherung von proteinvarianten mit geänderten bindungseigenschaften
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
DK0590058T3 (da) 1991-06-14 2004-03-29 Genentech Inc Humaniseret heregulin-antistof
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
IE922437A1 (en) 1991-07-25 1993-01-27 Idec Pharma Corp Recombinant antibodies for human therapy
WO1993006217A1 (en) 1991-09-19 1993-04-01 Genentech, Inc. EXPRESSION IN E. COLI OF ANTIBODY FRAGMENTS HAVING AT LEAST A CYSTEINE PRESENT AS A FREE THIOL, USE FOR THE PRODUCTION OF BIFUNCTIONAL F(ab')2 ANTIBODIES
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
JPH07501451A (ja) 1991-11-25 1995-02-16 エンゾン・インコーポレイテッド 多価抗原結合タンパク質
AU661533B2 (en) 1992-01-20 1995-07-27 Astrazeneca Ab Quinazoline derivatives
EP1997894B1 (en) 1992-02-06 2011-03-30 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Biosynthetic binding protein for cancer marker
PT672141E (pt) 1992-10-23 2003-09-30 Immunex Corp Metodos de preparacao de proteinas oligomericas soluveis
WO1994011026A2 (en) 1992-11-13 1994-05-26 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human b lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of b cell lymphoma
GB9314893D0 (en) 1993-07-19 1993-09-01 Zeneca Ltd Quinazoline derivatives
ATE207366T1 (de) 1993-12-24 2001-11-15 Merck Patent Gmbh Immunokonjugate
US5679683A (en) 1994-01-25 1997-10-21 Warner-Lambert Company Tricyclic compounds capable of inhibiting tyrosine kinases of the epidermal growth factor receptor family
IL112249A (en) 1994-01-25 2001-11-25 Warner Lambert Co Pharmaceutical compositions containing di and tricyclic pyrimidine derivatives for inhibiting tyrosine kinases of the epidermal growth factor receptor family and some new such compounds
IL112248A0 (en) 1994-01-25 1995-03-30 Warner Lambert Co Tricyclic heteroaromatic compounds and pharmaceutical compositions containing them
WO1996003397A1 (en) 1994-07-21 1996-02-08 Akzo Nobel N.V. Cyclic ketone peroxide formulations
US5804396A (en) 1994-10-12 1998-09-08 Sugen, Inc. Assay for agents active in proliferative disorders
US5639635A (en) 1994-11-03 1997-06-17 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
DK0817775T3 (da) 1995-03-30 2001-11-19 Pfizer Quinazolinderivater
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
GB9508537D0 (en) 1995-04-27 1995-06-14 Zeneca Ltd Quinazoline derivatives
GB9508538D0 (en) 1995-04-27 1995-06-14 Zeneca Ltd Quinazoline derivatives
GB9508565D0 (en) 1995-04-27 1995-06-14 Zeneca Ltd Quiazoline derivative
US5747498A (en) 1996-05-28 1998-05-05 Pfizer Inc. Alkynyl and azido-substituted 4-anilinoquinazolines
CA2222231A1 (en) 1995-06-07 1996-12-19 Imclone Systems Incorporated Antibody and antibody fragments for inhibiting the growth of tumors
IL122855A (en) 1995-07-06 2004-08-31 Novartis Ag History of N-Phenyl (Alkyl) - 7H-Pyrolo [-3,2d] Pyrimidine - 4 Amine, their preparation and pharmaceutical preparations containing them
US5760041A (en) 1996-02-05 1998-06-02 American Cyanamid Company 4-aminoquinazoline EGFR Inhibitors
GB9603095D0 (en) 1996-02-14 1996-04-10 Zeneca Ltd Quinazoline derivatives
PT892789E (pt) 1996-04-12 2002-07-31 Warner Lambert Co Inibidores irreversiveis de quinases de tirosina
EP0975355A2 (en) 1996-06-14 2000-02-02 Smithkline Beecham Corporation Hexameric fusion proteins and uses therefor
US6391874B1 (en) 1996-07-13 2002-05-21 Smithkline Beecham Corporation Fused heterocyclic compounds as protein tyrosine kinase inhibitors
ID18494A (id) 1996-10-02 1998-04-16 Novartis Ag Turunan pirazola leburan dan proses pembuatannya
US6002008A (en) 1997-04-03 1999-12-14 American Cyanamid Company Substituted 3-cyano quinolines
UA73073C2 (uk) 1997-04-03 2005-06-15 Уайт Холдінгз Корпорейшн Заміщені 3-ціанохіноліни, спосіб їх одержання та фармацевтична композиція
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
DK0980244T3 (da) 1997-05-06 2003-09-29 Wyeth Corp Anvendelse af quinazoline forbindelser til behandling af polycystisk nyresygdom
ZA986729B (en) 1997-07-29 1999-02-02 Warner Lambert Co Irreversible inhibitors of tyrosine kinases
ZA986732B (en) 1997-07-29 1999-02-02 Warner Lambert Co Irreversible inhibitiors of tyrosine kinases
US5866527A (en) 1997-08-01 1999-02-02 Colgate Palmolive Company All purpose liquid cleaning compositions comprising anionic EO nonionic and EO-BO nonionic surfactants
TW436485B (en) 1997-08-01 2001-05-28 American Cyanamid Co Substituted quinazoline derivatives
AU1308799A (en) 1997-11-06 1999-05-31 American Cyanamid Company Use of quinazoline derivatives as tyrosine kinase inhibitors for treating colonic polyps
US6610833B1 (en) 1997-11-24 2003-08-26 The Institute For Human Genetics And Biochemistry Monoclonal human natural antibodies
ES2375931T3 (es) 1997-12-05 2012-03-07 The Scripps Research Institute Humanización de anticuerpo murino.
JP2002510481A (ja) 1998-04-02 2002-04-09 ジェネンテック・インコーポレーテッド 抗体変異体及びその断片
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
IL127127A0 (en) 1998-11-18 1999-09-22 Peptor Ltd Small functional units of antibody heavy chain variable regions
IL143089A0 (en) 1998-11-19 2002-04-21 Warner Lambert Co N-[4-(3-chloro-4-fluoro-phenylamino)-7-(3-morpholin-4-yl-propoxy)-quinazolin-6-yl]-acrylamide, an irreversible inhibitor of tyrosine kinases
JP2003512019A (ja) 1999-01-15 2003-04-02 ジェネンテック・インコーポレーテッド 変化したエフェクター機能を有するポリペプチド変異体
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
WO2001044463A1 (en) 1999-12-15 2001-06-21 Genentech, Inc. Shotgun scanning, a combinatorial method for mapping functional protein epitopes
JP2003531588A (ja) 2000-04-11 2003-10-28 ジェネンテック・インコーポレーテッド 多価抗体とその用途
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
CN101940189A (zh) 2000-11-30 2011-01-12 米德列斯公司 用于生产人类抗体的转基因转染色体啮齿动物
US8372954B2 (en) 2000-12-22 2013-02-12 National Research Council Of Canada Phage display libraries of human VH fragments
JP2005289809A (ja) 2001-10-24 2005-10-20 Vlaams Interuniversitair Inst Voor Biotechnologie Vzw (Vib Vzw) 突然変異重鎖抗体
AU2003239966B9 (en) 2002-06-03 2010-08-26 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
NZ536746A (en) 2002-06-13 2007-02-23 Crucell Holland Bv An agonistic antibody or fragment thereof that immunospecifically binds and stimulates the human OX40-receptor
PL212899B1 (pl) 2002-12-16 2012-12-31 Genentech Inc Humanizowane przeciwcialo, kompozycja zawierajaca to przeciwcialo, wyrób fabryczny, przeciwcialo lub jego fragment do zastosowania w sposobie indukowania apoptozy, izolowany kwas nukleinowy, wektor ekspresji, komórka gospodarza, sposób wytwarzania przeciwciala lub jego fragmentu, plynny preparat i zastosowanie przeciwciala do wytwarzania leku
EP1585767A2 (en) 2003-01-16 2005-10-19 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
SI1639011T1 (sl) 2003-06-30 2009-04-30 Domantis Ltd Pegilirana protitelesa z enojno domeno (dAb)
JP5128935B2 (ja) 2004-03-31 2013-01-23 ジェネンテック， インコーポレイテッド ヒト化抗ＴＧＦ−β抗体
US7785903B2 (en) 2004-04-09 2010-08-31 Genentech, Inc. Variable domain library and uses
EP2360186B1 (en) 2004-04-13 2017-08-30 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-P-selectin antibodies
TWI309240B (en) 2004-09-17 2009-05-01 Hoffmann La Roche Anti-ox40l antibodies
CA2585776A1 (en) 2004-10-29 2006-05-11 University Of Southern California Combination cancer immunotherapy with co-stimulatory molecules
DK1877090T3 (da) 2005-05-06 2014-04-14 Providence Health System Trimert ox40-immunoglobulin-fusionsprotein og fremgangsmåder til anvendelse heraf
DK2161336T4 (en) 2005-05-09 2017-04-24 Ono Pharmaceutical Co Human monoclonal antibodies for programmed death 1 (PD-1) and methods for treating cancer using anti-PD-1 antibodies alone or in combination with other immunotherapies
EP1907424B1 (en) 2005-07-01 2015-07-29 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Human monoclonal antibodies to programmed death ligand 1 (pd-l1)
EP1957531B1 (en) 2005-11-07 2016-04-13 Genentech, Inc. Binding polypeptides with diversified and consensus vh/vl hypervariable sequences
EP1973951A2 (en) 2005-12-02 2008-10-01 Genentech, Inc. Binding polypeptides with restricted diversity sequences
TW200812616A (en) 2006-05-09 2008-03-16 Genentech Inc Binding polypeptides with optimized scaffolds
PL2059533T3 (pl) 2006-08-30 2013-04-30 Genentech Inc Przeciwciała wieloswoiste
WO2008049227A1 (en) 2006-10-27 2008-05-02 Sunnybrook Health Sciences Center Multimeric tie 2 agonists and uses thereof in stimulating angiogenesis
CN100592373C (zh) 2007-05-25 2010-02-24 群康科技(深圳)有限公司 液晶显示面板驱动装置及其驱动方法
MX2010006466A (es) 2007-12-14 2010-09-28 Bristol Myers Squibb Co Moleculas de union al receptor ox40 de humano.
US8592562B2 (en) 2008-01-07 2013-11-26 Amgen Inc. Method for making antibody Fc-heterodimeric molecules using electrostatic steering effects
RU2531758C2 (ru) 2008-02-11 2014-10-27 Куретек Лтд. Моноклональные антитела для лечения опухолей
US8168757B2 (en) 2008-03-12 2012-05-01 Merck Sharp & Dohme Corp. PD-1 binding proteins
CA2755238C (en) 2008-07-07 2017-06-27 Rich Products Corporation Method for treatment and storage of platelets
PE20110308A1 (es) 2008-07-08 2011-06-10 Incyte Corp 1,2,5-oxadiazoles como inhibidores de indolamina 2,3-dioxigenasa
US20110223188A1 (en) 2008-08-25 2011-09-15 Solomon Langermann Targeted costimulatory polypeptides and methods of use to treat cancer
PL2376535T3 (pl) 2008-12-09 2017-09-29 F.Hoffmann-La Roche Ag Przeciwciała ANTY-PD-L1 i ich zastosowanie do nasilania działania limfocytów T
JP2013512251A (ja) 2009-11-24 2013-04-11 アンプリミューン、インコーポレーテッド Ｐｄ−ｌ１／ｐｄ−ｌ２の同時阻害
EA029793B1 (ru) 2010-08-23 2018-05-31 Борд Оф Риджентс, Дзе Юниверсити Оф Техас Систем Антитела к ох40 и способы их применения
UA117901C2 (uk) 2011-07-06 2018-10-25 Ґенмаб Б.В. Спосіб посилення ефекторної функції вихідного поліпептиду, його варіанти та їх застосування
US20140194826A1 (en) 2011-07-07 2014-07-10 Novo Nordisk A/S Drug delivery injection pen with add-on dose capturing and display module
CN103946238B (zh) 2011-08-23 2016-10-12 德克萨斯州立大学董事会 抗ox40抗体及使用其的方法
GB201116092D0 (en) 2011-09-16 2011-11-02 Bioceros B V Antibodies and uses thereof
US8952134B2 (en) * 2011-09-26 2015-02-10 Jn Biosciences Llc Hybrid constant regions
WO2014022592A1 (en) * 2012-08-02 2014-02-06 Jn Biosciences Llc Antibodies or fusion proteins multimerized via cysteine mutation and a mu tailpiece
CA2896955C (en) 2013-01-10 2023-10-31 Genmab B.V. Human igg1 fc region variants and uses thereof
SG10201708048XA (en) 2013-03-18 2017-10-30 Biocerox Prod Bv Humanized anti-cd134 (ox40) antibodies and uses thereof

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103476795A (zh) * 2011-03-29 2013-12-25 罗切格利卡特公司 抗体Fc 变体
WO2014006217A1 (en) * 2012-07-06 2014-01-09 Genmab B.V. Dimeric protein with triple mutations

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MORRIS, NP等: ""Development and characterization of recombinant human Fc : OX40L fusion protein linked via a coiled-coil trimerization domain"", 《MOLECULAR IMMUNOLOGY》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112839958A (zh) * 2018-05-03 2021-05-25 根马布私人有限公司 抗体变体组合及其用途
CN111426845A (zh) * 2020-04-07 2020-07-17 中拓生物有限公司 一种血清载脂蛋白b测定试剂盒及其制备方法和应用
CN111426845B (zh) * 2020-04-07 2021-06-15 中拓生物有限公司 一种血清载脂蛋白b测定试剂盒及其制备方法和应用

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