CN110382542B

CN110382542B - 针对共刺激性tnf受体的双特异性抗原结合分子

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Publication number: CN110382542B
Application number: CN201880015464.6A
Authority: CN
Inventors: M·阿曼; S·格雷-理查兹; C·克莱恩; M·平查; P·乌玛娜
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2017-03-29
Filing date: 2018-03-27
Publication date: 2023-06-09
Anticipated expiration: 2038-03-27
Also published as: JP7205995B2; US20200277392A1; EP3601346A1; JP2020515541A; CN110382542A; US11453722B2; WO2018178076A1

Abstract

本发明涉及新颖的双特异性抗原结合分子,其包含(a)至少一个能够特异性结合OX40的模块,和(b)至少一个能够特异性结合生腱蛋白C(TnC)的模块,及生成这些分子的方法和使用它们的方法。

Description

针对共刺激性TNF受体的双特异性抗原结合分子

发明领域

本发明涉及新颖的双特异性抗原结合分子,其包含(a)至少一个能够特异性结合OX40的模块,和(b)至少一个能够特异性结合生腱蛋白C(TnC)的模块。本发明进一步涉及生成这些分子的方法和使用它们的方法。

发明背景

肿瘤坏死因子受体(TNFR)家族的数个成员在初始T细胞活化后发挥维持T细胞应答的功能且因此在免疫***的组织和功能中具有关键作用。CD27,4-1BB(CD137),OX40(CD134),HVEM,CD30,和GITR可对T细胞具有共刺激效果,这意味着它们在初始T细胞活化之后维持T细胞应答(Watts T.H.(2005)Annu.Rev.Immunol.23,23-68)。这些共刺激性TNFR家族成员的效果常常可以是与CD28的效果和彼此在功能上,在时间上,或在空间上隔离的。不同共刺激物对T细胞激活/存活信号的顺序和瞬时调节可能发挥功能,容许应答长存同时维持对T细胞存活的紧密控制。取决于疾病条件,经共刺激性TNF家族成员的刺激可加重或减轻疾病。尽管有这些复杂性,刺激或阻断TNFR家族共刺激物显示数种治疗性应用的希望,包括癌症,感染性疾病,移植,和自身免疫。

在数种共刺激分子中,肿瘤坏死因子(TNF)受体家族成员OX40(CD134)在效应和记忆T细胞的存活和稳态中发挥关键作用(Croft M.et al.(2009),Immunological Reviews229,173-191)。OX40(CD134)在数种类型的细胞中表达且调节针对感染,肿瘤和自身抗原的免疫应答,而且已经证明它在T细胞,NKT细胞和NK细胞以及嗜中性粒细胞的表面上的表达(Baumann R.et al.(2004),Eur.J.Immunol.34,2268-2275)且显示出响应多种刺激信号而严格可诱导地或强烈地上调。该分子的功能活性已经在每一种OX40表达性细胞类型中证明,提示在体内OX40介导的活性的复杂调节。与T细胞受体触发组合,T细胞上由其天然配体或激动性抗体实现的OX40啮合引起PI3K和NFκB信号传导途径的协同激活(Song J.et al.(2008)J.Immunology 180(11),7240-7248)。继而,这对活化的T细胞导致增强的增殖,升高的细胞因子受体和细胞因子生成及更好的存活。在它在效应CD4⁺或CD8⁺T细胞中的共刺激性活性以外,OX40触发最近显示抑制T调节细胞的发育和免疫抑制性功能。这种效果有可能至少部分对增强OX40对抗肿瘤或抗微生物免疫应答的活性负有责任。鉴于OX40卷入能扩充T细胞群体,促进细胞因子分泌,和支持T细胞记忆,激动剂包括抗体和可溶性形式的配体OX40L已经成功用于多种临床前肿瘤模型(Weinberg et al.(2000),J.Immunol.164,2160-2169)。

可用的临床前和临床数据清楚地表明,能够诱导和增强有效的针对癌症的内源免疫应答的,共刺激性TNFR家族成员诸如Ox40和4-1BB的有效激动剂的临床需求很高。然而,效果几乎从未限于单一细胞类型或经由单一机制的作用,而且设计用于阐明细胞间和细胞内信号传导机制的研究揭示了水平增长中的复杂性。如此,需要优选作用于单一细胞类型的“靶向”激动剂。本发明的抗原结合分子将能够优选地与肿瘤特异性或肿瘤相关靶标结合的模块与能够激动性结合共刺激性TNF受体的模块组合。本发明的抗原结合分子可能能够不仅有效触发TNF受体,而且非常选择性地在期望部位触发TNF受体,由此减轻不想要的副作用。

生腱蛋白是在脊椎动物中找到的,较大多聚体细胞外基质(ECM)糖蛋白的一个高度保守的家族。已经在哺乳动物中鉴定出四种生腱蛋白旁系同源物(paralogue),称作生腱蛋白-C(TnC),生腱蛋白-R,生腱蛋白-X和生腱蛋白-W。生腱蛋白家族蛋白质具有共同的一级结构,其包含N端七段重复,表皮生长因子(EGF)样重复,纤连蛋白III型结构域重复和C端纤连蛋白样球状结构域。经由N端寡聚化结构域,亚基个体装配成三聚体,或在生腱蛋白-C的情况中,装配成六聚体。

哺乳动物TnC单体通常具有由所有TnC同等型共享的14.5个EGF样重复和8个纤连蛋白III型结构域重复。然而,通过可变剪接,能独立包括或排除多至9个另外的纤连蛋白III型结构域重复(结构域A1至D),产生多种TnC同等型(参见例如Hsia and Schwarzbauer,J Biol Chem 280,26641-26644(2005))。

TnC在发育的胚胎中瞬时表达,但是在成年组织中实际上缺失。然而,它在经历重塑过程的组织中再现,包括某些病理状况,诸如伤口愈合,炎症和癌症(综述Chiquet-Ehrismann&Chiquet,J Pathol 200,488-499(2003))。

重要的是,TnC在大多数恶性实体瘤中高度表达,包括脑,***/乳腺,结肠,肺,皮肤和其它器官的肿瘤(综述Orend and Chiquet-Ehrismann,Cancer Letters 244,143-163(2006)),在那里它可以由转化的上皮细胞以及肿瘤微环境中的基质细胞表达(Yoshida etal.,J Pathol 182,421-428(1997),Hanamura et al.,Int J Cancer 73,10-15(1997))。特别地,含有可变剪接结构域A1至D的TnC“较大同等型”在侵入性癌瘤中表达,而在健康成年组织中几乎检测不到(Borsi et al.,Int J Cancer 52,688-692(1992),Carnemolla etal.,Eur J Biochem 205,561-567(1992))。

它的表达样式使得TnC(特别是它的可变剪接结构域)成为肿瘤靶向应用的一种有希望抗原,而且因此开发了针对该蛋白质中数种结构域的一些抗体(参见例如Brack etal.,Clin Cancer Res 12,3200-3208(2006)或EP 1 817 345,描述针对TnC的A1结构域的抗体；Silacci et al.,Prot Eng Des Sel 19,471-478(2006)或EP 1 173 766,描述针对TnC的C结构域的抗体；Wang et al.,Hybridoma 29,13-16(2010),描述针对TnC的D结构域的抗体；或Balza et al.,FEBS 332,39-43(1993),描述针对人生腱蛋白不同结构域的数种抗体)。最近,还描述了识别人TnC的A2结构域中特定表位的抗体(WO 2009/089998和WO2012/020038)。

发明概述

本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其包含

(a)至少一个能够特异性结合OX40的模块,其包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH),和

(b)至少一个能够特异性结合生腱蛋白C(TnC)的模块,其包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。

由于它们针对TnC的结合能力,本发明的新颖的双特异性抗原结合分子能够在TnC表达的位点处非常选择性地触发OX40。副作用因此可能剧烈降低。

在一些实施方案中,该双特异性抗原结合分子另外包含

(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc区。

在一些实施方案中,该能够特异性结合OX40的模块结合包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或由其组成的多肽。

在一些实施方案中,该能够特异性结合TnC的模块结合包含SEQ IDNO:39的氨基酸序列或由其组成的多肽。

在一些实施方案中,该能够特异性结合OX40的模块包含重链可变域(VH),其包含

(i)包含选自由SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3组成的组的氨基酸序列的CDR-H1,

(ii)包含选自由SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5组成的组的氨基酸序列的CDR-H2,和

(iii)包含选自由SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,SEQ IDNO:10,SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12组成的组的氨基酸序列的CDR-H3,

和轻链可变域(VL),其包含

(iv)包含选自由SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15组成的组的氨基酸序列的CDR-L1,

(v)包含选自由SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18组成的组的氨基酸序列的CDR-L2,和

(vi)包含选自由SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:22,SEQID NO:23和SEQ ID NO:24组成的组的氨基酸序列的CDR-L3。

在一些实施方案中,该能够特异性结合OX40的模块包含包含与选自由SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:29,SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:35和SEQ IDNO:37组成的组的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的重链可变区(VH)和包含与选自由SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:28,SEQ ID NO:30,SEQ IDNO:32,SEQ ID NO:34,SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:38组成的组的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。

在一些实施方案中,该能够特异性结合OX40的模块包含

(i)包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的VL,

(ii)包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的VL,

(iii)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的VL,

(iv)包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的VL,

(v)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VL,

(vi)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的VL,或

(vii)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的VL。

在一些实施方案中,该能够特异性结合TnC的模块包含包含下述各项的VH:

(i)包含选自由SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:41组成的组的氨基酸序列的CDR-H1,

(ii)包含选自由SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:43组成的组的氨基酸序列的CDR-H2,和

(iii)包含选自由SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45组成的组的氨基酸序列的CDR-H3,

和包含下述各项的VL:

(iv)包含选自由SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:47组成的组的氨基酸序列的CDR-L1,

(v)包含选自由SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49组成的组的氨基酸序列的CDR-L2,和

(vi)包含选自由SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:51组成的组的氨基酸序列的CDR-L3。

在一些实施方案中,该能够特异性结合TnC的模块包含包含与选自由SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:54组成的组的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VH和包含与选自由SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:55组成的组的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VL。

在一些实施方案中,该能够特异性结合TnC的模块包含

(i)包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的VL,或

(ii)包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的VL。

在一些实施方案中,该双特异性抗原结合分子包含

(i)至少一个能够特异性结合OX40的模块,其包含包含与SEQ ID NO:25,SEQ IDNO:27,SEQ ID NO:29,SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:37的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VH和包含与选自由SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:28,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:34,SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:38组成的组的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VL,和

(ii)至少一个能够特异性结合TnC的模块,其包含包含与选自由SEQ ID NO:52或SEQ ID NO:54组成的组的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VH和包含与选自由SEQ ID NO:53或SEQ ID NO:55组成的组的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VL。

在一些实施方案中,该双特异性抗原结合分子包含

(a)至少一个能够特异性结合OX40的模块,其包含包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的VL,和

(b)至少一个能够特异性结合TnC的模块,其包含

在一些实施方案中,该Fc区是IgG,特别是IgG1 Fc区或IgG4 Fc区。

在一些实施方案中,该Fc区包含一处或多处降低抗体对Fc受体的结合亲和力和/或效应器功能的氨基酸替代。

在一些实施方案中,该Fc区是人IgG1亚类的,具有氨基酸突变L234A,L235A和P329G(编号方式依照Kabat EU索引)。

在一些实施方案中,该Fc区包含促进Fc区的第一和第二亚基联合的修饰。

在一些实施方案中,依照节入穴方法该Fc区的第一亚基包含节且该Fc区的第二亚基包含穴。

在一些实施方案中,该Fc区的第一亚基包含氨基酸替代S354C和T366W(编号方式依照Kabat EU索引)且该Fc区的第二亚基包含氨基酸替代Y349C,T366S和Y407V(编号方式依照Kabat EU索引)。

在一些实施方案中,该双特异性抗原结合分子包含

(a)至少两个能够特异性结合OX40的Fab片段,其连接至该Fc区,和

(b)至少一个能够特异性结合TnC的模块,其包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH),连接至该Fc区的C端。

在一些实施方案中,该双特异性抗原结合分子包含

(a)包含两个能够特异性结合OX40的Fab片段和Fc区的抗体的两条轻链和两条重链,和

(b)能够特异性结合TnC的模块的VH和VL,其中该VH连接至(a)的两条重链之一的C端,且其中该VL连接至(a)的两条重链之另一的C端。

在一些实施方案中,该双特异性抗原结合分子包含

(b)两个能够特异性结合TnC的Fab片段,其中该Fab片段之一连接至(a)的两条重链之一的C端,且该Fab片段之另一连接至(a)的两条重链之另一的C端。

在一些实施方案中,该双特异性抗原结合分子包含

(a1)两条重链,每条重链包含能够特异性结合OX40的Fab片段的VH和CH1域和Fc区亚基,

(a2)两条轻链,每条轻链包含能够特异性结合OX40的Fab片段的VL和CL域,和

(b)能够特异性结合TnC的模块的VH和VL,其中该VH连接至(a1)的两条重链之一的C端,且其中该VL连接至(a1)的两条重链之另一的C端。

在一些实施方案中,该双特异性抗原结合分子包含

(a1)两条重链,每条重链包含能够特异性结合OX40的Fab片段的VH和CH1域,和Fc区亚基,

(a2)两条轻链,每条轻链包含能够特异性结合OX40的Fab片段的VL和CL域,(b)两个能够特异性结合TnC的Fab片段,其中该Fab片段之一连接至(a1)的两条重链之一的C端,且该Fab片段之另一连接至(a1)的两条重链之另一的C端。

在一些实施方案中,该两个能够特异性结合TnC的Fab片段是交换Fab片段,每个包含VL-CH1链和VH-CL链,且其中该VL-CH1链之一连接至(a1)的两条重链之一的C端,且该VL-CH1链之另一连接至(a1)的两条重链之另一的C端。

在一些实施方案中,该双特异性抗原结合分子包含四个能够特异性结合OX40的Fab片段。

在一些实施方案中,(a)的两条重链每条包含能够特异性结合OX40的Fab片段的两个VH域和两个CH1域。

在一些实施方案中,一个或多个该能够特异性结合OX40的Fab片段包含包含精氨酸(R)作为位置123(EU编号方式)处的氨基酸和赖氨酸(K)作为位置124(EU编号方式)处的氨基酸的CL域,和

包含谷氨酸(E)作为位置147(EU编号方式)处的氨基酸和谷氨酸(E)作为位置213(EU编号方式)处的氨基酸的CH1域。

本发明还提供一种双特异性抗原结合分子,其包含

每条包含SEQ ID NO:213的氨基酸序列的两条重链,

每条包含SEQ ID NO:212的氨基酸序列的两条轻链,和

每条包含SEQ ID NO:214的氨基酸序列的两条轻链。

本发明还提供一种双特异性抗原结合分子,其包含

每条包含SEQ ID NO:215的氨基酸序列的两条重链,

每条包含SEQ ID NO:212的氨基酸序列的两条轻链,和

每条包含SEQ ID NO:216的氨基酸序列的两条轻链。

本发明还提供一种双特异性抗原结合分子,其包含

包含SEQ ID NO:222的氨基酸序列的第一重链,

包含SEQ ID NO:223的氨基酸序列的第二重链,和

每条包含SEQ ID NO:212的氨基酸序列的四条轻链。

本发明还提供一种双特异性抗原结合分子,其包含

每条包含SEQ ID NO:225的氨基酸序列的两条重链,

每条包含SEQ ID NO:224的氨基酸序列的四条轻链,和

每条包含SEQ ID NO:226的氨基酸序列的两条轻链。

本发明还提供一种多核苷酸,其编码本发明的双特异性抗原结合分子。

本发明还提供一种表达载体,其包含本发明的多核苷酸。

本发明还提供一种宿主细胞,其包含本发明的多核苷酸或表达载体。

本发明还提供一种生成双特异性抗原结合分子的方法,其包含在适合于该双特异性抗原结合分子表达的条件下培养本发明的宿主细胞,并分离该双特异性抗原结合分子。

本发明还提供一种药物组合物,其包含本发明的双特异性抗原结合分子和至少一种药学可接受赋形剂。

本发明还提供本发明的双特异性抗原结合分子或本发明的药物组合物,用作药物。

本发明还提供本发明的双特异性抗原结合分子或本发明的药物组合物,其用于

(i)刺激T细胞应答,

(ii)支持激活的T细胞的存活,

(iii)治疗感染,

(iv)治疗癌症,

(v)延迟癌症进展,或

(vi)延长罹患癌症的患者的存活。

本发明还提供本发明的双特异性抗原结合分子或本发明的药物组合物,其用于治疗癌症。

本发明还提供本发明的双特异性抗原结合分子或本发明的药物组合物在制造用于治疗癌症的药物中的用途。

本发明还提供一种治疗具有癌症的个体的方法,其包含对该个体施用有效量的本发明的双特异性抗原结合分子或本发明的药物组合物。

本发明还提供本发明的双特异性抗原结合分子或本发明的药物组合物,其用于上调或延长细胞毒性T细胞活性。

本发明还提供本发明的双特异性抗原结合分子或本发明的药物组合物在制造用于上调或延长细胞毒性T细胞活性的药物中的用途。

本发明还提供一种在具有癌症的个体中上调或延长细胞毒性T细胞活性的方法,其包含对该个体施用有效量的本发明的双特异性抗原结合分子或本发明的药物组合物。

在依照本发明的各种方面的一些实施方案中,该个体是哺乳动物,特别是人。

附图简述

图1显示用于制备抗OX40抗体的单体形式的Fc连接的人OX40抗原ECD。

图2显示双特异性,二价抗OX40,二价抗TnC huIgG1 P329GLALA 2+2构建物的示意图。

图3A显示双特异性,四价抗OX40,单价抗TnC huIgG1 P329GLALA kih4+1构建物的示意图,而图3B显示双特异性,四价抗OX40,二价抗TnC huIgG1 P329GLALA 4+2构建物的示意图。带电荷的残基以星描绘。

图4A显示针对双特异性抗OX40,抗TnC抗原结合分子对人OX40和人TnC的同时结合的表面等离振子共振测定法的设置的示意图。图4B至4E显示双特异性抗OX40,抗TnC抗原结合分子对重组OX40 Fc(kih)受体和人TnC蛋白质的结合,如通过表面等离振子共振评估的。图4B显示包含抗OX40克隆49B4和抗TnC克隆11C7的‘2+2’分子的结合,图4C显示包含抗OX40克隆49B4和抗TnC克隆18D4的‘2+2’分子的结合,图4D显示包含抗OX40克隆49B4和抗TnC克隆18D4的‘4+1’分子的结合,而图4E显示包含抗OX40克隆49B4和抗TnC克隆18D4的‘4+2’分子的结合。

图5显示用于分析双特异性抗OX40,抗TnC抗原结合分子对人TnC,鼠TnC和食蟹猴TnC的结合的表面等离振子共振测定法的设置的示意图。

图6A至6D显示双特异性,二价抗OX40,二价抗TnC抗原结合分子(即2+2型式)对静息的和激活的人CD4+和CD8+T细胞的结合。图6A显示对激活的CD4+T细胞的结合,图6B显示对静息的CD4+T细胞的结合,图6C显示对激活的CD8+T细胞的结合,而图6D显示对静息的CD8+T细胞的结合。作为用作检测二抗的FITC缀合的抗人IgG F(ab')₂片段特异性山羊IgG F(ab`)2片段的中值荧光强度(MFI)显示结合。通过流式细胞术测量MFI并通过减去空白对照的MFI来修正基线。X轴显示抗原结合分子的浓度。所有抗原结合分子均包含结合激活的,OX40表达性人CD4+T细胞,且以较低程度结合激活的人CD8+T细胞的OX40结合域。OX40在静息的人PBMC上不表达(图6B和6D)。激活后,OX40在CD4+和CD8+T细胞上上调(图6A和6C)。人CD8+T细胞上的OX40表达比在CD4+T细胞上要低。

图7A至7D显示双特异性,四价抗OX40,单价或二价抗TnC抗原结合分子(即4+2或4+1型式)对静息的和激活的人CD4+和CD8+T细胞的结合。图7A显示对激活的CD4+T细胞的结合,图7B显示对静息的CD4+T细胞的结合,图7C显示对激活的CD8+T细胞的结合,而图7D显示对静息的CD8+T细胞的结合。作为用作检测二抗的FITC缀合的抗人IgG F(ab')₂片段特异性山羊IgG F(ab`)2片段的中值荧光强度(MFI)显示结合。通过流式细胞术测量MFI并通过减去空白对照的MFI来修正基线。X轴显示抗原结合分子的浓度。所有包含OX40结合域的抗原结合分子均结合激活的,OX40表达性人CD4+T细胞。OX40在静息的人PBMC上不表达(图7B和7D)。激活后,OX40在CD4+和CD8+T细胞上上调(图7A和7C)。人CD8+T细胞上的OX40表达比在CD4+T细胞上要低。

图8显示WM226-4,U87-MG和CT26huTnC细胞上人FAP和人TnC的表达,如通过流式细胞术测定的。WM266-4细胞显示表达FAP但不表达TnC。U87-MG细胞显示表达FAP和TnC。CT26huTnC细胞显示表达TnC。

图9A至9C显示双特异性,二价抗OX40,二价抗TnC抗原结合分子(即2+2型式)对WM266-4,U87-MG和CT26huTnC细胞的结合。图9A显示对不表达TnC的WM266-4细胞的结合。图9B显示对表达TnC的U87-MG细胞的结合。图9C显示对表达TnC的CT26huTnC细胞的结合。作为异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗人IgG抗体或藻红蛋白(PE)标记的抗人IgG抗体检测二抗的中值荧光强度(MFI)显示结合,如通过流式细胞术测量的。x轴显示抗原结合分子的浓度。

图10A至10C显示双特异性,四价抗OX40,单价或二价抗TnC抗原结合分子(即4+2或4+1型式)对WM266-4,U87-MG和CT26huTnC细胞的结合。图10A显示对不表达TnC的WM266-4细胞的结合。图10B显示对表达TnC的U87-MG细胞的结合。图10C显示对表达TnC的CT26huTnC细胞的结合。作为异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗人IgG抗体或藻红蛋白(PE)标记的抗人IgG抗体检测二抗的中值荧光强度(MFI)显示结合,如通过流式细胞术测量的。x轴显示抗原结合分子的浓度。

图11A至11D显示在交联存在或缺失下双特异性,二价抗OX40,二价抗TnC抗原结合分子(即2+2型式)对NFκB的激活。图11A显示在交联缺失下OX40+HeLa报告细胞中的抗原结合分子所致NFκB激活。图11B显示在抗人Fc特异性二抗所致交联存在下OX40+HeLa报告细胞中的抗原结合分子所致NFκB激活。图11C显示在U87-MG细胞所致交联存在下OX40+HeLa报告细胞中的抗原结合分子所致NFκB激活。通过将在0.5s期间测量的释放光单位(URL)针对抗原结合分子(以nM计)的浓度绘图来表征NFκB介导的萤光素酶活性。由于萤光素酶介导的萤光素氧化成氧化萤光素而发射URL。通过减去‘空白对照’条件的URL对值进行基线修正。图11D显示以曲线下面积(AUC)呈现的图11A至11C的数据。

图12A至12C显示在U87-MG细胞所致交联存在或缺失下双特异性,四价抗OX40,单价或二价抗TnC抗原结合分子(即4+2或4+1型式),和双特异性,二价抗OX40,二价抗TnC(即2+2型式)对NFκB的激活。图11A显示在交联缺失下OX40+HeLa报告细胞中的抗原结合分子所致NFκB激活。图11B显示在U87-MG细胞所致交联存在下在OX40+HeLa报告细胞中抗原结合分子所致NFκB激活。通过将在0.5s期间测量的释放光单位(URL)针对抗原结合分子(以nM计)的浓度绘图来表征NFκB介导的萤光素酶活性。由于萤光素酶介导的萤光素氧化成氧化萤光素而发射URL。通过减去‘空白对照’条件的URL对值进行基线修正。图12C显示以曲线下面积(AUC)呈现的图12A和12B的数据。

图13A至13C显示在CT26huTnC细胞所致交联存在或缺失下双特异性,四价抗OX40,单价或二价抗TnC抗原结合分子(即4+2或4+1型式),和双特异性,二价抗OX40,二价抗TnC(即2+2型式)对NFκB的激活。图13A显示在交联缺失下OX40+HeLa报告细胞中的抗原结合分子所致NFκB激活。图13B显示在CT26huTnC细胞所致交联存在下OX40+HeLa报告细胞中的抗原结合分子所致NFκB激活。通过将在0.5s期间测量的释放光单位(URL)针对抗原结合分子(以nM计)的浓度绘图来表征NFκB介导的萤光素酶活性。由于萤光素酶介导的萤光素氧化成氧化萤光素而发射URL。通过减去‘空白对照’条件的URL对值进行基线修正。图13C显示以曲线下面积(AUC)呈现的图13A和13B的数据。

图14A至14D显示在U87-MG细胞所致交联存在下用板固定化的双特异性,四价抗OX40,单价或二价抗TnC抗原结合分子(即4+2或4+1型式),和双特异性,二价抗OX40,二价抗TnC(即2+2型式)挽救预激活的CD4 T细胞的亚最佳TCR再刺激。图14A显示CD4+事件计数,图14B显示CD8+事件计数,图14C显示在CD4+T细胞上表达的CD127的均值荧光强度(MFI),而图14D显示在CD8+T细胞上表达的CD127的MFI。针对只含有抗人CD3的样品的值对值进行基线修正。

图15A至15D显示在U87-MG细胞所致交联存在下用板固定化的双特异性,四价抗OX40,单价或二价抗TnC抗原结合分子(即4+2或4+1型式),和双特异性,二价抗OX40,二价抗TnC(即2+2型式)挽救预激活的CD4 T细胞的亚最佳TCR再刺激。图15A显示CD4+CD25+T细胞的百分比,图15B显示CD8+CD25+T细胞的百分比,图15C显示在CD4+T细胞上表达的CD25的均值荧光强度(MFI),而图15D显示在CD8+T细胞上表达的CD25的MFI。针对只含有抗人CD3的样品的值对值进行基线修正。

图16A至16D显示在CT26huTnC细胞所致交联存在下用板固定化的双特异性,四价抗OX40,单价或二价抗TnC抗原结合分子(即4+2或4+1型式),和双特异性,二价抗OX40,二价抗TnC(即2+2型式)挽救预激活的CD4 T细胞的亚最佳TCR再刺激。图16A显示活的,CFSE标记的CD4+T细胞的百分比,图16B显示活的,CFSE标记的CD8+T细胞的百分比,图16C显示在CD4+T细胞上表达的CD127的均值荧光强度(MFI),而图16D显示在CD8+T细胞上表达的CD127的MFI。针对只含有抗人CD3的样品的值对值进行基线修正。

发明详述

定义

除非另有定义,本文中使用的技术和科学术语具有与此发明所属领域中一般使用的相同的含义。出于解释此说明书的目的,会应用下述定义,而且在适宜时,以单数使用的术语还会包括复数,反之亦然。

如本文中使用的,术语“抗原结合分子”以其最广义指特异性结合抗原性决定簇的分子。抗原结合分子的例子是抗体,抗体片段和支架抗原结合蛋白。

如本文中使用的,术语“能够特异性结合生腱蛋白C(TnC)的模块”或“能够特异性结合生腱蛋白C(TnC)的抗原结合域”指特异性结合TnC的多肽分子。在一个特定方面,抗原结合模块能够将其附着的实体引导至靶位点,例如携带TnC的特定类型的肿瘤细胞或肿瘤基质。能够特异性结合TnC的模块包括本文中进一步定义的抗体和其片段。另外,能够特异性结合TnC的模块包括本文中进一步定义的支架抗原结合蛋白,例如基于设计的重复蛋白或设计的重复域的结合域(参见例如WO 2002/020565)。

关于抗体或其片段,术语“能够特异性结合生腱蛋白C(TnC)的模块”或“能够特异性结合生腱蛋白C(TnC)的抗原结合域”指分子中包含与TnC的部分或全部特异性结合且互补的区域的部分。可以例如由一个或多个抗体可变域(也称作抗体可变区)提供能够进行特异性结合TnC的模块。特别地,能够进行特异性结合TnC的模块包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。在一些实施方案中,“能够特异性结合生腱蛋白C(TnC)的模块”可以是scFv,Fab片段或交叉Fab片段,特别是Fab片段或交叉Fab片段。

术语“能够特异性结合OX40的模块”或“能够特异性结合OX40的抗原结合域”指特异性结合OX40的多肽分子。在一个方面,抗原结合模块能够经由OX40激活信号传导。能够特异性结合OX40的模块包括本文中进一步定义的抗体和其片段。另外,能够特异性结合OX40的模块包括本文中进一步定义的支架抗原结合蛋白,例如基于设计的重复蛋白或设计的重复域的结合域(参见例如WO 2002/020565)。特别是,能够特异性结合OX40的模块包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。在一个特定方面,“能够特异性结合OX40的模块”可以是Fab片段,交叉Fab片段或scFv,特别是Fab片段或交叉Fab片段。

术语“抗体”在本文中以最广义使用且涵盖各种抗体结构,包括但不限于单克隆抗体,多克隆抗体,单特异性和多特异性抗体(例如双特异性抗体),和抗体片段,只要它们展现期望的抗原结合活性。

如本文中使用的术语“单克隆抗体”指自实质性同质的抗体群体获得的抗体,即构成该群体的抗体个体是同一的和/或结合相同表位,除了可能的抗体变体,例如,含有天然发生的突变的或在单克隆抗体制备物的生成期间产生的,此类变体一般以微小量存在。与典型地包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物形成对比,单克隆抗体制备物中的每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。

如本文中使用的术语“单特异性”抗体表示具有一个或多个结合位点的抗体,每个该位点结合相同抗原的相同表位。术语“双特异性”意味着抗原结合分子能够特异性结合至少两种截然不同的抗原性决定簇。双特异性抗原结合分子至少包含两个抗原结合位点,其每个是对不同抗原性决定簇特异性的。在某些实施方案中,双特异性抗原结合分子能够同时结合两种抗原性决定簇,特别是在两种截然不同的细胞上表达的两种抗原性决定簇。例如,本发明的抗原结合分子是双特异性的,包含能够特异性结合OX40的模块和能够特异性结合TnC的模块。

如本申请内使用的术语“价”表示抗原结合分子中规定数目的结合位点的存在。照此,术语“二价”,“四价”,和“六价”分别表示抗原结合分子中两个结合位点,四个结合位点,和六个结合位点的存在。还可以关于针对给定抗原性决定簇的结合位点的数目来表述抗原结合分子的价。例如,在一些实施方案中,本发明的抗原结合分子就OX40而言是四价的且就TnC而言是二价的(即4+2)。

术语“全长抗体”,“完整抗体”,和“全抗体”在本文中可互换使用,指具有与天然抗体结构实质性相似的结构的抗体。“天然抗体”指具有不同结构的天然发生的免疫球蛋白分子。例如,天然IgG类抗体是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白,由成二硫键的两条轻链和两条重链构成。自N端至C端,每条重链具有一个可变区(VH),也称作可变重域或重链可变域,接着是三个恒定域(CH1,CH2,和CH3),也称作重链恒定区。类似地,自N端至C端,每条轻链具有一个可变区(VL),也称作可变轻域或轻链可变域,接着是一个轻链恒定域(CL),也称作轻链恒定区。抗体的重链可指派至五种型之一,称作α(IgA),δ(IgD),ε(IgE),γ(IgG),或μ(IgM),其中一些可进一步分成亚型,例如γ1(IgG1),γ2(IgG2),γ3(IgG3),γ4(IgG4),α1(IgA1)和α2(IgA2)。基于其恒定域的氨基酸序列,抗体的轻链可指派至两种型之一,称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。

“抗体片段”指与完整抗体不同的分子,其包含完整抗体中与完整抗体所结合的抗原结合的部分。抗体片段的例子包括但不限于Fv,Fab,Fab’,Fab’-SH,F(ab’)₂；双抗体,三抗体,四抗体,交叉Fab片段；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和单域抗体。关于某些抗体片段的综述,参见Hudson et al.,Nat Med 9,129-134(2003)。关于scFv片段的综述,参见例如Plückthun,in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994)；还参见WO93/16185；和美国专利No.5,571,894和5,587,458。关于包含挽救受体结合表位残基且具有延长的体内半衰期的Fab和F(ab’)2片段的讨论,参见美国专利No.5,869,046。双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段,其可以是二价或双特异性的,参见例如EP 404,097；WO1993/01161；Hudson et al.,Nat Med 9,129-134(2003)；和Hollinger et al.,Proc NatlAcad Sci USA 90,6444-6448(1993)。Hudson et al.,Nat Med 9,129-134(2003)中还描述了三抗体和四抗体。单域抗体是包含抗体的重链可变域的全部或一部分或轻链可变域的全部或一部分的抗体片段。在某些实施方案中,单域抗体是人单域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA；参见例如美国专利No.6,248,516B1)。可以通过各种技术来生成抗体片段,包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)的生成,如本文中描述的。

完整抗体的木瓜蛋白酶消化生成两个同一的抗原结合片段,称作“Fab”片段,每个含有重和轻链可变域,还有轻链的恒定域和重链的第一恒定域(CH1)。如此,如本文中使用的,术语“Fab片段”指包含包含轻链的VL和恒定域(CL)的轻链片段,和重链的VH和第一恒定域(CH1)的抗体片段。Fab’片段因在重链CH1域的羧基末端增加少数残基而与Fab片段不同,包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab’-SH是其中恒定域的半胱氨酸残基携带游离硫醇基团的Fab’片段。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原结合位点(两个Fab片段)和Fc区的一部分的F(ab’)₂片段。依照本发明,术语“Fab片段”还包括如下文定义的“交叉Fab片段”或“交换Fab片段”。

术语“交叉Fab片段”或“xFab片段”或“交换Fab片段”指其中重和轻链的可变区或恒定区任一交换的Fab片段。交叉Fab分子的两种不同链组成是可能的且包含在本发明的双特异性抗体中:一方面,Fab重和轻链的可变区交换,即交换Fab分子包含由轻链可变区(VL)和重链恒定区(CH1)构成的肽链,和由重链可变区(VH)和轻链恒定区(CL)构成的肽链。这种交换Fab分子也称作CrossFab_(VLVH)。另一方面,当Fab重和轻链的恒定区交换时,交换Fab分子包含由重链可变区(VH)和轻链恒定区(CL)构成的肽链,和由轻链可变区(VL)和重链恒定区(CH1)构成的肽链。这种交换Fab分子也称作CrossFab_(CLCH1)。

“单链Fab片段”或“scFab”是由抗体重链可变域(VH),抗体恒定域1(CH1),抗体轻链可变域(VL),抗体轻链恒定域(CL)和接头组成的多肽,其中所述抗体域和所述接头以N端至C端方向具有下述次序之一:a)VH-CH1-接头-VL-CL,b)VL-CL-接头-VH-CH1,c)VH-CL-接头-VL-CH1或d)VL-CH1-接头-VH-CL；且其中所述接头是至少30个氨基酸,优选32至50个氨基酸的多肽。所述单链Fab片段经由CL域和CH1域之间的天然二硫键而稳定化。另外,这些单链Fab分子可通过经由半胱氨酸残基的***(例如依照Kabat编号方式的可变重链中的位置44和可变轻链中的位置100)生成链间二硫键而进一步稳定化。

“交换单链Fab片段”或“x-scFab”是由抗体重链可变域(VH),抗体恒定域1(CH1),抗体轻链可变域(VL),抗体轻链恒定域(CL)和接头组成的多肽,其中所述抗体域和所述接头以N端至C端方向具有下述次序之一:a)VH-CL-接头-VL-CH1和b)VL-CH1-接头-VH-CL；其中VH和VL一起形成特异性结合抗原的抗原结合位点,且其中所述接头是至少30个氨基酸的多肽。另外,这些x-scFab分子可通过经由半胱氨酸残基的***(例如依照Kabat编号方式的可变重链中的位置44和可变轻链中的位置100)生成链间二硫键而进一步稳定化。

“单链可变片段(scFv)”是以10至约25个氨基酸的短接头肽连接的抗体的重(V_H)和轻(V_L)链可变区的融合蛋白。接头经常富含出于柔性的甘氨酸,以及出于溶解性的丝氨酸或苏氨酸,而且可将V_H的N端与V_L的C端连接,或反之亦然。尽管去除恒定区并引入接头,此蛋白质保留原始抗体的特异性。scFv抗体描述于例如Houston,J.S.,Methods inEnzymol.203(1991)46-96。另外,抗体片段包含具有VH的特征(即能够与VL一起装配)或VL的特征(即能够与VH一起装配)的单链多肽,VH与VL一起装配成功能性抗原结合位点并由此提供全长抗体的抗原结合特性。

“支架抗原结合蛋白”在本领域中是已知的,例如,纤连蛋白和设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)已经用作抗原结合域的备选支架,参见例如Gebauer and Skerra,Engineered protein scaffolds as next-generation antibody therapeutics.CurrOpin Chem Biol 13:245-255(2009)和Stumpp et al.,Darpins:A new generation ofprotein therapeutics.Drug Discovery Today 13:695-701(2008)。在本发明的一个方面,支架抗原结合蛋白选自由CTLA-4(Evibody),脂质运载蛋白(Anticalin),蛋白A衍生的分子,诸如蛋白A的Z域(Affibody),A域(Avimer/Maxibody),血清转铁蛋白(trans-body)；设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin),抗体轻链或重链的可变域(单域抗体,sdAb),抗体重链的可变域(纳米抗体,aVH),V_NAR片段,纤连蛋白(AdNectin),C型凝集素域(Tetranectin)；新的抗原受体β-内酰胺酶的可变域(V_NAR片段),人γ-晶体蛋白或泛素(Affilin分子)；人蛋白酶抑制剂的kunitz型域,微体,诸如来自knottin家族的蛋白质,肽适体和纤连蛋白(adnectin)组成的组。CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4)是主要在CD4⁺T细胞上表达的CD28家族受体。其细胞外域具有类似可变域的Ig折叠。可用异源序列取代对应于抗体的CDR的环,以赋予不同的结合特性。经过工程化而具有不同结合特异性的CTLA-4分子也被称为Evibodies(例如,US7166697B1)。Evibodies的大小与抗体(例如,域抗体)的分离可变区大约相同。进一步的详情参见Journal of Immunological Methods 248(1-2),31-45(2001)。脂质运载蛋白为细胞外蛋白质家族,其转运小的疏水性分子,如类固醇,胆红素,类视黄醇和脂质。它们具有刚性β-片层二级结构,在锥形结构的开口端具有可被工程化以结合不同的靶抗原的多个环。Anticalin的大小在160-180个氨基酸之间,并且衍生自脂质运载蛋白。进一步的详情参见Biochim Biophys Acta 1482:337-350(2000),US7250297B1和US20070224633。亲和体是衍生自金黄色葡萄球菌蛋白A的支架,其可被工程化以结合抗原。该域由具有约58个氨基酸的三螺旋束组成。通过表面残基的随机化生成了文库。进一步的详情参见Protein Eng.Des.Sel.2004,17,455-462和EP 1641818A1。Avimers是衍生自A域支架家族的多域蛋白。具有约35个氨基酸的天然域采用定义的二硫键结构。多样性是通过改变A域家族所显示的自然变异产生的。进一步的详情参见Nature Biotechnology 23(12),1556-1561(2005)和Expert Opinion on Investigational Drugs 16(6),909-917(June 2007)。转铁蛋白是单体的血清转运糖蛋白。可以通过在允许的表面环中***肽序列将转铁蛋白工程化以结合不同的靶抗原。工程化转铁蛋白支架的实例包括Trans-body。进一步的详情参见J.Biol.Chem 274,24066-24073(1999)。设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)衍生自锚蛋白,锚蛋白是介导整合膜蛋白与细胞骨架附着的蛋白质家族。单个锚蛋白重复是由两个α-螺旋和β-转角组成的33个残基的基序。通过随机化每个重复的第一个α-螺旋和β-转角中的残基,它们可以被工程化以结合不同的靶抗原。通过增加模块的数量(亲和力成熟法)可以增加它们的结合界面。进一步的详情参见J.Mol.Biol.332,489-503(2003),PNAS100(4),1700-1705(2003)和J.Mol.Biol.369,1015-1028(2007)以及US20040132028A1。单域抗体是由单个单体的可变抗体域组成的抗体片段。第一个单域来源于来自骆驼科动物(camelids)抗体重链的可变域(纳米抗体或V_HH片段)。此外,术语单域抗体包括自主的人重链可变域(aVH)或来源于鲨鱼的V_NAR片段。纤连蛋白是一种可以被工程化为与抗原结合的支架。Adnectin由人纤连蛋白III型(FN3)的15个重复单元的第10个域的天然氨基酸序列的主链组成。可以将β-夹心一端的三个环工程化,使Adnectin能够特异性地识别感兴趣的治疗靶标。进一步的详情参见Protein Eng.Des.Sel.18,435-444(2005),US20080139791,WO2005056764和US6818418B1。肽适体是由恒定骨架蛋白组成的组合识别分子,所述骨架蛋白通常是含有在活性位点***的约束可变肽环的硫氧还蛋白(TrxA)。进一步的详情参见Expert Opin.Biol.Ther.5,783-797(2005)。微体源自长度为25-50个氨基酸的天然存在的微蛋白,其含有3-4个半胱氨酸桥-微蛋白的实例包括KalataBI以及芋螺毒素和半胱氨酸结肽(knottin)。微蛋白具有可以工程化以包括多达25个氨基酸而不影响微蛋白的整体折叠的环。工程化的半胱氨酸结肽域的更多详情参见WO2008098796。

与参照分子“结合相同表位的抗原结合分子”指如下的抗原结合分子,抗原结合分子在竞争测定法中将参照分子对其抗原的结合阻断50％或更多,相反,参照分子在竞争测定法中将抗原结合分子对其抗原的结合阻断50％或更多。

术语“抗原结合域”或“抗原结合位点”指抗原结合分子中包含与抗原的部分或全部特异性结合且互补的区域的部分。在抗原较大的情况中,抗原结合分子可仅仅结合抗原的特定部分,该部分称作表位。抗原结合域可以由例如一个或多个可变域(也称作可变区)提供。优选地,抗原结合域包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。

如本文中使用的,术语“抗原性决定簇”与“抗原”和“表位”同义,而且指多肽大分子上的如下位点(例如氨基酸的连续区段或由不连续氨基酸的不同区域构成的构象构造),抗原结合模块与该位点结合,形成抗原结合模块-抗原复合物。有用的抗原性决定簇可以例如在肿瘤细胞的表面上,在病毒感染的细胞的表面上,在其它患病细胞的表面上,在免疫细胞的表面上,游离在血清中,和/或在细胞外基质(ECM)中找到。作为本文中的抗原有用的蛋白质可以是来自任何脊椎动物来源的蛋白质的任何天然形式,包括哺乳动物,诸如灵长类(例如人)和啮齿类(例如小鼠和大鼠),除非另外指明。在一个特定实施方案中,抗原是人蛋白质。在提及本文中的特定蛋白质的情况中,该术语涵盖“全长”未加工的蛋白质以及源自细胞中的加工的任何形式的蛋白质。该术语还涵盖蛋白质的天然发生变体,例如剪接变体或等位变体。

“特异性结合”意味着结合对于抗原是选择性的且可以与不想要的或非特异性的相互作用区分开。抗原结合分子结合特定抗原的能力可经由酶联免疫吸附测定法(ELISA)或本领域技术人员熟悉的其它技术来测量,例如表面等离振子共振(SPR)技术(在BIAcore仪器上分析)(Liljeblad et al.,Glyco J 17,323-329(2000)),和传统的结合测定法(Heeley,Endocr Res 28,217-229(2002))。在一个实施方案中,抗原结合分子对无关蛋白质的结合的程度小于抗原结合分子对抗原的结合的约10％,如通过例如SPR测量的。在某些实施方案中,结合抗原的分子具有≤1μM,≤100nM,≤10nM,≤1nM,≤0.1nM,≤0.01nM,或≤0.001nM(例如10^-8M或更小,例如10^-8M至10^-13M,例如10^-9M至10^-13M)的解离常数(Kd)。

“亲和力”或“结合亲和力”指分子(例如抗体)的单一结合位点和其结合配偶(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指明,如本文中使用的,“结合亲和力”指反映结合对(例如抗体和抗原)的成员之间的1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶Y的亲和力一般可以用解离常数(Kd)来代表,它是解离和结合速率常数(分别是koff和kon)的比。如此,等同的亲和力可包含不同的速率常数,只要速率常数的比保持相同。可以通过本领域已知的常用方法来测量亲和力,包括本文中描述的那些。用于测量亲和力的一种特定方法是表面等离振子共振(SPR)。

“亲和力成熟的”抗体指与不拥有此类改变的亲本抗体相比,在一个或多个高变区(HVR)中具有一处或多处改变的抗体,此类改变导致该抗体对抗原的亲和力改善。

术语“生腱蛋白C(TnC)”指来自任何脊椎动物来源的任何天然TnC,包括哺乳动物,诸如灵长类(例如人),非人灵长类(例如食蟹猴)和啮齿类(例如小鼠和大鼠),除非另外指明。该术语包括“全长”未加工的TnC以及源自细胞中的加工的任何形式的TnC。该术语还涵盖TnC的天然发生变体,例如剪接变体或等位变体。在一个实施方案中,本发明的抗原结合分子能够特异性结合人,小鼠和/或食蟹猴TnC。人TnC的氨基酸序列在UniProt(www.uniprot.org)登录号P24821(版本196,SEQ ID NO:39),或NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/)RefSeq NP_002151.2中显示。C端带Avi和His标签的人TnC的核苷酸和氨基酸序列分别在SEQ ID NO:167和170中显示。小鼠TnC的氨基酸序列在UniProt(www.uniprot.org)登录号Q80YX1(版本125,SEQ ID NO:63),或NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/)RefSeq NP_035737.2中显示。C端带Avi和His标签的小鼠TnC的核苷酸和氨基酸序列分别在SEQ ID NO:168和171中显示。C端带Avi和His标签的食蟹猴TnC的核苷酸和氨基酸序列分别在SEQ ID NO:169和172中显示。

在某些实施方案中,本发明的抗原结合分子包含能够特异性结合TnC的至少一个选自由A1,A2,A3,A4,B,AD1,AD2,C和D组成的组的域的模块。在一些实施方案中,能够特异性结合TnC的模块结合TnC的A1和A4域。在一些实施方案中,能够特异性结合TnC的模块结合TnC的C域。

术语“成纤维细胞活化蛋白(FAP)”,也称作脯氨酰内肽酶FAP或分离酶(Seprase)(EC 3.4.21),指来自任何脊椎动物来源的任何天然FAP,包括哺乳动物,诸如灵长类(例如人),非人灵长类(例如食蟹猴)和啮齿类(例如小鼠和大鼠),除非另外指明。人FAP的氨基酸序列在UniProt(www.uniprot.org)登录号Q12884(版本149,SEQ ID NO:81),或NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/)RefSeq NP_004451.2中显示。

术语“可变区”或“可变域”指抗体重或轻链中牵涉抗原结合分子结合抗原的域。天然抗体的重链和轻链的可变域(分别是VH和VL)一般具有相似的结构,每个域包含四个保守的框架区(FR)和三个高变区(HVR)。参见例如Kindt et al.,Kuby Immunology,6th ed.,W.H.Freeman and Co.,p.91(2007)。单个VH或VL可足以赋予抗原结合特异性。

如本文中使用的,术语“高变区”或“HVR”指抗体可变域中在序列上高变和/或形成结构上限定的环(“高变环”)的每个区域。一般地,天然四链抗体包含六个HVR:三个在VH中(H1,H2,H3),三个在VL中(L1,L2,L3)。HVR一般包含来自高变环和/或来自“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基,后者具有最高的序列变异性和/或牵涉抗原识别。例示性高变环发生于氨基酸残基26-32(L1),50-52(L2),91-96(L3),26-32(H1),53-55(H2),和96-101(H3)(Chothia and Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。例示性CDR(CDR-L1,CDR-L2,CDR-L3,CDR-H1,CDR-H2,和CDR-H3)发生于氨基酸残基24-34(L1),50-56(L2),89-97(L3),31-35B(H1),50-65(H2),和95-102(H3)(Kabat et al.,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD(1991))。

高变区(HVR)也称作互补决定区(CDR),而且在提到可变区中形成抗原结合区的部分时,这些术语在本文中可互换使用。这个特定区域已经由Kabat et al.,U.S.Dept.ofHealth and Human Services,"Sequences of Proteins of Immunological Interest"(1983)和由Chothia et al.,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)描述,其中定义包括在针对彼此比较时的氨基酸残基的交叠或子集。无论如何,应用任一定义来提及抗体的CDR或其变体意图在如本文中定义和使用的术语的范围内。涵盖如由上文引用的每一篇参考文献定义的CDR的适宜氨基酸残基在下文表A中作为比较列出。涵盖特定CDR的确切残基编号会取决于CDR的序列和大小而变化。给予抗体的可变区氨基酸序列,本领域技术人员能例行确定哪些残基构成特定CDR。

表A:CDR定义¹

CDR	Kabat	Chothia	AbM²
				V_H CDR1	31-35	26-32	26-35
V_H CDR2	50-65	52-58	50-58
				V_H CDR3	95-102	95-102	95-102
V_L CDR1	24-34	26-32	24-34
				V_L CDR2	50-56	50-52	50-56
V_L CDR3	89-97	91-96	89-97

¹表A中的所有CDR定义的编号方式依照Kabat等人(见下文)列出的编号规则。

²如表A中使用的具有小写“b”的“AbM”指如由Oxford Molecular的“AbM”抗体建模软件定义的CDR。

Kabat等人还定义了可应用于任何抗体的可变区序列的编号***。本领域普通技术人员能明确地将“Kabat编号方式”的这种***指派给任何可变区序列,不依赖于超出序列本身的任何实验数据。如本文中使用的,“Kabat编号方式”是指由Kabat et al.,U.S.Dept.of Health and Human Services,"Sequence of Proteins of ImmunologicalInterest"(1983)中列出的编号***。除非另有规定,抗体可变区中具体氨基酸残基位置的编号的提及依照Kabat编号***。

除了VH中的CDR1之外,CDR一般包含形成高变环的氨基酸残基。CDR还包含“特异性决定残基”或“SDR”,它们是接触抗原的残基。SDR包含在称作缩短CDR或a-CDR的CDR区域中。例示性a-CDR(a-CDR-L1,a-CDR-L2,a-CDR-L3,a-CDR-H1,a-CDR-H2,和a-CDR-H3)发生于氨基酸残基31-34(L1),50-55(L2),89-96(L3),31-35B(H1),50-58(H2),和95-102(H3)(参见Almagro and Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))。除非另外指明,HVR残基和可变域中的其它残基(例如FR残基)在本文中依照Kabat等人,见上文编号。

“框架”或“FR”指除了高变区(HVR)残基之外的可变域残基。可变域的FR一般由四个FR域组成:FR1,FR2,FR3,和FR4。因而,HVR和FR序列一般在VH(或VL)中以下述顺序出现:FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。

术语“嵌合”抗体指如下的抗体,其中重和/或轻链的一部分自特定来源或物种衍生,而重和/或轻链的剩余部分自不同来源或物种衍生。

抗体的“类”指其重链拥有的恒定域或恒定区的类型。有五大类抗体:IgA,IgD,IgE,IgG,和IgM,而且其中若干可进一步分为亚类(同种型),例如IgG₁,IgG₂,IgG₃,IgG₄,IgA₁,和IgA₂。与不同类的免疫球蛋白对应的重链恒定域分别称作α,δ,ε,γ,和μ。

“人源化”抗体指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中,人源化抗体会包含至少一个,通常两个实质性整个如下的可变域,其中整个或实质性整个HVR(例如CDR)对应于非人抗体的那些,而且整个或实质性整个FR对应于人抗体的那些。人源化抗体任选可包含自人抗体衍生的抗体恒定区的至少一部分。抗体,例如非人抗体的“人源化形式”指经历人源化的抗体。本发明涵盖的其它形式的“人源化抗体”是其中恒定区已经自原始抗体的恒定区另外修饰或变化以生成依照本发明的特性,尤其是关于C1q结合和/或Fc受体(FcR)结合的那些。

“人”抗体是拥有与由人或人细胞生成的或自利用人抗体全集或其它人抗体编码序列的非人来源衍生的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列的抗体。人抗体的这种定义专门排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。

本文中的术语“Fc域”或“Fc区”用于定义含有恒定区的至少一部分的抗体重链的C端区。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。IgG Fc区包含IgG CH2和IgG CH3域。人IgG Fc区的“CH2域”通常自约位置231处的氨基酸残基延伸至约位置340处的氨基酸残基。在一个实施方案中,碳水化合物链附着于CH2域。本文中的CH2域可以是天然序列CH2域或变体CH2域。“CH3域”包含Fc区中在CH2域C端的那段残基(即自IgG的约位置341处的氨基酸残基至约位置447处的氨基酸残基)。本文中的CH3区可以是天然序列CH3域或变体CH3域(例如具有在其一条链中引入的“***”(“节”)和在其另一条链中相应引入的“空腔”(“穴”)的CH3域；参见美国专利No.5,821,333,通过援引明确收入本文)。如本文中描述的,此类变体CH3域可用于促进两条不相同抗体重链的异二聚化。在一个实施方案中,人IgG重链Fc区自Cys226或自Pro230延伸至重链的羧基末端。然而,Fc区的C末端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。除非本文中另有规定,Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号依照EU编号***,也称作EU索引,如Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中描述的。

“节-入-穴”技术在例如US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway et al.,Prot Eng9,617-621(1996)和Carter,J Immunol Meth 248,7-15(2001)中描述。一般地,该方法牵涉在第一多肽的界面处引入***(“节”)并在第二多肽的界面中引入相应的空腔(“穴”),使得该***可放置在该空腔中,从而促进异二聚体形成并阻碍同二聚体形成。通过将来自第一多肽的界面的小氨基酸侧链用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换来构建***。通过将大氨基酸侧链用较小侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换而在第二多肽的界面中创建与***相同或相似大小的补偿性空腔。可通过改变编码多肽的核酸,例如通过位点特异性诱变,或通过肽合成来生成***和空腔。在一个具体实施方案中,节修饰包含Fc域的两个亚基之一中的氨基酸替代T366W,而穴修饰包含Fc域的两个亚基之另一中的氨基酸替代T366S,L368A和Y407V。在又一个具体实施方案中,Fc域中包含节修饰的亚基另外包含氨基酸替代S354C,而Fc域中包含穴修饰的亚基另外包含氨基酸替代Y349C。引入这两个半胱氨酸残基导致在Fc区的两个亚基之间形成二硫桥,如此进一步稳定化二聚体(Carter,J Immunol Methods248,7-15(2001))。

“与免疫球蛋白的Fc区等同的区域”意图包括免疫球蛋白的Fc区的天然发生等位变体以及具有生成替代,添加,或删除的改变但并不实质性降低免疫球蛋白介导效应器功能(诸如抗体依赖性细胞的细胞毒性)的能力的变体。例如,可以自免疫球蛋白的Fc区的N端或C端删除一个或多个氨基酸,生物学功能没有实质性损失。可以依照本领域已知的一般规则来选择此类变体,从而对活性具有最小限度影响(参见例如Bowie,J.U.et al.,Science247:1306-10(1990))。

术语“效应器功能”指那些可归于抗体的Fc区的生物学活性,其随抗体同种型而变化。抗体效应器功能的例子包括:C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC),Fc受体结合,抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC),抗体依赖性细胞吞噬(ADCP),细胞因子分泌,免疫复合物介导的抗原呈递细胞对抗原的摄取,细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调,和B细胞活化。

Fc受体结合依赖性效应器功能可以通过抗体的Fc区与Fc受体(FcR,它们是造血细胞上的专门化细胞表面受体)的相互作用来介导。Fc受体属于免疫球蛋白超家族,而且已经显示介导通过免疫复合物的吞噬去除抗体包被的病原体和被相应抗体包被的红细胞和多种其它细胞靶(例如肿瘤细胞)经抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)裂解二者(参见例如Van de Winkel,J.G.and Anderson,C.L.,J.Leukoc.Biol.49(1991)511-524)。FcR通过它们对免疫球蛋白同种型的特异性来定义:针对IgG抗体的Fc受体称作FcγR。Fc受体结合记载于例如Ravetch,J.V.and Kinet,J.P.,Annu.Rev.Immunol.9(1991)457-492；Capel,P.J.,et al.,Immunomethods 4(1994)25-34；de Haas,M.,et al.,J.Lab.Clin.Med.126(1995)330-341；和Gessner,J.E.,et al.,Ann.Hematol.76(1998)231-248。

针对IgG抗体Fc区的受体(FcγR)的交联触发极其广泛的效应器功能,包括吞噬,抗体依赖性细胞细胞毒性,和释放炎症性介导物,以及免疫复合物清除和调节抗体生成。在人中,三类FcγR已经表征,它们是:

-FcγRI(CD64)以高亲和力结合单体IgG且在巨噬细胞,单核细胞,嗜中性细胞和嗜曙红细胞上表达。IgG Fc区中至少氨基酸残基E233-G236,P238,D265,N297,A327和P329(编号方式依照Kabat的EU索引)之一处的修饰降低对FcγRI的结合。将位置233-236处的IgG2残基替代入IgG1和IgG4将对FcγRI的结合降低103倍并消除针对抗体敏化的红血球的人单核细胞应答(Armour,K.L.,et al.,Eur.J.Immunol.29(1999)2613-2624)。

-FcγRII(CD32)以中等至低亲和力结合复合的IgG且广泛表达。这种受体可分成两个亚型,FcγRIIA和FcγRIIB。FcγRIIA在牵涉杀伤的许多细胞上找到(例如巨噬细胞,单核细胞,嗜中性细胞)且看来能够激活杀伤过程。FcγRIIB看来在抑制性过程中发挥作用且在B细胞,巨噬细胞上并在肥大细胞和嗜曙红细胞上找到。在B细胞上它看来发挥支持进一步免疫球蛋白生成和同种型转换成例如IgE类的功能。在巨噬细胞上,FcγRIIB起抑制经由FcγRIIA介导的吞噬的作用。在嗜曙红细胞和肥大细胞上,B形式可有助于经由结合其分开的受体的IgE遏制这些细胞的激活。例如,对包含至少在氨基酸残基E233-G236,P238,D265,N297,A327,P329,D270,Q295,A327,R292,和K414(编号方式依照Kabat的EU索引)之一处具有突变的IgG Fc区的抗体找到降低的对FcγRIIA的结合。

-FcγRIII(CD16)以中等至低亲和力结合IgG且以两种类型存在。FcγRIIIA在NK细胞,巨噬细胞,嗜曙红细胞和一些单核细胞和T细胞上找到且介导ADCC。FcγRIIIB在嗜中性细胞上高表达。例如,对包含至少在氨基酸残基E233-G236,P238,D265,N297,A327,P329,D270,Q295,A327,S239,E269,E293,Y296,V303,A327,K338和D376(编号方式依照Kabat的EU索引)之一处具有突变的IgG Fc区的抗体找到降低的对FcγRIIIA的结合。

人IgG1上针对Fc受体的结合位点的定位,上文所述突变位点和用于测量对FcγRI和FcγRIIA的结合的方法记载于Shields,R.L.,et al.J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604。

术语“ADCC”或“抗体依赖性细胞细胞毒性”是通过Fc受体结合介导的功能且指在效应细胞存在下如本文中报告的抗体对靶细胞的裂解。抗体诱导介导ADCC的初始步骤的能力通过测量它们对表达Fcγ受体的细胞,诸如重组表达FcγRI和/或FcγRIIA的细胞,或NK细胞(本质上表达FcγRIIIA)的结合来调查。特别地,测量对NK细胞上的FcγR的结合。

“活化性Fc受体”是在受到抗体的Fc区啮合后引发刺激携带该受体的细胞实施效应器功能的信号传导事件的Fc受体。活化性Fc受体包括FcγRIIIa(CD16a),FcγRI(CD64),FcγRIIa(CD32),和FcαRI(CD89)。一种特定活化性Fc受体是人FcγRIIIa(参见UniProt登录号P08637,版本141)。

“肿瘤坏死因子受体超家族”或“TNF受体超家族”当前由27种受体组成。它是一组特征在于经细胞外富半胱氨酸域(CRD)结合肿瘤坏死因子(TNF)的能力的细胞因子受体。这些假重复通过受体链内由高度保守的半胱氨酸残基生成的链内二硫化物来定义。除神经生长因子(NGF)以外,所有TNF与原型TNF-α同源。以它们的活性形式,绝大多数TNF受体在质膜中形成三聚体复合物。因而,大多数TNF受体含有跨膜域(TMD)。数种这些受体还含有细胞内死亡域(DD),它在配体结合后募集胱天蛋白酶相互作用蛋白以启动胱天蛋白酶激活的外在途径。其它缺乏死亡域的TNF超家族受体结合TNF受体相关因子并激活能导致增殖或分化的细胞内信号传导途径。这些受体还能启动凋亡,但是它们经间接机制这样做。在调节凋亡以外,数种TNF超家族受体牵涉调节免疫细胞功能,诸如B细胞稳态和激活,天然杀伤细胞激活,和T细胞共刺激。数种其它受体调节细胞类型特异性应答,诸如毛囊发育和破骨细胞发育。TNF受体超家族的成员包括下面的:肿瘤坏死因子受体1(1A)(TNFRSF1A,CD120a),肿瘤坏死因子受体2(1B)(TNFRSF1B,CD120b),淋巴毒素β受体(LTBR,CD18),OX40(TNFRSF4,CD134),CD40(Bp50),Fas受体(Apo-1,CD95,FAS),诱饵受体3(TR6,M68,TNFRSF6B),CD27(S152,Tp55),CD30(Ki-1,TNFRSF8),4-1BB(CD137,TNFRSF9),DR4(TRAILR1,Apo-2,CD261,TNFRSF10A),DR5(TRAILR2,CD262,TNFRSF10B),诱饵受体1(TRAILR3,CD263,TNFRSF10C),诱饵受体2(TRAILR4,CD264,TNFRSF10D),RANK(CD265,TNFRSF11A),骨保护素(OCIF,TR1,TNFRSF11B),TWEAK受体(Fn14,CD266,TNFRSF12A),TACI(CD267,TNFRSF13B),BAFF受体(CD268,TNFRSF13C),疱疹病毒进入介导物(HVEM,TR2,CD270,TNFRSF14),神经生长因子受体(p75NTR,CD271,NGFR),B细胞成熟抗原(CD269,TNFRSF17),糖皮质激素诱导的TNFR相关的(GITR,AITR,CD357,TNFRSF18),TROY(TNFRSF19),DR6(CD358,TNFRSF21),DR3(Apo-3,TRAMP,WS-1,TNFRSF25)和Ectodysplasin A2受体(XEDAR,EDA2R)。

肿瘤坏死因子受体(TNFR)家族的数个成员在初始T细胞活化后发挥维持T细胞应答的功能。术语“共刺激性TNF受体家族成员”或“共刺激性TNF家族受体”指TNF受体家族成员的一个亚组,它们能够共刺激T细胞的增殖和细胞因子生成。该术语指来自任何脊椎动物来源,包括哺乳动物诸如灵长类(例如人),非人灵长类(例如食蟹猴)和啮齿类(例如小鼠和大鼠)的任何天然TNF家族受体,除非另有说明。在本发明的具体实施方案中,共刺激性TNF受体家族成员选自由OX40(CD134),4-1BB(CD137),CD27,HVEM(CD270),CD30,和GITR组成的组,它们都对T细胞具有共刺激效果。更加特别地,本发明的抗原结合分子至少包含能够特异性结合共刺激性TNF受体家族成员OX40的模块。

可以自公众可及的数据库(诸如Uniprot(www.uniprot.org))获得TNF受体家族成员的别的信息(特别是序列)。例如,人共刺激性TNF受体具有下面的氨基酸序列:人OX40(UniProt登录号P43489,SEQ ID NO:56),人4-1BB(UniProt登录号Q07011,SEQ ID NO:57),人CD27(UniProt登录号P26842,SEQ ID NO:58),人HVEM(UniProt登录号Q92956,SEQ IDNO:59),人CD30(UniProt登录号P28908,SEQ ID NO:60),和人GITR(UniProt登录号Q9Y5U5,SEQ ID NO:61)。

如本文中使用的,术语“OX40”指来自任何脊椎动物来源,包括哺乳动物诸如灵长类(例如人)和啮齿类(例如小鼠和大鼠)的任何天然OX40,除非另有说明。该术语涵盖“全长”,未加工的OX40以及因细胞中的加工所致的任何形式的OX40。该术语还涵盖OX40的天然发生变体,例如剪接变体或等位变体。一种例示性的人OX40的氨基酸序列在SEQ ID NO:56(Uniprot P43489,版本112)中显示而一种例示性的鼠OX40的氨基酸序列在SEQ ID NO:62(Uniprot P47741,版本101)中显示。

术语“抗OX40抗体”,“抗OX40”,“OX40抗体”和“特异性结合OX40的抗体”指能够以足够的亲和力结合OX40,使得抗体可用作靶向OX40中的诊断和/或治疗剂的抗体。在一个实施方案中,抗OX40抗体对无关的,非OX40蛋白的结合程度小于抗体对OX40的结合的约10％,如例如通过放射性免疫测定法(RIA)或流式细胞术(FACS)测量的。在某些实施方案中,结合OX40的抗体具有≤1μM,≤100nM,≤10nM,≤1nM,≤0.1nM,≤0.01nM,或≤0.001nM(例如10^- ⁶M或更少,例如10^-68M至10^-13M,例如10^-8M至10^-10M)的解离常数(K_D)。

术语“抗TnC抗体”和“结合TnC的抗体”指能够以足够的亲和力结合生腱蛋白C(TnC),使得抗体可用作靶向TnC中的诊断和/或治疗剂的抗体。在一个实施方案中,抗TnC抗体对无关的,非TnC蛋白的结合程度小于抗体对TnC的结合的约10％,如例如通过放射性免疫测定法(RIA)测量的。在某些实施方案中,结合TnC的抗体具有≤1μM,≤100nM,≤10nM,≤5nM,≤2nM,≤1nM,≤0.1nM,≤0.01nM,或≤0.001nM(例如10^-8M或更少,例如10^-8M至10^-13M,例如10^-9M至10^-13M,例如10nM至0.1nM,例如5nM至0.1nM,例如2nM至0.1nM)的解离常数(K_D)。在某些实施方案中,抗TnC抗体结合在来自不同物种的TnC间保守的TnC表位。在某些实施方案中,结合TnC表位的抗体对于至少一个选自由A1,A2,A3,A4,B,AD1,AD2,C和D组成的组的域是特异性的。在某些实施方案中,提供对TnC A1和TnC A4域特异性的抗体。在某些实施方案中,提供对TnC C域特异性的抗体。

术语“肽接头”指包含一个或多个氨基酸,典型地约2-20个氨基酸的肽。肽接头在本领域中是已知的或在本文中描述。合适的非免疫原性接头肽是例如(G₄S)_n,(SG₄)_n或G₄(SG₄)_n肽接头,其中“n”一般是介于1和10之间,典型地介于2和4之间的数目,特别是2,即肽选自由GGGGS(SEQ ID NO:64),GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:65),SGGGGSGGGG(SEQ ID NO:66)和GGGGSGGGGSGGGG(SEQ ID NO:68)组成的组,但是还包括序列GSPGSSSSGS(SEQ ID NO:70),(G₄S)₃(SEQ ID NO:67),(G₄S)₄(SEQ ID NO:69),GSGSGSGS(SEQ ID NO:71),GSGSGNGS(SEQID NO:72),GGSGSGSG(SEQ ID NO:73),GGSGSG(SEQ ID NO:74),GGSG(SEQ ID NO:75),GGSGNGSG(SEQ ID NO:76),GGNGSGSG(SEQ ID NO:77)和GGNGSG(SEQ ID NO:78)。特别感兴趣的肽接头是(G₄S)(SEQ ID NO:64),(G₄S)₂或GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:65)和GSPGSSSSGS(SEQ ID NO:70)。

如此申请内使用的术语“氨基酸”表示天然发生羧基α-氨基酸的组,包含丙氨酸(三字母代码:ala,单字母代码:A),精氨酸(arg,R),天冬酰胺(asn,N),天冬氨酸(asp,D),半胱氨酸(cys,C),谷氨酰胺(gln,Q),谷氨酸(glu,E),甘氨酸(gly,G),组氨酸(his,H),异亮氨酸(ile,I),亮氨酸(leu,L),赖氨酸(lys,K),甲硫氨酸(met,M),苯丙氨酸(phe,F),脯氨酸(pro,P),丝氨酸(ser,S),苏氨酸(thr,T),色氨酸(trp,W),酪氨酸(tyr,Y),和缬氨酸(val,V)。

“融合”或“连接”意味着各构件(例如抗体和Fab片段的重链)通过肽键,或是直接地或是经由一个或多个肽接头连接。

关于参照多肽(蛋白质)序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为在比对序列和在必要时引入缺口以实现最大百分比序列同一性之后,而且不考虑任何保守替代作为序列同一性的一部分,候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基同一的氨基酸残基的百分比。出于确定百分比氨基酸序列同一性目的的比对可以以本领域的技能内的多种方式实现,例如使用公众可得的计算机软件,诸如BLAST,BLAST-2,ALIGN.SAWI或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员能确定用于比对序列的适宜参数,包括在所比较的序列的全长上实现最大比对需要的任何算法。然而,出于本文中的目的,使用序列比较计算机程序ALIGN-2生成％氨基酸序列同一性值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech公司编写,而且源代码已经与用户文档一起提交美国版权局(Washington D.C.,20559),以美国版权注册号TXU510087注册。公众自Genentech公司(South San Francisco,California)可得到ALIGN-2程序,或者可以自源代码编译。ALIGN-2程序应当编译成在UNIX操作***,包括数码UNIX V4.0D上使用。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设置且不变。在采用ALIGN-2进行氨基酸序列比较的情况中,给定氨基酸序列A相对于(to),与(with),或针对(against)给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者可表述为给定氨基酸序列A具有或包含相对于,与,或针对给定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性)如下计算:

100乘分数X/Y

其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B的比对中打分为同一匹配的氨基酸残基的数目,且其中Y是B中的氨基酸残基的总数。会领会的是,在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度的情况中,A相对于B的％氨基酸序列同一性会不等于B相对于A的％氨基酸序列同一性。除非另有具体说明,本文中使用的所有％氨基酸序列同一性值是如上一段中所述使用ALIGN-2计算机程序获得的。

在某些实施方案中,涵盖本文中提供的抗原结合分子的氨基酸序列变体。例如,可能想要改善抗原结合分子的结合亲和力和/或其它生物学特性。抗原结合分子的氨基酸序列变体可通过将适宜修饰引入编码该分子的核苷酸序列,或通过肽合成来制备。此类修饰包括例如抗体的氨基酸序列内的残基的删除,和/或***和/或替代。可进行删除,***,和替代的任何组合来得到最终的构建物,前提是最终的构建物拥有想要的特征,例如抗原结合。替代诱变感兴趣的位点包括HVR和框架(FR)。保守替代在表B中在标题“优选替代”下提供且在下文中提及氨基酸侧链类别(1)至(6)进一步描述。可将氨基酸替代引入感兴趣的分子并对产物筛选想要的活性,例如保留/改善的抗原结合,降低的免疫原性,或改善的ADCC或CDC。

表B

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氨基酸可以依照共同的侧链特性来分组:

(1)疏水性的:正亮氨酸,Met,Ala,Val,Leu,Ile；

(2)中性亲水性的:Cys,Ser,Thr,Asn,Gln；

(3)酸性的:Asp,Glu；

(4)碱性的:His,Lys,Arg；

(5)影响链取向的残基:Gly,Pro；

(6)芳香族的:Trp,Tyr,Phe。

非保守替代会需要用这些类别之一的成员替换另一类别。

术语“氨基酸序列变体”包括其中在亲本抗原结合分子(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基中有氨基酸替代的实质性变体。一般地,为进一步研究选择的所得变体相对于亲本抗原结合分子会具有某些生物学特性的改变(例如改善)(例如升高的亲和力,降低的免疫原性)和/或会实质性保留亲本抗原结合分子的某些生物学特性。例示性的替代变体是亲和力成熟的抗体,其可以例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术诸如本文中所描述的那些技术来方便地生成。简言之,将一个或多个HVR残基突变并将变体抗原结合分子在噬菌体上展示并对其筛选特定的生物学活性(例如结合亲和力)。在某些实施方案中,可以在一个或多个HVR内发生替代,***,或删除,只要此类变化不实质性降低抗原结合分子结合抗原的能力。例如,可以在HVR中进行不实质性降低结合亲和力的保守改变(例如如本文中提供的保守替代)。一种对于鉴定抗体中可以作为诱变靶位的残基或区域有用的方法称作“丙氨酸扫描诱变”,如由Cunningham and Wells(1989)Science,244:1081-1085描述的。在此方法中,鉴定残基或靶残基的组(例如带电荷的残基,诸如Arg,Asp,His,Lys,和Glu)并用中性或带负电荷的氨基酸(例如丙氨酸或多丙氨酸)替换以测定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可以在对初始替代表明功能敏感性的氨基酸位置引入进一步的替代。或者/另外,利用抗原-抗原结合分子复合物的晶体结构来鉴定抗体和抗原之间的接触点。作为替代的候选,可以靶向或消除此类接触残基和邻近残基。可以筛选变体以确定它们是否含有想要的特性。

氨基酸序列***包括长度范围为1个残基至含有100或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基端融合,以及单个或多个氨基酸残基的序列内***。末端***的例子包括具有N端甲硫氨酰基残基的本发明的双特异性抗原结合分子。分子的其它***变体包括与延长双特异性抗原结合分子的血清半衰期的多肽的N或C端的融合。

在某些实施方案中,改变本文中提供的双特异性抗原结合分子以提高或降低抗体糖基化的程度。可以通过改变氨基酸序列,使得创建或去除一个或多个糖基化位点来方便地获得分子的糖基化变体。在双特异性抗原结合分子包含Fc区的情况中,可改变附着于其的碳水化合物。由哺乳动物细胞生成的天然抗体典型地包含分支的双触角寡糖,其一般通过N连接附着至Fc区的CH2域的Asn297。参见例如Wright et al.,TIBTECH 15:26-32(1997)。寡糖可包括各种碳水化合物,例如甘露糖,N-乙酰葡糖胺(GlcNAc),半乳糖,和唾液酸,以及附着于双触角寡糖结构的“主干”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方案中,可进行抗原结合分子中的寡糖的修饰以创建具有某些改良特性的变体。在一个方面,提供具有缺乏(直接或间接)附着于Fc区的岩藻糖的碳水化合物结构的本发明的双特异性抗原结合分子或抗体的变体。此类岩藻糖基化变体可具有改善的ADCC功能,参见例如美国专利公开号US 2003/0157108(Presta,L.)或US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。在另一个方面,提供具有两分寡糖的本发明的双特异性抗原结合分子或抗体的变体,例如,其中附着于Fc区的双触角寡糖通过GlcNAc两分。此类变体可具有降低的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能,参见例如WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)；美国专利No.6,602,684(Umana等人)；和US 2005/0123546(Umana等人)。还提供附着于Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的变体。此类抗体变体可具有改善的CDC功能且在例如WO 1997/30087(Patel等人)；WO1998/58964(Raju,S.)；和WO 1999/22764(Raju,S.)中描述。

在某些方面,可能想要创建本发明的双特异性抗原结合分子的半胱氨酸工程化改造的变体,例如“thioMAb”,其中分子的一个或多个残基用半胱氨酸残基替代。在特定方面,替代的残基出现于分子的可及位点。通过用半胱氨酸替代那些残基,由此反应性硫醇基团放置在抗体的可及位点且可用于将抗体与其它模块诸如药物模块或接头-药物模块缀合以创建免疫缀合物。在某些方面,可以用半胱氨酸替代任一个或多个下述残基:轻链的V205(Kabat编号方式)；重链的A118(EU编号方式)；和重链Fc区的S400(EU编号方式)。可以如例如美国专利No.7,521,541中所述生成半胱氨酸工程化改造的抗原结合分子。

术语“多核苷酸”指分离的核酸分子或构建物,例如信使RNA(mRNA),病毒衍生的RNA,或质粒DNA(pDNA)。多核苷酸可包含常规的磷酸二酯键或非常规键(例如酰胺键,诸如在肽核酸(PNA)中找到的)。术语“核酸分子”指多核苷酸中存在的任一个或多个核酸区段,例如DNA或RNA片段。

“分离的”核酸分子或多核苷酸意指已经自其天然环境移出的核酸分子,DNA或RNA。例如,出于本发明的目的,认为载体中包含的编码多肽的重组多核苷酸是分离的。分离的多核苷酸的别的例子包括在异源宿主细胞中维持的重组多核苷酸或溶液中(部分或实质性)纯化的多核苷酸。分离的多核苷酸包括正常情况下含有该多核苷酸分子的细胞中含有的多核苷酸分子,但是该多核苷酸分子存在于染色体外或与其天然染色***置不同的染色***置。分离的RNA分子包括本发明的体内或体外RNA转录物,以及正和负链形式,和双链形式。依照本发明的分离的多核苷酸或核酸进一步包括合成生成的此类分子。另外,多核苷酸或核酸可以是或可以包括调节元件,诸如启动子,核糖体结合位点,或转录终止子。

具有与本发明的参照核苷酸序列至少例如95％“同一”的核苷酸序列的核酸或多核苷酸意指除了该多核苷酸序列可包括至多该参照核苷酸序列的每100个核苷酸的5个点突变之外,该多核苷酸的核苷酸序列与参照序列同一。换言之,为了获得具有与参照核苷酸序列至少95％同一的核苷酸序列的多核苷酸,参照序列中至多5％的核苷酸可以删除或用另一种核苷酸替代,或者,在参照序列中,总核苷酸的至多5％的数目的多个核苷酸可***参照序列。参照序列的这些改变可发生于参照核苷酸序列的5’或3’端位置或那些末端位置之间的任何地方,或是在参照序列中的残基间个别散布或是以一个或多个连续组在参照序列内散布。实际上,使用已知的计算机程序,诸如上文关于多肽讨论的(例如ALIGN-2),可常规确定任何特定多核苷酸序列是否与本发明的核苷酸序列至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98％或99％同一。

术语“表达盒”指重组或合成生成的多核苷酸,具有允许特定核酸在靶细胞中转录的一系列规定核酸元件。重组表达盒可并入质粒,染色体,线粒体DNA,质体DNA,病毒,或核酸片段。典型地,在其它序列以外,表达载体的重组表达盒部分包括要转录的核酸序列和启动子。在某些实施方案中,本发明的表达盒包含编码本发明的双特异性抗原结合分子或其片段的多核苷酸序列。

术语“载体”或“表达载体”与“表达构建物”同义且指用于将与其可操作联合的特定基因导入靶细胞并指导表达的DNA分子。该术语包括作为自身复制性核酸结构的载体以及并入其已经导入的宿主细胞的基因组的载体。本发明的表达载体包含表达盒。表达载体容许大量稳定mRNA的转录。一旦表达载体在靶细胞内,则由细胞转录和/或翻译机制生成由该基因编码的核糖核酸分子或蛋白质。在一个实施方案中,本发明的表达载体包含包含编码本发明的双特异性抗原结合分子或其片段的多核苷酸序列的表达盒。

术语“宿主细胞”,“宿主细胞系”,和“宿主细胞培养物”可互换使用且指其中已经导入外源核酸的细胞,包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体/转化子”和“转化细胞”,其包括原代转化细胞和自其衍生的后代,不管传代的次数。后代在核酸内容方面与亲本细胞可以不是完全同一,但是可含有突变。具有与在原始转化细胞中筛选或选择相同的功能或生物学活性的突变体后代包括在本文中。宿主细胞是可用于生成本发明的双特异性抗原结合分子的任何类型的细胞***。宿主细胞包括培养的细胞,例如培养的哺乳动物细胞,诸如CHO细胞,BHK细胞,NS0细胞,SP2/0细胞,YO骨髓瘤细胞,P3X63小鼠骨髓瘤细胞,PER细胞,PER.C6细胞或杂交瘤细胞,酵母细胞,昆虫细胞,和植物细胞,仅列举少数,但是还有转基因动物,转基因植物或培养的植物或动物组织内包含的细胞。

药剂的“有效量”指在接受其施用的细胞或组织中导致生理变化必需的量。

药剂(例如药用组合物)的“治疗有效量”指在剂量和时间段方面有效实现想要的治疗或预防结果必需的量。例如,治疗有效量的药剂消除,减轻/减少,延迟,最小化或预防疾病的不利影响。

“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛,绵羊,猫,犬,和马),灵长类(例如人和非人灵长类,诸如猴),家兔,和啮齿类(例如小鼠和大鼠)。特定地,个体或受试者是人。

术语“药用组合物”指其为此类形式的制剂,所述形式允许其中含有的活性组分的生物学活性是有效的,而且所述制剂不含另外的对会接受该配制剂施用的受试者具有不可接受的毒性的成分。

“药学可接受赋形剂”指药用组合物中除了活性组分以外,对受试者无毒的组分。药学可接受赋形剂包括但不限于缓冲剂,稳定剂,或防腐剂。

术语“包装插页”用于指通常包括在治疗性产品的商业包装中的说明书,其含有关于关注此类治疗性产品的使用的适应症,用法,剂量,施用,组合疗法,禁忌症和/或警告的信息。

如本文中使用的,“治疗/处理”指试图改变所治疗个体的自然进程的临床干预,而且可以或是为了预防或是在临床病理学的过程中实施的。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发,缓解症状,削弱疾病的任何直接或间接病理学后果,预防转移,减缓疾病进展的速率,改善或减轻疾病状态,和消退或改善的预后。在一些实施方案中,使用本发明的分子来延迟疾病的发生或减缓疾病的进展。

如本文中使用的术语“癌症”指增殖性疾病,诸如淋巴瘤,淋巴细胞性白血病,肺癌,非小细胞肺(NSCL)癌,支气管肺泡细胞肺癌,骨癌,胰腺癌,皮肤癌,头或颈癌,皮肤或眼内黑素瘤,子宫癌,卵巢癌,直肠癌,***区癌,胃癌,胃的癌,结肠癌,乳腺癌,子宫癌,输卵管癌,子宫内膜癌,***,***癌,外阴癌,霍奇金(Hodgkin)氏病,食管癌,小肠癌,内分泌***的癌症,甲状腺癌,甲状旁腺癌,肾上腺癌,软组织肉瘤,尿道癌,***癌,***癌,膀胱癌,肾或输尿管癌,肾细胞癌,肾盂癌,间皮瘤,肝细胞癌,胆道癌,中枢神经***(CNS)赘生物,脊索瘤,脑干胶质瘤,多形性成胶质细胞瘤,星形细胞瘤,施旺细胞瘤,室管膜瘤,成神经管细胞瘤,脑膜瘤,鳞状细胞癌,垂体腺瘤和尤因氏肉瘤,包括任何上述癌症的顽固性形式,或一种或多种上述癌症的组合。

本发明的双特异性抗原结合分子

本发明提供了具有特别有利的特性的新颖的双特异性抗原结合分子,所述特性诸如可生产性,稳定性,结合亲和力,生物学活性,靶向效率和降低的毒性。

本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其包含

在一些实施方案中,该双特异性抗原结合分子另外包含

(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc区。

在一个特定方面,这些双特异性抗原结合分子特征在于激动性结合OX40。

结合OX40的双特异性抗原结合分子

在一个方面,本发明提供双特异性抗原结合分子,其中该能够特异性结合OX40的模块结合包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或由其组成的多肽。

在一个方面,提供的是一种双特异性抗原结合分子,其包含至少一个能够特异性结合OX40的模块,其中所述模块包含包含下述各项的VH:

和包含下述各项的VL:

特别地,提供的是一种双特异性抗原结合分子,其包含至少一个能够特异性结合OX40的模块,其中所述模块包含

(a)包含包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR-H1,包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR-H2,包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR-H3的VH和包含包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-L1,包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR-L3的VL,

(b)包含包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR-H1,包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR-H2,包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR-H3的VH和包含包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-L1,包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR-L3的VL,

(c)包含包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR-H1,包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR-H2,包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR-H3的VH和包含包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-L1,包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR-L3的VL,

(d)包含包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR-H1,包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR-H2,包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR-H3的VH和包含包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-L1,包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR-L3的VL,

(e)包含包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H1,包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR-H2,包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR-H3的VH和包含包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-L1,包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR-L3的VL,

(f)包含包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H1,包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR-H2,包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR-H3的VH和包含包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-L1,包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR-L3的VL,或

(g)包含包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H1,包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR-H2,包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR-H3的VH和包含包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-L1,包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR-L3的VL。

在一个方面,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其包含至少一个能够特异性结合OX40的模块,其中所述模块包含VH和VL,该VH包含包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR-H1,包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR-H2,包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR-H3且该VL包含包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-L1,包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR-L3。

在另一个方面,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其中该能够特异性结合OX40的模块包含包含与选自由SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:29,SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:37组成的组的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VH和包含与选自由SEQ ID NO:26,SEQID NO:28,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:34,SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:38组成的组的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VL。

特别是,提供的是一种双特异性抗原结合分子,其中该能够特异性结合OX40的模块包含

(vi)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的VL,或(vii)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的VL。

在一个特定方面,提供的是一种双特异性抗原结合分子,其中该能够特异性结合OX40的模块包含包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的VL。

结合TnC的双特异性抗原结合分子

在一个方面,本发明提供双特异性抗原结合分子,其中该能够特异性结合生腱蛋白C(TnC)的模块结合包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列或由其组成的多肽。

在一个方面,提供的是一种双特异性抗原结合分子,其包含至少一个能够特异性结合TnC的模块,其中所述模块包含包含下述各项的VH:

和包含下述各项的VL:

特别地,提供的是一种双特异性抗原结合分子,其包含至少一个能够特异性结合TnC的模块,其中所述模块包含(a)包含包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的CDR-H1,包含SEQID NO:42的氨基酸序列的CDR-H2,包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的CDR-H3的VH和包含包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的CDR-L1,包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列的CDR-L3的VL,或(b)包含包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的CDR-H1,包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的CDR-H2,包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的CDR-H3的VH和包含包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的CDR-L1,包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列的CDR-L3的VL。

特别地,提供的是一种双特异性抗原结合分子,其包含至少一个能够特异性结合TnC的模块,其中所述模块包含VH和VL,该VH包含包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的CDR-H1,包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的CDR-H2,包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的CDR-H3且该VL包含包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的CDR-L1,包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列的CDR-L3。

在另一个方面,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其中该能够特异性结合TnC的模块包含包含与选自由SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:54组成的组的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VH和包含与选自由SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:55组成的组的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VL。

特别是,提供的是一种双特异性抗原结合分子,其中该能够特异性结合TnC的模块包含

在一个特定方面,提供的是一种双特异性抗原结合分子,其中该能够特异性结合OX40的模块包含包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的VL。

结合OX40和TnC的双特异性抗原结合分子

在又一个方面,提供的是一种双特异性抗原结合分子,其中

(i)该能够特异性结合OX40的模块包含包含与选自由SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:29,SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:37组成的组的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VH和包含与SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:28,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:34,SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:38的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VL,且

(ii)该能够特异性结合TnC的模块包含包含与选自由SEQ ID NO:52或SEQ ID NO:54组成的组的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VH和包含与选自由SEQ ID NO:53或SEQ ID NO:55组成的组的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VL。

在一个特定方面,提供的是一种双特异性抗原结合分子,其中

(a)该能够特异性结合OX40的模块包含包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的VL且该能够特异性结合TnC的模块包含包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的VL,

(b)该能够特异性结合OX40的模块包含包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的VL且该能够特异性结合TnC的模块包含包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的VL,

(c)该能够特异性结合OX40的模块包含包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的VL且该能够特异性结合TnC的模块包含包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的VL,

(d)该能够特异性结合OX40的模块包含包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的VL且该能够特异性结合TnC的模块包含包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的VL,

(e)该能够特异性结合OX40的模块包含包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的VL且该能够特异性结合TnC的模块包含包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的VL,

(f)该能够特异性结合OX40的模块包含包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的VL且该能够特异性结合TnC的模块包含包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的VL,

(g)该能够特异性结合OX40的模块包含包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的VL且该能够特异性结合TnC的模块包含包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的VL,

(h)该能够特异性结合OX40的模块包含包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的VL且该能够特异性结合TnC的模块包含包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的VL,

(i)该能够特异性结合OX40的模块包含包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VL且该能够特异性结合TnC的模块包含包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的VL,

(j)该能够特异性结合OX40的模块包含包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VL且该能够特异性结合TnC的模块包含包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的VL,

(k)该能够特异性结合OX40的模块包含包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的VL且该能够特异性结合TnC的模块包含包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的VL,

(l)该能够特异性结合OX40的模块包含包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的VL且该能够特异性结合TnC的模块包含包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的VL,

(m)该能够特异性结合OX40的模块包含包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的VL且该能够特异性结合TnC的模块包含包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的VL,或

(n)该能够特异性结合OX40的模块包含包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的VL且该能够特异性结合TnC的模块包含包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的VL。

在一个特定方面,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其中该能够特异性结合OX40的模块包含包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的VL且该能够特异性结合TnC的模块包含包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的VL,或该能够特异性结合OX40的模块包含包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的VL且该能够特异性结合TnC的模块包含包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的VL。

双特异性,二价抗原结合分子(2+2型式)

在一个方面,本发明涉及一种双特异性抗原结合分子,其包含

(a)两个能够特异性结合OX40的模块,其包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH),

(b)两个能够特异性结合TnC的模块,其包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH),和

(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc区。

在一个方面,该双特异性抗原结合分子对于OX40且对于TnC均是二价的。

在一个方面,本发明的双特异性抗原结合分子包含

(a)两条重链,每条重链包含能够特异性结合OX40的Fab片段的VH和CH1域,和Fc区亚基,

(b)两条轻链,每条轻链包含能够特异性结合OX40的Fab片段的VL和CL域,

(c)两个能够特异性结合TnC的Fab片段,其中该Fab片段之一连接至(a)的两条重链之一的C端,且该Fab片段之另一连接至(a)的两条重链之另一的C端。

在一些实施方案中,该两个能够特异性结合TnC的Fab片段是交换Fab片段,每个包含VL-CH1链和VH-CL链,且其中该VL-CH1链之一连接至(a)的两条重链之一的C端,且该VL-CH1链之另一连接至(a)的两条重链之另一的C端。

在依照本发明的各种方面的一些实施方案中,能够特异性结合TnC的Fab片段经由肽接头连接至(a)的重链的C端。在依照本发明的各种方面的一些实施方案中,能够特异性结合TnC的交换Fab片段的VL-CH1链经由肽接头连接至(a)的两条重链之一的C端。在特定实施方案中,该肽接头是(G4S)4(SEQ ID NO:69)。

在一个特定方面,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其包含

(a)每条包含SEQ ID NO:213的氨基酸序列的两条重链,包含SEQ ID NO:212的氨基酸序列的第一轻链,和包含SEQ ID NO:214的氨基酸序列的第二轻链,或

(b)每条包含SEQ ID NO:215的氨基酸序列的两条重链,包含SEQ ID NO:212的氨基酸序列的第一轻链,和包含SEQ ID NO:216的氨基酸序列的第二轻链。

每条包含SEQ ID NO:213的氨基酸序列的两条重链,

每条包含SEQ ID NO:212的氨基酸序列的两条轻链,和

每条包含SEQ ID NO:214的氨基酸序列的两条轻链。

每条包含SEQ ID NO:215的氨基酸序列的两条重链,

每条包含SEQ ID NO:212的氨基酸序列的两条轻链,和

每条包含SEQ ID NO:216的氨基酸序列的两条轻链。

具有对OX40的二价或四价结合和对TnC的单价结合的双特异性抗原结合分子(2+1和4+1型式)

在一个方面,该双特异性抗原结合分子对于OX40是二价的且对于TnC是单价的。

在一个方面,本发明的双特异性抗原结合分子包含

(a)两个能够特异性结合OX40的Fab片段,其连接至Fc区,和

(b)能够特异性结合TnC的模块,其包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH),连接至该Fc区的C端。

在一个方面,本发明的双特异性抗原结合分子包含

(a)两条重链,每条重链包含能够特异性结合OX40的Fab片段的VH和CH1域和Fc区亚基,

(b)两条轻链,每条轻链包含能够特异性结合OX40的Fab片段的VL和CL域,和

(c)能够特异性结合TnC的模块的VH和VL,其中该VH连接至(a)的两条重链之一的C端,且其中该VL连接至(a)的两条重链之另一的C端。

在另一个方面,本发明的双特异性抗原结合分子包含

(c)能够特异性结合TnC的Fab片段,其中该Fab片段的VHCH1链或VLCL链连接至(a)的两条重链之一的C端。

具有对OX40的四价结合和对TnC的单价结合的双特异性抗原结合分子(4+1型式)

在一个方面,该双特异性抗原结合分子对于OX40是四价的且对于TnC是单价的。

在一个方面,本发明的双特异性抗原结合分子包含

(a)四个能够特异性结合OX40的Fab片段,其连接至Fc区,和

在一个方面,本发明的双特异性抗原结合分子包含

(a)包含四个能够特异性结合OX40的Fab片段和Fc区的抗体的两条轻链和两条重链,和

在一个方面,本发明的双特异性抗原结合分子包含

(a)两条重链,每条重链包含能够特异性结合OX40的Fab片段的两个VH域和两个CH1域和Fc区亚基,

(b)四条轻链,每条轻链包含能够特异性结合OX40的Fab片段的VL和CL域,和

在依照本发明的各种方面的一些实施方案中,能够特异性结合TnC的模块的VH连经由肽接头接至(a)的两条重链之一的C端。在依照本发明的各种方面的一些实施方案中,能够特异性结合TnC的模块的VL经由肽接头连接至(a)的两条重链之一的C端。在特定实施方案中,该肽接头是(G₄S)₄(SEQ ID NO:69)。

在一个特定方面,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其包含包含SEQ IDNO:222的氨基酸序列的第一重链,包含SEQ ID NO:223的氨基酸序列的第二重链,和包含SEQ ID NO:212的氨基酸序列的轻链。

包含SEQ ID NO:222的氨基酸序列的第一重链,

包含SEQ ID NO:223的氨基酸序列的第二重链,和

每条包含SEQ ID NO:212的氨基酸序列的四条轻链。

在一个方面,本发明的双特异性抗原结合分子包含形成第一,第二,第三,第四,和第五抗原结合模块的第一和第二重链和四条轻链,其中该第一,该第二,该第三,和该第四抗原结合模块每个能够特异性结合OX40且该第五抗原结合模块能够特异性结合TnC,其中

(i)该第一多肽链以氨基(N)端至羧基(C)端方向包含VH(OX40),CH1,VH(OX40),CH1,CH2,CH3(Fc节)和VH(TnC),

(ii)该第二多肽链以N端至C端方向包含VH(OX40),CH1,VH(OX40),CH1,CH2,CH3(Fc穴)和VL(TnC),且

(iii)四条轻链以N端至C端方向包含VL(Ox40)和CL。

在另一个方面,本发明的双特异性抗原结合分子包含形成第一,第二,第三,第四,和第五抗原结合模块的第一和第二重链和四条轻链,其中该第一,该第二,该第三,和该第四抗原结合模块每个能够特异性结合OX40且该第五抗原结合模块能够特异性结合TnC,其中

(i)该第一多肽链以氨基(N)端至羧基(C)端方向包含VH(OX40),CH1,VH(OX40),CH1,CH2,CH3(Fc节)和VL(TnC),

(ii)该第二多肽链以N端至C端方向包含VH(OX40),CH1,VH(OX40),CH1,CH2,CH3(Fc穴)和VH(TnC),且

(iii)该四条轻链以N端至C端方向包含VL(Ox40)和CL。

具有对OX40的四价结合和对TnC的二价结合的双特异性抗原结合分子(4+2型式)

在一个方面,该双特异性抗原结合分子对于OX40是四价的且对于TnC是二价的。

在一个方面,本发明的双特异性抗原结合分子包含

(a)四个能够特异性结合OX40的Fab片段,其连接至Fc区,和

(b)两个能够特异性结合TnC的模块,其包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH),连接至该Fc区的C端。

在一个方面,本发明的双特异性抗原结合分子包含

(a)包含四个能够特异性结合OX40的Fab片段和Fc区的抗体的四条轻链和两条重链,和

在一个方面,本发明的双特异性抗原结合分子包含

在依照本发明的各种方面的一些实施方案中,能够特异性结合TnC的Fab片段经由肽接头连接至(a)的重链的C端。在依照本发明的各种方面的一些实施方案中,能够特异性结合TnC的交换Fab片段的VL-CH1链经由肽接头连接至(a)的两条重链之一的C端。在特定实施方案中,该肽接头是(G₄S)₄(SEQ ID NO:69)。

在一个特定方面,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其包含每条包含SEQID NO:225的氨基酸序列的两条重链,包含SEQ ID NO:224的氨基酸序列的第一轻链,和包含SEQ ID NO:226的氨基酸序列的第二轻链。

每条包含SEQ ID NO:225的氨基酸序列的两条重链,

每条包含SEQ ID NO:224的氨基酸序列的四条轻链,和

每条包含SEQ ID NO:226的氨基酸序列的两条轻链。

在一个方面,本发明的双特异性抗原结合分子包含形成第一,第二,第三,第四,第五,和第六抗原结合模块的第一和第二重链和六条轻链,其中该第一,该第二,该第三,和该第四抗原结合模块每个能够特异性结合OX40,且其中该第五和该第六抗原结合模块每个能够特异性结合TnC,其中

(i)该第一和该第二多肽链以氨基(N)端至羧基(C)端方向包含VH(OX40),CH1*,VH(OX40),CH1*,CH2,CH3,VL(TnC)和CH1,

(ii)四条轻链以N端至C端方向包含VL(OX40)和CL*,且

(iii)两条轻链以N端至C端方向包含VH(TnC)和CL且其中CH1*和CL*包含氨基酸突变以容许更好的配对。

降低Fc受体结合和/或效应器功能的Fc区修饰

在依照本发明的各种方面的实施方案中,双特异性抗原结合分子进一步包含由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc区。

在某些方面,可以将一处或多处氨基酸修饰引入本文中提供的抗体的Fc区中,由此生成Fc区变体。Fc区变体可以包含在一个或多个氨基酸位置包含氨基酸修饰(例如替代)的人Fc区序列(例如人IgG1,IgG2,IgG3或IgG4 Fc区)。

Fc区赋予本发明的双特异性抗体以有利的药动学特性,包括长血清半衰期,其有助于在靶组织中的较好积累和有利的组织-血液分配比。然而,同时它可能导致不想要的本发明的双特异性抗体对表达Fc受体的细胞而非优选的携带抗原的细胞的靶向。因而,在具体的实施方案中,本发明的双特异性抗体的Fc区展现出与天然IgG Fc区,特别是IgG1 Fc区或IgG4 Fc区相比降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应器功能。更加特别地,Fc区是IgG1Fc区。

在一个此类方面,Fc区(或包含所述Fc区的本发明的双特异性抗原结合分子)展现出与天然IgG1 Fc区(或包含天然IgG1 Fc区的本发明的双特异性抗原结合分子)相比少于50％,优选少于20％,更优选少于10％且最优选少于5％的对Fc受体的结合亲和力,和/或与天然IgG1 Fc区(或包含天然IgG1 Fc区的本发明的双特异性抗原结合分子)相比少于50％,优选少于20％,更优选少于10％且最优选少于5％的效应器功能。在一个方面,Fc区(或包含所述Fc区的本发明的双特异性抗原结合分子)没有实质性结合Fc受体和/或诱导效应器功能。在一个特定的方面,所述Fc受体是Fcγ受体。在一个方面,所述Fc受体是人Fc受体。在一个方面,所述Fc受体是活化性Fc受体。在一个具体的方面,所述Fc受体是活化性人Fcγ受体,更具体地是人FcγRIIIa,FcγRI或FcγRIIa,最具体地是人FcγRIIIa。在一个方面,所述Fc受体是抑制性Fc受体。在一个具体的方面,所述Fc受体是抑制性人Fcγ受体,更具体地是人FcγRIIB。在一个方面,效应器功能是CDC,ADCC,ADCP,和细胞因子分泌中的一项或多项。在一个特定的方面,所述效应器功能是ADCC。在一个方面,所述Fc区结构域展现出与天然IgG1 Fc区相比基本相似的对新生儿Fc受体(FcRn)的结合亲和力。当Fc区(或包含所述Fc区的本发明的双特异性抗原结合分子)展现出超过约70％,特别是超过约80％,更特别是超过约90％的天然IgG1 Fc区(或包含天然IgG1 Fc区的本发明的双特异性抗原结合分子)对FcRn的结合亲和力时,实现基本相似的对FcRn的结合。

在一个特定的方面,Fc区工程化改造为具有与非工程化Fc区相比降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应器功能。在一个特定的方面,本发明的双特异性抗原结合分子的Fc区包含一处或多处降低Fc区对Fc受体的结合亲和力和/或效应器功能的氨基酸突变。通常,Fc区的两个亚基的每一个中存在相同的一处或多处氨基酸突变。在一个方面,所述氨基酸突变降低Fc区对Fc受体的结合亲和力。在另一个方面,所述氨基酸突变将Fc区对Fc受体的结合亲和力降低至少2倍,至少5倍,或至少10倍。在一个方面,包含工程化Fc区的本发明的双特异性抗原结合分子展现出与包含非工程化Fc区的本发明的双特异性抗体相比少于20％,特别是少于10％,更特别是少于5％的对Fc受体的结合亲和力。在一个特定的方面,所述Fc受体是Fcγ受体。在其它方面,所述Fc受体是人Fc受体。在一个方面,所述Fc受体是抑制性Fc受体。在一个具体的方面,所述Fc受体是抑制性人Fcγ受体,更具体地是人FcγRIIB。在一些方面,所述Fc受体是活化性Fc受体。在一个具体的方面,所述Fc受体是活化性人Fcγ受体,更特别是人FcγRIIIa,FcγRI或FcγRIIa,最特别是人FcγRIIIa。优选地,对这些受体的每一种的结合是降低的。在一些方面,对补体成分的结合亲和力,特别是对C1q的结合亲和力也是降低的。在一个方面,对新生儿Fc受体(FcRn)的结合亲和力没有降低。当Fc区(或包含所述Fc区的本发明的双特异性抗原结合分子)展现出非工程化形式的Fc区(或包含所述非工程化形式的Fc区的本发明的双特异性抗原结合分子)对FcRn的结合亲和力的超过约70％时,实现基本相似的对FcRn的结合,即保留该Fc区对所述受体的结合亲和力。Fc区或包含所述Fc区的本发明的双特异性抗原结合分子可以展现出超过约80％和甚至超过约90％的此类亲和力。在某些实施方案中,本发明的双特异性抗原结合分子的Fc区工程化改造为具有与非工程化Fc区相比降低的效应器功能。所述降低的效应器功能可包括但不限于下列一项或多项:降低的补体依赖性细胞毒性(CDC),降低的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC),降低的抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP),降低的细胞因子分泌,降低的免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取,降低的对NK细胞的结合,降低的对巨噬细胞的结合,降低的对单核细胞的结合,降低的对多形核细胞的结合,降低的诱导凋亡的直接信号传导,降低的树突细胞成熟,或降低的T细胞引发。

具有降低的效应器功能的抗体包括那些具有Fc区残基238,265,269,270,297,327和329中的一个或多个的替代的(美国专利No.6,737,056)。此类Fc突变体包括在氨基酸位置265,269,270,297和327中的两处或更多处具有替代的Fc突变体,包括残基265和297替代成丙氨酸的所谓的“DANA”Fc突变体(美国专利No.7,332,581)。描述了具有改善的或降低的对FcR的结合的某些抗体变体(见例如美国专利No.6,737,056；WO 2004/056312,及Shields,R.L.et al.,J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604)。

在本发明的一个方面,Fc区包含在E233,L234,L235,N297,P331和P329位置处的氨基酸替代。在一些方面,Fc区包含氨基酸替代L234A和L235A(“LALA”)。在一个此类实施方案中,Fc区是IgG1 Fc区,特别是人IgG1 Fc区。在一个方面,Fc区包含在位置P329处的氨基酸替代。在一个更加具体的方面,氨基酸替代是P329A或P329G,特别是P329G。在一个实施方案中,Fc区包含在位置P329处的氨基酸替代和又一处选自下组的氨基酸替代:E233P,L234A,L235A,L235E,N297A,N297D或P331S。在更具体的实施方案中,所述Fc区包含氨基酸突变L234A,L235A和P329G(“P329G LALA”)。氨基酸替代组合“P329G LALA”几乎完全消除了人IgG1 Fc区的Fcγ受体结合,如记载于PCT专利申请No.WO 2012/130831A1。所述文件还描述了制备此类突变体Fc区的方法和用于测定其特性(诸如Fc受体结合或效应器功能)的方法。此类抗体是具有突变L234A和L235A或具有突变L234A,L235A和P329G(编号方式依照Kabatet al,Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5thEd.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991的EU索引)的IgG1。

在一个方面,Fc区为IgG4 Fc区。在一个更具体的实施方案中,Fc区是包含在位置S228(Kabat编号)处的氨基酸替代具体地为氨基酸替代S228P的IgG4 Fc区。在一个更具体的实施方案中,Fc区是包含氨基酸替代L235E和S228P和P329G的IgG4 Fc区。这种氨基酸替代降低体内IgG4抗体的Fab臂交换(参见Stubenrauch et al.,Drug Metabolism andDisposition 38,84-91(2010))。

具有延长的半衰期和改善的对新生儿Fc受体(FcRn)的结合的抗体记载于US2005/0014934,新生儿Fc受体(FcRn)负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer,R.L.et al.,J.Immunol.117(1976)587-593及Kim,J.K.et al.,J.Immunol.24(1994)2429-2434)。那些抗体包含其中具有改善Fc区对FcRn结合的一处或多处替代的Fc区。此类Fc变体包括那些在Fc区残基238,256,265,272,286,303,305,307,311,312,317,340,356,360,362,376,378,380,382,413,424或434中的一处或多处具有替代,例如,Fc区残基434的替代的(美国专利No.7,371,826)。还可见Duncan,A.R.and Winter,G.,Nature 322(1988)738-740；US 5,648,260；US 5,624,821；及WO 94/29351,其关注Fc区变体的其它例子。

可以例如通过ELISA或通过使用诸如BIAcore仪(GE Healthcare)的标准仪器的表面等离子体共振(SPR)容易地确定与Fc受体的结合,并且可以例如通过重组表达获得Fc受体。适合的此类结合测定描述于本文中。或者,可以使用已知表达特定Fc受体的细胞系例如表达FcγIIIa受体的人NK细胞来评估Fc区或包含Fc区的细胞活化性双特异性抗原结合分子针对Fc受体的结合亲和力。可以通过本领域已知的方法测量Fc区或包含Fc区的本发明的双特异性抗体的效应器功能。适合的用于测量ADCC的测定法描述于本文中。评估感兴趣分子的ADCC活性的体外测定法的其他实例描述于美国专利No.5,500,362；Hellstrom等人,Proc.Natl Acad Sci USA 83,7059-7063(1986)和Hellstrom等人,Proc Natl Acad SciUSA 82,1499-1502(1985)；美国专利No.5,821,337；Bruggemann等人,J Exp Med 166,1351-1361(1987)。或者,可以采用非放射性测定方法(参见,例如ACTI^TM non-radioactivecytotoxicity assay for flow cytometry(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)；CytoTox

non-radioactive cytotoxicity assay(Promega,Madison,WI))。用于这种测定法的有用的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。替代地,或另外地,可以在体内,例如,在Clynes等人,Proc Natl Acad Sci USA 95,652-656(1998)中公开的动物模型中评估感兴趣分子的ADCC活性。

下一节描述本发明的包含降低Fc受体结合和/或效应器功能的Fc区修饰的双特异性抗原结合分子的优选方面。在一个方面,本发明涉及双特异性抗原结合分子,其包含(a)至少一个能够特异性结合OX40的模块,(b)至少一个能够特异性结合TnC的模块,和(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc区,其中该Fc区包含一处或多处降低抗体对Fc受体,特别是Fcγ受体的结合亲和力的氨基酸替代。在另一个方面,本发明涉及双特异性抗原结合分子,其包含(a)至少一个能够特异性结合OX40的模块,(b)至少一个能够特异性结合TnC的模块,和(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc区,其中该Fc区包含一处或多处降低效应器功能的氨基酸替代。在特定的方面,该Fc区是人IgG1亚类的,其具有氨基酸突变L234A,L235A和P329G(编号方式依照Kabat EU索引)。

促进异源二聚化的Fc区修饰

本发明的双特异性抗原结合分子包含与Fc区的两个亚基中的一个或另一个融合的不同抗原结合位点,因此该Fc区的两个亚基可包含在两条不相同的多肽链中。这些多肽的重组共表达和随后的二聚化导致两种多肽的数种可能的组合。为了在重组生产中提高本发明的双特异性抗体的产率和纯度,因此在本发明的双特异性抗原结合分子的Fc区中引入促进期望多肽的联合的修饰会是有利的。

因此,在特定的方面,本发明涉及双特异性抗原结合分子,其包含(a)至少一个能够特异性结合OX40的模块,(b)至少一个能够特异性结合TnC的模块,和(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc区,其中该Fc区包含促进Fc区的第一和第二亚基联合的修饰。人IgG Fc区的两个亚基之间最广泛的蛋白质-蛋白质相互作用的位点在Fc区的CH3域中。因此,在一个方面,所述修饰在Fc区的CH3域中。

在一个具体的方面,所述修饰是所谓的“节入穴”修饰,包括在Fc区的两个亚基之一中的“节”修饰和Fc区的两个亚基的另一个中的“穴”修饰。因此,本发明涉及双特异性抗原结合分子,其包含(a)至少一个能够特异性结合OX40的模块,(b)至少一个能够特异性结合TnC的模块,和(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc区,其中依照该节入穴方法,该Fc区的第一亚基包含节且该Fc区的第二亚基包含穴。在一个特定的方面,该Fc区的第一亚基包含氨基酸替代S354C和T366W(EU编号方式)且该Fc区的第二亚基包含氨基酸替代Y349C,T366S和Y407V(编号方式依照Kabat EU索引)。

“节入穴”技术例如描述于US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway等人Prot Eng9,617-621(1996)and Carter,J Immunol Meth 248,7-15(2001)中。通常,该方法包括在第一多肽的界面处引入突起(“节”)并且在第二多肽的界面中引入相应的腔(“穴”),使得该突起可以定位在该腔中,从而促进异二聚体形成并阻碍同二聚体形成。通过用较大的侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换第一多肽的界面的小氨基酸侧链而构建突起。通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换大的氨基酸侧链,在第二多肽的界面中产生与突起具有相同或相似大小的补偿腔。

因此,在一个方面,在本发明的双特异性抗原结合分子的Fc区的第一亚基的CH3结构域中,将氨基酸残基替换为具有较大侧链体积的氨基酸残基,由此在第一亚基的CH3结构域内产生可定位于第二亚基的CH3结构域内的腔中的突起；并且在Fc区的第二亚基的CH3结构域中,将氨基酸残基替换为具有较小侧链体积的氨基酸酸残基,由此在第二亚基的CH3结构域内产生可将第一亚基的CH3结构域内的突起定位在其中的腔。可以通过改变编码多肽的核酸,例如通过位点特异性诱变,或通过肽合成而产生突起和腔。在一个具体方面,在Fc区的第一亚基的CH3结构域中,第366位的苏氨酸残基替换为色氨酸残基(T366W),而在Fc区的第二亚基的CH3结构域中,第407位酪氨酸残基替换为缬氨酸残基(Y407V)。在一个方面,在Fc区的第二亚基中,另外将366位的苏氨酸残基替换为丝氨酸残基(T366S),将368位的亮氨酸残基替换为丙氨酸残基(L368A)。

在还有又一个方面,在Fc区的第一亚基中,另外将第354位的丝氨酸残基替换为半胱氨酸残基(S354C),而在Fc区的第二亚基中,另外将第349位酪氨酸残基替换为半胱氨酸残基(Y349C)。引入这两个半胱氨酸残基导致在Fc区的两个亚基之间形成二硫桥,其进一步使该二聚体稳定(Carter(2001),J Immunol Methods 248,7-15)。在一个特定的方面,该Fc区的第一亚基包含氨基酸替代S354C和T366W(EU编号方式)且该Fc区的第二亚基包含氨基酸替代Y349C,T366S和Y407V(编号方式依照Kabat EU索引)。

在一个替代方面,促进Fc区的第一和第二亚基的联合的修饰包括介导静电操纵效应的修饰,例如,如PCT公开WO 2009/089004中所述。通常,这种方法包括通过将两个Fc区亚基的界面处的一个或多个氨基酸残基替换为带电氨基酸残基,使得在静电方面不利于同二聚体形成,但在静电方面有利于异二聚化。

如本文中报告的双特异性抗体的重链的C端可以是以氨基酸残基PGK结束的完整C端。重链的C端可以是缩短的C端,其中去除了一个或两个C端氨基酸残基。在一个优选的方面,重链的C端是以PG结束的缩短的C端。在如本文中报告的所有方面的一个方面,包含包括如本文中规定的C端CH3域的重链的双特异性抗体包含C端甘氨酸-赖氨酸二肽(G446和K447,编号方式依照Kabat EU索引)。在如本文中报告的所有方面的一个实施方案中,包含包括如本文中规定的C端CH3域的重链的双特异性抗体包含C端甘氨酸残基(G446,编号方式依照Kabat EU索引)。

Fab域中的修饰

在一个方面,本发明涉及一种双特异性抗原结合分子,其包含(a)能够特异性结合OX40的第一Fab片段,(b)能够特异性结合TnC的第二Fab片段,和(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc区,其中在该Fab片段之一中可变域VH和VL或恒定域CH1和CL任一是交换的。该双特异性抗体依照Crossmab技术来制备。

具有一个结合臂中的域替换/交换的多特异性抗体(CrossMabVH-VL或CrossMabCH-CL)详细记载于WO2009/080252和Schaefer,W.et al.,PNAS,108(2011)11187-1191。它们清楚地减少由针对第一抗原的轻链与错误的针对第二抗原的重链错配引起的副产物(与没有此类域交换的办法相比)。

在一个方面,本发明涉及一种双特异性抗原结合分子,其包含(a)能够特异性结合OX40的第一Fab片段,(b)能够特异性结合TnC的第二Fab片段,和(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc区,其中在该Fab片段之一中恒定域CL和CH1彼此替换使得该CH1域是轻链的一部分且该CL域是重链的一部分。更加特别地,在能够特异性结合TnC的第二Fab片段中恒定域CL和CH1彼此替换使得该CH1域是轻链的一部分且该CL域是重链的一部分。

在一个特定的方面,本发明涉及一种双特异性抗原结合分子,其包含(a)能够特异性结合OX40的第一Fab片段,(b)能够特异性结合TnC的第二Fab片段,其中恒定域CL和CH1彼此替换使得该CH1域是轻链的一部分且该CL域是重链的一部分。此类分子称作单价双特异性抗原结合分子。

在另一个方面,本发明涉及一种双特异性抗原结合分子,其包含(a)包含两个能够特异性结合OX40的Fab片段和Fc区的抗体的两条轻链和两条重链,和(b)两个另外的能够特异性结合TnC的Fab片段,其中所述另外的Fab片段各自经肽接头连接至(a)的重链的C端。在一个特定的方面,该另外的Fab片段是Fab片段,其中可变域VL和VH彼此替换使得该VH是轻链的一部分且该VL是重链的一部分。

如此,在一个特定方面,本发明包含一种双特异性抗原结合分子,其包含(a)包含两个能够特异性结合OX40的Fab片段和Fc区的抗体的两条轻链和两条重链,和(b)两个另外的能够特异性结合TnC的Fab片段,其中所述两个另外的能够特异性结合TnC的Fab片段是交换Fab片段,其中可变域VL和VH彼此替换且VL-CH链各自经肽接头连接至(a)的重链的C端。

在另一个方面,及为了进一步改善正确配对,包含(a)能够特异性结合OX40的第一Fab片段,(b)能够特异性结合TnC的第二Fab片段,和(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域的双特异性抗原结合分子可含有不同的带电荷的氨基酸替代(所谓的“带电荷的残基”)。在交叉或非交叉CH1和CL域中引入这些修饰。在一个特定的方面,本发明涉及一种双特异性抗原结合分子,其中在CL域之一中位置123(EU编号方式)处的氨基酸被精氨酸(R)替换且位置124(EU编号方式)处的氨基酸被赖氨酸(K)替代且其中在CH1域之一中位置147(EU编号方式)处的和位置213(EU编号方式)处的氨基酸被谷氨酸(E)替代。

更加特别地,本发明涉及一种双特异性抗原结合分子,其包含Fab,其中在CL域中位置123(EU编号方式)处的氨基酸被精氨酸(R)替换且位置124(EU编号方式)处的氨基酸被赖氨酸(K)替代,且其中在CH1域中位置147(EU编号方式)处的和位置213(EU编号方式)处的氨基酸被谷氨酸(E)替代。

因而,在一些实施方案中,本发明的双特异性抗原结合分子的一个或多个Fab片段(例如能够特异性结合OX40的Fab片段)包含包含精氨酸(R)作为位置123(EU编号方式)处的氨基酸和赖氨酸(K)作为位置124(EU编号方式)处的氨基酸的CL域,和包含谷氨酸(E)作为位置147(EU编号方式)处的氨基酸和谷氨酸(E)作为位置213(EU编号方式)处的氨基酸的CH1域。

多核苷酸

本发明进一步提供了编码如本文中描述的发明的双特异性抗原结合分子的分离的多核苷酸或其片段。

编码本发明的双特异性抗原结合分子的分离的多核苷酸可以表述为编码整个抗原结合分子的单个多核苷酸或共表达的多个(例如两个或更多个)多核苷酸。由共表达的多核苷酸编码的多肽可以通过例如二硫键或其他手段联合以形成功能性抗原结合分子。例如,能够特异性结合TnC的模块的轻链部分可以由与能够特异性结合TnC的模块的重链部分分开的多核苷酸编码。在共表达时重链多肽将与轻链多肽联合以形成能够特异性结合TnC的模块。类似地,能够特异性结合OX40的模块的轻链部分可以由与能够特异性结合OX40的模块的重链部分分开的多核苷酸编码。在共表达时重链多肽将与轻链多肽联合以形成能够特异性结合OX40的模块。

在某些实施方案中,该多核苷酸或核酸是DNA。在其它实施方案中,本发明的多核苷酸是RNA,例如处于信使RNA(mRNA)的形式。本发明的RNA可以是单链或双链的。

依照本发明的另一个方面,提供有分离的多核苷酸,其编码如本文中之前描述的双特异性抗原结合分子或如本文中之前描述的融合多肽。本发明进一步提供包含本发明的分离的多核苷酸的载体,特别是表达载体和包含分离的多核苷酸或本发明的载体的宿主细胞。在一些实施方案中,宿主细胞是真核细胞,特别是哺乳动物细胞。

在另一个方面,提供的是一种用于生成本发明的双特异性抗原结合分子的方法,其包含下述步骤:(i)在适合于所述抗原结合分子表达的条件下培养本发明的宿主细胞,并(ii)分离所述双特异性抗原结合分子。本发明还涵盖通过本发明的方法生成的双特异性抗原结合分子。

重组方法

可以例如通过固态肽合成(例如Merrifield固相合成)或重组生产获得本发明的双特异性抗原结合分子。对于重组生产,分离一个或多个编码例如上文所述的抗原结合分子或其多肽片段的多核苷酸,并将其***到一个或多个载体中用于进一步在宿主细胞中克隆和/或表达。可以使用常规程序容易地分离这样的多核苷酸并将其测序。在本发明的一个方面,提供了包含一个或多个本发明的多核苷酸的载体,优选表达载体。可使用本领域技术人员熟知的方法构建包括双特异性抗原结合分子(片段)的编码序列以及适当的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术,合成技术和体内重组/遗传重组。参见,例如描述于Maniatis等人,MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,Cold SpringHarbor Laboratory,N.Y.(1989)；和Ausubel等人,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULARBIOLOGY,Greene Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y.(1989)中的技术。表达载体可以是质粒,病毒的一部分,或者可以是核酸片段。表达载体包括将编码双特异性抗原结合分子或其多肽片段的多核苷酸(即,编码区)与启动子和/或其他转录或翻译控制元件以可操作地关联的方式克隆到其中的表达盒。如本文中使用的,“编码区”是由翻译成氨基酸的密码子组成的核酸模块。虽然“终止密码子”(TAG,TGA或TAA)不翻译成氨基酸,但如果存在的话,它可被认为是编码区的一部分,但任何侧翼序列,例如启动子,核糖体结合位点,转录终止子,内含子,5'和3'非翻译区等不是编码区的一部分。在单个多核苷酸构建体中,例如,在单个载体上,或在单独的多核苷酸构建体中,例如,在单独的(不同的)载体上可以存在两个或更多个编码区。此外,任何载体可以包含单个编码区,或者可以包含两个或更多个编码区,例如本发明的载体可以编码一个或多个多肽,其通过蛋白水解切割在翻译后或以共翻译方式分离成最终的蛋白质。另外,本发明的载体,多核苷酸或核酸可以编码异源编码区,所述异源编码区与编码本发明的双特异性抗原结合分子或其多肽片段或其变体或衍生物的多核苷酸融合或未融合。异源编码区包括但不限于专门的元件或基序,例如分泌信号肽或异源功能结构域。可操作地关联是指这样一种方式:基因产物例如多肽的编码区与一个或多个调节序列相关联以使基因产物的表达在调节序列的影响或控制下进行。如果启动子功能的诱导导致编码所需基因产物的mRNA的转录,并且如果两个DNA片段之间的连接性质不干扰表达调控序列指导基因产物表达的能力或不干扰DNA模板被转录的能力,则所述两个DNA片段(例如多肽编码区和与其关联的启动子)是“可操作地关联的”。因此,如果启动子能够影响编码多肽的核酸的转录,则启动子区与该核酸可操作地关联。启动子可以是仅在预定细胞中指导实质性DNA转录的细胞特异性启动子。除了启动子之外,其他转录控制元件例如增强子,操纵子,阻抑物和转录终止信号,可与多核苷酸可操作地关联以指导细胞特异性转录。

本文中公开了适合的启动子和其他转录控制区。许多转录控制区是本领域中的技术人员已知的。这些包括但不限于在脊椎动物细胞中起作用的转录控制区,例如但不限于来自巨细胞病毒(例如立即早期启动子,与内含子A结合),猿猴病毒40(例如早期启动子)和逆转录病毒(如,例如劳斯肉瘤病毒)的启动子和增强子区段。其他转录控制区包括衍生自脊椎动物基因如肌动蛋白,热休克蛋白,牛生长激素和兔α珠蛋白的那些转录控制区,以及能够控制真核细胞中基因表达的其他序列。另外的适合的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及诱导型启动子(例如四环素诱导型启动子)。类似地,许多翻译控制元件是本领域普通技术人员已知的。这些包括但不限于核糖体结合位点,翻译起始和终止密码子以及衍生自病毒***的元件(特别是内部核糖体进入位点或IRES,也称为CITE序列)。表达盒还可以包括诸如复制起点的其他特征,和/或诸如逆转录病毒长末端重复序列(LTR)或腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)的染色体整合元件。

本发明的多核苷酸和核酸编码区可以与另外的编码分泌肽或信号肽的编码区相关联,所述分泌肽或信号肽指导由本发明的多核苷酸编码的多肽的分泌。例如,如果希望分泌双特异性抗原结合分子或其多肽片段,则编码信号序列的DNA可以位于编码本发明的双特异性抗原结合分子或其多肽片段的核酸的上游。根据信号假说,由哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号肽或分泌前导序列,所述信号肽或分泌前导序列在起始生长蛋白质链输出穿过粗面内质网后被从成熟蛋白质切割下来。本领域普通技术人员知道,脊椎动物细胞分泌的多肽通常具有与多肽的N末端融合的信号肽,其被从翻译的多肽切割下来以产生多肽的分泌或“成熟”形式。在某些实施方案中,使用了天然信号肽例如免疫球蛋白重链或轻链信号肽,或该序列的功能衍生物,所述衍生物保留了指导与其可操作地相关联的多肽分泌的能力。或者,可以使用异源哺乳动物信号肽或其功能衍生物。例如,野生型前导序列可以替代为人组织纤溶酶原激活物(TPA)或小鼠β-葡糖醛酸糖苷酶的前导序列。

编码可用于促进后续纯化(例如组氨酸标签)或辅助标记融合蛋白的短蛋白质序列的DNA可以包括在编码本发明的双特异性抗原结合分子或其多肽片段的多核苷酸的内部或末端。

在本发明的一个另外的方面,提供了包含一个或多个本发明的多核苷酸的宿主细胞。在某些实施方案中,提供了包含一个或多个本发明的载体的宿主细胞。多核苷酸和载体可分别掺入关于多核苷酸和载体的单一或组合地在本文中描述的任何特征。在一个方面,宿主细胞包含(例如已经转化或转染)包含编码本发明的双特异性抗原结合分子的(一部分)的多核苷酸的载体。如本文中使用的,术语“宿主细胞”是指可以被工程化以产生本发明的融合蛋白或其片段的任何种类的细胞***。适合于复制和支持抗原结合分子表达的宿主细胞是本领域熟知的。可以使用特定的表达载体适当地转染或转导这样的细胞,并且可以培养大量含有载体的细胞用于接种大规模发酵罐以获得足够量的用于临床应用的抗原结合分子。适合的宿主细胞包括原核微生物,如大肠杆菌,或各种真核细胞,如中国仓鼠卵巢细胞(CHO),人胚胎肾(HEK)细胞,昆虫细胞等。例如,尤其是在不需要糖基化时,可以在细菌中产生多肽。表达后,可以从菌体糊分离出作为可溶性级分的多肽,并可将其进一步纯化。除了原核生物之外,诸如丝状真菌或酵母的真核微生物是编码多肽的载体的适合克隆或表达宿主,包括其糖基化途径已被“人源化”的导致产生具有部分或完全人糖基化样式的多肽的真菌和酵母菌株。参见Gerngross,Nat Biotech 22,1409-1414(2004),和Li等人,NatBiotech 24,210-215(2006)。

用于表达(糖基化)多肽的适合宿主细胞也源自多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了可以与昆虫细胞结合使用尤其是用于转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞的许多杆状病毒株。植物细胞培养物也可以用作宿主。参见例如美国专利Nos.5,959,177,6,040,498,6,420,548,7,125,978,和6,417,429(描述了用于在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIES^TM技术)。脊椎动物细胞也可以用作宿主。例如,适于在悬液中生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例是经SV40(COS-7)转化的猴肾CV1系；人胚胎肾细胞系(例如,在Graham等人,J Gen Virol 36,59(1977))中描述的293或293T细胞；仓鼠婴肾细胞(BHK)；小鼠sertoli细胞(如在Mather,Biol Reprod 23,243-251(1980)中所述的TM4细胞)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人***细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；Buffalo大鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺肿瘤细胞(MMT060562)；TRI细胞(如在Mather等人,Annals N.Y.Acad Sci 383,44-68(1982)中描述)；MRC5细胞和FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,包括dhfr-CHO细胞(Urlaub等人,Proc Natl Acad Sci USA 77,4216(1980))；和骨髓瘤细胞系如YO,NS0,P3X63和Sp2/0。对于适用于蛋白质产生的某些哺乳动物宿主细胞系的综述,参见例如Yazaki和Wu,Methods in Molecular Biology,Vol.248(B.K.C.Lo,ed.,HumanaPress,Totowa,NJ),pp.255-268(2003)。宿主细胞包括培养的细胞,例如培养的哺乳动物细胞,酵母细胞,昆虫细胞,细菌细胞和植物细胞,在此仅列举少数,还有包括在转基因动物,转基因植物或培养的植物或动物组织内的细胞。在一个实施方案中,宿主细胞是真核细胞,优选哺乳动物细胞,例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,人胚胎肾(HEK)细胞或淋巴样细胞(例如Y0,NS0,Sp20细胞)。在这些***中表达外源基因的标准技术在本领域中是已知的。可以将表达包含抗原结合域重链或轻链的多肽的细胞工程化,以便也表达另一个免疫球蛋白链,使得所表达的产物是具有重链和轻链两者的抗原结合域。

在另一个方面,提供的是一种用于生成本发明的双特异性抗原结合分子的方法,其包含下述步骤:(i)在适合于所述抗原结合分子表达的条件下培养本发明的宿主细胞,和(ii)自宿主细胞或宿主细胞培养液分离所述双特异性抗原结合分子。

双特异性抗原结合分子的各构件在遗传上彼此融合。双特异性抗原结合分子可设计成使得其构件直接地或经由接头序列间接地彼此融合。可以依照本领域公知的方法确定接头的组成和长度,而且可以测试功效。双特异性抗原结合分子的不同构件之间的接头序列的例子见本文中提供的序列。如果想要的话,还可以包括另外的序列以掺入切割位点以分开融合物的各个构件,例如内肽酶识别序列。

在某些实施方案中,形成抗原结合分子的一部分的能够特异性结合TnC的模块(例如Fab片段或scFv)至少包含能够结合TnC的免疫球蛋白可变区。类似地,在某些实施方案中,形成抗原结合分子的一部分的能够特异性结合OX40的模块(例如Fab片段或scFv)至少包含能够结合OX40的免疫球蛋白可变区。可变区可形成天然或非天然发生的抗体和其片段的一部分且自其衍生。生成多克隆抗体和单克隆抗体的方法是本领域公知的(参见例如Harlow and Lane,"Antibodies,a laboratory manual",Cold Spring HarborLaboratory,1988)。非天然发生抗体可以使用固相肽合成来构建,可以重组生成(例如如美国专利No.4,186,567中描述的)或可以通过例如筛选包含可变重链和可变轻链的组合文库来获得(参见例如授予McCafferty的美国专利No.5,969,108)。

任何动物物种的免疫球蛋白均可在本发明中使用。在本发明中有用的非限制性免疫球蛋白可以是鼠,灵长类,或人起源的。如果融合蛋白旨在供人使用的话,可使用嵌合形式的免疫球蛋白,其中免疫球蛋白的恒定区来自人。还可依照本领域公知的方法制备人源化或完全人形式的免疫球蛋白(参见例如授予Winter的美国专利No.5,565,332)。人源化可通过多种方法来实现,包括但不限于(a)将非人(例如供体抗体)CDR嫁接到人(例如受体抗体)框架和恒定区上,有或没有保留关键框架残基(例如那些对于保留优秀的抗原结合亲和力或抗体功能重要的残基),(b)仅将非人特异性决定区(SDR或a-CDR；对于抗体-抗原相互作用关键的残基)嫁接到人框架和恒定区上,或(c)移植整个非人可变域,但通过替换表面残基用人样区段“遮盖”它们。人源化抗体和生成它们的方法在例如Almagro andFransson,Front Biosci 13,1619-1633(2008)中综述,而且在例如Riechmann et al.,Nature 332,323-329(1988)；Queen et al.,Proc Natl Acad Sci USA 86,10029-10033(1989)；美国专利No.5,821,337,7,527,791,6,982,321,和7,087,409；Jones et al.,Nature 321,522-525(1986)；Morrison et al.,Proc Natl Acad Sci 81,6851-6855(1984)；Morrison and Oi,Adv Immunol 44,65-92(1988)；Verhoeyen et al.,Science239,1534-1536(1988)；Padlan,Molec Immun 31(3),169-217(1994)；Kashmiri et al.,Methods 36,25-34(2005)(描述SDR(a-CDR)嫁接)；Padlan,Mol Immunol 28,489-498(1991)(描述“表面重塑”)；Dall’Acqua et al.,Methods 36,43-60(2005)(描述“FR改组”)；和Osbourn et al.,Methods 36,61-68(2005)和Klimka et al.,Br J Cancer 83,252-260(2000)(描述用于FR改组的“导向选择”办法)中进一步描述。依照本发明的特定免疫球蛋白是人免疫球蛋白。人抗体和人可变区可使用本领域已知的多种技术来生成。人抗体在van Dijk and van de Winkel,Curr Opin Pharmacol 5,368-74(2001)和Lonberg,Curr Opin Immunol 20,450-459(2008)中一般性描述。人可变区能形成通过杂交瘤方法生成的人单克隆抗体的一部分且自其衍生(参见例如Monoclonal Antibody ProductionTechniques and Applications,pp.51-63(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987))。人抗体和人可变区还可以通过将免疫原施用于已经修饰以响应抗原性攻击而生成完整人抗体或具有人可变区的完整抗体的转基因动物来制备(参见例如Lonberg,Nat Biotech 23,1117-1125(2005)。人抗体和人可变区还可以通过分离自人衍生噬菌体展示文库选择的Fv克隆可变区序列来生成(参见例如Hoogenboom et al.,in Methods in MolecularBiology 178,1-37(O’Brien et al.,ed.,Human Press,Totowa,NJ,2001)；和McCaffertyet al.,Nature 348,552-554；Clackson et al.,Nature 352,624-628(1991))。噬菌体典型地或是以单链Fv(scFv)片段或是作为Fab片段展示抗体片段。

在某些方面,依照例如PCT公开文本WO 2012/020006(参见关于亲和力成熟的实施例)或美国专利申请公开文本No.2004/0132066中公开的方法工程化改造本发明的抗原结合分子中包含的能够特异性结合有关靶的模块(例如Fab片段或scFv)以具有增强的结合亲和力。本发明抗原结合分子结合特定抗原性决定簇的能力可经由酶联免疫吸附测定法(ELISA)或本领域技术人员熟悉的其它技术来测量,例如表面等离振子共振技术(Liljeblad et al.,Glyco J 17,323-329(2000))),和传统的结合测定法(Heeley,EndocrRes 28,217-229(2002))。可使用竞争测定法来鉴定与参照抗体竞争结合特定抗原的抗原结合分子。在某些实施方案中,此类竞争性抗原结合分子结合的表位(例如线性或构象表位)与参照抗原结合分子结合的相同。用于抗原结合分子结合的表位的作图的详细的例示性方法在Morris(1996)“Epitope Mapping Protocols”,in Methods in MolecularBiology vol.66(Humana Press,Totowa,NJ)中提供。在一种例示性竞争测定法中,在包含结合抗原的第一经标记抗原结合分子和第二未标记抗原结合分子(测试其与第一抗原结合分子竞争结合抗原的能力)的溶液中温育固定化抗原。第二抗原结合分子可以存在于杂交瘤上清液中。作为对照,在包含第一经标记抗原结合分子但不包含第二未标记抗原结合分子的溶液中温育固定化抗原。在允许第一抗体与抗原结合的条件下温育后,去除过量的未结合的抗体,并测量与固定化抗原联合的标记物的量。如果在测试样品中与固定化抗原联合的标记物的量相对于对照样品实质性降低,那么这指示第二抗原结合分子与第一抗原结合分子竞争结合抗原。参见Harlow and Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manualch.14(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)。

可以通过本领域已知的技术如高效液相色谱法,离子交换色谱法,凝胶电泳,亲和色谱法,尺寸排阻色谱法等来纯化如本文中描述制备的本发明的双特异性抗原结合分子。用于纯化特定蛋白质的实际条件将部分地取决于诸如净电荷,疏水性,亲水性等因素,并且对于本领域技术人员将是显而易见的。对于亲和色谱法纯化,可以使用与双特异性抗原结合分子结合的抗体,配体,受体或抗原。例如,为了本发明的融合蛋白的亲和色谱法纯化,可以使用具有蛋白A或蛋白G的基质。可以基本上如实施例中描述依次使用蛋白A或G亲和色谱法和尺寸排阻色谱法分离抗原结合分子。双特异性抗原结合分子或其片段的纯度可以通过各种熟知的分析方法中的任何一种加以测定,包括凝胶电泳,高压液相色谱法等。例如,正如通过还原和非还原性SDS-PAGE证实,如实施例中描述表达的双特异性抗原结合分子显示是完整且正确组装的。

本发明还涵盖通过本发明的方法生成的双特异性抗原结合分子。

测定法

可以通过本领域已知的各种测定法来鉴定,筛选或通过其物理/化学性质和/或生物学活性来表征在本文中提供的双特异性抗原结合分子。

1.亲和力测定法

根据实施例中提出的通过表面等离子体共振(SPR)的方法,使用标准仪器如BIAcore仪器(GE Healthcare),以及可以通过诸如重组表达获得的受体或靶蛋白,可以测定在本文中提供的双特异性抗原结合分子与OX40或TnC的亲和力。在实施例4.2中描述了用于测量结合亲和力的具体的说明性和示例性实施方案。根据一个方面,使用

T200仪(GE Healthcare)通过表面等离子体共振在25℃测量K_D。

2.结合测定法和其他测定法

例如通过流式细胞术(FACS),使用表达特定受体或靶抗原的细胞系,可以评价在本文中提供的双特异性抗原结合分子与相应的OX40和/或TnC表达细胞的结合。在一个方面,在结合测定中使用表达OX40的新鲜的外周血单个核细胞(PBMC)。在分离后(幼稚PMBC)或刺激后(活化的PMBC)直接使用这些细胞。在另一个方面,可以使用活化的小鼠脾细胞(表达OX40)来证明本发明的双特异性抗原结合分子与相应的OX40表达细胞的结合。

在又一个方面,使用表达TnC的癌细胞系来证明抗原结合分子与TnC的结合。

在另一个方面,可以使用竞争测定来鉴定与特异性抗体或抗原结合分子分别竞争结合TnC或OX40的抗原结合分子。在某些实施方案中,这种竞争性抗原结合分子结合的表位(例如线性或构象表位)与特异性抗TnC抗体或特异性抗OX40抗体结合的相同。用于抗体所结合的表位的作图的详细示例性方法提供于Morris(1996)“Epitope MappingProtocols,”in Methods in Molecular Biology vol.66(Humana Press,Totowa,NJ)中。

3.活性测定法

在一个方面,提供了用于鉴定具有生物学活性的与TnC和OX40结合的双特异性抗原结合分子的测定法。生物学活性可以包括例如通过表达OX40的细胞上的OX40的激动性信号传导。还提供了通过测定法鉴定为具有这样的体外生物学活性的双特异性抗原结合分子。特别地,提供检测表达人OX40且与TnC表达性肿瘤细胞共培养的Hela细胞中的NF-κB激活的报告细胞测定法(见例如实施例5.1)。

在某些方面,测试了本发明的双特异性抗原结合分子的这种生物学活性。用于检测本发明的分子的生物学活性的测定法是实施例5中描述的那些。此外,用于检测细胞裂解的测定法(例如通过测量LDH释放),诱导的凋亡动力学(例如通过测量半胱天冬酶3/7活性)或凋亡(例如使用TUNEL测定)是本领域熟知的。另外,可以通过评估复合物对各种淋巴细胞亚群如NK细胞,NKT细胞或γδT细胞的存活,增殖和淋巴因子分泌的影响,或评估其调节抗原呈递细胞如树突细胞,单核细胞/巨噬细胞或B细胞的表型和功能的能力来评估此类复合物的生物学活性。

药物组合物,制剂和给药途径

在又一个方面,本发明提供了包含本文中提供的任一种双特异性抗原结合分子的药物组合物,以供例如在任何下列治疗方法中使用。在一个实施方案中,药物组合物包含双特异性抗原结合分子和至少一种药学上可接受的赋形剂。在另一个实施方案中,药物组合物包含本文中提供的任一种双特异性抗原结合分子和至少一种另外的例如如下文所述的治疗剂。

本发明的药物组合物包含治疗有效量的一种或多种溶解或分散在药学上可接受的赋形剂中的双特异性抗原结合分子。短语“药学的或药学上可接受的”是指在采用的剂量和浓度下通常对接受者无毒的分子实体和组合物,即在适当施用于动物时例如人时不产生不利的,过敏的或其他不良的反应。根据本公开内容,包含至少一种双特异性抗原结合分子和任选地另外的活性成分的药物组合物的制备将是本领域技术人员已知的,如Remington's Pharmaceutical Sciences第18版,Mack Printing Company,1990所例示,通过提述将其并入本文。具体地说,组合物是冻干制剂或水溶液。如本文中使用的,正如本领域普通技术人员已知,“药学上可接受的赋形剂”包括溶剂,缓冲剂,分散介质,包衣,表面活性剂,抗氧化剂,防腐剂(例如抗菌剂,抗真菌剂),等渗剂,盐,稳定剂中任一种和全部及其组合。

肠胃外组合物包括为通过注射给药而设计的那些,例如皮下,皮内,病灶内,静脉内,动脉内,肌内,鞘内或腹膜内注射。为了注射,可以将本发明的双特异性抗原结合分子配制在水溶液中,优选在生理学相容的缓冲液如汉克斯溶液,林格氏溶液或生理盐水缓冲液中。溶液可以含有配制剂,例如悬浮剂,稳定剂和/或分散剂。或者,融合蛋白或双特异性抗原结合分子在使用前可处于粉末形式以与适合的载体(例如无菌无热原水)组构。根据需要,通过将在适当溶剂中的本发明的融合蛋白或双特异性抗原结合分子以所要求的量并入下文列举的多种其他成分中来制备无菌注射溶液。可以例如通过无菌过滤膜进行过滤而容易地实现无菌性。通常,通过将各种灭菌的活性成分并入无菌载体中来制备分散体,所述无菌载体含有基础分散介质和/或其他成分。在用于制备无菌注射溶液,悬浮液或乳状液的无菌粉末的情况下,优选制备方法为真空干燥和冷冻干燥技术,从而产生来自其先前无菌过滤的液体介质的活性成分加上任何其他期望的成分的粉末。必要时应该适当缓冲该液体介质并且在注射之前首先用足够盐水或葡萄糖使液体稀释剂变得等张。在制造和储存条件下该组合物必须是稳定的,并且保持对抗微生物诸如细菌和真菌的污染作用。应当理解,内毒素污染应该最低限度地保持在安全水平,例如低于0.5ng/mg蛋白质。适合的药学上可接受的赋形剂包括但不限于:诸如磷酸盐,柠檬酸盐,和其他有机酸的缓冲剂；包括抗坏血酸和甲硫氨酸在内的抗氧化剂；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵,苄索氯铵；苯酚,丁醇或苄醇；烷基对羟基苯甲酸酯,如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质,如血清白蛋白,明胶,或免疫球蛋白；亲水性聚合物,如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸,如甘氨酸,谷氨酰胺,天冬酰胺,组氨酸,精氨酸,或赖氨酸；单糖类,二糖类,和其他碳水化合物类,包括葡萄糖,甘露糖,或糊精；螯合剂,如EDTA；糖类,如蔗糖,甘露醇,海藻糖或山梨糖醇；成盐反离子,如钠；金属复合物(例如,Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子型表面活性剂,如聚乙二醇(PEG)。水性注射悬液可含有增加该悬液粘度的化合物,例如羧甲基纤维素钠,山梨糖醇,或葡聚糖等。任选地,悬液还可以含有适合的稳定剂或增加化合物的溶解度以允许制备高度浓缩的溶液的药剂。另外,这些活性化合物的悬液可制备为适当的油性注射悬液。适合的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油(如芝麻油),合成脂肪酸酯(如油酸乙酯或甘油三酯),或脂质体。

可以例如通过凝聚技术或通过界面聚合将活性成分包埋在制备的微胶囊中,例如分别在胶体药物递送***(例如,脂质体,白蛋白微球,微乳液,纳米颗粒和纳米胶囊)或在粗乳液中的羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚甲基丙烯酸甲酯微胶囊。这样的技术公开于Remington's Pharmaceutical Sciences(18th Ed.Mack Printing Company,1990)中。可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的适合实例包括含有该多肽的固体疏水聚合物的半透性基质,所述基质呈成形物品的形式,例如薄膜,或微胶囊。在特定实施方案中,通过在组合物中使用延迟吸收的药剂,例如单硬脂酸铝,明胶或其组合,可延长注射组合物的吸收。

本文中的示例性药学上可接受的赋形剂还包括诸如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)的间质药物分散剂,例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白,例如rHuPH20(

Baxter International,Inc.)。在美国专利公开No.2005/0260186和2006/0104968中描述了包括rHuPH20的某些示例性的sHASEGP和使用方法。在一个方面,将sHASEGP与一种或多种另外的糖胺聚糖酶如软骨素酶组合。

示例性的冻干抗体配制剂描述于美国专利No.6,267,958中。水性抗体配制剂包括美国专利No.6,171,586和WO2006/044908中描述的那些,后一种配制剂包括组氨酸-乙酸盐缓冲液。

除前述组合物之外,双特异性抗原结合分子还可配制为贮库制剂。此类长效配制剂可通过植入(例如皮下或肌内)或通过肌内注射给予。因此,例如,双特异性抗原结合分子可以用适合的聚合材料或疏水材料(例如作为药学可接受油中的乳液)或离子交换树脂配制,或配制为微溶的衍生物,例如微溶盐。

包含本发明的双特异性抗原结合分子的药物组合物可以通过常规的混合,溶解,乳化,包封,包埋或冻干过程进行制造。可以使用有利于将蛋白质加工成药学上可使用的制剂的一种或多种生理学上可接受的载体,稀释剂,赋形剂或助剂以常规方式配制药物组合物。适当的配制剂取决于所选择的给药途径。

可以将双特异性抗原结合分子配制成游离酸或碱,中性或盐形式的组合物。药学上可接受的盐是基本保留游离酸或碱的生物学活性的盐。这些盐包括酸加成盐,例如由蛋白质组合物的游离氨基形成的或与无机酸例如盐酸或磷酸形成的那些,或与诸如乙酸,草酸,酒石酸或扁桃酸的有机酸形成的那些。与游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱,例如氢氧化钠,氢氧化钾,氢氧化铵,氢氧化钙或氢氧化铁；或诸如异丙胺,三甲胺,组氨酸或普鲁卡因的有机碱。与相应的游离碱形式相比,药物盐在水性溶剂和其他质子溶剂中的溶解度更高。

在被治疗的特殊适应症需要时,药物组合物还可含有一种以上的活性成分,优选地,所述活性成分具有彼此无不良影响的互补活性。这样的活性成分以对预期目的有效的量适当地组合存在。在一个方面,药物组合物包含双特异性抗原结合分子和另一种活性抗癌剂。

用于体内给药的制剂通常是无菌的。可以例如通过无菌过滤膜进行过滤而容易地实现无菌性。

治疗方法和组合物

本文中提供的任何双特异性抗原结合分子均可在治疗方法中使用。为了在治疗方法中使用,本发明的抗原结合分子可以以符合良好医学实践的方式配制,给药和施用。在这种情况下考虑的因素包括正在治疗的具体病症,被治疗的具体哺乳动物,个体患者的临床状况,病症的原因,药剂的递送部位,给药方法,给药方案,以及执业医师已知的其他因素。

在一个方面,提供了本发明的双特异性抗原结合分子,其用作药剂。在另外的方面,提供了本发明的双特异性抗原结合分子,其用于治疗疾病,尤其是用于治疗癌症。在某些实施方案中,提供了本发明的双特异性抗原结合分子,其用于治疗方法。在一个实施方案中,本发明提供了用于治疗有需要的个体中的疾病的如本文中描述的双特异性抗原结合分子。在某些实施方案中,本发明提供了在治疗患有疾病的个体的方法中使用的双特异性抗原结合分子,所述方法包括向个体施用治疗有效量的双特异性抗原结合分子。在某些实施方案中,待治疗的疾病是癌症。在某些实施方案中,待治疗的疾病是增殖性病症,具体地是癌症。癌症的实例包括膀胱癌,脑癌,头颈癌,胰腺癌,肺癌,乳腺癌,卵巢癌,子宫癌,子***,子宫内膜癌,食道癌,结肠癌,结肠直肠癌,直肠癌,胃癌,***癌,血癌,皮肤癌,鳞状细胞癌,骨癌,和肾癌。可以使用本发明的双特异性抗原结合分子进行治疗的其他细胞增殖病症包括但不限于位于腹部,骨骼,乳腺,消化***,肝脏,胰腺,腹膜,内分泌腺(肾上腺,甲状旁腺,垂体,睾丸,卵巢,胸腺,甲状腺),眼,头颈部,神经***(中枢和外周),淋巴***,盆腔,皮肤,软组织,脾脏,胸部,和泌尿生殖***的肿瘤。还包括癌前状态或病变和癌症转移。在某些实施方案中,癌症选自由肾细胞癌,皮肤癌,肺癌,结肠直肠癌,乳腺癌,脑癌,头颈癌组成的组。需要治疗的受试者,患者或“个体”通常是哺乳动物,更具体地说是人。

本发明还涵盖的是本发明的双特异性抗原结合分子,或本发明的药物组合物,其用于上调或延长细胞毒性T细胞活性。

在又一个方面,本发明提供本发明的双特异性抗原结合分子在制造或制备用于治疗有需要的个体中的疾病的药剂中的用途。在一个方面,所述药剂用于在治疗疾病的方法中使用,所述方法包括向患有疾病的个体施用治疗有效量的药剂。在某些方面,待治疗的疾病是增殖性病症,具体地是癌症。癌症的实例包括膀胱癌,脑癌,头颈癌,胰腺癌,肺癌,乳腺癌,卵巢癌,子宫癌,子***,子宫内膜癌,食道癌,结肠癌,结肠直肠癌,直肠癌,胃癌,***癌,血癌,皮肤癌,鳞状细胞癌,骨癌,和肾癌。可以使用本发明的双特异性抗原结合分子进行治疗的其他细胞增殖病症包括但不限于位于腹部,骨骼,乳腺,消化***,肝脏,胰腺,腹膜,内分泌腺(肾上腺,甲状旁腺,垂体,睾丸,卵巢,胸腺,甲状腺),眼,头颈部,神经***(中枢和外周),淋巴***,盆腔,皮肤,软组织,脾脏,胸部,和泌尿生殖***的肿瘤。还包括癌前状态或病变和癌症转移。在某些实施方案中,癌症选自由肾细胞癌,皮肤癌,肺癌,结肠直肠癌,乳腺癌,脑癌,头颈癌组成的组。技术人员容易认识到,在许多情况下,双特异性抗原结合分子可能不能提供治愈,而可能仅仅提供部分益处。在一些实施方案中,具有一些益处的生理变化也被认为是治疗有益的。因此,在一些实施方案中,提供生理变化的双特异性抗原结合分子的量被认为是“有效量”或“治疗有效量”。在任何上述实施方案中,个体优选是哺乳动物,特别是人。

在又一个方面,本发明提供一种用于治疗个体中的疾病的方法,其包含对所述个体施用治疗有效量的本发明的双特异性抗原结合分子。在一个实施方案中,将组合物施用于所述个体,其包含处于药学可接受形式的本发明的双特异性抗原结合分子。在某些实施方案中,待治疗的疾病是增殖性病症。在一个特定实施方案中,该疾病是癌症。在某些实施方案中,该方法进一步包含对该个体施用治疗有效量的至少一种另外的治疗剂,例如抗癌剂(如果待治疗的疾病是癌症的话)。依照任何上述实施方案的“个体”可以是哺乳动物,优选人。

为了预防或治疗疾病,本发明的双特异性抗原结合分子的适当剂量(当单独使用或与一种或多种其他另外的治疗剂组合使用时)将取决于待治疗疾病的类型,给药途径,患者的体重,具体的双特异性抗原结合分子,疾病的严重程度和病程,给予本发明的双特异性抗原结合分子是用于预防还是治疗目的,先前或同时的治疗干预,患者的临床病史,和对融合蛋白的响应,和主治医师的决定。在任何情况下,负责给药的医师将决定组合物中活性成分的浓度和个体受试者的适当剂量。本文中考虑到各种给药方案,包括但不限于在各个时间点上的单次或多次给药,推注给药和脉冲输注。

一次性地或以一系列治疗的方式适当地向患者施用双特异性抗原结合分子。根据疾病的类型和严重程度,约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)的双特异性抗原结合分子可以是向患者施用的初始候选剂量,例如无论是通过一次或多次分开给药,还是通过连续输注。取决于上面提到的因素,一个典型的日剂量可能在约1μg/kg至100mg/kg或更高的范围内。对于数天或更长时间的反复给药,根据病情,治疗通常将持续到出现期望的疾病症状的抑制时为止。双特异性抗原结合分子的一个示例性剂量将在约0.005mg/kg至约10mg/kg的范围内。在其他实例中,剂量还可以包含每次给药从约1μg/kg体重,约5μg/kg体重,约10μg/kg体重,约50μg/kg体重,约100μg/kg体重,约200μg/kg体重,约350μg/kg体重,约500μg/kg体重,约1mg/kg体重,约5mg/kg体重,约10mg/kg体重,约50mg/kg体重,约100mg/kg体重,约200mg/kg体重,约350mg/kg体重,约500mg/kg体重,至约1000mg/kg体重或更多,以及其中可推导的任何范围。在本文中所列数字的可推导范围的实例中,可以基于上述数字以约5mg/kg体重至约100mg/kg体重,约5μg/kg体重至约500mg/kg体重等的范围进行施用。因此,可向患者施用约0.5mg/kg,2.0mg/kg,5.0mg/kg或10mg/kg(或其任何组合)的一个或多个剂量。这样的剂量可以间歇施用,例如,每周或每三周一次(例如使得患者接受约2个至约20个,或例如约6个剂量的双特异性抗原结合分子)。可以施用初始较高的加载剂量,然后施用一个或多个较低的剂量。然而,其他剂量方案可能是有用的。通过常规技术和测定法易于监测这种疗法的进展。

通常以有效实现预期目的的量使用本发明的双特异性抗原结合分子。为了用于治疗或预防疾病状况,以治疗有效量施用或应用本发明的双特异性抗原结合分子或其药物组合物。治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内,尤其是在根据本文中提供的详细公开内容的情况下。

对于全身给药,可以根据体外测定法(例如细胞培养物测定法)初步估计治疗有效剂量。然后可以在动物模型中配制剂量以达到包括在细胞培养中确定的IC₅₀在内的循环浓度范围。这类信息可以用来更精确地确定用于人的剂量。

也可以使用本领域熟知的技术根据体内数据(例如,动物模型)估计初始剂量。根据动物数据,本领域普通技术人员可以容易地优化对人的给药。

可以单独调整剂量和间隔以提供足以维持治疗效果的双特异性抗原结合分子的血浆水平。通常注射给药的患者剂量为约0.1至50mg/kg/天,一般为约0.5至1mg/kg/天。可以通过每天施用多个剂量来实现治疗有效的血浆水平。可以例如通过HPLC测量血浆中的水平。

在局部给药或选择性吸收的情况下,双特异性抗原结合分子的有效局部浓度可能与血浆浓度无关。本领域技术人员将能够优化治疗有效的局部剂量而无需过度实验。

本文中描述的双特异性抗原结合分子的治疗有效剂量通常将提供治疗益处而不引起实质性毒性。可以通过细胞培养或实验动物中的标准药物程序来确定双特异性抗原结合分子的毒性和治疗效果。可使用细胞培养物测定法和动物研究来确定LD₅₀(对群体的50％致死的剂量)和ED₅₀(在50％的群体中治疗有效的剂量)。毒性与疗效之间的剂量比为治疗指数,它可以被表示为比率LD₅₀/ED₅₀。表现出较大治疗指数的双特异性抗原结合分子是优选的。在一个实施方案中,依照本发明的双特异性抗原结合分子表现出高治疗指数。从细胞培养物测定法和动物研究中获得的数据可以在配制适合于在人类中使用的剂量范围中加以使用。剂量优选地处在循环浓度范围内,其包括具有很小或没有毒性的ED₅₀。取决于多种因素,例如采用的剂型,所用给药途径,受试者的状况等,剂量可以在这个范围内变化。考虑到患者的状况,个体医师可以选择确切的配方,给药途径和剂量(参见,例如Fingl等人,1975,in:The Pharmacological Basis of Therapeutics,Ch.1,p.1,通过提述将其完整并入本文)。

用本发明的双特异性抗原结合分子治疗患者的主治医师知道如何并且何时由于毒性,器官功能障碍等而终止,中断或调整给药。相反,如果临床响应不足(排除毒性),主治医师也会知道将治疗调整到更高水平。在感兴趣病症的管理中,施用剂量的大小将随着待治疗病症的严重程度,给药途径等而变化。可以例如部分地通过标准预后评价方法来评价病症的严重程度。此外,剂量和可能的剂量频率也将根据个体患者的年龄,体重和响应而变化。

其他药剂和治疗

本发明的双特异性抗原结合分子可以在治疗中与一种或多种其他药剂联合给药。例如,本发明的双特异性抗原结合分子可以与至少一种另外的治疗剂共同给药。术语“治疗剂”涵盖可施用于治疗需要这种治疗的个体中的症状或疾病的任何药剂。这种另外的治疗剂可包含任何适合于被治疗的特定适应症的任何活性成分,优选地,所述活性成分具有彼此无不良影响的互补活性。在某些实施方案中,另外的治疗剂是另一种抗癌剂。

此类其他药剂以对预期目的有效的量适当地组合存在。此类其他药剂的有效量取决于所使用的双特异性抗原结合分子的量,病症或治疗的类型,以及以上讨论的其他因素。通常以与本文中所述相同的剂量和给药途径,或本文中所述剂量的约1％至99％,或以在经验/临床上确定为适当的任何剂量并通过任何途径使用双特异性抗原结合分子。

上述此类联合疗法涵盖联合给药(其中两种或更多种治疗剂包括在同一个或分开的组合物中)和分开给药,在分开给药的情况下,本发明的双特异性抗原结合分子的给药可以发生在给予另外的治疗剂和/或佐剂之前,同时和/或之后。

制品

在本发明的另一个方面,提供了含有用于治疗,预防和/或诊断上述病症的物质的制品。制品包括容器和在容器上或与容器相关联的标签或包装插页。适合的容器包括例如瓶,小瓶,注射器,IV溶液袋等。可以由各种材料如玻璃或塑料形成容器。容器容纳组合物本身或连同另一种有效治疗,预防和/或诊断病症的组合物,并且可以具有无菌进入口(例如,该容器可以是具有可被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶或静脉内溶液袋)。组合物中至少一种活性剂是本发明的双特异性抗原结合分子。

标签或包装插页指示该组合物用于治疗选择的病症。而且,制品可以包括(a)其中含有组合物的第一容器,其中该组合物包含本发明的双特异性抗原结合分子；和(b)其中含有组合物的第二容器,其中该组合物包含另外的细胞毒性治疗剂或其它治疗剂。在本发明的这个实施方案中的制品可以进一步包括指示组合物可用于治疗特定病症的包装插页。

替代地或另外,制品可以进一步包括第二(或第三)容器,其包含药学上可接受的缓冲剂,例如抑菌性注射用水(BWFI),磷酸盐缓冲盐水,林格氏溶液和右旋糖溶液。它还可以包括立足于商业和用户立场所需的其它物品,包括其它缓冲剂,稀释剂,过滤器,针头和注射器。

表C(序列):

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本发明的方面

下面的编号的段落(段)描述本发明的各方面:

1.一种双特异性抗原结合分子,其包含

(a)至少一个能够特异性结合OX40的模块,和

(b)至少一个能够特异性结合生腱蛋白C(TnC)的模块。

2.段1的双特异性抗原结合分子,其另外包含

(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc区。

3.段1或段2的双特异性抗原结合分子,其中该能够特异性结合OX40的模块结合包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或由其组成的多肽。

4.段1至3任一项的双特异性抗原结合分子,其中该能够特异性结合TnC的模块结合包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列或由其组成的多肽。

5.段1至4任一项的双特异性抗原结合分子,其中该能够特异性结合OX40的模块包含包含下述各项的VH:

和包含下述各项的VL:

6.段1至5任一项的双特异性抗原结合分子,其中该能够特异性结合OX40的模块包含包含与选自由SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:29,SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:37组成的组的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VH和包含与选自由SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:28,SEQ IDNO:30,SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:34,SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:38组成的组的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VL。

7.段1至6任一项的双特异性抗原结合分子,其中该能够特异性结合OX40的模块包含

8.段1至7任一项的双特异性抗原结合分子,其中该能够特异性结合TnC的模块包含包含下述各项的VH:

和包含下述各项的VL:

9.段1至8任一项的双特异性抗原结合分子,其中该能够特异性结合TnC的模块包含包含与选自由SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:54组成的组的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VH和包含与选自由SEQ ID NO:53和SEQ IDNO:55组成的组的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VL。

10.段1至9任一项的双特异性抗原结合分子,其中该能够特异性结合TnC的模块包含

11.段1至10任一项的双特异性抗原结合分子,其包含

(i)至少一个能够特异性结合OX40的模块,其包含包含与选自由SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:29,SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:37组成的组的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VH和包含与选自由SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:28,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:32,SEQ IDNO:34,SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:38组成的组的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VL,和

12.段1至11任一项的双特异性抗原结合分子,其包含

(i)至少一个能够特异性结合OX40的模块,其包含包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的VL,和(ii)至少一个能够特异性结合TnC的模块,其包含

·包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的VL,或

·包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的VL。

13.段2至12任一项的双特异性抗原结合分子,其中该Fc区是IgG,特别是IgG1 Fc区或IgG4 Fc区。

14.段2至13任一项的双特异性抗原结合分子,其中该Fc区包含一处或多处降低抗体对Fc受体的结合亲和力和/或效应器功能的氨基酸替代。

15.段2至14任一项的双特异性抗原结合分子,其中该Fc区是人IgG1亚类的,具有氨基酸突变L234A,L235A和P329G(编号方式依照Kabat EU索引)。

16.段2至15任一项的双特异性抗原结合分子,其中该Fc区包含促进Fc区的第一和第二亚基联合的修饰。

17.段2至16任一项的双特异性抗原结合分子,其中依照节入穴方法该Fc区的第一亚基包含节和该Fc区的第二亚基包含穴。

18.段2至17任一项的双特异性抗体,其中该Fc区的第一亚基包含氨基酸替代S354C和T366W(编号方式依照Kabat EU索引)且该Fc区的第二亚基包含氨基酸替代Y349C,T366S和Y407V(编号方式依照Kabat EU索引)。

19.段1至18任一项的双特异性抗原结合分子,其中该双特异性抗原结合分子包含

(a)至少两个能够特异性结合OX40的Fab片段,其连接至该Fc区,和

(b)至少一个能够特异性结合TnC的模块,连接至该Fc区的C端。

20.段1至19任一项的双特异性抗原结合分子,其中该双特异性抗原结合分子包含

21.段1至20任一项的双特异性抗原结合分子,其中该双特异性抗原结合分子包含

22.段1至21任一项的双特异性抗原结合分子,其中该双特异性抗原结合分子包含

23.段1至19或段21任一项的双特异性抗原结合分子,其中该双特异性抗原结合分子包含

24.段21或段23的双特异性抗原结合分子,其中该两个能够特异性结合TnC的Fab片段是交换Fab片段,每个包含VL-CH1链和VH-CL链,且其中该VL-CH1链之一连接至(a)的两条重链之一的C端,且该VL-CH1链之另一连接至(a)的两条重链之另一的C端。

25.段1至24任一项的双特异性抗原结合分子,其中该双特异性抗原结合分子包含四个能够特异性结合OX40的Fab片段。

26.段20至25任一项的双特异性抗原结合分子,其中(a)的两条重链每条包含能够特异性结合OX40的Fab片段的两个VH域和两个CH1域。

27.段19至26任一项的双特异性抗原结合分子,其中一个或多个该能够特异性结合OX40的Fab片段包含

包含精氨酸(R)作为位置123(EU编号方式)处的氨基酸和赖氨酸(K)作为位置124(EU编号方式)处的氨基酸的CL域,和

28.一种双特异性抗原结合分子,其包含

每条包含SEQ ID NO:213的氨基酸序列的两条重链,

每条包含SEQ ID NO:212的氨基酸序列的两条轻链,和

每条包含SEQ ID NO:214的氨基酸序列的两条轻链。

29.一种双特异性抗原结合分子,其包含

每条包含SEQ ID NO:215的氨基酸序列的两条重链,

每条包含SEQ ID NO:212的氨基酸序列的两条轻链,和

每条包含SEQ ID NO:216的氨基酸序列的两条轻链。

30.一种双特异性抗原结合分子,其包含

包含SEQ ID NO:222的氨基酸序列的第一重链,

包含SEQ ID NO:223的氨基酸序列的第二重链,和

每条包含SEQ ID NO:212的氨基酸序列的四条轻链。

31.一种双特异性抗原结合分子,其包含

每条包含SEQ ID NO:225的氨基酸序列的两条重链,

每条包含SEQ ID NO:224的氨基酸序列的四条轻链,和

每条包含SEQ ID NO:226的氨基酸序列的两条轻链。

32.一种多核苷酸,其编码段1至31任一项的双特异性抗原结合分子。

33.一种表达载体,其包含段32的多核苷酸。

34.一种宿主细胞,其包含段32的多核苷酸或段33的表达载体。

35.一种生成双特异性抗原结合分子的方法,其包含在适合于该双特异性抗原结合分子表达的条件下培养段34的宿主细胞,并分离该双特异性抗原结合分子。

36.一种药物组合物,其包含段1至31任一项的双特异性抗原结合分子和至少一种药学可接受赋形剂。

37.段1至31任一项的双特异性抗原结合分子或段36的药物组合物,其用作药物。

38.段1至31任一项的双特异性抗原结合分子或段36的药物组合物,其用于

(i)刺激T细胞应答,

(ii)支持激活的T细胞的存活,

(iii)治疗感染,

(iv)治疗癌症,

(v)延迟癌症进展,或

(vi)延长罹患癌症的患者的存活。

39.段1至31任一项的双特异性抗原结合分子或段36的药物组合物,其用于治疗癌症。

40.段1至31任一项的双特异性抗原结合分子或段36的药物组合物在制造用于治疗癌症的药物中的用途。

41.一种治疗具有癌症的个体的方法,其包含对该个体施用有效量的段1至31任一项的双特异性抗原结合分子或段36的药物组合物。

42.段1至31任一项的双特异性抗原结合分子或段36的药物组合物,其用于上调或延长细胞毒性T细胞活性。

43.段1至31任一项的双特异性抗原结合分子或段36的药物组合物在制造用于上调或延长细胞毒性T细胞活性的药物中的用途。

44.一种在具有癌症的个体中上调或延长细胞毒性T细胞活性的方法,其包含对该个体施用有效量的段1至31任一项的双特异性抗原结合分子或段36的药物组合物。

实施例

以下是本发明的方法和组合物的实施例。应当理解,根据上面提供的一般描述,可以实践各种其它实施方案。

重组DNA技术

使用标准方法操作DNA,如Sambrook等人在Molecular cloning:A laboratorymanual；Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989中所述。按照制造商的说明使用分子生物学试剂。关于人免疫球蛋白轻链和重链的核苷酸序列的一般信息见:Kabat,E.A.等人,(1991)Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,Fifth Ed.,NIH公开号91-3242。

DNA测序

通过双链测序确定DNA序列。

基因合成

使用适当的模板通过PCR生成或由Geneart AG(Regensburg,Germany)从合成的寡核苷酸和PCR产物通过自动化基因合成来生成期望的基因区段。在没有可用的确切基因序列的情况下,基于来自最近同源物的序列设计寡核苷酸引物,并且通过RT-PCR从源自适当组织的RNA分离基因。将侧翼为单个限制性核酸内切酶切割位点的基因区段克隆到标准克隆/测序载体中。从转化的细菌中纯化质粒DNA,并通过紫外光谱法测定浓度。通过DNA测序证实亚克隆基因片段的DNA序列。设计具有适合的限制性位点的基因区段,以允许亚克隆到对应的表达载体中。所有构建体均被设计为具有编码前导肽的5'端DNA序列,所述前导肽将蛋白质靶向真核细胞中的分泌。

蛋白质纯化

参考标准方案,从过滤的细胞培养物上清液中纯化蛋白质。简言之,将抗体施加到蛋白A Sepharose柱(GE Healthcare)上并用PBS洗涤。在pH 2.8实现抗体的洗脱,然后立即中和样品。通过尺寸排阻色谱法(Superdex 200,GE Healthcare)在PBS中或在20mM组氨酸,150mM氯化钠(pH 6.0)中将单体抗体与聚集的蛋白质分开。合并单体抗体级分,使用例如MILLIPORE Amicon Ultra(30MWCO)离心浓缩机进行浓缩(如果需要的话),在-20℃或-80℃冷冻并储存。提供部分样品用于随后例如通过SDS-PAGE,尺寸排阻色谱法(SEC)或质谱法进行蛋白质分析和分析表征。

SDS-PAGE

根据制造商的说明使用

预制凝胶***(Invitrogen)。具体地说,使用10％或4-12％的/>

Bis-TRIS预制凝胶(pH 6.4)和/>

MES(还原凝胶,具有/>

抗氧化剂运行缓冲液添加剂)或MOPS(非还原凝胶)运行缓冲液。

分析尺寸排阻色谱法

通过HPLC色谱法进行尺寸排阻色谱法(SEC),用于测定抗体的聚集和寡聚状态。简言之,将蛋白A纯化的抗体施加到在Agilent HPLC 1100***上的300mM NaCl,50mM KH₂PO₄/K₂HPO₄(pH 7.5)中的Tosoh TSKgel G3000SW柱上,或者在Dionex HPLC***上的2x PBS中的Superdex 200柱(GE Healthcare)上。通过UV吸光度和峰面积的积分将洗脱的蛋白质定量。以BioRad凝胶过滤标准151-1901作为标准。

实施例1

OX40抗体的生成

1.1用于通过噬菌体展示生成新颖的OX40结合物的抗原和筛选工具的制备,纯化和表征

在节(Merchant et al.,Nat Biotechnol(1998)16,677-681)上与人IgG1重链CH2和CH3域同框亚克隆编码人,小鼠或食蟹猴OX40的外域的DNA序列(表1)。在抗原外域和人IgG1的Fc之间引入AcTEV蛋白酶切割位点。在抗原-Fc节的C端处引入用于定向生物素化的Avi标签。含有S354C/T366W突变的抗原-Fc节链与含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突变的Fc穴链的组合容许生成包括一个拷贝的含有OX40外域的链的异二聚体,从而创建单体形式的连接有Fc的抗原(图1)。表1显示多种OX40外域的氨基酸序列。表2显示如图1中所绘的单体抗原Fc(kih)融合分子的cDNA和氨基酸序列。

表1:抗原外域(ECD)的氨基酸编号方式及其起源

SEQ ID NO:	构建物	起源	ECD
				1	人OX40 ECD	依照P43489合成	aa 29-214
79	食蟹猴OX40 ECD	自食蟹猴血液分离	aa 29-214
				80	鼠OX40 ECD	依照P47741合成	aa 10-211

表2:单体抗原Fc(kih)融合分子(通过组合一条Fc穴链与一条抗原Fc节链而生成的)的cDNA和氨基酸序列

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将所有OX40-Fc融合物编码序列克隆入自MPSV启动子驱动***物表达且含有位于CDS的3’端的合成的polyA信号序列的质粒载体。另外,载体含有用于质粒的附加体维持的EBV OriP序列。

为了制备生物素化的单体抗原/Fc融合分子,用编码融合蛋白的两种成分(节和穴链)以及BirA(生物素化反应必需的一种酶)的三种载体共转染指数式生长中的悬浮HEK293EBNA细胞。以2:1:0.05比率(“抗原ECD-AcTEV-Fc节”:“Fc穴”:“BirA”)使用相应载体。

为了在500ml摇瓶中生成蛋白质,在转染前24小时接种400x 10⁶个HEK293 EBNA细胞。为了转染,将细胞以210g离心5分钟并用预温热的CD CHO培养基替换上清液。将表达载体在含有200μg载体DNA的20mL CD CHO培养基中重悬浮。添加540μL聚乙烯亚胺(PEI)后,将溶液漩涡震荡15秒并于室温温育10分钟。之后,将细胞与DNA/PEI溶液混合,转移至500mL摇瓶并在具有5％CO₂气氛的温箱中于37℃温育3小时。温育后,添加160mL F17培养基并将细胞培养24小时。转染后1天,对培养物添加1mM丙戊酸和7％补料。培养7天后,通过以210g 15分钟旋转下细胞来收集细胞上清液。将溶液无菌过滤(0.22μm滤器),补充叠氮化钠至终浓度0.01％(w/v),并于4℃保持。

通过使用蛋白A的亲和层析,继以大小排阻层析自细胞培养物上清液纯化分泌的蛋白质。为了亲和层析,在用40mL 20mM磷酸钠,20mM柠檬酸钠pH 7.5平衡的HiTrap蛋白AHP柱(CV＝5mL,GE Healthcare)上加载上清液。通过用至少10个柱体积的含有20mM磷酸钠,20mM柠檬酸钠和0.5M氯化钠(pH 7.5)的缓冲液清洗来去除未结合的蛋白质。使用在20个柱体积的20mM柠檬酸钠,0.01％(v/v)Tween-20,pH 3.0上创建的氯化钠的线性pH梯度(0至500mM)洗脱结合的蛋白质。然后用10个柱体积的含有20mM柠檬酸钠,500mM氯化钠和0.01％(v/v)Tween-20,pH 3.0的溶液清洗柱。

通过添加1/40(v/v)2M Tris,pH 8.0来调节收集的级分的pH。浓缩并过滤蛋白质,之后在用pH 7.4的2mM MOPS,150mM氯化钠,0.02％(w/v)叠氮化钠溶液平衡的HiLoadSuperdex 200柱(GE Healthcare)上加载。

1.2来自一般Fab和共同轻链文库的OX40特异性8H9,20B7,49B4,1G4,CLC-563,CLC-564和17A9抗体的选择

自三种不同的一般噬菌体展示文库选择抗OX40抗体:DP88-4(克隆20B7,8H9 1G4和49B4),共同轻链文库Vk3_20/VH3_23(克隆CLC-563和CLC-564)和λ-DP47(克隆17A9)。

DP88-4文库是使用包含轻链CDR3(L3,3种不同长度)和重链CDR3(H3,3种不同长度)中的随机化序列间隙的V域配对Vk1_5(κ轻链)和VH1_69(重链)基于人种系基因构建的。文库生成是通过交叠延伸(SOE)PCR应用剪接,通过装配3种PCR扩增片段而实施的。片段1包含抗体基因的5’端,包括随机化L3,片段2是中央恒定片段,跨越L3至H3,而片段3包含随机化H3和抗体基因的3’部分。分别使用下面的引物组合来生成用于DP88-4文库的这些文库片段:片段1(正向引物LMB3与反向引物Vk1_5_L3r_S或Vk1_5_L3r_SY或Vk1_5_L3r_SPY组合),片段2(正向引物RJH31与反向引物RJH32组合)和片段3(正向引物DP88-v4-4或DP88-v4-6或DP88-v4-8与反向引物fdseqlong组合)。用于生成文库片段的PCR参数是初始变性5分钟94℃,25个循环的1分钟94℃,1分钟58℃,1分钟72℃和终末延长10分钟72℃。为了装配PCR,使用等摩尔比率的凝胶纯化的单一片段作为模板,参数是初始变性3分钟94℃和5个循环的30秒94℃,1分钟58℃,2分钟72℃。在这个阶段,添加外部引物(LMB3和fdseqlong)并实施另外20个循环,之后是终末延长10分钟72℃。装配足够量的全长随机化Fab构建物后,将它们用NcoI/NheI消化并连接入类似处理的受体噬菌粒载体。将经过纯化的连接体系用于约60次电感受态大肠杆菌TG1的转化。挽救展示Fab文库的噬菌粒颗粒并通过PEG/NaCl纯化来纯化,待用于选择。将这些文库构建步骤重复三次以获得最终文库容量4.4×10⁹。通过点印迹中的C端标签检测测定的功能性克隆的百分比分别是轻链的92.6％和重链的93.7％。

共同轻链文库Vk3_20/VH3_23是使用包含恒定非随机化共同轻链Vk3_20和重链CDR3(H3,3种不同长度)中的随机化序列间隙的V域配对Vk3_20(κ轻链)和VH3_23(重链)基于人种系基因构建的。文库生成是通过交叠延伸(SOE)PCR应用剪接,通过装配2种PCR扩增片段而实施的。片段1是恒定片段,跨越L3至H3,而片段2包含随机化H3和抗体基因的3’部分。分别使用下面的引物组合来生成用于Vk3_20/VH3_23共同轻链文库的这些文库片段:片段1(正向引物MS64与反向引物DP47CDR3_ba(mod.)组合)和片段2(正向引物DP47-v4-4,DP47-v4-6,DP47-v4-8与反向引物fdseqlong组合)。用于生成文库片段的PCR参数是初始变性5分钟94℃,25个循环的1分钟94℃,1分钟58℃,1分钟72℃和终末延长10分钟72℃。为了装配PCR,使用等摩尔比率的凝胶纯化的单一片段作为模板,参数是初始变性3分钟94℃和5个循环的30秒94℃,1分钟58℃,2分钟72℃。在这个阶段,添加外部引物(MS64和fdseqlong)并实施另外18个循环,之后是终末延长10分钟72℃。装配足够量的全长随机化VH构建物后,将它们用MunI/NotI消化并连接入类似处理的受体噬菌粒载体。将经过纯化的连接体系用于约60次电感受态大肠杆菌TG1的转化。挽救展示Fab文库的噬菌粒颗粒并通过PEG/NaCl纯化来纯化,待用于选择。获得了最终文库容量3.75×10⁹。通过点印迹中的C端标签检测测定的功能性克隆的百分比分别是轻链的98.9％和重链的89.5％。

λ-DP47文库是使用下面的V域配对基于人种系基因构建的:Vl3_19λ轻链与VH3_23重链。文库在轻链CDR3(L3)和重链CDR3(H3)中随机化并通过“交叠延伸剪接”(SOE)PCR自3种片段装配。片段1包含抗体基因的5’端,包括随机化L3,片段2是中央恒定片段,跨越L3的结束至H3的开始,而片段3包含随机化H3和Fab片段的3’部分。分别使用下面的引物组合来生成用于文库的文库片段:片段1(LMB3-Vl_3_19_L3r_V/Vl_3_19_L3r_HV/Vl_3_19_L3r_HLV),片段2(RJH80–DP47CDR3_ba(mod))和片段3(DP47-v4-4/DP47-v4-6/DP47-v4-8–fdseqlong)。用于生成文库片段的PCR参数是初始变性5分钟94℃,25个循环的60秒94℃,60秒55℃,60秒72℃和终末延长10分钟72℃。为了装配PCR,使用等摩尔比率的3种片段作为模板,参数是初始变性3分钟94℃和5个循环的60秒94℃,60秒55℃,120秒72℃。在这个阶段,添加外部引物并实施另外20个循环,之后是终末延长10分钟72℃。装配足够量的全长随机化Fab片段后,将它们用NcoI/NheI消化,伴随类似处理受体噬菌粒载体。连接15μg Fab文库***物与13.3μg噬菌粒载体。将经过纯化的连接体系用于60次转化,产生1.5×10⁹个转化子。挽救展示Fab文库的噬菌粒颗粒并通过PEG/NaCl纯化来纯化,待用于选择。

作为抗原用于噬菌体展示选择的人OX40(CD134)在HEK EBNA细胞中作为N端单体Fc融合物瞬时表达并在位于携带受体链的Fc部分(Fc节链)C端的avi标签识别序列处经由共表达BirA生物素连接酶而体内位点特异性生物素化。

依照下面的样式在溶液中实施选择轮次(生物淘选):

1.在用10μg/ml无关人IgG包被的Maxisorp板上预清洁约10¹²个噬菌粒颗粒以对文库消减识别抗原的Fc部分的抗体,

2.在总体积1ml中在100nM无关非生物素化Fc节入穴构建物存在下将非结合性噬菌粒颗粒与100nM生物素化人OX40一起温育0.5小时以进一步消减Fc结合物,

3.通过转移至中性亲合素预包被微量滴定板的4个孔达10分钟来捕捉生物素化huOX40和附着的特异性结合性噬菌体(在第1和3轮中),

4.使用5x PBS/Tween20和5x PBS清洗相应孔,

5.通过添加250μl 100mM TEA(三乙胺)每孔达10分钟来洗脱噬菌体颗粒并通过对来自4个孔的合并洗出液添加500μl 1M Tris/HCl pH 7.4来中和,

6.通过与100nM生物素捕捉的Fc节入穴构建物一起在中性亲合素预包被微量滴定板上温育来后清洁经过中和的洗出液以最终去除Fc结合物,

7.用洗脱的噬菌体颗粒的上清液再感染对数期大肠杆菌TG1细胞,用辅助噬菌体VCSM13感染,在摇床上于30℃温育过夜,随后用PEG/NaCl沉淀噬菌粒颗粒,待用于下一个选择轮次。

使用恒定抗原浓度100nM进行3或4轮选择。为了提高不仅对食蟹猴OX40而且对鼠OX40交叉反应性的结合物的可能性,在一些选择轮次中,使用鼠靶物代替人OX40。在第2和4轮中,为了避免富集针对中性亲合素的结合物,通过添加5.4×10⁷个链霉亲合素包被的磁珠来实施抗原:噬菌体复合物的捕捉。如下通过ELISA鉴定特异性结合物:分别在中性亲合素板和Maxisorp板上包被100μl 25nM生物素化人OX40和10μg/ml人IgG。添加含有Fab的细菌上清液并使用抗Flag/HRP二抗经由它们的Flag标签检测结合性Fab。对人OX40展现信号且对人IgG呈现阴性的克隆通过初审用于进一步分析并还以类似方式针对食蟹猴和鼠OX40测试。它们在0.5升培养体积中由细菌表达,亲和纯化并使用BioRad的ProteOn XPR36生物传感器通过SPR分析进一步表征。

表3显示一般噬菌体展示抗体文库(DP88-4)的序列,表4提供文库DP88-4种系模板的cDNA和氨基酸序列,而表5显示用于生成DP88-4种系模板的引物序列。

表3:一般噬菌体展示抗体文库(DP88-4)的序列

表4:文库DP88-4种系模板的cDNA和氨基酸序列

表5:用于生成DP88-4文库的引物序列

表6显示一般噬菌体展示抗体共同轻链文库(Vk3_20/VH3_23)的序列。表7提供共同轻链文库(Vk3_20/VH3_23)种系模板的cDNA和氨基酸序列,而表8显示用于生成共同轻链文库(Vk3_20/VH3_23)的引物序列。

表6:用于PCR的一般噬菌体展示抗体共同轻链文库(Vk3_20/VH3_23)模板的序列

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表7:共同轻链文库(Vk3_20/VH3_23)种系模板的cDNA和氨基酸序列

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表8:用于生成共同轻链文库(Vk3_20/VH3_23)的引物序列

1:G/D＝20％,E/V/S＝10％,A/P/R/L/T/Y＝5％；2:G/Y/S＝15％,A/D/T/R/P/L/V/N/W/F/I/E＝4.6％；3:G/A/Y＝20％,P/W/S/D/T＝8％；4:F＝46％,L/M＝15％,G/I/Y＝8％；5:K＝70％,R＝30％。

表9显示用于PCR的一般噬菌体展示λ-DP47文库(Vl3_19/VH3_23)模板的序列。表10提供λ-DP47文库(Vl3_19/VH3_23)种系模板的cDNA和氨基酸序列,而表11显示用于生成λ-DP47文库(Vl3_19/VH3_23)的引物序列。

表9:用于PCR的一般噬菌体展示λ-DP47文库(Vl3_19/VH3_23)模板的序列

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表10:λ-DP47文库(Vl3_19/VH3_23)种系模板的cDNA和氨基酸序列

表11:用于生成λ-DP47文库(Vl3_19/VH3_23)的引物序列

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另外的用于构建λ-DP47文库的引物(即DP47CDR3_ba(mod.),DP47-v4-4,DP47-v4-6,DP47-v4-8和fdseqlong)与用于构建共同轻链文库(Vk3_20/VH3_23)的引物相同且已经在表8中列出。

克隆8H9,20B7,49B4,1G4,CLC-563,CLC-564和17A9经由上文描述的规程鉴定为人OX40特异性结合物。它们的可变区的cDNA序列在下文表12中显示,相应的氨基酸序列可以在表C中找到。

表12:噬菌体衍生的抗OX40抗体的可变区碱基对序列。下划线是互补决定区(CDR)

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1.3抗OX40 IgG1 P329G LALA抗体的制备,纯化和表征

与人IgG1的恒定重链或恒定轻链任一同框亚克隆选定抗OX40结合物的重和轻链可变区DNA序列。依照公开号WO 2012/130831A1的国际专利申请中描述的方法在节和穴重链的恒定区中引入Pro329Gly,Leu234Ala和Leu235Ala突变以消除对Fcγ受体的结合。

抗OX40克隆的cDNA和氨基酸序列在表13中显示。将所有抗OX40-Fc融合物编码序列克隆入自MPSV启动子驱动***物表达且含有位于CDS的3’端的合成的polyA信号序列的质粒载体。另外,载体含有用于质粒的附加体维持的EBV OriP序列。

表13:P329GLALA人IgG1型式的抗OX40克隆的序列

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通过使用聚乙烯亚胺用哺乳动物表达载体共转染HEK293-EBNA细胞来生成抗OX40抗体。以1:1比率(“载体重链”:“载体轻链”)用相应表达载体转染细胞。

为了500mL摇瓶中的生成,在转染前24小时接种400x 10⁶个HEK293 EBNA细胞。为了转染,将细胞以210g离心5分钟,并用预温热的CD CHO培养基替换上清液。在20mL CD CHO培养基中混合表达载体(200μg总DNA)。添加540μL PEI后,将溶液漩涡震荡15秒并于室温温育10分钟。之后,将细胞与DNA/PEI溶液混合,转移至500mL摇瓶并在具有5％CO₂气氛的温箱中于37℃温育3小时。温育后,添加160mL F17培养基并将细胞培养24小时。转染后1天,添加1mM丙戊酸和7％补料及补充物。培养7天后,通过以210x g离心15分钟来收集上清液。将溶液无菌过滤(0.22μm滤器),补充叠氮化钠至终浓度0.01％(w/v),并于4℃保持。

如上文关于抗原-Fc融合物的纯化描述的,通过使用蛋白A的亲和层析来进行自细胞培养物上清液纯化抗体分子。

浓缩并过滤蛋白质,之后在用pH 6.0的20mM组氨酸,140mM NaCl溶液平衡的HiLoad Superdex 200柱(GE Healthcare)上加载。

使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数,通过以280nm测量OD来测定经过纯化的抗体的蛋白质浓度。使用LabChipGXII(Caliper)通过还原剂(Invitrogen,USA)存在和缺失下的CE-SDS来分析抗体的纯度和分子量。于25℃使用在25mM K₂HPO₄,125mM NaCl,200mM单盐酸L-精氨酸,0.02％(w/v)NaN₃,pH 6.7运行缓冲液中平衡的TSKgel G3000 SW XL分析性大小排阻柱(Tosoh)分析抗体样品的聚集体含量。

表14汇总抗OX40 P329G LALA IgG1抗体的产率和最终含量。

表14:抗OX40 P329G LALA IgG1克隆的生化分析

实施例2

生腱蛋白C(TnC)抗体的生成

2.1用于通过噬菌体展示生成新颖的TnC结合物的抗原和筛选工具的制备,纯化和表征

将表15和表16的构建物融合至GST的C端并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。对于位点特异性生物素化,Avi标签添加至生腱蛋白序列的C端,并在分开的质粒上共表达BirA生物素连接酶(Avidity,Colorado,USA)。生长培养基是含100μg/ml氨苄青霉素和20μg/ml氯霉素的2YT。添加生物素至50μM的终浓度。用1mM IPTG于22℃诱导蛋白质表达过夜。通过离心收获细胞,并通过B-PER试剂(pierce 78260)存在下的超声波处理和1mg/ml溶菌酶(Sigma L6876)实施细胞裂解。将裂解物离心并将澄清后的裂解物加载到谷胱甘肽Sepharose柱(GE Healthcare；产品号17-0756-01)上。清洗后,于4℃经由凝血酶(SigmaAldrich；产品号10602400001)自GST切割TnC分子过夜。在50mM Tris缓冲液pH 8.0；200mMNaCl,5mM MgCl₂,1mM DTT和10％甘油中实施洗脱。最终的纯化步骤是在凝胶过滤柱(Superdex 75 16/60；GE Healthcare)上。将样品在液氮中闪冻直至加工。

表15:用于交叉物种亲和力测定的TnC抗原的序列

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表16:用于亲和力测定的TnC抗原的序列

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2.2自通用Fab文库选择TnC特异性抗体18D4和11C7

自两种不同通用噬菌体展示文库:DP88-4(克隆18D4)和λ-DP47(克隆11C7)选择抗TnC抗体。

文库构建

噬菌体展示选择和ELISA筛选

在大肠杆菌中表达作为抗原用于噬菌体展示选择的人GST融合的TnC fn5 A1234BC fn6并在位于融合蛋白C端的avi标签识别序列处经由共表达BirA生物素连接酶而体内位点特异性生物素化(抗原生成依照实施例2.1,序列衍生自表14)。此抗原包含位于两个纤连蛋白III型域5和6之间的人TnC外剪接域(extra splice domain)A1,A2,A3,A4,B,和C。噬菌体展示选择目标在于选择针对这些外剪接域任一的结合物并在后续步骤中使用包含较少外剪接域的另外的抗原构建物通过表面等离振子共振测定域特异性。

依照下面的样式在溶液中实施选择轮次(生物淘选):1.用也携带与TnC靶抗原相似的avi标签和His6标签的无关GST-融合蛋白预清洁约10¹²个噬菌粒颗粒以对文库消减识别三种不同标签的抗体,2.在1ml总体积中在无关非生物素化GST-融合蛋白存在下将预清洁后的噬菌粒颗粒在含100nM生物素化人GST融合的TnC fn5 A1234 BC fn6的上清液中温育0.5小时以进一步消减标签结合物,3.通过转移至中性亲合素预包被微量滴定板的4个孔达10分钟来捕捉生物素化人GST融合的TnC fn5 A1234 BC fn6和附着的特异性结合噬菌体(在第1和3轮中),4.使用5x PBS/Tween20和5x PBS清洗相应孔,5.通过添加250μl 100mMTEA(三乙胺)每孔达10分钟来洗脱噬菌体颗粒并通过对来自4个孔的合并洗出液添加500μl1M Tris/HCl pH 7.4来中和,6.用洗脱的噬菌体颗粒的上清液再感染对数期大肠杆菌TG1细胞,用辅助噬菌体VCSM13感染,在摇床上于30℃温育过夜,随后用PEG/NaCl沉淀噬菌粒颗粒,待用于下一个选择轮次。使用恒定抗原浓度100nM进行3轮选择。在第2轮中,为了避免富集针对中性亲合素的结合物,通过添加5.4×10⁷个链霉亲合素包被的磁珠来实施抗原:噬菌体复合物的捕捉。在第2和3轮后如下通过ELISA鉴定特异性结合物:在中性亲合素板上包被100μl 100nM生物素化人GST融合的TnC fn5 A1234 BC fn6。添加含有Fab的细菌上清液并使用抗Flag/HRP二抗经由它们的Flag标签检测结合性Fab。对人GST融合的TnC fn5A1234 BC fn6展现信号且对与靶携带相同标签的无关GST融合蛋白呈现阴性的克隆通过初审用于进一步分析。它们在0.5升培养体积中由细菌表达,亲和纯化并使用BioRad的ProteOn XPR36生物传感器通过SPR分析进一步表征以测试对鼠TnC的交叉反应性及测定抗体识别哪些外剪接域。

使用BioRad的ProteOn XPR36生物传感器的SPR分析

以通过中性亲合素捕捉在NLC芯片上固定化的生物素化人和鼠TnC抗原,于25℃使用ProteOn XPR36仪器(Biorad)通过表面等离振子共振(SPR)测量选定克隆的亲和力(K_D)。抗原(配体)的固定化:将重组抗原用PBST(10mM磷酸盐,150mM氯化钠pH 7.4,0.005％Tween20)稀释至10μg/ml,然后以垂直方向以30μl/min注射。分析物的注射:对于‘一击动力学’测量,注射方向改成水平取向,沿着分开的通道1-5分别同时注射经过纯化的Fab的两倍稀释系列,结合时间200秒,解离时间240秒。沿着第六通道注射缓冲液(PBST)以提供“在线”空白用于参照。通过同时拟合结合和解离传感图使用ProteOn Manager v3.1软件中的简单一对一朗格缪尔结合模型计算结合速率常数(k_on)和解离速率常数(k_off)。作为比率k_off/k_on计算平衡解离常数(K_D)。表15列出两个选定克隆18D4和11C7对在物种和外剪接域组成方面不同的数种TnC抗原的平衡解离常数(K_D)。

表17:克隆18D4和11C7的平衡解离常数(K_D)

表3显示通用噬菌体展示DP88-4文库(Vk1_5/VH1_69)的序列,表4提供文库DP88-4种系模板的cDNA和氨基酸序列而表5显示用于生成DP88-4种系模板的引物序列。

表9显示用于PCR的通用噬菌体展示λ-DP47文库(Vl3_19/VH3_23)模板的序列。表10提供λ-DP47文库(Vl3_19/VH3_23)种系模板的cDNA和氨基酸序列而表11显示用于生成λ-DP47文库(Vl3_19/VH3_23)的引物序列。

2.3将可变抗体域克隆入表达载体

与人IgG1的恒定重链或恒定轻链任一同框亚克隆选定抗TnC结合物的重和轻链可变区DNA序列(表18至表23)。或是作为野生型人IgG1主链或是作为含有Pro329Gly,Leu234Ala和Leu235Ala突变的变体制备抗体,所述突变依照公开号WO 2012/130831A1的国际专利申请中描述的方法引入以消除对Fcγ受体的结合。

抗TnC结合物的CDR序列显示于表20至表23。

抗TnC IgG的碱基对和氨基酸序列在表24和表25中显示。抗TnC P319GLALA IgG的碱基对和氨基酸序列在表26和表27中显示。将所有抗体编码序列克隆入以嵌合MPSV启动子驱动***物转录且含有位于CDS的3’端的合成的polyA信号序列的表达载体。另外,载体含有用于质粒的附加体维持的EBV OriP序列。

通过噬菌体展示选择的克隆11C7的LCDR3(NSINSTRNEV(SEQ ID NO:51))含有潜在的N-糖基化位点,即NST,其可潜在地通过氨基酸替代去除以便于生成均质产物。同时,对靶的结合应当保留。N(位置1)可优选通过Q,S或T替代。或者,S(位置2)可通过P替换。或者,T(位置3)可优选通过G或N或通过除了S或C以外的任何其它蛋白质原性氨基酸替代。哪种/哪些替代会是最好的可以由本领域技术人员凭经验确定。

表18:噬菌体衍生抗TnC抗体的可变区碱基对序列

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表19:噬菌体衍生抗TnC抗体的可变区多肽序列

表20:抗TnC抗体轻链的CDR碱基对序列

表21:抗TnC抗体轻链的CDR多肽序列

表22:抗TnC抗体重链的CDR碱基对序列

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表23:抗TnC抗体重链的CDR多肽序列

表24:野生型人IgG1型式的抗TnC克隆的碱基对序列

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表25:野生型人IgG1型式的抗TnC克隆的多肽序列

表26:P329GLALA人IgG1型式的抗TnC克隆的碱基对序列

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表27:P329GLALA人IgG1型式的抗TnC克隆的多肽序列

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实施例3

靶向OX40和生腱蛋白C(TnC)的双特异性抗体的生成

3.1靶向OX40和生腱蛋白C(TnC)的双特异性抗体的生成

制备具有针对OX40的二价结合和针对TnC的二价结合的双特异性激动性OX40构建物(即‘2+2’构建物)。

在这个实施例中,构建物的重链(HC)由下述构件构成:抗OX40 49B4 Fc(P329G/LALA)的VHCH1,接着是(G₄S)₄接头和抗TnC克隆18D4或11C7的VHCH1。依照国际专利申请公开号WO 2012/130831 A1中描述的方法在重链的恒定区中引入Pro329Gly,Leu234Ala和Leu235Ala突变以消除对Fcγ受体的结合。共表达此重链融合物与抗Ox40 49B4的轻链(VLCL)以及18D4或11C7的交叉Fab LC(VLCH1)。对TnC结合模块采用crossmab技术来减少错误配对的轻链的形成(参见WO 2010/145792A1)。所得双特异性,二价构建物在图2中描绘且碱基对和氨基酸的序列可分别在表28和表29中找到。

表28:成熟双特异性抗Ox40,抗TnC人IgG1 P329GLALA 2+2型式的碱基对序列

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表29:成熟双特异性抗Ox40,抗TNC人IgG1 P329GLALA 2+2型式的氨基酸序列

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所有基因在由MPSV核心启动子与CMV启动子增强子片段组合组成的嵌合MPSV启动子控制下瞬时表达。表达载体还含有用于含有EBNA(埃巴病毒核抗原)的宿主细胞中的附加体复制的oriP区。

通过使用聚乙烯亚胺用哺乳动物表达载体共转染HEK293-EBNA细胞来生成双特异性抗OX40,抗TnC 2+2构建物。以1:1:1比率(“载体LC1”:“载体HC”:“载体LC2”)用相应表达载体转染细胞。

为了500mL摇瓶中的200mL生成,在转染前24小时在具有补充物的Excell培养基中接种250x 10⁶个HEK293 EBNA细胞。为了转染,将细胞以210x g离心5分钟,并用预温热的CD-CHO培养基替换上清液。在20mL CD-CHO培养基中混合表达载体至200μg DNA的最终量。添加540μL PEI(1mg/mL)后,将溶液漩涡震荡15秒并于室温温育10分钟。之后,将细胞与DNA/PEI溶液混合,转移至500mL摇瓶并在具有5％CO₂气氛且以165rpm摇动的温箱中于37℃温育3小时。温育后,添加160mL具有补充物的Excell培养基并将细胞培养24小时。此时,丙戊酸浓度是1mM(在培养基中还有5g/L PepSoy和6mM L-谷氨酰胺)。转染后24小时,以12％终体积(24mL)和3g/L葡萄糖(来自500g/L储液的1.2mL)对细胞补充补料7。培养7天后,通过以2000-3000x g离心45分钟来收集细胞上清液。将溶液无菌过滤(0.22μm滤器),补充叠氮化钠至终浓度0.01％(w/v),并于4℃保持。

使用MabSelectSure通过亲和层析进行自细胞培养物上清液纯化双特异性构建物。浓缩并过滤蛋白质,之后在用pH 6.0的20mM组氨酸,140mM NaCl,0.01％Tween-20溶液平衡的HiLoad Superdex 200柱(GE Healthcare)上加载。

为了亲和层析,在用30mL 20mM柠檬酸钠,20mM磷酸钠,pH 7.5平衡的ProtAMabSelect Sure柱(CV＝5mL,GE Healthcare)上加载上清液。通过用6-10个柱体积的含有20mM磷酸钠,20mM柠檬酸钠和0.5M氯化钠(pH 7.5)的缓冲液清洗来去除未结合的蛋白质。使用15个CV的20mM柠檬酸钠,100mM氯化钠,100mM甘氨酸,0.01％(v/v)Tween-20,pH 3.0的氯化钠的步骤或线性pH梯度(0至100％)任一洗脱结合的蛋白质。然后用10个柱体积的含有20mM柠檬酸钠,100mM氯化钠,100mM甘氨酸,0.01％(v/v)Tween-20,pH 3.0的溶液清洗柱,接着是再平衡步骤。

通过添加1/10(v/v)0.5M Na₂HPO₄,pH8.0来调节收集的级分的pH。浓缩并过滤蛋白质,之后在用20mM组氨酸,140mM氯化钠,pH 6.0,0.01％Tween20平衡的HiLoad Superdex200柱(GE Healthcare)上加载。

使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数,通过以280nm测量OD来测定经过纯化的双特异性构建物的蛋白质浓度。使用LabChipGXII(Caliper)通过还原剂(Invitrogen,USA)存在和缺失下的CE-SDS来分析双特异性构建物的纯度和分子量。于25℃使用在25mMK₂HPO₄,125mM NaCl,200mM单盐酸L-精氨酸,0.02％(w/v)NaN₃,pH 6.7运行缓冲液中平衡的TSKgel G3000 SW XL分析性大小排阻柱(Tosoh)分析双特异性构建物的聚集体含量(表30)。

表30:双特异性抗OX40,抗TnC IgG1 P329G LALA 2+2构建物的生化分析

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3.2靶向OX40和生腱蛋白C(TnC)的双特异性抗体(4+1和4+2)的生成

制备具有针对OX40的四价结合,和针对TnC的单价结合(即‘4+1’)或针对TnC的二价结合(即‘4+2’)的双特异性激动性OX40构建物。对4+2型式的TnC结合模块应用crossmab技术来减少错误配对的轻链的形成(参见WO 2010/145792 A1)。

对于4+1构建物,构建物的HC1由下述构件构成:抗OX40 49B4_Fc穴(P329G/LALA)的VHCH1_VHCH1,接着是(G₄S)₄接头和抗TnC克隆18D4的VL。HC2由抗OX40 49B4的VHCH1_VHCH1,接着是Fc节(P329G/LALA)_(G₄S)₄接头,融合抗TnC克隆18D4的VH构成。节入穴技术描述于例如US 5,731,168和US 7,695,936且容许装配HC1和HC2。共表达重链融合多肽与抗OX40克隆49B4的轻链(CLVL)。

对于4+2构建物,构建物的HC由下述构件构成:抗OX40 49B4_Fc(P329G/LALA)的VHCH1_VHCH1,接着是(G₄S)₄接头,接着是TnC结合克隆18D4的交叉Fab单元(VLCH1),融合至Fc的C端。共表达重链融合多肽与抗OX40克隆49B4的轻链(LC1)(CLVL)。抗OX40 Fab的CH和CL含有带电荷的残基以防止生成Bence Jones蛋白质及进一步稳定化LC1与HC的正确配对。

具体地,在OX40(49B4)VLCL轻链(SEQ ID NO:212)的CL域中做出替代E123R和Q124K(残基依照EU编号方式),产生轻链序列SEQ ID NO:224；并在OX40(49B4)的CH1域中做出替代K147E和K213E(残基依照EU编号方式),产生重链序列SEQ ID NO:220。

在这种情况中引入节入穴并非必须的,因为两条HC含有相同的域。共表达重链融合多肽和LC1多肽与编码抗TnC结合克隆18D4的VH和CL的多肽。

依照国际专利申请公开号WO 2012/130831 A1中描述的方法在4+1和4+2构建物的重链的恒定区中引入Pro329Gly,Leu234Ala和Leu235Ala突变以消除对Fcγ受体的结合。

所得具有针对OX40的四价结合的双特异性抗原结合分子在图3中描绘,且碱基对和氨基酸的序列可分别在表31和表32中找到。

表31:成熟双特异性,四价抗OX40,单价和二价抗TnC huIgG1 P329GLALA分子的碱基对序列

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表32:成熟双特异性,四价抗OX40,单价和二价抗TnC huIgG1P329GLALA分子的氨基酸序列

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通过使用聚乙烯亚胺用哺乳动物表达载体共转染HEK293-EBNA细胞来生成双特异性抗OX40,抗TnC构建物。以1:1:4(“载体重链”:“载体轻链1”:“载体轻链2”,对于4+2)和1:1:4(“载体重链1”:“载体重链2”:“载体轻链”,对于4+1)比率用相应表达载体转染细胞。

为了亲和层析,在用30mL 20mM柠檬酸钠,20mM磷酸钠,pH 7.5平衡的ProtAMabSelect Sure柱(CV＝5mL,GE Healthcare)上加载上清液。通过用6-10个柱体积的含有20mM磷酸钠,20mM柠檬酸钠(pH 7.5)的缓冲液清洗来去除未结合的蛋白质。使用8个CV的20mM柠檬酸钠,100mM氯化钠,100mM甘氨酸,pH 3.0的步骤洗脱来洗脱结合的蛋白质。

通过添加1/10(v/v)0.5M Na₂HPO₄,pH8.0来调节收集的级分的pH。浓缩并过滤蛋白质,之后在用20mM组氨酸,140mM氯化钠,0.01％Tween20,pH6.0平衡的HiLoad Superdex200柱(GE Healthcare)上加载。

使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数,通过以280nm测量OD来测定经过纯化的双特异性四价4+1和4+2构建物的蛋白质浓度。使用LabChipGXII(Caliper)通过还原剂(Invitrogen,USA)存在和缺失下的CE-SDS来分析双特异性构建物的纯度和分子量。于25℃使用在25mM K₂HPO₄,125mM NaCl,200mM单盐酸L-精氨酸,0.02％(w/v)NaN₃,pH 6.7运行缓冲液中平衡的TSKgel G3000 SW XL分析性大小排阻柱(Tosoh)分析双特异性构建物的聚集体含量。

表33:双特异性四价抗Ox40,抗TnC IgG1 P329G LALA 4+1和4+2构建物的生化分析

3.3抗OX40,抗TnC 2+2,4+1和4+2构建物的聚集温度的测定

为了直接比较所有型式,通过静态光散射(SLS)和通过测量响应所应用的温度应力而发生的内在蛋白质荧光来监测热稳定性。将30mg经过过滤的蛋白质样品(蛋白质浓度1mg/ml)一式两份应用于Optim 2仪器(Avacta Analytical Ltd)。以0.1℃/min升高温度自25至85℃,收集径向和总散射强度。为了测定内在蛋白质荧光,以266nm激发样品并介于275nm和460nm之间收集发射。

表34:双特异性,抗OX40,抗TnC 2+2,4+1和4+2构建物的聚集温度

实施例4

靶向OX40和生腱蛋白C(TnC)的双特异性抗体的结合

4.1通过表面等离振子共振分析对OX40和TnC的同时结合的分析

通过表面等离振子共振(SPR)评估同时结合人OX40 Fc(kih)和人TnC的能力。所有SPR实验是用HBS-EP作为运行缓冲液(0.01M HEPES pH 7.4,0.15M NaCl,3mM EDTA,0.005％表面活性剂P20,Biacore,Freiburg/Germany)于25℃在Biacore T200上实施的。

将生物素化人TnC直接偶联至链霉亲合素(SA)传感器芯片的流动室。使用高至1000个共振单位(RU)的固定化水平。

以30μL/分钟的流速以250nM的浓度使靶向OX40和TnC的双特异性抗体流过芯片表面达90秒,并将解离设为零秒。以250nM的浓度以30μL/分钟的流速注射作为第二分析物的人OX40达90秒,并对解离监测120秒。通过减去在没有固定化蛋白质的参照流动室中获得的响应来修正本体折射率差异。

所有双特异性抗原结合分子能同时结合人OX40和人TnC(图4B至4E)。

4.2通过表面等离振子共振分析对人,鼠和食蟹猴TnC的结合的分析

通过表面等离振子共振(SPR)分析双特异性构建物结合人,鼠和食蟹猴TnC的能力。所有SPR实验是用HBS-EP作为运行缓冲液(0.01M HEPES pH7.4,0.15M NaCl,3mM EDTA,0.005％表面活性剂P20,Biacore,Freiburg/Germany)于25℃在Biacore T200上实施的。

在SA芯片上固定化生物素化的人,鼠或食蟹猴TnC分子以达到10个共振单位(RU)的固定化水平。

固定化后,立即以30μL/分钟的流速以范围为0.05-50nM的浓度使双特异性分子或对照分子通过芯片表面达120秒和180秒的解离期。使用10mM甘氨酸pH 2.1再生表面。通过减去在没有固定化TnC的参照流动室中获得的响应来修正本体折射率差异。使用朗格缪尔1:1曲线拟合来确定这些实验条件下的亲和力/亲合力。对于二价结合,使用相同的1:1拟合产生表观KD值。对于构建物49B4/11C7(2+2),对食蟹猴和鼠TnC的结合太弱,将其归类为“无结合”。

表35:所示靶向OX40和TnC的双特异性抗体对人,鼠和食蟹猴TnC的结合的KD值

4.3对人Ox40表达性细胞的结合的分析:幼稚的和激活的人外周单个核血白细胞(PBMC)

自苏黎世献血中心获得血沉棕黄层。为了分离新鲜的外周血单个核细胞(PBMC),用等体积的DPBS(Gibco by Life Technologies,目录号14190 326)稀释血沉棕黄层。给50mL聚丙烯离心管(TPP,目录号91050)供应15mL Histopaque 1077(SIGMA Life Science,目录号10771,聚蔗糖和泛影酸钠,调节至1.077g/mL的密度)并将血沉棕黄层溶液在Histopaque 1077上方分层。将管于室温以400x g离心30分钟,低加速且无中断。随后自界面收集PBMC,用DPBS清洗三次并在由供应有10％胎牛血清(FBS,Gibco by LifeTechnology,目录号16000-044,批次941273,经伽马照射,无支原体且于56℃热灭活35分钟的),1％(v/v)GlutaMAX I(GIBCO by Life Technologies,目录号35050 038),1mM丙酮酸钠(SIGMA,目录号S8636),1％(v/v)MEM非必需氨基酸(SIGMA,目录号M7145)和50μMβ-巯基乙醇(SIGMA,M3148)的RPMI 1640培养基(Gibco by Life Technology,目录号42401-042)组成的T细胞培养基中重悬浮。

或是在分离后直接地(用于对静息的人PBMC的结合的分析),或是在刺激以提供T细胞的细胞表面上人OX40表达的高表达后(用于对激活的人PBMC的结合的分析)在实验中使用PBMC。为了刺激,将幼稚的PBMC在6孔组织培养板中在供应有200U/mL Proleukin(Novartis)和2ug/mL PHA-L(Sigma-Aldrich,L2769-10)的T细胞培养基中培养4天,然后在预包被的6孔组织培养板[2ug/mL]抗人CD3(克隆OKT3,eBioscience,目录号16-0037-85)和[2ug/mL]抗人CD28(克隆CD28.2,eBioscience,目录号16-0289-85]上在供应有200U/mLProleukin的T细胞培养基中于37℃和5％CO₂培养1天。

为了检测OX40,混合幼稚的人PBMC和激活的人PBMC。为了能够区分幼稚的与激活的人PBMC,在结合测定法前使用eFluor670细胞增殖染料(eBioscience,目录号65-0840-85)标记幼稚的细胞。

为了标记,收获细胞,用预温热的(37℃)DPBS清洗并在DPBS中调节至1x 10⁷个细胞/mL的细胞密度。在DPBS中以0.5x 10⁷个细胞/mL的最终细胞密度和以2.5mM的终浓度将eFluor670细胞增殖染料(eBioscience,目录号65-0840-85)添加至幼稚的人PBMC的悬浮液。然后将细胞在黑暗中于室温温育10分钟。为了停止标记反应,添加4mL热灭活的FBS并将细胞用T细胞培养基清洗三次。将1x 10⁵个静息的eFluor670标记人PBMC和0.5x 10⁵个未标记的激活的人PBMC的2:1混合物添加至圆底悬浮细胞96孔板(Greiner bio-one,cellstar,目录号650185)的每个孔。

将细胞在50μL/孔4℃含有不同量的所示抗原结合分子的FACS缓冲液中在黑暗中于4℃染色120分钟。用4℃ FACS缓冲液清洗三次后,将细胞在25μL/孔4℃含有荧光标记的抗人CD4(克隆RPA-T4,小鼠IgG1κ,BioLegend,目录号300532),抗人CD8(克隆RPa-T8,小鼠IgG1κ,BioLegend,目录号3010441)和异硫氰酸荧光素(FITC)缀合的AffiniPure抗人IgGFcγ片段特异性山羊IgG F(ab`)2片段(Jackson ImmunoResearch,目录号109 096 098)的混合物的FACS缓冲液中在黑暗中于4℃染色45分钟。

然后在85μL/孔含有0.2μg/mL DAPI(Santa Cruz Biotec,目录号Sc-3598)的FACS缓冲液中重悬浮细胞并在同一天使用5激光LSR-Fortessa(带有DIVA软件的BDBioscience)获取。

如图6A至6D和图7A至7D中所示,对OX40特异性的抗原结合分子无一结合并不在细胞表面处表达OX40的静息的人CD4+T细胞或CD8+T细胞。与之对比,所有双特异性抗OX40,抗TnC分子均展示结合表达OX40的激活的CD8+或CD4+T细胞。对CD4+T细胞的结合比对CD8+T细胞强得多。激活的人CD8+T细胞以比激活的CD4+T细胞的表达水平低得多的水平表达OX40。OX40的表达水平取决于刺激的动力学和强度,并且在这里为CD4+T细胞但不为CD8+T细胞上的OX40表达优化条件。如此,在CD8+T细胞上仅仅诱导少量的OX40表达。

发现双特异性抗OX40,抗TnC分子在它们的结合强度方面不同。如表36中所示如图7A中可见,具有针对OX40的四价结合的4+2分子比二价2+2分子更强且以更高亲合力结合。

结果还提示TnC结合模块的存在并不影响四价OX40结合物对OX40的结合(见例如图6A和图7A)。

4.4对人TnC表达性和TnC阴性肿瘤细胞的结合

使用TnC表达性U87-MG细胞(ATCC HTB-14),和经转染稳定表达人TnC的CT26细胞系(称作‘CT26huTnC’细胞)分析双特异性抗OX40,抗TnC分子对在细胞表面处表达的TnC的结合。使用TnC阴性细胞系WM-266-4(ATCC CRL-1676)分析结合的特异性。

为了容许区分肿瘤细胞,用PKH-26红色荧光细胞接头试剂盒(Sigma,目录号PKH26GL)预标记WM266-4细胞。收获细胞并用RPMI 1640培养基清洗三次。然后将细胞在新鲜制备的PKH26红色染剂溶液(终浓度1nM,在稀释剂C(随PKH-26红色荧光细胞接头试剂盒提供)中)中以0.5x 10⁷个细胞的最终细胞密度在黑暗中于室温染色5分钟。添加过量的FBS以停止标记反应并将细胞用补充有10％(v/v)FBS,1％(v/v)GlutaMAX-I的RPMI 1640培养基清洗四次以去除过量的染料。

为了检测抗原结合分子对不同细胞类型的结合,将0.5-2x 10⁵个PkH26标记的WM266-4和/或未标记的U87-MG细胞或CT26huTnC细胞添加至圆底悬浮细胞96孔板(Greinerbio-one,cellstar,目录号650185)的孔。然后将细胞在50μL/孔4℃含有滴定的抗原结合分子的含BSA(0.1％v/w,Sigma-Aldrich,目录号A9418)的FACS缓冲液(DPBS(Gibco by LifeTechnologies,目录号14190326)中在黑暗中于4℃染色60至120分钟。用过量的FACS缓冲液清洗三次后,如所示的将细胞在25μL/孔4℃含有异硫氰酸荧光素(FITC)缀合的AffiniPure抗人IgG Fcγ片段特异性山羊IgG F(ab`)2片段(Jackson ImmunoResearch,目录号109096 098)或藻红蛋白(PE)缀合的AffiniPure抗人IgG Fcγ片段特异性山羊IgG F(ab`)2片段(Jackson ImmunoResearch,目录号109-116-098)的FACS缓冲液中在黑暗中于4℃染色30-60分钟。使用抗FAP抗体(Calbiochem,moIgG1,OP188)或抗TnC抗体(US Biological,moIgG1,T2550-20D)测定肿瘤细胞上的TnC和FAP的表达,并使用二抗FITC标记的抗小鼠IgG抗体(Dako,代码K0078(Quifikit))检测。

为了区分活的和死的细胞,使用两种方法。在同一天运行5激光LSR-Fortessa(带有DIVA软件的BD Bioscience)在85μL/孔含有0.2μg/mL DAPI(Santa Cruz Biotec,目录号Sc-3598)的FACS缓冲液中对非固定细胞获取。然而,在一些情况中,在结合测定法前用可固定存活力染料

660(eBioscience 65-0864-18)或用Zombie Aqua^TM可固定存活力试剂盒(BioLegend 423102)依照制造商的说明书标记死细胞以容许随后***固定细胞和在MACS Quant分析仪10或在5激光LSR_Fortessa(带有DIVA软件的BD Bioscience)上获取过夜。简言之,将细胞用DPBS(Gibco by Life Technologies,目录号14190 326)清洗一次并在含有存活力染料/>

660[1μg/mL]的DPBS中以1x 10⁶个细胞/mL的细胞浓度在黑暗中于4℃温育30分钟。或者,将细胞用DPBS清洗一次并在含有Zombie Aqua^TM存活力染料[1:800稀释]的DPBS中以1x 10⁶个细胞/mL的细胞浓度在黑暗中于4℃温育15分钟。随后将细胞用DPBS清洗一次以去除过量的染料,之后如上文所述将一抗抗原结合分子添加至细胞并温育细胞。随后在测量前将细胞在***溶液(1-2.5％(v/v),在DPBS中,SigmaHT501320)中于4℃固定15分钟。

如图8中所示,在U87-MG细胞上(以低水平),且以高水平在CT26huTnC细胞上检测到TnC表达,但是在WM-266-4细胞上没有。在WM-266-4和U87-MG细胞上检测到FAP表达。

如图9中所示,双特异性,二价抗OX40(克隆49B4),二价抗TnC(克隆11C7或克隆18D4)抗原结合分子并不展示对WM-266-4细胞的结合(图9A)。二价抗OX40,二价抗TnC克隆18D4抗原结合分子展示对U87-MG细胞上的TnC的结合(图9B),和对CT26huTnC细胞的强结合(图9C；实心三角形)。

如图10中所示,亲本二价抗TnC抗体克隆18D4(图10B；带有叉的方形)显示对U87-MG细胞上的TnC的强结合,和对CT26huTnC细胞的强结合(图10C；带有叉的方形)。二价抗OX40,二价抗TnC克隆18D4和四价抗OX40,二价抗TnC克隆18D4分子显示不及亲本二价抗TnC抗体克隆18D4强地结合CT26huTnC细胞(图10C；实心三角形和实心圆形对带有叉的方形),提示在抗原结合分子的C端表达该分子降低对TnC的结合。通过引入电荷的稳定化能略微提高N端表达的二价抗TnC对TnC的结合(图10C；实心圆形对实心三角形)。二价抗OX40,二价抗TnC克隆18D4和四价抗OX40,二价抗TnC克隆18D4分子显示比四价抗OX40,单价抗TnC克隆18D4分子更强地结合CT26huTnC细胞(图10C；实心方形对实心三角形和实心圆形)。抗TnC抗原结合分子并不显示对TnC阴性WM-226-4细胞的结合(图10A)。

表36显示所示抗原结合分子对WM266-4,U87-MG和CT26huTnC细胞的结合的EC₅₀值。

表36:不同双特异性人IgG1 P329GLALA型式的aOx40结合物49B9对细胞表面人TnC和人Ox40的结合的EC₅₀值

n.c.＝不拟合曲线,不可能计算EC₅₀。

实施例5

靶向OX40和TnC的双特异性抗原结合分子的生物学活性

5.1表达人OX40和报告基因NF-κB-萤光素酶的HeLa细胞

Ox40对它的配体的激动性结合经由激活核因子卡帕B(NFκB)而诱导下游信号传导(A.D.Weinberg et al.,J.Leukoc.Biol.2004,75(6),962-972)。生成在它的表面上表达人OX40的重组报告细胞系HeLa_hOX40_NFκB_Luc1。这种细胞系包含含有在NFκB敏感性增强子区段控制下的萤光素酶基因的报告质粒。OX40的结合和激活诱导NFκB的剂量依赖性激活,其然后易位至核,在那里它结合报告质粒的NFκB敏感性增强子以提高萤光素酶蛋白质的表达。萤光素酶催化萤光素氧化,产生发光的氧化萤光素。这可以使用发光计来检测和量化。如此,可使用HeLa_hOx40_NFkB_Luc1报告细胞来分析抗OX40分子诱导NFκB激活的能力作为生物活性的度量。

于37℃使用细胞解离缓冲液(Invitrogen,目录号13151-014)收获贴壁HeLa_hOx40_NFkB_Luc1细胞达10分钟。将细胞用DPBS清洗一次并在由MEM(Invitrogen,目录号22561-021),10％(v/v)热灭活的FBS,1mM丙酮酸钠和1％(v/v)非必需氨基酸构成的测定培养基中调节至1.33x 10⁵个的细胞密度。在带盖的无菌白色96孔平底组织培养板(greinerbio one,目录号655083)中以0.2x 10⁵个细胞每孔的密度接种细胞并在温箱(Hera Cell150)中在5％CO₂气氛中于37℃温育过夜。

次日,通过添加含有各种滴定的P329GLALA huIgG1型式的靶向OX40的双特异性抗原结合分子的测定培养基将HeLa_hOx40_NFkB_Luc1细胞刺激5-6小时。为了分析高交联对生物活性的影响,以1:2比率(二抗比一抗抗OX40 P329GLALA huIgG1抗原结合分子多2倍)添加25μL/孔含有二抗抗人IgG Fcγ片段特异性山羊IgG F(ab`)2片段(JacksonImmunoResearch,109-006-098)的培养基。通过以4:1比率(每孔中TnC+肿瘤细胞是报告细胞的4倍)添加25μL/孔含有TnC+肿瘤细胞(U87-MG或CT26huTnC细胞)的培养基测试细胞表面TnC+细胞对构建物的高交联。

温育后,吸出测定上清液并将板用DPBS清洗两次。依照制造商的说明书使用萤光素酶100测定***和报告物裂解缓冲液(都是Promega,目录号E4550和目录号E3971)实施发光的量化。简言之,通过添加30uL每孔1x裂解缓冲液,将细胞于-20℃裂解10分钟。将细胞于37℃融化20分钟,之后添加90μl每孔的萤光素酶测定试剂。立即用SpectraMax M5/M5e微量板读数仪(Molecular Devices,USA)或在

10M多模微量板读数仪(Tecan tradingAG)上量化发光,使用500ms积分时间,没有任何滤器来收集所有波长。所发出的相对光单位(RLU)通过HeLa_hOx40_NFkB_Luc1细胞的基础发光来修正并使用Prism4或6(GraphPadSoftware,USA)针对对数一抗浓度绘图。使用内置的S型(sigmoidal)剂量响应将数据拟合曲线。

如图11中所示,所有二价抗OX40抗原结合2+2分子均诱导有限的NFκB激活(图11A)。抗人Fc特异性二抗所致交联强烈增强生物活性,不依赖于靶向模块(图11B)。当使用TnC靶向性分子时TnC表达性肿瘤细胞提高对NFκB介导的萤光素酶激活的诱导(图11C和11D；实心方形和实心三角形)。

如图12和图13中所示,所有抗OX40抗原结合分子均诱导有限的NFκB激活(图12A和13A)。当使用TnC靶向性抗原结合分子时U87-MG细胞所致交联增强生物活性(图12B)。正如预期的,当用CT26huTnC细胞系交联时所有TnC靶向性分子均引起与U87-MG细胞所致交联相比高得多的对NFκB的诱导(比较图12B与图13B)。

确定各自绘图的剂量-响应曲线的曲线下面积作为每一种抗原结合分子的激动能力的指标。

如图12C中所示,四价抗OX40,二价抗TnC(克隆18D4)4+2分子在U87-MG细胞(其表达中等水平的表面TnC)所致交联存在下诱导最多NFκB激活,而且对等同的四价抗OX40,单价抗TnC(克隆18D4)4+1分子仅仅检测到U87-MG细胞所致交联所致低水平的激动作用。这一发现与4+2分子以比4+1分子更大的程度结合U87-MG细胞(见图10C)的发现一致。

然而,如图13B和13C中所示,当使用CT26huTnC细胞系时,四价抗OX40,二价抗TnC(克隆18D4)4+2分子和四价抗OX40,单价抗TnC(克隆18D4)4+1分子均诱导非常强烈的NFκB激活,而且程度相似。自图13B和13C还清楚的是,二价抗OX40,二价抗TnC(克隆18D4)2+2分子诱导与四价抗OX40,二价抗TnC(克隆18D4)4+2和四价抗OX40,单价抗TnC(克隆18D4)4+1分子相比更低水平的NFκB激活。

这后一发现提示TnC所致高交联以及针对OX40的高效价对于OX40抗原结合分子的激动剂功能是重要的。

5.2OX40介导对亚最佳TCR触发的静息的人PBMC的共刺激和细胞表面TnC所致高交联

OX40的连接提供协同的共刺激信号,在亚最佳的T细胞受体(TCR)刺激后促进T细胞的***和存活(M.Croft et al.,Immunol.Rev.2009,229(1),173-191)。另外,数种细胞因子的生成和T细胞激活标志物的表面表达在OX40的连接后升高(I.Gramaglia et al.,J.Immunol.1998,161(12),6510-6517；S.M.Jensen et al.,Seminars in Oncology 2010,37(5),524-532)。

对双特异性抗OX40,抗TnC抗原结合分子分析它们挽救静息的人PBMC细胞的亚最佳TCR刺激的能力。人PBMC制备物含有(1)静息的,OX40阴性CD4+和CD8+T细胞和(2)在它们的细胞表面上具有各种Fc受体分子的抗原呈递细胞,例如B细胞和单核细胞。在静息的OX40阴性CD4+和CD8+T细胞上人IgG1同种型的抗人CD3抗体经由它的Fc结合Fcγ受体分子并触发延长的TCR激活。然后这些细胞在数小时内开始表达OX40。针对OX40的功能性激动性化合物能经由激活的CD8+和CD4+T细胞上存在的OX40受体发信号并支持TCR介导的刺激。

将静息的eFluor670或CFSE标记的(细胞踪迹CFSE增殖试剂盒,Thermo Fischer,C34554)人PBMC在经过照射的U87-MG或CT26huTnC细胞和滴定的抗OX40抗原结合分子存在下用亚最佳浓度的抗CD3抗体刺激4天。经由通过流式细胞术监测总细胞计数和活细胞中的eFluor670/CFSE稀释来分析对T细胞存活,增殖和分化的影响。另外,将细胞用荧光标记的针对T细胞激活标志物CD25和成熟标志物CD127的抗体共染色。

于37℃使用细胞解离缓冲液(Invitrogen,目录号13151-014)10分钟来收获U87-MG或CT26huTnC细胞。将细胞用DPBS清洗一次。将U87-MG或CT26huTnC细胞以0.2x 10⁵个细胞每孔的密度在温箱(Hera Cell 150)中在无菌96孔圆底贴壁组织培养板(TPP,目录号92097)中在T细胞培养基中于37℃和5％CO₂培养过夜。次日,使用4500拉德的剂量在X射线照射器中照射它们以防止稍后肿瘤细胞系对人PBMC的过度生长(overgrowth)。

如实施例4.3中描述的通过Ficoll密度离心来分离人PBMC并用eFluor670标记。或者,用CFSE标记PBMC,为了标记,收获细胞,用预温热的(37℃)DPBS清洗并在DPBS中调节至1x 10⁷个细胞/mL的细胞密度。在DPBS中以0.5x 10⁷个细胞/mL的最终细胞密度和以0.2μM的终浓度将CFSE(细胞踪迹CFSE增殖试剂盒,Thermo Fischer,目录号C34554)添加至幼稚的人PBMC的悬浮液。然后将细胞在黑暗中于37℃温育10分钟。为了停止标记反应,添加4mL热灭活的FBS并将细胞用T细胞培养基清洗三次。以0.6x 10⁵个细胞每孔的密度将细胞添加至每个孔。添加终浓度10nM的抗人CD3抗体(克隆V9,人IgG1)和所示浓度的所示抗OX40抗原结合分子。将细胞在温箱(Hera Cell 150)中于37℃和5％CO₂激活4天。随后将细胞用荧光染料缀合的抗体抗人CD4(克隆RPA-T4,BioLegend,目录号300532),CD8(克隆RPa-T8,BioLegend,目录号3010441),抗CD25(克隆M-A251,BioLegend,目录号356112)和抗CD127(克隆A019D5,BioLegend,目录号351324)于4℃表面染色20分钟。将细胞团粒用FACS缓冲液清洗一次。最后在85μL/孔含有0.2μg/mL DAPI(Santa Cruz Biotec,目录号Sc-3598)的FACS缓冲液中重悬浮细胞并在同一天使用5激光LSR-Fortessa(带有DIVA软件的BDBioscience)获取。

在一些情况中,将细胞用DPBS清洗一次并在含有Zombie Aqua^TM存活力染料[1:800稀释]的DPBS中以1x 10⁶个细胞/mL的细胞浓度在黑暗中于4℃温育15分钟。将细胞用DPBS清洗一次以去除过量的并如上文描述的用荧光染料缀合的抗体实施表面染色。在测量前将细胞在***溶液(1％(v/v),在DPBS中,Sigma HT501320)中于4℃固定30分钟。最后在100μL/孔FACS缓冲液中重悬浮板并在同一天使用5激光LSR-Fortessa(带有DIVA软件的BDBioscience)获取。

实验结果在图14至16中显示。

通过在U87-MG细胞存在下培养,TnC靶向性4+2(实心圆形)抗OX40抗原结合分子的高交联在人CD4+和CD8+T细胞中强烈促进增殖和成熟(图14)且诱导增强的激活的(CD25+)表型(图15)。通过在CT26huTnC细胞存在下培养,TnC靶向性4+2(实心圆形)抗OX40抗原结合分子的高交联在人CD4+和CD8+T细胞中强烈促进增殖和成熟(图16)。与二价抗OX40,二价抗TnC 2+2分子(实心三角形)和四价抗OX40,单价抗TnC 4+1分子(实心方形)相比,四价抗OX40,二价抗TnC 4+2分子(实心圆形)在它们挽救亚最佳TCR刺激的能力方面明显优越。

四价抗OX40,单价抗TnC 4+1分子(实心方形)显示具有与二价抗OX40,二价抗TnC2+2分子(实心三角形)相比降低的挽救亚最佳TCR刺激的能力。这可以通过与二价分子相比降低的单体N端融合的抗TnC(18D4)分子对TnC的亲和力来解释。然而,由于空间位阻,可以预期N端融合的抗TnC(18D4)结合物只有小程度的细胞表面TnC所致交联。

结果提示,对于T细胞中的最佳OX40激动作用,不仅要求足够的OX40受体寡聚化(例如经由针对OX40的四价),而且OX40受体寡聚体的细胞表面固定化也是必须的。

序列表

<110> 豪夫迈·罗氏有限公司（F. Hoffmann-La Roche AG）

<120> 针对共刺激性TNF受体的双特异性抗原结合分子

<130> P34209-WO

<150> EP17163561.8

<151> 2017-03-29

<160> 226

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 186

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 1

Leu His Cys Val Gly Asp Thr Tyr Pro Ser Asn Asp Arg Cys Cys His

1 5 10 15

Glu Cys Arg Pro Gly Asn Gly Met Val Ser Arg Cys Ser Arg Ser Gln

20 25 30

Asn Thr Val Cys Arg Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Val Val

35 40 45

Ser Ser Lys Pro Cys Lys Pro Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly

50 55 60

Ser Glu Arg Lys Gln Leu Cys Thr Ala Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg

65 70 75 80

Cys Arg Ala Gly Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val Asp

85 90 95

Cys Ala Pro Cys Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala

100 105 110

Cys Lys Pro Trp Thr Asn Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln

115 120 125

Pro Ala Ser Asn Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro

130 135 140

Ala Thr Gln Pro Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Ile Thr

145 150 155 160

Val Gln Pro Thr Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln Gly Pro Ser Thr

165 170 175

Arg Pro Val Glu Val Pro Gly Gly Arg Ala

180 185

<210> 2

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> OX40(8H9,49B4,1G4, 20B7) CDR-H1

<400> 2

Ser Tyr Ala Ile Ser

1 5

<210> 3

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> OX40(CLC-563, CLC-564, 17A9) CDR-H1

<400> 3

Ser Tyr Ala Met Ser

1 5

<210> 4

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> OX40(8H9,49B4,1G4, 20B7) CDR-H2

<400> 4

Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 5

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> OX40(CLC-563, CLC-564, 17A9) CDR-H2

<400> 5

Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 6

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> OX40(8H9) CDR-H3

<400> 6

Glu Tyr Gly Trp Met Asp Tyr

1 5

<210> 7

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> OX40(49B4) CDR-H3

<400> 7

Glu Tyr Tyr Arg Gly Pro Tyr Asp Tyr

1 5

<210> 8

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> OX40(1G4) CDR-H3

<400> 8

Glu Tyr Gly Ser Met Asp Tyr

1 5

<210> 9

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> OX40(20B7) CDR-H3

<400> 9

Val Asn Tyr Pro Tyr Ser Tyr Trp Gly Asp Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 10

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> OX40(CLC-563) CDR-H3

<400> 10

Asp Val Gly Ala Phe Asp Tyr

1 5

<210> 11

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> OX40(CLC-564) CDR-H3

<400> 11

Asp Val Gly Pro Phe Asp Tyr

1 5

<210> 12

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> OX40(17A9)-CDR-H3

<400> 12

Val Phe Tyr Arg Gly Gly Val Ser Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 13

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> OX40(8H9,49B4,1G4, 20B7) CDR-L1

<400> 13

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ala

1 5 10

<210> 14

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> OX40(CLC-563, CLC564) CDR-L1

<400> 14

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 15

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> OX40(17A9) CDR-L1

<400> 15

Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser

1 5 10

<210> 16

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> OX40(8H9,49B4,1G4, 20B7) CDR-L2

<400> 16

Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser

1 5

<210> 17

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> OX40(CLC-563, CLC564) CDR-L2

<400> 17

Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr

1 5

<210> 18

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> OX40(17A9) CDR-L2

<400> 18

Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser

1 5

<210> 19

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> OX40(8H9) CDR-L3

<400> 19

Gln Gln Tyr Leu Thr Tyr Ser Arg Phe Thr

1 5 10

<210> 20

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> OX40(49B4) CDR-L3

<400> 20

Gln Gln Tyr Ser Ser Gln Pro Tyr Thr

1 5

<210> 21

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> OX40(1G4) CDR-L3

<400> 21

Gln Gln Tyr Ile Ser Tyr Ser Met Leu Thr

1 5 10

<210> 22

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> OX40(20B7) CDR-L3

<400> 22

Gln Gln Tyr Gln Ala Phe Ser Leu Thr

1 5

<210> 23

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> OX40(CLC-563, CLC-164) CDR-L3

<400> 23

Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Leu Thr

1 5

<210> 24

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> OX40(17A9) CDR-L3

<400> 24

Asn Ser Arg Val Met Pro His Asn Arg Val

1 5 10

<210> 25

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> OX40(8H9) VH

<400> 25

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Tyr Gly Trp Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 26

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> OX40(8H9) VL

<400> 26

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Thr Tyr Ser Arg

85 90 95

Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

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<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> OX40(49B4) VH

<400> 27

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Tyr Tyr Arg Gly Pro Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Val Thr Val Ser Ser

115

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<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> OX40(49B4) VL

<400> 28

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Gln Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

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<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> OX40(1G4) VH

<400> 29

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Tyr Gly Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 30

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> OX40(1G4) VL

<400> 30

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ile Ser Tyr Ser Met

85 90 95

Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> OX40(20B7) VH

<400> 31

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Val Asn Tyr Pro Tyr Ser Tyr Trp Gly Asp Phe Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 32

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> OX40(20B7) VL

<400> 32

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gln Ala Phe Ser Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 33

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> OX40(CLC-563) VH

<400> 33

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Leu Asp Val Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ala Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 34

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> OX40(CLC-563) VL

<400> 34

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro

85 90 95

Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 35

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> OX40(CLC-564) VH

<400> 35

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Phe Asp Val Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 36

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> OX40(CLC-564) VL

<400> 36

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro

85 90 95

Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 37

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> OX40(17A9) VH

<400> 37

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Val Phe Tyr Arg Gly Gly Val Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 38

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> OX40(17A9) VL

<400> 38

Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln

1 5 10 15

Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala

20 25 30

Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr

35 40 45

Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Val Met Pro His Asn Arg

85 90 95

Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val

100 105

<210> 39

<211> 2201

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 39

Met Gly Ala Met Thr Gln Leu Leu Ala Gly Val Phe Leu Ala Phe Leu

1 5 10 15

Ala Leu Ala Thr Glu Gly Gly Val Leu Lys Lys Val Ile Arg His Lys

20 25 30

Arg Gln Ser Gly Val Asn Ala Thr Leu Pro Glu Glu Asn Gln Pro Val

35 40 45

Val Phe Asn His Val Tyr Asn Ile Lys Leu Pro Val Gly Ser Gln Cys

50 55 60

Ser Val Asp Leu Glu Ser Ala Ser Gly Glu Lys Asp Leu Ala Pro Pro

65 70 75 80

Ser Glu Pro Ser Glu Ser Phe Gln Glu His Thr Val Asp Gly Glu Asn

85 90 95

Gln Ile Val Phe Thr His Arg Ile Asn Ile Pro Arg Arg Ala Cys Gly

100 105 110

Cys Ala Ala Ala Pro Asp Val Lys Glu Leu Leu Ser Arg Leu Glu Glu

115 120 125

Leu Glu Asn Leu Val Ser Ser Leu Arg Glu Gln Cys Thr Ala Gly Ala

130 135 140

Gly Cys Cys Leu Gln Pro Ala Thr Gly Arg Leu Asp Thr Arg Pro Phe

145 150 155 160

Cys Ser Gly Arg Gly Asn Phe Ser Thr Glu Gly Cys Gly Cys Val Cys

165 170 175

Glu Pro Gly Trp Lys Gly Pro Asn Cys Ser Glu Pro Glu Cys Pro Gly

180 185 190

Asn Cys His Leu Arg Gly Arg Cys Ile Asp Gly Gln Cys Ile Cys Asp

195 200 205

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210 215 220

Cys Asn Asp Gln Gly Lys Cys Val Asn Gly Val Cys Ile Cys Phe Glu

225 230 235 240

Gly Tyr Ala Gly Ala Asp Cys Ser Arg Glu Ile Cys Pro Val Pro Cys

245 250 255

Ser Glu Glu His Gly Thr Cys Val Asp Gly Leu Cys Val Cys His Asp

260 265 270

Gly Phe Ala Gly Asp Asp Cys Asn Lys Pro Leu Cys Leu Asn Asn Cys

275 280 285

Tyr Asn Arg Gly Arg Cys Val Glu Asn Glu Cys Val Cys Asp Glu Gly

290 295 300

Phe Thr Gly Glu Asp Cys Ser Glu Leu Ile Cys Pro Asn Asp Cys Phe

305 310 315 320

Asp Arg Gly Arg Cys Ile Asn Gly Thr Cys Tyr Cys Glu Glu Gly Phe

325 330 335

Thr Gly Glu Asp Cys Gly Lys Pro Thr Cys Pro His Ala Cys His Thr

340 345 350

Gln Gly Arg Cys Glu Glu Gly Gln Cys Val Cys Asp Glu Gly Phe Ala

355 360 365

Gly Val Asp Cys Ser Glu Lys Arg Cys Pro Ala Asp Cys His Asn Arg

370 375 380

Gly Arg Cys Val Asp Gly Arg Cys Glu Cys Asp Asp Gly Phe Thr Gly

385 390 395 400

Ala Asp Cys Gly Glu Leu Lys Cys Pro Asn Gly Cys Ser Gly His Gly

405 410 415

Arg Cys Val Asn Gly Gln Cys Val Cys Asp Glu Gly Tyr Thr Gly Glu

420 425 430

Asp Cys Ser Gln Leu Arg Cys Pro Asn Asp Cys His Ser Arg Gly Arg

435 440 445

Cys Val Glu Gly Lys Cys Val Cys Glu Gln Gly Phe Lys Gly Tyr Asp

450 455 460

Cys Ser Asp Met Ser Cys Pro Asn Asp Cys His Gln His Gly Arg Cys

465 470 475 480

Val Asn Gly Met Cys Val Cys Asp Asp Gly Tyr Thr Gly Glu Asp Cys

485 490 495

Arg Asp Arg Gln Cys Pro Arg Asp Cys Ser Asn Arg Gly Leu Cys Val

500 505 510

Asp Gly Gln Cys Val Cys Glu Asp Gly Phe Thr Gly Pro Asp Cys Ala

515 520 525

Glu Leu Ser Cys Pro Asn Asp Cys His Gly Gln Gly Arg Cys Val Asn

530 535 540

Gly Gln Cys Val Cys His Glu Gly Phe Met Gly Lys Asp Cys Lys Glu

545 550 555 560

Gln Arg Cys Pro Ser Asp Cys His Gly Gln Gly Arg Cys Val Asp Gly

565 570 575

Gln Cys Ile Cys His Glu Gly Phe Thr Gly Leu Asp Cys Gly Gln His

580 585 590

Ser Cys Pro Ser Asp Cys Asn Asn Leu Gly Gln Cys Val Ser Gly Arg

595 600 605

Cys Ile Cys Asn Glu Gly Tyr Ser Gly Glu Asp Cys Ser Glu Val Ser

610 615 620

Pro Pro Lys Asp Leu Val Val Thr Glu Val Thr Glu Glu Thr Val Asn

625 630 635 640

Leu Ala Trp Asp Asn Glu Met Arg Val Thr Glu Tyr Leu Val Val Tyr

645 650 655

Thr Pro Thr His Glu Gly Gly Leu Glu Met Gln Phe Arg Val Pro Gly

660 665 670

Asp Gln Thr Ser Thr Ile Ile Gln Glu Leu Glu Pro Gly Val Glu Tyr

675 680 685

Phe Ile Arg Val Phe Ala Ile Leu Glu Asn Lys Lys Ser Ile Pro Val

690 695 700

Ser Ala Arg Val Ala Thr Tyr Leu Pro Ala Pro Glu Gly Leu Lys Phe

705 710 715 720

Lys Ser Ile Lys Glu Thr Ser Val Glu Val Glu Trp Asp Pro Leu Asp

725 730 735

Ile Ala Phe Glu Thr Trp Glu Ile Ile Phe Arg Asn Met Asn Lys Glu

740 745 750

Asp Glu Gly Glu Ile Thr Lys Ser Leu Arg Arg Pro Glu Thr Ser Tyr

755 760 765

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770 775 780

Ile Val Lys Asn Asn Thr Arg Gly Pro Gly Leu Lys Arg Val Thr Thr

785 790 795 800

Thr Arg Leu Asp Ala Pro Ser Gln Ile Glu Val Lys Asp Val Thr Asp

805 810 815

Thr Thr Ala Leu Ile Thr Trp Phe Lys Pro Leu Ala Glu Ile Asp Gly

820 825 830

Ile Glu Leu Thr Tyr Gly Ile Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg Thr Thr

835 840 845

Ile Asp Leu Thr Glu Asp Glu Asn Gln Tyr Ser Ile Gly Asn Leu Lys

850 855 860

Pro Asp Thr Glu Tyr Glu Val Ser Leu Ile Ser Arg Arg Gly Asp Met

865 870 875 880

Ser Ser Asn Pro Ala Lys Glu Thr Phe Thr Thr Gly Leu Asp Ala Pro

885 890 895

Arg Asn Leu Arg Arg Val Ser Gln Thr Asp Asn Ser Ile Thr Leu Glu

900 905 910

Trp Arg Asn Gly Lys Ala Ala Ile Asp Ser Tyr Arg Ile Lys Tyr Ala

915 920 925

Pro Ile Ser Gly Gly Asp His Ala Glu Val Asp Val Pro Lys Ser Gln

930 935 940

Gln Ala Thr Thr Lys Thr Thr Leu Thr Gly Leu Arg Pro Gly Thr Glu

945 950 955 960

Tyr Gly Ile Gly Val Ser Ala Val Lys Glu Asp Lys Glu Ser Asn Pro

965 970 975

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980 985 990

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995 1000 1005

Leu Ala Lys Phe Asp Arg Tyr Arg Leu Asn Tyr Ser Leu Pro Thr

1010 1015 1020

Gly Gln Trp Val Gly Val Gln Leu Pro Arg Asn Thr Thr Ser Tyr

1025 1030 1035

Val Leu Arg Gly Leu Glu Pro Gly Gln Glu Tyr Asn Val Leu Leu

1040 1045 1050

Thr Ala Glu Lys Gly Arg His Lys Ser Lys Pro Ala Arg Val Lys

1055 1060 1065

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1070 1075 1080

Glu Val Gly Trp Asp Gly Leu Arg Leu Asn Trp Thr Ala Ala Asp

1085 1090 1095

Gln Ala Tyr Glu His Phe Ile Ile Gln Val Gln Glu Ala Asn Lys

1100 1105 1110

Val Glu Ala Ala Arg Asn Leu Thr Val Pro Gly Ser Leu Arg Ala

1115 1120 1125

Val Asp Ile Pro Gly Leu Lys Ala Ala Thr Pro Tyr Thr Val Ser

1130 1135 1140

Ile Tyr Gly Val Ile Gln Gly Tyr Arg Thr Pro Val Leu Ser Ala

1145 1150 1155

Glu Ala Ser Thr Gly Glu Thr Pro Asn Leu Gly Glu Val Val Val

1160 1165 1170

Ala Glu Val Gly Trp Asp Ala Leu Lys Leu Asn Trp Thr Ala Pro

1175 1180 1185

Glu Gly Ala Tyr Glu Tyr Phe Phe Ile Gln Val Gln Glu Ala Asp

1190 1195 1200

Thr Val Glu Ala Ala Gln Asn Leu Thr Val Pro Gly Gly Leu Arg

1205 1210 1215

Ser Thr Asp Leu Pro Gly Leu Lys Ala Ala Thr His Tyr Thr Ile

1220 1225 1230

Thr Ile Arg Gly Val Thr Gln Asp Phe Ser Thr Thr Pro Leu Ser

1235 1240 1245

Val Glu Val Leu Thr Glu Glu Val Pro Asp Met Gly Asn Leu Thr

1250 1255 1260

Val Thr Glu Val Ser Trp Asp Ala Leu Arg Leu Asn Trp Thr Thr

1265 1270 1275

Pro Asp Gly Thr Tyr Asp Gln Phe Thr Ile Gln Val Gln Glu Ala

1280 1285 1290

Asp Gln Val Glu Glu Ala His Asn Leu Thr Val Pro Gly Ser Leu

1295 1300 1305

Arg Ser Met Glu Ile Pro Gly Leu Arg Ala Gly Thr Pro Tyr Thr

1310 1315 1320

Val Thr Leu His Gly Glu Val Arg Gly His Ser Thr Arg Pro Leu

1325 1330 1335

Ala Val Glu Val Val Thr Glu Asp Leu Pro Gln Leu Gly Asp Leu

1340 1345 1350

Ala Val Ser Glu Val Gly Trp Asp Gly Leu Arg Leu Asn Trp Thr

1355 1360 1365

Ala Ala Asp Asn Ala Tyr Glu His Phe Val Ile Gln Val Gln Glu

1370 1375 1380

Val Asn Lys Val Glu Ala Ala Gln Asn Leu Thr Leu Pro Gly Ser

1385 1390 1395

Leu Arg Ala Val Asp Ile Pro Gly Leu Glu Ala Ala Thr Pro Tyr

1400 1405 1410

Arg Val Ser Ile Tyr Gly Val Ile Arg Gly Tyr Arg Thr Pro Val

1415 1420 1425

Leu Ser Ala Glu Ala Ser Thr Ala Lys Glu Pro Glu Ile Gly Asn

1430 1435 1440

Leu Asn Val Ser Asp Ile Thr Pro Glu Ser Phe Asn Leu Ser Trp

1445 1450 1455

Met Ala Thr Asp Gly Ile Phe Glu Thr Phe Thr Ile Glu Ile Ile

1460 1465 1470

Asp Ser Asn Arg Leu Leu Glu Thr Val Glu Tyr Asn Ile Ser Gly

1475 1480 1485

Ala Glu Arg Thr Ala His Ile Ser Gly Leu Pro Pro Ser Thr Asp

1490 1495 1500

Phe Ile Val Tyr Leu Ser Gly Leu Ala Pro Ser Ile Arg Thr Lys

1505 1510 1515

Thr Ile Ser Ala Thr Ala Thr Thr Glu Ala Leu Pro Leu Leu Glu

1520 1525 1530

Asn Leu Thr Ile Ser Asp Ile Asn Pro Tyr Gly Phe Thr Val Ser

1535 1540 1545

Trp Met Ala Ser Glu Asn Ala Phe Asp Ser Phe Leu Val Thr Val

1550 1555 1560

Val Asp Ser Gly Lys Leu Leu Asp Pro Gln Glu Phe Thr Leu Ser

1565 1570 1575

Gly Thr Gln Arg Lys Leu Glu Leu Arg Gly Leu Ile Thr Gly Ile

1580 1585 1590

Gly Tyr Glu Val Met Val Ser Gly Phe Thr Gln Gly His Gln Thr

1595 1600 1605

Lys Pro Leu Arg Ala Glu Ile Val Thr Glu Ala Glu Pro Glu Val

1610 1615 1620

Asp Asn Leu Leu Val Ser Asp Ala Thr Pro Asp Gly Phe Arg Leu

1625 1630 1635

Ser Trp Thr Ala Asp Glu Gly Val Phe Asp Asn Phe Val Leu Lys

1640 1645 1650

Ile Arg Asp Thr Lys Lys Gln Ser Glu Pro Leu Glu Ile Thr Leu

1655 1660 1665

Leu Ala Pro Glu Arg Thr Arg Asp Ile Thr Gly Leu Arg Glu Ala

1670 1675 1680

Thr Glu Tyr Glu Ile Glu Leu Tyr Gly Ile Ser Lys Gly Arg Arg

1685 1690 1695

Ser Gln Thr Val Ser Ala Ile Ala Thr Thr Ala Met Gly Ser Pro

1700 1705 1710

Lys Glu Val Ile Phe Ser Asp Ile Thr Glu Asn Ser Ala Thr Val

1715 1720 1725

Ser Trp Arg Ala Pro Thr Ala Gln Val Glu Ser Phe Arg Ile Thr

1730 1735 1740

Tyr Val Pro Ile Thr Gly Gly Thr Pro Ser Met Val Thr Val Asp

1745 1750 1755

Gly Thr Lys Thr Gln Thr Arg Leu Val Lys Leu Ile Pro Gly Val

1760 1765 1770

Glu Tyr Leu Val Ser Ile Ile Ala Met Lys Gly Phe Glu Glu Ser

1775 1780 1785

Glu Pro Val Ser Gly Ser Phe Thr Thr Ala Leu Asp Gly Pro Ser

1790 1795 1800

Gly Leu Val Thr Ala Asn Ile Thr Asp Ser Glu Ala Leu Ala Arg

1805 1810 1815

Trp Gln Pro Ala Ile Ala Thr Val Asp Ser Tyr Val Ile Ser Tyr

1820 1825 1830

Thr Gly Glu Lys Val Pro Glu Ile Thr Arg Thr Val Ser Gly Asn

1835 1840 1845

Thr Val Glu Tyr Ala Leu Thr Asp Leu Glu Pro Ala Thr Glu Tyr

1850 1855 1860

Thr Leu Arg Ile Phe Ala Glu Lys Gly Pro Gln Lys Ser Ser Thr

1865 1870 1875

Ile Thr Ala Lys Phe Thr Thr Asp Leu Asp Ser Pro Arg Asp Leu

1880 1885 1890

Thr Ala Thr Glu Val Gln Ser Glu Thr Ala Leu Leu Thr Trp Arg

1895 1900 1905

Pro Pro Arg Ala Ser Val Thr Gly Tyr Leu Leu Val Tyr Glu Ser

1910 1915 1920

Val Asp Gly Thr Val Lys Glu Val Ile Val Gly Pro Asp Thr Thr

1925 1930 1935

Ser Tyr Ser Leu Ala Asp Leu Ser Pro Ser Thr His Tyr Thr Ala

1940 1945 1950

Lys Ile Gln Ala Leu Asn Gly Pro Leu Arg Ser Asn Met Ile Gln

1955 1960 1965

Thr Ile Phe Thr Thr Ile Gly Leu Leu Tyr Pro Phe Pro Lys Asp

1970 1975 1980

Cys Ser Gln Ala Met Leu Asn Gly Asp Thr Thr Ser Gly Leu Tyr

1985 1990 1995

Thr Ile Tyr Leu Asn Gly Asp Lys Ala Glu Ala Leu Glu Val Phe

2000 2005 2010

Cys Asp Met Thr Ser Asp Gly Gly Gly Trp Ile Val Phe Leu Arg

2015 2020 2025

Arg Lys Asn Gly Arg Glu Asn Phe Tyr Gln Asn Trp Lys Ala Tyr

2030 2035 2040

Ala Ala Gly Phe Gly Asp Arg Arg Glu Glu Phe Trp Leu Gly Leu

2045 2050 2055

Asp Asn Leu Asn Lys Ile Thr Ala Gln Gly Gln Tyr Glu Leu Arg

2060 2065 2070

Val Asp Leu Arg Asp His Gly Glu Thr Ala Phe Ala Val Tyr Asp

2075 2080 2085

Lys Phe Ser Val Gly Asp Ala Lys Thr Arg Tyr Lys Leu Lys Val

2090 2095 2100

Glu Gly Tyr Ser Gly Thr Ala Gly Asp Ser Met Ala Tyr His Asn

2105 2110 2115

Gly Arg Ser Phe Ser Thr Phe Asp Lys Asp Thr Asp Ser Ala Ile

2120 2125 2130

Thr Asn Cys Ala Leu Ser Tyr Lys Gly Ala Phe Trp Tyr Arg Asn

2135 2140 2145

Cys His Arg Val Asn Leu Met Gly Arg Tyr Gly Asp Asn Asn His

2150 2155 2160

Ser Gln Gly Val Asn Trp Phe His Trp Lys Gly His Glu His Ser

2165 2170 2175

Ile Gln Phe Ala Glu Met Lys Leu Arg Pro Ser Asn Phe Arg Asn

2180 2185 2190

Leu Glu Gly Arg Arg Lys Arg Ala

2195 2200

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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Ser Tyr Ala Ile Ser

1 5

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser

1 5 10

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TnC(18D4) CDR-H2

<400> 42

Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

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<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TnC(11C7) CDR-H2

<400> 43

Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TnC(18D4) CDR-H3

<400> 44

Gly Asn Phe Tyr Gly Gly Leu Asp Tyr

1 5

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<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<400> 45

Thr Ser Pro Arg Val Pro Leu Asp Tyr

1 5

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<400> 46

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ala

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<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<400> 48

Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser

1 5

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<400> 49

Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser

1 5

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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Gln Gln Asn Lys Lys Phe Pro Ser Gly Thr

1 5 10

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<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TnC(11C7) CDR-L3

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Asn Ser Ile Asn Ser Thr Arg Asn Glu Val

1 5 10

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TnC(18D4) VH

<400> 52

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Gly Asn Phe Tyr Gly Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Val Thr Val Ser Ser

115

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<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<400> 53

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Lys Lys Phe Pro Ser

85 90 95

Gly Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 54

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<400> 54

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Thr Ser Pro Arg Val Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 55

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TnC(11C7) VL

<400> 55

Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln

1 5 10 15

Thr Val Arg Val Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala

20 25 30

Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr

35 40 45

Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Ile Asn Ser Thr Arg Asn Glu

85 90 95

Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 56

<211> 277

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 56

Met Cys Val Gly Ala Arg Arg Leu Gly Arg Gly Pro Cys Ala Ala Leu

1 5 10 15

Leu Leu Leu Gly Leu Gly Leu Ser Thr Val Thr Gly Leu His Cys Val

20 25 30

Gly Asp Thr Tyr Pro Ser Asn Asp Arg Cys Cys His Glu Cys Arg Pro

35 40 45

Gly Asn Gly Met Val Ser Arg Cys Ser Arg Ser Gln Asn Thr Val Cys

50 55 60

Arg Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Val Val Ser Ser Lys Pro

65 70 75 80

Cys Lys Pro Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly Ser Glu Arg Lys

85 90 95

Gln Leu Cys Thr Ala Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Ala Gly

100 105 110

Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val Asp Cys Ala Pro Cys

115 120 125

Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp

130 135 140

Thr Asn Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln Pro Ala Ser Asn

145 150 155 160

Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro Ala Thr Gln Pro

165 170 175

Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Ile Thr Val Gln Pro Thr

180 185 190

Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln Gly Pro Ser Thr Arg Pro Val Glu

195 200 205

Val Pro Gly Gly Arg Ala Val Ala Ala Ile Leu Gly Leu Gly Leu Val

210 215 220

Leu Gly Leu Leu Gly Pro Leu Ala Ile Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu

225 230 235 240

Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly

245 250 255

Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser

260 265 270

Thr Leu Ala Lys Ile

275

<210> 57

<211> 255

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 57

Met Gly Asn Ser Cys Tyr Asn Ile Val Ala Thr Leu Leu Leu Val Leu

1 5 10 15

Asn Phe Glu Arg Thr Arg Ser Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro

20 25 30

Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys

35 40 45

Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile

50 55 60

Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser

65 70 75 80

Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly

85 90 95

Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu

100 105 110

Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln

115 120 125

Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys

130 135 140

Ser Val Leu Val Asn Gly Thr Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro

145 150 155 160

Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala

165 170 175

Pro Ala Arg Glu Pro Gly His Ser Pro Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu

180 185 190

Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu

195 200 205

Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe

210 215 220

Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly

225 230 235 240

Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

245 250 255

<210> 58

<211> 260

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 58

Met Ala Arg Pro His Pro Trp Trp Leu Cys Val Leu Gly Thr Leu Val

1 5 10 15

Gly Leu Ser Ala Thr Pro Ala Pro Lys Ser Cys Pro Glu Arg His Tyr

20 25 30

Trp Ala Gln Gly Lys Leu Cys Cys Gln Met Cys Glu Pro Gly Thr Phe

35 40 45

Leu Val Lys Asp Cys Asp Gln His Arg Lys Ala Ala Gln Cys Asp Pro

50 55 60

Cys Ile Pro Gly Val Ser Phe Ser Pro Asp His His Thr Arg Pro His

65 70 75 80

Cys Glu Ser Cys Arg His Cys Asn Ser Gly Leu Leu Val Arg Asn Cys

85 90 95

Thr Ile Thr Ala Asn Ala Glu Cys Ala Cys Arg Asn Gly Trp Gln Cys

100 105 110

Arg Asp Lys Glu Cys Thr Glu Cys Asp Pro Leu Pro Asn Pro Ser Leu

115 120 125

Thr Ala Arg Ser Ser Gln Ala Leu Ser Pro His Pro Gln Pro Thr His

130 135 140

Leu Pro Tyr Val Ser Glu Met Leu Glu Ala Arg Thr Ala Gly His Met

145 150 155 160

Gln Thr Leu Ala Asp Phe Arg Gln Leu Pro Ala Arg Thr Leu Ser Thr

165 170 175

His Trp Pro Pro Gln Arg Ser Leu Cys Ser Ser Asp Phe Ile Arg Ile

180 185 190

Leu Val Ile Phe Ser Gly Met Phe Leu Val Phe Thr Leu Ala Gly Ala

195 200 205

Leu Phe Leu His Gln Arg Arg Lys Tyr Arg Ser Asn Lys Gly Glu Ser

210 215 220

Pro Val Glu Pro Ala Glu Pro Cys His Tyr Ser Cys Pro Arg Glu Glu

225 230 235 240

Glu Gly Ser Thr Ile Pro Ile Gln Glu Asp Tyr Arg Lys Pro Glu Pro

245 250 255

Ala Cys Ser Pro

260

<210> 59

<211> 283

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 59

Met Glu Pro Pro Gly Asp Trp Gly Pro Pro Pro Trp Arg Ser Thr Pro

1 5 10 15

Lys Thr Asp Val Leu Arg Leu Val Leu Tyr Leu Thr Phe Leu Gly Ala

20 25 30

Pro Cys Tyr Ala Pro Ala Leu Pro Ser Cys Lys Glu Asp Glu Tyr Pro

35 40 45

Val Gly Ser Glu Cys Cys Pro Lys Cys Ser Pro Gly Tyr Arg Val Lys

50 55 60

Glu Ala Cys Gly Glu Leu Thr Gly Thr Val Cys Glu Pro Cys Pro Pro

65 70 75 80

Gly Thr Tyr Ile Ala His Leu Asn Gly Leu Ser Lys Cys Leu Gln Cys

85 90 95

Gln Met Cys Asp Pro Ala Met Gly Leu Arg Ala Ser Arg Asn Cys Ser

100 105 110

Arg Thr Glu Asn Ala Val Cys Gly Cys Ser Pro Gly His Phe Cys Ile

115 120 125

Val Gln Asp Gly Asp His Cys Ala Ala Cys Arg Ala Tyr Ala Thr Ser

130 135 140

Ser Pro Gly Gln Arg Val Gln Lys Gly Gly Thr Glu Ser Gln Asp Thr

145 150 155 160

Leu Cys Gln Asn Cys Pro Pro Gly Thr Phe Ser Pro Asn Gly Thr Leu

165 170 175

Glu Glu Cys Gln His Gln Thr Lys Cys Ser Trp Leu Val Thr Lys Ala

180 185 190

Gly Ala Gly Thr Ser Ser Ser His Trp Val Trp Trp Phe Leu Ser Gly

195 200 205

Ser Leu Val Ile Val Ile Val Cys Ser Thr Val Gly Leu Ile Ile Cys

210 215 220

Val Lys Arg Arg Lys Pro Arg Gly Asp Val Val Lys Val Ile Val Ser

225 230 235 240

Val Gln Arg Lys Arg Gln Glu Ala Glu Gly Glu Ala Thr Val Ile Glu

245 250 255

Ala Leu Gln Ala Pro Pro Asp Val Thr Thr Val Ala Val Glu Glu Thr

260 265 270

Ile Pro Ser Phe Thr Gly Arg Ser Pro Asn His

275 280

<210> 60

<211> 595

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 60

Met Arg Val Leu Leu Ala Ala Leu Gly Leu Leu Phe Leu Gly Ala Leu

1 5 10 15

Arg Ala Phe Pro Gln Asp Arg Pro Phe Glu Asp Thr Cys His Gly Asn

20 25 30

Pro Ser His Tyr Tyr Asp Lys Ala Val Arg Arg Cys Cys Tyr Arg Cys

35 40 45

Pro Met Gly Leu Phe Pro Thr Gln Gln Cys Pro Gln Arg Pro Thr Asp

50 55 60

Cys Arg Lys Gln Cys Glu Pro Asp Tyr Tyr Leu Asp Glu Ala Asp Arg

65 70 75 80

Cys Thr Ala Cys Val Thr Cys Ser Arg Asp Asp Leu Val Glu Lys Thr

85 90 95

Pro Cys Ala Trp Asn Ser Ser Arg Val Cys Glu Cys Arg Pro Gly Met

100 105 110

Phe Cys Ser Thr Ser Ala Val Asn Ser Cys Ala Arg Cys Phe Phe His

115 120 125

Ser Val Cys Pro Ala Gly Met Ile Val Lys Phe Pro Gly Thr Ala Gln

130 135 140

Lys Asn Thr Val Cys Glu Pro Ala Ser Pro Gly Val Ser Pro Ala Cys

145 150 155 160

Ala Ser Pro Glu Asn Cys Lys Glu Pro Ser Ser Gly Thr Ile Pro Gln

165 170 175

Ala Lys Pro Thr Pro Val Ser Pro Ala Thr Ser Ser Ala Ser Thr Met

180 185 190

Pro Val Arg Gly Gly Thr Arg Leu Ala Gln Glu Ala Ala Ser Lys Leu

195 200 205

Thr Arg Ala Pro Asp Ser Pro Ser Ser Val Gly Arg Pro Ser Ser Asp

210 215 220

Pro Gly Leu Ser Pro Thr Gln Pro Cys Pro Glu Gly Ser Gly Asp Cys

225 230 235 240

Arg Lys Gln Cys Glu Pro Asp Tyr Tyr Leu Asp Glu Ala Gly Arg Cys

245 250 255

Thr Ala Cys Val Ser Cys Ser Arg Asp Asp Leu Val Glu Lys Thr Pro

260 265 270

Cys Ala Trp Asn Ser Ser Arg Thr Cys Glu Cys Arg Pro Gly Met Ile

275 280 285

Cys Ala Thr Ser Ala Thr Asn Ser Cys Ala Arg Cys Val Pro Tyr Pro

290 295 300

Ile Cys Ala Ala Glu Thr Val Thr Lys Pro Gln Asp Met Ala Glu Lys

305 310 315 320

Asp Thr Thr Phe Glu Ala Pro Pro Leu Gly Thr Gln Pro Asp Cys Asn

325 330 335

Pro Thr Pro Glu Asn Gly Glu Ala Pro Ala Ser Thr Ser Pro Thr Gln

340 345 350

Ser Leu Leu Val Asp Ser Gln Ala Ser Lys Thr Leu Pro Ile Pro Thr

355 360 365

Ser Ala Pro Val Ala Leu Ser Ser Thr Gly Lys Pro Val Leu Asp Ala

370 375 380

Gly Pro Val Leu Phe Trp Val Ile Leu Val Leu Val Val Val Val Gly

385 390 395 400

Ser Ser Ala Phe Leu Leu Cys His Arg Arg Ala Cys Arg Lys Arg Ile

405 410 415

Arg Gln Lys Leu His Leu Cys Tyr Pro Val Gln Thr Ser Gln Pro Lys

420 425 430

Leu Glu Leu Val Asp Ser Arg Pro Arg Arg Ser Ser Thr Gln Leu Arg

435 440 445

Ser Gly Ala Ser Val Thr Glu Pro Val Ala Glu Glu Arg Gly Leu Met

450 455 460

Ser Gln Pro Leu Met Glu Thr Cys His Ser Val Gly Ala Ala Tyr Leu

465 470 475 480

Glu Ser Leu Pro Leu Gln Asp Ala Ser Pro Ala Gly Gly Pro Ser Ser

485 490 495

Pro Arg Asp Leu Pro Glu Pro Arg Val Ser Thr Glu His Thr Asn Asn

500 505 510

Lys Ile Glu Lys Ile Tyr Ile Met Lys Ala Asp Thr Val Ile Val Gly

515 520 525

Thr Val Lys Ala Glu Leu Pro Glu Gly Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ala

530 535 540

Glu Pro Glu Leu Glu Glu Glu Leu Glu Ala Asp His Thr Pro His Tyr

545 550 555 560

Pro Glu Gln Glu Thr Glu Pro Pro Leu Gly Ser Cys Ser Asp Val Met

565 570 575

Leu Ser Val Glu Glu Glu Gly Lys Glu Asp Pro Leu Pro Thr Ala Ala

580 585 590

Ser Gly Lys

595

<210> 61

<211> 241

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 61

Met Ala Gln His Gly Ala Met Gly Ala Phe Arg Ala Leu Cys Gly Leu

1 5 10 15

Ala Leu Leu Cys Ala Leu Ser Leu Gly Gln Arg Pro Thr Gly Gly Pro

20 25 30

Gly Cys Gly Pro Gly Arg Leu Leu Leu Gly Thr Gly Thr Asp Ala Arg

35 40 45

Cys Cys Arg Val His Thr Thr Arg Cys Cys Arg Asp Tyr Pro Gly Glu

50 55 60

Glu Cys Cys Ser Glu Trp Asp Cys Met Cys Val Gln Pro Glu Phe His

65 70 75 80

Cys Gly Asp Pro Cys Cys Thr Thr Cys Arg His His Pro Cys Pro Pro

85 90 95

Gly Gln Gly Val Gln Ser Gln Gly Lys Phe Ser Phe Gly Phe Gln Cys

100 105 110

Ile Asp Cys Ala Ser Gly Thr Phe Ser Gly Gly His Glu Gly His Cys

115 120 125

Lys Pro Trp Thr Asp Cys Thr Gln Phe Gly Phe Leu Thr Val Phe Pro

130 135 140

Gly Asn Lys Thr His Asn Ala Val Cys Val Pro Gly Ser Pro Pro Ala

145 150 155 160

Glu Pro Leu Gly Trp Leu Thr Val Val Leu Leu Ala Val Ala Ala Cys

165 170 175

Val Leu Leu Leu Thr Ser Ala Gln Leu Gly Leu His Ile Trp Gln Leu

180 185 190

Arg Ser Gln Cys Met Trp Pro Arg Glu Thr Gln Leu Leu Leu Glu Val

195 200 205

Pro Pro Ser Thr Glu Asp Ala Arg Ser Cys Gln Phe Pro Glu Glu Glu

210 215 220

Arg Gly Glu Arg Ser Ala Glu Glu Lys Gly Arg Leu Gly Asp Leu Trp

225 230 235 240

Val

<210> 62

<211> 272

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 62

Met Tyr Val Trp Val Gln Gln Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Ala Leu

1 5 10 15

Thr Leu Gly Val Thr Ala Arg Arg Leu Asn Cys Val Lys His Thr Tyr

20 25 30

Pro Ser Gly His Lys Cys Cys Arg Glu Cys Gln Pro Gly His Gly Met

35 40 45

Val Ser Arg Cys Asp His Thr Arg Asp Thr Leu Cys His Pro Cys Glu

50 55 60

Thr Gly Phe Tyr Asn Glu Ala Val Asn Tyr Asp Thr Cys Lys Gln Cys

65 70 75 80

Thr Gln Cys Asn His Arg Ser Gly Ser Glu Leu Lys Gln Asn Cys Thr

85 90 95

Pro Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Pro Gly Thr Gln Pro Arg

100 105 110

Gln Asp Ser Gly Tyr Lys Leu Gly Val Asp Cys Val Pro Cys Pro Pro

115 120 125

Gly His Phe Ser Pro Gly Asn Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp Thr Asn

130 135 140

Cys Thr Leu Ser Gly Lys Gln Thr Arg His Pro Ala Ser Asp Ser Leu

145 150 155 160

Asp Ala Val Cys Glu Asp Arg Ser Leu Leu Ala Thr Leu Leu Trp Glu

165 170 175

Thr Gln Arg Pro Thr Phe Arg Pro Thr Thr Val Gln Ser Thr Thr Val

180 185 190

Trp Pro Arg Thr Ser Glu Leu Pro Ser Pro Pro Thr Leu Val Thr Pro

195 200 205

Glu Gly Pro Ala Phe Ala Val Leu Leu Gly Leu Gly Leu Gly Leu Leu

210 215 220

Ala Pro Leu Thr Val Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu Arg Lys Ala Trp

225 230 235 240

Arg Leu Pro Asn Thr Pro Lys Pro Cys Trp Gly Asn Ser Phe Arg Thr

245 250 255

Pro Ile Gln Glu Glu His Thr Asp Ala His Phe Thr Leu Ala Lys Ile

260 265 270

<210> 63

<211> 2110

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 63

Met Gly Ala Val Thr Trp Leu Leu Pro Gly Ile Phe Leu Ala Leu Phe

1 5 10 15

Ala Leu Thr Pro Glu Gly Gly Val Leu Lys Lys Ile Ile Arg His Lys

20 25 30

Arg Glu Ser Gly Leu Asn Met Thr Leu Pro Glu Glu Asn Gln Pro Val

35 40 45

Val Phe Asn His Ile Tyr Asn Ile Lys Leu Pro Met Gly Ser Gln Cys

50 55 60

Ser Val Asp Leu Glu Ser Ala Ser Gly Glu Lys Asp Leu Thr Pro Thr

65 70 75 80

Pro Glu Ser Ser Gly Ser Phe Gln Glu His Thr Val Asp Gly Glu Asn

85 90 95

Gln Ile Val Phe Thr His Arg Ile Asn Ile Pro Arg Arg Ala Cys Gly

100 105 110

Cys Ala Ala Ala Pro Asp Val Lys Glu Leu Leu Ser Arg Leu Glu Glu

115 120 125

Leu Glu Leu Leu Val Ser Ser Leu Arg Glu Gln Cys Thr Met Gly Thr

130 135 140

Gly Cys Cys Leu Gln Pro Ala Glu Gly Arg Leu Asp Thr Arg Pro Phe

145 150 155 160

Cys Ser Gly Arg Gly Asn Phe Ser Ala Glu Gly Cys Gly Cys Val Cys

165 170 175

Glu Pro Gly Trp Lys Gly Pro Asn Cys Ser Glu Pro Asp Cys Pro Gly

180 185 190

Asn Cys Asn Leu Arg Gly Gln Cys Leu Asp Gly Gln Cys Ile Cys Asp

195 200 205

Glu Gly Phe Thr Gly Glu Asp Cys Ser Gln Leu Ala Cys Pro Asn Asp

210 215 220

Cys Asn Asp Gln Gly Arg Cys Val Asn Gly Val Cys Val Cys Phe Glu

225 230 235 240

Gly Tyr Ala Gly Pro Asp Cys Gly Leu Glu Val Cys Pro Val Pro Cys

245 250 255

Ser Glu Glu His Gly Met Cys Val Asp Gly Arg Cys Val Cys Lys Asp

260 265 270

Gly Phe Ala Gly Glu Asp Cys Asn Glu Pro Leu Cys Leu Asn Asn Cys

275 280 285

Tyr Asn Arg Gly Arg Cys Val Glu Asn Glu Cys Val Cys Asp Glu Gly

290 295 300

Phe Thr Gly Glu Asp Cys Ser Glu Leu Ile Cys Pro Asn Asp Cys Phe

305 310 315 320

Asp Arg Gly Arg Cys Ile Asn Gly Thr Cys Tyr Cys Glu Glu Gly Phe

325 330 335

Thr Gly Glu Asp Cys Gly Glu Leu Thr Cys Pro Asn Asp Cys Gln Gly

340 345 350

Arg Gly Gln Cys Glu Glu Gly Gln Cys Val Cys Asn Glu Gly Phe Ala

355 360 365

Gly Ala Asp Cys Ser Glu Lys Arg Cys Pro Ala Asp Cys His His Arg

370 375 380

Gly Arg Cys Leu Asn Gly Gln Cys Glu Cys Asp Asp Gly Phe Thr Gly

385 390 395 400

Ala Asp Cys Gly Asp Leu Gln Cys Pro Asn Gly Cys Ser Gly His Gly

405 410 415

Arg Cys Val Asn Gly Gln Cys Val Cys Asp Glu Gly Tyr Thr Gly Glu

420 425 430

Asp Cys Ser Gln Arg Arg Cys Pro Asn Asp Cys His Asn Arg Gly Leu

435 440 445

Cys Val Gln Gly Lys Cys Ile Cys Glu Gln Gly Phe Lys Gly Phe Asp

450 455 460

Cys Ser Glu Met Ser Cys Pro Asn Asp Cys His Gln His Gly Arg Cys

465 470 475 480

Val Asn Gly Met Cys Ile Cys Asp Asp Asp Tyr Thr Gly Glu Asp Cys

485 490 495

Arg Asp Arg Arg Cys Pro Arg Asp Cys Ser Gln Arg Gly Arg Cys Val

500 505 510

Asp Gly Gln Cys Ile Cys Glu Asp Gly Phe Thr Gly Pro Asp Cys Ala

515 520 525

Glu Leu Ser Cys Pro Ser Asp Cys His Gly His Gly Arg Cys Val Asn

530 535 540

Gly Gln Cys Ile Cys His Glu Gly Phe Thr Gly Lys Asp Cys Lys Glu

545 550 555 560

Gln Arg Cys Pro Ser Asp Cys His Gly Gln Gly Arg Cys Glu Asp Gly

565 570 575

Gln Cys Ile Cys His Glu Gly Phe Thr Gly Leu Asp Cys Gly Gln Arg

580 585 590

Ser Cys Pro Asn Asp Cys Ser Asn Gln Gly Gln Cys Val Ser Gly Arg

595 600 605

Cys Ile Cys Asn Glu Gly Tyr Thr Gly Ile Asp Cys Ser Glu Val Ser

610 615 620

Pro Pro Lys Asp Leu Ile Val Thr Glu Val Thr Glu Glu Thr Val Asn

625 630 635 640

Leu Ala Trp Asp Asn Glu Met Arg Val Thr Glu Tyr Leu Ile Met Tyr

645 650 655

Thr Pro Thr His Ala Asp Gly Leu Glu Met Gln Phe Arg Val Pro Gly

660 665 670

Asp Gln Thr Ser Thr Thr Ile Arg Glu Leu Glu Pro Gly Val Glu Tyr

675 680 685

Phe Ile Arg Val Phe Ala Ile Leu Glu Asn Lys Arg Ser Ile Pro Val

690 695 700

Ser Ala Arg Val Ala Thr Tyr Leu Pro Ala Pro Glu Gly Leu Lys Phe

705 710 715 720

Lys Ser Ile Lys Glu Thr Ser Val Glu Val Glu Trp Asp Pro Leu Asp

725 730 735

Ile Ala Phe Glu Thr Trp Glu Ile Ile Phe Arg Asn Met Asn Lys Glu

740 745 750

Asp Glu Gly Glu Ile Thr Lys Ser Leu Arg Arg Pro Glu Thr Ser Tyr

755 760 765

Arg Gln Thr Gly Leu Ala Pro Gly Gln Glu Tyr Glu Ile Ser Leu His

770 775 780

Ile Val Lys Asn Asn Thr Arg Gly Pro Gly Leu Lys Lys Val Thr Thr

785 790 795 800

Thr Arg Leu Asp Ala Pro Ser His Ile Glu Val Lys Asp Val Thr Asp

805 810 815

Thr Thr Ala Leu Ile Thr Trp Phe Lys Pro Leu Ala Glu Ile Asp Ser

820 825 830

Ile Glu Leu Ser Tyr Gly Ile Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg Thr Thr

835 840 845

Ile Asp Leu Thr His Glu Asp Asn Gln Tyr Ser Ile Gly Asn Leu Arg

850 855 860

Pro Asp Thr Glu Tyr Glu Val Ser Leu Ile Ser Arg Arg Val Asp Met

865 870 875 880

Ala Ser Asn Pro Ala Lys Glu Thr Phe Ile Thr Gly Leu Asp Ala Pro

885 890 895

Arg Asn Leu Arg Arg Val Ser Gln Thr Asp Asn Ser Ile Thr Leu Glu

900 905 910

Trp Arg Asn Val Lys Ala Asp Ile Asp Ser Tyr Arg Ile Lys Tyr Ala

915 920 925

Pro Ile Ser Gly Gly Asp His Ala Glu Ile Asp Val Pro Lys Ser Gln

930 935 940

Gln Ala Thr Thr Lys Thr Thr Leu Thr Gly Leu Arg Pro Gly Thr Glu

945 950 955 960

Tyr Gly Ile Gly Val Ser Ala Val Lys Gly Asp Lys Glu Ser Asp Pro

965 970 975

Ala Thr Ile Asn Ala Ala Thr Glu Ile Asp Ala Pro Lys Asp Leu Arg

980 985 990

Val Ser Glu Thr Thr Gln Asp Ser Leu Thr Phe Phe Trp Thr Thr Pro

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Leu Ala Lys Phe Asp Arg Tyr Arg Leu Asn Tyr Ser Leu Pro Thr

1010 1015 1020

Gly Gln Ser Met Glu Val Gln Leu Pro Lys Asp Ala Thr Ser His

1025 1030 1035

Val Leu Thr Asp Leu Glu Pro Gly Gln Glu Tyr Thr Val Leu Leu

1040 1045 1050

Ile Ala Glu Lys Gly Arg His Lys Ser Lys Pro Ala Arg Val Lys

1055 1060 1065

Ala Ser Thr Glu Glu Val Pro Ser Leu Glu Asn Leu Thr Val Thr

1070 1075 1080

Glu Ala Gly Trp Asp Gly Leu Arg Leu Asn Trp Thr Ala Asp Asp

1085 1090 1095

Leu Ala Tyr Glu Tyr Phe Val Ile Gln Val Gln Glu Ala Asn Asn

1100 1105 1110

Val Glu Thr Ala His Asn Phe Thr Val Pro Gly Asn Leu Arg Ala

1115 1120 1125

Ala Asp Ile Pro Gly Leu Lys Val Ala Thr Ser Tyr Arg Val Ser

1130 1135 1140

Ile Tyr Gly Val Ala Arg Gly Tyr Arg Thr Pro Val Leu Ser Ala

1145 1150 1155

Glu Thr Ser Thr Gly Thr Thr Pro Asn Leu Gly Glu Val Thr Val

1160 1165 1170

Ala Glu Val Gly Trp Asp Ala Leu Thr Leu Asn Trp Thr Ala Pro

1175 1180 1185

Glu Gly Ala Tyr Lys Asn Phe Phe Ile Gln Val Leu Glu Ala Asp

1190 1195 1200

Thr Thr Gln Thr Val Gln Asn Leu Thr Val Pro Gly Gly Leu Arg

1205 1210 1215

Ser Val Asp Leu Pro Gly Leu Lys Ala Ala Thr Arg Tyr Tyr Ile

1220 1225 1230

Thr Leu Arg Gly Val Thr Gln Asp Phe Gly Thr Ala Pro Leu Ser

1235 1240 1245

Val Glu Val Leu Thr Glu Asp Leu Pro Gln Leu Gly Gly Leu Ser

1250 1255 1260

Val Thr Glu Val Ser Trp Asp Gly Leu Thr Leu Asn Trp Thr Thr

1265 1270 1275

Asp Asp Leu Ala Tyr Lys His Phe Val Val Gln Val Gln Glu Ala

1280 1285 1290

Asn Asn Val Glu Ala Ala Gln Asn Leu Thr Val Pro Gly Ser Leu

1295 1300 1305

Arg Ala Val Asp Ile Pro Gly Leu Lys Ala Asp Thr Pro Tyr Arg

1310 1315 1320

Val Ser Ile Tyr Gly Val Ile Gln Gly Tyr Arg Thr Pro Met Leu

1325 1330 1335

Ser Thr Asp Val Ser Thr Ala Arg Glu Pro Glu Ile Gly Asn Leu

1340 1345 1350

Asn Val Ser Asp Val Thr Pro Lys Ser Phe Asn Leu Ser Trp Thr

1355 1360 1365

Ala Thr Asp Gly Ile Phe Asp Met Phe Thr Ile Glu Ile Ile Asp

1370 1375 1380

Ser Asn Arg Leu Leu Gln Thr Ala Glu His Asn Ile Ser Gly Ala

1385 1390 1395

Glu Arg Thr Ala His Ile Ser Gly Leu Pro Pro Ser Thr Asp Phe

1400 1405 1410

Ile Val Tyr Leu Ser Gly Ile Ala Pro Ser Ile Arg Thr Lys Thr

1415 1420 1425

Ile Ser Thr Thr Ala Thr Thr Glu Ala Leu Pro Leu Leu Glu Asn

1430 1435 1440

Leu Thr Ile Ser Asp Thr Asn Pro Tyr Gly Phe Thr Val Ser Trp

1445 1450 1455

Thr Ala Ser Glu Asn Ala Phe Asp Ser Phe Leu Val Thr Val Val

1460 1465 1470

Asp Ser Gly Lys Leu Leu Asp Pro Gln Glu Phe Thr Leu Ser Gly

1475 1480 1485

Thr Gln Arg Lys Leu Glu Leu Arg Gly Leu Ile Thr Gly Ile Gly

1490 1495 1500

Tyr Glu Val Leu Val Ser Gly Phe Thr Gln Gly His Gln Thr Lys

1505 1510 1515

Pro Leu Arg Ala Glu Thr Ile Thr Glu Ala Glu Pro Glu Val Asp

1520 1525 1530

Asn Leu Leu Val Ser Asp Ala Thr Pro Asp Gly Phe Arg Leu Ser

1535 1540 1545

Trp Thr Ala Asp Glu Gly Ile Phe Asp Ser Phe Val Ile Arg Ile

1550 1555 1560

Arg Asp Thr Lys Lys Gln Ser Glu Pro Gln Glu Ile Ser Leu Pro

1565 1570 1575

Ser Pro Glu Arg Thr Arg Asp Ile Thr Gly Leu Arg Glu Ala Thr

1580 1585 1590

Glu Tyr Glu Ile Glu Leu Tyr Gly Ile Ser Arg Gly Arg Arg Ser

1595 1600 1605

Gln Pro Val Ser Ala Ile Ala Thr Thr Ala Met Gly Ser Pro Lys

1610 1615 1620

Glu Ile Met Phe Ser Asp Ile Thr Glu Asn Ala Ala Thr Val Ser

1625 1630 1635

Trp Arg Ala Pro Thr Ala Gln Val Glu Ser Phe Arg Ile Thr Tyr

1640 1645 1650

Val Pro Met Thr Gly Gly Ala Pro Ser Met Val Thr Val Asp Gly

1655 1660 1665

Thr Asp Thr Glu Thr Arg Leu Val Lys Leu Thr Pro Gly Val Glu

1670 1675 1680

Tyr Arg Val Ser Val Ile Ala Met Lys Gly Phe Glu Glu Ser Asp

1685 1690 1695

Pro Val Ser Gly Thr Leu Ile Thr Ala Leu Asp Gly Pro Ser Gly

1700 1705 1710

Leu Leu Ile Ala Asn Ile Thr Asp Ser Glu Ala Leu Ala Met Trp

1715 1720 1725

Gln Pro Ala Ile Ala Thr Val Asp Ser Tyr Val Ile Ser Tyr Thr

1730 1735 1740

Gly Glu Arg Val Pro Glu Val Thr Arg Thr Val Ser Gly Asn Thr

1745 1750 1755

Val Glu Tyr Glu Leu His Asp Leu Glu Pro Ala Thr Glu Tyr Ile

1760 1765 1770

Leu Ser Ile Phe Ala Glu Lys Gly Gln Gln Lys Ser Ser Thr Ile

1775 1780 1785

Ala Thr Lys Phe Thr Thr Asp Leu Asp Ser Pro Arg Glu Phe Thr

1790 1795 1800

Ala Thr Glu Val Gln Ser Glu Thr Ala Leu Leu Thr Trp Arg Pro

1805 1810 1815

Pro Arg Ala Ser Val Thr Gly Tyr Leu Leu Val Tyr Glu Ser Val

1820 1825 1830

Asp Gly Thr Val Lys Glu Val Ile Val Gly Pro Asp Thr Thr Ser

1835 1840 1845

Tyr Ser Leu Ala Asp Leu Ser Pro Ser Thr His Tyr Ser Ala Arg

1850 1855 1860

Ile Gln Ala Leu Ser Gly Ser Leu Arg Ser Lys Leu Ile Gln Thr

1865 1870 1875

Ile Phe Thr Thr Ile Gly Leu Leu Tyr Pro Phe Pro Arg Asp Cys

1880 1885 1890

Ser Gln Ala Met Leu Asn Gly Asp Thr Thr Ser Gly Leu Tyr Thr

1895 1900 1905

Ile Tyr Ile Asn Gly Asp Lys Thr Gln Ala Leu Glu Val Tyr Cys

1910 1915 1920

Asp Met Thr Ser Asp Gly Gly Gly Trp Ile Val Phe Leu Arg Arg

1925 1930 1935

Lys Asn Gly Arg Glu Asp Phe Tyr Arg Asn Trp Lys Ala Tyr Ala

1940 1945 1950

Ala Gly Phe Gly Asp Arg Arg Glu Glu Phe Trp Leu Gly Leu Asp

1955 1960 1965

Asn Leu Ser Lys Ile Thr Ala Gln Gly Gln Tyr Glu Leu Arg Val

1970 1975 1980

Asp Leu Gln Asp His Gly Glu Ser Ala Tyr Ala Val Tyr Asp Arg

1985 1990 1995

Phe Ser Val Gly Asp Ala Lys Ser Arg Tyr Lys Leu Lys Val Glu

2000 2005 2010

Gly Tyr Ser Gly Thr Ala Gly Asp Ser Met Asn Tyr His Asn Gly

2015 2020 2025

Arg Ser Phe Ser Thr Tyr Asp Lys Asp Thr Asp Ser Ala Ile Thr

2030 2035 2040

Asn Cys Ala Leu Ser Tyr Lys Gly Ala Phe Trp Tyr Lys Asn Cys

2045 2050 2055

His Arg Val Asn Leu Met Gly Arg Tyr Gly Asp Asn Asn His Ser

2060 2065 2070

Gln Gly Val Asn Trp Phe His Trp Lys Gly His Glu Tyr Ser Ile

2075 2080 2085

Gln Phe Ala Glu Met Lys Leu Arg Pro Ser Asn Phe Arg Asn Leu

2090 2095 2100

Glu Gly Arg Arg Lys Arg Ala

2105 2110

<210> 64

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽接头G4S

<400> 64

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 65

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽接头(G4S)2

<400> 65

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10

<210> 66

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽接头(SG4)2

<400> 66

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

1 5 10

<210> 67

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽接头(G4S)3

<400> 67

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 68

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽接头G4(SG4)2

<400> 68

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

1 5 10

<210> 69

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽接头(G4S)4

<400> 69

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser

20

<210> 70

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽接头GSPGSSSSGS

<400> 70

Gly Ser Pro Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser

1 5 10

<210> 71

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽接头GSGSGSGS

<400> 71

Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser

1 5

<210> 72

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽接头GSGSGNGS

<400> 72

Gly Ser Gly Ser Gly Asn Gly Ser

1 5

<210> 73

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽接头GGSGSGSG

<400> 73

Gly Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly

1 5

<210> 74

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽接头GGSGSG

<400> 74

Gly Gly Ser Gly Ser Gly

1 5

<210> 75

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽接头GGSG

<400> 75

Gly Gly Ser Gly

1

<210> 76

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽接头GGSGNGSG

<400> 76

Gly Gly Ser Gly Asn Gly Ser Gly

1 5

<210> 77

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽接头GGNGSGSG

<400> 77

Gly Gly Asn Gly Ser Gly Ser Gly

1 5

<210> 78

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽接头GGNGSG

<400> 78

Gly Gly Asn Gly Ser Gly

1 5

<210> 79

<211> 186

<212> PRT

<213> 食蟹猴（cynomolgus）

<400> 79

Leu His Cys Val Gly Asp Thr Tyr Pro Ser Asn Asp Arg Cys Cys Gln

1 5 10 15

Glu Cys Arg Pro Gly Asn Gly Met Val Ser Arg Cys Asn Arg Ser Gln

20 25 30

Asn Thr Val Cys Arg Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Val Val

35 40 45

Ser Ala Lys Pro Cys Lys Ala Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly

50 55 60

Ser Glu Arg Lys Gln Pro Cys Thr Ala Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg

65 70 75 80

Cys Arg Ala Gly Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val Asp

85 90 95

Cys Ala Pro Cys Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala

100 105 110

Cys Lys Pro Trp Thr Asn Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln

115 120 125

Pro Ala Ser Asn Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro

130 135 140

Pro Thr Gln Pro Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Thr Thr

145 150 155 160

Val Gln Pro Thr Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln Arg Pro Ser Thr

165 170 175

Arg Pro Val Glu Val Pro Arg Gly Pro Ala

180 185

<210> 80

<211> 192

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 80

Val Thr Ala Arg Arg Leu Asn Cys Val Lys His Thr Tyr Pro Ser Gly

1 5 10 15

His Lys Cys Cys Arg Glu Cys Gln Pro Gly His Gly Met Val Ser Arg

20 25 30

Cys Asp His Thr Arg Asp Thr Leu Cys His Pro Cys Glu Thr Gly Phe

35 40 45

Tyr Asn Glu Ala Val Asn Tyr Asp Thr Cys Lys Gln Cys Thr Gln Cys

50 55 60

Asn His Arg Ser Gly Ser Glu Leu Lys Gln Asn Cys Thr Pro Thr Gln

65 70 75 80

Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Pro Gly Thr Gln Pro Arg Gln Asp Ser

85 90 95

Gly Tyr Lys Leu Gly Val Asp Cys Val Pro Cys Pro Pro Gly His Phe

100 105 110

Ser Pro Gly Asn Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp Thr Asn Cys Thr Leu

115 120 125

Ser Gly Lys Gln Thr Arg His Pro Ala Ser Asp Ser Leu Asp Ala Val

130 135 140

Cys Glu Asp Arg Ser Leu Leu Ala Thr Leu Leu Trp Glu Thr Gln Arg

145 150 155 160

Pro Thr Phe Arg Pro Thr Thr Val Gln Ser Thr Thr Val Trp Pro Arg

165 170 175

Thr Ser Glu Leu Pro Ser Pro Pro Thr Leu Val Thr Pro Glu Gly Pro

180 185 190

<210> 81

<211> 760

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 81

Met Lys Thr Trp Val Lys Ile Val Phe Gly Val Ala Thr Ser Ala Val

1 5 10 15

Leu Ala Leu Leu Val Met Cys Ile Val Leu Arg Pro Ser Arg Val His

20 25 30

Asn Ser Glu Glu Asn Thr Met Arg Ala Leu Thr Leu Lys Asp Ile Leu

35 40 45

Asn Gly Thr Phe Ser Tyr Lys Thr Phe Phe Pro Asn Trp Ile Ser Gly

50 55 60

Gln Glu Tyr Leu His Gln Ser Ala Asp Asn Asn Ile Val Leu Tyr Asn

65 70 75 80

Ile Glu Thr Gly Gln Ser Tyr Thr Ile Leu Ser Asn Arg Thr Met Lys

85 90 95

Ser Val Asn Ala Ser Asn Tyr Gly Leu Ser Pro Asp Arg Gln Phe Val

100 105 110

Tyr Leu Glu Ser Asp Tyr Ser Lys Leu Trp Arg Tyr Ser Tyr Thr Ala

115 120 125

Thr Tyr Tyr Ile Tyr Asp Leu Ser Asn Gly Glu Phe Val Arg Gly Asn

130 135 140

Glu Leu Pro Arg Pro Ile Gln Tyr Leu Cys Trp Ser Pro Val Gly Ser

145 150 155 160

Lys Leu Ala Tyr Val Tyr Gln Asn Asn Ile Tyr Leu Lys Gln Arg Pro

165 170 175

Gly Asp Pro Pro Phe Gln Ile Thr Phe Asn Gly Arg Glu Asn Lys Ile

180 185 190

Phe Asn Gly Ile Pro Asp Trp Val Tyr Glu Glu Glu Met Leu Ala Thr

195 200 205

Lys Tyr Ala Leu Trp Trp Ser Pro Asn Gly Lys Phe Leu Ala Tyr Ala

210 215 220

Glu Phe Asn Asp Thr Asp Ile Pro Val Ile Ala Tyr Ser Tyr Tyr Gly

225 230 235 240

Asp Glu Gln Tyr Pro Arg Thr Ile Asn Ile Pro Tyr Pro Lys Ala Gly

245 250 255

Ala Lys Asn Pro Val Val Arg Ile Phe Ile Ile Asp Thr Thr Tyr Pro

260 265 270

Ala Tyr Val Gly Pro Gln Glu Val Pro Val Pro Ala Met Ile Ala Ser

275 280 285

Ser Asp Tyr Tyr Phe Ser Trp Leu Thr Trp Val Thr Asp Glu Arg Val

290 295 300

Cys Leu Gln Trp Leu Lys Arg Val Gln Asn Val Ser Val Leu Ser Ile

305 310 315 320

Cys Asp Phe Arg Glu Asp Trp Gln Thr Trp Asp Cys Pro Lys Thr Gln

325 330 335

Glu His Ile Glu Glu Ser Arg Thr Gly Trp Ala Gly Gly Phe Phe Val

340 345 350

Ser Thr Pro Val Phe Ser Tyr Asp Ala Ile Ser Tyr Tyr Lys Ile Phe

355 360 365

Ser Asp Lys Asp Gly Tyr Lys His Ile His Tyr Ile Lys Asp Thr Val

370 375 380

Glu Asn Ala Ile Gln Ile Thr Ser Gly Lys Trp Glu Ala Ile Asn Ile

385 390 395 400

Phe Arg Val Thr Gln Asp Ser Leu Phe Tyr Ser Ser Asn Glu Phe Glu

405 410 415

Glu Tyr Pro Gly Arg Arg Asn Ile Tyr Arg Ile Ser Ile Gly Ser Tyr

420 425 430

Pro Pro Ser Lys Lys Cys Val Thr Cys His Leu Arg Lys Glu Arg Cys

435 440 445

Gln Tyr Tyr Thr Ala Ser Phe Ser Asp Tyr Ala Lys Tyr Tyr Ala Leu

450 455 460

Val Cys Tyr Gly Pro Gly Ile Pro Ile Ser Thr Leu His Asp Gly Arg

465 470 475 480

Thr Asp Gln Glu Ile Lys Ile Leu Glu Glu Asn Lys Glu Leu Glu Asn

485 490 495

Ala Leu Lys Asn Ile Gln Leu Pro Lys Glu Glu Ile Lys Lys Leu Glu

500 505 510

Val Asp Glu Ile Thr Leu Trp Tyr Lys Met Ile Leu Pro Pro Gln Phe

515 520 525

Asp Arg Ser Lys Lys Tyr Pro Leu Leu Ile Gln Val Tyr Gly Gly Pro

530 535 540

Cys Ser Gln Ser Val Arg Ser Val Phe Ala Val Asn Trp Ile Ser Tyr

545 550 555 560

Leu Ala Ser Lys Glu Gly Met Val Ile Ala Leu Val Asp Gly Arg Gly

565 570 575

Thr Ala Phe Gln Gly Asp Lys Leu Leu Tyr Ala Val Tyr Arg Lys Leu

580 585 590

Gly Val Tyr Glu Val Glu Asp Gln Ile Thr Ala Val Arg Lys Phe Ile

595 600 605

Glu Met Gly Phe Ile Asp Glu Lys Arg Ile Ala Ile Trp Gly Trp Ser

610 615 620

Tyr Gly Gly Tyr Val Ser Ser Leu Ala Leu Ala Ser Gly Thr Gly Leu

625 630 635 640

Phe Lys Cys Gly Ile Ala Val Ala Pro Val Ser Ser Trp Glu Tyr Tyr

645 650 655

Ala Ser Val Tyr Thr Glu Arg Phe Met Gly Leu Pro Thr Lys Asp Asp

660 665 670

Asn Leu Glu His Tyr Lys Asn Ser Thr Val Met Ala Arg Ala Glu Tyr

675 680 685

Phe Arg Asn Val Asp Tyr Leu Leu Ile His Gly Thr Ala Asp Asp Asn

690 695 700

Val His Phe Gln Asn Ser Ala Gln Ile Ala Lys Ala Leu Val Asn Ala

705 710 715 720

Gln Val Asp Phe Gln Ala Met Trp Tyr Ser Asp Gln Asn His Gly Leu

725 730 735

Ser Gly Leu Ser Thr Asn His Leu Tyr Thr His Met Thr His Phe Leu

740 745 750

Lys Gln Cys Phe Ser Leu Ser Asp

755 760

<210> 82

<211> 681

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 核苷酸序列Fc穴链

<400> 82

gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 60

ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 120

tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 180

ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 240

cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 300

tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 360

gggcagcccc gagaaccaca ggtgtgcacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 420

aaccaggtca gcctctcgtg cgcagtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 480

tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 540

gacggctcct tcttcctcgt gagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 600

aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 660

ctctccctgt ctccgggtaa a 681

<210> 83

<211> 1335

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 核苷酸序列人OX40抗原Fc节链

<400> 83

ctgcactgcg tgggcgacac ctaccccagc aacgaccggt gctgccacga gtgcagaccc 60

ggcaacggca tggtgtcccg gtgcagccgg tcccagaaca ccgtgtgcag accttgcggc 120

cctggcttct acaacgacgt ggtgtccagc aagccctgca agccttgtac ctggtgcaac 180

ctgcggagcg gcagcgagcg gaagcagctg tgtaccgcca cccaggatac cgtgtgccgg 240

tgtagagccg gcacccagcc cctggacagc tacaaacccg gcgtggactg cgccccttgc 300

cctcctggcc acttcagccc tggcgacaac caggcctgca agccttggac caactgcacc 360

ctggccggca agcacaccct gcagcccgcc agcaatagca gcgacgccat ctgcgaggac 420

cgggatcctc ctgccaccca gcctcaggaa acccagggcc ctcccgccag acccatcacc 480

gtgcagccta cagaggcctg gcccagaacc agccaggggc ctagcaccag acccgtggaa 540

gtgcctggcg gcagagccgt cgacgaacag ttatattttc agggcggctc acccaaatct 600

gcagacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 660

gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 720

acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 780

gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 840

taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 900

aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 960

aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catgccggga tgagctgacc 1020

aagaaccagg tcagcctgtg gtgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 1080

gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1140

tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1200

gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1260

agcctctccc tgtctccggg taaatccgga ggcctgaacg acatcttcga ggcccagaag 1320

attgaatggc acgag 1335

<210> 84

<211> 1335

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 核苷酸序列食蟹猴OX40抗原Fc节链

<400> 84

ctccactgtg tcggggacac ctaccccagc aacgaccggt gctgtcagga gtgcaggcca 60

ggcaacggga tggtgagccg ctgcaaccgc tcccagaaca cggtgtgccg tccgtgcggg 120

cccggcttct acaacgacgt ggtcagcgcc aagccctgca aggcctgcac atggtgcaac 180

ctcagaagtg ggagtgagcg gaaacagccg tgcacggcca cacaggacac agtctgccgc 240

tgccgggcgg gcacccagcc cctggacagc tacaagcctg gagttgactg tgccccctgc 300

cctccagggc acttctcccc gggcgacaac caggcctgca agccctggac caactgcacc 360

ttggccggga agcacaccct gcagccagcc agcaatagct cggacgccat ctgtgaggac 420

agggaccccc cacccacaca gccccaggag acccagggcc ccccggccag gcccaccact 480

gtccagccca ctgaagcctg gcccagaacc tcacagagac cctccacccg gcccgtggag 540

gtccccaggg gccctgcggt cgacgaacag ttatattttc agggcggctc acccaaatct 600

gcagacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 660

gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 720

acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 780

gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 840

taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 900

aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 960

aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catgccggga tgagctgacc 1020

aagaaccagg tcagcctgtg gtgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 1080

gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1140

tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1200

gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1260

agcctctccc tgtctccggg taaatccgga ggcctgaacg acatcttcga ggcccagaag 1320

attgaatggc acgag 1335

<210> 85

<211> 1353

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 核苷酸序列鼠OX40抗原Fc节链

<400> 85

gtgaccgcca gacggctgaa ctgcgtgaag cacacctacc ccagcggcca caagtgctgc 60

agagagtgcc agcccggcca cggcatggtg tccagatgcg accacacacg ggacaccctg 120

tgccaccctt gcgagacagg cttctacaac gaggccgtga actacgatac ctgcaagcag 180

tgcacccagt gcaaccacag aagcggcagc gagctgaagc agaactgcac ccccacccag 240

gataccgtgt gcagatgcag acccggcacc cagcccagac aggacagcgg ctacaagctg 300

ggcgtggact gcgtgccctg ccctcctggc cacttcagcc ccggcaacaa ccaggcctgc 360

aagccctgga ccaactgcac cctgagcggc aagcagacca gacaccccgc cagcgacagc 420

ctggatgccg tgtgcgagga cagaagcctg ctggccaccc tgctgtggga gacacagcgg 480

cccaccttca gacccaccac cgtgcagagc accaccgtgt ggcccagaac cagcgagctg 540

cccagtcctc ctaccctcgt gacacctgag ggccccgtcg acgaacagtt atattttcag 600

ggcggctcac ccaaatctgc agacaaaact cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa 660

ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc 720

tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc 780

aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag 840

gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg 900

ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag 960

aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca 1020

tgccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc agcctgtggt gcctggtcaa aggcttctat 1080

cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc 1140

acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct acagcaagct caccgtggac 1200

aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac 1260

aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tctccgggta aatccggagg cctgaacgac 1320

atcttcgagg cccagaagat tgaatggcac gag 1353

<210> 86

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Fc穴链

<400> 86

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Lys

225

<210> 87

<211> 445

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人OX40抗原Fc节链

<400> 87

Leu His Cys Val Gly Asp Thr Tyr Pro Ser Asn Asp Arg Cys Cys His

1 5 10 15

Glu Cys Arg Pro Gly Asn Gly Met Val Ser Arg Cys Ser Arg Ser Gln

20 25 30

Asn Thr Val Cys Arg Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Val Val

35 40 45

Ser Ser Lys Pro Cys Lys Pro Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly

50 55 60

Ser Glu Arg Lys Gln Leu Cys Thr Ala Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg

65 70 75 80

Cys Arg Ala Gly Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val Asp

85 90 95

Cys Ala Pro Cys Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala

100 105 110

Cys Lys Pro Trp Thr Asn Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln

115 120 125

Pro Ala Ser Asn Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro

130 135 140

Ala Thr Gln Pro Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Ile Thr

145 150 155 160

Val Gln Pro Thr Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln Gly Pro Ser Thr

165 170 175

Arg Pro Val Glu Val Pro Gly Gly Arg Ala Val Asp Glu Gln Leu Tyr

180 185 190

Phe Gln Gly Gly Ser Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro

195 200 205

Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe

210 215 220

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

225 230 235 240

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe

245 250 255

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

260 265 270

Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr

275 280 285

Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val

290 295 300

Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala

305 310 315 320

Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg

325 330 335

Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly

340 345 350

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

355 360 365

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

370 375 380

Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln

385 390 395 400

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His

405 410 415

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser Gly Gly Leu

420 425 430

Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu

435 440 445

<210> 88

<211> 445

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 食蟹猴OX40抗原Fc节链

<400> 88

Leu His Cys Val Gly Asp Thr Tyr Pro Ser Asn Asp Arg Cys Cys Gln

1 5 10 15

Glu Cys Arg Pro Gly Asn Gly Met Val Ser Arg Cys Asn Arg Ser Gln

20 25 30

Asn Thr Val Cys Arg Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Val Val

35 40 45

Ser Ala Lys Pro Cys Lys Ala Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly

50 55 60

Ser Glu Arg Lys Gln Pro Cys Thr Ala Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg

65 70 75 80

Cys Arg Ala Gly Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val Asp

85 90 95

Cys Ala Pro Cys Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala

100 105 110

Cys Lys Pro Trp Thr Asn Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln

115 120 125

Pro Ala Ser Asn Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro

130 135 140

Pro Thr Gln Pro Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Thr Thr

145 150 155 160

Val Gln Pro Thr Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln Arg Pro Ser Thr

165 170 175

Arg Pro Val Glu Val Pro Arg Gly Pro Ala Val Asp Glu Gln Leu Tyr

180 185 190

Phe Gln Gly Gly Ser Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro

195 200 205

Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe

210 215 220

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

225 230 235 240

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe

245 250 255

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

260 265 270

Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr

275 280 285

Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val

290 295 300

Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala

305 310 315 320

Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg

325 330 335

Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly

340 345 350

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

355 360 365

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

370 375 380

Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln

385 390 395 400

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His

405 410 415

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser Gly Gly Leu

420 425 430

Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu

435 440 445

<210> 89

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鼠OX40抗原Fc节链

<400> 89

Val Thr Ala Arg Arg Leu Asn Cys Val Lys His Thr Tyr Pro Ser Gly

1 5 10 15

His Lys Cys Cys Arg Glu Cys Gln Pro Gly His Gly Met Val Ser Arg

20 25 30

Cys Asp His Thr Arg Asp Thr Leu Cys His Pro Cys Glu Thr Gly Phe

35 40 45

Tyr Asn Glu Ala Val Asn Tyr Asp Thr Cys Lys Gln Cys Thr Gln Cys

50 55 60

Asn His Arg Ser Gly Ser Glu Leu Lys Gln Asn Cys Thr Pro Thr Gln

65 70 75 80

Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Pro Gly Thr Gln Pro Arg Gln Asp Ser

85 90 95

Gly Tyr Lys Leu Gly Val Asp Cys Val Pro Cys Pro Pro Gly His Phe

100 105 110

Ser Pro Gly Asn Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp Thr Asn Cys Thr Leu

115 120 125

Ser Gly Lys Gln Thr Arg His Pro Ala Ser Asp Ser Leu Asp Ala Val

130 135 140

Cys Glu Asp Arg Ser Leu Leu Ala Thr Leu Leu Trp Glu Thr Gln Arg

145 150 155 160

Pro Thr Phe Arg Pro Thr Thr Val Gln Ser Thr Thr Val Trp Pro Arg

165 170 175

Thr Ser Glu Leu Pro Ser Pro Pro Thr Leu Val Thr Pro Glu Gly Pro

180 185 190

Val Asp Glu Gln Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Pro Lys Ser Ala Asp

195 200 205

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

210 215 220

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

225 230 235 240

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

245 250 255

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

260 265 270

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

275 280 285

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

290 295 300

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

305 310 315 320

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

325 330 335

Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

340 345 350

Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

355 360 365

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

370 375 380

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

385 390 395 400

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

405 410 415

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

420 425 430

Gly Lys Ser Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu

435 440 445

Trp His Glu

450

<210> 90

<211> 1613

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 文库DP88-4的核苷酸序列

<400> 90

tgaaatacct attgcctacg gcagccgctg gattgttatt actcgcggcc cagccggcca 60

tggccgacat ccagatgacc cagtctcctt ccaccctgtc tgcatctgta ggagaccgtg 120

tcaccatcac ttgccgtgcc agtcagagta ttagtagctg gttggcctgg tatcagcaga 180

aaccagggaa agcccctaag ctcctgatct atgatgcctc cagtttggaa agtggggtcc 240

catcacgttt cagcggcagt ggatccggga cagaattcac tctcaccatc agcagcttgc 300

agcctgatga ttttgcaact tattactgcc aacagtataa tagttattct acgtttggcc 360

agggcaccaa agtcgagatc aagcgtacgg tggctgcacc atctgtcttc atcttcccgc 420

catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg aataacttct 480

atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg ggtaactccc 540

aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc agcaccctga 600

cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc acccatcagg 660

gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgtggagcc gcagaacaaa 720

aactcatctc agaagaggat ctgaatggag ccgcagacta caaggacgac gacgacaagg 780

gtgccgcata ataaggcgcg ccaattctat ttcaaggaga cagtcatatg aaatacctgc 840

tgccgaccgc tgctgctggt ctgctgctcc tcgctgccca gccggcgatg gcccaggtgc 900

aattggtgca gtctggggct gaggtgaaga agcctgggtc ctcggtgaag gtctcctgca 960

aggcctccgg aggcacattc agcagctacg ctataagctg ggtgcgacag gcccctggac 1020

aagggctcga gtggatggga gggatcatcc ctatctttgg tacagcaaac tacgcacaga 1080

agttccaggg cagggtcacc attactgcag acaaatccac gagcacagcc tacatggagc 1140

tgagcagcct gagatctgag gacaccgccg tgtattactg tgcgagacta tccccaggcg 1200

gttactatgt tatggatgcc tggggccaag ggaccaccgt gaccgtctcc tcagctagca 1260

ccaaaggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct gggggcacag 1320

cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg tcgtggaact 1380

caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc tcaggactct 1440

actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag acctacatct 1500

gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aagtggacaa gaaagttgag cccaaatctt 1560

gtgacgcggc cgcaagcact agtgcccatc accatcacca tcacgccgcg gca 1613

<210> 91

<211> 723

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 核苷酸序列Fab轻链Vk1_5

<400> 91

gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60

atcacttgcc gtgccagtca gagtattagt agctggttgg cctggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaagctcct gatctatgat gcctccagtt tggaaagtgg ggtcccatca 180

cgtttcagcg gcagtggatc cgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cttgcagcct 240

gatgattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt attctacgtt tggccagggc 300

accaaagtcg agatcaagcg tacggtggct gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct 360

gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc 420

agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag 480

agtgtcacag agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg 540

agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg 600

agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgtg gagccgcaga acaaaaactc 660

atctcagaag aggatctgaa tggagccgca gactacaagg acgacgacga caagggtgcc 720

gca 723

<210> 92

<211> 241

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Fab轻链Vk1_5

<400> 92

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Ser Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro

100 105 110

Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr

115 120 125

Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys

130 135 140

Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu

145 150 155 160

Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

165 170 175

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala

180 185 190

Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe

195 200 205

Asn Arg Gly Glu Cys Gly Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu

210 215 220

Asp Leu Asn Gly Ala Ala Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Ala

225 230 235 240

Ala

<210> 93

<211> 720

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 核苷酸序列Fab重链VH1_69

<400> 93

caggtgcaat tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60

tcctgcaagg cctccggagg cacattcagc agctacgcta taagctgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggctcgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180

gcacagaagt tccagggcag ggtcaccatt actgcagaca aatccacgag cacagcctac 240

atggagctga gcagcctgag atctgaggac accgccgtgt attactgtgc gagactatcc 300

ccaggcggtt actatgttat ggatgcctgg ggccaaggga ccaccgtgac cgtctcctca 360

gctagcacca aaggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 420

ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 600

tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaaag tggacaagaa agttgagccc 660

aaatcttgtg acgcggccgc aagcactagt gcccatcacc atcaccatca cgccgcggca 720

<210> 94

<211> 240

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Fab重链VH1_69

<400> 94

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Ser Pro Gly Gly Tyr Tyr Val Met Asp Ala Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Ala Ala Ala Ser Thr Ser Ala His His His His His His Ala Ala Ala

225 230 235 240

<210> 95

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> LMB3引物

<400> 95

caggaaacag ctatgaccat gattac 26

<210> 96

<211> 71

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Vk1_5_L3r_S引物

<400> 96

ctcgactttg gtgccctggc caaacgtsba atacgaatta tactgttggc agtaataagt 60

tgcaaaatca t 71

<210> 97

<211> 74

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Vk1_5_L3r_SY引物

<400> 97

ctcgactttg gtgccctggc caaacgtmhr sgratacgaa ttatactgtt ggcagtaata 60

agttgcaaaa tcat 74

<210> 98

<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Vk1_5_L3r_SPY

<400> 98

ctcgactttg gtgccctggc caaacgtmhh msssgratac gaattatact gttggcagta 60

ataagttgca aaatcat 77

<210> 99

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> RJH31引物

<400> 99

acgtttggcc agggcaccaa agtcgag 27

<210> 100

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> RJH32引物

<400> 100

tctcgcacag taatacacgg cggtgtcc 28

<210> 101

<211> 64

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DP88-v4-4

<400> 101

ggacaccgcc gtgtattact gtgcgagaga ctactggggc caagggacca ccgtgaccgt 60

ctcc 64

<210> 102

<211> 64

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DP88-v4-6

<400> 102

ggacaccgcc gtgtattact gtgcgagaga ctactggggc caagggacca ccgtgaccgt 60

ctcc 64

<210> 103

<211> 64

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DP88-v4-8

<400> 103

ggacaccgcc gtgtattact gtgcgagaga ctactggggc caagggacca ccgtgaccgt 60

ctcc 64

<210> 104

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> fdseqlong引物

<400> 104

gacgttagta aatgaatttt ctgtatgagg 30

<210> 105

<211> 1596

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> (Vk3_20/VH3_23)模板

<400> 105

atgaaatacc tattgcctac ggcagccgct ggattgttat tactcgcggc ccagccggcc 60

atggccgaaa tcgtgttaac gcagtctcca ggcaccctgt ctttgtctcc aggggaaaga 120

gccaccctct cttgcagggc cagtcagagt gttagcagca gctacttagc ctggtaccag 180

cagaaacctg gccaggctcc caggctcctc atctatggag catccagcag ggccactggc 240

atcccagaca ggttcagtgg cagtggatcc gggacagact tcactctcac catcagcaga 300

ctggagcctg aagattttgc agtgtattac tgtcagcagt atggtagctc accgctgacg 360

ttcggccagg ggaccaaagt ggaaatcaaa cgtacggtgg ctgcaccatc tgtcttcatc 420

ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat 480

aacttctatc ccagagaggc caaagtacag tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt 540

aactcccagg agagtgtcac agagcaggac agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc 600

accctgacgc tgagcaaagc agactacgag aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc 660

catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag agcttcaaca ggggagagtg tggagccgca 720

catcaccatc accatcacgg agccgcagac tacaaggacg acgacgacaa gggtgccgca 780

taataaggcg cgccaattct atttcaagga gacagtcata tgaaatacct gctgccgacc 840

gctgctgctg gtctgctgct cctcgctgcc cagccggcga tggccgaggt gcaattgctg 900

gagtctgggg gaggcttggt acagcctggg gggtccctga gactctcctg tgcagcctcc 960

ggattcacct ttagcagtta tgccatgagc tgggtccgcc aggctccagg gaaggggctg 1020

gagtgggtct cagctattag tggtagtggt ggtagcacat actacgcaga ctccgtgaag 1080

ggccggttca ccatctccag agacaattcc aagaacacgc tgtatctgca gatgaacagc 1140

ctgagagccg aggacacggc cgtatattac tgtgcgaaac cgtttccgta ttttgactac 1200

tggggccaag gaaccctggt caccgtctcg agtgctagca ccaaaggccc atcggtcttc 1260

cccctggcac cctcctccaa gagcacctct gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc 1320

aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc 1380

gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc tcaggactct actccctcag cagcgtggtg 1440

accgtgccct ccagcagctt gggcacccag acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc 1500

agcaacacca aagtggacaa gaaagttgag cccaaatctt gtgacgcggc cgcagaacaa 1560

aaactcatct cagaagagga tctgaatgcc gcggca 1596

<210> 106

<211> 714

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Fab轻链Vk3_20

<400> 106

gaaatcgtgt taacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60

ctctcttgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120

cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggagcatcca gcagggccac tggcatccca 180

gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240

cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcaccgct gacgttcggc 300

caggggacca aagtggaaat caaacgtacg gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360

ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 420

tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480

caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540

acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 600

ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgtggagc cgcacatcac 660

catcaccatc acggagccgc agactacaag gacgacgacg acaagggtgc cgca 714

<210> 107

<211> 238

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Fab轻链Vk3_20

<400> 107

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro

85 90 95

Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala

100 105 110

Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser

115 120 125

Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu

130 135 140

Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser

145 150 155 160

Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu

165 170 175

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val

180 185 190

Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

195 200 205

Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Ala Ala His His His His His His

210 215 220

Gly Ala Ala Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Ala Ala

225 230 235

<210> 108

<211> 711

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Fab重链VH3_23

<400> 108

gaggtgcaat tgctggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaaccgttt 300

ccgtattttg actactgggg ccaaggaacc ctggtcaccg tctcgagtgc tagcaccaaa 360

ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc tccaagagca cctctggggg cacagcggcc 420

ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc 480

gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg gctgtcctac agtcctcagg actctactcc 540

ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cccagaccta catctgcaac 600

gtgaatcaca agcccagcaa caccaaagtg gacaagaaag ttgagcccaa atcttgtgac 660

gcggccgcag aacaaaaact catctcagaa gaggatctga atgccgcggc a 711

<210> 109

<211> 237

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Fab重链VH3_23 (DP47)

<400> 109

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

115 120 125

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

130 135 140

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

180 185 190

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

195 200 205

Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Ala Ala Ala Glu

210 215 220

Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ala Ala Ala

225 230 235

<210> 110

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MS64引物

<400> 110

acgttcggcc aggggaccaa agtgg 25

<210> 111

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DP47CDR3_ba引物

<400> 111

cgcacagtaa tatacggccg tgtcc 25

<210> 112

<211> 64

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DP47-v4-4

<400> 112

cgaggacacg gccgtatatt actgtgcgga ctactggggc caaggaaccc tggtcaccgt 60

ctcg 64

<210> 113

<211> 64

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DP47-v4-6

<400> 113

cgaggacacg gccgtatatt actgtgcgga ctactggggc caaggaaccc tggtcaccgt 60

ctcg 64

<210> 114

<211> 64

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DP47-v4-8

<400> 114

cgaggacacg gccgtatatt actgtgcgga ctactggggc caaggaaccc tggtcaccgt 60

ctcg 64

<210> 115

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> fdseqlong

<400> 115

gacgttagta aatgaatttt ctgtatgagg 30

<210> 116

<211> 1605

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Vl3_19/VH3_23文库模板

<400> 116

atgaaatacc tattgcctac ggcagccgct ggattgttat tactcgcggc ccagccggcc 60

atggcctcgt ctgagctgac tcaggaccct gctgtgtctg tggccttggg acagacagtc 120

aggatcacat gccaaggaga cagcctcaga agttattatg caagctggta ccagcagaag 180

ccaggacagg cccctgtact tgtcatctat ggtaaaaaca accggccctc agggatccca 240

gaccgattct ctggctccag ctcaggaaac acagcttcct tgaccatcac tggggctcag 300

gcggaagatg aggctgacta ttactgtaac tcccgtgata gtagcggtaa tcatgtggta 360

ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta ggacaaccca aggctgcccc cagcgtgacc 420

ctgttccccc ccagcagcga ggaattgcag gccaacaagg ccaccctggt ctgcctgatc 480

agcgacttct acccaggcgc cgtgaccgtg gcctggaagg ccgacagcag ccccgtgaag 540

gccggcgtgg agaccaccac ccccagcaag cagagcaaca acaagtacgc cgccagcagc 600

tacctgagcc tgacccccga gcagtggaag agccacaggt cctacagctg ccaggtgacc 660

cacgagggca gcaccgtgga gaaaaccgtg gcccccaccg agtgcagcgg agccgcagaa 720

caaaaactca tctcagaaga ggatctgaat ggagccgcag actacaagga cgacgacgac 780

aagggtgccg cataataagg cgcgccaatt ctatttcaag gagacagtca tatgaaatac 840

ctgctgccga ccgctgctgc tggtctgctg ctcctcgctg cccagccggc gatggccgag 900

gtgcaattgc tggagtctgg gggaggcttg gtacagcctg gggggtccct gagactctcc 960

tgtgcagcct ccggattcac ctttagcagt tatgccatga gctgggtccg ccaggctcca 1020

gggaaggggc tggagtgggt ctcagctatt agtggtagtg gtggtagcac atactacgca 1080

gactccgtga agggccggtt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg 1140

cagatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccgtatatt actgtgcgaa accgtttccg 1200

tattttgact actggggcca aggaaccctg gtcaccgtct cgagtgctag caccaaaggc 1260

ccatcggtct tccccctggc accctcctcc aagagcacct ctgggggcac agcggccctg 1320

ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc 1380

ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct gtcctacagt cctcaggact ctactccctc 1440

agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc ttgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg 1500

aatcacaagc ccagcaacac caaagtggac aagaaagttg agcccaaatc ttgtgacgcg 1560

gccgcaagca ctagtgccca tcaccatcac catcacgccg cggca 1605

<210> 117

<211> 726

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Fab轻链Vl3_19

<400> 117

tcgtctgagc tgactcagga ccctgctgtg tctgtggcct tgggacagac agtcaggatc 60

acatgccaag gagacagcct cagaagttat tatgcaagct ggtaccagca gaagccagga 120

caggcccctg tacttgtcat ctatggtaaa aacaaccggc cctcagggat cccagaccga 180

ttctctggct ccagctcagg aaacacagct tccttgacca tcactggggc tcaggcggaa 240

gatgaggctg actattactg taactcccgt gatagtagcg gtaatcatgt ggtattcggc 300

ggagggacca agctgaccgt cctaggacaa cccaaggctg cccccagcgt gaccctgttc 360

ccccccagca gcgaggaatt gcaggccaac aaggccaccc tggtctgcct gatcagcgac 420

ttctacccag gcgccgtgac cgtggcctgg aaggccgaca gcagccccgt gaaggccggc 480

gtggagacca ccacccccag caagcagagc aacaacaagt acgccgccag cagctacctg 540

agcctgaccc ccgagcagtg gaagagccac aggtcctaca gctgccaggt gacccacgag 600

ggcagcaccg tggagaaaac cgtggccccc accgagtgca gcggagccgc agaacaaaaa 660

ctcatctcag aagaggatct gaatggagcc gcagactaca aggacgacga cgacaagggt 720

gccgca 726

<210> 118

<211> 242

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Fab轻链Vl3_19

<400> 118

Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln

1 5 10 15

Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala

20 25 30

Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr

35 40 45

Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His

85 90 95

Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys

100 105 110

Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln

115 120 125

Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly

130 135 140

Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly

145 150 155 160

Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala

165 170 175

Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser

180 185 190

Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val

195 200 205

Ala Pro Thr Glu Cys Ser Gly Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu

210 215 220

Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly

225 230 235 240

Ala Ala

<210> 119

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> LMB3拉姆达-DP47文库

<400> 119

caggaaacag ctatgaccat gattac 26

<210> 120

<211> 85

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Vl_3_19_L3r_V拉姆达-DP47文库

<400> 120

ggacggtcag cttggtccct ccgccgaata cvhvattacc gctactatca cgggagttac 60

agtaatagtc agcctcatct tccgc 85

<210> 121

<211> 88

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Vl_3_19_L3r_HV拉姆达-DP47

<400> 121

ggacggtcag cttggtccct ccgccgaata ccmmatgatt accgctacta tcacgggagt 60

tacagtaata gtcagcctca tcttccgc 88

<210> 122

<211> 91

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Vl_3_19_L3r_HLV拉姆达-DP47

<400> 122

ggacggtcag cttggtccct ccgccgaata crhmvwgatg attaccgcta ctatcacggg 60

agttacagta atagtcagcc tcatcttccg c 91

<210> 123

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> RJH80拉姆达-DP47

<400> 123

ttcggcggag ggaccaagct gaccgtcc 28

<210> 124

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MS63

<400> 124

tttcgcacag taatatacgg ccgtgtcc 28

<210> 125

<211> 318

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DNA (8H9 ) VL

<400> 125

tcgtctgagc tgactcagga ccctgctgtg tctgtggcct tgggacagac agtcaggatc 60

acatgccaag gagacagcct cagaagttat tatgcaagct ggtaccagca gaagccagga 120

caggcccctg tacttgtcat ctatggtaaa aacaaccggc cctcagggat cccagaccga 180

ttctctggct ccagctcagg aaacacagct tccttgacca tcactggggc tcaggcggaa 240

gatgaggctg actattactg taactcccgt gttatgcctc ataatcgcgt attcggcgga 300

gggaccaagc tgaccgtc 318

<210> 126

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DNA (8H9) VH

<400> 126

gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gcgtgttttc 300

taccgtggtg gtgtttctat ggactactgg ggccaaggaa ccctggtcac cgtctcgagt 360

<210> 127

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DNA (49B4) VL

<400> 127

gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60

atcacttgcc gtgccagtca gagtattagt agctggttgg cctggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaagctcct gatctatgat gcctccagtt tggaaagtgg ggtcccatca 180

cgtttcagcg gcagtggatc cgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cttgcagcct 240

gatgattttg caacttatta ctgccaacag tatagttcgc agccgtatac gtttggccag 300

ggcaccaaag tcgagatcaa g 321

<210> 128

<211> 354

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DNA (49B4) VH

<400> 128

caggtgcaat tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60

tcctgcaagg cctccggagg cacattcagc agctacgcta taagctgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggctcgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180

gcacagaagt tccagggcag ggtcaccatt actgcagaca aatccacgag cacagcctac 240

atggagctga gcagcctgag atctgaggac accgccgtgt attactgtgc gagagaatac 300

taccgtggtc cgtacgacta ctggggccaa gggaccaccg tgaccgtctc ctca 354

<210> 129

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DNA (1G4) VL

<400> 129

gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60

atcacttgcc gtgccagtca gagtattagt agctggttgg cctggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaagctcct gatctatgat gcctccagtt tggaaagtgg ggtcccatca 180

cgtttcagcg gcagtggatc cgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cttgcagcct 240

gatgattttg caacttatta ctgccaacag tatatttcgt attccatgtt gacgtttggc 300

cagggcacca aagtcgagat caag 324

<210> 130

<211> 348

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DNA (1G4) VH

<400> 130

caggtgcaat tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60

tcctgcaagg cctccggagg cacattcagc agctacgcta taagctgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggctcgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180

gcacagaagt tccagggcag ggtcaccatt actgcagaca aatccacgag cacagcctac 240

atggagctga gcagcctgag atctgaggac accgccgtgt attactgtgc gagagaatac 300

ggttctatgg actactgggg ccaagggacc accgtgaccg tctcctca 348

<210> 131

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DNA (20B7) VL

<400> 131

gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60

atcacttgcc gtgccagtca gagtattagt agctggttgg cctggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaagctcct gatctatgat gcctccagtt tggaaagtgg ggtcccatca 180

cgtttcagcg gcagtggatc cgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cttgcagcct 240

gatgattttg caacttatta ctgccaacag tatcaggctt tttcgcttac gtttggccag 300

ggcaccaaag tcgagatcaa g 321

<210> 132

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DNA (20B7) VH

<400> 132

caggtgcaat tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60

tcctgcaagg cctccggagg cacattcagc agctacgcta taagctgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggctcgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180

gcacagaagt tccagggcag ggtcaccatt actgcagaca aatccacgag cacagcctac 240

atggagctga gcagcctgag atctgaggac accgccgtgt attactgtgc gagagttaac 300

tacccgtact cttactgggg tgacttcgac tactggggcc aagggaccac cgtgaccgtc 360

tcctca 366

<210> 133

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DNA (CLC-563) VL

<400> 133

gagatcgtgc tgacccagag ccccggcaca ctctccctgt ctcctgggga aagggccacc 60

ctttcatgca gagccagcca gtccgtctct agtagctacc tggcatggta tcagcagaag 120

ccaggacaag ccccccgcct cctgatttac ggcgcttcct ctcgggcaac tggtatccct 180

gacaggttct cagggagcgg aagcggaaca gattttacct tgactatttc tagactggag 240

ccagaggact tcgccgtgta ttactgtcag cagtacggta gtagccccct cacctttggc 300

caggggacaa aagtcgaaat caag 324

<210> 134

<211> 348

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DNA (CLC-563) VH

<400> 134

gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gcttgacgtt 300

ggtgctttcg actactgggg ccaaggagcc ctggtcaccg tctcgagt 348

<210> 135

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DNA (CLC-564) VL

<400> 135

gagatcgtgc tgacccagag ccccggcaca ctctccctgt ctcctgggga aagggccacc 60

ctttcatgca gagccagcca gtccgtctct agtagctacc tggcatggta tcagcagaag 120

ccaggacaag ccccccgcct cctgatttac ggcgcttcct ctcgggcaac tggtatccct 180

gacaggttct cagggagcgg aagcggaaca gattttacct tgactatttc tagactggag 240

ccagaggact tcgccgtgta ttactgtcag cagtacggta gtagccccct cacctttggc 300

caggggacaa aagtcgaaat caag 324

<210> 136

<211> 348

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DNA (CLC-564) VH

<400> 136

gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gttcgacgtt 300

ggtccgttcg actactgggg ccaaggaacc ctggtcaccg tctcgagt 348

<210> 137

<211> 318

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DNA (17A9) VL

<400> 137

tcgtctgagc tgactcagga ccctgctgtg tctgtggcct tgggacagac agtcaggatc 60

acatgccaag gagacagcct cagaagttat tatgcaagct ggtaccagca gaagccagga 120

caggcccctg tacttgtcat ctatggtaaa aacaaccggc cctcagggat cccagaccga 180

ttctctggct ccagctcagg aaacacagct tccttgacca tcactggggc tcaggcggaa 240

gatgaggctg actattactg taactcccgt gttatgcctc ataatcgcgt attcggcgga 300

gggaccaagc tgaccgtc 318

<210> 138

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DNA (17A9) VH

<400> 138

gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gcgtgttttc 300

taccgtggtg gtgtttctat ggactactgg ggccaaggaa ccctggtcac cgtctcgagt 360

<210> 139

<211> 645

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DNA 8H9 P329GLALA IgG1轻链

<400> 139

gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60

atcacttgcc gtgccagtca gagtattagt agctggttgg cctggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaagctcct gatctatgat gcctccagtt tggaaagtgg ggtcccatca 180

cgtttcagcg gcagtggatc cgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cttgcagcct 240

gatgattttg caacttatta ctgccaacag tatttgacgt attcgcggtt tacgtttggc 300

cagggcacca aagtcgagat caagcgtacg gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360

ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 420

tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480

caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540

acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 600

ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgt 645

<210> 140

<211> 1338

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DNA 8H9 P329GLALA IgG1重链

<400> 140

caggtgcaat tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60

tcctgcaagg cctccggagg cacattcagc agctacgcta taagctgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggctcgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180

gcacagaagt tccagggcag ggtcaccatt actgcagaca aatccacgag cacagcctac 240

atggagctga gcagcctgag atctgaggac accgccgtgt attactgtgc gagagaatac 300

ggttggatgg actactgggg ccaagggacc accgtgaccg tctcctcagc tagcaccaag 360

ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc tccaagagca cctctggggg cacagcggcc 420

ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc 480

gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg gctgtcctac agtcctcagg actctactcc 540

ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cccagaccta catctgcaac 600

gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagaaag ttgagcccaa atcttgtgac 660

aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca cctgaagctg cagggggacc gtcagtcttc 720

ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 780

gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 840

gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt 900

gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 960

aaggtctcca acaaagccct cggcgccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 1020

cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggatgagct gaccaagaac 1080

caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1140

gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 1200

ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 1260

gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 1320

tccctgtctc cgggtaaa 1338

<210> 141

<211> 215

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 8H9 P329GLALA IgG1轻链

<400> 141

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Thr Tyr Ser Arg

85 90 95

Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala

100 105 110

Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser

115 120 125

Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu

130 135 140

Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser

145 150 155 160

Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu

165 170 175

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val

180 185 190

Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

195 200 205

Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 142

<211> 446

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 8H9 P329GLALA IgG1重链

<400> 142

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Tyr Gly Trp Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

115 120 125

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

130 135 140

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

180 185 190

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

195 200 205

Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

210 215 220

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe

225 230 235 240

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

245 250 255

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

260 265 270

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

275 280 285

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

290 295 300

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

305 310 315 320

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

325 330 335

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

340 345 350

Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

355 360 365

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

370 375 380

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

385 390 395 400

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

405 410 415

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

420 425 430

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 143

<211> 642

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DNA 49B4 P329GLALA IgG1轻链

<400> 143

gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60

atcacttgcc gtgccagtca gagtattagt agctggttgg cctggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaagctcct gatctatgat gcctccagtt tggaaagtgg ggtcccatca 180

cgtttcagcg gcagtggatc cgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cttgcagcct 240

gatgattttg caacttatta ctgccaacag tatagttcgc agccgtatac gtttggccag 300

ggcaccaaag tcgagatcaa gcgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360

tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420

cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480

gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540

ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600

ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642

<210> 144

<211> 1344

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DNA 49B4 P329GLALA IgG1重链

<400> 144

caggtgcaat tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60

tcctgcaagg cctccggagg cacattcagc agctacgcta taagctgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggctcgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180

gcacagaagt tccagggcag ggtcaccatt actgcagaca aatccacgag cacagcctac 240

atggagctga gcagcctgag atctgaggac accgccgtgt attactgtgc gagagaatac 300

taccgtggtc cgtacgacta ctggggccaa gggaccaccg tgaccgtctc ctcagctagc 360

accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 420

gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 480

tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 540

tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 600

tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaagttga gcccaaatct 660

tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aagctgcagg gggaccgtca 720

gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 780

acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 840

gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 900

taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 960

aagtgcaagg tctccaacaa agccctcggc gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 1020

aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc 1080

aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 1140

gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1200

tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1260

gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1320

agcctctccc tgtctccggg taaa 1344

<210> 145

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 49B4 P329GLALA IgG1轻链

<400> 145

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Gln Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

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Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 146

<211> 448

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 49B4重链

<400> 146

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

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Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

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Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

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Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

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Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

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Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

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Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

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Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

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Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

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Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

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Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

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<212> DNA

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<220>

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tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480

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<211> 1338

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DNA 1G4 P329GLALA IgG1重链

<400> 148

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<210> 149

<211> 215

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1G4 P329GLALA IgG1轻链

<400> 149

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165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 150

<211> 446

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1G4 P329GLALA IgG1重链

<400> 150

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

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165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

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<210> 151

<211> 642

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

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gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60

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<212> DNA

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<220>

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195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 154

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<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 20B7 P329GLALA IgG1重链

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Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

180 185 190

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

195 200 205

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Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

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Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

260 265 270

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

275 280 285

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

290 295 300

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

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Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro

325 330 335

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

340 345 350

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355 360 365

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370 375 380

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

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<210> 155

<211> 645

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> DNA CLC-563 P329GLALA IgG1轻链

<400> 155

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<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> DNA CLC-563 P329GLALA IgG1重链

<400> 156

gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180

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ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gcttgacgtt 300

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ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cccagaccta catctgcaac 600

gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagaaag ttgagcccaa atcttgtgac 660

aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca cctgaagctg cagggggacc gtcagtcttc 720

ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 780

gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 840

gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt 900

gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 960

aaggtctcca acaaagccct cggcgccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 1020

cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggatgagct gaccaagaac 1080

caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1140

gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 1200

ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 1260

gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 1320

tccctgtctc cgggtaaa 1338

<210> 157

<211> 215

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> CLC-563 P329GLALA IgG1轻链

<400> 157

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

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65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro

85 90 95

Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala

100 105 110

Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser

115 120 125

Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu

130 135 140

Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser

145 150 155 160

Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu

165 170 175

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val

180 185 190

Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

195 200 205

Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 158

<211> 446

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> CLC-563 P329GLALA IgG1重链

<400> 158

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Leu Asp Val Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ala Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

115 120 125

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

130 135 140

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

180 185 190

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

195 200 205

Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

210 215 220

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe

225 230 235 240

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

245 250 255

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

260 265 270

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

275 280 285

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

290 295 300

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

305 310 315 320

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

325 330 335

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

340 345 350

Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

355 360 365

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

370 375 380

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

385 390 395 400

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

405 410 415

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

420 425 430

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 159

<211> 645

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> DNA CLC-564 P329GLALA IgG1轻链

<400> 159

gagatcgtgc tgacccagag ccccggcaca ctctccctgt ctcctgggga aagggccacc 60

ctttcatgca gagccagcca gtccgtctct agtagctacc tggcatggta tcagcagaag 120

ccaggacaag ccccccgcct cctgatttac ggcgcttcct ctcgggcaac tggtatccct 180

gacaggttct cagggagcgg aagcggaaca gattttacct tgactatttc tagactggag 240

ccagaggact tcgccgtgta ttactgtcag cagtacggta gtagccccct cacctttggc 300

caggggacaa aagtcgaaat caagcgtacg gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360

ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 420

tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480

caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540

acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 600

ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgt 645

<210> 160

<211> 1338

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> DNA CLC-564 P329GLALA IgG1重链

<400> 160

gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gttcgacgtt 300

ggtccgttcg actactgggg ccaaggaacc ctggtcaccg tctcgagtgc tagcaccaag 360

ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc tccaagagca cctctggggg cacagcggcc 420

ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc 480

gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg gctgtcctac agtcctcagg actctactcc 540

ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cccagaccta catctgcaac 600

gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagaaag ttgagcccaa atcttgtgac 660

aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca cctgaagctg cagggggacc gtcagtcttc 720

ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 780

gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 840

gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt 900

gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 960

aaggtctcca acaaagccct cggcgccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 1020

cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggatgagct gaccaagaac 1080

caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1140

gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 1200

ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 1260

gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 1320

tccctgtctc cgggtaaa 1338

<210> 161

<211> 215

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> CLC-564 P329GLALA IgG1轻链

<400> 161

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro

85 90 95

Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala

100 105 110

Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser

115 120 125

Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu

130 135 140

Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser

145 150 155 160

Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu

165 170 175

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val

180 185 190

Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

195 200 205

Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 162

<211> 446

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> CLC-564 P329GLALA IgG1重链

<400> 162

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Phe Asp Val Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

115 120 125

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

130 135 140

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

180 185 190

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

195 200 205

Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

210 215 220

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe

225 230 235 240

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

245 250 255

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

260 265 270

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

275 280 285

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

290 295 300

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

305 310 315 320

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

325 330 335

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

340 345 350

Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

355 360 365

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

370 375 380

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

385 390 395 400

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

405 410 415

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

420 425 430

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 163

<211> 639

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> DNA 17A9 P329GLALA IgG1轻链

<400> 163

tcgtctgagc tgactcagga ccctgctgtg tctgtggcct tgggacagac agtcaggatc 60

acatgccaag gagacagcct cagaagttat tatgcaagct ggtaccagca gaagccagga 120

caggcccctg tacttgtcat ctatggtaaa aacaaccggc cctcagggat cccagaccga 180

ttctctggct ccagctcagg aaacacagct tccttgacca tcactggggc tcaggcggaa 240

gatgaggctg actattactg taactcccgt gttatgcctc ataatcgcgt attcggcgga 300

gggaccaagc tgaccgtcct aggtcaaccc aaggctgccc ccagcgtgac cctgttcccc 360

cccagcagcg aggaactgca ggccaacaag gccaccctgg tctgcctgat cagcgacttc 420

tacccaggcg ccgtgaccgt ggcctggaag gccgacagca gccccgtgaa ggccggcgtg 480

gagaccacca cccccagcaa gcagagcaac aacaagtacg ccgccagcag ctacctgagc 540

ctgacccccg agcagtggaa gagccacagg tcctacagct gccaggtgac ccacgagggc 600

agcaccgtgg agaaaaccgt ggcccccacc gagtgcagc 639

<210> 164

<211> 1350

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> DNA 17A9 P329GLALA IgG1重链

<400> 164

gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gcgtgttttc 300

taccgtggtg gtgtttctat ggactactgg ggccaaggaa ccctggtcac cgtctcgagt 360

gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 420

ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 600

tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 660

aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaagc tgcaggggga 720

ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 780

gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 840

tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 900

agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 960

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcggcgccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020

aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 1080

ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1140

gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1200

ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1260

cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1320

cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 1350

<210> 165

<211> 213

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 17A9 P329GLALA IgG1轻链

<400> 165

Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln

1 5 10 15

Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala

20 25 30

Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr

35 40 45

Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Val Met Pro His Asn Arg

85 90 95

Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala

100 105 110

Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala

115 120 125

Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala

130 135 140

Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Val

145 150 155 160

Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser

165 170 175

Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr

180 185 190

Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala

195 200 205

Pro Thr Glu Cys Ser

210

<210> 166

<211> 450

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 17A9 P329GLALA IgG1重链

<400> 166

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Val Phe Tyr Arg Gly Gly Val Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Lys

450

<210> 167

<211> 3102

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 核苷酸序列带有C端Avi和His标签的人TnC

<400> 167

atgtccccta tactaggtta ttggaaaatt aagggccttg tgcaacccac tcgacttctt 60

ttggaatatc ttgaagaaaa atatgaagag catttgtatg agcgcgatga aggtgataaa 120

tggcgaaaca aaaagtttga attgggtttg gagtttccca atcttcctta ttatattgat 180

ggtgatgtta aattaacaca gtctatggcc atcatacgtt atatagctga caagcacaac 240

atgttgggtg gttgtccaaa agagcgtgca gagatttcaa tgcttgaagg agcggttttg 300

gatattagat acggtgtttc gagaattgca tatagtaaag actttgaaac tctcaaagtt 360

gattttctta gcaagctacc tgaaatgctg aaaatgttcg aagatcgttt atgtcataaa 420

acatatttaa atggtgatca tgtaacccat cctgacttca tgttgtatga cgctcttgat 480

gttgttttat acatggaccc aatgtgcctg gatgcgttcc caaaattagt ttgttttaaa 540

aaacgtattg aagctatccc acaaattgat aagtacttga aatccagcaa gtatatagca 600

tggcctttgc agggctggca agccacgttt ggtggtggcg accatcctcc aaaatcggat 660

ggttcaacta gtggttctgg tcatcaccat caccatcact ccgcgggtct ggtgccacgc 720

ggtagtactg caattggtat gaaagaaacc gctgctgcta aattcgaacg ccagcacatg 780

gacagcccag atctgggtac cggtggtggc tccggtattg agggacgcgg gtccatggga 840

tatcggggat ccgagctgga cacccccaag gacctgcagg tgtccgagac agccgagaca 900

agcctgaccc tgctgtggaa aacccccctg gccaagttcg accggtacag actgaactac 960

agcctgccca ctggacagtg ggtcggcgtg cagctgcccc ggaacaccac ctcctacgtg 1020

ctgcggggcc tggaacccgg ccaggaatac aacgtcctgc tgacggccga gaagggccgg 1080

cacaagagca agcccgccag agtgaaggcc agcaccgagc aggcccccga gctggaaaac 1140

ctgaccgtga ccgaagtggg ctgggacggc ctgcggctga actggaccgc ggctgaccag 1200

gcctatgagc actttatcat tcaggtgcag gaggccaaca aggtggaggc agctcggaac 1260

ctcaccgtgc ctggcagcct tcgggctgtg gacataccgg gcctcaaggc tgctacgcct 1320

tatacagtct ccatctatgg ggtgatccag ggctatagaa caccagtgct ctctgctgag 1380

gcctccacag gcgaaacacc gaacctgggc gaagtggtgg tggcggaagt gggttgggat 1440

gcgctgaaac tgaactggac cgcgccggaa ggcgcgtatg aatatttttt catccaggtg 1500

caggaagcgg ataccgttga agcggcgcag aacctgaccg ttccgggcgg tctgcgtagc 1560

accgatctgc cgggcctgaa agcggcgacc cattatacca ttaccatccg tggggtgacc 1620

caggacttct ctaccacccc tctgagcgtg gaggtgctga ccgaggaggt acccgacatg 1680

ggcaacctga ccgtgaccga ggtgtcctgg gacgccctgc ggctgaactg gaccaccccc 1740

gacggcacct acgaccagtt cacaatccag gtgcaggaag ccgaccaggt ggaagaagca 1800

cataatctga ccgttccggg tagcctgcgt agcatggaaa ttccgggtct gcgtgcaggc 1860

accccgtata ccgttaccct gcatggtgaa gttcgtggtc atagcacccg tccgctggca 1920

gttgaagttg ttaccgaaga tctgccgcag ctgggtgatc tggcagttag cgaagttggt 1980

tgggatggtc tgcgtctgaa ttggaccgca gcagataatg catatgaaca ttttgtgatc 2040

caggtgcaag aggtgaataa agttgaagca gcccagaatc tgaccctgcc tggttcactg 2100

cgtgcagttg atattccggg actcgaggca gcaaccccgt atcgtgttag catttatggt 2160

gttattcgcg gttatcgtac accggttctg agcgcagaag caagcaccgc aaaagaaccg 2220

gaaattggta atctgaacgt gagcgatatt acaccggaat catttaatct gagctggatg 2280

gcaaccgatg gtatttttga aacctttacc atcgagatca tcgatagcaa tcgtctgctg 2340

gaaaccgtgg aatataatat tagcggtgca gaacgtaccg cacatattag cggtctgcct 2400

ccgagcaccg attttattgt ttatctgagc ggtctggcac cgagcattcg taccaaaacc 2460

attagcgcaa ccgcaaccac cgaagcactg ccgctgctgg aaaatctgac cattagcgat 2520

attaacccgt atggttttac cgtttcatgg atggcaagcg aaaatgcatt tgatagcttt 2580

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acccagcgca aactggaact gcgtggtctg attaccggta ttggttatga agttatggtg 2700

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atgggtagcc cgaaagaagt tattttttcc gatatcaccg agaattcggc aaccgttagc 2820

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attccgggtg ttgaatatct ggttagcatt attgccatga aaggctttga agaaagcgaa 3000

ccggttagcg gtagctttac cacagctagc ggcctgaacg acatcttcga ggctcagaaa 3060

atcgaatggc acgaaggtac ccatcaccat caccaccact aa 3102

<210> 168

<211> 2566

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 核苷酸序列带有C端Avi和His标签的小鼠TnC

<400> 168

tatgtcccct atactaggtt attggaaaat taagggcctt gtgcaaccca ctcgacttct 60

tttggaatat cttgaagaaa aatatgaaga gcatttgtat gagcgcgatg aaggtgataa 120

atggcgaaac aaaaagtttg aattgggttt ggagtttccc aatcttcctt attatattga 180

tggtgatgtt aaattaacac agtctatggc catcatacgt tatatagctg acaagcacaa 240

catgttgggt ggttgtccaa aagagcgtgc agagatttca atgcttgaag gagcggtttt 300

ggatattaga tacggtgttt cgagaattgc atatagtaaa gactttgaaa ctctcaaagt 360

tgattttctt agcaagctac ctgaaatgct gaaaatgttc gaagatcgtt tatgtcataa 420

aacatattta aatggtgatc atgtaaccca tcctgacttc atgttgtatg acgctcttga 480

tgttgtttta tacatggacc caatgtgcct ggatgcgttc ccaaaattag tttgttttaa 540

aaaacgtatt gaagctatcc cacaaattga taagtacttg aaatccagca agtatatagc 600

atggcctttg cagggctggc aagccacgtt tggtggtggc gaccatcctc caaaatcgga 660

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cggtagtact gcaattggta tgaaagaaac cgctgctgct aaattcgaac gccagcacat 780

ggacagccca gatctgggta ccggtggtgg ctccggtatt gagggacgcg ggtccatggg 840

atatcgggga tccgagctgg acacccccaa ggacctgcag gtgtccgaga cagccgagac 900

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gcacaagagc aagcccgcca gagtgaaggc cagcaccgag gaagtgccca gcctggaaaa 1140

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ggcctacgag tacttcgtga tccaggtgca ggaagccaac aacgtcgaga cagcccacaa 1260

cttcaccgtg cccggcaacc tgagagccgc cgacatcccc ggcctgaagg tggccacatc 1320

ctaccgggtg tccatctacg gcgtggccag gggctaccgg acccccgtgc tgtccgccga 1380

gacaagcacc ggcaccacgc cgaacctggg cgaagtgacc gtggcggaag tgggttggga 1440

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cgtagatctg cctggtctga aagcagcaac ccgctattac attaccctgc gtggtgttac 1620

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cccgaaatca tttaatctga gctggaccgc aaccgatggt atttttgata tgtttaccat 2040

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<210> 169

<211> 2565

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 核苷酸序列带有C端Avi和His标签的食蟹猴TnC

<400> 169

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gttgttttat acatggaccc aatgtgcctg gatgcgttcc caaaattagt ttgttttaaa 540

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<210> 170

<211> 1033

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 带有C端Avi和His标签的人TnC

<400> 170

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Trp Thr Thr Pro Asp Gly Thr Tyr Asp Gln Phe Thr Ile Gln Val Gln

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 带有C端Avi和His标签的小鼠TnC

<400> 171

Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro

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530 535 540

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<210> 172

<211> 854

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 带有C端Avi和His标签的食蟹猴TnC

<400> 172

Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro

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Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu

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Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu

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Glu Ala Asp Gln Val Glu Glu Ala His Asn Leu Thr Val Pro Gly Ser

595 600 605

Leu Arg Ser Met Glu Ile Pro Gly Leu Arg Ala Gly Thr Pro Tyr Thr

610 615 620

Val Thr Leu His Gly Glu Val Arg Gly His Ser Thr Arg Pro Leu Ala

625 630 635 640

Val Glu Val Val Thr Glu Asp Leu Pro Gln Leu Gly Asp Leu Ala Val

645 650 655

Ser Glu Val Gly Trp Asp Gly Leu Arg Leu Asn Trp Thr Ala Ala Asp

660 665 670

Asn Ala Tyr Glu His Phe Val Ile Gln Val Gln Glu Val Asn Lys Val

675 680 685

Glu Ala Ala Gln Asn Leu Thr Leu Pro Gly Ser Leu Arg Ala Val Asp

690 695 700

Ile Pro Gly Leu Glu Ala Ala Thr Pro Tyr Arg Val Ser Ile Tyr Gly

705 710 715 720

Val Ile Arg Gly Tyr Arg Thr Pro Val Leu Ser Ala Glu Ala Ser Thr

725 730 735

Ala Lys Glu Ala Met Gly Ser Pro Lys Glu Val Ile Phe Ser Asp Ile

740 745 750

Thr Glu Asn Ser Ala Thr Val Ser Trp Arg Ala Pro Thr Ala Gln Val

755 760 765

Glu Ser Phe Arg Ile Thr Tyr Val Pro Ile Thr Gly Gly Thr Pro Ser

770 775 780

Met Val Thr Val Asp Gly Thr Lys Thr Gln Thr Arg Leu Val Lys Leu

785 790 795 800

Ile Pro Gly Val Glu Tyr Leu Val Ser Ile Ile Ala Met Lys Gly Phe

805 810 815

Glu Glu Ser Glu Pro Val Ser Gly Ser Phe Thr Thr Ala Ser Gly Leu

820 825 830

Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu Gly Thr His

835 840 845

His His His His His

850

<210> 177

<211> 400

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> huTnC A4 B

<400> 177

Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro

1 5 10 15

Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu

20 25 30

Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu

35 40 45

Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys

50 55 60

Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn

65 70 75 80

Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu

85 90 95

Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser

100 105 110

Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu

115 120 125

Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn

130 135 140

Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp

145 150 155 160

Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu

165 170 175

Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr

180 185 190

Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala

195 200 205

Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Gly Ser Thr Ser

210 215 220

Gly Ser Gly His His His His His His Ser Ala Gly Leu Val Pro Arg

225 230 235 240

Gly Ser Thr Ala Ile Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu

245 250 255

Arg Gln His Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Gly Gly Gly Ser Gly

260 265 270

Ile Glu Gly Arg Gly Ser Met Gly Tyr Arg Gly Ser Glu Asp Leu Pro

275 280 285

Gln Leu Gly Asp Leu Ala Val Ser Glu Val Gly Trp Asp Gly Leu Arg

290 295 300

Leu Asn Trp Thr Ala Ala Asp Asn Ala Tyr Glu His Phe Val Ile Gln

305 310 315 320

Val Gln Glu Val Asn Lys Val Glu Ala Ala Gln Asn Leu Thr Leu Pro

325 330 335

Gly Ser Leu Arg Ala Val Asp Ile Pro Gly Leu Glu Ala Ala Thr Pro

340 345 350

Tyr Arg Val Ser Ile Tyr Gly Val Ile Arg Gly Tyr Arg Thr Pro Val

355 360 365

Leu Ser Ala Glu Ala Ser Thr Ala Ser Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu

370 375 380

Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu Gly Thr His His His His His His

385 390 395 400

<210> 178

<211> 400

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> huTnC A1 B

<400> 178

Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro

1 5 10 15

Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu

20 25 30

Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu

35 40 45

Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys

50 55 60

Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn

65 70 75 80

Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu

85 90 95

Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser

100 105 110

Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu

115 120 125

Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn

130 135 140

Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp

145 150 155 160

Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu

165 170 175

Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr

180 185 190

Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala

195 200 205

Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Gly Ser Thr Ser

210 215 220

Gly Ser Gly His His His His His His Ser Ala Gly Leu Val Pro Arg

225 230 235 240

Gly Ser Thr Ala Ile Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu

245 250 255

Arg Gln His Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Gly Gly Gly Ser Gly

260 265 270

Ile Glu Gly Arg Gly Ser Met Gly Tyr Arg Gly Ser Glu Gln Ala Pro

275 280 285

Glu Leu Glu Asn Leu Thr Val Thr Glu Val Gly Trp Asp Gly Leu Arg

290 295 300

Leu Asn Trp Thr Ala Ala Asp Gln Ala Tyr Glu His Phe Ile Ile Gln

305 310 315 320

Val Gln Glu Ala Asn Lys Val Glu Ala Ala Arg Asn Leu Thr Val Pro

325 330 335

Gly Ser Leu Arg Ala Val Asp Ile Pro Gly Leu Lys Ala Ala Thr Pro

340 345 350

Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Ile Gln Gly Tyr Arg Thr Pro Val

355 360 365

Leu Ser Ala Glu Ala Ser Thr Ala Ser Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu

370 375 380

Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu Gly Thr His His His His His His

385 390 395 400

<210> 179

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 核苷酸序列TnC(18D4) VL

<400> 179

gacatccaga tgacccagtc tccatccacc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60

atcacttgcc gtgccagtca gagtattagt agctggttgg cctggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaagctcct gatctatgat gcctccagtt tggaaagtgg ggtcccatca 180

cgtttcagcg gcagtggatc cgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cttgcagcct 240

gatgattttg caacttatta ctgccaacag aataagaagt ttccttcggg gacgtttggc 300

cagggcacca aagtcgagat caag 324

<210> 180

<211> 354

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 核苷酸序列TnC(18D4) VH

<400> 180

caggtgcaat tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60

tcctgcaagg cctccggagg cacattcagc agctacgcta taagctgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggctcgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180

gcacagaagt tccagggcag ggtcaccatt actgcagaca aatccacgag cacagcctac 240

atggagctga gcagcctgag atctgaggac accgccgtgt attactgtgc gaaaggtaac 300

ttctacggtg gtctggacta ctggggccaa gggaccaccg tgaccgtctc ctca 354

<210> 181

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 核苷酸序列TnC(11C7) VL

<400> 181

tcgtctgagc tgactcagga ccctgctgtg tctgtggcct tgggacagac agtcagggtc 60

acatgccaag gagacagcct cagaagttat tatgcaagct ggtaccagca gaagccagga 120

caggcccctg tacttgtcat ctatggtaaa aacaaccggc cctcagggat cccagaccga 180

ttctctggct ccagctcagg aaacacagct tccttgacca tcactggggc tcaggcggaa 240

gatgaggctg actattactg taactccatt aatagtactc gtaatgaggt attcggcgga 300

gggaccaagc tgaccgtcct a 321

<210> 182

<211> 354

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 核苷酸序列TnC(11C7) VH

<400> 182

gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagcggta gtggtggtag cacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccaaagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaaacttct 300

ccgcgtgttc cgctggacta ctggggccaa ggaaccctgg tcaccgtctc gagt 354

<210> 183

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 核苷酸序列TnC(18D4) CDR-L1

<400> 183

cgtgccagtc agagtattag tagctggttg gcc 33

<210> 184

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 核苷酸序列TnC(11C7) CDR-L1

<400> 184

caaggagaca gcctcagaag ttattatgca agc 33

<210> 185

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 核苷酸序列TnC(18D4) CDR-L2

<400> 185

gatgcctcca gtttggaaag t 21

<210> 186

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 核苷酸序列TnC(11C7) CDR-L2

<400> 186

ggtaaaaaca accggccctc a 21

<210> 187

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 核苷酸序列TnC(18D4) CDR-L3

<400> 187

caacagaata agaagtttcc ttcggggacg 30

<210> 188

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 核苷酸序列TnC(11C7) CDR-L3

<400> 188

aactccatta atagtactcg taatgaggta 30

<210> 189

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 核苷酸序列TnC(18D4) CDR-H1

<400> 189

agctacgcta taagc 15

<210> 190

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 核苷酸序列TnC(11C7) CDR-H1

<400> 190

ggattcacct ttagcagtta tgccatgagc 30

<210> 191

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 核苷酸序列TnC(18D4) CDR-H2

<400> 191

gggatcatcc ctatctttgg tacagcaaac tacgcacaga agttccaggg c 51

<210> 192

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 核苷酸序列TnC(11C7) CDR-H2

<400> 192

gctattagcg gtagtggtgg tagcacatac tacgcagact ccgtgaaggg c 51

<210> 193

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 核苷酸序列TnC(18D4) CDR-H3

<400> 193

ggtaacttct acggtggtct ggactac 27

<210> 194

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 核苷酸序列TnC(11C7) CDR-H3

<400> 194

acttctccgc gtgttccgct ggactac 27

<210> 195

<211> 645

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 核苷酸序列处于人IgG1格式的TnC(18D4)轻链

<400> 195

gacatccaga tgacccagtc tccatccacc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60

atcacttgcc gtgccagtca gagtattagt agctggttgg cctggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaagctcct gatctatgat gcctccagtt tggaaagtgg ggtcccatca 180

cgtttcagcg gcagtggatc cgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cttgcagcct 240

gatgattttg caacttatta ctgccaacag aataagaagt ttccttcggg gacgtttggc 300

cagggcacca aagtcgagat caagcgtacg gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360

ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 420

tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480

caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540

acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 600

ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgt 645

<210> 196

<211> 1344

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 核苷酸序列处于人IgG1格式的TnC(18D4)重链

<400> 196

caggtgcaat tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60

tcctgcaagg cctccggagg cacattcagc agctacgcta taagctgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggctcgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180

gcacagaagt tccagggcag ggtcaccatt actgcagaca aatccacgag cacagcctac 240

atggagctga gcagcctgag atctgaggac accgccgtgt attactgtgc gaaaggtaac 300

ttctacggtg gtctggacta ctggggccaa gggaccaccg tgaccgtctc ctcagctagc 360

accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 420

gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 480

tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 540

tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 600

tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaagttga gcccaaatct 660

tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 720

gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 780

acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 840

gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 900

taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 960

aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 1020

aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc 1080

aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 1140

gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1200

tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1260

gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1320

agcctctccc tgtctccggg taaa 1344

<210> 197

<211> 639

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 核苷酸序列处于人IgG1格式的TnC(11C7)轻链

<400> 197

tcgtctgagc tgactcagga ccctgctgtg tctgtggcct tgggacagac agtcagggtc 60

acatgccaag gagacagcct cagaagttat tatgcaagct ggtaccagca gaagccagga 120

caggcccctg tacttgtcat ctatggtaaa aacaaccggc cctcagggat cccagaccga 180

ttctctggct ccagctcagg aaacacagct tccttgacca tcactggggc tcaggcggaa 240

gatgaggctg actattactg taactccatt aatagtactc gtaatgaggt attcggcgga 300

gggaccaagc tgaccgtcct aggtcaaccc aaggctgccc ccagcgtgac cctgttcccc 360

cccagcagcg aggaactgca ggccaacaag gccaccctgg tctgcctgat cagcgacttc 420

tacccaggcg ccgtgaccgt ggcctggaag gccgacagca gccccgtgaa ggccggcgtg 480

gagaccacca cccccagcaa gcagagcaac aacaagtacg ccgccagcag ctacctgagc 540

ctgacccccg agcagtggaa gagccacagg tcctacagct gccaggtgac ccacgagggc 600

agcaccgtgg agaaaaccgt ggcccccacc gagtgcagc 639

<210> 198

<211> 1344

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 核苷酸序列处于人IgG1格式的TnC(11C7)重链

<400> 198

gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagcggta gtggtggtag cacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccaaagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaaacttct 300

ccgcgtgttc cgctggacta ctggggccaa ggaaccctgg tcaccgtctc gagtgctagc 360

accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 420

gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 480

tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 540

tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 600

tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaagttga gcccaaatct 660

tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 720

gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 780

acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 840

gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 900

taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 960

aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 1020

aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc 1080

aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 1140

gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1200

tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1260

gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1320

agcctctccc tgtctccggg taaa 1344

<210> 199

<211> 215

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 处于人IgG1格式的TnC(18D4)轻链

<400> 199

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Lys Lys Phe Pro Ser

85 90 95

Gly Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala

100 105 110

Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser

115 120 125

Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu

130 135 140

Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser

145 150 155 160

Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu

165 170 175

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val

180 185 190

Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

195 200 205

Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 200

<211> 448

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 处于人IgG1格式的TnC(18D4)重链

<400> 200

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Gly Asn Phe Tyr Gly Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 201

<211> 213

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 处于人IgG1格式的TnC(11C7)轻链

<400> 201

Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln

1 5 10 15

Thr Val Arg Val Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala

20 25 30

Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr

35 40 45

Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Ile Asn Ser Thr Arg Asn Glu

85 90 95

Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala

100 105 110

Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala

115 120 125

Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala

130 135 140

Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Val

145 150 155 160

Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser

165 170 175

Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr

180 185 190

Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala

195 200 205

Pro Thr Glu Cys Ser

210

<210> 202

<211> 448

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 处于人IgG1格式的TnC(11C7)重链

<400> 202

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Thr Ser Pro Arg Val Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 203

<211> 1344

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 核苷酸序列处于P329GLALA人IgG1格式的TnC(18D4)重链

<400> 203

caggtgcaat tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60

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cctggacaag ggctcgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180

gcacagaagt tccagggcag ggtcaccatt actgcagaca aatccacgag cacagcctac 240

atggagctga gcagcctgag atctgaggac accgccgtgt attactgtgc gaaaggtaac 300

ttctacggtg gtctggacta ctggggccaa gggaccaccg tgaccgtctc ctcagctagc 360

accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 420

gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 480

tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 540

tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 600

tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaagttga gcccaaatct 660

tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aagctgcagg gggaccgtca 720

gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 780

acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 840

gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 900

taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 960

aagtgcaagg tctccaacaa agccctcggc gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 1020

aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc 1080

aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 1140

gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1200

tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1260

gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1320

agcctctccc tgtctccggg taaa 1344

<210> 204

<211> 1344

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 核苷酸序列处于P329GLALA人IgG1格式的TnC(11C7)重链

<400> 204

gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagcggta gtggtggtag cacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccaaagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaaacttct 300

ccgcgtgttc cgctggacta ctggggccaa ggaaccctgg tcaccgtctc gagtgctagc 360

accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 420

gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 480

tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 540

tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 600

tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaagttga gcccaaatct 660

tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aagctgcagg gggaccgtca 720

gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 780

acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 840

gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 900

taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 960

aagtgcaagg tctccaacaa agccctcggc gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 1020

aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc 1080

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agcctctccc tgtctccggg taaa 1344

<210> 205

<211> 448

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 处于P329GLALA人IgG1格式的TnC(18D4)重链

<400> 205

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

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Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

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Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Gly Asn Phe Tyr Gly Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

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His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser

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Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

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Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 206

<211> 448

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 处于P329GLALA人IgG1格式的TnC(11C7)重链

<400> 206

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Thr Ser Pro Arg Val Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 207

<211> 642

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 核苷酸序列LC1 (pCON323) OX40 (49B4) VL/CL

<400> 207

gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60

atcacttgcc gtgccagtca gagtattagt agctggttgg cctggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaagctcct gatctatgat gcctccagtt tggaaagtgg ggtcccatca 180

cgtttcagcg gcagtggatc cgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cttgcagcct 240

gatgattttg caacttatta ctgccaacag tatagttcgc agccgtatac gtttggccag 300

ggcaccaaag tcgagatcaa gcgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360

tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420

cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480

gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540

ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600

ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642

<210> 208

<211> 2079

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 核苷酸序列重链pETR14728 OX40 (49B4)

VHCH1_Fc_PGLALA_TnC (18D4) VHCL

<400> 208

caggtgcaat tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60

tcctgcaagg cctccggagg cacattcagc agctacgcta taagctgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggctcgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180

gcacagaagt tccagggcag ggtcaccatt actgcagaca aatccacgag cacagcctac 240

atggagctga gcagcctgag atctgaggac accgccgtgt attactgtgc gagagaatac 300

taccgtggtc cgtacgacta ctggggccaa gggaccaccg tgaccgtctc ctcagctagc 360

accaagggcc catccgtgtt ccctctggcc ccttccagca agtctacctc tggcggcaca 420

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tctggcgccc tgacatccgg cgtgcacacc tttccagctg tgctgcagtc ctccggcctg 540

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tgcaacgtga accacaagcc ctccaacacc aaggtggaca agaaggtgga acccaagtcc 660

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acctgcgtgg tggtggatgt gtcccacgag gaccctgaag tgaagttcaa ttggtacgtg 840

gacggcgtgg aagtgcacaa tgccaagacc aagcctagag aggaacagta caactccacc 900

taccgggtgg tgtccgtgct gaccgtgctg caccaggatt ggctgaacgg caaagagtac 960

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atctttggta cagcaaacta cgcacagaag ttccagggca gggtcaccat tactgcagac 1620

aaatccacga gcacagccta catggagctg agcagcctga gatctgagga caccgccgtg 1680

tattactgtg cgaaaggtaa cttctacggt ggtctggact actggggcca agggaccacc 1740

gtgaccgtct ccagcgcttc tgtggccgct ccctccgtgt tcatcttccc accttccgac 1800

gagcagctga agtccggcac tgcctctgtc gtgtgcctgc tgaacaactt ctaccctcgg 1860

gaagccaagg tgcagtggaa agtggataac gccctgcagt ccggcaactc ccaggaatcc 1920

gtgaccgagc aggactccaa ggacagcacc tactccctga gcagcaccct gaccctgtcc 1980

aaggccgact acgagaagca caaggtgtac gcctgtgaag tgacccacca gggcctgtcc 2040

agccccgtga ccaagtcctt caaccggggc gagtgctga 2079

<210> 209

<211> 642

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 核苷酸序列LC2 pETR14647 TnC (18D4) VLCH1

<400> 209

gacatccaga tgacccagtc tccatccacc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60

atcacttgcc gtgccagtca gagtattagt agctggttgg cctggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaagctcct gatctatgat gcctccagtt tggaaagtgg ggtcccatca 180

cgtttcagcg gcagtggatc cgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cttgcagcct 240

gatgattttg caacttatta ctgccaacag aataagaagt ttccttcggg gacgtttggc 300

cagggcacca aagtcgagat caagagctcc gctagcacca agggcccctc cgtgtttcct 360

ctggccccca gcagcaagag cacctctggc ggaacagccg ccctgggctg cctggtgaaa 420

gactacttcc ccgagcccgt gaccgtgtcc tggaactctg gcgccctgac cagcggcgtg 480

cacacctttc cagccgtgct gcagagcagc ggcctgtact ccctgagcag cgtggtgaca 540

gtgccctcca gcagcctggg cacccagacc tacatctgca acgtgaacca caagcccagc 600

aacaccaaag tggacaagaa ggtggaaccc aagagctgcg ac 642

<210> 210

<211> 2076

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 核苷酸序列重链pETR14727 OX40 (49B4)

VHCH1_Fc_PG/LALA_TnC (11C7) VHCL

<400> 210

caggtgcaat tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60

tcctgcaagg cctccggagg cacattcagc agctacgcta taagctgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggctcgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180

gcacagaagt tccagggcag ggtcaccatt actgcagaca aatccacgag cacagcctac 240

atggagctga gcagcctgag atctgaggac accgccgtgt attactgtgc gagagaatac 300

taccgtggtc cgtacgacta ctggggccaa gggaccaccg tgaccgtctc ctcagctagc 360

accaagggcc catccgtgtt ccctctggcc ccttccagca agtctacctc tggcggcaca 420

gccgctctgg gctgcctcgt gaaggactac ttccccgagc ctgtgacagt gtcctggaac 480

tctggcgccc tgacatccgg cgtgcacacc tttccagctg tgctgcagtc ctccggcctg 540

tactccctgt cctccgtcgt gacagtgccc tccagctctc tgggcaccca gacctacatt 600

tgcaacgtga accacaagcc ctccaacacc aaggtggaca agaaggtgga acccaagtcc 660

tgcgacaaga cccacacctg tcccccttgt cctgcccctg aagctgctgg cggccctagc 720

gtgttcctgt tccccccaaa gcccaaggac accctgatga tctcccggac ccccgaagtg 780

acctgcgtgg tggtggatgt gtcccacgag gaccctgaag tgaagttcaa ttggtacgtg 840

gacggcgtgg aagtgcacaa tgccaagacc aagcctagag aggaacagta caactccacc 900

taccgggtgg tgtccgtgct gaccgtgctg caccaggatt ggctgaacgg caaagagtac 960

aagtgcaagg tgtccaacaa ggccctggga gcccccatcg aaaagaccat ctccaaggcc 1020

aagggccagc ctcgcgagcc tcaggtgtac accctgcccc ctagcagaga tgagctgacc 1080

aagaaccagg tgtccctgac ctgtctcgtg aaaggcttct acccctccga tatcgccgtg 1140

gaatgggaga gcaacggcca gcccgagaac aactacaaga ccaccccccc tgtgctggac 1200

tccgacggct cattcttcct gtactctaag ctgacagtgg acaagtcccg gtggcagcag 1260

ggcaacgtgt tctcctgctc cgtgatgcac gaggccctgc acaaccacta cacccagaag 1320

tccctgtccc tgtctcccgg gggaggcggt ggatctggcg gaggcggatc cggtggtggc 1380

ggttccgggg gcggtggatc ggaggtgcaa ttgttggagt ctgggggagg cttggtacag 1440

cctggggggt ccctgagact ctcctgtgca gcctccggat tcacctttag cagttatgcc 1500

atgagctggg tccgccaggc tccagggaag gggctggagt gggtctcagc tattagcggt 1560

agtggtggta gcacatacta cgcagactcc gtgaagggcc ggttcaccat ctccaaagac 1620

aattccaaga acacgctgta tctgcagatg aacagcctga gagccgagga cacggccgta 1680

tattactgtg cgaaaacttc tccgcgtgtt ccgctggact actggggcca aggaaccctg 1740

gtcaccgtct cgagcgcttc tgtggccgct ccctccgtgt tcatcttccc accttccgac 1800

gagcagctga agtccggcac tgcctctgtc gtgtgcctgc tgaacaactt ctaccctcgg 1860

gaagccaagg tgcagtggaa agtggataac gccctgcagt ccggcaactc ccaggaatcc 1920

gtgaccgagc aggactccaa ggacagcacc tactccctga gcagcaccct gaccctgtcc 1980

aaggccgact acgagaagca caaggtgtac gcctgtgaag tgacccacca gggcctgtcc 2040

agccccgtga ccaagtcctt caaccggggc gagtgc 2076

<210> 211

<211> 643

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 核苷酸序列LC2 pETR14648 TnC (11C7) VLCH1

<400> 211

tcgtctgagc tgactcagga ccctgctgtg tctgtggcct tgggacagac agtcagggtc 60

acatgccaag gagacagcct cagaagttat tatgcaagct ggtaccagca gaagccagga 120

caggcccctg tacttgtcat ctatggtaaa aacaaccggc cctcagggat cccagaccga 180

ttctctggct ccagctcagg aaacacagct tccttgacca tcactggggc tcaggcggaa 240

gatgaggctg actattactg taactccatt aatagtactc gtaatgaggt attcggcgga 300

gggaccaagc tgaccgtcct aagctccgct agcaccaagg gcccctccgt gtttcctctg 360

gcccccagca gcaagagcac ctctggcgga acagccgccc tgggctgcct ggtgaaagac 420

tacttccccg agcccgtgac cgtgtcctgg aactctggcg ccctgaccag cggcgtgcac 480

acctttccag ccgtgctgca gagcagcggc ctgtactccc tgagcagcgt ggtgacagtg 540

ccctccagca gcctgggcac ccagacctac atctgcaacg tgaaccacaa gcccagcaac 600

accaaagtgg acaagaaggt ggaacccaag agctgcgact gat 643

<210> 212

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LC1 (pCON323) OX40 (49B4) VL/CL

<400> 212

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Gln Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 213

<211> 692

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链pETR14728 OX40 (49B4) VHCH1_Fc_PG/LALA_TnC (18D4)

VHCL

<400> 213

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Tyr Tyr Arg Gly Pro Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly

435 440 445

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

450 455 460

Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys

465 470 475 480

Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe

485 490 495

Ser Ser Tyr Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu

500 505 510

Glu Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala

515 520 525

Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser

530 535 540

Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val

545 550 555 560

Tyr Tyr Cys Ala Lys Gly Asn Phe Tyr Gly Gly Leu Asp Tyr Trp Gly

565 570 575

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser

580 585 590

Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala

595 600 605

Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val

610 615 620

Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser

625 630 635 640

Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr

645 650 655

Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys

660 665 670

Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn

675 680 685

Arg Gly Glu Cys

690

<210> 214

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LC2 pETR14647 TnC (18D4) VLCH1

<400> 214

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Lys Lys Phe Pro Ser

85 90 95

Gly Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser Ala Ser

100 105 110

Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr

115 120 125

Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro

130 135 140

Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val

145 150 155 160

His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile

180 185 190

Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val

195 200 205

Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210

<210> 215

<211> 692

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链pETR14727 OX40 (49B4) VHCH1_Fc_PG/LALA_TnC (11C7)

VHCL

<400> 215

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Tyr Tyr Arg Gly Pro Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser

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Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly

435 440 445

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

450 455 460

Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

465 470 475 480

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

485 490 495

Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

500 505 510

Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala

515 520 525

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn

530 535 540

Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val

545 550 555 560

Tyr Tyr Cys Ala Lys Thr Ser Pro Arg Val Pro Leu Asp Tyr Trp Gly

565 570 575

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser

580 585 590

Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala

595 600 605

Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val

610 615 620

Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser

625 630 635 640

Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr

645 650 655

Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys

660 665 670

Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn

675 680 685

Arg Gly Glu Cys

690

<210> 216

<211> 213

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LC2 pETR14648 TnC (11C7) VLCH1

<400> 216

Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln

1 5 10 15

Thr Val Arg Val Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala

20 25 30

Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr

35 40 45

Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Ile Asn Ser Thr Arg Asn Glu

85 90 95

Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Ser Ala Ser Thr

100 105 110

Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser

115 120 125

Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu

130 135 140

Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His

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Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser

165 170 175

Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys

180 185 190

Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu

195 200 205

Pro Lys Ser Cys Asp

210

<210> 217

<211> 2421

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 核苷酸序列HC1 pETR15193 OX40 (49B4)

VHCH1_VHCH1_Fc_穴_PG/LALA_TnC (18D4) VL

<400> 217

caggtgcaat tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60

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gcacagaagt tccagggcag ggtcaccatt actgcagaca aatccacgag cacagcctac 240

atggagctga gcagcctgag atctgaggac accgccgtgt attactgtgc gagagaatac 300

taccgtggtc cgtacgacta ctggggccaa gggaccaccg tgaccgtctc ctcagctagc 360

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gccgccctgg gctgcctcgt gaaggactac tttcccgagc ccgtgaccgt gtcctggaac 480

tctggcgctc tgacaagcgg cgtgcacacc tttccagccg tgctgcagag cagcggcctg 540

tactctctga gcagcgtcgt gacagtgccc agcagctctc tgggcaccca gacctacatc 600

tgcaacgtga accacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaggtgga acccaagagc 660

tgcgacggcg gagggggatc tggcggcgga ggatcccagg tgcaattggt gcagtctggg 720

gctgaggtga agaagcctgg gtcctcggtg aaggtctcct gcaaggcctc cggaggcaca 780

ttcagcagct acgctataag ctgggtgcga caggcccctg gacaagggct cgagtggatg 840

ggagggatca tccctatctt tggtacagca aactacgcac agaagttcca gggcagggtc 900

accattactg cagacaaatc cacgagcaca gcctacatgg agctgagcag cctgagatct 960

gaggacaccg ccgtgtatta ctgtgcgaga gaatactacc gtggtccgta cgactactgg 1020

ggccaaggga ccaccgtgac cgtctcctca gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc 1080

ctggcaccct cctccaagag cacctctggg ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag 1140

gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg 1200

cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc 1260

gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc tacatctgca acgtgaatca caagcccagc 1320

aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca 1380

ccgtgcccag cacctgaagc tgcaggggga ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc 1440

aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc 1500

cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc 1560

aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc 1620

gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc 1680

ctcggcgccc ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag 1740

gtgtgcaccc tgcccccatc ccgggatgag ctgaccaaga accaggtcag cctctcgtgc 1800

gcagtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg 1860

gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctcgtg 1920

agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg 1980

atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tccgggtgga 2040

ggcggcggaa gcggaggagg aggatccggc ggcggaggtt ccggaggcgg tggatcggac 2100

atccagatga cccagtctcc atccaccctg tctgcatctg taggagaccg tgtcaccatc 2160

acttgccgtg ccagtcagag tattagtagc tggttggcct ggtatcagca gaaaccaggg 2220

aaagccccta agctcctgat ctatgatgcc tccagtttgg aaagtggggt cccatcacgt 2280

ttcagcggca gtggatccgg gacagaattc actctcacca tcagcagctt gcagcctgat 2340

gattttgcaa cttattactg ccaacagaat aagaagtttc cttcggggac gtttggccag 2400

ggcaccaaag tcgagatcaa g 2421

<210> 218

<211> 2451

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 核苷酸序列HC2 pETR15194 OX40 (49B4)

VHCH1_VHCH1_Fc_节_PG/LALA_ TnC (18D4) VH

<400> 218

caggtgcaat tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60

tcctgcaagg cctccggagg cacattcagc agctacgcta taagctgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggctcgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180

gcacagaagt tccagggcag ggtcaccatt actgcagaca aatccacgag cacagcctac 240

atggagctga gcagcctgag atctgaggac accgccgtgt attactgtgc gagagaatac 300

taccgtggtc cgtacgacta ctggggccaa gggaccaccg tgaccgtctc ctcagctagc 360

acaaagggac ctagcgtgtt ccccctggcc cccagcagca agtctacatc tggcggaaca 420

gccgccctgg gctgcctcgt gaaggactac tttcccgagc ccgtgaccgt gtcctggaac 480

tctggcgctc tgacaagcgg cgtgcacacc tttccagccg tgctgcagag cagcggcctg 540

tactctctga gcagcgtcgt gacagtgccc agcagctctc tgggcaccca gacctacatc 600

tgcaacgtga accacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaggtgga acccaagagc 660

tgcgacggcg gagggggatc tggcggcgga ggatcccagg tgcaattggt gcagtctggg 720

gctgaggtga agaagcctgg gtcctcggtg aaggtctcct gcaaggcctc cggaggcaca 780

ttcagcagct acgctataag ctgggtgcga caggcccctg gacaagggct cgagtggatg 840

ggagggatca tccctatctt tggtacagca aactacgcac agaagttcca gggcagggtc 900

accattactg cagacaaatc cacgagcaca gcctacatgg agctgagcag cctgagatct 960

gaggacaccg ccgtgtatta ctgtgcgaga gaatactacc gtggtccgta cgactactgg 1020

ggccaaggga ccaccgtgac cgtctcctca gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc 1080

ctggcaccct cctccaagag cacctctggg ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag 1140

gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg 1200

cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc 1260

gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc tacatctgca acgtgaatca caagcccagc 1320

aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca 1380

ccgtgcccag cacctgaagc tgcaggggga ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc 1440

aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc 1500

cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc 1560

aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc 1620

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ctcggcgccc ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag 1740

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ctggtcaagg gcttctaccc cagcgatatc gccgtggagt gggagagcaa cggccagcct 1860

gagaacaact acaagaccac cccccctgtg ctggacagcg acggcagctt cttcctgtac 1920

tccaaactga ccgtggacaa gagccggtgg cagcagggca acgtgttcag ctgcagcgtg 1980

atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc cagaagtccc tgagcctgag ccccggcgga 2040

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tgcaaggcct ccggaggcac attcagcagc tacgctataa gctgggtgcg acaggcccct 2220

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tacggtggtc tggactactg gggccaaggg accacagtga ccgtaagctc c 2451

<210> 219

<211> 642

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 核苷酸序列LC1 pETR14912 OX40 (49B4) VLCL + 电荷

<400> 219

gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60

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gatgattttg caacttatta ctgccaacag tatagttcgc agccgtatac gtttggccag 300

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gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540

ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600

ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642

<210> 220

<211> 2736

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 核苷酸序列HC pETR15206 OX40

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gcccagaaat tccagggcag agtgaccatc accgccgaca agagcaccag caccgcctac 240

atggaactga gcagcctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgcgc cagagagtac 300

tacagaggcc cctacgacta ctggggccag ggcacaaccg tgaccgtgtc tagcgccagc 360

acaaagggcc ccagcgtgtt ccctctggcc cctagcagca agagcacatc tggcggaaca 420

gccgccctgg gctgcctggt ggaagattac ttccccgagc ccgtgacagt gtcctggaac 480

tctggcgccc tgacaagcgg cgtgcacacc tttccagccg tgctgcagag cagcggcctg 540

tactcactgt ccagcgtcgt gactgtgccc agcagcagcc tgggaaccca gacctacatc 600

tgcaacgtga accacaagcc cagcaacacc aaggtggacg agaaggtgga acccaagagc 660

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acaattacag ccgacaagtc cacctctaca gcttatatgg aactgtcctc cctgcgctcc 960

gaggatacag ctgtgtatta ttgtgcccgc gagtactacc ggggacctta cgattattgg 1020

ggacagggaa ccacagtgac tgtgtcctcc gctagcacca agggaccttc cgtgtttccc 1080

ctggctccca gctccaagtc tacctctggg ggcacagctg ctctgggatg tctggtggaa 1140

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cacacattcc ctgctgtgct gcagtcctcc ggcctgtata gcctgagcag cgtcgtgacc 1260

gtgccttcca gctctctggg cacacagaca tatatctgta atgtgaatca caaaccctct 1320

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aaggacaccc tgatgatcag ccggaccccc gaagtgacct gcgtggtggt ggatgtgtcc 1500

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gtgctgcacc aggactggct gaacggcaaa gagtacaagt gcaaggtgtc caacaaggcc 1680

ctgggagccc ccatcgagaa aaccatcagc aaggccaagg gccagccccg cgaacctcag 1740

gtgtacaccc tgcccccaag cagggacgag ctgaccaaga accaggtgtc cctgacctgt 1800

ctcgtgaagg gcttctaccc ctccgatatc gccgtggaat gggagagcaa cggccagccc 1860

gagaacaact acaagaccac cccccctgtg ctggacagcg acggctcatt cttcctgtac 1920

tccaagctga ccgtggacaa gagccggtgg cagcagggca acgtgttcag ctgcagcgtg 1980

atgcacgagg ccctgcacaa ccactacaca cagaagtctc tgagcctgag ccctggcgga 2040

gggggaggat ctgggggagg cggaagtggg ggagggggtt ccggaggcgg tggatcggac 2100

atccagatga cccagtctcc atccaccctg tctgcatctg taggagaccg tgtcaccatc 2160

acttgccgtg ccagtcagag tattagtagc tggttggcct ggtatcagca gaaaccaggg 2220

aaagccccta agctcctgat ctatgatgcc tccagtttgg aaagtggggt cccatcacgt 2280

ttcagcggca gtggatccgg gacagaattc actctcacca tcagcagctt gcagcctgat 2340

gattttgcaa cttattactg ccaacagaat aagaagtttc cttcggggac gtttggccag 2400

ggcaccaaag tcgagatcaa gtctagcgct tccaccaagg gcccctcagt gttcccactg 2460

gcaccatcca gcaagtccac aagcggagga accgccgctc tgggctgtct cgtgaaagac 2520

tactttccag agccagtgac cgtgtcctgg aatagtggcg ctctgacttc tggcgtgcac 2580

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<210> 221

<211> 675

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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VL

<400> 222

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Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

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Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

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Ala Arg Glu Tyr Tyr Arg Gly Pro Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

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Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

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Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

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Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

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Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

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Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

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Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly Gly

210 215 220

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly

225 230 235 240

Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala

245 250 255

Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala

260 265 270

Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly

275 280 285

Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala

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Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser

305 310 315 320

Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Tyr Tyr Arg Gly Pro

325 330 335

Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser

340 345 350

Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr

355 360 365

Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro

370 375 380

Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val

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His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser

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Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile

420 425 430

Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val

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Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

450 455 460

Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

465 470 475 480

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

485 490 495

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

500 505 510

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

515 520 525

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

530 535 540

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

545 550 555 560

Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

565 570 575

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Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

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Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val

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Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

645 650 655

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

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Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

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Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr

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Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile

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Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln

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<211> 817

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

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290 295 300

Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser

305 310 315 320

Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Tyr Tyr Arg Gly Pro

325 330 335

Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser

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Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val

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Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

485 490 495

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

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Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

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Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

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Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

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Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

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580 585 590

Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

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<213> 人工序列

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<223> LC1 pETR14912 OX40 (49B4) VLCL + 电荷

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210

<210> 225

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HC pETR15206 OX40 (49B4)VHCH1EE_OX40(49B4)VHCH1EE_Fc_PG/LALA_TnC

(18D4)VLCH1

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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

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Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

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Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

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Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

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Ala Arg Glu Tyr Tyr Arg Gly Pro Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

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260 265 270

Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly

275 280 285

Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala

290 295 300

Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser

305 310 315 320

Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Tyr Tyr Arg Gly Pro

325 330 335

Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser

340 345 350

Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr

355 360 365

Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro

370 375 380

Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val

385 390 395 400

His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser

405 410 415

Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile

420 425 430

Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val

435 440 445

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

450 455 460

Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

465 470 475 480

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

485 490 495

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

500 505 510

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

515 520 525

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

530 535 540

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

545 550 555 560

Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

565 570 575

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

580 585 590

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

595 600 605

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

610 615 620

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

625 630 635 640

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

645 650 655

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

660 665 670

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

675 680 685

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr

690 695 700

Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile

705 710 715 720

Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln

725 730 735

Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser

740 745 750

Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr

755 760 765

Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr

770 775 780

Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Lys Lys Phe Pro Ser Gly Thr Phe Gly Gln

785 790 795 800

Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

805 810 815

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

820 825 830

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

835 840 845

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

850 855 860

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

865 870 875 880

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

885 890 895

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

900 905 910

<210> 226

<211> 225

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LC2 pETR15202 TnC (18D4) VHCL

<400> 226

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Gly Asn Phe Tyr Gly Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile

115 120 125

Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val

130 135 140

Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys

145 150 155 160

Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu

165 170 175

Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu

180 185 190

Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr

195 200 205

His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu

210 215 220

Cys

225

Claims

1.一种双特异性抗原结合分子, 其包含

(a) 至少两个能够特异性结合OX40的Fab片段, 其包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH), 该VL包含如SEQ ID NO:13中所列的CDR-L1, 如SEQ ID NO:16中所列的CDR-L2, 和如SEQ ID NO:20中所列的CDR-L3, 该VH包含如SEQ ID NO:2中所列的CDR-H1,如SEQ ID NO:4中所列的CDR-H2, 和如SEQ ID NO:7中所列的CDR-H3, 连接至Fc区, 和

(b) 至少一个能够特异性结合生腱蛋白C (TnC)的模块, 其包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH), (i)该VL包含如SEQ ID NO:46中所列的CDR-L1, 如SEQ ID NO:48中所列的CDR-L2, 和如SEQ ID NO:50中所列的CDR-L3, 该VH包含如SEQ ID NO:40中所列的CDR-H1, 如SEQ ID NO:42中所列的CDR-H2, 和如SEQ ID NO:44中所列的CDR-H3, 或,(ii)该VL包含如SEQ ID NO:47中所列的CDR-L1, 如SEQ ID NO:49中所列的CDR-L2, 和如SEQ ID NO:51中所列的CDR-L3, 该VH包含如SEQ ID NO:41中所列的CDR-H1, 如SEQ IDNO:43中所列的CDR-H2, 和如SEQ ID NO:45中所列的CDR-H3, 连接至Fc区的C端, 和

(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc区, 其中该Fc区是人IgG1亚类的, 具有氨基酸突变L234A, L235A和P329G, 编号方式依照Kabat EU索引。

2.权利要求1的双特异性抗原结合分子, 其中该能够特异性结合OX40的Fab片段包含如SEQ ID NO:27中所列的VH和如SEQ ID NO:28中所列的VL。

3.权利要求1的双特异性抗原结合分子, 其中该能够特异性结合TnC的模块包含(i)如SEQ ID NO:52中所列的VH和如SEQ ID NO:53中所列的VL, 或, (ii)如SEQ ID NO:54中所列的VH和如SEQ ID NO:55中所列的VL。

4.权利要求1的双特异性抗原结合分子, 其包含

(a)至少两个能够特异性结合OX40的Fab片段, 其包含如SEQ ID NO: 27中所列的VH和如SEQ ID NO: 28中所列的VL, 和

(b)至少一个能够特异性结合TnC的模块, 其包含

(i)如SEQ ID NO:52中所列的VH和如SEQ ID NO:53中所列的VL, 或

(ii) 如SEQ ID NO:54中所列的VH和如SEQ ID NO:55中所列的VL。

5.权利要求1的双特异性抗原结合分子, 其中该Fc区包含促进Fc区的第一和第二亚基联合的修饰。

6.权利要求2的双特异性抗原结合分子, 其中该Fc区包含促进Fc区的第一和第二亚基联合的修饰。

7.权利要求3的双特异性抗原结合分子, 其中该Fc区包含促进Fc区的第一和第二亚基联合的修饰。

8.权利要求4的双特异性抗原结合分子, 其中该Fc区包含促进Fc区的第一和第二亚基联合的修饰。

9.权利要求1至8任一项的双特异性抗原结合分子, 其中该双特异性抗原结合分子包含

(a)两条重链, 每条重链包含能够特异性结合OX40的Fab片段的VH和CH1域, 和Fc区亚基,

(b)两条轻链, 每条轻链包含能够特异性结合OX40的Fab片段的VL和CL域,

(c)两个能够特异性结合TnC的Fab片段, 其中该Fab片段之一连接至(a)的两条重链之一的C端, 且该Fab片段之另一连接至(a)的两条重链之另一的C端。

10.权利要求1至8任一项的双特异性抗原结合分子, 其中该双特异性抗原结合分子包含四个能够特异性结合OX40的Fab片段。

11.权利要求10的双特异性抗原结合分子, 其中该双特异性抗原结合分子包含

(a)两条重链, 每条重链包含能够特异性结合OX40的Fab片段的两个VH域和两个CH1域和Fc区亚基,

(b)四条轻链, 每条轻链包含能够特异性结合OX40的Fab片段的VL和CL域, 和

(c)能够特异性结合TnC的模块的VH和VL, 其中该VH连接至(a)的两条重链之一的C端,且其中该VL连接至(a)的两条重链之另一的C端。

12.权利要求10的双特异性抗原结合分子, 其中该双特异性抗原结合分子包含

13.一种双特异性抗原结合分子, 其选自由下述各项组成的组:

(i) 一种双特异性抗原结合分子, 其包含每条包含SEQ ID NO:213的氨基酸序列的两条重链, 每条包含SEQ ID NO:212的氨基酸序列的两条轻链, 和每条包含SEQ ID NO:214的氨基酸序列的两条轻链,

(ii)一种双特异性抗原结合分子, 其包含每条包含SEQ ID NO:215的氨基酸序列的两条重链, 每条包含SEQ ID NO:212的氨基酸序列的两条轻链, 和每条包含SEQ ID NO:216的氨基酸序列的两条轻链,

(iii)一种双特异性抗原结合分子, 其包含包含SEQ ID NO:222的氨基酸序列的第一重链, 包含SEQ ID NO:223的氨基酸序列的第二重链, 和每条包含SEQ ID NO:212的氨基酸序列的四条轻链, 和

(iv)一种双特异性抗原结合分子, 其包含每条包含SEQ ID NO:225的氨基酸序列的两条重链, 每条包含SEQ ID NO:224的氨基酸序列的四条轻链, 和每条包含SEQ ID NO:226的氨基酸序列的两条轻链。

14.一种多核苷酸, 其编码权利要求1至13任一项的双特异性抗原结合分子。

15.一种表达载体, 其包含权利要求14的多核苷酸。

16.一种宿主细胞, 其包含权利要求14的多核苷酸或权利要求15的表达载体。

17.一种生成双特异性抗原结合分子的方法, 其包含在适合于该双特异性抗原结合分子表达的条件下培养权利要求16的宿主细胞, 并分离该双特异性抗原结合分子。

18.一种药物组合物, 其包含权利要求1至13任一项的双特异性抗原结合分子和至少一种药学可接受赋形剂。

19.权利要求1至13任一项的双特异性抗原结合分子或权利要求18的药物组合物在制造用于

(i) 刺激T细胞应答, 或

(ii)支持激活的T细胞的存活的药物中的用途。

20.权利要求1至13任一项的双特异性抗原结合分子或权利要求18的药物组合物在制造用于治疗TnC表达性癌症的药物中的用途。