MX2012009318A - Metodos y compuestos para el crecimiento muscular. - Google Patents

Metodos y compuestos para el crecimiento muscular.

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Abstract

La presente descripción se refiere al tratamiento de los trastornos asociados con la consunción muscular en un paciente, utilizando una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista de Fbxo40, en donde el antagonista reduce la expresión, el nivel o la actividad del Fbxo40. El antagonista de Fbxo40 aumenta la masa muscular, o previene, limita o reduce la pérdida de masa muscular, en el paciente. El antagonista de Fbxo40 puede ser un compuesto de bajo peso molecular (LMW), una proteína, un anticuerpo, o un ácido nucleico inhibidor, tal como un siARN. La presente descripción también se refiere a métodos de rastreo de los antagonistas de Fbxo40, y a métodos para diagnosticar o monitorear los niveles de mantenimiento, pérdida o aumento de la masa muscular.

Description

MÉTODOS Y COMPUESTOS PARA EL CRECIMIENTO MUSCULAR CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente divulgación se refiere a métodos para el tratamiento de trastornos asociados con la consunción muscular utilizando una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista de Fbxo40, en donde el antagonista reduce la expresión, el nivel o la actividad del Fbxo40. El antagonista de Fbxo40 aumenta la masa muscular, o previene, limita o reduce la pérdida de la masa muscular en un paciente con, o en riesgo de tener, un trastorno asociado con la consunción muscular. El antagonista de Fbxo40 puede comprender un compuesto de bajo peso molecular (LMW), una proteína, un anticuerpo, y/o un ácido nucleico inhibidor, tal como un siARN. La presente descripción también abarca métodos de rastreo de composiciones para determinar su capacidad para antagonizar Fbxo40 y aumentar la masa muscular, o para prevenir la pérdida de la masa muscular en un individuo. La presente descripción abarca además métodos de diagnóstico para detectar Fbxo40, en donde un nivel elevado de Fbxo40 está asociado con un trastorno de consunción muscular, o con un riesgo de tener el mismo.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La pérdida, consunción o atrofia muscular está asociada con muchos trastornos diferentes. La sarcopenia es una pérdida muscular relacionada con la edad. La caquexia es una grave consunción corporal, asociada con pérdida de peso, anorexia, astenia, anemia y consunción muscular. La disminución de la masa e integ ridad muscular también está asociada con síndrome de consunción por S I DA, desenervación , lesión , cánceres , y otros diferentes trastornos.
Se han sugerido varios tipos de tratamiento para aumentar la masa muscular, i ncluyendo aquéllos que se di rigen a los componentes de la senda de señales de IG F 1 , que culmina en la s íntesis de proteína y en la hipertrofia muscular. Si n embargo, muchos de los componentes de esta senda también funcionan en otras sendas, o se distribuyen en tejidos diferentes de los tejidos musculares . Esto puede hacer dif ícil el desarrollo de medicamentos que antagonicen estos componentes.
Existe la necesidad de un n uevo tratamiento di rigido específico para la pérdida muscular. Esta terapia puede operar sola, o en concierto con las terapias disponibles.
BR EV E DESCRI PCIÓN DE LA I NVENCIÓN La presente divulgación proporciona el uso de antagon istas para Fbxo40 para aumentar la masa muscular en individuos que lo necesiten. La presente descripción también proporciona métodos para rastrear composiciones con el fi n de determi nar su capacidad para antagonizar Fbxo40 y aumentar o mantener la masa muscular, o para prevenir, limitar o reducir la pérdida de la misma. La presente descripción abarca además métodos de diagnóstico para detectar Fbxo40 , en donde un nivel elevado de Fbxo40 está asociado con un trastorno de consunción muscular, o con un riesgo de tene r el mismo.
Como se muestra en la Figura 1, Fbxo40 es un componente en la senda de señalización dé IGF1, que promueve la hipertrofia muscular. IGF1, por medio de su receptor, activa IRS1 (sustrato receptor de insulina 1), que conduce, a través de distintos pasos, a la síntesis de proteína y al crecimiento muscular. Fbxo40 antagoniza esta función al facilitar la ubiquitinación y degradación de IRS1. La inhibición de Fbxo40 permite tener una actividad continua de IGF1 e IRS1, que mejora la hipertrofia muscular.
A diferencia de muchos de los otros componentes de la senda de IGF1, se sabe que Fbxo40 solamente participa en esta senda. En adición, a diferencia de muchos otros componentes de la senda de IGF1, Fbxo40 sólo se expresa altamente en el corazón y en los músculos esqueléticos. Por consiguiente, la inhibición de Fbxo40 proporciona un planteamiento dirigido específico para aumentar la masa muscular. Adicionalmente, la inhibición de Fbxo40 permite que se sostenga la senda, potenciando por consiguiente la capacidad de IGF1 para promover el crecimiento muscular. En resumen, la administración de los inhibidores de Fbxo40 puede actuar sola o en conjunto con otras terapias (incluyendo, pero no limitándose a, la administración de IGF1) para facilitar la hipertrofia muscular.
En una modalidad específica particular, la presente divulgación abarca métodos y composiciones relacionadas con los antagonistas para Fbxo40, los cuales mejoran el crecimiento muscular, o para prevenir, limitar o reducir la pérdida del mismo.
En una modalidad específica particular, la presente divulgación abarca métodos para la identificación de composiciones que comprendan un antagonista para Fbxo40, en donde la composición sea útil para mejorar o mantener la masa muscular, o para prevenir, limitar o reducir la pérdida de la misma.
En otra modalidad específica particular, la presente divulgación también abarca métodos de diagnóstico para detectar Fbxo40, en donde un nivel elevado de Fbxo40 está asociado con un trastorno de consunción muscular, o con un riesgo de tener el mismo.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 diagrama la senda de señalización de IGF1, que conduce a la síntesis de proteína y a la hipertrofia muscular.
La Figura 2 es un dibujo que muestra la configuración física de IRS1 y del complejo de SCFFb o40. El complejo comprende Fbxo40, Skp1, Cullin 1 , y Rbx1. El enlace de Fbxo40 al IRS1 fosforilado introduce al IRS1 en el complejo, en donde es ubiquitinado por Rbx1.
La Figura 3 muestra que Fbxo40 se expresa altamente en el músculo cardíaco y en el músculo esquelético, pero no en el tejido adiposo, vejiga, cerebro, cérvix, colon, esófago, riñon, hígado, pulmón, ovario, placenta, próstata, intestino delgado, bazo, testículos, timo, tiroides, o tráquea.
Las Figuras 4A, 4B, y 4E demuestran que, en los miotubos C2C12, IRS1 se degrada después del tratamiento con IGF1. Las Figuras 4C y 4D demuestran que, en los miotubos C2C12, IRS1 se ubiquitina, y esta ubiquitinación aumenta con el tratamiento con IGF1.
Las Figuras 5A a 5G muestran que IRS1 es el objetivo del complejo Skp1 -Culinl -Rbx1 , pero no del complejo que contiene Culin2.
Las Figuras 6A a 6D muestran que Fbxo40 se asocia con el complejo Skp1 -Culinl -Rbx1 y se dirige a IRS1 para la degradación.
Las Figuras 7A y 7B muestran que la eliminación genética parcial de Rbx1 potencia la acción hipertrófica de IGF1 en los miotubos C2C12.
La Figura 8A muestra que la expresión de Fbxo40 es detectable en las etapas posteriores de la diferenciación.
La Figura 9A muestra que la eliminación genética de Fbxo40 da como resultado la generación de miotubos dramáticamente más grandes, incluso sin un tratamiento con IGF1 adicional.
La Figura 9B muestra la cuantificación del diámetro del miotubo después de la eliminación genética de Fbxo40.
La Figura 9C muestra que, cuando IRS1 se elimina genéticamente junto con Fbxo40, se presenta un aumento de aproximadamente el 20 por ciento en el diámetro del miotubo.
La Figura 9D muestra que la proteína IRS1 es más alta en las muestras electroporadas con siRbxl y siFbxo40 que en las muestras de siCON.
La Figura 9E muestra que también se observan fibras musculares más grandes con la eliminación genética de Fbxo40, comparándose con las piernas contralaterales electroporadas con siCON .
D ESC R I PCI Ó N DETALLA DA D E LA I N VE NCI Ó N La presente divulgación se basa en la idea de que la antagonización de Fbxo40 aumenta la masa muscular y/o previene, limita o reduce la pérdida de la masa muscular. Proporcionamos en la presente un antagonista de Fbxo40 , el cual se puede utilizar para tratar sarcopenia, caquexia y otros trastornos asociados con la pérdida muscular, tales como aquéllos enlistados en la presente , y aquéllos que son conocidos o que lleguen a ser conocidos en la materia. Este antagonista puede ser un compuesto de bajo peso molecular (LMW) , un anticuerpo, o un ácido nucleico inhibidor, tal como un siAR N , o cualquier otra composición q ue antagonice Fbxo40. El antagonista de Fbxo40 aumenta la masa muscular, o previene , limita o reduce la pérdida de la masa m uscular. El antagonista para Fbxo40 se puede administrar solo o en conjunto con otras terapias. La presente divulgación también abarca métodos de rastreo de composiciones para determinar su capacidad para antagonizar Fbxo40 y aumentar la masa muscular, o para prevenir, limitar o reduci r la pérdida de la masa muscular. La presente divulgación también abarca métodos de diagnóstico para detectar Fbxo40, en donde un nivel elevado de Fbxo40 está asociado con un trastorno de consunción m uscular, o con un riesgo de tene r el mismo.
U n paciente humano con un trastorno asociado con la consunción muscular sería capaz de mantener la masa muscular, o podría tener un nivel más alto de masa y/o fuerza muscular como un resultado, directo o indirecto, de que se le administre el antagonista de Fbxo40. El antagonista también se puede administrar a animales no humanos, tales como, por ejemplo, reses, cerdos, pollos, perros, gatos, y otros animales, para aumentar su masa muscular.
Sin desear limitarse a una teoría en particular, los inventores sugieren que Fbxo40 media una actividad a través del contacto directo con IRS1 (sustrato receptor de insulina 1), como se muestra en la Figura 2. En la senda de señalización de IGF1, la activación de IRS1 conduce al crecimiento muscular. Fbxo40 antagoniza esta actividad. Fbxo40 pone al IRS1 en asociación con el complejo SC FFbxo4o (e] cua| comprende Fbxo40, Skp1, Culinl y Rbx1). En este complejo, Rbx1 ubiquitina el IRS1, marcándolo para la degradación. La inhibición de Fbxo40 previene la ubiquitinación de IRS1, permitiendo que el IRS1 continúe activando el crecimiento muscular.
De conformidad con lo anterior, en una modalidad específica particular, la presente divulgación abarca un método para aumentar la masa muscular, o para prevenir la pérdida de la masa muscular en un individuo, el cual comprende administrar al individuo, una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista de Fbxo40. En una modalidad, la presente descripción proporciona antagonistas de Fbxo40 para utilizarse en terapia o como un medicamento para utilizarse en el tratamiento de un trastorno patológico.
En una modalidad específica particular, la presente divulgación abarca un método para el rastreo de composiciones con el fin de determi nar su capacidad para aumentar la masa muscular, o para preveni r, l i mitar o reduci r la pérdida de la masa m uscular en un individuo , el cual comprende : (a) aseverar el nivel o la actividad del Fbxo40 en una célula del individuo, (b) opcionalmente , tratar la célula con una composición q ue comprenda un antagonista para Fbxo40, y (c) opcionalmente , aseverar el nivel o la actividad del Fbxo40 en la célula nuevamente , en donde un nivel elevado de Fbxo40 en relación con un control es una indicación de que el sujeto tiene o está en riesgo de desarrollar un trastorno de consunción muscular, y en donde la capacidad de la composición para disminuir el nivel o la actividad del Fbxo40 está correlacionada con la capacidad para au mentar la masa muscular, o para prevenir, limitar o reducir la pérdida de la masa muscular en un individuo.
En una modalidad de este método, el i ndividuo padece un trastorno asociado con la consunción muscular, seleccionado a partir de : caquexia, cáncer, pérdida de peso inducida por un tumor, sepsis, i nsuficiencia card íaca crónica, artritis reumatoide, síndrome de inmunodeficiencia adqui rida, sarcopenia, diabetes, hipertensión , altos niveles de colesterol en suero, altos niveles de triglicéridos , enfermedad de Parki nson, insomnio, adicción a drogas, dolor, insomnio , hipoglicemia, función hepática comprometida, cirrosis, trastornos de la ves ícula biliar, corea, disquinesia, trastorno renal , y/o uremia.
En una modalidad de este método, el antagonista reduce el nivel , la expresión o la actividad del Fbxo40.
En una modalidad específica particular, la presente divulgación abarca un método para diagnosticar o monitorear el nivel de aumento o mantenimiento de la masa muscular en un individuo, el cual comprende : (a) aseverar el nivel o la actividad del Fbxo40 en una célula del individuo, (b) opcionalmente , tratar la célula con una composición que comprenda un antagonista para Fbxo40, y (c) opcionalmente , aseverar el nivel o la actividad del Fbxo40 en la célula nuevamente , en donde un nivel elevado de Fbxo40 en relación con un control es una indicación de que el sujeto tiene o está en riesgo de desarrollar un trastorno de consu nción m uscular, y en donde la capacidad de la composición para disminui r el nivel o la actividad del Fbxo40 está correlacionada con la capacidad para aumentar la masa muscular, o para preveni r, limitar o reduci r la pérdida de la masa muscular en un individuo.
En una modalidad de este método , el individuo padece un trastorno asociado con la consunción muscular, seleccionado a parti r de: caquexia, cáncer, pérdida de peso inducida por un tumor, sepsis, insuficiencia card íaca crónica, artritis reumatoide, síndrome de inmunodeficiencia adqui rida, sarcopenia, diabetes , hipertensión , altos niveles de colesterol en suero, altos niveles de triglicéridos, enfermedad de Parkinson , insomnio, adicción a drogas, dolor, insomnio , hipoglicemia, función hepática comprometida, ci rrosis, trastornos de la ves ícula biliar, corea, disquinesia, trastorno renal, y/o u remia.
En una modalidad de este método, el antagonista reduce el nivel , la expresión o la actividad del Fbxo40.
En una modalidad específica particular, la presente divulgación abarca un método para aumentar la masa muscular, o para prevenir la pérdida de la masa muscular en un individuo, el cual comprende administrar al individuo, u na cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista de Fbxo40.
En una modalidad de este método, el individuo padece un trastorno asociado con la consu nción muscular, seleccionado a partir de: caquexia, cáncer, pérdida de peso inducida por un tumor, sepsis, insuficiencia cardíaca crónica, artritis reumatoide, síndrome de inmunodeficiencia adquirida, sarcopenia, diabetes , hipertensión, altos niveles de colesterol en suero, altos niveles de triglicéridos, enfermedad de Parki nson, insomnio, adicción a drogas , dolor, insomnio, hipoglicemia, función hepática comprometida, cirrosis, trastornos de la ves ícula biliar, corea, disquinesia, trastorno renal, y/o u remia.
En una modalidad de este método, el método comprende además admi nistrar fisioterapia, nutrientes , estim ulación eléctrica, estimuladores neuromusculares eléctricos (NM ES) , entrada neural a los músculos; y/o uno o más de los siguientes: esferoides, hormonas, hormona de crecimiento, secretagogo de hormona de crecimiento; mesilato de ibutamoreno (MK-677), extracto de gingko biloba, glicósido de flavona, ginkgolida, suplemento de aminoácidos, leucina, precursor de aminoácidos, precursor de leucina, piruvato y metabolito de piruvato, beta-hidroxi-beta-metil-butirato, alfa-cetoisocaproato, aminoácido de cadena ramificada, eritropoietina, opiato, escopolamina, insulina, factor de crecimiento tipo insulina-1 (IGF1), y/o testosterona; y/o inhibidor de aldosterona, receptor alfa, Angiotensina II, receptor beta, catepsina B, quimasa, receptor de endotelina, factor de iniciación eucariótico 2-alfa (elF2-alfa), receptor de imidazolina, interferón, MAFbx (F-box de Atrofia Muscular), MuRF1 (Dedo 1 de ANILLO de Músculo), miostatina, proteína relacionada con la hormona paratiroides (PTHrP) y/o su receptor, factor inductor de proteólisis (PIF), cinasa de proteína serina/treonina dependiente del ARN (PKR), factor de necrosis tumoral alfa (TNF-alfa), y/u oxidasa de xantina.
En una modalidad de este método, el antagonista reduce la expresión, el nivel, o la actividad del Fbxo40.
En una modalidad de este método, el antagonista de Fbxo40 es un compuesto de bajo peso molecular.
En una modalidad de este método, el antagonista es un polipéptido.
En una modalidad de este método, el antagonista de Fbxo40 es un siARN que se enlaza a un ácido nucleico que codifica el Fbxo40.
En una modalidad de este método, el siARN es de extremos romos.
En una modalidad de este método, el antagonista de Fbxo40 es un anticuerpo que se enlaza a Fbxo40.
En una modalidad específica particular, la presente divulgación abarca una composición que comprende un antagonista de Fbxo40, en donde el antagonista reduce la expresión, el nivel o la actividad del Fbxo40, y aumenta la masa muscular, o previene, limita o reduce la pérdida de la masa muscular.
En una modalidad de esta composición, la composición comprende además uno o más de los siguientes: esteroides, hormonas, hormona de crecimiento, secretagogo de hormona de crecimiento; mesilato de ibutamoreno (MK-677), extracto de gingko biloba, glicósido de flavona, ginkgolida, suplemento de aminoácidos, leucina, precursor de aminoácidos, precursor de leucina, piruvato y metabolito de piruvato, beta-hidroxi-beta-metil-butirato, alfa-cetoisocaproato, aminoácido de cadena ramificada, eritropoietina, opiato, escopolamina, insulina, factor de crecimiento tipo insulina-1 (IGF1), y/o testosterona; y/o inhibidor de aldosterona, receptor alfa, Angiotensina II, receptor beta, catepsina B, quimasa, receptor de endotelina, factor de iniciación eucariótico 2-alfa (elF2-alfa), receptor de imidazolina, interferón, MAFbx (F-box de Atrofia Muscular), MuRF1 (Dedo 1 de ANILLO de Músculo), miostatina, proteína relacionada con la hormona paratiroides (PTHrP) y/o su receptor, factor inductor de proteólisis (PIF), cinasa de proteína serina/treonina dependiente del ARN (PKR), factor de necrosis tumoral alfa (TNF-alfa), y/u oxidasa de xantina.
En una modalidad de esta composición, el antagonista reduce la expresión, el nivel o la actividad del Fbxo40.
En una modalidad de esta composición, el antagonista de Fbxo40 es un compuesto de bajo peso molecular.
En una modalidad de esta composición, el antagonista es un polipéptido.
En una modalidad de esta composición, el antagonista de Fbxo40 es un siARN que se enlaza a un ácido nucleico que codifica el Fbxo40.
En una modalidad de esta composición, el siARN es de extremos romos.
En una modalidad de esta composición, el antagonista de Fbxo40 es un anticuerpo que se enlaza a Fbxo40.
El antagonista de Fbxo40 de la presente divulgación, por consiguiente, puede ser útil para tratar la consunción muscular asociada con trastornos, incluyendo, pero no limitándose a, diabetes, desenervación, lesión, enfermedad cardiovascular, degeneración neural, y diferentes cánceres.
Definiciones Con el objeto de proporcionar un entendimiento claro de la memoria descriptiva y de las reivindicaciones, a continuación se proporcionan convenientemente las siguientes definiciones.
"Fbxo40" significa un gen o una proteína que es un miembro de la familia de genes y proteínas Fbxo, cuyo homólogo humano está representado por Genbank No. NM_016298. Los homólogos animales de este gen son conocidos en varias especies: Ratón (Mus musculus): NM_001037321 ; Rata (Rattus norvegicus): XM_344023; Chimpancé (Pan troglodytes): NC_006490.2; Macaco Rhesus (Macaca mulatta): NC_007859.1; Pez Zebra (Danio rerio): BX322577.11 (pseudo-gen) o XP_694708.3; Cerdo Salvaje (Sus scrofa): EU743742; Pollo (Gallus gallus): XP_424000.2; y Perro (Canis lupus familiaris): XP_545126.2.
Un homólogo humano representativo de Fbxo40 incluye, pero no se limita a, la siguiente secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO. 1, Genbank No. NM_016298): 1 MGKARRSPPG HHRHCEGCFN RHCHIPVEPN TSCLVISCHL LCGATFHMCK EAEHQLLCPL 61 EQVPCLNSEY GCPLSMSRHK LAKHLQVCPA S VVCCSM EWN RWPNVDSETT LHENIMKETP 121 SEECLDTALA LQDQKVLFRS LKM VELFPET REATEEEPTM NGETSVEEMG GAVGGVDIGL 181 VPHGLSATNG EMAELSQEER EVLAKTKEGM DLVKFGQWEN IFSKEHAASA LTNSSASCES 241 KNKNDSEKEQ ISSGHNM VEG EGAPKKKEPQ ENQKQQDVRT AMETTGLAPW QDGVLERLKT 301 AVDAKDYNMY LVHNGRMLIH FGQMPACTPK ERDFVYGKLE AQEVKTVYTF KVPVSYCGKR 361 ARLGDAMLSC KPSEHKAVDT SDLGITVEDL PKSDLIKTTL QCALERELKG HVISESRSID 421 GLFMDFATQT YNFEPEQFSS GTVLADLTAA TPGGLHVELH SECVTRRHNK SSSAFTFTCN 481 KFFRRDEFPL HFKNVHTDIQ SCLNGWFQHR CPLAYLGCTF VQNHFRPPGQ KAKVIYSQEL 541 KTFAI KPEVA PELSEGRKNN HLLGHGGKSQ NSLTSLPLEI LKYIAGFLDS VSLAQLSQVS 601 VLMRNICATL LQERGMVLLQ WKKKRYSHGG TSWRVHREIW QFSSLFSKIK SWEFNEVTSM 661 SEHLKSCPFN I VEHKTDPIL LTSMCQPREQ ARESLVSTFR IRPRGRYVS La secuencia de ARNm para el Fbxo40 humano está fácilmente disponible, por ejemplo, en GenBank: NM_016298 (SEQ ID NO: 2): 1 ATTTTTAACT TCGCAACACT TGGACTATTT CTGTTGAAGT TTTCTCTCCT TTCCCTGCCT 61 TCCCAACAGA ACGCTGTCCT CTACTGCAGC TGATGCAACC CAGCCACCTC CCGGCAATCC 121 GCTTACTTGC AATCAAGGGT TCAGGTGCAA GCAGATGCTG ACTCAGCCTG TTCCATTAAG 181 AGCTAAGAAG CAAGAAGAAA TTGGGGCGCC ATGGGGAAAG CCCGCAGATC CCCGCCAGGG 241 CACCACAGGC ATTGTG AGGG ATGCTTCAAC CGCCACTGCC ACATTCCTGT GGAACCCAAC 301 ACCTCCTGCC TGGTAATAAG CTGCCACCTG CTCTGTGGTG CCACCTTCCA CATGTGCAAA 361 GAGGCAGAGC ACCAGCTCCT CTGCCCTTTA GAGCAGGTTC CGTGCCTCAA CTCCGAATAT 421 GGCTGCCCTC TGTCCATGTC CCGCCACAAA CTGGCCAAGC ACCTGCAGGT GTGCCCCGCC 481 AGCGTGGTCT GCTGCTCCAT GGAGTGGAAC CGCTGGCCAA ATGTGGACTC TGAAACCACC 541 CTTCATGAAA ACATCATGAA AGAGACCCCC AGTG AGGAGT GTTTGGACAC AGCCCTGGCC 601 CTGCAGG ATC AGAAGGTCCT CTTCAG ATCC TTGAAAATGG TGGAACTTTT CCCAG AAACT 661 AGAGAGGCTA CTGAGGAGGA ACCAACTATG AATGGTGAAA CCAGTGTGGA GGAAATGGGA 721 GGAGCAGTGG GTGGAGTGGA TATCGGTTTG GTACCACATG GTCTGTCAGC AACTAATGGG 781 GAGATGGCAG AGCTAAGTCA AGAAGAACGG GAGGTGCTAG CCAAAACCAA AGAAGGGATG 841 GACCTGGTCA AGTTTGGCCA GTGGGAAAAT ATTTTCAGCA AAGAGCACGC AGCCTCTGCT 901 TTAACAAATT CATCAGCGAG CTGTGAGAGC AAGAACAAGA ATGACTCCGA GAAAGAACAG 961 ATTTCCAGTG GCCATAACAT GGTAGAAGGA GAGGGCGCTC CCAAAAAGAA AGAACCACAG 1021 GAAAATCAGA AGCAGCAGGA CGTTCGTACA GCCATGG AAA CCACAGGGCT TGCCCCTTGG 1081 CAGGATGGTG TTCTGGAAAG ACTGAAAACA GCTGTGGATG CAAAGGACTA TAACATGTAT 1141 CTAGTGCACA ATGGGCGGAT GCTGATACAC TTTGGTCAGA TGCCTGCTTG TACACCCAAG 1201 GAGAG AGACT TTGTTTATGG CAAGCTGGAG GCTCAGGAAG TTAAGACTGT TTACACCTTC 1261 AAAGTTCCTG TGAGCTACTG TGGAAAGCGA GCTCGACTTG GAGATGCCAT GTTGAGTTGT 1321 AAGCCAAGTG AACACAAGGC AGTGG ATACT TCAGATTTGG GGATCACTGT GGAGGACCTG 1381 CCCAAATCAG ATCTCATCAA GACCACCCTC CAGTGTGCTT TGG AAAGAGA ACTCAAAGGC 1441 CACGTCATCT CTGAATCCAG AAGCATTGAT GGACTGTTCA TGGATTTTGC CACACAAACA 1501 TACAACTTTG AGCCAG AACA GTTTTCCTCT GGGACAGTGC TGGCTGACCT AACCGCTGCC 1561 ACCCCAGGGG GACTCCACGT GGAGCTCCAC AGCGAGTGTG TGACCAGGAG ACACAACAAA 1621 AGCAGCTCTG CCTTCACTTT CACTTGCAAC AAATTCTTCA GGAGGGATGA GTTCCCCCTG 1681 CACTTCAAG A ATGTCCACAC AGACATTCAG TCATGTCTCA ATGGCTGGTT CCAGCATCGA 1741 TGCCCCCTCG CCTACTTGGG ATGTACATTT GTTCAAAACC ATTTCCGTCC CCCAGGGCAA 1801 AAGGCAAAAG TAATCTATAG CCAGG AGCTC AAGACCTTTG CCATTAAGCC GGAGGTTGCT 1 861 CCAGAGCTG A GCGAGGGAAG GAAGAACAAC CATCTTTTGG GTCATGGAGG AAAAAGCCAG 1 921 AATTCTTTAA CCAGCCTGCC CCTGGAGATT TTGAAGTACA TTGCTGGGTT CTTGGACAGC 1 981 GTCAGCCTGG CCCAGCTCTC CCAGGTGTCT GTGCTGATGA GGAATATCTG TGCCACTTTG 2041 TTACAAGAGA GAGGAATGGT CCTTTTGCAA TGGAAGAAAA AGAGGTATTC CCATGGAGGC 21 01 ACCTCCTGG A GAGTCCACAG AGAGATCTGG CAGTTCAGCA GCCTCTTCTC CAAAATCAAG 21 61 AGCTGGGAGT TTAATGAAGT CACCTCCATG TCTGAGCACC TGAAGTCCTG TCCTTTCAAC 2221 ATTGTAGAGC ACAAAACTGA CCCG ATTCTT TTGACTAGCA TGTGTCAGCC CCGTGAGCAG 2281 GCCCGAGAGA GCTTAGTCTC CACCTTTAGA ATCAGACCAC GAGGAAGATA CGTCTCCTAA 2341 AAATTCAGAT GCCACTCGAT GCACCCTTCT TGGATTTCTT CTCGG AGTTC CTGAAGTAGG 2401 ACAGAGTGTG TGGTTTTGAG GACTCCCTTC TGTAAACTGC CTATTTGCTT ATCGGGGTGT 2461 ATTGGAACAC GCAATGTCCT TCGAAACCTC AACACGAGGC CTAAGAATTT CCTAAGCCAT 2521 GTCTTGTACC ATAGTGCCAC ATTGATGACT TGTTTCCTTT TTTCTTTTCT TTTCTTTTCT 2581 TTTTTCTTTC TTTCTAAAAT AGATTGGTCT GAGAAGAAAA TAAGTAATTT GAGGCCATTT 2641 GGAAGATGG G CCCAATTTCT TAAGTGATGA GAG AGCACGA AATTCCATAA CCAGTACAGG 2701 CCTGTGCTTT TACATGGGCT TTTTAGTTCA CAAAGCACTT TCAAATTTAT GGG ACAGGAA 2761 ATGCAGGATG GGACTCCCCA GGGAACGCAG GGTGAAGGGA ACAAAGCTGG AGGCTCTGGA 2821 GCTGGGTCTG TTTTGACGGT CAAGTCCAGG GCTCATTTTG GTTATTCTAC TGCCTCTAGG 2881 CCAGGGTAGT CCTAACACAG CCTGACATAG GAG AGCCCCT GGCTGAGCAT GGCAGCCTTG 2941 AAGACACCAC AGGCCAAAAC ATGAGGGGCA GAAATGGGAT CACAGAGTCT GTTGCTAGAA 3001 TCTTGGCAAC ATACAGCAGG AAAGCCTTGA TAAATCG GGA GTCCAAAGGA GACACCATAT 3061 TTATGGAGAA CATTAGGACA AAAAGTCACC AACTTACTTT GTAACATTTT AATAATGACT 31 21 TAAGGGTCAA GATTTTTTTC TTCTGAAAAT TATGTTCTGA GTTAGGCAGA ACATAGCCAT 31 81 GGCCCTGGGC CACCCTGTGC TATCTG AAAT GACCTCAATA CACTAATGCC AACCTCAGCG 3241 TCATGCCAGA ATGCACAGGG CAGCCCAGGG AG ATCACACC TTTGGCAAAG TCCAGACAAG 3301 GCCCACTGCA GTTCCTATGG CGCCAGTCAC CAGCTCCTAG ACAGCACTTG GGTACCCCAT 3361 TGGGGTCTTG GAGAGGAAGA CATGTGAACA TAACGGCTCC CTGAAATTGC TCCTACCCAT 3421 CCATATTTCT GGTCATGCTT TCAGTCTGAC AAAAATGGAT GATACTGCTG TTTTTGGTAA 3481 CAAACAGTGA ATATTCATAA GAACAAAAGT AAAAGAAAAA AAGACACAGT AGAAACTGGC 3541 ATCCCCTAAA GCAGGGCTTC TTAGCCTTGG AACTATTGAC ATTTTTAAAT GGATAATTCT 3601 TTTTTTTTTT TTCTAGGTGG GGAGGGGATG GAGTTCACTC TTGTTGCCCA GGCTGGAGCG 3661 CAATGACATG ATCTCGGCTC ACCGCAACCT CCGCCTCCTG GGTTCAAGCG ATTCTCCTGC 3721 CTCAGCCTCC CGAGTAGCTG GGATTACTCG CCTGGCTAAT TTTGTATTTT TAGTAG AGAC 3781 GGGCTTTCTC CATGTTGTTC AGGCTGGTCT CAAACTCCCG ACCTCAGGTG ACTCGCCCGC 3841 CTTGGCCTTC CAAAGTGCTG GGTTTACAGG TGTGAGCCAC TGCGCCCTGC CTGAACTGGA 3901 TAATTCTTTG TTGCAAGGGA CTGTTCTGTG TACTACAGGA TACTTGGCAG CATCCTTGGC 3961 CTATCCATTA AATGTCAGTA GCACCCCCAC AGTGGCAACA ATCAAAAATG TCACCAGACA 4021 TTGCTAAATA TTGGGGAGCA AAATGGCTCC CCGTTGAAAA TCCCTAAAGG ATGTCATACT 4081 AGTGACAATA AGTTAGGATA TGCTTATTTT TTAGTACAGC AAAATCTTAT CGCACATAGC 4141 TATCCACAAT AGTTATGATT TAATGCAGCT CTTTATTTAT GAAATAGGTT TTAGACATGT 4201 GGTGATTTTA AGTTGGGAAC CAGAAGGAAA TGATTCGTTT GGTATGGCTT CATGTCCTTC 4261 AGCCACCCCC AAGAATGTAT CCTTTCAGCT CTCTTTGGTT ATACCTGAAG CCAGGAGCGT 4321 TGAGTTATTA GCCTTGTGTT TATATTCCTC TCACTGTAAT TGGTGTCATT TTCCCAGCAG 4381 TCCTAGCAGT CCTCAAGCAA GTGGGAAATC GGAAAAGAAA AGGACAGGCA TTGTAGGGAA 4441 GCAGAGG ATA AAGAATTTAG CCAACAAAAG AAACAATCTA GTCAATCTGG GTGCTTTTAT 4501 TTCCTGGGTT CTCTCTAAAC ATGGCTCAGA GCTGGTGTAG ATGAAGTAGG TGAAACCTCT 4561 GAAAAGAGTC TAGAAGGCAG TAGAGCAAGT CCCAGACCAG AAACATGCTC ATCTTTTCAT 4621 CGTAATGTGC CACTCGGTAC TATTTGGTAA TGTCACTCTA TTTTTCCTAA TCCCATCCTT 4681 TGGTTTGTAT TTCATATTTG TATATAAGGC ACCATTTTCT AAAAATATGA CTAGGGTGTG 4741 ACCTAAGGTT TTATTCTGTG AAGATGAGTA ACTGG AAAGA AGCTAACACT GCAGTGGGAA 4801 GGAAGGAAGA GAGTTGTCCA GGTGGTAGTT CGACGTGTTT TGAATCTAGT CCTTCCTACA 4861 TGG AGGATAA AAGCTCCTAA AGTCCACTCT GGGTTTGTGA TTTTAATAGA AATAGAAAGG 4921 GAAACTATAG ACCAATGGAG ATGAAAATCA GGGGCTATCG ACAGATGGAG GAGAAATAAG 4981 GTGCTACATA GAGAAAGGAA GAGGGCAGAA GGCTTTCCCT TCCCAAACTG GGTGAGCTGG 5041 GGAAGCCTTG GTTCAGGAGA GTGGCACTGC CCACAACTGC TTTGTGGGTT GTGCACTTCC 5101 AGCCGCACTC TCCCCCTCCA GTTGCTGCCT TCAGAGCCGT ACTG AAGCAC GAGCTTCAAT 5161 AAGACAAGCA CACTTCATAG TGAGAGGGCA GCGGTACCAA AGCCTTTCAG AGAGACTATG 5221 GATTAGACAG AAATG ATTTG TGAGAGGAAG CTGGAGTGAA CAGCATG AAC AGCGAGTGTT 5281 ACCTGACAGA GGCAAG ACAG CTAGAAGTGG CTTCAGATTT AGAAACAGCT GAGGGGAGCA 5341 AAGACGGACT GTGTACACAG GGAGGGAGGA TGTCTATGGG CAGAGCCCTT GGTGAGTATC 5401 ATCACCAAG A AAGGCAGTCC AGAGTAGAGA TCAGCCG AAT ATGGAGGCTG AGGTCTGTAG 5461 AACTGGGCCA GAGAGGACCT TACTGCCTTA GTAGCATAAG GGTCTGG AAA AGAAGTTTCT 5521 ATCTCACAAC AAAGGAAAAA GTGAAAAGCA AGGTGGAACT TGAAGATACG TCACG AAAAT 5581 CACTATAAAA GTCTG ATTTA TGTGTGATGT CAAATCAAAC TGAAATGAAG AATGAGATTG 5641 AGTATATCTG TGGTGACTGA CCTCTGTATA CTAGAAACCT CAACATCTCT AGAAGAGGAA 5701 ATAAAAGCTG CTTTGCACTC TG Las referencias para esta secuencia son: Need y colaboradores, 2009 Hum. Mol. Genet. 18 (23), 4650-4661; Ye y colaboradores, 2007 Gene 404 (1-2), 53-60 (2007); Jin y colaboradores, 2004 Genes Dev. 18 (21), 2573-2580 (2004).
Fbxo40 es un miembro de la familia de proteínas F-box, que cada una contiene cuando menos un motivo F-box, un motivo estructural de proteína de aproximadamente 50 aminoácidos que media las interacciones de proteína-proteína. Véase, por ejemplo, Bai y colaboradores, 1996 Cell 86: 263-74; Kipreos y colaboradores, 2000 Genome Biol. 1(5): RE VIEWS3002; Craig y colaboradores, 1999 Prog. Biophys. Mol. Biol. 72: 299-328; y Ye y colaboradores, 2007 Gene 404:53-60. El motivo F-box de Fbxo40 interactúa directamente con la proteína Skp1.
Como se menciona anteriormente, y como se diagrama en la Figura 1, Fbxo40 está involucrado en la senda de señalización de IGF1. En esta senda, la insulina e IGF1 se enlazan al receptor de insulina (IR) y al receptor de IGF1 (IGF1R), respectivamente; IGF1 se enlaza a ambos receptores y tiene una afinidad mucho más alta por IGF1R. Este enlace activa la actividad intrínseca de cinasa de tirosina del receptor, que autofosforila el racimo de tirosina triple en el ciclo de activación del dominio de cinasa y la tirosina fosforila IRS1. El IRS1 fosforilado se enlaza a la subunidad reguladora p85a de la cinasa de fosfatidil-inositol-3 (PI3K) clase IA, y activa la PI3K. La PI3K cataliza la fosforilación de la posición 3-OH de los lípidos de mio-inositol. El PIP3 (3,4,5-trifosfato de fosfatidil-inositol) recluta las moléculas que contienen el dominio PH, tales como PDK1 (cinasa de proteína-1 dependiente de 3-fosfoinositida, una cinasa maestra), y Akt (una cinasa de proteína clave), hacia la membrana celular, con la fosforilación y activación subsiguientes de Akt mediante PDK1. Akt fosforila e inactiva la cinasa de sintasa de glicógeno-3 (GSK3). GSK3 es una cinasa de proteína serina/treonina que fosforila e inactiva la sintasa de glicógeno, el NFAT (factor nuclear de células-T activadas, un factor de transcripción), y elF2B (factor de intercambio de nucleótido guanina por factor de iniciación eucariótico 2). La Akt activada también puede activar el mTor (una cinasa clave de serina/treonina), que a su vez activa el p70S6K e inactiva el PHAS-1 (4E-BP), y por último conduce a la síntesis de proteína y a la hipertrofia muscular.
La fosforilación de IRS1 inducida por IGF1 también puede dirigirse a IRS1 para ser ubiquitinado por el sCFFbxo4° y para ser degradado en el proteasoma.
Los factores que tienen una influencia negativa sobre la síntesis de proteína y la hipertrofia muscular son: PTP1b (una fosfatasa de proteína tirosina), GSK3, y PHAS-1. Los otros factores tienen un efecto positivo sobre la síntesis de proteína y la hipertrofia muscular: PI3K, NFAT, el F2B, Akt, mTOR, PDK1, y p70S6K.
En esta senda, Fbxo40 antagoniza IRS1. Como se muestra en la Figura 2, Fbxo40 se enlaza a IRS1, llevándolo hacia dentro del complejo SCFFbxo40. Observe que los símbolos "p" encerrados en un círculo indican que el IRS1 está fosforilado, aunque se especula, pero todavía no está claro, si la fosforilación del IRS1 está directamente involucrada en el enlace con el Fbxo40. El complejo 2QpFbxo4o comprenc|e Skp1, Culinl y Rbx1 (proteína de cuadro de ANILLO 1). Mientras está enlazado en el complejo, el IRS1 se ubiquitina ("Ub"), y se marca para su degradación mediante Rbx1. La inhibición de Fbxo40 impide la asociación del IRS1 con el complejo 2Q Fbxo4o y pQr consiguiente, impide la ubiquitinación y la degradación del IRS1. Esto permite tener una actividad continua del IRS1 en la promoción del crecimiento muscular. Por consiguiente, la inhibición del Fbxo40 permite la hipertrofia muscular.
A diferencia de Fbxo40, los otros componentes del complejo (Skp1, Culinl, y Rbx1) están cada uno involucrados en muchas otras sendas. Esto hace que el Fbxo40j sea adecuado de una manera única para la dirección.
En adición, a diferencia de IGF1, el Fbxo40 sólo se expresa altamente en los tejidos de músculo cardíaco y esquelético. Ye y colaboradores, 2007 mostraron que el Fbxo40 no se expresaba en varios tipos de tejidos. Nosotros mostramos datos adicionales en la Figura 3, de que el Fbxo40 no se expresa en el tejido adiposo, de vejiga, cerebro, cérvix, colon, esófago, riñon, hígado, pulmón, ovario, placenta, próstata, intestino delgado, bazo, testículos, timo, tiroides, o de tráquea . En esta Figura, "A. U ." indica unidades arbitrarias relativas . Esta alta especificidad del tejido también hace que el Fbxo40 sea un objetivo deseable para aumentar el crecimiento muscular.
Músculos y Trastornos asociados con la consunción muscular Un antagonista para el Fbxo40 se puede administrar, di recta o indirectamente , a los músculos y a los tejidos musculares de los individuos o de los pacientes que padezcan o que estén en riesgo de padecer un trastorno asociado con la consunción muscular, y el antagonista puede aumentar la masa muscular, o puede i mpedi r o hacer más lenta la disminución de la masa muscular en estos individuos y pacientes.
"Músculo" significa cualquiera de diferentes tejidos contráctiles , incluyendo músculo esquelético, l iso y card íaco; incluyendo músculo tanto volu ntario como involuntario, y también incluyendo músculo de contracción tanto lenta como rápida. Los antagonistas de la presente divulgación son particularmente útiles para promover el crecimiento o para preveni r la pérdida de los músculos card íaco y esquelético.
"Trastorno asociado con la consunción muscular" significa cualquier condición asociada con la pérdida del tono o de la masa muscular. Estas condiciones incluyen , pero no se limitan a, sarcopenia, caquexia, síndrome de consunción por S I DA, distrofia muscular (incluyendo s índrome de distrofia muscular de Duchenne y síndrome de distrofia muscular de Becker) , atrofia muscular, enfermedades neuromusculares, anorexia, enfermedades de las neuronas motoras, enfermedades de las articulaciones neuromusculares, miopatías inflamatorias, otras condiciones o enfermedades asociadas con disminución de la masa muscular, y otras enfermedades relacionadas. Estos trastornos también incluyen el "desacondicionamiento" crónico o agudo, como se puede presentar por la inmovilización o la inactividad, tal como aquél asociado con enfermedad o lesión, o los rigores de los viajes aéreos o de los viajes espaciales. La consunción muscular, incluyendo la atrofia muscular, también se puede presentar como una consecuencia de desenervación, lesión, inmovilización de articulaciones, reposo en cama obligado (atrofia por desuso), tratamiento con glucocorticoides, sepsis, pérdida de peso, cáncer, y envejecimiento. Jagoe y colaboradores, 2001 Curr. Opin. Clin. Nutr. Metab. Care 4: 183. En adición existe una variedad de formas raras de miopatía (trastornos del metabolismo de los carbohidratos, trastornos del metabolismo de los lípidos, miopatías lisosomales, miopatías de cuerpos de inclusión, miopatías distales, miopatías inflamatorias autoinmunes, etc.), que dan como resultado dolor severo, debilidad, fatiga y discapacidad.
La caquexia es una característica común de muchas enfermedades, incluyendo cáncer, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), sepsis, insuficiencia cardíaca crónica, artritis reumatoide, y síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). Ciertos tumores inducen caquexia a través de la producción de una glicoproteína de 24 kDa denominada como factor inductor de proteólisis (PIF). Solicitud de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 20090105123. La caquexia también se puede presentar idiopáticamente.
La caquexia se caracteriza por una pérdida de peso notoria, anorexia, astenia, y anemia. La caquexia también puede tener los síntomas de pérdida de apetito, debilidad, función inmunológica comprometida y desequilibrio de electrolitos. La pérdida de masa muscular puede ser el resultado de muchos factores, incluyendo disminución en el índice de la síntesis de proteína con la degradación muscular normal, aumento en la degradación con la síntesis normal, o una combinación de tanto reducción de la síntesis como aumento de degradación. El mantenimiento de la masa muscular depende de una nutrición apropiada, de la entrada neural, y del estado hormonal.
La sarcopenia es un padecimiento muscular que aflige a la mayoría de las personas más ancianas, y se manifiesta como una reducción en la masa muscular con la edad. La sarcopenia está relacionada con fragilidad, fracturas y caídas que conducen a patología y mortalidad. Baumgartner y colaboradores (1998 Am. J. Epidemiol. 147: 755-63; 149: 1161) definieron la sarcopenia como la masa de músculo esquelético apendicular (kilogramos/altura2) que es menor de dos desviaciones estándares por debajo de la media de un grupo de referencia joven.
En adición, el paciente puede estar padeciendo de uno o más de los siguientes: adicción al alcohol, altos niveles de colesterol en suero, corea, diabetes, adicción a drogas, disquinesia, trastornos de la vesícula biliar, insuficiencia cardíaca crónica, hipertensión, enfermedad de Huntington, hipoglicemia, una infección (incluyendo una infección crónica, tal como neumonía), insomnio, pérdida de peso inducida por un tumor, un trastorno renal, incluyendo uremia, función hepática comprometida, incluyendo cirrosis, pérdida, enfermedad o daño óseo (por ejemplo, osteoporosis), dolor, enfermedad de Parkinson, enfermedad pulmonar (incluyendo enfermedad pulmonar obstructiva crónica), artritis reumatoide, sepsis, altos niveles de triglicéridos, y condición inflamatoria (incluyendo inflamación crónica, incluyendo enfermedad inflamatoria del intestino).
Se han explorado algunos aspectos de la bioquímica de la pérdida de masa muscular. La caquectina, que se cree que es un agente causante de la caquexia por cáncer, es idéntica al factor de necrosis tumoral (TNF). Se ha encontrado que las citoquinas (por ejemplo, interleucina, IL-1, IL-6, LIF, IFN, etc.) también tienen las mismas acciones que la caquectina. Por consiguiente, sin obligarse por ninguna teoría en particular, los solicitantes observan que la caquexia puede ser inducida por la acción compuesta de múltiples factores.
La línea celular OCC-1, derivada a partir del carcinoma de la cavidad oral humano, produce diferentes factores líquidos involucrados en la caquexia por cáncer. Los ratones sin pelo implantados con células OCC-1 desarrollan diversos síndromes, incluyendo caquexia. Kajimura y colaboradores, 1996 Cáncer Chemother. Pharmacol. 38 Suplemento S48-52; Tanaka y colaboradores, 1996 Jpn. J. Clin. Oncol. 26: 88-94. Se cree que las células OCC-1 implantadas en los ratones sin pelo producen varias citoquinas (por ejemplo, G-CSF, IL-6, LIF, IL-11, y PTHrP) que actúan compuestamente para provocar los síntomas.
Las distrofias musculares de ejemplo que se pueden tratar con una composición de esta divulgación incluyen: Distrofia Muscular de Duchenne (DMD), Distrofia Muscular de Becker (BMD), Distrofia Muscular de Emery-Dreifuss (EDMD), Distrofia Muscular de Limb-Girdle (LGMD), Distrofia Muscular Facioescápulohumeral (FSH o FSHD) (también conocida como Landouzy-Dejerine), Distrofia Miotónica (MMD) (también conocida como Enfermedad de Steinert), Distrofia Muscular Oculofaríngea (OPMD), Distrofia Muscular Distal (DD), y Distrofia Muscular Congénita (CMD). Las enfermedades de las neuronas motoras de ejemplo que se pueden tratar con una composición de esta divulgación incluyen: esclerosis lateral amiotrófica (ALS) (también conocida como Enfermedad de Lou Gehrig), Atrofia Muscular Espinal Progresiva Infantil (SMA, SMA1 o WH) (también conocida como SMA Tipo 1, Werdnig-Hoffman), el intermediario de Atrofia Muscular Espinal (SMA o SMA2) (también conocido como SMA Tipo 2), Atrofia Muscular Espinal Juvenil (SMA, SMA3 o KW) (también conocida como SMA Tipo 3, Kugelberg-Welander), Atrofia Muscular Bulbar Espinal (SBMA) (también conocida como Enfermedad de Kennedy y SBMA X-Enlazada), y Atrofia Muscular Espinal de Adultos (SMA).
Las miopatías inflamatorias de ejemplo que se pueden tratar con una composición de esta divulgación incluyen: Dermatomiositis (PM/DM), Polimiositis (PM/DM), y Miositis de Cuerpos de Inclusión (IBM). Las enfermedades de la unión neuromuscular de ejemplo que se pueden tratar con una composición de esta divulgación incluyen: Miastenia Gravis (MG), Síndrome de Lambert-Eaton (LES), y Síndrome Miasténico Congénito (CMS). Las miopatías debidas a anormalidades endocrinas de ejemplo que se pueden tratar con una composición de esta divulgación incluyen: Miopatía Hipertiroidea (HYPTM), y Miopatía Hipotiroidea (HIPOTM). Las enfermedades de nervios periféricos de ejemplo que se pueden tratar con una composición de esta divulgación incluyen: Enfermedad de Charcot-Marie-Tooth (CMT), Enfermedad de Dejerine-Sottas (DS), y Ataxia de Friedreich (FA). Otras miopatías de ejemplo que se pueden tratar con una composición de esta divulgación incluyen: Miotonia Congénita (MC), Paramiotonia Congénita (PC), Enfermedad Nuclear Central (CCD), Miopatía Nemalina (NM), Miopatía Miotubular (MTM o MM), y Parálisis Periódica (PP). Las enfermedades metabólicas de los músculos de ejemplo que se pueden tratar con una composición de esta divulgación incluyen: Deficiencia de Fosforilasa (MPD o PYGM), Deficiencia de Maltasa de Ácido (AMD), Deficiencia de Fosfofructocinasa (PFKM), Deficiencia de Enzima de Debrancher (DBD), Miopatía Mitocondrial (MITO), Deficiencia de Carnitina (CD), Deficiencia de Palmitil-Transferasa de Carnitina (CPT), Deficiencia de Cinasa de Fosfoglicerato (PGK), Deficiencia de Mutasa de Fosfoglicerato (PGAM o PGAMM), Deficiencia de Deshidrogenasa de Lactato (LDHA), y Deficiencia de Desaminasa de Mioadenilato (MAD).
El antagonista para Fbxo40 de la presente divulgación se puede utilizar para tratar estos y otros diferentes trastornos asociados con la consunción muscular conocidos en la materia.
Tratamientos adicionales para los trastornos asociados con la consunción muscular El antagonista de Fbxo40 se puede co-administrar con otro medicamento o con el tratamiento que se sepa o se sospeche que aumenta la masa muscular, o que previene la pérdida de la masa y/o fuerza muscular. Estos tratamientos incluyen fisioterapia, nutrición, estimulación eléctrica (por ejemplo, estimuladores neuromusculares eléctricos (NMES)), y/o entrada neural a los músculos.
Se han propuesto diversos medicamentos para el tratamiento de caquexia, sarcopenia y otros trastornos musculares, incluyendo esteroides, hormonas, incluyendo hormona de crecimiento, secretagogos de hormona de crecimiento [incluyendo mesilato de ibutamoreno (MK-677)], extractos de gingko biloba (incluyendo glicósidos de flavona y/o ginkgolidas), suplemento de aminoácidos (por ejemplo, leucina), precursor de aminoácidos (por ejemplo, precursor de leucinas, tal como piruvato y metabolitos, tal como beta-hidroxi-beta-metil-butirato y alfa-cetoisocaproato), aminoácidos de cadena ramificada, eritropoietina, opiatos, escopolamina, insulina, factor de crecimiento tipo insulina-1 (IGF1), y testosterona.
Los medicamentos adicionales que se pueden co-administrar con un antagonista de Fbxo40 incluyen inhibidores de factores biológicos (agentes biológicos) y/o genes que sean factores directa o indirectamente causantes de caquexia, o relacionados de otra manera con el crecimiento muscular. Estos factores, agentes y/o genes incluyen: aldosterona (por ejemplo, espironolactona, testolactona, mespirenona, y canrenoato), receptor alfa (por ejemplo, doxazosina, prazosina, terazosina e ipsapirona), Angiotensina II, receptor beta (acebutolol, alprenolol, atenolol, betaxolol, bisoprolol, carteolol, celiprolol, esmolol, labetolol, lavobunolol, metipranolol, metoprolol, nadolol, oxprenolol, penbutolol, pindolol, propanolol, sotalol, nebivolol, carvedilol, bucindolol y timolol), catepsina B [por ejemplo, péptidos de epoxisuccinilo, tales como CA-074 y E-64c, estefina A, cistatina C (inhibidor endógeno), CA074 (un inhibidor específico de catepsina B), y E-64 (un inhibidor natural de catepsina B)], quimasa [por ejemplo, alendronato, aprotinina e inhibidores de tejido de las metaloproteinasas de matriz (TIMPs)], receptor de endotelina, factor de iniciación eucariótico 2-alfa (elF2-alfa), receptor de imidazolina [por ejemplo, moxonidina, clonidina, rilmenidina, pentamidina (1 ,5-bis-(4-amidonofenoxi)-pentano), y alfa-metil-dopa], interferón, MAFbx (F-box de Atrofia Muscular), MuRF1 (Dedo 1 de ANILLO de Músculo), miostatina, proteína relacionada con la hormona paratiroides (PTHrP) y/o su receptor, factor inductor de proteólisis (PIF), cinasa de proteína serina/treonina dependiente del ARN (PKR), factor de necrosis tumoral alfa (TNF-alfa), y oxidasa de xantina. En una modalidad específica particular, el factor de crecimiento tipo insulina-1 se co-administra con el antagonista para Fbxo40.
Para una referencia, véase, por ejemplo, la Solicitud de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 20090105123. Véanse: Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 6,194,402; 7,232,580; 7,417,038; 7,442,706; y 7,468,184; y Solicitudes de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Números 20020028838; 20040122097; y 20090105123; y Bodine y colaboradores, 2001; McPherron y colaboradores, 1997 Proc. Nati. Acad. Sci. 94: 12457-61; Williams 2004 N. Engl. J. Med. 351: 1030-1.
Las composiciones de la presente divulgación también se pueden utilizar para prevenir la pérdida de la masa muscular, o para aumentar la masa muscular en un paciente sano.
En otra modalidad de la descripción, las composiciones que comprenden un antagonista de Fbxo40 se pueden administrar a animales no humanos. Por ejemplo, las composiciones se pueden dar a pollos, pavos, animales de ganado (tales como ovejas, cerdos, caballos, reses, etc.), animales de compañía (por ejemplo, gatos y perros), o pueden tener utilidad en acuacultura para acelerar el crecimiento y mejorar la proporción de proteína/grasa. Las composiciones pueden estimular el crecimiento y mejorar la eficiencia de la alimentación de los animales criados para la producción de carne, y para mejorar la calidad de la res en canal. Tipos y eficacia de los antagonistas para Fbxo40 Como se utiliza en la presente, el término "antagonista de Fbxo40" y similares, se refiere a cualquier fracción, compuesto, composición o similares, que sub-regula el Fbxo40 o su actividad, nivel o expresión. Estos antagonistas pueden comprender, entre otras cosas, compuestos de bajo peso molecular (LMWs), anticuerpos, y/o ácidos nucleicos inhibidores [por ejemplo, ARN inhibidor corto (siARN)]. El antagonista da como resultado una disminución de la actividad, el nivel, y/o la expresión del Fbxo40, por ejemplo, una "eliminación genética" o una "extracción genética" del gen mediante la dirección al gen, al nivel de ARNm, y/o al nivel de proteína.
Como se utiliza en la presente, "sub-regula" se refiere a cualquier disminución estadísticamente significativa en una actividad biológica y/o expresión de Fbxo40, incluyendo el bloqueo total de la actividad (es decir, la inhibición completa) y/o expresión. Por ejemplo, la "sub-regulación" puede referirse a una disminución de cuando menos aproximadamente el 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ó 100 por ciento en la actividad y/o expresión de Fbxo40. El antagonista, por ejemplo, puede inhibir o degradar el Fbxo40, o puede ayudar a otros compuestos o componentes biológicos a degradar o inhibir la actividad de Fbxo40.
Como se utiliza en la presente, el término "inhibir" o inhibición" de Fbxo40 se refiere a cualquier disminución estadísticamente significativa en la actividad biológica y/o expresión de Fbxo40, incluyendo el bloqueo total de la actividad y/o expresión . Por ejemplo, la "inhibición" se puede referi r a una disminución de cuando menos aproximadamente el 1 0 , 20, 30, 40, 50 , 60, 70, 80, 90 ó 1 00 por ciento en la actividad y/o expresión de Fbxo40. Como se utiliza en la presente, el térmi no "inhibi r" se refiere de una manera si milar a una disminución significativa en la actividad y/o expresión , cuando se hace referencia a cualquier otro agente biológico o a cualquier otra composición .
El antagonista de Fbxo40 de la presente divulgación disminuye o sub-regula la expresión , el nivel o la actividad de Fbxo40. "Expresión" significa que el antagonista puede interferir con cualquiera de los pasos bioqu ímicos conocidos i nvol ucrados en la expresión de un gen, por ejemplo, la transcri pción del ADN en el ARNm , el procesamiento del AR Nm , la traducción del ARN m en proteína, y modificación de la proteína posteriormente a la traducción . Por ejemplo, un antagonista que interfiera con la expresión de Fbxo40 puede estar involucrado en impedir que se exprese el gen . Esto se puede llevar a cabo directamente, por ejemplo, mediante el enlace con el ADN o con el ARN m, o indirectamente , por ejemplo, interfiriendo con un factor de transcripción o con un co-factor de transcri pción necesario para transcribi r el gen , o con un factor requerido para el procesamiento del ARNm de Fbxo40.
"N ivel" significa que el antagonista de Fbxo40 puede interferi r con el nivel detectable de Fbxo40, por ejemplo, con el nivel del ARNm de Fbxo40, o con el nivel de prote ína de Fbxo40. Estos niveles se pueden determinar mediante Northern blots , Southern blots, inmunoprecipitación , o cualquiera de una variedad de técnicas conocidas en la materia.
"Actividad" significa que el antagonista de Fbxo40 puede interfe ri r con cualquier actividad conocida de Fbxo40 , como se describe en la presente o como se conoce en la literatura. En un aspecto de la descripción , el antagonista es cualq uier fracción, compuesto o similares, que antagonice directamente al Fbxo40 , por ejemplo, impidiendo o alterando la interacción i ndi recta o di recta (por ejemplo, el enlace) de Fbxo40 con otro componente biológico, incluyendo, pero no limitándose a, Skp 1 o I RS 1 . Como un ejemplo no limitante , un antagonista de Fbxo40 puede ser, por ejemplo, un anticuerpo que impida estéricamente el enlace de Fbxo40 con Skp 1 y/o con I RS 1 .
U n antagonista de Fbxo40 puede ser, como ejemplos no limitantes, una composición de bajo peso molecular (LMW) , una prote ína, un anticuerpo, o un ARN inhibidor corto (siAR N) , o una variante , un derivado, o una fusión de los mismos.
En diferentes modalidades de la presente divulgación , el antagonista de Fbxo40 (incluyendo, pero no limitándose a, una proteína o u n anticuerpo de bajo peso molecular (LMW)) puede interactuar con cualquiera de las estructuras conocidas o supuestas de Fbxo40. Estas estructu ras de Fbxo40 incluyen , pero no se limitan a, el motivo F-box en aproximadamente los ami noácidos (aa) 570-624 y el dominio tipo TRAF de dedo de zinc en los aminoácidos (aa) 54-96 (como se describe en Ye y colaboradores , 2007) . En otra modalidad , el antagonista de Fbxo40 es un anticuerpo que no se enlazan en la región de los ami noácidos (aa) 1 45-372 ; por consiguiente, el antagonista de Fbxo40 es un anticuerpo que se enlaza en la región de los aminoácidos (aa) 1 - 1 43 ó 373-709.
En las modal idades adicionales de la presente divulgación, el antagonista de Fbxo40 interactua con un aminoácido de Fbxo40, el cual está conservado en relación con otros miembros de la fami lia Fbox, incluyendo la secuencia de F-box. La secuencia en consenso para este motivo Fbox se proporciona en Kipreos y colaboradores, 2000 Genome Biol . 1 (5) : REVI EWS3002. El motivo Fbox a parti r de Fbxo40 está en aproxi madamente los aminoácidos (aa) 570 a 624. Ye y colaboradores, 2007.
En diferentes modalidades , la presente divulgación proporciona las siguientes condiciones : el antagonista de Fbxo40 i nteractúa con (por ejemplo, se enlaza f ísicamente a) Fbxo40 , pero no en cualquiera o más estructu ras o secuencias específicas enlistadas ; por consiguiente, el antagonista de Fbxo40 en diferentes modalidades puede interactuar con el gen o la proteína de Fbxo40 , pero no en el motivo Fbox en los aminoácidos (aa) 570 a 624; o el antagonista de Fbxo40 en diferentes modalidades puede interactuar con el gen o la proteína de Fbxo40 , pero no en el dominio de dedo de zinc de los aminoácidos (aa) 54 a 96.
En una modalidad, la presente divulgación tiene la condición de que el antagonista de Fbxo40 no es un anticuerpo policlonal. En otra modalidad, la presente divulgación tiene la condición de que el antagonista de Fbxo40 no es un anticuerpo policlonal que se reproduzca contra, o que se enlace a, la secuencia de Fbxo40 CEKARESLVSTFRARPRGRHF (SEQ ID NO: 34).
En una modalidad de la presente divulgación, el antagonista de Fbxo es un siARN que se dirige a la secuencia de CACCTCCTGGAAAGTCCACAA (SEQ ID NO: 19), GTGGGAAAGTATG TTCAGCAA (SEQ ID NO: 20) o AGCCGTGG ATGCCAAAG ACTA (SEQ ID NO: 21) (o el equivalente del ARN).
La administración del antagonista para Fbxo40 da como resultado la hipertrofia muscular, o la prevención, limitación o reducción de la pérdida muscular.
"Hipertrofia muscular", "crecimiento muscular", y similares, significan un aumento en la masa muscular. Esto puede incluir un aumento en el tamaño, en lugar del número, de fibras musculares.
Estas fibras musculares pueden incluir los músculos cardíaco y esquelético, incluyendo los músculos que cargan peso y que no cargan peso. La hipertrofia muscular se puede medir mediante diferentes métodos conocidos en la técnica, incluyendo medir las áreas de sección transversal promedio de las fibras musculares individuales. La hipertrofia muscular se puede medir in vitro (por ejemplo, con los miotubos C2C12) o in vivo.
"Prevención, limitación o reducción de la pérdida muscular" y frases similares, significan que la administración del antagonista de Fbxo40 previene, limita o reduce la cantidad o el índice de la pérdida muscular usualmente asociada con una condición particular, tal como caquexia o anorexia.
Como los ejemplos específicos particulares no limitantes, el antagonista para Fbxo40 puede comprender una composición (o un compuesto) de bajo peso molecular, un anticuerpo o similares, y/o un ácido nucleico inhibidor o un siARN o similares.
Composiciones de bajo peso molecular como antagonistas para Fbxo40 Un antagonista de Fbxo40 puede ser una composición de bajo peso molecular (LMW) o una molécula pequeña. En una modalidad, los antagonistas de Fbxo40 empleados en los métodos de la presente descripción son moléculas pequeñas. Como se utiliza en la presente, el término "molécula pequeña" es un término de la materia e incluye moléculas que son de menos de aproximadamente 7500, 7000, 6000, 5000, 4000, 3000, 2500, 2000, 1500, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, ó 100 de peso molecular, e inhiben la actividad del Fbxo40. Las moléculas pequeñas de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, moléculas orgánicas pequeñas (por ejemplo, Cañe y colaboradores, 1998. Science 282: 63), y bibliotecas de extractos de productos naturales. En otra modalidad, los compuestos son compuestos no peptídícos orgánicos pequeños. Como los anticuerpos, estos inhibidores de moléculas pequeñas inhiben la actividad de Fbxo40 indirectamente o directamente.
En otra modalidad de la divulgación, el antagonista de Fbxo40 es una proteína.
En una modal idad específica particular, la presente divulgación abarca un método para el rastreo de composiciones con el fi n de dete rminar su capacidad para aumentar la masa muscu lar, o para prevenir la pérdida de la masa muscular en un i ndividuo, el cual comprende : aseverar el nivel o la actividad del Fbxo40 en una célula, tratar la célula con una composición , y aseverar el nivel o la actividad del Fbxo40 en la célula nuevamente , en donde la capacidad de la composición para disminui r el nivel o la actividad del Fbxo40 está correlacionada con la capacidad para aumentar la masa muscular, o para prevenir la pérdida de la masa muscular en un individuo .
Para obtener los compuestos de bajo peso molecular (LMWs) que inhiban el Fbxo40 , se puede crear una biblioteca de los compuestos que i ncl uya nu merosas variantes de un compuesto. Los compuestos de la biblioteca se prueban para determinar su i nhibición específica de una actividad biológica de Fbxo40 (por ejemplo, su enlace a I RS 1 o Skp 1 ) . Los compuestos seleccionados se pueden utilizar como la base para la selección aleatoria adicional y la selección para producir derivados de afinidad o actividad i nhi bidora más alta.
Los métodos para desarrollar las bibliotecas de compuestos de bajo peso molecular (LMWs) y los métodos de rastreo de los mismos para enlazarse a u na prote ína objetivo, son conocidos en la materia. Por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica N úmero 7,377,894 describe un método para construi r una biblioteca de hasta 1 0 ,000 compuestos, la mayoría de los cuales son de preferencia de no más de 350 gramos/mol . Esta técnica involucra seleccionar los compuestos que tengan una solubilidad en agua deuterada de cuando menos aproximadamente 1 mM a temperatu ra ambiente , y utiliza espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RM N ) de flujo y la observación de ligandos de agua con métodos de espectroscop ia en gradiente ("WaterLOGSY") . Este método involucra identificar un compuesto que se enlace a una molécula objetivo (por ejemplo, a una prote ína) , basándose en las técnicas de espectroscop ia de resonancia magnética nuclear ( RM N) . Estos métodos típicamente i nvolucran el uso de técnicas editoras de relajación , por ejemplo, que involucran cambios de monitoreo en las intensidades de la resonancia (de preferencia, reducciones significativas en las intensidades) del compuesto de prueba después de la adición de una molécula objetivo. De preferencia, las técnicas editoras de relajación son unidimensionales, y de una manera muy preferible, son técnicas de 1 H RMN unidimensionales . De una manera alternativa, los métodos pueden invol ucrar el uso de WaterLOGSY. Esto involucra la transferencia de la magnetización a parti r del agua en volumen para detectar la interacción de enlace. Utilizando las técnicas WaterLOG SY , los compuestos enlazadores se distinguen de los no enlazadores mediante el signo opuesto de sus efectos Overhauser nucleares (NO Es) de ligandos de agua .
Se conocen otras técnicas para desarrollar bibl iotecas de compuestos. La Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 7,367 ,933 describe un método para produci r una biblioteca de compuestos qu ímicos, el cual comprende extraer cuando menos un extracto a parti r de cuando menos una especie de planta.
Cualq uiera de estos métodos , u otros métodos conocidos en la técnica, se pueden utilizar para producir bibliotecas de compuestos de bajo peso molecular (LMWs) , las cuales se pueden rastrear para determi nar el enlace y la antagonización de Fbxo40.
Los métodos de rastreo de bibliotecas de los compuestos para enlazarse a un objetivo (en este caso, Fbxo40) son conocidos en la materia.
La Patente de los Estados U nidos de Norteamérica Nú mero 7,238,490 se relaciona con la detección en tiempo real de la interacción i ntermolecular y con los estados en que se puede detectar el enlace intermolecular, mediante la formación de un "parátopo", lo cual da como resultado una generación i nmediata de una señal . Las sustancias q ue se van a probar para determi nar su interacción , se enlazan a los demítopos, en donde los dem ítopos son componentes de u n parátopo que se enlaza a un reportero que proporciona la señal cuando se enlaza. También se pueden emplear las interacciones conocidas medidas de esta manera, para rastrear los compuestos que interfieran con las interacciones. En adición a las pruebas para determinar las interacciones individuales, también se puede determinar la interacción de un compuesto con una biblioteca o las interacciones de biblioteca-por-biblioteca, y se evalúa el efecto de las sustancias que interfieran potencialmente.
Otros diferentes métodos para crear y rastrear las bibliotecas de compuestos se describen, entre otros, en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 6,764,858; 6,723,235; 6,720,190; 6,677,160; 6,656,739; 6,649,415; 6,630,835; 6,627,453; 6,617,114; 6,613,575; 6,607,921; 6,602,685; 6,448,794; 6,421,612; 6,395,169; 6,387,257; 6,355,163; 6,214,561; 6,187,923; y 6,054,047.
Se pueden utilizar cualquiera de estos métodos para crear y rastrear las bibliotecas de compuestos de bajo peso molecular (LMWs) o cualquier método conocido por un experto ordinario en este campo para obtener una molécula pequeña que se enlace y antagonice al Fbxo40.
Anticuerpos y similares como Antagonistas para Fbxo40 Un antagonista de Fbxo40 también puede ser un anticuerpo anti-Fbxo40, una molécula de tipo anticuerpo, y/o una molécula que se enlace específicamente y/o selectivamente al Fbxo40, o variantes, derivados o inmunoconjugados de los mismos, y similares.
En una modalidad de la divulgación, los métodos terapéutico y de diagnóstico descritos en la presente emplean un anticuerpo o inmunoglobulina que se enlaza a (directa o indirectamente), e inhibe la actividad de Fbxo40, mediante la interrupción del enlace de Fbxo40 al complejo Skp1-Culin1-Rbx1 y/o sub-modula la expresión de Fbxo40 (un anticuerpo neutralizante).
Los términos "anticuerpo" o "¡nmunoglobulina" y similares incluyen cualquier anticuerpo entero, cualquier porción de enlace a antígeno, cualquiera o más regiones determinantes de complementariedad (CDR), fragmento, o cadena individual del mismo, y moléculas que imiten las afinidades de enlace y las porciones de enlace a antígeno de los anticuerpos, y las variantes y derivados de los mismos. Un "anticuerpo" comprende dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) conectadas mediante enlaces de disulfuro. Cada cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada (VH), y una región constante de cadena pesada, comprendiendo ésta última tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera (VL), y una región constante de cadena ligera, la cual comprende un dominio, CL. Las regiones VH y VL pueden además subdividirse en regiones de hipervariabilidad [regiones determinantes de complementariedad (CDR)], intercaladas con regiones que estén más conservadas [regiones de estructura (FR)]. Cada VH y VL se compone de tres regiones determinantes de complementariedad (CDRs) y cuatro regiones de estructura (FRs). Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de enlace que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes pueden mediar el enlace del anticuerpo a los tejidos o factores del huésped, incluyendo las células del sistema inmunológico (por ejemplo, las células efectoras), y el primer componente (Clq) del sistema de complemento clásico.
Un anticuerpo anti-Fbxo40 de la presente descripción incluye, pero no se limita a, cualquier derivado o variante de un anticuerpo, un molécula tipo anticuerpo, un porción de enlace a antígeno de un anticuerpo, y cualquier anticuerpo monoclonal, policlonal, recombinante, quimérico, humano, no humano, humanizado, biespecífico, bifuncional, de isotipo conmutado, de isotipo no conmutado (o variantes o derivados de los mismos) que se enlaza al Fbxo40. El anticuerpo para Fbxo40 es de preferencia monoclonal. El anticuerpo anti-Fbxo40 de la presente divulgación también incluye los nanocuerpos de camélido, diacuerpos, diacuerpos de cadena individual y di-diacuerpos que se enlazan y antagonizan al Fbxo40.
La presente divulgación también abarca conjuntos de dos o más anticuerpos, variantes o moléculas de tipo anticuerpo que se pueden enlazar de manera no competitiva a Fbxo40. De preferencia, la afinidad del conjunto o de la combinación de moléculas es más alta que aquélla de cualquiera de las moléculas constituyentes.
El término "porción de enlace a antígeno" de un anticuerpo, como se utiliza en la presente, se refiere a los fragmentos de un anticuerpo que conservan la capacidad para enlazarse específicamente a un antígeno (por ejemplo, al Fbxo40). Los ejemplos de los fragmentos de enlace incluyen: (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados a un puente de disulfuro en la región de articulación; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un brazo individual de un anticuerpo, (v) un dAb que incluye los dominios VH y VL; (vi) un fragmento dAb [Ward y colaboradores, 1989 Nature 341, 544-546], que consiste en un dominio VH; (vi i ) un dAb que consiste en un dominio VH o VL; y (viii) una región determinante de complementariedad (CDR) aislada o (ix) una combinación de dos o más regiones determinantes de complementariedad (CDRs) aisladas que pueden unirse opcionalmente mediante un enlazador sintético. Estas composiciones, entre otras cosas, también están abarcadas por el término "molécula de tipo anticuerpo". Los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, son codificados por genes separados, pero se pueden unir, utilizando métodos recombinantes, mediante un enlazador sintético, creando una cadena de proteína individual monovalente conocida como Fv de una sola cadena (scFv). Bird y colaboradores, 1988 Science 242, 423-426; y Huston y colaboradores, 1988 Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 85, 5879-5883. Las porciones de enlace a antígeno se pueden producir mediante técnicas de ADN recombinante, o mediante la disociación enzimática o química de las inmunoglobulinas intactas.
El término "anticuerpo monoclonal", como se utiliza en la presente, se refiere a un anticuerpo a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, por ejemplo, que se enlazan y antagonizan al Fbxo40. Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar, por ejemplo, utilizando varios métodos, por ejemplo, Kohler y colaboradores, 1975 Nature, 256: 495; Lonberg y colaboradores, 1994 Nature 368: 856-859; Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,816,567; Clackson y colaboradores, 1991 Nature, 352: 624-628, y Marks y colaboradores, 1991 J. Mol. Biol., 222: 581-597.
En contraste con las preparaciones de anticuerpos policlonales, las cuales incluyen diferentes anticuerpos para los diferentes epítopos, cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un solo determinante sobre el antígeno. Los anticuerpos monoclonales, por consiguiente, son altamente específicos, y se dirigen contra un solo sitio antigénico o epítopo.
El término "epítopo" o "determinante antigénico" se refiere a un sitio sobre un antígeno, por ejemplo, Fbxo40, al que se enlaza un anticuerpo específicamente. Los epítopos se pueden formar tanto a partir de aminoácidos contiguos como a partir de aminoácidos no contiguos, yuxtapuestos mediante el plegado terciario de una proteína. Los epítopos formados a partir de los aminoácidos contiguos, típicamente se retienen sobre la exposición a los solventes desnaturalizantes, mientras que los epítopos formados mediante plegado terciario, típicamente se pierden sobre el tratamiento con los solventes desnaturalizantes. Un epítopo típicamente incluye cuando menos aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ó 15 aminoácidos en una conformación espacial única. Los métodos para determinar la conformación espacial de los epítopos incluyen las técnicas de la materia y aquéllas descritas en la presente , por ejemplo, cristalograf ía de rayos-X y resonancia magnética nuclear bidi mensional . Véase , por ejemplo, Epitope Mappi ng Protocols i n Methods in Molecular Biology, Vol umen 66, G . E . Morris , Editor, 1 996.
Los anticuerpos monoclonales incluyen los anticuerpos qui méricos , los anticuerpos humanos y los anticuerpos humanizados, y se pueden presentar naturalmente o se pueden producir de una manera recombinante.
El término "anticuerpo recombi nante" se refiere a los anticuerpos que se preparan , se expresan , se crean , o se aislan por medios recombinantes , tales como: (a) los anticuerpos aislados a parti r de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico o transcromosómico para los genes de inmunoglobulina (por ejemplo, los genes humanos) o un hibridoma preparado a parti r del mismo, (b) los anticuerpos aislados a parti r de una cél ula huésped transformada para expresar el anticuerpo, por ejemplo, a parti r de un transfectoma, (c) los anticuerpos aislados a parti r de una biblioteca de anticuerpos de combinación recombinantes (por ejemplo, que contiene secuencias de anticuerpos h umanos) utilizando exhibición de fagos , y (d) los anticuerpos preparados, expresados , creados o aislados por cualquier otro medio que involucre el empal me de las secuencias de los genes de i nmunoglobulina (por ejemplo, los genes humanos) con otras secuencias de ADN . Estos anticuerpos recombinantes pueden tener regiones variables y constantes derivadas a partir de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Estos anticuerpos recombinantes humanos se pueden someter a mutagénesis in vitro y, por consiguiente, las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque se deriven a partir de las secuencias de la línea germinal humana, pueden no existir naturalmente dentro del repertorio de la línea germinal de anticuerpos humanos in vivo.
El término "anticuerpo quimérico" se refiere a una inmunoglobulina o anticuerpo cuyas regiones variables se derivan a partir de una primera especie y cuyas regiones constantes se derivan a partir de una segunda especie.
El término "anticuerpo humano", como se utiliza en la presente, pretende incluir los anticuerpos que tienen regiones variables en donde tanto las regiones de estructura como las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) se derivan a partir de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Kabat y colaboradores (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publicación No. 91-3242. Las secuencias en consenso de regiones determinantes de complementariedad (CDRs) y de estructura también se han descrito en Chotia y colaboradores, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987), y en MacCallum y colaboradores, J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996); y Chotia y colaboradores, 1998, J.
Mol. Biol. 278: 457-479. Se puede utilizar cualquiera de éstos, pero de preferencia Kabat o Chotia, para determinar las secuencias de regiones determinantes de complementariedad (CDRs) dentro de una región variable de anticuerpo particular.
Un anticuerpo humano puede incluir una variante de una secuencia de la línea germinal humana de tipo silvestre.
El término "anticuerpo humanizado" se refiere a un anticuerpo que incluye cuando menos una cadena ligera o pesada humanizada, la cual tiene una región variable sustancialmente a partir de un anticuerpo humano y regiones determinantes de complementariedad (CDRs) sustancialmente a partir de un anticuerpo no humano, junto con regiones constantes. El término "región variable humanizada" se refiere a una región variable que incluye una región de estructura variable sustancialmente a partir de un anticuerpo humano y regiones determinantes de complementariedad (CDRs) sustancialmente a partir de un anticuerpo no humano.
El término anticuerpo "bi-específico" o "bi-funcional" incluye, entre otras cosas, un anticuerpo híbrido artificial que tiene dos pares de cadenas pesada/ligera diferentes, y dos sitios de enlace diferentes. Songsivilai y colaboradores, 1990 Clin. Exp. Immunol.79: 315-321; Kostelny y colaboradores, 1992 J. Immunol. 148: 1547-1553.
Como se utiliza en la presente, un "anticuerpo heterólogo" se define en relación con el organismo no humano transgénico o la planta que produzca ese anticuerpo.
Los anticuerpos de la presente divulgación abarcan, entre otras cosas, anticuerpos de isotipo conmutado y de isotipo no conmutado.
Como se utiliza en la presente, "isotipo" se refiere a la clase de anticuerpo (por ejemplo, Ig o IgG, etc.) que es codificado por los genes de región constante de cadena pesada. En una modalidad, un anticuerpo o una porción de enlace de antígeno del mismo, es de un isotipo seleccionado a partir de un isotipo de anticuerpo de una lgG1, una lgG2, una lgG3, una lgG4, una IgM, una lgA1 , una lgA2, una IgAsec, una IgD, o de una IgE.
Como se utiliza en la presente, "conmutación de isotipo" se refiere al fenómeno mediante el cual se cambia la clase o el isotipo de un anticuerpo desde una clase de Ig hasta una de las otras clases de Ig.
Como se utiliza en la presente, "isotipo no conmutado" se refiere a la clase isotípica de la cadena pesada que se produce cuando no ha habido conmutación del isotipo; el gen CH que codifica el isotipo no conmutado es típicamente el primer gen CH inmediatamente corriente abajo a partir del gen VDJ funcionalmente reconfigurado.
El anticuerpo anti-Fbxo40 de la presente divulgación también incluye nanocuerpos de camélido, diacuerpos, diacuerpos de una sola cadena, y di-diacuerpos que se enlaza al, y antagonizan el Fbxo40.
Se han caracterizado las proteínas de anticuerpos obtenidas a partir de los miembros de la familia del camello y el dromedario (Camelus bactrianus y Camelus dromaderius), incluyendo los miembros del Nuevo Mundo, tales como las especies de llamas (Lama páceos, Lama glama y lama vicugna). Ciertos anticuerpos de IgG encontrados en estos mamíferos carecen de cadenas ligeras y, por consiguiente, son estructuralmente distintas de los anticuerpos a partir de otros animales. Publicación Internacional del TCP Número WO 94/04678. El único dominio variable pequeño (VHH) del anticuerpo de camélido proporciona una proteína derivada de anticuerpo de bajo peso molecular y de alta afinidad conocida como un "nanocuerpo de camélido". Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,759,808; Stijlemans y colaboradores, 2004 J. Biol. Chem. 279: 1256-1261; Dumoulin y colaboradores, 2003 Nature 424: 783-788; Pleschberger y colaboradores, 2003 Bioconjugate Chem. 14: 440-448; Cortez-Retamozo y colaboradores, 2002 Int. J. Cáncer 89: 456-62; y Lauwereys y colaboradores, 1998 EMBO J. 17: 3512-3520. Las bibliotecas diseñadas de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos de camélidos están comercialmente disponibles, por ejemplo, en Ablynx, Ghent, Bélgica. El nanocuerpo se puede "humanizar", y se puede reducir adicionalmente la baja antigenicidad natural de los anticuerpos de camélidos.
El nanocuerpo de camélido tiene un peso molecular de aproximadamente una décima parte de aquél de una molécula de IgG humana, y tiene un diámetro de solamente unos cuantos nanómetros. Los nanocuerpos de camélido se pueden enlazar a los sitios antigénicos funcionalmente invisibles para las proteínas de anticuerpos más grandes.
Los nanocuerpos de camélido son termoestables, estables en un pH extremo y a la digestión proteolítica, y pobremente antigénicos. Se mueven fácilmente desde el sistema circulatorio hacia dentro de los tejidos, e incluso cruzan la barrera hematoencefálica y pueden tratar los trastornos que afecten al tejido nervioso. Los nanocuerpos pueden facilitar además el transporte de fármacos a través de la barrera hematoencefálica. Publicación de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 20040161738, publicada el 19 de agosto de 2004.
Los anticuerpos, las moléculas de tipo anticuerpo, y otras moléculas que se enlazan específicamente y/o selectivamente al Fbxo40 de la presente divulgación también incluyen, entre otras cosas, diacuerpos, diacuerpos de una sola cadena (scDb), moléculas que exhiben propiedades funcionales de los anticuerpos pero que derivan sus porciones de estructura y de enlace de antígeno a partir de otros polipéptidos (por ejemplo, fibronectinas y moléculas de tipo fibronectina), y cualquiera y todos los fragmentos de anticuerpos y miméticos, incluyendo, pero no limitándose a, por ejemplo, anticuerpos de dominio, nanocuerpos, Unicuerpos, Adnectinas, aptámeros, Affibodies, DARPins, Anticalinas, Avímeros, Versacuerpos, y/o SMIPsMR (Small Modular ImmunoPharmaceuticals-Trubion Pharmaceuticals).
Los diacuerpos are moléculas biespecíficas bivalentes en donde los dominios VH y VL se expresan sobre una sola cadena de polipéptido, conectada por un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios sobre la misma cadena. Los dominios VH y VL se emparejan con los dominios complementarios de otra cadena, creando de esta manera dos sitios de enlace de antígeno. Holliger y colaboradores, 1993 Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 90: 6444-6448; Poljak y colaboradores, 1994 Structure 2: 1121-1123.
Los diacuerpos de una sola cadena (scDb) se producen mediante la conexión de las dos cadenas de polipéptido que forman el diacuerpo con un enlazador de aproximadamente 15 residuos de aminoácidos. Holliger y colaboradores, 1997 Cáncer Immunol. Immunother., 45: 128-30; Wu y colaboradores, 1996 Immunotechnology, 2: 21-36; Pluckthun y colaboradores, 1997 Immunotech.3: 83-105; Ridgway y colaboradores, 1996 Protein Eng., 9: 617-21. Un diacuerpo se puede fusionar con Fe para generar un "di-diacuerpo". Lu y colaboradores, 2004 J. Biol. Chem., 279: 2856-65.
La presente descripción proporciona además moléculas de enlace de Fbxo40 que exhiben propiedades funcionales de los anticuerpos, pero que derivan sus porciones de estructura y de enlace de antígeno a partir de otros polipéptidos. Los dominios de enlace de antígeno de estas moléculas de enlace se pueden generar a través de un proceso de evolución dirigida. Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 7,115,396. Las moléculas que tienen un pliegue global similar a aquél de un dominio variable de un anticuerpo (un pliegue "de tipo inmunoglobulina") son proteínas de andamiaje apropiadas. Las proteínas de andamiaje adecuadas para derivar las moléculas de enlace de antígeno incluyen fibronectina o un dímero de fibronectina, tenascina, N-cadherina, E-cadherina, ICAM, titina, receptor de GCSF, receptor de citoquina, inhibidor de glicosidasa, cromoproteína antibiótica, molécula de adhesión de membrana de mielina PO, CD8, CD4, CD2, MHC clase I, receptor de antígeno de células-T, dominios CD1, C2 e l-set de VCAM-1, dominio l-set de inmunoglobulina de la proteína C de enlace de miosina, dominio l-set de inmunoglobulina dominio de la proteína H de enlace de miosina, dominio l-set de inmunoglobulina de la teloquina, NCAM, twitchina, neuroglian, receptor de hormona de crecimiento, receptor de eritropoietina, receptor de prolactina, receptor de interferón-gamma, ß-galactosidasa/glucuronidasa, ß-glucuronidasa, trans-glutaminasa, receptor de antígeno de células-T, dismutasa de superóxido, dominio de factor de tejido, citocromo F, proteína fluorescente verde, GroEL, y taumatina.
Los términos "anticuerpo de Fbxo40", "molécula de tipo anticuerpo de Fbxo40", "molécula que se enlaza específicamente y/o selectivamente al Fbxo40", y similares, también incluyen ampliamente, pero no se limitan a, fragmentos de anticuerpos y miméticos de anticuerpos. Se conoce una amplia variedad de tecnologías de fragmentos de anticuerpos y de miméticos de anticuerpos. Los términos "anticuerpo de Fbxo40", "molécula de tipo anticuerpo de Fbxo40", y "molécula que se enlaza específicamente y/o selectivamente al Fbxo40" significan ampliamente que abarcan cualquiera y todos los fragmentos de anticuerpos y miméticos, incluyendo, pero no limitándose a, por ejemplo, Anticuerpos de dominio, Nanocuerpos, Unicuerpos, Adnectinas, aptámeros, Affibodies, DARPins, Anticalinas, Avímeros, y Versacuerpos. Algunas de estas moléculas se revisan en Gilí y Damle (2006) 17: 653-658.
Los anticuerpos de dominio (dAbs) son las unidades de enlace funcionales más pequeñas de los anticuerpos, que corresponden a las regiones variables de cualquiera de las cadenas pesadas (VH) o ligeras (VL) de los anticuerpos humanos. Domantis ha desarrollado una serie de bibliotecas grandes y altamente funcionales de anticuerpos de dominio (dAbs) VH y VL completamente humanos, y utiliza estas bibliotecas para seleccionar los anticuerpos de dominio (dAbs) que sean específicos para los objetivos terapéuticos. Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 6,291,158; 6,582,915; 6,593,081; 6,172,197; 6,696,245; Solicitud de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica con Número de Serie 2004/0110941; Solicitud de Patente Europea Número 1433846, y Patentes Europeas Números 0368684 y 0616640; y Publicaciones Internacionales Números WO05/035572, WO04/101790, WO04/081026, WO04/058821, WO04/003019 y WO03/002609.
Los nanocuerpos son proteínas terapéuticas derivadas de anticuerpos que contienen las propiedades estructurales y funcionales únicas de los anticuerpos de cadena pesada que se presentan naturalmente. Estos anticuerpos de cadena pesada contienen un solo dominio variable (VHH), y dos dominios constantes (CH2 y CH3). Publicación Internacional Número WO 04/041867; Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número U.S. 6,765,087; y Publicación Internacional Número WO 06/079372.
Los Unicuerpos son una tecnología de fragmentos de anticuerpos basada en la remoción de la región de articulación de los anticuerpos de lgG4. Esta supresión produce una molécula que es esencialmente de la mitad del tamaño de los anticuerpos de lgG4 tradicionales, y tiene una región de enlace univalente. Publicación Internacional Número WO2007/059782.
Las moléculas de Adnectina son proteínas de enlace diseñadas derivadas a partir de uno o más dominios de la proteína fibronectina. Ward y colaboradores, callutheran.edu/Academic_Programs/ Departments/BioDev/omm/fibro/fibro.htm; Pankov y Yamada (2002) J Cell Sci. 115 (Pt 20): 3861-3, Hohenester y Engel (2002) 21: 115-128, y Lucena y colaboradores (2007) Invest Clin. 48: 249-262. Las moléculas de Adnectina se pueden derivar a partir del dominio de fibronectina tipo III mediante la alteración de la proteína nativa, la cual se compone de múltiples cadenas beta distribuidas entre dos hojas beta.
La presente divulgación también abarca ampliamente una molécula de fibronectina o de tipo fibronectina, la cual se enlaza específicamente y/o selectivamente al Fbxo40. Las fibronectinas pueden contener múltiples dominios tipo III, los cuales se pueden denotar como, por ejemplo, 1Fn3, 2Fn3, 3Fn3, etc. El dominio 10Fn3 contiene un motivo de enlace de integrina, y además contiene tres ciclos que conectan a las cadenas beta. Estos ciclos se pueden pensar como correspondientes a los ciclos de enlace de antígeno de la cadena pesada de IgG, y se pueden alterar mediante los métodos discutidos más adelante, para enlazarse específicamente al Fbxo40. Solicitud de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 20070082365; Szostak y colaboradores, Solicitudes de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica con Números de Serie 09/007,005 y 09/247,190; Szostak y colaboradores, Publicación Internacional Número W0989/31700; y Roberts y Szostak (1997) 94: 12297-12302; Lohse, Solicitudes de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica con Números de Serie 60/110,549 y 09/459,190, y Publicación Internacional Número WO 00/32823; Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 7,115,396; 6,818,418; 6,537,749; 6,660,473; 7,195,880; 6,416,950; 6,214,553; 6623926; 6,312,927; 6,602,685; 6,518,018; 6,207,446; 6,258,558; 6,436,665; 6,281,344; 7,270,950; 6,951,725; 6,846,655; 7,078,197; 6,429,300; 7,125,669; 6,537,749; 6,660,473; y Solicitudes de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Números 20070082365; 20050255548; 20050038229; 20030143616; 20020182597; 20020177158; 20040086980; 20040253612; 20030022236; 20030013160; 20030027194; 20030013110; 20040259155; 20020182687; 20060270604; 20060246059; 20030100004; 20030143616; y 20020182597. La generación de diversidad en los dominios de fibronectina tipo III, tales como 10Fn3, seguida por un paso de selección, se puede llevar a cabo utilizando otros métodos conocidos en la técnica, tales como exhibición de fagos, exhibición de ribosoma, o exhibición en la superficie de levadura, por ejemplo, Lipovsek y colaboradores (2007) Journal of Molecular Biology 368: 1024-1041; Sergeeva y colaboradores (2006) Adv Drug Deliv Rev.58: 1622-1654; Petty y colaboradores (2007) Trends Biotechnol. 25: 7-15; Rothe y colaboradores (2006) Expert Opin Biol Ther. 6: 177-187; y Hoogenboom (2005) Nat Biotechnol.23: 1105-1116.
Las moléculas adicionales que se pueden utilizar para generar miméticos de anticuerpos por medio de los métodos referenciados anteriormente incluyen, sin limitación, los módulos de fibronectina humana 1Fn3-9Fn3 y 11Fn3-17Fn3, así como los módulos Fn3 relacionados a partir de animales no humanos y procariotes, y los módulos Fn3 a partir de otras proteínas con homología de secuencia con 10Fn3, tales como las tenascinas y las undulinas. Otras proteínas que no son anticuerpos, que tienen pliegues de tipo inmunoglobulina incluyen N-cadherina, ICAM-2, titina, receptor de GCSF, receptor de citoquina, inhibidor de glicosidasa, E-cadherina, y cromoproteína antibiótica. Se pueden derivar otros dominios con estructuras relacionadas a partir de la molécula de adhesión de membrana de mielina P0, CD8, CD4, CD2, MHC clase I, receptor de antígeno de células-T, dominios CD1, C2 y l-set de VCAM-1, pliegue l-set de inmunoglobulina de la proteína C de enlace de miosina, pliegue l-set de inmunoglobulina de la proteína H de enlace de miosina, pliegue I-set de inmunoglobulina de enlace de miosina de la teloquina, teliquina, NCAM, twitchina, neuroglian, receptor de hormona de crecimiento, receptor de eritropoietina, receptor de prolactina, receptor de GC-SF, receptor de interferón-gamma, beta-galactosidasa/glucuronidasa, beta-glucuronidasa, y trans-glutaminasa. De una manera alternativa, se puede utilizar cualquier otra proteína que incluya uno o más pliegues de tipo inmunoglobulina para crear una fracción de enlace de tipo adnectina. Estas proteínas se pueden identificar, por ejemplo, utilizando el programa SCOP. Murzin y colaboradores, J. Mol. Biol. 247: 536 (1995); Lo Conté y colaboradores, Nucleic Acids Res.25: 257 (2000).
Un aptámero es un polímero de nucleótidos pequeño que se enlaza a objetivos específicos. Los aptámeros pueden ser moléculas de ácidos nucleicos de una sola cadena o de doble cadena (ADN o ARN). Los aptámeros con frecuencia forman estructuras tridimensionales complejas que determinan su afinidad por los objetivos. Ellington y colaboradores, 1990 Nature. 346: 818-22; Schneider y colaboradores, 1992. J Mol Biol.228: 862-9; Klussmann. The Aptamer Handbook: Funcional Oligonucleotides and Their Applications. ISBN: 978-3-527-31059-3; Ulrich y colaboradores, 2006. Comb Chem High Throughput Screen 9: 619-32; Cerchia y colaboradores, 2007. Methods Mol Biol. 361: 187-200; Ireson y colaboradores, 2006. Mol Cáncer Ther.20065: 2957-62; Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números: 5582981; 5840867; 5756291; 6261783; 6458559; 5792613; 6111095; y Solicitudes de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Números: 11/482,671; 11/102,428; 11/291,610; y 10/627,543. Se puede emplear el método SELEX para generar aptámeros. Bugaut y colaboradores, 2006. 4(22): 4082-8; Stoltenburg y colaboradores, 2007 Biomol. Eng. 2007 24(4): 381-403; y Gopinath. 2007. Anal. Bioanal Chem. 2007. 387(1): 171-82. Un aptámero de la presente descripción también incluye moléculas de aptámeros hechas a partir de péptidos en lugar de nucleótidos. Baines y Colas. 2006. Drug Discov. Today. 11(7-8): 334-41; y Bickle y colaboradores, 2006. Nat. Protoc. 1(3): 1066-91.
Las moléculas Affibody se basan en un dominio de proteína de 58 residuos de aminoácidos, derivado a partir de un dominio de enlace de IgG de la proteína estafilocócica A. Este dominio se ha utilizado como un andamiaje para la construcción de bibliotecas de fagémidos de combinación, a partir de las cuales, se pueden seleccionar variantes que se dirijan hacia las moléculas deseadas, utilizando la tecnología de exhibición de fagos (Nord y colaboradores, Nat. Biotechnol 1997; 15: 772-7; Ronmark y colaboradores, Eur J Biochem 2002; 269: 2647-55). La estructura simple y el tamaño pequeño de las moléculas Affibody las hacen adecuadas para muchas aplicaciones, por ejemplo, como reactivos de detección (Ronmark y colaboradores, J Immunol Methods 2002; 261: 199-211), y para inhibir las interacciones con el receptor (Sandstorm y colaboradores, Protein Eng 2003; 16: 691-7). Véase también, la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,831,012.
Las DAR Pins ( Proteínas de Repetición de Anqui rina Diseñadas) son un ejemplo de la tecnolog ía de una DR P ( Proteína de Repetición Diseñada) mimética de anticuerpo, que se ha desarrollado para explotar las capacidades de enlace de los pol ipéptidos que no son anticuerpos. Las proteínas de repetición , tales como las proteínas de repetición ricas en anqui ri na o en leucina, son moléculas de enlace ubicuitas con unidades estructurales de repetición , las cuales se apilan juntas para formar dominios alargados que exhiben superficies de enlace del objetivo variables y modulares . Se pueden generar bibliotecas de poli péptidos de combi nación con especificidades de enlace diversificadas . Publicación de Solicitud de Patente de los Estados U nidos de Norteamérica Número 2004/01 32028 y Publicación de Solicitud I nternacional de Patente N úmero WO 02/20565.
Las anticalinas son miméticos de anticuerpos derivados a partir de las lipocalinas , una familia de proteínas de bajo peso molecular expresadas en los tejidos humanos y en los fluidos corporales. Las lipocalinas están asociadas con el transporte y almacenamiento fisiológico de los compuestos qu ímicamente sensibles o i nsolubles. Las lipocali nas se clonan , y sus ciclos se someten a diseño con el objeto de crear las anticalinas. Se han generado bibl iotecas de anticali nas estructu ralmente diversas , y la exhibición de antical ina permite hacer la selección y el rastreo de la función de enlace , seguida por la expresión y la producción de la prote ína soluble . Las anticalinas también se pueden formatear como proteínas de di rección dobles, denominadas como Duocalinas. Una Duocalina se enlaza a dos objetivos terapéuticos separados en una proteína monomérica. Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 7,250,297 y Publicación de Solicitud Internacional de Patente Número WO 99/16873.
Otra tecnología de miméticos de anticuerpos útil para la presente invención es la de los Avímeros. Los Avímeros evolucionan a partir de una gran familia de dominios de receptores extracelulares humanos, mediante la mezcla de exones in vitro y la exhibición de fagos, generando proteínas de múltiples dominios con propiedades de enlace e inhibidoras. Publicaciones de Solicitudes de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Números 2006/0286603, 2006/0234299, 2006/0223114, 2006/0177831, 2006/0008844, 2005/0221384, 2005/0164301, 2005/0089932, 2005/0053973, 2005/0048512, 2004/0175756.
Los Versacuerpos son otra tecnología de miméticos de anticuerpos que se podría utilizar en el contexto de la presente descripción. Los Versacuerpos son pequeñas proteínas de 3 a 5 kDa con >15 por ciento de cisteínas, que forman un andamiaje de alta densidad de disulfuro, reemplazando el núcleo hidrofóbico que tienen las proteínas típicas. Publicación de Solicitud de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 2007/0191272.
Los SMIPsMR (Small Modular ImmunoPharmaceuticals-Trubion Pharmaceuticals) se diseñan para mantener y optimizar el enlace del objetivo, las funciones efectoras, la vida media in vivo, y los niveles de expresión. Zhao y colaboradores (2007) Blood 110: 2569-77; y Solicitudes de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Números 20050238646; 20050202534; 20050202028; 20050202023; 20050202012; 20050186216; 20050180970; y 20050175614.
Un anticuerpo de Fbxo40 (o una molécula de tipo anticuerpo, o una molécula que se enlaza específicamente y/o selectivamente al Fbxo40, o una variante o derivado de la misma, y similares) de la presente divulgación, también conserva el enlace específico al Fbxo40, y/o con KD, Kdesact¡vada, y/o EC50 similares de un anticuerpo de Fbxo40. Esta variante, derivado, o molécula de tipo anticuerpo puede tener opcionalmente el mismo o diferente patrón de glicosilación, o se puede presentar naturalmente o se puede reconfigurar, puede tener modificaciones, sustituciones conservadoras o no conservadoras, y/o puede conservar la estructura en consenso de un anticuerpo de Fbxo40.
De conformidad con lo anterior, como se utilizan en la presente, los términos "anticuerpo para Fbxo40," "anticuerpo de Fbxo40", "molécula de tipo anticuerpo" que se enlaza a Fbxo40, y similares, se refieren todos a los diferentes tipos de los anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, variantes y derivados, moléculas de tipo anticuerpo, y moléculas que se enlazan con especificidad, que se enlazan específicamente y/o selectivamente al Fbxo40. De preferencia, estas composiciones también inhiben una función de Fbxo40, por ejemplo, una función descrita en la presente.
Como se utilizan en la presente, los términos "enlace específico", "enlace selectivo", y similares, significan que un anticuerpo u otra molécula exhibe una afinidad apreciable por un antígeno o epítopo particular, pero no por otros antígenos y epítopos, por ejemplo, Fbxo40, pero no por otras entidades (a menos que el anticuerpo o la molécula también se enlace al Fbxo40). Enlace "Apreciable" o un enlace específico particular incluye el enlace con una afinidad de cuando menos 106, 107, 108, 109 M' , o 1010 M"1. Las afinidades mayores de 107 M'1, de preferencia mayores de 108 M"1 son las más preferidas. Un anticuerpo que "no exhibe una reactividad cruzada significativa" es uno que no se enlazará apreciablemente a una entidad indeseable (por ejemplo, una entidad proteinácea indeseable). El enlace específico o selectivo se puede determinar de acuerdo con cualquier medio reconocido en este campo, incluyendo, por ejemplo, de acuerdo con el análisis de Scatchard y/o con los ensayos de enlace competitivo.
El término "KD", como se utiliza en la presente, pretende referirse a la constante de equilibrio de disociación de una interacción particular de anticuerpo-antígeno, o a la afinidad de un anticuerpo por un antígeno. En una modalidad, el anticuerpo de acuerdo con la presente divulgación se enlaza a un antígeno con una afinidad (KD) de 50 nM o mejor (por ejemplo, 40 nM o 30 nM o 20 nM o 10 nM o menos), como se mide utilizando un ensayo de resonancia de plasmón superficial o un ensayo de enlace de células.
El término "KdeSact¡vada " > como se utiliza en la presente, pretende referirse a la constante de índice desactivada para la disociación de un anticuerpo a partir del complejo de anticuerpo/antígeno.
El término "EC50", como se utiliza en la presente, se refiere a la concentración de un anticuerpo que induce una respuesta, ya sea en un ensayo ¡n vitro o in vivo, la cual es el 50 por ciento de la respuesta máxima, es decir, a la mitad del camino entre la respuesta máxima y la línea base.
Los anticuerpos, las moléculas de tipo anticuerpo, y otras moléculas que se enlazan específicamente y/o selectivamente al Fbxo40 de la presente divulgación, por consiguiente, incluyen, sin limitación, entre otras cosas, cualquiera de los tipos de moléculas que se enlistan en la presente, y otras diferentes moléculas que se enlazan específicamente, como son conocidas en la materia. Estas moléculas se pueden generar utilizando cualquier técnica conocida en la materia, incluyendo, pero no limitándose a, aquéllas enlistadas en la presente.
Las tecnologías para generar estas moléculas incluyen las tecnologías alternativas basadas en polipéptidos, tales como fusiones de las regiones determinantes de complementariedad, como se ilustran en Qui y colaboradores, Nature Biotechnology, 25(8) 921-929 (2007), así como las tecnologías basadas en ácidos nucleicos, tales como las tecnologías de aptámeros de ARN descritas en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,789,157, 5,864,026, 5,712,375, 5,763,566, 6,013,443, 6,376,474, 6,613,526, 6,114,120, 6,261,774, y 6,387,620.
Con el fin de generar moléculas de enlace que no sean anticuerpos, se puede crear una biblioteca de clones en donde se seleccionan aleatoriamente las secuencias de una proteína de andamiaje (por ejemplo, una fibronectina o una molécula de tipo fibronectina) que se enlacen al antígeno. Los clones de la biblioteca se prueban para determinar su enlace específico con el antígeno y para determinar otras funciones (por ejemplo, la inhibición de una actividad biológica de Fbxo40). Los clones seleccionados se pueden utilizar como la base para una selección aleatoria adicional, y para la selección con el objeto de producir derivados de más alta afinidad por el antígeno.
También se pueden generar moléculas de enlace de alta afinidad, por ejemplo, utilizando el décimo módulo de fibronectina III (10Fn3 o Fn10) como el andamiaje. Se construye una biblioteca para cada uno de los tres ciclos de tipo de región determinante de complementariedad (CDR) de 10FN3 en los residuos 23-29, 52-55, y 78-87. Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 6,818,418 y 7,115,396; Roberts y Szostak, 1997 Proc. Nati. Acad. Sci EUA 94: 12297; Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 6,261,804; Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 6,258,558; y Szostak y colaboradores, Publicación Internacional Número W098/31700.
Las moléculas de enlace que no son anticuerpos se pueden producir como dimeros o como multímeros para aumentar la avidez por el objetivo. Por ejemplo, el dominio de enlace de antígeno se expresa como una fusión con una región constante (Fe) de un anticuerpo que forma dímeros de Fc-Fc. Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 7,115,396.
Los anticuerpos que reconocen el mismo epítopo o un epítopo traslapado, se pueden identificar utilizando las técnicas de rutina, tales como un inmunoensayo, por ejemplo, un ensayo de enlace competitivo. Se conocen numerosos tipos de ensayos de enlace competitivo, por ejemplo: radioinmunoensayo (RIA) directo o indirecto en fase sólida, inmunoensayo enzimático (EIA) directo o indirecto en fase sólida, ensayo de competición de emparedado (véase Stahli y colaboradores (1983) Methods in Enzymology 9: 242); inmunoensayo enzimático (EIA) de biotina-avidina directo en fase sólida (véase Kirkland y colaboradores (1986) J. Immunol. 137: 3614); ensayo marcado directo en fase sólida, ensayo de emparedado marcado directo en fase sólida (véase Harlow y Lañe, (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press); radioinmunoensayo (RIA) de marcado directo en fase sólida que utiliza la marca de 1-125 (véase Morel y colaboradores (1988) Mol. Immunol. 25(1): 7); inmunoensayo enzimático (EIA) de biotina-avidina directo en fase sólida (Cheung y colaboradores (1990) Virology 176: 546); y radioinmunoensayo (RIA) marcado directo. (Moldenhauer y colaboradores (1990) Scand. J. Immunol.32: 77).
Los anticuerpos, las moléculas de tipo anticuerpo, y otras moléculas de enlace que se enlazan específicamente al Fbxo40 también se pueden modificar. Estas modificaciones incluyen, entre otras cosas, cambios desde el estado de la molécula como se encuentra en la naturaleza (el estado "que se presenta naturalmente"), cambios en el patrón de glicosilación, reconfiguración, modificaciones de la secuencia de aminoácidos (incluyendo, entre otras cosas, sustituciones conservadoras y no conservadoras), injerto de región determinante de complementariedad (CDR), maduración de afinidad, modificación de la región Fe o de la región de articulación, y/o cambio en la pegilación o en otra modificación posterior a la traducción, y similares.
El término "que se presenta naturalmente", como se utiliza en la presente, en relación con su aplicación a un objeto, se refiere al hecho de que un objeto se puede encontrar en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de polipéptido o de polinucleótido que esté presente en un organismo (incluyendo virus), que se pueda aislar a partir de una fuente de la naturaleza, y que no haya sido intencionalmente modificada por el hombre en el laboratorio, es la que se presenta naturalmente.
Como se utiliza en la presente, "patrón de glicosilación" se define como el patrón de las unidades de carbohidrato que se unen covalentemente a una proteína, más específicamente a una proteína de ¡nmunoglobulina.
El término "reconfigurada" , como se utiliza en la presente, se refiere a una configuración de un locus de ¡nmunoglobulina de cadena pesada o de cadena ligera, en donde un segmento V se coloca inmediatamente adyacente a un segmento D-J o J en una conformación que codifica esencial mente un dominio VH o VL completo, respectivamente. U n locus del gen de in mu noglobulina reconfigurado se puede identificar mediante su comparación con el ADN de la l ínea germinal ; un locus reconfigu rado tendrá cuando menos un elemento de homología de heptámero/nonámero recombinado.
El térmi no "no reconfigurada" o "configu ración de la l ínea germi nal" , como se utiliza en la presente, con referencia a un segmento V , se refiere a la configuración en donde el segmento V no se recombi na para quedar inmediatamente adyacente a un segmento D o J .
El término "modificar, " o " modificación" , como se utiliza en la presente, pretende referi rse a cambiar uno o más aminoácidos en los anticuerpos . El cambio se puede producir mediante la adición , sustitución o supresión de un aminoácido en una o más posiciones. Los anticuerpos , las moléculas de tipo anticuerpo, y otras moléculas que se enlazan específicamente y/o selectivamente al Fbxo40, pueden tener modificaciones, i ncl uyendo sustituciones de aminoácidos conservadoras y no conservadoras.
La presente divulgación , por consiguiente , abarca las "sustituciones de aminoácidos conservadoras" en esa secuencia de nucleótidos y de aminoácidos, con modificaciones que no abroguen el enlace del anticuerpo con el Fbxo40. Las sustituciones de aminoácidos conservadoras i ncluyen la sustitución de un ami noácido de una clase por un aminoácido de la misma clase . Seis clases generales de cadenas laterales de aminoácidos incluyen: Clase I (Cys); Clase II (Ser, Thr, Pro, Ala, Gly); Clase III (Asn, Asp, Gln, Glu); Clase IV (His, Arg, Lys); Clase V (Me, Leu, Val, Met); y Clase VI (Phe, Tyr, Trp). Brummell y colaboradores, Biochem. 32: 1180-1187 (1993); Kobayashi y colaboradores, Protein Eng. 12(10): 879-884 (1999); y Burks y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 94: .412-417 (1997).
El término "sustitución de aminoácido no conservadora" se refiere a la sustitución de un aminoácido de una clase con un aminoácido a partir de otra clase.
De una manera alternativa, en otra modalidad, se pueden introducir mutaciones (conservadoras o no conservadoras) aleatoriamente a lo largo de toda o de una parte de una secuencia de codificación de un anticuerpo, tal como mediante mutagénesis de saturación, y los anticuerpos modificados resultantes se pueden rastrear para determinar su actividad de enlace. Las modificaciones conservadoras y no conservadoras se pueden presentar en una secuencia en consenso de un anticuerpo, en una molécula de tipo anticuerpo, o en otra molécula que se enlace específicamente y/o selectivamente al Fbxo40.
Una "secuencia en consenso" es una secuencia formada a partir de los aminoácidos (o de los nucleótidos) que se presenten con mayor frecuencia en una familia de secuencias relacionadas (Véase, por ejemplo, Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemania 1987). En una familia de proteínas, cada posición en la secuencia en consenso está ocupada por el aminoácido que se presenta con mayor frecuencia en esa posición en la fam i l ia. Si dos aminoácidos se presentan con igual frecuencia, se puede i nclui r cualquiera de los mismos en la secuencia en consenso. Una "estructura en consenso" de una inmunoglobulina se refiere a u na región de estructura en la secuencia de i nmunoglobul i na en consenso. En la materia se conocen otras secuencias en consenso de los anticuerpos, las moléculas de tipo anticuerpo, y otras moléculas que se enlazan específicamente y/o selectivamente.
Se pueden preparar versiones modificadas adicionales de estas composiciones utilizando las técnicas conocidas por una persona de una experiencia ordinaria en este campo . U n anticuerpo de la presente descripción se puede preparar utilizando un anticuerpo que tenga una o más secuencias VH y/o VL como material de partida para diseñar un anticuerpo modificado, el cual puede tener propiedades alteradas a parti r del anticuerpo de partida. U n anticuerpo se puede diseñar mediante la modificación de uno o más residuos dentro de una o ambas regiones variables. U n anticuerpo de Fbxo40 de la presente divulgación puede tener uno o más de los siguientes : injerto de región determinante de complementariedad (CDR) , aminoácido mutado, secuencia de afinidad madurada, y/o modificación de la región Fe, región de articulación , patrón de glicosi lación y/o patrón de pegilación .
U n tipo de diseño de región variable que se puede llevar a cabo es el injerto de región determinante de complementariedad (CDR); las secuencias de reglones determinantes de complementariedad (CDR) a partir de un anticuerpo se injertan sobre las secuencias de estructura a partir de un anticuerpo diferente con propiedades diferentes. (Riechmann y colaboradores, 1998 Nature 332: 323-327; Jones y colaboradores, 1986 Nature 321: 522-525; Queen y colaboradores, 1989 Proc. Nati. Acad. See. EUA 86: 10029-10033; Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,225,539; 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 y 6,180,370). Los métodos de injerto de región determinante de complementariedad (CDR) y las secuencias apropiadas son conocidos. Por ejemplo, véase www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase; Kabat y colaboradores, 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, U.S. Dept. of Health and Human Services, NIH Publicación No. 91-3242; Tomlinson y colaboradores, 1992 J. Mol. Biol. 227: 776-798; y Cox y colaboradores, 1994 Eur. J. Immunol. 24: 827-836; Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 y 6,180,370. Las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) también se pueden injertar en las regiones de estructura de polipéptidos diferentes de los dominios de inmunoglobulina, por ejemplo, una estructura basada en fibronectina, anquirina, lipocallna, neocarzinostaína, citocromo b, dedo de zinc CP1, PST1 , bobina enrollada, LACI-D1, dominio Z o tendramisat. Nygren y Uhlen, 1997 Current Opinión in Structural Biology, 7, 463-469).
Los residuos de aminoácidos dentro de las regiones C DR 1 , CDR2 y/o C DR3 VH y/o VL se pueden mutar para mejorar las propiedades de enlace del anticuerpo, lo que se conoce como "maduración de afinidad" . Las mutaciones pueden ser sustituciones, adiciones, o supresiones de aminoácidos, cambios conservadores o no conservadores, y/o el uso de un ami noácido qu ímicamente modificado. Se pueden hacer modificaciones a la estructura dentro de VH y/o VL, por ejemplo, para mejorar las propiedades del anticuerpo , por ejemplo, para disminui r la inmunogenicidad . Un planteamiento es " retromutar" uno o más residuos de estructura hasta la secuencia de la l ínea germi nal correspondiente. De una manera más específica, un anticuerpo que ha experi mentado u na mutación somática puede contener residuos de estructu ra que difieran de la secuencia de la l ínea germi nal a partir de la cual se derive el anticuerpo . Las mutaciones somáticas se pueden " retromutar" hasta la secuencia de la l ínea germinal .
Otro tipo de modificación de estructura invol ucra mutar uno o más residuos para remover los ep ítopos de células-T para reducir la inmunogenicidad potencial ("desi nmunizar") del anticuerpo. Publicación de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 200301 53043 por Carr y colaboradores.
Los anticuerpos de la presente descripción se pueden modificar dentro de la región Fe , por ejemplo , para alterar una o más propiedades , por ejemplo, vida media en suero , fijación del complemento, enlace del receptor de Fe, y/o citotoxicidad celular dependiente del antígeno. Adicionalmente, un anticuerpo de la presente descripción se puede modificar químicamente (por ejemplo, una o más fracciones químicas se pueden unir al anticuerpo) o se puede modificar para alterar su glicosilación, nuevamente para alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo.
En una modalidad, la región de articulación de CH1 se modifica de tal manera que se altera el número de residuos de cisteína en la región de articulación. Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,677,425. La región de articulación Fe también se puede mutar para alterar la vida media biológica del anticuerpo. Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 6,165,745.
El anticuerpo se puede modificar para aumentar su vida media biológica. Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 6,277,375; 5,869,046 y 6,121,022.
En diferentes modalidades del anticuerpo de la descripción, se pueden modificar (sustituir, agregar, suprimir, cambiar químicamente, o sustituir conservadoramente) uno o más aminoácidos para alterar las funciones efectoras, por ejemplo, la afinidad por un ligando efector (por ejemplo, un receptor de Fe o el componente de complemento C1) y/o la capacidad de enlace de antígeno, Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,624,821 y 5,648,260; para alterar el enlace de C1q y/o la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 6,194,551; para alterar la capacidad del anticuerpo para fijar el complemento. Publicación Internacional Número WO 94/29351; y/o para aumentar la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) y/o para aumentar la afinidad del anticuerpo por un receptor de Fcy, Publicación Internacional Número WO 00/42072 por Presta. Más aún, se han mapeado los sitios de enlace sobre la IgG 1 humana para FcyRI, FcyRII, Fcy R 111 y FcFtn, y se han descrito variantes con un enlace mejorado. Shields, R.L. y colaboradores, 2001 J. Biol. Chem. 276: 6591-6604.
El anticuerpo puede tener un patrón de glicosilación modificado, hipoglicosilación, modificación mediante carbohidratos alternativos, o ninguna glicosilación. Patente Europea Número EP 1,176,195 por Hang y colaboradores.; Publicación Internacional del TCP Número WO 03/035835 por Presta; Shields, R. L. y colaboradores, 2002 J. Biol. Chem. 277: 26733-26740); Publicación Internacional Número WO 99/54342 por Umana y colaboradores; Umana y colaboradores, 1999 Nat. Biotech. 17: 176-180.
El anticuerpo se puede pegilar, por ejemplo, para aumentar la vida media biológica (por ejemplo, en suero) del anticuerpo. Como se utiliza en la presente, el término "polietilenglicol" pretende abarcar cualquiera de las formas de PEG que se han utilizado para derivar otras proteínas, tales como mono-alcoxilo (de 1 a 10 átomos de carbono)- o ariloxi-polietilenglicol o polietilenglicol-maleimida. En ciertas modalidades, el anticuerpo que se va a pegilar es un anticuerpo aglicosilado. Patente Europea Número EP 0 154 316 por Nishimura y colaboradores, y Patente Europea Número EP 0401 384 por Ishikawa y colaboradores. La pegilación se puede alterar mediante la introducción de un aminoácido no natural. Deiters y colaboradores, J Am Chem Soc 125: 11782-11783, 2003; Wang y colaboradores, Science 301: 964-967, 2003; Wang y colaboradores, Science 292: 498-500, 2001; Zhang y colaboradores, Science 303: 371-373, 2004; Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 7,083,970.
La presente divulgación, por consiguiente, abarca cualquiera y toda forma de anticuerpo o inmunoglobulina para Fbxo40, modificación, fragmento o variante de los mismos, o molécula que imite la funcionalidad y/o la estructura de un anticuerpo anti-Fbxo40. Todos los documentos citados en la presente se incorporan a la presente como referencia en su totalidad.
Los anticuerpos, las moléculas de tipo anticuerpo, y otras moléculas que se enlazan específicamente y/o selectivamente al Fbxo40, se pueden utilizar para la elaboración de inmunoconjugados, en cuyo caso, se conjugan con otra fracción.
Por consiguiente, en otro aspecto, los métodos de la presente descripción emplean agentes inmunoconjugados que se dirigen al Fbxo40 y que inhiben o sub-modulan el Fbxo40, incluyendo, pero no limitándose a, agentes citotóxicos, agentes anti-inflamatorios, por ejemplo, un agente anti-inflamatorio esteroideo o no esteroideo, o antimetabolitos de citotoxinas (por ejemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluoro-uracilo, decarbacina), agentes alquilantes (por ejemplo, mecloretamina, tiotepa-clorambucil, melfalano, carmustina (BSNU), y lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfano, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C, y cis-diclorodiamina-platino (II) (DDP), cisplatina), antraciclinas (por ejemplo, daunorrubicina (anteriormente daunomicina), y doxorrubicina), antibióticos (por ejemplo, dactinomicina (actinomicina), bleomicina, mitramicina, y antramicina (AMC)), y agentes anti-mitóticos (por ejemplo, vincristina y vinblastina).
El término "citotoxina" o "agente citotóxico" incluye cualquier agente que sea perjudicial (por ejemplo, que aniquile) para el tejido fibrótico. Los ejemplos incluyen taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etoposida, tenoposida, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxi-antracina-diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1 -deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, y puromicina, y análogos u homólogos de los mismos.
Los inmunoconjugados se pueden formar mediante la conjugación (por ejemplo, el enlace químico o la expresión recombinante) de anticuerpos con los agentes terapéuticos adecuados. Los agentes adecuados incluyen, por ejemplo, un agente citotóxico, una toxina, y/o un isótopo radioactivo. Las toxinas y los fragmentos de las mismas que se pueden utilizar incluyen cadena A de difteria, fragmentos activos no enlazantes de toxina de difteria, cadena A de exotoxina (a partir de Pseudomonas aeruginosa), cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modeccina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, y PAP-S), inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina, y los tricotecenos. Se pueden utilizar una variedad de radionúclidos, por ejemplo, 212B¡, 31l, 131ln, 90Y y 186Re.
Los inmunoconjugados se pueden elaborar utilizando una variedad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales, tales como propionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditiol) (SPDP), iminotiolano (IT), derivados de imidoésteres bifuncionales (tales como adipimidato de dimetilo HCL), ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehidos (tales como glutaraldehído), compuestos de bis-azido (tales como bis-(p-azidobenzoil)-hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazonio-benzoil)-etilen-diamina), di-isocianatos (tales como 2,6-di-isocianato de tolileno), y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1 ,5-difluoro-2,4-dinitro-benceno). Se puede preparar una inmunotoxina de ricina. Vitetta y colaboradores, Science 238: 1098 (1987). El ácido 1 -isotiocianato-bencil-3-metil-dietilen-triamina-penta-acético marcado con Carbono-14 (MX-DTPA) es un agente quelante de ejemplo para la conjugación del radionucleótido al anticuerpo (véase, por ejemplo, la Publicación Internacional Número WO94/11026).
U n experto ordi nario en este campo puede preparar otros diferentes anticuerpos , moléculas de tipo anticuerpo, y otras moléculas, y variantes e inmunoconjugados de los mismos, que se enlacen específicamente y/o selectivamente y antagonicen al Fbxo40. siARN, otros ácidos nucleicos inhibidores y similares que antagonizan al Fbxo40 Un antagonista de Fbxo40 también puede ser un ácido nucleico inhibidor, por ejemplo, un ARN inhibidor corto (siARN) . En una modalidad , el antagonista de Fbxo40 empleado en los métodos de la presente divulgación es un siARN u otro ácido nucleico complementario para un ácido nucleico o gen Fbxo40 (o u na porción anti-sentido del mismo) , o un vector de expresión recombinante q ue codifique el ácido nucleico (o una porción anti-sentido del mismo) . Como se utiliza en la presente , u n ácido nucleico "anti-sentido" comprende una secuencia de nucleótidos complementaria para u n ácido nucleico "en sentido" que codifica la prote ína de Fbxo40 (por ejemplo, complementaria para la cadena codificante de un ADN de doble cadena, complementaria para un ARNm , o complementaria para una cadena codificante de u n gen Fbxo40) . Como se utiliza en la presente , un "siAR N o ácido nucleico anti-sentido" y similares, en dife rentes contextos, puede comprender cualquier siAR N (ARN de doble cadena) o cualquier ADN de una sola cadena. Como se uti liza en la presente , y como se detalla más adelante, el térmi no "siARN" puede abarcar cualquier tipo de ARN que comprenda una región de doble cadena capaz de mediar la interferencia del ARN (incluyendo las moléculas que comprenden dos cadenas separadas, dos cadenas conectadas con un ciclo [por ejemplo, una horquilla], dos cadenas en donde una o ambas cadenas comprenden una hendidura de una sola cadena, moléculas que comprenden nucleótidos modificados y/o tapas de extremo, etc.). En una modalidad, el siARN para Fbxo40 se enlaza en la porción del gen que representa el Fbox. En otra modalidad específica particular, el siARN para Fbxo40 se enlaza en la porción del gen que representa el dominio de dedo de zinc. En otra modalidad específica particular, el siARN se enlaza a una porción del gen que no representa el Fbox. En otra modalidad específica particular, el siARN se enlaza a una porción del gen.
El uso de ácidos nucleicos anti-sentido para sub-modular la expresión de una proteína particular en una célula es bien conocido en la materia. Weintraub y colaboradores, Reviews - Trends ¡n Genetics, Volumen 1 1986; Askari y colaboradores, 1996 N. Eng. J. Med. 334: 316-318; Bennett y colaboradores, 1995 Circulation 92: 1981-1993; Mercóla y colaboradores, 1995 Cáncer Gene Ther. 2: 47-59; Rossi 1995 Br. Med. Bull. 51: 217-225; Wagner 1994 Nature 372: 333-335.
Un siARN o un ácido nucleico anti-sentido comprende una secuencia complementaria para, y es capaz de tener enlace de hidrógeno con, la cadena codificante de otro ácido nucleico (por ejemplo, un ARNm). Las secuencias anti-sentido complementarias para un ARNm pueden ser complementarias para la región codificante , la región no traducida 5' ó 3' del AR N m , y/o una región que puentee las regiones codificante y no traducida, y/o porciones de las mismas . Adicionalmente , un siARN o un ácido nucleico antisentido puede ser complementario para una región reguladora del gen que codifique el ARN m , por ejemplo, una secuencia de i nicio de transcripción o de traducción o un elemento regulador. De preferencia, un ácido nucleico anti-sentido puede ser complementario para una región que preceda o que se extienda en el codón de i nicio sobre la cadena codificante o en la región no traducida 3' de un ARNm .
Los siARNs y los ácidos nucleicos anti-sentido se pueden diseñar de acuerdo con las reglas de emparejamiento de bases de Watson y Crick. El siARN o la molécula de ácido nucleico antisentido puede ser complementaria para la región codificante entera del ARN m de Fbxo40 , pero más preferiblemente es un oligonucleótido que es anti-sentido para solamente una porción de la región codificante o no codificante del AR Nm de Fbxo40. Por ejemplo, el siARN o el oligonucleótido anti-sentido puede ser complementario para la región que rodee al sitio de inicio de traducción del AR N m de Fbxo40. U n siARN o un ácido nucleico antisentido puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 5 , 1 0, 1 5 , 20, 25 , 30, 35 , 40, 45 ó 50 nucleótidos de longitud .
U n siARN o un ácido nucleico anti-sentido se puede construi r utilizando síntesis qu ímica y reacciones de ligamiento enzimático, empleando los procedimientos conocidos en la materia. Por ejemplo, un siARN o un ácido nucleico anti-sentido (por ejemplo, un oligonucleótido anti-sentido) se puede sintetizar químicamente utilizando nucleótidos que se presenten naturalmente o nucleótidos diversamente modificados diseñados para aumentar la estabilidad biológica de las moléculas o para aumentar la estabilidad física del dúplex formado entre los ácidos nucleicos anti-sentido y en sentido, por ejemplo, se pueden utilizar derivados de fosforotioato y nucleótidos sustituidos por acridina. Los ejemplos de los nucleótidos modificados que se pueden utilizar para generar el ácido nucleico anti-sentido incluyen 5-fluoro-uracilo, 5-bromo-uracilo, 5-cloro-uracilo, 5-yodo-uracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetil-citosina, 5-(carboxi-hidroxi-metil)-uracilo, 5-carboxi-met¡l-ami o-metil-2-tio-uridina, 5-carboxi-metil-amino-metil-uracilo, dihidro-uracilo, beta-D-galactosil-queosina, inosina, N6-isopentenil-adenina, 1-metil-guanina, 1 -metil-inosina, 2,2-dimetil-guanina, 2-metil-adenina, 2-metil-guanina, 3-metil-citosina, 5-metil-citosina, N6-adenina, 7-metil-guanina, 5-metil-amino-metil-uracilo, 5-metoxi-amino-metil-2-tiouracilo, beta-D-manosil-queosina, 5'-metoxi-carboxi-metil-uracilo, 5-metoxi-uracilo, 2-tiometil-N6-isopentenil-adenina, ácido uracil-5-oxiacético (v), wibutoxosina, pseudo-uracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, metil-éster del ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético (v), 5-metil -2-tiouracilo, 3-(3-amino-3-N-2-carboxi-propil)-uracilo, (acp3)w, y 2,6-diamino-purina.
El siARN o el ácido nucleico anti-sentido también puede tener una estructura base alternativa, tal como ácidos nucleicos asegurados (LNA), Morfolinos, ácidos nucleicos peptídicos (PNA), ácido nucleico de treosa (TNA), o ácido nucleico de glicol (GNA), y/o se puede marcar (por ejemplo, se puede radiomarcar o se puede marcar de otra manera). Publicaciones Internacionales Números WO 2005/075637 y WO 9518820; Zhang y colaboradores, 2005 J. Am. Chem. Soc. 127: 4174-5; Orgel 2000 Science 290 (5495): 1306-1307; Moulton 2009 Molecules 14: 1304-1323; Summerton 1999 Biochimica et Biophysica Acta 1489: 141-58.
En todavía otra modalidad, el siARN o la molécula de ácido nucleico anti-sentido empleada mediante los métodos de la presente divulgación puede incluir una molécula de ácido nucleico a-anomérica. Una molécula de ácido nucleico a-anomérica forma híbridos de doble cadena específicos con ARN complementario en donde, contrariamente a las unidades-ß usuales, las cadenas corren paralelas unas a otras. Gaultier y colaboradores, 1987 Nucleic Acids Res. 15: 6625-6641. El siARN o la molécula de ácido nucleico antisentido también puede comprender un ribonucleótido de 2'-o-metilo (Inoue y colaboradores, 1987 Nucleic Acids Res. 15: 6131-6148), o un análogo de ARN-ADN quimérico (Inoue y colaboradores, 1987 FEBS Lett.215: 327-330).
En todavía otra modalidad, un siARN o un ácido nucleico antisentido es una ribozima. Las ribozimas son moléculas de ARN catalíticas con actividad de ribonucleasa, las cuales son capaces de disociar un ácido nucleico de una sola cadena, tal como un ARNm, con el que tienen una región complementaria. Por consiguiente, las ribozimas [por ejemplo, ribozimas de cabeza de martillo (descritas en Haselhoff y colaboradores, 1988, Nature 334: 585-591)] se pueden utilizar para disociar catalíticamente las transcripciones de ARNm de Fbxo40 para inhibir de esta manera la traducción del ARNm de Fbxo40.
De una manera alternativa, la expresión genética se puede inhibir dirigiendo las secuencias de nucleótidos complementarias para la región reguladora de Fbxo40 (por ejemplo, el promotor y/o los potenciadores) para formar estructuras de triple hélice que impiden la transcripción del gen Fbxo40. Véase en general, Helene 1991 Anticancer Drug Des. 6(6): 569-84; Helene y colaboradores, 1992 Ann. N.Y. Acad. Sci. 660: 27-36; y Maher 1992, Bioassays 14(12): 807-15.
De una manera alternativa, el siARN o el ácido nucleico antisentido se puede producir biológicamente utilizando un vector de expresión en el que se haya sub-clonado un ácido nucleico en una orientación anti-sentido (es decir, el ARN transcrito a partir del ácido nucleico insertado tendrá una orientación anti-sentido para un ácido nucleico objetivo de interés, descrito adicionalmente en la siguiente subsección).
El siARN o las moléculas de ácido nucleico anti-sentido de la presente divulgación típicamente se administran a un sujeto o se generan in situ, de tal manera que se hibridan con el ARNm celular y/o con el ADN genómico que codifica Fbxo40, e inhiben la expresión mediante la inhibición de la transcripción y/o de la traducción . Un ejemplo de una vía de administración de moléculas de ácido nucleico anti-sentido incluye la inyección directa en el sitio del tejido. De una manera alternativa, el siARN o las moléculas de ácido nucleico anti-sentido se pueden modificar para di rigirse a las células seleccionadas, y entonces se administran sistémicamente . Por ejemplo, para la admi nistración sistémica, el siARN o las moléculas anti-sentido se pueden modificar de tal mane ra que se enlacen específicamente a los receptores o ant ígenos expresados sobre una superficie cel ular seleccionada, por ejemplo, mediante el enlace de las moléculas de ácido nucleico a los péptidos o anticuerpos que se enlacen con los receptores de superficie celular o con los antígenos. Las moléculas de ácido nucleico también se pueden sumi nistrar a las células utilizando vectores bien conocidos en la materia y descritos, por ejemplo, en la Patente de los Estados U nidos de Norteamérica Número U S200701 1 1230, cuyo contenido entero se i ncorpora a la presente . Para alcanzar concentraciones intracelulares suficientes de las moléculas , se prefieren las construcciones del vector en donde la molécula de ácido nucleico se coloca bajo el control de un promotor pol I I o pol I I I fuerte .
En otra modalidad, un siARN o un ácido nucleico anti-sentido utilizado en los métodos de la presente divulgación, es un compuesto que media la ARNi (interferencia del ARN) . Los agentes de interferencia del ARN i ncluyen , pero no se limitan a, moléculas de ácido nucleico q ue incluyen moléculas de ARN que son homologas al Fbxo40 o a un fragmento del mismo, "ARN de interferencia corto" (siARN), "ARN de horquilla corta", "ARN de horquilla pequeña" (shARN), "microARN" (miARN), y otras moléculas pequeñas que modulan, interfieren con, o inhiben la expresión de un gen objetivo mediante la interferencia del ARN (ARNi) al nivel de la regulación genética o de la transcripción del ARNm.
La interferencia del ARN es una técnica de silenciamiento genético dirigido posterior a la transcripción que utiliza el ARN de doble cadena (dsARN) para degradar el ARN mensajero (ARNm) que contiene la misma secuencia que el dsARN. Zamore y colaboradores, 2000 Cell 101: 25-33; Fire y colaboradores, 1998 Nature 391: 806; Hamilton y colaboradores, 1999 Science 286: 950-951; Lin y colaboradores, 1999 Nature 402: 128-129; Sharp 1999 Genes & Dev. 13: 139-141; Strauss 1999 Science 286: 886; Sharp y colaboradores, 2000 287: 2431-2432; Tuschl y colaboradores, 1999 Genes Dev. 13: 3191-3197.
El proceso de ARNi se presenta cuando la ribonucleasa III (Dicer) disocia el dsARN más largo en fragmentos más cortos denominados como siARNs. Los siARNs (ARNs de interferencia pequeños) son típicamente de aproximadamente 21 a 23 nucleotidos de largo, y comprenden aproximadamente 19 dúplexes de pares de bases. Bass 2000 Cell 101: 235; Zamore y colaboradores, 2000 Cell 101: 25-33; Hammond y colaboradores, 2000 Nature 404: 293; Berstein y colaboradores, 2001 Nature 409: 363; Elbashir y colaboradores, 2001 Genes Dev. 15: 188). Entonces los segmentos más pequeños del ARN median la degradación del ARNm objetivo.
La Dicer también se ha implicado en la separación de los ARNs temporales pequeños de 21 y 22 nucleotidos (stARNs) a partir del ARN precursor de estructura conservada, que están implicados en el control de la traducción. Hutvagner y colaboradores, 2001, Science, 293, 834. La respuesta de la ARNi también proporciona un complejo de endonucleasa, comúnmente referido como un complejo silenciador inducido por el ARN (RISC), el cual media la disociación de ARNm de una sola cadena complementario para la cadena anti-sentido del siARN. La disociación del ARN objetivo tiene lugar a la mitad de la región complementaria para la cadena anti-sentido del dúplex de siARN. Elbashir y colaboradores, 2001 Genes Dev. 15: 188.
Los kits para la síntesis de la ARNi están comercialmente disponibles, por ejemplo, en New England Biolabs and Ambion.
La ARNi se ha estudiado en una variedad de sistemas. Fire y colaboradores, 1998 Nature 391: 806; Bahramian y Zarbl 1999 Mol. Cell. Biology 19: 274-283; Wianny y Goetz 1999 Nature Cell Biol. 2: 70; Hammond y colaboradores, 2000 Nature 404: 293; Elbashir y colaboradores, 2001 Nature 411: 494 y Tuschl y colaboradores, Publicación Internacional del TCP Número WO 01/75164, describen la ARNi inducida mediante la introducción de dúplexes de ARNs sintéticos de 21 nucleotidos en células de mamífero cultivadas, incluyendo células HeLa y renales embrionarias humanas.
El trabajo reciente en Usados embrionarios de Drosophila (Elbashir y colaboradores, 2001 EMBO J. 20: 6877, y Tuschl y colaboradores, Publicación Internacional del TCP Número WO 01/75164) ha revelado ciertos requerimientos para la longitud, estructura, composición química, y secuencia del siARN que son esenciales para mediar una actividad eficiente de la ARNi. Estos estudios han demostrado que los dúplexes de siARN de 21 nucleótidos son más activos cuando contienen colgaduras de dinucleótidos 3'-terminales. Se toleró la sustitución de los nucleótidos de colgadura de siARN 3'-terminales con nucleótidos de 2'-desoxilo (2'-H). En adición, se requiere de un 5'-fosfato sobre la cadena complementaria del objetivo de un dúplex de siARN para la actividad del siARN. Nykanen y colaboradores, 2001 Cell 107: 309.
El reemplazo de los segmentos colgantes de nucleótidos 3'-terminales de un dúplex de 21-mer de siARN que tiene colgaduras-3' de dos nucleótidos con desoxirribonucleótidos no tiene un efecto adverso sobre la actividad de la ARNi. El reemplazo de hasta cuatro nucleótidos sobre cada extremo del siARN con desoxi-ribonucleótidos ha sido bien tolerado, mientras que la sustitución completa con desoxirribonucleótidos da como resultado ninguna actividad de ARNi. Elbashir y colaboradores, 2001, EMBO J., 20, 6877, y Tuschl y colaboradores, Publicación Internacional del TCP Número WO 01/75164. Li y colaboradores, Publicación Internacional del TCP Número WO 00/44914, y Beach y colaboradores, Publicación Internacional del TCP Número WO 01/68836, sugieren preliminarmente que el siARN puede incluir modificaciones a ya sea la estructura base de fosfato-azúcar o bien el nucleósido, para incluir cuando menos uno de un heteroátomo de nitrógeno o de azufre. Kreutzer y colaboradores , Solicitud de Patente Canadiense Número 2 ,359 , 1 80 , también describen ciertas modificaciones qu ímicas para utilizarse en las construcciones del dsARN con el objeto de contrarrestar la activación de la cinasa de prote ína dependiente del ARN de doble cadena (PKR) , específicamente los nucleótidos de 2'-amino o 2'-0-metilo, y los nucleótidos que contienen un puente de metileno 2'-0 ó 4'-C.
Parrish y colaboradores , 2000 Molecular Cell 6: 1 077- 1 087, probaron ciertas modificaciones qu ímicas que se di rigen al gen unc-22 en C. elegans utilizando transcripciones de siARN largas (>25 nucleótidos) . Los autores describen la introducción de residuos de tiofosfato en estas transcripciones de siAR N mediante la incorporación de análogos de nucleótidos de tiofosfato con polimerasa de ARN T7 y T3, y observaron que los AR Ns con dos bases modificadas por fosforotioato también tuvieron u na disminución sustancial en su efectividad como AR N i . Además, Parrish y colaboradores, reportaron que la modificación con fosforotioato de más de dos residuos desestabilizaba mucho los AR Ns in vitro, de tal manera que no se pudieron ensayar las actividades de interferencia. Id . en 1 081 . Los autores también probaron ciertas modificaciones en la posición 2' del azúcar del nucleótido en las transcripciones largas del siARN , y encontraron que la sustitución con desoxinucleótidos por los ribonucleótidos produc ía una dismi nución sustancial en la actividad de interferencia, en especial en el caso de las sustituciones de Uridina hasta Timidina y/o de Citidina hasta Desoxi-Citidina. Id. En adición, los autores probaron ciertas modificaciones de bases, incluyendo la sustitución, en las cadenas en sentido y anti-sentido del siARN, con 4-tiouracilo, 5-bromo-uracilo, 5-yodo-uracilo, y 3-(amino-alil)-uracilo en lugar de uracilo, y con inosina en lugar de guanosina. Mientras que la sustitución con 4-tiouracilo y 5-bromo-uracilo pareció ser tolerada, Parrish reportó que la inosina producía una disminución sustancial en la actividad de interferencia cuando se incorporaba en cualquiera de las cadenas. Parrish también reportó que la incorporación de 5-yodo-uracilo y 3-(amino-alil)-uracilo en la cadena anti-sentido dio como resultado una disminución sustancial en la actividad de la ARNi también.
Los expertos en este campo apreciarán que es posible sintetizar y modificar el siARN como sea deseado, empleando cualquier método convencional conocido en la materia (véase Henschel y colaboradores, 2004 DEQOR: a web-based tool for the design and quality control of siARNs. Nucleic Acids Research 32 (Publicación del Servidor Web): W113-W120). Además, será evidente para los expertos en este campo que hay una variedad de secuencias reguladoras (por ejemplo, promotores constitutivos o inducibles, promotores específicos del tejido o fragmentos funcionales de los mismos, etc.) que son útiles para la construcción/el vector de expresión de siARN, shARN, u oligonucleótido anti-sentido.
Existen varios ejemplos en la técnica que describen modificaciones de azúcar, base, fosfato y de la estructura base, que se pueden introducir en las moléculas de ácido nucleico con una mejora significativa en su estabilidad en nucleasa y en su eficacia. Por ejemplo, los oligonucleótidos se modifican para mejorar la estabilidad y/o para mejorar la actividad biológica mediante la modificación con grupos resistentes a nucleasa, por ejemplo, modificaciones con 2'-amino, 2'-C-alilo, 2'-flúor, 2'-0-metilo, 2'-0-alilo, 2'-H, y base de nucleótido (para una reseña, véase Usman y Cedergren 1992 TIBS. 17: 34; Usman y colaboradores, 1994 Nucleic Acids Symp. Ser.31: 163; Burgin y colaboradores, 1996 Biochemistry 35: 14090). La modificación de azúcar de las moléculas de ácido nucleico se ha descrito extensamente en la materia [véase Eckstein y colaboradores, Publicación Internacional del TCP Número WO 92/07065; Perrault y colaboradores, Nature 1990 344: 565-568; Pieken y colaboradores, Science 1991 253: 314-317; Usman y colaboradores, Trends in Biochem. Sci. 1992 17: 334-339; Usman y colaboradores, Publicación Internacional del TCP Número WO 93/15187; Sproat, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,334,711, y Beigelman y colaboradores, 1995 J. Biol. Chem. 270: 25702; Beigelman y colaboradores, Publicación Internacional del TCP Número WO 97/26270; Beigelman y colaboradores, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,716,824; Usman y colaboradores, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,627,053; Woolf y colaboradores, Publicación Internacional del TCP Número WO 98/13526; Thompson y colaboradores, Solicitud de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica con Número de Serie 60/082,404, la cual se presentó el 20 de abril de 1998; Karpeisky y colaboradores, 1998 Tetrahedron Lett. 39: 1131; Earnshaw y colaboradores, 1998 Biopolimers (Nucleic Acid Sciences) 48: 39-55; Verma y Eckstein 1998 Annu. Rev. Biochem. 67: 99-134; y Burlina y colaboradores, 1997 Bioorg. Med. Chem. 5, 1999-2010; Iwase y colaboradores, 2007 Nucleosides, Nucleotides, and Nucleic Acids 26: 1451-1454; Iwase y colaboradores, Peptide Science 2003; M. Ueki, Editor, The Japanese Peptide Society, Osaka, 2004, páginas 445-446; Elbashir y colaboradores, 2001 Nature 411: 494-498; Dowler y colaboradores, 2006 Nucí. Acids Res. 34: 1669-1675; Mesmaeker y colaboradores, 1996 Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 35: 2790-2794; Rozners y colaboradores, 1997 Nucleosides, Nucleotides 16: 967-970; Robins y colaboradores, 2000 Nucleosides, Nucleotides, Nucleic Acids 19: 69-86; todas las referencias se incorporan mediante la presente en su totalidad por referencia a la presente]. Otro ejemplo de modificaciones al siARN para alterar o mejorar su efectividad es descrito por Hohjoh en FEBS Letters 557 (2004) páginas 193-198. Se proporcionan modificaciones adicionales y tapas de extremo-3' en las Publicaciones Internacionales Números WO 2005/021749 y WO 2007/128477.
Soutschek y colaboradores, 2004 Nature 432: 173-178 presentaron la conjugación de colesterol con el extremo 3' de la cadena en sentido de una molécula de siARN por medio de un enlazador de pirrolidina, generando de esta manera un conjugado covalente e irreversible.
También se pueden hacer modificaciones químicas (incluyendo la conjugación con otras moléculas) de siARN para mejorar el tiempo de retención y la eficiencia farmacocinética K. Mark y colaboradores, 2006 Molecular Therapy, 13: 644-670.
Otra literatura general que describe modificaciones del siARN incluye: La modificación química de siARNs para su uso in vivo. Behlke 2008 Oligonucleptides 18: 305-19; Watts y colaboradores, 2008 Drug Discov. Today 13: 842-55; Peek y colaboradores, Curr. Opin. Mol. Ther. 2007 9: 110-8; Chen y colaboradores, 2005 Drug Discov. Today. 10: 587-93.
Se ha descrito el uso de dsARN más largo. Por ejemplo, Beach y colaboradores, Publicación Internacional del TCP Número WO 01/68836, describen la atenuación de la expresión genética utilizando dsARN endógenamente derivado. Tuschl y colaboradores, Publicación Internacional del TCP Número WO 01/75164, describen un sistema de ARNi in vitro de Drosophiia, y el uso de moléculas específicas de siARN para ciertas aplicaciones genómicas funcionales y para ciertas aplicaciones terapéuticas. Li y colaboradores, Publicación Internacional del TCP Número WO 00/44914, describen el uso de dsARNs específicos largos (de 141 pares de bases a 488 pares de bases) enzimáticamente sintetizados o expresados por el vector para atenuar la expresión de ciertos genes objetivo. Zernicka-Goetz y colaboradores, Publicación Internacional del TCP Número WO 01/36646, describen ciertos métodos para inhibir la expresión de genes particulares en células de mamífero utilizando ciertas moléculas de dsARN largas (de 550 pares de bases a 714 pares de bases) enzimáticamente sintetizadas o expresadas por el vector. Fire y colaboradores, Publicación Internacional del TCP Número WO 99/32619, describen métodos particulares para introducir ciertas moléculas de dsARN largas en las células para utilizarse en la inhibición de la expresión genética en los nemátodos. Plaetinck y colaboradores, Publicación Internacional del TCP Número WO 00/01846, describen ciertos métodos para identificar los genes específicos responsables de conferir un fenotipo particular en una célula utilizando moléculas de dsARN largas específicas. Mello y colaboradores, Publicación Internacional del TCP Número WO 01/29058, describen la identificación de genes específicos involucrados en la ARNi mediada por el dsARN. Pachuck y colaboradores, Publicación Internacional del TCP Número WO 00/63364, describen ciertas construcciones largas (de cuando menos 200 nucleótidos) del dsARN. Deschampe Depaillette y colaboradores, Publicación Internacional del TCP Número WO 99/07409, describen composiciones específicas que consisten en moléculas de dsARN particulares combinadas con ciertos agentes antivirales. Waterhouse y colaboradores, Publicación Internacional del TCP Número 99/53050 y 1998, PNAS, 95, 13959-13964, describen ciertos métodos para disminuir la expresión fenotípica de un ácido nucleico en células de plantas utilizando ciertos dsARNs. Driscoll y colaboradores, Publicación Internacional del TCP Número WO 01/49844, describen construcciones de expresión de ADN específicas para utilizarse con el fin de facilitar el silenciamiento genético en los organismos objetivo.
Otros han reportado sobre diferentes sistemas de ARNi y de silenciamiento genético. Por ejemplo, Parrish y colaboradores, 2000, Molecular Cell 6: 1077-1087, describen construcciones de dsARN químicamente modificadas específicas que se dirigen al gen unc-22 de C. elegans. Grossniklaus, Publicación Internacional del TCP Número WO 01/38551, describe ciertos métodos para regular la expresión genética de policomb en plantas utilizando ciertos dsARNs. Churikov y colaboradores, Publicación Internacional del TCP Número WO 01/42443, describen ciertos métodos para modificar las características genéticas de un organismo utilizando ciertos dsARNs. Cogoni y colaboradores, Publicación Internacional del TCP Número WO 01/53475, describen ciertos métodos para aislar un gen de silenciamiento de Neurospora, y el uso del mismo. Reed y colaboradores, Publicación Internacional del TCP Número WO 01/68836, describen ciertos métodos para el silenciamiento genético en plantas. Honer y colaboradores, Publicación Internacional del TCP Número WO 01/70944, describen ciertos métodos de rastreo de fármacos utilizando nemátodos transgénicos como modelos de Enfermedad de Parkinson utilizando ciertos dsARNs. Deak y colaboradores, Publicación Internacional del TCP Número WO 01/72774, describen ciertos productos genéticos derivados de Drosophila que pueden estar relacionados con la ARNi en Drosophila. Arndt y colaboradores, Publicación Internacional del TCP Número WO 01/92513, describen ciertos métodos para mediar la supresión genética utilizando factores que mejoran la ARNi. Tuschl y colaboradores, Publicación Internacional del TCP Número WO 02/44321, describen ciertas construcciones de siARN sintéticas. Pachuk y colaboradores, Publicación Internacional del TCP Número WO 00/63364, y Satishchandran y colaboradores, Publicación Internacional del TCP Número WO 01/04313, describen ciertos métodos y composiciones para inhibir la función de ciertas secuencias de polinucleotidos utilizando ciertos dsARNs largos (de más de 250 pares de bases) expresados por el vector. Echeverri y colaboradores, Publicación Internacional del TCP Número WO 02/38805, describen ciertos genes de C. elegans identificados por medio de la ARNi. Kreutzer y colaboradores, Publicaciones Internacionales del TCP Números WO 02/055692 y WO 02/055693, y Patente Europea Número EP 1144623 B1, describen ciertos métodos para inhibir la expresión genética utilizando el dsARN. Graham y colaboradores, Publicaciones Internacionales del TCP Números WO 99/49029 y WO 01/70949, y AU 4037501, describen ciertas moléculas de siARN expresadas por el vector. Fire y colaboradores, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 6,506,559, describen ciertos métodos para inhibir la expresión genética in vitro utilizando ciertas construcciones de dsARN largas (de 299 pares de bases a 1033 pares de bases) que median la ARNi. Martínez y colaboradores, 2002, Cell, 110, 563-574, describen ciertas construcciones de siARN de una sola cadena, incluyendo ciertos siARNs de una sola cadena 5'-fosforiladas que median la interferencia del ARN en células HeLa. Harborth y colaboradores, 2003, Antisense & Nucleic Acid Drug Development, 13, 83-105, describen ciertas moléculas de siARN químicamente y estructuralmente modificadas. Chiu y Rana, 2003, RNA, 9, 1034-1048, describen ciertas moléculas de siARN químicamente y estructuralmente modificadas. Woolf y colaboradores, Publicaciones Internacionales del TCP Números WO 03/064626 y WO 03/064625, describen ciertas construcciones de dsARN químicamente modificadas.
Los siARNs de la presente divulgación se pueden suministrar (por ejemplo, a una célula in vitro o a un paciente) por cualquier medio conocido en la materia.
El suministro del siARN al tejido es un problema tanto debido a que el material debe llegar al órgano objetivo, como que también debe entrar al citoplasma de las células objetivo. El ARN no puede penetrar en las membranas celulares, de tal manera que es poco probable que tenga éxito el suministro sistémico del siARN no protegido. El ARN se degrada rápidamente mediante la actividad de la ARNsa en suero. Por estas razones, se han ideado otros mecanismos para suministrar el siARN a las células objetivo. Los métodos conocidos en la técnica incluyen, pero no se limitan a: suministro viral (retrovirus, adenovirus, lentivirus, baculovirus, AAV); liposomas (Lipofectamina, DOTAP catiónico, DOPC neutro) o nanopartículas (polímero catiónico, PEI), suministro bacteriano (tkARNi), y también la modificación química (LNA) del siARN para mejorar la estabilidad.
Xia y colaboradores, 2002 Nat. Biotechnol. 20, y Devroe y colaboradores, 2002. BMC Biotechnol. 2 1: 15, dan a conocer la incorporación del siARN en un vector viral.
Los liposomas se han utilizado anteriormente para el suministro de fármacos (por ejemplo, el suministro de un producto quimioterapéutico). Los liposomas (por ejemplo, los liposomas catiónicos) se describen en las Publicaciones Internacionales del TCP Números WO02/100435A1 , WO03/015757A1 , y WO04029213A2; las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,962,016; 5,030,453; y 6,680,068; y la Solicitud de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 2004/0208921. Un proceso para la elaboración de liposomas también se describe en la Publicación Internacional Número WO04/002453A1. Adicionalmente, los lípidos neutros se han incorporado en los liposomas catiónicos (por ejemplo, Farhood y colaboradores, 1995). Los liposomas catiónicos se han utilizado para suministrar el siARN a diferentes tipos de células (Sioud y Sorensen 2003; Solicitud de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 2004/0204377; Duxbury y colaboradores, 2004; Donze y Picard, 2002). El uso de los liposomas neutros se da a conocer en Miller y colaboradores, 1998, y en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 2003/0012812.
La transfección química utilizando técnicas basadas en lípidos, basadas en amina, y basadas en polímeros, se da a conocer en los productos de Ambion Inc., Austin, Tex.¡ y de Novagen, EMD Biosciences, Inc, una Afiliada de Merck KGaA, Darmstadt, Alemania); Ovcharenko D (2003) "Eff icient Delivery of siRNAs to human primary cells". Ambion TechNotes 10 (5): 15-16). Adicionalmente, Song y colaboradores (Nat Med. publicado en línea (Fete I 0, 2003) doi: 10.1038/nm828), y otros [Caplen y colaboradores, 2001 Proc. Nati. Acad. Sci. (EUA), 98: 9742-9747; y McCaffrey y colaboradores, Nature 414: 34-39], dan a conocer que las células hepáticas se pueden transfectar eficientemente mediante la inyección del siARN en el sistema circulatorio de un mamífero.
Se han utilizado una variedad de moléculas para el suministro del siARN específico de las células. Por ejemplo, la propiedad de condensación del ácido nucleico de la protamina se ha combinado con anticuerpos específicos para suministrar siARNs. Song y colaboradores, 2005 Nat Biotch. 23: 709-717. También se ha utilizado el policatión PEGilado de auto-ensamble de polietilenimina (PEI) para condensar y proteger los siARNs. Schiffelers y colaboradores, 2004 Nucí. Acids Res.32: el49, 141-1 10.
Las nanopartículas que contienen el siARN se suministraron entonces con éxito a la neovasculatura tumoral que sobre-expresaba la integrina. Hu-Lieskovan y colaboradores, 2005 Cáncer Res. 65: 8984-8992.
Otras referencias que dan a conocer las metodologías de suministro del siARN se pueden encontrar en: Whitehead y colaboradores, 2009 Nat. Rev. Drug Discov. 8: 129-38; Wullner y colaboradores, 2009 Recent Pat. Anticancer Drug Discov. 4: 1-8; Aigner y colaboradores, 2008 Curr. Pharm. Des. 14(34): 3603-19; Kim y colaboradores, 2009 Pharm Res. 26: 657-66. Publicación Electrónica 18 de noviembre de 2008; Shen y colaboradores, IDrugs. agosto de 2008; 11(8): 572-8; Reischl y colaboradores, 2009 Nanomedicine. 2009 5: 8-20. Publicación Electrónica 18 de julio de 2008; Durcan y colaboradores, 2008 Mol Pharm. 5: 559-66; Sanguino y colaboradores, 2008 Mini Rev. Med. Chem. 8: 248-55; de Fougerolles y colaboradores, 2008 Hum. Gene Ther. 2008 19: 125-32; Akhtar y colaboradores, 2007 J. Clin. Invest. 117: 3623-32; Zhang y colaboradores, 2007 J. Control. Reléase 123: 1-10. Publicación Electrónica 7 de agosto de 2007; Meade y colaboradores, 2007 Adv. Drug Deliv. Rev. 59: 134-40. Publicación Electrónica 15 de marzo de 2007; Lewis y colaboradores, 2007 Adv. Drug Deliv. Rev. 59: 115-23. Publicación Electrónica 15 de marzo de 2007; Sioud 2005 Expert Opin. Drug Deliv.2: 639-51.
El diseño de un siARN específico puede involucrar un análisis de la estructura secundaria del ARNm. El ARNm in vivo no es lineal; más bien, se pliega sobre sí mismo de una manera compleja, formando regiones de doble cadena (por ejemplo, tallos), y regiones de una sola cadena (por ejemplo, ciclos). También puede formar regiones de triple cadena, pseudo-nudos, y otras estructuras. Por consiguiente, un ARNm puede tener múltiples segmentos emparejados y no emparejados y estructuras de horquilla asignadas. Se han propuesto métodos para predecir esta estructura secundaria de los ARNms. Zuker 2003 Nucí. Acids Res.31: 3406-15; y Mathews y colaboradores, 1999 J. Mol. Biol. 288: 911-940. También se han propuesto métodos para predecir cuál siARN se enlazaría en las regiones de una sola cadena de un ARNm. Publicación Internacional Número WO 2005/075637.
Los siARNs que son particularmente útiles para esta divulgación incluyen aquéllos que se pueden enlazar específicamente a una región del ARNm de Fbxo40, y que tienen una o más de las siguientes cualidades: el enlace en el segmento codificante de Fbxo40; el enlace en o cerca de la unión de la región no traducida 5\ y el inicio del segmento codificante; el enlace en o cerca del sitio de inicio de la traducción del ARNm; el enlace en o cerca de las uniones de los exones y los intrones; poco o ningún enlace con los ARNms de otros genes (pocos o ningún "efecto fuera del objetivo"); el enlace con el ARNm de Fbxo40 en o cerca de una región o regiones que no son de doble cadena o una región de tallo, por ejemplo, en un ciclo o en una porción de una sola cadena; la provocación de poca o ninguna inmunogenicidad; el enlace en un segmento de la secuencia del ARNm de Fbxo40 que está conservado entre diferentes especies de animales (incluyendo humano, ratón, rata, mono cinomolgo, etc.), como la presencia de una secuencia conservada facilita la prueba utilizando diferentes animales de laboratorio; el enlace con regiones de doble cadena del ARNm; el enlace con una región rica en AT (por ejemplo, cuando menos aproximadamente el 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, o 60 por ciento rica en AT); y la falta de secuencias particulares que se sabe o se sospecha que disminuyen la actividad del siARN, por ejemplo, la presencia de una secuencia de GG en el extremo 5', que puede disminuir la separación de la porción de doble cadena del siARN.
El siARN puede tener modificaciones internamente, o en uno o ambos extremos. Las modificaciones en los extremos pueden ayudar a estabilizar el siARN, protegiéndolo de la degradación por las nucleasas en la sangre. Los siARNs se pueden dirigir opcionalmente a las regiones del ARNm de Fbxo40 que se sepa o se prediga que están cerca de, o en, los sitios de empalme del gen, por ejemplo, en las uniones de exón-intrón. Los siARNs también se pueden diseñar opcionalmente para templarse con las regiones expuestas y/o de una sola cadena conocidas o predichas del ARNm (por ejemplo, los ciclos).
Como se observa anteriormente, la secuencia de ARNm para el Fbxo40 humano está fácilmente disponible, por ejemplo, en GenBank: NM_016298 (SEO. ID NO: 2). Las secuencias para varios homólogos de animales están disponibles: ratón (Mus musculus): NM_001037321 ; Rata (Rattus norvegicus): XM_344023; Chimpancé (Pan troglodytes): NC_006490.2; Macaco Rhesus (Macaca mulatta): NC_007859.1; Pez Zebra (Danio rerio): BX322577.11 (pseudo-gen) o XP_694708.3; Cerdo Salvaje (Sus scrofa): EU743742; Pollo (Gallus gallus): XP_424000.2; y Perro (Canis lupus familiaris): XP_545126.2.
Los siARNs se pueden diseñar como antagonistas de Fbxo40 que se enlazan con, y asisten en la degradación de, el ARNm de Fbxo40. Los siARNs anti-Fbxo40 se pueden diseñar para enlazarse al segmento codificante o al segmento no codificante (por ejemplo, las regiones no traducidas o UTRs 5' ó 3'). De preferencia, el siARN se enlaza al segmento codificante del ARNm. Los siARNs pueden tener regiones de doble cadena de, por ejemplo, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, o 24 pares de bases. De preferencia, el siARN comprende 19 ó 21 pares de bases. Los siARNs también pueden tener colgaduras de 0, 1 ó 2 colgaduras; de preferencia, como en el caso de las colgaduras de 0 nucleótidos, son de extremos romos. La secuencia de ARNm de un gen puede variar de individuo a individuo, en especial en las posiciones fluctuantes dentro del segmento codificante, o en la región no traducida; los individuos también pueden diferir unos de otros en la secuencia de codificación, dando como resultado diferencias adicionales en el ARNm y en la secuencia de siARN correspondiente. Los siARNs también se pueden modificar en la secuencia para reducir la inmunogenicidad, el enlace con los genes indeseados (por ejemplo, los "efectos fuera del objetivo"), o para aumentar la estabilidad en la sangre. (Estas variantes de secuencia son independientes de la modificación química de las bases ó 5' ó 3' u otras tapas de extremo de los siARNs.) A partir de la secuencia presentada como la SEQ ID NO: 2, se pueden determinar fácilmente las secuencias adecuadas de siARNs que comprendan el 19-mer y una colgadura. La cadena anti-sentido se deduce fácilmente, como en lo anterior, basándose en el emparejamiento de atson-Crick. Se pueden agregar colgaduras basándose en la secuencia genética completa proporcionada anteriormente, en la SEQ ID NO: 2.
En adición, en una modalidad específica particular, los siARNs de Fbxo40 comprenden una colgadura de dTdT sobre cualquiera o sobre ambos extremos 3'.
En adición, en diferentes modalidades específicas particulares, los siARNs de Fbxo40 comprenden una región de doble cadena que comprende cualquier porción de 15, 16, 17, o 18 nucleótidos de la SEQ ID NO: 1.
En una modalidad específica particular, los siARNs de Fbxo40 seleccionados consisten en las secuencias 19-mer de los siARNs que inician en las posiciones de los nucleótidos 1 a 5704, junto con la cadena anti-sentido.
En otra modalidad específica particular, los siARNs de Fbxo40 seleccionados comprenden las secuencias 19-mer de los siARNs que inician en las posiciones de los nucleótidos 1 a 5704, junto con la cadena anti-sentido, pero en adición, tienen colgaduras sobre una o la otra cadena. En otra modalidad específica particular, los siARNs de Fbxo40 seleccionados tienen colgaduras sobre ambas cadenas. En otra modalidad específica particular, los siARNs de Fbxo40 seleccionados tienen una colgadura sobre solamente una cadena. Las colgaduras pueden estar en el extremo 3' ó 5'. En otra modalidad específica particular, los siARNs de Fbxo40 seleccionados tienen colgaduras que son de menos de 5 nucleótidos de largo. En otra modalidad específica particular, los siARNs de Fbxo40 seleccionados tienen colgaduras que son de 2 nucleótidos de largo.
En otra modalidad, los siARNs de Fbxo40 comprenden cualquier siARN que inicia en cualquier secuencia de 1 a 5709, pero es de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45 ó 46 nucleótidos de longitud. En una modalidad específica particular, el siARN comprende una región de doble cadena de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45 ó 46 nucleótidos de longitud. En una modalidad específica especialmente particular, los siARNs de Fbxo40 comprenden una región de doble cadena de 19 ó 21 pares de bases.
En una modalidad específica particular, los siARNs de Fbxo40 seleccionados comprenden un 19-mer con un emparejamiento perfecto entre los homólogos humano y de ratón. Esto facilita el uso del ratón como un modelo animal.
En otra modalidad específica particular, los siARNs de Fbxo40 seleccionados comprenden un 19-mer con un emparejamiento perfecto entre los homólogos humano y de rata. Esto facilita el uso de la rata como un modelo animal.
En otra modalidad específica particular, los siARNs de Fbxo40 seleccionados comprenden un 19-mer con un emparejamiento perfecto entre los homólogos humano y de Sus scrofa.
En otra modalidad específica particular, los siAR Ns de Fbxo40 seleccionados comprenden un 1 9-mer con un emparejamiento perfecto entre los homólogos humano y de pol lo.
En otra modal idad específica particular, los siAR Ns de Fbxo40 seleccionados comprenden un 1 9-mer con un emparejamiento perfecto entre los homólogos humano y de Macaca.
En otra modalidad específica particular, los siARNs de Fbxo40 seleccionados comprenden un 1 9-mer con un emparejamiento perfecto entre los homólogos humano y de Pan.
En otra modal idad específica particular, los siARNs de Fbxo40 seleccionados se emparejan en la secuencia entre los homólogos humano, de rata, y de Macaca mulatta.
En otra modalidad específica particular, los siAR Ns de Fbxo40 seleccionados comprenden un 1 9-mer con un emparejamiento perfecto entre los homólogos humano , de ratón , y de Macaca.
En otra modalidad específica particular, los siAR Ns de Fbxo40 seleccionados comprenden un 1 9-mer con un emparejamiento perfecto entre los homólogos hu mano , de ratón, de rata, de Sus, de Pan y de Macaca.
En otra modalidad específica particular, los siARNs de Fbxo40 seleccionados comprenden un 1 9-mer con un emparejamiento perfecto entre los homólogos humano, de ratón , de rata, y de Macaca.
La presente divulgación comprende además secuencias que representan una porción (por ejemplo, 15, 16, 17, o 18 nucleótidos de largo) de los 19-mers mencionados. Por consiguiente, por ejemplo, un 19-mer con una secuencia que se empareja con el Fbxo40 humano y un animal particular comprende diferentes secuencias 15-, 16-, 17-, y 18-mer que también se pueden utilizar en esta descripción.
En una modalidad específica particular, los siARNs de Fbxo40 seleccionados se dirigen a las secuencias de CACCTCCTGGAAA GTCCACAA (SEQ ID NO: 19), GTGGGAAAGTATGTTCAGCAA (SEQ ID NO: 20) o AGCCGTGGATGCCAAAGACTA (SEQ ID NO: 21) (o los equivalentes de ARN de las mismas).
En otra modalidad específica particular, los siARNs de Fbxo40 seleccionados comprenden una secuencia que es única para el gen Fbxo40 humano (por consiguiente, no encontrada en otro gen humano). Esto reducirá los efectos fuera del objetivo.
En otra modalidad específica particular, los siARNs de Fbxo40 seleccionados se enlazan a estructuras secundarias particulares en el ARNm de Fbxo40. Los ARNms son conocidos por formar estructuras secundarias complejas, las cuales comprenden regiones de doble cadena (por ejemplo, tallos), y regiones de una sola cadena (por ejemplo, ciclos). También son posibles otras estructuras (por ejemplo, pseudo-nudos y regiones de triple cadena). Estas estructuras se pueden predecir a partir de una secuencia conocida mediante diferentes softwares. Zuker 2003 Nucí. Acids Res. 31: 3406-15; y Mathews y colaboradores, 1999 J. Mol. Biol. 288: 911- 940.
Como un ejemplo no li mitante, se pueden utilizar los siguientes parámetros : Temperatura de pliegue : 37°C . La secuencia de AR N es li neal . Condiciones iónicas : NaCI 1 M , no hay iones divalentes. Porcentaje de número de suboptimalidad: 5. Límite superior sobre el núme ro de pliegues calculados: 50. Parámetro de ventana: Por omisión . Máximo tamaño de ciclo interior/protuberante : 30. Máxi ma asi metría de un ciclo i nterior/protuberante : 30. Máxi ma distancia entre las bases emparejadas: si n l ímite.
Sin desear obligarse por u na teoría en particular, los inventores observan que las estructuras particulares con un ARNm pueden ser particularmente susceptibles al enlace con los siARNs. Estas áreas son designadas como "puntos calientes". También se han propuesto métodos para predeci r cuál siARN se enlazaría en las regiones de una sola cadena de un ARNm . Publicación I nternacional N úmero WO 2005/075637.
Estas estructuras i ncluyen regiones de una sola cadena (por ejemplo, ciclos) ; secuencias que comprenden ciclos cortos (por ejemplo, un siARN de 1 9 ó 21 nucleótidos, el cual comprende uno o dos ciclos más cortos intercalados con las regiones de tallo); secuencias adyacentes a los ciclos, en particular secuencias di rectamente corriente abajo de un ciclo (por ejemplo, con un ciclo 5' para la secuencia que se enlaza al siARN) ; secuencias que se extienden en dos regiones de tallo. Por consiguiente , un siARN útil como un antagonista de Fbxo40 se puede enlazar a una o más regiones de una sola cadena (o porción de las mismas) , a una o más regiones de doble cadena (o porción de las mismas) , o se puede enlazar adyacente a una o dos regiones de una sola cadena. Adicionalmente, las secuencias que están altamente conservadas a través de las l íneas de especies también pueden ser muy susceptible al siARN . En adición , las secuencias de ARNm que se sepa que son enlazadas por las prote ínas del huésped , pueden no serlo.
Por consiguiente , el antagonista de Fbxo40 de la presente divulgación puede incluir, sin limitación , un siARN que: (a) corresponda a (y se temple con) cuando menos uno, dos o más ciclos predichos en el ARNm de Fbxo40 (correspondientes o que se templen a porciones o a las totalidades de los ciclos) ; (b) esté adyacente a uno o dos ciclos predichos en el AR N m de Fbxo40; (c) corresponda a cuando menos una, dos o más estructu ras de tal lo; y/o (d) esté adyacente a u na o dos estructuras de tal lo del ARNm de Fbxo40. De preferencia, el siARN se templa a una secuencia de ARNm de Fbxo40 predicha para comprender un ciclo que comprende cuando menos aproximadamente 1 , 2 , 3, 4 , 5 , 6, 7, 8 , 9 , ó 1 0 nucleótidos , más preferiblemente cuando menos aproximadamente 4, todav ía más preferiblemente cuando menos aproximadamente 6. En otra modal idad específica particular, el siARN se templa a una secuencia de Fbxo40 adyacente a un ciclo que comprende cuando menos aproxi madamente 1 , 2, 3, 4, 5 , 6, 7, 8 , 9 , ó 1 0 nucleótidos, más preferiblemente cuando menos aproximadamente 4, todavía más preferiblemente cuando menos aproximadamente 6.
En adición a la descripción de la presente, se puede utilizar cualquier método o material conocido en la materia para preparar un ácido nucleico inhibidor, siARN, o similares, que sea capaz de antagonizar el Fbxo40.
Antagonización de Fbxo40 El antagonista de Fbxo40 (ya sea que comprenda un bajo peso molecular (LMW), anticuerpo, siARN u otra composición) disminuirá la actividad, el nivel y/o la expresión del Fbxo40.
Cualquier método conocido en la materia puede ser útil para medir los cambios en la actividad, el nivel, y/o la expresión del Fbxo40 inducidos por un antagonista de Fbxo40. Las mediciones se pueden llevar a cabo en múltiples puntos del tiempo, antes, durante y después de la administración del antagonista, para determinar el efecto del antagonista.
El nivel o expresión del Fbxo40 se puede medir mediante la evaluación del ARNm (por ejemplo, por medio de Northern blots o por medio de reacción en cadena de la polimerasa (PCR)) o de la proteína (por ejemplo, Western blots). El efecto de un antagonista sobre la expresión del Fbxo40 se puede determinar mediante la medición de los índices de transcripción del gen Fbxo40 (por ejemplo, por medio de Northern blots; o por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con transcriptasa inversa, o por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real). La reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) se ha utilizado para mostrar que los niveles de ARNm del Fbxo40 son altos en riñon , páncreas y próstata , y medianos en h ígado y bazo. Brauner-Osborne y colaboradores, 2001 . Biochim . Biophys . Acta 1 51 8: 237-248. Se pueden hace r mediciones directas de los niveles de Fbxo40 , por ejemplo, mediante Western blots de los tej idos en donde se exprese el Fbxo40 , incluyendo el músculo card íaco y esquelético.
Hay varios medios disponibles para medir la actividad del Fbxo40. La actividad del Fbxo40 se puede medi r por la capacidad del Fbxo40 para enlazarse al I RS 1 . De una manera alternativa, la actividad del Fbxo40 se puede medir por la capacidad de la proteína para enlazarse al Skp 1 .
Estas evaluaciones pueden medi r la sub-regulación de la expresión , el nivel o la actividad del Fbxo40 mediada por un antagonista de Fbxo40.
Un método para el rastreo de composiciones con el fi n de determi nar su capacidad para aumentar la masa muscular, o para preveni r, limitar o reducir la pérdida de la masa muscular en un individuo , el cual comprende: aseverar el nivel o la actividad del Fbxo40 en una célula, tratar la célula con una composición , y aseverar el nivel o la actividad del Fbxo40 en la cél ula nuevamente, en donde la capacidad de la composición para disminuir el nivel o la actividad del Fbxo40 está correlacionada con la capacidad para aumentar la masa muscular, o para prevenir la pérdida de la masa muscular en un individuo.
En este método, el nivel o la actividad del Fbxo40 se puede medir en una célula in vitro. El nivel o expresión del Fbxo40 se puede medir utilizando cualquier método conocido en la materia, por ejemplo, aquéllos discutidos anteriormente, tales como medir el nivel de ARNm o de proteína del Fbxo40. La actividad del Fbxo40 se puede medir mediante cualquier método conocido en la materia, por ejemplo, aquéllos discutidos anteriormente, tales como medir la capacidad del Fbxo40 para interactuar con Skp1 y/o IRS1.
La célula entonces se puede tratar con un antagonista de Fbxo40 supuesto. Varias células del mismo tipo se pueden tratar con diferentes niveles del antagonista supuesto o de un control (tal como PBS, suero regulado con fosfato). La célula también, o de una manera alternativa, se puede tratar muchas veces con el antagonista supuesto.
Las células entonces se pueden volver a medir para determinar el nivel, la expresión, o la actividad del Fbxo40.
En adición, en la materia se conocen los métodos para utilizar adenovirus para suministrar un antagonista de siARN, y entonces medir la eficacia del siARN sobre la promoción de la hipertrofia muscular.
Como un ejemplo no limitante, se pueden generar adenovirus de alta titulación y purificados que expresen un antagonista de siARN para el Fbxo40 humano. Los adenovirus se pueden titular. Los mioblastos primarios de ratón se aislan, se hacen crecer, y se diferencian como se describe anteriormente. Los mioblastos primarios se siembran, por ejemplo, a 8 x 105 células/pozo en placas de 6 pozos o a 4x105 células/pozo en placas de 12 pozos. Se inducen para diferenciarse al día siguiente. Dos días después de la diferenciación, los miotubos se transducen con diferentes adenovirus, como se indica. Las células se someten a diferentes análisis a las 48 o a las 72 horas después de la transducción como se indica. Las titulaciones utilizadas para la transducción pueden ser, por ejemplo, de 2.5 x 108 o de 1 x 109 partículas/mililitro.
Aquí se presenta un ejemplo no limitante del uso de un adenovirus para suministrar y probar la eficacia de un siARN sobre la antagonización del Fbxo40. Los miotubos primarios se pueden transducir, por ejemplo, con adenovirus, por ejemplo, durante 48 horas. El medio se remueve y las células se lavan con suero regulado con fosfato (PBS) tres veces. Se pueden fijar, por ejemplo, con glutaraldehído al 5 por ciento durante 20 minutos a 37°C, seguido por dos lavados con suero regulado con fosfato (PBS). La morfología de la célula se puede examinar, por ejemplo, utilizando un microscopio Zeiss Axovert ajustado en una amplificación 10x. Una vez que se obtiene la imagen enfocada, el microscopio se puede ajustar al FITC para la toma de imágenes fluorescentes. Se pueden capturar imágenes aleatorias a partir de cada pozo, y se pueden guardar para su análisis. Las imágenes se pueden analizar, por ejemplo, utilizando el Pipeline Pilot Webport, para obtener el grosor del miotubo, como una indicación del tamaño del músculo. El análisis estadístico se puede llevar a cabo sobre todos los datos, por ejemplo, utilizando la prueba t de Student de dos colas. Un valor p menor de 0.05, por ejemplo, se puede considerar como significativo.
Se pueden determinar pruebas adicionales para la eficacia de un antagonista de Fbxo40 (solo o en combinación con otros tratamientos) en el tratamiento de la pérdida muscular, mediante las mediciones de la masa muscular. Estas mediciones se pueden llevar a cabo por medios conocidos en la materia. Para la prueba de ratas y de otros animales de laboratorio, se pueden remover y examinar los músculos de las piernas (por ejemplo, soleo, tibialis anterior y gastrocnemio). La desenervación, la inmovilización, y la pérdida de peso en las ratas, dan todas como resultado índices similares de pérdida en la masa del músculo gastrocnemio medial. Bodine y colaboradores, Science 2001 294: 1704-1707. También se puede inducir caquexia en ratas mediante la administración de interleucina-1 (IL-1), y el glucocorticoide dexametasona. Bodine y colaboradores, 2001. En adición, los ratones sin pelo implantados con células OCC-1 son modelos animales útiles para la caquexia, con el fin de probar diferentes composiciones de la presente divulgación.
Para los pacientes humanos, se pueden utilizar actividades físicas repetitivas o cronometradas para medir la masa muscular. También se puede medir la masa esquelética apendicular total (ASM) de acuerdo con Gallagher y colaboradores, 1997 J. Appl. Physiol.83: 229-239; y Baumgartner y colaboradores, 1998. La masa esquelética muscular axial de un paciente se puede determinar mediante DEXA (absorciometría de rayos-X de energía doble) o una medida similar.
Una estrategia para evaluar un antagonista de Fbxo40 es tratar a los pacientes con reparación del ligamento cruciforme anterior (ACL) después de su ruptura traumática. Estos pacientes se someten a un escayolado por encima de la rodilla durante un período prolongado después de la operación, conduciendo con frecuencia a una atrofia sustancial del cuádriceps. La pierna contralateral puede servir como un comparador para la atrofia en el grupo tratado con placebo para validar el estudio. La masa muscular a medio muslo se puede evaluar mediante DEXA (absorciometría de rayos-X de energía doble), y la evaluación de fuerza máxima de una sola repetición mediante la extensión del cuádriceps. Las evaluaciones adicionales incluyen la medición de la potencia del becerro. Un resultado positivo puede incluir la conservación estadísticamente significativa de la masa y fuerza del cuádriceps en el grupo tratado con el fármaco comparándose con el placebo.
Otro método para probar la atrofia muscular in vitro involucra el uso de los miotubos. Un miotubo es una fibra de músculo esquelético en desarrollo con una apariencia tubular; es una fibra de músculo esquelético formada mediante la fusión de los mioblastos durante una etapa del desarrollo; se presentan unos cuantos miofibrilos en la periferia, y el núcleo central está ocupado por núcleos y sarcoplasma, de tal manera que la fibra tiene una apariencia tubular. Se pueden utilizar los miotubos esqueléticos C2C12 multi-nucleados, post-mitóticos, diferenciados, por ejemplo, Bains y colaboradores, 1 984 Mol . Cell. Biol . 4: 1 449. Éstos pueden estar infectados con un adenovi rus que codifique un gen asociado con la atrofia (por ejemplo, Fbxo40 j unto con prote ína fluorescente verde mejorada (EG FP) u otro marcador) , o con un control (adenovi rus con prote ína fluorescente verde mejorada ( EG FP) solamente) . Se pueden utilizar inmunotransferencias para confi rmar la infección y para cuantificar los niveles de expresión de Fbxo40 y de la proteína de control . Después de un tiempo adecuado (por ejemplo, 2 d ías) , se pueden medi r los diámetros de los miotubos, encontrándose que los miotubos i nfectados con adenovirus portadores del gen Fbxo40 son más delgados . Se puede utilizar el creci miento con los miotubos infectados con adenovirus portadores de Fbxo40 con el fi n de probar la eficacia del antagonista para suprimir la capacidad del Fbxo40 para mediar la atrofia.
Estas diferentes pruebas de la masa muscular se pueden repeti r a través del tiempo con el fin de eval uar el estado del músculo; o antes o después del tratamiento para evaluar la eficacia del régimen de tratamiento, y se ajusta el régimen de acuerdo con la respuesta del paciente . Baumgartner y colaboradores, 1 998 defi nieron la sarcopenia como un estado en donde el paciente tiene una AS M menor de dos desviaciones estándares por debajo de la media de un grupo de referencia joven (la puntuación-t) .
Un ejemplo de la presente divulgación que hace más lento el progreso de la sarcopenia sería cambiar la duración de tiempo que necesitaría un paciente para ir desde una puntuación-t de - 1 .5 hasta -2; por ejemplo, si ese progreso normalmente tomaría 5 años, entonces el tratamiento, como se utiliza en la presente, podría hacer más lento este cambio hasta 10 años. Los ejemplos de la reversión parcial incluyen reducir una puntuación-t por aproximadamente 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0 o más unidades (por ejemplo, cambiar desde una puntuación-t de -2 hasta una puntuación-t de -1.9, -1.8, -1.6, -1.5, -1.4, -1.3, -1.2, -1.1, etc.). El tratamiento de la sarcopenia también incluye retardar el establecimiento de la sarcopenia. Por ejemplo, si un hombre típico de 50 años de edad empezara a ver signos de sarcopenia a la edad de 55 años, el tratamiento de acuerdo con la presente divulgación retardaría el establecimiento por aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más años.
En adición a las mediciones ASM, también se pueden tomar mediciones del peso corporal, grasa, grasa visceral abdominal, masa sin grasa, ASM de la pierna, ASM del músculo del muslo, agua corporal y masa celular, y fuerza muscular.
La capacidad del antagonista para disminuir el nivel, la expresión, o la actividad del Fbxo40, está correlacionada con la capacidad del antagonista para aumentar la masa muscular, o para prevenir la pérdida de la masa muscular, en un individuo.
Rastreo de antagonistas de Fbxo40 La presente divulgación también abarca métodos para rastrear composiciones con el fin de determinar su utilidad en la antagonización del Fbxo40 y en el aumento de la masa muscular, o para prevenir, limitar o reduci r la pérdida de la masa muscular en un paciente.
En una modalidad específica, la presente divulgación abarca un método para el rastreo de composiciones con el fin de determi nar su capacidad para aumentar la masa muscular, o para preveni r, limitar o reducir la pérdida de la masa muscular en un i ndividuo, el cual comprende : (a) aseverar el nivel o la actividad del Fbxo40 en una célula del individuo, (b) opcionalmente , tratar la cél ula con una composición que comprenda un antagonista para Fbxo40, y (c) opcionalmente , aseverar el nivel o la actividad del Fbxo40 en la célula nuevamente , en donde un nivel elevado de Fbxo40 en relación con un control es una i ndicación de que el sujeto tiene o está en riesgo de desarrollar un trastorno de consunción muscular, y en donde la capacidad de la composición para dim inuir el nivel o la actividad del Fbxo40 está correlacionada con la capacidad para aumentar la masa muscular, o para preveni r la pérdida de la masa muscular en un individuo .
En una modalidad específica de este método, el i ndividuo padece un trastorno asociado con la consunción muscular seleccionado a partir de: caquexia, cáncer, pérdida de peso inducida por un tumor, sepsis , insuficiencia card íaca crónica, artritis reumatoide , s índrome de i nm unodeficiencia adqui rida, sarcopenia, diabetes, hipertensión, altos niveles de colesterol en suero, altos niveles de triglicéridos, enfermedad de Parkinson, insomnio, adicción a drogas, dolor, insomnio, hipoglicemia, función hepática comprometida, cirrosis, trastornos de la vesícula biliar, corea, disquinesia, trastorno renal, y/o uremia.
En una modalidad específica de este método, el antagonista reduce el nivel, la expresión o la actividad del Fbxo40.
En diferentes modalidades de este método, los antagonistas que se rastrean pueden incluir una composición de bajo peso molecular (LMW), un anticuerpo, o similares (por ejemplo, un anticuerpo de Fbxo40, una molécula de tipo anticuerpo de Fbxo40, una molécula que se enlaza específicamente y/o selectivamente al Fbxo40), y/o siARN u otro ácido nucleico inhibidor, como se describe en la presente o como se conoce de otra manera en la materia.
Como se observa anteriormente, otros diferentes métodos para crear y rastrear bibliotecas de compuestos de bajo peso molecular (LMWs) se describen, entre otras, en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 6,764,858; 6,723,235; 6,720,190; 6,677,160; 6,656,739; 6,649,415; 6,630,835; 6,627,453; 6,617,114; 6,613,575; 6,607,921; 6,602,685; 6,448,794; 6,421,612; 6,395,169; 6,387,257; 6,355,163; 6,214,561; 6,187,923; y 6,054,047.
Se puede emplear cualquiera de estos métodos para crear y rastrear bibliotecas de compuestos de bajo peso molecular (LMWs) o cualquier otro método conocido por un experto ordinario en este campo, para obtener una molécula pequeña que se enlace a, y antagonice el Fbxo40.
También se conocen en la materia métodos de rastreo de anticuerpos, moléculas de tipo anticuerpo, y/o moléculas que se enlazan específicamente y/o selectivamente a un objetivo, tal como Fbxo40.
En la materia también se conocen métodos de rastreo de siARNs y de otros ácidos nucleicos i nhibidores para un objetivo, tal como Fbxo40.
En la materia se conocen métodos de aseverar el nivel , la actividad , o la expresión del Fbxo40 en una célula a parti r de un individuo . Estos métodos se pueden utilizar antes y después de la exposición de la célula a un antagonista candidato para Fbxo40.
Estos métodos de rastreo son útiles para identificar composiciones para determi nar su capacidad para antagonizar el Fbxo40 y para aumentar la masa muscular, o para preveni r la pérdida de la masa muscular, como se describe en la presente , y como se conoce en la materia.
Diferentes términos en la modal idad de la presente descripción en relación con el rastreo de los antagonistas para Fbxo40 y su capacidad para prevenir la pérdida muscular o para mantener la masa m uscular, se definen en la presente .
Métodos de diagnóstico La presente i nvención también proporciona métodos novedosos para evaluar si un sujeto tiene o está en riesgo de desarrollar un trastorno de consunción muscular. Los individuos de los que se sospeche que tienen un trastorno de consu nción muscular, se beneficiarían de la detección oportuna, de tal manera que se pueda retardar o incluso detener o revertir el prog reso de la enfermedad. Los métodos incl uyen evaluar si un sujeto tiene o está en riesgo de desarrollar un trastorno de consunción muscular, los cuales comprenden poner en contacto una muestra a parti r de un sujeto, con un reactivo capaz de detectar el Fbxo40, y detectar el Fbxo40, en donde un nivel elevado del Fbxo40 en relación con un control es una i ndicación de que el sujeto tiene o está en riesgo de desarrol lar un trastorno de consunción muscular.
La invención proporciona además métodos para determi nar o predeci r la eficacia del régimen de tratamiento para el tratamiento de un trastorno de consunción muscular. Estos métodos i ncluyen evaluar la eficacia del régimen de tratamiento para el tratamiento de un trastorno de consunción muscular en un sujeto, comprendiendo el método: a) poner en contacto una primera muestra obtenida a partir del sujeto antes de administrar cuando menos una porción del régimen de tratamiento al sujeto, con un reactivo capaz de detectar el Fbxo40; b) poner en contacto una segunda muestra obtenida a parti r del sujeto en seguida de la administración de cuando menos una porción del régimen de tratamiento con un reactivo capaz de detectar el Fbxo40; y c) comparar los niveles de Fbxo40 a parti r de la primera y la segunda muestras, en donde un nivel elevado de Fbxo40 presente en la pri mera muestra, en relación con la segunda muestra, es una i ndicación de que el régimen de tratamiento es eficaz para el tratamiento de un trastorno de consunción muscular en el sujeto.
Como se utiliza en la presente, el término "muestra" incluye cualquier fluido corporal (por ejemplo, fluidos sanguíneos, linfa, fluidos ginecológicos, fluido cístico, orina, fluidos oculares y fluidos recolectados mediante enjuague peritoneal), o una célula a partir de un sujeto. Normalmente, el tejido o la célula se removerá del paciente, pero también se contempla el diagnóstico in vivo. Otras muestras del paciente incluyen lágrimas, suero, líquido cefalorraquídeo, heces, esputo y extractos celulares.
Como se utiliza en la presente, el término "reactivo capaz de detectar el Fbxo40" incluye cualquier agente capaz de enlazarse específicamente con el Fbxo40 y de transformar el Fbxo40 en una fracción detectable. Los reactivos adecuados incluyen anticuerpos, derivados de anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, y similares. Los reactivos adecuados para el enlace con un ácido nucleico de Fbxo40 (por ejemplo, un ADN genómico, un ARNm, un ARNm empalmado, un ADNc, o similares) incluyen los ácidos nucleicos complementarios. Por ejemplo, los reactivos de ácidos nucleicos pueden incluir oligonucleótidos (marcados o no marcados) fijados a un sustrato, oligonucleótidos marcados no enlazados con un sustrato, pares de cebadores de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), sondas de haces moleculares, y similares.
Como se utiliza en la presente, el término "control" puede ser el nivel de Fbxo40 en una muestra a partir de un sujeto que no padezca de un trastorno de consunción muscular. Puede ser el mismo tipo de muestra que la muestra de prueba, o diferente. Por ejemplo, si la muestra a parti r del sujeto q ue se está probando es una muestra de corazón o de músculo (por ejemplo, una cél ula, una colección de cél ulas, o tejido obtenido a parti r de una biopsia de corazón o de músculo) , entonces la muestra de control también puede ser una m uestra de corazón o de músculo a parti r de un sujeto que no padezca de un trastorno de consunción muscular. De una manera alternativa, la muestra de control puede ser de u n ti po diferente , por ejemplo, puede ser una muestra a parti r de un sujeto que no padezca de un trastorno de consunción muscular. En otras modalidades, la muestra de control puede ser una colección de muestras a parti r de u n sujeto que no tenga u n trastorno de consunción muscular, o una muestra a parti r de una colección de sujetos que no tengan un trastorno de consunción muscular.
Como se utiliza en la presente, "un nivel aberrante" de Fbxo40 es cualquier nivel de Fbxo40 que difiera del nivel de control del Fbxo40 , por ejemplo, los niveles significativamente más altos o elevados .
Como se utiliza en la presente, un "nivel más alto", "nivel elevado" , o "nivel i ncrementado" de Fbxo40 se refiere a un nivel que está elevado en relación con un control adecuado. De preferencia, el diferencial a parti r del control adecuado es mayor que el error estándar del ensayo empleado para evaluar el nivel . Más aú n , el nivel elevado es de preferencia cuando menos dos veces , y de una manera muy preferible tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, o diez veces el nivel del Fbxo40 en un control adecuado (por ejemplo, una muestra a partir de un sujeto que no tenga una enfermedad fibrótica, o el nivel promedio de Fbxo40 en varias muestras de control, u otra marca de referencia adecuada).
Como se utilizan en la presente, los términos "eficaz" y "eficacia" se refieren a la probabilidad de que el régimen de tratamiento trate un trastorno de consunción muscular en un sujeto. Por ejemplo, el régimen de tratamiento se considera "eficaz" y se considera como una opción de tratamiento viable si el tratamiento conduce a un alivio de los síntomas del trastorno de consunción muscular (por ejemplo, pérdida muscular, pérdida de apetito, debilidad, función inmunológica comprometida y/o desequilibrio de electrolitos) en un sujeto por cuando menos el 5 por ciento, el 6 por ciento, el 7 por ciento, el 8 por ciento, el 9 por ciento, el 10 por ciento, el 11 por ciento, el 12 por ciento, el 13 por ciento, el 14 por ciento, el 15 por ciento, el 16 por ciento, el 17 por ciento, el 18 por ciento, el 19 por ciento, el 20 por ciento, el 25 por ciento, el 30 por ciento, el 35 por ciento, el 40 por ciento, el 45 por ciento, el 50 por ciento, el 55 por ciento, el 60 por ciento, el 65 por ciento, el 70 por ciento, el 75 por ciento, el 80 por ciento, el 85 por ciento, el 90 por ciento, el 95 por ciento o más.
A. Ensayos La presencia, la ausencia, y/o el nivel de Fbxo40 en una muestra biológica obtenida a partir de un sujeto, se pueden evaluar mediante cualquiera de una amplia variedad de técnicas y métodos in vitro e in vivo, los cuales transforman el Fbxo40 dentro de la muestra en una fracción que se puede detectar y cuantificar. Los ejemplos no limitantes de estos métodos incluyen analizar la muestra utilizando métodos inmunológicos para la detección de proteínas, métodos de purificación de proteínas, ensayos de función o actividad de proteínas, métodos de hibridación de ácidos nucleicos, métodos de transcripción inversa de ácidos nucleicos, y métodos de amplificación de ácidos nucleicos, ensayos inmunosorbentes enlazados a enzimas (ELISAs), inmunotransferencia, Western blot, Northern blot, microscopio de electrones, espectrometría de masas, inmunoprecipitaciones, inmunofluorescencia, hibridaciones Southern, y similares.
En una modalidad, la presencia, la ausencia, y/o el nivel de Fbxo40 en una muestra, se pueden evaluar utilizando un reactivo, tal como un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo radio-marcado, marcado con cromóforo, marcado con fluoróforo, o marcado con enzima), un derivado de anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo conjugado con un sustrato o con la proteína o el ligando de un par de proteína-ligando (por ejemplo, biotina-estreptavidina)), o un fragmento de anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo de una sola cadena o un dominio hipervariable de un anticuerpo aislado) que se enlace específicamente a, y que transforme, el biomarcador, por ejemplo, el Fbxo40 de una muestra, en una molécula detectable.
El término "marcado", con respecto al anticuerpo, pretende abarcar el marcado di recto del anticuerpo mediante el acoplamiento (es deci r, el enlace físico) de una sustancia detectable al anticuerpo, as í como el marcado indi recto del anticuerpo por su reactividad con otro reactivo que esté di rectamente marcado. Los ejemplos del marcado indi recto incluyen la detección de un anticuerpo primario utilizando u n anticuerpo secundario fl uorescentemente marcado, de tal manera que se pueda detectar con la estreptavidina fl uorescentemente marcada.
En otra modalidad , la presencia, la ausencia, y/o el nivel de Fbxo40 se evalúa util izando un ácido nucleico. Por ejemplo, en una modalidad, la presencia, la ausencia, y/o el nivel de Fbxo40 se eval úa utilizando una sonda de ácido nucleico.
El término "sonda", como se utiliza en la presente , se refiere a cualquier molécula que sea capaz de enlazarse selectivamente con el Fbxo40. Las sondas pueden ser sintetizadas por un experto en la materia, o se pueden derivar a partir de las preparaciones biológicas apropiadas. Las sondas se pueden diseñar específicamente para marcarse . Los ejemplos de las moléculas que se pueden utilizar como sondas i ncluyen , pero no se li mitan a, AR N , ADN , proteínas, anticuerpos , y moléculas orgánicas.
El ARN m aislado se puede utilizar en los ensayos de hibridación o de amplificación , los cuales incluyen , pero no se limitan a, anál isis Southern o Northern , análisis de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) , y arreglos de sondas. Un método para la detección de los niveles de ARNm involucra poner en contacto el ARNm aislado con una molécula de ácido nucleico (sonda) que se pueda hibridar al ARNm de Fbxo40. La sonda de ácido nucleico puede ser, por ejemplo, un ADNc de longitud completa, o una porción del mismo, tal como un oligonucleótido de cuando menos 7, 15, 30, 50, 100, 250 ó 500 nucleótidos de longitud, y suficiente para hibridarse específicamente bajo condiciones restringentes al ADN genómico del Fbxo40.
En una modalidad, el ARNm se inmoviliza sobre una superficie sólida y se pone en contacto con una sonda, por ejemplo, pasando el ARNm aislado sobre un gel de agarosa, y transfiriendo el ARNm desde el gel hasta una membrana, tal como nitrocelulosa. En una modalidad alternativa, las sondas se inmovilizan sobre una superficie sólida, y el ARNm se pone en contacto con las sondas, por ejemplo, en un arreglo de chip genético Affymetrix. Un experto puede adaptar fácilmente los métodos de detección de ARNm conocidos para utilizarse en la detección del nivel de ARNm de Fbxo40.
Un método alternativo para determinar el nivel de ARNm de Fbxo40 en una muestra involucra el proceso de amplificación del ácido nucleico, por ejemplo, mediante reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) (la modalidad experimental estipulada en Mullís, 1987, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,683,202), reacción en cadena de la ligasa (Barany (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 88:189-193), réplica de secuencia auto-sostenida (Guatelli y colaboradores (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 87: 1874-1878), sistema de amplificación de transcripción ( woh y colaboradores (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 86: 1173-1177), Replicasa Q-Beta (Lizardi y colaboradores (1988) Bio/Technology 6: 1197), réplica de círculo rodante (Lizardi y colaboradores, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,854,033), o cualquier otro método de amplificación del ácido nucleico, seguido por la detección de las moléculas amplificadas utilizando técnicas bien conocidas por los expertos en este campo. Estos esquemas de detección son en especial útiles para la detección de moléculas de ácido nucleico si estas moléculas están presentes en números muy bajos. En los aspectos particulares de la invención, la expresión del Fbxo40 se evalúa mediante reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) fluorogénica cuantitativa (es decir, el Sistema TaqManMR). Estos métodos típicamente utilizan pares de cebadores de oligonucleótidos que son específicos para el Fbxo40. Los métodos para diseñar cebadores de oligonucleótidos específicos para una secuencia conocida, son bien conocidos en la materia.
Los niveles de expresión de ARNm de Fbxo40 se pueden monitorear utilizando una transferencia de membrana (tal como se utiliza en el análisis de hibridación, tal como Northern, Southern, puntos, y similares), o micropozos, tubos de muestras, geles, perlas o fibras (o cualquier soporte sólido que comprenda ácidos nucleicos enlazados). Véanse las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,770,722, 5,874,219, 5,744,305, 5,677,195 y 5,445,934, las cuales se incorporan a la presente como referencia.
La detección de la expresión del Fbxo40 también puede comprender el uso de sondas de ácidos nucleicos en sol ución .
En una modalidad de la invención , se utilizan microarreglos para detectar la expresión del Fbxo40. Los microarreglos son particularmente adecuados para este propósito, debido a la reproducibilidad entre diferentes experimentos. Los microarreglos de ADN proporcionan un método para la medición simultánea de los niveles de expresión de grandes números de genes . Cada arreglo consiste en u n patrón reproducible de sondas de captura unidas a u n soporte sólido. El ARN o el ADN marcado se híbrida a las sondas complementarias sobre el arreglo, y entonces se detecta mediante exploración con láser. Se determinan las intensidades de hibridación para cada sonda sobre el arreglo, y se convierten a un valor cuantitativo que representa los niveles relativos de expresión genética. Véanse las Patentes de los Estados U nidos de Norteamérica Números 6,040 , 1 38 , 5,800,992 y 6,020, 1 35 , 6,033,860, y 6,344,31 6 , las cuales se incorporan a la presente como referencia. Los arreglos de oligon ucleótidos de alta densidad son particularmente úti les para determinar el perfil de expresión genética para un gran número de AR Ns en una muestra.
Adicionalmente , las técnicas in vivo para la detección de Fbxo40 incluyen i ntroduci r en un sujeto, u n anticue rpo marcado di rigido contra el Fbxo40, que se enlaza a, y transforma, el Fbxo40 en una molécula detectable . Como se discute anteriormente , la presencia, el nivel , o i ncluso la localización del Fbxo40 detectable en un sujeto se puede detectar y determinar mediante técnicas de toma de imágenes convencionales.
En otra modalidad, se puede utilizar espectrometría de masas para detectar el Fbxo40 en una muestra. La espectrometría de masas es una técnica analítica que consiste en ionizar los compuestos químicos para generar moléculas cargadas (o fragmentos de las mismas), y medir sus proporciones de la masa a la carga. En un procedimiento típico de espectrometría de masas, se obtiene una muestra a partir de un sujeto, se carga sobre la espectrometría de masas, y se ionizan su componentes (por ejemplo, Fbxo40) mediante diferentes métodos (por ejemplo, impactándolos con un haz de electrones), dando como resultado la formación de partículas cargadas (iones). Entonces se calcula la proporción de la masa a la carga de las partículas a partir del movimiento de los iones a medida que transitan a través de los campos electromagnéticos.
A.1 Ensayos de diagnóstico La presencia, la ausencia, y/o el nivel de Fbxo40 se puede evaluar mediante cualquiera de una amplia variedad de métodos bien conocidos para detectar una molécula o una proteína. Los ejemplos no limitantes de estos métodos incluyen los métodos inmunológicos para la detección de proteínas, los métodos de purificación de proteínas, los ensayos de función o actividad de proteínas, los métodos de hibridación de ácidos nucleicos, los métodos de transcripción inversa de ácidos nucleicos, y los métodos de amplificación de ácidos nucleicos, ELISA, inmunotransferencia, Western blot, Northern blot, Southern blot, y si milares.
En una modal idad, la presencia, la ausencia, y/o el nivel de Fbxo40 se evalúa utilizando un anticuerpo (por ejemplo , un anticuerpo radio-marcado, marcado con cromóforo, marcado con fluoróforo, o marcado con enzi ma) , un derivado de anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo conjugado con un sustrato o con la prote ína o el ligando de un par de prote ína-ligando (por ejemplo, bioti na-estreptavidina)) , o un f ragmento de anticuerpo (por ejemplo, u n anticuerpo de una sola cadena, un dominio hipervariable de un anticuerpo aislado, etc .) que se enlace específicamente al biomarcador, es deci r, Fbxo40, tal como la prote ína codificada por el marco de lectu ra abierta correspondiente al biomarcador, o la prote ína que haya experimentado toda o una porción de su modificación normal posterior a la traducción . El término "marcado" , con respecto al anticuerpo, pretende abarcar el marcado di recto del anticuerpo mediante el acoplamiento (es deci r, el enlace f ísico) de una sustancia detectable con el anticuerpo, así como el marcado indirecto del anticuerpo mediante su reactividad con otro reactivo que esté directamente marcado. Los ejemplos del marcado i ndi recto incluyen la detección de un anticuerpo primario utilizando un anticuerpo secundario fluorescentemente marcado, de tal manera que se pueda detectar con estreptavidina fl uorescentemente marcada. En otra modalidad , la presencia, la ausencia, y/o el nivel de Fbxo40 se evalúa utilizando un ácido nucleico.
Los métodos de detección de la invención se pueden utilizar para detectar el Fbxo40, por ejemplo, en una muestra biológica in vitro así como in vivo. Por ejemplo, las técnicas in vitro para detección del ARNm incluyen hibridaciones Northern, hibridaciones in situ, y reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (QPCR). Las técnicas in vitro para la detección del Fbxo40 incluyen, por ejemplo, ensayos inmunosorbentes enlazados a enzimas (ELISAs), Western blots, inmunoprecipitaciones, e inmunofluorescencia. Las técnicas in vitro para la detección del ADN de Fbxo40 incluyen, por ejemplo, hibridaciones Southern. Adicionalmente, las técnicas in vivo para la detección del Fbxo40 incluyen introducir en un sujeto un anticuerpo marcado dirigido contra el Fbxo40. Como se discute en la presente, el anticuerpo se puede marcar con un biomarcador radioactivo cuya presencia y localización en un sujeto se puede detectar mediante técnicas de toma de imágenes convencionales.
Definiciones Adicionales Con el objeto de proporcionar un entendimiento claro de la memoria descriptiva y de las reivindicaciones, se proporcionan a continuación de una manera conveniente las siguientes definiciones adicionales.
La presente divulgación proporciona un antagonista de Fbxo40 (y los métodos para la elaboración y uso del mismo) para su administración a pacientes en riesgo de, o que sufran de un trastorno asociado con, la consunción muscular. La presente descripción también abarca tratamientos que comprenden una cantidad efectiva del antagonista. El tratamiento puede ser suministrado en varias dosificaciones, y puede comprender, como un ejemplo no limitante, una sal y/o un veh ículo farmacéuticamente aceptable.
"Paciente" significa un individuo, de preferencia un ser humano, afl igido por, o en riesgo de tener, u n trastorno asociado con consunción muscular, un trastorno relacionado o asociado con la pérdida m uscular. El paciente q ue necesite de un medicamento para preveni r la pérdida o el incremento la masa muscular puede ser afligido por uno o más padecimientos solamente relacionados indirectamente, o no relacionados del todo , con la pérdida de masa muscular. El paciente puede estar en riesgo de (por ejemplo, predispuesto genéticamente a) u n trastorno asociado con la consunción muscular, pero puede mostrar pocos o ningún signo de la enfermedad (por ejemplo, el trastorno puede ser sub-cl ínico) . En este caso, el antagonista se puede administrar como un tratamiento preventivo para preveni r el desarrollo de la pérdida muscular.
El paciente se puede tratar con cualquier tratamiento apropiado para estas enfermedades , en adición a (antes de , simultáneamente con, o después de) el tratamiento con un antagonista de Fbxo40. Por consiguiente , un paciente se puede tratar con u no o más antagonistas de Fbxo40 , opcionalmente uno o más tratamientos adicionales o medicamentos que disminuyan la pérdida muscular, y opcional mente uno o más tratamientos para otra enfermedad (por ejemplo, cáncer, diabetes, o enfermedad de H untington) . Por ejemplo, a un paciente con diabetes se le puede admi nistrar un antagonista de Fbxo40 e insul i na; a un paciente con cáncer se le puede administrar un antagonista de Fbxo40 y u n medicamento contra el cáncer. Los trastornos de consunción m uscular, en particular en los pacientes de edad avanzada, algunas veces se asocian con trastornos de pérdida ósea, tales como osteoporosis . Un antagonista de Fbxo40, por consiguiente , también se puede coadministrar con el tratamiento para osteoporosis , por ejemplo, Aclasta (ácido zoledrónico o zoledronato) o Denosumab (AMG 1 62; un anticuerpo que se di rige al RAN KL) .
La presente divulgación comprende además tratamientos y métodos de tratamiento que invol ucran a los antagonistas para Fbxo40, para su administración a los pacientes e individuos.
"Tratamiento" significa la profilaxis, terapia, cura, o cualquier cambio en la condición de los pacientes que indique una mejora o ausencia de degradación de la condición f ísica. "Tratamiento" significa el tratamiento de la pérdida muscular o el tratamiento de cualquier otra enfermedad que tenga el paciente . Como se utilizan en la presente, los términos "tratamiento" y "tratar" se refieren a los tratamientos profi láctico o preventivo y los tratamientos curativo o modificador de la enfermedad , i ncl uyendo el tratamiento de los pacientes en riesgo de contraer una enfermedad o que se sospeche que tienen u na enfermedad, as í como de los pacientes que ya estén enfermos o q ue se diagnostique que padecen una condición . Los términos "tratamiento" y "tratar" también se refieren al mantenimiento y/o a la promoción de la sal ud en un individuo que no padezca de una enfermedad, pero que pueda ser susceptible a desarrollar condiciones no saludables, tales como desequilibrio de nitrógeno o la pérdida muscular.
Una "cantidad efectiva" o una "cantidad terapéuticamente efectiva" es una cantidad que trata una enfermedad o condición médica de un individuo o, en términos más generales, proporciona un beneficio nutricional, fisiológico o médico a un individuo.
En diferentes modalidades de la descripción, el paciente es de cuando menos aproximadamente 6 meses, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, o 75 años de edad. En diferentes modalidades, el paciente no es de más de aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, ó 100 años de edad. En diferentes modalidades, el paciente tiene un peso corporal de cuando menos aproximadamente 40.824, 45.36, 54.432, 63.504, 72.576, 81.648, 90.72, 99.792, 108.864, 117.936, 127.008, 136.08, 145.152, 154.224, 163.296, 172.368 ó 181.44 kilogramos (90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380 ó 400 libras). En diferentes modalidades, el paciente tiene un peso corporal no de no más de aproximadamente 40.824, 45.36, 54.432, 63.504, 72.576, 81.648, 90.72, 99.792, 108.864, 117.936, 127.008, 136.08, 145.152, 154.224, 163.296, 172.368 ó 181.44 kilogramos (100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380 ó 400 libras).
En diferentes modalidades de la descripción, la dosificación puede ser de cuando menos aproximadamente 1, 5, 10, 25, 50, 100, 200, 250, 300, 250, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 ó 1,000 nanogramos, 1, 5, 10, 25, 50, 100, 200, 250, 300, 250, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 ó 1,000 microgramos, 1, 5, 10, 25, 50, 100, 200, 250, 300, 250, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 ó 1,000 miligramos. En diferentes modalidades, la dosificación no puede ser mayor de aproximadamente 10, 25, 50, 100, 200, 250, 300, 250, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 ó 1,000 miligramos. En diferentes modalidades, la dosificación se puede administrar cuando menos más de una vez al día, diariamente, más de una vez a la semana, semanalmente, dos veces por semana, mensualmente, cada 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ó 12 meses.
En diferentes modalidades, la dosificación se correlaciona con el peso corporal o con el área superficial corporal del individuo. El nivel de dosificación real se puede variar para obtener una cantidad del agente activo que sea efectiva para un paciente, composición y modo de administración particular, sin ser tóxica para el paciente. La dosis seleccionada dependerá de una variedad de factores farmacocinéticos, incluyendo la actividad del antagonista particular empleado, la vía de administración, la velocidad de excreción del agonista, la duración del tratamiento, otros fármacos, los compuestos y/o materiales utilizados en combinación con el agonista, la edad, sexo, peso, condición, salud general e historial médico previo del paciente, y factores similares bien conocidos en la materia médica. Un médico o veterinario que tenga una experiencia ordinaria en la materia puede determinar fácilmente , y entonces prescribi r, la cantidad efectiva del antagonista requerido. Una dosis adecuada será la cantidad q ue sea la dosis más baja efectiva para produci r un efecto terapéutico, o una dosis suficientemente baja para produci r un efecto terapéutico si n causar efectos secundarios .
"Sales farmacéuticamente aceptables" se refieren a los derivados de los compuestos descritos , en donde el compuesto progenitor se modifica mediante la elaboración de sales de ácido o de base del mismo. Los ejemplos de las sales farmacéuticamente aceptables incluyen , pero no se limitan a, las sales de ácidos mi nerales u orgánicos de los residuos básicos, tales como aminas; las sales alcalinas u orgánicas de los residuos ácidos , tales como ácidos carbox íücos; y similares . Las sales farmacéuticamente aceptables incl uyen las sales no tóxicas convencionales o las sales de amonio cuaternario del compuesto progenitor formadas , por ejemplo, a partir de ácidos inorgánicos u orgánicos no tóxicos. Por ejemplo, las sales no tóxicas convencionales incluyen , pero no se limitan a, aquél las derivadas a parti r de ácidos inorgánicos u orgánicos seleccionados a parti r de los ácidos 1 ,2-etan-disulfónico, 2-acetoxi-benzoico, 2-hidroxi-etan-sulfónico, acético, ascórbico, bencen-sulfónico, benzoico, bicarbónico, carbónico, cítrico, edético, etan-disulfónico, etan-sulfónico, fumárico, glucoheptónico, glucónico, glutámico, glicólico , glicoliarsan ílico, hexilresorc ínico, hidrabámico, bromhídrico, clorh ídrico, yodhidrato, hidroxi-maleico , hidroxi-naftoico, isetiónico , láctico, lactobiónico, lau ril-sulfónico, maleico, málico, mandélico, metan-sulfónico, napsílico, nítrico, oxálico, pamoico, pantoténico, fenil-acético, fosfórico, poligalacturónico, propiónico, salicílico, esteárico, subacético, succínico, sulfámico, sulfanílico, sulfúrico, tánico, tartárico, y toluen-sulfónico.
Las sales farmacéuticamente aceptables de la presente divulgación se pueden sintetizar a partir del compuesto progenitor que contenga una fracción básica o ácida mediante los métodos químicos convencionales. En términos generales, estas sales se pueden preparar mediante la reacción de las formas de ácido o de base libre de estos compuestos con una cantidad estequiométrica de la base o del ácido apropiado en agua o en un solvente orgánico, o en una mezcla de los dos; en términos generales, se prefieren los medios no acuosos como éter, acetato de etilo, etanol, isopropanol, o acetonitrilo. Las listas de las sales adecuadas se encuentran en Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Edición, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1990, página 1445, cuya descripción se encuentra incorporada a la presente como referencia.
Las composiciones farmacéuticas que comprendan un antagonista de Fbxo40 pueden estar en forma sólida, por ejemplo, polvos, gránulos, tabletas, pildoras, cápsulas de gel, cápsulas de gelatina, liposomas, supositorios, formas masticables, o parches. Las composiciones farmacéuticas que comprendan un antagonista de Fbxo40 también pueden presentarse en forma líquida, por ejemplo, soluciones, emulsiones, suspensiones, elíxires, o jarabes. Los soportes líquidos apropiados pueden ser, por ejemplo, agua, solventes orgánicos, tales como poliol, tal como glicerol o glicoles, incluyendo propilenglicol y polietilenglicol, o etanol, Cremophor EL, o mezclas de los mismos, en varias proporciones, en agua. Las composiciones pueden comprender gránulos amorfos o cristalinos de tamaño nano recubiertos con albúmina o un tensoactivo.
Los soportes apropiados pueden incluir, por ejemplo, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes reguladores del pH, fosfato de calcio, celulosa, metil-celulosa, cloro-butanol, manteca de cacao, colorantes, dextrina, emulsionantes, recubrimientos entéricos, saborizantes, gelatina, agentes isotónicos, lecitina, estearato de magnesio, agentes perfumantes, poli-alcoholes, tales como manitol, esteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo, parabeno, ácido sórbico de fenol, polietilenglicol, polivinil-pirrolidina, suero regulado con fosfato (PBS), agentes conservadores, propilenglicol, carboxi-metil-celulosa de sodio, cloruro de sodio, sorbitol, diversos azúcares (incluyendo, pero no limitándose a, sacarosa, fructosa, galactosa, lactosa y trehalosa), almidón, cera para supositorios, talco, aceites vegetales, tales como aceite de oliva y aceite de maíz, vitaminas, cera, y/o agentes humectantes. Para los antagonistas de Fbxo40 que son siARNs, un soporte específico particular comprende dextrano y agua, por ejemplo, dextrosa al 5 por ciento en agua (D5W).
La porción biológicamente inerte de la composición farmacéutica opcionalmente puede estar en capas y/o puede ser erosionable, permitiendo la liberación temporizada del antagonista.
La composición farmacéutica que comprende a Fbxo40 se puede administrar por la vía bucal, inhalación (incluyendo insuflación e inhalación profunda), nasal, oral, parenteral, implante, inyección o infusión por la vía epidural, intra-arterial, intra-articular, intra-capsular, intracardíaca, intracerebroventricular, intracraneal, intradérmica, intramuscular, intraorbital, intraperitoneal, intraespinal, intraesternal, intratecal, intravenosa, subaracnoidea, subcapsular, subcutánea, subcuticular, transendotelial, transtraqueal, trans-vascular, rectal, sublingual, tópica, y/o vaginal. Esto puede ser mediante inyección, infusión, parche dérmico, o cualquier otro método conocido en la materia. La formulación puede estar en polvo, nebulizada, en aerosol, granulada o en cualquier otra forma apropiada preparada para su suministro. La administración, si es líquida, puede ser lenta o por medio de bolo, aunque, bajo algunas circunstancias conocidas en la materia, las inyecciones de bolo pueden conducir a la pérdida de material a través de los ríñones.
El antagonista de Fbxo40as se puede administrar con dispositivos médicos conocidos en la materia. Por ejemplo, en una modalidad particular específica, se puede administrar un antagonista con un dispositivo de inyección hipodérmica sin aguja, tal como un dispositivo dado a conocer en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,399,163, 5,383,851, 5,312,335, 5,064,413, 4,941,880, 4,790,824, ó 4,596,556. Los ejemplos de implantes y módulos bien conocidos útiles en la presente divulgación incluyen: la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,487,603, que da a conocer una bomba de micro-infusión implantable para dosificar el medicamento a una velocidad controlada; la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4. ,486, 194, que da a conocer un dispositivo terapéutico para administrar los medicamentos a través del piel; la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,447,233, que da a conocer una bomba de infusión de medicamento para suministrar el medicamento a una velocidad de infusión precisa; la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,447,224, que da a conocer un aparato de infusión implantable de flujo variable para el suministro continuo del fármaco; la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,439,196, que da a conocer un sistema de suministro de fármaco osmótico que tiene compartimientos de múltiples cámaras; y la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,475,196, que da a conocer un sistema de suministro de fármaco osmótico. Muchos otros de estos implantes, sistemas de suministro, y módulos son conocidos por los expertos en este campo.
En ciertas modalidades, los antagonistas se pueden formular para asegurar la distribución adecuada in vivo. Por ejemplo, la barrera hematoencefálica (BBB) excluye muchos compuestos altamente hidrof ílicos. Para asegurar que el antagonista de Fbxo40as cruce de la barrera hematoencefálica (BBB) (si se desea), se puede formular, por ejemplo, en liposomas. Para conocer los métodos para la elaboración de liposomas, véanse, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 4,522,811; 5,374,548; y 5,399,331. Los liposomas pueden comprender una o más fracciones, las cuales se transportan selectivamente hacia dentro de las células u órganos específicos, y por consiguiente, mejoran el suministro del fármaco dirigido (véase, por ejemplo, V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29: 685). Las fracciones de dirección de ejemplo incluyen folato o biotina (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,416,016 para Low y colaboradores); manosidas (Umezawa y colaboradores (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153: 1038); anticuerpos (P.G. Bloeman y colaboradores (1995) FEBS Lett. 357: 140; M. Owais y colaboradores (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39: 180); receptor de proteína A tensoactivo (Briscoe y colaboradores (1995) Am. J. Physiol. 1233: 134), diferentes especies que pueden comprender las formulaciones de las divulgaciones, así como componentes de las moléculas inventadas; p120 (Schreier y colaboradores (1994) J. Biol. Chem. 269: 9090); véase también K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346: 123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4: 273.
En diferentes modalidades, los métodos y las composiciones de esta divulgación son como se describen en la presente, pero con la condición de que el antagonista no sea un anticuerpo. En diferentes modalidades, los métodos y las composiciones de esta divulgación son como se describen en la presente, pero con la condición de que el antagonista no sea una molécula tipo anticuerpo. En diferentes modalidades, los métodos y las composiciones de esta divulgación son como se describen en la presente, pero con la condición de que el antagonista no sea un compuesto orgánico pequeño (LMW). En diferentes modalidades, los métodos y las composiciones de esta divulgación son como se describen en la presente, pero con la condición de que el antagonista no sea un siARN.
Los artículos "un" y "uno", como se utiliza en la presente, se refiere a uno o a más de uno (cuando menos uno) de los objetos gramaticales del artículo.
La presente divulgación se ilustra además mediante los siguientes ejemplos, los cuales no se deben interpretar como limitantes adicionales. El contenido de todas figuras y todas las referencias, patentes, solicitudes de patente publicadas citadas a través de toda esta solicitud se incorporan expresamente a la presente como referencia.
EJEMPLO 1 Después del tratamiento con IGF1. el IRS1 se degrada rápidamente en los miotubos C2C12 Se ha demostrado que el IGF1 es suficiente para inducir hipertrofia en el músculo esquelético adulto. Los sustratos receptores de insulina (IRS) son tirosina fosforilada sobre IGF1 o enlace de insulina al receptor cognado, permitiéndoles así formar un complejo de señalización con muchas proteínas que contienen dominio SH2, e inician múltiples señales intracelulares. La alteración de los niveles de sustratos receptores de insulina (IRS) puede afectar la sensibilidad y la respuesta tanto al IGF1 como a la insulina. En muchos sistemas de modelo celular diferentes, la exposición a IGF1 o a insulina conduce a una reducción en los niveles de los sustratos receptores de insulina (IRS).
En este ejemplo, revisamos si el IRS1 endógeno se degrada en células de músculo después del tratamiento con IGF1. Los miotubos C2C12 diferenciados se tratan con una concentración creciente de IGF1 o dexametasona (DEX), un glucocorticoide que puede conducir a la atrofia muscular, junto con el inhibidor de la síntesis de proteína Emetin (Eme). La Figura 4A demuestra que el IRS1 se degrada después del tratamiento con IGF1, pero no con DEX, de una manera dependiente de la dosis en miotubos C2C12. Basándose en este resultado, escogemos el uso de IGF1 10nM para nuestros futuros experimentos. En los miotubos C2C12, el IRS1 se degrada rápidamente después del tratamiento con IGF1 con una vida media de alrededor de 2 horas (Figuras 4B y 4E). Se observa que el nivel de proteína de IRS1 también disminuye en las células tratadas con IGF1 solo aunque con una cinética más lenta (Figura 4E), sugiriendo que esta degradación rápida supera la síntesis de proteína activa.
El IRS1 se degrada a través de una senda dependiente del proteasoma. Esta conclusión se basa en la observación de que el inhibidor proteasomal MG132 sustancialmente estabiliza esta proteína (Figura 4B). Debido a que las proteínas ubiquitinadas se degradan rápidamente en las células, con el objeto de detectar la proteína de IRS1 ubiquitinada en el experimento mostrado en la Figura 4C, los miotubos C2C12 se infectan con un adenovirus que sobre-expresa la ubiquitina marcada con his-myc, y se incuban con IGF1 junto con MG132 o un inhibidor de isopeptidasa G5. El IRS1 se inmunoprecipita con el anticuerpo policlonal de conejo anti-IRS1 (pistas 6, 8, 10, 12) o IgG no específica (pistas 5, 7, 9, 11) como control. Se detecta la poli-ubiquitinación con el anticuerpo monoclonal anti-myc contra la ubiquitina marcada con his-myc, y se encuentra que se inmunoprecipita específicamente con IRS1 (Figura 4C, panel superior). Es interesante que los cambios superiores en la movilidad electroforética de IRS1 solamente son obvios con el tratamiento con G5 (Figura 4C, panel inferior, pistas 10 y 12), siendo esto consistente con la función inhibidora de G5 sobre la isopeptidasa. Se observa que, en el panel superior de la Figura 4C, el tratamiento con G5 también provoca un cambio superior de la ubiquitina marcada con his-myc en comparación con el tratamiento con MG132 solo (compare la pista 10 con la pista 8). De acuerdo con la degradación de IRS1 inducida después del tratamiento con IGF1, el IRS1 poli-ubiquitinado también aumenta con el tratamiento con IGF1 (Figura 4D, panel superior) a pesar de que la cantidad total de proteínas ubiquitinadas en las células incluso descendió un poco (Figura 4D, panel inferior).
Estos datos muestran que el IGF1 conduce a una rápida degradación de IRS1 en los miotubos C2C12. Adicionalmente, el IRS1 se degrada a través de una senda dependiente del proteasoma.
Después determinamos cuáles enzimas están involucradas o no en esta degradación.
EJEMPLO 2 La degradación de IRS1 en miotubos C2C12 no se puede rescatar mediante los inhibidores para cinasa-PI3 y mTOR Con el objeto de determinar cuáles sendas de señalización tienen una función en la activación de la degradación de IRS1 en los miotubos C2C12, los miotubos se incuban con IGF1 10 n y los inhibidores para cinasa-PI3 (wortmanina), Akt (API-2), GSK3 (LiCI), mTor (rapamicina), MEK (PD98059 e inhibidor de MEK1/2), p38 y JNK o vehículo (sulfóxido de dimetilo (DMSO)). Los datos (no mostrados) indican que la degradación de IRS1 en los miotubos C2C12 no se puede rescatar mediante los inhibidores para PI3-cinasa y mTOR. Estos datos sugieren que la degradación de IRS inducida por el ligando puede ser debida a la fosforilación directa de IRS1 mediante el IGF1 R.
EJEMPLO 3 El IRS1 se dirige mediante el Complejo Skp1-Culin1-Rbx1 En este ejemplo, tratamos de encontrar las ligasas E3 que son responsables de dirigir el IRS1 hacia el proteasoma para la degradación. Enfocamos nuestra búsqueda en los miotubos C2C12, debido a que el IRS1 tiene una degradación rápida en los miotubos C2C12 que se regulan de manera diferente de cualesquiera otros tipos de células reportadas hasta ahora en la literatura.
Hay más de 600 ligasas E3 en la célula [Li y colaboradores, 2008 PLoS One 3: e1487], que incluyen dos tipos mayores: Las ligasas E3 que contienen dominio de dedo de Anillo (RNF) y dominio HECT. La Hgasas E3 dependientes del dominio de dedo de Anillo (RNF) además se pueden dividir en dos categorías: E3 de RNF de una sola cadena de polipéptido y los complejos de múltiples subunidades de Culin-Anillo E3. El Rbx1 es la proteína de RNF pequeña común que se puede asociar a diferentes factores para formar cuatro tipos diferentes de complejos de múltiples subunidades de Culin-Anillo E3. Con el objeto de encontrar rápidamente las ligasas E3 que se dirigen al IRS1, primero tratamos de delimitar los objetivos potenciales mediante la eliminación genética de Rbx1. Se transfectan los miotubos C2C12 con tres siARNs diferentes que se dirigen a Rbx1. Como se muestra en la Figura 5A, siRbx1_1 y siRbx1_2 eliminan genéticamente la proteína Rbx1 hasta el 50 por ciento del nivel basal y bloquean casi completamente la degradación del IRS1 inducida por el IGF1; mientras el siRbx1_3, que no elimina genéticamente la proteína de una manera significativa, no tiene efecto alguno (Figura 5A). Adicionalmente los siARNs para Skp1 (Figura 5B), y Culinl (Figuras 5C y 5D) tienen un efecto similar, sugiriendo que el Rbx1 que contiene el complejo Skp1 -Culinl -F-box (SCF) es la ligasa E3 que se dirige al IRS1 para la degradación proteasómica. Como un control, también revisamos el efecto de la eliminación genética de de Culin2, y encontramos que el Culin2 no está involucrado (Figuras 5F y 5G). Finalmente, Rbx1 se puede co-inmunoprecipitar con IRS1, sugiriendo que estas dos proteínas existen en un complejo (Figura 5E).
Estos datos muestran que el IRS1 es el objetivo del complejo Skp1 -Culinl -Rbx1. Por consiguiente, una proteína Fbox está, involucrada en la degradación de IRS1 inducida por IGF1. El siguiente paso es determinar cuál proteína Fbox está involucrada.
EJEMPLO 4 Fbxo40 se asocia con el Complejo Skp1 -Culinl -Rbx1 y se dirige al IRS1 para la degradación Hay alrededor de setenta y siete proteínas F-box identificadas en los ratones hasta ahora. Usamos un planteamiento genómico funcional para rastrear las proteínas F-box que se dirijan al IRS1. Los miotubos C2C12 se transfectan con el subconjunto 2 de la biblioteca de siARN de conjugación con ubiquitina de ratón de Dharmacon, que contiene siARNs contra las proteínas que contienen SOCS-box y F-box, o siCON. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, se tratan las células con IGF1 10 nM durante 16 horas. El nivel de la proteína de IRS1 se analiza mediante Western blot. Los impactos positivos a partir de este rastreo además se corroboran mediante tres siARNs diferentes a partir de una fuente diferente, Qiagen. Se evalúa la eficiencia de la eliminación genética mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) cuantitativa en tiempo real para los impactos positivos. En algunos casos, ninguno de los tres siARNs de Qiagen puede silenciar la expresión genética objetivo por cuando menos el 70 por ciento al nivel del ARNm. En este caso, se utiliza el ON-TARGETplus siARN SMARTpool de Dharmacon para las validaciones adicionales. De las 67 proteínas F-box rastreadas (no se representaron los siARNs para los genes restantes en la biblioteca), identificamos un impacto positivo, Fbxo40. La Figura 6A demuestra el rescate de IRS1 dependiente de la dosis mediante la eliminación genética de Fbxo40. Entre los tres siARNs que se dirigen al Fbxo40, el siFbxo40_7 disminuye el nivel de proteína hasta el 10 por ciento del nivel basal, y tiene la mejor eficacia, mientras que el siFbxo40_9, que conduce a la menor eliminación genética, solamente provoca un pequeño incremento de la proteína de IRS1 por encima del nivel del control. Es importante que ninguno de estos tres siARNs causó un aumento en el nivel de la proteína de IRS1 sin el tratamiento con el IGF1 (Figura 6A, paneles de la izquierda).
Fbxo40 es una proteína F-box novedosa que se sobre-regula en el músculo desnervado. Ye y colaboradores, 2007 Gene 404: 53-60. Estudiamos el Panel de ARN Total Humano FirstChoice mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) cuantitativa en tiempo real, y encontramos que el Fbxo40 se expresa altamente en el corazón y el músculo (Figura 3). Adicionalmente, se inducen su ARNm (Figura 6B) y su proteína (Figura 8A) durante la diferenciación de las células C2C12, lo cual coincide con la degradación acelerada de IRS1 en los miotubos C2C12. IRS1 y Rbx1 pueden ser co-inmunoprecipitados con el anticuerpo contra Fbxo40 (Figura 6C). Observe que el nivel de proteína Fbxo40 aumenta después de la incubación con MG132 (Figura 6C, compare las pistas 1 a 3), indicando que esta proteína también cambia rápidamente en las células. También utilizamos este complejo de Fbxo40-Rbx1 inmunoprecipitado para ubiquitinar el IRS1 recombinante in vitro, y encontramos que el IRS1 se puede ubiquitinar de una manera dependiente del tiempo (Figura 6D). En este experimento, incluimos seis reacciones de control. Los primeros cuatro controles son las reacciones llevadas a cabo a 30°C durante 90 minutos con la omisión de E1, o E2 (UbcH5c), o His6-Biotina-Ubiquitina N-terminal, o el IRS1 recombinante, respectivamente. Los últimos dos controles son las reacciones completas llevadas a cabo sin Fbxo40 inmunoprecipitado (con perlas incubadas con el lisado sin IgG o con IgG de conejo no específico). El IRS1 poli-ubiquitinado se puede observar en las reacciones completas después de 60 minutos o de 90 minutos a 30°C.
Estos datos sostienen la hipótesis de que el Fbox40 es la ligasa E3 que regula la proteína de IRS1 después del tratamiento con IGF1.
EJEMPLO 5 La eliminación genética parcial de Rbx1 potencia la acción hipertrófica de IGF1 en los miotubos C2C12 Como una prueba indirecta de que la inhibición de Fbxo40 puede conducir a la hipertrofia muscular, eliminamos genéticamente el Rbx1 parcialmente, el cual se asocia con Fbxo40 y cuya función en la ubiquitinación del IRS1 requiere de Fbxo40.
En el siguiente conjunto de experimentos, eliminamos genéticamente la expresión de Rbx1 con los siARNs de Qiagen. Observe que, como se muestra en la Figura 5A, el siRbx1_1 y el siRbx1_2 pueden reducir la expresión de proteína hasta alrededor del 50 por ciento del nivel basal, mientras que el siRbx1_3 apenas funciona. Solamente utilizamos siRbx1_1 y siRbx1_2 para este experimento. Las células transfectadas se tratan con dos dosis diferentes de IGF1 durante 24 horas. El diámetro de los miotubos se mide utilizando un software automatizado con 10 imágenes de cada grupo de tratamiento. La eliminación genética de Rbx1 da como resultado la generación de miotubos más grandes incluso con el tratamiento con IGF1 1 nM (Figura 7A). En las células transfectadas con siCON, solamente el IGF1 10 nM produjo miotubos más gruesos estadísticamente significativos. El análisis estadístico utilizando ANOVA de dos vías indica que la introducción de siRbx1_1 y siRbx1_2 potencian significativamente más la acción hipertrófica de IGF1 que las células transfectadas con siCON (Figura 7B).
EJEMPLO 6 La eliminación genética de Fbxo40 da como resultado miotubos más gruesos y un aumento de la masa muscular Este ejemplo muestra que la eliminación genética de Fbxo40 da como resultado miotubos más gruesos, indicando el incremento de la masa muscular.
Este ejemplo se diseña para determinar las consecuencias in vivo de la eliminación genética de Fbxo40, debido a que el IGF1 es capaz de aumentar el tamaño de miotubos diferenciados posteriormente. Rommel y colaboradores, 2001 Nat. Cell Biol. 3: 1009-1013; Jacquemin y colaboradores, 2004 Exp. Cell Res. 299: 148-158; y Semsarian y colaboradores, 1999 Nature 400: 576-581.
Basándose en la eficiencia de la eliminación genética de tres Fbxo40 dirigidos por los siARNs mostrados en la Figura 6A, utilizamos los dos siARNs más efectivos, siFbxo40_7 y siFbxo40_8, para este experimento. Debido a que la expresión de Fbxo40 es detectable en las etapas posteriores de la diferenciación (Figuras 6B y 8A, los miotubos se transfectan con siCON, siFbxo40_7 y siFbxo40_8 dos días después de la diferenciación; entonces, un día después (día 3 después de la diferenciación), los miotubos se tratan con cualquiera de dos dosis diferentes de IGF1 durante 24 horas. El diámetro de los miotubos se mide utilizando un software automatizado, tomando 10 imágenes de cada grupo de tratamiento. La eliminación genética de Fbxo40 da como resultado la generación de miotubos dramáticamente más grandes, incluso sin el tratamiento con IGF1 adicional (Figura 9A). Se debe observar que los miotubos producen IGF1 endógeno (no se muestran los datos). Se presenta una imagen representativa de los miotubos después de la eliminación genética con siFbxo40_7 en la Figura 9A. También se observan miotubos más grandes con siFbxo40_8, el siARN menos eficaz, veinticuatro horas después de la transfección (no se muestran los datos). La cuantificación del diámetro del miotubo se muestra en la Figura 9B. Entre los grupos transfectados con siCON, solamente el IGF1 10 n produce miotubos más gruesos estadísticamente significativos comparándose con las células tratadas sólo con vehículo; éstos muestran un incremento en el diámetro de los miotubos de alrededor del 11 por ciento. Sin embargo, la introducción del siFbxo40_7 da como resultado miotubos más gruesos significativos que las células transfectadas con siCON. El efecto que se ve es bastante más grande - un incremento de aproximadamente el 50 por ciento en el diámetro del miotubo. Adicionalmente, cuando el IRS1 se eliminó genéticamente (el ARNm disminuye hasta el 65 por ciento de las células transfectadas con siCON, no se muestran los datos) junto con Fbxo40, solamente vimos un incremento de aproximadamente el 20 por ciento en el diámetro del miotubo (Figura 9C), que además probó que el Fbxo40 regula el diámetro del miotubo a través de la regulación del IRS1, opuestamente a algún otro sustrato potencial. Estos experimentos muestran que la eliminación genética del Fbxo40 da como resultado miotubos más gruesos, indicando un incremento en la masa muscular.
Entonces revisamos si el Fbxo40 también regula los niveles de proteína de IRS1 en los ratones. El músculo tibialis anterior de los ratones se electropora con siCON en la pierna izquierda, y s¡Rbx1_1 o siFbxo40_7 en la pierna derecha. Se co-inyecta un plásmido pCMV-LacZ con el siARN, para ayudar a identificar las fibras con expresión del siARN. Después de recuperarse durante dos días, el IGF1 (100 microgramos por inyección) se inyecta intramuscularmente en el músculo tibialis anterior en los días 2, 5, y 7. El músculo se recolecta en el día 8, y se preparan los extractos de proteína. La Figura 9D muestra que la proteína de IRS1 es más alta en las muestras electroporadas con siRbxl y siFbxo40, que las muestras con siCON. En adición, también se observan fibras musculares más grandes con la el imi nación genética de Fbxo40 - incremento del 1 8 por ciento ± 5 por ciento comparándose con las piernas contralaterales electroporadas con siCON ( Figura 9 E) .
Por consiguiente , se hacen los experimentos para determi nar cuál es la consecuencia fenotípica de eliminar genéticamente el Fbxo40 en los miotubos. Probamos esto con y sin estimulación con el IG F1 , investigando si una disminución en la expresión de Fbxo40 podría mejorar la hipertrofia mediada por I G F1 . Para nuestra sorpresa, la eliminación genética de Fbxo40 es suficiente para provocar un incremento dramático en el tamaño de los miotubos; la eli mi nación genética de Fbxo40 da como resultado un incremento en el tamaño del miotubo del 50 por ciento. Esto no deja l ugar a un efecto añadido encima del I G F1 . El I GF1 ( 1 0 n M ) solo, únicamente puede provocar un incremento del tamaño de miotubo del 1 1 por ciento en las cél ulas transfectadas con siCON . Sin embargo, se debe observar que los miotubos producen IGF1 endógeno. Por consiguiente, la implicación es que la disminución en Fbxo40 da como resultado una respuesta hipertrófica autocrinamente mediada no controlada al factor del crecimiento producido endógenamente , ayudando a explicar por qué es necesario el Fbxo40 para regular esta señalización autocrina. Esto se prueba por la eliminación genética del I RS 1 enci ma del Fbxo40 reducido.
Por consiguiente , los datos muestran que la eliminación genética de Fbxo40 da como resultado miotubos más gruesos e incrementa la masa muscular.
EJEMPLO 7.
Materiales y Métodos Se pueden utilizar los materiales y métodos conocidos por las personas de una experiencia ordinaria en este campo, en la elaboración y utilización de la presente divulgación. Los siguientes son un ejemplo y los materiales y métodos no limitantes, e incluyen aquéllos empleados en los Ejemplos 1 a 6.
Anticuerpos e inhibidores En este estudio, utilizamos los anticuerpos de Akt, fosfo-Akt (Ser473), fosfo-Akt (Thr308), fosfo-GSK-3a/R(Ser21/9), receptor ß del factor de crecimiento tipo insulina-1, receptor 3 de fosfo-IGF1 (TyM 135/1136), I RS 1 policlonal de conejo, cinasa MAP p44/p42, cinasa MAP fosfo-p44/p42 (Thr202/Tyr204), fosfo-mTOR (Ser2448), mTOR, cinasa fosfo-p70 S6 (Thr389), cinasa p70 S6, c-Cbl, NEDD4 y a/ß-tubulina de Cell Signaling Technology (Danvers, MA); un anticuerpo monoclonal de ratón anti-Cbl-b de Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA); anticuerpo anti-Skpl de BD Tranduction Laboratories (San José, CA); anti-Culin7 y un anticuerpo policlonal de conejo anti- 1 RS 1 , y un anticuerpo monoclonal de ratón anti-IRS1 de Millipore (Billerica, MA); un anticuerpo policlonal de conejo anti-Rbxl de Abcam (Cambridge, MA); anticuerpos monoclonales de ratón anti-ubiquitina y anti-myc de Invitrogen (Carlsbad, CA). Un anticuerpo policlonal de conejo contra Fbxo40 (Fbxo40-691:710: CEKARESLVSTFRARPRGRHF (SEQ ID NO: 34)) fue reproducido y purificado en su afinidad por Open Biosystems (Huntsville, AL).
Los inhibidores de señalización, rapamicina (utilizada en una concentración final de 100 nM), LY294002 (concentración final de 50 µ?), wortmanina (concentración final de 100 nM), inhibidor de Akt API-2 (concentración final de 1 µ?), inhibidor de GSK3 LiCI (concentración final de 20 niM), inhibidor de cinasa MAP p38 SB202190 (concentración final de 10 µ?), inhibidor de MEK PD98059 (concentración final de 25 µ?), inhibidor de MEK1/2 (un inhibidor de MEK1 y MEK2 selectivo permeable a las células, concentración final de 10 µ?), e inhibidor de JNK V (concentración final de 20 µ?) se adquieren en EMD Chemicals, Inc. (Gibbstown, NJ).
Cultivo celular Los mioblastos C2C12 (ATCC) se cultivan y se diferencian como se describe anteriormente. Rommel y colaboradores, 1999 Science 286: 1738-1741. El día 0 se define como el día en que se cambian las células al medio de diferenciación bajo en suero.
Tratamiento con los inhibidores y Western blot Las células se lavan dos veces con DMEM sin suero caliente, y se agotan del DMEM sin suero durante 4 horas con un intercambio con medio fresco a la mitad. Entonces se agregan los inhibidores de señalización para tratar previamente las células durante 30 minutos antes de la incubación con inhibidores recién preparados con IGF1 10 nM (la forma R3, Sigma, St. Louis, MO) o Emetin 10 µ? (Sigma, St. Louis, MO) o MG132 20 µ? (Alexis Biochemicals, Carlsbad, CA) como se especifica durante 5 horas adicionales. Las células se enjuagan dos veces con suero regulado con fosfato (PBS) helado, y se cosechan en regulador RIPA helado con MG132 10 µ? y tabletas de inhibidores de proteasa/fosfatasa (Roche, Basilea, Suiza). Los lisados celulares se rotan a 4°C durante cuando menos un hora, y se centrifugan durante 10 minutos a 16,000 x g en un microcentrífugo a 4°C. Las concentraciones de proteína de los sobrenadantes se determinan mediante el Kit de Ensayo de Proteínas BCA (Pierce/Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL). Se cargan cantidades iguales de proteínas (de 10 a 20 microgramos) por pista sobre geles de Bis-Tris al 4-12 por ciento (Invitrogen, Carlsbad, CA), y se transfieren sobre membranas de PVDF (Millipore, Billerica, MA). Las membranas se bloquean en leche al 10 por ciento (peso/volumen) en TBST durante 1 hora a temperatura ambiente, seguido por una incubación con el anticuerpo primario en TBST con BSA al 5 por ciento a 4°C durante la noche. Los anticuerpos secundarios se incuban con las membranas a temperatura ambiente durante 1 hora. La inmuno-reactividad se detecta mediante ECL, y se exponen a la película o a la Kodak Image Station 4000R (Eastman Kodak Company, Rochester, NY). La densitometría se analiza utilizando el software Kodak Molecular Imaging, versión 4.0.
Medición de estabilidad de la proteína Las células se lavan dos veces con DMEM sin suero caliente, y se agotan de DMEM sin suero durante 4 horas con un intercambio con medio fresco a la mitad. En el tiempo cero, se agregan Emetin 10 µ?, ó 100 microgramos/mililitro de cicloheximída, ó IGF1 10 nM ó MG132 20 µ? a las células como se especifica. En los intervalos de tiempo indicados, las células se enjuagan dos veces con suero regulado con fosfato (PBS) y se cosechan en regulador RIPA helado con MG132 10 µ? e inhibidores de proteasa/fosfatasa. Los lisados celulares se rotan a 4°C durante cuando menos un hora, y se centrifugan durante 10 minutos a 16,000 x g en un microcentrífugo a 4°C. Los sobrenadantes se analizan mediante Western blot.
Ensayo de ubiquitinación e inmunoprecipitación in vivo Las construcciones de expresión adenoviral de His-myc-ubiquitina se envían a Welgen Inc. (Worcester, MA) para la producción y la purificación. El adenovirus purificado se agrega a la células C2C12 2 días después de la diferenciación en una concentración de 2 x 108 pf u/mililitro durante la noche. Cuarenta y ocho horas después de de la infección, la células se agotan y se tratan con IGF1 10 nM ó MG132 20 µ?, ó G5 5 µ? (un inhibidor de isopeptidasa, EMD Chemicals, Inc., Gibbstown, NJ) como se especifica, durante 5 horas. Entonces las células se enjuagan dos veces con suero regulado con fosfato (PBS), y se cosechan en 800 microlitros de regulador RIPA helado por cada plato de 10 centímetros con MG132 10 µ?, G5 5 µ?, y tabletas inhibidoras de proteasa/fosfatasa. Los lisados celulares se rotan a 4°C durante cuando menos una hora, y se centrifugan durante 10 minutos a 16,000 x g en un microcentrífugo a 4°C. La concentración de proteína en el sobrenadante se determina mediante análisis BCA. Este material (1 miligramo de la proteína total) se incuba con el anticuerpo policlonal de conejo IRS1 (Cell Signaling, Denvers, MA), e IgG de conejo no específica (cada 3 microgramos), junto con 40 microlitros de Dynabeads de IgG anti-conejo de ovejas M-280 (Invitrogen, Carlsbad, CA) durante la noche a 4°C con rotación. Las perlas se lavan entonces tres veces con regulador de lisis Tritón (Tris-HCI 50 mM, NaCI 150 mM, EDTA 5 mM, y Tritón al 1 por ciento, pH de 7.4). La elución se lleva a cabo volviendo a suspender las perlas en 30 microlitros del regulador de muestras con DTT 100 mM, y luego se pone a hervir a 95°C durante 5 minutos. Se analiza una alícuota (20 microgramos) del Usado mediante Western blot, junto con el 100 por ciento del eluato.
En el experimento de co-inmunoprecipitación de IRS1 y Rbx1, en el día 3 se agotan los miotubos C2C12 en DMEM sin suero durante 4 horas con un intercambio con medio fresco a la mitad. Entonces las células se tratan con IGF1 10 nM, junto con MG132 20µ? en DMEM sin suero durante 16 horas. Las células se enjuagan dos times con suero regulado con fosfato (PBS) helado, y se Usan en regulador de lisis Tritón helado complementado con MG132 10 µ? e inhibidores de proteasa/fosfatasa. Los Usados celulares se rotan a 4°C durante cuando menos un hora. Los sobrenadantes (1 miligramo) a 16,000 x g se incuban con el anticuerpo policlonal de conejo IRS1 (Cell Signaling), e IgG de conejo no específica (cada 3 microgramos) junto con 40 microlitros de Dynabeads de IgG anti-conejo de ovejas M-280 durante la noche a 4°C con rotación. Las proteínas enlazadas se eluyen con 30 microlitros del regulador de muestras con DTT 100mM.
De una manera alternativa, en el experimento de co-inmunoprecipitación de IRS1 y Rbx1 con Fbxo40, en el día 3, los miotubos C2C12 se agotan y se tratan con IGF1 10 nM ó G132 20µ? como se describe anteriormente. El lisado celular (1 miligramo) se incuba con el anticuerpo Fbxo40 purificado en su afinidad e IgG de conejo no específica (cada 3 microgramos), junto con 40 microlitros de Dynabeads de IgG anti-conejo de ovejas M-280.
Ensayo de ubiquitinación in vitro Para el ensayo de ubiquitinación in vitro, se adquirieron levadura E1, UbcH5c recombinante humana, His6-Biotina- Ubiquitina-N-terminal humana, Ubiquitina-Aldehído, y solución de regeneración de energía (ERS) en Boston Biochem, Inc. (Cambridge, MA). La lactacistina se adquiere en Alexis Biochemicals (San Diego, CA). La proteína de IRS1 recombinante purificada se adquiere en Millipore (Billerica, MA).
En el día 2, los miotubos C2C12 se tratan con IGF1 10 nM y MG132 20 µ? en un medio Complete durante 16 horas. Las células se enjuagan dos veces con suero regulado con fosfato (PBS) helado, y se lisan en regulador de lisis Tritón helado complementado con MG132 10 µ?, G5 5 µ?, e inhibidores de proteasa/fosfatasa. El lisado celular se rota a 4°C durante cuando menos una hora. Los sobrenadantes a 16,000 x g (1 miligramo) se incuban con el anticuerpo anti-Fbxo40 o con la IgG de conejo no específica (cada 3 microgramos), junto con 40 microlitros de Dynabeads de IgG anti- conejo de ovejas M-280 durante la noche a 4°C con rotación. En una condición de control, el Usado sin IgG se incuba con las perlas. Entonces las perlas se lavan tres veces con regulador de lisis Tritón durante 10 minutos con oscilación. La reacción de ubiquitinación se lleva a cabo mediante la adición de E1 (125 nM), UbcH5c (3.125 µ?), His6-Biotina-Ubiquitina N-terminal (5.4 µ?), 1X ERS, Ubiquitina-Aldehído (5 µ ), Lactacistina (20 µ?), IRS1 recombinante (40 nanogramos), y regulador de reacción (HEPES 50 mM, DTT 0.6 mM, pH de 7.4) en un volumen total de 40 microlitros, a las perlas. Las reacciones se llevan a cabo a 30°C durante 0, 30, 60, 90 minutos. Las reacciones de control se llevan a cabo con la omisión de E1 o E2 (UbcH5c), o His6-Biotina-Ubiquitina N-terminal, o IRS1 a 30°C durante 90 minutos. Cada condición se lleva a cabo en conjuntos duplicados. Para un conjunto, la reacción se finaliza mediante la separación de la mezcla de reacción a partir de las perlas, la adición del regulador de muestras de SDS-PAGE, y calentamiento. Para otro conjunto, se agrega regulador de lisis Tritón helado adicional (800 microlitros) para interrumpir la reacción. Entonces, la mezcla de reacción se separa de las perlas, y se somete a otra ronda de inmunoprecipitación con anticuerpo policlonal de conejo anti-IRS1 (Cell Signaling), junto con 40 microlitros de Dynabeads de IgG anticonejo de ovejas M-280 durante la noche a 4°C con rotación. Las proteínas enlazadas se eluyen con 35 microlitros del regulador de muestras con DTT 100 mM. Las reacciones se ejecutan sobre geles de Bis-Tris del 4 por ciento al 12 por ciento con regulador de ejecución MOPS o sobre geles de Tris-Acetato del 3 por ciento al 8 por ciento (Invitrogen), y se transfieren a membranas de PVDF para la inmunotransferencia con peroxidasa de radícula roja conjugada con estreptavidina (Pierce).
Secuencias de siARN A menos que se indique de otra manera, los siARNs se adquieren en Qiagen (Valencia, CA). Utilizamos siARN de Control Negativo AllStars como nuestro siARN de control. Las secuencias objetivo de los de siARNs son: La biblioteca de siARN que se dirige a las proteínas involucradas en la conjugación de ubiquitina se adquieren en Dharmacon (Dharmacon/Thermo Fisher Scientific, Lafayette, CO). Esta biblioteca contiene tres subconjuntos, que incluyen las proteínas E1, E2, F-box y SOCS-box, Culins, y E3s que contienen dominio HECT, dedo de ANILLO y dominio de tipo dedo de ANILLO. Cada gen es dirigido por una reserva de cuatro siARNs individuales. La reserva de siARN sin dirección ON-TARG ETpIus de Dharmacon se utiliza como un control negativo. Solamente se muestra una cadena del ARN de doble cadena. El siARN de Fbxo40, siFbxo40_7, se dirige a la secuencia CACCTCCTGGAAAGTCCACAA (SEQ ID NO: 19); este siARN es Qiagen, Número de Catálogo SÍ04390162. El siARN de Fbxo40, siFbxo40_8, se dirige a la secuencia GTGGGAAAGTATGTT CAGCAA (SEQ ID NO: 20); este siARN es Qiagen, Número de Catálogo SÍ04390169. El siARN de Fbxo40, siFbxo40_9, se dirige a la secuencia AGCCGTGGATGCCAAAGACTA (SEQ ID NO: 21); este siARN es Qiagen, Número de Catálogo SÍ04390176.
ARNi El día 1, las células C2C12 se transfectan con los siARNs como se describe en el protocolo de Qiagen para el reactivo de transfección HiPerfect. Dicho de una manera breve, más adelante se describe el procedimiento para células que crecen en placas de 6 pozos. Primero, se mezclan 56 microlitros de OPTI-MEM (Invitrogen) con 4 microlitros de siARN (suministro de 10 µ?). Luego se agregan 40 microlitros de reactivo de transfección HiPerFect a esta mezcla para dar un volumen total de 100 microlitros. La mezcla se incuba durante 10 minutos a temperatura ambiente para permitir la formación del complejo de transfección. Mientras tanto, las células se alimentan con 2 mililitros del medio de diferenciación fresco por pozo de la placa de 6 pozos. Se agregan por goteo 100 microlitros de los complejos sobre las células en un pozo. Las placas se giran suavemente para asegurar la distribución uniforme, y se devuelven a la incubadora a 37°C. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, se agotan las células durante 4 horas DMEM sin suero, y se tratan con IGF1 10 nM ó MG132 20 µ? durante 16 horas a 37°C. Entonces, las células se lisan y las proteínas se analizan mediante Western blot como se describe en el sección de Tratamiento de Inhibidores y Western Blot. La expresión del ARN también se revisa 48 después de la transfección.
En el día 1, las células C2C12 cultivadas en placas de 12 pozos se transfectan con la biblioteca de siARN Dharmacon, (solución de suministro 10 µ?) utilizando Dharmafect 3 de acuerdo con el protocolo descrito por Dharmacon. La concentración final de los siARNs incubados con células es 100 nM. Las células se tratan y los ARNs se cosechan 48 horas después de la transfección como se describe anteriormente.
PCR cuantitativa en tiempo real El ARN total se aisla a partir de las células utilizando reactivo Tri (Molecular Research Center, Inc., Cincinnati, OH). Para cada condición de tratamiento, hay tres muestras independientes. El ADN genómico se remueve a partir de las muestras de ARN con la ayuda del kit libre de ADN TURBO (Applied Biosystems/Ambion, Austin, TX). Las muestras de ARN (1 microgramo de cada muestra) se trascriben inversamente al ADNc utilizando el kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad (High Capacity ADNc Reverse Transcription Kit) (Applied Biosystems, Foster City, CA). Las muestras de ADNc resultantes se diluyen a 1:10, y se analizan 9 microlitros por triplicado en placas de 384 pozos con los Ensayos de Expresión Genética Taqman enlistados en la siguiente tabla utilizando el sistema de reacción en cadena de la pol imerasa (PC R) en tiempo real rápido 7900HT (Applied Biosystems) . Se anal izan los datos con el software SDS v2.2. Los niveles de ARNm en las células transfectadas con el siAR N de control o con veh ículo se establecen en 1 . Las veces de cambio relativo se calcula utilizando el método 2"AACI para cada muestra. Se grafican las 5728 veces de cambio promedio y el error estándar del promedio de tres muestras independientes .
Se adquiere el Panel de Estudio de ARN Total Humano FirstChoice en Ambion (Applied Biosystems/Ambion, Austin, TX).
Medición del diámetro de los miotubos Las células se lavan dos veces con suero regulado con fosfato (PBS) helado después del tratamiento, y entonces se fijan con glutaraldehído al 5 por ciento a 37°C durante 15 a 30 minutos, seguido por dos enjuagues con suero regulado con fosfato (PBS). Se toman diez imágenes para cada condición con un lente de amplificación de 10 veces utilizando un microscopio fluorescente Cari Zeiss Axio Observer.ZI (Cari Zeiss Inc., Thornwood, NY). Los diámetros de los miotubos se determinan a partir de las imágenes en formato TIFF utilizando un software automático desarrollado por Novartis. El valor promedio de las células de control no tratadas en cada grupo de transfección se establece en 1 para eliminar las complicaciones que puedan resultar de la introducción del siARN específico. Se calcula y se grafican las veces de cambio promedio relativo y el error estándar del promedio.
Análisis estadísticos Excepto en las Figuras 7B y 9B, se analizan las diferencias entre dos condiciones de tratamiento utilizando ANOVA de una vía. El significado se determina mediante la prueba post hoc de Bonferroni. Los valores se consideran significativos en p < 0.01.
En las Figuras 7B y 9B, se analizan las diferencias entre los grupos utilizando el ANOVA de dos vías. El significado se determina mediante la prueba post hot de Bonferroni. Los valores se consideran significativos en p < 0.01.
Procedimientos en ratones Se anestesian los ratones C57BL/6 J (Taconic Inc, Hudson, NY) de 12 a 14 semanas de edad con isofluorano del 2 al 3 por ciento. Se afeita el pelo del área que rodea el músculo. En el día 0, se inyectan 500 picomoles de siCON junto con 50 microgramos del plásmido pCMV-LacZ en el músculo tibialis izquierdo. El músculo tibialis derecho se inyecta con 500 picomoles de siRbx1_1 o siFbxo40_7 y 50 microgramos del plásmido pCMV-LacZ. Inmediatamente en seguida de la inyección, las extremidades se pulsan con 5 impulsos "positivos" de 125 V/cm, duración de 30 milisegundos, con un intervalo de tiempo de 400 milisegundos, seguidos por 5 impulsos "negativos" del mismo parámetro. Los ratones se dejan para recuperarse en sus jaulas durante 2 días. Se inyecta intramuscularmente Long-R3-IGF1 (100 microgramos por inyección) en el músculo tibialis en los días 2, 5, 7. En el día 8, los ratones se sacrifican y se disecta rápidamente el músculo tibialis, y se congela instantáneamente en 2-met¡l-butano enfriado previamente en nitrógeno líquido. Las secciones transversales en serie, con un espesor de 8 mieras, se crioseccionan y se colocan en los portaobjetos positivamente cargados. Se tiñen las secciones para la í-galactosidasa (LacZ). Se adquieren las imágenes de la sección de tejido entera utilizando Imagescope (Aperio), y se mide el área de sección transversal (CSA) de las fibras positivas para LacZ utilizando Adobe Photoshop. El resto del músculo tibialis se pulveriza bajo nitrógeno líquido y se extrae la proteína. Todos los procedimientos con animales están aprobados por el Institutional Animal Care and Use Committee (Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucionales) del Novartis Institute for Biomedical Research y están de conformidad con los Reglamentos de la Ley de Bienestar Animal 9 del Código de Reglamentos Federales (CFR) Partes 1, 2 y 3, y con los Reglamentos de los Estados Unidos (Lineamientos para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, 1995).

Claims (23)

REIVINDICACIONES
1. Un método para el rastreo de composiciones con el fin de determinar su capacidad para aumentar la masa muscular, o para prevenir, limitar o reducir la pérdida de la masa muscular en un individuo, el cual comprende: (a) aseverar el nivel o la actividad del Fbxo40 en una célula del individuo, (b) opcionalmente, tratar la célula con una composición que comprenda un antagonista para Fbxo40, y (c) opcionalmente, aseverar el nivel o la actividad del Fbxo40 en la célula nuevamente, en donde un nivel elevado de Fbxo40 en relación con un control es una indicación de que el sujeto tiene o está en riesgo de desarrollar un trastorno de consunción muscular, y en donde la capacidad de la composición para diminuir el nivel o la actividad del Fbxo40 está correlacionada con la capacidad para aumentar la masa muscular, o para prevenir la pérdida de la masa muscular en un individuo.
2. El método de la reivindicación 1, en donde el individuo padece un trastorno asociado con la consunción muscular seleccionado a partir de: caquexia, cáncer, pérdida de peso inducida por un tumor, sepsis, insuficiencia cardíaca crónica, artritis reumatoide, síndrome de inmunodeficiencia adquirida, sarcopenia, diabetes, hipertensión, altos niveles de colesterol en suero, altos niveles de triglicéridos, enfermedad de Parkinson , i nsomnio, adicción a drogas, dolor, insomnio, hipoglicemia, función hepática comprometida, ci rrosis, trastornos de la vesícula bi l iar, corea, disquinesia, trastorno renal , y/o uremia.
3. El método de la reivindicación 1 , en donde el antagonista reduce el nivel, la expresión o la actividad del Fbxo40.
4. Un método para diagnosticar o monitorear el nivel de aumento o mantenimiento de la masa muscular, o una pérdida reducida de la masa muscular en un i ndividuo, el cual comprende: (a) aseverar el nivel o la actividad del Fbxo40 en una célula del i ndividuo, (b) opcionalmente , tratar la célula con una composición que comprenda u n antagonista para Fbxo40 , y (c) opcional mente , aseverar el nivel o la actividad del Fbxo40 en la cél ula nuevamente , en donde u n nivel elevado de Fbxo40 en relación con un control es una indicación de que el sujeto tiene o está en riesgo de desarrollar un trastorno de consunción muscular, y en donde la capacidad de la composición para di m inuir el nivel o la actividad del Fbxo40 está correlacionada con la capacidad para aumentar la masa muscular, o para preveni r la pérdida de la masa muscular en un individuo.
5. El método de la reivi ndicación 4, en donde el individuo padece un trastorno asociado con la consunción muscular, seleccionado a parti r de: caquexia, cáncer, pérdida de peso inducida por un tumor, sepsis, insuficiencia card íaca crónica, artritis reumatoide , sínd rome de inmunodeficiencia adqui rida, sarcopenia, diabetes , hipertensión , altos niveles de colesterol en suero, altos niveles de triglicéridos, enfermedad de Parkinson , i nsomnio, adicción a drogas , dolor, insomnio, hipoglicemia, función hepática comprometida, cirrosis, trastornos de la ves ícula bi liar, corea, disquinesia, trastorno renal , y/o uremia.
6. El método de la reivi ndicación 4, en donde el antagonista reduce el nivel , la expresión o la actividad del Fbxo40.
7. Un método para aumentar la masa muscular, o para mantener o preveni r la pérdida de la masa muscular en un individuo, el cual comprende admi nistrar al individuo, u na cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista de Fbxo40.
8. El método de la reivindicación 7, en donde el i ndividuo padece un trastorno asociado con la consunción muscular, seleccionado a parti r de: caquexia, cáncer, pérdida de peso i nducida por un tumor, sepsis, insuficiencia card íaca crónica, artritis reumatoide , s índrome de inmunodeficiencia adqui rida, sarcopenia, diabetes, hipertensión , altos niveles de colesterol en suero, altos niveles de triglicéridos, enfermedad de Parkinson , insomnio, adicción a drogas , dolor, insomnio, hipoglicemia, función hepática comprometida, cirrosis , trastornos de la vesícula biliar, corea, disqui nesia, trastorno renal, y/o uremia.
9. El método de la reivi ndicación 7, en donde el método comprende además admi nistrar fisioterapia, nutrientes , estimulación eléctrica, estimuladores neuromusculares eléctricos (NMES), entrada neural a los músculos; y/o uno o más de los siguientes: esteroides, hormonas, hormona de crecimiento, secretagogo de hormona de crecimiento; mesilato de ibutamoreno (MK-677), extracto de gingko biloba, glicósido de flavona, ginkgolida, suplemento de aminoácidos, leucina, precursor de aminoácidos, precursor de leucina, piruvato y metabolito de piruvato, beta-hidroxi-beta-metil-butirato, alfa-cetoisocaproato, aminoácido de cadena ramificada, eritropoietina, opiato, escopolamina, insulina, factor de crecimiento tipo insulina-1 (IGF1), y/o testosterona; y/o inhibidor de aldosterona, receptor alfa, Angiotensina II, receptor beta, catepsina B, quimasa, receptor de endotelina, factor de iniciación eucariótico 2-alfa (elF2-alfa), receptor de imidazolina, interferón, MAFbx (F-box de Atrofia Muscular), MuRF1 (Dedo 1 de ANILLO de Músculo), miostatina, proteína relacionada con la hormona paratiroides (PTHrP) y/o su receptor, factor inductor de proteólisis (PIF), cinasa de proteína serina/treonina dependiente del ARN (PKR), factor de necrosis tumoral alfa (TNF-alfa), y/u oxidasa de xantina.
10. El método de la reivindicación 7, en donde el antagonista reduce la expresión, el nivel, o la actividad del Fbxo40.
11. El método de la reivindicación 7, en donde el antagonista de Fbxo40 es un compuesto de bajo peso molecular.
12. El método de la reivindicación 7, en donde el antagonista es un polipéptido.
13. El método de la reivindicación 7, en donde el antagonista de Fbxo40 es un siARN que se enlaza a un ácido nucleico que codifica el Fbxo40.
14. El método de la reivindicación 13, en donde el siARN es de extremos romos.
15. El método de la reivindicación 7, en donde el antagonista de Fbxo40 es un anticuerpo que se enlaza a Fbxo40.
16. Una composición que comprende un antagonista de Fbxo40, en donde el antagonista reduce la expresión, el nivel o la actividad del Fbxo40, y aumenta la masa muscular, o previene, limita o reduce la pérdida de la masa muscular.
17. La composición de la reivindicación 16, en donde la composición comprende además uno o más de los siguientes: esteroides, hormonas, hormona de crecimiento, secretagogo de hormona de crecimiento; mesilato de ibutamoreno (MK-677), extracto de gingko biloba, glicósido de flavona, ginkgolida, suplemento de aminoácidos, leucina, precursor de aminoácidos, precursor de leucina, piruvato y metabolito de piruvato, beta-hidroxi-beta-metil-butirato, alfa-cetoisocaproato, aminoácido de cadena ramificada, eritropoietina, opiato, escopolamina, insulina, factor de crecimiento tipo insulina-1 (IGF1), y/o testosterona; y/o inhibidor de aldosterona, receptor alfa, Angiotensina II, receptor beta, catepsina B, quimasa, receptor de endotelina, factor de iniciación eucariótico 2-alfa (elF2-alfa), receptor de imidazolina, interferón, MAFbx (F-box de Atrofia Muscular), MuF¡F1 (Dedo 1 de ANILLO de Músculo), miostatina, proteína relacionada con la hormona paratiroides (PTHrP) y/o su receptor, factor inductor de proteólisis (PIF), cinasa de proteína serina/treonina dependiente del ARN (PKR), factor de necrosis tumoral alfa (TNF-alfa), y/u oxidasa de xantina.
18. La composición de la reivindicación 16, en donde el antagonista reduce la expresión, el nivel o la actividad del Fbxo40.
19. La composición de la reivindicación 16, en donde el antagonista de Fbxo40 es un compuesto de bajo peso molecular.
20. La composición de la reivindicación 16, en donde el antagonista es un polipéptido.
21. La composición de la reivindicación 16, en donde el antagonista de Fbxo40 es un siARN que se enlaza a un ácido nucleico que codifica el Fbxo40.
22. La composición de la reivindicación 21, en donde el siARN es de extremos romos.
23. La composición de la reivindicación 16, en donde el antagonista de Fbxo40 es un anticuerpo que se enlaza a Fbxo40. R E S U M E N La presente descripción se refiere al tratamiento de los trastornos asociados con la consunción muscular en un paciente, utilizando una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista de Fbxo40 , en donde el antagonista reduce la expresión , el nivel o la actividad del Fbxo40. El antagonista de Fbxo40 aumenta la masa muscular, o previene, limita o reduce la pérdida de masa muscular, en el paciente . El antagonista de Fbxo40 puede ser un compuesto de bajo peso molecular (LMW) , una prote ína, u n anticuerpo, o un ácido nucleico i nhibidor, tal como un siARN . La presente descripción también se refiere a métodos de rastreo de los antagonistas de Fbxo40 , y a métodos para diagnosticar o monitorear los niveles de manteni miento, pérdida o aumento de la masa muscular.
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