JP6126773B2 - 癌のターゲッティングおよび検出のための高親和性抗前立腺幹細胞抗原（ｐｓｃａ）抗体 - Google Patents

癌のターゲッティングおよび検出のための高親和性抗前立腺幹細胞抗原（ｐｓｃａ）抗体 Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
該当なし
連邦支援の研究または開発下でなされた発明の権利に関する陳述
本発明は、ＮＩＨ／ＮＣＩによって与えられた助成金番号ＣＡ０９２１３１の政府支援を受けて創出された。政府は、本発明において一定の権利を有する。
コンパクトディスクで提出された、「配列表」、表またはコンピュータプログラム表付属物についての言及
該当なし
正常ヒト前立腺および膀胱において発現される、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）細胞表面糖タンパク質は、前立腺癌では過剰発現される（原発腫瘍の４０％およびリンパ節および骨髄転移の６０〜１００％）。また、膀胱および膵臓癌腫の移行型癌腫においても高度に発現される。ＰＳＣＡに特異的な抗ＰＳＣＡマウスモノクローナル抗体である１Ｇ８は、インビボで抗腫瘍ターゲッティング活性を実証した（Gu Z, et al. Cancer Res. 2005; 65: 9495）。この抗体は、ヒトフレームワークにグラフトすることによってヒト化され（トラスツズマブ）、２Ｂ３と名づけられた（Olafsen T, et al. J. Immunotherapy 2007; 30: 396）。
本発明は、ＰＳＣＡを発現する腫瘍を標的とし、画像化するための適当な薬力学的特性を有する薬剤の必要性に対処する。感度および特異性を有する、癌を画像化するのに有効な薬剤は、当技術分野では非常に必要とされており、特に初期段階の腫瘍または初期に転移するものは、従来の手段では画像化できない。ＰＳＣＡは、ほとんどの前立腺、膀胱および膵臓腫瘍によって高度に発現されており、これらの癌の検出、診断、予後および治療において重要な標的である。本発明は、腫瘍画像化およびターゲッティングにとって最適な特徴を有する革新的な構築物を記載する。それらはまた、遺伝子療法、放射能療法の腫瘍ターゲッティングのために使用してもよく、また、それ自体による治療的有用性を有する場合もある。
発明の概要
本発明は、前立腺およびその他の癌において、高親和性で新規細胞表面マーカーを認識する改変抗体を記載する。これらの遺伝的に改変された抗体断片は、ターゲッティングおよび検出のためのインビボ使用に明確に適合している。
本発明は、ＰＳＣＡを発現する腫瘍を標的とし、画像化するための適当な薬力学的特性を有する薬剤の必要性に対処する。感度および特異性を有する、癌を画像化するのに有効な薬剤は、当技術分野では非常に必要とされており、特に初期段階の腫瘍または初期に転移するものは、従来の手段では画像化できない。ＰＳＣＡは、ほとんどの前立腺、膀胱および膵臓腫瘍によって高度に発現されており、見込みのある標的である。本発明は、腫瘍画像化にとって最適な特徴を有する革新的な分子を記載する。それはまた、遺伝子療法、放射能の腫瘍ターゲッティングにとっても有用であり得、またはそれ自体による治療的有用性を有し得る。
複数の実施形態がある。例えば、ｓｃＦｖｓ、ダイアボディー（diabody）、トリアボディー（triabody）、ミニボディー（minibody）およびｓｃＦｖ−Ｆｃなど、種々の改変抗体形式がある。一般に、上記薬剤は、少なくとも、一価結合ではなく、二価を示すべきである。薬剤の全体的な大きさ、形およびドメイン組成は、最終適用に適するよう変えてよい。ヒトにおいて最適ターゲッティングを示す改変断片は、マウスにおいて最適である形式とはわずかに異なり得る。１つの目標はヒト適用であるので、本発明は、抗体可変領域のヒト化セットならびにヒトヒンジおよび定常領域を組み込む。さらなる実施形態は、完全（fully）ヒト可変領域を含む。これらのタンパク質は、微生物細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞培養物およびトランスジェニック動物をはじめ、種々の系において発現させることができる。
画像化を目的として、γまたはＳＰＥＣＴカメラまたはＰＥＴスキャナーでの検出のために種々の放射性核種を改変抗体と結合してもよい。治療用に、腫瘍へのＰＳＣＡ標的化デリバリーを行うために、薬物、毒素、サイトカイン、酵素またはその他の治療部分を結合することができる。改変ＰＳＣＡ特異的抗体を、検出（インビトロまたはインビボ）用のナノセンサーまたはデリバリー（インビボ）用のナノ粒子と結合してもよい。また、腫瘍の標的遺伝子療法のために、ＰＳＣＡ抗体断片をウイルスベクターに組み込むこともできる。
本発明は、早期診断または転移性疾患の診断において癌を画像化するための満たされていない必要性に対処する。特に、検出およびステージ分類のために前立腺癌を画像化するためのより良好な薬剤の臨床的必要性がある。ＰＳＣＡ抗体断片画像化は、骨転移を画像化することおよび治療に対する応答を評価することにとって極めて有用となる；現在利用可能な良好な画像化アプローチはない。膵臓癌の検出は、緊急に必要であり、ハイリスク患者では造影剤が有用であろう。本発明は、前立腺癌、膀胱癌および膵臓癌患者におけるＰＳＣＡのインビボターゲッティングおよび検出に適合させた高親和性の、高度に特異的な改変抗体を記載する。
したがって、第１の態様において、本発明は、ＰＳＣＡを過剰発現する癌の処置および検出において使用できる、高親和性ＰＳＣＡ抗原結合タンパク質構築物を提供する。いくつかの実施形態では、これらの構築物は、以下にさらに記載されるような、ミニボディー、ダイアボディー、トリアボディー、ＳｃＦｖまたはＳｃＦｖ−Ｆｃである。一実施形態では、本発明は、選択される構築物が、抗ＰＳＣＡ抗体のＶＬドメインおよびＶＨドメインと、それぞれ実質的に同一であるＶＬおよびＶＨドメインを有する、ミニボディー、ダイアボディーおよびｓｃＦｖ−Ｆｃからなる群から選択される、哺乳類ＰＳＣＡタンパク質（例えば、ヒト、マウス）への指向性を有する抗原結合タンパク質構築物を提供する。例えば、上記構築物は、抗ＰＳＣＡ抗体のＶＬおよびＶＨ鎖可変ドメインが、抗体のヒンジ領域の一部、アミノ酸リンカーおよび免疫グロブリン分子のＣＨ３ドメインと融合しているミニボディーであり得る。その他の実施形態では、構築物は、ダイアボディーである。
構築物が、ミニボディーまたはダイアボディーまたはｓｃＦＶ−Ｆｃである実施形態では、抗ＰＳＣＡ抗体は、ヒト化抗体であり得、ＣＨ３ドメインは、ヒト免疫グロブリン分子に由来する。好ましい実施形態では、抗ＰＳＣＡ抗体は、２Ｂ３または１Ｇ８である。さらにその他の実施形態では、構築物は、本明細書においてＡ１１、Ａ２またはＣ５と表されるｓｃＦｖ断片と実質的に同一であるＶＨおよびＶＬドメインを有するミニボディーである。なおさらなる実施形態では、構築物は、ヒト免疫グロブリン分子に由来するＣＨ３ドメインを有する。例えば、構築物は、ヒトＩｇＧヒンジ領域およびヒトＣＨ３ドメインであるヒンジ領域およびＣＨ３ドメインを有し得る。
いくつかの実施形態では、抗ＰＳＣＡ抗体は、１Ｇ８（ＡＴＣＣ番号ＨＢ−１２６１２）、２Ａ２（ＡＴＣＣ番号ＨＢ−１２０３）、２Ｈ９（ＡＴＣＣ番号ＨＢ−１２６１４）、３Ｃ５（ＡＴＣＣ番号ＨＢ−１２６１６）、３Ｅ６（ＡＴＣＣ番号ＨＢ１２６１８）、３Ｇ３（ＡＴＣＣ番号ＨＢ−１２６１５）または４Ａ１０（ＡＴＣＣ番号ＨＢ−１２６１７）と表されるモノクローナル抗体である。
本発明の構築物はまた、治療薬または検出可能なマーカーと連結させてもよい。いくつかの実施形態では、上記治療薬は、細胞傷害性薬剤である。例えば、上記薬剤は、リシン、リシンＡ鎖、ドキソルビシン、ダウノルビシン、タキソール、エチジウム（ethiduim）ブロマイド、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド（tenoposide）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ジヒドロキシアントラシン（anthracin）ジオン、アクチノマイシンＤ、ジフテリア（diphteria）毒素、シュードモナス外毒素（ＰＥ）Ａ、ＰＥ４０、アブリン、アルブリン（arbrin）Ａ鎖、モデクシン（modeccin）Ａ鎖、α−サルシン、ゲロニン、ミトゲリン（mitogellin）、レトストリクトシン（retstrictocin）、フェノマイシン（phenomycin）、エノマイシン（enomycin）、クリシン（curicin）、クロチン（crotin）、カリケアマイシン（calicheamicin）、サパオナリアオフィシナリス（sapaonaria officinalis）インヒビター、マイタンシノイド類またはグルココルチコイドリシンであり得る。その他の実施形態では、治療薬は、放射性同位元素である。放射性同位元素は、例えば、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、９０Ｙおよび１８６Ｒｅからなる群から選択され得る。その他の実施形態では、構築物は、プロドラッグをその活性型に変換できる抗癌薬プロドラッグ活性化酵素と連結している。
上記の別の好ましい実施形態では、抗ＰＳＣＡ抗体によって標的とされるＰＳＣＡは、ヒトＰＳＣＡである。
別の態様では、本発明は、選択される構築物が、２Ｂ３または本明細書においてＡ１１、Ａ２もしくはＣ５と表されるｓｃＦｖ変異体のＶＬおよびＶＨドメインと実質的に同一であるＶＬおよびＶＨドメインを有する、ミニボディー、ダイアボディー、ｓｃＦｖおよびｓｃＦｖ−Ｆｃからなる群から選択される抗原結合タンパク質構築物を提供する。その他の実施形態では、本発明の結合構築物は、変異体抗体Ａ１１、Ａ２またはＣ５中に見られる１つまたは複数の突然変異を含み得る。
さらに別の態様では、本発明は、選択される構築物が、抗ＰＳＣＡ抗体のＣＤＲ領域を含む、ミニボディー、ダイアボディー、ｓｃＦｖおよびｓｃＦｖ−Ｆｃからなる群から選択される抗原結合タンパク質構築物を提供する。特定の実施形態では、抗ＰＳＣＡ抗体は、２Ｂ３と表される抗体と同等以上の親和性でＰＳＣＡと結合する。その他の実施形態では、抗ＰＳＣＡ抗体は、親和性成熟（affinity matured）抗体であり得、親和性成熟抗体は、ＰＳＣＡに対して、親抗体がなすよりも高い親和性を含む。
別の態様では、本発明の抗ＰＳＣＡ構築物は、検出可能マーカーで標識される。マーカーは、例えば、放射性同位元素、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤または酵素であり得る。限定するものではないが、１２４Ｉ、８６Ｙ、１８Ｆ、９４Ｔｃなどをはじめ、多数の放射性核種を画像化標識として使用してよい。当業者ならば、本発明における使用に特によく適している、その他の放射性核種を承知しているであろう。
上記のいずれかのさらなるその他の実施形態では、本発明は、本発明の構築物の医薬組成物を提供する。
さらに別の態様では、本発明は、癌細胞（例えば、前立腺、膀胱、膵臓癌細胞）を、癌細胞の増殖を阻害するのに有効な量の本発明の構築物と接触させる工程を含む、癌（例えば、前立腺、膵臓または膀胱癌）を有する被験体を治療する方法または前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）タンパク質を発現する前立腺癌細胞の増殖を阻害する方法を提供する。上記方法は、癌細胞を死滅させ得る。いくつかの実施形態では、構築物は、アミノ酸位置２２のロイシンで始まり、アミノ酸位置９９のアラニンで終了する以下に示されるＰＳＣＡタンパク質を認識し、結合する。さらなる実施形態では、上記方法は、化学療法薬、放射線療法を施す工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、被験体はまた、ホルモンアブレーション療法またはホルモンアンタゴニスト療法で処置される。
上記処置は、静脈内、腹腔内、筋肉内、腫瘍内または皮内によって、患者または被験体に施され得る。いくつかの実施形態では、上記接触させる工程は、構築物を、前立腺癌、膀胱癌、膵臓癌またはその転移癌に直接投与することを含む。
別の態様では、本発明は、癌細胞を、検出可能マーカーを保有する構築物と接触させることによって、被験体において癌性細胞を検出する方法を提供する。上記方法は、癌のリスクの高い患者のスクリーニングにおいて、または治療に対する応答をモニターする（ｍｏｎｉｔｏｒｙ）ために、または癌（例えば、前立腺、膀胱または膵臓癌）の予後を示すために使用してもよい。上記方法は、癌の転移の検出において特に有利である。
抗ＰＳＣＡミニボディーの概略図である。ミニボディーをコードする遺伝子は、ＶＬ−リンカー−ＶＨ−ヒンジ−ＣＨ３の順に組み立てられ、ヒンジおよびＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１由来である。上記タンパク質は、８０ｋＤａの二量体に自己組織化する。 ２Ｂ３ ＳｃＦｖ変異体タンパク質配列の比較を示す図である。ＶＬ配列およびリンカーの一部が上部枠中にあり、リンカーの残りおよびＶＨ配列は下部の枠中にある。また、ＣＤＲも示されており、野生型配列に下線が引かれている。突然変異は、異なる陰影で強調されている。親のＳｃＦｖ Ｐ−２Ｂ３配列（配列番号４）ならびに変異体Ｃ５（配列番号５）、Ａ２（配列番号６）およびＡ１１（配列番号７）ＳｃＦｖ配列が示されている。 同上 親の２Ｂ３ミニボディー（配列番号９）のＤＮＡ配列（配列番号８）および翻訳されたタンパク質配列を示す図である。また、以下のタンパク質セグメントの出発点も示されている：シグナルペプチド（哺乳類分泌の）、軽鎖可変領域（ＶＬ）、１５個のアミノ酸のドメイン間ペプチドリンカー、重鎖可変領域（ＶＨ）、ヒトＩｇＧ１ヒンジ配列および１０個のアミノ酸伸長およびヒトＩｇＧ１ＣＨｊドメインとそれに続く２つの停止コドン。 同上 同上 非還元条件での、４つのミニボディー、すなわち、親（ｐ）、Ａ１１、Ａ２およびＣ５のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。矢印は、ミニボディーの予測分子量を示す。 予測される分子サイズにおける均一ピークを示す、Ａ１１ミニボディーのサイズ排除ＨＰＬＣを示す図である。 親和性ランキングを示す図である。（Ａ）競合ＥＬＩＳＡ結合実験によるランキング：プレートをＣＥＡでコーティングし、ビオチン化された完全な（intact）抗ＣＥＡキメラ抗体をプローブとして使用した。 親和性ランキングを示す図である。（Ｂ）フローサイトメトリーによるランキング：各ミニボディーの５ｐｇ／ｍｌをＰＳＣＡ発現細胞とともにインキュベートした。次いで、細胞を、ＰＥコンジュゲートした抗ヒトＦｃを用いて染色した。 ＬＡＰＣ−９ＡＤ（ＰＳＣＡ陽性ヒト前立腺癌）異種移植片（xenograft）を保有するヌードマウスの同時記録マイクロＰＥＴ／マイクロＣＴスキャンを示す図である。マウスにＩ−１２４放射標識Ａ１１ミニボディー変異体を注射し、連続スキャンした。Ａ、Ｂ、Ｃ；矢状断面；Ｄ、Ｅ、Ｆ；冠状断面。Ａ、Ｄ；白色の長方形としてＲＯＩ（関心領域）を示す、同時記録マイクロＰＥＴおよびマイクロＣＴ。Ｂ、Ｅ；マイクロＰＥＴ像およびＲＯＩ。Ｃ、Ｆ；マイクロＰＥＴ像のみ。 ２Ｂ３ミニボディー変異体の生体内分布およびマイクロＰＥＴ画像化ランキングを示す図である。生体内分布の単位は、ｙ−カウンターにおける、注射時間の２１または２５時間後の、秤量した組織１ｇあたりの％ＩＤ値である。マイクロＰＥＴ画像化値は、図６に示され、材料および方法に記載されるように、４つのＲＯＩの平均値について取得した。 ＰＳＣＡデータおよび特性のまとめを示す図である。 本発明の種々の構築物を示す図である。 ２Ｂ３変異体を製造するスキームを示す図である。 同上 種々の構築物のマイクロＰＥＴ画像化および生体内分布データを示す図である。 Ａ１１および親２Ｂ３のマイクロＰＥＴ画像化および生体内分布結果を示す図である。 親２Ｂ３および変異体Ａ１１抗ＰＳＣＡミニボディーを使用した、膵臓癌Ｃａｐａｎ−１異種移植マウスのマイクロＰＥＴ画像化および体内分布データを示す図である。 親２Ｂ３および変異体Ａ１１抗ＰＳＣＡミニボディーを使用した、膵臓癌ＭＩＡ ＰａＣａ−２異種移植マウスのマイクロＰＥＴ画像化および体内分布データを示す図である。 親２Ｂ３（配列番号１０）および変異体Ａ２（配列番号１１）抗ＰＳＣＡミニボディーのアミノ酸配列を示す図である。 変異体Ａ１１抗ＰＳＣＡミニボディーのアミノ酸配列（配列番号１２）を示す図である。 変異体Ｃ５抗ＰＳＣＡミニボディーのアミノ酸配列（配列番号１３）を示す図である。
発明の詳細な説明
造影剤および治療薬としての完全抗体の開発は、インビボで腫瘍標的に放射性核種を効果的にデリバリーするその能力にもかかわらず、長いクリアランス動態によって妨げられてきた。ここで、本発明者らはまた、ヌードマウスモデルにおける循環からの迅速なクリアランスと併せて、迅速で、高レベルの腫瘍取り込みを示す遺伝的に改変された抗体断片によって、インビボで腫瘍を容易に検出することが可能になることを報告する。
２Ｂ３抗体は、ヒトフレームワークにグラフトすることによってヒト化され（トラスツズマブ）、命名された（Olafsen T, et al. J. Immunotherapy 2007; 30: 396；この文献の全文を、説明、生物活性および抗体の作製に関して、参照により本明細書に組み込む）。２Ｂ３の抗体断片は、ＰＥＴ画像化適用のために作製された。これらの抗体断片のうち１種、２Ｂ３ミニボディーは、マウスモデルにおいてＰＳＣＡ発現腫瘍に対して迅速かつ特異的な局在性を示した。しかし、ヒト化は、ＰＳＣＡに対する完全抗体の親和性を、２．６ｎＭのＫｄから１６．７ｎＭに低減させた。さらに、完全抗体の、抗体断片への再編成も、結合効率に影響を及ぼし得る。ＳｃＦｖの定量的腫瘍滞留性は親和性とともに高まるが、１０−９ Ｍに近い閾値までであるということが示されている（Adams GP, et al. Cancer Res. 2001; 61: 4750）。腫瘍ターゲッティングおよび画像化特性への、ミニボディー親和性の影響に関する刊行されたデータはない。ここで、本発明者らは、３種の高親和性抗ＰＳＣＡ ＳｃＦｖの作製と、それに続く、３種の高親和性抗ＰＳＣＡミニボディーの作製および特性決定とを記載する。本発明者らは、良好な腫瘍ターゲッティング／画像化適性を有するミニボディー断片を作製した。本発明の構築物に関するいくつかの実施形態では、構築物は、２Ｂ３抗体の対応するドメインと同一ではないＶＨまたはＶＬドメインを含むという条件がある。
一実施形態では、本発明は、ＶＬおよびＶＨドメインが、２Ｂ３において見られるものと実質的に同一である、抗体、ミニボディー、ダイアボディー、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃなどからなる群から選択される抗原結合構築物を提供する。第２の実施形態では、抗原結合構築物は、本明細書においてＡ１１、Ａ２またはＣ５と表される抗体変異体において見られる１つまたは複数の突然変異を含み得る。第３の実施形態では、結合構築物は、配列番号４のアミノ酸に対応する残基に、Ｔ５、Ｓ１０、Ｖ１５、Ｓ９１、Ｓ１２３、Ｓ１３１、Ｎ１７９、Ｔ１８２、Ｉ１９４、Ａ２０３、Ｇ２１３、Ｑ２２８およびそれらの組合せからなる群から選択される、少なくとも１つの突然変異を含む。特定の実施形態では、上記少なくとも１つの突然変異は、Ｔ５Ｉ、Ｓ１０Ｉ、Ｖ１５Ｍ、Ｓ９１Ｇ、Δ１２３、Ｓ１３１Ｙ、Ｎ１７９Ｙ、Ｔ１８２Ｓ、Ｉ１９４Ｍ、Ａ２０３Ｖ、Ｅ２１３Ｋ、Ｑ２２８Ｒおよびそれらの組合せを含む群から選択される、配列番号４中の突然変異に対応する突然変異を含む。その他の実施形態では、本発明の結合構築物は、変異体Ａ１１、Ａ２またはＣ５中に見られるものに対応する突然変異を含む。
特定の実施形態では、本発明は、ＶＬおよびＶＨドメインが、配列番号１０中に見られるものと実質的に同一であるミニボディーを提供する。一実施形態では、本発明のミニボディーは、配列番号１０のアミノ酸配列を含む。その他の実施形態では、ミニボディーは、配列番号１０と実質的に同一であるアミノ酸配列を含み、前記ミニボディーは、配列番号１０のミニボディーよりも高い親和性でＰＳＣＡと結合する。さらにその他の実施形態では、ミニボディーは、配列番号１０のアミノ酸に対応する残基に、Ｔ５、Ｓ１０、Ｖ１５、Ｓ９１、Ｓ１２３、Ｓ１３１、Ｎ１７９、Ｔ１８２、Ｉ１９４、Ａ２０３、Ｇ２１３、Ｑ２２８およびそれらの組合せを含む群から選択される、１つまたは複数の突然変異を含み得る。さらに別の実施形態では、上記構築物は、配列番号１１、１２および１３から選択される配列を含み得る。
一実施形態では、本発明は、選択される構築物が、抗ＰＳＣＡ抗体のＣＤＲ領域を含む、ミニボディー、ダイアボディー、ｓｃＦｖおよびｓｃＦｖ−Ｆｃからなる群から選択される抗原結合タンパク質構築物を提供する。一実施形態では、上記結合タンパク質構築物は、抗ＰＳＣＡ抗体に由来するＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２またはＣＤＲ−Ｈ３から選択される少なくとも１つのＣＤＲ領域を含む。さらにその他の実施形態では、タンパク質結合構築物は、３種の軽鎖ＣＤＲ領域のすべてまたは３種の重鎖ＣＤＲ領域のすべてを含み得る。一実施形態では、本発明のタンパク質結合構築物は、抗ＰＳＣＡ抗体のＣＤＲ領域のすべてを含み得る。特定の実施形態では、抗ＰＳＣＡ抗体は、２Ｂ３と表される抗体と同等以上の親和性でＰＳＣＡと結合する。その他の実施形態では、抗ＰＳＣＡ抗体は、親和性成熟抗体であり得、上記親和性成熟抗体は、ＰＳＣＡに対して、親抗体がなすよりも高い親和性を含む。特定の実施形態では、親の抗ＰＳＣＡ抗体は、１Ｇ８（ＡＴＣＣ番号ＨＢ−１２６１２）、２Ａ２（ＡＴＣＣ番号ＨＢ−１２０３）、２Ｈ９（ＡＴＣＣ番号ＨＢ−１２６１４）、３Ｃ５（ＡＴＣＣ番号ＨＢ−１２６１６）、３Ｅ６（ＡＴＣＣ番号ＨＢ１２６１８）、３Ｇ３（ＡＴＣＣ番号ＨＢ−１２６１５）、４Ａ１０（ＡＴＣＣ番号ＨＢ−１２６１７）および２Ｂ３からなる群から選択され得る。その他の実施形態では、ＣＤＲは、配列番号１０、１１、１２および１３中に見られるものから選択され得る。
「ミニボディー」とは、ヒンジ領域および免疫グロブリン分子のＣＨ３ドメインと融合している、天然抗体の重鎖可変（ＶＨ）および軽鎖可変（ＶＬ）鎖ドメインから構成される改変抗体構築物である（図１を参照のこと）。したがって、ミニボディーは、抗原結合領域と、二価分子への組み立てを可能にするＣＨ３ドメインと、ジスルフィド結合による二量化に適応するための抗体ヒンジとを保持し、かつ単一タンパク質鎖中にコードされる、完全（whole）抗体の小型版である。対照的に、天然抗体は、４つの鎖、すなわち、２つの重鎖および２つの軽鎖から構成される。ミニボディーの大きさ、結合価および親和性は、インビボターゲッティングに特に適している。細菌または哺乳類細胞における発現は、ミニボディーが単一アミノ酸鎖として産生され得るので単純化されている（米国特許第５，８３７，８２１号明細書を参照のこと）。この開示の全文を、特に、ミニボディー、その構造、その作製方法およびその適した医薬製剤に関して、本明細書に参照により組み込む。
「ダイアボディー」は、第１のポリペプチド鎖上の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および、それに連結されている重鎖（ＶＨ）可変ドメイン（ＶＨ−ＶＬ）（第１のポリペプチド鎖上のその２つのドメイン間で対形成するには短すぎるペプチドリンカーによって接続されている）を含む第１のポリペプチド鎖と、第２のポリペプチド鎖上の重鎖可変ドメインＶＨおよび、それに連結されている軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）（ＶＬ−ＶＨ）（第２のポリペプチド鎖上のその２つのドメイン間で対形成するには短すぎるペプチドリンカーによって接続されている）を含む第２のポリペプチド鎖とを含む。その短い結合が、第１および第２のポリペプチド鎖の相補的なドメイン間の鎖の対形成を推し進め、２つの機能的抗原結合部位を有する二量体分子の組み立てを促進する。
二重特異性ダイアボディーを構築するためには、異なる抗体（例えば、抗体Ａおよび抗体Ｂ）のＶ−ドメインを融合して、２種の鎖（例えば、ＶＨＡ−ＶＬＢ、ＶＨＢ−ＶＬＡ）を作製する。各鎖は、抗原との結合において不活性であるが、もう一方の鎖との対形成時に抗体ＡおよびＢの機能的抗原結合部位を再形成する。
前立腺、膀胱および膵臓の癌におけるＰＳＣＡおよびその発現は、その全文が参照により組み込まれる米国特許第６，７５６，０３６号明細書に開示されている。ヒトＰＳＣＡ翻訳アミノ酸配列は以下のとおりである：
MKAVLLALLMAGLALQPGTALLCYSCKAQVSNEDCLQV
ENCTQLGEQCWTARIRAVGLLTVISKGCSLNCVDDS
QDYYVGKKNITCCDTDLCNASGAHALQPAAAILALLPAL
GLLLWGPGQL
（配列番号１）
２種以上の核酸またはポリペプチド配列の関連で、用語「実質的に同一である」とは、以下に記載されるデフォルトパラメータを用いてＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ２．０配列比較アルゴリズムを使用して、または手作業でのアラインメントおよび目視検査によって測定されるような、比較ウィンドウもしくは指定された領域にわたる最大一致を求めて比較およびアラインされた場合に、参照される配列もしくは部分にわたって、同一であるか、または特定のパーセンテージの同一であるアミノ酸残基もしくはヌクレオチド（すなわち、約８０％の同一性、好ましくは、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の同一性）を有する２種以上の配列または部分配列を指す（例えば、ＮＣＢＩウェブサイトhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/などをを参照のこと）。この定義はまた、欠失および／または付加を有する配列ならびに置換を有するものを含む。配列同一性は、２種の参照されるドメイン間で少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％であることが好ましい。いくつかの実施形態では、配列の相違は、参照される配列またはドメインについて１、２、３または４または５〜１２個のアミノ酸だけである。以下に記載されるように、好ましいアルゴリズムは、ギャップなどを説明することができる。同一性は、少なくとも約１５個のアミノ酸またはヌクレオチドの長さである領域にわたって存在することが好ましく、１５〜５０個のアミノ酸またはヌクレオチドの長さである領域にわたって存在することがより好ましい。その他の実施形態では、同一性は、少なくとも約５０、１００、１５０、２００個以上のアミノ酸である領域にわたって存在し得る。
配列比較のためには、通常、１つの配列が、それに対して試験配列が比較される参照配列として作用する。配列比較アルゴリズムを使用する場合には、試験配列および参照配列をコンピュータに入力し、必要に応じて、部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。デフォルトプログラムパラメータを使用してもよく、代替パラメータを指定してもよいことが好ましい。次いで、プログラムパラメータに基づいて、配列比較アルゴリズムによって、参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを計算する。
本明細書において使用する場合、「比較ウィンドウ」とは、特定の範囲の残基にわたって選択される任意の数の隣接する位置のセグメント（例えば、２０〜５０個、通常、約５０〜約２００個、より通常は、約１００〜約１５０個）を参照することを含み、ここで、ある配列は、同数の隣接する位置の参照配列と、最適にアラインされた後に比較され得る。比較のための配列のアラインメントの方法は、当技術分野で周知である。比較のための配列の最適アラインメントは、例えば、Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)の局所相同性アルゴリズムによって、Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970)の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988)の類似性検索法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行（Wisconsin遺伝子ソフトウェアパッケージ、Genetics Computer Group、575 Science Dr., Madison, WIの、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）によって、または手作業でのアラインメントおよび目視検査によって（例えば、Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1995 supplement)を参照のこと）実施できる。
配列同一性および配列類似性パーセントを決定するために適しているアルゴリズムの好ましい例として、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムがあり、これらは、それぞれ、Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402 (1977)およびAltschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)に記載されている。ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ ２．０は、本明細書に記載されるパラメータを用いて使用され、本発明の核酸およびタンパク質の配列同一性パーセントを決定する。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、全米バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information）（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を介して公的に入手可能である。このアルゴリズムは、まず、データベース配列中の同じ長さのワードとアラインした場合に、マッチするか、何らかの正の値の閾値スコアＴを満たす、クエリー配列中の長さＷの短いワードを同定することによってハイスコアリング配列対（high scoring sequence pair）（ＨＳＰ）を同定すること含む。Ｔは、隣接ワードスコア閾値（neighborhood word score threshold）と呼ばれる（Altschul et al.,前掲）。これらの初期隣接ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見出すための検索を開始するための種として作用する。累積アラインメントスコアが増大され得る限り、ワードヒットを各配列に沿って両方向に伸長する。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメータＭ（マッチする残基の対に対するリワードスコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチする残基に対するペナルティースコア；常に＜０）を使用して算出する。アミノ酸配列については、スコアリングマトリックスを用いて累積スコアを算出する。各方向へのワードヒットの伸長は、累積アラインメントスコアが、その最大に達成された値から量Ｘだけ低下する；累積スコアが、１個または複数の負にスコアリングする残基アラインメントの蓄積のためにゼロ以下になる；または、いずれかの配列の末端に達する時点で停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、ＴおよびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列に対して）は、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列に対しては、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、ワード長３および期待値（Ｅ）１０およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 (1989)を参照のこと）アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両鎖の比較を使用する。
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書において同義的に使用され、アミノ酸残基のポリマーを意味する。この用語は、１個または複数のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工的化学模倣物であるアミノ酸ポリマー、ならびに、天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび天然に存在しないアミノ酸ポリマーに適用する。
アミノ酸は、本明細書において、そのよく知られている三文字記号によって、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢバイオケミカル命名委員会（Biochemical Nomenclature Commission）によって推奨される一文字記号のいずれかによって呼ばれ得る。同様に、ヌクレオチドも、その一般に受け入れられた一文字コードによって呼ばれ得る。
アミノ酸配列については、当業者ならば、コードされる配列中の単一のアミノ酸または小さなパーセンテージのアミノ酸を変更、付加または欠失する、核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質配列への個々の置換、欠失または付加は、その改変により、あるアミノ酸が化学的に同様のアミノ酸によって置換される「保存的に改変された変異体」であることを認識するであろう。機能的に同様のアミノ酸を提供する保存的置換表は、当技術分野で周知である。このような保存的に改変された変異体は、本発明の多型変異体、種間相同体および対立遺伝子に加えて存在し、かつこれらを除外しない。
以下の８群は、各々、互いに保存的置換であるアミノ酸を含む：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；および８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Creighton, Proteins (1984)を参照のこと）。
「標識」または「検出可能な部分」または「検出可能なマーカー」とは、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、化学的またはその他の物理的手段によって検出可能な組成物である。例えば、有用な標識として、３２Ｐ、蛍光色素、電子密度試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡにおいてよく用いられる）、ビオチン、ジゴキシゲニンまたはハプテンおよび例えば、ペプチドに放射標識を組み込むことによって検出可能にされ得る、またはペプチドと特異的に反応する抗体を検出するために使用されるタンパク質が挙げられる。
「抗体」とは、抗原と特異的に結合し、それを認識する免疫グロブリン遺伝子またはその断片に由来するフレームワーク領域を含むポリペプチドを意味する。認識される免疫グロブリン遺伝子は、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロンおよびミュー定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。軽鎖は、カッパまたはラムダのいずれかとして分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタまたはイプシロンとして分類され、これらは、次いで、免疫グロブリンクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥをそれぞれ規定する。一般に、抗体の抗原−結合領域は、結合の特異性および親和性において最も重要であろう。
１つの例示的免疫グロブリン（抗体）構造単位は、四量体を含む。各四量体は、ポリペプチド鎖の２つの同一の対からなり、各対は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤ）および１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤ）を有する。各鎖のＮ末端は、主に抗原認識に関与する、約１００〜１１０またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を規定する。用語可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）とは、これらの軽鎖および重鎖をそれぞれ意味する。
抗体は、例えば、完全免疫グロブリンとして、または種々のペプチダーゼを用いる消化によって生じたいくつかの十分に特性決定された断片として存在する。したがって、例えば、ペプシンは、抗体をヒンジ領域中のジスルフィド結合の下で消化し、ジスルフィド結合によってＶＨ−ＣＨ１と接続している軽鎖であるＦａｂの二量体、Ｆ（ａｂ）’２を生成する。Ｆ（ａｂ）’２は、穏やかな条件下で還元されて、ヒンジ領域中のジスルフィド結合を分解し、それによって、Ｆ（ａｂ）’２二量体がＦａｂ’単量体に変換し得る。Ｆａｂ’単量体は、本質的には、ヒンジ領域の一部を含むＦａｂである（Fundamental Immunology、Paul編、第3版、1993を参照のこと）。完全抗体の消化の観点から種々の抗体断片が定義されているが、当業者には当然のことながら、そのような断片は、化学的に、または組換えＤＮＡ法を使用することによってデノボ合成してもよい。したがって、用語「抗体」とはまた、本明細書において、全抗体の改変によって生じた抗体断片、または組換えＤＮＡ法を使用してデノボ合成されたもの（例えば、単鎖Ｆｖ）またはファージディスプレイライブラリーを使用して同定されたもの（例えば、McCafferty et al., Nature 348: 552-554 (1990)を参照のこと）のいずれかを含む。
本発明の適した抗体または構築物の調製のために、また、本発明に従う使用のために、例えば、組換え、モノクローナルまたはポリクローナル抗体、当技術分野で公知の多数の技術を使用してよい（特に、ミニボディーおよびダイアボディー設計に関して、その全文が、各々、参照により組み込まれる、米国特許出願公開第２００７０１９６２７４号および同２００５０１６３７８２号明細書を参照のこと）（例えば、Kohler & Milstein, Nature 256: 495-497 (1975); Kozbor et al., Immunology Today 4: 72 (1983); Cole et al., pp. 77-96 in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985); Coligan, Current Protocols in Immunology (1991); Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (1988)；およびGoding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (第2版、1986)を参照のこと）。注目する抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子を、細胞からクローニングしてもよく、例えば、モノクローナル抗体をコードする遺伝子を、ハイブリドーマからクローニングし、組換えモノクローナル抗体を製造するために使用してもよい。モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子ライブラリーはまた、ハイブリドーマまたは形質細胞から作製してもよい。重鎖および軽鎖遺伝子産物の無作為組合せによって、異なる抗原特異性を有する抗体の大きなプールが生じる（例えば、Kuby, Immunology (第3版、1997)を参照のこと）。単鎖抗体または組換え抗体の製造のための技術（米国特許第４，９４６，７７８号、同４，８１６，５６７号明細書）を適応させて、本発明のポリペプチドに対する抗体を製造してもよい。また、ヒト化またはヒト抗体を発現するために、トランスジェニックマウスまたはその他の哺乳類などのその他の生物を使用してもよい（例えば、米国特許第５，５４５，８０７号；同５，５４５，８０６号；同５，５６９，８２５号；同５，６２５，１２６号；同５，６３３，４２５号；同５，６６１，０１６号明細書、Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14: 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826 (1996)；およびLonberg & Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995)を参照のこと）。あるいは、ファージディスプレイ技術を使用して、選択された抗原と特異的に結合する抗体およびヘテロマーＦａｂ断片を同定してもよい（例えば、McCafferty et al., Nature 348: 552-554 (1990); Marks et al., Biotechnology 10: 779-783 (1992)を参照のこと）。抗体はまた、二重特異性にすることができる、すなわち、２種の異なる抗原を認識できる（例えば、国際公開第９３／０８８２９号パンフレット、Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655-3659 (1991)；およびSuresh et al., Methods in Enzymology 121: 210 (1986)を参照のこと）。抗体はまた、ヘテロコンジュゲート、例えば、２種の共有結合によって結合している抗体または免疫毒素であってもよい（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号明細書、国際公開第９１／００３６０号；同第９２／２００３７３号パンフレット；および欧州特許第０３０８９号明細書を参照のこと）。
本発明の抗体は、修飾されている、すなわち、抗体への任意の種類の分子の共有結合によって修飾されている誘導体を含む。例えば、抗体誘導体として、限定するものではないが、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／遮断基による誘導体化、タンパク質分解切断、細胞性リガンドまたはその他のタンパク質との結合などによって改変されている抗体が挙げられる。多数の化学修飾はいずれも、公知の技術、例えば、それだけには限らないが、特異的化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などによって実施してよい。さらに、誘導体は１個以上の非天然アミノ酸を含み得る。
非ヒト抗体をヒト化または霊長類化（primatizing）する方法は、当技術分野で周知である。通常、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源からそれに導入された、１個または複数のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、インポート残基と呼ばれることが多く、これは、通常、インポート可変ドメインから取り込まれる。ヒト化は、本質的に、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者の方法に従って（例えば、Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239: 1534-1536(1988)およびPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992)を参照のこと）、げっ歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列を、ヒト抗体の対応する配列と置換することによって実施してよい。したがって、このようなヒト化抗体は、キメラ抗体であり（米国特許第４，８１６，５６７号明細書）、これでは、実質的に、完全ヒト可変ドメイン未満のものが、非ヒト種に由来する対応する配列によって置換されている。実際には、ヒト化抗体は、通常、いくつかのＣＤＲ残基およびおそらくはいくつかのＦＲ残基が、げっ歯類抗体中の類似部位に由来する残基によって置換されているヒト抗体である。
「キメラ抗体」とは、（ａ）抗原結合部位（可変領域）が、異なるもしくは変更されたクラス、エフェクター機能および／もしくは種の定常領域、またはキメラ抗体に新規特性を付与する全く異なる分子、例えば、酵素、毒素、ホルモン、増殖因子、薬剤などと結合されるよう、定常領域またはその一部が変更、置換または交換されている、あるいは（ｂ）可変領域またはその一部が、異なるもしくは変更された抗原特異性を有する可変領域で、変更、置換または交換されている抗体分子である。本発明の、および本発明に従って使用するために好ましい抗体として、ヒト化および／またはキメラモノクローナル抗体が挙げられる。
いくつかの実施形態では、抗体は、「エフェクター」部分とコンジュゲートされている。エフェクター部分は、放射性標識または蛍光標識などの標識部分を含めた任意の数の分子であり得、または治療用部分であり得る。一態様では、抗体は、タンパク質の活性を調節する。このようなエフェクター部分として、それだけには限らないが、抗腫瘍薬、毒素、放射性薬剤、サイトカイン、二次抗体または酵素が挙げられる。さらに、本発明は、本発明の抗体が、プロドラッグを細胞傷害性薬剤に変換する酵素と連結している実施形態を提供する。
エフェクター部分を、ＰＳＣＡ陽性細胞、特に、ＰＣＳＡタンパク質を過剰発現する細胞にターゲッティングするために、免疫複合体を使用してもよい。このような相違は、試験サンプルおよび対照サンプルを用いて、ほぼ同様にロードされるゲルのバンドを見ると容易に理解できる。細胞傷害性薬剤の例として、それだけには限らないが、リシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、タキソール、エチジウム（ethiduim）ブロマイド、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ジヒドロキシアントラシンジオン、アクチノマイシンＤ、ジフテリア（diphteria）毒素、シュードモナス外毒素（ＰＥ）Ａ、ＰＥ４０、アブリンおよびグルココルチコイドおよびその他の化学療法薬、ならびに放射性同位元素が挙げられる。適した検出可能なマーカーとして、それだけには限らないが、放射性同位元素、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤または酵素が挙げられる。
いくつかの実施形態では、本発明は、単独で、またはエフェクター部分とコンジュゲートしている場合に、癌（例えば、前立腺、膵臓または膀胱癌）を処置するために全身に使用される抗原結合タンパク質構築物を提供する。リシンなどの毒性物質とコンジュゲートしているＰＳＣＡをターゲッティングする構築物ならびにコンジュゲートしていない抗体は、ＰＳＣＡを保有する癌細胞を天然にターゲッティングする有用な治療薬であり得る。このような構築物は、侵襲性を妨げるのに有用であり得る。
さらに、本発明の抗原結合性タンパク質構築物を使用して、癌を処置できる。このような状況では、構築物を治療活性を有する第２のタンパク質または毒性分子の少なくとも１種の機能的に活性な部分と結合する。第２のタンパク質として、それだけには限らないが、酵素、リンホカイン、オンコスタチンまたは毒素を挙げることができる。適した毒素として、ドキソルビシン、ダウノルビシン、タキソール、エチジウム（ethiduim）ブロマイド、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ジヒドロキシアントラシンジオン、アクチノマイシンＤ、ジフテリア（diphteria）毒素、シュードモナス外毒素（ＰＥ）Ａ、ＰＥ４０、リシン、アブリン、グルココルチコイドおよび放射性同位元素が挙げられる。
治療薬を本発明の構築物とコンジュゲートする技術は、周知である（例えば、「Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy」、Reisfeldら(編)中の、Arnonら、「Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy」、pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985);「Controlled Drug Delivery」(第2版)、Robinsonら(編)中の、Hellstromら、「Antibodies For Drug Delivery」、pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987);「Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications」、Pincheraら(編)中の、Thorpe、「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review」、pp. 475-506 (1985)；およびThorpe et al., 「The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates」, Immunol. Rev., 62: 119-58 (1982)を参照のこと）。
本発明のタンパク質またはペプチドまたは構築物を言及する際の、抗体と「特異的に（または選択的に）結合する」または「特異的に（または選択的に）免疫反応性の」なる語句は、多くはタンパク質およびその他の生物学的物質の不均一な集団中のタンパク質の存在を決定するような結合反応を意味する。したがって、指定されたイムノアッセイ条件下で、指定された抗体は、バックグラウンドの少なくとも２倍、より典型的には、バックグラウンドの１０〜１００倍を超えて特定のタンパク質と結合する。このような条件下での抗体との特異的結合には、構築物が、特定のタンパク質に対するその特異性について選択される必要がある。種々のイムノアッセイ形式を使用して、ＰＳＣＡと特異的に免疫反応する構築物を選択することができる。例えば、タンパク質と特異的に免疫反応する抗体を選択するために、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイがルーチン的に使用されている（例えば、特異的免疫反応性を調べるために使用できるイムノアッセイ形式および条件の説明については、Harlow & Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual (1998)を参照のこと）。
本明細書において、「治療上有効な用量または量」とは、投与する目的の効果を生じる用量を意味する。正確な用量および処方は、治療の目的に応じて変わり、公知の技術を使用して当業者によって確定可能である（例えば、Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, Gennaro, Editor (2003)およびPickar, Dosage Calculations (1999)を参照のこと）。
用語「医薬上許容される塩」または「医薬上許容される担体」とは、本明細書に記載される化合物上に見られる特定の置換基に応じて、比較的非毒性の酸または塩基を用いて調製される活性化合物の塩を含むものとする。本発明の化合物が、比較的酸性の官能基を含む場合は、ニートなまたは適した不活性溶媒中のいずれかで、このような化合物の中間の形態（neutral form）を、十分な量の所望の塩基と接触させることによって塩基付加塩を得ることができる。医薬上許容される塩基付加塩の例として、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム、有機アミノまたはマグネシウム塩または同様の塩が挙げられる。本発明の化合物が比較的塩基性の官能基を含む場合には、ニートなまたは適した不活性溶媒中のいずれかで、このような化合物の中間の形態を、十分な量の所望の酸と接触させることによって、酸付加塩を得ることができる。医薬上許容される酸付加塩の例として、塩酸、臭化水素酸、硝酸、炭酸、一水素炭酸（monohydrogencarbonic）、リン酸、一水素リン酸（monohydrogenphosphoric）、二水素リン酸（dihydrogenphosphoric）、硫酸、一水素硫酸（monohydrogensulfuric）、ヨウ化水素酸または亜リン酸などのような無機酸からの塩、ならびに酢酸、プロピオン酸、イソ酪酸、マレイン酸、マロン酸、安息香酸、コハク酸、スベリン酸、フマル酸、乳酸、マンデル酸、フタル酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トリルスルホン酸、クエン酸、酒石酸、メタンスルホン酸などのような比較的非毒性の有機酸からの塩が挙げられる。また、アルギン酸（arginate）などといったアミノ酸の塩およびグルクロン酸またはガラクツロン酸（galactunoric acid）などのような有機酸の塩も含まれる（例えば、Berge et al., Journal of Pharmaceutical Science 66: 1-19 (1977)を参照のこと）。本発明の特定の具体的な化合物は、化合物が塩基または酸付加塩のいずれかに変換されることを可能にする塩基性および酸性官能基の両方を含有する。当業者に公知のその他の医薬上許容される担体が、本発明に適している。
中間の形態の化合物は、塩を塩基または酸と接触させることと、従来法で親化合物を単離することとによって再生され得る。化合物の親の形態は、特定の物理的特性、例えば、極性溶媒における可溶性において、種々の塩の形態とは異なるが、その他の点では、塩は、本発明の目的上、化合物の親の形態と同等である。
上記方法は、ＰＳＣＡを過剰発現する癌、例えば、前立腺、膵臓および膀胱癌の診断、予後および処置において特に適用される。特定の実施形態では、方法は、ホルモン不応性癌または治療抵抗性癌に適用される。特定の実施形態では、方法は転移性癌に適用される。
処置は、通常、有効用量で、静脈注射（ＩＶ）などの許容される投与経路による構築物およびその免疫複合体の反復投与を含む。投与量は、当業者によって一般に理解されている種々の因子、例えば、制限するものではないが、癌の種類および癌の重篤度、グレードまたはステージ、使用される薬剤の結合親和性および半減期、所望の定常状態抗体濃度レベル、処置の頻度および本発明の処置法と組み合わせて使用される化学療法薬の影響に応じて変わる。通常の１日用量は、約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。１週間あたり１０〜５００ｍｇの範囲の構築物またはその免疫複合体の用量が有効であり得、耐用性良好であるが、さらに高い１週間用量も適当かつ／または耐用性良好であり得る。適当な用量の規定における主要な決定要因は、特定の関連で治療上有効であるのに必要な特定の薬剤の量である。腫瘍阻害または退縮を達成するために反復投与が必要である場合もある。初期負荷用量は、より高いものであってもよい。初期負荷用量は、注入として投与してよい。定期的維持量は、初期用量が耐用性良好であるならば、同様に投与してよい。
構築物の直接投与もまた可能であり、特定の関連では利点を有し得る。例えば、膀胱癌腫の治療には、薬剤を、膀胱中に直接注射してもよい。
別の実施形態では、本発明は、本発明の抗体およびその断片をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。一実施形態では、本発明は、本発明の抗体またはその断片をコードする発現ベクターを提供する。別の実施形態では、本発明は、遺伝子療法において、またはインビボ投与において使用するための本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドを提供する。
「核酸」とは、一本鎖または二本鎖いずれかの形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそれらのポリマーならびにそれらの相補体を指す。この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有し、参照ヌクレオチドと同様に代謝される、合成である、天然に生じる、天然に生じない、既知ヌクレオチド類似体または修飾された基本骨格残基または結合を含有する核酸を包含する。このような類似体の例として、制限するものではないが、ホスホロチオエート、ホスホラミデート、メチルホスホネート、キラル−メチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられる。
特に断りのない限り、特定の核酸配列も、その保存的に改変された変異体（例えば、縮重コドン置換）および相補配列、ならびに明示的に示される配列を暗黙的に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１つまたは複数の選択された（またはすべての）コドンの第３の位置が、混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を作製することによって達成され得る（Batzer et al., Nucleic Acids Res. 19: 5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260: 2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8: 91-98 (1994)）。用語「核酸」は、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドと同義的に使用される。
投与方法および製剤方法
構築物は、静脈内投与などの公知の方法を踏まえて、例えば、ボーラスとして、または一定時間にわたる持続注入によって、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内（intracerobrospinal）、皮下、関節内、滑液包内、くも膜下腔内、経口、局所または吸入経路によって被験体に投与される。静脈内または皮下投与が好ましい。投与は、局所であっても、全身であってもよい。
投与のための組成物は、医薬上許容される担体、好ましくは、水性担体に溶解した本明細書に記載される薬剤を含むことが多い。種々の水性担体、例えば、緩衝生理食塩水などを使用してよい。これらの溶液は、無菌であり、通常、望ましくない物質を含まない。これらの組成物は、従来の、周知の滅菌技術によって滅菌してよい。組成物は、生理学的条件に近づけるために、必要に応じて、例えば、ｐＨ調整剤および緩衝剤、毒性調整剤など、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム塩などの医薬上許容される補助物質を含有し得る。これらの製剤中の活性薬剤の濃度は、広く変化し得、選択される特定の投与様式および患者の要求に従って、液量、粘度、体重などに主に基づいて選択される。
したがって、静脈内投与用の通常の医薬組成物は、薬剤に従って変わる。非経口的に投与可能な組成物の実際の調製方法は、当業者に公知であるか、明らかであり、「Remington's Pharmaceutical Science」、第15版、Mack Publishing Company、Easton、Pa. (1980)などの刊行物に、より詳細に記載されている。
本医薬組成物は、投与方法に応じて種々の単位投与形で投与してよい。例えば、経口投与に適した単位投与形として、それだけには限らないが、散剤、錠剤、丸剤、カプセル剤およびロゼンジ剤が挙げられる。構築物は、経口投与される場合には、消化から保護されるべきであると認識される。これは、通常、分子を組成物と複合体形成し、それらを酸性および酵素的加水分解に対して耐性にすることによって、または分子を適切に耐性の担体、例えば、リポソームまたは保護バリアにパッケージングすることのいずれかによって達成される。薬剤を消化から保護する手段は、当技術分野で周知である。
医薬製剤、特に、本発明とともに使用するための構築物および免疫複合体および阻害剤は、所望の純度を有する構築物を、所望の医薬上許容される担体、賦形剤または安定剤と混合することによって調製できる。そのような製剤は、凍結乾燥製剤または水溶液であり得る。許容される担体、賦形剤または安定剤は、使用される投与量および濃度で、レシピエントに対して非毒性である。許容される担体、賦形剤または安定剤は、酢酸、リン酸、クエン酸およびその他の有機酸；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸）、保存料低分子量ポリペプチド；血清アルブミンもしくはゼラチンなどのタンパク質またはポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；およびアミノ酸、単糖類、二糖類およびその他の炭水化物、例えば、グルコース、マンノースまたはデキストリン；キレート化剤；ならびにイオン性および非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート）；塩形成性対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；および／または非イオン性界面活性剤であり得る。構築物は、０．５〜２００ｍｇ／ｍｌの間または１０〜５０ｍｇ／ｍｌの間の濃度で製剤してよい。
上記製剤はまた、さらなる活性化合物、例えば、化学療法薬、細胞傷害性薬剤、サイトカイン、増殖阻害剤および抗ホルモン剤を提供し得る。有効成分はまた、持続放出製剤（例えば、固体疎水性ポリマー（例えば、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド）の半透性マトリックスとして調製してもよい。抗体およびイムノコンジュゲートはまた、例えば、コアセルベーション技術によって、または界面重合によって調製されたマイクロカプセル中に、例えば、コロイド薬物デリバリーシステム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子およびナノカプセル）において、またはマクロエマルションにおいて、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセル中に、およびポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル中に封入してもよい。
上記組成物は、治療的処置または予防的処置のために投与してもよい。治療的適用では、組成物を、疾患（例えば、癌）を患っている患者に、「治療上有効な用量」で投与する。この用途のために有効な量は、疾患の重篤度および患者の健康の全身状態に応じて変わる。患者に必要とされ、耐容される投与量および頻度に応じて、単回または複数回投与の組成物を投与してもよい。本発明の目的上、「患者」または「被験体」とは、ヒトおよびその他の動物、特に、哺乳類の両方を含む。したがって、方法は、ヒトの処置および獣医適用の両方に適用できる。好ましい実施形態では、患者は哺乳類、好ましくは、霊長類であり、最も好ましい実施形態では、患者はヒトである。その他の公知の癌治療を、本発明の方法と組み合わせて使用してもよい。例えば、本発明に従って使用するための組成物を使用して、細胞をターゲッティングするか、または５ＦＵ、ビンブラスチン、アクチノマイシンＤ、シスプラチン、メトトレキサートなどといったその他の癌治療薬に対して感作させてもよい。
その他の実施形態では、本発明の方法は、その他の癌治療（例えば、前立腺全摘除術）、放射線療法（外部ビームまたは近接照射療法）、ホルモン治療（例えば、精巣摘出術、テストステロン産生を抑制するためのＬＨＲＨ−類似体治療、抗アンドロゲン療法）または化学療法と一緒に実施してよい。前立腺全摘除術は、前立腺全体およびいくらかの周囲組織の除去を含む。この治療は、癌が組織を越えて広がっていないと考えられる場合によく使用される。放射線療法は、まだ前立腺に限定されているか、隣接する組織に広がっている前立腺癌を治療するためによく使用される。疾患がより進行性である場合には、腫瘍の大きさを減少させるために放射線を使用する場合もある。ホルモン療法は、前立腺癌が前立腺を越えて広がった、または再発した患者に使用されることが多い。ホルモン療法の目的は、男性ホルモン、アンドロゲンのレベルを低下させ、それによって、前立腺癌を収縮させるか、より低速で増殖させる。黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）アゴニストは、テストステロンの産生を減少させる。これらの薬剤は、毎月、またはそれより長い間隔で注射してもよい。２種のこのような類似体として、ロイプロリドおよびゴセレリンがある。抗アンドロゲン（例えば、フルタミド、ビカルタミドおよびニルタミド）も使用してよい。全アンドロゲン遮断とは、精巣摘出術またはＬＨＲＨ類似体と組み合わせた抗アンドロゲンの使用を意味し、ｓ組合せが呼ばれる。化学療法は、前立腺癌が前立腺の外側に広がっており、ホルモン療法が失敗している患者にとっての選択肢である。癌細胞のすべてを破壊することは期待されないが、腫瘍増殖を低速にし、疼痛を低減し得る。ホルモン療法を用いる処置後に回復または継続して増殖し、広がった前立腺癌を治療するのに使用されるいくつかの化学療法薬として、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、エストラムスチン、エトポシド、ミトキサントロン、ビンブラスチンおよびパクリタキセルが挙げられる。癌細胞が化学療法に対して耐性になる可能性を低減するために、２種以上の薬剤を一緒に投与することも多い。小さい細胞癌腫は、ホルモン療法よりも化学療法に応じる可能性がより高い、稀な種類の前立腺癌である。
併用投与は、別個の製剤または単一の医薬製剤を使用する同時投与、および両（またはすべての）活性薬剤がその生物活性を同時に発揮する期間があることが好ましい、いずれかの順序での逐次投与を意図する。
選択した化合物を単独またはその他の適した成分と組み合わせて、吸入によって投与されるようエアゾール製剤に製造してもよい（すなわち、それらを「霧状にし」てもよい）。エアゾール製剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などといった加圧された許容される噴霧剤中に入れてもよい。
非経口投与、例えば、関節内（関節中）、静脈内、筋肉内、腫瘍内、皮内、腹腔内および皮下経路による投与などに適した製剤として、抗酸化剤、バッファー、静菌薬、および製剤を意図されるレシピエントの血液と等張にする溶質、を含み得る水性および非水性の等張性滅菌注射溶液、ならびに、懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤および保存料、を含み得る水性および非水性の滅菌懸濁液が挙げられる。本発明の実施では、組成物を、例えば、静脈内注入によって、経口的に、局所的に、腹腔内に、膀胱内にまたはくも膜下腔内に投与してよい。非経口投与、経口投与および静脈内投与は、好ましい投与方法である。化合物の製剤は、アンプルおよびバイアルなどの単位用量または複数回用量密閉容器中にて提供してもよい。
注射溶液および懸濁液は、先に記載した種類の滅菌散剤、顆粒剤および錠剤から調製できる。また、エキソビボ治療のために核酸によって形質導入された細胞を、上記のように静脈内に、または非経口的に投与してもよい。
医薬品は、単位投与形であることが好ましい。このような形態では、製剤は、適当な量の活性成分を含有する単位用量に細分割される。単位投与形は、パッケージされた製剤、個別量の製剤を含有するパッケージ、例えば、バイアルまたはアンプル中のパッケージングされた錠剤、カプセル剤および散剤であり得る。また、単位投与形は、カプセル剤、錠剤、カシェ剤またはロゼンジ剤自体であり得、または、パッケージングされた形態の適当な数のこれらのいずれかであり得る。組成物は、必要に応じて、その他の適合する治療薬も含み得る。
好ましい医薬品は、１種または複数の本発明の構築物を、所望により、持続放出製剤中で、１種または複数の化学療法薬または免疫療法薬と組み合わせてデリバリーする。構築物は、その他の細胞傷害性癌治療、例えば、化学療法、放射線療法、免疫療法およびホルモン療法に対する腫瘍細胞の感受性を増大させる感作剤として治療的に投与してもよい。
癌の処置のための治療的使用では、本発明の製薬法において使用される構築物は、１日、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１０００ｍｇ／ｋｇの初期投与量で投与される。約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇまたは約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇまたは約１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇまたは約１０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの１日用量範囲を使用してよい。しかし、投与量は、患者の必要条件、治療されている状態の重篤度および使用されている化合物に応じて変わり得る。例えば、投与量は、特定の患者において診断された癌の種類およびステージを考慮して経験的に決定することができる。本発明との関連で、患者に投与される用量は、患者において長い時間をかけて、有益な治療反応を達成するのに十分でなくてはならない。特定の状況にとっての適切な投与量の決定は、医師の技術の範囲内にある。通常、処置は、化合物の最適用量より少ない、より少量の投与量を用いて開始される。したがって、投与量を、状況下で最適な効果が達せられるまで少しずつ増やして増大する。便宜上、総１日投与量を、必要に応じて、分割し、１日の間に部分で投与してもよい。
本発明に従って使用するための医薬品は、通常、ヒトおよび非ヒト哺乳類を含めた哺乳類にデリバリーされる。本方法を使用して処置される非ヒト哺乳類として、家畜化動物（すなわち、イヌ、ネコ、マウス、げっ歯類およびウサギ目）および農業用動物（ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ）が挙げられる。
腫瘍画像化法
特定の実施形態では、本発明は、本発明の抗体の投与によって、インビボで癌細胞または腫瘍を画像化する方法を提供する。一実施形態では、本発明は、インビボで癌細胞を画像化する方法を提供し、この方法は、哺乳類に標識された抗ＰＳＣＡ抗体を投与することおよびインビボで抗体を画像化することを含む。本発明の方法を使用して、哺乳類、例えば、限定するものではないが、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ブタ、ヒトなどにおいて癌細胞を画像化することができる。
インビボ画像化法は、当技術分野で周知であり、限定するものではないが、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、核磁気共鳴（ＮＭＲ）（R. Weissleder, 1999, Radiology 212: 609-14）、コンピュータ断層撮影（ＣＡＴ）スキャン、冷却電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラ光学画像化（Honigman, et al., 2001 Mol. Ther. 4: 239-249）、生物発光光学画像化（P R Contag, et al., 1998 Nat. Med. 4: 245-247）、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）（M E Phelps, 1991 Neurochemical Research 16: 929-994; J G Tjuvajev, et al., 1998 Cancer Res 58: 4333-4341）、単一光子放射コンピュータ断層撮影法（J G. Tjuvajev, et al., 1996 Cancer Res. 45: 4087-4095）、マイクロＰＥＴ（McVeigh, 2006, Circ. Res. 98: 879-86に概説される）などが挙げられる。
以下の実施例は、特許請求される本発明を、制限するのではなく例示するために提示する。
［実施例１］
本実施例は、突然変異体ｓｃＦｖ酵母ディスプレイライブラリーの構築およびＰＳＣＡ結合親和性が改善されたＳｃＦｖ突然変異体の選択を記載する。
ライブラリーの構築において使用されるオリゴヌクレオチドおよびベクターとして、以下が挙げられる；ギャップ５’：5'-TTAAGCTTCTGCAGGCTAGTG-3'（配列番号２）；ギャップ３’：5'-GAGACCGAGGAGAGGGTTAGG-3'（配列番号３）；ｐＹＤ２内側ＮｃｏＩ−Ｎｏｔ１制限部位（Razai A, et al. J Mol Biol. 2005; 35 1: 1 58）。
まず、２Ｂ３ ＳｃＦｖ遺伝子を、ＮｃｏＩ−Ｎｏｔ１制限部位を使用して酵母ディスプレイベクターｐＹＤ２（Razai A, et al. J Mol. Biol. 2005; 351: 158）にクローニングした。正しい配列を有する細菌クローンを増幅し、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐを用いてＤＮＡを抽出した。以下のとおりにエラープローンＰＣＲを使用して２Ｂ３ Ｓｃｆｖ遺伝子にランダム突然変異を導入した：２Ｂ３ ＳｃＦｖ遺伝子を、１００ｍＭ ＭｎＣｌ２の存在下でＴａｑを用いる２０サイクルのＰＣＲに供し、ランダム突然変異を作製した。ＰＣＲ産物をアガロースゲルに流し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出を使用して精製した。精製したＰＣＲ産物を、プルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼを使用して３５サイクルの間再度増幅させた。ギャップ５’およびギャップ３’プライマーを用いて両ＰＣＲを実施した。増幅した２Ｂ３ Ｆｖ遺伝子を、再度アガロースゲルに流し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出を使用して精製した。突然変異したｓｃＦｖ遺伝子およびＮｃｏＩ−Ｎｏｔ１消化したｐＹＤ２を使用して、ギャップ修復によってＬｉＡｃ処理ＥＢＹ１００細胞を形質転換した。得られた遺伝子レパートリーを、ギャップ修復を使用してｐＹＤ２にクローニングして５．９×ｌ０５ 個の形質転換体のライブラリーを作製した。形質転換混合物をＳＤ−ＣＡＡで培養し、継代培養した。ライブラリーの大きさは、形質転換混合物の段階希釈をＳＤ−ＣＡＡプレートにプレーティングすることによって決定した。
選択のために、ＳＧ−ＣＡＡ培地およびゼオシンにおいて、２０℃で２４時間培養することによって、ｓｃＦｖディスプレイを誘導した。第１ラウンドの選択のために、２０００万個の酵母（ライブラリーサイズの３０倍を超える）を洗浄し、ＦＡＣＳバッファー（リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）、０．５％ウシ血清アルブミン）に再懸濁し、これに２００ｎＭのＰＳＣＡヒトγ１融合タンパク質を加え、室温で１時間インキュベートした。ラウンド２、３および４のソーティングために使用したＰＳＣＡヒトγ１の濃度は、それぞれ、５ｎＭ、２ｎＭおよび１ｎＭであった。細胞を、二次抗体とともに４℃で３０分間インキュベートし、ＦＡＣＳバッファーで１回洗浄し、２００〜５００μｌのＦＡＣＳバッファーに再懸濁し、ＦＡＣＳＡｒｉａでソートした。通常、１％のＰＳＣＡ結合集団にゲートをかけて収集した。収集した細胞をＳＤ−ＣＡＡ培地で増殖させ、ＳＧ−ＣＡＡにおいて誘導した後、次のソーティングのラウンドに使用した。４回目のラウンドから２０個の酵母クローンをフローサイトメトリーによって分析した。強力な染色を示すこれらのクローンのうち８個を選択し（Ａ２、Ａ４、Ａ８、Ａ９、Ａ１１、Ａ１２、Ｂ５およびＣ５）、そのＤＮＡを配列決定した。Ａ２、Ａ４、Ａ８、Ａ９、Ａ１２、Ｂ５タンパク質配列を１０の突然変異に関して同定した。Ａ１１が６つの突然変異を有し、Ｃ５は４つの突然変異を有していた。親の２Ｂ３ ＳｃＦｖと、Ａ２、Ａ１１およびＣ５のタンパク質配列比較が、図２に示されている。
［実施例２］
この実施例は、突然変異体２Ｂ３ ｓｃＦｖのミニボディーへの再編成を記載する。
親２Ｂ３ミニボディーｐＥＥ１２構築物（図２）を基本骨格として使用して、野生型ＳｃＦｖ挿入断片が、３種の２Ｂ３ ＳｃＦｖ親和性変異体の各々で置換されている３種の２Ｂ３ミニボディー親和性変異体を作製した。図１に親２Ｂ３ミニボディー構築物が示されている。手短には、ＶＬおよびＶＨ領域を、１５残基長のＧｌｙ−ＳｅｒリッチリンカーとＶＬ−ＶＨ方向にて融合させた。このＳｃＦｖを、上流にてシグナルペプチドと、および下流にて１０残基のＧｌｙＳｅｒペプチドリンカーを含むヒトＩｇＧ１ヒンジを介してヒトＩｇＧ１ＣＨ３ドメインと隣接させる。最終産物を、発現のＰＥＥ１２ベクターにクローニングした（Lonza Biologics、Slough、UK）。このベクターは、ｈＣＭＶプロモーターおよび選択のためのグルタミンシンセターゼ遺伝子を含む（Bebbington et al., Biotechnology (N Y). 1992; 10: 169）。親２Ｂ３ミニボディーｐＥＥ１２構築物をバックボーンとして使用して、３種の２Ｂ３ミニボディー親和性変異体を作製した。親ｐＥＥ１２ ＤＮＡをＸｂａＩおよびＸｈｏＩ制限部位で消化し、３種の２Ｂ３ ＳｃＦｖ親和性変異体の各々で置換された親２Ｂ３ ＳｃＦｖ挿入断片を除去した。伸長ＰＣＲによって、ｐＥＥ１２へのサブクローニングのためにＸｂａＩ−ＸｈｏＩ制限部位を２Ｂ３ ＳｃＦｖ親和性変異体の末端に加えた。
［実施例３］
この実施例では、抗ＰＳＣＡミニボディーの発現、選択および精製を記載する。
合計２×１０６個のＮＳ０マウス骨髄腫細胞を、記載されるように（Yazaki PJ, et al. J Immunol Methods. 2001; 253: 195）、１０μｇの直線化（ＳａｌＩで切断した）ベクターＤＮＡを用い、エレクトロポレーションによってトランスフェクトし、グルタミン欠乏培地で選択した。クローンをＥＬＩＳＡによって発現についてスクリーニングし、それによって、所望のタンパク質をヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）によって獲得し、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）コンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）によって検出した（両方とも、Jackson ImmunoResearch Labs、West Grove、PA製）。最大に産生するクローンを増殖させ、最終培養に移した。
可溶性ミニボディーを、分取Ｐｏｒｏｓ５０Ａカラム（Applied Biosystems、Foster City、CA）を備え、インラインＵＶモニターを備えたＴｈｅｒｍａｌ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ＨＰＬＣを使用して、タンパク質Ｌクロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した（図３）。４種のミニボディーが同様の結果を示した。すべてのミニボディーが、非還元条件下で約９５ｋＤａの分子量種として移動し、すべて良好な純度を示した。さらに、Ａ１１ミニボディーは、較正されたサイズ排除カラムで実施した場合に、予想されるとおり２９．５分で溶出した（図４）。上清を１０×５０ｍｍカラムにロードし、０．１ＭグリシンｐＨ２．５を使用して溶出し、２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣ１ ｐＨ８を用いてｐＨを直ちに中性にした。次いで、精製されたタンパク質を、分子多孔質メンブレンチューブ（ｍｗｃｏ：３０，０００）を使用してＰＢＳに対して透析し、Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ Ｖｉｖａｓｐｉｎ２０（ｍｗｃｏ：３０，０００）を用いて濃縮した。最終タンパク質濃度は、親のマウス抗体を標準として使用し、２８０ｎｍでのＵＶ吸光度を測定することによって求めた。
この実施例は、抗ＰＳＣＡミニボディーの生化学的特性決定を記載する。
［実施例４］
大きさおよび組成：精製したタンパク質を、非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した（図３）。天然の構造的大きさを、サイズ排除カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５）（Pharmacia）によって決定した。
競合ＥＬＩＳＡおよびフローサイトメトリーによって４種のミニボディーの順位を決定した（図５）。競合ＥＬＩＳＡによって測定される相対的親和性は、３種の親和性変異体のすべてが、親よりも高い親和性を有し、親と比較して、Ａ２、Ａ１１およびＣ５それぞれについて、４．４×、３．０×および１．９×改善されたことを示した。フローサイトメトリーデータもまた、細胞表面に発現されたＰＳＣＡをターゲッティングした場合に、同じ順序での４種のミニボディーの順位付けをもたらした。結論として、４種のミニボディーの親和性順位は以下のとおりであった：Ａ２＞Ａ１１＞Ｃ５＞親。
競合ＥＬＩＳＡ：ミニボディーのＰＳＣＡ相対的結合親和性を、マイクロタイタープレートウェルを精製ＰＳＣＡ−Ｆｃでコーティングした競合ＥＬＩＳＡによって決定した（Olafsen T, et al. J. Immunotheray 2007: 30: 396）。
フローサイトメトリー：細胞ＰＳＣＡ結合活性を評価するために実施した。ＰＳＣＡを用いて安定にトランスフェクトされたＥＢＶ形質転換Ｂ細胞リンパ腫細胞株を使用した。手短には、細胞５×１０'個を、２μｇ／ｍｌの濃度のミニボディー１００μｌとともに氷上で３０分間インキュベートした。細胞を洗浄し、１：１００希釈したヤギ抗ｈＦｃ ＰＥコンジュゲート抗体を用いて染色した。
放射性ヨウ素化：先に記載されたように、精製したミニボディーを、Advanced Nuclide Technologies、Indianapolis、INによって提供された陽電子放出同位元素ｌ２４Ｉ（０．０２Ｍ ＮａＯＨ中ヨウ化ナトリウム；放射性核種純度＞９９％）を用いて放射性ヨウ素化した（Kenanova, Olafsen et al., Cancer Res. 65: 622, 2005）。免疫反応は、放射性ヨウ素化したミニボディーを、過剰量のＳＫＷ−ＰＳＣＡ＋細胞とともに室温で１時間インキュベートし、細胞を遠心分離し、対照と比較して上清中に存在する放射能をカウントすることによってアッセイした。
［実施例５］
この実施例は、抗ＰＳＣＡミニボディーのマイクロＰＥＴ画像化および生体内分布研究を記載する。
すべての動物研究は、カリフォルニア大学、ロサンジェルス校の学長の（Chancellor's）動物研究委員会（Animal Research Committee）によって承認されたプロトコール下で実施した。異種移植片は、７〜８週齢の雄のヌードマウス（Charles River Laboratories、Wilmington、MA）において肩の領域に２×１０６個のＬＡＰＣＰ ＡＤ細胞を皮下注射接種することによって確立した。１４日後、腫瘍質量が１００〜３００ｍｇの範囲である時点で、１００μＣｉの同位元素ｌ２４Ｉ（３０〜５０μｇのタンパク質）を各動物の尾静脈中に注射した。マウスをＰ４マイクロＰＥＴスキャナー（Concorde Microsystems， Inc.、Knoxville、TN）を使用して画像化した。画像化を可能にするために、２％イソフルランを使用してマウスを麻酔し、マイクロＰＥＴスキャナーの長軸に沿って腹臥位におき、画像化した。獲得時間は、１０分とし（１ベッド位置）、フィルタ補正逆投影再構築アルゴリズムを使用して画像を再構築した。画像がディスプレイされ、目的の領域（ＲＯＩ）が図６に示すように描かれ、ＡＭＩＤＥ（Loening and Gambhir, Molecular Imaging 2: 13 1, 2003）によって定量化された。スキャニング後、腫瘍、肝臓、脾臓、腎臓、肺および血液を摘出し、秤量し、ウェルカウンター（Cobra II AutoGamma、Packard、IL）でカウントした。バックグラウンド、クロスオーバーおよび減衰補正を実施した。結果は、組織１グラム当たりの注射した用量のパーセンテージとして算出した（％ ＩＤ／ｇ）。
腫瘍ターゲッティングおよびマイクロＰＥＴ画像化効率を評価するために、１２４Ｉ標識ミニボディーを、右肩にＬＡＰＣ−９ＡＤ腫瘍を保持するヌードマウスに注射した。２１時間および／または２５時間に全身マイクロ（mico）ＰＥＴおよびＣＴスキャンを実施し、その後、動物を屠殺し、γカウンターを使用して種々の組織における活性を定量化した。マイクロＰＥＴ画像化を定量化するために、腫瘍において４種の３次元ＲＯＩを描き、腫瘍周辺の軟組織中の４種のその他のＲＯＩが図６に提示されている。ＲＯＩ位置および大きさは、ＣＴ画像情報を基にした。体内分布および画像化定量化の両方とも、バックグラウンドに対する腫瘍シグナルの比として表される。Ａ１１ミニボディーは、３種の親和性変異体を比較した実験において最良の体内分布および画像化データを示した（図７Ａ）。したがって、３種の親和性変異体ミニボディーの、親和性順位（図５）およびインビボ腫瘍ターゲッティング／画像化順位（図７Ａ）は異なっており、このことは、本発明者らのモデルでは、インビボ腫瘍ターゲッティング／画像化有効性は、単に、トレーサーの、その標的に対する固有の親和性に依存するものではないということを示唆する。ＰＳＣＡに対して最良の親和性を有するＡ２は、最良のインビボ腫瘍ターゲッティング／画像化結果を示さなかった。この不一致についての１つの可能性ある説明は、Ａ２は、ＶＬ ＣＤＲ２中にアスパラギンのチロシンへの置換を有し、この新しいチロシンのヨウ素化が、ＰＳＣＡとの結合に影響を及ぼし得るということである。第２の実験では、Ａ１１ミニボディーを、そのインビボ腫瘍ターゲッティング／画像化効率について親のミニボディーと比較した。Ａ１１は、腫瘍ターゲッティングにおける２０％の増大（ｎ＝３）およびマイクロＰＥＴ腫瘍画像化における１４１％の増大（ｎ＝２）を示した（図７Ｂ）。
［実施例６］
この実施例は、抗ＰＳＣＡミニボディーを使用した種々の膵臓癌腫瘍の画像化を記載する。
親和性成熟抗ＰＳＣＡミニボディーのターゲッティングおよび画像化能力を評価するために、１２４Ｉ標識したミニボディー（親の２Ｂ３および変異体Ａ１１）を、低レベルの標的ＰＳＣＡ抗原を発現する腫瘍を保持する胸腺欠損ヌードマウスに注射した。手短には、ヒトＣａｐａｎ−１（図１４）またはヒトＭＩＡ ＰａＣａ−２（図１５）膵臓腫瘍（pancreactic tumors）のいずれかを保持する異種移植マウスに、２００または３００μｇいずれかの標識された抗ＰＳＣＡミニボディーを注射した。先と同様に全身マイクロ（mico）ＰＥＴおよびＣＴスキャンを実施し、組織放射能を測定した。同様に、実施例５におけるとおりに、マイクロＰＥＴ画像化の定量化ならびにＲＯＩ位置および大きさを決定した。
図１４および１５において見ることができるように、変異体Ａ１１抗ＰＳＣＡマイクロボディーは、親の２Ｂ３ミニボディーと比較して、筋肉に対する腫瘍の特異性の比についての改善を一貫して示した。インビボ特異性のほぼ２倍の増大は、これらの変異体ミニボディーが、既存の抗ＰＳＣＡ抗体よりも、治療的ターゲッティングおよび腫瘍画像化における使用に、より良好に適合することを示唆する。特に、Ｃａｐａｎ−１およびＨＰＡＦ−１１における腫瘍取り込み（示されていないデータ）は、およそ２％であり、ＭＩＡ ＰａＣａ−２腫瘍では１％未満であり、このことは特異的取り込みを示唆するものである。
関連技術：
１）Sundaresan, G., Yazaki, P. J., Shively, J. E., Finn, R. D., Larson, S. M., Raubitschek, A. A., Williams, L. E., Chatziioannou, A. F., Gambhir, S. S., and Wu, A. M. (2003) Iodine-1 24 labeled engineered anti-CEA minibodies and diabodies allow highcontrast, antigen-specific small-animal PET imaging of xenografts in athymic mice. J, Nucl. Med., 44: 1962-1969。
２）Olafsen, T., Gu, Z., Sherman, M. A., Leyton, J. V., Witkosky, M. E., Shively, J. E., Raubitschek, A. A., Morrison, S. L., Wu, A. M. and Reiter, R. E. (2007) Targeting, imaging, and therapy using a humanized anti-prostate stem cell antigen (PSCA) antibody. J. lmmunotherapy 30: 396-405。
３）Leyton, J. V., Olafsen, T., Sherman, M. A., Reiter, R. E., and Wu, A. M. Anti-prostate stem cell antigen (PSCA) antibody fragments for PET imaging of prostate cancer (abstract). Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals 21 : 391, 2006。
本明細書に記載される実施例および実施形態は単に例示を目的とすること、およびそれらを踏まえた種々の改変または変法が当業者に示唆されるであろうこと、そしてそれらも本出願の精神および範囲ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれるべきであることを理解されたい。本明細書に引用される、すべての刊行物、特許および特許出願は、これにより、本開示内容と対応する範囲について、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるものとする。

Claims (18)

  1. ａ）配列番号６の配列、
    ｂ）配列番号７の配列、
    ｃ）配列番号１１の配列、または
    ｄ）配列番号１２の配列、
    を含む、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ；配列番号１）に特異的に結合する抗原結合タンパク質。
  2. ａ）治療薬とコンジュゲートしているか、または
    ｂ）検出可能マーカーで標識されている、
    請求項１記載の抗原結合タンパク質。
  3. 治療薬が細胞傷害性薬、放射性同位元素またはプロドラッグである、請求項２記載の抗原結合タンパク質。
  4. 細胞傷害性薬剤が、リシン、リシンＡ鎖、ドキソルビシン、ダウノルビシン、タキソール、エチジウムブロマイド、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ジヒドロキシアントラシンジオン、アクチノマイシンＤ、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素（ＰＥ）Ａ、ＰＥ４０、アブリン、アルブリンＡ鎖、モデクシンＡ鎖、α−サルシン、ゲロニン、ミトゲリン、レトストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、クリシン、クロチン、カリケアマイシン、サパオナリアオフィシナリスインヒビター、マイタンシノイド類およびグルココルチコイドリシンからなる群から選択される、請求項３記載の抗原結合タンパク質。
  5. 放射性同位元素が、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、９０Ｙおよび１８６Ｒｅからなる群から選択される、請求項３記載の抗原結合タンパク質。
  6. 検出可能マーカーが、放射性同位元素、蛍光化合物、生物発光化合物、金属キレート剤、酵素、および１２４Ｉからなる群から選択される、請求項２記載の抗原結合タンパク質。
  7. 請求項１記載の抗原結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
  8. インビボで非ヒト哺乳動物における癌細胞を画像化する方法であって、請求項１または２記載の抗原結合タンパク質を対象に投与し、該抗原結合タンパク質を検出し、それにより、癌細胞を画像化することを含む方法。
  9. 抗原結合タンパク質が磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、コンピュータ断層撮影（ＣＡＴ）スキャン、冷却電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラ光学画像化、生物発光光学画像化、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）、単一光子放射コンピュータ断層撮影法、またはマイクロＰＥＴによって検出される、請求項８記載の方法。
  10. 前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）タンパク質を発現する前立腺癌細胞の増殖を阻害する方法であって、前記癌細胞を、前記癌細胞の増殖を阻害するのに有効な量の請求項１記載の抗原結合タンパク質と接触させることを含む方法において使用するための、請求項１記載の抗原結合タンパク質。
  11. （ａ）該方法が前立腺癌細胞を死滅させるための方法であり、
    （ｂ）該抗原結合タンパク質が、アミノ酸位置２２のロイシンで始まり、アミノ酸位置９９のアラニンで終了する配列番号２に示されるＰＳＣＡタンパク質を認識および結合し、
    （ｃ）該方法が、該細胞に化学療法薬を投与することをさらに含み、または
    （ｄ）該方法が、該細胞に放射線療法を施すことをさらに含む、
    請求項１０記載の使用のための抗原結合タンパク質。
  12. 該方法が前立腺、膀胱または膵臓癌に罹患している患者を処置するための方法である、請求項１０または１１記載の使用のための抗原結合タンパク質。
  13. 該方法がホルモンアブレーション療法またはホルモンアンタゴニスト療法を患者に施すことを含む、請求項１２記載の使用のための抗原結合タンパク質。
  14. （ａ）該抗原結合タンパク質を患者に静脈内、腹腔内、筋内、腫瘍内または皮内投与するか、または
    （ｂ）該抗原結合タンパク質を直接、前立腺癌、膀胱癌、膵臓癌、またはその転移中に投与する
    ことを含む、請求項１３記載の使用のための抗原結合タンパク質。
  15. 癌細胞を検出する方法において使用するための、請求項２記載の抗原結合タンパク質。
  16. 対象における前立腺、膀胱または膵臓癌の処置または検出において使用するための、請求項１記載の抗原結合タンパク質。
  17. 請求項１記載の抗原結合タンパク質と、医薬上許容される賦形剤、担体または安定剤とを含む医薬組成物。
  18. 凍結乾燥製剤または水溶液である、請求項１７に記載の医薬組成物。
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