TW202021618A - 抗ｉｌ１ｒａｐ抗體及其使用方法 - Google Patents

抗ｉｌ１ｒａｐ抗體及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本發明提供結合蛋白，諸如抗體及抗原結合片段，其與人類介白素-1受體輔助蛋白(hu-IL1RAP)特異性結合且完全阻斷IL-1、IL-33及IL-36細胞內信號傳導途徑。亦提供包括此類結合蛋白之組合物及此類結合蛋白之製造及使用方法。

Description

抗IL1RAP抗體及其使用方法 【交叉引用】
本申請案主張2018年8月17日申請之美國臨時專利申請案第62/719,397號的優先權，所述美國臨時專利申請案出於所有目的以引用之方式併入本文中。
本發明大體上關於與介白素-1受體輔助蛋白結合之結合蛋白，諸如抗體及抗原結合片段，及此類結合蛋白之使用方法。
【參考序列表】
序列表之正式複本以ASCII格式的正文檔案經由EFS-Web與說明書同時提交，其中檔案名稱為「09402-002US1_SeqListing_ST25.txt」，創建日期為2019年7月15日，且大小為180,859個位元組。經由EFS-Web申請之序列表為說明書之一部分且以全文引用之方式併入本文中。
細胞介素配體及受體之介白素-1(IL-1)家族與發炎、自體免疫、免疫調節、細胞增殖及宿主防禦相關，且對發炎、自體免疫、免疫調節、退化性及細胞增殖性(例如，癌症)疾病及病症之病理學有幫助，且其細胞介素及受體充當此類疾病及病症之病原性介體。參見例如Garlanda等人，《免疫(Immunity)》,39：1003-1018(2013)。
IL-1家族之細胞介素包含介白素-1阿爾法(IL-1阿爾法或IL-1a 或IL-1α)、介白素-1貝他(IL-1β或IL-1b)、介白素-33(IL-33)、介白素-36阿爾法(IL-36阿爾法或IL-36α)、介白素-36貝他(IL-36β或IL-36b)及介白素-36伽瑪(IL-36伽瑪或IL-36γ)。此等細胞介素中之每一者充當能夠結合在某些細胞之表面上表現的特異性IL-1家族細胞膜受體的配體。在IL-1家族細胞介素與其同源受體結合時，募集輔受體以形成包括細胞介素、其同源膜受體及其輔受體之三元複合物。所得三元複合物促進細胞內信號轉導及包含NF-κB及AP-1的一組轉錄因子及促***原活化蛋白激酶之活化，其觸發發炎及免疫反應之級聯，包含大量細胞介素、趨化介素、酶及黏著分子之產生。
介白素-1受體輔助蛋白(IL1RAP)充當IL-1家族中之若干受體的共同細胞膜輔受體，包含介白素-1受體1(IL1R1)、ST2(亦稱為類介白素-1受體1或IL1RL1)及類介白素-1受體2(IL1RL2)。IL1RAP為由上述IL-1家族細胞介素中之一者、細胞介素之特異性同源受體及IL1RAP輔受體形成之三元信號傳導複合物的必需組分。因此，IL1RAP在IL-1家族信號轉導途徑中起重要作用，因為其為促進由IL-1家族細胞介素IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β及IL-36γ刺激之特定下游信號傳導途徑所需的。
WO2012098407A1係有關包括諸如抗體之對IL1RAP具有特異性之結合部分的藥劑，其用於誘導細胞死亡及/或抑制與表現IL1RAP之實體腫瘤相關的細胞之生長及/或增殖。WO2012098407A1揭示一種針對人類IL1RAP之小鼠IgG2a單株抗體「mAb 81.2」，其在活體內投與時引起黑色素瘤小鼠模型中之腫瘤生長的統計顯著延遲。
WO2015132602A1係有關對人類IL1RAP具有特異性之抗體及其治療實體腫瘤之用途。WO2015132602A1揭示一種特異性小鼠衍生之抗體「CAN04」，其與人類IL1RAP之結構域2以200pM之KD特異性結合，與食蟹獼猴IL1RAP交叉反應，能夠在一或多個癌細胞株(諸如CML)中誘導ADCC， 且對由IL-1α、IL-1β及IL-33刺激之信號傳導具有一些抑制作用。
WO2016020502A1揭示兩種特異性小鼠衍生之抗體「CAN01」及「CAN03」，其與人類IL1RAP之結構域3分別以1.4及0.9nM之KD特異性結合，與食蟹獼猴IL1RAP交叉反應，且能夠在一或多個癌細胞株(諸如CML)中誘導ADCC。確定CAN03對由IL-1α、IL-1β及IL-33刺激之信號傳導具有一些抑制作用，然而發現CAN01對IL-1α、IL-1β及IL-33信號傳導沒有明顯的抑制作用。
WO2016207304A1係有關兔衍生之抗體，其特異性結合人類IL-1RAcP且對由IL-1α、IL-1β、IL-33及/或IL-36β刺激之NFkB活性具有一些抑制作用。
WO2017191325A9係有關人類化IgG1抗體，其特異性結合人類IL-1R3且對由IL-1α、IL-1β、IL-33及/或IL-36β刺激之NFkB活性具有一些抑制作用。
仍然需要用以治療、改善或預防與細胞介素配體及受體之IL-1家族相關之發炎、自體免疫、免疫調節、退化性及細胞增殖性疾病或病症的療法。本發明滿足此等需求及其他需求。
本發明提供以高親和力特異性結合人類IL1RAP之抗體。所述抗體能夠降低、抑制及/或完全阻斷IL-1、IL-33及/或IL-36信號傳導途徑，包含藉由以下促效劑中之一或多者之結合刺激的信號傳導：IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β及IL-36γ。本發明亦提供治療響應於IL-1、IL-33及/或IL-36信號傳導之抑制的疾病及病狀之方法。
在一些實施例中，本發明提供一種抗IL1RAP抗體，其包括(i) 第一輕鏈高變區(HVR-L1)、第二輕鏈高變區(HVR-L2)及第三輕鏈高變區(HVR-L3)，及/或(ii)第一重鏈高變區(HVR-H1)、第二重鏈高變區(HVR-H2)及第三重鏈高變區(HVR-H3)，其中：(a)HVR-L1包括胺基酸序列RASENIXXNXX(SEQ ID NO：10)，其中在位置7處之X為Y或W，在位置8處之X為S、H、K、L、M、N、Q、R或Y，在位置10處之X為L、A、G、I、M、N、Q、S、T、V或Y，且在位置11處之X為A、G、N、S或T；(b)HVR-L2包括胺基酸序列GXXNXAD(SEQ ID NO：36)，其中在位置2處之X為A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y，在位置3處之X為K、G或N，且在位置5處之X為L、F、H、W或Y；(c)HVR-L3包括胺基酸序列XXFXTXPRT(SEQ ID NO：62)，其中在位置1處之X為Q或S，在位置2處之X為H或S，在位置4處之X為W、A、F、G、H、I、K、L、M、V或Y，且在位置6處之X為T、I或V；(d)HVR-H1包括胺基酸序列XXXXXXX(SEQ ID NO：77)，其中在位置1處之X為F、A、D、E、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、W或Y，在位置2處之X為S、E、G、K、P、Q、R或T，在位置3處之X為N、D、E、G、K、Q或R，在位置4處之X為Y、A、D、E、H、S或V，在位置5處之X為A、N或S，在位置6處之X為M、V或W，且在位置7處之X為S或G；(e)HVR-H2包括胺基酸序列TXXXXXXXXYXLXDVKG(SEQ ID NO：140)，其中在位置2處之X為V、A、N或S，在位置3處之X為T或S，在位置4處之X為E、D、N、T或V，在位置5處之X為G、I、P、T或V，在位置6處之X為G、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y，在位置7處之X為D、A、E、G、H、K、N、P、Q、R或S，在位置8處之X為Y或W，在位置9處之X為N、A、G、P或R，在位置11處之X為C、 A、D、F、R、S、T、V或Y，且在位置13處之X為D、S或W；(f)HVR-H3包括胺基酸序列XXDXXPYFXDY(SEQ ID NO：202)，其中在位置1處之X為A、G、S或T，在位置2處之X為H、I、L、M、N、Q或V，在位置4處之X為R、A、D、E、I、M、N、Q或S，在位置5處之X為W或F，且在位置9處之X為F、L、M或W。
在一些實施例中，本發明提供一種抗IL1RAP抗體，其包括(i)第一輕鏈高變區(HVR-L1)、第二輕鏈高變區(HVR-L2)及第三輕鏈高變區(HVR-L3)及/或(ii)第一重鏈高變區(HVR-H1)、第二重鏈高變區(HVR-H2)及第三重鏈高變區(HVR-H3)，其中：(a)HVR-L1包括選自SEQ ID NO：11-35之胺基酸序列；(b)HVR-L2包括選自SEQ ID NO：37-61之胺基酸序列；(c)HVR-L3包括選自SEQ ID NO：63-76之胺基酸序列；(d)HVR-H1包括選自SEQ ID NO：78-120之胺基酸序列；(e)HVR-H2包括選自SEQ ID NO：141-201之胺基酸序列；(f)HVR-H3包括選自SEQ ID NO：203-225之胺基酸序列。
在一些實施例中，本發明提供一種抗IL1RAP抗體，其包括(i)第一輕鏈高變區(HVR-L1)、第二輕鏈高變區(HVR-L2)及第三輕鏈高變區(HVR-L3)及/或(ii)第一重鏈高變區(HVR-H1)、第二重鏈高變區(HVR-H2)及第三重鏈高變區(HVR-H3)，其中：(a)HVR-L1包括SEQ ID NO：11之胺基酸序列；(b)HVR-L2包括SEQ ID NO：37之胺基酸序列；(c)HVR-L3包括SEQ ID NO：63之胺基酸序列；(d)HVR-H1包括SEQ ID NO：78之胺基酸序列；(e)HVR-H2包括選自SEQ ID NO：141、184、185、186、187、188、189、190及191之胺基酸序列；(f)HVR-H3包括SEQ ID NO：203之胺基酸序列。
在一些實施例中，本發明提供一種抗IL1RAP抗體，其包括(i)第一輕鏈高變區(HVR-L1)、第二輕鏈高變區(HVR-L2)及第三輕鏈高變區 (HVR-L3)及/或(ii)第一重鏈高變區(HVR-H1)、第二重鏈高變區(HVR-H2)及第三重鏈高變區(HVR-H3)，其中：(a)HVR-L1包括選自SEQ ID NO：11、13及23之胺基酸序列；(b)HVR-L2包括選自SEQ ID NO：37、38、45、49、54及61之胺基酸序列；(c)HVR-L3包括選自SEQ ID NO：63、67、69、70、71、75及76之胺基酸序列；(d)HVR-H1包括選自SEQ ID NO：78、81、90、92及118之胺基酸序列；(e)HVR-H2包括選自SEQ ID NO：141、144、149、153、172、181、191、194、195、196、197、198、199、200及201之胺基酸序列；(f)HVR-H3包括選自SEQ ID NO：203、214、215、220及222之胺基酸序列。
在一些實施例中，本發明之抗IL1RAP抗體包括互補決定區CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，其中：(a)CDR-L1包括胺基酸序列RASENIXXNXX(SEQ ID NO：10)，其中在位置7處之X為Y或W，在位置8處之X為S、H、K、L、M、N、Q、R或Y，在位置10處之X為L、A、G、I、M、N、Q、S、T、V或Y，且在位置11處之X為A、G、N、S或T；(b)CDR-L2包括胺基酸序列GXXNXAD(SEQ ID NO：36)，其中在位置2處之X為A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y，在位置3處之X為K、G或N，且在位置5處之X為L、F、H、W或Y；(c)CDR-L3包括胺基酸序列XXFXTXPRT(SEQ ID NO：62)，其中在位置1處之X為Q或S，在位置2處之X為H或S，在位置4處之X為W、A、F、G、H、I、K、L、M、V或Y，且在位置6處之X為T、I或V；(d)CDR-H1包括胺基酸序列XXXXX(SEQ ID NO：121)，其中在位置1處之X為N、D、E、G、K、Q或R，在位置2處之X為Y、A、D、E、H、S或V，在位置3處之X為A、N或S，在位置4處之X為M、V或W，且在位 置5處之X為S或G；(e)CDR-H2包括胺基酸序列TXXXXXXXXYXLXDVKG(SEQ ID NO：140)，其中在位置2處之X為V、A、N或S，在位置3處之X為T或S，在位置4處之X為E、D、N、T或V，在位置5處之X為G、I、P、T或V，在位置6處之X為G、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y，在位置7處之X為D、A、E、G、H、K、N、P、Q、R或S，在位置8處之X為Y或W，在位置9處之X為N、A、G、P或R，在位置11處之X為C、A、D、F、R、S、T、V或Y，且在位置13處之X為D、S或W；(f)CDR-H3包括胺基酸序列DXXPYFXDY(SEQ ID NO：226)，其中在位置2處之X為R、A、D、E、I、M、N、Q或S，在位置3處之X為W或F，且在位置7處之X為F、L、M或W。
在一些實施例中，本發明之抗IL1RAP抗體包括互補決定區CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，其中：(a)CDR-L1包括選自SEQ ID NO：11-35之胺基酸序列；(b)CDR-L2包括選自SEQ ID NO：37-61之胺基酸序列；(c)CDR-L3包括選自SEQ ID NO：63-76之胺基酸序列；(d)CDR-H1包括選自SEQ ID NO：122-139之胺基酸序列；(e)CDR-H2包括選自SEQ ID NO：141-201之胺基酸序列；(f)CDR-H3包括選自SEQ ID NO：227-239之胺基酸序列。
在一些實施例中，本發明之抗IL1RAP抗體包括與選自SEQ ID NO：257、258或259之序列具有至少90%一致性的輕鏈可變結構域(VL)胺基酸序列；及/或與選自SEQ ID NO：279、285或290之序列具有至少90%一致性的重鏈可變結構域(VH)胺基酸序列。在一些實施例中，所述抗體包括選自SEQ ID NO：257-278之輕鏈可變結構域(VL)胺基酸序列。在一些實施例中，所述抗體包括選自SEQ ID NO：279-310之重鏈可變結構域(VH)胺基酸序列。
在一些實施例中，本發明提供一種抗IL1RAP抗體，其中所述抗體包括：SEQ ID NO：259之輕鏈可變結構域(VL)胺基酸序列及SEQ ID NO：290之重鏈可變結構域(VH)胺基酸序列；SEQ ID NO：268之輕鏈可變結構域(VL)胺基酸序列及SEQ ID NO：307之重鏈可變結構域(VH)胺基酸序列；SEQ ID NO：268之輕鏈可變結構域(VL)胺基酸序列及SEQ ID NO：298之重鏈可變結構域(VH)胺基酸序列；SEQ ID NO：269之輕鏈可變結構域(VL)胺基酸序列及SEQ ID NO：307之重鏈可變結構域(VH)胺基酸序列；SEQ ID NO：269之輕鏈可變結構域(VL)胺基酸序列及SEQ ID NO：298之重鏈可變結構域(VH)胺基酸序列；SEQ ID NO：269之輕鏈可變結構域(VL)胺基酸序列及SEQ ID NO：297之重鏈可變結構域(VH)胺基酸序列；SEQ ID NO：270之輕鏈可變結構域(VL)胺基酸序列及SEQ ID NO：307之重鏈可變結構域(VH)胺基酸序列；或SEQ ID NO：270之輕鏈可變結構域(VL)胺基酸序列及SEQ ID NO：298之重鏈可變結構域(VH)胺基酸序列。
在一些實施例中，本發明之抗IL1RAP抗體包括與選自SEQ ID NO：328、329、330或331之序列具有至少90%一致性的輕鏈(LC)胺基酸序列；及/或與選自SEQ ID NO：332、333、334、335或336之序列具有至少90%一致性的重鏈(HC)胺基酸序列。在一些實施例中，所述抗體包括選自SEQ ID NO：328-331之輕鏈(LC)胺基酸序列。在一些實施例中，所述抗體包括選自SEQ ID NO：332-336之重鏈(HC)胺基酸序列。
在一些實施例中，本發明提供一種抗IL1RAP抗體，其中所述抗體包括：SEQ ID NO：328之輕鏈(LC)胺基酸序列及SEQ ID NO：332之重鏈(HC)胺基酸序列；SEQ ID NO：329之輕鏈(LC)胺基酸序列及SEQ ID NO：335之重鏈(HC)胺基酸序列；SEQ ID NO：329之輕鏈(LC)胺基酸序列及SEQ ID NO：336之重鏈(HC)胺基酸序列；SEQ ID NO：329之輕鏈(LC)胺基酸序列及SEQ ID NO：333之重鏈(HC)胺基酸序列；SEQ ID NO：329之輕鏈(LC)胺基酸序列及SEQ ID NO：334之重鏈(HC)胺基酸序列；SEQ ID NO：330之輕鏈(LC)胺基酸序列及SEQ ID NO：335之重鏈(HC)胺基酸序列；SEQ ID NO：330之輕鏈(LC)胺基酸序列及SEQ ID NO：336之重鏈(HC)胺基酸序列；SEQ ID NO：330之輕鏈(LC)胺基酸序列及SEQ ID NO：333之重鏈(HC)胺基酸序列；SEQ ID NO：330之輕鏈(LC)胺基酸序列及SEQ ID NO：334之重鏈(HC)胺基酸序列；SEQ ID NO：331之輕鏈(LC)胺基酸序列及SEQ ID NO：335之重鏈(HC)胺基酸序列；SEQ ID NO：331之輕鏈(LC)胺基酸序列及SEQ ID NO：336之重鏈(HC)胺基酸序列； SEQ ID NO：331之輕鏈(LC)胺基酸序列及SEQ ID NO：333之重鏈(HC)胺基酸序列；或SEQ ID NO：331之輕鏈(LC)胺基酸序列及SEQ ID NO：334之重鏈(HC)胺基酸序列。
在本發明所提供之抗IL1RAP抗體之各種實施例中，所述抗體之特徵在於以下特性中之一或多者：(a)所述抗體以1×10-8M或更小、1×10-9M或更小、1×10-10M或更小或1×10-11M或更小之結合親和力與人類IL1RAP結合；視情況，其中所述結合親和力藉由與SEQ ID NO：3之hu-M-IL1RAP多肽的平衡解離常數(KD)來量測；(b)所述抗體使IL-1刺激的信號、IL-33刺激的信號及/或IL-36刺激的信號減少至少90%、至少95%、至少99%或100%；視情況，其中信號之所述減少藉由基於細胞之阻斷分析來量測；視情況，其中IL-1、IL-33及/或IL-36刺激的信號係藉由選自IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β及IL-36γ之促效劑刺激的；視情況，其中在約EC50之促效劑濃度下，所述抗體具有10nM或更小、5nM或更小或1nM或更小之IC50；(c)所述抗體使由與其同源受體結合之IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β及IL-36γ促效劑中之一或多者引發的細胞內信號減少至少90%、至少95%、至少99%或100%；視情況，其中細胞內信號之所述減少藉由基於細胞之阻斷分析來量測；視情況，其中在約EC50之IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β及/或IL-36γ濃度下，所述抗體以10nM或更小、5nM或更小或1nM之IC50減少由促效劑引發之細胞內信號；(d)所述抗體抑制IL8從初代人類肺纖維母細胞(PHLF)之由IL-1α、IL-1β及/或IL-36β刺激之釋放；視情況，其中在約EC50之IL-1α、IL-1β及/或IL-36β濃度下，所述抗體具有10nM或更小、5nM或更小、或1nM或更小之IC50； (e)所述抗體抑制IL6從初代人類單核球之由IL-1β刺激之釋放；視情況，其中在約EC50之IL-1β濃度下，所述抗體具有10nM或更小、5nM或更小、或1nM或更小之IC50；(f)所述抗體抑制INF-γ從人類自然殺手(NK)細胞之由IL-33刺激之釋放；視情況，其中在約EC50之IL-33濃度下，所述抗體具有10nM或更小、5nM或更小、或1nM或更小之IC50；(g)所述抗體抑制IL8從人類表皮角質細胞(HEKn)之由IL-36β刺激之釋放；視情況，其中在約EC60之IL-36β濃度下，所述抗體具有10nM或更小、5nM或更小、或2nM或更小之IC50；(h)所述抗體抑制嗜鹼性球中之由IL-33刺激之磷酸化；視情況，其中在約EC56之IL-33濃度下，所述抗體具有75nM或更小、50nM或更小、或45nM或更小之IC50；(i)所述抗體抑制INF-γ從CD4+ T細胞之由IL-33刺激之釋放；視情況，其中在約EC34之IL-33濃度下，所述抗體具有75nM或更小、50nM或更小、或45nM或更小之IC50；(j)所述抗體與人類IL1RAP之結構域3內之一或多個胺基酸殘基特異性結合，其中結構域3包括SEQ ID NO：1或3之胺基酸序列之位置238-367；(k)所述抗體與SEQ ID NO：1或3之胺基酸序列之位置243-255、位置257-268及/或位置333-336特異性結合；(l)所述抗體不與人類IL1RAP之結構域1或結構域2內之胺基酸殘基結合；視情況，其中結構域1及結構域2包括SEQ ID NO：1或3之胺基酸序列之位置21-237；(m)所述抗體與SEQ ID NO：8之食蟹獼猴IL1RAP多肽交叉反應；及/或 (n)所述抗體與SEQ ID NO：9之小鼠IL1RAP多肽交叉反應。
本發明亦提供抗IL1RAP抗體之實施例，其中：(i)所述抗體為單株抗體；(ii)所述抗體為人類抗體、人類化抗體或嵌合抗體；(iii)所述抗體為IgG類全長抗體，視情況，其中所述IgG類抗體具有選自IgG1、IgG2、IgG3及IgG4之同型；(iv)所述抗體為Fc區變體，視情況，改變效應功能之Fc區變體(例如，產生無效應抗體之變體)或改變抗體半衰期之Fc區變體；(v)所述抗體為抗體片段，視情況選自由F(ab')2、Fab'、Fab、Fv、單結構域抗體(VHH)及scFv組成之群組；(vi)所述抗體為免疫結合物，視情況，其中所述免疫結合物包括用於治療由IL1RAP介導之疾病或病狀之治療劑；(vii)所述抗體為多特異性抗體，視情況雙特異性抗體；及(viii)所述抗體為合成抗體，其中CDR接枝至除免疫球蛋白支架或構架外之支架或構架，視情況選自替代性蛋白質支架及人工聚合物支架之支架上。
在其他實施例中，本發明提供編碼本文所揭示之抗IL1RAP抗體的經分離核酸。
在一些實施例中，本發明亦提供一種宿主細胞，其包括編碼如本文所揭示之抗IL1RAP抗體之核酸。
本發明亦提供一種製造抗IL1RAP抗體之方法，其中所述方法包括培養包括編碼抗IL1RAP抗體之核酸(或載體)的宿主細胞以使得抗體產生。
在一些實施例中，本發明提供一種醫藥組合物，其包括如本文所揭示之抗IL1RAP抗體及醫藥學上可接受之載劑。在一些實施例中，所述醫藥組合物進一步包括用於治療由IL-1、IL-33、IL-36及/或IL1RAP介導之疾病或病狀之治療劑；視情況，其中所述治療劑為化學治療劑。
本發明亦提供一種治療個體中之由IL1RAP介導之疾病的方法，所述方法包括向個體投與治療有效量之如本文所揭示之抗IL1RAP抗體或治 療有效量之如本文所揭示之抗IL1RAP抗體之醫藥調配物。
本發明亦提供一種治療個體中之由IL-1、IL-33及/或IL-36信號傳導介導之疾病的方法，所述方法包括向個體投與治療有效量之如本文所揭示之抗IL1RAP抗體或治療有效量之如本文所揭示之抗IL1RAP抗體之醫藥組合物。
本發明亦提供一種治療個體中之由IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β及/或IL-36γ刺激的信號傳導介導之疾病的方法，所述方法包括向個體投與治療有效量之如本文所揭示之抗IL1RAP抗體或治療有效量之如本文所揭示之抗IL1RAP抗體之醫藥組合物。
在本文所揭示之治療方法之各種實施例中，由IL1RAP介導之疾病及病狀或由IL-1、IL-33及/或IL-36信號傳導介導之疾病包含發炎疾病、自體免疫疾病、呼吸道疾病、代謝失調、感染及癌症。在一些實施例中，IL1RAP介導之疾病及病狀可以選自：痤瘡、急性胰臟炎、急性重度潰瘍性結腸炎、成年發病型斯蒂爾氏病(adult-onset Still's disease)、年齡相關性黃斑變性(AMD)、氣管過度反應、氣管發炎、過敏性結膜炎、過敏性鼻炎、過敏、阿茲海默氏病(Alzheimer's disease)、肌肉萎縮性側索硬化(ALS)、全身性過敏反應、關節炎疼痛、哮喘、動脈粥樣硬化、異位性皮炎、異位性濕疹、自體免疫血管炎、***(Behcet's disease)、骨癌、腦癌、乳癌、惡病質/厭食症、軟骨損壞、大腦缺血、慢性疲勞症候群、慢性阻塞性肺病、梭菌相關疾病(Clostridium associated illnesses)、結腸癌、充血性心臟衰竭、結膜炎、冠狀動脈繞道移植、冠狀動脈再狹窄、克羅恩氏病(Crohn's disease)、糖尿病、糖尿病性黃斑部水腫、糖尿病性視網膜病變、乾眼病、子宮內膜異位、嗜伊紅血球相關胃腸病症、嗜伊紅血球食道炎、家族性冷因性自體發炎症候群、家族性地中海熱、發熱、肌肉纖維疼痛、纖維化病症、食物過敏、全身性膿皰型牛皮癬、青光眼、絲球 體腎炎、痛風性關節炎、移植物抗宿主疾病、蠕蟲感染、出血性休克、化膿性汗腺炎、痛覺過敏、高IgD症候群、高尿酸血症、特發性肺纖維化(IPF)、癌症相關疼痛、感染、發炎性腸病(IBD)、由菌株引起的發炎性病狀、與角膜移植相關之發炎性眼病、發炎性疼痛、流感、腸癌、缺血、幼年型關節炎、川崎氏病(Kawasaki's disease)、腎癌、萊伯氏先天性黑矇症(Leber's congenital amaurosis)、肝癌、肝病、肺癌、穆-韋二氏症候群(Muckle-Wells syndrome)、多發性骨髓瘤、多發性硬化症、肌肉骨骼痛、骨髓性白血病及其他白血病、心肌功能障礙、肌病、鼻息肉、新生兒發作型多系統發炎疾病、神經毒性、非傳染性結膜炎、非小細胞肺癌、矯形外科、骨關節炎、骨質疏鬆症、疼痛、掌蹠膿皰病、胰臟癌、帕金森氏病(Parkinson's disease)、牙周病、周邊血管疾病、風濕性多肌痛、息肉狀脈絡膜血管病變(PCV)、早產、***癌、原蟲傳染、牛皮癬、牛皮癬性關節炎、壞疽性膿皮病、再灌注損傷、呼吸道融合性病毒(RSV)、再狹窄、視網膜脫落、色素性視網膜炎、早產兒視網膜病(ROP)、類風濕性關節炎、敗血性休克、鐮狀細胞貧血、來自放射治療之副作用、竇炎、皮膚癌、睡眠障礙、扭傷、斯特格氏病(Stargardt's disease)、胃癌、顳頜關節疾病、TNF受體相關的週期性症候群、移植排斥反應、創傷、創傷性眼損傷、第2型糖尿病、潰瘍性結腸炎及葡萄膜炎。
在一些實施例中，本發明亦提供一種治療個體中之癌症之方法，所述方法包括向個體投與治療有效量之如本文所揭示之抗IL1RAP抗體之抗體或治療有效量之如本文所揭示之抗IL1RAP抗體之醫藥調配物。在實施例中，所述癌症係選自乳癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、胰臟癌。
在一些實施例中，本發明亦提供一種治療個體中之哮喘之方法，所述方法包括向個體投與治療有效量之如本文所揭示之抗IL1RAP抗體之抗體或治療有效量之如本文所揭示之抗IL1RAP抗體之醫藥調配物。
在一些實施例中，本發明亦提供一種用於偵測生物樣品中之IL1RAP之含量的方法，所述方法包括使樣品與如本文所揭示之抗IL1RAP抗體接觸之步驟。本發明之抗IL1RAP抗體可用於任何已知分析方法中，諸如競爭性結合分析、直接及間接夾心分析、免疫沈澱分析及酶聯免疫吸附分析(ELISA)，關於IL1RAP之偵測及定量(參見Sola,1987,《單株抗體：技術手冊(Monoclonal Antibodies：A Manual of Techniques)》，第147-158頁，CRC出版公司(CRC Press,Inc.))。所述抗體以高親和力結合hu-IL1RAP，適合於廣泛範圍的分析。
圖1描繪小鼠融合瘤衍生之抗hu-IL1RAP抗體11C5(Hy)在IL-1、IL-33及IL-36刺激的細胞內信號傳導之抑制分析中的結果之圖，所述細胞內信號傳導係在HEK-BLUETM IL-1/IL-33反應性感測器細胞或HEK-BLUETM IL-36反應性感測器細胞(亦即，短暫表現IL-36受體之IL-33細胞)中評定且用各種所示促效劑刺激。圖1A：11C5(Hy)對HEK-BLUETM IL-1/IL-33反應細胞之IL-1α刺激([IL-1α]=35pM)的抑制；IC50=4.70nM。圖1B：11C5(Hy)對HEK-BLUETM IL-1/IL-33反應細胞之IL-1β刺激([IL-1β]=7pM)的抑制；IC50=1.00nM。圖1C：11C5(Hy)對HEK-BLUETM IL-1/IL-33反應細胞之IL-33刺激([IL-33]=60pM)的抑制；IC50=3.71nM。圖1D：11C5(Hy)對HEK-BLUETM IL-36反應細胞之IL-36α刺激([IL-36α]=10pM)的抑制；IC50=2.52nM。圖1E：11C5(Hy)對HEK-BLUETM IL-36反應細胞之IL-36β刺激([IL-36β]=5pM)的抑制；IC50=0.98nM。圖1F：11C5(Hy)對HEK-BLUETM IL-36反應細胞之IL-36γ刺激([IL-36γ]=7pM)的抑制；IC50=0.67nM。所有分析皆在約EC50至EC70之促效劑濃度下進行；所示誤差槓代表兩個重複樣品之標準差；且陽性對照(PC)由黑色虛線表示，而陰性對照(NC)由灰色虛線表示。
圖2描繪最接近的人類生殖系κ輕鏈VL區(基因ID-V基因：IGKV1-NL1*01，J基因：IGKJ4*02)及重鏈VH區(基因ID-V基因：IGHV3-7*03，J基因：IGHJ4*03)相對於融合瘤衍生之鼠類抗hu-IL1RAP抗體11C5(Hy)及此抗體之人類化形式h11C5之VL及VH區的胺基酸序列比對。
圖3描繪人類化抗hu-IL1RAP抗體h11C5及陽性及陰性對照參考抗體之濃度與450nm下之桿狀病毒(BV)粒子ELISA信號之圖，指示不存在h11C5與BV粒子之非特異性結合。
圖4描繪以下基於融合瘤衍生之抗hu-IL1RAP抗體11C5(Hy)之重組製備的抗體之細胞內信號傳導抑制分析結果之圖：鼠類11C5(「m11C5」)、嵌合11C5(「c11C5」)、人類化11C5mAb(「h11C5」)、c11C5之C59Y變體(「c11C5_C59Y」)及h11C5之C59Y變體(「h11C5_C59Y」)。為了比較，亦包含11C5(Hy)及人類同型對照抗體(「Hu IgG1對照」)之分析結果之圖。圖4A：11C5(Hy)、m11C5及h11C5對HEK-BLUETM IL-1/IL-33反應細胞之IL-1β刺激([IL-1β]=7pM)的抑制。圖4B：11C5(Hy)、m11C5及h11C5對HEK-BLUETM IL-1/IL-33反應細胞之IL-33刺激([IL-33]=60pM)的抑制。圖4C：h11C5及h11C5_C59Y對HEK-BLUETM IL-1/IL-33反應細胞之IL-1β刺激([IL-1β]=7pM)的抑制。圖4D：h11C5及h11C5_C59Y對HEK-BLUETM IL-1/IL-33反應細胞之IL-33刺激([IL-33]=60pM)的抑制。圖4E：c11C5_C59Y對初代人類肺纖維母細胞(PHLF)之IL-1α刺激([IL-1α]=10pM)的抑制；IC50=3.96nM。圖4F：c11C5_C59Y對初代人類單核球(PHM)之IL-1β刺激([IL-1β]=0.925nM)的抑制；IC50=0.74nM。圖4G：c11C5_C59Y對初代人類NK(PHNK)細胞之IL-33刺激([IL-33]=1nM，[IL-12]=0.1ng/mL)的抑制；IC50=2.90nM。圖4H：c11C5_C59Y對PHLF之IL-36β刺激([IL-36β]=2nM)的抑制；IC50=0.28nM。所有重組抗體亦含有賦予無效應功能之N297G突變；促效劑係以約EC50 至EC70之有效濃度使用；誤差槓代表兩個重複樣品之標準差；陽性對照(PC)由黑色虛線表示，而陰性對照(NC)由灰色虛線表示。
圖5描繪h11C5_C59Y/A43S之親和力成熟變體的HEK-Blue細胞內信號傳導抑制分析結果之圖，所述變體為Fab或IgG蛋白質，在VL或VH區中之任一者或兩者中含有單一、雙重或三重突變，如實例9及10中所述。圖5A：對HEK-BLUETM IL-1/IL-33反應細胞之IL-1β刺激([IL-1β]=7pM)的抑制。圖5B：對HEK-BLUETM IL-1/IL-33反應細胞之IL-33刺激([IL-33]=40pM)的抑制。圖5C：對HEK-BLUETM IL-36反應細胞之IL-36α刺激([IL-36α]=60pM)的抑制。圖1D：對HEK-BLUETM IL-1/IL-33反應細胞之IL-1β刺激([IL-1β]=9pM)的抑制。圖5E：對HEK-BLUETM IL-1/IL-33反應細胞之IL-33刺激([IL-33]=60pM)的抑制。圖5F：對HEK-BLUETM IL-36反應細胞之IL-36α刺激([IL-36α]=50pM)的抑制。在實例9中解釋與圖中所用之變體之識別符對應的VL及VH區突變。圖5A-C描繪親和力成熟變體之Fab形式的結果，包含非親和力成熟親本抗體之Fab形式「h11C5_AC59Y/A43S」及IgG對照「Fab對照」。圖5D-F描繪親和力成熟變體之全長IgG抗體形式的結果且包含非親和力成熟親本抗體之全長IgG抗體形式「h11C5_AC59Y/A43S」及IgG對照。所測試的所有全長IgG抗體，包含同型IgG對照抗體，皆含有賦予無效應功能之N297G突變。IL-1β或IL-36α刺激之分析在約EC50至EC60之促效劑濃度下進行。IL-33刺激之分析在約EC35至EC45之促效劑濃度下進行。所示誤差槓代表兩個重複樣品之標準差。陽性對照(PC)由黑色虛線表示，而陰性對照(NC)由灰色虛線表示。
圖6A、6B及6C描繪h11C5變體YKD/YTE(或「11C5-YKD/YTE」)對比h11C5變體YKD(或「11C5-YKD」)之HEK-Blue細胞內信號傳導抑制分析結果之圖，如實例12中所述。圖6A顯示經IL-1β刺激之HEK-Blue細胞之分析結果；圖6B顯示經IL-33刺激之HEK-Blue細胞之分析 結果；且圖6C顯示經IL-36β刺激之HEK-Blue細胞之分析結果。在各分析中，促效劑濃度為接近或大於EC55。所示誤差槓代表兩個重複樣品之平均值之標準誤差。陽性對照(PC)由黑色虛線表示，而陰性對照(NC)由灰色虛線表示。
圖7描繪在經IL-1β以大於EC55之促效劑濃度刺激之單核球中(如實例12中所述)，h11C5變異抗體YKD/YTE(或「11C5-YKD/YTE」)對比YKD(或「11C5-YKD」)或同型對照(IgG對照)之阻斷功效分析之圖。所示誤差槓代表兩個重複樣品之標準差。陽性對照(PC)由黑色虛線表示，而陰性對照(NC)由灰色虛線表示。
圖8描繪在經IL-1α以接近或大於EC55之促效劑濃度刺激之PHLF細胞中(如實例12中所述)，h11C5變體YKD/YTE(或「11C5-YKD/YTE」)對比變體YKD(或「11C5-YKD」)或同型對照(IgG對照)之阻斷功效分析之圖。所示誤差槓代表兩個重複樣品之標準差。陽性對照(PC)由黑色虛線表示，而陰性對照(NC)由灰色虛線表示。
圖9描繪在經IL-36β以大於EC55之促效劑濃度刺激之HEKn細胞中(如實例12中所述)，h11C5變異抗體YKD/YTE(或「11C5-YKD/YTE」)對比YKD(或「11C5-YKD」)或同型對照(IgG對照)之阻斷功效分析之圖。所示誤差槓代表兩個重複樣品之標準差。陽性對照(PC)由黑色虛線表示。
圖10描繪在經IL-36β以接近或大於EC55之促效劑濃度刺激之PHLF細胞中(如實例12中所述)，h11C5變異抗體YKD/YTE(或「11C5-YKD/YTE」)對比YKD(或「11C5-YKD」)或同型對照(IgG對照)之阻斷功效分析之圖。所示誤差槓代表兩個重複樣品之標準差。陽性對照(PC)由黑色虛線表示，而陰性對照(NC)由灰色虛線表示。
圖11描繪在IL-12存在下經IL-33刺激之初代人類NK細胞中(如實例12中所述)，h11C5變異抗體YKD/YTE(或「11C5-YKD/YTE」)對比 YKD(或「11C5-YKD」)或同型對照(IgG對照)之阻斷功效分析之圖。IL-33之有效濃度相當於EC50。所示誤差槓代表兩個重複樣品之標準差。陽性對照(PC)由黑色虛線表示，而陰性對照(NC)由灰色虛線表示。
圖12描繪在經IL-33以EC56之促效劑濃度刺激之嗜鹼性球中(如實例12中所述)，h11C5變異抗體YKD/YTE(或「11C5-YKD/YTE」)或同型對照(IgG對照)之阻斷功效分析之圖。所示誤差槓代表兩個重複樣品之標準差。陽性對照(PC)由黑色虛線表示，而陰性對照(NC)由灰色虛線表示。
圖13描繪在經IL-33以EC34之促效劑濃度刺激之CD4+ T細胞中(如實例12中所述)，h11C5變異抗體YKD/YTE(或「11C5-YKD/YTE」)或同型對照(IgG對照)之阻斷功效分析之圖。所示誤差槓代表三個重複樣品之平均值之標準誤差。陽性對照(PC)由黑色虛線表示，而陰性對照(NC)由灰色虛線表示。
圖14A描繪非線性二室模型，其最佳描述自如實例14中所述在食蟹獼猴中進行之藥物動力學研究1、2及3獲得之資料。模型參數、變數及初始條件定義如下：「Vc」為中央室之體積/體重，以mL/kg為單位；「Vp」為周邊室之體積/體重，以mL/kg為單位；「CLt」為假定經由由FcRn介導之IgG分解代解及再循環發生之線性清除率/體重，以mL/天/kg為單位；「CLd」為中央室與周邊室之間的分佈清除率/體重，以mL/天/kg為單位；「A(1)(t)」為中央室中之藥物在時間t之量/體重，且因此，血漿濃度時間曲線之模型預測為「A(1)(t)/Vc」，以μg/kg為單位，其中A(1)(0)=0；且「A(2)(t)」為周邊室中之藥物在時間t之量/體重，以μg/kg為單位，其中A(2)(0)=0。
圖14B及14C描繪在食蟹獼猴中投與單次IV劑量之抗體後YKD(圖14B)及YKD/YTE(圖14C)之藥物動力學，如實例14中所述。圖14B：YKD劑量為40mg/kg(顯示為實心圓)、20mg/kg(空心圓)、10mg/kg(實 心正方形)、3mg/kg(空心正方形)及1mg/kg(實心三角形)。圖14C：YKD/YTE劑量為40mg/kg(顯示為實心圓)、10mg/kg(空心正方形)及3mg/kg(實心三角形)。誤差槓代表標準差。
圖15描繪人類IL1RAP(分子表面)、IL-1β(深灰色帶)及IL-1R1(淺灰色帶)之三元複合物之晶體結構(PDB代碼：3O4O)的分子表面及帶狀表示。所述表示描繪經鑑定為對抗hu-IL1RAP抗體YIS及YKS之結合有害，但對參考抗體(若突變)之結合無害的IL1RAP胺基酸殘基之空間分佈，如實例15中所述。觀察到具有9個或更多個標記取代之IL1RAP殘基I245、E261及T267呈黑色，且抗原決定基中其他具有6-8個標記取代之殘基呈深灰色。
圖16A及16B描繪如實例18中所述，如在單一IL-1β攻擊模型(圖16A)或單一IL-36α攻擊模型(圖16B)中測定的14F4或同型對照(IgG對照)的阻斷功效之圖。圖16A：給予小鼠14F4或IgG對照，且一天後用D-PBS或50ng IL-1β i.p.攻擊小鼠；在攻擊後兩小時，收集血液，且測定血清IL-6含量；資料來自於5隻小鼠/組且代表兩個獨立實驗；條形圖指示平均值+/- SEM；個別圓圈指示來自於一隻個別小鼠之資料；給予14F4或IgG對照之小鼠分別由白色或黑色圓圈指示；** p
Figure 108129005-A0202-12-0020-64
0.01，使用曼-惠特尼檢定(Mann-Whitney test)，比較經同型/PBS及同型/IL-1β攻擊之小鼠或比較經同型/IL-1β攻擊及經14F4/IL-1β攻擊之小鼠。圖16B：給予小鼠14F4或IgG對照，且一天後用D-PBS或10ng IL-36α i.n.攻擊小鼠；在攻擊後一天，測定肺部氣腔中之細胞發炎；資料來自於5隻小鼠/組且代表兩個獨立實驗；條形圖指示平均值+/- SEM；個別圓圈指示來自於一隻個別小鼠之資料；給予14F4或IgG對照之小鼠分別由白色或黑色圓圈指示；** p
Figure 108129005-A0202-12-0020-67
0.01，使用曼-惠特尼檢定，比較經同型/PBS及同型/IL-36α攻擊之小鼠或比較經同型/IL-36α攻擊及經14F4/IL-36α攻擊之小鼠。
圖17A、17B、17C、17D及17E描繪如實例18中所述，如在分 析肺部氣腔中之免疫細胞浸潤的多重IL-1β攻擊模型中測定的14F4或同型對照(IgG對照)的阻斷功效之圖。針對五種不同的細胞類型在肺部氣腔中之浸潤量測阻斷功效：嗜中性白血球(圖17A)；CD4 T細胞(圖17B)；T1-ST2+ CD4 T細胞(圖17C)；單核球(圖17D)；及樹突狀細胞(圖17E)。在第-1天及第2天給予小鼠14F4或IgG對照，且在第0天、第1天及第2天用D-PBS或30ng IL-1β i.n.攻擊小鼠；在第3天，測定肺部氣腔中之細胞發炎；資料來自於5隻小鼠/組且代表兩個獨立實驗；條形圖指示平均值+/- SEM。個別圓圈指示來自一隻個別小鼠之資料；給予14F4或IgG對照之小鼠分別由白色或黑色圓圈指示；* p
Figure 108129005-A0202-12-0021-56
0.05及** p
Figure 108129005-A0202-12-0021-57
0.01，使用曼-惠特尼檢定，比較經同型/PBS及同型/IL-1β攻擊之小鼠或比較經同型/IL-1β攻擊及經14F4/IL-1β攻擊之小鼠。
圖18A、18B及18C描繪如實例18中所述，如在分析肺組織中之趨化介素及細胞介素含量的多重IL-1β攻擊模型中測定的14F4或同型對照(IgG對照)的阻斷功效之圖。阻斷功效基於如從肺組織樣品量測之三種不同的趨化介素及細胞介素之含量而測定：IL-1β(圖18A)；IL-17A(圖18B)；及CXCL1(圖18C)。在第-1天及第2天給予小鼠14F4或IgG對照，且在第0天、第1天及第2天用D-PBS或30ng IL-1β i.n.攻擊小鼠；在第3天，收集肺組織用於蛋白質趨化介素及細胞介素分析；資料來自於5隻小鼠/組且代表兩個獨立實驗；條形圖指示平均值+/- SEM；個別圓圈指示來自於一隻個別小鼠之資料；給予14F4或IgG對照之小鼠分別由白色或黑色圓圈指示；* p
Figure 108129005-A0202-12-0021-59
0.05及** p
Figure 108129005-A0202-12-0021-60
0.01，使用曼-惠特尼檢定，比較經同型/PBS及同型/IL-1β攻擊之小鼠或比較經同型/IL-1β攻擊及經14F4/IL-1β攻擊之小鼠。
圖19A及19B描繪如實例18中所述如在分析血清抗體含量之急性HDM哮喘模型中測定的14F4或同型對照(IgG對照)的阻斷功效之圖。圖19A：分析HDM特異性IgE；圖19B：分析HDM特異性IgG1。在第-1天、第 2天、第6天、第9天及第13天，i.p.給予小鼠14F4或IgG對照；在第0-3天、第6-10天、第13天及第14天，用生理鹽水或25μg HDM i.n.攻擊小鼠；在最後一次攻擊後一天，收集血液，且測定血清HDM特異性IgE及IgG1含量；資料來自於6-10隻小鼠/組且代表兩個獨立實驗；條形圖指示平均值+/- SEM；個別圓圈指示來自於一隻個別小鼠之資料；給予14F4或IgG對照之小鼠分別由白色或黑色圓圈指示；* p
Figure 108129005-A0202-12-0022-61
0.05，** p
Figure 108129005-A0202-12-0022-62
0.01，*** p
Figure 108129005-A0202-12-0022-63
0.001，使用曼-惠特尼檢定，比較經同型/生理鹽水及同型/HDM攻擊之小鼠或比較經同型/HDM攻擊及經14F4/HDM攻擊之小鼠。
本發明提供以高親和力特異性結合人類IL1RAP之抗體，包含人類化抗體。所揭示之抗IL1RAP抗體能夠降低、抑制及/或完全阻斷藉由由IL1RAP介導之途徑進行之細胞內信號傳導，包含IL-1、IL-33及/或IL-36信號傳導途徑。 更具體而言，本文所揭示之抗IL1RAP抗體能夠降低、抑制及/或完全阻斷藉由以下促效劑中之一或多者之結合刺激的信號傳導：IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β及IL-36γ。本發明亦提供抗IL1RAP抗體在治療由IL1RAP介導之疾病之方法中的用途，所述疾病包含響應於IL-1、IL-33及/或IL-36信號傳導之抑制的疾病及病狀，包含但不限於各種癌症(例如，乳癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、胰臟癌)，以及發炎疾病、傳染病及自體免疫疾病，包含關節炎、哮喘及潰瘍性結腸炎。
術語及技術之概述
對於本文及隨附申請專利範圍中之描述，除非上下文另外明確指示，否則單數形式「一(a)」及「一個(an)」包含複數個指示物。因此，例如，提及「一蛋白質」包含超過一種蛋白質，且提及「一化合物」係指超過一 種化合物。「包括(comprise/comprises/comprising)」及「包含(include/includes/including)」之使用為可互換的且並不意欲為限制性的。更應理解，在各種實施例之描述使用術語「包括」的情況下，本領域中熟習此項技術者將理解在一些特定情況中，可使用語言「主要由......組成」或「由......組成」替代性地描述實施例。
在提供值範圍之情況下，除非上下文另有明確指示，否則應理解，本發明內涵蓋所述值之各介於其間的整數，及除非上下文另有明確指示，否則本發明涵蓋所述值之各介於其間的整數之在所述範圍之上限與下限之間的各十分之一，及所陳述範圍中之任何其他所陳述的或介於其間的值。此等較小範圍之上限及下限可獨立地包含於更小的範圍內，且亦涵蓋於本發明內，在所陳述範圍內受到任何特別排除的限制。在所陳述之範圍包含此等限制中之一者或兩者之情況下，排除彼等所包含之限制中之(i)任一者或(ii)兩者之範圍亦包含於本發明中。例如，「1至50」包含「2至25」、「5至20」、「25至50」、「1至10」等。
通常，本文所用之命名法及本文所述之技術及程序包含本領域中之一般技術者充分理解且通常所採用的命名法與技術及程序，諸如以下文獻中所述之常見技術及方法：Sambrook等人，《分子選殖實驗指南(Molecular Cloning-A Laboratory Manual)》(第2版)，第1-3卷，紐約州冷泉港之冷泉港實驗室(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.),1989(下文「Sambrook」)；《分子生物學實驗操作手冊(Current Protocols in Molecular Biology)》,F.M.Ausubel等人編，Current Protocols，格林出版聯合公司(Greene Publishing Associates,Inc.)與約翰．威利父子出版公司(John Wiley & Sons,Inc.)之合資公司(增刊至2011年)(下文「Ausubel」)；《抗體工程化(Antibody Engineering)》，第1卷及第2卷，R.Kontermann及S.Dubel編，施普林格出版社 (Springer-Verlag)，柏林(Berlin)及海德堡(Heidelberg)(2010)；《單株抗體：方法及實驗方案(Monoclonal Antibodies：Methods and Protocols)》,V.Ossipow及N.Fischer編，第2版，胡馬納出版社(Humana Press)(2014)；《治療性抗體：從實驗室至臨床(Therapeutic Antibodies：From Bench to Clinic)》,Z.An編，新澤西州荷波肯之約翰．威利父子出版公司(J.Wiley & Sons,Hoboken,N.J.)(2009)；及《噬菌體呈現(Phage Display)》,Tim Clackson及Henry B.Lowman編，英國牛津大學出版社(Oxford University Press,United Kingdom)(2004)。
本發明中所引用之所有出版物、專利、專利申請案及其他文獻均出於所有目的以全文引用之方式併入本文中，引用程度就如同各個別出版物、專利、專利申請案或其他文獻經個別地指示出於所有目的以引用之方式併入本文中一樣。
除非另外定義，否則本文所用之所有技術及科學術語均具有與本發明所屬領域的普通技術人員通常理解的含義相同的含義。應理解，本文所用之術語僅用於描述特定實施例且不意欲為限制性的。出於解釋本發明之目的，以下對術語之描述將適用，且在適當的情況下，以單數形式使用之術語亦將包含複數形式，且反之亦然。
如本文所用之「IL1RAP」係指介白素-1受體輔助蛋白，其為IL-1家族中之若干受體的細胞膜輔受體，包含介白素-1受體1(IL1R1)、ST2(亦稱為類介白素-1受體1或IL1RL1)及類介白素-1受體蛋白2(IL1RL2)。應注意，介白素-1受體輔助蛋白或IL1RAP有時在本領域中稱為「IL-1RAP」、「IL-1RAcP」、「IL1RAcP」或「IL-1R3」。術語「IL1RAP」、「IL1RAP多肽」及「IL1RAP蛋白」在本文中可互換使用。
如本文所用之「由IL1RAP介導之病狀」或「由IL1RAP介導之疾病」涵蓋任何與由IL-1家族之細胞介素連同充當輔受體之IL1RAP一起介導 之信號傳導途徑之異常功能相關的醫學病狀，包含但不限於藉由IL-1家族細胞介素IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β及IL-36γ刺激之下游信號傳導途徑。例如，由IL1RAP介導之疾病可以包含但不限於由IL-1、IL-33及/或IL-36信號傳導途徑之拮抗劑或抑制劑介導及/或對所述拮抗劑或抑制劑起反應的疾病，包含癌症、發炎疾病、傳染病及自體免疫疾病。更具體而言，由IL1RAP介導之疾病可以包含但不限於痤瘡、急性重度潰瘍性結腸炎、成年發病型斯蒂爾氏病、過敏性鼻炎、痛風性關節炎、幼年型關節炎、骨關節炎、類風濕性關節炎、關節炎疼痛、哮喘、動脈粥樣硬化、異位性濕疹、***、惡病質、乳癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、胰臟癌、慢性阻塞性肺病、乾眼症候群、家族性冷因性自體發炎症候群、家族性地中海熱、食物過敏、全身性膿皰型牛皮癬、化膿性汗腺炎、高IgD症候群、高尿酸血症、穆-韋二氏症候群、新生兒發作型多系統發炎疾病、肌肉骨骼痛、掌蹠膿皰病、周邊血管疾病、風濕性多肌痛、鼻息肉、牛皮癬、壞疽性膿皮病、再狹窄、鐮狀細胞貧血、竇炎、TNF受體相關的週期性症候群、第2型糖尿病及潰瘍性結腸炎。
如本文所用之「IL-1刺激的信號」係指藉由諸如IL-1α或IL-1β之IL-1細胞介素與其同源細胞表面受體IL1R1之結合引發的細胞內信號。例示性IL-1刺激的信號包含使用基於細胞之阻斷分析可量測之信號，所述分析諸如如本文實例中所揭示之基於HEK-BLUETM IL-1反應細胞之分析。
如本文所用之「IL-33刺激的信號」係指藉由諸如IL-33之IL-33細胞介素與其同源細胞表面受體IL1RL1(亦稱為ST2)之結合引發的細胞內信號。例示性IL-33刺激的信號包含使用基於細胞之阻斷分析可量測之信號，所述分析諸如如本文實例中所揭示之基於HEK-BLUETM IL-33反應細胞之分析。
如本文所用之「IL-36刺激的信號」係指藉由諸如IL-36α、IL-36β或IL-36γ之IL-36細胞介素與其同源細胞表面受體IL1RL2之結合引發的細胞內 信號。例示性IL-36刺激的信號包含藉由基於替代細胞之阻斷分析量測之信號，所述分析諸如如本文實例中所揭示之基於HEK-BLUETM IL-36反應細胞之分析。
「基於細胞之阻斷分析」係指可量測抗體抑制或降低其所結合之抗原之生物活性的能力的分析。例如，基於細胞之阻斷分析可用於量測抑制特定的生物或生物化學功能所需之抗體濃度，所述功能諸如經由IL-1、IL-33及IL-36信號傳導途徑的由IL1RAP介導之細胞內信號傳導。在一些實施例中，使用基於細胞之阻斷分析來量測抗體(例如，本發明之抗IL1RAP抗體)之半數最大抑制濃度(IC50)及/或90%抑制濃度(IC90)。在一些實施例中，基於細胞之阻斷分析用於確定抗體是否阻斷促效劑(例如，IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β、IL-36γ)與其同源受體之間的相互作用。適用於本發明之抗體的基於細胞之阻斷分析可以包含初代細胞分析(例如，PHLF細胞)以及報導或感測器細胞分析(例如，HEK-BLUETM報導細胞分析)。用於IL-1、IL-33及IL-36信號傳導途徑之例示性基於細胞之阻斷分析，諸如適合的基於HEK-BLUETM特異性細胞介素反應性報導細胞之分析，描述於本文所提供之實例中。
如本文所用之「抗體」係指包括一或多條與特定抗原特異性結合或可與特定抗原發生免疫反應的多肽鏈的分子。例示性本發明抗體包含單株抗體、多株抗體、嵌合抗體、人類化抗體、人類抗體、多特異性(或異結合)抗體(例如，雙特異性抗體)、單價抗體(例如，單臂抗體)、多價抗體、抗原結合片段(例如，Fab'、F(ab')2、Fab、Fv、rIgG及scFv片段)、抗體融合物及合成抗體(或抗體模擬物)。
「抗IL1RAP抗體」或「結合IL1RAP之抗體」係指以足夠的親和力結合IL1RAP以使得抗體適用作靶向IL1RAP之診斷劑及/或治療劑的抗體。在一些實施例中，抗IL1RAP抗體與不相關的非IL1RAP抗原之結合程度小於抗體與IL1RAP之結合的約10%，如例如藉由放射免疫分析(RIA)所量測。 在一些實施例中，與IL1RAP結合之抗體具有<1μM、<100nM、<10nM、<1nM、<0.1nM、<0.01nM或<1pM(例如10-8M或更小，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)之解離常數(KD)。
「全長抗體」、「完整抗體」或「完全抗體」在本文中可互換使用，係指具有基本上類似於天然抗體結構之結構或具有含有如本文所定義之Fc區之重鏈的抗體。
「抗體片段」係指全長抗體之能夠與全長抗體結合相同抗原的部分。抗體片段之實例包含但不限於Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；雙功能抗體；線性抗體；單價或單臂抗體；單鏈抗體分子(例如，scFv)；及由抗體片段形成之多特異性抗體。
抗體之「類別」係指其重鏈所具有之恆定結構域或恆定區的類型。存在五種主要的抗體類別：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且此等類別中之若干類別可進一步分成亞類(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。對應於不同類別免疫球蛋白之重鏈恆定結構域分別稱作α、δ、ε、γ及μ。
「可變區」或「可變結構域」係指抗體重鏈或輕鏈中參與抗體與抗原之結合的結構域。天然抗體之重鏈及輕鏈之可變結構域(分別為VH及VL)通常具有類似結構，其中各結構域包括四個保守性構架區(FR)及三個高變區(HVR)(參見例如Kindt等人，《Kuby免疫學(Kuby Immunology)》，第6版，W.H.Freeman and Co.，第91頁)。單一VH或VL結構域足以賦予抗原結合特異性。此外，結合特定抗原之抗體可使用來自結合所述抗原之抗體的VH或VL結構域分別篩選互補VL或VH結構域之庫而分離(參見例如Portolano等人，《免疫學雜誌(J.Immunol.)》,150：880-887(1993)；Clarkson等人，《自然(Nature)》,352：624-628(1991))。
如本文所用之「高變區」或「HVR」係指抗體可變域中在序列 上高變的及/或形成結構上限定之環(「高變環」)的各區域。通常，天然抗體包括四條鏈，具有六個HVR；三個在重鏈可變結構域VH中(HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3)，且三個在輕鏈可變結構域VL中(HVR-L1、HVR-L2、HVR-L3)。HVR通常包括來自高變環及/或來自「互補決定區」(CDR)之胺基酸殘基。除非另有指示，否則可變結構域中之HVR殘基及其他殘基(例如，FR殘基)在本文中根據Kabat等人，《免疫學感興趣的蛋白質之序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)》，第5版公共衛生處(Public Health Service)，馬里蘭州貝塞斯達之國立衛生研究院(National Institutes of Health,Bethesda,MD)(1991)編號。
如本文所用之「互補決定區」或「CDR」係指可變結構域之HVR內具有最高序列變異性及/或參與抗原識別之區域。通常，天然抗體包括四條鏈，具有六個CDR；三個在重鏈可變結構域VH中(H1、H2、H3)，且三個在輕鏈可變結構域VL中(L1、L2、L3)。例示性CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3)出現在L1之胺基酸殘基24-34、L2之胺基酸殘基50-56、L3之胺基酸殘基89-97、H1之胺基酸殘基31-35B、H2之胺基酸殘基50-65及H3之胺基酸殘基95-102處。(Kabat等人，同前文獻)。
「構架」或「FR」係指除高變區(HVR)殘基外之可變結構域殘基。可變結構域之FR通常由四個FR結構域組成：FR1、FR2、FR3及FR4。因此，HVR及FR序列在VH(或VL)中通常按以下序列出現：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
「天然抗體」係指天然存在之免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗體為約150,000道爾頓(Dalton)之雜四聚體糖蛋白，其由以二硫鍵鍵結之兩條相同輕鏈及兩條相同重鏈構成。自N端至C端，各重鏈具有可變區(VH)，亦稱為可變重鏈結構域或重鏈可變結構域，隨後為三個恆定結構域(CH1、CH2 及CH3)。類似地，自N端至C端，各輕鏈具有可變區(VL)，亦稱為可變輕鏈結構域或輕鏈可變結構域，隨後為恆定輕鏈(CL)結構域。抗體之輕鏈可基於其恆定結構域之胺基酸序列歸為兩種類型中之一種，這兩種類型稱為卡帕(κ)及拉姆達(λ)。
如本文所用之「單株抗體」係指自基本上同質的抗體群體獲得之抗體，亦即，除了可能的變異抗體(例如，含有天然存在或在單株抗體之產生期間出現且通常以少量存在的突變的變異抗體)以外，構成所述群體之個別抗體為相同的及/或結合相同抗原決定基。相比於通常包含針對不同決定子(抗原決定基)之不同抗體的多株抗體製劑，單株抗體製劑之各單株抗體係針對抗原上之單一決定子。因此，術語「單株」指示抗體之特徵為自基本上同質的抗體群體獲得，且不應解釋為需要藉由任何特定方法產生抗體。例如，待使用之單株抗體可藉由多種技術製得，所述技術包含但不限於融合瘤方法、重組DNA方法、噬菌體呈現方法及利用含有所有或部分人類免疫球蛋白基因座之基因轉殖動物的方法，此類方法及其他用於製造單株抗體之例示性方法皆描述於本文中。
「嵌合抗體」係指重鏈及/或輕鏈之一部分衍生自特定來源或物種，而重鏈及/或輕鏈之其餘部分衍生自不同來源或物種的抗體。
「人類化抗體」係指包括來自非人類HVR之胺基酸序列及來自人類FR之胺基酸序列的嵌合抗體。在某些實施例中，人類化抗體將包括基本上所有的至少一個且通常兩個可變結構域，其中所有或基本上所有HVR(例如CDR)皆與非人類抗體之HVR對應，且所有或基本上所有FR皆與人類抗體之FR對應。人類化抗體視情況可包括衍生自人類抗體之抗體恆定區的至少一部分。例如非人類抗體之抗體的「人類化形式」係指已經歷人類化之抗體。
「人類抗體」係指具有與由人類或人類細胞產生或衍生自利用人類抗體譜系或其他編碼人類抗體之序列的非人類來源之抗體的胺基酸序列對應 的胺基酸序列的抗體。人類抗體之此定義特別排除包括非人類抗原結合殘基之人類化抗體。
「人類共同構架」為表示人類免疫球蛋白VL或VH構架序列選集中最常出現之胺基酸殘基的構架。通常，所述人類免疫球蛋白VL或VH序列選集係來自可變結構域序列之亞群。通常，所述序列亞群為如Kabat等人，《免疫學感興趣的蛋白質之序列》，第五版，NIH公開案91-3242，馬里蘭州貝塞斯達(1991)，第1-3卷中之亞群。在一個實施例中，對於VL，所述亞群為如Kabat等人之同前文獻中之亞群κI。在一個實施例中，對於VH，所述亞群為如Kabat等人之同前文獻中之亞群III。
如本文所用之「接受體人類構架」為包括衍生自人類免疫球蛋白構架或人類共同構架的輕鏈可變結構域(VL)構架或重鏈可變結構域(VH)構架之胺基酸序列的構架。「衍生自」人類免疫球蛋白構架或人類共同構架之接受體人類構架可包括與其相同的胺基酸序列，或其可含有胺基酸序列改變。在一些實施例中，胺基酸改變之數目為10個或更少、9個或更少、8個或更少、7個或更少、6個或更少、5個或更少、4個或更少、3個或更少、或2個或更少。在一些實施例中，VL接受體人類構架在序列上與VL人類免疫球蛋白構架序列或人類共同構架序列相同。
「Fc區」係指包括免疫球蛋白重鏈之C端多肽序列之二聚體複合物，其中C端多肽序列為可藉由完整抗體之木瓜蛋白酶消化獲得的序列。Fc區可包括天然或變異Fc序列。雖然免疫球蛋白重鏈之Fc序列之邊界可以變化，但是通常將人類IgG重鏈Fc序列定義為從在約位置Cys226或從約位置Pro230處之胺基酸殘基延伸至在Lys447處之Fc序列之羧基端。然而，Fc序列之C端離胺酸(Lys447)可存在或可不存在於重組抗體之Fc區中，此係歸因於可能發生於用於重組產生(例如，在CHO細胞中產生)之細胞培養系統中的酶促裂解。 免疫球蛋白之Fc區通常包括兩個恆定結構域，即CH2結構域及CH3結構域，且視情況包括CH4結構域。
「Fc受體」或「FcR」係指與抗體之Fc區結合之受體。在一些實施例中，FcR為天然人類FcR。在一些實施例中，FcR為結合IgG抗體之受體(γ受體)且包含FcγRI、FcγRII及FcγRIII亞類之受體，包含彼等受體之對偶基因變體及交替剪接形式。FcγRII受體包含FcγRIIA(「活化受體」)及FcγRIIB(「抑制受體」)，其具有主要在其細胞質結構域方面不同的類似胺基酸序列。活化受體FcγRIIA在其細胞質結構域中含有免疫受體酪胺酸基活化基元(immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM)。抑制受體FcγRIIB在其細胞質結構域中含有免疫受體酪胺酸基抑制基元(immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif，ITIM)(參見例如Daeron，《免疫學年鑒(Annu.Rev.Immunol.)》15：203-234(1997))。如本文所用之FcR亦包含新生兒受體FcRn，其負責將母體IgG轉運至胎兒(Guyer等人，《免疫學雜誌》,1 17：587(1976)；及Kim等人，《歐洲免疫學雜誌(Eur.J.Immunol.)》,24：2429-2434(1994))且調節免疫球蛋白之穩態。FcR綜述於例如Ravetch及Kinet,《免疫學年鑒》,9：457-92(1991)；Capel等人，《免疫方法(Immunomethods)》4：25-34(1994)；及de Haas等人，《實驗室與臨床醫學雜誌(J.Lab.Clin.Med.)》,126：330-41(1995)中。
如本文所用之「多價抗體」為包括三個或更多個抗原結合位點之抗體。多價抗體較佳經工程化為具有三個或更多個抗原結合位點且通常不為天然序列IgM或IgA抗體。
「多特異性抗體」為具有至少兩個不同結合位點之抗體，各位點具有不同結合特異性。多特異性抗體可為全長抗體或抗體片段，且不同結合位點可各自與不同抗原結合或不同結合位點可與相同抗原之兩種不同抗原決定基 結合。
「Fv片段」係指含有完整抗原識別及結合位點之抗體片段。此區域由緊密締合的一個重鏈及一個輕鏈可變結構域之二聚體組成，所述緊密締合在性質上可為共價的，例如在scFv中。在此組態中，各可變結構域之三個HVR相互作用以界定VH-VL二聚體表面上之抗原結合位點。六個HVR或其亞組一起賦予抗體抗原結合特異性。然而，即使單一可變結構域(或僅包括三個對抗原具有特異性之HVR的半個Fv)亦具有識別及結合抗原之能力，儘管親和力通常低於整個結合位點。
「Fab片段」係指含有輕鏈之可變結構域及恆定結構域及重鏈之可變結構域及第一恆定結構域(CH1)的抗體片段。「F(ab')2片段」包括一對Fab片段，其通常在其羧基端附近藉由兩者之間的鉸鏈半胱胺酸共價連接。本領域中亦已知抗體片段之其他化學偶合。
如本文所用之「抗原結合臂」係指具有特異性結合感興趣之目標分子的能力的抗體組分。通常，抗原結合臂為免疫球蛋白多肽序列之複合物，例如免疫球蛋白輕鏈及重鏈之HVR及/或可變結構域序列。
「單鏈Fv」或「scFv」係指包括抗體之VH及VL結構域的抗體片段，其中此等結構域存在於單一多肽鏈中。通常，Fv多肽進一步包括在VH與VL結構域之間的多肽連接子，其使得scFv能夠形成所期望的抗原結合結構。
「雙功能抗體」係指具有兩個抗原結合位點之小抗體片段，所述片段包括與同一多肽鏈中之輕鏈可變結構域(VL)連接的重鏈可變結構域(VH)(VH及VL)。藉由使用過短以使得同一鏈上之兩個結構域之間不能配對的連接子，迫使結構域與另一條鏈之互補結構域配對，且產生兩個抗原結合位點。
「線性抗體」係指Zapata等人，《蛋白質工程化(Protein Eng.)》,8(10)：1057-1062(1995)中所述之抗體。簡言之，此等抗體包括重鏈片段之串聯 重複(VH-CH1-VH-CH1)，其與互補輕鏈多肽一起形成一對抗原結合區。線性抗體可為雙特異性或單特異性的。
「裸抗體」係指未與異源部分(例如，細胞毒性部分)或放射性標記結合之抗體。
「親和力」係指分子(例如，抗體)之單一結合位點與其結合搭配物(例如，抗原)之間的非共價相互作用的總和的強度。「結合親和力」係指內在結合親和力，其反映結合對(例如，抗體及抗原)之成員之間的1：1相互作用。分子X對其搭配物Y之親和力通常可由平衡解離常數(KD)表示。親和力可藉由本領域中已知之常用方法，包含本文所述之方法來量測。用於量測結合親和力之特定說明性及例示性實施例描述於下文中。
「特異性地結合」或「特異性結合」係指抗體與抗原以不超過約1×10-7M之親和力值結合。
「親和力成熟」抗體係指相比於親本抗體，在一或多個HVR中存在一或多種改變的抗體，親本抗體沒有此類改變，此類改變引起抗體對抗原之親和力改善。
抗體之「功能性抗原結合位點」為能夠結合目標抗原之抗原結合位點。抗原結合位點之抗原結合親和力不一定與衍生出抗原結合位點之親本抗體一樣強，但是結合抗原之能力必須可使用已知用於評估抗體與抗原之結合的各種方法中之任一者量測。
「經分離抗體」係指已與其天然環境之組分分離之抗體。在一些實施例中，將抗體純化至大於95%或99%之純度，如藉由例如電泳(例如，SDS-PAGE、等電聚焦(IEF)、毛細管電泳)或層析方法(例如，離子交換或逆相HPLC)所測定。關於用於評定抗體純度之方法的綜述，參見例如Flatman等人，《層析雜誌B輯：生物醫學與生命科學中之分析技術(J.Chromatogr.B Analyt.Technol Biomed Life Sci)》,848：79-87。
如本文所用之「基本上相似」或「基本上相同」係指兩個數值(例如，一個與測試抗體相關且另一個與參考抗體相關)之間的相似度足夠高，使得本領域中之熟習此項技術者將認為，在由所述值(例如，KD值)量測之生物學特徵的背景下，兩個值之間的差異具有很小的或沒有生物及/或統計顯著性。
如本文所用之「基本上不同」係指兩個數值(通常，一個與一種分子相關且另一個與參考分子相關)之間的差異度足夠高，使得本領域中之熟習此項技術者將認為，在由所述值(例如，KD值)量測之生物學特徵的背景下，兩個值之間的差異具有統計顯著性。
「效應功能」係指可歸因於抗體之Fc區之生物活性，其隨抗體同型而變化。抗體效應功能之實例包含：Clq結合及補體依賴性細胞毒性(CDC)；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細胞表面受體(例如，B細胞受體)之下調；及B細胞活化。
「免疫結合物」係指與一或多個異源分子結合之抗體，所述異源分子包含但不限於細胞毒性劑。
「治療(Treatment/treat/treating)」係指試圖改變待治療個體之病症之自然過程的臨床干預，且可為了預防而進行或在臨床病理學過程中進行。所期望的治療結果可以包含但不限於預防病症發生或復發，緩解症狀，減輕病症之任何直接或間接病理性結果，預防轉移，減緩進展速率，改善或緩和疾病狀態，及緩解或改善預後。例如，治療可以包含向個體投與治療有效量之包括抗IL1RAP抗體之醫藥調配物以延遲由IL1RAP介導之疾病或病狀之發展或減緩其進展。
「醫藥調配物」係指一種形式的製劑，其允許活性成分之生物活性是有效的，且不含對投與所述調配物之個體有毒的其他組分。
「醫藥學上可接受之載劑」係指醫藥調配物中除活性成分以外之對其所投與之個體無毒的成分。醫藥學上可接受之載劑包含但不限於緩衝劑、賦形劑、穩定劑或防腐劑。
「治療有效量」係指活性成分或藥劑(例如，醫藥調配物)達成所期望的治療或預防結果，例如治療或預防個體中之疾病、病症或病狀的量。在由IL1RAP介導之疾病或病狀之情況下，治療劑之治療有效量為在一定程度上降低、預防、抑制及/或減輕與疾病、病症或病狀相關的症狀中之一或多者的量。對於哮喘治療，活體內功效可以例如藉由評定症狀之持續時間、嚴重程度及/或復發、反應率(RR)、反應持續時間及/或生活品質來量測。
如本文所用之「同時」係指兩種或更多種治療劑之投與，其中至少一部分投與在時間上重疊。因此，同時投與包含在停止投與一或多種其他藥劑之後繼續投與一或多種藥劑時的給藥方案。
「個體(individual)」或「個體(subject)」係指哺乳動物，包含但不限於家畜(例如，牛、羊、貓、狗及馬)、靈長類動物(例如，人類及非人類靈長類動物，諸如猴)、兔及嚙齒動物(例如，小鼠及大鼠)。
各種實施例之詳細描述
I. IL-1細胞介素家族
IL-1家族包括多種促效劑細胞介素，包含IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β及IL-36γ，其充當免疫、細胞增殖及發炎之病原性介體及調節劑。此類細胞介素各自與其各別同源細胞膜受體之結合引起IL1RAP輔受體之募集及觸發細胞內信號轉導之信號傳導複合物之形成。
例如，IL-1α充當促效劑細胞介素，經由其與其同源受體IL1R1之結合而引發細胞內信號傳導。在IL-1α與IL1R1結合時，輔受體輔助蛋白IL1RAP被募集且結合，形成包括IL-1α、IL1R1及IL1RAP之三元信號傳導複合 物。由IL-1α刺激之信號轉導引起目標細胞中之核因子κB(NF-κB)轉錄因子途徑及促***原活化蛋白激酶(MAPK)途徑之活化且觸發病原性發炎、細胞增殖及免疫反應之級聯。隨後發生之信號級聯引起與病原性發炎、細胞增殖及免疫反應相關之若干蛋白質的表現。參見例如Garlanda等人，《免疫》,39：1003-1018(2013)。
類似地，IL-1β充當促效劑細胞介素，經由與其同源受體IL1R1之結合而引發細胞內信號傳導。在IL-1β與IL1R1結合時，輔受體IL1RAP被募集且結合，引起包括IL-1β、IL1R1及IL1RAP之三元信號傳導複合物之形成。由IL-1β介導之信號轉導引起目標細胞中之NF-κB轉錄因子途徑及促***原活化蛋白激酶途徑之活化，其促成信號級聯，引起與病原性發炎、細胞增殖及免疫反應相關之多種蛋白質的表現。參見例如Wang等人，《自然．免疫學(Nature Immunol.)》,11(1)：905-912(2010)；Saluja等人，《臨床及轉化過敏(Clin.Transl.Allergy)》,5：33(2015)。
促效劑細胞介素IL-33藉由與其同源受體ST2(亦稱為IL1RL1)結合而介導其功能性細胞內信號傳導作用，其後繼之以輔受體IL1RAP之募集及結合，形成包括IL-33、ST2及IL1RAP之三元信號傳導複合物。由IL-33介導之信號轉導引起NF-κB轉錄因子途徑及AP-1途徑之活化且產生一系列的免疫及發炎反應。參見例如Sebastian Gunther等人，《免疫》,47：510-523(2017)。信號級聯引起與病原性發炎、細胞增殖及免疫反應相關之多種蛋白質的表現。Shafaqat Ali等人，PNAS,104(47)：18660-18665(2007)。
促效劑細胞介素IL-36α、IL-36β及IL-36γ中之每一者藉由與同源受體IL1RL2結合而誘導細胞內信號傳導。此等IL-36細胞介素中之任一者與IL1RL2之結合造成輔受體IL1RAP之募集及結合，引起包括IL1RL2、IL1RAP及引發信號傳導事件之各別IL-36細胞介素的三元信號傳導複合物之形成。由 IL-36α、IL-36β或IL-36γ刺激之信號轉導引起目標細胞中之NK-κB轉錄因子及AP-1途徑之活化且誘導各種發炎、增殖及病原性免疫反應。參見例如Jennifer Towne等人，《生物化學雜誌(J.Biol.Chem.)》,279(14)：13677-13688(2004)；Sebastian Gunther等人，《免疫學雜誌》,193(2)：921-930(2014)。
II. IL1RAP
IL1RAP為在某些細胞表面上表現之膜蛋白。人類IL1RAP(在本文中亦稱為「hu-IL1RAP」)之序列及註釋可藉由Genbank寄存編號AAB84059.1或UniProt條目Q9NPH3找到。全長hu-IL1RAP前驅蛋白之胺基酸序列在本文中列為SEQ ID NO：1。編碼全長hu-IL1RAP之例示性1740個核苷酸的序列在本文中列為SEQ ID NO：2。
全長hu-IL1RAP之胺基酸序列以連續次序包括信號肽、細胞外結構域、跨膜結構域及細胞質結構域。信號序列包括SEQ ID NO：1之胺基酸1-20。hu-IL1RAP之成熟形式包括SEQ ID NO：1之胺基酸21-570。hu-IL1RAP之細胞外結構域包括SEQ ID NO：1之胺基酸21-367。hu-IL1RAP之細胞外結構域進一步包括三個不同結構域。結構域1(「D1」)包括SEQ ID NO：1之胺基酸21-133。結構域2(「D2」)包括SEQ ID NO：1之胺基酸134-237。結構域3(「D3」)包括SEQ ID NO：1之胺基酸238-367。hu-IL1RAP之跨膜結構域及細胞質結構域分別包括SEQ ID NO：1之胺基酸368-388及胺基酸389-570。
與全長hu-IL1RAP蛋白之部分對應的多肽構築體可用作抗原以引發具有高結合親和力之抗IL1RAP抗體。如本文其他地方所揭示，此等抗IL1RAP抗體能夠減少藉由IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β及IL-36γ中之一或多者與其同源受體之結合引發的細胞內信號。與hu-IL1RAP蛋白之部分對應的適用作抗原的多肽構築體包含與hu-IL1RAP之細胞外結構域及結構域D1、D2、D1+D2及D3對應的多肽。
下表1提供本發明之hu-IL1RAP多肽構築體之序列之概述及其序列識別符。另外，提供與小鼠及食蟹獼猴IL1RAP蛋白對應的簡化多肽構築體，因為其適用於確定抗hu-IL1RAP抗體之交叉反應性。所述序列亦包含於隨附序列表中。
Figure 108129005-A0202-12-0038-518
Figure 108129005-A0202-12-0039-519
Figure 108129005-A0202-12-0040-520
III.抗IL1RAP抗體
在一些實施例中，本發明按照各種熟知免疫球蛋白特徵(例如，CDR、HVR、FR、VH及VL結構域)之胺基酸及編碼核苷酸序列提供抗IL1RAP抗體之結構。下表2提供本發明之抗IL1RAP抗體序列之概述及其序列識別符。所述序列包含於隨附序列表中。
Figure 108129005-A0202-12-0041-521
Figure 108129005-A0202-12-0042-522
Figure 108129005-A0202-12-0043-523
Figure 108129005-A0202-12-0044-524
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Figure 108129005-A0202-12-0046-526
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Figure 108129005-A0202-12-0051-531
1.抗IL1RAP抗體之結合親和力及細胞信號傳導抑制
在一些實施例中，本文所提供之抗IL1RAP抗體對於與人類IL1RAP之結合具有<100nM、<10nM、<1nM、<0.1nM、<0.01nM或<0.001nM(例如，10-8M或更小、10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)之平衡解離常數(KD)。更具體而言，在一些實施例中，本發明之抗IL1RAP抗體以1×10-8M或更小、1×10-9M或更小、1×10-10M或更小、或1×10-11M或更小之結合親和力與人類IL1RAP結合。在一些實施例中，結合親和力按照與SEQ ID NO：3之hu-M-IL1RAP多肽結合之平衡解離常數(KD)來量測。通常，配體與其受體之結合親和力可以使用各種分析中之任一者測定且以各種定量值來表示。適用於測定抗體親和力之特異性IL1RAP結合分析揭示於本文實例中。另外，本領域中已知且本文中可使用的抗原結合分析包含但不限於使用諸如西方墨點法(western blots)之技術的任何直接或競爭性結合分析、放射免疫分析、酶聯免疫吸附分析(ELISA)、「夾心」免疫分析、基於表面電漿子共振之分析(諸如如WO2005/012359中所述之BIAcore分析)、免疫沈澱分析、螢光免疫分析及蛋白A免疫分析。
因此，在一些實施例中，結合親和力表示為KD值且反映內在結合親和力(例如，具有最小化的親合效應)。本發明之抗IL1RAP抗體對hu-M-IL1RAP多肽(SEQ ID NO：3)呈現強結合親和力，例如呈現介於10nM與1pM之間的KD值。
在一些實施例中，本文所提供之抗IL1RAP抗體降低、抑制及/或完全阻斷藉由由IL1RAP介導之途徑的細胞內信號傳導，所述途徑包含IL-1、IL-33及/或IL-36信號傳導途徑，且更具體而言，藉由以下促效劑中之一或多者之結合刺激的信號傳導途徑：IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β及IL-36γ。 抗體抑制此等由IL1RAP介導之信號傳導途徑的能力可以使用已知基於細胞之阻斷分析進行活體外分析，所述基於細胞之阻斷分析包含本發明之實例中所述的HEK-BLUETM報導細胞分析及基於初代細胞之阻斷分析。在一些實施例中，抗體降低、抑制及/或完全阻斷細胞內信號傳導之能力按照抗體之IC50，使用基於報導細胞之阻斷分析，採用濃度為約EC50之促效劑IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β及/或IL-36γ來測定。促效劑EC50在分析之前常常只能估計且在使用資料之非線性回歸分析完成分析之後確定。在此類分析中，約EC50之值通常將在EC40-45至EC55-60之範圍內。
因此，在一些實施例中，基於降低、抑制及/或完全阻斷藉由由IL1RAP介導之途徑的細胞內信號傳導的能力，本發明之IL1RAP抗體之特徵在於以下功能特性中之一或多者。
在一些實施例中，抗IL1RAP抗體使IL-1刺激的信號、IL-33刺激的信號及/或IL-36刺激的信號減少至少90%、至少95%、至少99%或100%。在一些實施例中，信號之減少可使用基於報導細胞之阻斷分析(例如，HEK-BLUETM報導細胞分析)量測。一般技術者可以選擇已知用於測定IL-1刺激的、IL-33刺激的及/或IL-36刺激的途徑中之細胞信號傳導之抑制的已知報導細胞分析中之任一者。通常，本發明之抗IL1RAP抗體減少藉由濃度為約EC50(例如，EC40至EC60)之促效劑之結合引發的由IL1RAP介導之細胞內信號，其中抗體之IC50值為10nM或更小、5nM或更小、或1nM。
在一些實施例中，抗IL1RAP抗體使IL-1刺激的信號、IL-33刺激的信號及IL-36刺激的信號減少至少95%或至少99%；視情況，其中IL-1、IL-33及/或IL-36刺激的信號係藉由選自IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β及IL-36γ之促效劑刺激的；視情況，其中在約EC50之促效劑濃度下，抗體具有10nM或更小、5nM或更小、或1nM或更小之IC50。
在一些實施例中，抗IL1RAP抗體使藉由IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β及IL-36γ促效劑中之一或多者與其同源受體結合引發的細胞內信號減少至少90%、至少95%、至少99%或100%。在一些實施例中，抗IL1RAP抗體抑制IL8從初代人類肺纖維母細胞(PHLF)之由IL-1α、IL-1β及/或IL-36β刺激之釋放；視情況，其中在約EC50之IL-1α、IL-1β及/或IL-36β濃度下，所述抗體具有10nM或更小、5nM或更小、或1nM或更小之IC50。在一些實施例中，抗IL1RAP抗體抑制IL6從初代人類單核球之由IL-1β刺激之釋放；視情況，其中在約EC50之IL-1β濃度下，所述抗體具有10nM或更小、5nM或更小、或1nM或更小之IC50。在一些實施例中，抗IL1RAP抗體抑制INF-γ從人類自然殺手(NK)細胞之由IL-33刺激之釋放；視情況，其中在約EC50之IL-33濃度下，所述抗體具有10nM或更小、5nM或更小、或1nM或更小之IC50。在一些實施例中，抗體抑制IL8從人類表皮角質細胞(HEKn)之由IL-36β刺激之釋放；視情況，其中在約EC60之IL-36β濃度下，所述抗體具有10nM或更小、5nM或更小、或2nM或更小之IC50。在一些實施例中，抗體抑制嗜鹼性球中之由IL-33刺激之磷酸化；視情況，其中在約EC56之IL-33濃度下，所述抗體具有75nM或更小、50nM或更小、或45nM或更小之IC50。在一些實施例中，抗體抑制INF-γ從CD4+ T細胞之由IL-33刺激之釋放；視情況，其中在約EC34之IL-33濃度下，所述抗體具有75nM或更小、50nM或更小、或45nM或更小之IC50。
2.抗體片段
在一些實施例中，本發明之抗IL1RAP抗體可為抗體片段。可與本發明之結合決定子一起使用的抗體片段包含但不限於Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、Fv、單價單臂(one-armed/single-armed)抗體、scFv片段及本文所述且本領域中已知之其他片段。關於各種抗體片段之綜述，參見例如Hudson等人，《自然．醫學(Nat.Med.)》,9：129-134(2003)。關於scFv片段之綜述，參見例如 Pluckthun,《單株抗體之藥理學(The Pharmacology of Monoclonal Antibodies)》，第113卷，Rosenburg及Moore編，(紐約施普林格出版社)，第269-315頁(1994)；亦參見WO93/16185；及美國專利第5,571,894號及第5,587,458號。關於包括救助受體結合抗原決定基殘基且具有增加之活體內半衰期之Fab及F(ab')2片段的描述，參見美國專利第5,869,046號。其他單價抗體形式描述於例如WO2007/048037、WO2008/145137、WO2008/145138及WO2007/059782中。單價單臂抗體描述於例如WO2005/063816中。雙功能抗體為具有兩個抗原結合位點之抗體片段，其可為二價或雙特異性的(參見例如EP0404097；WO93/01161；Hudson等人，《自然．醫學》,9：129-134(2003)；及Holliger等人，《美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad. Sci.USA)》,90：6444-6448(1993))。
在一些實施例中，抗體片段為單結構域抗體，其包括抗體之全部或部分重鏈可變結構域或全部或部分輕鏈可變結構域。在一些實施例中，單結構域抗體為人類單結構域抗體(馬薩諸塞州沃爾珊(Waltham,MA)之Domantis,Inc.；參見例如美國專利第6,248,516號)。
抗體片段可藉由各種技術製得，所述技術包含但不限於蛋白分解消化完整抗體以及藉由重組宿主細胞(例如，大腸桿菌(E.coli)或噬菌體)產生，如本文所述。
預期本發明之抗IL1RAP抗體中之任一者可使用本領域中已知及/或本文所述之方法及技術製備為抗體片段。例如，本發明之各種抗IL1RAP抗體之Fab形式之製備及分析描述於實例8中。
3.嵌合抗體及人類化抗體
在一些實施例中，本發明之抗IL1RAP抗體可為嵌合抗體。(參見例如如美國專利第4,816,567號；及Morrison等人，《美國國家科學院院刊》,81：6851-6855(1984)中所述之嵌合抗體)。在一個實施例中，嵌合抗體包括非人 類可變區(例如，衍生自小鼠、大鼠、倉鼠、兔或諸如猴之非人類靈長類動物的可變區)及人類恆定區。在一些實施例中，嵌合抗體為「類別轉換」抗體，其中類別或亞類已自親本抗體之類別或亞類改變。預期嵌合抗體可以包含其抗原結合片段。
在一些實施例中，本發明之抗IL1RAP抗體為人類化抗體。通常，對非人類抗體進行人類化以降低對人類之免疫原性，同時保留親本非人類抗體之特異性及親和力。通常，人類化抗體包括一或多個可變結構域，其中HVR，例如CDR(或其部分)，衍生自非人類抗體，且FR(或其部分)衍生自人類抗體序列。人類化抗體視情況亦將包括人類恆定區之至少一部分。在一些實施例中，人類化抗體中之一些FR殘基經來自非人類抗體(例如，衍生出CDR殘基之抗體)之對應殘基取代，以恢復或改善抗體特異性或親和力。
人類化抗體及其製造方法綜述於例如Almagro及Fransson,《生物科學前沿(Front.Biosci.)》,13：1619-1633(2008)中，且進一步描述於以下各者中：例如Riechmann等人，《自然》,332：323-327(1988)；Queen等人，《美國國家科學院院刊》,86：10029-10033(1989)；美國專利第5,821,337號、第7,527,791號、第6,982,321號及第7,087,409號；Kashmiri等人，《方法(Methods)》,36：25-34(2005)(描述SDR(a-HVR)接枝)；Padlan,《分子免疫學(Mol.Immunol.)》,28：489-498(1991)(描述「表面再修飾(resurfacing)」)；Dall'Acqua等人，《方法》,36：43-60(2005)(描述「FR改組」)；及Osbourn等人，《方法》,36：61-68(2005)及Klimka等人，《英國癌症雜誌(Br.J.Cancer)》,83：252-260(2000)(描述用以FR改組之「導向選擇」方法)。
可用於人類化之人類構架區包含但不限於：使用「最佳擬合」方法選擇之構架區(參見例如Sims等人，《免疫學雜誌》,151：2296(1993))；衍生自輕鏈或重鏈可變區之特定亞群之人類抗體之共同序列的構架區(參見例如 Carter等人，《美國國家科學院院刊》,89：4285(1992)；及Presta等人，《免疫學雜誌》,151：2623(1993))；人類成熟(體細胞突變)構架區或人類生殖系構架區(參見例如Almagro及Fransson,《生物科學前沿》13：1619-1633(2008))；及衍生自篩選FR庫之構架區(參見例如Baca等人，《生物化學雜誌》272：10678-10684(1997)；及Rosok等人，《生物化學雜誌》,271：22611-22618(1996))。
預期本發明之抗IL1RAP抗體中之任一者可以使用本領域中已知及/或本文所述之方法及技術製備為人類化抗體。例如，本發明之抗IL1RAP抗體之人類化形式之製備及分析描述於實例5-7中。
4.人類抗體
在一些實施例中，本發明之抗IL1RAP抗體可為人類抗體。人類抗體可使用本領域中已知之各種技術產生。人類抗體通常描述於van Dijk及van de Winkel,《化學生物學新見(Curr.Opin.Chem.Biol.)》,5：368-74(2001)及Lonberg,《免疫學新見(Curr.Opin.Immunol.)》,20：450-459(2008)中。人類抗體可藉由向已經修飾以響應於抗原攻擊而產生完整人類抗體或具有人類可變區之完整抗體的基因轉殖動物投與免疫原來製備。此類動物通常含有人類免疫球蛋白基因座之全部或一部分，其置換內源性免疫球蛋白基因座，或存在於染色體外或隨機整合至動物染色體中。在此類基因轉殖小鼠中，內源性免疫球蛋白基因座通常已失活。關於自基因轉殖動物獲得人類抗體之方法之綜述，參見Lonberg,《自然．生物技術(Nat.Biotech.)》23：1117-1125(2005)。亦參見例如美國專利第6,075,181號及第6,150,584號中之XENOMOUSETM技術；美國專利第5,770,429號中之HUMAB®技術；美國專利第7,041,870號中之K-M MOUSE®技術；及美國專利申請公開案第US 2007/0061900號中之VELOCIMOUSE®技術。來自由此類動物產生之完整抗體之人類可變區可例如藉由與不同人類恆定區組合而進一步修飾。
人類抗體亦可藉由基於融合瘤之方法製得。已描述用於產生人類單株抗體之人類骨髓瘤及小鼠-人類雜骨髓瘤細胞株。參見例如Kozbor,《免疫學雜誌》,133：3001(1984)；Brodeur等人，《單株抗體生產技術及應用(Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications)》，第51-63頁(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；及Boerner等人，《免疫學雜誌》,147：86(1991)。經由人類B細胞融合瘤技術產生的人類抗體亦描述於Li等人，《美國國家科學院院刊》,103：3557-3562(2006)中。描述自融合瘤細胞株產生單株人類IgM抗體之額外方法包含例如美國專利第7,189,826號中所述之方法。人類融合瘤技術(亦即，三源融合瘤技術(Trioma technology))描述於例如Vollmers等人，《組織學及組織病理學(Histology and Histopathology)》,20(3)：927-937(2005)及Vollmers等人，《實驗及臨床藥理學中之方法及發現(Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology)》,27(3)：185-91(2005)中。
人類抗體亦可藉由分離選自由人類衍生之噬菌體呈現庫之Fv純系可變結構域序列而產生。此類可變結構域序列隨後可與所期望的人類恆定結構域組合。下文描述用於自抗體庫選擇人類抗體之技術。
預期本發明之抗IL1RAP抗體中之任一者可以使用本領域中已知及/或本文所述之方法及技術製備為人類抗體。
5.庫衍生之抗體
在一些實施例中，本發明之抗IL1RAP抗體可藉由針對具有所期望的一或多種活性之抗體篩選組合庫而分離。例如，本領域中已知多種方法可用於產生噬菌體呈現庫及針對具有所期望的結合特徵之抗體篩選此類庫。本文所揭示之實例中描述使用噬菌體呈現來製備本發明之抗IL1RAP抗體之人類化形式之親和力成熟變體。用於產生此類庫衍生之抗體之其他方法可見於以下各者中：例如Hoogenboom等人，《分子生物學方法(Methods in Molecular Biology)》, 178：1-37(O'Brien等人編，《抗體噬菌體呈現(Antibody Phage Display)》，新澤西州特圖瓦市之胡馬納出版社(Humana Press,Totowa,NJ),2001)；McCafferty等人，《自然》,348：552-554；Clackson等人，《自然》,352：624-628(1991)；Marks等人，《分子生物學雜誌(J.Mol.Biol.)》,222：581-597(1992)；Marks及Bradbury,《分子生物學方法》,248：161-175(Lo編，《抗體工程化(Antibody Engineering)》，新澤西州特圖瓦市之胡馬納出版社，2003)；Sidhu等人，《分子生物學雜誌》,338(2)：299-310(2004)；Lee等人，《分子生物學雜誌》,340(5)：1073-1093(2004)；Fellouse,《美國國家科學院院刊》,101(34)：12467-12472(2004)；及Lee等人，《免疫學方法雜誌(J.Immunol.Methods)》,284(1-2)：119-132(2004)。
預期，可使用組合庫篩選，使用本領域中已知及/或本文所述之方法及技術，產生本發明之抗IL1RAP抗體之變體。例如，實例8中描述使用噬菌體呈現庫產生及篩選以製備廣泛範圍之本發明之人類化抗IL1RAP抗體之親和力成熟變體。
6.多特異性抗體
在一些實施例中，本發明之抗IL1RAP抗體為多特異性抗體，例如雙特異性抗體。在一些實施例中，多特異性抗體為具有至少兩個不同結合位點之單株抗體，各結合位點對不同抗原具有結合特異性，其中之至少一者特異性結合IL1RAP。在一些實施例中，結合位點中之至少一者特異性結合細胞毒性劑。在例示性實施例中，本發明之抗IL1RAP抗體為雙特異性抗體且可用以將細胞毒性劑定位於表現IL1RAP之細胞。
用於製造多特異性抗體之技術包含但不限於重組共表現具有不同特異性之兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(參見例如Milstein及Cuello,《自然》,305：537(1983)；WO 93/08829；及Traunecker等人，《歐洲分子生物學學會雜誌(EMBO J.)》,10：3655(1991))。亦可以使用「杵-臼(knob-in-hole)」工程化 (參見例如美國專利第5,731,168號)。
多特異性抗體亦可如下製備：藉由工程化有利於形成Fc-異源二聚抗體分子而非同源二聚體之「靜電導向(electrostatic steering)」效應(WO 2009/089004A1)；使兩個或更多個抗體或片段交聯(參見例如美國專利第4,676,980號及Brennan等人，《科學(Science)》,229：81(1985))；使用白胺酸拉鏈產生雙特異性抗體(參見例如Kostelny等人，《免疫學雜誌》,148(5)：1547-1553(1992))；使用用於製造雙特異性抗體片段之「雙功能抗體」技術(參見例如Hollinger等人，《美國國家科學院院刊》,90：6444-6448(1993))；使用單鏈Fv(sFv)二聚體(參見例如Gruber等人，《免疫學雜誌》,152：5368(1994))；或三特異性抗體(參見例如Tutt等人，《免疫學雜誌》147：60(1991))。
預期本發明之抗IL1RAP抗體中之任一者可以使用本領域中已知及/或本文所述之方法及技術製備為多特異性抗體。
7.抗體變體
在一些實施例中，亦涵蓋本發明之抗IL1RAP抗體之變體。例如，具有改善的結合親和力及/或抗體之其他生物特性之抗體可藉由將適當修飾引入編碼抗體之核苷酸序列中或藉由肽合成來製備。此類修飾包含例如抗體之胺基酸序列內的殘基之缺失及/或***及/或取代。可產生缺失、***及取代之任何組合以獲得最終構築體，其限制條件為所述最終構築體具有所期望的IL1RAP抗原結合特徵。預期本發明之抗IL1RAP抗體之廣泛範圍之變體可以使用本領域中已知及/或本文所述之方法及技術製備，包含但不限於：(i)胺基酸取代、***及/或缺失變體；(ii)糖基化變體；(iii)Fc區變體；(iv)半胱氨酸工程化變體；及(v)衍生之變體。本發明之實例5-9、表2及序列表提供融合瘤衍生之11C5(Hy)抗IL1RAP抗體之大量例示性變體以及其人類化形式h11C5。例示性變體包括以下中之一或多者：CDR-H2中用以消除半胱胺酸不利條件之胺基酸 取代(例如，C59Y)；賦予無效應功能之Fc區變體(例如，N297G)；及CDR及可變結構域區域中之一系列增加抗原親和力及/或基於細胞之阻斷活性的單一、雙重、三重胺基酸取代(例如，SEQ ID NO：12-35、38-61、64-76、79-120、123-139、142-201、204-225、228-239、259-278及280-310)。
A.取代、***及缺失變體
在一些實施例中，提供具有一或多個除本文所述之胺基酸取代外之胺基酸取代的抗IL1RAP抗體變體。突變誘發位點可以包含HVR及FR。典型的「保守」胺基酸取代及/或基於共同側鏈類別或特性之取代為本領域中熟知的且可用於在本發明之實施例中。本發明亦涵蓋基於非保守胺基酸取代之變體，其中用其中一個胺基酸側鏈類別之成員更換另一類別之胺基酸。
胺基酸側鏈通常根據以下類別或共同特性分組；(1)疏水性：Met、Ala、Val、Leu、Ile、正白胺酸；(2)中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)鹼性：His、Lys、Arg；(5)鏈取向影響：Gly、Pro；及(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
用於抗體中之胺基酸取代及隨後針對所期望的功能篩選之技術為本領域中熟知的，所述功能例如保留的/改善的抗原結合、減小的免疫原性或改善的ADCC或CDC。
胺基酸取代變體可以包含取代親本抗體(例如，人類化抗體或人類抗體)之一或多個高變區殘基。通常，選擇用於進一步研究之所得變體相對於親本抗體將在某些生物特性方面具有修飾(例如，增加的親和力、減小的免疫原性)及/或將基本上保留親本抗體之某些生物特性。例示性取代變體為親和力成熟抗體，其可例如使用基於噬菌體呈現之親和力成熟技術，諸如本文實例中所述之技術，便利地產生。簡言之，使一或多個HVR殘基發生突變，且在噬菌體上呈現變異抗體且針對特定生物活性(例如，結合親和力)進行篩選。
一種適用於鑑定可經靶向用於突變誘發之抗體殘基或區域的方法為「丙胺酸掃描突變誘發」(參見例如Cunningham及Wells(1989)《科學》,244：1081-1085)。在此方法中，鑑定殘基或一組目標殘基(例如帶電殘基，諸如Arg、Asp、His、Lys及Glu)且將其替換為中性或帶負電胺基酸(例如，Ala或聚丙胺酸)以確定抗體與抗原之相互作用是否受影響。可在胺基酸位置引入進一步取代，證明對初始取代之功能敏感性。或者或另外，可測定抗原-抗體複合物之晶體結構以鑑定抗體與抗原之間的接觸點。此類接觸殘基及鄰近殘基可作為取代候選者而被靶向或消除。可篩選變體以確定其是否含有所期望的特性。
胺基酸序列***包含在一個殘基至含有一百個或更多個殘基之多肽的長度範圍內的胺基及/或羧基端融合物，以及單個或多個胺基酸殘基之序列內***。末端***之實例包含具有N端甲硫胺醯基殘基之抗體。抗體分子之其他***變體包含抗體之N端或C端與酶或增加抗體之血清半衰期之多肽的融合。
可以在HVR中進行取代以改善抗體親和力。可在「熱點」中做出此類改變，所述熱點亦即由在體細胞成熟過程期間經歷高頻率突變之密碼子所編碼之殘基(參見例如Chowdhury,《分子生物學方法》,207：179-196(2008))，其中測試所得變異VH或VL之結合親和力。在一個實施例中，親和力成熟可以藉由構築及從二級庫再選擇而進行(參見例如Hoogenboom等人，《分子生物學方法》,178：1-37(O'Brien等人編，《抗體噬菌體呈現》，新澤西州特圖瓦市之胡馬納出版社，(2001)))。另一種用以引入多樣性之方法涉及HVR定向方法，其中將若干HVR殘基(例如，一次4-6個殘基)隨機化。可特異性地鑑定參與抗原結合之HVR殘基，例如使用丙胺酸掃描突變誘發或模型化。常常尤其靶向CDR-H3及CDR-L3。
在一些實施例中，取代、***或缺失可發生在一或多個HVR內， 只要此等改變不實質上降低抗體結合抗原之能力即可。例如，可在HVR中進行不實質上降低結合親和力之保守改變(例如，如本文所提供之保守取代)。此類改變可在HVR「熱點」外部。在上文所提供之變異VH及VL序列之一些實施例中，各HVR未改變或含有不超過一個、兩個或三個胺基酸取代。
B.糖基化變體
在一些實施例中，改變本發明之抗IL1RAP抗體以增加或降低抗體之糖基化程度。向抗體添加糖基化位點或使抗體缺失糖基化位點可藉由改變胺基酸序列以使得一或多個糖基化位點產生或被移除來實現。
在抗體包括Fc區之實施例中，可改變與Fc區連接之碳水化合物。通常，由哺乳動物細胞產生之天然抗體包括藉由N鍵與Fc區之CH2結構域之Asn297連接的分支鏈雙觸角寡醣(參見例如Wright等人，《生物技術趨勢(TIBTECH)》,15：26-32(1997))。寡醣可包含各種碳水化合物，諸如甘露糖、N-乙醯基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖及唾液酸，以及與雙觸角寡醣結構之「主幹」中之GlcNAc連接的岩藻糖。在一些實施例中，對抗體Fc區之寡醣之修飾可產生具有某些改善特性之變體。
在一些實施例中，本發明之抗IL1RAP抗體可為親本抗體之變體，其中所述變體包括沒有岩藻糖與Fc區連接(直接或間接)的碳水化合物結構。例如，此類抗體中之岩藻糖之量可為約1%至約80%、約1%至約65%、約5%至約65%、或約20%至約40%。岩藻糖之量可藉由相對於如藉由MALDI-TOF質譜法(參見例如WO 2008/077546)所量測的與Asn 297連接之所有糖結構(例如，複雜、混合及高甘露糖結構)之總和計算糖鏈內在Asn297處之岩藻糖之平均量來測定。Asn297係指位於Fc區中約位置297之天冬醯胺殘基(Fc區殘基之Eu編號)；然而，歸因於抗體中微小的序列變異，Asn297亦可位於位置297之上游或下游約±3個胺基酸處，亦即介於位置294與300之間。
在一些實施例中，岩藻糖基化變體可以具有改善的ADCC功能。參見例如美國專利公開案第US 2003/0157108號或第US 2004/0093621號。「去岩藻糖基化」或「缺乏岩藻糖之」抗體及其相關製備方法之實例揭示於以下各者中：例如US2003/0157108；US2003/0115614；US2002/0164328；US2004/0093621；US2004/0132140；US2004/0110704；US2004/0110282；US2004/0109865；WO2000/61739；WO2001/29246；WO2003/085119；WO2003/084570；WO2005/035586；WO2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等人，《分子生物學雜誌》,336：1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人，《生物技術與生物工程(Biotech.Bioeng.)》87：614(2004)。
適用於產生去岩藻糖基化抗體之細胞株包含缺乏蛋白質岩藻糖基化之Led 3 CHO細胞(參見例如Ripka等人，《生物化學與生物物理學集刊(Arch.Biochem.Biophys.)》,249：533-545(1986)；US2003/0157108；及WO2004/056312)，及基因剔除(knockout)細胞株，諸如α-1,6-岩藻糖基轉移酶基因FUT8基因剔除CHO細胞(參見例如Yamane-Ohnuki等人，《生物技術與生物工程》87：614(2004)；Kanda,Y.等人，《生物技術與生物工程》,94(4)：680-688(2006)；及WO2003/085107)。
C. Fc區變體
在一些實施例中，本發明之抗IL1RAP抗體可在Fc區中包括一或多個胺基酸修飾(亦即，Fc區變體)。Fc區變體可包括在一或多個胺基酸殘基位置包括胺基酸取代的人類Fc區序列(例如，人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc區)。下文描述本領域中已知的可與本發明之抗IL1RAP抗體一起使用的廣泛範圍的Fc區變體。
在一些實施例中，抗IL1RAP抗體為具有改變的效應功能之Fc區變體。在一些實施例中，具有改變的效應功能之抗體具有親本抗體之一些(而 非所有)效應功能、降低的效應功能或沒有效應功能(例如，無效應)。對於某些應用，其中效應功能(諸如ADCC)係不必要的或有害的及/或抗體之活體內半衰期係重要的，無效應Fc區變體更為合乎需要。
具有降低的效應功能或無效應的Fc區變異抗體可以在以下Fc區位置中之一或多者包含胺基酸取代：238、265、269、270、297、327及329。(參見例如美國專利第6,737,056號)。此類Fc區變體可以在位置265、269、270、297及327中之兩者或更多者包含胺基酸取代。此類Fc區變體亦可以包含丙胺酸對殘基265及297之取代(參見例如美國專利第7,332,581號)。如本文實例及其他地方所揭示，在一些實施例中，本發明之抗IL1RAP抗體為無效應Fc區變體。在一些實施例中，抗IL1RAP抗體之無效應Fc區變體包括胺基酸取代N297G。
與FcR之結合改善或減弱的Fc區變體揭示於例如美國專利第6,737,056號；WO 2004/056312；及Shields等人，《生物化學雜誌》,276(9)：6591-6604(2001)中。具有改善的ADCC之Fc區變體可在例如Fc區之位置298、333及/或334(基於EU編號)包括一或多個胺基酸取代。具有改變的(亦即，改善的或減弱的)Clq結合及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)之Fc區變體如例如美國專利第6,194,551號；WO99/51642；及Idusogie等人，《免疫學雜誌》,164：4178-4184(2000)中所述。半衰期增加且與新生兒Fc受體(FcRn)之結合改善的Fc區變體揭示於例如US2005/0014934A1(Hinton等人)中。此類Fc區變體在以下位置中之一或多者包括胺基酸取代：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424及434。其他具有增加的半衰期之Fc區變體包含在位置252、254及256之YTE突變組(亦即，M252Y/S254T/T256E)，如例如US 7658921B2(Dall'Acqua等人)中所述。如本文實例及其他地方所揭示，在一些實施例中，本發明之抗 IL1RAP抗體為包含YTE突變組之Fc區變體。Fc區變體之其他實例可見於例如美國專利第5,648,260號及第5,624,821號；及第WO94/29351號中。
如本文其他地方所述，天然存在之抗體之Fc區通常在位置447包含C端離胺酸(Lys447)。然而，由於酶促裂解(例如，在CHO細胞中產生)，此C端離胺酸常常在細胞培養物中產生重組抗體期間從Fc區裂解。因此，意欲本文中描述為包括具有C端離胺酸之Fc區的抗IL1RAP抗體中之任一者亦包含除沒有C端離胺酸外相同的包括Fc區之抗IL1RAP抗體。類似地，意欲本文描述為包括無C端離胺酸之Fc區的抗IL1RAP抗體中之任一者亦包含除含C端離胺酸外相同的包括Fc區之抗IL1RAP抗體。
通常，可進行活體外及/或活體內細胞毒性分析以證實Fc區變體中CDC及/或ADCC活性之降低/耗竭。例如，可進行Fc受體(FcR)結合分析以確保抗體缺乏FcγR結合(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn結合能力。用於介導ADCC之初代細胞NK細胞僅表現FcγRIII，而單核球表現FcγRI、FcγRII及FcγRIII。用以評定感興趣的分子之ADCC活性之活體外分析之非限制性實例描述於美國專利第5,500,362號(參見例如Hellstrom等人，《美國國家科學院院刊》,83：7059-7063(1986))及Hellstrom等人，《美國國家科學院院刊》,82：1499-1502(1985)；5,821,337(參見Bruggemann,M.等人，《實驗醫學雜誌(J.Exp.Med.)》,166：1351-1361(1987))中。或者，可採用非放射性分析方法(參見例如用於流動式細胞測量術之ACTITM非放射性細胞毒性分析(加利福尼亞州山景城之細胞科技公司(CellTechnology,Inc.MountainView,CA))；及CytoTox96®非放射性細胞毒性分析(威斯康星州麥迪遜之普洛麥格(Promega,Madison,WI))。適用於此類分析之效應細胞包含末梢血液單核細胞(PBMC)及自然殺手(NK)細胞。或者或另外，可活體內評定感興趣的分子之ADCC活性，例如在動物模型中，諸如Clynes等人，《美國國家科學院院刊》,95：652-656(1998) 中所揭示之動物模型。亦可進行Clq結合分析以確認抗體不能結合Clq且因此缺乏CDC活性。參見例如WO2006/029879及WO2005/100402中之Clq及C3c結合ELISA。為了評定補體活化，可進行CDC分析(參見例如Gazzano-Santoro等人，《免疫學方法雜誌》,202：163(1997)；Cragg,M.S.等人，《血液(Blood)》101,1045-1052(2003)；及Cragg,M.S.及M.J.Glennie,《血液》,103：2738-2743(2004))。可使用本領域中已知之方法進行FcRn結合及活體內消除率/半衰期測定(參見例如Petkova等人，《國際免疫學(Int.Immunol.)》,18(12)：1759-1769(2006))。
預期本發明之抗IL1RAP抗體之廣泛範圍的Fc區變體可以使用本領域中已知及/或本文所述之方法及技術製備。例如，如實例9中所述，製備成具有N297G胺基酸取代之Fc區變體賦予抗IL1RAP抗體無效應功能，且保留基於細胞之阻斷活性。
D.半胱胺酸工程化變體
在一些實施例中，預期本文所述之抗IL1RAP抗體可在特定的非CDR位置經半胱胺酸殘基取代以便產生反應性硫醇基。此類工程化「thioMAb」可用於使抗體與例如藥物部分或連接子-藥物部分結合且從而產生免疫結合物，如本文其他地方所述。半胱胺酸工程化抗體可如例如美國專利第7,521,541號中所述產生。在一些實施例中，以下抗體殘基中之任一者或多者可經半胱胺酸取代：輕鏈之V205(Kabat編號)；重鏈之A118(EU編號)；及重鏈Fc區之S400(EU編號)。
E.衍生變體
在一些實施例中，本發明之抗IL1RAP抗體可經非蛋白質部分進一步修飾(亦即，衍生化)。適合於衍生抗體之非蛋白質部分包含但不限於水溶性聚合物，諸如：聚乙二醇(PEG)、乙二醇與丙二醇之共聚物、羧甲基纖維 素、聚葡萄糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚-1,3-二氧雜環戊烷、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/順丁烯二酸酐共聚物、聚-胺基酸均聚物或無規共聚物、及聚葡萄糖或聚(n-乙烯基吡咯啶酮)聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如，甘油)、聚乙烯醇及其混合物。在一些實施例中，可使用甲氧基-聚乙二醇丙醛對抗體進行修飾。聚合物可具有任何分子量，且可為分支鏈或未分支的。與抗體連接之聚合物的數目可變化，且若連接超過一個聚合物，則所述聚合物可為相同或不同分子。一般而言，用於衍生化之聚合物的數目及/或類型可基於以下考慮因素來確定：包含但不限於抗體之特定特性或功能，例如是否將在限定條件下之療法中使用抗體衍生物。
8.免疫結合物
在一些實施例中，本發明之抗IL1RAP抗體亦可為免疫結合物，其中免疫結合物包括與一或多種細胞毒性劑結合之抗IL1RAP抗體。本發明所涵蓋之適合細胞毒性劑包含化學治療劑、藥物、生長抑制劑、毒素(例如，蛋白質毒素；細菌、真菌、植物或動物來源之酶促活性毒素；或其片段)或放射性同位素。
在一些實施例中，免疫結合物為抗體-藥物結合物(ADC)，其中如本文所述之抗IL1RAP抗體與一或多種藥物結合。
在一些實施例中，本發明之免疫結合物包括與藥物或治療劑結合的如本文所述之抗IL1RAP抗體以用於治療由IL-1、IL-33、IL-36及/或IL1RAP介導之疾病或病狀。
在一些實施例中，如本文所述之抗IL1RAP抗體可以與酶促活性毒素或其片段結合，所述酶促活性毒素或其片段包含但不限於白喉A鏈(diphtheria A chain)、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素A鏈(來自綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒素A鏈(ricin A chain)、相思子毒素 A鏈(abrin A chain)、莫迪素A鏈(modeccin A chain)、α-帚麴菌素(alpha-sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白、康乃馨(dianthin)蛋白、洋商陸(Phytolaca americana)蛋白、苦瓜(Momordica charantia)抑制劑、麻瘋樹毒蛋白(curcin)、巴豆毒素(crotin)、肥皂草(Sapaonaria officinalis)抑制劑、白樹素(gelonin)、有絲***素(mitogellin)、侷限麴菌素(restrictocin)、酚黴素(phenomycin)、伊諾黴素(enomycin)及黴菌毒素(tricothecenes)。
在一些實施例中，本發明之免疫結合物包括與放射性同位素結合的如本文所述之抗IL1RAP抗體(亦即，放射性結合物)。多種放射性同位素可用於產生此類放射性結合物。實例包含211At、131I、125I、90Y、186Re、188Re、153Sm、212Bi、32P、212Pb及Lu之放射性同位素。在一些實施例中，免疫結合物可包括用於閃爍攝影偵測之放射性同位素或用於NMR偵測或MRI之自旋標記。適合的放射性同位素或自旋標記可包含123I、131I、111In、13C、19F、15N、17O、Gd、Mn及Fe之各種同位素。
抗IL1RAP抗體與細胞毒性劑之免疫結合物可以使用各種熟知的雙功能試劑及適合與蛋白質結合之化學物質製得。此類試劑包含但不限於：N-丁二醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)、丁二醯亞胺基-4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸酯(SMCC)、亞胺基硫雜環戊烷(IT)、亞胺基酯之雙功能衍生物(例如，二亞胺代己二酸二甲酯HQ)、活性酯(例如，辛二酸二丁二醯亞胺酯)、醛(例如，戊二醛)、雙疊氮基化合物(例如，雙(對疊氮基苄醯基)-己二胺)、雙重氮衍生物(例如，雙(對重氮苄醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(例如，甲苯-2,6-二異氰酸酯)及雙活性氟化合物(例如，1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。
用於製備本發明之免疫結合物的試劑亦可包含市售「交聯」試劑，諸如：BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、 SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺酸基-EMCS、磺酸基-GMBS、磺酸基-KMUS、磺酸基-MBS、磺酸基-SIAB、磺酸基-SMCC及磺酸基-SMPB及SVSB(丁二醯亞胺基-(4-乙烯基碸)苯甲酸酯)(參見例如，美國伊利諾伊州洛克福之皮爾斯生物技術公司(Pierce Biotechnology,Inc.,Rockford,IL.,U.S.A))。
9.合成抗體
在一些實施例中，本發明之抗IL1RAP抗體可為合成抗體，其包括來自抗IL1RAP免疫球蛋白之一組CDR(例如，CDR-L1等)，該組CDR被接枝至除免疫球蛋白支架或構架外之支架或構架上，諸如替代性蛋白質支架或人工聚合物支架。
預期用於製備本發明之合成抗體的例示性替代性蛋白質支架可以包含但不限於：纖維結合蛋白(fibronectin)、新制癌菌素(neocarzinostatin)CBM4-2、脂質運載蛋白(lipocalins)、T細胞受體、蛋白A結構域(蛋白Z)、Im9、TPR蛋白、鋅指結構域、pVIII、禽類胰臟多肽、GCN4、WW結構域Src同源結構域3、PDZ結構域、TEM-1 β-內醯胺酶、硫氧還蛋白(thioredoxin)、葡萄球菌核酸酶、PHD指結構域、CL-2、BPTI、APPI、HPSTI、大腸桿菌素(ecotin)、LACI-D1、LDTI、MTI-II、蠍毒素、昆蟲防禦素-A肽、EETI-II、Min-23、CBD、PBP、細胞色素b-562、Ldl受體結構域、γ-晶體蛋白、泛蛋白、運鐵蛋白及/或C型類凝集素結構域。
適用於合成抗體之例示性人工聚合物(非蛋白質)支架描述於例如Fiedler等人，(2014)「作為替代性治療劑之非抗體支架(Non-Antibody Scaffolds as Alternative Therapeutic Agents)」,《治療性抗體手冊(Handbook of Therapeutic Antibodies)》(S.Dübel及J.M.Reichert編),Wiley-VCH Verlag GmbH & Co.；Gebauer等人，《化學生物學新見(Curr.Opin.Chem.Biol.)》,13：245-255(2009)；Binz等人，《自然．生物技術》,23(10)：1257-1268(2005)中。
IV.重組方法及組合物
本發明之抗IL1RAP抗體可以使用抗體製造領域中熟知的重組方法及材料產生。在一些實施例中，本發明提供一種編碼抗IL1RAP抗體之經分離核酸。所述核酸可以編碼包括抗體之VL之胺基酸序列及/或包括抗體之VH之胺基酸序列(例如，抗體之輕鏈及/或重鏈)。在一些實施例中，提供一或多種載體(例如，表現載體)，其包括編碼本發明之抗IL1RAP抗體之核酸序列。在一些實施例中，提供一種宿主細胞，其包括編碼本發明之抗IL1RAP抗體之核酸序列。在一個實施例中，宿主細胞已經載體轉形，所述載體包括一種核酸，所述核酸編碼包括抗體之VL之胺基酸序列及包括抗體之VH之胺基酸序列。在另一實施例中，宿主細胞已經第一載體及第二載體轉形，所述第一載體包括編碼包括抗體之VL之胺基酸序列的核酸，所述第二載體包括編碼包括抗體之VH之胺基酸序列的核酸。
在重組方法之一些實施例中，所用宿主細胞為真核細胞，諸如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，或淋巴細胞(例如，Y0、NS0、Sp20)。在一個實施例中，提供一種製造抗IL1RAP抗體之方法，其中所述方法包括在適合於表現抗體之條件下培養如上文所提供之包括編碼抗體之核酸的宿主細胞且視情況自宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收抗體。
簡言之，抗IL1RAP抗體之重組產生係藉由分離編碼抗體(例如，如本文所述)之核酸且將此核酸***一或多個載體中以便在宿主細胞中進一步選殖及/或表現而進行。使用本領域中熟知的習知程序(例如，藉由使用能夠與編碼所期望的抗體之重鏈及輕鏈之基因特異性結合的寡核苷酸探針)，容易對此類核酸進行分離及定序。適合選殖或表現編碼抗體之載體的宿主細胞及培養方法為本領域中熟知的且包含原核或真核細胞。通常，在表現之後，抗體可以可溶性級分自細胞糊狀物分離且進一步經純化。除原核生物之外，諸如絲 狀真菌或酵母之真核微生物亦為適合編碼抗體之載體之選殖或表現宿主，包含糖基化途徑已經「人類化」之真菌及酵母株，從而產生具有部分或完全人類糖基化型態的抗體(參見例如，Gerngross,《自然．生物技術》,22：1409-1414(2004)；及Li等人，《自然．生物技術》,24：210-215(2006))。
適合表現本發明之糖基化抗IL1RAP抗體之宿主細胞亦可衍生自多細胞生物體(無脊椎動物及脊椎動物)。無脊椎動物細胞之實例包含植物細胞及昆蟲細胞。已鑑定眾多可與昆蟲細胞聯合使用，尤其用於轉染草地黏蟲(Spodoptera frugiperda)細胞之桿狀病毒株。植物細胞培養物亦可以用作宿主(參見例如美國專利第5,959,177號、第6,040,498號、第6,420,548號及第7,125,978號)。
適用於產生本發明之抗IL1RAP抗體之哺乳動物宿主細胞株的實例包含中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，包含DHFR-CHO細胞(參見例如Urlaub等人，《美國國家科學院院刊》,77：4216(1980))；骨髓瘤細胞株，諸如Y0、NS0及Sp2/0；經SV40轉形之猴腎CVl細胞株(COS-7)；人類胚腎細胞株(293或293細胞，如例如Graham等人，《普通病毒學雜誌(J.Gen Virol.)》,36：59(1977)中所述)；幼倉鼠腎細胞(BHK)；小鼠塞特利氏細胞(mouse Sertoli cell)(TM4細胞，如例如Mather,《生殖生物學(Biol.Reprod.)》,23：243-251(1980)中所述)；猴腎細胞(CVl)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76)；人類子宮頸癌細胞(HELA)；犬腎細胞(MDCK；水牛鼠肝細胞(BRL 3A)；人類肺細胞(W138)；人類肝細胞(Hep G2)；小鼠***腫瘤(MMT 060562)；TRI細胞(參見例如Mather等人，《紐約科學院年鑒(Annals N Y.Acad.Sci.)》,383：44-68(1982))；MRC 5細胞；及FS4細胞。關於適合於產生抗體之適用哺乳動物宿主細胞株的一般綜述，參見例如Yazaki及Wu,《分子生物學方法》，第248卷(B.K.C.Lo編，《抗體工程化》，新澤西州特圖瓦市之胡馬納出版社)，第255-268頁(2003)。
V.抗IL1RAP抗體之醫藥組合物及調配物
本發明亦提供包括抗IL1RAP抗體之醫藥組合物及醫藥調配物。在一些實施例中，本發明提供一種醫藥調配物，其包括如本文所述之抗IL1RAP抗體及醫藥學上可接受之載劑。此類醫藥調配物可以藉由將具有所期望的純度之抗IL1RAP抗體與一或多種醫藥學上可接受之載劑混合而製備。通常，此類抗體調配物可以製備為水溶液(參見例如美國專利第6,171,586號及WO2006/044908)或製備為凍乾調配物(參見例如美國專利第6,267,958號)。
此外，預期包括如本文所揭示之抗IL1RAP抗體之組合物及調配物除了抗IL1RAP之外，可以進一步含有適用於所述調配物所投與之個體中之待治療的特定適應症的其他活性成分(亦即，治療劑)。較佳地，任何額外治療劑具有與抗IL1RAP抗體活性互補之活性且所述活性不會不利地互相影響。因此，在一些實施例中，本發明提供一種醫藥組合物，其包括如本文所揭示之抗IL1RAP抗體及醫藥學上可接受之載劑，且進一步包括適用於治療由IL-1、IL-33、IL-36及/或IL1RAP介導之疾病或病狀的治療劑。在一些實施例中，例如其中所述疾病適應症為癌症，所述治療劑為適合特定癌症的化學治療劑。在一些實施例中，組合物中之其他治療劑為IL-1、IL-33、IL-36信號傳導途徑之拮抗劑。
醫藥學上可接受之載劑在所採用之劑量及濃度下通常對接受者無毒。本領域中熟知廣泛範圍的此類醫藥學上可接受之載劑(參見例如《雷明頓氏醫藥科學(Remington's Pharmaceutical Sciences)》第16版，Osol,A.編(1980))。適用於本發明之調配物中之例示性醫藥學上可接受之載劑可以包含但不限於：緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包含抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如氯化十八烷基二甲基苄基銨；氯化六羥季銨(hexamethonium chloride)；氯苄烷銨(benzalkonium chloride)；苄索氯銨 (benzethonium chloride)；苯酚、丁醇或苄醇；對羥基苯甲酸烷基酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(少於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他碳水化合物，包含葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖，諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽相對離子，諸如鈉；金屬錯合物(例如，Zn-蛋白質錯合物)；及/或非離子界面活性劑，諸如聚乙二醇(PEG)。
適用於本發明之調配物中之醫藥學上可接受之載劑亦可以包含間質藥物分散劑，諸如可溶性中性活性玻尿酸酶糖蛋白(sHASEGP)(參見例如美國專利公開案第2005/0260186號及第2006/0104968號)，諸如人類可溶性PH-20玻尿酸酶糖蛋白(例如，rHuPH20或HYLENEX®，Baxter International,Inc.)。
額外治療劑及活性成分可被包埋於例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合製備之微膠囊中，例如分別為羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊；包埋於膠態藥物遞送系統(例如，脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米粒子及奈米膠囊)中或***液中。此類技術揭示於《雷明頓氏醫藥科學》第16版，Osol,A.編(1980)中。
在一些實施例中，調配物可為抗體及/或其他活性成分之持續釋放製劑。持續釋放製劑之適合實例包含含有抗體之固體疏水性聚合物之半滲透基質，所述基質呈成形物品形式，例如膜或微膠囊。
通常，待投與給個體之本發明之調配物為無菌的。無菌調配物可容易地使用熟知技術，例如藉由經由無菌過濾膜過濾來製備。
IV.用途及治療方法
預期包括本發明之抗IL1RAP抗體的組合物或調配物中之任一者可以用於任何方法或用途，諸如治療方法，其利用所述組合物或調配物與IL1RAP特異性結合及/或阻斷IL1RAP之活性的能力，特別是阻斷IL1RAP介導IL-1家族細胞介素IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β及/或IL-36γ之細胞內信號傳導之能力。由IL1RAP介導之細胞內信號傳導途徑包含IL-1、IL-33及IL-36途徑，且更具體而言，至少包含藉由細胞介素促效劑IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β及/或IL-36γ刺激之信號傳導途徑。由IL1RAP介導之信號傳導途徑之抑制可以使用已知基於細胞之阻斷分析進行活體外分析，所述基於細胞之阻斷分析包含本發明之實例中所述的HEK-BLUETM報導細胞分析及基於初代細胞之阻斷分析。
由IL1RAP介導之疾病可以包含與體液或組織中升高含量之IL-1家族之細胞介素相關的任何疾病或病狀，其中IL1RAP在介導信號傳導方面充當輔受體：IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β及/或IL-36γ。IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β及/或IL-36γ之升高含量可以包含例如超過特定細胞或組織中通常所發現之含量的含量，或可為通常不表現此等細胞介素之細胞或組織中的任何可偵測含量。通常，由IL1RAP介導之病狀或疾病呈現以下特徵：(1)與病狀或疾病相關之病理學可以藉由投與IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β及/或IL-36γ及/或藉由上調IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β及/或IL-36γ之表現而在動物中以實驗方式誘導；及(2)在實驗動物模型中產生的與病狀或疾病相關之病理學可以藉由已知抑制IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β及/或IL-36γ之作用的藥劑抑制。
IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β及/或IL-36γ已知為促炎性細胞介素，然而，如由IL1RAP作為輔受體介導之藉由此等細胞介素刺激之IL-1、IL-33及/或IL-36信號傳導途徑之異常功能已知與廣泛範圍的疾病及病狀 相關，所述疾病及病狀通常包含但不限於發炎疾病、自體免疫疾病、呼吸道疾病、代謝失調、感染及癌症。
例如，與IL-33信號傳導之異常功能相關且因此亦由IL1RAP之輔受體活性介導的廣泛範圍的病狀及疾病包含但不限於：所介導之病症可為發炎病狀(例如，哮喘、氣管過度反應、氣管發炎、敗血症、敗血性休克、異位性皮炎、過敏性鼻炎、類風濕性關節炎或慢性阻塞性肺病(COPD))；免疫病症(例如，哮喘、類風濕性關節炎、過敏、異位性過敏、全身性過敏反應、過敏性休克、過敏性鼻炎、牛皮癬、發炎性腸病(IBD)、克羅恩氏病、糖尿病或肝病)；纖維化病症(例如，特發性肺纖維化(IPF))；嗜伊紅血球病症(例如，嗜伊紅血球相關胃腸病症，諸如嗜伊紅血球食道炎)；感染(例如，蠕蟲、諸如碩大利什曼原蟲(Leishmania major)之原蟲、或病毒感染，諸如RSV或流感)；疼痛(例如，發炎性疼痛)；中樞神經系統病症(例如，阿爾茨海默病)；實體腫瘤(例如，***腫瘤、結腸腫瘤、***腫瘤、肺腫瘤、腎腫瘤、肝腫瘤、胰臟腫瘤、胃腫瘤、腸腫瘤、腦腫瘤、骨腫瘤或皮膚腫瘤)；或眼科病症。由IL-33介導之特定的眼科病症包含但不限於：年齡相關性黃斑變性(AMD)(包含濕性AMD、乾性AMD、中度AMD、晚期AMD及地圖狀萎縮(geographic atrophy，GA))、視網膜病變(例如，糖尿病性視網膜病變(DR)、早產兒視網膜病(ROP)及高山性DR)、息肉狀脈絡膜血管病變(PCV)、糖尿病性黃斑部水腫、乾眼病、***、視網膜脫落、青光眼、葡萄膜炎(例如，傳染性及非傳染性葡萄膜炎)、色素性視網膜炎、萊伯氏先天性黑矇症、斯特格氏病、創傷性眼損傷及結膜炎(例如，傳染性結膜炎、非傳染性結膜炎及過敏性結膜炎)。
類似地，與IL-1之異常功能相關且因此亦由IL1RAP之輔受體活性介導的廣泛範圍的病狀及疾病包含但不限於：急性胰臟炎；肌肉萎縮性側 索硬化(ALS)；阿茲海默氏病；惡病質/厭食症，包含愛滋病誘發之惡病質；哮喘及其他肺病；動脈粥樣硬化；自體免疫血管炎；慢性疲勞症候群；梭菌相關疾病，包含梭菌相關腹瀉；冠狀動脈病狀及適應症，包含充血性心臟衰竭、冠狀動脈再狹窄、心肌梗塞、心肌功能障礙(例如，與敗血症相關)及冠狀動脈繞道移植；癌症，諸如多發性骨髓瘤及骨髓性白血病(例如，AML或CML)及其他白血病，以及腫瘤轉移；糖尿病(例如，胰島素依賴型糖尿病)；子宮內膜異位；發熱、肌肉纖維疼痛；絲球體腎炎；移植物抗宿主疾病/移植排斥反應；出血性休克；痛覺過敏；發炎性腸病；關節發炎性病狀，包含骨關節炎、牛皮癬性關節炎及類風濕性關節炎；發炎性眼病，如可能與例如角膜移植相關；缺血，包含大腦缺血(例如，由於創傷、癲癇、出血或中風之腦損傷，其各自會引起神經退化)；川崎氏病；學習障礙；肺病(例如，ARDS)；多發性硬化症；肌病(例如，肌肉蛋白代謝，尤其在敗血症中)；神經毒性(例如，如由HIV誘發)；骨質疏鬆症；疼痛，包含癌症相關疼痛；帕金森氏病；牙周病；早產；牛皮癬；再灌注損傷；敗血性休克；來自放射治療之副作用；顳頜關節疾病；睡眠障礙；葡萄膜炎；或由擰傷、扭傷、軟骨損壞、創傷、矯形外科、感染或其他疾病過程引起的發炎病狀。
用作IL-1、IL-33及/或IL-36信號傳導途徑之拮抗劑或抑制劑的藥劑正在臨床開發中用於治療一系列疾病及病狀，包含但不限於以下：痤瘡、急性重度潰瘍性結腸炎、成年發病型斯蒂爾氏病、過敏性鼻炎、關節炎(包含痛風性關節炎、幼年型關節炎、骨關節炎及類風濕性關節炎)、關節炎疼痛、哮喘、動脈粥樣硬化、異位性濕疹、***、惡病質、癌症(包含乳癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌及胰臟癌)、慢性阻塞性肺病、乾眼症候群、家族性冷因性自體發炎症候群、家族性地中海熱、食物過敏、全身性膿皰型牛皮癬、化膿性汗腺炎、高IgD症候群、高尿酸血症、穆-韋二氏症候群、新生兒發作型 多系統發炎疾病、肌肉骨骼痛、掌蹠膿皰病、周邊血管疾病、風濕性多肌痛、鼻息肉、牛皮癬、壞疽性膿皮病、再狹窄、鐮狀細胞貧血、竇炎、TNF受體相關的週期性症候群、第2型糖尿病及潰瘍性結腸炎。
預期包括本發明之抗IL1RAP抗體之組合物或調配物中之任一者可以用於用於治療以上所列之與IL-1、IL-33及/或IL-36信號傳導途徑之異常功能相關且因此由IL1RAP之輔受體活性介導的疾病或病狀中之任一者的方法或用途中。通常，此等病狀及疾病包含但不限於發炎疾病、自體免疫疾病、呼吸道疾病、代謝失調、感染及癌症。
因此，在一些實施例中，包括本發明之抗IL1RAP抗體的組合物或調配物可以用於用於治療選自以下之病狀或疾病的方法、療法、藥物、診斷或用途中：痤瘡、急性胰臟炎、急性重度潰瘍性結腸炎、成年發病型斯蒂爾氏病、年齡相關性黃斑變性(AMD)、氣管過度反應、氣管發炎、過敏性結膜炎、過敏性鼻炎、過敏、阿茲海默氏病、肌肉萎縮性側索硬化(ALS)、全身性過敏反應、關節炎疼痛、哮喘、動脈粥樣硬化、異位性皮炎、異位性濕疹、自體免疫血管炎、***、骨癌、腦癌、乳癌、惡病質/厭食症、軟骨損壞、大腦缺血、慢性疲勞症候群、慢性阻塞性肺病、梭菌相關疾病、結腸癌、充血性心臟衰竭、結膜炎、冠狀動脈繞道移植、冠狀動脈再狹窄、克羅恩氏病、糖尿病、糖尿病性黃斑部水腫、糖尿病性視網膜病變、乾眼病、子宮內膜異位、嗜伊紅血球相關胃腸病症、嗜伊紅血球食道炎、家族性冷因性自體發炎症候群、家族性地中海熱、發熱、肌肉纖維疼痛、纖維化病症、食物過敏、全身性膿皰型牛皮癬、青光眼、絲球體腎炎、痛風性關節炎、移植物抗宿主疾病、蠕蟲感染、出血性休克、化膿性汗腺炎、痛覺過敏、高IgD症候群、高尿酸血症、特發性肺纖維化(IPF)、癌症相關疼痛、感染、發炎性腸病(IBD)、由菌株引起的發炎性病狀、與角膜移植相關之發炎性眼病、發炎性疼痛、流感、腸癌、缺血、 幼年型關節炎、川崎氏病、腎癌、萊伯氏先天性黑矇症、肝癌、肝病、肺癌、穆-韋二氏症候群、多發性骨髓瘤、多發性硬化症、肌肉骨骼痛、骨髓性白血病及其他白血病、心肌功能障礙、肌病、鼻息肉、新生兒發作型多系統發炎疾病、神經毒性、非傳染性結膜炎、非小細胞肺癌、矯形外科、骨關節炎、骨質疏鬆症、疼痛、掌蹠膿皰病、胰臟癌、帕金森氏病、牙周病、周邊血管疾病、風濕性多肌痛、息肉狀脈絡膜血管病變(PCV)、早產、***癌、原蟲傳染、牛皮癬、牛皮癬性關節炎、壞疽性膿皮病、再灌注損傷、呼吸道融合性病毒(RSV)、再狹窄、視網膜脫落、色素性視網膜炎、早產兒視網膜病(ROP)、類風濕性關節炎、敗血性休克、鐮狀細胞貧血、來自放射治療之副作用、竇炎、皮膚癌、睡眠障礙、扭傷、斯特格氏病、胃癌、顳頜關節疾病、TNF受體相關的週期性症候群、移植排斥反應、創傷、創傷性眼損傷、第2型糖尿病、潰瘍性結腸炎及葡萄膜炎。
如本文所揭示，包含在以下實例中，本發明之抗IL1RAP抗體具有降低、抑制及/或阻斷由IL1RAP介導之細胞內信號傳導的能力，所述細胞內信號傳導包含IL-1、IL-33及IL-36信號傳導途徑。因此，在一些實施例中，本發明提供一種治療個體中之由IL1RAP介導之疾病或病狀的方法，所述方法包括向個體投與治療有效量之本發明之抗IL1RAP抗體或向有需要之個體投與治療有效量之包括本發明之抗IL1RAP抗體及醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物。
如本文其他地方所揭示，本發明之抗IL1RAP抗體具有降低、抑制及/或阻斷IL-1、IL-33及IL-36信號傳導途徑的能力。因此，本發明亦提供治療對IL-1、IL-33及/或IL-36信號傳導途徑之降低、抑制及/或阻斷起反應的疾病及病狀的方法。
另外，本發明之抗IL1RAP抗體具有降低、抑制及/或阻斷藉由促效劑IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β及/或IL-36γ刺激之細胞內信號傳 導的能力。因此，本發明亦提供治療對藉由促效劑IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β及/或IL-36γ刺激之細胞內信號傳導之降低、抑制及/或阻斷起反應的疾病及病狀的方法。
IL-1信號傳導途徑，亦為由IL1RAP介導之途徑，與諸多形式之癌症相關。因此，在一些實施例中，本發明提供一種治療個體中之癌症之方法，所述方法包括向有需要之個體投與治療有效量之本發明之抗IL1RAP抗體或向個體投與治療有效量之包括本發明之抗IL1RAP抗體及醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物。
所有三種IL-1、IL-33及/或IL-36信號傳導途徑，其亦為由IL1RAP介導之途徑，皆與哮喘相關。因此，在一些實施例中，本發明提供一種治療個體中之哮喘之方法，所述方法包括向有需要之個體投與治療有效量之本發明之抗IL1RAP抗體或向個體投與治療有效量之包括本發明之抗IL1RAP抗體及醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物。
在一些實施例中，本發明提供一種治療及/或預防由IL1RAP介導之疾病、由IL-1、IL-33及IL-36信號傳導途徑介導之疾病及/或由藉由促效劑IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β及/或IL-36γ刺激之細胞內信號傳導介導之疾病的方法。在此類治療方法實施例中，所述方法包括向有需要之個體投與治療有效量之抗IL1RAP抗體，或包括如本文所述之抗IL1RAP抗體的組合物或醫藥調配物。
根據所述治療方法投與抗體、組合物或醫藥調配物提供抗體誘導之治療作用，其保護個體及/或治療個體中之由IL1RAP介導之疾病之進展。在一些實施例中，所述治療方法可以進一步包括投與一或多種本領域中熟習此項技術者已知預防及/或治療由IL1RAP介導之疾病或病狀的額外治療劑或治療。此類包括投與一或多種額外藥劑的方法可以涵蓋組合投與(其中在相同或分開 的調配物中包含兩種或更多種治療劑)，及分開投與，在此情況下，抗體組合物或調配物之投與可以在額外治療劑之投與之前、與此同時及/或在此之後發生。
在本發明之治療方法之一些實施例中，抗IL1RAP抗體或包括抗IL1RAP抗體之醫藥調配物係藉由任何全身性遞送藥劑或將藥劑遞送至所期望的目標組織的投與模式向個體投與。全身性投與通常指抗體進入個體之部位，而非直接進入所期望的目標部位、組織或器官的任何投與模式，所述投與模式使得抗體或其調配物進入個體之循環系統，且因此經歷代謝及其他類似過程。
因此，適用於本發明之治療方法的投與模式可以包含但不限於注射、輸注、滴注及吸入。藉由注射投與可以包含靜脈內、肌肉內、動脈內、鞘內、室內、囊內、眶內、心內、皮內、腹膜內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、囊下、蛛膜下、脊柱內、腦脊髓內及胸骨內注射及輸注。
在一些實施例中，將抗IL1RAP抗體之醫藥調配物調配成使得抗體受保護而不會在腸道中失活。因此，治療方法可包括口服調配物。
在一些實施例中，亦提供包括本發明之抗IL1RAP抗體的組合物或調配物作為藥物的用途。另外，在一些實施例中，本發明亦提供包括抗IL1RAP抗體之組合物或調配物在製造或製備藥物，特別是用於治療、預防或抑制由IL1RAP介導之疾病的藥物中之用途。在另一實施例中，所述藥物係用於治療、預防或抑制由IL1RAP介導之疾病的方法中，所述方法包括向患有由IL1RAP介導之疾病之個體投與有效量之藥物。在某些實施例中，藥物進一步包括有效量之至少一種額外治療劑或治療。
在另一實施例中，藥物係用於治療、抑制或預防個體中之由IL1RAP介導之疾病，包括向個體投與有效量之藥物以治療、抑制或預防由IL1RAP介導之疾病。
對於由IL1RAP介導之疾病或病狀之預防或治療，本發明之組合 物及調配物中所含有的抗IL1RAP抗體之適當劑量(當單獨或與一或多種其他額外治療劑組合使用時)將視以下而定：待治療之特定疾病或病狀、疾病之嚴重程度及病程、抗體係出於預防目的還是治療目的而投與的、先前向患者投與之療法、患者之臨床病史及對抗體之反應、及主治醫師之判斷。本文所描述之組合物及調配物中所包含的抗IL1RAP抗體可以適當地一次性或經一系列治療向患者投與。本文涵蓋各種給藥時程，包含但不限於單次投與或經各個時間點多次投與、快速投與及脈衝式輸注。
視疾病之類型及嚴重程度而定，本發明之調配物中約1μg/kg至15mg/kg之抗IL1RAP抗體為向人類個體投與之初始候選劑量，無論是例如藉由一或多次分開投與還是藉由連續輸注。通常，所投與之抗體劑量將在約0.05mg/kg至約10mg/kg範圍內。在一些實施例中，可向患者投與約0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg中之一或多個劑量(或其任何組合)。
劑量投與可以持續數天或更久，視個體狀況而定，例如，可以一直投與，直至由IL1RAP介導之疾病得到充分治療為止，如藉由本領域中已知之方法所測定。在一些實施例中，可以投與初始較高起始劑量，隨後投與一或多個較低劑量。然而，其他給藥方案可為適用的。劑量投與之治療作用之進展可以藉由習知技術及分析監測。
因此，在本發明方法之一些實施例中，抗IL1RAP抗體之投與包括約1mg/kg至約100mg/kg之日劑量。在一些實施例中，抗IL1RAP抗體之劑量包括至少約1mg/kg、至少約5mg/kg、至少約10mg/kg、至少約20mg/kg或至少約30mg/kg之日劑量。
另外，本發明之抗IL1RAP抗體可用於偵測IL1RAP之分析方法中。本文所揭示之抗IL1RAP抗體由於其以高親和力結合人類IL1RAP之能力而適合於廣泛範圍的分析方法及形式。預期本發明之抗IL1RAP抗體可用於任何已 知分析方法中，諸如競爭性結合分析、直接及間接夾心分析、免疫沈澱分析及酶聯免疫吸附分析(ELISA)，關於IL1RAP之偵測及定量(參見Sola,1987,《單株抗體：技術手冊》，第147-158頁，CRC出版公司)。因此，在一些實施例中，本發明提供一種用於偵測生物樣品中之IL1RAP之含量的方法，所述方法包括使樣品與如本文所揭示之抗IL1RAP抗體接觸之步驟。此外，在一些實施例中，預期偵測生物樣品中之IL1RAP之含量的方法可以用於偵測及/或診斷例如來自人類個體之生物樣品中之由IL1RAP介導之病狀或疾病。
實例
在以下代表性實例中說明本發明之各種特徵及實施例，所述實例意欲為說明性的，而非限制性的。本領域中熟習此項技術者將容易理解，具體實例僅為說明本發明，如隨後的申請專利範圍中更充分地描述。本申請案中所描述之每一個實施例及特徵應理解為與其中所含的每一個實施例係可互換的且可組合的。
實例1：產生IL1RAP多肽
此實例說明在引發及篩選本發明之抗IL1RAP抗體時用作抗原之各種IL1RAP多肽構築體的製備。
基於Wang等人，《自然．免疫學(Nat.Immunol.)》,11：905-912(2010)中之結構資訊，將hu-IL1RAP之細胞外結構域重組純化為全長及個別結構域(亦即，D1、D2、D3)。表現構築體之胺基酸序列邊界提供於上表1及隨附序列表中。出於純化及偵測目的，所有重組IL1RAP多肽構築體皆具有以下「GGGS-V5-6XHis」C端標籤：GGGSGKPIPNPLLGLDSTHHHHHH(SEQ ID NO：319)。出於純化及偵測目的，個別結構域(例如，D1、D1D2、D3)之構築體具有以下「GGGS-V5-Avi-6XHis」C端標籤(其亦包含「Avi」標籤)：GGGSGKPIPNPLLGLDSTGLNDIFEAQKIEWHEHHHHHH(SEQ ID NO：320)。
根據製造商之方案，使IL1RAP構築體蛋白質在Expi293F細胞(美國馬薩諸塞州沃爾珊之賽默飛世爾科技(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA))中表現。5天後收穫細胞且給澄清上清液補充20mM咪唑pH 7.5且將其施加至HisTrap FF粗製管柱(美國伊利諾伊州芝加哥之GE醫療(GE Healthcare,Chicago,IL,USA))，所述管住在20mM Tris-HCl、150mM NaCl(TBS)、20mM咪唑pH 7.5中平衡。用20CV梯度至100% TBS、500mM咪唑pH 7.5溶離蛋白質。將含有蛋白質之溶離級分合併且視蛋白質之分子量而定加載至Superdex 75或Superdex 200新增管柱(美國伊利諾伊州芝加哥之GE醫療)上。將含有單體蛋白質之峰值級分合併且儲存於1×PBS，pH 7.5或25mM HEPES、150mM NaCl(HBS)，pH 8.0中。
實例2：使用融合瘤方法產生抗人類IL1RAP抗體，篩選且選擇以進行進一步表徵
此實例說明使用小鼠融合瘤技術產生抗hu-IL1RAP抗體之方法及篩選及選擇抗體以進行進一步表徵之方法。
免疫及融合：採用包括hu-IL1RAP之膜形式之細胞外結構域的SEQ ID NO：3之hu-M-IL1RAP多肽構築體(參見表1)，使用50μg/小鼠，對Balb/c、Swiss Webster及SJ/L小鼠進行免疫。在初始免疫後，按照時程投與以下3種不同的IL1RAP免疫原進行後續增強免疫且持續在小鼠中誘導抗IL1RAP抗體之適合效價所必需的持續時間：25μg/小鼠之SEQ ID NO：3之多肽(hu-M-IL1RAP)、25μg/小鼠之SEQ ID NO：9之多肽(mo-M-IL1RAP)或25μg/小鼠之SEQ ID NO：6之多肽(hu-M-IL1RAP-D3)。對所有免疫使用佐劑Magic小鼠(紐約州社利(Shirley,NY)之Creative Diagnostics)。效價藉由ELISA如下所述測定。向基於效價選擇之小鼠給予最終融合前增強免疫而無佐劑。一天後，收穫脾臟且根據標準方案處理脾臟。使用PEG且遵循標準方案將脾細胞與 骨髓瘤P3X63Ag8.653細胞(美國菌種保存中心CRL 1580)融合，且使用標準技術將其以大約50,000個骨髓瘤細胞/孔種植至96孔盤中，以使所得群落之選殖性最大化。使用補充有AH(偶氮絲胺酸+次黃嘌呤)之選擇培養基選擇親本融合瘤。
ELISA分析：在培養12-14天後，收集融合瘤上清液且藉由ELISA採用塗有SEQ ID NO：3之hu-M-IL1RAP細胞外結構域之96孔盤對其進行初步篩選。ELISA分析通常如Baker等人，《生物技術趨勢(Trends Biotechnol.)》,20：149-156(2002)中所述進行。簡言之，在4℃下用塗佈緩衝液(0.05M碳酸鹽緩衝液，pH 9.6或磷酸鹽緩衝鹽水，PBS)中濃度為1μg/mL之蛋白質以50μL/孔塗佈96孔MAXISORP®平底培養盤(馬薩諸塞州沃爾珊之賽默飛世爾科技；目錄號439454)隔夜。在移除塗佈溶液後，藉由添加200μL於磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)pH 7.4(ELISA稀釋劑)中含有1%牛血清白蛋白(BSA)之分析/阻斷溶液阻斷非特異性結合且在室溫下在攪拌下培育一小時或在4℃下在無攪拌下培育隔夜。隨後用300μL PBS、0.05% TWEEN®-20(洗滌緩衝液)洗滌培養盤三次。向個別孔中添加100μL來自個別融合瘤純系之培養上清液(或指定濃度之經純化抗體)，隨後在室溫下在攪拌下培育一小時。將培養盤用洗滌緩衝液洗滌三次，隨後添加50μL/孔之在ELISA稀釋劑中以1：3,000稀釋的與辣根過氧化酶結合之山羊抗小鼠IgG Fc(美國德克薩斯州蒙哥馬利(Montgomery,TX,USA)之Bethyl Laboratories；目錄號A90-131P)或在ELISA稀釋劑中以1：10,000稀釋的與辣根過氧化酶結合之山羊抗小鼠IgG(H+L)(美國賓夕法尼亞州西格羅夫(West Grove,PA,USA)之Jackson ImmunoResearch,Inc.；目錄號109-035-088)。將培養盤在室溫下在攪拌下培育一小時，用洗滌緩衝液洗滌六次且藉由添加50μL/孔之四甲基聯苯胺(TMB)微孔過氧化酶受質(美國猶他州洛幹(Logan,UT,USA)之Scytek Laboratories,Inc.；目錄號TM1999)顯影3-10分鐘。藉由用50 μL/孔之2N H2SO4(美國密蘇里州聖路易之西格瑪奧德里奇公司(Sigma-Aldrich Corporation,St.Louis,MO,USA)；目錄號258105)酸化，停止酶促顯色。用SpectraMax i3X盤式讀取器(美國加利福尼亞州聖荷西(San Jose,CA,USA)之Molecular Devices LLC)在450nm之波長下分析培養盤。
此初步ELISA分析篩選從由三隻Swiss Webster小鼠產生之融合瘤鑑定總共470個抗人類IL1RAP黏合劑，所述小鼠經SEQ ID NO：3之hu-M-IL1RAP多肽及SEQ ID NO：6之hu-M-IL1RAP-D3多肽免疫。將這470個親本融合瘤擴增至24孔盤且如上所述進行確認ELISA篩選，產生315種經確認的hu-IL1RAP黏合劑。
融合瘤之基於HEK-Blue細胞之阻斷分析，針對次選殖篩選及純化
使用下文所述之基於HEK-Blue細胞之阻斷分析，進一步表徵確認hu-M-IL1RAP結合陽性的315個融合瘤抑制由IL-1介導之IL1R1/IL1RAP及由IL-33介導之ST2/IL1RAP信號傳導途徑的能力。
HEK Blue細胞株：此實例及以下實例中所述之HEK-Blue細胞株使用HEK-293細胞株(人類胚腎上皮細胞)作為原始親本譜系。對IL-1α、IL-1β及IL-33刺激起反應的HEK-Blue IL-1/IL-33感測器細胞獲自InvivoGen(美國加利福尼亞州聖地亞哥(San Diego,CA,USA)之InvivoGen；目錄號hkb-il33)。此等IL-1/IL-33感測器細胞藉由用表現IL-33受體ST2之人類ST2基因穩定轉染HEK-Blue IL-1β感測器細胞(InvivoGen；目錄號hkb-il1b)而產生。HEK-Blue IL-1β細胞表現NF-κB/AP-1 SEAP(分泌性胚胎鹼性磷酸酶)報導基因且含有不活化TNF-α反應以確保SEAP產生代表IL-1或IL-33途徑活化。HEK-Blue IL-1/IL-33反應細胞根據製造商之準則維持。簡言之，在標準生長培養基中維持細胞，所述培養基由DMEM(美國紐約州康寧之康寧公司(Corning,Inc.,Corning,NY, USA))組成，補充有10%胎牛血清(FBS)(美國佐治亞州弗羅爾布萊什(Flowery Branch,GA,USA)之Atlanta Biologicals,Inc.)、100IU/mL青黴素及100μg/mL鏈黴素。所述生長培養基進一步補充有100μg/mL用以維持編碼SEAP之質體的吉歐黴素(zeocin)、200μg/mL用以維持IL-1特異性之潮黴素B及100μg/mL用以維持編碼ST2之質體的殺稻瘟菌素(blasticidin)。
HEK-Blue SEAP分析：將HEK-Blue IL-1/IL-33反應性感測器細胞用於所有HEK-Blue SEAP分析，其中發生IL-1α、IL-1β或IL-33刺激。在所有分析之前產生由八點連續稀釋系列組成之促效劑劑量-反應曲線，以提供對分析中所用之促效劑之半數最大有效濃度(EC50)的估計。在實驗使用前24小時，將細胞以一定濃度種植於96孔平底培養盤上，在使用時產生最小80%之匯合度。向細胞中添加所期望的促效劑至最終體積200μL且將細胞在37℃下在5% CO2下培育24小時。使用SEAP偵測分析定量SEAP產量。使用SEAP偵測培養基QUANTI-Blue(InvivoGen)，在各種指定條件下且根據普通製造商準則，測定SEAP之含量。具體而言，向130μL QUANTI-Blue偵測培養基中添加20μL細胞培養上清液(在添加促效劑後24小時收集)。使反應在37℃下進行一小時，此時使用SpectraMax(Molecular Devices)分光光度計聯合SoftMax Pro軟體(Molecular Devices)量測650nm波長下之吸光度。使用GraphPad Prism 7軟體分析原始分析資料，對分析中之促效劑EC50值進行非線性回歸測定。
如上所述，但採用以下修改，對融合瘤細胞培養上清液(SN)中之非純化抗hu-IL1RAP抗體進行HEK-Blue SEAP分析。向HEK-Blue IL-1/IL-33細胞中以4×最終體積50μL添加含有抗hu-IL1RAP抗體之非純化的融合瘤細胞培養物SN。將細胞及含抗體之融合瘤細胞培養物SN在37℃下在5% CO2下培育一小時。在一小時抗體培育後，以4×所期望的濃度且以在200μL之總體積內產生1×最終所期望的濃度的方式向含有細胞及抗體之孔中添加促效 劑。藉由從獲自樣品(在此情況下，含抗hu-IL1RAP抗體之融合瘤細胞培養物SN)之值減去獲自陰性對照之吸光度值計算抑制百分比。隨後使用經陰性對照調節之樣品確定相對於陽性對照(在不存在含抗體之融合瘤細胞培養物SN的情況下，僅曝露於促效劑的細胞)之比率。
使用經純化融合瘤衍生之抗hu-IL1RAP抗體進行的HEK-Blue SEAP分析類似於上文採用融合瘤細胞培養物SN之分析進行。簡言之，將抗體與細胞一起在不存在促效劑的情況下在標準生長培養基內在37℃下在5% CO2下培育一小時。在一小時培育後，以所估計的EC50濃度添加所期望的促效劑至最終體積200μL且使實驗再進行24小時。陰性對照(NC)表示僅曝露於生長培養基之細胞，而陽性對照(PC)表示僅曝露於促效劑之細胞(在不存在拮抗性或對照抗體的情況下)。
為了確定抗體(包含如以下實例中所述之Fab)之半數最大抑制濃度(IC50)，使用七點連續稀釋系列(以指定濃度開始)。與先前提及之促效劑劑量反應曲線一樣，使用GraphPad Prism 7軟體進行非線性回歸分析以從分析結果確定IC50值。
以下市售人類細胞介素用作HEK-Blue分析中之促效劑：IL-1α(Gibco/賽默飛世爾科技)、IL-1β(美國加利福尼亞州聖地亞哥之InvivoGen)及IL-33(InvivoGen；或美國新澤西州洛基山(Rocky Hill,NJ,USA)之PeproTech US)。
使用ELISA篩選及基於HEK-Blue細胞之阻斷分析結果選擇一組15個親本融合瘤細胞株進行次選殖及純化。所選擇的融合瘤及基於HEK-Blue細胞之阻斷分析之結果顯示於下表3中。
表3：所選擇之親本融合瘤的ELISA及基於HEK-Blue細胞之阻斷分析結果
Figure 108129005-A0202-12-0088-532
融合瘤次選殖及純化：藉由標準限制稀釋法採用經ELISA篩選(如上所述)確認之次純系進行次選殖。將次純系在無血清培養基中按比例增加至30mL培養物。如下純化抗體。藉由在300g下離心10分鐘以移除細胞且藉由用0.22μm孔徑過濾器過濾，使上清液培養基澄清。將澄清之上清液培養基與經PBS緩衝液平衡之POROS MabCapture A樹脂(美國馬薩諸塞州沃爾珊之賽默飛世爾科技)混合，且在溫和旋轉下在室溫下培育1.5小時。在培育後，將漿料加載至管柱中且用20管柱體積(CV)含有0.5M NaCl之PBS緩衝液洗滌樹脂。用3CV之0.1M乙酸、0.15M NaCl溶離IgG分子。用1M MOPS pH 7.0快速中和溶離劑至pH 5.2，且使用PD-10脫鹽管柱(GE Healthcare)將緩衝液更換成PBS緩衝液。
表徵經純化融合瘤抗體
ELISA分析：使用ELISA分析(如上所述)確認獲自15個親本 融合瘤之經純化抗體與hu-M-IL1RAP多肽以及可溶性hu-S-IL1RAP多肽(SEQ ID NO：7)結合的能力，且確定與小鼠mo-M-IL1RAP多肽(SEQ ID NO：9)及食蟹獼猴cyno-M-IL1RAP多肽(SEQ ID NO：8)之交叉反應程度。從20nM開始，測試自融合瘤純化之15個抗體的連續稀釋液，且計算各自之EC50，如下表4中所示。
Figure 108129005-A0202-12-0089-533
結合結構域定位：使用上述ELISA分析，採用以1μg/ml塗佈於分析培養盤上之以下IL1RAP多肽構築體進行15個經純化抗體之結合結構域定位：hu-M-IL1RAP、hu-M-IL1RAP-D1、hu-M-IL1RAP-D1D2及hu-M-IL1RAP-D3。以10nM之濃度測試15個mAb且ELISA分析結果顯示於下表5中。
表5：經純化融合瘤衍生之抗體之藉由ELISA分析的結構域定位
Figure 108129005-A0202-12-0090-534
HEK-Blue分析：使用如上所述之HEK-Blue分析，測試衍生自15個親本融合瘤之經純化抗hu-IL1RAP抗體，以測定其阻斷IL1R1/IL1RAP及ST2/IL1RAP途徑之由IL-1β及IL-33介導之活化的能力。對所有mAb進行劑量反應且測定在100nM之抗體濃度下對由IL-1β及IL-33介導之活化的抑制程度，所述抑制程度按照自僅曝露於促效劑之細胞獲得之最大信號的百分比來計算。此等HEK-Blue分析之結果顯示於下表6中。
Figure 108129005-A0202-12-0091-535
如表6之HEK-Blue分析結果所示，在所測試之所有抗體中，只有來自融合瘤11C5之mAb在100nM之濃度下顯示出IL-1β及IL-33活化途徑之完全或接近完全的阻斷活性(分別為99%及93%)。
OCTET結合親和力：使用OCTET®生物層干涉法(BLI)結合分析(美國加利福尼亞州夫利蒙(Fremont,CA,USA)之Pall ForteBio USA)量測來自11C5融合瘤之經純化mAb(下文「11C5(Hy)」)與hu-M-IL1RAP及cyno-M-IL1RAP多肽構築體之結合親和力。BLI實驗形式將抗體固定於生物層表面上，其中IL1RAP抗原在溶液中。在實驗緩衝液(含0.01% Tween-20之PBS緩衝液)中稀釋SEQ ID NO：3之hu-M-IL1RAP多肽、SEQ ID NO：8之cyno-M-IL1RAP多肽或來自融合瘤11C5之經純化mAb，最終體積各為200μL。將所有樣品置放於黑色96孔盤中且在25℃下進行實驗。將來自融合瘤11C5之經純化mAb稀釋至35nM之最終濃度且固定於抗小鼠IgG Fc捕捉(AMC)生 物感測器(Pall ForteBio)上。在0.9-25nM範圍內在實驗緩衝液中連續稀釋分析物。在開始實驗之前，將生物感測器在25℃下在實驗緩衝液中平衡十分鐘。
按以下步驟進行動力學實驗，其中列出步驟名稱、溶液及時間：基線(緩衝液-60秒)、加載(抗體-200秒)、基線2(緩衝液-最少120秒)、締合(分析物-200-300秒)及解離(緩衝液-1000秒)。使用OCTET®資料分析軟體(Pall ForteBio)分析由抗原與經固定抗體之分析物締合及解離產生的BLI信號。首先，使用參考孔(與實驗孔經歷相同步驟但分析物不用於締合步驟之生物傳感器)對所有記錄的跡線進行參考減法，隨後將所有跡線與締合步驟之開始對齊。將整個締合及解離步驟用於1：1結合模型中之全擬合(最少四條分析物濃度跡線)，以計算mAb 11C5(Hy)與各分析物之KD。此OCTET BLI分析之結果顯示於下表7中。
Figure 108129005-A0202-12-0092-536
總結：基於上述分析中之優異特性，選擇衍生自融合瘤11C5之經純化抗M-IL1RAP抗體11C5(Hy)用於進一步表徵及親和力成熟。亦即，11C5(Hy)mAb與IL1RAP之結構域3(D3)結合，與hu-M-IL1RAP、hu-S-IL1RAP及cyno-M-IL1RAP多肽同樣良好地結合，如藉由ELISA所測定，且展現對IL-1β及IL-33活化途徑之完全或接近完全的阻斷活性，如藉由HEK-Blue分析所測定。然而，11C5(Hy)mAb不與SEQ ID NO：9之小鼠M-IL1RAP多肽交叉反應。
實例3：所選抗人類IL1RAP抗體之定序
此實例說明融合瘤衍生之抗hu-IL1RAP抗體之序列之測定。
使用以下方案對編碼來自所選融合瘤之抗體重鏈及輕鏈片段之基因進行鑑定、選殖及定序。
使感興趣的融合瘤在T75燒瓶中之標準融合瘤培養基(DMEM/F12，10% FBS、1% Glutamax、1%青黴素/鏈黴素)中生長7-10天，達到1-3×105之密度，且活力>80%。在15mL falcon管中在300g下離心5分鐘，由培養物產生100-300萬個細胞集結粒。藉由將粒狀細胞再懸浮於5mL冰冷的PBS中對其進行洗滌。在300g下離心5分鐘後，移除PBS且將細胞再懸浮且溶解於1mL TRIZOL試劑(美國加利福尼亞州喀斯巴德(Carlsbad,CA,USA)之Life Technologies)中。使溶解產物通過含20G1號針(BD 305175)之1mL注射器20次以確保細胞完全溶解。將TRIZOL/細胞懸浮液立即於乾冰上冷凍且儲存在-80℃下直至處理。
使用Direct-zol RNA Miniprep Plus套組(美國加利福尼亞州厄凡(Irvine,CA,USA)之Zymo Research)自溶解產物分離總RNA，且使用SMARTer RACE 5'套組(日本Takara Bio)，使用5μg總RNA產生5'-RACE即用型融合瘤cDNA。使用以下小鼠VH家族特異性可變區引子擴增來自cDNA之重鏈及輕鏈特異性基因片段：TCTTGTCCACCTTGGTGCTGCTGGCCGG(SEQ ID NO：321)及TTTGTCCACCGTGGTGCTGCTGGCTGGT(SEQ ID NO：322)。以下小鼠Vκ家族特異性可變區引子GATCAGTCCAACTGTTCAGGACGCC(SEQ ID NO：323)或小鼠Vλ家族特異性可變區引子ACACTCAGCACGGGACAAACTCTTCTCCACAGT(SEQ ID NO：324)、ACACTCTGCAGGAGACAGACTCTTTTCCACAGT(SEQ ID NO：325)及ACACTCAGCACGGGACAAACTCTTCTCCACATG(SEQ ID NO：326)結合套組中所提供之通用引子一起用於5'-RACE PCR反應中。
純化PCR產物，且使用In-Fusion選殖套組(日本Takara Bio) 將其選殖至pRACE中。使用Sanger定序器，採用M13正向引子及M13反向引子對兩股進行定序。
針對衍生自融合瘤11C5之mAb測定的輕鏈及重鏈可變結構域胺基酸序列VL及VH列於上表2中且分別以SEQ ID NO：257及279提供於隨附序列表中。
另外，針對衍生自融合瘤10A11、9D5、8H1及13D8之mAb測定的VL及VH序列列於表2中且分別以SEQ ID NO：311、312、313、314、315、316、317及318提供於隨附序列表中。
實例4：藉由11C5融合瘤衍生之抗Hu-IL1RAP mAb抑制IL-1、IL-33及IL-36刺激的細胞內信號傳導
此實例說明衍生自11C5之經純化抗hu-IL1RAP mAb 11C5(Hy)能夠阻斷IL-1α、IL-1β、IL-33及IL-36α、IL-36β及IL-36γ刺激的細胞內信號傳導，如在基於HEK-Blue細胞之阻斷分析中所測定。簡言之，使用經IL-36受體IL1RL2短暫轉染之HEK-Blue IL-1/IL-33感測器細胞或HEK-Blue IL-33感測器細胞確定11C5(Hy)是否阻斷IL-1、IL-33及IL-36依賴性信號傳導途徑。此等HEK-Blue細胞株均表現NF-κB/AP-1 SEAP報導基因，其允許經由簡單的SEAP偵測分析監測IL-1、IL-33或IL-36活化。
材料及方法
HEK-Blue細胞：此實例中所用之HEK-Blue IL-1/IL-33感測器細胞上文已在實例2中描述。HEK-Blue IL-33感測器細胞(InvivoGen；目錄號hkb-hil33)類似於HEK-Blue IL-1/IL-33細胞，但阻斷IL-1及TNF-α反應。HEK-Blue IL-33細胞根據製造商準則維持，使用先前所述且補充有1×HEK-Blue選擇抗生素(InvivoGen；目錄號hb-sel)之標準生長培養基以維持編碼SEAP、ST2及IL-33特異性之質體。
IL-36受體對HEK-Blue IL-33細胞之短暫轉染：由AvantGen(定製)產生含有編碼IL-36受體之人類IL1RL2基因的質體。使用LyoVec(InvivoGen)根據製造商之準則短暫轉染HEK-Blue IL-33感測器細胞。簡言之，將LyoVec-DNA複合物以將在轉染後24小時產生最小80%匯合度之濃度直接添加至懸浮於標準生長培養基中之細胞中，且立即種植於96孔平底培養盤上。轉染後24小時，將細胞用於標準HEK-Blue SEAP分析中。
HEK-Blue SEAP分析：將HEK-Blue IL-1/IL-33細胞用於所有HEK-Blue SEAP分析，其中發生IL-1或IL-33刺激且所述刺激上文已在實例2中描述。對於IL-36刺激的分析，採用短暫表現IL-36受體IL1RL2之HEK-Blue IL-33細胞。此等短暫轉染之HEK-Blue IL-33感測器細胞對IL-36α、IL-36β及IL-36-γ之刺激起反應。將人類IL-36α、IL-36β及IL-36γ細胞介素自N端序列裂解下來以產生完全成熟的細胞介素。如先前所述獲得促效劑EC50及拮抗劑抗體IC50之值。陰性對照(NC)表示僅曝露於生長培養基之細胞，而陽性對照(PC)表示僅曝露於促效劑之細胞(在不存在拮抗性或對照抗體的情況下)。
結果
將11C5(Hy)mAb與HEK-Blue IL-1/IL-33細胞一起培育一小時，隨後以先前確定的大致相當於EC55-60之濃度添加IL-1α(圖1A)或IL-1β(圖1B)。11C5(Hy)mAb展現強阻斷活性，針對IL-1α及IL-1β之IC50分別等於4.7E-09M及1.0E-09M。在100nM之抗體濃度下，當相比於各別陽性(PC)及陰性(NC)對照時，觀察到接近完全抑制(針對IL-1α及IL-1β分別為94%及99%)。
進行類似分析以確定IL-33刺激的HEK-Blue IL-1/IL-33細胞中之阻斷效力及功效(圖1C)。如IL-1阻斷分析所觀察到，11C5(Hy)對IL-33刺激展現強阻斷活性(IC50=3.71E-09M)，在所測試抗體之最大濃度(100nM)下觀察到接近完全阻斷(93%)。
將HEK-Blue IL-36反應細胞(亦即，短暫表現IL-36受體IL1RL2之IL-33細胞)與11C5(Hy)一起培育一小時，隨後用IL-36α(圖1D)、IL-36β(圖1E)或IL-36γ(圖1F)刺激。在100nM之11C5(Hy)抗體濃度下，觀察到對IL-36依賴性信號傳導之接近完全抑制，具體而言，對IL-36α、IL-36β及IL-36γ分別為98%、98%及99%抑制。IL-36α、IL-36β及IL-36γ之IC50值分別為2.52E-09M、9.81E-10M及6.65E-10M。
mAb 11C5(Hy)在HEK-Blue分析中之IC50值及抑制%概述於下表8中。
Figure 108129005-A0202-12-0096-537
如上表8中之結果所示，在基於HEK Blue細胞之阻斷分析中，經純化融合瘤衍生之抗體11C5(Hy)能夠在所有六種細胞介素(IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β及IL-36γ)之刺激時有效地阻斷所有三個感興趣的途徑(IL-1、IL-33及IL-36)。
實例5：製備抗IL1RAP mAb 11C5(Hy)之人類化、嵌合及C59突變體形式
此實例說明衍生自融合瘤11C5之鼠類抗IL1RAP mAb 11C5(Hy)之人類化及嵌合形式之製備。另外，所述實例說明以一系列替代性胺基酸C59A、C59S、C59T、C59V及C59Y取代在位置59處之重鏈半胱胺酸殘基的11C5(Hy)mAb之鼠類、人類化及嵌合變體之製備。
鼠類抗IL1RAP 11C5可變區序列之人類化
相對於人類生殖系抗體序列比對SEQ ID NO：257之鼠類11C5(Hy)抗體輕鏈可變區(VL)序列及SEQ ID NO：279之重鏈可變區(VH)序列。人類生殖系κ輕鏈(基因ID-V基因：IGKV1-NL1*01，J基因：IGKJ4*02)及人類生殖系重鏈(基因ID-V基因：IGHV3-7*03，J基因：IGHJ4*03)經鑑定為最接近的人類構架。鼠類11C5(Hy)、最接近的人類生殖系序列及人類化h11C5之VL及VH結構域之胺基酸序列比對顯示於圖2中。
將鼠類11C5(Hy)輕鏈及重鏈之互補決定區(CDR)分別接枝至所鑑定的最接近的輕鏈及重鏈人類構架中，以產生人類化抗體純系(下文稱為「h11C5」)。將鼠類11C5(Hy)VL序列(SEQ ID NO：257)之CDR-L1中之位置24-34、CDR-L2中之位置50-56及CDR-L3中之位置89-97接枝至人類κ輕鏈構架受體中。將鼠類11C5(Hy)VH序列(SEQ ID NO：279)之CDR-H1中之位置31-35、CDR-H2中之位置50-65及CDR-H3中之位置95-102接枝至人類重鏈構架受體中。亦將鼠類11C5(Hy)輕鏈之構架區2中之位置48接枝至人類κ輕鏈構架受體中，因為發現此位置為VH-VL相互作用界面之一部分或為充當「游標(Vernier)」區之構架殘基，其可以調整CDR結構且對其進行微調以適合抗原(參見例如Foote等人，《分子生物學雜誌》,224：4887-499(1992))。
以DNA片段形式合成人類化可變結構域序列，其中對於VL，以AgeI作為5'側接限制酶位點且以KpnI作為3'側接限制酶位點，且對於VH，以AgeI作為5'側接限制酶位點且以BstEII作為3'側接限制酶位點。h11C5之輕鏈表現質體藉由用含有完整人類κ輕鏈恆定結構域之pRK質體中之合成h11C5 VL DNA片段替換AgeI-KpnI片段而衍生。h11C5之重鏈表現質體藉由用含有完整人類IgG1重鏈恆定結構域之pRK質體中之合成h11C5 VH DNA片段替換AgeI-BstEII片段而衍生。
為了與人類化h11C5抗體比較，如上所述合成鼠類11C5(Hy)VL 及VH序列之DNA片段。表現鼠類11C5(Hy)或11C5之嵌合形式(含有鼠類VL及VH結構域，及人類CL及CH1-CH3結構域)之輕鏈及重鏈的質體藉由將合成DNA片段選殖至分別攜帶鼠類IgG2a或人類IgG1恆定結構域之pRK質體中而構築。
產生抗IL1RAP 11C5之重鏈Cys59變體
鼠類11C5(Hy)之VH之CDR-H2序列在位置59處含有未配對的半胱胺酸殘基(Cys59)，其可為抗體之進一步治療性開發的主要不利條件。為了移除此不利條件，合成以丙胺酸(A)、絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)、纈胺酸(V)或酪胺酸(Y)對位置59處之半胱胺酸(C)進行胺基取代的VH結構域序列之一系列變體。所述取代基於與半胱胺酸之胺基酸側鏈相似性(丙胺酸、絲胺酸、蘇胺酸及纈胺酸)或基於在位置59處之最接近的生殖系序列(酪胺酸)而選擇。在鼠類11C5(「11C5(Hy)」)、嵌合11C5(「c11C5」)及人類化11C5(「h11C5」)中之每一者之VH序列之情況下產生的一系列Cys59 mAb變體係以DNA片段形式合成，其中以AgeI作為5'側接限制酶位點且以BstEII作為3'側接限制酶位點。如上所述產生Cys59變體之重鏈表現質體。
產生11C5(Hy)衍生之鼠類、嵌合及人類化抗IL1RAP mAb及其Cys59變體之重組形式
重組IgG分子之表現係使用Expi293F表現系統(美國加利福尼亞州喀斯巴德之Life Technologies)根據製造商提供之說明書進行。對於轉染反應，重鏈及輕鏈之質體之比率保持在1：1，且在收穫前將經轉染細胞培養6天。
按以下方案純化重組IgG分子。藉由在300g下離心10分鐘以移除細胞且藉由用0.22μm孔徑過濾器過濾，使上清液培養基澄清。將澄清之上清液培養基與經PBS緩衝液平衡之POROS MabCapture A樹脂(賽默科技)混合，且在溫和旋轉下在室溫下培育1.5小時。在培育後，將漿料加載至管柱中且 用20管柱體積含有0.5M NaCl之PBS緩衝液洗滌樹脂。隨後用3管柱體積之0.1M乙酸、0.15M NaCl溶離重組IgG分子。用1M MOPS pH 7.0快速中和溶離劑至pH 5.2，且用PD-10管柱(GE)將緩衝液更換為PBS緩衝液。
11C5(Hy)衍生之鼠類、嵌合及人類化抗IL1RAP mAb及其Cys59變體之重組形式之結合親和力
藉由OCTET生物層干涉法(BLI)結合分析(Pall ForteBio)量測衍生自11C5(Hy)之鼠類(「m11C5」)、嵌合(「c11C5」)及人類化(「h11C5」)mAb之重組形式對SEQ ID NO：3之hu-M-IL1RAP多肽的結合親和力。
實驗形式具有固定於生物層表面上之抗體且抗原IL1RAP在溶液中。在實驗緩衝液(含0.01% Tween-20之PBS緩衝液)中稀釋重組hu-M-IL1RAP及所有11C5變體(最終體積各為200μL)。將所有樣品置放於黑色96孔盤中且在25℃下進行實驗。將鼠類及嵌合11C5變體(35nM)固定於抗小鼠IgG Fc捕捉(AMC)生物感測器(Pall ForteBio)上。抗人類IgG Fc捕捉(AHC)生物感測器(Pall ForteBio)用於人類化11C5變體(35nM)。在1-81nM範圍內在實驗緩衝液中連續稀釋hu-M-IL1RAP分析物溶液。在開始實驗之前，將生物感測器在25℃下在實驗緩衝液中平衡十分鐘。
按以下步驟進行動力學實驗，其中列出步驟名稱、溶液及時間：基線(緩衝液-60秒)、加載(抗體-200秒)、基線2(緩衝液-最少120秒)、締合(分析物-200-300秒)及解離(緩衝液-1000秒)。
使用Octet資料分析軟體(Pall ForteBio)分析由與經固定抗體之分析物締合及解離產生的BLI信號。首先，使用參考孔(與實驗孔經歷相同步驟但分析物不用於締合步驟之生物傳感器)對所有記錄的跡線進行參考減法，隨後將所有跡線與締合步驟之開始對齊。將整個締合及解離步驟用於1：1結合模型中之全擬合(最少四條分析物濃度跡線)，以計算各11C5變體與hu-M-IL1RAP 之KD。所計算之KD值列於下表9中。
Figure 108129005-A0202-12-0100-538
實例6：人類化11C5之非特異性結合評定
此實例說明桿狀病毒(BV)粒子ELISA分析，其顯示人類化11C5(h11C5)不展現非特異性結合。
以下方案用於根據Hotzel等人，mAbs,4(6)：753-760(2012)中所述之方案評定h11C5與桿狀病毒(BV)粒子之非特異性結合。簡言之，將BV粒子以2.5%懸浮液形式塗佈於96孔ELISA培養盤上，在4℃下隔夜。隨後用含1% BSA、0.05% Tween-20之PBS在室溫下阻斷培養盤一小時。將經連續稀釋之h11C5抗hu-IL1RAP抗體添加至培養盤，持續一小時，且用與辣根過氧化酶結合之山羊抗人類IgG(Jackson ImmunoResearch)偵測所結合之抗體，隨後添加3,3',5,5'-四甲基聯苯胺受質(賽默飛世爾科技)及2N硫酸。量測450nm下之吸光度且將其與參考抗體進行比較。
結果：如圖3之圖所示，h11C5抗體在450nm下未顯示可偵測的BV ELISA信號，指示不存在與BV粒子之任何非特異性結合。
實例7：基於11C5之鼠類、嵌合及人類化抗IL1RAP抗體之功能分析
此實例說明實例4及5中所述之重組鼠類、嵌合及人類化抗IL1RAP抗體的基於細胞之阻斷分析，以確定其各自抑制IL-1、IL-33及IL-36刺激的細胞內信號傳導之能力。
材料及方法
細胞株及HEK-Blue分析：此實例7中所用之細胞株及HEK-Blue分析如上文在實例2及4中所述。
初代人類肺纖維母細胞及相關分析：初代人類肺纖維母細胞(PHLF)為市售的且獲自龍沙(Lonza)(目錄號CC-2512)。自正常(無疾病)捐贈的人類組織分離細胞且由製造商冷凍保存所述細胞。使用製造商推薦的普通準則解凍及維持細胞。在生長培養基中維持PHLF，所述生長培養基由FibroLife基礎培養基(LifeLine)組成，所述培養基補充有在使用前加熱不活化(56℃，30分鐘)之2%人類AB血清(康寧)、7.5mM Glutamax(Gibco)、100IU/mL青黴素及100μg/mL鏈黴素。在實驗使用前一天，將PHLF以將在使用當天產生約80-85%之匯合度的濃度接種於平底96孔盤上。
在用於抗體阻斷分析中之前，藉由以如實例2中針對HEK-Blue細胞所述之類似方式，伴隨以下修改，進行促效劑劑量-反應曲線以測定促效劑EC50。在向僅含PHLF生長培養基之孔中之PHLF中添加促效劑(最終體積200μL)後，細胞返回組織培養培育箱(37℃，5% CO2)，持續四小時。隨後收集組織培養上清液且將其於4℃下儲存1-3天。使用IL-8(人類)AlphaLISA偵測套組(珀金埃爾默(Perkin Elmer))定量存在於所收集之上清液中的IL-8之含量。按製造商準則中之指示進行分析。使用GraphPad Prism軟體分析使用 EnVision-Alpha讀取器(珀金埃爾默)獲得之原始資料，且使用S形4PL非線性回歸分析(曲線擬合)進行內插，X為log(濃度)且加權由「權重1/Y2」定義。隨後使用標準非線性回歸分析分析內插資料。
如實例4中進行基於細胞之阻斷分析，但改為有利於獲得IC50值之方式，伴隨修改以特別考慮PHLF使用。簡言之，將c11C5_C59Y或適當的抗體對照(例如，HuIgG1對照)與PHLF一起在37℃下培育1小時，隨後添加促效劑(IL-1α或IL-36β)。使實驗再進行四小時(37℃，5% CO2)，收集細胞培養上清液且定量IL-8，如上文所述進行。
初代人類單核球及相關分析.藉由負向免疫磁性選擇分離之初代人類單核球(PHMO)，亦稱為「未接觸的」，為市售的且獲自STEMCELL Technologies。根據普通製造商準則解凍單核球且在標準生長培養基中維持，如實例4中所述。對於抗體阻斷分析，在分析前一天將PHMO以80,000個/孔種植於平底96孔盤上。將抗體c11C5_C59Y或適當的抗體同型對照(Hu IgG對照)與PHMO一起在37℃與5% CO2下一起培育1小時，隨後添加感興趣的促效劑(例如，IL-1β)。所有孔之最終體積為200μL，其中陽性對照(PC)指示僅生長培養基及促效劑，且陰性對照(NC)指示僅PHMO及生長培養基。
在添加促效劑後二十四小時收集組織培養上清液且將其儲存於-80℃下，直至可進行ELISA分析以確定所存在之IL-6之含量。使用人類IL-6 ELISA套組(賽默飛世爾科技)定量上清液中之IL-6之含量。使用GraphPad Prism軟體及非線性回歸分析進行原始資料分析及內插。在抗體阻斷分析之前，產生促效劑劑量-反應曲線以確定EC50值，如實例2中大體所述，伴隨修改以特別考慮PHMO之使用及如上所述。以相同方式測定抗體IC50值。
初代人類NK細胞及相關分析.在商業上自STEMCELL Technologies(加拿大溫哥華(Vancouver,Canada))獲得藉由負向免疫磁性選 擇分離之初代人類NK細胞。在實驗使用當天，根據普通製造商準則，伴隨以下修改，解凍NK細胞。在由補充有0.05mg/mL DNAse I(STEMCELL Technologies)之RPMI(康寧)組成的解凍培養基中解凍細胞。解凍後，在實驗使用之前給予細胞最少1小時之回收時間(37℃，5% CO2)，且在由RPMI(康寧)組成之NK生長培養基中維持細胞，所述培養基補充有在使用前加熱不活化(56℃，30分鐘)之10%人類AB血清(康寧)、1mM丙酮酸鈉(Corning Cellgro)、2mM Glutamax(Gibco)及1×MEM非必需胺基酸(Gibco)。
在實驗中用於抗體阻斷分析中之前，藉由以如實例2中針對HEK-Blue細胞所述之類似方式，伴隨以下修改，進行促效劑劑量-反應曲線以測定促效劑EC50。將NK細胞以50,000個/孔接種於圓底96孔盤中。在向懸浮於僅NK生長培養基中之NK細胞中添加促效劑(最終體積200μL)後，細胞返回組織培養培育箱(37℃，5% CO2)，持續24小時。除了僅含NK生長培養基之標準陰性對照(NC)之外，陽性對照(PC)由含有IL-33(指定濃度)及0.1ng/mL IL-12之NK生長培養基組成。亦包含額外「僅IL-12」對照。
在添加促效劑後24小時收集組織培養上清液且將其於4℃下儲存1-3天。使用人類IFN-γ ELISA套組(英傑(Invitrogen)/賽默飛世爾科技)根據製造商準則測定存在於上清液中之IFN-γ之含量。使用GraphPad Prism 7軟體進行非線性回歸分析以獲得最終EC50值。
類似地進行抗體阻斷分析，但改為有助於獲得IC50值之方式，如實例2中大體所述且經過修改以特別考慮NK細胞使用，如上文所詳述。簡言之，將c11C5_C59Y或適當的抗體同型對照(Hu IgG對照)與NK細胞一起在37℃下培育1小時，隨後添加促效劑(IL-33+IL-12，或僅IL-12)。實驗再進行24小時(37℃，5% CO2)，收集細胞培養上清液且進行IFNγ定量，如上所述。
結果
為了測定重組人類化11C5(「h11C5」)之阻斷效力及功效，吾人進行HEK-Blue IL-1/IL-33阻斷分析。亦分析原始鼠類融合瘤衍生抗體(「11C5(Hy)」)及重組鼠類無效應形式(「m11C5」)以及無效應人類IgG同型對照(「Hu IgG1對照」)，以評定由於人類化所導致的任何潛在的阻斷活性喪失。
人類化引起IL-1β(圖4A)及IL-33(圖4B)刺激的細胞中之阻斷活性略微喪失。在IL-1β刺激之細胞的情況下，相比於融合瘤衍生之11C5(Hy)之重組形式m11C5，人類化抗體h11C5顯示出98%抑制(IC50=3.12nM)，所述重組形式在100nM下展現完全抑制(IC50=0.705nM)。同樣，對於IL-33刺激之細胞，h11C5在100nM下展現80%抑制(IC50=24.0nM)，對比m11C5所觀察到之96%抑制(IC50=2.25nM)。如圖4C及4D中所示，移除了C59不利條件之11C5_C59Y變體部分恢復了h11C5之IL-1β及IL-33阻斷活性。對於h11C5_C59Y，IL-1β阻斷活性之IC50提高至1.03nM，且IL-33阻斷活性之IC50提高至3.75nM。
總之，融合瘤衍生之抗Hu IL1RAP抗體11C5(Hy)成功人類化，其阻斷IL-1及IL-33依賴性途徑之能力僅略微下降，所述能力藉由VH區中之C59Y取代而部分恢復。
雖然迄今為止所使用之HEK-Blue細胞株提供快速且簡單的評定IL-1、IL-33或IL-36途徑活化之方式，但是諸如此等細胞株之細胞株可能不代表活體內可能發生的情況。因此，吾人設法使用初代人類細胞評估11C5之阻斷活性。已知人類肺纖維母細胞表現IL-1受體(IL1R1)及其相關輔受體IL1RAP。此外，咸信其有助於先天性及發炎性免疫反應(Suwara,Green等人，2014)。為了測定11C5抗體抑制初代人類肺纖維母細胞(PHLF)中之IL-1信號傳導的程度，修改用於HEK-Blue細胞株分析之一般實驗方法以考慮PHLF之特殊要求及 技術要求。另外，在分析中使用以無效應N297G突變為特徵的11C5抗體之重組嵌合形式(「c11C5_C59Y」)。
如圖4E中所示，c11C5_C59Y顯示與在HEK-Blue分析中針對IL-1α刺激之活性所觀察到的(參見圖1A)非常相似的阻斷PHLF中由IL-1α介導之IL-8產生之活性，兩種情況下觀察到之IC50均為大約4nM(100nM c11C5_C59Y在PHLF中，IC50 3.96nM及87%抑制)。
咸信IL-1途徑有助於氣管發炎且已知人類單核球對IL-1起反應(Sims及Smith 2010)。如圖4F中所示，當在c11C5_C59Y存在下用IL-1β刺激初代人類單核球(PHMO)時，觀察到對IL-6產生之100%抑制及0.733nM之IC50。此表明c11C5_C59Y能夠完全阻斷PHMO中之由IL-1β介導之信號傳導。
IL-33途徑對哮喘症狀之作用及貢獻已有充分記錄(參見例如Sims及Smith,《自然．免疫學綜述(Nat.Rev.Immunol.)》,10(2)：89-102(2010)；Garlanda等人，《免疫》,39(6)：1003-1018(2013)；Saluja等人，《臨床及轉化過敏》,5：33(2015))。為了確定c11C5_C59Y是否能夠阻斷初代人類細胞中之IL-33途徑，使用人類NK細胞進行分析。已知IL-12刺激NK細胞對ST2(IL-33受體)之表現，且視為一般NK刺激因子，增加IFN-γ之產生及增殖，以及增強細胞毒性(參見例如Liew等人，《自然．免疫學綜述》,16(11)；676-689(2016)；Granzin等人，《免疫學前沿(Front.Immunol.)》,8：458(2017))。在IL-12存在下經IL-33刺激之初代人類NK細胞產生IFN-γ，然而僅曝露於IL-12之NK細胞未能產生可偵測的IFN-γ。
為了確定c11C5_C59Y阻斷人類NK細胞中之IL-33/IL-12信號傳導之程度，將c11C5_C59Y或無效應同型對照抗體(「IgG對照」)與人類NK細胞一起培育一小時，隨後IL-33/IL-12刺激24小時。如圖4G中所示，IFN-γ產生在與對照抗體一起培育之人類NK細胞中係可偵測的，但降低至接近與 c11C5_C59Y一起培育之NK細胞中之NC的含量的含量，其中在100nM下，IC50為2.90nM且抑制87%。
氣管上皮、上皮細胞及免疫細胞串擾(cross-talk)及上皮細胞與纖維母細胞之間的相互作用因其在免疫發炎及哮喘中之作用而愈來愈受到關注(參見例如Lambrecht及Hammad(2012)；Nowarski等人，《細胞(Cell)》,168(3)：362-375(2017))。已知支氣管上皮細胞促進在損傷或應激後，諸如在病毒或細菌感染及曝露於香菸煙霧後，產生發炎性細胞介素，諸如IL-1及IL-36。此外，已知肺纖維母細胞對IL-1及IL-36起反應以誘導發炎反應(參見例如Suwara等人，《黏膜免疫(Mucosal Immunol.)》,7(3)：684-693(2014)；Bassoy等人，《免疫學評論(Immunol.Rev.)》,281(1)：169-178(2018))。如圖4H中所示，證明c11C5_C59Y可阻斷IL-36β對PHLF之刺激且發現其將IL-8產生降低至與NC組中之PHLF相當的含量(100%抑制)，其中IC50為0.28nM。
如此實例7之結果所示，包含下表10中所概述之c11C5_C59Y之結果，基於融合瘤衍生之抗hu-IL1RAP抗體11C5(Hy)之重組抗體能夠阻斷HEK-Blue細胞株及初代人類細胞中之IL-1、IL-33及IL-36信號傳導。此外，初代人類細胞分析進一步驗證HEK-Blue細胞株分析之使用。
Figure 108129005-A0202-12-0106-539
實例8：使用噬菌體庫淘選，人類化抗IL1RAP抗體之親和力成熟
此實例說明用於人類化抗IL1RAP抗體h11C5之親和力成熟以改 善與人類IL1RAP之結合的噬菌體庫構築及淘選技術。
人類化11C5 C59Y/A43S親和力成熟NNK庫構築
進行親和力成熟方法以進一步改善h11C5_C59Y抗體與hu-IL1RAP之結合親和力。在開始構築庫之前，將丙胺酸(A)至絲胺酸(S)取代(A43S)引入h11C5_C59Y輕鏈之構架區2中。引入A43S取代以使由於人類化過程而改變VH-VL相互作用界面之潛在影響降至最低(Foote等人，《分子生物學雜誌》,224：487-499(1992))。因此，基於使用h11C5_C59Y/A43S變體作為親本序列而構築噬菌體庫。針對單價Fab噬菌體呈現，使用編碼所有20種胺基酸之NNK簡併密碼子，以Fab-amber格式構築噬菌體庫，且對輕鏈或重鏈CDR殘基進行殘基隨機化(Brenner等人，《美國國家科學院院刊》,89(12)：5381-5383(1992))。設計突變誘發寡核苷酸以將一個NNK突變應用於三個輕鏈或重鏈CDR中之每一者中之CDR殘基。因此，庫之各成員攜帶三個NNK簡併密碼子，輕鏈或重鏈之各CDR各一個。隨後使用Kunkel突變誘發(Kunkel等人，《酶學方法(Methods Enzymol.)》,154：367-382(1987))，使用合成的突變誘發寡核苷酸構築輕鏈或重鏈庫。將所得庫DNA電穿孔至大腸桿菌XL1細胞中，得到大約1.3×109個轉形體。
將SEQ ID NO：3之hu-M-IL1RAP多肽構築體(2μg/mL)塗佈於Maxisorp培養盤上，在4℃下隔夜。對於第一輪淘選，在含有0.05% TWEEN® 20及1% BSA之PBS緩衝液中阻斷培養盤及噬菌體庫1小時(培養盤)或30分鐘(噬菌體庫)。在洗滌緩衝液(含有0.05% TWEEN® 20之PBS緩衝液)中洗滌培養盤且將其與經阻斷之噬菌體庫一起在震盪下培育2小時。藉由用洗滌緩衝液劇烈洗滌移除非特異性結合的噬菌體。特異性結合的噬菌體用0.1N HCl溶離且使用1/10 v/v 1.3M Tris鹼中和。藉由添加1/10 v/v 1% BSA抑制非特異性相互作用。
第二輪淘選與第一輪相同，但改為使用SUPERBLOCKTM PBS緩衝液(Pierce)及0.05% TWEEN® 20進行阻斷步驟。
對於第三至五輪淘選，將噬菌體庫與阻斷緩衝液(第3輪中為含1% BSA之PBS緩衝液，且第4輪及第5輪中為SUPERBLOCKTM PBS緩衝液(Pierce)及0.05% TWEEN® 20)一起培育30分鐘，且隨後與遞減濃度之生物素標記之hu-M-IL1RAP一起培育1小時。將Hu-M-IL1RAP結合之噬菌體捕捉於經阻斷之塗有中性抗生物素蛋白(neutravidin)之培養盤上，用洗滌緩衝液充分洗滌，且以與第1輪及第2輪中相同之方式溶離及中和。在最後一輪選擇中，添加1000×非生物素標記之hu-M-IL1RAP作為競爭者以增加選擇嚴格性。
為了使用NGS從親和力成熟庫提取序列，從初始噬菌體庫(未分選庫)及從第二輪及第三輪溶液選擇(分選庫)從攜帶噬質體之大腸桿菌XL-1細胞分離噬質體雙股DNA。使用經純化DNA作為模板，使用Illumina 16s庫製備方案(美國加利福尼亞州聖地亞哥之Illumina,Inc.)產生VL及VH區域之擴增子。使用Illumina Nextera XT索引套組(Illumina,Inc.)添加定序銜接子及雙索引條碼。準備在Illumina MiSeq上定序時，使用MiSeq試劑套組v3(600個循環)(Illumina,Inc.)，使銜接子連接之擴增子經歷標準Illumina庫變性及樣品加載方案。進行配對末端定序以覆蓋擴增子之整個長度，***大小為200bp至300bp。
h11C5_C59Y/A43S親和力成熟庫之NGS資料分析
首先使用配對末端組譯器PANDAseq(參見例如Masella等人，《BMC生物信息學(BMC Bioinformatics)》,13：31(2012))組譯配對末端定序資料以獲得完整擴增子。隨後對經鑑定擴增子進行品質控制(QC)，其中檢查各擴增子沒有序列***或缺失及沒有終止密碼子，允許各CDR序列攜帶至多僅一個NNK突變且沒有非NNK突變。藉由計算每一個隨機化位置之所有突變之頻率產生位置權重矩陣。藉由分選樣品中在給定位置之給定突變之頻率除以未 分選樣品中完全相同突變之頻率來計算各突變之富集比率，如先前所描述(Koenig等人，《生物化學雜誌》,290(36)：21773-27896(2015))。對NGS資料之分析鑑定了六個CDR中之每一者中之廣泛範圍的胺基酸取代，其產生保留對hu-M-IL1RAP之高親和力的抗IL1RAP抗體，且其列於下表11中。
Figure 108129005-A0202-12-0109-540
對來自親和力成熟庫之NGS資料之進一步分析得到針對所選擇的具有胺基酸取代之變異h11C5抗體亞組的所計算之富集比率及所預測之親和力改善，所述亞組經預測呈現下表12中所示之最高親和力改善。
Figure 108129005-A0202-12-0109-541
Figure 108129005-A0202-12-0110-542
具有親和力成熟V L 或V H 區之Fab變體之Biacore分析
選擇從親和力成熟VL或VH庫鑑定之具有高富集比率之突變作為單一、雙重或三重突變選殖至含有8XHis標籤之哺乳動物Fab表現構築體中以產生Fab蛋白質。針對20-30mL表現，使用1：1比率之HC：LC，將編碼親和力成熟VL或VH區之質體轉染至Expi293F細胞(賽默飛世爾科技)中。藉由用1×磷酸鹽緩衝鹽水pH 7.2(PBS)稀釋上清液1.5×，添加10mM咪唑，且以分批模式與樹脂結合2小時，用HisPur Ni-NTA管柱純化Fab蛋白質。在培育後，將漿料加載至管柱中且用20管柱體積(CV)PBS+20mM咪唑洗滌樹脂。用5CV PBS+250mM咪唑溶離重組Fab分子。使用PD10脫鹽管柱(GE Healthcare)將經純化Fab之緩衝液更換成PBS。
使用表面電漿子共振(SPR)分析，使用BIACORETM 8K儀器測定在VL或VH區中含有所選擇的單一、雙重及三重突變之經純化Fab對hu-M-IL1RAP的結合親和力。簡言之，以2μL/min流動速率向晶片施加生物素捕捉試劑(GE Healthcare)於HBS-EP緩衝液(0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005%界面活性劑P20)中之1：4稀釋液。對於動力學量 測，以10μL/min捕捉5nM生物素標記之hu-M-IL1RAP以在第二流量槽(FC2)中達成約50個反應單位。FC1保持作為參考。接著，在25℃或37℃下從低(0.31nM)至高(20nM)注射(流動速率：10μL/min)Fab蛋白質於HBS-P緩衝液(0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、0.005%界面活性劑P20)中之2倍連續稀釋液。記錄感測器圖譜且在用BIACORE® 8K評估軟體(1.1.1.7442版)進行資料分析之前進行參考及緩衝減法。使用簡單的一對一朗格繆爾結合模型(one-to-one Langmuir binding model)計算締合速率(kon)及解離速率(koff)。平衡解離常數(KD)按比率koff/kon來計算。
結果
親和力成熟Fab變體之Biacore親和力結果概述於下表13中。諸多變體顯示改善的結合親和力。將A51Y及W92I突變引入親本序列中之變體K13使親和力相對於h11C5_C59Y/A43S之輸入親本Fab改善9倍。
Figure 108129005-A0202-12-0111-543
Figure 108129005-A0202-12-0112-544
具有改善的親和力之組合的V L 及V H 區變體之Fab蛋白質
展現改善最多的KD值的Fab變體選自VL區(K10、K13及K17)及VH區(H2及H3)變體以產生包括VL及VH區變體之變體。如上所述進行所得組合變體之BIACORETM SPR分析，且結果概述於下表14中。組合Fab變體K10/H2、K13/H2及K13/H3展現親和力相對於h11C5_C59Y/A43S之輸入親本Fab改善約12-13倍。
Figure 108129005-A0202-12-0112-545
Figure 108129005-A0202-12-0113-546
實例9：分析親和力成熟抗IL1RAP抗體
此實例說明用於表徵實例8中所述之親和力成熟人類化抗IL1RAP抗體變體之功能活性的基於細胞之阻斷分析，所述變體呈Fab及全長IgG形式。
材料及方法
細胞株及HEK-Blue分析.此實例9之細胞株及HEK-Blue相關分析如實例2中所述進行。
產生全長h11C5 IgG變體.針對30mL表現，使用1：1比率之HC：LC將編碼重鏈或輕鏈之質體轉染至Expi293F細胞(賽默飛世爾科技)中。藉由使上清液流經管柱，用20管柱體積(CV)之PBS+500mM NaCl洗滌，且用20CV PBS平衡，用HiTrap MabSelect SuRe管柱(GE Healthcare)純化IgG。用5CV 0.1M乙酸+150mM NaCl pH 3.0溶離IgG，且立即用0.2CV 1.0M MOPS pH 7中和。進一步經由凝膠過濾，使用S200製備級篩分管柱(GE Healthcare)於2×PBS pH 6.5中進一步純化IgG。
結果
對實例8之親和力成熟Fab變體以及變體抗體之全長IgG形式進行HEK-Blue分析(如實例4及7中所用)以確定所觀察到之對hu-M-IL1RAP之結合親和力之改善是否與阻斷IL-1、IL-33及IL-36信號傳導活性方面之改善 相關。如圖5A、5B及5C中所示，在實例8中顯示出最大親和力改善的九種Fab變體(亦即，K10、K13、K17、K10/H2、K10/H3、K13/H2、K13/H3、K17/H2、K17/H3)亦在HEK-Blue分析中展現出對IL-1、IL-33及IL-36信號傳導活性之抑制相對於h11C5_C59Y/A43S之親本Fab增加。九種親和力成熟Fab變體在100nM下之效力(IC50)及抑制%概述於下表15中。
Figure 108129005-A0202-12-0114-547
亦分析呈具有無效應N297G突變之全長IgG抗體形式的相同親和力成熟變體。如圖5D及5F中所示，在分別使用IL-1β或IL-36α刺激的HEK-Blue IL-1/IL-33細胞或IL-33細胞(短暫表現IL-36受體IL1RL2)的分析中觀察到相似結果。然而，如圖5E中所示，大多數，但不是所有變體對IL-33刺激的HEK-Blue IL-1/IL-33細胞均展現增加的阻斷活性。全長IgG親和力成熟變體在100nM下之效力(IC50)及抑制%概述於下表16中。
表16.親和力成熟h11C5 IgG變體之抑制效力.
Figure 108129005-A0202-12-0115-548
實例10：h11C5變體之pH依賴性結合
此實例說明實例9之親和力成熟h11C5變體中之一些在pH 6及pH 7.4下結合hu-IL1RAP及cyno-IL1RAP之動力學。為了延長11C5變體之活體內半衰期，吾人設法增加h11C5在pH 6下對新生兒Fc受體FcRn之親和力(同時保持在中性pH下之親和力不變)。在投與後，IgG最初內化至細胞中且隨後在內體中被加工(參見例如Kuo等人，MAbs,3(5),422-430(2011))。內體之酸化促進IgG Fc片段與FcRn之結合，在低pH下的一種高親和力相互作用(參見例如Roopenian等人，《自然．免疫學綜述(Nature Reviews Immunology)》,7(9),715-725(2007))。在作為複合物轉運至細胞表面後，IgG由於在中性pH下FcRn對Fc之較低親和力而釋放回至循環中。此再循環過程保護IgG免於降解，從而有助於其活體內長半衰期。
增加IgG在低pH下對FcRn之親和力的突變可藉由允許抗體再循環至細胞表面且回至循環中而產生治療性抗體之較大活體內半衰期。然而， IL1RAP對治療分子之由目標介導之藥物處置(TMDD)可防止藉由FcRn再循環。在酸性pH下與IL1RAP具有相對較快解離速率(「koff」)之h11C5變體可限制來自TMDD之干擾且可從增強FcRn結合之突變受益最多。
為了確定實例9中哪種h11C5變體具有最佳的在低pH下逃脫TMDD之可能性，吾人量測h11C5變體在pH 7.4及pH 6下結合IL1RAP之動力學。在所測試的四種11C5變體中，來自實例9之h11C5變體K17/H2(或「YKD」)在pH 6下具有最快的koff。這表明YKD具有最佳的逃脫由目標介導之藥物處置(TMDD)之可能性且因此可從FcRn結合突變受益最多。
材料及方法
h11C5 IgG變體在pH 7.4及pH 6下之BIACORE SPR分析：在pH 7.4下結合hu-M-IL1RAP(SEQ ID NO：3)及cyno-M-IL1RAP(SEQ ID NO：8)之四種h11C5 IgG變體的BIACORETM SPR分析如實例8中所述進行，其中將0.6nM生物素標記之hu-M-IL1RAP或1.8nM cyno-M-IL1RAP捕捉於晶片上且在37℃下從低(0.103nM)至高(10nM)注射11C5 IgG之3倍連續稀釋液作為分析物。對於11C5變體與hu-M-IL1RAP及cyno-M-IL1RAP在pH 6下之結合，方法與在pH 7.4下之結合相同，但改為使用pH 6操作緩衝液(10mM MES pH 6、150mM NaCl、0.005%(w/v)P20)，其亦用於1：4稀釋生物素捕捉試劑(GE Healthcare)。
結果
在pH 7.4及pH 6下之BIACORE SPR分析之結果概述於表17中，其中KD為所量測之表觀親和力(假定IgG為呈此形式之分析物)，且koff為解離速率。
表17.h11C5變體在pH 7.4及pH 6下結合hu-M-IL1RAP及cyno-M-IL1RAP之BIACORE SPR動力學.
Figure 108129005-A0202-12-0117-549
h11C5變體YKD在pH 6下之較快解離速率(亦即，「與YIS之koff(6)比率」之最大值)表明此變體可能將具有最佳的逃脫由目標介導之藥物處置(TMDD)之可能性。若h11C5-IL1RAP複合物在內體中內化且加工，則YKD變體將相對於其他h11C5變體最快地從IL1RAP解離。FcRn隨後可結合游離h11C5且將其遞送至細胞表面，允許藥物釋放回至循環中。因此，h11C5變體YKD可以從Fc區中增加在酸性pH下而不是在中性pH下對FcRn之親和力的額外突變受益最多。
實例11：產生含YTE突變之h11C5變體
此實例說明產生促進IgG Fc片段與FcRn以較高親和力在低pH下結合之h11C5變體的方法及進一步表徵變體之方法。
材料及方法
產生含YTE突變之抗體：將已知增加Fc片段與FcRn之親和力的YTE三重突變M252Y/S254T/T256E(根據Eu索引編號，YTE)(參見例如Dall' Acqua等人，《免疫學雜誌(J Immunol)》169(9)：5171-5180(2002))藉由基因合成引入實例9及10中所述之h11C5變體YKD及YIS之Fc部分中以產生YKD/YTE及YIS/YTE。重組抗體YKD/YTE及YIS/YTE如實例5中所述產生。
含YTE取代之11C5 IgG變體之BIACORE SPR分析：變異h11C5抗體YIS、YIS/YTE、YKD及YKD/YTE與hu-M-IL1RAP及cyno-M-IL1RAP在pH 7.4及37℃下之BIACORETM SPR結合分析如實例10中所述進行。
在pH 6.0及7.4下之FcRn結合之分析：為了確定YKD及YKD/YTE與人類FcRn及食蟹獼猴FcRn之結合親和力，用BIACORETM 8K儀器進行SPR量測。簡言之，使用S系列感測器晶片CAP捕捉生物素標記之人類FcRn或食蟹獼猴FcRn進行結合量測。以2μL/min流動速率向晶片施加生物素捕捉試劑(GE Healthcare，目錄號28-9202-34)於HBS-EP緩衝液(0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005%界面活性劑P20)中之1：4稀釋液。以10μL/min捕捉10nM生物素標記之人類FcRn(Acro biosystems，目錄號FCN-H52W7)或食蟹獼猴FcRn(Acro biosystems，目錄號FCM-C5284)以在第二流量槽(FC2)中達成大約50個反應單位。第一流量槽(FC1)保持作為參考。接著，在25℃下以30μL/min之流動速率從低(1.37nM)至高(1000nM)濃度注射YKD或YKD/YTE IgG於MES緩衝液(10mM MES pH 6.0、150mM NaCl、0.005%界面活性劑P20)或HBS-P緩衝液(0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、0.005%界面活性劑P20)中之3倍連續稀釋液。記錄感測器圖譜且在藉由BIACORE® 8K評估軟體(1.1.1.7442版)評估之前進行參考及緩衝減法。
用以測定含YTE突變之h11C5變體之非特異性結合的桿狀病毒(BV)ELISA：YIS/YTE及YKD/YTE之非特異性結合藉由BV ELISA如實例6中所述評定，但改為用含1% BSA之PBS(無0.05% Tween-20)阻斷培養盤。
結果
產生含YTE突變之抗體：產生含YTE取代之Fc片段且其胺基酸序列列於表2中且作為SEQ ID NO：327提供於隨附序列表中。
含YTE突變之h11C5變體之BIACORE SPR分析：結合結果概述於表18中，分別比較YKD/YTE及YIS/YTE與其親本分子YKD及YIS。
Figure 108129005-A0202-12-0119-550
KD為所量測之表觀親和力(假定IgG為呈此實驗形式之分析物)，且koff為解離速率。YKD/YTE及YIS/YTE對hu-M-IL1RAP或cyno-M-IL1RAP之親和力與其各別親本分子之親和力並無顯著不同，如在2倍 內之其KD值之比率(「KD YTE/KD親本」)所示。因此，可以得出結論，添加YTE取代不影響與IL1RAP之結合。
在pH 6.0及7.4下之FcRn結合之分析：使用SPR量測測定YKD及YKD/YTE與hu-FcRn及cyno-FcRn在6.0及7.4之pH值下的結合親和力。使用穩態分析計算平衡解離常數(KD)值以比較YKD與YKD/YTE之間在pH 6.0及pH 7.4下的人類FcRn及食蟹獼猴FcRn結合。如表19中所示，結果指示YKD/YTE明顯改善人類FcRn及食蟹獼猴FcRn在pH 6.0下而非pH 7.4下之結合。
Figure 108129005-A0202-12-0120-551
用以確定h11C5 YTE變體之非特異性結合的桿狀病毒(BV)ELISA：如表20中所示，YIS/YTE及YKD/YTE抗體在450nm下均不顯示高於培養基對照抗體樣品之可偵測的BV ELISA吸光度信號。因此，引入YTE突變尚未引入與BV粒子之非特異性結合。
Figure 108129005-A0202-12-0120-552
實例12：含YTE突變之抗人類IL1RAP抗體之阻斷活性的基於細胞之分析
此實例說明基於HEK-Blue報導及初代細胞之分析中IL-1、IL-33及IL-36途徑的功能性抑制，使用含有實例11中所述之YTE突變的變異抗人類IL1RAP抗體。
材料及方法
細胞株及HEK-Blue報導細胞分析：細胞株及HEK-Blue報導分析如實例2及4中所述進行。
初代人類NK細胞及相關分析：初代人類NK細胞及相關分析，包含促效劑劑量反應及抗體阻斷分析，先前已在實例7中描述及討論。此實例中之抗體阻斷分析以相同方式進行，但改為使用阻斷抗體，亦即YKD/YTE及YKD(實例11中所述)。陰性對照及陽性對照已描述於實例7中。抑制百分比藉由從使用指定抗體濃度獲得之值減去用陰性對照獲得之值來計算。隨後使用經陰性對照調整之值確定相對於陽性對照之比率。若不能內插陰性對照值(例如，低於偵測臨限值)，則抑制百分比反映使用指定抗體濃度獲得之值相對於僅陽性對照的比率。商業上獲得人類細胞介素IL-33及IL-12(Peprotech)。
初代人類肺纖維母細胞及相關分析：所用初代人類肺纖維母細胞(PHLF)及相關分析如實例7中所述。陽性對照表示僅在促效劑(IL-1α或IL-36β)存在下的PHLF。在接近或大於EC55之促效劑濃度下進行抗體阻斷分析。陰性對照表示尚未曝露於促效劑或抗體之PHLF。如上文關於初代人類NK細胞分析所述計算抑制百分比。內部產生經處理以產生完全成熟細胞介素之人類IL-36β。商業上獲得人類IL-1α(Gibco)。
初代人類單核球及相關分析：單核球分析如實例7所述伴隨以下例外之處進行：將單核球接種於96孔盤中且在實驗使用之前給予3小時回收時間(37℃，5% CO2)。
人類表皮角質細胞及相關分析：自多個新生兒***分離之人類表皮角質細胞(HEKn合併)獲自賽默飛世爾科技(目錄號13401)。將HEKn細胞根據普通製造商準則解凍及繼代培養且維持在EpiLife®培養基(目錄號M-EPI-500-CA)中，所述培養基補充有1%人類角質細胞生長補充劑(HKGS)(目錄號S-001-5)及1×青黴素-鏈黴素溶液(康寧，目錄號30-002-CI)。對於抗體阻斷分析，解凍且培養HEKn細胞直至其達到80%匯合度。隨後將細胞以10,000個/孔種植於平底96孔盤上且在37℃與5% CO2下培育隔夜(約18小時)。在培育隔夜後，將HEKn細胞曝露於11C5-YKD、11C5-YKD/YTE或適當的抗體同型對照(IgG對照)之溶液中，且在37℃與5% CO2下培育1小時，隨後添加促效劑(IL-36β，在EC60下)。陽性對照條件(PC)包含細胞、生長培養基及促效劑(IL-36β)。陰性對照條件(NC)僅包含細胞及生長培養基。在添加促效劑後二十四小時收集組織培養上清液且將其儲存於-80℃下直至進行ELISA以測定IL-8之含量。使用人類IL-8 ELISA套組(英傑/賽默飛世爾科技)根據製造商之建議定量上清液中之IL-8之含量。在抗體阻斷分析之前，產生促效劑及拮抗劑劑量-反應曲線以(分別)確定EC50及IC50，如實例5中所述。
嗜鹼性球細胞分析：從PCT公開案第WO2016077381A1號中所述之分析方法修改以下方案，所述公開案以引用之方式併入本文中。從收集在肝素鈉中之周邊全血分離PBMC(Stemcell Tech)。用PBS 1：1稀釋血液。將30mL經稀釋血液層覆於15mL Ficoll Paque Premium(GE Healthcare 17-5442-03)上，且使樣品在400g下在20℃下無停頓地旋轉20分鐘。將含PBMC層轉移至50mL管中且用50mL PBS洗滌兩次。將經洗滌之PBMC再懸浮於PBS中，稀釋至2000萬個細胞/毫升，且以100萬個細胞(50μL)/孔種植於v底96孔盤中。將25μL經連續稀釋之抗體溶液以於PBS中4×最終濃度添加至孔中，且在37℃與5% CO2下培育培養盤。60分鐘後，將25μL IL-33(Peprotech 200-33)以 於PBS中4×最終濃度添加至孔中(100μL最終體積)。將細胞在37℃與5% CO2下培育20分鐘，隨後添加100μL預溫熱之Phosflow固定緩衝液I(BD 557870)。將培養盤在37℃與5% CO2下培育10分鐘，隨後在500g下離心5分鐘。丟棄上清液且將細胞再懸浮於FACS緩衝液(PBS+0.5% BSA+0.05%疊氮化鈉)中。將培養盤在500g下離心5分鐘且丟棄上清液。藉由簡單地渦旋培養盤將細胞集結粒再懸浮於剩餘體積中，且向各孔緩慢添加100μL冰冷的Phosflow Perm緩衝液II(BD 558052)。將培養盤在Perm緩衝液II中在-20℃下儲存隔夜。第二天，將培養盤在500g下旋轉5分鐘且用FACS緩衝液洗滌細胞兩次。用以下抗體在50μL FACS緩衝液中在室溫下對細胞染色1小時：抗CD123 FITC(Ebiosciences 11-1239-42，1：10稀釋)、抗磷酸基-p38 PE(Cell Signaling Technology 6908S，1：50稀釋)、抗HLA-DR BV421(Biolegend 307636，1：20稀釋)及抗CD203c APC(Biolegend 3246101：200)。在一些孔中，用同型對照(Cell Signaling Technology 4752S)取代抗磷酸基-p38 PE抗體以促進經磷酸基-p38陽性染色之群體的設門(gating)。細胞用FACS緩衝液洗滌兩次，再懸浮於FACS緩衝液中且在CytoFLEX流式細胞儀(Beckman Coulter)上讀數。使用Ultracomp珠粒(賽默飛世爾01-2222-41)製備補償對照且與細胞一起操作所述對照。使用Flowjo軟體(BD)在CD123+ HLADR-嗜鹼性球中分析磷酸基-p38染色。CD203c染色用於驗證基於CD123+ HLADR-設門之嗜鹼性球之身分。使用GraphPad Prism 7軟體分析來自CD123+ HLADR-嗜鹼性球之磷酸基-p38陽性資料%以確定所述分析中之抗體IC50值。促效劑劑量反應與抗體劑量反應一起進行。用促效劑以基於先前實驗估計之EC50刺激與抗體劑量反應一起培育之細胞。陽性對照用促效劑以所估計之EC50處理且用PBS代替抗體溶液進行處理。陰性對照用PBS代替抗體及促效劑溶液進行處理。將資料按照平均值±SD作圖，每個濃度重複2次。
CD4 T細胞分析：以下方案係基於Komai-Koma等人，《免疫生 物學(Immunobiology)》,221(3)：412-417(2016)中所述之方法。將平底96孔盤在4℃下用100μL之3μg/mL抗CD3抗體(英傑16-0037-85)塗佈隔夜。如上所述從收集在肝素鈉中之周邊全血分離PBMC(Stemcell Tech)。使用負向選擇(Miltenyi Biotec 130-096-533)，根據製造商之說明書，自PBMC分離CD4+ T細胞。在分離後，將細胞以500,000個細胞/毫升再懸浮於T細胞培養基(RPMI-1640，5%加熱不活化人類A/B血清、100U/mL青黴素、100μg/mL鏈黴素、1×MEM非必需胺基酸、1mM丙酮酸鈉)中。將塗有抗CD3之培養盤用PBS洗滌一次，且每孔添加50,000個CD4+細胞(100μL)。將抗體以4×最終濃度在T細胞培養基中連續稀釋，且向各孔添加50μL抗體溶液。在37℃與5% CO2下培育培養盤。一小時後，將50μL含有IL-33(Peprotech 200-33)及IL-12(Peprotech 200-12)之T細胞培養基以4×最終濃度添加至各孔(總共200μL，10ng/mL最終濃度IL-12)，且將培養盤放回培育箱。72小時後，使用習知IFN-γ ELISA套組(英傑88-7316-88)量測T細胞上清液中之IFN-γ含量。使用GraphPad Prism 7軟體內插且分析資料以確定所述分析中之抗體IC50值。促效劑劑量反應與抗體劑量反應一起進行。用促效劑以基於先前實驗估計之EC50刺激與抗體劑量反應一起培育之細胞。陽性對照用促效劑以所估計之EC50及代替抗體溶液之T細胞培養基處理。陰性對照用T細胞培養基代替抗體及IL-33處理，而IL-12最終濃度保持10ng/mL。抑制百分比按照峰值抗體濃度下之反應減少量除以總反應量值計算：抑制%=100% *(陽性對照-經處理抗體)/(陽性對照-陰性對照)。將資料按照平均值±SEM作圖，每個抗體濃度重複三次。
結果
HEK-Blue分析中IL-1、IL-33及IL-36途徑之功能性抑制：為了確認YTE突變之添加未改變h11C5變體YKD之阻斷效力及功效，如實例2及4所述進行HEK-Blue IL-1/IL-33/IL-36阻斷分析中YKD及YKD/YTE之功能性抑 制的比較。如圖6A、6B及6C中所示，YKD(「11C5-YKD」)及YKD/YTE(「11C5-YKD/YTE」)在IL-1β、IL-33及IL-36β刺激的細胞中顯示相似的阻斷活性。在IL1β刺激之細胞的情況下，YKD及YKD/YTE在100nM下具有相同效力(IC50=0.51nM)及接近完全抑制，分別為97%及98%。對於IL-33刺激的HEK-Blue細胞，YKD及YKD/YTE均展現約3nM之效力(11C5-YKD IC50=3.15nM；11C5-YKD/YTE IC50=3.3nM)，在100nM下接近完全抑制(YKD及YKD/YTE分別為95%及97%抑制)。最後，當用IL-36β刺激HEK-Blue細胞時，兩種分子均以0.9nM(IC50)之效力抑制且在100nM下具有98%或更大的抑制。總之，人類化變異抗hu-IL1RAP抗體YKD及YKD/YTE在HEK-Blue IL-1、IL-33及IL-36分析中對SEAP產生展現相當的效力及接近完全阻斷。
YKD/YTE及YKD抑制初代細胞中之IL-1、IL-33及IL-36活化：如實例7中所論述，HEK-Blue報導細胞株可以提供用以確定11C5變體在IL-1、IL-33及IL-36途徑之活化後之阻斷活性的快速分析。使用基於初代人類細胞之實驗，在具有更多生理相關性之分析中進行h11C5變體之阻斷活性的進一步表徵。除了實例7中所述之初代細胞分析之外，本實例亦包含使用人類表皮角質細胞(HEKn)、嗜鹼性球及CD4 T細胞之功能性抑制分析。
人類單核球(PHMO)及PHLF中之分析用以確認YKD及YKD/YTE在阻斷初代人類細胞中之IL-1途徑方面具有相當的效力及功效。如圖7中所示，當在YKD YKD/YTE存在下用IL-1β刺激初代人類單核球(PHMO)時，觀察到IL-6產生之完全抑制。兩種抗體展現相似的效力(對於YKD及YKD/YTE，IC50分別=63pM及158pM)。在YKD/YTE、YKD或同型對照存在下，用IL-1α(EC55)刺激PHLF。如圖8中之圖所示，任一h11C5抗體變體之存在均在IL-1α刺激的PHLF中引起對IL-8產生之接近完全抑制(YKD/YTE及YKD分別為98%及99%)，兩個抗體觀察到相似的IC50值(對於YKD/YTE 及YKD，IC50分別=6.47nM及9.10nM)。總之，分析結果表明，YKD/YTE及YKD展現相當的功效及效力，包含在IL-1β刺激的PHMO中對IL-6產生之完全抑制及在IL-1α刺激的PHLF中對IL-8產生之完全阻斷。
HEKn細胞及PHLF中之分析用於驗證YKD/YTE及YKD在阻斷IL-36途徑方面展現相當的效力及功效。已知IL-36受體及其受體輔助蛋白(IL1RAP)在人類角質細胞上表現(參見例如Ding等人，《腫瘤目標(Oncotarget)》,9(2)2895-2901(2017))。經IL-36β刺激之HEKn細胞產生IL-8，其可以經由標準ELISA在上清液中偵測。為了確定YKD/YTE及YKD是否能夠阻斷IL-36β刺激的HEKn細胞中之IL-8產生，將HEKn細胞與YKD/YTE、YKD或同型對照(IgG對照)之連續稀釋液一起培育。如圖9中所示，YKD及YKD/YTE均顯示對IL-8產生之完全抑制(100%)。兩種變體展現相似的效力，YKD及YKD/YTE之IC50值分別為1.39nM及1.16nM。如圖10中所示，當測試YKD/YTE及YKD阻斷IL-36β刺激的PHLF中之IL-8產生的能力時，兩者均展現對IL-8產生之完全抑制。此外，兩種抗體變體具有相似的抑制效力(對於YKD/YTE及YKD，IC50分別=0.50nM及0.39nM)。總之，YKD/YTE及YKD在阻斷IL-36β刺激的HEKn細胞及IL-36β刺激的PHLF中之IL-8產生方面具有相當的功效及效力。
分析亦確認，YKD/YTE可阻斷初代人類NK細胞、嗜鹼性球及CD4+ T細胞中之IL-33途徑。如實例7中所述，在IL-12存在下經IL-33刺激之初代人類NK細胞產生IFN-γ，不同於僅曝露於IL-12之NK細胞，其未能產生可偵測的IFN-γ。如圖11中所示，IFN-γ在與同型對照抗體一起培育之NK細胞之上清液中為可偵測的，但用YKD/YTE或YKD處理人類NK細胞阻斷幾乎所有IFN-γ產生(YKD/YTE及YKD分別為96%及97%抑制)。兩個抗體所觀察到之IC50值為YKD/YTE 1.32nM及YKD 2.93nM。已在哮喘患者之肺中觀察到 增加數目的嗜鹼性球(參見例如Schwartz等人，《歐洲藥理學雜誌(European Journal of Pharmacology)》,778：90-95(2016))。測試YKD/YTE阻斷IL-33對嗜鹼性球之刺激的能力。PBMC之IL-33刺激在嗜鹼性球中引起p38 MAPK之磷酸化。將PBMC與YKD/YTE一起培育一小時，隨後用IL-33以所估計之EC50刺激20分鐘。如圖12中之結果所示，YKD/YTE在促效劑EC56下以41nM之IC50基本上完全阻斷嗜鹼性球中之p38磷酸化(99%抑制)。為了檢查YKD/YTE在CD4+ T細胞中之功效及效力，用IL-33及IL-12共刺激CD4+ T細胞且分析IFN-γ產生。將CD4+ T細胞與YKD/YTE一起培育一小時，隨後用IL-12以10ng/mL及IL-33以所估計之EC50刺激。如圖13中所示，YKD/YTE在促效劑EC34下以44nM之IC50幾乎完全阻斷IFN-γ產生(89%抑制)。總之，YKD/YTE及YKD在IL-33刺激的初代人類NK細胞中顯示相似的阻斷效力及功效。此外，YKD/YTE完全阻斷嗜鹼性球中由IL-33誘導之p38 MAPK磷酸化且幾乎完全阻斷IL-33刺激的CD4+ T細胞中之IFN-γ產生。
因此，此實例12之結果表明，在所描述的細胞株(HEK-Blue報導細胞株)及所有初代人類細胞分析中，YKD/YTE及YKD阻斷IL-1、IL-33及IL-36活化。結果包含接近或完全阻斷PHLF及PHMO中之IL-1活化；NK細胞、嗜鹼性球及CD4 T細胞中之IL-33活化；及PHLF及HEKn中之IL-36活化。此外，YKD/YTE及YKD在所進行的所有功能性分析中展現相當的功效及效力。
實例13：缺乏抗人類IL1RAP抗體變體之細胞毒性
此實例說明抗體依賴性細胞毒性(ADCC)、補體依賴性細胞毒性(CDC)及抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)之分析，其表明缺乏抗人類IL1RAP抗體YKD/YTE、11C5-N297G及YKD之細胞毒性。
材料及方法
試劑：所述分析中所用之抗體為：YKD/YTE(如實例11中所 述)；YKD(如實例8中所述)；11C5-N297G(含有N297G突變之親本11C5分子，如實例5及7中所述)；11C5 wt(缺乏增加親和力之N297G突變及YKD突變的親本11C5分子)；同型對照hIgG1(N297G)；及抗CD20抗體利妥昔單抗(Rituximab)(加利福尼亞州南舊金山(South San Francisco,CA)之Genentech)作為已知具有細胞毒性活性之陽性對照抗體。使用以下細胞株：Jurkat、Daudi及THP-1(維吉尼亞馬納沙斯(Manassas,Virginia)之ATCC)。PBMC、初代人類嗜中性白血球及初代人類單核球獲自Stemcell Technologies。Jurkat細胞株由於其顯著的IL1RAP表現而被用作對照。表現CD20之Daudi細胞株用作額外的陽性對照且充當抗CD20抗體利妥昔單抗之目標細胞株。
ADCC分析：為了確定YKD/YTE及相關分子是否展現ADCC活性，使用NK細胞作為由單核球、嗜中性白血球或Jurkat細胞組成之目標細胞的效應細胞。對分析施加8：1之效應物：目標(E：T)比率。用CellTrace紫色染色(英傑)標記目標細胞。在標記後，在RPMI完全培養基中，將目標細胞(96孔盤中1×104個細胞/孔)與四種不同濃度之指定抗體混合，且隨後進一步與NK細胞(96孔盤中8×104個細胞/孔)混合。反應在37℃下進行5小時。在培育後，將細胞用PBS洗滌一次，且隨後用碘化丙錠(PI)(Life Technologies)染色15分鐘。隨後使用CytoFLEX流式細胞儀(Beckman Coulter)及Flowjo軟體(BD)分析細胞。基於經CellTrace紫色染色之活目標細胞群體內經PI染色之細胞的百分比計算細胞死亡。
CDC分析：為了確定YKD/YTE及相關分子是否展現CDC活性，使用來自Quidel(目錄號A113，加利福尼亞州聖地亞哥)之正常人類血清作為細胞毒性效應物，且向分析培養基施加20%之血清。用CellTrace紫色染色標記目標細胞(人類單核球、嗜中性白血球及Jurkat細胞)。在標記後，在AIM-V培養基CTSTM(目錄號0870112-DK，Life Technologies)中，將目標細胞(5×104 個細胞/孔，96孔盤)與四種不同濃度的指定抗體混合，且隨後進一步與正常人類血清(20%之最終濃度)混合。反應在37℃下培育1小時。在培育後，將細胞用PBS洗滌一次，且隨後用PI染色15分鐘。如先前關於ADCC分析所描述，使用流動式細胞測量術分析細胞樣品且測定細胞死亡百分比(細胞毒性)。
ADCP分析：為了確定YKD/YTE及相關分子是否存在ADCP活性，將人類THP-1衍生之巨噬細胞用作效應細胞，且目標細胞由人類單核球、嗜中性白血球、Jurkat或Daudi細胞組成。將THP-1細胞用佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)(西格瑪奧德里奇)處理兩天，且隨後進一步用IFN-γ(50ng/ml)及脂多醣(LPS)(西格瑪奧德里奇)刺激。ADCP反應之E：T比率為2：1。用CellTrace紫色染色標記目標細胞(人類單核球、嗜中性白血球、Jurkat或Daudi細胞)且用PKH26標記套組(目錄號PKH26PCL-1KT，西格瑪)標記THP-1細胞。在標記後，在RPMI完全培養基中，將目標細胞(96孔盤中5×104個細胞/孔)與四種不同濃度之指定抗體混合，且隨後進一步與THP-1衍生之巨噬細胞(96孔盤中1×105個細胞/孔)混合。反應在37℃下培育5小時。在培育後，藉由流動式細胞測量術分析細胞之CellTrace紫色螢光(用以鑑定目標細胞之PB450通道)及PKH26螢光(用以鑑定THP-1衍生之巨噬細胞效應細胞之PE通道)。細胞吞噬作用由雙重螢光細胞指示，亦即，在PB450及PE通道中均觀察到螢光。吞噬率按照具有雙重螢光之細胞之數目相對於經標記目標細胞來計算。
結果
IL1RAP在諸如嗜中性白血球及單核球之人類血球中表現，因此測定諸如YKD/YTE之抗IL1RAP抗體對其所展現之ADCC、CDC或ADCP活性的程度對於進一步臨床開發很重要，所述ADCC、CDC或ADCP活性各自在活體內引起細胞毒性。用以確定YKD/YTE之ADCC、CDC或ADCP活性程度 的分析如上所述進行。如表21(下方)中所概述，在所述分析中，抗IL1RAP抗體11C5-N297G、YKD、YKD/YTE不顯示細胞毒性活性。(「+」指示陽性細胞毒性且「-」指示無細胞毒性)。
Figure 108129005-A0202-12-0130-553
如表21中之結果所示，YKD/YTE、11C5-N297G及YKD對人類單核球及嗜中性白血球或Jurkat細胞不展現細胞毒性作用。親本分子11C5 wt缺乏消除效應功能之N297G突變，不展現細胞毒性，如藉由CDC或ADCP分析所量測，但確實在ADCC分析中展現一些弱活性。在三個分析中，陽性對照抗體利妥昔單抗展現預期水準的細胞毒性活性(資料未示出)。總之，抗IL1RAP抗體YKD/YTE、11C5-N297G及YKD不展現細胞毒性活性，如藉由評估ADCC、CDC及ADCP活性之分析所測定。
實例14：變異抗人類IL1RAP抗體之藥物動力學
此實例說明在食蟹獼猴中進行之用以表徵YKD及YKD/YTE之藥物動力學(PK)的研究，YKD/YTE為在Fc區中含有改善與FcRn之結合親和力的改變的YKD變體。研究1及2檢查YKD在1-40mg/kg範圍內之單次靜脈內(IV)劑量下之PK以便表徵抗體在寬劑量範圍內之PK且定量由潛在目標介導之清除機制。研究3檢查變體YKD/YTE在食蟹獼猴中在3-40mg/kg範圍內之單次靜脈內IV劑量下之PK以便確定YTE突變對YKD藥物動力學之影響。
材料及方法
研究設計及藥物動力學取樣時程：進行兩個研究(1及2)以檢查YKD在食蟹獼猴中之PK。進行額外的研究3以檢查YKD YTE之PK。所有研究使用IV給藥。在200mM精胺酸琥珀酸鹽中在pH 5.5下調配測試物品。在以下時間點經由各動物之頭靜脈收集血液：給藥前、10分鐘、2小時、8小時及第1天、第2天、第4天、第7天、第10天、第14天、第17天、第21天、第24天、第28天。將PK樣品處理成血清。研究設計之概述顯示於表22(下方)中。
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用於量測藥物濃度之生物分析型分析：使用ELISA分析量測猴血清中之IL1RAP特異性抗體之濃度，所述分析使用由在50至0.78ng/mL之操作範圍內之7個標準加零標準在0.2%猴血清基質中產生的標準曲線校準。在0.2%猴血清中以40ng/mL、8ng/mL及2ng/mL之濃度製備QC樣品。將人類IL1RAP蛋白質之細胞外結構域(SEQ ID NO：3)塗佈於微量滴定培養盤上，且隨後用於捕捉來自所給予樣品、校準標準及品質控制樣品之抗IL1RAP抗體。藉由與辣根過氧化酶(HRP)結合之山羊抗人類IgG多株抗體偵測所捕捉之抗 IL1RAP抗體。添加顯色受質四甲基聯苯胺(TMB)以與HRP反應。隨後藉由酸溶液停止反應以達成與各孔中所捕捉之抗IL1RAP之量成比例的吸光度信號。使用加權4參數邏輯(4PL)模型擬合校準標準之信號強度及其各別標稱濃度以產生校準方程。使用所述方程，自重複測定之平均值計算各樣品中抗IL1RAP之濃度。
藥物動力學分析方法：組合來自研究1及2之資料以估計YKD之PK參數。來自研究3之資料用於估計YKD-YTE之PK參數。使用PK/PD模型化軟體ADAPT V進行室體模型化及參數估計(D'Argenio,D.Z.等人，《ADAPT 5使用者指南：藥物動力學/藥效學系統分析軟體(ADAPT 5 User's Guide：Pharmacokinetic/Pharmacodynamic Systems Analysis Software)》，生物醫學模擬資源(Biomedical Simulations Resource)，加利福尼亞州洛杉磯(Los Angeles,CA.)(2009))。對於各劑量組，首先產生組平均濃度-時間曲線；隨後將來自多個劑量組之組平均濃度-時間曲線同時與各個候選模型結構擬合。基於在目視檢查時沒有顯著的性別差異，組合來自兩種性別之資料以計算組平均濃度-時間曲線。在室體資料分析中包含所有分析上可報告的PK資料。
使用Akiake資訊準則(AIC)指導模型選擇。使用最大概似估計方法估計參數(D'Argenio,D.Z.等人，《ADAPT 5使用者指南：藥物動力學/藥效學系統分析軟體》，生物醫學模擬資源，加利福尼亞州洛杉磯(2009))。發現圖14A中所描繪之非線性二室模型描述組平均資料最佳。
結果
YKD及YKD/YTE之組平均血清濃度之時間曲線分別顯示於圖14B及圖14C中。對於兩種抗體，相對於高劑量，在低劑量下濃度下降更快速，表明1-40mg/kg之劑量範圍內之非線性PK，可能係由於與目標IL1RAP之結合。將組平均資料與如上所述及圖14A中所描繪之非線性二室模型擬合。抗人類 IL1RAP抗體YKD及YKD-YTE之所得PK參數估計值概述於表23(下方)中。
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變異抗hu-IL1RAP抗體YKD之線性清除率(CLt)及t1/2分別為6.3mL/天/kg及7.4天。此等值在IgG1在食蟹獼猴中之所期望的範圍內。抗hu-IL1RAP抗體變體YKD/YTE相比於YKD展現減小的CLt(4.9mL/天/kg)及增加的t1/2(11.9天)，證明YKD/YTE變體相對於YKD在食蟹獼猴中具有改善的PK特性。
實例15：抗人類IL1RAP抗體之抗原決定基殘基定位
此實例說明使用噬菌體呈現技術聯合次世代定序(Next Generation Sequencing，NGS)鑑定對於h11C5變體K13/H3(或「YIS」)及K17/H3(或「YKS」)之結合重要的人類IL1RAP殘基的方法。人類IL1RAP變體庫呈現於噬菌體上且使庫經歷針對YIS、YKS或參考抗體的噬菌體淘選。純化攜帶保留與抗體之結合的人類IL1RAP變體的噬菌體且藉由NGS獲得人類IL1RAP序列。鑑定人類IL1RAP上對YIS或YKS結合有害但對參考抗體結合無害的突變且將其定義為抗原決定基殘基。
材料及方法
選擇人類IL1RAP(SEQ ID NO：1)之自Ser21至Lys350之胺基酸序列在噬菌體上呈現。如實例2之表5(上文)中所述，11C5結合人類IL1RAP之結構域3。因此，呈現人類IL1RAP之變體的噬菌體庫藉由使用NNK簡併密碼子進行殘基隨機化來構築，所述簡併密碼子編碼僅在IL1RAP之結構域3中之 所有20種胺基酸(SEQ ID NO：1之Lys238至Lys350)。如實例8中所述進行突變誘發，但改為將突變誘發寡核苷酸設計成允許在各庫成員中之人類IL1RAP結構域3殘基中存在僅一個NNK突變。將所得庫DNA電穿孔至大腸桿菌XL1細胞中，得到大約4.6×109個轉形體。
如實例8中所述進行第一輪噬菌體淘選，但改為將1μg/mL變異抗體YIS、YKS或與人類IL1RAP結構域1(SEQ ID NO：4)結合之參考抗體塗佈於Maxisorp培養盤上。與人類IL1RAP結構域1結合之參考抗體充當用以鑑定對人類IL1RAP之一般摺疊有害，但不一定對11C5抗體與人類IL1RAP結構域3之結合有害的突變的方法的對照。
第二輪至第四輪噬菌體淘選如實例8中所述進行，但改為將經阻斷之噬菌體庫與遞減濃度之生物素標記之YIS、YKS或參考抗體一起培育1小時。將抗體結合之噬菌體捕捉於經阻斷之塗有中性抗生物素蛋白之培養盤上，用洗滌緩衝液充分洗滌，且以與第1輪中相同之方式溶離及中和。
使用NGS如實例8中所述提取初始噬菌體庫(未分選樣品)及第2至4輪淘洗(分選樣品)之序列，但改為產生人類IL1RAP結構域3擴增子用於NGS。
在NGS後，如實例8中所述進行定序讀段之配對末端定序資料組譯及品質控制。將來自第2輪至第4輪噬菌體淘洗之讀段合併在一起用於資料分析。藉由計算每一個隨機化位置之所有突變之頻率產生位置權重矩陣。藉由分選樣品中在給定位置之給定突變之頻率除以未分選樣品中完全相同突變之頻率來計算各突變之富集比率，如實例8中所述。
結果
NGS資料用於分析人類IL1RAP結構域3之各胺基酸位置之取代對YIS或YKS之結合的影響。小於零之富集比率指示對YIS、YKS或參考抗體 之結合有害的胺基酸取代。NGS資料進一步用於標記人類IL1RAP結構域3殘基之對參考抗體結合無害但對YIS或YKS結合有害的取代。觀察到大量經標記取代的人類IL1RAP結構域3殘基位置可能為YIS或YKS結合抗原決定基之一部分，因為對結構域3施加殘基隨機化且殘基隨機化不應影響與人類IL1RAP結構域1結合之參考抗體。
如圖15中所示，當經鑑定之IL1RAP抗原決定基殘基定位於人類IL-1β、IL-1R1及IL1RAP三元複合物(PDB：3O4O)之晶體結構上時，其分佈叢集且位於IL1RAP與IL-1β及IL-1R1之二元複合物之間的結合界面。本實例之抗原決定基資料從而對諸如YIS或YKS之本發明抗hu-IL1RAP抗體之結合可以如何阻斷三元複合物之形成且從而抑制下游細胞內信號傳導事件提供結構解釋。此外，鑒於IL1RAP與IL-33/ST2(Günther等人，《免疫》,47：510-523(2017))或IL-36/IL1RL2(Yi等人，《生物化學雜誌(The Journal of Biological Chemistry)》,291(32)：16597-16609(2016))之間之結構相互作用的整體相似性，本實例之抗原決定基資料亦支持對諸如YIS及YKS之本發明抗IL1RAP抗體亦阻斷這兩種途徑之能力的可能結構解釋。
表24顯示在人類IL1RAP結構域3位置觀察到之經標記取代的相對數目(+++：等於或多於9個經標記取代；++：6-8個經標記取代；+：3-5個經標記取代；-：少於3個經標記取代)。具有大量經標記取代之殘基被認為較可能為抗原決定基之一部分。
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如表24中所列之結果所表明，用於與人類IL1RAP殘基結合之高親和力抗體11C5的抗原決定基主要在D3結構域內在位置243-255、位置257-268及位置333-336處。此等位點中之大多數在IL1RAP之結構域3之表面上叢集在一起(參見圖15)。此等不連續殘基定位於主要貼片，其經推斷為如本文所揭示之抗體11C5及其變體之抗原決定基。
實例16：產生替代抗小鼠IL1RAP抗體
此實例說明使用小鼠融合瘤技術產生抗mu-IL1RAP抗體、表徵抗mu-IL1RAP抗體14F4及使用此替代抗體進行活體內小鼠研究之方法。
材料及方法
免疫及融合：將IL1RAP基因剔除小鼠(The Jackson Laboratory，貨號003284)用25μg/免疫/小鼠之mu-M-IL1RAP-D3(具有殘基邊界K239-T368之mu-IL1RAP結構域3)(SEQ ID NO：337)免疫三次。各小鼠給予五次後續免疫，所述後續免疫為總共25μg/免疫/小鼠的mu-M-IL1RAP(與C端6x組胺酸標籤融合之細胞外部分)(SEQ ID NO：9)與mu-M-IL1RAP-D3(SEQ ID NO：337)之1：1混合物。西格瑪佐劑系統(西格瑪-奧德里奇)用於所有免疫。隨後給予小鼠25μg/小鼠之mu-M-IL1RAP與mu-M-IL1RAP-D3之1：1混合物的最終增強免疫，無佐劑。三天後，收穫脾臟且根據標準方案處理脾臟。使用PEG遵循標準方案將脾細胞與骨髓瘤Sp2/0細胞(ATCC)融合且將其種植於96孔盤中。使用補充有次黃嘌呤-胺基喋呤(aminopterin)-胸苷之選擇培養基選擇親本融合 瘤。
ELISA分析：在培養12-14天後，收集融合瘤上清液且藉由ELISA採用塗有含1μg/mL mu-M-IL1RAP之PBS的96孔盤對其進行初步篩選。將融合瘤上清液(65μL/孔)在經塗佈培養盤上在室溫下培育至少1小時，且用洗滌緩衝液(含0.05% Tween-20之PBS)洗滌培養盤三次。添加山羊抗小鼠Fc-HRP二級(Jackson Immunoresearch，在PBS中1：5000稀釋)(65μL/孔)且將其在室溫下培育一小時。在用洗滌緩衝液洗滌三次後，添加1-Step Ultra TMB ELISA受質顯影溶液(Thermo Pierce Scientific，65μL/孔)且將其在室溫下培育20分鐘。在不淬滅顯影劑之情況下讀取650nm下之吸光度。
將初步ELISA篩選中呈陽性的親本融合瘤在24孔盤中含有次黃嘌呤-胸苷之培養基中擴增，且如實例2中所述使用以1μg/mL塗佈之mu-M-IL1RAP進行確認ELISA篩選。使用極限稀釋法以0.5個細胞/孔之密度次選殖感興趣的融合瘤純系，且使用細胞集結粒測定各抗體純系(下文所述)之重鏈及輕鏈序列。
14F4之定序及重組產生：如實例3中所述進行融合瘤衍生之抗mu-IL1RAP抗體之序列測定。如實例5中所述產生重組抗mu-IL1RAP抗體14F4。
結合mu-IL1RAP之重組14F4之BIACORE SPR分析：使用表面電漿子共振(SPR)分析，使用BIACORETM 8K儀器測定14F4對mu-IL1RAP之結合親和力。對於動力學量測，將重組14F4在HBS-P緩衝液(0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、0.005%界面活性劑P20)中稀釋至10μg/mL且在第二流量槽(FC2)中以10μL/min捕捉於抗小鼠晶片(GE Healthcare)上。FC1保持作為參考。接著，在37℃下自低(0.14nM)至高(100nM)注射(流動速率：30μL/min)mu-M-IL1RAP於HBS-P中之3倍連續稀釋液。在注射各分析物之前使用60mM鹽酸使晶片再生兩次(流動速率：90μL/min)。記錄感測器圖譜且 在用BIACORE® 8K評估軟體(1.1.1.7442版)進行資料分析之前進行參考及緩衝減法。使用簡單的一對一朗格繆爾結合模型計算締合速率(kon)及解離速率(koff)。平衡解離常數(KD)按比率koff/kon來計算。
用於測定重組14F4之非特異性結合的BV ELISA：如實例11中所詳述，使用14F4進行BV ELISA以確定非特異性結合程度。
IL1RAP之特異性結合活性之分析：為了測定14F4對hu-IL1RAP及mu-IL1RAP之不同結構域的特異性，如先前在實例2中所述使用ELISA，其中以下蛋白質單獨地以1μg/mL塗佈：mu-M-IL1RAP(SEQ ID NO：337)、mu-M-IL1RAP-D1D2(結構域1-2，S21-P237)(SEQ ID NO：338)、hu-M-IL1RAP(SEQ ID NO：3)、hu-M-IL1RAP-D1(結構域1，S21-Q133)(SEQ ID NO：4)及hu-M-IL1RAP-D3(結構域3，K238-T367)(SEQ ID NO：6)。在10nM之濃度下分析重組14F4。
結果
產生抗mu-IL1RAP抗體：在IL1RAP基因剔除小鼠之免疫及隨後收穫脾細胞之後，藉由ELISA針對與mu-M-IL1RAP(SEQ ID NO：9)之結合篩選親本融合瘤(經由PEG融合產生)。初步ELISA分析篩選自融合瘤鑑定總共17種抗小鼠IL1RAP黏合劑，在擴增至24孔盤中後藉由ELISA進一步確認其結合mu-M-IL1RAP。在如實例2中所述在HEK-Blue SEAP分析中篩選所有17份上清液之後(資料未示出)，基於阻斷所有三個途徑(IL-1、IL-33及IL-36)之能力選擇14F4。選擇純系14F4用於自融合瘤細胞定序其VL及VH區、重組表現及純化。
與mu-IL1RAP結合之重組14F4之動力學：如表25中所示，重組14F4結合mu-M-IL1RAP(SEQ ID NO：9)，其中KD=0.219nM。
表25.重組14F4與mu-IL1RAP結合的BIACORE SPR結果
Figure 108129005-A0202-12-0140-559
非特異性結合之BV ELISA結果：如表26中所示，重組14F4不顯示大於培養基對照之BV ELISA信號，表明14F4與BV粒子沒有非特異性結合。
Figure 108129005-A0202-12-0140-560
IL1RAP之特異性結合活性分析：如表27中所示，重組抗mu-IL1RAP抗體14F4不顯示與人類IL1RAP結合，但在mu-M-IL1RAP(SEQ ID NO：9)與mu-M-IL1RAP-D1D2(SEQ ID NO：338)之間顯示類似的結合，表明14F4特異性結合鼠類IL1RAP結構域1或結構域2。
Figure 108129005-A0202-12-0140-561
實例17：替代抗小鼠IL1RAP抗體14F4之IL1RAP阻斷活性的基於細胞之分析
此實例說明抗mu-IL1RAP替代抗體14F4在小鼠細胞株或初代小鼠細胞中阻斷所有三個途徑(由IL-1介導、由IL-33介導及由IL-36介導)之能力。
材料及方法
NIH-3T3細胞及相關分析：商業上獲得小鼠纖維母細胞細胞株NIH-3T3(ATCC CRL-1658)。在培養物中根據製造商之準則維持NIH-3T3細胞，使用由DMEM(康寧10-013-CV)組成之標準生長培養基，所述培養基補充有10%胎牛血清(FBS；Atlanta Biologicals)、100IU/mL青黴素、100μg/mL鏈黴素、1×非必需胺基酸(Gibco 11140-050，100×溶液)及1×Glutamax(Gibco 35050-61，100×溶液)。商業上獲得小鼠IL-1β(Peprotech)及IL-36α(BioLegend)。
抗體阻斷分析及促效劑劑量反應曲線以與實例7中所述相似之方式進行，但存在一些修改以考慮本實例之條件。簡言之，在實驗使用前一天，將NIH-3T3細胞以將在使用當天產生約80-85%匯合度之濃度接種於平底96孔盤上。在分析當天，將替代抗體14F4或同型對照與NIH-3T3細胞一起培育1小時(37℃，5% CO2)，隨後添加促效劑(IL-1β或IL-36α)。使實驗再進行二十四小時(37℃，5% CO2)。收集細胞培養上清液且藉由ELISA(賽默飛世爾科技)根據製造商之準則測定IL-6產生量。對於所描述之所有抗體阻斷分析，用促效劑以EC85或更大的濃度刺激NIH-3T3細胞。陽性對照由NIH-3T3細胞與僅生長培養基及促效劑組成(不存在抗體)，而陰性對照樣品由NIH-3T3細胞與僅生長培養基組成(不存在促效劑刺激及抗體)。
J774-Dual細胞及相關分析：J774-Dual細胞衍生自小鼠J774.1類巨噬細胞細胞株。此等細胞已經工程化以表現NF-κB報導基因，分泌性胚胎鹼 性磷酸酶(SEAP)。J774-Dual細胞為市售的且獲自InvivoGen(目錄號j774d-nfis)。J774-Dual細胞根據普通製造商準則解凍且維持在細胞培養基中，所述培養基包含：DMEM(2mM L-麩醯胺酸、3.7g/L碳酸氫鈉、4.5g/L葡萄糖及1.0mM丙酮酸鈉)，其具有10%加熱不活化胎牛血清(在56℃下30分鐘)、100μg/ml Normocin(InvivoGen目錄號ant-nr-1)、1×青黴素-鏈黴素溶液且補充有選擇抗生素殺稻瘟菌素(InvivoGen目錄號ant-bl-1)及吉歐黴素(InvivoGen目錄號ant-zn-1)。對於抗體阻斷分析，在不含選擇抗生素(殺稻瘟菌素及吉歐黴素)之細胞培養基中培養J774-Dual細胞直至細胞達到80%匯合度。隨後將細胞以50,000個/孔種植於平底96孔盤上且在37℃與5% CO2下培育隔夜(約18小時)。將14F4與J774-Dual細胞一起培育1小時，隨後添加促效劑(處於EC55之小鼠IL-33，PeproTech，目錄號1209434)。將細胞在37℃與5% CO2下再培育二十四小時。使用實例2中所述之SEAP偵測分析定量上清液中之SEAP產生。陽性對照條件(PC)包含細胞、生長培養基及促效劑(IL-33)，且陰性對照條件(NC)僅包含細胞及生長培養基。使用GraphPad Prism 7軟體分析資料，進行非線性回歸分析以確定促效劑EC50值。在抗體阻斷分析之前，產生促效劑及拮抗劑劑量-反應曲線以(分別)確定EC50及IC50，如實例5中所述。
初代小鼠胚胎纖維母細胞及相關分析：初代小鼠胚胎纖維母細胞(初代MEF)獲自龍沙(目錄號M-FB-481)。此等初代細胞自交配後14天及15天CD-1小鼠胚胎解離，在培養物中擴增，且隨後由製造商冷凍保存。將細胞解凍且維持在培養物中，使用含有4.5g/L葡萄糖、L-麩醯胺酸及丙酮酸鈉(康寧，目錄號10-013-CV)之DMEM，其補充有10%加熱不活化胎牛血清(Atlanta Biologicals，目錄號S11150H)、10IU青黴素及10μg/mL鏈黴素(康寧，目錄號30-002-CI)，遵循製造商提供之準則。小鼠IL-36β獲自Biolegend(目錄號554506)。
如實例7中所述進行促效劑劑量反應曲線及抗體阻斷分析，但做如下文所提及之修改。簡言之，將初代MEF以15,000個細胞/孔之密度接種於平底96孔盤上之前述生長培養基中。將細胞在37℃與5% CO2下培育隔夜。在培育隔夜後，將14F4或同型對照與初代MEF一起在37℃與5% CO2下培育1小時。此後添加預定濃度之促效劑(小鼠IL-1β或IL-36β)。各孔中之最終體積為200μL且抗體阻斷分析在EC70或更高的促效劑下進行。
在促效劑刺激後，在37℃，5% CO2下培育細胞21小時。隨後，將培養盤短暫離心且收集上清液以使用市售小鼠IL-6 ELISA套組(英傑/賽默飛世爾科技目錄號88-7064-88)，遵循製造商之準則，測定所分泌之小鼠IL-6之含量。陽性對照孔由在生長培養基中含有促效劑的細胞組成且陰性對照孔由細胞與單獨的生長培養基組成。使用Graphpad Prism 7軟體進行資料分析，進行非線性回歸(曲線擬合)以確定促效劑EC50及拮抗劑IC50值。
結果
選擇替代抗小鼠IL1RAP抗體14F4(如實例16中所述製備)以證明小鼠模型中之活體內功效。在活體內研究之前，使用小鼠細胞株及初代細胞分析，活體外分析14F4在阻斷所有三個由IL1RAP介導之途徑(IL-1、IL-36及IL-33)方面的功效。
NIH-3T3細胞株用於確定14F4是否能夠活體外阻斷小鼠IL-1及IL-36途徑。已知NIH-3T3細胞對IL-1刺激起反應，且因此表現IL1RAP(參見例如Smeets等人，《關節炎與風濕病(Arthritis and Rheumatism)》,52(7)：2202-2211(2005))。如上所述用IL-1β刺激NIH-3T3細胞，且將其曝露於14F4以阻斷IL1-β刺激，或曝露於同型對照抗體。量測曝露於同型對照抗體之細胞以及陽性對照細胞之上清液中之IL-6產生。如表28(下文)中所示，接受抗小鼠IL1RAP抗體14F4之NIH-3T3細胞展現所偵測到之IL-6含量相比於陽性對照接近完全降低 (98%抑制)。14F4抑制由IL-1β誘導之IL-6產生，IC50=1.36nM，其接近在實例12中所述之HEK-Blue分析中用YKD/YTE觀察到之效力(IC50=0.51nM)。
亦發現NIH-3T3細胞對IL-36起反應，在用IL-36α刺激時以劑量依賴性方式分泌IL-6(資料未示出)。所觀察到之最大IL-6產生為相似的，無論是用IL-1β還是IL-36α刺激NIH-3T3細胞。如表28中所示，使用經IL-36α刺激之NIH-3T3細胞進行的14F4阻斷分析得到對IL-6產生之100%抑制。此外，14F4能夠以比在IL-1β刺激後所觀察到的更大的效力抑制由IL-36α誘導之IL-6產生(IC50=0.18nM)，14F4在16.7nM下觀察到完全抑制。如實例12中所述，14F4之此低於奈莫耳之抑制效力與抗人類IL1RAP抗體YKD/YTE在IL-36HEK-Blue分析中所觀察到的相當。總之，替代抗mu-IL1RAP小鼠抗體14F4有效地抑制小鼠細胞株NIH-3T3中由IL-1及IL-36誘導之IL-6產生，且顯示與抗hu-IL1RAP抗體YKD/YTE所觀察到的類似的活體外效力。
類巨噬細胞J774-Dual細胞株用於確定14F4是否能夠活體外阻斷小鼠IL-33刺激的途徑。IL-33及其受體IL1R1廣泛地在諸多免疫細胞中表現，所述免疫細胞包含巨噬細胞。藉由IL-33活化之ST2信號傳導引起巨噬細胞中之NF-κB活化(參見例如Kakkar等人，《自然綜述：藥物發現(Nature Reviews.Drug Discovery)》,7(10),827-840(2008))。如表28中所示，14F4在2μM下在IL-33刺激的J774細胞中以97%抑制(IC50=6.6nM)展現阻斷活性。對IL-33刺激之此抑制效力類似於如實例12之HEK-Blue分析中所述由抗人類IL1RAP抗體YKD/YTE所觀察到的(IC50=3.30nM)。
在初代MEF中測定替代抗體14F4阻斷IL-1及IL-36刺激的途徑之能力。初代MEF具有響應於IL-1刺激產生IL-6之能力，表明IL1RAP之表現(參見例如Nold-Petry等人，《生物化學雜誌》,284(38)：25900-25911(2009))。因為此等初代小鼠纖維母細胞表現IL1RAP且小鼠胚胎纖維母細胞細胞株 NIH-3T3對IL-36刺激起反應，所以推斷初代MEF亦應該對IL-36刺激起反應。實際上，在用IL-36β刺激時，初代MEF以劑量依賴性方式分泌IL-6(資料未示出)。如表28中所示，相對於陽性對照，14F4顯示對由IL-1β刺激之IL-6產生的基本上完全抑制，其中IC50為6.1nM。類似地，由IL-36β刺激的IL-6產生被完全抑制，其中IC50值為0.094nM。總之，14F4具有完全阻斷初代MEF中之IL-1及IL-36途徑的能力，儘管與IL-1途徑相比，對IL-36之效力要大得多。
Figure 108129005-A0202-12-0145-562
總之，14F4之以上結果支持其用作小鼠活體內研究之替代抗體來確定經由IL1RAP抑制同時阻斷IL-1、IL-33及IL-36途徑之功效及作用。
實例18：替代抗小鼠IL1RAP抗體之活體內功效
此實例說明小鼠替代抗體14F4為至少兩個IL-1家族途徑之功能性活體內阻斷劑，且亦為小鼠哮喘模型中誘導之更複雜表型的功能性阻斷劑。
材料及方法
活體內小鼠模型研究中之研究方案概述於表29中。
Figure 108129005-A0202-12-0146-563
動物及飼養：雌性BALB/cAnNHsd小鼠購自Envigo且所用小鼠介於6-13週齡。給小鼠餵食經照射之Harlan Teklad global 18%蛋白質嚙齒動物飼料且讓其隨意飲水。將動物飼養在含有玉米芯墊料之Innovive拋棄式通風籠中，每小時全室換氣60次。將環境控制在70℉±2℉之溫度範圍及30-70%之濕度範圍。所有動物研究根據由Explora之實驗動物照護及使用委員會(加利福尼亞州聖地亞哥)批准之動物照護使用方案進行。
活體內處理：對於鼻內(i.n.)處理，用3-4%異氟烷(愛達荷州波夕(Boise,Idaho)之VetOne)麻醉小鼠且使小鼠經由鼻孔吸入35μl藉由微量吸管投與之溶液。藉由投與麻醉劑量之2.5% 2,2,2-三溴乙醇溶液(密蘇里州聖路易之西格瑪奧德里奇(Sigma Aldrich,St.Louis,Mo))使小鼠安樂死，隨後進行兩側胸空切開術或頸椎脫位術(針對僅單一IL-1β攻擊)。
資料分析：對於所有活體內研究，使用GraphPad Prism 8軟體進行資料及統計分析。在給予IgG對照的未被攻擊小鼠與給予IgG對照的被攻擊小鼠之間進行曼-惠特尼檢定以確定細胞介素或HDM攻擊是否引起生物反應統計顯著增加。在測定顯著性後，在給予IgG對照的被攻擊小鼠與給予14F4的被 攻擊小鼠之間進行曼-惠特尼檢定。
A.單一細胞介素攻擊模型及相關分析：基於Gabrielsson等人，《歐洲藥物科學雜誌(European Journal of Pharmaceutical Sciences)》：歐洲藥物科學聯合會官方雜誌，67：144-159(2015)修改單一IL-1β攻擊研究方案。在第-1天，每公斤平均組體重腹膜內(i.p.)給予小鼠30mg IgG對照或14F4，總體積為100-200μl。在第0天，用D-PBS或50ng IL-1β以100μl之總體積i.p.攻擊小鼠。在攻擊後兩小時，使小鼠安樂死，經由心臟穿刺收集血液，且將血液置放於BD Microtainer血清分離管(BD Biosciences)中。至少30分鐘後，使管在9,300×g下離心5分鐘，且收集血清並將其保存在-80℃下。藉由商業IL-6 ELISA套組(英傑/賽默飛世爾科技目錄號88-7064-88)根據製造商說明書量測小鼠血清IL-6濃度。將血清樣品1：5稀釋用於分析。
基於Ramadas等人，《公共科學圖書館．綜合(PloS One)》,7(9)：e45784(2012)修改單一IL-36α攻擊研究方案。在第-1天，類似於單一IL-1β攻擊研究，i.p.給予小鼠抗體。在第0天，用D-PBS或10ng IL-36α以35μl之總體積i.n.攻擊小鼠。在第1天，使小鼠安樂死。藉由在氣管中作切口，***20G鈍端針或18G導管鞘，且使用1mL注射器注射及擷取0.8mL HBSS/2mM EDTA緩衝液，進行支氣管肺泡灌洗術(Bronchoalveolar lavage，BAL)。此程序進行3次。為了確定BAL流體中細胞類型之數目，使BAL流體在365×g下離心10分鐘。在移除上清液後，向細胞中添加2mL 1×溶解緩衝液(BD Biosciences，目錄號555899)以溶解任何紅血球。2分鐘後，添加5mL D-PBS/2% FBS緩衝液以停止反應。使細胞在365×g下離心5分鐘。在移除上清液後，將細胞再懸浮於HBSS/2 mM EDTA中，轉移至96孔圓底培養盤，在570×g下離心2分鐘，且移除上清液。所有染色步驟皆在冰上及在暗處進行。為了對死細胞染色，添加25μl LIVE/DEAD可固定遠紅死細胞染色套組(1：1000稀釋，賽默飛世爾)。 15-20分鐘後，向細胞中添加FACS染色緩衝液中之25μl抗CD16/32(2.4G2，BD Biosciences)以阻斷Fc受體結合。15分鐘後，隨後藉由向孔中添加50μl亮染色緩衝液(BD Biosciences)中之抗體而對細胞染色。抗體全部以1：200稀釋使用。以下抗體購自Tonbo Biosciences(加利福尼亞州聖地亞哥)：Ly6G-FITC(1A8)及CD11b-APC(M1/70)。以下抗體購自BD Biosciences：SiglecF-PE(E50-2440)及CD11c-BV785(N418)。Ly6C-PerCp-Cyanine5.5(HK1.4)購自賽默飛世爾。30分鐘後，將細胞在FACS緩衝液中洗滌2-3次。洗滌後，將細胞再懸浮於FACS緩衝液中，且隨後在CytoFlex流式細胞儀上分析。使用FlowJo 10軟體分析資料。在對細胞設門且排除死細胞及肺泡巨噬細胞(SiglecF+CD11c+)後，基於標記物之表現定義細胞類型：嗜伊紅血球(SiglecF+CD11c-Ly6G-)、嗜中性白血球(Ly6G+Ly6C+CD11b+SiglecF-CD11c-)及單核球(Ly6C+Ly6G-CD11b+SiglecF-CD11c-)。為了計算BAL流體中之細胞類型之數目，將所獲取的總細胞中各細胞類型之百分比乘以全細胞計數。全細胞計數係使用Guava easyCyte 5HT系統流式細胞儀(馬薩諸塞州比勒利卡之EMD密理博(EMD Millipore,Billerica,MA))，使用ViaCount分析，根據製造商之說明書獲得。
B.多重IL-1β細胞介素攻擊模型及相關分析：多重IL-1β攻擊研究方案係基於Kim等人，《美國呼吸與重症監護醫學雜誌(American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine)》,196(3)：283-297(2017)。在第-1天及第2天，類似於單一IL-1β攻擊研究，i.p.給予小鼠抗體。在第0天、第1天及第2天，用D-PBS或D-PBS中之30ng IL-1β以35μl之總體積i.n.攻擊小鼠。在第3天，使小鼠安樂死。如先前所描述進行BAL。將左、中、下及後腔肺葉收集在2.0mL管中，快速冷凍，且保存在-80℃下以用於隨後的蛋白質趨化介素/細胞介素分析。BAL之細胞分析如先前所描述進行，但改為用LIVE/DEAD可固定淺綠色死細胞染色套組(1：250稀釋，賽默飛世爾)對細胞染色，且以下抗體全部 1：200稀釋：Ly6G-FITC(Tonbo Biosciences，1A8)；SiglecF-PE(BD Biosciences，E50-2440)；Ly6C-PerCp-Cyanine5.5(賽默飛世爾，HK1.4)；CD11b-APC-Cy7(BD Biosciences，M1/70)；CD11c-BV785(Biolegend，N418)；CD3-PE-Cy7(Biolegend，17A2)；CD4-BV605(BD Biosciences，RM4-5)；CD19-BV650(BD Biosciences，1D3)；T1/ST2-BV421(BD Biosciences，U29-93)；及MHC II類-APC(賽默飛世爾，M5/114.15.2)。使用FlowJo 10軟體分析資料。在對細胞設門且排除死細胞及肺泡巨噬細胞(CD11c+SiglecF+)後，基於以下標記物之表現定義BAL中之以下細胞類型：嗜中性白血球(Ly6G+Ly6C+CD11b+)、嗜伊紅血球(SiglecF+CD11c-Ly6G-)、樹突狀細胞(CD11c+MHCII+Ly6G-SiglecF-)、單核球(Ly6C+Ly6G-CD11b+SiglecF-)、CD4 T細胞(CD3+CD4+CD19-CD11b-Ly6G-SiglecF-)、T1-ST2+ CD4 T細胞(CD3+CD4+T1/ST2+CD19-CD11b-Ly6G-SiglecF-)、CD8 T細胞(CD3+CD4-CD19-CD11b-Ly6G-SiglecF-)及B細胞(CD19+MHCII+CD3-CD11b-Ly6G-SiglecF-)。如上所述計算BAL中之細胞計數。對於肺趨化介素/細胞介素蛋白質分析，將肺樣品在含有蛋白酶及磷酸酶抑制劑混合物(賽默飛世爾科技，目錄號78443)之組織提取試劑I(賽默飛世爾科技，目錄號FNN0071)中使用Tissuelyser II(QIAGEN)以25Hz均質化2分鐘，持續3個循環。將勻漿在9,300×g下在4℃下離心10分鐘。藉由Pierce二喹啉甲酸(BCA)蛋白質分析(賽默飛世爾科技，目錄號23227)定量組織溶解產物(上清液)中之蛋白質量。將溶解物儲存在-80℃下用於細胞介素分析。上清液用於細胞介素量測。200μg總蛋白質肺溶解物中之鼠類細胞介素及趨化介素(CXCL1、CXCL2、IFNγ、IL-10、IL-12、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-25、IL-4、IL-5、IL-6、IL-13、IL-17A、IL-33、TNFα及TSLP)之含量使用小鼠定製ProcartaPlex 17-plex套組(英傑/賽默飛世爾科技，目錄號PPX-17-MXCE4AT)根據製造商說 明書來量測。
C.急性家塵蟎(HDM)哮喘模型及相關分析：急性家塵蟎(HDM)哮喘模型係基於Piyadasa等人，《開放生物學(Biology Open)》,5(2)：112-121(2016)。在第-1天、第2天、第6天、第9天及第13天，以30mg/kg i.p.給予小鼠IgG對照或14F4。在第0-3天、第6-10天、第13天及第14天，用生理鹽水或25μg HDM(北卡羅來納州列諾爾(Lenoir,NC)之Stallergenes Greer，目錄號XPB82D3A.5)i.n.攻擊小鼠。在第15天，使小鼠安樂死，且如先前所描述自血液收集血清。小鼠抗體之血清濃度使用HDM特異性IgE(華盛頓州雷蒙德(Redmond,WA)之Chondrex，目錄號3037)及HDM特異性IgG1(Chondrex，目錄號3034)套組根據製造商之說明書量測。將血清樣品針對HDM特異性IgE量測1：4稀釋且針對HDM特異性IgG1量測1：12稀釋。
結果
如實例17之結果所示，小鼠替代抗體14F4能夠在基於活體外細胞之分析中阻斷所有三個IL-1家族途徑。為了確定14F4是否能夠在活體內阻斷此等途徑，本實例18在短藥效學(PD)分析中測試14F4阻斷個別途徑之能力。先前的研究表明，IL-1家族細胞介素當活體內投與時具有急性作用(參見例如Gabrielsson等人，《歐洲藥物科學雜誌》：歐洲藥物科學聯合會官方雜誌，67：144-159(2015)；Ramadas等人，《公共科學圖書館．綜合》,7(9)：e45784(2012))。類似地，如圖16A及16B中所描繪之結果所示，用IL-1β全身性攻擊之小鼠相比於用PBS攻擊之小鼠以血清IL-6含量快速增加作出反應(圖16A)。用IL36αi.n.攻擊之小鼠相比於用PBS攻擊之小鼠以嗜中性白血球快速流入肺部氣腔中作出反應(圖16B)。14F4處理可影響這兩種所觀察到之免疫反應。如圖16A中所示，在攻擊之前給予14F4之小鼠在IL-1β誘導血清IL-6含量增加方面展現強抑制(88%抑制)。另外，如圖16B中所示，在攻擊之前給予14F4之小鼠展現 肺部氣腔中之IL-36α誘導之嗜中性白血球流入減少(100%抑制)。此等結果有力地表明14F4具有活體內阻斷IL-1及IL-36信號傳導途徑的能力。
本實例之研究亦用於確定14F4是否具有阻斷人類哮喘中所見之複雜表型的能力。先前的研究已顯示，在4天過程內一天一次以IL-1β攻擊之小鼠在肺部氣腔中具有增加數目之嗜中性白血球、巨噬細胞及淋巴細胞(參見例如Kim等人，《美國呼吸與重症監護醫學雜誌》,196(3)：283-297(2017))。IL-1β誘導之嗜中性白血球流入已被證明具有類固醇抗性，類似於患有嚴重的不受控制的哮喘的人類患者中所看到的。如圖17A-17E之圖中所描繪之結果所示，在3天過程內以IL-1β攻擊之小鼠在肺部氣腔中具有顯著增加的嗜中性白血球(圖17A)、CD4 T細胞(圖17B)、T1-ST2+ CD4 T細胞(圖17C)、單核球(圖17D)及樹突狀細胞(圖17E)。如圖18A-18C中所描繪之圖所示，多重IL-1β攻擊亦引起肺組織中發炎性細胞介素IL-1β(圖18A)及IL-17A(圖18B)及吸引嗜中性白血球之趨化介素CXCL1(圖18C)的含量增加。CXCL2、IFN-γ、IL-10、IL-12、IL-1α、IL-2、IL-25、IL-4、IL-5、IL-6、IL-13、IL-33、TNF-α及TSLP之含量在多重IL-1β攻擊後低於偵測極限或不上調(資料未示出)。14F4處理減小此等在被IL-1β攻擊之小鼠中所觀察到之作用。如圖17A-17E中所示，在3天過程內以IL-1β攻擊且用14F4處理之小鼠在肺部氣腔中具有減小數目之嗜中性白血球(74%抑制)(圖17A)、CD4 T細胞(75%抑制)(圖17B)、T1-ST2+ CD4 T細胞(76%抑制)(圖17C)、單核球(58%抑制)(圖17D)及樹突狀細胞(64%抑制)(圖17E)。如圖18A-18C中所示，14F4處理引起肺組織中IL-1β(88%抑制)(圖18A)、IL-17A(89%抑制)(圖18B)及CXCL1(68%抑制)(圖18C)之含量顯著降低。此等結果有力地表明14F4具有阻斷在數天內發展的較複雜免疫反應的能力。
在確定14F4在簡化的細胞介素攻擊中模型具有阻斷複雜免疫表 型的能力後，進一步測試14F4阻斷由相關的且複雜的人類過敏原家塵蟎(HDM)誘發之類哮喘表型的能力(參見例如Nials等人，《疾病模型與機制(Disease Models & Mechanisms)》,1(4-5)：213-220(2008))。如圖19A及19B中所示，類似於先前研究(參見例如Piyadasa等人，《開放生物學》,5(2)：112-121(2016))，經HDM攻擊之小鼠相比於經生理鹽水攻擊之小鼠具有顯著升高含量之HDM特異性IgE(圖19A)及IgG1(圖19B)。然而，經HDM攻擊且用14F4處理之小鼠相比於用IgG對照處理之小鼠顯示HDM特異性IgE顯著降低(64%抑制)(圖19A)及HDM特異性IgG1顯著降低(70%抑制)(圖19B)。此等結果指示，阻斷IL-1家族信號傳導能夠部分阻斷類哮喘表型之發展。
雖然出於清楚起見及便於理解，本發明之上述揭露內容已藉由舉例及圖解說明而略為詳細地描述，但是本發明，包含本文所述之實例、描述及實施例，係出於說明的目的，意圖為例示性的，且不應被解釋為限制本發明。本領域普通技術人員將清楚，可以對本文所述之實例、描述及實施例作出各種修改或改變，且所述修改或改變包含於本發明及隨附申請專利範圍之精神及範圍內。此外，本領域中熟習此項技術者將想到多種與本文所述之方法及程序等同的方法及程序。所有此類等同物應理解為在本發明之範疇內且由隨附申請專利範圍所涵蓋。
本發明之其他實施例闡述於以下申請專利範圍中。
本文所提及之所有出版物、專利申請案、專利或其他文獻之揭示內容均出於所有目的明確以其全文引用之方式併入本文中，引用程度就如同各此類個別出版物、專利、專利申請案或其他文獻經個別地特定地指示出於所有目的以全文引用之方式併入本文中且在本文中完整地闡述。在有衝突之情況下，將以本說明書為準，包含指定術語。
參考書目
1. Almagro, J.C. and J. Fransson, “Humanization of antibodies.” Front Biosci, 2008.13: 1619-33 (2008).
2. Baca, M., et al., “Antibody humanization using monovalent phage display.” J Biol Chem, 272(16): 10678-84 (1997).
3. Baker et al., “Rapid monitoring of recombinant protein products: a comparison of current technologies.” Trends Biotechnol., 20:149-156 (2002).
4. Bassoy, et al., "Regulation and function of interleukin-36 cytokines." Immunol.Rev. 281(1): 169-178 (2018).
5. Binz et al., “Engineering novel binding proteins from nonimmunoglobulin domains.” Nat. Biotech., 23(10): 1257-1268 (2005).
6. Boerner, P., et al., “Production of antigen-specific human monoclonal antibodies from in vitro-primed human splenocytes. ” J Immunol., 1991.147(1): 86-95(1991).
7. Brennan, M., P.F. Davison, and H. Paulus, “Preparation of bispecific antibodies by chemical recombination of monoclonal immunoglobulin G1 fragments.” Science, 229(4708): p.81-3 (1985).
8. Brenner et al., “Encoded combinatorial chemistry. ” Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89(12): 5381-5383 (1992).
9. Bruggemann, M. et al., “Comparison of the effector functions of human immunoglobulins using a matched set of chimeric antibodies.” J. Exp. Med., 166: 1351-1361 (1987).
10. Capel, P.J. et al., “Heterogeneity of human IgG Fc receptors.” Immunomethods 4, 25-34 (1994).
11. Carter, P., et al., “Humanization of an anti-p185HER2 antibody for human cancer therapy. ” Proc Natl Acad Sci USA, 89(10): p.4285-9 (1992).
12. Clackson, T., et al., “Making antibody fragments using phage display libraries.” Nature, 352(6336): 624-8 (1991).
13. Clynes et al., “Fc receptors are required in passive and active immunity to melanoma.” Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 95:652- 656 (1998).
14. Cragg, M.S. and Glennie M.J., “Antibody specificity controls in vivo effector mechanisms of anti-CD20 reagents,” Blood, 103(7): 2738-43 (2004).
15. Cragg, M.S. et al., “Complement-mediated lysis by anti-CD20 mAb correlates with segregation into lipid rafts,” Blood, 101(3): 1045-53 (2003).
16. Cunningham, B.C. and J.A. Wells, “High-resolution epitope mapping of hGH-receptor interactions by alanine-scanning mutagenesis. ” Science, 1989.244(4908): 1081-5 (1989).
17. D’Argenio et al., ADAPT 5 User’s Guide: Pharmacokinetic/Pharmacodynamic Systems Analysis Software.Biomedical Simulations Resource, Los Angeles, CA (2009).
18. Daeron, M.“Fc receptor biology.” Annu Rev Immunol 15, 203-234 (1997).
19. Dall’ Acqua et al., “Increasing the Affinity of a Human IgG1 for the Neonatal Fc Receptor: Biological Consequences,” J Immunol, 169(9), 5171-5180 (2002). https://doi.org/10.4049/jimmunol.169.9.5171
20. Dall'Acqua, W.F., et al., “Antibody humanization by framework shuffling.” Methods, 36(1): p.43-60 (2005).
21. de Haas, M. et al., “Fc gamma receptors of phagocytes.” J Lab Clin Med 126, 330-341 (1995).
22. Ding et al., “IL-36 cytokines in autoimmunity and inflammatory disease.” Oncotarget, 9(2), 2895-2901 (2017). https://doi.org/10.18632/oncotarget.22814
23. Fellouse, F.A., C. Wiesmann, and S.S. Sidhu, “Synthetic antibodies from a four-amino-acid code: a dominant role for tyrosine in antigen recognition.” Proc Natl Acad Sci USA, 101(34): p.12467-72 (2004).
24. Fiedler et al., “Non-Antibody Scaffolds as Alternative Therapeutic Agents,” in Handbook of Therapeutic Antibodies (eds.S. Dübel and J. M. Reichert), Wiley-VCH Verlag GmbH & Co (2014).
25. Flatman, S. et al., “Process analytics for purification of monoclonal antibodies.” Journal of chromatography.B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences 848, 79-87 (2007).
26. Foote et al., “Antibody framework residues affecting the conformation of the hypervariable loops.” J. Mol. Biol., 224: 487-499 (1992).
27. Gabrielsson et al., “Modeling and design of challenge tests: Inflammatory and metabolic biomarker study examples,” European Journal of Pharmaceutical Sciences: Official Journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences, 67, 144-159 (2015). https://doi.org/10.1016/j.ejps.2014.11.006
28. Garlanda et al., "The interleukin-1 family: back to the future." Immunity 39(6): 1003-1018 (2013).
29. Gazzano-Santoro et al., “A non-reactive complement-dependent cytotoxicity assay for anti-CD20 monoclonal antibody.” J. Immunol.Methods, 202(2): 163-171 (1997).
30. Gebauer et al., “”Engineered protein scaffolds as next-geneartion antibody therapeutics.” Curr. Opin. Chem. Biol., 13:245-255 (2009)
31. Gerngross, “Advances in the production of human therapeutic proteins in yeasts and filamentous fungi. ” Nat. Biotech., 22: 1409-1414 (2004).
32. Graham et al., “Characteristics of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus type 5.” J. Gen Virol., 36:59 (1977).
33. Granzin et al., “Shaping of Natural Killer Cell Antitumor Activity by Ex Vivo Cultivation.” Front.Immunol. 8: 458 (2017).
34. Gruber, M., et al., “Efficient tumor cell lysis mediated by a bispecific single chain antibody expressed in Escherichia coli.” J Immunol, 152(11): p.5368-74 (1994).
35. Günther et al., “IL-1 family cytokines use distinct molecular mechanisms to signal through their shared co-receptor,” Immunity, 47(3), 510-523.e4 (2017). https://doi.org/10.1016/j.immuni.2017.08.004
36. Gunther, S., and E. J. Sundberg, “Molecular determinants of agonist and antagonist signaling through the IL-36 receptor.” J Immunol 193, 921-930 (2014).
37. Guyer, R.L. et al., “Immunoglobulin binding by mouse intestinal epithelial cell receptors.” J Immunol 117, 587-593 (1976).
38. Hass et al., (2016).PCT publication no. WO2016077381A1.
39. Hellstrom, et al., “Strong antitumor activities of IgG3 antibodies to a human melanoma-associated ganglioside.” Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 82: 1499-1502 (1985).
40. Hellstrom, et al., “Antitumor effects of L6, an IgG2a antibody that reacts with most human carcinomas.” Proc. Nat 'l Acad. Sci. USA, 83:7059-7063 (1986).
41. Holliger, P., T. Prospero, and G. Winter, ‘‘‘Diabodies’: small bivalent and bispecific antibody fragments.” Proc Natl Acad Sci U S A, 90(14): p.6444-8 (1993).
42. Hoogenboom et al., Methods in Molecular Biology, 178: 1-37 (O’Brien et al., ed., Antibody Phage Display, Humana Press, Totowa, NJ, (2001).
43. Hotzel et al., “A strategy for risk mitigation of antibodies with fast clearance.” mAbs , 4(6): 753-760 (2012).
44. Hudson, P.J. and C. Souriau, “Engineered antibodies.” Nat Med, 9(1): p.129-34 (2003).
45. Idusogie et al., “Mapping of the C1q binding site on rituxan, a chimeric antibody with a human IgG1 Fc.” J. Immunol., 164: 4178- 4184 (2000).
46. Kabat, E.A.(Bethesda, Md.(Bethesda, 20892): U.S. Dept. of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health, 1991., 2019).
47. Kakkar et al., “The IL-33/ST2 pathway: therapeutic target and novel biomarker,” Nature Reviews.Drug Discovery, 7(10), 827-840 (2008). https://doi.org/10.1038/nrd2660.
48. Kanda, Y. et al., “Comparison of cell clines for stable production of fucose-negative antibodies with enhanced ADCC.” Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006).
49. Kashmiri, S.V., et al., “SDR grafting--a new approach to antibody humanization.” Methods, 36(1): p.25-34 (2005).
50. Kim et al., “Role for NLRP3 Inflammasome-mediated, IL-1β-Dependent Responses in Severe, Steroid-Resistant Asthma,” American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine, 196(3), 283-297 (2017). https://doi.org/10.1164/rccm.201609-1830OC
51. Kim et al., “Localization of the site of murine IgG1 molecule that is involved in binding to the murine intestinal Fc receptor,” Eur.J. Immunol., 24:2429-2434 (1994)
52. Klimka, A., et al., “Human anti-CD30 recombinant antibodies by guided phage antibody selection using cell panning.” Br J Cancer, 83(2): p.252-60 (2000).
53. Koenig et al., J. Biol. Chem. 290(36): 21773-21786 (2015).
54. Komai-Koma et al., “Interleukin-33 promoting Th1 lymphocyte differentiation dependents on IL-12,” Immunobiology, 221(3), 412-417 (2016). https://doi.org/10.1016/j.imbio.2015.11.013
55. Kostelny, S.A., M.S. Cole, and J.Y. Tso, “Formation of a bispecific antibody by the use of leucine zippers. ” J Immunol, 148(5): p.1547-53 (1992).
56. Kozbor, D., et al., “A human hybrid myeloma for production of human monoclonal antibodies.” J Immunol, 133(6): p.3001-5 (1984).
57. Kuby Immunology.- NLM Catalog - NCBI, (available at https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nlmcatalog/101275636).
58. Kunkel et al., “Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection.” Methods Enzymol., 154: 367-382 (1987).
59. Kuo et al., “Neonatal Fc receptor and IgG-based therapeutics,” MAbs, 3(5), 422-430 (2011). https://doi.org/10.4161/mabs.3.5.16983
60. Lambrecht et al., “The airway epithelium in asthma.” Nat. Med. 18(5): 684-692 (2012).
61. Lee, C.V., et al., “High-affinity human antibodies from phage-displayed synthetic Fab libraries with a single framework scaffold.” J Mol Biol, 340(5): p.1073-93 (2004).
62. Lee, C.V., S.S. Sidhu, and G. Fuh, “Bivalent antibody phage display mimics natural immunoglobulin.” J Immunol Methods, 284(1-2): p.119-32 (2004).
63. Li et al., “Optimization of humanized IgGs in glycoengineered Pichia pastoris.” Nat. Biotech., 24(2):210-215 (2006).
64. Li, J., et al., “Human antibodies for immunotherapy development generated via a human B cell hybridoma technology.” Proc Natl Acad Sci U S A, 103(10): p.3557-62 (2006).
65. Liew et al., (2016).“Interleukin-33 in health and disease.” Nat. Rev. Immunol. 16(11): 676-689 (2016).
66. Lonberg, N., “Fully human antibodies from transgenic mouse and phage display platforms.” Curr Opin Immunol, 20(4): p.450-9 (2008).
67. Lonberg, N., “Human antibodies from transgenic animals.” Nat Biotechnol, 23(9): p.1117-25 (2005).
68. Mather, “Establishment and characterization of two distinct mouse testicular epithelial cell lines.” Biol. Reprod., 23:243-252 (1980).
69. Mather et al., “Culture of testicular cells in hormone-supplemented serum-free medium.” Annals N Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982).
70. Marks and Bradbury, Methods in Molecular Biology, 248: 161-175 (Lo, ed., Antibody Engineering, Humana Press, Totowa, NJ, 2003).
71. Masella et al., “PANDAseq: paired-end assembler for illumina sequences.” BMC Bioinformatics, 13:31 (2012).
72. McCafferty, J., et al., “Phage antibodies: filamentous phage displaying antibody variable domains. ” Nature, 348(6301): p.552-4 (1990).
73. Nials et al., “Mouse models of allergic asthma: Acute and chronic allergen challenge.” Disease Models & Mechanisms, 1(4-5), 213-220 (2008). https://doi.org/10.1242/dmm.000323
74. Nold-Petry et al., “Increased Cytokine Production in Interleukin-18 Receptor α-deficient Cells Is Associated with Dysregulation of Suppressors of Cytokine Signaling,” Journal of Biological Chemistry, 284(38), 25900-25911 (2009). https://doi.org/10.1074/jbc.M109.004184
75. Nowarski et al., “The Stromal Intervention: Regulation of Immunity and Inflammation at the Epithelial-Mesenchymal Barrier.” Cell 168(3): 362-375 (2017).
76. Okazaki et al., “Fucose depletion from human IgG1 oligosaccharide enhances binding enthalpy and association rate between IgG1 and Fc-γ-RIIIa.” J. Mol. Biol., 336: 1239-1249 (2004).
77. Osbourn, J., M. Groves, and T. Vaughan, “From rodent reagents to human therapeutics using antibody guided selection.” Methods, 36(1): p.61-8 (2005).
78. Padlan, E.A., “A possible procedure for reducing the immunogenicity of antibody variable domains while preserving their ligand-binding properties.” Mol Immunol, 1991.28(4-5): p.489-98 (1991).
79. Petkova, et al., “Enhanced half-life of genetically engineered human IgG1 antibodies in a humanized FcRn mouse model: potential application in humorally mediated autoimmune disease.” Intl. Immunol., 18(12): 1759-1769 (2006).
80. Piyadasa et al., (2016).“Biosignature for airway inflammation in a house dust mite-challenged murine model of allergic asthma,” Biology Open, 5(2), 112-121 (2016). https://doi.org/10.1242/bio.014464
81. Portolano, S., et al., “Lack of promiscuity in autoantigen-specific H and L chain combinations as revealed by human H and L chain ‘roulette’.” J Immunol, 150(3): p.880-7 (1993).
82. Presta, L.G., et al., “Humanization of an antibody directed against IgE. ” J Immunol, 151(5): p.2623-32 (1993).
83. Queen, C., et al., “A humanized antibody that binds to the interleukin 2 receptor.” Proc Natl Acad Sci U S A, 86(24): p.10029-33 (1989).
84. Ramadas, et al., “IL-36α exerts pro-inflammatory effects in the lungs of mice.” PloS One, 7(9), e45784 (2012). https://doi.org/10.1371/journal.pone.0045784
85. Ravetch, J.V. and J. P. Kinet, “Fc receptors.” Annu Rev Immunol 9, 457-492 (1991).
86. Riechmann, L., et al., “Reshaping human antibodies for therapy.” Nature, 332(6162): p.323-7 (1988).
87. Ripka et al., “Two Chinese hamster ovary glycosylation mutants affected in the conversion of GDP-mannose to GDP-fucose.” Arch.Biochem.Biophys,.249:533-545 (1986).
88. Roopenian et al., “FcRn: the neonatal Fc receptor comes of age,” Nature Reviews Immunology, 7(9), 715-725 (2007). https://doi.org/10.1038/nri2155
89. Rosok, M.J., et al., “A combinatorial library strategy for the rapid humanization of anticarcinoma BR96 Fab.” J Biol Chem, 271(37): p.22611-8 (1996).
90. Saluja et al., “The role of IL-33 and mast cells in allergy and inflammation.” Clin. Transl. Allergy 5: 33 (2015).
91. Schwartz et al., “Basophils in inflammation.” European Journal of Pharmacology, 778, 90-95 (2016). https://doi.org/10.1016/j.ejphar.2015.04.049
92. Shields et al., “High resolution mapping of the binding site on human IgG1 for Fc gamma RI, Fc Gamma RII, Fc gamma RIII, and FcRn and design of IgG1 variants with improved binding to the Fc gamma R.” J. Biol. Chem., 276(9): 6591- 6604 (2001).
93. Sidhu, S.S., et al., “Phage-displayed antibody libraries of synthetic heavy chain complementarity determining regions. ” J Mol Biol, 338(2): p.299-310 (2004).
94. Sims et al., “The IL-1 family: regulators of immunity.” Nat. Rev. Immunol. 10(2): 89-102 (2010).
95. Sims, M.J., et al., “A humanized CD18 antibody can block function without cell destruction. ” J Immunol, 151(4): p.2296-308 (1993).
96. Smeets et al., “Soluble interleukin-1 receptor accessory protein ameliorates collagen-induced arthritis by a different mode of action from that of interleukin-1 receptor antagonist,” Arthritis and Rheumatism, 52(7), 2202-2211 (2005). https://doi.org/10.1002/art.21108
97. Sola, (1987).Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158, CRC Press, Inc.
98. Suwara et al., “IL-lalpha released from damaged epithelial cells is sufficient and essential to trigger inflammatory responses in human lung fibroblasts.” Mucosal Immunol. 7(3): 684-693 (2014).
99. Towne, J.E., et al., “Interleukin (IL)-1F6, IL-1F8, and IL-1F9 signal through IL-1Rrp2 and IL-1RAcP to activate the pathway leading to NF-kappaB and MAPKs.” J Biol Chem, 279(14): p.13677-88 (2004).
100. Traunecker et al., “Bispecific single chain molecules (Janusins) target cytotoxic lymphocytes on HIV infected cells,” EMBO J., 10(12):3655-9 (1991).
101. Tutt, A., G.T. Stevenson, and M.J. Glennie, “Trispecific F(ab')3 derivatives that use cooperative signaling via the TCR/CD3 complex and CD2 to activate and redirect resting cytotoxic T cells.” J Immunol, 147(1): p.60-9 (1991).
102. Urlaub et al., “Isolation of Chinese hamster cell mutants deficient in dihydrofolate reductase activity.” Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980).
103. van Dijk, M.A. and J.G. van de Winkel, “Human antibodies as next generation therapeutics.” Curr Opin Chem Biol, 5(4): p.368-74 (2001).
104. Vollmers, H.P. and S. Brandlein, “Death by stress: natural IgM-induced apoptosis.” Methods Find Exp Clin Pharmacol, 27(3): p.185-91 (2005).
105. Vollmers, H.P. and S. Brandlein, “The ‘early birds:’ natural IgM antibodies and immune surveillance. ” Histol Histopathol, 20(3): p.927-37 (2005).
106. Wang et al., “Structural insights into the assembly and activation of IL-1β with its receptors.” Nat. Immunol., 11:905-912 (2010).
107. Wright et al., “Effect of glycosylation on antibody function: implications for genetic engineering.” TIBTECH, 15:26-32 (1997).
108. Yamane-Ohnuki et al., “Establishment of FUT8 knockout Chinese hamster ovary cells: an ideal host cell line for producing completely defucosylated antibodies with enhanced antibody-dependent cellular cytotoxicity.” Biotech. Bioeng.87: 614 (2004).
109. Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Antibody Engineering, Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003).
110. Yi et al., “Structural and Functional Attributes of the Interleukin-36 Receptor.” The Journal of Biological Chemistry, 291(32), 16597-16609 (2016). https://doi.org/10.1074/jbc.M116.723064
111. Zapata, G. et al., “Engineering linear F(ab')2 fragments for efficient production in Escherichia coli and enhanced antiproliferative activity.” Protein Eng 8, 1057-1062 (1995).
<110> 23與我有限公司 佛羅帝 達維德 卡勒 埃里克 傅凱立 傑曼 伊巴爾拉 克里斯蒂 鄭 泉 黃 耀民 戴斯 琳茲 沃拉克 克莉絲汀
<120> 抗IL1RAP抗體及其使用方法
<130> 09402.002US1
<150> US 62/719,397
<151> 2018-08-17
<160> 338
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 570
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<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 48
Figure 108129005-A0202-12-0188-111
<210> 49
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 49
Figure 108129005-A0202-12-0188-112
Figure 108129005-A0202-12-0189-113
<210> 50
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 50
Figure 108129005-A0202-12-0189-114
<210> 51
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 51
Figure 108129005-A0202-12-0189-115
<210> 52
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 52
Figure 108129005-A0202-12-0189-116
<210> 53
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 53
Figure 108129005-A0202-12-0190-117
<210> 54
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 54
Figure 108129005-A0202-12-0190-118
<210> 55
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 55
Figure 108129005-A0202-12-0190-119
<210> 56
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 56
Figure 108129005-A0202-12-0190-120
<210> 57
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 57
Figure 108129005-A0202-12-0191-121
<210> 58
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 58
Figure 108129005-A0202-12-0191-122
<210> 59
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 59
Figure 108129005-A0202-12-0191-123
<210> 60
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 60
Figure 108129005-A0202-12-0191-124
<210> 61
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 61
Figure 108129005-A0202-12-0192-125
<210> 62
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 變體
<222> (1)..(1)
<223> X為Q或S
<220>
<221> 變體
<222> (2)..(2)
<223> X為H或S
<220>
<221> 變體
<222> (4)..(4)
<223> X為W、A、F、G、H、I、K、L、M、V或Y
<220>
<221> 變體
<222> (6)..(6)
<223> X為T、I或V
<400> 62
Figure 108129005-A0202-12-0192-126
<210> 63
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 63
Figure 108129005-A0202-12-0192-127
<210> 64
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 64
Figure 108129005-A0202-12-0193-128
<210> 65
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 65
Figure 108129005-A0202-12-0193-129
<210> 66
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 66
Figure 108129005-A0202-12-0193-131
<210> 67
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 67
Figure 108129005-A0202-12-0193-130
<210> 68
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 68
Figure 108129005-A0202-12-0194-132
<210> 69
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 69
Figure 108129005-A0202-12-0194-133
<210> 70
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 70
Figure 108129005-A0202-12-0194-134
<210> 71
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 71
Figure 108129005-A0202-12-0194-135
<210> 72
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 72
Figure 108129005-A0202-12-0195-136
<210> 73
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 73
Figure 108129005-A0202-12-0195-137
<210> 74
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 74
Figure 108129005-A0202-12-0195-138
<210> 75
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 75
Figure 108129005-A0202-12-0195-139
Figure 108129005-A0202-12-0196-140
<210> 76
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 76
Figure 108129005-A0202-12-0196-141
<210> 77
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 變體
<222> (1)..(1)
<223> X為F、A、D、E、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、W或Y
<220>
<221> 變體
<222> (2)..(2)
<223> X為S、E、G、K、P、Q、R或T
<220>
<221> 變體
<222> (3)..(3)
<223> X為N、D、E、G、K、Q或R
<220>
<221> 變體
<222> (4)..(4)
<223> X為Y、A、D、E、H、S或V
<220>
<221> 變體
<222> (5)..(5)
<223> X為A、N或S
<220>
<221> 變體
<222> (6)..(6)
<223> X為M、V或W
<220>
<221> 變體
<222> (7)..(7)
<223> X為S或G
<400> 77
Figure 108129005-A0202-12-0197-142
<210> 78
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 78
Figure 108129005-A0202-12-0197-143
<210> 79
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 79
Figure 108129005-A0202-12-0197-144
<210> 80
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 80
Figure 108129005-A0202-12-0197-145
<210> 81
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 81
Figure 108129005-A0202-12-0198-146
<210> 82
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 82
Figure 108129005-A0202-12-0198-147
<210> 83
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 83
Figure 108129005-A0202-12-0198-148
<210> 84
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 84
Figure 108129005-A0202-12-0198-149
<210> 85
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 85
Figure 108129005-A0202-12-0199-150
<210> 86
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 86
Figure 108129005-A0202-12-0199-151
<210> 87
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 87
Figure 108129005-A0202-12-0199-152
<210> 88
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 88
Figure 108129005-A0202-12-0199-153
<210> 89
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 89
Figure 108129005-A0202-12-0200-154
<210> 90
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 90
Figure 108129005-A0202-12-0200-155
<210> 91
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 91
Figure 108129005-A0202-12-0200-156
<210> 92
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 92
Figure 108129005-A0202-12-0200-157
<210> 93
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 93
Figure 108129005-A0202-12-0201-158
<210> 94
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 94
Figure 108129005-A0202-12-0201-159
<210> 95
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 95
Figure 108129005-A0202-12-0201-160
<210> 96
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 96
Figure 108129005-A0202-12-0201-161
Figure 108129005-A0202-12-0202-162
<210> 97
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 97
Figure 108129005-A0202-12-0202-163
<210> 98
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 98
Figure 108129005-A0202-12-0202-164
<210> 99
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 99
Figure 108129005-A0202-12-0202-165
<210> 100
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 100
Figure 108129005-A0202-12-0203-166
<210> 101
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 101
Figure 108129005-A0202-12-0203-167
<210> 102
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 102
Figure 108129005-A0202-12-0203-168
<210> 103
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 103
Figure 108129005-A0202-12-0203-169
<210> 104
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 104
Figure 108129005-A0202-12-0204-170
<210> 105
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 105
Figure 108129005-A0202-12-0204-171
<210> 106
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 106
Figure 108129005-A0202-12-0204-172
<210> 107
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 107
Figure 108129005-A0202-12-0204-173
<210> 108
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 108
Figure 108129005-A0202-12-0205-174
<210> 109
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 109
Figure 108129005-A0202-12-0205-175
<210> 110
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 110
Figure 108129005-A0202-12-0205-176
<210> 111
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 111
Figure 108129005-A0202-12-0205-177
<210> 112
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 112
Figure 108129005-A0202-12-0206-178
<210> 113
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 113
Figure 108129005-A0202-12-0206-179
<210> 114
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 114
Figure 108129005-A0202-12-0206-180
<210> 115
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 115
Figure 108129005-A0202-12-0206-181
<210> 116
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 116
Figure 108129005-A0202-12-0207-182
<210> 117
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 117
Figure 108129005-A0202-12-0207-183
<210> 118
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 118
Figure 108129005-A0202-12-0207-184
<210> 119
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 119
Figure 108129005-A0202-12-0207-185
<210> 120
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 120
Figure 108129005-A0202-12-0208-186
<210> 121
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 變體
<222> (1)..(1)
<223> X為N、D、E、G、K、Q或R
<220>
<221> 變體
<222> (2)..(2)
<223> X為Y、A、D、E、H、S或V
<220>
<221> 變體
<222> (3)..(3)
<223> X為A、N或S
<220>
<221> 變體
<222> (4)..(4)
<223> X為M、V或W
<220>
<221> 變體
<222> (5)..(5)
<223> X為S或G
<400> 121
Figure 108129005-A0202-12-0208-187
<210> 122
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 122
Figure 108129005-A0202-12-0209-188
<210> 123
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 123
Figure 108129005-A0202-12-0209-189
<210> 124
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 124
Figure 108129005-A0202-12-0209-190
<210> 125
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 125
Figure 108129005-A0202-12-0209-191
<210> 126
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 126
Figure 108129005-A0202-12-0210-192
<210> 127
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 127
Figure 108129005-A0202-12-0210-193
<210> 128
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 128
Figure 108129005-A0202-12-0210-194
<210> 129
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 129
Figure 108129005-A0202-12-0210-195
<210> 130
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 130
Figure 108129005-A0202-12-0211-196
<210> 131
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 131
Figure 108129005-A0202-12-0211-197
<210> 132
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 132
Figure 108129005-A0202-12-0211-198
<210> 133
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 133
Figure 108129005-A0202-12-0211-199
<210> 134
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 134
Figure 108129005-A0202-12-0212-200
<210> 135
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 135
Figure 108129005-A0202-12-0212-201
<210> 136
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 136
Figure 108129005-A0202-12-0212-203
<210> 137
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 137
Figure 108129005-A0202-12-0212-204
<210> 138
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 138
Figure 108129005-A0202-12-0213-205
<210> 139
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 139
Figure 108129005-A0202-12-0213-206
<210> 140
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 變體
<222> (2)..(2)
<223> X為V、A、N或S
<220>
<221> 變體
<222> (3)..(3)
<223> X為T或S
<220>
<221> 變體
<222> (4)..(4)
<223> X為E、D、N、T或V
<220>
<221> 變體
<222> (5)..(5)
<223> X為G、I、P、T或V
<220>
<221> 變體
<222> (6)..(6)
<223> X為G、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y
<220>
<221> 變體
<222> (7)..(7)
<223> X為D、A、E、G、H、K、N、P、Q、R或S
<220>
<221> 變體
<222> (8)..(8)
<223> 在8位之X為Y或W
<220>
<221> 變體
<222> (9)..(9)
<223> X為N、A、G、P或R
<220>
<221> 變體
<222> (11)..(11)
<223> X為C、A、D、F、R、S、T、V或Y
<220>
<221> 變體
<222> (13)..(13)
<223> X為D、S或W
<400> 140
Figure 108129005-A0202-12-0214-207
<210> 141
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 141
Figure 108129005-A0202-12-0214-208
<210> 142
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 142
Figure 108129005-A0202-12-0215-209
<210> 143
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 143
Figure 108129005-A0202-12-0215-210
<210> 144
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 144
Figure 108129005-A0202-12-0215-211
<210> 145
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 145
Figure 108129005-A0202-12-0216-212
<210> 146
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 146
Figure 108129005-A0202-12-0216-213
<210> 147
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 147
Figure 108129005-A0202-12-0216-214
<210> 148
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 148
Figure 108129005-A0202-12-0217-215
<210> 149
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 149
Figure 108129005-A0202-12-0217-216
<210> 150
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 150
Figure 108129005-A0202-12-0217-217
<210> 151
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 151
Figure 108129005-A0202-12-0218-218
<210> 152
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 152
Figure 108129005-A0202-12-0218-219
<210> 153
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 153
Figure 108129005-A0202-12-0218-220
<210> 154
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 154
Figure 108129005-A0202-12-0219-221
<210> 155
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 155
Figure 108129005-A0202-12-0219-222
<210> 156
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 156
Figure 108129005-A0202-12-0219-223
<210> 157
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 157
Figure 108129005-A0202-12-0220-224
<210> 158
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 158
Figure 108129005-A0202-12-0220-225
<210> 159
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 159
Figure 108129005-A0202-12-0220-226
<210> 160
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 160
Figure 108129005-A0202-12-0221-227
<210> 161
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 161
Figure 108129005-A0202-12-0221-228
<210> 162
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 162
Figure 108129005-A0202-12-0221-229
<210> 163
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 163
Figure 108129005-A0202-12-0222-230
<210> 164
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 164
Figure 108129005-A0202-12-0222-231
<210> 165
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 165
Figure 108129005-A0202-12-0222-232
<210> 166
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 166
Figure 108129005-A0202-12-0223-233
<210> 167
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 167
Figure 108129005-A0202-12-0223-234
<210> 168
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 168
Figure 108129005-A0202-12-0223-235
<210> 169
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 169
Figure 108129005-A0202-12-0224-236
<210> 170
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 170
Figure 108129005-A0202-12-0224-237
<210> 171
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 171
Figure 108129005-A0202-12-0224-238
<210> 172
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 172
Figure 108129005-A0202-12-0225-239
<210> 173
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 173
Figure 108129005-A0202-12-0225-240
<210> 174
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 174
Figure 108129005-A0202-12-0225-241
<210> 175
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 175
Figure 108129005-A0202-12-0226-242
<210> 176
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 176
Figure 108129005-A0202-12-0226-243
<210> 177
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 177
Figure 108129005-A0202-12-0226-244
<210> 178
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 178
Figure 108129005-A0202-12-0227-245
<210> 179
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 179
Figure 108129005-A0202-12-0227-246
<210> 180
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 180
Figure 108129005-A0202-12-0227-247
<210> 181
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 181
Figure 108129005-A0202-12-0228-248
<210> 182
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 182
Figure 108129005-A0202-12-0228-249
<210> 183
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 183
Figure 108129005-A0202-12-0228-250
<210> 184
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 184
Figure 108129005-A0202-12-0228-251
Figure 108129005-A0202-12-0229-252
<210> 185
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 185
Figure 108129005-A0202-12-0229-253
<210> 186
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 186
Figure 108129005-A0202-12-0229-254
<210> 187
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 187
Figure 108129005-A0202-12-0229-255
Figure 108129005-A0202-12-0230-256
<210> 188
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 188
Figure 108129005-A0202-12-0230-257
<210> 189
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 189
Figure 108129005-A0202-12-0230-258
<210> 190
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 190
Figure 108129005-A0202-12-0230-259
Figure 108129005-A0202-12-0231-260
<210> 191
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 191
Figure 108129005-A0202-12-0231-261
<210> 192
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 192
Figure 108129005-A0202-12-0231-262
<210> 193
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 193
Figure 108129005-A0202-12-0231-263
Figure 108129005-A0202-12-0232-264
<210> 194
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 194
Figure 108129005-A0202-12-0232-265
<210> 195
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 195
Figure 108129005-A0202-12-0232-267
<210> 196
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 196
Figure 108129005-A0202-12-0232-268
<210> 197
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 197
Figure 108129005-A0202-12-0233-269
<210> 198
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 198
Figure 108129005-A0202-12-0233-270
<210> 199
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 199
Figure 108129005-A0202-12-0233-271
<210> 200
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 200
Figure 108129005-A0202-12-0234-272
<210> 201
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 201
Figure 108129005-A0202-12-0234-273
<210> 202
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 變體
<222> (1)..(1)
<223> X為A、G、S或T
<220>
<221> 變體
<222> (2)..(2)
<223> X為H、I、L、M、N、Q或V
<220>
<221> 變體
<222> (4)..(4)
<223> X為R、A、D、E、I、M、N、Q或S
<220>
<221> 變體
<222> (5)..(5)
<223> 在5位之X為W或F
<220>
<221> 變體
<222> (9)..(9)
<223> X為F、L、M或W
<400> 202
Figure 108129005-A0202-12-0235-274
<210> 203
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 203
Figure 108129005-A0202-12-0235-275
<210> 204
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 204
Figure 108129005-A0202-12-0235-276
<210> 205
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 205
Figure 108129005-A0202-12-0236-277
<210> 206
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 206
Figure 108129005-A0202-12-0236-278
<210> 207
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 207
Figure 108129005-A0202-12-0236-279
<210> 208
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 208
Figure 108129005-A0202-12-0236-280
<210> 209
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 209
Figure 108129005-A0202-12-0237-281
<210> 210
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 210
Figure 108129005-A0202-12-0237-282
<210> 211
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 211
Figure 108129005-A0202-12-0237-283
<210> 212
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 212
Figure 108129005-A0202-12-0237-284
<210> 213
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 213
Figure 108129005-A0202-12-0238-285
<210> 214
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 214
Figure 108129005-A0202-12-0238-286
<210> 215
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 215
Figure 108129005-A0202-12-0238-287
<210> 216
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 216
Figure 108129005-A0202-12-0238-288
<210> 217
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 217
Figure 108129005-A0202-12-0239-289
<210> 218
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 218
Figure 108129005-A0202-12-0239-290
<210> 219
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 219
Figure 108129005-A0202-12-0239-291
<210> 220
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 220
Figure 108129005-A0202-12-0239-292
<210> 221
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 221
Figure 108129005-A0202-12-0240-293
<210> 222
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 222
Figure 108129005-A0202-12-0240-294
<210> 223
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 223
Figure 108129005-A0202-12-0240-295
<210> 224
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 224
Figure 108129005-A0202-12-0240-296
<210> 225
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 225
Figure 108129005-A0202-12-0241-297
<210> 226
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 變體
<222> (2)..(2)
<223> X為R、A、D、E、I、M、N、Q或S
<220>
<221> 變體
<222> (3)..(3)
<223> X為W或F
<220>
<221> 變體
<222> (7)..(7)
<223> X為F、L、M或W
<400> 226
Figure 108129005-A0202-12-0241-298
<210> 227
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 227
Figure 108129005-A0202-12-0242-299
<210> 228
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 228
Figure 108129005-A0202-12-0242-300
<210> 229
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 229
Figure 108129005-A0202-12-0242-515
<210> 230
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 230
Figure 108129005-A0202-12-0242-302
<210> 231
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 231
Figure 108129005-A0202-12-0243-303
<210> 232
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 232
Figure 108129005-A0202-12-0243-304
<210> 233
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 233
Figure 108129005-A0202-12-0243-305
<210> 234
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 234
Figure 108129005-A0202-12-0243-306
<210> 235
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 235
Figure 108129005-A0202-12-0244-307
<210> 236
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 236
Figure 108129005-A0202-12-0244-308
<210> 237
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 237
Figure 108129005-A0202-12-0244-309
<210> 238
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 238
Figure 108129005-A0202-12-0244-310
<210> 239
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 239
Figure 108129005-A0202-12-0245-311
<210> 240
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 240
Figure 108129005-A0202-12-0245-312
<210> 241
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 241
Figure 108129005-A0202-12-0245-313
<210> 242
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 242
Figure 108129005-A0202-12-0245-314
<210> 243
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 243
Figure 108129005-A0202-12-0246-315
<210> 244
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 244
Figure 108129005-A0202-12-0246-316
<210> 245
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 245
Figure 108129005-A0202-12-0246-317
<210> 246
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 246
Figure 108129005-A0202-12-0247-318
<210> 247
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 247
Figure 108129005-A0202-12-0247-320
<210> 248
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 248
Figure 108129005-A0202-12-0247-321
<210> 249
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 249
Figure 108129005-A0202-12-0247-322
<210> 250
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 250
Figure 108129005-A0202-12-0248-323
<210> 251
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 251
Figure 108129005-A0202-12-0248-324
<210> 252
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 252
Figure 108129005-A0202-12-0248-325
<210> 253
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 253
Figure 108129005-A0202-12-0249-326
<210> 254
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 254
Figure 108129005-A0202-12-0249-327
<210> 255
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 255
Figure 108129005-A0202-12-0249-328
<210> 256
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 256
Figure 108129005-A0202-12-0249-329
<210> 257
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 257
Figure 108129005-A0202-12-0250-330
<210> 258
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 258
Figure 108129005-A0202-12-0250-331
Figure 108129005-A0202-12-0251-333
<210> 259
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 259
Figure 108129005-A0202-12-0251-334
Figure 108129005-A0202-12-0252-335
<210> 260
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 260
Figure 108129005-A0202-12-0252-336
<210> 261
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 261
Figure 108129005-A0202-12-0252-337
Figure 108129005-A0202-12-0253-338
<210> 262
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 262
Figure 108129005-A0202-12-0253-339
Figure 108129005-A0202-12-0254-340
<210> 263
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 263
Figure 108129005-A0202-12-0254-341
<210> 264
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 264
Figure 108129005-A0202-12-0255-342
<210> 265
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 265
Figure 108129005-A0202-12-0255-343
Figure 108129005-A0202-12-0256-344
<210> 266
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 266
Figure 108129005-A0202-12-0256-345
<210> 267
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 267
Figure 108129005-A0202-12-0257-346
<210> 268
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 268
Figure 108129005-A0202-12-0257-347
Figure 108129005-A0202-12-0258-348
<210> 269
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 269
Figure 108129005-A0202-12-0258-349
<210> 270
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 270
Figure 108129005-A0202-12-0259-350
<210> 271
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 271
Figure 108129005-A0202-12-0259-351
Figure 108129005-A0202-12-0260-352
<210> 272
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 272
Figure 108129005-A0202-12-0260-353
Figure 108129005-A0202-12-0261-354
<210> 273
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 273
Figure 108129005-A0202-12-0261-355
<210> 274
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 274
Figure 108129005-A0202-12-0261-356
Figure 108129005-A0202-12-0262-357
<210> 275
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 275
Figure 108129005-A0202-12-0262-358
Figure 108129005-A0202-12-0263-359
<210> 276
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 276
Figure 108129005-A0202-12-0263-360
<210> 277
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 277
Figure 108129005-A0202-12-0264-361
<210> 278
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 278
Figure 108129005-A0202-12-0264-362
Figure 108129005-A0202-12-0265-363
<210> 279
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 279
Figure 108129005-A0202-12-0265-364
<210> 280
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 280
Figure 108129005-A0202-12-0266-365
<210> 281
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 281
Figure 108129005-A0202-12-0266-366
Figure 108129005-A0202-12-0267-368
<210> 282
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 282
Figure 108129005-A0202-12-0267-369
Figure 108129005-A0202-12-0268-370
<210> 283
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 283
Figure 108129005-A0202-12-0268-371
Figure 108129005-A0202-12-0269-372
<210> 284
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 284
Figure 108129005-A0202-12-0269-373
<210> 285
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 285
Figure 108129005-A0202-12-0270-374
<210> 286
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 286
Figure 108129005-A0202-12-0270-375
Figure 108129005-A0202-12-0271-376
<210> 287
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 287
Figure 108129005-A0202-12-0271-377
Figure 108129005-A0202-12-0272-378
<210> 288
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 288
Figure 108129005-A0202-12-0272-379
<210> 289
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 289
Figure 108129005-A0202-12-0273-380
<210> 290
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 290
Figure 108129005-A0202-12-0273-381
Figure 108129005-A0202-12-0274-382
<210> 291
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 291
Figure 108129005-A0202-12-0274-383
Figure 108129005-A0202-12-0275-384
<210> 292
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 292
Figure 108129005-A0202-12-0275-385
<210> 293
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 293
Figure 108129005-A0202-12-0276-386
<210> 294
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 294
Figure 108129005-A0202-12-0276-387
Figure 108129005-A0202-12-0277-388
<210> 295
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 295
Figure 108129005-A0202-12-0277-389
Figure 108129005-A0202-12-0278-390
<210> 296
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 296
Figure 108129005-A0202-12-0278-391
<210> 297
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 297
Figure 108129005-A0202-12-0279-392
<210> 298
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 298
Figure 108129005-A0202-12-0279-393
Figure 108129005-A0202-12-0280-395
<210> 299
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 299
Figure 108129005-A0202-12-0280-396
Figure 108129005-A0202-12-0281-397
<210> 300
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 300
Figure 108129005-A0202-12-0281-398
<210> 301
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 301
Figure 108129005-A0202-12-0282-399
<210> 302
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 302
Figure 108129005-A0202-12-0282-400
Figure 108129005-A0202-12-0283-401
<210> 303
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 303
Figure 108129005-A0202-12-0283-402
Figure 108129005-A0202-12-0284-403
<210> 304
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 304
Figure 108129005-A0202-12-0284-404
Figure 108129005-A0202-12-0285-405
<210> 305
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 305
Figure 108129005-A0202-12-0285-406
<210> 306
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 306
Figure 108129005-A0202-12-0286-407
<210> 307
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 307
Figure 108129005-A0202-12-0286-408
Figure 108129005-A0202-12-0287-409
<210> 308
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 308
Figure 108129005-A0202-12-0287-410
Figure 108129005-A0202-12-0288-411
<210> 309
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 309
Figure 108129005-A0202-12-0288-412
<210> 310
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 310
Figure 108129005-A0202-12-0289-413
<210> 311
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 311
Figure 108129005-A0202-12-0289-414
Figure 108129005-A0202-12-0290-416
<210> 312
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 312
Figure 108129005-A0202-12-0290-417
Figure 108129005-A0202-12-0291-419
<210> 313
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 313
Figure 108129005-A0202-12-0291-420
<210> 314
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 314
Figure 108129005-A0202-12-0292-421
<210> 315
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 315
Figure 108129005-A0202-12-0292-422
Figure 108129005-A0202-12-0293-424
<210> 316
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 316
Figure 108129005-A0202-12-0293-425
<210> 317
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 317
Figure 108129005-A0202-12-0294-426
<210> 318
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 318
Figure 108129005-A0202-12-0294-427
Figure 108129005-A0202-12-0295-429
<210> 319
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 319
Figure 108129005-A0202-12-0295-430
<210> 320
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 320
Figure 108129005-A0202-12-0296-431
<210> 321
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 321
Figure 108129005-A0202-12-0296-516
<210> 322
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 322
Figure 108129005-A0202-12-0296-433
<210> 323
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 323
Figure 108129005-A0202-12-0296-434
<210> 324
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 324
Figure 108129005-A0202-12-0297-435
<210> 325
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 325
Figure 108129005-A0202-12-0297-436
<210> 326
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 326
Figure 108129005-A0202-12-0297-517
<210> 327
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 327
Figure 108129005-A0202-12-0297-438
Figure 108129005-A0202-12-0298-439
Figure 108129005-A0202-12-0299-440
<210> 328
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 328
Figure 108129005-A0202-12-0299-441
Figure 108129005-A0202-12-0300-442
<210> 329
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 329
Figure 108129005-A0202-12-0300-443
Figure 108129005-A0202-12-0301-444
<210> 330
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 330
Figure 108129005-A0202-12-0301-445
Figure 108129005-A0202-12-0302-446
<210> 331
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 331
Figure 108129005-A0202-12-0303-447
<210> 332
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 332
Figure 108129005-A0202-12-0304-448
Figure 108129005-A0202-12-0305-449
Figure 108129005-A0202-12-0306-450
<210> 333
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 333
Figure 108129005-A0202-12-0306-451
Figure 108129005-A0202-12-0307-452
Figure 108129005-A0202-12-0308-453
<210> 334
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 334
Figure 108129005-A0202-12-0308-454
Figure 108129005-A0202-12-0309-455
Figure 108129005-A0202-12-0310-456
<210> 335
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 335
Figure 108129005-A0202-12-0310-457
Figure 108129005-A0202-12-0311-458
Figure 108129005-A0202-12-0312-459
<210> 336
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 336
Figure 108129005-A0202-12-0313-460
Figure 108129005-A0202-12-0314-461
Figure 108129005-A0202-12-0315-462
<210> 337
<211> 130
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 337
Figure 108129005-A0202-12-0315-463
<210> 338
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 338
Figure 108129005-A0202-12-0316-464
Figure 108129005-A0202-12-0317-465

Claims (79)

  1. 一種抗IL1RAP抗體，其包括：(i)一第一輕鏈高變區(HVR-L1)、一第二輕鏈高變區(HVR-L2)及一第三輕鏈高變區(HVR-L3)，及/或(ii)一第一重鏈高變區(HVR-H1)、一第二重鏈高變區(HVR-H2)及一第三重鏈高變區(HVR-H3)；其中：(a)HVR-L1包括一胺基酸序列RASENIXXNXX(SEQ ID NO：10)，其中在位置7處之X為Y或W，在位置8處之X為S、H、K、L、M、N、Q、R或Y，在位置10處之X為L、A、G、I、M、N、Q、S、T、V或Y，且在位置11處之X為A、G、N、S或T；(b)HVR-L2包括一胺基酸序列GXXNXAD(SEQ IDNO：36)，其中在位置2處之X為A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y，在位置3處之X為K、G或N，且在位置5處之X為L、F、H、W或Y；(c)HVR-L3包括一胺基酸序列XXFXTXPRT(SEQ ID NO：62)，其中在位置1處之X為Q或S，在位置2處之X為H或S，在位置4處之X為W、A、F、G、H、I、K、L、M、V或Y，且在位置6處之X為T、I或V；(d)HVR-H1包括一胺基酸序列XXXXXXXX(SEQ ID NO：77)，其中在位置1處之X為F、A、D、E、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、W或Y，在位置2處之X為S、E、G、K、P、Q、R或T，在位置3處之X為N、D、E、G、K、Q或R，在位置4處之X為Y、A、D、E、H、S或V，在位置5處之X為A、N或S，在位置6處之X為M、V或W，且在位置7處之X為S或G；(e)HVR-H2包括一胺基酸序列TXXXXXXXXYXLXDVKG(SEQ ID NO：140)，其中在位置2處之X為V、A、N或S，在位置3處之X為T或S，在位置4處之X為E、D、N、T或V，在位置5處之X為G、I、P、T或V，在位置6處之X為G、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或 Y，在位置7處之X為D、A、E、G、H、K、N、P、Q、R或S，在位置8處之X為Y或W，在位置9處之X為N、A、G、P或R，在位置11處之X為C、A、D、F、R、S、T、V或Y，且在位置13處之X為D、S或W；(f)HVR-H3包括一胺基酸序列XXDXXPYFXDY(SEQ ID NO：202)，其中在位置1處之X為A、G、S或T，在位置2處之X為H、I、L、M、N、Q或V，在位置4處之X為R、A、D、E、I、M、N、Q或S，在位置5處之X為W或F，且在位置9處之X為F、L、M或W。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之抗體，其中：(a)HVR-L1包括一選自SEQ ID NO：11-35之胺基酸序列；(b)HVR-L2包括一選自SEQ ID NO：37-61之胺基酸序列；(c)HVR-L3包括一選自SEQ ID NO：63-76之胺基酸序列；(d)HVR-H1包括一選自SEQ ID NO：78-120之胺基酸序列；(e)HVR-H2包括一選自SEQ ID NO：141-201之胺基酸序列；(f)HVR-H3包括一選自SEQ ID NO：203-225之胺基酸序列。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之抗體，其中：(a)HVR-L1包括SEQ ID NO：11之胺基酸序列；(b)HVR-L2包括SEQ ID NO：37之胺基酸序列；(c)HVR-L3包括SEQ ID NO：63之胺基酸序列；(d)HVR-H1包括SEQ ID NO：78之胺基酸序列；(e)HVR-H2包括選自SEQ ID NO：141、184、185、186、187、188、189、190及191之胺基酸序列；(f)HVR-H3包括SEQ ID NO：203之胺基酸序列。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之抗體，其中：(a)HVR-L1包括選自SEQ ID NO：11、13及23之胺基酸序列； (b)HVR-L2包括選自SEQ ID NO：37、38、45、49、54及61之胺基酸序列；(c)HVR-L3包括選自SEQ ID NO：63、67、69、70、71、75及76之胺基酸序列；(d)HVR-H1包括選自SEQ ID NO：78、81、90、92及118之胺基酸序列；(e)HVR-H2包括選自SEQ ID NO：141、144、149、153、172、181、191、194、195、196、197、198、199、200及201之胺基酸序列；(f)HVR-H3包括選自SEQ ID NO：203、214、215、220及222之胺基酸序列。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之抗體，其中所述抗體包括互補決定區CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，其中：(a)CDR-L1包括一胺基酸序列RASENIXXNXX(SEQ ID NO：10)，其中在位置7處之X為Y或W，在位置8處之X為S、H、K、L、M、N、Q、R或Y，在位置10處之X為L、A、G、I、M、N、Q、S、T、V或Y，且在位置11處之X為A、G、N、S或T；(b)CDR-L2包括一胺基酸序列GXXNXAD(SEQ ID NO：36)，其中在位置2處之X為A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y，在位置3處之X為K、G或N，且在位置5處之X為L、F、H、W或Y；(c)CDR-L3包括一胺基酸序列XXFXTXPRT(SEQ ID NO：62)，其中在位置1處之X為Q或S，在位置2處之X為H或S，在位置4處之X為W、A、F、G、H、I、K、L、M、V或Y，且在位置6處之X為T、I或V；(d)CDR-H1包括一胺基酸序列XXXXX(SEQ ID NO：121)，其中在位置1處之X為N、D、E、G、K、Q或R，在位置2處之X為Y、A、D、E、H、S或V，在位置3處之X為A、N或S，在位置4處之X為M、V或W，且在位 置5處之X為S或G；(e)CDR-H2包括一胺基酸序列TXXXXXXXXYXLXDVKG(SEQ ID NO：140)，其中在位置2處之X為V、A、N或S，在位置3處之X為T或S，在位置4處之X為E、D、N、T或V，在位置5處之X為G、I、P、T或V，在位置6處之X為G、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y，在位置7處之X為D、A、E、G、H、K、N、P、Q、R或S，在位置8處之X為Y或W，在位置9處之X為N、A、G、P或R，在位置11處之X為C、A、D、F、R、S、T、V或Y，且在位置13處之X為D、S或W；(f)CDR-H3包括一胺基酸序列DXXPYFXDY(SEQ ID NO：226)，其中在位置2處之X為R、A、D、E、I、M、N、Q或S，在位置3處之X為W或F，且在位置7處之X為F、L、M或W。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之抗體，其中：(a)CDR-L1包括一選自SEQ ID NO：11-35之胺基酸序列；(b)CDR-L2包括一選自SEQ ID NO：37-61之胺基酸序列；(c)CDR-L3包括一選自SEQ ID NO：63-76之胺基酸序列；(d)CDR-H1包括一選自SEQ ID NO：122-139之胺基酸序列；(e)CDR-H2包括一選自SEQ ID NO：141-201之胺基酸序列；(f)CDR-H3包括一選自SEQ ID NO：227-239之胺基酸序列。
  7. 如申請專利範圍第5項所述之抗體，其中：(a)CDR-L1包括SEQ ID NO：11之胺基酸序列；(b)CDR-L2包括SEQ ID NO：37之胺基酸序列；(c)CDR-L3包括SEQ ID NO：63之胺基酸序列；(d)CDR-H1包括SEQ ID NO：122之胺基酸序列；(e)CDR-H2包括選自SEQ ID NO：141、184、185、186、187、188、189、 190及191之胺基酸序列；(f)CDR-H3包括SEQ ID NO：227之胺基酸序列。
  8. 如申請專利範圍第1項所述之抗體，其中所述抗體包括：一第一輕鏈構架區(FR-L1)，其包括一SEQ ID NO：240之胺基酸序列；一第二輕鏈構架區(FR-L2)，其包括一SEQ ID NO：241之胺基酸序列；一第三輕鏈構架區(FR-L3)，其包括一SEQ ID NO：242之胺基酸序列；一第四輕鏈構架區(FR-L4)，其包括一SEQ ID NO：243之胺基酸序列；一第一重鏈構架區(FR-H1)，其包括一SEQ ID NO：249之胺基酸序列；一第二重鏈構架區(FR-H2)，其包括一SEQ ID NO：250之胺基酸序列；一第三重鏈構架區(FR-H3)，其包括一SEQ ID NO：251之胺基酸序列；一第四重鏈構架區(FR-H4)，其包括一SEQ ID NO：252之胺基酸序列。
  9. 如申請專利範圍第1項所述之抗體，其中所述抗體包括：一第一輕鏈構架區(FR-L1)，其包括一SEQ ID NO：244之胺基酸序列；一第二輕鏈構架區(FR-L2)，其包括一SEQ ID NO：245或246之胺基酸序列；一第三輕鏈構架區(FR-L3)，其包括一SEQ ID NO：247之胺基酸序列；一第四輕鏈構架區(FR-L4)，其包括一SEQ ID NO：248之胺基酸序列；一第一重鏈構架區(FR-H1)，其包括一SEQ ID NO：253之胺基酸序列；一第二重鏈構架區(FR-H2)，其包括一SEQ ID NO：254之胺基酸序列；一第三重鏈構架區(FR-H3)，其包括一SEQ ID NO：255之胺基酸序列；一第四重鏈構架區(FR-H4)，其包括一SEQ ID NO：256之胺基酸。
  10. 如申請專利範圍第1項至第9項中任一項所述之抗體，其中所述抗體包括與一選自SEQ ID NO：257、258或259之序列具有至少90%一致性的一輕鏈可變結構域(VL)胺基酸序列；及/或與一選自SEQ ID NO：279、285或290 之序列具有至少90%一致性的一重鏈可變結構域(VH)胺基酸序列。
  11. 如申請專利範圍第1項至第9項中任一項所述之抗體，其中所述抗體包括與SEQ ID NO：257具有至少90%一致性的一輕鏈可變結構域(VL)胺基酸序列，及/或與SEQ ID NO：279具有至少90%一致性的一重鏈可變結構域(VH)胺基酸序列。
  12. 如申請專利範圍第1項至第9項中任一項所述之抗體，其中所述抗體包括與SEQ ID NO：258或259具有至少90%一致性的一輕鏈可變結構域(VL)胺基酸序列，及/或與SEQ ID NO：285或290具有至少90%一致性的一重鏈可變結構域(VH)胺基酸序列。
  13. 如申請專利範圍第10項所述之抗體，其中所述抗體包括一選自SEQ ID NO：257-278之輕鏈可變結構域(VL)胺基酸序列。
  14. 如申請專利範圍第10項所述之抗體，其中所述抗體包括一選自SEQ ID NO：279-310之重鏈可變結構域(VH)胺基酸序列。
  15. 如申請專利範圍第10項所述之抗體，其中所述抗體包括：SEQ ID NO：259之輕鏈可變結構域(VL)胺基酸序列及SEQ ID NO：290之重鏈可變結構域(VH)胺基酸序列；SEQ ID NO：268之輕鏈可變結構域(VL)胺基酸序列及SEQ ID NO：307之重鏈可變結構域(VH)胺基酸序列；SEQ ID NO：268之輕鏈可變結構域(VL)胺基酸序列及SEQ ID NO：298之重鏈可變結構域(VH)胺基酸序列；SEQ ID NO：269之輕鏈可變結構域(VL)胺基酸序列及SEQ ID NO：307之重鏈可變結構域(VH)胺基酸序列；SEQ ID NO：269之輕鏈可變結構域(VL)胺基酸序列及SEQ ID NO：298之重鏈可變結構域(VH)胺基酸序列； SEQ ID NO：269之輕鏈可變結構域(VL)胺基酸序列及SEQ ID NO：297之重鏈可變結構域(VH)胺基酸序列；SEQ ID NO：270之輕鏈可變結構域(VL)胺基酸序列及SEQ ID NO：307之重鏈可變結構域(VH)胺基酸序列；或SEQ ID NO：270之輕鏈可變結構域(VL)胺基酸序列及SEQ ID NO：298之重鏈可變結構域(VH)胺基酸序列。
  16. 如申請專利範圍第1項至第13項中任一項所述之抗體，其中所述抗體包括與一選自SEQ ID NO：328、329、330或331之序列具有至少90%一致性的一輕鏈(LC)胺基酸序列；及/或與一選自SEQ ID NO：332、333、334、335或336之序列具有至少90%一致性的一重鏈(HC)胺基酸序列。
  17. 如申請專利範圍第14項所述之抗體，其中所述抗體包括一選自SEQ ID NO：328-331之輕鏈(LC)胺基酸序列。
  18. 如申請專利範圍第14項所述之抗體，其中所述抗體包括一選自SEQ ID NO：332-336之重鏈(HC)胺基酸序列。
  19. 如申請專利範圍第14項所述之抗體，其中所述抗體包括：SEQ ID NO：328之輕鏈(LC)胺基酸序列及SEQ ID NO：332之重鏈(HC)胺基酸序列；SEQ ID NO：329之輕鏈(LC)胺基酸序列及SEQ ID NO：335之重鏈(HC)胺基酸序列；SEQ ID NO：329之輕鏈(LC)胺基酸序列及SEQ ID NO：336之重鏈(HC)胺基酸序列；SEQ ID NO：329之輕鏈(LC)胺基酸序列及SEQ ID NO：333之重鏈(HC)胺基酸序列；SEQ ID NO：329之輕鏈(LC)胺基酸序列及SEQ ID NO：334之重鏈(HC) 胺基酸序列；SEQ ID NO：330之輕鏈(LC)胺基酸序列及SEQ ID NO：335之重鏈(HC)胺基酸序列；SEQ ID NO：330之輕鏈(LC)胺基酸序列及SEQ ID NO：336之重鏈(HC)胺基酸序列；SEQ ID NO：330之輕鏈(LC)胺基酸序列及SEQ ID NO：333之重鏈(HC)胺基酸序列；SEQ ID NO：330之輕鏈(LC)胺基酸序列及SEQ ID NO：334之重鏈(HC)胺基酸序列；SEQ ID NO：331之輕鏈(LC)胺基酸序列及SEQ ID NO：335之重鏈(HC)胺基酸序列；SEQ ID NO：331之輕鏈(LC)胺基酸序列及SEQ ID NO：336之重鏈(HC)胺基酸序列；SEQ ID NO：331之輕鏈(LC)胺基酸序列及SEQ ID NO：333之重鏈(HC)胺基酸序列；或SEQ ID NO：331之輕鏈(LC)胺基酸序列及SEQ ID NO：334之重鏈(HC)胺基酸序列。
  20. 一種抗IL1RAP抗體，其包括：一SEQ ID NO：11之第一輕鏈高變區(HVR-L1)、一SEQ ID NO：37之第二輕鏈高變區(HVR-L2)、一SEQ ID NO：63之第三輕鏈高變區(HVR-L3)；及/或一SEQ ID NO：78之第一重鏈高變區(HVR-H1)、一SEQ ID NO：191之第二重鏈高變區(HVR-H2)及一SEQ ID NO：203之第三重鏈高變區(HVR-H3)；一SEQ ID NO：11之第一輕鏈高變區(HVR-L1)、一SEQ ID NO：54之第二輕鏈高變區(HVR-L2)、一SEQ ID NO：63之第三輕鏈高變區(HVR-L3)； 及/或一SEQ ID NO：78之第一重鏈高變區(HVR-H1)、一SEQ ID NO：191之第二重鏈高變區(HVR-H2)及一SEQ ID NO：215之第三重鏈高變區(HVR-H3)；一SEQ ID NO：11之第一輕鏈高變區(HVR-L1)、一SEQ ID NO：54之第二輕鏈高變區(HVR-L2)、一SEQ ID NO：63之第三輕鏈高變區(HVR-L3)；及/或一SEQ ID NO：78之第一重鏈高變區(HVR-H1)、一SEQ ID NO：195之第二重鏈高變區(HVR-H2)及一SEQ ID NO：203之第三重鏈高變區(HVR-H3)；一SEQ ID NO：11之第一輕鏈高變區(HVR-L1)、一SEQ ID NO：54之第二輕鏈高變區(HVR-L2)、一SEQ ID NO：63之第三輕鏈高變區(HVR-L3)；及/或一SEQ ID NO：78之第一重鏈高變區(HVR-H1)、一SEQ ID NO：191之第二重鏈高變區(HVR-H2)及一SEQ ID NO：215之第三重鏈高變區(HVR-H3)；一SEQ ID NO：11之第一輕鏈高變區(HVR-L1)、一SEQ ID NO：54之第二輕鏈高變區(HVR-L2)、一SEQ ID NO：69之第三輕鏈高變區(HVR-L3)；及/或一SEQ ID NO：78之第一重鏈高變區(HVR-H1)、一SEQ ID NO：195之第二重鏈高變區(HVR-H2)及一SEQ ID NO：203之第三重鏈高變區(HVR-H3)；一SEQ ID NO：11之第一輕鏈高變區(HVR-L1)、一SEQ ID NO：54之第二輕鏈高變區(HVR-L2)、一SEQ ID NO：70之第三輕鏈高變區(HVR-L3)；及/或一SEQ ID NO：78之第一重鏈高變區(HVR-H1)、一SEQ ID NO：191之第二重鏈高變區(HVR-H2)及一SEQ ID NO：215之第三重鏈高變區(HVR-H3)；或一SEQ ID NO：11之第一輕鏈高變區(HVR-L1)、一SEQ ID NO：54之第二輕鏈高變區(HVR-L2)、一SEQ ID NO：70之第三輕鏈高變區(HVR-L3)；及/或一SEQ ID NO：78之第一重鏈高變區(HVR-H1)、一SEQ ID NO：195之第二重鏈高變區(HVR-H2)及一SEQ ID NO：203之第三重鏈高變區(HVR-H3)。
  21. 一種抗IL1RAP抗體，其包括： 一SEQ ID NO：11之第一輕鏈互補決定區(CDR-L1)、一SEQ ID NO：37之第二輕鏈互補決定區(CDR-L2)、一SEQ ID NO：63之第三輕鏈互補決定區(CDR-L3)；及/或一SEQ ID NO：122之第一重鏈互補決定區(CDR-H1)、一SEQ ID NO：191之第二重鏈互補決定區(CDR-H2)及一SEQ ID NO：227之第三重鏈互補決定區(CDR-H3)；一SEQ ID NO：11之第一輕鏈互補決定區(CDR-L1)、一SEQ ID NO：54之第二輕鏈互補決定區(CDR-L2)、一SEQ ID NO：63之第三輕鏈互補決定區(CDR-L3)；及/或一SEQ ID NO：122之第一重鏈互補決定區(CDR-H1)、一SEQ ID NO：191之第二重鏈互補決定區(CDR-H2)及一SEQ ID NO：229之第三重鏈互補決定區(CDR-H3)；一SEQ ID NO：11之第一輕鏈互補決定區(CDR-L1)、一SEQ ID NO：54之第二輕鏈互補決定區(CDR-L2)、一SEQ ID NO：63之第三輕鏈互補決定區(CDR-L3)；及/或一SEQ ID NO：122之第一重鏈互補決定區(CDR-H1)、一SEQ ID NO：195之第二重鏈互補決定區(CDR-H2)及一SEQ ID NO：227之第三重鏈互補決定區(CDR-H3)；一SEQ ID NO：11之第一輕鏈互補決定區(CDR-L1)、一SEQ ID NO：54之第二輕鏈互補決定區(CDR-L2)、一SEQ ID NO：63之第三輕鏈互補決定區(CDR-L3)；及/或一SEQ ID NO：122之第一重鏈互補決定區(CDR-H1)、一SEQ ID NO：191之第二重鏈互補決定區(CDR-H2)及一SEQ ID NO：229之第三重鏈互補決定區(CDR-H3)；一SEQ ID NO：11之第一輕鏈互補決定區(CDR-L1)、一SEQ ID NO：54之第二輕鏈互補決定區(CDR-L2)、一SEQ ID NO：69之第三輕鏈互補決定區(CDR-L3)；及/或一SEQ ID NO：122之第一重鏈互補決定區(CDR-H1)、一SEQ ID NO：195之第二重鏈互補決定區(CDR-H2)及一SEQ ID NO：227之第 三重鏈互補決定區(CDR-H3)；一SEQ ID NO：11之第一輕鏈互補決定區(CDR-L1)、一SEQ ID NO：54之第二輕鏈互補決定區(CDR-L2)、一SEQ ID NO：70之第三輕鏈互補決定區(CDR-L3)；及/或一SEQ ID NO：122之第一重鏈互補決定區(CDR-H1)、一SEQ ID NO：191之第二重鏈互補決定區(CDR-H2)及一SEQ ID NO：229之第三重鏈互補決定區(CDR-H3)；或一SEQ ID NO：11之第一輕鏈互補決定區(CDR-L1)、一SEQ ID NO：54之第二輕鏈互補決定區(CDR-L2)、一SEQ ID NO：70之第三輕鏈互補決定區(CDR-L3)；及/或一SEQ ID NO：122之第一重鏈互補決定區(CDR-H1)、一SEQ ID NO：195之第二重鏈互補決定區(CDR-H2)及一SEQ ID NO：227之第三重鏈互補決定區(CDR-H3)。
  22. 一種抗IL1RAP抗體，其包括：SEQ ID NO：259之輕鏈可變結構域(VL)胺基酸序列及SEQ ID NO：290之重鏈可變結構域(VH)胺基酸序列；SEQ ID NO：268之輕鏈可變結構域(VL)胺基酸序列及SEQ ID NO：307之重鏈可變結構域(VH)胺基酸序列；SEQ ID NO：268之輕鏈可變結構域(VL)胺基酸序列及SEQ ID NO：298之重鏈可變結構域(VH)胺基酸序列；SEQ ID NO：269之輕鏈可變結構域(VL)胺基酸序列及SEQ ID NO：307之重鏈可變結構域(VH)胺基酸序列；SEQ ID NO：269之輕鏈可變結構域(VL)胺基酸序列及SEQ ID NO：298之重鏈可變結構域(VH)胺基酸序列；SEQ ID NO：269之輕鏈可變結構域(VL)胺基酸序列及SEQ ID NO：297之重鏈可變結構域(VH)胺基酸序列； SEQ ID NO：270之輕鏈可變結構域(VL)胺基酸序列及SEQ ID NO：307之重鏈可變結構域(VH)胺基酸序列；或SEQ ID NO：270之輕鏈可變結構域(VL)胺基酸序列及SEQ ID NO：298之重鏈可變結構域(VH)胺基酸序列。
  23. 一種抗IL1RAP抗體，其包括：SEQ ID NO：328之輕鏈(LC)胺基酸序列及SEQ ID NO：332之重鏈(HC)胺基酸序列；SEQ ID NO：329之輕鏈(LC)胺基酸序列及SEQ ID NO：335之重鏈(HC)胺基酸序列；SEQ ID NO：329之輕鏈(LC)胺基酸序列及SEQ ID NO：336之重鏈(HC)胺基酸序列；SEQ ID NO：329之輕鏈(LC)胺基酸序列及SEQ ID NO：333之重鏈(HC)胺基酸序列；SEQ ID NO：329之輕鏈(LC)胺基酸序列及SEQ ID NO：334之重鏈(HC)胺基酸序列；SEQ ID NO：330之輕鏈(LC)胺基酸序列及SEQ ID NO：335之重鏈(HC)胺基酸序列；SEQ ID NO：330之輕鏈(LC)胺基酸序列及SEQ ID NO：336之重鏈(HC)胺基酸序列；SEQ ID NO：330之輕鏈(LC)胺基酸序列及SEQ ID NO：333之重鏈(HC)胺基酸序列；SEQ ID NO：330之輕鏈(LC)胺基酸序列及SEQ ID NO：334之重鏈(HC)胺基酸序列；SEQ ID NO：331之輕鏈(LC)胺基酸序列及SEQ ID NO：335之重鏈(HC) 胺基酸序列；SEQ ID NO：331之輕鏈(LC)胺基酸序列及SEQ ID NO：336之重鏈(HC)胺基酸序列；SEQ ID NO：331之輕鏈(LC)胺基酸序列及SEQ ID NO：333之重鏈(HC)胺基酸序列；或SEQ ID NO：331之輕鏈(LC)胺基酸序列及SEQ ID NO：334之重鏈(HC)胺基酸序列。
  24. 如申請專利範圍第1項至第23項中任一項所述之抗體，其中所述抗體以1×10-8M或更小、1×10-9M或更小、1×10-10M或更小或1×10-11M或更小之結合親和力與人類IL1RAP結合；視情況，其中所述結合親和力藉由與SEQ ID NO：3之hu-M-IL1RAP多肽的平衡解離常數(KD)來量測。
  25. 如申請專利範圍第1項至第23項中任一項所述之抗體，其中所述抗體使一IL-1刺激的信號、一IL-33刺激的信號及/或一IL-36刺激的信號減少至少90%、至少95%、至少99%或100%；視情況，其中信號之所述減少係藉由一基於細胞之阻斷分析來量測。
  26. 如申請專利範圍第25項所述之抗體，其中所述抗體使一IL-1刺激的信號、一IL-33刺激的信號及一IL-36刺激的信號減少至少95%或至少99%。
  27. 如申請專利範圍第25項所述之抗體，其中所述IL-1刺激的信號、所述IL-33刺激的信號及/或所述IL-36刺激的信號係藉由一選自IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β及IL-36γ之促效劑刺激的。
  28. 如申請專利範圍第25項所述之抗體，其中在約EC50之一促效劑濃度下，所述抗體具有10nM或更小、5nM或更小或1nM或更小的一IC50。
  29. 如申請專利範圍第1項至第23項中任一項所述之抗體，其中所述抗體使由與其同源受體結合之IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β及IL-36γ促效劑中之一 或多者引發的一細胞內信號減少至少90%、至少95%、至少99%或100%；視情況，其中細胞內信號之所述減少係藉由一基於細胞之阻斷分析量測。
  30. 如申請專利範圍第29項所述之抗體，其中所述抗體使由IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β及IL-36γ促效劑結合引發之所述細胞內信號減少至少95%或至少99%。
  31. 如申請專利範圍第29項所述之抗體，其中在約EC50之一IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β及/或IL-36γ濃度下，所述抗體具有10nM或更小、5nM或更小、或1nM或更小的一IC50。
  32. 如申請專利範圍第31項所述之抗體，其中在約EC50之一IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β及/或IL-36γ濃度下，所述抗體具有5nM或更小的一IC50。
  33. 如申請專利範圍第1項至第23項中任一項所述之抗體，其中所述抗體抑制IL8從初代人類肺纖維母細胞(PHLF)之由IL-1α、IL-1β及/或IL-36β刺激之釋放；視情況，其中在約EC50之一IL-1α、IL-1β及/或IL-36β濃度下，所述抗體具有10nM或更小、5nM或更小、或1nM或更小的一IC50。
  34. 如申請專利範圍第1項至第23項中任一項所述之抗體，其中所述抗體抑制IL6從初代人類單核球之由IL-1β刺激之釋放；視情況，其中在約EC50之一IL-1β濃度下，所述抗體具有10nM或更小、5nM或更小、或1nM或更小的一IC50。
  35. 如申請專利範圍第1項至第23項中任一項所述之抗體，其中所述抗體抑制INF-γ從人類自然殺手(NK)細胞之由IL-33刺激之釋放；視情況，其中在約EC50之一IL-33濃度下，所述抗體具有10nM或更小、5nM或更小、或1nM或更小的一IC50。
  36. 如申請專利範圍第1項至第23項中任一項所述之抗體，其中所述抗體抑制IL8從人類表皮角質細胞(HEKn)之由IL-36β刺激之釋放；視情況，其中在約EC60之一IL-36β濃度下，所述抗體具有10nM或更小、5nM或更小、或2nM或更 小的一IC50。
  37. 如申請專利範圍第1項至第23項中任一項所述之抗體，其中所述抗體抑制嗜鹼性球中之由IL-33刺激之磷酸化；視情況，其中在約EC56之一IL-33濃度下，所述抗體具有75nM或更小、50nM或更小、或45nM或更小的一IC50。
  38. 如申請專利範圍第1項至第23項中任一項所述之抗體，其中所述抗體抑制INF-γ從CD4+ T細胞之由IL-33刺激之釋放；視情況，其中在約EC34之一IL-33濃度下，所述抗體具有75nM或更小、50nM或更小、或45nM或更小的一IC50。
  39. 如申請專利範圍第1項至第38項中任一項所述之抗體，其中所述抗體與人類IL1RAP之結構域3內之一或多個胺基酸殘基特異性結合，其中結構域3包括SEQ ID NO：1或3之胺基酸序列之位置238-367。
  40. 如申請專利範圍第1項至第39項中任一項所述之抗體，其中所述抗體與SEQ ID NO：1或3之胺基酸序列之位置243-255、位置257-268及/或位置333-336特異性結合。
  41. 如申請專利範圍第1項至第40項中任一項所述之抗體，其中所述抗體不與人類IL1RAP之結構域1或結構域2內之胺基酸殘基結合；視情況，其中結構域1及結構域2包括SEQ ID NO：1或3之胺基酸序列之位置21-237。
  42. 如申請專利範圍第1項至第41項中任一項所述之抗體，其中所述抗體與一SEQ ID NO：8之食蟹獼猴IL1RAP多肽交叉反應。
  43. 如申請專利範圍第1項至第42項中任一項所述之抗體，其中所述抗體與一SEQ ID NO：9之小鼠IL1RAP多肽交叉反應。
  44. 如申請專利範圍第1項至第43項中任一項所述之抗體，其中所述抗體為一單株抗體。
  45. 如申請專利範圍第1項至第43項中任一項所述之抗體，其中所述抗體為一重組抗體。
  46. 如申請專利範圍第1項至第43項中任一項所述之抗體，其中所述抗體為一嵌合抗體。
  47. 如申請專利範圍第1項至第43項中任一項所述之抗體，其中所述抗體為一人類化抗體或人類抗體。
  48. 如申請專利範圍第1項至第47項中任一項所述之抗體，其中所述抗體為一抗體片段，視情況選自由F(ab')2、Fab'、Fab、Fv、單結構域抗體(VHH)、單臂抗體及scFv組成之群組。
  49. 如申請專利範圍第1項至第47項中任一項所述之抗體，其中所述抗體為一IgG類全長抗體；視情況，其中所述IgG類抗體具有一選自IgG1、IgG2、IgG3及IgG4之同型。
  50. 如申請專利範圍第49項所述之抗體，其中所述抗體為一Fc區變體；視情況其中所述Fc區變體改變效應功能或改變半衰期；視情況，其中所述半衰期增加至至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天或更多天。
  51. 如申請專利範圍第50項所述之抗體，其中所述Fc區變體包括一組YTE突變；視情況其中所述YTE突變包括胺基酸取代：M252Y、S254T及T256E。
  52. 如申請專利範圍第50項所述之抗體，其中所述Fc區變體降低效應功能，降低CDC活性，降低ADCC活性，降低ADCP活性，降低對人類單核球、嗜中性白血球或Jurkat細胞之細胞毒性活性，及/或產生一無效應抗體。
  53. 如申請專利範圍第52項所述之抗體，其中所述Fc區變體包括在位置297處之一胺基酸取代；視情況其中在位置297處之所述胺基酸取代為N297G。
  54. 如申請專利範圍第1項至第43項中任一項所述之抗體，其中所述抗體為一免疫結合物；視情況，其中所述免疫結合物包括用於治療由IL1RAP介導之病狀或疾病之一治療劑；視情況，其中所述治療劑為用於治療癌症之一化學治療劑或細胞毒性劑。
  55. 如申請專利範圍第1項至第43項中任一項所述之抗體，其中所述抗體為一多特異性抗體，視情況為一雙特異性抗體。
  56. 如申請專利範圍第1項至第55項中任一項所述之抗體，其中所述抗體為一合成抗體，其包括接枝至除一免疫球蛋白支架或免疫球蛋白構架外之一支架，視情況選自一替代性蛋白質支架及一人工聚合物支架之一支架上的CDR。
  57. 一種抗IL1RAP抗體，其與如申請專利範圍第1項至第56項中任一項所述之抗體特異性結合相同抗原決定基。
  58. 一種抗IL1RAP，其中所述抗體與IL1RAP之結構域3內之一或多個胺基酸殘基特異性結合，其中結構域3包括SEQ ID NO：1或3之胺基酸序列之位置238-367。
  59. 如申請專利範圍第58項所述之抗體，其中所述抗體與SEQ ID NO：1或3之胺基酸序列之位置243-255、位置257-268及/或位置333-336特異性結合。
  60. 一種經分離多核苷酸，其編碼如申請專利範圍第1項至第59項中任一項所述之抗體。
  61. 如申請專利範圍第60項所述之多核苷酸，其進一步包括編碼一信號肽(SP)之一核苷酸序列。
  62. 如申請專利範圍第60項所述之多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼一輕鏈及一重鏈。
  63. 如申請專利範圍第60項所述之多核苷酸，其中所述多核苷酸包括一多核苷酸序列，所述多核苷酸序列包括一或多個針對所述抗體在一哺乳動物細胞中之最佳表現選擇的密碼子。
  64. 如申請專利範圍第60項所述之多核苷酸，其中所述多核苷酸序列包括一或多個針對所述抗體在一中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中之最佳表現選擇的密碼子。
  65. 一種載體，其包括一如申請專利範圍第60項至第64項中任一項所述之多核苷酸。
  66. 一種經分離宿主細胞，其包括如申請專利範圍第65項所述之載體。
  67. 一種宿主細胞，其包括一如申請專利範圍第60項至第64項中任一項所述之多核苷酸。
  68. 一種經分離宿主細胞，其表現如申請專利範圍第1項至第59項中任一項所述之抗體。
  69. 如申請專利範圍第68項所述之宿主細胞，其中所述宿主細胞係選自一中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、一骨髓瘤細胞(例如，Y0、NS0、Sp2/0)、一猴腎細胞(COS-7)、一人類胚腎細胞株(293)、一幼倉鼠腎細胞(BHK)、一小鼠塞特利氏細胞(mouse Sertoli cell)(例如，TM4)、一非洲綠猴腎細胞(VERO-76)、一人類子宮頸癌細胞(HELA)、一犬腎細胞、一人類肺細胞(W138)、一人類肝細胞(Hep G2)、一小鼠***腫瘤細胞、一TRI細胞、一MRC 5細胞及一FS4細胞。
  70. 一種製造一抗體之方法，所述方法包括培養如申請專利範圍第66項至第69項中任一項所述之宿主細胞以使得一抗體產生。
  71. 一種融合瘤，其產生一如申請專利範圍第1項至第59項中任一項所述之抗體。
  72. 一種醫藥組合物，其包括一如申請專利範圍第1項至第59項中任一項所述之抗體及一醫藥學上可接受之載劑。
  73. 如申請專利範圍第72項所述之醫藥組合物，其中所述組合物進一步包括用於治療一由IL-1、IL-33、IL-36及/或IL1RAP介導之疾病或病狀之一治療劑；視情況，其中所述治療劑為一化學治療劑。
  74. 一種治療一個體中之一由IL1RAP介導之疾病的方法，所述方法包括向所述個體投與一治療有效量之一如申請專利範圍第1項至第59項中任一項所述之抗體或一治療有效量之一如申請專利範圍第72項所述之醫藥組合物。
  75. 一種治療一個體中之一由IL-1、IL-33及/或IL-36信號傳導介導之疾病的方法，所述方法包括向所述個體投與一治療有效量之一如申請專利範圍第1項至第59 項中任一項所述之抗體或一治療有效量之一如申請專利範圍第72項所述之醫藥組合物。
  76. 一種治療一個體中之由IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β及/或IL-36γ刺激之信號傳導介導之一疾病的方法，所述方法包括向所述個體投與一治療有效量之一如申請專利範圍第1項至第59項中任一項所述之抗體或一治療有效量之一如申請專利範圍第72項所述之醫藥組合物。
  77. 如申請專利範圍第74項至第77項中任一項所述之方法，其中所述疾病係選自：痤瘡、急性胰臟炎、急性重度潰瘍性結腸炎、成年發病型斯蒂爾氏病(adult-onset Still's disease)、年齡相關性黃斑變性(AMD)、氣管過度反應、氣管發炎、過敏性結膜炎、過敏性鼻炎、過敏、阿茲海默氏病(Alzheimer's disease)、肌肉萎縮性側索硬化(ALS)、全身性過敏反應、關節炎疼痛、哮喘、動脈粥樣硬化、異位性皮炎、異位性濕疹、自體免疫血管炎、***(Behcet's disease)、骨癌、腦癌、乳癌、惡病質/厭食症、軟骨損壞、大腦缺血、慢性疲勞症候群、慢性阻塞性肺病、梭菌相關疾病(Clostridium associated illnesses)、結腸癌、充血性心臟衰竭、結膜炎、冠狀動脈繞道移植、冠狀動脈再狹窄、克羅恩氏病(Crohn's disease)、糖尿病、糖尿病性黃斑部水腫、糖尿病性視網膜病變、乾眼病、子宮內膜異位、嗜伊紅血球相關胃腸病症、嗜伊紅血球食道炎、家族性冷因性自體發炎症候群、家族性地中海熱、發熱、肌肉纖維疼痛、纖維化病症、食物過敏、全身性膿皰型牛皮癬、青光眼、絲球體腎炎、痛風性關節炎、移植物抗宿主疾病、蠕蟲感染、出血性休克、化膿性汗腺炎、痛覺過敏、高IgD症候群、高尿酸血症、特發性肺纖維化(IPF)、癌症相關疼痛、感染、發炎性腸病(IBD)、由菌株引起的發炎性病狀、與角膜移植相關之發炎性眼病、發炎性疼痛、流感、腸癌、缺血、幼年型關節炎、川崎氏病(Kawasaki's disease)、腎癌、萊伯氏先天性黑矇症(Leber's congenital amaurosis)、肝癌、肝病、肺癌、穆-韋二氏症 候群(Muckle-Wells syndrome)、多發性骨髓瘤、多發性硬化症、肌肉骨骼痛、骨髓性白血病及其他白血病、心肌功能障礙、肌病、鼻息肉、新生兒發作型多系統發炎疾病、神經毒性、非傳染性結膜炎、非小細胞肺癌、矯形外科、骨關節炎、骨質疏鬆症、疼痛、掌蹠膿皰病、胰臟癌、帕金森氏病(Parkinson's disease)、牙周病、周邊血管疾病、風濕性多肌痛、息肉狀脈絡膜血管病變(PCV)、早產、***癌、原蟲傳染、牛皮癬、牛皮癬性關節炎、壞疽性膿皮病、再灌注損傷、呼吸道融合性病毒(RSV)、再狹窄、視網膜脫落、色素性視網膜炎、早產兒視網膜病(ROP)、類風濕性關節炎、敗血性休克、鐮狀細胞貧血、來自放射治療之副作用、竇炎、皮膚癌、睡眠障礙、扭傷、斯特格氏病(Stargardt's disease)、胃癌、顳頜關節疾病、TNF受體相關的週期性症候群、移植排斥反應、創傷、創傷性眼損傷、第2型糖尿病、潰瘍性結腸炎及葡萄膜炎。
  78. 一種治療一個體中之哮喘之方法，所述方法包括向所述個體投與一治療有效量之一如申請專利範圍第1項至第59項中任一項所述之抗體或一治療有效量之一如申請專利範圍第73項所述之醫藥組合物。
  79. 一種治療一個體中之癌症之方法，所述方法包括向所述個體投與一治療有效量之一如申請專利範圍第1項至第59項中任一項所述之抗體或一治療有效量之一如申請專利範圍第73項所述之醫藥組合物；視情況，其中所述癌症係選自乳癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、胰臟癌。
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021112196A1 (ja) * 2019-12-05 2021-06-10 学校法人東京薬科大学 筋組織の減少を抑制するための組成物
KR20230086690A (ko) 2020-09-14 2023-06-15 아이크노스 사이언스 에스. 아. Il1rap에 결합하는 항체 및 이의 용도
AU2021405730A1 (en) * 2020-12-23 2023-07-06 Cantargia Ab Anti-il1rap antibody
EP4288457A2 (en) * 2021-02-05 2023-12-13 Boehringer Ingelheim International GmbH Anti-il1rap antibodies
EP4330271A1 (en) * 2021-04-26 2024-03-06 Easemedcontrol R & D GmbH & Co KG Identification of b-cell and t-cell receptor chains for diagnosis and treatment of inflammatory diseases
IL308602A (en) 2021-05-21 2024-01-01 Leo Pharma As Anti-IL-1 receptor associated protein antibodies
CN114835799A (zh) * 2021-05-28 2022-08-02 百奥赛图江苏基因生物技术有限公司 Il1rap基因人源化非人动物的构建方法及应用
WO2024011189A2 (en) * 2022-07-06 2024-01-11 Bluefin Biomedicine, Inc. Methods of treating disease using anti-il1rap antibodies and antibody drug conjugates

Family Cites Families (99)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
DE3883899T3 (de) 1987-03-18 1999-04-22 Sb2 Inc Geänderte antikörper.
JP2919890B2 (ja) 1988-11-11 1999-07-19 メディカル リサーチ カウンスル 単一ドメインリガンド、そのリガンドからなる受容体、その製造方法、ならびにそのリガンドおよび受容体の使用
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
DK0590058T3 (da) 1991-06-14 2004-03-29 Genentech Inc Humaniseret heregulin-antistof
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
EP1997894B1 (en) 1992-02-06 2011-03-30 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Biosynthetic binding protein for cancer marker
CA2163345A1 (en) 1993-06-16 1994-12-22 Susan Adrienne Morgan Antibodies
PE64396A1 (es) 1995-01-23 1997-01-28 Hoffmann La Roche Proteina accesoria del receptor de la interleucina 1
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
WO1998008969A1 (en) 1996-08-26 1998-03-05 Human Genome Sciences, Inc. Soluble interleukin-1 receptor accessory molecule
US6974682B1 (en) 1996-08-26 2005-12-13 Human Genome Sciences, Inc. Soluble interleukin-1 receptor accessory molecule
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
US6326472B1 (en) 1997-10-15 2001-12-04 Schering Corporation Human receptor proteins; related reagents and methods
US6610833B1 (en) 1997-11-24 2003-08-26 The Institute For Human Genetics And Biochemistry Monoclonal human natural antibodies
ES2375931T3 (es) 1997-12-05 2012-03-07 The Scripps Research Institute Humanización de anticuerpo murino.
US6280955B1 (en) 1997-12-16 2001-08-28 Tularik Inc. Interleukin-1 receptor accessory proteins, nucleic acids and methods
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
JP2002510481A (ja) 1998-04-02 2002-04-09 ジェネンテック・インコーポレーテッド 抗体変異体及びその断片
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
ES2420835T3 (es) 1999-04-09 2013-08-27 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Procedimiento para controlar la actividad de las moléculas inmunofuncionales
MXPA02003456A (es) 1999-10-04 2002-10-23 Medicago Inc Metodo para regular la transcripcion de genes foraneos.
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
JP4668498B2 (ja) 1999-10-19 2011-04-13 協和発酵キリン株式会社 ポリペプチドの製造方法
US7064191B2 (en) 2000-10-06 2006-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
CA2953239A1 (en) 2000-10-06 2002-04-18 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Antibody composition-producing cell
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
WO2002064630A2 (en) 2000-10-31 2002-08-22 Immunex Corporation Il-1 receptor accessory protein
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
CN101940189A (zh) 2000-11-30 2011-01-12 米德列斯公司 用于生产人类抗体的转基因转染色体啮齿动物
US7658921B2 (en) 2000-12-12 2010-02-09 Medimmune, Llc Molecules with extended half-lives, compositions and uses thereof
ES2326964T3 (es) 2001-10-25 2009-10-22 Genentech, Inc. Composiciones de glicoproteina.
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
ATE503829T1 (de) 2002-04-09 2011-04-15 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Zelle mit erniedrigter oder deletierter aktivität eines am gdp-fucosetransport beteiligten proteins
BR0309145A (pt) 2002-04-09 2005-02-01 Kyowa Hakko Kogyo Kk Células das quais o genoma é modificado
CA2481920A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Antibody composition-containing medicament
WO2003085119A1 (fr) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Procede d'amelioration de l'activite d'une composition d'anticorps de liaison avec le recepteur fc$g(g) iiia
AU2003236019A1 (en) 2002-04-09 2003-10-20 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Drug containing antibody composition appropriate for patient suffering from Fc Gamma RIIIa polymorphism
CA2481837A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Production process for antibody composition
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
PL212899B1 (pl) 2002-12-16 2012-12-31 Genentech Inc Humanizowane przeciwcialo, kompozycja zawierajaca to przeciwcialo, wyrób fabryczny, przeciwcialo lub jego fragment do zastosowania w sposobie indukowania apoptozy, izolowany kwas nukleinowy, wektor ekspresji, komórka gospodarza, sposób wytwarzania przeciwciala lub jego fragmentu, plynny preparat i zastosowanie przeciwciala do wytwarzania leku
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
US20050106667A1 (en) 2003-08-01 2005-05-19 Genentech, Inc Binding polypeptides with restricted diversity sequences
US20050129685A1 (en) 2003-09-18 2005-06-16 Jingtai Cao Use of IL-1 blockers to prevent corneal inflammation and neovascularization
CA2542046A1 (en) 2003-10-08 2005-04-21 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Fused protein composition
CA2542125A1 (en) 2003-10-09 2005-04-21 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for producing antibody composition by using rna inhibiting the function of .alpha.1,6-fucosyltransferase
JPWO2005053742A1 (ja) 2003-12-04 2007-06-28 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物を含有する医薬
PL1718677T3 (pl) 2003-12-19 2012-09-28 Genentech Inc Jednowartościowe fragmenty przeciwciała stosowane jako środki lecznicze
JP5128935B2 (ja) 2004-03-31 2013-01-23 ジェネンテック， インコーポレイテッド ヒト化抗ＴＧＦ−β抗体
EP2360186B1 (en) 2004-04-13 2017-08-30 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-P-selectin antibodies
TWI309240B (en) 2004-09-17 2009-05-01 Hoffmann La Roche Anti-ox40l antibodies
NZ580115A (en) 2004-09-23 2010-10-29 Genentech Inc Cysteine engineered antibody light chains and conjugates
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
EP2366786A3 (en) 2005-05-05 2012-08-29 VALORISATION HSJ, Société en Commandite Cytokine receptor modulators and uses thereof
TW200732350A (en) 2005-10-21 2007-09-01 Amgen Inc Methods for generating monovalent IgG
EA016609B1 (ru) 2005-11-28 2012-06-29 Генмаб А/С Рекомбинантные моновалентные антитела и способы их получения
US20120171190A1 (en) 2005-12-21 2012-07-05 Donndelinger Thomas M Methods for diagnosing chronic diarrhea through protein secretion analysis
US7560530B1 (en) 2006-07-20 2009-07-14 Schering Corporation IL-33 receptor
US20080226635A1 (en) 2006-12-22 2008-09-18 Hans Koll Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
WO2008145138A1 (en) 2007-05-31 2008-12-04 Genmab A/S Recombinant fucose modified monovalent half-antibodies obtained by molecular engineering
WO2008145137A2 (en) 2007-05-31 2008-12-04 Genmab A/S Recombinant non glycosylated monovalent half-antibodies obtained by molecular engineering
US8592562B2 (en) 2008-01-07 2013-11-26 Amgen Inc. Method for making antibody Fc-heterodimeric molecules using electrostatic steering effects
US20110044894A1 (en) 2008-03-26 2011-02-24 Cellerant Therapeutics, Inc. Immunoglobulin and/or Toll-Like Receptor Proteins Associated with Myelogenous Haematological Proliferative Disorders and Uses Thereof
AU2010208394A1 (en) 2009-01-27 2011-09-08 Hologic, Inc. Biomarkers for detection of neonatal sepsis in biological fluid
GB2472856B (en) 2009-08-21 2012-07-11 Cantargia Ab IL1-RAP modulators and uses thereof
DK2665749T3 (en) 2011-01-19 2016-03-21 Cantargia Ab Anti-il1rap antibodies and their use for the treatment of solid tumors
US20140030735A1 (en) 2011-03-07 2014-01-30 Temple University - Of The Commonwealth System Of Higher Education Biomarkers of chronic obstructive pulmonary disease
US20140308294A1 (en) 2011-04-15 2014-10-16 Merck Patent Gmbh Anti-IL-1R1 Inhibitors For Use in Cancer
MX2013013627A (es) 2011-06-21 2014-04-25 Oncofactor Corp Composiciones y metodos para la terapia y diagnostico de cancer.
US9873918B2 (en) 2011-08-11 2018-01-23 Albert Einstein College Of Medicine, Inc. Treatment of acute myeloid leukemia and myelodysplastic syndromes
US20150315279A1 (en) 2012-12-21 2015-11-05 Cellerant Therapeutics, Inc. Antibodies that bind membrane-bound il1rap
GB201307269D0 (en) 2013-04-23 2013-05-29 Ph Therapeutics Ltd Combination Therapy
GB201403875D0 (en) * 2014-03-05 2014-04-16 Cantargia Ab Novel antibodies and uses thereof
GB201413913D0 (en) 2014-08-06 2014-09-17 Cantargia Ab Novel antibodies and uses thereof
JP6929771B2 (ja) 2014-11-10 2021-09-01 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗インターロイキン−３３抗体及びその使用
US11137397B2 (en) 2014-11-24 2021-10-05 Albert Einstein College Of Medicine Peptides for blocking IL1RAP protein-protein interaction and uses thereof for treatment of disease
CN108026172B (zh) 2015-06-26 2022-04-29 赛诺菲生物技术公司 单克隆抗il-1racp抗体
US20180312592A1 (en) 2015-07-16 2018-11-01 Cellerant Therapeutics, Inc. Cysteine-substituted immunoglobulins
EP3371220A2 (en) 2015-11-02 2018-09-12 Janssen Pharmaceutica NV Anti-il1rap antibodies, bispecific antigen binding molecules that bind il1rap and cd3, and uses thereof
EP3241845A1 (en) 2016-05-06 2017-11-08 MAB Discovery GmbH Humanized anti-il-1r3 antibodies
EP4257613A3 (en) * 2016-06-14 2023-12-13 Xencor, Inc. Bispecific checkpoint inhibitor antibodies
CN107056946A (zh) * 2016-12-28 2017-08-18 华南农业大学 一种抗二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药的Fab抗体及制备方法和应用
EP3401332A1 (en) 2017-05-08 2018-11-14 MAB Discovery GmbH Anti-il-1r3 antibodies for use in inflammatory conditions
JP2020527332A (ja) 2017-06-12 2020-09-10 ブルーフィン バイオメディシン， インコーポレイテッド 抗−ｉｌ１ｒａｐ抗体および抗体薬物コンジュゲート
AU2018312563A1 (en) 2017-08-01 2020-03-12 City Of Hope Anti-IL1RAP antibodies

Also Published As

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