UA123323C2 - Димерний злитий поліпептид - Google Patents

Димерний злитий поліпептид Download PDF

Info

Publication number
UA123323C2
UA123323C2 UAA201811685A UAA201811685A UA123323C2 UA 123323 C2 UA123323 C2 UA 123323C2 UA A201811685 A UAA201811685 A UA A201811685A UA A201811685 A UAA201811685 A UA A201811685A UA 123323 C2 UA123323 C2 UA 123323C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
domain
fusion polypeptide
antibody
amino acid
binding
Prior art date
Application number
UAA201811685A
Other languages
English (en)
Inventor
Штефан ДЕНГЛЬ
Гі Жорж
Ги ЖОРЖ
Фрідеріке Гессе
Фридерике Гессе
Забіне Імхоф-Юнг
Забине ИМХОФ-ЮНГ
Йозеф Платцер
Original Assignee
Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг filed Critical Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг
Publication of UA123323C2 publication Critical patent/UA123323C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/524—CH2 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/53—Hinge
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Abstract

Винахід стосується димерного злитого поліпептиду, який містить: першу частину зв'язувального домену, другу частину зв'язувального домену і спейсерний домен, в якому спейсерний домен являє собою поліпептид і містить принаймні 25 амінокислотних залишків, перша частина зв'язувального домену являє собою поліпептид, який злитий через перший лінкер з N-кінцем спейсерного домену, друга частина зв'язувального домену являє собою поліпептид, злитий через другий лінкер з С-кінцем спейсерного домену, перша частина зв'язувального домену та друга частина зв'язувального домену асоційовані одна з одною і утворюють сайт зв'язування, який специфічно зв'язується з мішенню.

Description

домену, другу частину зв'язувального домену і спейсерний домен, в якому спейсерний домен являє собою поліпептид і містить принаймні 25 амінокислотних залишків, перша частина зв'язувального домену являє собою поліпептид, який злитий через перший лінкер з М-кінцем спейсерного домену, друга частина зв'язувального домену являє собою поліпептид, злитий через другий лінкер з С-кінцем спейсерного домену, перша частина зв'язувального домену та друга частина зв'язувального домену асоційовані одна з одною і утворюють сайт зв'язування, який специфічно зв'язується З мішенню. шк и и її г 2-00 ЕЕ" нс . нс с
То ще ; о. о. о. У ння о -н о ! с я - ни нн п нн нина . о. о НН рн . о. З шо нс . с в нс о. о що нн с с . о нн с с клан . і . НН вн . с НН нн с с
Боран вх: с. ОККО Я ПОКАЖЕ в--Н |. с в. ел Ж ьо ші а
Даний винахід відноситься до ділянки молекул, які зв'язуюють мішені. В даному описі представлений одноланцюговий зв'язувальний агент, який містить спейсерний домен, локалізований між першим фрагментом зв'язувального домену та іншим фрагментом зв'язувального домену.
Передумови створення винаходу
З моменту створення перших моноклональних антитіл Коепіег і Міївієїп в 1974 році багато зусиль було направлено на розробку антитіл, придатних для лікування людей. Перші доступні моноклональні антитіла були створені на мишах і щурах. Ці антитіла при їх застосуванні в терапії людини можуть викликати небажані побічні дії через вироблення антитіл проти антитіл гризунів. Багато зусиль було направлено на зниження або навіть усунення вказаних небажаних побічних дій.
В останні роки людські моноклональні антитіла або гуманізовані моноклональні антитіла надходять у продаж в дедалі більшій кількості. Добре відомими прикладами таких антитіл є
Негсерііпб і МарТнегає фірми НойПтапни-і а Носпе, Базель.
Крім того, створені нові формати антитіл на основі формату антитіл дикого типу, що має чотириланцюгову М-форму. Вказані формати являють собою в основному бі- та мультиспецифічні формати (див., наприклад, огляд Копіеттапп Н., тАбрз 4, 2012, сс. 182-197). в 05 2009/0175867 описані одноланцюгові багатовалентні зв'язуювальні білки, які мають ефекторну функцію.
В МО 2014/131711 описані біспецифічні антитіла, в яких другий і третій антигензв'язуючі фрагменти можуть бути злиті з ЕбС-доменом безпосередньо або через шарнірну ділянку імуноглобуліну.
В ЕР 15176083 описаний новий формат антитіл з більш низькою молекулярною масою порівняно з повнорозмірним антитілом, і їх застосування.
В УМО 2007/048022 описані злиті білки антитіло-поліпептид і методи їх одержання і застосування.
В МО 2007/146968 описані одноланцюгові багатовалентні зв'язуювальні білки, які мають ефекторну функцію.
В ЕР 1378520 описане циклічне одноланцюгове триспецифічне антитіло.
Зо Короткий виклад суті винаходу
В даному описі представлений однокільцевий поліпептид як агент, що зв'язує мішень. В указаному кільцевому поліпептиді М-кінцева ділянка містить першу частину сайта зв'язування, а
С-кінцева ділянка містить другу частину сайта зв'язування. Перша частина сайта зв'язування та друга частина сайта зв'язування асоційовані одна з одною з утворенням повного або функціонального сайта зв'язування. Тим самим поліпептид циркулюється. Асоціація може бути нековалентною або ковалентною. В разі ковалентної асоціації вона не являє собою пептидний зв'язок, а здійснюється, наприклад, за допомогою дисульфідного зв'язку.
Одним із об'єктів винаходу є (кільцевий) (одноланцюговий) злитий поліпептид, який (специфічно) зв'язується з мішенню і містить першу частину зв'язувального домену, другу частину зв'язувального домену і спейсерний домен, в якому - спейсерний домен являє собою поліпептид (який утворює структурний домен після фолдінгу), - перша частина зв'язувального домену являє собою поліпептид і злита (або безпосередньо, або) через перший (пептидний) лінкер з М-кінцем спейсерного домену, - друга частина зв'язувального домену являє собою поліпептид і злита (або безпосередньо, або) через другий (пептидний) лінкер з С-кінцем спейсерного домену, - перша частина зв'язувального домену та друга частина зв'язувального домену (одного і того ж (одноланцюгового) злитого поліпептиду) (асоційовані/асоціюється за допомогою/ковалентного або нековалентного зв'язку одна з одною Її) утворюють (функціональний) сайт зв'язування, який специфічно зв'язується з мішенню.
В одному із варіантів здійснення винаходу (кільцевий) (одноланцюговий) злитий поліпептид містить строго одну частину зв'язувального домену на М-кінці відносно спейсерного домену і строго одну, але відмінну від першої, частину цього ж зв'язувального домену на С-кінці відносно спейсерного домену.
В одному із варіантів здійснення винаходу перша частина зв'язувального домену являє собою варіабельний домен важкого ланцюга антитіла, а друга частина зв'язувального домену являє собою варіабельний домен легкого ланцюга антитіла або навпаки.
В одному із варіантів здійснення винаходу перша частина зв'язувального домену та друга частина зв'язувального домену ковалентно асоційовані одна з одною. В одному із варіантів бо здійснення винаходу перша частина зв'язувального домену та друга частина зв'язувального домену ковалентно асоційовані одна з одною за допомогою зв'язку, відмінного від пептидного зв'язку. В одному із переважних варіантів здійснення винаходу перша частина зв'язувального домену та друга частина зв'язувального домену ковалентно асоційовані одна з одною за допомогою дисульфідного зв'язку.
В одному із варіантів здійснення винаходу перша частина зв'язувального домену являє собою важкий ланцюг ЕРаб-фрагмента (МНАСНІ) антитіла, а друга частина зв'язувального домену являє собою легкий ланцюг РГаб-фрагмента (МІ --СІ) антитіла або навпаки.
В одному із варіантів здійснення винаходу сайт зв'язування не містить пару: варіабельний домен важкого ланцюга антитіла і варіабельний домен легкого ланцюга антитіла/є вільним від варіабельних доменів антитіла.
В одному із переважних варіантів здійснення винаходу спейсерний домен містить принаймні 25 амінокислотних залишків. В одному із варіантів здійснення винаходу спейсерний домен містить принаймні 50 амінокислотних залишків. В одному із варіантів здійснення винаходу спейсерний домен містить принаймні 100 амінокислотних залишків.
В одному із варіантів здійснення винаходу (кільцевий) (одноланцюговий) злитий поліпептид має ефекторну функцію. В одному із варіантів здійснення винаходу ефекторна функція являє собою АОСС і/або СОС.
В одному із варіантів здійснення винаходу спейсерний домен містить шарнірну ділянку антитіла або її фрагмент і СН2-домен антитіла або його фрагмент. В одному із варіантів здійснення винаходу шарнірна ділянка антитіла і СН2-домен антитіла або їх фрагменти відносяться до людського ІдС1-підкласу. В одному із варіантів здійснення винаходу шарнірна ділянка і СН2-домен антитіла мають амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 105.
В одному із варіантів здійснення винаходу спейсерний домен містить шарнірну ділянку антитіла або її фрагмент, СН2-домен антитіла і СНЗ-домен антитіла або його фрагмент. В одному із варіантів здійснення винаходу СН2-домен антитіла і СНЗ-домен антитіла або їх фрагменти відносяться до людського Ідс11-підкласу. В одному із варіантів здійснення винаходу шарнірна ділянка, СН2г-домен антитіла і СНЗ-домен антитіла мають амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з 5ЕО ІО МО: 31-51. В одному переважному варіанті здійснення винаходу шарнірна ділянка, СН2-домен антитіла і СНЗ-домен антитіла
Ко) мають амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 32 або 5ЕО ІО МО: 33, або 5ЕО ІО МО: 38, або
ЗЕО І МО: 39, або 5ЕО ІО МО: 40, або 5ЕО І МО: 41.
В одному із варіантів здійснення винаходу перший і/або другий лінкер являє собою пептидний лінкер.
В одному із варіантів здійснення винаходу (кільцевий) (одноланцюговий) злитий поліпептид, який (специфічно) зв'язується з мішенню, містить першу частину зв'язувального домену, другу частину зв'язувального домену і спейсерний домен, де - спейсерний домен має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з
ЗЕО ІЮ МО: 32, 5ЕО ІЮ МО: 33, 5ЕО І МО: 38, 5ЕО ІО МО: 39, 5ЕО ІЮ МО: 40 ї БЕО ІЮ МО: 41, - перша частина зв'язувального домену являє собою важкий ланцюг Рар-фрагмента антитіла, а друга частина зв'язувального домену являє собою легкий ланцюг Рар-фрагмента антитіла або навпаки, - перша частина зв'язувального домену злита через перший пептидний лінкер, який має
ЗЕБЕО І МО: 64 або 5ЕО І МО: 65, з М-кінцем спейсерного домену, а друга частина зв'язувального домену злита через другий пептидний лінкер, який має 5ЕО ІЮО МО: 64 або 5ЕО
ІО МО: 65, з С-кінцем спейсерного домену, при цьому, перший та другий пептидний лінкер вибирають незалежно один від одного, і - важкий ланцюг Раб-фрагмента і легсий ланцюг Рар-фрагмента (які асоційовані один з одним), утворюють (функціональний) сайт зв'язування, який (специфічно) зв'язується з мішенню.
В одному із варіантів здійснення винаходу (кільцевий) (одноланцюговий) злитий поліпептид містить в напрямку від М-кінця до С-кінця перед спейсерним доменом (тобто на М-кінці відносно спейсерного домену) строго один варіабельний домен антитіла і після спейсерного домену (тобто на С-кінці відносно спейсерного домену) строго один варіабельний домен антитіла.
В одному із варіантів здійснення винаходу мішень являє собою антиген клітинної поверхні або розчинний ліганд рецептора клітинної поверхні.
В одному із варіантів здійснення винаходу зв'язувальний домен являє собою канонічний
Еаб, Стоз5Рар або Ошагаь.
В одному із варіантів здійснення винаходу зв'язувальний домен являє собою канонічний бо Еарб, в якому одна частина зв'язувального домену містить варіабельний домен важкого ланцюга
(МН) антитіла і принаймні М-кінцевий фрагмент першого константного домену важкого ланцюга (СНІ) антитіла (або повний домен), і відповідно інший зв'язувальний домен містить варіабельний домен легкого ланцюга (МІ) антитіла і принаймні М-кінцевий фрагмент константного домену легкого ланцюга (СІ) антитіла (або повний домен), або навпаки.
В одному із варіантів здійснення винаходу одна частина зв'язувального домену містить в напрямку від М-кінця до С-кінця МН-СНІ, а інша частина зв'язувального домену містить в напрямку від М-кінця до С-кінця МІ -СІЇ, або навпаки.
В одному із варіантів здійснення винаходу зв'язувальний домен являє собою Сто55ГРар, в якому обидві частини зв'язувального домену містять варіабельний домен антитіла і принаймні
М-кінцевий фрагмент константного домену антитіла (або повний домен), при цьому пари варіабельного домену і константного домену не зустрчаються в асоціації одна з одною в природних умовах і мають кросовер доменів/обмін домену важкого ланцюга і домену легкого ланцюга. В одному із варіантів здійснення винаходу обмін являє собою заміну МН на Мі. або
СНІ на СІ.
В одному із варіантів здійснення винаходу одна частина зв'язувального домену містить в напрямку від М-кінця до С-кінця МІ-СНІ, а інша частина зв'язувального домену містить в напрямку від М-кінця до С-кінця МН-СЇ..
В одному із варіантів здійснення винаходу одна частина зв'язувального домену містить в напрямку від М-кінця до С-кінця МН-СЇ, а інша частина зв'язувального домену містить в напрямку від М-кінця до С-кінця МІ -СНІ1.
Асоціацію (когнатних) частинин зв'язувального домену можна додатково підвищувати крім обміну доменів в Сто55Бар шляхом інтродукції зарядів. В деяких варіантах (багатокільцевий) (димерний кільцевий) злитий поліпептид містить принаймні перший (кільцевий) злитий поліпептид та другий (кільцевий) злитий поліпептид.
В одному із варіантів здійснення винаходу (багатокільцевий) злитий поліпептид містить а) перший (кільцевий) злитий поліпептид, який містить як сайт зв'язування Рар, що (специфічно) зв'язується з першим антигеном, і б) другий (кільцевий) злитий поліпептид, який містить як сайт зв'язування Рар, що (специфічно) зв'язується з іншим антигеном, в якому варіабельні домени МІ і УН в Раб (другого кільцевого злитого поліпептиду) замінені один на одний. (Кільцевий) злитий поліпептид, вказаний в підпункті а), не містить модифікацію, вказану в підпункті б).
В (кільцевому) злитому поліпептиді, вказаному в підпункті б), у фрагменті легкого ланцюга антитіла варіабельний домен легкого ланцюга М! замінений варіабельним доменом важкого ланцюга
МН вказаного Раб, і у фрагменті важкого ланцюга антитіла варіабельний домен важкого ланцюга МН замінений варіабельним доменом легкого ланцюга
МІ. вказаного Раб.
В одному із варіантів здійснення винаходу
ЇЇ в константному домені СіЇ першого (кільцевого) злитого поліпептиду (багатокільцевого злитого поліпептиду) амінокислота в положенні, що відповідає положенню 124 за Кеботом, замінена на позитивно заряджену амінокислоту, і в константному домені СНІ першого (кільцевого) злитого поліпептиду (багатокільцевого злитого поліпептиду) амінокислота в положенні, що відповідає положенню 147 відповідно до ЕО-індексу Кебота, або амінокислота в положенні, що відповідає положенню 213 відповідно до ЕОИО-індексу Кебота, замінена на негативно заряджену амінокислоту, або
І) в константному домені Сі другого (кільцевого) злитого поліпептиду (багатокільцевого злитого поліпептиду) амінокислота в положенні, що відповідає положенню 124 за Кеботом, замінена на позитивно заряджену амінокислоту, і константному домені СНІ другого (кільцевого) злитого поліпептиду (багатокільцевого злитого поліпептиду) амінокислота в положенні, що відповідає положенню 147 відповідно до ЕЮО-індексу Кебота, або амінокислота в положенні, що відповідає положенню 213 відповідно до ЄЮ-індексу Кебота, замінена на негативно заряджену амінокислоту.
В одному із переважних варіантів здійснення винаходу
ЇЇ в константному домені СіЇ першого (кільцевого) злитого поліпептиду (багатокільцевого злитого поліпептиду) амінокислота в положенні, що відповідає положенню 124 за Кеботом, бо замінена незалежно на лізин (К), аргінін (Р) або гістидин (Н) (В одному із переважних варіантів здійснення винаходу незалежно на лізин (К) або аргінін (Р)), і в константному домені СНІ першого (кільцевого) злитого поліпептиду (багатокільцевого злитого поліпептиду) амінокислота в положенні, що відповідає положенню 147 відповідно до ЕЮО-індексу Кебота, або амінокислота в положенні, що відповідає положенню 213 відповідно до ЕОМ-індексу Кебота, замінена незалежно на глутамінову кислоту (Е) або аспарагінову кислоту (0), або
І) в константному домені Сі другого (кільцевого) злитого поліпептиду (багатокільцевого злитого поліпептиду) амінокислота в положенні, що відповідає положенню 124 за Кеботом, замінена незалежно на лізин (К), аргінін (ЕВ) або гістидин (Н) (В одному із переважних варіантів здійснення винаходу незалежно на лізин (К) або аргінін (Р)), і в константному домені СНІ другого (кільцевого) злитого поліпептиду (багатокільцевого злитого поліпептиду) амінокислота в положенні, що відповідає положенню 147 відповідно до ЕО-індексу Кебота, або амінокислота в положенні, що відповідає положенню 213 відповідно до ЕО-індексу Кебота, замінена незалежно на глутамінову кислоту (Е) або аспарагінову кислоту (0).
В одному із варіантів здійснення винаходу в константному домені Сі другого (кільцевого) злитого поліпептиду (багатокільцевого злитого поліпептиду) амінокислоти в положеннях, які відповідають положенням 124 і 123 відповідно до ЕЮ-індексу Кебота, замінені на К.
В одному із варіантів здійснення винаходу в константному домені СНІ другого (кільцевого) злитого поліпептиду (багатокільцевого злитого поліпептиду) амінокислоти в положеннях, які відповідають положенням 147 і 213 відповідно до ЕЮ-індексу Кебота, замінені на Е.
В одному із варіантів здійснення винаходу зв'язувальний домен являє собою Юшагаб, в якому одна частина зв'язувального домену містить варіабельний домен важкого ланцюга (МН) антитіла і принаймні М-кінцевий фрагмент першого константного домену важкого ланцюга (СНІ) антитіла (або повний домен), а відповідний інший зв'язувальний домен містить варіабельний домен легкого ланцюга (МІ) антитіла (або повний домен) і принаймні М-кінцевий фрагмент константної ділянки легкого ланцюга (СІ) антитіла (або повний фрагмент), де зв'язувальний домен містить два паратопа, що не перекриваються, в комплементарній парі: варіабельний домен важкого ланцюга (УН) і варіабельний домен легкого ланцюга (МІ), де перший паратоп містить залишки з СОВІ ії СОВЗ Мі -домену і СОВ2 МН-домену, а другий паратоп містить
Ко) залишки з СОВІ1 ії СОВЗ МН-домену і СОВа2 Мі -домену.
Одним із об'єктів винаходу є (двокільцевий) злитий поліпептид, який містить перший (кільцевий) злитий поліпептид, вказаний в даному описі, та другий (кільцевий) злитий поліпептид, вказаний в даному описі, в якому перший та другий (кільцеві) злиті поліпептиди є ідентичними або різними і в якому спейсерний домен першого (кільцевого) злитого поліпептиду (ковалентно) кон'югований зі спейсерним доменом другого (кільцевого) злитого поліпептиду.
В одному із варіантів здійснення винаходу (двокільцевий) злитий поліпептид містить - перший (кільцевий) (одноланцюговий) злитий поліпептид, який (специфічно) зв'язується з першою мішенню, який містить першу частину зв'язувального домену, другу частину зв'язувального домену і спейсерний домен, в якому - спейсерний домен має амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 32 або 5ЕО ІО МО: 38, або
ЗЕО І МО: 40, - перша частина зв'язувального домену являє собою важкий ланцюг Рар-фрагмента антитіла, а друга частина зв'язувального домену являє собою легкий ланцюг Рар-фрагмента антитіла або навпаки, - перша частина зв'язувального домену злита через перший пептидний лінкер, який має
ЗЕБЕО ІО МО: 64 або 5БО ІО МО: 65, з М-кінцевим спейсерним доменом, а друга частина зв'язувального домену злита через другий пептидний лінкер, який має 5ЕО ІЮО МО: 64 або 5ЕО
ІЮО МО: 65, з С-кінцем спейсерного домену, при цьому перший та другий пептидні лінкери вибрані незалежно один від одного, і - важкий ланцюг ЕРар-фрагмента антитіла і легсий ланцюг ЕРар-фрагмента антитіла (які асоційовані одна з одною) утворюють (функціональний) сайт зв'язування, який (специфічно) зв'язується з першою мішенню, і - другий (кільцевий) (одноланцюговий) злитий поліпептид, який (специфічно) зв'язується із другою мішенню, який містить першу частину зв'язувального домену, другу частину зв'язувального домену і спейсерний домен, в якому - спейсерний домен має амінокислотну послідовність 5ЕС ІЮ МО: 33 або 5ЕО ІО МО: 39, або
ЗЕО І МО: 41,
- перша частина зв'язувального домену являє собою важкий ланцюг Рар-фрагмента антитіла, а друга частина зв'язувального домену являє собою легкий ланцюг Рар-фрагмента антитіла або навпаки, - перша частина зв'язувального домену злита через перший пептидний лінкер, який має ЗЕО ІО МО: 64 або 5ЕО ІО МО: 65, з М-кінцем спейсерного домену, а друга частина зв'язувального домену злита через другий пептидний лінкер, який має 5ЕО ІЮО МО: 64 або 5ЕО
ІО МО: 65, з С-кінцем спейсерного домену, при цьому перший та другий пептидні лінкери вибрані незалежно один від одного, і - важкий ланцюг ЕРар-фрагмента антитіла і легсий ланцюг ЕРар-фрагмента антитіла (які асоційовані одна з одною) утворюють (функціональний) сайт зв'язування, який (специфічно) зв'язується із другою мішенню.
В одному із варіантів здійснення винаходу кожний з (кільцевих) (одноланцюгових) злитих поліпептидів містить в напрямку від М-кінця до С-кінця перед спейсерним доменом (тобто на М- кінці відносно спейсерного домену) строго один варіабельний домен антитіла і після спейсерного домену (тобто на С-кінці відносно спейсерного домену) строго один варіабельний домен антитіла.
В одному із варіантів здійснення винаходу мішень являє собою антиген клітинної поверхні або розчинний ліганд рецептора клітинної поверхні.
В одному із варіантів здійснення винаходу зв'язувальний домен являє собою канонічний
Еаб, Стоз5Рар або Ошагаь.
В одному із варіантів здійснення винаходу один або кожний із зв'язуювальних доменів являє собою канонічний Раб, в якому одна частина зв'язувального домену містить варіабельний домен важкого ланцюга (УН) антитіла і принаймні М-кінцевий фрагмент першого константного домену важкого ланцюга (СНІ) антитіла (або повний домен), і відповідно інший зв'язувальний домен містить варіабельний домен легкого ланцюга (МІ) антитіла і принаймні М-кінцевий фрагмент константного домену легкого ланцюга (СІ) антитіла (або повний домен).
В одному із варіантів здійснення винаходу одна частина зв'язувального домену містить в напрямку від М-кінця до С-кінця МН-СНІ, а інша частина зв'язувального домену містить в
Зо напрямку від М-кінця до С-кінця МІ -СІЇ, або навпаки.
В одному із варіантів здійснення винаходу один або кожний із зв'язуювальних доменів являє собою Стго55Рар, в якому обидві частини зв'язувального домену містять варіабельний домен антитіла і принаймні М-кінцевий фрагмент константного домену антитіла (або повний домен), при цьому пари варіабельного домену і константного домену не зустрчаються в асоціації одна з одною в природних умовах і мають кросовер доменів/обмін домену важкого ланцюга і домену легкого ланцюга. В одному із варіантів здійснення винаходу обмін являє собою заміну МН на МІ. або СНІ на СІ.
В одному із варіантів здійснення винаходу одна частина зв'язувального домену містить в напрямку від М- кінця до С-кінця МІ-СНІ, а інша частина зв'язувального домену містить в напрямку від М- кінця до С-кінця МН-СЇ.
В одному із варіантів здійснення винаходу одна частина зв'язувального домену містить в напрямку від М- кінця до С-кінця МН-СЇ, а інша частина зв'язувального домену містить в напрямку від М- кінця до С-кінця МІ -СНІ1.
Асоціацію когнатних частинин зв'язувального домену можна додатково підвищувати крім обміну доменів в Сто55баб шляхом інтродукції зарядів. В цьому разі (багатокільцевий) (димерний кільцевий) злитий поліпептид містить принаймні перший (кільцевий) злитий поліпептид та другий (кільцевий) злитий поліпептид.
В одному із варіантів здійснення винаходу (багатокільцевий) злитий поліпептид містить а) перший (кільцевий) злитий поліпептид, який містить як сайт зв'язування Рар, що (специфічно) зв'язується з першим антигеном, і б) другий (кільцевий) злитий поліпептид, який містить як сайт зв'язування Рар, що (специфічно) зв'язується з іншим антигеном, в якому варіабельні домени МІ і УН в Раб (другого (кільцевого) злитого поліпептиду) замінені один на одний. (Кільцевий) злитий поліпептид, вказаний в підпункті а), не містить модифікацію, вказану в підпункті б).
В (кільцевому) злитому поліпептиді, вказаному в підпункті б), у фрагменті легкого ланцюга антитіла варіабельний домен легкого ланцюга МІ. замінений варіабельним доменом важкого ланцюга
МН вказаного Раб, (510) і у фрагменті важкого ланцюга антитіла варіабельний домен важкого ланцюга МН замінений варіабельним доменом легкого ланцюга
МІ. вказаного Раб.
В одному із варіантів здійснення винаходу
ЇЇ в константному домені СіЇ першого (кільцевого) злитого поліпептиду (багатокільцевого злитого поліпептиду) амінокислота в положенні, що відповідає положенню 124 за Кеботом, замінена на позитивно заряджену амінокислоту, і в константному домені СНІ першого (кільцевого) злитого поліпептиду (багатокільцевого злитого поліпептиду) амінокислота в положенні, що відповідає положенню 147 відповідно до ЕО-індексу Кебота, або амінокислота в положенні, що відповідає положенню 213 відповідно до ЕОМО-індексу Кебота, замінена на негативно заряджену амінокислоту, або
І) в константному домені Сі другого (кільцевого) злитого поліпептиду (багатокільцевого злитого поліпептиду) амінокислота в положенні, що відповідає положенню 124 за Кеботом, замінена на позитивно заряджену амінокислоту, і константному домені СНІ другого (кільцевого) злитого поліпептиду (багатокільцевого злитого поліпептиду) амінокислота в положенні, що відповідає положенню 147 відповідно до ЕЮ-індексу Кебота, або амінокислота в положенні, що відповідає положенню 213 відповідно до ЄЮ-індексу Кебота, замінена на негативно заряджену амінокислоту.
В одному із переважних варіантів здійснення винаходу
ЇЇ в константному домені СіЇ першого (кільцевого) злитого поліпептиду (багатокільцевого злитого поліпептиду) амінокислота в положенні, що відповідає положенню 124 за Кеботом, замінена незалежно на лізин (К), аргінін (Р) або гістидин (Н) (в одному із переважних варіантів здійснення винаходу незалежно на лізин (К) або аргінін (Р)), і в константному домені СНІ першого (кільцевого) злитого поліпептиду (багатокільцевого злитого поліпептиду) амінокислота в положенні, що відповідає положенню 147 відповідно до ЕЮО-індексу Кебота, або амінокислота в положенні, що відповідає положенню 213 відповідно до ЕОМ-індексу Кебота, замінена незалежно на глутамінову кислоту (Е) або аспарагінову кислоту (0), або
Зо І) в константному домені Сі другого (кільцевого) злитого поліпептиду (багатокільцевого злитого поліпептиду) амінокислота в положенні, що відповідає положенню 124 за Кеботом, замінена незалежно на лізин (К), аргінін (ЕВ) або гістидин (Н) (В одному із переважних варіантів здійснення винаходу незалежно на лізин (К) або аргінін (Р)), і в константному домені СНІ другого (кільцевого) злитого поліпептиду (багатокільцевого злитого поліпептиду) амінокислота в положенні, що відповідає положенню 147 відповідно до ЕО-індексу Кебота, або амінокислота в положенні, що відповідає положенню 213 відповідно до ЕО-індексу Кебота, замінена незалежно на глутамінову кислоту (Е) або аспарагінову кислоту (0).
В одному із варіантів здійснення винаходу в константному домені Сі другого (кільцевого) злитого поліпептиду (багатокільцевого злитого поліпептиду) амінокислоти в положеннях, які відповідають положенням 124 і 123 відповідно до ЕЮ-індексу Кебота, замінені на К.
В одному із варіантів здійснення винаходу в константному домені СНІ другого (кільцевого) злитого поліпептиду (багатокільцевого злитого поліпептиду) амінокислоти в положеннях, які відповідають положенням 147 і 213 відповідно до ЕЮ-індексу Кебота, замінені на Е.
В одному із варіантів здійснення винаходу один або кожний із зв'язуювальних доменів являє собою ЮОшіангБар, в якому одна частина зв'язувального домену містить варіабельний домен важкого ланцюга (МН) антитіла і принаймні М-кінцевий фрагмент першого константного домену важкого ланцюга (СНІ) антитіла (або повний домен), а відповідний інший зв'язувальний домен містить варіабельний домен легкого ланцюга (МІ) антитіла і принаймні М-кінцевий фрагмент константної ділянки легкого ланцюга (СІ) антитіла (або повний фрагмент), де зв'язувальний домен містить два паратопа, що не перекриваються, в комплементарній парі: варіабельний домен важкого ланцюга (УН) і варіабельний домен легкого ланцюга (МІ), де перший паратоп містить залишки з СОВІ ії СОВЗ Мі -домену і СОВ2 МН-домену, а другий паратоп містить залишки з СОВІ і СОВЗ МН-домену і СОВ2 Мі -домену. Одним із об'єктів даного винаходу є виділена нуклеїнова кислота, що кодує кільцевий злитий поліпептид, вказаний в даному описі
Одним із об'єктів даного винаходу є пара виділених нуклеїнових кислот, які разом кодують димерний (кільцевий) злитий поліпептид, вказаний в даному описі.
Одним із об'єктів даного винаходу є клітина-хазяїн, яка містить нуклеїнову кислоту, вказану в даному описі, або пару нуклеїнових кислот, вказаних в даному описі.
Одним із об'єктів даного винаходу є спосіб одержання (кільцевого або двокільцевого) 60 злитого поліпептиду, що включає культивування клітини-хазяїна, вказаної в даному описі, з одержанням (кільцевого або двокільцевого) злитого поліпептиду і виділення (кільцевого або двокільцевого) злитого поліпептиду з клітини або культурального середовища.
Одним із об'єктів даного винаходу є імунокон'югат, який містить (кільцевий) злитий поліпептид, вказаний в даному описі, і цитотоксичний агент.
Одним із об'єктів даного винаходу є фармацевтична композиція, яка містить (кільцевий) злитий поліпептид, вказаний в даному описі, або (димерний) (кільцевий) злитий поліпептид, вказаний в даному описі, і фармацевтично прийнятний носій.
Одним із об'єктів даного винаходу є (кільцевий) злитий поліпептид, вказаний в даному описі, або (димерний) (кільцевий) злитий поліпептид, вказаний в даному описі, призначений для застосування як лікарського засобу.
Одним із об'єктів даного винаходу є застосування (кільцевого) злитого поліпептиду, вказаного в даному описі, або (димерного) (кільцевого) злитого поліпептиду, вказаного в даному описі, для приготування лікарського засобу.
Детальний опис винаходу
І. Визначення
Модулі димеризації, створені за допомогою технології "Кпор5 іпіо ПоІе5" ("виступи" у "западини"), і їх застосування в інженерії антитіл описані в публікації Сапег Р., Віддулау -.В.В,
Ргевзіа І .С., Іттипоїесппоіоду, т. 2, Мо 1, лютий 1996 р., сс. 73-73(1).
Загальна інформація, що стосується нуклеотидних послідовностей легких і важких ланцюгів людських імуноглобулінів, представлена в: Караї Е.А. та ін., бедиєпсе5з ої Ргоївіп5. ої
Ітітипоїодіса! Іпієге5і, 5--е вид., вид-во Рибіїс Неанйй бегмісе, Маїйопа! Іпвійшев ої Неапц,
Веїпезаа, МО, 1991.
В контексті даного опису амінокислотні положення всіх константних ділянок і доменів важкого і легкого ланцюгів нумерують відповідно до системи нумерації за Кеботом, яка описана в Кабаї та ін., Зедоепсев ої Ргоївєїн5 ої Іттипо!іодіса! Іпіегеві, 5-те вид., вид-во Рибіїс Неаїкт
Зегмісе, Маїйопа! Іпзійшіев ої Нєайй, Веїпезаа, МО, 1991 їі яку позначають в контексті даного опису як "нумерація за Кеботом". Зокрема, систему нумерації за Кеботом (див. сс. 647-660), описану в КаБбаї та ін., Зедиепсевз ої Ргоївіп5 ої Іттипоіодіса! Іпіегеві, 5-те вид., вид-во Рибіїс
Неацй 5егуісе, Маїйопа! Іпвійшев ої Неайй, ВеїШезаа, МО, 1991, застосовуть для константного
Зо домену Сі легкого ланцюга каппа- і лямбда-ізотипу, а систему нумерації відповідно до ЕО- індексу Кебота (див. сс. 661-723) застосовуть для константних доменів у важкому ланцюзі (СНІ, шарнір, СНЕ2 ї СНЗ, що в цьому разі в контексті даного опису додатково роз'яснено посиланням на "нумерацію відповідно до ЄО-індексу Кебота").
Методи і технології, придатні для здійснення даного винаходу, описані, наприклад, в Ситепі
Ргоїосої5 іп МоїІесшіаг Віоіоду, під ред. Айвзире! Е.М., т.т. І-Ш, 1997; ОМА сіопіпд: А Ргасіїса!
Арргоасі, під ред. Сіомег М.О. і Натез В.О., т.т. І-ІІ, вид-во Охіога Опімегейу Ргезв, 1985; Апітаї!
Сеї! Сийиге - а ргасіїса! арргоаси, ІВ! Ргезз І Ітіїед, під ред. ЕгезНпеу В.І., 1986; М/аїзоп 4.0. та ін., Весотбріпапі ОМА, 2-те вид., вид-во СН5ОЇ. Ргез5, 1992; М/іппаскКег Е.Ї., Егот Сепез ю сіопев; вид-во М.У., МСН Рибіївпегтв, 1987; Сеї! Віоіоду, під ред. Сеїї5 у., 2-те вид., вид-во Асадетіс
Ргезв, 1998; ЕгезНппеу В.І., бийте ої Апітаї! СеїІвє: А Мапиаї ої Вазіс Тесппідпе, 2-те вид., вид-во
Агап В. І ів5, Іпс., М.М., 1987.
Застосування технології рекомбінантної ДНК дозволяє створювати похідні нуклеїнової кислоти. Вказані похідні можуть, наприклад, бути модифіковані в індивідуальному нуклеотидному положенні або в декількох положеннях шляхом заміни, зміни, обміну, делеції або інсернції. Модифікацію або дериватизацію можна здійснювати, наприклад, за допомогою сайтнаправленого мутагеназу. спеціаліст в даній галузі може легко здійснювати вказані модифікації (див., наприклад, Затьгоок .. та ін., МоіІесшіаг сіопіпд: А Іарогаюгу тапиаї!; вид-во
Соїа 5ргіпд Натбог І арогаюгу Ргез5, Мем Моїк, ОА, 1999; Натез В.О. і Ніддіпе 5.2, Мисівєїс асій
Нубгіаігайноп - а ргасіїса! арргоасні, вид-во ІВГ. Ргеззв, Охгога, Епдіапа, 1985).
Слід зазначити, що в даному описі та в прикладеній формулі винаходу поняття, що застосовуться в однині, включають також їх застосування у множині, якщо з контексту чітко не випливає інше. Так, наприклад, посилання на "клітину" включає безліч вказаних клітин або їх еквівалентів, відомих спеціалістам в даній галузі тощо. Крім того, поняття "один", "один або декілька", "один або більше" і "принаймні один" в контексті даного опису можна застосовувати взаємозамінно. Також слід зазначити, що поняття "який містить", "який включає" і "який має" можна застосовувати взаємозамінно.
Поняття "приблизно" позначає діапазон хз 20 925 від наступної чисельної величини. В одному із варіантів здійснення винаходу поняття "приблизно" позначає діапазон х 10 95 від наступної чисельної величини. В одному із варіантів здійснення винаходу поняття "приблизно" позначає 60 діапазон х 5 95 від наступної чисельної величини.
Поняття "афінність" відноситься до сумарної сили всіх нековалентних взаємодій між одним сайтом зв'язування молекули (наприклад, антитіла) і її партнером із зв'язування (наприклад, антигеном). В контексті даного опису, якщо не вказано інше, "афінність зв'язування" відноситься до афіннності зв'язування, властивої молекулі, що відображає взаємодію за типом 1:11 між компонентами пари, що з'вязується (наприклад, антитілом і антигеном). Афінність молекули Х до її партнера У, як правило, можна характеризувати за допомогою константи дисоціації (Ка).
Афінність можна оцінювати за допомогою загальноприйнятих методів, відомих в даній галузі, включаючи ті, які представлені в даному описі.
Поняття "амінокислотна послідовність-мітка" означає послідовність амінокислотних залишків, зв'язану з будь-якою іншою послідовністю через пептидні зв'язки, яка має специфічні зв'язувальні властивості В одному із варіантів здійснення винаходу амінокислотна послідовність-мітка являє собою афінну мітку або мітку для очистки. В одному із варіантів здійснення винаходу амінокислотну послідовність-мітку вибирають з Аго-мітки, Нівз-мітки, ЕІад- мітки, Зх РіІад-мітки, зпгер-мітки, Мапо-мітки, ЗВР-мітки, с-тус-мітки, о-мітки, калмодулінзв'язувального пептиду, домену, що зв'язує целюлозу, домену, що зв'язує хітин, с5Т- мітки або МВР-мітки. В одному із варіантів здійснення винаходу амінокислотну послідовність-мітку вибирають з БЕО ІЮО МО: 01 (АВВВРЕ) або 5ЕО ІО МО: 02 (ВВАВВАЕ), або
ЗЕО Ір МО: 03 (НННННН), або 5ЕО І МО: 04 (КОНГІНМУНК ЕЕРНАНАНМК), або 5ЕО ІО МО: 05 (ОУКООООК), або 5ЕО Ір МО: 06 (вУКОонрариук рнорІОУКОрО ОК), або 5ЕО І МО: 07 (АМ/АВНРОБРОИС), або 5ЕО ІЮ МО: 08 (М/УЗНРОРГЕК), або 5ЕО ІЮ МО: 09 (МОМЕАМ/І САР), або
ЗЕО І МО: 10 (МОМЕАМ/І САВА УРІ МЕТ), або 5ЕО І МО: 11 (МОЕКТТаМУВОа СНУМЕаІ АСЕ
ІГЕОГВАВЕН НРОСОВЕР), або 5ЕО ІЮ МО: 12 (ЕОКІИІ5ЕЕОІ), або 5БО ІЮО МО: 13 (КЕТАААКЕРЕВ ОНМОЗ5), або 5ЕО ІО МО: 14 (КАВУУККМРІА УЗААМАЕККІ 555(1АЇ, або 5ЕО 10
МО: 15 (домен, що зв'язує целюлозу), або 5ЕО ІО МО: 16 (домен, що зв'язує целюлозу), або
ЗЕО І МО: 17 (ТМРЕУБАУМОМ МТАУТАСОЇ М ТУИМОКТУКСІ ОРНТОЗІ АСМ/Е РЗОМУРАЇ МОЇ О), або 5ЕО І МО: 18 (51 -мітка), або БЕО ІО МО: 19 (МВР-мітка).
Поняття "амінокислотна заміна" означає заміщення принаймні одного амінокислотного залишку в попередньо визначеній батьківській амінокислотній послідовності на інший "заміщуючий" амінокислотний залишок. Заміщуючий залишок або залишки може(уть) являти
Зо собою "амінокислотний залишок, який зустрічається в природних умовах" (тобто кодований генетичним кодом) і його вибирають з групи, яка складається з: аланіну (Аа); аргініну (Аг); аспарагіну (Авп); аспарагінової кислоти (Авзр), цистеїну (Суз), глутаміну (СіІп), глутамінової кислоти (С1и), гліцину (СПіу), гістидину (Нів), ізолейцину (Пе), лейцину (І ей), лізину (Гуз), метіоніну (Мед), фенілаланіну (Ріє), проліну (Рго), серину (5ег), треоніну (ТНг), триптофану (Тр), тирозину (Ту) і валіну (Маї). В одному із варіантів здійснення винаходу заміщуючий залишок не являє собою цистеїн. Заміна на один або декілька амінокислотних залишків, які не зустрічаються в природних умовах, в контексті даного опису також підпадає під поняття амінокислотна заміна. Поняття "амінокислотний залишок, який не зустрічається в природних умовах" означає залишок, відмінний від амінокислотних залишків, які зустрічаються в природних умовах, перерахованих вище, який має здатність ковалентно зв'язуватись з сусіднім(іми) амінокислотним(и) залишком(ами) в поліпептидному ланцюзі. Приклади амінокислотних залишків, які не зустрічаються в природних умовах, включають норлейцин, орнітин, норвалін, гомосерин, аїб (аміноізомасляна кислота) та інші аналоги амінокислотних залишків, наприклад, описані у ЕПтап та ін., Мей. Еплут. 202, 1991, со. 301-336. Для створення вказаних амінокислотних залишків, які не зустрічаються в природних умовах, можна застосовувати процеси, описані у Могеп та ін., 5сіепсе 244, 1989, с. 182 і/або у ЕПптап та ін. (вище). В цілому, ці процедури включають хімічну активацію супресорної тРНК за допомогою амінокислотного залишка, що не зустрічається в природних умовах, з подальшою транскрипцією і трансляцією
РНК іп міїго. Амінокислоти, які не зустрічаються в природних умовах, можна включати в пептиди шляхом хімічного синтезу пептидів і подальшого злиття цих пептидів з одержаними за допомогою рекомбінації поліпептидами, такими як антитіла або фрагменти антитіл.
Поняття "антитіло-обумовлена клітинозалежна цитотоксичність (АОСС)» відноситься до функції, опосередкованої зв'язуванням з Ес-рецептором, і відноситься до лізису клітин-мішеней, зумовленого Ес-ділянкою антитіла, в присутності ефекторних клітин. В одному із варіантів здійснення винаходу АЮСС вимірюють шляхом обробки препарату мішені, яка експресує еритроїдні клітини (наприклад, К5б2-клітини, які експресують рекомбінантну мішень), багатокільцевим злитим поліпептидом, який містить Ес-ділянку, зазначеним у даному описі, в присутності ефекторних клітин, таких як свіжевиділені РВМС (мононуклеарні клітини периферичної крові) або чисті ефекторні клітини з лейкоцитарних плівок, типу моноцитів або бо МК-клітин (природні клітини-кілери). Клітини мішені мітять за допомогою Ст-51 і потім інкубують з багатокільцевим злитим поліпептидом. Мічені клітини інкубують з ефекторними клітинами і супернатант аналізують щодо вивільнення Стг-51. Контролі включають інкубацію ендотеліальних клітин-мішеней з ефекторними клітинами, але без багатокільцевого злитого поліпептиду.
Здатність багатокільцевого злитого поліпептиду індукувати початкові стадії АОСС вивчають шляхом вимірювання зв'язування з клітинами, що експресуюють Есу-рецептор, такими як клітини, що рекомбінантно експресують ЕсукіІ і/або ЕсукПА або МК-клітини (експресують головним чином ЕСуКкША). В переважному варіанті здійснення винаходу вимірюють зв'язування з Есук на МК-клітинах.
Поняття "зв'язування з" означає зв'язування сайта зв'язування з його мішенню, наприклад, зв'язування сайта зв'язування антитіла, що містить варіабельний домен важкого ланцюга антитіла і варіабельний домен легкого ланцюга антитіла, з відповідним антигеном. Вказане зв'язування можна визначати, наприклад, за допомогою аналізу ВіІАсогефб (фірма СЕ Неайнсаге,
Уппсала, Швеція).
Наприклад, в одному із можливих варіантів здійснення аналізу ВіАсогеф антиген зв'язують з поверхнею і зв'язування із сайтом зв'язування антитіла вимірюють за допомогою поверхневого плазмонного резонансу (5РЕ), афінність зв'язування визначають в поняттях Ка (константа асоціації: константа швидкості реакції асоціації що призводить до утворення комплексу), Ка (константа дисоціації; константа швидкості реакції дисоціації комплексу) і КО (ка/Ка).
Альтернативно цьому, сигнал, який свідчить про зв'язування на 5РА-сенсограмі, можна порівнювати безпосередньо зі сигналом відповіді в референс-контролі, з точки зору висоти резонансного сигналу і характеру дисоціації.
Поняття "СНі-домен" означає частину поліпептиду важкого ланцюга антитіла, яка простягається приблизно з ЕО-положення 118 до ЕюО-положення 215 (система ЕО-нумерації). В одному із варіантів здійснення винаходу СНі-домен має амінокислотну послідовність
АЗТІКОРОМЕР ІАРББКОТ5О СТААгОаСІМК ОМЕРЕРМТУМ5 УМУМЗОАІ!Т5аМ НТЕРАМ О55
СІ М5І 55УМТ МРБББІ аТОТ МІСМУМНКРЗ МТКМОККМ (ЗЕО І МО: 20).
Поняття "СН2г-домен" означає частину поліпептиду важкого ланцюга антитіла, яка простягається приблизно з ЕО-положення 231 до ЕюО-положення 340 (система ЕО-нумерації). В одному із варіантів здійснення винаходу СН2г-домен має амінокислотну послідовність
Зо АРЕЇ І СЯСРОМ БРІЕРРКРКОТ ІМІЗВАТРЕМТ СУМ/ОМ5НЕОР ЕУКЕММУУУра МЕМНМАКТКР
ВЕЕОЕБЗТУВМ/ ЗМІ ТМ НОМУ І МаКЕМУКСКМ 5МКАЇРАРІЕ КТІЗБКАК (5ЕО ІЮ МО: 21). СН2- домен є унікальним в тому плані, що він не є тісно спареним з іншим доменом. точніше, два М- зцеплені розгалужені вуглеводні ланцюги розташовуться між двома СН2-доменами інтактної нативної Ес-ділянки. Це дозволяє припустити, що вуглевод може являти собою заміну домен- доменному спарюванню і сприяє стабілізації СН2-домену (Випоп, Мої. Іттипої. 22, 1985, сс. 161-206).
Поняття "СНЗ-домен" означає частину поліпептиду важкого ланцюга антитіла, яка простягається приблизно з ЕО-положення 341 до ЕЄЮО-положення 446 (система ЕО-нумерації). В одному із варіантів здійснення винаходу СНЗ-домен має амінокислотну послідовність
СОРВЕРОМУТ ІРРОБАВОБЕЇ ТК МОМ5ІТСІМК сЕМРБЗОІАМЕ М/ЕЗБМООРЕММ УКТТРРМІ О5 равггі кі ТМОКЗАУМСОСІ ММЕЗСЗУМНЕ АІ НМНУТОКЗ5 І 5І РО (ЗЕО ІО МО: 22).
Поняття "клас" антитіла або Ес-ділянки відноситься до типу константного домену або константної ділянки, який входить/яка входить у важкі ланцюги або їх фрагменти. Існує п'ять основних класів антитіл: ІдА, ІДдО, ІДЕ, да і ІМ, а деякі з них можна додатково підрозділяти на підкласи (ізотипи), наприклад, Ідс1, дае, Ідс3, Ідс4, ІА! ї ІДА2. Константні домени важких ланцюгів, відповідні різним класам імуноглобулінів, позначають як а, б, є, у і М відповідно.
В контексті даного опису поняття "цитотоксичний агент" відноситься до субстанції, яка пригнічує або перешкоджає клітинній функції і/або викликає загибель або деструкцію клітини.
Цитотоксичні агенти включають (але не обмежуючись тільки ними) радіоактивні ізотопи
БО (наприклад, А", 191, 125, уз0, Веб Ве піз, Ві?12, рзг2, рр: і радіоактивні ізотопи и); хіміотерапевтичні агенти або лікарські засоби (наприклад, метотрексат, адріаміцин, алкалоїди барвінку (вінкристин, вінбластин, етопозид), доксорубіцин, мелфалан, мітоміцин С, хлорамбуцил, даунорубіцин або інші інтеркалуючі агенти); агенти, які інгібують ріст; ферменти та їх фрагменти, такі як нуклеолітичні ферменти; антибіотики; токсини, такі як низькомолекулярні токсини або токсини, що мають ферментативну активність, бактеріального, грибного, рослинного або тваринного походження, включаючи їх фрагменти і/або варіанти; і різні протипухлинні або протиракові агенти, описані нижче.
Поняття "комплементзалежна цитотоксичність (СОС)» відноситься до лізису клітин, індукованому Ес-ділянкою антитіла, зазначеного в даному описі, в присутності комплементу. В бо одному із варіантів здійснення винаходу СОС вимірюють шляхом обробки людських ендотеліальних клітин, які експресують мішень, багатокільцевим злитим поліпептидом, зазначеним в даному описі, в присутності комплементу. В одному із варіантів здійснення винаходу клітини мітять кальцеїном. Вважається, що має місце СОС, якщо багатокільцевий злитий поліпептид індукує лізис 20 95 або більше клітин-мішеней в концентрації 30 мкг/мл.
Зв'язування з фактором системи комплементу С14 можна вимірювати за допомогою ЕГІЗА. При здійсненні такого аналізу, звичайно планшет для ЕГІ5А сенсибілізують багатокільцевим злитим поліпептидом, застосовуваним в діапазоні концентрацій, і до нього додають очищений людський Сід або людську сироватку. Зв'язування Сід визначають за допомогою антитіла проти С14, а потім за допомогою міченого пероксидазою кон'югату. Визначення зв'язування (максимальне зв'язування Вітах) здійснюють, вимірюючи оптичну густину при 405 нм (ОПоао5) для субстрата пероксидази АВТ5Ф (2,2'-азіно-ді(З-етилбентіазолін-б6-сульфонаті).
Поняття "кросовер доменів" в контексті даного опису означає, що в парі, яка складається з
МН-СНІ-фрагмента важкого ланцюга антитіла і відповідного когнатного легкого ланцюга антитіла, тобто в зв'язувальному плечі антитіла (тобто в Рар-фрагменті), послідовність домену відрізняється від послідовності, що зустрічається в природних умовах, тим, що принаймні один домен важкого ланцюга замінений на відповідний домен легкого ланцюга і навпаки. Відомо три основні типи кросовера доменів (І) кросовер СНІ- і СІ -доменів, який призводить до кросовера домену легкого ланцюга з послідовністю МІ -СНІ-домену і кросовера домену фрагмента важкого ланцюга з послідовністю МН-СІ -домену (або повнорозмірного важкого ланцюга антитіла з послідовністю УН-СІ -шарнір-СН2-СНЗ-домену), (ІЇ) кросовер доменів МН- і Мі -доменів, який призводить до кросовера домену легкого ланцюга з послідовністю МН-СІ -домену і кросовера домену фрагмента важкого ланцюга з послідовністю МІ -СНІ-домену, і (ПП) кросовер домену повного легкого ланцюга (МІ-С1Ї) ії повного МН-СНІ-фрагмента важкого ланцюга ("Рар- кросовер"), який призводить до кросовера домену легкого ланцюга з послідовністю МН-СНІ1- домену і кросовера домену фрагмента важкого ланцюга з послідовністю МІ -СіІ-домену (всі вищеперераховані послідовності доменів вказані в напрямку від М- кінця до С-кінця).
В контексті даного опису поняття "замінені один на одний" стосовно відповідних доменів важкого і легкого ланцюгів відноситься до вказаних вище кросоверів доменів. Так, коли СНІ1- і
СІ -домени є "заміненими один на одний", то це відноситься до кросовера доменів, вказаного в
Зо пункті (І), і одержаного в результаті послідовності доменів важкого і легкого ланцюгів.
Відповідно, коли МН і МІ. є "заміненим один на одний", то це відноситься до кросовера доменів, вказаного в пункті (ІІ); ї коли СНІ- і СІ -домени є "заміненим один на одний" і МНІ1- і МІ -домени є "заміненим один на одний", то це відноситься до кросовера доменів, вказаного в пункті (11).
Біспецифічні антитіла, що включають кросовери доменів, описані, наприклад, в У/О 2009/080251, МО 2009/080252, МО 2009/080253, МО 2009/080254 і у Зснаєтег МУ. та ін., Ргос.
Маї. Асад. 5сі ОБА 108, 2011, сс. 11187-11192.
Мультиспецифічне антитіло, одержане за допомогою вказаного в даному описі методу, головним чином містить РГар-фрагменти, що включають кросовер доменів СНІ- і Сі -доменів, вказаний вище в пункті (І), або кросовер доменів УН- і МІ -доменів, вказаний вище в пункті (І).
Еаб-фрагменти, які специфічно зв'язуються з одним(и) і тим(и) ж антигеном(ами), створюють так, щоб вони мали однакові послідовності доменів. Таким чином, в разі, коли більше одного
Еаб-фрагмента з кросовером доменів міститься в мультиспецифічному антитілі, то вказаний(і)
Еаб-фрагмент(и) специфічно зв'язується(ються) з одним і тим же антигеном.
Поняття "ефекторні функції" відноситься до видів біологічної активності, властивих Ес- ділянці антитіла, які варіюються залежно від класу антитіла, з якого вона має походження.
Прикладами ефекторних функцій антитіла є: здатність зв'язуватися з С14 і комплементзалежна цитотоксичність (СОС); здатність зв'язуватись з Ес-рецептором; антитіло-обумовлена клітинозалежна цитотоксичність (АЮСС); фагоцитоз; знижувальна регуляція рецепторів клітинної поверхні (наприклад, В-клітинного рецептора); і активація В-клітин.
Залежні від зв'язування Ес-рецептора ефекторні функції можуть опосередковуватись взаємодією Ес-ділянки антитіла з Ес-рецепторами (БСК), які представляють собою спеціалізовані рецептори клітинної поверхні гематопоетичних клітин. Ес-рецептори належать до суперсімейства імуноглобулінів і, як встановлено, опосередковують як видалення "покритих" антитілом патогенів шляхом фагоцитозу імунних комплексів, так і лізис еритроцитів і різних інших клітинних мішеней (наприклад, пухлинних клітин), що презентують РЕос-ділянку, за допомогою антитіло-обумовленої клітинозалежної цитотоксичності (АОСС) (див., наприклад,
Мап де У/іпке! Ус і Апдегзоп СІ, 9. І еиКос. Віої. 49, 1991, сб. 511-524). ЕсК класифікують на основі їх специфічності по відношенню до ізотипів імуноглобулінів: Ес-рецептори для антитіл
ІдСі-типу позначають як Есук. Зв'язування з ЕС-рецепторами описане, наприклад, у Намеїсі У.У. 60 і Кіпеї У.Р., Аппи. Веу. Іттипої. 9, 1991, сс. 457-492; Сареї! Р... та ін., Іттипотеїнодз 4, 1994,
сс. 25-34; де Нааг: М. та ін., у. Г аб. Сі іп. Мед. 126, 1995, сс. 330-341; і Сеззпег ..Е. та ін., Апп.
Нетагїйо!. 76, 1998, сс. 231-248.
Перехресне зшивання рецепторів для Ес-ділянки антитіл ІдСі-типу (ЕсуйВ) запускає широке різноманіття ефекторних функцій, включаючи фагоцитоз, антитіло-обумовлену клітинозалежну цитотоксичність і вивільнення медіаторів запалення, а також кліренз імунного комплексу і регуляцію виробництва антитіл. У людини охарактеризовано три наступні класи ЕсуВ: - ЕСУВІ (СОб4) зв'язується з мономерним ІдС;т з високою афінністю і експресується на макрофагах, моноцитах, нейтрофілах и еозинофілах. Модифікація в Ес-ділянці ДС принаймні одного з амінокислотних залишків Е233-с:236, Р2г38, 0265, М297, АЗ27 і РЗ29 (нумерація відповідно до ЕЮО-індексу Кебота) знижує зв'язування з ЕСУВІ. Залишки в се в положеннях 233-236, замінені на залишки, присутні в Їде і Ід(54, знижують зв'язування з ЕСУВІ в 103 разів і елімінують відповідь людських моноцитів на сенсибілізовані антитілом еритроцити (Аптоиг К.І. та ін., Єик. у). Іттипої. 29, 1999, сс. 2613-2624). - ЕСУВІІ (СО32) зв'язується з ЇдС, що входить в комплекс, з афінністю від середньої до низької і характеризується широким рівнем експресії. Цей рецептор можна підрозділяти на два підтипи, ЕСсуКІІА і ЕСуКІІВ. ЕсукІА виявлений на багатьох клітинах, що беруть участь в цитолізі (наприклад, макрофаги, макроцити, нейтрофіли) і, ймовірно, може активувати процез цитолізу.
ЕсуМІІВ, ймовірно, відіграє роль в процесах інгібування і виявлений на В-клітинах, макрофагах і огрядних клітинах і еозинофілах. На В-клітинах його функцією, ймовірно, є придушення додаткового вироблення імуноглобулінів і переключення ізотипу, наприклад, на ІДЕ-клас. На макрофагах дія ЕсСукКіІІВ полягає в інгібуванні фагоцитозу, опосередкованого ЕсукІА. На еозинофілах і огрядних клітинах В-форма може сприяти придушенню активації цих клітин через
ІДЕ-зв'язування з його окремим рецептором. Знижене зв'язування ЕсукІїА виявлено, наприклад, у антитіл, що містять Ес-ділянку ЇДО з мутаціями принаймні одного з амінокислотних залишків
Ег233-с236, Р238, 0265, М297, АЗ27, РЗ29, 0270, 0295, АЗ27, К292 і К414 (нумерація відповідно до ЕО-індексу Кебота). - ЕСУАКПП (СО16) зв'язується з Ідсї з афінністю від середньої до низької та існує у вигляді двох типів. ЕСУКІПА виявлений на МК-клітинах, макрофагах, еозинофілах і деяких моноцитах і на Т-клітинах і опосередковує АОСО. Для ЕСУМКІІВ характерним є високий рівень експресії на
Зо нейтрофілах. Знижене зв'язування з ЕСУКПА виявлене, наприклад, у антитіл, які містять Ес- ділянку їдсї з мутацією принаймні одного з амінокислотних залишків Е233-с236, Р238, ре265,
М297, АЗ27, РЗ29, 0270, 0295, АЗ27, 5239, Е269, Е293, М296, М303, АЗ27, КЗ338 і 0376 (нумерація відповідно до ЕО-індексу Кебота).
Картування сайтів зв'язування на людському ДС! для Ес-рецепторів, вказані вище сайти мутації і методи вимірювання зв'язування з ЕСУКІ і ЕСУКІА описані у 5пНієїЇа5 В.І. та ін., у. Віої.
Спет. 276, 2001, сс. 6591-6604.
Поняття "ефективна кількість" агента, наприклад, фармацевтичної композиції, означає кількість, ефективну в дозах і протягом періоду часу, необхідних для досягнення потрібного терапевтичного або профілактичного результату.
Поняття "епітоп" відноситься до ділянки даної мішені, яка потрібна для специфічного зв'язування між мішенню і сайтом зв'язування. Епітоп може бути безперервним, тобто таким, що складається із суміжних структурних елементів, присутніх в мішені, або може бути переривчастим, тобто таким, що складається зі структурних елементів, що знаходяться в різних положеннях в первинній послідовності мішені, такої як амінокислотна послідовність білка, що являє собою мішень, але в тісній близькості в тримерній структурі, характерній для мішені в її природному середовищі, такому як загальна вода організму.
Поняття "Рс-рецептор" в контексті даного опису відноситься до активуючих рецепторів, характеризується присутністю цитоплазматичної ІГАМ-послідовності, асоційованої з рецептором (див., наприклад, Намеїсі ..М. і ВоПапа 5., Аппи. Веу. Іттипої. 19, 2001, сс. 275- 290). Вказані рецептори являють собою ЕСУКІ, ЕСУКПА і ЕСУКША. Поняття "відсутність зв'язування з ЕСук" означає, що при використанні антитіла в концентрації 10 мкг/мл зв'язування антитіла, вказаного в даному описі, з МК-клітинами складає 10 95 або менше від зв'язування, виявленого для антитіла до ОХ40І І С.001, що описано в М/О 2006/029879.
В той чаз як для Ідс4 характерна знижена здатність зв'язуватись з ЕСВ, антитіла з інших підкласів (ДС мають сильну здатність до зв'язування. Проте Рго238, Азр2б5, Авзр2г70, Азп297 (втрата вуглеводу Ес), Рго329, І ец234, І ен235, Сіу2г36, Сіу2г37, Пе253, 5ег254, І уз288,. ТАг307,
Сійп311, А5зп434 і Ніє435 являють собою залишки, які при їх зміні також знижують здатність зв'язуватись з ЕСА (ЗпПієїЇде5 В.І. та ін., у). Віої. Снет. 276, 2001, сс. 6591-6604; І па .. та ін.,
ЕАБЗЕВ У. 9, 1995, сс. 115-119; Могодап А. та ін., Іттипоіоду 86, 1995, сс. 319-324; і ЕР 0307434).
В одному із варіантів здійснення винаходу спейсерний домен кільцевого одноланцюгового злитого поліпептиду, вказаного в даному описі, являє собою Ес-ділянку антитіла.
В одному із варіантів здійснення винаходу Ес-ділянка в кільцевому одноланцюговому злитому поліпептиді, вказаному в даному описі, являє собою Ес-ділянку підкласу ІдДИ1 або Ідс2 і містить мутацію РМА236, СІ РБЗБ5БЗ331 і/або І 234А/ 235А/РЗ29С.
В одному із варіантів здійснення винаходу Ес-ділянка в кільцевому злитому поліпептиді, вказаному в даному описі, являє собою Ес-ділянку підкласу Ідс1 і містить мутації І 234А/ 235А.
В одному із варіантів здійснення винаходу Ес-ділянка в кільцевому злитому поліпептиді додатково містить мутацію РЗ290. В одному із варіантів здійснення винаходу Ес-ділянка в кільцевому злитому поліпептиді, вказаному в даному описі, являє собою Ес-ділянку підкласу
Іда11 і містить мутації І 234А/Л 235А/РЗ29. (вся нумерація відповідно до ЕО-індексу Кебота).
В одному із варіантів здійснення винаходу Ес-ділянка в кільцевому злитому поліпептиді, вказаному в даному описі, являє собою Ес-ділянку підкласу Ісая і містить мутацію І 235Е. В одному із варіантів здійснення винаходу Ес-ділянка в кільцевому злитому поліпептиді додатково містить мутацію 5228Р. В одному із варіантів здійснення винаходу Ес-ділянка в кільцевому злитому поліпептиді додатково містить мутацію РЗ290. В одному із варіантів здійснення винаходу Ес-ділянка в кільцевому злитому поліпептиді, вказаному в даному описі, являє собою
Ес-ділянку підкласу да і містить мутації 5228Р/ 235Е/РЗ29 (вся нумерація відповідно до ЕЄЮ- індексу Кебота).
Поняття "Рс-ділянка" в контексті даного опису відноситься до С-кінцевої ділянки важкого ланцюга імуноглобуліну, яка містить принаймні частину константної ділянки. Поняття включає
Ес-ділянки, які мають нативну послідовність, і варіанти Ес-ділянок. В одному із варіантів здійснення винаходу Ес-ділянка важкого ланцюга людського Ідсї простягається від Субз226 або від Рго230 до карбоксильного кінця важкого ланцюга. Проте С-кінцевий лізин (Іуз447) Ес- ділянки може або бути присутнім, або бути відсутнім.
Кільцеві злиті поліпептиди, вказані в даному описі, можуть містити Ес-ділянку, в одному із варіантів здійснення винаходу Ес-ділянка людського походження. В одному із варіантів здійснення винаходу Ес-ділянка містить всі ділянки людської константної ділянки. Ес-ділянка безпосередньо бере участь в активації комплементу, зв'язуванні С1д, активації СЗ і зв'язуванні
Зо Ес-рецептора. Зв'язування з С1д4 обумовлено певними сайтами зв'язування в Ес-ділянці. Вказані сайти зв'язування відомі в даній галузі і описані, наприклад, у І иКаз Т.). та ін., У. Іттипої. 127, 1981, сс. 2555-2560; Вгиппоизе В. і Себга 9.9., Мої. Іттипої. 16, 1979, сс. 907-917; Випоп О.В. та ін., Майте 288, 1980, сс. 338-344; Тпоттезеп У.Е. та ін., Мої. Іттипої. 37, 2000, сс. 995-1004;
Ідизодіє Е.Е. та ін., 9. Іттипої. 164, 2000, сс. 4178-4184; Негагепй М. та ін., 9. Мігої. 75, 2001, со. 12161-12168; Могдап А. та ін., Іттипоіоду 86, 1995, сс. 319-324; і в ЕР 0307434. Вказані сайти зв'язування являють собою, наприклад, 1 234, 1235, 0270, М297, ЕЗ318, КЗ20, КЗ22, РЗ331 і РЗ29 (нумерація відповідно до ЕЄО-індексу Кебота). Антитіла підкласів ІДС, Іде і ДСЗ, як правило, характеризуються активацією комплементу, зв'язуванням С14 і активацією С3, в той чаз як Їд4с4 не активують систему комплементу, не зв'язують С14 і не активують С3. "Рс-ділянка антитіла" являє собою поняття, добре відоме спеціалісту в даній галузі, і Ес-ділянку визначають на основі розщеплення папаїном антитіл. В одному із варіантів здійснення винаходу Ес-ділянка являє собою людську Ес-ділянку. В одному із варіантів здійснення винаходу Ес-ділянка являє собою
Ес-ділянку людського Ідсі4-підкласу, що містить мутації 5228Р і/або І235Е, (або РЗ290а: (нумерація відповідно до ЕО-індексу Кебота). В одному із варіантів здійснення винаходу Ес- ділянка являє собою Ес-ділянку людського ІдДС1-підкласу, що містить мутації І 234А і І1235А ї необов'язково РЗ29С (нумерація відповідно до ЕО-індексу Кебота).
Поняття "шарнірна ділянка" відноситься до частини поліпептиду важкого ланцюга антитіла, яка з'єднує у важкому ланцюзі антитіла дикого типу СНІ-домен і СН2-домен, наприклад, від положення приблизно 216 до положення приблизно 230 відповідно до системи нумерації ЄЮ
БО Кебота або від положення приблизно 226 до положення приблизно 230 відповідно до системи нумерації ЄЮ Кебота. Шарнірні ділянки інших підкласів (ІД можна визначати, вирівнюючи із залишками цистеїну в послідовності шарнірної ділянки Ідс1-підкласу.
Шарнірна ділянка, як правило, являє собою димерну молекулу, яка складається з двох поліпептидів з ідентичною амінокислотною послідовністю. Шарнірна ділянка містить, як правило, приблизно 25 амінокислотних залишків і є гнучкою, даючи можливість асоційованим з нею сайтам зв'язування мішені переміщатись незалежно. Шарнірну ділянку можна підрозділяти три домени: верхній, середній і нижній домен шарнірної ділянки (див., наприклад, Ноих та ін., «).
Іттипої. 161, 1998, с. 4083).
В одному із варіантів здійснення винаходу шарнірна ділянка має амінокислотну 60 послідовність ОКТНТСОРХСР (ЗЕО ІО МО: 23), в якій Х позначає або 5, або Р. В одному із варіантів здійснення винаходу шарнірна ділянка має амінокислотну послідовність НІСРХОР (ЗЕО ІО МО: 24), в якій Х позначає або 5, або Р. В одному із варіантів здійснення винаходу шарнірна ділянка має амінокислотну послідовність СРХСР (5ЕО ІО МО: 25), в якій Х позначає або 5, або Р.
Поняття "Рс-ділянка дикого типу" означає амінокислотну послідовність, ідентичну амінокислотній послідовності Ес-ділянки, що зустрічається в природних умовах. Людські Ес- ділянки дикого типу включають нативну людську Ес-ділянку ЇДС1 (аллотипи ні-А і А), нативну людську Ес-ділянку ІЇдс22, нативну людську Ес-ділянку ДСЗ і нативну людську Ес-ділянку Ідс4, а також їх варіанти, що зустрічаються в природних умовах. Ес-ділянки дикого типу представлені в
БЕО І МО: 26 (421, європеоїдний аллотип), 5ЕО ІО МО: 27 (421, афроамериканський аллотип), зХЕО ІЮ МО: 28 (Ідаг), ЗЕО ІО МО: 29 (Ідаз) і БЕО ІО МО: 30 (да).
Поняття "варіант (людської) Ес-ділянки" означає амінокислотну послідовність, яка відрізняється від амінокислотної послідовності «(людської) Ес-ділянки дикого типу" через наявність принаймні однієї "амінокислотної мутації". В одному із варіантів здійснення винаходу варіант ЕРс-ділянки має принаймні одну амінокислотну мутацію порівняно з нативною Ес- ділянкою, наприклад, від приблизно 1 до приблизно 10 амінокислотних мутацій, і в одному із варіантів здійснення винаходу від приблизно 1 до приблизно 5 амінокислотних мутацій в нативній Рс-ділянці. В одному із варіантів здійснення винаходу РЕс-ділянка (її варіант) гомологічна принаймні приблизно на 8095 Ес-ділянці дикого типу і в одному із варіантів здійснення винаходу варіант Ес-ділянки гомологічний принаймні приблизно на 90 95, в одному із варіантів здійснення винаходу варіант Ес-ділянки гомологічний принаймні приблизно на 95 95.
Варіант (людських) Ес-ділянок визначається наявністю амінокислотних мутацій, які містяться в них. Так, наприклад, поняття РЗ29С означає варіант Ес-ділянки з мутацією, що призводить до заміни проліну на гліцин в амінокислотному положенні 329 по відношенню до батьківської (дикого типу) Ес-ділянки (нумерація відповідно до ЕОМ-індексу Кебота). Ідентичність з амінокислотою дикого типу може бути неспецифічною, в такому разі вищевказаний варіант позначають як 32920. Поняття "мутація" означає заміну на амінокислоти, що зустрічаються в природних умовах, а також заміну на амінокислоти, які не зустрічаються в природних умовах (див., наприклад, ОБ Мо 6586207, МО 98/48032, МО 03/073238, 05 2004/0214988, МО
Зо 2005/35727, МО 2005/74524, Спіп УМ. та ін., ). Ат. Спет. бос. 124, 2002, сс. 9026-9027; Сніп
УМ. ії сп!» Р.С., СпетВіоСтпет 11, 2002, сс. 1135-1137; Сніп ).МУ. та ін., РІСА5 Опнйей еаїез ої
Атетїіса 99, 2002, сс. 11020-11024; Мапа І. і спи» Р.С., Спет., 2002, сс. 1-10).
Поліпептидний ланцюг людської Ес-ділянки дикого типу Ідсі-підкласу має наступну амінокислотну послідовність, починаючись із залишка цистеїну в положенні 227 і закінчуючись залишком гліцину в положенні 446:
СРРОРАРЕЇЇ СОРБОУБРЕРР КРКОТІМІЗА ТРЕМТСУУММО М5НЕОРЕМКЕ МУМУрамЕМУнН
МАКТКРАЕЕЄО УМ5ТУВМУБМ ІТМІНОСУМІМ СКЕМКСКУБМ КАГРАРІЕКТ ІЗКАКСОРАЕ
РОМУТІ РРЗА (Е/ОЛДЕ(ІМЛ)ТКМОМ5І ТС! УКагМРБ ОІАМЕМЕЗМОа ОРЕММУКТТР РМ ЮОБООаЗЕЕ
ГМ5КІТУрке ВМО, ММУЕ5С ЗУМНЕАЇ НМН УТОКБІ 5І БР С (ЗЕО ІЮ МО: 31).
Поліпептидний ланцюг варіанта людської Ес-ділянки Ід(11-підкласу з мутаціями 173665,
І З368А і У407М має наступну амінокислотну послідовність:
СРРОРАРЕЇЇ СОРБОУБРЕРР КРКОТІМІЗА ТРЕМТСУУММО М5НЕОРЕМКЕ МУМУрамЕМУнН
МАКТКРАЕЕЄО УМ5ТУВМУБМ ІТМІНОСУМІМ СКЕМКСКУБМ КАГРАРІЕКТ ІЗКАКСОРАЕ
РОМУМТІРРЗА ОБ ТКМОУ5І САМУКОаЕМРО ОІАМЕМЖМЕЗМО ОРЕММУКТТР РМ'рБравеЕг
ГУБКІТУрКк ЕМО, ММУЕ5С ЗУМНЕАЇ НМН УТОКБІ 5І БР С (ЗЕО ІЮ МО: 32).
Поліпептидний ланцюг варіанта людської Ес-ділянки ІдДС1-підкласу з мутацією ТЗ366УУ має наступну амінокислотну послідовність:
СРРОРАРЕЇЇ СОРБОУБРЕРР КРКОТІМІЗА ТРЕМТСУУММО М5НЕОРЕМКЕ МУМУрамЕМУнН
МАКТКРАЕЕЄО УМ5ТУВМУБМ ІТМІНОСУМІМ СКЕМКСКУБМ КАГРАРІЕКТ ІЗКАКСОРАЕ
РОММУМТІРРЗА ОБ! ТКМОМ5І М/С УКагМРЗ ОІАМЕМЕЗМО ОРЕММУКТТР РМ'рБравзеЕг
ГМ5КІТУрке ВМО, ММУЕ5С ЗУМНЕАЇ НМН УТОКБІ 5І БР С (ЗЕО ІЮ МО: 33).
Поліпептидний ланцюг варіанта людської Ес-ділянки Ідс31-підкласу з мутаціями І234А і
І235А має наступну амінокислотну послідовність:
СРРСОРАРЕАДА СОРБЗМЕ ЕРР КРКОТІ МІЗА ТРЕМТСУММО У5НЕОРЕМКЕ МУУУрамЕМН
МАКТКРАЕЕЄО УМ5ТУВМУБМ ІТМІНОСУМІМ СКЕМКСКУБМ КАГРАРІЕКТ ІЗКАКСОРАЕ
РОМУМТІРРЗА ОБ! ТКМОМ5І ТС УКагМРЗ ОІАМЕМЖМЕЗМО ОРЕММУКТТР РМ рБравеЕгЕ
ГМ5КІТУрке ВМО, ММУЕ5С ЗУМНЕАЇ НМН УТОКБІ 5І БР С (ЗЕО ІЮ МО: 34).
Поліпептидний ланцюг варіанта людської Ес-ділянки ІдСі-підкласу з мутаціями І234А,
ІЇ235А, 73665, І З68А і у407М має наступну амінокислотну послідовність:
СРРСОРАРЕАДА СОРБЗМЕ ЕРР КРКОТІ МІЗА ТРЕМТСУММО У5НЕОРЕМКЕ МУУУрамЕМН
МАКТКРАЕЕЄО УМ5ТУВМУБМ ІТМІНОСУМІМ СКЕМКСКУБМ КАГРАРІЕКТ ІЗКАКСОРАЕ
РОМУМТІРРЗА ОБ ТКМОУ5І САМУКОаЕМРО ОІАМЕМЖМЕЗМО ОРЕММУКТТР РМ'рБравеЕг
ГУБКІТУрКк ЕМО, ММУЕ5С ЗУМНЕАЇ НМН УТОКБІ 5І БР С (ЗЕО І МО: 35).
Поліпептидний ланцюг варіанта людської Ес-ділянки ІдСі-підкласу з мутаціями І234А,
І235А і ТЗ366М/ має наступну амінокислотну послідовність:
СРРСОРАРЕАДА СОРБЗМЕ ЕРР КРКОТІ МІЗА ТРЕМТСУММО У5НЕОРЕМКЕ МУУУрамЕМН
МАКТКРАЕЕЄО УМ5ТУВМУБМ ІТМІНОСУМІМ СКЕМКСКУБМ КАГРАРІЕКТ ІЗКАКСОРАЕ
РОММУМТІРРЗА ОБ! ТКМОМ5І М/С УКагМРЗ ОІАМЕМЕЗМО ОРЕММУКТТР РМ'рБравзеЕг
ГМ5КІТУрке ВМО, ММУЕ5С ЗУМНЕАЇ НМН УТОКБІ 5І БР С (ЗЕО І МО: 36).
Поліпептидний ланцюг варіанта людської Ес-ділянки ІдСі-підкласу з мутаціями І234А, 1235А і РЗ29С має наступну амінокислотну послідовність:
СРРСОРАРЕАДА СОРБЗМЕ ЕРР КРКОТІ МІЗА ТРЕМТСУММО У5НЕОРЕМКЕ МУУУрамЕМН
МАКТКРАЕЄО УМЗТУВУМ5М ІТМІНОСУМІМ СКЕМКСКУОМ КАЇСАРІЕКТ ІЗКАКСОРАЕ
РОМУМТІРРЗА ОБ! ТКМОМ5І ТС УКагМРЗ ОІАМЕМЖМЕЗМО ОРЕММУКТТР РМ рБравеЕгЕ
ГМ5КІТУрке ВМОбаММУЕ5С ЗУМНЕАЇ НМН УТОКБІ 5І БР С (ЗЕО ІЮ МО: 37).
Поліпептидний ланцюг варіанта людської Ес-ділянки ІдСі-підкласу з мутаціями І234А,
І235А, РЗ2гОС, 13665, І З368А і У407М має наступну амінокислотну послідовність:
СРРСОРАРЕАДА СОРБЗМЕ ЕРР КРКОТІ МІЗА ТРЕМТСУММО У5НЕОРЕМКЕ МУУУрамЕМН
МАКТКРАЕЄО УМЗТУВУМ5М ІТМІНОСУМІМ СКЕМКСКУОМ КАЇСАРІЕКТ ІЗКАКСОРАЕ
РОМУМТІРРЗА ОБ ТКМОУ5І САМУКОаЕМРО ОІАМЕМЖМЕЗМО ОРЕММУКТТР РМ'рБравеЕг
ГУБКІТУрКк ЕМО, ММУЕ5С ЗУМНЕАЇ НМН УТОКБІ 5І БР С (ЗЕО ІЮ МО: 38).
Поліпептидний ланцюг варіанта людської Ес-ділянки ІдСі-підкласу з мутаціями І234А,
І235А, РЗ29С і ТЗ366МУ має наступну амінокислотну послідовність:
СРРСОРАРЕАДА СОРБЗМЕ ЕРР КРКОТІ МІЗА ТРЕМТСУММО У5НЕОРЕМКЕ МУУУрамЕМН
МАКТКРАЕЄО УМЗТУВУМ5М ІТМІНОСУМІМ СКЕМКСКУОМ КАЇСАРІЕКТ ІЗКАКСОРАЕ
РОММУМТІРРЗА ОБ! ТКМОМ5І М/С УКагМРЗ ОІАМЕМЕЗМО ОРЕММУКТТР РМ'рБравзеЕг
ГМ5КІТУрке ВМО, ММУЕ5С ЗУМНЕАЇ НМН УТОКБІ 5І БР С (ЗЕО ІЮ МО: 39).
Поліпептидний ланцюг варіанта людської Ес-ділянки ІдСі-підкласу з мутаціями І234А,
Зо І235А, РЗ2ОСІ, 3490, 13665, І З368А і У407М має наступну амінокислотну послідовність:
СРРСОРАРЕАДА СОРБЗМЕ ЕРР КРКОТІ МІЗА ТРЕМТСУММО У5НЕОРЕМКЕ МУУУрамЕМН
МАКТКРАЕЄО УМЗТУВУМ5М ІТМІНОСУМІМ СКЕМКСКУОМ КАЇСАРІЕКТ ІЗКАКСОРАЕ
РОМСТІРРБА ОБ! ТКМОУМ5І 5САУКОаЕМРЗ ОІАМЕЖМЕЗМО ОРЕММУКТТР РМ рБравеЕгЕ
ГУБКІТУрКк ЕМО, ММУЕ5С ЗУМНЕАЇ НМН УТОКБІ 5І БР С (ЗЕО ІЮ МО: 40).
Поліпептидний ланцюг варіанта людської Ес-ділянки ІдСі-підкласу з мутаціями І234А,
ІЇ235А, РЗ29С, 53540 і ТЗ66МУ має наступну амінокислотну послідовність:
СРРСОРАРЕАДА СОРБЗМЕ ЕРР КРКОТІ МІЗА ТРЕМТСУММО У5НЕОРЕМКЕ МУУУрамЕМН
МАКТКРАЕЄО УМЗТУВУМ5М ІТМІНОСУМІМ СКЕМКСКУОМ КАЇСАРІЕКТ ІЗКАКСОРАЕ
РОММТІРРСВА ОБ! ТКМОМ5І МУСІ УКаБЕМРО БІАМЕЖМЕЗМО ОРЕММУКТТР РМ'рБравеЕг
ГМ5КІТУрке ВМОбаММУЕ5С ЗУМНЕАЇ НМН УТОКБІ 5І 5Р С (5ЕО ІЮ МО: 41).
Поліпептидний ланцюг варіанта людської Ес-ділянки ІдСі-підкласу з мутаціями І234А,
І235А, РЗ2гОСІ, 53540, 13665, І З368А і У407М має наступну амінокислотну послідовність:
СРРСОРАРЕАДА СОРБЗМЕ ЕРР КРКОТІ МІЗА ТРЕМТСУММО У5НЕОРЕМКЕ МУУУрамЕМН
МАКТКРАЕЄО УМЗТУВУМ5М ІТМІНОСУМІМ СКЕМКСКУОМ КАЇСАРІЕКТ ІЗКАКСОРАЕ
РОМУМТІРРСВА ОБЇТКМОУМ5І 5САМУКОаЕМРЗ ОІАМЕЖМЕЗМО ОРЕММУКТТР РМ рБравеЕгЕ
ГУБКІТУрКк ЕМО, ММУЕ5С ЗУМНЕАЇ НМН УТОКБІ 5І 5Р С (ЗЕО ІЮ МО: 42).
Поліпептидний ланцюг варіанта людської Ес-ділянки ІдСі-підкласу з мутаціями І234А,
ІЇ235А, РЗ29С, 3490 і ТЗ66МУ має наступну амінокислотну послідовність:
СРРСОРАРЕАДА СОРБЗМЕ ЕРР КРКОТІ МІЗА ТРЕМТСУММО У5НЕОРЕМКЕ МУУУрамЕМН
МАКТКРАЕЄО УМЗТУВУМ5М ІТМІНОСУМІМ СКЕМКСКУОМ КАЇСАРІЕКТ ІЗКАКСОРАЕ
РОМСТІРРБА ОБ! ТКМОМ5І МУСІ УКаБЕМРО БІАМЕЖМЕЗМО ОРЕММУКТТР РМ'рБравеЕг
ГМ5КІТУрке ВМОбаММУЕ5С ЗУМНЕАЇ НМН УТОКБІ 5І БР С (ЗЕО ІЮ МО: 43).
Поліпептидний ланцюг варіанта людської Ес-ділянки Ід(31-підкласу з мутаціями І25ЗА,
НЗІОА і Н4іЗБА має наступну амінокислотну послідовність:
СРРОРАРЕЇЇ СОРБОУБЕРР КРКОТІ МАЗА ТРЕМТСУММО М5НЕОРЕУМКЕ МУУУраТмЕМУН
МАКТКРАЕЕЄО УМ5ТУВУУМБ5М ІТМАОСУМІМ СКЕМКСКМ5ОМ КАЇРАРІЕКТ ІЗКАКСОРАЕ
РОМУМТІРРЗА ОБ! ТКМОМ5І ТС УКагМРЗ ОІАМЕМЖМЕЗМО ОРЕММУКТТР РМ рБравеЕгЕ
ГМ5КІТУрке ВМО, ММУЕ5ОС ЗММНЕАЇ НМА УТОКОБІ БІ БР С (5ЕО ІЮ МО: 44).
Поліпептидний ланцюг варіанта людської Ес-ділянки ІдДС1-підкласу з мутаціями НЗІОА, бо НаЗЗА і У4З36А має наступну амінокислотну послідовність:
СРРОРАРЕЇЇ СОРБОМЕБ ЕРР КРКОТІМІЗВ ТРЕМТСМУМО УМ5НЕОРЕМКЕ МУУМраМЕМН
МАКТКРАЕЕО ММ5ТУВММБ5М ІТМАООМІМ ОКЕУКСКМУМО5М КАЇ РАРІЕКТ І5БКАКООРАЕ
РОМУТІРРБА ОБ ТКМОМ5І ТС МКаБМРО ОІАМЕМЕЗМО ОРЕММУКТТР РМІ О5БООаБЕЕ
ГМ5КІТУрке ВМО, ММУЕ5С ЗУМНЕАЇАМН АТОКОБІ 5І 5Р С (5ЕО ІЮ МО: 45).
Поліпептидний ланцюг варіанта людської Ес-ділянки ІдДС1-підкласу з мутаціями М252У, 52541 і Т256Е має наступну амінокислотну послідовність:
СРРОРАРЕЇЇ СОРБОМЕБ ЕРР КРКОТІ МІТА ЕРЕМТСМУМО М5НЕОРЕМКЕ МУМУрОаМЕМН
МАКТКРАЕЕО УМ5ТМВУМБМ ІТМІНОСУМІМ ОКЕМКСКУ5М КАЇ РАРІЕКТ І5БКАКООРАЕ
РОМУТІРРБА ОБ ТКМОМ5І ТС МКаБМРО ОІАМЕМЕЗМО ОРЕММУКТТР РМІ О5БООаБЕЕ
ГМ5КІТУрке ВМО, ММУЕ5С ЗУМНЕАЇ НМН УТОКБІ 5І БР С (ЗЕО ІЮ МО: 46).
Поліпептидний ланцюг людської Ес-ділянки дикого типу Ідса4-підкласу має наступну амінокислотну послідовність:
СРОСРАРЕР СОРБОБМЕ ЕРР КРКОТІМІЗВ ТРЕМТСОМУММО МБОБЕОРЕМОЕЄ МУМУраТмЕМН
МАКТКРАЕЕО ЕМ5ТУВУМБМ ІТМІНОСУМІМ СКЕМУКСКУБМ КОСІ РБОУБІЕЄКТ ІЗКАКСООРВАВЕ
РОМУТІРРБО ЕЕМТКМОМ5І ТС МКагМР5 ОІАМЕЖМЕВМО ОРЕММУКТТР РМІ О5БОрОаБЕЕ
ГМ5ВАТУОК5 ВУМОБС,ММЕ5ОС ЗУММНЕАНМН ТОК БІ 51 с (ЗЕО І МО: 47).
Поліпептидний ланцюг варіанта людської Ес-ділянки Ід(14-підкласу з мутаціями 5228Р і
І235Е має наступну амінокислотну послідовність:
СРРСОРАРЕРЕ СОРОМЕ ЕРР КРКОТІ МІЗВ ТРЕМТСУМММО МБОЕБЕОРЕМОЕЄ МУ МУраТамЕМН
МАКТКРАЕЕО ЕМ5ТУВУМБМ ІТМІНОСУМІМ СКЕМУКСКУБМ КОСІ РБОУБІЕЄКТ ІЗКАКСООРВАВЕ
РОМУТІРРБО ЕЕМТКМОМ5І ТС МКагМР5 ОІАМЕЖМЕВМО ОРЕММУКТТР РМІ О5БОрОаБЕЕ
ГМ5ВАТУОК5 ВУМОБС,ММЕ5ОС ЗУММНЕАНМН ТОК БІ 51 с (ЗЕО І МО: 48).
Поліпептидний ланцюг варіанта людської Ес-ділянки ІдСі4-підкласу з мутаціями 5228Р, 1235Е і РЗ29С має наступну амінокислотну послідовність:
СРРСОРАРЕРЕ СОРОМЕ ЕРР КРКОТІ МІЗВ ТРЕМТСУМММО МБОЕБЕОРЕМОЕЄ МУ МУраТамЕМН
МАКТКРАЕЕО ЕМ5ТУВМУ5М ІТМІНОСУУМІМ СКЕМКСКУ5М КОаїс55ІЕКТ ІЗКАКООРВАВЕ
РОМУТІРРБО ЕЕМТКМОМ5І ТС МКагМР5 ОІАМЕЖМЕВМО ОРЕММУКТТР РМІ О5БОрОаБЕЕ
ГМ5ВАТУОК5 ВУМОБС,ММЕ5ОС ЗУММНЕАНМН ТОК БІ 51 с (ЗЕО І МО: 49).
Поліпептидний ланцюг варіанта людської Ес-ділянки ІдСі4-підкласу з мутаціями 5228Р,
Зо ІЇ235Е, РЗ29С, 13665, І З368А і У407М має наступну амінокислотну послідовність:
ЕЗБКМОаРРСОРР СРАРЕРЕСОР 5МБРІ ЕРРКРК ОТІМІЗВТРЕ МТСУМУМОМ50 ЕОРЕМОЄММ/У
МООМЕУНМАК ТКРАЕЕОЕМО ТУвВМУ5МІТМ ІНООМІМОКЕ МКСКУБМКОЇ Са55І1ЕКТІВК
АКОСОРАВЕРОМ УТІРРБОЕБЕЕМ ТКМОМ5ІБСА УКОагМРБОІА МЕМЕЗМООРЕ ММУКТТРРМІ. рзравзгЕвггм5 ВІ ТМОКЗАУО ЕСММЕЗСОСЗУМ НЕАЇІ НМНУТО КІ 5І 51 СА (ЗЕО ІО МО: 50).
Поліпептидний ланцюг варіанта людської Ес-ділянки ІдСі4-підкласу з мутаціями 5228Р, 1Ї235Е, РЗ29С і ТЗ366МУ має наступну амінокислотну послідовність:
ЕЗБКМОаРРСОРР СРАРЕРЕСОР 5МБРІ ЕРРКРК ОТІМІЗВТРЕ МТСУМУМОМ50 ЕОРЕМОЄММ/У
МООМЕУНМАК ТКРАЕЕОЕМО ТУвВМУ5МІТМ ІНООМІМОКЕ МКСКУБМКОЇ Са55І1ЕКТІВК
АКОСОРАВЕРОМ МТІРРБОЕЕМ ТКМОМ5БІМУСІ МКагмМРБОІА МЕМЕБМООРЕ ММУКТТРРМІ. рзравзгЕвімь5 ВІ ТМОКЗАУО ЕСММЕЗСОСЗУМ НЕАЇІ НМНУТО КІ 5І 51 СА (ЗЕО ІЮ МО: 51). "Каркасні ділянки" або "Рг" являють собою ділянки варіабельних доменів, відмінні від залишків гіперваріабельних ділянок (НМА). Ег варіабельного домену, як правило, представлені чотирма ЕРі-доменами: Би, Ег2, РІЗ ї Ег4. Таким чином, послідовності НМА і Кут, як правило, розташовані в МН (або МІ) в наступному порядку: Еи1-НІ (1 1)-Ег2-Н2(І2)-Е3-НЗ(І 3)-ЕНга.
Поняття "повнорозмірне антитіло", "Іінтактне антитіло" і "цільне антитіло" в контексті даного опису використовуються як взаємозамінні для позначення антитіла, що має структуру, практично схожу з нативною структурою антитіла.
В контексті даного опису поняття "клітина-хазяїн", "лінія клітин-хазяїнів" і "культура клітин- хазяїнів" використовуються як взаємозамінні, і вони відносяться до клітин, в які інтродукована екзогенна нуклеїнова кислота, включаючи потомство зазначених клітин. До клітин-хазяїнів відносяться "трансформанти" і "трансформовані клітини", які включають первинні трансформовані клітини, а також потомство, що походить від них, незалежно від кількості пересівань. Потомство може не бути строго ідентичним батьківській клітині за складом нуклеїнових кислот, а може нести мутації. Під дане поняття підпадає мутантне потомство, яке має таку ж функцію або біологічну активність, що і відібрана шляхом скринінгу або селекції вихідна трансформована клітина.
Поняття "гуманізоване" антитіло відноситься до химерного антитіла, яке містить амінокислотні залишки з нелюдських НМЕ і амінокислотні залишки з людських Ег. В деяких варіантах здійснення винаходу гуманізоване антитіло може містити практично всі з принаймні 60 одного і, як правило, двох варіабельних доменів, в яких всі або практично всві НМЕ (наприклад,
СОВ) відповідають ділянкам нелюдського антитіла, а всі або практично всі Ег відповідають ділянкам людського антитіла. Гуманізоване антитіло необов'язково може містити принаймні частина константної ділянки антитіла, що походить з людського антитіла. Поняття "гуманізована форма" антитіла, наприклад, нелюдського антитіла, відноситься до антитіла, яке піддавали гуманізації.
Поняття "гіперваріабельна ділянка" або "НМА" в контексті даного опису відноситься до кожного із ділянок варіабельного домену антитіла, фрагменти амінокислотних залишків яких є гіперваріабельними за їх послідовністю ("ділянки, які визначають комплементарність" або "СОВ") і/або формують петлі певної структури ("тіперваріабельні петлі"), і/або містять залишки, що контактують з антигеном ("контакти з антигеном"). Як правило, антитіла містять шість НМА; три в МН (НІ, Н2, НЗ)ітрив МІ (11,12, 1 3).
НМА включають: (а) гіперваріабельні петлі, що включають амінокислотні залишки 26-32 (І 1), 50-52 (І 2), 91-96 (3), 26-32 (НІ), 53-55 (Н2) і 96-101 (НЗ) (Споїйіа б. і Їе5Кк А.М., У. Мої. Віо!. 196, 1987, сс. 901- 917); (6) СОВ, що включають амінокислотні залишки 24-34 (І 1), 50-56 (І 2), 89-97 (І 5), 31-35Б (НІ), 50-65 (Н2) і 95-102 (НЗ) (КаБбаї Е.А. та ін., Зедиепсевз ої Ргоїєїп5 ої Іттипоіодісаї! Іпіегеві, 5-те вид., вид-во Рибіїс Неайй бегуісе, Маїйопаї! Іпзійшев ої Неєаїййп, Веїпезаа, МО, 1991, публикація
МІН 91-3242); (в) ділянки контакта з антигеном, що включають амінокислотні залишки 27-36 (11), 46-55 (12), 89-96 (І 3), 30-356 (НІ), 47-58 (Н2) і 93-101 (НЗ) (МасСайшт та ін., у). Мої. Віої. 262, 1996, со. 732-145); 1 (г) комбінації залишків, вказаних в підпунктах (а), (б) і/або (в), що включають амінокислотні залишки НМА 46-56 (12), 47-56 (І 2), 48-56 (12), 49-56 (12), 26-35 (НІ), 26-356 (НІ), 49-65 (Н2г), 93-102 (НЗ) і 94-102 (НЗ).
Якщо не вказано інше, то НУВ-залишки та інші залишки в варіабельному домені (наприклад,
Еі-залишки) нумерують в даному описі відповідно до КарБбаї та ін., вище.
Поняття "імунокон'югат" відноситься до антитіла, кон'югованого з однією або декількома молекулою(ами), включаючи (але не обмежуючись тільки цим) цитотоксичний агент.
Зо "Індивід" або "суб'єкт" є ссавцем. Ссавці є (але не обмежуючись тільки ними) одомашненими тваринами (наприклад, коровами, вівцями, кішками, собаками і конями), приматами (наприклад, людьми і приматами крім людини, такими як мавпи), кроликами і гризунами (наприклад, мишами та щурами). В деяких варіантах здійснення винаходу індивідуум або суб'єкт являє собою людину. "Виділений" кільцевий злитий поліпептид, тобто двокільцевий злитий поліпептид або багатокільцевий злитий поліпептид, являє собою поліпептид, відокремлений від компонента його природного середовища. В деяких варіантах здійснення винаходу кільцевий злитий поліпептид очищають до чистоти, що перевищує 9595 або 9995 за даними, наприклад, електрофоретичних аналізів (таких, наприклад, як ДСН-ПААГ, ізоелектричне фокусування (ІЕФ), капілярний електрофорез) або хроматографічних аналізів (таких, наприклад, як іонообмінна хроматографія або РХВР з оберненою фазою). Огляд методів оцінки чистоти див., наприклад, у
Ніаїтап 5. та ін., У. Спгот. В 848, 2007, сс. 79-87. "Виділена" нуклеїнова кислота являє собою молекулу нуклеїнової кислоти, яка відокремлена від компонента її природного середовища. Виділена нуклеїнова кислота включає молекулу нуклеїнової кислоти, що міститься в клітині, яка в нормі включає молекулу нуклеїнової кислоти, але в якій молекула нуклеїнової кислоти присутня поза хромосомою або в якій її локалізація на хромосомі відрізняється від її локалізації на хромосомі, що зустрічається в природних умовах.
Поняття "виділена нуклеїнова кислота, що кодує (багато)кільцевий злитий поліпептид" відноситься до однієї (в разі гомомультимерного (багато)кільцевого злитого поліпептиду) або декількох (в разі гетеромультимерного (багато)кільцевого злитого поліпептиду) молекул нуклеїнових кислот, кожна з яких кодує одноланцюговий поліпептид кільцевого злитого поліпептиду, включаючи таку(ї) молекулу(и) нуклеїнової(их) кислоти(т), яка(ї) перебуває(ють) в одному векторі в різних векторах і, таку() молекулу(и) нуклеїнової(их) кислоти(т), яка) присутній(ї) в одному або декількох ділянках в клітині-хазяїні.
Поняття "легкий ланцюг" означає більш короткий ланцюг нативних антитіл ЇІдс-класу. Легкий ланцюг антитіла може належати до одного з двох типів, позначених каппа (к) і лямбда (Х), на основі амінокислотної послідовності константного домену (див. ЗЕО ІЮ МО: 52, що являє собою константний домен людського легкого каппа-ланцюга, і 5ЗЕО ІЮО МО: 53, що являє собою 60 константний домен людського легкого лямбда-ланцюга).
Поняття "моноклональне антитіло" в контексті даного опису відноситься до антитіла, одержаного з популяції практично гомогенних антитіл, тобто індивідуальні антитіла, що входять в популяцію, є ідентичними і/або зв'язуються з одним і тим же епітопом, за винятком можливих варіантів антитіл, наприклад таких, які містять мутації, що зустрічаються в природних умовах, або виникають в процесі виробництва препарату моноклонального антитіла, зазначені варіанти, як правило, присутні в мінорних кількостях. На відміну від препаратів поліклональних антитіл, які як правило, включають різні антитіла до різних детермінантів (епітопів), кожне моноклональне антитіло з препарату моноклонального антитіла направлено проти однієї детермінанти антигену. Таким чином, прикметник "моноклональний" визначає особливість антитіла, характеризуючи його як одержане з практично гомогенної популяції антитіл, а не сконструйоване відповідно до вимог до одержання антитіла за допомогою будь-якого конкретного методу. Наприклад, моноклональні антитіла, які можна застосовувати відповідно до даного винаходу, можна створювати за допомогою різних технологій, включаючи (але не обмежуючись тільки ними) метод гібридом, методи рекомбінантних ДНК, методи фагового дисплея і методи на основі трансгенних тварин, які містять всі або частину локусів імуноглобуліну, зазначені методи та інші наведені як приклади методи одержання моноклональних антитіл представлені в даному описі.
Поняття "голий кільцевий злитий поліпептид" відноситься до кільцевого злитого поліпептиду, який некон'югований з фрагментом (наприклад, цитотоксичним фрагментом) або радіоактивною міткою. Голий кільцевий злитий поліпептид може бути присутнім в фармацевтичній композиції.
Наприклад, нативні антитіла у вигляді ЇД є гетеротетрамерними глікопротеїнами масою приблизно 150000 Да, що складаються з двох ідентичних легких ланцюгів і двох ідентичних важких ланцюгів, зв'язаних дисульфідними містками. Кожний важкий ланцюг в напрямку від М- кінця до С-кінця містить варіабельну ділянку (МН), яку називають також варіабельним важким доменом або варіабельним доменом важкого ланцюга, за яким розташовані три константні домени (СНІ, СН2 ї СНЗ), при цьому між першим і другим константним доменом локалізована шарнірна ділянка. Аналогічно цьому, кожний легкий ланцюг в напрямку від М- до С-кінця містить варіабельну ділянку (МІ), яку називають також варіабельним легким доменом або варіабельним
Зо доменом легкого ланцюга, за яким розташований константний легкий (С!) домен. Легкий ланцюг може відноситись до одного з двох типів, позначених як каппа (к) або лямбда (Х), на основі амінокислотної послідовності його константного домену.
Поняття "листівка-вкладиш в упаковку" в контексті даного опису відноситься до інструкцій, які звичайно поміщають в упаковки терапевтичних продуктів, що надходять у продаж, які містять інформацію про показання, застосування, дози, шляхи введення, комбіновану терапію, протипоказання і/або запобіжні заходи при застосуванні зазначених терапевтичних продуктів.
Поняття "паратоп" відноситься до частини даної молекули антитіла, яка потрібна для специфічного зв'язування між мішенню і сайтом зв'язування. Паратоп може бути неперервним, тобто може складатись із суміжних амінокислотних залишків, присутніх в сайті зв'язування, або може бути переривчастим, тобто може складатись з амінокислотних залишків, що знаходяться в різних положеннях в первинній послідовності мішені, такої як амінокислотна послідовність амінокислотних залишків СОМ, але знаходяться в тісній близькості в тримерній структурі, характерній для сайта зв'язування.
Поняття "пептидний лінкер"- відноситься до лінкера природного і/або синтетичного походження. Пептидний лінкер складається з лінійного ланцюга амінокислот, в якому 20 амінокислот, які зустрічаються в природних умовах, є мономерними конструктивними блоками, з'єднаними пептидними зв'язками. Ланцюг має в довжину від 1 до 50 амінокислотних залишків, переважно від 1 до 28 амінокислотних залишків, найбільш переважно від З до 25 амінокислотних залишків. Пептидний лінкер може містити повторювані амінокислотні послідовності або послідовності поліпептидів, які зустрічаються в природних умовах. Пептидний лінкер має здатність гарантувати, що домени кільцевого злитого поліпептиду можуть здійснювати їх біологічну активність, даючи доменам правильно укладатись і відповідним чином презентувати. Переважно пептидний лінкер є "синтетичним пептидним лінкером", який створюють так, щоб він був збагачений залишками гліцину, глутаміну і/або серину. Ці залишки організовані, наприклад, у вигляді невеликих повторюваних ланок, що містять аж до 5 амінокислот, таких як (05 (5ЕО ІЮ МО: 54), ОСОО5 (ЗЕО ІЮ МО: 55), 0000 (5ЕО ІЮО МО: 56),
ОО (ЗЕО ІЮО МО: 57), 5555 (5ЕБО ІЮ МО: 58) або 55555 (5ЕО ІЮ МО: 59). Зазначена невелика повторювана ланка може повторюватись 2-5 разів, утворюючи мультимерну ланку, таку, наприклад, як ((505655)2 (5ЕО ІЮ МО: 60), (505655)3 (ЗЕО ІЮО МО: 61), (5505)4 (ЗЕО ІЮ МО: 60 62), (5505)5 (ЗЕО ІЮ МО: 63), (30505055)2 (ЗЕО ІЮ МО: 64), (5050055)3 (ЗЕО ІЮ МО: 65) або
(60005)4 (ЗЕО ІО МО: 66). На аміно- і/або карбоксильний кінець мультимерної ланки можна додавати аж до 6 додаткових довільних амінокислот, які зустрічаються в природних умовах.
Інші синтетичні пептидні лінкери складаються з однієї амінокислоти, яка повторюється від 10 до 20 разів, і можуть містити на аміно- і/або карбоксильному кінці аж до 6 додаткових довільних амінокислот, які зустрічаються в природних умовах, наприклад, серин в лінкері с5Б555555555555550 (5БО ІЮ МО: 67). Всі пептидні лінкери можуть кодуватись молекулою нуклеїнової кислоти і тому їх можна рекомбінантно експресувати. Оскільки лінкери самі по собі являють собою пептиди, то пептид з антифузогенною активністю з'єднують з лінкером через пептидний зв'язок, що утворюється між двома амінокислотами. "Відсоток (95) ідентичності амінокислотної послідовності" по відношенню до поліпептидної референс-послідовності визначають як відсоток амінокислотних залишків в послідовності- кандидаті, які ідентичні амінокислотним залишкам в поліпептидній референс-послідовності, після вирівнювання послідовностей та інтродукції за необхідності пустот для досягнення максимального відсотка ідентичності послідовностей, і при цьому будь-які консервативні заміни не враховуються при оцінці ідентичності послідовностей. Порівняльний аналіз для визначення відсотка ідентичності амінокислотних послідовностей можна здійснювати різними шляхами, які знаходяться в компетенції спеціаліста в даній галузі, наприклад, з використанням публічно доступних комп'ютерних програм, таких як програма ВГА5Т, ВІ АБТ-2, АГІСМ або Медадаїїдн (ОМАЗТАБР). Спеціалісти в цій галузі можуть визначати відповідні параметри для вирівнювання послідовностей, включаючи будь-які алгоритми, необхідні для досягнення максимального вирівнювання по всій довжині порівнюваних послідовностей. Проте для цілей даного винаходу величину 95 ідентичності амінокислотних послідовностей отримують з використанням призначеної для порівняння послідовностей комп'ютерної програми АГІСМ-2. Призначена для порівняння послідовностей комп'ютерна програма АГІСМ-2 розроблена фірмою Сепепіесі, Іпс., і вихідний код поміщений на зберігання разом з документацією для користувача в О.5. Соругідні
Опйісе, Мазпіпдюп 0.С., 20559, де він зареєстрований під реєстраційним номером Ш.5. Соругідні
Кедівігайоп, Мо ТХО510087. Програма АГІСМ-2 являє собою публічно доступну програму фірми
Сепепіесі, Іпс., Південний Сан-Франциско, шт. Каліфорнія, або її можна компілювати з вихідного коду. Програму АСГІОМ-2 можна компілювати для застосування в операційній системі
Зо МІХ, включаючи цифрову версію МІХ М4.00. В програмі АСІСМ-2 всі параметри для порівняння послідовностей є заданими і не повинні змінюватись. В ситуаціях, коли АГІМ-2 застосовують для порівняння амінокислотних послідовностей, 9о ідентичності амінокислотних послідовностей даної амінокислотної послідовності А по відношенню до або порівняно з даною амінокислотною послідовністю Б (яку інакше кажучи можна позначати як дану амінокислотну послідовність А, яка має або відрізняється певним 95 ідентичності амінокислотної послідовності по відношенню до або порівняно з даною амінокислотною послідовністю Б), розраховують наступним чином: 100 х частка Х/У, де Х позначає кількість амінокислотних залишків, оцінених програмою порівняльного аналізу послідовностей АЇ ЇМ-2 як ідентичні збіги при порівняльному аналізі послідовностей А та Б за допомогою зазначеної програми, і де У означає загальну кількість амінокислотних залишків в Б.
Має бути очевидним, що, коли довжина амінокислотної послідовності А не дорівнює довжині амінокислотної послідовності Б, то965 ідентичності амінокислотної послідовності А по відношенню до амінокислотної послідовності Б не повинен дорівнювати бо ідентичності амінокислотної послідовності Б по відношенню до амінокислотної послідовності А. Якщо спеціально не вказано інше, то в контексті даного опису все величини 95 ідентичності амінокислотних послідовностей одержують відповідно до процедури, описаної в останньому з попередніх параграфів, за допомогою комп'ютерної програми АСГІСМ-2.
Поняття "фармацевтична композиція" відноситься до препарату, який знаходиться в такій формі, що він забезпечує біологічну активність діючої речовини, що входить до його складу, яка повинна мати ефективність, і яка не містить додаткових компонентів, що мають неприйнятну токсичність для індивідуума, якому слід вводити композицію. "Фармацевтично прийнятний носій" відноситься до інгредієнта у фармацевтичній композиції, відмінному від діючої речовини, який є нетоксичним для індивідуума. Фармацевтично прийнятні носії включають (але не обмежуючись тільки ними) буфер, ексципієнт, стабілізатор або консервант.
В контексті даного опису поняття "лікування" (і його граматичні варіації, такі як "лікувати" або "процес лікування") відноситься до клінічного втручання з метою зміни природного перебігу хвороби в індивідуума, що підлягає лікуванню, і його можна здійснювати або для профілактики, бо або в процесі розвитку клінічної патології. Необхідними діями лікування є (але не обмежуючись тільки ними) попередження виникнення або рецидиву хвороби, полегшення симптомів, зменшення будь-яких прямих або непрямих патологічних наслідків хвороби, попередження метастазів, зниження швидкості розвитку хвороби, полегшення або тимчасове послаблення хвороби і ремісія або покращення прогнозу. В деяких варіантах здійснення винаходу антитіла, запропоновані у винаході, застосовують для затримки розвитку хвороби або уповільнення прогресування хвороби.
Поняття "варіабельна ділянка" або "варіабельний домен" відноситься до домену важкого або легкого ланцюга антитіла, який бере участь у зв'язуванні антитіла з антигеном. Варіабельні домени важкого ланцюга і легкого ланцюга (МН і Мі. відповідно) нативного антитіла, як правило, мають подібні структури, при цьому кожен домен містить чотири консервативні каркасні ділянки (Рг) і три гіперваріабельні ділянки (НМК) (див., наприклад, Кіпаї Т.) та ін., Кибу Іттипоїіоду, 6б-е вид., вид-во М/Н Егеетап апа Со., 2007, с. 91). Для забезпечення специфічності зв'язування антигена може бути досить одного МН- або Мі -домену. Крім того, антитіла, які зв'язуються з конкретним антигеном, можна виділяти, використовуючи МН- або Мі-домен з антитіла, яке зв'язується з антигеном, шляхом скринінгу бібліотеки комплементарних МІ- або МН-доменів відповідно (див., наприклад, Рогіоіапо 5. та ін., у). Іттипої. 150, 1993, сс. 880-887; СіІагк5зоп Т. та ін., Маїиге 352, 1991, сс. 624-628).
В контексті даного опису поняття "вектор" відноситься до молекули нуклеїнової кислоти, яка має здатність ампліфікувати іншу нуклеїнову кислоту, з якою вона зв'язана. Поняття відноситься до вектора як структури, що самореплікується, яка містить нуклеїнові кислоти, а також до вектора, вбудованого в геном клітини-хазяїна, в яку інтродукований вектор. Деякі вектори мають здатність контролювати експресію нуклеїнових кислот, з якими вони функціонально зв'язані.
Такі вектори в контексті даного опису позначають як "експресійні вектори".
Нижче винахід описаний з використанням як прикладу вказаних нижче кільцевих злитих поліпептидів різної структури і специфічності. Вони подаються у винаході тільки як приклад.
Вони не направлені на обмеження винаходу. Справжній обсяг винаходу представлений в формулі винаходу.
ІЇ. Кільцевий злитий поліпептид, вказаний в даному описі
Даний винахід базується, принаймні частково, на відкритті того, що злиття варіабельного
Зо домену легкого ланцюга з С-кінцем (повнорозмірного) важкого ланцюга або навпаки, призводить до утворення функціонального сайта зв'язування відповідних М|Н- і Мі -доменів, тобто пара варіабельний домен легкого ланцюга і варіабельний домен важкого ланцюга в одному поліпептидному ланцюзі утворює функціональну МН/МІ-пару їі тим самим функціональний сайт зв'язування в результаті внутрішньоланцюгової циркуляризації.
Даний винахід базується, принаймні частково, на відкритті того, що можна одержувати агент, який зв'язує мішень, що містить один (кільцевий) поліпептид. У вказаному (кільцевому) поліпептиді М-кінцева ділянка містить першу частину зв'язувального домену, а С-кінцева ділянка містить другу частину зв'язувального домену. Перша частина зв'язувального домену та друга частина зв'язувального домену (в асоціації одна з одною) утворюють повний або функціональний сайт зв'язування. Тим самим поліпептид циркулюється.
Даний винахід базується, принаймні частково, на відкритті того, що можна шляхом модифікації довжини пептидного лінкера, що з'єднує індивідуальні варіабельні домени антитіла з відповідними М- ії С-кінцями центрального спейсерного домену, такого, наприклад, як поліпептиди Ес-ділянки, регулювати геометрію/відстань між двома сайтами зв'язування з одержанням (двокільцевого) димерного злитого поліпептиду.
Даний винахід базується, принаймні частково, на відкритті того, що геометрія зв'язування димерного, тобто двокільцевого злитого поліпептиду, може змінюватись залежно від довжин першого лінкера і другого лінкера (тобто від співвідношення довжин лінкерів). Тим самим можна фіксувати геометрію дво Рар-подібних зв'язуювальних плечей один відносно одного.
В даному описі представлений кільцевий злитий поліпептид, який містить першу частину зв'язувального домену, другу частину зв'язувального домену і спейсерний домен, в якому - спейсерний домен являє собою поліпептид, наприклад, який утворює структурний домен після фолдінгу, - перша частина зв'язувального домену являє собою поліпептид і злита через перший пептидний лінкер з М-кінцем спейсерного домену, - друга частина зв'язувального домену являє собою поліпептид і злита через другий пептидний лінкер з С-кінцем спейсерного домену, - перша частина зв'язувального домену та друга частина зв'язувального домену (одного і того ж злитого поліпептиду) асоційовані одна з одною і утворюють (функціональний) сайт бо зв'язування, який специфічно зв'язується з мішенню.
Перша частина зв'язувального домену та друга частина зв'язувального домену можуть бути нековалентно або ковалентно асоційовані одна з одною. Якщо асоціація є ковалентною, то вона здійснюється за допомогою зв'язку, відмінного від пептидного зв'язку, наприклад, за допомогою дисульфідного зв'язку.
Спейсерний домен являє собою поліпептид, який утворює структурний домен після фолдінгу. Так, спейсерний домен може складатись з менше ніж 100 амінокислотних залишків, але повинен бути структурно обмежений так, щоб фіксувати зв'язувальні мотиви. Прикладами спейсерних доменів є пентамерні структури типу соїЇ-соїї5 (суперспіралізована са-спіраль), шарнірні ділянки антитіл або Ес-ділянки антитіл або їх фрагменти.
Кільцевий злитий поліпептид, вказаний в даному описі, являє собою одноланцюговий поліпептид. Загальна структура кільцевого злитого поліпептиду представлена на фіг. 1.
Як вказано в даному описі, він являє собою димерний, тобто двокільцевий, злитий поліпептид, який містить перший кільцевий злитий поліпептид, вказаний в даному описі, та другий кільцевий злитий поліпептид, вказаний в даному описі, в якому перший та другий кільцеві злиті поліпептиди є ідентичними або різними, і в якому спейсерний домен першого кільцевого злитого поліпептиду кон'югований зі спейсерним доменом другого кільцевого злитого поліпептиду за допомогою принаймні одного непептидного зв'язку, в одному із варіантів здійснення винаходу за допомогою принаймні одного дисульфідного зв'язку.
В цьому разі спейсерний домен являє собою димеризуючий домен, тобто структурною особливістю спейсерного домену є його функціональність по відношенню до димеризаціїї.
Аналогічно цьому, можна одержувати тримерні, тобто трикільцеві, злиті поліпептиди і тетрамерні, тобто чотирикільцеві, злиті поліпептиди, якщо як спейсерний домен застосовуть відповідно тримеризуючий домен або тетрамеризуючий домен.
Багатокільцеві злиті поліпептиди, вказані в даному описі, позначають також як Сопіогзроду.
Загальна структура двокільцевого злитого поліпептиду/Сопіот5роду представлена на фіг. 2А (з димеризуючим спейсерним доменом) і 2Б (без димеризуючого спейсерного домену), трикільцевого злитого поліпептиду/Сопіогзроду представлена на фіг. 3, а чотирикільцевого злитого поліпептиду/Сопіогзроду представлена на фіг 4А (з тетрамеризуючим спейсерним доменом) і 4Б (без тетрамеризуючого спейсерного домену).
Якщо спейсерний домен являє собою Ес-ділянка антитіла, як наприклад, в разі димеризуючого домену, а зв'язувальні домени являють собою фрагменти важкого і легкого ланцюга Раб антитіла, то вказаний специфічний поліпептид Сопіогзроду має форму антитіла.
Порівняно зі звичайними антитілами ІдС-типу в Сопіогзроду використовується тільки один ланцюг, а не важкий і легкий ланцюги. Особливістю Сопіогзроду є те, що кодуюча послідовність
Ес-ділянки локалізована між важким ланцюгом Еар-фрагмента і легким ланцюгом РЕар- фрагмента.
Вказану специфічну молекулу Сопіогтероду застосовуть нижче для демонстрації специфічних властивостей двокільцевого злитого поліпептиду, вказаного в даному описі. Крім
Еаб-фрагментів можна застосовувати також виділені варіабельні домени як частини сайта зв'язування.
Одноланцюгові злиті поліпептиди, вказані в даному описі, зі спейсерним доменом "шарнір-
Сн2г-СнНЗ" як димеризуючий домен між важким ланцюгом Рар-фрагмента і легким ланцюгом
Еар-фрагмента димеризуються через їх Ес-ділянки, які тим самим утворюють повний ЕС-домен антитіла, що презентує два Рар, де два Рар фіксовані у визначеній орієнтації один відносно одного. На противагу цьому, в звичайному антитілі ІдС1ї-типу два Раб є більше гнучкими і орієнтовані істотно відмінним від вказаного чином.
Геометрію двох сайтів зв'язування один відносно одного можна модулювати в Сопіот5роду за допомогою довжини застосовуваних лінкерів. Орієнтація і просторова відстань між сайтами зв'язування звичайного антитіла ІдСі-типу і двокільцевого злитого білка, вказаного в даному описі в наведених як приклад варіантах здійснення винаходу, представлені на фіг. 5.
Просторова відстань між сайтами зв'язування канонічного антитіла І(дДСсі-типу складає 80 А або більше. Просторова відстань між сайтами зв'язування двокільцевого злитого поліпептиду, вказаного в даному описі, може складати від приблизно 20 до приблизно 50 А залежно від довжини і співвідношення довжин пептидних лінкерів в індивідуальних кільцевих злитих поліпептидах, які утворюють двокільцевий злитий поліпептид. Пептидний лінкер вибирають залежно від необхідної геометрії. В одному із варіантів здійснення винаходу пептидні лінкери вибирають незалежно один від одного з групи, пептидних лінкерів, яка складається з 5ЕО ІЮ
МО: 54-5ЕО ІО МО: 70.
І.1. Моноспецифічні багатокільцеві злиті поліпептиди, вказані в даному описі
Моноспецифічний багатокільцевий злитий поліпептид містить два або більшу кількість кільцевих злитих поліпептидів, вказаних в даному описі, при цьому, кожний з кільцевих злитих поліпептидів специфічно зв'язується з одним і тим же епітопом на одній і тій же мішені, тобто містить однаковий сайт зв'язування.
Прикладом моноспецифічного багатокільцевого злитого поліпептиду є анти-Нег2
Сопіогероау (містить кільцевий злитий поліпептид, який має 5ЕО І МО: 96). Його одержували шляхом трансфекції НЕК293-клітин вектором, який містить нуклеотидну послідовність, що кодує кільцевий злитий поліпептид.
Було встановлено, що загальноприйнята афінна хроматографія на білку А придатна для екстракції фракції супернатанта культури, що містить Ес-ділянку. Альтернативно цьому, з метою очистки можна застосовувати гексагістидинову С-кінцеву мітку (ЗЕО ІО МО: 03), з'єднану через пептидний лінкер 150.
Препаративну гель-фільтрацію застосовували як другу стадію очистки для відокремлення кільцевого злитого поліпептиду від зв'язаних з продуктом домішок, структур кільцевого злитого поліпептиду найбільш високого порядку (невелика частина агрегатів також помітна на хроматограмі, як і в разі антитіла ІдсС-типу) (див. фіг. 15). Як правило, вихід зазначених конструкцій становив у середньому 10 мг/л. Анти-Нег2 Сопіог5роду екпресували у вигляді декількох партій (збовтані колби місткістю від 0,5 до 2 л). Якість продукту аналізували за допомогою мас-спектрометрії (див. фіг. 6). Ідентичність продукту підтверджена рівнем чистоти вище 95 95.
Зв'язування анти-Нег2 СопіогеБроду в двокільцевій формі (пор. фіг. 2А) і чотирикільцевій формі (пор. фіг. 4Б) визначали за допомогою поверхневого плазмонного резонансу (5РА, наприклад, ВіІАсогеє) в двох різних експериментальних умовах для оцінки афінності та авідності молекул порівняно з канонічним антитілом до Нег2 Іда-типу.
При здійсненні аналізу в перших експериментальних умовах (1 в наведеній нижче таблиці; оцінка афінності) відповідну молекулу анти-Нег2 Сопіогтербоду захоплювали за допомогою антитіла до людської Ес-ділянки, кон'югованого з поверхнею 5РВ-чіпа. Як аналіт застосовували позаклітинний домен (ЕСО) Нег!2. При здійсненні аналізу в других експериментальних умовах (2 в наведеній нижче таблиці; оцінка авідності) антитіл до Нег2 пертузумаб (надходить у продаж як
Зо Регієїта"")) іммобілізували на поверхні чіпа і застосовували для захоплення ЕСО Нег!2. Як аналіт застосовували відповідну молекулу Сопіогероду. Авідність референс-антитіла ІдС-типу трастузумабу, двовалентної молекули анти-Нег2 Сопіог5роду і чотиривалентної молекули анти-
Нег2 Сопіот5роду вимірювали з використанням серій концентрацій аналіту. Як референс- антитіло в обох експериментальних умовах застосовували антитіло до Нег2 трастузумаб (надходить у продаж як Негсеріїп'Р)), ментальні Молекула й З й Втах умови оодм'єт | 0-1 | мін (М) | експер.теор.
Сопіогзрой
Сопіогерой
Сопіогерой опіогзрой
Молекула Сопіогероду є суттєво більш компактною порівняно з канонічним антитілом Іда- типу.
Молекули анти-Нег2 Сопіогероду тестували з використанням аналізу проліферації.
Аналогічно даним, отриманим зспеег зі співавторами (5спеег та ін., Р о5 Опе 7, 2012 е51817), які застосовували хімічно перехресно зшиті Габ-фрагменти трастузумабу, молекули анти-Нег2
Сопіогероду здійснювали рекрутинг рецепторів на клітинній поверхні і посилювали сигнал активації. Трастузумаб, агент, що зв'язує епітоп Нег2, локалізований у стеблевому домені рецептора, утримує рецептори на віддалі один від одного і, отже, є антагоністом проліферації.
На фіг. 7 представлені дані про різні впливи трастузумабу і обох молекул, двокільцевої і чотирикільцевої молекул анти-Нег2 Сопіогероду відповідно, які є антипроліферативними і пропроліферативними.
Визначали здатність анти-Нег2 Сопіог5роду зв'язуватись з ЕсКп-рецептором. Порівняно з трастузумабом, антитілом Ідс-типу, Ідс1-підкласу, зв'язування обох молекул анти-Нег2
Сопіогебоду з людським ЕсКп-рецептором виявилось несподівано вищим, тобто приблизно 10- кратним і З0-кратним для двокільцевої молекули Сопіогероду і чотирикільцевої молекули
Сопіогероду відповідно (див. фіг. ВА). Стосовно ЕсКп мавп ціномолгуз поведінка трастузумабу і
Сопіог5роду виявилась подібною (див. фіг. 8Б), при цьому димерна молекула Сопіог5боду мала в 4,5 рази вищу афінність, ніж трастузумаб, а тетрамерна молекула Сопіог5роду мала в 61 раз вищу афінність.
Вивчали здатність молекул анти-Нег2 Сопіогзбоду викликати антитіло-обумовлену клітинозалежну цитотоксичність (АЮСС). За допомогою зв'язування з Есук дб можуть запускати АОСС. На фіг. 9 представлені дані про кінетику АОСС при використанні молекул анти-
Нег2 Сопіогероду і трастузумабу.
За даними, одержаними на основі автофлуоресценції триптофану, для Сопіотгероду перша температура теплової денатурації Ти! складала приблизно 63 "С. За даними, одержаними за допомогою статичного розсіювання світла, для Сопіогзроду температура початку агрегації складала приблизно 66 "С. За даними, одержаними за допомогою динамічного розсіювання світла, для Сопіогероду температура початку агрегації складала приблизно 66 "С. У всіх експериментах застосовували композицію, що містить 1 мг/мл Сопіогзроду в 20мМ Нів/Нізх НОЇ, 140мМм Масі.
За допомогою мас-спектрометрії вдалось підтвердити, що змішані Рар-фрагменти не утворюються.
Іншими прикладами двокільцевих моноспецифічних Сопіот5роду є анти-СМмМЕТ Сопіогзроду (кільцевий злитий поліпептид, який має 5ЕО ІО МО: 97) і анти-СО20 Сопіогзроду з різними варіабельними доменами ((1) кільцевий злитий поліпептид, який має 5ЕО ІО МО: 98; (2) кільцевий злитий поліпептид, який має 5ЕО ІО МО: 99). Нижче в таблиці представлені дані про рівень експресії, вихід і якість вказаних Сопіогероду. пи ія шкщ| ни | оо» | обов
Сопіогзрой Сопіогероду (1 Сопіог:роду (2
Об'єм, в якому здійснювали концентрація|мгимл| | 7777/1060 | 77717067 77711110
Зеосновногопіка(КЕ-ДСН) | 9630 | 993 | 996
Зо
Всі Сопюгзроду короткочасно експресувались в НЕК-293 з виходами від 2 до 15 мг/л. Після очистки продукту на колонці з білком А чистота складала більше 85 95 і очистка від побічних продуктів за допомогою гель-фільтрації (ЕС) на колонках дозволяла одержувати чистоту, в цілому, що перевищує 96 95.
І.2. Мультиспецифічні багатокільцеві злиті поліпептиди
Мультиспецифічний багатокільцевий злитий поліпептид містить два або більшу кількість кільцевих злитих поліпептидів, вказаних в даному описі, при цьому, кожний з кільцевих злитих поліпептидів специфічно зв'язується з різними мішенями і/або різними епітопами на одній і тій же мішені, тобто містить принаймні два сайта зв'язування з різними специфічностями.
Не вдаючись в конкретну теорію, можна припустити, що самоскладання відповідних доменів сайтів зв'язування в одноланцюговому поліпептиді превалює над міжланцюговою асоціацією, тобто, інакшекажучи, після експресії одного кільцевого злитого поліпептиду індивідуально відбувається асоціація нефункціональних доменів сайта зв'язування і утворюється функціональний сайт зв'язування. Наприклад, якщо функціональний сайт зв'язування являє собою Раб і спейсерний домен являє собою Ес-ділянка, то ділянки Раб, тобто фрагмент важкого ланцюга (МН-СНІ) і фрагмент легкого ланцюга (МК-СК), утворюють конститутивний зв'язувальний компонент Рар-фрагмента і "сирітська" половина Ес-ділянки вказаного першого зібраного кільцевого злитого поліпептиду вступає в асоціацію з іншим кільцевим злитим поліпептидом з утворенням двокільцевого злитого поліпептиду (молекула Сопіогероду, що містить димер з двох одиничних кільцевих злитих поліпептидів). Для одержання мультиспецифічного багатокільцевого злитого поліпептиду слід посилювати гетеродимеризацію виділених кільцевих злитих поліпептидів. Одним из прикладів елемента, що посилює гетеродимеризацію, є мутації, одержані за допомогою технології "Кпоб-іпіо-поїе".
Можна змінювати довжину лінкера на відповідних М- і С-кінцях спейсерного домену, що являє собою собою Ес-ділянку, для зміни геометрії/відстані між двома сайтами зв'язування утвореної біспецифічної молекули СопіогеБроду; це ж стосується також і моноспецифічних
Сопіог:роду.
Можна змінювати геометрію/відстань між сайтами зв'язування шляхом зміни відносного(их) положенняць) сайта(ів) зв'язування по відношенню один до одного.
Наприклад, в тому разі, коли сайт зв'язування являє собою Рар, послідовність домену важкого ланцюга Раб-фрагмента і легкого ланцюга РГар-фрагмента можна інвертувати, тобто, наприклад, важкий ланцюг Рар-фрагмента може мати домен, який має послідовність МН-СНІ1 або СНІ-МН (в напрямку від М-кінця до С-кінця) відповідно, і аналогічно, легкий ланцюг Еар- фрагмента може мати послідовність доменів МІ -СЇ або СІ -МІ (в напрямку від М-кінця до С- кінця) або може мати місце комбінація вказаних положень. Враховучи, що лінкер присутній до і після спейсерного домену, наприклад, до і після Ес-ділянки (в напрямку від М-кінця до С-кінця),
Еаб-фрагмент обмежений в його орієнтаціях відносно спейсерного домену. Таким чином, відносне положення МіІ-домену являє собою або положення поблизу РЕс-ділянки, яке позначають як "МН-іп", або більш віддалене положення від Ес-ділянки, яке позначають в контексті даного опису як "УН-оицї" (див. фіг. 10 ї 11).
Можна також змінювати особливості складання з використанням технології Сто55Маб, тобто обміну доменів в одному плечі. Цю технологію можна об'єднувати також з технологією, що базується на варіації зарядів в плечі, що піддається обміну, або в плечі, що не піддається обміну. Приклади ланцюгів анти-сМЕТ кільцевих злитих поліпептидів у відповідній орієнтації, що застосовуться для одержання біспецифічних двокільцевих злитих поліпептидів, представлена на фіг. 12 (МН-оші, МН-іп), і відповідний рівень експресії, вихід і кількість вказаних різних комбінацій ланцюгів представлені нижче в таблиці.
МН-оці- МН-іп- МН-оці- МУН-іп-
МН-оші- МУН-іп- «виступ»/УН- |«виступ»/УН- | «виступ»/МУ Н- | «виступ»//Н- «виступ»/УН- | «виступ»/УН- оШ- оШ- іп- іп- оШ- оШі- «западина»- | «западина»- | «западина»- | «западина»- «западина» | «западина» СН-СІ- СН-СІ- МН-МІ- МН-МІ- схрещені схрещені схрещені схрещені
Об'єм, в якому здійснювали 250 250 250 250 250 250 експресію
Гмлі ше ля іон | з | зоровою
Імг/млі кількістьїмі(| 2,88 | 060 | 081 | 117 | 043 | 065 мономер (аналітична 98,10 93,80 97,34 97,90 98,74 98,88
ЗЕС) |У основа (пі
МН-оці-«виступ" - 5ЕО ІЮ МО: 100,
МН-іп-«виступ" - 5ЕО ІЮ МО: 101,
МН-ошц-«западина" - ЗЕО ІЮ МО: 102,
МН-ош-«западина»-СН-СІ -схрещені - 5ЕО ІО МО: 103,
МН-іп-«западина»-МН-МІ -схрещені - 5ЕО ІО МО: 104.
Кільцеві злиті поліпептиди, вказані в даному описі, можуть містити будь-який тип дво- або багатокомпонентного комплексу, якщо мультимеризуючий домен, такий, наприклад, як половина Ес-ділянки, може бути вбудований в послідовність утвореного одноланцюгового поліпептиду. Наприклад, вказаний багатокомпонентний комплекс являє собою завантажений пептидом комплекс ГКГС-І. Відповідна молекула Сопіогероду представлена на фіг. 13.
Дія, обумовлена опосередкованим ГКГС-І рекрутингом клітин-кілерів і ліквідацією клітин, для злиття ГКГСОС-І-антитіло ІдС-типу і двокільцевого злитого поліпептиду, вказаного в даному описі, виявилося зіставним (фіг. 14).
Загальноприйнятні методики створення канонічних мультиспецифічних антитіл можна застосовувати також і адаптувати для створення мультиспецифічних багатокільцевих злитих поліпептидів, вказаних в даному описі.
Наприклад, методики створення мультиспецифічних антитіл включають (але не обмежуючись тільки ними) рекомбінантну спільну експресію двох пар важких ланцюгів-легких ланцюгів імуноглобулінів, які мають різні специфічності (див. Міївієїп С. ії СциеПо А.С., Майшге 305, 1983, сс. 537-540, МО 93/08829 і ТтайпесКег А. та ін, ЕМВО .. 10,1991, сс. 3655-3659), і технологію "Кпор-іп-ноЇе" (див., наприклад, 5 Мо 5731168). Мультиспецифічні антитіла можна одержувати також шляхом створення регульованих електростутичних впливів для одержання молекул антитіла з гетеродимерними Ес (М/О 2009/089004); перехресного зв'язування двох або більшої кількості антитіл або фрагментів (див., наприклад, Ш5 Мо 4676980 і Вгеппап М. та ін.,
Зсівєпсе 229, 1985, сс. 81-83); застосування лейцинових блискавок для одержання біспецифічних антитіл (див., наприклад, Козієїпу 5.А. та ін., У. Іттипої. 148, 1992, сс. 1547- 1553); застосування технології "димерних антитіл (діабоді)» для створення фрагментів біспецифічних антитіл (див., наприклад, Ноїїдег Р. та ін., Ргос. Маї). Асад. 5сі. ОБА 90, 1993, со. 6444-6448); і застосування димерів одноланцюгових Ем (5Ех) (див., наприклад, Стибрег М та ін., у.
Іттипої. 152, 1994, сс. 5368-5374); і одержання триспецифічних антитіл відповідно до методу, описаному, наприклад, у Тиїй А. та ін., у. Іттипої. 147, 1991, сс. 60-69).
В одному із варіантів здійснення всіх об'єктів винаходу кільцевий злитий поліпептид, вказаний в даному описі, являє собою мультиспецифічний багатокільцевий злитий поліпептид, для одержання якого необхідна гетеродимеризація принаймні двох кільцевих злитих поліпептидів.
Аналогічно цьому, одним із об'єктів винаходу є мультимерний, переважно димерний, кільцевий злитий поліпептид, вказаний в даному описі, в якому перший кільцевий злитий поліпептид специфічно зв'язується з першою мішенню, а другий кільцевий злитий поліпептид специфічно зв'язується з другий мішенню, кожний з яких містить як спейсерний домен домен
Зо гетеродимеризаціїї.
Ес-ділянка, що входить в Сопіогзроду, може мати (дикий тип; 5ЕО ІЮО МО: 31)) або не мати ефекторну функцію, опосередковану ЕСВ (без ефекторної функції, опосередкованої ЕсгамманйІЇ, з мутаціями І/234А, І235А, РЗ2ОСІ (ЗЕО ІО МО: 37; без ефекторної функції, опосередкованої
ЕсВп, з мутаціями І25З3А, НЗІОА, Н4З5А (5ЕО І МО: 44) або НЗ1ОА, НАЗЗА, У4З6А (5ЕО ІО МО: 45); нумерація відповідно до ЕО-індексу Кебота).
Сайт зв'язування можна вибирати з сайта зв'язування антитіла, що містить пару, яка включає варіабельний домен важкого ланцюга антитіла і варіабельний домен легкого ланцюга антитіла, ЕсАПп, який містить ГКГО-подібний домен і бета-2-микроглобулін, або пару, що містить рАВРІМ (створені домени, які містять анкіринові повтори) тандемний 5сЕм і два антикаліни в ряду).
Як правило, для Сопіогзроду кожен раз можна застосовувати необхідне геометричне обмеження для фіксованої орієнтації двох сайтів зв'язування.
В одному із варіантів здійснення винаходу спейсерний домен містить мітку. В одному із варіантів здійснення винаходу мітку кон'югують з С-кінцем кільцевого злитого поліпептиду.
В одному із варіантів здійснення винаходу спейсерний домен містить мультимеризуючий домен. В одному із варіантів здійснення винаходу мультимеризуючий домен вибирають з групи, яка складається з Ес-ділянки антитіла і її варіантів і домену тетранектину і його варіантів.
Спейсерний домен може являти собою домен, який складається з однієї спіралі, що утворює мультимери, або функціональний білок, який зустрічається в природних умовах, для якого відома здатність до мультимеризації і який у вигляді мультимерної зібраної конструкції надає свою функцію Сопіогзроду. Наприклад, сімейство димерів Мус/Мах/Майд або лейцинова блискавка створюють димерну конструкцію типу соїЇ-соїї, СОМР (олігомерний матриксний білок хряща) утворює пентамерну систему типу соїЇ-сої з дисульфідним містком між ними і при орієнтації "голова-до-голови". Відомо декілька інших систем з орієнтацією типу "голова-до- хвоста" типу БАВАН (С-кінцевий димеризуючий домен людського М5ОТ1 (залишки 431-487)), димеризуючий домен, структура типу соїЇ-соїЇ з дисульфідним містком, придатна для одержання
Еаб-фрагментів, фіксованих під кутом 1807. Крім того, можна застосовувати тримеризуючий домен тенасцину-С (ТМ).
І. Сайти зв'язування бо ІШ.1. Одержаний з фрагмента антитіла сайт зв'язування
В деяких варіантах здійснення винаходу сайт зв'язування в кільцевому злитому поліпептиді, вказаному в даному описі, складається з варіабельного домену важкого ланцюга (МН) антитіла і варіабельного домену легкого ланцюга (МІ) антитіла.
В деяких варіантах здійснення винаходу сайт зв'язування в кільцевому злитому поліпептиді являє собою фрагмент антитіла. Фрагменти антитіл включають (але не обмежуючись тільки ними) Раб-, Раб-, Рар'-5Н і Еу-фрагменти. Огляд деяких фрагментів антитіл див., наприклад, у
Ниавзоп та ін., Маї Меа 9, 2003, сс. 129-134. Огляд зсЕм-фрагментів див., наприклад, у РінсКкійип в: Ше Рпаптасоіоду ої Мопосіопаї Апіібодієв, т. 113, під ред. Козепригу і Мооге, вид-во Зргіпдег-
Мепад, Мем Моїк, 1994, сс. 269-315; див. також МО 93/16185; і 05 МоМо 5571894 і 5587458.
Обговорення ГРар- і Е(аб)25-фрагментів, які містять залишки епітопу, що зв'язується з рецептором спасіння, і мають подовжений чаз напівжиття іп мімо, див. в ШО Мо 5869046.
Фрагмент антитіла може являти собою також "Бар подвійної дії" або "ОАЕ", (див., наприклад, 5 2008/0069820).
Однодоменні антитіла являють собою фрагменти антитіл, які містять увесь варіабельний домен важкого ланцюга або його частину або увесь варіабельний домен легкого ланцюга антитіла або його частину. В деяких варіантах здійснення винаходу однодоменне антитіло являє собою людське однодоменне антитіло (фірма Юотапії5, Іпс., Валтам, шт. Массачусетс; див., наприклад, 5 Мо 6248516 В1).
Фрагменти антитіл можна створювати за допомогою різних методик, включаючи (але не обмежуючись тільки ними) протеолітичне розщеплення інтактного антитіла, а також одержувати з використанням рекомбінантних клітин-хазяїв (наприклад, Е. соїї або фага), як вказано в даному описі.
Якщо сайт зв'язування являє собою Бар, то Бар може являти собою канонічний Раб,
Сто55Раб або Ошагаь.
В разі канонічного Гар одна частина зв'язувального домену містить варіабельний домен важкого ланцюга (МН) і принаймні М-кінцевий фрагмент першого константного домену важкого ланцюга (СНІ) антитіла (або повний домен), а відповідний інший зв'язувальний домен містить варіабельний домен легкого ланцюга (МІ) антитіла і принаймні М-кінцевий фрагмент константної ділянки легкого ланцюга (СІ) антитіла (або повний домен). Порядок розташування
Зо цих доменів може бути будь-яким, якщо можливо (тобто відсутні перешкоди) асоціація між ними і утворення (функціонального) сайта зв'язування.
В одному із варіантів здійснення винаходу одна частина зв'язувального домену містить в напрямку від М-кінця до С-кінця МН-СНІ, а інша частина зв'язувального домену містить в напрямку від М-кінця до С-кінця МІ -С.
В разі Сто55Раб обидві частини зв'язувального домену містять варіабельний домен антитіла і принаймні М-кінцевий фрагмент константного домену антитіла (або повний домен), при цьому пари варіабельного домену і константного домену не зустрічаються в асоціації одна з одною в природних умовах, а одержані шляхом кросовера доменів/обміну домену важкого ланцюга і домену легкого ланцюга. Це може являти собою заміну МН на Мі або СНІ на СІ. Порядок розташування цих доменів може бути будь-яким, якщо можлива (тобто відсутні перешкоди) асоціація між ними і утворення (функціонального) сайта зв'язування.
В одному із варіантів здійснення винаходу одна частина зв'язувального домену містить в напрямку від М- кінця до С-кінця МІ-СНІ, а інша частина зв'язувального домену містить в напрямку від М- кінця до С-кінця МН-СЇ.
В одному із варіантів здійснення винаходу одна частина зв'язувального домену містить в напрямку від М- кінця до С-кінця МН-СЇ, а інша частина зв'язувального домену містить в напрямку від М- кінця до С-кінця МІ -СНІ1.
В разі багатокільцевого злитого поліпептиду асоціацію когнатних зв'язуювальних доменів можна додатково підвищувати крім обміну доменів в Сто55Бар шляхом інтродукції зарядів. В деяких варіантах багатокільцевий злитий поліпептид містить принаймні перший кільцевий злитий поліпептид та другий кільцевий злитий поліпептид.
В одному із варіантів здійснення винаходу багатокільцевий злитий поліпептид містить а) перший кільцевий злитий поліпептид, який містить як сайт зв'язування Еар, що специфічно зв'язується з першим антигеном, і б) другий кільцевий злитий поліпептид, який містить як сайт зв'язування Рар, що специфічно зв'язується з іншим антигеном, в якому варіабельні домени МІ і МН в Раб (другого кільцевого злитого поліпептиду) замінені один на одний.
Кільцевий злитий поліпептид, вказаний в підпункті а), не містить модифікацію, вказану в підпункті б). бо В кільцевому злитому поліпептиді, вказаному в підпункті б),
у фрагменті легкого ланцюга антитіла варіабельний домен легкого ланцюга МІ. замінений варіабельним доменом важкого ланцюга
МН вказаного Раб, і у фрагменті важкого ланцюга антитіла варіабельний домен важкого ланцюга МН замінений варіабельним доменом легкого ланцюга
МІ. вказаного Раб.
В одному із варіантів здійснення винаходу
ЇЇ в константному домені Сі першого кільцевого злитого поліпептиду багатокільцевого злитого поліпептиду амінокислота в положенні, що відповідає положенню 124 за Кеботом, замінена на позитивно заряджену амінокислоту, і в константному домені СНІ першого кільцевого злитого поліпептиду багатокільцевого злитого поліпептиду амінокислота в положенні, що відповідає положенню 147 відповідно до ЕО-індексу Кебота, або амінокислота в положенні, що відповідає положенню 213 відповідно до ЕОМО-індексу Кебота, замінена на негативно заряджену амінокислоту, або
І) в константному домені Сі другого кільцевого злитого поліпептиду багатокільцевого злитого поліпептиду амінокислота в положенні, що відповідає положенню 124 за Кеботом, замінена на позитивно заряджену амінокислоту, і константному домені СНІ другого кільцевого злитого поліпептиду багатокільцевого злитого поліпептиду амінокислота в положенні, що відповідає положенню 147 відповідно до ЕЮ-індексу Кебота, або амінокислота в положенні, що відповідає положенню 213 відповідно до ЄЮ-індексу Кебота, замінена на негативно заряджену амінокислоту.
В одному із переважних варіантів здійснення винаходу
ЇЇ в константному домені Сі першого кільцевого злитого поліпептиду багатокільцевого злитого поліпептиду амінокислота в положенні, що відповідає положенню 124 за Кеботом, замінена незалежно на лізин (К), аргінін (Р) або гістидин (Н) (в одному із переважних варіантів здійснення винаходу незалежно на лізин (К) або аргінін (Р)), і в константному домені СНІ першого кільцевого злитого поліпептиду багатокільцевого злитого поліпептиду амінокислота в положенні, що відповідає положенню 147 відповідно до ЕО-індексу Кебота, або амінокислота в положенні, що відповідає положенню 213 відповідно до ЕО-індексу Кебота, замінена незалежно на глутамінову кислоту (Е) або аспарагінову кислоту (0), або
І) в константному домені Сі другого кільцевого злитого поліпептиду багатокільцевого злитого поліпептиду амінокислота в положенні, що відповідає положенню 124 за Кеботом, замінена незалежно на лізин (К), аргінін (Р) або гістидин (Н) (в одному із переважних варіантів здійснення винаходу незалежно на лізин (К) або аргінін (Р)), і в константному домені СНІ другого кільцевого злитого поліпептиду багатокільцевого злитого поліпептиду амінокислота в положенні, що відповідає положенню 147 відповідно до ЕО-індексу Кебота, або амінокислота в положенні, що відповідає положенню 213 відповідно до ЕО-індексу Кебота, замінена незалежно на глутамінову кислоту (Е) або аспарагінову кислоту (0).
В одному із варіантів здійснення винаходу в константному домені Сі другого кільцевого злитого поліпептиду багатокільцевого злитого поліпептиду амінокислоти в положеннях, які відповідають положенням 124 і 123 відповідно до ЕЮ-індексу Кебота, замінені на К.
В одному із варіантів здійснення винаходу в константному домені СНІ другого кільцевого злитого поліпептиду багатокільцевого злитого поліпептиду амінокислоти в положеннях, які відповідають положенням 147 і 213 відповідно до ЕЮ-індексу Кебота, замінені на Е.
В одному із переважних варіантів здійснення винаходу в константному домені Сі першого кільцевого злитого поліпептиду багатокільцевого злитого поліпептиду амінокислоти в положеннях, які відповідають положенням 124 і 123 відповідно до ЕЮ-індексу Кебота, замінені на К ї в константному домені СНІ першого кільцевого злитого поліпептиду багатокільцевого злитого поліпептиду амінокислоти в положеннях, які відповідають положенням 147 і 213 відповідно до ЕО-індексу Кебота, замінені на Е.
В одному із варіантів здійснення винаходу в константному домені Сі другого кільцевого злитого поліпептиду багатокільцевого злитого поліпептиду амінокислоти в положеннях, які відповідають положенням 124 і 123 відповідно до ЕМО-індексу Кебота, замінені на К ів константному домені СНІ другого кільцевого злитого поліпептиду багатокільцевого злитого поліпептиду амінокислоти в положеннях, які відповідають положенням 147 і 213 відповідно до
Еи-індексу Кебота, замінені на Е, і в варіабельному домені МІ першого кільцевого злитого 60 поліпептиду багатокільцевого злитого поліпептиду амінокислота в положенні, що відповідає положенню 38 за Кеботом, замінена на К, в варіабельному домені МН першого кільцевого злитого поліпептиду багатокільцевого злитого поліпептиду амінокислота в положенні, що відповідає положенню 39 за Кеботом, замінена на Е, в варіабельному домені МІ другого кільцевого злитого поліпептиду багатокільцевого злитого поліпептиду амінокислота в положенні, що відповідає положенню 38 за Кеботом, замінена на К, і в варіабельному домені
МН другого кільцевого злитого поліпептиду багатокільцевого злитого поліпептиду амінокислота в положенні, що відповідає положенню 39 за Кеботом, замінена на Е.
В разі Ошагар одна частина зв'язувального домену містить варіабельний домен важкого ланцюга (УН) антитіла і принаймні М-кінцевий фрагмент першого константного домену важкого ланцюга (СНІ) антитіла (або повний домен), а відповідний інший зв'язувальний домен містить варіабельний домен легкого ланцюга (МІ) антитіла і принаймні М-кінцевий фрагмент константного домену легкого ланцюга (СІ!) антитіла (або повний домен), де зв'язувальний домен містить два паратопа, що не перекриваються, в комплементарній парі: варіабельний домен важкого ланцюга (УН) і варіабельний домен легкого ланцюга (МІ), де перший паратоп містить залишки з СОВІ ії СОВЗ Мі -домену і СОВ2 МН-домену, а другий паратоп містить залишки з СОВІ1 ії СОВЗ МН-домену і СОВа2 Мі -домену.
В одному із варіантів здійснення винаходу перший паратоп містить залишки з СОН і СОВЗ
МІ-домену і СОВ2 МН-домену, а другий паратоп містить залишки з СОВІ і СОВЗ МН-домену і
СОВа МІ -домену.
В одному із варіантів здійснення винаходу основою варіабельного домену важкого ланцюга сайта зв'язування є послідовність важкого ланцюга людського сімейства МНЗ, а основою варіабельного домену легкого ланцюга сайта зв'язування є послідовність легкого ланцюга людського сімейства Укаппа1.
В одному із варіантів здійснення винаходу основою варіабельного домену важкого ланцюга сайта зв'язування є послідовність важкого ланцюга людського сімейства МНЗ, а основою варіабельного домену легкого ланцюга сайта зв'язування є послідовність легкого ланцюга людського сімейства Млямбда!.
І.2. Сайт зв'язування, одержаний з химерного і гуманізованого антитіла
В деяких варіантах здійснення винаходу сайт зв'язування кільцевого злитого поліпептиду,
Зо вказаного в даному описі, складається з варіабельного домену важкого ланцюга (УН) антитіла і варіабельного домену легкого ланцюга (МІ) антитіла. В деяких варіантах здійснення винаходу варіабельні домени являють собою химерні домени, одержані з химерного антитіла, наприклад, гуманізованого антитіла. "Каркасні ділянки" або "Рг»-ділянки являють собою ділянки варіабельних доменів, відмінні від залишків гіперваріабельних ділянок (НМА). г варіабельного домену, як правило, представлені чотирма Кі-доменами: Ні, Ег2, РІЗ і Ег4. Таким чином, послідовності НМЕ і Рг, як правило, розташовані в МН (або МІ) в наступному порядку: Ри-НІ(І1)-Егт2-Н2(І 2)-Ег3-НЗІІ 3)-
Га.
Поняття "гіперваріабельна ділянка" або "НМА" в контексті даного опису відноситься до кожного із ділянок варіабельного домену антитіла, послідовності яких є гіперваріабельними (ділянки, які визначають комплементарність" або "СОВ") і/або формують петлі певної структури (Стіперваріабельні петлі"), або містять залишки, що контактують з антигеном ("контакти з антигеном"). Як правило, антитіла містять шість НМЕ; три в МН (НІ, Н2, НЗ) ітрив МІ (І 1, 12,
І 3).
В контексті даного опису НУВ включають (а) гіперваріабельні петлі, що включають амінокислотні залишки 26-32 (І 1), 50-52 (І 2), 91-96 (3), 26-32 (НІ), 53-55 (Н2) і 96-101 (НЗ) (Споїйіа б. і Їе5Кк А.М., У. Мої. Віо!. 196, 1987, сс. 901- 917); (6) СОВ, що включають амінокислотні залишки 24-34 (І 1), 50-56 (І 2), 89-97 (І 5), 31-35Б (НІ), 50-65 (Н2) і 95-102 (НЗ) (КаБбаї Е.А. та ін., Зедиепсевз ої Ргоїєїп5 ої Іттипоіодісаї! Іпіегеві, 5-те вид., вид-во Рибіїс Неайй бегуісе, Маїйопаї! Іпзійшев ої Неєаїййп, Веїпезаа, МО, 1991, публикація
МІН 91-3242); (в) ділянки контакта з антигеном, що включають амінокислотні залишки 27-36 (11), 46-55 (12), 89-96 (І 3), 30-356 (НІ), 47-58 (Н2) і 93-101 (НЗ) (МасСайшт та ін., у). Мої. Віої. 262, 1996, со. 732-145); 1 (г) комбінації залишків, вказаних в підпунктах (а), (б) і/або (в), що включають амінокислотні залишки НМА 46-56 (12), 47-56 (І 2), 48-56 (12), 49-56 (12), 26-35 (НІ), 26-356 (НІ), 49-65 (Н2г), 93-102 (НЗ) і 94-102 (НЗ).
Якщо не вказано інше, то НУВ-залишки та інші залишки в варіабельному домені (наприклад, бо Еі-залишки) нумерують в даному описі відповідно до системи нумерації Кабаї та ін., вище.
В деяких варіантах здійснення винаходу химерне антитіло являє собою гуманізоване антитіло. Як правило, нелюдське антитіло гуманізують для зниження імуногенності для людей, зберігаючи при цьому специфічність і афінність батьківського нелюдського антитіла. Як правило, гуманізоване антитіло містить один або декілька варіабельних доменів, в яких НМВ, наприклад, СОВА (або їх ділянки), походять з нелюдського антитіла, а Ег (або їх ділянки) походять з послідовностей людського антитіла. В деяких варіантах здійснення винаходу деякі залишки Кг в гуманізованому антитілі замінені на відповідні залишки з нелюдського антитіла (наприклад, антитіла, з якого походять залишки НУ), наприклад, для зберігання або покращення специфічності або афіннності антитіла.
Гуманізовані антитіла і методи їх створення узагальнені, наприклад, в АЇІтадго ..С. і
Егапззоп 9., Егопі. Віозсі. 13, 2008, сс. 1619-1633, і описані також в Віесптаптп І. та ін., Майте 332, 1988, сс. 323-329; Оцееєп б. та ін., Ргос. Маї). Асад. сі. ОБА 86, 1989, сс. 10029-10033; 005
Мо 5821337, 5 Мо 7527791, 5 Мо 6982321 ії 5 Мо 7087409; КазПптігі 5.М. та ін., Меїйод 36, 2005, сс. 25-34 (опис трансплантації ділянок, які визначають специфічність (З5ОРА)); Радіап Е.А.
МОЇ. Іттипої. 28, 1991, сс. 489-498 опис "методу зміни поверхні" ("нанесення нового покриття"));
БраігАсдца М/.Е. та ін., Меїйодз 36, 2005, сс. 43-60 (опис "перестановки Ег); Ов5рошт .. та ін.,
Меїпоад» 36, 2005, сс. 61-68 і КіїтКа А. та ін., Вг. У. Сапсег 83, 2000, сс. 252-260 (опис підходу "направленої селекції" для перестановки Ні).
Людські каркасні ділянки, які можна застосовувати для гуманізації, включають (але не обмежуючись тільки ними): каркасні ділянки, вибрані з використанням методів "найкращого підбору" (див., наприклад, біт5 М.). та ін., у). Іттипої. 151, 1993, сс. 2296-2308; каркасні ділянки, що походять з консенсусної послідовності конкретної підгрупи варіабельних ділянок легких і важких ланцюгів людських антитіл (див., наприклад, Сапег Р. та ін., Ргос. Маї). Асай. сі.
ИБА 89, 1992, сс. 4285-4289 і Ргезіа І сх. та ін., У. Іттипої. 151, 1993, сс. 2623-2632); людські зрілі (зі соматичними мутаціями) каркасні ділянки або каркасні ділянки людської зародкової лінії (див., наприклад, АІтадго ..С. ії Егап55оп 4)., Егопі. Віозсі. 13, 2008, с. 1619-1633); і каркасні ділянки, одержані в результаті скринінгу Ег-бібліотек (див., наприклад, Васа М. та ін., у. Віої!.
Спет. 272, 1997, сс. 10678-10684 і Бозок М... та ін., у. ВіоЇ. Спет. 271, 1996, сс. 22611-22618).
ІІ.З3. Одержані з людського антитіла сайти зв'язування
Зо В деяких варіантах здійснення винаходу сайт зв'язування в кільцевому злитому поліпептиді, вказаному в даному описі, складається з варіабельного домену важкого ланцюга (МН) антитіла і варіабельного домену легкого ланцюга (МІ) антитіла. В деяких варіантах здійснення винаходу варіабельні домени одержують з людського антитіла.
Людські антитіла можна одержувати, використовучи різноманітні методики, відомі в даній галузі. Людські антитіла описані в цілому в мап ОК М.А. і мап де М/іпКе! 9У.2., Си. Оріп.
Рпагтасої. 5, 2001, сс. 368-374 і І опрего М., Си. Оріп. Іттипої. 20, 2008, сс. 450-459.
Людські антитіла можна одержувати шляхом введення імуногена трансгенних тварин, модифікованому таким чином, щоб він продукував інтактні людські антитіла або інтактні антитіла з людськими варіабельними ділянками у відповідь на контрольне зараження антигеном. Вказані тварини, як правило, містять всі або частину локусів людського імуноглобуліну замість ендогенних імуноглобулінових локусів, які або присутні поза хромосомами, або інтегровані довільно в хромосоми тварини. В таких трансгенних мишей ендогенні імуноглобулінові локуси, як правило, інактивовані Огляд методів одержання людських антитіл в трансгенних тварин див. у Гопрего М., Маї. Віоїесп. 23, 2005, сс. 1117-1125 (див., наприклад, також в ОО Мо 6075181 ії 05 Мо 6150584 опис технології ХЕМОМОИЗ5Е"М; в О5
Мо 5770429 опис технології НиМарФ; в 05 Мо 7041870 опис технології К-«М МООБЕФ і в 05 2007/0061900 опис технології МеіосіМоизеФф). Людські варіабельні ділянки з інтактних антитіл, одержаних за допомогою вказаних тварин, можна додатково модифікувати.
Людські антитіла можна створювати за допомогою методів на основі гібридом. Описані клітинні лінії людської мієломи і мишачої-людської гетеро мієломи, призначені для одержання людських моноклональних антитіл (див., наприклад, Когброг О., у. Іттипої!. 133, 1984, сс. 3001- 3005; Вгодешиг В.В. та ін., Мопосіопа! Апіїбоду Ргодисіюп Тесппідое5 апа Арріїсайоп5, вид-во
Магсе! Оеккетг, Іпс., Мем Могк, 1987, сс. 51-63 і Воєтпег" Р. та ін., У. Іттипої. 147, 1991, сс. 86-95).
Людські антитіла, створені з використанням технології на основі людських В-клітинних гібридом, описані також у І і .). та ін., Ргос. Маї). Асад. сі. ОБА 103, 2006, сс. 3557-3562. Додаткові методи включають методи, описані, наприклад, в 5 Мо 7189826 (опис одержання моноклональних людських антитіл типу ІДМ з клітинних ліній гібридом), і у Мі У., Хіапдаії Міапуїхое 26, 2006, со. 265-268 (опис людських-людських гібридом). Технологія людських гібридом (технологія Піота) описана також у МоїІте!їв Н.Р. і Вгапаїєїп 5., Нізіоіоду апа НівіораїноЇіоду 20, 2005, сс. 927-937 і
МоїІтегв Н.Р. і Вгапаїєїп 5., Меїнодз апа Ріпаїпов5 іп Ехрегітепіа! апа сіїпіса! Рнаптасоіоду 27, 2005, сс. 185-191.
Людські антитіла можна створювати також шляхом виділення послідовностей варіабельних доменів Ем-клонів, вибраних з фагових дисплейних бібліотек для створення яких використовували людські антитіла. Вказані послідовності варіабельних доменів потім можна об'єднувати з необхідним людським константним доменом. Методики відбору людських антитіл з бібліотек антитіл описані нижче. 11.4. Сайти зв'язування одержаного з бібліотеки антитіла
В деяких варіантах здійснення винаходу сайт зв'язування в кільцевому злитому поліпептиді, вказаному в даному описі, складається з варіабельного домену важкого ланцюга (УН) антитіла і варіабельного домену легкого ланцюга (МІ) антитіла. В деяких варіантах здійснення винаходу варіабельні домени виділяють шляхом скринінгу комбінаторних бібліотек антитіл з необхідною активністю або видами активності.
Наприклад, в даній галузі відомі різноманітні методи для створення фагових дисплейних бібліотек і скринінгу вказаних бібліотек по відношенню до антитіл, які мають необхідні характеристики зв'язування. Вказані методи узагальнені, наприклад, у Ноодепроот Н.Н. та ін.,
Меїносд3з іп Моїесшіаг Віоіоду 178, 2001, сс. 1-37, і описані також, наприклад, у МеСайенпу ». та ін.,
Маїцге 348, 1990, сс. 552-554; СіасКзвоп Т. та ін., Майте 352, 1991, сс. 624-628; Магкз 9.0. та ін.,
У. Мої. Віої. 222, 1992, сс. 581-597; Магк5 9.0. і Вгадригу А., Меїтпоаз іп МоїІесшаг Віоіоду 248, 2003, сс. 161-175; біапи 5.5. та ін., У. Мої. Вісі. 338, 2004, сс. 299-310; І еє С.М. та ін., 9. Мої. Віої. 340, 2004, сс. 1073-1093; Рейоизе Е.А., Ргос. Маї!Ї. Асад. Осі. ОБА 101, 2004, сс. 12467-12472 і
Ї ее С.М. та ін., уУ. Іттипої. Меїнодз 284, 2004, сс. 119-132.
При здійсненні деяких методів фагового дисплея популяції МН- і МІ -генів клонують окремо за допомогою полімеразній ланцюговій реакції (ПЛР) і рекомбінують довільно в фагових бібліотеках, які потім піддають скринінгу щодо антигензв'язуючого фага відповідно до методу, описаному в М/іпієг С. та ін., Апп. Веу. Іттипої). 12, 1994, сс. 433-455. Фаг, як правило, експонує фрагменти антитіл або у вигляді одноланцюгових Ем-фрагментів (зсЕм), або у вигляді Еабр- фрагментів. Бібліотеки, отримані з імунізованих джерел, включають антитіла, що мають високу афінність до імуногена, при цьому відсутня необхідність в створенні гібридом. Альтернативно
Зо цьому, можна клонувати необроблену ("наївну") популяцію (наприклад, з організму людини), одержуючи одне джерело антитіл до широкого спектру чужих, а також своїх антигенів без будь- якої імунізації, що описано у Стіййне А.О. та ін., ЕМВО У, 12, 1993, со. 725-734. І, нарешті, "наївні" бібліотеки можна отримувати також методами синтезу шляхом клонування неперегрупованих сегментів У-гена зі стовбурових клітин і за допомогою ПЛР-праймерів, що містять випадкову послідовність, для кодування гіперваріабельних СОНЗ-ділянок та для здійснення перегрупування іп міїто відповідно до методу, описаному в Ноодепроот Н.В. і Міпіег
СЄ., у. Мої. Віої!. 227, 1992, сс. 381-388. Фагові бібліотеки людських антитіл описані, наприклад, в наступних патентних публикаціях: ОЗ Мо 5750373 і 05 2005/0079574, 05 2005/0119455, 5 2005/0266000, 005 2007/0117126, 05 2007/0160598, 05 2007/0237764, 005 2007/0292936 і 05 2009/0002360.
Антитіла або фрагменти антитіл, виділені з бібліотек людських антитіл, розглядаються як людські антитіла або фрагменти людських антитіл.
ІМ. Гетеромульти(ди)меризуючі домени
Для забезпечення правильної асоціації індивідуальних кільцевих злитих поліпептидів з утворенням гетеробагатокільцевих злитих поліпептидів можна застосовувати різноманітні технології. Однією з них є так звана технологія "Кпоб-іп-поЇе" (забезпечення взаємодії за типом "виступ-у западину" (див., наприклад, ШО Мо 5731168). Багатокільцеві злиті поліпептиди можна створювати також на основі впливів, регульованих електростутичними силами, для одержання молекул з гетеродимерними ЕС (УМО 2009/089004); перехресного зв'язування двох або більшої кількості кільцевих злитих поліпептидів (див., наприклад, Є Мо 4676980 і Вгеппап М. та ін., осієпсе 229, 1985, сс. 81-83); застосування лейцинових блискавок для одержання двокільцевих злитих поліпептидів (див., наприклад, Ковів!пу 5.А. та ін., У. Іттипої. 148, 1992, сс. 1547-1553).
Декілька підходів до СНЗ-модифікацій, що сприяють гетеродимеризації, описано, наприклад, в МО 96/27011, МО 98/050431, ЕР 1870459, МО 2007/110205, МО 2007/147901, МО 2009/089004, МО 2010/129304, МО 2011/90754, М/О 2011/143545, МО 2012/058768, МО 2013/157954, МО 2013/096291, які включені в даний опис як посилання.
Як правило, в підходах, відомих в даній галузі, СНЗз-домен першого важкого ланцюга і СНЗ- домен другого важкого ланцюга обидва конструюють комплементарним чином, в результаті чого важкий ланцюг, що містить один зі сконструйованих СНЗ-доменів, не може більше бо утворювати гомодимер з іншим важким ланцюгом такої ж структури (наприклад, перший важкий ланцюг зі сконструйованим СНЗ не може більше утворювати гомодимер з іншим першим важким ланцюгом зі сконструйованим СНЗ; і другий важкий ланцюг зі сконструйованим СНЗ не може більше утворювати гомодимер з іншим другим важким ланцюгом зі сконструйованим
СНЗ). Таким чином, у першого важкого ланцюга, який містить один сконструйований СНЗ- домен, посилюється здатність до гетеродимеризаціїї з іншим важким ланцюгом, що містить
СНЗ-домен, сконструйований комплементарним чином. Відповідно до цього варіанта здійснення винаходу СНЗ-домен першого важкого ланцюга і СНЗ-домен другого важкого ланцюга створюють комплементарним чином за допомогою амінокислотних замін, які посилюють здатність до гетеродимеризації першого важкого ланцюга та другого важкого ланцюга, при цьому перший важкий ланцюг і другий важкий ланцюг більше не можуть утворювати гомодимер (наприклад, через стеричні перешкоди).
В даній галузі відомі різноманітні підходи, що сприяють гетеродимеризаціїї важких ланцюгів, які процитовані і описані вище, і вони розглядаються як різноманітні альтернативи, застосовувані в мультиспецифічному антитілі вказаному в даному описі, яке містить "несхрещену Рар-ділянку" з першого антитіла, яке специфічно зв'язується з першим антигеном, і "схрещену ЕРаб-ділянку" з другого антитіла, що специфічно зв'язується з іншим антигеном, в поєднанні з конкретними амінокислотними замінами, описаними вище у винаході.
СНЗ-домени багатокільцевого злитого поліпептиду (Сопіогзроду), вказаного в даному описі, можна змінювати за допомогою технології "Кпор-іпіо-поЇІез", яка описана детально за допомогою декількох прикладів, наприклад, в МО 96/027011, у Віддмау -.В. та ін., Ргоїєїп Епо 9, 1996, сс. 617-621 і МегеНапі А.М. та ін., Маї Віоїтеснпої! 16, 1998, сс. 677-681. При здійсненні цього методу поверхні взаємодії двох СНЗ-доменів змінюють з метою підвищення гетеродимеризаціїї обох важких ланцюгів, які містять два вказані СНЗ-домени. Кожний з двох СНЗ-доменів (дво важких ланцюгів) може містити "виступ", а інший може містити "западину". Інтродукція дисульфідного містка стабілізує гетеродимери (Мегспапі А.М. та ін., Майте Віоїесі 16, 1998, сс. 677-681; АмуеєїЇ 5. та ін., У. Мої. Віої. 270, 1997, сс. 26-35) і підвищує вихід.
В переважному варіанті здійснення винаходу багатокільцевий злитий поліпептид, вказаний в даному описі, містить мутацію ТЗ366УУ в СНЗ-домені "ланцюга із виступами" (тобто в першому кільцевому злитому поліпептиді) і мутації 73665, І 368А, У407М в СНЗ-домені "ланцюга із
Зо впадиною" (тобто в іншому кільцевому злитому поліпептиді) (нумерація відповідно до ЕО- індексу Кебота). Можна застосовувати також додатковий міжланцюговий дисульфідний місток між СНЗ-доменами (Мегспапі А.М. та ін., Маїшгте Віоїесп 16, 1998, сс. 677-681), наприклад, шляхом інтродукції мутації М3490 в СНЗ-домен "ланцюга із виступами" і мутації ЕЗ56С або мутації 5354С0 в СНЗ-домен "ланцюга із впадиною". Так, відповідно до іншого переважного варіанта здійснення винаходу багатокільцевий злитий поліпептид, вказаний в даному описі, містить мутації 3490 і ТЗ66МУ в одному із двох СНЗ-доменів і мутації ЕЗЬбС, 73665, І З68А і
У407М в іншому з двох СНЗ-доменів або багатокільцевий злитий поліпептид, вказаний в даному описі, містить мутації 3490 і ТЗ366МУ в одному із двох СНЗ-доменів і мутації 53540, 3665,
І З68А і У407М в іншому з двох СНЗ-доменів (додаткова мутація У349С в одному із СНЗ-доменів і додаткова мутація ЕЗ56С або 5354Сб в іншому СНЗ-домені призводить до утворення міжланцюгового дисульфідного містка) (нумерація відповідно до ЄО-індексу Кебота).
Проте в альтернативному або додатковому варіанті можна застосовувати також інші варіанти технології "Кпор5-іп-поЇїез", представлені в ЕР 1870459 А1. Так, іншим прикладом мутацій для багатокільцевого злитого поліпептиду, вказаного в даному описі, є мутації Н4090 і
КЗ7ОЕ в СНЗ-домені "ланцюга із виступами" і мутації ОЗ399К і ЕЗ57К в СНЗ-домені "ланцюга із впадиною" (нумерація відповідно до ЕЄО-індексу Кебота).
В одному із варіантів здійснення винаходу багатокільцевий злитий поліпептид, вказаний в даному описі, містить мутацію ТЗ366МУ в СНЗ-домені "ланцюга із виступами" і мутації 73665,
І З68А і Х407М в СНЗ-домені "ланцюга із впадиною" і додатково містить мутації 84090 і КЗ7ОЕ в
СНЗ-домені "ланцюга із виступами" і мутації О399К і ЕЗ57К в СНЗ-домені "ланцюга із впадиною" (нумерація відповідно до ЕО-індексу Кебота).
В одному із варіантів здійснення винаходу багатокільцевий злитий поліпептид, вказаний в даному описі, містить мутації У349С і ТЗ36б6МУ в одному із двох СНЗ-доменів і мутації 53540,
Т3665, І 368А і М407М в іншому з двох СНЗ-доменів або багатокільцевий злитий поліпептид, вказаний в даному описі, містить мутації 3490 і ТЗ366МУ в одному із двох СНЗ-доменів і мутації 3540, 13665, І З68А і М407У в іншому з двох СНЗ-доменів і додатково містить мутації Н4090 і
КЗ7ОЕ в СНЗ-домені "ланцюга із виступами" і мутації ОЗ399К і ЕЗ57К в СНЗ-домені "ланцюга із впадиною" (нумерація відповідно до ЕЄО-індексу Кебота).
Крім технології "Кпор-іпіо-НоїЇе" в даній галузі відомі інші технології модифікації СНЗ-доменів бо важких ланцюгів мультиспецифічного злитого поліпептиду для посилення гетеродимеризаціїї.
Зо
Вказані технології, насамперед описані в МО 96/27011, МО 98/050431, ЕР 1870459, МО 2007/110205, МО 2007/147901, МО 2009/089004, МО 2010/129304, МО 2011/90754, МО 2011/143545, МО 2012/058768, МО 2013/157954 і МО 2013/096291, розглядаються в даному описі як альтернативи технології "Кпор-іпіо-поїе" стосовно мультиспецифічного злитого поліпептиду, вказаного в даному описі.
В одному із варіантів здійснення винаходу стосовно багатокільцевого злитого поліпептиду, вказаного в даному описі, застосовуть підхід, описаний в ЕР 1870459, для підтримання гетеродимеризації першого важкого ланцюга та другого важкого ланцюга багатокільцевого злитого поліпептиду. Цей підхід базується на інтродукції заряджених амінокислот з протилежними зарядами в конкретні амінокислотні положення в поверхні розділу. СНЗ/СНЗ- доменів між обома важкими ланцюгами, тобто першою та другий важким ланцюгом.
Так, вказаний варіант здійснення винаходу відноситься до багатокільцевого злитого поліпептиду, вказаного в даному описі, в якому в третинній структурі антитіла СНЗ-домен першого важкого ланцюга і СНЗ-домен другого важкого ланцюга утворюють поверхню розділу, локалізовану між відповідними СНЗ-доменами антитіла, в якому відповідні амінокислотні послідовності СНЗ-домену першого важкого ланцюга і СНЗ-домену другого важкого ланцюга кожна містить групу амінокислот, локалізовану у вказаній поверхні розділу в третинній структурі кільцевого злитого поліпептиду, при цьому в групі амінокислот, яка локалізована в поверхні розділу СНЗ-домену одного важкого ланцюга, перша амінокислота замінена на позитивно заряджену амінокислоту, а в групі амінокислот, яка локалізована в поверхні розділу СНЗ-домену іншого важкого ланцюга, друга амінокислота замінена на негативно заряджену амінокислоту.
Багатокільцевий злитий поліпептид, вказаний в цьому варіанті здійснення винаходу, в контексті даного опису позначають також як "СНЗ(-/-)-сконструйований багатокільцевий злитий поліпептид" (де скорочення «/-» позначає наявність амінокислот з протилежними зарядами, які були інтродуковані у відповідні СНЗ-домени).
В одному із варіантів вказаного "СНЗ(-/-)-сконструйованого багатокільцевого злитого поліпептиду", представленого в даному описі, позитивно заряджена амінокислота вибрана з К,
Він, а негативно заряджена амінокислота вибрана з Е або 0.
В одному із варіантів вказаного "СНЗ(-/-)-сконструйованого багатокільцевого злитого поліпептиду", представленого в даному описі, позитивно заряджена амінокислота вибрана зк і
В, а негативно заряджена амінокислота вибрана з Е або 0.
В одному із варіантів вказаного "СНЗ(-/-)-сконструйованого багатокільцевого злитого поліпептиду", вказаного в даному описі, позитивно заряджена амінокислота являє собою К, а негативно заряджена амінокислота являє собою Е.
В одному із варіантів вказаного "СНЗ(-/-)-сконструйованого багатокільцевого злитого поліпептиду", представленого в даному описі, в СНЗ-домені одного важкого ланцюга амінокислота В в положенні 409 замінена на О і амінокислота К в положенні замінена наєв, а в
СНЗ-домені іншого важкого ланцюга амінокислота О в положенні 399 замінена на К, амінокислота Е в положенні 357 замінена на К (нумерація відповідно до ЕЄЮ-індексу Кебота).
В одному із варіантів багатокільцевого злитого поліпептиду, представленого в даному описі, застосовували підхід, описаний в М/О 2013/157953, для підтримання гетеродимеризаціїї першого важкого ланцюга та другого важкого ланцюга багатокільцевого злитого поліпептиду. В одному із варіантів багатокільцевого злитого поліпептиду, представленого в даному описі, в
СНЗ-домені одного важкого ланцюга амінокислота Т в положенні 366 замінена на К, і в СНЗ- домені іншого важкого ланцюга амінокислота Ї в положенні 351 замінена на О (нумерація відповідно до ЕИМ-індексу Кебота). В іншому варіанті вказаного багатокільцевого злитого поліпептиду, представленого в даному описі, в СНЗ-домені одного важкого ланцюга амінокислота Т в положенні 366 замінена на К і амінокислота І в положенні 351 замінена нак, а в СНЗ-домені іншого важкого ланцюга амінокислота І в положенні 351 замінена на 0 (нумерація
БО відповідно до ЕО-індексу Кебота).
В іншому варіанті багатокільцевого злитого поліпептиду, представленого в даному описі, в
СНЗ-домені одного важкого ланцюга амінокислота Т в положенні 366 замінена на К і амінокислота Ї в положенні 351 замінена на К, а в СНЗ-домені іншого важкого ланцюга амінокислота Ї в положенні 351 замінена на 0 (нумерація відповідно до ЕО-індексу Кебота).
Крім того, принаймні одна із вказаних нижче замін міститься в СНЗ-домені іншого важкого ланцюга: амінокислота М в положенні 349 замінена на Е, амінокислота У в положенні 349 замінена на О і амінокислота І в положенні 368 замінена на Е (нумерація відповідно до ЕО- індексу Кебота). В одному із варіантів здійснення винаходу амінокислота Ї в положенні 368 замінена на Е (нумерація відповідно до ЕЄЮ-індексу Кебота).
В одному із варіантів багатокільцевого злитого поліпептиду, представленого в даному описі, застосовуть підхід, описаний в УМО 2012/058768, для підтримання гетеродимеризаціїї першого кільцевого злитого поліпептиду і другого кільцевого злитого поліпептиду багатокільцевого злитого поліпептиду. В одному із варіантів вказаного багатокільцевого злитого поліпептиду, представленого в даному описі, в СНЗ-домені одного важкого ланцюга амінокислота | в положенні 351 замінена на У і амінокислота У в положенні 407 замінена на А, а в СНЗ-домені іншого важкого ланцюга амінокислота Її в положенні 366 замінена на А і амінокислота К в положенні 409 замінена на Е (нумерація відповідно до ЕО-індексу Кебота). В іншому варіанті здійснення винаходу на додаток до вищевказаних замін в СНЗ-домені іншого важкого ланцюга замінена принаймні одна з амінокислот в положеннях 411 (початково Т), 399 (початково 0), 400 (початково 5), 405 (початково Е), 390 (початково М) і 392 (початково К) (нумерація відповідно до
Еи-індексу Кебота).
Переважні заміни являють собою: - заміну амінокислоти Т в положенні 411 на амінокислоту, вибрану з М, А, ОО, К, 0, Е і М (нумерація відповідно до ЕО-індексу Кебота), - заміну амінокислоти О в положенні 399 на амінокислоту, вибрану з Н, МУ, М і К (нумерація відповідно до ЕО-індексу Кебота), - заміну амінокислоти 5 в положенні 400 на амінокислоту, вибрану з Е, 0, ЕВ і К (нумерація відповідно до ЕО-індексу Кебота), - заміну амінокислоти Е в положенні 405 на амінокислоту, вибрану з І, М, Т, 5, М ії М (нумерація відповідно до ЕО-індексу Кебота), - заміну амінокислоти М в положенні 390 на амінокислоту, вибрану з Н,К і 0 (нумерація відповідно до ЕЮО-індексу Кебота), і - заміну амінокислоти К в положенні 392 на амінокислоту, вибрану з М, М, В, Її, Її Е (нумерація відповідно до ЕО-індексу Кебота).
В іншому варіанті вказаного багатокільцевого злитого поліпептиду, представленого в даному описі (сконструйованого відповідно до МО 2012/058768), в СНЗ-домені одного важкого ланцюга амінокислота Ї в положенні 351 замінена на М і амінокислота У в положенні 407 замінена на А, а в СНЗ-домені іншого важкого ланцюга амінокислота Т в положенні 366
Зо замінена на М і амінокислота К в положенні 409 замінена на Е (нумерація відповідно до ЕО- індексу Кебота) В іншому варіанті вказаного багатокільцевого злитого поліпептиду, представленого в даному описі в СНЗ-домені одного важкого ланцюга амінокислота М в положенні 407 замінена на А і в СНЗ-домені іншого важкого ланцюга амінокислота Т в положенні 366 замінена на А і амінокислота К в положенні 409 замінена на Е (нумерація відповідно до ЕюЮ-індексу Кебота). В останньому із вказаних вище варіантів здійснення винаходу в СНЗ-домені вказаного іншого важкого ланцюга амінокислота К в положенні 392 замінена на Е, амінокислота Т в положенні 411 замінена на Е, амінокислота О в положенні 399 замінена на В і амінокислота 5 в положенні 400 замінена на В (нумерація відповідно до ЕО-індексу Кебота).
В одному із варіантів багатокільцевого злитого поліпептиду, представленого в даному описі, застосовуть підхід, описаний в УМО 2011/143545, для підтримання гетеродимеризаціїї першого кільцевого злитого поліпептиду і другого кільцевого злитого поліпептиду багатокільцевого злитого поліпептиду. В одному із варіантів вказаного багатокільцевого злитого поліпептиду, представленого в даному описі, амінокислотні модифікації в СНЗ-доменах обох важких ланцюгів інтродукують в положення 368 і/або 409 (нумерація відповідно до ЕО-індексу Кебота).
В одному із варіантів багатокільцевого злитого поліпептиду, представленого в даному описі, застосовуть підхід, описаний в УМО 2011/090762, для підтримання гетеродимеризаціїї першого кільцевого злитого поліпептиду і другого кільцевого злитого поліпептиду багатокільцевого злитого поліпептиду. В МО 2011/090762 описані амінокислотні модифікації, здійснені відповідно до технології "Кпоб-іпіо-поїе" (КІН). В одному із варіантів вказаного СНЗ(КІіІН)-сконструйованого багатокільцевого злитого поліпептиду, представленого в даному описі, в СНЗ-домені одного важкого ланцюга амінокислота Т в положенні 366 замінена на МУ, а в СНЗ-домені іншого важкого ланцюга амінокислота М в положенні 407 замінена на А (нумерація відповідно до ЕО-індексу
Кебота). В іншому варіанті вказаного СНЗ(КіН)-сконструйованого багатокільцевого злитого поліпептиду, представленого в даному описі, в СНЗ-домені одного важкого ланцюга амінокислота Т в положенні 366 замінена на У, а в СНЗ-домені іншого важкого ланцюга амінокислота У в положенні 407 замінена на Т (нумерація відповідно до ЕЄО-індексу Кебота).
В одному із варіантів багатокільцевого злитого поліпептиду, представленого в даному описі, який має ІдсСег-ізотип, застосовуть підхід, описаний в УМО 2011/090762, для підтримання гетеродимеризації першого важкого ланцюга та другого важкого ланцюга багатокільцевого 60 злитого поліпептиду.
В одному із варіантів багатокільцевого злитого поліпептиду, представленого в даному описі, застосовуть підхід, описаний в УУО 2009/089004, для підтримання гетеродимеризаціїї першого кільцевого злитого поліпептиду і другого кільцевого злитого поліпептиду багатокільцевого злитого поліпептиду. В одному із варіантів вказаного багатокільцевого злитого поліпептиду, представленого в даному описі, в СНЗ-домені одного важкого ланцюга амінокислота К або М в положенні 392 замінена на негативно заряджену амінокислоту (в одному із переважних варіантів здійснення винаходу на Е або ОО, В одному із переважних варіантів здійснення винаходу на 0), а в СНЗ-домені іншого важкого ланцюга амінокислота ЮО в положенні 399, амінокислота Е або ЮО в положенні 356 або амінокислота Е в положенні 357 замінена на позитивно заряджену амінокислоту (в одному із переважних варіантів здійснення винаходу на К або В, в одному із переважних варіантів здійснення винаходу на К, в одному із переважних варіантів здійснення винаходу амінокислоти в положенні 399 або 356 замінені на К) (нумерація відповідно до ЕО-індексу Кебота). В наступному варіанті здійснення винаходу на додаток до вищевказаних замін в СНЗ-домені одного важкого ланцюга амінокислота К або ЕК в положенні 409 замінена на негативно заряджену амінокислоту (в одному із переважних варіантів здійснення винаходу на Е або 0, в одному із переважних варіантів здійснення винаходу на р) (нумерація відповідно до ЕО-індексу Кебота). В ще одному варіанті здійснення винаходу на додаток до вищевказаних замін або як альтернативи їм в СНЗ-домені одного важкого ланцюга амінокислота К в положенні 439 і/або амінокислота К в положенні 370 заміну незалежно один від одного на негативно заряджену амінокислоту (в одному із переважних варіантів здійснення винаходу на Е або 0, в одному із переважних варіантів здійснення винаходу на 0) (нумерація відповідно до ЕО-індексу Кебота).
В одному із варіантів багатокільцевого злитого поліпептиду, представленого в даному описі, застосовуть підхід, описаний в УМО 2007/147901, для підтримання гетеродимеризаціїї першого кільцевого злитого поліпептиду і другого кільцевого злитого поліпептиду багатокільцевого злитого поліпептиду. В одному із варіантів вказаного багатокільцевого злитого поліпептиду, представленого в даному описі, в СНЗ-домені одного важкого ланцюга амінокислота К в положенні 253 замінена на Е, амінокислота О в положенні 282 замінена на К і амінокислотак в положенні 322 замінена на О, а в СНЗ-домені іншого важкого ланцюга амінокислота О в положенні 239 замінена на К, амінокислота Е в положенні 240 замінена на К і амінокислотакК в положенні 292 замінена на О (нумерація відповідно до ЕО-індексу Кебота).
В одному із варіантів багатокільцевого злитого поліпептиду, представленого в даному описі, застосовуть підхід, описаний в УМО 2007/110205, для підтримання гетеродимеризаціїї першого кільцевого злитого поліпептиду і другого кільцевого злитого поліпептиду багатокільцевого злитого поліпептиду.
В одному із варіантів здійснення всіх об'єктів і варіантів здійснення винаходу, представлених в даному описі, багатокільцевий злитий поліпептид являє собою двокільцевий злитий поліпептид або трикільцевий злитий поліпептид. В одному із переважних варіантів здійснення винаходу багатокільцевий злитий поліпептид являє собою біспецифічний двокільцевий злитий поліпептид.
В одному із варіантів здійснення всіх об'єктів винаходу, вказаних в даному описі, багатокільцевий злитий поліпептид має структуру константного домену антитіла ІдСі-типу. В одному із наступних варіантів здійснення всіх об'єктів винаходу, вказаних в даному описі, багатокільцевий злитий поліпептид відрізняється тим, що вказаний багатокільцевий злитий поліпептид містить Ес-ділянку людського ІдсСиі-підкласу або людського ІдсСті-підкласу з мутаціями І 234А і І 235А і необов'язково у РЗ29а2. В одному із додаткових варіантів всіх об'єктів винаходу, вказаних в даному описі, багатокільцевий злитий поліпептид відрізняється тим, що вказаний багатокільцевий злитий поліпептид містить Ес-ділянку людського підкласу Ідас2г. В одному із додаткових варіантів всіх об'єктів винаходу, вказаних в даному описі, багатокільцевий злитий поліпептид відрізняється тим, що вказаний багатокільцевий злитий поліпептид містить
Ес-ділянку людського підкласу ІД23. В одному із додаткових варіантів всіх об'єктів винаходу, вказаних в даному описі, багатокільцевий злитий поліпептид відрізняється тим, що вказаний багатокільцевий злитий поліпептид містить Ес-ділянку людського підкласу ЗсЯ4 або людського підкласу ІдС4 з додатковими мутаціями 5228Р і 1 235Е і необов'язково РЗ29ОИ.
М. Варіанти
Деякі варіанти здійснення винаходу відносяться до варіантів амінокислотних послідовностей кільцевого злитого поліпептиду, представленого в даному описі. Наприклад, може вимагатись підвищення афінності зв'язування і/або інші біологічні властивості кільцевого злитого поліпептиду. Варіанти амінокислотної послідовності кільцевого злитого поліпептгиду можна бо одержувати шляхом інтродукції відповідних модифікацій в нуклеотидну послідовність, що кодує кільцевий злитий поліпептид, або шляхом синтезу пептидів. Вказані модифікації включають, наприклад, делеції і/або інсерції, і/або заміни залишків в амінокислотних послідовностях кільцевого злитого поліпептиду. Для одержання кінцевої конструкції можна використовувати будь-яку комбінацію делецій, інсерцій і замін, за умови, що кінцева конструкція має необхідні характеристики, наприклад, здатність зв'язуватись з антигеном. а) Варіанти, одержані шляхом заміни, інсерції та делеції
Деякими варіантами здійснення винаходу є варіанти кільцевого злитого поліпептиду, які мають одну або декілька амінокислотних замін. Сайти, що представляють інтерес для заміщувального мутагенезу, включають НМК і Ег. Консервативні заміни представлені нижче в таблиці під заголовком "переважні заміни". Більш загальні заміни представлені нижче в таблиці під заголовком "заміни, наведені як приклад", і вони додатково описані нижче з посиланням на класи бічних ланцюгів амінокислот. Амінокислотні заміни можна інтродукувати в кільцевий злитий поліпептид, який представляє інтерес, і продукти піддавати скринінгу щодо необхідної активності, наприклад, збереження/підвищення здатності до зв'язування антигена, зниженої імуногенності або підвищеної АОСС або СОС.
Ше() 71111111 (СешМа;МесАв; Рпеснорлейцин.////// Ме цец(Ю 77111111 ІнорлейциноМе; Ма; МесАвєРйє.їдЗ Ше 7777
Амінокислоти можна групувати на основі загальних властивостей бічних ланцюгів наступним чином: (1) гідрофобні: норлейцин, Меї, Аа, Маї, І єи, Пе; (2) нейтральні гідрофільні: Сувз, Зег, ТНг, Азп, Сп; (3) кислотні: Авр, Спи; (4) основні: Нів, І ув, Аго; (5) залишки, які впливають на орієнтацію ланцюга: Спу, Рго; (6) ароматичні: Тр, Гуг, РНе.
Під неконсервативними замінами мають на увазі заміну представника одного із зазначених класів на представника з іншого класу.
Один з типів одержаного в результаті заміни варіанта включає заміну одного або декількох залишків гіперваріабельної ділянки батьківського кільцевого злитого поліпептиду (наприклад,
Зо що містить сайт зв'язування, одержаний з гуманізованого або людського антитіла). Як правило, одержаний(ії) в результаті варіант(и), відібраний(і) для додаткового дослідження, повинені(ї) мати модифікації (наприклад, покращення) деяких біологічних властивостей (наприклад, підвищену афінність, знижену імуногенність) по відношенню до батьківського кільцевого злитого поліпептиду і/або повинен(ї) мати практично збережені певні біологічні властивості батьківського кільцевого злитого поліпептиду. Прикладом одержаного в результаті заміни варіанта є кільцевий злитий поліпептид з дозрілою афінністю, який можна створювати, наприклад, з використанням технологій дозрівання афінності на основі фагового дисплея, наприклад, зазначених у даному описі. В цілому, метод полягає в наступному: один або декілька залишків НУК піддають мутації і варіанти кільцевого злитого поліпептиду експонують на фагові і піддають скринінгу по відношенню до конкретної біологічної активності (наприклад, афінності зв'язування).
Зміни (наприклад, заміни) можна здійснювати в НУК, наприклад, для підвищення афінності кільцевого злитого поліпептиду. Зазначені зміни можна робити в "гарячих (активних) точках" в
НМЕ, тобто залишках, що кодуються кодонами, які з високою частотою піддаються мутації в процесі соматичного дозрівання (див., наприклад, Споуапигу Р5, Меїтоаз Мої. Віої. 207, 2008, сс. 179-196), і/або залишки, які контактують з антигеном, з подальшим тестуванням варіанти МН або МІ по відношенню до афінності зв'язування. Дозрівання афінності шляхом створення і повторної селекції з вторинних бібліотек описане, наприклад, у Ноодепроот Н.Е. та ін., Меїйоа5 іп МоїІесшаг Віоіоду 178, 2002 сс. 1-37. В деяких варіантах здійснення процесу дозрівання афінності інтродукують різноманітність в гени варіабельної ділянки, вибрані для створення мутації, за допомогою будь-якого з широкої різноманітності методів (наприклад, ПЛР зниженої точності, перестановка ланцюга або сайтнаправленого мутагенезу з використанням олігонуклеотидів). Потім створюють вторинну бібліотеку. Потім бібліотеку піддають скринінгу для ідентифікації будь-яких варіантів кільцевого злитого поліпептиду з необхідною афінністю.
Інший метод, застосовуваний для інтродукції різноманітності, включає підходи, мішенню яких є
НМК, при яких декілька залишків НМК (наприклад, 4-6 залишків одночасно) рандомізують.
Залишки НМК, які беруть участь у зв'язуванні антигена, можна специфічно ідентифікувати, наприклад, використовуючи аланін-скануючий мутагенез або моделювання. Часто мішенями є перш за все СОК-НЗ і СОК-Ї 3.
В деяких варіантах здійснення винаходу заміни, інсерції або делеції можуть зачіпати один або декілька НМЕ, якщо зазначені зміни не знижують істотно здатність кільцевого злитого поліпептиду зв'язуватись з необхідною мішенню. Наприклад, в НМА можуть бути зроблені консервативні зміни (наприклад, консервативні заміни, зазначені в даному описі), які не знижують істотно афінність зв'язування. Зазначені зміни, наприклад, можуть перебувати поза залишками НМР, які беруть участь в контактуванні з антигеном. В деяких варіантах здійснення винаходу в послідовності варіантів УН і МІ, зазначених вище, кожен НМЕК або є незмінним, або містить не більше однієї, двох або трьох амінокислотних замін.
Цінним методом ідентифікації залишків або ділянок кільцевого злитого поліпептиду, які можна піддавати мутагенезу, є так званий "аланін-скануючий мутагенез", описаний у
Сиппіпоапат В.С. і Умеї5 9.А., Зсіепсе 244, 1989, сс. 1081-1085. При здійсненні цього методу залишок або групу залишків-мішеней (наприклад, заряджені залишки, такі як агу, азр, пів, Туз і дії) ідентифікують і замінюють на нейтральну або негативно заряджену амінокислоту (наприклад, аланін або поліаланін) для вирішення питання про те, чи буде це впливати на взаємодію кільцевого злитого поліпептиду 3 його мішенню. Додаткові заміни можна інтродукувати в ті положення амінокислот, для яких продемонстрована функціональна чутливість до початкових замін. В альтернативному або додатковому варіанті вивчають кристалічну структуру комплексу мішень-кільцевий злитий поліпептид для ідентифікації точок контакту між кільцевим злитим поліпептидом і його мішенню. Зазначені контактувальні залишки і сусідні залишки можна розглядати як мішені або не враховувати при розгляді як кандидатів для заміни. Варіанти можна піддавати скринінгу для вирішення питання про те, чи мають вони необхідні властивості.
Інсерції в амінокислотні послідовності включають аміно- і/(або карбоксикінцеві злиття, які варіюють за довжиною від одного залишку до поліпептидів, що містять сто або більше залишків, а також інсерції одного або декількох амінокислотних залишків всередину послідовності.
Прикладом результату здійснення кінцевих інсерцій є кільцевий злитий поліпептид з М-кінцевим метіонільним залишком. Інші інсерційні варіанти молекул кільцевого злитого поліпептиду включають злиття М- або С-залишків кільцевого злитого поліпептиду з ферментом (наприклад, для АОЕРТ (антитіло-направлений фермент пролікарської терапії) або поліпептидом, який подовжує час напіввиведення кільцевого злитого поліпептиду в сироватці. б) Варіанти глікозилювання
В деяких варіантах здійснення винаходу кільцевий злитий поліпептид, представлений в даному описі, змінюють з метою підвищення або зниження ступеня глікозилювання кільцевого злитого поліпептиду. Додавання або делецію сайтів глікозилювання в кільцевому злитому поліпептиді можна легко здійснювати шляхом такої зміни амінокислотної послідовності, що дозволяє створювати або видаляти один або декілька сайтів глікозилювання.
Якщо кільцевий злитий поліпептид містить Ес-ділянку, то можна змінювати приєднаний до неї вуглевод. Нативні кільцеві злиті поліпептиди, що містять Ес-ділянку, які продукуються 60 клітинами ссавців, як правило, містять розгалужений біантенний олігосахарид, який, як правило,
приєднаний за допомогою М-зв'язку до Азп297 СН2-домену Ес-ділянки (див., наприклад, Умгідні
А. і Моїгтізоп 5.І., ТІВТЕСН 15, 1997, сс. 26-32). Олігосахарид може включати різні вуглеводи, наприклад, манозу, М-ацетилглюкозамін (СІСМАс), галактозу і сіалову кислоту, а також фукозу, приєднану до СіІСМАс в "стеблі" біантенної олігосахаридної структури. В деяких варіантах здійснення винаходу модифікації олігосахариду в кільцевому злитому поліпептиді, запропонованому у винаході, можна здійснювати для створення варіантів кільцевого злитого поліпептиду з певними покращеними властивостями.
Одним із варіантів здійснення винаходу є варіанти кільцевого злитого поліпептиду, що мають вуглеводну структуру, в якій знижений вміст фукози, приєднаної (прямо чи опосередковано) до Рс-ділянки. Наприклад, вміст фукози у зазначеній Ес-ділянці може становити від 1 95 до 80 95, від 1 95 до 65 905, від 5 95 до 65 95 або від 20 95 до 40 95. Вміст фукози визначають шляхом розрахунку середнього вмісту фукози в цукровому ланцюзі на Аб5п297 по відношенню до суми всіх глікоструктур, приєднаних до А5п297 (наприклад, комплексних, гібридних структур і структур з високим вмістом манози), що вимірюють за допомогою МАЇ 0І-
ТОРЕ-мас-спектрометрії відповідно до методу, описаному, наприклад, в УМО 2008/077546. Азп297 позначає залишок аспарагіну, присутній приблизно в положенні 297 в Ес-ділянці (ЕО-нумерація залишків Ес-ділянки); проте внаслідок мінорних варіацій послідовності антитіла Азп297 може розташовуватись також приблизно на «3 амінокислоти в прямому або зворотному напрямку по відношенню до положення 297, тобто між положеннями 294 і 300. Зазначені фукозильовані варіанти можуть мати покращену АЮСОС-функцію (див., наприклад, 05 2003/0157108; 05 2004/0093621). Прикладами публікацій, що стосуються "дефукозильованих" варіантів антитіл або варіантів антитіл "з дефіцитом фукози", є: 05 2003/0157108; УМО 2000/61739; МО 2001/29246; 005 2003/0115614; 05 2002/0164328; 005 2004/0093621; 05 2004/0132140;. 05 2004/0110704; 005 2004/0110282; 005 2004/0109865; МО 2003/085119; МО 2003/084570; МО 2005/035586; МО 2005/035778; МО 2005/053742; МО 2002/031140; ОКалакі та ін., У. Мої. Віо!. 336, 2004, сс. 1239-1249; Матапе-ОНпикі та ін., Віоїесн. Віоєпуд. 87, 2004, с. 614-622).
Прикладами клітинних ліній, які мають здатність продукувати дефукозильовані кільцеві злиті поліпептиди, є І ес13 СНО-клітини з дефіцитом білкового фукозилювання (ВіркКа .. та ін., Агсп.
Віоспет. Віорпув. 249, 1986, сс. 533-545; 05 2003/0157108 ії М/О 2004/056312, см., перш за все, приклад 11), і клітинні лінії з "вимкненим" геном, наприклад, СНО-клітини з "вимкненим" геном альфа-1,6-фукозилтрансферази, РОТ8 (див., наприклад, Матапе-ОНпикі М. та ін., Віоїесн.
Віоепд. 87, 2004, с. 614-622); Капаа У. та ін., Віоїесппої. Віоепо., 94 (4), 2006, сс. 680-688; ії ММО 2003/085107).
Крім того, описані варіанти кільцевого злитого поліпептиду з бісекційними олігосахаридами, наприклад, в яких біантенний олігосахарид, приєднаний до Ес-ділянки кільцевого злитого поліпептиду, бісекціонується за допомогою (С1ІсСМАс. Зазначені варіанти кільцевого злитого поліпептиду можуть відрізнятись зниженим фукозилюванням і/або підвищеною АЮСС-функцією.
Приклади зазначених варіантів антитіл описані, наприклад, в ММО 2003/011878; 05 Мо 6602684 та 005 2005/0123546. Запропоновані також варіанти кільцевого злитого поліпептиду принаймні з одним залишком галактози в олігосахариди, приєднаним до Ес-ділянки. Зазначені варіанти кільцевого злитого поліпептиду можуть мати підвищену СОС-функцію. Зазначені варіанти антитіл описані, наприклад, в УМО 1997/30087; УМО 1998/58964 та МО 1999/22764. в) Варіанти Ес-ділянки
Відповідно до конкретних варіантів здійснення винаходу можна інтродукувати в Ес-ділянку кільцевого злитого поліпептиду, представленого в даному описі, одну або декілька амінокислотних модифікацій, створюючи тим самим варіант Ес-ділянки. Варіант Ес-ділянки може містити послідовність людської Ес-ділянки (наприклад, Есо-ділянки людського ІдДС1, Ідс2, 993 або Ідс4), що включає амінокислотну модифікацію (наприклад, заміну) в одному або декількох амінокислотних положеннях).
Деякі варіанти здійснення винаходу належать до варіанта кільцевого злитого поліпептиду, який має деякі, але не всі ефекторні функції, що робить його перспективним кандидатом для шляхів застосування, для яких є важливим час напівжиття іп мімо, проте деякі ефекторні функції (такі як СОС ії АЮСС) не є необхідними або є шкідливими. Можна здійснювати аналізи цитотоксичності іп міїго і/або іп мімо для підтвердження зниження/виснаження СОС- і/або АЮСС- активності. Наприклад, можна здійснювати аналізи зв'язування Ес-рецептора (ЕсК) для гарантії того, що у кільцевого злитого поліпептиду відсутня здатність до зв'язування з ЕСУВ (і тому, ймовірно, відсутня АОСС -активність), але зберігається здатність зв'язуватись з ЕсКп. Первинні клітини, що опосередковують АЮСС, тобто МК-клітини, експресують тільки ЕсугВІІЇ, в той час як моноцити експресують ЕсуКіІ, ЕсуКіІ! ії ЕсуКП. Дані про експресії ЕСК на гематопоетичних 60 клітинах узагальнені в таблиці З на с. 464 у Камеїсй У.М. і Кіпеї 9У.Р., Аппи. Кем. Іттипої. 9, 1991,
сс. 457-492. Прикладами аналізів іп міго АОСС-активності молекули, що представляє інтерес, є (але не обмежуючись тільки ними) аналізи, описані в ШО Мо 5500362 (див., наприклад, НеїЇбігот
І. та ін., Ргос. Маї). Асад. сі. ОБА 83, 1986, сс. 7059-7063 і НеїЇвігот І. та ін., Ргос. Маї! Асад. осі.
ИБА 82, 1985, сс.1499-15023; 5 Мо 5821337 (див. Вгпіпадетапп М. та ін., У. Ехр. Мед. 166, 1987, со. 1351-1361). В альтернативному варіанті можна застосовувати нерадіоактивні методи аналізу (див., наприклад, нерадіоактивний аналіз цитотоксичності АСТІТМ вна основі проточної цитометрії (фірма СеїІГесппоіоду, Іпс. Маунтін-В'ю, шт. Каліфорнія), і нерадіоактивний аналіз цитотоксичності СуюТох 962 (фірма Рготеда, Медісон, шт. Вісконсін). Придатними для таких аналізів ефекторними клітинами є мононуклеарні клітини периферичної крові (РВМС) і природні клітини-кілери (МК). В альтернативному або додатковому варіанті АОСС-активність молекули, що представляє інтерес, можна оцінювати іп мімо, наприклад, на тваринній моделі, наприклад, як описано у Сіупез В. та ін., Ргос. Маї). Асад. сі. ОБА 95, 1998, сс. 652-656. Можна здійснювати також аналізи зв'язування Сід для підтвердження того, що антитіло не може пов'язувати Сід і тому у нього відсутня СОС-активність (див., наприклад, опис ЕГІЗА для оцінки зв'язування Сід і СЗс в МО 2006/029879 і МО 2005/100402). для оцінки активації комплемента можна здійснювати СОС-аналіз (див., наприклад, Саггапо-Запіого Н. та ін., У. Іттипої. Меїйоав» 202, 1996, сс. 163-171; Стадад М.5. і ін., Вісой 101, 2003 сс.1045-1052; і Стадуд М.5. і М.У. Спеппіє,
Віоса 103, 2004, со. 2738-2743). Визначення ЕсАп-зв'язування і кліренсу/часу напівжиття іп мімо можна здійснювати також з використанням методів, відомих в даній галузі (див., наприклад,
Реїкома 5В та ін., Іпг. Іттипої. 18 (12), 2006, сс. 1759-1769).
Кільцеві злиті поліпептиди зі зниженою ефекторною функцією, що містять РЕс-ділянку, включають поліпептиди із заміною одного або декількох наступних залишків Ес-ділянки, таких як 238, 265, 269, 270, 297, 327 і 329 (див., наприклад, ОЗ Мо 6737056). До зазначених мутантів Ес відносяться мутанти Ес із замінами в двох або більшій кількості з наступних амінокислотних положень: 265, 269, 270, 297 і 327, включаючи так званий мутант "САМА" Ес-ділянки, що несе заміну залишків 265 і 297 на аланін (05 Мо 7332581).
Описані деякі варіанти, які містять Ес-ділянку кільцевих злитих поліпептидів з підвищеною або пониженою здатністю зв'язуватись з ЕРСсВ (див., наприклад, О5 Мо 6737056; МО 2004/056312 і ЗПпівєїЇдз» В... та ін., у. Віо!Ї. Снет. 276, 2001, сс. 6591-6604).
Відповідно до конкретних варіантів здійснення винаходу варіант кільцевого злитого поліпептиду містить Ес-ділянку з однією або декількома амінокислотними замінами, які підвищують АЮСС, наприклад, заміни в положеннях 298, 333, і/або 334 Рс-ділянки (БО- нумерація залишків).
В деяких варіантах здійснення винаходу в Ес-ділянці здійснюють зміни, які призводять до зміненої (тобто або підвищеної або пониженої) здатності зв'язувати Сід і/або комплементзалежної цитотоксичності (СОС), що описано, наприклад, в 05 Мо 6194551, МО 99/51642 і у Ідизодіє Е.Е. та ін., 9. Іттипої. 164, 2000, сс. 4178-4184.
Антитіла з подовженим часом напіввиведення і підвищеною здатністю до зв'язування з неонатальним Ес-рецептором (ЕсАп), відповідальним за перенесення материнських Ідс ембріону (Спшуеєг В.І. та ін., У. Іттипої. 117, 1976, сс. 587-593 і Кіт .К. та ін., У. Іттипої. 24, 1994, сс. 2429-2434), описані в 05 2005/0014934. Ці антитіла містять Ес-ділянку з однією або декількома замінами, які підвищують зв'язування Ес-ділянки з ЕсАп. Вказані варіанти Ес-ділянки включають варіанти із замінами одного або декількох наступних залишків Ес-ділянки: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 або 434, наприклад, заміну залишка 434 в Ес-ділянки (05 Мо 7371826).
Додаткові приклади, що стосуються інших варіантів Ес-ділянки, описані також у бипсап А.В. і М/іптег С., Майте 322, 1988, сс. 738-740; в О5 Мо 5648260; 05 Мо 5624821 і М/О 94/29351.
В одному із варіантів всіх об'єктів винаходу кільцевий злитий поліпептид містить (всі положення пронумеровані відповідно до ЄО-індексу Кебота):
І) гомодимерну Ес-ділянку людського ІдС1-підкласу необов'язково з мутаціями РЗ29а,
І 234А і І 235А або
І) гомодимерну Ес-ділянку людського Ідс4-підкласу необов'язково з мутаціями РЗ29а, 5228Р і1235Е, або
ІП) гомодимерну Ес-ділянку людського Ід(11-підкласу необов'язково з мутаціями РЗ29аО,
ІЇ234А, І1235А, І253А, НЗІОА і На4ЗБА або необов'язково з мутаціями РЗ29а, І 234А, І2З5А,
НЗІОА, Н4ІЗЗА і У4З6А, або
ІМ) гетеродимерну Ес-ділянку, в якій а) один поліпептид Ес-ділянки містить мутацію ТЗ36бУУ, а інший поліпептид Ес-ділянки містить мутації 73665, І З68А і 407, або б) один поліпептид Ес-ділянки містить мутації ТЗ36бМУ і У349С, а інший поліпептид Ес-ділянки містить мутації 73665, І З68А, 407 і 5354С, або в) один поліпептид Ес-ділянки містить мутації ТЗ36бМУ і 5354С, а інший поліпептид Ес-ділянки містить мутації 73665, І З368А, 407 і 3496, або
М) гетеродимерну Ес-ділянку людського ІдС1-підкласу, в якій обидва поліпептиди Ес-ділянки містять мутації РЗ329С, І 234А і І 235А і а) один поліпептид Ес-ділянки містить мутацію ТЗ36бУУ, а інший поліпептид Ес-ділянки містить мутації 73665, І З68А і 407, або б) один поліпептид Ес-ділянки містить мутації ТЗ36бМУ і У349С, а інший поліпептид Ес-ділянки містить мутації 73665, І З68А, 407 і 5354С, або в) один поліпептид Ес-ділянки містить мутації ТЗ36бМУ і 5354С, а інший поліпептид Ес-ділянки містить мутації 73665, І З368А, 407 і 3496, або
МІ) гетеродимерну Ес-ділянку людського ІдДс4-підкласу, в якій обидва поліпептиди Ес- ділянки містять мутації РЗ29С, 5228Р і 1 235Е і а) один поліпептид Ес-ділянки містить мутацію ТЗ36бУУ, а інший поліпептид Ес-ділянки містить мутації 73665, І З68А і 407, або б) один поліпептид Ес-ділянки містить мутації ТЗ36бМУ і У349С, а інший поліпептид Ес-ділянки містить мутації 73665, І З68А, 407 і 5354С, або в) один поліпептид Ес-ділянки містить мутації ТЗ36бМУ і 5354С, а інший поліпептид Ес-ділянки містить мутації 73665, І З368А, 407 і 3496, або
МІЇ) комбінацію варіантів, вказаних в одному із підпунктів І), ІІ) ї І), з варіантом, вказаним в одному із підпунктів ІМ), М) і МІ).
В одному із варіантів всіх об'єктів винаходу, вказаних в даному описі, кільцевий злитий поліпептид, який містить СНЗ-домен, містить додатковий С-кінцевий дипептид гліцин-лізин (2446 і К447, нумерація відповідно до ЕО-індексу Кебота). В одному із варіантів всіх об'єктів винаходу, вказаних в даному описі, кільцевий злитий поліпептид, який містить СНЗ-домен,
Зо містить додатковий С-кінцевий залишок гліцину (1446, нумерація відповідно до ЕШО-індексу
Кебота).
В одному із варіантів здійснення винаходу кільцевий злитий поліпептид, представлений в даному описі, містить Ес-ділянку, яка відрізняється тим, що вона відноситься до людського
Ідс11-підкласу з мутаціями РМА2З6, І 234А/ 235А і/або СІ РОБЗЗ31 (нумерація відповідно до ЕЄЮ- індексу Кебота) або ІдС4-підкласу. В іншому варіанті здійснення винаходу кільцевий злитий поліпептид відрізняється тим, що містить Ес-ділянку, яка відноситься до будь-якого Ід(сз-класу, в одному із варіантів здійснення винаходу відноситься до Ідсі- або ІдС4-підкласу і містить принаймні одну з мутацій в положеннях Е233, І 234, 1235, 236, 0270, М297, ЕЗ318, КЗ20, КЗ22,
АЗ27, АЗЗ30, РЗ331 і/або РЗ29 (нумерація відповідно до ЄО-індексу Кебота). Крім того, в одному із варіантів здійснення винаходу кільцевий злитий поліпептид містить Ес-ділянку людського Ідсасі4- підкласу, яка містить мутацію 5228Р або мутації 5228Р і 1235Е (Апааї 5. та ін., Мої. Іттипої. 30, 1993, сс. 105-108) (нумерація відповідно до ЄО-індексу Кебота).
С-кінець поліпептидів Ес-ділянки, які містяться в кільцевому злитому поліпептиді, представленому в даному описі, може являти собою повний С-кінець, що закінчується амінокислотними залишками РОК. С-кінець може являти собою вкорочений С-кінець, в якому один або два з С-кінцевих амінокислотних залишків видалені. В одному із переважних варіантів здійснення винаходу С-кінець являє собою вкороченийй С-кінець, який закінчується амінокислотними залишками Ра. г) Кільцеві злиті поліпептиди, сконструйовані за допомогою цистеїну
В деяких варіантах здійснення винаходу може виявитись бажаним створювати сконструйовані за допомогою цистеїну кільцеві злиті поліпептиди, в яких один або декілька залишків замінені на залишки цистеїну. В конкретних варіантах здійснення винаходу замінені залишки знаходяться в доступних сайтах кільцевого злитого поліпептиду. Шляхом заміни цих залишків на цистеїн реакційноздатні тіольні групи поміщаються в доступні сайти кільцевого злитого поліпептиду і можуть використовуватись для кон'югації кільцевого злитого поліпептиду з іншими фрагментами, такими як фрагменти, що являють собою лікарський засіб, або фрагменти, що являють собою лінкер, зв'язаний з лікарським засобом, зі створенням імунокон'югату, вказаним в цьому описі. В деяких варіантах здійснення винаходу будь-якийі) один або декілька наступних залишків кільцевого злитого поліпептиду, насамперед Сопіогзроду, бо може(уть) бути замінений(ї) на цистеїн: М205 (нумерація за Кеботом) легкого ланцюга; А118
(БЕО-нумерація) важкого ланцюга і 5400 (ЕО-нумерація) Ес-ділянки важкого ланцюга. Кільцевий злитий поліпептид, сконструйований за допомогою цистеїну, можна створювати відповідно до методу, наприклад, описаному, наприклад, в ШО Мо 7521541. д) Похідні кільцевого злитого поліпептиду
В деяких варіантах здійснення винаходу кільцевий злитий поліпептид, представлений в даному описі, можна додатково модифікувати таким чином, щоб він містив додаткові небілкові фрагменти, відомі в даній галузі і легко доступні. Фрагменти, придатні для дериватизації кільцевого злитого поліпептиду, включають (але не обмежуючись тільки ними) водорозчинні полімери. Прикладами водорозчинних полімерів є (але, не обмежуючись тільки ними) поліетиленгліколь (ПЕГ), сополімери етиленгліколю/пропіленгліколю, карбоксиметилцелюлоза, декстран, полівініловий спирт, полівінілпіролідон, полі-1,3-діоксолан, полі-1,3,6-триоксан, сополімер етилену/малеїнового ангідриду, поліамінокислоти (або гомополімери, або статистичні сополімери) і декстран- або полі(н-вінілпіролідон), поліетиленгліколь, гомополімери пропіленгліколю, сополімери пропіленоксиду/"етиленоксиду, поліоксиетильовані поліоли (наприклад, гліцерин), полівініловий спирт і їх суміші. Поліетиленглікольпропіональдегід може мати перевагу при виробництві завдяки його стабільності в воді. Полімер може мати будь-яку молекулярну масу і може бути розгалуженим або нерозгалуженим. Кількість полімерів, приєднаних до кільцевого злитого поліпептиду, може варіюватись і, якщо приєднано більше одного полімеру, то вони можуть являти собою однакові або різні молекули. В цілому, кількість іабо тип полімерів, що застосовуються для дериватизації, можна визначати з урахуванням таких особливостей (але не обмежуючись тільки ними), як конкретні властивості або функції кільцевого злитого поліпептиду, що підлягають вдосконаленню, чи передбачається застосування похідного кільцевого злитого поліпептиду в терапії за певних умов тощо.
Іншим варіантом здійснення винаходу є кон'югати кільцевого злитого поліпептиду і небілкового фрагмента, які можна вибірково нагрівати, впливаючи на нього випромінюванням. В одному із варіантів здійснення винаходу небілковий фрагмент являє собою вуглецеву нанотрубку (Кат М.МУ. та ін., Ргос. Май. Асад. Зсі ОБА 102, 2005, сс. 11600-11605).
Випромінювання може мати будь-яку довжину хвилі, включаючи (але не обмежуючись тільки ними) довжини хвиль, які не ушкоджують звичайні клітини, але які нагрівають небілковий
Зо фрагмент до температури, при якій знищуються клітини, найближчі до кон'югату: антитіло- небілковий фрагмент. е) Кон'югати з шатлом для гематоенцефалічного бар'єра
В деяких варіантах здійснення винаходу кільцевий злитий поліпептид, представлений в даному описі, можна додатково модифікувати так, щоб він містив один або декілька модулей шатлу для гематоенцефалічного бар'єра, відомих в даній галузі і легко доступних.
Модуль шатлу для гематоенцефалічного бар'єра відрізняється наявністю зв'язувальної специфічності по відношенню до рецептора гематоенцефалічного бар'єра. Вказану зв'язувальну специфічність можна одержувати або шляхом злиття модуля шатлу для гематоенцефалічного бар'єра з кільцевим злитим поліпептидом, вказаним в даному описі, або її можна одержувати шляхом інтродукції зв'язувальної специфічності по відношенню до рецептора гематоенцефалічного бар'єра як однієї із зв'язувальних специфічностей мультиспецифічного (одно- або багато)кільцевого злитого поліпептиду і, який в результаті містить зв'язувальну специфічність для терапевтичної мішені і зв'язувальну специфічність для рецептора гематоенцефалічного бар'єра.
Один або декілька модулей шатлу для гематоенцефалічного бар'єра можна зливати з будь- яким кінцем легкого або важкого ланцюга кільцевого злитого поліпептиду, вказаного в даному описі. В одному із переважних варіантів здійснення винаходу модуль шатлу для гематоенцефалічного бар'єра зливають з С-кінцем кільцевого злитого поліпептиду. В одному із переважних варіантів здійснення винаходу модуль шатлу для гематоенцефалічного бар'єра зливають з М-кінцем кільцевого злитого поліпептиду.
Один або декілька модулей шатлу для гематоенцефалічного бар'єра можна зливати з відповідним кільцевим злитим поліпептидом або безпосередньо, або через пептидний лінкер. В одному із переважних варіантів здійснення винаходу пептидний лінкер має амінокислотну послідовність СОСОССИОБОСОСО (5ЕО ІЮ МО: 64) або ССВСОаЗОСОСОСВОССОСе (ЗЕО ІО МО: 65), або (с45)6 (БЕО ІО МО: 70).
Модуль шатлу для гематоенцефалічного бар'єра може являти собою 5сЕм-фрагмент або
Еаб-фрагмент антитіла. В одному із варіантів здійснення винаходу модуль шатлу для гематоенцефалічного бар'єра являє собою 5сЕм, який містить в напрямку від М-кінця до С-кінця варіабельний домен легкого ланцюга - константний домен легкого ланцюга - пептидний лінкер бо - варіабельний домен важкого ланцюга - константний домен 1 важкого ланцюга.
В одному із варіантів здійснення винаходу модуль шатлу для гематоенцефалічного бар'єра являє собою 5сЕм-фрагмент або РГаб-фрагмент гуманізованого варіанта антитіла до рецептора трансферину 803 з пептидним лінкером ((45)6 (ЗЕО І МО: 70).
Поняття "її гуманізований варіант" відноситься до молекули, одержаної шляхом трансплантації НМА мишачого антитіла 803 в людську каркасну ділянку з необов'язковою інтродукцією 1-3 мутацій незалежно один від одного в кожну з каркасних ділянок (Р) і/або гіперваріабельних ділянок (НМА).
Антитіло до рецептора трансферину 803 (див., наприклад, Воадо Н.). та ін., Віоїеснпої.
Віоєпа. 102, 2009, сс. 1251-1258) являє собою мишаче антитіло, в якому варіабельний домен важкого ланцюга має амінокислотну послідовність БЕО ІЮО МО: 71 і в якому варіабельний домен легкого ланцюга має амінокислотну послідовність ЕО ІЮ МО: 72 (варіант 1) або 5ЕО І МО: 73 (варіант 2).
В одному із варіантів здійснення винаходу модуль шатлу для гематоенцефалічного бар'єра являє собою 5сЕм-фрагмент або РГаб-фрагмент гуманізованого варіанта антитіла до рецептора трансферину 299 (див. УУО 2017/055541).
Поняття "її гуманізований варіант" відноситься до молекули, одержаної шляхом трансплантації НМВ антитіла 299 в людську каркасну ділянку з необов'язковою інтродукцією 1-3 мутацій незалежно один від одного в кожну з каркасних ділянок (Рі) і/або гіперваріабельних ділянок (НМН).
Антитіло до рецептора трансферину 299 являє собою кроляче антитіло, в якому варіабельний домен важкого ланцюга має амінокислотну послідовність 5ЕСО ІЮО МО: 74 і варіабельний домен легкого ланцюга має амінокислотну послідовність хЕО ІЮО МО: 75.
В одному із варіантів здійснення винаходу модуль шатлу для гематоенцефалічного бар'єра містить зв'язувальну специфічність для рецептора трансферину, що містить (а) НМВ-НІ, який містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 76; (б) НУВ-Н2, який містить амінокислотну послідовність ФЕО ІЮО МО: 77; (в) НУВ-НЗ, який містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 178, 79 або 80; (г) НМВ-1І1, який містить амінокислотну послідовність ЕС ІЮ МО: 81; (д) НМВ-12, який містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 82; і (є) НМВ-І3, який містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 83.
Зо В одному із варіантів здійснення винаходу модуль шатлу для гематоенцефалічного бар'єра містить принаймні одну пару, яка включає варіабельний домен важкого ланцюга, який має 5ЕО
ІО МО: 84, і варіабельний домен легкого ланцюга, який має 5ЕО ІО МО: 85, що утворює сайт зв'язування для рецептора трансферину.
В одному із варіантів здійснення винаходу модуль шатлу для гематоенцефалічного бар'єра містить принаймні одну пару, яка включає варіабельний домен важкого ланцюга, який має 5ЕО
ІО МО: 86, і варіабельний домен легкого ланцюга, який має 5ЕО ІО МО: 87, що утворює сайт зв'язування для рецептора трансферину.
В одному із варіантів здійснення винаходу модуль шатлу для гематоенцефалічного бар'єра містить принаймні одну пару, яка включає варіабельний домен важкого ланцюга, який має 5ЕО
ІО МО: 88, і варіабельний домен легкого ланцюга, який має 5ЕО ІО МО: 87, що утворює сайт зв'язування для рецептора трансферину.
В одному із варіантів здійснення винаходу модуль шатлу для гематоенцефалічного бар'єра являє собою 5сЕм-фрагмент або РГаб-фрагмент гуманізованого варіанта антитіла до рецептора трансферину 494 (див. ЕР 15187820).
Поняття "її гуманізований варіант" відноситься до молекули, одержаної шляхом трансплантації НМВ антитіла 494 в людську каркасну ділянку з необов'язковою інтродукцією 1-3 мутацій незалежно одна від одної в кожну з каркасних ділянок (Рг) і/або гіперваріабельних ділянок (НМН).
Антитіло до рецептора трансферину 494 являє собою мишаче антитіло, в якому варіабельний домен важкого ланцюга має амінокислотну послідовність 5ЕСО ІЮО МО: 89 і варіабельний домен легкого ланцюга має амінокислотну послідовність ФЕО ІЮО МО: 90.
В одному із варіантів здійснення винаходу модуль шатлу для гематоенцефалічного бар'єра являє собою 5сЕм-фрагмент або Рарб-фрагмент антитіла до рецептора трансферину, яке специфічно зв'язується з людським рецептором трансферину (пит) і рецептором трансферину мавп ціномолгус (суГЕк). В деяких варіантах здійснення винаходу антитіло до рецептора трансферину - зв'язується з людським рецептором трансферину (пиТЕг) і рецептором трансферину мавп ціномолгус (сУТЕг) і/або - має швидкість дисоціації з комплексу з людським рецептором трансферину, рівну або бо більш низьку (тобто таку, що не перевищує) швидкість антитіла до рецептора трансферину
128.1 з комплексу з рецептором трансферину мавп ціномолгус при визначенні швидкості дисоціації за допомогою поверхневого плазмонного резонансу, і де антитіло до рецептора трансферину 128.1 має варіабельний домен важкого ланцюга, який має 5ЕО ІО МО: 91, і варіабельний домен легкого ланцюга, який має 5ЕО І МО: 92, і/або - швидкість дисоціації якого при зв'язуванні з людським рецептором трансферину знаходиться в діапазоні від 0,1 до 0,005 1/с включно.
Одним із об'єктів даного винаходу є антитіло до рецептора трансферину, яке специфічно зв'язується з людським рецептором трансферину і рецептором трансферину мавп ціномолгус, яке містить
І) гуманізований варіабельний домен важкого ланцюга, одержаний з варіабельного домену важкого ланцюга, який має 5ЕО 10 МО: 74, і
І) гуманізований варіабельний домен легкого ланцюга, одержаний з варіабельного домену легкого ланцюга, який має 5ЕО ІО МО: 75, де антитіло має швидкість дисоціації з комплексу з людським рецептором трансферину, рівну або більш низьку (тобто таку, що не перевищує) швидкість антитіла до рецептора трансферину 128.1 з комплексу з рецептором трансферину мавп ціномолгус, де швидкість дисоціації визначають за допомогою поверхневого плазмонного резонансу, і де антитіло до рецептора трансферину 128.1 має варіабельний домен важкого ланцюга, який має 5ЕО ІО МО: 91, і варіабельний домен легкого ланцюга, який має 5ЕО І МО: 92.
В одному із варіантів здійснення винаходу антитіло має в варіабельному домені легкого ланцюга в положенні 80 амінокислотний залишок проліну (Р) (нумерація за Кеботом).
В одному із варіантів здійснення винаходу антитіло має в варіабельному домені легкого ланцюга в положенні 91 амінокислотний залишок аспарагіну (М) (нумерація за Кеботом).
В одному із варіантів здійснення винаходу антитіло має в варіабельному домені легкого ланцюга в положенні 93 амінокислотний залишок аланіну (А) (нумерація за Кеботом).
В одному із варіантів здійснення винаходу антитіло має в варіабельному домені важкого ланцюга в положенні 1009 амінокислотний залишок серину (5) (нумерація за Кеботом).
В одному із варіантів здійснення винаходу антитіло має в варіабельному домені важкого ланцюга в положенні 1009 амінокислотний залишок глутаміну (0) (нумерація за Кеботом).
Зо В одному із варіантів здійснення винаходу антитіло має в варіабельному домені важкого ланцюга в положенні 65 амінокислотний залишок серину (5) (нумерація за Кеботом).
В одному із варіантів здійснення винаходу антитіло має в варіабельному домені важкого ланцюга в положенні 105 амінокислотний залишок глутаміну (0) (нумерація за Кеботом).
В одному із варіантів здійснення винаходу антитіло має в варіабельному домені легкого ланцюга в положенні 80 амінокислотний залишок проліну (Р), в варіабельному домені легкого ланцюга в положенні 91 амінокислотний залишок аспарагіну (М), в варіабельному домені легкого ланцюга в положенні 93 амінокислотний залишок аланіну (А), в варіабельному домені важкого ланцюга в положенні 1009 амінокислотний залишок серину (5), в варіабельному домені важкого ланцюга в положенні 65 амінокислотний залишок серину (5) і в варіабельному домені важкого ланцюга в положенні 105 амінокислотний залишок глутаміну (С) (нумерація за
Кеботом).
В одному із варіантів здійснення винаходу антитіло має в варіабельному домені легкого ланцюга в положенні 80 амінокислотний залишок проліну (Р), в варіабельному домені легкого ланцюга в положенні 91 амінокислотний залишок аспарагіну (М), в варіабельному домені легкого ланцюга в положенні 93 амінокислотний залишок аланіну (А), в варіабельному домені важкого ланцюга в положенні 100уд амінокислотний залишок глутаміну (0), в варіабельному домені важкого ланцюга в положенні 65 амінокислотний залишок серину (5) і в варіабельному домені важкого ланцюга в положенні 105 амінокислотний залишок глутаміну (С) (нумерація за
Кеботом).
Одним із об'єктів даного винаходу є антитіло до рецептора трансферину, яке специфічно зв'язується з людським рецептором трансферину (пит), що містить:
І) послідовність варіабельного домену важкого ланцюга (УН), яка ідентична принаймні на 90 95 амінокислотній послідовності ФЗЕО ІО МО: 88, і
І) послідовність варіабельного домену легкого ланцюга (МІ), яка ідентична принаймні на 90 95 амінокислотній послідовності ФЕО ІЮО МО: 87, де антитіло має практично таку ж швидкість дисоціації, що і антитіло, яке містить послідовність варіабельного домену важкого ланцюга (МН) 5ЕО ІЮО МО: 88 ї послідовність варіабельного домену легкого ланцюга (МІ) 5ЕО ІО МО: 87.
Одним із об'єктів даного винаходу є кільцевий злитий поліпептид, представлений в даному описі, кон'юЮюгований через пептидний лінкер з одновалентним з'єднувальним агентом, що зв'язується з рецептором гематоенцефалічного бар'єра.
Одним із об'єктів даного винаходу є двокільцевий злитий поліпептид, представлений в даному описі, в якому один кільцевий злитий поліпептид кон'югований через пептидний лінкер з одновалентним з'єднувальним агентом, що зв'язується з рецептором гематоенцефалічного бар'єра.
Одним із об'єктів даного винаходу є двокільцевий злитий поліпептид, представлений в даному описі, в якому кожний з обох кільцевих злитих поліпептидів індивідуально кон'югований з одновалентним з'єднувальним агентом, що зв'язується з рецептором гематоенцефалічного бар'єра. Вказаний кон'югат містить два одновалентних зв'язуювальних агента, які зв'язуються з рецептором гематоенцефалічного бар'єра.
В одному із варіантів здійснення винаходу одновалентний зв'язувальний агент, що зв'язується з рецептором гематоенцефалічного бар'єра, вибирають з групи, яка складається з білків, поліпептидів і пептидів.
В одному із варіантів здійснення винаходу одновалентний зв'язувальний агент, що зв'язується з рецептором гематоенцефалічного бар'єра, містить молекулу, вибрану з групи, яка складається з ліганду рецептора гематоенцефалічного бар'єра, зсЕм, Ем, зсГРар, УНН, в одному із переважних варіантів здійснення винаходу з5сЕм або зсЕар.
В одному із варіантів здійснення винаходу рецептор гематоенцефалічного бар'єра вибирають з групи, яка складається з рецептора трансферину, рецептора інсуліну, рецептора інсулінподібного фактора росту, білка 8, родинного рецептора ліпопротеїнів низької густини, білка 1, родинного рецептора ліпопротеїнів низької густини, і гепаринзв'язувального епідермального фактора росту. В одному із переважних варіантів здійснення винаходу рецептор гематоенцефалічного бар'єра являє собою рецептор трансферину.
В одному із варіантів здійснення винаходу одновалентний зв'язувальний агент, що зв'язується з рецептором гематоенцефалічного бар'єра, містить один зсРар або один 5сЕм проти рецептора трансферину, більше конкретно 5сРабБ або 5сЕм, який розпізнає епітоп в рецепторі трансферину, який міститься в амінокислотній послідовності 560) ІЮО МО: 93, 94 або
Зо 95.
В одному із варіантів здійснення винаходу одновалентний зв'язувальний агент, що зв'язується з рецептором гематоенцефалічного бар'єра, зшитий з С-кінцем кільцевого злитого поліпептиду за допомогою лінкера.
В одному із варіантів здійснення винаходу пептидний лінкер має амінокислотну послідовність, яка складається принаймні з 15 амінокислот, яка більш переважно складається з 18-25 амінокислот.
В переважному варіанті здійснення винаходу кон'югат містить кільцевий злитий поліпептид, вказаний в даному описі (який специфічно зв'язується з мішенню в головному мозку), як ефекторної субстанції для головного мозку, лінкер, який має послідовність ,аазасса5асаавБасосе (5ЕО ІО МО: 68), і один 5сЕРар як одновалентного зв'язувального агента, який зв'язується 3 людським рецептором трансферину як рецептора для гематоенцефалічного бар'єра, де зсбар зшитий за допомогою лінкера з С-кінцем кільцевого злитого поліпептиду, і де 5сРар розпізнає епітоп в людському рецепторі трансферину, який міститься в амінокислотній послідовності зЗЕО ІЮ МО: 93, 94 або 95.
В одному із переважних варіантів здійснення винаходу кон'югат містить двокільцевий злитий поліпептид, вказаний в даному описі (який специфічно зв'язується з мішенню в головному мозку), як ефекторну субстанцію для головного мозку, два лінкера, що мають послідовність аезассаазассававасе (5ЕО ІЮО МО: 68), і два зсЕаь як одновалентні зв'язуювальні агенти, що зв'язуються людським рецептором трансферину як рецептора для гематоенцефалічного бар'єра, де кожний з з5сРар зшитий за допомогою одного лінкера з С-кінцями різноманітних кільцевих злитих поліпептидів, і де зсЕар розпізнає епітоп в людському рецепторі трансферину, який міститься в амінокислотній послідовності зхЕО ІЮ МО: 93, 94 або 95.
В одному із варіантів здійснення винаходу перший кільцевий злитий поліпептид містить перший модуль димеризаціїї, а другий кільцевий злитий поліпептид містить другий модуль димеризаціїї, що забезпечують гомо- і/або гетеродимеризацію дво кільцевих злитих поліпептидів.
В одному із варіантів здійснення винаходу модуль гетеродимеризаціїї першого кільцевого злитого поліпептиду являє собою важкий ланцюг з "виступом" Ес-ділянки і модуль гетеродимеризаціїї другого кільцевого злитого поліпептиду являє собою важкий ланцюг із 60 "впадиною" Ес-ділянки (відповідно до стратегії "Кпоб-іпіо-поіев"; див., наприклад, УО 96/027011;
Віддулау ..В. та ін., Ргої. Епа. 9, 1996, сс. 617-621; МегсНапі А.М. та ін., Маї. Віоїтесппої. 16, 1998, сс. 677-681). Інтродукція дисульфідного містка додатково стабілізує гетеродимери (МегсНапі
А.М. та ін., Майшге Віоїєсі 16, 1998, сс. 677-681; Аїмеї! 5. та ін., у). Мої. Віої. 270, 1997, сс. 26-35) і підвищує вихід.
В одному із варіантів здійснення винаходу модуль гомодимеризаціїї першого кільцевого злитого поліпептиду являє собою важкий ланцюг Ес-ділянки і модуль гомодимеризаціїї другого кільцевого злитого поліпептиду являє собою важкий ланцюг Ес-ділянки, де обидві Ес-ділянки модифіковані шляхом амінокислотних замін 53640, ІЗ368Е, 0399К і К4090 (амінокислотні положення пронумеровані відповідно до ЕО-індексу Кебота). Модифікація/мутація підтримує атрактивні взаємодії між ідентичними ланцюгами, але призводять до відштовхування різноманітних ланцюгів.
В одному із варіантів здійснення винаходу модуль гетеродимеризаціїї першого кільцевого злитого поліпептиду являє собою важкий ланцюг із "виступом" с-ділянки і модуль гетеродимеризаціїї другого кільцевого злитого поліпептиду являє собою важкий ланцюг із "впадиною" Ес-ділянки (відповідно до стратегії "Кпоб-іпіо-поіе5"), де одна Ес-ділянка модифікована шляхом амінокислотних замін 53640, І 368Е, 0399К і К4090 (амінокислотні положення пронумеровані відповідно до ЕОМ-індексу Кебота). Модифікація/мутація щ знижує атрактивні взаємодії між ланцюгами із "западинами" і посилюють гетеродимеризацію. "Систему нумерації ЕЄО" або "ЕЄО-індекс", як правило, застосовуть для позначення залишка в константній ділянці важкого ланцюга імуноглобуліну (наприклад, ЕО-індекс описаний в Кабаї та ін, Зедиепсев ої Ргоївіпе ої Іттипоіодіса! Іпіегеві, б5-те вид., вид-во Рибріїс Неайй з5егмісе,
Маїйопаї! Іпвійшевз ої Неайй, ВеїШезаа, МО, 1991, публикація спеціально включена в даний опис як посилання).
Кон'югат кільцевого злитого поліпептиду, вказаного в даному описі, можна застосовувати для транспортування кільцевого злитого поліпептиду через гематоенцефалічний бар'єр.
В одному із варіантів здійснення винаходу кільцевий злитий поліпептид, зшитий на його С- кінці з зсгар як одновалентний зв'язувальний агент, який зв'язується з людським рецептором трансферину, має наступну структуру в напрямку від М-кінця до С-кінця: - кільцевий злитий поліпептид,
Зо - пептидний лінкер, який з'єднує С-кінець кільцевого злитого поліпептиду з М-кінцем Мі - домену 5сЕРар, В одному із переважних варіантів здійснення винаходу пептидний лінкер має амінокислотну послідовність ШСОЗОСВСОаЗБОаСОСасасе (5ЕО ІЮ МО: 68), - варіабельний домен легкого ланцюга (МІ) і С-каппа-домен легкого ланцюга з5сРЕар, - пептидний лінкер, який з'єднує С-кінець С-каппа-домену легкого ланцюга зсЕаб з М-кінцем
МН-домену зеГабр, В одному із переважних варіантів здійснення винаходу пептидний лінкер має амінокислотну послідовність ((145)40325 (ЗЕО І МО: 69), - варіабельний домен важкого ланцюга (УН) 5сЕРаб антитіла і СНІ-домен важкого ланцюга
Іа.
В одному із варіантів здійснення винаходу кільцевий злитий поліпептид, зшитий на його С- кінці з 5сСЕм як одновалентний зв'язувальний агент, який зв'язується з людським рецептором трансферину, має наступну структуру в напрямку від М-кінця до С-кінця: - кільцевий злитий поліпептид, - пептидний лінкер, який з'єднує С-кінець кільцевого злитого поліпептиду з М-кінцем Мі - домену 5сЕм-фрагмента антитіла, В одному із переважних варіантів здійснення винаходу пептидний лінкер являє собою пептид, який має амінокислотну послідовність сазасасвзассавасисе (ЗЕОО МО: 68), - варіабельний домен легкого ланцюга (МІ), - пептидний лінкер, який з'єднує С-кінець варіабельного домену легкого ланцюга з М-кінцем
МН-домену 5сЕм, В одному із переважних варіантів здійснення винаходу пептидний лінкер являє
БО собою пептид, який має амінокислотну послідовність ((345)40323 (5ЕО 10 МО: 69), - варіабельний домен важкого ланцюга (УН) зсЕм-фрагмента антитіла.
Один модуль шатлу для гематоенцефалічного бар'єра
В одному із об'єктів винаходу кільцевий злитий поліпептид або багатокільцевий злитий поліпептид містить строго одну зв'язувальну специфічність для гематоенцефалічного бар'єра або модуль шатлу, таким чином, є принаймні біспецифічним, де зв'язувальна специфічність для гематоенцефалічного бар'єра або модуль шатлу містить - гуманізовані варіанти варіабельних доменів антитіла до людського рецептора трансферину 803, які мають 5ЕО ІО МО: 71 і 72 або 73, або - пару, яка містить варіабельний домен важкого ланцюга, який має 5ЕО І МО: 88, 60 варіабельний домен легкого ланцюга, який має 5ЕО І МО: 87, або
- гуманізовані варіанти варіабельних доменів антитіла до людського рецептора трансферину 494, які мають 5ЕО І МО: 89 і 90, де зв'язувальна специфічність для гематоенцефалічного бар'єра або модуль шатлу транспортує (багато)кільцевий злитий поліпептид через гематоенцефалічний бар'єр.
Один або два модуля шатлу для гематоенцефалічного бар'єра
В одному із об'єктів винаходу кільцевий злитий поліпептид або багатокільцевий злитий поліпептид містить строго одну або дві зв'язувальну(ї) специфічність(ї) для гематоенцефалічного бар'єра або модулкькі(і) шатлу, таким чином, є принаймні біспецифічним, в якому сайт зв'язування або модуль шатлу для гематоенцефалічного бар'єра одержують з антитіла, яке зв'язується з низькою афінністю з рецептором гематоенцефалічного бар'єра (ГЕБ-
Е, ГЕБ-В-зв'язувальна специфічність), де зв'язувальна специфічність для гематоенцефалічного бар'єра або модуль шатлу, одержана/одержаний з антитіла, що зв'язується з низькою афінністю з рецептором гематоенцефалічного бар'єра, транспортує (багато)кільцевий злитий поліпептид через гематоенцефалічний бар'єр.
В одному із варіантів здійснення винаходу ГЕБ-К вибирають з групи, яка складається з рецептора трансферину (ТЕ), рецептора інсуліну, рецептора інсулінподібного фактора росту (ІСЕ-рецептор), білка 8, спорідненого з рецептором ліпопротеїнів низької густини (І ВР), білка 1, спорідненого з рецептором ліпопротеїнів низької густини (І ВРВ), і гепаринзв'язувального епідермального фактора росту (НВ-ЕСЕ). В іншому об'єкті винаходу ГЕБ-К являє собою людський ГЕБ-К. В одному із вказаних об'єктів винаходу ГЕБ-К являє собою ТЕг. В іншому із вказаних об'єктів винаходу ГЕБ-К являє собою ТЕг і антитіло не інгібує активність ТЕг. В іншому об'єкті винаходу ГЕБ-К являє собою ТЕ і антитіло не інгібує зв'язування ТЕг з трансферином.
В одному із варіантів здійснення винаходу антитіло не порушує зв'язування ГЕБ-К з одним або декількома його нативними лігандами. В одному із вказаних варіантів здійснення винаходу антитіло специфічно зв'язується з людським рецептором трансферину (НТР) так, що воно не інгібує зв'язування НТЕг з людським трансферином.
В одному із варіантів здійснення винаходу зв'язувальна специфічність по відношенню до
ГЕБ-К характеризується величиною ІСвзо для ГЕБ-К, що складає від приблизно їнМ до приблизно 100мкМ. В одному із варіантів здійснення винаходу величина ІСво складає від
Зо приблизно 5нНМ до приблизно 100мкМ. В одному із варіантів здійснення винаходу величина ІСво складає від приблизно 5ОНМ до приблизно 100мкМ. В одному із варіантів здійснення винаходу величина ІСсо складає від приблизно 100нМ до приблизно 100мкМ. В одному із варіантів здійснення винаходу зв'язувальна специфічність по відношенню до ГЕБ-К характеризується афінністю по відношенню до ГЕБ-К, що складає від приблизно ЗНМ до приблизно 1ОмкМ. В одному із варіантів здійснення винаходу зв'язувальна специфічність по відношенню до ГЕБ-А при кон'югації з кільцевим злитим поліпептидом або в поєднанні з ним характеризується афінністю по відношенню до ГЕБ-К, що складає від приблизно ЗОНМ до приблизно їмкМ. В одному із варіантів здійснення винаходу зв'язувальна специфічність по відношенню до ГЕБ-В при кон'югації з кільцевим злитим поліпептидом або в поєднанні з ним характеризується афінністю по відношенню до ГЕБ-К, що складає від приблизно 5ОНМ до приблизно їмкМ. В одному із варіантів здійснення винаходу афінність зв'язувальної специфічності по відношенню до ГЕБ-К або кон'югату з кільцевим злитим поліпептидом по відношенню до ГЕБ-К вимірюють з використанням аналізу Скетчарда. В одному із варіантів здійснення винаходу афінність зв'язувальної специфічності по відношенню до ГЕБ-К або кон'югату з кільцевим злитим поліпептидом по відношенню до ГЕБ-К вимірюють з використанням ВІАСОВЕ-аналізу. В одному із варіантів здійснення винаходу афінність зв'язувальної специфічності по відношенню до ГЕБ-В або кон'югату з кільцевим злитим поліпептидом по відношенню до ГЕБ-К вимірюють з використанням ЕГІ5ЗА в умовах конкуренції.
Застосування кон'югатів, які містять шатл для гематоенцефалічного бар'єра
Іншим варіантом здійснення винаходу є спосіб підвищення тривалості впливу (експозиції) на
ЦНС кільцевого злитого поліпептиду, коли кільцевий злитий поліпептид зшитий з антитілом або фрагментом антитіла, яке/який зв'язується з низькою афінністю з ГЕБ-К, що підвищує тривалість впливу на ЦНС кільцевого злитого поліпептиду.
Поняття "зшитий, зв'язаний" включає випадки, коли зв'язувальну специфічність антитіла до
ГЕБ-К інтродукують як другу зв'язувальну специфічність принаймні в біспецифічний кільцевий злитий поліпептид. Поняття "зшитий, зв'язаний" включає випадки, коли зв'язувальну специфічність антитіла до ГЕБ-К кон'югують як незалежну зв'язувальну специфічність з кільцевим злитим поліпептидом.
В одному із варіантів здійснення винаходу підвищення тривалості впливу на ЦНС кільцевого бо злитого поліпептиду змінюють відносно тривалості впливу на ЦНС кільцевого злитого поліпептиду, зшитого з канонічним антитілом, що не має понижену афінність по відношенню до
ГЕБ-К. В одному із варіантів здійснення винаходу підвищення тривалості впливу на ЦНС кільцевого злитого поліпептиду вимірюють як співвідношення кількості кільцевого злитого поліпептиду, виявленого в ЦНС, і кількості, виявленого в сироватці, після введення. В одному із варіантів здійснення винаходу підвищення тривалості впливу на ЦНС характеризується співвідношенням, що складає більше 0,195. В одному із варіантів здійснення винаходу підвищення тривалості впливу на ЦНС кільцевого злитого поліпептгиду вимірюють відносно тривалості впливу на ЦНС кільцевого злитого поліпептиду за відсутності зшитого антитіла до
ГЕБ-К. В одному із варіантів здійснення винаходу підвищення тривалості впливу на ЦНС кільцевого злитого поліпептиду вимірюють шляхом візуалізації. В одному із варіантів здійснення винаходу підвищення тривалості впливу на ЦНС кільцевого злитого поліпептиду вимірюють шляхом оцінки непрямих показників, таких як визначення зміни одного або декількох фізіологічних симптомів.
Запропоновано спосіб збільшення утримування в ЦНС кільцевого злитого поліпептиду, введеного суб'єкту, в якому кільцевий злитий поліпептид зшивають з антитілом або фрагментом антитіла, яке/який зв'язується з низькою афінністю з ГЕБ-К, в результаті чого час утримування в
ЦНС кільцевого злитого поліпептиду збільшується.
Іншим варіантом здійснення винаходу є спосіб оптимізації фармакокінетики і/або фармакодинаміки кільцевого злитого поліпептиду, який повинен проявляти ефективність в ЦНС суб'єкта, в якому кільцевий злитий поліпептид зшивають з антитілом або фрагментом антитіла, що зв'язуються з низькою афінністю з ГЕБ-К, в якому антитіло або фрагмент антитіла вибирають так, щоб його афінність по відношенню до ГЕБ-К після зшивання з кільцевим злитим полипептидом призводила до транспорту через ГЕБ такої кількості антитіла або фрагмента антитіла, кон'югованого з кільцевим злитим поліпептидом, що оптимізує фармакокінетику і/або фармакодинаміку кільцевого злитого поліпептиду в ЦНС.
Іншим варіантом здійснення винаходу є спосіб лікування неврологічного порушення у ссавця, який включає введення ссавцю антитіла або фрагмента антитіла, що зв'язується з ГЕБ-
КЕ ї зшитого з кільцевим злитим поліпептидом, в якому антитіло вибране так, щоб воно мало низьку афінність по відношенню до ГЕБ-К і тим самим підвищувало поглинання ЦНС антитіла і
Зо зшитого кільцевого злитого поліпептиду. В одному із варіантів здійснення винаходу лікування призводить до зменшення або елімінації симптомів порушення. В іншому об'єкті винаходу лікування призводить до полегшення неврологічного порушення.
В одному із варіантів всіх вищевикладених об'єктів винаходу антитіло до ГЕБ-В характеризується величиною ІСзо по відношенню до ГЕБ-К, що складає від приблизно 1нНМ до приблизно 100мкМ. В іншому вказаному варіанті здійснення винаходу величина ІСхо складає від приблизно 5нМ до приблизно 100мкМ. В іншому варіанті здійснення винаходу величина ІСвхо складає від приблизно 50нМ до приблизно 100мкМ. В іншому варіанті здійснення винаходу величина ІСво складає від приблизно 100нМ до приблизно 100мкМ. В іншому варіанті здійснення винаходу антитіло має афінністю по відношенню до ГЕБ-К, що складає від приблизно 5нМ до приблизно 1О0мкМ. В іншому варіанті здійснення винаходу антитіло при кон'югації з кільцевим злитим поліпептидом, характеризується афінністю по відношенню до
ГЕБ-К, що складає від приблизно ЗОнМ до приблизно імкМ. В іншому варіанті здійснення винаходу антитіло при кон'югації з кільцевим злитим поліпептидом, характеризується афінністю по відношенню до ГЕБ-К, що складає від приблизно 50нМ до приблизно їмкМ. В одному із варіантів здійснення винаходу афінність антитіла до ГЕБ-К або кон'югату з кільцевим злитим поліпептидом по відношенню до ГЕБ-К вимірюють з використанням аналізу Скетчарда. В іншому варіанті здійснення винаходу афінність антитіла до ГЕБ-К або кон'югату з кільцевим злитим поліпептидом по відношенню до ГЕБ-К вимірюють з використанням ВІАСОРВЕ-аналізу. В іншому варіанті здійснення винаходу афінність антитіла до ГЕБ-К або кон'югату з кільцевим злитим поліпептидом по відношенню до ГЕБ-К вимірюють з використанням ЕГІ5БА в умовах конкуренції.
В іншому варіанті здійснення винаходу кон'югат, який містить кільцевий злитий поліпептид, є міченим. В іншому варіанті здійснення винаходу антитіло до ГЕБ-К або його фрагмент не порушує зв'язування ГЕБ-К з одним або декількома його нативними лігандами. В іншому варіанті здійснення винаходу антитіло до ГЕБ-К специфічно зв'язується з НТЕг так, що не інгібує зв'язування НТР з людським трансферином. В іншому варіанті здійснення винаходу кон'югат, який містить кільцевий злитий поліпептид, вводять ссавцю. В іншому варіанті здійснення винаходу ссавець являє собою людину. В іншому варіанті здійснення винаходу ссавець має неврологічне порушення. В іншому варіанті здійснення винаходу неврологічне порушення бо вибирають з групи, яка складається з з хвороби Альцгеймера (АБ), "удару", деменції, м'язової дистрофії (МО), розсіяного склерозу (М5), аміотрофічного бічного склерозу (АЇ 5), муковісцидозу, синдрому Ангельмана, синдрому Ліддла, хвороби Паркінсона, хвороба Піка, хвороби Педжета, раку і травматичного пошкодження головного мозку.
Нековалентні комплекси як шатли для гематоенцефалічного бар'єра
Одна частина нековалентного комплексу являє собою модуль шатлу для гематоенцефалічного бар'єра (модуль ГЕБ-шатлу), який являє собою біспецифічне антитіло з першою зв'язувальною специфічністю по відношенню до гаптену та другою зв'язувальною специфічністю по відношенню до рецептора гематоенцефалічного бар'єра (ГЕБ-К). Вказаний модуль ГЕБ-шатлу розпізнає мішень на клітинній поверхні гематоенцефалічного бар'єра, для якої можливий трансцитоз (наприклад, ТЕг, І ВР або інші мішені, ГЕБ-К) і одночасно зв'язується з гаптенильованим кільцевим злитим поліпептидом.
Більше конкретно, кільцевий злитий поліпептид кон'югують з гаптеном і включають в комплекс за допомогою гаптензв'язувального сайта шатлу для гематоенцефалічного бар'єра.
Вказаний комплекс має визначену структуру і є стабильним і специфічно доставляє гаптенільований кільцевий злитий поліпептид через гематоенцефалічний бар'єр. Вказаний гаптенільований кільцевий злитий поліпептид включають в комплекс нековалентно за допомогою шатлу для гематоенцефалічного бар'єра, гаптенільований кільцевий злитий поліпептид, з одного боку, зв'язаний з носієм, який забезпечує його доставку (- шатл для гематоенцефалічного бар'єра - біспецифічне антитіло) під час його присутності в кровотоці, але також, з іншого боку, може ефективно вивільнятись після трансцитозу. Кон'югація за допомогою гаптену може бути ефективною, не впливаючи на активність кільцевого злитого поліпептиду.
Шатл для гематоенцефалічного бар'єра не містить незвичайної ковалентного добавки і тому при його використанні усувається будь-який ризик імуногенності. Комплекси гаптенильованого кільцевого злитого поліпептиду з біспецифічним антитілом, що містить гаптенспецифічні сайти зв'язування, надають сприятливі (нешкідливі) біофізичні властивості кільцевому злитому поліпептиду. Крім того, зазначені комплекси можуть забезпечувати направлене перенесення "вантажу" в клітини або тканини, експонують антиген, який розпізнається другою зв'язувальною специфічністю біспецифічного антитіла.
Кільцевій злитий поліпептид зберігає свою функціональність, незважаючи на те, що є
Зо гаптенильованим, а також включеним до комплексу з шатлом для гематоенцефалічного бар'єра (- біспецифічне антитіло). Крім того, сайт зв'язування рецептора гематоенцефалічного бар'єра біспецифічного антитіла зберігає свою зв'язувальну специфічність і афінність в присутності гаптенильованого кільцевого злитого поліпептиду, що входить в комплекс. Комплекси гаптенильованого кільцевого злитого поліпептиду з біспецифічним антитілом, зазначені в
З5 даному описі, можна застосовувати для спрямованого перенесення кільцевого злитого поліпептиду специфічно до клітин, що експресують рецептор гематоенцефалічного бар'єра.
Тому, якщо гаптенильований кільцевий злитий поліпептид зшитий нековалентно з біспецифічним антитілом, то кільцевий злитий поліпептид може вивільнятись після інтерналізації або трансцитозу.
МІ. Методи рекомбінації та композиції
Кільцевий злитий поліпептид аналогічно антитілам можна одержувати, використовучи методи рекомбінації і композиції, наприклад, описані в 05 Мо 4816567. Одним із варіантів здійснення винаходу є виділена нуклеїнова кислота, що кодує кільцевий злитий поліпептид, представлений в даному описі. Зазначена нуклеїнова кислота може кодувати амінокислотну послідовність, що містить один кільцевий злитий поліпептид, і необов'язково також амінокислотну послідовність, що містить другий кільцевий злитий поліпептид (наприклад, перший кільцевий злитий поліпептид та другий кільцевий злитий поліпептид двокільцевого злитого поліпептиду). Наступним варіантом здійснення винаходу є один або декілька векторів (наприклад, експресійних векторів), що містить(ять) вказану нуклеїнову кислоту. Ще одним варіантом здійснення винаходу є клітина-хазяїн, яка містить вказану нуклеїнову кислоту. В одному із вказаних варіантів здійснення винаходу клітина-хазяїн містить (наприклад, в результаті трансформації): (1) вектор, який містить нуклеїнову кислоту, що кодує амінокислотну послідовність, що містить кільцевий злитий поліпептид (гомомерний або гомомультимерний кільцевий злитий поліпептид), і необов'язково другу амінокислотну послідовність, що містить другий кільцевий злитий поліпептид в разі гетеродимерного двокільцевого злитого поліпептиду, і необов'язково додаткові нуклеїнові кислоти, які кодують амінокислотні послідовності додаткових кільцевих злитих поліпептидів в разі багатокільцевого злитого поліпептиду, або (2) в разі гетеродимерного двокільцевого злитого поліпептиду перший вектор, який містить нуклеїнову кислоту, що кодує амінокислотну послідовність першого кільцевого злитого бо поліпептиду, та другий вектор, який містить нуклеїнову кислоту, що кодує амінокислотну послідовність, що містить другий кільцевий злитий поліпептид. В одному із варіантів здійснення винаходу клітина-хазяїн являє собою еукаріотичну клітину, наприклад, клітину яєчника китайського хом'ячка (СНО) або лимфоїдну клітину (наприклад, МО-, М50-, 5рагО-клітину). Одним з варіантів здійснення винаходу є спосіб одержання кільцевого злитого поліпептиду, вказаного в даному описі, що включає культивування клітини-хазяїна, що містить нуклеїнову кислоту, що кодує кільцевий злитий поліпептид, описаний вище, в умовах, придатних для експресії кільцевого злитого поліпептиду, і необов'язково виділення кільцевого злитого поліпептиду з клітини-хазяїна (або середовища для культивування клітини-хазяїна).
Для рекомбінантного одержання кільцевого злитого поліпептиду, зазначеного в даному описі, нуклеїнову кислоту, що кодує антитіло, наприклад, описану вище, виділяють і вбудовують в один або декілька векторів для подальшого клонування і/або експресії в клітині-хазяїні.
Вказану нуклеїнову кислоту легко можна одержувати з використанням загальноприйнятих процедур.
Прийнятні клітини-хазяїни для клонування або експресії векторів, які кодують кільцевий злитий поліпептид, включають прокаріотичні або еукаріотичні клітини, представлені в даному описі. Наприклад, кільцеві злиті поліпептиди можна одержувати в бактеріях, зокрема, коли не потрібне глікозилювання і зв'язана з Ес ефекторна функція. Відомості про експресію фрагментів антитіла і поліпептидів в бактеріях див. наприклад, в ШО Мо 5648237, 005 Мо 5789199 і 05 Мо 5840523 (див. також у Спапоп К.А. в: Меїнодз іп Моїєсшіаг Віоіоаду, під ред. Го В.К.С., вид-во
Нитапа Ргезз, Тоїома, Му, т. 248, 2003, сс. 245-254 опис експресії фрагментів антитіл в Е. сої.)
Після експресії кільцевий злитий поліпептид можна виділяти з пасти бактеріальних клітин у вигляді розчинної фракції і можна додатково очищати.
Крім прокаріотичних організмів як хазяїнів, придатних для клонування або експресії векторів, які кодують кільцеві злиті поліпептиди, можна використовувати еукаріотичні мікроорганізми, такі як нитчасті гриби або дріжджі, включаючи штами грибів і дріжджів, шляхи глікозилювання яких були "гуманізовані" що дозволяє одержувати кільцевий злитий поліпептид з частково або повністю людською схемою глікозилювання (див. Сгпдго55 Т.О., Маї. Віоїесп. 22, 2004, сс. 1409-1414 і | та ін., Маї. Віоїесн. 24, 2006, сс. 210-215).
Клітини-хазяїни, які можна використовувати для експресії глікозильованого кільцевого
Зо злитого поліпептиду, одержують також з багатоклітинних організмів (безхребетних і хребетних тварин). Прикладами клітин безхребетних є клітини комах, а також можна застосовувати клітини рослин. Були виявлені численні штами бакуловірусів і відповідні придатні для них як хязяїни клітини комах, перш за все для трансфекції клітин 5родорієга Іпидірегаа.
Як хазяїни можна застосовувати також культури рослинних клітин (див., наприклад, 05 Мо 5959177, 05 Мо 6040498, 05 Мо 6420548, 05 Мо 7125978 і 05 Мо 6417429 (опис технології
РІГАМТІВООІЕ5"М для одержання антитіл в трансгенних рослинах).
Як хазяїни можна застосовувати також клітини хребетних. Наприклад, можна використовувати клітинні лінії ссавців, які адаптовані до зростуння в суспензії. Іншими прикладами прийнятних ліній клітин-хазяїнів ссавців є лінія клітин нирки мавпи СМ1, трансформована за допомогою ОВ40 (СО5-7); лінія клітин нирки ембріона людини (НЕК 293- клітини або клітини лінії 293, описані, наприклад, у Сгапат Р... і ін., У. еп. Мігої., 36, 1977, сс. 59-74); клітини нирки дитинчати хом'яка (ВНК); клітини Сертолі миші (ТМа4-клітини, описані, наприклад, у МаїНег .).Р., Віо!. Кергоад., 23, 1980, сс. 243-251); клітини нирки мавпи (СМ1); клітини нирки африканської зеленої мавпи (МЕКО-76,); клітини карциноми шийки матки людини (НЕГА); клітини нирки собаки (МОСК); клітини печінки бичачого щура (ВК. ЗА); клітини легені людини (М/138); клітини печінки людини (Нер 02); клітини пухлини молочної залози миші (ММТ 060562); клітини ТК, описані, наприклад, у Маїег .).Р. і ін., АппаїЇ5 М.У. Асай. 5сі., 383, 1982, сс. 44-68); клітини МКС 5 і клітини Е54. Іншими цінними лініями клітин-хазяїнів ссавців є клітини яєчника китайського хом'ячка (СНО), включаючи ОНЕг - СНО-клітини (Огіацр с. та ін., Ргос. Май). Асад. збі. ОБА, 77, 1980, сс. 4216-4220); і клітинні лінії мієломи, такі як МО, М5О ї 5р2/0. Огляд конкретних ліній клітин-хазяїнів ссавців, які можна застосовувати для виробництва антитіл, див., наприклад, у Маакі Р. і М/и А.М., в: Мешоад:5 іп МоїІесшіаг Віоіоду під ред. В.К.С. І о, вид-во
Нитапа Ргез5, Тома, Му, т. 248, 2003 сс. 255-268.
МІ. Аналізи
Кільцеві злиті поліпептиди, представлені в даному описі, можна ідентифікувати, піддавати скринінгу або характеризувати їх фізичні/хімічні властивості і/або види біологічної активності за допомогою різних аналізів, відомих в даній галузі, які призначені для визначення зв'язування поліпептиду з його мішенню.
МІ. Імунокон'югати
У винаході запропоновані також імунокон'югати, що містять кільцевий злитий поліпептид, представлений в даному описі, кон'югований з одним або декількома цитотоксичними агентами, такими як хіміотерапевтичні агенти або лікарські засоби, агенти, що інгібують зростуння, токсини (наприклад, білкові токсини, токсини, що мають ферментативну активність, бактеріального, грибного, рослинного або тваринного походження або їх фрагменти) або радісактивні ізотопи.
В одному із варіантів здійснення винаходу імунокон'югат являє собою кон'югат кільцевий злитий поліпептид-лікарський засіб, в якому кільцевий злитий поліпептид кон'югований з одним або декількома лікарськими засобами, включаючи (але не обмежуючись тільки ними) майтансиноїд (див. ШО Мо 5208020, 05 Мо 5416064 і ЕР 0425235 ВІ); ауристатин, наприклад, фрагменти ОЕ і ОЕ монометилауристатину (ММАЕ і ММАБЕ) (див. О5 Мо 5635483, 05 Мо 5780588 і 005 Мо 7498298); доластатин; каліхеаміцин або його похідні (див. 5 Мо 5712374, 5 Мо 5714586, 05 Мо 5739116, 05 Мо 5767285, 05 Мо 5770701, О5 Мо 5770710, 05 Мо 5773001 ії О5 Мо 5877296; Ніптап І.М. та ін., Сапсег Вез. 53, 1993, сс. 3336-3342; і І оде Н.М. та ін., Сапсег Везв. 58, 1998, сс. 2925-2928); антрациклін, такий як дауноміцин або доксорубіцин (див. Кпгаїх КЕ. та ін.,
Сит. Мед. Спет. 13, 2006, сс. 477-523; деїЕгеу 5.0. та ін., Вісога. Мед. Спет. І ей. 16, 2006, сс. 358-362; Тогдом М.У. та ін., Віосопіца. Спет. 16, 2005, сс. 717-721; Маду А. та ін., Ргос. Маї!).
Асад. осі. ОБА 97, 2000, сс. 829-834; ВБиромснік а.М. та ін., Віоогу. 5 Мед. Спет. І еЦегв 12, 2002, сс. 1529-1532; Кіпд Н. 0. та ін., У. Мед. Снет. 45, 2002, сс. 4336-4343; і 05 Мо 6630579); метотрексат; віндесин; таксан, такий як доцетаксел, паклітаксел, ларотаксел, тесетаксел і ортатаксел; трихотецен і СС1065.
В іншому варіанті здійснення винаходу імунокон'югат містить кільцевий злитий поліпептид, представлений в даному описі, кон'югований з токсином, який має ферментативну активність або його фрагментом, включаючи (але не обмежуючись тільки ними) А-ланцюг дифтерійного токсину, активні фрагменти дифтерійного токсину, що не зв'язуються, А-ланцюг екзотоксину (з
Резємдотопав аєгидіпоза), А-ланцюг ріцину, А-ланцюг абрину, А-ланцюг модецину, альфа- сарцин, білки АПІешіез Тогаїї, діантинові білки, білки Рнпуіаса атегісапа (РАРІ, РАРІЇ ї РАР-5), інгібітор з Мотогаїса сНагапііа, курцин, кротин, інгібітор з бараопагіа огпісіпаїї5, гелонін, мітогеллін, рестріктоцин, феноміцин, еноміцин і тріхотецени.
Зо В іншому варіанті здійснення винаходу імунокон'югат містить кільцевий злитий поліпептид, представлений в даному описі, кон'югований з радіоактивним атомом з утворенням радіокон'югата. Широку різноманітність радіоактивних ізотопів можна застосовувати для одержання радіокон'югатів. Приклади включають 2" АЇ, 191, 125), з0у, 186Де, 188Де, 7535111, 212ВІ, З2рР, г2грр ії радіоактивні ізотопи и. Коли радіокон'югат застосовують для детекції, то він може містити радіоактивний атом для сцинтиграфічних досліджень, наприклад, , ТС99т або 123, або спінову мітку для візуалізації методом ядерного магнітного резонансу (ЯМР) (відомий також як магнітно-резонансна візуалізація, МРВ), таку як йод-123, йод-131, індій-111, фтор-19, вуглець- 13, азот-15, кисень-17, гадоліній, марганець або залізо.
Кон'югати кільцевого злитого поліпептиду і цитотоксичного агента можна одержувати з використанням широкого розмаїття біфункціональних агентів, які зв'язують білки, таких як М- сукциніміди-3-(2-піридилдитіо)пропіонат (5РОР), сукциніміди-4-(М-малеїімідометил) циклогексан- 1-карбоксилат (5МСОС), імінотіолан (ІТ), біфункціональні похідні складних імідоефірів (такі як диметиладипимідатх НОСІ), активні складні ефіри (такі як дисукцинімідилсуберат), альдегіди (такі як глутаровий альдегід), бісазидопохідні (такі як біс(пара-азідобензоіл) гександиамін), похідні бісдіазонію (такі як біс(пара-діазоніумбензоїл) етилендіамін), діїзоцианату (такі як толуол-2,6- діїзоцианат), і фторвмісні сполуки, що мають подвійну активність (такі як 1,5-дифтор-2,4- динітробензол). Наприклад, імунотоксіновин рицин можна одержувати згідно з методом, описаним у Міїена Е.5. і ін., 5сіепсе 238, 1987, сс. 1098-1104. Мічена за допомогою С14 1- ізотіоціанатбензил-3-метилдіетилентриамінпентаоцтова кислота (МХ-ОТРА) є прикладом хелатуючого агента, що застосовується для кон'югації радіонуклеотиду з антитілом (див. МО 94/11026). Лінкер може являти собою "розщеплюваний лінкер", який полегшує вивільнення цитотоксичного лікарського засобу. Наприклад, можна використовувати нестійкий в кислому середовищі лінкер, чутливий до дії пептидаз лінкер, фотолабільний лінкер, диметильний лінкер або линкер, який містить дисульфід (СпНагі В.М. та ін., Сапсег Вез. 52, 1992, сс. 127-131; 05 Мо 5208020).
В контексті даного опису під імунокон'югатуми або АОС розуміють (але не обмежуючись тільки ними) вказані кон'югати, одержані з використанням перехреснозшивальних реагентів, які включають (але не обмежуючись тільки ними) ВМР5, ЕМО5, СМВ5, НВУ5, І 0-5МОС, МВ5,
МРВН, 5ВАР, ІА, БІАВ, 5МОС, 5МРВ, ЗМРН, сульфо-ЕМО5, сульфо-4МВ5, сульфо-КМИ5, 60 сульфо-МВ5, сульфо-5БІАВ, сульфо-ЗМОС і сульфо-5МРВ, а також 5М5В (сукцинімідил(4-
вінілсульфон)бензоат), які надходять у продаж (наприклад, від фірми Рієгсе ВіоїтесНпоіоаду, Іпс.,
Рокфорд, шт. Іллінойс, США).
ЇХ. Способи і композиції для діагностування і виявлення
В деяких варіантах здійснення винаходу кільцеві злиті поліпептиди, представлені в даному описі, можна застосовувати для виявлення присутності мішені в біологічному зразку. Поняття "виявлення (детекція)» в контексті даного опису передбачає кількісне або якісне виявлення. В деяких варіантах здійснення винаходу біологічний зразок містить кров, сироватку, плазму, клітини або тканину.
Одним з варіантів здійснення винаходу є кільцевий злитий поліпептид, призначений для застосування в способі діагностування або виявлення. Інший об'єкт винаходу відноситься до способу виявлення присутності мішені кільцевого злитого поліпептиду в біологічному зразку. В іншому варіанті здійснення винаходу спосіб полягає в тому, що приводять в контакт біологічний зразок з кільцевим злитим поліпептидом, представленим в даному описі, в умовах, що забезпечують зв'язування кільцевого злитого поліпептиду з його мішенню, і виявляють утворення комплексу між кільцевим злитим поліпептидом і його мішенню. Зазначений спосіб може являти собою спосіб іп мйго або іп мімо. В одному із варіантів здійснення винаходу кільцевий злитий поліпептид застосовують для відбору індивідуумів, яких можна лікувати за допомогою вказаного кільцевого злитого поліпептиду.
Деякими варіантами здійснення винаходу є мічені кільцеві злиті поліпептиди. Мітки включають (але, не обмежуючись тільки ними) мітки або фрагменти, які можна виявляти безпосередньо (такі як флуоресцентні, хромофорні, електроннощільні, хемілюмінесцентні та радіоактивні мітки), а також фрагменти, такі як ферменти або ліганди, які підлягають непрямому виявленню, наприклад, за допомогою ферментативної реакції або молекулярної взаємодії.
Приклади міток включають (але не обмежуючись тільки ними) радіоіїзотопи З2Р, 190, 125І, ЗН і 151, флуорофори, такі як хелати рідкоземельних металів або флуоресцеїн і його похідні, родамін і його похідні, данс, умбелліферон, люциферази, наприклад, люцифераза світляка і бактеріальна люціфераза (05 4737456), люциферин, 2,3-дигідрофталазиндіони, пероксидаза з хрону (НЕР), лужна фосфатаза, р-галактозидаза, глюкоамілаза, лізоцим, оксидази сахаридів, наприклад, глюкозооксидаза, галактозооксидаза і глюкозо-6-фосфатдегідрогеназа, гетероциклічні оксидази,
Зо такі як уриказа і ксантиноксидаза, зшиті з ферментом, який використовує пероксид водню для окислення попередника барвника, такого як НЕР, лактопероксидаза або мікропероксидаза, біотин/авідин, спінові мітки, мітки у вигляді бактеріофагів, стабільні вільні радикали тощо.
Х. Фармацевтичні композиції
Фармацевтичні композиції кільцевого злитого поліпептиду, представленого в даному описі, одержують шляхом змішування зазначеного кільцевого злитого поліпептиду, що має необхідний ступінь чистоти, з одним або декількома необов'язковими фармацевтично прийнятними носіями (Ветіпдюп'в Ріпаптасешіса! Зсієпсев, 16-е вид. під ред. О5о0ї А., 1980) у формі ліофілізованих композицій або водних розчинів. Фармацевтично прийнятні носії, як правило, є нетоксичними для реципієнтів у використовуваних дозах і концентраціях, вони включають (але не обмежуючись тільки ними): буфери, такі як фосфатний, цитратний буфери, а також буфери на основі інших органічних кислот; антиоксиданти, включаючи аскорбінову кислоту та метіонін; консерванти (такі як хлорид октадецилдиметилбензиламонію; хлорид гексаметонію; хлорид бензалконію; хлорид бензетонію; фенол; бутиловий або бензиловий спирт; алкілпарабени, такі як метил або пропілпарабен; катехол; резорцинол; циклогексанол; З-пентанол і мета-крезол); поліпептиди з низькою молекулярною масою (що містять менше приблизно 10 залишків); білки, такі як сироватковий альбумін, желатин або імуноглобуліни; гідрофільні полімери, такі як полі(вінілпіролідон); амінокислоти, такі як гліцин, глутамін, аспарагін, гістидин, аргінін або лізин; моносахариди, дисахариди та інші вуглеводи, включаючи глюкозу, манозу або декстрини; хелатуючі агенти, такі як ЕДТА; цукри, такі як сахароза, маніт, трегалоза або сорбіт; солетворні протиїіони, такі як натрій; комплекси, що містять метал (наприклад, комплекси 2п-білок); і/або неіоногенні поверхнево-активні речовини, такі як поліетиленгліколь (ПЕГ). В контексті даного опису приклади фармацевтично прийнятних носіїв включають також диспергуючі агенти інтерстиціальних лікарських засобів, такі як розчинні активні в нейтральному середовищі глікопротеїни гіалуронідази (5НАБЕОР), наприклад, людські розчинні глікопротетїни гіалуронідази РН-20, такі як гНиИРН2гО (НУ ЕМЕХФ, фірма Вахіег Іпіегпайопаї!, Іпс.). Деякі приклади зНА5ЕОР і методи їх застосування, в тому числі ГНиИРН2О, описані в 5 2005/0260186 і 05 2006/0104968. Відповідно до одного з об'єктів винаходу ЗХЗНАБЕОР об'єднують з одним або декількома додатковими глікозаміногліканазами, такими як хондроїітинази.
Приклади ліофілізованих композицій антитіл описані в 5 Мо 6267958. Водні композиції антитіл включають композиції, описані в ОЗ Мо 6171586 та УМО 2006/044908, останні композиції включають гістидин-ацетатний буфер.
Композиція, запропонована у винаході, може містити також більш однієї діючої речовини, якщо це необхідно для конкретного показання, що підлягає лікуванню, переважно речовини з додатковими видами активності, які не чинять негативний вплив одна на одну. Такі діючі речовини повинні бути присутніми в комбінації в кількостях, ефективних для вирішення поставленого завдання.
Діючі речовини можна включати також в мікрокапсули, наприклад, одержані за допомогою методів коацервації або міжфазної полімеризації, наприклад в гідроксиметилцелюлозні або желатинові і полі(метилметакрилатні) мікрокапсули відповідно, в колоїдні системи введення лікарського засобу (наприклад в ліпосоми, альбумінові мікросфери, мікроемульсії, наночастинки і нанокапсули) або в макроемульсії. Такі методи описані в Кетіпоаїоп'є Рнаптасеціїйса! бсієпсев, 16-е вид., під ред. О5о0ї А., 1980.
Можна готувати препарати з уповільненим вивільненням. Прийнятними прикладами препаратів з уповільненим вивільненням є напівпроникні матриці з твердих гідрофобних полімерів, які включають кільцевий злитий поліпептид, такі матриці являють собою вироби певної форми, наприклад, плівки або мікрокапсули.
Композиції, призначені для застосування іп мімо, як правило, повинні бути стерильними.
Стерильність можна легко забезпечувати, наприклад, шляхом фільтрації через стерильні фільтруючі мембрани.
ХІ. Терапевтичні способи і композиції
Будь-який з кільцевих злитих поліпептидів, представлених в цьому описі, можна застосовувати в терапевтичних способах.
Одним із об'єктів винаходу є кільцевий злитий поліпептид, призначений для застосування як лікарського засобу. Іншими об'єктами винаходу є кільцевий злитий поліпептид, призначений для застосування при лікуванні захворювання. Деякими варіантами здійснення винаходу є кільцевий злитий поліпептид, призначений для застосування в способі лікування. Деякими варіантами здійснення винаходу є кільцевий злитий поліпептид, призначений для застосування
Зо в способі лікування індивідуума, який має захворювання, що включає введення індивідууму в ефективній кількості кільцевого злитого поліпептиду. В одному із зазначених варіантів здійснення винаходу спосіб додатково включає введення індивідууму в ефективній кількості принаймні одного додаткового терапевтичного засобу. "Індивід" відповідно до будь-якого із зазначених вище варіантів здійснення винаходу переважно являє собою людину.
Наступним об'єктом винаходу є застосування кільцевого злитого поліпептиду для виробництва або приготування лікарського засобу. В одному із варіантів здійснення винаходу лікарський засіб призначений для лікування захворювання. В іншому варіанті здійснення винаходу лікарський засіб призначений для застосування в способі лікування захворювання, який включає введення індивідууму, що має зазначене захворювання, в ефективній кількості лікарського засобу. В одному із зазначених варіантів здійснення винаходу спосіб додатково включає введення індивідууму в ефективній кількості принаймні одного додаткового терапевтичного засобу. "Індивід" відповідно до будь-якому із зазначених вище варіантів здійснення винаходу може являти собою людину.
Наступним об'єктом винаходу є спосіб лікування захворювання. В одному із варіантів здійснення винаходу спосіб включає введення індивідууму, що має зазначене захворювання, в ефективній кількості кільцевого злитого поліпептиду. В одному із вказаних варіантів здійснення винаходу спосіб включає також введення індивідууму в ефективній кількості принаймні одного додаткового терапевтичного засобу. "Індивідуум" відповідно до будь-якого із вказаних вище варіантів здійснення винаходу може являти собою людину.
Наступним об'єктом винаходу є фармацевтичні композиції, які містять будь-який з кільцевих злитих поліпептидів, представлених в даному описі, наприклад, призначені для застосування в будь-якому з вказаних вище терапевтичних способів. В одному із варіантів здійснення винаходу фармацевтична композиція містить будь-який з кільцевих злитих поліпептидів, представлених в даному описі, і фармацевтично прийнятний носій. В іншому варіанті здійснення винаходу фармацевтична композиція містить будь-який з кільцевих злитих поліпептидів, представлених в даному описі, і принаймні один додатковий терапевтичний засіб.
Кільцеві злиті поліпептиди можна застосовувати для лікування або індивідуально, або в поєднанні з іншими засобами. Наприклад, кільцевий злитий поліпептид, запропонований у винаході, можна вводити спільно принаймні з одним додатковим терапевтичним засобом. 5О0
Такі зазначені вище комбіновані терапії включають спільне введення (коли два або більшу кількість терапевтичних засобів включені в одні й ті ж або різні композиції) і роздільне введення, в цьому разі введення кільцевого злитого поліпептиду, запропонованого у винаході, можна здійснювати до, одночасно і/або після введення додаткового(их) терапевтичного(их) засобу або засобів. В одному із варіантів здійснення винаходу введення кільцевого злитого поліпептиду і введення додаткового терапевтичного засобу можна здійснювати в межах принаймні 1 місяця або в межах приблизно 1, 2 або З тижнів, або в межах приблизно 1, 2, 3, 4, 5 або 6 днів по відношенню один до одного. Прийнятні кільцеві злиті поліпептиди, запропоновані у винаході, можна застосовувати також в поєднанні з променевою терапією.
Кільцевій злитий поліпептид (і будь-який додатковий лікарський засіб), можна вводити будь- якими прийнятними шляхами, включаючи парентеральний, внутрішньолегеневий та інтраназальний і за необхідності застосовувати для місцевої обробки, здійснюючи введення в пошкодження. Парентеральні інфузії включають внутрішньом'язове, внутрішньовенне, внутрішньоартеріальне, внутрішньочеревне або підшкірне введення. Дозування можна здійснювати будь-яким прийнятним шляхом, наприклад, шляхом ін'єкцій, таких як внутрішньовенні або підшкірні ін'єкції залежно, в тому числі, від того, чи є лікування короткочасним або хронічним. Можна застосовувати різні схеми дозування, включаючи (але не обмежуючись тільки ними) одноразове введення або декілька введень в різні моменти часу, болюсне введення і пульсуючу інфузію.
Кільцеві злиті поліпептиди, запропоновані у винаході можна включати до складу композицій, дозувати і вводити відповідно до належної клінічної практики. Розглянуті в цьому контексті чинники включають конкретне захворювання, яке підлягає лікуванню, конкретного ссавця, що підлягає лікуванню, клінічний стан індивідуального пацієнта, причину захворювання, ділянку введення агента, метод введення, схему введення та інші чинники, відомі практикуючим медикам. Кільцевій злитий поліпептид можна, але це не є обов'язковим, включати в композицію в поєднанні з одним або декількома іншими агентами, які в даний чаз застосовуть для попередження або лікування даного захворювання. Ефективна кількість зазначених інших агентів залежить від кількості кільцевого злитого поліпептиду, присутнього в композиції, типу порушення або лікування та інших зазначених вище факторів. Їх, як правило, застосовуть в таких же дозах і з використанням таких же шляхів введення, які вказані в цьому описі, або в кількості, що становить приблизно від 1 до 99 95 від дози, зазначеної в цьому описі, або в будь- якій дозі і з допомогою будь-якого шляху, який за даними емпіричної/клінічної оцінки є придатним.
Для попередження або лікування захворювання відповідна доза кільцевого злитого поліпептиду, запропонованого у винаході (при його застосуванні індивідуально або в поєднанні з одним або декількома іншими додатковими терапевтичними засобами), повинна залежати від типу захворювання, що підлягає лікуванню, типу кільцевого злитого поліпептиду, серйозності і перебігу хвороби, чи застосовуть кільцевої злитий поліпептид для профілактичних або терапевтичних цілей, попередньої терапії, історії хвороби пацієнта і відповіді на кільцевий злитий поліпептид, а також приписи лікуючого лікаря. Кільцевий злитий поліпептид можна вводити пацієнту одноразово або у вигляді серій обробок. Залежно від типу і серйозності захворювання приблизно від 1 мкг/кг до 15 мг/кг (наприклад, 0,5-10 мг/кг) кільцевого злитого поліпептиду може являти собою початкову можливу дозу для введення пацієнту, наприклад, за допомогою однієї або декількох окремих обробок або за допомогою безперервної інфузії.
Одним із прикладів типових добових доз може бути доза, яка становить від приблизно 1 мкг/кг до 100 мг/кг або більше залежно від зазначених вище факторів. При використанні повторних введень протягом декількох днів або більш тривалого періоду часу, залежно від стану, лікування, як правило, слід продовжувати до досягнення придушення симптомів захворювання.
Одним із прикладів доз кільцевого злитого поліпептиду є доза, яка становить від приблизно 0,05 до приблизно 10 мг/кг. Так, пацієнту можна вводити одну або декілька наступних доз: приблизно 0,5, 2,0, 4,0 або 10 мг/кг (або будь-яку їх комбінацію). Зазначені дози можна вводити дрібно, наприклад, щотижня або кожні три тижні (наприклад, так, щоб пацієнт отримував від приблизно двох до приблизно двадцяти, наприклад, приблизно шість доз кільцевого злитого поліпептиду).
Можна застосовувати початкову підвищену ударну дозу з подальшим введенням однієї або декількох нижчих доз. Однак, можна застосовувати і інші режими дозування. За допомогою загальноприйнятих методів і аналізів можна легко здійснювати моніторинг дії зазначеної терапії.
Має бути очевидним, що будь-яку з описаних вище композицій можна застосовувати або будь-який із терапевтичних способів можна здійснювати з використанням імунокон'югату, запропонованого у винаході, замість або на додаток до кільцевого злитого поліпептиду. 60 ХІІ. Вироби
Іншим об'єктом винаходу є виріб, який містить продукти, що застосовуться для лікування, попередження і/або діагностування порушення. Виріб являє собою контейнер і етикетку або листівку-вкладиш в упаковку, які розміщені на контейнері або вкладені в нього. Прийнятними контейнерами є, наприклад банки, бульбашки, шприци, пакети для внутрішньовенного (ІМ) розчину і т.д. Контейнери можна виготовляти з різних матеріалів, таких як скло або пластмаса.
Контейнер містить композицію, яка сама або в поєднанні з іншою композицією є ефективною для лікування, попередження і/або діагностування стану, і може мати стерильний порт доступу (наприклад, контейнер може являти собою пакет для внутрішньовенного розчину або пляшечку, оснащену пробкою, яку можна проколювати за допомогою голки для підшкірних ін'єкцій).
Принаймні одна діюча речовина в композиції є кільцевим злитим поліпептидом, запропонованим у винаході. На етикетці або листівці-вкладиші в упаковку зазначено, що композицію застосовуть для лікування обраного стану. Крім того, виріб може включати (а) перший контейнер з розташованою в ньому композицією, де композиція містить кільцевий злитий поліпептид, запропонований у винаході; і (б) другий контейнер з розташованою в ним композицією, де композиція містить додатковий цитотоксичний або інший терапевтичний засіб.
Відповідно до даного варіанта здійснення винаходу виріб може додатково містити листівку- вкладиш в упаковку, яка містить інформацію про те, що композиції можна використовувати для лікування конкретного стану. В альтернативному або додатковому варіанті виріб може додатково включати другий (або третій) контейнер з фармацевтично прийнятним буфером, таким як бактеріостатична вода для ін'єкцій (БСВІ), забуферений фосфатом фізіологічний розчин, розчин Рінгера та розчин глюкози. Крім того, він може включати інші продукти, необхідні з комерційної точки зору і з точки зору споживача, зокрема, інші буфери, розріджувачі, фільтри, голки і шприци.
Всі документи, процитовані в даному описі (наукові статті, книги або патенти), включені в нього як посилання.
Представлені нижче приклади і креслення дані з метою кращого розуміння винаходу, справжній обсяг якого викладено в поданій формулі винаходу. Слід розуміти, що можна вносити зміни в викладені процедури без відхилення від суті винаходу.
Опис креслень
Зо На кресленях показано: на фіг. 1 - схематичне зображення загальної структури кільцевого злитого поліпептиду, представленого в даному описі; на фіг. 2 - схематичне зображення загальної структури двокільцевих злитих поліпептидів, представлених в даному описі; на фіг. З - схематичне зображення загальної структури трикільцевих злитих поліпептидів, представлених в даному описі; на фіг. 4 - схематичне зображення загальної структури чотирикільцевих злитих поліпептидів, представлених в даному описі; на фіг. 5 - орієнтація і просторова відстань між сайтами зв'язування канонічного антитіла
ІдСі-типу і наведених як приклад двокільцевих злитих поліпептидів, представлених в даному описі; на фіг. 6 - результати аналізу якості продукту у вигляді кільцевого злитого поліпептиду, представленого в даному описі, за допомогою мас-спектрометрії; на фіг. 7 - дані про різні впливи трастузумабу і двокільцеву і чотирикільцеву молекули анти-
Нег2 Сопіюгзроду відповідно, на проліферацію; на фіг. 8 - дані про зв'язування наведеного як приклад двокільцевого злитого поліпептиду, представленого в даному описі, з ЕсВп; на фіг. 9 - дані про кінетику АОСС різноманітних анти-Нег2 Сопіогзроду і трастузумабу; на фіг. 10-11 - схематичне зображення відносних положень і орієнтацій МН-домену в орієнтації "МН-іп" (поблизу Ес-ділянки) і "МН-оці" (в більш віддаленому положенні від Ес- ділянки); на фіг. 12 - наведені як приклад ланцюги анти-смМЕТ кільцевих злитих поліпептидів з відповідною орієнтацією, що застосовуться для одержання біспецифічних двокільцевих злитих поліпептидів, представлених в даному описі; на фіг. 13 - схематичне зображення двокільцевого злитого поліпептиду, представленого в даному описі, в якому один кільцевий злитий поліпептид містить МН/У/І-пару як сайт зв'язування, а інший кільцевий злитий поліпептид містить завантажений пептидом ГКГС-1- комплекс як сайт зв'язування;
на фіг. 14 - дані про вплив на опосередкований ГКГСОС-І рекрутинг клітин-кілерів і на ліквідацію клітин злиття ГКГС-І антитіло Ідс-типу і двокільцевого злитого поліпептиду, представленого в даному описі та вказаного на фіг. 13; на фіг. 15 - хроматограма Уф-екстинкції (280 нм) різних форм Сопіоггероау.
ХІІ. Приклади
Нижче представлені приклади способів і композицій, застосованих у винаході. Слід розуміти, що з урахуванням представленого вище загального опису для втілення на практиці можна використовувати різні інші варіанти здійснення винаходу.
Матеріали і методи
Методи рекомбінантної ДНК
Для маніпуляцій з ДНК використовували стандартні методи, описані у Затюогоок .. та ін.,
Моїесшіаг сіопіпуд: А Іарогаїогу тапиаї; вид-во Соїд Зргіпд Нагрог І арогаїогу Ргез5, Соїй 5ргіпд
Нагрог, Мем/ МогкК, 1989. Реагенти для молекулярної біології застосовували відповідно до інструкцій виробників.
Синтез генів і олігонуклеотидів
Необхідні сегменти генів створювали за допомогою хімічного синтезу на фірмі Сепеагі АС (Регенсбург, Німеччина). Синтезовані фрагменти генів клонували в плазміді Е. соїї для розмноження/ампліфікації. Послідовності ДНК субклонованих фрагментів гена підтверджували шляхом секвенування ДНК. Альтернативно цьому, короткі синтетичні ДНК-фрагменти збирали шляхом "відпалювання" хімічно синтезованих олігонуклеотидів або за допомогою ПЛР.
Відповідні олігонуклеотиди отримували на фірмі Меїаріоп СтрН (Планегг-Мартінесрід,
Німеччина).).
Реагенти
Всі хімічні агенти, антитіла і набори, що надходять у продаж, застосовували згідно з протоколом виробника, якщо не вказано інше.
Приклад 1
Конструювання експресійних плазмід для кільцевих злитих поліпептидів
Для експресії кільцевого злитого поліпептиду, представленого в даному описі, застосовували транскрипційну одиницю, що містить наступні функціональні елементи:
Зо - негайно-ранній енхансер і промотор з людського цитомегаловірусу (Р-СММ), включаючи інтрон А, - -нетрансльована ділянка (5'ОТЕ) важкого ланцюга людського імуноглобуліну, - сигнальна послідовність важкого ланцюга мишачого імуноглобуліну, - нуклеїнова кислота, що кодує відповідний кільцевий злитий поліпептид, і - послідовність поліаденілювання бичачого гормону росту (ВОН рА).
Крім експресійної одиниці/касети, що включає необхідний ген, який підлягає експресії, основна/стандартна експресійна плазміда для клітин ссавців містила - сайт ініціації реплікації з вектора рисС18, який забезпечує реплікацію зазначеної плазміди в
Е. сої, і - ген бета-лактамази, який надає Е. соїї стійкість до ампіциліну
Приклад 2
Експресія кільцевих злитих поліпептидів
Короткочасну експресію кільцевих злитих поліпептидів здійснювали в адаптованих для зростуння в суспензії клітинах лінії НЕК2ОЗЕ (Ргеебіує 293-БЕ-клітини; фірма Іпмігодеп) з використанням реагенту для трансфекції 293-їтеє (фірма Момадеп).
Клітини пересівали шляхом розведення принаймні 4 рази (об'єм 30 мл) після відтавання в 125-мілілітрових струшувальних колбах (інкубація/струшування при 37 "С, 7 95 СО», вологість 85 95, 135 об/хв).
Клітини розмножували до досягнення густини 3х109 клітин/мл в об'ємі 250 мл. Через З дні клітини розщеплювали і знову висівали з густиною 7х105 клітин/мл в об'ємі 250 мл в 1-літрову струшувальну колбу. Трансфекцію здійснювали через 24 год. при клітинній густині приблизно 1,4-2,0х105 клітин/мл.
Перед трансфекцією 250 мкг плазмідної ДНК розводили в кінцевому об'ємі 10 мл попередньо нагрітим (водяна баня; 37 "С) середовищем Оріі- МЕМ (фірма сірсо). Розчин обережно перемішували та інкубували при кімнатній температурі протягом не більше 5 хв.
Потім додавали 333,3 мкл реагенту для траснфекції 293-їее до розчину ДНК-ОрІМЕМ. Потім розчин обережно перемішували та інкубували при кімнатній температурі протягом 15-20 хв.
Весь об'єм суміші додавали в 1-літрову струшувальну колбу в об'ємі культури клітин НЕК 250 мл.
Здійснювали інкубацію/струшування при 37 "С, 7 95 СО», вологість 85 95, 135 об/хв протягом б або 7 днів.
Супернатант збирали шляхом першої стадії центрифугування при 2000 об/хв при 4 "с, протягом 10 хв. Потім супернатант перенесли в новий центрифужний флакон для другої центрифуги і центрифугували при 4000 об/хв при 4 "С, протягом 20 хв. Потім безклітковий супернатант фільтрували через пляшку-топ-фільтр з розміром пор 0,22 мкм і зберігали (20 С).
Приклад З
Очистка кільцевих злитих поліпептидів
Супернатанти культури, що містять антитіло, фільтрували і очищали з використанням двох стадій хроматографії. Антитіла іммобілізували за допомогою афінної хроматографії з використанням системи НіТтар МарзеївєсізиВе (фірма СЕ Неайнсагє), врівноваженої ЗФР (1мММ
КНегРО», 10мМ МагНРО», 137мМ Масі, 2,7мМ КС), рН 7,4. Незв'язані білюи видаляли шляхом промивання буфером для врівноважування, і антитіло виділяли за допомогою 50мМ цитратного буфера, рнН 2,8 і негайно після елюції нейтралізували до рН 6,0 за допомогою 1М трис-основи, рН 9,0. Гель-фільтрацію на колонці з Зирегаєх 2007М (фірма СЕ Неайнсаге) застосовували як другу стадію очистки. Гель-фільтрацію здійснювали в 20мМ гістидиновому буфері, 0,14М Масі, рН 6,0. Возчини, які містять антитіло, концентрували за допомогою центрифужного фільтра
ОПгатее-СІ, оснащеного мембраною Віотах-5К (фірма МіПіроге, Біллеріка, шт. Массачусетс), і зберігали при -80 "С.
Приклад 4
Зв'язування анти-Нег2 кільцевого злитого поліпептиду
Оцінка зв'язування з Нег2-рецептором за допомогою поверхневого плазмонного резонансу
Поверхня чіпа: СМ5-чіп.
Т:37 "Сі 25 С відповідно для варіанта аналізу 1 і 2.
Рухомий буфер:ЗФР ж 0,05 об. 95 Твін 20.
Буфер для розведення: рухомий буфер -- 0,1 95 БСА.
Аналіти: концентрація (с) (НЕН2 ЕСБ) - 0,41-900НМ для варіанта аналізу 1; с (димерні анти-Нег2 Сопіоггероаду) - 3,7-ЗО00нМ,
Зо с (тетрамерні анти-Нег2 Сопіогероду) - 1,85-150нМ, с (трастузумаб) - 3,7-ЗО0НМ для варіанта аналізу 2.
Ліганд: димерні і тетрамерні анти-Нег2 Сопігзроаду, трастузумаб, зв'язаний через антитіло до людської Ес-ділянки у варіанті аналізу 1; Нег2-ЕСО, зв'язаний через пертузумаб у варіанті аналізу 2.
Одиниці відповіді прямо пропорційні молекулярній масі. Теоретичний максимум зв'язування аналіту базується на відомому рівні зв'язування Нег2 ЕСО. 100 95 - 1 молекула димерних анти-
Нег2 Сопіогзроду або трастузумабу зв'язується з 2 молекулами НЕН2 ЕСО відповідно; 1 молекула тетрамерних анти-Нег2 Сопіогзроду зв'язується з 4 молекулами НЕН2 ЕСО.
Приклад 5
АрсСб-аналіз за допомогою пристрою (проточного цитометру) фірми АСЕА
ВТ-474-клітини "солюбілізовали" за допомогою акутази, визначали кількість в середовищі і доводили до клітинної густини 2х10Е5 клітин/мл. 50 мкл середовища додавали за допомогою піпетки в кожну лунку 9б-лункових планшетів, фонову дію вимірювали з використанням пристрою фірми АСЕА, і, нарешті, додавали по 50 мкл суспензії клітин/лунку (- 10000 клітин/лунку). Планшети поміщали в пристрій фірми АСЕА для вимірювання клітинного індексу через 15 хв. Потім середовище видаляли піпетуванням, здійснювали стадію промивання з використанням середовища АІЇМ-М та додавали 50 мкл антитіла в трьох різних концентраціях.
Підраховували кількість природних клітин-кілерів і поміщали в середовище АЇМ-М з клітинною густиною бх105. Додавали по 50 мкл (30000 клітин/лунку і Е/Т 3:1) в АСЕА і вимірювали клітинний індекс кожні 5 хв. Через 24 год. експеримент припиняли і розраховували АОСС через 214 год.
Приклад 6
Мас-спектрометричний аналіз димерного анти-Нег2 кільцевого злитого поліпептиду
РМСіаазу Е одержували від фірми Коспе Оіадповіїсв СітЬН (14,3 од./мкл; розчин в фосфаті натрію, ЕДТА і гліцерин). Специфічний для протеази сайт розщеплення в шарнірній ділянці антитіла Ідо-типу знову відновлювали з ліофілізату перед розщепленням.
Ферментативне деглікозилювання за допомогою РМюсази Е 50 мкг Сопіогероду розводили до кінцевої концентрації 0,6 мг/мл з використанням 10ММ натрій-фосфатного буфера, рН 7,1 і деглікозилювали за допомогою 1 мкл РМсази Е при 37 "С 60 протягом 16 год.
Ферментативне розщеплення
Деглікозильований зразок розводили до кінцевої концентрації 0,5 мг/мл з використанням 200
ММ трис-буферу, рН 8,0 і потім розщеплювали специфічною для Ід протеазою при 37 "С протягом 1 год.
ЕБІ-ОТОЕ-мас-спектрометрія
Зразок знесолювали за допомогою РХВР на колонці Сефадекс 25 (фірма Кгопіаб, 5х250 мм, ТАСОБ5/250050-54) з використанням 40 95 ацетонітрилу з 2 95 мурашиної кислоти (об./об.).
Загальну масу визначали за допомогою ЕБІ-ОТОБЕ-МС з використанням МОС-системи тахів 40
ИНВА-ОТОЕ (фірма Вгикег байопік), оснащеною джерелом ТгімМегза МапоМаїе (фірма Ааміоп).
Калібрування здійснювали за допомогою йодиду натрію (набір: УМаїег5 ТОЕ 52-Затріє Кі 2 Ран: 700008892-1). Для розщепленого Сопіог:роау збір даних здійснювали при 1000-4000 пт/ (ІЗСІЮ: 30 еВ). Спектр необроблених даних оцінювали і трансформували в індивідуальні відносні молярні маси. Для візуалізації результатів застосували власну програму для отримання мас- спектрів шляхом деконволюції (зверненої згортки).
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«1105 Ф. ХОФФМАНН-ЛЯ РОШ АГ «1205 СОМТОВ5ВОруУ - ОДНОЛАНЦЮГОВИЙ АГЕНТ, ЯКИЙ ЗВ'ЯЗУЄ МІШЕНЬ «1305 РЗ3504-ШЩО «1505 ЕРІ6167920 «1515 2016-05-02 «1605 105 «1705 РасепсІп уеквіоп 3.5 «2105 1 «2115 5 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» Агкдд-гад «4005 1
Ага Агуд Агуд Агуд Агд 1 5 «2105 2 «2115» 6 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205» «223» Агд-бад 2 «4005 2
Ага Агу Агу Агуд Агуд Агд 1 5 «2105 З «2115 6 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205» «223» Нів-гад «4005 З
Нівз Нів Нів Нів Нів Нів 1 5 «2105 4 «2115 19 «212» РВТ «213» Штучна послідовність «2205» «223» амінокислотна мітка «4005 4 60 Пув Авр о Нів їеч І1е Нів Авп Маї Нів Пув бі Рре Ніз Аза Нів А1а 1 5 10 15
Нів АБп Гув «2105 5 65 «2115. 8 «2125 РВТ
«213» Штучна послідовність «223» амінокислотна мітка «4005 5
Авр Тук Ппув Авр АБр АБр АБр Гуз 1 5 «2105 6 «2115 22 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» амінокислотна мітка «4005 6
Авр о Тук пуб АБр оНіб АБр обіу АБр Туг Пуб Авр о Ніб АБр І1е АБр Туг 1 5 10 15
Тув АБр АБр АБр АБр Гу «2105 17 «2115 39 20 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» амінокислотна міткай «4005 7
Аза Тгр Аку Нів Рго Сіп Рбе С1у С1У 1 5 «2105 8 «2115 8 «2125 РЕТ
Зо «213» Штучна послідовність «220» «223» амінокислотна мітка «4005 8
Тер Бек Ні Рго біп Рпе біц Гув 1 5 «2105 139 «2115 10 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» амінокислотна мітка «4005 9
Меє АБр Уаі! бічЧ Аза Тер Гецш сіу Аза Агд 1 5 10 «2105 10 «2115 16 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» оамінокислотна мітка «4005 10
Меє АБр Уаі! бічЧ Аза Тер Геш сіу Аза Аку Маії Ркго Іеч Уаї біц Торг 1 5 10 15 «2105 11 «2115 38 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» амінокислотна мітка (516) «4005 11
Меє АБр біч губ Тс ТБ сіу Тер Акуд сіу б1у Ніз Уаї Уаі бі щ1Уу 1 5 10 15
Теч Аїа сіу біц Ге сій сбіп Геї Агу Азїа Агу Теч біц Ні Нів Рго 20 25 30 65 сіп б1у Сбіп Агд січ Рго 35 «2105 12 «2115 10
«212» РВТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» амінокислотна мітка «4005 12 біч біп Гуз Гей Іїе Бек січ січ4 АБр Іеч 1 5 10 «2105 13 «2115 15 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» амінокислотна мітка «4005 13 пув бі Тс Аза Атїа Аїа їу5 Рре Сі Агуд біп Нів Меє Авр 5бег 1 5 10 15 «2105 14 «2115 26 «212» РВТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» амінокислотна мітка «4005 14
Туз Агуд Агуд Тер пуб пуб АБп Рре І1їе Аїа Уа! бег Аїа Аза А5п Агд 1 5 10 15
Рпе Ппув Пув І1е бек бек бек біу Аїа Гец 20 25 «2105 15 «2115 47
Зо «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» амінокислотна мітка «4005 15
Рго Аїа Тс Тис Тбг о сСіу бек бек Рго Сіу Рго ТПг Сіп бек Нів Туг 1 5 10 15 біу біп Су5 сіу сіу Іїе сіу Тугк бек біу Ргко ТПг Уаї Сув5 Аза бБег 20 25 Зо біу ТБ ТпЕ Сув біп Уа1ї Геї АБп Рго Туг Тук бек біп Суб Гей 35 40 45 «2105 16 «2115 32 «212» РВТ «213» ВиИабукіуіркіо ТіргівоїЇуепьв «4005 16
Меє АБр Тгр АБп Аза Авп І1їе Аза Рго сіу АБп бек Уаі бі Рпое с01УуУ 1 5 10 15
Іїе сбіп сіу Аїа біу бек Уаі! біу Авп Уаі Іїе Аб5р Іїе ТПг Уа1ї січ 20 25 Зо «2105 17 «2115 51 «212» РВТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» хітин-зв'язувальний домен «4005 17
ТПЕ АБп о Рго біу Уа! бек Аїа Тер біп Уаі АБп ТПг Аза Туг ТПг Аза 1 5 10 15 біу біп Гецп Уа! ТпПг Тук АБп сіу Пуб5 ТБг Тук пув Сув Геч біп Рго 60 20 25 30
Нів ТіПг бек Іеч Аза біу Тер бій Рго Бек АБп УМаі Рго Аїа Іеч Тгр 35 40 45 біп Теч сіп 5о0 65 «2105 18 «2115 209 «212» РВТ «213» Спопагки5 сгіврив5
«4005 18
Меє Рго біч Іїе Ппу5 Пец ТПг Тук Ррбе АБр Меє Агу сб1у Агуд Аза сі1ц 1 5 10 15
Аа Бек Акуд Геї Аїа Іечп Уаі! Уа! сіу біц Іїе Рго Рбе сії АБр січ 20 25 Зо
Агуд Уа1ії Уа1і Рре АБр Ніб5 Ткр їув біц АТа пуб Рго Пув ТПг Рго Туг 35 40 45
Аза Аза Геї Ркго Меє Іечп ТБг Уаі! Авр сіу Меє сіп Уаі Азїа біп 5ег 5о0 ів) бо
АБр Аза І1е Гей Агкуд Туг Сув біу Пув Пе Аїа біу Пе Тук Рго 5бег 65 70 75 80
АвБр Рго Геї сії Аза Аїа Гуз Уаі АвБр біц Уаі сіу сіу Уа1і І1е АБр 85 90 95
Авр Уа1 Тпг Нів Аза Меє Туг Агку Туг Акуд сб1іу Авр АБр Гу5 АБр Гуз 100 105 110
Теч Аку бій бі Агуд Ар оПув Роре бек Гувз Уаі Ар Уаї Рго Агуд Туг 115 120 125
Уаї б1у Аїа їеч біц пуб Акд Геї сії Аза Робе сбіу АвБр сіу Рго Тгр 130 135 140
Аза Ма1 сіу сСі1іу Авп Меє ТБг І1їе Аїа А5вр Іїеч Ніє І1е Сув Нів Іеч 145 150 155 160
Уаї ТЕ АБп Іїе Аку Суб сіу Меє Гечп АБр Роре Уаії АБр Гу5 Ар Гец 165 170 175
Теч біч сіу Тук Уаі Аку Іїе Ма1ії Гу5 бек Туг бек Аїа Уаі1і Меє сій 180 185 190
Нів Ркго Ппув Маі! Тбг біцч Тер Тук бі пуб пуб Рго Маї Гуз Меє Ре 195 200 205 зекг
Зо «2105 19 «2115 396 «2125 РЕТ «213» Евспегкісніа соїї «4005 19
Меє цЦув І1їе Ппув Ті С1у Аза Агу Іїе Іец Аїа Іеєп бек Аїа Іеч Тс 1 5 10 15
ТПг Меє Меє Рре бег Аза бег Аїа Гечш Аїа Гу5 Іїе біч біч с1іу Був 20 25 Зо
Теч Уаі Іїе Тер Іїе АбБп сіу АБр Гуз біу Туг АБп біу Ге Аза сій 35 40 45
Уаї б1у Гуз Пув Рпе біц Пув Авр Тс сіу І1ї1е Гуз Уа! ТПг Уаї сіц 5о0 ів) бо
Нів Рго АБр Гу5з Іеч біц біц пуб Рбе Рго сбіп Уаі Аїа Аза ТПгЕ с1Уу 65 70 75 80
Авр біу Рго АБр І1їе І1їе Рре Тгр Аїа Нів АБр Агд Рре СсСіу СсСі1у Туг 85 90 95
Аза сіп Бек сіу Геч Іеп Аза біц Іїе ТБПг Рго Ар Пу5 Аїа Рое сіп 100 105 110
Авр пуб Геч Тугк Рго Роре ТБбг Тгр Авр Аза Уаі Агку Туг АБп б1у Гуз 115 120 125
Теч Іїе Аза Туг Рго Іїе Аїа Уаії біп Аза Іеч бек Ге Іїе Тук АБп 130 135 140
Тув АБр Геч Гей Рго АвБп Рго Рго Губ5 ТПг Тгр бічЧ біц Іїе Рго Аза 145 150 155 160
Печ Авр Ппуз бі Гечп Ппуз Аїа Ппуз біу Пув бек Аїа їечп Меє Роре Авп 165 170 175
Теч біп біц Рго Тук Рре ТПг Тгр Рго Те І1їе Аїа Аза А5р сіу с1у 180 185 190
Тук Аїа Рре Гуз Тук біц Авп сіу пуб Туг АБр І1е Гуз Ар Уаі с01У (516) 195 200 205
Уаї АБр АБп Азїа біу Аза Пу5 Аза сіу Геї ТПг Роре Іеч Уаї Ар Гец 210 215 220
Іїе Ппув АБп о Гпуб Ні Месє АБп Аза А5р ТПг Азр Туг бек Іїе Аза січ 225 230 235 240 65 Аза Аза Рре Авп о Пув сіу сії ТБг Аза Меєсє Тс І1ї1е АвБп СсС1у Рго Тгр 245 250 255
Аза Тер Бек АБп І1е АБр ТПйг бек пуб Уа1і А5зп Туг сіу УМа1ї! ТБг Уаї 260 265 270
Теч Рго ТПЕ Рпе Пув сіу біп Ркго бек Гувз Рго Рпе Уаї сіу Уаї Гей 275 280 285
Бек Аїа сіу Іїе АБп Аїа Аза бек Рго АвБп ПуБ січ Геї Аїа Гу5 січ 290 295 300
Рпе Ге бій АвБп Туг Іїеч Іїеч Трг Авр бі біу Геп бі Аїа Уаї АБп 305 310 315 320
Туз АБр о пуб Рго Геч сіу Аїа Уаі Аза Іеч Гуз бег Тук бій сій сій 325 330 335
Теч Аїа пуб Авр Рго Агу І1ї1е Аза Азїа ТПг Месє біц А5Бп Аза сіп Гув 340 345 350 біу бічЧ Іїе Меє Рго Аб5п Іїе Рго біп Меє б5ег Аїа Рре Тер Туг Аза 355 360 365
Уаї Аку Тс Аза Уаі! Іїе А5п Аза Аза бек біу Аку біп Трг Уаі1ї! Авр 370 375 З8о січ Аза їеч Гуз Авр Аїа Сіп Трг Агу І1е Тс Був 385 390 395 «2105 20 «2115 98 «2125 РЕТ «213» Ното варієпв «4005 20
Аа Бек ТПг Ппув біу Рго бек Уаі Рре Рго Ге Аза Рго бек бек Кув 1 5 10 15
Бек ТПг Бек сіу біу Тс Аза Аза Гей сіу Суб Геч Уа1ї Гпу5 АБр Туг 20 25 Зо
Рпе Ркго сії Рко УМаі! ТіБг Уаї бек Тер Авп бек сіу Аїа Геї ТПг 5ег 35 40 45 біу Уаії Нів ТПг Рпе Рго Аїа Уаії Іечп біп бек бек біу Геч Тукгк бБег 5о0 ів) бо
Теч бек бек Ма1 Уа1ї Тіг Уа1ї Рго бЗег бек бБег їеч Сіу ТПг сбіп Тис 65 70 75 80
Тук І1ї1е Суб АБп Уаі Авп Нібв пуб Рго Бек АБп о ТБПг Гуз Уаії Авр Був 85 90 95
Туз Уаї
З5 «2105 21 «2115 107 «2125 РЕТ «213» Ното 5арієпь 40 «4005 21
Аза Рго сії Геї ІГеч біу біу Рго бек Уа! Рпе Геї Роре Рго Рго Гуз 1 5 10 15
Рго пуб АБр Тс Іечп Мес Ії1е бек Агуд ТпПг Рго сії Ма1ї Тбг Сувз Уаї 20 25 Зо 45 Тер Авр Маії бек Нів біц Авр Рго біц Маї Пув Рпе Авп Тер Тук Уаї
Авр о сіу Уаі1і сії Маї Ніб5 АБп Аза Пу5 ТПг пуб Рго Агуд січ бі біп 5о0 ів) бо біч бек ТрПг Ту Агуд Тер Бек Маії Іеч ТПг Уаї Іеч Ні5 сіп Авр Тгр 65 7о 75 80
Теч АБп о біу пуб бі Тук Ппув Сув Кпубв Маії бек АБп Гуз Аїа Геч Рго 85 90 95
Аза Рго Іїе сії Ппуб5 ТПг І1їе бек їув Аза Гув 100 105 «2105 22 «2115 106 «2125 РЕТ «213» Ното 5арієпь «4005 22 60 біу біп Рго Агу бій Рго біп Маії Тугє Тбг Гей Рго Рго б5ег Агу Авр 1 5 10 15 біч Геч ТБЕ пуб Авп біп Уаії бек Геї ТП Сувз Теч Уаі Ппув сіу Робе 20 25 Зо
Тук Рго бек АБр Іїе Аїа Уа! сій Тер сі бек АБп біу біп Рго сіц 65 35 40 45
Авп о Авп о Тук Пув Тс ТБ Ргро Рго Уаі Гей Авр бек Авр сіу Бек Ріе 5о0 ів) бо
Рпе Геч Туг бек Гув5 Теч Тбйг Уаі Авр пуб Бек Агу Тгр біп біп с1Уу
65 70 75 80
Авп оУа1 Рре бек Суб бек Уаії Меєсє Ні сіц Аза Геч Нібв АБп Ні Туг 85 90 95
ТЕ біп Гуз бек Тец бек Гей бек Рго с1УуУ 100 105 «2105 23 «2115 10 «2125 РЕТ «213» Ното 5арієпь «220» «221» ІНША ОЗНАКА «222» (8)..(8) «223» Х-5.або Р «4005 23
Авр Пув Трпг Нів Тс о Сув Рго Хаа Сув Рего 1 5 10 «2105 24 «2115 7 «2125 РЕТ «213» Ното варієпв «2205 «221» ІНША ОЗНАКА «2225 (5)..(5) «223» Х-5.або Р «4005 24
Нів ТП Суб Рго Хаа Сув Рго 1 5 «2105 25 «2115 5
Зо «2125 РВТ «213» Ното 5арієпь «2205 «221» ІНША ОЗНАКА «222» (3)..(3) «223» Х-5 або Р «4005 25
Сув Рго Хаа Суб Рго 1 5 «2105 26 «2115 330 «2125 РЕТ «213» Ното 5арієпь «4005 26
Аа Бек ТПг Ппув біу Рго бек Уаі Рре Рго Ге Аза Рго бек бек Кув 1 5 10 15
Бек ТПг Бек сіу біу Тс Аза Аза Гей сіу Суб Геч Уа1ї Гпу5 АБр Туг 20 25 Зо
Рпе Ркго сії Рко УМаі! ТіБг Уаї бек Тер Авп бек сіу Аїа Геї ТПг 5ег 35 40 45 сіу Ма1 Нів Трпг Рре Рго Аза Маї Із Сіп бБег бек Сіу Іеч Туг бЗег 5о0 ів) бо
Теч бек бек Уа1і Уа1 ТПг Уа1ї Ркго бек бек бег Гец біу ТПг сбіп Тс 65 70 75 80
Тук І1ї1е Суб АБп Уаі Авп Нібв пуб Рго Бек АБп о ТБПг Гуз Уаії Авр Був 85 90 95
Туз Уаії бій Рго Пув Бек Суб АБр Гу5 ТПг Нів ТЕ Суб Рго Рго Сув 100 105 110
Рго Аїа Рго біп Іеч ІТеч біу біу Рго Бек Уа1і Роре Іечп Рое Рго Рго 115 120 125 60 Пув Рго ПЦув Авр ТіПг їеч Меє І1е бек Агуд Трг Рго Січ Ма1 Тс Сув 130 135 140
Уаї Маї Уаї АБвБр Уаї бек НівБ сії АБр Ркго біц Уаії пу5 Рре Авп Тгр 145 150 155 160
Тук Маі АБр біу Уаі! біц Уаї Нів А5п Аза Пуб5 ТПг Гу5з Рго Агкуду сбіц 65 165 170 175 біч біп Тук Авп бек ТПг Туг Аку Уаії Уаї бек Уаі Гей ТпПг Уаї Гей 180 185 190
Нів біп АБр Тер Теч АвБп о сбіу пуб сії Тук Ппув Суб Гув Уаї бек Авп
195 200 205
Туз Аза Гей Рго Аза Рго Іїе біп Гуз Тбг Іїе бек пуб Аїа Ппув5 Сс1УуУ 210 215 220 біп Рго Акуд бі Рго сбіп Уаї Тугк ТПг Те Рго Рго бег Агуд Ар сій 225 230 235 240
Теч ТБ Ппув Авп о біп Уа1ї Бек Геї ТПг Сувз Теч Уаі Ппув сіу Рпе Туг 245 250 255
Рго Бек АБр Іїе Аїа Уа! біч Ткр біц бек Авп сіу біп Рго біч4 АБп 260 265 270
АБп оТук пуб ТВг ТВг Рго Рко Уаі Гей Авр бек Авр біу бек Роре Ріе 275 280 285
Теч Тук бек Пув Геч ТПг Уаі АБр Гу5 бек Агу Тер біп біп с1у АБп 290 295 300
Уаї Рре бек Суб бек Уаії Меє Ніб сії Аїа Геч Ніб АБп Нібв Тугє Трг 305 310 315 320 біп Гуз бек ГПецп бек Геч бек Рго біу Гуз 325 330 «2105 27 «2115 330 «2125 РВТ «213» Ното 5арієпь «4005 27
Аа Бек ТПг Ппув біу Рго бек Уаі Рре Рго Ге Аза Рго бек бек Кув 1 5 10 15 бек ТрПг бек Сі1іу біу Трг Аїа А1їа ес СсСіу Сув їеч Уаї Пув Авр Туг 20 25 Зо
Рпе Ркго сії Рко УМаі! ТіБг Уаї бек Тер Авп бек сіу Аїа Геї ТПг 5ег біу Уаії Нів ТПг Рпе Рго Аїа Уаії Іечп біп бек бек біу Геч Тукгк бБег
Зо 50 55 бо
Теч бек бек Уа1і Уа1 ТПг Уа1ї Ркго бек бек бег Гец біу ТПг сбіп Тс 65 70 75 80
Тук І1ї1е Суб АБп Уаі Авп Нібв пуб Рго Бек АБп о ТБПг Гуз Уаії Авр Був 85 90 95 35 пув Маї бій Рго Ппуз Бек Сув Авр Пув ТПг Нів ТПг Суб Рго Рго Сув 100 105 110
Рго Аїа Рго біп Іеч ІТеч біу біу Рго Бек Уа1і Роре Іечп Рое Рго Рго 115 120 125
Тув Рго Пув Авр ТПг Геч Меє І11е бек Агу ТПг Рго бі Уа1і ТПг Сув 40 130 135 140
Уаї Маї Уаї АБвБр Уаї бек НівБ сії АБр Ркго біц Уаії пу5 Рре Авп Тгр 145 150 155 160
Тук Маі АБр біу Уаі! біц Уаї Нів А5п Аза Пуб5 ТПг Гу5з Рго Агкуду сбіц 165 170 175 45 сій біп Туг Авп о бег Тпг Туг Акуд Уаі1і Уаї бБег Уаї їеч ТіПг Уаї Ієч 180 185 190
Нів біп АБр Тер Теч АвБп о сбіу пуб сії Тук Ппув Суб Гув Уаї бек Авп 195 200 205
Туз Аза Гей Рго Аза Рго Іїе біп Гуз Тбг Іїе бек пуб Аїа Ппув5 Сс1УуУ 210 215 220 біп Рго Акуд бі Рго сбіп Уаї Тугк ТПг Те Рго Рго бег Агд січ сій 225 230 235 240
Меє ТЕ Гуз АБп о біп Уаії бек Геч ТПг Суб Тез УМаї Туз біу Робе Туг 245 250 255
Рго Бек Авр І1їе Аза Уаї Січ Тгр бій бек АБп біу Сіп Рго Січ Авп 260 265 270
Авп оТук пуб Тбг ТБ Рго Рго Уаі Гец Авр бек Авр сіу Бек Роре Ріе 275 280 285
Теч Тук бек Пув Геч ТПг Уаі АБр Гу5 бек Агу Тер біп біп с1у АБп 60 290 295 300
Уаї Рре бек Суб бек Уаії Меє Ніб сії Аїа Геч Ніб АБп Нібв Тугє Трг 305 310 315 320 біп Гуз бек ГПецп бек Геч бек Рго біу Гуз 325 330 65 «2105 28 «2115 326 «2125 РЕТ «213» Ното 5арієпь
«4005 28
Аа Бек ТПг Ппув біу Рго бек Уаі Рре Рго Гей Аза Рго Суб б5ег Агд 1 5 10 15
Бек ТПг Бек біп бек Тйг Аза Аза Гей сіу Суб Геч Уа1ї Гпу5 АБр Туг 20 25 Зо
Рпе Ркго сії Рко УМаі! ТіБг Уаї бек Тер Авп бек сіу Аїа Геї ТПг 5ег 35 40 45 біу Уаії Нів ТПг Рпе Рго Аїа Уаії Іечп біп бек бек біу Геч Тукгк бБег 5о0 ів) бо
Теч бек бек Ма1 Уаї Ті Уа1ї Рго бек бек Ап Рре Сіу ТПг Ссіп Тис 65 70 75 80
Тук ТК Суб АвБп о Уаії Авр о Нібв пуб Рго Бек АБп ТЕ Туз Уаії Авр Був 85 90 95
ТЕ Маї1ї січ Аку Гуз Суб Сув Уа1і! січ Суб Рго Рго Суб5 Рго Аза Рго 100 105 110
Рго Уаі Аїа сбіу Рго бек Уаі Рпе Гей Рпе Рго Рго Пу5 Рго КТУу5 Авр 115 120 125
ТПЕ Геч Меє І1їе бек Агку ТПг Рго бі Уа1і ТПг Суб Уаї Уаї Уаї Авр 130 135 140
Уаї бек Нів сі Авр Рго біц Уаі Сіп Рбре Авп Тгр Туг Маї Авр С1У 145 150 155 160
Уаї біч УМаї Ні АвБп Аза Пу5 ТпПг пуб Рго Аку біз бі біп Рбе Авхп 165 170 175 ек ТПЕ Рре Аку Уаі! Уаї бек Уаі Гей ТпПг Уа1ї Уаї Ніб5 біп АБр Тгр 180 185 190
Теч АБп о біу пуб бій Тук Ппув Сув Кпув Маії бек АБп Пу5 сіу Геч Рго 195 200 205
Аза Рго Іїе сії Ппуб5 ТПг Іїе бек Пу5 ТПг пуб сіу біп Рго Агку січ 210 215 220
Рго біп Уа1і Тугє ТПг Гечп Рго Рго бег Акуд Січ біц Меє Тс Пув Авп 225 230 235 240 біп Уаії бек Гей ТпПг Суб Геч Маї Гуз біу Ропе Туг Рго бег АБр Ше 245 250 255
Ззек Уа1і сії Тер біп бек АБп біу біп Рго бій Абп АБп Тугє Гу5 Тс 260 265 270
ТПЕ Рго Ркго Меєсє Іец Авр бег Авр сіу Бек Роре Робе ІТеч Тукг бек ГПув 275 280 285
Теч Тпг Уаї Авр пуб Бек Агуд Тер біп біп біу Авп Уа! Рре Бек Сув 290 295 300 бек Ма1 Меє Нів бі Аїа Іеч Нів Авп Нів Туг ТПг Сіп Пув бег Іеч 305 310 315 320 ек Геч Бек Рго біу Гуз 325 «2105 29 «2115 377 «2125 РЕТ «213» Ното 5арієпь «4005 29
Аа Бек ТПг Ппув біу Рго бек Уаі Рре Рго Гей Аза Рго Суб б5ег Агд 1 5 10 15
Бек ТПг Бек сіу біу Тс Аза Аза Гей сіу Суб Геч Уа1ї Гпу5 АБр Туг 20 25 Зо
Рпе Ркго сії Рко УМаі! ТіБг Уаї бек Тер Авп бек сіу Аїа Геї ТПг 5ег 35 40 45 сіу Ма1 Нів Трпг Рре Рго Аза Маї Із Сіп бБег бек Сіу Іеч Туг бЗег 5о0 ів) бо
Теч бек бек Уа1і Уа1 ТПг Уа1ї Ркго бек бек бег Гец біу ТПг сбіп Тс 65 70 75 80
Тук ТК Суб АвБп о Уаі Авп Нібв пуб Рго Бек АБп о ТБПг Туз Уаії Авр Був (516) 85 90 95
Агуд Уа1і січ Геч пуб ТБ Рго Теч біу Авр ТПг Тпг Ні Тбг Сув Рго 100 105 110
Агуд Сув Рго бій Рго Гув5 бек Суб Авр ТПг Рго Рго Рго Суб Рго Агд 115 120 125 65 Сув Рго біп Рго Ппуз Бек Сув Авр ТПг Рго Рго Рго Сув Рго Агу Сув 130 135 140
Рго бій Рго пуб бек Сув АБр ТПг Рго Рго Рго Субв Рго Агу Сув Рго 145 150 155 160
Аза Рго сії Геї ІГеч біу біу Рго бек Уа! Рпе Геї Роре Рго Рго Гуз 165 170 175
Рго пуб АБр Тс Іечп Мес Ії1е бек Агуд ТпПг Рго сії Ма1ї Тбг Сувз Уаї 180 185 190
Уа1ії Уаі1і Авр Уаї бек Нів біцп Авр Рго бі Маі біп Рбе Гуз Тегр Туг 195 200 205
Уаї АБр біу Уаії біц Уаї Нів А5п Аза Пуб5 ТП Гуз Рго Агу бі сі 210 215 220 біп Тук Авп бек ТПг Рре Аку Уаі Уаі! бек Уаі Гей ТПг Уаі1ї Геч Нів 225 230 235 240 біп Абр Тер Гей Авзп сіу Ппув бі Тук Гуз Суб пуб Уа1! Бек АвБп Гув 245 250 255
Аза Геч Рго Аїа Рго Іїе біч Гу5 Трг Іїе бек пуб ТПг Ппув5 б1у біп 260 265 270
Рго Акд Сі Рго біп Маї Тугє ТіПг Гей Рго Рго бБег Акуд Січ Січ Меє 275 280 285
ТПЕ пуб АБп обіп Уа! бек Гецп ТПг Суб Геч УМа1ї Ппу5 біу Рое Туг Рго 290 295 300 век АвБр Іїе Аїа Уаі біп Ткср біц бек бек сіу сбіп Рго сії АБп АБп 305 310 315 320
Тук АБп о ТПг ТБЕ Ргсо Рго Меє Гей Авр бБег АБр біу бек Ропе Ріе Гец 325 330 335
Тук Бек КПув ТІГеч Тбг Уаі Авр пуб бек Агуд Тер біп біп б1у АБп Іе 340 345 350
Рпе бег Сув бек Ма1 Меє Нів Сбіц Аїа Тез Нів Ап Агуд Рбе ТіПг сіп 355 360 365
Туз бек Пец бек Геч Бек Рго біу Гуз 370 375 «2105 30
Зо «2115 327 «2125 РЕТ «213» Ното 5арієпь «4005 30
Аа Бек ТПг Ппув біу Рго бек Уаі Рре Рго Гей Аза Рго Суб б5ег Агд 1 5 10 15
Бек ТПг Бек біп бек Тйг Аза Аза Гей сіу Суб Геч Уа1ї Гпу5 АБр Туг 20 25 Зо
Рпе Ркго сії Рко УМаі! ТіБг Уаї бек Тер Авп бек сіу Аїа Геї ТПг 5ег 35 40 45 сіу Ма1 Нів Трпг Рре Рго Аза Маї Із Сіп бБег бек Сіу Іеч Туг бЗег 5о0 ів) бо
Теч бек бек Уа1і Уа1 ТПг Уа1ї Ркго бек бек бек Ге біу ТПг Ппуб5 Тс 65 70 75 80
Тук ТК Суб АвБп о Уаії Авр о Нібв пуб Рго Бек АБп ТЕ Туз Уаії Авр Був 85 90 95
Агуд Уа1і сій Бек Ппув Тук біу Рго Рго Суб Рго бек Суб Рго Аїа Рго 100 105 110 біч Рпе Гей сіу сіу Рго Бек Маі Рбе Теч Робе Рго Рго ПуБ Рго Пув 115 120 125
Авр ТіПг Геч Меє І1е бБег Аку Тпг Рго сі Уа1ї Тпг Сув Ма1ї Уа1ї Уаї 130 135 140
Авр Уа1і Бек біп сії АБр Рго біч Уаі біп Рпе Абзп Тер Тугє Уа1ї АБр 145 150 155 160 біу Уаі біц Уаі Нів А5п Аза Пуб5 ТП Гуз Рго Акуд бі бі біп Рбе 165 170 175
АБпобБек ТПг Туг Аку Уаії Уаї бек Уаі Гей ТпПг Уаії Гечш Нібв сіп Ар 180 185 190
Тер Геч АБп о біу Гуз біч Тук пуб Суб пуб Ма1ї бек АБп ТУувз біу Гец 195 200 205 60 Рго бБег бек І1е біц Ппув ТиЬг І1е бег Пув Аїа Ппув С1у Сіп Рго Агд 210 215 220 біч Рко біп Уа! Тук Тбг Геї Рго Рго бек біп біц бі Меє ТПг Гув 225 230 235 240
Авп обіп Уа1і Бек Геч ТПг Сув Теч Уаі Ппув сіу Рпе Туг Рго 5ег АБр 65 245 250 255
Іїе Аїа Уаі1і сії Тер біч бек АвБп біу біп Рго бі АБп АБп Тук Гуз 260 265 270
ТПг ТБ Ркго Рго Уа! ІГец Авр бек Авр сіу Бек Роре Рібе Іеч Туг 5бег
275 280 285
Агуд Геч Тбг Уаї АБр Гув5 бек Агу Тер біп бі сб1іу Абп Уа1ї Рое б5ег 290 295 300
Сув бек Уаії Меє Нів сії Аїа Геч Ніб АвБп Нів Туг ТПг біп пуб бБег 305 310 315 320
Теч бек Гей бек Геч с1іу Гуз 325 «2105 31 «2115 226 «2125 РВТ «213» Ното 5арієпь «2205 «221» ІНША ОЗНАКА «222» (131)..(131) «223» Х-Е або р «2205 «221» ІНША ОЗНАКА «222» (133)..(133) «223» Х-М або І «220» «221» ІНША ОЗНАКА «222» (136)..(136) «223» Хаа може являти собою будь-яку амінокислоту, що зустрічається в природі «2205 «221» ІНША ОЗНАКА «222» (138)..(138) «223» Хаа може являти собою будь-яку амінокислоту, що зустрічається в природі «4005 31
Авр пуб ТПЕ Ні ТБ о Сув Ргро Рго Суб Рго Аїа Рго січ Іеч Іеєч С1Уу 1 5 10 15 біу Ркго бек Уаі Рпе Геч Робе Рго Рго Гу5з Рго Губ Авр ТПг Геч Меє 20 25 Зо
І1їе Бек Аку ТП Рко біч Уа! ТБг Суб Уа1і! Уа1і Уа1і АБр Уаї бек Нів 35 сі Авр Рго біц УМа1ї ПЦув Рбре Авп Тгр Туг Ма1і Авр Сіу Ма1 січ Уаї 5о0 ів) бо
Нів АБп Азїа Гуз Тпг пуб Рго Агуд бій бій біп Тук АБп бек Тс Тусг 65 70 75 80
Агуд Уа1ї Уа1ї Бек Маії Іеч ТБг Уаії Гей Ніб сіп Абвр Тер Геї АБп б1Уу 40 85 90 95
Туз бічЧ Тук Ппув Сув пуб Уа1і Бек АБп Гуз Аза Те Рго Аїа Рго Те 100 105 110 біч пувз Тбг Іїе Бек Ппув Аїа Гуз біу біп Рго Акуд бій Рго сіп Уаї 115 120 125 45 Тук Тпг Гей Рго Рго бек Агу Хаа бі Хаа ТБПг Ппуз АБп біп Уа1ї 5ег 130 135 140
Теч ТП Суб Пец Уа1ї Ппув сіу Роре Тук Рго бек АвБр Іїе Аїа Уа1ї сій 145 150 155 160
Тер бі бек АБп біу біп Рго бій Абп Аб5п Туг Пуб5 Тс Тс Рго Рго 165 170 175
Уаї Іеч Авр бек Авр бсіу бек Рпе Ррбе Геч Тук бек їув Геч ТіПг Уаї 180 185 190
Авр ПувБ Бек Агуд Тер біп біп біу АбБп Уаі Рре бек Суб Бек МУаі1! Меє 195 200 205
Нів біц Аїа Тез Нів Авп Нів Тугє ТПг біп Пув бек Теч бег Ієч бег 210 215 220
Рго б1У 225 «2105 32 (516) «2115 226 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» варіант людської Ес-ділянки ізотипу Ідбі із западиною 65 «4005 32
Авр пуб ТПЕ Ні ТБ о Сув Ргро Рго Суб Рго Аїа Рго січ Іеч Іеєч С1Уу 1 5 10 15 біу Ркго бек Уаі Рпе Геч Робе Рго Рго Гу5з Рго Губ Авр ТПг Геч Меє
20 25 Зо
І1їе Бек Аку ТП Рко біч Уа! ТБг Суб Уа1і! Уа1і Уа1і АБр Уаї бек Нів 35 40 45 біч Авр Ркго біц Уа1і Ппубв Роре АБп Тр Туг Уаі Авр сіу Уа1і січ МУаї 50 55 бо
Нів АБп Азїа Гуз Тпг пуб Рго Агуд бій бій біп Тук АБп бек Тс Тусг 65 70 75 80
Агуд Уа1ї Уа1ї Бек Маії Іеч ТБг Уаії Гей Ніб сіп Абвр Тер Геї АБп б1Уу 85 90 95 цпув бій Тук Ппув Сув Ппуз Маії бек АБп Гуз Аїа ІТеч Рго Аїа Рго І1е 100 105 110 біч пувз Тбг Іїе Бек Ппув Аїа Гуз біу біп Рго Акуд бій Рго сіп Уаї 115 120 125
Тук ТП Гей Рго Рго бек Агуд Авр бі Геї Тс Гуз АБп о біп Уаї 5бег 130 135 140
Теч бек Сув Аїа Уа1і Ппув сіу Роре Тук Рго бек АвБр Іїе Аїа Уа1ї сій 145 150 155 160
Тер бі бек АБп біу біп Рго бій Абп Аб5п Туг Пуб5 Тс Тс Рго Рго 165 170 175
Уаї їеч Авр бег Авр Сіу бБег Рре Ріе Іеч Маї бек ПЦув їеч ТіПг Уаї 180 185 190
Авр ПувБ Бек Агуд Тер біп біп біу АбБп Уаі Рре бек Суб Бек МУаі1! Меє 195 200 205
Нів сі Аза Іеч Нів АвБп Ніб Тук ТПг сіп Ппув бек ІГеч бег Іеч бег 210 215 220
Рго б1У 225 «2105 33 «2115 226
Зо «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» варіант людської Ес-ділянки ізотипу Ідбі з виступом «4005 33
АБвр Ппув ТБг Нів ТВг о Сув Рго Рго Сув Рго Азїа Рго бій Геч Ге Сс1У 1 5 10 15 біу Ркго бек Уаі Рпе Геч Робе Рго Рго Гу5з Рго Губ Авр ТПг Геч Меє 20 25 Зо
І1їе Бек Аку ТП Рко біч Уа! ТБг Суб Уа1і! Уа1і Уа1і АБр Уаї бек Нів 35 40 45 біч Авр Ркго біц Уа1і Ппубв Роре АБп Тр Туг Уаі Авр сіу Уа1і січ МУаї 5о0 ів) бо
Нів АБп Азїа Гуз Тпг пуб Рго Агуд бій бій біп Тук АБп бек Тс Тусг 65 70 75 80
Агуд Ма1 Уаї бек Уаї Гечп ТЬг Уаї їеч Нів Сіп Ар Тер Іеч АБп С1У 85 90 95
Туз бічЧ Тук Ппув Сув пуб Уа1і Бек АБп Гуз Аза Те Рго Аїа Рго Те 100 105 110 біч пувз Тбг Іїе Бек Ппув Аїа Гуз біу біп Рго Акуд бій Рго сіп Уаї 115 120 125
Тук ТП Гей Рго Рго бек Агуд Авр бі Геї Тс Гуз АБп о біп Уаї 5бег 130 135 140
Теч Тер Суб Геч Уа1ї Ппув сіу Роре Тук Рго бек АвБр Іїе Аїа Уа1ї сій 145 150 155 160
Тгр бій бек Авп біу біп Рго бій Авп АвБп Тук Ппуз ТБг Тс Рго Рего 165 170 175
Уаї Іеч Авр бек Авр бсіу бек Рпе Ррбе Геч Тук бек їув Геч ТіПг Уаї 180 185 190
Авр ПувБ Бек Агуд Тер біп біп біу АбБп Уаі Рре бек Суб Бек МУаі1! Меє 60 195 200 205
Нів сі Аза Іеч Нів АвБп Ніб Тук ТПг сіп Ппув бек ІГеч бег Іеч бег 210 215 220
Рго б1У 225 65 «2105 34 «2115 226 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність
«223» варіант людської Ес-ділянки ізотипу Ідбі з мутаціями 1234А, 1235А «4005 34
АБвр Ппув ТБг Нів ТБг о Сув Рго Рго Сув Рго Аза Рго біцш Аїа Аза с1У 1 5 10 15 біу Ркго бек Уаі Рпе Геч Робе Рго Рго Гу5з Рго Губ Авр ТПг Геч Меє 20 25 Зо
І1їе Бек Аку ТП Рко біч Уа! ТБг Суб Уа1і! Уа1і Уа1і АБр Уаї бек Нів 35 40 45 біч Авр Ркго біц Уа1і Ппубв Роре АБп Тр Туг Уаі Авр сіу Уа1і січ МУаї 5о0 ів) бо
Нів АБп Азїа Гуз Тпг пуб Рго Агуд бій бій біп Тук АБп бек Тс Тусг 65 70 75 80
Агуд Ма1 Уаї бек Уаї Гечп ТЬг Уаї їеч Нів Сіп Ар Тер Іеч АБп С1У 85 90 95
Туз бічЧ Тук Ппув Сув пуб Уа1і Бек АБп Гуз Аза Те Рго Аїа Рго Те 100 105 110 біч пувз Тбг Іїе Бек Ппув Аїа Гуз біу біп Рго Акуд бій Рго сіп Уаї 115 120 125
Тук ТП Гей Рго Рго бек Агуд Авр бі Геї Тс Гуз АБп о біп Уаї 5бег 130 135 140
Теч ТП Суб Пец Уа1ї Ппув сіу Роре Тук Рго бек АвБр Іїе Аїа Уа1ї сій 145 150 155 160
Тгр бій бек Авп біу біп Рго бій Авп АвБп Тук Ппуз ТБг Тс Рго Рего 165 170 175
Уаї Іеч Авр бек Авр бсіу бек Рпе Ррбе Геч Тук бек їув Геч ТіПг Уаї 180 185 190
Авр ПувБ Бек Агуд Тер біп біп біу АбБп Уаі Рре бек Суб Бек МУаі1! Меє 195 200 205
Нів сі Аза Іеч Нів АвБп Ніб Тук ТПг сіп Ппув бек ІГеч бег Іеч бег 210 215 220
Рго б1У 225 «2105 35 «2115 226 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» варіант людської Ес-ділянки ізотипу Ідб1і з мутацією І1234А, І1235А і западиною «4005 35
Авр пуб ТПЕ Ні ТБ Суб Ргро Рго Суб5 Рго Аіїа Рго сії Аза Аза с1Уу 1 5 10 15 б1іу Рго бек Маії Робе Гей Робе Рго Рго Пув Рго Пув Авр ТПг ТГеч Меє 20 25 Зо
І1їе Бек Аку ТП Рко біч Уа! ТБг Суб Уа1і! Уа1і Уа1і АБр Уаї бек Нів 35 40 45 біч Авр Ркго біц Уа1і Ппубв Роре АБп Тр Туг Уаі Авр сіу Уа1і січ МУаї 50 55 бо
Нів АБп Азїа Гуз Тпг пуб Рго Агуд бій бій біп Тук АБп бек Тс Тусг 65 70 75 80
Агуд Уа1ї Уа1ї Бек Маії Іеч ТБг Уаії Гей Ніб сіп Абвр Тер Геї АБп б1Уу 85 90 95 цпув бій Тук Ппув Сув Ппуз Маії бек АБп Гуз Аїа ІТеч Рго Аїа Рго І1е 100 105 110 біч пувз Тбг Іїе Бек Ппув Аїа Гуз біу біп Рго Акуд бій Рго сіп Уаї 115 120 125
Тук ТП Гей Рго Рго бек Агуд Авр бі Геї Тс Гуз АБп о біп Уаї 5бег 60 130 135 140
Теч бек Сув Аїа Уа1і Ппув сіу Роре Тук Рго бек АвБр Іїе Аїа Уа1ї сій 145 150 155 160
Тер бі бек АБп біу біп Рго бій Абп Аб5п Туг Пуб5 Тс Тс Рго Рго 165 170 175 65 Уаї їеч Авр бег Авр Сіу бБег Рре Ріе Іеч Маї бек ПЦув їеч ТіПг Уаї 180 185 190
Авр ПувБ Бек Агуд Тер біп біп біу АбБп Уаі Рре бек Суб Бек МУаі1! Меє 195 200 205
Нів сі Аза Іеч Нів АвБп Ніб Тук ТПг сіп Ппув бек ІГеч бег Іеч бег 210 215 220
Рго б1У 225 «2105 36 «2115 226 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» варіант людської Ес-ділянки ізотипу Ідсі з І1234А, І235А і виступом «4005 36
Авр пуб ТПЕ Ні ТБ Суб Ргро Рго Суб5 Рго Аіїа Рго сії Аза Аза с1Уу 1 5 10 15 б1іу Рго бек Маії Робе Гей Робе Рго Рго Пув Рго Пув Авр ТПг ТГеч Меє
Зо
І1їе Бек Аку ТП Рко біч Уа! ТБг Суб Уа1і! Уа1і Уа1і АБр Уаї бек Нів 35 40 45 біч Авр Ркго біц Уа1і Ппубв Роре АБп Тр Туг Уаі Авр сіу Уа1і січ МУаї 20 50 55 бо
Нів АБп Азїа Гуз Тпг пуб Рго Агуд бій бій біп Тук АБп бек Тс Тусг 65 70 75 80
Агуд Уа1ї Уа1ї Бек Маії Іеч ТБг Уаії Гей Ніб сіп Абвр Тер Геї АБп б1Уу 85 90 95 25 цпув бій Тук Ппув Сув Ппуз Маії бек АБп Гуз Аїа ІТеч Рго Аїа Рго І1е 100 105 110 біч пувз Тбг Іїе Бек Ппув Аїа Гуз біу біп Рго Акуд бій Рго сіп Уаї 115 120 125
Тук ТП Гей Рго Рго бек Агуд Авр бі Геї Тс Гуз АБп о біп Уаї 5бег 130 135 140
Теч Тер Суб Геч Уа1ї Ппув сіу Роре Тук Рго бек АвБр Іїе Аїа Уа1ї сій 145 150 155 160
Тер бі бек АБп біу біп Рго бій Абп Аб5п Туг Пуб5 Тс Тс Рго Рго 165 170 175
Уаії ІГечп Авр бек Авр біу бек Рібе Рібе Гей Туг бек Гув Теч ТПг Уаї 180 185 190
Авр ПувБ Бек Агуд Тер біп біп біу АбБп Уаі Рре бек Суб Бек МУаі1! Меє 195 200 205
Нів сі Аза Іеч Нів АвБп Ніб Тук ТПг сіп Ппув бек ІГеч бег Іеч бег 210 215 220
Рго б1У 225 «2105 37 «2115 226 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» варіант людської Ес-ділянки ізотипу Ідб1і з мутацією І1234А, І1235А і РЗ296 «4005 37
Авр пуб ТПЕ Ні ТБ Суб Ргро Рго Суб5 Рго Аіїа Рго сії Аза Аза с1Уу 1 5 10 15 біу Ркго бек Уаі Рпе Геч Робе Рго Рго Гу5з Рго Губ Авр ТПг Геч Меє 20 25 Зо
І1е бБег Аку Тбг Рго сі Уа1і Тпг Суб Уаї Уаї Уаї Авр Уа1і бек Нів 35 40 45 біч Авр Ркго біц Уа1і Ппубв Роре АБп Тр Туг Уаі Авр сіу Уа1і січ МУаї 5о0 ів) бо
Нів АБп Азїа Гуз Тпг пуб Рго Агуд бій бій біп Тук АБп бек Тс Тусг 60 65 7о 75 80
Агуд Уа1ї Уа1ї Бек Маії Іеч ТБг Уаії Гей Ніб сіп Абвр Тер Геї АБп б1Уу 85 90 95
Туз бічЧ Тук Ппув Сув пуб Уа1і Бек АБп Гуз Аза Іеп сіу Аїа Рго Ше 100 105 110 65 сій Пув Тпс І1їе бек ПЦув Аїа Ппув Сбіу біп Рго Акуд Сіц Рго Сіп Уаї 115 120 125
Тук ТП Гей Рго Рго бек Агуд Авр бі Геї Тс Гуз АБп о біп Уаї 5бег 130 135 140
Теч ТП Суб Пец Уа1ї Ппув сіу Роре Тук Рго бек АвБр Іїе Аїа Уа1ї сій 145 150 155 160
Тер бі бек АБп біу біп Рго бій Абп Аб5п Туг Пуб5 Тс Тс Рго Рго 165 170 175
Уаії ІГечп Авр бек Авр біу бек Рібе Рібе Гей Туг бек Гув Теч ТПг Уаї 180 185 190
Авр ПувБ Бек Агуд Тер біп біп біу АбБп Уаі Рре бек Суб Бек МУаі1! Меє 195 200 205
Нів сі Аза Іеч Нів АвБп Ніб Тук ТПг сіп Ппув бек ІГеч бег Іеч бег 210 215 220
Рго б1У 225 «2105 38 «2115 226 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» варіант людської Ес-ділянки ізотипу Ідс1і з мутацією І1234А, І1235А,
РЗ329б і западиною «4005 38
Авр пуб ТПЕ Ні ТБ Суб Ргро Рго Суб5 Рго Аіїа Рго сії Аза Аза с1Уу 1 5 10 15 біу Ркго бек Уаі Рпе Геч Робе Рго Рго Гу5з Рго Губ Авр ТПг Геч Меє 20 25 Зо
І1е бБег Аку Тбг Рго сі Уа1і Тпг Суб Уаї Уаї Уаї Авр Уа1і бек Нів 35 40 45 біч Авр Ркго біц Уа1і Ппубв Роре АБп Тр Туг Уаі Авр сіу Уа1і січ МУаї 5о0 ів) бо
Нів АБп Азїа Гуз Тпг пуб Рго Агуд бій бій біп Тук АБп бек Тс Тусг 65 7о 75 80
Агуд Уа1ї Уа1ї Бек Маії Іеч ТБг Уаії Гей Ніб сіп Абвр Тер Геї АБп б1Уу 85 90 95
Туз бічЧ Тук Ппув Сув пуб Уа1і Бек АБп Гуз Аза Іеп сіу Аїа Рго Ше 100 105 110 сій Пув Тпс І1їе бек ПЦув Аїа Ппув Сбіу біп Рго Акуд Сіц Рго Сіп Уаї 115 120 125
Тук ТП Гей Рго Рго бек Агуд Авр бі Геї Тс Гуз АБп о біп Уаї 5бег 130 135 140
Теч бек Сув Аїа Уа1і Ппув сіу Роре Тук Рго бек АвБр Іїе Аїа Уа1ї сій 145 150 155 160
Тер бі бек АБп біу біп Рго бій Абп Аб5п Туг Пуб5 Тс Тс Рго Рго 165 170 175
Уаї Іеч Авр бек Авр бсіу бек Рпе Ррбе Геч Уаі! бек їув Геч ТПг Уаї 180 185 190
Авр Пув бег Агуд Тер біп Сіп С1іу Авп Маї Ре бЗег Сув бег Уа1 Меб 195 200 205
Нів сі Аза Іеч Нів АвБп Ніб Тук ТПг сіп Ппув бек ІГеч бег Іеч бег 210 215 220
Рго б1У 225 «2105 39 «2115 226 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» варіант людської Ес-ділянки ізотипу Ідс1і з мутацією І1234А, І1235А,
РЗ29б і виступом «4005 39
Авр пуб ТПЕ Ні ТБ Суб Ргро Рго Суб5 Рго Аіїа Рго сії Аза Аза с1Уу 60 1 5 10 15 біу Ркго бек Уаі Рпе Геч Робе Рго Рго Гу5з Рго Губ Авр ТПг Геч Меє 20 25 Зо
І1їе Бек Аку ТП Рко біч Уа! ТБг Суб Уа1і! Уа1і Уа1і АБр Уаї бек Нів 35 40 45 65 сі Авр Рго біц УМа1ї ПЦув Рбре Авп Тгр Туг Ма1і Авр Сіу Ма1 січ Уаї 5о0 ів) бо
Нів АБп Азїа Гуз Тпг пуб Рго Агуд бій бій біп Тук АБп бек Тс Тусг 65 70 75 80
Агуд Уа1ї Уа1ї Бек Маії Іеч ТБг Уаії Гей Ніб сіп Абвр Тер Геї АБп б1Уу 85 90 95
Туз бічЧ Тук Ппув Сув пуб Уа1і Бек АБп Гуз Аза Іеп сіу Аїа Рго Ше 100 105 110 біц пуз Тс І1їе бек Ппуз Аїа Ппув біу біп Рго Аку бій Рго біп Уаї 115 120 125
Тук ТП Гей Рго Рго бек Агуд Авр бі Геї Тс Гуз АБп о біп Уаї 5бег 130 135 140
Теч Тер Суб Геч Уа1ї Ппув сіу Роре Тук Рго бек АвБр Іїе Аїа Уа1ї сій 145 150 155 160
Тер бі бек АБп біу біп Рго бій Абп Аб5п Туг Пуб5 Тс Тс Рго Рго 165 170 175
Уаї Іеч Авр бек Авр бсіу бек Рпе Ррбе Геч Тук бек їув Геч ТіПг Уаї 180 185 190
Авр Пув бег Агуд Тер біп Сіп С1іу Авп Маї Ре бЗег Сув бег Уа1 Меб 195 200 205
Нів сі Аза Іеч Нів АвБп Ніб Тук ТПг сіп Ппув бек ІГеч бег Іеч бег 210 215 220
Рго б1У 225 «2105 40 «2115 221 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» варіант людської Ес-ділянки підкласу Ідбі з мутаціями 1234А, 1235А, РЗ29с, У349С, Т3665, ІЗ6ВА 1 У407У «4005 40
Сув Рго Рго Суб Рго Аза Рго сії Аза Аза Сбіу біу Ркго бек Уа1і Роіе
Зо 1 5 10 15
Теч Ріпе Рго Рго ПувБ Рго Пув АБр ТПг ІТечп Месє І1е бег Агу ТпПг Рго 20 25 Зо біч Уаії ТрпЕ Суб Уа1і Уаї Маїії АБр Уаї бек Ніб біц Авр Рго січ Уаї 35 Пув Рпе Авп Тгр Туг УМаі1і Авр сіу Уаі Сіц Ма1ї Нів АБп Аїа ГПув Тис 5о0 ів) бо
Туз Рго Акд бій бій біп Тук АБп бек Тйг Туг Акуд Уа1і Уаі1і Бек Уаї 65 70 75 80
Теч Тпг Уаії Гей Нів сіп АБр Тгр Іеч АБп біу Ппув бі Тук Пув Сув 40 85 90 95
Туз Уаії бек Авп пуб Аза Геї сіу Азїа Рго Іїе біц пуб ТПг Іе бБег 100 105 110
Туз Аїа Ппуз сіу біп Рго Акуд бій Рго біп Уаі! Суб Трг Гей Рго Рго 115 120 125 45 век Агу АБр бій Теч ТПг Гпув Авп біп Уаї бек Ге бек Суз Аїа Уаї 130 135 140
Туз біу Рпе Тук Рго Бек АБр І1ї1е Аїа Уа! бі Тер бій бек Ап с1Уу 145 150 155 160 біп Рго біц Авп Ап Туг Пув Тс ТБ Ргро Рго Уаі Гей Авр бек Авр 165 170 175 біу бек Рпе Рпе Гей Уа1ї! Бек Пуб5 Геї ТБг Уаії Авр Пубз бег Агуд Тгр 180 185 190 біп біп біу Авп Уа1і Роре бек Суб5 бек Уа! Меєсє Ніб5 сій Аза Геч Нів 195 200 205
АБп о Нів Туг Тип біп ГПув бек їеч бБег Теч бек Рго С1У 210 215 220 «2105 41 «2115 221 «2125 РЕТ 10) «213» Штучна послідовність «2205 «223» варіант людської Ес-ділянки підкласу Ідбі з І234А, І235А,
РЗ29б і 5354С, ТЗ66 «4005 41 65 Сув Рго Рго Сув Рго Аїа Рго сіц Аїа Азїа сіу СсС1іу Рго Бек Уаї Ре 1 5 10 15
Теч Ріпе Рго Рго ПувБ Рго Пув АБр ТПг ІТечп Месє І1е бег Агу ТпПг Рго 20 25 Зо біч Уаії ТрпЕ Суб Уа1і Уаї Маїії АБр Уаї бек Ніб біц Авр Рго січ Уаї 35 40 45
Туз Рпе Авп Тер Тук Уаі АБр сіу Маі біч Уаії Ні5 АвБп Аза Пуб5 ТПг 5о0 ів) бо
Пцув Рго Агу бій бій біп Туг Авп о бег ТПг Туг Агкуд Уа1ї Уа1ії бек Уаї 65 70 75 80
Теч Тпг Уаії Гей Нів сіп АБр Тгр Іеч АБп біу Ппув бі Тук Пув Сув 85 90 95
Туз Уаії бек Авп пуб Аза Геї сіу Азїа Рго Іїе біц пуб ТПг Іе бБег 100 105 110
Туз Аїа Ппуз сіу біп Рго Акуд бій Рго біп Уа! Тугє Трг Гей Рго Рго 115 120 125
Сув Акуд Авр бій Геч Тс Ппув АБп обіп Уа! бек Гецп Тер Сув Геч Уаї 130 135 140 пув біу Рпе Туг Рго бек Авр І1ї1е Аїа Уаї бі Тер Січ бег Авп С1Уу 145 150 155 160 біп Рго біц Авп Ап Туг Пув Тс ТБ Ргро Рго Уаі Гей Авр бек Авр 165 170 175 біу бек Рпе Рпе Гей Тугк Бек Пув Геї ТПг Уаі! Авр Пубз бег Агуд Тгр 180 185 190 біп біп біу Авп Уа1і Роре бек Суб5 бек Уа! Меєсє Ніб5 сій Аза Геч Нів 195 200 205
АвБп о Нів Туг Тс біп Гуз бек Те бек Гец бек Рго с1Уу 210 215 220 «2105 42 «2115 221 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 0) «223» варіант людської Ес-ділянки підкласу Ідбі з мутацією І1234А, 1235А,
РЗ29б і 5354, Т3665, ІЗ6бВА і У407У «4005 42
Сув Рго Рго Суб Рго Аза Рго сії Аза Аза Сбіу біу Ркго бек Уа1і Роіе 1 5 10 15
Пес Рпе Рго Рго Пувз Рго Ппувз АБр ТПг Гей Меє І1їе б5ег Агуд ТіПг Рго 20 25 Зо біч Уаії ТрпЕ Суб Уа1і Уаї Маїії АБр Уаї бек Ніб біц Авр Рго січ Уаї 35 40 45
Туз Рпе Авп Тер Тук Уаі АБр сіу Маі біч Уаії Ні5 АвБп Аза Пуб5 ТПг 50 55 бо
Туз Рго Акд бій бій біп Тук АБп бек Тйг Туг Акуд Уа1і Уаі1і Бек Уаї 65 70 75 80
Теч Тпг Уаії Гей Нів сіп АБр Тгр Іеч АБп біу Ппув бі Тук Пув Сув 85 90 95
Пув Ма1і бек Авп Пув Аїа Іеч сСіу Аза Рго Іїе Сі Пув ТПг І1е 5ег 100 105 110
Туз Аїа Ппуз сіу біп Рго Акуд бій Рго біп Уа! Тугє Трг Гей Рго Рго 115 120 125
Сув Акуд Авр бій Геч Тс Ппув АБп обіп Уаі! бек Гей бек Суб Аїа Уаї 130 135 140
Туз біу Рпе Тук Рго Бек АБр І1ї1е Аїа Уа! бі Тер бій бек Ап с1Уу 145 150 155 160 біп Рго біц Авп Ап Туг Пув Тс ТБ Ргро Рго Уаі Гей Авр бек Авр 165 170 175 біу бек Рпе Робе Гей УМаї бек Ппув Гей ТПг Уаі Авр Пув бег Агу Тгр 180 185 190 біп біп біу Авп Уа1і Роре бек Суб5 бек Уа! Меєсє Ніб5 сій Аза Геч Нів 195 200 205
АвБп о Нів Туг Тс біп Гуз бек Те бек Гец бек Рго с1Уу 60 210 215 220 «2105 43 «2115 221 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність 65 «220» «223» варіант людської Ес-ділянки підкласу Ідбі з мутацією І1234А, 1235А,
РЗ29б і У349с, ТЗ6б «4005 43
Сув Рго Рго Суб Рго Аза Рго сії Аза Аза Сбіу біу Ркго бек Уа1і Роіе 1 5 10 15
Теч Ріпе Рго Рго ПувБ Рго Пув АБр ТПг ІТечп Месє І1е бег Агу ТпПг Рго 20 25 Зо бі Маї Тпг Суз Уаї Маії Уаії Авр Уа1і бек Нів бій Авр Рго бі Уаї 35 40 45
Туз Рпе Авп Тер Тук Уаі АБр сіу Маі біч Уаії Ні5 АвБп Аза Пуб5 ТПг 5о0 ів) бо
Туз Рго Акд бій бій біп Тук АБп бек Тйг Туг Акуд Уа1і Уаі1і Бек Уаї 65 7о 75 80
Теч Тпг Уаії Гей Нів сіп АБр Тгр Іеч АБп біу Ппув бі Тук Пув Сув 85 90 95
Туз Уаії бек Авп пуб Аза Геї сіу Азїа Рго Іїе біц пуб ТПг Іе бБег 100 105 110 пув Аїа Пув біу Сіп Рго Агд бій Рго Сіп Ма1! Сув Тіг Іеч Рго Ркго 115 120 125 век Акуд АБр бічш Теч ТБг губ Авп обіп Уа! Бек Геї Ткгр Су5 Іеч Уаї 130 135 140
Туз біу Рпе Тук Рго Бек АБр І1ї1е Аїа Уа! бі Тер бій бек Ап с1Уу 145 150 155 160 біп Рго біц Авп Ап Туг Пув Тс ТБ Ргро Рго Уаі Гей Авр бек Авр 165 170 175 біу бек Рпе Рпе Гей Тугк Бек Пув Геї ТПг Уаі! Авр Пубз бег Агуд Тгр 180 185 190 сіп біп б1у Авп Уаі1і Рібе бБег Сув бек Уа1ї Меє Нів Січ Аїа Ієч Нів 195 200 205
АвБп о Нів Туг Тс біп Гуз бек Те бек Гец бек Рго с1Уу 210 215 220 «2105 144
Зо «2115 221 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» варіант людської Ес-ділянки підкласу Ідсіз мутаціями
І25ЗА, НЗІОА і НАЗ5А «4005 44
Сув Рго Рго Суб Рго Аза Рго сії Іеч Іеч Сбіу біу Ркго бек Уа1і Роіе 1 5 10 15
Теч Рпе Рго Рго ПувБ Рго Пув АБр ТПг ІТеп Мес Аза бег Агу ТпПг Рго 20 25 Зо біч Уаії ТрпЕ Суб Уа1і Уаї Маїії АБр Уаї бек Ніб біц Авр Рго січ Уаї 35 40 45
Туз Рпе Авп Тер Тук Уаі АБр сіу Маі біч Уаії Ні5 АвБп Аза Пуб5 ТПг 5о0 ів) бо
Пув Рго Агд бі сії Сбіп Туг Авп бЗегє ТПг Туг Аку Уа1ї Ма1ї бег Уаї 65 70 75 80
Теч Тс Уаії Ге Аза сіп АБр Тгр Іеч АБп о біу Ппув бі Тук Пув Сув 85 90 95
Туз Уаії бек Авп пуб Аїа Геї Рго Аїа Рго Іїе біц пуб ТПг Іе бБег 100 105 110
Туз Аїа Ппуз сіу біп Рго Акуд бій Рго біп Уа! Тугє Трг Гей Рго Рго 115 120 125 век Акуд АБр бічш Теч ТБг губ Авп обіп Уа! Бек Геї ТПг Су5 Іеч Уаї 130 135 140 пув біу Рпе Туг Рго бек Авр І1ї1е Аїа Уаї бі Тер Січ бег Авп С1Уу 145 150 155 160 біп Рго біц Авп Ап Туг Пув Тс ТБ Ргро Рго Уаі Гей Авр бек Авр 165 170 175 біу бек Рпе Рпе Гей Тугк Бек Пув Геї ТПг Уаі! Авр Пубз бег Агуд Тгр (516) 180 185 190 біп біп біу Авп Уа1і Роре бек Суб5 бек Уа! Меєсє Ніб5 сій Аза Геч Нів 195 200 205
АБп Аза Тугк ТПг біп Гуз бек Те бек Гец бек Рго с1Уу 210 215 220 65 «2105» 45 «2115 221 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність
«223» варіант людської Ес-ділянки підкласу Ідбі з мутаціями
НЗІ1ІОА, НАЗЗА ії У4З36А «4005 45
Сув Рго Рго Сув Рго Аїа Рго бій Гей Гей сбіу біу Рго бек Уаі1! Рре 1 5 10 15
Теч Ріпе Рго Рго ПувБ Рго Пув АБр ТПг ІТечп Месє І1е бег Агу ТпПг Рго 20 25 Зо біч Уаії ТрпЕ Суб Уа1і Уаї Маїії АБр Уаї бек Ніб біц Авр Рго січ Уаї 35 40 45
Туз Рпе Авп Тер Тук Уаі АБр сіу Маі біч Уаії Ні5 АвБп Аза Пуб5 ТПг 5о0 ів) бо
Туз Рго Акд бій бій біп Тук АБп бек Тйг Туг Акуд Уа1і Уаі1і Бек Уаї 65 70 75 80
Пес Тпг Уаї Геп Аїа сіп Авр Тгср Гей АвБп біу Пув бій Тугк Ппув Сув 85 90 95
Туз Уаії бек Авп пуб Аїа Геї Рго Аїа Рго Іїе біц пуб ТПг Іе бБег 100 105 110
Туз Аїа Ппуз сіу біп Рго Акуд бій Рго біп Уа! Тугє Трг Гей Рго Рго 115 120 125 век Акуд АБр бічш Теч ТБг губ Авп обіп Уа! Бек Геї ТПг Су5 Іеч Уаї 130 135 140
Туз біу Рпе Тук Рго Бек АБр І1ї1е Аїа Уа! бі Тер бій бек Ап с1Уу 145 150 155 160 біп Рго бій Авп Авп Тук Ппуз ТБг ТБг Ргсо Рго Уа! Іечй Авзр 5ег Авр 165 170 175 біу бек Рпе Рпе Гей Тугк Бек Пув Геї ТПг Уаі! Авр Пубз бег Агуд Тгр 180 185 190 біп біп біу Авп Уа1! Рре бБег Субв бек Ма! Меєсє Ні5 сбіц Аза Геч Аза 195 200 205
АБп о Нів Аза ТПг о біп Гуз бек ІТец бек Гец бек Рго с1Уу 210 215 220 «2105 46 «2115 221 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» варіант людської Ес-ділянки підкласу Ідбі з мутаціями
М252У, 5254Т і Т256Е «4005 46
Сув Рго Рго Суб Рго Аза Рго сії Іеч Іеч Сбіу біу Ркго бек Уа1і Роіе 1 5 10 15
Теч Рпе Рго Рго ПувБ Рго Пув АБр ТПг Іечп Туг І1е Трг Агдуд бій Рего 20 25 Зо сій Уаї1ї Тпс Сув УМа1ї Уаї Ма1 Авр Уаї бек Нів Сі Авр Рго січ Уаї 35 40 45
Туз Рпе Авп Тер Тук Уаі АБр сіу Маі біч Уаії Ні5 АвБп Аза Пуб5 ТПг 5о0 ів) бо
Туз Рго Акд бій бій біп Тук АБп бек Тйг Туг Акуд Уа1і Уаі1і Бек Уаї 65 7о 75 80
Теч Тпг Уаії Гей Нів сіп АБр Тгр Іеч АБп біу Ппув бі Тук Пув Сув 85 90 95
Туз Уаії бек Авп пуб Аїа Геї Рго Аїа Рго Іїе біц пуб ТПг Іе бБег 100 105 110 пув Аїа Пув біу Сіп Рго Агд бій Рго Сіп Ма1! Тує Тбг Іеч Рго Ркго 115 120 125 век Акуд АБр бічш Теч ТБг губ Авп обіп Уа! Бек Геї ТПг Су5 Іеч Уаї 130 135 140
Туз біу Рпе Тук Рго Бек АБр І1ї1е Аїа Уа! бі Тер бій бек Ап с1Уу 60 145 150 155 160 біп Рго біц Авп Ап Туг Пув Тс ТБ Ргро Рго Уаі Гей Авр бек Авр 165 170 175 біу бек Рпе Рпе Гей Тугк Бек Пув Геї ТПг Уаі! Авр Пубз бег Агуд Тгр 180 185 190 65 сіп біп б1у Авп Уаі1і Рібе бБег Сув бек Уа1ї Меє Нів Січ Аїа Ієч Нів 195 200 205
АвБп о Нів Туг Тс біп Гуз бек Те бек Гец бек Рго с1Уу 210 215 220
«2105 47 «2115 228 «2125 РЕТ «213» Ното 5арієпь «4005 47 біч бек Ппув Тук сіу Рго Рго Сув Рго бек Сув Рго Аїа Рго січ Ріе 1 5 10 15
Теч біу біу Рго Бек Уа1і Роре Геї Робе Рго Рго Пу5 Рго пуб АвБр Тс 20 25 Зо
Теч Меє І1їе бБег Агку Тіг Рго сі Уа1ї ТПг Сув Уаі1і Уаї Ма1 Авр Уаї 35 40 45
Бек біп бі АБр Рго біч Уаі біп Рпре Абзп Тер Туг Маі АБр сіу Уаї 5о0 ів) бо біч Уаії Ні Авп Аза Пуб5 ТПг пуб Рго Агу бі бід біп Рбе Ап бБег 65 7о 75 80
ТПг Тук Аку Уаї Уаї бек Уаі ГПеп ТпПг Уаї Геч Ні біп АБр Тгр Гец 85 90 95
Авп о сіу пуб бі Тук Гуз Сув Гув Уаії бек Авп пуб сіу Геч Рго 5ег 100 105 110 бек І1е сії ПЦув ТПг І1е бек ув Аїа пув С1у біп Рго Агу Січ Рего 115 120 125 біп Уаії Тук Тпг Гей Рго Рго бек біп біч бічЧ Меє ТБпг Пуб5 Авп о сіп 130 135 140
Уаї бек ТГеч Тпг Суб Пец Уа1ї Ппув сіу Роре Туг Рго бег АвБр Іїе Аза 145 150 155 160
Уаї біч Терр бічЧ бек АвБп біу сбіп Рго бі АБп АБп Тук Ту5 Тс То 165 170 175
Рго Ркго Уаі Геї АБр бек АБр біу бек Рпе Рпе Ге Туг бек Агу Іеч 180 185 190
Та Уаї Авр Пув бек Агд Тер Сіп бі с1іу Авп Уа1ї Ріре бег Сув бег 195 200 205
Уаї Меє Нібз біч Аза Пец Нібв Авп Ні Туг ТПг біп Гуз бек Іеч бег 210 215 220
Теч бек Геч С1У 225 «2105 48 «2115 228 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» варіант людської Ес-ділянки ізотипу Ідс4і4 з мутацією 5228Р 1 1235Е «4005 48 біч бек Ппув Тук сіу Рго Рго Суб Рго Рго Сув Рго Аіїа Рго січ Ріе 1 5 10 15 біч біу біу Рго Бек Уа1і Роре Геї Робе Рго Рго Пу5 Рго пуб АвБр Тс 20 25 Зо
Теч Меєсє І1їе бек Аку ТПг Ркго біп Уа! ТБг Сувз Уаї Уа1 Уа1і АБвБр Уаї 35 40 45 бек біп сії Авр Рго Сіш Уаі1і біп Рре Авп Тгр Туг Уаі АБвр сіу Уаї 5о0 ів) бо біч Уаії Ні Авп Аза Пуб5 ТПг пуб Рго Агу бі бід біп Рбе Ап бБег 65 70 75 80
ТПг Тук Аку Уаї Уаї бек Уаі ГПеп ТпПг Уаї Геч Ні біп АБр Тгр Гец 85 90 95
Авп о сіу пуб бі Тук Гуз Сув Гув Уаії бек Авп пуб сіу Геч Рго 5ег 100 105 110 зек Іїе січ Ппуб5 ТБг Іїе бек Ппуб5 Аїа пуб сіу біп Рго Агку біч Рго 115 120 125 60 сіп Уа1ї Тує Тпг Гей Рго Рго бег біп Сі бі Меє Тбг Гув Авп сСіп 130 135 140
Уаї бек ТГеч Тпг Суб Пец Уа1ї Ппув сіу Роре Туг Рго бег АвБр Іїе Аза 145 150 155 160
Уаї біч Терр бічЧ бек АвБп біу сбіп Рго бі АБп АБп Тук Ту5 Тс То 65 165 170 175
Рго Ркго Уаі Геї АБр бек АБр біу бек Рпе Рпе Ге Туг бек Агу Іеч 180 185 190
ТЕ Маї1ї АБр Гуз бек Агу Тер біп бій сб1іу АБп о Уаі! Рібе бек Сув бег
195 200 205
Уаї Меє Нібз біч Аза Пец Нібв Авп Ні Туг ТПг біп Гуз бек Іеч бег 210 215 220
Теч бек Геч С1У 225 «2105 49 «2115 228 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» варіант людської Ес-ділянки ізотипу Ідс4 з мутацією 5228Р, 1235Е і РЗ296 «4005 49 біч бек Ппув Тук сіу Рго Рго Суб Рго Рго Сув Рго Аіїа Рго січ Ріе 1 5 10 15 біч біу біу Рго Бек Уа1і Роре Геї Робе Рго Рго Пу5 Рго пуб АвБр Тс
Зо
Теч Меєсє І1їе бек Аку ТПг Ркго біп Уа! ТБг Сувз Уаї Уа1 Уа1і АБвБр Уаї 35 40 45 20 бек біп сії Авр Рго Сіш Уаі1і біп Рре Авп Тгр Туг Уаі АБвр сіу Уаї 5о0 ів) бо біч Уаії Ні Авп Аза Пуб5 ТПг пуб Рго Агу бі бід біп Рбе Ап бБег 65 70 75 80
ТПг Тук Аку Уаї Уаї бек Уаі ГПеп ТпПг Уаї Геч Ні біп АБр Тгр Гец 25 85 90 95
Авп о сіу пуб бі Тук Гуз Сув Гув Уаії бек Авп пуб сіу Геч біу б5ег 100 105 110 зек Іїе січ Ппуб5 ТБг Іїе бек Ппуб5 Аїа пуб сіу біп Рго Агку біч Рго 115 120 125 сіп Уа1ї Тує Тпг Гей Рго Рго бег біп Сі бі Меє Тбг Гув Авп сСіп 130 135 140
Уаї бек ТГеч Тпг Суб Пец Уа1ї Ппув сіу Роре Туг Рго бег АвБр Іїе Аза 145 150 155 160
Уаї біч Терр бічЧ бек АвБп біу сбіп Рго бі АБп АБп Тук Ту5 Тс То 165 170 175
Рго Ркго Уаі Геї АБр бек АБр біу бек Рпе Рпе Ге Туг бек Агу Іеч 180 185 190
ТЕ Маї1ї АБр Гуз бек Агу Тер біп бій сб1іу АБп о Уаі! Рібе бек Сув бег 195 200 205
Уаї Меє Нів сі Аїа їеч Нів Авп Нів Туг ТрПг Сіп Пув бБег Іеч бег 210 215 220
Теч бек Геч С1У 225 «2105 1550 «2115 228 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» варіант людської Ес-ділянки ізотипу Ідс4і4 з мутацією 5228Р 1
Т235Е «4005 50 біч бек Ппув Тук сіу Рго Рго Суб Рго Рго Сув Рго Аіїа Рго січ Ріе 1 5 10 15 біч біу біу Рго Бек Уа1і Роре Геї Робе Рго Рго Пу5 Рго пуб АвБр Тс 20 25 Зо
Теч Меєсє І1їе бек Аку ТПг Ркго біп Уа! ТБг Сувз Уаї Уа1 Уа1і АБвБр Уаї 35 40 45
Бек біп бі АБр Рго біч Уаі біп Рпре Абзп Тер Туг Маі АБр сіу Уаї 5о0 ів) бо 60 сі Уа1 Нів Авп Аїа Пув ТПг о Гуз Рго Агд бі бі біп Рбе Авп 5ег 65 70 75 80
ТПг Тук Аку Уаї Уаї бек Уаі ГПеп ТпПг Уаї Геч Ні біп АБр Тгр Гец 85 90 95
Авп о сіу пуб бі Тук Гуз Сув Гув Уаії бек Авп пуб сіу Геч біу б5ег 65 100 105 110 зек Іїе січ Ппуб5 ТБг Іїе бек Ппуб5 Аїа пуб сіу біп Рго Агку біч Рго 115 120 125 біп Уаії Тук Тпг Гей Рго Рго бек біп біч бічЧ Меє ТБпг Пуб5 Авп о сіп
130 135 140
Уаї бек ІГеч бек Суб Аїа Уа1і Ппу5 сіу Роре Туг Рго бег АвБр Іїе Аза 145 150 155 160
Уаї біч Терр бічЧ бек АвБп біу сбіп Рго бі АБп АБп Тук Ту5 Тс То 165 170 175
Рго Ркго Уаі Геї АБр бек АБр біу бек Рпе Рпе Гечп Уаі1і! бег Агу Іеч 180 185 190
ТЕ Маї1ї АБр Гуз бек Агу Тер біп бій сб1іу АБп о Уаі! Рібе бек Сув бег 195 200 205
Уаї Меє Нів сі Аїа їеч Нів Авп Нів Туг ТрПг Сіп Пув бБег Іеч бег 210 215 220
Теч бек Геч С1У 225 «2105 51 «2115 228 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» варіант людської Ес-ділянки ізотипу Ідс4 з мутацією 5228Р, 1235Е і РЗ296 «4005 51 біч бек Ппув Тук сіу Рго Рго Суб Рго Рго Сув Рго Аіїа Рго січ Ріе 1 5 10 15 біч біу біу Рго Бек Уа1і Роре Геї Робе Рго Рго Пу5 Рго пуб АвБр Тс 20 25 Зо
Теч Меєсє І1їе бек Аку ТПг Ркго біп Уа! ТБг Сувз Уаї Уа1 Уа1і АБвБр Уаї 35 40 45
Бек біп бі АБр Рго біч Уаі біп Рпре Абзп Тер Туг Маі АБр сіу Уаї 5о0 ів) бо сі Уа1 Нів Авп Аїа Пув ТПг о Гуз Рго Агд бі бі біп Рбе Авп 5ег 65 70 75 80
ТПг Тук Аку Уаї Уаї бек Уаі ГПеп ТпПг Уаї Геч Ні біп АБр Тгр Гец 85 90 95
Авп о сіу пуб бі Тук Гуз Сув Гув Уаії бек Авп пуб сіу Геч біу б5ег 100 105 110 зек Іїе січ Ппуб5 ТБг Іїе бек Ппуб5 Аїа пуб сіу біп Рго Агку біч Рго 115 120 125 біп Уаії Тук Тпг Гей Рго Рго бек біп біч бічЧ Меє ТБпг Пуб5 Авп о сіп 130 135 140
Уа1ї бек Гечп Тер Су5 Ппечп УМаї Ппуз сі1у Робе Туг Рго бег Авр Іїе Аза 145 150 155 160
Уаї біч Терр бічЧ бек АвБп біу сбіп Рго бі АБп АБп Тук Ту5 Тс То 165 170 175
Рго Ркго Уаі Геї АБр бек АБр біу бек Рпе Рпе Ге Туг бек Агу Іеч 180 185 190
ТЕ Маї1ї АБр Гуз бек Агу Тер біп бій сб1іу АБп о Уаі! Рібе бек Сув бег 195 200 205
Уаї Меє Нібз біч Аза Пец Нібв Авп Ні Туг ТПг біп Гуз бек Іеч бег 210 215 220
Тїеч бЗег Ієч С1У 225 «2105 чф1352 «2115 107 «2125 РЕТ «213» Ното варієпе «4005 52
Агуд ТП Уаі Аза Аза Ркго бек Уаі Рпе Іїе Рпе Рго Рго бек АБр біцЧ 1 5 10 15 біп Геч Ппуз бек сіу ТпПг Аїа бек УМаі УМаї Сув Те Гей Авп Авп Ріе (516) 20 25 Зо
Тук Рго Аку бі Аза пуз Уаії біп Тер Пу5 Маі АБр АБп Аза Іеч сіп 35 40 45
Зек біу АБп бек біп біц бек Уаі ТП бій біп Авр Бек Пув АБр 5ег 5о0 ів) бо 65 ТВг Туг бек ТІеч бег бег ТПг Ппеп ТПг Ге бек Ппуз Аза Ар Туг біч 65 70 75 80
Туз Нівз Ппув Уа1! Тук Аза Суб січ Маії ТБг Нів біп сіу Гей бек бБег 85 90 95
Рго Уа1і ТП Ппув5 бек Ропе А5п Агуд сіу січ Сув 100 105 «2105 53 «2115 105 «2125 РВТ «213» Ното 5арієпь «4005 153 біп Ркго Пув Аза Аза Рго Бек МУМаі! ТіПг Те Робе Рго Рго бек бек сій 1 5 10 15 сій Те біп Аза Авп Пувз Азїа ТрПг Тез Уаї Сув Теч І1еє Бег Авр Ріє 20 25 Зо
Тук Ркго біу Аїа Уа! Тпйг Уаі Аза Тер пуб Аза АБр бек бек Рго Уаї 35 40 45
Туз Аїа сіу Уа1і сій Тбг ТБ ТБг Рго бек пуб біп бек Авп АвБп о Гув 50 ів) бо
Тук А1їа Аза бек бек Тук Пец бек Геч ТПг Рго біп біп Ткр Гпув бег 65 70 75 80
Нів Аку бек Тук бек Суб біп Уаі! ТпПгЕ Нів сії сбіу бек ТПг Уаї сіц 85 90 95 пув Тип Уаії Аїа Рго ТБ Січ Сув бег 100 105 «2105 54 «2115 4 «212» РВТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» пептидний лінкер «4005 54
Сіу бі1у біу бег
Зо 1 «2105 55 «2115 5 «212» РВТ «213» Штучна послідовність
З5 «220» «223» пептидний лінкер «4005 155
Сіу біу сіу сіу бБег 1 5 «2105 56 «2115 4 «212» РВТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» пептидний лінкер «4005 56 біп біп біп бег 1 «2105 57 «2115 5 «212» РВТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» пептидний лінкер «4005 57 біп біп біп сбіп бБег 1 5 «2105 58 «2115 4 бо «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» пептидний лінкер «4005 58 65 бег бег бек С1У 1 «2105 159 «2115 5
«2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» пептидний лінкер «4005 59
Зек бБег бек бек б1у 1 5 «2105 60 «2115 8 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» пептидний лінкер «4005 60 сі1іу бі1у С1у бБег сС1у Сі1у сС1у бег 1 5 «2105 61 «2115 12 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» пептидний лінкер «4005 61
Сіу біу сбіу бек сіу сіу сіу бек біу біу біу бег 1 в) 10 «2105 62 «2115 16 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» пептидний лінкер «4005 62
Сіу біу сбіу бек сіу сіу сіу бек біу біу біу бек біу сіу сіу бБег 1 5 10 15 «2105 63 «2115 20 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» пептидний лінкер «4005 63
Сіу біу сбіу бек сіу сіу сіу бек біу біу біу бек біу сіу сіу бБег 1 5 10 15
Сіу бі1у біу бег 20 «2105 64 «2115 10 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» пептидний лінкер «4005 64
Сіу біу біу сіу бек сіу сіу сіу біу б5ег 1 5 10 «2105 65 «2115 15 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» 10) «223» пептидний лінкер «4005 65
Сіу біу сбіу сіу Бек сіу сіу біу біу бек біу сбіу сіу сіу бБег 1 5 10 15 «2105 56566 65 «2115 20 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220»
«223» пептидний лінкер «4005 66
Сіу бі1у сіу сіу бек сіу сіу біу біу бек біу сбіу сіу сіу Бек сб1Уу 1 5 10 15 сі1іу б1у сС1у бег 20 «2105 657 «2115 17 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» пептидний лінкер «4005 6567 біу бек бек бекг бек бБег бБег бег бек бег бег бег бег бек бек бБег 1 5 10 15 свіу «2105 658 «2115 18 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» пептидний лінкер «4005 68 сіу с1у бек сіу сі1іу Сіу с1у бег С1іу С1у сіу сС1у бек С1у С1у С1Уу 1 5 10 15
Сіу б5ег «2105 69
Зо «2115 22 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» пептидний лінкер
З5 «4005 69
Сіу бі1у сіу сіу бек сіу сіу біу біу бек біу сбіу сіу сіу Бек сб1Уу 1 5 10 15
Сіу біу сіу бек с1у с1Уу 20 40 «2105 70 «2115 30 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 45 «223» пептидний лінкер «4005 70
Сіу бі1у сіу сіу бек сіу сіу біу біу бек біу сбіу сіу сіу Бек сб1Уу 1 5 10 15
Сіу біу біу бек сіу сіу сіу сіу бек біу біу біу біу бег 50 20 25 Зо «2105 71 «2115 118 «2125 РЕТ «2135 Миа5 тиавсп1ий5 55 «4005 71 біч Уаії біп Ге Уаі! сій Бек сбіу біу біу Теч Уаі біп Рго с1у АБп 1 5 10 15
Ззек Пес ТПг Геч бек Сув Уаі Аза бек сіу Рпе ТПг Рре б5ег АБп Туг 20 25 Зо 60 сіу Меє Нів Тер І1е Агу біп Аїа Рго Пув Ппув С1у їеч біч Тер І1е
Аа Меє Іїе Тугк Тук АБвр бек бек Пуб5 Меє А5п Туг Аїа АБр ТіПг Уаї 5о0 ів) бо
Туз біу Акуд Рпе ТПг Іїе Бек Агу АБр АБп о бег Гу5 Ап ТпПг Геч Туг 65 65 7о 75 80
Теч біц Меє Авп бек Геї Агуд бек бі Авр ТБг Аза Меє Тук Тукгк Сув 85 90 95
Аа Уа1 Ркго ТіПг бек Ні Туг Уа! Уаії Авр Уаі Тер сі1у біп сі1у Уаї
100 105 110 век Уаі ТПг Уаї бег 5ег 115 «2105 72 «2115 107 «2125 РЕТ «2135 Ми5 тизсчій5 «4005 72
АБр Іїе сіп Меє Тс о біп бек Рго Аза бек Гей бек Аїа бек Іеч січ 1 5 10 15 біч І1їе Уаії ТПпг Іїе Тпг Суб сбіп Азїа бек біп АБр І1їе с1іу АвБп Тгр 20 25 Зо
Теч Аїа Тер Тук біп сіп Пув Рго біу Гувз бек Рго біп Гец Ге Те 35 40 45
Тук б1у Аза Трг бек їеч Аїа Авр Сіу Ма1 Рго бек Агд Рре бек С1У 5о0 ів) бо
Бек Акуд Бек біу Тбг біп Рбе бек Гецп пуб Іїе Бек Аку Уа! Сіп Уаї 65 70 75 80 біч АвБр Іїе сіу Іїе Тук Тук Суб Гезч біп Аїа Туг АБп ТПг Рго Тгр 85 90 95
ТЕ Рбе біу біу біу Тпг пуб Геч січ Геч Гуз 100 105 «2105 73 «2115 107 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» анти-ТЕВ шАр 803 УІ варіант 1104У П1061І «4005 73
АБр І1е СсСіп Меє ТПг о біп бек Рго Аїа бег Іїеч бБег Аїа бек Ієч Січ 1 5 10 15 біч І1їе Уаії ТПпг Іїе Тпг Суб сбіп Азїа бек біп АБр І1їе с1іу АвБп Тгр 20 25 Зо
Теч Аїа Тер Тук біп сіп Пув Рго біу Гувз бек Рго біп Гец Ге Те 35 40 45
Тук б1у Аїа ТБг бек Гец Аза Ар сіу Уа1і Рго бек Агу Ропе бесг с01УуУ 5о0 ів) бо
Бек Акуд Бек біу Тбг біп Рбе бек Гецп пуб Іїе Бек Аку Уа! Сіп Уаї 65 70 75 80 сі Авр І1е с1іу І1е Тук Туг Сув їеч Сіп Аїа Туг АБп ТіПг Рго Тгр 85 90 95
ТЕ Рбе біу біу біу Тіп Ппуз Уаі сі ІШе Гув 100 105 «2105 174 «2115 122 «2125 РЕТ «213» ОгусеЕо1ади5 счпісцчіць5 «4005 174 біп бек Меє бі сій бек сіу сбі1у Аку Іеч Уа! ТрПг Рго с1іу Тпг Рго 1 5 10 15
Теч ТП Пец ТПг Суб Тс Уа1ї бек біу Ріре бег Іец бек бег Туг Аза 20 25 Зо
Меє бек Теср Уаі Аку сбіп Аза Рго сіу Ппув бі1у Іеч бічЧ Тр Ше с01Уу 35 40 45
Тук І1е Тер бек Сіу біу бег ТЬг Авр Туг Аїа бек Тгр Аїа туз С1У 5о0 ів) бо
Агуд Рпе ТПг І1їе бек Гу5 ТПг бек Тс Тбг Уа1ї Авр Геї Гуз І1е ТЕбг 65 70 75 80
Бек Ркго ТПг ТПг бій АвБр Тс Аза ТБПг Тукє Рпе Суб Аза Агу Агу Туг (516) 85 90 95 біу Тпг бек Тук Рго Авр Тугк бі1у АБр Аїа АБп біу Роре Авр Рго Тгр 100 105 110 біу Рко біу ТПг Ге Уа1! ТПг Уаї бек б5ег 115 120 65 «2105 75 «2115 110 «2125 РЕТ «213» ОгусеЕо1ади5 счпісцчіць5
«4005 75
Аа Тук Авр Меє Тс о біп ТБг Ргко Аза бек Уаі сі Уаі Аїа Уа1і с1Уу 1 5 10 15 біу Тс Уаії Тпг Іїе Ппу5 Сув біп Азїа бек біп бек І1їе бек бек Туг 20 25 Зо
Теч бек Тер Тук біп сбіп Пув Рго біу біп Аку Рго Пу5з Геч Геч Те 35 40 45
Тук Аку Азїа бек Тйг Гец Аза бек сіу Уа1і бек бек Аку Ропе пуз с01УуУ 5о0 ів) бо бек біу бек Сіу ТПпг Сіп Рре ТіПг тес Трг І1їе бек сіу Уа1 Січ Сув 65 70 75 80
Аза АвБр Аза Аїа ТП Тук Тук Сув біп біп Суб Туг Берг бек бек АБп 85 90 95
Уаї АБр АБп Тйг Рпе сіу сіу сіу ТбПг сі Маї Уаї Уаї Гув 100 105 110 «2105 76 «2115 7 «2125 РЕТ «213» ОгусеЕо1ади5 счпісцчіць5 «4005 76 біу Рпе бек Гей бек бБекг Туг 1 5 «2105 177 «2115 5 «2125 РВТ «213» ОгусеЕо1ади5 счпісцчіць5 «4005 77
Тер Бек біу біу б5ег 1 5
Зо «2105 78 «2115 17 «2125 РЕТ «213» ОгусеЕо1ади5 счпісцчіць5 «4005 78
Акуд Тук б1у ТБг бек Туг Рго Авр Туг біу Авр Аіїа АвБп біу Роре АБвр 1 5 10 15
РЕО
«2105 79 «2115 17 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» 299-000 НУВ-НЗ рАВ5О «4005 79
Агуд Тук сб1іу ТБ бек Тук Рго АБр Туг біу АвБр Аїа Бек сіу Роре АБр 1 5 10 15
РЕО
«2105» 80 «2115 17 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» 299-000 НУВ-НЗ рАОС «4005 80
Агуд Тук сб1іу ТБ бек Тук Рго АБр Туг біу АБр Аїа сіп сіу Роре Ар 1 5 10 15
РЕО
60 «2105 81 «2115 11 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність 65 «220» «223» 299-000 НУВ-І11 ВАА «4005 81
Агу Аза Бек біп бек І1е бек бег Туг Геч Аза
1 5 10 «2105 82 «2115 7 «2125 РЕТ «213» ОгусеЕо1ади5 счпісцчіць5 «4005 82
Агуд Аза Бек ТПг Іеч Аза 5ег 1 5 «2105 83 «2115 12 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» 299-000 НУВ-ІЗ МУА «4005 83 біп біп Азп Туг Аза бБег Бек АБп Уаі АБр АБп ТОП 1 5 10 «2105 84 «2115 122 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» анти-ТЕВ штшАБбБ 567 УН (-гуманізоване 299 УН основний) «4005 84 сСіп бек Меє бі сі бек сіу с1у Акуд їеч Ма1і! Тбг Рго С1іу Трг Ркго 1 5 10 15
Теч ТП Пец ТПг Суб Тс Уа1ї бек біу Ріре бег Іец бек бег Туг Аза 20 25 Зо
Меє бек Теср Уаі Аку сбіп Аза Рго сіу Ппув бі1у Іеч бічЧ Тр Ше с01Уу
Тук І1е Тер бек біу біу бек ТПг Авр Туг Аїа бек Тгр Аїа пуз с01Уу 5о0 ів) бо
Агуд Рпе ТПг І1їе бек Гу5 ТПг бек Тс Тбг Уа1ї Авр Геї Гуз І1е ТЕбг 65 70 75 80 35 бек Рго Тпг Тіг біц Авр ТБ Азта Трг Тує Рпе Суб А1їа Агу Агд Туг 85 90 95 біу Тпг бек Тук Рго Авр Тугк бі1у АБр Аїа АБп біу Роре Авр Рго Тгр 100 105 110 біу Рко біу ТПг Ге Уа1! ТПг Уаї бек б5ег 40 115 120 «2105 85 «2115 110 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність 45 «220» «223» анти-ТЕВ шАБбБ 567 Мі, (-гуманізоване 299 МІ, основний) «4005 85
Аа Тук Авр Меє Тс о біп ТБг Ргко Аза бек Уаі сі Уаі Аїа Уа1і с1Уу 1 5 10 15 сіу Ти Уаї Тпг І1е Пув Сув біп Аїа бек біп бег І1є Бег бег Туг 20 25 Зо
Теч бек Тер Тук біп сбіп Пув Рго біу біп Аку Рго Пу5з Геч Геч Те 35 40 45
Тук Аку Азїа бек Тйг Гец Аза бек сіу Уа1і бек бек Аку Ропе пуз с01УуУ 50 55 бо
Бек сіу Бек біу ТПг біп Рбе Тс Гей ТПг Іїе Бек сіу Уа1і бі 5ег 65 70 75 80
Аза АвБр Аза Аїа ТПг Тук Тук Суб біп біп бек Туг бБег бек бек АБп 85 90 95 60 Уаї Авр Авп Тіпг Рре Сі1іу сіу с1іу Таг бі Ма1ї Уа1ї Уаї Був 100 105 110 «2105 86 «2115 122 «2125 РЕТ 65 «213» Штучна послідовність «2205 «223» анти-ТЕВ штАБб 932 УН (-гуманізоване 299 УН мутований) «4005 86 біп бек Меє сбіп сій бек сіу Рко біу Теч Уа! Пу5 Рго бек біп ТПг 1 5 10 15
Теч бек Пец ТПг Суб ТПг Уа1ї бек біу Ріре бег Іец бег бег Туг Аза 20 25 Зо
Меє бек Тер Іїе Агу біп Ніз Рго сіу Ппуз с1у Гей бій Тер Іїе 0Щ1У 35 40 45
Тук І1е Тегр бек біу біу бек ТПг Авр Туг Аїа бек Тгр Аїа Ппу5 5бег 5о0 ів) бо
Агуд Уа1ї ТБ І1їе бек Гу5 ТПг бек Тс Тбг Уа1ї Бек Геч пуб Іеч 5ег 65 7о 75 80
Бек Уаі Тпг Азїа Аза АБр Тйг Аза Уаї Туг Тук Сув Аїа Агу Агуду Туг 85 90 95 біу Тпг бек Тук Рго Авр Тугк бі1у АБр Аїа АБп біу Роре Авр Рго Тгр 100 105 110 сі1у біп с1у Тпг Те Уа1ї ТПг Уаї бекг бег 115 120 «2105 87 «2115 110 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» анти-ТЕВ штАБбБ 932 Уії, (-гуманізоване 299 МУІ, мутований) «4005 87
Аза Іїе сіп Геї ТП обіп бек Рго бек бек Гечс Бек Аїа бек Уаі б1Уу 1 5 10 15
АвБр Акуд Уа1і Тс І1е Тс Суз Агу Аза бек біп Бек І1їе бек бек Туг 20 25 Зо
Теч Аїа Тер Тук біп сіп Пув Рго біу Гуз Аза Рго Пу5з Геч Геч Ше 35 40 45
Тук Агуд Аїа бек Тіг їеч Аїа бек Сіу Ма1 Рго бек Агд Рре бек С1У 5о0 ів) бо
Бек сіу Бек біу ТБг АБр Рпе ТПг Гец ТПг Іїе бБег бек Іеч біп Рго 65 70 75 80 біч АвБр Рпе Аза ТПг Туг Тугк Суб біп біп АБп Туг Аза бек Бек АБп 85 90 95
Уаї АБр АБп Тс Рпе сіу сіу сіу Тбг Ппув Маї січ І1е Гуз 100 105 110 «2105 88 «2115 122 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» 299-023 УН гуманізований варіант РАБ5О «4005 88 сСіп бек Меє біп Сі бек бі1іу Рго біу їеч Ма1 Ппув Рго бБег біп Тис 1 5 10 15
Теч бек Пец ТПг Суб ТПг Уа1ї бек біу Ріре бег Іец бег бег Туг Аза 20 25 Зо
Меє бек Тгр Іїе Аку біп Ніє Рго сіу Ппув бі1у Іеч бічЧ Тр Ше с01Уу 35 40 45
Тук І1е Тегр бек біу біу бек ТПг Авр Туг Аїа бек Тгр Аїа Ппу5 5бег 5о0 ів) бо
Агуд Уа1ї ТБ І1їе бек Гу5 ТПг бек Тс Тбг Уа1ї Бек Геч пуб Іеч 5ег 65 70 75 80 бек Ма1! Тр Аза АзТа Авр Тпг Азїа Ма1ї Тує Туг Сув А1їа Агу Агд Туг 85 90 95 біу Тпг бек Тук Рго Авр Тугк біу АБр Аїа бек біу Роре Авр Рго Тгр 100 105 110 біу біп біу ТПг Гей Уа1! ТПг Уаї бек б5ег (516) 115 120 «2105 89 «2115 119 «2125 РЕТ «2135 Ми5 тизсчій5 65 «4005 89 біч Уаі біп Гей сіп сіп Бек сі1іу Аїа Уаії Іеч Уаі Пу5 Рго сіу Аза 1 5 10 15
Зек Уа1ї Ппув Ге бек Сув Рго Аза бек сіу Рпе Аб5п Іїе Пу5 АБр ТЕГ
20 25 Зо
Тук І1е Ніб5 Тегр Уаі! Іїе біп Агу Рго бі сбіп сіу Іеч біч Ткр Іе 35 40 45 біу Акуд Іїе Авр Рго Аза АБп о сіу АБр ТБПг Гу5з Суб Авр о Рго Пув Ріе 50 55 бо біп Уаі Ппуз Аза ТПг Іїе ТПг Аза АБр ТПг бег бег АБп ТПг Аза Туг 65 70 75 80
Теч біп Пец бек бек Геї ТПг бек біцш АвБр Тбг Аза Уа1і Тук Роре Сув 85 90 95
Уа1 Акуд Авр Тугк Ппечп Тук Рго Тук Тук Роре АБр Робе Тер сбіу біп 0Ш1У 100 105 110
ТВг ТВг Тен Трг Уаі1ї бег 5ег 115 «2105 190 «2115 108 «2125 РЕТ «2135 Ми5 тизсчій5 «4005 190
Туз І1е Уаї Меє Тпг сіп Бек Ркго Гувз бек Мес бек Меє бек Уа1і сС1Уу 1 5 10 15 біч Акуд Уаі Тбг Гей Абп Сув Агу Азїа бек бі бек Уаі Авр ТпПг Туг 20 25 Зо
Уаї бек Ткр Тук біп біп пуб Рго сії біп бек Рго біц Гецп Ге Ше 35 40 45
Тук б1у Аїа бек Авп Агуд Туг Тип біу Ма1 Рго АБр Агд Рре Тис С1У 5о0 ів) бо
Бек сіу Бек Аїа ТПг АБр Рпе ТПг Гец ТПг Іїе бБег бек Уа! Сбіп Аза 65 70 75 80 біч Авр Ге Аза Авр Туг Тугк Суб біу біп Тбйг Тук Авп Тук Рго Гей
Зо 85 90 95
ТПЕ Ррпе бі1у Аїа біу ТП пуб Геч січ Геч Гуз Агд 100 105 «2105 91 «2115 118 «2125 РВТ «2135 Ми5 тизсчій5 «4005 191 біп Уаі біп Ге Уаі! сіп Бек сі1іу Аїа бічп Уа! пу5з Ппу5з Рго сіу Аза 1 5 10 15 бек Ма1 Ппув Ма1ї БбБег Сув їув А1їа бег Сіу Тугє Тпг Рре Тпс СсС1у Туг 20 25 Зо
ТПг Меє АБп Тгср Уаі! Агу біп Аза Рго сіу сіп сіу Іеч біч Ткр Меє 35 40 45 біу Акуд Іїе АвБп Рго Ніб АБп о сіу біу ТБг АБр Туг Аїа біп Пув Робе бо біп бі1у Акуд Уаі Тпг Меє Трбг Агу АвБр Тс бег І1е бег ТПг Аза Туг 65 70 75 80
Меє біп Іеч бек Акуд Гей Агуд бек Авр АБр Тс Аза Уаї Тук Тук Сув 85 90 95 50 Аза Акуд сб1у Туг Туг Туг Тугк бек Гечп Авр Туг Тер біу біп с1у ТЕГ 100 105 110
Печ Уаї ТП Уаї Бек 5ег 115 «2105 12 55 «2115 106 «2125 РЕТ «2135 Ми5 тизсчій5 «4005 92
АБр Іїе сбіп Меє ТПг о біп бек Рго бек бек Гечс Бек Аїа бек Уаі б1Уу (516) 1 5 10 15
АБр Акуд Уа1і Тс І1е Тс Суз Агу Аза бег бек бек Іїе Агу Тугк І1е 20 25 Зо
Нів Тер Тук біп біп Гпу5 Рго біу пуб Аза Рго Гуз Агу Теч Іїе Туг 35 40 45 65 АБвр ТПг 5Бег АБп Гей Аза бек біу Уа1і Рго бек Агу Роре бек сіу бег 5о0 ів) бо біу бек біу ТПг сій Рре ТПг Геї ТПг І1їе бег бек Ге біп Рго сій 65 70 75 80
Авр Рпе Аза ТіПг Тугк Тук Сув Ні біп Агуд Авп о бБег Туг Рго Тгр Тс 85 90 95
Рпе сіу сбіп сб1у Тс Агу Теч біч Іїе Гуз 100 105 «2105 93 «2115 15 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» фрагмент людського рецептора трансферину «4005 193
Іїе сіу сбіп АБп Меє Уа! ТБбг Іїе Уаії сіп Бек АБп сіу АБп Іеч 1 5 10 15 «2105 94 «2115 15 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» фрагмент людського рецептора трансферину «4005 94
Авп оМеє Уа1і ТПг І1ї1е УМаії біп бек АбБп біу Авп Гей Авр Рго Уаї 1 5 10 15 «2105 195 «2115 15 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» фрагмент людського рецептора трансферину «4005 195 сСіп бек Авп біу Авп Тїеч Авр Рго Уаі Сіц бБег Рго Січ С1у Туг 1 5 10 15 «2105 1196 «2115 693 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» анти-Нек2 кільцевого злитого поліпептиду «4005 196 біч Уаії сбіп Пец Уаі! сі бек біу біу біу ІТеч Уаі сіп Рго сіу с1у 1 5 10 15
Ззек Геч Акуд Тез бек Сув Аза Аза бек сіу Рпе Аб5п Іїе Пу5 АБр ТЕГ 20 25 Зо
Тук І1е Ніб5 Тер Уаі Агу біп Аза Рго сіу Ппув сіу Іезч бічп Тгср Уаї 35 40 45
Аза Агуд І1е Ту Рго ТрПг Авп о Сбіу Туг ТПг Асуд Туг Аза Авр бек Уаї 5о0 ів) бо
Туз біу Акуд Рпе ТПг Іїе Бек Аїа АБр ТПг бег Пу5 АБп ТПг Аза Туг 65 70 75 80
Теч біп Меє Ап бек Геї Агу Аза бі АвБр ТБ Аза Уа1і Тук Тук Сув 85 90 95 зек Акуд Тер сбіу бі1у АвБр біу Рпе Туг Аїа Меє Аб5р Тугє Тгр б1у біп 100 105 110 біу ТЕ Пец Уа! ТпПг Уаї бек бек Аза бек Тс пуб сіу Рго Бек Уаї 115 120 125
Рпе Рго Те Аїа Рго бег бек Пув бег ТіПг бек біу сС1у Тйг Аза А1а 130 135 140
Теч біу Сув ГПеч Уа1ї Ппув АвБр Тук Роре Рго біц Ркго Уаі ТпПг Уа1ї 5Бег 145 150 155 160
Тер АБп бек біу Аза Те Трг бек сіу Уа1і Ніб ТПг Роре Рго Аїа Уаї (516) 165 170 175
Теч біп бек бек сіу Геч Туг Бек Геч бек бек Уаі Уаі ТрПг Уа1ї Рго 180 185 190 бЗек Бек Бек Геч біу ТБ біп ТБг Тук Іїе Суб АвБп Уаі АБп Нів Гуз 195 200 205 65 Рго Бек АБп ТПйг Ппув Уаі Авр о Ппув Ппув УМаї бій Рго Ппуз Бек Суз б1У 210 215 220
Сіу біу біу бек сіу сіу сіу сіу бек Авр Гу5 ТПг Нібв ТПг Суб Рго 225 230 235 240
Рго Суб Рго Аїа Рго біч їецш Пец сіу сіу Рго Бек Маі! Рібе Іеч Ре 245 250 255
Ркго Ркго Пув Рго Гуз АБр ТПг Гей Меє Іїе Бек Агу ТПг Рго біч Уаї 260 265 270
ТВ Сув Уаії Уа1ї Уа1ї Авр Уаї бек Нів біп АБр Рго бій Уаї Пув Рре 275 280 285
АвБп Тер Тук Уаі АБр біу Маії біч Уаі Ніб5 АвБп Аза Пуб5 ТПг пув Рего 290 295 300
Агуд бій бій біп Тук АБп о бек Тбг Туг Агуд Уа1! Уа1ї Бек Уаї Іеч ТЕбг 305 310 315 320
Уаї Іеч Нібз біп Авр Тер Гечп Аб5п сіу Ппув бі Тук Гув Суб Пув Уаї 325 330 335
Бек АвБп пув Аїа Іеїп Рго Аза Рго Іїе сії Ппу5 ТПг І1е бек Туз Аїа 340 345 350 пув б1іу біп Рго Агу бій Рго біп Уаї Туг Тпг Течй Рго Рго бек Агд 355 360 365
Авр січ Геч Тс губ АБп обіп Уаі! бек Гечп ТпПг Суб Геч Уаї Гуз б1У 370 375 З8о
Рпе Туг Рго бек АБр Іїе Аїа Уаі сій Тер бій Бек АБп біу біп Рго 385 390 395 400 біч АвБп о Авп о Тук пуб Тбг ТБ Рго Рго Уаії Іеч Авр бег Авр сіу бБег 405 410 415
Рпе Рпе Геч Тугк бек Гувз ТГеч ТБПг Уаі Авр ПувБ бБег Агуд Тгр біп сбіп 420 425 430 сі1у Авп Уа1ї Рре бек Сув бБег УМаї Меє Нів сі Аїа Геч Нів Авп Нів 435 440 445
Тук Тс біп Гуз бек Гец бек Геп бек Рго сіу Гуз біу бі1у с1у .Ш1Уу 450 455 460 бек сіу сіу сіу біу бек АБр І1е біп Меє ТпПг сіп бБег Рго бек 5ег 465 470 475 480
Теч бек Аза бек Уаі сіу АБр Аку Уа! ТБг Іїе ТБг Суб Агуд Аза бБег 485 490 495 біп Авр Уаі Авп ТпПг Аза Уаі Аза Теср Тук біп біп Пу5 Рго сіу ГПув 500 505 510
АТа Рго Ппув Геч Іеч Іїе Туг бек Аїа бек Робе Ге Туг бБег с1у Уаї 515 520 525
Рго Бек Агку Ріре бек біу бек Агкуд бек біу ТПг Авр Рре ТПг Іеч Тс 530 535 540
І1їе Бек Бек Геч біп Рго бічЧ Абр Рпе Аза ТПг Туг Туг Суб біп сбіп 545 550 555 560
Нів Тугє ТПг ТБЕ Рго Рго ТПг Рпе сіу сіп сіу Тс Гуз Уаі біч Іе 565 570 575
Туз Агуд Тс Уаі Аза Аза Рго бек Ма! Роре Іїе Робе Рго Рго бек Авр 580 585 590 сій біп їеч Був бек Сіу ТПг Аїа бек Уа1ї Ма1 Сув їеч Іеч Авп Авп 595 6о0 605
Рпе Тук Рго Аку біп Аза Гуз Уаі біп Тер пуб Уаі АБр АБп Аза Іеч 610 615 620 біп бек біу Авп бек біп бі бек Ма! ТБг бічЧ біп Авр бек пуб Авр 625 630 635 640
Бек ТПг Туг бек ТГеч бек бек ТПг Гей ТПг Гей бек Пув Аза АБр Туг 645 650 655 біч Гуз Нів пуб Уа1! Тук Аїа Су5 біп Ма! ТБг Ніз сбіп сіу Геч бБег 66о 665 670 бек Рго УМаі1і Тип Пув бег Рре Авп Агуд сС1іу Січ Сув сіу бек С1у Нів 675 680 685
Нів Нів Нів Нів Нів 690 «2105 137 (516) «2115 692 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» анти-сМеє кільцевого злитого поліпептиду 65 «4005 97
АБр Іїе сбіп Меє ТПг о біп бек Рго бек бек Гечс Бек Аїа бек Уаі б1Уу 1 5 10 15
АвБр Акуд Уа1і Тс І1е ТП Суз Агу Тс бе бій Аб5п І1їе Туг бек Туг
20 25 Зо
Теч Аїа Тер Тук сбіп сіп Пув Рго біу Гуз Аза Рго ПувБ Геч Геч Уаї 35 40 45
Тук АБп Аїа Туз Тпйг Ге Аза сі сіу УМа1і Ркго бек Агу Ропе бесг с01УуУ 50 55 бо
Бек сіу Бек біу ТБг АБр Рпе ТПг Гец ТПг Іїе бБег бек Іеч біп Рго 65 70 75 80 біч А5р Рпе Аза ТПг Туг Тугк Суб біп Ні Нів Туг біу ТПг Рго Ріе 85 90 95
ТаЕ Рпе сі1у Сіп С1у Тпг Пув Тез бі І1е Пув Агу Тбг Уаї Аїтїа А1а 100 105 110
Рго Бек Маі Роре Іїе Робе Рго Рго бек Авр сії сбіп Геч Гу5 бек б1у 115 120 125
ТПг Аїа бек Уаії Уаї Суб Пец Гей Абзп Ап Рре Туг Рго Агу біч Аїа 130 135 140
Туз Уаі біп Тер пуб Уа1і АБр АБп Аза Тез біп бек біу Ап бек сіп 145 150 155 160 біч бек Уаі ТП сій сбіп Авр бек Куб Авр бег ТПг Тукг бек Геч бБег 165 170 175 век ТПг Гей ТПг Гей бек Пув Аза Авр Тук біп Ппувз Нів Ппуз Уаї Туг 180 185 190
Аа Сув сії Ма1ї ТП Ні біп біу Пец бек бек Рго Уа1і ТПг Пув5 б5ег 195 200 205
Рпе АбБп Агуд сіу біз Суз біу біу сбіу сіу бек сіу сіу сіу біу б5ег 210 215 220 сбіу біу біу сіу Бек Авр Пуб5 ТП Ні ТБг Сув Рго Рго Суб Рго Аза 225 230 235 240
Рго біц Геч ІГеч біу біу Ркго бек Уа! Рпе Геї Роре Рго Рго КТув5 Рго 245 250 255
Пув Авр Тс Тез Меє І1їе бБег Акуд Тип Рго бі Уаі1і Ті Сув Уаї Уаї 260 265 270
Уаї АБр Уаї бек Ніб бій Авр Рго сії Маї Гуз Робе АБп Тгр Тук Уаї! 275 280 285
Авр о сіу Уаі1і сії Маї Ніб5 АБп Аза Пу5 ТПг пуб Рго Агуд січ бі біп 290 295 300
Тук АБп бек ТПг Туг Акуд Уаї Уа1! Бек Уа1ї Геї ТПг Уаї Іеч Нів сіп 305 310 315 320
АвБр Тер Геч АБп о сіу Гуз бі Тук Ппуз Сув Пув Уа1! Бек АБп Гу5 Аа 325 330 335
Теч Рго Аза Рго І1е Січ Пув ТрПг І1їе бек Ппув Аза Пув Сіу Сіп Рго 340 345 350
Агуд бій Ркго біп Маї Тук ТБг Те Рго Рго бек Агуд АБр січ Іеч ТЕГ 355 360 365
Туз АБп обіп Уа! бек Гечш Тс Суб Геч УМаї Гуз біу Рпе Тугк Рго бБег 370 375 З8о
АБр Іїе Аїа Уаі сії Тер біч бек АвБп біу біп Рго бі АБп АБп Туг 385 390 395 400
Тув Тпг ТБЕ Рго Рго Уаії Геї АБр бек Авр біу бек Рпе Рпе Геч Туг 405 410 415 бек Ппув Те Тіг Ма1 Авр Гуз бег Акуд Тгр Сіп біп сС1у Авп Уа1ї! Рре 420 425 430
Ззек Сув Бек Маі Меє Нібз біц Аза Гец Нібв А5п Ні Туг ТПг біп Гуз 435 440 445
Зек Пес Бек Геч бек Рго біу Ппуз сіу сіу сіу сіу Бек біу бі1іу б1Уу 450 455 460 біу бек біп Уаі сіп Ге сіп сі бек біу Рко біу Ге Уаї Ппув Рго 465 470 475 480
Зек бії ТіПг Ге бек Теч ТПг Суб ТрПг Уа1! бек сіу Туг бек І1е ТЕбг 485 490 495 60 век Авр Туг Аїа Тер АБп Тер Іїе Агу біп Рпе Рго сіу Ппуз с1у Гей 500 505 510 біч Тер Іїе сіу Тук Іїе бБег Туг бек біу бек ТПг бек Тукг Геч Рго 515 520 525
Ззек Геч Ппув бек Агку Ма! ТПг І1е бек Агу Ар Тбг бБег Пуб5 АБп біп 65 530 535 540
Рпе Бек Геч пуб ІГеч бек бек Уаі ТрПг Аза Аза А5р ТПг Аза Уа1ї Туг 545 550 555 560
Тук Сув Аїа Рго бек Туг Тукг Тук сіу сіу Ппув Нів УМаії Аза Іеч Ре
565 570 575
Аза Тук Тер сіу біп біу ТБг Теч Уа! Трг Уа1ї Бек Бек Аїа бек ТЕГ 580 585 590
Туз біу Рго бек Уа1і Рре Рго Геї Аза Рго бег бек пуб бек ТПг бБег 595 6о0 605
Сбіу бі1у ТЕ Аза Аза Гечп сіу Суб Геч Маї Гув Авр Тукє Рпе Рго сій 610 615 620
Рго Уа1і ТПг МУМаї бек Тгр АБп бек біу Аїа Геї ТПг бек сбіу Уаї Нів 625 630 635 640
ТВЕ Рпе Ркго Аїа Уаії Пеп біп бек бек сбіу Пес Туг бек Гей бег 5бег 645 650 655
Уаї Маї ТБг Уаї Рго бек бек бек Геї сіу Тс біп ТбПг Тук І1е Сув 66о 665 670
Авп оУа1і Авп о Нів пуб Ргро бек АБп ТПг пуб Уа1і Авр о Ппув Ппув Уаї січ 675 680 685
Рго Пув бек Сув 690 «2105 198 «2115 693 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» анти-С020 кільцевого злитого поліпептиду (1) «4005 198 сіп Уаі1ї Сіп Те Сіп Сіп Рго сіу Аїа Сі їеч Уа1ї ПЦув Рго сС1у Аза 1 5 10 15
Зек Уа1ї Ппув Меє бек Сув Гуз Аза бек сіу Тук ТПг Рре ТПг бек Туг 20 25 Зо
Авп оМеє Ніб Тер Маії Гуз біп Тбг Рго біу Акуд сіу Геї сії Тгр І1е
Зо 35 40 45 біу Аїа Іїе Тук Рго сбіу АБп біу АБр ТПг бек Туг АвБп біп Пув Робе 5о0 ів) бо
Туз біу Ппув Аїа ТпПг Геї Тс Аза АБр Гуз бег бек бег ТПг Аза Туг 65 70 75 80
Меє біп їей бег бек Ппеп ТПг бек біш АвБр бБег Аїа Уаї Туг Тук Сув 85 90 95
Аза Акуд Бек ТПг Тук Тук біу біу Авр Тер Тук Рре АБп Уаі Тегр б1Уу 100 105 110
Аа сіу ТПг Тс УМаї Тс Уаї бек бек Аза бек ТПг Ппуб5 сі1у Рго 5ег 115 120 125
Уаї Рре Рго Іїец Аза Рго бек бБег Пув бек ТПг бек біу сіу ТПг Аза 130 135 140
Аа Ггеч сіу Суб Геч Маї Гув Авр Тук Рпе Рго сії Ркго Уаі! Тібг Уаї 145 150 155 160 бек Тер Авп бек біу Аїа Іїеч ТіПг бег Сіу Уа1ї Нів Трг Рре Рго А1а 165 170 175
Уаї Іеч біп бек бек біу Пес Туг Бек Геч бек бек Уаі Уаї ТрПг Уаї 180 185 190
Рго Бег бБег бек Геч біу Тбйг біп ТБПг Тук Іїе Суб АБп Уаії АБп Нів 195 200 205
Тув Рго бек Авп ТПг пуб Маі АБр оГу5 Туз Уаії бій Рго ПпуБ Бек Сув 210 215 220
Сіу біу сбіу сіу Бек сіу сіу біу біу бек АБр Пуб5 ТПг Ні ТПг Сув 225 230 235 240
Рго Рго Сув Рго Аїа Ркго бій Іїечп Гей біу біу Рго бек Уаії Ріре Іецй 245 250 255
Рпе Ркго Рго пуб Рго Гу5з АБр ТПг Гей Меє Іїе Бек Агу ТПг Рго січ 260 265 270
Уаї ТЕ Сув Уаії Уаї Уаї Авр Уа1і Бек Нібв бій АвБр Ргко біч Уаї Пув (516) 275 280 285
Рпе Абвп Тгр Тук Маі АБр біу Уаі біц Уаі Ніб Ап Аза Пу5 ТіПг Гуз 290 295 300
Рго Акд бі бі біп Тук АБп о бег ТПг Туг Акуд Уа1і Уаі1ї бек Уаї Іеч 305 310 315 320 65 ТВгЕ Маї Іїеч Нів біп Авр Тер Геш Ап сіу Ппуз бій Тук Ппув Сув Тув 325 330 335
Уаї Бек АБп Гуз Аза Гей Рго Аза Рго Іїе сії Гу5 Тбг І1е бек Пув 340 345 350
Аза ПпувБ сіу біп Рго Аку бі Ргко біп Уаі! Тук ТПг Геї Рго Ркго 5ег 355 360 365
Агуд Авр о біч Геч ТБ Гуз АБп обіп Уаії бек Геч ТПг Суб Геч Уаї Гуз 370 375 З8о б1у Рпе Тук Рго бек АБр І1їе Аїа Уаі бій Тер бій б5ег Авп б1іу біп 385 390 395 400
Рго біц АБп АБп о Тук Гув Тбг ТБЕ Рго Рго Уаі Геї АБр 5ег АБр б1Уу 405 410 415
Бек Рпе Рбе Геч Тук бек Гув Ге ТПг Уаі! Авр Пубв бБег Агу Тер біп 420 425 430 біп бі1у Авп Уа1! Ррпе бБег Сув бек Ма! Меєсє Ні біц Аза Гей Нібв Ап 435 440 445
Нів Тук ТП біп Гувз бек Гей бек Геч бек Рго біу Гуз біу с1у .Ш1УуУ 450 455 460 сі1у бек сі1у сіу сіу Сіу Бек сСіп І1їе Уаї їец бек Сіп бБег Рго Аза 465 470 475 480
Іїе Геп бек Аза бек Рго біу біц пуб Уа1! ТПг Меє Тс Суз Агку Аза 485 490 495 бЗек Бек Бек Маії бек Тук Іїе Ніб5 Тер Рпе сіп сіп Пув5 Рго біу б5ег 500 505 510
Бек Ркго Пув Рго Тер І1їе Туг Аза ТПг бек Аб5п Геї Аза бек біу Уаї 515 520 525
Рго Уаі Аку Ріре бек біу бек біу бек біу ТПг бБег Туг бек Іеч ТЕбг 530 535 540
І1е бБег Акуд УМа1і бічц Аза Січ Ар Аїа Аза ТіПг Туг Туг Сув біп сіп 545 550 555 560
Тер ТП бек АБп о Рго Рго ТПг Рпе сіу сіу сіу Тс Гуз Іеч біч Іе 565 570 575
Туз Агуд Тс Уаі Аза Аза Рго бек Ма! Роре Іїе Робе Рго Рго бек Авр
Зо 580 585 590 біч біп Гей Ппув бек сіу ТПг Аїа бек Уаї Уаї Суб Гец Гей Авп АБпП 595 6о0 605
Рпе Тук Рго Аку біп Аза Гуз Уаі біп Тер пуб Уаі АБр АБп Аза Іеч 610 615 620 сСіп бек б1у Авп бег Сіп біц бег Уа1і Тс бі Сіп Авр бБег Пув Авр 625 630 635 640
Бек ТПг Туг бек ТГеч бек бек ТПг Гей ТПг Гей бек Пув Аза АБр Туг 645 650 655 біч Гуз Нів пуб Уа1! Тук Аїа Су5 біп Ма! ТБг Ніз сбіп сіу Геч бБег 6ббо 665 670
Бек Ркго Уа1і ТП Гуз бек Рпе АбБп Акуд сіу сій Суб сіу бек біу Нів 675 680 685
Нів Нів Нів Нів Нів 690 «2105 99 «2115 697 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» анти-С020 кільцевого злитого поліпептиду (2) «4005 199 біп Уаі біп Ге Уаі! сіп Бек сбі1іу Аїа біч Уаії Ппу5з пуб Рго сіу бБег 1 5 10 15
Зек Уа1ї Ппув Ма1ії бек Сув Туз Аза бек сіу Тук Азїа Ріре бег Туг 5ег 20 25 Зо
Тер І1е АБп Тегр Уаі Агу біп Аза Рго сіу сіп сіу Іеч біч Ткр Меє 35 40 45 біу Акуд Іїе Рпбе Рго сіу АБр сбіу АБр ТБПг АБр Туг Авп о біу Ппув Робе 5о0 ів) бо 60 пув біу Агд Ма1 Трпг І1їе ТПг Атїа Авр Пув бБег ТіПг бек ТіПг Аїа Туг 65 70 75 80
Меє біп Іеч бек бек Гей Агуд бек бі АБр ТПг Аза Уаї Тук Тук Сув 85 90 95
Аза Акуд Абп о Уаії Роре АБр біу Туг Тер Геч Уа1і Тугє Тер сб1у біп б1Уу 65 100 105 110
ТПЕ Геч УМа1ії ТБг Уаї бек бек Аза бек ТПг Пув сбіу Ркго бек Уаї Ре 115 120 125
Рго Геч Аїа Ркго бек бек Гув бек ТПг бек сіу сіу ТПг Аза Аї1а Іеч
130 135 140 біу Сув Печ Уаі! Ппув Авр Тугк Роре Рго біцп Рго Уа! Трг Уа1ї бек Тгр 145 150 155 160
АБп бек сіу Аїа Геї ТіПг бек біу Уаі Ніб ТпПг Рре Рго Аїа Уаї1ї Іеч 165 170 175 біп бек бек біу Пес Туг Бек Геч бек бек Уа! Уаі Трг Уаі1ї Рго 5Бег 180 185 190
Бек Бек Геч біу ТБ біп ТБ Тук Іїе Суб АвБп Уаі АБп о Нібв КТу5 Рго 195 200 205 век АБвп ТПг Ппув Уаі Авр Пув Ппув Маї бій Рго Ппуз бек Суз с1у С1У 210 215 220
Сіу біу бек сбіу сіу сіу сіу Бек АБр Гу5 ТПг Нібв ТрПг Суб Рго Рго 225 230 235 240
Сув Рго Аїа Рго бі Геч Геї сіу біу Ргро бек Уаі Рре Гей Рпе Рго 245 250 255
Рго Пув Рго Пув АБр ТПг Теч Меєсє І1їе бек Агу ТПг Рго січ Уаї ТЕбг 260 265 270
Сув Уаії Уаії Уа1і Авр Уа1ї Бек Ні біцп Авр Рко біц Уаї пуб Роре АБп 275 280 285
Тер Туг Ма1 Авр СсСіу Ма1 сі Уа1 Нів Авп Аза Пув ТПг о Гпув Рго Агд 290 295 300 біч біч біп Тук Авп бБег ТПг Туг Агу Уаії Уаії бек Уаі Геч ТПг Уаї 305 310 315 320
Теч Ні біп Авр Тер Геї АБп о сбіу Гуз біч Тук Ппув Сув Пув Уа1ї бБег 325 330 335
АвБп о пуб Аза Геї Рго Аїа Рго Іїе біц пуб ТПг Іїе Бек Ппу5 Аїа Гуз 340 345 350 біу біп Рго Акуд бій Рго біп Маї Тук ТБг Теч Рго Рго бег Агуд Авр 355 360 365 сій Те Тпг о Гпув Авп обіп УМа1ї бег Те ТПг Суб Теч Уа1ї Ппув с1у Ре 370 375 З8о
Тук Рго бек АБр Іїе Аїа Уа! сій Тер сі бек АБп біу біп Рго сіц 385 390 395 400
Авп о Авп о Тук Пув Тс ТБ Ргро Рго Уаі Гей Авр бек Авр сіу Бек Ріе 405 410 415
Рпе Геч Туг бек Гув5 Теч Тбйг Уаі Авр пуб Бек Агу Тгр біп біп с1Уу 420 425 430
Авп оУа1 Рре бек Суб бек Уаії Меєсє Ні сіц Аза Геч Нібв АБп Ні Туг 435 440 445
Тис біп Пув бек Ге бБег Геч бек Рго біу Пув Сіу Сіу с1у С1і1у бег 450 455 460
Сбіу біу біу сіу Бек Ар Іїе Маії Меє Тс біп Тс Рго Гей бек Гей 465 470 475 480
Рго Уа1і ТП Рго біу біц Рго Аза бек І1їе Бек Суб Агу бек бек КТув 485 490 495
Ззек Геч Геч Нів бек АБп біу І1е ТПг Тук Геч Туг Тер Туг Іеч бсіп 500 505 510
Туз Рго біу біп бек Рго бсіп Геч ІТечп І1їе Туг біп Меє бек А5вп Гей 515 520 525
Уаї бек бі1у Маї Рго Авр Агуд Рре бек Сіу бБег Сіу бек б1у ТрПг Авр 530 535 540
Рпе ТпПг Геї Ппуб5 І1е бек Аку Уаі біц Аза сій Абзр Уа1і сіу Уа1ї Туг 545 550 555 560
Тук Сув Аїа біп АБп Теч бій Гей Рго Туг ТПг Роре біу біу біу Тр 565 570 575
Туз Уаі біц Іїе пуб Акуд Тс УМаі Аза Аза Рго бек Уаі Рпе Іїе Ріє 580 585 590
Рго Рго Бек АБр біп біп Теч Ппуз бек сіу ТПг Аза Бек Уаі1ї Уаї Сув 595 6о0 605 60 Пес пеп Ап Авп Роре Туг Рго Акуд біц Аїа пув Уаї біп Тер Пуз Уаї 610 615 620
АвБр Авп Аза Геї біп бек біу АБп бек біп бій Бек Уаі Тс січ біп 625 630 635 640
Авр Бек Пув АБр бек ТПг Тук бек Гец бек бек ТПг Геї ТПг Іеч 5ег 65 645 650 655
Туз Аза Авр Тук січ Ппув Нів Ппуб5 Ма! Туг Аїа Суб5 бій Уа1і ТіПкг Нів 66о 665 670 біп біу Пец бек бек Рго УМаі ТП Гуз бек Ропе Абхп Агуд сіу січ Сув
675 680 685 біу бек біу Нів Нів Нів Ні Нів Нів 690 695 «2105 100 «2115 689 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» анти-сМеє кільцевого злитого поліпептиду УН-очЕ-КпоБ «4005 100 біп Уаі біп Гей сіп сій Бек біу Рко біу Теч Уаі Пу5 Рго бек сій 1 5 10 15
ТПЕ Ге бек ІГеч Тбг Суб ТрПг Уа1! бек сіу Туг бек І1е ТБг 5ег Авр 20 25 Зо
Тук А1а Тер Авп о Тгр І1е Акуд Сіп Рбе Рго СсС1іу ПЦув С1у їеч Січ Тгр 35 40 45
Іїе сіу Туг І1е бек Тук бек біу бек ТПг бек Туг Геї Рго бек Іеч 5о0 ів) бо
Туз бек Акуд Уаі! ТпПг Іїе Бек Агу АБр ТПг бек Пу5 Авп о біп Роре бег 65 7о 75 80
Теч Ппув Пец бек бек Уаі ТПг Аза Аза АБр ТПг Аза Уа1 Тук Тук Сув 85 90 95
Аза Рго Бек Туг Тук Тук біу біу Ппу5з Ніб Уаі Аза Геї Рое Аза Туг 100 105 110
Тгр с1у біп с1іу Тбйг тез Уаї ТЬг Уаї бег бек Аза бБег ТіПг Кув С1У 115 120 125
Рго Бек Маі1і Роре Рго ІТеч Аза Рго бек бек ПубвБ бБег ТПг бек біу б1Уу 130 135 140
ТПг Азїа Аза Іеч сіу Суб Пец Уаї пуб Авр Тугк Роре Рго бій Ркго Уаї 145 150 155 160
ТПг Маї бек Тгр АБп бек біу Аїа Гечп ТПг бек сіу Маії Ні5з Тбг Ре 165 170 175
Рго Аїа Уаі Іеч біп бек бек біу Пец Тук Бек Геї бек бек Уа! Уаї 180 185 190
Таг Уа1ї Рго бек бек бБег Геч Сіу Тпг біп Тис Туг І1їе Сув Авп Уаї 195 200 205
Авп оНів пуб Рго бек АБп Тс пуб Уаії Авр о Ппув пуб УМа1ї бій Рго Гуз 210 215 220
Зек Сув сіу бек біу біу біу біу бек сіу сіу сіу сіу бек АБвр Гуз 225 230 235 240
ТПЕ Ні ТПг Суб Рго Рго Суб Рго Аїа Рго сії ІГеч Іечп Сіу б1іу Ркго 245 250 255
Зек Уа1ї Рре Геї Робе Рго Рго Пу5 Рго Пув Авр ТПг Геч Меє І1е 5ег 260 265 270
Агуд Тпг Рго біз Уаї Трг о Сув Уа1ї УМа1ї Маї Авр Уаї бБег Нів Січ Авр 275 280 285
Рго біц Маї Ппув Роре АБп Тгр Туг Уаі Авр сіу Уаі1і сії Маї Ніб5 АБп 290 295 300
Аа пуб ТПг Ппув Рго Аку бі бі біп Туг Абзп бБег ТПг Туг Агуду Уаї 305 310 315 320
Уаї бек УМаї Іїеч ТБг Уаї Ге Нів сіп АБр Тгр ІГеч АБп біу Ппу5з сіц 325 330 335
Тук Ппув Сув Гуз Уаії бек АвБп пуб Аза Геї Рго Аїа Рго Іїе біц Був 340 345 350
Та І1ї1е бБег Пув Аїа Ппув С1іу Сіп Рго Акд Сі Рго біп Уаї Тує Тіг 355 360 365
Теч Рго Рго Суб Агуд Авр січ Геї ТП Гуз АБп о біп Уаії бек Геч Тгр 370 375 З8о
Сув Теч Уаі Ппув сіу Рбе Туг Рго бек АБр Іїе Аїа Уаі сій Тер сій 60 385 390 395 400 век Авп біу біп Рго біц АБп АбБп Тук пуб ТПг Тс Рго Рго Уаї Іеч 405 410 415
Авр Бек Авр сіу бек Рре Робе Те Тук бек ПпувБ Геч ТПг УМаї АБр Гуз 420 425 430 65 бек Агд Тер Сіп біп с1іу Авп Уа1! Рре бЗег Сув Бег Уаї Меє Нів січ 435 440 445
Аза Ггеч Ні АБп о Нів Тук Тйг біп пуб бек Геч бБег Геч бек Рго б1Уу 450 455 460
Туз біу сбіу сіу сіу Бек сіу сбіу бі1у біу бек АБр Іїе біп Меє Тс 465 470 475 480 біп бек Рго бек бек Геч Бек Аїа бек Уа! біу АБр Аку Уаі ТПпг Ше 485 490 495
ТВг Сув Акуд ТБг о бегє бій Авп Іїе Тук бек Туг Ге Аза Тгср Туг біп 500 505 510 біп губ Ркго біу Пув Аза Рго пуб ІГеч ІТеч Уа! Туг АБп Аза Пуб5 ТПг 515 520 525
Теч Аїа сбіц сіу Уа1і Рго Бек Аку Ріре бек біу бек біу бек с1у ТПг 530 535 540
АвБр Рпе ТПг Геї ТіПг І1е бек бек Ге біп Рго бій АбБр Рое Аза ТЕГ 545 550 555 560
Тук Тук Суб біп Нів Нів Тук сіу ТПг Рго Рре Тс Рое сіу сбіп с01УуУ 565 570 575
Та пуб їеч Січ І1е Пу5 Агуд ТБс Уаї Аїа Аїа Рго бБег Уаї Ріре І1е 580 585 590
Рпе Рго Рго бек АБр біч біп Гей пуб бек сіу ТПг Аїа бек Уаї Уаї 595 6о0 605
Сув Геч Гей Авп Авзп Рре Туг Рго Аку бічЧ Аза Ппуз Уа1і! сіп Тер Гув 610 615 620
Уаї АБр АБп Аза Те біп бек сіу АбБп Бек біп біп бек Уа! Тс сіц 625 630 635 640 біп Авр бек пуб Авр о бБег ТПг Туг бек ТІГеч бег бек ТПг Гей ТпПг Гей 645 650 655 бек Ппув АТїа Авр Туг січ Кув Нів Ппув Маі1і Туг Аїа Сув Січ Уаї Тіг 66о 665 670
Нів сбіп біу Течп бек бек Рго Уаі ТпПг Ппуб5 Бек Роре АБп Агу біу сіц 675 680 685
Сув
Зо «2105 101 «2115 692 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» анти-сМеє кільцевого злитого поліпептиду УН-іп-Кпор «4005 101
АБр Іїе сбіп Меє ТПг о біп бек Рго бек бек Гечс Бек Аїа бек Уаі б1Уу 1 5 10 15
Авр Агуд УМаїії Таг І1е Трг Сув Агуд Тбг беє Січ Ап І1е Туг бег Туг 20 25 Зо
Теч Аїа Тер Тук сбіп сіп Пув Рго біу Гуз Аза Рго ПувБ Геч Геч Уаї 35 40 45
Тук АБп Аїа Туз Тпйг Ге Аза сі сіу УМа1і Ркго бек Агу Ропе бесг с01УуУ бо
Бек сіу Бек біу ТБг АБр Рпе ТПг Гец ТПг Іїе бБег бек Іеч біп Рго 65 70 75 80 біч А5р Рпе Аза ТПг Туг Тугк Суб біп Ні Нів Туг біу ТПг Рго Ріе 85 90 95 50 ТаЕ Рпе сі1у Сіп С1у Тпг Пув Тез бі І1е Пув Агу Тбг Уаї Аїтїа А1а 100 105 110
Рго Бек Маі Роре Іїе Робе Рго Рго бек Авр сії сбіп Геч Гу5 бек б1у 115 120 125
ТПг Аїа бек Уаії Уаї Суб Пец Гей Абзп Ап Рре Туг Рго Агу біч Аїа 55 130 135 140
Туз Уаі біп Тер пуб Уа1і АБр АБп Аза Тез біп бек біу Ап бек сіп 145 150 155 160 біч бек Уаі ТП сій сбіп Авр бек Куб Авр бег ТПг Тукг бек Геч бБег 165 170 175 60 век ТПг Гей ТПг Гей бек Пув Аза Авр Тук біп Ппувз Нів Ппуз Уаї Туг 180 185 190
Аа Сув сії Ма1ї ТП Ні біп біу Пец бек бек Рго Уа1і ТПг Пув5 б5ег 195 200 205
Рпе АбБп Агуд сіу біз Суз біу біу сбіу сіу бек сіу сіу сіу біу б5ег 65 210 215 220 сбіу біу біу сіу Бек Авр Пуб5 ТП Ні ТБг Сув Рго Рго Суб Рго Аза 225 230 235 240
Рго біц Геч ІГеч біу біу Ркго бек Уа! Рпе Геї Роре Рго Рго КТув5 Рго
245 250 255
Тув АБр Тс Гес Меє Іїе бек Аку ТПг Рко біц Уаі! ТпПг Суб Уа1ї Уаї 260 265 270
Уаї АБр Уаї бек Ніб бій Авр Рго сії Маї Гуз Робе АБп Тгр Тук Уаї! 275 280 285
Авр о сіу Уаі1і сії Маї Ніб5 АБп Аза Пу5 ТПг пуб Рго Агуд січ бі біп 290 295 300
Тук АБп бек ТПг Туг Акуд Уаї Уа1! Бек Уа1ї Геї ТПг Уаї Іеч Нів сіп 305 310 315 320
АБр Тер Ге АБп о біу Ппув біч Тук Ппув Сув Ппув УМа1ї бек АБп Пуз Аїа 325 330 335
Теч Рго Аза Рго Іїе сії Ппу5 ТПг І1е бек Гуз Аїа Пу5 с1іу біп Рго 340 345 350
Агуд бій Ркго біп Маї Тук ТБг Те Рго Рго СубБ Агуд АБр січ Іеч ТЕГ 355 360 365
Туз АБп обіп Уа! бек Геї Ткгр Суб ІГеч Маї їув біу Рре Тугк Рго бБег 370 375 З8о
АБр Іїе Аїа Уаі сії Тер біч бек АвБп біу біп Рго бі АБп АБп Туг 385 390 395 400
Пув ТПг ТВ Рго Рго УМаії Гей Авр бБег Авр біу бек Рре Роре Ге Туг 405 410 415 зек пуб Геї ТПг УМаії Авр Гуз бег Агуд Тер біп біп б1у АвБп Уаї Ре 420 425 430
Ззек Сув Бек Маі Меє Нібз біц Аза Гец Нібв А5п Ні Туг ТПг біп Гуз 435 440 445
Зек Пес Бек Геч бек Рго біу Ппуз сіу сіу сіу сіу Бек біу бі1іу б1Уу 450 455 460 біу бек біп Уаі сіп Ге сіп сі бек біу Рко біу Ге Уаї Ппув Рго 465 470 475 480 бек бі Тпг Геч бБег Геч Тип Суб Трг Уа1і бек сіу Туг бек І1е Тіг 485 490 495
Бек Авр Туг Аїа Тгр АБп Тгр І1їе Аку біп Рпе Рго сіу Ппув б1Уу Іеч 500 505 510 біч Тер Іїе сіу Тук Іїе бБег Туг бек біу бек ТПг бек Тукг Геч Рго 515 520 525
Ззек Геч Ппув бек Агку Ма! ТПг І1е бек Агу Ар Тбг бБег Пуб5 АБп біп 530 535 540
Рпе Бек Геч пуб ІГеч бек бек Уаі ТрПг Аза Аза А5р ТПг Аза Уа1ї Туг 545 550 555 560
Тук Сув АТїа Рго бек Туг Туг Тук сі1у с1у Пув Нів Ма1і Аїа Іеч Рре 565 570 575
Аза Тук Тер сіу біп біу ТБг Теч Уа! Трг Уа1ї Бек Бек Аїа бек ТЕГ 580 585 590
Туз біу Рго бек Уа1і Рре Рго Геї Аза Рго бег бек пуб бек ТПг бБег 595 6о0 605
Сбіу бі1у ТЕ Аза Аза Гечп сіу Суб Геч Маї Гув Авр Тукє Рпе Рго сій 610 615 620
Рго Уа1і ТПг МУМаї бек Тгр АБп бек біу Аїа Геї ТПг бек сбіу Уаї Нів 625 630 635 640
ТВЕ Рпе Ркго Аїа Уаії Пеп біп бек бек сбіу Пес Туг бек Гей бег 5бег 645 650 655
Уаї Маї ТБг Уаї Рго бек бек бек Геї сіу Тс біп ТбПг Тук І1е Сув 66о 665 670
Авп оУа1і Авп о Нів пуб Ргро бек АБп ТПг пуб Уа1і Авр о Ппув Ппув Уаї січ 675 680 685
Рго Пув бек Сув 690 «2105 102 «2115 685 бо «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» анти-сМеє кільцевого злитого поліпептиду УН-очЕ-По1е «4005 102 65 сі Уаї Сіп теп Уаї Сіп бек сі1у Аїа Січ Ма1ї Ппув Пув Рго с1у січ 1 5 10 15
Ззек Геч Ппув І1е бек Сув КГув біу бек біу Тук Бек Рре ТПг Аза Туг 20 25 Зо
Рпе Іїе АБп Ткгр Маі Аку біп Меє Рго сіу Ппув сіу Іеч біч Ткр Меє 35 40 45 біу Акуд Іїе Тук Рго Тук АБп біу АБп ТЕ Робе Туг Авр біп бек Ріе 5о0 ів) бо біп біу біп УМаії Тс І1їе 5Бег Аїа Авр Губ5 бег Іїе бег ТПг Аїа Туг 65 70 75 80
Теч біп Тер бек бек Геч Ппу5 Аза бек АБр ТіПг Аза Меє Тук Тукгк Сув 85 90 95
Аза Акуд Тер АБр о Тук АБп о Туг Авр о Уаі! Тер сіу сбіп сі1іу Тбг Тс Уаї 100 105 110
ТПг Маї бек бек Аза бек ТПг пуб сіу Рго Бек Маі Рое Рго Іеч Аїа 115 120 125
Рго Бек Бек пуб бек ТПг бек біу біу ТПг Аза Аза Геч сіу Сув5 Іеч 130 135 140
Уаї цЦув Авр Туг Рре Рго бій Рго Уа1і ТіПг Уаї бек Тгр Авп бек С1У 145 150 155 160
Аа Геч ТПг бек біу Маії Нів ТБбг Рре Рго Аїа Уаії Геї сіп бек 5ег 165 170 175 біу Геч Тук бек Гецп бБег Бек УМаі УМаі! ТБг Уаі! Рго бек бек бек Гей 180 185 190 біу ТЕ біп Тбпг Ту Іїе Суб АБп о Уаі АБп Нібв пуб5 Рго бек АБп о ТПг 195 200 205
Туз Маії Авр пуб пуб Уа1ї сій Ркго Гув5 бек Сув біу сбіу сіу сіу бБег 210 215 220 сіу бі1у с1у с1іу бек Сі1у сіу сі1у Сіу бек Авр пуб ТіПг Нів ТіПг Сув 225 230 235 240
Рго Ркго Сув Рго Аїа Рго біч їецш Гей сіу сіу Рго Бек Маі1ії Роіе Іеч 245 250 255
Рпе Ркго Рго пуб Рго Гу5з АБр ТПг Гей Меє Іїе Бек Агу ТПг Рго січ
Зо 260 265 270
Уаї ТЕ Сув Уаії Уаї Уаї Авр Уа1і Бек Нібв бій АвБр Ргко біч Уаї Пув 275 280 285
Рпе Абвп Тгр Тук Маі АБр біу Уаі біц Уаі Ніб Ап Аза Пу5 ТіПг Гуз 290 295 300
Рго Акд сії Січ біп Туг Авп бег Трг Тує Агу Ма1 Уаї бек Уаї Іеч 305 310 315 320
ТПгЕ Маї Іеч Ні біп Абвр Тер Геч Ап сіу Ппув бі Тук Гув Сув Гуз 325 330 335
Уаї Бек АБп Гуз Аза Гей Рго Аза Рго Іїе сії Гу5 Тбг І1е бек Пув 340 345 350
Аза ПпувБ сіу біп Рго Аку бі Ргко біп Уаї Суб ТпПг Геї Рго Рго 5ег 355 360 365
Агуд Авр о біч Геч ТБ Гуз АБп обіп Уаії бек Геч бек Сув Аїа Уаї Гуз 370 375 З8о с1у Рпе Туг Рго бек АБвр І1їе Аїа Уаі Сі Тгр Сі бек Ап с1у сіп 385 390 395 400
Рго біц АБп АБп о Тук Гув Тбг ТБЕ Рго Рго Уаі Геї АБр 5ег АБр б1Уу 405 410 415
Зек Рпе Рбе Геч МУМаі! бек Гув Ге ТБПг Уаі! Авр Пубв бБег Агу Тер біп 420 425 430 біп бі1у Авп Уа1! Ррпе бБег Сув бек Ма! Меєсє Ні біц Аза Гей Нібв Ап 435 440 445
Нів Тук ТП біп Гувз бек Гей бек Геч бек Рго біу Гуз біу с1у .Ш1УуУ 450 455 460 сіу бек сі1у сіу сіу Сі1іу Бек сії І1їе Уаї теп Трг Сіп бБег Рго Аза 465 470 475 480
ТПЕ Ге бек Тез бек Рго біу біц Агуд Аза ТПг Ге бек Суз Агу Аза 485 490 495 бЗек Бек Бек Маії бек Нів ІТеч Туг Тер Тук біп сбіп Пув Рго біу біп (516) 500 505 510
Аза Рго Акд Геї Тгр І1е Туг АвБр ТПг бек А5п Геї Аза бек біу Уаї 515 520 525
Рго Аіїа Акуд Ріре бек біу бек Агкуд бек біу ТПг Авр Рре ТПг Іеч Тс 530 535 540 65 І1е бБег бек їеч біц Рго Січ Авр Рре Аїа Уа1ї Туг Рре Сув Нів сіп 545 550 555 560
Агуд Тпг АвБп о Туг Рго Тер Тс Рбе біу біп сіу ТпПг Ппу5 Геч січ Іе 565 570 575
Туз Агуд Тс Уаі Аза Аза Рго бек Ма! Роре Іїе Робе Рго Рго бек Авр 580 585 590 біч біп Гей Ппув бек сіу ТПг Аїа бек Уаї Уаї Суб Гец Гей Авп АБпП 595 6о0 605
Рпе Туг Рго Акуд бійц Аїа пув Уаі біп Тер Пуз Уаї Авр АБп Аїа Гей 610 615 620 біп бек біу Авп бек біп бі бек Ма! ТБг бічЧ біп Авр бек пуб Авр 625 630 635 640
Бек ТіПг Туг бек ТІГечп бек бек ТПг Гецп ТПг Бек Геч бек Гуз Аза Ар 645 650 655
Тук січ Гуз Ні Гуз Уаії Тук Аїа Суб сії Маії ТПг Нівз біп с1іу Гец 66о 665 670
Зек Бек Рго Маі ТПг Гуз бек Ропе Абп Агуд сіу січ Сув 675 680 685 «2105 103 «2115 686 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» анти-сМеє кільцевого злитого поліпептиду УМН-очЧЕ-пПо1е-СН-СІ-сгроввей «4005 103 біч Уаії біп Ге Уаі! сіп Бек сбіу Аїа біч Уаі! Ппуз пуб Рго сіу сій 1 5 10 15
Ззек Геч Ппув І1е бек Сув КГув біу бек біу Тук Бек Рре ТПг Аза Туг 20 25 Зо
Рпе Іїе АБп Ткгр Маі Аку біп Меє Рго сіу Ппув сіу Іеч біч Ткр Меє 35 40 45 біу Акуд Іїе Тук Рго Тук АБп біу АБп ТЕ Робе Туг Авр біп бек Ріе 5о0 ів) бо сіп б1іу біп Ма1 Трг І1їе бБег Аїа Авр Пув бБег І1е бегє ТіПг Аїа Туг 65 70 75 80
Теч біп Тер бек бек Геч Ппу5 Аза бек АБр ТіПг Аза Меє Тук Тукгк Сув 85 90 95
Аза Акуд Тер АБр о Тук АБп о Туг Авр о Уаі! Тер сіу сбіп сі1іу Тбг Тс Уаї 100 105 110
ТВг УМаї бек бек бек Аїа Уаі Аїа Аза Рго Бек Маі Роре І1е Робе Рго 115 120 125
Рго Бек АБр сії біп Теч Гуз бек біу ТПг Аза Бек Уа1і Уаї Сув5 Іеч 130 135 140
Пес Авп Авп Робе Тук Рго Агу бій Аїа Ппуз Уаі! біп Тер Пув Уаі1ї! Авр 145 150 155 160
АБп Аза Геї сіп бек біу АБп бек біп біц бек Уаі ТПг січ сбіп АБр 165 170 175 зек Ппув АБр бек ТПг Тук бек Гец бек бек ТПг Геї ТіПг Геч бек Гуз 180 185 190
Аза Авр Тук січ пуб Ні Гуз Уа! Тук Аза СубБ сії Уа1і Тс Нів сіп 195 200 205 біу Пец бек бек Рго Уа1і ТПг Ппуб5 бек Рпе АБп Агуд сіу січ Сув с1УуУ 210 215 220 сіу бі1у с1у бек с1іу С1у сіу сіу бек сі1у сіу С1у С1у Бег Авр Гуз 225 230 235 240
ТПЕ Ні ТПг Суб Рго Рго Суб Рго Аїа Рго сії ІГеч Іечп Сіу б1іу Ркго 245 250 255
Зек Уа1ї Рре Геї Робе Рго Рго Пу5 Рго Пув Авр ТПг Геч Меє І1е 5ег 260 265 270
Агуд Тпкг Рго бій Маї Тс Сувз Уаії Уаії Уаї Авр Уаії Бек Нібв січ Ар 275 280 285
Рго біц Маї Ппув Роре АБп Тгр Туг Уаі Авр сіу Уаі1і сії Маї Ніб5 АБп 290 295 300 60 Аза Ппув Трпг Пув Рго Агд Сі Січ біп Туг Авп бег Тпг Туг Агу Уаї 305 310 315 320
Уаї бек УМаї Іїеч ТБг Уаї Ге Нів сіп АБр Тгр ІГеч АБп біу Ппу5з сіц 325 330 335
Тук Ппув Сув Гуз Уаії бек АвБп пуб Аза Геї Рго Аїа Рго Іїе біц Був 65 340 345 350
ТПг І1ї1е бек Гуз Аза пу5 сіу біп Рго Акуд бій Рго біп Уаї Су5 Тр 355 360 365
Теч Рго Рго бек Агуд АвБр сії Геї ТП Гуз АБп о біп Уаї бек Геч бБег
370 375 З8о
Сув Аїа Уаії Ппув сіу Рбе Туг Рго бек АБр Іїе Аїа Уаі сій Тер сій 385 390 395 400 век Авп біу біп Рго біц АБп АбБп Тук пуб ТПг Тс Рго Рго Уаї Іеч 405 410 415
Авр Бек Авр сіу бек Ріре Рібе Те Уаії бек Ппув Геї ТПг УМаї АБр Гуз 420 425 430 ек Акуд Тер біп біп біу АБп Уаі Рре бек СубвБ Бек Уа1і Меє Нів січ 435 440 445
А1їа Геч Нів АБп Нів Туг ТПг біп Ппув бек Пец бек Гей бБег Рго сб1УуУ 450 455 460
Туз біу сбіу сіу сіу Бек сіу сіу біу біу бек біц Іїе Уа1і Геч Тс 465 470 475 480 біп бек Рго Аїа ТПг Гей бБег Ге бек Рго біу біц Агуд Аїа ТпПг Гей 485 490 495 зек Сув Агкуд Аїа бек бек бек Уаі бек Нібв Геч Туг Тгр Тугєк біп сіп 500 505 510
Туз Рго біу біп Аза Рго Ак Геї Тгр І1е Туг АвБр ТПг бек Авп Гей 515 520 525
А1їа Бек сіу Уаі1і Рго Аїа Аку Ріе бБег Сіу бек Агуд бБег С1у Типг Авр 530 535 540
Рпе ТПг Геї ТПг І1е бек бек Те біц Рго бій Ар Рре Аїа Уа1ї! Туг 545 550 555 560
Рпе Суб Нів біп Аку ТБг АБвБп Туг Рго Тер ТПг Рбе сіу сіп сб1у ТЕбг 565 570 575
Туз Теч біц Іїе ПувБ Бек Бек Аїа бек ТПг Гуз біу Рго бек Уа1 Роіе 580 585 590
Рго Геч Аїа Ркго бек бек Гув бек ТПг бек сіу сіу ТПг Аза Аї1а Іеч 595 6о0 605 сі1у Сув Печ Ма1 Ппув Авр Туг Рре Рго біц Рго Уаі1і Тіг Уаі1ї бег Тгр 610 615 620
АБп бек сіу Аїа Геї ТіПг бек біу Уаі Ніб ТпПг Рре Рго Аїа Уаї1ї Іеч 625 630 635 640 біп бек бек біу Пес Туг Бек Геч бек бек Уа! Уаі Трг Уаі1ї Рго 5Бег 645 650 655
Бек Бек Геч біу ТБ біп ТБ Тук Іїе Суб АвБп Уаі АБп о Нібв КТу5 Рго 66о 665 670 век Авп ТПг Ппув Маі АБвр о Гувз пуб Уаії бій Рго Пув Бек Сув 675 680 685 «2105 104 «2115 683 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» анти-сМеє кільцевого злитого поліпептиду УМН-очЧЕ-пПо1е-УН-МУ1-сговвей «4005 104 біч Іїе Уаії Гей ТПг сіп Бек Рго Аїа ТПг Іец бек Гец бек Рго с1у 1 5 10 15 біч Акуд Аза Тбг Гей бек Сув Агу Аза бек бег бек Уаії бек Нів Гей 20 25 Зо
Тук Тегр Тук біп біп Гуз Рго біу сбіп Аза Рго Агу Іечп Тгр Ії1е Туг 35 40 45
АвБр ТПг Бек АБп Геї Аза бек біу Уаі Рго Аіїа Аку Рре бек біу б5ег 5о0 ів) бо
Агуд Бек Сс1у Тпг Авр Рре Тс їец Трг І1е бек бБег їеч Січ Рго січ 65 70 75 80
Авр Рпе Аїа Уа1і Тук Рре Су5з Ні біп Агуд ТПг Абп Туг Рго Тер Тс 85 90 95
Рпе сіу сбіп сбіу ТБ Гуз Теч біц Іїе Пув бБег Бек Аїа бек ТПг Гуз (516) 100 105 110 біу Ркго бек Уаі Ррпе Рго Геї Аза Рго бек бек пуб бек ТПг Бек с1Уу 115 120 125 біу ТЕ Аза Аїа Геп сіу Суб Геч Маії Гуз АБр Туг Роре Рго бій Рго 130 135 140 65 Уаї Тиг Уаї бег Тгр Авп бБег сСіу Аїа їец Трг бек Сіу Ма1 Нів Тс 145 150 155 160
Рпе Рго Аїа Уаії Іечп біп бек бек біу ГПечп Туг Бек Геч бек бек Уаї 165 170 175
Уаї Трг Уаї Рго бек бек бек Геч сіу ТПг біп Тс Тук Іїе Су5 Авп 180 185 190
Уаї АБп о Нів пуб Рго бек Авп ТПг Ппув Маі АБвр о ТГу5з пув Уаї сбіц Ркго 195 200 205 пув бек Сув біу Бек сіу сіу сіу сбіу бек біу біу біу біу бБег Авр 210 215 220
Тув ТБпЕ Нібв Тс Суб Рго Рго Суб Рго Аїа Рго біц Гец Ге сіу с1у 225 230 235 240
Рго Бек Ма1і Роре Те Робе Рго Рго пуб Рго Пубв АБр ТПг Іечп Меє Те 245 250 255
Бек Акуд ТПг Ркго біп Ма! ТБг Сув Уаії Уа1і Уа1і Авр Уаі1ї бек Нів січ 260 265 270
Авр Рго бі Маї Ппуб5 Роре АБп о Тгр Тук Уаі Авр сіу Уа1і січ Уаї Нів 275 280 285
АБп Аїа Ппуз ТВг Ппув Рго Акуд бій бій біп Тук Авп бек ТПг Туг Агд 290 295 300
Уаї УМаї бек Уаі Ге ТБПг Уаї Гечш Нів сіп АБр Тгр Теч АБп б1іу Пув 305 310 315 320 біч Тук Ппув Сув пуб Уа1ї Бек АБп Гуз Аза Тез Рго Аїа Рго Іїе сій 325 330 335
Туз ТП Іїе бек ПувБ Аза Ппув біу біп Рго Акуд бі Рго біп Уа1ї! Сув 340 345 350
ТПЕ Геї Ркго Рго бек Агуд Авр бі Геч Тс Ппуб5 АБп обіп Уа! бек Гец 355 360 365 бЗек Сув Аїа Ма1ї Ппув СсСіу Рпе Туг Рго бек АБр Іїе Аїа Уа1ї Січ Тер 370 375 З8о біч бек АвБп сбіу сбіп Рго бі АБп АвБп Туг ГПу5 Тс Тпг Рго Рго Уаї 385 390 395 400
Теч АБр бек Авр сіу Бек Рібе Робе ІГеч Ма! бек Гув Гец ТПг Уаі1і Авр
Зо 405 410 415
Туз бек Агуд Тер біп біп сбіу АБп Уа! Рібе бек Суб бек Уа1і Меє Ні 420 425 430 біч Азїа Гецп Ніб Авп Нібв Туг ТПг біп ув бек Тец бек Гей бек Рго 435 440 445 с1у цЦув Сі1іу сіу сіу Сіу Бек сіу Сіу С1у сіу бек Січ Уаї Ссіп Ієц 450 455 460
Уаї біп бек біу Аїа сі Уа1ї Ппу5 Ппув Рго біу біч бек Ге Ппув5 Ше 465 470 475 480 зек Сув Ппув біу бек біу Тук бек Рпе ТПг Аза Тугк Роре І1їе АБп Тгр 485 490 495
Уаї Аку біп Месє Рго сіу пуб сіу Геї сії Тер Меє с1у Агу І1е Туг 500 505 510
Рго Тук АБп о біу АБп Тс Рбе Туг Авр біп Бек Рре сіп біу біп Уаї 515 520 525
Тис І1ї1е бБег Аза АБр Пув бег І1е бег ТрПг Аїа Туг їеч Сіп Тгр бег 530 535 540 зек Геч пуб Аїа бек АБр ТПг Аза Меє Туг Тугк Сув Аїа Агу Тгр Авр 545 550 555 560
Тук АБп Тук Авр Уа! Тер сіу біп сіу Тбг Тс Уа1і! ТБг Уаї бек бег 565 570 575 зек Аїа Уаі Аїа Аза Рго бек Уаі Рпе Іїе Рпе Рго Рго бек АБр січ 580 585 590 біп Геч Ппуз бек сіу ТпПг Аїа бек УМаі УМаї Сув Те Гей Авп Авп Ріе 595 6о0 605
Тук Рго Акуд Сі Аза Пув УМаї Сіп Тер пув Уаі1і Авр Ап Аїа Іеєч Сіп 610 615 620
Зек біу АБп бек біп біц бек Уаі ТП бій біп Авр Бек Пув АБр 5ег 625 630 635 640
ТПг Тугк бек ТІГечп бек бек ТПг Гецп ТпПг Гечп бек Гуз Аза АБр Тук біц (516) 645 650 655
Туз Нівз Ппув Уа1! Тук Аза Суб січ Маії ТБг Нів біп сіу Гей бек бБег 66о 665 670
Рго Уа1і ТП Ппув5 бек Ропе А5п Агуд сіу січ Сув 675 680 65 «2105 105 «2115 120 «2125 РЕТ «213» Ното 5арієпь
«221» ІНША ОЗНАКА «222» (131)..(131) «223» Х-Е або р «2205 «221» ІНША ОЗНАКА «222» (133)..(133) «223» Х-М або І «4005 105
Авр пуб ТПЕ Ні ТБ о Сув Ргро Рго Суб Рго Аїа Рго січ Іеч Іеєч С1Уу 1 5 10 15 біу Ркго бек Уаі Рпе Геч Робе Рго Рго Гу5з Рго Губ Авр ТПг Геч Меє 20 25 30
І1їе Бек Аку ТП Рко біч Уа! ТБг Суб Уа1і! Уа1і Уа1і АБр Уаї бек Нів 35 40 45 біч Авр Ркго біц Уа1і Ппубв Роре АБп Тр Туг Уаі Авр сіу Уа1і січ МУаї 50 55 6о
Нів АБп Азїа Гуз Тпг пуб Рго Агуд бій бій біп Тук АБп бек Тс Тусг 65 70 75 80
Агуд Уаіїії Уаї бек Уаї їеч ТЬг Уаї Ієц Ні Сіп Авр Тер Геч АБп С1УуУ 85 90 95
Туз бічЧ Тук Ппув Сув пуб Уа1і Бек АБп Гуз Аза Те Рго Аїа Рго Те 100 105 110 біч Гпу5 ТЕ Іїе бек Пув Аїа Гув

Claims (5)

115 120 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Димерний злитий поліпептид, який містить: Зо перший злитий поліпептид, що специфічно зв'язується з мішенню, що містить першу частину зв'язувального домену, другу частину зв'язувального домену і спейсерний домен, в якому: - спейсерний домен являє собою поліпептид і містить принаймні 25 амінокислотних залишків, - перша частина зв'язувального домену являє собою поліпептид, який злитий або безпосередньо, або через перший лінкер з М-кінцем спейсерного домену, - друга частина зв'язувального домену являє собою поліпептид, який злитий або безпосередньо, або через другий лінкер з С-кінцем спейсерного домену, - перша частина зв'язувального домену та друга частина зв'язувального домену одного і того ж одноланцюгового злитого поліпептиду асоціюються і утворюють функціональний сайт зв'язування, який специфічно зв'язується з мішенню, і другий злитий поліпептид, який специфічно зв'язується з мішенню, що містить першу частину зв'язувального домену, другу частину зв'язувального домену і спейсерний домен, в якому - спейсерний домен являє собою поліпептид і містить принаймні 25 амінокислотних залишків, - перша частина зв'язувального домену являє собою поліпептид, який злитий або безпосередньо, або через перший лінкер з М-кінцем спейсерного домену, - друга частина зв'язувального домену являє собою поліпептид, який злитий або безпосередньо, або через другий лінкер з С-кінцем спейсерного домену, - перша частина зв'язувального домену та друга частина зв'язувального домену одного і того ж одноланцюгового злитого поліпептиду асоціюються і утворюють функціональний сайт зв'язування, який специфічно зв'язується з мішенню, в якому перший та другий злиті поліпептиди є ідентичними або різними і в якому спейсерний домен першого злитого поліпептиду ковалентно кон'югований зі спейсерним доменом другого злитого поліпептиду.
2. Димерний злитий поліпептид за п. 1, в якому перша частина зв'язувального домену являє собою варіабельний домен важкого ланцюга антитіла, а друга частина зв'язувального домену являє собою варіабельний домен легкого ланцюга антитіла або навпаки.
3. Димерний злитий поліпептид за будь-яким із пп. 1-2, в якому перша частина зв'язувального домену являє собою важкий ланцюг Раб-фрагмента антитіла, а друга частина зв'язувального домену являє собою легкий ланцюг Гар-фрагмента антитіла або навпаки. 60
4. Димерний злитий поліпептид за п. 1, де злитий поліпептид не містить варіабельних доменів антитіла.
5. Димерний злитий поліпептид за будь-яким із пп. 1-4, в якому перша частина зв'язувального домену та друга частина зв'язувального домену асоційовані ковалентно одна з одною за допомогою дисульфідного зв'язку.
б. Димерний злитий поліпептид за будь-яким із пп. 1-5, в якому спейсерний домен містить шарнірну ділянку антитіла або її (С-кінцевий) фрагмент і СН2-домен антитіла або його (М- кінцевий) фрагмент.
7. Димерний злитий поліпептид за будь-яким із пп. 1-6, в якому спейсерний домен містить шарнірну ділянку антитіла або її фрагмент і СН2-домен антитіла, і СНЗ-домен антитіла або його фрагмент.
8. Димерний злитий поліпептид за будь-яким із пп. 1-7, в якому перший і/або другий лінкер являє собою пептидний лінкер.
9. Пара виділених нуклеїнових кислот, які разом кодують димерний злитий поліпептид за п. 1.
10. Клітина-хазяїн, що містить пару нуклеїнових кислот за п. 9.
11. Спосіб одержання злитого поліпептиду, що включає культивування клітини-хазяїна за п. 10 з одержанням злитого поліпептиду або димерного злитого поліпептиду і виділення злитого поліпептиду або димерного злитого поліпептиду з клітини або культурального середовища.
12. Фармацевтична композиція, яка містить димерний злитий поліпептид за п. 1 і фармацевтично прийнятний носій.
13. Димерний злитий поліпептид за п. 1 для застосування як лікарського засобу.
14. Застосування димерного злитого поліпептиду за п. 1 для приготування лікарського засобу. Мк Оу а що ОХ жання г пики. с м с А и ек ж З ше А Ух с : шанни и ВН ниви йо о. викине с ники. о. нини. о ж х : Я: Ж ВУХ нини: с не ОККО ший о. винне; о. виник с ШИ: шо а в Я ах МК ЯК: в нижні с пеня о.
Б. Б. І Ще й й Щек х
Фіг.
зма уту я ки о рракекК КК нн роки о. : ення Ка: Я Я Ж с о У о М К. кунмкиннии Бобові М | с ши Я в м АН. илену ШЕ 0 шщ Б 1 ЕТ-
лий. о. с : ння ше 00000 ше у | о. с п, Книш ек о. с п т екеже о. о. о . пе НН РАК юю І. ке НИХ | о. о ше, нЕннаейй п. ши шинежи ай с шк минав кий | с в шЕжжш й, с ве мижениййе г шу нинжн ий її шо ння, Ії ПО ення о. Б Конні І БЕ ЯЕЕЕ ше | і о . НЕ МИШИН: І НН К у Ка о ОХ ЕК ЕЕ Генні о: МІНІ
Фіг. 2
ОВ ПИ с Ба МКК ковка двооінонюов сонанея ни : | т в: ФЕТА ЕНН ! о. п АЙ ЕЕНЕЕЕВееиненнне за Б й З зерня ЖК: ЗК со В: ЕН ЕЗЙ КОХ Ж ет нших шинннянни жа о ОХ КО КК Ж З сов. ж НЕ о За ква | о. о зей СУК і КО КО З КЗ КЕ о | о КЕ: що ВЕ Я .
о. п п о с. | Я СХ ЖЖ о ї о СЕ о тут о. о у о че / ШИЮ »
о. ПОЛА й р о. | І " "ан нийннкнниннкик РЕННЯ ее Дфнінфнінфнін ВВА ЯК НЕ З ВККЯК хквнн є ЕЕ ЕЕЕЕ ЕЕ
Фіг. 26
Й вх шк вн ее о днів чо Р й й Кесненн кое же " ши о» З Мк дра г шо елкюя, я Ан дяня 0 ш же с Гері ее би с ні І КН зи ЕХ 1 3 БВ М АК У: ОО Б Б ОН винний ии о Б ши ениші щЕ с в КЕНЕ кри г . хв НЕ ЖЕК шенні я ши КК с 0 ЕН І ЯК АК АК п 0 БО КУ во с жу ПЕН КК о. 0 р какякі , НО. кикик й НО ваших і Що
Фіг. З яв: З УКХ га ЖК кенанутня Е жа: що В ню о свій ФММ ния "ОД, сш 000 я - ЕН Я я ОБ ія У с Зк У СО ши Дитучточетеееетя м Ж о М! Еко 22525 ШИ но ца ев Бен КО мейсй шик ОО НН шо. 000 р и БЕ се НО нн осо ша: ОО ЗК ОВ ШИ пеня "ЕНН вишжайк й ит хом БЕ ННЕ дня ро І маш: и нн о кв ІК миша: ие ше миши г С ЕЕ ЕАКК кН мк; че; ШІ МЕН о. ОО ше НН гав ае йкх й ШИ СК с о Ше ЕВ НОК ях УА АИ у оов МИК о Ов БЕН нива о ші Ї Е ; о ВЕ М ВО, КЕНЕ пиши жі МО о. с ЕНН маки НИ І вЕнЕшЕ о - ЕЕ ввижих Мо ОВ а ПЕН панки 000 НЕ в, І; шана Мр М ОВ ОВ й БЕН Я содовий с щи ТЕЕКЕКЖ рен Мо сссьньнЙ ла ше
Фіг. 4А котик Маки БД ЗД тенту їе ННЯ Ше м і. ІБН НН ! ! з ОО о ТУ. ЕНН Ї її МО КО Ж ї ВЕК КЕКВ ок ун ПАК Кр й п . о 0» я. до М о. що о. ння ння ; : о. . п | о . Ох у о. ка БО ж ВО. ВОК ЕХ о. ОО КК х о БОБ Ї о СУ ЕК І Б о ї і. : ВО Ен п. 00 ба о п м НН її пот ен он у НН миши КП ; дій ши І ІК Ме ай
Фіг. 46 реч 5 шо и ДИ зва . е Е ла
Фіг. 5
Ж З кі їх 1 хі кі Ж У ЕН ЗЕ ї 38 КЕ кі я ЩЕ її Ж: з СУШІ і хх: 3: ї Ж її Ж І 1 її я 5 4 я киену шенню ЩЕ ж хе СОКУ нт я ЕВ а п нн а ВИ її кю го с і не 1 з бю кА Ж: ї її й її ж ЖІ ОХ ЕХ ЕН М мк що з їз їх ї ї ї У У ж ЕЕ т ЗШ х ЕК г: і ТІВ Ж: х 5 х. Ку ГУ хо ї у СОЖ ЕЕ ЗЕ: ТУ й Еш ї Ж хз і. зе ЕР Ті ЗМУ 54 о ІН ЕЗШУ Ж рах х 35 РУШННУ х 1 МА хі ГОД її ої М І ЕЕ ХЕ ЗІ їх ЗЕ Коб б - сеЖх ї пня С Б пи НК а КО НИ пт ї го б її 1 к ще її ра Мо МО хо ЕК ЖЕ ге ЗШКЯ Ж: її ї Ж жк ї З : : ї : : ї Я ї Х. Б жук ше ше ши ши ше ше шк шк щ с
Фіг. 6
Ми а м і: ІЗ ; Ї В Н 3 Н Тож - Н 1 З ай ; я Ї ее З Яке Во і фООш і Кс в " : ре : Я У ї безобробкн о і до 3 з Я І КОЖ ня у Кол : ї БеЯ ЗНА ЖНО й зм кп нів іннн ТК у тут в у ут пут пух ну ув чук ву ту чув чу пулу пу пуд пу пуд ву ув у т м чити Км Ми сич с я В
Ж Ї.. дрохххоюохюоюсо ооо ооооююхоюосостохя З ЕЗ і і ре рпираневне Ат ле Най х 3 Е З ГУК В ще Ан я : То ОО 3 сій нм Як дю Не чо шк: ; Ж Е клея Ши: виник ши ЕЕ Ї ферум с : їж Ї фоооеж х і 3 КО У в в В в в в в в В М В СВ АН ІЗ їх меж я я : і ; вах ВА. ї за з зов : Е жнив СБ : 1 ІЗ мн КК КИ КК КК ОН ННУ Не
Фіг. 7 як їн з х Ж ! Кз я Баш Р і їх Е Ї ; Ж Е : у | НИ ще ще і : ї | їі 2 Е ї ї Бо сх | ї ї та ча ІЗ 3 ш ! ; ї я. з Е Н я дане А я КБ Я т Я Її з 5 г жи мли 5 шк й ! і - ие тртума ме Як зв» Нет Зм ї сах ння я о Н вла м їх 5 Я: й Е ен ох До ВН ОКеНееіНУ в Ж вв. Є і ще | КІ и й г А ЩІ ! Мт заст мнй ЕЗ З і М й Я З, «в ! ; Ше КЕ Модровенити й і як ; ї зонетнес В Са й як ; ох ще сно, добоесоосівно і й 5 З одно фВХ Нови ши: на З кун они Е ; з скотч однн і ще содовий дк У зв е че зе же «в ще зе н Я хх спол тав их ек вх ух жуки н хе час захват вихідний мемент часу) є
Фіг. ЗА х . же до Ва; Я і м Ї її що Ве ; ач і і й, тетрамере й да Меч В | | ї Анну і дв ожнтеніН шо Ї З о ї и твасхутуний Як Е Ї : я дення Я Е й вся : і ї Б Я 2 ї х Е пкяккк п со І о я дани З У І й КУ 5 4 -о ех УК Ме оо нини Мао да МУ «На а чав же ее жк ще же часі с закнах внхідннй момент часту е
Фіг. 86
А) . зни мерне Ат до Не І ! нь ««вететрамерне Ат до Не З ЗО нн шин с то Е і дення ше 0 М ії їв ме Б о Є п М ФОДЮО. пеня твій Дня змо нн нн ще ж й і 30 з М
Фіг. 5
КН ЩЕ З ваш о. ще о ння й Б чи і Б ЩЕ і же НЕ. Ве ! | а о. в Її шо с пе о о ..Дощ.д. кеш Є х З о т Її. (В нний ши: ш--еж її щ ! інший В .' с з Я шиє шт щі ши 0 00 й. і
ЩЕ. о 1. в с . щ- жтжо сю ОО КЕРУРКЕНеНЯ І ОУН дяк, Че: | я Бе ж Чер "Чи ЦЮ У ма УН-в УН-оці
Фіг. 10
; о 0 з о. шт
Кр . щ шо її. ши ш ::: ЩЕ 7 ши кн щи ШИ ВАЛЯНКИ Ж Ж КК зі щ ее ШЕ. ши с: і шшші с: ЕЕ щ ни ш ше ши п ШЕ й щЩщ п: ш- щ г: ШЕ 0 ж 0-0; аа и о. п 1, пою о. І. НН. с: ше. крон СО ШЕ Я ОВ НВ.
ші .
шин. / ще Я н ее о. я і. Е
Б. ЕЕ ща
Фіг. 1
Кк ЗУ ДМ КУХУУКНЯ сус п 1 . о як: Ко ЗНКНВ ВЕКОКУ З К ЖЕ Ах Ех Я КН МІЗКН З с п о. о. ТІЕе Б ОК п. У с о. . . Ь фея КОМ ОК СУ Б а п. о Зах Ку ЩЕ Ви КО Е ї і | ! Н 1 ї І Е Є І ЕЕ Є ще є ь НЕ Ен ще н БЕ ЩЕ | ш ЩЕ і і ї | І Її іч Ходи Ко сх я: З х о Кз У я ОД УК Во КК. се щ 5 У що ОО 55 5 КО о М КО о. кщ КО ОО п. У 55 о у і. щ . СО ВО МО КК КО ХО КО З МО с КК х ТК ЕКО З . Х ЖК - я й. о. . і УЗ КО щ СО Ку ОК С ОКО о рф ке ОК Ж Ко сифони ЖК Ко їж ох їх Е о їх КО І о що г. о о. СОКУ я В КОХ КУА АХ нат ВО КАВИ ЗКУ ох РЕВЕ ГО КО ТНК
6. ВЕКЕЕ п о ж СОЯ З. 5 З ОО В ще З Я ЕЕ ВЕЖУ МО ОНКО оо ні СЕ косо реко - ші Їчетеней Геклежжжиниі кни ІЗ Я ї шк ше шк Ї і ШШАКУ Її. я: щі я щ- ГК С. Є Є
Ін. Го І В гЯ ЕМ я З сріг. 12
Бек не о п че, в "0 » невакя Тек о. т: о. її . | ІЧ ее щі У НЕ ми ОК і. с й о ГНН вЕЕнавИКе й ж - і кА ща ее: ШЕ КО КО ВЖИВ З ШО КЕ се ; ваниниканио ІЗ ОН рі й Не В и: І Й і Фо вентини Кх ОХ і Я Є Б ІЙ НЕ ЕИЗВ: БУ : ОО 0 КЕ й : дес УК ЕЕЕЕЕЕЕ і: Ше о й ее як й екв . ЕЕ. | ий Й т зай ї ЕЕ Я Кн й ОК ке: сх х. СХ Е ОА ААААААА я : Є і / і а ШИЯ ще Е со ба й ше о Б й ше ш. - комплекс: І КС» дети Х
Фіг. 13
! Де з ї Мен й -- | ! хна я З ї слави : . , ї - Ех і Е Я і ї ї ІЗ : ; у ч ХК : : , | | ЩЕ : і Е ! : ї з ї Е ; і : що | А й : І х зе х 5 НИК Е й х Ву ; ; с : і й й Ї : г : ї ї сувій ї ах Я : Н : ; вч З ї ї Т ї щ й 3 Ж е ї Е Е т й ; | Кї Я ї х х
В. 5 ; І КЕ : | й в : ї З ї 3 ГИ ЯКІ Е ! й х і х і жі І ї ї з х С : і ї . ї і ІЗ Во Н : ї т хоча : : Е Е коня Ге : ї х В Ї са Е. : х х в ї аз З ; х х У КУ т Ї Е ! х х як їх в Ж : Щі ї ї Ь. Не : я ! Н : г : | І: Щ : : і х ї їх - ї М З : і КУ ї ї й х Ж У : ї - х Й ї ї НН. ї ; ; . З ї ве. у К.. з : ї ї нерв і ої ; і : х Я й х ох : : й і ой : У Я : гу хх Ж 3 и: і ; : з ї , Й т . ! й док ра Ом гю у уавовнння ї ї : ї ій ЕВ ково кКя ! В
: К. я і - що (У ка Ще» 5 р ї ще: ле ку їх ЗО | Е : ; в ! йри ШЕ: ї Е . Же ї і бі 3 і і о ;
ї г. у й у | й ; У шк ! п. ! ї Я З ї і х ке і. КУ К КУ -Яй їх х ой, ; 8 Е ВК ї х інн ї КК Я х 3 К с ї ЕТО ІЗ ї ИН Е КУ ек Я І . Ще ї З ХМ Ж х х вва З :
Я. | ж 1 ТК: ІЗ іЗ в оон і : ї КУ. ІЗ ЕЗ ве В їх КУ ї З ЗМОВ ВХ : с я х ЛИ вв І ї х 2 Ж у Її : і ; х Ж Зк хЕ Е КЕ ДВ Ш
5. КК. Е | й | й ЖЕ і ї "ДЕ: ї 5 й ие : І жа Й Е о ; їх З : аг ей І дона З 3 Ї еч, : З вн З З ЕЙ ї і ЗУ ї с вві : ; ї КЕ В й ій ; . - седан ; : ЩЕ я І. ізн в ї І Не : ! ' г. ї ї ; Е : х Х Я х Зав і : і І Е її чаї і і: А Ще св, в | ! ' Її Е хз дохо фей ї ї й ї ї : ї ї яееся ї ІЗ ІЗ Н Я дж клала и ї ї пихи данних жклядкняди лк м м У плину кю у ужюююю ЖЖ ни Ж х В з ї ї ї у а з х
UAA201811685A 2016-05-02 2017-05-02 Димерний злитий поліпептид UA123323C2 (uk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP16167920 2016-05-02
PCT/EP2017/060354 WO2017191101A1 (en) 2016-05-02 2017-05-02 The contorsbody - a single chain target binder

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA123323C2 true UA123323C2 (uk) 2021-03-17

Family

ID=56008478

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201811685A UA123323C2 (uk) 2016-05-02 2017-05-02 Димерний злитий поліпептид

Country Status (18)

Country Link
US (2) US20190389971A1 (uk)
EP (2) EP3889175A1 (uk)
JP (2) JP6675017B2 (uk)
KR (1) KR102523682B1 (uk)
CN (1) CN109071635B (uk)
AU (1) AU2017259869A1 (uk)
BR (1) BR112018069890A2 (uk)
CA (1) CA3019524A1 (uk)
CL (1) CL2018003007A1 (uk)
CR (1) CR20180509A (uk)
IL (1) IL262523A (uk)
MA (1) MA56474A (uk)
MX (1) MX2018013342A (uk)
PE (1) PE20181890A1 (uk)
RU (1) RU2018141360A (uk)
SG (1) SG11201809620UA (uk)
UA (1) UA123323C2 (uk)
WO (1) WO2017191101A1 (uk)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK3227311T3 (da) * 2014-12-05 2022-03-07 Xyphos Biosciences Inc Indsættelige, variable fragmenter af antistoffer og modificerede A1- A2-domæner af NKG2D-ligander
EP3697441B1 (en) 2017-10-20 2023-06-07 F. Hoffmann-La Roche AG Method for generating multispecific antibodies from monospecific antibodies
PL3704146T3 (pl) * 2017-11-01 2022-03-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Przeciwciało Contorsbody trifab
EP3703821A2 (en) * 2017-11-01 2020-09-09 F. Hoffmann-La Roche AG Bispecific 2+1 contorsbodies
WO2019136405A1 (en) * 2018-01-05 2019-07-11 City Of Hope Multi-specific ligand binders
WO2020027330A1 (ja) 2018-08-03 2020-02-06 中外製薬株式会社 互いに連結された２つの抗原結合ドメインを含む抗原結合分子
EP4100433A4 (en) 2020-02-05 2024-03-13 Chugai Pharmaceutical Co Ltd METHOD FOR PRODUCING AND/OR ENRICHING RECOMBINANT ANTIGEN-BINDING MOLECULES
WO2021200898A1 (en) 2020-03-31 2021-10-07 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Dll3-targeting multispecific antigen-binding molecules and uses thereof
KR20220104423A (ko) 2021-01-18 2022-07-26 성기봉 페달엔진자전거(실용모델)
KR102604934B1 (ko) * 2021-10-27 2023-11-23 주식회사 베르티스 피분석물을 검출 또는 측정하기 위한 조성물

Family Cites Families (124)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
EP0307434B2 (en) 1987-03-18 1998-07-29 Scotgen Biopharmaceuticals, Inc. Altered antibodies
US5606040A (en) 1987-10-30 1997-02-25 American Cyanamid Company Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group
US5770701A (en) 1987-10-30 1998-06-23 American Cyanamid Company Process for preparing targeted forms of methyltrithio antitumor agents
KR0184860B1 (ko) 1988-11-11 1999-04-01 메디칼 리써어치 카운실 단일영역 리간드와 이를 포함하는 수용체 및 이들의 제조방법과 이용(법)
CA2026147C (en) 1989-10-25 2006-02-07 Ravi J. Chari Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
ES2113940T3 (es) 1990-12-03 1998-05-16 Genentech Inc Metodo de enriquecimiento para variantes de proteinas con propiedades de union alteradas.
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
ES2206447T3 (es) 1991-06-14 2004-05-16 Genentech, Inc. Anticuerpo humanizado para heregulina.
US7018809B1 (en) 1991-09-19 2006-03-28 Genentech, Inc. Expression of functional antibody fragments
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
AU675929B2 (en) 1992-02-06 1997-02-27 Curis, Inc. Biosynthetic binding protein for cancer marker
CA2149329C (en) 1992-11-13 2008-07-15 Darrell R. Anderson Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human b lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of b cell lymphoma
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
US5780588A (en) 1993-01-26 1998-07-14 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of selected pentapeptides
JPH08511420A (ja) 1993-06-16 1996-12-03 セルテック・セラピューテイクス・リミテッド 抗 体
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
US5789199A (en) 1994-11-03 1998-08-04 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5712374A (en) 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
WO1998048032A2 (en) 1997-04-21 1998-10-29 Donlar Corporation POLY-(α-L-ASPARTIC ACID), POLY-(α-L-GLUTAMIC ACID) AND COPOLYMERS OF L-ASP AND L-GLU, METHOD FOR THEIR PRODUCTION AND THEIR USE
DE69830901T2 (de) 1997-05-02 2006-05-24 Genentech Inc., San Francisco ein verfahren zur herstellung multispezifischer antikörper die heteromultimere und gemeinsame komponenten besitzen
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
DE69830315T2 (de) 1997-06-24 2006-02-02 Genentech Inc., San Francisco Galactosylierte glykoproteine enthaltende zusammensetzungen und verfahren zur deren herstellung
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
ATE419009T1 (de) 1997-10-31 2009-01-15 Genentech Inc Methoden und zusammensetzungen bestehend aus glykoprotein-glykoformen
US6610833B1 (en) 1997-11-24 2003-08-26 The Institute For Human Genetics And Biochemistry Monoclonal human natural antibodies
ATE531812T1 (de) 1997-12-05 2011-11-15 Scripps Research Inst Humanisierung von nager-antikörpern
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
ATE375365T1 (de) 1998-04-02 2007-10-15 Genentech Inc Antikörper varianten und fragmente davon
AU3657899A (en) 1998-04-20 1999-11-08 James E. Bailey Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
HUP0104865A3 (en) 1999-01-15 2004-07-28 Genentech Inc Polypeptide variants with altered effector function
EP2275540B1 (en) 1999-04-09 2016-03-23 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
AU782626B2 (en) 1999-10-04 2005-08-18 Medicago Inc. Method for regulating transcription of foreign genes
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
EP1229125A4 (en) 1999-10-19 2005-06-01 Kyowa Hakko Kogyo Kk PROCESS FOR PRODUCING A POLYPEPTIDE
AU784983B2 (en) 1999-12-15 2006-08-17 Genentech Inc. Shotgun scanning, a combinatorial method for mapping functional protein epitopes
AU767394C (en) 1999-12-29 2005-04-21 Immunogen, Inc. Cytotoxic agents comprising modified doxorubicins and daunorubicins and their therapeutic use
US7449443B2 (en) 2000-03-23 2008-11-11 California Institute Of Technology Method for stabilization of proteins using non-natural amino acids
US6586207B2 (en) 2000-05-26 2003-07-01 California Institute Of Technology Overexpression of aminoacyl-tRNA synthetases for efficient production of engineered proteins containing amino acid analogues
CA2424602C (en) 2000-10-06 2012-09-18 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Antibody composition-producing cell
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
US7064191B2 (en) 2000-10-06 2006-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
JP3523245B1 (ja) 2000-11-30 2004-04-26 メダレックス，インコーポレーテッド ヒト抗体作製用トランスジェニック染色体導入齧歯動物
CN1294148C (zh) * 2001-04-11 2007-01-10 中国科学院遗传与发育生物学研究所 环状单链三特异抗体
NZ592087A (en) 2001-08-03 2012-11-30 Roche Glycart Ag Antibody glycosylation variants having increased antibody-dependent cellular cytotoxicity
ES2326964T3 (es) 2001-10-25 2009-10-22 Genentech, Inc. Composiciones de glicoproteina.
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
AU2003248370A1 (en) 2002-02-27 2003-09-09 California Institute Of Technology Computational method for designing enzymes for incorporation of amino acid analogs into proteins
AU2002316574B2 (en) * 2002-03-15 2008-05-01 Brandeis University Central airway administration for systemic delivery of therapeutics
US20040110704A1 (en) 2002-04-09 2004-06-10 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells of which genome is modified
AU2003236019A1 (en) 2002-04-09 2003-10-20 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Drug containing antibody composition appropriate for patient suffering from Fc Gamma RIIIa polymorphism
CA2481837A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Production process for antibody composition
AU2003236018A1 (en) 2002-04-09 2003-10-20 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. METHOD OF ENHANCING ACTIVITY OF ANTIBODY COMPOSITION OF BINDING TO FcGamma RECEPTOR IIIa
ATE503829T1 (de) 2002-04-09 2011-04-15 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Zelle mit erniedrigter oder deletierter aktivität eines am gdp-fucosetransport beteiligten proteins
US7691568B2 (en) 2002-04-09 2010-04-06 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd Antibody composition-containing medicament
EP1513879B1 (en) 2002-06-03 2018-08-22 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
DE60332957D1 (de) 2002-12-16 2010-07-22 Genentech Inc Immunoglobulinvarianten und deren verwendungen
AU2004205631A1 (en) 2003-01-16 2004-08-05 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
US20080241884A1 (en) 2003-10-08 2008-10-02 Kenya Shitara Fused Protein Composition
SG143252A1 (en) 2003-10-09 2008-06-27 Ambrx Inc Polymer derivatives
AU2004280065A1 (en) 2003-10-09 2005-04-21 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Process for producing antibody composition by using RNA inhibiting the function of alpha1,6-fucosyltransferase
EA036531B1 (ru) 2003-11-05 2020-11-19 Роше Гликарт Аг Гуманизированное антитело типа ii к cd20 (варианты), фармацевтическая композиция, содержащая эти варианты антитела, и их применение
KR101520209B1 (ko) 2003-11-06 2015-05-13 시애틀 지네틱스, 인크. 리간드에 접합될 수 있는 모노메틸발린 화합물
JPWO2005053742A1 (ja) 2003-12-04 2007-06-28 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物を含有する医薬
AU2005211362B2 (en) 2004-02-02 2008-03-13 Ambrx, Inc. Modified human interferon polypeptides and their uses
MXPA06011199A (es) 2004-03-31 2007-04-16 Genentech Inc Anticuerpos anti-tgf-beta humanizados.
US7785903B2 (en) 2004-04-09 2010-08-31 Genentech, Inc. Variable domain library and uses
CA2885854C (en) 2004-04-13 2017-02-21 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-p-selectin antibodies
TWI380996B (zh) 2004-09-17 2013-01-01 Hoffmann La Roche 抗ｏｘ４０ｌ抗體
EP1791565B1 (en) 2004-09-23 2016-04-20 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
US10011858B2 (en) 2005-03-31 2018-07-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for producing polypeptides by regulating polypeptide association
WO2007048022A2 (en) 2005-10-21 2007-04-26 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Antibody-polypeptide fusion proteins and methods for producing and using same
ES2577292T3 (es) 2005-11-07 2016-07-14 Genentech, Inc. Polipéptidos de unión con secuencias hipervariables de VH/VL diversificadas y consenso
US20070237764A1 (en) 2005-12-02 2007-10-11 Genentech, Inc. Binding polypeptides with restricted diversity sequences
AU2007229698B9 (en) 2006-03-24 2012-11-08 Merck Patent Gmbh Engineered heterodimeric protein domains
CA2651567A1 (en) 2006-05-09 2007-11-22 Genentech, Inc. Binding polypeptides with optimized scaffolds
US20070266448A1 (en) 2006-05-11 2007-11-15 Alexander Lifke Method for the production of antibodies
JP2009539413A (ja) 2006-06-12 2009-11-19 トゥルビオン・ファーマシューティカルズ・インコーポレーテッド エフェクター機能を有する単鎖多価結合タンパク質
JP2009541275A (ja) 2006-06-22 2009-11-26 ノボ・ノルデイスク・エー／エス 二重特異性抗体の生産
EP2471816A1 (en) 2006-08-30 2012-07-04 Genentech, Inc. Multispecific antibodies
US20080226635A1 (en) 2006-12-22 2008-09-18 Hans Koll Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
CN100592373C (zh) 2007-05-25 2010-02-24 群康科技(深圳)有限公司 液晶显示面板驱动装置及其驱动方法
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
US8227577B2 (en) 2007-12-21 2012-07-24 Hoffman-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US8242247B2 (en) 2007-12-21 2012-08-14 Hoffmann-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
PT2235064E (pt) 2008-01-07 2016-03-01 Amgen Inc Método de preparação de moléculas heterodiméricas de fc de anticorpos utilizando efeitos de indução eletrostática
EP2417156B1 (en) * 2009-04-07 2015-02-11 Roche Glycart AG Trivalent, bispecific antibodies
CN102459346B (zh) 2009-04-27 2016-10-26 昂考梅德药品有限公司 制造异源多聚体分子的方法
SI2519543T1 (sl) 2009-12-29 2016-08-31 Emergent Product Development Seattle, Llc Beljakovine, ki se vežejo s heterodimeri in njihova uporaba
TW201138821A (en) * 2010-03-26 2011-11-16 Roche Glycart Ag Bispecific antibodies
US9527926B2 (en) 2010-05-14 2016-12-27 Rinat Neuroscience Corp. Heterodimeric proteins and methods for producing and purifying them
AU2011325833C1 (en) 2010-11-05 2017-07-13 Zymeworks Bc Inc. Stable heterodimeric antibody design with mutations in the Fc domain
EP2729488A4 (en) * 2011-07-06 2015-01-14 Medimmune Llc PROCESS FOR PREPARING MULTIMANT POLYPEPTIDES
CA2859667C (en) 2011-12-20 2022-05-24 Medimmune, Llc Modified polypeptides for bispecific antibody scaffolds
MX360109B (es) 2012-04-20 2018-10-23 Merus Nv Metodos y medios para la produccion de moleculas de tipo ig.
AU2013322710A1 (en) * 2012-09-25 2015-04-16 Glenmark Pharmaceuticals S.A. Purification of hetero-dimeric immunoglobulins
EP2961770A1 (en) 2013-02-26 2016-01-06 Roche Glycart AG Bispecific t cell activating antigen binding molecules
EP2964669B1 (en) * 2013-03-06 2018-09-12 Protalix Ltd. Use of plant cells expressing a tnfalpha polypeptide inhibitor in therapy
EP3313890A1 (en) * 2015-06-24 2018-05-02 H. Hoffnabb-La Roche Ag Trispecific antibodies specific for her2 and a blood brain barrier receptor and methods of use
AR106188A1 (es) 2015-10-01 2017-12-20 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-cd19 humano humanizados y métodos de utilización
EP3703821A2 (en) * 2017-11-01 2020-09-09 F. Hoffmann-La Roche AG Bispecific 2+1 contorsbodies

Also Published As

Publication number Publication date
AU2017259869A1 (en) 2018-09-27
SG11201809620UA (en) 2018-11-29
BR112018069890A2 (pt) 2019-02-05
CA3019524A1 (en) 2017-11-09
JP6675017B2 (ja) 2020-04-01
CN109071635A (zh) 2018-12-21
WO2017191101A1 (en) 2017-11-09
KR102523682B1 (ko) 2023-04-19
CR20180509A (es) 2019-02-15
PE20181890A1 (es) 2018-12-11
JP2020103314A (ja) 2020-07-09
IL262523A (en) 2018-12-31
CL2018003007A1 (es) 2019-02-08
KR20190003678A (ko) 2019-01-09
EP3889175A1 (en) 2021-10-06
US20190389971A1 (en) 2019-12-26
JP2019521084A (ja) 2019-07-25
US20210347916A1 (en) 2021-11-11
CN109071635B (zh) 2023-09-01
MX2018013342A (es) 2019-05-09
MA56474A (fr) 2022-05-11
EP3452502A1 (en) 2019-03-13
RU2018141360A3 (uk) 2020-10-16
RU2018141360A (ru) 2020-06-03
EP3452502B1 (en) 2021-03-03
JP6994066B2 (ja) 2022-02-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA123323C2 (uk) Димерний злитий поліпептид
JP6872069B2 (ja) ＦｃＲＨ５に対するヒト化親和性成熟抗体及び使用方法
US20210206829A1 (en) Treatment of cd47+ disease cells with sirp alpha-fc fusions
CN107428835B (zh) 抗cd3抗体、抗cd123抗体和与cd3和/或cd123特异性结合的双特异性抗体
CN112135626B (zh) 抗tigit抗体及其用途
UA125285C2 (uk) Гуманізоване антитіло до cd19 людини та спосіб його застосування для лікування в-клітинного раку
KR20190028771A (ko) Cd3 및 cd123에 특이적으로 결합하는 이중특이성 항체-유사 결합 단백질
EA028202B1 (ru) Анти-lrp5 антитела и способы их применения
CN105899533A (zh) 人源化的抗-Tau(pS422)抗体和使用方法
CN111269315A (zh) 针对bcma的单克隆抗体
CA3145940A1 (en) Anti-cd39 antibody compositions and methods
WO2014076292A1 (en) Recombinant bispecific antibody binding to cd20 and cd95
CA3127624A1 (en) Anti-cd38 antibodies
TW202043278A (zh) 結合ｐｄ－ｌ１和ｏｘ４０的雙特異性抗體
CN112442132A (zh) 靶向肿瘤的重组双功能融合蛋白及其应用
KR20230079165A (ko) 항-클라우딘18.2 및 cd3 이특이적 항체 및 이의 용도
TW201605902A (zh) 結合ＨＥＲ３之β－髮夾結構的抗ＨＥＲ３抗體
RU2705299C2 (ru) Антитела против 5-бром-2'-дезоксиуридина и способы применения
KR20230124959A (ko) 항-b7-h3 항체 및 이의 용도
WO2020156507A1 (zh) 抗pd-l1的新型抗体及其用途
CN116323665A (zh) 抗cd200r1抗体及其使用方法
WO2023284829A1 (zh) 特异性结合hgfr和egfr的抗原结合分子及其医药用途