CN108728444A - 免疫调节性多核苷酸及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及包含作为治疗剂(例如免疫疗法)的免疫调节性多核苷酸的组合物。进一步而言，本发明涉及所述组合物在治疗诸如癌症之类的疾病中的应用。

Description

免疫调节性多核苷酸及其应用

技术领域

本发明涉及包含作为治疗剂(例如用于免疫治疗)的免疫调节性多核苷酸的组合物。进一步而言，本发明涉及所述组合物在治疗诸如癌症之类的疾病中的应用。

背景技术

已在临床试验中对各种TLR激动剂的促进抗肿瘤免疫的能力进行了研究。抗肿瘤反应很大程度上归因于它们能够刺激APC(例如树突细胞(DC))，进而活化肿瘤特异性T细胞反应。

Toll-样受体9(TLR9)是指非甲基化的CpG二核苷酸，其是微生物DNA的标志，所述非甲基化的CpG二核苷酸可由合成的包含CpG基序的寡核苷酸(CpG ODN)模拟。由CpG DNA或CpG ODN刺激的TLR9触发活化巨噬细胞、DC细胞和B细胞并生成细胞因子、趋化因子和免疫球蛋白的细胞内信号传导。随后，由DC生成的细胞因子(例如IL-2)诱导初始T细胞分化为1型辅助T细胞(Th1)和细胞毒性T细胞(CTL)。

TLR9激动剂可引发先天性免疫防御和抗原T细胞特异性反应，这是其发展成为疫苗佐剂或用于感染性疾病和癌症的免疫治疗剂的重要特性。动物模型中的研究已证明仅由CpG ODN建立的免疫防御或作为疫苗佐剂的免疫防御可防御多种病毒性疾病、细菌性疾病和寄生性疾病。已从采用CpG ODN和乙肝表面抗原(Heplisav)的临床三期试验中取得了在乙型肝炎的预防性治疗方面有希望的结果。

CpG ODN的抗肿瘤活性也已在多种小鼠模型中建立。从使用CpG ODN作为肿瘤疫苗佐剂的单一疗法或与化疗结合的联合疗法的临床一期和二期试验中取得了在癌症治疗方面的令人鼓舞的结果。然而，也有一些令人失望的结果，一家制药公司最近放弃了其使用TLR9激动剂治疗非小细胞肺癌的临床项目。PF-3512676(以前称为CpG 2006)的两个临床三期试验的数据显示与单独化疗相比其未能改善临床结果。本领域仍然需要继续发现新的免疫调节性多核苷酸。

免疫疗法为诸如癌症和自体免疫性疾病之类的疾病的治疗提供了有望的选择。对越来越多的肿瘤相关抗原(本文中也称为肿瘤抗原)的识别对免疫治疗的合适的靶点进行了广泛收集。另一方面，靶向治疗(例如抗体定向的治疗)相对于非靶向治疗(例如，口服给药或静脉给药的全身性治疗)或全身疗法(例如外部放射疗法(XRT))产生了很多优势。抗体定向治疗的优势，尤其是使用单克隆抗体(mAb)治疗的优势在于能够将较高剂量的治疗剂递送至肿瘤，并且更好地避免了正常组织受到治疗剂的影响。这种定向治疗可包括使用裸mAb或与药物，细菌或其他毒素，放射性核素，或中子捕获剂(例如硼附加物)偶联的mAb。

总体而言，治疗性抗体经由如下三种机制杀伤肿瘤细胞(Scott AM,Wolchok JD,Old LJ.Antibody therapy of cancer.Nat Rev Cancer.(2012),12:278-87)：(1)抗体直接作用，也就是阻断或激动配体/受体信号传导活性，诱导细胞凋亡并递送药物或细胞毒素剂。抗体受体活化活性可产生直接杀伤肿瘤细胞的作用。例如，一些抗体可与肿瘤细胞表面的受体结合，活化受体，导致细胞凋亡(例如，在线粒体中)。抗体还可通过受体拮抗活性介导肿瘤细胞杀伤。例如，一些抗体可与细胞表面受体结合并阻断二聚化作用、激酶活化以及下游信号传导，从而抑制增殖并促进细胞凋亡。抗体与酶的结合可导致中和作用、信号阻断以及细胞死亡。(2)免疫介导的细胞杀伤机制，该机制包括补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、T细胞功能调节，等等。免疫介导的肿瘤细胞杀伤可通过如下方式完成：诱导吞噬作用、活化补体、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性、通过单链可变片段(scFv)使基因修饰的T细胞靶定肿瘤，通过树突细胞的抗体介导的抗原交叉呈递活化T细胞、抑制T细胞抑制性受体(例如，细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA4))。其中，抗体的Fc部分的特性对于CDC和ADCC介导的肿瘤细胞杀伤作用特别重要。(3)抗体对肿瘤脉管***和基质的特异性效应，通过捕获血管受体拮抗剂或配体诱导血管和基质细胞消融，包括：抑制基质细胞、将毒素递送至基质细胞以及将毒素递送至脉管***(Scott AM,WolchokJD,Old LJ.Antibody therapy of cancer.Nat Rev Cancer.2012,12(4):278-87)。

治疗性单克隆抗体药物已推进了抗癌药物研究和发展。然而，其中仍然还存在一些问题需要进一步研究解决，例如，抗体免疫原性，肿瘤靶点长期使用的耐药性以及简单的单一阻断信号转导通路的长期作用。简言之，过半数的抗体难以达到长期有效地抑制和杀伤肿瘤细胞。

发明内容

一方面，本发明提供免疫调节性多核苷酸，其包含选自以下的序列：SEQ ID NO.:1,SEQ ID NO.:2,SEQ ID NO.:3,SEQ ID NO.:4,SEQ ID NO.:5,SEQ ID NO.:6,SEQ IDNO.:7,SEQ ID NO.:8,SEQ ID NO.:9,SEQ ID NO.:10,SEQ ID NO.:11和SEQ ID NO.:12。

在一些实施方式中，所述多核苷酸包含化学修饰。在一些实施方式中，所述多核苷酸包含一个或多于一个磷酸酯基团的修饰。在一些实施方式中，所述一个或多于一个磷酸酯基团的修饰是硫代磷酸酯键合。在一些实施方式中，所述多核苷酸的磷酸骨架是完全硫代磷酸酯修饰的。在一些实施方式中，一个或多于一个磷酸酯基团的修饰是键合。

另一方面，本发明提供调节受治者体内的免疫反应的方法，其包括：以足以调节个体体内的免疫反应的量将本文提供的免疫调节性多核苷酸给药于所述受治者。

另一方面，本发明提供增加受治者体内的干扰素-α的方法，其包括：以足以增加所述受治者体内的IFN-α的量将本文提供的免疫调节性多核苷酸给药于所述受治者。

再一方面，本发明提供增加受治者体内的干扰素-γ的方法，其包括以足以增加所述受治者体内IFN-γ的量将本文提供的免疫调节性多核苷酸给药于所述受治者。

又一方面，本发明提供改善受治者体内的感染性疾病的症状的方法，其包括将有效量的本文提供的免疫调节性多核苷酸给药于受治者，其中，所述有效量是足以改善所述感染性疾病的症状的量。

另一方面，本发明提供治疗受治者体内的癌症或肿瘤的方法，其包括将有效量的本文提供的免疫调节性多核苷酸给药于受治者，其中，所述有效量是足以治疗所述癌症或所述肿瘤的量。

另一方面，本发明提供治疗组合，其包括：(i)有效量的针对癌症的靶向治疗剂和(ii)有效量的本文提供的免疫调节性多核苷酸或其组合。

在一些实施方式中，所述靶向治疗剂能够特异性结合肿瘤细胞或者相较于非肿瘤细胞能够优先结合肿瘤细胞。在一些实施方式中，所述肿瘤细胞是癌细胞、肉瘤细胞、淋巴瘤细胞、骨髓瘤细胞或中枢神经***癌症细胞。在一些实施方式中，所述靶向治疗剂能够特异性结合肿瘤抗原或者相较于非肿瘤抗原能够优先结合肿瘤抗原。

在一些实施方式中，所述肿瘤抗原选自：CD2,CD19,CD20,CD22,CD27,CD33,CD37,CD38,CD40,CD44,CD47,CD52,CD56,CD70,CD79和CD137。

在一些实施方式中，所述肿瘤抗原选自：4-1BB,5T4，AGS-5,AGS-16,血管生成素2,B7.1,B7.2,B7DC,B7H1,B7H2,B7H3,BT-062,BTLA,CAIX,癌胚抗原,CTLA4,Cripto,ED-B,ErbB1,ErbB2,ErbB3,ErbB4,EGFL7,EpCAM,EphA2,EphA3,EphB2,FAP,纤连蛋白,叶酸盐受体,神经节苷酯GM3,GD2,糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(GITR),gp100,gpA33,GPNMB,ICOS,IGF1R,整联蛋白αν,整联蛋白ανβ,KIR,LAG-3,Lewis Y,间皮素,c-MET,MN碳酸酐酶IX,MUC1,MUC16,粘连蛋白-4,NKGD2,NOTCH,OX40,OX40L,PD-1,PDL1,PSCA,PSMA,RANKL,ROR1,ROR2,SLC44A4,STING(IFN基因的刺激剂)，多配体蛋白聚糖-1,TACI,TAG-72,腱生蛋白,TIM3,TRAILR1,TRAILR2,VEGFR-1,VEGFR-2,VEGFR-3和它们的变体。

在一些实施方式中，所述靶向治疗剂包括免疫球蛋白、蛋白质、肽、小分子、纳米颗粒或核酸。在一些实施方式中，所述靶向治疗剂包括抗体或其功能片段。在一些实施方式中，所述抗体选自：美罗华(利妥昔单抗)、赫赛汀(曲妥珠单抗)、爱必妥(西妥昔单抗)、维克替比(帕尼单抗)、Arzerra(奥法木单抗)、Benlysta(贝利木单抗)、Yervoy(伊匹单抗)、Perjeta(帕妥珠单抗)、Tremelimumab、Opdivo(纳武单抗),Dacetuzumab,乌瑞芦单抗,Tecentriq(MPDL3280A),Lambrolizumab,Blinatumomab,CT-011,Keytruda(pembrolizumab,MK-3475),BMS-936559,MED14736,MSB0010718C,和margetuximab(MGAH22)。

在一些实施方式中，所述靶向治疗剂包括Fab、Fab’、F(ab’)2、单结构域抗体、T和Ab二聚物、Fv、scFv、dsFv、ds-scFv、Fd、线性抗体、微小抗体、双价抗体、双特异性抗体片段、bibody、tribody、sc-双价抗体、κ(λ)body、BiTE、DVD-Ig、SIP、SMIP、DART或者含有一个或一个以上CDR的抗体类似物。

在一些实施方式中，所述靶向治疗剂包括VEFGR的ATWLPPR多肽，血小板反应蛋白-1模拟物、CDCRGDCFCG(环状)多肽、SCH 221153片段、NCNGRC(环状)多肽、CTTHWGFTLC多肽、CGNKRTRGC多肽(LyP-1)、奥曲肽、伐普肽、兰乐肽、C-3940多肽、达必佳、利普安、诺雷德或西曲瑞克。

在一些实施方式中，所述靶向治疗剂包括细胞外结构域(ECD)或PD-1、PDL-1、CTLA4、BTLA、KIR、TIM3、4-1BB、LAG3的可溶形式、全长的部分表面配体双调蛋白、β动物纤维素、EGF、肝配蛋白、上皮细胞有丝***蛋白抗体、上皮调节蛋白、IGF、神经调节蛋白、TGF、TRAIL或VEGF。

在一些实施方式中，本文提供的组合还包括化疗剂。在一些实施方式中，所述化疗剂选自：它莫西芬(tamoxifen)，雷洛昔芬(raloxifene),阿那曲唑(anastrozole),依西美坦(exemestane),来曲唑(letrozole),imatanib,紫杉醇,环磷酰胺,洛伐他汀(lovastatin),minosine,吉西他滨(gemcitabine),阿糖胞苷(cytarabine),5-氟尿嘧啶,甲氨蝶呤,多西他赛(docetaxel),戈舍瑞林(goserelin),长春新碱,长春碱,噻氨酯哒唑(nocodazole),替尼泊苷(teniposide),依托泊苷(etoposide),吉西他滨,埃博霉素,长春瑞滨(vinorelbine),喜树碱,道诺霉素(daunorubicin),放线菌素D,米托蒽醌,吖啶,阿霉素,表柔比星,或去甲氧基柔红霉素。

再一方面，本发明提供治疗有此治疗需求的受治者体内的疾病病症的方法，所述方法包括将本文提供的治疗组合给药于所述受治者。

在一些实施方式中，所述疾病病症是肿瘤。

在一些实施方式中，所述疾病病症包括异常细胞增殖。在一些实施方式中，所述异常细胞增殖包括癌前病变。在一些实施方式中，所述异常增殖的细胞是癌细胞。在一些实施方式中，所述癌症选自：乳腺癌、结肠直肠癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤、子宫内膜癌、滤泡性淋巴瘤、胃癌、胶质母细胞瘤、头颈癌、肝细胞癌、肺癌、黑色素瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、胰腺癌、***癌和肾细胞癌。

通过引用合并

说明书中涉及的所有公开出版物、专利和专利申请通过引用并入本文，如同具体地且单独地说明通过引用将每个单独的公开出版物、专利或专利申请并入本文一样。

附图说明

本发明的新特点在所附的权利要求书中具体说明。通过结合后面列举的对示例性的实施方式的详细描述可更好地对本发明的特点和优势加以理解，其中，使用了本发明的原理，并且具有如下附图：

图1显示了CpG 5有效刺激pDC分泌IFN-α。接种于96孔板中的人PBMC(5×10⁵细胞/孔)和小鼠脾脏细胞(1×10⁶细胞/孔)采用1μM不同的CpG(CpG3，CpG5和CpG23)，培养基对照(RPMI-1640培养基)和作为阳性对照的CpG 684培养24小时和48小时。收集培养物上清液并通过ELISA或CBA测量分泌的IFN-α的量(平均值±SEM,n＝3)。

图2显示了CpG 5有效刺激B细胞分泌IL-6。接种于96孔板中的人PBMC(5×10⁵细胞/孔)和小鼠脾脏细胞(1×10⁶细胞/孔)采用1μM不同的CpG(CpG3，CpG5和CpG23)，培养基对照(RPMI-1640培养基)和作为阳性对照的CpG 2006培养24小时和48小时。收集培养物上清液并通过ELISA或CBA测量分泌的IL-6的量(平均值±SEM,n＝3)。

图3显示了CpG 1和CpG 9以及CpG 10有效刺激pDC分泌IFN-α。接种于96孔板中的人PBMC(5×10⁵细胞/孔)和小鼠脾脏细胞(1×10⁶细胞/孔)采用1μM不同的CpG(CpG1，CpG9和CpG10)，培养基对照(RPMI-1640培养基)和作为阳性对照的CpG 2395培养24小时和48小时。收集培养物上清液并通过ELISA或CBA测量分泌的IFN-α的量(平均值±SEM,n＝3)。

具体实施方式

通过结合用于举例说明的示例性应用，在下文中对本发明的许多方面进行描述。应当理解的是，列举出许多具体的细节、关系以及方法来全面理解本发明。然而，本领域普通技术人员可容易地意识到本发明可不按照具体细节中的一种或一种以上来实施或者可采用其他方法来实施。本发明不受举例说明的操作顺序或事件的限制，因为，一些操作可以不同的顺序进行和/或可同时与其他操作或事件一同进行。

进一步地，不是所有举例说明的操作或事件都需要根据本发明的方法来实施。

本文使用的术语是仅仅是为了说明具体实施方式，而无意限定本发明。除非另有明确说明，如本文使用的不指明具体数目的冠词(“a”，“an”和“the”)意在包括复数形式。此外，在具体实施方式部分和/或权利要求中使用的术语“包括(“including”，“include”)、具有(“having”，“has”，“with”)或其变体意在包括与术语“包含(comprising)”类似的方式。

术语“约”或“大约”是指由本领域普通技术人员测定的特定值在可接受的误差范围内，该误差范围部分取决于该值如何测量或确定，即，测量***的限制。例如，“约”可意味着在本领域中每一操作在1个标准偏差范围内或超过一个标准偏差。可选地，“约”可意味着高达给定值的20％的范围，优选地高达给定值的10％的范围，更优选地高达给定值的5％的范围并且更优选地高达给定值的1％的范围。可选地，尤其对于生物***或过程而言，该术语可意味着在某个值的某个数量级范围内，优选地在某个值的5倍范围内，更优选地在某个值的2倍范围内。在本申请和权利要求书中描述特定值的条件下，除非另有说明，应当假定术语“约”意味着在特定值的可接受的误差范围内。

I.释义和缩写

除非另有说明，本文使用的所有技术术语和科学术语通常具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。一般而言，本文使用的命名***和细胞培养、分子遗传学、有机化学和核酸化学以及杂交中的实验操作是本领域熟知的且普遍使用的。标准技术用于核酸和肽的合成。所述技术和操作通常根据本领域的常规方法和各种不同的通用参考文献进行，本领域的常规方法和各种不同的通用参考文献在本文中提供。本文使用的命名***和下面描述的分析化学和有机合成中的实验操作是本领域熟知的且普遍使用的。标准技术或其改良用于化学合成和化学分析。

除非另有说明，术语“烷基”其自身或作为另一取代基的一部分是指含有指定数目的碳原子(即，C₁-C₁₀是指1至10个碳原子)的直链或支链或环状烃自由基或者其组合，所述直链或支链或环状烃自由基或者其组合可为完全饱和的、单不饱和的或多不饱和的并且可包括二价和多价自由基。饱和的烃自由基的实例包括但不限于如下基团，例如，甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、环己基、(环己基)甲基、环丙基甲基、它们的同系物或异构体，例如，正戊基、正己基、正庚基、正辛基等等。不饱和烷基为具有一个或一个以上双键或三键的烷基。不饱和烷基的实例包括但不限于：乙烯基、2-丙烯基、巴豆基、2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2,4-戊二烯基、3-(1,4-戊二烯基)、乙炔基、1-丙炔基和3-丙炔基、3-丁炔基以及高级同系物和异构体。除非另有说明，术语“烷基”还意在包括下面更加详细定义的那些烷基衍生物，例如，“杂烷基”。限定为烃基的烷基基团被称为“均烷基(homoalkyl)”。

术语“亚烷基”其自身或作为另一取代基的一部分是指从烷烃衍生得到的二价自由基，例如，但不限于：-CH₂CH₂CH₂CH₂-，并且还包括下面如“杂亚烷基”所描述的那些基团。通常，烷基(或亚烷基)基团可具有1至24个碳原子，本发明中优选地为具有10个或更少的碳原子的那些基团。“低级烷基”或“低级亚烷基”是较短链烷基或亚烷基基团，通常具有8个或更少的碳原子。

术语“烷氧基”、“烷基氨基”和“烷硫基”(或硫代烷氧基)以其常规含义使用，并且分别是指通过氧原子、氨基基团或硫原子与分子的剩余部分连接的那些烷基基团。

除非另有说明，术语“杂烷基”其自身或与另一术语结合是指由规定数目的碳原子和至少一个选自O、N、Si和S的杂原子构成的、稳定的直链或支链或环状烃自由基或者其组合，并且，其中，氮和硫原子可被任选地氧化并且氮杂原子可被任选地季铵化。杂原子O、N和S以及Si可位于杂烷基的任何内部位置或者位于烷基与分子的剩余部分连接的位置。实例包括但不限于：-CH₂-CH₂-O-CH₃,-CH₂-CH₂-NH-CH₃,-CH₂-CH₂-N(CH₃)-CH₃,-CH₂-S-CH₂-CH₃,-CH₂-CH₂,-S(O)-CH₃,-CH₂-CH₂-S(O)₂-CH₃,-CH＝CH-O-CH₃,-Si(CH₃)₃,-CH₂-CH＝N-OCH₃,和-CH＝CH-N(CH₃)-CH₃。最多两个杂原子可以是相邻的，例如，-CH₂-NH-OCH₃和-CH₂-O-Si(CH₃)₃。类似地，术语“杂亚烷基”其自身或作为另一取代基的一部分是指从杂烷基衍生得到的二价自由基，例如但不限于：-CH₂-CH₂-S-CH₂-CH₂-和-CH₂-S-CH₂-CH₂-NH-CH₂-。对于杂亚烷基基团而言，杂原子还可占据链端中的一个末端或者链端的两个末端(例如，亚烷基氧、亚烷基二氧、亚烷基氨基、亚烷基二氨基，等等)。而且，对于亚烷基和杂亚烷基的连接基团而言，连接基团的分子式的书写方向并不暗示连接基团的方向。例如，分子式-C(O)₂R’-代表-C(O)₂R’-和-R’C(O)₂-。

一般而言，“酰基取代基”也选自上面列举的基团。如本文使用的术语“酰基取代基”是指连接至本发明的化合物的多环核心的基团且该基团满足直接或间接地连接至本发明的化合物的多环核心的羰基碳的化合价。

除非另有说明，术语“环烷基”和“杂环烷基”其自身或者与其他术语的组合分别表示“烷基”和“杂烷基”的环状形式。此外，对于杂环烷基而言，杂原子可占据杂环与分子的剩余部分连接的位置。环烷基的实例包括但不限于：环戊基、环己基、1-环己烯基、3-环己烯基、环庚基，等等。杂环烷基的实例包括但不限于：1-(1,2,5,6-四氢吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-吗啉基、3-吗啉基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、四氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基，等等。

除非另有说明，术语“卤代”或“卤素”其自身或作为另一取代基的一部分是指氟、氯、溴或碘原子。此外，诸如“卤代烷基”之类的术语意在包括单卤代烷基和多卤代烷基。例如，术语“卤代(C₁-C₄)烷基”意在包括但不限于：三氟甲基、2,2,2-三氟乙基、4-氯代丁基、3-溴代丙基，等等。

除非另有说明，术语“芳基”是指多不饱和的、芳香性的烃取代基，其可以是单环或多环(优选地1至3个环)，其是稠合在一起的或共价连接的。术语“杂芳基”是指是指含有1个至4个选自N、O和S的杂原子芳基基团，其中，氮原子和硫原子被任选地氧化，并且氮原子被任选地季铵化。杂芳基基团可通过杂原子连接至分子的剩余部分。芳基和杂芳基基团的非限定性的实例包括：苯基、1-萘基、2-萘基、4-联苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-恶唑基、4-恶唑基、2-苯基-4-恶唑基、5-恶唑基、3-异恶唑基、4-异恶唑基、5-异恶唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基和6-喹啉基。上述芳基和杂芳基环***中的每一个的取代基选自下文所述的可接受的取代基。

为了简洁起见，当与其他术语(例如，芳氧基、芳硫氧基、芳基烷基)组合使用时，术语“芳基”包括上述芳环和杂芳环。因此，术语“芳基烷基”意在包括其中芳基连接至烷基的那些自由基(例如，苄基、苯乙基、吡啶甲基，等等)，所述烷基包括碳原子(例如，亚甲基)被例如氧原子取代的那些烷基(例如，苯氧基甲基、2-吡啶基氧甲基、3-(1-萘基氧)丙基，等等)。

上述术语(例如“烷基”、“杂烷基”、“芳基”和“杂芳基”)的每一个包括所指定的自由基的取代形式和未取代形式这两者。每种类型的自由基的优选的取代基在下文提供。

烷基和杂烷基自由基(包括通常称为亚烷基、烯基、杂亚烷基、杂烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基和杂环烯基的那些基团)的取代基通常分别被称为“烷基取代基”和“杂烷基取代基”，并且它们可为选自下列多种基团中的一种或一种以上，但不限于下列基团：-OR’,＝O,＝NR’,＝N-OR’,-NR’R”,-SR’,-卤素,-SiR’R”R”’,-OC(O)R’,-C(O)R’,-CO₂R’,-CONR’R”,-OC(O)NR’R”,-NR”C(O)R’,-NR’-C(O)NR”R”’,-NR”C(O)₂R’,-NR-C(NR’R”R”)＝NR””,-NR-C(NR’R”)＝NR”’,-S(O)R’,-S(O)₂R’,-S(O)₂NR’R”,-NRSO₂R’,-CN和-NO₂，数量为0至(2m’+1)，其中，m’为该自由基的碳原子总数。R’,R”,R”’和R””优选地分别独立地指氢、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基(例如，被1个至3个卤素取代的芳基)，取代或未取代的烷基、烷氧基或硫代烷氧基，或者芳基烷基基团。例如，当本发明的化合物包括一个以上R基团时，R基团中的每一个独立地选自各R’,R”,R”’和R””基团(当存在这些基团中的一个以上时)。当R’和R”连接至相同的氮原子时，它们可与氮原子结合形成5元环、6元环或7元环。例如，-NR’R”意在包括但不限于：1-吡咯烷基和4-吗啉基。通过以上对取代基的讨论，本领域技术人员会理解的是，术语“烷基”意在包括如下基团：该基团包括连接至除了氢基团以外的基团的碳原子，例如，卤代烷基(例如，-CF₃和-CH₂CF₃)和酰基(例如，-C(O)CH₃，-C(O)CF₃，-C(O)CH₂OCH₃，等等)。

类似于对于烷基自由基的取代基的描述，芳基取代基和杂芳基取代基通常被分别称为“芳基取代基”和“杂芳基取代基”，并且为不同的，选自例如，卤素，-OR’，＝O，＝NR’，＝N-OR’，-NR’R”，-SR’，-卤素，-SiR’R”R”’，-OC(O)R’，-C(O)R’，-CO₂R’，-CONR’R”，-OC(O)NR’R”，-NR”C(O)R’，-NR’-C(O)NR”R”’，-NR”C(O)₂R’，-NR-C(NR’R”)＝NR’”，-S(O)R’，-S(O)₂R’，-S(O)₂NR’R”，-NRSO₂R’，-CN和-NO₂，-R’，-N₃，-CH(Ph)₂，氟代(C₁-C₄)烷氧基和氟代(C₁-C₄)烷基，数量为0至芳香族环***上开放的化合价的总数，并且其中，R’,R”,R”’和R””优选地独立地选自：氢、(C₁-C₈)烷基和杂烷基、未取代的芳基和杂芳基，(未取代的芳基)-(C₁-C₄)烷基以及(未取代的芳基)氧-(C₁-C₄)烷基。例如，当本发明的化合物包含一个以上R基团时，R基团中的每一个独立地选自各R’,R”,R”’和R””基团(当存在这些基团中的一个以上时)。

芳环或杂芳环的相邻原子上的芳基取代基中的两个可任选地被通式–T-C(O)-(CRR’)_q-U-的取代基取代，其中，T和U独立地为-NR-，-O-,-CRR’-或单个化学键，并且q为0至3的整数。可选地，芳环或杂芳环的相邻原子上的取代基中的两个可任选地被通式–A-(CH₂)_r-B-的取代基取代，其中，A和B独立地为–CRR’-,-O-,-NR-,-S-,-S(O)-,-S(O)₂-,-S(O)₂NR’-或单个化学键，并且r为1至4的整数。由此形成的新环中的单个化学键中的一个可被双键任选地取代。可选地，芳基环或杂芳基环的相邻原子上的取代基中的两个可任选地被通式–(CRR’)_s-X-(CR”R’”)_d-的取代基取代，其中，s和d独立地为0至3的整数，并且X为-O-，-NR’-,-S-,-S(O)-,-S(O)₂-,或–S(O)₂NR’-。取代基R,R’,R”和R”’优选地独立地选自氢或者取代或未取代的(C₁-C₆)烷基。

本文使用的术语“杂原子”包括氧(O)、氮(N)、硫(S)、磷(P)和硅(Si)。

II.组合物

总体而言，本发明提供免疫调节性多核苷酸，尤其是合成的含有CpG基序(CpGODN)的寡核苷酸，以及含有所述免疫调节性多核苷酸的药物组合物和组合，以及使用所述组合物预防或治疗疾病(例如癌症)的方法。

A.TLR9激动剂

总体而言，本发明的组合物包含TLR9激动剂。

本领域已知TLR9识别细菌DNA和合成的寡核苷酸中的非甲基化的CpG基序。含有CpG的硫代磷酸酯寡核苷酸的其他修饰也可影响其通过TLR9充当免疫反应的调节剂的能力。

本文中的“调节”或“调节性”是指改变，例如，反应的增加，或者TLR9介导的反应中的质量差异。

本文中的“TLR9激动剂”是指能够提高、诱导或调节TLR9介导的免疫刺激的化合物，例如，基于寡核苷酸的化合物。

在一些实施方式中，TLR9激动剂包括免疫调节性多核苷酸，例如，作为免疫刺激性多核苷酸。

本文中的“免疫刺激性多核苷酸”是指影响和/或有助于可测量的免疫反应的核酸分子(例如，多核苷酸)，所述免疫反应如体外测量、体内测量和/或从体外至体内测量。可测量的免疫反应的实例包括但不限于：抗原特异性抗体生成，细胞因子的分泌，淋巴细胞群(例如，NK细胞、CD+ T淋巴细胞、CD8+ T淋巴细胞、B淋巴细胞等等)的活化或扩增。本领域已知免疫刺激性核酸(ISNA)序列刺激先天性免疫反应，具体而言，那些反应通过细胞中的TLR-9信号转导而发生。如本领域已知的，免疫刺激性核酸(ISNA)分子可从微生物源(例如，细菌)中分离出来，可存在于用于基因疗法的核酸载体中，或可使用本领域已知的和本文描述的技术和仪器合成。总体而言，免疫刺激性核酸序列包括至少一个CG二核苷酸，其中，该二核苷酸的C是非甲基化的。因此，在一些情况下，微生物感染和施用的DNA可刺激先天性免疫反应。

本文中的“免疫刺激性”或“刺激免疫反应”是指刺激如下类型的细胞：该类型的细胞参与免疫反应并且提高对特异性抗原性物质的免疫反应。由免疫刺激性核酸刺激的免疫反应通常是“Th1型”免疫反应，其与“Th2型”免疫反应相对。Th1型免疫反应的特征通常为对抗原的“延迟性超敏”反应，Th1型免疫反应活化巨噬细胞功能并且可通过诸如IFN-γ，IL-2，IL-12和TNF-β之类的Th1相关细胞因子的水平的提高在生物化学水平上被检测。Th2-型免疫反应通常与高水平的抗体生成有关，尤其是高水平的IgE抗体的生成并且Th2-型免疫反应提高嗜酸性粒细胞的数量和活性以及诸如IL-4，IL-5和IL-13之类的Th2-相关细胞因子的表达。

本文中的“先天性免疫反应”或“先天性免疫性”意在包括多种固有抗性机制，通过这些机制，细胞或个体识别并响应病原体的存在。如本文使用的，“先天性免疫反应”包括在细胞识别病原体相关分子模型或信号时发生的细胞内和细胞间事件和反应。先天性免疫反应中活化的细胞受体包括Toll-样受体(TLR)家族，并且，如本文所述的，若干TLR的微生物配体已被识别。可测量的先天性免疫反应的实例包括但不限于：细胞因子的分泌，诸如NK细胞、CD4+ T淋巴细胞，CD8+ T淋巴细胞之类的淋巴细胞群的活化或扩增。

TLR9激动剂活化先天性免疫反应和获得性免疫反应(Arthur M.Krieg.NatureReviews Drug Discovery,Vol 5.June 2006,471-484)。含有CpG的寡核苷酸(CpG ODN)是TLR9激动剂。D.M.Klinman,Nat.Rev.,Immunol.4(2004)249–258。基于功能性特征，CpG ODN分为三种类型。Tomoki Ito,et al.Blood,2006,Vol 107,Num 6:2423-2431。A型CpG ODN活化人浆细胞样树突细胞(pDC)以生成大量I型干扰素(IFN-α/β)并且有力地活化天然杀伤细胞(NK细胞)。B型CpG ODN主要活化B细胞，从而导致B细胞的增殖和抗体分泌。C型CpG ODN共享A型和B型CpG ODN这两者的活性。作为TLR9激动剂的诸如CpG2216或CpG2006或CpG2395之类的CpG ODN可被内吞进入细胞腔室，在该腔室中，CpG ODN暴露于TLR9并且活化TLR9。在pDC中，TLR9的活化启动特征为促炎性细胞因子(IL-6，肿瘤坏死因子-α(TNFα))的分泌，I型干扰素(IFN)的分泌以及IFN可诱导的趋化因子的分泌的快速先天性免疫反应。通过IFN依赖性通路和独立于IFN的通路，包括天然杀伤(NK)细胞，单核细胞和中性粒细胞在内的先天性免疫细胞被pDC二次活化。通过TLR9活化的B细胞对抗原刺激具有大大提高的灵敏性并且有效分化为分泌抗体的细胞，由此有助于获得性免疫反应，尤其是体液免疫反应。通过TLR9活化的pDC分泌IFNα，其驱动pDC迁移并聚集至***和其他二级淋巴组织，在所述***和其他二级淋巴组织中，pDC活化初始T细胞和记忆T细胞，帮助可溶性蛋白抗原交叉呈递至CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)并且促进强的TH1偏向的细胞CD4和CD8 T-细胞反应。基于上述发现，显而易见的是，拮抗CpG ODN活性的试剂可通过抑制先天性免疫反应和获得性免疫反应用于治疗或预防免疫介导的失调。

总体而言，本发明的TLR9激动剂包括寡核苷酸(ODN)。

本文中的“寡核苷酸”是指连接至磷酸酯基团和可互换的有机碱基的多个核苷酸(即，含有糖(例如，脱氧核糖)的分子)，所述有机碱基是取代的嘧啶(Py)(例如，胞嘧啶(C)，胸腺嘧啶(T))或取代的嘌呤(Pu)(例如，腺嘌呤(A)或鸟嘌呤(G))。本文使用的术语寡核苷酸是指寡聚脱氧核糖核苷酸(ODN)。寡核苷酸可从已有的核酸来源(例如，基因组或cDNA)中获得，但是优选地，寡核苷酸为合成的。本发明的寡核苷酸可通过多种商售的自动核酸合成仪合成。这些寡核苷酸被称为合成的寡核苷酸。

在一些实施方式中，TLR9激动剂包括含有非甲基化的CpG基序的寡核苷酸。

在一些实施方式中，TLR9激动剂包括具有选自表1的序列的寡核苷酸。

表1.TLR9激动剂

名称	序列
		CpG 1	5’-tcgggaacgt tccccgcgtt cgaacgcgg-3’(SEQ ID No.:1)
CpG 2	5’-tcgcgaacgt tcgcggcgtt cgaacgccg-3’(SEQ ID No.:2)
		CpG 3	5’-tcgcgaacgt tcgccgggtt cgaacccgg-3’(SEQ ID No.:3)
CpG 4	5’-tcgcgaacgt tcgccgcctt cgaaggcgg-3’(SEQ ID No.:4)
		CpG 5	5’-tcgcgaacgt tcgccgcgat cgatcgcgg-3’(SEQ ID No.:5)
CpG 6	5’-tcgcgaacgt tcgccgcgta cgtacgcgg-3’(SEQ ID No.:6)
		CpG 7	5’-tcgcgaacgt tcgcgcgcgt tcgaacgcgg-3’(SEQ ID No.:7)
CpG 8	5’-tcgccgaacg ttcggccgcg gttcgaaccg cgg-3’(SEQ ID No.:8)
		CpG 9	5’-tcgcgaacgt tcgctcgcgt tcgaacgcgg-3’(SEQ ID No.:9)
CpG 10	5’-tcgcgaacgt tcgccgacgt tcgaacgtcg g-3’(SEQ ID No.:10)
		CpG 11	5’-tcgcgaacgt tcgccggttc gaaccgg-3’(SEQ ID No.:11)
CpG 12	5’-tcgcgaacgt tcgccgcttc gaagcgg-3’(SEQ ID No.:12)

注：本文提供的序列具有小写字母和大写字母，小写字母代表PS键合，大写字母代表PO键合。

在一些实施方式中，本发明的寡核苷酸包括或具有表1的序列中的一个，并在5’端或3’端或者这两端具有一个核苷酸或额外的核苷酸(例如，1个，2个，3个，4个或5个)。

在一些实施方式中，本发明的寡核苷酸只具有表1的序列中的一个，而在5’端或3’端不具有任何额外的核苷酸。

在一些实施方式中，本发明的寡核苷酸由表1的序列中的一个构成。

在一些实施方式中，本发明的寡核苷酸不包含化学修饰。

在一些实施方式中，本发明的寡核苷酸包含化学修饰。

与天然DNA相比，本发明公开的寡核苷酸可包括各种不同的化学修饰，所述化学修饰涉及磷酸二酯核苷酸间桥键，核糖单元和/或天然核苷碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶)。所述修饰可在寡核苷酸的合成过程中进行或在寡核苷酸合成之后进行。在合成过程中，修饰的碱基可并入内部或并入其末端。在合成之后，修饰可使用活性基团(通过氨基改性剂，通过3’或5’羟基基团或通过磷酸酯基团)进行。

根据本发明的寡核苷酸可具有一种或多于一种修饰，其中，与由天然DNA构成的相同序列的寡核苷酸相比，每种修饰可位于特定的磷酸二酯核苷酸间桥键和/或特定的核糖单元和/或特定的天然核苷碱基位置。化学修饰包括本发明的寡核苷酸的“骨架修饰”。如本文使用的，本发明的寡核苷酸的修饰的骨架包括但不限于：“硫代磷酸酯骨架”，其是指核酸分子的稳定化的糖磷酸酯骨架，在该骨架中，在至少一个核苷酸间键合处，非桥接的磷酸酯氧被硫取代。

在一些实施方式中，在每个核苷酸间键合和每隔一个核苷酸间键合处，非桥接的磷酸酯氧被硫取代。其他骨架修饰是指采用非离子型DNA类似物(例如，烷基膦酸酯和芳基膦酸酯(其中，带电荷的膦酸酯氧被烷基或芳基取代))，磷酸二酯和烷基磷酸三酯(其中，带电荷的氧基团被烷基化)进行的修饰。

在一些实施方式中，寡核苷酸的磷酸酯骨架是未修饰的。

在一些实施方式中，寡核苷酸的磷酸酯骨架被部分或全部硫代磷酸酯修饰。

在一些实施方式中，寡核苷酸是硫代磷酸酯/磷酸二酯嵌合体。

化学修饰还包括对本发明公开的寡核苷酸进行碱基取代。取代的嘌呤和嘧啶可以是C-5丙炔嘧啶和7-去氮-7-取代的嘌呤。取代的嘌呤和嘧啶包括但不限于：腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶以及其他天然生成的或非天然生成的核碱基。本发明的寡核苷酸的化学修饰进一步包括对寡核苷酸的碱基的修饰。修饰的碱基是与通常在DNA中发现的天然生成的碱基(例如，T，C，G和A)化学上不同的任何碱基，但是修饰的碱基与这些天然生成的碱基共享基本的化学结构。

在一些实施方式中，本发明的寡核苷酸通过使用胞嘧啶核苷衍生物进行修饰。术语“胞嘧啶核苷衍生物”是指胞嘧啶核苷样核苷酸(不包括胞嘧啶核苷)并且术语“胸腺嘧啶核苷衍生物”是指胸腺嘧啶核苷样核苷酸(不包括胸腺嘧啶核苷)。此外，本发明的寡核苷酸可通过在寡核苷酸的任一端或两端连接二醇进行化学修饰，所述二醇例如：四乙二醇或六乙二醇。

除了在Py-Pu二核苷酸处具有磷酰基乙酸或磷酸基乙酸样键合之外，寡核苷酸可进一步具有骨架修饰。与磷酸二酯核苷酸间键合相比，稳定化的核苷酸间键合是对体内降解(例如，通过外源性核酸酶或内源性核酸酶)具有相对耐受性的核苷酸间键合。除了磷酰基乙酸和磷酰基乙酸样键合之外，寡核苷酸还可包含其他稳定化的核苷酸间键合，包括但不限于：硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，甲基膦酸酯和甲基硫代磷酸酯。其他稳定的核苷酸间键合包括但不限于：肽、烷基和脱磷酸。类似于其他稳定化的键合那样，磷酰基乙酸核苷酸间键合具有较低的核酸酶消化敏感性和增强的活化RNAse H的能力。因此，例如，磷酸二酯寡核苷酸但非磷酰基乙酸寡核苷酸易受核酸酶消化的影响，而磷酸二酯寡核苷酸和磷酰基乙酸寡核苷酸这两者活化RNAse H。在一些实施方式中，Py-Pu寡核苷酸包括至少一个磷酸二酯核苷酸间键合。除了在优选的内部位置处的磷酰基乙酸或磷酰基乙酸样核苷酸间键合之外，寡核苷酸还可包括对降解具有耐受性的5’端和3’端的磷酰基乙酸或磷酰基乙酸样核苷酸间键合。这些降解耐受性端可涉及相对于对应的未修饰的端对外源性核酸酶的消化具有较高耐受性的任何合适的修饰。例如，5’端和3’端可通过在其中包括骨架的至少一种磷酸酯修饰来进行稳定。在一种实施方式中，在每一端处的所述骨架的至少一种磷酸酯修饰独立地为硫代磷酸酯核苷酸间键合、二硫代磷酸酯核苷酸间键合、磷酰基乙酸核苷酸间键合、磷酰基乙酸样核苷酸间键合、甲基磷酸酯核苷酸间键合或甲基硫代磷酸酯核苷酸间键合。在另一实施方式中，降解耐受性端包括一个或多于一个由在3’端的肽键或酰胺键连接的核苷酸单元。

术语“核酸”和“寡核苷酸”还包括带有取代或修饰的核酸或寡核苷酸，例如，在碱基和/或糖中具有取代或修饰的核酸或寡核苷酸。例如，它们包括具有如下糖骨架的核酸，所述糖骨架共价键合至不同于2’位置的羟基的低分子量有机基团以及不同于5’位置的磷酸基团或羟基基团的低分子量有机基团。因此，修饰的核酸可包括2’-O-烷基化的脱氧核糖基团。此外，修饰的核酸可包括诸如***糖或2’-O-氟代***糖之类的糖类，而非脱氧核糖。因此，核酸可以是骨架组成非均质的，从而含有任何可能的键合在一起的聚合物单元的组合，例如，肽-核酸(其具有带有核酸碱基的氨基酸骨架)。在本发明的上下文中，寡核苷酸不是反义寡核苷酸、核糖酶或适体。

核酸还包括取代的嘌呤和嘧啶，例如，C-5丙炔嘧啶和7-去氮-7-取代的嘌呤修饰的碱基(Wagner RW et al.,(1996)Nat Biotechnol 14:840-4)。嘌呤和嘧啶包括但不限于：腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-羟基胞嘧啶、5-氟代胞嘧啶、2-氨基嘌呤、2-氨基-6-氯代嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、次黄嘌呤以及其他天然生成的和非天然生成的核酸碱基、取代的和未取代的芳香基团。其他这样的修饰是本领域技术人员所熟知的。

寡核苷酸可以是DNA或RNA。在一种实施方式中，本发明的寡核苷酸是DNA/RNA杂交分子，其包含核糖和脱氧核糖的混合骨架。DNA/RNA杂交寡核苷酸通常显示出较高的活性。在一种实施方式中，这些DNA/RNA杂交寡核苷酸是单链的。在另一实施方式中，全部寡核苷酸或寡核苷酸的一部分是双链的。在一种实施方式中，本发明的寡核苷酸是具有初级结构和二级结构的共价封闭的哑铃型分子形式。在一种实施方式中，这种环状寡核糖核苷酸包括通过介入中间的双链片段连接的两个单链环。在一种实施方式中，至少一个单链环包括本发明的免疫刺激性DNA基序。本发明的其他共价封闭的哑铃型分子包括嵌合的DNA/RNA分子，其中，例如，双链片段是至少部分DNA(例如同型二聚体dsDNA或异型二聚体DNA:RNA)，并且至少一个单链环包括本发明的免疫刺激性DNA基序。可选地，嵌合分子的双链片段是DNA。

本发明的寡核苷酸可还包括其他修饰。这些修饰包括非离子型DNA类似物，例如，烷基磷酸酯和芳基磷酸酯(其中，带电荷的磷酸酯氧被烷基或芳基取代)，磷酸二酯和烷基磷酸三酯(其中，带电荷的氧基团被烷基化)。在任一末端或两个末端包含二醇(例如，四乙二醇或六乙二醇)的核酸也已表现出对核酸酶降解具有基本耐受性。

与天然RNA和DNA相比，本发明的寡核苷酸可包括各种不同的化学修饰和取代，其涉及磷酸二酯核苷酸间桥键，β-D-核糖单元和/或天然核苷酸碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶)。化学修饰的实例是本领域技术人员已知的并且在例如Uhlmann,E.等人(1990)Chem Rev 90:543；"Protocols for Oligonucleotides and Analogs"Synthesis and Properties&Synthesis and Analytical Techniques,S.Agrawal,Ed,Humana Press,Totowa,USA 1993；Crooke,ST.等人(1996)Annu Rev Pharmacol Toxicol36:107-129；以及Hunziker,J.等人(1995)Mod Synth Methods 7:331-417中描述。根据本发明的寡核苷酸可具有一种或多于一种修饰，其中，与由天然DNA或RNA构成的相同的序列的寡核苷酸相比，每种修饰位于特定的磷酸二酯核苷酸间桥键和/或特定的β-D-核糖单元和/或特定的天然核苷酸碱基的位置。

例如，本发明涉及可包括一种或多于一种修饰的寡核苷酸，并且其中，每种修饰独立地选自：a)由修饰的核苷酸间桥键取代位于核苷酸的3’端和/或5’端的磷酸二酯核苷酸间桥键，b)由脱磷酸桥键取代位于核苷酸的3’端和/或5’端的磷酸二酯桥键，c)由另一单元取代糖磷酸酯骨架中的糖磷酸酯单元，d)由修饰的糖单元取代β-D-核糖单元，以及e)由修饰的核苷酸碱基取代天然核苷酸碱基。

位于核苷酸的3’端和/或5’端的磷酸二酯核苷酸间桥键可被修饰的核苷酸间桥键取代，其中，修饰的核苷酸间桥键选自例如：硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，NR₁R₂-氨基磷酸酯，硼烷磷酸酯(boranophosphate)，α-羟基苄基磷酸酯，磷酸酯-(C₁-C₂₁)-O-烷基酯，磷酸酯-(C₆-C₁₂)芳基-(C₁-C₂₁)-O-烷基酯，d-烷基磷酸酯和/或(C₆-C₁₂)芳基磷酸酯桥键，(C₇-C₁₂)-α-羟基甲基-芳基(例如，WO95/01363中公开的)，其中，(C₆-C₁₂)芳基，(C₈-C₂₀)芳基和(C₆-C₁₄)芳基被卤素、烷基、烷氧基、硝基、氰基任选地取代，并且其中，R₁和R₂分别独立地为氢、(C₁-C₁₈)-烷基，(C₆-C₂₀)-芳基，(C₆-C₁₄)-芳基-(C₁-C₈)-烷基，优选地为氢、(C₁-C₈)-烷基，优选地为(C₁-C₄)-烷基和/或甲氧基乙基，或者R₁和R₂与其所带有的氮原子一同形成5元至6元杂环，该杂环还可包含选自O，S和N的额外的杂原子。

由脱磷酸桥键取代位于核苷酸的3’端和/或5’端的磷酸二酯桥键(脱磷酸桥键在例如Uhlmann E and Peyman A in"Methods in Molecular Biology,"Vol.20,"Protocolsfor Oligonucleotides and Analogs,"S.Agrawal,Ed.,Humana Press,Totowa 1993,Chapter 16,pp.355ff中描述)，其中，脱磷酸桥键选自例如：脱磷酸桥键甲缩醛，3’-硫代甲缩醛，甲基羟胺，肟，亚甲基二甲基-亚肼基，二亚甲基砜(dimethylenesulfone)和/或甲硅烷基基团。糖磷酸酯骨架(即，由糖磷酸酯单元构成的糖磷酸酯骨架)中的糖磷酸酯单元(即，β-D-核糖和磷酸二酯核苷酸间桥键一同形成的糖磷酸酯单元)可被另一单元取代，其中，所述另一单元例如适于构建“吗啉代-衍生物”寡聚体(例如在Stirchak EP等人,(1989)Nucleic Acids Res 17:6129-41中所描述的)，也就是，例如，由吗啉代-衍生物单元进行取代，或构建聚酰胺核酸(“PNA”，例如在Nielsen PE等人,(1994)Bioconjug Chem 5:3-7中所描述的)，也就是，例如，由PNA骨架单元(例如，2-氨乙基甘氨酸)进行取代。

β-D-核糖单元或β-D-2'-脱氧核糖单元可被修饰的糖单元取代，其中，修饰的糖单元例如选自：α-D-2'-脱氧核糖,α-L-2'-脱氧核糖,β-L-2'-脱氧核糖,β-L-核糖,2'-F-21-脱氧核糖,2'-F-2'-脱氧***糖,2'-O-(C1-C6)烷基-核糖,优选地，2'-O-(C1-C6)烷基-核糖是2'-O-甲基核糖,2I-O-(C2-C6)烯基-核糖,21-[O-(C1-C6)烷基-O-(C1-C6)烷基]-核糖,21-NH2-21-脱氧核糖,β-D-呋喃木糖,α-***呋喃糖,2,4-双脱氧-β-D-赤式-六吡喃糖,和碳环(在例如Froehler,J.(1992)Am Chem Soc 114:8320中描述)和/或开链糖类似物(在例如Vandendriessche等人,(1993)Tetrahedron 49:7223中描述)和/或双环糖类似物(在例如Tarkov,M.等人,(1993)HeIv Chim Acta 76:481中描述)。

在一些实施方式中，糖是2'-O-甲基核糖，2'-脱氧核糖，2'-氟代-2'-脱氧核糖，2'-氨基-2'-脱氧核糖，2'-O-烷基-核糖，或3'-O-烷基-核糖和/或2'-O-4'-C-亚烷基核糖，例如，2'-O-4'-C-亚甲基核糖(也称为LNA)。

核酸还包括取代的嘌呤和嘧啶，例如，C-5丙炔嘧啶和7-去氮-7-取代的嘌呤修饰的碱基(Wagner,R.W.等人,(1996)Nat Biotechnol 14:840-4)。嘌呤和嘧啶包括但不限于：腺嘌呤，胞嘧啶，鸟嘌呤和胸腺嘧啶，以及其他天然和非天然生成的核酸碱基，取代和未取代的芳香基团。

修饰的碱基是与通常在DNA和RNA中发现的天然生成的碱基(例如，T，C，G，A和U)在化学上不同的任何碱基，但是它们与这些天然生成的碱基共享基本的化学结构。修饰的核苷酸碱基可例如选自：次黄嘌呤，尿嘧啶，二氢尿嘧啶，假尿嘧啶，2-硫尿嘧啶，4-硫尿嘧啶，5-氨基尿嘧啶，5-(C₁-C₆)-烷基尿嘧啶，5-(C₂-C₈)-烯基尿嘧啶，5-(C₂-C₆)-炔基尿嘧啶，5-(羟甲基)尿嘧啶，5-氯代尿嘧啶，5-氟代尿嘧啶，5-溴代尿嘧啶，5-碘代尿嘧啶，2,4-二氟代-甲苯，和3-硝基吡咯，5-羟基胞嘧啶，5-(C₁-C₆)-烷基胞嘧啶，5-(C₂-C₆)-烯基胞嘧啶，5-(C₂-C₆)-炔基胞嘧啶，5-氯代胞嘧啶，5-氟代胞嘧啶，5-溴代胞嘧啶，N₂-二甲基鸟嘌呤，2,4-二氨基嘌呤，8-氮杂嘌呤，取代的7-去氮嘌呤，优选地，7-去氮-7-取代的和/或7-去氮-8-取代的嘌呤，5-羟甲基胞嘧啶，N₄-烷基胞嘧啶(例如，N₄-乙基胞嘧啶)，5-羟基脱氧胞苷，5-羟甲基脱氧胞苷，N₄-烷基脱氧胞苷(例如，N₄-乙基脱氧胞苷)，6-硫代脱氧鸟苷，和硝基吡咯的脱氧核糖核苷酸，C₅-丙炔基嘧啶和二氨基嘌呤(例如，2,6-二氨基嘌呤)，肌苷，5-甲基胞嘧啶，2-氨基嘌呤，2-氨基-6-氯代嘌呤，次黄嘌呤，或天然核苷酸碱基的其他修饰。上述所列举的修饰的核苷酸碱基意在进行举例说明，不能将其解释为对本发明的限定。

本文使用的“Py”是指嘧啶，并且在一些实施方式中，是指含有胞嘧啶或修饰的胞嘧啶的核苷酸。本文使用的修饰的胞嘧啶是胞嘧啶的天然生成的或非天然生成的嘧啶碱基类似物，所述嘧啶碱基类似物可取代胞嘧啶碱基而不损害寡核苷酸的免疫刺激活性。修饰的胞嘧啶包括但不限于：5-取代的胞嘧啶(例如，5-甲基-胞嘧啶，5-氟代-胞嘧啶，5-氯代-胞嘧啶，5-溴代-胞嘧啶，5-碘代-胞嘧啶，5-羟基-胞嘧啶，5-羟甲基-胞嘧啶，5-二氟甲基-胞嘧啶，和未取代的或取代的5-炔基-胞嘧啶)，6-取代的胞嘧啶，N₄-取代的胞嘧啶(例如，N₄-乙基-胞嘧啶)，5-氮杂-胞嘧啶，2-巯基-胞嘧啶，异胞嘧啶，假-异胞嘧啶，带有稠环***的胞嘧啶类似物(例如，N,N'-丙烯胞嘧啶或吩噁嗪)，以及尿嘧啶及其衍生物(例如，5-氟代-尿嘧啶，5-溴代-尿嘧啶，5-溴代乙烯基-尿嘧啶，4-硫代-尿嘧啶，5-羟基-尿嘧啶，5-丙炔基-尿嘧啶)。一些优选的胞嘧啶包括5-甲基胞嘧啶，5-氟代-胞嘧啶，5-羟基-胞嘧啶，5-羟甲基-胞嘧啶，和N₄-乙基-胞嘧啶。在本发明的另一实施方式中，胞嘧啶碱基被通用碱基(例如，3-硝基吡咯，P-碱基)、芳香环***(例如，氟代苯或二氟代苯)或氢原子(无碱基间隔(dSpacer))取代。

本文使用的“Pu”是指嘌呤或修饰的嘌呤。在一些实施方式中，Pu是鸟嘌呤或修饰的鸟嘌呤碱基。本文使用的修饰的鸟嘌呤是鸟嘌呤的天然生成的或非天然生成的鸟嘌呤碱基类似物，所述鸟嘌呤碱基类似物取代该鸟嘌呤而不会损害寡核苷酸的免疫刺激活性。修饰的鸟嘌呤包括但不限于：7-去氮鸟嘌呤，7-去氮-7-取代的鸟嘌呤(例如，7-去氮-7-(C₂-C₆)炔基鸟嘌呤)，7-取代-8-取代的鸟嘌呤，次黄嘌呤，N₂-取代的鸟嘌呤(例如，N₂-甲基-鸟嘌呤)，5-氨基-3-甲基-3H,6H-噻唑[4,5-d]嘧啶-2,7-二酮，2,6-二氨基嘌呤，2-氨基嘌呤，嘌呤，吲哚，腺嘌呤，取代的腺嘌呤(例如，N₆-甲基-腺嘌呤，8-羟基腺嘌呤)，8-取代的鸟嘌呤(例如，8-羟基鸟嘌呤和8-溴代鸟嘌呤)和6-硫代鸟嘌呤。在本发明的另一实施方式中，鸟嘌呤碱基被通用碱基(例如，4-甲基-吲哚，5-硝基-吲哚和K碱基)、芳香环***(例如，苯并咪唑或二氯苯并咪唑，1-甲基-1H-[1,2,4]***-3-羧酸酰胺)或氢原子(无碱基间隔)取代。

本发明还包括具有不常见的核苷酸间键合的寡核苷酸，所述不常见的核苷酸间键合包括5'-5',2'-2',2'-3'和2'-5'核苷酸间键合。在本发明的一些方面，寡核苷酸具有一个或多于一个可结合的5'端是有优势的。这有可能生成具有两个这种5'端的修饰的寡核苷酸。这可通过例如通过3'-3'键合连接两个寡核苷酸从而生成具有一个或两个可结合的5'端的寡核苷酸来实现。3'-3'键合可以是磷酸二酯，硫代磷酸酯，磷酰基乙酸酯或任何其他修饰的核苷酸间桥键。用于完成这种键合的方法是本领域已知的。例如，这种键合在Seliger,H.等人Oligonucleotide analogs with terminal 3'-3'-and 5'-5'-internucleotidic linkages as antisense inhibitors of viral gene expression,Nucleotides&Nucleotides(1991),10(1-3),469-77和Jiang等人Pseudo-cyclicoligonucleotides:in vitro and in vivo properties,Bioorganic&MedicinalChemistry(1999),7(12),2727-2735中描述。在一种实施方式中，从免疫刺激性DNA基序中排除这种不常见的键合，即便这种键合中的一种或多于一种可能发生在聚合物中的其他地方。对于具有自由端的聚合物而言，将一个3'-3'核苷酸间键合包括在内可产生具有两个自由5'端的聚合物。相反，对于具有自由端的聚合物而言，将一个5'-5'核苷酸间键合包括在内可产生具有两个自由3'端的聚合物。此外，其中键合不是磷酸二酯，硫代磷酸酯，磷酰基乙酸酯或其他修饰的桥键的3'-3'-,5'-5'-,2'-2',2'-3'-和2'-5'-连接的核酸可使用其他间隔体制备，所述其他间隔体例如三乙二醇磷酸酯基团或四乙二醇磷酸酯基团(Durand,M.等人.,Triple-helix formation by an oligonucleotide containing one(dA)12 andtwo(dT)12 sequences bridged by two hexaethylene glycol chains,Biochemistry(1992),31(38),9197-204,美国专利US5658738,和美国专利US5668265)。可选地，非核苷酸连接体可从乙二醇，丙二醇衍生得到，或可使用标准亚磷酰胺化学或从无碱基脱氧核糖(无碱基间隔)单元(Fontanel,Marie Laurence等人,Sterical recognition by T4polynucleotide kinase of non-nucleosidic moieties 51-attached tooligonucleotides；Nucleic Acids Research(1994),22(11),2022-7)衍生得到。所述非核苷酸连接体可被并入一次或多次，或者可彼此结合以在待连接的两个ODN的3'端之间产生任何理想的距离。

寡核苷酸可包含双倍体单元(doubler unit)或三倍体单元(trebler unit)(GlenResearch,Sterling,VA)，尤其是带有3'-3'键合的那些修饰的寡聚脱氧核糖核苷酸类似物。在一种实施方式中，双倍体单元可基于1,3-双-[5-(4,4'-二甲氧基三苯甲氧(trityloxy))戊基胺基]丙基-2-[(2-氰乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺。通过多个双倍体、三倍体或其他多倍体单元使修饰的寡聚核糖核苷酸类似物分支而产生树枝状大分子，该树枝状大分子是本发明的又一实施方式。分支的修饰的寡聚核糖核苷酸类似物可导致受体交联，尤其是对于免疫刺激性RNA和DNA的组合(例如，TLR3，TLR7，TLR8和TLR9)而言，相对于非分支形式的类似物，其具有不同的免疫作用。此外，分支的或其他多聚类似物的合成可使DNA针对降解稳定并且能够使DNA序列弱化或部分有效，从而发挥治疗有用水平的免疫活性。修饰的寡聚脱氧核糖核苷酸类似物还可包含由肽修饰试剂或寡核苷酸修饰试剂(GlenResearch)产生的连接体单元。而且，修饰的寡聚脱氧核糖核苷酸类似物可包含一个或多于一个通过肽(酰胺)键合连接至聚合物的天然的或非天然的氨基酸残基。

3'-5',5'-5',3'-3',2'-2',2'-3'和2'-5'核苷酸间键合可以是直接的或间接的。本文中直接的键合是指本文公开的磷酸酯或修饰的磷酸酯键合，不含介于中间的连接体基团。介于中间的连接体基团是与本文公开的磷酸酯或修饰的磷酸酯键合不同的有机基团，其可包括例如，聚乙二醇，三乙二醇，六乙二醇，无碱基间隔(即，无碱基脱氧核苷酸)，双倍体单元或三倍体单元。键合优选地由C,H,N,O,S,B,P和卤素构成，其包含3个至300个原子。带有3个原子的实例是乙缩醛键合(ODN1-3'-O-CH2-O-3'-ODN2)，其例如将一个核苷酸的3'-羟基连接至另一寡核苷酸的3'-羟基。具有大约300个原子的实例是PEG-40(四十烷聚乙二醇)。优选的键合是磷酸二酯，硫代磷酸酯，甲基磷酸酯，磷酰胺，硼烷磷酸酯，酰胺，醚，硫代醚，乙缩醛，硫代乙缩醛，脲，硫脲，磺酰胺，希夫碱和二硫化物键合。还可使用SolulinkBioConjugation***。

如果寡核苷酸由两个或多于两个序列部分构成，那么这些部分可以是相同的或不同的。因此，在具有3'3'-键合的寡核苷酸中，序列可以是相同的5'-ODN1-3'3'-ODN1-5'或者可以是不同的5'-ODN1-3'3'-ODN2-5'。而且，各种不同的寡核苷酸部分的化学修饰以及连接各种不同的寡核苷酸部分的连接体可以是不同的。因为较短的寡核苷酸的吸收看起来没有较长的寡核苷酸的吸收那么有效，所以两个或多于两个短序列的连接产生改善的免疫刺激。较短的寡核苷酸的长度优选地为2-20个核苷酸，更优选地为3-16个核苷酸，但最优选为5-10个核苷酸。优选的是连接具有两个或多于两个未连接的5'-端的寡核苷酸。

寡核苷酸部分序列还可通过非核苷酸连接体连接。本文使用的“非核苷酸连接体”是指不是核苷酸或其聚合物(即，多核苷酸)的任何连接体成分，其中，核苷酸包括嘌呤或嘧啶核酸碱基和糖磷酸酯，具体而言，包括无碱基连接体(无碱基间隔)，三乙二醇单元或六乙二醇单元。进一步优选的连接体是烷基氨基连接体，例如，C₃，C₆，C₁₂氨基连接体，并且进一步优选的连接体也是烷硫基连接体，例如，C₃或C₆硫代连接体。寡核苷酸还可由可被烷基或取代的烷基进一步取代的芳香族残基连接。

其他稳定的寡核苷酸包括：非离子型DNA类似物，例如，烷基-和芳基-磷酸酯(其中，带电荷的磷酸酯氧被烷基或芳基基团取代)，磷酸二酯和烷基磷酸三酯(其中，带电荷的氧基团被烷基化)。在任一末端或两个末端包含二醇(例如，四乙二醇或六乙二醇)的核酸也已经表现出对核酸酶降解具有基本耐受性。

在一些实施方式中，活化基团能够活化人免疫细胞，所述人免疫细胞包括但不限于：树突细胞和B细胞或其组合。

树突细胞

在一些实施方式中，本文提供的ODN能够活化树突细胞，尤其是浆细胞样树突细胞。

树突细胞是最强的抗原呈递细胞。树突细胞在启动先天性免疫反应和获得性免疫反应中发挥至关重要的作用。树突细胞还在诱导和维持免疫耐受方面发挥关键作用。

本文中的“树突细胞(DC)”是指异质细胞群，其包括两个主要的亚型，即髓样DC(mDC)和浆细胞样DC(pDC)(Steinman等人,1979,J.Exp.Med.,149,1-16)。这两种血液DC亚组最初通过它们的CD11c(整合素补体受体)和CD123(IL-3Rα)的表达来区分。pDC和mDC群中的每一种构成人体内PBMC群的约0.2％至约0.6％。

本文中的“pDC”是指浆细胞样树突细胞，并且它们代表了在血液和外周淋巴器官中发现的树突细胞的亚型。这些细胞表达表面标记物CD123、BDCA-2(CD303)和BDCA-4(CD304)以及HLA-DR，但是不表达CD11c,CD14,CD3,CD20或CD56，这使pDC区别于一般树突细胞、单核细胞、T细胞、B细胞和NK细胞。作为先天性免疫***的成分，这些细胞表达细胞内Toll样受体7和9，这使病毒和细菌核酸能够得到检测，所述病毒和细菌核酸例如，ssRNA或CpG DNA基序。在刺激和随后的活化之后，这些细胞产生大量I型干扰素(主要为IFN-α和IFN-β)和III型干扰素(例如，IFN-λ)，这两种干扰素是介导多种作用的重要的多效性抗病毒化合物。通过产生大量I型干扰素、细胞因子和趋化因子，浆细胞样树突细胞广泛参与人体先天性免疫反应和获得性免疫反应。它们可调节NK细胞、T细胞、B细胞和其他涉及免疫反应强度、持续期和反应模式的细胞，因此，它们在肿瘤、感染和自体免疫疾病中发挥非常重要的作用(Liu YJ.IPC:professional type 1 interferon-producing cells andplasmacytoid dendritic cell precursors.Annu Rev Immunol.2005；23:275-306.Gilliet M,Cao W,Liu YJ.Plasmacytoid dendritic cells:sensing nucleic acidsin viral infection and autoimmune diseases.Nat Rev Immunol.2008 Aug；8(8):594-606)。

本文中的“mDC”是指髓样树突细胞，并且它们表示血液和外周淋巴器官中发现的循环树突细胞的亚型。这些细胞表达表面标记物CD11c,CD1a,HLA-DR以及BDCA-1(CD1c)和BDCA-3(CD141)中的任一种。它们不表达BDCA-2或CD123，这使mDC区别于pDC。mDC也不表达CD3,CD20或CD56。作为先天性免疫***的成分，mDC表达Toll样受体(TLR)，该受体包括TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6和TLR8，其使细菌和病毒成分能够得到检测。在刺激和随后的活化之后，这些细胞为最有效的抗原呈递细胞，从而活化抗原特异性CD4和CD8T细胞。此外，mDC具有产生大量IL-12和IL23的能力，这种能力对于诱导Th1介导的或Th17细胞介导的免疫非常重要。

研究发现许多实体瘤(例如，乳腺癌和头颈癌，卵巢癌)具有pDC浸润(TreilleuxI,Blay JY,Bendriss-Vermare N等人，Dendritic cell infiltration and prognosis ofearly stage breast cancer.Clin Cancer Res 2004；10:7466-7474,Hartmann E,Wollenberg B,Rothenfusser S等人，Identification and functional analysis oftumor-infiltrating plasmacytoid dendritic cells in head and neckcancer.Cancer Res 2003；63:6478-6487.Zou WP,Machelon V,Coulomb-L'Hermin A,等人，Stromal-derived factor-1 in human tumors recruits and alters the functionof plasmacytoid precursor dendritic cells.Nat Med 2001；7:1339-1346)并且由肿瘤细胞分泌的因子抑制DC成熟(Gabrilovich DI,Corak J,Ciernik IF等人，Decreasedantigen presentation by dendritic cells in patients with breast cancer.ClinCancer Res 1997；3:483-490.Bell D,Chomarat P,Broyles D等人，In breast carcinomatissue,immature dendritic cells reside within the tumor,whereas maturedendritic cells are located in peritumoral areas.J Exp Med 1999；190:1417-1425.Menetrier-Caux C,Montmain G,Dieu MC等人，Inhibition of thedifferentiation of dendritic cells from CD34(+)progenitors by tumor cells:role of interleukin-6and macrophage colony-stimulating factor.Blood 1998；92:4778-4791)。这些未成熟的DC细胞无法在提高抗肿瘤免疫方面发挥作用。相比之下，肿瘤微环境中的DC通过抑制抗肿瘤免疫和促进血管生成而促进肿瘤生长。有证据表明Toll样受体7激动剂咪喹莫特和Toll样受体9激动剂CpG药物可刺激肿瘤微环境中的pDC，从而抑制肿瘤发展(Dummer R,Urosevic M,Kempf W等人，Imiquimod in basal cell carcinoma:howdoes it work？Br J Dermatol 2003；149:57-58.Miller RL,Gerster JF,Owens ML等人，Imiquimod applied topically:a novel immune response modifier and new class ofdrug.Int J Immunopharmacol 1999；21:1-14.Hofmann MA,Kors C,Audring H等人，Phase1 evaluation of intralesionally injected TLR9-agonist PF-3512676 in patientswith basal cell carcinoma or metastatic melanoma.J Immunother 2008；31:520-527)。

在一些实施方式中，人树突细胞是浆细胞样树突细胞。

B.带有靶向治疗剂的组合

另一方面，本发明提供治疗组合或药物组合物，包括：(i)有效量的针对癌症的靶向治疗剂；(ii)有效量的免疫调节性多核苷酸(例如，本文提供的CpG ODN)或者它们的组合；以及任选地(iii)一种或多于一种药学上可接受的载体。

治疗组合可以单一的药物组合物的形式提供，这样，靶向治疗剂和免疫治疗剂这两者可一同给药。在可选的实施方式中，治疗组合可使用多于一种药物组合物来提供。在这样的实施方式中，在一种药物组合物中提供靶向治疗剂，并在另一药物组合物中提供免疫治疗剂，这样，这两种化合物可分别给药，例如，在不同的时间，通过不同的给药途径，等等。因此，也可能以不同的给药方案给药靶向治疗剂和免疫治疗剂。

除非另有说明，本文涉及的化合物可包括任何药学上接受的形式的化合物，包括任何异构体(例如，非对映异构体或对映异构体)，盐，溶剂化物，多晶型物，等等。具体而言，如果化合物是光学活性的，那么涉及该化合物时可包括该化合物的对映异构体中的每一个以及对映异构体的外消旋混合物。

总体而言，靶向治疗剂和免疫调节性多核苷酸彼此不连接，例如彼此不通过共价连接体连接。

靶向治疗剂

总体而言，本文提供的组合包括靶向治疗剂。

本文中的“靶向治疗剂”是指特异性地或选择性地与目标分子、细胞、颗粒、组织或聚集体结合的治疗剂，所述目标分子、细胞、颗粒、组织或聚集体通常被称为“靶点”或“标记物”并且本文将进一步详细讨论这些目标分子、细胞、颗粒、组织或聚集体。

本文中的“治疗剂”是指具有治疗作用(例如在改善或治疗癌症方面)的试剂。

在一些实施方式中，所述靶向治疗剂包括免疫球蛋白，蛋白质，肽，小分子，纳米颗粒或核酸。

在一些实施方式中，所述靶向治疗剂包括如本文所提供的抗体药物偶联物(ADC)。

在一些实施方式中，所述靶向治疗剂包括免疫球蛋白，蛋白质或肽，但是不包括小分子。

在一些实施方式中，所述靶向治疗剂不是ADC。

示例性的诸如抗体(例如，嵌合的抗体，人源化抗体和人抗体)之类的靶向治疗剂是本领域所识别的并且不受限制地用于实施本发明。

在一些实施方式中，靶向治疗剂是抗体，抗体片段，双特异性抗体或其他基于抗体的分子或化合物。

在一些实施方式中，靶向治疗剂选自：适体、高亲和性多聚体(avimer)，受体-结合配体，核酸，生物素-亲和素结合对，结合的肽或蛋白质，等等，所述靶向治疗剂与目标分子特异性结合或优先结合目标分子并且具有治疗作用(例如，针对癌症或肿瘤)。

本文中的“靶点”或“标记物”是指能够特异性结合特定的靶向治疗剂的任何实体，例如，Her2/Neu。在一些实施方式中，靶点与一种或多于一种特定的细胞或组织类型特异性相关。在一些实施方式中，靶点与一种或多于一种特定的疾病状态特异性相关。在一些实施方式中，靶点与一种或多于一种特定的发育阶段特异性相关。例如，细胞类型特异性标记物在该细胞类型中的表达水平通常是其在参比细胞群中的表达水平的至少两倍。在一些实施方式中，细胞类型特异性标记物的水平是其在参比细胞群中的平均表达水平的至少3倍，至少4倍，至少5倍，至少6倍，至少7倍，至少8倍，至少9倍，至少10倍，至少50倍，至少100倍或至少1,000倍。细胞类型特异性标记物的检测或测量能够使该细胞类型或目标细胞类型区别于许多其他类型的细胞，大多数其他类型的细胞或所有其他类型的细胞。在一些实施方式中，如本文所述的，靶点可包括蛋白质，糖类，脂质和/或核酸。

本文中的“特异性结合”或“优先结合”是指在两个结合搭档之间(例如，在靶向部分及其结合搭档之间)的结合对两个结合搭档具有选择性并且可从不想要的或非特异性相互作用中区分出来。例如，抗原结合部分结合特异性抗原决定簇的能力可通过酶联免疫吸附分析法(ELISA)或其他本领域技术人员熟悉的技术(例如，表面等离子共振技术(在BIAcore仪器上分析)(Liljeblad等人,Glyco J 17,323-329(2000))和传统的结合分析(Heeley,Endocr Res 28,217-229(2002)))测量。术语“抗-[抗原]抗体”和“与[抗原]结合的抗体”是指能够通过足够的亲合力结合各自的抗原的抗体，这样，所述抗体用作靶定抗原的诊断剂和/或治疗剂。在一些实施方式中，抗-[抗原]抗体结合不相关的蛋白质的程度小于所测量(例如，通过放射性免疫分析(RIA))的抗体抗原结合程度的约10％。在一些实施方式中，结合[抗原]的抗体的解离常数(KD)小于1μM、小于100nM、小于10nM、小于1nM、小于0.1nM、小于0.01nM或小于0.001nM(例如，10^-8M或更小，例如，10^-8M至10^-13M，例如，10^-9M至10^-13M)。应当理解的是，上述定义还可应用于与抗原结合的抗原结合部分。

在一些具体的实施方式中，靶点是肿瘤标记物。在一些实施方式中，肿瘤标记物是存在于肿瘤中但不存在于正常器官、组织和/或细胞中的抗原。在一些实施方式中，相对于在正常器官、组织和/或细胞中，肿瘤标记物是在肿瘤中更加普遍的抗原。在一些实施方式中，相对于在正常细胞中，肿瘤标记物是在恶性肿瘤细胞中更加普遍的抗原。

本文中的“肿瘤抗原”是指由肿瘤细胞生成的抗原性物质，即，其触发宿主体内的免疫反应。人体内的正常蛋白质由于自身耐受性而不是抗原性的，所述自身耐受性是如下过程：在该过程中，自反应性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和自身抗体生成的B淋巴细胞在初级淋巴组织(BM)中被“中央”剔除并在次级淋巴组织(大部分胸腺的T细胞和脾脏/***的B细胞)被“外周”剔除。因此，没有暴露于免疫***的任何蛋白质触发免疫反应。这可包括很好地隔绝于免疫***的正常蛋白质，通常以极小量生成的蛋白质，通常仅在某些发育阶段生成的蛋白质，或者其结构由于突变而被修饰的蛋白质。

在一些实施方式中，相对于正常组织和/或正常细胞，靶点优先在肿瘤组织和/或肿瘤细胞中表达。

在本发明的一些实施方式中，标记物是肿瘤标记物。所述标记物可以是在***的细胞上的表达水平高于在未***的细胞上的表达水平的多肽。例如，Her2/neu(也称为ErbB-2)是EGF受体家族的成员并且其在与乳腺癌相关的肿瘤的细胞表面表达。另一实例是称为F3的肽，其是将纳米颗粒引导至核仁素的合适的靶向试剂(Porkka等人,2002,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,99:7444；and Christian et al.,2003,J.Cell Biol.,163:871)。包含纳米颗粒和A10适体(特异性结合至PSMA)的靶向颗粒已表现出能够特异性且有效地将多烯紫杉醇递送至***癌肿瘤。

特异性靶向这些肿瘤靶点的抗体或其他药物特异性地干扰并调节肿瘤细胞的生物行为的信号转导通路，直接调节或阻断信号转导通路，从而抑制肿瘤细胞生长或诱导细胞凋亡。迄今为止，已有数十种靶向药物被批准用于实体肿瘤或恶性血液病的临床研究和治疗，并且已有许多靶向药物用于恶性血液病。

在一些实施方式中，肿瘤抗原(或肿瘤靶点)选自：CD2,CD19,CD20,CD22,CD27,CD33,CD37,CD38,CD40,CD44,CD47,CD52,CD56,CD70,CD79和CD137。

在一些实施方式中，肿瘤抗原(或肿瘤靶点)选自：4-1BB,5T4,AGS-5,AGS-16,血管生成素2,B7.1,B7.2,B7DC,B7H1,B7H2,B7H3,BT-062,BTLA,CAIX,癌胚抗原,CTLA4,Cripto,ED-B,ErbB1,ErbB2,ErbB3,ErbB4,EGFL7,EpCAM,EphA2,EphA3,EphB2,FAP,纤连蛋白,叶酸盐受体,神经节苷脂GM3,GD2,糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(GITR),gp100,gpA33,GPNMB,ICOS,IGF1R,整联蛋白αν，整联蛋白ανβ,KIR,LAG-3,Lewis Y抗原,间皮素,c-MET,MN碳酸酐酶IX,MUC1,MUC16,粘连蛋白-4,NKGD2,NOTCH，OX40,OX40L,PD-1,PDL1,PSCA,PSMA,RANKL,ROR1,ROR2,SLC44A4,STING,多配体蛋白聚糖-1,TACI,TAG-72,腱生蛋白,TIM3,TRAILR1,TRAILR2,VEGFR-1,VEGFR-2,VEGFR-3,以及它们的变体。肿瘤抗原的变体包括本领域已知的和/或天然生成的各种不同的突变体或多形态。

在一些实施方式中，靶向治疗剂包括抗体或其功能片段。

本文中的“免疫球蛋白”或抗体是指全长(即，天然生成的或通过正常免疫球蛋白基因片段重组过程形成的)免疫球蛋白分子(例如，IgG抗体)或免疫球蛋白分子的免疫活性(即，特异性结合)部分，例如抗体片段。在本发明要求保护的范围内，抗体或抗体片段可被偶联或衍生。这些抗体包括IgGl,lgG2a,IgG3,IgG4(以及IgG4亚型)和IgA同种型。

本文的术语“抗体”以其广义使用并包含各种不同的抗体结构，包括但不限于：单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出期望的抗原结合活性并且包含免疫球蛋白的Fc区域或等同于该Fc区域的区域。本文中可互换使用的术语“全长抗体”、“完整抗体”和“整个抗体”是指具有与天然抗体结构基本类似的结构的抗体或者具有含本文定义的Fc区域的重链的抗体。

本文的“天然抗体”是指具有不同结构的天然生成的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体为约150,000道尔顿的异源四聚体糖蛋白，其由被二硫键连接的两个相同的轻链和两个相同的重链构成。从N端至C端，每一重链具有可变区(VH)，也称为可变重链结构域或重链可变结构域，重链之后为三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)，也称为重链恒定区。类似地，从N端至C端，每一轻链具有可变区(VL)，也称为可变轻链结构域或轻链可变结构域，轻链之后为恒定轻链结构域(CL)，也称为轻链恒定区。基于抗体恒定结构域的氨基酸序列，抗体的轻链可指定为两种类型(称为κ和λ)中的一种。

本文中的“抗体片段”是指不同于完整抗体的包含完整抗体的一部分的分子，所述完整抗体的一部分结合与完整抗体结合的抗原。抗体片段的实例包括但不限于：Fv,Fab,Fab',Fab'-SH,F(ab')2,双价抗体,线性抗体,单链抗体分子(例如，scFv),单结构域抗体和由抗体片段形成的多特异性抗体。关于一些抗体片段的综述请参见，Hudson等人,Nat Med9,129-134(2003)。关于scFv片段的综述请参见例如，Pliickthun,in The Pharmacologyof Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg和Moore编辑,Springer-Verlag,NewYork,pp.269-315(1994)；以及WO 93/16185；和美国专利第5,571,894号和第5,587,458号。关于含有挽救受体结合表位残基且具有提高的体内半衰期的Fab和F(ab’)2片段的讨论，请参见美国专利第5,869,046号。双价抗体为可为二价的或双特异性的具有两个抗原结合位点的抗体片段。请参见例如，EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人,Nat Med 9,129-134(2003)；和Hollinger等人,Proc Natl Acad Sci USA 90,6444-6448(1993)。三价抗体和四价抗体也在Hudson等人,Nat Med 9,129-134(2003)中描述。单结构域抗体为含有抗体的全部重链可变结构域或一部分重链可变结构域或者含有抗体的全部轻链可变结构域或一部分轻链可变结构域的抗体片段。在一些实施方式中，单结构域抗体为人单结构域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA；参见例如，美国专利No.6,248,516 Bl)。抗体片段可通过各种不同的技术制备，所述技术包括但不限于：如本文描述的，完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞(例如，大肠杆菌或噬菌体)生成。

本文中的“抗原结合结构域”是指包含如下区域的抗体的一部分，所述区域特异性结合抗原的一部分或全部抗原并且与抗原的一部分或全部抗原互补。抗原结合结构域可由例如，一个或一个以上抗体可变结构域(也称为抗体可变区)来提供。具体而言，抗原结合结构域包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。

本文中的“可变区”或“可变结构域”是指参与抗体与抗原的结合的抗体重链结构域或轻链结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有类似的结构，其中，每一结构域包含四个保守的框架区(FR)和三个高变区(HVR)。参见例如，Kindt等人,Kuby Immunology,第六版,W.H.Freeman and Co.,第91页(2007)。单个VH或VL结构域可足以带来抗原结合特异性。

本文中的“高变区”或“HVR”是指序列高度可变和/或形成结构限定的环(“高变环”)的抗体可变结构域的各个区域。一般而言，天然四链抗体包含六个HVR，三个在VH(H1、H2、H3)中，三个在VL(L1、L2、L3)中。HVR通常包含来自高变环的氨基酸残基和/或来自互补决定区(CDR)的氨基酸残基，后者具有最高的序列可变性和/或参与抗原识别。除了VH中的CDR1，CDR通常包含形成高变环的氨基酸残基。高变区(HVR)也被称为“互补决定区(CDR)”并且与形成抗原结合区的可变区部分有关的这些术语在本文中互换使用。该特定区域已由Kabat等人,U.S.Dept.of Health and Human Services,Sequences of Proteins ofImmunological Interest(1983)和Chothia等人,J Mol Biol 196:901-917(1987)描述，其中，当彼此进行比较时，定义包括氨基酸残基的重叠或子集。尽管如此，关于抗体的CDR或其变体的任何定义的应用意在本文定义的和本文使用的术语的范围内。包含特定CDR的确切的残基数目随CDR的序列和尺寸的不同而不同。在给出抗体的可变区氨基酸序列的条件下，本领域技术人员可常规确定哪些残基包含特定CDR。

本发明的抗体可为嵌合抗体、人源化抗体、人抗体或抗体融合蛋白。

本文中的“嵌合抗体”是指包含抗体重链和轻链这两者的可变结构域的重组蛋白质，所述可变结构域包括来源于一个物种的抗体(优选地为啮齿动物抗体，更优选地为鼠科动物抗体)的互补决定区(CDR)，而抗体分子的恒定结构域来源于人抗体的恒定结构域。对于兽医应用而言，嵌合抗体的恒定结构域可来源于其它物种的恒定结构域，所述其它物种例如，类人类灵长类动物、猫或狗。

本文中的“人源化抗体”是指如下重组蛋白：在该重组蛋白中，来自于一个物种的抗体(例如，啮齿动物抗体)的CDR从啮齿动物抗体的可变重链和可变轻链转移至人重链可变结构域和人轻链可变结构域中。抗体分子的恒定结构域来源于人抗体的恒定结构域。在一些实施方式中，人源化抗体的框架区的特定残基，尤其是接触或靠近CDR序列的那些特定残基，可被修饰，例如可被来自于原始啮齿动物、类人类灵长类动物的相应残基或其他抗体取代。

本文中的“人抗体”是指例如从转基因小鼠中获得的抗体，所述转基因小鼠已被“基因工程化”为响应抗原刺激生成特定的人抗体。在该技术中，人重链基因座和人轻链基因座的元件被引入来源于胚胎干细胞系的小鼠品系中，所述胚胎干细胞系包含内源性重链基因座和轻链基因座的靶向断裂。转基因小鼠可合成对人抗原具有特异性的人抗体，并且小鼠可用于生成分泌人抗体的杂交瘤。从转基因小鼠中获得人抗体的方法由Green等人,Nature Genet.7:13(1994)，Lonberg等人,Nature 368:856(1994)，Taylor等人,Int.Immun.6:579(1994)描述。完全人抗体还可通过基因转染法或染色体转染法以及噬菌体展示技术来构建，所有这些方法为本领域已知的。请参见例如，McCafferty等人,Nature348:552-553(1990)，其中描述了通过来自于未免疫的供体的免疫球蛋白可变结构域基因谱系体外生成人抗体及其片段。在该技术中，抗体可变结构域基因框内克隆至丝状噬菌体的主要或次要外壳蛋白基因中，并且在噬菌体颗粒的表面上展示为功能抗体片段。因为丝状颗粒包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝，基于抗体的功能性质的选择还导致对编码表现出那些性质的抗体的基因的选择。通过该方式，噬菌体模拟B细胞的一些性质。噬菌体展示可以多种形式进行，关于噬菌体展示的综述请参见例如，Johnson和Chiswell,CurrentOpinion in Structural Biology 3:5564-571(1993)。人抗体还可通过体外活化B细胞产生。请参见美国专利第5,567,610号和第5,229,275号，该美国专利的全部内容通过引用并入本文。

本文中的“抗体融合蛋白”是指通过重组产生的抗原结合分子，其中，相同或不同的天然抗体、具有相同或不同特异性的单链抗体或抗体片段中的两个或两个以上被连接。融合蛋白包含至少一个特异性结合位点。融合蛋白的化合价表示融合蛋白具有的与抗原或表位结合的结合臂或结合位点的总数，即，单价的、二价的、三价的或多价的。多价的抗体融合蛋白是指该抗体融合蛋白可利用多种与抗原结合的相互作用，因此增加与抗原或不同抗原结合的亲合力。特异性表示抗体融合蛋白能够与多少种不同类型的抗原或表位结合，即，单特异性、双特异性、三特异性、多特异性。使用这些定义，天然抗体(例如，IgG)为二价的，因为其具有两个结合臂，但是其为单特异性的，因为其结合一种类型的抗原或表位。单特异性多价融合蛋白具有一个以上用于相同抗原或表位的结合位点。例如，单特异性双价抗体为具有两个与相同的抗原反应的结合位点的融合蛋白。融合蛋白可包含不同抗体成分的多价或多特异性组合或同一抗体成分的多个拷贝。融合蛋白还可包含治疗剂。

在一些实施方式中，靶向部分包含前抗体(probody)，例如美国专利第8,518,404号、第8,513,390号以及美国专利申请公开US 20120237977A1，US 20120149061A1，US20130150558A1中公开的那些前抗体(probody)，上述美国专利和美国专利申请公开的全部内容通过引用并入本文。

前抗体(Probody)是在癌症微环境中被选择性地活化的单克隆抗体，其使治疗性抗体的活性作用于肿瘤并且不影响健康组织。

总体而言，前抗体(probody)包括至少能够特异性结合靶点的抗体或其抗体片段(统称为“AB”)，其中，AB被遮盖部分(MM)修饰。当AB被MM修饰并且存在有靶点时，AB与其靶点的特异性结合相较于未被MM修饰的AB与靶点的特异性结合或亲本AB与靶点的特异性结合而被降低或抑制。MM相对于AB的解离常数(K_d)通常大于AB相对于靶点的K_d。当AB被MM修饰并且存在有靶点时，AB与其靶点的特异性结合相较于未被MM修饰的AB与靶点的特异性结合或亲本AB与靶点的特异性结合而被降低或抑制。当AB连接至MM或被MM修饰时，MM可‘遮盖’或降低或抑制AB与其靶点的特异性结合。当AB连接至MM或被MM修饰时，所述连接或修饰可产生结构改变，所述结构改变降低或抑制AB特异性结合其靶点的能力。

在一些实施方式中，前抗体(probody)是可活化的抗体(AA)，在该可活化的抗体中，被MM修饰的AB还可包括一种或多于一种可裂解的部分(CM)。这种AA表现出可活化地/可转换地与AB的靶点结合。AA通常包括被遮盖部分(MM)修饰或连接至MM的抗体或抗体片段(AB)以及可修饰的或可裂解的部分(CM)。在一些实施方式中，CM包括用作目标蛋白酶的底物的氨基酸序列。在其他实施方式中，CM提供通过还原作用可裂解的半胱氨酸-半胱氨酸二硫键。在其他实施方式中，CM提供通过光解作用可活化的光解底物。

AA的CM和AB可如下进行选择：AB代表目标靶点的结合部分，CM代表与靶点共同定位于受治者体内的治疗位点的蛋白酶的底物。可选地或此外，CM是半胱氨酸-半胱氨酸二硫键，该二硫键的还原作用可导致该二硫键裂解。AA包括蛋白酶-可裂解CM或半胱氨酸-半胱氨酸二硫键中的至少一种，并且在一些实施方式中，AA包括两种类型的CM。可选地或进一步地，AA可包括由光源活化的、光致不稳定的底物。例如，在能够裂解CM中的某个位点的蛋白酶在治疗位点的含靶点的组织(例如，患病组织，例如，接受治疗的或诊断出的患病组织)中的水平相较于非治疗位点的组织(例如，健康组织)中的水平相对较高的情况下，本文公开的AA具有特定的用途。例如，在能够还原CM中的某个位点的还原剂在治疗或诊断位点的含靶点的组织中的水平相较于非治疗或非诊断位点的组织中的水平相对较高的情况下，本文公开的AA也具有特定的用途。例如，在能够光解CM中的某个位点的光源(例如，以激光的方式)被引入治疗或诊断位点的含靶点的组织中的情况下，本文公开的AA也具有特定的用途。

在一些实施方式中，如果AB没有被遮盖或抑制其与靶点的结合，那么在非治疗位点处AB的结合会产生毒性和/或不良副作用，AA可使所述毒性和/或不良副作用降低。在AA包含通过促进二硫键还原的还原剂可裂解的CM的情况下，当目标靶点存在于理想治疗位点的条件下，这些AA中的AB可选择用于进行AB的活化，所述理想治疗位点的特征为还原剂水平升高，这样，治疗位点的环境的还原电势高于例如非治疗位点的环境的还原电势。

总体而言，AA可通过选择目标AB并且构建AA的剩余部分来设计，这样，当构象受到限制时，MM提供对AB的遮盖或降低AB与其靶点的结合。结构设计标准要考虑到提供这种功能特性。

在一些实施方式中，靶向治疗剂是抗体或抗体片段，其基于其对在目标靶细胞或目标靶位点上表达的抗原的特异性进行选择。多种肿瘤特异性或其他疾病特异性抗原已被识别并且那些抗原的抗体已被用于或计划用于治疗这些肿瘤或其他疾病。本领域已知的抗体可用于本发明的组合物中，具体而言，本领域已知的抗体可用于治疗与靶抗原相关的疾病。可被本发明的靶向治疗剂靶定的靶抗原(及其相关疾病)的实例包括：CD2,CD19,CD20,CD22,CD27,CD33,CD37,CD38,CD40,CD44,CD47,CD52,CD56,CD70,CD79，CD137，4-1BB,5T4，AGS-5,AGS-16,血管生成素2,B7.1,B7.2,B7DC,B7H1,B7H2,B7H3,BT-062,BTLA,CAIX,癌胚抗原,CTLA4,畸胎瘤衍化生长因子单克隆抗体(Cripto),ED-B,ErbB1,ErbB2,ErbB3,ErbB4,EGFL7,EpCAM,EphA2,EphA3,EphB2,FAP,纤连蛋白,叶酸盐受体,神经节苷酯GM3,GD2,糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(GITR),gp100,gpA33,GPNMB,ICOS,IGF1R,整联蛋白αν,整联蛋白ανβ,KIR,LAG-3,Lewis Y,间皮素,c-MET,MN碳酸酐酶IX,MUC1,MUC16,粘连蛋白-4,NKGD2,NOTCH,OX40,OX40L,PD-1,PDL1,PSCA,PSMA,RANKL,ROR1,ROR2,SLC44A4,STING,多配体蛋白聚糖-1,TACI,TAG-72,腱生蛋白,TIM3,TRAILR1,TRAILR2,VEGFR-1,VEGFR-2,VEGFR-3。

在一些实施方式中，抗体选自：美罗华(利妥昔单抗)、赫赛汀(曲妥珠单抗)、爱必妥(西妥昔单抗)、维克替比(帕尼单抗)、Arzerra(奥法木单抗(Ofatumumab))、Benlysta(贝利木单抗)、Yervoy(伊匹单抗)、Perjeta(帕妥珠单抗)、Tremelimumab、Opdivo(纳武单抗(Nivolumab,ONO-4538,BMS-936558,或MDX1106),Dacetuzumab,乌瑞芦单抗(Urelumab),Tecentriq(MPDL3280A),Lambrolizumab和Blinatumomab,CT-011,Keytruda(pembrolizumab,MK-3475),BMS-936559,MED14736,或MSB0010718C。

在一些实施方式中，抗-HER2抗体是曲妥珠单抗(赫赛汀)，帕妥珠单抗或margetuximab(MGAH22)。曲妥珠单抗和帕妥珠单抗这两者是单克隆抗体，它们具有针对HER2阳性肿瘤或癌细胞的抗-肿瘤活性。Margetuximab(或MGAH22)是靶向HER2的第二代Fc优化的单克隆抗体(mAb)。临床试验已表明margetuximab对于表达中等水平的HER2的肿瘤或癌细胞有效。

赫赛汀(曲妥珠单抗)是作用于Her2的人表皮生长因子受体细胞外结构域的人源化单克隆抗体，Her2在25％至30％的乳腺癌中表达。曲妥珠单抗被认为通过以下三方面产生抗肿瘤作用：(1)下调Her2受体，抑制Her2细胞内信号转导通路以及诱导细胞凋亡；(2)使抗体依赖性ADCC和CDC与杀伤肿瘤细胞相关联的免疫机制；(3)提高化疗效果。

在一些实施方式中，抗-EGFR抗体是西妥昔单抗，帕尼单抗，necitumumab，马妥珠单抗，尼妥珠单抗，扎鲁木单抗(Zalutumumab)，RO5083945,MDX447,或MEHD7945。这些抗体结合EGFR并且抑制活化肿瘤细胞***、增殖和生长的信号转导通路。

爱必妥(西妥昔单抗)为作用于表皮生长因子受体(EGFR)的嵌合抗体。爱必妥结合EGFR，从而抑制EGFR的信号转导通路，影响细胞增殖、浸润和转移，以及血管生成。对EGFR信号转导通路的抑制可提高化疗药物的疗效和放疗的疗效。

在一些实施方式中，抗-CD20抗体选自：利妥昔单抗,奥法木单抗(ofatumumab),维妥珠单抗(veltuzumab),ocrelizumab,AME-133v,PRO131921,GA101,替伊莫单抗(Ibritumomab tiuxetan),托西莫单抗(tositumomab)和TRU-015。

第一代CD20mAb利妥昔单抗可诱导补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，这产生了其针对淋巴瘤细胞的临床活性。CDC代表通过利妥昔单抗杀伤细胞的主要机制。然而，一些淋巴细胞(即，10％的CLL细胞)对CDC具有耐受性，这是因为活化的补体具有较低水平的补体活性或降低的细胞毒性。此外，利妥昔单抗可在与CD20结合之后导致B细胞凋亡，由此可直接抑制细胞生长。最近，已报道了通过mAb杀伤细胞的新机制，其涉及通过NADPH介导的反应性氧物种。

“利妥昔单抗”抗体通常是基因工程的嵌合人γ1小鼠恒定结构域，其包含定向于人CD20抗原的单克隆抗体。该嵌合抗体包含人γ1恒定结构域并且在US5,736,137中以名称“C2B8”被识别。

美罗华(利妥昔单抗)为用于治疗B细胞非霍奇金淋巴瘤的嵌合抗体。其作用于表达CD20抗原的B细胞表面，CD20抗原在90％的B细胞非霍奇金淋巴瘤上表达。美罗华与CD20结合，从而通过CDC和ADCC诱导B细胞溶解并且敏化对一些细胞毒性化疗具有耐药性的人淋巴细胞。

第二代抗-CD20mAb包括奥法木单抗(ofatumumab),维妥珠单抗(veltuzumab)和ocrelizumab。这些单抗被人源化以降低免疫原性。

奥法木单抗(Genmab)是完全人I型抗-CD20IgG1κmAb。奥法木单抗结合CD20分子的小的细胞外环和大的细胞外环(ECL)，并且在杀伤靶细胞方面比利妥昔单抗更加有效。奥法木单抗已表现出相较于利妥昔单抗针对利妥昔单抗敏感性细胞和利妥昔单抗耐药性细胞更加有效。奥法木单抗针对利妥昔单抗耐药性细胞的活性及其有效的CDC作用被认为是由于CD20分子的小环的近侧表位和较高的活化C1q的能力而产生的。奥法木单抗(arzerra)已被批准用于治疗氟达拉滨和阿伦单抗(FA-ref)无效的复发的或难以治疗的CLL。奥法木单抗以固定的剂量(一次给药300mg)IV方式每周给药，并且后续以每周2000mg x7的剂量给药。这之后每四周给药大于四个剂量。

Ocrelizumab(PRO70769)(Genentech/Roche/Biogen)是另一I型第二代人源化mAb，其与利妥昔单抗的区别在于轻链可变区和重链可变区的CDR中的若干个氨基酸位点。该mAb对淋巴恶性肿瘤具有提高的疗效并且对FcγRIIIa受体(CD16)的低亲和性变体具有增加的结合亲和性，因此，该mAb相对于利妥昔单抗具有较高的ADCC和较低的CDC活性。

维妥珠单抗(IMMU-106,hA20)相对于利妥昔单抗具有更强的结合亲和力并且对CDC具有更强的作用。维妥珠单抗是人源化的I型抗-CD20 IgG1 mAb，其采用与利妥昔单抗相同的互补决定区(CDR)(除了可变重链的CDR3中的单个氨基酸进行了改变，由Asp101代替了Asn101)进行基因工程重组。这种修饰在三种人淋巴瘤细胞系中产生显著较低的解离率和提高的CDC细胞毒性。

第三代人源化CD-20mAb具有基因工程Fc区以增加它们对FcγRIIIa受体的结合亲和性。已有至少三种第三代mAb，AME-133v,PRO131921和GA101。

AME-133v(LY2469298,ocaratuzumab)(Applied Molecular Evolution/EliLilly)是I型人源化IgG1mAb。其与CD20的结合亲和性增加了13-20倍，其中对FcγRIIIa受体的低亲和性(F/F和F/V)变体的亲和力提高了5-7倍。

PRO131921(Genentech)是具有修饰的Fc的人源化IgG1(ocrelizumab)，其相对于利妥昔单抗具有提高的CDC和ADCC活性。

GA101(RO5072759,obinutuzumab)(Glycart/Roche)是通过亲本B-Ly1小鼠抗体的人源化和随后的Fc区的糖基化工程而衍生得到的完全人源化II型IgG1 mAb。GA101通过与利妥昔单抗完全不同的方向并且跨过更多的表位结合CD20。GA101看起来通过直接杀伤以及NK-细胞介导的ADCC作用具有更强的活性。GA101表现出对利妥昔单抗耐药性细胞系具有活性。

在一些实施方式中，抗-PD-1抗体是MK-3475(之前称为lambrolizumab,Merck)，AMP-514，AMP-224((医学免疫公司)MedImmune/(阿斯利康)AstraZeneca)，BMS-936558(MDX-1106,Bristol-Myers Squibb)或CT-011(Curetech)。

Pembrolizumab(MK-3475)是人源化的单克隆抗-PD-1抗体，其被设计为重新活化抗肿瘤免疫性。Pembrolizumab通过抑制T细胞上PD-1与其配体PD-L1和PD-L2的相互作用而发挥双配体阻断PD-1通路的作用。

在一些实施方式中，抗-PD-1抗体是US8,354,509和US8,168,757中公开的抗体中的一种，该美国专利文献的全部内容通过引用并入本文。

Nivolumab(也称为BMS-936558或MDX1106)是完全人IgG4单克隆抗体，由Bristol-Myers Squibb研发，用于治疗癌症。

在一些实施方式中，抗-PD-1抗体是WO2004/056875、US7,488,802和US8,008,449中公开的抗体中的一种，这些专利文献的全部内容通过引用并入本文。

AMP-514和AMP-224是抗-程序性细胞死亡1(PD-1)单克隆抗体(mAb)，其由Amplimmune研发，被MedImmune获得。

在一些实施方式中，抗-PD-1抗体是美国申请公开第20140044738号中公开的抗体中的一种，该美国申请公开的全部内容通过引用并入本文。

在一些实施方式中，六个CDR是：(A)抗-PD-1抗体1E3的三个轻链CDR和三个重链CDR；(B)抗-PD-1抗体1E8的三个轻链CDR和三个重链CDR；或(C)抗PD-1抗体1H3的三个轻链CDR和三个重链CDR。

Pidilizumab(CT-011)是由以色列的Curetech Ltd公司研发的抗-PD-1单克隆抗体。

在一些实施方式中，抗-PD-1抗体是美国专利申请公开第20080025980号和第20130022595号中公开的抗体中的一种，该美国专利申请公开的全部内容通过引用并入本文。

在一些实施方式中，抗-PD-1抗体是MPDL3280A和YW243.55.S70,(Genentech/Roche),MEDI-4736(MedImmune/AstraZeneca),BMS-936559(MDX-1105,Bristol-MyersSquibb),以及MSB0010718C(EMD Serono/Merck KGaA)。

MPDL3280A(Tecentriq,Genentech)是一种设计为靶向在肿瘤细胞和肿瘤浸润的免疫细胞上表达的PD-L1的基因工程抗-PD-L1抗体。MPDL3280A被设计为阻止PD-L1与PD-1和B7.1结合。对PD-L1的这种阻断能够活化T细胞，恢复T细胞检测和攻击肿瘤细胞的能力。MPDL3280A包含设计为通过最小化抗体依赖性细胞毒性(ADCC)优化疗效和安全性的基因工程片段可结晶(Fc)结构域。

在一些实施方式中，抗-PD-L1抗体是US7,943,743中公开的抗体中的一种，该美国专利的全部内容通过引用并入本文。

BMS-936599(MDX-1105,Bristol-Myers Squibb)是抑制PD-L1配体与PD-1和CD80这两者结合的完全人IgG4抗-PD-L1 mAb。

在一些实施方式中，抗-PD-L1抗体是US7,943,743中公开的抗体中的一种，该美国专利的全部内容通过引用并入本文。

MSB0010718C(EMD Serono of Merck KGaA)是与PD-L1结合的完全人IgG1单克隆抗体。

在一些实施方式中，抗-PD-L1抗体是WO2013079174 A1中公开的抗体中的一种，该专利文献的全部内容通过引用并入本文。

MEDI4736(MedImmune/AstraZeneca)是特异性结合PD-L1，阻止PD-L1与PD-1和CD80结合的人IgG1抗体。

在一些实施方式中，抗-PD-L1抗体是WO2011066389A1和US8,779,108中公开的抗体中的一种，该专利文献的全部内容通过引用并入本文。

在一些实施方式中，抗-PD-L1抗体是US8,552,154中公开的抗体中的一种，该美国专利的全部内容通过引用并入本文。

阿瓦斯汀(贝伐单抗)为靶向血管内皮生长因子(VEGF)的人源化单克隆抗体。阿瓦斯汀与血管内皮生长因子受体(VEGFR)的结合抑制VEGF和信号转导，从而抑制了肿瘤血管生成。

目前正在研发的其他抗体也可用作靶向治疗剂。例如，正在研发用于***的针对下列靶点的治疗性单克隆抗体：CD2,CD19,CD20,CD22,CD27,CD33,CD37,CD38,CD40,CD44,CD47,CD52,CD56,CD70,CD79，CD137。并且也正在研发用于***的针对下列靶点的治疗性单克隆抗体：4-1BB,5T4，AGS-5,AGS-16,血管生成素2,B7.1,B7.2,B7DC,B7H1,B7H2,B7H3,BT-062,BTLA,CAIX,癌胚抗原,CTLA4,Cripto,ED-B,ErbB1,ErbB2,ErbB3,ErbB4,EGFL7,EpCAM,EphA2,EphA3,EphB2,FAP,纤连蛋白,叶酸盐受体,神经节苷酯GM3,GD2,糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(GITR),gp100,gpA33,GPNMB,ICOS,IGF1R,整联蛋白αν,整联蛋白ανβ,KIR,LAG-3,Lewis,间皮素,c-MET,MN碳酸酐酶IX,MUC1,MUC16,粘连蛋白-4,NKGD2,NOTCH,OX40,OX40L,PD-1,PDL1,PSCA,PSMA,RANKL,ROR1,ROR2,SLC44A4,STING,多配体蛋白聚糖-1,TACI,TAG-72,腱生蛋白,TIM3,TRAILR1,TRAILR2,VEGFR-1,VEGFR-2,VEGFR-3，以及它们的变体。(Scott AM,Wolchok JD,Old LJ.Antibody Therapyof Cancer.Nat Rev Cancer.2012 Mar 22；12(4):278-87)。

在一些实施方式中，靶向治疗剂包含Fab，Fab’，F(ab’)2，单结构域抗体，T和Abs二聚物，Fv，scFv，dsFv，ds-scFv，Fd，线性抗体，微小抗体、双价抗体、双特异性抗体片段、bibody、tribody、sc-双价抗体、κ(λ)body，BiTE，DVD-Ig，SIP，SMIP，DART，或者含有一个或一个以上CDR的抗体类似物。

包含靶向部分的靶向治疗剂

在一些方面，本发明的靶向治疗剂包含靶向部分，例如，ADC。

本文中的“靶向部分(TM)”或“靶向剂”是指特异性地或选择性地与目标分子、细胞、颗粒、组织或聚集体结合的分子、复合物或聚集体，所述目标分子、细胞、颗粒、组织或聚集体通常称为“靶点”或“标记物”并且本文将进一步详细讨论这些目标分子、细胞、颗粒、组织或聚集体。

在一些实施方式中，靶向部分包含免疫球蛋白、蛋白质、肽、小分子、纳米颗粒或核酸。

诸如抗体(例如，嵌合抗体、人源化抗体和人抗体)、受体的配体、植物凝集素和糖类以及一些酶的底物之类的示例性的靶向剂在本领域中被识别并且不受限制地用于实施本发明。其他靶向剂包括一类如下化合物：该化合物不包括特异性分子识别基序，该化合物包括将分子质量加至活化部分的纳米颗粒、诸如聚(乙二醇)之类的大分子、多糖，以及聚氨基酸。额外的分子质量影响活化部分的药代动力学，例如血清半衰期。

在一些实施方式中，靶向部分为抗体，抗体片段，双特异性抗体或其他基于抗体的分子或化合物。然而，靶向部分的其他实例为本领域已知的并且可使用靶向部分的其他实例，例如，适体、高亲和性多聚体(avimer)、受体结合配体、核酸、生物素-亲和素结合对、结合肽或蛋白质，等等。术语“靶向部分”和“结合部分”在本文中同义使用。

本文中的“靶点”或“标记物”是指能够特异性结合特定的靶向部分的任何实体。在一些实施方式中，靶点与一个或一个以上特定的细胞或组织类型特别相关。在一些实施方式中，靶点与一种或一种以上特定的疾病状态特别相关。在一些实施方式中，靶点与一种或一种以上特定的发育阶段特别相关。例如，细胞类型特异性标记物在该细胞类型中的表达水平通常是其在参比细胞群中的表达水平的至少两倍。在一些实施方式中，细胞类型特异性标记物的水平是其在参比细胞群中的平均表达水平的至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍或者至少1,000倍。细胞类型特异性标记物的检测或测量可将该细胞类型或目标细胞类型与许多其他细胞类型、大多数其他细胞类型或所有其他细胞类型区别开。在一些实施方式中，靶点可包含本文所描述的蛋白质、糖类、脂质和/或核酸。

如果一种物质与核酸靶向部分特异性结合，那么该物质可被认为是为了本文所述的目的而“被靶向的”。在一些实施方式中，核酸靶向部分在严格条件下与靶点特异性结合。如果靶向部分与靶点特异性结合，那么含有靶向部分的本发明的复合物或化合物被认为是“靶向的”，从而将整个复合物或化合物组合物递送至特定的器官、组织、细胞、细胞外基质成分和/或细胞内腔室。

在一些实施方式中，根据本发明的化合物包含特异性结合与器官、组织、细胞、细胞外基质成分和/或细胞内腔室有关的一个或多于一个靶点(例如，抗原)的靶向部分。在一些实施方式中，化合物包含特异性结合与特定器官或器官***有关的靶点的靶向部分。在一些实施方式中，根据本发明的化合物包含特异性结合一个或多于一个细胞内靶点(例如，细胞器、细胞内蛋白质)的核靶向部分。在一些实施方式中，化合物包含特异性结合与病态的器官、组织、细胞、细胞外基质成分和/或细胞内腔室有关的靶点的靶向部分。在一些实施方式中，化合物包含特异性结合与特定细胞类型(例如，内皮细胞、癌细胞、恶性癌细胞、***癌细胞，等等)有关的靶点的靶向部分。

在一些实施方式中，根据本发明的化合物包含与对一种或多于一种特定组织类型(例如，肝脏组织和***组织)具有特异性的靶点结合的靶向部分。在一些实施方式中，根据本发明的化合物包含与对一种或多于一种特定细胞类型(例如，T细胞和B细胞)具有特异性的靶点结合的靶向部分。在一些实施方式中，根据本发明的化合物包含与对一种或多于一种特定疾病状态(例如，肿瘤细胞和健康细胞)具有特异性的靶点结合的靶向部分。在一些实施方式中，根据本发明的化合物包含与对一种或多于一种特定发育阶段(例如，干细胞和分化的细胞)具有特异性的靶点结合的靶向部分。

在一些实施方式中，靶点可为标记物，所述标记物仅仅或主要与一种或几种细胞类型、一种或几种疾病和/或一种或几种发育阶段有关。细胞类型特异性标记物在该细胞类型中的表达水平通常是其在参比细胞群中的表达水平的至少两倍，例如，所述参比细胞群可由含有几乎等量的来自多种(例如，5-10种，或者更多)不同的组织或器官的细胞的混合物构成。在一些实施方式中，细胞类型特异性标记物的表达水平是其在参比细胞群中的平均表达水平的至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍或至少1000倍。细胞类型特异性标记物的检测或测量可将该细胞类型或多种目标细胞类型与许多其他细胞类型、大多数其他细胞类型或所有其他细胞类型区别开。

在一些实施方式中，靶点包含蛋白质、糖类、脂质和/或核酸。在一些实施方式中，靶点包含蛋白质和/或其特征部分，例如，肿瘤标记物、整联蛋白、细胞表面受体、跨膜蛋白、细胞间蛋白、离子通道、膜转运蛋白、酶、抗体、嵌合蛋白、糖蛋白，等等。在一些实施方式中，靶点包含糖类和/或其特征部分，例如，糖蛋白，糖(例如，单糖、二糖、多糖)、多糖包被(即，大多数真核细胞的外表面上富集糖类的外周区域)，等等。在一些实施方式中，靶点包含脂质和/或其特征部分，例如，油、脂肪酸、甘油酯、激素、类固醇(例如，胆固醇、胆汁酸)、维生素(例如，维生素E)、磷脂、神经鞘脂、脂蛋白，等等。在一些实施方式中，靶点包含核酸和/或其特征部分，例如，DNA核酸、RNA核酸、修饰的DNA核酸、修饰的RNA核酸、包括DNA、RNA、修饰的DNA和修饰的RNA的任何组合在内的核酸。

本领域已知多种标记物。典型的标记物包括细胞表面蛋白质，例如，受体。示例性的受体包括但不限于：转铁蛋白受体、LDL受体、生长因子受体(例如，表皮生长因子受体家族成员(例如，EGFR、Her2、Her3、Her4))或血管内皮生长因子受体、细胞因子受体、细胞粘附分子、整联蛋白、选择素和CD分子。所述标记物可为仅仅存在于或大量存在于恶性肿瘤细胞上的分子，例如，肿瘤抗原。

在一些实施方式中，所述靶向部分特异性结合肿瘤细胞，或者相较于非肿瘤细胞优先结合肿瘤细胞。

靶向部分与肿瘤细胞的结合可使用本领域已知的方法检测。

在一些实施方式中，所述肿瘤细胞为癌细胞、肉瘤细胞、淋巴瘤细胞、骨髓瘤细胞或中枢神经***癌症细胞。

在一些实施方式中，所述靶向部分能够特异性结合肿瘤抗原，或者相较于非肿瘤抗原优先结合肿瘤抗原。

在一些特定的实施方式中，靶点为肿瘤标记物。在一些实施方式中，肿瘤标记物为存在于肿瘤中而不存在于正常器官、组织和/或细胞中的抗原。在一些实施方式中，肿瘤标记物为在肿瘤中比在正常器官、组织和/或细胞中更加普遍的抗原。在一些实施方式中，肿瘤标记物为在恶性癌症细胞中比在正常细胞中更加普遍的抗原。

在一些实施方式中，靶向部分包含叶酸或其衍生物。

近年来，关于叶酸的研究取得了很大进步。叶酸为一种细胞***必需的小分子维生素。肿瘤细胞***异常，叶酸盐受体(FR)在肿瘤细胞表面高表达以捕获足以支持细胞***的叶酸。

数据显示FR在肿瘤细胞中的表达是其在正常细胞中的表达的20倍至200倍。FR在各种不同的恶性肿瘤中的表达率为：在卵巢癌中为82％，在非小细胞肺癌中为66％，在肾癌中为64％，在结肠癌中为34％，在乳腺癌中为29％(Xia W，Low PS.Late-targetedtherapies for cancer.J Med Chem.2010；14；53(19):6811-24)。FA的表达率和上皮肿瘤浸润和转移的恶性程度正相关。FA通过FR介导的内吞作用进入细胞，并且FA通过其羧基基团与进入细胞的药物形成FA复合物。在酸性(pH值为5)条件下，FR从FA中分离出来，并且FA将药物释放进入细胞质。

临床上，此***可用于递送选择性攻击肿瘤细胞的药物。叶酸具有小分子量，不具有免疫原性且具有高稳定性，并且叶酸的合成并不昂贵。更重要的是，药物和载体之间的化学偶联简单，因此，使用FA作为靶向分子构建药物递送***用于癌症治疗已成为研究热点。目前，正在临床试验中的EC145(FA化疗药物偶联化合物)可有效攻击癌细胞(Pribble P和Edelman MJ.EC145:a novel targeted agent for adenocarcinoma of the lung.ExpertOpin.Investig.Drugs(2012)21:755-761)。

在一些实施方式中，靶向部分包含细胞外结构域(ECD)或PD-1,PDL-1,CTLA4,CD47,BTLA,KIR,TIM3,4-1BB和LAG3的可溶形式，全长的部分表面配体双调蛋白，β动物纤维素，EGF，肝配蛋白，上皮细胞有丝***蛋白抗体(Epigen)，上皮调节蛋白，IGF，神经调节蛋白，TGF，TRAIL或VEGF。

在一些实施方式中，所述靶向部分包含Fab、Fab’、F(ab’)2、单结构域抗体、T和Abs二聚体、Fv、scFv、dsFv、ds-scFv、Fd、线性抗体、微小抗体、双价抗体、双特异性抗体片段、bibody、tribody、sc-双价抗体、κ(λ)body、BiTE、DVD-Ig、SIP、SMIP、DART或者含有一个或一个以上CDR的抗体类似物。

在一些实施方式中，靶向部分为抗体或抗体片段，该靶向部分基于其对抗原的特异性进行选择，所述抗原在目标靶细胞或靶位点上表达。已识别出多种不同的肿瘤特异性抗原或其他疾病特异性抗原，并且那些抗原的抗体已用于或计划用于治疗这些肿瘤或其他疾病。本领域已知的抗体可用于本发明的化合物，尤其用于治疗与靶抗原有关的疾病。可被本发明的抗体-连接体-药物偶联物靶定的目标抗原(及其相关疾病)的实例包括：CD2,CD19,CD20,CD22,CD27,CD33,CD37,CD38,CD40,CD44,CD47,CD52,CD56,CD70,CD79，CD137，4-1BB,5T4，AGS-5,AGS-16,血管生成素2,B7.1,B7.2,B7DC,B7H1,B7H2,B7H3,BT-062,BTLA,CAIX,癌胚抗原,CTLA4,Cripto,ED-B,ErbB1,ErbB2,ErbB3,ErbB4,EGFL7,EpCAM,EphA2,EphA3,EphB2,FAP,纤连蛋白,叶酸盐受体,神经节苷酯GM3,GD2,糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(GITR),gp100,gpA33,GPNMB,ICOS,IGF1R,整联蛋白αν,整联蛋白ανβ,KIR,LAG-3,Lewis Y,间皮素,c-MET,MN碳酸酐酶IX,MUC1,MUC16,粘连蛋白-4,NKGD2,NOTCH,OX40,OX40L,PD-1,PDL1,PSCA,PSMA,RANKL,ROR1,ROR2,SLC44A4,STING,多配体蛋白聚糖-1,TACI,TAG-72,腱生蛋白,TIM3,TRAILR1,TRAILR2,VEGFR-1,VEGFR-2,VEGFR-3。

在一些实施方式中，靶向部分包含颗粒(靶向颗粒)，优选地为纳米颗粒，任选地为连接至靶向分子的靶向纳米颗粒，所述靶向分子可特异性结合或优先结合靶点。在一些实施方式中，靶向颗粒其自身引导本发明的化合物(例如，通过在肿瘤细胞或肿瘤组织中的富集)，而无需与其连接的额外的靶向分子。

本文中的“纳米颗粒”是指直径小于1000nm的任何颗粒。在一些实施方式中，治疗剂和/或靶向分子可与聚合物基体结合。在一些实施方式中，靶向分子可与聚合物基体的表面共价结合。在一些实施方式中，共价结合由连接体介导。在一些实施方式中，治疗剂可与聚合物基体表面结合，封装在聚合物基体内，被聚合物基体包围，和/或分散于整个聚合物基体。美国专利第8,246,968号，该美国专利的全部内容在此通过引用并入本文。

总体而言，本发明的纳米颗粒包含任何类型的颗粒。根据本发明可使用任何颗粒。在一些实施方式中，颗粒是可生物降解的且生物相容的。总体而言，生物相容性物质对细胞无毒。在一些实施方式中，如果将某种物质加至细胞中产生小于细胞死亡的某一阈值的结果，那么认为该物质是生物相容的。在一些实施方式中，如果将某种物质加至细胞中不诱导副作用，那么认为该物质为生物相容的。总体而言，可生物降解的物质是经过治疗相关时间段过程(例如，数周、数月或者数年)在生理学条件下发生分解的物质。在一些实施方式中，可生物降解的物质为可通过细胞机制进行分解的物质。在一些实施方式中，可生物降解的物质是可通过化学过程分解的物质。在一些实施方式中，颗粒是既生物相容又可生物降解的物质。在一些实施方式中，颗粒是生物相容性物质，但不是可生物降解的物质。在一些实施方式中，颗粒是可生物降解的物质，但不是生物相容性物质。

在一些实施方式中，颗粒的粒度大于肾***极限(例如，直径大于6nm的颗粒)。在一些实施方式中，颗粒尺寸为足以避免通过肝脏从血流中清除的大小(例如，直径小于1000nm的颗粒)。总体而言，颗粒的生理化学特性应当允许靶向颗粒通过降低肾***和肝脏清除在血浆中长期循环。

通常，理想的是使用尺寸、形状和/或组成相对均匀的颗粒群，这样，每一颗粒具有类似的性质。例如，至少80％的颗粒，至少90％的颗粒或至少95％的颗粒的直径或最大尺寸在平均直径或最大尺寸的5％，10％或20％的范围内。在一些实施方式中，颗粒群的尺寸、形状和/或组成可为不均一的。

ζ(Zeta)电位为颗粒表面电势的测量值。在一些实施方式中，颗粒的ζ电位为-50mV至+50mV。在一些实施方式中，颗粒的ζ电位为-25mV至+25mV。在一些实施方式中，颗粒的ζ电位为-10mV至+10mV。在一些实施方式中，颗粒的ζ电位为-5mV至+5mV。在一些实施方式中，颗粒的ζ电位为0mV至+50mV。在一些实施方式中，颗粒的ζ电位为0mV至+25mV。在一些实施方式中，颗粒的ζ电位为0mV至+10mV。在一些实施方式中，颗粒的ζ电位为0mV至+5mV。在一些实施方式中，颗粒的ζ电位为-50mV至0mV。在一些实施方式中，颗粒的ζ电位为-25mV至0mV。在一些实施方式中，颗粒的ζ电位为-10mV至0mV。在一些实施方式中，颗粒的ζ电位为-5mV至0mV。在一些实施方式中，颗粒的ζ电位基本为中性(即，约0mV)。

根据本发明可使用多种不同的颗粒。在一些实施方式中，颗粒为球形或类球形。在一些实施方式中，颗粒为球形或类球形。在一些实施方式中，颗粒为扁平的或板状的。在一些实施方式中，颗粒为立方体或长方体。在一些实施方式中，颗粒为卵形或椭圆形。在一些实施方式中，颗粒为圆柱形、圆锥形或金字塔形。

在一些实施方式中，颗粒为微颗粒(例如，微球)。总体而言，“微颗粒”是指直径小于1000μm的任何颗粒。在一些实施方式中，颗粒为微微型颗粒(picoparticle)(例如，微微球体)。总体而言，“微微型颗粒”是指直径小于1nm的任何颗粒。在一些实施方式中，颗粒为脂质体。在一些实施方式中，颗粒为胶束。

颗粒可为实心的或中空的并且可包含一个或多于一个层(例如，纳米壳，纳米环)。在一些实施方式中，每层相对于其他各层具有独特的组成和独特的性质。例如，颗粒可具有核/壳结构，其中，核为一层，壳为另一层。颗粒可包含多个不同的层。在一些实施方式中，一层可为充分交联的，另一层不充分交联，等等。在一些实施方式中，不同层中的一层，几层或所有层可包含一种或一种以上待递送的治疗剂或诊断剂。在一些实施方式中，一层包含待递送的药剂，另一层不含待递送的药剂，等等。在一些实施方式中，每个单独的层包含不同的待递送的药剂或药剂的集合。

在一些实施方式中，颗粒为多孔的，其是指颗粒包含孔或通道，所述孔或通道通常比颗粒的尺寸小。例如，颗粒可为多孔二氧化硅颗粒，例如，介孔二氧化硅纳米颗粒，或者颗粒可具有介孔二氧化硅涂层(Lin等人,2005,J.Am.Chem.Soc.,17:4570)。颗粒可具有直径为约1nm至约50nm的孔，例如，直径为约1nm至20nm的孔。颗粒体积的约10％至95％可由孔或通道内的空隙构成。

颗粒可具有涂层。例如，如果颗粒包含对细胞具有毒性的物质，那么生物相容性涂层的使用可为有优势的。合适的涂层物质包括但不限于：诸如牛血清白蛋白(BSA)之类的天然蛋白质、诸如聚乙二醇(PEG)或PEG衍生物之类的生物相容性亲水聚合物、磷脂-(PEG)、二氧化硅、脂质、聚合物、诸如葡萄聚糖之类的糖类、可与本发明的纳米颗粒结合的其他纳米颗粒，等等。涂层可通过诸如浸蘸、使用层-层技术、自组装、共轭作用等的多种方式涂敷或组装。自组装是指自发地组装成高级结构的过程，该过程依赖于高级结构的成分(例如，分子)彼此之间的自然吸引作用。该过程通常基于尺寸、形状、组成或化学性质通过分子的随机运动和键的形成而发生。

聚合物的实例包括聚亚烷基(例如，聚乙烯)，聚碳酸酯(例如，聚(1,3-二氧杂环己烷-2酮))，聚酐(例如，聚(癸二酸酐))，聚羟基酸(例如，聚(β-羟基链烷酸酯))，聚延胡索酸酯，聚己酸内酯，聚酰胺(例如，聚己内酰胺)，聚缩醛树脂，聚醚，聚酯(例如，聚乳酸，聚乙醇酸交酯)，聚(原酸酯)，聚乙烯醇，聚氨酯，聚磷腈，聚丙烯酸酯，聚甲基丙烯酸酯，聚氰基丙烯酸酯，聚脲，聚苯乙烯和聚胺。在一些实施方式中，根据本发明的聚合物包括已由美国食品药品管理局(FDA)根据21 C.F.R.§177.2600批准用于人体的聚合物，包括但不限于：聚酯(例如，聚乳酸，聚乙醇酸，聚(丙交酯-乙交酯)嵌段共聚物，聚己酸内酯，聚戊内酯，聚(1,3-二氧杂环己烷-2酮))，聚酐(例如，聚(癸二酸酐))，聚醚(例如，聚乙二醇)，聚氨酯，聚甲基丙烯酸酯，聚丙烯酸酯和聚氰基丙烯酸酯。

在一些实施方式中，颗粒可为非聚合颗粒(例如，金属颗粒，量子点，陶瓷颗粒，含有无机材料的聚合物，骨衍生的材料，骨代用品，病毒颗粒，等等)。在一些实施方式中，待递送的治疗剂或诊断剂可与这样的非聚合颗粒的表面结合。在一些实施方式中，非聚合颗粒为非聚合成分的聚集体，例如，金属原子(例如，金原子)的聚集体。在一些实施方式中，待递送的治疗剂或诊断剂可与非聚合成分的聚集体的表面结合和/或封装在非聚合成分的聚集体内、被非聚合成分的聚集体围绕和/或分散于整个非聚合成分的聚集体。

颗粒(例如，纳米颗粒，微颗粒)可使用本领域已知的任何方法制备。例如，颗粒剂型可通过下列方法以及本领域普通技术人员熟知的其他方法形成：例如纳米沉淀，流动聚焦流体通道，喷雾干燥，单乳液和双乳液溶剂蒸发，溶剂萃取，相分离，研磨，微乳液操作，微制造，纳米制造，牺牲层，简单和复合凝聚。可选地或额外地，已经描述了用于单分散半导体纳米颗粒，导电性纳米颗粒，磁性纳米颗粒，有机纳米颗粒和其他纳米颗粒的水性和有机溶剂合成方法(Pellegrino等人,2005,Small,1:48；Murray等人,2000,Ann.Rev.Mat.Sci.,30:545；以及Trindade等人,2001,Chem.Mat.,13:3843)。

制备用于递送封装的药剂的微颗粒的方法在文献中描述(参见，例如，Doubrow,编辑,“Microcapsules and Nanoparticles in Medicine and Pharmacy,”CRC Press,BocaRaton,1992；Mathiowitz等人,1987,J.Control.Release,5:13；Mathiowitz等人,1987,Reactive Polymers,δ:275；以及Mathiowitz等人,1988,J.Appl.Polymer Sci.,35:755)。

在一些实施方式中，靶向部分包含核酸靶向部分。

总体而言，核酸靶向部分是结合与器官、组织、细胞、细胞外基质成分和/或细胞内腔室有关的成分(靶点)的任何多核苷酸。

在一些实施方式中，核酸靶向部分为适体。

适体通常为与特定目标结构结合的多核苷酸，所述特定目标结构与特定器官、组织、细胞、细胞外基质成分和/或细胞内腔室有关。总体而言，适体的靶向功能基于适体的三维结构。在一些实施方式中，适体与靶点的结合通常由适体和靶点这两者的二维和/或三维结构之间的相互作用介导。在一些实施方式中，适体与靶点的结合不仅仅基于适体的基本序列，还取决于适体和/或靶点的三维结构。在一些实施方式中，适体通过Watson-Crick互补碱基配对与其靶点结合，所述Watson-Crick碱基配对被破坏碱基配对的结构(例如，发夹环)中断。

在一些实施方式中，核酸靶向部分为spiegelmer(PCT公布WO 98/08856,WO 02/100442和WO 06/117217)。总体而言，spiegelmer为合成的镜像核酸，其可特异性结合靶点(即，镜像适体)。Spiegelmer通过如下结构特征表征：所述结构特征使得它们不易受外切-核酸酶和内切-核酸酶的影响。

本领域普通技术人员会意识到的是，根据本发明可使用任何能够特异性结合靶点的核酸靶向部分(例如，适体或spiegelmer)。在一些实施方式中，根据本发明待使用的核酸靶向部分可靶定与疾病、失调和/或病症有关的标记物。在一些实施方式中，根据本发明待使用的核酸靶向部分可靶定癌相关靶点。在一些实施方式中，根据本发明待使用的核酸靶向部分可靶定肿瘤标记物。使用根据本发明的核酸靶向部分可靶定任何类型的癌症标记物和/或任何肿瘤标记物。举例而言，核酸靶向部分可靶定与***癌、肺癌、乳腺癌、结肠直肠癌、膀胱癌、胰腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、骨癌、食管癌、肝癌、胃癌、脑肿瘤、皮肤黑色素瘤和/或白血病有关的标记物。

本发明的核酸(包括核酸靶向部分和/或待递送的功能性RNA，例如，RNAi-诱导实体，核酶，tRNA，等等，下面进一步详细描述)可根据任何可获得的技术制备，包括但不限于：化学合成、酶合成、较长的前体的酶裂解或化学裂解，等等。合成RNA的方法为本领域已知的(参见例如，Gait,M.J.(编辑)Oligonucleotide synthesis:a practical approach,Oxford[Oxfordshire],Washington,D.C.:IRL Press,1984；和Herdewijn,P.(编辑)Oligonucleotide synthesis:methods and applications,Methods in molecularbiology,v.288(Clifton,N.J.)Totowa,N.J.:Humana Press,2005)。

形成核酸靶向部分的核酸可包含天然生成的核苷，修饰的核苷，具有在一个或一个以上核苷之间***的烃连接体(例如，亚烷基)或聚醚连接体(例如，PEG连接体)的天然生成的核苷，具有在一个或一个以上核苷之间***的烃连接体或PEG连接体的修饰的核苷，或它们的组合。在一些实施方式中，只要核酸靶向部分的结合亲合力和选择性基本不会由于取代(例如，核酸靶向部分对靶点的解离常数不应大于约1×10^-3M)而降低，核酸靶向部分的核苷酸或修饰的核苷酸可被烃连接体或聚醚连接体取代。

本领域普通技术人员已知，根据本发明的核酸可包含天然生成的核酸中发现的全部类型的核苷酸或者可包括一种或一种以上核苷酸类似物或具有与天然生成的核酸的结构不同的结构。美国专利第6,403,779号、第6,399,754号、第6,225,460号、第6,127,533号、第6,031,086号、第6,005,087号、第5,977,089号，这些美国专利中的参考文献公开了多种不同的具体核苷类似物和可使用的修饰。参见Crooke,S.(编辑)Antisense DrugTechnology:Principles,Strategies,and Applications(第一版),Marcel Dekker；ISBN:0824705661；第一版(2001)以及其中的参考文献。例如，2'-修饰包括卤代、烷氧基和烯丙氧基。在一些实施方式中，2'-OH基团被选自下列的基团取代：H，OR，R，卤素，SH，SR，NH₂，NHR，NR₂或CN，其中，R为C₁-C₆烷基，烯基，或炔基，并且卤素为F，Cl，Br或I。修饰的键合的实例包括硫代磷酸酯和5'-N-亚磷酰胺键合。

根据本发明，可使用包含多种不同的核苷酸类似物、修饰的骨架或非天然生成的核苷间键合的核酸。本发明的核酸可包括天然核苷(即，腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷及脱氧胞苷)或修饰的核苷。修饰的核苷酸的实例包括碱基修饰的核苷(例如，阿糖胞苷(aracytidine)、肌苷、异鸟苷、水粉荤素(nebularine)、假尿苷、2,6-二氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、2-硫代胸苷、3-去氮-5-氮杂胞苷、2'-脱氧尿苷、3-硝基吡咯、4-甲基吲哚、4-硫代尿苷、4-硫代胸苷、2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、2-硫代尿苷、5-溴代胞苷、5-碘代尿苷、肌苷、6-氮杂尿苷、6-氯代嘌呤、7-去氮腺苷、7-去氮鸟苷、8-氮杂腺苷、8-叠氮腺苷、苯并咪唑、M1-甲基腺苷、吡咯并嘧啶、2-氨基-6-氯代嘌呤、3-甲基腺苷、5-丙炔基胞苷、5-丙炔基尿苷、5-溴代尿苷、5-氟代尿苷、5-甲基胞苷、7-去氮腺苷、7-去氮鸟苷、8-氧腺苷、8-氧鸟苷、O(6)-甲基鸟嘌呤和2-硫代胞苷)，化学或生物修饰的碱基(例如，甲基化的碱基)，修饰的糖类(例如，2'-氟代核糖、2'-氨基核糖、2'-叠氮核糖、2'-O-甲基核糖、L-对映异构体核苷阿糖和己糖)，修饰的磷酸酯基团(例如，硫代磷酸酯和5'-N-亚磷酰胺键合)以及它们的组合。用于核酸的化学合成的天然核苷酸单体和修饰的核苷酸单体易于获得。在一些情况下，含有这些修饰的核酸相对于仅由天然生成的核苷酸构成的核酸表现出改善的性质。在一些实施方式中，本文所述的核酸修饰被用于降低和/或防止核酸酶(例如，核酸外切酶，核酸内切酶，等等)消化。例如，核酸的结构可通过在一条链或两条链的3'端包括核苷酸类似物以降低消化来稳定。

修饰的核酸不需要沿着分子的全长进行一致性修饰。不同的核苷酸修饰和/或骨架结构可存在于核酸的各个不同位置。本领域普通技术人员可理解的是，核苷酸类似物或其他修饰可位于使核酸的功能基本不受影响的核酸的任何位置。举例而言，修饰可位于使核酸靶向部分特异性结合靶点的能力基本不受影响的核酸靶向部分的任何位置。修饰的区域可位于一条链或两条链的5'端和/或3'端。例如，已使用如下修饰的核酸靶向部分：位于该修饰的核酸靶向部分中的两条链中的任一条链的5'端和/或3'端处的大约1至5个残基为核苷酸类似物和/或具有骨架修饰。所述修饰可为5'或3'末端修饰。一条或两条核酸链可包含至少50％未修饰的核苷酸，至少80％未修饰的核苷酸，至少90％未修饰的核苷酸或100％未修饰的核苷酸。

例如，根据本发明的核酸可包含对糖类、核苷或核苷间键合的修饰，例如，美国专利申请公开第2003/0175950号,第2004/0192626号,第2004/0092470号,第2005/0020525号以及第2005/0032733号中描述的那些。本发明包括使用具有本文所述的修饰中的任何一种或一种以上的任何核酸。例如，已报道了多种末端偶联物(例如，脂质(例如，胆固醇)、石胆酸、月桂酸(aluric acid)、长支链烷基)改善细胞摄取。例如，可使用本领域已知的任何合适的测试方法检测类似物和修饰，从而选择使治疗剂或诊断剂的递送得到改善、使核酸的靶向部分与靶点的特异性结合得到改善等等的那些类似物和修饰。在一些实施方式中，根据本发明的核酸可包括一个或一个以上非天然核苷键合。在一些实施方式中，一个或一个以上位于核酸靶向部分的3'端、5'端或3'端和5'端这两端的内在核苷酸被倒转生成诸如3'-3'键合或5'-5'键合之类的键合。

在一些实施方式中，根据本发明的核酸不是合成的，其为已从其天然环境中分离出来的天然生成的实体。

可使用任何方法来设计新的核酸靶向部分(请参见例如下列美国专利：6,716,583；6,465,189；6,482,594；6,458,543；6,458,539；6,376,190；6,344,318；6,242,246；6,184,364；6,001,577；5,958,691；5,874,218；5,853,984；5,843,732；5,843,653；5,817,785；5,789,163；5,763,177；5,696,249；5,660,985；5,595,877；5,567,588和5,270,163以及下列美国专利申请公开：2005/0069910,2004/0072234,2004/0043923,2003/0087301,2003/0054360和2002/0064780)。本发明提供一种用于设计新的核酸靶向部分的方法。本发明还提供一种用于从候选核酸靶向部分的混合物中分离或识别新的核酸靶向部分的方法。

可设计和/或识别与蛋白质、糖类、脂质和/或核酸结合的核酸靶向部分。在一些实施方式中，核酸靶向部分可被设计和/或识别为在与蛋白质和/或其特征部分结合的本发明的复合物中使用，所述蛋白质和/或其特征部分例如，肿瘤标记物、整合蛋白、细胞表面受体、跨膜蛋白、细胞间蛋白质、离子通道、膜转运蛋白、酶、抗体、嵌合蛋白，等等。在一些实施方式中，核酸靶向部分可被设计和/或识别为在与糖类和/或其特征部分结合的本发明的复合物中使用，所述糖类和/或其特征部分例如，糖蛋白、糖类(例如，单糖、二糖和多糖)、多糖包被(即，大多数真核细胞的外表面上的碳水化合物富集的外周区域)，等等。在一些实施方式中，核酸靶向部分可被设计和/或识别为在与脂质和/或其特征部分结合的本发明的复合物中使用，所述脂质和/或其特征部分例如，油、饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸、甘油酯、激素、类固醇(例如，胆固醇、胆汁酸)、维生素(例如，维生素E)、磷脂、神经鞘脂、脂蛋白，等等。在一些实施方式中，核酸靶向部分可被设计和/或识别为在与核酸和/或其特征部分结合的本发明的复合物中使用，所述核酸和/或其特征部分例如，DNA核酸、RNA核酸、修饰的DNA核酸、修饰的RNA核酸和包括DNA、RNA、修饰的DNA和修饰的RNA的任何组合的核酸，等等。

可使用任何可获得的方法设计和/识别核酸靶向部分(例如，适体或spiegelmer)。在一些实施方式中，核酸靶向部分通过从候选的核酸混合物中识别核酸靶向部分来设计和/或识别。指数富集配体***进化(SELEX)或其改良方法为从候选的核酸混合物中识别与靶点结合的核酸靶向部分的常用方法。

选择性结合任何靶点的核酸靶向部分可通过SELEX方法或其改良方法分离，条件是所述靶点可用作SELEX方法中的靶点。

III.药物制剂和给药方式

本发明进一步涉及包含本发明的化合物或其药学上可接受的盐以及一种或多于一种药学上可接受的载体的药物制剂。

包括本文所述的化合物(例如，其加成盐或水合物)以及药学上可接受的载体在内的本发明的药物制剂可使用多种不同的给药模式或途径递送至患者。合适的给药途径包括但不限于：吸入给药、透皮给药、口服给药、直肠给药、透过粘膜给药、肠道给药和肠胃外给药(包括肌肉内、皮下和静脉注射)。优选地，包含作为靶向部分的抗体或抗体片段的本发明的化合物以肠胃外的方式给药，更优选地，以静脉注射方式给药。

本文使用的术语“给药”意在包括直接和间接地将化合物递送至期望的作用位点的所有方式。

本文所述的化合物或其药学上可接受的盐和/或其水合物可单独给药，与本发明的其他化合物联合给药和/或与其他治疗剂联合以混合剂的形式给药。当然，对可与本发明的化合物联合给药的治疗剂的选择部分取决于治疗中的病症。

例如，当向患有由依赖于自诱导物的生物体引起的疾病病症的患者给药时，本发明的化合物可以混合剂的形式给药，所述混合剂含有用于治疗疼痛、感染和其他症状以及通常与疾病有关的副作用的药剂。这些药剂包括例如，镇痛剂、抗生素，等等。

当向正在进行癌症治疗的患者给药时，化合物可以混合剂的形式给药，所述混合剂包含抗癌剂和/或补充增效剂。所述化合物还可以含有治疗放疗的副作用的药剂的混合剂的形式给药，所述治疗放疗的副作用的药剂例如，止吐药，防辐射剂，等等。

可与本发明的化合物联合给药的补充增效剂包括例如，三环类抗抑郁药(例如，丙咪嗪(imipramine)、地昔帕明(desipramine)、阿米替林(amitriptyline)、氯米帕明(clomipramine)、曲米帕明(trimipramine)、多塞平(doxepin)、去甲替林(nortriptyline)、普罗替林(protriptyline)、阿莫沙平(amoxapine)和马普替林(maprotiline))，非三环类抗抑郁药(例如，舍曲林(sertraline)、曲唑酮(trazodone)和西酞普兰(citalopram))，Ca²⁺拮抗剂(例如，维拉帕米(verapamil)、硝苯地平(nifedipine)、尼群地平(nitrendipine)和卡罗维林(caroverine))，两性霉素，三苯乙醇类似物(例如，它莫昔芬(tamoxifen))，抗心律失常药物(例如，奎尼丁(quinidine))，抗高血压药物(例如，利血平(reserpine))，硫醇消耗物(例如，丁硫氨酸和亚砜亚胺)以及甲酰四氢叶酸钙。

本发明的活性化合物以其自身的形式给药或者以药物组合物的形式给药，在所述药物组合物中，所述活性化合物与一种或一种以上药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂混合。根据本发明使用的药物组合物通常使用一种或一种以上生理学可接受的载体以常规方式配制，所述生理学可接受的载体包含赋形剂和助剂，所述生理学可接受的载体有利于将活性化合物加工成可在药学上使用的制剂。合适的剂型取决于所选择的给药途径。

对于透过粘膜给药而言，在剂型中使用适于待穿透的屏障的渗透剂。这些渗透剂通常为本领域已知的。

对于口服给药而言，化合物易于通过将活性化合物与本领域已知的药学上可接受的载体结合配制。这些载体能够使本发明的化合物配制成由待治疗的患者口服的片剂、药丸、糖衣药丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆状物和悬浮液。口服的药物制剂可通过如下方式获得：将固体赋形剂与活性剂化合物混合，任选地研磨得到的混合物，并对颗粒混合物进行加工，如果想要得到片剂或糖衣片芯的话，需要在该过程之前加入合适的助剂。具体而言，合适的赋形剂为填充剂(例如，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇的糖)，纤维素制剂(例如，玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、土豆淀粉、明胶、黄耆胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧乙基纤维素钠)和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要的话，可加入崩解剂，例如，交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其盐(例如，海藻酸钠)。

向糖衣片芯提供合适的包衣。为了实现这个目的，可使用浓缩的糖溶液，该溶液可任选地含有***树胶、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、卡伯波凝胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆用溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。可将染料或颜料加至片剂或糖衣药丸包衣中，用于识别或表征不同的活性化合物剂量组合。

可口服使用的药物制剂包括由明胶制成的推合式胶囊和由明胶和增塑剂(例如，丙三醇或山梨糖醇)制成的软的密封的胶囊。推合式胶囊可含有与诸如乳糖之类的填充剂、诸如淀粉之类的粘合剂和/或诸如滑石粉或硬脂酸镁之类的润滑剂和任选地稳定剂混合的活性成分。在软胶囊中，活性化合物可溶解于或悬浮于合适的液体中，例如，脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。此外，可加入稳定剂。用于口服给药的所有剂型的剂量应当适于这种给药方式。

对于口腔给药而言，组合物可以通过常规方式配制的片剂或含片的形式给药。

对于吸入给药而言，根据本发明使用的化合物便于通过使用合适的推进剂(例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体)以由加压包或喷雾器提供的喷雾的形式递送。在使用加压喷雾的情况下，剂量单位可通过提供递送计量的量的阀来确定。在吸入器或吹入器中使用的胶囊和药筒(例如，明胶胶囊和药筒)可被配制为含有化合物和合适粉末基体(例如，乳糖或淀粉)的粉末混合物的剂型。

化合物可被配制为通过注射(例如，快速注射或连续输注)方式肠胃外给药的剂型。注射为本发明的组合物的优选的给药方法。用于注射的剂型可以是带有添加的防腐剂的单位剂量形式，例如，安瓶或多剂量容器的形式。组合物可采用诸如油性载体或水性载体中的悬浮液、溶液或乳液之类的形式并且可含有诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂之类的调配剂(formulatory)，并且可加入例如交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其盐(例如，海藻酸钠)。

用于肠胃外给药的药物剂型包括水溶性形式的活性化合物的水溶液。此外，活性化合物的悬浮液可制备成合适的油性注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油(例如，芝麻油)或合成的脂肪酸酯(例如，油酸乙酯或甘油三酯)或脂质体。水性注射悬浮液可包含增加悬浮液的粘度的物质，例如，羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。任选地，悬浮液还可含有合适的稳定剂或药剂，该稳定剂或药剂增加化合物的溶解度，从而制备高度浓缩的溶液。对于注射而言，本发明的药剂可被配制成水性溶液，优选地配制成生理相容性缓冲液(例如，Hanks溶液、林格氏溶液或生理盐水缓冲液)。

可选地，活性成分可为使用前溶解于合适的载体中的粉末形式，所述合适的载体例如，无菌无热原水。

化合物还可被配制成直肠用组合物，例如，栓剂或保留灌肠剂型，例如含有常规栓剂基体(例如可可油或其他甘油酯)。

除了前述剂型之外，化合物还可被配制成长效制剂。这种长期起效的剂型可通过植入或经皮递送(例如，皮下递送或肌肉内递送)、肌肉内注射或透皮贴剂给药。因此，例如，化合物可通过合适的聚合材料或疏水性材料(例如，可接受的油中的乳液)或离子交换树脂配制或可将化合物配制成微溶衍生物，例如，配制成微溶的盐。

药物组合物还可包含合适的固体或凝胶相载体或赋形剂。这些载体或赋形剂的实例包括碳酸钙、磷酸钙、各种糖类、淀粉、纤维素衍生物、明胶和诸如聚乙二醇之类的聚合物。

优选的药物组合物为配制成注射剂型的组合物，例如，静脉注射剂型，并且该优选的药物组合物包含基于总的100重量％的药物组合物的约0.01重量％至约100重量％的本发明的化合物。药物配体偶联物可为抗体-细胞毒素偶联物，其中，选择靶向特定癌症的抗体。

在一些实施方式中，本发明的药物组合物还包含另一化疗剂。

本文中的“化疗剂”是指在治疗癌症中有用的化学化合物。实例包括但不限于：吉西他滨(Gemcitabine),伊立替康(Irinotecan),阿霉素(Doxorubicin),5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil),阿糖胞苷(Cytosine arabinoside，“Ara-C”),环磷酰胺(Cyclophosphamide),塞替派(Thiotepa),白消安(Busulfan),细胞毒素,紫杉酚,甲氨蝶呤(Methotrexate),顺铂(Cisplatin),美法仑(Melphalan),长春碱(Vinblastine)和卡铂(Carboplatin)。

在一些实施方式中，所述另一化疗剂选自：他莫昔芬(tamoxifen),雷洛昔芬(raloxifene),阿那曲唑(anastrozole),依西美坦(exemestane),来曲唑(letrozole),伊马替尼(imatanib),紫杉醇(paclitaxel),环磷酰胺(cyclophosphamide),洛伐他汀(lovastatin),含羞草素(minosine),吉西他滨(gemcitabine),阿糖胞苷(cytarabine),5-氟尿嘧啶,甲氨蝶呤,多西他赛(docetaxel),戈舍瑞林(goserelin),长春新碱(vincristine),长春碱(vinblastine),诺考达唑(nocodazole),替尼泊苷(teniposide),依托泊苷(etoposide),吉西他滨,埃博霉素(epothilone),长春瑞滨(vinorelbine),喜树碱(camptothecin),柔红霉素(daunorubicin),放线菌素D(actinomycin D),米托蒽醌(mitoxantrone),吖啶(acridine),阿霉素(doxorubicin),表柔比星(epirubicin)或去甲氧基柔红霉素(idarubicin)。

IV.试剂盒

另一方面，本发明提供试剂盒。在一些实施方式中，本发明的试剂盒包含一个或多于一个容器，该容器包含本文提供的组合物或化合物。所述试剂盒还包含关于将组合物用于预期的治疗(例如，免疫调节，缓解感染性疾病的症状，***，增加IFN-γ水平，增加IFN-α水平或缓解IgE相关失调)的合适的说明集，通常是书面说明。

所述试剂盒可包括包装在任何方便的合适的包装中的本文提供的组合物。例如，如果组合物是干燥的制剂(例如，冻干粉或干粉)，那么通常使用带有弹性塞子的小瓶，这样，可通过弹性塞子向瓶内注射液体而易于重悬组合物。带有无弹性可除去的瓶盖(例如，密封的玻璃)或弹性塞子的安瓶最方便用于组合物的液体制剂。还考虑与特定设备(例如吸入器)、鼻给药设备(例如，喷雾器)或输注设备(例如，微型泵)联合使用的包装。

与组合物的使用有关的说明通常包括与用于预期的治疗的剂量、给药方案和给药途径有关的信息。组合物的容器可以是单位剂量、大包装(例如，多剂量包装)或亚单位剂量。在本发明的试剂盒中提供的说明通常是标签或包装内插页(例如，包括在试剂盒内的纸页)上的书面说明，但机器可读的说明(例如，装载于磁盘或光盘上的说明)也是可接受的。

V.医疗用途

另一方面，本发明提供一种用于治疗需要这种治疗的受治者体内的疾病病症的方法，所述方法包括将包含治疗有效量的本发明的化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体的药物组合物给药于所述受治者。

除了上述组合物和构建体之外，本发明还提供本发明的化合物的多种用途。本发明的化合物的用途包括：杀死肿瘤细胞或癌细胞或者抑制肿瘤细胞或癌细胞的生长或复制，治疗癌症、治疗癌前症状、预防肿瘤细胞或癌细胞繁殖、预防癌症、预防表达自体免疫抗体的细胞繁殖。这些用途包括将有效量的本发明的化合物给药于有此需要的诸如哺乳动物或人类之类的动物。

本发明的化合物可用于治疗诸如人类之类的动物体内的疾病(例如，癌症)。本发明提供组合物及其在***中的应用，所述应用包括以药学上可接受的方式向受治者提供药学有效量的本发明的组合物。

本文中的“癌症”是指人体内的病理状态，其特征为不受控制的细胞增殖。实例包括但不限于：恶性上皮肿瘤、淋巴瘤、母细胞瘤和白血病。癌症的更加具体的实例包括但不限于：肺(小细胞和非小细胞)癌、乳腺癌、***癌、类癌性癌症、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、肝癌(肝细胞癌)、肝母细胞瘤、结肠直肠癌、头颈癌、鳞状细胞癌、食管癌、卵巢癌、子宫癌、子宫内膜癌、间皮瘤、黑色素瘤、肉瘤、骨肉瘤、脂肪肉瘤、甲状腺癌、硬纤维瘤、急性髓细胞白血病(AML)和慢性粒细胞白血病(CML)。

本文中的“抑制”或“治疗”是指降低、治疗性和预防性治疗，其中，目的是降低或预防目标病理性失调或病症。在一个实施例中，给药本发明的化合物之后，癌症患者可经历肿瘤尺寸减小。“治疗”包括(1)抑制患有或表现出疾病的病理或症状的受治者体内的疾病；(2)缓解患有或表现出疾病的病理或症状的受治者体内的疾病；和/或(3)影响患有或表现出疾病的病理或症状的受治者或患者体内的疾病的任何可测量的降低。本发明的化合物在一定程度上可防止癌细胞生长和/或杀死癌细胞，在该程度上的本发明的化合物可为抑制细胞生长的和/或细胞毒性的。

本文中的“治疗有效量”是指有效“治疗”受治者或哺乳动物体内的失调的本文提供的化合物的量。在治疗癌症的情况下，治疗有效量的药物可降低癌细胞的数目，使肿瘤尺寸减小，抑制癌细胞浸润进入外周器官，抑制肿瘤转移，抑制肿瘤生长至某一程度，和/或一定程度地减轻与癌症相关的症状中的一种或一种以上。

与一种或一种以上其他治疗剂“联合”给药包括同时给药和以任何顺序连续给药。本文使用的术语“药物组合”是指通过混合活性成分或组合活性成分得到的产品，并且包括活性成分的固定组合和非固定组合这两者。术语“固定组合”是指活性成分(例如通式(1)的化合物)和联合药剂以单个实体或剂量同时给药于患者。术语“非固定组合”是指活性成分(例如通式(1)的化合物)和联合药剂作为分开的实体同时或按顺序(没有特定的时间限制)给药于患者，这种给药向患者体内提供治疗有效量的活性成分。后者还用于混合剂治疗，例如，给药三种或三种以上活性成分。

在一些实施方式中，疾病病症是肿瘤。

在一些实施方式中，疾病病症包括异常细胞增殖，例如，癌前病变。

本发明尤其对于治疗动物体内的癌症和抑制动物体内的肿瘤细胞或癌细胞的繁殖有用。癌症或癌前病症包括肿瘤、转移或任何特征为不受控制的细胞生长的疾病或失调，癌症或癌前病症可通过给药本发明的药物-配体复合物来治疗或预防。化合物将活化部分递送至肿瘤细胞或癌细胞。在一些实施方式中，靶向部分与癌细胞或肿瘤细胞相关抗原特异性结合。由于活化部分靠近配体，所以在内在化之后，活化部分可通过例如受体介导的内吞作用被摄取进入肿瘤细胞或癌细胞的内部。抗原可连接至肿瘤细胞或癌细胞或者可为与肿瘤细胞或癌细胞有关的细胞外基质蛋白质。一旦进入细胞内部，连接体以水解的方式裂解或被肿瘤细胞相关蛋白酶或癌细胞相关蛋白酶以酶的方式裂解，从而释放活化部分。释放的活化部分随后自由扩散并诱导或提高免疫细胞或肿瘤细胞的免疫活性。在可选的实施方式中，活化部分从化合物肿瘤微环境中裂解出来，随后药物渗入细胞。

可被本发明的化合物靶定的癌前症状的代表性的实例包括：化生、增生、异常、结肠直肠息肉、光化性角化病、光化性唇炎、人***瘤病毒、白斑、扁平苔藓和博温氏病。

可被本发明的化合物靶定的癌症或肿瘤的代表性实例包括：肺癌、结肠癌、***癌、淋巴瘤、黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、睾丸癌、中枢神经***癌、肾脏癌、肾癌、胰腺癌、胃癌、口腔癌、鼻癌、子***和白血病。对于本领域普通技术人员来说明显的是，可选择使活化部分靶定待用药物治疗的肿瘤组织的在化合物中使用的特定靶向部分(即，选择对肿瘤特异性抗原具有特异性的靶向剂)。这种靶向部分的实例是本领域已知的，实例包括用于治疗乳腺癌的抗Her2，用于治疗淋巴瘤的抗CD20，用于治疗***癌的抗PSMA和用于治疗淋巴瘤(包括非霍奇金淋巴瘤)的抗CD30。

因此，本发明提供用于协同治疗多种癌症的方法，所述癌症包括但不限于：恶性上皮肿瘤(包括膀胱的恶性上皮肿瘤(包括恶化的膀胱癌和转移的膀胱癌))，乳腺癌，结肠癌(包括结肠直肠癌)，肾癌，肝癌，肺癌(包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌以及肺腺癌)，卵巢癌，***癌，睾丸癌，泌尿生殖道癌，淋巴***癌症，直肠癌，喉头癌，胰腺癌(包括外分泌胰腺恶性上皮肿瘤)，食道癌，胃癌，胆囊癌，子***，甲状腺癌和皮肤癌(包括鳞状细胞癌)，淋巴谱系的造血***肿瘤(包括白血病，急性淋巴细胞性白血病，急性成淋巴细胞性白血病，B-细胞淋巴瘤，T-细胞淋巴瘤，霍奇金氏淋巴瘤，非霍奇金氏淋巴瘤，多毛细胞淋巴瘤，组织细胞性淋巴瘤以及伯奇氏(Burkett)淋巴瘤)，骨髓谱系的造血***肿瘤(包括急性和慢性骨髓性白血病，骨髓增生异常综合征，骨髓性白血病和早幼粒细胞白血病)，中枢神经***和周围神经***的肿瘤(包括星形细胞瘤，神经母细胞瘤，胶质瘤和神经鞘瘤)，间充质细胞起源的肿瘤(包括纤维肉瘤，横纹肌肉瘤和骨肉瘤)，其他肿瘤(包括黑色素瘤，着色性干皮病，角化棘皮瘤，***瘤，甲状腺滤泡癌症，和畸胎瘤)，黑色素瘤，不可切除的第III期或第IV期恶性黑色素瘤，鳞状细胞癌，小细胞肺癌，非小细胞肺癌，胶质瘤，胃肠癌，肾癌，卵巢癌，肝癌，结肠直肠癌，子宫内膜癌，肾癌，***癌，甲状腺癌，神经母细胞瘤，胰腺癌，多形性胶质母细胞瘤，***，胃癌，膀胱癌，肝细胞癌，乳腺癌，结肠癌，头颈癌，胃癌，生殖细胞瘤，骨癌，骨肿瘤，骨成年恶性纤维组织细胞瘤，骨幼年恶性纤维组织细胞瘤，肉瘤，小儿肉瘤，鼻腔鼻窦(sinonasal)天然杀伤，赘生物，浆细胞赘生物，骨髓增生异常综合症，神经母细胞瘤，睾丸生殖细胞肿瘤，眼内黑色素瘤，骨髓增生异常综合症，骨髓增生异常/骨髓增殖性疾病，滑膜肉瘤，慢性骨髓性白血病，急性成淋巴细胞性白血病，费城染色体阳性急性成淋巴细胞白血病(Ph+ALL)，多发性骨髓瘤，急性骨髓性白血病，慢性淋巴细胞白血病，肥大细胞增多症以及与肥大细胞增多症有关的任何症状，以及它们的任何转移。此外，失调包括着色性荨麻疹，肥大细胞增多症(例如，弥漫性皮肤肥大细胞增多症，人体内的孤立肥大细胞瘤，以及狗肥大细胞瘤和一些罕见的类似大疱的亚型，红皮病型和毛细血管扩张型肥大细胞增多症，带有相关的造血***疾病(例如，骨髓增生性或骨髓增生异常综合症，或急性白血病，与肥大细胞增多症相关骨髓增生性失调，肥大细胞白血病)的肥大细胞增多症)。在失调的范围内还包括其他癌症，所述癌症包括但不限于：恶性上皮细胞肿瘤，其包括：膀胱癌，尿路上皮癌，乳腺癌，结肠癌，肾癌，肝癌，肺癌，卵巢癌，胰腺癌，胃癌，子***，甲状腺癌，睾丸癌(特别是睾丸***瘤)以及皮肤癌(包括，鳞状细胞癌)，胃肠道间质瘤(“GIST”)，淋巴谱系的造血***肿瘤(包括白血病，急性淋巴细胞性白血病，急性成淋巴细胞性白血病，B-细胞淋巴瘤，T-细胞淋巴瘤，霍奇金氏淋巴瘤，非霍奇金氏淋巴瘤，多毛细胞淋巴瘤和伯奇氏(Burkett)淋巴瘤)，骨髓谱系的造血***肿瘤(包括急性和慢性粒细胞性白血病和早幼粒细胞白血病)，间充质细胞起源的肿瘤(包括纤维肉瘤和横纹肌肉瘤)，其他肿瘤(包括黑色素瘤，***瘤，畸胎瘤，神经母细胞瘤和胶质瘤)；中枢神经***和周围神经***的肿瘤(包括星形细胞瘤，神经母细胞瘤，胶质瘤和神经鞘瘤)，间充质细胞起源的肿瘤(包括纤维肉瘤，横纹肌肉瘤和骨肉瘤)，以及其他肿瘤(包括黑色素瘤，着色性干皮病，角化棘皮瘤，***瘤，甲状腺滤泡癌，畸胎瘤，化疗难以治疗的非***型生殖细胞肿瘤以及卡波济氏肉瘤)，以及它们的任何转移。

最优选地，本发明用于治疗恶化的或转移的膀胱癌，胰腺癌，***癌，非小细胞肺癌，结肠直肠癌以及乳腺癌。

在本发明的优选实施方式中，本发明提供用于协同治疗癌性肿瘤的方法。有优势地是，本发明的协同方法减缓了肿瘤的发展，降低了肿瘤负荷或在哺乳动物体内产生肿瘤衰退。

在一些实施方式中，异常增殖的细胞是癌细胞。

在一些实施方式中，癌症选自：乳腺癌、结肠直肠癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤、子宫内膜癌、滤泡性淋巴瘤、胃癌、胶质母细胞瘤、头颈癌、肝细胞癌、肺癌、黑色素瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、胰腺癌、***癌和肾细胞癌。

在一些实施方式中，本发明提供用于杀伤细胞的化合物。所述化合物以足以杀伤所述细胞的量给药于细胞。在示例性的实施方式中，所述化合物给药于带有所述细胞的受治者。在另一示例性的实施方式中，所述给药使肿瘤的生长延迟或停止，所述肿瘤包括所述细胞(例如，所述细胞可为肿瘤细胞)。对于延迟生长的给药而言，所述细胞的生长速度应当为比给药前的生长速度小至少10％。优选地，生长速度会延迟至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或完全停止。

另一方面，本文提供的本发明的组合物用于治疗需要这种治疗的受治者或个体体内的自体免疫疾病病症。

在一些实施方式中，所述个体患有与不理想的免疫活化有关的失调，例如，自体免疫疾病和炎症性疾病。患有自体免疫疾病或炎症性疾病的个体是具有已有的自体免疫疾病或炎症性疾病的可识别的症状的个体。

自体免疫疾病可分为如下两个大类：器官特异性的和全身性的。自体免疫疾病包括但不限于：类风湿性关节炎(RA)，全身性红斑狼疮(SLE),I型糖尿病，II型糖尿病，多发性硬化(MvS),免疫介导的***症(例如，卵巢功能早衰)，硬皮病，干燥综合症(Sjogren'sdisease)，白癜风，秃头症(秃头)，多腺体衰竭，格雷夫斯病(Grave's disease),甲状腺功能减退，多发性肌炎，寻常型天疱疮，落叶型天疱疮，炎症性肠病(包括克罗恩氏病和溃疡性结肠炎)，自体免疫肝炎(包括与乙肝病毒(HBV)和丙肝病毒(HCV)有关的肝炎)，垂体机能减退，移植物抗宿主疾病(GvHD)，心肌炎，爱迪生氏病，自体免疫皮肤病，葡萄膜炎，恶性贫血和甲状旁腺机能减退。

自体免疫疾病可还包括但不限于：乔本氏甲状腺炎(Hashimoto's thyroiditis),I型和II型自体免疫多腺性综合症，副肿瘤型天疱疮(paraneoplastic pemphigus),水疱性类天疱疮，疱疹样皮炎，线状IgA疾病，获得性大疱性表皮松解症，结节性红斑(erythemanodosa),妊娠性类天疱疮，瘢痕性类天疱疮，特发性混合型冷沉淀球蛋白血症(mixedessential cryoglobulinemia),慢性儿童大疱疾病，溶血性贫血，血小板减小性紫癜，古德帕斯丘综合征(Goodpasture's syndrome),自体免疫嗜中性白血球减少症，重症肌无力，Eaton-Lambert肌无力综合症，全身肌强直综合症，急性播散性脑脊髓炎，格林巴利综合症(Guillain-Barre syndrome),慢性炎性脱髓鞘性多发性神经根神经病，带有传导阻滞的多灶性运动神经病，带有单克隆丙种球蛋白病的慢性神经病，眼阵挛–肌阵挛综合征，小脑变性，脑脊髓炎，视网膜病，原发性胆汁性肝硬化，硬化性胆管炎，麸质敏感性肠病，强直性脊柱炎，反应性关节炎，多发性肌炎/皮肌炎，混合的***病，白塞氏综合症，牛皮癣，结节性多动脉炎，变应性脉管炎和肉芽肿病(Churg-Strauss疾病)，多血管炎重叠综合症，高敏感性脉管炎，韦格纳氏肉芽肿病，颞动脉炎，大动脉炎(Takayasu's arteritis)，川崎病，中枢神经***孤立性血管炎，血栓闭塞性脉管炎，结节病，肾小球性肾炎，以及寒冷病。这些病症是医学领域熟知的并且在例如Harrison's Principles of Internal Medicine,第14版.,Fauci A S等人,编辑.,New York:McGraw-Hill,1998中描述。

全身性疾病SLE的特征为存在有针对几乎在每个细胞中富集的抗原的抗体，例如，抗染色质抗体，抗-splicesosome抗体，抗核糖体抗体和抗-DNA抗体。因此，在多种组织(例如皮肤和肾脏)中看到SLE的作用。自体反应性T细胞也在SLE中发挥作用。例如，在小鼠狼疮模型中的研究已显示出非DNA核小体抗原(例如，组蛋白)刺激自体反应性T细胞，该自体反应性T细胞可驱动生成B细胞的抗DNA。已在SLE患者体内观察到了提高的IFN-α血清水平并且该提高的IFN-α血清水平表现出与疾病活性和严重性(包括发热和皮疹)相关，以及与疾病过程相关的必要标记物(例如，抗-dsDNA抗体滴度)相关。在循环中存在的免疫复合物也已经表现出可触发这些患者体内的IFN-α并且由此维持提高的IFN-α的长期存在。两种不同类型的免疫复合物已被描述为由人PDC:DNA/抗-DNA抗体复合物触发IFN-α以及由RNA/抗-核糖核蛋白-RNA抗体复合物触发IFN-α。因为DNA是TLR-9的配体并且RNA是TLR-7/8的配体，所以，预期这两种通路分别利用TLR-9和TLR-7/8信号转导长期诱导IFN-α并且由此参与SLE的发病机制。因此，有效抑制TLR-7/8和TLR-9反应的IRP和/或IRC组合物可在治疗SLE方面特别有效。

在一些实施方式中，自体免疫疾病选自：红斑狼疮，多发性硬化，类风湿性关节炎，牛皮癣，硬皮病和干燥综合症。

有效剂量

适用于本发明的药物组合物包括包含治疗有效量的活性成分的组合物，所述治疗有效量即为有效实现期望目的的量。对特定应用有效的实际量将(尤其)取决于治疗中的病症。有效量的确定恰好在本领域技术人员的能力范围内(尤其是根据本文具体公开的内容)。

对于本文所述的任何化合物而言，治疗有效量可最先通过细胞培养检测法确定。目标血药浓度为能够抑制细胞生长或***的活性化合物的浓度。在优选的实施方式中，细胞活性的至少25％被抑制。能够诱导至少约30％、50％、75％或甚至90％或者更高的细胞活性抑制的活性化合物的目标血药浓度为目前优选的。可监测患者体内的细胞活性抑制的百分数，从而评估所达到的血药浓度的适当性，并且可上调或下调剂量以实现期望的抑制百分数。

如本领域已知的，用于人体的治疗有效量还可通过动物模型来确定。例如，用于人体的剂量可被配制成实现已在动物体内发现的有效循环浓度。如上所述，人体内的剂量可通过监测细胞抑制和上调或下调剂量来调节。

治疗有效剂量还可通过已知的表现出类似药理学活性的化合物的人体数据来确定。所使用的剂量可基于与已知化合物比较的所给药的化合物的相对生物利用度和效力来调节。

基于上述方法和本领域熟知的其他方法为实现人体内的最大效力对剂量进行调节恰好在本领域普通技术人员的能力范围内。

在局部给药的情况下，所给药的化合物的全身循环浓度不是特别重要。在这种情况下，给药化合物以达到在局部区域有效实现期望的结果的浓度。

对于预防和/或治疗与异常细胞增殖有关的疾病而言，优选的是给药的化合物的循环浓度为约0.001μM至20μM，优选的是给药的化合物的循环浓度为约0.01μM至5μM。

口服给药本文所述的化合物的患者剂量通常为约1mg/天至约10,000mg/天，更通常地为约10mg/天至约1,000mg/天，并且最通常地为约50mg/天至500mg/天。依据患者的体重，通常剂量为约0.01mg/kg/天至约150mg/kg/天，更通常地为约0.1mg/kg/天至约15mg/kg/天，并且最通常地为约1mg/kg/天至约10mg/kg/天，例如，5mg/kg/天或3mg/kg/天。

在至少一些实施方式中，阻止或抑制肿瘤生长的患者剂量可以是1μmol/kg/天或更少。例如，患者剂量可为0.9μmol/kg/天,0.6μmol/kg/天,0.5μmol/kg/天,0.45μmol/kg/天,0.3μmol/kg/天,0.2μmol/kg/天,0.15μmol/kg/天,或0.1μmol/kg/天或者更少(参考药物的摩尔数)。优选地，当以每天剂量给药持续至少五天的时间时具有药物偶联物的抗体阻止肿瘤的生长。

对于其他给药模式而言，剂量和间隔可单独地进行调节以提供对于正在治疗的特定临床适应症有效的给药的化合物的血药浓度。例如，在一种实施方式中，根据本发明的化合物可以相对高的浓度每天多次给药。可选地，更加理想的是，以最小有效浓度给药本发明的化合物并且使用较低频率的给药方案。这将提供与个体的疾病的严重性相称的治疗方案。

使用本文的教导可安排有效的治疗方案，而不导致较大的毒性，并且还完全有效地治疗特定患者表现出的临床症状。这种安排应当包括通过考虑多种因素仔细选择活性化合物，所述多种因素例如，化合物效力、相对生物利用度、患者体重、存在的不良副作用及其严重性、优选的给药模式和所选择的药剂的毒性特征。

虽然本文描述并显示了本发明的优选的实施方式，但是对于本领域技术人员而言显而易见的是，这些实施方式仅仅是举例说明。本领域技术人员可对这些实施方式作出多种改变、修改和替换，而不背离本发明。应当理解的是，本文所述的本发明的可选实施方式可用于实践本发明。通过所附的权利要求来限定本发明的范围，并且这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物也被所附的权利要求涵盖。

实施例

本发明进一步通过下述实施例举例说明，但本发明不限于此，下述实施例举例说明本发明的化合物的制备方法。

实施例1

材料和方法

CpG寡核苷酸(CpG-ODN)：CpG-ODN由苏州瑞博生物科技有限公司合成。CpG 1-12是修饰的序列。A型CpG2216(5’-ggGGGACGATCGTCgggggG-3’SEQ ID NO.:13)、B型CpG2006(5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3，SEQ ID NO.:14)和CpG 684(5’-TCgACgTTCgTCgTTCgTCgTTC-3’,SEQ ID NO.:15),CpG 1018(5′-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3’,SEQ ID NO.:16)以及C型CpG2395(5’tcgtcgttttcggcgcgcgccg-3’,SEQ ID NO.:17)分别用作阳性对照。GC-ODN(5’-tggccaagcttgggccccttgcaagggcc-3’SEQ ID No.:18)用作阴性对照。所有的CpG-ODN溶解于无菌/无内毒素水(InvivoGen，美国)，-40℃保存备用。

人外周血浓缩白细胞和实验动物：

人外周血浓缩白细胞购自长春市中心血站。

小鼠和细胞系。雌性BALB/c小鼠(6-8周龄)购自长春生物制品公司(中国)，并且所有动物实验根据吉林大学实验动物管理委员会批准的规程实施。BALB/c小鼠的脾脏细胞在补充有10％胎牛血清(Clark，中国)和100IU/mL青霉素以及100μg/mL链霉素(Hyclone，美国)的RPMI-1640培养基(Corning，美国)中，在37℃条件下，5％CO₂孵育器中培养。

hPBMC的分离。使用Ficoll密度梯度离心法从人外周血中分离人外周血单核细胞(hPBMC)。简言之，使用磷酸盐缓冲盐水(PBS)两倍稀释血液。将稀释的血液以1:1的比例覆盖在Ficoll(Axis-Shield,Norway)上，随后以2,800rpm的速度在室温下进行梯度离心持续20分钟，其中8分钟加速并在0分钟减速。由吸管小心收集hPBMC界面并通过在1,500rpm条件下离心5分钟用PBS洗涤hPBMC界面。在补充有10％人血清(Equitech-Bio,美国)和100IU/mL青霉素以及100μg/mL链霉素(Hyclone，美国)的RPMI-1640培养基(Corning，美国)中在37℃条件下，5％CO₂孵育器中培养获得的hPBMC。

增殖检测。通过羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CFSE)测试确定细胞增殖。将细胞以约10⁷细胞/ml的浓度悬浮于1mPBS中。用9μM CFSE(Invitrogen，美国)处理hPBMC并用6.3μM CFSE处理小鼠脾脏细胞。如果一次测试更多的细胞，那么按照比例增加。在黑暗中静置细胞7分钟，随后加入补充有10％胎牛血清的冷的RPMI-1640培养基至最终体积15ml。随后在1,500rpm转速条件下离心5分钟，丢弃上清液。在补充有10％FBS和100IU/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI-1640培养基中重悬细胞并将细胞以5×10⁵细胞/孔的密度接种于96孔板中。1小时后，用1μM CpG ODN刺激细胞。置于37℃，5％CO₂的孵箱中培养6天(hPBMC)或5天(小鼠脾脏细胞)之后，收集细胞并进行染色，通过流式细胞仪进行分析。

流式细胞分析。用CpG ODN(1μM)孵育hPBMC和小鼠脾脏细胞持续24小时，48小时和6天或5天，或者不用CpG ODN孵育hPBMC和小鼠脾脏细胞，并且将细胞悬浮于PBS。对于活化实验而言，刺激24小时和48小时的细胞用下列mAb染色：抗-CD3，抗-CD4，抗-CD19，抗-CD69。对于增殖测试而言，刺激6天或5天的细胞用下列mAb染色：抗-CD3，抗-CD4，和抗-CD19。用各个Ab在4℃下孵育30分钟之后，用PBS洗涤细胞两次并随后通过LSRFortessa^TM流式细胞仪(BD，美国)进行分析。

ELISA和CBA检测。将hPBMC(5×10⁵细胞/孔)和小鼠脾脏细胞(1×10⁶细胞/孔)接种于96孔板并且向培养的细胞中加入溶解于无菌/无内毒素的水(InvivoGen，美国)中的CpGODN。24小时和48小时后收集培养物的上清液。由ELISA试剂盒(elabscience，中国)或流式微球阵列(CBA)(BD，美国)测量培养物上清液按照ELISA试剂盒说明书检测上清液中人IFN-a(Mabtech,瑞典)、小鼠IFN-a(eBioscience,澳大利亚)、小鼠IL-6(Mabtech,瑞典)和小鼠TNF-a(Mabtech,瑞典)的含量。简言之，将50μl样品或重组的标准加至50μl混合的捕获小球中并孵育1小时。随后再加入50μl PE检测试剂再孵育2小时。洗涤两次除去未结合的PE检测试剂之后，通过流式细胞仪FACS阵列(BD)检测样品并且使用FCAP阵列软件(BD)分析样品。

表2 CpG对细胞因子的调节与活化作用

表3显示了CpG 2有效诱导B细胞活化和增殖。人PBMC(5×10⁵细胞/孔)和小鼠脾脏细胞(1×10⁶细胞/孔)接种于含有1μM不同的CpG(CpG1-12)，培养基对照(RPMI-1640培养基)和作为阳性对照的CpG 684的96孔板中。24小时和48小时之后，收集细胞并用抗-CD3，抗-CD4，抗-CD19以及抗-CD69进行染色，随后通过流式细胞仪进行分析(平均值±SEM,n＝3)。

表3 CpG分别诱导人与小鼠B细胞活化和增殖

表4显示了CpG有效诱导CD8+T和CD4+T细胞活化。人PBMC(5×10⁵细胞/孔)和小鼠脾脏细胞(1×10⁶细胞/孔)接种于含有1μM不同的CpG(CpG1-12)，培养基对照(RPMI-1640培养基)和作为阳性对照的CpG684的96孔板中。24小时和48小时之后，收集细胞并用抗-CD3，抗-CD4，抗-CD19以及抗-CD69进行染色，随后通过流式细胞仪进行分析(平均值±SEM,n＝3)。

表4 CpG分别有效诱导人与小鼠T细胞CD8+T和CD4+T细胞活化

<110> 长春华普生物技术有限公司

<120> 免疫调节性多核苷酸及其应用

<130> H15-5P-HT

<160> 18

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CpG 1

<400> 1

tcgggaacgt tccccgcgtt cgaacgcgg 29

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CpG 2

<400> 2

tcgcgaacgt tcgcggcgtt cgaacgccg 29

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CpG 3

<400> 3

tcgcgaacgt tcgccgggtt cgaacccgg 29

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CpG 4

<400> 4

tcgcgaacgt tcgccgcctt cgaaggcgg 29

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CpG 5

<400> 5

tcgcgaacgt tcgccgcgat cgatcgcgg 29

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CpG 6

<400> 6

tcgcgaacgt tcgccgcgta cgtacgcgg 29

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CpG 7

<400> 7

tcgcgaacgt tcgcgcgcgt tcgaacgcgg 30

<210> 8

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CpG 8

<400> 8

tcgccgaacg ttcggccgcg gttcgaaccg cgg 33

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CpG 9

<400> 9

tcgcgaacgt tcgctcgcgt tcgaacgcgg 30

<210> 10

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CpG 10

<400> 10

tcgcgaacgt tcgccgacgt tcgaacgtcg g 31

<210> 11

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CpG 11

<400> 11

tcgcgaacgt tcgccggttc gaaccgg 27

<210> 12

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CpG 12

<400> 12

tcgcgaacgt tcgccgcttc gaagcgg 27

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> A型CpG2216

<400> 13

ggGGGACGAT CGTCgggggG 20

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> B型CpG2006

<400> 14

TCGTCGTTTT GTCGTTTTGT CGTT 24

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> B型CpG684

<400> 15

TCgACgTTCg TCgTTCgTCg TTC 23

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> B型CpG1018

<400> 16

TGACTGTGAA CGTTCGAGAT GA 22

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> C型CpG2395

<400> 17

tcgtcgtttt cggcgcgcgc cg 22

<210> 18

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GC-ODN

<400> 18

tggccaagct tgggcccctt gcaagggcc 29

Claims (31)

1.免疫调节性多核苷酸，其包含选自以下的序列：SEQ ID NO.:1,SEQ ID NO.:2,SEQID NO.:3,SEQ ID NO.:4,SEQ ID NO.:5,SEQ ID NO.:6,SEQ ID NO.:7,SEQ ID NO.:8,SEQID NO.:9,SEQ ID NO.:10,SEQ ID NO.:11和SEQ ID NO.:12。

2.如权利要求1所述的免疫调节性多核苷酸，其中，所述多核苷酸包含化学修饰。

3.如权利要求1所述的免疫调节性多核苷酸，其中，所述多核苷酸包含一个或多于一个磷酸酯基团的修饰。

4.如权利要求3所述的免疫调节性多核苷酸，其中，所述一个或多于一个磷酸酯基团的修饰是硫代磷酸酯键合。

5.如权利要求3所述的免疫调节性多核苷酸，其中，所述多核苷酸的磷酸骨架是完全硫代磷酸酯修饰的。

6.如权利要求2所述的免疫调节性多核苷酸，其中，一个或多于一个磷酸酯基团的修饰是键合。

7.调节受治者体内的免疫反应的方法，其包括：以足以调节个体体内的免疫反应的量将权利要求1至6中任一项所述的免疫调节性多核苷酸给药于所述受治者。

8.增加受治者体内的干扰素-α的方法，其包括：以足以增加所述受治者体内的IFN-α的量将权利要求1至6中任一项所述的免疫调节性多核苷酸给药于所述受治者。

9.增加受治者体内的干扰素-γ的方法，其包括以足以增加所述受治者体内IFN-γ的量将权利要求1至6中任一项所述的免疫调节性多核苷酸给药于所述受治者。

10.改善受治者体内的感染性疾病的症状的方法，其包括将有效量的权利要求1至6中任一项所述的免疫调节性多核苷酸给药于受治者，其中，所述有效量是足以改善所述感染性疾病的症状的量。

11.治疗受治者体内的癌症或肿瘤的方法，其包括将有效量的权利要求1至6中任一项所述的免疫调节性多核苷酸给药于所述受治者，其中，所述有效量是足以治疗所述癌症或所述肿瘤的量。

12.治疗组合，其包括：

(i)有效量的针对癌症的靶向治疗剂和

(ii)有效量的权利要求1至6中任一项所述的免疫调节性多核苷酸或其组合。

13.如权利要求12所述的组合，其中，所述靶向治疗剂能够特异性结合肿瘤细胞或者相较于非肿瘤细胞能够优先结合肿瘤细胞。

14.如权利要求13所述的组合，其中，所述肿瘤细胞是癌细胞、肉瘤细胞、淋巴瘤细胞、骨髓瘤细胞或中枢神经***癌症细胞。

15.如权利要求12至14中任一项所述的组合，其中，所述靶向治疗剂能够特异性结合肿瘤抗原或者相较于非肿瘤抗原能够优先结合肿瘤抗原。

16.如权利要求15所述的组合，其中，所述肿瘤抗原选自：CD2,CD19,CD20,CD22,CD27,CD33,CD37,CD38,CD40,CD44,CD47,CD52,CD56,CD70,CD79和CD137。

17.如权利要求15所述的组合，其中，所述肿瘤抗原选自：4-1BB,5T4，AGS-5,AGS-16,血管生成素2,B7.1,B7.2,B7DC,B7H1,B7H2,B7H3,BT-062,BTLA,CAIX,癌胚抗原,CTLA4,Cripto,ED-B,ErbB1,ErbB2,ErbB3,ErbB4,EGFL7,EpCAM,EphA2,EphA3,EphB2,FAP,纤连蛋白,叶酸盐受体,神经节苷酯GM3,GD2,糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(GITR),gp100,gpA33,GPNMB,ICOS,IGF1R,整联蛋白αν,整联蛋白ανβ,KIR,LAG-3,Lewis Y,间皮素,c-MET,MN碳酸酐酶IX,MUC1,MUC16,粘连蛋白-4,NKGD2,NOTCH,OX40,OX40L,PD-1,PDL1,PSCA,PSMA,RANKL,ROR1,ROR2,SLC44A4,STING,多配体蛋白聚糖-1,TACI,TAG-72,腱生蛋白,TIM3,TRAILR1,TRAILR2,VEGFR-1,VEGFR-2,VEGFR-3和它们的变体。

18.如权利要求12至17中任一项所述的组合，其中，所述靶向治疗剂包括免疫球蛋白、蛋白质、肽、小分子、纳米颗粒或核酸。

19.如权利要求12至17中任一项所述的组合，其中，所述靶向治疗剂包括抗体或其功能片段。

20.如权利要求19所述的组合，其中，所述抗体选自：美罗华(利妥昔单抗)、赫赛汀(曲妥珠单抗)、爱必妥(西妥昔单抗)、维克替比(帕尼单抗)、Arzerra(奥法木单抗)、Benlysta(贝利木单抗)、Yervoy(伊匹单抗)、Perjeta(帕妥珠单抗)、Tremelimumab、Opdivo(纳武单抗),Dacetuzumab,乌瑞芦单抗,MPDL3280A,Lambrolizumab,Blinatumomab,CT-011,Keytruda(pembrolizumab,MK-3475),BMS-936559,MED14736,MSB0010718C,和margetuximab(MGAH22)。

21.如权利要求18所述的组合，其中，所述靶向治疗剂包括Fab、Fab’、F(ab’)2、单结构域抗体、T和Ab二聚物、Fv、scFv、dsFv、ds-scFv、Fd、线性抗体、微小抗体、双价抗体、双特异性抗体片段、bibody、tribody、sc-双价抗体、κ(λ)body、BiTE、DVD-Ig、SIP、SMIP、DART或者含有一个或一个以上CDR的抗体类似物。

22.如权利要求12所述的组合，其中，所述靶向治疗剂包括VEFGR的ATWLPPR多肽，血小板反应蛋白-1模拟物、CDCRGDCFCG(环状)多肽、SCH221153片段、NCNGRC(环状)多肽、CTTHWGFTLC多肽、CGNKRTRGC多肽(LyP-1)、奥曲肽、伐普肽、兰乐肽、C-3940多肽、达必佳、利普安、诺雷德或西曲瑞克。

23.如权利要求12所述的组合，其中，所述靶向治疗剂包括细胞外结构域(ECD)或PD-1、PDL-1、CTLA4、BTLA、KIR、TIM3、4-1BB、LAG3的可溶形式、全长的部分表面配体双调蛋白、β动物纤维素、EGF、肝配蛋白、上皮细胞有丝***蛋白抗体、上皮调节蛋白、IGF、神经调节蛋白、TGF、TRAIL或VEGF。

24.如权利要求12至23中任一项所述的组合，其还包括化疗剂。

25.如权利要求24所述的组合，其中，所述化疗剂选自：它莫西芬(tamoxifen)，雷洛昔芬(raloxifene),阿那曲唑(anastrozole),依西美坦(exemestane),来曲唑(letrozole),imatanib,紫杉醇,环磷酰胺,洛伐他汀(lovastatin),minosine,吉西他滨(gemcitabine),阿糖胞苷(cytarabine),5-氟尿嘧啶,甲氨蝶呤,多西他赛(docetaxel),戈舍瑞林(goserelin),长春新碱,长春碱,噻氨酯哒唑(nocodazole),替尼泊苷(teniposide),依托泊苷(etoposide),吉西他滨,埃博霉素,长春瑞滨(vinorelbine),喜树碱,道诺霉素(daunorubicin),放线菌素D,米托蒽醌,吖啶,阿霉素,表柔比星,或去甲氧基柔红霉素。

26.治疗有此治疗需求的受治者体内的疾病病症的方法，所述方法包括将权利要求12至25中任一项所述的治疗组合给药于所述受治者。

27.如权利要求26所述的方法，其中，所述疾病病症是肿瘤。

28.如权利要求26所述的方法，其中，所述疾病病症包括异常细胞增殖。

29.如权利要求26所述的方法，其中，所述异常细胞增殖包括癌前病变。

30.如权利要求29所述的方法，其中，所述异常增殖的细胞是癌细胞。

31.如权利要求30所述的方法，其中，所述癌症选自：乳腺癌、结肠直肠癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤、子宫内膜癌、滤泡性淋巴瘤、胃癌、胶质母细胞瘤、头颈癌、肝细胞癌、肺癌、黑色素瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、胰腺癌、***癌和肾细胞癌。