CN110023339A - 凝血因子结合蛋白及其应用 - Google Patents

凝血因子结合蛋白及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110023339A
CN110023339A CN201780072317.8A CN201780072317A CN110023339A CN 110023339 A CN110023339 A CN 110023339A CN 201780072317 A CN201780072317 A CN 201780072317A CN 110023339 A CN110023339 A CN 110023339A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
sequence
protein
ser
antibody
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201780072317.8A
Other languages
English (en)
Inventor
P·施密特
陈朝广
C·帕诺西斯
L·法布里
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
CSL Ltd
Original Assignee
CSL Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from AU2016903858A external-priority patent/AU2016903858A0/en
Application filed by CSL Ltd filed Critical CSL Ltd
Publication of CN110023339A publication Critical patent/CN110023339A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/36—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against blood coagulation factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4721—Lipocortins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/035—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal for targeting to the external surface of a cell, e.g. to the outer membrane of Gram negative bacteria, GPI- anchored eukaryote proteins

Abstract

结合至少一种凝血因子的膜靶向结合蛋白，其中结合蛋白具有促凝血活性。

Description

凝血因子结合蛋白及其应用
相关申请数据
本申请要求2016年9月23日提交的标题为“凝血因子结合蛋白及其应用(Coagulation factor binding proteins and uses thereof)”的澳大利亚专利申请号2016903858和2017年6月20日提交的标题为“凝血因子结合蛋白及其应用(Coagulationfactor binding proteins and uses thereof)”的澳大利亚专利申请号2017902352的优先权。
序列表
本申请与电子格式的序列表一同提交。该序列表的全部内容通过引用纳入本文。
技术领域
本公开涉及凝血因子结合蛋白及其应用。
背景技术
正常的血液凝固是哺乳动物生物学中高度保守的过程，涉及复杂的生理和生化过程，包括激活凝血因子(coagulation factor)(或凝结因子(clotting factor))级联，最终导致纤维蛋白形成和血小板聚集。血液凝固级联包括“外在(extrinsic)”途径(凝血启动的主要方式)和有助于纤维蛋白凝块稳定的“内在(intrinsic)”途径。
凝血级联中涉及的大多数凝血因子是称为酶原的蛋白水解酶的前体。这些酶以非活化的形式在血液中循环，并且它们一旦被激活(例如通过蛋白水解切割)仅参与凝血级联反应。
出血性疾病中血液凝固不充分，这可能是由于先天性凝血障碍，获得性凝血障碍或由创伤引起的出血性状况引起。先天性凝血障碍包括血友病，涉及凝血因子VIII(血友病A)或因子IX(血友病B)缺乏的隐性X连锁疾病和冯维勒布兰德氏病(von Willebranddisease)，所述维勒布兰德氏病是一种涉及冯维勒布兰德因子(von Willebrand factor)严重缺乏的出血性疾病。
由于疾病累进，没有出血既往史的个体可能出现获得性凝血障碍。例如，获得性凝血障碍可能是这样而被引起的：由针对凝血因子(如因子VIII，冯维勒布兰德因子，因子IX，V，XI，XII和XIII)的自身免疫或抑制剂；或由止血障碍，例如由肝病引起的止血障碍，这可能与凝血因子的合成减少相关。
出血性疾病和凝血因子缺乏通常通过因子替换法治疗，而这是昂贵的且并不总是有效。例如，接受长期因子替换疗法的患者可能产生对于替换因子的中和抗体(即，抑制剂)，从而使治疗无效。另一个缺点是输注的凝血因子的半衰期短，导致需要多次和频繁的输注。正在开发各种技术来延长凝血因子的半衰期并降低免疫原性，包括通过白蛋白融合，Fc融合，PEG化和唾液酸化(sialyation)进行修饰。使用重组凝血因子或其修饰形式的替代方式是产生针对凝血级联中一种或多种凝血因子的基于抗体的疗法，例如，抗-因子IX或抗-因子IX/X抗体。增加止血效力的另一方法是靶向凝血的抑制剂，如组织因子途径抑制剂(TFPI)。尽管进行了这些努力，但凝血因子半衰期的延长仍然很短，并且需要持续的重复治疗来预防该疾病。
因此，本领域需要改善出血性疾病的治疗。
发明内容
本公开内容基于发明人这样的认识：将凝血因子结合蛋白靶向细胞膜改善了其活性。与至少一种凝血因子结合的膜靶向结合蛋白可具有促凝血活性。
本发明人的发现提供了与至少一种凝血因子结合的膜靶向结合蛋白的基础。本发明人的发现还也为用于治疗对象中出血性疾病的方法提供了基础。
本发明的促凝血膜靶向结合蛋白(例如，膜靶向抗-FIX抗体)特异性地靶向对象中的损伤部位(例如，血友病患者的出血部位)，并且因此，相较于非膜靶向促凝血蛋白，如抗-FIX/FX双特异性抗体，不太可能在远离损伤部位或距离损伤部位远处的位置引起不希望的凝血或血栓形成。
因此，相比非膜靶向促凝血蛋白，本发明的促凝血膜靶向结合蛋白可以成为对患者而言更安全的治疗选择，例如，正接受具有促凝血活性的蛋白质和其他出血控制法(例如，活化的凝血酶复合物)的具有FVIII抑制剂的血友病患者。相较于非膜靶向促凝血蛋白，将促凝血蛋白靶向损伤部位还可以允许较低的剂量，这将还有助于更好的安全性。
例如，本公开提供了结合至少一种凝血因子的膜靶向结合蛋白，其中结合蛋白调节凝血。
例如，本公开提供了结合至少一种凝血因子的膜靶向结合蛋白，其中结合蛋白具有促凝血活性。
在一实例中，本公开提供了结合至少一种凝血因子的膜靶向结合蛋白，其中结合蛋白具有抗-凝血活性。
在一实例中，本公开提供了结合或特异性结合至少一种凝血因子的膜靶向结合蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段)。
在一实例中，本公开提供了结合至少一种凝血因子的膜靶向结合蛋白，其中该蛋白质包含特异性结合至少一种凝血因子的结合区。在一实例中，结合区特异性地结合一种凝血因子和/或其活化形式。
在一实例中，本公开提供了结合至少一种凝血因子的膜靶向结合蛋白，其中该蛋白质包含特异性结合哺乳动物细胞质膜组分的结合区。在一个实例中，细胞是血浆可及的，或者与血浆接触，例如，在其天然状态下。在一个实例中，细胞在血管内。在一个实例中，细胞在血液内，例如，是血细胞。
在一实例中，本公开提供了结合至少一种凝血因子的膜靶向结合蛋白，其中该蛋白质包含特异性结合至少一种凝血因子的第一结合区和特异性结合哺乳动物质膜组分的第二结合区。在一实例中，特异性结合至少一种凝血因子的第一结合区区具有促凝血活性。
在一实例中，膜靶向结合蛋白特异性地结合至少一种凝血因子。这并不意味着本公开的膜靶向结合蛋白不结合其他蛋白质，只是膜靶向结合蛋白(或其部分)对凝血因子具有特异性并且通常不结合蛋白质。该术语也并未排除例如包含其结合区的双特异性抗体或蛋白质，其能通过一个(或多个)结合区特异性地结合第一凝血因子，且能通过另一结合区特异性地结合另一凝血因子。
本公开内容考虑的结合区可以采用多种形式中的任何一种，包括天然蛋白质或生物蛋白质。示例性的结合区包括核酸(例如，适配体)，多肽，肽，小分子，抗体或抗体的抗原结合片段。
在一个实例中，第一和/或第二结合区是基于蛋白质(例如，肽)的多肽或蛋白质。在一个实例中，第一结合区不是凝血因子。
在一个实例中，第一和/或第二结合区是抗体模拟物。例如，第一和/或第二结合区是包含免疫球蛋白的抗原结合结构域的蛋白质，例如，IgNAR、骆驼抗体或T细胞受体。
在一个实例中，第一和/或第二结合区是结构域抗体(例如，仅包含重链可变区或仅包含轻链可变区)或仅重链抗体(例如，骆驼抗体或IgNAR)或其可变区。
在一个实例中，第一和/或第二结合区是包含可变区片段(Fv)的蛋白质。例如，第一和/或第二结合区选自：
(i)单链Fv片段(scFv)；
(ii)二聚scFv(二-scFv)；或
(iii)双抗体(diabody)；
(iv)三抗体(triabody)；
(v)四抗体(tetrabody)；
(vi)Fab；
(vii)F(ab’)2；
(viii)Fv；或
(ix)与抗体的恒定区、Fc或重链恒定结构域(CH)2和/或CH3相连的(i)
至(viii)之一，(任选地，这类蛋白质包含介于Fv和恒定区、Fc或重链
恒定结构域之间的接头，例如，本文所述的接头，如柔性接头)。
在另一个实例中，第一和/或第二结合区是抗体。示例性抗体是全长和/或裸(例如，未偶联的)抗体。在一个实例中，本公开的抗体是全长抗体。
在一实例中，抗体是IgG或IgE或IgM或IgD或IgA或IgY抗体。例如，抗体是IgG抗体。
在一实例中，IgG抗体是IgG1或IgG2或IgG3或IgG4。例如，抗体是IgG1抗体。在另一实例中，抗体是IgG4抗体。在一个实例中，抗体是稳定化的IgG4抗体。
在一个实例中，第一和/或第二结合区是重组、嵌合、CDR移植、人源化、同人源化(synhumanized)、灵长类化、去免疫化或人的蛋白质。
在一个实例中，第一结合区是单特异性的、双特异性的或多特异性的。例如，第一结合区是单特异性的。在一个实例中，第一结合区是多特异性的，例如，第一结合区是双特异性的。
在一个实例中，第一结合区是单特异性的。
在一个实例中，第一结合区不是双特异性的。
在一个实例中，本公开的凝血因子选自：因子I，因子II，因子III，因子V，因子VII，因子VIII，因子IX，因子X，因子XI，因子XII因子XIII和前述任一者的活化形式。
在一个实例中，第一结合区特异性地结合因子IX和/或因子IXa。在一个实例中，第一结合区特异性地结合因子X和/或因子Xa。在其他实例中，第一结合区特异性地结合因子IX/IXa和/或因子X/Xa。
在一个实例中，本公开提供了膜靶向结合蛋白，其包含特异性结合凝血因子的第一结合区。在一个实例中，第一结合区是抗-因子IX抗体或其抗原结合片段。在一个实例中，抗-因子IX抗体或其抗原结合片段结合非活化的因子IX和/或活化的因子IXa。在一个实例中，抗-因子IX抗体或其抗原结合片段结合因子IX和/或因子IXa并增强因子IX和/或因子IXa的活性。例如，抗-因子IX抗体或其抗原结合片段结合因子IXa并增强因子IXa的活性。在另一个实例中，抗-因子IX抗体结合因子IX并增强因子IX活化。用于确定因子IX和/或因子IXa活性的方法是本领域已知的和/或描述于本文中。
在一个实例中，膜靶向结合蛋白包含具有旁路活性(bypassing activity)的第一结合区。例如，结合区替代凝血级联(例如，外在凝血级联)中的内源性凝血因子。因此，该蛋白质可以在其绕过(bypass)的凝血因子不存在的情况下和/或在其绕过的凝血因子的抑制剂存在的情况下诱导凝结。在一个实例中，膜靶向结合蛋白包含第一结合区，其结合因子IX并且不需要活化的因子VIIIa以提供活性诱导凝血(即，该蛋白质绕过因子VIII/VIIIa)。
在一个实例中，相较于非膜靶向形式的结合蛋白，膜靶向结合蛋白具有增加的因子VIII旁路活性。例如，相较于非膜靶向形式的结合蛋白，本公开的膜靶向结合蛋白的因子VIII旁路活性增加至少2倍，如约2.5倍，或约3倍，或约3.5倍，或约4倍，或约5倍或约6倍或约8倍或约10倍。
在一个实例中，第一结合区结合活化的凝血因子(例如，活化的FIX)并使该因子稳定在其活性构象中。
在一个实例中，膜靶向结合蛋白在活化部分凝血活酶时间(aPTT)试验中的最大有效浓度(EC50)小于非膜靶向形式的结合蛋白。例如，本公开的膜靶向结合蛋白在aPPT试验中的EC50小于5nM，如约4.5nM或约4nM或约3.5nM或约3nM。例如，aPPT试验中的膜靶向结合蛋白的EC50是约2.5nM或约2nM或约1.5nM或约1nM或约0.5nM或约0.1nM或约0.05nM或约0.01nM。
在一个实例中，本公开的抗原结合片段是半抗体。例如，抗-因子IX抗体是包含单条重链和单条轻链的半抗体。
在一个实例中，本公开的抗原结合片段包含IgG4恒定区或稳定化的IgG4恒定区。
在一个实例中，抗-因子IX抗体或其抗原结合片段包含IgG4恒定区或稳定化的IgG4恒定区。在一个实例中，稳定化的IgG4恒定区包含根据Kabat***(Kabat等，Sequences ofProteins of Immunological Interest(免疫学感兴趣的蛋白质序列)，华盛顿特区，美国，健康与人类服务部，1987和/或1991)确定的铰链区第241位处的脯氨酸或根据EU编码***(Edelman,G.M.等,Proc.Natl.Acad.USA,63,78-85(1969))确定的铰链区第228位处的脯氨酸。
在一个实例中，IgG4 Fc包含SEQ ID NO:15-19中任一所示的序列。
示例性的IgG4 Fc氨基酸取代包括根据EU编号***的S228P，或S228P和T366W，或S228P，T366S，L368A和Y407V，或T350V，T366L，K392L和T394W，或T350V，L351Y，F405A和Y407V。
在一个实例中，IgG4 Fc包含SEQ ID NO:15所示的序列。例如，人IgG4 Fc包含S228P突变。
在一个实例中，IgG4 Fc包含SEQ ID NO:16所示的序列。例如，人IgG4 Fc包含S228P和T366W突变。
在一个实例中，IgG4 Fc包含SEQ ID NO:17所示的序列。例如，人IgG4 Fc包含S228P、T366S、L368A和Y407V突变。
在一个实例中，IgG4 Fc包含SEQ ID NO:18所示的序列。例如，人IgG4 Fc包含T350V、T366L、K392L和T394W突变。
在一个实例中，IgG4 Fc包含SEQ ID NO:19所示的序列。例如，人IgG4 Fc包含T350V、L351Y、F405A和Y407V突变。
在一个实例中，本公开的膜靶向结合蛋白的第一结合区包含含有SEQ ID NO:13所示序列的VH和含有SEQ ID NO:11所示序列的VL。
在一个实例中，本公开的膜靶向结合蛋白的第一结合区是包含含有SEQ ID NO:13所示序列的VH和含有SEQ ID NO:11所示序列的VL的抗体。
在一个实例中，膜靶向结合蛋白的第一结合区是包含含有SEQ ID NO:13所示序列的VH和含有SEQ ID NO:11所示序列的VL的半抗体。
在一个实例中，本公开的膜靶向结合蛋白的第一结合区包含含有SEQ ID NO:35所示序列的VH和含有SEQ ID NO:11所示序列的VL。
在一个实例中，本公开的膜靶向结合蛋白的第一结合区包含含有SEQ ID NO:38所示序列的VH和含有SEQ ID NO:11所示序列的VL。
在一个实例中，本公开的膜靶向结合蛋白的第一结合区包含含有SEQ ID NO:41所示序列的VH和含有SEQ ID NO:11所示序列的VL。
在一个实例中，本公开的膜靶向结合蛋白的第一结合区包含含有SEQ ID NO:50所示序列的VH和含有SEQ ID NO:11所示序列的VL。
在一个实例中，VH的氨基酸序列包含位置103处的酪氨酸(T)、异亮氨酸(I)或赖氨酸(K)或谷氨酸(E)和/或位置104处的赖氨酸(K)或酪氨酸(Y)和/或位置105处的脯氨酸(P)、苏氨酸(T)或甘氨酸(G)和/或位置106处的色氨酸(W)或甘氨酸(G)和/或位置107处的甘氨酸(G)或组氨酸(H)和/或位置108处的酪氨酸(Y)或苯丙氨酸(F)或色氨酸(W)。
在一个实例中，VH的氨基酸序列包含位置103处的谷氨酸(E)，位置104处的酪氨酸(Y)，位置105位处的甘氨酸(G)，位置106位处的甘氨酸(G)，位置107处的甘氨酸(G)和位置108处的色氨酸(W)。
在一个实例中，VH的氨基酸序列包含位置103处的酪氨酸(T)，位置104处的赖氨酸(K)，位置105位处的脯氨酸(P)，位置106位处的色氨酸(W)，位置107处的甘氨酸(G)和位置108处的酪氨酸(Y)。
在一个实例中，VH的氨基酸序列包含位置103处的异亮氨酸(I)，位置104处的赖氨酸(K)，位置105位处的苏氨酸(T)，位置106位处的色氨酸(W)，位置107处的甘氨酸(G)和位置108处的酪氨酸(Y)。
在一个实例中，VH的氨基酸序列包含位置103处的赖氨酸(K)，位置104处的赖氨酸(K)，位置105处的甘氨酸(G)，位置106处的色氨酸(W)，位置107处的组氨酸(H)和位置108处的苯丙氨酸(F)。
在一个实例中，本公开的膜靶向结合蛋白的第一结合区是包含含有SEQ ID NO:35所示序列的VH和含有SEQ ID NO:11所示序列的VL的抗体。
在一个实例中，本公开的膜靶向结合蛋白的第一结合区是包含含有SEQ ID NO:38所示序列的VH和含有SEQ ID NO:11所示序列的VL的抗体。
在一个实例中，本公开的膜靶向结合蛋白的第一结合区是包含含有SEQ ID NO:41所示序列的VH和含有SEQ ID NO:11所示序列的VL的抗体。
在一个实例中，本公开的膜靶向结合蛋白的第一结合区是包含含有SEQ ID NO:50所示序列的VH和含有SEQ ID NO:11所示序列的VL的抗体。
在一个实例中，VH的氨基酸序列包含位置103处的酪氨酸(T)、异亮氨酸(I)或赖氨酸(K)或谷氨酸(E)和/或位置104处的赖氨酸(K)或酪氨酸(Y)和/或位置105处的脯氨酸(P)、苏氨酸(T)或甘氨酸(G)和/或位置106处的色氨酸(W)或甘氨酸(G)和/或位置107处的甘氨酸(G)或组氨酸(H)和/或位置108处的酪氨酸(Y)或苯丙氨酸(F)或色氨酸(W)。
在一个实例中，VH的氨基酸序列包含位置103处的谷氨酸(E)，位置104处的酪氨酸(Y)，位置105位处的甘氨酸(G)，位置106位处的甘氨酸(G)，位置107处的甘氨酸(G)和位置108处的色氨酸(W)。
在一个实例中，VH的氨基酸序列包含位置103处的酪氨酸(T)，位置104处的赖氨酸(K)，位置105位处的脯氨酸(P)，位置106位处的色氨酸(W)，位置107处的甘氨酸(G)和位置108处的酪氨酸(Y)。
在一个实例中，VH的氨基酸序列包含位置103处的异亮氨酸(I)，位置104处的赖氨酸(K)，位置105位处的苏氨酸(T)，位置106位处的色氨酸(W)，位置107处的甘氨酸(G)和位置108处的酪氨酸(Y)。
在一个实例中，VH的氨基酸序列包含位置103处的赖氨酸(K)，位置104处的赖氨酸(K)，位置105处的甘氨酸(G)，位置106处的色氨酸(W)，位置107处的组氨酸(H)和位置108处的苯丙氨酸(F)。
在一个实例中，本公开的膜靶向结合蛋白的第一结合区是包含含有SEQ ID NO:35所示序列的VH和含有SEQ ID NO:11所示序列的VL的半抗体。
在一个实例中，本公开的膜靶向结合蛋白的第一结合区是包含含有SEQ ID NO:38所示序列的VH和含有SEQ ID NO:11所示序列的VL的半抗体。
在一个实例中，本公开的膜靶向结合蛋白的第一结合区是包含含有SEQ ID NO:41所示序列的VH和含有SEQ ID NO:11所示序列的VL的半抗体。
在一个实例中，本公开的膜靶向结合蛋白的第一结合区是包含含有SEQ ID NO:50所示序列的VH和含有SEQ ID NO:11所示序列的VL的半抗体。
在一个实例中，VH的氨基酸序列包含位置103处的酪氨酸(T)、异亮氨酸(I)或赖氨酸(K)或谷氨酸(E)和/或位置104处的赖氨酸(K)或酪氨酸(Y)和/或位置105处的脯氨酸(P)、苏氨酸(T)或甘氨酸(G)和/或位置106处的色氨酸(W)或甘氨酸(G)和/或位置107处的甘氨酸(G)或组氨酸(H)和/或位置108处的酪氨酸(Y)或苯丙氨酸(F)或色氨酸(W)。
在一个实例中，VH的氨基酸序列包含位置103处的谷氨酸(E)，位置104处的酪氨酸(Y)，位置105位处的甘氨酸(G)，位置106位处的甘氨酸(G)，位置107处的甘氨酸(G)和位置108处的色氨酸(W)。
在一个实例中，VH的氨基酸序列包含位置103处的酪氨酸(T)，位置104处的赖氨酸(K)，位置105位处的脯氨酸(P)，位置106位处的色氨酸(W)，位置107处的甘氨酸(G)和位置108处的酪氨酸(Y)。
在一个实例中，VH的氨基酸序列包含位置103处的异亮氨酸(I)，位置104处的赖氨酸(K)，位置105位处的苏氨酸(T)，位置106位处的色氨酸(W)，位置107处的甘氨酸(G)和位置108处的酪氨酸(Y)。
在一个实例中，VH的氨基酸序列包含位置103处的赖氨酸(K)，位置104处的赖氨酸(K)，位置105处的甘氨酸(G)，位置106处的色氨酸(W)，位置107处的组氨酸(H)和位置108处的苯丙氨酸(F)。
在一个实例中，本公开的膜靶向结合蛋白的第一结合区是由编码任何前述蛋白质或抗体的核酸编码的任何形式的蛋白质或抗体。
在一个实例中，本公开的膜靶向结合蛋白的第一结合区包含含有SEQ ID NO:2-7、34、37或40中任一所示序列的VH和含有SEQ ID NO:1所示序列的VL。
在一个实例中，本公开的膜靶向结合蛋白包含：
(i)SEQ ID NO:1所示的VL序列，SEQ ID NO:2所示的VH序列和SEQ ID NO:3所示的VH序列；或
(ii)SEQ ID NO:1所示的VL序列和SEQ ID NO:4所示的VH序列；或
(iii)SEQ ID NO:1所示的VL序列和SEQ ID NO:5所示的VH序列；或
(iv)SEQ ID NO:1所示的VL序列和SEQ ID NO:6所示的VH序列；或
(v)SEQ ID NO:1所示的VL序列和SEQ ID NO:7所示的VH序列；或
(vi)SEQ ID NO:1所示的VL序列和SEQ ID NO:8所示的VH序列；或
(vii)SEQ ID NO:1所示的VL序列和SEQ ID NO:9所示的VH序列；或
(viii)SEQ ID NO:1所示的VL序列和SEQ ID NO:10所示的VH序列；或
(ix)SEQ ID NO:1所示的VL序列，SEQ ID NO:32所示的VH序列；或
(x)SEQ ID NO:1所示的VL序列，SEQ ID NO:33所示的VH序列；或
(xi)SEQ ID NO:1所示的VL序列，SEQ ID NO:9所示的VH序列和SEQ ID NO:10所示的VH序列；或
(xii)SEQ ID NO:1所示的VL序列，SEQ ID NO:6所示的VH序列和SEQ ID NO:10所示的VH序列；或
(xiii)SEQ ID NO:1所示的VL序列，SEQ ID NO:9所示的VH序列和SEQ ID NO:7所示的VH序列。
在一个实例中，本公开的膜靶向结合蛋白包含：
(i)SEQ ID NO:1所示的VL序列，SEQ ID NO:2所示的VH序列和SEQ ID NO:3所示的VH序列；或
(ii)SEQ ID NO:1所示的VL序列和SEQ ID NO:4所示的VH序列；或
(iii)SEQ ID NO:1所示的VL序列和SEQ ID NO:5所示的VH序列；或
(iv)SEQ ID NO:1所示的VL序列和SEQ ID NO:6所示的VH序列；或
(v)SEQ ID NO:1所示的VL序列和SEQ ID NO:7所示的VH序列；或
(vi)SEQ ID NO:1所示的VL序列和SEQ ID NO:8所示的VH序列；或
(vii)SEQ ID NO:1所示的VL序列和SEQ ID NO:9所示的VH序列；或
(viii)SEQ ID NO:1所示的VL序列和SEQ ID NO:10所示的VH序列；或
(ix)SEQ ID NO:1所示的VL序列，SEQ ID NO:31所示的VH序列；或
(x)SEQ ID NO:1所示的VL序列，SEQ ID NO:32所示的VH序列；或
(xi)SEQ ID NO:1所示的VL序列，SEQ ID NO:33所示的VH序列；或
(xii)SEQ ID NO:1所示的VL序列，SEQ ID NO:34所示的VH序列；或
(xiii)SEQ ID NO:1所示的VL序列，SEQ ID NO:36所示的VH序列；或
(xiv)SEQ ID NO:1所示的VL序列，SEQ ID NO:37所示的VH序列；或
(xv)SEQ ID NO:1所示的VL序列，SEQ ID NO:39所示的VH序列；或
(xvi)SEQ ID NO:1所示的VL序列，SEQ ID NO:40所示的VH序列；或
(xvii)SEQ ID NO:1所示的VL序列，SEQ ID NO:42所示的VH序列；或
(xviii)SEQ ID NO:1所示的VL序列，SEQ ID NO:9所示的VH序列和SEQ ID NO:10所示的VH序列；或
(xix)SEQ ID NO:1所示的VL序列，SEQ ID NO:6所示的VH序列和SEQ ID NO:10所示的VH序列；或
(xx)SEQ ID NO:1所示的VL序列，SEQ ID NO:9所示的VH序列和SEQ ID NO:7所示的VH序列；或
(xxi)SEQ ID NO:1所示的VL序列，SEQ ID NO:54所示的VH序列；或
(xxii)SEQ ID NO:1所示的VL序列，SEQ ID NO:55所示的VH序列。
在一个实例中，VH CDR1包含SEQ ID NO:13的氨基酸31-35，VH CDR2包含SEQ IDNO:13的氨基酸50-59，和VH CDR3包含SEQ ID NO:13的氨基酸99-106。
在一个实例中，VL CDR1包含SEQ ID NO:11的氨基酸24-34，VL CDR2包含SEQ IDNO:11的氨基酸50-56，和VL CDR3包含SEQ ID NO:11的氨基酸89-97。
在一个实例中，膜靶向结合蛋白的第一结合区包含：
(i)VH，其包含：
(a)CDR1，其包含SEQ ID NO：13的氨基酸31-35所示的序列；
(b)CDR2，其包含SEQ ID NO：13的氨基酸50-66所示的序列；和
(c)CDR3，其包含SEQ ID NO：13的氨基酸99-112所示的序列；和
(ii)VL，其包含：
(a)CDR1，其包含SEQ ID NO：11的氨基酸24-34所示的序列；
(b)CDR2，其包含SEQ ID NO：11的氨基酸50-56所示的序列；和
(c)CDR3，其包含SEQ ID NO：11的氨基酸89-97所示的序列。
在一个实例中，膜靶向结合蛋白的第一结合区是抗体，该抗体包含：
(i)VH，其包含：
(a)CDR1，其包含SEQ ID NO：13的氨基酸31-35所示的序列；
(b)CDR2，其包含SEQ ID NO：13的氨基酸50-66所示的序列；和
(c)CDR3，其包含SEQ ID NO：13的氨基酸99-112所示的序列；和
(ii)VL，其包含：
(a)CDR1，其包含SEQ ID NO：11的氨基酸24-34所示的序列；
(b)CDR2，其包含SEQ ID NO：11的氨基酸50-56所示的序列；和
(c)CDR3，其包含SEQ ID NO：11的氨基酸89-97所示的序列。
在一个实例中，膜靶向结合蛋白的第一结合区是半抗体，该半抗体包含：
(i)VH，其包含：
(a)CDR1，其包含SEQ ID NO：13的氨基酸31-35所示的序列；
(b)CDR2，其包含SEQ ID NO：13的氨基酸50-66所示的序列；和
(c)CDR3，其包含SEQ ID NO：13的氨基酸99-112所示的序列；和
(ii)VL，其包含：
(a)CDR1，其包含SEQ ID NO：11的氨基酸24-34所示的序列；
(b)CDR2，其包含SEQ ID NO：11的氨基酸50-56所示的序列；和
(c)CDR3，其包含SEQ ID NO：11的氨基酸89-97所示的序列。
在一个实例中，VH CDR1包含SEQ ID NO:43中示出的氨基酸序列，VH CDR2包含SEQID NO:44中示出的氨基酸序列，和VH CDR3包含SEQ ID NO:45中示出的氨基酸序列。
在一个实例中，VL CDR1包含SEQ ID NO:47中示出的氨基酸序列，VL CDR2包含SEQID NO:48中示出的氨基酸序列，和VL CDR3包含SEQ ID NO:49中示出的氨基酸序列。在一个实例中，膜靶向结合蛋白的第一结合区包含：
(i)VH，其包含：
(a)CDR1，其包含SEQ ID NO：43所示的序列；
(b)CDR2，其包含SEQ ID NO：44所示的序列；和
(c)CDR3，其包含SEQ ID NO：45所示的序列；和
(ii)VL，其包含：
(a)CDR1，其包含SEQ ID NO：47所示的序列；
(b)CDR2，其包含SEQ ID NO：48所示的序列；和
(c)CDR3，其包含SEQ ID NO：49所示的序列。
在一个实例中，膜靶向结合蛋白的第一结合区是抗体，该抗体包含：
(i)VH，其包含：
(a)CDR1，其包含SEQ ID NO：43所示的序列；
(b)CDR2，其包含SEQ ID NO：44所示的序列；和
(c)CDR3，其包含SEQ ID NO：45所示的序列；和
(ii)VL，其包含：
(a)CDR1，其包含SEQ ID NO：47所示的序列；
(b)CDR2，其包含SEQ ID NO：48所示的序列；和
(c)CDR3，其包含SEQ ID NO：49所示的序列。
在一个实例中，膜靶向结合蛋白的第一结合区是半抗体，该半抗体包含：
(i)VH，其包含：
(a)CDR1，其包含SEQ ID NO：43所示的序列；
(b)CDR2，其包含SEQ ID NO：44所示的序列；和
(c)CDR3，其包含SEQ ID NO：45所示的序列；和
(ii)VL，其包含：
(a)CDR1，其包含SEQ ID NO：47所示的序列；
(b)CDR2，其包含SEQ ID NO：48所示的序列；和
(c)CDR3，其包含SEQ ID NO：49所示的序列。
在一个实例中，VH CDR1包含SEQ ID NO:13、35、38或41中任一者的氨基酸31-35，VHCDR2包含SEQ ID NO:13、35、38或41中任一者的氨基酸50-59，和VH CDR3包含SEQ ID NO:35、38、41或51中任一者的氨基酸99-106。
在一个实例中，膜靶向结合蛋白的第一结合区包含：
(i)VH，其包含：
(a)CDR1，其包含SEQ ID NO：35的氨基酸31-35所示的序列；
(b)CDR2，其包含SEQ ID NO：35的氨基酸50-66所示的序列；和
(c)CDR3，其包含SEQ ID NO：35的氨基酸99-112所示的序列；和
(ii)VL，其包含：
(a)CDR1，其包含SEQ ID NO：11的氨基酸24-34所示的序列；
(b)CDR2，其包含SEQ ID NO：11的氨基酸50-56所示的序列；和
(c)CDR3，其包含SEQ ID NO：11的氨基酸89-97所示的序列。
在一个实例中，膜靶向结合蛋白的第一结合区是抗体，该抗体包含：
(i)VH，其包含：
(a)CDR1，其包含SEQ ID NO：35的氨基酸31-35所示的序列；
(b)CDR2，其包含SEQ ID NO：35的氨基酸50-66所示的序列；和
(c)CDR3，其包含SEQ ID NO：35的氨基酸99-112所示的序列；和
(ii)VL，其包含：
(a)CDR1，其包含SEQ ID NO：11的氨基酸24-34所示的序列；
(b)CDR2，其包含SEQ ID NO：11的氨基酸50-56所示的序列；和
(c)CDR3，其包含SEQ ID NO：11的氨基酸89-97所示的序列。
在一个实例中，膜靶向结合蛋白的第一结合区是半抗体，该半抗体包含：(i)VH，其包含：
(a)CDR1，其包含SEQ ID NO：35的氨基酸31-35所示的序列；
(b)CDR2，其包含SEQ ID NO：35的氨基酸50-66所示的序列；和
(c)CDR3，其包含SEQ ID NO：35的氨基酸99-112所示的序列；和
(ii)VL，其包含：
(a)CDR1，其包含SEQ ID NO：11的氨基酸24-34所示的序列；
(b)CDR2，其包含SEQ ID NO：11的氨基酸50-56所示的序列；和
(c)CDR3，其包含SEQ ID NO：11的氨基酸89-97所示的序列。
在一个实例中，膜靶向结合蛋白的第一结合区包含：
(i)VH，其包含：
(a)CDR1，其包含SEQ ID NO：38的氨基酸31-35所示的序列；
(b)CDR2，其包含SEQ ID NO：38的氨基酸50-66所示的序列；和
(c)CDR3，其包含SEQ ID NO：38的氨基酸99-112所示的序列；和
(ii)VL，其包含：
(a)CDR1，其包含SEQ ID NO：11的氨基酸24-34所示的序列；
(b)CDR2，其包含SEQ ID NO：11的氨基酸50-56所示的序列；和
(c)CDR3，其包含SEQ ID NO：11的氨基酸89-97所示的序列。
在一个实例中，膜靶向结合蛋白的第一结合区是抗体，该抗体包含：
(i)VH，其包含：
(a)CDR1，其包含SEQ ID NO：38的氨基酸31-35所示的序列；
(b)CDR2，其包含SEQ ID NO：38的氨基酸50-66所示的序列；和
(c)CDR3，其包含SEQ ID NO：38的氨基酸99-112所示的序列；和
(ii)VL，其包含：
(a)CDR1，其包含SEQ ID NO：11的氨基酸24-34所示的序列；
(b)CDR2，其包含SEQ ID NO：11的氨基酸50-56所示的序列；和
(c)CDR3，其包含SEQ ID NO：11的氨基酸89-97所示的序列。
在一个实例中，膜靶向结合蛋白的第一结合区是半抗体，该半抗体包含：(i)VH，其包含：
(a)CDR1，其包含SEQ ID NO：38的氨基酸31-35所示的序列；
(b)CDR2，其包含SEQ ID NO：38的氨基酸50-66所示的序列；和
(c)CDR3，其包含SEQ ID NO：38的氨基酸99-112所示的序列；和
(ii)VL，其包含：
(a)CDR1，其包含SEQ ID NO：11的氨基酸24-34所示的序列；
(b)CDR2，其包含SEQ ID NO：11的氨基酸50-56所示的序列；和
(c)CDR3，其包含SEQ ID NO：11的氨基酸89-97所示的序列。
在一个实例中，膜靶向结合蛋白的第一结合区包含：
(i)VH，其包含：
(a)CDR1，其包含SEQ ID NO：41的氨基酸31-35所示的序列；
(b)CDR2，其包含SEQ ID NO：41的氨基酸50-66所示的序列；和
(c)CDR3，其包含SEQ ID NO：41的氨基酸99-112所示的序列；和
(ii)VL，其包含：
(a)CDR1，其包含SEQ ID NO：11的氨基酸24-34所示的序列；
(b)CDR2，其包含SEQ ID NO：11的氨基酸50-56所示的序列；和
(c)CDR3，其包含SEQ ID NO：11的氨基酸89-97所示的序列。
在一个实例中，膜靶向结合蛋白的第一结合区是抗体，该抗体包含：
(i)VH，其包含：
(a)CDR1，其包含SEQ ID NO：41的氨基酸31-35所示的序列；
(b)CDR2，其包含SEQ ID NO：41的氨基酸50-66所示的序列；和
(c)CDR3，其包含SEQ ID NO：41的氨基酸99-112所示的序列；和
(ii)VL，其包含：
(a)CDR1，其包含SEQ ID NO：11的氨基酸24-34所示的序列；
(b)CDR2，其包含SEQ ID NO：11的氨基酸50-56所示的序列；和
(c)CDR3，其包含SEQ ID NO：11的氨基酸89-97所示的序列。
在一个实例中，膜靶向结合蛋白的第一结合区是半抗体，该半抗体包含：(i)VH，其包含：
(a)CDR1，其包含SEQ ID NO：41的氨基酸31-35所示的序列；
(b)CDR2，其包含SEQ ID NO：41的氨基酸50-66所示的序列；和
(c)CDR3，其包含SEQ ID NO：41的氨基酸99-112所示的序列；和
(ii)VL，其包含：
(a)CDR1，其包含SEQ ID NO：11的氨基酸24-34所示的序列；
(b)CDR2，其包含SEQ ID NO：11的氨基酸50-56所示的序列；和
(c)CDR3，其包含SEQ ID NO：11的氨基酸89-97所示的序列。
在一个实例中，膜靶向结合蛋白的第一结合区包含：
(i)VH，其包含：
(a)CDR1，其包含SEQ ID NO：13、35、38或41中任一者的氨基酸31-35所示的序列；
(b)CDR2，其包含SEQ ID NO：13、35、38或41中任一者的氨基酸50-66所示的序列；和
(c)CDR3，其包含SEQ ID NO：50的氨基酸99-112所示的序列；和
(ii)VL，其包含：
(a)CDR1，其包含SEQ ID NO：11的氨基酸24-34所示的序列；
(b)CDR2，其包含SEQ ID NO：11的氨基酸50-56所示的序列；和
(c)CDR3，其包含SEQ ID NO：11的氨基酸89-97所示的序列。
在一个实例中，膜靶向结合蛋白的第一结合区是抗体，该抗体包含：
(i)VH，其包含：
(a)CDR1，其包含SEQ ID NO：13、35、38或41中任一者的氨基酸31-35所示的序列；
(b)CDR2，其包含SEQ ID NO：13、35、38或41中任一者的氨基酸50-66所示的序列；和
(c)CDR3，其包含SEQ ID NO：50的氨基酸99-112所示的序列；和
(ii)VL，其包含：
(a)CDR1，其包含SEQ ID NO：11的氨基酸24-34所示的序列；
(b)CDR2，其包含SEQ ID NO：11的氨基酸50-56所示的序列；和
(c)CDR3，其包含SEQ ID NO：11的氨基酸89-97所示的序列。
在一个实例中，膜靶向结合蛋白的第一结合区是半抗体，该半抗体包含：
(i)VH，其包含：
(a)CDR1，其包含SEQ ID NO：13、35、38或41中任一者的氨基酸31-35所示的序列；
(b)CDR2，其包含SEQ ID NO：13、35、38或41中任一者的氨基酸50-66所示的序列；和
(c)CDR3，其包含SEQ ID NO：50的氨基酸99-112所示的序列；和
(ii)VL，其包含：
(a)CDR1，其包含SEQ ID NO：11的氨基酸24-34所示的序列；
(b)CDR2，其包含SEQ ID NO：11的氨基酸50-56所示的序列；和
(c)CDR3，其包含SEQ ID NO：11的氨基酸89-97所示的序列。
在一个实例中，VH CDR1包含SEQ ID NO:43中示出的氨基酸序列，VH CDR2包含SEQID NO:44中示出的氨基酸序列，和VH CDR3包含SEQ ID NO:46或51-53中任一者示出的氨基酸序列。
在一个实例中，膜靶向结合蛋白的第一结合区包含：
(i)VH，其包含：
(a)CDR1，其包含SEQ ID NO：43所示的序列；
(b)CDR2，其包含SEQ ID NO：44所示的序列；和
(c)CDR3，其包含SEQ ID NO：46所示的序列；和
(ii)VL，其包含：
(a)CDR1，其包含SEQ ID NO：47所示的序列；
(b)CDR2，其包含SEQ ID NO：48所示的序列；和
(c)CDR3，其包含SEQ ID NO：49所示的序列。
在一个实例中，膜靶向结合蛋白的第一结合区是抗体，该抗体包含：
(i)VH，其包含：
(a)CDR1，其包含SEQ ID NO：43所示的序列；
(b)CDR2，其包含SEQ ID NO：44所示的序列；和
(c)CDR3，其包含SEQ ID NO：46所示的序列；和
(ii)VL，其包含：
(a)CDR1，其包含SEQ ID NO：47所示的序列；
(b)CDR2，其包含SEQ ID NO：48所示的序列；和
(c)CDR3，其包含SEQ ID NO：49所示的序列。
在一个实例中，膜靶向结合蛋白的第一结合区是半抗体，该半抗体包含：(i)VH，其包含：
(a)CDR1，其包含SEQ ID NO：43所示的序列；
(b)CDR2，其包含SEQ ID NO：44所示的序列；和
(c)CDR3，其包含SEQ ID NO：46所示的序列；和
(ii)VL，其包含：
(a)CDR1，其包含SEQ ID NO：47所示的序列；
(b)CDR2，其包含SEQ ID NO：48所示的序列；和
(c)CDR3，其包含SEQ ID NO：49所示的序列。
在一个实例中，膜靶向结合蛋白的第一结合区包含：
(i)VH，其包含：
(a)CDR1，其包含SEQ ID NO：43所示的序列；
(b)CDR2，其包含SEQ ID NO：44所示的序列；和
(c)CDR3，其包含SEQ ID NO：51所示的序列；和
(ii)VL，其包含：
(a)CDR1，其包含SEQ ID NO：47所示的序列；
(b)CDR2，其包含SEQ ID NO：48所示的序列；和
(c)CDR3，其包含SEQ ID NO：49所示的序列。
在一个实例中，膜靶向结合蛋白的第一结合区是抗体，该抗体包含：
(i)VH，其包含：
(a)CDR1，其包含SEQ ID NO：43所示的序列；
(b)CDR2，其包含SEQ ID NO：44所示的序列；和
(c)CDR3，其包含SEQ ID NO：51所示的序列；和
(ii)VL，其包含：
(a)CDR1，其包含SEQ ID NO：47所示的序列；
(b)CDR2，其包含SEQ ID NO：48所示的序列；和
(c)CDR3，其包含SEQ ID NO：49所示的序列。
在一个实例中，膜靶向结合蛋白的第一结合区是半抗体，该半抗体包含：(i)VH，其包含：
(a)CDR1，其包含SEQ ID NO：43所示的序列；
(b)CDR2，其包含SEQ ID NO：44所示的序列；和
(c)CDR3，其包含SEQ ID NO：51所示的序列；和
(ii)VL，其包含：
(a)CDR1，其包含SEQ ID NO：47所示的序列；
(b)CDR2，其包含SEQ ID NO：48所示的序列；和
(c)CDR3，其包含SEQ ID NO：49所示的序列。
在一个实例中，膜靶向结合蛋白的第一结合区包含：
(i)VH，其包含：
(a)CDR1，其包含SEQ ID NO：43所示的序列；
(b)CDR2，其包含SEQ ID NO：44所示的序列；和
(c)CDR3，其包含SEQ ID NO：52所示的序列；和
(ii)VL，其包含：
(a)CDR1，其包含SEQ ID NO：47所示的序列；
(b)CDR2，其包含SEQ ID NO：48所示的序列；和
(c)CDR3，其包含SEQ ID NO：49所示的序列。
在一个实例中，膜靶向结合蛋白的第一结合区是抗体，该抗体包含：
(i)VH，其包含：
(a)CDR1，其包含SEQ ID NO：43所示的序列；
(b)CDR2，其包含SEQ ID NO：44所示的序列；和
(c)CDR3，其包含SEQ ID NO：52所示的序列；和
(ii)VL，其包含：
(a)CDR1，其包含SEQ ID NO：47所示的序列；
(b)CDR2，其包含SEQ ID NO：48所示的序列；和
(c)CDR3，其包含SEQ ID NO：49所示的序列。
在一个实例中，膜靶向结合蛋白的第一结合区是半抗体，该半抗体包含：(i)VH，其包含：
(a)CDR1，其包含SEQ ID NO：43所示的序列；
(b)CDR2，其包含SEQ ID NO：44所示的序列；和
(c)CDR3，其包含SEQ ID NO：52所示的序列；和
(ii)VL，其包含：
(a)CDR1，其包含SEQ ID NO：47所示的序列；
(b)CDR2，其包含SEQ ID NO：48所示的序列；和
(c)CDR3，其包含SEQ ID NO：49所示的序列。
在一个实例中，膜靶向结合蛋白的第一结合区包含：
(i)VH，其包含：
(a)CDR1，其包含SEQ ID NO：43所示的序列；
(b)CDR2，其包含SEQ ID NO：44所示的序列；和
(c)CDR3，其包含SEQ ID NO：53所示的序列；和
(ii)VL，其包含：
(a)CDR1，其包含SEQ ID NO：47所示的序列；
(b)CDR2，其包含SEQ ID NO：48所示的序列；和
(c)CDR3，其包含SEQ ID NO：49所示的序列。
在一个实例中，膜靶向结合蛋白的第一结合区是抗体，该抗体包含：
(i)VH，其包含：
(a)CDR1，其包含SEQ ID NO：43所示的序列；
(b)CDR2，其包含SEQ ID NO：44所示的序列；和
(c)CDR3，其包含SEQ ID NO：53所示的序列；和
(ii)VL，其包含：
(a)CDR1，其包含SEQ ID NO：47所示的序列；
(b)CDR2，其包含SEQ ID NO：48所示的序列；和
(c)CDR3，其包含SEQ ID NO：49所示的序列。
在一个实例中，膜靶向结合蛋白的第一结合区是半抗体，该半抗体包含：(i)VH，其包含：
(a)CDR1，其包含SEQ ID NO：43所示的序列；
(b)CDR2，其包含SEQ ID NO：44所示的序列；和
(c)CDR3，其包含SEQ ID NO：53所示的序列；和
(ii)VL，其包含：
(a)CDR1，其包含SEQ ID NO：47所示的序列；
(b)CDR2，其包含SEQ ID NO：48所示的序列；和
(c)CDR3，其包含SEQ ID NO：49所示的序列。
在一个实例中，VH包含SEQ ID NO:43中示出的氨基酸序列，VH CDR2包含SEQ IDNO:44中示出的氨基酸序列，和VH CDR2包含SEQ ID NO:46中示出的氨基酸序列。
在一个实例中，VH CDR3的氨基酸序列包含位置5处的酪氨酸(T)、异亮氨酸(I)或赖氨酸(K)或谷氨酸(E)和/或位置6处的赖氨酸(K)或酪氨酸(Y)和/或位置7处的脯氨酸(P)、苏氨酸(T)或甘氨酸(G)和/或位置8处的色氨酸(W)或甘氨酸(G)和/或位置9处的甘氨酸(G)或组氨酸(H)和/或位置10处的酪氨酸(Y)或苯丙氨酸(F)或色氨酸(W)。
在一个实例中，VH CDR3的氨基酸序列包含位置5处的谷氨酸(E)，位置6处的酪氨酸(Y)，位置7位处的甘氨酸(G)，位置8位处的甘氨酸(G)，位置9处的甘氨酸(G)和位置10处的色氨酸(W)。
在一个实例中，VH CDR3的氨基酸序列包含位置5处的酪氨酸(T)，位置6处的赖氨酸(K)，位置7位处的脯氨酸(P)，位置8位处的色氨酸(W)，位置9处的甘氨酸(G)和位置10处的酪氨酸(Y)。
在一个实例中，VH CDR3的氨基酸序列包含位置5处的异亮氨酸(I)，位置6处的赖氨酸(K)，位置7位处的苏氨酸(T)，位置8位处的色氨酸(W)，位置9处的甘氨酸(G)和位置10处的酪氨酸(Y)。
在一个实例中，VH CDR3的氨基酸序列包含位置5处的赖氨酸(K)，位置6处的赖氨酸(K)，位置7处的甘氨酸(G)，位置8处的色氨酸(W)，位置9处的组氨酸(H)和位置10处的苯丙氨酸(F)。
在一个实例中，膜靶向结合蛋白包含SEQ ID NO:1所示的轻链，SEQ ID NO:2所示的重链，和SEQ ID NO:3所示的重链。
在一个实例中，膜靶向结合蛋白包含SEQ ID NO:1所示的轻链，SEQ ID NO:4所示的重链。
在一个实例中，膜靶向结合蛋白包含SEQ ID NO:1所示的轻链和SEQ ID NO:5所示的重链。
在一个实例中，膜靶向结合蛋白包含SEQ ID NO:1所示的轻链和SEQ ID NO:6所示的重链。
在一个实例中，膜靶向结合蛋白包含SEQ ID NO:1所示的轻链，SEQ ID NO:7所示的重链。
在一个实例中，膜靶向结合蛋白包含SEQ ID NO:1所示的轻链和SEQ ID NO:8所示的重链。
在一个实例中，膜靶向结合蛋白包含SEQ ID NO:1所示的轻链和SEQ ID NO:9所示的重链。
在一个实例中，膜靶向结合蛋白包含SEQ ID NO:1所示的轻链和SEQ ID NO:10所示的重链。
在一个实例中，膜靶向结合蛋白包含SEQ ID NO:1所示的轻链和SEQ ID NO:31所示的重链。
在一个实例中，膜靶向结合蛋白包含SEQ ID NO:1所示的轻链和SEQ ID NO:32所示的重链。
在一个实例中，膜靶向结合蛋白包含SEQ ID NO:1所示的轻链和SEQ ID NO:33所示的重链。
在一个实例中，膜靶向结合蛋白包含SEQ ID NO:1所示的轻链和SEQ ID NO:34所示的重链。
在一个实例中，膜靶向结合蛋白包含SEQ ID NO:1所示的轻链和SEQ ID NO:36所示的重链。
在一个实例中，膜靶向结合蛋白包含SEQ ID NO:1所示的轻链和SEQ ID NO:37所示的重链。
在一个实例中，膜靶向结合蛋白包含SEQ ID NO:1所示的轻链和SEQ ID NO:39所示的重链。
在一个实例中，膜靶向结合蛋白包含SEQ ID NO:1所示的轻链和SEQ ID NO:40所示的重链。
在一个实例中，膜靶向结合蛋白包含SEQ ID NO:1所示的轻链和SEQ ID NO:42所示的重链。
在一个实例中，膜靶向结合蛋白包含SEQ ID NO:1所示的轻链和SEQ ID NO:54所示的重链。
在一个实例中，膜靶向结合蛋白包含SEQ ID NO:1所示的轻链和SEQ ID NO:55所示的重链。
在一个实例中，膜靶向结合蛋白包含SEQ ID NO:1所示的轻链，SEQ ID NO:9所示的重链，和SEQ ID NO:10所示的重链。
在一个实例中，膜靶向结合蛋白包含SEQ ID NO:1所示的轻链，SEQ ID NO:6所示的重链，和SEQ ID NO:10所示的重链。
在一个实例中，膜靶向结合蛋白包含SEQ ID NO:1所示的轻链，SEQ ID NO:9所示的重链，和SEQ ID NO:7所示的重链。
在一个实例中，本公开的膜靶向结合蛋白包含第二结合区，所述第二结合区特异性地结合哺乳动物细胞质膜的组分。
在一个实例中，膜靶向结合蛋白的第二结合区选自：抗体或其抗原结合片段，膜联蛋白或其变体，γ-羧基谷氨酸(GLA)结构域或其变体，乳凝集素(lactadherin)结构域或其片段/变体，蛋白激酶C(PKC)结构域，PKC保守1(C1)结构域，PKC保守2(C2)结构域普列克底物蛋白同源结构域，和PSP1肽(包含SEQ ID NO:28所示的序列)或其变体。例如，乳凝集素片段是C1C2片段，例如，如SEQ ID NO:27所示的。
在一个实例中，膜靶向结合蛋白的第二结合区是不基于抗体的蛋白质，例如选自：膜联蛋白或其变体，γ-羧基谷氨酸(GLA)结构域或其变体，乳凝集素结构域或其片段/变体，蛋白激酶C(PKC)结构域，PKC保守1(C1)结构域，PKC保守2(C2)结构域普列克底物蛋白同源结构域，和PSP1肽(包含SEQ ID NO:28所示的序列)或其变体。例如，乳凝集素片段是C1C2片段，例如，如SEQ ID NO:27所示的。
在一个实例中，膜靶向结合蛋白的第二结合区不涉及或不具有促凝血活性。
在一个实例中，膜靶向结合蛋白的第二结合区是膜联蛋白或其变体，或膜联蛋白的磷脂酰丝氨酸结合片段或其变体。膜联蛋白示例性的变体为本领域已知和/或述于本文。在一个实例中，第二结合区是膜联蛋白。例如，膜联蛋白是膜联蛋白A5。在一个实例中，膜靶向结合蛋白的第二结合区是包含SEQ ID NO:14所示序列的膜联蛋白A5。在一个实例中，膜靶向结合蛋白的第二结合区是包含SEQ ID NO:26所示序列的膜联蛋白A5的E5突变体(其对应Bouter等,Nature Communications 2:270(2011)中公开的膜联蛋白A5五倍(quintuple)突变体，即在膜联蛋白A5中包含16E、R23E、K27E、K56E和K191E突变)。在另一个实例中，膜靶向结合蛋白的第二结合区是膜联蛋白A1。例如，膜靶向结合蛋白的第二结合区是包含SEQID NO:29所示序列的膜联蛋白A1。在另一个实例中，膜靶向结合蛋白的第二结合区是包含SEQ ID NO:30所示序列的截短膜联蛋白A1(其中已经将含有自切割位点的41个N-末端氨基酸从野生型膜联蛋白A1去除)。
在一个实例中，本公开的膜靶向结合蛋白包含抗体，其中该抗体的各重链连接膜联蛋白，所述膜联蛋白结合哺乳动物细胞质膜的组分。例如，所述抗体各重链连接膜联蛋白，如膜联蛋白A5或膜联蛋白A1。在另一实例中，该抗体只有一条重链连接膜联蛋白。
在一个实例中，第二结合区结合选自下述的质膜组分：氨基磷脂，膜相关多肽及其混合物。
在一个实例中，质膜的组分是氨基磷脂。例如，质膜的组分是选自下组的氨基磷脂：磷脂酰丝氨酸，磷脂酰乙醇胺及其混合物。
在一个实例中，质膜的组分是膜相关多肽。在一个实例中，膜相关多肽选自：GPIIb/IIIa、β2GP1、TLT-1、凝血因子、选择素及其混合物。
在一个实例中，哺乳动物细胞选自血小板，内皮细胞和血红细胞。例如，哺乳动物细胞是血小板。
在一实例中，结合至少一种凝血因子的膜靶向结合蛋白包含：
(i)含有抗-因子IX抗体或其抗原结合片段的第一结合区；和
(ii)第二结合区，其包含：
(a)包含SEQ ID NO:14所示序列的膜联蛋白A5；或
(b)包含SEQ ID NO:30所示序列的截短膜联蛋白A1；
(c)膜联蛋白A5的磷脂酰丝氨酸结合片段或变体；或
(d)膜联蛋白A1的磷脂酰丝氨酸结合片段或变体。
在一个实例中，本公开提供了结合凝血因子的膜靶向结合蛋白，其中，所述蛋白质包含：
(i)第一结合区，所述第一结合区是包含含有SEQ ID NO:13所示序列的VH和含有SEQ ID NO:11所示序列的VL的抗-因子IX半抗体；和
(ii)第二结合区，其包含：
(a)包含SEQ ID NO:14所示序列的膜联蛋白A5；
(b)包含SEQ ID NO:30所示序列的截短膜联蛋白A1；
(c)膜联蛋白A5的磷脂酰丝氨酸结合片段或变体；或
(d)膜联蛋白A1的磷脂酰丝氨酸结合片段或变体。
在一个实例中，本公开提供了结合凝血因子的膜靶向结合蛋白，其中，该蛋白质包含：
(i)第一结合区，所述第一结合区是包含含有SEQ ID NO:13所示序列的VH和含有SEQ ID NO:11所示序列的VL的抗-因子IX半抗体；和
(ii)第二结合区，所述第二结构域包含含有SEQ ID NO:14所示序列的膜联蛋白A5。
在一个实例中，本公开提供了结合凝血因子的膜靶向结合蛋白，其中，该蛋白质包含：
(i)第一结合区，所述第一结合区是包含含有SEQ ID NO:13所示序列的VH和含有SEQ ID NO:11所示序列的VL的抗-因子IX半抗体；和
(ii)第二结合区，所述第二结构域包含含有SEQ ID NO:30所示序列的截短膜联蛋白A1。
在一个实例中，本公开提供了结合凝血因子的膜靶向结合蛋白，其中，该蛋白质包含：
(i)第一结合区，所述第一结合区是包含含有SEQ ID NO:13所示序列的VH和含有SEQ ID NO:11所示序列的VL的抗-因子IX半抗体；和
(ii)第二结合区，所述第二结合区包含膜联蛋白A5的磷脂酰丝氨酸结合片段或变体。
在一个实例中，本公开提供了结合凝血因子的膜靶向结合蛋白，其中，该蛋白质包含：
(i)第一结合区，所述第一结合区是包含含有SEQ ID NO:13所示序列的VH和含有SEQ ID NO:11所示序列的VL的抗-因子IX半抗体；和
(ii)第二结合区，所述第二结合区包含膜联蛋白A1的磷脂酰丝氨酸结合片段或变体。
在一个实例中，本公开提供了结合凝血因子的膜靶向结合蛋白，其中，所述蛋白质包含：
(i)第一结合区，所述第一结合区是包含含有SEQ ID NO:35所示序列的VH和含有SEQ ID NO:11所示序列的VL的抗-因子IX半抗体；和
(ii)第二结合区，所述第二结构域包含含有SEQ ID NO:14所示序列的膜联蛋白A5。
在一个实例中，本公开提供了结合凝血因子的膜靶向结合蛋白，其中，该蛋白质包含：
(i)第一结合区，所述第一结合区是包含含有SEQ ID NO:38所示序列的VH和含有SEQ ID NO:11所示序列的VL的抗-因子IX半抗体；和
(ii)第二结合区，所述第二结构域包含含有SEQ ID NO:14所示序列的膜联蛋白A5。
在一个实例中，本公开提供了结合凝血因子的膜靶向结合蛋白，其中，该蛋白质包含：
(i)第一结合区，所述第一结合区是包含含有SEQ ID NO:41所示序列的VH和含有SEQ ID NO:11所示序列的VL的抗-因子IX半抗体；和
(ii)第二结合区，所述第二结构域包含含有SEQ ID NO:14所示序列的膜联蛋白A5。
在一个实例中，本公开提供了结合凝血因子的膜靶向结合蛋白，其中，该蛋白质包含：
(i)第一结合区，所述第一结合区是包含含有SEQ ID NO:50所示序列的VH和含有SEQ ID NO:11所示序列的VL的抗-因子IX半抗体；和
(ii)第二结合区，所述第二结构域包含含有SEQ ID NO:14所示序列的膜联蛋白A5。
在一个实例中，VH的氨基酸序列包含位置103处的酪氨酸(T)、异亮氨酸(I)或赖氨酸(K)或谷氨酸(E)和/或位置104处的赖氨酸(K)或酪氨酸(Y)和/或位置105处的脯氨酸(P)、苏氨酸(T)或甘氨酸(G)和/或位置106处的色氨酸(W)或甘氨酸(G)和/或位置107处的甘氨酸(G)或组氨酸(H)和/或位置108处的酪氨酸(Y)或苯丙氨酸(F)或色氨酸(W)。
在一个实例中，VH的氨基酸序列包含位置103处的谷氨酸(E)，位置104处的酪氨酸(Y)，位置105位处的甘氨酸(G)，位置106位处的甘氨酸(G)，位置107处的甘氨酸(G)和位置108处的色氨酸(W)。
在一个实例中，VH的氨基酸序列包含位置103处的酪氨酸(T)，位置104处的赖氨酸(K)，位置105位处的脯氨酸(P)，位置106位处的色氨酸(W)，位置107处的甘氨酸(G)和位置108处的酪氨酸(Y)。
在一个实例中，VH的氨基酸序列包含位置103处的异亮氨酸(I)，位置104处的赖氨酸(K)，位置105位处的苏氨酸(T)，位置106位处的色氨酸(W)，位置107处的甘氨酸(G)和位置108处的酪氨酸(Y)。
在一个实例中，VH的氨基酸序列包含位置103处的赖氨酸(K)，位置104处的赖氨酸(K)，位置105处的甘氨酸(G)，位置106处的色氨酸(W)，位置107处的组氨酸(H)和位置108处的苯丙氨酸(F)。
在一个实例中，本公开的膜靶向结合蛋白的第一结合区直接连接第二结合区(即，没有连接区)。在另一实例中，第一结合区通过接头连接第二结合区。
在一个实例中，第一结合区和第二结合区(以及接头，如果存在)是融合蛋白。因此，第一结合区和第二结合区通过酰胺键共价连接。本公开包括其他形式的共价和非共价连接。例如，域或区域可以通过化学接头连接。
在一个实例中，接头是柔性接头，例如，柔性肽接头。例如，第一结合区通过柔性接头连接第二结合区。
在一个实例中，接头是肽接头。例如，第一结合区通过接头连接第二结合区，其中所述接头是包含长度为2至31个氨基酸的肽接头。例如，接头序列的长度为约16个氨基酸。在一个实例中，接头包含序列(Gly4Ser)3或SGGGGSGGGGSGGGGS(GS16)或SEQ ID NO:20所示的序列。在另一个实例中，接头包含序列SG(GS2)或SGGGGS(GS6)或SEQ ID NO:24所示的序列。在一个实例中，接头包含序列SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(GS31)或SEQ ID NO:25所示的序列。
在一个实例中，接头是刚性接头。例如，刚性接头包含序列(EAAAK)n，其中n为1至3之间。例如，刚性接头包含(EAAAK)n，其中n为1至10之间或约1至100之间。例如，n至少为1，或至少为2，或至少为3，或至少为4，或至少为5，或至少为6，或至少为7，或至少为8，或至少为9，或至少为10。在一个实例中，n小于100。例如，n小于90，或小于约80，或小于约60，或小于约50，或小于约40，或小于约30，或小于约20，或小于约10。
在一个实例中，接头是可切割接头。例如，接头可以通过蛋白酶或肽酶切割。
在一个实例中，接头将第二结合区的N-末端接合到第一结合区的重链或其结构域(例如，VH)或轻链或其结构域(例如，VL，CH1)的N-或C-末端，所述第一结合区是抗体(例如，抗-因子IX抗体或其抗原结合片段)。例如，接头在第二结合区的N-末端和第一结合区(例如，抗-因子IX抗体或其抗原结合片段)的重链或其结构域的C-末端之间延伸。
在一个实例中，柔性接头将第二结合区的N-末端接合到第一结合区的重链或其结构域(例如，VH)或轻链或其结构域(例如，VL)的C-末端，所述第一结合区是抗体(例如，抗-因子IX抗体或其抗原结合片段)。在一个实例中，柔性接头将第二结合区的C-末端接合到第一结合区的重链或其结构域(例如，VH)或轻链或其结构域(例如，VL)的N-末端，所述第一结合区是抗体(例如，抗-因子IX抗体或其抗原结合片段)。
在一个实例中，本公开的膜靶向结合蛋白与化合物偶联，其直接或间接结合膜靶向结合蛋白。
在一实例中，化合物是治疗剂或可检测试剂。合适的治疗剂或可检测试剂为本领域已知并且包括但不限于，细胞毒素，放射性同位素，免疫调节剂和抗血管生成剂，抗新血管形成剂(anti-neovascularisation agent)，毒素，抗增殖剂，促凋亡剂，化疗剂，治疗性核酸和荧光标记物。
本公开还提供了包含本公开的膜靶向结合蛋白和药学上可接受的运载体的组合物。在一个实例中，结合蛋白具有促凝血活性。在一个实例中，结合蛋白具有抗凝血活性。
本公开还提供了治疗或预防对象中疾病或病症的方法，所述方法包括向有此需要的对象给予本公开的膜靶向结合蛋白或包含本公开的膜靶向结合蛋白的组合物。
在一个实例中，本公开提供了本公开的膜靶向结合蛋白在制备用于治疗或预防对象中疾病或病症的药物中的用途。
在一个实例中，疾病或病症是出血性疾病。
在一个实例中，对象患有出血性疾病。在一个实例中，对象已被诊断为患有出血性疾病。在一个实例中，对象正在接受针对出血性疾病的治疗。
在一个实例中，对象患有出血性疾病并且已经发展出对出血性疾病治疗的抑制剂(例如，已经发展出针对凝血因子或其重组或修饰形式的抑制性自身抗体)。
在本文所述的任何方法的一个实例中，在发展出出血性疾病之前或之后给予本公开的膜靶向结合蛋白。在本文所述的任何方法的一个实例中，在发展出出血性疾病之前给予本公开的膜靶向结合蛋白。在本文所述的任何方法的一个实例中，在发展出出血性疾病之后给予本公开的膜靶向结合蛋白。
在本文所述的任何方法的一个实例中，在出血事件发生之前或之后给予本公开的膜靶向结合蛋白。在一个实例中，在出血事件发生之前给予本公开的膜靶向结合蛋白。在另一个实例中，在出血事件发生之后给予本公开的膜靶向结合蛋白。
出血事件对于本领域技术人员而言是显而易见的并且包括例如小和/或大出血事件。在一个实例中，出血事件是大出血事件。例如，大出血事件是导致血红蛋白降低≥5g/dL或血细胞比容绝对降低≥15％的任何情况。在一个实例中，出血事件是轻微出血事件。例如，小出血事件是导致血红蛋白降低≤4g/dL或血细胞比容绝对降低≥10％的任何情况。
在本文所述的任何方法的一个实例中，在发展出针对出血性疾病治疗的抑制剂之后给予本公开的膜靶向结合蛋白。
在一个实例中，对象具有发展出出血性疾病的风险。例如，具有发展出出血性疾病的风险的对象包括但不限于，凝血因子(例如，因子VIII)中具有突变、缺失或重排的那些或患有血小板异常的那些。在一个实例中，对象的亲属已经发展出出血性疾病。例如，出血性疾病是遗传性的。在一个实施例中，出血性疾病是获得性的。在一个实例中，具有发展出出血性疾病的风险的对象已经发展出凝血因子的抑制剂。
在一个实例中，在出血性疾病的症状发生之前或之后给予膜靶向结合蛋白。在一个实例中，在出血性疾病的症状发生之前给予膜靶向结合蛋白。在一个实例中，在出血性疾病的症状发生之后给予膜靶向结合蛋白。在一个实例中，以减缓或降低出血性疾病的一个或多个症状的剂量给予本公开的膜靶向结合蛋白。
出血性疾病的症状对于本领域技术人员将是显而易见的并且包括，例如：
·容易瘀伤；
·牙龈出血；
·小切口或牙科治疗引起的大量出血；
·不明原因的流鼻血；
·月经期大量出血；
·关节内出血；和/或
·手术后出血过多。
在一个实施例中，出血性疾病由血液凝固障碍引起。例如，血液凝固障碍是血友病，冯维勒布兰德氏病，因子I缺乏症，因子II缺乏症，因子V缺乏症，因子V/因子VIII组合型缺乏症，因子VII缺乏症，因子X缺乏症，因子XI缺乏症或因子XIII缺乏症。在一个实例中，血友病是A型血友病或B型血友病。在一个实例中，对象具有需要预防性治疗的病症。
在一个实例中，对象已经发展出因子VIII的抑制剂(例如，抑制性抗体)。
在一个实例中，对象患有A型血友病，在一个实例中，对象患有A型血友病并且已经发展出针对因子VIII的抑制剂(例如，抑制性抗体)。例如，本公开的蛋白质具有因子VIII旁路活性。
在一个实例中，以降低对象出血严重性的量向对象给予本公开的膜靶向结合蛋白。例如，增加或绕过凝血因子的活性。例如，相对于用本公开的蛋白质治疗之前，对象中凝血的水平增加。
在本文所述的任何方法的一个实例中，对象是哺乳动物，例如灵长类动物，如人。
本文所述的治疗方法可另外包括给予另外的化合物以减少，治疗或预防出血性疾病的影响。
本公开还提供了包含膜靶向结合蛋白的组合物，所述膜靶向结合蛋白结合凝血因子，用于治疗或预防出血性疾病。
本公开还提供了包含与凝血因子结合的膜靶向结合蛋白的组合物在制备用于治疗或预防出血性疾病的药物中的用途。
本公开还提供了药盒，所述药盒包括与说明书包装在一起的与凝血因子结合的至少一种膜靶向结合蛋白，用于治疗或预防对象中的出血性疾病。任选地，药盒还包含治疗活性化合物或药物。
本公开还提供了药盒，所述药盒包括与说明书包装在一起的与凝血因子结合的至少一种膜靶向结合蛋白，以将膜靶向结合蛋白给予对象，所述对象患有出血性疾病或具有患出血性疾病的风险，任选地，与治疗活性化合物或药物组合。
本文描述了与凝血因子结合的膜靶向结合蛋白的示例性作用，并且适用于前述5段所述实例(加上必要的调整)。
本公开还提供了用于抑制凝血的方法，所述方法包括向有此需要的对象给予本公开的蛋白质，所述蛋白质包含抑制凝血因子的第一结合区。
附图说明
图1是显示(A)包含2个膜联蛋白A5分子的膜靶向抗-因子IX单特异性抗体和(B)包含1个膜联蛋白A5分子的膜靶向抗-因子IX/X双特异性抗体与磷脂囊泡的结合亲和力的图表。
图2是显示(A)膜靶向和非膜靶向抗-因子IX单特异性抗体和(B)膜靶向和非膜靶向抗-因子IX半抗体的因子VIII旁路活性的图表。
图3是显示膜靶向和非膜靶向抗-因子IX/X双特异性抗体的因子VIII旁路活性的图表。
图4是显示膜联蛋白A5膜靶向抗因子IX抗体、E5突变膜联蛋白A5膜靶向抗因子IX抗体和截短膜联蛋白A1膜靶向抗因子IX抗体的因子VIII旁路活性的图表。
图5是显示在(A)aPTT试验和(B)单级凝结(one-stage clot)试验中离体测量掺有人FIX的FVIII缺陷型小鼠血浆中膜靶向抗人因子IX抗体的因子VIII旁路活性的图表。
图6是显示使用显色测定在不存在磷脂的情况下膜联蛋白A5膜靶向抗因子IX抗体、非膜靶向抗-因子IX抗体和非膜靶向抗-因子IX/X双特异性抗体的因子VIII旁路活性的图表。
图7是显示人FVIII耗尽的血浆中的内在凝血试验中膜靶向抗-因子IX抗体、非膜靶向抗-因子IX/X双特异性抗体和对照的(A)代表3个独立实验的单个实验中测量的凝血酶产生(B)凝血酶峰高(平均值±SD，n＝3)和(C)时滞(平均值±SD，n＝3)的图表。
序列表要点
SEQ ID NO:1抗-因子X/因子IX抗体轻链的氨基酸序列
SEQ ID NO:2抗-因子X抗体重链的氨基酸序列
SEQ ID NO:3抗-因子IX抗体重链的氨基酸序列
SEQ ID NO:4抗-因子X抗体重链的氨基酸序列
SEQ ID NO:5抗-因子IX抗体重链的氨基酸序列
SEQ ID NO:6抗-因子IX抗体重链的氨基酸序列
SEQ ID NO:7抗-因子X抗体重链的氨基酸序列
SEQ ID NO:8融合膜联蛋白A5的抗-因子IX抗体重链的氨基酸序列
SEQ ID NO:9融合膜联蛋白A5的抗-因子IX抗体重链的氨基酸序列
SEQ ID NO:10融合膜联蛋白A5的抗-因子X重链的氨基酸序列SEQ ID NO:11抗-因子X/因子IX抗体的轻链的轻链VL氨基酸序列
SEQ ID NO:12抗-因子X抗体的重链VH氨基酸序列
SEQ ID NO:13抗-因子IX抗体的重链VH氨基酸序列
SEQ ID NO:14野生型膜联蛋白A5的氨基酸序列
SEQ ID NO:15具有S228P突变的人IgG4重链恒定区的氨基酸序列
SEQ ID NO:16具有S228P、T336W突变的人IgG4重链恒定区的氨基酸序列
SEQ ID NO:17具有S228P、T366S、L368A、Y407V突变的人IgG4重链恒定区的氨基酸序列
SEQ ID NO:18具有T350V、T366L、K392L、T394W突变的人IgG4重链恒定区的氨基酸序列
SEQ ID NO:19具有T350V、L351Y、F405A、Y407V突变的人IgG4重链恒定区的氨基酸序列
SEQ ID NO:20接头GS16的氨基酸序列
SEQ ID NO:21人凝血因子VIII的氨基酸序列
SEQ ID NO:22人凝血因子IX的氨基酸序列
SEQ ID NO:23人凝血因子X的氨基酸序列
SEQ ID NO:24接头GS6的氨基酸序列
SEQ ID NO:25接头GS31的氨基酸序列
SEQ ID NO:26膜联蛋白A5的E5突变体的氨基酸序列
SEQ ID NO:27人乳凝集素C1C2序列(也称之为MFG-E8)的氨基酸序列
SEQ ID NO:28PSP1的氨基酸序列
SEQ ID NO:29野生型膜联蛋白A1的氨基酸序列
SEQ ID NO:30截短膜联蛋白A1的氨基酸序列
SEQ ID NO:31融合膜联蛋白A5的E5突变体的抗-因子IX抗体重链的氨基酸序列
SEQ ID NO:32融合截短膜联蛋白A1的抗-因子IX抗体重链的氨基酸序列
SEQ ID NO:33融合截短膜联蛋白A1的抗-因子IX抗体重链的氨基酸序列
SEQ ID NO:34抗-因子IX抗体重链A10的氨基酸序列
SEQ ID NO:35抗-因子IX抗体A10的重链VH氨基酸序列
SEQ ID NO:36融合膜联蛋白A5的抗-因子IX抗体重链A10的氨基酸序列
SEQ ID NO:37抗-因子IX抗体重链B2的氨基酸序列
SEQ ID NO:38抗-因子IX抗体B2的重链VH氨基酸序列
SEQ ID NO:39融合膜联蛋白A5的抗-因子IX抗体重链B2的氨基酸序列
SEQ ID NO:40抗-因子IX抗体重链C12的氨基酸序列
SEQ ID NO:41抗-因子IX抗体C12的重链VH氨基酸序列
SEQ ID NO:42融合膜联蛋白A5的抗-因子IX抗体重链C12的氨基酸序列
SEQ ID NO:43抗-因子IX抗体的重链VH CDR1氨基酸序列SEQ ID NO:44抗-因子IX抗体的重链VH CDR2氨基酸序列SEQ ID NO:45抗-因子IX抗体的重链VH CDR3氨基酸序列SEQID NO:46抗-因子IX抗体的重链VH CDR3氨基酸共有序列
SEQ ID NO:47抗-因子IX抗体的轻链VL CDR1氨基酸序列
SEQ ID NO:48抗-因子IX抗体的轻链VL CDR2氨基酸序列
SEQ ID NO:49抗-因子IX抗体的轻链VL CDR3氨基酸序列
SEQ ID NO:50抗-因子IX抗体的重链VH氨基酸共有序列
SEQ ID NO:51抗-因子IX抗体A10的重链VH CDR3氨基酸序列
SEQ ID NO:52抗-因子IX抗体B2的重链VH CDR3氨基酸序列
SEQ ID NO:53抗-因子IX抗体C12的重链VH CDR3氨基酸序列
SEQ ID NO:54抗-因子IX抗体重链ATG16028的氨基酸序列
SEQ ID NO:55融合膜联蛋白A5的抗-因子IX抗体重链ATG16028的氨基酸序列
具体实施方式
概述
通篇中，除非另有说明或上下文另有要求，应认为单个步骤、组合物、步骤的组或组合物的组包括一个和多个(即一个或多个)这些步骤、组合物、步骤组或组合物组。
本领域技术人员应理解，本发明易于进行除说明书中所述的那些以外的变化和修改。应理解本发明包含所有这些变化和修改。本发明还包括说明书中单独或共同提到或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及所述步骤或特征中任意两种或更多种或任意和全部组合。
本发明的范围不限于本文所述的具体实施例，实施例仅用于示例目的。功能上等同的产品、组合物和方法清楚地包含于本发明的范围内。
本发明的任何实施例都将经必要的修改以适用于本发明的任何其他实施例，除非另有明确说明。换言之，本公开的任何具体实例可以与本公开的其他任何具体实例组合(除非相互排斥)。
公开特定特征或特征组或方法或方法步骤的本公开的任何实例将不被认为为放弃特定特征或特征组或方法或方法步骤提供了明确支持。
除非另有明确定义，本文使用的所有技术和科学术语都具有与本领域普通技术人员的常规理解相同的含义(例如在细胞培养、分子遗传学、免疫学、免疫组化、蛋白质化学和生物化学领域)。
除非另有说明，本发明中使用的重组蛋白、细胞培养和免疫技术是标准方法，其是本领域技术人员熟知的。这类技术描述并解释于文献中，例如J.Perbal，A PracticalGuide to Molecular Cloning(《分子克隆实践指南》)，约翰韦利森出版社(John Wileyand Sons)(1984)，J.Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(《分子克隆：实验室指南》)，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbour Laboratory Press)(1989)，T.A.Brown(编)，Essential Molecular Biology:A Practical Approach(《精编分子生物学：实践指南》)，卷1和2，IRL出版社(1991)，D.M.Glover和B.D.Hames(编)，DNA Cloning:APractical Approach(《DNA克隆：实践指南》)，卷1-4，IRL出版社(1995和1996)，以及F.M.Ausubel等(编)，Current Protocols in Molecular Biology(《新编分子生物学实验指南》)，格林出版联合公司和韦利科学公司(Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience)(1988，包括直至今日的所有更新)，Ed Harlow和David Lane(编)，Antibodies:A Laboratory Manual(《抗体：实验室手册》)，冷泉港实验室出版社(1988)，以及J.E.Coligan等(编)，Current Protocols in Immunology(《新编免疫学实验指南》)，约翰韦利森出版社(包括直至今日的所有更新)。
本文所述可变区和其部分、抗体和其片段的描述和定义可以通过Kabat《免疫学感兴趣的蛋白质的序列》(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，马里兰州贝塞斯达的国立卫生研究院，1987和1991中的讨论进一步阐释。
术语“Kabat的EU编号***”将理解为意指根据Kabat等，1991，《免疫学感兴趣的蛋白质的序列》(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，第5版，公共卫生署，国立卫生研究院，贝塞斯达中教导的EU索引进行编号。EU索引基于人IgG1EU抗体的残基编号。
术语“和/或”(例如“X和/或Y”)应理解为表示“X和Y”或“X或Y”且应被认为提供了对这两种含义或各含义的明确支持。
整篇说明书中，词语“包括”或其变化形式，如“包含”或“含有”应理解为意味着包括所指的元素、整数或步骤，或成组的元素、整数或步骤，但不排除任何其它元素、整数或步骤，或成组的元素、整数或步骤。
本文所用术语“来源于”或“源自”表示特定整体可获自特定来源，但并不一定直接来自该来源。
本文中提及的范围(如残基的范围)应理解为包含性的。例如，“包含SEQ ID NO:1的氨基酸56-65的区域”应当理解为意指包含SEQ ID NO:1序列中氨基酸编码为56、57、58、59、60、61、62、63、64和65的序列的区域。
选择的定义
本文所用术语“膜靶向”是指结合哺乳动物细胞质膜组分的蛋白质。例如，哺乳动物细胞在与蛋白质相关的质膜上包含结构限定的结构域。
本文所用“凝血因子”指与印迹凝结(blot clot)(即，血液凝固)的形成相关的因子。在一个实例中，凝血因子具有促凝血活性。凝血因子为本领域已知并且包括但不限于，因子I，因子II，因子III，因子V，因子VII，因子VIII，因子IX，因子X，因子XI，因子XII因子XIII和前述中任一者的活化形式。该术语还包括凝血因子的重组形式和/或其修饰形式，例如，如本领域已知的和/或本文所述的。
凝血因子上下文中的术语“不相同的(distinct)”指彼此之间可区别或不同的两种或更多种凝血因子。例如，两种或更多种凝血因子彼此不相同，例如，因子IX和因子X。
“促凝血活性”指增强或促进血液凝固的作用。一些实例中，膜靶向结合蛋白与凝血因子的结合可能不直接引起凝固，但是可以通过促进/增强凝血反应而在凝血级联中起作用。例如，相较于该蛋白质不存在的情况，反应水平(可以是凝血因子的活化或凝血的水平)在膜靶向结合蛋白存在的情况下增强。因此，在一些实例中，膜靶向结合蛋白本身不具有任何凝血活性，例如，膜靶向结合蛋白促进凝血级联中的反应或促进凝血。在一个实例中，膜靶向结合蛋白与活化的凝血因子(例如，活化的FIX)的结合可以将该因子稳定在其活性构象中。不受理论或作用模式的约束，在因子IX的情况下，这种稳定化可以增强其催化辅因子活性用于凝血途径的内在活化。“促凝血活性”可以是“旁路活性”。
“抗凝血活性”指阻滞或抑制血液凝固的作用。膜靶向结合蛋白与凝血因子的结合可能不直接抑制凝血，但可能在减缓或抑制凝血级联中起重要作用。
本文所用术语“旁路活性”是指膜靶向结合蛋白在凝血级联中绕过或替代内源性凝血因子的能力。例如，膜靶向结合蛋白的结合区替代凝血级联(例如，内在凝血级联)中的内在凝血因子。例如，膜靶向结合蛋白的结合区具有模拟和替代缺失的(例如，非表达)、非功能性的(例如，突变体)或阻断的(例如，通过抑制剂)凝血因子的凝血增强性质的能力，例如，通过增加上游凝血因子的促凝血活性或通过替换缺失或非功能性凝血因子，从而使有效的凝血酶产生或凝血活性不再需要缺失、非功能性或阻断的内源性凝血因子。
术语“结合区”应理解为指能够与抗原(例如，细胞组分或分子，如蛋白质，例如，凝血因子)相互作用或与抗原特异性结合的膜靶向结合蛋白或其部分或膜靶向结合蛋白的其他区域。例如，结合区可以是抗体或半抗体或抗体的抗原结合片段(例如，Fv或scFv或双抗体等)。
述及膜靶向结合蛋白的结合区与组分(即，凝血因子或质膜的组分)的相互作用，本文所用术语“结合”意味着该相互作用依赖于组分上存在的特定结构(例如，表位)。例如，抗体识别并结合特定蛋白质结构而非广泛结合蛋白质。如果抗体结合表位“A”，则在含有标记的“A”和该蛋白质的反应中存在含有表位“A”(或游离、未结合的“A”)的分子会降低与该抗体结合的标记的“A”的量。
本文所用术语“特异性结合”应理解为意指膜靶向结合蛋白上的结合区与组分(即，凝血因子或质膜的组分)之间的结合相互作用取决于抗原决定簇或表位的存在。即使存在于其他分子的混合物或生物体中，结合区也优先结合或识别特定的抗原决定簇或表位。在一个实例中，相比与其它抗原或细胞的关系，结合区与特定组分或表达该特定组分的细胞更频繁地，更快速地反应或相关联，所述反应或关联持续更长时间和/或具有更强的亲和力。通过阅读该定义还可以理解的是，例如，特异性结合特定组分的结合区可以或可以不特异性结合第二抗原。因此，“特异性结合”不一定需要排他性地结合或不可检测地结合另一抗原。术语“特异性结合”可与本文所述“选择性结合”互换使用。通常，本文提及结合时指特异性结合，且各术语应理解为对其他术语提供明确支持。用于确定特异性结合的方法对于本领域技术人员而言是显而易见的。例如，包含本公开的结合区的结合蛋白与所述组分或表达该组分的细胞或其变体形式或替代性抗原接触。然后确定与所述组分或突变体形式或替代性抗原的结合，并且认为如上所示结合的结合区特异性地结合该组分。在一个实例中，“特异性结合”所述组分或表达该组分的细胞意指结合区以1μM或更少的平衡常数(KD)结合：如100nM或更少，如50nM或更少，例如20nM或更少，如1nM或更少，例如，0.8nM或更少，1x10-8M或更少，如5x10-9M或更少，例如，3x10-9M或更少，如2.5x10-9M或更少。
术语“优选结合”应理解为意指膜靶向结合蛋白上的结合区与一组分(即，凝血因子或质膜的组分)的结合优先于或有利于另一组分。因此，“优选结合”不一定需要排他性地结合或不可检测地结合另一组分。例如，相较于未活化的因子FIX，本公开的膜靶向结合蛋白优先结合活化的因子IXa。
术语“质膜的组分”应理解为意指存在于哺乳动物细胞表面上的可与膜靶向结合蛋白的结合区结合的任何组分。在一个实例中，所述组分暴露在细胞质膜的细胞外表面上。在一个实例中，所述组分可以大量存在于哺乳动物细胞的表面上以实现结合蛋白的特异性和有效靶向。例如，组分可以足以在体内结合的量存在以在结合区结合后起始作用。存在于哺乳动物细胞表面上的组分的实例是本领域已知的并且包括但不限于，氨基磷脂(例如，磷脂酰丝氨酸或磷脂酰乙醇胺)；膜相关多肽(例如，糖蛋白GPIIb/IIa，β2GP1，TLT-1，凝血因子和选择素)和包含两种或更多种不相同的凝血因子的膜相关复合物。
术语“重组”应理解为指人工遗传重组的产物。因此，对于抗体或其抗原结合片段的上下文中，该术语不包括作为B细胞成熟期间发生的天然重组的产物的在对象体内天然产生的抗体。然而，如果这类抗体被分离，其应被认为是包含抗体可变区的分离的蛋白质。类似地，如果编码该蛋白质的核酸被分离并使用重组方式表达，则所得蛋白质是重组蛋白。重组蛋白还包括当其处于细胞、组织或对象(例如蛋白质在其中表达的细胞、组织或对象)内时通过人工重组方式表达的蛋白质。
术语“蛋白质”应理解为包括单条多肽链(即通过肽键连接的一系列相邻氨基酸)或彼此共价或非共价连接的一系列多肽链(即多肽复合物)。例如，可使用合适的化学键或二硫键共价连接该一系列多肽链。非共价键的示例包括氢键、离子键、范德华力和疏水相互作用。
术语“多肽”或“多肽链”应据以上段落理解为表示通过肽键连接的一系列相邻氨基酸。
本领域技术人员将意识到，“抗体”通常被认为是包含由多个多肽链组成的可变区的蛋白质，例如包含轻链可变区(VL)的多肽和包含重链可变区(VH)的多肽。抗体还通常包含恒定结构域，其中一些可以排列成恒定区，对重链而言包括恒定片段或可结晶片段(Fc)。VH和VL相互作用形成包含能够特异性结合一个或几个密切相关抗原的抗原结合区的Fv。通常，来自哺乳动物的轻链为κ轻链或λ轻链，而来自哺乳动物的重链为α、δ、ε、γ或μ。抗体可以是任何类型(如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类(如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。术语“抗体”还包括人源化抗体、灵长类化抗体、人抗体、合成人源化抗体和嵌合抗体。术语“抗体”还包括缺失编码的C-末端赖氨酸残基的变体，脱酰胺化变体和/或糖基化变体和/或包含焦谷氨酸的变体(例如，在蛋白质(例如，抗体)的N末端)和/或缺失N-末端残基(例如，抗体或V区中的N-末端谷氨酰胺)的变体和/或包含全部或部分分泌信号的变体。编码的天冬酰胺残基的脱酰胺变体可产生异天冬氨酸和产生天冬氨酸异构体，或甚至产生涉及相邻氨基酸残基的琥珀酰胺。编码的谷氨酰胺残基的脱酰胺变体可产生谷氨酸。当提及特定的氨基酸序列时，包括包含这种序列和变体的非均相混合物的组合物。
在本公开的上下文中，术语“半抗体”指包含单条抗体重链和单条抗体轻链的蛋白质。术语“半抗体”还涵盖包含抗体轻链和抗体重链的抗体，其中，抗体重链已经突变成防止与另一抗体重链相关联。
术语“全长抗体”、“完整的抗体”或“全抗体”可互换使用以指与抗体的抗原结合片段相对而言基本完整形式的抗体。具体而言，全抗体包含具有重链和轻链(包含Fc区)的那些抗体。恒定结构域可以是野生型序列恒定结构域(如人野生型序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。
本文所用“可变区”指本文所定义抗体的轻链和/或重链的部分，其特异性结合抗原并且(例如)包含CDR(即，CDR1、CDR2和CDR3)和框架区(FR)的氨基酸序列。例如，可变区包含三个或四个FR(如FR1、FR2、FR3和任选的FR4)以及三个CDR。VH指重链的可变区。VL指轻链的可变区。
本文所用术语“互补决定区”(同义词CDR；即CDR1、CDR2和CDR3)指抗体可变区的氨基酸残基，其存在是特异性抗原结合的主要原因。每个可变区通常具有被鉴定为CDR1、CDR2和CDR3的三个CDR区。在一个实施例中，分配给CDR和FR的氨基酸位置是根据Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest(《免疫学感兴趣的蛋白质序列》)，国立卫生研究院(National Institutes of Health)，马里兰州贝塞斯达，1987和1991(本文中也称作“Kabat编码***”)来定义的。根据Kabat的编码***，VH FR和CDR的位置如下：残基1-30(FR1)、31-35(CDR1)、36-49(FR2)、50-65(CDR2)、66-94(FR3)、95-102(CDR3)和103-113(FR4)。根据Kabat的编码***，VL FR和CDR的位置如下：残基1-23(FR1)、24-34(CDR1)、35-49(FR2)、50-56(CDR2)、57-88(FR3)、89-97(CDR3)和98-107(FR4)。
“框架区”(之后称之为FR)是除了CDR残基以外的其他可变结构域残基。
本文所用术语“Fv”应理解为指任何如下所述蛋白质，无论其由多个多肽或单个多肽组成：其中VL和VH相联并形成具有抗原结合位点的复合物(即能够特异性结合抗原)。形成抗原结合位点的VH和VL可以在单条多肽链中或不同多肽链中。此外，本公开的Fv(以及本公开的任何蛋白质)可具有多个抗原结合位点，可结合或可不结合相同的抗原。该术语应理解为包括直接来源于抗体的片段以及采用重组方式生产的对应于这类片段的蛋白质。在一些实例中，VH不与重链恒定结构域(CH)1相连和/或VL不与轻链恒定结构域(CL)相连。示例性的含Fv多肽或蛋白质包括Fab片段、Fab’片段、F(ab’)片段、scFv、双抗体、三抗体、四抗体或更高级的复合物，或者与恒定区或其结构域(如CH2或CH3结构域)相连的任意前述物质，如微小抗体。“Fab片段”由抗体的单价抗原结合片段组成，且可通过使用木瓜蛋白酶消化全抗体以生成由完整轻链和一部分重链组成的片段来生产或者可使用重组方法来生产。通过使用胃蛋白酶处理全抗体随后还原以生成由完整轻链和一部分重链(包含VH和单个恒定结构域)组成的分子，由此可获得抗体的“Fab'片段”。通过该方式处理，每个抗体可获得两个Fab'片段。还可通过重组方式生产Fab'片段。抗体的“F(ab')2片段”由通过两个二硫键联合在一起的两个Fab'片段的二聚体组成，并可通过使用胃蛋白酶处理全抗体分子而不进行后续还原来获得。“Fab2”片段是包含两个Fab片段的重组片段，这两个Fab片段采用例如亮氨酸拉链或CH3结构域连接。“单链Fv”或“scFV”是含有抗体的可变区片段(Fv)的重组分子，其中轻链的可变区和重链的可变区通过合适的柔性多肽接头共价连接。
本文所用术语“恒定区”是指抗体重链或轻链除可变区外的一部分。在重链中，恒定区通常包含多个恒定结构域和铰链区，例如，IgG恒定区包含以下连接的组分：恒定重链(CH)1、接头、CH2和CH3。在重链中，恒定区包含Fc。在轻链中，恒定区通常包含一个恒定结构域(CL1)。
术语“可结晶片段”或“Fc”或“Fc区”或“Fc部分”(在本文中可互换使用)指包含至少一个恒定结构域的抗体区域，且其通常(但不是必须)经糖基化并且能够结合一个或多个Fc受体和/或补体级联的组分。重链恒定区可以选自下述五种同种型中的任一种：α、δ、ε、γ或μ。此外，各种亚类的重链(如IgG亚类的重链)负责不同的效应功能，并且因此，通过选择所需的重链恒定区，可以产生具有所需效应功能的蛋白质。示例性的重链恒定区是γ1(IgG1)、γ2(IgG2)和γ3(IgG3)或其杂合体。
抗体的“抗原结合片段”包含完整抗体的一个或多个可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子，半抗体和由抗体片段形成的多特异性抗体。
术语“稳定化的IgG4恒定区”应理解为指经修饰以降低Fab臂交换或发生Fab臂交换的倾向性或形成半抗体或形成半抗体的倾向的IgG4恒定区。“Fab臂交换”指人IgG4的一种蛋白质修饰类型，其中IgG4重链和与之结合的轻链(半分子)被交换成源自另一IgG4分子的重链-轻链对。这样，IgG4分子可能获得识别两种不同抗原的两个不相同的Fab臂(形成双特异性分子)。Fab臂交换在体内自然发生并可在体外用纯化的血细胞或还原剂(如还原型谷胱甘肽)诱导。
本文所用术语“单特异性”指包含各自具有相同的表位特异性的一个或多个抗原结合位点的结合区。因此，单特异性结合区可以包含单个抗原结合位点(例如，Fv、scFv、Fab等)或可以包含识别相同表位(例如，彼此相同)的几个抗原结合位点，例如，双抗体或抗体。结合区是“单特异性”的要求并不意味着它仅与一种抗原结合，因为多种抗原可以具有共有的或高度相似的表位，所述表位可由单个抗原结合位点结合。仅与一种抗原结合的单特异性结合区被称为“排他性结合”该抗原。
术语“多特异性”是指包含两个或更多个抗原结合位点的结合区，其各自结合不相同的表位，例如，其各自结合不相同的抗原。例如，多特异性结合区可以包含这样的抗原结合位点，所述抗原结合位点识别相同蛋白质(例如，凝血因子)的两个或更多个不同表位或可以识别不同蛋白质(即，不相同的凝血因子)的两个或更多个不同表位。在一个实例中，结合区可以是“双特异性的”，即，它包含特异性结合两个不相同表位的两个抗原结合位点。例如，双特异性结合区特异性结合相同蛋白质上的两个不同表位或对相同蛋白质上的两个不同表位具有特异性。在另一个实例中，双特异性结合区特异性结合两个不同蛋白质(例如，因子IX和因子X)上的两个不相同的表位。
本文所用术语“疾病”、“紊乱”或“病症”指对正常功能的破坏或干扰，并不限于任何特定病症，且包括疾病或紊乱。
本文所用术语“出血性病症”或“出血性疾病”指存在血液凝固异常的病症，例如，血液凝固能力降低或不足和/或异常出血(内部和/或外部)，例如，出血过多。
如本文所用，对象具有发展出疾病或病症或其复发或重新恶化的“风险”可能或可能不具有可检测的疾病或疾病的症状，并且在根据本公开治疗之前可能或可能没有显示出可检测的疾病或疾病的症状。“具有风险”表示对象具有一种或多种风险因素，这些风险因素是与疾病或病症的发展相关的可测参数，如本领域已知和/或本文所述的。
本文所用术语“治疗”或“处理”包括给予本文所述的蛋白质从而降低或消除特定疾病或病症的至少一种症状或减缓该疾病或病症的进展。
本文所用术语“预防”、“阻止”或“避免”包括提供关于个体中出血性疾病或出血性疾病的发生或复发的预防。个体可能倾向于或有风险发展出疾病或疾病复发，但尚未被诊断患有该疾病或复发。
“有效量”指按照一定剂量和必要时程至少能够有效实现所需效果的量。例如，所需结果可能是治疗性或预防性结果。可在一次或多次给药中给予有效量。在本公开的一些实例中，术语“有效量”意指实现对前述疾病或病症治疗所必需的量。在本公开的一些实例中，术语“有效量”意指实现对前述疾病或病症相关的因子变化所必需的量。例如，有效量可足以实现凝结水平的变化。有效量可以根据待治疗的疾病或病症或待改变的因素以及根据体重、年龄、种族背景、性别，健康和/或身体状况以及与所治疗的哺乳动物相关的其他因素而变化。通常，有效量将落入相对宽的范围(例如“剂量”范围)，其可以通过常规试验和医师的实验来确定。因此，该术语不应被解释为将本公开限制于特定量，例如结合蛋白质的重量或数量。有效量可以在治疗期间以单剂量或以重复一次或数次的剂量给予。
“治疗有效量”是至少实现特定疾病或病症可测量改善所需的最小浓度。本文所述治疗有效量可以根据诸如患者的疾病状态、年龄、性别和体重等因素以及抗体或其抗原结合片段在个体中引发所需反应的能力而变化。治疗有效量也是抗体或其抗原结合部分的治疗有益效果胜过毒性或有害效果的量。在一个实例中，治疗有效量应被理解为指足以减少或抑制出血性疾病或其并发症的一种或多种症状的膜靶向结合蛋白的量。
本文所用术语“预防有效量”应理解为指足以预防或抑制或延迟出血性疾病或其并发症的一种或多种可检测症状发生的膜靶向结合蛋白的量。
本文所用术语“对象”应理解为指包括人的任何动物，例如哺乳动物。示例性对象包括但不限于人和非人灵长类动物。例如，该对象是人。
凝血因子本公开提供了结合至少一种凝血因子的膜靶向结合蛋白。
血液凝固通过多个阶段的级联作用发生，包括释放若干凝血因子，最终导致含有不溶性纤维蛋白的血凝块的形成。示例性的凝血因子包括但不限于，因子I(纤维蛋白原)，因子II(凝血酶原/凝血酶)，因子III(组织因子)，因子V(不稳定因子)，因子VII(前转变素(Proconvertin))，因子VIII(抗血友病因子)，因子IX(克雷司马斯因子(Christmasfactor))，因子X(斯图尔特-普劳厄因子(Stuart-Prower factor))，因子XI(血浆促凝血酶原激酶前因物(antecedent))，因子XII(哈格曼(Hageman)(接触)因子)和因子XIII(纤维蛋白稳定因子/前激肽释放酶(弗莱彻(Fletcher))因子/HMWK(菲茨杰拉德(Fitzgerald))因子)。
在一个实例中，本公开提供了包含特异性结合凝血因子的第一结合区的膜靶向结合蛋白。
在一个实例中，凝血因子是因子VIII。仅为了命名的目的而非限制，人因子VIII的示例性序列示于NCBI参考序列NP_000123中，NCBI蛋白质登录号NM_000132.3和在SEQ IDNO:21中。
在一个实例中，凝血因子是因子IX。仅为了命名的目的而非限制，人因子IX的示例性序列示于GenBank编号AAA98726.1和SEQ ID NO:22中。
在一个实例中，凝血因子是因子X。仅为了命名的目的而非限制，人因子X的示例性序列示于基因编号:2159和SEQ ID NO:23中。
仅为了命名的目的而非限制，人因子I的示例性序列示于NCBI参考序列编号NM_000508(α链)和NM_005141(β链)中，人因子II的示例性序列示于参考序列编号NM_000506，人因子III的示例性序列示于参考序列编号NM_001993，人因子V的示例性序列示于参考序列编号NM_000130，人因子VII的示例性序列示于参考序列编号NM_00131，人因子XI的示例性序列示于参考序列编号NM_000128，人因子XII的示例性序列示于参考序列编号NM_000505，人因子XIII的示例性序列示于参考序列编号NM_000129(A链)和NM_001994(B链)。
可以使用本文提供的序列和/或在公共数据库中的和/或使用标准技术确定凝血因子的其他序列(例如，如Ausubel等，(编辑)，《新编分子生物学实验指南》)，格林出版联合公司和韦利科学公司(Current Protocols in Molecular Biology,GreenePub.Associates and Wiley-Interscience)(1988，包括直到现在的所有更新)或Sambrook等，分子克隆：实验室手册》，冷泉港实验室出版社(Molecular Cloning：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press)(1989))。
本公开的膜靶向结合蛋白还可以结合凝血因子的重组形式。
本公开的膜靶向结合蛋白还可以结合凝血因子的修饰形式。凝血因子的修饰形式为本领域已知并且述于，例如，Morfini和Zanon Expert Opinion on Emerging Drugs,21:301-313,2016或Peyvandi等,Journal of Thrombosis and Haemostasis,11:84–98,2013中。凝血因子的示例性修饰形式包括，截短蛋白质，PEG化蛋白质，糖PEG化(glycopegylated)蛋白质，Fc融合蛋白，白蛋白融合蛋白，白蛋白偶联物，单链蛋白和这类修饰的混合情况。因子VIII的修饰形式包括，B结构域缺失的形式，PEG化形式，Fc融合形式，单链形式和其混合物，如图罗革尔法(Turoctocog alfa)，图罗革尔法贝吉(Turoctocogalfa Pegol)，西蒙革尔法(Simoctocog alf)，戴蒙革尔法贝吉(Damoctocog alfa pegol)，欧革尔法贝吉(Octocog alfa pegol)，约诺革尔法(Ionoctocog alfa)或尔法革尔法(Efraloctocog alfa)。因子IX的修饰形式包括，PEG化形式，Fc融合形式和白蛋白形式，如奥鹏纳革尔法(Albutrepenonacog alfa)，艾富纳革尔法(Eftrenonacog alfa)或诺纳革尔法贝吉(Nonacog beta pegol)。
结合修饰形式凝血因子的本公开的膜靶向结合蛋白也可结合其内源形式和/或其未修饰的重组形式。
结合蛋白
如本文所讨论，本公开的结合蛋白可以采取各种形式并包含一个或多个结合区。本公开的示例性结合蛋白包含特异性结合凝血因子的第一结合区和特异性结合哺乳动物细胞质膜组分的第二结合区。通常，本公开的第一结合区包含抗体或其抗原结合片段。示例性的结合蛋白和结合区在本文中讨论。
抗体
在一个实例中，本公开的膜靶向结合蛋白包含抗体或其抗原结合片段。基于免疫的方法
用于生成抗体的方法是本领域已知的和/或描述于Harlow和Lane(编)Antibodies:A Laboratory Manual(《抗体：实验室手册》)，冷泉港实验室(1988)。通常，在这些方法中，将蛋白质或免疫原性片段或其表位或表达和展示相同的细胞(即，免疫原)给予非人类动物，例如，小鼠，鸡，大鼠，兔，豚鼠，狗，马，牛，山羊或猪，任选地，与任何合适的或期望的载体、佐剂或药学上可接受的赋形剂一起配制。免疫原可以经鼻内，肌肉内，皮下，静脉内，皮内，腹膜内或通过其他已知途径给药。
可通过在免疫后不同时间点对被免疫动物的血液进行取样来监测多克隆抗体的产生。需要时，可给予一次或多次进一步免疫以达到所需抗体效价。重复加强和滴度测定的过程直至达到合适的滴度。在获得所需免疫原性水平时，对被免疫的动物取血并分离和储存血清，和/或将该动物用于生成单克隆抗体(Mab)。
单克隆抗体是本公开所涵盖的抗体的一种示例性形式。术语“单克隆抗体”或“mAb”指能够结合相同抗原(例如结合抗原内的相同表位)的同质性抗体群体。该术语并不旨在限制抗体的来源或其制备的方式。
对于mAb的生产，可以使用多种已知技术中的任一种，例如US4196265或Harlow和Lane(1988)，同上所例示的方法。
例如，在足以刺激生产抗体的细胞的条件下使用免疫原免疫合适的动物。啮齿类动物(如兔、小鼠和大鼠)是示例性动物。经遗传工程改造以表达人免疫球蛋白且例如不表达鼠免疫球蛋白的小鼠也可被用于生成本发明的抗体(例如，参见WO2002066630)。
免疫后，选择具有生产抗体潜能的体细胞，例如，B淋巴细胞(B细胞)用于Aab生成方案。这些细胞可获自脾、扁桃体或***的活检样品，或者来自外周血样品。随后将来自免疫的动物的B细胞与永生骨髓瘤细胞的细胞融合，其通常来源于与使用免疫原免疫的动物相同的物种。
通过在选择性培养基中培养来扩增杂交体，该选择性培养基包含阻止组织培养基中核苷酸从头合成的试剂。示例性的试剂是氨蝶呤、甲氨蝶呤和重氮丝氨酸。
针对抗体特异性和/或效价对扩增的杂交瘤进行功能性选择，例如通过流式细胞术和/或免疫组化和/或免疫试验(例如放射性免疫试验、酶免疫试验、细胞毒性试验、空斑试验、斑点免疫试验等)。
或者，使用ABL-MYC技术(新克隆公司(Neoclone)，威斯康星州麦迪逊53713，美国)以生产分泌MAb的细胞系(例如，参见Largaespada等，J.Immunol.Methods.197:85-95,1996)。
基于文库的方法
本公开还包括筛选抗体或其抗原结合片段(例如，包含其可变区)的文库。
本公开所涵盖的文库的实例包括初始文库(libraries，源自未经刺激(unchallenged)的对象)、经免疫文库(源自用抗原免疫过的对象)或合成文库。通过常规技术(例如，如Sambrook和Russell编，《分子克隆：实验室手册》第三版第1-3卷，冷泉港实验室出版社，2001中所述)克隆编码抗体或其区域的核酸，并将其用于以本领域已知的方法编码和展示蛋白质。用于产生蛋白质文库的其它技术描述于例如US6300064(例如，MorphosysAG公司的HuCAL文库)；US5885793；US6204023；US6291158；或US6248516中。
根据本公开的抗原结合片段可以是可溶性分泌蛋白质，或者可以作为融合蛋白展示于颗粒(例如，噬菌体或其它病毒、核糖体或孢子)或细胞表面上。各种展示文库形式在本领域中是已知的。例如，文库是体外展示文库(例如，核糖体展示文库、共价展示文库或mRNA展示文库，例如，如US7270969中所述)。在另一个实例中，展示文库是噬菌体展示文库，其中，包含抗体的抗原结合片段的蛋白质在噬菌体上表达，例如如US6300064；US5885793；US6204023；US6291158；或US6248516所述。其它噬菌体展示方法是本领域已知的，并且为本公开所涵盖。类似地，细胞展示的方法也为本公开所涵盖，例如细菌展示文库，例如US5516637中所述；酵母展示文库，例如如US6423538所述，或哺乳动物展示文库。
筛选展示文库的方法是本领域已知的。在一个实例中，使用亲和纯化筛选本公开的展示文库，例如如Scopes所述(《蛋白质纯化：原理和实践》第三版中，(Proteinpurification：principles and practice，Third Edition)Springer Verlag公司，1994)。亲和纯化方法通常包括使包含文库展示的抗原结合片段的蛋白质与靶抗原(例如，IL-3Rα)接触，并且在洗涤后洗脱那些仍然结合抗原的结构域。
如果需要，通过筛选鉴定的任何可变区或scFv很容易修饰成完整的抗体。将可变区或scFv修饰或重排成完整抗体的示例性方法描述于例如Jones等，J ImmunolMethods.354:85-90,2010；或Jostock等，J Immunol Methods,289:65-80,2004；或WO2012040793。或者或另外，采用标准克隆方法，例如，如Ausubel等(刊于：《新编分子生物学方法》(Current Protocols in Molecular Biology)，韦利科学出版社；ISBN 047150338,1987)和/或Sambrook等(刊于：《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)，冷泉港实验室出版社，纽约，第三版2001)中所述。
去免疫化的、嵌合的、人源化的、同人源化的、灵长类化的和人抗体或抗原结合片 段
本公开的抗体或抗原结合片段可以是经人源化的。
术语“人源化抗体”应理解为指包含人样可变区(human-like variable region)的蛋白质，其包含移植于源自人抗体的FR上或***源自人抗体的FR中的源自非人物种(如小鼠或大鼠或非人灵长类动物)抗体的CDR(该抗体类型也称为“CDR移植抗体”)。人源化抗体还包含下述抗体：其中人蛋白质的一个或多个残基被一个或多个氨基酸取代修饰和/或人抗体的一个或多个FR残基被相应非人残基替代。人源化抗体还可包含在人抗体和非人抗体中均不存在的残基。该抗体的任何其他区域(如Fc区)通常是人的。可使用本领域已知的方法进行人源化，例如US5225539、US6054297、US7566771或US5585089。术语“人源化抗体”还包括超人源化抗体，例如如US7732578中所述。类似的含义将用于术语“人源化抗原结合片段”。
本公开的抗体或抗原结合片段可以是人抗体或其抗原结合片段。本文所用术语“人抗体”指具有人中所见可变抗体区域和可选的恒定抗体区域的抗体，“人中所见“例如人生殖细胞或体细胞中所见或来自使用这类区域生成的文库。此类“人”抗体可包含不是由人序列编码的氨基酸残基，例如通过体外随机或定点突变导入的突变(特别是涉及少量蛋白质残基(例如该蛋白质的残基中的1、2、3、4或5个)中的保守取代或突变的突变)。这些“人抗体”无需作为人免疫应答的结果而生成，而是可采用重组方式(如筛选噬菌体展示文库)和/或通过包含人抗体恒定和/或可变区编码核酸的转基因动物(如小鼠)和/或采用定向选择(例如US5565332中所述)来产生。该术语还包括这类抗体的亲和成熟形式。就本公开而言，人抗体也可被认为包含如下蛋白质：该蛋白质包含源自人抗体的FR或含有源自人FR共有序列的序列的FR且其中一个或多个CDR是随机或半随机的，例如如US6300064和/或US6248516中所述。类似的含义将用于术语“人抗原结合片段”。
本公开的抗体或抗原结合片段可以是同人源化(synhumanized)抗体或其抗原结合片段。术语“同人源化抗体”是指通过WO2007019620中所述方法制备的抗体。同人源化蛋白包含抗体的可变区，其中该可变区包含源自新世界(New World)灵长类动物抗体可变区的FR和源自非新世界灵长类动物抗体可变区的CDR。
本公开的抗体或抗原结合片段可以是灵长类化的。“灵长类化抗体”包含源自抗体的可变区，该抗体在非人灵长类动物(如猕猴)的免疫后产生。可任选地，该非人灵长类动物抗体的可变区与人恒定区相连以产生灵长类化抗体。用于生产灵长类化抗体的示例性方法描述于US6113898。
在一个实例中，本公开的抗体或抗原结合片段是嵌合抗体或片段。术语“嵌合抗体”或“嵌合抗原结合片段”是指如下抗体或片段：其中的一种或更多种的可变结构域源自特定物种(例如，鼠，如小鼠或大鼠)或属于特定抗体类或亚类，而该抗体或片段的其余部分源自其他物种(例如，人或非人灵长类动物)或属于另一抗体类或亚类。在一个实施例中，嵌合蛋白包含源自非人抗体(例如，鼠抗体)的VH和/或VL且该抗体的其余部分源自人抗体。这类嵌合抗体和其抗原结合片段的生产是本领域已知的且可通过标准方法实现(描述于例如US6331415；US5807715；US4816567和US4816397)。
本公开还涉及去免疫化抗体或其抗原结合片段，例如，如WO200034317和WO2004108158中所述。去免疫化抗体和片段去除(即突变)一个或多个表位(如B细胞表位或T细胞表位)，从而降低对象发生针对该抗体或蛋白质的免疫应答的可能性。例如，分析本公开的抗体以鉴定一个或多个B或T细胞表位，并且突变表位内的一个或多个氨基酸残基从而降低抗体的免疫原性。
双特异性抗体
本公开的抗体或抗原结合片段可以是双特异性抗体或其片段。例如，抗体或片段可以结合两个或更多个凝血因子。在另一实例中，双特异性抗体或片段可以结合凝血因子和哺乳动物细胞质膜组分。双特异性抗体是包含对不同抗原或表位具有特异性的两种类型的抗体或抗体片段(例如，两个半抗体)的分子。示例性的双特异性抗体结合相同蛋白质的两个不同表位。或者，双特异性抗体结合两个不同蛋白质上的两个不同表位。
示例性的“钥匙和匙孔”或“球和孔”双特异性蛋白，如US5731168中所述。例如，恒定区(例如，IgG4恒定区)包含T366W突变(或球)，而恒定区(例如，IgG4恒定区)包含T366S、L368A和Y407V突变(或孔)。在另一实例中，第一恒定区包含T350V、T366L、K392L和T394W突变(球)，而第二恒定区包含T350V、L351Y、F405A和Y407V突变(孔)。
用于生产双特异性蛋白质的方法是本领域已知的并且描述于本文中。
在一个实例中，IgG型双特异性抗体由杂交杂交瘤(四价体瘤(quadroma))分泌，所述杂交杂交瘤由阐释IgG抗体的两种类型的杂交瘤形成(Milstein C等,Nature 1983,305:537-540)。在另一实例中，可以通过将构成对共表达感兴趣的两种IgG的L链和H链的基因导入细胞来分泌抗体(Ridgway,JB等.Protein Engineering 1996,9:617-621；Merchant,AM等Nature Biotechnology 1998,16:677-681)。
在一个实例中，双特异性抗体片段通过化学交联源自不同抗体的Fab'制备(KelerT等.Cancer Research 1997,57:4008-4014)。
在一个实例中，将源自Fos和Jun的亮氨酸拉链用于形成双特异性抗体片段(Kostelny SA等J.of Immunology,1992,148:1547-53)。
在一个实例中，以双抗体的形式制备双特异性抗体片段，所述双抗体包含两个交叉scFv片段(Holliger P等Proc.of the National Academy of Sciences of the USA1993,90:6444-6448)。
还可以制备多特异性蛋白质，其结合两个或更多个凝血因子和哺乳动物细胞质膜的组分，例如，三特异性分子。
抗体片段
单结构域抗体
在一些实例中，本公开抗体的抗原结合片段是或包含单域抗体(其可与术语“结构域抗体”或“dAb”互换使用)。单域抗体是包含抗体重链可变结构域的全部或部分的单条多肽链。
双抗体、三抗体、四抗体
在一些实施例中，本公开的抗原结合片段是或包含双抗体、三抗体、四抗体或更高级的蛋白复合物，如WO98/044001和/或WO94/007921中所述的那些。
例如，双抗体是包含两个相关多肽链的蛋白质，各多肽链包含结构VL-X-VH或VH-X-VL，其中X是包含不足残基以允许单条多肽链中VH和VL连接(或形成Fv)的接头或者是缺失的，并且其中一个多肽链的VH结合另一多肽链的VL以形成抗原结合位点，以形成抗体结合位点，即形成能够特异性结合一种或多种抗原的Fv分子。各多肽链中VL和VH可以是相同的或者各多肽链中VL和VH可以是不同的，从而形成双特异性双抗体(即包含具有不同特异性的两个Fv)。
单链Fv(scFv)片段
本领域技术人员应意识到，scFv包含单条多肽链中的VH和VL区以及VH和VL之间的多肽接头(其促使scFV形成用于抗原结合的所需结构，即用于使单条多肽链的VH和VL彼此连接以形成Fv)。例如，该接头包含超过12个氨基酸残基与(Gly4Ser)3，其是scFV的较有利接头之一。
在一个实例中，接头包含序列SGGGGSGGGGSGGGGS。
本发明还涉及二硫键稳定化的Fv(或diFv或dsFv)，其中单个半胱氨酸残基被导入VH的FR和VL的FR并通过二硫键连接半胱氨酸残基以生成稳定的Fv。
或者或此外，本发明包括二聚体scFv，即包含通过非共价或共价连接(例如通过亮氨酸拉链结构域(如来源于Fos或Jun))相连的两个scFV分子。或者，通过足够长的肽接头连接两个scFv以允许两个scFv形成并结合抗原，如US20060263367中所述。
半抗体
在一些实例中，本公开的抗原结合片段是半抗体或半分子。本领域的技术人员将意识到，半抗体指包含单条重链和单条轻链的蛋白质。术语”半抗体“还涵盖包含抗体轻链和抗体重链的抗体，其中，抗体重链已经突变成防止与另一抗体重链相关联。在一个实例中，当抗体解离从而形成各自含有单条重链和单条轻链的两个分子时，形成“半抗体”。
用于生产半抗体的方法是本领域已知的并且描述于本文中。
在一个实例中，可以通过将构成期望表达的IgG的单条重链和单条轻链导入细胞来分泌半抗体。在一个实例中，恒定区(例如，IgG4恒定区)包含“钥匙和匙孔”(或“球和孔”)突变以防止异二聚体形成。在一个实例中，恒定区(例如，IgG4恒定区)包含T366W突变(或球)。在另一个实例中，恒定区(例如，IgG4恒定区)包含T366S、L368A和Y407V突变(或孔)。在另一实例中，恒定区包含T350V、T366L、K392L和T394W突变(球)。在另一实例中，恒定区包含T350V、L351Y、F405A和Y407V突变(孔)。示例性的恒定区氨基酸取代根据EU编码***进行编码。
其他抗体和抗体片段
本公开还涉及其他抗体和抗体片段，如：
(i)微小抗体(minibody)，例如如US5837821中所述；
(ii)异源偶联蛋白，例如如US4676980中所述；
(iii)使用化学交联剂生产的异源偶联蛋白，如US4676980中所述；以及
(iv)Fab3(例如如EP19930302894中所述)。
稳定化的蛋白质
本公开的结合蛋白可以包含IgG4恒定区或稳定化的IgG4恒定区。术语“稳定化的IgG4恒定区”应理解为指经修饰以降低Fab臂交换或发生Fab臂交换的倾向性或形成半抗体或形成半抗体的倾向的IgG4恒定区。“Fab臂交换”指人IgG4的一种蛋白质修饰类型，其中IgG4重链和与之结合的轻链(半分子)被交换成源自另一IgG4分子的重链-轻链对。这样，IgG4分子可能获得识别两种不同抗原的两个不同的Fab臂(形成双特异性分子)。Fab臂交换在体内自然发生并可在体外用纯化的血细胞或还原剂(如还原型谷胱甘肽)诱导。
在一个实例中，稳定化的IgG4恒定区包含根据Kabat***(Kabat等，Sequences ofProteins of Immunological Interest(免疫学感兴趣的蛋白质序列)，华盛顿特区，美国，健康与人类服务部，1987和/或1991)确定的铰链区第241位处的脯氨酸。该位置对应于根据EU编码***(Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫学感兴趣的蛋白质序列)，华盛顿特区，美国，健康与人类服务部，2001和Edelman等，Proc.Natl.Acad.USA,63,78-85,1969)确定的铰链区第228位。在人IgG4中，该残基通常是丝氨酸。在用脯氨酸取代丝氨酸后，该IgG4铰链区包含序列CPPC。就此而言，本领域技术人员应理解，“铰链区”是连接Fc和Fab区的抗体重链恒定区的富脯氨酸部分，其赋予抗体两条Fab臂移动性。该铰链区包含半胱氨酸残基，其涉及重链间二硫键。根据Kabat的编号***，其通常定义为从人IgG1的Glu226至Pro243。可通过形成重链间二硫(S-S)键的第一和最后一个半胱氨酸残基的对其来进行其他IgG同种型的铰链区与IgG1序列的比对(参见例如WO2010080538)。
免疫球蛋白和免疫球蛋白片段
本公开的结合蛋白的实例是包含免疫球蛋白可变区的蛋白质，例如T细胞受体或重链免疫球蛋白(例如，IgNAR，骆驼抗体)。
重链免疫球蛋白
重链免疫球蛋白在结构上与许多其他形式的免疫球蛋白(例如抗体)不同在于虽然其包含重链，但不包含轻链。因此，这些免疫球蛋白也被称为“仅重链抗体”。重链免疫球蛋白存在于例如骆驼科动物和软骨鱼中(也称作IgNAR)。
天然重链免疫球蛋白中的可变区通常称作骆驼科Ig中的“VHH结构域”和IgNAR中的V-NAR，从而将其与常规四链抗体中的重链可变区(其称作“VH结构域”)和常规四链抗体中的轻链可变区(其称作“VL结构域)区分开。
重链免疫球蛋白不需要轻链的存在来实现与相关抗原的高亲和力和高特异性结合。这意味着单结构域结合片段可以衍生自重链免疫球蛋白，它们易于表达并且通常是稳定和可溶的。
源自骆驼科的重链免疫球蛋白及其可变区和其生产和/或分离和/或使用方法的一般描述参见以下参考文献(但不限于此)：WO94/04678、WO97/49805和WO 97/49805。
源自软骨鱼的重链免疫球蛋白及其可变区和其生产和/或分离和/或使用方法的一般描述参见WO2005118629(但不限于此)。
V-样蛋白
在一个实例中，本公开的结合蛋白包含T细胞受体。T细胞受体具有两个V结构域，其结合成类似于抗体Fv模块的结构。Novotny等，Proc Natl Acad Sci USA 88：8646-8650,1991描述了T细胞受体的两个V-结构域(称为α和β)如何融合并表达为单链多肽，以及如何改变表面残基以类似于抗体scFv地直接降低疏水性。描述包含两个V-α和V-β结构域的单链T细胞受体或多聚体T细胞受体的生产的其他公开文献包括WO1999045110或WO2011107595。
包含抗原结合结构域的其它非抗体蛋白包括通常为单体的具有V样结构域的蛋白质。包含这种V样结构域的蛋白质的实例包括CTLA-4、CD28和ICOS。包含这种V样结构域的蛋白质的进一步公开包括在WO1999045110中。
附着连接蛋白(adnectin)
在一个实例中，本公开的结合蛋白包含附着连接蛋白。附着连接蛋白基于人纤维连接蛋白的第十纤连蛋白III型(10Fn3)结构域，其中环区被改变以赋予抗原结合能力。例如，可以对10Fn3结构域β-夹心的一端的三个环进行工程改造以使附着连接蛋白能够特异性识别抗原。更详细内容参见US20080139791或WO2005056764。
抗运载蛋白(Anticalins)
在另一个实例中，本公开中的结合蛋白是抗运载蛋白。抗运载蛋白衍生自脂质运载蛋白，其是运输小疏水分子如类固醇、胆汁三烯、类维生素A和脂质的胞外蛋白家族。脂质运载蛋白具有刚性β-折叠二级结构，在锥形结构的开口端具有多个环，其可被工程化改造以结合抗原。这种工程化改造的脂质运载蛋白被称为抗运载蛋白。有关抗运载蛋白的进一步描述，请参见US7250297或US20070224633。
亲和体
在另一个实例中，本公开中的结合蛋白是亲和体。亲和体是衍生自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)蛋白A的Z结构域(抗原结合结构域)的骨架，可被工程化改造以结合抗原。Z结构域由约58个氨基酸的三螺旋束组成。已通过表面残基的随机化产生文库。详见EP1641818。
高亲合性多聚体(Avimer)
在另一个实例中，本公开中的结合蛋白是高亲合性多聚体。高亲合性多聚体是衍生自A结构域骨架家族的多结构域蛋白。约35个氨基酸的天然结构域采用确定的二硫键合结构。多样性产生于A结构域家族所展示的自然变异的改组。详见WO2002088171。
DARP蛋白(DARPin)
在另一个实例中，本公开中的结合蛋白包含设计的锚蛋白重复蛋白(DesignedAnkyrin Repeat Protein，DARPin)。DARP蛋白衍生自锚蛋白，是介导整合膜蛋白与细胞骨架附着的蛋白家族。单个锚蛋白重复是由两个α-螺旋和一个β-转角组成的33个残基基序。它们可以被工程化改造成通过随机化每个重复的β-转角和第一α-螺旋中的残基来结合不同的靶抗原。可以通过增加模块数量(亲和力成熟法)来增加它们的结合界面。详见US20040132028。
膜联蛋白
在一个实例中，本公开的结合蛋白包含膜联蛋白。
膜联蛋白，也称为脂皮质素，形成可溶性蛋白质家族，其以Ca2+依赖性方式结合暴露带负电磷脂，特别是磷脂酰丝氨酸(PS)的膜。膜联蛋白通过高度保守的70个氨基酸结构域的四倍(特殊地为八倍)重复和通过可变氨基(N)-末端结构域形成，这被认为是其功能特异性的原因。膜联蛋白在各种细胞和生理过程中是重要的，如提供膜支架，这与细胞形状的变化相关。膜联蛋白还已经显示出参与囊泡的运输和组织，胞吐作用，胞吞作用以及钙离子通道形成。
已知II、V和XI类膜联蛋白位于细胞膜内。膜联蛋白A5是丰度最高的膜结合膜联蛋白支架。膜联蛋白A5在与膜的磷脂酰丝氨酸单元结合时可形成二维网络。膜联蛋白A5在内吞作用和胞吐作用以及其他细胞膜过程中有效稳定细胞形态的变化。
I类膜联蛋白(或膜联蛋白A1)优先位于质膜的胞质面，并与膜的磷脂酰丝氨酸单元结合。膜联蛋白A1不在活化的膜上形成二维网络。
在一个实例中，膜联蛋白物质是膜联蛋白衍生物或其变体。本领域已知膜联蛋白衍生物或其变体，并且本文公开了示例性衍生物或变体。例如，膜联蛋白变体/衍生物公开于WO199219279，WO2002067857，WO2007069895，WO2010140886，WO2012126157，Schutters等，Cell Death and Differentiation 20:49–56，2013，或Ungethüm等，J Biol Chem.，286(3):1903-10，2011。
例如，膜联蛋白衍生物可以被截短，例如，包括一个或多个结构域或比天然蛋白质更少的氨基酸残基，或者可以含有取代的氨基酸。在一个实例中，膜联蛋白衍生物是截短膜联蛋白1。例如，截短膜联蛋白1不包含N-末端自切割位点(例如，缺失了41个N-末端氨基酸)。在一个实例中，修饰的膜联蛋白可具有包含氨基酸延伸的N-末端螯合位点，如X1-Gly-X2，其中X1和X2选自Gly和Cys。在一个实例中，膜联蛋白衍生物或修饰的膜联蛋白与磷脂酰丝氨酸结合。在一个实例中，膜联蛋白衍生物或修饰的膜联蛋白以与也野生型膜联蛋白相似的水平结合磷脂酰丝氨酸。例如，膜联蛋白衍生物或修饰的膜联蛋白以与野生型膜联蛋白相同的水平结合磷脂酰丝氨酸。
在一个实例中，本公开的膜靶向结合蛋白包含第二结合区，所述第二结合区是膜联蛋白A5。在另一实例中，本公开的膜靶向结合蛋白包含第二结合区，所述第二结合区是膜联蛋白A1。在一个实例中，本公开的膜靶向结合蛋白包含抗体或其部分，其中抗体的各重链连接膜联蛋白，所述膜联蛋白结合质膜上的组分。例如，膜靶向结合蛋白包含全长抗体，所述全长抗体包含各自连接膜联蛋白(如膜联蛋白A5或膜联蛋白A1)的两条重链。在另一实例中，本公开的膜靶向结合蛋白是包含与结合区连接的单条重链的半抗体，所述结合区包含膜联蛋白，如膜联蛋白A5或膜联蛋白A1。仅为了命名的目的而非限制，基因登录编号308、NCBI参照序列NP_001145和/或SEQ ID NO:14中教导了膜联蛋白A5的氨基酸序列。在一个实例中，膜联蛋白具有与膜联蛋白A5序列90％或95％相同的序列。在一个实例中，膜联蛋白是包含SEQ ID NO:26中所示序列的膜联蛋白变体。仅为了命名的目的而非限制，NCBI参照序列NP_000691.1和/或SEQ ID NO:29中教导了膜联蛋白A1的氨基酸序列。在一个实例中，膜联蛋白具有与膜联蛋白A1序列90％或95％相同的序列。在一个实例中，膜联蛋白是包含SEQID NO:30中所示序列的截短膜联蛋白A1。
富含γ-羧基谷氨酸(GLA)结构域
在一个实例中，本公开的膜靶向结合蛋白包含富含γ-羧基谷氨酸(GLA)的结构域或其变体。
GLA结构域含有谷氨酸残基，所述谷氨酸残基已经通过维生素K依赖性羧化作用进行翻译后修饰以形成γ-羧基谷氨酸(Gla)。
已知包含GLA结构域的蛋白质是本领域已知的，包括但不限于，维生素K依赖性蛋白质S和Z，凝血酶原，转甲状腺素蛋白，骨钙蛋白，基质GLA蛋白，间-α-胰蛋白酶抑制剂重链H2和生长抑制特异性蛋白6。
乳凝集素结构域
在一个实例中，本公开的膜靶向结合蛋白包含乳凝集素结构域。
乳凝集素是由各种细胞类型分泌的糖蛋白并且包含两个EGF结构域和两个C结构域(C1C2和C2)，其与凝血因子V和VIII的C1和C2结构域具有序列同源性。与这些凝血因子相似，乳凝集素以高亲和力结合含磷脂酰丝氨酸(PS)的膜。
在一个实例中，乳凝集素结构域是C1C2结构域(例如，如SEQ ID NO:27所示)。在另一实例中，乳凝集素结构域是C2结构域。
蛋白激酶结构域
在一个实例中，本公开提供了包含蛋白激酶C结构域的膜靶向结合蛋白。
蛋白激酶C(PKC)是这样的蛋白激酶家族或该家族的成员：涉及通过使其他蛋白质上的丝氨酸和苏氨酸氨基酸残基的羟基基团磷酸化来控制这些蛋白质的功能。
PKC的结构为本领域已知并且由通过铰链区栓系在一起的调节结构域和催化结构域组成。调节结构域包含C1和C2结构域，它们分别结合DAG和Ca2+，以招募PKC至质膜。
在一个实例中，蛋白激酶C结构域是C1结构域。在另一个实例中，蛋白激酶C结构域是C2结构域。
普列克底物蛋白同源结构域
在一个实例中，本公开提供了包含普列克底物蛋白同源性(PH)结构域的膜靶向结合蛋白。
PH结构域为本领域已知并且是小模块化结构域，其存在于涉及细胞内信号传导的多种蛋白质中或作为细胞骨架的组成部分。PH结构域包含大约120个氨基酸。该结构域可以结合生物膜内的磷脂酰肌醇和蛋白质，如异源三聚体G蛋白的β/γ亚基。通过这些相互作用，PH结构域在将蛋白质募集至不同的膜中起作用，从而将它们靶向适当的细胞区室或使它们能够与信号转导途径的其他组分相互作用。
磷脂酰丝氨酸相互作用肽
在一个实例中，本公开提供了包含磷脂酰丝氨酸相互作用肽的膜靶向结合蛋白以靶向膜组分。合适的肽为本领域已知并且包括例如，Thapa等,J.Cell.Mol.Med.12.1649-1660,2008和Kim等,PLOS One,10(3):e0121171中所述的PSP1。PSP1包含序列CLSYYPSYC(SEQ ID NO:28)。本公开还涵盖了这样的PSP1的变体，其保留了其结合磷脂酰丝氨酸的能力。
在一个实例中，本公开的膜靶向结合蛋白包含抗体或其部分，其中抗体的各重链(或轻链)连接PSP1或其变体，所述PSP1或其变体结合质膜的组分。例如，膜靶向结合蛋白包含全长抗体，所述全长抗体包含各自连接PSP1的两条重链(或两条轻链)。在另一实例中，本公开的膜靶向结合蛋白是包含与结合区连接的单条重链(或轻链)的半抗体，所述结合区包含膜PSP1。
接头
在一个实例中，膜靶向结合蛋白的第一结合区经由接头连接第二结合区。例如，接头是接头肽。
在一个实例中，可以在第一和第二结合区之间引入间插肽接头。
在一个实例中，接头是柔性接头。例如，接头将第二结合区的N-末端接合到抗-因子IX抗体或其抗原结合片段的轻链或其结构域或重链或其结构域的N-或C-末端。
“柔性”接头是在溶液中不具有固定结构(二级或三级结构)的氨基酸序列。因此，这类柔性接头可以自由地接受各种构象。本领域已知适合用于本公开的柔性接头。用于本发明的柔性接头的实例是接头序列SGGGGS/GGGGS/GGGGS或(Gly4Ser)3。柔性接头还公开于WO1999045132。
接头可包含基本上不妨碍结合区与其靶标相互作用的任何氨基酸序列。柔性接头序列优选的氨基酸残基包括但不限于，甘氨酸，丙氨酸，丝氨酸，苏氨酸脯氨酸，赖氨酸，精氨酸，谷氨酰胺和谷氨酸。
结合区之间的接头序列优选包含五个或更多个氨基酸残基。根据本公开的柔性接头序列由5个或更多个残基组成，优选地，5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20或更多个残基。在本发明的一个高度优选的实施方式中，柔性接头序列由5、7、10或16个残基组成。
在一实例中，柔性接头具有根据SEQ ID NO:20，即SGGGGSGGGGSGGGGS(GS16)的氨基酸序列。
在另一实例中，接头具有氨基酸序列SG(GS2)。
在一实例中，柔性接头具有根据SEQ ID NO:24，即SGGGGS(GS6)的氨基酸序列。
在一实例中，柔性接头具有根据SEQ ID NO:25，即SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(GS31)的氨基酸序列。
在一个实例中，接头是刚性接头。“刚性接头”(包括“半刚性接头”)指柔韧性有限的接头。例如，相对刚性接头包含序列(EAAAK)n，其中n在1至3之间。n的值可以在1至约100之间或约1至100之间。例如，n至少为1，或至少为2，或至少为3，或至少为4，或至少为5，或至少为6，或至少为7，或至少为8，或至少为9，或至少为10。在一个实例中，n不小于100。例如，n小于90，或小于约80，或小于约60，或小于约50，或小于约40，或小于约30，或小于约20，或小于约10。刚性接头不需要完全缺失柔韧性。
在一个实例中，接头是可切割接头。例如，接头包含肽酶的切割位点。例如，接头包含尿激酶、尿激酶原、纤溶酶、纤溶酶原、TGFβ，葡萄球菌激酶、凝血酶、凝血因子(例如，因子IXa，因子Xa)或金属蛋白酶(如间质胶原酶)的切割位点。示例性的可切割接头述于US6,004,555、US5,877,289、US6,093,399和US5,877,289。
质膜靶标
本公开提供了特异性结合哺乳动物细胞质膜组分的膜靶向结合蛋白。例如，膜靶向结合蛋白经由结合区结合组分。结合蛋白与哺乳动物细胞质膜组分的结合增强结合蛋白的活性。
本领域已知质膜靶标。示例性的质膜靶标包括但不限于氨基磷脂，和膜相关多肽。
在一个实例中，膜相关多肽不是凝血因子。在一个实例中，膜相关多肽不是因子X/Xa。在一个实例中，如果第一结合区结合因子IX/IXa，那么膜相关多肽不是因子X/Xa。
氨基磷脂
在一个实例中，本公开提供了特异性结合哺乳动物细胞质膜上氨基磷脂的膜靶向结合蛋白。
术语“氨基磷脂”涵盖含有一个或多个氨基的任何磷脂。氨基磷脂位于健康哺乳动物细胞质膜的内表面。然而，在细胞衰老、细胞凋亡和免疫细胞活化期间，氨基磷脂易位至质膜的外表面。氨基磷脂易位至质膜的外表面有助于凝血因子结合。
示例性的氨基磷脂为本领域已知。例如，氨基磷脂是磷脂酰丝氨酸或磷脂酰乙醇胺。
结合氨基磷脂的化合物是本领域已知的并且本文描述了示例性的化合物。例如，结合氨基磷脂的化合物包括膜联蛋白，如上文所讨论的膜联蛋白A5。
膜相关多肽
在一个实例中，本公开提供了特异性结合哺乳动物细胞质膜上膜相关多肽的膜靶向结合蛋白。
示例性的膜相关多肽是本领域已知的并且包括，例如，糖蛋白IIb/IIIa(GPIIb/IIIa)，β-2糖蛋白1(β2GP1)，转录物-1(TLT-1)，凝血因子和选择素。
糖蛋白IIb/IIIa(GPIIb/IIIa)
糖蛋白IIb/IIIa是在血小板上存在的整联蛋白复合物。通常，它是纤维蛋白原和冯维勒布兰德因子的受体，有助于血小板活化。该复合物通过gpIIb和gpIIIa的钙依赖性结合形成，这是正常血小板聚集和内皮粘附的必需步骤。
在一个实例中，本公开提供了特异性结合哺乳动物细胞质膜上GPIIb/IIIa的膜靶向结合蛋白。
结合糖蛋白IIb/IIIa的化合物是本领域已知的并且本文描述了示例性的化合物。例如，糖蛋白IIb/IIIa拮抗剂是可以商购的，包括阿昔单抗(Abciximab)依替巴肽(Eptifibatid)和替罗非班(Tirofiban)
β-2-糖蛋白-1(β2GP1)
β-2-糖蛋白(也称为载脂蛋白H或Apo-H)是38kDa的多功能载脂蛋白，其在人体中由APOH基因编码。β2GP1通过抑制血小板释放血清素参与血小板的凝集。Apo-H通过肝细胞、内皮细胞和滋养层细胞合成。
在一个实例中，本公开提供了特异性结合哺乳动物细胞质膜上β2GP1的膜靶向结合蛋白。
TREM样转录物-1(TLT-1)
TLT-1是属于TREM蛋白质家族的某结合蛋白受体。LT-1存在于血小板和巨核细胞的α-颗粒中。血小板活化后，TLT-1被快速地带到血小板的表面。
在一个实例中，本公开提供了特异性结合哺乳动物细胞质膜上TLT-1的膜靶向结合蛋白。
结合TREM样转录物-1的化合物是本领域已知的并且述于例如US7553936中。
选择素
选择素(分化簇62或CD62)是细胞粘附分子(或CAM)家族。所有选择素都是单链跨膜糖蛋白，由于相关的氨基末端和钙依赖性结合，它们与C型凝集素具有相似的性质。选择素与糖部分结合，因此被认为是一种凝集素类型，一种结合糖聚合物的细胞粘附蛋白。
选择素家族所有三个已知的成员(L-、E-和P-选择素)具有相似的盒结构：N-末端，钙依赖性凝集素结构域，表皮生长因子(EGF)样结构域，可变数量的共有重复单元(对L-、E-和P-选择素分别为2、6和9)，跨膜结构域(TM)和细胞内细胞质尾(cyto)
L-选择素是最小的血管选择素，在所有粒细胞和单核细胞上以及大多数的淋巴细胞上表达，并且可以在大多数白细胞中发现。P-选择素是最大的选择素，储存在血小板的α-颗粒和内皮细胞的怀布尔-帕拉得(Weibel-Palade)小体中，并且易位至活化的内皮细胞和血小板的细胞表面。E-选择素在基线条件下不表达，除了在皮肤微血管中，但是由炎性细胞因子快速诱导。
结合选择素的化合物为本领域已知并述于，例如US5800815(P-选择素)、US5632991(E-选择素)和US5756095(E-和L-选择素)中。
在一个实例中，本公开提供了特异性结合哺乳动物细胞质膜上选择素的膜靶向结合蛋白。例如，选择素是P-选择素。
筛选试验
本领域技术人员能够获得用于筛选特异性结合至少一种凝血因子的膜靶向结合蛋白的合适方法。例如，可以进行筛选以鉴定能够结合凝血因子的结合蛋白。
类似地，可以采用本领域已知的技术来确定或估计适用于本文所述方法的给予膜靶向结合蛋白的量和事件，例如如下所述。
血液凝固试验
本公开提供了包含结合区的膜靶向结合蛋白，所述结合区结合凝血因子。为了确定膜靶向结合蛋白的凝血活性，可以使用体外试验。
在一个实例中，凝血活性指示膜靶向结合蛋白的旁路活性。
在一个实例中，膜靶向结合蛋白的凝血活性可以基于活化的部分促凝血酶原激酶时间(aPTT)测量。例如，将缺乏因子的血浆与磷脂、接触活化剂和不同浓度的膜靶向凝血因子结合蛋白孵育，随后用钙处理。钙的添加引发凝固并开始计时。aPTT是纤维蛋白凝结形成所花费的时间。
aPTT可以使用本领域已知的标准方法或试验来确定，例如，ThrombolyzerCompact X***(Behnk Elektronik公司)。
发现有效增强凝血活性(即，诱导纤维蛋白凝结)的膜靶向结合蛋白被鉴定为本公开的膜靶向结合蛋白。
显色FVIII试验
对于包含结合因子IX的结合区的膜靶向结合蛋白，可以使用显色因子VIII试验测量因子VIII旁路活性。
在一个实例中，将测定缓冲液与因子IXa、因子X和磷脂预混合。添加本发明的膜靶向结合蛋白，然后添加钙和显色底物。停止显色反应后，评估结合蛋白的因子VIII旁路活性。
用于测量因子VIII活性和/或FVIII旁路活性的显色试验为本领域已知并且包括，例如，COATEST SP4FVIII(Chromogeneix公司)。
发现显示出FVIII旁路活性的膜靶向结合蛋白被鉴定为本公开的结合蛋白。
确定亲和力
任选地，确定凝血因子结合区的解离常数(Kd)或结合常数(Ka)或平衡常数(KD)。在一个实例中，结合区(例如，抗体或抗原结合片段)的这些常数通过使用表面等离子体共振试验具有含磷脂酰丝氨酸的固定囊泡的生物传感器测量。示例性的SPR方法述于US7229619。
亲和力测量可以通过抗体反应的标准方法确定，例如，免疫试验，表面等离子共振(SPR)(Rich和Myszka Curr.Opin.Biotechnol 11:54,2000；Englebienne Analyst.123:1599,1998)，等温滴定量热法(ITC)或本领域已知的其他动力学相互作用试验。
体外细胞试验
在一个实例中，膜靶向结合蛋白的摄取和再循环在体外细胞试验中测试。
评估细胞摄取和再循环的方法是本领域已知的和/或示例于本文中。例如，荧光标记的膜靶向结合蛋白与在细胞表面上表达人FcRn受体的细胞一起孵育。在添加标记的膜靶向结合蛋白后，可以追踪结合蛋白再循环的进展并通过共聚焦荧光显微镜与非靶向结合蛋白进行比较。可以鉴定并表征特定膜靶向结合蛋白正常再循环途径的改变。
发现有效再循环的膜靶向结合蛋白被鉴定为本公开的结合蛋白。
凝血酶生成试验
在一个实例中，在凝血酶生成试验中评估内在和/或外在凝血途径的活化。
评估内在和/或外在凝血途径的活化的方法为本领域已知(例如，凝血显微术(Thrombinoscope))和/或本文示例。例如，将膜靶向结合蛋白与内在或外在途径的活化剂，组织因子和磷脂混合。添加Fluo-底物后，监测并计算凝血酶的生成。
发现有效增强内在和/或外在凝血途径的膜靶向结合蛋白被鉴定为本公开的膜靶向结合蛋白。
药代动力学分析
在一个实例中，评估膜靶向结合蛋白的药代动力学(PK)性质。
评估PK性质的方法是本领域已知的和/或示例于本文中。例如，将膜靶向结合蛋白注入表达人FcRn受体的转基因小鼠中。使用采用市售抗体的ELISA评估膜靶向结合蛋白的血浆水平。
体内动物模型
在一个实例中，在出血性疾病的动物模型中测试以膜靶向结合蛋白治疗出血性疾病的方法。
出血性疾病的动物模型法是本领域已知的。可以将膜靶向结合蛋白给予这类动物模型。
在一个实例中，动物模型是血友病模型，例如，血友病A模型。例如，小鼠模型是FVIII敲除小鼠模型，如Bi L.等,1995小鼠因子VIII基因的靶向破坏产生血友病A的模型(Targeted disruption of the mouse factor VIII gene produces a model ofhaemophilia A).Nature Genetics 10(1):119-21中所述的。确定膜靶向蛋白对这类小鼠中凝血的作用，例如，在尾夹试验中。
在一个实例中，将人因子IX和/或人因子X给予FVIII缺陷型小鼠。确定膜靶向蛋白对这类经治疗的FVIII缺陷型小鼠中凝血的作用，例如，在尾夹试验中。
贝塞斯达试验(Bethesda Assay)
在一个实例中，可以使用体外凝血试验来确定针对膜靶向结合蛋白的抑制剂的研究，例如，使用市售可得的试剂盒，例如贝塞斯达试验(亲和生物公司(AffinityBiologicals))和/或FVIII抑制剂试剂盒(泰克尼克公司(Technoclone))。
药物组合物
适当地，在向对象给予本公开的膜靶向结合蛋白的组合物或方法中，如本领域所理解的，将膜靶向结合蛋白与药学上可接受的运载体组合。相应地，本公开还的一个实例提供了包含本公开的膜靶向结合蛋白与药学上可接受的运载体组合的组合物(例如，药物组合物)。
通常，“运载体(carrier)”意指可以安全地给予任何对象(例如，人)的固体或液体填充剂，粘合剂，稀释剂，包封物质，乳化剂，润湿剂，溶剂，悬浮剂，包衣或润滑剂。根据具体的给药途径，可以使用本领域已知的各种可接受的运载体，例如，《雷明顿药物科学》(Remington's Pharmaceutical Sciences)(马克出版公司(Mack Publishing Co.)美国新泽西州,1991)中所述的。
结合至少一种凝血因子的膜靶向结合蛋白可用于胃肠外、外用、口服或局部给药，气雾剂给药或透皮给药，用于预防性或治疗性治疗。在一个实例中，膜靶向结合蛋白通过肠胃外给药，例如皮下或静脉内给予。例如，静脉内给予膜靶向结合蛋白。
待给予的膜靶向结合蛋白的配制将根据所选择的给药途径和制剂(例如，溶液、乳剂、胶囊)而不同。可以在生理上可接受的运载体中制备包含待给予膜靶向结合蛋白的合适药物组合物。对于溶液或乳剂，合适的运载体包括例如水溶液或醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和含缓冲的介质。胃肠道外载剂可包括氯化钠溶液、林格右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸林格溶液或非挥发性油。各种合适的水性运载体是本领域技术人员已知的，包括水、含缓冲的水、含缓冲的盐水、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)、右旋糖溶液和甘氨酸。静脉内载剂可以包括各种添加剂、防腐剂或流体、营养物质或电解质补充剂(通常可参见《雷明顿药物科学》(Remington's Pharmaceutical Science)第16版，Mack编，1980)。组合物可根据需要可任选地含有药学上可接受的辅助物质以接近生理条件，如pH调节和缓冲剂和毒性调节剂，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙和乳酸钠。根据本领域已知的冻干和重建技术，膜靶向结合蛋白可以在使用前冻干储存并在合适的运载体中重建。
治疗或预防出血性疾病的方法如本文所讨论，本公开提供了治疗或预防对象中疾病或病症的方法，所述方法包括向有此需要的对象给予本公开的膜靶向结合蛋白或本公开的组合物。在一个实例中，本发明提供了在有此需要的对象中治疗疾病或病症的方法。
本公开还提供了本公开的膜靶向蛋白在治疗或预防对象中疾病或病症的用途，包括向有此需要的对象给予本公开的膜靶向结合蛋白或本公开的组合物。在一个实例中，本公开提供了本公开的膜靶向结合蛋白在治疗在有此需要的对象中治疗疾病或病症的用途。
在一个实例中，疾病或病症是出血性疾病。
在一个实例中，对象患有出血性疾病。出血性疾病可以遗传的或获得的。例如，患有出血性疾病的对象经受出血性疾病的症状，如：
·容易瘀伤；
·牙龈出血；
·小切口或牙科治疗引起的大量出血；
·不明原因的流鼻血；
·月经期大量出血；
·关节内出血；和/或
·手术后出血过多。
在一个实例中，对象具有发展出血性疾病的风险。如果患者发生出血性的风险高于对照群体，则对象处于危险之中。对照群体可以包括从一般人群中随机选择的一个或多个对象(例如，年龄、性别、种族和/或种族匹配)，其未具有或患有心绞痛、中风和/或心脏病发作的家族史。如果发现与出血性疾病相关的“风险因素”与对象相关，那么可以认为该对象处于出血性疾病的风险。风险因素可包括与给定疾病相关的任何活动、性状、事件或特性，例如，通过对对象群体的统计学或流行病学研究。因此，即使研究鉴定潜在风险因素没有具体包括对象，也可将该对象分类为处于出血性疾病的风险。例如，出血过多的对象处于发展出出血性疾病的风险，因为相较于没有过多出血的对象，出血过多的对象的群体的出血性疾病的频率增加。
在一个实例中，对象具有发展出血性疾病的风险，并且在出血性疾病的症状发生之前或之后给予膜靶向结合蛋白。在一个实例中，在出血性疾病的症状发生之前给予膜靶向结合蛋白。在一个实例中，在出血性疾病的症状发生之后给予膜靶向结合蛋白。在一个实例中，以减缓或降低处于风险的对象的出血性疾病的一个或多个症状的剂量给予本公开的膜靶向结合蛋白。
本公开的方法可以容易地应用于对象中任何形式的出血疾病。
本公开的方法还可包括共同给予本公开的至少一种膜靶向结合蛋白和另一治疗有效的物质以预防或治疗出血性疾病。
在一个实例中，本公开的膜靶向结合蛋白与目前正在使用或正在开发的用于预防或治疗出血性疾病的至少一种其他已知化合物或治疗性蛋白质组合使用。用于治疗出血性疾病的化合物是本领域已知的。示例性的治疗性蛋白质可以是源自供体的血浆或重组蛋白。例如，治疗性蛋白质是源自血浆或重组凝血因子蛋白。例如，治疗性蛋白质选自：因子I，因子II((凝血酶原)/凝血酶)，因子III，因子V，因子VII，因子VIIa(例如，)，因子VIII(如单链重组因子VIII，例如，如Zollner等,Thromb Res.132:280-287,2013中所述，血浆来源的因子VIII产物，如Monoclate-或或重组因子VIII产物，如Kogenate Fs， /RefactoHemofil-Monarc- Koate- 或Hyate:)，因子IX(例如，源自血浆的因子IX产物，如P，或或重组因子IX产物，如AlphanineBebulinProfilnineProplex或)，因子X，因子XI，因子XII和因子XIII(例如，P，或)。在一实例中，治疗性蛋白质是冯维勒布兰德因子/FVIII复合物(例如，Humate- -P、或)。在另一实例中，治疗性蛋白质是凝血酶原(例如，P/N、或)。在另一实例中，治疗性多肽是纤维蛋白与那(例如， P)。在一个实例中，治疗性蛋白质是凝血因子的修饰形式，例如，如本文所述的。
从上文将显而易见，本公开提供了对对象的联合治疗性处理(concomitanttherapeutic treatment)的方法，其包括向有此需要的对象给予有效量的第一物质和第二物质，其中所述第一物质是本公开的膜靶向结合蛋白，第二物质还用于预防或治疗出血性疾病。
如本文所用，术语“伴随”如短语“伴随治疗性治疗”包括在第二物质存在下给予第一物质。伴随的治疗方法包括共同给予第一种，第二种，第三种或其它药剂的方法。伴随治疗性治疗方法还包括其中在第二或其他物质存在的情况下给予第一或其它物质的方法，其中例如可以先前给予第二或其它物质。可通过不同实施者(actor)分步骤实施联合治疗性处理方法。例如，一个操作者可以向对象给予第一药剂，并且第二操作者可以向对象给予第二药剂，并且可以在同一时间或几乎相同的时间或在较远的时间执行所述给药步骤，只要第一试剂(和/或其他药剂)在第二药剂(和/或另外的药剂)存在下给药之后。实施者和该对象可以是相同的实体(例如同一人)。
所选介质中活性成分的最佳浓度可以根据本领域技术人员已知的程序经验性地确定，并且将取决于所需的最终药物制剂。
本公开的结合蛋白的给药剂量范围是大到足以产生所需效果的剂量范围。例如，组合物包含有效量的膜靶向结合蛋白。在一个实例中，组合物包含治疗有效量的膜靶向结合蛋白。在另一个实例中，组合物包含预防有效量的膜靶向结合蛋白。
剂量不宜大到引起不良副作用，如反常出血和出现抑制剂。通常，剂量将随着患者的年龄、病症、性别和疾病的程度而不同，并且可以由本领域技术人员确定。如果发生任何并发症，可由医师调整剂量。
剂量可以在约0.1mg/kg至约300mg/kg之间变化，例如约0.2mg/kg至约200mg/kg，如约0.5mg/kg至约20mg/kg，每天给药一次或多次，持续一天或多天。
在一些实例中，膜靶向结合蛋白以高于后续(维持剂量)剂量的初始(或加载)剂量给予。例如，膜靶向结合蛋白以约10mg/kg至约30mg/kg的初始剂量给予。然后，以约0.0001mg/kg至约10mg/kg的维持剂量给予结合蛋白。维持剂量可以每7-35天给予，如每14或7或28天给予。
在一些实例中，采用剂量递增方案，其中膜靶向结合蛋白最初以比后续剂量所用更低的剂量给予。该剂量方案在对象最初遭受不良事件的情况下是有用的。
在对象未对治疗产生充分应答的情况下，可在一周内给予多重剂量。或者或此外，可给予提高的剂量。
通过给予多于一次的接触或一组剂量，如接触结合蛋白至少约两次，例如接触约2-60次，更具体为接触约2-40次，更具体为接触约2-20次，可以用膜靶向结合蛋白再次治疗对象。
在一个实例中，可在疾病征兆或症状再次出现(出血性事件)时给予各自再治疗。
在另一实例中，可按确定的间隔给予各自再治疗。例如，可按照多种间隔，例如约24-28周或48-56周或更长的间隔给予后续接触。例如，此类接触可按照各自为约24-26周或38-42周或约50-54周的间隔给予。
在对象未对治疗产生充分应答的情况下，可在一周内给予多重剂量。或者或此外，可给予提高的剂量。
在另一个实施例中，对于经历不良反应的对象，可将初始(或加载)剂量分割为一周内的数天或连续数天。
根据本公开的方法给予膜靶向结合蛋白可以是连续的或间歇的，这取决于例如受体的生理条件，给药的目的是治疗性的还是预防性的，和技术人员已知的其他因素。物质的给予可以在预选的一段时间内基本连续，或者可以是一系列间隔的剂量，例如，在病症发展期间或之后。
药盒和其他物质组成
本公开的另一个实例提供了包含本公开的膜靶向结合蛋白的药盒，其能够用于治疗或预防如上所述的出血性疾病。
在一个实例中，药盒包含：(a)容器，其包含膜靶向结合蛋白，可任选地包含于药学上可接受的运载体或稀释剂中；和(b)含有关于治疗对象中出血性疾病的说明的包装插页。
在一个实例中，药盒包含：(a)结合凝血因子的只是一种膜靶向结合蛋白；(b)使用该药盒治疗或预防对象出血性疾病的说明书；(c)任选地，至少一种其他治疗活性化合物或药物。
根据本公开的该实例，包装插页在容器上或与容器相关联。合适的容器包括例如，瓶、小瓶和注射器等。容器可由各种材料如玻璃或塑料制成。容器装载或包含有效治疗动脉粥样硬化的组合物，并且可具有无菌进入端口(例如，所述容器可以是具有皮下注射针可刺穿塞子的静脉输液袋或小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是膜靶向结合蛋白。标签或包装插页指示组合物用于治疗符合治疗条件的对象，例如，具有或易患出血性疾病的对象，并提供关于结合蛋白和任何其他药物的给药量和间隔的具体指导。药盒还可以包含其他的容器，其包含药学上可接受的稀释缓冲液，例如用于注射的抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和/或右旋糖溶液。药盒还可以包括就商业和用户角度而言所需的其它材料，包括其它缓冲液、稀释剂、过滤器、针头和注射器。
药盒可任选地还包含含第二药物的容器，其中膜靶向结合蛋白是第一药物，且该制品还包含包装插页上指导用有效量的第二药物治疗对象的说明。该第二药物可以是前述的治疗性蛋白质。
本发明包括以下非限制性实施例。
实施例
实施例1：生成和纯化重组抗体
使用标准分子生物学方法生成表达构建体。通过Geneart(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)，美国纽约州)合成编码抗体、膜联蛋白A5(NP_001145；SEQID NO:14)和GS接头(SEQ ID NO:20)的核苷酸序列。通过PCR扩增序列，通过限制性酶切消化并通过T4DNA连接酶克隆到表达载体中。
根据下述表1生成抗体。
表1：重组抗体
使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(凯杰公司(QIAGEN)，德国希尔登(Hilden))纯化重组质粒DNA并通过Nanodrop UV分光光度计定量。转染前确认序列。
根据生产商的说明，使用Expi293FTM表达***通过瞬时转染进行所有转染。
纯化前，通过离心和过滤从所得条件培养基中收获蛋白质。如前所述进行小规模(mg)机器人抗体纯化(Schmidt等.Journal of Chromatography,1455(2016)9-19)。
实施例2：膜联蛋白A5连接的抗体是膜靶向的
为了评估膜联蛋白A5连接的抗体是否靶向细胞膜，进行了膜联蛋白A5连接的抗体的生物传感器分析。简言之，将磷脂酰丝氨酸(PS)/磷脂酰胆碱(PC)/磷脂酰乙醇胺(PE)(PS/PC/PE-生物素基70:25:5)磷脂混合物溶解于TRIS[20mM]pH 8.0，NaCl[150mM]，NOG[2mM]中，并且使用超声处理获得囊泡。以相似的方式制备缺乏磷脂酰丝氨酸的磷脂(PC/PE-生物素基95:5)作为生物传感器研究中的参照表面。
将含有磷脂酰丝氨酸的囊泡以低水平固定在与SA传感器芯片对接的T-200生物传感器的活性流动池上。将缺乏PS的囊泡固定在上游参照细胞上。通过注射5分钟3.3，1.1，0.37，0.12和0.04nM aFIX-膜联蛋白A5(CSL4060)在37℃评估与PS/PC/PE的结合。使用结合阶段结束时的响应将数据拟合至1：1稳态结合模型，以确定相互作用的亲和力(KD)。整个过程使用的允许缓冲液是具有0.1％BSA的HEPES[10mM]pH 7.3，NaCl[150mM]，CaCl2[2mM]。
图1A显示了以0.1351±0.003nM的亲和力和41.67±0.19nM的Rmax结合含磷脂酰丝氨酸的囊泡的单特异性抗-因子IX-膜联蛋白A5连接的抗体(CSL4060)，其包含两个膜联蛋白A5分子。此外，图1B显示了以0.1349±0.013nM的亲和力和46.17±1.0nM的Rmax结合含磷脂酰丝氨酸的囊泡的双特异性抗-因子IX/X-膜联蛋白A5连接的抗体(CSL4062/3572)，其包含一个膜联蛋白A5分子。各试验重复两次。
实施例3：膜靶向抗-因子IX单特异性完全抗体和半抗体相较于非靶向的抗体具有增强的因子VII旁路活性
为了研究生成的抗体的潜在因子VIII-旁路活性和凝血活性，按照生产商的说明，使用以西门子医疗公司(Siemens Healthcare)(德国西门子)的标准测定试剂的Thrombolyzer Compact X***(Behnk Elektronik公司，德国)测量活化的部分促凝血酶原激酶时间(aPTT)。如图所示，抗体在FVIII缺陷型血浆(西门子医疗公司)中稀释，以达到1000nM至1pM的终浓度。简言之，将50μl的各种稀释液与50μl的aPTT试剂(Pathromtin SL)在Thrombolyzer比色皿的一侧混合。将50ul的CaCl2[25mM]添加到Thrombolyzer比色皿的另一侧并允许温度平衡到37℃。通过将CaCl2溶液与抗体/aPTT试剂混合物混合来引发凝血反应，并在405nm和620nm波长下连续监测凝血。绘制抗体浓度与凝结形成的时间的图表。为了将值与曲线拟合并允许计算EC50值，省去了最高浓度的膜联蛋白A5靶向的aFIX抗体，并将曲线的下端设定为24秒(类似于以非膜靶向抗-因子IX/X双特异性抗体CSL3415/3416于1000nM处观测到的凝血时间)。
如图2所示，相较于非靶向的抗体，膜靶向的完全和半抗-因子IX单特异性抗体的因子VIII旁路活性增强。图2A显示了三个或四个独立实验的结果，证明了相较于非膜靶向的完全抗-因子IX抗体CSL3492(EC50 621nM)，膜靶向的完全抗-因子IX抗体(CSL4060)的旁路活性增强(EC50 1.64nM)。此外，图2B显示了三个独立实验的结果，证明了相较于非膜靶向的半抗-因子IX抗体CSL3535(EC50 142nM)，膜靶向的半抗-因子IX抗体(CSL4062)的旁路活性增强(EC50 0.89nM)。
实施例4：膜靶向抗-因子IX/X双特异性抗体相较于非靶向的抗体具有增强的因子VII旁路活性
使用aPTT试验如上所述测量因子VIII旁路活性。
图3显示了五个或六个独立实验的结果，证明了相较于非膜靶向抗-因子IX/X双特异性抗体CSL3415/3416(EC50 0.505nM)，包含两个膜联蛋白A5分子(CSL4062/4063)的膜靶向抗-因子IX/X双特异性抗体的旁路活性增强(EC500.016nM)。
此外，相较于非靶向的抗-FIX/FX双特异性抗体CSL3415/3416(EC50为0.505nM)，仅包含一个膜联蛋白A5分子的膜靶向抗-因子IX/X双特异性抗体的FVIII旁路活性增加。例如，CSL4062/3572具有与抗-FIX重链连接的膜联蛋白A5分子，其EC50为0.015nM。CSL3535/4063具有与抗-因子X重链连接的膜联蛋白A5分子，其EC50为0.015nM。进行四到六次独立实验。
实施例5：膜靶向抗-因子IX抗体的因子VIII旁路活性增强而抗凝固作用降低
使用标准分子生物学方法生成表达构建体。通过Geneart(赛默飞世尔科技公司，美国纽约州)合成编码抗体、膜联蛋白A5(NP_001145；SEQ ID NO:14)、膜联蛋白A5的E5突变体(SEQ ID NO:26)、截短膜联蛋白A1(SEQ ID NO:30)和GS接头(SEQ ID NO:20)的核苷酸序列。通过PCR扩增序列，通过限制性酶切消化并通过T4DNA连接酶克隆到表达载体中。
使用实施例1中所述方法根据下述表2生成抗体。
表2：重组抗体
使用aPTT试验如上所述测量因子VIII旁路活性。为了使值与曲线拟合并允许计算EC50值，省去了最高浓度的抗体。
如图4所示，相较于膜联蛋白A5的E5突变体膜靶向完全抗-因子IX抗体(EC501.39nM)和膜联蛋白A5膜靶向完全抗-因子IX单特异性抗体(CSL4060；EC50 1.76nM)，截短膜联蛋白A1膜靶向完全抗-因子IX单特异性抗体的旁路活性增强(EC50 0.96nM)。处于最高浓度时，截短膜联蛋白A1抗-FIX抗体、膜联蛋白A5的E5突变体抗-FIX抗体和膜联蛋白A5抗-FIX抗体的凝血时间分别为35.5秒(SD 0.3秒)、52.3秒(SD 3.4秒)和81.0秒(3.0秒)。
实施例6：膜靶向抗-因子IX抗体在血浆存在的情况下FVIII旁落活性增强
雄性FVIII敲除小鼠(n＝3/组)静脉注射：a)单独的80IU/kg重组因子IXb)80IU/kg重组因子IX和800μg/kg CSL4060，或c)80IU/kg重组因子IX和800μg/kg BM4-膜联蛋白A5来处理。给药后约15分钟时，使用柠檬酸钠作为抗凝血剂(1份柠檬酸钠+9份全血)对小鼠进行末端放血。
使用如上所述的aPTT试验并在使用人FVIII耗尽的血浆(西门子医疗公司)和Pathromtin SL作为活化试剂，采用BCS XP(西门子医疗公司)，在单级凝结试验中测量各样品的因子VIII旁路活性。
图5和下述表3显示了，相较于源自经单独重组因子IX处理的小鼠的样品(aPTT试验中p＝0.0418)和源自经膜联蛋白A5偶联的BM4抗体和人FIX处理的小鼠的样品(aPTT试验中p＝0.0443)，源自经膜联蛋白A5膜靶向抗人因子IX抗体(CSL4060)和人FIX处理的小鼠的样品在aPTT试验(A)和单级凝结试验(B)中的FVIII旁路活性显著增强。
表3：FVIII旁路活性
实施例7：膜靶向抗-因子IX抗体的体外FVIII旁路活性
在磷脂不存在的情况下，在显色试验中测量膜联蛋白A5膜靶向的完全抗-因子IX单特异性抗体(CSL4060)的因子VIII-旁路活性。
膜联蛋白A5膜靶向的完全抗-因子IX单特异性抗体(CSL4060)、单特异性抗-FIX抗体(CSL3492)、抗-因子IX/X双特异性抗体(CSL3415/3416)或BM4抗体对照在不存在磷脂的情况下在实验缓冲液中与人FIXa和人FX预混合。向各溶液中添加钙和显色底物，然后停止显色反应，评估结合蛋白的因子VIII旁路活性。
如图6和下表4所示，采用膜联蛋白A5膜靶向的完全抗-因子IX单特异性抗体(CSL4060)、单特异性抗-FIX抗体(CSL3492)或BM4对照未检测到因子VIII旁路活性。相反，抗因子IX/X双特异性抗体(CSL3415/3416)在没有膜的情况下显示出因子VIII旁路活性，EC50为8.6nM。
表4：体外因子VIII旁路活性
实施例8：膜联蛋白A5-和截短膜联蛋白A1-偶联的抗-因子IX抗体在凝血酶生成试验中的相对活性
在设计成测量经由内在凝血途径生成的凝血酶的试验中测量膜联蛋白A5-和截短膜联蛋白A1-偶联的抗-因子IX抗体的相对活性。
使用校准的自动血栓图(CAT)在人FVIII耗尽的血浆中确定凝血酶生成参数。以10μg/mL的浓度添加截短膜联蛋白A1膜靶向完全抗-因子IX单特异性抗体(ATG17090)、膜联蛋白A5膜靶向半抗-因子IX单特异性抗体(ATG16028)、抗-因子IX/X双特异性抗体(CSL3415/3416)、膜联蛋白A5偶联的BM4或单独的BM4抗体至FVIII耗尽的血浆中，其中<0.01U/mLFVIII残留。标准人血浆(西门子医疗公司)用作对照。通过添加5μL RD-试剂触发内在凝血。
简言之，将5μLRD-试剂或凝血酶校准物和80μL加标血浆移液到96孔微板的孔中。将平板在荧光计(Fluoroskan Ascent，赛默飞世尔科技公司，德国)上于37℃孵育约10分钟。通过向微量滴定板孔各样品中添加20μL荧光底物和凝血酶校准物然后振荡2秒来开始试验。试验期间产生的凝血酶转化荧光底物，并以5秒间隔记录荧光变化，总试验时间为1小时。基于各样品各自的凝血酶校准物计算凝血酶生成的摩尔浓度。
如图7所示，相较于膜联蛋白A5膜靶向抗-因子IX半抗体，在10μg/mL抗-因子IX/X双特异性抗体和膜联蛋白A1膜靶向完全抗-因子IX单特异性抗体存在的情况下，FVIII耗尽的血浆中凝血酶产生更快且持续更长时间。
实施例9：其他膜靶向抗-因子IX抗体的FVIII旁路活性增强
生成抗-因子IX单特异性抗体A10、B2和C12及其膜联蛋白A5偶联的形式(表5)，并使用如前所述的显色FVIII旁路试验测量它们相对的因子VIII-旁路活性。
表5：亲和力成熟的抗体
如下表6中所示，三种膜联蛋白A5膜靶向亲和力成熟的抗-因子IX单特异性抗体(A10、B2和C12)相较于其未偶联的对应物在10nM浓度下在至少三个独立实验中的FVIII旁路活性改善。
表6：亲和力成熟的膜靶向抗体的FVIII旁路活性
序列表
<110> CSL有限公司(CSL Limited)
<120> 凝血因子结合蛋白及其应用
<130> 523245PCT
<150> AU2016903858
<151> 2016-09-23
<150> AU2017902352
<151> 2017-06-20
<160> 55
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链序列
<400> 1
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Arg Asn Ile Glu Arg Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Glu Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gln Ala Ser Arg Lys Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Pro Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 2
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 因子X重链
<400> 2
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Asn
20 25 30
Asn Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asp Ile Asn Thr Arg Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Glu Glu Phe
50 55 60
Gln Asp Arg Val Ile Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr His Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Lys Ser Tyr Gly Tyr Tyr Leu Asp Glu Trp Gly Glu Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 3
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 因子IX重链
<400> 3
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr
20 25 30
Asp Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gln Ser Thr Tyr Tyr Arg Arg Glu Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Thr Gly Arg Glu Tyr Gly Gly Gly Trp Tyr Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val
195 200 205
Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys
210 215 220
Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 4
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 因子X重链
<400> 4
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Asn
20 25 30
Asn Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asp Ile Asn Thr Arg Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Glu Glu Phe
50 55 60
Gln Asp Arg Val Ile Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr His Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Lys Ser Tyr Gly Tyr Tyr Leu Asp Glu Trp Gly Glu Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 5
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 因子IX重链
<400> 5
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr
20 25 30
Asp Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gln Ser Thr Tyr Tyr Arg Arg Glu Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Thr Gly Arg Glu Tyr Gly Gly Gly Trp Tyr Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val
195 200 205
Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys
210 215 220
Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 6
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 因子IX重链
<400> 6
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr
20 25 30
Asp Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gln Ser Thr Tyr Tyr Arg Arg Glu Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Thr Gly Arg Glu Tyr Gly Gly Gly Trp Tyr Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val
195 200 205
Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys
210 215 220
Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Val Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Leu Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Leu Thr Trp Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 7
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 因子X重链
<400> 7
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Asn
20 25 30
Asn Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asp Ile Asn Thr Arg Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Glu Glu Phe
50 55 60
Gln Asp Arg Val Ile Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr His Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Lys Ser Tyr Gly Tyr Tyr Leu Asp Glu Trp Gly Glu Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Val Tyr Pro Pro
340 345 350
Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Ala Leu Val Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 8
<211> 785
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 因子IX重链偶联A5
<400> 8
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr
20 25 30
Asp Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gln Ser Thr Tyr Tyr Arg Arg Glu Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Thr Gly Arg Glu Tyr Gly Gly Gly Trp Tyr Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val
195 200 205
Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys
210 215 220
Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Gly Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
450 455 460
Gly Ser Ala Gln Val Leu Arg Gly Thr Val Thr Asp Phe Pro Gly Phe
465 470 475 480
Asp Glu Arg Ala Asp Ala Glu Thr Leu Arg Lys Ala Met Lys Gly Leu
485 490 495
Gly Thr Asp Glu Glu Ser Ile Leu Thr Leu Leu Thr Ser Arg Ser Asn
500 505 510
Ala Gln Arg Gln Glu Ile Ser Ala Ala Phe Lys Thr Leu Phe Gly Arg
515 520 525
Asp Leu Leu Asp Asp Leu Lys Ser Glu Leu Thr Gly Lys Phe Glu Lys
530 535 540
Leu Ile Val Ala Leu Met Lys Pro Ser Arg Leu Tyr Asp Ala Tyr Glu
545 550 555 560
Leu Lys His Ala Leu Lys Gly Ala Gly Thr Asn Glu Lys Val Leu Thr
565 570 575
Glu Ile Ile Ala Ser Arg Thr Pro Glu Glu Leu Arg Ala Ile Lys Gln
580 585 590
Val Tyr Glu Glu Glu Tyr Gly Ser Ser Leu Glu Asp Asp Val Val Gly
595 600 605
Asp Thr Ser Gly Tyr Tyr Gln Arg Met Leu Val Val Leu Leu Gln Ala
610 615 620
Asn Arg Asp Pro Asp Ala Gly Ile Asp Glu Ala Gln Val Glu Gln Asp
625 630 635 640
Ala Gln Ala Leu Phe Gln Ala Gly Glu Leu Lys Trp Gly Thr Asp Glu
645 650 655
Glu Lys Phe Ile Thr Ile Phe Gly Thr Arg Ser Val Ser His Leu Arg
660 665 670
Lys Val Phe Asp Lys Tyr Met Thr Ile Ser Gly Phe Gln Ile Glu Glu
675 680 685
Thr Ile Asp Arg Glu Thr Ser Gly Asn Leu Glu Gln Leu Leu Leu Ala
690 695 700
Val Val Lys Ser Ile Arg Ser Ile Pro Ala Tyr Leu Ala Glu Thr Leu
705 710 715 720
Tyr Tyr Ala Met Lys Gly Ala Gly Thr Asp Asp His Thr Leu Ile Arg
725 730 735
Val Met Val Ser Arg Ser Glu Ile Asp Leu Phe Asn Ile Arg Lys Glu
740 745 750
Phe Arg Lys Asn Phe Ala Thr Ser Leu Tyr Ser Met Ile Lys Gly Asp
755 760 765
Thr Ser Gly Asp Tyr Lys Lys Ala Leu Leu Leu Leu Cys Gly Glu Asp
770 775 780
Asp
785
<210> 9
<211> 785
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 因子IX重链偶联A5
<400> 9
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr
20 25 30
Asp Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gln Ser Thr Tyr Tyr Arg Arg Glu Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Thr Gly Arg Glu Tyr Gly Gly Gly Trp Tyr Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val
195 200 205
Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys
210 215 220
Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Val Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Leu Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Leu Thr Trp Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Gly Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
450 455 460
Gly Ser Ala Gln Val Leu Arg Gly Thr Val Thr Asp Phe Pro Gly Phe
465 470 475 480
Asp Glu Arg Ala Asp Ala Glu Thr Leu Arg Lys Ala Met Lys Gly Leu
485 490 495
Gly Thr Asp Glu Glu Ser Ile Leu Thr Leu Leu Thr Ser Arg Ser Asn
500 505 510
Ala Gln Arg Gln Glu Ile Ser Ala Ala Phe Lys Thr Leu Phe Gly Arg
515 520 525
Asp Leu Leu Asp Asp Leu Lys Ser Glu Leu Thr Gly Lys Phe Glu Lys
530 535 540
Leu Ile Val Ala Leu Met Lys Pro Ser Arg Leu Tyr Asp Ala Tyr Glu
545 550 555 560
Leu Lys His Ala Leu Lys Gly Ala Gly Thr Asn Glu Lys Val Leu Thr
565 570 575
Glu Ile Ile Ala Ser Arg Thr Pro Glu Glu Leu Arg Ala Ile Lys Gln
580 585 590
Val Tyr Glu Glu Glu Tyr Gly Ser Ser Leu Glu Asp Asp Val Val Gly
595 600 605
Asp Thr Ser Gly Tyr Tyr Gln Arg Met Leu Val Val Leu Leu Gln Ala
610 615 620
Asn Arg Asp Pro Asp Ala Gly Ile Asp Glu Ala Gln Val Glu Gln Asp
625 630 635 640
Ala Gln Ala Leu Phe Gln Ala Gly Glu Leu Lys Trp Gly Thr Asp Glu
645 650 655
Glu Lys Phe Ile Thr Ile Phe Gly Thr Arg Ser Val Ser His Leu Arg
660 665 670
Lys Val Phe Asp Lys Tyr Met Thr Ile Ser Gly Phe Gln Ile Glu Glu
675 680 685
Thr Ile Asp Arg Glu Thr Ser Gly Asn Leu Glu Gln Leu Leu Leu Ala
690 695 700
Val Val Lys Ser Ile Arg Ser Ile Pro Ala Tyr Leu Ala Glu Thr Leu
705 710 715 720
Tyr Tyr Ala Met Lys Gly Ala Gly Thr Asp Asp His Thr Leu Ile Arg
725 730 735
Val Met Val Ser Arg Ser Glu Ile Asp Leu Phe Asn Ile Arg Lys Glu
740 745 750
Phe Arg Lys Asn Phe Ala Thr Ser Leu Tyr Ser Met Ile Lys Gly Asp
755 760 765
Thr Ser Gly Asp Tyr Lys Lys Ala Leu Leu Leu Leu Cys Gly Glu Asp
770 775 780
Asp
785
<210> 10
<211> 781
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 因子X重链偶联A5
<400> 10
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Asn
20 25 30
Asn Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asp Ile Asn Thr Arg Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Glu Glu Phe
50 55 60
Gln Asp Arg Val Ile Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr His Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Lys Ser Tyr Gly Tyr Tyr Leu Asp Glu Trp Gly Glu Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Val Tyr Pro Pro
340 345 350
Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Ala Leu Val Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Ser Gly
435 440 445
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Gln
450 455 460
Val Leu Arg Gly Thr Val Thr Asp Phe Pro Gly Phe Asp Glu Arg Ala
465 470 475 480
Asp Ala Glu Thr Leu Arg Lys Ala Met Lys Gly Leu Gly Thr Asp Glu
485 490 495
Glu Ser Ile Leu Thr Leu Leu Thr Ser Arg Ser Asn Ala Gln Arg Gln
500 505 510
Glu Ile Ser Ala Ala Phe Lys Thr Leu Phe Gly Arg Asp Leu Leu Asp
515 520 525
Asp Leu Lys Ser Glu Leu Thr Gly Lys Phe Glu Lys Leu Ile Val Ala
530 535 540
Leu Met Lys Pro Ser Arg Leu Tyr Asp Ala Tyr Glu Leu Lys His Ala
545 550 555 560
Leu Lys Gly Ala Gly Thr Asn Glu Lys Val Leu Thr Glu Ile Ile Ala
565 570 575
Ser Arg Thr Pro Glu Glu Leu Arg Ala Ile Lys Gln Val Tyr Glu Glu
580 585 590
Glu Tyr Gly Ser Ser Leu Glu Asp Asp Val Val Gly Asp Thr Ser Gly
595 600 605
Tyr Tyr Gln Arg Met Leu Val Val Leu Leu Gln Ala Asn Arg Asp Pro
610 615 620
Asp Ala Gly Ile Asp Glu Ala Gln Val Glu Gln Asp Ala Gln Ala Leu
625 630 635 640
Phe Gln Ala Gly Glu Leu Lys Trp Gly Thr Asp Glu Glu Lys Phe Ile
645 650 655
Thr Ile Phe Gly Thr Arg Ser Val Ser His Leu Arg Lys Val Phe Asp
660 665 670
Lys Tyr Met Thr Ile Ser Gly Phe Gln Ile Glu Glu Thr Ile Asp Arg
675 680 685
Glu Thr Ser Gly Asn Leu Glu Gln Leu Leu Leu Ala Val Val Lys Ser
690 695 700
Ile Arg Ser Ile Pro Ala Tyr Leu Ala Glu Thr Leu Tyr Tyr Ala Met
705 710 715 720
Lys Gly Ala Gly Thr Asp Asp His Thr Leu Ile Arg Val Met Val Ser
725 730 735
Arg Ser Glu Ile Asp Leu Phe Asn Ile Arg Lys Glu Phe Arg Lys Asn
740 745 750
Phe Ala Thr Ser Leu Tyr Ser Met Ile Lys Gly Asp Thr Ser Gly Asp
755 760 765
Tyr Lys Lys Ala Leu Leu Leu Leu Cys Gly Glu Asp Asp
770 775 780
<210> 11
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链可变序列
<400> 11
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Arg Asn Ile Glu Arg Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Glu Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gln Ala Ser Arg Lys Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Pro Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 12
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 因子X重链可变区
<400> 12
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Asn
20 25 30
Asn Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asp Ile Asn Thr Arg Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Glu Glu Phe
50 55 60
Gln Asp Arg Val Ile Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr His Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Lys Ser Tyr Gly Tyr Tyr Leu Asp Glu Trp Gly Glu Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 13
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 因子IX重链可变区
<400> 13
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr
20 25 30
Asp Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gln Ser Thr Tyr Tyr Arg Arg Glu Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Thr Gly Arg Glu Tyr Gly Gly Gly Trp Tyr Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 14
<211> 320
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 14
Met Ala Gln Val Leu Arg Gly Thr Val Thr Asp Phe Pro Gly Phe Asp
1 5 10 15
Glu Arg Ala Asp Ala Glu Thr Leu Arg Lys Ala Met Lys Gly Leu Gly
20 25 30
Thr Asp Glu Glu Ser Ile Leu Thr Leu Leu Thr Ser Arg Ser Asn Ala
35 40 45
Gln Arg Gln Glu Ile Ser Ala Ala Phe Lys Thr Leu Phe Gly Arg Asp
50 55 60
Leu Leu Asp Asp Leu Lys Ser Glu Leu Thr Gly Lys Phe Glu Lys Leu
65 70 75 80
Ile Val Ala Leu Met Lys Pro Ser Arg Leu Tyr Asp Ala Tyr Glu Leu
85 90 95
Lys His Ala Leu Lys Gly Ala Gly Thr Asn Glu Lys Val Leu Thr Glu
100 105 110
Ile Ile Ala Ser Arg Thr Pro Glu Glu Leu Arg Ala Ile Lys Gln Val
115 120 125
Tyr Glu Glu Glu Tyr Gly Ser Ser Leu Glu Asp Asp Val Val Gly Asp
130 135 140
Thr Ser Gly Tyr Tyr Gln Arg Met Leu Val Val Leu Leu Gln Ala Asn
145 150 155 160
Arg Asp Pro Asp Ala Gly Ile Asp Glu Ala Gln Val Glu Gln Asp Ala
165 170 175
Gln Ala Leu Phe Gln Ala Gly Glu Leu Lys Trp Gly Thr Asp Glu Glu
180 185 190
Lys Phe Ile Thr Ile Phe Gly Thr Arg Ser Val Ser His Leu Arg Lys
195 200 205
Val Phe Asp Lys Tyr Met Thr Ile Ser Gly Phe Gln Ile Glu Glu Thr
210 215 220
Ile Asp Arg Glu Thr Ser Gly Asn Leu Glu Gln Leu Leu Leu Ala Val
225 230 235 240
Val Lys Ser Ile Arg Ser Ile Pro Ala Tyr Leu Ala Glu Thr Leu Tyr
245 250 255
Tyr Ala Met Lys Gly Ala Gly Thr Asp Asp His Thr Leu Ile Arg Val
260 265 270
Met Val Ser Arg Ser Glu Ile Asp Leu Phe Asn Ile Arg Lys Glu Phe
275 280 285
Arg Lys Asn Phe Ala Thr Ser Leu Tyr Ser Met Ile Lys Gly Asp Thr
290 295 300
Ser Gly Asp Tyr Lys Lys Ala Leu Leu Leu Leu Cys Gly Glu Asp Asp
305 310 315 320
<210> 15
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 稳定化的IgG4重链恒定
<400> 15
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 16
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有S228P、T366W突变的人IgG4重链恒定区
<400> 16
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 17
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有S228P、T366S、L368A、Y407V突变的人IgG4重链恒定区
<400> 17
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 18
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有T350V、T366L、K392L、T394W突变的人IgG4重链恒定区
<400> 18
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Leu Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Leu
260 265 270
Thr Trp Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 19
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有T350V、L351Y、F405A、Y407V突变的人IgG4重链恒定区
<400> 19
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Val Tyr Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Ala Leu Val Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 20
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 20
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 21
<211> 2351
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 21
Met Gln Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe
1 5 10 15
Cys Phe Ser Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser
20 25 30
Trp Asp Tyr Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg
35 40 45
Phe Pro Pro Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val
50 55 60
Tyr Lys Lys Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile
65 70 75 80
Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln
85 90 95
Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser
100 105 110
His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser
115 120 125
Glu Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp
130 135 140
Asp Lys Val Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu
145 150 155 160
Lys Glu Asn Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser
165 170 175
Tyr Leu Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile
180 185 190
Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr
195 200 205
Gln Thr Leu His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly
210 215 220
Lys Ser Trp His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp
225 230 235 240
Ala Ala Ser Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr
245 250 255
Val Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val
260 265 270
Tyr Trp His Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile
275 280 285
Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser
290 295 300
Leu Glu Ile Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met
305 310 315 320
Asp Leu Gly Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His
325 330 335
Asp Gly Met Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro
340 345 350
Gln Leu Arg Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp
355 360 365
Leu Thr Asp Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser
370 375 380
Pro Ser Phe Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr
385 390 395 400
Trp Val His Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro
405 410 415
Leu Val Leu Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn
420 425 430
Asn Gly Pro Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met
435 440 445
Ala Tyr Thr Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu
450 455 460
Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu
465 470 475 480
Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro
485 490 495
His Gly Ile Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys
500 505 510
Gly Val Lys His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe
515 520 525
Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp
530 535 540
Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg
545 550 555 560
Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu
565 570 575
Ser Val Asp Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val
580 585 590
Ile Leu Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu
595 600 605
Asn Ile Gln Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp
610 615 620
Pro Glu Phe Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val
625 630 635 640
Phe Asp Ser Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp
645 650 655
Tyr Ile Leu Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe
660 665 670
Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr
675 680 685
Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro
690 695 700
Gly Leu Trp Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly
705 710 715 720
Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp
725 730 735
Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys
740 745 750
Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Ser Arg His Pro
755 760 765
Ser Thr Arg Gln Lys Gln Phe Asn Ala Thr Thr Ile Pro Glu Asn Asp
770 775 780
Ile Glu Lys Thr Asp Pro Trp Phe Ala His Arg Thr Pro Met Pro Lys
785 790 795 800
Ile Gln Asn Val Ser Ser Ser Asp Leu Leu Met Leu Leu Arg Gln Ser
805 810 815
Pro Thr Pro His Gly Leu Ser Leu Ser Asp Leu Gln Glu Ala Lys Tyr
820 825 830
Glu Thr Phe Ser Asp Asp Pro Ser Pro Gly Ala Ile Asp Ser Asn Asn
835 840 845
Ser Leu Ser Glu Met Thr His Phe Arg Pro Gln Leu His His Ser Gly
850 855 860
Asp Met Val Phe Thr Pro Glu Ser Gly Leu Gln Leu Arg Leu Asn Glu
865 870 875 880
Lys Leu Gly Thr Thr Ala Ala Thr Glu Leu Lys Lys Leu Asp Phe Lys
885 890 895
Val Ser Ser Thr Ser Asn Asn Leu Ile Ser Thr Ile Pro Ser Asp Asn
900 905 910
Leu Ala Ala Gly Thr Asp Asn Thr Ser Ser Leu Gly Pro Pro Ser Met
915 920 925
Pro Val His Tyr Asp Ser Gln Leu Asp Thr Thr Leu Phe Gly Lys Lys
930 935 940
Ser Ser Pro Leu Thr Glu Ser Gly Gly Pro Leu Ser Leu Ser Glu Glu
945 950 955 960
Asn Asn Asp Ser Lys Leu Leu Glu Ser Gly Leu Met Asn Ser Gln Glu
965 970 975
Ser Ser Trp Gly Lys Asn Val Ser Ser Thr Glu Ser Gly Arg Leu Phe
980 985 990
Lys Gly Lys Arg Ala His Gly Pro Ala Leu Leu Thr Lys Asp Asn Ala
995 1000 1005
Leu Phe Lys Val Ser Ile Ser Leu Leu Lys Thr Asn Lys Thr Ser
1010 1015 1020
Asn Asn Ser Ala Thr Asn Arg Lys Thr His Ile Asp Gly Pro Ser
1025 1030 1035
Leu Leu Ile Glu Asn Ser Pro Ser Val Trp Gln Asn Ile Leu Glu
1040 1045 1050
Ser Asp Thr Glu Phe Lys Lys Val Thr Pro Leu Ile His Asp Arg
1055 1060 1065
Met Leu Met Asp Lys Asn Ala Thr Ala Leu Arg Leu Asn His Met
1070 1075 1080
Ser Asn Lys Thr Thr Ser Ser Lys Asn Met Glu Met Val Gln Gln
1085 1090 1095
Lys Lys Glu Gly Pro Ile Pro Pro Asp Ala Gln Asn Pro Asp Met
1100 1105 1110
Ser Phe Phe Lys Met Leu Phe Leu Pro Glu Ser Ala Arg Trp Ile
1115 1120 1125
Gln Arg Thr His Gly Lys Asn Ser Leu Asn Ser Gly Gln Gly Pro
1130 1135 1140
Ser Pro Lys Gln Leu Val Ser Leu Gly Pro Glu Lys Ser Val Glu
1145 1150 1155
Gly Gln Asn Phe Leu Ser Glu Lys Asn Lys Val Val Val Gly Lys
1160 1165 1170
Gly Glu Phe Thr Lys Asp Val Gly Leu Lys Glu Met Val Phe Pro
1175 1180 1185
Ser Ser Arg Asn Leu Phe Leu Thr Asn Leu Asp Asn Leu His Glu
1190 1195 1200
Asn Asn Thr His Asn Gln Glu Lys Lys Ile Gln Glu Glu Ile Glu
1205 1210 1215
Lys Lys Glu Thr Leu Ile Gln Glu Asn Val Val Leu Pro Gln Ile
1220 1225 1230
His Thr Val Thr Gly Thr Lys Asn Phe Met Lys Asn Leu Phe Leu
1235 1240 1245
Leu Ser Thr Arg Gln Asn Val Glu Gly Ser Tyr Asp Gly Ala Tyr
1250 1255 1260
Ala Pro Val Leu Gln Asp Phe Arg Ser Leu Asn Asp Ser Thr Asn
1265 1270 1275
Arg Thr Lys Lys His Thr Ala His Phe Ser Lys Lys Gly Glu Glu
1280 1285 1290
Glu Asn Leu Glu Gly Leu Gly Asn Gln Thr Lys Gln Ile Val Glu
1295 1300 1305
Lys Tyr Ala Cys Thr Thr Arg Ile Ser Pro Asn Thr Ser Gln Gln
1310 1315 1320
Asn Phe Val Thr Gln Arg Ser Lys Arg Ala Leu Lys Gln Phe Arg
1325 1330 1335
Leu Pro Leu Glu Glu Thr Glu Leu Glu Lys Arg Ile Ile Val Asp
1340 1345 1350
Asp Thr Ser Thr Gln Trp Ser Lys Asn Met Lys His Leu Thr Pro
1355 1360 1365
Ser Thr Leu Thr Gln Ile Asp Tyr Asn Glu Lys Glu Lys Gly Ala
1370 1375 1380
Ile Thr Gln Ser Pro Leu Ser Asp Cys Leu Thr Arg Ser His Ser
1385 1390 1395
Ile Pro Gln Ala Asn Arg Ser Pro Leu Pro Ile Ala Lys Val Ser
1400 1405 1410
Ser Phe Pro Ser Ile Arg Pro Ile Tyr Leu Thr Arg Val Leu Phe
1415 1420 1425
Gln Asp Asn Ser Ser His Leu Pro Ala Ala Ser Tyr Arg Lys Lys
1430 1435 1440
Asp Ser Gly Val Gln Glu Ser Ser His Phe Leu Gln Gly Ala Lys
1445 1450 1455
Lys Asn Asn Leu Ser Leu Ala Ile Leu Thr Leu Glu Met Thr Gly
1460 1465 1470
Asp Gln Arg Glu Val Gly Ser Leu Gly Thr Ser Ala Thr Asn Ser
1475 1480 1485
Val Thr Tyr Lys Lys Val Glu Asn Thr Val Leu Pro Lys Pro Asp
1490 1495 1500
Leu Pro Lys Thr Ser Gly Lys Val Glu Leu Leu Pro Lys Val His
1505 1510 1515
Ile Tyr Gln Lys Asp Leu Phe Pro Thr Glu Thr Ser Asn Gly Ser
1520 1525 1530
Pro Gly His Leu Asp Leu Val Glu Gly Ser Leu Leu Gln Gly Thr
1535 1540 1545
Glu Gly Ala Ile Lys Trp Asn Glu Ala Asn Arg Pro Gly Lys Val
1550 1555 1560
Pro Phe Leu Arg Val Ala Thr Glu Ser Ser Ala Lys Thr Pro Ser
1565 1570 1575
Lys Leu Leu Asp Pro Leu Ala Trp Asp Asn His Tyr Gly Thr Gln
1580 1585 1590
Ile Pro Lys Glu Glu Trp Lys Ser Gln Glu Lys Ser Pro Glu Lys
1595 1600 1605
Thr Ala Phe Lys Lys Lys Asp Thr Ile Leu Ser Leu Asn Ala Cys
1610 1615 1620
Glu Ser Asn His Ala Ile Ala Ala Ile Asn Glu Gly Gln Asn Lys
1625 1630 1635
Pro Glu Ile Glu Val Thr Trp Ala Lys Gln Gly Arg Thr Glu Arg
1640 1645 1650
Leu Cys Ser Gln Asn Pro Pro Val Leu Lys Arg His Gln Arg Glu
1655 1660 1665
Ile Thr Arg Thr Thr Leu Gln Ser Asp Gln Glu Glu Ile Asp Tyr
1670 1675 1680
Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp Ile
1685 1690 1695
Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys Lys
1700 1705 1710
Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr
1715 1720 1725
Gly Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln Ser
1730 1735 1740
Gly Ser Val Pro Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr
1745 1750 1755
Asp Gly Ser Phe Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu
1760 1765 1770
His Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp
1775 1780 1785
Asn Ile Met Val Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser
1790 1795 1800
Phe Tyr Ser Ser Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly
1805 1810 1815
Ala Glu Pro Arg Lys Asn Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr
1820 1825 1830
Tyr Phe Trp Lys Val Gln His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu
1835 1840 1845
Phe Asp Cys Lys Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu
1850 1855 1860
Lys Asp Val His Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His
1865 1870 1875
Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala His Gly Arg Gln Val Thr Val Gln
1880 1885 1890
Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile Phe Asp Glu Thr Lys Ser Trp
1895 1900 1905
Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg Asn Cys Arg Ala Pro Cys Asn
1910 1915 1920
Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys Glu Asn Tyr Arg Phe His
1925 1930 1935
Ala Ile Asn Gly Tyr Ile Met Asp Thr Leu Pro Gly Leu Val Met
1940 1945 1950
Ala Gln Asp Gln Arg Ile Arg Trp Tyr Leu Leu Ser Met Gly Ser
1955 1960 1965
Asn Glu Asn Ile His Ser Ile His Phe Ser Gly His Val Phe Thr
1970 1975 1980
Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr
1985 1990 1995
Pro Gly Val Phe Glu Thr Val Glu Met Leu Pro Ser Lys Ala Gly
2000 2005 2010
Ile Trp Arg Val Glu Cys Leu Ile Gly Glu His Leu His Ala Gly
2015 2020 2025
Met Ser Thr Leu Phe Leu Val Tyr Ser Asn Lys Cys Gln Thr Pro
2030 2035 2040
Leu Gly Met Ala Ser Gly His Ile Arg Asp Phe Gln Ile Thr Ala
2045 2050 2055
Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu His
2060 2065 2070
Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser Thr Lys Glu Pro Phe Ser
2075 2080 2085
Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro Met Ile Ile His Gly Ile
2090 2095 2100
Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe Ser Ser Leu Tyr Ile Ser
2105 2110 2115
Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp Gln Thr
2120 2125 2130
Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu Met Val Phe Phe Gly Asn
2135 2140 2145
Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn Ile Phe Asn Pro Pro Ile
2150 2155 2160
Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg
2165 2170 2175
Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys
2180 2185 2190
Ser Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile Ser Asp Ala Gln
2195 2200 2205
Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser
2210 2215 2220
Pro Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gln Gly Arg Ser Asn Ala Trp
2225 2230 2235
Arg Pro Gln Val Asn Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gln Val Asp Phe
2240 2245 2250
Gln Lys Thr Met Lys Val Thr Gly Val Thr Thr Gln Gly Val Lys
2255 2260 2265
Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu Ile Ser Ser
2270 2275 2280
Ser Gln Asp Gly His Gln Trp Thr Leu Phe Phe Gln Asn Gly Lys
2285 2290 2295
Val Lys Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp Ser Phe Thr Pro Val Val
2300 2305 2310
Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His
2315 2320 2325
Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala Leu Arg Met Glu Val Leu
2330 2335 2340
Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr
2345 2350
<210> 22
<211> 462
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 22
Met Gln Arg Val Asn Met Ile Met Ala Glu Ser Pro Ser Leu Ile Thr
1 5 10 15
Ile Cys Leu Leu Gly Tyr Leu Leu Ser Ala Glu Cys Thr Val Phe Leu
20 25 30
Asp His Glu Asn Ala Asn Lys Ile Leu Asn Arg Pro Lys Arg Tyr Asn
35 40 45
Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gln Gly Asn Leu Glu Arg Glu Cys
50 55 60
Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Pro Arg Glu Val Phe Glu Asn
65 70 75 80
Thr Glu Lys Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gln Tyr Val Asp Gly Asp Gln
85 90 95
Cys Glu Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Asp Ile
100 105 110
Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro Phe Gly Phe Glu Gly Lys Asn Cys
115 120 125
Glu Leu Asp Val Thr Cys Asn Ile Lys Asn Gly Arg Cys Glu Gln Phe
130 135 140
Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val Cys Ser Cys Thr Glu Gly
145 150 155 160
Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys Ser Cys Glu Pro Ala Val Pro Phe
165 170 175
Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr Arg Ala
180 185 190
Glu Ala Val Phe Pro Asp Val Asp Tyr Val Asn Pro Thr Glu Ala Glu
195 200 205
Thr Ile Leu Asp Asn Ile Thr Gln Gly Thr Gln Ser Phe Asn Asp Phe
210 215 220
Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp Ala Lys Pro Gly Gln Phe Pro Trp
225 230 235 240
Gln Val Val Leu Asn Gly Lys Val Asp Ala Phe Cys Gly Gly Ser Ile
245 250 255
Val Asn Glu Lys Trp Ile Val Thr Ala Ala His Cys Val Glu Thr Gly
260 265 270
Val Lys Ile Thr Val Val Ala Gly Glu His Asn Ile Glu Glu Thr Glu
275 280 285
His Thr Glu Gln Lys Arg Asn Val Ile Arg Ala Ile Ile Pro His His
290 295 300
Asn Tyr Asn Ala Ala Ile Asn Lys Tyr Asn His Asp Ile Ala Leu Leu
305 310 315 320
Glu Leu Asp Glu Pro Leu Val Leu Asn Ser Tyr Val Thr Pro Ile Cys
325 330 335
Ile Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Asn Ile Phe Leu Lys Phe Gly Ser Gly
340 345 350
Tyr Val Ser Gly Trp Ala Arg Val Phe His Lys Gly Arg Ser Ala Leu
355 360 365
Val Leu Gln Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys Leu
370 375 380
Arg Ser Thr Lys Phe Thr Ile Tyr Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly Phe
385 390 395 400
His Glu Gly Gly Arg Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro His
405 410 415
Val Thr Glu Val Glu Gly Thr Ser Phe Leu Thr Gly Ile Ile Ser Trp
420 425 430
Gly Glu Glu Cys Ala Met Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys Val
435 440 445
Ser Arg Tyr Val Asn Trp Ile Lys Glu Lys Thr Lys Leu Thr
450 455 460
<210> 23
<211> 488
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 23
Met Gly Arg Pro Leu His Leu Val Leu Leu Ser Ala Ser Leu Ala Gly
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Gly Glu Ser Leu Phe Ile Arg Arg Glu Gln Ala Asn
20 25 30
Asn Ile Leu Ala Arg Val Thr Arg Ala Asn Ser Phe Leu Glu Glu Met
35 40 45
Lys Lys Gly His Leu Glu Arg Glu Cys Met Glu Glu Thr Cys Ser Tyr
50 55 60
Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe Glu Asp Ser Asp Lys Thr Asn Glu Phe
65 70 75 80
Trp Asn Lys Tyr Lys Asp Gly Asp Gln Cys Glu Thr Ser Pro Cys Gln
85 90 95
Asn Gln Gly Lys Cys Lys Asp Gly Leu Gly Glu Tyr Thr Cys Thr Cys
100 105 110
Leu Glu Gly Phe Glu Gly Lys Asn Cys Glu Leu Phe Thr Arg Lys Leu
115 120 125
Cys Ser Leu Asp Asn Gly Asp Cys Asp Gln Phe Cys His Glu Glu Gln
130 135 140
Asn Ser Val Val Cys Ser Cys Ala Arg Gly Tyr Thr Leu Ala Asp Asn
145 150 155 160
Gly Lys Ala Cys Ile Pro Thr Gly Pro Tyr Pro Cys Gly Lys Gln Thr
165 170 175
Leu Glu Arg Arg Lys Arg Ser Val Ala Gln Ala Thr Ser Ser Ser Gly
180 185 190
Glu Ala Pro Asp Ser Ile Thr Trp Lys Pro Tyr Asp Ala Ala Asp Leu
195 200 205
Asp Pro Thr Glu Asn Pro Phe Asp Leu Leu Asp Phe Asn Gln Thr Gln
210 215 220
Pro Glu Arg Gly Asp Asn Asn Leu Thr Arg Ile Val Gly Gly Gln Glu
225 230 235 240
Cys Lys Asp Gly Glu Cys Pro Trp Gln Ala Leu Leu Ile Asn Glu Glu
245 250 255
Asn Glu Gly Phe Cys Gly Gly Thr Ile Leu Ser Glu Phe Tyr Ile Leu
260 265 270
Thr Ala Ala His Cys Leu Tyr Gln Ala Lys Arg Phe Lys Val Arg Val
275 280 285
Gly Asp Arg Asn Thr Glu Gln Glu Glu Gly Gly Glu Ala Val His Glu
290 295 300
Val Glu Val Val Ile Lys His Asn Arg Phe Thr Lys Glu Thr Tyr Asp
305 310 315 320
Phe Asp Ile Ala Val Leu Arg Leu Lys Thr Pro Ile Thr Phe Arg Met
325 330 335
Asn Val Ala Pro Ala Cys Leu Pro Glu Arg Asp Trp Ala Glu Ser Thr
340 345 350
Leu Met Thr Gln Lys Thr Gly Ile Val Ser Gly Phe Gly Arg Thr His
355 360 365
Glu Lys Gly Arg Gln Ser Thr Arg Leu Lys Met Leu Glu Val Pro Tyr
370 375 380
Val Asp Arg Asn Ser Cys Lys Leu Ser Ser Ser Phe Ile Ile Thr Gln
385 390 395 400
Asn Met Phe Cys Ala Gly Tyr Asp Thr Lys Gln Glu Asp Ala Cys Gln
405 410 415
Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Val Thr Arg Phe Lys Asp Thr Tyr Phe
420 425 430
Val Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Glu Gly Cys Ala Arg Lys Gly Lys
435 440 445
Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys Val Thr Ala Phe Leu Lys Trp Ile Asp Arg
450 455 460
Ser Met Lys Thr Arg Gly Leu Pro Lys Ala Lys Ser His Ala Pro Glu
465 470 475 480
Val Ile Thr Ser Ser Pro Leu Lys
485
<210> 24
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GS6接头
<400> 24
Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 25
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GS31接头
<400> 25
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30
<210> 26
<211> 319
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 膜联蛋白A5的E5-变体
<400> 26
Ala Gln Val Leu Arg Gly Thr Val Thr Asp Phe Pro Gly Phe Asp Glu
1 5 10 15
Glu Ala Asp Ala Glu Thr Leu Glu Lys Ala Met Glu Gly Leu Gly Thr
20 25 30
Asp Glu Glu Ser Ile Leu Thr Leu Leu Thr Ser Arg Ser Asn Ala Gln
35 40 45
Arg Gln Glu Ile Ser Ala Ala Phe Glu Thr Leu Phe Gly Arg Asp Leu
50 55 60
Leu Asp Asp Leu Lys Ser Glu Leu Thr Gly Lys Phe Glu Lys Leu Ile
65 70 75 80
Val Ala Leu Met Lys Pro Ser Arg Leu Tyr Asp Ala Tyr Glu Leu Lys
85 90 95
His Ala Leu Lys Gly Ala Gly Thr Asn Glu Lys Val Leu Thr Glu Ile
100 105 110
Ile Ala Ser Arg Thr Pro Glu Glu Leu Arg Ala Ile Lys Gln Val Tyr
115 120 125
Glu Glu Glu Tyr Gly Ser Ser Leu Glu Asp Asp Val Val Gly Asp Thr
130 135 140
Ser Gly Tyr Tyr Gln Arg Met Leu Val Val Leu Leu Gln Ala Asn Arg
145 150 155 160
Asp Pro Asp Ala Gly Ile Asp Glu Ala Gln Val Glu Gln Asp Ala Gln
165 170 175
Ala Leu Phe Gln Ala Gly Glu Leu Lys Trp Gly Thr Asp Glu Glu Glu
180 185 190
Phe Ile Thr Ile Phe Gly Thr Arg Ser Val Ser His Leu Arg Lys Val
195 200 205
Phe Asp Lys Tyr Met Thr Ile Ser Gly Phe Gln Ile Glu Glu Thr Ile
210 215 220
Asp Arg Glu Thr Ser Gly Asn Leu Glu Gln Leu Leu Leu Ala Val Val
225 230 235 240
Lys Ser Ile Arg Ser Ile Pro Ala Tyr Leu Ala Glu Thr Leu Tyr Tyr
245 250 255
Ala Met Lys Gly Ala Gly Thr Asp Asp His Thr Leu Ile Arg Val Met
260 265 270
Val Ser Arg Ser Glu Ile Asp Leu Phe Asn Ile Arg Lys Glu Phe Arg
275 280 285
Lys Asn Phe Ala Thr Ser Leu Tyr Ser Met Ile Lys Gly Asp Thr Ser
290 295 300
Gly Asp Tyr Lys Lys Ala Leu Leu Leu Leu Cys Gly Glu Asp Asp
305 310 315
<210> 27
<211> 318
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 乳凝集素（Lactadherin）C1C2序列（也称为MFG-E8）
<400> 27
Cys Val Glu Pro Leu Gly Met Glu Asn Gly Asn Ile Ala Asn Ser Gln
1 5 10 15
Ile Ala Ala Ser Ser Val Arg Val Thr Phe Leu Gly Leu Gln His Trp
20 25 30
Val Pro Glu Leu Ala Arg Leu Asn Arg Ala Gly Met Val Asn Ala Trp
35 40 45
Thr Pro Ser Ser Asn Asp Asp Asn Pro Trp Ile Gln Val Asn Leu Leu
50 55 60
Arg Arg Met Trp Val Thr Gly Val Val Thr Gln Gly Ala Ser Arg Leu
65 70 75 80
Ala Ser His Glu Tyr Leu Lys Ala Phe Lys Val Ala Tyr Ser Leu Asn
85 90 95
Gly His Glu Phe Asp Phe Ile His Asp Val Asn Lys Lys His Lys Glu
100 105 110
Phe Val Gly Asn Trp Asn Lys Asn Ala Val His Val Asn Leu Phe Glu
115 120 125
Thr Pro Val Glu Ala Gln Tyr Val Arg Leu Tyr Pro Thr Ser Cys His
130 135 140
Thr Ala Cys Thr Leu Arg Phe Glu Leu Leu Gly Cys Glu Leu Asn Gly
145 150 155 160
Cys Ala Asn Pro Leu Gly Leu Lys Asn Asn Ser Ile Pro Asp Lys Gln
165 170 175
Ile Thr Ala Ser Ser Ser Tyr Lys Thr Trp Gly Leu His Leu Phe Ser
180 185 190
Trp Asn Pro Ser Tyr Ala Arg Leu Asp Lys Gln Gly Asn Phe Asn Ala
195 200 205
Trp Val Ala Gly Ser Tyr Gly Asn Asp Gln Trp Leu Gln Val Asp Leu
210 215 220
Gly Ser Ser Lys Glu Val Thr Gly Ile Ile Thr Gln Gly Ala Arg Asn
225 230 235 240
Phe Gly Ser Val Gln Phe Val Ala Ser Tyr Lys Val Ala Tyr Ser Asn
245 250 255
Asp Ser Ala Asn Trp Thr Glu Tyr Gln Asp Pro Arg Thr Gly Ser Ser
260 265 270
Lys Ile Phe Pro Gly Asn Trp Asp Asn His Ser His Lys Lys Asn Leu
275 280 285
Phe Glu Thr Pro Ile Leu Ala Arg Tyr Val Arg Ile Leu Pro Val Ala
290 295 300
Trp His Asn Arg Ile Ala Leu Arg Leu Glu Leu Leu Gly Cys
305 310 315
<210> 28
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> PSP1肽
<400> 28
Cys Leu Ser Tyr Tyr Pro Ser Tyr Cys
1 5
<210> 29
<211> 346
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 29
Met Ala Met Val Ser Glu Phe Leu Lys Gln Ala Trp Phe Ile Glu Asn
1 5 10 15
Glu Glu Gln Glu Tyr Val Gln Thr Val Lys Ser Ser Lys Gly Gly Pro
20 25 30
Gly Ser Ala Val Ser Pro Tyr Pro Thr Phe Asn Pro Ser Ser Asp Val
35 40 45
Ala Ala Leu His Lys Ala Ile Met Val Lys Gly Val Asp Glu Ala Thr
50 55 60
Ile Ile Asp Ile Leu Thr Lys Arg Asn Asn Ala Gln Arg Gln Gln Ile
65 70 75 80
Lys Ala Ala Tyr Leu Gln Glu Thr Gly Lys Pro Leu Asp Glu Thr Leu
85 90 95
Lys Lys Ala Leu Thr Gly His Leu Glu Glu Val Val Leu Ala Leu Leu
100 105 110
Lys Thr Pro Ala Gln Phe Asp Ala Asp Glu Leu Arg Ala Ala Met Lys
115 120 125
Gly Leu Gly Thr Asp Glu Asp Thr Leu Ile Glu Ile Leu Ala Ser Arg
130 135 140
Thr Asn Lys Glu Ile Arg Asp Ile Asn Arg Val Tyr Arg Glu Glu Leu
145 150 155 160
Lys Arg Asp Leu Ala Lys Asp Ile Thr Ser Asp Thr Ser Gly Asp Phe
165 170 175
Arg Asn Ala Leu Leu Ser Leu Ala Lys Gly Asp Arg Ser Glu Asp Phe
180 185 190
Gly Val Asn Glu Asp Leu Ala Asp Ser Asp Ala Arg Ala Leu Tyr Glu
195 200 205
Ala Gly Glu Arg Arg Lys Gly Thr Asp Val Asn Val Phe Asn Thr Ile
210 215 220
Leu Thr Thr Arg Ser Tyr Pro Gln Leu Arg Arg Val Phe Gln Lys Tyr
225 230 235 240
Thr Lys Tyr Ser Lys His Asp Met Asn Lys Val Leu Asp Leu Glu Leu
245 250 255
Lys Gly Asp Ile Glu Lys Cys Leu Thr Ala Ile Val Lys Cys Ala Thr
260 265 270
Ser Lys Pro Ala Phe Phe Ala Glu Lys Leu His Gln Ala Met Lys Gly
275 280 285
Val Gly Thr Arg His Lys Ala Leu Ile Arg Ile Met Val Ser Arg Ser
290 295 300
Glu Ile Asp Met Asn Asp Ile Lys Ala Phe Tyr Gln Lys Met Tyr Gly
305 310 315 320
Ile Ser Leu Cys Gln Ala Ile Leu Asp Glu Thr Lys Gly Asp Tyr Glu
325 330 335
Lys Ile Leu Val Ala Leu Cys Gly Gly Asn
340 345
<210> 30
<211> 305
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 截短膜联蛋白A1
<400> 30
Phe Asn Pro Ser Ser Asp Val Ala Ala Leu His Lys Ala Ile Met Val
1 5 10 15
Lys Gly Val Asp Glu Ala Thr Ile Ile Asp Ile Leu Thr Lys Arg Asn
20 25 30
Asn Ala Gln Arg Gln Gln Ile Lys Ala Ala Tyr Leu Gln Glu Thr Gly
35 40 45
Lys Pro Leu Asp Glu Thr Leu Lys Lys Ala Leu Thr Gly His Leu Glu
50 55 60
Glu Val Val Leu Ala Leu Leu Lys Thr Pro Ala Gln Phe Asp Ala Asp
65 70 75 80
Glu Leu Arg Ala Ala Met Lys Gly Leu Gly Thr Asp Glu Asp Thr Leu
85 90 95
Ile Glu Ile Leu Ala Ser Arg Thr Asn Lys Glu Ile Arg Asp Ile Asn
100 105 110
Arg Val Tyr Arg Glu Glu Leu Lys Arg Asp Leu Ala Lys Asp Ile Thr
115 120 125
Ser Asp Thr Ser Gly Asp Phe Arg Asn Ala Leu Leu Ser Leu Ala Lys
130 135 140
Gly Asp Arg Ser Glu Asp Phe Gly Val Asn Glu Asp Leu Ala Asp Ser
145 150 155 160
Asp Ala Arg Ala Leu Tyr Glu Ala Gly Glu Arg Arg Lys Gly Thr Asp
165 170 175
Val Asn Val Phe Asn Thr Ile Leu Thr Thr Arg Ser Tyr Pro Gln Leu
180 185 190
Arg Arg Val Phe Gln Lys Tyr Thr Lys Tyr Ser Lys His Asp Met Asn
195 200 205
Lys Val Leu Asp Leu Glu Leu Lys Gly Asp Ile Glu Lys Cys Leu Thr
210 215 220
Ala Ile Val Lys Cys Ala Thr Ser Lys Pro Ala Phe Phe Ala Glu Lys
225 230 235 240
Leu His Gln Ala Met Lys Gly Val Gly Thr Arg His Lys Ala Leu Ile
245 250 255
Arg Ile Met Val Ser Arg Ser Glu Ile Asp Met Asn Asp Ile Lys Ala
260 265 270
Phe Tyr Gln Lys Met Tyr Gly Ile Ser Leu Cys Gln Ala Ile Leu Asp
275 280 285
Glu Thr Lys Gly Asp Tyr Glu Lys Ile Leu Val Ala Leu Cys Gly Gly
290 295 300
Asn
305
<210> 31
<211> 785
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 因子IX重链偶联膜联蛋白A5的E5变体
<400> 31
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr
20 25 30
Asp Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gln Ser Thr Tyr Tyr Arg Arg Glu Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Thr Gly Arg Glu Tyr Gly Gly Gly Trp Tyr Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val
195 200 205
Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys
210 215 220
Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Gly Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
450 455 460
Gly Ser Ala Gln Val Leu Arg Gly Thr Val Thr Asp Phe Pro Gly Phe
465 470 475 480
Asp Glu Glu Ala Asp Ala Glu Thr Leu Glu Lys Ala Met Glu Gly Leu
485 490 495
Gly Thr Asp Glu Glu Ser Ile Leu Thr Leu Leu Thr Ser Arg Ser Asn
500 505 510
Ala Gln Arg Gln Glu Ile Ser Ala Ala Phe Glu Thr Leu Phe Gly Arg
515 520 525
Asp Leu Leu Asp Asp Leu Lys Ser Glu Leu Thr Gly Lys Phe Glu Lys
530 535 540
Leu Ile Val Ala Leu Met Lys Pro Ser Arg Leu Tyr Asp Ala Tyr Glu
545 550 555 560
Leu Lys His Ala Leu Lys Gly Ala Gly Thr Asn Glu Lys Val Leu Thr
565 570 575
Glu Ile Ile Ala Ser Arg Thr Pro Glu Glu Leu Arg Ala Ile Lys Gln
580 585 590
Val Tyr Glu Glu Glu Tyr Gly Ser Ser Leu Glu Asp Asp Val Val Gly
595 600 605
Asp Thr Ser Gly Tyr Tyr Gln Arg Met Leu Val Val Leu Leu Gln Ala
610 615 620
Asn Arg Asp Pro Asp Ala Gly Ile Asp Glu Ala Gln Val Glu Gln Asp
625 630 635 640
Ala Gln Ala Leu Phe Gln Ala Gly Glu Leu Lys Trp Gly Thr Asp Glu
645 650 655
Glu Glu Phe Ile Thr Ile Phe Gly Thr Arg Ser Val Ser His Leu Arg
660 665 670
Lys Val Phe Asp Lys Tyr Met Thr Ile Ser Gly Phe Gln Ile Glu Glu
675 680 685
Thr Ile Asp Arg Glu Thr Ser Gly Asn Leu Glu Gln Leu Leu Leu Ala
690 695 700
Val Val Lys Ser Ile Arg Ser Ile Pro Ala Tyr Leu Ala Glu Thr Leu
705 710 715 720
Tyr Tyr Ala Met Lys Gly Ala Gly Thr Asp Asp His Thr Leu Ile Arg
725 730 735
Val Met Val Ser Arg Ser Glu Ile Asp Leu Phe Asn Ile Arg Lys Glu
740 745 750
Phe Arg Lys Asn Phe Ala Thr Ser Leu Tyr Ser Met Ile Lys Gly Asp
755 760 765
Thr Ser Gly Asp Tyr Lys Lys Ala Leu Leu Leu Leu Cys Gly Glu Asp
770 775 780
Asp
785
<210> 32
<211> 771
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 因子IX重链偶联截短膜联蛋白A1
<400> 32
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr
20 25 30
Asp Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gln Ser Thr Tyr Tyr Arg Arg Glu Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Thr Gly Arg Glu Tyr Gly Gly Gly Trp Tyr Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val
195 200 205
Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys
210 215 220
Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Gly Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
450 455 460
Gly Ser Phe Asn Pro Ser Ser Asp Val Ala Ala Leu His Lys Ala Ile
465 470 475 480
Met Val Lys Gly Val Asp Glu Ala Thr Ile Ile Asp Ile Leu Thr Lys
485 490 495
Arg Asn Asn Ala Gln Arg Gln Gln Ile Lys Ala Ala Tyr Leu Gln Glu
500 505 510
Thr Gly Lys Pro Leu Asp Glu Thr Leu Lys Lys Ala Leu Thr Gly His
515 520 525
Leu Glu Glu Val Val Leu Ala Leu Leu Lys Thr Pro Ala Gln Phe Asp
530 535 540
Ala Asp Glu Leu Arg Ala Ala Met Lys Gly Leu Gly Thr Asp Glu Asp
545 550 555 560
Thr Leu Ile Glu Ile Leu Ala Ser Arg Thr Asn Lys Glu Ile Arg Asp
565 570 575
Ile Asn Arg Val Tyr Arg Glu Glu Leu Lys Arg Asp Leu Ala Lys Asp
580 585 590
Ile Thr Ser Asp Thr Ser Gly Asp Phe Arg Asn Ala Leu Leu Ser Leu
595 600 605
Ala Lys Gly Asp Arg Ser Glu Asp Phe Gly Val Asn Glu Asp Leu Ala
610 615 620
Asp Ser Asp Ala Arg Ala Leu Tyr Glu Ala Gly Glu Arg Arg Lys Gly
625 630 635 640
Thr Asp Val Asn Val Phe Asn Thr Ile Leu Thr Thr Arg Ser Tyr Pro
645 650 655
Gln Leu Arg Arg Val Phe Gln Lys Tyr Thr Lys Tyr Ser Lys His Asp
660 665 670
Met Asn Lys Val Leu Asp Leu Glu Leu Lys Gly Asp Ile Glu Lys Cys
675 680 685
Leu Thr Ala Ile Val Lys Cys Ala Thr Ser Lys Pro Ala Phe Phe Ala
690 695 700
Glu Lys Leu His Gln Ala Met Lys Gly Val Gly Thr Arg His Lys Ala
705 710 715 720
Leu Ile Arg Ile Met Val Ser Arg Ser Glu Ile Asp Met Asn Asp Ile
725 730 735
Lys Ala Phe Tyr Gln Lys Met Tyr Gly Ile Ser Leu Cys Gln Ala Ile
740 745 750
Leu Asp Glu Thr Lys Gly Asp Tyr Glu Lys Ile Leu Val Ala Leu Cys
755 760 765
Gly Gly Asn
770
<210> 33
<211> 786
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 因子IX重链偶联截短膜联蛋白A1
<400> 33
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr
20 25 30
Asp Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gln Ser Thr Tyr Tyr Arg Arg Glu Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Thr Gly Arg Glu Tyr Gly Gly Gly Trp Tyr Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val
195 200 205
Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys
210 215 220
Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Gly Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
450 455 460
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
465 470 475 480
Ser Phe Asn Pro Ser Ser Asp Val Ala Ala Leu His Lys Ala Ile Met
485 490 495
Val Lys Gly Val Asp Glu Ala Thr Ile Ile Asp Ile Leu Thr Lys Arg
500 505 510
Asn Asn Ala Gln Arg Gln Gln Ile Lys Ala Ala Tyr Leu Gln Glu Thr
515 520 525
Gly Lys Pro Leu Asp Glu Thr Leu Lys Lys Ala Leu Thr Gly His Leu
530 535 540
Glu Glu Val Val Leu Ala Leu Leu Lys Thr Pro Ala Gln Phe Asp Ala
545 550 555 560
Asp Glu Leu Arg Ala Ala Met Lys Gly Leu Gly Thr Asp Glu Asp Thr
565 570 575
Leu Ile Glu Ile Leu Ala Ser Arg Thr Asn Lys Glu Ile Arg Asp Ile
580 585 590
Asn Arg Val Tyr Arg Glu Glu Leu Lys Arg Asp Leu Ala Lys Asp Ile
595 600 605
Thr Ser Asp Thr Ser Gly Asp Phe Arg Asn Ala Leu Leu Ser Leu Ala
610 615 620
Lys Gly Asp Arg Ser Glu Asp Phe Gly Val Asn Glu Asp Leu Ala Asp
625 630 635 640
Ser Asp Ala Arg Ala Leu Tyr Glu Ala Gly Glu Arg Arg Lys Gly Thr
645 650 655
Asp Val Asn Val Phe Asn Thr Ile Leu Thr Thr Arg Ser Tyr Pro Gln
660 665 670
Leu Arg Arg Val Phe Gln Lys Tyr Thr Lys Tyr Ser Lys His Asp Met
675 680 685
Asn Lys Val Leu Asp Leu Glu Leu Lys Gly Asp Ile Glu Lys Cys Leu
690 695 700
Thr Ala Ile Val Lys Cys Ala Thr Ser Lys Pro Ala Phe Phe Ala Glu
705 710 715 720
Lys Leu His Gln Ala Met Lys Gly Val Gly Thr Arg His Lys Ala Leu
725 730 735
Ile Arg Ile Met Val Ser Arg Ser Glu Ile Asp Met Asn Asp Ile Lys
740 745 750
Ala Phe Tyr Gln Lys Met Tyr Gly Ile Ser Leu Cys Gln Ala Ile Leu
755 760 765
Asp Glu Thr Lys Gly Asp Tyr Glu Lys Ile Leu Val Ala Leu Cys Gly
770 775 780
Gly Asn
785
<210> 34
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 因子IX重链A10的氨基酸序列
<400> 34
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr
20 25 30
Asp Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gln Ser Thr Tyr Tyr Arg Arg Glu Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Thr Gly Arg Thr Lys Pro Trp Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val
195 200 205
Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys
210 215 220
Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 35
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 因子IX A10的重链VH氨基酸序列
<400> 35
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr
20 25 30
Asp Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gln Ser Thr Tyr Tyr Arg Arg Glu Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Thr Gly Arg Thr Lys Pro Trp Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 36
<211> 785
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合因子IX重链 A10的膜联蛋白A5的氨基酸序列
<400> 36
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr
20 25 30
Asp Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gln Ser Thr Tyr Tyr Arg Arg Glu Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Thr Gly Arg Thr Lys Pro Trp Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val
195 200 205
Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys
210 215 220
Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Gly Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
450 455 460
Gly Ser Ala Gln Val Leu Arg Gly Thr Val Thr Asp Phe Pro Gly Phe
465 470 475 480
Asp Glu Arg Ala Asp Ala Glu Thr Leu Arg Lys Ala Met Lys Gly Leu
485 490 495
Gly Thr Asp Glu Glu Ser Ile Leu Thr Leu Leu Thr Ser Arg Ser Asn
500 505 510
Ala Gln Arg Gln Glu Ile Ser Ala Ala Phe Lys Thr Leu Phe Gly Arg
515 520 525
Asp Leu Leu Asp Asp Leu Lys Ser Glu Leu Thr Gly Lys Phe Glu Lys
530 535 540
Leu Ile Val Ala Leu Met Lys Pro Ser Arg Leu Tyr Asp Ala Tyr Glu
545 550 555 560
Leu Lys His Ala Leu Lys Gly Ala Gly Thr Asn Glu Lys Val Leu Thr
565 570 575
Glu Ile Ile Ala Ser Arg Thr Pro Glu Glu Leu Arg Ala Ile Lys Gln
580 585 590
Val Tyr Glu Glu Glu Tyr Gly Ser Ser Leu Glu Asp Asp Val Val Gly
595 600 605
Asp Thr Ser Gly Tyr Tyr Gln Arg Met Leu Val Val Leu Leu Gln Ala
610 615 620
Asn Arg Asp Pro Asp Ala Gly Ile Asp Glu Ala Gln Val Glu Gln Asp
625 630 635 640
Ala Gln Ala Leu Phe Gln Ala Gly Glu Leu Lys Trp Gly Thr Asp Glu
645 650 655
Glu Lys Phe Ile Thr Ile Phe Gly Thr Arg Ser Val Ser His Leu Arg
660 665 670
Lys Val Phe Asp Lys Tyr Met Thr Ile Ser Gly Phe Gln Ile Glu Glu
675 680 685
Thr Ile Asp Arg Glu Thr Ser Gly Asn Leu Glu Gln Leu Leu Leu Ala
690 695 700
Val Val Lys Ser Ile Arg Ser Ile Pro Ala Tyr Leu Ala Glu Thr Leu
705 710 715 720
Tyr Tyr Ala Met Lys Gly Ala Gly Thr Asp Asp His Thr Leu Ile Arg
725 730 735
Val Met Val Ser Arg Ser Glu Ile Asp Leu Phe Asn Ile Arg Lys Glu
740 745 750
Phe Arg Lys Asn Phe Ala Thr Ser Leu Tyr Ser Met Ile Lys Gly Asp
755 760 765
Thr Ser Gly Asp Tyr Lys Lys Ala Leu Leu Leu Leu Cys Gly Glu Asp
770 775 780
Asp
785
<210> 37
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 因子IX重链B2的氨基酸序列
<400> 37
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr
20 25 30
Asp Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gln Ser Thr Tyr Tyr Arg Arg Glu Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Thr Gly Arg Ile Lys Thr Trp Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val
195 200 205
Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys
210 215 220
Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 38
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 因子IX B2的重链VH氨基酸序列
<400> 38
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr
20 25 30
Asp Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gln Ser Thr Tyr Tyr Arg Arg Glu Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Thr Gly Arg Ile Lys Thr Trp Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 39
<211> 785
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合因子IX重链 B2的膜联蛋白A5的氨基酸序列
<400> 39
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr
20 25 30
Asp Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gln Ser Thr Tyr Tyr Arg Arg Glu Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Thr Gly Arg Ile Lys Thr Trp Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val
195 200 205
Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys
210 215 220
Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Gly Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
450 455 460
Gly Ser Ala Gln Val Leu Arg Gly Thr Val Thr Asp Phe Pro Gly Phe
465 470 475 480
Asp Glu Arg Ala Asp Ala Glu Thr Leu Arg Lys Ala Met Lys Gly Leu
485 490 495
Gly Thr Asp Glu Glu Ser Ile Leu Thr Leu Leu Thr Ser Arg Ser Asn
500 505 510
Ala Gln Arg Gln Glu Ile Ser Ala Ala Phe Lys Thr Leu Phe Gly Arg
515 520 525
Asp Leu Leu Asp Asp Leu Lys Ser Glu Leu Thr Gly Lys Phe Glu Lys
530 535 540
Leu Ile Val Ala Leu Met Lys Pro Ser Arg Leu Tyr Asp Ala Tyr Glu
545 550 555 560
Leu Lys His Ala Leu Lys Gly Ala Gly Thr Asn Glu Lys Val Leu Thr
565 570 575
Glu Ile Ile Ala Ser Arg Thr Pro Glu Glu Leu Arg Ala Ile Lys Gln
580 585 590
Val Tyr Glu Glu Glu Tyr Gly Ser Ser Leu Glu Asp Asp Val Val Gly
595 600 605
Asp Thr Ser Gly Tyr Tyr Gln Arg Met Leu Val Val Leu Leu Gln Ala
610 615 620
Asn Arg Asp Pro Asp Ala Gly Ile Asp Glu Ala Gln Val Glu Gln Asp
625 630 635 640
Ala Gln Ala Leu Phe Gln Ala Gly Glu Leu Lys Trp Gly Thr Asp Glu
645 650 655
Glu Lys Phe Ile Thr Ile Phe Gly Thr Arg Ser Val Ser His Leu Arg
660 665 670
Lys Val Phe Asp Lys Tyr Met Thr Ile Ser Gly Phe Gln Ile Glu Glu
675 680 685
Thr Ile Asp Arg Glu Thr Ser Gly Asn Leu Glu Gln Leu Leu Leu Ala
690 695 700
Val Val Lys Ser Ile Arg Ser Ile Pro Ala Tyr Leu Ala Glu Thr Leu
705 710 715 720
Tyr Tyr Ala Met Lys Gly Ala Gly Thr Asp Asp His Thr Leu Ile Arg
725 730 735
Val Met Val Ser Arg Ser Glu Ile Asp Leu Phe Asn Ile Arg Lys Glu
740 745 750
Phe Arg Lys Asn Phe Ala Thr Ser Leu Tyr Ser Met Ile Lys Gly Asp
755 760 765
Thr Ser Gly Asp Tyr Lys Lys Ala Leu Leu Leu Leu Cys Gly Glu Asp
770 775 780
Asp
785
<210> 40
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 因子IX重链 C12的氨基酸序列
<400> 40
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr
20 25 30
Asp Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gln Ser Thr Tyr Tyr Arg Arg Glu Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Thr Gly Arg Lys Lys Gly Trp His Phe Tyr Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val
195 200 205
Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys
210 215 220
Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 41
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 因子IX C12的重链VH氨基酸序列
<400> 41
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr
20 25 30
Asp Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gln Ser Thr Tyr Tyr Arg Arg Glu Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Thr Gly Arg Lys Lys Gly Trp His Phe Tyr Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 42
<211> 785
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合因子IX重链C12的膜联蛋白A5的氨基酸序列
<400> 42
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr
20 25 30
Asp Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gln Ser Thr Tyr Tyr Arg Arg Glu Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Thr Gly Arg Lys Lys Gly Trp His Phe Tyr Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val
195 200 205
Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys
210 215 220
Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Gly Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
450 455 460
Gly Ser Ala Gln Val Leu Arg Gly Thr Val Thr Asp Phe Pro Gly Phe
465 470 475 480
Asp Glu Arg Ala Asp Ala Glu Thr Leu Arg Lys Ala Met Lys Gly Leu
485 490 495
Gly Thr Asp Glu Glu Ser Ile Leu Thr Leu Leu Thr Ser Arg Ser Asn
500 505 510
Ala Gln Arg Gln Glu Ile Ser Ala Ala Phe Lys Thr Leu Phe Gly Arg
515 520 525
Asp Leu Leu Asp Asp Leu Lys Ser Glu Leu Thr Gly Lys Phe Glu Lys
530 535 540
Leu Ile Val Ala Leu Met Lys Pro Ser Arg Leu Tyr Asp Ala Tyr Glu
545 550 555 560
Leu Lys His Ala Leu Lys Gly Ala Gly Thr Asn Glu Lys Val Leu Thr
565 570 575
Glu Ile Ile Ala Ser Arg Thr Pro Glu Glu Leu Arg Ala Ile Lys Gln
580 585 590
Val Tyr Glu Glu Glu Tyr Gly Ser Ser Leu Glu Asp Asp Val Val Gly
595 600 605
Asp Thr Ser Gly Tyr Tyr Gln Arg Met Leu Val Val Leu Leu Gln Ala
610 615 620
Asn Arg Asp Pro Asp Ala Gly Ile Asp Glu Ala Gln Val Glu Gln Asp
625 630 635 640
Ala Gln Ala Leu Phe Gln Ala Gly Glu Leu Lys Trp Gly Thr Asp Glu
645 650 655
Glu Lys Phe Ile Thr Ile Phe Gly Thr Arg Ser Val Ser His Leu Arg
660 665 670
Lys Val Phe Asp Lys Tyr Met Thr Ile Ser Gly Phe Gln Ile Glu Glu
675 680 685
Thr Ile Asp Arg Glu Thr Ser Gly Asn Leu Glu Gln Leu Leu Leu Ala
690 695 700
Val Val Lys Ser Ile Arg Ser Ile Pro Ala Tyr Leu Ala Glu Thr Leu
705 710 715 720
Tyr Tyr Ala Met Lys Gly Ala Gly Thr Asp Asp His Thr Leu Ile Arg
725 730 735
Val Met Val Ser Arg Ser Glu Ile Asp Leu Phe Asn Ile Arg Lys Glu
740 745 750
Phe Arg Lys Asn Phe Ala Thr Ser Leu Tyr Ser Met Ile Lys Gly Asp
755 760 765
Thr Ser Gly Asp Tyr Lys Lys Ala Leu Leu Leu Leu Cys Gly Glu Asp
770 775 780
Asp
785
<210> 43
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 因子IX的重链VH CDR1氨基酸序列
<400> 43
Tyr Tyr Asp Ile Gln
1 5
<210> 44
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 因子IX的重链VH CDR2氨基酸序列
<400> 44
Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gln Ser Thr Tyr Tyr Arg Arg Glu Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 45
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 因子IX的重链VH CDR3氨基酸序列
<400> 45
Arg Thr Gly Arg Glu Tyr Gly Gly Gly Trp Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 46
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 因子IX的重链VH CDR3氨基酸共有序列
<220>
<221> X
<222> (5)..(5)
<223> T或I或K或E
<220>
<221> X
<222> (6)..(6)
<223> K或Y
<220>
<221> X
<222> (7)..(7)
<223> P或T或G
<220>
<221> X
<222> (8)..(8)
<223> W或G
<220>
<221> X
<222> (9)..(9)
<223> G或H
<220>
<221> X
<222> (10)..(10)
<223> Y或F或W
<400> 46
Arg Thr Gly Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 47
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 因子IX的轻链VL CDR1氨基酸序列
<400> 47
Lys Ala Ser Arg Asn Ile Glu Arg Asn Leu Ala
1 5 10
<210> 48
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 因子IX的轻链VL CDR2氨基酸序列
<400> 48
Gln Ala Ser Arg Lys Glu Ser
1 5
<210> 49
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 因子IX的轻链VL CDR3氨基酸序列
<400> 49
Gln Gln Tyr Ser Ser Pro Pro Leu Thr
1 5
<210> 50
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 因子IX的重链VH氨酸氨基酸共有序列
<220>
<221> X
<222> (103)..(103)
<223> T或I或K或E
<220>
<221> X
<222> (104)..(104)
<223> K或Y
<220>
<221> X
<222> (105)..(105)
<223> P或T或G
<220>
<221> X
<222> (106)..(106)
<223> W或G
<220>
<221> X
<222> (107)..(107)
<223> G或H
<220>
<221> X
<222> (108)..(108)
<223> Y或F或W
<400> 50
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr
20 25 30
Asp Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gln Ser Thr Tyr Tyr Arg Arg Glu Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Thr Gly Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 51
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 因子IX A10的重链VL CDR3氨基酸序列
<400> 51
Arg Thr Gly Arg Thr Lys Pro Trp Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 52
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 因子IX B2的重链VL CDR3氨基酸序列
<400> 52
Arg Thr Gly Arg Ile Lys Thr Trp Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 53
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 因子IX C12的重链VH CDR3氨基酸序列
<400> 53
Arg Thr Gly Arg Lys Lys Gly Trp His Phe Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 54
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-因子IX抗体重链ATG16028的氨基酸序列
<400> 54
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr
20 25 30
Asp Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gln Ser Thr Tyr Tyr Arg Arg Glu Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Thr Gly Arg Glu Tyr Gly Gly Gly Trp Tyr Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Arg Lys Thr His Thr Cys Pro Arg Cys Pro Ala Pro Glu Leu
225 230 235 240
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Tyr Thr Lys Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Ser Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Val Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Arg Leu Ala Ser Tyr Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210> 55
<211> 788
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合抗-因子IX抗体重链ATG16028的膜联蛋白A5的氨基酸序列
<400> 55
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr
20 25 30
Asp Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gln Ser Thr Tyr Tyr Arg Arg Glu Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Thr Gly Arg Glu Tyr Gly Gly Gly Trp Tyr Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Arg Lys Thr His Thr Cys Pro Arg Cys Pro Ala Pro Glu Leu
225 230 235 240
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Tyr Thr Lys Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Ser Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Val Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Arg Leu Ala Ser Tyr Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro Gly Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
450 455 460
Gly Gly Gly Gly Ser Ala Gln Val Leu Arg Gly Thr Val Thr Asp Phe
465 470 475 480
Pro Gly Phe Asp Glu Arg Ala Asp Ala Glu Thr Leu Arg Lys Ala Met
485 490 495
Lys Gly Leu Gly Thr Asp Glu Glu Ser Ile Leu Thr Leu Leu Thr Ser
500 505 510
Arg Ser Asn Ala Gln Arg Gln Glu Ile Ser Ala Ala Phe Lys Thr Leu
515 520 525
Phe Gly Arg Asp Leu Leu Asp Asp Leu Lys Ser Glu Leu Thr Gly Lys
530 535 540
Phe Glu Lys Leu Ile Val Ala Leu Met Lys Pro Ser Arg Leu Tyr Asp
545 550 555 560
Ala Tyr Glu Leu Lys His Ala Leu Lys Gly Ala Gly Thr Asn Glu Lys
565 570 575
Val Leu Thr Glu Ile Ile Ala Ser Arg Thr Pro Glu Glu Leu Arg Ala
580 585 590
Ile Lys Gln Val Tyr Glu Glu Glu Tyr Gly Ser Ser Leu Glu Asp Asp
595 600 605
Val Val Gly Asp Thr Ser Gly Tyr Tyr Gln Arg Met Leu Val Val Leu
610 615 620
Leu Gln Ala Asn Arg Asp Pro Asp Ala Gly Ile Asp Glu Ala Gln Val
625 630 635 640
Glu Gln Asp Ala Gln Ala Leu Phe Gln Ala Gly Glu Leu Lys Trp Gly
645 650 655
Thr Asp Glu Glu Lys Phe Ile Thr Ile Phe Gly Thr Arg Ser Val Ser
660 665 670
His Leu Arg Lys Val Phe Asp Lys Tyr Met Thr Ile Ser Gly Phe Gln
675 680 685
Ile Glu Glu Thr Ile Asp Arg Glu Thr Ser Gly Asn Leu Glu Gln Leu
690 695 700
Leu Leu Ala Val Val Lys Ser Ile Arg Ser Ile Pro Ala Tyr Leu Ala
705 710 715 720
Glu Thr Leu Tyr Tyr Ala Met Lys Gly Ala Gly Thr Asp Asp His Thr
725 730 735
Leu Ile Arg Val Met Val Ser Arg Ser Glu Ile Asp Leu Phe Asn Ile
740 745 750
Arg Lys Glu Phe Arg Lys Asn Phe Ala Thr Ser Leu Tyr Ser Met Ile
755 760 765
Lys Gly Asp Thr Ser Gly Asp Tyr Lys Lys Ala Leu Leu Leu Leu Cys
770 775 780
Gly Glu Asp Asp
785

Claims (36)

1.一种结合至少一种凝血因子的膜靶向结合蛋白，其中，所述结合蛋白具有促凝血活性。
2.如权利要求1所述的蛋白质，其中，所述蛋白质包含特异性结合所述凝血因子的第一结合区和特异性结合哺乳动物细胞质膜组分的第二结合区。
3.如权利要求2所述的蛋白质，其中，所述第一结合区具有促凝血活性。
4.如权利要求2或3所述的蛋白质，其中，所述第一和/或第二结合区选自：
(i)单链Fv片段(scFv)；
(ii)二聚scFv(二-scFv)；或
(iii)双抗体；
(iv)三抗体；
(v)四抗体；
(vi)Fab；
(vii)F(ab’)2；
(viii)Fv；或
(ix)与抗体的恒定区、Fc或重链恒定结构域(CH)2和/或CH3相连的(i)至(viii)之一。
5.如权利要求2-4中任一项所述的蛋白质，其中，所述第一和/或第二结合区是抗体或其抗原结合片段、抗体模拟物、结构域抗体、嵌合抗体或融合蛋白。
6.如权利要求2-5中任一项所述的蛋白质，其中，所述第一结合区是单特异性的、双特异性的或多特异性的。
7.如权利要求1-6中任一项所述的蛋白质，其中，所述凝血因子选自：因子I，因子II(凝血酶原)/凝血酶、因子III、因子V、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI、因子XII因子XIII和前述任一者的活化形式。
8.如权利要求2-7中任一项所述的蛋白质，其中，所述第一结合区是抗-因子IX抗体或其因子IX结合片段。
9.如权利要求8所述的蛋白质，其中，所述抗-因子IX抗体或其因子IX结合片段结合非活化的因子IX(FIX)和/或活化的因子IX(FIXa)。
10.如权利要求2-7中任一项所述的蛋白质，其中，所述第一结合区特异性地结合因子IX/IXa和因子X/Xa。
11.如权利要求4-9中任一项所述的蛋白质，其中，所述第一结合区是半抗体。
12.如权利要求4-10中任一项所述的蛋白质，其中，所述第一结合区抗原包含IgG4恒定区或稳定化的IgG4恒定区。
13.如权利要求12所述蛋白质，其中，所述IgG4 Fc包含SEQ ID NO:15至SEQ ID NO:19中任一项所示的序列。
14.如权利要求2-13中任一项所述的蛋白质，其中，所述第一结合区包含：含有SEQ IDNO:2-7、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:40中任一所示序列的VH和含有SEQ IDNO:1所示序列的VL。
15.如权利要求14所述的蛋白质，其中，所述蛋白质包含：
(i)SEQ ID NO:1所示的VL序列，SEQ ID NO:2所示的VH序列和SEQ ID NO:3所示的VH序列；或
(ii)SEQ ID NO:1所示的VL序列和SEQ ID NO:4所示的VH序列；或
(iii)SEQ ID NO:1所示的VL序列和SEQ ID NO:5所示的VH序列；或
(iv)SEQ ID NO:1所示的VL序列和SEQ ID NO:6所示的VH序列；或
(v)SEQ ID NO:1所示的VL序列和SEQ ID NO:7所示的VH序列；或
(vi)SEQ ID NO:1所示的VL序列和SEQ ID NO:8所示的VH序列；或
(vii)SEQ ID NO:1所示的VL序列和SEQ ID NO:9所示的VH序列；或
(viii)SEQ ID NO:1所示的VL序列和SEQ ID NO:10所示的VH序列；或
(ix)SEQ ID NO:1所示的VL序列，SEQ ID NO:31所示的VH序列；或
(x)SEQ ID NO:1所示的VL序列，SEQ ID NO:32所示的VH序列；或
(xi)SEQ ID NO:1所示的VL序列，SEQ ID NO:33所示的VH序列；
(xii)SEQ ID NO:1所示的VL序列，SEQ ID NO:34所示的VH序列；或
(xiii)SEQ ID NO:1所示的VL序列，SEQ ID NO:36所示的VH序列；或
(xiv)SEQ ID NO:1所示的VL序列，SEQ ID NO:37所示的VH序列；或
(xv)SEQ ID NO:1所示的VL序列，SEQ ID NO:39所示的VH序列；或
(xvi)SEQ ID NO:1所示的VL序列，SEQ ID NO:40所示的VH序列；或
(xvii)SEQ ID NO:1所示的VL序列，SEQ ID NO:42所示的VH序列；或
(xviii)SEQ ID NO:1所示的VL序列，SEQ ID NO:9所示的VH序列和SEQ ID NO:10所示的VH序列；或
(xix)SEQ ID NO:1所示的VL序列，SEQ ID NO:6所示的VH序列和SEQ ID NO:10所示的VH序列；或
(xx)SEQ ID NO:1所示的VL序列，SEQ ID NO:9所示的VH序列和SEQ ID NO:7所示的VH序列；或
(xxi)SEQ ID NO:1所示的VL序列，SEQ ID NO:54所示的VH序列；或
(xxii)SEQ ID NO:1所示的VL序列，SEQ ID NO:55所示的VH序列。
16.如权利要求2-15中任一项所述的蛋白质，其中，所述第一结合区是半抗体，该半抗体包含：
(i)VH，其包含：
(a)CDR1，其包含SEQ ID NO：13的氨基酸31-35所示的序列；
(b)CDR2，其包含SEQ ID NO：13的氨基酸50-66所示的序列；和
(c)CDR3，其包含SEQ ID NO：13的氨基酸99-112所示的序列；和
(ii)VL，其包含：
(a)CDR1，其包含SEQ ID NO：11的氨基酸24-34所示的序列；
(b)CDR2，其包含SEQ ID NO：11的氨基酸50-56所示的序列；和
(c)CDR3，其包含SEQ ID NO：11的氨基酸89-97所示的序列。
17.如权利要求2-16中任一项所述的蛋白质，其中，所述质膜组分选自：氨基磷脂；膜相关多肽及其混合物。
18.如权利要求17所述的蛋白质，其中，所述氨基磷脂选自：磷脂酰丝氨酸，磷脂酰乙醇胺及其混合物。
19.如权利要求18所述的蛋白质，其中，所述膜相关多肽选自：GPIIb/IIIa、β2GP1、TLT-1、凝血因子、选择素及其混合物。
20.如权利要求2-19中任一项所述的蛋白质，其中，所述第二结合区选自：抗体或其抗原结合片段、膜联蛋白或变体、富含γ-羧基谷氨酸(GLA)的结构域或变体、乳凝集素结构域、PSP1肽或变体、蛋白激酶C(PKC)结构域和普列克底物蛋白同源结构域。
21.如权利要求20所述的蛋白质，其中，所述膜联蛋白是含有SEQ ID NO:14所示序列的膜联蛋白A5或含有SEQ ID NO:30所示序列的截短膜联蛋白A1或膜联蛋白A5的磷脂酰丝氨酸结合片段或变体或膜联蛋白A1的磷脂酰丝氨酸结合片段或变体。
22.如权利要求2-21中任一项所述的蛋白质，其中，所述哺乳动物细胞选自：血小板、内皮细胞和血红细胞。
23.如权利要求2-22中任一项所述的蛋白质，其中，所述第一结合区经由接头连接所述第二结合区。
24.如权利要求23所述的蛋白质，其中，所述接头是包含长度为2-31个氨基酸的肽接头。
25.如权利要求1-24中任一项所述的蛋白质，其中，所述蛋白质包含：
(i)含有抗-因子IX抗体或其因子IX结合片段的第一结合区；和
(ii)第二结合区，其包含：
(a)包含SEQ ID NO:14所示序列的膜联蛋白A5；或
(b)包含SEQ ID NO:30所示序列的截短膜联蛋白A1；
(c)膜联蛋白A5的磷脂酰丝氨酸结合片段或变体；或
(d)膜联蛋白A1的磷脂酰丝氨酸结合片段或变体。
26.如权利要求25所述的蛋白质，其中，接头将所述第二结合区的N-末端接合到所述抗-因子IX抗体或其抗原结合片段的轻链或其结构域或重链或其结构域的C-末端。
27.如权利要求26所述的蛋白质，其中，所述接头在所述第二结合区的N-末端与所述抗-因子IX抗体或其抗原结合片段的重链或其结构域的C-末端之间延伸。
28.一种结合凝血因子的膜靶向结合蛋白，其中，该蛋白质包含：
(i)第一结合区，所述第一结合区是包含含有SEQ ID NO:13所示序列的VH和含有SEQ IDNO:11所示序列的VL的抗-因子IX/IXa半抗体；和
(ii)第二结合区，所述第二结构域包含含有SEQ ID NO:14所示序列的膜联蛋白A5。
29.一种组合物，其包含权利要求1-28中任一项所述的蛋白质和药学上可接受的运载体。
30.一种治疗或预防对象中疾病或病症的方法，所述方法包括向有此需要的对象给予权利要求1-28中任一项所述的蛋白质或权利要求29所述的组合物。
31.权利要求1-28中任一项所述的蛋白质在制备用于治疗或预防对象中疾病或病症的药物中的用途。
32.如权利要求30所述的方法或如权利要求31所述的用途，其中，所述疾病或病症是出血性疾病。
33.如权利要求30或32所述的方法或如权利要求31或32所述的用途，其中，所述对象具有发展出血性疾病或其症状的风险。
34.如权利要求32或33所述的方法，其中，所述出血性疾病是A型血友病、B型血友病、冯维勒布兰德氏病、因子I缺乏症、因子II缺乏症、因子V缺乏症、因子V/因子VIII组合型缺乏症、因子VII缺乏症、因子X缺乏症、因子XI缺乏症或因子XIII缺乏症。
35.如权利要求33所述的方法，其中，所述对象患有血友病A并且已经产生了因子VIII的抑制剂。
36.一种用于治疗或预防对象中出血性疾病的药盒，所述药盒包括：
(a)结合凝血因子的至少一种膜靶向结合蛋白；
(b)供于使用所述药盒治疗或预防对象中出血性疾病的说明书；和
(c)任选地，至少一种其他治疗活性化合物或药物。
CN201780072317.8A 2016-09-23 2017-09-22 凝血因子结合蛋白及其应用 Pending CN110023339A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU2016903858A AU2016903858A0 (en) 2016-09-23 Coagulation factor binding proteins and uses thereof
AU2016903858 2016-09-23
AU2017902352 2017-06-20
AU2017902352A AU2017902352A0 (en) 2017-06-20 Coagulation factor binding proteins and uses thereof
PCT/AU2017/051038 WO2018053597A1 (en) 2016-09-23 2017-09-22 Coagulation factor binding proteins and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110023339A true CN110023339A (zh) 2019-07-16

Family

ID=61689344

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780072317.8A Pending CN110023339A (zh) 2016-09-23 2017-09-22 凝血因子结合蛋白及其应用

Country Status (8)

Country Link
US (2) US20190248920A1 (zh)
EP (1) EP3515948A4 (zh)
JP (1) JP7051826B2 (zh)
KR (1) KR20190052027A (zh)
CN (1) CN110023339A (zh)
AU (1) AU2017331739A1 (zh)
CA (1) CA3034105A1 (zh)
WO (1) WO2018053597A1 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110343181A (zh) * 2018-04-08 2019-10-18 苏州康宁杰瑞生物科技有限公司 针对凝血因子ix(fix)的单域抗体
CN115386009A (zh) * 2022-04-26 2022-11-25 江苏靶标生物医药研究所有限公司 一种膜联蛋白v与血管生成抑制剂融合蛋白的构建方法和应用

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JOP20200312A1 (ar) 2015-06-26 2017-06-16 Novartis Ag الأجسام المضادة للعامل xi وطرق الاستخدام
TW201802121A (zh) 2016-05-25 2018-01-16 諾華公司 抗因子XI/XIa抗體之逆轉結合劑及其用途
EP3559047A1 (en) 2016-12-23 2019-10-30 Novartis AG Factor xi antibodies and methods of use
US10344091B2 (en) 2017-10-27 2019-07-09 New York University Anti-Galectin-9 antibodies and uses thereof
AU2020247993A1 (en) * 2019-03-25 2021-11-18 New York University Anti-Galectin-9 antibodies and uses thereof
EP3956359A1 (en) * 2019-04-17 2022-02-23 Novo Nordisk A/S Bispecific antibodies
KR102647642B1 (ko) * 2021-05-04 2024-03-15 (주)케어젠 혈액 응고 활성을 갖는 펩타이드와 이의 용도

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000002587A1 (en) * 1998-07-13 2000-01-20 Board Of Regents, The University Of Texas System Cancer treatment methods using therapeutic conjugates that bind to aminophospholipids
US20050058640A1 (en) * 2003-09-12 2005-03-17 Baxter International Inc. Factor IXa specific antibodies displaying factor VIIIa like activity
CN101405017A (zh) * 2005-03-09 2009-04-08 斯图尔特·E·林德 具有磷脂酰丝氨酸结合结构域的嵌合蛋白
CN102112144A (zh) * 2008-05-16 2011-06-29 拜耳医药保健有限公司 靶向性凝固因子及其使用方法
CN103298937A (zh) * 2010-11-17 2013-09-11 中外制药株式会社 具有代替凝血因子viii的功能的功能的多特异性抗原结合分子
US20160060358A1 (en) * 2014-08-28 2016-03-03 California Institute Of Technology Induction of antigen-specific tolerance

Family Cites Families (62)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5800815A (en) 1903-05-05 1998-09-01 Cytel Corporation Antibodies to P-selectin and their uses
US4196265A (en) 1977-06-15 1980-04-01 The Wistar Institute Method of producing antibodies
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US5618920A (en) 1985-11-01 1997-04-08 Xoma Corporation Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
AU634186B2 (en) 1988-11-11 1993-02-18 Medical Research Council Single domain ligands, receptors comprising said ligands, methods for their production, and use of said ligands and receptors
US5632991A (en) 1988-11-14 1997-05-27 Brigham & Women's Hospital Antibodies specific for E-selectin and the uses thereof
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US6291158B1 (en) 1989-05-16 2001-09-18 Scripps Research Institute Method for tapping the immunological repertoire
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
JPH05508664A (ja) 1991-05-09 1993-12-02 ボード・オブ・リージェンツ・オブ・ザ・ユニヴァーシティ・オブ・ワシントン リン脂質標的血栓溶解剤
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
ES2227512T3 (es) 1991-12-02 2005-04-01 Medical Research Council Produccion de anticuerpos contra auto-antigenos a partir de repertorios de segmentos de anticuerpos fijados en un fago.
US5877289A (en) 1992-03-05 1999-03-02 The Scripps Research Institute Tissue factor compositions and ligands for the specific coagulation of vasculature
US6004555A (en) 1992-03-05 1999-12-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for the specific coagulation of vasculature
US6093399A (en) 1992-03-05 2000-07-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for the specific coagulation of vasculature
KR950701681A (ko) 1992-05-22 1995-04-28 로저 엔, 플레어 다중 부착 분자에 특이성을 갖는 항체
DK1087013T3 (da) 1992-08-21 2009-05-11 Univ Bruxelles Immunoglobuliner uden lette kæder
WO1994007921A1 (en) 1992-09-25 1994-04-14 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Target binding polypeptide
EP0627932B1 (en) 1992-11-04 2002-05-08 City Of Hope Antibody construct
US5516637A (en) 1994-06-10 1996-05-14 Dade International Inc. Method involving display of protein binding pairs on the surface of bacterial pili and bacteriophage
HU220347B (hu) * 1994-07-11 2001-12-28 Board Of Regents The University Of Texas System Készítmény az érrendszer specifikus koagulálásához
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
AUPO591797A0 (en) 1997-03-27 1997-04-24 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation High avidity polyvalent and polyspecific reagents
US6113898A (en) 1995-06-07 2000-09-05 Idec Pharmaceuticals Corporation Human B7.1-specific primatized antibodies and transfectomas expressing said antibodies
WO1997008320A1 (en) 1995-08-18 1997-03-06 Morphosys Gesellschaft Für Proteinoptimierung Mbh Protein/(poly)peptide libraries
US6699658B1 (en) 1996-05-31 2004-03-02 Board Of Trustees Of The University Of Illinois Yeast cell surface display of proteins and uses thereof
ATE374248T1 (de) 1996-06-27 2007-10-15 Vlaams Interuniv Inst Biotech Antikörpermoleküle, die spezifisch mit dem aktiven zentrum oder dem aktiven spalt eines zielmoleküls interagieren
DE19742706B4 (de) 1997-09-26 2013-07-25 Pieris Proteolab Ag Lipocalinmuteine
AU746454B2 (en) 1998-03-02 2002-05-02 Massachusetts Institute Of Technology Poly zinc finger proteins with improved linkers
AUPP221098A0 (en) 1998-03-06 1998-04-02 Diatech Pty Ltd V-like domain binding molecules
EP1051432B1 (en) 1998-12-08 2007-01-24 Biovation Limited Method for reducing immunogenicity of proteins
US7115396B2 (en) 1998-12-10 2006-10-03 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
US7270969B2 (en) 1999-05-05 2007-09-18 Phylogica Limited Methods of constructing and screening diverse expression libraries
AT411997B (de) 1999-09-14 2004-08-26 Baxter Ag Faktor ix/faktor ixa aktivierende antikörper und antikörper-derivate
US7229619B1 (en) 2000-11-28 2007-06-12 Medimmune, Inc. Methods of administering/dosing anti-RSV antibodies for prophylaxis and treatment
ATE448301T1 (de) 2000-09-08 2009-11-15 Univ Zuerich Sammlung von proteinen mit sich wiederholenden sequenzen (repeat proteins), die repetitive sequenzmodule enthalten
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
ES2286247T3 (es) 2001-02-21 2007-12-01 Alavita Pharmaceuticals, Inc. Proteinas anexinicas modificacdas y tratamiento de la trombosis.
WO2002088171A2 (en) 2001-04-26 2002-11-07 Avidia Research Institute Combinatorial libraries of monomer domains
WO2004006955A1 (en) 2001-07-12 2004-01-22 Jefferson Foote Super humanized antibodies
EP1658095A4 (en) 2003-06-02 2006-06-14 Alexion Pharma Inc ANTI-CD3 ANTIBODY DESIMMUNISE
JP4871126B2 (ja) 2003-07-04 2012-02-08 アフィボディ・アーベー Ｈｅｒ２に対する結合親和性を有するポリペプチド
WO2005019255A1 (en) 2003-08-25 2005-03-03 Pieris Proteolab Ag Muteins of tear lipocalin
AU2004296376B2 (en) 2003-12-05 2010-03-04 Bristol-Myers Squibb Company Inhibitors of type 2 vascular endothelial growth factor receptors
US7977071B2 (en) 2004-06-02 2011-07-12 Adalta Pty Ltd. Binding moieties based on shark ignar domains
US20060263367A1 (en) 2005-05-23 2006-11-23 Fey Georg H Bispecific antibody devoid of Fc region and method of treatment using same
EP1945668A4 (en) 2005-08-15 2009-07-22 Arana Therapeutics Ltd SYNTHETIC ANTIBODIES WITH FRAMEWORK REGIONS OF NEUWELTPRIMATEN
JP5558719B2 (ja) 2005-12-12 2014-07-23 モサメディックス・ビー．ブイ． 治療および診断におけるプレターゲッティングに適したアネキシン誘導体
US7553936B2 (en) 2006-12-04 2009-06-30 The United States of America as represented by Secretary Department of Health and Human Services Anti-TREM-like transcript-1 (TLT-1) antibodies and compositions
CN106432503B (zh) 2008-12-19 2020-03-06 宏观基因有限公司 共价双抗体及其用途
US8658768B2 (en) 2009-06-03 2014-02-25 Mosamedix B.V. Method for enhancing phagocytosis of phosphatidylserine-exposing cells
EP2367000A1 (en) 2010-03-04 2011-09-21 Charité Universitätsmedizin Berlin High throughput analysis of T-cell receptor repertoires
EP2591006B1 (en) 2010-07-09 2019-04-24 Bioverativ Therapeutics Inc. Processable single chain molecules and polypeptides made using same
US9617329B2 (en) 2010-10-01 2017-04-11 Csl Limited Method of cloning nucleic acid
MX2013009862A (es) 2011-03-02 2013-10-25 Novo Nordisk As Factor de coagulacion dirigido al transcripto 1 tipo trem (tlt-1) en plaquetas activadas.
CN102690345B (zh) 2011-03-24 2014-03-19 江苏靶标生物医药研究所有限公司 人膜联蛋白v变体及其表达、制备和应用
TW201625299A (zh) 2014-06-20 2016-07-16 Chugai Pharmaceutical Co Ltd 用於因第ｖｉｉｉ凝血因子及／或活化的第ｖｉｉｉ凝血因子的活性降低或欠缺而發病及／或進展的疾病之預防及／或治療之醫藥組成物

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000002587A1 (en) * 1998-07-13 2000-01-20 Board Of Regents, The University Of Texas System Cancer treatment methods using therapeutic conjugates that bind to aminophospholipids
US20050058640A1 (en) * 2003-09-12 2005-03-17 Baxter International Inc. Factor IXa specific antibodies displaying factor VIIIa like activity
CN101405017A (zh) * 2005-03-09 2009-04-08 斯图尔特·E·林德 具有磷脂酰丝氨酸结合结构域的嵌合蛋白
CN102112144A (zh) * 2008-05-16 2011-06-29 拜耳医药保健有限公司 靶向性凝固因子及其使用方法
CN103298937A (zh) * 2010-11-17 2013-09-11 中外制药株式会社 具有代替凝血因子viii的功能的功能的多特异性抗原结合分子
US20160060358A1 (en) * 2014-08-28 2016-03-03 California Institute Of Technology Induction of antigen-specific tolerance

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110343181A (zh) * 2018-04-08 2019-10-18 苏州康宁杰瑞生物科技有限公司 针对凝血因子ix(fix)的单域抗体
CN110343181B (zh) * 2018-04-08 2022-04-08 苏州康宁杰瑞生物科技有限公司 针对凝血因子ix(fix)的单域抗体
CN115386009A (zh) * 2022-04-26 2022-11-25 江苏靶标生物医药研究所有限公司 一种膜联蛋白v与血管生成抑制剂融合蛋白的构建方法和应用
CN115386009B (zh) * 2022-04-26 2023-12-01 江苏靶标生物医药研究所有限公司 一种膜联蛋白v与血管生成抑制剂融合蛋白的构建方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
US20220089778A1 (en) 2022-03-24
EP3515948A1 (en) 2019-07-31
KR20190052027A (ko) 2019-05-15
AU2017331739A1 (en) 2019-03-07
CA3034105A1 (en) 2018-03-29
JP7051826B2 (ja) 2022-04-11
US20190248920A1 (en) 2019-08-15
EP3515948A4 (en) 2020-04-08
JP2019532057A (ja) 2019-11-07
WO2018053597A1 (en) 2018-03-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110023339A (zh) 凝血因子结合蛋白及其应用
Schiele et al. A specific antidote for dabigatran: functional and structural characterization
ES2898683T3 (es) Direccionamiento del factor tisular a las plaquetas activadas
CA2747519C (en) Anti-fxi antibodies and methods of use
CN110248964A (zh) 促凝血抗体
JP7414929B2 (ja) ヒト補体因子ｃ２に結合する結合分子、及び、その使用。
TWI716059B (zh) 經改良的促凝血抗體
CN109153726A (zh) 抗因子xi的活性位点的单克隆抗体及其用途
CA3144755A1 (en) Method of inhibiting or activating gamma delta t cells
KR20220019806A (ko) 가용성 보체 수용체 1형 변이체 접합체 및 이의 용도
JP2022529036A (ja) 二重特異性抗体
JP6445440B2 (ja) 抗プロテインｃ抗体による出血性疾患の治療
WO2020114614A1 (en) Proteinaceous molecules binding factor ixa and factor x
RU2818588C2 (ru) Биспецифические антитела
TWI837084B (zh) 促凝血抗體
RU2810094C2 (ru) Прокоагулянтные антитела
US20210309746A1 (en) Antibodies that bind cd277 and uses thereof
TW201617371A (zh) 針對經活化之因子ｖ之抗體
US20210388089A1 (en) Antigen binding agents that bind cd277 and uses thereof
EP4153633A1 (en) Mageb2 binding constructs
WO2020115281A1 (en) Proteinaceous molecules binding factor ixa and factor x
Litzenburger A specific antidote for dabigatran: functional and structural characterization
Abdalla Identification of the Regions in Factor V Mediating its Edocytosis by Megakaryocytes to Form the Unique Platelet-Derived Cofactor Molecule

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20190716

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication