TW201902512A - 治療方法 - Google Patents

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克里斯俊 克雷恩
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Abstract

本發明係關於治療疾病之方法，及減少與投與T細胞活化治療劑相關之細胞介素釋放之方法。本發明進一步係關於治療疾病之組合治療方法及用於此類方法之抗體。

Description

治療方法
本發明係關於治療疾病、特定言之B細胞增生性病症之方法，及減少對T細胞活化治療劑投與起反應之副作用之方法。本發明進一步係關於治療疾病之組合治療方法及用於此類方法之抗體。
B細胞增生性病症描述包括白血病與淋巴瘤之惡性疾病之異質群體。淋巴瘤發展於淋巴細胞且包括兩個主要類別：霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin lymphomas；HL)及非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin lymphomas；NHL)。在美國，B細胞來源之淋巴瘤構成所有非霍奇金氏淋巴瘤病例之大致80%至85%，且基於來源之B細胞之基因型及表現型表現模式在B細胞亞群中存在相當大的異質性。舉例而言，B細胞淋巴瘤亞群包括緩慢生長之頑固性且不可治癒之疾病，諸如濾泡性淋巴瘤(Follicular lymphoma；FL)或慢性淋巴球性白血病(CLL)以及更具侵襲性之亞型套細胞淋巴瘤(MCL)及瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)。
儘管可獲得用於治療B細胞增生性病症之各種藥劑，但仍持續需要開發安全且有效的治療劑以延長緩解期及提高患者之治癒率。
目前正在研究的策略係使T細胞與惡性B細胞接合。為使T細胞有效接合惡性B細胞，近來已研發出兩種方法。此等兩種方法係：1)投與經離體工程改造之T細胞以識別腫瘤細胞(亦稱為嵌合抗原受體修飾之T細胞療法[CAR-T細胞]) (Maude等人, N Engl J Med (2014) 371,1507-1517)；及2)投與活化內源性T細胞之藥劑，諸如雙特異性抗體(Oak及Bartlett, Expert Opin Investig Drugs (2015) 24, 715-724)。
第一方法之實例報導於Maude等人之研究中，其中30個成年及小兒患者用經針對CD19之嵌合抗原受體豆狀病毒載體轉導之自體T細胞(CTL019 CAR-T細胞)治療。結果係基於67%之6個月無事件存活率及78%之總存活率之持續緩解。然而，所有患者均患有細胞介素釋放症候群(CRS)(與腫瘤負荷相關)，27%之患者患有嚴重CRS。未知病因之中樞神經系統毒性亦標記為高頻。
相反，涉及活化內源性T細胞以識別腫瘤標靶之第二方法繞過此可擴增性障礙，且亦可提供競爭性功效、安全性資料及可能長期的反應持續時間。在不同CD20+ 血液科惡性疾病中，此方法最佳由布林莫單抗(blinatumomab)例示，一種CD19 CD3靶向T細胞雙特異性分子(Bargou等人, Science (2008) 321, 974-977)，其近年來得以批准以用於患有微小殘留病陽性急性淋巴球性白血病(ALL)之患者。此由兩個單鏈Fv片段構成(所謂BiTE®形式)之化合物引導CD19+ 細胞藉由溶胞T細胞溶解。布林莫單抗之主要限制因素係其短半衰期(大致2小時)，由此使得必須經由泵連續輸注4至8週。然而，其對於患有復發/難治癒性非霍奇金淋巴瘤(r/r NHL)與ALL之患者有較強功效，其中需要增加給藥(SUD)以緩解嚴重細胞介素釋放症候群及CNS毒性(Nagorsen及Baeuerle, Exp Cell Res (2011) 317, 1255-1260)。
CD20 CD3靶向T細胞雙特異性分子，CD20XCD3 bsAB，係下一代B細胞靶向抗體之另一實例。CD20XCD3 bsAB係靶向B細胞上表現之CD20及呈現於T細胞上之CD3 ε鏈(CD3e)的T細胞雙特異性(TCB)抗體。
CD20XCD3 bsAB之作用機制包含同時結合至CD20+ B細胞及CD3+ T細胞，從而致使T細胞活化及T細胞介導之B細胞殺死。在CD20+ B細胞存在下，無論係循環或組織駐存的，藥理學活性劑量將觸發T細胞活化及相關細胞介素釋放。CD20XCD3 bsAB在非臨床模型中展示相比於競爭性T細胞接合劑增強之效力，且在具有基於IgG之形式下，具有相比於布林莫單抗極大改良之半衰期。
細胞介素釋放係T細胞活化之結果。在由TeGenero進行的1階段之研究(Suntharalingam等人, N Engl J Med (2006) 355,1018-1028)中，所有6個健康志願者在不適當給藥之T細胞刺激超促效劑抗CD28單株抗體之輸注後迅速經歷幾乎致命之嚴重細胞介素釋放症候群(CRS)。近年來，在以上提及之Maude等人關於患有復發性ALL之患者之CD19靶向嵌合抗原受體T細胞(CAR-T細胞)治療之研究中，所有30個患者均具有細胞介素釋放，在27%之患者中，其歸類為嚴重。CRS係CAR-T細胞療法之常見但嚴重的併發症(綜述於Xu及Tang, Cancer Letters (2014) 343, 172-178中)。
在CD19-CD3 T細胞雙特異性藥劑布林莫單抗下亦常觀察到嚴重CRS及CNS毒性(Klinger等人, Blood. 2012;119(26):6226-6233)。在所有臨床試驗中，在接受布林莫單抗之患者中，神經毒性出現於大致50%之患者中，且觀察到之毒性類型在藥品說明書中充分界定。
未充分瞭解CNS毒性是否或如何與早期細胞介素釋放或T細胞活化相關。與布林莫單抗類似，43% (13/30)之用靶向CD19之CAR-T細胞治療之患有r/r ALL之患者報導為CNS AE (譫妄至完全腦病範圍內)(Maude等人, N Engl J Med (2014) 371,1507-1517；Ghorashian等人, Br J Haematol (2015) 169, 463-478)。通常在CRS症狀之後出現之神經毒性效應達到峰值且開始消散；然而並未發現與嚴重CRS之直接明確關聯。作者提出神經毒性之機制可涉及直接CAR-T細胞介導之毒性或其可經細胞介素介導。相反，嚴重CRS與神經毒性(例如腦病)之間的關聯已在靶向CD19之CAR-T細胞療法之另一研究中表明(Davila等人, Sci Transl Med (2014) 6, 224ra25)且經推測相對於直接CAR-T誘導之損壞，係歸因於通用T細胞活化。
與使CD3+ 細胞連接至組織限制性(亦即非循環)標靶細胞之其他T細胞雙特異性抗體相比，細胞介素釋放及/或CNS相關之毒性在使CD3+ 細胞連接至B細胞之T細胞雙特異性抗體中尤其明顯。
因此，需要減輕或預防此等可明顯有助於治療患有諸如NHL及CLL之B細胞增生性病症之患者的有前景的藥劑之此類副作用之方法。
本發明係基於以下出人意料的研究結果，與向個體投與諸如CD20XCD3 bsAB之T細胞活化治療劑相關之細胞介素釋放可藉由用諸如奧濱尤妥珠單抗(obinutuzumab)之II型抗CD20抗體預治療該個體而明顯減少。
奧濱尤妥珠單抗係人類化經糖基工程改造之II型抗CD20 mAb，其以高親和力結合至CD20抗原，從而誘導抗體依賴性細胞毒性(ADCC)及抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)、低補體依賴性細胞毒性(CDC)活性及高直接細胞死亡誘導。
不希望受理論所束縛，GAZYVA®預治療(Gpt)之使用應有助於迅速耗乏末梢血液與周圍淋巴樣器官中之B細胞，以使得與由T細胞活化治療劑引起的較強全身性T細胞活化高度相關之不良事件(AE)(例如CRS)的風險降低，同時支援自給藥開始足夠高以介導腫瘤細胞消除的暴露量之T細胞活化治療劑。迄今為止，已在持續奧濱尤妥珠單抗臨床試驗中經數百患者評定及管理奧濱尤妥珠單抗之安全概況(包括細胞介素釋放)。最終，除支援諸如CD20XCD3 bsAB之T細胞活化治療劑之安全概況以外，Gpt亦應有助於防止抗藥物抗體(ADA)形成此等特有分子。
用於患者，Gpt應轉變為安全概況增強之較佳藥物暴露。
與T細胞雙特異性藥劑下所用之其他方法(諸如增加給藥(SUD))相比，Gpt對於實現上文目的應更有效。單次劑量之奧濱尤妥珠單抗一旦確定，即應使復發/難治癒性患者接受全部治療劑量之T細胞活化治療劑，諸如CD20XCD3 bsAB，而無來自增加給藥之時間延遲。舉例而言，近年來報導在進行中的第2階段試驗中用於患有r/r DLBCL之患者的布林莫單抗給藥方案併有雙重增加方法(亦即9→28→112 µg/m2 /天)，因此，需要14天以達到最大劑量112 µg/m2 /天(Viardot等人, Hematol Oncol (2015) 33, 242(摘要285))。
如實例中所示，在用奧濱尤妥珠單抗預治療之後，向食蟹猴中投與CD20XCD3 bsAB在高達無Gpt下所耐受十倍之含量時仍耐受。
在Gpt時觀察到有效末梢血液B細胞耗乏及抗腫瘤活性以及與第一CD20XCD3 bsAB注射相關之末梢血液中之極大減少之細胞介素釋放。
因此，在第一態樣中，本發明提供一種用於減少個體之與投與T細胞活化治療劑相關之細胞介素釋放之方法，其包含在投與治療劑之前向個體投與II型抗CD20抗體。在一個實施例中，投與II型抗CD20抗體與投與治療劑之間的時間段足以對II型抗CD20抗體之投與起反應而減少個體之B細胞數。
在另一態樣中，本發明提供一種治療個體之疾病之方法，該方法包含有包含以下之治療方案： (i) 向個體投與II型抗CD20抗體， 及在一段時間之後連續 (ii) 向個體投與T細胞活化治療劑， 其中投與II型抗CD20抗體與投與治療劑之間的時間段足以對II型抗CD20抗體之投與起反應而減少個體之B細胞數。
在一個實施例中，該治療方案與不投與II型抗CD20抗體之對應治療方案相比有效減少個體之與投與治療劑相關之細胞介素釋放。
在另一態樣中，本發明提供一種用於減少個體之與投與T細胞活化治療劑相關之細胞介素釋放之方法中的II型抗CD20抗體，其包含在投與治療劑之前向個體投與II型抗CD20抗體。
在一個實施例中，投與II型抗CD20抗體與投與治療劑之間的時間段足以對CD20抗體之投與起反應而減少個體之B細胞數。
在另一態樣中，本發明提供一種用於治療個體之疾病之方法中的II型抗CD20抗體，該方法包含有包含以下之治療方案： (i) 向個體投與II型抗CD20抗體， 及在一段時間之後連續 (ii) 向個體投與T細胞活化治療劑， 其中投與II型抗CD20抗體與投與治療劑之間的時間段足以對II型抗CD20抗體之投與起反應而減少個體之B細胞數。
在一個實施例中，該治療方案與不投與II型抗CD20抗體之對應治療方案相比有效減少個體之與投與治療劑相關之細胞介素釋放。
在另一態樣中，本發明提供II型抗CD20抗體之用途，其係用於製造用以減少個體之與投與T細胞活化治療劑相關之細胞介素釋放之藥劑， 其中將該藥劑用於包含以下之治療方案中： (i) 向個體投與II型抗CD20抗體， 及在一段時間之後連續 (ii) 向個體投與T細胞活化治療劑， 其中投與II型抗CD20抗體與投與治療劑之間的時間段足以對II型抗CD20抗體之投與起反應而減少個體之B細胞數。
在一個實施例中，該治療方案與不投與II型抗CD20抗體之對應治療方案相比有效減少個體之與投與T細胞活化治療劑相關之細胞介素釋放。
在又一態樣中，本發明提供一種用於減少個體之與投與T細胞活化治療劑相關之細胞介素釋放之套組，其包含有包含II型抗CD20抗體組合物及在治療方案中使用II型抗CD20抗體組合物之說明書的套裝，該治療方案包含 (i) 向個體投與II型抗CD20抗體組合物， 及在一段時間之後連續 (ii) 向個體投與T細胞活化治療劑， 其中投與II型抗CD20抗體組合物與投與治療劑之間的時間段足以對CD20抗體之投與起反應而減少個體之B細胞數。
在一個實施例中，該治療方案與不投與II型抗CD20抗體組合物之對應治療方案相比有效減少個體之與投與T細胞活化治療劑相關之細胞介素釋放。在一個實施例中，該套組進一步包含治療劑組合物。
在另一態樣中，本發明提供一種用於治療個體之疾病之方法的T細胞活化治療劑，該方法包含有包含以下之治療方案： (i) 向個體投與II型抗CD20抗體， 及在一段時間之後連續 (ii) 向個體投與T細胞活化治療劑， 其中投與II型抗CD20抗體與投與治療劑之間的時間段足以對CD20抗體之投與起反應而減少個體之B細胞數。
在一個實施例中，該治療方案與不投與II型抗CD20抗體之對應治療方案相比有效減少個體之與投與T細胞活化治療劑相關之細胞介素釋放。
在又另一態樣中，本發明提供T細胞活化治療劑之用途，其係用於製造用於治療個體之疾病之藥劑，其中該治療包含有包含以下之治療方案： (i) 向個體投與II型抗CD20抗體， 及在一段時間之後連續 (ii) 向個體投與T細胞活化治療劑， 其中投與II型抗CD20抗體與投與治療劑之間的時間段足以對II型抗CD20抗體之投與起反應而減少個體之B細胞數。
在一個實施例中，該治療方案與不投與II型抗CD20抗體之對應治療方案相比有效減少個體之與投與T細胞活化治療劑相關之細胞介素釋放。
在另一態樣中，本發明提供一種用於治療個體之疾病之套組，其包含有包含T細胞活化治療劑組合物及在治療方案中使用治療劑組合物之說明書的套裝，該治療方案包含 (i) 向個體投與II型抗CD20抗體， 及在一段時間之後連續 (ii) 向個體投與T細胞活化治療劑組合物， 其中投與II型抗CD20抗體組合物與投與治療劑組合物之間的時間段足以對CD20抗體之投與起反應而減少個體之B細胞數。
在一個實施例中，該治療方案與不投與II型抗CD20抗體組合物之對應治療方案相比有效減少個體之與投與T細胞活化治療劑相關之細胞介素釋放。在一個實施例中，該套組進一步包含II型抗CD20抗體組合物。
本發明之方法、用途、II型抗CD20抗體、治療劑及套組可併有單獨或呈組合形式之任何下文中所述特徵。
在一個實施例中，II型抗CD20抗體包含重鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 4之重鏈CDR (HCDR) 1、SEQ ID NO: 5之HCDR2及SEQ ID NO: 6之HCDR3；及輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 7之輕鏈CDR (LCDR) 1、SEQ ID NO: 8之LCDR2及SEQ ID NO: 9之LCDR3。
在一更特定實施例中，II型抗CD20抗體包含SEQ ID NO: 10之重鏈可變區序列及SEQ ID NO: 11之輕鏈可變區序列。
在一個實施例中，II型抗CD20抗體係IgG抗體，尤其IgG1 抗體。
在另一態樣中，與未經工程改造之抗體相比，II型抗CD20抗體經工程改造而在Fc區中具有增加之比例的非海藻糖基化寡醣。在一個實施例中，II型抗CD20抗體之Fc區中的至少約40%之N-連接寡醣係非海藻糖基化的。
在一特定實施例中，II型抗CD20抗體係奧濱尤妥珠單抗。
在一個實施例中，T細胞活化治療劑包含抗體，尤其多特異性(例如雙特異性)抗體。
在一個實施例中，抗體特異性結合至活化T細胞抗原。
在一個實施例中，抗體特異性結合至選自以下之群的抗原：CD3、CD28、CD137 (亦稱為4-1BB)、CD40、CD226、OX40、GITR、CD27、HVEM及CD127。
在一個實施例中，抗體特異性結合至CD3，尤其CD3ɛ。
在一個實施例中，抗體包含重鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 12之重鏈CDR (HCDR) 1、SEQ ID NO: 13之HCDR2及SEQ ID NO: 14之HCDR3；及輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 15之輕鏈CDR (LCDR) 1、SEQ ID NO: 16之LCDR2及SEQ ID NO: 17之LCDR3。
在一個實施例中，抗體包含SEQ ID NO: 18之重鏈可變區序列及SEQ ID NO: 19之輕鏈可變區序列。
在一個實施例中，抗體特異性結合至B細胞抗原，尤其惡性B細胞抗原。
在一個實施例中，抗體特異性結合至選自由以下組成之群的抗原：CD20、CD19、CD22、ROR-1、CD37及CD5，尤其CD20或CD19。
在一個實施例中，抗體特異性結合至CD20。
在一個實施例中，抗體包含重鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 4之重鏈CDR (HCDR) 1、SEQ ID NO: 5之HCDR2及SEQ ID NO: 6之HCDR3；及輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 7之輕鏈CDR (LCDR) 1、SEQ ID NO: 8之LCDR2及SEQ ID NO: 9之LCDR3。
在一個實施例中，抗體包含SEQ ID NO: 10之重鏈可變區序列及SEQ ID NO: 11之輕鏈可變區序列。
在一個實施例中，抗體係多特異性抗體，尤其雙特異性抗體。
在一個實施例中，多特異性抗體特異性結合至(i)活化T細胞抗原及(ii)B細胞抗原。
在一個實施例中，多特異性抗體特異性結合至(i) CD3及(ii)選自CD20及CD19之抗原。
在一個實施例中，多特異性抗體特異性結合至CD3及CD20。
在一個實施例中，治療劑包含有包含以下之雙特異性抗體： (i)特異性結合至CD3且包含以下之抗原結合部分：包含SEQ ID NO: 12之重鏈CDR (HCDR) 1、SEQ ID NO: 13之HCDR2及SEQ ID NO: 14之HCDR3的重鏈可變區；及包含SEQ ID NO: 15之輕鏈CDR (LCDR) 1、SEQ ID NO: 16之LCDR2及SEQ ID NO: 17之LCDR3的輕鏈可變區；及 (ii)特異性結合至CD20且包含以下之抗原結合部分：包含SEQ ID NO: 4之重鏈CDR (HCDR) 1、SEQ ID NO: 5之HCDR2及SEQ ID NO: 6之HCDR3的重鏈可變區；及包含SEQ ID NO: 7之輕鏈CDR (LCDR) 1、SEQ ID NO: 8之LCDR2及SEQ ID NO: 9之LCDR3的輕鏈可變區。
在一特定實施例中，治療劑包含CD20XCD3 bsAB。
在一個實施例中，治療劑包含嵌合抗原受體(CAR)或表現CAR之T細胞，尤其特異性結合至B細胞抗原之CAR，更尤其特異性結合至選自CD20、CD19、CD22、ROR-1、CD37及CD5之群的抗原之CAR。
在一個實施例中，疾病係B細胞增生性病症，尤其CD20陽性B細胞病症。
在一個實施例中，疾病係選自由以下組成之群：非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性淋巴球性白血病(ALL)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡性淋巴瘤(FL)、套細胞淋巴瘤(MCL)、邊緣區B細胞淋巴瘤(MZL)、多發性骨髓瘤(MM)及霍奇金淋巴瘤(HL)。
在另一態樣中，本發明提供一種II型抗CD20抗體，其係用於治療個體癌症或延緩其進展之方法中。使II型抗CD20抗體與抗CD20/抗CD3雙特異性抗體組合使用。
抗CD20/抗CD3雙特異性抗體及II型抗CD20抗體可以單一組合物一起投與或以兩種或更多種不同組合物個別投與。
抗CD20/抗CD3雙特異性抗體及II型抗CD20抗體可以兩種或更多種不同組合物投與。兩種或更多種不同組合物可在不同時間點投與。
II型抗CD20抗體可包含有包含SEQ ID NO: 4之重鏈CDR (HCDR) 1、SEQ ID NO: 5之HCDR2及SEQ ID NO: 6之HCDR3的重鏈可變區。II型抗CD20抗體可進一步包含有包含SEQ IDNO:7之輕鏈CDR (LCDR) 1、SEQ ID NO: 8之LCDR2及SEQ ID NO: 9之LCDR3的輕鏈可變區。
II型抗CD20抗體可包含SEQ ID NO: 10之重鏈可變區序列及SEQ ID NO: 11之輕鏈可變區序列。
II型抗CD20抗體可為IgG抗體，尤其IgG1抗體。抗CD20抗體之Fc區中的至少約40%之N-連接寡醣可為非海藻糖基化的。
特定言之，II型抗CD20抗體係奧濱尤妥珠單抗。
II型抗CD20抗體可與抗CD20/抗CD3雙特異性抗體同時、之前或之後投與。
此外，可投與抗PD-L1抗體，較佳阿特珠單抗(Atezolizumab)。
抗PD-L1抗體可個別或與抗CD20/抗CD3雙特異性抗體及II型抗CD20抗體中之至少一者組合投與。在本文中，「與……中之至少一者組合」意謂抗PD-L1抗體與抗CD20/抗CD3雙特異性抗體一起或與II型抗CD20抗體一起或與兩者一起投與。
抗CD20/抗CD3雙特異性抗體可包含結合至CD3之第一抗原結合域及結合至CD20之第二抗原結合域。
抗CD20/抗CD3雙特異性抗體可包含有包含重鏈可變區(VHCD3)及輕鏈可變區(VLCD3)之第一抗原結合域，及包含重鏈可變區(VHCD20)及輕鏈可變區(VLCD20)之第二抗原結合域。
抗CD20/抗CD3雙特異性抗體之第一抗原結合域可包含有包含SEQ ID NO: 97之CDR-H1序列、SEQ ID NO: 98之CDR-H2序列及SEQ ID NO: 99之CDR-H3序列的重鏈可變區(VHCD3)；及/或包含SEQ ID NO: 100之CDR-L1序列、SEQ ID NO: 101之CDR-L2序列及SEQ ID NO: 102序列CDR-L3序列的輕鏈可變區(VLCD3)。
抗CD20/抗CD3雙特異性抗體之第一抗原結合域可包含有包含SEQ ID NO: 103之胺基酸序列的重鏈可變區(VHCD3)及/或包含SEQ ID NO: 104之胺基酸序列的輕鏈可變區(VLCD3)。
抗CD20/抗CD3雙特異性抗體之第二抗原結合域可包含有包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1序列、SEQ ID NO: 5之CDR-H2序列及SEQ ID NO: 6之CDR-H3序列的重鏈可變區(VHCD20)，及/或包含SEQ ID NO: 7之CDR-L1序列、SEQ ID NO: 8之CDR-L2序列及SEQ ID NO: 9之CDR-L3序列的輕鏈可變區(VLCD20)。
抗CD20/抗CD3雙特異性抗體之第二抗原結合域可包含有包含SEQ ID NO: 10之胺基酸序列的重鏈可變區(VHCD20)及/或包含SEQ ID NO: 11之胺基酸序列的輕鏈可變區(VLCD20)。
抗CD20/抗CD3雙特異性抗體可包含結合至CD20之第三抗原結合域。
抗CD20/抗CD3雙特異性抗體之第三抗原結合域包含有，包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1序列、SEQ ID NO: 5之CDR-H2序列及SEQ ID NO: 6之CDR-H3序列的重鏈可變區(VHCD20)；及/或包含SEQ ID NO: 7之CDR-L1序列、SEQ ID NO: 8之CDR-L2序列及SEQ ID NO: 9之CDR-L3序列的輕鏈可變區(VLCD20)。
抗CD20/抗CD3雙特異性抗體之第三抗原結合域可包含有包含SEQ ID NO: 10之胺基酸序列的重鏈可變區(VHCD20)及/或包含SEQ ID NO: 11之胺基酸序列的輕鏈可變區(VLCD20)。
抗CD20/抗CD3雙特異性抗體之第一抗原結合域可為Fab重鏈及輕鏈之可變域或恆定域交換之互換Fab分子，且第二及第三抗原結合域若存在，則可為習知Fab分子。
抗CD20/抗CD3雙特異性抗體可包含IgG1 Fc結構域。抗CD20/抗CD3雙特異性抗體之IgG1 Fc結構域可包含一或多個減少與Fc受體之結合及/或降低效應功能之胺基酸取代。抗CD20/抗CD3雙特異性抗體之IgG1 Fc結構域可包含胺基酸取代L234A、L235A及P329G (根據Kabat EU索引編號)。
抗CD20/抗CD3雙特異性抗體可包含第三抗原結合域，其中(i)抗CD20/抗CD3雙特異性抗體之第二抗原結合域在Fab重鏈C端與第一抗原結合域之Fab重鏈N端融合，抗CD20/抗CD3雙特異性抗體之第一抗原結合域在Fab重鏈C端與Fc域之第一亞單元之N端融合，且抗CD20/抗CD3雙特異性抗體之第三抗原結合域在Fab重鏈C端與Fc域之第二亞單元之N端融合。或者，(ii)抗CD20/抗CD3雙特異性抗體之第一抗原結合域在Fab重鏈C端與第二抗原結合域之Fab重鏈N端融合，抗CD20/抗CD3雙特異性抗體之第二抗原結合域在Fab重鏈C端與Fc域之第一亞單元之N端融合，且抗CD20/抗CD3雙特異性抗體之第三抗原結合域在Fab重鏈C端與Fc域之第二亞單元之N端融合。
II型CD20抗體及抗CD20/抗CD3雙特異性抗體之組合可以約一週至三週之時間間隔投與。
此外，用II型抗CD20抗體、較佳奧濱尤妥珠單抗進行預治療可在組合治療之前執行。預治療與組合治療之間的時間段可足以對II型抗CD20抗體、較佳地奧濱尤妥珠單抗起反應而減少個體之B細胞。預治療中所用之II型抗CD20抗體可具有一或多個如上文及下文所描述之II型抗CD20抗體之特徵。
本發明之另一態樣係關於一種用於治療個體之增生性疾病、尤其癌症或延緩其進展之方法。該方法包含投與II型抗CD20抗體及抗CD20/抗CD3雙特異性抗體，其中II型抗CD20抗體及抗CD20/抗CD3雙特異性抗體以單一組合物或以兩種或更多種組合物投與。
本發明之另一態樣係關於一種醫藥組合物，其包含用於組合治療之II型抗CD20抗體及視情況存在之醫藥學上可接受之載劑、及包含抗CD20/抗CD3雙特異性抗體及視情況存在之醫藥學上可接受之載劑的第二藥劑、及視情況存在之包含抗PD-L1抗體及視情況存在之醫藥學上可接受之載劑的第三藥劑，其係用於疾病、尤其癌症之組合治療中。醫藥組合物之要素可依序或同時用於組合治療中。
本發明之另一態樣係關於套組，其包含有包含II型抗CD20抗體及視情況存在之醫藥學上可接受之載劑之第一藥劑、及包含抗CD20/抗CD3雙特異性抗體及視情況存在之醫藥學上可接受之載劑之第二藥劑，其係用於疾病、尤其癌症之組合治療中。視情況，該套組包含有包含抗PD-L1抗體及視情況存在之醫藥學上可接受之載劑之第三藥劑，其係用於疾病、尤其癌症之前述組合治療中。套組之要素可依序或同時用於組合治療中。
該套組可進一步包含第一藥劑及第二藥劑及視情況存在之第三藥劑用於治療個體之癌症或延緩其進展之使用說明書。使用說明書可為藥品說明書。
本發明之另一態樣係關於II型抗CD20抗體及抗CD20/抗CD3雙特異性抗體之組合之用途，其係用於製造用於治療性應用、較佳用於治療個體之增生性疾病、尤其癌症或延緩其進展之藥劑。
本發明之另一態樣係關於II型抗CD20抗體之用途，其係用於製造用於治療個體之癌症或延緩其進展之藥劑，其中該藥劑包含II型抗CD20抗體及視情況存在之醫藥學上可接受之載劑，且其中治療包含投與藥劑與包含抗CD20/抗CD3雙特異性抗體及視情況存在之醫藥學上可接受之載劑的組合物之組合。
本發明之另一態樣係關於抗CD20/抗CD3雙特異性抗體之用途，其係用於製造用於治療個體之癌症或延緩其進展之藥劑，其中該藥劑包含抗CD20/抗CD3雙特異性抗體及視情況存在之醫藥學上可接受之載劑，且其中該治療包含投與藥劑與包含抗CD20抗體及視情況存在之醫藥學上可接受之載劑的組合物之組合。
本發明之另一態樣係關於抗CD20抗體之製造，該抗CD20抗體用於用以治療個體之癌症或延緩其進展之方法中，其中II型抗CD20抗體與抗CD20/抗CD3雙特異性抗體組合使用。
本發明之另一態樣係關於抗CD20/抗CD3雙特異性抗體之製造，該抗CD20/抗CD3雙特異性抗體係用於用以治療個體之癌症或延緩其進展之方法中，其中該抗CD20/抗CD3雙特異性抗體與II型抗CD20抗體組合使用。
本發明之另一態樣係關於一種用於治療個體之癌症或延緩其進展之方法，其包含向個體投與II型抗CD20抗體及投與抗CD20/抗CD3雙特異性抗體。投與II型抗CD20抗體及抗CD20/抗CD30雙特異性抗體以致兩者之組合表示有效量。相反，II型抗CD20抗體本身不以有效量投與且抗CD20/抗CD30雙特異性抗體本身不以有效量投與。然而，兩者之組合產生有效量。
另外，可向個體投與抗PD-L1抗體。包括PD-L1抗體之組合表示有效量。
本發明之另一態樣係關於抗CD20/抗CD3雙特異性抗體，其係用於用以治療個體之癌症或延緩其進展之方法中。使抗CD20/抗CD3雙特異性抗體與II型抗CD20抗體組合使用。
抗CD20/抗CD3雙特異性抗體及II型抗CD20抗體可以單一組合物一起投與或以兩種或更多種不同組合物個別投與。
抗CD20/抗CD3雙特異性抗體及II型抗CD20抗體可以兩種或更多種不同組合物投與。兩種或更多種不同組合物可在不同時間點投與。
II型抗CD20抗體可包含有包含SEQ ID NO: 4之重鏈CDR (HCDR) 1、SEQ ID NO: 5之HCDR2及SEQ ID NO: 6之HCDR3的重鏈可變區。II型抗CD20抗體可進一步包含有包含SEQ IDNO:7之輕鏈CDR (LCDR) 1、SEQ ID NO: 8之LCDR2及SEQ ID NO: 9之LCDR3的輕鏈可變區。
II型抗CD20抗體可包含SEQ ID NO: 10之重鏈可變區序列及SEQ ID NO: 11之輕鏈可變區序列。
II型抗CD20抗體可為IgG抗體，尤其IgG1抗體。抗CD20抗體之Fc區中的至少約40%之N-連接寡醣可為非海藻糖基化的。
特定言之，II型抗CD20抗體係奧濱尤妥珠單抗。
II型抗CD20抗體可與抗CD20/抗CD3雙特異性抗體同時、之前或之後投與。
此外，可投與抗PD-L1抗體，較佳阿特珠單抗。
抗PD-L1抗體可個別或與抗CD20/抗CD3雙特異性抗體及II型抗CD20抗體中之至少一者組合投與。在本文中，「與……中之至少一者組合」意謂抗PD-L1抗體與抗CD20/抗CD3雙特異性抗體一起或與II型抗CD20抗體一起或與兩者一起投與。
抗CD20/抗CD3雙特異性抗體可包含結合至CD3之第一抗原結合域及結合至CD20之第二抗原結合域。
抗CD20/抗CD3雙特異性抗體可包含有包含重鏈可變區(VHCD3)及輕鏈可變區(VLCD3)之第一抗原結合域，及包含重鏈可變區(VHCD20)及輕鏈可變區(VLCD20)之第二抗原結合域。
抗CD20/抗CD3雙特異性抗體之第一抗原結合域可包含有包含SEQ ID NO: 97之CDR-H1序列、SEQ ID NO: 98之CDR-H2序列及SEQ ID NO: 99之CDR-H3序列的重鏈可變區(VHCD3)；及/或包含SEQ ID NO: 100之CDR-L1序列、SEQ ID NO: 101之CDR-L2序列及SEQ ID NO: 102序列CDR-L3序列的輕鏈可變區(VLCD3)。
抗CD20/抗CD3雙特異性抗體之第一抗原結合域可包含有包含SEQ ID NO: 103之胺基酸序列的重鏈可變區(VHCD3)及/或包含SEQ ID NO: 104之胺基酸序列的輕鏈可變區(VLCD3)。
抗CD20/抗CD3雙特異性抗體之第二抗原結合域可包含有包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1序列、SEQ ID NO: 5之CDR-H2序列及SEQ ID NO: 6之CDR-H3序列的重鏈可變區(VHCD20)，及/或包含SEQ ID NO: 7之CDR-L1序列、SEQ ID NO: 8之CDR-L2序列及SEQ ID NO: 9之CDR-L3序列的輕鏈可變區(VLCD20)。
抗CD20/抗CD3雙特異性抗體之第二抗原結合域可包含有包含SEQ ID NO: 10之胺基酸序列的重鏈可變區(VHCD20)及/或包含SEQ ID NO: 11之胺基酸序列的輕鏈可變區(VLCD20)。
抗CD20/抗CD3雙特異性抗體可包含結合至CD20之第三抗原結合域。
抗CD20/抗CD3雙特異性抗體之第三抗原結合域可包含有包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1序列、SEQ ID NO: 5之CDR-H2序列及SEQ ID NO: 6之CDR-H3序列的重鏈可變區(VHCD20)；及/或含包含SEQ ID NO: 7之CDR-L1序列、SEQ ID NO: 8之CDR-L2序列及SEQ ID NO: 9之CDR-L3序列的輕鏈可變區(VLCD20)。
抗CD20/抗CD3雙特異性抗體之第三抗原結合域可包含有包含SEQ ID NO: 10之胺基酸序列的重鏈可變區(VHCD20)及/或包含SEQ ID NO: 11之胺基酸序列的輕鏈可變區(VLCD20)。
抗CD20/抗CD3雙特異性抗體之第一抗原結合域可為Fab重鏈及輕鏈之可變域或恆定域交換之互換Fab分子，且第二及第三抗原結合域若存在，則可為習知Fab分子。
抗CD20/抗CD3雙特異性抗體可包含IgG1 Fc結構域。抗CD20/抗CD3雙特異性抗體之IgG1 Fc結構域可包含一或多個減少與Fc受體之結合及/或降低效應功能之胺基酸取代。抗CD20/抗CD3雙特異性抗體之IgG1 Fc結構域可包含胺基酸取代L234A、L235A及P329G (根據Kabat EU索引編號)。
抗CD20/抗CD3雙特異性抗體可包含第三抗原結合域，其中(i)抗CD20/抗CD3雙特異性抗體之第二抗原結合域在Fab重鏈C端與第一抗原結合域之Fab重鏈N端融合，抗CD20/抗CD3雙特異性抗體之第一抗原結合域在Fab重鏈C端與Fc域之第一亞單元之N端融合，且抗CD20/抗CD3雙特異性抗體之第三抗原結合域在Fab重鏈C端與Fc域之第二亞單元之N端融合。或者，(ii)抗CD20/抗CD3雙特異性抗體之第一抗原結合域在Fab重鏈C端與第二抗原結合域之Fab重鏈N端融合，抗CD20/抗CD3雙特異性抗體之第二抗原結合域在Fab重鏈C端與Fc域之第一亞單元之N端融合，且抗CD20/抗CD3雙特異性抗體之第三抗原結合域在Fab重鏈C端與Fc域之第二亞單元之N端融合。
II型CD20抗體及抗CD20/抗CD3雙特異性抗體之組合可以約一週至三週之時間間隔投與。
此外，用II型抗CD20抗體、較佳奧濱尤妥珠單抗進行預治療在組合治療之前執行。預治療與組合治療之間的時間段可足以對II型抗CD20抗體、較佳地奧濱尤妥珠單抗起反應而減少個體之B細胞。預治療中所用之II型抗CD20抗體可具有一或多個如上文及下文所描述之II型抗CD20抗體之特徵。
抗CD20/抗CD3雙特異性抗體及II型抗CD20抗體可以單一組合物一起投與或以兩種或更多種不同組合物個別投與。
抗CD20/抗CD3雙特異性抗體及II型抗CD20抗體可以兩種或更多種不同組合物投與，其中兩種或更多種不同組合物在不同時間點投與。
II型抗CD20抗體可包含有包含SEQ ID NO: 4之重鏈CDR (HCDR) 1、SEQ ID NO: 5之HCDR2及SEQ ID NO: 6之HCDR3的重鏈可變區；及SEQ ID NO: 7之輕鏈CDR (LCDR) 1、SEQ ID NO: 8之LCDR2及SEQ ID NO: 9之LCDR3的輕鏈可變區。
II型抗CD20抗體可包含SEQ ID NO: 10之重鏈可變區序列及SEQ ID NO: 11之輕鏈可變區序列。
II型抗CD20抗體可為IgG抗體、尤其IgG1抗體，且其中抗CD20抗體之Fc區中的至少約40%之N-連接寡醣可為非海藻糖基化的。II型抗CD20抗體可為奧濱尤妥珠單抗。
II型抗CD20抗體可與抗CD20/抗CD3雙特異性抗體同時、之前或之後投與。
此外，可投與抗PD-L1抗體，較佳阿特珠單抗。
抗PD-L1抗體可個別或與抗CD20/抗CD3雙特異性抗體及II型抗CD20抗體中之至少一者組合投與。
抗CD20/抗CD3雙特異性抗體可包含結合至CD3之第一抗原結合域及結合至CD20之第二抗原結合域。
抗CD20/抗CD3雙特異性抗體可包含有包含重鏈可變區(VHCD3)及輕鏈可變區(VLCD3)之第一抗原結合域，及包含重鏈可變區(VHCD20)及輕鏈可變區(VLCD20)之第二抗原結合域。
抗CD20/抗CD3雙特異性抗體之第一抗原結合域可包含有包含SEQ ID NO: 97之CDR-H1序列、SEQ ID NO: 98之CDR-H2序列及SEQ ID NO: 99之CDR-H3序列的重鏈可變區(VHCD3)；及/或包含SEQ ID NO: 100之CDR-L1序列、SEQ ID NO: 101之CDR-L2序列及SEQ ID NO: 102序列CDR-L3序列的輕鏈可變區(VLCD3)。
抗CD20/抗CD3雙特異性抗體之第一抗原結合域可包含有包含SEQ ID NO: 103之胺基酸序列的重鏈可變區(VHCD3)及/或包含SEQ ID NO: 104之胺基酸序列的輕鏈可變區(VLCD3)。
抗CD20/抗CD3雙特異性抗體之第二抗原結合域可包含有包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1序列、SEQ ID NO: 5之CDR-H2序列及SEQ ID NO: 6之CDR-H3序列的重鏈可變區(VHCD20)，及/或包含SEQ ID NO: 7之CDR-L1序列、SEQ ID NO: 8之CDR-L2序列及SEQ ID NO: 9之CDR-L3序列的輕鏈可變區(VLCD20)。
抗CD20/抗CD3雙特異性抗體之第二抗原結合域可包含有包含SEQ ID NO: 10之胺基酸序列的重鏈可變區(VHCD20)及/或包含SEQ ID NO: 11之胺基酸序列的輕鏈可變區(VLCD20)。
抗CD20/抗CD3雙特異性抗體可包含結合至CD20之第三抗原結合域。
抗CD20/抗CD3雙特異性抗體之第三抗原結合域可包含有包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1序列、SEQ ID NO: 5之CDR-H2序列及SEQ ID NO: 6之CDR-H3序列的重鏈可變區(VHCD20)；及/或含包含SEQ ID NO: 7之CDR-L1序列、SEQ ID NO: 8之CDR-L2序列及SEQ ID NO: 9之CDR-L3序列的輕鏈可變區(VLCD20)。
抗CD20/抗CD3雙特異性抗體之第三抗原結合域可包含有包含SEQ ID NO: 10之胺基酸序列的重鏈可變區(VHCD20)及/或包含SEQ ID NO: 11之胺基酸序列的輕鏈可變區(VLCD20)。
抗CD20/抗CD3雙特異性抗體之第一抗原結合域可為Fab重鏈及輕鏈之可變域或恆定域交換之互換Fab分子，且第二及第三抗原結合域若存在，則可為習知Fab分子。
抗CD20/抗CD3雙特異性抗體可包含IgG1 Fc結構域。抗CD20/抗CD3雙特異性抗體之IgG1 Fc結構域可包含一或多個減少與Fc受體之結合及/或降低效應功能之胺基酸取代。抗CD20/抗CD3雙特異性抗體之IgG1 Fc結構域可包含胺基酸取代L234A、L235A及P329G (根據Kabat EU索引編號)。
抗CD20/抗CD3雙特異性抗體包含第三抗原結合域。(i)抗CD20/抗CD3雙特異性抗體之第二抗原結合域可在Fab重鏈C端與第一抗原結合域之Fab重鏈N端融合，抗CD20/抗CD3雙特異性抗體之第一抗原結合域可在Fab重鏈C端與Fc域之第一亞單元之N端融合，且抗CD20/抗CD3雙特異性抗體之第三抗原結合域可在Fab重鏈C端與Fc域之第二亞單元之N端融合。或者，(ii)抗CD20/抗CD3雙特異性抗體之第一抗原結合域可在Fab重鏈C端與第二抗原結合域之Fab重鏈N端融合，抗CD20/抗CD3雙特異性抗體之第二抗原結合域可在Fab重鏈C端與Fc域之第一亞單元之N端融合，且抗CD20/抗CD3雙特異性抗體之第三抗原結合域可在Fab重鏈C端與Fc域之第二亞單元之N端融合。
抗CD20/抗CD3雙特異性抗體及II型CD20抗體之組合可以約一週至三週之時間間隔投與。
用II型抗CD20抗體、較佳奧濱尤妥珠單抗進行預治療可在組合治療之前執行。預治療與組合治療之間的時間段可足以對II型抗CD20抗體、較佳地奧濱尤妥珠單抗起反應而減少個體之B細胞。預治療中所用之II型抗CD20抗體可具有一或多個如上文及下文所描述之II型抗CD20抗體之特徵。
本發明之另一態樣係關於一種醫藥組合物，其包含用於組合治療之抗CD20/抗CD3雙特異性抗體及視情況存在之醫藥學上可接受之載劑、及包含II型抗CD20抗體及視情況存在之醫藥學上可接受之載劑的第二藥劑、及視情況存在之包含抗PD-L1抗體及視情況存在之醫藥學上可接受之載劑的第三藥劑，其係用於疾病、尤其癌症之組合治療中。醫藥組合物之要素可依序或同時用於組合治療中。
本發明之另一態樣係關於如上文所述之本發明。
定義 除非下文中另外定義，否則術語在本文中的使用如此項中一般所用。
CD20 (亦稱為B淋巴細胞抗原CD20、B淋巴細胞表面抗原B1、Leu-16、Bp35、BM5及LF5；人類蛋白質由UniProt資料庫條目P11836表徵)係前B及成熟B淋巴細胞上表現之分子量係大致35 kD之疏水性跨膜蛋白(Valentine, M.A.等人, J. Biol. Chem. 264 (1989) 11282-11287；Tedder, T.F.,等人, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85 (1988) 208-212；Stamenkovic, I.,等人, J. Exp. Med. 167 (1988) 1975-1980；Einfeld, D.A.,等人, EMBO J. 7 (1988) 711-717；Tedder, T.F.,等人, J. Immunol. 142 (1989) 2560-2568)。對應的人類基因係膜跨越4域，子族A，成份1，亦稱為MS4A1。此基因編碼膜跨越4A基因家族之一員。此初生蛋白家族之成員之特徵為常見結構特徵及類似的內含子/外顯子剪接界限且在造血細胞及非淋巴組織中呈現獨特的表現模式。此基因編碼B淋巴細胞表面分子，其在B細胞發育且分化為漿細胞之過程中發揮作用。在家族成員之叢集中，此家族成員侷限於11q12。此基因之替代性剪接產生編碼相同蛋白質之兩個轉錄變異體。
除非另外指明，否則如本文所用，術語「CD20」係指來自任何脊椎動物來源，包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類)及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠)之任何原生CD20。術語「CD20」涵蓋「全長」的未經處理之CD20以及由細胞中之處理產生的CD20之任何形式。該術語亦涵蓋天然產生之CD20變異體，例如剪接變異體或對偶基因變異體。在一個實施例中，CD20係人類CD20。例示性人類CD20之胺基酸序列示於SEQ ID NO: 1中。
術語「抗CD20抗體」及「結合於CD20之抗體」係指能夠以足夠親和力結合CD20以使得該抗體適用作靶向CD20之診斷劑及/或治療劑之抗體。在一個實施例中，抗CD20抗體與不相關非CD20蛋白質之結合程度低於該抗體與CD20之結合約10%，如藉由放射免疫分析(RIA)所量測。在某些實施例中，結合至CD20之抗體之解離常數(Kd) ≤ 1 μM、≤ 100 nM、≤ 10 nM、≤ 1 nM、≤ 0.1 nM、≤ 0.01 nM或≤ 0.001 nM (例如10- 8 M或更小，例如10- 8 M至10- 13 M，例如10- 9 M至10- 13 M)。在某些實施例中，抗CD20抗體結合至保存在來自不同物種之CD20中的CD20抗原決定基。
「II型抗CD20抗體」意謂具有II型抗CD20抗體之結合特性及生物活性的抗CD20抗體，如Cragg等人, Blood 103 (2004) 2738-2743; Cragg等人, Blood 101 (2003) 1045-1052, Klein等人, mAbs 5 (2013), 22-33中所描述且以下表1中所概述。表 1. I 型 及 II 型 抗 CD20 抗體之特性 * 若IgG1 同型
II型抗CD20抗體之實例包括例如奧濱尤妥珠單抗(GA101)、托斯圖單抗(tositumumab；B1)、人類化B-Ly1抗體IgG1 (揭示於WO 2005/044859中之嵌合人類化IgG1抗體)、11B8 IgG1 (揭示於WO 2004/035607中)及AT80 IgG1。
I型抗CD20抗體之實例包括例如利妥昔單抗(rituximab)、奧伐木單抗(ofatumumab)、維托珠單抗(veltuzumab)、奧卡拉珠單抗(ocaratuzumab)、奧克珠單抗(ocrelizumab)、PRO131921、尤必昔單抗(ublituximab)、HI47 IgG3 (ECACC，融合瘤)、2C6 IgG1 (揭示於WO 2005/103081中)、2F2 IgG1 (揭示於WO 2004/035607及WO 2005/103081中)及2H7 IgG1 (揭示於WO 2004/056312中)。
術語「人類化B-Ly1抗體」係指如WO 2005/044859及WO 2007/031875中所揭示之人類化B-Ly1抗體，其係藉由與來自IgG1之人類恆定結構域嵌合及之後進行人類化(參見WO 2005/044859及WO 2007/031875)獲自鼠類單株抗CD20抗體B-Ly1(鼠類重鏈(VH)之可變區：SEQ ID NO:2；鼠類輕鏈(VL)之可變區：SEQ ID NO:3 (參見Poppema, S.及Visser, L., Biotest Bulletin 3 (1987) 131-139)。此等「人類化B-Ly1抗體」詳細揭示於WO 2005/044859及WO 2007/031875中。
如本文所用，術語「細胞介素之釋放」或「細胞介素釋放」與「細胞介素風暴」或「細胞介素釋放症候群」(縮寫係「CRS」)同義，且係指在投與治療劑期間或之後即刻(例如在1天內)個體血液中細胞介素，尤其腫瘤壞死因子α (TNF-α)、干擾素γ (IFN-γ)、介白素-6 (IL-6)、介白素-10 (IL-10)、介白素-2 (IL-2)及/或介白素-8 (IL-8)之含量增加，從而產生不良症狀。細胞介素釋放係一種類型之輸注相關反應(IRR)，其係治療劑之常見不良藥物反應且與投與治療劑及時相關。IRR通常主要在第一輸注時在投與治療劑期間或之後即刻，亦即通常在輸注之後24小時內出現。在一些情況下，例如在投與CAR-T細胞之後，CRS亦可僅隨後出現，例如在CAR-T細胞增殖時在投與之後若干天。發病率及嚴重程度通常隨後續輸注而降低。症狀可在症狀性不適至致命事件之範圍內，且可包括發熱、發冷、眩暈、高血壓、低血壓、呼吸困難、不安靜、出汗、面紅、皮疹、心動過速、呼吸急促、頭痛、腫瘤疼痛、噁心、嘔吐及/或器官破壞。
如本文所用，術語「胺基酸突變」意欲包含胺基酸取代、缺失、***及修飾。可進行取代、缺失、***及修飾之任何組合以獲得最終構築體，其限制條件為最終構築體具有所需特徵(例如與Fc受體之減弱的結合)。胺基酸序列缺失及***包括胺基酸之胺基端及/或羧基端缺失及***。特定胺基酸突變係胺基酸取代。出於改變例如Fc區之結合特徵之目的，尤其較佳的是非保守性胺基酸取代，亦即一種胺基酸用具有不同結構及/或化學特性之另一胺基酸置換。胺基酸取代包括經非天然產生之胺基酸置換或經二十種標準胺基酸之天然產生之胺基酸衍生物(例如4-羥基脯胺酸、3-甲基組胺酸、鳥胺酸、高絲胺酸、5-羥基離胺酸)置換。胺基酸突變可使用此項技術中熟知之遺傳學或化學方法產生。遺傳學方法可包括定點突變誘發、PCR、基因合成及其類似方法。預期藉由除遺傳學工程改造之外的諸如化學修飾之方法改變胺基酸側鏈基團的方法亦可為適用的。本文中可使用不同名稱指示相同的胺基酸突變。舉例而言，Fc區之位置329之脯胺酸取代為甘胺酸可以329G、G329、G329 、P329G或Pro329Gly表示。
「親和力」係指在分子之單一結合位點(例如受體)與其結合搭配物(例如配位體)之間的非共價相互作用之總和之強度。除非另外指明，否則如本文所用，「結合親和力」係指反映結合對(例如受體與配位體)成員之間1:1相互作用之固有結合親和力。分子X對其搭配物Y的親和力一般可由解離常數(KD )表示，解離常數係解離速率常數與締合速率常數(分別係koff 及kon )之比率。因此，等效親和力可包含不同速率常數，只要速率常數之比率保持相同即可。可藉由此項技術中已知的已充分確立之方法量測親和力。一種用於測量親和力之特定方法係表面電漿子共振(SPR)。
術語「減少(reduction)」(及其文法變化形式，諸如「減少(reduce)」或「減少(reducing)」)，例如B細胞之數目或細胞介素釋放的減少，係指對應量之減小，如藉由此項技術中已知之適當方法所量測。為了清楚起見，該術語亦包括減少至零(或低於分析方法之偵測極限)，亦即完全去除或消除。相反，「增加」係指對應量之增加。
如本文所用，術語「抗原結合部分」係指特異性結合至抗原決定子之多肽分子。在一個實施例中，抗原結合部分能夠將其所連接的實體(例如細胞介素或第二抗原結合部分)引導至標靶位點，例如帶有抗原決定子之特定類型腫瘤細胞或腫瘤基質。抗原結合部分包括如本文進一步定義的抗體及其片段。較佳抗原結合部分包括抗體之抗原結合域，包含抗體重鏈可變區及抗體輕鏈可變區。在某些實施例中，抗原結合部分可包括如本文進一步定義且此項技術中已知之抗體恆定區。適用的重鏈恆定區包括五種同型中之任一者：α、δ、ε、γ或μ。適用的輕鏈恆定區包括兩種同型中之任一者：κ及λ。
「特異性結合」意謂結合對於抗原具選擇性且可與非所需或非特異性相互作用區分。抗原結合部分結合至特異性抗原決定子之能力可經由酶聯結免疫吸附分析(ELISA)或熟習此項技術者熟悉之其他技術(例如表面電漿子共振(SPR)技術(在BIAcore儀器上分析)(Liljeblad等人, Glyco J 17, 323-329 (2000))及傳統結合分析(Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002))量測。在一個實施例中，抗原結合部分與不相關蛋白質之結合程度低於抗原結合部分與抗原之結合的約10%，如藉由例如SPR所量測。在某些實施例中，結合至抗原之抗原結合部分或包含該抗原結合部分之抗原結合分子之解離常數(KD ) ≤ 1 μM、≤ 100 nM、≤ 10 nM、≤ 1 nM、≤ 0.1 nM、≤ 0.01 nM或≤ 0.001 nM (例如10- 8 M或更小，例如10- 8 M至10- 13 M，例如10- 9 M至10- 13 M)。
「減弱的結合」(例如與Fc受體之減弱的結合)係指對應相互作用的親和力降低，如藉由例如SPR所量測。為清楚起見，該術語亦包括親和力降低至零(或低於分析方法之偵測極限)，亦即相互作用完全去除。相反，「增強之結合」係指對應相互作用之結合親和力增強。
如本文所用，術語「抗原結合分子」在其最廣泛的意義上係指特異性結合抗原決定子之分子。抗原結合分子之實例係免疫球蛋白及其衍生物，例如片段。
如本文所用，術語「抗原決定子」與「抗原」及「抗原決定基」同義且係指多肽大分子上與抗原結合部分結合，形成抗原結合部分-抗原複合物的位點(例如鄰近胺基酸區段或由非鄰近胺基酸之不同區域製成的構形組態)。適用的抗原決定子可見於例如腫瘤細胞之表面、病毒感染之細胞之表面、其他患病細胞之表面上、游離於血清中及/或細胞外基質(ECM)中 除非另外指明，否則本文中稱為抗原之蛋白質(例如CD3)可為來自任何脊椎動物來源(包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類)及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠))之蛋白質的任何原生形式。在特定實施例中，抗原係人類蛋白質。在本文中提及特定蛋白質的情況下，該術語涵蓋「全長」的未經處理之蛋白質，以及由細胞中之處理所產生的任何形式之蛋白質。該術語亦涵蓋天然產生之蛋白質變異體，例如剪接變異體或對偶基因變異體。適用作抗原的例示性人類蛋白質係CD3，特定言之，CD3之ε亞單元(參見UniProt第P07766號(130版)、NCBI RefSeq第NP_000724.1號，人類序列之SEQ ID NO: 105；或UniProt第Q95LI5號(49版)、NCBI基因庫第BAB71849.1號，食蟹獼猴[食蟹猴(Macaca fascicularis)]序列之SEQ ID NO: 106)。在某些實施例中，本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子結合至CD3或靶細胞抗原的抗原決定基，該抗原決定基在來自不同物種之CD3或靶細胞抗原中具保守性。
如本文所用，術語「多肽」係指由單體(胺基酸)經醯胺鍵(亦稱為肽鍵)線性連接而構成之分子。術語「多肽」係指兩個或更多個胺基酸之任何鏈，且並非指產物之特定長度。因此，「多肽」之定義內包括肽、二肽、三肽、寡肽、「蛋白質」、「胺基酸鏈」或用於指兩個或更多個胺基酸之鏈的任何其他術語，且可使用術語「多肽」替代此等術語中的任一者，或術語「多肽」可與此等術語中的任一者互換使用。術語「多肽」亦意指多肽之表現後修飾產物，包括(但不限於)糖基化、乙醯化、磷酸化、醯胺化、藉由已知保護/封阻基團衍生化、蛋白水解***或藉由非天然產生之胺基酸修飾。多肽可衍生自天然生物學來源或藉由重組技術製得，但不一定自指定的核酸序列轉譯而成。其可以任何方式產生，包括化學合成。本發明之多肽之大小可為約3個或更多個、5個或更多個、10個或更多個、20個或更多個、25個或更多個、50個或更多個、75個或更多個、100個或更多個、200個或更多個、500個或更多個、1,000個或更多個或2,000個或更多個胺基酸。多肽可具有定義之三維結構，但其不一定具有此類結構。具有定義之三維結構的多肽稱為摺疊的，且不具有定義之三維結構，而是可採用許多不同構形的多肽稱為未摺疊的。
「經分離」多肽或其變異體或衍生物意指不處於天然環境下的多肽。不需要特定程度的純化。舉例而言，分離多肽可自其原生或天然環境中移除。出於本發明之目的，宿主細胞中所表現之重組產生型多肽及蛋白質視為經分離，已藉由任何適合技術分離、分級分離或部分或實質上純化的原生或重組多肽亦視為經分離。
相對於參考多肽序列之「胺基酸序列一致性百分比(%)」定義為在比對序列且引入空位(若需要)以達到最大序列一致性百分比之後，候選序列中與參考多肽序列中之胺基酸殘基一致之胺基酸殘基的百分比，且任何保守性取代均不視為序列一致性之一部分。出於確定胺基酸序列一致性百分比之目的之比對可以此項技術內之各種方式實現，例如使用公開可獲得之電腦軟體，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)軟體。熟習此項技術者可測定用於比對序列之適當參數，包括在所比較序列之全長內達成最大比對所需的任何算法。然而，出於本文之目的，使用序列比較電腦程式ALIGN-2產生胺基酸序列一致性%值。ALIGN-2序列比較電腦程式由Genentech, Inc.創作，且原始程式碼已在美國版權局(U.S. Copyright Office), Washington D.C., 20559申請用戶文檔，其在此註冊在美國版權註冊第TXU510087號下。ALIGN-2程序可公開獲自Genentech, Inc., South San Francisco, California，或可自原始碼編譯。ALIGN-2程式經編譯可用於UNIX操作系統，包括數位UNIX V4.0D。所有序列比較參數由ALIGN-2程式設定且不變化。在採用ALIGN-2進行胺基酸序列比較之情形下，既定胺基酸序列A與既定胺基酸序列B之胺基酸序列一致性% (或者，其可表述為與既定胺基酸序列B具有或包含一定胺基酸序列一致性%的既定胺基酸序列A)如下計算： 100乘以分數X/Y 其中X係在A與B之比對程式中藉由序列比對程式ALIGN-2評為一致匹配之胺基酸殘基之數目，且其中Y係B中之胺基酸殘基之總數目。應瞭解，在胺基酸序列A之長度與胺基酸序列B之長度不相等之情況下，A相對於B之胺基酸序列一致性%與B相對於A之胺基酸序列一致性%將不相等。除非另外特定陳述，否則本文所使用之所有胺基酸序列一致性%值如緊接前述段落中所描述使用ALIGN-2電腦程式獲得。
術語「抗體」在本文中以最廣泛意義使用且涵蓋各種抗體結構，包括(但不限於)單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)及抗體片段，只要其展現所需抗原結合活性即可。
術語「全長抗體」、「完整抗體」及「全抗體」在本文中可互換使用，以指結構實質上類似於天然抗體結構或具有含有如本文所定義之Fc區之重鏈的抗體。
「抗體片段」係指不同於完整抗體，包含完整抗體之一部分，結合完整抗體所結合之抗原的分子。抗體片段之實例包括(但不限於)Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2 ；雙功能抗體；線性抗體；單鏈抗體分子(例如scFv)；及由抗體片段形成之多特異性抗體。如本文所用，術語「抗體片段」亦涵蓋單域抗體。
術語「免疫球蛋白分子」係指具有天然產生之抗體之結構的蛋白質。舉例而言，IgG類免疫球蛋白係約150,000道爾頓(dalton)之雜四聚體糖蛋白，其由兩條輕鏈及兩條重鏈經二硫鍵鍵結而構成。自N端至C端，各重鏈具有可變區(VH)，亦稱為可變重鏈域或重鏈可變域，之後係三個恆定域(CH1、CH2及CH3)，亦稱為重鏈恆定區。類似地，自N端至C端，各輕鏈具有可變區(VL)，亦稱為可變輕鏈域或輕鏈可變區；之後係恆定輕鏈(CL)域，亦稱為輕鏈恆定區。免疫球蛋白之重鏈可歸屬於五種類別中之一者，該五種類別稱為α (IgA)、δ (IgD)、ε (IgE)、γ (IgG)或μ (IgM)，其中一些可進一步分成亞類，例如γ1 (IgG1 )、γ2 (IgG2 )、γ3 (IgG3 )、γ4 (IgG4 )、α1 (IgA1 )及α2 (IgA2 )。免疫球蛋白之輕鏈基於其恆定域之胺基酸序列可歸屬於兩種類型中之一者，該兩種類型稱為卡帕(kappa；κ)及拉姆達(lambda；λ)。免疫球蛋白基本上由兩個Fab分子及一個Fc域經由免疫球蛋白鉸鏈區連接而組成。
術語「抗原結合域」係指抗體中包含特異性結合至抗原之一部分或全部且與之互補的區域的部分。抗原結合域可由例如一或多個抗體可變域(亦稱為抗體可變區)提供。較佳地，抗原結合域包含抗體輕鏈可變區(VL)及抗體重鏈可變區(VH)。
術語「可變區」或「可變域」係指抗體重鏈或輕鏈中參與抗體與抗原之結合的結構域。天然抗體之重鏈及輕鏈(分別係VH及VL)可變域通常具有類似的結構，其中各結構域包含四個保守性構架區(FR)及三個高變區(HVR)。參見例如Kindt等人, KubyImmunology, 第6版, W.H. Freeman and Co., 第91頁 (2007)。單一VH或VL結構域可足以賦予抗原結合特異性。
「人類抗體」係胺基酸序列對應於由人類或人類細胞產生或來源於利用人類抗體譜系或其他人類抗體編碼序列之非人類來源之抗體的胺基酸序列之抗體。人類抗體之此定義特定排除包含非人類抗原結合殘基之人類化抗體。
「人類化」抗體係指包含來自非人類HVR之胺基酸殘基及來自人類FR之胺基酸殘基之嵌合抗體。在某些實施例中，人類化抗體將包含至少一個且典型地兩個可變域之實質上所有者，其中所有或實質上所有HVR (例如CDR)皆對應於非人類抗體之HVR，且所有或實質上所有FR皆對應於人類抗體之FR。人類化抗體視情況可包含來源於人類抗體之抗體恆定區的至少一部分。抗體(例如非人類抗體)之「人類化形式」係指已經歷人類化之抗體。
如本文所用，術語「高變區」或「HVR」係指抗體可變域中序列高變(「互補決定區」或「CDR」)及/或形成經結構界定之環(「高變環」)及/或含有抗原接觸殘基(「抗原觸點」)之各個區域。一般而言，抗體包含六個HVR：三個在VH (H1、H2、H3)中，且三個在VL (L1、L2、L3)中。本文之例示性HVR包括： (a)出現在胺基酸殘基26-32 (L1)、50-52 (L2)、91-96 (L3)、26-32 (H1)、53-55 (H2)及96-101 (H3)處之高變環(Chothia及Lesk,J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))； (b)出現在胺基酸殘基24-34 (L1)、50-56 (L2)、89-97 (L3)、31-35b (H1)、50-65 (H2)及95-102 (H3)處之CDR (Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest , 第5版. 公共衛生服務部(Public Health Service), 美國國家衛生研究院(National Institutes of Health), Bethesda, MD (1991))； (c)存在於胺基酸殘基27c-36 (L1)、46-55 (L2)、89-96 (L3)、30-35b (H1)、47-58 (H2)及93-101 (H3)處之抗原觸點(MacCallum等人,J . Mol . Biol . 262: 732-745 (1996))；及 (d) (a)、(b)及/或(c)之組合，包括HVR胺基酸殘基46-56 (L2)、47-56 (L2)、48-56 (L2)、49-56 (L2)、26-35 (H1)、26-35b (H1)、49-65 (H2)、93-102 (H3)及94-102 (H3)。
除非另外指示，否則在本文中，根據Kabat等人, 同上對可變域中之HVR殘基及其他殘基(例如FR殘基)進行編號。
「構架」或「FR」係指除高變區(HVR)殘基外之可變域殘基。可變域之FR一般由四個FR域組成：FR1、FR2、FR3及FR4。因此，在VH (或VL)中HVR及FR序列一般出現以下序列中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
抗體之「類別」係指其重鏈所具有之恆定域或恆定區的類型。存在五種主要類別之抗體：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且此等類別中之若干者可進一步分成亞類(同型)，例如IgG1 、IgG2 、IgG3 、IgG4 、IgA1 及IgA2 。對應於不同類別之免疫球蛋白之重鏈恆定域分別稱為α、δ、ε、γ及μ。
本文術語「Fc域」或「Fc區」用於定義含有恆定區之至少一部分的免疫球蛋白重鏈之C端區。該術語包括原生序列Fc區及變異型Fc區。儘管IgG重鏈之Fc區的邊界可能稍有變化，但人類IgG重鏈Fc區通常定義為自Cys226或自Pro230延伸至重鏈之羧基端。然而，宿主細胞所產生的抗體可在重鏈C端經歷一或多個(尤其一或兩個)胺基酸之轉譯後***。因此，宿主細胞藉由表現編碼全長重鏈之特定核酸分子而產生的抗體可包括全長重鏈，或其可包括全長重鏈的***型變異體(在本文中亦稱為「***變異型重鏈」)。此情況可為在重鏈之最末兩個C末端胺基酸係甘胺酸(G446)及離胺酸(K447，根據Kabat EU索引編號)的情況下。因此，Fc區之C末端離胺酸(Lys447)或C末端甘胺酸(Gly446)及離胺酸(K447)可存在或可不存在。除非本文另外說明，否則Fc區或恆定區胺基酸殘基之編號係依據EU編號系統，亦稱為EU索引，如Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版中。公共衛生服務部, 美國國家衛生研究院, Bethesda, MD, 1991 (亦參見上述)所述。如本文所用，Fc域之「亞單元」係指形成二聚Fc域之兩個多肽中之一者，亦即能夠穩定自結合之包含免疫球蛋白重鏈之C端恆定區之多肽。舉例而言，IgG Fc域之亞單元包含IgG CH2及IgG CH3恆定域。
「促進Fc域之第一亞單元與第二亞單元結合的修飾」係肽主鏈之操縱或Fc域亞單元之轉譯後修飾，從而減少或阻止包含Fc域亞單元之多肽與相同多肽結合形成均二聚體。如本文所用之促進結合之修飾尤其包括對希望結合之兩個Fc域亞單元(亦即Fc域之第一及第二亞單元)中之每一者所做的單獨修飾，其中該等修飾彼此互補，以便促進兩個Fc域亞單元之結合。舉例而言，促進結合之修飾可改變Fc域亞單元中之一或兩者的結構或電荷以便使其結合在空間上或在靜電上分別係有利的。因此，包含第一Fc域亞單元之多肽與包含第二Fc域亞單元之多肽之間發生(雜)二聚，就與亞單元(例如抗原結合部分)中之每一者融合的其他組分不相同而言，(雜)二聚可能不相同。在一些實施例中，促進結合之修飾包含Fc域中之胺基酸突變，特定言之胺基酸取代。在一特定實施例中，促進結合之修飾包含Fc域之兩個亞單元中之每一者中的各別胺基酸突變，特定言之胺基酸取代。
「活化Fc受體」係一種Fc受體，其與抗體之Fc區接合之後，引發信號傳導事件，其刺激攜帶受體之細胞執行效應功能。活化Fc受體包括FcγRIIIa (CD16a)、FcγRI (CD64)、FcγRIIa (CD32)及FcαRI (CD89)。
術語「效應功能」當關於抗體使用時，係指可歸因於抗體之Fc區的彼等生物活性，其因抗體同型而異。抗體效應功能之實例包括：C1q結合及補體依賴性細胞毒性(CDC)、Fc受體結合、抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)、抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)、細胞介素分泌、免疫複合體介導之抗原呈遞細胞之抗原吸收、細胞表面受體(例如B細胞受體)之下調及B細胞活化。
如本文所用，術語「效應細胞」係指將效應部分受體(例如細胞介素受體)及/或Fc受體呈現於其表面上的淋巴細胞群體，其經由該等受體結合效應部分(例如細胞介素)及/或抗體之Fc區且促進標靶細胞(例如腫瘤細胞)之破壞。效應細胞可例如介導細胞毒性或吞噬細胞效應。效應細胞包括(但不限於)效應T細胞，諸如CD8+ 細胞毒素T細胞、CD4+ 輔助T細胞、γδ T細胞、NK細胞、淋巴激素活化殺手(LAK)細胞及巨噬細胞/單核細胞。
如本文所用，術語「工程改造(engineer/engineered/engineering)」視為包括任何肽主鏈操縱或天然存在或重組多肽或其片段之轉譯後修飾。工程改造包括胺基酸序列、糖基化模式或個別胺基酸之側鏈基團之修飾，以及此等方法之組合。“特定言之具有前綴「糖基」之「工程改造」以及術語「糖基化工程改造」包括細胞之糖基化機制之代謝工程改造，包括基因操控寡醣合成路徑以達成表現於細胞中之醣蛋白之變化糖基化。此外，糖基化工程改造包括突變及細胞環境對糖基化之作用。在一個實施例中，糖基化工程改造為糖基轉移酶活性之變化。在一特定實施例中，工程改造引起改變之葡萄糖胺基轉移酶活性及/或海藻糖基轉移酶活性。糖基化工程改造可用以獲得「具有提高之GnTIII活性之宿主細胞」(例如經操作以表現提高量之一或多種具有β(1,4)-N-乙醯胺基葡萄糖轉移酶III (GnTIII)活性之多肽的宿主細胞)、「具有提高之ManII活性之宿主細胞」(例如經操作以表現提高量之一或多種具有α-甘露糖苷酶II (ManII)活性之多肽的宿主細胞)或「具有降低α(1,6)海藻糖基轉移酶活性之宿主細胞」(例如經操作以表現降低量之α(1,6)海藻糖基轉移酶的宿主細胞)。
術語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及「宿主細胞培養物」可互換使用且係指已引入外源核酸之細胞，包括此類細胞之子代。宿主細胞包括「轉型體」及「轉型細胞」，其包括初級轉型細胞及來源於其之子代(不考慮繼代次數)。子代之核酸含量與母細胞可能不完全相同，但可能含有突變。本文包括針對原始轉型細胞篩檢或選擇具有相同功能或生物活性之突變型子代。宿主細胞係可用於產生用於本發明之蛋白質的任何類型之細胞系統。在一個實施例中，宿主細胞經工程改造以允許產生具有經修飾之寡醣的抗體。在某些實施例中，宿主細胞已經操作以表現增加量之一或多種具有β(1,4)-N-乙醯胺基葡萄糖轉移酶III (GnTIII)活性之多肽。在某些實施例中，該宿主細胞已經進一步操作以表現增加量之一或多種具有α-甘露糖苷酶II (ManII)活性之多肽。宿主細胞包括培養細胞，例如哺乳動物培養細胞，諸如CHO細胞、BHK細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、YO骨髓瘤細胞、P3X63小鼠骨髓瘤細胞、PER細胞、PER.C6細胞或融合瘤細胞、酵母細胞、昆蟲細胞及植物細胞(僅舉數例)，而且包括轉殖基因動物、轉殖基因植物或培養植物或動物組織內所含的細胞。
如本文所用，術語「具有GnTIII活性之多肽」係指能夠催化β-1,4鍵中之N-乙醯基葡糖胺(GlcNAc)殘基添加至N-連接寡醣之三甘露糖基核心之β連接甘露糖的多肽。此包括呈現與β(1,4)-N-乙醯胺基葡萄糖轉移酶III (亦稱為β-1,4-甘露糖基-醣蛋白4-β-N-乙醯基葡糖胺基-轉移酶(EC 2.4.1.144))之活性類似，但未必一致之酶促活性的融合多肽，根據國際生物化學及分子生物學聯合命名委員會(Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology；NC-IUBMB)，如在具有或不具有劑量依賴性之特定生物分析法中量測。在其中存在劑量依賴性之情況下，其無需與GnTIII一致，而是與GnTIII相比，與既定活性中之劑量依賴性實質上類似(亦即，候選多肽將呈現更大的活性或活性比GnTIII低不超過約25倍，且較佳低不超過約十倍，且最佳低不超過約三倍)。在某些實施例中，具有GnTIII活性之多肽係包含GnTIII之催化域及異源高爾基體駐留多肽之高爾基體定位域的融合多肽。特定言之，高爾基體定位域係甘露糖苷酶II或GnTI之定位域，最特定言之，甘露糖苷酶II之定位域。或者，高爾基體定位域係選自由以下組成之群：甘露糖苷酶I之定位域、GnTII之定位域及α1,6核海藻糖基轉移酶之定位域。產生此類融合多肽及使用其產生具有增加之效應功能之抗體的方法揭示於WO2004/065540、美國臨時專利申請案第60/495,142號及美國專利申請公開案第2004/0241817號，其全部內容以引用的方式明確併入本文中。
如本文所用，術語「高爾基體定位域」係指高爾基體駐留多肽之胺基酸序列，其負責將多肽錨定至高爾基體複合物內之一個位置。一般而言，定位域包含酶之胺基端「尾部」。
如本文所用，術語「具有ManII活性之多肽」係指能夠催化N-連接寡醣之分支鏈GlcNAcMan5 GlcNAc2 甘露糖中間物中之末端1,3-及1,6-連接α-D甘露糖殘基之水解的多肽。此包括展現與高爾基體α-甘露糖苷酶II(亦稱為甘露糖基寡醣1,3-1,6-α-甘露糖苷酶II(EC 3.2.1.114))之活性類似，但未必一致之酶活性的多肽，根據國際生物化學及分子生物學聯合命名委員會(NC-IUBMB)。
抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)係促使免疫效應細胞溶解塗有抗體之標靶細胞的免疫機制。標靶細胞係包含Fc區之抗體或其片段特異性結合(一般經由係N端之蛋白質部分)至Fc區的細胞。如本文所用，術語「ADCC增加/減少」定義為在圍繞標靶細胞之培養基中、在既定抗體濃度下、在既定時間內、藉由上文所定義之ADCC機制溶解之標靶細胞的數目增加/減少，及/或在圍繞標靶細胞之培養基中，在既定時間內藉由ADCC機制達成既定數目個標靶細胞溶解所需的抗體濃度降低/提高。ADCC之增加/減少係相對於由同類型宿主細胞使用相同的標準生產、純化、調配及儲存方法(熟習此項技術者已知)所產生、但尚未經工程改造之相同抗體介導的ADCC而言。舉例而言，藉由本文所描述之方法經工程改造以具有糖基化之變化模式(例如以表現糖基轉移酶GnTIII或其他糖基轉移酶)之由寄主細胞產生之抗體介導的ADCC之增加係相對於藉由相同類型之未經工程改造之宿主細胞產生之相同抗體介導的ADCC而言。
「抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)增加/減少之抗體」意謂如藉由一般熟習此項技術者已知之任何適合方法所確定ADCC增加/減少之抗體。一種可接受之活體外ADCC分析法如下： 1) 該分析法使用已知表現抗體之抗原結合區所辨識之標靶抗原的標靶細胞。 2) 該分析法使用自隨機選擇的健康供體之血液分離的人類外周血液單核細胞(PBMC)作為效應細胞； 3) 該分析法根據以下協定進行： i) 使用標準密度離心程序分離PBMC，且將其以5×106 個細胞/毫升懸浮於RPMI細胞培養基中； ii) 標靶細胞藉由標準組織培養方法生長，自具有高於90%之存活率之指數生長期收集，用RPMI細胞培養基洗滌，以100微居里(micro-Curies)之51 Cr標記，用細胞培養基洗滌兩次，且以105 個細胞/毫升之密度再懸浮於細胞培養基中； iii) 將100微升上文之最終靶細胞懸浮液轉移至96孔微量滴定盤之各孔中； iv) 在細胞培養基中將抗體自4000 ng/ml連續稀釋至0.04 ng/ml，且將50微升之所得抗體溶液添加至96孔微量滴定盤中之標靶細胞中，重複三次測試涵蓋上文所有濃度範圍之各種抗體濃度； v) 對於最大釋放(MR)對照物，在該盤中含有經標記之標靶細胞之3個額外孔接納50微升之2% (V/V)非離子清潔劑水溶液(Nonidet, Sigma, St. Louis)，而非抗體溶液(以上第iv點)； vi) 對於自發釋放(SR)對照物，在含有經標記之目標細胞之盤中之3個額外孔接納50微升RPMI細胞培養基，而非抗體溶液(上文第iv點)； vii) 隨後在50×g下將96孔微量滴定盤離心1分鐘且在4℃下培育1小時； viii) 將50微升PBMC懸浮液(上文第i點)添加至各孔中以產生25:1之效應劑:標靶細胞比率且將盤置放於37℃下、5%之CO2 氛圍下之培養箱中4小時； ix) 收集來自各孔之無細胞上清液且使用γ計數器量化實驗釋放的放射能(ER)； x) 對於各抗體濃度根據式(ER-MR)/(MR-SR)×100計算比溶胞率百分比，其中ER係對抗體濃度所量化之平均放射能(參見上文第ix點)，MR係對MR對照組(參見上文第v點)所量化之平均放射能(參見上文第ix點)，且SR係對SR對照組(參見上文第vi點)所量化之平均放射能(參見上文第ix點)； 4) 「ADCC增加/減少」定義為在上文所測試之抗體濃度範圍內觀察到之最大比溶胞率百分比之增加/減少，及/或達成上文所測試之抗體濃度範圍內觀察到之半數最大比溶胞率百分比所需的抗體濃度降低/提高。ADCC之增加/減少係相對於由上文分析法所量測之由同類型宿主細胞使用相同的標準生產、純化、調配及儲存方法(熟習此項技術者已知)所產生、但尚未經工程改造之相同抗體介導的ADCC而言。
如本文所用，術語「單株抗體」係指獲自實質上均質的抗體群體之抗體，亦即除例如含有天然產生之突變或在單株抗體製劑產生期間出現之可能的變異型抗體以外群體所包含之個別抗體相同及/或結合相同抗原決定基，此類變異體一般少量存在。相比於通常包括針對不同決定子(抗原決定基)之不同抗體的多株抗體製劑，單株抗體製劑中之各單株抗體係針對抗原上之單一決定子。因此，修飾語「單株」指示抗體之特性係獲自實質上均質的抗體群體，且不應解釋為需要藉由任何特定方法產生該抗體。舉例而言，根據本發明使用之單株抗體可藉由多種技術製得，包括(但不限於)融合瘤方法、重組DNA方法、噬菌體呈現方法及利用含有所有或部分人類免疫球蛋白基因座之轉殖基因動物的方法、本文所描述的製得單株抗體之此類方法及其他例示性方法。
如本文所用，當各類型部分超過一種時，為便於區別，關於抗原結合部分等使用術語「第一」、「第二」、「第三」。除非如此明確地陳述，否則使用此等術語並不意欲賦予特定次序或定向。
術語「多特異性」及「雙特異性」意謂能夠特異性結合至至少兩個不同抗原決定子之抗原結合分子。通常，雙特異性抗原結合分子包含兩個抗原結合位點，其中每一者對不同抗原性決定子具有特異性。在某些實施例中，雙特異性抗原結合分子能夠同時結合兩個抗原性決定子，尤其，兩個不同細胞上所表現的兩個抗原性決定子。
如本文所用，術語「價」表示抗原結合分子中存在指定數目個抗原結合位點。因而，術語「單價結合至抗原」表示抗原結合分子中存在一個(及不超過一個)特異性針對抗原的抗原結合位點。
「抗原結合位點」係指抗原結合分子之與抗原相互作用之位點，亦即一或多個胺基酸殘基。舉例而言，抗體之抗原結合位點包含來自互補決定區(CDR)的胺基酸殘基。原生免疫球蛋白分子通常具有兩個抗原結合位點，Fab分子通常具有單個抗原結合位點。
如本文所用，「T細胞活化治療劑」係指能夠在個體內誘導T細胞活化之治療劑，尤其經設計用於在個體內誘導T細胞活化的治療劑。T細胞活化治療劑之實例包括特異性結合活化T細胞抗原(諸如CD3)及標靶細胞抗原(諸如CD20或CD19)的雙特異性抗體。其他實例包括包含T細胞活化域及特異性結合至標靶細胞抗原(諸如CD20或CD19)之抗原結合部分的嵌合抗原受體(CAR)。
如本文所用，「活化T細胞抗原」係指由T淋巴細胞、尤其細胞毒性T淋巴細胞表現之抗原決定子，其能夠在與抗原結合分子相互作用時誘導或提高T細胞活化。特定言之，抗原結合分子與活化T細胞抗原之相互作用可藉由觸發T細胞受體複合物之信號級聯來誘導T細胞活化。例示性活化T細胞抗原係CD3。在一特定實施例中，活化T細胞抗原係CD3，尤其CD3之ε亞單元(參見UniProt第P07766號(130版)，NCBI RefSeq第NP_000724.1號，人類序列之SEQ ID NO: 105；或UniProt第Q95LI5號(49版)，NCBI GenBank第BAB71849.1號，食蟹獼猴[食蟹猴(Macaca fascicularis)]序列之SEQ ID NO: 106)。
如本文所用，「T細胞活化」係指T淋巴細胞(尤其細胞毒性T淋巴細胞)之一或多種細胞反應，其選自：增殖、分化、細胞介素分泌、細胞毒性效應分子釋放、細胞毒性活性及活化標記表現。本發明中所用之T細胞活化治療劑能夠誘導T細胞活化。適於量測T細胞活化的分析在本文所述之技術中已知。
如本文所用，「目標細胞抗原」係指目標細胞(例如腫瘤細胞，諸如癌細胞或腫瘤基質細胞)表面上所呈遞之抗原決定子。在一特定實施例中，標靶細胞抗原係CD20，尤其人類CD20 (參見UniProt第P11836號)。
如本文所用，「B細胞抗原」係指呈現於B淋巴細胞、尤其惡性B淋巴細胞之表面上的抗原決定子(在彼情況下，該抗原亦稱為「惡性B細胞抗原」)。
如本文所用，「T細胞抗原」係指呈現於T淋巴細胞、尤其細胞毒性T淋巴細胞之表面上的抗原決定子。
「Fab分子」係指由免疫球蛋白之重鏈(「Fab重鏈」)之VH及CH1域及輕鏈(「Fab輕鏈」)之VL及CL域組成之蛋白質。
「嵌合抗原受體」或「CAR」意謂包含抗原結合部分之經遺傳工程改造之受體蛋白，該抗原結合部分係例如標靶抗體之單鏈可變片段(scFv)、跨膜域、細胞內T細胞活化信號傳導域(例如T細胞受體之CD3 ζ鏈)及視情況存在之一或多個細胞內協同刺激域(例如CD28、CD27、CD137 (4-1BB)、Ox40)。CAR介導抗原識別、T細胞活化及(在第二代CAR之情況下)協同刺激以增強T細胞功能及持續性。對於綜述，參見例如Jackson等人, Nat Rev Clin Oncol (2016) 13, 370-383。
「B細胞增生性病症」意謂患者之B細胞數目相較於健康個體之B細胞數目增加，且在B細胞數目之增加係疾病之病因或標誌的疾病下尤其如此。「CD20陽性B細胞增生性病症」係B細胞、尤其惡性B細胞(除正常B細胞外)表現CD20之B細胞增生性病症。
例示性B細胞增生性病症包括非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、急性淋巴球性白血病(ALL)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡性淋巴瘤(FL)、套細胞淋巴瘤(MCL)、邊緣區淋巴瘤(MZL)以及一些類型之多發性骨髓瘤(MM)及霍奇金氏淋巴瘤(HL)。
「融合」意謂組分(例如Fab分子及Fc域亞單元)藉由肽鍵直接或經由一或多個肽連接子連接。
藥劑之「有效量」係指在所投與之細胞或組織中產生生理變化所需的量。
藥劑(例如醫藥組合物)之「治療有效量」係指在必需的劑量及時段內有效獲得所需治療或預防性結果有效的量。舉例而言，治療有效量之藥劑可消除、減少、延遲、最小化或預防疾病之副作用。
「治療劑」意謂向個體投與以試圖改變所治療之個體之疾病之自然過程的例如醫藥組合物之活性成分，且可出於預防目的進行或可在臨床病理過程中進行。「免疫治療劑」係指向個體投與以試圖恢復或增強個體例如對腫瘤之免疫反應的治療劑。
「個體(individual/subject)」係哺乳動物。哺乳動物包括(但不限於)馴養動物(例如牛、綿羊、貓、狗及馬)、靈長類動物(例如人類及非人類靈長類動物，諸如猴)、兔及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠)。較佳地，個體係人類。
術語「醫藥組合物」係指呈准許其中所含活性成分之生物活性有效之形式且不含有對該組合物將投與之個體具有不可接受之毒性的其他組分的製劑。
「醫藥學上可接受之載劑」係指醫藥組合物中除活性成分以外之對個體無毒的成分。醫藥學上可接受之載劑包括(但不限於)緩衝液、賦形劑、穩定劑或防腐劑。
如本文所用，「治療(treatment)」(及其文法變化形式，諸如「治療(treat)」或「治療(treating)」)係指試圖改變所治療個體之疾病之自然過程的臨床介入，且可出於預防目的進行或在臨床病理學過程中進行。所需治療作用包括(但不限於)預防疾病發生或復發，緩解症狀，減輕疾病之任何直接或間接病理性結果，預防癌轉移，減緩疾病進展速率，改善或緩和疾病病況及緩解或改良預後。在一些實施例中，本發明之方法用於延遲疾病發生或減慢疾病進展。
術語「藥品說明書」或「使用說明書」用以指通常包括於治療性產品之商業包裝中之說明書，其含有關於適應症、用法、劑量、投藥、組合療法、與使用此類治療性產品有關之禁忌症及/或警告之資訊。
在本文中所提及之術語「組合治療」涵蓋組合投與(其中兩種或更多種治療劑包括於同一或個別調配物中)、及個別投與，在此情況下，投與如本文所報導之抗體可在投與額外治療劑或藥劑、較佳抗體或抗體之前、同時及/或之後出現。
除非另外指明，否則「CD3」係指來自任何脊椎動物來源(包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類)、非人類靈長類動物(例如食蟹獼猴)及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠)的任何原生CD3。該術語涵蓋「全長」未經處理之CD3以及由在該細胞中處理產生之任何形式之CD3。該術語亦涵蓋天然產生之CD3變異體，例如剪接變異體或對偶基因變異體。在一個實施例中，CD3係人類CD3，尤其人類CD3之ε子單元(CD3ε)。人類CD3ε之胺基酸序列示於UniProt (www.uniprot.org)寄存編號P07766 (144版)或NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/) RefSeq NP_000724.1中。亦參見SEQ ID NO: 91。食蟹獼猴[食蟹猴]CD3ε之胺基酸序列示於NCBI GenBank第BAB71849.1號中。亦參見SEQ ID NO: 92。
除非另外指明，否則「CD19」係指B淋巴細胞抗原CD19，亦稱為B淋巴細胞表面抗原B4或T細胞表面抗原Leu-12，且包括來自任何脊椎動物來源(包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類)及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠))之任何原生CD19。該術語涵蓋「全長」未經處理之CD19以及由在該細胞中處理產生之任何形式之CD19。該術語亦涵蓋天然產生之CD19變異體，例如剪接變異體或對偶基因變異體。在一個實施例中，CD19係人類CD19。例示性人類CD19之胺基酸序列示於UniProt (www.uniprot.org)寄存編號P15391 (174版)或NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/) RefSeq NP_NP_001770.5及SEQ ID NO: 93中。
「互換型」Fab分子(亦稱為「互換Fab」)意謂Fab重鏈及輕鏈之可變域或恆定域交換(亦即彼此置換)之Fab分子，亦即互換型Fab分子包含由輕鏈可變域VL及重鏈恆定域1 CH1構成之肽鏈(VL-CH1，N端至C端方向)及由重鏈可變域VH及輕鏈恆定域CL構成之肽鏈(VH-CL，N端至C端方向)。為了清楚起見，在Fab輕鏈與Fab重鏈之可變域交換的互換型Fab分子中，包含重鏈恆定域1 CH1之肽鏈在本文中稱為(互換型)Fab分子之「重鏈」。相反，在Fab輕鏈與Fab重鏈之恆定域發生交換的互換型Fab分子中，包含重鏈可變域VH的肽鏈在本文中稱為(互換型)Fab分子之「重鏈」。
與此相反，「習知」Fab分子意謂呈天然形式之Fab分子，亦即包含由重鏈可變域及恆定域構成之重鏈(VH-CH1，N端至C末端方向)及由輕鏈可變域及恆定域構成之輕鏈(VL-CL，N端至C端方向)。
術語「聚核苷酸」係指分離之核酸分子或構築體，例如信使RNA (mRNA)、病毒源RNA或質體DNA (pDNA)。聚核苷酸可包含習知磷酸二酯鍵或非習知鍵(例如醯胺鍵，諸如肽核酸(PNA)中所見)。術語「核酸分子」係指聚核苷酸中存在之任一或多個核酸區段，例如DNA或RNA片段。
「分離之」核酸分子或聚核苷酸意欲係已自原生環境中移除之核酸分子、DNA或RNA。舉例而言，出於本發明之目的，編碼載體中所含之多肽的重組聚核苷酸視為分離。分離之聚核苷酸之其他實例包括異質宿主細胞中所維持的重組聚核苷酸或溶液中經純化(部分或實質上)之聚核苷酸。分離之聚核苷酸包括通常含有聚核苷酸分子之細胞中所含的聚核苷酸分子，但聚核苷酸分子存在於染色體外或與其天然染色體位置不同之染色體位置處。分離之RNA分子包括本發明之活體內或活體外RNA轉錄物，以及正股及負股形式，及雙股形式。本發明之分離之聚核苷酸或核酸進一步包括以合成方式產生的此類分子。另外，聚核苷酸或核酸可為或可包括調節要素，諸如啟動子、核糖體結合位點或轉錄終止子。
一種核酸或聚核苷酸的核苷酸序列與本發明之參考核苷酸序列至少例如95%「一致」意指該聚核苷酸之核苷酸序列與參考序列一致，但其中該聚核苷酸序列相對於參考核苷酸序列可每100個核苷酸中包括至多五個點突變。換言之，為了獲得核苷酸序列與參考核苷酸序列至少95%一致的聚核苷酸，參考序列中至多5%的核苷酸可缺失或經另一核苷酸取代，或參考序列中可***佔參考序列核苷酸總數至多5%的多個核苷酸。參考序列之此等改變可發生於參考核苷酸序列之5'或3'端位置或彼等末端位置之間的任何位置，此等位置個別地穿插於參考序列殘基中或參考序列內的一或多個鄰近基團中。實際上，任何特定聚核苷酸序列是否與本發明之核苷酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致可以習知方式使用已知電腦程式確定，諸如如上文針對多肽所述之電腦程式(例如ALIGN-2)。
術語「表現卡匣」係指以重組或合成方式產生之聚核苷酸，其具有允許標靶細胞中之特定核酸發生轉錄的一系列特定核酸要素。重組表現卡匣可併入至質體、染色體、粒線體DNA、質體DNA、病毒或核酸片段中。通常，表現載體之重組表現卡匣部分包括待轉錄的核酸序列及啟動子，以及其他序列。在某些實施例中，本發明之表現卡匣包含編碼本發明之雙特異性抗原結合分子或其片段的聚核苷酸序列。
術語「載體」或「表現載體」與「表現構築體」同義且係指用於引入特定基因且引導該基因表現的DNA分子，該DNA分子與該基因在目標細胞中可操作地連接。該術語包括呈自我複製核酸結構之載體以及併入已引入其之宿主細胞之基因組中的載體。本發明之表現載體包含表現卡匣。表現載體允許大量的穩定mRNA發生轉錄。一旦表現載體進入靶細胞內，則藉由細胞轉錄及/或轉譯機構產生由該基因編碼的核糖核酸分子或蛋白質。在一個實施例中，本發明之表現載體包含表現卡匣，該表現卡匣包含編碼本發明之雙特異性抗原結合分子或其片段的聚核苷酸序列。
II 型 抗 CD20 抗體 CD20分子(亦稱為人類B淋巴細胞限制性分化抗原或Bp35)係已充分描述之惡性及非惡性前B及成熟B淋巴細胞之表面上表現之疏水性跨膜蛋白(Valentine, M.A.等人, J. Biol. Chem. 264 (1989) 11282-11287；及Einfeld, D.A.等人, EMBO J. 7 (1988) 711-717；Tedder, T.F.等人, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85 (1988) 208-212；Stamenkovic, I.等人, J. Exp. Med. 167 (1988) 1975-1980；Tedder, T.F.等人, J. Immunol. 142 (1989) 2560-2568)。
CD20由大於90%之B細胞非霍奇金氏淋巴瘤(NHL) (Anderson, K.C.,等人, Blood 63 (1984) 1424-1433)高度表現但未在造血幹細胞祖B細胞(pro-B cell)、正常漿細胞或其他正常組織上發現(Tedder, T.F.,等人, J, Immunol. 135 (1985) 973- 979)。
存在兩種不同類型之抗CD20抗體，其明顯不同之處在於其CD20結合模式及生物活性(Cragg, M.S.,等人, Blood 103 (2004) 2738-2743；及Cragg, M.S.,等人, Blood 101 (2003) 1045-1052)。I型抗CD20抗體主要利用補體殺死標靶細胞，而II型抗體主要經由直接誘導細胞死亡來操作。
I型及II型抗CD20抗體及其特徵綜述例如於Klein等人, mAbs 5 (2013), 22-33中。II型抗CD20抗體與I型抗CD20抗體相比並不使CD20定位於脂膜筏，展示低CDC活性，展示僅約一半之與B細胞之結合力，且誘導同型聚集且引導細胞死亡。與此相反，I型抗體使CD20定位於脂膜筏，展示高CDC活性，與B細胞之完全結合力且僅微弱誘導同型聚集且引導細胞死亡。
奧濱尤妥珠單抗及托斯圖單抗(CAS編號192391-48)係II型抗CD20抗體之實例，而利妥昔單抗、奧伐木單抗、維托珠單抗、奧卡拉珠單抗、奧克珠單抗、PRO131921及烏妥昔單抗係I型抗CD20抗體之實例。
根據本發明，抗CD20抗體係II型抗CD20抗體。在根據本發明之一個實施例中，II型抗CD20抗體能夠減少個體之B細胞之數目。在一個實施例中，II型抗CD20抗體係IgG抗體，尤其IgG1抗體。在一個實施例中，II型抗CD20抗體係全長抗體。在一個實施例中，II型抗CD20抗體包含Fc區，尤其IgG Fc區，或更尤其IgG1 Fc區。在一個實施例中，II型抗CD20抗體係人類化B-Ly1抗體。詳言之，II型抗CD20抗體係具有鼠類B-Ly1抗體之結合特異性的人類化IgG類II型抗CD20抗體(Poppema及Visser, Biotest Bulletin 3, 131-139 (1987)；SEQ ID NO 2及3)。
在一個實施例中，II型抗CD20抗體包含重鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 4之重鏈CDR (HCDR) 1、SEQ ID NO: 5之HCDR2及SEQ ID NO: 6之HCDR3；及輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 7之輕鏈CDR (LCDR) 1、SEQ ID NO: 8之LCDR2及SEQ ID NO: 9之LCDR3。詳言之，該II型抗CD20抗體之重鏈可變區構架區(FR) FR1、FR2及FR3係由VH1_10人類生殖系序列編碼之人類FR序列，該II型抗CD20抗體之重鏈可變區FR4係由JH4人類生殖系序列編碼之人類FR序列，該II型抗CD20抗體之輕鏈可變區FR FR1、FR2及FR3係由VK_2_40人類生殖系序列編碼之人類FR序列，且該II型抗CD20抗體之輕鏈可變區FR4係由JK4人類生殖系序列編碼之人類FR序列。在一個實施例中，II型抗CD20抗體包含重鏈可變區序列SEQ ID NO: 10及輕鏈可變區序列SEQ ID NO: 11。
在一特定實施例中，II型抗CD20抗體係奧濱尤妥珠單抗(推薦的INN, WHO Drug Information, 第26卷, 第4期, 2012, 第453頁)。如本文中所用，奧濱尤妥珠單抗係GA101之同物異名。商標係GAZYVA®或GAZYVARO®。此置換所有先前版本(例如第25卷,第1期, 2011,第75-76頁)且以前稱為阿夫妥珠單抗(afutuzumab) (推薦的INN, WHO Drug Information, 第23卷, 第2期, 2009, 第176頁; 第22卷, 第2期, 2008, 第124頁)。在一個實施例中，II型抗CD20抗體係托西莫單抗(tositumomab)。
適用於本發明之II型抗CD20抗體可經工程改造以與對應非工程改造之抗體相比具有增加之效應功能。在一個實施例中，經工程改造以具有增加之效應功能之抗體與對應非工程改造之抗體相比具有至少2倍、至少10倍或甚至至少100倍增加之效應功能。增加之效應功能可包括(但不限於)以下中之一或多者：Fc受體結合增加、C1q結合及補體依賴性細胞毒性(CDC)增加、抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)增加、抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)增加、細胞介素分泌增加、免疫複合體介導之抗原呈遞細胞之抗原吸收增加、與NK細胞之結合增加、與巨噬細胞之結合增加、與單核細胞之結合增加、與多形核細胞之結合增加、誘導細胞凋亡之直接信號傳導增加、標靶所結合抗體之交聯增加、樹突狀細胞成熟增加或T細胞激活增加。
在一個實施例中，增加之效應功能係選自以下之群的一或多者：Fc受體結合增加、CDC增加、ADCC增加、ADCP增加及細胞介素分泌增加。在一個實施例中，增加之效應功能係與活化Fc受體之結合增加。在一個此類實施例中，與活化Fc受體之結合親和力與對應非工程改造之抗體之結合親和力相比增加至少2倍、尤其至少10倍。在一特定實施例中，活化Fc受體係選自FcγRIIIa、FcγRI及FcγRIIa之群。在一個實施例中，活化Fc受體係FcγRIIIa，尤其人類FcγRIIIa。在另一實施例中，增加之效應功能係ADCC增加。在一個此類實施例中，ADCC與藉由對應非工程改造之抗體介導之ADCC相比增加至少10倍，尤其至少100倍。在另一實施例中，增加之效應功能係與活化Fc受體之結合增加及ADCC增加。
增加之效應功能可藉由此項技術中已知之方法量測。適用於量測ADCC之分析描述於本文中。評定所關注分子之ADCC活性之活體外分析之其他實例描述於美國專利第5,500,362號；Hellstrom等人 Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986)及Hellstrom等人, Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985)；美國專利第5,821,337號；Bruggemann等人, J Exp Med 166, 1351-1361 (1987)中。或者，可採用非放射性分析方法(參見例如用於流動式細胞測量術之ACTI™非放射性細胞毒性分析(CellTechnology, Inc. Mountain View, CA)；及CytoTox 96® 非放射性細胞毒性分析(Promega, Madison, WI))。適用於此類分析之效應細胞包括周邊血液單核細胞(PBMC)及自然殺手(NK)細胞。或者或另外，可例如在動物模型中，諸如Clynes等人, Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 (1998)中所揭示之動物模型中活體內評定相關分子之ADCC活性。與Fc受體之結合可容易測定，例如藉由ELISA，或藉由表面電漿子共振(SPR)，使用標準儀器，諸如BIAcore儀器(GE Healthcare)，且可藉由重組表現來獲得諸如Fc受體。根據一特定實施例，與活化Fc受體之結合親和力在25℃下藉由表面電漿子共振使用BIACORE®T100機(GE Healthcare)來量測。或者，抗體與Fc受體之結合親和力可使用已知表現特定Fc受體之細胞株，諸如表現FcγIIIa受體之NK細胞來評估。亦可進行C1q結合分析以確定抗體是否能夠結合C1q且因此具有CDC活性。參見例如WO 2006/029879及WO 2005/100402中之C1q及C3c結合ELISA。為評定補體活化，可執行CDC分析(參見例如Gazzano-Santoro等人, J Immunol Methods 202, 163 (1996)；Cragg等人, Blood 101, 1045-1052 (2003)；及Cragg及Glennie, Blood 103, 2738-2743 (2004))。
增加之效應功能可例如由Fc區之糖基工程改造或在抗體之Fc區中引入胺基酸突變而產生。在一個實施例中，抗CD20抗體經在Fc區中引入一或多個胺基酸突變而工程改造。在一特定實施例中，胺基酸突變係胺基酸取代。在一甚至更特定實施例中，胺基酸取代位於Fc區之位置298、333及/或334 (殘基之EU編號)。其他適合的胺基酸突變描述例如於Shields等人, J Biol Chem 9(2), 6591-6604 (2001)；美國專利第6,737,056號；WO 2004/063351及WO 2004/099249中。突變型Fc區可使用此項技術中熟知之遺傳學或化學方法、藉由胺基酸缺失、取代、***或修飾來製備。遺傳學方法可包括DNA編碼序列之定點突變誘發、PCR、基因合成及類似方法。恰當的核苷酸變化可藉由例如定序來檢驗。
在另一實施例中，II型抗CD20抗體經在Fc區中之糖基化修飾而工程改造。在一特定實施例中，與未經工程改造之抗體相比，II型抗CD20抗體經工程改造而在Fc區中具有增加之比例的非海藻糖基化寡醣。抗體之Fc區中之增加之比例的非海藻糖基化寡醣產生具有增加之效應功能，尤其增加之ADCC的抗體。
在一更特定實施例中，II型抗CD20抗體之Fc區中之至少約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%或約100%，較佳至少約40%之N-連接寡醣係非海藻糖基化的。在一個實施例中，在II型抗CD20抗體之Fc區中之約40%與約80%之間的N-連接寡醣係非海藻糖基化的。在一個實施例中，在II型抗CD20抗體之Fc區中約40%與約60%之間的N-連接寡醣係非海藻糖基化的。非海藻糖基化之寡醣可具有雜交或複合類型。
在另一特定實施例中，與未經工程改造之抗體相比，II型抗CD20抗體經工程改造而在Fc區中具有增加之比例的等分寡醣。在一更特定實施例中，II型抗CD20抗體之Fc區中之至少約10%、至少約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%或約100%，較佳至少約40%之N-連接寡醣係等分的。在一個實施例中，在抗CD20抗體之Fc區中之約40%與約80%之間的N-連接寡醣係等分的。在一個實施例中，抗CD20抗體之Fc區中之約40%與約60%之間的N-連接寡醣係等分的。等分寡醣可具有雜交或複合類型。
在又一特定實施例中，與非工程改造之抗體相比，II型抗CD20抗體經工程改造以在Fc區中具有增加之比例的等分非海藻糖基化寡醣。在一更特定實施例中，II型抗CD20抗體之Fc區中之至少約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%或約100%，較佳至少約15%，更佳至少約25%之N-連接寡醣係等分非海藻糖基化的。等分非海藻糖基化之寡醣可具有雜交或複合類型。
抗體Fc區中之寡醣結構可藉由此項技術中熟知之方法，例如藉由MALDI TOF質譜分析法來分析，如Umana等人, Nat Biotechnol 17, 176-180 (1999)或Ferrara等人, Biotechn Bioeng 93, 851-861 (2006)中所述。非海藻糖基化寡醣之百分比係不具有海藻糖殘基之寡醣相對於連接於Asn 297之所有寡醣(例如複合、雜交及高甘露糖結構)之量，且在N-糖苷酶F治療之樣品中藉由MALDI TOF MS鑑別。Asn 297係指位於Fc區中之約位置297 (Fc區殘基之EU編號)的天冬醯胺殘基；然而，Asn297亦可為位於位置297之上游或下游之約±3個胺基酸處，亦即位於位置294與300之間，此係歸因於抗體中之輕微序列變異。等分寡醣或等分非海藻糖基化寡醣之百分比以類似方式確定。
在一個實施例中，與非工程改造之抗體相比，II型抗CD20抗體經工程改造以藉由在宿主細胞中產生一或多個糖基轉移酶活性改變之抗體而在Fc區中經修飾糖基化。糖基轉移酶包括β(1,4)-N-乙醯胺基葡萄糖轉移酶III (GnTIII)、β(1,4)-半乳糖苷基轉移酶(GalT)、β(1,2)-N-乙醯胺基葡萄糖轉移酶I (GnTI)、β(1,2)-N-乙醯胺基葡萄糖轉移酶II (GnTII)及α(1,6)-海藻糖基轉移酶。在一特定實施例中，與非工程改造之抗體相比，II型抗CD20抗體經工程改造以藉由在宿主細胞中產生β(1,4)-N-乙醯胺基葡萄糖轉移酶III (GnTIII)活性增加之抗體而在Fc區中具有增加之比例的非海藻糖基化寡醣。在一甚至更特定實施例中，宿主細胞另外具有增加之α-甘露糖苷酶II (ManII)活性。可用於工程改造適用於本發明之抗體之糖基工程改造方法更詳細描述於Umana等人, Nat Biotechnol 17, 176-180 (1999)；Ferrara等人, Biotechn Bioeng 93, 851-861 (2006)；WO 99/54342 (美國專利第6,602,684號；EP 1071700)；WO 2004/065540 (美國專利申請公開案第2004/0241817號；EP 1587921)、WO 03/011878 (美國專利申請公開案第2003/0175884號)中，其各全部內容以全文引用的方式併入本文中。使用此方法糖基工程改造之抗體在本文中稱為GlycoMabs。
一般而言，任何類型的培養細胞株，包括本文所論述之細胞株均可用以產生用於生產糖基化模式變化之抗TNC A2抗體之細胞株。特定細胞株包括CHO細胞、BHK細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、YO骨髓瘤細胞、P3X63小鼠骨髓瘤細胞、PER細胞、PER.C6細胞或融合瘤細胞，及其他哺乳動物細胞。在某些實施例中，宿主細胞已經操作以表現增加量之一或多種具有β(1,4)-N-乙醯胺基葡萄糖轉移酶III (GnTIII)活性之多肽。在某些實施例中，該宿主細胞已經進一步操作以表現增加量之一或多種具有α-甘露糖苷酶II (ManII)活性之多肽。在一特定實施例中，具有GnTIII活性之多肽係包含GnTIII之催化域及異源高爾基體駐留多肽之高爾基體定位域的融合多肽。詳言之，該高爾基體定位域係甘露糖苷酶II之高爾基體定位域。產生此類融合多肽及使用其產生效應功能增加之抗體之方法揭示於Ferrara等人, Biotechn Bioeng 93, 851-861 (2006)及WO2004/065540中，其全部內容明確以引用的方式併入本文中。
含有適用於本發明之抗體之編碼序列及/或具有糖基轉移酶活性之多肽之編碼序列且表現生物學活性基因產物的宿主細胞可例如藉由以下鑑別：DNA-DNA或DNA-RNA雜交；「標記」基因功能之存在或不存在；評定轉錄程度，如藉由對應mRNA轉錄物在宿主細胞中之表現所量測；或偵測基因產物，如藉由免疫分析或藉由此項技術中熟知之其生物活性方法所量測。GnTIII或Man II活性可例如藉由使用分別結合於GnTIII或ManII之生物合成產物的凝集素來偵測。此類凝集素之實例係E4 -PHA凝集素，其優先結合含有等分GlcNAc之寡醣。具有GnTIII或ManII活性之多肽之生物合成產物(亦即特異性寡醣結構)亦可藉由對表現該多肽之細胞產生之糖蛋白釋放之寡醣之質譜分析來偵測。或者，可使用量測藉由經具有GnTIII或ManII活性之多肽工程改造之細胞產生之抗體介導之效應功能增加(例如Fc受體結合增加)之功能分析。
在另一實施例中，與非工程改造之抗體相比，II型抗CD20抗體經工程改造以藉由在宿主細胞中產生α(1,6)-海藻糖基轉移酶活性降低之抗體而在Fc區中具有增加之比例的非海藻糖基化寡醣。α(1,6)-海藻糖基轉移酶活性降低之宿主細胞可為α(1,6)-海藻糖基轉移酶基因已破壞或以其他方式失活之細胞，例如基因剔除(參見Yamane-Ohnuki等人, Biotech Bioeng 87, 614 (2004)；Kanda等人, Biotechnol Bioeng , 94(4), 680-688 (2006)；Niwa等人, J Immunol Methods 306, 151-160 (2006))。
能夠產生去海藻糖基化抗體之細胞株之其他實例包括缺乏蛋白質海藻糖基化之Lec13 CHO細胞(Ripka等人, Arch Biochem Biophys 249, 533-545 (1986)；美國專利申請案第US 2003/0157108號；及WO 2004/056312，尤其在實例11)。適用於本發明之抗體或者可根據EP 1 176 195 A1、WO 03/084570、WO 03/085119及美國專利申請公開案第2003/0115614號、第2004/093621號、第2004/110282號、第2004/110704號、第2004/132140號、美國專利第6,946,292號(Kyowa)中所揭示之技術例如藉由減少或去除用於抗體產生之宿主細胞中之GDP-海藻糖轉運體蛋白質之活性經糖基工程改造以在Fc區中具有海藻糖殘基。
適用於本發明之經糖基工程改造之抗體亦可在產生修飾糖蛋白之表現系統中產生，諸如WO 03/056914 (GlycoFi, Inc.)中或WO 2004/057002及WO 2004/024927 (Greenovation)中所教示之彼等系統。
T 細胞 活化治療劑 本發明適用於與各種治療劑，尤其與活化個體之T細胞，亦即具有誘導個體中之T細胞活化之能力的治療劑結合。此類治療劑包括例如針對T細胞抗原(尤其活化T細胞抗原)之抗體、或經嵌合抗原受體(CAR)或重組T細胞受體(TCR)修飾之T細胞。本發明尤其適用於與靶向B細胞之T細胞活化治療劑結合。
在一個實施例中，在不投與II型抗CD20抗體之治療方案中，當向個體投與時，治療劑誘導個體之細胞介素釋放。
在一個實施例中，治療劑係生物劑。在一個實施例中，治療劑包含多肽，尤其重組多肽。在一個實施例中，治療劑包含不天然出現於個體中之多肽。在一個實施例中，治療劑全身投與。在一個實施例中，治療劑藉由輸注，尤其靜脈內輸注投與。
在一個實施例中，治療劑包含抗原結合多肽。在一個實施例中，治療劑包含選自以下之群的多肽：抗體、抗體片段、抗原受體或其抗原結合片段及其受體配位體或受體結合片段。在一個實施例中，治療劑包含抗體。在一個實施例中，抗體係單株抗體。在一個實施例中，抗體係多株抗體。在一個實施例中，抗體係人類抗體。在一個實施例中，抗體係人類化抗體。在一個實施例中，抗體係嵌合抗體。在一個實施例中，抗體係全長抗體。在一個實施例中，抗體係IgG類抗體，尤其IgG1亞類抗體。在一個實施例中，抗體係重組抗體。
在某些實施例中，治療劑包含抗體片段。抗體片段包括(但不限於) Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2 、Fv及scFv片段及下文描述之其他片段。關於某些抗體片段之綜述，參見Hudson等人,Nat . Med . 9:129-134 (2003)。關於scFv片段之綜述，參見例如Plückthun,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies , 第113卷, Rosenburg及Moore編, (Springer-Verlag, New York), 第269-315頁(1994)；亦參見WO 93/16185；及美國專利第5,571,894號及第5,587,458號。關於包含救助受體結合抗原決定基殘基及具有增加之活體內半衰期之Fab及F(ab')2 片段的論述，參見美國專利第5,869,046號。在一個實施例中，抗體片段係Fab片段或scFv片段。
雙功能抗體係兩個抗原結合位點可為二價或雙特異性之抗體片段。參見例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人,Nat. Med. 9:129-134 (2003)；and Hollinger等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)。三功能抗體及四功能抗體亦描述於Hudson等人,Nat. Med. 9:129-134 (2003)中。
單域抗體係包含抗體之重鏈可變域之全部或一部分或輕鏈可變域之全部或一部分的抗體片段。在某些實施例中，單域抗體係人類單域抗體(Domantis, Inc., Waltham, MA；參見例如美國專利第6,248,516 B1號)。
抗體片段可藉由各種技術製得，包括(但不限於)蛋白水解消化完整抗體以及藉由重組宿主細胞(例如大腸桿菌(E . coli )或噬菌體)產生，如本文所述。
在某些實施例中，治療劑包含嵌合抗體。某些嵌合抗體描述於例如美國專利第4,816,567號；及Morrison等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 81:6851-6855 (1984))中。在一個實例中，嵌合抗體包含非人類可變區(例如源自小鼠、大鼠、倉鼠、兔或非人類靈長類動物(諸如猴)之可變區)及人類恆定區。在另一實例中，嵌合抗體係「類別轉換」抗體，其中類別或亞類已自親本抗體之類別或亞類改變。嵌合抗體包括其抗原結合片段。
在一些實施例中，治療劑包含人類化抗體。通常，對非人類抗體進行人類化以降低對人類之免疫原性，同時保留親本非人類抗體之特異性及親和力。一般而言，人類化抗體包含一或多個可變域，其中HVR (例如CDR (或其一部分))係源自非人類抗體，且FR (或其一部分)係源自人類抗體序列。人類化抗體視情況亦包含人類恆定區之至少一部分。在一些實施例中，人類化抗體中之一些FR殘基經來自非人類抗體(例如HVR殘基所來源之抗體)之相應殘基取代以例如恢復或提高抗體特異性或親和力。
人類化抗體及其製造方法綜述於例如Almagro及Fransson,Front . Biosci . 13:1619-1633(2008)中，且進一步描述於例如Riechmann等人,Nature 332:323-329 (1988)；Queen等人,Proc . Nat ' l Acad . Sci . USA 86:10029-10033 (1989)；美國專利第5, 821,337號、第7,527,791號、第6,982,321號及第7,087,409號；Kashmiri等人,Methods 36:25-34 (2005) (描述特異性決定區(SDR)移植)；Padlan,Mol . Immunol . 28:489-498 (1991) (描述「表面再塑」)；Dall'Acqua等人,Methods 36:43-60 (2005) (描述「FR改組」)；及Osbourn等人,Methods 36:61-68 (2005)及Klimka等人,Br . J . Cancer , 83:252-260 (2000)(描述FR改組之「導引選擇」方法)中。
可用於人類化之人類構架區包括(但不限於)：使用「最佳擬合(best-fit)」法選擇之構架區(參見例如Sims等人,J . Immunol . 151:2296 (1993))；源自具有輕鏈或重鏈可變區之特定子組之人類抗體的共同序列之構架區(參見例如Carter等人,Proc . Natl . Acad . Sci . USA , 89:4285 (1992)；及Presta等人,J . Immunol ., 151:2623 (1993))；人類成熟(體細胞突變)構架區或人類生殖系構架區(參見例如Almagro及Fransson,Front . Biosci . 13:1619-1633 (2008))；及源自篩選FR文庫之構架區(參見例如Baca等人,J . Biol . Chem . 272:10678-10684 (1997)及Rosok等人,J . Biol . Chem . 271:22611-22618 (1996))。
在某些實施例中，治療劑包含人類抗體。可使用此項技術中已知之各種技術產生人類抗體。人類抗體一般描述於van Dijk及van de Winkel,Curr . Opin . Pharmacol . 5: 368-74 (2001)及Lonberg,Curr . Opin . Immunol . 20:450-459 (2008)中。
人類抗體可藉由將免疫原投與已經修飾以對抗原攻毒起反應而產生完整人類抗體或具有人類可變區之完整抗體的轉殖基因動物來製備。此類動物通常含有人類免疫球蛋白基因座之全部或一部分，其置換內源性免疫球蛋白基因座，或存在於染色體外或隨機整合至動物染色體中。在此類轉殖基因小鼠中，內源性免疫球蛋白基因座一般已失活。對於自轉殖基因動物獲得人類抗體之方法的綜述，參見Lonberg,Nat . Biotech . 23:1117-1125 (2005)。亦參見例如美國專利第6,075,181號及第6,150,584號，描述XENOMOUSETM 技術；美國專利第5,770,429號，描述HUMAB®技術；美國專利第7,041,870號，描述K-M MOUSE®技術；及美國專利申請公開案第US 2007/0061900號，描述VELOCIMOUSE®技術)。可進一步修飾由此類動物產生之完整抗體之人類可變區，例如藉由與不同人類恆定區組合。
人類抗體亦可藉由基於融合瘤之方法製備。已描述用於產生人類單株抗體之人類骨髓瘤及小鼠-人類融合骨髓瘤細胞株。(參見例如KozborJ. Immunol. , 133: 3001 (1984)；Brodeur等人,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications , 第51-63頁 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)；及Boerner等人,J. Immunol ., 147: 86 (1991)。)經由人類B細胞融合瘤技術產生之人類抗體亦描述於Li等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 103:3557-3562 (2006)中。額外方法包括描述於例如美國專利第7,189,826號(描述自融合瘤細胞株產生單株人類IgM抗體)及Ni,Xiandai Mianyixue 26(4):265-268 (2006) (描述人類-人類融合瘤)中之彼等方法。人類融合瘤技術(三源融合瘤技術(Trioma technology))亦描述於Vollmers及Brandlein,Histology and Histopathology , 20(3):927-937 (2005)以及Vollmers及Brandlein,Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology , 27(3):185-91 (2005)中。
人類抗體亦可藉由分離選自人類衍生之噬菌體呈現庫之Fv純系可變域序列產生。此類可變域序列接著可與所需人類恆定域組合。下文描述用於自抗體文庫選擇人類抗體之技術。
包含於治療劑中之抗體可藉由篩檢組合性文庫中之一或多種所需活性之抗體分離。舉例而言，此項技術中已知的多種方法用於產生噬菌體呈現文庫及篩選此類文庫中之具有所需結合特徵之抗體。此類方法綜述於例如Hoogenboom等人Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien等人編, Human Press, Totowa, NJ, 2001)中且進一步描述於例如McCafferty等人,Nature 348:552-554；Clackson等人,Nature 352: 624-628 (1991)；Marks等人,J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992)；Marks及Bradbury,Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo編, Human Press, Totowa, NJ, 2003)；Sidhu等人,J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004)；Lee等人,J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004)；Fellouse,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004)；及Lee等人,J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)中。
在某些噬菌體呈現方法中，VH及VL基因之譜系分別藉由聚合酶鏈式反應(PCR)選殖及在噬菌體文庫中無規重組，接著可篩檢抗原結合噬菌體，如Winter等人,Ann. Rev. Immunol. , 12: 433-455 (1994)中所述。噬菌體通常以單鏈Fv (scFv)片段或Fab片段形式呈現抗體片段。來自經免疫來源之文庫提供抗免疫原之高親和力抗體而無需構築融合瘤。或者，未處理譜系可經選殖(例如自人類)以在無任何免疫接種下提供各種非自體以及自體抗原之單一抗體來源，如所描述Griffiths等人,EMBO J, 12: 725-734 (1993)所描述。最終，未處理文庫亦可以合成方式藉由自幹細胞選殖未經重排之V基因區段，且使用含有無規序列以編碼高度可變CDR3區及實現活體外重排之PCR引子來製得，如由Hoogenboom及Winter,J . Mol . Biol . , 227: 381-388 (1992)所描述。描述人類抗體噬菌體文庫之專利公開案包括例如：美國專利第5,750,373號及美國專利公開案第2005/0079574號、第2005/0119455號、第2005/0266000號、第2007/0117126號、第2007/0160598號、第2007/0237764號、第2007/0292936號及第2009/0002360號。
自人類抗體文庫分離之抗體或抗體片段在本文中視為人類抗體或人類抗體片段。
在某些實施例中，治療劑包含多特異性抗體，例如雙特異性抗體。多特異性抗體係對至少兩個不同位點具有結合特異性之單株抗體。在某些實施例中，結合特異性係針對不同抗原。在某些實施例中，結合特異性係針對相同抗原上之不同抗原決定基。雙特異性抗體亦可用以使細胞毒性劑定位至表現抗原之細胞。雙特異性抗體可以全長抗體或抗體片段形式製備。
用於製造多特異性抗體之技術包括(但不限於)重組共表現具有不同特異性之兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(參見Milstein及Cuello,Nature 305: 537 (1983))，WO 93/08829，及Traunecker等人,EMBO J . 10: 3655 (1991))，及「杵-臼結構(knob-in-hole)」工程改造(參見例如美國專利第5,731,168號)。多特異性抗體亦可藉由以下製得：工程改造用於製造抗體Fc雜二聚體分子之靜電操控效應(WO 2009/089004A1)；交聯兩種或更多種抗體或片段(參見例如美國專利第4,676,980號及Brennan等人,Science , 229: 81 (1985))；使用白胺酸拉鏈以產生雙特異性抗體(參見例如Kostelny等人,J . Immunol . , 148(5):1547-1553 (1992))；使用製造雙特異性抗體片段之「雙功能抗體」技術(參見例如Hollinger等人,Proc . Natl . Acad . Sci . USA , 90:6444-6448 (1993))；及使用單鏈Fv (sFv)二聚體(參見例如Gruber等人,J . Immunol . , 152:5368 (1994))；及製備三特異性抗體，如例如Tutt等人 J. Immunol. 147: 60 (1991)中所描述。
包括「章魚抗體(Octopus antibody)」之具有三個或更多個官能性抗原結合位點之經工程改造之抗體亦包括在本文中(參見例如US 2006/0025576A1)。
抗體或片段在本文中亦包括包含結合至兩種不同抗原之抗原結合位點之「雙作用FAb」或「DAF」(參見例如US 2008/0069820)。
「互換mab」抗體亦包括在本文中(參見例如WO2009080251、WO2009080252、WO2009080253、WO2009080254)。
製造雙特異性抗體片段之另一技術係「雙特異性T細胞接合子」或BiTE®方法(參見例如WO2004/106381、WO2005/061547、WO2007/042261及WO2008/119567)。此方法利用排列於單一多肽上之兩個抗體可變域。舉例而言，單一多肽鏈包括兩個單鏈Fv (scFv)片段，各自具有藉由長度足以允許兩個結構域之間的分子內結合的多肽連接體分離的可變重鏈(VH)域及可變輕鏈(VL)域。此單一多肽進一步包括兩個scFv片段之間的多肽間隔序列。各scFv識別不同抗原決定基，且此等抗原決定基可對不同細胞類型具有特異性，以使得當各scFv與其同源抗原決定基接合時兩個不同細胞類型之細胞接近或經繫栓。此方法之一個特定實施例包括scFv識別連接至另一scFv的由免疫細胞表現之細胞表面抗原，例如T細胞上之CD3多肽，該另一scFv識別由標靶細胞表現之細胞表面抗原，諸如惡性或腫瘤細胞。
由於其係單一多肽，雙特異性T細胞接合子可使用此項技術中已知之任何原核或真核細胞表現系統(例如CHO細胞株)表現。然而，特定純化技術(參見例如EP1691833)可為分離單體雙特異性T細胞接合子與其他多聚物種所必需，該等其他多聚物種可具有除單體之預期活性外之生物活性。在一個例示性純化方案中，首先對含有所分泌多肽之溶液進行金屬親和力層析，且用咪唑濃度之梯度溶離多肽。使用陰離子交換層析進一步純化此溶離液，且使用氯化鈉濃度之梯度溶離多肽。最後，對此溶離液進行尺寸排阻層析以分離單體與多聚物種。
涵蓋具有超過兩價之抗體。舉例而言，可製備三特異性抗體。Tuft等人 J. Immunol. 147: 60 (1991)。
在某些實施例中，治療劑中所包含之抗體可經進一步修飾以含有此項技術中已知且可易於獲得之額外非蛋白質部分。適用於抗體之衍生作用之部分包括(但不限於)水溶性聚合物。水溶性聚合物之非限制性實例包括(但不限於)聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇之共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚-1,3-二氧雜環戊烷、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/順丁烯二酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或無規共聚物)及葡聚糖或聚(n-乙烯吡咯啶酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙烯多元醇(例如丙三醇)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛因其於水中之穩定性而可在製造中具有優勢。聚合物可具有任何分子量，且可為分支鏈或未分支鏈。與抗體連接之聚合物的數目可變化，且若連接一個以上聚合物，則聚合物可為相同或不同分子。一般而言，用於衍生之聚合物的數目及/或類型可基於包括(但不限於)待改良抗體之特定特性或功能、抗體衍生物是否將用於限定條件下之療法等考慮因素來確定。
治療劑亦可包含與一或多種細胞毒性劑結合之抗體，該一或多種細胞毒性劑係諸如化學治療劑或藥物、生長抑制劑、毒素(例如蛋白質毒素；細菌、真菌、植物或動物來源之酶促活性毒素，或其片段)或放射性同位素。
在一個實施例中，治療劑包含抗體與一或多種藥物結合之抗體-藥物結合物(ADC)，該一或多種藥物包括(但不限於)類美登素(maytansinoid) (參見美國專利第5,208,020號、第5,416,064號及歐洲專利EP 0 425 235 B1)；奧瑞他汀(auristatin)，諸如單甲基奧瑞他汀藥物部分DE及DF (MMAE及MMAF) (參見美國專利第5,635,483號及第5,780,588號及第7,498,298號；海兔毒素(dolastatin)；卡奇黴素(calicheamicin)或其衍生物(參見美國專利第5,712,374號、第5,714,586號、第5,739,116號、第5,767,285號、第5,770,701號、第5,770,710號、第5,773,001號及第5,877,296號；Hinman等人,Cancer Res. 53:3336-3342 (1993)；及Lode等人,Cancer Res. 58:2925-2928 (1998))；蒽環黴素(anthracycline)，諸如道諾黴素(daunomycin)或小紅莓(doxorubicin) (參見Kratz等人,Current Med. Chem. 13:477-523 (2006)；Jeffrey等人,Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006)；Torgov等人,Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005); Nagy等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchik等人,Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002)；King等人,J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002)；及美國專利第6,630,579號)；甲胺喋呤(methotrexate)；長春地辛(vindesine)；紫杉烷(taxane)，諸如多烯紫杉醇(docetaxel)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、拉洛他賽(larotaxel)、替司他賽(tesetaxel)及奧他賽(ortataxel)；單端孢黴烯族毒素；及CC1065。
在另一實施例中，治療劑包含結合至酶促活性毒素或其片段之如本文所述之抗體，該酶促活性毒素或其片段包括(但不限於)白喉A鏈(diphtheria A chain)、白喉毒素(diphtheria toxin)之非結合活性片段、外毒素A鏈(來自綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒素A鏈(ricin A chain)、相思子毒素A鏈(abrin A chain)、莫迪素A鏈(modeccin A chain)、α-帚麴菌素(alpha-sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白質、康乃馨(dianthin)蛋白質、洋商陸(Phytolaca americana)蛋白質(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制劑、麻瘋樹毒蛋白(curcin)、巴豆毒素(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制劑、白樹素(gelonin)、有絲***素(mitogellin)、侷限麴菌素(restrictocin)、酚黴素(phenomycin)、伊諾黴素(enomycin)及黴菌毒素。
在另一實施例中，治療劑包含與放射性原子結合以形成放射性結合物之如本文所述之抗體。多種放射性同位素可用於產生放射性結合物。實例包括At211 、I131 、I125 、Y90 、Re186 、Re188 、Sm153 、Bi212 、P32 、Pb212 及Lu之放射性同位素。當放射性結合物用於偵測時，其可包含用於閃爍攝影研究之放射性原子，例如TC99m 或I123 ；或用於核磁共振(NMR)成像(亦稱磁共振成像，mri)之自旋標記物，又諸如碘-123、碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳或鐵。
可使用多種雙功能蛋白質偶合劑製得抗體與細胞毒性劑之結合物，該等雙功能蛋白質偶合劑係諸如N-丁二醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)、丁二醯亞胺基-4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸酯(SMCC)、亞胺基硫雜環戊烷(IT)、亞胺基酯之雙功能衍生物(諸如二亞胺代己二酸二甲酯HCl)、活性酯(諸如辛二酸二丁二醯亞胺基酯)、醛(諸如戊二醛)、雙疊氮基化合物(諸如雙(對疊氮基苯甲醯基)己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙(對重氮苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2,6-二異氰酸酯)及雙活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。舉例而言，蓖麻毒素免疫毒素可如Vitetta等人,Science 238:1098 (1987)中所述來製備。碳14標記之1-異硫氰基苯甲基-3-甲基二伸乙三胺五乙酸(MX-DTPA)係用於使放射性核苷酸結合於抗體之例示性螯合劑。參見WO94/11026。連接子可為有助於細胞毒性藥物在細胞中釋放之「可裂解連接子」。舉例而言，可使用酸不穩定連接子、肽酶敏感連接子、光不穩定連接子、二甲基連接子或含二硫鍵連接子(Chari等人,Cancer Res . 52:127-131 (1992)；美國專利第5,208,020號)。
在一個實施例中，治療劑包含指示用於癌症治療之抗體。在一個實施例中，指示治療劑用於癌症治療。在一個實施例中，癌症係B細胞增生性病症。在一個實施例中，癌症係CD20陽性B細胞增生性病症。在一個實施例中，癌症係選自由以下組成之群：非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性淋巴球性白血病(ALL)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡性淋巴瘤(FL)、套細胞淋巴瘤(MCL)、邊緣區淋巴瘤(MZL)、多發性骨髓瘤(MM)及霍奇金淋巴瘤(HL)。在一個實施例中，治療劑係免疫治療劑。
在一些實施例中，治療劑包含特異性結合至活化T細胞抗原之抗體。在一個實施例中，治療性抗體可包含特異性結合至選自CD3、CD28、CD137(亦稱為4-1BB)、CD40、CD226、OX40、GITR、CD27、HVEM及CD127之群的抗原之抗體。
在一個實施例中，治療劑包含特異性結合至CD3、尤其CD3ɛ之抗體。
在一個實施例中，治療劑包含為或可競爭以與如下結合之抗體：抗體H2C(PCT公開案第WO2008/119567號)、抗體V9 (Rodrigues等人, Int J Cancer增刊7, 45-50 (1992)及美國專利第6,054,297號)、抗體FN18 (Nooij等人, Eur J Immunol 19, 981-984 (1986))、抗體SP34 (Pessano等人, EMBO J 4, 337-340 (1985))、抗體OKT3 (Kung等人, Science 206, 347-349 (1979))、抗體WT31 (Spits等人, J Immunol 135, 1922 (1985))、抗體UCHT1 (Burns等人, J Immunol 129, 1451-1457 (1982))、抗體7D6 (Coulie等人, Eur J Immunol 21, 1703-1709 (1991))或抗體Leu-4。在一些實施例中，治療劑亦可包含特異性結合至CD3之抗體，如WO 2005/040220、WO 2005/118635、WO 2007/042261、WO 2008/119567、WO 2008/119565、WO 2012/162067、WO 2013/158856、WO 2013/188693、WO 2013/186613、WO 2014/110601、WO 2014/145806、WO 2014/191113、WO 2014/047231、WO 2015/095392、WO 2015/181098、WO 2015/001085、WO 2015/104346、WO 2015/172800、WO 2016/020444或WO 2016/014974中所述。
在一個實施例中，治療劑可包含特異性結合至B細胞抗原、尤其惡性B細胞抗原之抗體。在一個實施例中，治療劑可包含特異性結合至選自由CD20、CD19、CD22、ROR-1、CD37及CD5組成之群的抗原，尤其CD20或CD19之抗體。
在一些實施例中，治療劑可包含選自利妥昔單抗、奧克珠單抗、奧伐木單抗、奧卡拉珠單抗、維托珠單抗及烏妥昔單抗之抗體。
在一些實施例中，治療劑可包含多特異性抗體，尤其雙特異性抗體。在一些實施例中，治療劑可包含能夠結合至T細胞及標靶細胞，例如腫瘤細胞之雙特異性抗體。在一些實施例中，標靶細胞係B細胞，尤其惡性B細胞。在一些實施例中，治療劑可包含特異性結合至(i)活化T細胞抗原及(ii)B細胞抗原之雙特異性抗體。在一些實施例中，治療劑可包含特異性結合至T細胞上之CD3及靶細胞抗原之雙特異性抗體。在一些實施例中，靶細胞抗原係B細胞抗原，尤其惡性B細胞抗原。在一些實施例中，治療劑可包含雙特異性T細胞接合子(BiTE®)。
在一些實施例中，治療劑可包含針對CD3及CD20之雙特異性抗體。在一個實施例中，雙特異性抗體係XmAb® 13676。在一個實施例中，雙特異性抗體係REGN1979。在一個實施例中，雙特異性抗體係FBTA05 (Lymphomun)。
在一些實施例中，治療劑可包含針對CD3及CD19之雙特異性抗體。在一個實施例中，雙特異性抗體係布林莫單抗(BLINCYTO®)。在一個實施例中，雙特異性抗體係AFM11。在一個實施例中，雙特異性抗體係MGD011 (JNJ-64052781)。
在一些實施例中，治療劑可包含針對CD3及CD38之雙特異性抗體。在一個實施例中，雙特異性抗體係XmAb® 13551、XmAb® 15426或XmAb® 14702。
在一些實施例中，治療劑可包含針對CD3及BCMA之雙特異性抗體。在一個實施例中，雙特異性抗體係BI836909。
在一些實施例中，治療劑可包含針對CD3及CD33之雙特異性抗體。在一個實施例中，雙特異性抗體係AMG330。
在一些實施例中，治療劑可包含針對CD3及CD123之雙特異性抗體。在一個實施例中，雙特異性抗體係MGD006。在一個實施例中，雙特異性抗體係XmAb® 14045。在一個實施例中，雙特異性抗體係JNJ-63709178。
在一些實施例中，治療劑可包含重組受體或其片段。在一些實施例中，受體係T細胞受體(TCR)。在一些實施例中，治療劑可包含嵌合抗原受體(CAR)。
在一些實施例中，治療劑可包含表現嵌合抗原受體(CAR)之T細胞(例如細胞毒性T細胞或CTL)。在一些實施例中，治療劑可包含表現重組T細胞受體(TCR)之T細胞。
在一個實施例中，治療劑可包含特異性結合至B細胞抗原，尤其惡性B細胞抗原之CAR。在一個實施例中，治療劑可包含特異性結合至選自由CD20、CD19、CD22、ROR-1、CD37及CD5組成之群的抗原，尤其CD20或CD19之CAR。
在一些實施例中，治療劑可包含針對CD19之CAR或表現針對CD19之CAR的T細胞。在一些實施例中，治療劑可包含KTE-C19、CTL019、JCAR-014、JCAR-015、JCAR-017、BPX-401、UCART19，
在一些實施例中，治療劑可包含針對CD22之CAR或表現針對CD22之CAR的T細胞。在一些實施例中，治療劑可包含JCAR-018或UCART22。
在一些實施例中，治療劑可包含針對T細胞活化協同刺激分子之促效劑。在一些實施例中，T細胞活化協同刺激分子可包括CD40、CD226、CD28、OX40、GITR、CD137、CD27、HVEM或CD127。在一些實施例中，針對T細胞活化協同刺激分子之促效劑係結合至以下之促效劑抗體：CD40、CD226、CD28、OX40、GITR、CD137、CD27、HVEM或CD127。在一些實施例中，治療劑可包含靶向GITR之抗體。在一些實施例中，靶向GITR之抗體係TRX518。
在一些實施例中，治療劑可包含針對CD137 (亦稱為TNFRSF9、4-1BB或ILA)之促效劑，例如活化抗體。在一些實施例中，治療劑可包含烏瑞魯單抗(urelumab)(亦稱為BMS-663513)。在一些實施例中，治療劑可包含CD137 (亦稱為TNFRSF9、4-1BB或ILA)之配位體，諸如4-1BBL。在一些實施例中，治療劑可包含針對CD40之促效劑，例如活化抗體。在一些實施例中，治療劑可包含CP-870893。在一些實施例中，治療劑可包含針對OX40 (亦稱為CD134)之促效劑，例如活化抗體。在一些實施例中，治療劑可包含抗OX40抗體(例如AgonOX)。在一些實施例中，治療劑可包含OX40之配位體，諸如OX40L。在一些實施例中，治療劑可包含針對CD27之促效劑，例如活化抗體。在一些實施例中，治療劑可包含CDX-1127。
在一些實施例中，治療劑可包含通用、生物類似或非可比生物形式之藥劑，例如本文中所命名之抗體。
在一個實施例中，治療劑不包含奧濱尤妥珠單抗。
在一些實施例中，治療劑包含特異性結合至CD3、尤其CD3ɛ之抗體。在一個實施例中，特異性結合至CD3之抗體包含有包含SEQ ID NO: 12之重鏈CDR (HCDR) 1、SEQ ID NO: 13之HCDR2及SEQ ID NO: 14之HCDR3的重鏈可變區；及包含SEQ ID NO: 15之輕鏈CDR (LCDR) 1、SEQ ID NO: 16之LCDR2及SEQ ID NO: 17之LCDR3的輕鏈可變區。在另一實施例中，特異性結合CD3之抗體包含與SEQ ID NO: 18至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之重鏈可變區序列及與SEQ ID NO: 19之序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之輕鏈可變區序列。在另一實施例中，特異性結合CD3之抗體包含SEQ ID NO: 18之重鏈可變區序列及SEQ ID NO: 19之輕鏈可變區序列。
在一個實施例中，特異性結合至CD3之抗體係全長抗體。在一個實施例中，特異性結合於CD3之抗體係人類IgG類抗體，尤其人類IgG1 類抗體。在一個實施例中，特異性結合於CD3之抗體係抗體片段，尤其Fab分子或scFv分子，更尤其Fab分子。在一特定實施例中，特異性結合至CD3之抗體係互換型Fab分子，其中Fab重鏈及輕鏈之可變域或恆定域交換(亦即彼此置換)。在一個實施例中，特異性結合至CD3之抗體係人類化抗體。
在一個實施例中，治療劑包含多特異性抗體，尤其雙特異性抗體。在一個實施例中，多特異性抗體特異性結合至(i)活化T細胞抗原及(ii)B細胞抗原。特定雙特異性抗體描述於PCT公開案第WO 2016/020309號及歐洲專利申請案第EP15188093號及第EP16169160號中(各以全文引用的方式併入本文中)。
在一個實施例中，雙特異性抗體特異性結合至CD3及CD20。在一個實施例中，雙特異性抗體包含特異性結合至CD20之抗原結合部分及特異性結合至CD3之抗原結合部分。在一個實施例中，雙特異性抗體包含特異性結合至CD3之第一抗原結合部分及特異性結合至CD20之第二及第三抗原結合部分。在一個實施例中，第一抗原結合部分係互換型Fab分子，且第二及第一抗原結合部分各係習知Fab分子。在一個實施例中，雙特異性抗體進一步包含Fc域。雙特異性抗體可包含Fc區及/或如本文所述之抗原結合部分中之修飾。
在一個實施例中，治療劑包含有包含以下之雙特異性抗體： (i)特異性結合至CD3且包含以下之抗原結合部分：包含SEQ ID NO: 12之重鏈CDR (HCDR) 1、SEQ ID NO: 13之HCDR2及SEQ ID NO: 14之HCDR3的重鏈可變區；及包含SEQ ID NO: 15之輕鏈CDR (LCDR) 1、SEQ ID NO: 16之LCDR2及SEQ ID NO: 17之LCDR3的輕鏈可變區；及 (ii)特異性結合至CD20且包含以下之抗原結合部分：包含SEQ ID NO: 4之重鏈CDR (HCDR) 1、SEQ ID NO: 5之HCDR2及SEQ ID NO: 6之HCDR3的重鏈可變區；及包含SEQ ID NO: 7之輕鏈CDR (LCDR) 1、SEQ ID NO: 8之LCDR2及SEQ ID NO: 9之LCDR3的輕鏈可變區。
在一個實施例中，治療劑包含有包含以下之雙特異性抗體： (i)特異性結合至CD3且包含SEQ ID NO: 18之重鏈可變區；及SEQ ID NO: 19之輕鏈可變區的抗原結合部分；及 (ii)特異性結合至CD20且包含SEQ ID NO: 10之重鏈可變區；及SEQ ID NO: 11之輕鏈可變區的抗原結合部分。
在一特定實施例中，治療劑包含有包含以下之雙特異性抗體： a)特異性結合至第一抗原之第一Fab分子； b)特異性結合至第二抗原之第二Fab分子，且其中Fab輕鏈可變域VL與Fab重鏈可變域VH彼此置換； c)特異性結合至第一抗原之第三Fab分子；及 d)由能夠穩定締合之第一及第二亞單元構成之Fc域； 其中 (i)第一抗原係CD20且第二抗原係CD3，尤其CD3 ε； (ii) a)項下之第一Fab分子及c)項下之第三Fab分子各自包含SEQ ID NO: 4之重鏈互補決定區(CDR) 1、SEQ ID NO: 5之重鏈CDR 2、SEQ ID NO: 6之重鏈CDR 3、SEQ ID NO: 7之輕鏈CDR 1、SEQ ID NO: 8之輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 9之輕鏈CDR 3，且b)項下之第二Fab分子包含SEQ ID NO: 12之重鏈CDR 1、SEQ ID NO: 13之重鏈CDR 2、SEQ ID NO: 14之重鏈CDR 3、SEQ ID NO: 15之輕鏈CDR 1、SEQ ID NO: 16之輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 17之輕鏈CDR 3； (iii)在a)項下之第一Fab分子及c)項下之第三Fab分子之恆定域CL中，位置124之胺基酸經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)且位置123之胺基酸經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代，尤其經精胺酸(R)取代(根據Kabat編號)，且其中在a)項下之第一Fab分子及c)項下之第三Fab分子之恆定域CH1中，位置147之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)且位置213之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)；及 (iv) a)項下之第一Fab分子在Fab重鏈C端與b)項下之第二Fab分子之Fab重鏈N端融合，且b)項下之第二Fab分子及c)項下之第三Fab分子各自在Fab重鏈C端與d)項下之Fc域之亞單元中之一者的N端融合。
在一個實施例中，a)項下之第一Fab分子及c)項下之第三Fab分子各自包含與SEQ ID NO: 10之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致之重鏈可變區，及與SEQ ID NO: 11之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致之輕鏈可變區。
在一個實施例中，a)項下之第一Fab分子及c)項下之第三Fab分子各自包含SEQ ID NO: 10之重鏈可變區序列及SEQ ID NO: 11之輕鏈可變區序列。
在一個實施例中，b)項下之第二Fab分子包含與SEQ ID NO: 18之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致之重鏈可變區及與SEQ ID NO: 19之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致之輕鏈可變區。
在又另一實施例中，b)項下之第二Fab分子包含SEQ ID NO: 18之重鏈可變區序列及SEQ ID NO: 19之輕鏈可變區序列。
在一特定實施例中，雙特異性抗體包含與SEQ ID NO: 20之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致之多肽、與SEQ ID NO: 21之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致之多肽、與SEQ ID NO: 22之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致之多肽及與SEQ ID NO: 23之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致之多肽。在另一特定實施例中，雙特異性抗體包含SEQ ID NO: 20之多肽序列、SEQ ID NO: 21之多肽序列、SEQ ID NO: 22之多肽序列及SEQ ID NO: 23之多肽序列。(CD20XCD3 bsAB)
在一個實施例中，雙特異性抗體包含特異性結合至CD19之抗原結合部分及特異性結合至CD3之抗原結合部分。在一個實施例中，雙特異性抗體包含特異性結合至CD3之第一抗原結合部分及特異性結合至CD19之第二及第三抗原結合部分。在一個實施例中，第一抗原結合部分係互換型Fab分子，且第二及第一抗原結合部分各係習知Fab分子。在一個實施例中，雙特異性抗體進一步包含Fc域。雙特異性抗體可包含Fc區及/或如本文所述之抗原結合部分中之修飾。
在一個實施例中，治療劑包含有包含以下之雙特異性抗體： (i)特異性結合至CD3且包含以下之抗原結合部分：包含SEQ ID NO: 12之重鏈CDR (HCDR) 1、SEQ ID NO: 13之HCDR2及SEQ ID NO: 14之HCDR3的重鏈可變區；及包含SEQ ID NO: 15之輕鏈CDR (LCDR) 1、SEQ ID NO: 16之LCDR2及SEQ ID NO: 17之LCDR3的輕鏈可變區；及 (ii)特異性結合至CD19且包含以下之抗原結合部分：包含SEQ ID NO: 24之重鏈CDR (HCDR) 1、SEQ ID NO: 25之HCDR2及SEQ ID NO: 26之HCDR3的重鏈可變區；及包含SEQ ID NO: 27之輕鏈CDR (LCDR) 1、SEQ ID NO: 28之LCDR2及SEQ ID NO: 29之LCDR3的輕鏈可變區。
在一個實施例中，治療劑包含有包含以下之雙特異性抗體： (i)特異性結合至CD3且包含SEQ ID NO: 18之重鏈可變區；及SEQ ID NO: 19之輕鏈可變區的抗原結合部分；及 (ii)特異性結合至CD19且包含SEQ ID NO: 30之重鏈可變區；及SEQ ID NO: 31之輕鏈可變區的抗原結合部分。
在一特定實施例中，治療劑包含有包含以下之雙特異性抗體： a)特異性結合至第一抗原之第一Fab分子； b)特異性結合至第二抗原之第二Fab分子，且其中Fab輕鏈可變域VL與Fab重鏈可變域VH彼此置換； c)特異性結合至第一抗原之第三Fab分子；及 d)由能夠穩定締合之第一及第二亞單元構成之Fc域； 其中 (i)第一抗原係CD19且第二抗原係CD3，尤其CD3 ε； (ii) a)項下之第一Fab分子及c)項下之第三Fab分子各自包含SEQ ID NO: 24之重鏈互補決定區(CDR) 1、SEQ ID NO: 25之重鏈CDR 2、SEQ ID NO: 26之重鏈CDR 3、SEQ ID NO: 27之輕鏈CDR 1、SEQ ID NO: 28之輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 29之輕鏈CDR 3，且b)項下之第二Fab分子包含SEQ ID NO: 12之重鏈CDR 1、SEQ ID NO: 13之重鏈CDR 2、SEQ ID NO: 14之重鏈CDR 3、SEQ ID NO: 15之輕鏈CDR 1、SEQ ID NO: 16之輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 17之輕鏈CDR 3； (iii)在a)項下之第一Fab分子及c)項下之第三Fab分子之恆定域CL中，位置124之胺基酸經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)且位置123之胺基酸經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代，尤其經精胺酸(R)取代(根據Kabat編號)，且其中在a)項下之第一Fab分子及c)項下之第三Fab分子之恆定域CH1中，位置147之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)且位置213之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)；及 (iv) a)項下之第一Fab分子在Fab重鏈C端與b)項下之第二Fab分子之Fab重鏈N端融合，且b)項下之第二Fab分子及c)項下之第三Fab分子各自在Fab重鏈C端與d)項下之Fc域之亞單元中之一者的N端融合。
在一個實施例中，a)項下之第一Fab分子及c)項下之第三Fab分子各自包含與SEQ ID NO: 30之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致之重鏈可變區及與SEQ ID NO: 31之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致之輕鏈可變區。
在一個實施例中，a)項下之第一Fab分子及c)項下之第三Fab分子各自包含SEQ ID NO: 30之重鏈可變區序列及SEQ ID NO: 31之輕鏈可變區序列。
在一個實施例中，b)項下之第二Fab分子包含與SEQ ID NO: 18之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致之重鏈可變區及與SEQ ID NO: 19之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致之輕鏈可變區。
在又另一實施例中，b)項下之第二Fab分子包含SEQ ID NO: 18之重鏈可變區序列及SEQ ID NO: 19之輕鏈可變區序列。
在一特定實施例中，雙特異性抗體包含與SEQ ID NO: 23之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致之多肽、與SEQ ID NO: 32之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致之多肽、與SEQ ID NO: 33之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致之多肽及與SEQ ID NO: 34之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致之多肽。在另一特定實施例中，雙特異性抗體包含SEQ ID NO: 23之多肽序列、SEQ ID NO: 32之多肽序列、SEQ ID NO: 33之多肽序列及SEQ ID NO: 34之多肽序列。
抗體形式 包含於治療劑中之抗體、尤其多特異性抗體之組分可以多種組態彼此融合。例示性組態描繪於圖1中。
在特定實施例中，包含於抗體中之抗原結合部分係Fab分子。在此類實施例中，第一、第二、第三抗原結合部分等在本文中可分別稱為第一、第二、第三Fab分子等。此外，在特定實施例中，抗體包含由能夠穩定締合之第一及第二亞單元構成之Fc域。
在一些實施例中，第二Fab分子在Fab重鏈C端與Fc域之第一或第二亞單元N端融合。
在一個此類實施例中，第一Fab分子在Fab重鏈C端與第二Fab分子之Fab重鏈N端融合。在一特定此類實施例中，抗體基本上由以下組成：第一及第二Fab分子、由第一及第二亞單元構成之Fc域及視情況存在之一或多個肽連接子，其中第一Fab分子在Fab重鏈C端與第二Fab分子之Fab重鏈N端融合，且第二Fab分子在Fab重鏈C端與Fc域之第一或第二亞單元N端融合。此類組態示意性地描繪於圖1G及1K中。視情況，第一Fab分子之Fab輕鏈與第二Fab分子之Fab輕鏈可另外彼此融合。
在另一此類實施例中，第一Fab分子在Fab重鏈C端與Fc域之第一或第二亞單元N端融合。在一特定此類實施例中，抗體基本上由以下組成：第一及第二Fab分子、由第一及第二亞單元構成之Fc域及視情況存在之一或多個肽連接子，其中第一及第二Fab分子在Fab重鏈C端與Fc域之亞單元中之一者的N端融合。此類組態示意性地描繪於圖1A及1D中。第一及第二Fab分子可與Fc域直接融合或經由肽連接子融合。在一個特定實施例中，第一及第二Fab分子各自經由免疫球蛋白鉸鏈區與Fc域融合。在一特定實施例中，免疫球蛋白鉸鏈區係人類IgG1 鉸鏈區，Fc域係IgG1 Fc域之情況下尤其如此。
在其他實施例中，第一Fab分子在Fab重鏈C端與Fc域之第一或第二亞單元之N端融合。
在一個此類實施例中，第二Fab分子在Fab重鏈C端與第二Fab分子之Fab重鏈N端融合。在一特定此類實施例中，抗體基本上由以下組成：第一及第二Fab分子、由第一及第二亞單元構成之Fc域及視情況存在之一或多個肽連接子，其中第二Fab分子在Fab重鏈C端與第一Fab分子之Fab重鏈N端融合，且第一Fab分子在Fab重鏈C端與Fc域之第一或第二亞單元N端融合。此類組態示意性地描繪於圖1H及1L中。視情況，第一Fab分子之Fab輕鏈與第二Fab分子之Fab輕鏈可另外彼此融合。
Fab分子可直接或經由包含一或多個胺基酸(通常約2-20個胺基酸)的肽連接子與Fc域融合或彼此融合，肽連接子在此項技術中已知且描述於本文中。適合的非免疫原性肽連接子包括例如(G4 S)n 、(SG4 )n 、(G4 S)n 或G4 (SG4 )n 肽連接子。「n」一般係1至10，通常2至4之整數。在一個實施例中，該肽連接子具有至少5個胺基酸之長度；在一個實施例中，具有5至100個胺基酸之長度；在另一實施例中，具有10至50個胺基酸之長度。在一個實施例中，該肽連接子係(GxS)n 或(GxS)n Gm ，其中G =甘胺酸，S =絲胺酸，且(x = 3，n = 3、4、5或6，且m = 0、1、2或3)或(x = 4，n = 2、3、4或5且m = 0、1、2或3)，在一個實施例中，x = 4且n = 2或3，在另一實施例中，x = 4且n = 2。在一個實施例中，該肽連接子係(G4 S)2 。尤其適用於第一Fab分子與第二Fab分子之Fab輕鏈彼此融合的肽連接子係(G4 S)2 。適用於連接第一Fab片段與第二Fab片段之Fab重鏈的例示性肽連接子包含序列(D)-(G4 S)2 (SEQ ID NO 95及96)。另一適合的此類連接子包含序列(G4 S)4 。另外，連接子可包含免疫球蛋白鉸鏈區(之一部分)。尤其在Fab分子與Fc域亞單元N端融合之情況下，其可在額外肽連接子存在或不存在之情況下經由免疫球蛋白鉸鏈區或其一部分融合。
單一抗原結合部分(諸如Fab分子)能夠特異性結合至標靶細胞抗原(例如如圖1A、D、G、H、K、L中所示)之抗體適用，在預期在高親和力抗原結合部分結合之後內化標靶細胞抗原之情況下尤其如此。在此類情況下，存在超過一個對靶細胞抗原具有特異性之抗原結合部分可增強標靶細胞抗原之內化，從而降低其可利用性。
然而，在許多其他情況中，有利的將是具有包含兩個或更多個對標靶細胞抗原具有特異性之抗原結合部分(諸如Fab分子)的抗體(參見圖1B、1C、1E、1F、1I、1J、1M或1N中所示之實例)，例如使靶向目標位點達最佳或使得標靶細胞抗原交聯。
因此，在特定實施例中，抗體進一步包含特異性結合至第一抗原之第三Fab分子。第一抗原較佳係標靶細胞抗原。在一個實施例中，第三Fab分子係習知Fab分子。在一個實施例中，第三Fab分子與第一Fab分子相同(亦即第一及第三Fab分子包含相同重鏈及輕鏈胺基酸序列且具有相同的結構域排列(亦即習知或互換型))。在一特定實施例中，第二Fab分子特異性結合至活化T細胞抗原，尤其CD3，且第一及第三Fab分子特異性結合至靶細胞抗原。
在替代實施例中，抗體進一步包含特異性結合至第二抗原之第三Fab分子。在此等實施例中，第二抗原較佳係標靶細胞抗原。在一個此類實施例中，第三Fab分子係互換型Fab分子(Fab分子，其中Fab重鏈及輕鏈之可變域VH及VL或恆定域CL及CH1彼此交換/置換)。在一個此類實施例中，第三Fab分子與第二Fab分子相同(亦即第二及第三Fab分子包含相同重鏈及輕鏈胺基酸序列且具有相同的結構域排列(亦即習知或互換型))。在一個此類實施例中，第一Fab分子特異性結合至活化T細胞抗原，尤其CD3，且第二及第三Fab分子特異性結合至標靶細胞抗原。
在一個實施例中，第三Fab分子在Fab重鏈C端與Fc域之第一或第二亞單元之N端融合。
在一特定實施例中，第二及第三Fab分子各自在Fab重鏈C端與Fc域之亞單元中之一者的N端融合，且第一Fab分子在Fab重鏈C端與第二Fab分子之Fab重鏈N端融合。在一特定此類實施例中，抗體基本上由以下組成：第一、第二及第三Fab分子、由第一及第二亞單元構成之Fc域及視情況存在之一或多個肽連接子，其中第一Fab分子在Fab重鏈C端與第二Fab分子之Fab重鏈N端融合，且第二Fab分子在Fab重鏈C端與Fc域之第一亞單元之N端融合，且其中第三Fab分子在Fab重鏈C端與Fc域之第二亞單元之N端融合。此類組態示意性地描繪於圖1B及1E (特定實施例，其中第三Fab分子係習知Fab分子且較佳與第一Fab分子相同)，及圖1I及1M (替代實施例，其中第三Fab分子係互換型Fab分子且較佳與第二Fab分子相同)。第二及第三Fab分子可與Fc域直接融合或經由肽連接子融合。在一個特定實施例中，第二及第三Fab分子各自經由免疫球蛋白鉸鏈區與Fc域融合。在一特定實施例中，免疫球蛋白鉸鏈區係人類IgG1 鉸鏈區，Fc域係IgG1 Fc域之情況下尤其如此。視情況，第一Fab分子之Fab輕鏈與第二Fab分子之Fab輕鏈可另外彼此融合。
在另一個實施例中，第一及第三Fab分子各自在Fab重鏈C端與Fc域之亞單元中之一者之N端融合，且第二Fab分子在Fab重鏈C端與第一Fab分子Fab重鏈N端融合。在一特定此類實施例中，抗體基本上由以下組成：第一、第二及第三Fab分子、由第一及第二亞單元構成之Fc域及視情況存在之一或多個肽連接子，其中第二Fab分子在Fab重鏈C端與第二Fab分子之Fab重鏈N端融合，且第一Fab分子在Fab重鏈C端與Fc域之第一亞單元之N端融合，且其中第三Fab分子在Fab重鏈C端與Fc域之第二亞單元之N端融合。此類組態示意性地描繪於圖1C及1F (特定實施例，其中第三Fab分子係習知Fab分子且較佳與第一Fab分子相同)，及圖1J及圖1N (替代實施例，其中第三Fab分子係互換型Fab分子且較佳與第二Fab分子相同)中。第一及第三Fab分子可與Fc域直接融合或經由肽連接子融合。在一特定實施例中，第一及第三Fab分子各自經由免疫球蛋白鉸鏈區與Fc域融合。在一特定實施例中，免疫球蛋白鉸鏈區係人類IgG1 鉸鏈區，Fc域係IgG1 Fc域之情況下尤其如此。視情況，第一Fab分子之Fab輕鏈與第二Fab分子之Fab輕鏈可另外彼此融合。
在Fab分子在Fab重鏈C端經由免疫球蛋白鉸鏈區與Fc域之亞單元中之各者之N端融合之抗體之組態中，兩種Fab分子，鉸鏈區及Fc域基本上形成免疫球蛋白分子。在一特定實施例中，免疫球蛋白分子係IgG類免疫球蛋白。在一更特定實施例中，免疫球蛋白係IgG1 亞類免疫球蛋白。在另一個實施例中，免疫球蛋白係IgG4 亞類免疫球蛋白。在另一特定實施例中，免疫球蛋白係人類免疫球蛋白。在其他實施例中，免疫球蛋白係嵌合免疫球蛋白或人類化免疫球蛋白。
在一些抗體中，第一Fab分子之Fab輕鏈及第二Fab分子之Fab輕鏈視情況經由肽連接子彼此融合。視第一及第二Fab分子之組態而定，第一Fab分子之Fab輕鏈可其C端與第二Fab分子之Fab輕鏈N端融合，或第二Fab分子之Fab輕鏈可在其C端與第一Fab分子之Fab輕鏈N端融合。第一及第二Fab分子之Fab輕鏈之融合進一步減少不匹配Fab重鏈及輕鏈之錯配，且亦減少表現一些抗體所需之質體數目。
在某些實施例中，抗體包含其中第二Fab分子之Fab輕鏈可變區與第二Fab分子之Fab重鏈恆定區共有羧基端肽鍵(亦即第二Fab分子包含互換型Fab重鏈，其中重鏈可變區經輕鏈可變區置換)、該第二Fab分子之Fab重鏈恆定區又與Fc域亞單元共有羧基端肽鍵之多肽(VL( 2 ) -CH1( 2 ) -CH2-CH3(-CH4))，及其中第一Fab分子之Fab重鏈與Fc域亞單元共有羧基端肽鍵之多肽(VH( 1 ) -CH1( 1 ) -CH2-CH3(-CH4))。在一些實施例中，抗體進一步包含其中第二Fab分子之Fab重鏈可變區與第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區共有羧基端肽鍵之多肽(VH( 2 ) -CL( 2 ) )，及第一Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL( 1 ) -CL( 1 ) )。在某些實施例中，多肽例如藉由二硫鍵共價連接。
在某些實施例中，抗體包含其中第二Fab分子之Fab重鏈可變區與第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區共有羧基端肽鍵(亦即第二Fab分子包含互換型Fab重鏈，其中重鏈恆定區經輕鏈恆定區置換)、該第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區又與Fc域亞單元共有羧基端肽鍵之多肽(VH( 2 ) -CL( 2 ) -CH2-CH3(-CH4))，及其中第一Fab分子之Fab重鏈與Fc域亞單元共有羧基端肽鍵之多肽(VH( 1 ) -CH1( 1 ) -CH2-CH3(-CH4))。在一些實施例中，抗體進一步包含其中第二Fab分子之Fab輕鏈可變區與第二Fab分子之Fab重鏈恆定區共有羧基端肽鍵之多肽(VL( 2 ) -CH1( 2 ) )，及第一Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL( 1 ) -CL( 1 ) )。在某些實施例中，多肽例如藉由二硫鍵共價連接。
在一些實施例中，抗體包含其中第二Fab分子之Fab輕鏈可變區與第二Fab分子之Fab重鏈恆定區共有羧基端肽鍵(亦即第二Fab分子包含互換型Fab重鏈，其中重鏈可變區經輕鏈可變區置換)，該第二Fab分子之Fab重鏈恆定區又與第一Fab分子之Fab重鏈共有羧基端肽鍵，該第一Fab分子之Fab重鏈又與Fc域亞單元共有羧基端肽鍵之多肽(VL( 2 ) -CH1( 2 ) -VH( 1 ) -CH1( 1 ) -CH2-CH3(-CH4))。在其他實施例中，抗體包含其中第一Fab分子之Fab重鏈與第二Fab分子之Fab輕鏈可變區共有羧基端肽鍵，該第二Fab分子之Fab輕鏈可變區又與第二Fab分子之Fab重鏈恆定區共有羧基端肽鍵(亦即第二Fab分子包含互換型Fab重鏈，其中重鏈可變區經輕鏈可變區置換)，該第二Fab分子之Fab重鏈恆定區又與Fc域亞單元共有羧基端肽鍵之多肽(VH( 1 ) -CH1( 1 ) -VL( 2 ) -CH1( 2 ) -CH2-CH3(-CH4))。
在一些此等實施例中，抗體進一步包含其中第二Fab分子之Fab重鏈可變區與第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區共有羧基端肽鍵之第二Fab分子之互換型Fab輕鏈多肽(VH( 2 ) -CL( 2 ) )及第一Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL( 1 ) -CL( 1 ) )。在其他此等實施例中，適當時抗體進一步包含其中第二Fab分子之Fab重鏈可變區與第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區共有羧基端肽鍵，該第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區又與第一Fab分子之Fab輕鏈多肽共有羧基端肽鍵之多肽(VH( 2 ) -CL( 2 ) -VL( 1 ) -CL( 1 ) )，或其中第一Fab分子之Fab輕鏈多肽與第二Fab分子之Fab重鏈可變區共有羧基端肽鍵，該第二Fab分子之Fab重鏈可變區又與第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區共有羧基端肽鍵之多肽(VL( 1 ) -CL( 1 ) -VH( 2 ) -CL( 2 ) )。
根據此等實施例之抗體可進一步包含(i)Fc域亞單元多肽(CH2-CH3(-CH4))或(ii)第三Fab分子之Fab重鏈與Fc域亞單元共有羧基端肽鍵之多肽(VH( 3 ) -CH1( 3 ) -CH2-CH3(-CH4))及第三Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL( 3 ) -CL( 3 ) )。在某些實施例中，多肽例如藉由二硫鍵共價連接。
在一些實施例中，抗體包含其中第二Fab分子之Fab重鏈可變區與第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區共有羧基端肽鍵(亦即第二Fab分子包含互換型Fab重鏈，其中重鏈可變區經輕鏈恆定區置換)，該第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區又與第一Fab分子之Fab重鏈共有羧基端肽鍵，該第一Fab分子之Fab重鏈又與Fc域亞單元共有羧基端肽鍵之多肽(VH( 2 ) -CL( 2 ) -VH( 1 ) -CH1( 1 ) -CH2-CH3(-CH4))。在其他實施例中，抗體包含其中第一Fab分子之Fab重鏈與第二Fab分子之Fab重鏈可變區共有羧基端肽鍵，該第二Fab分子之Fab重鏈可變區又與第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區共有羧基端肽鍵(亦即第二Fab分子包含互換型Fab重鏈，其中重鏈恆定區經輕鏈恆定區置換)，該第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區又與Fc域亞單元共有羧基端肽鍵之多肽(VH( 1 ) -CH1( 1 ) -VH( 2 ) -CL( 2 ) -CH2-CH3(-CH4))。
在一些此等實施例中，抗體進一步包含其中第二Fab分子之Fab輕鏈可變區與第二Fab分子之Fab重鏈恆定區共有羧基端肽鍵之第二Fab分子之互換型Fab輕鏈多肽(VL( 2 ) -CH1( 2 ) )及第一Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL( 1 ) -CL( 1 ) )。在其他此等實施例中，適當時抗體進一步包含其中第二Fab分子之Fab輕鏈可變區與第二Fab分子之Fab重鏈恆定區共有羧基端肽鍵，該第二Fab分子之Fab重鏈恆定區又與第一Fab分子之Fab輕鏈多肽共有羧基端肽鍵之多肽(VL( 2 ) -CH1( 2 ) -VL( 1 ) -CL( 1 ) )，或其中第一Fab分子之Fab輕鏈多肽與第二Fab分子之Fab重鏈可變區共有羧基端肽鍵，該第二Fab分子之Fab重鏈可變區又與第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區共有羧基端肽鍵之多肽(VL( 1 ) -CL( 1 ) -VH( 2 ) -CL( 2 ) )。
根據此等實施例之抗體可進一步包含(i)Fc域亞單元多肽(CH2-CH3(-CH4))或(ii)第三Fab分子之Fab重鏈與Fc域亞單元共有羧基端肽鍵之多肽(VH( 3 ) -CH1( 3 ) -CH2-CH3(-CH4))及第三Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL( 3 ) -CL( 3 ) )。在某些實施例中，多肽例如藉由二硫鍵共價連接。
在一些實施例中，第一Fab分子在Fab重鏈C端與第二Fab分子之Fab重鏈N端融合。在某些此類實施例中，抗體不包含Fc域。在某些實施例中，抗體基本上由第一及第二Fab分子及視情況存在之一或多個肽連接子組成，其中第一Fab分子在Fab重鏈C端與第二Fab分子之Fab重鏈N端融合。此組態示意性地描繪於圖1O及1S中。
在其他實施例中，第二Fab分子在Fab重鏈C末端與第一Fab分子Fab重鏈N末端融合。在某些此類實施例中，抗體不包含Fc域。在某些實施例中，抗體基本上由第一及第二Fab分子及視情況存在之一或多個肽連接子組成，其中第二Fab分子在Fab重鏈C端與第一Fab分子之Fab重鏈N端融合。此類組態示意性地描繪於圖1P及1T中。
在一些實施例中，第一Fab分子在Fab重鏈C端與第二Fab分子之Fab重鏈N端融合，且抗體進一步包含第三Fab分子，其中該第三Fab分子在Fab重鏈之C端與第一Fab分子之Fab重鏈N端融合。在特定的此類實施例中，該第三Fab分子係習知Fab分子。在其他此類實施例中，該第三Fab分子係如本文所描述之互換型Fab分子，亦即其中Fab重鏈及輕鏈之可變域VH及VL或恆定域CL及CH1 Fab分子彼此交換/置換。在某些此類實施例中，抗體基本上由第一、第二及第三Fab分子及視情況存在之一或多個肽連接子組成，其中第一Fab分子在Fab重鏈C端與第二Fab分子之Fab重鏈N端融合，且第三Fab分子在Fab重鏈C端與第一Fab分子之Fab重鏈N端融合。此類組態示意性地描繪於圖1Q及1U中(特定實施例，其中第三Fab分子為習知Fab分子且較佳與第一Fab分子相同)。
在一些實施例中，第一Fab分子在Fab重鏈C端與第二Fab分子之Fab重鏈N端融合，且抗體進一步包含第三Fab分子，其中該第三Fab分子在Fab重鏈N端與第二Fab分子之Fab重鏈C端融合。在特定此類實施例中，該第三Fab分子係如本文所描述之互換型Fab分子，亦即其中Fab重鏈及輕鏈之可變域VH及VL或恆定域CH1及CL之Fab分子彼此交換/置換。在其他此類實施例中，該第三Fab分子係習知Fab分子。在某些此類實施例中，抗體基本上由第一、第二及第三Fab分子及視情況存在之一或多個肽連接子組成，其中第一Fab分子在Fab重鏈C端與第二Fab分子之Fab重鏈N端融合，且第三Fab分子在Fab重鏈N端與第一Fab分子之Fab重鏈C端融合。此組態示意性地描繪於圖1W及1Y中(特定實施例，其中第三Fab分子係互換型Fab分子且較佳與第二Fab分子相同)。
在一些實施例中，第二Fab分子在Fab重鏈C端與第一Fab分子之Fab重鏈N端融合，且抗體進一步包含第三Fab分子，其中該第三Fab分子在Fab重鏈N端與第一Fab分子之Fab重鏈C端融合。在特定的此類實施例中，該第三Fab分子係習知Fab分子。在其他此類實施例中，該第三Fab分子係如本文所描述之互換型Fab分子，亦即Fab重鏈及輕鏈之可變域VH及VL或恆定域CH1及CL Fab分子彼此交換/置換。在某些此類實施例中，抗體基本上由第一、第二及第三Fab分子及視情況存在之一或多個肽連接子組成，其中第二Fab分子在Fab重鏈C端與第一Fab分子之Fab重鏈N端融合，且第三Fab分子在Fab重鏈N端與第一Fab分子之Fab重鏈C端融合。此類組態示意性地描繪於圖1R及1V中(特定實施例，其中第三Fab分子係習知Fab分子且較佳與第一Fab分子相同)。
在一些實施例中，第二Fab分子在Fab重鏈C端與第一Fab分子之Fab重鏈N端融合，且抗體進一步包含第三Fab分子，其中該第三Fab分子在Fab重鏈C端與第二Fab分子之Fab重鏈N端融合。在特定此類實施例中，該第三Fab分子係如本文所描述之互換型Fab分子，亦即其中Fab重鏈及輕鏈之可變域VH及VL或恆定域CH1及CL之Fab分子彼此交換/置換。在其他此類實施例中，該第三Fab分子係習知Fab分子。在某些此類實施例中，抗體基本上由第一、第二及第三Fab分子及視情況存在之一或多個肽連接子組成，其中第二Fab分子在Fab重鏈C端與第一Fab分子之Fab重鏈N端融合，且第三Fab分子在Fab重鏈C端與第二Fab分子之Fab重鏈N端融合。此類組態示意性地描繪於圖1X及1Z中(特定實施例，其中第三Fab分子係互換型Fab分子且較佳與第一Fab分子相同)。
在某些實施例中，抗體包含其中第一Fab分子之Fab重鏈與第二Fab分子之Fab輕鏈可變區共有羧基端肽鍵，該第二Fab分子之Fab輕鏈可變區又與第二Fab分子之Fab重鏈恆定區共有羧基端肽鍵(亦即第二Fab分子包含互換型Fab重鏈，其中重鏈可變區經輕鏈可變區置換)之多肽(VH( 1 ) -CH1( 1 ) -VL( 2 ) -CH1( 2 ) )。在一些實施例中，抗體進一步包含其中第二Fab分子之Fab重鏈可變區與第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區共有羧基端肽鍵之多肽(VH( 2 ) -CL( 2 ) )，及第一Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL( 1 ) -CL( 1 ) )。
在某些實施例中，抗體包含其中第二Fab分子之Fab輕鏈與第二Fab分子之Fab重鏈恆定區共有羧基端肽鍵(亦即第二Fab分子包含互換型Fab重鏈，其中重鏈可變區經輕鏈可變區置換)，該第二Fab分子之Fab重鏈恆定區又與第一Fab分子之Fab重鏈共有羧基端肽鍵之多肽(VL( 2 ) -CH1( 2 ) -VH( 1 ) -CH1( 1 ) )。在一些實施例中，抗體進一步包含其中第二Fab分子之Fab重鏈可變區與第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區共有羧基端肽鍵之多肽(VH( 2 ) -CL( 2 ) )，及第一Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL( 1 ) -CL( 1 ) )。
在某些實施例中，抗體包含其中第二Fab分子之Fab重鏈與第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區共有羧基端肽鍵(亦即第二Fab分子包含互換型Fab重鏈，其中重鏈恆定區經輕鏈恆定區置換)，該第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區又與第一Fab分子之Fab重鏈共有羧基端肽鍵之多肽(VH( 2 ) -CL( 2 ) -VH( 1 ) -CH1( 1 ) )。在一些實施例中，抗體進一步包含其中第二Fab分子之Fab輕鏈可變區與第二Fab分子之Fab重鏈恆定區共有羧基端肽鍵之多肽(VL( 2 ) -CH1( 2 ) )，及第一Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL( 1 ) -CL( 1 ) )。
在某些實施例中，抗體包含其中第三Fab分子之Fab重鏈與第一Fab分子之Fab重鏈共有羧基端肽鍵，該第一Fab分子之Fab重鏈又與第二Fab分子之Fab輕鏈可變區共有羧基端肽鍵，該第二Fab分子之Fab輕鏈可變區又與第二Fab分子之Fab重鏈恆定區共有羧基端肽鍵(亦即第二Fab分子包含互換型Fab重鏈，其中重鏈可變區經輕鏈可變區置換)之多肽(VH( 3 ) -CH1( 3 ) -VH( 1 ) -CH1( 1 ) -VL( 2 ) -CH1( 2 ) )。在一些實施例中，抗體進一步包含其中第二Fab分子之Fab重鏈可變區與第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區共有羧基端肽鍵之多肽(VH( 2 ) -CL( 2 ) )，及第一Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL( 1 ) -CL( 1 ) )。在一些實施例中，抗體進一步包含第三Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL( 3 ) -CL( 3 ) )。
在某些實施例中，抗體包含其中第三Fab分子之Fab重鏈與第一Fab分子之Fab重鏈共有羧基端肽鍵，該第一Fab分子之Fab重鏈又與第二Fab分子之Fab重鏈可變區共有羧基端肽鍵，該第二Fab分子之Fab重鏈可變區又與第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區共有羧基端肽鍵(亦即第二Fab分子包含互換型Fab重鏈，其中重鏈恆定區經輕鏈恆定區置換)之多肽(VH( 3 ) -CH1( 3 ) -VH( 1 ) -CH1( 1 ) -VH( 2 ) -CL( 2 ) )。在一些實施例中，抗體進一步包含其中第二Fab分子之Fab輕鏈可變區與第二Fab分子之Fab重鏈恆定區共有羧基端肽鍵之多肽(VL( 2 ) -CH1( 2 ) )，及第一Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL( 1 ) -CL( 1 ) )。在一些實施例中，抗體進一步包含第三Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL( 3 ) -CL( 3 ) )。
在某些實施例中，抗體包含其中第二Fab分子之Fab輕鏈可變區與第二Fab分子之Fab重鏈恆定區共有羧基端肽鍵(亦即第二Fab分子包含互換型Fab重鏈，其中重鏈可變區經輕鏈可變區置換)，該第二Fab分子之Fab重鏈恆定區又與第一Fab分子之Fab重鏈共有羧基端肽鍵，該第一Fab分子之Fab重鏈又與第三Fab分子之Fab重鏈共有羧基端肽鍵之多肽(VL( 2 ) -CH1( 2 ) -VH( 1 ) -CH1( 1 ) -VH( 3 ) -CH1( 3 ) )。在一些實施例中，抗體進一步包含其中第二Fab分子之Fab重鏈可變區與第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區共有羧基端肽鍵之多肽(VH( 2 ) -CL( 2 ) )，及第一Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL( 1 ) -CL( 1 ) )。在一些實施例中，抗體進一步包含第三Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL( 3 ) -CL( 3 ) )。
在某些實施例中，抗體包含其中第二Fab分子之Fab重鏈可變區與第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區共有羧基端肽鍵(亦即第二Fab分子包含互換型Fab重鏈，其中重鏈恆定區經輕鏈恆定區置換)，該第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區又與第一Fab分子之Fab重鏈共有羧基端肽鍵，該第一Fab分子之Fab重鏈又與第三Fab分子之Fab重鏈共有羧基端肽鍵之多肽(VH( 2 ) -CL( 2 ) -VH( 1 ) -CH1( 1 ) -VH( 3 ) -CH1( 3 ) )。在一些實施例中，抗體進一步包含其中第二Fab分子之Fab輕鏈可變區與第二Fab分子之Fab重鏈恆定區共有羧基端肽鍵之多肽(VL( 2 ) -CH1( 2 ) )，及第一Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL( 1 ) -CL( 1 ) )。在一些實施例中，抗體進一步包含第三Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL( 3 ) -CL( 3 ) )。
在某些實施例中，抗體包含其中第一Fab分子之Fab重鏈與第二Fab分子之Fab輕鏈可變區共有羧基端肽鍵，該第二Fab分子之Fab輕鏈可變區又與第二Fab分子之Fab重鏈恆定區共有羧基端肽鍵(亦即第二Fab分子包含互換型Fab重鏈，其中重鏈可變區經輕鏈可變區置換)，該第二Fab分子之Fab重鏈恆定區又與第三Fab分子之Fab輕鏈可變區共有羧基端肽鍵，該第三Fab分子之Fab輕鏈可變區又與第三Fab分子之Fab重鏈恆定區共有羧基端肽鍵(亦即第三Fab分子包含互換型Fab重鏈，其中重鏈可變區經輕鏈可變區置換)之多肽(VH( 1 ) -CH1( 1 ) -VL( 2 ) -CH1( 2 ) -VL( 3 ) -CH1( 3 ) )。在一些實施例中，抗體進一步包含其中第二Fab分子之Fab重鏈可變區與第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區共有羧基端肽鍵之多肽(VH( 2 ) -CL( 2 ) )，及第一Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL( 1 ) -CL( 1 ) )。在一些實施例中，抗體進一步包含其中第三Fab分子之Fab重鏈可變區與第三Fab分子之Fab輕鏈恆定區共有羧基端肽鍵之多肽(VH( 3 ) -CL( 3 ) )。
在某些實施例中，抗體包含其中第一Fab分子之Fab重鏈與第二Fab分子之Fab重鏈可變區共有羧基端肽鍵，該第二Fab分子之Fab重鏈可變區又與第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區共有羧基端肽鍵(亦即第二Fab分子包含互換型Fab重鏈，其中重鏈恆定區經輕鏈恆定區置換)，該第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區又與第三Fab分子之Fab重鏈可變區共有羧基端肽鍵，該第三Fab分子之Fab重鏈可變區又與第三Fab分子之Fab輕鏈恆定區共有羧基端肽鍵(亦即第三Fab分子包含互換型Fab重鏈，其中重鏈恆定區經輕鏈恆定區置換)之多肽(VH( 1 ) -CH1( 1 ) -VH( 2 ) -CL( 2 ) -VH( 3 ) -CL( 3 ) )。在一些實施例中，抗體進一步包含其中第二Fab分子之Fab輕鏈可變區與第二Fab分子之Fab重鏈恆定區共有羧基端肽鍵之多肽(VL( 2 ) -CH1( 2 ) )，及第一Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL( 1 ) -CL( 1 ) )。在一些實施例中，抗體進一步包含其中第三Fab分子之Fab輕鏈可變區與第三Fab分子之Fab重鏈恆定區共有羧基端肽鍵之多肽(VL( 3 ) -CH1( 3 ) )。
在某些實施例中，抗體包含其中第三Fab分子之Fab輕鏈可變區與第三Fab分子之Fab重鏈恆定區共有羧基端肽鍵(亦即第三Fab分子包含互換型Fab重鏈，其中重鏈可變區經輕鏈可變區置換)，該第三Fab分子之Fab重鏈恆定區又與第二Fab分子之Fab輕鏈可變區共有羧基端肽鍵，該第二Fab分子之Fab輕鏈可變區又與第二Fab分子之Fab重鏈恆定區共有羧基端肽鍵(亦即第二Fab分子包含互換型Fab重鏈，其中重鏈可變區經輕鏈可變區置換)，該第二Fab分子之Fab重鏈恆定區又與第一Fab分子之Fab重鏈共有羧基端肽鍵之多肽(VL( 3 ) -CH1( 3 ) -VL( 2 ) -CH1( 2 ) -VH( 1 ) -CH1( 1 ) )。在一些實施例中，抗體進一步包含其中第二Fab分子之Fab重鏈可變區與第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區共有羧基端肽鍵之多肽(VH( 2 ) -CL( 2 ) )，及第一Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL( 1 ) -CL( 1 ) )。在一些實施例中，抗體進一步包含其中第三Fab分子之Fab重鏈可變區與第三Fab分子之Fab輕鏈恆定區共有羧基端肽鍵之多肽(VH( 3 ) -CL( 3 ) )。
在某些實施例中，抗體包含其中第三Fab分子之Fab重鏈可變區與第三Fab分子之Fab輕鏈恆定區共有羧基端肽鍵(亦即第三Fab分子包含互換型Fab重鏈，其中重鏈恆定區經輕鏈恆定區置換)，該第三Fab分子之Fab輕鏈恆定區又與第二Fab分子之Fab重鏈可變區共有羧基端肽鍵，該第二Fab分子之Fab重鏈可變區又與第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區共有羧基端肽鍵(亦即第二Fab分子包含互換型Fab重鏈，其中重鏈恆定區經輕鏈恆定區置換)，該第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區又與第一Fab分子之Fab重鏈共有羧基端肽鍵(VH( 3 ) -CL( 3 ) -VH( 2 ) -CL( 2 ) -VH( 1 ) -CH1( 1 ) )。在一些實施例中，抗體進一步包含其中第二Fab分子之Fab輕鏈可變區與第二Fab分子之Fab重鏈恆定區共有羧基端肽鍵之多肽(VL( 2 ) -CH1( 2 ) )，及第一Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL( 1 ) -CL( 1 ) )。在一些實施例中，抗體進一步包含其中第三Fab分子之Fab輕鏈可變區與第三Fab分子之Fab重鏈恆定區共有羧基端肽鍵之多肽(VL( 3 ) -CH1( 3 ) )。
根據以上實施例中之任一者，抗體之組分(例如Fab分子、Fc域)可直接或經由本文所述或此項技術中已知的各種連接子、尤其包含一或多個胺基酸、通常約2-20個胺基酸之肽連接子融合。適合的非免疫原性肽連接子包括例如(G4 S)n 、(SG4 )n 、(G4 S)n 或G4 (SG4 )n 肽連接子，其中n一般係整數1至10，通常係2至4。
Fc 域 包含於治療劑中之抗體，例如雙特異性抗體可包含由包含抗體分子之重鏈域之多肽鏈對組成之Fc域。舉例而言，免疫球蛋白G (IgG)分子之Fc域係二聚體，其中各亞單元包含CH2及CH3 IgG重鏈恆定域。Fc域之兩個亞單元能夠彼此穩定結合。
在一個實施例中，Fc域係IgG Fc域。在一特定實施例中，Fc域係IgG1 Fc域。在另一實施例中，Fc域係IgG4 Fc域。在一更特定實施例中，Fc域係包含位置S228 (Kabat編號)之胺基酸取代(尤其胺基酸取代S228P)的IgG4 Fc域。此胺基酸取代減少活體內IgG4 抗體之Fab臂交換(參見Stubenrauch等人, Drug Metabolism and Disposition 38, 84-91 (2010))。在另一特定實施例中，Fc域係人類Fc域。人類IgG1 Fc區之例示性序列以SEQ ID NO: 94給出。
(i) 促進雜二聚化之 Fc 域 修飾 包含於治療劑中之抗體，尤其雙特異性抗體可包含融合至Fc域之兩個亞單元中之一者或另一者之不同組分(例如抗原結合域)，因此Fc域之兩個亞單元通常包含於兩個不相同多肽鏈中。此等多肽之重組共表現及後續二聚化引起兩種多肽之若干種可能的組合。為改良重組製造中之此類抗體之產率及純度，因此將促進所需多肽之締合的修飾引入抗體之Fc域中將為有利的。
因此，在特定實施例中，Fc域包含促進Fc域之第一及第二亞單元之締合的修飾。人類IgG Fc域中之兩個亞單元之間最廣泛蛋白質-蛋白質相互作用的位點存在於Fc域之CH3域中。因此，在一個實施例中，該修飾存在於Fc域之CH3域中。
存在若干種修飾Fc域之CH3域以加強雜二聚化之方法，其充分描述例如於WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012058768、WO 2013157954、WO 2013096291中。通常，在所有此類方法中，Fc域之第一亞單元之CH3域與Fc域之第二亞單元之CH3域均以互補方式經工程改造，以使得各CH3域(或包含其之重鏈)本身不再發生均二聚，而是被迫與以互補方式經工程改造之另一CH3域雜二聚(以使得第一與第二CH3域發生雜二聚且兩個第一或兩個第二CH3域之間不形成均二聚體)。涵蓋此等改良之重鏈雜二聚化之不同方法組合減少輕鏈錯配及本斯-瓊斯型副產物(Bence Jones-type side product)之重鏈-輕鏈修飾(例如Fab臂中之可變或恆定區交換/置換，或引入帶電胺基酸之取代，在CH1/CL界面中具有相反電荷))作為不同替代。
在一特定實施例中，促進Fc域之第一及第二亞單元結合之該修飾係所謂的「臼包杵」型修飾，包含發生於Fc域之兩個亞單元中之一者中的「杵」型修飾及發生於Fc域之兩個亞單元之另一者中的「臼」型修飾。
臼包杵技術描述於例如US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway等人, Prot Eng 9, 617-621 (1996)及Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)中。一般而言，方法涉及在第一多肽之界面處引入隆凸(「杵」)及在第二多肽之界面處引入相應凹穴(「臼」)，使得隆凸可定位於凹穴中以便促進雜二聚體形成且阻礙均二聚體形成。隆凸藉由用較大側鏈(例如酪胺酸或色胺酸)置換第一多肽界面中之小胺基酸側鏈來構築。大小與隆凸相同或類似之補償性空腔藉由用較小胺基酸側鏈(例如丙胺酸或蘇胺酸)置換大胺基酸側鏈而形成於第二多肽之界面中。
因此，在一特定實施例中，在Fc域之第一亞單元之CH3域中，胺基酸殘基經具有較大側鏈體積之胺基酸殘基置換，由此在第一亞單元之CH3域內產生可定位於第二亞單元之CH3域內之空腔中的隆凸，且在Fc域之第二亞單元之CH3域中，胺基酸殘基經具有較小側鏈體積之胺基酸殘基置換，由此在第二亞單元之CH3域內產生第一亞單元之CH3域內之隆凸可定位於其中的空腔。
較佳地，具有較大側鏈體積之該胺基酸殘基選自由精胺酸(R)、***酸(F)、酪胺酸(Y)及色胺酸(W)組成之群。
較佳地，具有較小側鏈體積之該胺基酸殘基選自由丙胺酸(A)、絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)及纈胺酸(V)組成之群。
隆凸及空腔可藉由改變編碼多肽之核酸，例如藉由定點突變誘發或藉由肽合成產生。
在一特定實施例中，在Fc域之第一亞單元(「杵」亞單元)之CH3域中，位置366之蘇胺酸殘基經色胺酸殘基置換(T366W)，且在Fc域之第二亞單元(「臼」亞單元)之CH3域中，位置407之酪胺酸殘基經纈胺酸殘基置換(Y407V)。在一個實施例中，在Fc域之第二亞單元中，另外，位置366之蘇胺酸殘基經絲胺酸殘基置換(T366S)且位置368之白胺酸殘基經丙胺酸殘基置換(L368A)(根據Kabat EU索引編號)。
在又另一個實施例中，在Fc域之第一亞單元中，另外，位置354之絲胺酸殘基經半胱胺酸殘基置換(S354C)或位置356之麩胺酸殘基經半胱胺酸殘基置換(E356C)，且在Fc域之第二亞單元中，另外，位置349之酪胺酸殘基經半胱胺酸殘基置換(Y349C)(根據Kabat EU索引編號)。引入此等兩個半胱胺酸殘基使得Fc域之兩個亞單元之間形成二硫橋鍵，使二聚體進一步穩定(Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001))。
在一特定實施例中，Fc域之第一亞單元包含胺基酸取代S354C及T366W，且Fc域之第二亞單元包含胺基酸取代Y349C、T366S、L368A及Y407V (根據Kabat EU索引編號)。
在一特定實施例中，本文所述之CD3抗原結合部分與Fc域之第一亞單元融合(包含「杵」修飾)。不希望受理論束縛，CD3抗原結合部分與Fc域之含杵亞單元之融合將(進一步)使包含兩種CD3抗原結合部分之雙特異性抗體的產生降至最低(兩種含杵多肽發生空間位阻)。
涵蓋用於加強雜二聚化之CH3修飾之其他技術作為根據本發明之替代，且描述例如於WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012/058768、WO 2013/157954、WO 2013/096291中。
在一個實施例中，替代地使用EP 1870459 A1中所述之雜二聚化方法。此方法係基於在Fc域之兩個亞單元之間的CH3/CH3域界面中的特定胺基酸位置引入具有相反電荷之帶電胺基酸。一個較佳實施例係(Fc域之)兩個CH3域中之一者中之胺基酸突變R409D；K370E，及Fc域之CH3域中之另一者中之胺基酸突變D399K；E357K(根據Kabat EU索引編號)。
在另一實施例中，抗體包含Fc域之第一亞單元之CH3域中之胺基酸突變T366W，及Fc域之第二亞單元之CH3域中之胺基酸突變T366S、L368A、Y407V，及另外Fc域之第一亞單元之CH3域中之胺基酸突變R409D、K370E及Fc域之第二亞單元之CH3域中之胺基酸突變D399K、E357K(根據Kabat EU索引編號)。
在另一實施例中，抗體包含Fc域之第一亞單元之CH3域中的胺基酸突變S354C、T366W及Fc域之第二亞單元之CH3域中的胺基酸突變Y349C、T366S、L368A、Y407V，或抗體包含Fc域之第一亞單元之CH3域中的胺基酸突變Y349C、T366W及Fc域之第二亞單元之CH3域中的胺基酸突變S354C、T366S、L368A、Y407V，以及另外Fc域之第一亞單元之CH3域中的胺基酸突變R409D、K370E及Fc域之第二亞單元之CH3域中的胺基酸突變D399K、E357K (所有均根據Kabat EU索引編號)。
在一個實施例中，替代地使用WO 2013/157953中所述之雜二聚化方法。在一個實施例中，第一CH3域包含胺基酸突變T366K且第二CH3域包含胺基酸突變L351D (根據Kabat EU索引編號)。在另一實施例中，第一CH3域進一步包含胺基酸突變L351K。在另一實施例中，第二CH3域進一步包含選自Y349E、Y349D及L368E之胺基酸突變(較佳係L368E) (根據Kabat EU索引編號)。
在一個實施例中，替代地使用WO 2012/058768中所述之雜二聚化方法。在一個實施例中，第一CH3域包含胺基酸突變L351Y、Y407A且第二CH3域包含胺基酸突變T366A、K409F。在另一實施例中，第二CH3域包含位置T411、D399、S400、F405、N390或K392之另一胺基酸突變，例如選自以下之胺基酸突變：a) T411N、T411R、T411Q、T411K、T411D、T411E或T411W；b) D399R、D399W、D399Y或D399K；c) S400E、S400D、S400R或S400K；d) F405I、F405M、F405T、F405S、F405V或F405W；e) N390R、N390K或N390D；f) K392V、K392M、K392R、K392L、K392F或K392E (根據Kabat EU索引編號)。在另一實施例中，第一CH3域包含胺基酸突變L351Y、Y407A且第二CH3域包含胺基酸突變T366V、K409F。在另一實施例中，第一CH3域包含胺基酸突變Y407A且第二CH3域包含胺基酸突變T366A、K409F。在另一實施例中，第二CH3域進一步包含胺基酸突變K392E、T411E、D399R及S400R (根據Kabat EU索引編號)。
在一個實施例中，或者使用WO 2011/143545中所述之雜二聚化方法，例如有選自由368及409組成之群的位置之胺基酸修飾(根據Kabat EU索引編號)。
在一個實施例中，替代地使用WO 2011/090762中所述之雜二聚化方法，其亦使用上述臼包杵技術。在一個實施例中，第一CH3域包含胺基酸突變T366W且第二CH3域包含胺基酸突變Y407A。在一個實施例中，第一CH3域包含胺基酸突變T366Y且第二CH3域包含胺基酸突變Y407T (根據Kabat EU索引編號)。
在一個實施例中抗體或其Fc域屬於IgG2 亞類，且或者使用WO 2010/129304中所述之雜二聚化方法。
在一替代實施例中，促進Fc域之第一及第二亞單元之締合的修飾包含調節靜電操控效應之修飾，例如PCT公開案WO 2009/089004中所描述。一般而言，此方法涉及用帶電胺基酸殘基置換兩個Fc域子單元之界面處之一或多個胺基酸殘基，使得均二聚體形成變成在靜電上不利的，但雜二聚化在靜電上為有利的。在一個此類實施例中，第一CH3域包含帶負電胺基酸(例如麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)，較佳K392D或N392D)對K392或N392發生的胺基酸取代且第二CH3域包含帶正電胺基酸(例如離胺酸(K)或精胺酸(R)，較佳D399K、E356K、D356K或E357K，且更佳D399K及E356K)對D399、E356、D356或E357發生的胺基酸取代。在另一實施例中，第一CH3域進一步包含帶負電胺基酸(例如麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)，較佳K409D或R409D)對K409或R409發生的胺基酸取代。在另一實施例中，第一CH3域進一步或替代地包含帶負電胺基酸(例如麩胺酸(E)或天冬胺酸(D))對K439及/或K370實現的胺基酸取代(所有編號均根據Kabat EU索引)。
在又另一實施例中，替代地使用WO 2007/147901中所述之雜二聚化方法。在一個實施例中，第一CH3域包含胺基酸突變K253E、D282K及K322D且第二CH3域包含胺基酸突變D239K、E240K及K292D (根據Kabat EU索引編號)。
在再另一實施例中，可替代地使用WO 2007/110205中所述之雜二聚化方法。
在一個實施例中，Fc域之第一亞單元包含胺基酸取代K392D及K409D，且Fc域之第二亞單元包含胺基酸取代D356K及D399K (根據Kabat EU索引編號)。
(ii) 降低 Fc 受體結合及 / 或效應功能之 Fc 域 修飾 Fc域賦予抗體(諸如雙特異性抗體)有利的藥物動力學特性，包括長血清半衰期，其有助於良好聚集於目標組織中及有利的組織-血液分佈率。然而，其可能同時引起抗體對表現Fc受體之細胞而非較佳帶有抗原之細胞的非所需靶向。此外，Fc受體信號傳導路徑之共活化可引起細胞介素釋放，細胞介素釋放與抗體可具有之其他免疫刺激特性及抗體之長半衰期組合，導致全身性投藥後的細胞介素受體過度活化及重度副作用。
因此，在特定實施例中，抗體、尤其雙特異性抗體之Fc域與原生IgG1 Fc域相比展現降低之對Fc受體的結合親和力及/或降低之效應功能。在一個此類實施例中，Fc域(或包含該Fc域之分子，例如抗體)展現與原生IgG1 Fc域(或包含原生IgG1 Fc域之對應分子)相比小於50%、較佳小於20%、更佳小於10%且最佳小於5%之對Fc受體之結合親和力，及/或與原生IgG1 Fc域(或包含原生IgG1 Fc域之對應分子)相比小於50%、較佳小於20%、更佳小於10%且最佳小於5%之效應功能。在一個實施例中，Fc域(或包含該Fc域之分子，例如抗體)基本上不結合至Fc受體及/或誘導效應功能。在一特定實施例中，Fc受體係Fcγ受體。在一個實施例中，Fc受體係人類Fc受體。在一個實施例中，Fc受體係活化Fc受體。在一特定實施例中，Fc受體係活化人類Fcγ受體，更特定言之人類FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最特定言之人類FcγRIIIa。在一個實施例中，效應功能係選自CDC、ADCC、ADCP及細胞介素分泌之群的一或多者。在一特定實施例中，效應功能係ADCC。在一個實施例中，與原生IgG1 Fc域相比，Fc域對新生兒Fc受體(FcRn)展現實質上類似的結合親和力。當Fc域(或包含該Fc域之分子，例如抗體)展現大於約70%、尤其大於約80%、更尤其大於約90%之原生IgG1 Fc域(或包含原生IgG1 Fc域之對應分子)對FcRn之結合親和力時，實現與FcRn之實質上類似的結合。
在某些實施例中，相較於未經工程改造之Fc域，Fc域經工程改造具有降低之對Fc受體的結合親和力及/或降低之效應功能。在特定實施例中，Fc域包含一或多個使Fc域與Fc受體之結合親和力及/或效應功能降低之胺基酸突變。通常，Fc域之兩個亞單元中之每一者中存在相同的一或多個胺基酸突變。在一個實施例中，胺基酸突變使Fc域對Fc受體之結合親和力降低。在一個實施例中，胺基酸突變使Fc域對Fc受體之結合親和力降低至少2倍、至少5倍或至少10倍。在其中存在超過一個使Fc域對Fc受體之結合親和力降低之胺基酸突變的實施例中，此等胺基酸突變之組合可使Fc域對Fc受體之結合親和力降低至少10倍、至少20倍或甚至至少50倍。在一個實施例中，包含經工程改造之Fc域之分子，例如抗體，與包含非經工程改造之Fc域對應分子相比展現小於20%、尤其小於10%、更尤其小於5%之對Fc受體之結合親和力。在一特定實施例中，Fc受體係Fcγ受體。在一些實施例中，Fc受體係人類Fc受體。在一些實施例中，Fc受體係活化Fc受體。在一特定實施例中，Fc受體係活化人類Fcγ受體，更特定言之人類FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最特定言之人類FcγRIIIa。較佳地，與此等受體中之每一者的結合減少。在一些實施例中，對補體組分之結合親和力，特定言之對C1q之結合親和力，亦降低。在一個實施例中，對新生兒Fc受體(FcRn)之結合親和力未降低。當Fc域(或包含該Fc域之分子，例如抗體)展現大於約70%之非經工程改造之形式之Fc域(或包含該非經工程改造形式之Fc域的對應分子)與FcRn之結合親和力時實現與FcRn之實質上類似的結合，亦即Fc域與該受體之結合親和力之保持。Fc域或包含該Fc域之分子(例如抗體)可展現大於約80%及甚至大於約90%之此類親和力。在某些實施例中，與非經工程改造之Fc域相比，Fc域經工程改造以具有降低之效應功能。降低之效應功能可包括(但不限於)以下中之一或多者：補體依賴性細胞毒性(CDC)降低、抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)降低、抗體依賴性細胞吞噬(ADCP)減少、細胞介素分泌減少、免疫複合物介導之抗原呈遞細胞攝入抗原減少、與NK細胞之結合減弱、與巨噬細胞之結合減弱、與單核細胞之結合減弱、與多形核細胞之結合減弱、誘導細胞凋亡之直接信號傳導減少、標靶所結合抗體之交聯減少、樹突狀細胞成熟減少或T細胞激活減少。在一個實施例中，降低之效應功能係選自以下之群的一或多者：CDC降低、ADCC降低、ADCP減少及細胞介素分泌減少。在一特定實施例中，降低之效應功能係ADCC降低。在一個實施例中，ADCC降低係藉由非經工程改造之Fc域(或包含非經工程改造之Fc域的抗體)誘導之ADCC的小於20%。
在一個實施例中，使Fc域對Fc受體之結合親和力及/或效應功能降低之胺基酸突變係胺基酸取代。在一個實施例中，Fc域包含位於選自以下之群的位置之胺基酸取代：E233、L234、L235、N297、P331及P329 (根據Kabat EU索引編號)。在一更特定實施例中，Fc域包含位於選自以下之群的位置之胺基酸取代：L234、L235及P329 (根據Kabat EU索引編號)。在一些實施例中，Fc域包含胺基酸取代L234A及L235A (根據Kabat EU索引編號)。在一個此類實施例中，Fc域係IgG1 Fc域，尤其人類IgG1 Fc域。在一個實施例中，Fc域包含位置P329之胺基酸取代。在一更特定實施例中，胺基酸取代係P329A或P329G，尤其P329G (根據Kabat EU索引編號)。在一個實施例中，Fc域包含位置P329之胺基酸取代及選自E233、L234、L235、N297及P331之位置的另一胺基酸取代(根據Kabat EU索引編號)。在一更特定實施例中，胺基酸取代係E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D或P331S。在特定實施例中，Fc域包含位置P329、L234及L235之胺基酸取代(根據Kabat EU索引編號)。在更特定實施例中，Fc域包含胺基酸突變L234A、L235A及P329G (「P329G LALA」)。在一個此類實施例中，Fc域係IgG1 Fc域，尤其人類IgG1 Fc域。「P329G LALA」胺基酸取代組合幾乎徹底地消除人類IgG1 Fc域與Fcγ受體(以及補體)之結合，如PCT公開案第WO 2012/130831號中所述，該文獻以全文引用的方式併入本文中。WO 2012/130831亦描述製備此類突變型Fc域之方法及測定其特性(諸如Fc受體結合或效應功能)之方法。
相比於IgG1 抗體，IgG4 抗體展現降低之與Fc受體的結合親和力及降低之效應功能。因此，在一些實施例中，Fc域係IgG4 Fc域，尤其人類IgG4 Fc域。在一個實施例中，IgG4 Fc域包含位置S228之胺基酸取代，特定言之，胺基酸取代S228P (根據Kabat EU索引編號)。為進一步降低其對Fc受體的結合親和力及/或其效應功能，在一個實施例中，IgG4 Fc域包含位置L235之胺基酸取代，特定言之，胺基酸取代L235E (根據Kabat EU索引編號)。在另一個實施例中，IgG4 Fc域包含位置P329之胺基酸取代，特定言之，胺基酸取代P329G (根據Kabat EU索引編號)。在一個特定實施例中，IgG4 Fc域包含位置S228、L235及P329之胺基酸取代，特定言之，胺基酸取代S228P、L235E及P329G (根據Kabat EU索引編號)。此類IgG4 Fc域突變體及其Fcγ受體結合特性描述於PCT公開案第WO 2012/130831號中，該案以全文引用的方式併入本文中。
在一特定實施例中，相比於原生IgG1 Fc域展現針對Fc受體之結合親和力降低及/或效應功能降低之Fc域係包含胺基酸取代L234A、L235A及視情況存在之P329G的人類IgG1 Fc域，或包含胺基酸取代S228P、L235E及視情況存在之P329G的人類IgG4 Fc域(根據Kabat EU索引編號)。
在某些實施例中，Fc域之N糖基化已消除。在一個此類實施例中，Fc域包含位置N297之胺基酸突變，尤其丙胺酸(N297A)或天冬胺酸(N297D)或甘胺酸N297G)置換天冬醯胺之胺基酸取代(根據Kabat EU索引編號)。
除上文及PCT公開案第WO 2012/130831號中所述之Fc域以外，Fc受體結合及/或效應功能降低之Fc域亦包括具有Fc域殘基238、265、269、270、297、327及329中之一或多者之取代的彼等Fc域(美國專利第6,737,056號) (根據Kabat EU索引編號)。此類Fc突變體包括具有胺基酸位置265、269、270、297及327中之兩者或更多者之取代的Fc突變體，包括殘基265及297之取代為丙胺酸的所謂「DANA」Fc突變體(美國專利第7,332,581號)。
突變型Fc域可使用此項技術中熟知之遺傳學或化學方法，藉由胺基酸缺失、取代、***或修飾來製備。遺傳學方法可包括DNA編碼序列之定點突變誘發、PCR、基因合成及類似方法。恰當的核苷酸變化可藉由例如定序來檢驗。
與Fc受體之結合可容易測定，例如藉由ELISA，或藉由表面電漿子共振(SPR)，使用標準儀器，諸如BIAcore儀器(GE Healthcare)，且可藉由重組表現來獲得諸如Fc受體。或者，Fc域或包含Fc域之分子對於Fc受體之結合親和力可使用已知表現特定Fc受體之細胞株，諸如表現FcγIIIa受體之人類NK細胞評估。
Fc域或包含Fc域之分子(例如抗體)之效應功能可藉由此項技術中已知之方法量測。適用於量測ADCC之分析描述於本文中。評定所關注分子之ADCC活性之活體外分析之其他實例描述於美國專利第5,500,362號；Hellstrom等人 Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986)及Hellstrom等人, Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985)；美國專利第5,821,337號；Bruggemann等人, J Exp Med 166, 1351-1361 (1987)中。或者，可採用非放射性分析方法(參見例如用於流動式細胞測量術之ACTI™非放射性細胞毒性分析(CellTechnology, Inc. Mountain View, CA)；及CytoTox 96® 非放射性細胞毒性分析(Promega, Madison, WI))。適用於此類分析之效應細胞包括周邊血液單核細胞(PBMC)及自然殺手(NK)細胞。或者或另外，可例如在動物模型中活體內評定所關注分子之ADCC活性，諸如Clynes等人, Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 (1998)中所揭示之動物模型。
在一些實施例中，Fc域與補體組分(特定言之C1q)之結合減少。因此，在其中Fc域經工程改造而具有降低之效應功能的一些實施例中，該降低之效應功能包括CDC降低。可進行C1q結合分析以確定Fc域或包含Fc域之分子(例如抗體)是否能夠結合C1q且因此具有CDC活性。參見例如WO 2006/029879及WO 2005/100402中之C1q及C3c結合ELISA。為評定補體活化，可進行CDC分析(參見例如Gazzano-Santoro等人, J Immunol Methods 202, 163 (1996)；Cragg等人, Blood 101, 1045-1052 (2003)；及Cragg及Glennie, Blood 103, 2738-2743 (2004))。
抗原結合部分 包含於治療劑中之抗體可具有雙特異性，亦即其包含至少兩個能夠特異性結合至兩個不同抗原性決定子之抗原結合部分。根據特定實施例，抗原結合部分係Fab分子(亦即由各自包含可變域及恆定域之重鏈及輕鏈構成之抗原結合域)。在一個實施例中，該等Fab分子係人類Fab分子。在另一實施例中，該等Fab分子係人類化Fab分子。在又另一實施例中，該等Fab分子包含人類重鏈及輕鏈恆定域。
在一些實施例中，抗原結合部分中之至少一者係互換型Fab分子。此類修飾減少來自不同Fab分子之重鏈及輕鏈之錯配，由此改良重組製造中之抗體之產率及純度。在適用於抗體之一特定互換型Fab分子中，Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域(分別VL及VH)交換。然而，甚至在此結構域交換之情況下，抗體製劑可包含歸因於錯配之重鏈與輕鏈之間的所謂本斯-瓊斯型相互作用的某些副產物(參見Schaefer等人, PNAS, 108 (2011) 11187-11191)。為進一步減少來自不同Fab分子之重鏈及輕鏈之錯配且因此增加所需抗體之純度及產率，可在特異性結合至標靶細胞抗原之Fab分子或特異性結合至活化T細胞抗原之Fab分子的CH1及CL域中之特定胺基酸位置引入具有相反電荷之帶電胺基酸。電荷修飾發生於包含於抗體中之習知Fab分子中(諸如例如圖1 A-C、G-J中所示)或包含於抗體中之VH/VL互換型Fab分子中(諸如例如圖1 D-F、K-N中所示)(但不在兩者中)。在特定實施例中，電荷修飾發生於包含於抗體中之習知Fab分子(在特定實施例中特異性結合標靶細胞抗原)中。
在根據本發明之一特定實施例中，抗體能夠同時結合至標靶細胞抗原、尤其腫瘤細胞抗原，及活化T細胞抗原、尤其CD3。在一個實施例中，抗體能夠藉由同時結合至標靶細胞抗原及活化T細胞抗原而交聯T細胞及結標靶細胞。在一甚至更特定實施例中，此類同時結合促使靶細胞(尤其腫瘤細胞)溶解。在一個實施例中，此類同時結合引起T細胞活化。在其他實施例中，此類同時結合引起T淋巴細胞(尤其細胞毒性T淋巴細胞)之細胞反應，細胞反應選自以下之群組：增殖、分化、細胞介素分泌、細胞毒性效應分子釋放、細胞毒活性及活化標記之表現。在一個實施例中，抗體與活化T細胞抗原、尤其CD3在不同時結合至標靶細胞抗原下之結合不產生T細胞活化。
在一個實施例中，抗體能夠使T細胞之細胞毒活性再定向至標靶細胞。在一特定實施例中，該再定向不依賴於標靶細胞之MHC介導之肽抗原呈遞及/或T細胞之特異性。
詳言之，根據本發明之任一實施例的T細胞係細胞毒性T細胞。在一些實施例中，T細胞係CD4+ 或CD8+ T細胞，尤其CD8+ T細胞。
(i) 活化 T 細胞抗原結合部分 在一些實施例中，包含於治療劑中之抗體、尤其雙特異性抗體，包含至少一個抗原結合部分、尤其Fab分子，其特異性結合至活化T細胞抗原(在本文中亦稱為「活化T細胞抗原結合部分或活化T細胞抗原結合Fab分子」)。在一特定實施例中，抗體包含不超過一個能夠特異性結合於活化T細胞抗原之抗原結合部分。在一個實施例中，抗體提供與活化T細胞抗原之單價結合。
在特定實施例中，特異性結合活化T細胞抗原之抗原結合部分係如本文所描述之互換型Fab分子，亦即其中Fab重鏈及輕鏈之可變域VH及VL或恆定域CH1及CL之Fab分子彼此交換/置換。在此類實施例中，特異性結合標靶細胞抗原之抗原結合部分較佳係習知Fab分子。在存在超過一個特異性結合至包含於抗體中之標靶細胞抗原的抗原結合部分、尤其Fab分子之實施例中，特異性結合至活化T細胞抗原之抗原結合部分較佳係互換型Fab分子且特異性結合至靶細胞抗原之抗原結合部分係習知Fab分子。
在替代實施例中，特異性結合活化T細胞抗原之抗原結合部分係習知Fab分子。在此類實施例中，特異性結合標靶細胞抗原之抗原結合部分係如本文所描述之互換型Fab分子，亦即其中Fab重鏈及輕鏈之可變域VH及VL或恆定域CH1及CL彼此交換/置換的Fab分子。
在一個實施例中，活化T細胞抗原係選自由以下組成之群：CD3、CD28、CD137 (亦稱為4-1BB)、CD40、CD226、OX40、GITR、CD27、HVEM及CD127。
在一個特定實施例中，活化T細胞抗原係CD3，尤其人類CD3 (SEQ ID NO: 91)或食蟹獼猴CD3 (SEQ ID NO: 92)，最尤其人類CD3。在一特定實施例中，活化T細胞抗原結合部分與人類及食蟹獼猴CD3交叉反應(亦即特異性結合)。在一些實施例中，活化T細胞抗原係CD3之ε亞單元(CD3 ε)。
在一些實施例中，活化T細胞抗原結合部分特異性結合至CD3、尤其CD3ε，且包含至少一個選自由SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13及SEQ ID NO: 14組成之群的重鏈互補決定區(CDR)及至少一個選自SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17之群的輕鏈CDR。
在一個實施例中，CD3結合抗原結合部分、尤其Fab分子包含包含SEQ ID NO: 12之重鏈CDR1、SEQ ID NO: 13之重鏈CDR2、SEQ ID NO: 14之重鏈CDR3的重鏈可變區及包含SEQ ID NO: 15之輕鏈CDR1、SEQ ID NO: 16之輕鏈CDR2及SEQ ID NO: 17之輕鏈CDR3的輕鏈可變區。
在一個實施例中，CD3結合抗原結合部分、尤其Fab分子包含與SEQ ID NO: 18至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之重鏈可變區序列及與SEQ ID NO: 19至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之輕鏈可變區序列。
在一個實施例中，CD3結合抗原結合部分、尤其Fab分子包含有包含SEQ ID NO: 18之胺基酸序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO: 19之胺基酸序列的輕鏈可變區。
在一個實施例中，CD3結合抗原結合部分、尤其Fab分子包含SEQ ID NO: 18之重鏈可變區序列及SEQ ID NO: 19之輕鏈可變區序列。
(ii) 標靶細胞抗原結合部分 在一些實施例中，包含於治療劑中之抗體、尤其雙特異性抗體包含至少一個，特異性結合至標靶細胞抗原之抗原結合部分、尤其Fab分子。在某些實施例中，抗體包含兩個特異性結合至標靶細胞抗原之抗原結合部分、尤其Fab分子。在一特定此類實施例中，此等抗原結合部分中之每一者特異性結合至相同抗原決定子。在一甚至更尤其實施例中，所有此等抗原結合部分相同，亦即其包含包括如本文所述之CH1及CL域中之相同胺基酸取代(若存在)的相同胺基酸序列。在一個實施例中，抗體包含特異性結合至標靶細胞抗原之免疫球蛋白分子。在一個實施例中，抗體包含不超過兩個特異性結合至標靶細胞抗原之抗原結合部分、尤其Fab分子。
在特定實施例中，特異性結合至靶細胞抗原之抗原結合部分係習知Fab分子。在此類實施例中，特異性結合活化T細胞抗原之抗原結合部分係如本文所述之互換型Fab分子，亦即其中Fab重鏈及輕鏈之可變域VH及VL或恆定域CH1及CL彼此交換/置換之Fab分子。
在替代實施例中，特異性結合至標靶細胞抗原之抗原結合部分係如本文所述之互換型Fab分子，亦即Fab重鏈及輕鏈之可變域VH及VL或恆定域CH1及CL之Fab分子彼此交換/置換。在此類實施例中，特異性結合活化T細胞抗原之抗原結合部分係習知Fab分子。
標靶細胞抗原結合部分能夠將抗體引導至標靶位點，例如表現標靶細胞抗原之特定類型之腫瘤細胞。
在一個實施例中，標靶細胞抗原係B細胞抗原，尤其惡性B細胞抗原。在一個實施例中，標靶細胞抗原係細胞表面抗原。在一個實施例中，標靶細胞抗原係選自由以下組成之群：CD20、CD19、CD22、ROR-1、CD37及CD5。
在一個實施例中，標靶細胞抗原係CD20、尤其人類CD20。
在一個實施例中，特異性結合至CD20之抗原結合部分、尤其Fab分子包含有包含SEQ ID NO: 4之重鏈互補決定區(CDR) 1、SEQ ID NO: 5之重鏈CDR 2及SEQ ID NO: 6之重鏈CDR 3的重鏈可變區及包含SEQ ID NO: 7之輕鏈CDR 1、SEQ ID NO: 8之輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 9之輕鏈CDR 3的輕鏈可變區。在另一實施例中，特異性結合至CD20之抗原結合部分、尤其Fab分子包含與SEQ ID NO: 10之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致之重鏈可變區及與SEQ ID NO: 11之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致之輕鏈可變區。在又另一實施例中，特異性結合至CD20之抗原結合部分、尤其Fab分子包含SEQ ID NO: 10之重鏈可變區序列及SEQ ID NO: 11之輕鏈可變區序列。
在一個實施例中，標靶細胞抗原係CD19、尤其人類CD19。
在一個實施例中，特異性結合至CD19之抗原結合部分、尤其Fab分子包含有包含SEQ ID NO: 24之重鏈互補決定區(CDR) 1、SEQ ID NO: 25之重鏈CDR 2及SEQ ID NO: 26之重鏈CDR 3的重鏈可變區及包含SEQ ID NO: 27之輕鏈CDR 1、SEQ ID NO: 28之輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 29之輕鏈CDR 3的輕鏈可變區。在另一實施例中，特異性結合至CD19之抗原結合部分、尤其Fab分子包含與SEQ ID NO: 30之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致之重鏈可變區及與SEQ ID NO: 31之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致之輕鏈可變區。在又另一實施例中，特異性結合至CD19之抗原結合部分、尤其Fab分子包含SEQ ID NO: 30之重鏈可變區序列及SEQ ID NO: 31之輕鏈可變區序列。
在另一實施例中，特異性結合至CD19之抗原結合部分、尤其Fab分子包含有包含SEQ ID NO: 35之重鏈互補決定區(CDR) 1、SEQ ID NO: 36之重鏈CDR 2及SEQ ID NO: 37之重鏈CDR 3的重鏈可變區及包含SEQ ID NO: 38之輕鏈CDR 1、SEQ ID NO: 39之輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 40之輕鏈CDR 3的輕鏈可變區。在另一實施例中，特異性結合至CD19之抗原結合部分、尤其Fab分子包含與SEQ ID NO: 41之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致之重鏈可變區及與SEQ ID NO: 42之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致之輕鏈可變區。在又另一實施例中，特異性結合至CD19之抗原結合部分、尤其Fab分子包含SEQ ID NO: 41之重鏈可變區序列及SEQ ID NO: 42之輕鏈可變區序列。
在另一實施例中，特異性結合至CD19之抗原結合部分、尤其Fab分子包含有 (i) 包含SEQ ID NO: 43之重鏈互補決定區(CDR) 1、SEQ ID NO: 44之重鏈CDR 2及SEQ ID NO: 45之重鏈CDR 3的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO: 46之輕鏈CDR 1、SEQ ID NO: 47之輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 48之輕鏈CDR 3的輕鏈可變區； (ii) 包含SEQ ID NO: 51之重鏈互補決定區(CDR) 1、SEQ ID NO: 52之重鏈CDR 2及SEQ ID NO: 53之重鏈CDR 3的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO: 54之輕鏈CDR 1、SEQ ID NO: 55之輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 56之輕鏈CDR 3的輕鏈可變區； (iii) 包含SEQ ID NO: 59之重鏈互補決定區(CDR) 1、SEQ ID NO: 60之重鏈CDR 2及SEQ ID NO: 61之重鏈CDR 3的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO: 62之輕鏈CDR 1、SEQ ID NO: 63之輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 64之輕鏈CDR 3的輕鏈可變區； (iv) 包含SEQ ID NO: 67之重鏈互補決定區(CDR) 1、SEQ ID NO: 68之重鏈CDR 2及SEQ ID NO: 69之重鏈CDR 3的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO: 70之輕鏈CDR 1、SEQ ID NO: 71之輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 72之輕鏈CDR 3的輕鏈可變區； (v) 包含SEQ ID NO: 75之重鏈互補決定區(CDR) 1、SEQ ID NO: 76之重鏈CDR 2及SEQ ID NO: 77之重鏈CDR 3的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO: 78之輕鏈CDR 1、SEQ ID NO: 79之輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 80之輕鏈CDR 3的輕鏈可變區；或 (vi) 包含SEQ ID NO: 83之重鏈互補決定區(CDR) 1、SEQ ID NO: 84之重鏈CDR 2及SEQ ID NO: 85之重鏈CDR 3的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO: 86之輕鏈CDR 1、SEQ ID NO: 87之輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 88之輕鏈CDR 3的輕鏈可變區。
在另一實施例中，特異性結合至CD19之抗原結合部分、尤其Fab分子包含 (i) 與SEQ ID NO: 49之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致之重鏈可變區及與SEQ ID NO: 50之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致之輕鏈可變區； (ii) 與SEQ ID NO: 57之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致之重鏈可變區及與SEQ ID NO: 58之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致之輕鏈可變區； (iii) 與SEQ ID NO: 65之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致之重鏈可變區及與SEQ ID NO: 66之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致之輕鏈可變區； (iv) 與SEQ ID NO: 73之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致之重鏈可變區及與SEQ ID NO: 74之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致之輕鏈可變區； (v) 與SEQ ID NO: 81之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致之重鏈可變區及與SEQ ID NO: 82之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致之輕鏈可變區；或 (vi) 與SEQ ID NO: 89之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致之重鏈可變區及與SEQ ID NO: 90之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致之輕鏈可變區。
在又另一實施例中，特異性結合至CD19之抗原結合部分、尤其Fab分子包含有 (i) SEQ ID NO: 49之重鏈可變區序列及SEQ ID NO: 50之輕鏈可變區序列； (ii) SEQ ID NO: 57之重鏈可變區序列及SEQ ID NO: 58之輕鏈可變區序列； (iii) SEQ ID NO: 65之重鏈可變區序列及SEQ ID NO: 66之輕鏈可變區序列； (iv) SEQ ID NO: 73之重鏈可變區序列及SEQ ID NO: 74之輕鏈可變區序列； (v) SEQ ID NO: 81之重鏈可變區序列及SEQ ID NO: 82之輕鏈可變區序列；或 (vi) SEQ ID NO: 89之重鏈可變區序列及SEQ ID NO: 90之輕鏈可變區序列。
電荷修飾 包含於治療劑中之抗體、尤其多特異性抗體可在其中所包含之Fab分子中包含胺基酸取代，該等胺基酸取代尤其有效減少輕鏈與不匹配重鏈之錯配(本斯-瓊斯型副產物)，該錯配可出現於在其結合臂中之一者(或更多者，在分子包含多於兩個抗原結合Fab分子之情況下)中有VH/VL交換之基於Fab之二/多特異性抗原結合分子之產生中(亦參見PCT公開案第WO 2015/150447號，尤其其中之實例，其以全文引用的方式併入本文中)。
因此，在特定實施例中，包含於治療劑中之抗體包含 (a) 特異性結合至第一抗原之第一Fab分子 (b)特異性結合至第二抗原之第二Fab分子，且其中Fab輕鏈可變域VL與Fab重鏈可變域VH彼此置換， 其中第一抗原係活化T細胞抗原且該第二抗原係標靶細胞抗原，或第一抗原係標靶細胞抗原且第二抗原係活化T細胞抗原；且 其中 i)在a)項下之第一Fab分子之恆定域CL中，位置124之胺基酸經帶正電胺基酸取代(根據Kabat編號)，且其中在a)項下之第一Fab分子之恆定域CH1中，位置147之胺基酸或位置213之胺基酸經帶負電的胺基酸取代(根據Kabat EU索引編號)；或 ii)在b)項下之第二Fab分子之恆定域CL中，位置124之胺基酸經帶正電的胺基酸取代(根據Kabat編號)，且其中在b)項下之第二Fab分子之恆定域CH1中，位置147之胺基酸或位置213之胺基酸經帶負電的胺基酸取代(根據Kabat EU索引編號)。
抗體不包含i)與ii)項下提及之修飾。第二Fab分子之恆定域CL與CH1彼此不置換(亦即保持不交換)。
在抗體之一個實施例中，在a)項下之第一Fab分子之恆定域CL中，位置124之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)(在一個較佳實施例中，獨立地經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代)，且在a)項下之第一Fab分子之恆定域CH1中，位置147之胺基酸或位置213之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
在另一實施例中，在a)項下之第一Fab分子之恆定域CL中，位置124之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，且在a)項下之第一Fab分子之恆定域CH1中，位置147之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
在一特定實施例中，在a)項下之第一Fab分子之恆定域CL中，位置124之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)(在一個較佳實施例中，獨立地經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代)且位置123之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)(在一個較佳實施例中，獨立地經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代)，且在a)項下之第一Fab分子之恆定域CH1中，位置147之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)且位置213之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
在一更特定實施例中，在a)項下之第一Fab分子之恆定域CL中，位置124之胺基酸經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)且位置123之胺基酸經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代(根據Kabat編號)，且在a)項下之第一Fab分子之恆定域CH1中，位置147之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)且位置213之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)。
在一甚至更特定實施例中，在a)項下之第一Fab分子之恆定域CL中，位置124之胺基酸經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)且位置123之胺基酸經精胺酸(R)取代(根據Kabat編號)，且在a)項下之第一Fab分子之恆定域CH1中，位置147之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)且位置213之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)。
在特定實施例中，a)項下之第一Fab分子之恆定域CL係κ同型。
或者，根據上述實施例之胺基酸取代可發生於b)項下之第二Fab分子之恆定域CL及恆定域CH1中，而非a)項下之第一Fab分子之恆定域CL及恆定域CH1中。在特定此類實施例中，b)項下之第二Fab分子之恆定域CL係κ同型。
抗體可進一步包含特異性結合至第一抗原之第三Fab分子。在特定實施例中，該第三Fab分子與a)項下之第一Fab分子相同。在此等實施例中，根據上述實施例之胺基酸取代發生於第一Fab分子及第三Fab分子中之每一者之恆定域CL及恆定域CH1中。或者，根據上述實施例之胺基酸取代可發生於b)項下之第二Fab分子之恆定域CL及恆定域CH1中，而非發生於第一Fab分子及第三Fab分子之恆定域CL及恆定域CH1中。
在特定實施例中，抗體進一步包含由能夠穩定締合之第一及第二亞單元構成之Fc域。
治療方案 根據本發明，II型抗CD20抗體及治療劑可以各種方式投與(例如關於投與途徑、劑量及/或時機)，只要II型抗CD20抗體在治療劑之前投與即可，且在投與治療劑時投與II型抗CD20抗體已有效誘導經治療個體中B細胞數目之減少。
不希望受理論所束縛，治療劑投與之前個體之B細胞數目之減少將減少或防止與治療劑投與相關之細胞介素釋放，且因此將減少或防止個體之與治療劑投與相關之不良事件(諸如IRR)。
在一個實施例中，治療方案與不投與II型抗CD20抗體之對應治療方案相比有效減少個體之與投與治療劑相關之細胞介素釋放。在一個實施例中，與不投與II型抗CD20抗體之對應治療方案相比，細胞介素釋放降低至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍或至少100倍。在一個實施例中，基本上阻止細胞介素釋放。在一個實施例中，在治療劑投與之後1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小時減少或阻止細胞介素釋放。在一個實施例中，細胞介素釋放之減少或阻止在治療劑投與之後最初24小時內。
在一個實施例中，治療劑投與之後個體之細胞介素濃度(如例如獲自個體之血液樣品中所量測)不超過治療劑投與之前個體之細胞介素濃度。在一個實施例中，治療劑投與之後個體之細胞介素濃度不超過治療劑投與之前個體之細胞介素濃度大於1.1倍、大於1.2倍、大於1.5倍、大於2倍、大於3倍、大於4倍、大於5倍、大於10倍、大於20倍、大於50倍或大於100倍。在一個實施例中，與治療劑投與之前個體之細胞介素濃度相比，治療劑投與之後個體之細胞介素濃度增加小於1.1倍、小於1.2倍、小於1.5倍、小於2倍、小於3倍、小於4倍、小於5倍、小於10倍、小於20倍、小於50倍或小於100倍。在一個實施例中，治療劑投與之後個體之細胞介素濃度係治療劑投與之後1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小時之細胞介素濃度。在一個實施例中，治療劑投與之後個體之細胞介素濃度係治療劑投與之後最初24小時內之細胞介素濃度。
在一個實施例中，在治療劑投與之後，尤其在治療劑投與之後1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小時，在個體中可偵測到細胞介素之濃度基本上不增加。
細胞介素可藉由此項技術中已知之方法，諸如ELISA、FACS或Luminex®分析偵測。
可例如在獲自個體之血液樣品中偵測到細胞介素。在一個實施例中，細胞介素濃度係個體之血液。
在一些實施例中，細胞介素係選一或多個自由以下組成之群的細胞介素：腫瘤壞死因子α (TNF-α)、干擾素γ (IFN-γ)、介白素-6 (IL-6)、介白素-10 (IL-10)、介白素-2 (IL-2)及介白素-8 (IL-8)，尤其由以下組成之群：TNF-α、IFN-γ及IL-6。在一些實施例中，細胞介素係TNF-α。在一些實施例中，細胞介素係IFN-γ。在一些實施例中，細胞介素係IL-6。在一些實施例中，細胞介素係IL-10。在一些實施例中，細胞介素係IL-2。在一些實施例中，細胞介素係IL-8。
在一些實施例中，與不投與II型抗CD20抗體之對應治療方案相比，治療方案增加治療劑之安全性。在一些實施例中，與不投與II型抗CD20抗體之對應治療方案相比，治療方案減少個體之不良事件。在一些實施例中，與不投與II型抗CD20抗體之對應治療方案相比，治療方案增加治療劑之功效。在一些實施例中，與不投與II型抗CD20抗體之對應治療方案相比，治療方案增加治療劑之血清半衰期。在一些實施例中，與不投與II型抗CD20抗體之對應治療方案相比，治療方案減少治療劑之毒性。
根據本發明，其中投與II型抗CD20抗體與投與治療劑之間的時間段足以對II型抗CD20抗體之投與起反應而減少個體中之B細胞數。
在一個實施例中，時間段係3天至21天、5天至20天、7天至21天、7天至14天、5天至15天、7天至15天、8天至15天、10天至20天、10天至15天、11天至14天或12天至13天。在一個實施例中，時間段係7天至14天。在一個實施例中，時間段係5天至10天。在一特定實施例中，時間段係7天。
在一個實施例中，時間段係約約3天、約4天、約5天、約6天、約7天、約8天、約9天、約10天、約11天、約12天、約13天、約14天、約15天、約16天、約17天、約18天、約19天、約20天、約21天、約22天、約23天、約24天、約25天、約26天、約27天、約28天、約29天或約30天。
在一個實施例中，時間段係至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天或至少15天。在一特定實施例中，時間段係至少5天。在另一特定實施例中，時間段係至少7天。
在一個實施例中，時間段係最後一次投與II型抗CD20抗體與(第一次，若有若干次)投與治療劑之間。在一個實施例中，在該時間段期間不投與治療劑。
在一特定實施例中，在個體之血液中B細胞數目減少。在一個實施例中，B細胞係末梢血液B細胞。在一個實施例中，B細胞係惡性及正常B細胞。在一個實施例中，B細胞係惡性B細胞。
在一些實施例中，在個體之組織中B細胞減少。在一個實施例中，組織係腫瘤。在一個實施例中，組織係淋巴結。在一個實施例中，組織係脾臟。在一個實施例中，組織係脾臟之邊緣區。在一個實施例中，B細胞係淋巴結B細胞。在一個實施例中，B細胞係脾B細胞。在一個實施例中，B細胞係脾邊緣區B細胞。在一個實施例中，B細胞係CD20陽性B細胞，亦即其表面上表現CD20之B細胞。
在一個實施例中，B細胞數之減少係減少至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%或至少約95%。在一個實施例中，B細胞數之減少係完全消除B細胞。在一特定實施例中，B細胞數之減少係減少至少90%、尤其至少95%之個體之(周邊)血液中之B細胞數。在一個實施例中，B細胞數之減少係與向個體(第一次，若有若干次)投與II型抗CD20抗體之前個體之B細胞數相比減少。
個體之B細胞數可藉由適用於定量患者血液或組織中之B細胞之本領域中已知之任何方法使用針對諸如CD20、CD19及/或PAX5之B細胞標記之抗體來測定，該方法係諸如流動式細胞測量術、免疫組織化學或免疫螢光方法。
B細胞數亦可藉由定量患者血液或組織中之B細胞標記之蛋白質或mRNA含量間接測定。適用於測定特定蛋白質含量之此項技術中已知之方法包括免疫分析方法，諸如酶聯結免疫吸附分析法(ELISA)或西方墨點法，用於測定mRNA含量之方法包括例如定量RT-PCR或微陣列技術。
所有上文所提及方法及技術在此項技術中已熟知，且可自標準教科書推斷，諸如Lottspeich (Bioanalytik, Spektrum Akademisher Verlag, 1998)或Sambrook及Russell (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, NY, U.S.A., 2001)。
在某些實施例中，B細胞數之減少藉由定量個體血液(例如獲自個體之血液樣品中)中之B細胞來測定。在一個此類實施例中，B細胞藉由流動式細胞量測分析定量。流動式細胞測量方法(FACS)在用於定量血液或組織樣品中之細胞的技術中已熟知。詳言之，其測定表現特定抗原(例如CD20及/或CD19)之細胞之數目，以及血液或組織樣品(例如血液樣品或(一部分)組織生物檢體)中細胞之規定的總數。在一個實施例中，B細胞藉由流動式細胞量測分析使用抗CD19抗體及/或抗CD20抗體定量。
在其他實施例中，B細胞數之減少藉由定量該個體(例如獲自個體之組織生物檢體)之組織(例如腫瘤)中之B細胞來測定。在一個此類實施例中，B細胞藉由免疫組織化學或免疫螢光分析來定量。在一個實施例中，B細胞藉由免疫組織化學分析使用抗CD19抗體、抗CD20抗體及/或抗PAX5抗體來定量。
本發明之方法視所用治療劑而定可適用於治療多種疾病。然而，該等方法尤其適用於治療B細胞增生性病症、尤其CD20陽性B細胞病症，其中(CD20陽性)B細胞大量存在(亦即與健康個體相比，罹患病症之個體中存在增加數目之B細胞)。
因此，在一個實施例中，疾病係B細胞增生性病症，尤其CD20陽性B細胞病症。
在一個實施例中，疾病係選自由以下組成之群：非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性淋巴球性白血病(ALL)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡性淋巴瘤、套細胞淋巴瘤(MCL)、邊緣區淋巴瘤(MZL)、多發性骨髓瘤(MM)或霍奇金淋巴瘤(HL)。在一個實施例中，疾病係選自由以下組成之群：非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性淋巴球性白血病(ALL)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡性淋巴瘤(FL)、套細胞淋巴瘤(MCL)及邊緣區淋巴瘤(MZL)。
在一特定實施例中，疾病係NHL，尤其復發/難治癒性(r/r) NHL。在一個實施例中，疾病係DLBCL。在一個實施例中，疾病係FL。在一個實施例中，疾病係MCL。在一個實施例中，疾病係MZL。
熟習此項技術者容易認識到，在許多情況下，治療劑可能不會提供治癒，而僅可能提供部分益處。在一些實施例中，具有一些益處之生理學變化亦視為治療上有益的。因此，在一些實施例中，提供生理學變化之治療劑的量視為「有效量」或「治療有效量」。
需要治療之個體(subject)、患者或個體(individual)通常係哺乳動物，更特定言之人類。
在某些實施例中，個體係人類。在一個實施例中，個體罹患B細胞增生性病症，尤其非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性淋巴球性白血病(ALL)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡性淋巴瘤(FL)、套細胞淋巴瘤(MCL)、邊緣區淋巴瘤(MZL)、多發性骨髓瘤(MM)或霍奇金淋巴瘤(HL)。
在一個實施例中，個體罹患復發/難治癒性(r/r) NHL。
投與 II 型 抗 CD20 抗體 根據本發明，選擇投與II型抗CD20抗體與投與治療劑之間的時間段及II型抗CD20抗體之劑量以便有效減少個體投與治療劑前之B細胞數。
II型抗CD20抗體可藉由任何適合手段投與，包括非經腸、肺內及鼻內，且必要時用於局部治療之病灶內投與。非經腸輸注包括肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下投與。部分視投藥之短期或長期性而定，可藉由任何適合途徑(例如藉由注射，諸如靜脈內或皮下注射)給藥。本文中涵蓋各種給藥時程，包括(但不限於)單次投藥或在不同時間點的多次投藥、快速投藥及脈衝式輸注。在一個實施例中，II型抗CD20抗體非經腸、尤其靜脈內，例如藉由靜脈內輸注投與。
II型抗CD20抗體將以與良好醫學實踐一致之方式調配、給藥及投與。在此情形中考慮之因素包括所治療之特定病症、所治療之特定哺乳動物、個別患者之臨床病狀、病症起因、藥劑傳遞位點、投藥方法、投藥時程及醫學從業者已知之其他因子。
在一個實施例中，II型抗CD20抗體投與係單次投與。在另一實施例中，II型抗CD20抗體之投與係兩次或更多次個別投與。在一個實施例中，兩次或更多次個別投與連續兩日或更多日。在一個實施例中，在治療劑投與之前或之後不再向個體投與II型抗CD20抗體。在一個實施例中，II型抗CD20抗體之投與係單次投與，或兩次投與連續兩日，且不再投與II型抗CD20抗體。在一個實施例中，時間段係最後一次投與II型抗CD20抗體與(第一次，若有若干次)投與治療劑之間。
在一個實施例中，II型抗CD20抗體之投與係對減少個體中之B細胞有效之II型抗CD20抗體之劑量。在一個實施例中，該劑量之II型抗CD20抗體在投與II型抗CD20抗體與投與治療劑之間的時間段內有效減少個體之B細胞數。在一個實施例中，投與II型抗CD20抗體與投與治療劑之間的時間段及II型抗CD20抗體之投與劑量足以對II型CD20抗體投與起反應而減少個體之B細胞數。
在一個實施例中，II型抗CD20抗體之投與係約2 g II型抗CD20抗體之劑量。可以單次投與約2 g，或以若干次投與，例如兩次投與各次約1 g或例如100 mg、900 mg及1000 mg之三次投與向個體投與約2 g II型抗CD20抗體之劑量。在一個實施例中，向個體一次投與約2 g II型抗CD20抗體。在另一實施例中，向個體兩次投與各約1 g II型抗CD20抗體連續兩日。在另一實施例中，向個體三次投與((i)至(iii)) (i)約100 mg II型抗CD20抗體、(ii)約900 mg II型抗CD20抗體及(iii)約1000 mg II型抗CD20抗體連續三日。在一個實施例中，在投與治療劑之前10天至15天，向個體兩次投與約1 g II型抗CD20抗體連續兩日。在一個實施例中，在投與治療劑之前10天至15天，進行向個體一次投與約2 g II型抗CD20抗體。在一個實施例中，不再向個體投與II型抗CD20抗體。在一個實施例中，在投與II型抗CD20抗體之前不向個體投與治療劑(至少不在同一治療過程內)。
在一個實施例中，II型抗CD20抗體之投與係約1000 mg II型抗CD20抗體之劑量。可以單次投與約1000 mg或以若干次投與，例如兩次投與各約500 mg向個體投與約1000 mg II型抗CD20抗體之劑量。在一特定實施例中，向個體一次投與約1000 mg II型抗CD20抗體。在另一實施例中，向個體兩次投與各約500 mg II型抗CD20抗體連續兩日。在一個實施例中，在投與治療劑之前7天，向個體一次投與約1000 mg II型抗CD20抗體。在一個實施例中，不再向個體投與II型抗CD20抗體。在一個實施例中，在投與II型抗CD20抗體之前不向個體投與治療劑(至少不在同一治療過程內)。
在一個實施例中，治療方案進一步包含在投與II型抗CD20抗體之前投與治療前用藥。在實施例中，治療前用藥包含皮質類固醇(諸如潑尼龍(prednisolone)、***(dexamethasone)或甲基潑尼龍(methylprednisolone))、撲熱息痛/乙醯胺苯酚及/或抗組胺劑(諸如苯海拉明(diphenhydramine))。在一個實施例中，治療前用藥在投與II型抗CD20抗體之前至少60分鐘投與。
在一個實施例中，治療方案不包含在投與治療劑之前投與除II型抗CD20抗體外之免疫抑制劑(及視情況存在之上述治療前用藥)。在一個實施例中，治療方案不包含在投與治療劑之前投與選自以下之群的藥劑：甲胺喋呤(methotrexate)、硫唑嘌呤(azathioprine)、6-巰基嘌呤(6-mercaptopurine)、來氟米特(leflunomide)、環孢靈(cyclosporine)、他克莫司(tacrolimus)/FK506、黴酚酸嗎啉乙酯(mycophenolate mofetil)及黴酚酸鈉(mycophenolate sodium)。在一個實施例中，治療方案不包含在投與治療劑之前投與除II型抗CD20抗體外之另一抗體。
投與治療劑 治療劑可藉由任何適合手段投與，包括非經腸、肺內及鼻內，且必要時用於局部治療之病灶內投與。然而，本發明方法對於藉由非經腸(尤其靜脈內)輸注投與之治療劑尤其適用。
非經腸輸注包括肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下投與。部分視投藥之短期或長期性而定，可藉由任何適合途徑(例如藉由注射，諸如靜脈內或皮下注射)給藥。本文中涵蓋各種給藥時程，包括(但不限於)單次投藥或在不同時間點的多次投藥、快速投藥及脈衝式輸注。在一個實施例中，治療劑非經腸(尤其靜脈內)投與。在一特定實施例中，治療劑藉由靜脈內輸注投與。
治療劑將以與良好醫學實踐一致之方式調配、給藥及投與。在此情形中考慮之因素包括所治療之特定病症、所治療之特定哺乳動物、個別患者之臨床病狀、病症起因、藥劑傳遞位點、投藥方法、投藥時程及醫學從業者已知之其他因子。治療劑並非必須，而是視情況與一或多種當前用於預防或治療所述病症之藥劑一起調配。此類其他藥劑之有效量視存在於調配物中之治療劑之量、病症或治療之類型及上文所論述之其他因子而定。此等藥劑一般以相同劑量且用如本文所述之投藥途徑使用，或以本文所述之劑量之約1%至99%使用，或以任何劑量且憑經驗/臨床上確定為適當之任何途徑使用。
對於疾病之預防或治療，治療劑之適當劑量(當單獨或與一或多種其他額外治療劑組合使用時)將視以下而定：待治療之疾病之類型、治療劑之類型、疾病之嚴重程度及過程、是否投與治療劑以達到預防或治療目的、先前療法、患者之臨床病史及對治療劑之反應、及主治醫師之判斷。一次性或歷經一系列治療向患者適當地投與治療劑。視疾病之類型及嚴重程度而定，約1 µg/kg至15 mg/kg(例如0.1 mg/kg-10 mg/kg)之治療劑可為例如藉由一或多次個別投與或藉由連續輸注向個體投與之初始候選劑量。視上文所提及之因子而定，一種典型日劑量可在約1 μg/kg至100 mg/kg或更高之範圍內。對於歷經數日或更長時間之重複投藥，視病狀而定，治療通常將持續至疾病症狀之所需抑制發生為止。治療劑之一種例示性劑量將在約0.05 mg/kg至約10 mg/kg之範圍內。因此，可向個體投與約0.5 mg/kg、2.0 mg/kg、4.0 mg/kg或10 mg/kg (或其任何組合)之一或多個劑量。此類劑量可間歇地，例如每週、每兩週或每三週投與(例如以使得個體接受約兩至約二十、或例如約六個治療劑劑量)。可在最初投與較高起始劑量、之後一或多個較低劑量，或最初投與較低劑量、之後一或多個較高劑量。例示性給藥方案包含投與約10 mg之初始劑量、之後約20 mg之治療劑之每兩週劑量。然而，其他給藥方案可為適用的。此療法之進程易於藉由習知技術及分析法來監測。
在一個實施例中，治療劑之投與係單次投與。在某些實施例中，治療劑之投與係兩次或更多次投與。在一個此類態樣中，每週、每兩週或每三週，尤其每兩週投與治療劑。在一個實施例中，投與治療有效量之治療劑。在一個實施例中，以約50 µg/kg、約100 µg/kg、約200 µg/kg、約300 µg/kg、約400 µg/kg、約500 µg/kg、約600 µg/kg、約700 µg/kg、約800 µg/kg、約900 µg/kg或約1000 µg/kg之劑量投與治療劑。在一個實施例中，以高於不投與II型抗CD20抗體之對應治療方案中之治療劑劑量之劑量投與治療劑。在一個實施例中，治療劑之投與包含初始投與第一劑量之治療劑及一或多次後續投與第二劑量之治療劑，其中第二劑量高於第一劑量。在一個實施例中，治療劑之投與包含初始投與第一劑量之治療劑及一或多次後續投與第二劑量之治療劑，其中第一劑量不小於第二劑量。
在一個實施例中，在根據本發明之治療方案中投與治療劑係向個體第一次投與治療劑(至少在同一治療過程內)。在一個實施例中，在II型抗CD20抗體投與之前不向個體投與治療劑。
在本發明中，在療法中治療劑可單獨或與其他藥劑組合使用。舉例而言，治療劑可與至少一種額外治療劑共同投與。在某些實施例中，額外治療劑係免疫治療劑。
上文所提及之此類組合療法涵蓋組合投與(其中兩種或更多種治療劑包括在同一或個別調配物中)及個別投與，在此情況下，治療劑之投與可在投與額外治療劑或藥劑之前、同時及/或之後進行。在一個實施例中，治療劑之投與及額外治療劑之投與彼此在約一個月；或相隔約一週、兩週或三週；或相隔約一天、兩天、三天、四天、五天或六天內進行。
製品 在本發明之另一態樣中，提供含有適用於疾病之治療、預防及/或診斷或適用於減少如本文所述之細胞介素釋放之物質的製品，例如套組。製品包含容器及容器上或容器隨附之標籤或藥品說明書。適合的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、靜脈內溶液袋等。容器可由各種材料形成，諸如玻璃或塑膠。容器容納獨自或與對治療、預防及/或診斷病狀有效之另一組合物組合之組合物，或容納對減少細胞介素釋放有效之組合物，且可具有無菌接取口(例如容器可為具有可藉由皮下注射針刺穿之塞的靜脈內溶液袋或小瓶)。組合物中之至少一種活性劑係II型抗CD20抗體或如本文所述之治療劑。標籤或藥品說明書指示組合物用於治療所選病況及/或減少細胞介素釋放。此外，製品可包含(a)其中含有組合物之第一容器，其中該組合物包如本文所述之II型抗CD20抗體；及(b)其中含有組合物之第二容器，其中該組合物包含如本文所述之治療劑。本發明之此實施例中之製品可進一步包含指示組合物可用以治療特定病狀及/或減少細胞介素釋放之藥品說明書。或者或另外，製品可進一步包含第二(或第三)容器，其包含醫藥學上可接受之緩衝液，諸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)及右旋糖溶液。其可進一步包括就商業及使用者觀點而言所需之其他物質，包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針及注射器。
術語「PD-L1結合拮抗劑」係指降低、阻斷、抑制、消除或干擾由PD-L1與其結合搭配物中之任一或多者（諸如PD-1、B7-1)之相互相用引起的信號轉導的分子。在一些實施例中，PD-L1結合拮抗劑係抑制PD-L1與其結合搭配物之結合的分子。在一特定態樣中，PD-L1結合拮抗劑抑制PD-L1與PD-1及/或B7-1之結合。在一些實施例中，PD-L1結合拮抗劑包括減少、阻斷、抑制、消除或干擾由PD-L1與其結合搭配物中之一或多者(諸如PD-1、B7-1)之相互相用引起的信號轉導的抗PD-L1抗體、其抗原結合片段、免疫黏附素、融合蛋白、寡肽及其他分子。在一個實施例中，PD-L1結合拮抗劑減少藉由或經由表現細胞表面蛋白質之T淋巴細胞介導之PD-L1信號傳導介導之陰性協同刺激信號，以便使功能異常T細胞較少出現功能異常(例如提高對抗原識別之效應子反應)。在一些實施例中，PD-L1結合拮抗劑係抗PD-L1抗體。在一些實施例中，抗體係人類化抗體、嵌合抗體或人類抗體。在一些實施例中，抗體係抗原結合片段。在一些實施例中，抗原結合片段係選自由以下組成之群：Fab、Fab'、 F(ab')2 及Fv。在一特定態樣中，抗PD-L1抗體係本文所述之YW243.55.S70。在另一特定態樣中，抗PD-L1抗體係本文所述之MDX-1105。在再一特定態樣中，抗PD-L1抗體係本文所述之MPDL3280A (阿特珠單抗(atezolizumab))。在再一特定態樣中，抗PD-L1抗體係本文所述之MDX-1105。在再一特定態樣中，抗PD-L1抗體係本文所述之YW243.55.S70。在再一特定態樣中，抗PD-L1抗體係本文所述之MEDI4736 (德瓦魯單抗(durvalumab))。在再一特定態樣中，抗PD-L1抗體係本文所述之MSB0010718C (阿維魯單抗(avelumab))。
在一些實施例中，PD-1軸結合拮抗劑係PD-1結合拮抗劑。在一些實施例中，PD-1結合拮抗劑抑制PD-1與其配位體結合搭配物之結合。在一些實施例中，PD-1結合拮抗劑抑制PD-1與PD-L1之結合。在一些實施例中，PD-1結合拮抗劑抑制PD-1與PD-L2之結合。在一些實施例中，PD-1結合拮抗劑抑制PD-1與PD-L1及PD-L2兩者之結合。在一些實施例中，PD-1結合拮抗劑係抗體。在一些實施例中，PD-1結合拮抗劑係選自由以下組成之群：MDX1106 (納武單抗(nivolumab))、MK-3475 (派立珠單抗(pembrolizumab))、CT-011 (皮立珠單抗(pidilizumab))、MEDI-0680 (AMP-514)、PDR001、REGN2810及BGB-108。
在一些實施例中，PD-1軸結合拮抗劑係PD-L1結合拮抗劑。在一些實施例中，PD-L1結合拮抗劑抑制PD-L1與PD-1之結合。在一些實施例中，PD-L1結合拮抗劑抑制PD-L1與B7-1之結合。在一些實施例中，PD-L1結合拮抗劑抑制PD-L1與PD-1及B7-1兩者之結合。在一些實施例中，PD-L1結合拮抗劑係抗PD-L1抗體。在一些實施例中，PD-L1結合拮抗劑係選自由以下組成之群：MPDL3280A (阿特珠單抗)、YW243.55.S70、MDX-1105、MEDI4736 (德瓦魯單抗)及MSB0010718C (阿維魯單抗(avelumab))。在特定實施例中，抗PD-L1抗體係MPDL3280A (阿特珠單抗)。在一些實施例中，以每三週約800 mg至約1500 mg (例如每三週約1000 mg至約1300 mg，例如每三週約1100 mg至約1200 mg)之劑量投與MPDL3280A。在一些實施例中，以每三週約1200 mg之劑量投與MPDL3280A。在一些實施例中，抗PD-L1抗體包含有包含SEQ ID NO: 107之HVR-H1序列、SEQ ID NO: 108之HVR-H2序列及SEQ ID NO: 109之HVR-H3序列的重鏈；及/或包含SEQ ID NO: 110之HVR-L1序列、SEQ ID NO: 111之HVR-L2序列及SEQ ID NO: 112之HVR-L3序列的輕鏈。在一些實施例中，抗PD-L1抗體包含有包含SEQ ID NO: 113或SEQ ID NO: 114之胺基酸序列的重鏈可變區及/或包含SEQ ID NO: 115之胺基酸序列的輕鏈可變區。在一些實施例中，抗PD-L1抗體包含有包含SEQ ID NO: 113之胺基酸序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO: 115之胺基酸序列的輕鏈可變區。在一些實施例中，抗PD-L1抗體包含WO 2010/077634及美國專利第8,217,149號中所述之抗體YW243.55.S70之三個重鏈HVR序列及/或抗體YW24355.S70之三個輕鏈HVR序列，其以引用的方式併入本文中。在一些實施例中，抗PD-L1抗體包含抗體YW243.55.S70之重鏈可變區序列及/或抗體YW24355.S70之輕鏈可變區序列。
在一些實施例中，PD-1軸結合拮抗劑係PD-L2結合拮抗劑。在一些實施例中，PD-L2結合拮抗劑係抗體。在一些實施例中，PD-L2結合拮抗劑係免疫黏附素。
在一些實施例中，PD-1軸結合拮抗劑係抗體(例如抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體或抗PD-L2抗體)且包含非糖基化位點突變。在一些實施例中，非糖基化位點突變係取代突變。在一些實施例中，取代突變在胺基酸殘基N297、L234、L235及/或D265 (EU編號)處。在一些實施例中，取代突變係選自由以下組成之群：N297G、N297A、L234A、L235A及D265A。在一些實施例中，取代突變係D265A突變及N297G突變。在一些實施例中，非糖基化位點突變會降低抗體之效應功能。在一些實施例中，PD-1軸結合拮抗劑(例如抗-PD-1抗體、抗PD-L1抗體或抗PD-L2抗體)係根據EU編號在位置297具有Asn至Ala取代之人類IgG1。
術語「PD-L2結合拮抗劑」係指降低、阻斷、抑制、消除或干擾由PD-L2與其結合搭配物中之任一或多者(諸如PD-1)之相互相用引起的信號轉導的分子。在一些實施例中，PD-L2結合拮抗劑係抑制PD-L2與一或多種其結合搭配物之結合的分子。在一特定態樣中，PD-L2結合拮抗劑抑制PD-L2與PD-1之結合。在一些實施例中，PD-L2拮抗劑包括抗PD-L2抗體、其抗原結合片段、免疫黏附素、融合蛋白、寡肽及其他降低、阻斷、抑制、消除或干擾由PD-L2與其結合搭配物中之任一或多者(諸如PD-1)之相互相用引起的信號轉導之分子。在一個實施例中，PD-L2結合拮抗劑減少藉由或經由表現細胞表面蛋白質之T淋巴細胞介導之PD-L2信號傳導介導之陰性協同刺激信號，以便使功能異常T細胞較少出現功能異常(例如提高對抗原識別之效應子反應)。在一些實施例中，PD-L2結合拮抗劑係免疫黏附素。
本發明之其他態樣 在本發明之另一實施例中，組合治療包括至少第一次投與抗CD20抗體及至少第二次投與抗CD20/抗CD3雙特異性抗體，其中至少第一次投與與至少第二次投與之間的時間段不足以對II型抗CD20抗體之投與起反應而減少個體之B細胞數。
在另一實施例中，組合治療可包含投與免疫黏附素、較佳包含與恆定區(例如免疫球蛋白序列之Fc區)融合之PD-L1或PD-L2之細胞外或PD-1結合部分之免疫黏附素、更佳抗PD-L1抗體。在一個實施例中，抗PD-L1抗體係選自由以下組成之群：YW243.55.S70、MPDL3280A、MDX-1105及MEDI4736。抗體YW243.55.S70係WO 2010/077634中所述之抗PD-L1抗體。MDX-1105，亦稱為BMS-936559，係WO2007/005874中所述之抗PD-L1抗體。MEDI4736係WO2011/066389及US2013/034559中所述之抗PDL1單株抗體。在一個實施例中，抗PD-L1抗體係阿特珠單抗。
實施例 在下文中，列舉本發明之一些實施例。 1. 一種治療個體之疾病之方法，該方法包含有包含以下之治療方案 (i)向該個體投與II型抗CD20抗體， 及在一段時間之後連續 (ii)向該個體投與T細胞活化治療劑， 其中投與該II型抗CD20抗體與投與該治療劑之間的時間段足以對該CD20抗體之投與起反應而減少該個體之B細胞數。 2. 如實施例1之方法，其中該治療方案與不投與該II型抗CD20抗體之對應治療方案相比有效減少該個體之與投與該治療劑相關之細胞介素釋放。 3. 一種用於減少個體之與投與治療劑相關之細胞介素釋放之方法，其包含在投與該治療劑之前向該個體投與II型抗CD20抗體。 4. 如實施例3之方法，其中該投與該II型抗CD20抗體與投與該治療劑之間的時間段足以對該II型抗CD20抗體之投與起反應而減少該個體之B細胞數。 5. 如前述實施例中任一項之方法，其中該II型抗CD20抗體包含有包含SEQ ID NO: 4之重鏈CDR (HCDR) 1、SEQ ID NO: 5之HCDR2及SEQ ID NO: 6之HCDR3的重鏈可變區；及包含SEQ ID NO: 7之輕鏈CDR (LCDR) 1、SEQ ID NO: 8之LCDR2及SEQ ID NO: 9之LCDR3的輕鏈可變區。 6. 如前述實施例中任一項之方法，其中該II型抗CD20抗體包含SEQ ID NO: 10之重鏈可變區序列及SEQ ID NO: 11之輕鏈可變區序列。 7. 如前述實施例中任一項之方法，其中該II型抗CD20抗體係IgG抗體、尤其IgG1 抗體。 8. 如前述實施例中任一項之方法，其中與非工程改造之抗體相比，該II型抗CD20抗體經工程改造以在Fc區中具有增加之比例的非海藻糖基化寡醣。 9. 如前述實施例中任一項之方法，其中該II型抗CD20抗體之該Fc區中的至少約40%之N-連接寡醣係非海藻糖基化的。 10. 如前述實施例中任一項之方法，其中該II型抗CD20抗體係奧濱尤妥珠單抗。 11. 如前述實施例中任一項之方法，其中該治療劑包含抗體、尤其多特異性抗體。 12. 如實施例11之方法，其中該抗體特異性結合至活化T細胞抗原、尤其選自由以下組成之群的抗原：CD3、CD28、CD137 (亦稱為4-1BB)、CD40、CD226、OX40、GITR、CD27、HVEM及CD127，更尤其CD3，最尤其CD3ɛ。 13. 如實施例11或12之方法，其中該抗體包含有包含SEQ ID NO: 12之重鏈CDR (HCDR) 1、SEQ ID NO: 13之HCDR2及SEQ ID NO: 14之HCDR3的重鏈可變區；及包含SEQ ID NO: 15之輕鏈CDR (LCDR) 1、SEQ ID NO: 16之LCDR2及SEQ ID NO: 17之LCDR3的輕鏈可變區。 14. 如實施例11至13中任一項之方法，其中該抗體包含SEQ ID NO: 18之重鏈可變區序列及SEQ ID NO: 19之輕鏈可變區序列。 15. 如實施例11至14中任一項之方法，其中該抗體特異性結合至B細胞抗原、尤其選自由以下組成之群的抗原：CD20、CD19、CD22、ROR-1、CD37及CD5，更尤其CD20或CD19，最尤其CD20。 16. 如實施例15之方法，其中該抗體包含有包含該SEQ ID NO: 4之重鏈CDR (HCDR) 1、該SEQ ID NO: 5之HCDR2及該SEQ ID NO: 6之HCDR3的重鏈可變區；及包含該SEQ ID NO: 7之輕鏈CDR (LCDR) 1、該SEQ ID NO: 8之LCDR2及該SEQ ID NO: 9之LCDR3的輕鏈可變區。 17. 如實施例15或16之方法，其中該抗體包含該SEQ ID NO: 10之重鏈可變區序列及該SEQ ID NO: 11之輕鏈可變區序列。 18. 如前述實施例中任一項之方法，其中該抗體係包含(i)如實施例12至14中任一項所定義之抗體及(ii)如實施例15至17中任一項所定義之抗體的雙特異性抗體。 19. 如前述實施例中任一項之方法，其中該治療劑包含CD20XCD3 bsAB。 20. 如實施例1至10中任一項之方法，其中該治療劑包含表現嵌合抗原受體(CAR)之T細胞，尤其特異性結合至B細胞抗原之CAR，更尤其特異性結合至選自CD20、CD19、CD22、ROR-1、CD37及CD5之群的抗原之CAR。 21. 如前述實施例中任一項之方法，其中該疾病係B細胞增生性病症、尤其CD20陽性B細胞病症，及/或係選自由以下組成之群的疾病：非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性淋巴球性白血病(ALL)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡性淋巴瘤(FL)、套細胞淋巴瘤(MCL)、邊緣區淋巴瘤(MZL)、多發性骨髓瘤(MM)及霍奇金淋巴瘤(HL)。 22. 一種II型抗CD20抗體，其係用於治療個體之疾病之方法中，該方法包含有包含以下之治療方案： (i)向該個體投與該II型抗CD20抗體， 及在一段時間之後連續 (ii)向該個體投與T細胞活化治療劑， 其中投與該II型抗CD20抗體與投與該治療劑之間的時間段足以對該II型抗CD20抗體之投與起反應而減少該個體之B細胞數。 23. 如實施例22之II型抗CD20抗體，其中該治療方案與不投與該II型抗CD20抗體之對應治療方案相比有效減少該個體之與投與該治療劑相關之細胞介素釋放。 24. 一種II型抗CD20抗體，其係用於減少個體之與投與治療劑相關之細胞介素釋放之方法中，該方法包含在投與該治療劑之前向該個體投與該II型抗CD20抗體。 25. 如實施例24之II型抗CD20抗體，其中投與該II型抗CD20抗體與投與該治療劑之間的時間段足以對該II型抗CD20抗體之投與起反應而減少該個體之B細胞數。 26. 如實施例22至25中任一項之II型抗CD20抗體，其中該II型抗CD20抗體包含有包含SEQ ID NO: 4之重鏈CDR (HCDR) 1、SEQ ID NO: 5之HCDR2及SEQ ID NO: 6之HCDR3的重鏈可變區；及包含SEQ ID NO: 7之輕鏈CDR (LCDR) 1、SEQ ID NO: 8之LCDR2及SEQ ID NO: 9之LCDR3的輕鏈可變區。 27. 如實施例22至26中任一項之II型抗CD20抗體，其中該II型抗CD20抗體包含SEQ ID NO: 10之重鏈可變區序列及SEQ ID NO: 11之輕鏈可變區序列。 28. 如實施例22至27中任一項之II型抗CD20抗體，其中該II型抗CD20抗體係IgG抗體、尤其IgG1 抗體。 29. 如實施例22至28中任一項之II型抗CD20抗體，其中與非工程改造之抗體相比，該II型抗CD20抗體經工程改造以在Fc區中具有增加之比例的非海藻糖基化寡醣。 30. 如實施例22至29中任一項之II型抗CD20抗體，其中該II型抗CD20抗體之該Fc區中的至少約40%之N-連接寡醣係非海藻糖基化的。 31. 如實施例22至30中任一項之II型抗CD20抗體，其中該II型抗CD20抗體係奧濱尤妥珠單抗。 32. 如實施例22至31中任一項之II型抗CD20抗體，其中該治療劑包含抗體、尤其多特異性抗體。 33. 如實施例32之II型抗CD20抗體，其中包含於該治療劑中之該抗體特異性結合至活化T細胞抗原、尤其選自由以下組成之群的抗原：CD3、CD28、CD137 (亦稱為4-1BB)、CD40、CD226、OX40、GITR、CD27、HVEM及CD127，更尤其CD3，最尤其CD3ɛ。 34. 如實施例32或33之II型抗CD20抗體，其中包含於該治療劑中之該抗體包含有包含SEQ ID NO: 12之重鏈CDR (HCDR) 1、SEQ ID NO: 13之HCDR2及SEQ ID NO: 14之HCDR3的重鏈可變區；及包含SEQ ID NO: 15之輕鏈CDR (LCDR) 1、SEQ ID NO: 16之LCDR2及SEQ ID NO: 17之LCDR3的輕鏈可變區。 35. 如實施例32至34中任一項之II型抗CD20抗體，其中包含於該治療劑中之該抗體包含SEQ ID NO: 18之重鏈可變區序列及SEQ ID NO: 19之輕鏈可變區序列。 36. 如實施例32至35中任一項之II型抗CD20抗體，其中包含於該治療劑中之該抗體特異性結合至B細胞抗原、尤其選自由以下組成之群的抗原：CD20、CD19、CD22、ROR-1、CD37及CD5，更尤其CD20或CD19，最尤其CD20。 37. 如實施例36之II型抗CD20抗體，其中包含於該治療劑中之該抗體包含有包含該SEQ ID NO: 4之重鏈CDR (HCDR) 1、該SEQ ID NO: 5之HCDR2及該SEQ ID NO: 6之HCDR3的重鏈可變區；及包含該SEQ ID NO: 7之輕鏈CDR (LCDR) 1、該SEQ ID NO: 8之LCDR2及該SEQ ID NO: 9之LCDR3的輕鏈可變區。 38. 如實施例36或37之II型抗CD20抗體，其中包含於該治療劑中之該抗體包含SEQ ID NO: 10之重鏈可變區序列及SEQ ID NO: 11之輕鏈可變區序列。 39. 如實施例22至38中任一項之II型抗CD20抗體，其中包含於該治療劑中之該抗體係包含(i)如實施例33至35中任一項所定義之抗體及(ii)如實施例36至38中任一項所定義之抗體的雙特異性抗體。 40. 如實施例22至39中任一項之II型抗CD20抗體，其中該治療劑包含CD20XCD3 bsAB。 41. 如實施例22至31中任一項之II型抗CD20抗體，其中該治療劑包含表現嵌合抗原受體(CAR)之T細胞，尤其特異性結合至B細胞抗原之CAR，更尤其特異性結合至選自CD20、CD19、CD22、ROR-1、CD37及CD5之群的抗原之CAR。 42. 如實施例22至41中任一項之II型抗CD20抗體，其中該疾病係B細胞增生性病症、尤其CD20陽性B細胞病症，及/或係選自由以下組成之群的疾病：非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性淋巴球性白血病(ALL)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡性淋巴瘤(FL)、套細胞淋巴瘤(MCL)、邊緣區淋巴瘤(MZL)、多發性骨髓瘤(MM)及霍奇金淋巴瘤(HL)。 43. 一種II型抗CD20抗體之用途，其係用於製造用於減少個體之與投與T細胞活化治療劑相關之細胞介素釋放之藥劑，其中將該藥劑用於包含以下之治療方案中： (i)向該個體投與該II型抗CD20抗體， 及在一段時間之後連續 (ii)向該個體投與T細胞活化治療劑， 其中投與該II型抗CD20抗體與投與該治療劑之間的時間段足以對該CD20抗體之投與起反應而減少該個體之B細胞數。 44. 一種T細胞活化治療劑之用途，其係用於製造用於治療個體之疾病之藥劑，其中該治療包含有包含以下之治療方案： (i)向該個體投與II型抗CD20抗體， 及在一段時間之後連續 (ii)向該個體投與該T細胞活化治療劑， 其中投與該II型抗CD20抗體與投與該治療劑之間的時間段足以對該CD20抗體之投與起反應而減少該個體之B細胞數。 45. 如實施例43或44之用途，其中該治療方案與不投與該II型抗CD20抗體之對應治療方案相比有效減少個體之與投與該治療劑相關之細胞介素釋放。 46. 如實施例43至45中任一項之用途，其中該II型抗CD20抗體包含有包含SEQ ID NO: 4之重鏈CDR (HCDR) 1、SEQ ID NO: 5之HCDR2及SEQ ID NO: 6之HCDR3的重鏈可變區；及包含SEQ ID NO: 7之輕鏈CDR (LCDR) 1、SEQ ID NO: 8之LCDR2及SEQ ID NO: 9之LCDR3的輕鏈可變區。 47. 如實施例43至46中任一項之用途，其中該II型抗CD20抗體包含SEQ ID NO: 10之重鏈可變區序列及SEQ ID NO: 11之輕鏈可變區序列。 48. 如實施例43至47中任一項之用途，其中該II型抗CD20抗體係IgG抗體、尤其IgG1 抗體。49. 如實施例43至48中任一項之用途，其中與非工程改造之抗體相比，該II型抗CD20抗體經工程改造以在Fc區中具有增加之比例的非海藻糖基化寡醣。 50. 如實施例43至49中任一項之用途，其中該II型抗CD20抗體之該Fc區中的至少約40%之N-連接寡醣係非海藻糖基化的。 51. 如實施例43至50中任一項之用途，其中該II型抗CD20抗體係奧濱尤妥珠單抗。 52. 如實施例43至51中任一項之用途，其中該治療劑包含抗體、尤其多特異性抗體。 53. 如實施例51之用途，其中該抗體特異性結合至活化T細胞抗原、尤其選自由以下組成之群的抗原：CD3、CD28、CD137 (亦稱為4-1BB)、CD40、CD226、OX40、GITR、CD27、HVEM及CD127，更尤其CD3，最尤其CD3ɛ。 54. 如實施例52或53之用途，其中該抗體包含有包含SEQ ID NO: 12之重鏈CDR (HCDR) 1、SEQ ID NO: 13之HCDR2及SEQ ID NO: 14之HCDR3的重鏈可變區；及包含SEQ ID NO: 15之輕鏈CDR (LCDR) 1、SEQ ID NO: 16之LCDR2及SEQ ID NO: 17之LCDR3的輕鏈可變區。 55. 如實施例52至54中任一項之用途，其中該抗體包含SEQ ID NO: 18之重鏈可變區序列及SEQ ID NO: 19之輕鏈可變區序列。 56. 如實施例52至55中任一項之用途，其中該抗體特異性結合至B細胞抗原、尤其選自由以下組成之群的抗原：CD20、CD19、CD22、ROR-1、CD37及CD5，更尤其CD20或CD19，最尤其CD20。 57. 如實施例56之用途，其中該抗體包含有包含該SEQ ID NO: 4之重鏈CDR (HCDR) 1、該SEQ ID NO: 5之HCDR2及該SEQ ID NO: 6之HCDR3的重鏈可變區；及包含該SEQ ID NO: 7之輕鏈CDR (LCDR) 1、該SEQ ID NO: 8之LCDR2及該SEQ ID NO: 9之LCDR3的輕鏈可變區。 58. 如實施例56或57之用途，其中該抗體包含該SEQ ID NO: 10之重鏈可變區序列及該SEQ ID NO: 11之輕鏈可變區序列。 59. 如實施例43至58中任一項之用途，其中該抗體係包含(i)如實施例53至55中任一項所定義之抗體及(ii)如實施例56至58中任一項所定義之抗體的雙特異性抗體。 60. 如實施例43至59中任一項之用途，其中該治療劑包含CD20XCD3 bsAB。 61. 如實施例43至51中任一項之用途，其中該治療劑包含表現嵌合抗原受體(CAR)之T細胞，尤其特異性結合至B細胞抗原之CAR，更尤其特異性結合至選自CD20、CD19、CD22、ROR-1、CD37及CD5之群的抗原之CAR。 62. 如實施例43至61中任一項之用途，其中該疾病係B細胞增生性病症，尤其CD20陽性B細胞病症，及/或選自由以下組成之群的疾病：非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、急性淋巴球性白血病(ALL)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡性淋巴瘤(FL)、套細胞淋巴瘤(MCL)、邊緣區淋巴瘤(MZL)、多發性骨髓瘤(MM)及霍奇金氏淋巴瘤(HL)。 63. 一種用於減少個體之與投與T細胞活化治療劑相關之細胞介素釋放之套組，其包含有包含II型抗CD20抗體組合物及在治療方案中使用II型抗CD20抗體組合物之說明書的套裝，該治療方案包含 (i)向該個體投與該II型抗CD20抗體組合物， 及在一段時間之後連續 (ii)向該個體投與T細胞活化治療劑， 其中投與該II型抗CD20抗體組合物與投與該治療劑之間的時間段足以對CD20抗體之投與起反應而減少該個體之B細胞數。 64. 如實施例63之套組，其進一步包括T細胞活化治療劑組合物。 65. 一種用於治療個體之疾病之套組，其包含有包含T細胞活化治療劑組合物及在治療方案中使用治療劑組合物之說明書的套裝，該治療方案包含 (i)向該個體投與II型抗CD20抗體， 及在一段時間之後連續 (ii)向該個體投與該T細胞活化治療劑組合物， 其中投與該II型抗CD20抗體組合物與投與該治療劑組合物之間的時間段足以對該CD20抗體之投與起反應而減少該個體之B細胞數。 66. 如實施例65之套組，其進一步包含II型抗CD20抗體組合物。 67. 如實施例63至66中任一項之套組，其中該治療方案與不投與該II型抗CD20抗體組合物之對應治療方案相比有效減少個體之與投與該治療劑相關之細胞介素釋放。 68. 如實施例63至67中任一項之套組，其中該II型抗CD20抗體包含有包含SEQ ID NO: 4之重鏈CDR (HCDR) 1、SEQ ID NO: 5之HCDR2及SEQ ID NO: 6之HCDR3的重鏈可變區；及包含SEQ ID NO: 7之輕鏈CDR (LCDR) 1、SEQ ID NO: 8之LCDR2及SEQ ID NO: 9之LCDR3的輕鏈可變區。 69. 如實施例63至68中任一項之套組，其中該II型抗CD20抗體包含SEQ ID NO: 10之重鏈可變區序列及SEQ ID NO: 11之輕鏈可變區序列。 70. 如實施例63至69中任一項之套組，其中該II型抗CD20抗體係IgG抗體、尤其IgG1 抗體。 71. 如實施例63至70中任一項之套組，其中與非工程改造之抗體相比，該II型抗CD20抗體經工程改造以在Fc區中具有增加之比例的非海藻糖基化寡醣。 72. 如實施例63至71中任一項之套組，其中該II型抗CD20抗體之該Fc區中的至少約40%之N-連接寡醣係非海藻糖基化的。 73. 如實施例63至72中任一項之套組，其中該II型抗CD20抗體係奧濱尤妥珠單抗。 74. 如實施例63至73中任一項之套組，其中該治療劑包含抗體、尤其多特異性抗體。 75. 如實施例74之套組，其中該抗體特異性結合至活化T細胞抗原、尤其選自由以下組成之群的抗原：CD3、CD28、CD137 (亦稱為4-1BB)、CD40、CD226、OX40、GITR、CD27、HVEM及CD127，更尤其CD3，最尤其CD3ɛ。 76. 如實施例74或75之套組，其中該抗體包含有包含SEQ ID NO: 12之重鏈CDR (HCDR) 1、SEQ ID NO: 13之HCDR2及SEQ ID NO: 14之HCDR3的重鏈可變區；及包含SEQ ID NO: 15之輕鏈CDR (LCDR) 1、SEQ ID NO: 16之LCDR2及SEQ ID NO: 17之LCDR3的輕鏈可變區。 77. 如實施例74至76中任一項之套組，其中該抗體包含SEQ ID NO: 18之重鏈可變區序列及SEQ ID NO: 19之輕鏈可變區序列。 78. 如實施例74至77中任一項之套組，其中該抗體特異性結合至B細胞抗原、尤其選自由以下組成之群的抗原：CD20、CD19、CD22、ROR-1、CD37及CD5，更尤其CD20或CD19，最尤其CD20。 79. 如實施例78之套組，其中該抗體包含有包含該SEQ ID NO: 4之重鏈CDR (HCDR) 1、該SEQ ID NO: 5之HCDR2及該SEQ ID NO: 6之HCDR3的重鏈可變區；及包含該SEQ ID NO: 7之輕鏈CDR (LCDR) 1、該SEQ ID NO: 8之LCDR2及該SEQ ID NO: 9之LCDR3的輕鏈可變區。 80. 如實施例78或79之套組，其中該抗體包含該SEQ ID NO: 10之重鏈可變區序列及該SEQ ID NO: 11之輕鏈可變區序列。 81. 如實施例78至80中任一項之套組，其中該抗體係包含(i)如實施例75至77中任一項所定義之抗體及(ii)如實施例78至80中任一項所定義之抗體的雙特異性抗體。 82. 如實施例63至81中任一項之套組，其中該治療劑包含CD20XCD3 bsAB。 83. 如實施例63至73中任一項之套組，其中該治療劑包含表現嵌合抗原受體(CAR)之T細胞，尤其特異性結合至B細胞抗原之CAR，更尤其特異性結合至選自CD20、CD19、CD22、ROR-1、CD37及CD5之群的抗原之CAR。 84. 如實施例63至83中任一項之套組，其中該疾病係B細胞增生性病症，尤其CD20陽性B細胞病症，及/或選自由以下組成之群的疾病：非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、急性淋巴球性白血病(ALL)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、瀰漫性大型B細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡性淋巴瘤(FL)、套細胞淋巴瘤(MCL)、邊緣區淋巴瘤(MZL)、多發性骨髓瘤(MM)及霍奇金氏淋巴瘤(HL)。 85. 一種T細胞活化治療劑，其係用於治療個體之疾病之方法中，該方法包含有包含以下之治療方案： (i)向該個體投與II型抗CD20抗體， 及在一段時間之後連續 (ii)向該個體投與該T細胞活化治療劑， 其中投與該II型抗CD20抗體與投與該治療劑之間的時間段足以對該CD20抗體之投與起反應而減少該個體之B細胞數。 86. 如實施例85之T細胞活化治療劑，其中該治療方案與不投與該II型抗CD20抗體之對應治療方案相比有效減少該個體之與投與該治療劑相關之細胞介素釋放。 87. 如實施例85或86之T細胞活化治療劑，其中該II型抗CD20抗體包含有包含SEQ ID NO: 4之重鏈CDR (HCDR) 1、SEQ ID NO: 5之HCDR2及SEQ ID NO: 6之HCDR3的重鏈可變區；及含有SEQ ID NO: 7之輕鏈CDR (LCDR) 1、SEQ ID NO: 8之LCDR2及SEQ ID NO: 9之LCDR3的輕鏈可變區。 88. 如實施例85至87中任一項之T細胞活化治療劑，其中該II型抗CD20抗體包含SEQ ID NO: 10之重鏈可變區序列及SEQ ID NO: 11之輕鏈可變區序列。 89. 如實施例85至88中任一項之T細胞活化治療劑，其中該II型抗CD20抗體係IgG抗體、尤其IgG1 抗體。 90. 如實施例85至89中任一項之T細胞活化治療劑，其中與非工程改造之抗體相比，該II型抗CD20抗體經工程改造以在Fc區中具有增加之比例的非海藻糖基化寡醣。 91. 如實施例85至90中任一項之T細胞活化治療劑，其中該II型抗CD20抗體之該Fc區中的至少約40%之N-連接寡醣係非海藻糖基化的。 92. 如實施例85至91中任一項之T細胞活化治療劑，其中該II型抗CD20抗體係奧濱尤妥珠單抗。 93. 如實施例85至92中任一項之T細胞活化治療劑，其中該治療劑包含抗體、尤其多特異性抗體。 94. 如實施例93之T細胞活化治療劑，其中該抗體特異性結合至活化T細胞抗原、尤其選自由以下組成之群的抗原：CD3、CD28、CD137 (亦稱為4-1BB)、CD40、CD226、OX40、GITR、CD27、HVEM及CD127，更尤其CD3，最尤其CD3ɛ。 95. 如實施例93或94之T細胞活化治療劑，其中該抗體包含有包含SEQ ID NO: 12之重鏈CDR (HCDR) 1、SEQ ID NO: 13之HCDR2及SEQ ID NO: 14之HCDR3的重鏈可變區；及包含SEQ ID NO: 15之輕鏈CDR (LCDR) 1、SEQ ID NO: 16之LCDR2及SEQ ID NO: 17之LCDR3的輕鏈可變區。 96. 如實施例93至95中任一項之T細胞活化治療劑，其中該抗體包含SEQ ID NO: 18之重鏈可變區序列及SEQ ID NO: 19之輕鏈可變區序列。 97. 如實施例93至96中任一項之T細胞活化治療劑，其中該抗體特異性結合至B細胞抗原、，選自由以下組成之群的抗原：CD20、CD19、CD22、ROR-1、CD37及CD5，更尤其CD20或CD19，最尤其CD20。 98. 如實施例97之T細胞活化治療劑，其中該抗體包含有包含該SEQ ID NO: 4之重鏈CDR (HCDR) 1、該SEQ ID NO: 5之HCDR2及該SEQ ID NO: 6之HCDR3的重鏈可變區；及含有該SEQ ID NO: 7之輕鏈CDR (LCDR) 1、該SEQ ID NO: 8之LCDR2及該SEQ ID NO: 9之LCDR3的輕鏈可變區。 99. 如實施例97或98之T細胞活化治療劑，其中該抗體包含該SEQ ID NO: 10之重鏈可變區序列及該SEQ ID NO: 11之輕鏈可變區序列。 100. 如實施例85至99中任一項之T細胞活化治療劑，其中該抗體係包含(i)如實施例94至96中任一項所定義之抗體及(ii)如實施例97至99中任一項所定義之抗體的雙特異性抗體。 101. 如實施例85至100中任一項之T細胞活化治療劑，其中該治療劑包含CD20XCD3 bsAB。 102. 如實施例85至92中任一項之T細胞活化治療劑，其中該治療劑包含表現嵌合抗原受體(CAR)之T細胞，尤其特異性結合至B細胞抗原之CAR，更尤其特異性結合至選自CD20、CD19、CD22、ROR-1、CD37及CD5之群的抗原之CAR。 103. 如實施例85至102中任一項之T細胞活化治療劑，其中該疾病係B細胞增生性病症，尤其CD20陽性B細胞病症，及/或選自由以下組成之群的疾病：非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性淋巴球性白血病(ALL)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡性淋巴瘤(FL)、套細胞淋巴瘤(MCL)、邊緣區淋巴瘤(MZL)、多發性骨髓瘤(MM)及霍奇金淋巴瘤(HL)。 在下文中，給出本發明之其他態樣。 I. 一種II型抗CD20抗體，其係用於治療個體之疾病之方法中，該方法包含有包含以下之治療方案： (i)向該個體投與該II型抗CD20抗體， 及在一段時間之後連續 (ii)向該個體投與T細胞活化治療劑， 其中投與該II型抗CD20抗體與投與該治療劑之間的時間段足以對該CD20抗體之投與起反應而減少該個體之B細胞數。 II. 如態樣I之II型抗CD20抗體，其中該治療方案與不投與該II型抗CD20抗體之對應治療方案相比有效減少該個體之與投與該治療劑相關之細胞介素釋放。 III. 一種II型抗CD20抗體，其係用於減少個體之與投與T細胞活化治療劑相關之細胞介素釋放之方法中，該方法包含在投與該治療劑之前向該個體投與該II型抗CD20抗體。 IV. 如態樣III之II型抗CD20抗體，其中投與該II型抗CD20抗體與投與該治療劑之間的時間段足以對該II型抗CD20抗體之投與起反應而減少該個體之B細胞數。 V. 如態樣I至IV中任一項之II型抗CD20抗體，其中該II型抗CD20抗體包含有包含SEQ ID NO: 4之重鏈CDR (HCDR) 1、SEQ ID NO: 5之HCDR2及SEQ ID NO: 6之HCDR3的重鏈可變區；及包含SEQ ID NO: 7之輕鏈CDR(LCDR) 1、SEQ ID NO: 8之LCDR2及SEQ ID NO: 9之LCDR3的輕鏈可變區。 VI. 如態樣I至V中任一項之II型抗CD20抗體，其中該II型抗CD20抗體包含SEQ ID NO: 10之重鏈可變區序列及SEQ ID NO: 11之輕鏈可變區序列。 VII. 如態樣I至VI中任一項之II型抗CD20抗體，其中該II型抗CD20抗體係IgG抗體、尤其IgG1抗體，且其中該II型抗CD20抗體之Fc區中的至少約40%之N-連接寡醣係非海藻糖基化的。 VIII. 如態樣I至VII中任一項之II型抗CD20抗體，其中該II型抗CD20抗體係奧濱尤妥珠單抗。 IX. 如態樣I至XIII中任一項之II型抗CD20抗體，其中該治療劑包含抗體、尤其多特異性抗體。 X. 如態樣IX之II型抗CD20抗體，其中包含於該治療劑中之該抗體特異性結合至活化T細胞抗原、尤其選自由以下組成之群的抗原：CD3、CD28、CD137 (亦稱為4-1BB)、CD40、CD226、OX40、GITR、CD27、HVEM及CD127，更尤其CD3，最尤其CD3ɛ。 XI. 如態樣IX或X之II型抗CD20抗體，其中包含於該治療劑中之該抗體包含有包含SEQ ID NO: 12之重鏈CDR (HCDR) 1、SEQ ID NO: 13之HCDR2及SEQ ID NO: 14之HCDR3的重鏈可變區；及包含SEQ ID NO: 15之輕鏈CDR (LCDR) 1、SEQ ID NO: 16之LCDR2及SEQ ID NO: 17之LCDR3的輕鏈可變區。 XII. 如態樣IX至XI中任一項之II型抗CD20抗體，其中包含於該治療劑中之該抗體包含SEQ ID NO: 18之重鏈可變區序列及SEQ ID NO: 19之輕鏈可變區序列。 XIII. 如態樣IX至XII中任一項之II型抗CD20抗體，其中包含於該治療劑中之該抗體特異性結合至B細胞抗原、尤其選自由以下組成之群的抗原：CD20、CD19、CD22、ROR-1、CD37及CD5，更尤其CD20或CD19，最尤其CD20。 XIV. 如態樣XIII之II型抗CD20抗體，其中包含於該治療劑中之該抗體包含有包含該SEQ ID NO: 4之重鏈CDR (HCDR) 1、該SEQ ID NO: 5之HCDR2及該SEQ ID NO: 6之HCDR3的重鏈可變區；及含有該SEQ ID NO: 7之輕鏈CDR (LCDR) 1、該SEQ ID NO: 8之LCDR2及該SEQ ID NO: 9之LCDR3的輕鏈可變區。 XV. 如態樣XIII或IV之II型抗CD20抗體，其中包含於該治療劑中之該抗體包含該SEQ ID NO: 10之重鏈可變區序列及該SEQ ID NO: 11之輕鏈可變區序列。 XVI. 如態樣I至XV中任一項之II型抗CD20抗體，其中包含於該治療劑中之該抗體係包含(i)如技術方案10至12中任一項所定義之抗體及(ii)如態樣XIII至XV中任一項所定義之抗體的雙特異性抗體。 XVII.如態樣I至VIII中任一項之II型抗CD20抗體，其中該治療劑包含表現嵌合抗原受體(CAR)之T細胞，尤其特異性結合至B細胞抗原之CAR，更尤其特異性結合至選自CD20、CD19、CD22、ROR-1、CD37及CD5之群的抗原之CAR。 XVIII. 如態樣I至XVII中任一項之II型抗CD20抗體，其中該疾病係B細胞增生性病症、尤其CD20陽性B細胞病症，及/或係選自由以下組成之群的疾病：非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性淋巴球性白血病(ALL)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡性淋巴瘤(FL)、套細胞淋巴瘤(MCL)、邊緣區淋巴瘤(MZL)、(多發性骨髓瘤(MM)及霍奇金淋巴瘤(HL)。
實例 以下係本發明之方法及組合物之實例。應理解，考慮到上文所提供之一般描述，可實踐各種其他實施例。
實例1 在全人類化小鼠中評定藉由CD20XCD3 bsAB ± 奧濱尤妥珠單抗預治療(Gpt)介導之抗腫瘤活性及細胞介素釋放 吾人在全人類化NOG小鼠中研究Gpt是否可阻止與第一次投與CD20XCD3 bsAB相關之細胞介素釋放。
所有治療選項(奧濱尤妥珠單抗、CD20XCD3 bsAB及Gpt + CD20XCD3 bsAB)導致在第一次療法施與之後24小時偵測到有效末梢血液B細胞耗乏(圖1A)。T細胞計數顯示在末梢血液中在第一次投與CD20XCD3 bsAB之後而非在奧濱尤妥珠單抗或Gpt + CD20XCD3 bsAB之後24小時瞬時降低(圖1B)。因此，當在CD20XCD3 BsAb之前投與時，單次投與奧濱尤妥珠單抗消除末梢血液中CD20XCD3 bsAB介導之T細胞減少。
不同實驗組中對經治療小鼠之血液中釋放之細胞介素之分析顯示CD20XCD3 bsAB治療誘血液中導若干細胞介素之瞬時升高，其中在第一次投與之後24小時達到峰值且藉由72小時返回至接近基線含量(圖2)。MIP-1b、IL-5、IL-10、MCP-1展示與IFNγ、TNFα及IL-6類似的趨勢(未圖示)。Gpt劇烈減少末梢血液中與第一次CD20XCD3 bsAB注射相關之細胞介素釋放(表2)。 表2. 全人類化NOG小鼠在CD20XCD3 bsAB及Gpt + CD20XCD3 bsAB治療時之末梢血液中釋放之細胞介素
CD20XCD3 bsAB之抗腫瘤活性不受奧濱尤妥珠單抗預治療影響(圖3)。作為單一療法之奧濱尤妥珠單抗展示強烈抗腫瘤活性，但在此腫瘤及小鼠模型中當與CD20XCD3 bsAB相比時具有較慢動力學。
因此，資料指示Gpt減少與第一次CD20XCD3 bsAB注射相關之細胞介素釋放，然而，儘管使相同抗原靶向腫瘤細胞，但CD20XCD3 bsAB之抗腫瘤活性不受Gpt影響。
實例2 食蟹獼猴中之奧濱尤妥珠單抗預治療研究 在雄性食蟹獼猴中進行機制研究(非GLP)以調查奧濱尤妥珠單抗預治療對0.1、0.3及1 mg/kg之劑量的CD20XCD3 bsAB之作用(表3)。在此研究中，每組6個未處理雄性食蟹獼猴(第1組係4個)接受靜脈內給藥對照物品1 (第1及2組)或奧濱尤妥珠單抗(50 mg/kg，第3、4及5組)，之後在4天後用對照物品2 (第1組)、CD20XCD3 bsAB (0.1 mg/kg) (第2組、第3組)、CD20XCD3 bsAB (0.3 mg/kg) (第4組)或CD20XCD3 bsAB (1 mg/kg) (第5組)治療。認為奧濱尤妥珠單抗與CD20XCD3 bsAB給藥之間有四天足以藉由奧濱尤妥珠單抗耗乏末梢血液、淋巴結及脾臟中之B細胞。在第12天，將來自第1組之2個動物，及來自第2至5組之4個動物屍體解剖(最終屍體解剖)。使來自各組之兩個動物維持8週恢復時段。 表3. 研究設計：食蟹獼猴中之奧濱尤妥珠單抗預治療. 注意：對照物品1 = 對於奧濱尤妥珠單抗之對照：對照物品2 = 對於CD20XCD3 bsAB之對照。a 主組動物，第12天最終屍體解剖。b 恢復動物，第8週屍體解剖。
以下初始資料獲自此目前進行中之研究： • 在用奧濱尤妥珠單抗(50 mg/kg，Gpt)預治療之後，靜脈內投與CD20XCD3 bsAB耐受至多1 mg/kg(最高測試劑量)。在單獨CD20XCD3 bsAB下觀察到之臨床症狀(嘔吐、駝背體態及活動減退)在所有劑量之CD20XCD3 bsAB下藉由Gpt明顯減輕。 • 單獨CD20XCD3 bsAB投與導致B淋巴細胞減少及T淋巴細胞(CD4+及CD8+)亞組及NK細胞活化及增殖。此外，相對於單獨用CD20XCD3 bsAB治療之動物所存在之變化，在CD20XCD3 bsAB投與之前投與奧濱尤妥珠單抗導致B淋巴細胞耗乏，以及後續T淋巴細胞活化衰減，如在CD20XCD3 bsAB投與之後藉由淋巴細胞及單核球群體之瞬時降低以及T細胞活化標記上調及增殖降低所表明。 在Gpt組中，0.1 mg/kg CD20XCD3 bsAB治療後4小時，IFNγ、IL-8、TNFα、IL-2及IL-6之釋放明顯減少。類似地，在Gpt組中，在較高劑量之CD20XCD3 bsAB下注意到低水準之細胞介素釋放。 CD20XCD3 bsAB相關之組織病理學研究結果限於淋巴器官(例如特定影響CD20陽性細胞之細胞含量降低存在於脾臟之淋巴濾泡中)。在8週無治療時段之後，CD20陽性細胞減少幾乎完全逆轉。不存在其他組織病理學變化，包括在用0.1 mg/kg之CD20XCD3 bsAB治療之猴中及在Gpt之後投與0.1、0.3或1 mg/kg CD20XCD3 bsAB之動物中之大腦、脊髓及坐骨神經中之組織病理學變化。
實例3在患有 r / r NHL 之患者中在奧比尼單抗預治療下 CD20XCD3 bsAB 之安全性、耐受性及藥物動力學之臨床評估 將進行I期劑量遞增研究，其主要目的包括評估患有復發/難治癒性(r/r) NHL之患者中在奧濱尤妥珠單抗預治療下CD20XCD3 bsAB之安全性、耐受性及藥物動力學。
研究將登記患有r/r NHL之患者，預期其腫瘤使CD20表現於B細胞中。不登記患有CLL之患者。預期患者在至少一種先前治療方案之後復發或對至少一種先前治療方案無反應。
將靜脈內(IV)投與奧濱尤妥珠單抗及CD20XCD3 bsAB。
在投與奧濱尤妥珠單抗及CD20XCD3 bsAB之前，將投與具有皮質類固醇之治療前用藥(例如100 mg IV潑尼龍或等效物)以及抗組胺劑及乙醯胺苯酚。亦視需要推薦或指定用於諸如腫瘤溶解症候群之其他事件之預防性量測。
在第一次CD20XCD3 bsAB給藥(第1循環/第1天)之前(第1循環/第-7天)用單次劑量之奧濱尤妥珠單抗(1000 mg；靜脈內)預治療七天之後，CD20XCD3 bsAB以單一藥劑藉由靜脈內(IV)輸注在第1循環/第1天(C1/D1)起始。CD20XCD3 bsAB之預期起始劑量將係5微克(平緩給藥)。所有給藥週期係14天(Q2W)長。給藥方案係在第1循環中在第1及8天(C1/D1；C1/D8)投與CD20XCD3 bsAB，之後在所有後續週期中僅在第1天(Q2W)給藥，持續總計12個治療週期(24週)或直至出現不可接受之毒性或進展。
在適當時間點收集血液樣品以確定CD20XCD3 bsAB之相關PK特性以及血液中之一系列PD標記，以評定例如Gpt及CD20XCD3 bsAB給藥起始後之B細胞耗乏之量值及動力學、T細胞表現型，且評定所選時間點投與Gpt及CD20XCD3 bsAB後之可溶性介質釋放(細胞介素及趨化介素)。
實例4避免用 CAR - T 細胞進行 過繼性 T 細胞 療法後之細胞介素釋放的 GAZYVA 預治療 細胞介素釋放症候群(CRS)係用CD19CAR-T細胞以及可導致致死性副作用之針對CD20或CD22之CAR-T細胞治療後之極常見的現象。避免或減少CRS之策略集中於CAR-T療法之各個態樣(綜述於Xu及Tang, Cancer Letters (2014) 343, 172-178中)。
吾人表明藉由使用奧濱尤妥珠單抗預治療耗乏周邊及惡性B細胞而避免B細胞增生性病症中用CAR-T細胞治療後之CRS的新穎方法。
出於此目的，將患有B細胞增生性病症(例如NHL)之患者隨機分為奧濱尤妥珠單抗預治療組及無奧濱尤妥珠單抗預治療之對照組。奧濱尤妥珠單抗預治療組中之患者接受1 g奧濱尤妥珠單抗，在投與CD19、CD20或CD22 CAR-T細胞之前第-7天(+/-2天)投與。
患者輸注對於所用特異性CAR-T細胞、待治療之患者及疾病適當劑量之經CAR豆狀病毒載體轉導自體T細胞(例如每公斤體重0.76×106 至20.6×106 個CAR-T細胞，如Maude等人, N Engl J Med (2014) 371,1507-1517中所述；每公斤體重1.4×106 至1.2×107 個CAR-T細胞，如Grupp等人, New Engl J Med (2013) 368, 1509-1518中所述；或0.14 × 108 至11 × 108 個CAR-T細胞，如Porter等人, Sci Transl Med (2015) 7, 303ra139中所述)。監測患者之反應、毒性效應及循環中之CAR-T細胞之擴增及存留。
在各奧濱尤妥珠單抗給藥之前給予治療前用藥。在治療期之前及期間收集血液樣品以用於監測B淋巴細胞計數。使用流式細胞測量術及CD19染色獲得B細胞計數。另外，CRS之發病率藉由量測包括IL-6之細胞介素來篩檢。
實例 5 抗 CD20 / 抗 CD3 雙特異性抗體與奧濱尤妥珠單抗或抗 PD - L1 抗體之組合治療 圖6展示抗CD20/抗CD3雙特異性抗體與奧濱尤妥珠單抗(圖6D)之組合治療及抗CD20/抗CD3雙特異性抗體與抗PD-L1抗體之組合治療(圖6E)之功效。
抗CD20/抗CD3雙特異性抗體係「2:1」T細胞雙特異性人類化單株抗體，其經由兩個片段抗原結合(Fab)域結合至腫瘤細胞上之人類CD20，及經由單一Fab域結合至T細胞上之T細胞受體(TCR)複合物之人類CD3ε亞單元(CD3e)。分子係基於人類IgG1同型，但含有無Fcγ受體(FcγR)及補體(C1q)結合之Fc部分。分子量係大致194 kDa。在實例5中，抗CD20/抗CD3雙特異性包含根據SEQ ID NO: 116之重鏈、根據SEQ ID NO: 117之重鏈、兩倍根據SEQ ID NO: 118之輕鏈及根據SEQ ID NO: 119之輕鏈。
抗PD-L1抗體係基於WO 2010/077634中所述之YW243.55.S70 PD-L1抗體(WO 2010/077634之圖11中所示之序列)。此抗體含有DAPG突變以消除FcγR相互作用。YW243.55.S70之可變區連接至具有DAPG Fc突變之鼠類IgG1恆定域。用於實例5中之抗PD-L1抗體包含根據SEQ ID NO: 120之重鏈及根據SEQ ID NO: 121之輕鏈。
在帶有侵襲性淋巴瘤模型(WSU-DLCL2腫瘤)之人類造血幹細胞人類化小鼠(HSC-NSG小鼠)中分析與奧濱尤妥珠單抗(GAZYVA；圖6D)及抗PD-L1抗體(圖6E)組合時之抗CD20/抗CD3雙特異性抗體之抗腫瘤活性，其在第0天皮下注射。當如由圖6A-F中之箭頭所指示腫瘤平均體積為600 mm3 時療法開始。在研究第15天達到600 mm3 之腫瘤平均體積。
對於抗CD20/抗CD3雙特異性抗體與奧濱尤妥珠單抗之組合治療，靜脈內投與0.15 mg/kg之次最佳有效劑量之抗CD20/抗CD3雙特異性抗體每週一次。靜脈內投與10 mg/kg之奧濱尤妥珠單抗每週一次(圖6D)。同時注射兩種搭配物。
對於抗CD20/抗CD3雙特異性抗體與抗PD-L1抗體之組合治療，靜脈內投與0.15 mg/kg之次最佳有效劑量之抗CD20/抗CD3雙特異性抗體每週一次，且靜脈內投與10 mg/kg之抗PD-L1抗體每週一次(圖6E)。亦同時注射兩種搭配物。
媒劑組中之動物每週接受磷酸鹽緩衝鹽水之靜脈內注射(圖6A)。在單一療法組中，靜脈內投與10 mg/kg之抗CD20/抗CD3雙特異性抗體(圖6B)每週一次，靜脈內投與10 mg/kg之奧濱尤妥珠單抗(圖6C)每週一次，且靜脈內投與10 mg/kg之抗PD-L1(圖6F)抗體每週一次。各組包含10個動物。根據標準化曲線下面積(sAUC)之單向ANOVA及鄧尼特氏方法(Dunnet's method)單一療法組彼此並無統計學差異(表4)。 表4. 單一療法組之活體內資料之統計分析。
如上所指出之抗CD20/抗CD3雙特異性抗體與奧濱尤妥珠單抗或抗CD20/抗CD3雙特異性抗體與抗PD-L1抗體之組合治療展示在研究過程期間腫瘤平均尺寸顯著減小。此情況指示與抗CD20/抗CD3雙特異性抗體、奧濱尤妥珠單抗或抗PD-L1抗體之個別治療相比，組合治療更有可能減小腫瘤平均尺寸。
根據sAUC之單向ANOVA及鄧尼特氏方法以統計學方式分析上文與實例5之組合治療相關之活體內資料(表5)。 表5. 組合治療之活體內資料之統計分析.
在測試條件中，與抗CD20/抗CD3雙特異性抗體與抗PD-L1抗體之組合治療相比，抗CD20/抗CD3雙特異性抗體與奧濱尤妥珠單抗之組合治療展示對減小平均腫瘤尺寸有較強作用。
圖7展示抗CD20/抗CD3雙特異性抗體與奧濱尤妥珠單抗之組合治療之功效(圖7A及圖7B)。關於抗CD20/抗CD3雙特異性抗體之架構，參考實例5。在帶有侵襲性淋巴瘤模型(OCI-Ly18腫瘤)之人類造血幹細胞人類化小鼠(HSC-NSG小鼠)中，測試抗CD20/抗CD3雙特異性抗體(本文中RO7082859)與奧濱尤妥珠單抗組合時之抗腫瘤活性。在第0天皮下注射該組合。當腫瘤平均體積在研究第14天達到500 mm3 時療法開始。靜脈內投與0.5 mg/kg之劑量的抗CD20/抗CD3雙特異性抗體一週一次。靜脈內投與30 mg/kg之奧濱尤妥珠單抗每週一次。組合之兩種搭配物在組合群中同時注射。媒劑組中之動物每週接受磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)之注射。各組含有8個動物。圖7A以平均值及平均值之標準誤差(SEM)展示所有組之腫瘤生長動力學。圖7B展示各治療組中單個小鼠之腫瘤生長動力學。用ANOVA進行統計分析。比較個別組，其中在圖7A中，「*」表示抗CD20/抗CD3雙特異性抗體相對於抗CD20/抗CD3雙特異性抗體及奧濱尤妥珠單抗之組合，且「**」表示奧濱尤妥珠單抗相對於抗CD20/抗CD3雙特異性抗體及奧濱尤妥珠單抗之組合。
當一起投與兩種抗體若干個投與週期時，抗CD20/抗CD3雙特異性抗體及奧濱尤妥珠單抗之可組合性藉由強烈抗腫瘤功效例示。在兩種不同DLBCL模型(亦即WSU-DLCL2及OCI-Ly18)中觀察到其組合之協同作用，且藉由與對應單個抗體相比所有動物及兩種腫瘤模型中之快速腫瘤消退證明。 * * *
儘管前述本發明已藉助於說明及實例較詳細地描述以用於清楚理解之目的，但描述及實例不應解釋為限制本發明之範疇。本文中所引用之所有專利及科學文獻之揭示內容均以全文引用的方式明確併入本文中。
圖1. 本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子(TCB)之例示性組態。(A，D)說明「1+1 互換單抗(CrossMab)」分子。(B，E)說明「2+1 IgG互換Fab」分子，其中互換Fab及Fab組分的次序係交替的(「倒置式」)。(C，F)說明「2+1 IgG互換Fab」分子。(G，K)說明「1+1 IgG互換Fab」分子，其中互換Fab及Fab組分的次序係交替的(「倒置式」)。(H，L)說明「1+1 IgG互換Fab」分子。(I，M)說明具有兩個互換Fab的「2+1 IgG互換Fab」分子。(J，N)說明具有兩個互換Fab的「2+1 IgG互換Fab」分子，其中互換Fab及Fab組分之次序係交替的(「倒置式」)。(O，S)說明「Fab-互換Fab」分子。(P，T)說明「互換Fab-Fab」分子。(Q，U)說明「(Fab)2 -互換Fab」分子。(R，V)說明「互換Fab-(Fab)2 」分子。(W，Y)說明「Fab-(互換Fab)2 」分子。(X，Z)說明「(互換Fab)2 -Fab」分子。黑點：Fc域中視情況存在之促進雜二聚化的修飾。++、--：視情況引入CH1及CL域中之帶有相反電荷的胺基酸。互換Fab分子描繪為包含VH與VL區之交換，但在CH1及CL域中未引入電荷修飾的實施例中，可替代地包含CH1與CL域之交換。 圖2. 不同治療組中之末梢血液中之B細胞及T細胞計數。在第一及第二CD20XCD3 bsAB投與之後24小時及72小時，對媒劑及CD20XCD3 bsAB治療之全人類化NOG小鼠之末梢血液中之CD19+ B細胞（A）及CD3+ T細胞（B）進行流式細胞測量術分析。黑色箭頭指示CD20XCD3 bsAB投與天數。 圖3. 不同治療組中之末梢血液中釋放之細胞介素。在第一及第二投與CD20XCD3 bsAB之後24小時及72小時，對媒劑及治療小鼠之血液中之細胞介素之多工分析。直方圖條柱表示5隻動物之平均值且誤差條指示標準差。展示IFNγ、TNFα及IL-6之代表性圖表。比較存在及不存在奧濱尤妥珠單抗預治療下CD20XCD3 bsAB之第一注射之細胞介素釋放(待比較之條柱藉由連接線指出)。 圖4. CD20XCD3 bsAB、奧濱尤妥珠單抗及Gpt + CD20XCD3 bsAB之抗腫瘤活性。全人類化NOG小鼠中CD20XCD3 bsAB及奧濱尤妥珠單抗作為單一療法或Gpt + CD20XCD3 bsAB之抗腫瘤活性。黑色箭頭指示治療開始。(8＜n＜10)。腫瘤模型：WSU-DLCL2。 圖5. 食蟹猴在投用CD20XCD3 bsAB及Gpt + CD20XCD3 bsAB治療後之末梢血液中釋放之細胞介素。 圖6. (A-F)在帶有侵襲性淋巴瘤模型(WSU-DLCL2腫瘤)之人類造血幹細胞人類化小鼠(HSC-NSG小鼠)中，對抗CD20/CD3雙特異性抗體與奧濱尤妥珠單抗或阿特珠單抗之組合治療中之抗腫瘤活性之分析。(A)媒劑該功效，（B）抗CD20-抗CD3T細胞雙特異性抗體之治療功效，（C）奧濱尤妥珠單抗(GAZYVA®)之治療功效，(D)抗CD20/CD3雙特異性抗體與奧濱尤妥珠單抗(GAZYVA®)之組合治療之功效，(E)抗CD20/CD3雙特異性抗體與阿特珠單抗之組合治療之功效，(F)抗PD-L1抗體之治療功效。 圖7. (A-B)在帶有侵襲性淋巴瘤模型(OCI-Ly18腫瘤)之人類造血幹細胞人類化小鼠(HSC-NSG小鼠)中，對抗CD20/CD3雙特異性抗體與奧濱尤妥珠單抗之組合治療中抗腫瘤活性之分析。(A)媒劑、抗CD20/CD3雙特異性抗體、奧濱尤妥珠單抗及抗CD20/CD3雙特異性抗體及奧濱尤妥珠單抗之組合之功效。(B)抗CD20/CD3雙特異性抗體、奧濱尤妥珠單抗及抗CD20/CD3雙特異性抗體及奧濱尤妥珠單抗之組合對個別小鼠之功效。

Claims (58)

  1. 一種II型抗CD20抗體之用途，其係用於製造用於治療個體之癌症或延緩其進展之藥劑，其中該藥劑包含II型抗CD20抗體及視情況存在之醫藥學上可接受之載劑，且其中治療包含投與該藥劑與包含抗CD20/抗CD3雙特異性抗體及視情況存在之醫藥學上可接受之載劑的組合物之組合。
  2. 如請求項1之用途，其中該抗CD20/抗CD3雙特異性抗體及該II型抗CD20抗體係用於以單一組合物一起投與，或用於以兩種或更多種不同組合物個別投與。
  3. 如請求項1或2之用途，其中該抗CD20/抗CD3雙特異性抗體及該II型抗CD20抗體係以兩種或更多種不同組合物投與，其中該兩種或更多種不同組合物係在不同時間點投與。
  4. 如請求項1或2之用途，其中該II型抗CD20抗體包含有包含SEQ ID NO: 4之重鏈CDR (HCDR) 1、SEQ ID NO: 5之HCDR2及SEQ ID NO: 6之HCDR3的重鏈可變區；及包含SEQ ID NO: 7之輕鏈CDR (LCDR) 1、SEQ ID NO: 8之LCDR2及SEQ ID NO: 9之LCDR3的輕鏈可變區。
  5. 如請求項1或2之用途，其中該II型抗CD20抗體包含SEQ ID NO: 10之重鏈可變區序列及SEQ ID NO: 11之輕鏈可變區序列。
  6. 如請求項1或2之用途，其中該II型抗CD20抗體係IgG抗體、尤其IgG1抗體，且其中該抗CD20抗體之Fc區中的至少約40%之N-連接寡醣係未經海藻糖基化的。
  7. 如請求項1或2之用途，其中該II型抗CD20抗體係奧濱尤妥珠單抗(Obinutuzumab)。
  8. 如請求項1或2之用途，其中該II型抗CD20抗體係用於與投與該抗CD20/抗CD3雙特異性抗體同時、之前或之後投與。
  9. 如請求項1或2之用途，其中該治療進一步包含投與抗PD-L1抗體、較佳阿特珠單抗(Atezolizumab)。
  10. 如請求項9之用途，其中該抗PD-L1抗體係用於個別投與或與該抗CD20/抗CD3雙特異性抗體及該II型抗CD20抗體中之至少一者組合投與。
  11. 如請求項1或2之用途，其中該抗CD20/抗CD3雙特異性抗體包含結合至CD3之第一抗原結合域及結合至CD20之第二抗原結合域。
  12. 如請求項11之用途，其中該抗CD20/抗CD3雙特異性抗體包含有包含重鏈可變區(VHCD3)及輕鏈可變區(VLCD3)之第一抗原結合域、及包含重鏈可變區(VHCD20)及輕鏈可變區(VLCD20)之第二抗原結合域。
  13. 如請求項11之用途，其中該抗CD20/抗CD3雙特異性抗體之該第一抗原結合域包含有包含SEQ ID NO: 97之CDR-H1序列、SEQ ID NO: 98之CDR-H2序列及SEQ ID NO: 99之CDR-H3序列的重鏈可變區(VHCD3)；及/或包含SEQ ID NO: 100之CDR-L1序列、SEQ ID NO: 101之CDR-L2序列及SEQ ID NO: 102之CDR-L3序列的輕鏈可變區(VLCD3)。
  14. 如請求項11之用途，其中該抗CD20/抗CD3雙特異性抗體之該第一抗原結合域包含有包含SEQ ID NO: 103之胺基酸序列的重鏈可變區(VHCD3)及/或包含SEQ ID NO: 104之胺基酸序列的輕鏈可變區(VLCD3)。
  15. 如請求項11之用途，其中該抗CD20/抗CD3雙特異性抗體之該第二抗原結合域包含有包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1序列、SEQ ID NO: 5之CDR-H2序列及SEQ ID NO: 6之CDR-H3序列的重鏈可變區(VHCD20)，及/或包含SEQ ID NO: 7之CDR-L1序列、SEQ ID NO: 8之CDR-L2序列及SEQ ID NO: 9之CDR-L3序列的輕鏈可變區(VLCD20)。
  16. 如請求項11之用途，其中該抗CD20/抗CD3雙特異性抗體之該第二抗原結合域包含有包含SEQ ID NO: 10之胺基酸序列的重鏈可變區(VHCD20)及/或包含SEQ ID NO: 11之胺基酸序列的輕鏈可變區(VLCD20)。
  17. 如請求項11之用途，其中該抗CD20/抗CD3雙特異性抗體包含結合於CD20之第三抗原結合域。
  18. 如請求項17之用途，其中該抗CD20/抗CD3雙特異性抗體之該第三抗原結合域包含有包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1序列、SEQ ID NO: 5之CDR-H2序列及SEQ ID NO: 6之CDR-H3序列的重鏈可變區(VHCD20)；及/或包含SEQ ID NO: 7之CDR-L1序列、SEQ ID NO: 8之CDR-L2序列及SEQ ID NO: 9之CDR-L3序列的輕鏈可變區(VLCD20)。
  19. 如請求項17之用途，其中該抗CD20/抗CD3雙特異性抗體之該第三抗原結合域包含有包含SEQ ID NO: 10之胺基酸序列的重鏈可變區(VHCD20)及/或包含SEQ ID NO: 11之胺基酸序列的輕鏈可變區(VLCD20)。
  20. 如請求項11之用途，其中該抗CD20/抗CD3雙特異性抗體之該第一抗原結合域係Fab重鏈及輕鏈之可變域或恆定域交換之互換Fab分子，且該第二及第三抗原結合域若存在，則係習知Fab分子。
  21. 如請求項20之用途，其中該抗CD20/抗CD3雙特異性抗體包含IgG1 Fc域。
  22. 如請求項21之用途，其中該抗CD20/抗CD3雙特異性抗體之IgG1 Fc域包含一或多個使與Fc受體之結合及/或效應功能降低之胺基酸取代。
  23. 如請求項21之用途，其中該抗CD20/抗CD3雙特異性抗體之該IgG1 Fc域包含胺基酸取代L234A、L235A及P329G(根據Kabat EU索引編號)。
  24. 如請求項21之用途，其中該抗CD20/抗CD3雙特異性抗體包含第三抗原結合域， 其中(i)該抗CD20/抗CD3雙特異性抗體之該第二抗原結合域在Fab重鏈C端與該第一抗原結合域之Fab重鏈N端融合，該抗CD20/抗CD3雙特異性抗體之該第一抗原結合域在Fab重鏈C端與該Fc域之第一亞單元之N端融合，且該抗CD20/抗CD3雙特異性抗體之該第三抗原結合域在Fab重鏈C端與該Fc域之第二亞單元之N端融合，或(ii)該抗CD20/抗CD3雙特異性抗體之該第一抗原結合域在該Fab重鏈C端與該第二抗原結合域之Fab重鏈N端融合，該抗CD20/抗CD3雙特異性抗體之該第二抗原結合域在該Fab重鏈C端與該Fc域之第一亞單元之N端融合，且該抗CD20/抗CD3雙特異性抗體之該第三抗原結合域在該Fab重鏈C端與該Fc域之第二亞單元之N端融合。
  25. 如請求項1或2之用途，其中該組合係用於以約一週至三週之時間間隔投與。
  26. 如請求項1或2之用途，其中在組合治療之前用II型抗CD20抗體、較佳奧濱尤妥珠單抗進行預治療，其中該預治療與該組合治療之間的時間段足以對該II型抗CD20抗體、較佳奧濱尤妥珠單抗起反應而減少個體之B細胞。
  27. 一種醫藥組合物，其包含用於組合治療之II型抗CD20抗體及視情況存在之醫藥學上可接受之載劑、及包含抗CD20/抗CD3雙特異性抗體及視情況存在之醫藥學上可接受之載劑的第二藥劑、及視情況存在之包含抗PD-L1抗體及視情況存在之醫藥學上可接受之載劑的第三藥劑，其係用於疾病、尤其癌症之組合治療中。
  28. 一種套組，其包含有包含II型抗CD20抗體及視情況存在之醫藥學上可接受之載劑之第一藥劑、及包含抗CD20/抗CD3雙特異性抗體及視情況存在之醫藥學上可接受之載劑之第二藥劑、及視情況存在之包含抗PD-L1抗體及視情況存在之醫藥學上可接受之載劑之第三藥劑，其係用於疾病、尤其癌症之組合治療中。
  29. 如請求項28之套組，其中該套組包含該第一藥劑及該第二藥劑及視情況存在之該第三藥劑用於治療個體之癌症或延緩其進展之使用說明書。
  30. 一種II型抗CD20抗體及抗CD20/抗CD3雙特異性抗體之組合之用途，其係用於製造用於治療性應用、較佳用於治療個體之增生性疾病、尤其癌症或延緩其進展之藥劑。
  31. 如請求項30之用途，其中該治療進一步包含向該個體投與抗PD-L1抗體。
  32. 一種抗CD20/抗CD3雙特異性抗體之用途，其係用於製造用於治療個體之癌症或延緩其進展之藥劑，其中該藥劑包含該抗CD20/抗CD3雙特異性抗體及視情況存在之醫藥學上可接受之載劑，且其中治療包含投與該藥劑與包含抗CD20抗體及視情況存在之醫藥學上可接受之載劑的組合物之組合。
  33. 如請求項32之用途，其中該抗CD20/抗CD3雙特異性抗體及該II型抗CD20抗體係用於以單一組合物一起投與，或用於以兩種或更多種不同組合物個別投與。
  34. 如請求項32或33之用途，其中該抗CD20/抗CD3雙特異性抗體及該II型抗CD20抗體係用於以兩種或更多種不同組合物投與，其中該兩種或更多種不同組合物係在不同時間點投與。
  35. 如請求項32或33之用途，其中該II型抗CD20抗體包含有包含SEQ ID NO: 4之重鏈CDR (HCDR) 1、SEQ ID NO: 5之HCDR2及SEQ ID NO: 6之HCDR3的重鏈可變區；及包含SEQ ID NO: 7之輕鏈CDR (LCDR) 1、SEQ ID NO: 8之LCDR2及SEQ ID NO: 9之LCDR3的輕鏈可變區。
  36. 如請求項32或33之用途，其中該II型抗CD20抗體包含SEQ ID NO: 10之重鏈可變區序列及SEQ ID NO: 11之輕鏈可變區序列。
  37. 如請求項32或33之用途，其中該II型抗CD20抗體係IgG抗體、尤其IgG1抗體，且其中該抗CD20抗體之Fc區中的至少約40%之N-連接寡醣係未經海藻糖基化的。
  38. 如請求項32或33之用途，其中該II型抗CD20抗體係奧濱尤妥珠單抗。
  39. 如請求項32或33之用途，其中該II型抗CD20抗體係用於與投與該抗CD20/抗CD3雙特異性抗體同時、之前或之後投與。
  40. 如請求項32或33之用途，其中該治療進一步包含投與抗PD-L1抗體、較佳阿特珠單抗。
  41. 如請求項40之用途，其中該抗PD-L1抗體係用於個別投與或與該抗CD20/抗CD3雙特異性抗體及該II型抗CD20抗體中之至少一者組合投與。
  42. 如請求項32或33之用途，其中該抗CD20/抗CD3雙特異性抗體包含結合至CD3之第一抗原結合域及結合至CD20之第二抗原結合域。
  43. 如請求項42之用途，其中該抗CD20/抗CD3雙特異性抗體包含有包含重鏈可變區(VHCD3)及輕鏈可變區(VLCD3)之第一抗原結合域，及包含重鏈可變區(VHCD20)及輕鏈可變區(VLCD20)之第二抗原結合域。
  44. 如請求項42之用途，其中該抗CD20/抗CD3雙特異性抗體之該第一抗原結合域包含有包含SEQ ID NO: 97之CDR-H1序列、SEQ ID NO: 98之CDR-H2序列及SEQ ID NO: 99之CDR-H3序列的重鏈可變區(VHCD3)；及/或包含SEQ ID NO: 100之CDR-L1序列、SEQ ID NO: 101之CDR-L2序列及SEQ ID NO: 102之CDR-L3序列的輕鏈可變區(VLCD3)。
  45. 如請求項42之用途，其中該抗CD20/抗CD3雙特異性抗體之該第一抗原結合域包含有包含SEQ ID NO: 103之胺基酸序列的重鏈可變區(VHCD3)及/或包含SEQ ID NO: 104之胺基酸序列的輕鏈可變區(VLCD3)。
  46. 如請求項42之用途，其中該抗CD20/抗CD3雙特異性抗體之該第二抗原結合域包含有包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1序列、SEQ ID NO: 5之CDR-H2序列及SEQ ID NO: 6之CDR-H3序列的重鏈可變區(VHCD20)，及/或包含SEQ ID NO: 7之CDR-L1序列、SEQ ID NO: 8之CDR-L2序列及SEQ ID NO: 9之CDR-L3序列的輕鏈可變區(VLCD20)。
  47. 如請求項42之用途，其中該抗CD20/抗CD3雙特異性抗體之該第二抗原結合域包含有包含SEQ ID NO: 10之胺基酸序列的重鏈可變區(VHCD20)及/或包含SEQ ID NO: 11之胺基酸序列的輕鏈可變區(VLCD20)。
  48. 如請求項42之用途，其中該抗CD20/抗CD3雙特異性抗體包含結合於CD20之第三抗原結合域。
  49. 如請求項48之用途，其中該抗CD20/抗CD3雙特異性抗體之該第三抗原結合域包含有包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1序列、SEQ ID NO: 5之CDR-H2序列及SEQ ID NO: 6之CDR-H3序列的重鏈可變區(VHCD20)；及/或包含SEQ ID NO: 7之CDR-L1序列、SEQ ID NO: 8之CDR-L2序列及SEQ ID NO: 9之CDR-L3序列的輕鏈可變區(VLCD20)。
  50. 如請求項48之用途，其中該抗CD20/抗CD3雙特異性抗體之該第三抗原結合域包含有包含SEQ ID NO: 10之胺基酸序列的重鏈可變區(VHCD20)及/或包含SEQ ID NO: 11之胺基酸序列的輕鏈可變區(VLCD20)。
  51. 如請求項42之用途，其中該抗CD20/抗CD3雙特異性抗體之該第一抗原結合域係Fab重鏈及輕鏈之可變域或恆定域交換之互換Fab分子，且該第二及第三抗原結合域若存在，則係習知Fab分子。
  52. 如請求項51之用途，其中該抗CD20/抗CD3雙特異性抗體包含IgG1 Fc域。
  53. 如請求項52之用途，其中該抗CD20/抗CD3雙特異性抗體之該IgG1 Fc域包含一或多個使與Fc受體之結合及/或效應功能降低之胺基酸取代。
  54. 如請求項52之用途，其中該抗CD20/抗CD3雙特異性抗體之該IgG1 Fc域包含胺基酸取代L234A、L235A及P329G(根據Kabat EU索引編號)。
  55. 如請求項52之用途，其中該抗CD20/抗CD3雙特異性抗體包含第三抗原結合域， 其中(i)該抗CD20/抗CD3雙特異性抗體之該第二抗原結合域在Fab重鏈C端與該第一抗原結合域之Fab重鏈N端融合，該抗CD20/抗CD3雙特異性抗體之該第一抗原結合域在Fab重鏈C端與該Fc域之第一亞單元之N端融合，且該抗CD20/抗CD3雙特異性抗體之該第三抗原結合域在Fab重鏈C端與該Fc域之第二亞單元之N端融合，或(ii)該抗CD20/抗CD3雙特異性抗體之該第一抗原結合域在該Fab重鏈C端與該第二抗原結合域之Fab重鏈N端融合，該抗CD20/抗CD3雙特異性抗體之該第二抗原結合域在該Fab重鏈C端與該Fc域之第一亞單元之N端融合，且該抗CD20/抗CD3雙特異性抗體之該第三抗原結合域在該Fab重鏈C端與該Fc域之第二亞單元之N端融合。
  56. 如請求項32或33之用途，其中該組合係用於以約一週至三週之時間間隔投與。
  57. 如請求項32或33之用途，其中在組合治療之前用II型抗CD20抗體、較佳奧濱尤妥珠單抗進行預治療，其中該預治療與該組合治療之間的時間段足以對該II型抗CD20抗體、較佳奧濱尤妥珠單抗起反應而減少個體之B細胞。
  58. 一種醫藥組合物，其包含用於組合治療之抗CD20/抗CD3雙特異性抗體及視情況存在之醫藥學上可接受之載劑、及包含II型抗CD20抗體及視情況存在之醫藥學上可接受之載劑的第二藥劑、及視情況存在之包含抗PD-L1抗體及視情況存在之醫藥學上可接受之載劑的第三藥劑，其係用於疾病、尤其癌症之組合治療中。
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