TW202011029A - 偵測及定量fgf21之方法 - Google Patents

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Abstract

本發明揭示之主題提供結合FGF21之抗體及其使用方法。特定而言，本發明提供用於偵測及定量樣品中之活性及總FGF21含量之免疫分析方法以及用於進行此類方法之套組。

Description

偵測及定量FGF21之方法
本發明係關於結合於FGF21之抗體以及使用該等抗體之免疫分析方法及套組。
纖維母細胞生長因子21 (FGF21)為FGF超家族之內分泌成員且在葡萄糖及脂類代謝之調控中起作用。FGF21需要FGF-受體(FGFR)同種型及膜結合共受體Klotho-β (KLB)來進行信號傳導(Ogawa等人Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104(18):7432-37 (2007)；US 2010/0184665)。FGF21為一種有效疾病調節蛋白，其對葡萄糖穩態及胰島素敏感性具有有益影響，且已在動物疾病模型中顯示逆轉肥胖症及2型糖尿病(Kharitonenkov等人J. Clin. Invest. 115(6): 1627-35 (2005))。已顯示投與重組FGF21會減少肝臟脂質，改良胰島素敏感性，且使瘦素信號傳導缺陷型(ob/ob或db/db)小鼠或高脂肪膳食(HFD)飼喂之小鼠中之血糖控制正常化(Dunshee等人J. Biol. Chem. 291(11):5986-96 (2016)；US 2015/0218276)。在每天用重組FGF21處理之肥胖及糖尿病恆河猴中亦已觀測到血糖減少及各種心血管危險因子提高。
FGF21可在N端與C端發生蛋白水解裂解，且已顯示此類裂解影響FGF21之活性。在N端，人類FGF21中具有序列His-Pro-Ile-Pro (HPIP (SEQ ID NO: 76))之頭四個胺基酸可由二肽基肽酶裂解(Dunshee等人(2016))。在C端，內肽酶纖維母細胞活化蛋白(FAP)裂解人類FGF21中具有胺基酸序列Ser-Gln-Gly-Arg-Ser-Pro-Ser-Tyr-Ala-Ser (SQGRSPSYAS (SEQ ID NO: 77))之最未端10個胺基酸(Dunshee等人(2016))。缺乏四個N端胺基酸之FGF21為完全活性的；而缺乏最後十個C端胺基酸之FGF21不能結合共受體KLB且為非活性的(Yie等人FEBS Letters 583:19-24 (2009))。
已提出循環FGF21為代謝病症(諸如糖尿病)之生物標記物，因為在肥胖個體中、患有非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)之個體中及患有2型糖尿病之個體中觀測到FGF21之血清含量增加(Zhang等人Diabetes 57(5):1246-1253 (2008)；Li等人Diabetes Res. Clin. Pract. 93(1):10-16 (2011))。鑒於FGF21在代謝病症之治療及發展中之顯著作用，此項技術中仍需要用於測定個體中FGF21蛋白之量的分析。
本發明提供結合纖維母細胞生長因子21 (FGF21)之抗體及此類抗體在用於偵測及定量樣品中之FGF21蛋白(例如總體及/或活性FGF21蛋白)之免疫分析方法中的用途。
在某些實施例中，本發明提供用於測定樣品中之總FGF21蛋白之量的免疫分析。舉例而言，但不限制，用於測定樣品中之總FGF21蛋白之量的方法可包括使結合於存在於FGF21之胺基酸殘基5-172內之抗原決定基的捕獲抗體與樣品接觸，以產生樣品-捕獲抗體組合物質，(b)使樣品-捕獲抗體組合物質與結合於存在於FGF21之胺基酸殘基5-172內之抗原決定基的偵測抗體接觸，(c)偵測結合於樣品-捕獲抗體組合物質之偵測抗體及(d)基於所結合之偵測抗體的水準計算存在於樣品中之總FGF21蛋白的量。在某些實施例中，捕獲抗體及偵測抗體結合於FGF21之胺基酸殘基5-172內之不同抗原決定基。
在某些實施例中，本發明提供用於測定樣品中之活性FGF21蛋白之量的免疫分析。舉例而言，但不限制，用於測定樣品中之活性FGF21蛋白之量的方法可包括(a)使結合於存在於FGF21之胺基酸殘基5-172內之抗原決定基的的捕獲抗體與樣品接觸，以產生樣品-捕獲抗體組合物質，(b)使樣品-捕獲抗體組合物質與結合於存在於FGF21之胺基酸殘基173-182內之抗原決定基的偵測抗體接觸，(c)偵測結合於樣品-捕獲抗體組合物質之偵測抗體及(d)基於所結合之偵測抗體的水準計算存在於樣品中之活性FGF21蛋白的量。
在某些實施例中，本發明提供用於測定樣品中活性FGF21蛋白與總FGF21蛋白之比率的免疫分析。舉例而言，但不限制，該方法可包括(i)使結合於存在於FGF21之胺基酸殘基5-172內之抗原決定基的第一捕獲抗體與樣品接觸，以產生第一樣品-捕獲抗體組合物質，(ii)使第一樣品-捕獲抗體組合物質與結合於存在於FGF21之胺基酸殘基5-172內之抗原決定基的第一偵測抗體接觸，(iii)偵測結合於樣品-捕獲抗體組合物質之第一偵測抗體及(iv)基於所結合之第一偵測抗體的水準計算存在於樣品中之總FGF21蛋白的量。在某些實施例中，該方法可進一步包括(i)使結合於存在於FGF21之胺基酸殘基5-172內之抗原決定基的第二捕獲抗體與樣品接觸，以產生第二樣品-捕獲抗體組合物質，(ii)使第二樣品-捕獲抗體組合物質與結合於存在於FGF21之胺基酸殘基173-182內之抗原決定基的第二偵測抗體接觸，(iii)偵測結合於樣品-捕獲抗體組合物質之第二偵測抗體及(iv)基於所結合之第二偵測抗體的水準計算存在於樣品中之活性FGF21蛋白的量。在某些實施例中，該方法可包括將所計算之總FGF21蛋白的量與所計算之活性FGF21蛋白的量相比較，以確定樣品中活性FGF21蛋白與總FGF21蛋白之比率。在某些實施例中，第一捕獲抗體與第二捕獲抗體為相同抗體。在某些實施例中，第一捕獲抗體及第一偵測抗體結合於FGF21之胺基酸殘基5-172內之不同抗原決定基。
在某些實施例中，免疫分析方法為酶聯免疫吸附分析(ELISA)。在某些實施例中，免疫分析方法以約2 pg/ml至約20 pg/ml之孔內靈敏度偵測樣品中之總體或活性FGF21蛋白的量。
在某些實施例中，免疫分析方法為單分子偵測分析，例如使用Quanterix Simoa HD-1 Analyzer™之單分子偵測分析。在某些實施例中，免疫分析方法以約0.2 pg/ml至約0.5 pg/ml之孔內靈敏度偵測樣品中之總體或活性FGF21蛋白的量。
本發明進一步提供用於進行免疫分析方法以便偵測及定量FGF21蛋白之套組。在某些實施例中，本發明提供用於測定樣品中之總FGF21蛋白之量的套組。舉例而言，但不限制，用於定量總FGF21蛋白之量的套組包括(a)捕獲抗體，其結合於存在於FGF21之胺基酸殘基5-172內之抗原決定基，(b)偵測抗體，其結合於存在於FGF21之胺基酸殘基5-172內之抗原決定基及(c)偵測劑。在某些實施例中，捕獲抗體及偵測抗體結合於FGF21之胺基酸殘基5-172內之不同抗原決定基。
在某些實施例中，本發明提供用於測定樣品中之活性FGF21蛋白之量的套組。舉例而言，但不限制，用於定量活性FGF21蛋白之量的套組包括(a)捕獲抗體，其結合於存在於FGF21之胺基酸殘基5-172內之抗原決定基，(b)偵測抗體，其結合於存在於FGF21之胺基酸殘基173-182內之抗原決定基及(c)偵測劑。
在某些實施例中，本發明提供用於測定樣品中之活性FGF21蛋白之量的套組。舉例而言，但不限制，用於測定樣品中活性FGF21蛋白與總FGF21蛋白之比率的套組可包括(a)第一捕獲抗體，其結合於存在於FGF21之胺基酸殘基5-172內之抗原決定基，(b)第一偵測抗體，其結合於存在於FGF21之胺基酸殘基5-172內之抗原決定基，(c)第二捕獲抗體，其結合於存在於FGF21之胺基酸殘基5-172內之抗原決定基，(d)第二偵測抗體，其結合於存在於FGF21之胺基酸殘基173-182內之抗原決定基及(e)一或多種偵測劑。在某些實施例中，第一捕獲抗體與第二捕獲抗體為相同抗體。在某些實施例中，第一捕獲抗體及第一偵測抗體結合於FGF21之胺基酸殘基5-172內之不同抗原決定基。
在某些實施例中，用於偵測偵測抗體、第一偵測抗體及/或第二偵測抗體之偵測劑可選自由以下組成之群：鏈黴親和素-β-D-半乳哌喃糖接合物、鏈黴親和素-辣根過氧化酶接合物及其組合。在某些實施例中，鏈黴親和素-β-D-半乳哌喃糖接合物具有約100 pM至約400 pM之濃度。
在某些實施例中，本發明之套組可進一步包括試鹵靈(resorufin) β-D-半乳哌喃糖苷、四甲基聯苯胺、過氧化氫或其組合。舉例而言，但不限制，本發明之套組可包括鏈黴親和素-β-D-半乳哌喃糖接合物作為偵測劑且可進一步包括試鹵靈β-D-半乳哌喃糖苷。在某些實施例中，本發明之套組可包括鏈黴親和素-辣根過氧化酶接合物作為偵測劑且可進一步包括四甲基聯苯胺及過氧化氫。
在某些實施例中，本文所揭示之套組以約2 pg/ml至約20 pg/ml之孔內靈敏度偵測樣品中之總體或活性FGF21蛋白的量。在某些實施例中，本文所揭示之套組以約0.2 pg/ml至約0.5 pg/ml之孔內靈敏度偵測樣品中之總體或活性FGF21蛋白的量。
在某些實施例中，捕獲抗體、第一捕獲抗體或第二捕獲抗體固定至順磁性珠粒。在某些實施例中，捕獲抗體、第一捕獲抗體及/或第二捕獲抗體以約10-10 M至10-13 M之Kd 結合於FGF21。在某些實施例中，偵測抗體、第一偵測抗體及第二偵測抗體接合至生物素。在某些實施例中，偵測抗體及/或第一偵測抗體以約10-10 M至10-13 M之Kd 結合於FGF21。在某些實施例中，用於測定總FGF21蛋白之量的偵測抗體及/或第一偵測抗體具有約0.1 μg/ml至約1 μg/ml之濃度。在某些實施例中，用於測定活性FGF21蛋白之量的偵測抗體及/或第二偵測抗體具有約1 μg/ml至約3 μg/ml之濃度。
在某些實施例中，捕獲抗體、第一捕獲抗體及/或第二捕獲抗體包括以下各項或競爭性結合於包括以下各項之抗體：(a)重鏈可變區CDR1，其包含選自由SEQ ID NO: 26及27 (例如26)組成之群的胺基酸序列及其保守取代，(b)重鏈可變區CDR2結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 30及31 (例如30)組成之群的胺基酸序列及其保守取代，(c)重鏈可變區CDR3結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 34及35 (例如34)組成之群的胺基酸序列及其保守取代，(d)輕鏈可變區CDR1結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 38及39 (例如38)組成之群的胺基酸序列及其保守取代，(e)輕鏈可變區CDR2結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 42及43 (例如42)組成之群的胺基酸序列及其保守取代及(f)輕鏈可變區CDR3結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 46及47 (例如46)組成之群的胺基酸序列及其保守取代。
在某些實施例中，捕獲抗體、第一捕獲抗體及/或第二捕獲抗體包括以下各項或競爭性結合於包括以下各項之抗體：(a)重鏈可變區，其包含選自由SEQ ID NO: 54、55、74及75 (例如54)組成之群的胺基酸序列及其保守取代；及(b)輕鏈可變區，其包含選自由SEQ ID NO: 50、51、70及71 (例如50)組成之群的胺基酸序列及其保守取代。在某些實施例中，捕獲抗體、第一捕獲抗體及/或第二捕獲抗體包括以下各項或競爭性結合於包括以下各項之抗體：(a)重鏈，其包含選自由SEQ ID NO: 22、23、66及67 (例如22)組成之群的胺基酸序列及其保守取代；及(b)輕鏈，其包含選自由SEQ ID NO: 18、19、62及63 (例如18)組成之群的胺基酸序列及其保守取代。
在某些實施例中，偵測抗體及/或第一偵測抗體包括以下各項或競爭性結合於包括以下各項之抗體：(a)重鏈可變區CDR1，其包含選自由SEQ ID NO: 28及29 (例如29)組成之群的胺基酸序列及其保守取代，(b)重鏈可變區CDR2結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 32及33 (例如33)組成之群的胺基酸序列及其保守取代，(c)重鏈可變區CDR3結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 36及37 (例如37)組成之群的胺基酸序列及其保守取代，(d)輕鏈可變區CDR1結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 40及41 (例如41)組成之群的胺基酸序列及其保守取代，(e)輕鏈可變區CDR2結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 44及45 (例如45)組成之群的胺基酸序列及其保守取代及(f)輕鏈可變區CDR3結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 48及49 (例如49)組成之群的胺基酸序列及其保守取代。
在某些實施例中，偵測抗體及/或第一偵測抗體包括以下各項或競爭性結合於包括以下各項之抗體：(a)重鏈可變區，其包含選自由SEQ ID NO: 56、57、72及73 (例如57)組成之群的胺基酸序列及其保守取代；及(b)輕鏈可變區，其包含選自由SEQ ID NO: 52、53、68及69 (例如53)組成之群的胺基酸序列及其保守取代。在某些實施例中，偵測抗體及/或第一偵測抗體包括以下各項或競爭性結合於包括以下各項之抗體： (a)重鏈，其包含選自由SEQ ID NO: 24、25、64及65 (例如25)組成之群的胺基酸序列及其保守取代；及(b)輕鏈，其包含選自由SEQ ID NO: 20、21、60及61 (例如21)組成之群的胺基酸序列及其保守取代。
在某些實施例中，所揭示之免疫分析方法中所用之抗體可為單株抗體、嵌合抗體、人類化抗體或人類抗體。在某些實施例中，所揭示之免疫分析方法中所用之抗體可為抗體片段，例如Fv、Fab、Fab’、scFv、雙功能抗體或F(ab’)2 片段。
在某些實施例中，所分析之樣品為自個體獲得之血液樣品。在某些實施例中，樣品為自個體獲得之血漿樣品。
本發明進一步提供經分離之抗FGF21抗體。在某些實施例中，經分離之抗FGF21抗體或其抗原結合部分包含：(a)重鏈可變區CDR1，其包含選自由SEQ ID NO: 26-29組成之群的胺基酸序列及其保守取代； (b)重鏈可變區CDR2結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 30-33組成之群的胺基酸序列及其保守取代； (c)重鏈可變區CDR3結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 34-37組成之群的胺基酸序列及其保守取代； (d)輕鏈可變區CDR1結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 38-41組成之群的胺基酸序列及其保守取代； (e)輕鏈可變區CDR2結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 42-45組成之群的胺基酸序列及其保守取代；及(f)輕鏈可變區CDR3結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 46-49組成之群的胺基酸序列及其保守取代。
在某些實施例中，經分離之抗FGF21抗體或其抗原結合部分包含： (a)重鏈可變域(VH)序列，其包含選自由SEQ ID NO: 54-57及72-75組成之群的胺基酸序列；及(b)輕鏈可變域(VH)序列，其包含選自由SEQ ID NO: 50-53及68-71組成之群的胺基酸序列。在某些實施例中，經分離之抗FGF21抗體或其抗原結合部分包含： (a)重鏈序列，其包含選自由SEQ ID NO: 22-25及64-67組成之群的胺基酸序列；及(b)輕鏈序列，其包含選自由SEQ ID NO: 18-21及60-63組成之群的胺基酸序列。
相關申請案之交叉參考
本申請案主張2018年4月4日申請之美國臨時申請案第62/652,701號之權益，該臨時申請案之揭示內容以全文引用之方式併入本文中。序列表
本申請案含有序列表，其已以ASCII格式經由EFS網提交且以全文引用之方式併入本文中。該ASCII拷貝創建於2019年4月2日，名稱為00B206_0809_SL.txt且大小為105,595位元組。
為清楚起見，但不限制，將當前所揭示之主題的詳細描述分成以下小節： I. 定義； II. 免疫分析； III. 抗體； IV. 套組；及 V. 示例性實施例。I. 定義
除非另外定義，否則本文中所用之所有技術及科學術語具有熟習本發明所屬技術者通常所理解之含義。以下參考文獻為熟習此項技術者提供本發明中所用之許多術語之一般定義：Singleton等人, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (第2版1994)；The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker編, 1988)；The Glossary of Genetics, 第5版, R. Rieger等人(編), Springer Verlag (1991)；及Hale及Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。除非另外指定，否則如本文所用，以下術語具有以下歸屬於它們之含義。
如本文所用，術語「約」或「大約」可意謂在如由一般熟習此項技術者所確定之特定值的可接受誤差範圍內，其將部分取決於如何量測或測定該值，例如量測系統之限制。舉例而言，「約」可意謂給定值根據實踐在1個或大於1個標準偏差以內。在本申請案及申請專利範圍中描述特定值之情況下，除非另外說明，否則術語「約」可意謂特定值之可接受誤差範圍，諸如由術語「約」修飾之值±10%。
如本文中可互換使用之術語「多肽」及「蛋白質」係指任何長度之胺基酸聚合物。聚合物可為直鏈或分枝鏈的，其可包含經修飾之胺基酸，且其可由非胺基酸間斷開。該等術語亦涵蓋已天然地或藉由干預(例如二硫鍵形成、糖基化、脂化、乙醯化、磷酸化或任何其他操縱或修飾(諸如與標記組分接合))加以修飾之胺基酸聚合物。該定義內亦包括例如含有一或多種胺基酸類似物(包括例如非天然胺基酸等)以及此項技術中已知之其他修飾之多肽。如本文所用之術語「多肽」及「蛋白質」特定而言涵蓋抗體。
除非另外指出，否則如本文所用，術語「纖維母細胞生長因子21」或「FGF21」係指來自任何脊椎動物來源，包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類)及囓齒動物(例如小鼠及大鼠)之任何天然FGF21。該術語涵蓋「全長」未加工之FGF21以及由細胞中之加工產生之任何形式的FGF21。除非另外指出，否則該術語亦涵蓋天然存在之FGF21變異體，例如剪接變異體或對偶變異體。以下顯示全長人類FGF21胺基酸之非限制性實例： HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS (SEQ ID NO: 1)。
如本文所用，術語「總FGF21」包括未加工形式之FGF21以及由細胞加工產生之所有形式的FGF21，例如N端裂解之FGF21及C端裂解之FGF21。缺乏十個C端胺基酸之人類FGF21胺基酸之非限制性實例為： HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGP (SEQ ID NO: 58)。缺乏4個N端胺基酸之人類FGF21胺基酸之非限制性實例為： DSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS (SEQ ID NO: 59)。舉例而言，但不限制，術語「總FGF21」包括具有SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 58或SEQ ID NO: 59中所闡述之胺基酸序列的FGF21蛋白。
如本文所用，術語「活性FGF21」係指保留C端片段之FGF21蛋白。在某些實施例中，該術語包括經加工形式之FGF21，諸如其中FGF21之N端片段(例如SEQ ID NO: 1之胺基酸殘基1-4)已裂解之彼等形式。舉例而言，但不限制，術語「活性FGF21」包括具有SEQ ID NO: 1中所闡述之胺基酸序列或SEQ ID NO: 59中所闡述之胺基酸序列的FGF21蛋白。
術語「抗體」在本文中以廣義使用且涵蓋各種抗體結構，包括但不限於單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)及抗體片段，只要其展現所需抗原結合活性即可。
「抗體片段」係指不是完整抗體之分子，其包含完整抗體中結合與完整抗體結合之抗原的部分。抗體片段之實例包括但不限於Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2 ；雙功能抗體；線性抗體；單鏈抗體分子(例如scFv)；及由抗體片段形成之多特異性抗體。
「結合相關抗原(例如FGF21蛋白)」之抗體為以足夠親和力結合抗原以使得抗體適合作為分析試劑(例如作為捕獲抗體或作為偵測抗體)之抗體。典型地，此類抗體不會顯著地與其他多肽交叉反應。關於多肽結合於目標分子，術語「特異性結合特定多肽或特定多肽靶標上之抗原決定基」或「特異性結合於特定多肽或特定多肽靶標上之抗原決定基」或「對特定多肽或特定多肽靶標上之抗原決定基具特異性」意謂結合可量測地不同於非特異性相互作用。特異性結合可例如藉由測定與對照分子之結合相比目標分子之結合來量測，該對照分子通常為具有類似結構且不具有結合活性之分子。
術語「抗FGF21抗體」係指能夠以足夠親和力結合FGF21使得抗體適合作為靶向FGF21之藥劑(例如作為本文所描述之分析中的藥劑)的抗體。在某些實施例中，如例如藉由放射免疫分析(RIA)所量測，抗FGF21抗體結合於不相關、非FGF21蛋白之程度不到該抗體結合於FGF21之約10%。在某些實施例中，結合於FGF21之抗體具有≤ 1 M、≤ 100 mM、≤ 10 mM、≤ 1 mM、≤ 100 μM、≤ 10 μM、≤ 1μM、≤ 100 nM、≤ 10 nM、≤ 1 nM、≤ 0.1 nM、≤ 0.01 nM或≤ 0.001 nM之解離常數(Kd )。在某些實施例中，本文所揭示之結合於FGF21之抗體的Kd 可為10-3 M或更小或10-8 M或更小，例如10-8 M至10-13 M，例如10-9 M至10-13 M。在某些實施例中，本文所揭示之結合於FGF21之抗體的Kd 可為10-10 M至10-13 M。在某些實施例中，抗FGF21抗體結合於FGF21之在來自不同物種之FGF21間保守的抗原決定基。
用於本文目的之「受體人類構架」為包含如下文所定義之衍生自人類免疫球蛋白構架或人類共同構架之輕鏈可變域(VL)構架或重鏈可變域(VH)構架之胺基酸序列的構架。「衍生自」人類免疫球蛋白構架或人類共同構架之受體人類構架可包含其相同胺基酸序列，或其可含有胺基酸序列變化。在某些實施例中，胺基酸之數目變化為10或更少、9或更少、8或更少、7或更少、6或更少、5或更少、4或更少、3或更少或2或更少。在某些實施例中，VL受體人類構架之序列與VL人類免疫球蛋白構架序列或人類共同構架序列相同。
「親和力」係指分子(例如抗體)之單一結合位點與其結合配偶體(例如抗原)之間的非共價相互作用之總和強度。除非另有指示，否則如本文所用，「結合親和力」係指固有結合親和力，其反映結合對成員(例如抗體及抗原)之間的1:1相互作用。分子X對其配偶體Y之親和力通常可由解離常數(Kd )表示。親和力可藉由此項技術中已知之常用方法來量測，包括本文所描述之彼等方法。用於量測結合親和力之特定說明性及示例性實施例描述於下文中。
「親和力成熟」之抗體係指與不具有改變之親本抗體相比在一或多個高變區(CDR)中具有一或多處改變的抗體，此類改變引起抗體對抗原親和力之改良。
「抗體與參考抗體競爭結合」係指抗體在競爭分析中將參考抗體與其抗原之結合阻斷50%或更多，且相反地，參考抗體在競爭分析中將抗體與其抗原之結合阻斷50%或更多。示例性競爭分析描述於「Antibodies」, Harlow及Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY)中。
如本文所用，「捕獲抗體」係指特異性結合樣品中之目標分子(例如一種形式之FGF21)的抗體。在某些條件下，捕獲抗體與目標分子形成複合物使得抗體-靶標分子複合物可與樣品之其餘部分分離。在某些實施例中，此類分離可包括洗掉樣品中不結合捕獲抗體之物質或材料。在某些實施例中，捕獲抗體可附接至固體支撐物表面，諸如但不限於板或珠粒，例如順磁性珠粒。
如本文所用，「偵測抗體」係指特異性結合樣品中或樣品-捕獲抗體組合物質中之目標分子的抗體。在某些條件下，偵測抗體與目標分子或與目標分子-捕獲抗體複合物形成複合物。偵測抗體能夠直接通過可經擴增之標記或間接地例如通過使用經標記且結合偵測抗體之另一抗體來偵測。對於直接標記，偵測抗體典型地接合至可藉由一些手段偵測之例如包括但不限於生物素或釕之部分。
術語「嵌合」抗體係指重鏈及/或輕鏈之一部分衍生自特定來源或物種，而重鏈及/或輕鏈之其餘部分衍生自不同來源或物種的抗體。
抗體之「類別」係指其重鏈所具有之恆定域或恆定區的類型。存在五種主要類別之抗體：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且此等類別中之若干可進一步劃分成諸多個子類(同型)，例如IgG1 、IgG2 、IgG3 、IgG4 、IgA1 及IgA2 。對應於不同類別之免疫球蛋白的重鏈恆定域分別稱為α、δ、ε、γ及μ。
如本文所用之術語「細胞毒性劑」係指抑制或阻止細胞功能及/或引起細胞死亡或破壞之物質。細胞毒性劑包括但不限於放射性同位素(例如At211 、I131 、I125 、Y90 、Re186 、Re188 、Sm153 、Bi212 、P32 、Pb212 及Lu之放射性同位素)；化學治療劑或藥物(例如胺甲喋呤、亞德里亞黴素(adriamicin)、長春花生物鹼(長春新鹼、長春花鹼、依託泊苷(etoposide))、阿黴素(doxorubicin)、美法侖(melphalan)、絲裂黴素C、氮芥苯丁酸、道諾黴素(daunorubicin)或其他***劑)；生長抑制劑；酶及其片段，諸如溶核酶；抗生素；毒素，諸如細菌、真菌、植物或動物來源之小分子毒素或酶促活性毒素，包括其片段及/或其變異體；及下文揭示之各種抗腫瘤或抗癌劑。
「效應功能」係指可歸因於抗體之Fc區的彼等生物活性，其隨抗體同型而變化。抗體效應功能之實例包括：C1q結合及補體依賴性細胞毒性(CDC)；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)；噬菌作用；細胞表面受體(例如B細胞受體)之下調；及B細胞活化。
術語「Fc區」在本文中用於定義免疫球蛋白重鏈之C端區，其含有恆定區之至少一部分。該術語包括天然序列Fc區及變異體Fc區。在某些實施例中，人類IgG重鏈Fc區自Cys226或自Pro230延伸至重鏈之羧基端。然而，Fc區之C端離胺酸(Lys447)可能存在或可能不存在。除非本文中另外指明，否則Fc區或恆定區中之胺基酸殘基的編號係如Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest , 第5版Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991中所描述，根據EU編號系統(亦稱為EU索引)來進行。
「構架」或「FR」係指除高變區(CDR)殘基外之可變域殘基。可變域之FR通常由四個FR域組成：FR1、FR2、FR3及FR4。因此，CDR及FR序列通常按以下順序出現在VH (或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
術語「全長抗體」、「完整抗體」及「全抗體」在本文中可互換地用於指具有實質上類似於天然抗體結構之結構或具有含有如本文所定義之Fc區的重鏈之抗體。
「人類抗體」為具有如下胺基酸序列之抗體，該胺基酸序列對應於由人類或人類細胞產生或衍生自非人類來源之抗體的胺基酸序列，該非人類來源利用人類抗體譜或其他人類抗體編碼序列。此人類抗體定義特定地排除包含非人類抗原結合殘基之人類化抗體。
「人類共同構架」為代表在人類免疫球蛋白VL或VH構架序列之選擇中最常出現之胺基酸殘基的構架。通常，人類免疫球蛋白VL或VH序列之選擇係來自可變域序列之亞群。通常，序列亞群為如Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest , 第五版, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), 第1-3卷中之亞群。在某些實施例中，對於VL，該亞群為如Kabat等人，同上中之亞群κ I。在某些實施例中，對於VH，該亞群為如Kabat等人，同上中之亞群III。
「人類化」抗體係指包含來自非人類CDR之胺基酸殘基及來自人類FR之胺基酸殘基的嵌合抗體。在某些實施例中，人類化抗體將包含至少一個(且典型地兩個)可變域的實質上全部，其中所有或實質上所有CDR (例如CDR)對應於非人類抗體之彼等HVR，且所有或實質上所有FR對應於人類抗體之彼等FR。人類化抗體視情況可包含衍生自人類抗體之抗體恆定區的至少一部分。抗體(例如非人類抗體)之「人類化形式」係指已經歷人類化之抗體。
如本文所用，術語「高變區」或「CDR」係指抗體可變域中序列高度可變(本文中亦稱為「互補決定區」或「CDR」)及/或形成結構確定之環(「高變環」)及/或含有抗原接觸殘基(「抗原接點」)之區域中的每一者。除非另外指出，否則可變域中之CDR殘基及其他殘基(例如FR殘基)在本文中係根據Kabat等人，同上來編號。通常，抗體包含六個CDR：三個在VH中(H1、H2、H3)，且三個在VL中(L1、L2、L3)。本文中之示例性CDR包括： (a) 存在於胺基酸殘基26-32 (L1)、50-52 (L2)、91-96 (L3)、26-32 (H1)、53-55 (H2)及96-101 (H3)處之高變環(Chothia及Lesk,J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))； (b) 存在於胺基酸殘基24-34 (L1)、50-56 (L2)、89-97 (L3)、31-35b (H1)、50-65 (H2)及95-102 (H3)處之CDR (Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest , 第5版Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))； (c) 存在於胺基酸殘基27c-36 (L1)、46-55 (L2)、89-96 (L3)、30-35b (H1)、47-58 (H2)及93-101 (H3)處之抗原接點(MacCallum等人J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996))；及 (d) (a)、(b)及/或(c)之組合，包括CDR胺基酸殘基46-56 (L2)、47-56 (L2)、48-56 (L2)、49-56 (L2)、26-35 (H1)、26-35b (H1)、49-65 (H2)、93-102 (H3)及94-102 (H3)。
「免疫接合物」係指抗體接合至一或多個異源分子，包括但不限於細胞毒性劑。
「經分離」之抗體為已與天然環境之組分分離的抗體。在某些實施例中，如藉由例如電泳(例如SDS-PAGE、等電聚焦(IEF)、毛細管電泳)或層析(例如離子交換或逆相HPLC)所測定，將抗體純化至大於95%或99%之純度。關於用於評估抗體純度之方法的綜述，參見例如Flatman等人,J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)。
「經分離」之核酸係指已與天然環境之組分分離之核酸分子。經分離之核酸包括如下細胞中所含之核酸分子，該等細胞通常含有該核酸分子，但該核酸分子存在於染色體外或不同於其天然染色體位置之染色體位置。
「編碼抗體(包括提及特異性抗體，例如抗FGF21抗體)之經分離之核酸」係指編碼抗體重鏈及輕鏈(或其片段)之一或多個核酸分子，包括單一載體或分開之載體中的此類核酸分子，及存在於宿主細胞中之一或多個位置的此類核酸分子。
如本文所用，術語「單株抗體」係指獲自實質上均質之抗體群體(亦即構成群體之個別抗體為相同的及/或結合相同抗原決定基)的抗體，除了例如含有天然存在之突變或在單株抗體製劑之製備期間出現之可能的變異體抗體，此類變異體通常以微小量存在。與典型地包括針對不同決定位(抗原決定基)之不同抗體的多株抗體製劑相比之下，單株抗體製劑之各單株抗體係針對抗原上之單一決定位。因此，修飾語「單株」指示抗體之特徵為獲自實質上均質之抗體群體，且不應視為需要藉由任何特定方法來產生抗體。舉例而言，要根據目前揭示之主題使用之單株抗體可藉由多種技術來製備，包括但不限於雜交瘤法、重組DNA法、噬菌體展示法及利用含有全部或部分之人類免疫球蛋白基因座之基因轉殖動物的方法，此類方法及用於製備單株抗體之其他示例性方法描述於本文中。
「裸抗體」係指未接合至異源部分(例如細胞毒性部分)或放射性標記之抗體。裸抗體可存在於醫藥調配物中。
「天然抗體」係指具有不同結構之天然存在之免疫球蛋白分子。舉例而言，天然IgG抗體為約150,000道耳頓(dalton)之雜四聚醣蛋白，其由二硫鍵鍵結之兩個相同輕鏈及兩個相同重鏈組成。自N端至C端，各重鏈具有可變區(VH)，亦稱為可變重結構域或重鏈可變域，隨後為三個恆定域(CH1、CH2及CH3)。類似地，自N端至C端，各輕鏈具有可變區(VL)，亦稱為可變輕結構域或輕鏈可變域，隨後為恆定輕(CL)結構域。抗體之輕鏈可基於其恆定域之胺基酸序列分配至稱為κ及λ之兩種類型中之一者。
如本文所用，「經純化」之多肽(例如抗體)係指多肽之純度已增加，使得其以與其存在於其天然環境中及/或當最初在實驗室條件下合成及/或擴增時相比更純之形式存在。純度為相對項且不一定意謂絕對純度。
如本文所用，術語「包裝插頁」係指照例包括於商業包裝中且含有關於包裝組分之使用之資訊的說明書。
相對於參考多肽序列之「胺基酸序列一致性百分比(%)」定義為在比對序列且在必要時引入間隙以實現最大序列一致性百分比之後，在候選序列中與參考多肽序列中之胺基酸殘基相同的胺基酸殘基之百分比，並且不將任何保守取代視為序列一致性之一部分。出於測定胺基酸序列一致性百分比之目的而進行比對可以此項技術內之各種方式來達成，例如使用公共可獲得之電腦軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)軟體。熟習此項技術者可確定用於比對序列之適當參數，包括在所比較之序列的整個長度上達成最大比對所需之任何算法。然而，出於本文之目的，使用序列比較電腦程式ALIGN-2來產生胺基酸序列一致性%值。ALIGN-2序列比較電腦程式由Genentech, Inc.創作，且源代碼已與用戶文檔一起提交給美國版權局(U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559)，其登記在美國版權登記號TXU510087下。ALIGN-2程式為自Genentech, Inc., South San Francisco, California公共可獲得的，或可由源代碼編譯而來。ALIGN-2程式應經編譯用於在UNIX作業系統，包括數位UNIX V4.0D上使用。所有序列比較參數係藉由ALIGN-2程式設定且不改變。
在採用ALIGN-2進行胺基酸序列比較之情況中，給定胺基酸序列A對、與或相對於給定胺基酸序列B之胺基酸序列一致性%(其可替代地用片語表述為給定胺基酸序列A對、與或相對於給定胺基酸序列B具有或包含某一胺基酸序列一致性%)係如下計算： 100×分數X/Y 其中X為在序列比對程式ALIGN-2之A與B之比對中由該程式評為一致匹配之胺基酸殘基的數目，且其中Y為B中之胺基酸殘基的總數目。應瞭解，在胺基酸序列A之長度與胺基酸序列B之長度不同的情況下，A對B之胺基酸序列一致性%與B對A之胺基酸序列一致性%將不相等。除非另外特別陳述，否則本文中所用之所有胺基酸序列一致性%值係如前一段落中所描述使用ALIGN-2電腦程式獲得。
術語「可變區」或「可變域」係指抗體重鏈或輕鏈中參與抗體與抗原之結合的結構域。天然抗體之重鏈及輕鏈之可變域(分別為VH及VL)通常具有類似結構，各結構域包含四個保守構架區(FR)及三個高變區(CDR)。(參見例如Kindt等人Kuby Immunology , 第6版, W.H. Freeman and Co., 第91頁(2007)。)單一VH或VL結構域可足以賦予抗原結合特異性。此外，結合特定抗原之抗體可使用來自結合該抗原之抗體的VH或VL結構域分別篩選互補VL或VH結構域之文庫而加以分離。參見例如Portolano等人,J. Immunol. 150:880-887 (1993)；Clarkson等人,Nature 352:624-628 (1991)。
如本文中可互換使用之術語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及「宿主細胞培養物」係指已向其中引入外源性核酸之細胞，包括此類細胞之子代。宿主細胞包括「轉型體」及「轉型細胞」，其包括原代轉型細胞及由其衍生之子代，不考慮代數。子代之核酸內容可不與親本細胞完全相同，而是可含有突變。本文中包括具有與在最初轉型之細胞中所篩選或選擇相同之功能或生物活性的突變體子代。
如本文所用，術語「載體」係指能夠使與其連接之另一核酸增殖之核酸分子。該術語包括作為自我重複核酸結構之載體以及併入其已引入之宿主細胞的基因組中之載體。某些載體能夠引導與其可操作地連接之核酸的表現。此類載體在本文中稱為「表現載體」。
如本文所用，術語「標記」或「可偵測標記」係指可連接至所要偵測或定量之物質(例如抗體)的任何化學基團或部分。標記為適合於物質之靈敏偵測或定量的可偵測標記。可偵測標記之非限制性實例包括但不限於冷光標記(例如螢光、磷光、化學冷光、生物冷光及電化學冷光標記)、放射性標記、酶、粒子、磁性物質、電活性物質及類似物。或者，可偵測標記可藉由參與特定結合反應指示其存在。此類標記之非限制性實例包括半抗原、抗體、生物素、鏈黴親和素、his-標籤、氮基三乙酸、麩胱甘肽S-轉移酶、麩胱甘肽及類似物。
如本文所用，術語「偵測手段」係指用於通過接著在分析中讀出之信號報導來偵測可偵測抗體之存在的部分或技術。典型地，偵測手段採用試劑，例如偵測劑，其擴增經固定之標記，諸如捕獲至微量滴定板上之標記，例如親和素、鏈黴親和素-HRP或鏈黴親和素-β-D-半乳哌喃糖。
本文中使用術語「偵測」來包括目標分子(例如FGF21或其經加工之形式)之定性與定量量測兩者。在某些實施例中，偵測包括鑑定樣品中僅僅是存在目標分子以及確定目標分子是否以可偵測水準存在於樣品中。
如本文中可互換使用之「個體(individual/subject)」為哺乳動物。哺乳動物包括但不限於馴養動物(例如牛、綿羊、貓、狗及馬)、靈長類動物(例如人類及非人類靈長類動物，諸如猴)、兔及囓齒動物(例如小鼠及大鼠)。在某些實施例中，個體(individual/subject)為人類。
如本文所用，「樣品」係指較大量之材料中的一小部分。在某些實施例中，樣品包括但不限於培養物中之細胞、細胞上清液、細胞溶解產物、血清、血漿、生物流體(例如血液、血漿、血清、糞便、尿液、淋巴液、腹水、乳管灌洗液、唾液及腦脊髓液)及組織樣品。樣品之來源可為實體組織(例如來自新鮮、冷凍及/或保存之器官、組織樣品、活組織切片或吸出物)、血液或任何血液組成、體液(諸如尿液、淋巴液、腦脊髓液、羊水、腹膜液或間隙液)或來自個體之細胞，包括循環細胞。II. 免疫分析
當前所揭示之主題提供偵測及定量FGF21蛋白之方法。在某些實施例中，本發明提供用於測定樣品中之總FGF21及/或活性FGF21蛋白之量的免疫分析。本發明進一步提供用於測定樣品中活性FGF21蛋白與總FGF21蛋白之比率的免疫分析方法。在某些實施例中，本發明之免疫分析方法使用本文所揭示之抗FGF21抗體。用於當前所揭示之方法中的抗FGF21抗體之非限制性實例提供於表8-13及16-19中。
在某些實施例中，本發明提供用於偵測及定量人類FGF21蛋白之免疫分析方法。舉例而言，該等免疫分析方法可用於偵測及定量樣品中之FGF21，例如總人類FGF21及/或活性人類FGF21蛋白。本發明之免疫分析方法可併有此項技術中已知之策略，包括但不限於夾心分析、酶聯免疫吸附分析(ELISA)分析、數位形式之ELISA、電化學分析(ECL)及磁性免疫分析。在某些實施例中，免疫分析方法為單分子免疫分析，例如使用單分子陣列。舉例而言，但不限制，免疫分析方法可使用Quanterix儀器(例如Simoa HD-1 Analyzer™)來進行。
在某些實施例中，本發明之方法包括使獲自個體之樣品與捕獲抗FGF21抗體(諸如本文所描述之彼等抗體)在允許捕獲抗FGF21抗體與樣品中之FGF21蛋白結合的條件下接觸。舉例而言，但不限制，可將樣品與結合於存在於FGF21上之抗原決定基之捕獲抗體一起孵育，以產生樣品-捕獲抗體組合物質。孵育樣品及捕獲抗體之條件可經選擇以使分析之靈敏度最大化及/或使解離最小化，並且確保存在於樣品中之FGF21蛋白結合於捕獲抗體。
在某些實施例中，用於本文所揭示之免疫分析方法中之捕獲抗體可以約0.1 μg/ml至約5.0 μg/ml之濃度使用。舉例而言，但不限制，捕獲抗體可按以下濃度使用：約0.1 μg/ml至約0.5 μg/ml、約0.1 μg/ml至約1.0 μg/ml、約0.1 μg/ml至約1.5 μg/ml、約0.1 μg/ml至約2.0 μg/ml、約0.1 μg/ml至約2.5 μg/ml、約0.1 μg/ml至約3.0 μg/ml、約0.1 μg/ml至約3.5 μg/ml、約0.1 μg/ml至約4.0 μg/ml、約0.1 μg/ml至約4.5 μg/ml、約0.5 μg/ml至約5.0 μg/ml、約1.0 μg/ml至約5.0 μg/ml、約1.5 μg/ml至約5.0 μg/ml、約2.0 μg/ml至約5.0 μg/ml、約2.5 μg/ml至約5.0 μg/ml、約3.0 μg/ml至約5.0 μg/ml、約3.5 μg/ml至約5.0 μg/ml、約4.0 μg/ml至約5.0 μg/ml、約4.5 μg/ml至約5.0 μg/ml、約0.5 μg/ml至約2.0 μg/ml或約0.5 μg/ml至約1.0 μg/ml，例如約0.5 μg/ml。
在某些實施例中，捕獲抗體可於塗佈緩衝液中稀釋。塗佈緩衝液之非限制性實例包括PBS、碳酸鹽緩衝液、碳酸氫鹽緩衝劑或其組合。在某些實施例中，塗佈緩衝液為碳酸氫鈉。在某些實施例中，塗佈緩衝液為PBS。在某些實施例中，塗佈緩衝液可以約10 mM至約1 M之濃度使用。舉例而言，但不限制，塗佈緩衝液可按以下濃度使用：約10 mM至約100 mM、約10 mM至約200 mM、約10 mM至約300 mM、約10 mM至約400 mM、約10 mM至約500 mM、約10 mM至約600 mM、約10 mM至約700 mM、約10 mM至約800 mM、約10 mM至約900 mM、約100 mM至約1 M、約200 mM至約1 M、約300 mM至約1 M、約400 mM至約1 M、約500 mM至約1 M、約600 mM至約1 M、約700 mM至約1 M、約800 mM至約1 M或約900 mM至約1 M。
如本文所用，捕獲抗體可固定於固相上。舉例而言，但不限制，固相可為適用於免疫計量分析之任何惰性支撐物或載體，包括呈例如表面、粒子、多孔基質、珠粒及類似形式之形式的支撐物。常用支撐物之非限制性實例包括小薄片、SEPHADEX®、凝膠、聚氯乙烯、塑膠珠粒及由聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯及類似物製造之分析板或試管，包括96孔微量滴定板，以及微粒材料，諸如濾紙、瓊脂糖、交聯右旋糖酐及其他多醣。在某些實施例中，用於固定之固相可為珠粒。舉例而言，但不限制，本文揭示之捕獲抗體係固定至順磁性珠粒。在某些實施例中，經固定之捕獲抗體係塗佈於可用於一次分析若干樣品之微量滴定板上。
在某些實施例中，偶合至捕獲抗體之順磁性珠粒可按以下濃度使用：每毫升約0.1 x 107 個珠粒至每毫升約10.0 x 107 個珠粒，例如每毫升約0.1 x 107 個珠粒至每毫升約0.5 x 107 個珠粒、每毫升約0.1 x 107 個珠粒至每毫升約1.0 x 107 個珠粒、每毫升約0.1 x 107 個珠粒至每毫升約2.0 x 107 個珠粒、每毫升約0.1 x 107 個珠粒至每毫升約3.0 x 107 個珠粒、每毫升約0.1 x 107 個珠粒至每毫升約4.0 x 107 個珠粒、每毫升約0.1 x 107 個珠粒至每毫升約5.0 x 107 個珠粒、每毫升約0.1 x 107 個珠粒至每毫升約6.0 x 107 個珠粒、每毫升約0.1 x 107 個珠粒至每毫升約7.0 x 107 個珠粒、每毫升約0.1 x 107 個珠粒至每毫升約8.0 x 107 個珠粒、每毫升約0.1 x 107 個珠粒至每毫升約9.0 x 107 個珠粒、每毫升約0.5 x 107 個珠粒至每毫升約10.0 x 107 個珠粒、每毫升約1.0 x 107 個珠粒至每毫升約10.0 x 107 個珠粒、每毫升約2.0 x 107 個珠粒至每毫升約10.0 x 107 個珠粒、每毫升約3.0 x 107 個珠粒至每毫升約10.0 x 107 個珠粒、每毫升約4.0 x 107 個珠粒至每毫升約10.0 x 107 個珠粒、每毫升約5.0 x 107 個珠粒至每毫升約10.0 x 107 個珠粒、每毫升約6.0 x 107 個珠粒至每毫升約10.0 x 107 個珠粒、每毫升約7.0 x 107 個珠粒至每毫升約10.0 x 107 個珠粒、每毫升約8.0 x 107 個珠粒至每毫升約10.0 x 107 個珠粒、每毫升約9.0 x 107 個珠粒至每毫升約10.0 x 107 個珠粒、每毫升約0.5 x 107 個珠粒至每毫升約1.0 x 107 個珠粒、每毫升約0.5 x 107 個珠粒至每毫升約2.0 x 107 個珠粒或每毫升約0.5 x 107 個珠粒至每毫升約3.0 x 107 個珠粒。在某些實施例中，順磁性珠粒可以每毫升約0.5 x 107 個珠粒至每毫升約2.0 x 107 個珠粒之濃度使用。在某些實施例中，順磁性珠粒可以每毫升約1.0 x 107 個珠粒，例如每毫升約1.22 x 107 個珠粒之濃度使用，或以每毫升約0.5 x 107 個珠粒，例如每毫升約0.59 x 107 個珠粒之濃度使用。
本文所揭示之免疫分析方法可進一步包括使樣品-捕獲抗體組合物質與偵測抗體接觸。在某些實施例中，偵測抗體結合於存在於FGF21上之抗原決定基。在某些實施例中，偵測抗體結合於存在於樣品-捕獲抗體組合物質上但在不存在FGF21之情況下不存在於捕獲抗體上之抗原決定基。在某些實施例中，隨後使用針對偵測抗體之偵測手段(例如一或多種偵測劑)量測或定量結合於樣品-捕獲抗體組合之偵測抗體，以測定由偵測抗體結合之FGF21蛋白(例如總FGF21或活性FGF21蛋白)之量。
在某些實施例中，偵測抗體可以約0.1 μg/ml至約5.0 μg/ml之濃度使用。舉例而言，但不限制，偵測抗體可按以下濃度使用：約0.1 µg/ml至約0.5 µg/ml、約0.1 µg/ml至約1.0 µg/ml、約0.1 µg/ml至約1.5 µg/ml、約0.1 µg/ml至約2.0 µg/ml、約0.1 µg/ml至約2.5 µg/ml、約0.1 µg/ml至約3.0 µg/ml、約0.1 µg/ml至約3.5 µg/ml、約0.1 µg/ml至約4.0 µg/ml、約0.1 µg/ml至約4.5 µg/ml、約0.5 µg/ml至約5.0 µg/ml、約1.0 µg/ml至約5.0 µg/ml、約1.5 µg/ml至約5.0 µg/ml、約2.0 µg/ml至約5.0 µg/ml、約2.5 µg/ml至約5.0 µg/ml、約3.0 µg/ml至約5.0 µg/ml、約3.5 µg/ml至約5.0 µg/ml、約4.0 µg/ml至約5.0 µg/ml、約4.5 µg/ml至約5.0 µg/ml、約1.0 µg/ml至約3.0 µg/ml、約0.5 µg/ml至約3.0 µg/ml或約0.5 µg/ml至約2.0 µg/ml。在某些實施例中，用於偵測總FGF21蛋白之免疫分析可以約0.1 μg/ml至約1.0 μg/ml，例如約0.4 μg/ml或約0.8 μg/ml之間的濃度使用偵測抗體。在某些實施例中，用於偵測活性FGF21蛋白之免疫分析可以約1.0 μg/ml至約3.0 μg/ml，例如約1.1 μg/ml或約2.1 μg/ml之間的濃度使用偵測抗體。
在某些實施例中，用於所揭示之方法中的抗FGF21抗體可經標記。標記包括但不限於直接偵測之標記或部分，諸如螢光、發色、電子緻密、化學冷光及放射性標記，以及例如通過酶反應或分子間相互作用間接偵測之部分，諸如酶或配位體。標記之非限制性實例包括放射性同位素32 P、14 C、125 I、3 H及131 I；螢光團，諸如稀土螯合物或螢光素及其衍生物；羅丹明及其衍生物；丹醯；傘形酮；螢光素酶，例如螢火蟲螢光素酶及細菌螢光素酶(參見美國專利第4,737,456號)；螢光素；2,3-二氫酞嗪二酮；辣根過氧化酶(HRP)；鹼性磷酸酶；β-半乳糖苷酶；葡糖澱粉酶；溶菌酶；醣氧化酶，例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶及葡萄糖-6-磷酸脫氫酶；雜環氧化酶，諸如尿酸酶及黃嘌呤氧化酶，其與採用過氧化氫氧化染料前驅體之酶(諸如HRP、乳過氧化物酶或微過氧化酶)偶合；生物素/親和素；自旋標記；噬菌體標記；穩定自由基；及類似物。在某些實施例中，偵測抗體經生物素標記，例如偵測抗體接合至生物素。
在某些實施例中，用於生物素化偵測抗體之偵測劑為親和素、鏈黴親和素-HRP或鏈黴親和素-β-D-半乳哌喃糖(SBG)。在某些實施例中，偵測劑之讀出為螢光或比色的。舉例而言，但不限制，四甲基聯苯胺及過氧化氫可用作讀出。在某些實施例中，若偵測劑為鏈黴親和素-HRP，則藉由使用四甲基聯苯胺及過氧化氫讀出可為比色的。或者，在某些實施例中，試鹵靈β-D-半乳哌喃糖苷可用作讀出。舉例而言，但不限制，若偵測劑為SBG，則藉由使用試鹵靈β-D-半乳哌喃糖苷讀出可為螢光的。
在某些實施例中，偵測劑(例如SBG)可以約50至約500 pM之濃度使用。舉例而言，但不限制，偵測劑可按以下濃度使用：約50至約100 pM、約50至約150 pM、約50至約200 pM、約50至約250 pM、約50至約300 pM、約50至約350 pM、約50至約400 pM、約50至約450 pM、約100至約500 pM、約150至約500 pM、約200至約500 pM、約250至約500 pM、約300至約500 pM、約350至約500 pM、約400至約500 pM、約450至約500 pM、約100至約400 pM或約200至約400 pM。在某些實施例中，偵測劑可以約100 pM至約400 pM之濃度使用，例如SBG可以約110 pM、約155 pM或約310 pM之濃度使用。在某些實施例中，SBG係以約310 pM之濃度使用。在某些實施例中，偵測劑(例如HRP)可以約1/10至約1/1000之稀釋度使用。舉例而言，但不限制，偵測劑可按以下稀釋度使用：約1/10至約1/100、約1/10至約1/500、約1/100至約1/1000或約1/500至約1/1000。在某些實施例中，偵測劑可以約1/100至約1/1000之稀釋度使用，例如HRP可以約1/100或約1/500之稀釋度使用。
在某些實施例中，本發明之方法可包括用阻斷緩衝液阻斷捕獲抗體。在某些實施例中，阻斷緩衝液可包括PBS、牛血清白蛋白(BSA)及/或抗微生物劑，例如ProClin™ (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO)。在某些實施例中，該方法可包括多個洗滌步驟。在某些實施例中，用於洗滌之溶液通常為緩衝液(例如「洗滌緩衝液」)，諸如但不限於包括洗滌劑(例如Tween 20)之PBS緩衝液。舉例而言，但不限制，可在阻斷之後洗滌捕獲抗體及/或可例如藉由洗滌將樣品與捕獲抗體分離以移除未捕獲之材料。
在某些實施例中，本發明之免疫分析方法可用於例如藉由偵測全長及經加工形式之FGF21來偵測樣品中之總FGF21蛋白的量。舉例而言，但不限制，用於偵測總FGF21蛋白之免疫分析方法可使用結合於存在於FGF21之胺基酸殘基5-172 (例如SEQ ID NO: 1之胺基酸殘基5-172)內的抗原決定基之一或多種抗體。在某些實施例中，捕獲抗體為結合於存在於FGF21之胺基酸殘基5-172內之抗原決定基的抗體且偵測抗體為結合於存在於FGF21之胺基酸殘基5-172內之抗原決定基的抗體。在某些實施例中，捕獲抗體與偵測抗體為相同抗體，而在其他實施例中，捕獲抗體與偵測抗體為不同抗體，但兩者均結合於存在於FGF21之胺基酸殘基5-172內之抗原決定基。在某些實施例中，捕獲抗體及偵測抗體結合於FGF21之胺基酸殘基5-172內之不同抗原決定基。舉例而言，但不限制，捕獲抗體及偵測抗體結合於FGF21之胺基酸殘基5-172內不重疊之抗原決定基。在某些實施例中，捕獲抗體及偵測抗體結合於FGF21之胺基酸殘基5-172內部分重疊之抗原決定基。
在某些實施例中，用於測定樣品中之總FGF21蛋白之量的免疫分析可包括(a)使結合於存在於FGF21之胺基酸殘基5-172內之抗原決定基的捕獲抗體與樣品接觸，以產生樣品-捕獲抗體組合物質；(b)使樣品-捕獲抗體組合物質與結合於存在於FGF21之胺基酸殘基5-172內之抗原決定基的偵測抗體接觸；(c)偵測結合於樣品-捕獲抗體組合物質之偵測抗體；及(d)基於所結合之偵測抗體之水準計算存在於樣品中的總FGF21蛋白之量。
在某些實施例中，本發明之免疫分析方法可用於例如藉由偵測保留C端片段之FGF21蛋白來偵測樣品中之活性FGF21蛋白的量。在某些實施例中，用於偵測總FGF21蛋白之免疫分析方法可使用結合於存在於FGF21之胺基酸殘基173-182 (例如SEQ ID NO: 1之胺基酸殘基173-182)內之抗原決定基的一或多種抗體，及結合於存在於FGF21之胺基酸殘基5-172內之抗原決定基的一或多種抗體。舉例而言，但不限制，用於偵測活性FGF21蛋白之量的免疫分析方法可使用結合於存在於FGF21之胺基酸殘基5-172內之抗原決定基的捕獲抗體及結合於存在於FGF21之胺基酸殘基173-182內之抗原決定基的偵測抗體。在某些實施例中，結合於FGF21之胺基酸殘基173-182之偵測抗體可為來自Epitope Diagnostics, Inc., San Diego, CA、以目錄號31002出售之抗FGF21抗體。在某些實施例中，結合於FGF21之胺基酸殘基173-182之偵測抗體可為來自Epitope Diagnostics, Inc., San Diego, CA、以目錄號30661出售之抗FGF21抗體。在某些實施例中，用於測定樣品中之活性FGF21蛋白之量的免疫分析方法可包括(a)使結合於存在於FGF21之胺基酸殘基5-172內之抗原決定基的捕獲抗體與樣品接觸，以產生樣品-捕獲抗體組合物質；(b)使樣品-捕獲抗體組合物質與結合於存在於FGF21之胺基酸殘基173-182內之抗原決定基的偵測抗體接觸；(c)偵測結合於樣品-捕獲抗體組合物質之偵測抗體；及(d)基於所結合之偵測抗體之水準計算存在於樣品中的活性FGF21蛋白之量。
本發明進一步提供用於測定樣品中活性FGF21蛋白與總FGF21蛋白之比率的免疫分析方法。舉例而言，但不限制，此類方法可涉及將用於偵測總FGF21蛋白之免疫分析與用於偵測活性FGF21蛋白之免疫分析組合。在某些實施例中，用於測定樣品中活性FGF21蛋白與總FGF21蛋白之比率的免疫分析方法可包括(a) (i)使結合於存在於FGF21之胺基酸殘基5-172內之抗原決定基的第一捕獲抗體與樣品接觸，以產生第一樣品-捕獲抗體組合物質；(ii)使第一樣品-捕獲抗體組合物質與結合於存在於FGF21之胺基酸殘基5-172內之抗原決定基的第一偵測抗體接觸；(iii)偵測結合於樣品-捕獲抗體組合物質之第一偵測抗體；及(iv)基於所結合之第一偵測抗體之水準計算存在於樣品中的總FGF21蛋白之量；及(b) (i)使結合於存在於FGF21之胺基酸殘基5-172內之抗原決定基的第二捕獲抗體與樣品接觸，以產生第二樣品-捕獲抗體組合物質；(ii)使第二樣品-捕獲抗體組合物質與結合於存在於FGF21之胺基酸殘基173-182內之抗原決定基的第二偵測抗體接觸；(iii)偵測結合於樣品-捕獲抗體組合物質之第二偵測抗體；及(iv)基於所結合之第二偵測抗體之水準計算存在於樣品中的活性FGF21蛋白之量。該方法可進一步包括將如藉由步驟(a)所測定之總FGF21蛋白的量與如藉由步驟(b)所測定之活性FGF21蛋白的量相比較，以確定樣品中活性FGF21蛋白與總FGF21蛋白之比率。在某些實施例中，第一捕獲抗體與第二捕獲抗體為相同抗體。或者，在某些實施例中，第一捕獲抗體與第二捕獲抗體為不同抗體，但兩者均結合於存在於FGF21之胺基酸殘基5-172內之抗原決定基。在某些實施例中，第一捕獲抗體及第一偵測抗體結合於FGF21之胺基酸殘基5-172內之不同抗原決定基。舉例而言，但不限制，第一捕獲抗體及第一偵測抗體結合於FGF21之胺基酸殘基5-172內不重疊之抗原決定基。在某些實施例中，第一捕獲抗體及第一偵測抗體結合於FGF21之胺基酸殘基5-172內部分重疊之抗原決定基。
在某些實施例中，本文所揭示之免疫分析方法具有約2 pg/ml至約20 pg/ml之偵測靈敏度(例如孔內靈敏度)。舉例而言，但不限制，本文所揭示之免疫分析具有以下靈敏度：約2 pg/ml至約3 pg/ml、約2 pg/ml至約4 pg/ml、約2 pg/ml至約5 pg/ml、約2 pg/ml至約6 pg/ml、約2 pg/ml至約7 pg/ml、約2 pg/ml至約8 pg/ml、約2 pg/ml至約10 pg/ml、約2 pg/ml至約11 pg/ml、約2 pg/ml至約12 pg/ml、約2 pg/ml至約13 pg/ml、約2 pg/ml至約14 pg/ml、約2 pg/ml至約15 pg/ml、約2 pg/ml至約16 pg/ml、約2 pg/ml至約17 pg/ml、約2 pg/ml至約18 pg/ml、約2 pg/ml至約19 pg/ml、約3 pg/ml至約15 pg/ml、約3 pg/ml至約10 pg/ml或約3 pg/ml至約5 pg/ml。在某些實施例中，本文所揭示之免疫分析具有約2 pg/ml或更大、1 pg/ml或更大或0.5 pg/ml或更大之靈敏度。在某些實施例中，本文所揭示之免疫分析具有約0.2 pg/ml至約2.0 pg/ml (例如約0.2 pg/ml至約0.5 pg/ml、約0.2 pg/ml至約1.0 pg/ml或約0.2 pg/ml至約1.5 pg/ml)之偵測靈敏度(例如孔內靈敏度)。舉例而言，但不限制，本文所揭示之免疫分析(例如使用Simoa HD-1 Analyzer™之單分子免疫分析)具有約0.2 pg/ml至約0.5 pg/ml之靈敏度(例如孔內靈敏度)。
藉由本發明之免疫分析方法分析之樣品可為臨床樣品、培養物中之細胞、細胞上清液、細胞溶解產物、血清樣品、血漿樣品、其他生物流體(例如淋巴液)樣品或組織樣品。在某些實施例中，樣品之來源可為實體組織(例如來自新鮮、冷凍及/或保存之器官、組織樣品、血清、血漿、活組織切片或吸出物)或來自個體之細胞。在某些實施例中，樣品為血液樣品。在某些實施例中，樣品為血漿樣品。在某些實施例中，可自個體獲得樣品(例如血液或血漿樣品)且經一或多種蛋白酶、酯酶、DDP-IV及/或磷酸酶抑制劑處理。舉例而言，但不限制，樣品可經蛋白酶與磷酸酶抑制劑之混合物(例如MS-SAFE，Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO)處理。在某些實施例中，樣品經阻凝劑處理或收集於含有阻凝劑(例如K2 -EDTA)之管子中。在某些實施例中，可使用P800血液收集系統(BD Biosciences, San Jose, CA)收集樣品。III. 抗體
本發明進一步提供結合於FGF21 (例如人類FGF21)之抗體。本發明之抗體適用於偵測及定量樣品中之FGF21蛋白含量。在某些實施例中，本發明之抗體可用於本文所揭示之用於偵測及定量FGF21蛋白之免疫分析方法中。舉例而言，但不限制，本發明之抗體可用於偵測樣品中之總FGF21蛋白及/或活性FGF21蛋白的含量。
在某些實施例中，本發明之抗體可為人類化的。在某些實施例中，本發明之抗體包含受體人類構架，例如人類免疫球蛋白構架或人類共同構架。在某些實施例中，本發明之抗體可為單株抗體，包括嵌合、人類化或人類抗體。舉例而言，但不限制，本發明之抗體可為嵌合的。在某些實施例中，本發明之抗體可為抗體片段，例如Fv、Fab、Fab’、scFv、雙功能抗體或F(ab’)2 片段。在某些實施例中，抗體為IgG。在某些實施例中，抗體係選自IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。在某些實施例中，抗體為全長抗體，例如完整IgG1抗體，或如本文所定義之其他抗體類別或同型。在某些實施例中，本文所揭示之抗FGF21抗體可經標記，例如接合至生物素。在某些實施例中，本發明之抗體可單獨或組合地併有如下文詳述之章節1-7中所描述的特徵中之任一者。A. 示例性抗 FGF21 抗體
本發明提供結合於FGF21蛋白之經分離之抗體。在某些實施例中，本發明之抗體可結合於存在於FGF21之胺基酸殘基5-172 (例如SEQ ID NO: 1之胺基酸殘基5-172)內之抗原決定基。在某些實施例中，本發明之抗體可結合於存在於FGF21之胺基酸殘基173-182 (例如SEQ ID NO: 1之胺基酸殘基173-182)內之抗原決定基。在某些實施例中，本發明之抗體不結合於存在於FGF21之胺基酸殘基1-4 (例如SEQ ID NO: 1之胺基酸殘基1-4)內之抗原決定基。抗FGF21抗體之非限制性實例揭示於表8-13及16-19及圖41A-B中。
本發明提供抗FGF21抗體，其在某些實施例中包含選自以下之至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個CDR：(a) CDR-H1，其包含SEQ ID NO: 26-29中之任一者之胺基酸序列及其保守取代；(b) CDR-H2，其包含SEQ ID NO: 30-33中之任一者之胺基酸序列及其保守取代；(c) CDR-H3，其包含SEQ ID NO: 34-37中之任一者之胺基酸序列及其保守取代；(d) CDR-L1，其包含SEQ ID NO: 38-41中之任一者之胺基酸序列及其保守取代；(e) CDR-L2，其包含SEQ ID NO: 42-45及其保守取代；及(f) CDR-L3，其包含SEQ ID NO: 46-49中之任一者之胺基酸序列及其保守取代。
本發明提供抗FGF21抗體，其在某些實施例中包含：(a) CDR-H1，其包含SEQ ID NO: 26之胺基酸序列及其保守取代；(b) CDR-H2，其包含SEQ ID NO: 30之胺基酸序列及其保守取代；(c) CDR-H3，其包含SEQ ID NO: 34之胺基酸序列及其保守取代；(d) CDR-L1，其包含SEQ ID NO: 38之胺基酸序列及其保守取代；(e) CDR-L2，其包含SEQ ID NO: 42之胺基酸序列及其保守取代；及(f) CDR-L3，其包含SEQ ID NO: 46之胺基酸序列及其保守取代。
本發明提供抗FGF21抗體，其在某些實施例中包含：(a) CDR-H1，其包含SEQ ID NO: 27之胺基酸序列及其保守取代；(b) CDR-H2，其包含SEQ ID NO: 31之胺基酸序列及其保守取代；(c) CDR-H3，其包含SEQ ID NO: 35之胺基酸序列；(d) CDR-L1，其包含SEQ ID NO: 39之胺基酸序列及其保守取代；(e) CDR-L2，其包含SEQ ID NO: 43之胺基酸序列及其保守取代；及(f) CDR-L3，其包含SEQ ID NO: 47之胺基酸序列及其保守取代。
本發明提供抗FGF21抗體，其在某些實施例中包含：(a) CDR-H1，其包含SEQ ID NO: 28之胺基酸序列及其保守取代；(b) CDR-H2，其包含SEQ ID NO: 32之胺基酸序列及其保守取代；(c) CDR-H3，其包含SEQ ID NO: 36之胺基酸序列及其保守取代；(d) CDR-L1，其包含SEQ ID NO: 40之胺基酸序列及其保守取代；(e) CDR-L2，其包含SEQ ID NO: 44之胺基酸序列及其保守取代；及(f) CDR-L3，其包含SEQ ID NO: 48之胺基酸序列及其保守取代。
本發明提供抗FGF21抗體，其在某些實施例中包含：(a) CDR-H1，其包含SEQ ID NO: 29之胺基酸序列及其保守取代；(b) CDR-H2，其包含SEQ ID NO: 33之胺基酸序列及其保守取代；(c) CDR-H3，其包含SEQ ID NO: 37之胺基酸序列及其保守取代；(d) CDR-L1，其包含SEQ ID NO: 41之胺基酸序列及其保守取代；(e) CDR-L2，其包含SEQ ID NO: 45之胺基酸序列及其保守取代；及(f) CDR-L3，其包含SEQ ID NO: 49之胺基酸序列及其保守取代。
在某些實施例中，本發明之抗FGF21抗體包含與SEQ ID NO: 54-57及72-75中之任一者之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的重鏈可變域(VH)序列。在某些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之VH序列相對於參考序列含有取代(例如保守取代)、***或缺失，但包含該序列之抗FGF21抗體保留結合於FGF21之能力。在某些實施例中，已取代、***及/或缺失總共1至10個胺基酸。在某些實施例中，取代、***或缺失發生在CDR外部之區域(亦即，FR中)。在某些實施例中，本發明之抗FGF21抗體包含含有SEQ ID NO: 54-57及72-75中之任一者之胺基酸序列的VH序列。
在某些實施例中，本發明之抗FGF21抗體包含與SEQ ID NO: 50-53及68-71中之任一者之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的輕鏈可變域(VL)序列。在某些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之VL序列相對於參考序列含有取代(例如保守取代)、***或缺失，但包含該序列之抗FGF21抗體保留結合於FGF21之能力。在某些實施例中，已取代、***及/或缺失總共1至10個胺基酸。在某些實施例中，取代、***或缺失發生在CDR外部之區域(亦即，FR中)。在某些實施例中，本發明之抗FGF21抗體包含含有SEQ ID NO: 50-53及68-71中之任一者之胺基酸序列的VL序列。
在某些實施例中，本發明之抗FGF21抗體包含與SEQ ID NO: 54之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的VH序列。在某些實施例中，本發明之抗FGF21抗體包含與SEQ ID NO: 50之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的VL序列。在某些實施例中，VH包含選自以下之一個、兩個或三個CDR：(a) CDR-H1，其包含SEQ ID NO: 26之胺基酸序列，(b) CDR-H2，其包含SEQ ID NO: 30之胺基酸序列，及(c) CDR-H3，其包含SEQ ID NO: 34之胺基酸序列。在某些實施例中，VL包含選自以下之一個、兩個或三個CDR：(a) CDR-L1，其包含SEQ ID NO: 38之胺基酸序列，(b) CDR-L2，其包含SEQ ID NO: 42之胺基酸序列，及(c) CDR-L3，其包含SEQ ID NO: 46之胺基酸序列。
在某些實施例中，本發明之抗FGF21抗體包含與SEQ ID NO: 55之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的VH序列。在某些實施例中，本發明之抗FGF21抗體包含與SEQ ID NO: 51之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的VL序列。在某些實施例中，VH包含選自以下之一個、兩個或三個CDR：(a) CDR-H1，其包含SEQ ID NO: 27之胺基酸序列，(b) CDR-H2，其包含SEQ ID NO: 31之胺基酸序列，及(c) CDR-H3，其包含SEQ ID NO: 35之胺基酸序列。在某些實施例中，VL包含選自以下之一個、兩個或三個CDR：(a) CDR-L1，其包含SEQ ID NO: 39之胺基酸序列，(b) CDR-L2，其包含SEQ ID NO: 43之胺基酸序列，及(c) CDR-L3，其包含SEQ ID NO: 47之胺基酸序列。
在某些實施例中，本發明之抗FGF21抗體包含與SEQ ID NO: 56之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的VH序列。在某些實施例中，本發明之抗FGF21抗體包含與SEQ ID NO: 52之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的VL序列。在某些實施例中，VH包含選自以下之一個、兩個或三個CDR：(a) CDR-H1，其包含SEQ ID NO: 28之胺基酸序列，(b) CDR-H2，其包含SEQ ID NO: 32之胺基酸序列，及(c) CDR-H3，其包含SEQ ID NO: 36之胺基酸序列。在某些實施例中，VL包含選自以下之一個、兩個或三個CDR：(a) CDR-L1，其包含SEQ ID NO: 40之胺基酸序列，(b) CDR-L2，其包含SEQ ID NO: 44之胺基酸序列，及(c) CDR-L3，其包含SEQ ID NO: 48之胺基酸序列。
在某些實施例中，本發明之抗FGF21抗體包含與SEQ ID NO: 57之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的VH序列。在某些實施例中，本發明之抗FGF21抗體包含與SEQ ID NO: 53之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的VL序列。在某些實施例中，VH包含選自以下之一個、兩個或三個CDR：(a) CDR-H1，其包含SEQ ID NO: 29之胺基酸序列，(b) CDR-H2，其包含SEQ ID NO: 33之胺基酸序列，及(c) CDR-H3，其包含SEQ ID NO: 37之胺基酸序列。在某些實施例中，VL包含選自以下之一個、兩個或三個CDR：(a) CDR-L1，其包含SEQ ID NO: 41之胺基酸序列，(b) CDR-L2，其包含SEQ ID NO: 45之胺基酸序列，及(c) CDR-L3，其包含SEQ ID NO: 49之胺基酸序列。
在某些實施例中，本發明之抗FGF21抗體包含與SEQ ID NO: 75之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的VH序列。在某些實施例中，本發明之抗FGF21抗體包含與SEQ ID NO: 71之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的VL序列。在某些實施例中，VH包含選自以下之一個、兩個或三個CDR：(a) CDR-H1，其包含SEQ ID NO: 26之胺基酸序列，(b) CDR-H2，其包含SEQ ID NO: 30之胺基酸序列，及(c) CDR-H3，其包含SEQ ID NO: 34之胺基酸序列。在某些實施例中，VL包含選自以下之一個、兩個或三個CDR：(a) CDR-L1，其包含SEQ ID NO: 38之胺基酸序列，(b) CDR-L2，其包含SEQ ID NO: 42之胺基酸序列，及(c) CDR-L3，其包含SEQ ID NO: 46之胺基酸序列。
在某些實施例中，本發明之抗FGF21抗體包含與SEQ ID NO: 74之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的VH序列。在某些實施例中，本發明之抗FGF21抗體包含與SEQ ID NO: 70之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的VL序列。在某些實施例中，VH包含選自以下之一個、兩個或三個CDR：(a) CDR-H1，其包含SEQ ID NO: 27之胺基酸序列，(b) CDR-H2，其包含SEQ ID NO: 31之胺基酸序列，及(c) CDR-H3，其包含SEQ ID NO: 35之胺基酸序列。在某些實施例中，VL包含選自以下之一個、兩個或三個CDR：(a) CDR-L1，其包含SEQ ID NO: 39之胺基酸序列，(b) CDR-L2，其包含SEQ ID NO: 43之胺基酸序列，及(c) CDR-L3，其包含SEQ ID NO: 47之胺基酸序列。
在某些實施例中，本發明之抗FGF21抗體包含與SEQ ID NO: 73之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的VH序列。在某些實施例中，本發明之抗FGF21抗體包含與SEQ ID NO: 69之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的VL序列。在某些實施例中，VH包含選自以下之一個、兩個或三個CDR：(a) CDR-H1，其包含SEQ ID NO: 28之胺基酸序列，(b) CDR-H2，其包含SEQ ID NO: 32之胺基酸序列，及(c) CDR-H3，其包含SEQ ID NO: 36之胺基酸序列。在某些實施例中，VL包含選自以下之一個、兩個或三個CDR：(a) CDR-L1，其包含SEQ ID NO: 40之胺基酸序列，(b) CDR-L2，其包含SEQ ID NO: 44之胺基酸序列，及(c) CDR-L3，其包含SEQ ID NO: 48之胺基酸序列。
在某些實施例中，本發明之抗FGF21抗體包含與SEQ ID NO: 72之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的VH序列。在某些實施例中，本發明之抗FGF21抗體包含與SEQ ID NO: 68之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的VL序列。在某些實施例中，VH包含選自以下之一個、兩個或三個CDR：(a) CDR-H1，其包含SEQ ID NO: 29之胺基酸序列，(b) CDR-H2，其包含SEQ ID NO: 33之胺基酸序列，及(c) CDR-H3，其包含SEQ ID NO: 37之胺基酸序列。在某些實施例中，VL包含選自以下之一個、兩個或三個CDR：(a) CDR-L1，其包含SEQ ID NO: 41之胺基酸序列，(b) CDR-L2，其包含SEQ ID NO: 45之胺基酸序列，及(c) CDR-L3，其包含SEQ ID NO: 49之胺基酸序列。
在某些實施例中，本發明之抗FGF21抗體包含與SEQ ID NO: 22-25及64-67中之任一者之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的全長重鏈(HC)序列。在某些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之HC序列相對於參考序列含有取代(例如保守取代)、***或缺失，但包含該序列之抗FGF21抗體保留結合於FGF21之能力。在某些實施例中，已取代、***及/或缺失總共1至10個胺基酸。在某些實施例中，取代、***或缺失發生在CDR外部之區域(亦即，FR中)。在某些實施例中，本發明之抗FGF21抗體包含含有SEQ ID NO: 22-25及64-67中之任一者之胺基酸序列的HC序列。
在某些實施例中，本發明之抗FGF21抗體包含與SEQ ID NO: 18-21及60-63中之任一者之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的全長輕鏈(LC)序列。在某些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之LC序列相對於參考序列含有取代(例如保守取代)、***或缺失，但包含該序列之抗FGF21抗體保留結合於FGF21之能力。在某些實施例中，已取代、***及/或缺失總共1至10個胺基酸。在某些實施例中，取代、***或缺失發生在CDR外部之區域(亦即，FR中)。在某些實施例中，本發明之抗FGF21抗體包含含有SEQ ID NO: 18-21及60-63中之任一者之胺基酸序列的LC序列。
在某些實施例中，本發明之抗FGF21抗體包含與SEQ ID NO: 22之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的HC序列。在某些實施例中，本發明之抗FGF21抗體包含與SEQ ID NO: 18之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的LC序列。
在某些實施例中，本發明之抗FGF21抗體包含與SEQ ID NO: 23之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的HC序列。在某些實施例中，本發明之抗FGF21抗體包含與SEQ ID NO: 19之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的LC序列。
在某些實施例中，本發明之抗FGF21抗體包含與SEQ ID NO: 24之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的HC序列。在某些實施例中，本發明之抗FGF21抗體包含與SEQ ID NO: 20之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的LC序列。
在某些實施例中，本發明之抗FGF21抗體包含與SEQ ID NO: 25之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的HC序列。在某些實施例中，本發明之抗FGF21抗體包含與SEQ ID NO: 21之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的LC序列。
在某些實施例中，本發明之抗FGF21抗體包含與SEQ ID NO: 67之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的HC序列。在某些實施例中，本發明之抗FGF21抗體包含與SEQ ID NO: 63之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的LC序列。
在某些實施例中，本發明之抗FGF21抗體包含與SEQ ID NO: 66之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的HC序列。在某些實施例中，本發明之抗FGF21抗體包含與SEQ ID NO: 62之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的LC序列。
在某些實施例中，本發明之抗FGF21抗體包含與SEQ ID NO: 65之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的HC序列。在某些實施例中，本發明之抗FGF21抗體包含與SEQ ID NO: 61之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的LC序列。
在某些實施例中，本發明之抗FGF21抗體包含與SEQ ID NO: 64之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的HC序列。在某些實施例中，本發明之抗FGF21抗體包含與SEQ ID NO: 60之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的LC序列。
在某些實施例中，提供一種抗FGF21抗體，其中該抗體包含如上文所提供之任一實施例中的VH及如上文所提供之任一實施例中的VL。在某些實施例中，提供一種抗FGF21抗體，其中該抗體包含如上文所提供之任一實施例中的全長HC及如上文所提供之任一實施例中的全長LC。1. 抗體親和力
在某些實施例中，本發明之抗FGF21抗體可具有≤ 1 M、≤ 100 mM、≤ 10 mM、≤ 1 mM、≤ 100 μM、≤ 10 μM、≤ 1μM、≤ 100 nM、≤ 10 nM、≤ 1 nM、≤ 0.1 nM、≤ 0.01 nM或≤ 0.001 nM之解離常數(Kd )。在某些實施例中，本發明之抗體可具有約10-3 或更小或10-8 M或更小(例如10-8 M至10-13 M，例如來自10-9 M至10-13 M)之Kd 。在某些實施例中，本文所揭示之抗FGF21抗體可具有約10-10 M至10-13 M之Kd 。舉例而言，但不限制，本發明之捕獲抗體或偵測抗體以約10-10 M至10-13 M之Kd 結合於FGF21。
在某些實施例中，Kd 可藉由經放射性標記之抗原結合分析(RIA)來量測。在某些實施例中，RIA可用Fab型式之相關抗體及其抗原來進行。舉例而言，但不限制，Fab對抗原之溶液結合親和力係如下量測：在存在滴定系列之非標記抗原的情況下用最小濃度之(125 I)標記抗原平衡Fab，接著用抗Fab抗體塗佈之板捕獲所結合之抗原(參見例如Chen等人,J. Mol. Biol. 293:865-881(1999))。為建立用於分析之條件，用含5 μg/ml之捕獲抗Fab抗體(Cappel Labs)之50 mM碳酸鈉(pH 9.6)將MICROTITER® 多孔板(Thermo Scientific)塗佈隔夜，且隨後在室溫(約23℃)下用含2% (w/v)牛血清白蛋白之PBS阻斷二至五小時。在非吸附板(Nunc #269620)中，將100 pM或26 pM [125 I]-抗原與相關Fab之連續稀釋液混合(例如與Presta等人,Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)中之抗VEGF抗體Fab-12之評估一致)。接著將相關Fab孵育隔夜；然而，該孵育可持續更長時間(例如約65小時)以確保達到平衡。其後，將混合物轉移至捕獲板以在室溫下孵育(例如持續一個小時)。接著移除溶液且用含0.1%聚山梨醇酯20 (TWEEN-20® )之PBS將板洗滌八次。當板已乾燥時，每孔添加150 μl之閃爍劑(MICROSCINT-20TM ；Packard)，且在TOPCOUNTTM γ計數儀(Packard)上對板計數十分鐘。選擇各Fab之給出小於或等於20%之最大結合的濃度用於競爭性結合分析。
在某些實施例中，Kd 可使用BIACORE® 表面電漿子共振分析來量測。舉例而言，但不限制，在25℃下使用經固定之抗原CM5晶片在約10個反應單位(RU)下進行使用BIACORE® -2000、BIACORE® -3000、BIACORE X100或BIACORE T200處理單元(Biacore, Inc., Piscataway, NJ)之分析。在某些實施例中，根據供應商之說明書用N -乙基-N’ -(3-二甲胺基丙基)-碳二醯亞胺鹽酸鹽(EDC)及N -羥基丁二醯亞胺(NHS)活化羧基甲基化右旋糖酐生物感測器晶片(CM5，Biacore, Inc.)。將抗原用10 mM乙酸鈉(pH 4.8)稀釋至5 μg/ml (約0.2 μM)，然後以每分鐘5 μl之流速注射以達成約10個反應單位(RU)之偶合蛋白質。在注射抗原之後，注射1 M乙醇胺以阻斷未反應之基團。對於動力學量測，在25℃下於含有0.05%聚山梨醇酯20 (TWEEN-20TM )表面活性劑(PBST)之PBS中以約25 μl/min之流速注射Fab之兩倍連續稀釋液(0.78 nM至500 nM)。締合速率(k締合 )及解離速率(k解離 )係使用簡單一對一朗繆爾結合模型(Langmuir binding model) (BIACORE® 評估軟體版本3.2)藉由同時擬合締合及解離感測器圖來計算。平衡解離常數(Kd )可以比率k解離 /k締合 形式來計算。參見例如Chen等人,J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)。若藉由以上表面電漿子共振分析締合速率超過106 M-1 s-1 ，則締合速率可藉由使用螢光淬滅技術來測定，該螢光淬滅技術量測在如在光譜儀(諸如停-流裝備分光光度計(Aviv Instruments)或具有經攪拌比色皿之8000-系列SLM-AMINCOTM 分光光度計(ThermoSpectronic))中所量測存在增加濃度之抗原的情況下，在25℃下於PBS (pH 7.2)中之20 nM抗原抗體(Fab形式)之螢光發射強度(激發= 295 nm；發射= 340 nm，16 nm帶通)的增加或減小。2. 抗體片段
在某些實施例中，本發明之抗體為抗體片段。抗體片段包括但不限於Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2 、Fv及scFv片段及下文所描述之其他片段。關於某些抗體片段之綜述，參見Hudson等人Nat. Med. 9:129-134 (2003)。關於scFv片段之綜述，參見例如Pluckthün,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies , 第113卷, Rosenburg及Moore編, (Springer-Verlag, New York), 第269-315頁(1994)；亦參見WO 93/16185；及美國專利第5,571,894號及第5,587,458號。關於包含挽救受體結合抗原決定基殘基且具有增加之活體內半衰期的Fab及F(ab’)2 片段之論述，參見美國專利第5,869,046號。
在某些實施例中，本發明之抗體可為雙功能抗體。雙功能抗體為包含兩個抗原結合位點之抗體片段，其可為二價或雙特異性的。參見例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人,Nat. Med. 9:129-134 (2003)；及Hollinger等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)。三功能抗體及四功能抗體為在本發明抗體之範疇內的其他抗體片段，其亦描述於Hudson等人,Nat. Med. 9:129-134 (2003)中。
在某些實施例中，本發明之抗體可為單結構域抗體。單結構域抗體為包含抗體之重鏈可變域之全部或一部分或輕鏈可變域之全部或一部分的抗體片段。在某些實施例中，單結構域抗體為人類單結構域抗體(Domantis, Inc., Waltham, MA；參見例如美國專利第6,248,516 B1號)。
如本文所描述，抗體片段可藉由各種技術來製備，包括但不限於完整抗體之蛋白水解消化以及藉由重組宿主細胞(例如大腸桿菌(E. coli )或噬菌體)來製備。3. 嵌合及人類化抗體
在某些實施例中，本發明之抗體為嵌合抗體。某些嵌合抗體描述於此項技術中，例如美國專利第4,816,567號；及Morrison等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 81:6851-6855 (1984))中。在某些實施例中，本發明之嵌合抗體包含非人類可變區(例如衍生自小鼠、大鼠、倉鼠、兔或非人類靈長類動物，諸如猴之可變區)及人類恆定區。在另一實例中，嵌合抗體可為「類別轉換」抗體，其中類別或子類已相較於親本抗體有所變化。嵌合抗體包括其抗原結合片段。
在某些實施例中，本發明之嵌合抗體可為人類化抗體。典型地，非人類抗體經人類化以降低對人類之免疫原性，同時保留親本非人類抗體之特異性及親和力。通常，人類化抗體包含一或多個可變域，其中CDR (例如CDR) (或其部分)衍生自非人類抗體，且FR (或其部分)衍生自人類抗體序列。人類化抗體視情況將亦包含人類恆定區之至少一部分。在某些實施例中，人類化抗體中之一些FR殘基經非人類抗體(例如衍生出CDR殘基之抗體)之對應殘基取代，例如以恢復或改良抗體特異性或親和力。
人類化抗體及其製備方法綜述於例如Almagro及Fransson,Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)中，且進一步描述於例如以下各項中：Riechmann等人, Nature 332:323-329 (1988)；Queen等人,Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989)；美國專利第5, 821,337號、第7,527,791號、第6,982,321號及第7,087,409號；Kashmiri等人,Methods 36:25-34 (2005) (描述特異性決定區(SDR)移植)；Padlan,Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) (描述「表面重修」)；Dall’Acqua等人,Methods 36:43-60 (2005) (描述「FR改組」)；及Osbourn等人,Methods 36:61-68 (2005)及Klimka等人,Br. J. Cancer , 83:252-260 (2000) (描述FR改組之「導向選擇」方法)。
可用於人類化之人類構架區包括但不限於：使用「最佳擬合」方法選擇之構架區(參見例如Sims等人J. Immunol. 151:2296 (1993))；源自特定輕鏈或重鏈可變區子組之人類抗體之共同序列的構架區(參見例如Carter等人Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 89:4285 (1992)；及Presta等人J. Immunol. , 151:2623 (1993))；人類成熟(體細胞突變)構架區或人類生殖系構架區(參見例如Almagro及Fransson,Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008))；及源自篩選FR文庫之構架區(參見例如Baca等人,J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997)及Rosok等人,J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996))。4. 人類抗體
在某些實施例中，本發明之抗體可為人類抗體。人類抗體可使用此項技術中已知之各種技術來製備。人類抗體總體描述於van Dijk及van de Winkel,Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001)及Lonberg,Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)中。
人類抗體可藉由響應於抗原攻擊向已經修飾之基因轉殖動物投與免疫原以產生完整人類抗體或具有人類可變區之完整抗體來製備。此類動物典型地含有人類免疫球蛋白基因座之全部或一部分，其替代內源性免疫球蛋白基因座，或其存在於染色體外或整合隨機至動物染色體中。在此類基因轉殖小鼠中，內源性免疫球蛋白基因座通常已去活化。關於自基因轉殖動物獲得人類抗體之方法的綜述，參見Lonberg,Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)。亦參見例如美國專利第6,075,181號及第6,150,584號，其描述XENOMOUSETM 技術；美國專利第5,770,429號，其描述HUMAB® 技術；美國專利第7,041,870號，其描述K-M MOUSE® 技術；及美國專利申請公開案第US 2007/0061900號，其描述VELOCIMOUSE® 技術)。來自由此類動物產生之完整抗體之人類可變區可例如藉由與不同人類恆定區組合而經進一步修飾。
人類抗體亦可藉由基於雜交瘤之方法來製備。已描述用於製備人類單株抗體之人類骨髓瘤及小鼠-人類異源骨髓瘤細胞株。(參見例如KozborJ. Immunol. , 133: 3001 (1984)；Brodeur等人,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications , 第51-63頁(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)；及Boerner等人,J. Immunol ., 147: 86 (1991)。)經由人類B細胞雜交瘤技術產生之人類抗體亦描述於Li等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 103:3557-3562 (2006)中。其他方法包括描述於例如美國專利第7,189,826號(描述自雜交瘤細胞株製備單株人類IgM抗體)及倪(Ni), 現代免疫學(Xiandai Mianyixue ), 26(4):265-268 (2006) (描述人類-人類雜交瘤)中之彼等方法。人類雜交瘤技術(三體瘤技術)亦描述於Vollmers及Brandlein,Histology and Histopathology , 20(3):927-937 (2005)及Vollmers及Brandlein,Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology , 27(3):185-91 (2005)中。
人類抗體亦可藉由分離選自人類衍生之噬菌體展示文庫的Fv純系可變域序列來產生。此類可變域序列可接著與所需人類恆定域組合。用於自抗體文庫選擇人類抗體之技術描述於下文中。5. 文庫衍生之抗體
可藉由篩選組合文庫中具有所需活性之抗體來分離本發明之抗體。舉例而言，此項技術中已知多種方法用於產生噬菌體展示文庫及篩選此類文庫中具有所需結合特徵之抗體。此類方法綜述於例如Hoogenboom等人,Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien等人編, Human Press, Totowa, NJ, 2001)中且進一步描述於例如以下文獻中：McCafferty等人,Nature 348:552-554；Clackson等人,Nature 352: 624-628 (1991)；Marks等人,J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992)；Marks及Bradbury,Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo編, Human Press, Totowa, NJ, 2003)；Sidhu等人,J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004)；Lee等人,J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004)；Fellouse,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004)；及Lee等人,J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004)。
在某些噬菌體展示方法中，藉由聚合酶鏈反應(PCR)分開選殖VH及VL基因譜且隨機重組於噬菌體文庫中，如Winter等人,Ann. Rev. Immunol. , 12: 433-455 (1994)中所描述接著可篩選該等噬菌體文庫中之抗原結合噬菌體。噬菌體典型地以單鏈Fv (scFv)片段或以Fab片段之形式展示抗體片段。來自經免疫來源之文庫為免疫原提供高親和力抗體，而不需要構築雜交瘤。或者，如Griffiths等人,EMBO J, 12: 725-734 (1993)所描述，原初譜可經選殖(例如自人類)以在不進行任何免疫之情況下為廣泛範圍之非自體以及自體抗原提供抗體之單一來源。在某些實施例中，如Hoogenboom及Winter,J. Mol. Biol. , 227: 381-388 (1992)所描述，亦可藉由由幹細胞選殖未重排V-基因區段，且使用含有隨機序列之PCR引物以編碼高度可變之CDR3區且實現活體外重排而合成製備原初文庫。描述人類抗體噬菌體文庫之專利公開案包括例如：美國專利第5,750,373號及美國專利公開案第2005/0079574號、第2005/0119455號、第2005/0266000號、第2007/0117126號、第2007/0160598號、第2007/0237764號、第2007/0292936號及第2009/0002360號。
自人類抗體文庫分離之抗體或抗體片段被視為本文中之人類抗體或人類抗體片段。6. 多特異性抗體
在某些實施例中，本發明之抗體可為多特異性抗體，例如雙特異性抗體。多特異性抗體為對至少兩種不同抗原決定基具有結合特異性之單株抗體。在某些實施例中，結合特異性中之一者係針對存在於FGF21上之抗原決定基，而另一者係針對任何其他抗原。雙特異性抗體可經製備呈全長抗體或抗體片段形式。
用於製備多特異性抗體之技術包括但不限於具有不同特異性之兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對之重組共表現(參見Milstein及Cuello,Nature 305: 537 (1983))、WO 93/08829及Traunecker等人,EMBO J. 10: 3655 (1991))及「杵臼」工程改造(參見例如美國專利第5,731,168號)。亦可如下製備多特異性抗體：藉由工程改造靜電轉向效應(engineering electrostatic steering effect)以製備抗體Fc-異二聚分子(WO 2009/089004A1)；交聯兩種或更多種抗體或片段(參見例如美國專利第4,676,980號及Brennan等人, Science , 229: 81 (1985))；使用白胺酸拉鏈來製備雙特異性抗體(參見例如Kostelny等人,J. Immunol. , 148(5):1547-1553 (1992))；使用用於製備雙特異性抗體片段之「雙功能抗體」技術(參見例如Hollinger等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 90:6444-6448 (1993))；及使用單鏈Fv (sFv)二聚體(參見例如Gruber等人, J. Immunol. , 152:5368 (1994))；及如例如Tutt等人J. Immunol. 147: 60 (1991)中所描述製備三特異性抗體。
本文中亦包括具有三個或更多個功能性抗原結合位點之經工程改造之抗體，包括「章魚抗體(Octopus antibody)」(參見例如US 2006/0025576A1)。7. 抗體變異體
當前所揭示之主題進一步提供所揭示之抗體的胺基酸序列變異體。舉例而言，可能需要改良抗體之結合親和力及/或其他生物特性。抗體之胺基酸序列變異體可藉由將適當修飾引入編碼抗體之核苷酸序列中，或藉由肽合成來製備。此類修飾包括但不限於抗體之胺基酸序列內的殘基的缺失及/或***及/或取代。可進行缺失、***及取代之任何組合以成為最終構築體，前提條件為最終抗體(亦即，經修飾)具有所需特徵，例如抗原結合。a) 取代、***及缺失變異體
抗體變異體可具有一或多個胺基酸取代、***及/或缺失。此類變異之位點相關包括但不限於CDR及FR。保守取代之非限制性實例顯示於表1中之「較佳取代」標題下。更多實質性變化之非限制性實例提供於表1中之「示例性取代」標題下，且如下文關於胺基酸側鏈類別所進一步描述。可將胺基酸取代引入相關抗體中且針對所需活性(例如保留/改良之抗原結合、降低之免疫原性或改良之補體依賴性細胞毒性(CDC)或抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC))對產物進行篩選。 表1
Figure 108112039-A0304-0001
可根據常見側鏈特性對胺基酸進行分組： (1) 疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile； (2) 中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln； (3) 酸性：Asp、Glu； (4) 鹼性：His、Lys、Arg； (5) 影響鏈取向之殘基：Gly、Pro； (6) 芳族：Trp、Tyr、Phe。
在某些實施例中，非保守取代將需要將此等類別中之一者的成員換成另一類別。
在某些實施例中，取代變異體之類型涉及取代親本抗體(例如人類化或人類抗體)之一或多個高變區殘基。通常，經選擇用於進一步研究之所得變異體將相對於親本抗體在某些生物特性方面具有改變(例如改良) (諸如但不限於增加之親和力、降低之免疫原性)且/或將實質上保留親本抗體之某些生物特性。取代變異體之非限制性實例為親和力成熟之抗體，其可例如使用基於噬菌體展示之親和力成熟技術(諸如本文所描述之彼等技術)適宜地產生。簡單來說，使一或多個CDR殘基發生突變，且使變異體抗體展示於噬菌體上，且針對特定生物活性(例如結合親和力)進行篩選。
在某些實施例中，改變(例如取代)可在CDR中進行，例如以改良抗體親和力。此類改變可在CDR「熱點」(亦即，在體細胞成熟過程期間以高頻率經歷突變之密碼子編碼之殘基(參見例如Chowdhury,Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)))及/或接觸抗原之殘基中進行，並且對所得變異體VH或VL之結合親和力進行測試。藉由構築二級文庫及自其選擇來實現親和力成熟已描述於例如Hoogenboom等人,Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien等人編, Human Press, Totowa, NJ, (2001))中。在親和力成熟之某些實施例中，可藉由多種方法中之任一者(例如易錯PCR、鏈改組或寡核苷酸定向誘變)將多樣性引入經選擇用於成熟之可變基因中。接著形成二級文庫。接著篩選該文庫以識別具有所需親和力之任何抗體變異體。引入多樣性之另一方法涉及CDR導向之方法，其中若干CDR殘基(例如一次4-6個殘基)經隨機化。可例如使用丙胺酸掃描誘變或模型化特定地識別參與抗原結合之CDR殘基。常常特定而言靶向CDR-H3及CDR-L3。
在某些實施例中，可在一或多個CDR內發生取代、***及/或缺失，只要此類改變不實質上降低抗體結合抗原之能力即可。舉例而言，可在CDR中作出不實質上降低結合親和力之保守改變(例如如本文所提供之保守取代)。此類改變可例如在CDR中之抗原接觸殘基以外。在上文提供之變異體VH及VL序列之某些實施例中，各CDR未改變，或不含超過一個、兩個或三個胺基酸取代。
適用於識別抗體中可經靶向以進行誘變之殘基或區的方法如由Cunningham及Wells (1989)Science , 244:1081-1085所描述稱為「丙胺酸掃描誘變」。在此方法中，識別殘基或目標殘基群(例如帶電荷殘基，諸如arg、asp、his、lys及glu)且用中性或帶負電荷之胺基酸(例如丙胺酸或聚丙胺酸)置換以確定抗體與抗原之相互作用是否受到影響。可在對初始取代展示功能敏感性之胺基酸位置引入其他取代。替代地或另外，抗原-抗體複合物之晶體結構以鑑定抗體與抗原之間的接觸點。可靶向此類接觸殘基及相鄰殘基作為取代之候選者或將其清除。可篩選變異體以確定其是否含有所需特性。
胺基酸序列***包括長度在一個殘基至含有一百或更多個殘基之多肽範圍內的胺基未端及/或羧基未端融合，以及單個或多個胺基酸殘基之序列內***。未端***之實例包括具有N端甲硫胺醯基殘基之抗體。抗體分子之其他***變異體包括抗體之N端或C端融合至酶(例如用於抗體導向之酶前藥療法(ADEPT))或多肽，此增加抗體之血清半衰期。b) 糖基化變異體
在某些實施例中，本發明之抗體可經改變以增加或降低抗體糖基化之程度。舉例而言，但不限制，抗體之糖基化位點的添加或缺失可適宜地藉由改變胺基酸序列使得形成或移除一或多個糖基化位點來實現。
在本發明之抗體包含Fc區之情況下，可改變與其連接之碳水化合物(若存在)。由哺乳動物細胞產生之天然抗體典型地包含分枝雙觸角寡醣，其通常藉由N-鍵聯附接至Fc區之CH2結構域之Asn297。參見例如Wright等人TIBTECH 15:26-32 (1997)。寡醣可包括各種碳水化合物，例如甘露糖、N-乙醯基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖及唾液酸，以及附接至雙觸角寡醣結構之「主幹」中的GlcNAc之海藻糖。在某些實施例中，可對本發明之抗體中之寡醣進行修飾以形成具有某些改良之特性的抗體變異體。
在某些實施例中，提供具有缺少附接(直接或間接)至Fc區之海藻糖的碳水化合物結構的抗體變異體。舉例而言，此類抗體中之海藻糖的量可為約1%至約80%、約1%至約65%、約5%至約65%或約20%至約40%及其間之值。
在某些實施例中，海藻糖之量可如例如WO 2008/077546中所描述，藉由計算相對於如藉由MALDI-TOF質譜法所量測附接至Asn 297之所有糖結構(例如複合、雜合及高甘露糖結構)的總和，糖鏈內在Asn297處之海藻糖的平均量來確定。Asn297係指位於Fc區中約位置297 (Fc區殘基之Eu編號)的天冬醯胺殘基；然而，歸因於抗體中之微小序列變異，Asn297亦可定位於位置297上游或下游約±3個胺基酸處，亦即，位置294與300之間。此類海藻糖基化變異體可具有改良之ADCC功能。參見例如美國專利公開案第US 2003/0157108號(Presta, L.)；第US 2004/0093621號(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd)。與「去海藻糖基化」或「海藻糖缺陷型」抗體變異體有關之出版物的實例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等人J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004)；Yamane-Ohnuki等人Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)。
去海藻糖基化抗體可在缺乏蛋白質海藻糖基化之任何細胞株中製備。細胞株之非限制性實例包括缺乏蛋白質海藻糖基化之Lec13 CHO細胞(Ripka等人Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)；美國專利申請案第US 2003/0157108 A1號, Presta, L；及WO 2004/056312 A1, Adams等人，尤其實例11)及敲出細胞株，諸如α-1,6-海藻糖基轉移酶基因FUT8 敲出CHO細胞(參見例如Yamane-Ohnuki等人Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)；Kanda, Y.等人, Biotechnol. Bioeng ., 94(4):680-688 (2006)；及WO2003/085107)。
進一步提供具有二等分寡醣之抗體變異體，例如其中附接至抗體Fc區之雙觸角寡醣由GlcNAc二等分。此類抗體變異體可具有降低之海藻糖基化及/或改良之ADCC功能。此類抗體變異體之非限制性實例描述於例如WO 2003/011878 (Jean-Mairet等人)；美國專利第6,602,684號(Umana等人)；及US 2005/0123546 (Umana等人)中。亦提供在附接至Fc區之寡醣中具有至少一個半乳糖殘基之抗體變異體。此類抗體變異體可具有改良之CDC功能。此類抗體變異體描述於例如WO 1997/30087 (Patel等人)；WO 1998/58964 (Raju, S.)；及WO 1999/22764 (Raju, S.)中。c) Fc 區變異體
在某些實施例中，可將一或多個胺基酸修飾引入本文所提供之抗體的Fc區中，由此產生Fc區變異體。Fc區變異體可包含在一或多個胺基酸位置包含胺基酸修飾(例如取代)之人類Fc區序列(例如人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區)。
在某些實施例中，本發明提供具有一些但非全部效應功能之抗體變異體。此類有限效應功能可使得抗體變異體成為如下應用之所需候選者，在該等應用中抗體活體內半衰期為重要的，但某些效應功能(諸如補體及ADCC)為不必要的或有害的。可進行活體外及/或活體內細胞毒性分析以證實CDC及/或ADCC活性之降低/減損。舉例而言，可進行Fc受體(FcR)結合分析以確保抗體缺乏FcγR結合能力(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn結合能力。用於介導ADCC之原代細胞NK細胞僅表現FcγRIII，而單核細胞表現FcγRI、FcγRII及FcγRIII。造血細胞上之FcR表現概括於Ravetch及Kinet,Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)之第464頁的表3中。用於評估相關分子之ADCC活性的活體外分析之非限制性實例描述於美國專利第5,500,362號(參見例如Hellstrom, I.等人Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986))及Hellstrom, I等人,Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985)；5,821,337 (參見Bruggemann, M.等人,J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987))中。或者，可採用非放射性分析方法(參見例如用於流式細胞術之ACTITM 非放射性細胞毒性分析(Cell Technology, Inc. Mountain View, CA；及CYTOTOX 96® 非放射性細胞毒性分析(Promega, Madison, WI)。適用於此類分析之效應細胞包括外周血單核細胞(PBMC)及自然殺傷(NK)細胞。替代地或另外，可在活體內，例如在動物模型(諸如揭示於Clynes等人Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)中之動物模型)中評估相關分子之ADCC活性。亦可進行C1q結合分析以證實抗體不能結合C1q且因此缺乏CDC活性。參見例如WO 2006/029879及WO 2005/100402中之C1q及C3c結合性ELISA。為評估補體活化，可進行CDC分析(參見例如Gazzano-Santoro等人,J. Immunol. Methods 202:163 (1996)；Cragg, M.S.等人,Blood 101:1045-1052 (2003)；及Cragg, M.S.及M.J. Glennie,Blood 103:2738-2743 (2004))。亦可使用此項技術中已知之方法進行FcRn結合及活體內清除率/半衰期測定(參見例如Petkova, S.B.等人,Int’l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006))。在某些實施例中，例如如美國專利第6,194,551號、WO 99/51642及Idusogie等人J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)中所描述，可在Fc區中作出改變，從而產生改變(亦即，改良或削弱)之C1q結合及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)。
具有降低之效應功能的抗體包括具有Fc區殘基238、265、269、270、297、327及329中之一者或多者之取代的彼等抗體(美國專利第6,737,056號)。此類Fc突變體包括在胺基酸位置265、269、270、297及327中之兩者或更多者處具有取代之Fc突變體，包括殘基265及297取代為丙胺酸的所謂「DANA」Fc突變體(美國專利第7,332,581號)。
描述了具有改良或削弱之FcR結合的某些抗體變異體。參見例如美國專利第6,737,056號；WO 2004/056312及Shields等人, J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)。
在某些實施例中，本發明之抗體變異體包含具有改良ADCC之一或多個胺基酸取代(例如在Fc區之位置298、333及/或334 (殘基之EU編號)處之取代)的Fc區。
在某些實施例中，在本文所揭示之抗體(例如雙特異性抗體)之Fc區中作出之改變可產生具有增加之半衰期及改良之與負責將母體IgG轉移至胎兒(Guyer等人,J. Immunol. 117:587 (1976)及Kim等人,J. Immunol. 24:249 (1994))之新生兒Fc受體(FcRn)的結合的變異體抗體，其描述於US2005/0014934A1 (Hinton等人)中。彼等抗體包含其中具有改良Fc區與FcRn之結合的一或多個取代之Fc區。此類Fc變異體包括如下Fc變異體，其在以下Fc區殘基中之一或多處具有取代：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如Fc區殘基434之取代(美國專利第7,371,826號)。
關於Fc區變異體之其他實例亦參見Duncan及Winter,Nature 322:738-40 (1988)；美國專利第5,648,260號；美國專利第5,624,821號；及WO 94/29351。d) 半胱胺酸工程改造之抗體變異體
在某些實施例中，可能需要形成半胱胺酸工程改造之抗體，例如「硫基MAb」，其中抗體之一或多個殘基經半胱胺酸殘基取代。在特定實施例中，取代之殘基存在於抗體之可及位點處。藉由用半胱胺酸取代彼等殘基，由此將反應性硫醇基安置在抗體之可及位點處，且其可用於使抗體接合至其他部分，諸如藥物部分或連接子-藥物部分，以形成如本文中進一步描述之免疫接合物。在某些實施例中，以下殘基中之任何一或多者可經半胱胺酸取代：輕鏈之V205 (Kabat編號)；重鏈之A118 (EU編號)；及重鏈Fc區之S400 (EU編號)。可如例如美國專利第7,521,541號中所描述產生半胱胺酸工程改造之抗體。e) 抗體衍生物
在某些實施例中，本發明之抗體可進一步經修飾以含有此項技術中已知且輕易可獲得之其他非蛋白質部分。適合用於抗體之衍生化的部分包括但不限於水溶性聚合物。水溶性聚合物之非限制性實例包括但不限於聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇之共聚物、羧甲基纖維素、右旋糖酐、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚1,3-二氧雜環戊烷、聚1,3,6-三氧雜環己烷、乙烯/順丁烯二酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或隨機共聚物)及右旋糖酐或聚(n-乙烯吡咯啶酮)聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚環氧丙烷/環氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛歸因於其在水中之穩定性可在製造中具有優勢。聚合物可具有任何分子量，且可為分枝的或不分枝的。附接至抗體之聚合物的數目可變化，且若附接超過一個聚合物，則其可為相同或不同分子。一般而言，用於衍生化之聚合物之數目及/或類型可基於包括但不限於以下之考慮因素來確定：所要改良之特定抗體特性或功能、抗體衍生物是否將在所定義條件下用於療法中等。
在某些實施例中，提供抗體及非蛋白質部分之接合物，其可藉由暴露於輻射而經選擇性加熱。在一個實施例中，非蛋白質部分為碳奈米管(carbon nanotube) (Kam等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005))。在某些實施例中，輻射可具有任何波長，且包括但不限於不損害普通細胞但將非蛋白質部分加熱至使抗體-非蛋白質部分近端之細胞被殺死之溫度的波長。B. 抗體製備方法
本文所揭示之抗體可使用任何此項技術中可獲得或已知之技術來製備。舉例而言，但不限制，可例如如美國專利第4,816,567號中所描述使用重組方法及組合物來產生抗體。以下實例中描述用於產生抗體之詳細程序。
當前所揭示之主題進一步提供一種編碼本文所揭示之抗體的經分離之核酸。舉例而言，經分離之核酸可編碼包括抗體之VL的胺基酸序列及/或包含VH之胺基酸序列，例如抗體之輕鏈及/或重鏈。在某些實施例中，經分離之核酸可包括編碼具有SEQ ID NO: 54中所闡述之序列的重鏈可變區胺基酸序列之核苷酸序列，及/或編碼具有SEQ ID NO: 50中所闡述之序列的輕鏈可變區胺基酸序列之核苷酸序列。在某些實施例中，經分離之核酸可包括編碼具有SEQ ID NO: 57中所闡述之序列的重鏈可變區胺基酸序列之核苷酸序列，及/或編碼具有SEQ ID NO: 53中所闡述之序列的輕鏈可變區胺基酸序列之核苷酸序列。
在某些實施例中，核酸可存在於一或多個載體(例如表現載體)中。如本文所用，術語「載體」係指能夠轉運與其連接之另一核酸的核酸分子。一種類型之載體為「質粒」，其係指其他DNA區段可連結至其中之環狀雙股DNA環。另一類型之載體為病毒載體，其中其他DNA區段可連結至病毒基因組中。某些載體能夠在其引入之宿主細胞中自主複製(例如具有細菌複製起點之細菌載體及附加型哺乳動物載體)。其他載體(例如非附加型哺乳動物載體)在引入宿主細胞中後整合至宿主細胞之基因組中，且由此與宿主基因組一起複製。此外，某些載體(表現載體)能夠引導與其可操作地連接之基因的表現。一般而言，用於重組DNA技術中之表現載體常常呈質粒(載體)形式。然而，所揭示之主題旨在包括發揮同等功能之此類其他形式之表現載體，諸如病毒載體(例如複製缺陷型逆轉錄病毒、腺病毒及腺相關病毒)。
在某些實施例中，可將編碼本發明之抗體的核酸及/或包括該核酸之一或多個載體引入宿主細胞中。在某些實施例中，將核酸引入細胞中可藉由此項技術中已知之任何方法來進行，包括但不限於轉染、電穿孔、微量注射、用含有核酸序列之病毒或噬菌體載體感染、細胞融合、染色體介導之基因轉移、微細胞介導之基因轉移、原生質球狀體融合等。在某些實施例中，宿主細胞可包括(例如已用以下各項轉型)：(1)包含編碼包含抗體之VL的胺基酸序列及包含抗體之VH的胺基酸序列之核酸的載體，或(2)第一載體，其包含編碼包含抗體之VL的胺基酸序列的核酸；及第二載體，其包含編碼包含抗體之VH的胺基酸序列的核酸。在某些實施例中，宿主細胞為真核細胞，例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或淋巴樣細胞(例如Y0、NS0、Sp20細胞)。
在某些實施例中，製備所揭示之抗FGF21抗體之方法可包括在適合抗體表現之條件下培養已引入編碼抗體之核酸的宿主細胞，及視情況自宿主細胞及/或宿主細胞培養基回收抗體。在某些實施例中，通過層析技術自宿主細胞回收抗體。
對於本發明之抗體之重組製備，可分離例如如上文所描述編碼抗體之核酸，且***一或多個載體中以便進一步在宿主細胞中選殖及/或表現。此類核酸可使用習知程序(例如藉由使用寡核苷酸探針，其能夠特異性結合於編碼抗體之重鏈及輕鏈的基因)輕易地分離及測序。
適合用於抗體編碼載體之選殖或表現的宿主細胞包括本文所描述之原核或真核細胞。舉例而言，特定而言當不需要糖基化及Fc效應功能時，可在細菌中產生抗體。關於抗體片段及多肽在細菌中之表現，參見例如美國專利第5,648,237號、第5,789,199號及第5,840,523號。(參見例如Charlton,Methods in Molecular Biology, 第 248 卷 (B.K.C. Lo編, Humana Press, Totowa, NJ, 2003), 第245-254頁，其描述抗體片段在大腸桿菌中之表現)。在表現之後，可於可溶性級分中自細菌細胞糊分離抗體且可進一步純化。
除原核生物之外，諸如絲狀真菌或酵母之真核微生物亦為適合於抗體編碼載體之選殖或表現宿主，包括糖基化路徑已「經人類化」從而使得以部分或完全人類糖基化模式產生抗體之真菌及酵母菌株。參見Gerngross,Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004)及Li等人,Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)。適合用於表現糖基化抗體之宿主細胞亦可衍生自多細胞有機體(無脊椎動物及脊椎動物)。無脊椎動物細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。已識別許多桿狀病毒株，其可與昆蟲細胞結合使用，特定而言用於轉染草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda )細胞。
適合用於表現糖基化抗體之宿主細胞亦衍生自多細胞有機體(無脊椎動物及脊椎動物)。無脊椎動物細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。已識別許多桿狀病毒株，其可與昆蟲細胞結合使用，特定而言用於轉染草地貪夜蛾細胞。
在某些實施例中，可利用植物細胞培養物作為宿主細胞。參見例如美國專利第5,959,177號、第6,040,498號、第6,420,548號、第7,125,978號及第6,417,429號(描述用於在基因轉殖植物中產生抗體之PLANTIBODIESTM 技術)。
在某些實施例中，亦可使用脊椎動物細胞作為宿主。舉例而言，但不限制，適合於在懸浮液中生長之哺乳動物細胞株可為適用的。適用之哺乳動物宿主細胞株之非限制性實例為由SV40轉型之猴腎CV1細胞株(COS-7)；人類胚胎腎細胞株(如例如Graham等人, J. Gen Virol. 36:59 (1977)中所描述之293或293細胞)；幼倉鼠腎細胞(BHK)；小鼠足細胞(如例如Mather,Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)中所描述之TM4細胞)；猴腎細胞(CV1)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76)；人類子宮頸癌細胞(HELA)；犬腎細胞(MDCK；布法羅大鼠(buffalo rat)肝細胞(BRL 3A)；人類肺細胞(W138)；人類肝細胞(Hep G2)；小鼠***腫瘤(MMT 060562)；如例如Mather等人, Annals N.Y. Acad. Sci . 383:44-68 (1982)中所描述之TRI細胞；MRC 5細胞；及FS4細胞。其他適用之哺乳動物宿主細胞株包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，包括DHFR- CHO細胞(Urlaub等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980))；及骨髓瘤細胞株，諸如Y0、NS0及Sp2/0。關於適合用於產生抗體之某些哺乳動物宿主細胞株的綜述，參見例如Yazaki及Wu,Methods in Molecular Biology, 第 248 卷 (B.K.C. Lo編, Humana Press, Totowa, NJ), 第255-268頁(2003)。
在某些實施例中，用於製備雙特異性抗體及/或多特異性抗體之技術包括但不限於具有不同特異性之兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對之重組共表現(參見Milstein及Cuello,Nature 305: 537 (1983))、PCT專利申請號WO 93/08829及Traunecker等人,EMBO J. 10: 3655 (1991))及「杵臼」工程改造(參見例如美國專利第5,731,168號)。亦可如下製備雙特異性抗體：藉由工程改造靜電轉向效應以製備抗體Fc-異二聚分子(WO 2009/089004A1)；交聯兩種或更多種抗體或片段(參見例如美國專利第4,676,980號及Brennan等人, Science , 229: 81 (1985))；使用白胺酸拉鏈來製備雙特異性抗體(參見例如Kostelny等人 ,J. Immunol. , 148(5):1547-1553 (1992))；使用用於製備雙特異性抗體片段之「雙功能抗體」技術(參見例如Hollinger等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 90:6444-6448 (1993))；及使用單鏈Fv (sFv)二聚體(參見例如Gruber等人, J. Immunol. , 152:5368 (1994))；及如例如Tutt等人J. Immunol. 147: 60 (1991)中所描述製備三特異性抗體。
本發明之雙特異性及多特異性分子亦可使用化學技術(參見例如Kranz (1981)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5807)、「多域(polydoma)」技術(參見例如美國專利4,474,893)或重組DNA技術來製備。當前所揭示之主題的雙特異性及多特異性分子亦可藉由使用此項技術中已知及如本文所描述之方法將組成結合特異性(例如第一抗原決定基及第二抗原決定基結合特異性)相接合來製備。舉例而言，但不限制，可分開地產生雙特異性及多特異性分子之各結合特異性且接著接合至彼此。當結合特異性為蛋白質或肽時，可使用多種偶合或交聯劑來進行共價接合。交聯劑之非限制性實例包括蛋白質A、碳二醯亞胺、N-丁二醯亞胺基-S-乙醯基-硫代乙酸酯(SATA)、N-丁二醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)及磺基丁二醯亞胺基4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸酯(磺基-SMCC) (參見例如Karpovsky (1984) J. Exp. Med. 160:1686；Liu (1985)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648)。其他方法包括由Paulus (Behring Ins. Mitt. (1985) 第78期, 118-132；Brennan (1985)Science 229:81-83), Glennie (1987)J. Immunol. 139: 2367-2375)描述之彼等方法。當結合特異性為抗體(例如兩種人類化抗體)時，其可經由兩條重鏈之C端鉸鏈區之硫氫基鍵結而接合。在某些實施例中，鉸鏈區可經修飾以在接合之前含有奇數之硫氫基殘基，例如一個。
在某些實施例中，雙特異性抗體之兩種結合特異性可在相同載體中編碼且在相同宿主細胞中表現及組裝。此方法在雙特異性及多特異性分子為MAb x MAb、MAb x Fab、Fab x F(ab’)2 或配位體x Fab融合蛋白之情況下特別適用。在某些實施例中，本發明之雙特異性抗體可為單鏈分子，諸如單鏈雙特異性抗體、包含一個單鏈抗體及結合決定位之單鏈雙特異性分子或包含兩個結合決定位之單鏈雙特異性分子。雙特異性及多特異性分子亦可為單鏈分子或可包含至少兩個單鏈分子。製備雙特異性分子及多特異性分子之方法描述於例如美國專利第5,260,203號；美國專利第5,455,030號；美國專利第4,881,175號；美國專利第5,132,405號；美國專利第5,091,513號；美國專利第5,476,786號；美國專利第5,013,653號；美國專利第5,258,498號；及美國專利第5,482,858號中。本文亦包括具有三個或更多個功能性抗原結合位點(例如抗原決定基結合位點)之經工程改造之抗體，包括「章魚抗體」(參見例如US 2006/0025576A1)。
在某些實施例中，可使用動物系統來產生本發明之抗體。一種用於製備雜交瘤之動物系統為鼠系統。小鼠中之雜交瘤製備為充分確立之程序。用於分離經免疫之脾細胞以用於融合之免疫方案及技術為此項技術中已知的。融合配偶體(例如鼠骨髓瘤細胞)及融合程序亦為已知的(參見例如Harlow及Lane (1988), Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor New York)。C. 結合競爭分析
可藉由此項技術中已知及本文所提供之各種分析對本文所提供之本發明的抗FGF21抗體之物理/化學特性及/或生物活性加以鑑定、篩選或表徵。1. 結合分析及其他分析
本發明之抗體的抗原結合活性可藉由諸如酶聯免疫吸附分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)或西方墨點分析(Western Blot Assay)之已知方法來測試。此等分析中之每一者通常藉由採用對相關複合物具特異性的經標記試劑(例如抗體)來偵測特別關注之蛋白質-抗體複合物之存在。舉例而言，FGF21-抗體複合物可使用例如識別且特異性結合於抗體-FGF21複合物之酶聯抗體或抗體片段來偵測。或者，可使用多種其他免疫分析中之任一者來偵測複合物。舉例而言，抗體可經放射性標記且用於放射免疫分析(RIA)中(參見例如Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, 1986年3月，其以引用之方式併入本文中)。可藉由諸如使用蓋革計數器(Geiger counter)或閃爍計數器或藉由自動射線照相術之手段來偵測放射性同位素。
在某些實施例中，競爭分析可用於鑑定與本發明之抗FGF21抗體(例如mAb4或mAb15)競爭結合於FGF21之抗體。在某些實施例中，此類競爭抗體結合於mAb4或mAb15所結合之相同抗原決定基(例如線性或構象抗原決定基)。用於定位抗體結合之抗原決定基之詳細示例性方法提供於Morris (1996) 「Epitope Mapping Protocols」,Methods in Molecular Biology 第66卷(Humana Press, Totowa, NJ)中。
在競爭分析之一個非限制性實例中，可將經固定之FGF21在包含結合於FGF21 (例如mAb4或mAb15)之第一經標記抗體及針對與第一抗體競爭結合於FGF21之能力進行測試的第二未標記抗體之溶液中孵育。第二抗體可存在於雜交瘤上清液中。作為對照，將經固定之FGF21在包含第一經標記抗體但不包含第二未標記抗體之溶液中孵育。在允許第一抗體結合於FGF21之條件下孵育之後，將過量未結合之抗體移除，且量測與經固定之FGF21相關之標記的量。若在測試樣品中與經固定之FGF21相關之標記的量相對於對照樣品實質上減少，則此表明第二抗體與第一抗體競爭結合於FGF21。參見Harlow及Lane (1988)Antibodies: A Laboratory Manual 第14章(Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)。D. 免疫接合物
當前所揭示之主題進一步提供包含接合至一或多種細胞毒性劑之抗體的免疫接合物，該一或多種細胞毒性劑為諸如化學治療劑或藥物、生長抑制劑、毒素(例如蛋白質毒素、細菌、真菌、植物或動物來源之酶活性毒素或其片段)或放射性同位素。舉例而言，所揭示之主題的抗體或抗原結合部分可在功能上連接(例如藉由化學偶合、基因融合、非共價締合或以其他方式)至一或多個其他結合分子，諸如另一抗體、抗體片段、肽或結合模擬物。
在某些實施例中，免疫接合物為抗體-藥物接合物(ADC)，其中抗體接合至一或多種藥物，包括但不限於類美登素(maytansinoid) (參見美國專利第5,208,020號、第5,416,064號及歐洲專利EP 0 425 235)；澳瑞他汀(auristatin)，諸如單甲基澳瑞他汀藥物部分DE及DF (MMAE及MMAF) (參見美國專利第5,635,483號及第5,780,588號及第7,498,298號)；多拉司他汀(dolastatin)；加利車黴素(calicheamicin)或其衍生物(參見美國專利第5,712,374號、第5,714,586號、第5,739,116號、第5,767,285號、第5,770,701號、第5,770,710號、第5,773,001號及第5,877,296號；Hinman等人,Cancer Res. 53:3336-3342 (1993)；及Lode等人,Cancer Res. 58:2925-2928 (1998))；蒽環類，諸如道諾黴素或阿黴素(參見Kratz等人,Current Med. Chem. 13:477-523 (2006)；Jeffrey等人,Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006)；Torgov等人,Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005)；Nagy等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000)；Dubowchik等人,Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002)；King等人,J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002)；及美國專利第6,630,579號)；胺甲喋呤；長春地辛；紫杉烷，諸如多西他賽(docetaxel)、帕西他賽(paclitaxel)、拉洛他賽(larotaxel)、替司他賽(tesetaxel)及奧他賽(ortataxel)；單端孢黴烯(trichothecene)；及CC1065。
在某些實施例中，免疫接合物包含接合至包括但不限於以下之酶活性毒素或其片段之如本文所描述之抗體：白喉A鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素A鏈(來自綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa))、篦麻毒素A鏈、相思豆毒素A鏈、蒴蓮根毒素A鏈、α-八疊球菌素、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素蛋白、美洲商陸(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制劑、麻風樹毒素、巴豆毒素、肥阜草(sapaonaria officinalis)抑制劑、白樹毒素(gelonin)、絲林黴素(mitogellin)、侷限麴菌素(restrictocin)、酚黴素、伊諾黴素(enomycin)及單端孢黴烯。
在某些實施例中，免疫接合物包含接合至放射性原子以形成放射性接合物的如本文所描述之抗體。多種放射性同位素可用於製備放射性接合物。非限制性實例包括At211 、I131 、I125 、Y90 、Re186 、Re188 、Sm153 、Bi212 、P32 、Pb212 及Lu之放射性同位素。當放射性接合物用於偵測時，其可包括用於閃爍圖像研究之放射性原子，例如tc99m或I123，或用於核磁共振(NMR)成像(亦稱為磁共振成像，mri)之自旋標記，諸如再次碘-123、碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳或鐵。
抗體與細胞毒性劑之接合物可使用諸如以下之多種雙官能蛋白質偶合劑來製備：N-丁二醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、丁二醯亞胺基-4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸酯(SMCC)、亞胺基硫雜環戊烷(IT)、亞胺酸酯之雙官能衍生物(諸如二亞胺代己二酸二甲酯鹽酸鹽)、活性酯(諸如辛二酸二丁二醯亞胺酯)、醛(諸如戊二醛)、雙疊氮基化合物(諸如雙(對疊氮基苯甲醯基)己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙(對重氮苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2,6-二異氰酸酯)及雙活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。舉例而言，篦麻毒素免疫毒素可如Vitetta等人,Science 238:1098 (1987)中所描述來製備。碳-14-標記之1-異硫氰酸苯甲基-3-甲基二伸乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)為用於使放射性核苷酸接合至抗體之示例性螯合劑。參見WO94/11026。連接子可為有助於細胞中細胞毒性藥物之釋放的「可裂解連接子」。舉例而言，可使用酸不穩定性連接子、肽酶敏感性連接子、光不穩性連接子、二甲基連接子或含二硫化物之連接子(Chari等人,Cancer Res. 52:127-131 (1992)；美國專利第5,208,020號)。
本文所揭示之免疫接合物明確涵蓋但不限於此類用包括但不限於以下之交聯劑試劑製備之接合物：BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC及磺基-SMPB及SVSB (丁二醯亞胺基-(4-乙烯基碸)苯甲酸酯)，該等物質可商購獲得(例如來自Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.A)。IV. 套組
當前所揭示之主題進一步提供含有適用於進行本文所揭示之免疫分析的材料之套組。在某些實施例中，該套組包括含有本文所揭示之抗FGF21抗體之容器。適合之容器之非限制性實例包括瓶子、試管、小瓶及微量滴定板。容器可由諸如玻璃或塑膠之多種材料形成。在某些實施例中，該套組進一步包括包裝插頁，該包裝插頁提供關於在所揭示之免疫分析方法中使用抗FGF21抗體之說明書。
在某些實施例中，該套組可包括含有一或多種抗FGF21抗體之一或多個容器。抗FGF21抗體之非限制性實例揭示於表8-13及16-19及圖41A及B中。舉例而言，但不限制，該套組可包括至少一個包括抗FGF21捕獲抗體之容器及至少一個包括抗FGF21偵測抗體之容器。
在某些實施例中，用於偵測樣品中之總FGF21蛋白之套組包括第一容器，其含有結合於存在於FGF21之胺基酸殘基5-172內之抗原決定基的捕獲抗體；第二容器，其含有結合於存在於FGF21之胺基酸殘基5-172內之抗原決定基的偵測抗體；及第三容器，其含有偵測劑。
在某些實施例中，用於偵測樣品中之活性FGF21蛋白之套組包括第一容器，其含有結合於存在於FGF21之胺基酸殘基5-172內之抗原決定基的捕獲抗體；第二容器，其含有結合於存在於FGF21之胺基酸殘基173-182內之抗原決定基的偵測抗體；及第三容器，其含有偵測劑。
在某些實施例中，用於測定樣品中活性FGF21蛋白與總FGF21蛋白之比率的套組包括第一容器，其含有結合於存在於FGF21之胺基酸殘基5-172內之抗原決定基的第一捕獲抗體；第二容器，其含有結合於存在於FGF21之胺基酸殘基5-172內之抗原決定基的第一偵測抗體；第三容器，其含有結合於存在於FGF21之胺基酸殘基5-172內之抗原決定基的第二捕獲抗體；第四容器，其含有結合於存在於FGF21之胺基酸殘基173-182內之抗原決定基的第二偵測抗體；及第五容器，其含有偵測劑。在某些實施例中，第一與第二捕獲抗體為相同抗體且可提供於單一容器中。或者，第一與第二捕獲抗體為不同抗體，且可提供於分開之容器中。
在某些實施例中，捕獲抗體及/或偵測抗體可以約0.1 μg/ml至約5.0 μg/ml之濃度提供於本發明之套組中。在某些實施例中，偵測抗體可例如經生物素標記。
在某些實施例中，提供於本發明之套組中之偵測劑可為親和素、鏈黴親和素-HRP或鏈黴親和素-β-D-半乳哌喃糖(SBG)。在某些實施例中，本發明之套組可進一步包括四甲基聯苯胺、過氧化氫及/或試鹵靈β-D-半乳哌喃糖苷。在某些實施例中，若套組包括鏈黴親和素-HRP，則套組可進一步包括四甲基聯苯胺及過氧化氫。在某些實施例中，若套組包括SBG，則套組可進一步包括試鹵靈β-D-半乳哌喃糖苷。在某些實施例中，SBG可以約100 pM至約400 pM之濃度提供於套組中。
在某些實施例中，可提供附接至固體支撐物表面(諸如但不限於板或珠粒，例如順磁性珠粒)之捕獲抗體。替代地或另外，該套組可進一步包括可偶合至捕獲抗體之固體支撐物表面。在某些實施例中，固體支撐物可為順磁性珠粒且可以每毫升約0.1 x 107 個珠粒至每毫升約10.0 x 107 個珠粒之濃度提供。
替代地或另外，該套組可包括由商業及使用者立場來看所需之其他材料，包括其他緩衝液、稀釋劑及過濾器。在某些實施例中，該套組可包括用於收集及/或加工血液樣品之材料。V. 示例性實施例
A. 在某些非限制性實施例中，當前所揭示之主題提供一種用於測定樣品中之總FGF21蛋白的量之免疫分析方法，該免疫分析方法包括： (a) 使結合於存在於FGF21之胺基酸殘基5-172內之抗原決定基的捕獲抗體與該樣品接觸，以產生樣品-捕獲抗體組合物質； (b) 使該樣品-捕獲抗體組合物質與結合於存在於FGF21之胺基酸殘基5-172內之抗原決定基的偵測抗體接觸； (c) 偵測結合於該樣品-捕獲抗體組合物質之該偵測抗體；及 (d) 基於所結合之該偵測抗體之水準計算存在於該樣品中的總FGF21蛋白之量。
A1. 如A之前述免疫分析方法，其中該捕獲抗體及該偵測抗體結合於FGF21之胺基酸殘基5-172內之不同抗原決定基。
B. 在某些非限制性實施例中，當前所揭示之主題提供一種用於測定樣品中之活性FGF21蛋白的量之免疫分析方法，該免疫分析方法包括： (a) 使結合於存在於FGF21之胺基酸殘基5-172內之抗原決定基的捕獲抗體與該樣品接觸，以產生樣品-捕獲抗體組合物質； (b) 使該樣品-捕獲抗體組合物質與結合於存在於FGF21之胺基酸殘基173-182內之抗原決定基的偵測抗體接觸； (c) 偵測結合於該樣品-捕獲抗體組合物質之該偵測抗體；及 (d) 基於所結合之該偵測抗體之水準計算存在於該樣品中的活性FGF21蛋白之量。
C. 在某些非限制性實施例中，當前所揭示之主題提供一種用於測定樣品中活性FGF21蛋白與總FGF21蛋白之比率的免疫分析方法，該免疫分析方法包括： (a) (i)使結合於存在於FGF21之胺基酸殘基5-172內之抗原決定基的第一捕獲抗體與該樣品接觸，以產生第一樣品-捕獲抗體組合物質；(ii)使該第一樣品-捕獲抗體組合物質與結合於存在於FGF21之胺基酸殘基5-172內之抗原決定基的第一偵測抗體接觸；(iii)偵測結合於該樣品-捕獲抗體組合物質之該第一偵測抗體；及(iv)基於所結合之該第一偵測抗體之水準計算存在於該樣品中的總FGF21蛋白之量； (b) (i)使結合於存在於FGF21之胺基酸殘基5-172內之抗原決定基的第二捕獲抗體與該樣品接觸，以產生第二樣品-捕獲抗體組合物質；(ii)使該第二樣品-捕獲抗體組合物質與結合於存在於FGF21之胺基酸殘基173-182內之抗原決定基的第二偵測抗體接觸；(iii)偵測結合於該樣品-捕獲抗體組合物質之該第二偵測抗體；及(iv)基於所結合之該第二偵測抗體之水準計算存在於該樣品中的活性FGF21蛋白之量；及 (c) 將如藉由步驟(a)所測定之總FGF21蛋白的量與如藉由步驟(b)所測定之活性FGF21蛋白的量相比較，以確定該樣品中活性FGF21蛋白與總FGF21蛋白之比率。
C1. 如C之前述免疫分析方法，其中該第一捕獲抗體與該第二捕獲抗體為相同抗體。
C2. 如C之前述免疫分析方法，其中該第一捕獲抗體及該第一偵測抗體結合於FGF21之胺基酸殘基5-172內之不同抗原決定基。
C3. 如A-C2中任一項之前述免疫分析方法，其中該免疫分析為酶聯免疫吸附分析(ELISA)。
C4. 如A-C3中任一項之前述免疫分析方法，其中該捕獲抗體、該第一捕獲抗體及該第二捕獲抗體中之一或多者固定至順磁性珠粒。
C5. 如A-C4中任一項之前述免疫分析方法，其中該偵測抗體、該第一偵測抗體及該第二偵測抗體中之一或多者接合至生物素。
C6. 如A-C5中任一項之前述免疫分析方法，其中該捕獲抗體、該第一捕獲抗體及該第二捕獲抗體中之一或多者以約10-10 M至10-13 M之Kd 結合於FGF21。
C7. 如A及C-C6中任一項之前述免疫分析方法，其中該偵測抗體及該第一偵測抗體中之一或多者以約10-10 M至10-13 M之Kd 結合於FGF21。
C8. 如A-C7中任一項之前述免疫分析方法，其中該樣品為血液樣品。
C9. 如A-C7中任一項之前述免疫分析方法，其中該樣品為血漿樣品。
C10. 如A-C9中任一項之前述免疫分析方法，其中該方法以約2 pg/ml至約20 pg/ml之孔內靈敏度偵測該樣品中之總體或活性FGF21蛋白的量。
C11. 如A-C9中任一項之前述免疫分析方法，其中該免疫分析方法係使用單分子偵測儀器進行。
C12. 如C11之前述免疫分析方法，其中該單分子偵測儀器為Quanterix Simoa HD-1 Analyzer™。
C13. 如C11及C12之前述免疫分析方法，其中該方法以約0.2 pg/ml至約0.5 pg/ml之孔內靈敏度偵測該樣品中之總體或活性FGF21蛋白的量。
C14. 如A-C13中任一項之前述免疫分析方法，其中該捕獲抗體、該第一捕獲抗體及該第二捕獲抗體中之一或多者包含： (a) 重鏈可變區CDR1，其包含選自由SEQ ID NO: 26及27組成之群的胺基酸序列及其保守取代； (b) 重鏈可變區CDR2結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 30及31組成之群的胺基酸序列及其保守取代； (c) 重鏈可變區CDR3結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 34及35組成之群的胺基酸序列及其保守取代； (d) 輕鏈可變區CDR1結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 38及39組成之群的胺基酸序列及其保守取代； (e) 輕鏈可變區CDR2結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 42及43組成之群的胺基酸序列及其保守取代；及 (f) 輕鏈可變區CDR3結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 46及47組成之群的胺基酸序列及其保守取代。
C15. 如A-C13中任一項之前述免疫分析，其中該捕獲抗體、該第一捕獲抗體及該第二捕獲抗體中之一或多者包含： (a) 重鏈可變區，其包含選自由SEQ ID NO: 54、55、74及75組成之群的胺基酸序列及其保守取代；及 (b) 輕鏈可變區，其包含選自由SEQ ID NO: 50、51、70及71組成之群的胺基酸序列及其保守取代。
C16. 如A-C13中任一項之前述免疫分析，其中該捕獲抗體、該第一捕獲抗體及該第二捕獲抗體中之一或多者包含： (a) 重鏈，其包含選自由SEQ ID NO: 22、23、66及67組成之群的胺基酸序列及其保守取代；及 (b) 輕鏈，其包含選自由SEQ ID NO: 18、19、62及63組成之群的胺基酸序列及其保守取代。
C17. 如A及C-C13中任一項之前述免疫分析方法，其中該偵測抗體及該第一偵測抗體中之一或多者包含： (a) 重鏈可變區CDR1，其包含選自由SEQ ID NO: 28及29組成之群的胺基酸序列及其保守取代； (b) 重鏈可變區CDR2結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 32及33組成之群的胺基酸序列及其保守取代； (c) 重鏈可變區CDR3結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 36及37組成之群的胺基酸序列及其保守取代； (d) 輕鏈可變區CDR1結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 40及41組成之群的胺基酸序列及其保守取代； (e) 輕鏈可變區CDR2結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 44及45組成之群的胺基酸序列及其保守取代；及 (f) 輕鏈可變區CDR3結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 48及49組成之群的胺基酸序列及其保守取代。
C18. 如A及C-C13中任一項之前述免疫分析，其中該偵測抗體及該第一偵測抗體中之一或多者包含： (a) 重鏈可變區，其包含選自由SEQ ID NO: 56、57、72及73組成之群的胺基酸序列及其保守取代；及 (b) 輕鏈可變區，其包含選自由SEQ ID NO: 52、53、68及69組成之群的胺基酸序列及其保守取代。
C19. 如A及C-C13中任一項之前述免疫分析，其中該偵測抗體及該第一偵測抗體中之一或多者包含： (a) 重鏈，其包含選自由SEQ ID NO: 24、25、64及65組成之群的胺基酸序列及其保守取代；及 (b) 輕鏈，其包含選自由SEQ ID NO: 20、21、60及61組成之群的胺基酸序列及其保守取代。
C20. 如C14之前述免疫分析方法，其中該捕獲抗體、該第一捕獲抗體及該第二捕獲抗體中之一或多者包含： (a) 重鏈可變區CDR1，其包含SEQ ID NO: 26之胺基酸序列及其保守取代； (b) 重鏈可變區CDR2結構域，其包含SEQ ID NO: 30之胺基酸序列及其保守取代； (c) 重鏈可變區CDR3結構域，其包含SEQ ID NO: 34之胺基酸序列及其保守取代； (d) 輕鏈可變區CDR1結構域，其包含SEQ ID NO: 38之胺基酸序列及其保守取代； (e) 輕鏈可變區CDR2結構域，其包含SEQ ID NO: 42之胺基酸序列及其保守取代；及 (f) 輕鏈可變區CDR3結構域，其包含SEQ ID NO: 46之胺基酸序列及其保守取代。
C21. 如C20之前述免疫分析，其中該捕獲抗體、該第一捕獲抗體及該第二捕獲抗體中之一或多者包含： (a) 重鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 54之胺基酸序列及其保守取代；及 (b) 輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 50之胺基酸序列及其保守取代。
C22. 如C21之前述免疫分析，其中該捕獲抗體、該第一捕獲抗體及該第二捕獲抗體中之一或多者包含： (a) 重鏈，其包含SEQ ID NO: 22之胺基酸序列及其保守取代；及 (b) 輕鏈，其包含SEQ ID NO: 18之胺基酸序列及其保守取代。
C23. 如C17之前述免疫分析方法，其中該偵測抗體及該第一偵測抗體中之一或多者包含： (a) 重鏈可變區CDR1，其包含SEQ ID NO: 29之胺基酸序列及其保守取代； (b) 重鏈可變區CDR2結構域，其包含SEQ ID NO: 33之胺基酸序列及其保守取代； (c) 重鏈可變區CDR3結構域，其包含SEQ ID NO: 37之胺基酸序列及其保守取代； (d) 輕鏈可變區CDR1結構域，其包含SEQ ID NO: 41之胺基酸序列及其保守取代； (e) 輕鏈可變區CDR2結構域，其包含SEQ ID NO: 45之胺基酸序列及其保守取代；及 (f) 輕鏈可變區CDR3結構域，其包含SEQ ID NO: 49之胺基酸序列及其保守取代。
C24. 如C23之前述免疫分析，其中該偵測抗體及該第一偵測抗體中之一或多者包含： (a) 重鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 57之胺基酸序列及其保守取代；及 (b) 輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 53之胺基酸序列及其保守取代。
C25. 如C24之前述免疫分析，其中該偵測抗體及該第一偵測抗體中之一或多者包含： (a) 重鏈，其包含SEQ ID NO: 25之胺基酸序列及其保守取代；及 (b) 輕鏈，其包含SEQ ID NO: 21之胺基酸序列及其保守取代。
C26. 如A-C13中任一項之前述免疫分析方法，其中該捕獲抗體、該第一捕獲抗體及該第二捕獲抗體中之一或多者與包含以下各項之抗體競爭性結合： (a) 重鏈可變區CDR1，其包含選自由SEQ ID NO: 26及27組成之群的胺基酸序列及其保守取代； (b) 重鏈可變區CDR2結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 30及31組成之群的胺基酸序列及其保守取代； (c) 重鏈可變區CDR3結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 34及35組成之群的胺基酸序列及其保守取代； (d) 輕鏈可變區CDR1結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 38及39組成之群的胺基酸序列及其保守取代； (e) 輕鏈可變區CDR2結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 42及43組成之群的胺基酸序列及其保守取代；及 (f) 輕鏈可變區CDR3結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 46及47組成之群的胺基酸序列及其保守取代。
C27. 如A及C-C13中任一項之前述免疫分析方法，其中該偵測抗體及該第一偵測抗體中之一或多者與包含以下各項之抗體競爭性結合： (a) 重鏈可變區CDR1，其包含選自由SEQ ID NO: 28及29組成之群的胺基酸序列及其保守取代； (b) 重鏈可變區CDR2結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 32及33組成之群的胺基酸序列及其保守取代； (c) 重鏈可變區CDR3結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 36及37組成之群的胺基酸序列及其保守取代； (d) 輕鏈可變區CDR1結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 40及41組成之群的胺基酸序列及其保守取代； (e) 輕鏈可變區CDR2結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 44及45組成之群的胺基酸序列及其保守取代；及 (f) 輕鏈可變區CDR3結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 48及49組成之群的胺基酸序列及其保守取代。
D. 在某些非限制性實施例中，當前所揭示之主題提供一種用於偵測樣品中之總FGF21蛋白的套組，該套組包含： (a) 捕獲抗體，其結合於存在於FGF21之胺基酸殘基5-172內之抗原決定基； (b) 偵測抗體，其結合於存在於FGF21之胺基酸殘基5-172內之抗原決定基；及 (c) 偵測劑。
D1. 如D之前述套組，其中該捕獲抗體及該偵測抗體結合於FGF21之胺基酸殘基5-172內之不同抗原決定基。
E. 在某些非限制性實施例中，當前所揭示之主題提供一種用於偵測樣品中之活性FGF21蛋白的套組，該套組包含： (a) 捕獲抗體，其結合於存在於FGF21之胺基酸殘基5-172內之抗原決定基； (b) 偵測抗體，其結合於存在於FGF21之胺基酸殘基173-182內之抗原決定基；及 (c) 偵測劑。
F. 在某些非限制性實施例中，當前所揭示之主題提供一種用於測定樣品中之活性FGF21蛋白與總FGF21蛋白之比率的套組，該套組包含： (a) (i)第一捕獲抗體，其結合於存在於FGF21之胺基酸殘基5-172內之抗原決定基及(ii)第一偵測抗體，其結合於存在於FGF21之胺基酸殘基5-172內之抗原決定基； (b) (i)第二捕獲抗體，其結合於存在於FGF21之胺基酸殘基5-172內之抗原決定基及(ii)第二偵測抗體，其結合於存在於FGF21之胺基酸殘基173-182內之抗原決定基；及 (c) 一或多種偵測劑。
F1. 如F之前述套組，其中該第一捕獲抗體與該第二捕獲抗體為相同抗體。
F2. 如F之前述套組，其中該第一捕獲抗體及該第一偵測抗體結合於FGF21之胺基酸殘基5-172內之不同抗原決定基。
F3. 如D-F2中任一項之前述套組，其中該捕獲抗體、該第一捕獲抗體及該第二捕獲抗體中之一或多者固定至順磁性珠粒。
F4. 如D-F3中任一項之前述套組，其中該偵測抗體、該第一偵測抗體及該第二偵測抗體中之一或多者接合至生物素。
F5. 如D-F4中任一項之前述套組，其中該偵測劑係選自由以下組成之群：鏈黴親和素-β-D-半乳哌喃糖接合物、鏈黴親和素-辣根過氧化酶接合物及其組合。
F6. 如F5之前述套組，其進一步包含試鹵靈β-D-半乳哌喃糖苷、四甲基聯苯胺、過氧化氫或其組合。
F7. 如D-F6中任一項之前述套組，其中該捕獲抗體、該第一捕獲抗體及該第二捕獲抗體中之一或多者以約10-10 M至10-13 M之Kd結合於FGF21。
F8. 如D及F-F7中任一項之前述套組，其中該偵測抗體及該第一偵測抗體中之一或多者以約10-10 M至10-13 M之Kd結合於FGF21。
F9. 如D及F-F8中任一項之前述套組，其中該偵測抗體或該第一偵測抗體具有約0.1 μg/ml至約1 μg/ml之濃度。
F10. 如E-F7中任一項之前述套組，其中該偵測抗體或該第二偵測抗體中之一或多者具有約1 μg/ml至約3 μg/ml之濃度。
F11. 如F5之前述套組，其中該鏈黴親和素-β-D-半乳哌喃糖接合物具有約100 pM至約400 pM之濃度。
F12. 如D-F11中任一項之前述套組，其中該捕獲抗體、該第一捕獲抗體及該第二捕獲抗體中之一或多者包含： (a) 重鏈可變區CDR1，其包含選自由SEQ ID NO: 26及27組成之群的胺基酸序列及其保守取代； (b) 重鏈可變區CDR2結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 30及31組成之群的胺基酸序列及其保守取代； (c) 重鏈可變區CDR3結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 34及35組成之群的胺基酸序列及其保守取代； (d) 輕鏈可變區CDR1結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 38及39組成之群的胺基酸序列及其保守取代； (e) 輕鏈可變區CDR2結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 42及43組成之群的胺基酸序列及其保守取代；及 (f) 輕鏈可變區CDR3結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 46及47組成之群的胺基酸序列及其保守取代。
F13. 如D-F11中任一項之前述套組，其中該捕獲抗體、該第一捕獲抗體及該第二捕獲抗體中之一或多者包含： (a) 重鏈可變區，其包含選自由SEQ ID NO: 54、55、74及75組成之群的胺基酸序列及其保守取代；及 (b) 輕鏈可變區，其包含選自由SEQ ID NO: 50、51、70及71組成之群的胺基酸序列及其保守取代。
F14. 如D-F11中任一項之前述套組，其中該捕獲抗體、該第一捕獲抗體及該第二捕獲抗體中之一或多者包含： (a) 重鏈，其包含選自由SEQ ID NO: 22、23、66及67組成之群的胺基酸序列及其保守取代；及 (b) 輕鏈，其包含選自由SEQ ID NO: 18、19、62及63組成之群的胺基酸序列及其保守取代。
F15. 如D及F-F11中任一項之前述套組，其中該偵測抗體及該第一偵測抗體中之一或多者包含： (a) 重鏈可變區CDR1，其包含選自由SEQ ID NO: 28及29組成之群的胺基酸序列及其保守取代； (b) 重鏈可變區CDR2結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 32及33組成之群的胺基酸序列及其保守取代； (c) 重鏈可變區CDR3結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 36及37組成之群的胺基酸序列及其保守取代； (d) 輕鏈可變區CDR1結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 40及41組成之群的胺基酸序列及其保守取代； (e) 輕鏈可變區CDR2結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 44及45組成之群的胺基酸序列及其保守取代；及 (f) 輕鏈可變區CDR3結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 48及49組成之群的胺基酸序列及其保守取代。
F16. 如D及F-F11中任一項之前述套組，其中該偵測抗體及該第一偵測抗體中之一或多者包含： (a) 重鏈可變區，其包含選自由SEQ ID NO: 56、57、72及73組成之群的胺基酸序列及其保守取代；及 (b) 輕鏈可變區，其包含選自由SEQ ID NO: 52、53、68及69組成之群的胺基酸序列及其保守取代。
F17. 如D及F-F11中任一項之前述套組，其中該偵測抗體及該第一偵測抗體中之一或多者包含： (a) 重鏈，其包含選自由SEQ ID NO: 24、25、64及65組成之群的胺基酸序列及其保守取代；及 (b) 輕鏈，其包含選自由SEQ ID NO: 20、21、60及61組成之群的胺基酸序列及其保守取代。
F18. 如F12之前述套組，其中該捕獲抗體、該第一捕獲抗體及該第二捕獲抗體中之一或多者包含： (a) 重鏈可變區CDR1，其包含SEQ ID NO: 26之胺基酸序列及其保守取代； (b) 重鏈可變區CDR2結構域，其包含SEQ ID NO: 30之胺基酸序列及其保守取代； (c) 重鏈可變區CDR3結構域，其包含SEQ ID NO: 34之胺基酸序列及其保守取代； (d) 輕鏈可變區CDR1結構域，其包含SEQ ID NO: 38之胺基酸序列及其保守取代； (e) 輕鏈可變區CDR2結構域，其包含SEQ ID NO: 42之胺基酸序列及其保守取代；及 (f) 輕鏈可變區CDR3結構域，其包含SEQ ID NO: 46之胺基酸序列及其保守取代。
F19. 如F18之前述套組，其中該捕獲抗體、該第一捕獲抗體及該第二捕獲抗體中之一或多者包含： (a) 重鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 54之胺基酸序列及其保守取代；及 (b) 輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 50之胺基酸序列及其保守取代。
F20. 如F19之前述套組，其中該捕獲抗體、該第一捕獲抗體及該第二捕獲抗體中之一或多者包含： (a) 重鏈，其包含SEQ ID NO: 22之胺基酸序列及其保守取代；及 (b) 輕鏈，其包含SEQ ID NO: 18之胺基酸序列及其保守取代。
F21. 如F15之前述套組，其中該偵測抗體及該第一偵測抗體中之一或多者包含： (a) 重鏈可變區CDR1，其包含SEQ ID NO: 29之胺基酸序列及其保守取代； (b) 重鏈可變區CDR2結構域，其包含SEQ ID NO: 33之胺基酸序列及其保守取代； (c) 重鏈可變區CDR3結構域，其包含SEQ ID NO: 37之胺基酸序列及其保守取代； (d) 輕鏈可變區CDR1結構域，其包含SEQ ID NO: 41之胺基酸序列及其保守取代； (e) 輕鏈可變區CDR2結構域，其包含SEQ ID NO: 45之胺基酸序列及其保守取代；及 (f) 輕鏈可變區CDR3結構域，其包含SEQ ID NO: 49之胺基酸序列及其保守取代。
F22. 如F21之前述套組，其中該偵測抗體及該第一偵測抗體中之一或多者包含： (a) 重鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 57之胺基酸序列及其保守取代；及 (b) 輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 53之胺基酸序列及其保守取代。
F23. 如F22之前述套組，其中該偵測抗體及該第一偵測抗體中之一或多者包含： (a) 重鏈，其包含SEQ ID NO: 25之胺基酸序列及其保守取代；及 (b) 輕鏈，其包含SEQ ID NO: 21之胺基酸序列及其保守取代。
F24. 如D-F11中任一項之前述套組，其中該捕獲抗體、該第一捕獲抗體及該第二捕獲抗體中之一或多者與包含以下各項之抗體競爭性結合： (a) 重鏈可變區CDR1，其包含選自由SEQ ID NO: 26及27組成之群的胺基酸序列及其保守取代； (b) 重鏈可變區CDR2結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 30及31組成之群的胺基酸序列及其保守取代； (c) 重鏈可變區CDR3結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 34及35組成之群的胺基酸序列及其保守取代； (d) 輕鏈可變區CDR1結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 38及39組成之群的胺基酸序列及其保守取代； (e) 輕鏈可變區CDR2結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 42及43組成之群的胺基酸序列及其保守取代；及 (f) 輕鏈可變區CDR3結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 46及47組成之群的胺基酸序列及其保守取代。
F25. 如D及F-F11中任一項之前述套組，其中該偵測抗體及該第一偵測抗體中之一或多者與包含以下各項之抗體競爭性結合： (a) 重鏈可變區CDR1，其包含選自由SEQ ID NO: 28及29組成之群的胺基酸序列及其保守取代； (b) 重鏈可變區CDR2結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 32及33組成之群的胺基酸序列及其保守取代； (c) 重鏈可變區CDR3結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 36及37組成之群的胺基酸序列及其保守取代； (d) 輕鏈可變區CDR1結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 40及41組成之群的胺基酸序列及其保守取代； (e) 輕鏈可變區CDR2結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 44及45組成之群的胺基酸序列及其保守取代；及 (f) 輕鏈可變區CDR3結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 48及49組成之群的胺基酸序列及其保守取代。
F26. 如D-F25中任一項之前述套組，其中該樣品為血液樣品。
F27. 如D-F25中任一項之前述套組，其中該樣品為血漿樣品。
F28. 如D-F27中任一項之前述套組，其中該套組以約0.2 pg/ml至約0.5 pg/ml之孔內靈敏度偵測該樣品中之總體或活性FGF21蛋白的量。
G. 在某些非限制性實施例中，當前所揭示之主題提供一種經分離之抗FGF21抗體或其抗原結合部分，其包含： (a) 重鏈可變區CDR1，其包含選自由SEQ ID NO: 26-29組成之群的胺基酸序列及其保守取代； (b) 重鏈可變區CDR2結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 30-33組成之群的胺基酸序列及其保守取代； (c) 重鏈可變區CDR3結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 34-37組成之群的胺基酸序列及其保守取代； (d) 輕鏈可變區CDR1結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 38-41組成之群的胺基酸序列及其保守取代； (e) 輕鏈可變區CDR2結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 42-45組成之群的胺基酸序列及其保守取代；及 (f) 輕鏈可變區CDR3結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 46-49組成之群的胺基酸序列及其保守取代。
G1. 如G之前述經分離之抗體，其中該抗體或其抗原結合部分包含： (a) 重鏈可變區CDR1，其包含SEQ ID NO: 26之胺基酸序列及其保守取代； (b) 重鏈可變區CDR2結構域，其包含SEQ ID NO: 30之胺基酸序列及其保守取代； (c) 重鏈可變區CDR3結構域，其包含SEQ ID NO: 34之胺基酸序列及其保守取代； (d) 輕鏈可變區CDR1結構域，其包含SEQ ID NO: 38之胺基酸序列及其保守取代； (e) 輕鏈可變區CDR2結構域，其包含SEQ ID NO: 42之胺基酸序列及其保守取代；及 (f) 輕鏈可變區CDR3結構域，其包含SEQ ID NO: 46之胺基酸序列及其保守取代。
G2. 如G之前述經分離之抗體，其中該抗體或其抗原結合部分包含： (a) 重鏈可變區CDR1，其包含SEQ ID NO: 27之胺基酸序列及其保守取代； (b) 重鏈可變區CDR2結構域，其包含SEQ ID NO: 31之胺基酸序列及其保守取代； (c) 重鏈可變區CDR3結構域，其包含SEQ ID NO: 35之胺基酸序列及其保守取代； (d) 輕鏈可變區CDR1結構域，其包含SEQ ID NO: 39之胺基酸序列及其保守取代； (e) 輕鏈可變區CDR2結構域，其包含SEQ ID NO: 43之胺基酸序列及其保守取代；及 (f) 輕鏈可變區CDR3結構域，其包含SEQ ID NO: 47之胺基酸序列及其保守取代。
G3. 如G之前述經分離之抗體，其中該抗體或其抗原結合部分包含： (a) 重鏈可變區CDR1，其包含SEQ ID NO: 28之胺基酸序列及其保守取代； (b) 重鏈可變區CDR2結構域，其包含SEQ ID NO: 32之胺基酸序列及其保守取代； (c) 重鏈可變區CDR3結構域，其包含SEQ ID NO: 36之胺基酸序列及其保守取代； (d) 輕鏈可變區CDR1結構域，其包含SEQ ID NO: 40之胺基酸序列及其保守取代； (e) 輕鏈可變區CDR2結構域，其包含SEQ ID NO: 44之胺基酸序列及其保守取代；及 (f) 輕鏈可變區CDR3結構域，其包含SEQ ID NO: 48之胺基酸序列及其保守取代。
G4. 如G之前述經分離之抗體，其中該抗體或其抗原結合部分包含： (a) 重鏈可變區CDR1，其包含SEQ ID NO: 29之胺基酸序列及其保守取代； (b) 重鏈可變區CDR2結構域，其包含SEQ ID NO: 33之胺基酸序列及其保守取代； (c) 重鏈可變區CDR3結構域，其包含SEQ ID NO: 37之胺基酸序列及其保守取代； (d) 輕鏈可變區CDR1結構域，其包含SEQ ID NO: 41之胺基酸序列及其保守取代； (e) 輕鏈可變區CDR2結構域，其包含SEQ ID NO: 45之胺基酸序列及其保守取代；及 (f) 輕鏈可變區CDR3結構域，其包含SEQ ID NO: 49之胺基酸序列及其保守取代。
G5. 如G1之前述經分離之抗體，其中該抗體或其抗原結合部分包含： (a) 重鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 54之胺基酸序列及其保守取代；及 (b) 輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 50之胺基酸序列及其保守取代。
G6. 如G2之前述經分離之抗體，其中該抗體或其抗原結合部分包含： (a) 重鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 55之胺基酸序列及其保守取代；及 (b) 輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 51之胺基酸序列及其保守取代。
G7. 如G3之前述經分離之抗體，其中該抗體或其抗原結合部分包含： (a) 重鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 56之胺基酸序列及其保守取代；及 (b) 輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 52之胺基酸序列及其保守取代。
G8. 如G4之前述經分離之抗體，其中該抗體或其抗原結合部分包含： (a) 重鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 57之胺基酸序列及其保守取代；及 (b) 輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 53之胺基酸序列及其保守取代。
G9. 如G1之前述經分離之抗體，其中該抗體或其抗原結合部分包含： (a) 重鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 75之胺基酸序列及其保守取代；及 (b) 輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 71之胺基酸序列及其保守取代。
G10. 如G2之前述經分離之抗體，其中該抗體或其抗原結合部分包含： (a) 重鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 74之胺基酸序列及其保守取代；及 (b) 輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 70之胺基酸序列及其保守取代。
G11. 如G3之前述經分離之抗體，其中該抗體或其抗原結合部分包含： (a) 重鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 73之胺基酸序列及其保守取代；及 (b) 輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 69之胺基酸序列及其保守取代。
G12. 如G4之前述經分離之抗體，其中該抗體或其抗原結合部分包含： (a) 重鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 72之胺基酸序列及其保守取代；及 (b) 輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 68之胺基酸序列及其保守取代。
G13. 如G5之前述經分離之抗體，其中該抗體或其抗原結合部分包含： (a) 重鏈，其包含SEQ ID NO: 22之胺基酸序列及其保守取代；及 (b) 輕鏈，其包含SEQ ID NO: 18之胺基酸序列及其保守取代。
G14. 如G6之前述經分離之抗體，其中該抗體或其抗原結合部分包含： (a) 重鏈，其包含SEQ ID NO: 23之胺基酸序列及其保守取代；及 (b) 輕鏈，其包含SEQ ID NO: 19之胺基酸序列及其保守取代。
G15. 如G7之前述經分離之抗體，其中該抗體或其抗原結合部分包含： (a) 重鏈，其包含SEQ ID NO: 24之胺基酸序列及其保守取代；及 (b) 輕鏈，其包含SEQ ID NO: 20之胺基酸序列及其保守取代。
G16. 如G8之前述經分離之抗體，其中該抗體或其抗原結合部分包含： (a) 重鏈，其包含SEQ ID NO: 25之胺基酸序列及其保守取代；及 (b) 輕鏈，其包含SEQ ID NO: 21之胺基酸序列及其保守取代。
G17. 如G9之前述經分離之抗體，其中該抗體或其抗原結合部分包含： (a) 重鏈，其包含SEQ ID NO: 67之胺基酸序列及其保守取代；及 (b) 輕鏈，其包含SEQ ID NO: 63之胺基酸序列及其保守取代。
G18. 如G10之前述經分離之抗體，其中該抗體或其抗原結合部分包含： (a) 重鏈，其包含SEQ ID NO: 66之胺基酸序列及其保守取代；及 (b) 輕鏈，其包含SEQ ID NO: 62之胺基酸序列及其保守取代。
G19. 如G11之前述經分離之抗體，其中該抗體或其抗原結合部分包含： (a) 重鏈，其包含SEQ ID NO: 65之胺基酸序列及其保守取代；及 (b) 輕鏈，其包含SEQ ID NO: 61之胺基酸序列及其保守取代。
G20. 如G12之前述經分離之抗體，其中該抗體或其抗原結合部分包含： (a) 重鏈，其包含SEQ ID NO: 64之胺基酸序列及其保守取代；及 (b) 輕鏈，其包含SEQ ID NO: 60之胺基酸序列及其保守取代。
H. 在某些非限制性實施例中，當前所揭示之主題提供一種經分離之核酸，其編碼如G-G20中任一項之抗體或其抗原結合部分。
I. 在某些非限制性實施例中，當前所揭示之主題提供一種宿主細胞，其包含如H之核酸。
J. 在某些非限制性實施例中，當前所揭示之主題提供一種產生抗體之方法，該方法包括培養如I之宿主細胞以產生該抗體。
J1. 如J之前述方法，其進一步包括自該宿主細胞回收該抗體。
K. 在某些非限制性實施例中，當前所揭示之主題提供一種組合物，其包含一或多種如G-G20中任一項之抗體或其抗原結合部分。實例
以下實例僅僅說明當前所揭示之主題且不應視為以任何方式加以限制。實例 1 ：抗 FGF21 抗體產生
藉由用重組人類FGF21對SJL及Balb/c小鼠進行免疫來產生單株抗體。藉由ELISA篩選80份雜交瘤上清液(圖1)。基於與完整人類FGF21 (PUR 98271)、完整食蟹猴FGF21 (PUR 98270)及藉由由人類FAP消化完整人類FGF21產生之裂解的人類FGF21 (PUR 102247)之結合選擇20份雜交瘤。實例 2 ：抗 FGF21 抗體表徵
藉由ELISA進一步表徵自所選擇之在實例1中所鑑定之20份雜交瘤獲得的IgG。如下進行ELISA：在4℃下將96孔MaxiSorp板(439454，Nalge Nunc International; Rochester, NY)用含1 μg/mL之抗FGF21 mAb或抗FGF21綿羊pAb (目錄號RD184108100，Biovendor, Asheville, NC)之塗佈緩衝液(50 mM碳酸鈉，pH 9.6)塗佈隔夜。在次日，在用含有0.5% BSA及10 ppm ProClin之PBS (pH 7.4)阻斷且用洗滌緩衝液(PBS，0.05% Tween 20，pH7.2)洗滌之後，在室溫下將板與含0.00000186-2000 pg/mL之完整人類FGF21 (全長未裂解之FGF21；目錄號2539-FG，R&D Systems)或FAP裂解之人類FGF21的分析緩衝液(25 mM HEPES，pH 7.2，150 mM NaCl，0.2 mM CaCl2 ，0.1%牛血清白蛋白(BSA)，0.05% Tween 20)一起孵育1-2 h。在用洗滌緩衝液洗滌之後，在室溫下將板與0.5 μg/ml之二次抗體(R&D Systems，生物素化山羊抗FGF21 pAb BAF2539)一起孵育1-2 h。在用洗滌緩衝液洗滌之後，將板在於分析緩衝液中1:1,000稀釋之高敏感性鏈黴親和素-HRP (PIERCE目錄號21130)存在下進行孵育。在用洗滌緩衝液洗滌之後，藉由添加受質3,3’,5,5’四甲基聯苯胺(TMBE 1000，Moss; Pasadena, MD)評估抗FGF21與重組FGF21之結合。繪製雙份孔之平均吸光度值隨抗體濃度而變之曲線且使用Prism 6 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA)將數據對三參數方程進行擬合以計算各抗體之半數最大有效濃度(EC50 )值(表2)。 表2. 各FGF21抗體之EC50 值.
Figure 108112039-A0304-0002
基於完整與裂解之FGF21的差別偵測及絕對EC50 值，將抗體mAb5、mAb6、mAb7及mAb12排除在進一步分析之外。藉由使用EZ-Link™ NHS-PEG固相生物素化套組(PIERCE目錄號21450)將抗體mAb1、mAb2、mAb3、mAb4、mAb8、mAb9、mAb10、mAb11、mAb13、mAb15及mAb16生物素化且使用完整FGF21以成對組合方式進行夾心ELISA (表3及4)。將經生物素化之山羊抗FGF21 pAb BAF2539 (R&D Systems)用作陽性對照。 表3. 夾心ELISA中抗FGF21 mAb之相容性.
Figure 108112039-A0304-0003
 XX：強信號且OD＞1，X：強信號且OD＜1 表4. 夾心ELISA中抗FGF21 mAb之相容性.
Figure 108112039-A0304-0004
 XX：強信號且OD＞1.5，X：強信號且0.5＜OD＜1.5，-：當使用653 pg/mL FGF21時OD＜0.5。使用完整FGF21及FAP裂解之FGF21情況下的平均值來生成該表格。
基於表3中提供之結果，將抗體mAb2、3及13排除在進一步分析之外。表3之結果將抗體mAb1、4、8、9、10及11置於三個抗原決定基倉(epitope bin)中(表5)。 表5. 抗原決定基建倉.
Figure 108112039-A0304-0005
接著在ELISA中使用完整人類FGF21 (目錄號2539-FG，R&D Systems)以組合方式對抗體mAb1、4、8、9、10及11進行測試。繪製吸光度值隨抗體濃度而變之曲線且使用Prism 6 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA)將數據對三參數方程進行擬合以計算各抗體之半數最大有效濃度(EC50 )值(表6)。如表6中所示，當對於完整人類FGF21將抗體mAb4或9用作捕獲抗體且抗體mAb10或11用作偵測抗體時觀測到較佳效能。 表6. 夾心ELISA中各種抗FGF21 mAb組合之EC50 值.
Figure 108112039-A0304-0006
接著在ELISA中使用完整人類FGF21 (目錄號2539-FG，R&D systems)或FAP裂解之人類FGF21以組合方式對抗體mAb4、8、9、10、11、15及16進行測試。繪製吸光度值隨抗體濃度而變之曲線且使用Prism 6 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA)針對各抗體將數據對三參數方程進行擬合。當抗體mAb4或9用作捕獲抗體且抗體mAb11或mAb15用作偵測抗體時觀測到最一致之結果(圖2及表7)。因此，將mAb8及16自進一步分析中移除。圖2表明抗體均等地結合於完整及FAP裂解之FGF21 (cFGF21)，此對於偵測總FGF21 (亦即，完整與FAP裂解兩者)之濃度為重要的。 表7. 夾心ELISA中各種抗FGF21 mAb組合之EC50 值.
Figure 108112039-A0304-0007
藉由BIACORE® 表面電漿子共振進一步分析抗體mAb4、9、11及15以確定Kd 。如圖3中所示，mAb4具有3.689 x 1010 之Kd ，mAb9具有8.895 x 1010 之Kd ，mAb11具有2.704 x 1010 之Kd 且mAb15具有3.955 x 1012 之Kd 。實例 3 ：抗原決定基分析
藉由使FGF19、FGF21或FGF19-FGF21嵌合蛋白以FLAG標記之蛋白質的形式在瞬時轉染之HEK293培養物上清液中表現且藉由ELISA測試抗體mAb4、9、11及15之結合來進行抗原決定基定位。對於ELISA，在4℃下將96孔MaxiSorp板(439454，Nalge Nunc International; Rochester, NY)用15 μl含有分泌之蛋白質的培養物上清液與135 μl之1倍塗佈緩衝液(50 mM碳酸鈉，pH 9.6)之混合物塗佈隔夜。使用結合於FGF21 C端之商業抗體R5及R9作為陽性對照。 人類FGF19： RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (SEQ ID NO: 2) 人類FGF21： HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS (SEQ ID NO: 1) 人類FGF21-19嵌合體蛋白(FGF21部分為斜體且FGF19部分加下劃線)：HPIPDSS PHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (SEQ ID NO: 3)HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLE IRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (SEQ ID NO: 4)HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIRE DGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (SEQ ID NO: 5)HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAAD QSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (SEQ ID NO: 6)HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPE SLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (SEQ ID NO: 7)HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQIL GVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (SEQ ID NO: 8)HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRF LCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (SEQ ID NO: 9)HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPAR FLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (SEQ ID NO: 10)RPLAFSDAG PLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS (SEQ ID NO: 11)RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLR IREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS (SEQ ID NO: 12)RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRA DGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS (SEQ ID NO: 13)RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARG QSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS (SEQ ID NO: 14)RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAH SLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS (SEQ ID NO: 15)RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRY LCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS (SEQ ID NO: 16)RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSH FLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS (SEQ ID NO: 17)
如圖4中所示，抗體mAb4、9、11及15結合於人類FGF21之核心FGF摺疊而不結合於N端或C端柔性區域。實例 4 ： FGF21 ELISA 分析
與藉由使用EZ-Link™ NHS-PEG固相生物素化套組(PIERCE #21450)生物素化之C端特異性抗FGF21 pAb (目錄號30661，Epitope Diagnostics, San Diego, CA；本文中亦稱為「C-ter pAb」))組合，對在偵測完整FGF21時使用抗體mAb4及11作為捕獲抗體進行測試。用於測定總FGF21及活性FGF21含量之免疫分析的示意圖顯示於圖5中。
如下進行ELISA分析：在4℃下將96孔MaxiSorp板(目錄號439454，Nalge Nunc International; Rochester, NY)用含0.5 μg/mL之抗FGF21 mAb之塗佈緩衝液(50 mM碳酸鈉，pH 9.6)塗佈隔夜。在次日，在用含有0.5% BSA及10ppm Proclin之PBS (pH 7.4)阻斷且用洗滌緩衝液(PBS，0.05% Tween 20，pH7.2)洗滌之後，在室溫下將板與含0.0004-32000 pg/mL之完整人類FGF21 (2539-FG，R&D systems)的分析緩衝液(25 mM HEPES，pH 7.2，150 mM NaCl，0.2 mM CaCl2 ，0.1%牛血清白蛋白[BSA]，0.05% Tween-20)一起孵育1-2 h。在用洗滌緩衝液洗滌之後，在室溫下將板與含0.5 μg/ml之二次Ab (生物素化之抗FGF21 C端pAb 30661或抗FGF21 mAb11或15)之魔法緩衝液(Magic buffer) (1x PBS pH 7.4，0.5% BSA，0.05% Tween 20，0.2% BgG，0.25% CHAPS，5mM EDTA，0.35M NaCl，10PPM Proclin)一起孵育1-2 h。在用洗滌緩衝液洗滌之後，將板在於分析緩衝液中1:1,000稀釋之高靈敏度鏈黴親和素-HRP (PIERCE #21130)存在下進行孵育。在用洗滌緩衝液洗滌之後，藉由添加受質3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺(TMBE-1000，Moss; Pasadena, MD)來評估抗FGF21與重組FGF21之結合。更詳細之方案提供於圖6中。繪製雙份孔之平均吸光度值隨抗體濃度而變之曲線且使用Prism 6 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA)將數據對三參數方程進行擬合(圖7)。
如圖8中所示，總FGF21 ELISA分析具有5 pg/ml之孔內靈敏度且活性FGF21 ELISA分析具有28 pg/ml之孔內靈敏度。活性FGF21 ELISA分析不偵測丟失最後10個C端胺基酸之裂解形式之FGF21。
進行其他實驗以確定血清對總FGF21 ELISA分析之影響。進行使用mAb4作為捕獲抗體且使用mAb15作為偵測抗體之FGF21 ELISA分析。如圖9中所示，對分析存在最小血清干擾。亦測試分析對人類FGF21之特異性。如圖9中所示，對總FGF21之分析偵測與對照小鼠相比在人類-FGF21敲入小鼠中表現之人類FGF21。圖10亦表明使用所揭示之抗體的分析對人類FGF21具特異性且不偵測小鼠FGF21。
基於此等資料，選擇4種抗體mAb4、mAb9、mAb11及mAb15進行cDNA選殖用於重組表現。此等抗體之胺基酸序列提供於表8-13及圖41A及41B中。在鼠IgG2a背景下重組mAb在100 mL CHO培養物中表現。 表8. 鼠抗FGF21單株抗體之全長輕鏈(LC)序列.
Figure 108112039-A0304-0008
 表9. 鼠抗FGF21單株抗體之全長重鏈(HC)序列.
Figure 108112039-A0304-0009
 表10. 鼠抗FGF21單株抗體之輕鏈可變區(VL)序列.
Figure 108112039-A0304-0010
 表11. 鼠抗FGF21單株抗體之重鏈可變區(VH)序列.
Figure 108112039-A0304-0011
 表12. 鼠抗FGF21單株抗體之重鏈CDR序列.
Figure 108112039-A0304-0012
 表13. 鼠抗FGF21單株抗體之輕鏈CDR序列.
Figure 108112039-A0304-0013
 實例 5 ： FGF21 ELISA 分析之優化
將實例4中描述之FGF21 ELISA分析進一步優化以改良分析之靈敏度。
將不同捕獲抗體相比較以確定哪種捕獲抗體產生更優良之偵測。對抗體mAb4與mAb9作為捕獲抗體進行測試。如圖11中所示，與mAb9相比使用mAb4作為捕獲抗體獲得較佳分析靈敏度。
針對總FGF21分析及活性FGF21分析在固定偵測抗體濃度下對不同類型之塗佈緩衝液及不同濃度之塗佈抗體進行分析。在不同塗佈抗體濃度下分析碳酸氫鹽塗佈緩衝液及PBS塗佈緩衝液。如圖12中所示，對於總FGF21分析，碳酸氫鈉與PBS塗佈緩衝液甚至在不同塗佈抗體濃度下亦觀測到類似孔內靈敏度。舉例而言，塗佈含2 μg/ml mAb4之PBS具有2 pg/ml之孔內靈敏度且塗佈2 μg/ml之mAb4具有3 pg/ml之孔內靈敏度。
對於活性FGF21分析，碳酸氫鈉與PBS塗佈緩衝液觀測到類似孔內靈敏度(圖13)。
進行其他實驗以確定偵測抗體(mAb15)之濃度及辣根過氧化物(HRP)之濃度對總FGF21分析的靈敏度之影響。對於偵測抗體測試0.2、1及2 μg/ml之濃度且對於HRP測試1/100及1/500之稀釋度。如圖14中所示，較高濃度之偵測抗體及HRP未顯著改良分析之靈敏度。實例 6 ：使用 Quanterix Simoa 之 FGF21 偵測分析
基於ELISA模式之優化，如實例5中所論述，將使用Quanterix Simoa HD-1 Analyzer™之分析調整為使用mAb4作為捕獲抗體，且生物素化之mAb15 (用於偵測總FGF21)或生物素化之C-ter pAb (用於偵測活性FGF21)作為偵測抗體。分析之示意圖顯示於圖15中。
提供了免疫分析之概述。Quanterix Simoa免疫分析以使用2-步分析方案用酶接合物(鏈黴親和素β-半乳糖苷酶(SBG))捕獲及標記總FGF21開始(圖16)。在第一步中將用接合至mAb4之磁性珠粒捕獲之總FGF21與生物素化之偵測抗體(用於總FGF21之mAb15-生物素或用於活性FGF21之C-ter pAb-生物素)添加在一起，以形成捕獲之分析物夾心，接著添加SBG以便在第二步中進行偵測。在各步驟之間，洗滌珠粒。在各洗滌循環期間，儀器使用磁體使珠粒集結成糰粒，然後自動吸出上清液。在最後一個洗滌循環之後，將捕獲珠粒再懸浮於試鹵靈β-D-半乳哌喃糖苷(RGP)受質中。接著將珠粒轉移至Simoa圓盤之入口端為成像及分析物定量作準備。
在捕獲及標記FGF21之後，將捕獲珠粒加載至含有216,000個40-fL孔之陣列中，各孔已經尺寸調節以固持不超過每孔一個珠粒(4.25 μm寬，3.25 μm深)。通過入口通道推動珠粒懸浮液且置於陣列上。允許珠粒經由重力沈入孔中持續約90秒。將油等分試樣分配於陣列入口通道中且將陣列拉過來，將珠粒及RGP受質捕獲於微孔中並且自表面移除過量珠粒。若已捕獲且標記FGF21分子，則SBG將RGP受質水解為螢光產物試鹵靈。螢光產物在密封之微孔內積累，使得能夠偵測單分子。
使用兩步EDAC偶合方案(Simoa Homebrew 2.0多重珠粒塗佈方案USER-213-11)製備多重捕獲珠粒。使珠粒與0.5 mg/mL mAb4及0.25 mg/mL EDAC偶合。在抗體一級胺基與珠粒上之羧基之間發生偶合反應。
在96孔Nunc™ 96孔聚丙烯MicroWell™板(V形底，Thermo Scientific Nunc 249944, Rochester, NY)中進行Quanterix Simoa分析。對於標準曲線，將重組完整人類FGF21 (iFGF21)及裂解之人類FGF21 (cFGF21)在Simoa緩衝液(PBS pH 7.4，2% BSA (級分B，不含蛋白酶)，0.1% Tween，5 mM EDTA) (0.200-500 pg/mL) (圖17)或魔法緩衝液(BA010) (圖19-25、28-32及33-37)中連續稀釋。為測定FGF21之未知濃度(例如於血漿或血清中)，將測試樣品在Simoa緩衝液或魔法緩衝液中以1:5-1:20加以稀釋。將分析板與所需之推薦試劑一起加載至Simoa HD-1 Analyzer中。在各孔中，對於各反應，使用32 μL之接合至mAb 4之捕獲珠粒、32 μL之1 μg/mL之偵測抗體(mAb15-生物素或C-ter pAb-生物素)及110 μL之SBG。對於各孔，一式兩份進行分析。選擇製造商之預設Homebrew分析作為自動化程序之程式。關於分析方案之其他資訊提供於圖18中。
如圖19中所示，總(T) FGF21之基於Quanterix Simoa之分析(QSA)以0.3 pg/ml之孔內靈敏度(基於2倍空白孔平均AEB)偵測完整(野生型(WT)) FGF21，且以0.6 pg/ml之孔內靈敏度偵測不具有最後10個C端胺基酸之裂解(CL)形式之FGF21。活性(A) FGF21 QSA以1.8 pg/ml之孔內靈敏度偵測完整FGF21。與傳統ELISA相比在總FGF21與活性FGF21 QSA兩者中均觀測到分析靈敏度之顯著改良。圖20顯示總體及活性FGF21分析之標準曲線效能的代表圖。觀測到良好標準曲線效能。實例 7 ：使用 Quanterix Simoa 之 FGF21 偵測分析的優化
將實例6中描述之FGF21 QSA進一步優化以改良分析之靈敏度。
分析了分析稀釋劑類型對分析靈敏度之影響。測試了兩種不同稀釋劑，BA010稀釋劑(PBS，0.5% BSA，0.25% CHAPS，5mM EDTA，0.35M NaCl，0.05% Tween-20，0.05% Proclin 300，pH 7.4)及IL-12稀釋劑(PBS，1.5% BSA，0.15% Tween-20，0.05% Proclin 300，pH 7.4)。BA010稀釋劑對於總體及活性FGF21分析兩者均表現良好，且產生較低之背景值及改良之靈敏度(圖21)。
亦分析了順磁性珠粒之濃度對分析靈敏度之影響。測試了兩種不同濃度，每毫升1.22 x 107 個珠粒之「高」珠粒濃度及每毫升0.59 x 107 個珠粒之「低」珠粒濃度。如圖22中所示，對於總FGF21分析在高珠粒濃度與低珠粒濃度之間觀測到類似分析靈敏度。然而，對於活性FGF21分析在低珠粒濃度下觀測到改良之靈敏度(圖22)。特定而言，與在低珠粒濃度情況下觀測到0.6 pg/ml之孔內靈敏度相比，當使用高珠粒濃度時活性FGF21分析具有1.2 pg/ml之孔內靈敏度。亦分析了三種不同順磁性珠粒批次。如圖23中所示，在本發明批次及新批次之捕獲順磁性珠粒情況下觀測到類似結合曲線及分析靈敏度。優化之分析參數顯示於表14中。 表14. 優化之分析參數.
Figure 108112039-A0304-0014
針對總FGF21分析測試了不同偵測抗體。測試了抗體mAb11、mAb15及C-ter pAb。在總FGF21分析中在各種偵測抗體情況下觀測到類似靈敏度(圖24)。然而，mAb15之曲線具有最低背景值。
由圖14、19及22中所示之結果，確定對於總體及活性FGF21分析而言經優化之偵測抗體及SBG之濃度(表15)。當偵測抗體及SBG之濃度增加時總FGF21與活性FGF21分析兩者之分析靈敏度均改良。在0.8 μg/mL之偵測抗體濃度及310 pM之SBG濃度情況下總FGF21分析之靈敏度得以改良，且在2.2 μg/mL之偵測抗體濃度及310 pM之SBG濃度情況下活性FGF21分析之靈敏度得以改良。 表15. 偵測抗體濃度及SBG之優化.
Figure 108112039-A0304-0015
對總FGF21分析進行進一步分析以確定是否觀測到鉤狀效應。當樣品中存在高量之分析物時典型地觀測到鉤狀效應且所觀測之值假性較低。如下進行分析：對於總體分析，藉由使用每毫升0.59 x 107 個珠粒之濃度的mAb4接合性順磁性珠粒進行捕獲且使用0.8 μg/mL之生物素化mAb15進行偵測；對於活性分析，使用每毫升0.59 x 107 個珠粒之濃度的mAb4接合性順磁性珠粒進行捕獲且使用2.2 μg/mL生物素化綿羊抗FGF21 C-ter pAb進行偵測。如圖25中所示，在總FGF21分析情況下未觀測到鉤狀效應。另外，總FGF21分析以類似靈敏度偵測完整人類FGF21及FAP裂解之人類FGF21 (CL hFGF21) (圖25)。實例 8 ：使用 FGF21 QSA 分析血漿樣品
使用總體及活性FGF21 QSA來分析自健康人類供體獲得且新製備之樣品。如實例6中所描述進行分析。如圖26中所示，分析能夠偵測健康供體血清樣品中之低含量活性FGF21。再在高血壓或不使用任何藥物之供體中進行實驗且與使用蛋白酶抑制劑混合物MS-SAFE進行比較(圖27)。再在2型糖尿病患者中進行實驗。如圖28A-B中所示，在14個樣品中，使用總FGF21分析在所有樣品(100%)中均偵測到FGF21。對於活性FGF21分析，在12/14之樣品(86%)中偵測到FGF21蛋白(圖28A-B)。自該等分析獲得之結果為可再現的(圖29)。在總FGF21與活性FGF21分析兩者中再現性在±30%差異內為可接受的。
分析總體及活性FGF21分析之稀釋線性。對於總FGF21稀釋線性相較於最低所需稀釋度(MRD) (1:20稀釋度)變化±30%以內為可接受的，而在活性FGF21分析中則為在1:40稀釋度下(圖30)。在初始MRD下觀測較高濃度之傾向。確定總體及活性FGF21分析之LLOQ。對於總FGF21及活性FGF21分析，基於在最高稀釋係數下之平均計算濃度±30%之內的可接受回收率，初步LLOQ經確定分別為3.15 pg/ml及10.94 pg/ml (圖31)。
進一步分析該等分析之特異性。如圖32中所示，特異性係藉由在總FGF21及活性FGF21分析中在存在10 μg/mL之mAb4的情況下所有六種2型糖尿病血漿樣品之AEB值均抑制大於90%來展現。
將使用包括蛋白酶、酯酶及DPP-IV抑制劑之組合且包括抗凝劑K2 -EDTA之P800血液收集系統與單獨使用K2 -EDTA進行比較(圖33)。在總FGF21及活性FGF21分析中觀測到在P800及K2EDTA篩選血漿樣品之間在可接受之±30%差異以內的類似結果(圖34)。在總FGF21及活性FGF21分析中觀測到P800與K2 -EDTA篩選血漿樣品之間的良好相關性(圖35-36)。分析了血漿樣品在儲存在2-8℃下之後的穩定性。如圖37中所示，在總FGF21及活性FGF21分析中觀測到在可接受之相較於2-8℃穩定性樣品回收率±30%以內的樣品穩定性。
如圖38及39中所示，在藉由總體及活性FGF21分析所分析之K2 -EDTA篩選血漿樣品中觀測到高於100%之活性比率，表明由異嗜性抗體帶來干擾。特定而言，由K2 -EDTA篩選血漿樣品16及17觀測到高於100%之活性比率，但由單獨使用分析稀釋劑時之GC29819研究的樣品9及10未觀測到此類活性比率。活性比率高於100%之樣品16及17含有人類抗小鼠抗體(HAMA)及人類抗綿羊抗體(HASA)，表明患者血漿樣品中HAMA及HASA之存在干擾總體及活性分析之準確性。如圖38及39中所示，HAMA影響總體與活性分析兩者；而HASA僅影響活性分析。將10 μg/ml之小鼠IgG添加至總體分析之稀釋劑中及將10 μg/ml之綿羊IgG添加至活性分析之稀釋劑中分別有效移除HAMA及HASA干擾，且解決了所觀測到的高於100%之活性比率(圖38及39)。如圖40中所示，分析稀釋劑中存在10 μg/ml之抗小鼠IgG或抗綿羊IgG未分別影響總體及活性分析之標準曲線。實例 9 ：嵌合抗 FGF21 抗體
將抗體mAb4、mAb9、mAb11及mAb15接枝至具有K149C突變之人類IgG1構架上以產生小鼠/人類嵌合抗FGF21抗體，其具有小鼠VH及VL區及具有K149C突變之人類恆定區。嵌合抗體之胺基酸序列提供於下表16-19及圖41A及41B中。 表16
Figure 108112039-A0304-0016
 表17
Figure 108112039-A0304-0017
 表18
Figure 108112039-A0304-0018
 表19
Figure 108112039-A0304-0019
除所描繪及主張之各個實施例外，所揭示之主題亦係有關具有本文所揭示及主張之特徵的其他組合之其他實施例。因而，本文所呈現之特定特徵可在所揭示主題之範疇內以其他方式彼此組合，使得所揭示之主題包括本文所揭示之特徵的任何適合之組合。已出於說明及描述之目的呈現對所揭示主題之特定實施例的前述描述。其不旨在為詳盡的或將所揭示之主題限制於彼等所揭示之實施例。
對熟習此項技術者而言將顯而易見的是，可在不背離所揭示主題之精神或範疇之情況下在所揭示主題的組合物及方法中作出各種修改及變化。因此，所揭示之主題旨在包括在隨附申請專利範圍及其等效物範疇內之修改及變化。
本文引用了各種出版物、專利以及專利申請案，該等文獻之內容以全文引用之方式併入本文中。
圖1. 描繪表現抗FGF21抗體之80份雜交瘤上清液的ELISA篩選結果。
圖2：描繪使用mAb4或mAb9捕獲抗體及mAb11偵測抗體藉由夾心ELISA進行之完整與裂解之FGF21偵測的劑量反應。
圖3：描繪抗FGF21抗體mAb4、mAb9、mAb11及mAb15之BIACORE®表面電漿子共振分析。
圖4：描繪顯示抗FGF21抗體結合於FGF21 (FGF19用作陰性對照)之示意圖。
圖5：描繪用於偵測總FGF21及活性FGF21之比色ELISA法之非限制性實施例的示意圖。
圖6：描繪用於進行總體及活性FGF21 ELISA分析之方案的非限制性實施例。
圖7：描繪使用mAb4或mAb11捕獲抗體及各種偵測抗體之ELISA分析的結果。
圖8：描繪使用示例性總體及活性FGF21 ELISA分析偵測野生型及裂解之人類FGF21之靈敏度的比較。
圖9：描繪使用示例性總FGF21 ELISA分析偵測人類FGF21。
圖10：描繪表明示例性抗FGF21抗體不與小鼠FGF21交叉反應之ELISA分析。
圖11：描繪示例性總體及活性FGF21 ELISA分析中捕獲抗體mAb4及mAb9之靈敏度的比較。
圖12：描繪塗佈緩衝液及濃度對使用mAb4作為捕獲抗體且使用mAb15作為偵測抗體之示例性總FGF21 ELISA分析之靈敏度的影響。
圖13：描繪塗佈緩衝液及濃度對使用mAb4作為捕獲抗體且使用綿羊C端pAb作為偵測抗體之示例性活性FGF21 ELISA分析之靈敏度的影響。
圖14：描繪生物素接合型偵測抗體及HRP濃度對使用mAb4作為捕獲抗體且使用mAb15作為偵測抗體之示例性總FGF21 ELISA分析之靈敏度的影響。
圖15：描繪用於使用Quanterix Simoa HD-1 Analyzer™ (「Quanterix Simoa」)偵測總FGF21及活性FGF21之單分子偵測方法的非限制性實施例之示意圖。
圖16：描繪使用Quanterix Simoa之示例性總FGF21及活性FGF21分析之兩步分析方案的非限制性實施例。
圖17：描繪使用Quanterix Simoa藉由示例性總FGF21及活性FGF21分析進行之完整與裂解之FGF21偵測的劑量反應。
圖18：描繪使用Quanterix Simoa進行示例性總體及活性FGF21分析之方案的非限制性實施例。
圖19：描繪使用Quanterix Simoa之示例性總體及活性FGF21分析中的標準曲線。
圖20：描繪使用Quanterix Simoa之示例性總體及活性FGF21分析中的標準曲線效能。
圖21：描繪在使用Quanterix Simoa之示例性總體及活性FGF21分析中在存在BA010及IL-12緩衝液之情況下偵測總體及活性FGF21的靈敏度之比較。
圖22：描繪高珠粒(HB)及低珠粒(LB)濃度對使用Quanterix Simoa之示例性總體及活性FGF21分析之靈敏度的影響。
圖23：描繪在使用Quanterix Simoa之示例性總體及活性FGF21分析中使用三種捕獲順磁性珠粒批次偵測總體及活性FGF21之靈敏度的比較。
圖24：描繪在使用Quanterix Simoa之示例性總FGF21分析中使用各種偵測抗體偵測總體及活性FGF21之靈敏度的比較。
圖25：描繪使用Quanterix Simoa之使用mAb4作為捕獲抗體且使用mAb15作為偵測抗體之示例性總FGF21分析中的鉤狀效應之分析。
圖26：描繪使用示例性總體及活性FGF21 ELISA分析偵測來自健康供體之血漿及血清樣品中之總FGF21及活性FGF21。
圖27：描繪使用示例性總體及活性FGF21 ELISA分析偵測來自高血壓供體及不使用藥物之供體的經MS-SAFE處理之血漿樣品或血漿樣品中之總FGF21及活性FGF21。
圖28A：描繪利用使用Quanterix Simoa之示例性總體及活性FGF21分析偵測來自健康患者及2型糖尿病患者之血漿樣品中之總FGF21及活性FGF21 (第1天)。
圖28B：描繪利用使用Quanterix Simoa之示例性總體及活性FGF21分析偵測來自健康患者及2型糖尿病患者之血漿樣品中之總FGF21及活性FGF21 (第2天)。
圖29：描繪用於使用Quanterix Simoa偵測來自健康患者及2型糖尿病患者之血漿樣品中之總FGF21及活性FGF21的示例性總體及活性FGF21分析之再現性。
圖30：描繪用於使用Quanterix Simoa偵測來自2型糖尿病患者之血漿樣品中之總FGF21及活性FGF21的示例性總體及活性FGF21分析之稀釋線性。
圖31：描繪用於使用Quanterix Simoa偵測來自2型糖尿病患者之血漿樣品中之總FGF21及活性FGF21的示例性總體及活性FGF21分析中之定量下限(LLOQ)之確定。
圖32：描繪用於使用Quanterix Simoa偵測來自2型糖尿病患者之血漿樣品中之總FGF21及活性FGF21的示例性總體及活性FGF21分析之特異性。
圖33：描繪利用使用Quanterix Simoa之示例性總體及活性FGF21分析偵測使用P800或K2 -EDTA製備之血漿樣品中之總FGF21及活性FGF21。
圖34：描繪在使用Quanterix Simoa之示例性總體及活性FGF21分析中在來自GC29819研究之P800及K2 -EDTA血漿樣品中偵測之總FGF21及活性FGF21的分析。
圖35：描繪利用使用Quanterix Simoa之示例性總FGF21分析定量之在P800及K2 -EDTA血漿樣品(GC29819臨床研究)中偵測之總FGF21及活性FGF21的量之間的相關性。
圖36：描繪利用使用Quanterix Simoa之示例性活性FGF21分析定量之在P800及K2 -EDTA血漿樣品(GC29819研究)中偵測之總FGF21及活性FGF21的量之間的相關性。
圖37：描繪利用使用Quanterix Simoa之示例性總體及活性FGF21分析評估來自GC29819研究之P800血漿樣品之穩定性。
圖38：描繪含有10 μg/ml之小鼠或綿羊IgG之分析稀釋劑對使用Quanterix Simoa的總體及活性分析之影響。
圖39：描繪含有10 μg/ml之小鼠及綿羊IgG之分析稀釋劑對使用Quanterix Simoa的總體及活性分析之影響。
圖40：描繪含有10 μg/ml之小鼠或綿羊IgG之分析稀釋劑對使用Quanterix Simoa的總體及活性分析之標準曲線之影響。
圖41A：描繪示例性抗FGF21抗體之輕鏈可變區之序列。按出現順序分別以SEQ ID NO: 50、51、52、53、71、70、69及68之形式揭示輕鏈可變區序列。按出現順序分別以SEQ ID NO: 38、39、40、41、38、39、40及41之形式揭示CDR-L1序列；按出現順序分別以SEQ ID NO: 42、43、44、45、42、43、44及45之形式揭示CDR-L2序列；且按出現順序分別以SEQ ID NO: 46、47、48、49、46、47、48及49之形式揭示CDR-L3序列。
圖41B：描繪示例性抗FGF21抗體之重鏈可變區之序列。按出現順序分別以SEQ ID NO: 54、55、56、57、75、74、73及72之形式揭示重鏈可變區序列。按出現順序分別以SEQ ID NO: 26、27、28、29、26、27、28及29之形式揭示CDR-H1序列；按出現順序分別以SEQ ID NO: 30、31、32、33、30、31、32及33之形式揭示CDR-H2序列；且按出現順序分別以SEQ ID NO: 34、35、36、37、34、35、36及37之形式揭示CDR-H3序列。
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Claims (89)

  1. 一種用於測定樣品中之總FGF21蛋白之量的免疫分析方法，該方法包括： (a) 使結合於存在於FGF21之胺基酸殘基5-172內之抗原決定基的捕獲抗體與該樣品接觸，以產生樣品-捕獲抗體組合物質； (b) 使該樣品-捕獲抗體組合物質與結合於存在於FGF21之胺基酸殘基5-172內之抗原決定基的偵測抗體接觸； (c) 偵測結合於該樣品-捕獲抗體組合物質之該偵測抗體；及 (d) 基於所結合之該偵測抗體之水準計算存在於該樣品中的總FGF21蛋白之量。
  2. 如申請專利範圍第1項之免疫分析方法，其中該捕獲抗體及該偵測抗體結合於FGF21之胺基酸殘基5-172內之不同抗原決定基。
  3. 一種用於測定樣品中之活性FGF21蛋白之量的免疫分析方法，該方法包括： (a) 使結合於存在於FGF21之胺基酸殘基5-172內之抗原決定基的捕獲抗體與該樣品接觸，以產生樣品-捕獲抗體組合物質； (b) 使該樣品-捕獲抗體組合物質與結合於存在於FGF21之胺基酸殘基173-182內之抗原決定基的偵測抗體接觸； (c) 偵測結合於該樣品-捕獲抗體組合物質之該偵測抗體；及 (d) 基於所結合之該偵測抗體之水準計算存在於該樣品中的活性FGF21蛋白之量。
  4. 一種用於測定樣品中活性FGF21蛋白與總FGF21蛋白之比率的免疫分析方法，該方法包括： (a) (i)使結合於存在於FGF21之胺基酸殘基5-172內之抗原決定基的第一捕獲抗體與該樣品接觸，以產生第一樣品-捕獲抗體組合物質；(ii)使該第一樣品-捕獲抗體組合物質與結合於存在於FGF21之胺基酸殘基5-172內之抗原決定基的第一偵測抗體接觸；(iii)偵測結合於該樣品-捕獲抗體組合物質之該第一偵測抗體；及(iv)基於所結合之該第一偵測抗體之水準計算存在於該樣品中的總FGF21蛋白之量； (b) (i)使結合於存在於FGF21之胺基酸殘基5-172內之抗原決定基的第二捕獲抗體與該樣品接觸，以產生第二樣品-捕獲抗體組合物質；(ii)使該第二樣品-捕獲抗體組合物質與結合於存在於FGF21之胺基酸殘基173-182內之抗原決定基的第二偵測抗體接觸；(iii)偵測結合於該樣品-捕獲抗體組合物質之該第二偵測抗體；及(iv)基於所結合之該第二偵測抗體之水準計算存在於該樣品中的活性FGF21蛋白之量；及 (c) 將如藉由步驟(a)所測定之總FGF21蛋白的量與如藉由步驟(b)所測定之活性FGF21蛋白的量相比較，以確定該樣品中活性FGF21蛋白與總FGF21蛋白之比率。
  5. 如申請專利範圍第4項之免疫分析方法，其中該第一捕獲抗體及該第一偵測抗體結合於FGF21之胺基酸殘基5-172內之不同抗原決定基。
  6. 如申請專利範圍第4項之免疫分析方法，其中該第一捕獲抗體及該第二捕獲抗體為相同抗體。
  7. 如申請專利範圍第1項至第6項中任一項之免疫分析方法，其中該免疫分析為酶聯免疫吸附分析(ELISA)。
  8. 如申請專利範圍第1項至第7項中任一項之免疫分析方法，其中該捕獲抗體、該第一捕獲抗體及該第二捕獲抗體中之一或多者固定至順磁性珠粒。
  9. 如申請專利範圍第1項至第8項中任一項之免疫分析方法，其中該偵測抗體、該第一偵測抗體及該第二偵測抗體中之一或多者接合至生物素。
  10. 如申請專利範圍第1項至第9項中任一項之免疫分析方法，其中該捕獲抗體、該第一捕獲抗體及該第二捕獲抗體中之一或多者以約10-10 M至10-13 M之Kd 結合於FGF21。
  11. 如申請專利範圍第1項及第4項至第9項中任一項之免疫分析方法，其中該偵測抗體及該第一偵測抗體中之一或多者以約10-10 M至10-13 M之Kd 結合於FGF21。
  12. 如申請專利範圍第1項至第11項中任一項之免疫分析方法，其中該樣品為血液樣品。
  13. 如申請專利範圍第1項至第11項中任一項之免疫分析方法，其中該樣品為血漿樣品。
  14. 如申請專利範圍第1項至第13項中任一項之免疫分析方法，其中該方法以約2 pg/ml至約20 pg/ml之孔內靈敏度偵測該樣品中之總體或活性FGF21蛋白的量。
  15. 如申請專利範圍第1項至第13項中任一項之免疫分析方法，其中該免疫分析方法係使用單分子偵測儀器進行。
  16. 如申請專利範圍第15項之免疫分析方法，其中該單分子偵測儀器為Quanterix Simoa HD-1 Analyzer™。
  17. 如申請專利範圍第15項或第16項之免疫分析方法，其中該方法以約0.2 pg/ml至約0.5 pg/ml之孔內靈敏度偵測該樣品中之總體或活性FGF21蛋白的量。
  18. 如申請專利範圍第1項至第17項中任一項之免疫分析方法，其中該捕獲抗體、該第一捕獲抗體及該第二捕獲抗體中之一或多者包含： (a) 重鏈可變區CDR1，其包含選自由SEQ ID NO: 26及27組成之群的胺基酸序列及其保守取代； (b) 重鏈可變區CDR2結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 30及31組成之群的胺基酸序列及其保守取代； (c) 重鏈可變區CDR3結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 34及35組成之群的胺基酸序列及其保守取代； (d) 輕鏈可變區CDR1結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 38及39組成之群的胺基酸序列及其保守取代； (e) 輕鏈可變區CDR2結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 42及43組成之群的胺基酸序列及其保守取代；及 (f) 輕鏈可變區CDR3結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 46及47組成之群的胺基酸序列及其保守取代。
  19. 如申請專利範圍第1項至第17項中任一項之免疫分析，其中該捕獲抗體、該第一捕獲抗體及該第二捕獲抗體中之一或多者包含： (a) 重鏈可變區，其包含選自由SEQ ID NO: 54、55、74及75組成之群的胺基酸序列及其保守取代；及 (b) 輕鏈可變區，其包含選自由SEQ ID NO: 50、51、70及71組成之群的胺基酸序列及其保守取代。
  20. 如申請專利範圍第1項至第17項中任一項之免疫分析，其中該捕獲抗體、該第一捕獲抗體及該第二捕獲抗體中之一或多者包含： (a) 重鏈，其包含選自由SEQ ID NO: 22、23、66及67組成之群的胺基酸序列及其保守取代；及 (b) 輕鏈，其包含選自由SEQ ID NO: 18、19、62及63組成之群的胺基酸序列及其保守取代。
  21. 如申請專利範圍第1項及第4項至第17項中任一項之免疫分析方法，其中該偵測抗體及該第一偵測抗體中之一或多者包含： (a) 重鏈可變區CDR1，其包含選自由SEQ ID NO: 28及29組成之群的胺基酸序列及其保守取代； (b) 重鏈可變區CDR2結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 32及33組成之群的胺基酸序列及其保守取代； (c) 重鏈可變區CDR3結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 36及37組成之群的胺基酸序列及其保守取代； (d) 輕鏈可變區CDR1結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 40及41組成之群的胺基酸序列及其保守取代； (e) 輕鏈可變區CDR2結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 44及45組成之群的胺基酸序列及其保守取代；及 (f) 輕鏈可變區CDR3結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 48及49組成之群的胺基酸序列及其保守取代。
  22. 如申請專利範圍第1項及第4項至第17項中任一項之免疫分析，其中該偵測抗體及該第一偵測抗體中之一或多者包含： (a) 重鏈可變區，其包含選自由SEQ ID NO: 56、57、72及73組成之群的胺基酸序列及其保守取代；及 (b) 輕鏈可變區，其包含選自由SEQ ID NO: 52、53、68及69組成之群的胺基酸序列及其保守取代。
  23. 如申請專利範圍第1項及第4項至第17項中任一項之免疫分析，其中該偵測抗體及該第一偵測抗體中之一或多者包含： (a) 重鏈，其包含選自由SEQ ID NO: 24、25、64及65組成之群的胺基酸序列及其保守取代；及 (b) 輕鏈，其包含選自由SEQ ID NO: 20、21、60及61組成之群的胺基酸序列及其保守取代。
  24. 如申請專利範圍第18項之免疫分析方法，其中該捕獲抗體、該第一捕獲抗體及該第二捕獲抗體中之一或多者包含： (a) 重鏈可變區CDR1，其包含SEQ ID NO: 26之胺基酸序列及其保守取代； (b) 重鏈可變區CDR2結構域，其包含SEQ ID NO: 30之胺基酸序列及其保守取代； (c) 重鏈可變區CDR3結構域，其包含SEQ ID NO: 34之胺基酸序列及其保守取代； (d) 輕鏈可變區CDR1結構域，其包含SEQ ID NO: 38之胺基酸序列及其保守取代； (e) 輕鏈可變區CDR2結構域，其包含SEQ ID NO: 42之胺基酸序列及其保守取代；及 (f) 輕鏈可變區CDR3結構域，其包含SEQ ID NO: 46之胺基酸序列及其保守取代。
  25. 如申請專利範圍第24項之免疫分析，其中該捕獲抗體、該第一捕獲抗體及該第二捕獲抗體中之一或多者包含： (a) 重鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 54之胺基酸序列及其保守取代；及 (b) 輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 50之胺基酸序列及其保守取代。
  26. 如申請專利範圍第25項之免疫分析，其中該捕獲抗體、該第一捕獲抗體及該第二捕獲抗體中之一或多者包含： (a) 重鏈，其包含SEQ ID NO: 22之胺基酸序列及其保守取代；及 (b) 輕鏈，其包含SEQ ID NO: 18之胺基酸序列及其保守取代。
  27. 如申請專利範圍第21項之免疫分析方法，其中該偵測抗體及該第一偵測抗體中之一或多者包含： (a) 重鏈可變區CDR1，其包含SEQ ID NO: 29之胺基酸序列及其保守取代； (b) 重鏈可變區CDR2結構域，其包含SEQ ID NO: 33之胺基酸序列及其保守取代； (c) 重鏈可變區CDR3結構域，其包含SEQ ID NO: 37之胺基酸序列及其保守取代； (d) 輕鏈可變區CDR1結構域，其包含SEQ ID NO: 41之胺基酸序列及其保守取代； (e) 輕鏈可變區CDR2結構域，其包含SEQ ID NO: 45之胺基酸序列及其保守取代；及 (f) 輕鏈可變區CDR3結構域，其包含SEQ ID NO: 49之胺基酸序列及其保守取代。
  28. 如申請專利範圍第27項之免疫分析，其中該偵測抗體及該第一偵測抗體中之一或多者包含： (a) 重鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 57之胺基酸序列及其保守取代；及 (b) 輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 53之胺基酸序列及其保守取代。
  29. 如申請專利範圍第28項之免疫分析，其中該偵測抗體及該第一偵測抗體中之一或多者包含： (a) 重鏈，其包含SEQ ID NO: 25之胺基酸序列及其保守取代；及 (b) 輕鏈，其包含SEQ ID NO: 21之胺基酸序列及其保守取代。
  30. 如申請專利範圍第1項至第17項中任一項之免疫分析方法，其中該捕獲抗體、該第一捕獲抗體及該第二捕獲抗體中之一或多者與包含以下各項之抗體競爭性結合： (a) 重鏈可變區CDR1，其包含選自由SEQ ID NO: 26及27組成之群的胺基酸序列及其保守取代； (b) 重鏈可變區CDR2結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 30及31組成之群的胺基酸序列及其保守取代； (c) 重鏈可變區CDR3結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 34及35組成之群的胺基酸序列及其保守取代； (d) 輕鏈可變區CDR1結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 38及39組成之群的胺基酸序列及其保守取代； (e) 輕鏈可變區CDR2結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 42及43組成之群的胺基酸序列及其保守取代；及 (f) 輕鏈可變區CDR3結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 46及47組成之群的胺基酸序列及其保守取代。
  31. 如申請專利範圍第1項及第4項至第17項中任一項之免疫分析方法，其中該偵測抗體及該第一偵測抗體中之一或多者與包含以下各項之抗體競爭性結合： (a) 重鏈可變區CDR1，其包含選自由SEQ ID NO: 28及29組成之群的胺基酸序列及其保守取代； (b) 重鏈可變區CDR2結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 32及33組成之群的胺基酸序列及其保守取代； (c) 重鏈可變區CDR3結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 36及37組成之群的胺基酸序列及其保守取代； (d) 輕鏈可變區CDR1結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 40及41組成之群的胺基酸序列及其保守取代； (e) 輕鏈可變區CDR2結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 44及45組成之群的胺基酸序列及其保守取代；及 (f) 輕鏈可變區CDR3結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 48及49組成之群的胺基酸序列及其保守取代。
  32. 一種用於偵測樣品中之總FGF21蛋白的套組，其包含： (a) 捕獲抗體或其抗原結合部分，其結合於存在於FGF21之胺基酸殘基5-172內之抗原決定基； (b) 偵測抗體或其抗原結合部分，其結合於存在於FGF21之胺基酸殘基5-172內之抗原決定基；及 (c) 偵測劑。
  33. 如申請專利範圍第32項之套組，其中該捕獲抗體及該偵測抗體結合於FGF21之胺基酸殘基5-172內之不同抗原決定基。
  34. 一種用於偵測樣品中之活性FGF21蛋白的套組，其包含： (a) 捕獲抗體或其抗原結合部分，其結合於存在於FGF21之胺基酸殘基5-172內之抗原決定基； (b) 偵測抗體或其抗原結合部分，其結合於存在於FGF21之胺基酸殘基173-182內之抗原決定基；及 (c) 偵測劑。
  35. 一種用於測定樣品中活性FGF21蛋白與總FGF21蛋白之比率的套組，其包含： (a) (i)第一捕獲抗體或其抗原結合部分，其結合於存在於FGF21之胺基酸殘基5-172內之抗原決定基，及(ii)第一偵測抗體或其抗原結合部分，其結合於存在於FGF21之胺基酸殘基5-172內之抗原決定基； (b) (i)第二捕獲抗體或其抗原結合部分，其結合於存在於FGF21之胺基酸殘基5-172內之抗原決定基，及(ii)第二偵測抗體或其抗原結合部分，其結合於存在於FGF21之胺基酸殘基173-182內之抗原決定基；及 (c) 一或多種偵測劑。
  36. 如申請專利範圍第35項之套組，其中該第一捕獲抗體及該第二捕獲抗體為相同抗體。
  37. 如申請專利範圍第35項之套組，其中該第一捕獲抗體及該第一偵測抗體結合於FGF21之胺基酸殘基5-172內之不同抗原決定基。
  38. 如申請專利範圍第32項至第37項中任一項之套組，其中該捕獲抗體、該第一捕獲抗體及該第二捕獲抗體中之一或多者固定至順磁性珠粒。
  39. 如申請專利範圍第32項至第38項中任一項之套組，其中該偵測抗體、該第一偵測抗體及該第二偵測抗體中之一或多者接合至生物素。
  40. 如申請專利範圍第32項至第39項中任一項之套組，其中該偵測劑係選自由以下組成之群：鏈黴親和素-β-D-半乳哌喃糖接合物、鏈黴親和素-辣根過氧化酶接合物及其組合。
  41. 如申請專利範圍第40項之套組，其進一步包含試鹵靈β-D-半乳哌喃糖苷、四甲基聯苯胺、過氧化氫或其組合。
  42. 如申請專利範圍第32項至第41項中任一項之套組，其中該捕獲抗體、該第一捕獲抗體及該第二捕獲抗體中之一或多者以約10-10 M至10-13 M之Kd 結合於FGF21。
  43. 如申請專利範圍第32項及第35項至第42項中任一項之套組，其中該偵測抗體及該第一偵測抗體中之一或多者以約10-10 M至10-13 M之Kd 結合於FGF21。
  44. 如申請專利範圍第32項及第35項至第43項中任一項之套組，其中該偵測抗體或該第一偵測抗體具有約0.1 μg/ml至約1 μg/ml之濃度。
  45. 如申請專利範圍第33項至第42項中任一項之套組，其中該偵測抗體或該第二偵測抗體中之一或多者具有約1 μg/ml至約3 μg/ml之濃度。
  46. 如申請專利範圍第40項之套組，其中該鏈黴親和素-β-D-半乳哌喃糖接合物具有約100 pM至約400 pM之濃度。
  47. 如申請專利範圍第32項至第46項中任一項之套組，其中該捕獲抗體、該第一捕獲抗體及該第二捕獲抗體中之一或多者包含： (a) 重鏈可變區CDR1，其包含選自由SEQ ID NO: 26及27組成之群的胺基酸序列及其保守取代； (b) 重鏈可變區CDR2結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 30及31組成之群的胺基酸序列及其保守取代； (c) 重鏈可變區CDR3結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 34及35組成之群的胺基酸序列及其保守取代； (d) 輕鏈可變區CDR1結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 38及39組成之群的胺基酸序列及其保守取代； (e) 輕鏈可變區CDR2結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 42及43組成之群的胺基酸序列及其保守取代；及 (f) 輕鏈可變區CDR3結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 46及47組成之群的胺基酸序列及其保守取代。
  48. 如申請專利範圍第32項至第46項中任一項之套組，其中該捕獲抗體、該第一捕獲抗體及該第二捕獲抗體中之一或多者包含： (a) 重鏈可變區，其包含選自由SEQ ID NO: 54、55、74及75組成之群的胺基酸序列及其保守取代；及 (b) 輕鏈可變區，其包含選自由SEQ ID NO: 50、51、70及71組成之群的胺基酸序列及其保守取代。
  49. 如申請專利範圍第32項至第46項中任一項之套組，其中該捕獲抗體、該第一捕獲抗體及該第二捕獲抗體中之一或多者包含： (a) 重鏈，其包含選自由SEQ ID NO: 22、23、66及67組成之群的胺基酸序列及其保守取代；及 (b) 輕鏈，其包含選自由SEQ ID NO: 18、19、62及63組成之群的胺基酸序列及其保守取代。
  50. 如申請專利範圍第32項及第35項至第46項中任一項之套組，其中該偵測抗體及該第一偵測抗體中之一或多者包含： (a) 重鏈可變區CDR1，其包含選自由SEQ ID NO: 28及29組成之群的胺基酸序列及其保守取代； (b) 重鏈可變區CDR2結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 32及33組成之群的胺基酸序列及其保守取代； (c) 重鏈可變區CDR3結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 36及37組成之群的胺基酸序列及其保守取代； (d) 輕鏈可變區CDR1結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 40及41組成之群的胺基酸序列及其保守取代； (e) 輕鏈可變區CDR2結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 44及45組成之群的胺基酸序列及其保守取代；及 (f) 輕鏈可變區CDR3結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 48及49組成之群的胺基酸序列及其保守取代。
  51. 如申請專利範圍第32項及第35項至第46項中任一項之套組，其中該偵測抗體及該第一偵測抗體中之一或多者包含： (a) 重鏈可變區，其包含選自由SEQ ID NO: 56、57、72及73組成之群的胺基酸序列及其保守取代；及 (b) 輕鏈可變區，其包含選自由SEQ ID NO: 52、53、68及69組成之群的胺基酸序列及其保守取代。
  52. 如申請專利範圍第32項及第35項至第46項中任一項之套組，其中該偵測抗體及該第一偵測抗體中之一或多者包含： (a) 重鏈，其包含選自由SEQ ID NO: 24、25、64及65組成之群的胺基酸序列及其保守取代；及 (b) 輕鏈，其包含選自由SEQ ID NO: 20、21、60及61組成之群的胺基酸序列及其保守取代。
  53. 如申請專利範圍第47項之套組，其中該捕獲抗體、該第一捕獲抗體及該第二捕獲抗體中之一或多者包含： (a) 重鏈可變區CDR1，其包含SEQ ID NO: 26之胺基酸序列及其保守取代； (b) 重鏈可變區CDR2結構域，其包含SEQ ID NO: 30之胺基酸序列及其保守取代； (c) 重鏈可變區CDR3結構域，其包含SEQ ID NO: 34之胺基酸序列及其保守取代； (d) 輕鏈可變區CDR1結構域，其包含SEQ ID NO: 38之胺基酸序列及其保守取代； (e) 輕鏈可變區CDR2結構域，其包含SEQ ID NO: 42之胺基酸序列及其保守取代；及 (f) 輕鏈可變區CDR3結構域，其包含SEQ ID NO: 46之胺基酸序列及其保守取代。
  54. 如申請專利範圍第53項之套組，其中該捕獲抗體、該第一捕獲抗體及該第二捕獲抗體中之一或多者包含： (a) 重鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 54之胺基酸序列及其保守取代；及 (b) 輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 50之胺基酸序列及其保守取代。
  55. 如申請專利範圍第54項之套組，其中該捕獲抗體、該第一捕獲抗體及該第二捕獲抗體中之一或多者包含： (a) 重鏈，其包含SEQ ID NO: 22之胺基酸序列及其保守取代；及 (b) 輕鏈，其包含SEQ ID NO: 18之胺基酸序列及其保守取代。
  56. 如申請專利範圍第50項之套組，其中該偵測抗體及該第一偵測抗體中之一或多者包含： (a) 重鏈可變區CDR1，其包含SEQ ID NO: 29之胺基酸序列及其保守取代； (b) 重鏈可變區CDR2結構域，其包含SEQ ID NO: 33之胺基酸序列及其保守取代； (c) 重鏈可變區CDR3結構域，其包含SEQ ID NO: 37之胺基酸序列及其保守取代； (d) 輕鏈可變區CDR1結構域，其包含SEQ ID NO: 41之胺基酸序列及其保守取代； (e) 輕鏈可變區CDR2結構域，其包含SEQ ID NO: 45之胺基酸序列及其保守取代；及 (f) 輕鏈可變區CDR3結構域，其包含SEQ ID NO: 49之胺基酸序列及其保守取代。
  57. 如申請專利範圍第56項之套組，其中該偵測抗體及該第一偵測抗體中之一或多者包含： (a) 重鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 57之胺基酸序列及其保守取代；及 (b) 輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 53之胺基酸序列及其保守取代。
  58. 如申請專利範圍第57項之套組，其中該偵測抗體及該第一偵測抗體中之一或多者包含： (a) 重鏈，其包含SEQ ID NO: 25之胺基酸序列及其保守取代；及 (b) 輕鏈，其包含SEQ ID NO: 21之胺基酸序列及其保守取代。
  59. 如申請專利範圍第32項至第46項中任一項之套組，其中該捕獲抗體、該第一捕獲抗體及該第二捕獲抗體中之一或多者與包含以下各項之抗體競爭性結合： (a) 重鏈可變區CDR1，其包含選自由SEQ ID NO: 26及27組成之群的胺基酸序列及其保守取代； (b) 重鏈可變區CDR2結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 30及31組成之群的胺基酸序列及其保守取代； (c) 重鏈可變區CDR3結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 34及35組成之群的胺基酸序列及其保守取代； (d) 輕鏈可變區CDR1結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 38及39組成之群的胺基酸序列及其保守取代； (e) 輕鏈可變區CDR2結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 42及43組成之群的胺基酸序列及其保守取代；及 (f) 輕鏈可變區CDR3結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 46及47組成之群的胺基酸序列及其保守取代。
  60. 如申請專利範圍第32項及第35項至第46項中任一項之套組，其中該偵測抗體及該第一偵測抗體中之一或多者與包含以下各項之抗體競爭性結合： (a) 重鏈可變區CDR1，其包含選自由SEQ ID NO: 28及29組成之群的胺基酸序列及其保守取代； (b) 重鏈可變區CDR2結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 32及33組成之群的胺基酸序列及其保守取代； (c) 重鏈可變區CDR3結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 36及37組成之群的胺基酸序列及其保守取代； (d) 輕鏈可變區CDR1結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 40及41組成之群的胺基酸序列及其保守取代； (e) 輕鏈可變區CDR2結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 44及45組成之群的胺基酸序列及其保守取代；及 (f) 輕鏈可變區CDR3結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 48及49組成之群的胺基酸序列及其保守取代。
  61. 如申請專利範圍第32項至第60項中任一項之套組，其中該樣品為血液樣品。
  62. 如申請專利範圍第32項至第60項中任一項之套組，其中該樣品為血漿樣品。
  63. 如申請專利範圍第32項至第62項中任一項之套組，其中該套組以約0.2 pg/ml至約0.5 pg/ml之孔內靈敏度偵測該樣品中之總體或活性FGF21蛋白的量。
  64. 一種經分離之抗FGF21抗體或其抗原結合部分，其包含： (a) 重鏈可變區CDR1，其包含選自由SEQ ID NO: 26-29組成之群的胺基酸序列及其保守取代； (b) 重鏈可變區CDR2結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 30-33組成之群的胺基酸序列及其保守取代； (c) 重鏈可變區CDR3結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 34-37組成之群的胺基酸序列及其保守取代； (d) 輕鏈可變區CDR1結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 38-41組成之群的胺基酸序列及其保守取代； (e) 輕鏈可變區CDR2結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 42-45組成之群的胺基酸序列及其保守取代；及 (f) 輕鏈可變區CDR3結構域，其包含選自由SEQ ID NO: 46-49組成之群的胺基酸序列及其保守取代。
  65. 如申請專利範圍第64項之經分離之抗體，其中該抗體或其抗原結合部分包含： (a) 重鏈可變區CDR1，其包含SEQ ID NO: 26之胺基酸序列及其保守取代； (b) 重鏈可變區CDR2結構域，其包含SEQ ID NO: 30之胺基酸序列及其保守取代； (c) 重鏈可變區CDR3結構域，其包含SEQ ID NO: 34之胺基酸序列及其保守取代； (d) 輕鏈可變區CDR1結構域，其包含SEQ ID NO: 38之胺基酸序列及其保守取代； (e) 輕鏈可變區CDR2結構域，其包含SEQ ID NO: 42之胺基酸序列及其保守取代；及 (f) 輕鏈可變區CDR3結構域，其包含SEQ ID NO: 46之胺基酸序列及其保守取代。
  66. 如申請專利範圍第64項之經分離之抗體，其中該抗體或其抗原結合部分包含： (a) 重鏈可變區CDR1，其包含SEQ ID NO: 27之胺基酸序列及其保守取代； (b) 重鏈可變區CDR2結構域，其包含SEQ ID NO: 31之胺基酸序列及其保守取代； (c) 重鏈可變區CDR3結構域，其包含SEQ ID NO: 35之胺基酸序列及其保守取代； (d) 輕鏈可變區CDR1結構域，其包含SEQ ID NO: 39之胺基酸序列及其保守取代； (e) 輕鏈可變區CDR2結構域，其包含SEQ ID NO: 43之胺基酸序列及其保守取代；及 (f) 輕鏈可變區CDR3結構域，其包含SEQ ID NO: 47之胺基酸序列及其保守取代。
  67. 如申請專利範圍第64項之經分離之抗體，其中該抗體或其抗原結合部分包含： (a) 重鏈可變區CDR1，其包含SEQ ID NO: 28之胺基酸序列及其保守取代； (b) 重鏈可變區CDR2結構域，其包含SEQ ID NO: 32之胺基酸序列及其保守取代； (c) 重鏈可變區CDR3結構域，其包含SEQ ID NO: 36之胺基酸序列及其保守取代； (d) 輕鏈可變區CDR1結構域，其包含SEQ ID NO: 40之胺基酸序列及其保守取代； (e) 輕鏈可變區CDR2結構域，其包含SEQ ID NO: 44之胺基酸序列及其保守取代；及 (f) 輕鏈可變區CDR3結構域，其包含SEQ ID NO: 48之胺基酸序列及其保守取代。
  68. 如申請專利範圍第64項之經分離之抗體，其中該抗體或其抗原結合部分包含： (a) 重鏈可變區CDR1，其包含SEQ ID NO: 29之胺基酸序列及其保守取代； (b) 重鏈可變區CDR2結構域，其包含SEQ ID NO: 33之胺基酸序列及其保守取代； (c) 重鏈可變區CDR3結構域，其包含SEQ ID NO: 37之胺基酸序列及其保守取代； (d) 輕鏈可變區CDR1結構域，其包含SEQ ID NO: 41之胺基酸序列及其保守取代； (e) 輕鏈可變區CDR2結構域，其包含SEQ ID NO: 45之胺基酸序列及其保守取代；及 (f) 輕鏈可變區CDR3結構域，其包含SEQ ID NO: 49之胺基酸序列及其保守取代。
  69. 如申請專利範圍第65項之經分離之抗體，其中該抗體或其抗原結合部分包含： (a) 重鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 54之胺基酸序列及其保守取代；及 (b) 輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 50之胺基酸序列及其保守取代。
  70. 如申請專利範圍第66項之經分離之抗體，其中該抗體或其抗原結合部分包含： (a) 重鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 55之胺基酸序列及其保守取代；及 (b) 輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 51之胺基酸序列及其保守取代。
  71. 如申請專利範圍第67項之經分離之抗體，其中該抗體或其抗原結合部分包含： (a) 重鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 56之胺基酸序列及其保守取代；及 (b) 輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 52之胺基酸序列及其保守取代。
  72. 如申請專利範圍第68項之經分離之抗體，其中該抗體或其抗原結合部分包含： (a) 重鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 57之胺基酸序列及其保守取代；及 (b) 輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 53之胺基酸序列及其保守取代。
  73. 如申請專利範圍第65項之經分離之抗體，其中該抗體或其抗原結合部分包含： (a) 重鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 75之胺基酸序列及其保守取代；及 (b) 輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 71之胺基酸序列及其保守取代。
  74. 如申請專利範圍第66項之經分離之抗體，其中該抗體或其抗原結合部分包含： (a) 重鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 74之胺基酸序列及其保守取代；及 (b) 輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 70之胺基酸序列及其保守取代。
  75. 如申請專利範圍第67項之經分離之抗體，其中該抗體或其抗原結合部分包含： (a) 重鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 73之胺基酸序列及其保守取代；及 (b) 輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 69之胺基酸序列及其保守取代。
  76. 如申請專利範圍第68項之經分離之抗體，其中該抗體或其抗原結合部分包含： (a) 重鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 72之胺基酸序列及其保守取代；及 (b) 輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 68之胺基酸序列及其保守取代。
  77. 如申請專利範圍第69項之經分離之抗體，其中該抗體或其抗原結合部分包含： (a) 重鏈，其包含SEQ ID NO: 22之胺基酸序列及其保守取代；及 (b) 輕鏈，其包含SEQ ID NO: 18之胺基酸序列及其保守取代。
  78. 如申請專利範圍第70項之經分離之抗體，其中該抗體或其抗原結合部分包含： (a) 重鏈，其包含SEQ ID NO: 23之胺基酸序列及其保守取代；及 (b) 輕鏈，其包含SEQ ID NO: 19之胺基酸序列及其保守取代。
  79. 如申請專利範圍第71項之經分離之抗體，其中該抗體或其抗原結合部分包含： (a) 重鏈，其包含SEQ ID NO: 24之胺基酸序列及其保守取代；及 (b) 輕鏈，其包含SEQ ID NO: 20之胺基酸序列及其保守取代。
  80. 如申請專利範圍第72項之經分離之抗體，其中該抗體或其抗原結合部分包含： (a) 重鏈，其包含SEQ ID NO: 25之胺基酸序列及其保守取代；及 (b) 輕鏈，其包含SEQ ID NO: 21之胺基酸序列及其保守取代。
  81. 如申請專利範圍第73項之經分離之抗體，其中該抗體或其抗原結合部分包含： (a) 重鏈，其包含SEQ ID NO: 67之胺基酸序列及其保守取代；及 (b) 輕鏈，其包含SEQ ID NO: 63之胺基酸序列及其保守取代。
  82. 如申請專利範圍第74項之經分離之抗體，其中該抗體或其抗原結合部分包含： (a) 重鏈，其包含SEQ ID NO: 66之胺基酸序列及其保守取代；及 (b) 輕鏈，其包含SEQ ID NO: 62之胺基酸序列及其保守取代。
  83. 如申請專利範圍第75項之經分離之抗體，其中該抗體或其抗原結合部分包含： (a) 重鏈，其包含SEQ ID NO: 65之胺基酸序列及其保守取代；及 (b) 輕鏈，其包含SEQ ID NO: 61之胺基酸序列及其保守取代。
  84. 如申請專利範圍第76項之經分離之抗體，其中該抗體或其抗原結合部分包含： (a) 重鏈，其包含SEQ ID NO: 64之胺基酸序列及其保守取代；及 (b) 輕鏈，其包含SEQ ID NO: 60之胺基酸序列及其保守取代。
  85. 一種經分離之核酸，其編碼如申請專利範圍第64項至第84項中任一項之抗體或其抗原結合部分。
  86. 一種宿主細胞，其包含如申請專利範圍第85項之核酸。
  87. 一種產生抗體之方法，該方法包括培養如申請專利範圍第86項之宿主細胞以產生該抗體。
  88. 如申請專利範圍第87項之方法，其進一步包括自該宿主細胞回收該抗體。
  89. 一種組合物，其包含一或多種如申請專利範圍第64項至第84項中任一項之抗體或其抗原結合部分。
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