ES2875905T3 - Composiciones que comprenden polipéptidos ActRIIA para su uso en el tratamiento de la hipertensión pulmonar - Google Patents

Composiciones que comprenden polipéptidos ActRIIA para su uso en el tratamiento de la hipertensión pulmonar Download PDF

Info

Publication number
ES2875905T3
ES2875905T3 ES17828540T ES17828540T ES2875905T3 ES 2875905 T3 ES2875905 T3 ES 2875905T3 ES 17828540 T ES17828540 T ES 17828540T ES 17828540 T ES17828540 T ES 17828540T ES 2875905 T3 ES2875905 T3 ES 2875905T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
activin
amino acid
seq
acid sequence
polypeptide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES17828540T
Other languages
English (en)
Inventor
Ravindra Kumar
John Knopf
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Acceleron Pharma Inc
Original Assignee
Acceleron Pharma Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Acceleron Pharma Inc filed Critical Acceleron Pharma Inc
Application granted granted Critical
Publication of ES2875905T3 publication Critical patent/ES2875905T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1875—Bone morphogenic factor; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone-inducing factor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/179—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/1796—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/33—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans derived from pro-opiomelanocortin, pro-enkephalin or pro-dynorphin
    • A61K38/35—Corticotropin [ACTH]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/45—Transferases (2)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

Una composición para su uso en el tratamiento de la hipertensión arterial pulmonar, donde la composición comprende un polipéptido ActRIIA que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32.

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones que comprenden polipéptidos ActRIIA para su uso en el tratamiento de la hipertensión pulmonar REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS
Esta solicitud reivindica el beneficio de prioridad con respecto a las solicitudes provisionales de Estados Unidos números de serie 62/362.955, presentada el 15 de julio de 2016; 62/453.888, presentada el 2 de febrero de 2017; y 62/510.403, presentada el 24 de mayo de 2017.
ANTECEDENTES
La hipertensión pulmonar (HP) es una enfermedad caracterizada por presión arterial alta en la vasculatura pulmonar, incluyendo arterias pulmonares, venas pulmonares y capilares pulmonares. En general, la HP se define como una presión arterial pulmonar (PA) media >25 mm Hg en reposo o >30 mm Hg con el ejercicio [Hill y col., Respiratory Care 54(7):958-68 (2009)]. El síntoma principal de la HP es la dificultad para respirar o falta de aire, y otros síntomas incluyen fatiga, mareos, desmayos, edema periférico (hinchazón de pies, piernas o tobillos), labios y piel azulados, dolor torácico, angina de pecho, desvanecimiento durante ejercicio, tos no productiva, pulso acelerado y palpitaciones. La HP puede ser una enfermedad grave que causa insuficiencia cardíaca, que es una de las causas más comunes de muerte en personas que tienen hipertensión pulmonar. La hipertensión pulmonar posoperatoria puede complicar muchos tipos de cirugías o procedimientos y presentar un desafío asociado con una alta mortalidad.
La HP puede agruparse basándose en diferentes manifestaciones de la enfermedad que comparten similitudes en los mecanismos fisiopatológicos, la presentación clínica y los enfoques terapéuticos [Simonneau y col., JACC 54(1 ):S44-54 (2009)]. La clasificación clínica de la HP se propuso por primera vez en 1973, y la Organización Mundial de la Salud (OMS) aprobó una clasificación clínica actualizada recientemente en 2008. Según la clasificación clínica de la HP actualizada, hay cinco grupos principales de HP: hipertensión arterial pulmonar (HAP), caracterizada por una presión de enclavamiento AP <15 mm Hg; HP debido a una cardiopatía izquierda (también conocida como hipertensión venosa pulmonar o insuficiencia cardíaca congestiva), caracterizada por una presión de enclavamiento AP >15 mm Hg; HP debido a enfermedades pulmonares y/o hipoxia; HP tromboembólica crónica; e HP con etiologías poco claras o multifactoriales [Simonneau y col., Ja Cc 54(1):S44-54 (2009); Hill y col., Respiratory Care 54(7):958-68 (2009)]. La HAP se clasifica además en HAP idiopática (HAPI), una enfermedad esporádica en la que no hay antecedentes familiares de HAP ni un factor de riesgo identificado; HAP hereditaria; HAP inducida por fármacos y toxinas; HAP asociada con enfermedades del tejido conectivo, infección por VIH, hipertensión portal, cardiopatías congénitas, esquistosomiasis y anemia hemolítica crónica; y HP persistente de los recién nacidos [Simonneau y col., JACC 54(1 ):S44-54 (2009)]. El diagnóstico de diversos tipos de HP requiere una serie de pruebas.
En general, el tratamiento de la HP depende de la causa o clasificación de la HP. Cuando la HP es causada por un medicamento o una afección médica conocida, se conoce como HP secundaria y su tratamiento normalmente se dirige a la enfermedad subyacente. El tratamiento de la hipertensión venosa pulmonar generalmente implica optimizar la función del ventrículo izquierdo mediante la administración de diuréticos, betabloqueantes e inhibidores de la ACE, o reparar o reemplazar una válvula mitral o una válvula aórtica. Las terapias para la HAP incluyen vasodilatadores pulmonares, digoxina, diuréticos, anticoagulantes y oxigenoterapia. Los vasodilatadores pulmonares se dirigen a diferentes vías, incluida la vía de la prostaciclina (por ejemplo, prostaciclinas, incluyendo epoprostenol intravenoso, treprostinil subcutáneo o intravenoso e iloprost inhalado), la vía del óxido nítrico (por ejemplo, inhibidores de la fosfodiesterasa-5, incluyendo sildenafilo y tadalafilo) y la vía de la endotelina-1 (por ejemplo, antagonistas del receptor de endotelina, incluyendo bosentán oral y ambrisentán oral) [Humbert, M. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 179:650-6 (2009); Hill y col., Respiratory Care 54(7):958-68 (2009)]. Sin embargo, las terapias actuales no proporcionan cura para la HP y no tratan directamente la remodelación vascular subyacente y la muscularización de los vasos sanguíneos que se observa en muchos pacientes con HP. El documento EP2594280 se refiere al uso de neutralizadores de activina para el tratamiento de enfermedades asociadas con la activación aberrante de la "respuesta de defensa del huésped". El documento AU2012244215 se refiere a procedimientos y composiciones que comprenden polipéptidos del receptor ActRII para su uso en el tratamiento de enfermedades asociadas con la actividad anormal de una proteína ActRII y/o un ligando de ActRII, incluyendo enfermedad pulmonar.
Por lo tanto, existe una gran necesidad insatisfecha de terapias eficaces para tratar la hipertensión pulmonar. Por consiguiente, es un objeto de la presente descripción proporcionar composiciones para su uso en el tratamiento, prevención o reducción de la tasa de progresión y/o la gravedad de la HP, el tratamiento, prevención o reducción particular de la tasa de progresión y/o la gravedad de una o más complicaciones asociadas a la HP.
RESUMEN
El alcance para el que se solicita la protección es el que se define en las reivindicaciones 1-24.
A este respecto, la presente invención proporciona una composición para su uso en el tratamiento de la hipertensión arterial pulmonar, donde la composición comprende administrar a un paciente que lo necesite una cantidad eficaz de un polipéptido ActRIIA que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32.La presente invención también proporciona una composición para su uso en el tratamiento de la hipertensión arterial pulmonar, donde la composición comprende administrar a un paciente que lo necesite una cantidad eficaz de un polipéptido ActRIIA que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 39. En un caso, el paciente tiene una presión arterial pulmonar (PAP) en reposo de al menos 25 min Hg. En un caso adicional, la composición para su uso reduce la PAP en el paciente; disminuye la hipertrofia ventricular en el paciente; disminuye la hipertrofia del músculo liso en el paciente; disminuye la musculatura de las arteriolas pulmonares en el paciente; disminuye la resistencia vascular pulmonar en el paciente; reduce la resistencia vascular pulmonar en el paciente; aumenta la presión de enclavamiento capilar pulmonar; aumenta la presión telediastólica del ventrículo izquierdo; aumenta la capacidad de ejercicio del paciente; aumenta la distancia de caminata de 6 minutos del paciente; y/o reduce el índice de disnea de Borg (BDI, por sus siglas en inglés) del paciente. En un caso, el paciente tiene hipertensión pulmonar de Clase funcional II o Clase funcional III según lo reconocido por la Organización Mundial de la Salud. En un caso adicional, la composición para su uso previene o retrasa la progresión de la Clase funcional de la hipertensión pulmonar. En un caso adicional, la composición para su uso promueve o aumenta la regresión de la Clase funcional de la hipertensión pulmonar. En un caso adicional, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 85 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32. En un caso adicional, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32. En un caso adicional, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32. En un caso adicional, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32. En un caso adicional, el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32. En un caso adicional, el polipéptido consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32. En un caso, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 85 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 39. En un caso adicional, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 39. En un caso adicional, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 39. En un caso adicional, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 39. En un caso adicional, el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 39. En un caso, el polipéptido forma parte de un complejo proteico homodimérico. En un caso adicional, el procedimiento comprende además la administración de uno o más agentes seleccionados de entre el grupo que consiste en: vasodilatadores, inhibidores de fosfodiesterasa tipo 5, estimuladores de guanilato ciclasa soluble, agonistas del receptor de prostaciclina y antagonistas del receptor de endotelina. En un caso, el paciente ha sido tratado con uno o más vasodilatadores. En un caso adicional, el uno o más vasodilatadores se selecciona de entre el grupo que consiste en: bosentán, sildenafilo, beraprost, macitentán, selexipag, epoprostenol, treprostinil, iloprost, ambrisentán y tadalafilo. En un caso, el polipéptido ActRIIA se une a uno o más ligandos seleccionados de entre el grupo que consiste en: activina A, activina B y GDF11.
En parte, los datos presentados en esta invención demuestran que los antagonistas (inhibidores) de GDF/BMP pueden usarse para tratar la hipertensión pulmonar. Por ejemplo, se demostró que un polipéptido ActRIIA soluble y un heterodímero de ALK4:ActRIIB pueden usarse, individualmente, para reducir la presión arterial, la hipertrofia cardíaca y el peso pulmonar en un modelo de hipertensión arterial pulmonar (HAP) inducida por monocrotalina. Se observaron efectos positivos similares para el polipéptido ActRIIA en el modelo de HAP de hipoxia de Sugen. El análisis histológico reveló además que el polipéptido ActRIIA tenía efectos sorprendentes y significativos sobre la disminución de la remodelación vascular y la muscularización de los vasos sanguíneos en los modelos de HAP tanto inducida por monocrotalina como de hipoxia de Sugen. Además, tanto el polipéptido ActRIIA como el heterodímero de ALK4:ActRIIB tuvieron sorprendentemente un efecto mayor en la mejora de diversas complicaciones de la HAP en comparación con el sildenafilo, que es un fármaco aprobado para el tratamiento de la HAP. Por lo tanto, la descripción establece que pueden usarse antagonistas de las vías de señalización de ActRII (ActRIIA y ActRIIB) para reducir la gravedad de la hipertensión pulmonar. Mientras que los polipéptidos ActRIIa solubles y los heteromultímeros de ALK4:ActRIIB pueden afectar a la hipertensión pulmonar a través de un mecanismo distinto a los antagonismos del ligando de ActRIIA/B, la descripción demuestra, no obstante, que los agentes terapéuticos deseables pueden seleccionarse sobre la base de la actividad antagonista de señalización de ActRII. Por lo tanto, en algunos casos, la descripción proporciona procedimientos para usar diversos antagonistas de señalización de ActRII para tratar la hipertensión, particularmente la hipertensión pulmonar, incluyendo, por ejemplo, antagonistas que inhiben uno o más ligandos de ActRIIA/B [por ejemplo, activina (activina A, activina B, activina AB, activina C, activina AC, activina BC, activina E, activina AE y/o activina BE), Gd F8, GDF11, GDF3, BMP6 , BMP15 y BMP10]; antagonistas que inhiben uno o más receptores de tipo I y/o de tipo II (por ejemplo, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7 y ALK5); y antagonistas que inhiben uno o más componentes de señalización cadena abajo (por ejemplo, proteínas Smad tales como Smads 2 y 3). Como se usan en esta invención, dichos antagonistas de señalización se denominan colectivamente "antagonistas de GDF/BMP" o "inhibidores de GDF/BMP". Por consiguiente, la descripción proporciona, en parte, composiciones de antagonistas de GDF/BMP y composiciones para su uso en el tratamiento de la hipertensión pulmonar (por ejemplo, HAP), particularmente el tratamiento de una o más complicaciones de la hipertensión pulmonar (por ejemplo, presión arterial elevada, hipertrofia cardíaca, remodelación vascular y muscularización de los vasos). Los antagonistas de GDF/BMP que se usarán según los procedimientos y usos de la descripción incluyen, por ejemplo, trampas de ligandos (por ejemplo, polipéptidos ActRIIA solubles, polipéptidos ActRIIB, heterodímeros de ALK4:ActRIIB, polipéptidos de folistatina y polipéptidos FLRG), antagonistas de anticuerpos, antagonistas de moléculas pequeñas y antagonistas de nucleótidos. Opcionalmente, los antagonistas de GDF/BMP pueden usarse en combinación con una o más terapias de apoyo y/o agentes activos adicionales para tratar la hipertensión pulmonar.
En determinados casos, la descripción se refiere a composiciones para su uso en el tratamiento de la hipertensión arterial pulmonar que comprenden administrar a un paciente que lo necesite una cantidad eficaz de un polipéptido ActRIIA. En algunos casos, el polipéptido ActRIIA comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 % (por ejemplo, al menos un 70 %,75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 %) idéntica a una secuencia de aminoácidos que comienza en cualquiera de los aminoácidos 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 de SEQ ID NO: 9 y termina en cualquiera de los aminoácidos 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134 o 135 de SEQ ID NO: 9. En algunos casos, el polipéptido ActRIIA comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 % (por ejemplo, al menos un 70 %,75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 %) idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10. En algunos casos, el polipéptido ActRIIA comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 % (por ejemplo, al menos un 70 %,75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 %) idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11. En algunos casos, el polipéptido ActRIIA es una proteína de fusión que comprende un dominio ActRIIA y uno o más dominios polipeptídicos heterólogos a ActRIIA. En algunos casos, el polipéptido ActRIIA es una proteína de fusión que comprende un dominio Fc de una inmunoglobulina. En algunos casos, el dominio Fc de la inmunoglobulina es un dominio Fc de una inmunoglobulina IgG1. En algunos casos, la proteína de fusión ActRIIA comprende además un dominio de enlazador posicionado entre el dominio polipeptídico ActRIIA y uno o más dominios heterólogos (por ejemplo, un dominio Fc de inmunoglobulina). En algunos casos, el dominio de enlazador se selecciona de entre el grupo que consiste en: TGGG (SEQ ID NO: 23), TGGGG (SEQ ID NO: 21), SGGGG (SEQ ID NO: 22), GGGGS (SEQ ID NO: 25), GGG (SEQ ID NO: 19), GGGG (SEQ ID nO: 20) y SGGG (SEQ ID NO: 24). En algunos casos, el polipéptido ActRIIA comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32. En algunos casos, el polipéptido ActRIIA comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32. En algunos casos, el polipéptido ActRIIA consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32. En algunos casos, el polipéptido ActRIIA forma parte de un complejo proteico homodimérico. En algunos casos, el polipéptido ActRIIA está glucosilado.En algunos casos, el polipéptido ActRIIA tiene un patrón de glucosilación que se puede obtener mediante la expresión en una célula de ovario de hámster chino. En algunos casos, la administración del polipéptido ActRIIA disminuye la presión arterial pulmonar en el paciente. En algunos casos, la administración del polipéptido ActRIIA disminuye la presión arterial pulmonar en el paciente en al menos un 10 % (por ejemplo, un 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 % o al menos un 80 %). En algunos casos, la administración del polipéptido ActRIIA disminuye la hipertrofia ventricular en el paciente. En algunos casos, la administración del polipéptido ActRIIA disminuye la hipertrofia ventricular en el paciente en al menos un 10 % (por ejemplo, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 % o al menos un 80 %). En algunos casos, la administración del polipéptido ActRIIA disminuye la hipertrofia del músculo liso en el paciente. En algunos casos, la administración del polipéptido ActRIIA disminuye la hipertrofia del músculo liso en el paciente en al menos un 10 % (por ejemplo, un 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 % o al menos un 80 %). En algunos casos, la administración del polipéptido ActRIIA disminuye la musculatura de las arteriolas pulmonares en el paciente. En algunos casos, la administración del polipéptido ActRIIA disminuye la musculatura de las arteriolas pulmonares en el paciente en al menos un 10 % (por ejemplo, un 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 % o al menos un 80 %). En algunos casos, la administración del polipéptido ActRIIA disminuye la resistencia vascular pulmonar en el paciente. En algunos casos, la administración del polipéptido ActRIIA disminuye la resistencia vascular pulmonar en el paciente en al menos un 10 % (por ejemplo, un 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 % o al menos un 80 %). En algunos casos, la administración del polipéptido ActRIIA disminuye la resistencia vascular pulmonar en el paciente en al menos un 25-30 %. En algunos casos, el paciente tiene hipertensión arterial pulmonar y tiene hipertensión pulmonar de Clase funcional II o Clase funcional III según el sistema de clasificación funcional de la Organización Mundial de la Salud para la hipertensión pulmonar. En algunos casos, el paciente tiene hipertensión arterial pulmonar que se clasifica como uno o más subtipos seleccionados de entre el grupo que consiste en: hipertensión arterial pulmonar idiopática o hereditaria, hipertensión pulmonar inducida por fármacos y/o toxinas, hipertensión pulmonar asociada con enfermedad del tejido conectivo e hipertensión pulmonar asociada con derivaciones congénitas sistémico-pulmonares al menos 1 año después de la reparación de la derivación. En algunos casos, el paciente ha sido tratado con uno o más vasodilatadores. En algunos casos, el paciente ha sido tratado con uno o más agentes seleccionados de entre el grupo que consiste en: inhibidores de fosfodiesterasa tipo 5, estimuladores de guanilato ciclasa soluble, agonistas del receptor de prostaciclina y antagonistas del receptor de endotelina. En algunos casos, el uno o más agentes se seleccionan de entre el grupo que consiste en: bosentán, sildenafilo, beraprost, macitentán, selexipag, epoprostenol, treprostinil, iloprost, ambrisentán y tadalafilo. En algunos casos, el procedimiento comprende además la administración de uno o más vasodilatadores. En algunos casos, el procedimiento comprende además la administración de uno o más agentes seleccionados de entre el grupo que consiste en: inhibidores de fosfodiesterasa tipo 5, estimuladores de guanilato ciclasa soluble, agonistas del receptor de prostaciclina y antagonistas del receptor de endotelina. En algunos casos, el uno o más agentes se seleccionan de entre el grupo que consiste en: bosentán, sildenafilo, beraprost, macitentán, selexipag, epoprostenol, treprostinil, iloprost, ambrisentán y tadalafilo. En algunos casos, el paciente tiene una distancia de caminata de 6 minutos de 150 a 400 metros. En algunos casos, el procedimiento aumenta la distancia de caminata de 6 minutos del paciente en al menos 10 metros (por ejemplo, al menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300 o más de 400 metros). En algunos casos, el paciente tiene un nivel de hemoglobina de> 8 y <15 g/dl. En algunos casos, el procedimiento retrasa el empeoramiento clínico de la hipertensión arterial pulmonar. En algunos casos, el procedimiento retrasa el empeoramiento clínico de la hipertensión pulmonar según el sistema de clasificación funcional de la Organización Mundial de la Salud para la hipertensión pulmonar. En algunos casos, el procedimiento reduce el riesgo de hospitalización por una o más complicaciones asociadas con la hipertensión arterial pulmonar. En algunos casos, los polipéptidos ActRIIA se unen a uno o más ligandos seleccionados de entre el grupo que consiste en: activina A, activina B, GDF11, GDF8, BMP10 y BMP6.
En algunos casos, la presente descripción se refiere a procedimientos para tratar la hipertensión pulmonar que comprenden administrar a un paciente que lo necesite una cantidad eficaz de un antagonista de GDF/BMP, o una combinación de antagonistas de GDF/BMP. En determinados casos, la presente descripción se refiere a procedimientos para prevenir la hipertensión pulmonar que comprenden administrar a un paciente que lo necesite una cantidad eficaz de un antagonista de GDF/BMP, o una combinación de antagonistas de GDF/BMP. En determinados casos, la descripción se refiere a procedimientos para reducir la tasa de progresión de la hipertensión pulmonar que comprenden administrar a un paciente que lo necesite una cantidad eficaz de un antagonista de GDF/BMP, o una combinación de antagonistas de GDF/BMP. En algunos casos, la descripción proporciona una composición para su uso en el tratamiento de una enfermedad pulmonar intersticial, que comprende administrar a un paciente que lo necesite una cantidad eficaz de un antagonista de GDF/BMP, donde el antagonista de GDF/BMP inhibe uno o más de activina, GDF8, GDF11, GDF3, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5 y ALK7. En algunos casos, la descripción proporciona una composición para su uso en el tratamiento, prevención o reducción de la tasa de progresión y/o la gravedad de una o más complicaciones de una enfermedad pulmonar intersticial, que comprende administrar a un paciente que lo necesite una cantidad eficaz de un antagonista de GDF/BMP, donde el antagonista de GDF/BMP inhibe uno o más de activina, GDF8, GDF11, GDF3, BMP6 , BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5 y ALK7. En algunos casos, la enfermedad pulmonar intersticial es fibrosis pulmonar idiopática. En determinados casos, la descripción se refiere a procedimientos para reducir la gravedad de la hipertensión pulmonar que comprenden administrar a un paciente que lo necesite una cantidad eficaz de un antagonista de GDF/BMP, o una combinación de antagonistas de GDF/b Mp . En determinados casos, la descripción se refiere a composiciones para su uso en el tratamiento de una o más complicaciones de la hipertensión pulmonar (por ejemplo, proliferación de músculo liso y/o células endoteliales en la arteria pulmonar, angiogénesis en la arteria pulmonar, disnea, dolor torácico, remodelación vascular pulmonar, hipertrofia ventricular derecha y fibrosis pulmonar) que comprenden administrar a un paciente que lo necesite una cantidad eficaz de un antagonista de GDF/BMP, o una combinación de antagonistas de GDF/BMP. En determinados casos, la descripción se refiere a composiciones para su uso en la prevención de una o más complicaciones de la hipertensión pulmonar (por ejemplo, proliferación de músculo liso y/o células endoteliales en la arteria pulmonar, angiogénesis en la arteria pulmonar, disnea, dolor torácico, remodelación vascular pulmonar, hipertrofia ventricular derecha y fibrosis pulmonar) que comprenden administrar a un paciente que lo necesite una cantidad eficaz de un antagonista de GDF/BMP, o una combinación de antagonistas de GDF/BMP. En determinados casos, la descripción se refiere a composiciones para su uso en la reducción de la tasa de progresión de una o más complicaciones de la hipertensión pulmonar (por ejemplo, proliferación de músculo liso y/o células endoteliales en la arteria pulmonar, angiogénesis en la arteria pulmonar, disnea, dolor torácico, remodelación vascular pulmonar, hipertrofia ventricular derecha y fibrosis pulmonar) que comprenden administrar a un paciente que lo necesite una cantidad eficaz de un antagonista de GDF/BMP, o una combinación de antagonistas de GDF/BMP. En determinados casos, la descripción se refiere a composiciones para su uso en la reducción de una o más complicaciones de la hipertensión pulmonar (por ejemplo, proliferación de músculo liso y/o células endoteliales en la arteria pulmonar, angiogénesis en la arteria pulmonar, disnea, dolor torácico, remodelación vascular pulmonar, hipertrofia ventricular derecha y fibrosis pulmonar) que comprenden administrar a un paciente que lo necesite una cantidad eficaz de un antagonista de GDF/BMP, o una combinación de antagonistas de GDF/BMP. En determinados casos preferidos, los procedimientos descritos en esta invención se refieren a un paciente que tiene hipertensión arterial pulmonar. En algunos casos, los procedimientos descritos en esta invención se refieren a un paciente que tiene una presión arterial pulmonar (PAP) en reposo de al menos 25 mm Hg (por ejemplo, al menos 25, 30, 35, 40, 45 o 50 mm Hg). En algunos casos, los procedimientos descritos en esta invención reducen la PAP en un paciente que tiene hipertensión pulmonar. Por ejemplo, el procedimiento puede reducir la PAP en al menos 3 mm Hg (por ejemplo, al menos 3, 5, 7, 10, 12, 15, 20 o 25 mm Hg) en un paciente que tiene hipertensión pulmonar. En algunos casos, los procedimientos descritos en esta invención reducen la resistencia vascular pulmonar en un paciente que tiene hipertensión pulmonar. En algunos casos, los procedimientos descritos en esta invención aumentan la presión de enclavamiento capilar pulmonar en un paciente que tiene hipertensión pulmonar. En algunos casos, los procedimientos descritos en esta invención aumentan la presión telediastólica del ventrículo izquierdo en un paciente que tiene hipertensión pulmonar. En algunos casos, los procedimientos descritos en esta invención aumentan (mejoran) la capacidad de ejercicio (habilidad, tolerancia) en un paciente que tiene hipertensión pulmonar. Por ejemplo, el procedimiento puede aumentar la distancia de caminata de 6 minutos en un paciente que tiene hipertensión pulmonar, aumentando opcionalmente la distancia de caminata de 6 minutos en al menos 10 metros (por ejemplo, al menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o más metros). Además, el procedimiento puede reducir el índice de disnea de Borg (BDI) del paciente, que opcionalmente se puede evaluar después de una prueba de caminata de 6 minutos. En algunos casos, el procedimiento reduce el índice de disnea de Borg (BDI) del paciente en al menos 0,5 puntos índice (por ejemplo, al menos 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5 o 10 puntos índice). En algunos casos, los procedimientos descritos en esta invención se refieren a un paciente que tiene hipertensión pulmonar de Clase I, Clase II, Clase III o Clase IV según lo reconoce la Organización Mundial de la Salud. En algunos casos, los procedimientos descritos en esta invención se refieren a retrasar la progresión clínica (empeoramiento) de la hipertensión pulmonar (por ejemplo, progresión según lo medido por el estándar de la Organización Mundial de la Salud). En algunos casos, el procedimiento previene o retrasa la progresión de la Clase de la hipertensión pulmonar (por ejemplo, previene o retrasa la progresión de la hipertensión pulmonar de la Clase I a la Clase II, de la Clase II a la Clase III o de la Clase III a la Clase IV según lo reconocido por la Organización Mundial de la Salud). En algunos casos, el procedimiento promueve o aumenta la regresión de la Clase de la hipertensión pulmonar (por ejemplo, promueve o aumenta la regresión de la hipertensión pulmonar de la Clase IV a la Clase III, de la Clase III a la Clase II o de la Clase II a la Clase I según lo reconocido por la Organización Mundial de la Salud). En algunos casos, al paciente se le administra además una o más terapias de apoyo o agentes activos para tratar la hipertensión pulmonar además del uno o más antagonistas de GDF/BMP. Por ejemplo, al paciente también se le puede administrar una o más terapias de apoyo o agentes activos seleccionados de entre el grupo que consiste en: prostaciclina y derivados de la misma (por ejemplo, epoprostenol, treprostinil e iloprost); agonistas del receptor de prostaciclina (por ejemplo, selexipag); antagonistas del receptor de endotelina (por ejemplo, telina, ambrisentán, macitentán y bosentán); bloqueadores de los canales de calcio (por ejemplo, amlodipina, diltiazem y nifedipina; anticoagulantes (por ejemplo, warfarina); diuréticos; oxigenoterapia; septostomía auricular; tromboendarterectomía pulmonar; inhibidores de la fosfodiesterasa tipo 5 (por ejemplo, sildenafilo y tadalafilo); activadores de la guanilato ciclasa soluble (por ejemplo, cinaciguat y riociguat); inhibidores de ASK-1 (por ejemplo, CIIA; SCH79797; GS-4997; MSC2032964 A; 3H-nafto[1,2,3-de]quinilin-2,7-dionas, NQDI-1; 2-tioxo-tiazolidinas, 5-bromo-3-(4-oxo-2-tioxo-tiazolidin-5-iliden)-1,3-dihidro-indol-2-ona); antagonistas de NF-kB (por ejemplo, dh404, CDDO-epóxido; 2,2-difluoropropionamida; Imidazol C28 (CDDO-Im); ácido 2-ciano-3,12-dioxoolean-1,9-dien-28-oico (CDDO); ácido 3-acetiloleanólico; ácido 3-trifluoroacetiloleanólico; 28-metil-3-acetiloleanano; 28-metil-3-trifluoroacetiloleanano; ácido 28-metiloxioleanólico; SZC014; SCZ015; SZC017; derivados PEGilados de ácido oleanólico; ácido 3-O-(beta-D-glucopiranosil)oleanólico; ácido 3-O-[beta-D-glucopiranosil-(1-->3)-beta-D-glucopiranosil]oleanólico; ácido 3-O-[beta-D-glucopiranosil-(1-->2)-beta-D-glucopiranosil]oleanólico; 28-O-beta-D-glucopiranosil éster del ácido 3-O-[beta-D-glucopiranosil-(1-->3)-beta-D-glucopiranosil]oleanólico; 28-O-beta-D-glucopiranosil éster del ácido 3-O-[beta-D-glucopiranosil-(1-->2)-beta-D-glucopiranosil]oleanólico; ácido 3-O-[a-L-ramnopiranosil-(1-->3)-beta-D-glucuronopiranosil]oleanólico; 28-O-beta-D-glucopiranosil éster del ácido 3-O-[alfa-L-ramnopiranosil-(1-->3)-beta-D-glucuronopiranosil]oleanólico; ácido 28-O-p-D-glucopiranosil-oleanólico; ácido 3-O-p-D-glucop¡ranos¡l(1^3)-p-D-glucopiranosidurónico (CS1); ácido oleanólico ácido 3-O-p-D-glucopiranos¡l(1^3)-p-D-glucopiranosidurónico (CS2); 3,11-dioxoolean-12-en-28-olato de metilo (DIOXOL); ZCVU-2; 3-deshidroxi-1,2,5-oxadiazolo[3',4':2,3]oleanolato de metilo), trasplante de pulmón y/o corazón. En algunos casos, al paciente también se le puede administrar un polipéptido BMP9. En algunos casos, el polipéptido BMP9 es un polipéptido BMP9 maduro. En algunos casos, el polipéptido BMP9 comprende un polipéptido del prodominio BMP9. En algunos casos, el polipéptido BMP9 se administra en una preparación farmacéutica, que opcionalmente puede comprender un polipéptido del prodominio BMP9. En dichas preparaciones farmacéuticas de BMP9 que comprenden un polipéptido del prodominio BMP9, el polipéptido BMP9 puede estar asociado no covalentemente con el polipéptido del prodominio BMP9. En algunos casos, las preparaciones farmacéuticas de BMP9 están sustancialmente libres o no comprenden el polipéptido del prodominio BMP9. En algunos casos, al paciente también se le puede administrar ácido oleanólico 0 un derivado del mismo.
En determinados casos, un antagonista de GDF/BMP, o una combinación de antagonistas, a usar según los procedimientos y usos descritos en esta invención, es un agente que inhibe al menos GDF11 (por ejemplo, un antagonista de GDF11). Los efectos sobre la inhibición de GDF11 pueden determinarse, por ejemplo, usando un ensayo basado en células incluyendo los descritos en esta invención (por ejemplo, un ensayo indicador de señalización de Smad). Por lo tanto, en algunos casos, un antagonista de GDF/BMP, o una combinación de antagonistas, de la descripción puede unirse al menos a GDF11. La actividad de unión a ligando se puede determinar, por ejemplo, usando un ensayo de afinidad de unión que incluye los descritos en esta invención. En algunos casos, un antagonista de GDF/BMP, o una combinación de antagonistas, de la descripción se une al menos a GDF11 con una Kd de al menos 1 x 10'7 M (por ejemplo, al menos 1 x 10'8 M, al menos 1 x 10'9 M, al menos 1 x 10'10 M, al menos 1 x 10'11 M o al menos 1 x 10'12 M). Como se describe en esta invención, se pueden usar diversos antagonistas de GDF/BMP que inhiben GDF11 según los procedimientos y usos descritos en esta invención incluyendo, por ejemplo, trampas de ligandos (por ejemplo, polipéptidos ActRII, trampas de GDF, polipéptidos de folistatina, polipéptidos FLRG y heteromultímeros de ALK4:ActRIIB), anticuerpos, moléculas pequeñas, secuencias de nucleótidos y combinaciones de los mismos. En determinados casos, un antagonista de GDF/BMP, o una combinación de antagonistas, que inhibe GDF11 puede inhibir adicionalmente uno o más de: activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina AB, activina C, activina AC, activina BC, activina E, activina AE y/o activina BE), GDF8, GDF3, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7 y uno o más Smads (por ejemplo, Smads 2 y 3).
En determinados casos, un antagonista de GDF/BMP, o una combinación de antagonistas, a usar según los procedimientos y usos descritos en esta invención, es un agente que inhibe al menos GDF8 (por ejemplo, un antagonista de GDF8). Los efectos sobre la inhibición de GDF8 pueden determinarse, por ejemplo, usando un ensayo basado en células incluyendo los descritos en esta invención (por ejemplo, un ensayo indicador de señalización de Smad). Por lo tanto, en algunos casos, un antagonista de GDF/BMP, o una combinación de antagonistas, de la descripción puede unirse al menos a GDF8. La actividad de unión a ligando se puede determinar, por ejemplo, usando un ensayo de afinidad de unión que incluye los descritos en esta invención. En algunos casos, un antagonista de GDF/BMP, o una combinación de antagonistas, de la descripción se une al menos a GDF8 con una Kd de al menos 1 x 10-7 M (por ejemplo, al menos 1 x 10-8 M, al menos 1 x 10-9 M, al menos 1 x 10-10 M, al menos 1 x 10-11 M o al menos 1 x 10-12 M). Como se describe en esta invención, se pueden usar diversos antagonistas de GDF/BMP que inhiben GDF8 según los procedimientos y usos descritos en esta invención incluyendo, por ejemplo, trampas de ligandos (por ejemplo, polipéptidos ActRII, trampas de GDF, polipéptidos de folistatina, polipéptidos FLRG y heteromultímeros de ALK4:ActRIIB), anticuerpos, moléculas pequeñas, secuencias de nucleótidos y combinaciones de los mismos. En determinados casos, un antagonista de GDF/BMP, o una combinación de antagonistas, que inhibe GDF8 puede inhibir adicionalmente uno o más de: activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina AB, activina C, activina AC, activina BC, activina E, activina AE y/o activina BE), GDF11, GDF3, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7 y uno o más Smads (por ejemplo, Smads 2 y 3).
En determinados casos, un antagonista de GDF/BMP, o una combinación de antagonistas, a usar según los procedimientos y usos descritos en esta invención, es un agente que inhibe al menos GDF3 (por ejemplo, un antagonista de GDF3). Los efectos sobre la inhibición de GDF3 pueden determinarse, por ejemplo, usando un ensayo basado en células incluyendo los descritos en esta invención (por ejemplo, un ensayo indicador de señalización de Smad). Por lo tanto, en algunos casos, un antagonista de g Df/BMP, o una combinación de antagonistas, de la descripción puede unirse al menos a GDF3. La actividad de unión a ligando se puede determinar, por ejemplo, usando un ensayo de afinidad de unión que incluye los descritos en esta invención. En algunos casos, un antagonista de GDF/BMP, o una combinación de antagonistas, de la descripción se une al menos a GDF3 con una Kd de al menos 1 x 10-7 M (por ejemplo, al menos 1 x 10-8 M, al menos 1 x 10-9 M, al menos 1 x 10-10 M, al menos 1 x 10-11 M o al menos 1 x 10-12 M). Como se describe en esta invención, se pueden usar diversos antagonistas de GDF/BMP que inhiben GDF3 según los procedimientos y usos descritos en esta invención incluyendo, por ejemplo, trampas de ligandos (por ejemplo, polipéptidos ActRII, trampas de GDF, polipéptidos de folistatina, polipéptidos FLRG y heteromultímeros de ALK4:ActRIIB), anticuerpos, moléculas pequeñas, secuencias de nucleótidos y combinaciones de los mismos. En determinados casos, un antagonista de GDF/BMP, o una combinación de antagonistas, que inhibe GDF3 puede inhibir adicionalmente uno o más de: activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina AB, activina C, activina AC, activina BC, activina E, activina AE y/o activina BE), GDF8, GDF11, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7 y uno o más Smads (por ejemplo, Smads 2 y 3).
En determinados casos, un antagonista de GDF/BMP, o una combinación de antagonistas, a usar según los procedimientos y usos descritos en esta invención, es un agente que inhibe al menos BMP6 (por ejemplo, un antagonista de BMP6). Los efectos sobre la inhibición de BMP6 pueden determinarse, por ejemplo, usando un ensayo basado en células incluyendo los descritos en esta invención (por ejemplo, un ensayo indicador de señalización de Smad). Por lo tanto, en algunos casos, un antagonista de g Df/b Mp , o una combinación de antagonistas, de la descripción puede unirse al menos a BMP6. La actividad de unión a ligando se puede determinar, por ejemplo, usando un ensayo de afinidad de unión que incluye los descritos en esta invención. En algunos casos, un antagonista de GDF/BMP, o una combinación de antagonistas, de la descripción se une al menos a BMP6 con una Kd de al menos 1 x 10-7 M (por ejemplo, al menos 1 x 10-8 M, al menos 1 x 10-9 M, al menos 1 x 10-10 M, al menos 1 x 10-11 M o al menos 1 x 10-12 M). Como se describe en esta invención, se pueden usar diversos antagonistas de GDF/BMP que inhiben BMP6 según los procedimientos y usos descritos en esta invención incluyendo, por ejemplo, trampas de ligandos (por ejemplo, polipéptidos ActRII, trampas de GDF, polipéptidos de folistatina, polipéptidos FLRG y heteromultímeros de ALK4:ActRIIB), anticuerpos, moléculas pequeñas, secuencias de nucleótidos y combinaciones de los mismos. En determinados casos, un antagonista de GDF/BMP, o una combinación de antagonistas, que inhibe BMP6 puede inhibir adicionalmente uno o más de: activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina AB, activina C, activina AC, activina BC, activina E, activina AE y/o activina BE), GDF8, GDF3, GDF11, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7 y uno o más Smads (por ejemplo, Smads 2 y 3).
En determinados casos, un antagonista de GDF/BMP, o una combinación de antagonistas, a usar según los procedimientos y usos descritos en esta invención, es un agente que inhibe al menos BMP15 (por ejemplo, un antagonista de BMP15). Los efectos sobre la inhibición de BMP15 pueden determinarse, por ejemplo, usando un ensayo basado en células incluyendo los descritos en esta invención (por ejemplo, un ensayo indicador de señalización de Smad). Por lo tanto, en algunos casos, un antagonista de GDF/BMP, o una combinación de antagonistas, de la descripción puede unirse al menos a BMP15. La actividad de unión a ligando se puede determinar, por ejemplo, usando un ensayo de afinidad de unión que incluye los descritos en esta invención. En algunos casos, un antagonista de GDF/BMP, o una combinación de antagonistas, de la descripción se une al menos a BMP15 con una Kd de al menos 1 x 10-7 M (por ejemplo, al menos 1 x 10-8 M, al menos 1 x 10-9 M, al menos 1 x 10-10 M, al menos 1 x 10-11 M o al menos 1 x 10-12 M). Como se describe en esta invención, se pueden usar diversos antagonistas de GDF/BMP que inhiben BMP15 según los procedimientos y usos descritos en esta invención incluyendo, por ejemplo, trampas de ligandos (por ejemplo, polipéptidos ActRII, trampas de GDF, polipéptidos de folistatina, polipéptidos FLRG y heteromultímeros de ALK4:ActRIIB), anticuerpos, moléculas pequeñas, secuencias de nucleótidos y combinaciones de los mismos. En determinados casos, un antagonista de GDF/BMP, o una combinación de antagonistas, que inhibe BMP15 puede inhibir adicionalmente uno o más de: activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina AB, activina C, activina AC, activina BC, activina E, activina AE y/o activina BE), Gd F8, GDF3, GDF11, BMP6, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7 y uno o más Smads (por ejemplo, Smads 2 y 3).
En determinados casos, un antagonista de GDF/BMP, o una combinación de antagonistas, a usar según los procedimientos y usos descritos en esta invención, es un agente que inhibe al menos BMP10 (por ejemplo, un antagonista de BMP10). Los efectos sobre la inhibición de BMP10 pueden determinarse, por ejemplo, usando un ensayo basado en células incluyendo los descritos en esta invención (por ejemplo, un ensayo indicador de señalización de Smad). Por lo tanto, en algunos casos, un antagonista de GDF/BMP, o una combinación de antagonistas, de la descripción puede unirse al menos a BMP10. La actividad de unión a ligando se puede determinar, por ejemplo, usando un ensayo de afinidad de unión que incluye los descritos en esta invención. En algunos casos, un antagonista de GDF/BMP, o una combinación de antagonistas, de la descripción se une al menos a BMP10 con una Kd de al menos 1 x 10-7 M (por ejemplo, al menos 1 x 10-8 M, al menos 1 x 10-9 M, al menos 1 x 10-10 M, al menos 1 x 10-11 M o al menos 1 x 10-12 M). Como se describe en esta invención, se pueden usar diversos antagonistas de GDF/BMP que inhiben BMP10 según los procedimientos y usos descritos en esta invención incluyendo, por ejemplo, trampas de ligandos (por ejemplo, polipéptidos ActRII, trampas de GDF, polipéptidos de folistatina, polipéptidos FLRG y heteromultímeros de ALK4:ActRIIB, polipéptidos FLRG), anticuerpos, moléculas pequeñas, secuencias de nucleótidos y combinaciones de los mismos. En determinados casos, un antagonista de GDF/BMP, o una combinación de antagonistas, que inhibe BMP10 puede inhibir adicionalmente uno o más de: activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina AB, activina C, activina AC, activina BC, activina E, activina AE y/o activina BE), GDF8, GDF3, GDF11, BMP6, BMP15, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7 y uno o más Smads (por ejemplo, Smads 2 y 3).
En determinados casos, un antagonista de GDF/BMP, o una combinación de antagonistas, a usar según los procedimientos y usos descritos en esta invención, es un agente que inhibe al menos la activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina AB, activina C, activina AC, activina BC, activina E, activina AE y/o activina b E) (por ejemplo, un antagonista de activina). Los efectos sobre la inhibición de activina pueden determinarse, por ejemplo, usando un ensayo basado en células incluyendo los descritos en esta invención (por ejemplo, un ensayo indicador de señalización de Smad). Por lo tanto, en algunos casos, un antagonista de GDF/BMP, o una combinación de antagonistas, de la descripción puede unirse al menos a activina. La actividad de unión a ligando se puede determinar, por ejemplo, usando un ensayo de afinidad de unión que incluye los descritos en esta invención. En algunos casos, un antagonista de GDF/BMP, o una combinación de antagonistas, de la descripción se une al menos a activina con una Kd de al menos 1 x 10-7 M (por ejemplo, al menos 1 x 10-8 M, al menos 1 x 10-9 M, al menos 1 x 10-10 M, al menos 1 x 10-11 M o al menos 1 x 10-12 M). Como se describe en esta invención, se pueden usar diversos antagonistas de GDF/BMP que inhiben la activina según los procedimientos y usos descritos en esta invención incluyendo, por ejemplo, trampas de ligandos (por ejemplo, polipéptidos ActRII, trampas de GDF, polipéptidos de folistatina, polipéptidos FLRG y heteromultímeros de ALK4:ActRIIB), anticuerpos, moléculas pequeñas, secuencias de nucleótidos y combinaciones de los mismos. En determinados casos, un antagonista de GDF/BMP, o una combinación de antagonistas, que inhibe la activina puede inhibir además uno o más de: BMP15, GDF8, GDF3, GDF11, BMP6, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7 y uno o más Smads (por ejemplo, Smads 2 y 3). En determinados casos preferidos, un antagonista de GDF/BMP, o una combinación de antagonistas, a usar según los procedimientos y usos descritos en esta invención, es un agente que inhibe al menos la activina B. En algunos casos, un antagonista de GDF/BMP, o una combinación de antagonistas, a usar según los procedimientos y usos descritos en esta invención no se une sustancialmente a la activina A (por ejemplo, se une a la activina A con una Kd superior a 1 x 10-7 M o tiene una unión relativamente modesta, por ejemplo, aproximadamente 1 x 10-8 M o aproximadamente 1 x 10-9 M) y/o inhibe la actividad de la activina A. En determinados casos, un antagonista de GDF/BMP, o una combinación de antagonistas, a usar según los procedimientos y usos descritos en esta invención es un agente que inhibe al menos la activina B pero no se une sustancialmente a la activina A (por ejemplo, se une a la activina A con una Kd superior a 1 x 10-7 M o tiene una unión relativamente modesta, por ejemplo, aproximadamente 1 x 10-8 M o aproximadamente 1 x 10-9 M) y/o inhibe la actividad de la activina A.
En determinados casos, un antagonista de GDF/BMP, o una combinación de antagonistas, a usar según los procedimientos y usos descritos en esta invención, es un agente que inhibe al menos ActRII (por ejemplo, ActRIIA y/o ActRIIB) (por ejemplo, un antagonista de ActRII). Los efectos sobre la inhibición de ActRII pueden determinarse, por ejemplo, usando un ensayo basado en células incluyendo los descritos en esta invención (por ejemplo, un ensayo indicador de señalización de Smad). Por lo tanto, en algunos casos, un antagonista de GDF/BMP, o una combinación de antagonistas, de la descripción puede unirse al menos a ActRII. La actividad de unión a ligando se puede determinar, por ejemplo, usando un ensayo de afinidad de unión que incluye los descritos en esta invención. En algunos casos, un antagonista de GDF/BMP, o una combinación de antagonistas, de la descripción se une al menos a ActRII con una Kd de al menos 1 x 10-7 M (por ejemplo, al menos 1 x 10-8 M, al menos 1 x 10-9 M, al menos 1 x 10­ 10 M, al menos 1 x 10-11 M o al menos 1 x 10-12 M). Como se describe en esta invención, se pueden usar diversos antagonistas de GDF/BMP que inhiben ActRII según los procedimientos y usos descritos en esta invención incluyendo, por ejemplo, trampas de ligandos (por ejemplo, polipéptidos ActRII, trampas de GDF, polipéptidos de folistatina, polipéptidos FLRG y heteromultímeros de ALK4:ActRIIB), anticuerpos, moléculas pequeñas, secuencias de nucleótidos y combinaciones de los mismos. En determinados casos, un antagonista de g Df/Bm P, o una combinación de antagonistas, que inhibe ActRII puede inhibir adicionalmente uno o más de: activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina AB, activina C, activina AC, activina BC, activina E, activina AE y/o activina BE), GDF8, GDF3, GDF11, BMP6, BMP15, BMP10, ALK4, ALK5, ALK7 y uno o más Smads (por ejemplo, Smads 2 y 3).
En determinados casos, un antagonista de GDF/BMP, o una combinación de antagonistas, a usar según los procedimientos y usos descritos en esta invención, es un agente que inhibe al menos ALK4 (por ejemplo, un antagonista de ALK4). Los efectos sobre la inhibición de ALK4 pueden determinarse, por ejemplo, usando un ensayo basado en células incluyendo los descritos en esta invención (por ejemplo, un ensayo indicador de señalización de Smad). Por lo tanto, en algunos casos, un antagonista de GDF/BMP, o una combinación de antagonistas, de la descripción puede unirse al menos a ALK4. La actividad de unión a ligando se puede determinar, por ejemplo, usando un ensayo de afinidad de unión que incluye los descritos en esta invención. En algunos casos, un antagonista de GDF/BMP, o una combinación de antagonistas, de la descripción se une al menos a ALK4 con una Kd de al menos 1 x 10-7 M (por ejemplo, al menos 1 x 10-8 M, al menos 1 x 10-9 M, al menos 1 x 10-10 M, al menos 1 x 10-11 M o al menos 1 x 10-12 M). Como se describe en esta invención, se pueden usar diversos antagonistas de GDF/BMP que inhiben ALK4 según los procedimientos y usos descritos en esta invención incluyendo, por ejemplo, trampas de ligandos (por ejemplo, polipéptidos ActRII, trampas de GDF, polipéptidos de folistatina, polipéptidos FLRG y heteromultímeros de ALK4:ActRIIB), anticuerpos, moléculas pequeñas, secuencias de nucleótidos y combinaciones de los mismos. En determinados casos, un antagonista de Gd F/BMP, o una combinación de antagonistas, que inhibe ALK4 puede inhibir adicionalmente uno o más de: activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina AB, activina C, activina AC, activina BC, activina E, activina AE y/o activina BE), GDF8, GDF3, GDF11, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK5, ALK7 y uno o más Smads (por ejemplo, Smads 2 y 3).
En determinados casos, un antagonista de GDF/BMP, o una combinación de antagonistas, a usar según los procedimientos y usos descritos en esta invención, es un agente que inhibe al menos ALK5 (por ejemplo, un antagonista de ALK5). Los efectos sobre la inhibición de ALK5 pueden determinarse, por ejemplo, usando un ensayo basado en células incluyendo los descritos en esta invención (por ejemplo, un ensayo indicador de señalización de Smad). Por lo tanto, en algunos casos, un antagonista de g Df/BMP, o una combinación de antagonistas, de la descripción puede unirse al menos a ALK5. La actividad de unión a ligando se puede determinar, por ejemplo, usando un ensayo de afinidad de unión que incluye los descritos en esta invención. En algunos casos, un antagonista de GDF/BMP, o una combinación de antagonistas, de la descripción se une al menos a ALK5 con una Kd de al menos 1 x 10-7 M (por ejemplo, al menos 1 x 10-8 M, al menos 1 x 10-9 M, al menos 1 x 10-10 M, al menos 1 x 10-11 M o al menos 1 x 10-12 M). Como se describe en esta invención, se pueden usar diversos antagonistas de GDF/BMP que inhiben ALK5 según los procedimientos y usos descritos en esta invención incluyendo, por ejemplo, trampas de ligandos (por ejemplo, polipéptidos ActRII, trampas de GDF, polipéptidos de folistatina, polipéptidos FLRG y heteromultímeros de ALK4:ActRIIB), anticuerpos, moléculas pequeñas, secuencias de nucleótidos y combinaciones de los mismos. En determinados casos, un antagonista de Gd F/BMP, o una combinación de antagonistas, que inhibe ALK5 puede inhibir adicionalmente uno o más de: activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina AB, activina C, activina AC, activina BC, activina E, activina AE y/o activina BE), GDF8, GDF3, GDF11, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK7, ALK4 y uno o más Smads (por ejemplo, Smads 2 y 3).
En determinados casos, un antagonista de GDF/BMP, o una combinación de antagonistas, a usar según los procedimientos y usos descritos en esta invención, es un agente que inhibe al menos ALK7 (por ejemplo, un antagonista de ALK7). Los efectos sobre la inhibición de ALK7 pueden determinarse, por ejemplo, usando un ensayo basado en células incluyendo los descritos en esta invención (por ejemplo, un ensayo indicador de señalización de Smad). Por lo tanto, en algunos casos, un antagonista de g Df/b Mp , o una combinación de antagonistas, de la descripción puede unirse al menos a ALK7. La actividad de unión a ligando se puede determinar, por ejemplo, usando un ensayo de afinidad de unión que incluye los descritos en esta invención. En algunos casos, un antagonista de GDF/BMP, o una combinación de antagonistas, de la descripción se une al menos a ALK7 con una Kd de al menos 1 x 10-7 M (por ejemplo, al menos 1 x 10-8 M, al menos 1 x 10-9 M, al menos 1 x 10-10 M, al menos 1 x 10-11 M o al menos 1 x 10-12 M). Como se describe en esta invención, se pueden usar diversos antagonistas de GDF/BMP que inhiben ALK7 según los procedimientos y usos descritos en esta invención incluyendo, por ejemplo, trampas de ligandos (por ejemplo, polipéptidos ActRII, trampas de GDF, polipéptidos de folistatina, polipéptidos FLRG y heteromultímeros de ALK4:ActRIIB), anticuerpos, moléculas pequeñas, secuencias de nucleótidos y combinaciones de los mismos. En determinados casos, un antagonista de Gd F/BMP, o una combinación de antagonistas, que inhibe ALK7 puede inhibir adicionalmente uno o más de: activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina AB, activina C, activina AC, activina BC, activina E, activina AE y/o activina BE), GDF8, GDF3, GDF11, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK5, ALK4 y uno o más Smads (por ejemplo, Smads 2 y 3).
En determinados casos, un antagonista de GDF/BMP, o una combinación de antagonistas, a usar según los procedimientos y usos descritos en esta invención, es un agente que inhibe al menos una o más proteínas Smad (por ejemplo, Smads 2 y 3). Los efectos sobre la inhibición de Smad pueden determinarse, por ejemplo, usando un ensayo basado en células incluyendo los descritos en esta invención (por ejemplo, un ensayo indicador de señalización de Smad). Por lo tanto, en algunos casos, un antagonista de GDF/BMP, o una combinación de antagonistas, de la descripción puede unirse al menos a una o más proteínas Smad (por ejemplo, Smads 2 y 3). La actividad de unión a ligando se puede determinar, por ejemplo, usando un ensayo de afinidad de unión que incluye los descritos en esta invención. En algunos casos, un antagonista de GDF/BMP, o una combinación de antagonistas, de la descripción se une al menos a una o más proteínas Smad (por ejemplo, Smads 2 y 3) con una Kd de al menos 1 x 10-7 M (por ejemplo, al menos 1 x 10-8 M, al menos 1 x 10-9 M, al menos 1 x 10-10 M, al menos 1 x 10-11 M o al menos 1 x 10-12 M). Como se describe en esta invención, diversos antagonistas de GDF/BMP que inhiben una o más proteínas Smad (por ejemplo, Smads 2 y 3) se pueden usar según los procedimientos y usos descritos en esta invención que incluyen, por ejemplo, trampas de ligandos (por ejemplo, polipéptidos ActRII, trampas de GDF, polipéptidos de folistatina, polipéptidos FLRG y heteromultímeros de ALK4:ActRIIB), anticuerpos, moléculas pequeñas, secuencias de nucleótidos y combinaciones de los mismos. En determinados casos, un antagonista de GDF/BMP, o una combinación de antagonistas, que inhibe una o más proteínas Smad (por ejemplo, Smads 2 y 3) puede inhibir además una o más de: activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina AB, activina C, activina AC, activina BC, activina E, activina AE y/o activina BE), GDF8, GDF3, GDF11, BMP6 , BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK5 y ALK4.
En determinados casos, un antagonista de GDF/BMP a usar según los procedimientos y usos descritos en esta invención es un polipéptido ActRII. La expresión "polipéptido ActRII" se refiere colectivamente a polipéptidos ActRIIA y ActRIIB de origen natural, así como truncamientos y variantes de los mismos como los descritos en esta invención (por ejemplo, polipéptidos trampa de GDF). Preferentemente, los polipéptidos ActRII comprenden, consisten esencialmente o consisten en un dominio de unión a ligando de un polipéptido ActRII o una forma modificada (variante) del mismo. Por ejemplo, en algunos casos, un polipéptido ActRIIA comprende, consiste esencialmente o consiste en un dominio de unión a ligando de ActRIIA de un polipéptido ActRIIA, por ejemplo, una porción del dominio extracelular de ActRIIA. De manera similar, un polipéptido ActRIIB puede comprender, consistir esencialmente o consistir en un dominio de unión a ligando de ActRIIB de un polipéptido ActRIIB, por ejemplo, una porción del dominio extracelular de ActRIIB. Preferentemente, los polipéptidos ActRII a usar según los procedimientos descritos en esta invención son polipéptidos solubles.
En determinados casos, la descripción se refiere a composiciones que comprenden un polipéptido ActRIIA y usos del mismo. Por ejemplo, en algunos casos, un polipéptido ActRIIA de la descripción comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos 30-110 de SEQ ID NO: 9. En algunos casos, un polipéptido ActRIIA de la descripción comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a una porción de ActRIIA que comienza en un residuo correspondiente a cualquiera de los aminoácidos 21-30 (por ejemplo, que comienza en cualquiera de los aminoácidos 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30) de SEQ ID NO: 9 y que termina en una posición correspondiente a cualquiera de los aminoácidos 110-135 (por ejemplo, que termina en cualquiera de los aminoácidos 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134 o 135) de SEQ ID NO: 9. En otros casos, un polipéptido ActRIIA puede comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9. En otros casos, un polipéptido ActRIIA puede comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10. Incluso en otros casos, un polipéptido ActRIIA puede comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11. Aún en otros casos, un polipéptido ActRIIA puede comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32. Incluso aún en otros casos, un polipéptido ActRIIA puede comprender, consistir esencialmente o consistir en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36. Incluso aún en otros casos, un polipéptido ActRIIA puede comprender, consistir esencialmente o consistir en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 39.
En otros casos, la descripción se refiere a composiciones que comprenden un polipéptido ActRIIB y usos del mismo. Por ejemplo, en algunos casos, un polipéptido ActRIIB de la descripción comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos 29-109 de SEQ ID NO: 1. En algunos casos, un polipéptido ActRIIB puede comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos 29-109 de SEQ ID NO: 1, donde el polipéptido ActRIIB comprende un aminoácido ácido [aminoácido ácido de origen natural (E o D) o artificial] en la posición 79 con respecto a la SEQ ID NO: 1. En otros casos, un polipéptido ActRIIB puede comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos 25-131 de SEQ ID NO: 1. En algunos casos, un polipéptido ActRIIB puede comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos 25-131 de SEQ ID NO: 1, donde el polipéptido ActRIIB comprende un aminoácido ácido en la posición 79 con respecto a la SEQ ID NO: 1. En algunos casos, un polipéptido ActRIIB puede comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a una secuencia que comienza en un residuo correspondiente cualquiera de los aminoácidos 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 o 29 de SeQ ID NO: 1 y que termina en un residuo correspondiente cualquiera de los aminoácidos 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133 o 134 de SEQ ID NO: 1. En otros casos, un polipéptido ActRIIB puede comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a una secuencia que comienza en un residuo correspondiente cualquiera de los aminoácidos 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 o 29 de SEQ ID NO: 1 y que termina en un residuo correspondiente cualquiera de los aminoácidos 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133 o 134 de SEQ ID NO: 1, donde el polipéptido ActRIIB comprende un aminoácido ácido en la posición 79 con respecto a la SEQ ID NO: 1. En otros casos, un polipéptido ActRIIB puede comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. En algunos casos, un polipéptido ActRIIB puede comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, donde el polipéptido ActRIIB comprende un aminoácido ácido en la posición 79 con respecto a la SEQ ID NO: 1. Incluso en otros casos, un polipéptido ActRIIB puede comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. En otros casos un polipéptido ActRIIB puede comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, donde el polipéptido ActRIIB comprende un aminoácido ácido en la posición 79 con respecto a la SEQ ID NO: 1. Aún en otros casos, un polipéptido ActRIIB puede comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. En otros casos, un polipéptido ActRIIB puede comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, donde el polipéptido ActRIIB comprende un aminoácido ácido en la posición 79 con respecto a la SEQ ID NO: 1. En otros casos, un polipéptido ActRIIB puede comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. En algunos casos, un polipéptido ActRIIB puede comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, donde el polipéptido ActRIIB comprende un aminoácido ácido en la posición 79 con respecto a la SEQ ID NO: 4. En otros casos un polipéptido ActRIIB puede comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5. En algunos casos, un polipéptido ActRIIB puede comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, donde el polipéptido ActRIIB comprende un aminoácido ácido en la posición 79 con respecto a la SEQ ID NO: 5. En otros casos, un polipéptido ActRIIB puede comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. En algunos casos, un polipéptido ActRIIB puede comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 , donde el polipéptido ActRIIB comprende un aminoácido ácido en la posición 79 con respecto a la SEQ ID NO: 6. Incluso aún en otros casos, un polipéptido ActRIIB puede comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 40. Incluso aún en otros casos, un polipéptido ActRIIB puede comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 42. Incluso aún en otros casos, un polipéptido ActRIIB puede comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45. Incluso aún en otros casos, un polipéptido ActRIIB puede comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46. En algunos casos, un polipéptido ActRIIB puede comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, donde el polipéptido ActRIIB comprende un aminoácido ácido en la posición 79 con respecto a la SEQ ID NO: 1. Incluso aún en otros casos, un polipéptido ActRIIB puede comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47. En algunos casos, un polipéptido ActRIIB puede comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47, donde el polipéptido ActRIIB comprende un aminoácido ácido en la posición 79 con respecto a la SEQ ID NO: 1. Incluso aún en otros casos, un polipéptido ActRIIB puede comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 48. En algunos casos, un polipéptido ActRIIB puede comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 48, donde el polipéptido ActRIIB comprende un aminoácido ácido en la posición 79 con respecto a la SEQ ID NO: 1. Incluso aún en otros casos, un polipéptido ActRIIB puede comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 69. Incluso aún en otros casos, un polipéptido ActRIIB puede comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 74. En algunos casos, un polipéptido ActRIIB puede comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 74, donde el polipéptido ActRIIB comprende un aminoácido ácido en la posición 79 con respecto a la SEQ ID NO: 1. Incluso aún en otros casos, un polipéptido ActRIIB puede comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 77. En algunos casos, un polipéptido ActRIIB puede comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 77, donde el polipéptido ActRIIB comprende un aminoácido ácido en la posición 79 con respecto a la SEQ ID NO: 1. Incluso aún en otros casos, un polipéptido ActRIIB puede comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 78. En algunos casos, un polipéptido ActRIIB puede comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 78, donde el polipéptido ActRIIB comprende un aminoácido ácido en la posición 79 con respecto a la SEQ ID NO: 1. Incluso aún en otros casos, un polipéptido ActRIIB puede comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 79. En algunos casos, un polipéptido ActRIIB puede comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 79, donde el polipéptido ActRIIB comprende un aminoácido ácido en la posición 79 con respecto a la SEQ ID NO: 1. En determinados casos, los polipéptidos ActRIIB a usar según los procedimientos y usos descritos en esta invención no comprenden un aminoácido ácido en la posición correspondiente a L79 de SEQ ID NO: 1.
Como se describe en esta invención, los polipéptidos ActRII, polipéptidos ALK4 y variantes de los mismos (trampas de GDF) pueden ser homomultímeros, por ejemplo, homodímeros, homotrímeros, homotetrámeros, homopentámeros y complejos homomultiméricos de orden superior. En determinados casos preferidos, los polipéptidos ActRII y variantes de los mismos son homodímeros. En determinados casos, los dímeros del polipéptido ActRII descritos en esta invención comprenden un primer polipéptido ActRII asociado covalentemente o no covalentemente con un segundo polipéptido ActRII donde el primer polipéptido comprende un dominio ActRII y una secuencia de aminoácidos de un primer miembro (o segundo miembro) de un par de interacción (por ejemplo, un dominio constante de una inmunoglobulina) y el segundo polipéptido comprende un polipéptido ActRII y una secuencia de aminoácidos de un segundo miembro (o primer miembro) del par de interacción.
En determinados casos, un antagonista de GDF/BMP a usar según los procedimientos y usos descritos en esta invención es un heteromultímero de ALK4:ActRIIB. Como se describe en esta invención, se ha descubierto que un complejo proteico de heterodímero de ALK4:ActRIIB tiene un perfil/selectividad de unión a ligando diferente en comparación con los correspondientes homodímeros de ActRIIB y ALK4. En particular, el heterodímero de ALK4:ActRIIB muestra una unión mejorada a la activina B en comparación con cualquier homodímero, conserva una unión fuerte a la activina A, GDF8 y GDF11 como se observa con el homodímero de ActRIIB, y muestra una unión sustancialmente reducida a BMP9, BMP10 y GDF3. En particular, BMP9 muestra una afinidad baja o nula por el heterodímero de ALK4:ActRIIB, mientras que este ligando se une fuertemente al homodímero de ActRIIB.Al igual que el homodímero de ActRIIB, el heterodímero de ALK4:ActRIIB conserva la unión de nivel intermedio a BMP6. Véase la figura 19. Por lo tanto, estos resultados demuestran que los heterodímeros de ALK4:ActRIIB son antagonistas (inhibidores) más selectivos de la activina A, activina B, GDF8 y GDF11 en comparación con los homodímeros de ActRIIB. Por consiguiente, un heterodímero de ALK4:ActRIIB será más útil que un homodímero de ActRIIB en determinadas aplicaciones donde dicho antagonismo selectivo sea ventajoso. Los ejemplos incluyen aplicaciones terapéuticas donde es deseable conservar el antagonismo de uno o más de la activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina AB, activina AC), GDF8 y GDF11 pero minimizar el antagonismo de uno o más de BMP9, BMP10 y GDF3. Además, se ha demostrado que un heterodímero de ALK4:ActRIIB trata la HAP en el paciente. Si bien no se desea estar ligado a un mecanismo de acción particular, se espera que los heteromultímeros de ALK4:ActRIIB, así como variantes de los mismos, que se unan al menos a uno o más de la activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina AB, y activina AC), GDF8 y/o GDF11, sean agentes útiles para promover efectos beneficiosos en pacientes con HAP.
Por lo tanto, la presente descripción proporciona complejos heteromultiméricos (heteromultímeros) que comprenden al menos un polipéptido ALK4 y al menos un polipéptido ActRIIB (heteromultímeros de ALK4:ActRIIB), así como usos de los mismos. Preferentemente, los polipéptidos ALK4 comprenden un dominio de unión a ligando de un receptor ALK4, por ejemplo, una porción del dominio extracelular de ALK4. De manera similar, los polipéptidos ActRIIB generalmente comprenden un dominio de unión a ligando de un receptor ActRIIB, por ejemplo, una porción del dominio extracelular de ActRIIB. Preferentemente, dichos polipéptidos a LK4 y ActRIIB, así como los heteromultímeros resultantes de los mismos, son solubles.
En determinados casos, un heteromultímero de ALK4:ActRIIB comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a los aminoácidos 34-101 de SEQ ID NO: 100. En otros casos, los heteromultímeros de ALK4:ActRIIB comprenden una secuencia de aminoácidos de ALK4 que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 101. En otros casos, los heteromultímeros de ALK4:ActRIIB comprenden una secuencia de aminoácidos de ALK4 que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 105. En otros casos, los heteromultímeros de ALK4:ActRIIB comprenden una secuencia de aminoácidos de ALK4 que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 122. En otros casos, los heteromultímeros de ALK4:ActRIIB comprenden una secuencia de aminoácidos de ALK4 que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 124. En otros casos, los heteromultímeros de ALK4:ActRIIB comprenden una secuencia de aminoácidos de ALK4 que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 116. Aún en otros casos, los heteromultímeros de ALK4:ActRIIB comprenden una secuencia de aminoácidos de ALK4 que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 117. En otros casos, los heteromultímeros de ALK4:ActRIIB comprenden una secuencia de aminoácidos de ALK4 que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 111. Aún en otros casos, los heteromultímeros de ALK4:ActRIIB comprenden una secuencia de aminoácidos de ALK4 que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 113.
En determinados casos, un heteromultímero de ALK4:ActRIIB comprende una secuencia de aminoácidos de ActRIIB que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a los aminoácidos 29-109 de SEQ ID NO: 1. En otros casos, los heteromultímeros de ALK4:ActRIIB comprenden una secuencia de aminoácidos de ActRIIB que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 2. En otros casos, los heteromultímeros de ALK4:ActRIIB comprenden una secuencia de aminoácidos de ActRIIB que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 3. En otros casos, los heteromultímeros de ALK4:ActRIIB comprenden una secuencia de aminoácidos de ActRIIB que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 5. En otros casos, los heteromultímeros de ALK4:ActRIIB comprenden una secuencia de aminoácidos de ActRIIB que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 6. En otros casos, los heteromultímeros de ALK4:ActRIIB comprenden una secuencia de aminoácidos de ActRIIB que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 118. Incluso aún en otros casos, los heteromultímeros de ALK4:ActRIIB comprenden una secuencia de aminoácidos de ActRIIB que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 120 En otros casos, los heteromultímeros de ALK4:ActRIIB comprenden una secuencia de aminoácidos de ActRIIB que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 114. En otros casos, los heteromultímeros de ALK4:ActRIIB pueden comprender una secuencia de aminoácidos de ActRIIB que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 115. En otros casos, los heteromultímeros de ALK4:ActRIIB comprenden una secuencia de aminoácidos de ActRIIB que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 108. En otros casos, los heteromultímeros de ALK4:ActRIIB pueden comprender una secuencia de aminoácidos de ActRIIB que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 110. En determinados casos preferidos, los heteromultímeros de ALK4:ActRIIB comprenden no comprenden un polipéptido ActRIIB que comprende un aminoácido ácido (por ejemplo, E o D) en la posición correspondiente a L79 de SEQ ID NO: 1.
Como se describe en esta invención, las estructuras de heteromultímero de ALK4:ActRIIB incluyen, por ejemplo, heterodímeros, heterotrímeros, heterotetrámeros, heteropentámeros y complejos heteromultiméricos de orden superior. Véanse, por ejemplo, las figuras 21-23. En determinados casos preferidos, los heteromultímeros de ALK4:ActRIIB son heterodímeros. En determinados casos, los polipéptidos ALK4 y/o ActRIIB pueden ser proteínas de fusión.
En determinados casos, los polipéptidos ActRII, los polipéptidos ALK4, incluidas las variantes de los mismos (por ejemplo, trampas de GDF), pueden ser proteínas de fusión. Por ejemplo, en algunos casos, un polipéptido ActRII (o ALK4) puede ser una proteína de fusión que comprende un dominio polipeptídico ActRII (o ALK4) y uno o más dominios polipeptídicos heterólogos (no ActRII). En algunos casos, un polipéptido ActRII (o ALK4) puede ser una proteína de fusión que tiene, como un dominio, una secuencia de aminoácidos derivada de un polipéptido ActRII (o ALK4) (por ejemplo, un dominio de unión a ligando de un receptor ActRII (o ALK4) o una variante del mismo) y uno o más dominios heterólogos que proporcionan una propiedad deseable, tal como farmacocinética mejorada, purificación más fácil, direccionamiento a tejidos particulares, etc. Por ejemplo, un dominio de una proteína de fusión puede mejorar uno o más de la estabilidad in vivo, la semivida in vivo, la captación/administración, la localización o distribución tisular, la formación de complejos proteicos, la multimerización de la proteína de fusión y/o la purificación. Opcionalmente, un dominio polipeptídico ActRII (o ALK4) de una proteína de fusión se conecta directamente (se fusiona) a uno o más dominios polipeptídicos heterólogos o una secuencia intermedia, tal como un enlazador, puede posicionarse entre la secuencia de aminoácidos del polipéptido ActRII (o ALK4) y la secuencia de aminoácidos de uno o más dominios heterólogos. En determinados casos, una proteína de fusión ActRII (o ALK4) comprende un enlazador relativamente no estructurado posicionado entre el dominio heterólogo y el dominio ActRII (o ALK4). Este enlazador no estructurado puede corresponder a la región no estructurada de aproximadamente 15 aminoácidos en el extremo C del dominio extracelular de ActRII (o ALK4), o puede ser una secuencia artificial de entre 3 y 15, 20, 30, 50 o más aminoácidos que están relativamente libres de estructura secundaria. Un enlazador puede ser rico en residuos de glicina y/o prolina y puede contener, por ejemplo, secuencias repetidas de treonina/serina y glicinas. Los ejemplos de enlazadores incluyen, pero sin limitación, las secuencias Tg Gg (SEQ ID NO: 23), SGg G (SEQ ID NO: 24), TGGGG (SEQ ID NO: 21), SGGGG (SEQ ID NO: 22), GGGGS (SEQ ID NO: 25), GGGG (SEQ ID NO: 20), y GGG (SEQ ID NO: 19). En algunos casos, las proteínas de fusión ActRII (o ALK4) pueden comprender un dominio constante de una inmunoglobulina, incluyendo, por ejemplo, la porción Fc de una inmunoglobulina. Por ejemplo, una secuencia de aminoácidos que se deriva de un dominio Fc de una inmunoglobulina IgG (IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4), IgA (IgA1 o IgA2), IgE o IgM. Por ejemplo, una porción Fc de un dominio de inmunoglobulina puede comprender, consistir esencialmente o consistir en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a cualquiera de las SEQ ID NO: 14-18. Dichos dominios de inmunoglobulina pueden comprender una o más modificaciones de aminoácidos (por ejemplo, deleciones, adiciones y/o sustituciones) que confieren una actividad Fc alterada, por ejemplo, disminución de una o más funciones efectoras de Fc. En algunos casos, una proteína de fusión ActRII (o ALK4) comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en la fórmula A-B-C. Por ejemplo, la porción B es un polipéptido ActRII (o ALK4) truncado en el extremo N y C, por ejemplo, como se describe en esta invención. Las porciones A y C pueden ser independientemente cero, uno o más de un aminoácido, y ambas porciones A y C son heterólogas a B. Las porciones A y/o C pueden unirse a la porción B a través de una secuencia enlazadora. En determinados casos, una proteína de fusión ActRII (o ALK4) comprende una secuencia líder. La secuencia líder puede ser una secuencia líder nativa de ActRII (o ALK4) o una secuencia líder heteróloga. En determinados casos, la secuencia líder es una secuencia líder del activador del plasminógeno tisular (TPA, por sus siglas en inglés) (por ejemplo, SEQ ID NO: 34).
Un polipéptido ActRII o un polipéptido ALK4, incluidas variantes de los mismos, pueden comprender una subsecuencia de purificación, tal como una etiqueta de epítopo, una etiqueta FLAG, una secuencia de polihistidina y una fusión de GST. Opcionalmente, un polipéptido ActRII o un polipéptido ALK4 comprenden uno o más residuos de aminoácidos modificados seleccionados de entre: un aminoácido glucosilado, un aminoácido PEGilado, un aminoácido farnesilado, un aminoácido acetilado, un aminoácido biotinilado y/o un aminoácido conjugado con un resto lipídico. Los polipéptidos ActRII y los polipéptidos ALK4 pueden comprender al menos un azúcar unido a N y pueden incluir dos, tres o más azúcares unidos a N. Dichos polipéptidos también pueden comprender azúcares unidos a O. En general, es preferible que los polipéptidos ActRII y a LK4 se expresen en una línea celular de mamífero que medie adecuadamente la glucosilación natural del polipéptido para disminuir la probabilidad de una respuesta inmunitaria desfavorable en un paciente. Los polipéptidos ActRII y ALK4 se pueden producir en una diversidad de líneas celulares que glucosilan la proteína de una manera adecuada para su uso en el paciente, incluyendo células de insecto o levadura genomanipuladas, y células de mamífero, tales como células COS, células CHO, células HEK y células NSO. En algunos casos, un polipéptido ActRII o ALK4 está glucosilado y tiene un patrón de glucosilación que se puede obtener a partir de una línea celular de ovario de hámster chino. En algunos casos, los polipéptidos ActRII o ALK4 de la descripción exhiben una semivida en suero de al menos 4, 6 , 12, 24, 36, 48 o 72 horas en un mamífero (por ejemplo, un ratón o un ser humano). Opcionalmente, los polipéptidos ActRII o ALK4 pueden exhibir una semivida en suero de al menos 6 , 8, 10, 12, 14, 20, 25 o 30 días en un mamífero (por ejemplo, un ratón o un ser humano).
En determinados casos, la descripción proporciona preparaciones farmacéuticas que comprenden uno o más antagonistas de GDF/BMP de la presente descripción y un portador farmacéuticamente aceptable. Una preparación farmacéutica también puede comprender uno o más agentes activos adicionales tales como un compuesto que se usa para tratar la hipertensión pulmonar, particularmente el tratamiento o la prevención de una o más complicaciones de la hipertensión pulmonar (por ejemplo, proliferación de músculo liso y/o células endoteliales en la arteria pulmonar, angiogénesis en la arteria pulmonar, disnea, dolor torácico, remodelación vascular pulmonar, hipertrofia ventricular derecha y fibrosis pulmonar) incluyendo, por ejemplo, vasodilatadores tales como prostaciclina, epoprostenol y sildenafilo; antagonistas del receptor de endotelina tales como bosentán; bloqueadores de los canales de calcio tales como amlodipina, diltiazem y nifedipina; anticoagulantes tales como warfarina; diuréticos; polipéptidos BMP9; polipéptidos BMP10; bardoxolona metilo; y ácido oleanólico. En general, la preparación farmacéutica será preferentemente apirógena (lo que significa libre de pirógenos en la medida requerida por las regulaciones que rigen la calidad de los productos para uso terapéutico).
En determinados casos, cuando se administra un antagonista de GDF/BMP, o una combinación de antagonistas, de la descripción para trastornos o afecciones descritas en esta invención, puede ser deseable monitorizar los efectos sobre los glóbulos rojos durante la administración del antagonista de GDF/BMP, o determinar o ajustar la dosificación del antagonista de GDF/BMP, con el fin de reducir los efectos no deseados sobre los glóbulos rojos. Por ejemplo, el aumento en los niveles de glóbulos rojos, los niveles de hemoglobina o los niveles de hematocrito puede causar aumentos no deseados de la presión arterial.
En determinados casos, un antagonista de GDF/BMP a usar según los procedimientos y usos de la descripción es un anticuerpo o una combinación de anticuerpos. En algunos casos, el anticuerpo se une al menos a ActRII (ActRIIA y/o ActRIIB). En determinados casos, un anticuerpo que se une a ActRII inhibe la señalización de ActRII, opcionalmente según lo medido en un ensayo basado en células tal como los descritos en esta invención. En determinados casos, un anticuerpo que se une a ActRII inhibe la unión de uno o más ligandos de GDF/BMP, receptores de tipo I o correceptores a ActRII. En determinados casos, un anticuerpo que se une a ActRII inhibe la unión de uno o más ligandos de GDF/BMP a ActRII seleccionados de entre el grupo que consiste en: activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina AB, activina AC, activina BC, activina E, activina AE y activina BE), GDF8, GDF11, BMP6 , BMP15, BMP10 y GDF3. En algunos casos, el anticuerpo se une al menos a ALK4. En determinados casos, un anticuerpo que se une a ALK4 inhibe la señalización de ALK4, opcionalmente según lo medido en un ensayo basado en células tal como los descritos en esta invención. En determinados casos, un anticuerpo que se une a ALK4 inhibe la unión de uno o más ligandos de GDF/BMP, receptores de tipo II o correceptores a a LK4. En determinados casos, un anticuerpo que se une a ALK4 inhibe la unión de uno o más ligandos de GDF/BMP a ALK4 seleccionados de entre el grupo que consiste en: activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina AB, activina AC, activina BC, activina E, activina AE y activina BE), GDF8, GDF11, BMP6 , BMP15, BMP10 y GDF3. En algunos casos, el anticuerpo se une al menos a ALK5. En determinados casos, un anticuerpo que se une a ALK5 inhibe la señalización de ALK5, opcionalmente según lo medido en un ensayo basado en células tal como los descritos en esta invención. En determinados casos, un anticuerpo que se une a ALK5 inhibe la unión de uno o más ligandos de GDF/BMP, receptores de tipo II o correceptores a ALK5. En determinados casos, un anticuerpo que se une a ALK5 inhibe la unión de uno o más ligandos de GDF/BMP a ALK5 seleccionados de entre el grupo que consiste en: activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina AB, activina AC, activina BC, activina E, activina AE y activina BE), GDF8, GDF11, BMP6 , BMP15, BMP10 y GDF3. En algunos casos, el anticuerpo se une al menos a a Lk7. En determinados casos, un anticuerpo que se une a ALK7 inhibe la señalización de ALK7, opcionalmente según lo medido en un ensayo basado en células tal como los descritos en esta invención. En determinados casos, un anticuerpo que se une a ALK7 inhibe la unión de uno o más ligandos de GDF/BMP, receptores de tipo II o correceptores a a LK7. En determinados casos, un anticuerpo que se une a ALK7 inhibe la unión de uno o más ligandos de GDF/BMP a ALK7 seleccionados de entre el grupo que consiste en: activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina AB, activina AC, activina BC, activina E, activina AE y activina BE), GDF8, GDF11, BMP6 , BMP15, BMP10 y GDF3. En algunos casos, el anticuerpo se une al menos a GDF11. En determinados casos, un anticuerpo que se une a GDF11 inhibe la señalización de ActRII, opcionalmente según lo medido en un ensayo basado en células tal como los descritos en esta invención. En determinados casos, un anticuerpo que se une a GDF11 inhibe la unión a GDF11-ActRII y/o la unión a GDF11-ALK (por ejemplo, la unión a GDF11-ALK4, GDF11-ALK5 y/o GDF11-ALK7). En algunos casos, el anticuerpo se une al menos a GDF8. En determinados casos, un anticuerpo que se une a GDF8 inhibe la señalización de ActRII, opcionalmente según lo medido en un ensayo basado en células tal como los descritos en esta invención. En determinados casos, un anticuerpo que se une a GDF8 inhibe la unión a GDF8-ActRII y/o la unión a GDF8-ALK (por ejemplo, la unión a GDF8-ALK4, GDF8-ALK5 y/o GDF8-ALK7). En algunos casos, el anticuerpo se une al menos a BMP6. En determinados casos, un anticuerpo que se une a BMP6 inhibe la señalización de ActRII, opcionalmente según lo medido en un ensayo basado en células tal como los descritos en esta invención. En determinados casos, un anticuerpo que se une a BMP6 inhibe la unión a BMP6-ActRII y/o la unión a BMP6-ALK (por ejemplo, la unión a BMP6-ALK4, BMP6-ALK5 y/o BMP6-ALK7). En algunos casos, el anticuerpo se une al menos a BMP15. En determinados casos, un anticuerpo que se une a BMP15 inhibe la señalización de ActRII, opcionalmente según lo medido en un ensayo basado en células tal como los descritos en esta invención. En determinados casos, un anticuerpo que se une a BMP15 inhibe la unión de BMP15-ActRII y/o la unión de BMP15-ALK (por ejemplo, la unión de BMP15-ALK4, BMP15-ALK5 y/o BMP15-ALK7). En algunos casos, el anticuerpo se une al menos a GDF3. En determinados casos, un anticuerpo que se une a GDF3 inhibe la señalización de ActRII, opcionalmente según lo medido en un ensayo basado en células tal como los descritos en esta invención. En determinados casos, un anticuerpo que se une a GDF3 inhibe la unión a GDF3-ActRII y/o la unión a GDF3-ALK (por ejemplo, la unión a GDF3-ALK4, GDF3-ALK5 y/o GDF3-ALK7). En algunos casos, el anticuerpo se une al menos a BMP10. En determinados casos, un anticuerpo que se une a BMP10 inhibe la señalización de ActRII, opcionalmente según lo medido en un ensayo basado en células tal como los descritos en esta invención. En determinados casos, un anticuerpo que se une a BMP10 inhibe la unión de BMP10-ActRII y/o la unión de BMP10-ALK (por ejemplo, la unión de BMP10-Alk4, BMP10-ALK5 y/o BMP10-ALK7). En algunos casos, el anticuerpo se une a la activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina AB, activina AC, activina BC, activina E, activina AE y activina BE). En determinados casos, un anticuerpo que se une a la activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina AB, activina AC, activina BC, activina E, activina AE y activina BE) inhibe la señalización de ActRII, opcionalmente según lo medido en un ensayo basado en células tales como los descritos en esta invención. En determinados casos, un anticuerpo que se une a la activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina AB, activina AC, activina BC, activina E, activina AE y activina b E) inhibe la unión a activina-ActRII y/o la unión a activina-ALK (por ejemplo, la unión a activina-ALK4, activina-ALK5 y/o activina-ALK7). En algunos casos, el anticuerpo se une a la activina B. En determinados casos, un anticuerpo que se une a la activina B inhibe la señalización de ActRII, opcionalmente según lo medido en un ensayo basado en células tales como los descritos en esta invención. En determinados casos, un anticuerpo que se une a la activina B inhibe la unión a activina B-ActRII y/o la unión a activina B-ALK (por ejemplo, la unión a activina B-ALK4, activina B-ALK5 y/o activina B-ALK7). En algunos casos, el anticuerpo es un anticuerpo multiespecífico, o una combinación de anticuerpos multiespecíficos que se une a uno o más de ActRIIB, ActRIIA, ALK4, ALK5, ALK7, GDF11, GDF8, activina, BMP6 , GDF3, BMP10 y b Mp 15. En determinados casos, el anticuerpo multiespecífico, o una combinación de anticuerpos multiespecíficos, inhibe la señalización en un ensayo basado en células de uno o más de: ActRIIB, GDF11, GDF8, activina, BMP6, GDF3, BMP10 y BMP15. En algunos casos, el anticuerpo es un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo humano. En algunos casos, el anticuerpo es un anticuerpo monocatenario, un fragmento F(ab')2, un diacuerpo monocatenario, un fragmento Fv monocatenario en tándem, un diacuerpo monocatenario en tándem, una proteína de fusión que comprende un diacuerpo monocatenario y al menos una porción de una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina.
En determinados casos, el antagonista de GDF/BMP es un inhibidor de molécula pequeña o una combinación de inhibidores de molécula pequeña. En algunos casos, el inhibidor de molécula pequeña es un inhibidor de al menos ActRII (por ejemplo, ActRIIA y/o ActRIIB). En algunos casos, el inhibidor de molécula pequeña es un inhibidor de al menos ALK4. En algunos casos, el inhibidor de molécula pequeña es un inhibidor de al menos ALK5. En algunos casos, el inhibidor de molécula pequeña es un inhibidor de al menos ALK7. En algunos casos, el inhibidor de molécula pequeña es un inhibidor de al menos GDF11. En algunos casos, el inhibidor de molécula pequeña es un inhibidor de al menos GDF8. En algunos casos, el inhibidor de molécula pequeña es un inhibidor de al menos BMP6. En algunos casos, el inhibidor de molécula pequeña es un inhibidor de al menos BMP15. En algunos casos, el inhibidor de molécula pequeña es un inhibidor de al menos BMP10. En algunos casos, el inhibidor de molécula pequeña es un inhibidor de al menos GDF3. En algunos casos, el inhibidor de molécula pequeña es un inhibidor de al menos una activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina AB, activina AC, activina BC, activina E, activina AE y activina BE). En algunos casos, el inhibidor de molécula pequeña es un inhibidor de al menos la activina B. En algunos casos, el inhibidor de molécula pequeña es un inhibidor de al menos una o más proteínas Smad (por ejemplo, Smads 2 y 3).
En determinados casos, el antagonista de GDF/BMP es un inhibidor de ácido nucleico o una combinación de inhibidores de ácido nucleico. En algunos casos, el inhibidor de ácido nucleico es un inhibidor de al menos ActRII (por ejemplo, ActRIIA y/o ActRIIB). En algunos casos, el inhibidor de ácido nucleico es un inhibidor de al menos ALK4. En algunos instances, the nucleic acid inhibitor is an inhibitor of at least ALK5. In some instances, the nucleic acid inhibitor is an inhibitor of at least ALK7. In some instances, the nucleic acid inhibitor is an inhibitor of at least GDF11. In some instances, the nucleic acid inhibitor is an inhibitor of at least GDF8. In some instances, the nucleic acid inhibitor is an inhibitor of at least BMP6. In some casos, el inhibidor de ácido nucleico es un inhibidor de al menos BMP15. En algunos casos, el inhibidor de ácido nucleico es un inhibidor de al menos BMP10. En algunos casos, el inhibidor de ácido nucleico es un inhibidor de al menos GDF3. En algunos casos, el inhibidor de ácido nucleico es un inhibidor de al menos activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina AB, activina AC, activina BC, activina E, activina AE y activina BE). En algunos casos, el inhibidor de ácido nucleico es un inhibidor de al menos la activina B. En algunos casos, el inhibidor de ácido nucleico es un inhibidor de al menos una o más Smads (por ejemplo, Smads 2 y 3).
En determinados casos, el antagonista de GDF/BMP es un polipéptido de folistatina. En algunos casos, el polipéptido de folistatina comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 % 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26. En algunos casos, el polipéptido de folistatina comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 % 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27. En algunos casos, el polipéptido de folistatina comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 % 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28. En algunos casos, el polipéptido de folistatina comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 % 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29. En algunos casos, el polipéptido de folistatina comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 % 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30.
En determinados casos, el antagonista de GDF/BMP es un polipéptido FLRG. En algunos casos, el polipéptido FLRG comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 % 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La figura 1 muestra un alineamiento de dominios extracelulares de ActRIIB humana (SEQ ID NO: 2) y ActRIIA humana (SEQ ID NO: 10) con los residuos que se deducen en esta invención, basándose en el análisis compuesto de múltiples estructuras cristalinas de ActRIIB y ActRIIA, para entrar en contacto directamente con el ligando indicado con recuadros.
La figura 2 muestra un alineamiento de múltiples secuencias de diversas proteínas ActRIIB de vertebrados (SEQ ID NO: 53-58) y ActRIIA humana (SEQ ID NO: 59), así como una secuencia consenso de ActRII derivada del alineamiento (SEQ ID NO: 60).
La figura 3 muestra un alineamiento de múltiples secuencias de diversas proteínas ActRIIA de vertebrados y ActRIIA humana (SEQ ID NO: 61-68).
La figura 4 muestra un alineamiento de múltiples secuencias de dominios Fc de isotipos de IgG humana usando Clustal 2.1. Las regiones de bisagra se indican mediante un subrayado discontinuo. El doble subrayado indica ejemplos de posiciones genomanipuladas en IgG1 Fc para promover el emparejamiento de cadenas asimétricas y las posiciones correspondientes con respecto a otros isotipos IgG2, IgG3 e IgG4.
La figura 5 muestra la purificación de ActRIIA-hFc expresada en células CHO. La proteína se purifica como un solo pico bien definido como se visualiza mediante el dimensionamiento de la columna (panel superior) y SDS-PAGE teñido con Coomassie (panel inferior) (carril izquierdo: estándares de peso molecular; carril derecho: ActRIIA-hFc). La figura 6 muestra la unión de ActRIIA-hFc a activina (panel superior) y GDF-11 (panel inferior), según lo medido mediante el ensayo Biacore™.
La figura 7 muestra la secuencia de aminoácidos completa sin procesar para ActRIIB(25-131)-hFc (SEQ ID NO: 69). Cada uno del líder de TPA (residuos 1-22) y el dominio extracelular de ActRIIB doblemente truncado (residuos 24- 131, usando la numeración basada en la secuencia nativa en la SEQ ID NO: 1) está subrayado. Se destaca el glutamato revelado por secuenciación como el aminoácido N-terminal de la proteína de fusión madura, que está en la posición 25 con respecto a la SEQ ID NO: 1.
Las figuras 8A y 8B muestran una secuencia de nucleótidos que codifica ActRIIB(25-131)-hFc (la hebra codificante se muestra en la parte superior, SEQ ID NO: 70, y el complemento se muestra en la parte inferior 3'-5', SEQ ID NO: 71). Las secuencias que codifican el líder de TPA (nucleótidos 1-66) y el dominio extracelular de ActRIIB (nucleótidos 73-396) están subrayadas. También se muestra la secuencia de aminoácidos correspondiente para ActRIIB(25-131).
Las figuras 9A y 9B muestran una secuencia de nucleótidos alternativa que codifica ActRIIB(25-131)-hFc (la hebra codificante se muestra en la parte superior, SEQ ID NO: 72, y el complemento se muestra en la parte inferior 3'-5', SEQ ID NO: 73). Esta secuencia confiere un mayor nivel de expresión de proteínas en los transformantes iniciales, lo que hace que el desarrollo de la línea celular sea un proceso más rápido. Las secuencias que codifican el líder de TPA (nucleótidos 1-66) y el dominio extracelular de ActRIIB (nucleótidos 73-396) están subrayadas y las sustituciones en la secuencia de nucleótidos de tipo silvestre del ECD (véase la figura 8) están resaltadas. También se muestra la secuencia de aminoácidos correspondiente para ActRIIB(25-131).
La figura 10 muestra la secuencia de aminoácidos completa para la trampa de GDF ActRIIB(L79D 20-134)-hFc (SEQ ID NO: 74), incluida la secuencia líder de TPA (doble subrayado). el dominio extracelular de ActRIIB (residuos 20-134 en la SEQ ID NO: 1; subrayado sencillo) y el dominio hFc. El aspartato sustituido en la posición 79 en la secuencia nativa tiene doble subrayado y está resaltado, al igual que la glicina revelada por secuenciación como el residuo N-terminal en la proteína de fusión madura.
Las figuras 11A y 11B muestran una secuencia de nucleótidos que codifica ActRIIB(L79D 20-134)-hFc. La SEQ ID NO: 75 corresponde a la hebra sentido y la SEQ ID NO: 76 corresponde a la hebra antisentido. El líder de TPA (nucleótidos 1-66) tiene doble subrayado y el dominio extracelular de ActRIIB (nucleótidos 76-420) tiene subrayado sencillo.
La figura 12 muestra la secuencia de aminoácidos completa para la trampa de GDF truncada ActRIIB(L79D 25-131)-hFc (SEQ ID NO: 77), incluyendo el líder de TpA (doble subrayado), el dominio extracelular de ActRIIB truncado (residuos 25-131 en la SEQ ID NO:1; subrayado sencillo) y el dominio hFc. El aspartato sustituido en la posición 79 en la secuencia nativa tiene doble subrayado y está resaltado, al igual que el glutamato revelado por secuenciación como el residuo N-terminal en la proteína de fusión madura.
La figura 13 muestra la secuencia de aminoácidos para la trampa de GDF truncada ActRIIB(L79D 25-131)-hFc sin un líder (SEQ ID NO: 78). El dominio extracelular de ActRIIB truncado (residuos 25-131 en la SEQ ID NO: 1) está subrayado. El aspartato sustituido en la posición 79 en la secuencia nativa tiene doble subrayado y está resaltado, al igual que el glutamato revelado por secuenciación como el residuo N-terminal en la proteína de fusión madura. La figura 14 muestra la secuencia de aminoácidos para la trampa de GDF truncada ActRIIB(L79D 25-131) sin el líder, el dominio hFc y el enlazador (SEQ ID NO: 79). El aspartato sustituido en la posición 79 en la secuencia nativa está subrayado y resaltado, al igual que el glutamato revelado por secuenciación como el residuo N-terminal en la proteína de fusión madura.
Las figuras 15A y 15B muestran una secuencia de nucleótidos que codifica ActRIIB(L79D 25-131)-hFc. La SEQ ID NO: 80 corresponde a la hebra sentido y la SEQ ID NO: 81 corresponde a la hebra antisentido. El líder de TPA (nucleótidos 1-66) tiene doble subrayado y el dominio extracelular de ActRIIB truncado (nucleótidos 76-396) tiene subrayado sencillo. También se muestra la secuencia de aminoácidos para el dominio extracelular de ActRIIB (residuos 25-131 en la SEQ ID NO:1).
Las figuras 16A y 16B muestran una secuencia de nucleótidos alternativa que codifica ActRIIB(L79D 25-131)-hFc. La SEQ ID NO: 82 corresponde a la hebra sentido y la SEQ ID NO: 83 corresponde a la hebra antisentido. El líder de TPA (nucleótidos 1-66) tiene doble subrayado, el dominio extracelular de ActRIIB truncado (nucleótidos 76-396) está subrayado, y las sustituciones en la secuencia de nucleótidos de tipo silvestre del dominio extracelular tienen doble subrayado y están resaltadas (comparar con la SEQ ID NO: 81, figura 15). También se muestra la secuencia de aminoácidos para el dominio extracelular de ActRIIB (residuos 25-131 en la SEQ ID NO:1).
La figura 17 muestra los nucleótidos 76-396 (SEQ ID NO: 84) de la secuencia de nucleótidos alternativa mostrada en la figura 16 (SEQ ID NO: 82). Las mismas sustituciones de nucleótidos indicadas en la figura 16 también están subrayadas y resaltadas aquí. La SEQ ID NO: 84 codifica solo el dominio extracelular de ActRIIB truncado (correspondiente a los residuos 25-131 en la SEQ ID NO: 1) con una sustitución L79D, por ejemplo, ActRIIB(L79D 25- 131).
La figura 18 muestra un alineamiento de múltiples secuencias de diversas proteínas ALK4 de vertebrados y ALK4 humana (SEQ ID NO: 126-132).
La figura 19 muestra datos de unión a ligando comparativos para un complejo proteico heterodimérico de ALK4Fc:ActRIIB-Fc en comparación con el homodímero de ActRIIB-Fc y el homodímero de ALK4-Fc. Para cada complejo proteico, los ligandos se clasifican por kdisociación, una constante cinética que se correlaciona bien con la inhibición de la señalización del ligando, y se enumeran en orden descendente de afinidad de unión (los ligandos unidos más estrechamente se enumeran en la parte superior). A la izquierda, las líneas de color amarillo, rojo, verde y azul indican la magnitud de la constante de disociación. Las líneas de color negro continuas indican ligandos cuya unión al heterodímero está mejorada o inalterada en comparación con el homodímero, mientras que las líneas de color rojo discontinuas indican una unión sustancialmente reducida en comparación con el homodímero. Como se muestra, el heterodímero de ALK4-Fc:ActRIIB-Fc muestra una unión mejorada a la activina B en comparación con cualquier homodímero, conserva una unión fuerte a la activina A, GDF8 y GDF11 como se observa con el homodímero de ActRIIB-Fc, y muestra una unión sustancialmente reducida a BMP9, BMP10 y GDF3. Al igual que el homodímero de ActRIIB-Fc, el heterodímero conserva la unión de nivel intermedio a BMP6. La figura 20 muestra datos comparativos de CI50 del heterodímero de ALK4-Fc:ActRIIB-Fc/homodímero de ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc según se determina mediante un ensayo del gen indicador A-204 como se describe en esta invención. El heterodímero de ALK4-Fc:ActRIIB-Fc inhibe las vías de señalización de activina A, activina B, GDF8 y GDF11 de manera similar al homodímero de ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc. Sin embargo, la inhibición del heterodímero de ALK4-Fc:ActRIIB-Fc de las vías de señalización de BMP9 y BMP10 se reduce significativamente en comparación con el homodímero de ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc. Estos datos demuestran que los heterodímeros de ALK4:ActRIIB son antagonistas más selectivos de activina A, activina B, GDF8 y GDF11 en comparación con el homodímero de ActRIIB:ActRIIB correspondiente.
Las figuras 21A y 21B muestran dos ejemplos esquemáticos de complejos proteicos heteroméricos que comprenden polipéptidos del receptor de tipo I y del receptor de tipo II. La figura 21A representa un complejo proteico heterodimérico que comprende un polipéptido de fusión de receptor de tipo I y un polipéptido de fusión de receptor de tipo II, que se pueden ensamblar covalente o no covalentemente mediante un dominio de multimerización contenido dentro de cada cadena polipeptídica. Dos dominios de multimerización ensamblados constituyen un par de interacción, que puede ser guiado o no guiado. La figura 21B representa un complejo proteico heterotetramérico que comprende dos complejos heterodiméricos como se representa en la figura 21A. Se pueden prever complejos de orden superior.
La figura 22 muestra un ejemplo esquemático de un complejo proteico heteromérico que comprende un polipéptido del receptor de tipo I (indicado como "I") (por ejemplo, un polipéptido que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntico a un dominio extracelular de una proteína ALK4 de seres humanos u otras especies tales como las descritas en esta invención) y un polipéptido del receptor de tipo II (indicado como "II") (por ejemplo, un polipéptido que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntico a un dominio extracelular de una proteína ActRIIB de seres humanos u otras especies tales como las descritas en esta invención). En los casos ilustrados, el polipéptido del receptor de tipo I forma parte de un polipéptido de fusión que comprende un primer miembro de un par de interacción ("Ci"), y el polipéptido del receptor de tipo II forma parte de un polipéptido de fusión que comprende un segundo miembro de un par de interacción ("C2"). En cada polipéptido de fusión, se puede posicionar un enlazador entre el polipéptido del receptor de tipo I o de tipo II y el miembro correspondiente del par de interacción. El primer y segundo miembros del par de interacción pueden ser un par guiado (asimétrico), lo que significa que los miembros del par se asocian preferentemente entre sí en lugar de autoasociarse, o el par de interacción puede ser no guiado, lo que significa que los miembros del par pueden asociarse entre sí o autoasociarse sin una preferencia sustancial y pueden tener la misma o diferentes secuencias de aminoácidos. Las proteínas de fusión Fc y los anticuerpos tradicionales son ejemplos de pares de interacción no guiados, mientras que una diversidad de dominios Fc genomanipulados se han diseñado como pares de interacción guiados (asimétricos) [por ejemplo, Spiess y col. (2015) Molecular Immunology 67(2A): 95-106].
Las figuras 23A-23D muestran ejemplos esquemáticos de complejos proteicos heterodiméricos que comprenden un polipéptido ALK4 (por ejemplo, un polipéptido que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntico a un dominio extracelular de una proteína ALK4 de seres humanos u otras especies tales como las descritas en esta invención) y un polipéptido ActRIIB (por ejemplo, un polipéptido que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntico a un dominio extracelular de una proteína ActRIIB de seres humanos u otras especies tales como las descritas en esta invención). En los casos ilustrados, el polipéptido ALK4 forma parte de un polipéptido de fusión que comprende un primer miembro de un par de interacción ("Ci"), y el polipéptido ActRIIB forma parte de un polipéptido de fusión que comprende un segundo miembro de un par de interacción ("C2"). Los pares de interacción adecuados incluían, por ejemplo, pares de interacción de inmunoglobulina de cadena pesada y/o cadena ligera, truncamientos y variantes de los mismos, tales como los descritos en esta invención [por ejemplo, Spiess y col. (2015) Molecular Immunology 67(2A): 95-106]. En cada polipéptido de fusión, se puede posicionar un enlazador entre el polipéptido ALK4 o ActRIIB y el miembro correspondiente del par de interacción. El primer y segundo miembros del par de interacción pueden ser no guiados, lo que significa que los miembros del par pueden asociarse entre sí o autoasociarse sin una preferencia sustancial, y pueden tener las mismas o diferentes secuencias de aminoácidos. Véase la figura 23A. Como alternativa, el par de interacción puede ser un par guiado (asimétrico), lo que significa que los miembros del par se asocian preferentemente entre sí en lugar de autoasociarse. Véase la figura 23b . Se pueden prever complejos de orden superior. Véanse las figuras 23C y 23D.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
1. Descripción general
La superfamilia de TGF-p está compuesta por más de 30 factores secretados que incluyen TGF-beta, activinas, nodales, proteínas morfogenéticas óseas (BMP), factores de crecimiento y diferenciación (GDF) y hormona anti-Mulleriana (AMH) [Weiss y col. (2013) Developmental Biology, 2(1): 47-63]. Los miembros de la superfamilia, que se encuentran tanto en vertebrados como en invertebrados, se expresan de manera ubicua en diversos tejidos y funcionan durante las primeras etapas de desarrollo a lo largo de la vida de un animal. De hecho, las proteínas de la superfamilia de TGF-p son mediadores clave de la autorrenovación de células madre, gastrulación, diferenciación, morfogénesis de los órganos y homeostasis del tejido adulto. Según esta actividad ubicua, la señalización aberrante de la superfamilia de TGF-beta se asocia con una amplia gama de patologías humanas incluyendo, por ejemplo, enfermedad autoinmunitaria, enfermedad cardiovascular, enfermedad fibrótica y cáncer.
Los ligandos de la superfamilia de TGF-beta comparten la misma estructura dimérica en la que la hélice de giro central 3-1/2 de un monómero se empaqueta contra la superficie cóncava formada por las hebras beta del otro monómero. La mayoría de los miembros de la familia de TGF-beta se estabilizan aún más mediante un enlace disulfuro intermolecular. Estos enlaces disulfuro atraviesan un anillo formado por otros dos enlaces disulfuro que generan lo que se ha denominado un motivo de "nudo de cisterna" [Lin y col. (2006) Reproduction 132: 179-190; y Hinck y col. (2012) FEBS Letters 586: 1860-1870].
La señalización de la superfamilia de TGF-beta está mediada por complejos heteroméricos de receptores de serina/treonina cinasa de tipo I y tipo II, que fosforilan y activan proteínas SMAD cadena abajo (por ejemplo, proteínas SMAD 1, 2, 3, 5 y 8) tras la estimulación de ligandos [Massagué (2000) Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1:169-178]. Estos receptores de tipo I y tipo II son proteínas transmembrana, compuestas por un dominio extracelular de unión a ligando con la región rica en cisteína, un dominio transmembrana y un dominio citoplásmico con especificidad de serina/treonina cinasa predicha. En general, los receptores de tipo I median en la señalización intracelular, mientras que los receptores de tipo II son necesarios para la unión a ligandos de la superfamilia de TGF-beta. Los receptores de tipo I y II forman un complejo estable después de la unión al ligando, lo que da como resultado la fosforilación de los receptores de tipo I por los receptores de tipo II.
La familia de TGF-beta se puede dividir en dos ramas filogenéticas en función de los receptores de tipo I a los que se unen y las proteínas Smad que activan. Una es la rama de evolución más reciente, que incluye, por ejemplo, TGF-beta, activinas, GDF8, GDF9, GDF11, BMP3 y nodal, que señalizan a través de receptores de tipo I que activan Smads 2 y 3 [Hinck (2012) FEBS Letters 586:1860-1870]. La otra rama comprende las proteínas más distantes de la superfamilia e incluye, por ejemplo, BMP2, BMP4, BMP5, BMP6, BMp7, BMP8a, BMP8b, BMP9, BMP10, GDF1, g Df5, GDF6 y GDF7, que señalizan a través de Smads 1, 5 y 8.
Las activinas son miembros de la superfamilia de TGF-beta y se descubrieron inicialmente como reguladores de la secreción de la hormona estimulante del folículo, pero posteriormente se han caracterizado diversas funciones reproductoras y no reproductoras. Hay tres formas principales de activina (A, B y AB) que son homo/heterodímeros de dos subunidades p estrechamente relacionadas (pApA, pBpB y pApB, respectivamente). El genoma humano también codifica una activina C y una activina E, que se expresan principalmente en el hígado, y también se conocen formas heterodiméricas que contienen pC o pE. En la superfamilia de TGF-beta, las activinas son factores únicos y multifuncionales que pueden estimular la producción de hormonas en las células ováricas y placentarias, apoyar la supervivencia de las células neuronales, influir en el progreso del ciclo celular de manera positiva o negativa dependiendo del tipo de célula, e inducir la diferenciación mesodérmica al menos en los embriones de anfibios [DePaolo y col. (1991) Proc Soc Ep Biol Med. 198: 500-512; Dyson y col. (1997) Curr Biol. 7:81-84; y Woodruff (1998) Biochem Pharmacol. 55:953-963]. En varios tejidos, la señalización de activina se antagoniza por su heterodímero relacionado, la inhibina. Por ejemplo, en la regulación de la secreción de la hormona estimulante del folículo (FSH) de la pituitaria, la activina promueve la síntesis y secreción de FSH, mientras que la inhibina reduce la síntesis y secreción de FSH. Otras proteínas que pueden regular la bioactividad de la activina y/o unirse a la activina incluyen la folistatina (FS), la proteína relacionada con la folistatina (FSRP, también conocida como FLRG o FSTL3) y la a2-macroglobulina.
Como se describe en esta invención, los agentes que se unen a la "activina A" son agentes que se unen específicamente a la subunidad pA, ya sea en el contexto de una subunidad pA aislada o como un complejo dimérico (por ejemplo, un homodímero pApA o un heterodímero pApB). En el caso de un complejo heterodimérico (por ejemplo, un heterodímero pApB), los agentes que se unen a la "activina A" son específicos para los epítopos presentes dentro de la subunidad pA, pero no se unen a los epítopos presentes dentro de la subunidad no Pa del complejo (por ejemplo, la subunidad pB del complejo). De manera similar, los agentes descritos en esta invención que antagonizan (inhiben) la "activina A" son agentes que inhiben una o más actividades según lo mediado por una subunidad pA, ya sea en el contexto de una subunidad pA aislada o como un complejo dimérico (por ejemplo, un homodímero pApB o un heterodímero pApB). En el caso de los heterodímeros pApB, los agentes que inhiben la "activina A" son agentes que inhiben específicamente una o más actividades de la subunidad pA, pero no inhiben la actividad de la subunidad no pA del complejo (por ejemplo, la subunidad pB del complejo). Este principio se aplica también a los agentes que se unen y/o inhiben la "activina B", la "activina C" y la "activina E". Los agentes descritos en esta invención que antagonizan la "activina AB" son agentes que inhiben una o más actividades según lo mediado por la subunidad pa y una o más actividades según lo mediado por la subunidad pB.
Las BMP y GDF forman juntas una familia de citocinas del nudo de cisteína que comparten el pliegue característico de la superfamilia de TGF-beta [Rider y col. (2010) Biochem J., 429(1): 1-12]. Esta familia incluye, por ejemplo, BMP2, BMP4, BMP6, BMP7, BMP2a, BMP3, BMP3b (también conocida como GDF10), BMP4, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8, BMP8a, BMP8b, BMP9 (también conocida como GDF2), BMP10, BMP11 (también conocida como GDF11), BMP12 (también conocida como GDF7), BMP13 (también conocida como GDF6), BMP14 (también conocida como GDF5), BMP15, GDF1, GDF3 (también conocida como VGR2), GDF8 (también conocida como miostatina), GDF9, GDF15 y decapentaplégico.Además de la capacidad de inducir la formación de hueso, que dio nombre a las BMP, las BMP/GDF muestran actividades morfogenéticas en el desarrollo de una amplia gama de tejidos. Los homodímeros y heterodímeros de BMP/GDF interactúan con combinaciones de dímeros de receptores de tipo I y tipo II para producir múltiples complejos de señalización posibles, lo que lleva a la activación de uno de los dos conjuntos competidores de factores de transcripción de SMAD. Las BMP/GDF tienen funciones muy específicas y localizadas. Se regulan de varias formas, incluida la restricción del desarrollo de la expresión de BMP/GDF y mediante la secreción de varias proteínas antagonistas de BMP específicas que se unen con alta afinidad a las citocinas. Curiosamente, varios de estos antagonistas se parecen a los ligandos de la superfamilia de TGF-beta.
El factor de crecimiento y diferenciación 8 (GDF8) también se conoce como miostatina. GDF8 es un regulador negativo de la masa del músculo esquelético y está altamente expresado en el músculo esquelético en desarrollo y adulto. La mutación nula de GDF8 en ratones transgénicos se caracteriza por una hipertrofia e hiperplasia marcadas del músculo esquelético [McPherron y col. Nature (1997) 387:83-90]. Son evidentes aumentos similares en la masa del músculo esquelético en mutaciones de origen natural de GDF8 en ganado vacuno y, sorprendentemente, en seres humanos [Ashmore y col. (1974) Growth, 38:501-507; Swatland y Kieffer, J. Anim. Sci. (1994) 38:752-757; McPherron y Lee, Proc. Natl. Acad. Sci. Us a (1997) 94:12457-12461; Kambadur y col. Genome Res. (1997)7:910-915; y Schuelke y col. (2004) N Engl J Med, 350:2682-8]. Los estudios también han demostrado que la atrofia muscular asociada con la infección por VIH en seres humanos va acompañada de aumentos en la expresión de la proteína GDF8 [Gonzalez-Cadavid y col., PNAS (1998) 95:14938-43]. Además, GDF8 puede modular la producción de enzimas específicas de músculo (por ejemplo, creatina cinasa) y modular la proliferación de células de mioblastos [Publicación de Solicitud de Patente Internacional N.° WO 00/43781]. El propéptido GDF8 puede unirse no covalentemente al dímero del dominio GDF8 maduro, inactivando su actividad biológica [Miyazono y col. (1988) J. Biol. Chem., 263: 6407-6415; Wakefield y col. (1988) J. Biol. Chem., 263; 7646-7654; y Brown y col. (1990) Growth Factors, 3: 35-43]. Otras proteínas que se unen a GDF8 o proteínas relacionadas estructuralmente e inhiben su actividad biológica incluyen folistatina y, potencialmente, proteínas relacionadas con folistatina [Gamer y col. (1999) Dev. Biol., 208: 222-232].
GDF11, también conocida como BMP11, es una proteína secretada que se expresa en la yema de la cola, la yema de la extremidad, los arcos maxilar y mandibular y los ganglios de la raíz dorsal durante el desarrollo del ratón [McPherron y col. (1999) Nat. Genet., 22: 260-264; y Nakashima y col. (1999) Mech. Dev., 80: 185-189]. GDF11 desempeña un papel único en el modelado de tejidos tanto mesodérmicos como neurales [Gamer y col. (1999) Dev Biol., 208:222-32]. Se demostró que GDF11 es un regulador negativo de la condrogénesis y la miogénesis en la extremidad de un pollo en desarrollo [Gamer y col. (2001) Dev Biol., 229:407-20]. La expresión de GDF11 en el músculo también sugiere su papel en la regulación del crecimiento muscular de manera similar a GDF8. Además, la expresión de GDF11 en el cerebro sugiere que GDF11 también puede poseer actividades relacionadas con la función del sistema nervioso. Curiosamente, se encontró que GDF11 inhibía la neurogénesis en el epitelio olfatorio [Wu y col. (2003) Neuron., 37:197-207]. Por lo tanto, GDF11 puede tener aplicaciones in vitro e in vivo en el tratamiento de enfermedades tales como enfermedades musculares y enfermedades neurodegenerativas (por ejemplo, esclerosis lateral amiotrófica).
Como se demuestra en esta invención, un polipéptido ActRIIA soluble y un heterodímero de ALK4:ActRIIB, que se unen a diversos ligandos que interactúan con ActRIIA y ActRIIB, son eficaces para disminuir la presión arterial y la hipertrofia cardíaca en un modelo de HAP. Sin desear quedar ligado a ningún mecanismo en particular, se espera que los efectos de estos agentes sean causados principalmente por un efecto antagonista de señalización de ActRIIA/B. Independientemente del mecanismo, es evidente a partir de los datos presentados en esta invención que los antagonistas de señalización de ActRIIA/B (antagonistas de GDF/BMP) disminuyen la presión arterial, disminuyen la hipertrofia cardíaca y tienen otros efectos positivos en el tratamiento de la hipertensión pulmonar. Cabe señalar que la presión arterial y la hipertrofia son dinámicas, con cambios que dependen de un equilibrio de factores que aumentan la presión arterial y la hipertrofia y factores que disminuyen la presión arterial y la hipertrofia. La presión arterial y la hipertrofia cardíaca se pueden disminuir aumentando los factores que reducen la presión arterial y la hipertrofia cardíaca, disminuyendo los factores que promueven la presión arterial elevada y la hipertrofia cardíaca, o ambos. Las expresiones disminución de la presión arterial o disminución de la hipertrofia cardíaca se refieren a los cambios físicos observables en la presión arterial y el tejido cardíaco y están destinadas a ser neutrales en cuanto al mecanismo por el cual se producen los cambios.
Se considera que los modelos de rata para HAP que se usaron en los estudios descritos en esta invención son predicativos de la eficacia en seres humanos y, por lo tanto, esta descripción proporciona procedimientos para usar polipéptidos ActRIIA, heteromultímeros de ALK4:ActRIIB y otros antagonistas de GDF/BMP para tratar la hipertensión pulmonar (por ejemplo, HAP), particularmente tratar, prevenir o reducir la gravedad o la duración de una o más complicaciones de la hipertensión pulmonar, en seres humanos. Como se describe en esta invención, la expresión antagonistas de GDF/b Mp se refiere a una diversidad de agentes que pueden usarse para antagonizar la señalización de ActRIIA/B incluyendo, por ejemplo, antagonistas que inhiben uno o más ligandos de ActRIIA/B [por ejemplo, activina (activina A, activina B, activina AB, activina C, activina AC, activina BC, activina E, activina AE y/o activina BE), GDF8, GDF11, GDF3, BMP6 , BMP15, BMP10]; antagonistas que inhiben uno o más receptores de tipo I y/o de tipo II (por ejemplo, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7 y ALK5); y antagonistas que inhiben uno o más componentes de señalización cadena abajo (por ejemplo, proteínas Smad tales como Smads 2 y 3). Los antagonistas de GDF/BMP a usar según los procedimientos y usos de la descripción incluyen una diversidad de formas, por ejemplo, trampas de ligandos (por ejemplo, polipéptidos ActRIIA solubles, polipéptidos ActRIIB, heterodímeros de ALK4:ActRIIB, polipéptidos de folistatina y polipéptidos FLRG), antagonistas de anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos que inhiben uno o más de activina, GDF8, GDF11, GDF3, BMP6 , BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7 y ALK5), antagonistas de molécula pequeña [por ejemplo, moléculas pequeñas que inhiben uno o más de activina, GDF8, GDF11, GDF3, BMP6 , BMP15, Bm P10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, AlK7, ALK5 y una o más proteínas Smad (por ejemplo, Smads 2 y 3)] y antagonistas de nucleótidos [por ejemplo, secuencias de nucleótidos que inhiben uno o más de activina, GDF8, GDF11, GDF3, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7, ALK5 y una o más proteínas Smad (por ejemplo, Smads 2 y 3)].
Los términos usados en esta memoria descriptiva generalmente tienen sus significados habituales en la técnica, dentro del contexto de esta descripción y en el contexto específico donde se usa cada término. Determinados términos se analizan a continuación o en otra parte de la memoria descriptiva para proporcionar una orientación adicional al profesional en la descripción de las composiciones y procedimientos de la descripción y cómo hacerlos y usarlos. El alcance o significado de cualquier uso de un término será evidente a partir del contexto específico en el que se usa.
"Homólogo", en todas sus formas gramaticales y variaciones de ortografía, se refiere a la relación entre dos proteínas que poseen un "origen evolutivo común", incluidas proteínas de superfamilias en la misma especie de organismo, así como proteínas homólogas de diferentes especies de organismos. Dichas proteínas (y sus ácidos nucleicos codificantes) tienen homología de secuencia, como se refleja por su similitud de secuencia, ya sea en términos de porcentaje de identidad o por la presencia de residuos o motivos específicos y posiciones conservadas. Sin embargo, en el uso común y en la presente solicitud, el término "homólogo", cuando se modifica con un adverbio tal como "altamente", puede referirse a la similitud de secuencia y puede relacionarse o no con un origen evolutivo común.
La expresión "similitud de secuencia", en todas sus formas gramaticales, se refiere al grado de identidad o correspondencia entre secuencias de ácido nucleico o aminoácidos que pueden o no compartir un origen evolutivo común.
El "porcentaje (%) de identidad de secuencia" con respecto a una secuencia polipeptídica (o de nucleótidos) de referencia se define como el porcentaje de residuos de aminoácidos (o ácidos nucleicos) en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos de aminoácidos (o ácidos nucleicos) en la secuencia polipeptídica (o de nucleótidos) de referencia, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. El alineamiento con el fin de determinar el porcentaje de identidad de secuencias de aminoácidos se puede lograr de diversas maneras que se encuentran dentro de la experiencia en la técnica, por ejemplo, utilizando un software informático disponible públicamente tal como el software BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la técnica pueden determinar los parámetros apropiados para el alineamiento de secuencias, incluyendo cualquier algoritmo necesario para lograr un alineamiento máximo sobre la longitud completa de las secuencias que se comparan. Sin embargo, para los fines de esta invención, los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos (ácidos nucleicos) se generan usando el programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2. El programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2 fue creado por Genentech, Inc., y el código fuente se ha presentado con la documentación del usuario en la Oficina de derechos de autor de EE.UU., Washington D.C., 20559, donde está registrado con el número de registro de derechos de autor de EE.UU. TXU510087. El programa ALIGN-2 está disponible públicamente en Genentech, Inc., South San Francisco, California, o puede compilarse a partir del código fuente. El programa ALIGN-2 debe compilarse para su uso en un sistema operativo UNIX, incluido UNIX digital V4.0D. Todos los parámetros de comparación de secuencias son establecidos por el programa ALIGN-2 y no varían.
"Agonizar", en todas sus formas gramaticales, se refiere al proceso de activación de una proteína y/o gen (por ejemplo, activando o amplificando la expresión génica de esa proteína o induciendo a una proteína inactiva a entrar en un estado activo) o aumentando la actividad de una proteína y/o un gen.
"Antagonizar", en todas sus formas gramaticales, se refiere al proceso de inhibir una proteína y/o gen (por ejemplo, inhibiendo o disminuyendo la expresión génica de esa proteína o induciendo a una proteína activa a entrar en un estado inactivo) o disminuyendo la actividad de una proteína y/o un gen.
Los términos "aproximadamente" y "alrededor de", como se usan en relación con un valor numérico a lo largo de la memoria descriptiva y las reivindicaciones, representan un intervalo de precisión, conocido y aceptable para un experto en la técnica. En general, dicho intervalo de precisión es ±10 %. Como alternativa, y particularmente en sistemas biológicos, los términos "aproximadamente" y "alrededor de" pueden significar valores que están dentro de un orden de magnitud, preferentemente <5 veces y más preferentemente <2 veces de un valor dado.
Los intervalos numéricos descritos en esta invención incluyen los números que definen los intervalos.
Los términos "un" y "una" incluyen referentes en plural a menos que el contexto en el que se usa el término indique claramente lo contrario. En el presente documento, los términos "un" (o "una"), así como las expresiones "uno o más" y "al menos uno" pueden usarse indistintamente. Además, "y/o", cuando se usa en esta invención, debe tomarse como descripción específica de cada una de las dos o más características o componentes especificados con o sin la otra. Por lo tanto, el término "y/o", como se usa en una expresión tal como "A y/o B" en esta invención pretende incluir "A y B", "A o B", "A" (en solitario) y "B" (en solitario). Asimismo, el término "y/o", como se usa en una expresión tal como "A, B y/o C", pretende incluir cada uno de los siguientes casos: A, B, y C; A, B, o C; A o C; A o B; B o C; A y C; A y B; B y C; A (en solitario); B (en solitario); y C (en solitario).
A lo largo de esta memoria descriptiva, se entenderá que la palabra "comprender" o variaciones tales como "comprende" o "que comprende" implica la inclusión de un integrante entero o grupos de integrantes indicado pero no la exclusión de ningún otro integrante o grupo de integrantes.
2. Polipéptidos ActRII, polipéptidos ALK4, heteromultímeros de ALK4:ActRIIB y variantes de los mismos En determinados casos, la descripción se refiere a polipéptidos ActRII y usos de los mismos (por ejemplo, para tratar, prevenir o reducir la tasa de progresión y/o la gravedad de la hipertensión pulmonar o una o más complicaciones de la hipertensión pulmonar) y/o una enfermedad pulmonar intersticial (por ejemplo, fibrosis pulmonar idiopática). Como se usa en esta invención, el término "ActRII" se refiere a la familia de receptores de activina de tipo II. Esta familia incluye el receptor de activina de tipo IIA (ActRIIA) y el receptor de activina de tipo IIB (ActRIIB).
Como se usa en esta invención, el término "ActRIIB" se refiere a una familia de proteínas del receptor de activina de tipo IIB (ActRIIB) de cualquier especie y variantes derivadas de dichas proteínas ActRIIB por mutagénesis u otra modificación. Se entiende que la referencia a ActRIIB en esta invención es una referencia a cualquiera de las formas identificadas actualmente. Los miembros de la familia ActRIIB son generalmente proteínas transmembrana, compuestas por un dominio extracelular de unión a ligando que comprende una región rica en cisteína, un dominio transmembrana y un dominio citoplásmico con actividad de serina/treonina cinasa predicha.
La expresión "polipéptido ActRIIB" incluye polipéptidos que comprenden cualquier polipéptido de origen natural de un miembro de la familia ActRIIB, así como cualquier variante del mismo (incluidos mutantes, fragmentos, fusiones y formas peptidomiméticas) que conservan una actividad útil. Se proporcionan ejemplos de dichos polipéptidos ActRIIB variantes a lo largo de la presente descripción, así como en las Publicaciones de Solicitud de Patente Internacional N.° WO 2006/012627, WO 2008/097541, WO 2010/151426 y WO 2011/020045. La numeración de aminoácidos para todos los polipéptidos relacionados con ActRIIB descritos en esta invención se basa en la numeración de la secuencia de la proteína precursora de ActRIIB humana proporcionada a continuación (SEQ ID NO: 1), a menos que se designe específicamente de otro modo.
La secuencia de la proteína precursora de ActRIIB humana es la siguiente:
1 MTAPWVARAL LWGSLÜAGñG RGEAETRECI YYNANWE LE R TNQSGLERCE
51 GEQDKRLHCY ASWRNSSGTI ELVKKGCWLD DFNCYDRQEC VATEENPQVY
101 FCCCEGNFCN ERFTHLPEAG GPEVTYE PPP TAPTLLTVLA YSLLPIGGLS
151 LIVLLAFWMY RHRKPPYGHV DIHEDPGPPP PSPLVGLKPL QLLEIKARGR
201 FGCVWKAQLM NDFVAVKIFP LQDKQSWQSE REIFSTPGMK HENI.iLQFI.AA
251 EKRGSNLEVE LWLITAFHDK GSLTDYLKGN IITWNSLCHV AETMSRGLSY
301 LHEDVPWCRG EGHKPSIAHR DFKSKNVLLK SDLTAVLADF GLAVRFEPGK
351 PPGDTHGQVG TRRYMAPEVL EGAINFQRDA FLRIDMYAMG LVLWELVSRC
401 KAADGPVDEY MLPFEEEIGQ HPSLEELQEV WKKKMRPTI KDHWLKHPGL
451 AQLCVTIEEC WDHDAEARL3 AGCVEERVSL IRRSVNGTTS DCLVSLVTSV
501 TNVDLPPKES SI (SEQ ID NO: 1)
El péptido señal se indica con un subrayado sencillo; el dominio extracelular se indica en negrita; y los sitios de glucosilación endógenos ligados a N potenciales se indican con un doble subrayado.
La secuencia del polipéptido ActRIIB extracelular procesada (madura) es la siguiente:
GRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDD
FNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT (SEQ ID
NO: 2).
En algunos casos, la proteína se puede producir con una secuencia "SGR..." en el extremo N. La "cola" C-terminal del dominio extracelular se indica mediante un subrayado sencillo. La secuencia con la "cola" eliminada (una secuencia A15) es la siguiente:
GRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRWSSGTIELVKKGCWLDD
FNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEA (SEQ ID NO: 3).
También se informa en la bibliografía una forma de ActRIIB con una alanina en la posición 64 de SEQ ID NO: 1 (A64). Véase, por ejemplo, Hilden y col. (1994) Blood, 83(8): 2163-2170. Los solicitantes han determinado que una proteína de fusión ActRIIB-Fc que comprende un dominio extracelular de ActRIIB con la sustitución A64 tiene una afinidad relativamente baja por la activina y GDF11. Por el contrario, la misma proteína de fusión ActRIIB-Fc con una arginina en la posición 64 (R64) tiene una afinidad por la activina y GDF11 en el intervalo de nanomolar bajo a picomolar alto. Por lo tanto, las secuencias con una R64 se utilizan como la secuencia de referencia de "tipo silvestre" para ActRIIB humana en esta descripción.
La forma de ActRIIB con una alanina en la posición 64 es la siguiente:
1 MTAPWVALAL LWGSLCAGSG RGEAETRECI YYNANWELER TNQSGLERCE
51 GEQDKRLHCY ASWANSSGTI ELVKKGCWLD DFNCYDRQEC VATEENPQVY
101 FCCCEGNFCN ERFTHLPEAG GPEVTYEPPP TAPTLLTVLA YSLLPIGGLS
151 LIVLLAFWMY RHRKPPYGHV D1HEDPGPPP PSPLVGLKPL QLLEIKARGR
201 FGCVWKAQLM NDFVAVKIFP LQDKQSWQSE REIFSTPGMK HENLLQFIAA
251 EKRGSNLEVE LWLITAFHDK GSLTDYLKGN IITWNELCHV AETMSRGLSY
301 LHEDVPWCRG EGHKPSIAHR DFKSKNVLLK SDLTAVLADF GLAVRFEPGK
351 PPGDTHGQVG TRRYMAPEVL EGAINFQRDA FLRIDMYAMG LVLWELVSRC
401 KAADGPVDEY MLPFEEEIGQ HPSLEELQEV WHKKMRPTI KDHWLKHPGL
451 AQLCVTIEEC WDHDAEARLS AGCVEERVSL IRRSVNGTTS DCLVSLVTSV
501 TWVDLPPKES S I (SEQ ID NO: 4}
El péptido señal se indica con un subrayado sencillo y el dominio extracelular se indica con negrita.
La secuencia del polipéptido ActRIIB extracelular procesada (madura) de la forma A64 alternativa es la siguiente:
GRGEAE T RE CIYYNANWE LERTNQSGLERCEGE Q DKR LH CYAS WANS S GTIE LVKKGCWLDD
f n c y d r q e c v a t e e n p q v y f c c c e g n f c n e r f t h l p e a g g p e v t y e p p p t a .p t (SEQ ID NO: 5)
En algunos casos, la proteína se puede producir con una secuencia "SGR..." en el extremo N. La "cola" C-terminal del dominio extracelular se indica mediante un subrayado sencillo. La secuencia con la "cola" eliminada (una secuencia A15) es la siguiente:
Figure imgf000024_0001
A continuación se muestra una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína precursora de ActRIIB humana (SEQ ID NO: 7), que representa los nucleótidos 25-1560 de la secuencia de referencia de Genbank NM_001106.3, que codifica los aminoácidos 1-513 del precursor de ActRIIB. La secuencia que se muestra proporciona una arginina en la posición 64 y puede modificarse para proporcionar una alanina en su lugar. La secuencia señal está subrayada.
1 ATGACGGCGC CCTGGGTGGC CCTCGCCCTC CTCTGGGGAT CGCTGTGCGC
51 C (:j í 7 ü T CTÜGG CGTGGGGAGG CTGAGACACG GGAGTGCATC TAC TAGAACG
101 CCAACTGGGA GGTGGAGCGC ACCAAC CAGA GCGGCCTGGA GCGCTGCGAA
151 GGCGAGCAGG ACAAGCGGCT GCACTGCTAC GCCTCCTGGC GCAACAGCTC
2 01 TGGCACCATC GAGCTCGTGA AGAAGGGGTG C r G G(. l'AGAT GACTTCAACT
2 51 GCTACGATAG GCAGGAGTGT GTGGCCACTG AGGAGAACC G CCAGGTGTAC
301 TTCTGCTGCT GTGAAGGCAA CTTCTGCAAC GAACGCTTCA CTGATTTGCC
351
Figure imgf000024_0002
GGCCCGGAAG TCACGTACGA GCCACCCCCG ACAGCCCCCA
4 01 CCCTGCTCAC GGTGCTGGCC TACTCACTGC TGCCCATCGG GGGCCTTTCC
451 CTCATCGTCC TGCTGGCCTT TTGGATGTAC CGGCATCGCA AGCCCCCCTA
501 CGGTCATGTG GACATCCATG AGGACCCTGG GCCTCCACGA r r * \ m 7 - 1
í j i I g r * r *n
V * y r '- * ' x- 1 r ^ * 551 r r r 1 r-* m
.1. O J k G r lL je r o j ' w ' w 1 GAAGCCACTG CAGCTGCTGG AGATCAAGGC TCGGGGGCGC
601 TTTGGCTGTG TCTGGAAGGC CCAGCTCATG AATGACTTTG TAGCTGTCAA
651 GATCTTCCCA CTCCAGGACA AGCAGTCGTG GCAGAGTGAA CGGGAGATCT
701 TCAGCACACC TGGCATGAAG CACGAGAACC TGCTACAGTT CATTGCTGCC
7 51 GAGAAGCGAG GCTCCAACCT CGAAGTAGAG CTGTGGCTCA TCACGGCCTT
801 CCAT GACAAG GGCTCCCTCA CGGATTACCT CAAGGGGAAC ATCATCACAT
8 51 GGAACGAACT GTGTCATGTA GCAGAGACGA TGTCACGAGG CCTCTCATAC
901 CTGCATGAGG ATGTGCCCTG GTGCCGTGGC GAGGGCCACA AGCCGTCTAT
951 TGCCCACAGG GACTTTAAAA GTAAGAATGT ATTGCTGAAG AGCGACCTCA
1001 CAGCCGTGCT GGCTGACTT? GGCTTGGCTG TTCGATTTGA GCCAGGGAAA
1051 CCTCCAGGGG ACACCCACGG ACAGGTAGGC ACGAGACGGT ACATGGCTCC
1101 m ^ 7. r* r* rn r* r~* ¡V
1 k J i l L U GJ 1 O J O 1 G_- GAGGGAGCCA TCAACTTCCA GAGAGATGCC TTCCTGCGCA
1151 TTGACATGTA TGCCATGGGG TTGGTGCTGT GGGAGCTTGT GTCTCGCTGC
1201
Figure imgf000024_0003
ACGGACCCGT GGATGAGTAC ATGCTGCCCT TTGAGGAAGA
1251 GATTGGCCAG CACCCTTCGT TGGAGGAGCT GCAGGAGGTG GTGGTGCACA 1301 AGAAGATGAG GCCCACCATT AAAGATCACT GGTTGAAACA CCCGGGCCTG
1351 GCCCAGCTTT GTGTGACCAT CGAGGAGTGC TGGGACCATG ATGCAGAGGC
1401 TCGCTTGTCC GCGGGCTGTG TGGAGGAGCG GGTGTCCCTG ATTCGGAGGT
1451 CGGTCAACGG CACTACCTCG GACTGTCTCG TTTCCCTGGT GACCTCTGTC
1501 ACCAATGTGG ACCTGCCCCC TAAAGAGTCA AGCATC (SEQ ID NO: 7)
Una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido ActRIIB humano extracelular procesado es la siguiente (SEQ ID NO: 8). La secuencia que se muestra proporciona una arginina en la posición 64 y puede modificarse para proporcionar una alanina en su lugar.
1 GGGCGIGGGG AGGCTGAGAC ACGGGAGTGC ATCTACTACA ACGCCAACTG
51 GGAGCTGGAG CGCACCAACC AGAGCGGCCT GGAGCGCTGC GAAGGCGAGC
101 AGGACAAGCG GCTGCACTGC TACGCCTCCT GGCGCAACAG CTCTGGCACC
151 ATCGAGCTCG TGAAGAAGGG CTGCTGGCTA GATGACTTCA ACTGCTACGA
201 TAGGCAGGAG TGTGTGGCCA CTGAGGAGAA CCCCCAGGTG TACTTCTGCT
251 GCTGTGAAGG CAACTTCTGC AACGAACGCT TCACTCATTT GCCAGAGGCT
301 GGGGGCCCGG AAGTCACGTA CGAGCCACCC CCGACAGCCC CCACC
(SEQ ID NO: 8 )
En la figura 1 se ilustra un alineamiento de las secuencias de aminoácidos del dominio extracelular de ActRIIB humano y del dominio extracelular de ActRIIA humano. Este alineamiento indica residuos de aminoácidos dentro de ambos receptores que se cree que entran en contacto directamente con ligandos de ActRII. Por ejemplo, las estructuras compuestas de ActRII indicaron que la cavidad de unión a ligando de ActRIIB está definido, en parte, por los residuos Y31, N33, N35, L38 a T41, E47, E50, Q53 a K55, L57, H58, Y60, S62, K74, W78 a N83, Y85, R87, A92 y E94 a F101. En estas posiciones, se espera que se toleren mutaciones conservadoras.
Además, ActRIIB está bien conservada entre los vertebrados, con grandes extensiones del dominio extracelular completamente conservadas. Por ejemplo, la figura 2 representa un alineamiento de múltiples secuencias de un dominio extracelular de ActRIIB humano en comparación con diversos ortólogos de ActRIIB. Muchos de los ligandos que se unen a ActRIIB también están muy conservados. Por consiguiente, a partir de estos alineamientos, es posible predecir las posiciones de los aminoácidos clave dentro del dominio de unión a ligando que son importantes para las actividades normales de unión a ligando de ActRIIB, así como predecir las posiciones de los aminoácidos que probablemente sean tolerantes a la sustitución sin alterar significativamente las actividades normales de unión a ligando de ActRIIB. Por lo tanto, un polipéptido variante de ActRIIB humano activo útil según los presentes procedimientos descritos puede incluir uno o más aminoácidos en las posiciones correspondientes de la secuencia de otra ActRIIB de vertebrado, o puede incluir un residuo que es similar al de las secuencias humanas o de otros vertebrados. Sin pretender ser limitativos, los siguientes ejemplos ilustran este enfoque para definir una variante activa de ActRIIB. L46 en el dominio extracelular humano (SeQ ID NO: 2) es una valina en ActRIIB de Xenopus (SEQ ID NO: 58), por lo que esta posición se puede alterar y, opcionalmente, se puede alterar con respecto a otro residuo hidrófobo, tal como V, I o F, o un residuo no polar tal como A. E52 en el dominio extracelular humano es una K en Xenopus, lo que indica que este sitio puede ser tolerante a una amplia diversidad de cambios, incluyendo residuos polares, tales como E, D, K, R, H, S, T, P, G, Y y probablemente A. T93 en el dominio extracelular humano es una K en Xenopus, lo que indica que se tolera una amplia variación estructural en esta posición, con residuos polares favorecidos, tales como S, K, R, E, D, H, G, P, G e Y. F108 en el dominio extracelular humano es una Y en Xenopus y, por lo tanto, debería tolerarse Y u otro grupo hidrófobo, tal como I, V o L. E111 en el dominio extracelular humano es K en Xenopus, lo que indica que los residuos cargados serán tolerados en esta posición, incluyendo D, R, K y H, así como Q y N. R112 en el dominio extracelular humano es K en Xenopus, lo que indica que los residuos básicos se toleran en esta posición, incluyendo R y H. A en la posición 119 en el dominio extracelular humano está relativamente poco conservada y aparece como P en roedores y V en Xenopus, por lo que prácticamente cualquier aminoácido debería tolerarse en esta posición.
Además, las proteínas ActRII se han caracterizado en la técnica en términos de características estructurales y funcionales, particularmente con respecto a la unión a ligando [Attisano y col. (1992) Cell 68(1):97-108; Greenwald y col. (1999) Nature Structural Biology 6(1): 18-22; Allendorph y col. (2006) PNAS 103(20: 7643-7648; Thompson y col. (2003) The EMBO Journal 22(7): 1555-1566; así como las Patentes de EE.UU. N.° 7.709.605, 7.612.041 y 7.842.663]. Además de las enseñanzas de esta invención, estas referencias proporcionan una amplia orientación sobre cómo generar variantes de ActRIIB que conservan una o más actividades normales (por ejemplo, actividad de unión a ligando).
Por ejemplo, un motivo estructural definitorio conocido como pliegue de toxina de tres dedos es importante para la unión a ligando por los receptores de tipo I y tipo II y está formado por residuos de cisteína conservados ubicados en posiciones variables dentro del dominio extracelular de cada receptor monomérico [Greenwald y col. (1999) Nat Struct Biol 6:18-22; y Hinck (2012) FEBS Lett 586:1860-1870]. Por consiguiente, los dominios de unión a ligando centrales de ActRIIB humana, según lo demarcado por la más externa de estas cisteínas conservadas, corresponden a las posiciones 29-109 de la SEQ ID NO: 1 (precursor de ActRIIB). Los aminoácidos estructuralmente menos ordenados que flanquean estas secuencias centrales demarcadas por cisteína se pueden truncar por 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 o 28 residuos en el extremo N y/o 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 o 22 residuos en el extremo C sin alterar necesariamente la unión a ligando. Los dominios extracelulares de ActRIIB de ejemplo para el truncamiento N-terminal y/o C-terminal incluyen las SEQ ID NO: 2, 3, 5 y 6.
Attisano y col. mostraron que una deleción del nudo de prolina en el extremo C del dominio extracelular de ActRIIB reducía la afinidad del receptor por la activina. Una proteína de fusión ActRIIB-Fc que contiene los aminoácidos 20­ 119 de la presente SEQ ID NO: 1, "ActRIIB(20-119)-Fc", tiene una unión reducida a GDF11 y activina en relación con una ActRIIB(20-134)-Fc, que incluye la región del nudo de prolina y el dominio de yuxtamembrana completo (véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. N.° 7.842.663). Sin embargo, una proteína ActRIIB(20-129)-Fc conserva una actividad similar, pero algo reducida, en relación con la de tipo silvestre, aunque la región del nudo de prolina esté alterada.
Por lo tanto, se espera que los dominios extracelulares de ActRIIB que se detienen en los aminoácidos 134, 133, 132, 131, 130 y 129 (con respecto a la SEQ ID NO: 1) sean activos, pero las construcciones que se detienen en 134 o 133 pueden ser más activas. De manera similar, no se espera que las mutaciones en cualquiera de los residuos 129-134 (con respecto a la SEQ ID NO: 1) alteren la afinidad de unión a ligando en grandes márgenes. En apoyo de esto, se sabe en la técnica que las mutaciones de P129 y P130 (con respecto a la SEQ ID NO: 1) no disminuyen sustancialmente la unión a ligando. Por lo tanto, un polipéptido ActRIIB de la presente descripción puede terminar tan pronto como el aminoácido 109 (la cisteína final), sin embargo, se espera que las formas que terminen en o entre 109 y 119 (por ejemplo, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118 o 119) tengan una unión a ligando reducida. El aminoácido 119 (con respecto a la presente SEQ ID NO: 1) está escasamente conservado y, por lo tanto, se altera o se trunca fácilmente. Los polipéptidos ActRIIB que terminan en 128 (con respecto a la SEQ ID NO: 1) o posterior deben conservar la actividad de unión a ligando. Los polipéptidos ActRIIB que terminan en o entre 119 y 127 (por ejemplo, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126 o 127), con respecto a la SEQ ID NO: 1, tendrán una capacidad de unión intermedia. Puede ser deseable utilizar cualquiera de estas formas, dependiendo del entorno clínico o experimental.
En el extremo N-terminal de ActRIIB, se espera que una proteína que comience en el aminoácido 29 o antes (con respecto a la SEQ ID NO: 1) conserve la actividad de unión a ligando. El aminoácido 29 representa la cisteína inicial. Una mutación de alanina a asparagina en la posición 24 (con respecto a la SEQ ID NO: 1) introduce una secuencia de glucosilación ligada a N sin afectar sustancialmente a la unión a ligando [Patente de EE.UU. N.° 7.842.663]. Esto confirma que las mutaciones en la región entre el péptido de escisión de señal y la región reticulada de cisteína, correspondiente a los aminoácidos 20-29, se toleran bien. En particular, los polipéptidos ActRIIB que comienzan en la posición 20, 21,22, 23 y 24 (con respecto a la SEQ ID NO: 1) deben conservar la actividad de unión a ligando general, y también se espera que los polipéptidos ActRIIB que comienzan en las posiciones 25, 26, 27, 28, y 29 (con respecto a la SEQ ID NO: 1) conserven la actividad de unión a ligando. Se ha demostrado, por ejemplo, la Patente de EE.UU. N.° 7.842.663, que, sorprendentemente, una construcción de ActRIIB que comienza en 22, 23, 24 o 25 tendrá la mayor actividad.
Tomados en conjunto, una fórmula general para una porción activa (por ejemplo, porción de unión a ligando) de ActRIIB comprende los aminoácidos 29-109 de SEQ ID NO: 1. Por lo tanto, los polipéptidos ActRIIB pueden, por ejemplo, comprender, consistir esencialmente o consistir en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a una porción de ActRIIB que comienza en un residuo correspondiente cualquiera de los aminoácidos 20-29 (por ejemplo, que comienza en cualquier de los aminoácidos 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 o 29) de SEQ ID NO: 1 y que termina en una posición correspondiente a cualquiera de los aminoácidos 109-134 (por ejemplo, que termina en cualquiera de los aminoácidos 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133 o 134) de SEQ ID NO: 1. Otros ejemplos incluyen polipéptidos que comienzan en una posición desde 20-29 (por ejemplo, cualquiera de las posiciones 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 o 29) o 21­ 29 (por ejemplo, cualquiera de las posiciones 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 o 29) de SEQ ID NO: 1 y terminan en una posición desde 119-134 (por ejemplo, cualquiera de las posiciones 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133 o 134), 119-133 (por ejemplo, cualquiera de las posiciones 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132 o 133), 129-134 (por ejemplo, cualquiera de las posiciones 129, 130, 131, 132, 133 o 134) o 129-133 (por ejemplo, cualquiera de las posiciones 129, 130, 131, 132 o 133) de SEQ ID NO: 1. Otros ejemplos incluyen construcciones que comienzan en una posición desde 20-24 (por ejemplo, cualquiera de las posiciones 20, 21,22, 23 o 24), 21-24 (por ejemplo, cualquiera de las posiciones 21,22, 23 o 24) o 22-25 (por ejemplo, cualquiera de las posiciones 22, 22, 23 o 25) de SEQ ID NO: 1 y terminan en una posición desde 109-134 (por ejemplo, cualquiera de las posiciones 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133 o 134), 119-134 (por ejemplo, cualquiera de las posiciones 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133 o 134) o 129-134 (por ejemplo, cualquiera de las posiciones 129, 130, 131, 132, 133 o 134) de SEQ ID NO: 1. También se contemplan variantes dentro de estos intervalos, particularmente aquellas que comprenden, consisten esencialmente o consisten en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % de identidad con la porción correspondiente de SEQ ID NO: 1.
Las variaciones descritas en esta invención se pueden combinar de diversas formas. En algunos casos, las variantes de ActRIIB no comprenden más de 1, 2, 5, 6 , 7, 8, 9, 10 o 15 cambios de aminoácidos conservadores en la cavidad de unión a ligando, opcionalmente cero, una o más alteraciones no conservadoras en las posiciones 40, 53, 55, 74, 79 y/o 82 en la cavidad de unión a ligando. Los sitios fuera de la cavidad de unión, en los que la variabilidad puede tolerarse particularmente bien, incluyen los extremos amino y carboxi del dominio extracelular (como se ha indicado anteriormente) y las posiciones 42-46 y 65-73 (con respecto a la SEQ ID NO: 1). Una alteración de asparagina a alanina en la posición 65 (N65A) no parece disminuir la unión a ligando en el transfondo de R64 [Patente de EE.UU. N.° 7.842.663]. Este cambio probablemente elimina la glucosilación en N65 en el transfondo de A64, demostrando así que es probable que se tolere un cambio significativo en esta región. Si bien un cambio de R64A se tolera mal, la R64K se tolera bien y, por lo tanto, otro residuo básico, tal como H, puede tolerarse en la posición 64 [Patente de EE.UU. N.° 7.842.663]. Además, los resultados del programa de mutagénesis descrito en la técnica indican que existen posiciones de aminoácidos en ActRIIB que a menudo son beneficiosas de conservar. Con respecto a la SEQ ID NO: 1, estas incluyen la posición 80 (aminoácido ácido o hidrófobo), la posición 78 (hidrófobo y particularmente triptófano), la posición 37 (ácido, y particularmente ácido aspártico o glutámico), posición 56 (aminoácido básico), posición 60 (aminoácido hidrófobo, particularmente fenilalanina o tirosina). Por lo tanto, la descripción proporciona un marco de aminoácidos que pueden conservarse en polipéptidos ActRIIB. Otras posiciones que pueden ser deseables de conservar son las siguientes: posición 52 (aminoácido ácido), posición 55 (aminoácido básico), posición 81 (ácido), 98 (polar o cargado, particularmente E, D, R o K), todo con respecto a la SEQ ID NO: 1.
Se ha demostrado previamente que la adición de un sitio de glucosilación ligado a N adicional (N-X-S/T) en el dominio extracelular de ActRIIB se tolera bien (véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. N.° 7.842.663). Por lo tanto, las secuencias N-X-S/T pueden introducirse generalmente en posiciones fuera de la cavidad de unión a ligando definida en la figura 1 en el polipéptido ActRIIB de la presente descripción. Los sitios particularmente adecuados para la introducción de secuencias N-X-S/T no endógenas incluyen los aminoácidos 20-29, 20-24, 22-25, 109-134, 120-134 o 129-134 (con respecto a la SEQ ID NO: 1). Las secuencias N-X-S/T también pueden introducirse en el enlazador entre la secuencia de ActRIIB y un dominio Fc u otro componente de fusión, así como opcionalmente en el propio componente de fusión. Dicho sitio puede introducirse con un esfuerzo mínimo introduciendo un N en la posición correcta con respecto a un S o T preexistentes, o introduciendo un S o T en una posición correspondiente a un N preexistente. Por lo tanto, las alteraciones deseables que crearían un sitio de glucosilación ligado a N son: A24N, R64N, S67N (posiblemente combinada con una alteración N65A), E105N, R112N, G120N, E123N, P129N, A132N, R112S y R112T (con respecto a la SEQ ID NO: 1). Cualquier S que se predice que está glucosilado puede alterarse con respecto a un T sin crear un sitio inmunógeno, debido a la protección proporcionada por la glucosilación. Asimismo, cualquier T que se predice que está glucosilado puede alterarse con respecto a un S. Por lo tanto, se contemplan las alteraciones S67T y S44T (con respecto a la SEQ ID NO: 1). Asimismo, en una variante A24N, se puede utilizar una alteración S26T. Por consiguiente, un polipéptido ActRIIB de la presente descripción puede ser una variante que tenga una o más secuencias consenso de glucosilación ligada a N no endógenas adicionales como se ha descrito anteriormente.
En determinados casos, la descripción se refiere a antagonistas (inhibidores) de GDF/BMP que comprenden un polipéptido ActRIIB, que incluye fragmentos, variantes funcionales y formas modificadas de los mismos, así como usos de los mismos (por ejemplo, tratar o prevenir la HP o una o más complicaciones asociadas a la HP). Preferentemente, los polipéptidos ActRIIB son solubles (por ejemplo, comprenden un dominio extracelular de ActRIIB). En algunos casos, los polipéptidos ActRIIB antagonizan la actividad (por ejemplo, señalización de Smad) de uno o más ligandos de GDF/b Mp [por ejemplo, GDF11, GDF8, activina (activina A, activina B, activina AB, activina C, activina E), BMP6 , GDF3, BMP15 y BMP10]. Por lo tanto, en algunos casos, los polipéptidos ActRIIB se unen a uno o más ligandos de GDF/BMP [por ejemplo, GDF11, GDF8, activina (activina A, activina B, activina AB, activina C, activina E), BMP6 , GDF3, BMp15 y BMP10]. En algunos casos, los polipéptidos ActRIIB de la descripción comprenden, consisten esencialmente o consisten en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a una porción de ActRIIB que comienza en un residuo correspondiente a los aminoácidos 20-29 (por ejemplo, que comienza en cualquiera de los aminoácidos 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 o 29) de SEQ ID NO: 1 y que termina en una posición correspondiente a los aminoácidos 109-134 (por ejemplo, que termina en cualquiera de los aminoácidos 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133 o 134) de SEQ ID NO: 1. En algunos casos, los polipéptidos ActRIIB comprenden, consisten o consisten esencialmente en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a los aminoácidos 29-109 de SEQ ID NO: 1. En algunos casos, los polipéptidos ActRIIB de la descripción comprenden, consisten o consisten esencialmente en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a los aminoácidos 29-109 de SEQ ID NO: 1, donde la posición correspondiente a L79 de SEQ ID NO: 1 es un aminoácido ácido (aminoácidos ácidos de origen natural D y E o un aminoácido ácido artificial). En determinados casos, los polipéptidos ActRIIB de la descripción comprenden, consisten o consisten esencialmente en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a los aminoácidos 25-131 de SEQ ID NO: 1. En determinados casos, los polipéptidos ActRIIB de la descripción comprenden, consisten o consisten esencialmente en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a los aminoácidos 25-131 de SEQ ID NO: 1, donde la posición correspondiente a L79 de SEQ ID NO: 1 es un aminoácido ácido. En algunos casos, los polipéptidos ActRIIB de la descripción comprenden, consisten o consisten esencialmente en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 40, 42, 45, 46, 47, 48, 69, 74, 77, 78, 79, 108, 110, 114, 115, 118 y 120. En algunos casos, los polipéptidos ActRIIB de la descripción comprenden, consisten o consisten esencialmente en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 1,2, 3, 4, 5, 6 , 40, 42, 45, 46, 47, 48, 69, 74, 77, 78, 79, 108, 110, 114, 115, 118 y 120, donde la posición correspondiente a L79 de SEQ ID NO: 1 es un aminoácido ácido. En algunos casos, los polipéptidos ActRIIB de la descripción comprenden, consisten o consisten esencialmente en al menos un polipéptido ActRIIB donde la posición correspondiente a L79 de SEQ ID NO: 1 no es un aminoácido ácido (es decir, no es un aminoácido de origen natural D o E o un residuo de aminoácido ácido artificial).
En determinados casos, la presente descripción se refiere a polipéptidos ActRIIA. Como se usa en esta invención, el término "ActRIIA" se refiere a una familia de proteínas del receptor de activina de tipo IIA (ActRIIA) de cualquier especie y variantes derivadas de dichas proteínas ActRIIA por mutagénesis u otra modificación. Se entiende que la referencia a ActRIIA en esta invención es una referencia a cualquiera de las formas identificadas actualmente. Los miembros de la familia ActRIIA son generalmente proteínas transmembrana, compuestas por un dominio extracelular de unión a ligando que comprende una región rica en cisteína, un dominio transmembrana y un dominio citoplásmico con actividad de serina/treonina cinasa predicha.
La expresión "polipéptido ActRIIA" incluye polipéptidos que comprenden cualquier polipéptido de origen natural de un miembro de la familia ActRIIA, así como cualquier variante del mismo (incluidos mutantes, fragmentos, fusiones y formas peptidomiméticas) que conservan una actividad útil. Se proporcionan ejemplos de dichos polipéptidos ActRIIA variantes a lo largo de la presente descripción, así como en las Publicaciones de Solicitud de Patente Internacional N.° WO 2006/012627 y WO 2007/062188. La numeración de aminoácidos para todos los polipéptidos relacionados con ActRIIA descritos en esta invención se basa en la numeración de la secuencia de la proteína precursora ActRIIA humana proporcionada a continuación (SEQ ID NO: 9), a menos que se designe específicamente de otro modo.
La secuencia de la proteína precursora ActRIIA humana canónica es la siguiente:
1 MGAAAKLAFA VFLISCSSGA ILGRSETQEC LFFNANWEKD RTNQTGVE PC
51 YGDKDKRRHC FATWKNISGS IEIVKQGCWL DDINCYDRTD CVEKKDSPEV
101 YFCCCEGNMC NEKFSYFPEM EVTQPTSNPV TPKPPYYNIL LYSLVPLMLI
151 AGIVICAFWV YRHHKMAYPP VLVPTQDPGP PPPSPLLGLK PLQLLEVKAR
201 GRFGCVWKAQ LLNEYVAVKI FPIQDKQSWQ NEYEVYSLPG MKHENILQFI
251 GAEKRGTSVD VDLWLITAFH EKGSLSDFLK ANVV'SWNELC HIAETMARGL
301 AYLHEDIPGL KDGHKPAISH RDIKSKNVLL KNNLTACIAD FGLALKFEAG
351 KSAGDTHGQV GTRRYMAPEV LEGAINFQRD AFLRIDMYAM GLVLWELASR
401 CTAADGPVDE YMLPFEEEIG QHPSLEDMQE VWHKKKRPV LRDYWQKHAG
451 MAMLCETIEE CWDHDAEARL SAGCVGERIT QMQRLTNIIT TEDIVTWTM
501 VTNVDFPPKE SSL (SEQ ID NO: 9)
El péptido señal se indica mediante un subrayado sencillo; el dominio extracelular se indica en negrita; y los sitios de glucosilación endógenos ligados a N potenciales se indican mediante un doble subrayado.
La secuencia del polipéptido ActRIIA humano extracelular procesada (madura) es la siguiente:
ILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCFATWKNISGSIEIVKQGCWLDD INCYDRTDCVEKKDSFEVYFCCCEGNMCNEKFSYFFEMEVTQFTSNPVTFKFF (SEQ ID NO: 10)
La "cola" C-terminal del dominio extracelular se indica mediante un subrayado sencillo. La secuencia con la "cola" eliminada (una secuencia A15) es la siguiente:
1LGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHC FATWKNISGSIEIVKQGCWLDD INCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNMCNEKFSYFPEM (SEQ ID NO: 11)
A continuación se muestra la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína precursora ActRIIA humana (SEQ ID NO: 12), de la siguiente manera: Nucleótidos 159-1700 de la secuencia de referencia de Genbank NM_001616.4. La secuencia señal está subrayada.
1 ATGGGAGCTG CTGCAAAGTT GGCGTTTGCC GTCTTTCTTA TCTCCTGTTC
51 TTCAGGTGCT ATACTTGGTA GATCAGAAAC TCAGGAGTGT CTTTTCTTTA
101 ATGCTAATTG GGAAAAAGAC AGAACCAATC AAACTGGTGT TGAACCGTGT 151 TATGGTGACA AAGATAAACG GCGGCATTGT TTTGCTACCT GGAAGAATAT 201 TTCTGGTTCC ATTGAAATAG TGAAACAAGG TTGTTGGCTG GATGATATCA 251 ACTGCTATGA CAGGACTGAT TGTGTAGAAA AAAAAGACAG CCCTGAAGTA 301 TATTTTTGTT GCTGTGAGGG CAATATGTGT AATGAAAAGT rp « p i j i Q í j t p p
351 TCCGGAGATG GAAGTCACAC AGCCCACTTC AAATCCAGTT ACACCTAAGC
401 CACCCTATTA CAACATCCTG CTCTATTCCT TGGTGCCACT TATGTTAATT
451 GCGGGGATTG TCATTTGTGC ATTTTGGGTG TACAGGCATC ACAAGATGGC
501 CTACCCTCCT GTACTTGTTC CAACTCAAGA CCCAGGACCA CCCCCACCTT
551 CTCCATTACT AGGTTTGAAA CCACTGCAGT TATTAGAAGT GAAAGCAAGG
601 GGAAGATTTG GTTGTGTCTG GAAAGCCCAG TTGCTTAACG AATATGTGGC
651 TGTCAAAATA TTTCCAATAC AGGACAAACA GTCATGGCAA AATGAATACG
701 AAGTCTACAG TTTGCCTGGA ATGAAGCATG AGAACAT AT T ACAGTTCATT
7 51 GGTGCAGAAA AACGAGGCAC CAGTGTTGAT GTGGATCTTT GGCTGATCAC SOI AGCATTTCAT GAAAAGGC-TT CACTATCAGA CTTTCTTAAG GCTAATGTGG 851 i C 1' . i i '5 G AA TGAACTGTGT CATATTGCAG AAACGATG G C TAGAGGATTG 901 GCATATTTAC ATGAGGATAT ACCTGGCCTA AAAGATGGCC a c a a a c c t g c CATATCTCAC AC-GGACATCA AAAGTAAAAA TGTGCTGTTG AAAAACAACC 1001 TGACAGCTTG CATTGCTGAC TTTGGGTTGG CCTTAAAATT TGAGGCTGGC 1051 AAGTCTGCAG GCGATACCCA TGGACAGGTT GGTACCCGGA GGTACATGGC 11 0 i TCCAGAGGTA TTAGAGGGTG CTATAAACTT CCAAAGGGAT GCATTTTTGA 1 ID 1 GGATAGATAT GTATGCCATG GGATTAGTCC TATGGGAACT GGCTTCTCGC 1201 TGTACTGCTG CAGATGGACC TGTAGATGAA TACATGTTGC CATTTGAGGA 1251 GGAAATTGGC CAGCATCCAT CTCTTGAAGA lAT GCAG GAA GTTGTTGTGC 1301 ATAAAAAAAA GAGGCCTGTT TTAAGAGATT ATTGGCAGAA ACATGCTGGA 1351 ATGGCAATGC TCTGTGAAAC CATTGAAGAA TGTTGGGATC ACGACGCAGA 1401 AGCCAGGTTA TCAGCTGGAT GTGTAGGTGA AA.GAATTACC CAGATGCAGA 1451 GACTAACAAA TATTATTACC ACAGAGGACA TTGTAACAGT GGTCACAATG 1501 GTGACAAATG TTGACTTTCC TCCCAAAGAA TCTAGTCTA (SEQ ID NO: La secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido ActRIIA humano (extracelular) soluble procesado es la siguiente:
1 ATACTTGGTA GATCAGAAAC TCAGGAGTGT CTTTTCTTTA ATGCTAATTG 51 g g aaaaag ac AGAACCAATC AAACTGGTG! TGAACCGTGT TATGGTGACA
10 1 AAGATAAACG GCGGCATTGT TTTGCTACCT GGAAGAATAT TTCTGGTTCC
151 ATTGAAATAG TGAAACAAGG TTGTTGGCTG GATGATATCA ACTGCTATGA
2 01 CAGG/iC T G/iT TGTGTAGAAA AAAAAGACAG CCCTGAAGTA TA.TTTTTGTT 2 51 GCTGTGAGGG CAATATGTGT AATGAAAAGT T"T T o T T AT T T TCCGGAGATG 301 GAAGTCACAC AGCCCACTTC AAATCCAGTT ACACCTAAGC CACCCíseq id NO:13 i
ActRIIA está bien conservada entre los vertebrados, con grandes extensiones del dominio extracelular completamente conservadas. Por ejemplo, la figura 3 representa un alineamiento de múltiples secuencias de un dominio extracelular de ActRIIA humana en comparación con diversos ortólogos de ActRIIA. Muchos de los ligandos que se unen a ActRIIA también están muy conservados. Por consiguiente, a partir de estos alineamientos, es posible predecir las posiciones de los aminoácidos clave dentro del dominio de unión a ligando que son importantes para las actividades normales de unión a ligando de ActRIIA, así como predecir las posiciones de los aminoácidos que probablemente sean tolerantes a la sustitución sin alterar significativamente las actividades normales de unión a ligando de ActRIIA. Por lo tanto, un polipéptido variante de ActRIIA humano activo útil según los presentes procedimientos descritos puede incluir uno o más aminoácidos en las posiciones correspondientes de la secuencia de otra ActRIIA de vertebrado, o puede incluir un residuo que es similar al de las secuencias humanas o de otros vertebrados.
Sin pretender ser limitativos, los siguientes ejemplos ilustran este enfoque para definir una variante activa de ActRIIA. Como se ilustra en la figura 3, F13 en el dominio extracelular humano es Y en ActRIIA de Ovis aries (SEQ ID NO: 62), Gallus gallus (SEQ ID NO: 65), Bos Taurus (SEQ ID NO: 66), Tyto alba (SEQ ID NO: 67) y Myotis davidii (SEQ ID NO: 68), lo que indica que se toleran residuos aromáticos en esta posición, incluyendo F, W e Y. Q24 en el dominio extracelular humano es R en ActRIIA de Bos Taurus, lo que indica que los residuos cargados serán tolerados en esta posición, incluyendo D, R, K, H y E. S95 en el dominio extracelular humano es F en ActRIIA de Gallus gallus y Tyto alba, lo que indica que este sitio puede tolerar una amplia diversidad de cambios, incluyendo residuos polares, tales como E, D, K, R, H, S, T, P, G, Y, y probablemente un residuo hidrófobo tal como L, I o F. E52 en el dominio extracelular humano es D en ActRIIA de Ovis aries, lo que indica que los residuos ácidos se toleran en esta posición, incluyendo D y E. P29 en el dominio extracelular humano está relativamente mal conservado, apareciendo como S en ActRIIA de Ovis aries y L en ActRIIA de Myotis davidii, por lo que prácticamente cualquier aminoácido debe tolerarse en esta posición.
Además, como se ha analizado anteriormente, las proteínas ActRII se han caracterizado en la técnica en términos de características estructurales/funcionales, particularmente con respecto a la unión a ligando [Attisano y col. (1992) Cell 68(1):97-108; Greenwald y col. (1999) Nature Structural Biology 6(1): 18-22; Allendorph y col. (2006) PNAS 103(20: 7643-7648; Thompson y col. (2003) The EMBO Journal 22(7): 1555-1566; así como las Patentes de EE.UU. N.° 7.709.605, 7.612.041 y 7.842.663]. Además de las enseñanzas de esta invención, estas referencias proporcionan una amplia orientación sobre cómo generar variantes de ActRIIA que conservan una o más actividades deseadas (por ejemplo, actividad de unión a ligando).
Por ejemplo, un motivo estructural definitorio conocido como pliegue de toxina de tres dedos es importante para la unión a ligando por los receptores de tipo I y tipo II y está formado por residuos de cisteína conservados ubicados en posiciones variables dentro del dominio extracelular de cada receptor monomérico [Greenwald y col. (1999) Nat Struct Biol 6:18-22; y Hinck (2012) FEBS Lett 586:1860-1870]. Por consiguiente, los dominios de unión a ligando centrales de ActRIIA humana, según lo demarcado por la más externa de estas cisteínas conservadas, corresponden a las posiciones 30-110 de la SEQ ID NO: 9 (precursor de ActRIIA). Por lo tanto, los aminoácidos estructuralmente menos ordenados que flanquean estas secuencias centrales demarcadas por cisteína se pueden truncar por aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 o 29 residuos en el extremo N y por aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 residuos en el extremo C sin alterar necesariamente la unión a ligando. Los truncamientos de dominios extracelulares de ActRIIA de ejemplo incluyen las SEQ ID NO: 10 y 11.
Por consiguiente, una fórmula general para una porción activa (por ejemplo, unión a ligando) de ActRIIA es un polipéptido que comprende, consiste esencialmente o consiste en los aminoácidos 30-110 de SEQ ID NO: 9. Por lo tanto, los polipéptidos ActRIIA pueden, por ejemplo, comprender, consistir esencialmente o consistir en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a una porción de ActRIIA que comienza en un residuo correspondiente cualquiera de los aminoácidos 21-30 (por ejemplo, que comienza en cualquiera de los aminoácidos 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30) de SEQ ID NO: 9 y que termina en una posición correspondiente a cualquiera de los aminoácidos 110-135 (por ejemplo, que termina en cualquiera de los aminoácidos 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134 o 135) de SEQ ID NO: 9. Otros ejemplos incluyen construcciones que comienzan en una posición seleccionada de entre 21-30 (por ejemplo, que comienzan en cualquiera de los aminoácidos 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30), 22-30 (por ejemplo, que comienzan en cualquiera de los aminoácidos 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30), 23-30 (por ejemplo, que comienzan en cualquiera de los aminoácidos 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30), 24-30 (por ejemplo, que comienzan en cualquiera de los aminoácidos 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30) de SEQ ID NO: 9, y terminan en una posición seleccionada de entre 111-135 (por ejemplo, que terminan en cualquiera de los aminoácidos 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134 o 135), 112-135 (por ejemplo, que terminan en cualquiera de los aminoácidos 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134 o 135), 113-135 (por ejemplo, que terminan en cualquiera de los aminoácidos 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134 o 135), 120-135 (por ejemplo, que terminan en cualquiera de los aminoácidos 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134 o 135),130-135 (por ejemplo, que terminan en cualquiera de los aminoácidos 130, 131, 132, 133, 134 o 135), 111-134 (por ejemplo, que terminan en cualquiera de los aminoácidos 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133 o 134), 111-133 (por ejemplo, que terminan en cualquiera de los aminoácidos 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132 o 133), 111-132 (por ejemplo, que terminan en cualquiera de los aminoácidos 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131 o 132), o 111-131 (por ejemplo, que terminan en cualquiera de los aminoácidos 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130 o 131) de SEQ ID NO: 9. También se contemplan variantes dentro de estos intervalos, particularmente aquellas que comprenden, consisten esencialmente o consisten en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % de identidad con la porción correspondiente de SEQ ID NO: 9. Por lo tanto, en algunos casos, un polipéptido ActRIIA puede comprender, consistir esencialmente o consistir en un polipéptido que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntico a los aminoácidos 30-110 de SEQ ID NO: 9. Opcionalmente, los polipéptidos ActRIIA comprenden un polipéptido que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntico a los aminoácidos 30-110 de SEQ ID NO: 9, y que comprenden no más de 1, 2, 5, 10 o 15 cambios de aminoácidos conservadores en la cavidad de unión a ligando.
En determinados casos, la descripción se refiere a antagonistas (inhibidores) de GDF/BMP que comprenden un polipéptido ActRIIA, que incluye fragmentos, variantes funcionales y formas modificadas de los mismos, así como usos de los mismos (por ejemplo, aumentar una respuesta inmunitaria en un paciente que lo necesite y tratar un cáncer). Preferentemente, los polipéptidos ActRIIA son solubles (por ejemplo, un dominio extracelular de ActRIIA). En algunos casos, los polipéptidos ActRIIA inhiben (por ejemplo, señalización de Smad) de uno o más ligandos de GDF/BMP [por ejemplo, GDF11, GDF8, activina (activina A, activina B, activina AB, activina C, activina E), BMP6 , GDF3, BMP15 y/o BMP10]. En algunos casos, los polipéptidos ActRIIA se unen a uno o más ligandos GDF/BMP [por ejemplo, GDF11, GDF8, activina (activina A, activina B, activina AB, activina C, activina E), BMP6 , GDF3, BMP15 y/o BMP10]. En algunos casos, los polipéptidos ActRIIA de la descripción comprenden, consisten esencialmente o consisten en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a una porción ActRIIA que comienza en un residuo correspondiente a los aminoácidos 21-30 (por ejemplo, que comienza en cualquiera de los aminoácidos 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30) de SEQ ID NO: 9 y que termina en una posición correspondiente a cualquiera de los aminoácidos 110-135 (por ejemplo, que termina en cualquiera de los aminoácidos 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134 o 135) de SEQ ID NO: 9. En algunos casos, los polipéptidos ActRIIA comprenden, consisten o consisten esencialmente en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a los aminoácidos 30-110 de SEQ ID NO: 9. En determinados casos, los polipéptidos ActRIIA comprenden, consisten o consisten esencialmente en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a los aminoácidos 21-135 de SEQ ID NO: 9. En algunos casos, los polipéptidos ActRIIA comprenden, consisten o consisten esencialmente en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 9, 10, 11, 32, 36 y 39.
En determinados casos, la presente descripción se refiere a polipéptidos trampa de GDF (también denominados "trampas de GDF"). En algunos casos, las trampas de GDF de la presente descripción son polipéptidos ActRII variantes (por ejemplo, polipéptidos ActRIIA y ActRIIB) que comprenden una o más mutaciones (por ejemplo, adiciones, deleciones, sustituciones y combinaciones de aminoácidos de los mismo) en el dominio extracelular (también denominado como dominio de unión a ligando) de un polipéptido ActRII (por ejemplo, un polipéptido ActRII "de tipo silvestre" o no modificado) de modo que el polipéptido ActRII variante tiene una o más actividades de unión a ligando alteradas que el polipéptido ActRII de tipo silvestre correspondiente. En casos preferidos, los polipéptidos trampa de GDF de la presente descripción conservan al menos una actividad similar a un polipéptido ActRII de tipo silvestre correspondiente. Por ejemplo, las trampas de GDF preferentes se unen e inhiben (por ejemplo, antagonizan) la función de GDF11 y/o GDF8. En algunos casos, las trampas de GDF de la presente descripción se unen e inhiben además uno o más ligandos de GDF/BMP. Por consiguiente, la presente descripción proporciona polipéptidos trampa de GDF que tienen una especificidad de unión alterada para uno o más ligandos de ActRII.
Con fines ilustrativos, se pueden seleccionar una o más mutaciones que aumenten la selectividad del dominio de unión a ligando alterado para GDF11 y/o GDF8 sobre uno o más ligandos de unión a ActRII tales como activinas (activina A, activina B, activina AB, activina C y/o activina E), particularmente activina A. Opcionalmente, el dominio de unión a ligando alterado tiene una relación de Kd para la unión a activina con respecto a Kd para la unión a GDF11 y/o GDF8 que es al menos 2, 5, 10, 20, 50, 100 o incluso 1000 veces mayor en relación con la relación del dominio de unión a ligando de tipo silvestre. Opcionalmente, el dominio de unión a ligando alterado tiene una relación de CI50 para inhibir la activina con respecto a una CIso para inhibir GDF11 y/o GDF8 que es al menos 2, 5, 10, 20, 50, 100 o incluso 1000 veces mayor en relación con el dominio de unión a ligando de tipo silvestre. Opcionalmente, el dominio de unión a ligando alterado inhibe GDF11 y/o GDF8 con una CI50 al menos 2, 5, 10, 20, 50, 100 o incluso 1000 veces menor que la CI50 para inhibir la activina.
Los residuos de aminoácidos de las proteínas ActRIIB (por ejemplo, E39, K55, Y60, K74, W78, L79, D80 y F101 con respecto a la SEQ ID NO: 1) están en la cavidad de unión a ligando de ActRIIB y facilitan unión mediada a sus ligandos incluyendo, por ejemplo, activina A, GDF11 y GDF8. Por lo tanto, la presente descripción proporciona polipéptidos trampa de GDF que comprenden un dominio de unión a ligando alterado (por ejemplo, un dominio de unión a GDF8/GDF11) de un receptor ActRIIB que comprende una o más mutaciones en estos residuos de aminoácidos. Como ejemplo específico, el residuo de aminoácido cargado positivamente Asp (D80) del dominio de unión a ligando de ActRIIB se puede mutar a un residuo de aminoácido diferente para producir un polipéptido trampa de GDF que se une preferentemente a GDF8, pero no a activina. Preferentemente, el residuo D80 con respecto a la SEQ ID NO: 1 se cambia a un residuo de aminoácido seleccionado entre el grupo que consiste en: un residuo de aminoácido no cargado, un residuo de aminoácido negativo y un residuo de aminoácido hidrófobo. Como un ejemplo específico adicional, el residuo hidrófobo L79 de SEQ ID NO: 1 se puede alterar para conferir propiedades de unión a activina-GDF11/GDF8 alteradas. Por ejemplo, una sustitución de L79P reduce la unión a GDF11 en mayor medida que la unión a activina. Por el contrario, la sustitución de L79 por un aminoácido ácido [un ácido aspártico o ácido glutámico; una sustitución de L79D o L79E] reduce en gran medida la afinidad de unión a activina A mientras que conserva la afinidad de unión a GDF11. En casos de ejemplo, los procedimientos descritos en esta invención utilizan un polipéptido trampa GDF que es un polipéptido ActRIIB variante que comprende un aminoácido ácido (por ejemplo, D o E) en la posición correspondiente a la posición 79 de SEQ ID NO: 1, opcionalmente en combinación con uno o más sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos adicionales.
En determinados casos, la descripción se refiere a polipéptidos ALK4 y usos de los mismos. Como se usa en esta invención, el término "ALK4" se refiere a una familia de proteínas cinasa 4 de tipo receptor de activina de cualquier especie y variantes derivadas de dichas proteínas ALK4 por mutagénesis u otra modificación. Se entiende que la referencia a ALK4 en esta invención es una referencia a cualquiera de las formas identificadas actualmente. Los miembros de la familia ALK4 son generalmente proteínas transmembrana, compuestas por un dominio extracelular de unión a ligando con una región rica en cisteína, un dominio transmembrana y un dominio citoplásmico con actividad de serina/treonina cinasa predicha.
La expresión "polipéptido ALK4" incluye polipéptidos que comprenden cualquier polipéptido de origen natural de un miembro de la familia ALK4, así como cualquier variante del mismo (incluidos mutantes, fragmentos, fusiones y formas peptidomiméticas) que conservan una actividad útil. La numeración de aminoácidos para todos los polipéptidos relacionados con ALK4 descritos en esta invención se basa en la numeración de la secuencia de la proteína precursora de ALK4 humana a continuación (SEQ ID NO: 100), a menos que se designe específicamente de otro modo.
Una secuencia de proteína precursora de ALK4 humana (Sec. de ref. de NCBI NP_004293) es la siguiente:
1 MAE SAGAS S F FPLWLLLAG SGGSGPRGVQ ALLCACTSCL QANYTCE TDG
ACMVSIFNLD
61 GMEHHVRTCI PKVELVPAGK PFYCLSSEDL RNTHCCYTDY CNRIDLRVPS
GHLKEPEHPS
121 MWGPVELVGI IAGPVFLLFL I I I IV F L V IW YHQRVYHWRQ RLDMEDPSCE
MCLSKDKTLQ
181 DLVYDLSTSG SGSGLFLFVQ RTVARTIVLQ EIIGKGRFGE VWRGRWRGGD
VAVKIFSSRE
241 ERSWFREAEI YQTVMLRHEN ILGFIAADNK DNGTWTQLWL VSDYHEHGSL
FDYLNRYTVT
301 IEGMIKLALS AASGLAHLHM EIVGTQGKPG IAHRDLKSKN ILVKKNGMCA
IADLGLAVRH
361 DAVTDTIDIA PNQRVGTKRY MAPEVLDETI NMKHFDSFKC ADIYALGLVY
WEIARRCNSG
421 GVHEEYQLPY YDLVPSDPSI EEMRKWCDQ KLRPWIPNWW QSYEALRVMG
KMMRECWYAN
481 GAARLTALRI KKTLSQLSVQ EDVKI (SEQ ID NO: 100)
El péptido señal se indica con un subrayado sencillo y el dominio extracelular se indica en negrita.
Una secuencia de polipéptido ALK4 humano extracelular procesada es la siguiente:
5GPRGVQALLCACTSCLQANYTCETDGACMVSIFNLDGMEHHVRTCIPKVELVPAGKPFYCL
SSEDLRNTHCCYTDYCNRIDLRVPSGHLKEPEHPSMWGPVE (SEQ ID NO: 101)
A continuación se muestra una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína precursora de ALK4 (SEQ ID NO: 102), correspondiente a los nucleótidos 78-1592 de la secuencia de referencia de Genbank NM_004302.4. La secuencia señal está subrayada y el dominio extracelular se indica en negrita.
ATGGCGGAGTCGGCCGGAGCCTCCTCCTTCTTCCCCCTTGTTGTCCTCCTGCTCGCCGGCAG
CGGCGGGTCCGGGCCCCGGGGGGTCCAGGCTCTGCTGTGTGCGTGCACCAGCTGCCTCCAGG
CCAAC TACACG TG TGAGACAGATGGGGCC TGCATGGT T TCCAT T T TCAATC TGGATGGGATG
GAGCACCATGTGCGCACCTGCATCCCCAAAGTGGAGCTGGTCCCTGCCGGGAAGCCCTTCTA
CTGCCTGAGCTCGGAGGACCTGCGCAACACCCACTGCTGCTACACTGACTACTGCAACAGGA
TCGACTTGAGGGTGCCCAGTGGTCACCTCAAGGAGCCTGAGCACCCGTCCATGTGGGGCCCG
GTGGAGCTGGTAGGCATCATCGCCGGCCCGGTGTTCCTCCTGTTCCTCATCATCATCATTGT
TTTCCTTGTCATTAACTATCATCAGCGTGTCTATCACAACCGCCAGAGACTGGACATGGAAG
AT C C C T C AT G T G AG AT GTGTCTCTC CAAAGACAAGAC G C T C CA.G GA_T C T T G T C T A_C GA_T C T C
TCCACCTCAGGGTCTGGCTCAGGGTTACCCCTCTTTGTCCAGCGCACAGTGGCCCGAACCAT
CGTTTTACAAGAGATTATTGGCAAGGGTCGGTTTGGGGAAGTATGGCGGGGCCGCTGGAGGG
GTGGTGATGTGGCTGTGAAAATATTCTCTTCTCGTGAAGAACGGTCTTGGTTCAGGGAAGCA
GAGATATACCAGACGGT CAT GCTGCGCCATGAAAACAT CCT T GGAT T TAT T GCT GCT GACAA
TAAAGATAATGGCACCTGGACACAGCTGTGGCTTGTTTCTGACTATCATGAGCACGGGTCCC
TGTTTGATTATCTGAACCGGTACACAGTGACAATTGAGGGGATGATTAAGCTGGCCTTGTCT
GCTGCTAGTGGGCTGGCACACCTGCACATGGAGATCGTGGGCACCCAAGGGAAGCCTGGAAT
T G C T CAT C GAGAC T TAAAGT CAAAGAACAT T CT GGT GAAGAAAAATGGCAT GT GT GCCATAG
CAGACCTGGGCCTGGCTGTCCGTCATGATGCAGTCACTGACACCATTGACATTGCCCCGAAT
CAGAGGGTGGGGACCAAACGATACATGGCCCCTGAAGTACTTGATGAAACCATTAATATGAA
a c a c t t t g a c t c c t t t a a a t g t g c t g a t a t t t a t g c c c t c g g g c t t g t a t a t t g g g a g a t t g
CTCGAAGATGCAATTCTGGAGGAGTCCATGAAGAATATCAGCTGCCATATTACGACTTAGTG
C c c T c T GAC C C T T CCAT T GAGGAAATGCGAAAGGT T GTAT GT GAT CAGAAGCTGCGTCCCAA
CATCCCCAACTGGTGGCAGAGTTATGAGGCACTGCGGGTGATGGGGAAGATGATGCGAGAGT
g t t g g t a t g c c a a c g g c g c a g c c c g c c tg a c g g c c c tg c g c a tc a a g a ag a c c c t c tc c c a g CTCAGCGTGCAGGAAGACGTGAAGATC (SEQ ID NO: 102}
Una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido ALK4 extracelular es la siguiente:
T C C G G G C CCCGGG G G G T CCAGGCTC T G C T GT GTGCG I' G CAC C/CC-i C T G C C T C CAG G C CAAC T A C AC G T G T G AC-AGAGAT G G G G C C T G C A T G G T T T C CA T T T T CA AT C T G G AT G G GAT G GAG CAC C AT G T G C G CAC C T G CA.T C C C CAAAG T G GAG C T G G T C C C T G C C G G GAAG C C C T T C T A.C T G C C T G AG C T C G GAG GAC CTGCGCAACACCCACTGCTG C TACAC T GAC TAC T G CAACAGGAT CGACT T GAG G G T G C C CAG T G G T CAC C T CAAG GAG C C T GAG CAC C C G T C CAT G T G G GGCCCGGTGGAG
(SEQ ID NO: 103}
Una ¡soforma alternativa de la secuencia de la proteína precursora de ALK4 humana, la ¡soforma B (Sec. de Ref. de NCBI NP_064732.3), es la siguiente:
I MVSIFNLDGM EHHVRTCIPK VELVPAGKPF YCLSSEDLRN THCCYTDYCN RIDLRVPSGH
61 LKEPEHPSMW GPVELVGIIA GPVFLLFLII IIVFLVINYH QRVYHNRQRL DMEDPSCEMC
121 LSKDKTLQDL VYDLSTSGSG SGLPLFVQRT VARTIVLQEI IGKGRFGEVW RGRWRGGDVA
131 VKIFSSREER SWFREAEIYQ TVMLRHENIL GFIAADNKDN GTWTQLWLVS DYHEHGSLFD
2 41 YLNRYTVTIE GMIKLALSAA SGLAHLHMEI VGTQGIÍPGIA HRDLKSKNIL VKKNGMCAIA
301 DLGLAVRHDA VTDTIDIAPN QRVGTKRYMA PEVLDETINM KHED3FKCAD IYALGLVYWE
361 IARRCNSGGV HEEYQLPYYD LVPSDPSIEE MRKWCDQKL RPNIPKWWQS YEALR\T*IGKM
421 MRECWYANGA ARLTALRIKK TLSQLSVQED VKI (SEQ ID NO: 104)
El dominio extracelular se indica en negrita.
Una secuencia de polipéptido ALK4 extracelular procesada es la siguiente:
i MVSIFNLDGM EliÍIVRTClPK VELVPAGKPF YCLSGEDLRE TIICCYTDYCN RIDLRVPSGH 61 LKEPEHPSMW GPVE í SEQ ID NO: 105)
A continuación se muestra una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína precursora de ALK4 (isoforma B) (SEQ ID NO: 106), correspondiente a los nucleótidos 186-1547 de la secuencia de referencia de Genbank NM_020327.3. Los nucleótidos que codifican el dominio extracelular se indican en negrita.
1 ATGGTTTCCA TTTTCAATCT GGATGGGATG GAGCACCATG TGCGCACCTG
51 CATCCCCAAA GTGGAGCTGG TCCCTGCCGG GAAGCCCTTC TACTGCCTGA
101 GCTCGGAGGA CCTGCGCAAC ACCCACTGCT GCTACACTGA CTACTGCAAC
151 AGGATCGACT TGAGGGTGCC CAGTGGTCAC CTCAAGGAGC CTGAGCACCC
201 GTCCATGTGG GGCCCGGTGG AGCTGGTAGG CATCATCGCC GGCCCGGTGT
251 TCCTCCTGTT CCTCATCATC ATCATTCTTT TCCTTCTCAT TAACTATCAT
301 CAGCGTGTCT ATCACAACCG CCAGAGACTG GACATGGAAG ATCCCTCATG
351 TGAGATGTGT C'i'CTCCAAAG ACAAGACGGT CCAGGATCTT GTCTACGATC
401 TCTCCACCTC AGGGTCTGGC TCAGCGTTAC CCCTCTTTGT CCAGCGCACA.
451 GTGGCCCGAA CCATCGTTTT ACAAGAGATT ATTGGCAAGG GTCGGTTTGG
501 GGAAGTATGG CGGGGCCGCT GGAGGGGTGG TGATGTGGCT GTGAAAATAT
551 TCTCTTCTCG TGAAGAACGG TCTTGGTT'CA. GGGAAGCAGA GATATACCAG
601 ACGGTCATGC TGCGCCATGA AAACATCCTT GGATTTATTG CTGCTGACAA
651 TAAAGATAAT GGCACCTGGA CACAGCTGTG GCTTGTTTCT GACTATCATG
701 AGCACGGGTC CCTGTTTGA.T TATCTGAACC GGTACACAGT GACAATTGAG
751 GGGATGATTA AGCTGGCCTT GTCTGCTGCT AGTGGGCTGG CACACCTGCA
801 CATGGAGATC GTGGGCACCC AAGGGAAGCC TGGAATTGCT CATCGAGACT
851 TAAAGTCAAA GAACATTCTG GTGAAGAAAA ATGGCATGTG TGCCATAGCA
901 GACGTGGGCC TGGCTGTCCG TCATGATGCA GTCACTGACA CCATTGACAT
951 TGCCCCGAAT CAGAGGGTGG GGACCAAACG A.TACATGGCC CCTGAAGTAC
1001 TTGATGAAAC CATTAATATG AAACACTTTG ACTCCTTTAA ATGTGCTGAT
1051 ATTTATGCCC TCGGGCTTGT ATATTGGGAG A.TTGCTCGAA GATGCAATTC
1101 TGGAGGAGTC CATGAAGAAT ATCAGCTGCC ATATTACGAC TTAGTGCCCT
1151 CTGACCCTTC CATTGAGGAA ATGCGAAAGG TTGTA.TGTGA TCAGAAGCTG
1201 CGTCCCAACA TCCCCAACTG GTGGCAGAGT TATGA.GGCAC TGCGGGTGAT
1251 GGGGAAGATG ATGCGAGAGT GTTGGTATGC CAACGGCGCA GCCCGCCTGA
1301 CGGCCCTGCG CATCAAGAAG ACCCTCTCCC A.GCTCAGCGT GCAGGAAGAC
1351 GTGAAGATCT AA (SEQ ID NO: 106]
Una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido ALK4 extracelular (isoforma B) es la siguiente:
1 ATGGTTTCCA TTTTCAATCT GGATGGGATG GAGCACCATG TGCGCACCTG
51 CATCCCCAAA GTGGAGCTGG TCCCTGCCGG GAAGCCCTTC TACTGCCTGA
101 GCTCGGAGGA CCTGCGCAAC ACCCACTGCT GCTACACTGA CTACTGCAAC
151 AGGATCGACT TGAGGGTGCC CAGTGGTCAC CTCAAGGAGC CTGAGCACCC
201 GTCCATGTGG GGCCCGGTGG AGCTGGTAGG { SEQ ID NO: 107}
ALK4 está bien conservada entre los vertebrados, con grandes extensiones del dominio extracelular completamente conservadas. Por ejemplo, la figura 18 representa un alineamiento de múltiples secuencias de un dominio extracelular de ALK4 humana en comparación con diversos ortólogos de ALK4. Muchos de los ligandos que se unen a ALK4 también están muy conservados. Por consiguiente, a partir de estos alineamientos, es posible predecir las posiciones de los aminoácidos clave dentro del dominio de unión a ligando que son importantes para las actividades normales de unión a ligando de ALK4, así como predecir las posiciones de los aminoácidos que probablemente sean tolerantes a la sustitución sin alterar significativamente las actividades normales de unión a ligando de ALK4. Por lo tanto, un polipéptido variante de ALK4 humano activo útil según los presentes procedimientos descritos puede incluir uno o más aminoácidos en las posiciones correspondientes de la secuencia de otra ALK4 de vertebrado, o puede incluir un residuo que es similar al de las secuencias humanas o de otros vertebrados.
Sin pretender ser limitativos, los siguientes ejemplos ilustran este enfoque para definir una variante activa de ALK4. Como se ilustra en la figura 18, V6 en el dominio extracelular de ALK4 humana (SEQ ID NO: 126) es isoleucina en ALK4 de Mus muculus (SEQ ID NO: 130), por lo que la posición se puede alterar, y opcionalmente se puede alterar con respecto a otro residuo hidrófobo tal como L, I o F, o un residuo no polar tal como A, como se observa en ALK4 de Gallus gallus (SEQ ID NO: 129). E40 en el dominio extracelular humano es K en ALK4 de Gallus gallus, lo que indica que este sitio puede tolerar una amplia diversidad de cambios, incluidos residuos polares, tales como E, D, K, R, H, S, T, P, G, Y, y probablemente un residuo no polar tal como A. S15 en el dominio extracelular humano es D en ALK4 de Gallus gallus, lo que indica que se tolera una amplia variación estructural en esta posición, con residuos polares favorecidos, tales como S, T, R, E, K, H, G, P, G e Y. E40 en el dominio extracelular humano es K en ALK4 de Gallus gallus, lo que indica que se tolerarán residuos cargados en esta posición, incluyendo D, R, K, H, así como Q y N. R80 en el dominio extracelular humano es K en ALK4 de Condylura cristata (SEQ ID NO: 127), lo que indica que se toleran residuos básicos en esta posición, incluyendo R, K y H. Y77 en el dominio extracelular humano es F en ALK4 de Sus scrofa (SEQ ID NO: 131), lo que indica que se toleran residuos aromáticos en esta posición, incluyendo F, W e Y. P93 en el extracto humano El dominio extracelular humano está relativamente mal conservado, apareciendo como S en ALK4 de Erinaceus europaeus (SEQ ID NO: 128) y N en ALK4 de Gallus gallus, por lo que prácticamente cualquier aminoácido debería tolerarse en esta posición.
Además, las proteínas ALK4 se han caracterizado en la técnica en términos de características estructurales y funcionales, particularmente con respecto a la unión a ligando [por ejemplo, Harrison y col. (2003) J Biol Chem 278(23):21129-21135; Romano y col. (2012) J Mol Model 18 (8): 3617-3625; y Calvanese y col. (2009) 15(3): 175­ 183]. Además de las enseñanzas de esta invención, estas referencias proporcionan una amplia orientación sobre cómo generar variantes de ALK4 que conservan una o más actividades normales (por ejemplo, actividad de unión a ligando).
Por ejemplo, un motivo estructural definitorio conocido como pliegue de toxina de tres dedos es importante para la unión a ligando por los receptores de tipo I y tipo II y está formado por residuos de cisteína conservados ubicados en posiciones variables dentro del dominio extracelular de cada receptor monomérico [Greenwald y col. (1999) Nat Struct Biol 6:18-22; y Hinck (2012) FEBS Lett 586:1860-1870]. Por consiguiente, los dominios de unión a ligando centrales de ALK4 humana, según lo demarcado por la más externa de estas cisteínas conservadas, corresponden a las posiciones 34-101 de la SEQ ID NO: 100 (precursor de ALK4). Los aminoácidos estructuralmente menos ordenados que flanquean estas secuencias centrales demarcadas por cisteína se pueden truncar por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 residuos en el extremo N y/o por 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24 o 25 residuos en el extremo C sin alterar necesariamente la unión a ligando. Los dominios extracelulares de ALK4 de ejemplo para el truncamiento N-terminal y/o C-terminal incluyen las SEQ ID NO: 101 y 105.
Por consiguiente, una fórmula general para una porción activa (por ejemplo, porción de unión a ligando) de ALK4 comprende los aminoácidos 34-101 con respecto a la SEQ ID NO: 100. Por lo tanto, los polipéptidos ALK4 pueden, por ejemplo, comprender, consistir esencialmente o consistir en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a una porción de ALK4 que comienza en un residuo correspondiente cualquiera de los aminoácidos 24-34 (por ejemplo, que comienza en cualquiera de los aminoácidos 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 o 34) de SEQ ID NO: 100 y que termina en una posición correspondiente a cualquiera de los aminoácidos 101-126 (por ejemplo, que termina en cualquiera de los aminoácidos 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 o 126) de SEQ ID NO: 100. Otros ejemplos incluyen construcciones que comienzan en una posición desde 24-34 (por ejemplo, cualquiera de las posiciones 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 o 34), 25-34 (por ejemplo, cualquiera de las posiciones 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 o 34), o 26-34 (por ejemplo, cualquiera de las posiciones 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 o 34) de SEQ ID NO: 100 y terminan en una posición desde 101-126 (por ejemplo, cualquiera de las posiciones 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 o 126), 102-126 (por ejemplo, cualquiera de las posiciones 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 o 126), 101-125 (por ejemplo, cualquiera de las posiciones 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124 o 125), 101-124 (por ejemplo, cualquiera de las posiciones 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123 o 124), 101-121 (por ejemplo, cualquiera de las posiciones 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120 o 121), 111-126 (por ejemplo, cualquiera de las posiciones 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 o 126), 111-125 (por ejemplo, cualquiera de las posiciones 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124 o 125), 111-124 (por ejemplo, cualquiera de las posiciones 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123 o 124), 121-126 (por ejemplo, cualquiera de las posiciones 121, 122, 123, 124, 125 o 126), 121-125 (por ejemplo, cualquiera de las posiciones 121, 122, 123, 124 o 125), 121-124 (por ejemplo, cualquiera de las posiciones 121, 122, 123 o 124), o 124-126 (por ejemplo, cualquiera de las posiciones 124, 125 o 126) de SEQ ID NO: 100. También se contemplan variantes dentro de estos intervalos, particularmente aquellas que tienen al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % de identidad con la porción correspondiente de SEQ ID NO: 100.
Las variaciones descritas en esta invención se pueden combinar de diversas formas. En algunos casos, las variantes de ALK4 no comprenden más de 1, 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o 15 cambios de aminoácidos conservadores en la cavidad de unión a ligando. Los sitios fuera de la cavidad de unión, en los que la variabilidad puede tolerarse particularmente bien, incluyen los extremos amino y carboxi del dominio extracelular (como se ha indicado anteriormente).
En determinados casos, la descripción se refiere a antagonistas de BMP/GDF que son heteromultímeros que comprenden al menos un polipéptido ALK4, que incluye fragmentos, variantes funcionales y formas modificadas de los mismos, así como usos de los mismos (por ejemplo, tratar, prevenir o reducir la gravedad de la HAP o una o más complicaciones de la HAP). Preferentemente, los polipéptidos ALK4 son solubles (por ejemplo, un dominio extracelular de ALK4). En algunos casos, los heteromultímeros que comprenden un polipéptido ALK4 inhiben (por ejemplo, señalización de Simad) de uno o más ligandos de la superfamilia de TGFp [por ejemplo, GDF11, g DF8, activina (activina A, activina B, activina AB, activina C, activina E), BMP6, GDF3, bMP10 y/o b Mp9]. En algunos casos, los heteromultímeros que comprenden un polipéptido ALK4 se unen a uno o más ligandos de la superfamilia de TGFp [por ejemplo, GDF11, GDf8, activina (activina A, activina B, activina AB, activina C, activina E), b Mp6, GDF3, BMP10 y/o bMP9]. En algunos casos, los heteromultímeros comprenden al menos un polipéptido ALK4 que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 %, 100 % idéntico a los aminoácidos 34-101 con respecto a la SEQ ID NO: 100. En algunos casos, los heteromultímeros comprenden al menos un polipéptido ALK4 que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntico a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 100, 101, 104, 105, 111, 113, 116, 117, 122 y 124. En algunos casos, los heteromultímeros comprenden al menos un polipéptido ALK4 que consiste o consiste esencialmente en al menos un polipéptido ALK4 que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntico a la secuencia de aminoácidos de SeQ ID NO: 100, 101, 104, 105, 111, 113, 116, 117, 122 y 124.
En determinados casos, la presente descripción se refiere a complejos heteromultiméricos que comprenden uno o más polipéptidos del receptor ALK4 (por ejemplo, SEQ ID NO: 100, 101, 104, 105, 111, 113, 116, 117, 122 y 124 y variantes de las mismas) y uno o más polipéptidos del receptor ActRIIB (por ejemplo, SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 58, 59, 60, 63, 64, 65, 66, 68, 69, 70, 71, 73, 77, 78, 108, 110, 114, 115, 118 y 120 y variantes de las mismas), que generalmente se denominan en esta invención "complejos heteromultiméricos de ALK4:ActRIIB" o "heteromultímeros de ALK4:ActRIIB", incluidos los usos de los mismos (por ejemplo, aumentar una respuesta inmunitaria en un paciente que lo necesite y tratar un cáncer). Preferentemente, los heteromultímeros de ALK4:ActRIIB son solubles [por ejemplo, un complejo heteromultimérico comprende una porción (dominio) soluble de un receptor ALK4 y una porción (dominio) soluble de un receptor ActRIIB]. En general, los dominios extracelulares de ALK4 y ActRIIB corresponden a la porción soluble de estos receptores. Por lo tanto, en algunos casos, los heteromultímeros de ALK4:ActRIIB comprenden un dominio extracelular de un receptor ALK4 y un dominio extracelular de un receptor ActRIIB. En algunos casos, los heteromultímeros de ALK4:ActRIIB inhiben (por ejemplo, señalización de Smad) de uno o más ligandos de la superfamilia de TGFp [por ejemplo, GDF11, g DF8, activina (activina A, activina B, activina AB, activina C, activina E), b Mp6, GDF3, BMP10 y/o Bm P9]. En algunos casos, los heteromultímeros de ALK4:ActRIIB se unen a uno o más ligandos de la superfamilia de TGFp [por ejemplo, GDF11, GDF8, activina (activina A, activina B, activina AB, activina C, activina E), BMP6, GDF3, BMP10 y/o BMP9]. En algunos casos, los heteromultímeros de ALK4:ActRIIB comprenden al menos un polipéptido ALK4 que comprende, consiste esencialmente o consiste en una secuencia que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 % 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 100, 101, 104, 105, 111, 113, 116, 117, 122 y 124. En algunos casos, los complejos heteromultiméricos de ALK4:ActRIIB de la descripción comprenden al menos un polipéptido ALK4 que comprende, consiste esencialmente o consiste en una secuencia que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 % 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a una porción de ALK4 que comienza en un residuo correspondiente cualquiera de los aminoácidos 24-34, 25-34 o 26-34 de SEQ ID NO: 100 y que termina en una posición desde 101-126, 102-126, 101-125, 101-124, 101­ 121, 111-126, 111-125, 111-124, 121-126, 121-125, 121-124 o 124-126 de SEQ ID NO: 100. En algunos casos, los heteromultímeros de ALK4:ActRIIB comprenden al menos un polipéptido ALK4 que comprende, consiste esencialmente o consiste en una secuencia que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 % 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a los aminoácidos 34-101 con respecto a la SEQ ID NO: 100. En algunos casos, los heteromultímeros de ALK4-ActRIIB comprenden al menos un polipéptido ActRIIB que comprende, consiste esencialmente o consiste en una secuencia que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 % 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 58, 59, 60, 63, 64, 65, 66, 68, 69, 70, 71, 73, 77, 78, 108, 110, 114, 115, 118 y 120. En algunos casos, los complejos heteromultiméricos de ALK4:ActRIIB de la descripción comprenden al menos un polipéptido ActRIIB que comprende, consiste esencialmente o consiste en una secuencia que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 % 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a una porción de ActRIIB que comienza en un residuo correspondiente cualquiera de los aminoácidos 20-29, 20-24, 21-24, 22-25 o 21-29 y termina en una posición desde 109-134, 119-134, 119-133, 129-134 o 129-133 de SEQ ID NO: 1. En algunos casos, los heteromultímeros de ALK4:ActRIIB comprenden al menos un polipéptido ActRIIB que comprende, consiste esencialmente o consiste en una secuencia que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 % 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a los aminoácidos 29-109 de SEQ ID NO: 1. En algunos casos, los heteromultímeros de ALK4:ActRIIB comprenden al menos un polipéptido ActRIIB que comprende, consiste esencialmente o consiste en una secuencia que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 % 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a los aminoácidos 25-131 de SEQ ID NO: 1. En determinados casos, los complejos heteromultiméricos de ALK4:ActRIIB de la descripción comprenden al menos un polipéptido ActRIIB donde la posición correspondiente a L79 de SEQ ID NO: 1 no es un aminoácido ácido (es decir, residuos de aminoácidos D o E que no son de origen natural o un residuo de aminoácido ácido artificial). Los heteromultímeros de ALK4:ActRIIB de la descripción incluyen, por ejemplo, heterodímeros, heterotrímeros, heterotetrámeros y estructuras oligoméricas de orden superior adicionales. Véanse, por ejemplo, las figuras 21 -23. En determinados casos preferidos, los complejos heteromultiméricos de la descripción son heterodímeros de ALK4:ActRIIB.
En algunos casos, la presente descripción contempla la elaboración de variantes funcionales modificando la estructura de un polipéptido ActRII y/o ALK4 con fines tales como mejorar la eficacia terapéutica o la estabilidad (por ejemplo, semivida y resistencia a la degradación proteolítica in vivo). Las variantes se pueden producir mediante sustitución, deleción o adición de aminoácidos o combinaciones de los mismos. Por ejemplo, es razonable esperar que un reemplazo aislado de una leucina por una isoleucina o valina, un aspartato por un glutamato, una treonina por una serina, o un reemplazo similar de un aminoácido por un aminoácido estructuralmente relacionado (por ejemplo, mutaciones conservadoras) no tendrá un efecto importante sobre la actividad biológica de la molécula resultante. Los reemplazos conservadores son aquellos que se llevan a cabo dentro de una familia de aminoácidos que están relacionados respecto a sus cadenas laterales. Puede determinarse fácilmente si un cambio en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de la descripción da como resultado un homólogo funcional evaluando la capacidad del polipéptido variante para producir una respuesta en las células de una manera similar al polipéptido de tipo silvestre, o para unirse a uno o más ligandos de TGF-beta, incluyendo, por ejemplo, BMP2, BMP2/7, BMP3, BMP4, BMP4/7, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8a, BMP8b, BMP9, BMP10, GDF3, GDF5, GDF6/BMP13, GDF7, GDF8, GDF9b/BMP15, GDF11/BMP11, GDF15/MIC1, TGF-p1, TGF-p2, TGF-p3, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, nodal, factor neurotrófico derivado de células gliales (GDNF), neurturina, artemina, persefina, MIS y Lefty.
En determinados casos, la presente descripción contempla mutaciones específicas de un polipéptido ActRII y/o ALK4 para alterar la glucosilación del polipéptido. Dichas mutaciones se pueden seleccionar para introducir o eliminar uno o más sitios de glucosilación, tales como sitios de glucosilación ligados a O o N. Los sitios de reconocimiento de glucosilación ligados a asparagina comprenden generalmente una secuencia tripeptídica, asparagina-X-treonina o asparagina-X-serina (donde "X" es cualquier aminoácido) que se reconoce específicamente por enzimas de glucosilación celular apropiadas. La alteración también puede realizarse mediante la adición o sustitución por uno o más residuos de serina o treonina con respecto a la secuencia del polipéptido (para los sitios de glucosilación ligados a O). Una diversidad de sustituciones o deleciones de aminoácidos en una o ambas de la primera o tercera posiciones de aminoácidos de un sitio de reconocimiento de glucosilación (y/o deleción de aminoácidos en la segunda posición) da como resultado la no glucosilación en la secuencia tripeptídica modificada. Otro medio para aumentar el número de restos de carbohidratos en un polipéptido es mediante acoplamiento químico o enzimático de glucósidos al polipéptido. Dependiendo del modo de acoplamiento utilizado, el azúcar o azúcares pueden unirse a (a) arginina e histidina; (b) grupos carboxilo libres; (c) grupos sulfhidrilo libres tales como los de cisteína; (d) grupos hidroxilo libres tales como los de serina, treonina o hidroxiprolina; (e) residuos aromáticos tales como los de fenilalanina, tirosina o triptófano; o (f) el grupo amida de la glutamina. La eliminación de uno o más restos de carbohidratos presentes en un polipéptido se puede realizar química y/o enzimáticamente. La desglucosilación química puede implicar, por ejemplo, la exposición de un polipéptido al compuesto ácido trifluorometanosulfónico, o un compuesto equivalente. Este tratamiento da como resultado la escisión de la mayor parte o todos los azúcares excepto el azúcar de enlace (N-acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina), dejando intacta la secuencia de aminoácidos. La escisión enzimática de restos de carbohidratos en polipéptidos se puede lograr mediante el uso de una diversidad de endo y exoglucosidasas como se describe por Thotakura y col. [Meth. Enzymol. (1987) 138:350]. La secuencia de un polipéptido puede ajustarse, según sea apropiado, dependiendo del tipo de sistema de expresión usado, ya que las células de mamífero, levadura, insecto y vegetales pueden introducir patrones de glucosilación diferentes que pueden verse afectados por la secuencia de aminoácidos del péptido. En general, los polipéptidos de la presente descripción para su uso en seres humanos pueden expresarse en una línea celular de mamífero que proporcione una glucosilación adecuada, tal como líneas celulares HEK293 o CHO, aunque se espera que también sean útiles otras líneas celulares de expresión de mamífero.La presente descripción contempla además un procedimiento para generar mutantes, particularmente conjuntos de mutantes combinatorios de un polipéptido ActRII y/o ALK4, así como mutantes de truncamiento. Los conjuntos de mutantes combinatorios son especialmente útiles para identificar secuencias de ActRII funcionalmente activas (por ejemplo, unión a ligando de GDF/BMP). El propósito de cribar dichas bibliotecas combinatorias puede ser generar, por ejemplo, variantes de polipéptidos que tengan propiedades alteradas, tales como farmacocinética alterada o unión a ligando alterada. A continuación se proporciona una diversidad de ensayos de cribado, y dichos ensayos pueden usarse para evaluar variantes. Por ejemplo, las variantes de ActRII y/o ALK4, y los heteromultímeros que comprenden los mismos, pueden cribarse para determinar su capacidad para unirse a uno o más ligandos de GDF/BMP (por ejemplo, BMP2, BMP2/7, BMP3, BMP4, BMP4/7, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8a, BMP8b, BMP9, BMP10, GDF3, GDF5, GDF6/BMP13, GDF7, GDF8, GDF9b/BMP15, GDF11/BMP11, GDF15/MIC1, TGF-pi, TGF-P2, TGF-p3, activina A, activina B, activina AB, activina AC, nodal, factor neurotrófico derivado de células gliales (GDNF), neurturina, artemina, persefina, MIS y Lefty), para evitar la unión de un ligando de GDF/BMP a un polipéptido ActRII y/o ALK4, así como heteromultímeros de los mismos, y/o para interferir con la señalización provocada por un ligando de GDF/BMP.
La actividad de los polipéptidos ActRII, polipéptidos ALK4 y heterodímeros de ALK4:ActRIIB también se puede ensayar en un ensayo in vivo o basado en células. Por ejemplo, se evaluó el efecto de un polipéptido ActRII, polipéptido ALK4 o heterodímero de ALK4:ActRIIB sobre la expresión de genes implicados en la patogénesis de la HP. Esto se puede realizar, según sea necesario, en presencia de una o más proteínas de ligando recombinantes (por ejemplo, BMP2, BMP2/7, BMP3, BMP4, BMP4/7, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8a, BMP8b, BMP9, BMP10, GDF3, GDF5, GDF6/BMP13, GDF7, GDF8, GDF9b/BMP15, GDF11/BMP11, GDF15/MIC1, TGF-pi, TGF-p2, TGF-p3, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, nodal, factor neurotrófico derivado de células gliales (GDNF), neurturina, artemina, persefina, MIS y Lefty), y las células pueden transfectarse para producir un polipéptido ActRII, polipéptido ALK4 o heterodímero de ALK4:ActRIIB y opcionalmente, un ligando de GDF/BMP. Asimismo, se puede administrar a un ratón u otro animal un polipéptido ActRII, polipéptido ALK4 o heterodímero de ALK4:ActRIIB y se pueden evaluar los efectos sobre la patogénesis de la HP usando procedimientos reconocidos en la técnica. De manera similar, la actividad de un polipéptido ActRII, polipéptido ALK4 o heterodímero de ALK4:ActRIIB o una variante de los mismos puede ensayarse en células precursoras de células sanguíneas para determinar cualquier efecto sobre el crecimiento de estas células, por ejemplo, mediante los ensayos como se describen en esta invención y los de conocimiento común en la técnica. Puede usarse un gen indicador que responde a SMAD en dichas líneas celulares para monitorizar los efectos sobre la señalización cadena abajo.
Se pueden generar variantes derivadas de combinaciones que tienen una selectividad aumentada o una potencia generalmente aumentada con respecto a un polipéptido ActRII de referencia, polipéptido ALK4 o heterodímero de ALK4:ActRIIB. Dichas variantes, cuando se expresan a partir de construcciones de ADN recombinante, pueden usarse en protocolos de terapia génica. Asimismo, la mutagénesis puede dar lugar a variantes que tienen semividas intracelulares drásticamente diferentes a las del polipéptido ActRII, polipéptido ALK4 o heterodímero de ALK4:ActRIIB no modificados correspondientes. Por ejemplo, la proteína alterada puede volverse más estable o menos estable a la degradación proteolítica u otros procesos celulares que dan como resultado la destrucción, o inactivación de otro modo, de un polipéptido no modificado. Dichas variantes, y los genes que las codifican, pueden utilizarse para alterar los niveles de complejos polipeptídicos modulando la semivida del polipéptido. Por ejemplo, una semivida corta puede dar lugar a efectos biológicos más transitorios y, cuando forma parte de un sistema de expresión inducible, puede permitir un control más estricto de los niveles de complejos polipeptídicos recombinantes dentro de la célula. En una proteína de fusión Fc, se pueden realizar mutaciones en el enlazador (si existe) y/o la porción Fc para alterar la semivida del polipéptido ActRII, polipéptido ALK4 o heterodímero de ALK4:ActRIIB.
Se puede producir una biblioteca combinatoria por medio de una biblioteca degenerada de genes que codifican una biblioteca de polipéptidos que incluyen cada uno al menos una porción de polipéptido ActRII, polipéptido ALK4 o secuencias heterodiméricas de ALK4:ActRIIB potenciales. Por ejemplo, una mezcla de oligonucleótidos sintéticos se puede ligar enzimáticamente en secuencias génicas de manera que el conjunto degenerado de posibles secuencias de nucleótidos que codifican ActRII y/o ALK4 se pueda expresar como polipéptidos individuales, o como alternativa, como un conjunto de proteínas de fusión más grandes (por ejemplo, para presentación en fagos).
Hay muchas formas mediante las cuales se puede generar la biblioteca de homólogos potenciales a partir de una secuencia de oligonucleótidos degenerada. La síntesis química de una secuencia génica degenerada se puede realizar en un sintetizador de ADN automático, y a continuación los genes sintéticos pueden ligarse en un vector apropiado para su expresión. La síntesis de oligonucleótidos degenerados se conoce bien en la técnica [Narang, SA (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura y col. (1981) Recombinant DNA, Proc. 3rd Cleveland Sympos. Macromolecules, ed. Ag Walton, Ámsterdam: Elsevier págs. 273-289; Itakura y col. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura y col. (1984) Science 198:1056; e Ike y col. (1983) Nucleic Acid Res. 11:477]. Dichas técnicas se han empleado en la evolución dirigida de otras proteínas [Scott y col., (1990) Science 249:386-390; Roberts y col. (1992) PnAs USA 89:2429-2433; Devlin y col. (1990) Science 249: 404-406; Cwirla y col., (1990) PNAS USA 87: 6378-6382; así como las Patentes de EE.UU. N.° 5.223.409, 5.198.346 y 5.096.815].
Como alternativa, se pueden utilizar otras formas de mutagénesis para generar una biblioteca combinatoria. Por ejemplo, los polipéptidos ActRII, los polipéptidos ALK4 y los heterodímeros de ALK4:ActRIIB de la descripción se pueden generar y aislar de una biblioteca mediante cribado usando, por ejemplo, mutagénesis de barrido de alanina [Ruf y col. (1994) Biochemistry 33:1565-1572; Wang y col. (1994) J. Biol. Chem. 269:3095-3099; Balint y col. (1993) Gene 137:109-118; Grodberg y col. (1993) Eur. J. Biochem. 218:597-601; Nagashima y col. (1993) J. Biol. Chem.
268:2888-2892; Lowman y col. (1991) Biochemistry 30:10832-10838; y Cunningham y col. (1989) Science 244:1081-1085], mediante mutagénesis de barrido de enlazador [Gustin y col. (1993) Virology 193: 653-660; y Brown y col. (1992) Mol. Cell Biol. 12:2644-2652; McKnight y col. (1982) Science 232:316], mediante mutagénesis por saturación [Meyers y col., (1986) Science 232:613]; por mutagénesis por PCR [Leung y col. (1989) Method Cell Mol Biol 1:11-19]; o mediante mutagénesis aleatoria, incluyendo mutagénesis química [Miller y col. (1992) A Short Course in Bacterial Genetics, CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY; y Greener y col. (1994) Strategies in Mol Biol 7:32-34]. La mutagénesis de barrido de enlazador, particularmente en un entorno combinatorio, es un procedimiento atractivo para identificar formas truncadas (bioactivas) de polipéptidos ActRII, polipéptidos ALK4 o heterodímeros de ALK4:ActRIIB.
Se conoce en la técnica una amplia gama de técnicas para cribar productos génicos de bibliotecas combinatorias elaboradas por mutaciones puntuales y truncamientos y, en este sentido, para cribar bibliotecas de ADNc en busca de productos génicos que tengan una determinada propiedad. Dichas técnicas serán generalmente adaptables para el cribado rápido de las genotecas generadas por la mutagénesis combinatoria de polipéptidos ActRII. Las técnicas más ampliamente utilizadas para cribar grandes genotecas comprenden típicamente clonar la genoteca en vectores de expresión replicables, transformar células apropiadas con la biblioteca de vectores resultante y expresar los genes combinatorios en condiciones en las que la detección de una actividad deseada facilita el aislamiento relativamente fácil del vector que codifica el gen cuyo producto se detectó. Los ensayos preferidos incluyen ensayos de unión a ligando (por ejemplo, BMP2, BMP2/7, BMP3, BMP4, BMP4/7, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8a, BMP8b, BMP9, BMP10, GDF3, GDF5, GDF6/BMP13, GDF7, GDF8, GDF9b/BMP15, GDF11/BMP11, GDF15/MIC1, TGF-pi, TGF-p2, TGF-p3, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, nodal, factor neurotrófico derivado de células gliales (GDNF), neurturina, artemina, persefina, MIS y Lefty) y/o ensayos de señalización celular mediada por ligando.
Como reconocerá un experto en la técnica, la mayoría de las mutaciones, variantes o modificaciones descritas en esta invención pueden realizarse a nivel de ácido nucleico o, en algunos casos, mediante modificación postraduccional o síntesis química. Dichas técnicas se conocen bien en la técnica y algunas de las cuales se describen en esta invención. En parte, la presente descripción identifica porciones (fragmentos) funcionalmente activas y variantes de polipéptidos ActRII, polipéptidos ALK4 o heterodímeros de ALK4:ActRIIB que se pueden usar como orientación para generar y usar otros polipéptidos ActRII variantes dentro del alcance de esta invención.
En determinados casos, los fragmentos funcionalmente activos de polipéptidos ActRII, polipéptidos ALK4 y heterodímeros de ALK4:ActRIIB de la presente descripción se pueden obtener cribando polipéptidos producidos de forma recombinante a partir del fragmento correspondiente del ácido nucleico que codifica un polipéptido ActRII y/o ALK4. Además, los fragmentos se pueden sintetizar químicamente usando técnicas conocidas en la técnica tales como la química de f-Moc o t-Boc de fase sólida de Merrifield convencional. Los fragmentos se pueden producir (de forma recombinante o mediante síntesis química) y ensayar para identificar aquellos fragmentos de peptidilo que pueden funcionar como antagonistas (inhibidores) de los receptores ActRII y/o ALK4 y/o uno o más ligandos (por ejemplo, BMP2, BMP2/7, BMP3, BMP4, BMP4/7, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8a, BMP8b, BMP9, BMP10, GDF3, GDF5, GDF6/BMP13, GDF7, GDF8, GDF9b/BMP15, GDF11/BMP11, GDF15/MIC1, TGF-pi TGF-p2, TGF-p3, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, nodal, factor neurotrófico derivado de células gliales (GDNF), neurturina, artemina, persefina, MIS y Lefty).
En determinados casos, el polipéptido ActRII, el polipéptido ALK4 y/o el heterodímero de ALK4:ActRIIB de la presente descripción pueden comprender además modificaciones postraduccionales además de cualquiera que esté naturalmente presente en el polipéptido ActRII, el polipéptido ALK4 o el heterodímero de ALK4:ActRIIB. Dichas modificaciones incluyen, pero sin limitación, acetilación, carboxilación, glucosilación, fosforilación, lipidación y acilación. Como resultado, el polipéptido ActRII, el polipéptido ALK4 o el heterodímero de ALK4:ActRIIB pueden contener elementos no aminoacídicos, tales como polietilenglicoles, lípidos, polisacáridos o monosacáridos y fosfatos. Los efectos de dichos elementos no aminoacídicos sobre la funcionalidad de un polipéptido trampa de ligandos pueden ensayarse como se describe en esta invención para otras variantes de ActRII, ALK4 y ALK4:ActRIIB. Cuando un polipéptido de la descripción se produce en las células escindiendo una forma activa del polipéptido, el procesamiento postraduccional también puede ser importante para el plegamiento y/o función correctos de la proteína. Diferentes células (por ejemplo, ChO, HeLa, MDCK, 293, W i38, NIH-3T3 o HEK293) tienen una maquinaria celular específica y mecanismos característicos para dichas actividades postraduccionales y pueden elegirse para asegurar la modificación y el procesamiento correctos de los polipéptidos ActRII.
En determinados casos, los polipéptidos ActRII y ALK4 de la presente descripción incluyen proteínas de fusión que tienen al menos una porción (dominio) de un polipéptido ActRII o ALK4 y una o más porciones (dominios) heterólogas. Ejemplos bien conocidos de dichos dominios de fusión incluyen, pero sin limitación, polihistidina, Glu-Glu, glutatión S-transferasa (GST), tiorredoxina, proteína A, proteína G, una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina (Fc), proteína de unión a maltosa (MBP) o albúmina sérica humana. Puede seleccionarse un dominio de fusión para conferir una propiedad deseada. Por ejemplo, algunos dominios de fusión son particularmente útiles para el aislamiento de las proteínas de fusión mediante cromatografía de afinidad. Con el fin de purificar por afinidad, se utilizan matrices relevantes para cromatografía de afinidad, tales como resinas conjugadas con glutatión, amilasa y níquel o cobalto. Muchas de estas matrices están disponibles en forma de "kit", tal como el sistema de purificación Pharmacia GST y el sistema QIAexpress™ útil con compañeros de fusión (HIS6). Como otro ejemplo, se puede seleccionar un dominio de fusión para facilitar la detección del polipéptido ActRII o ALK4. Los ejemplos de dichos dominios de detección incluyen las diversas proteínas fluorescentes (por ejemplo, GFP, por sus siglas en inglés), así como las "etiquetas de epítopo", que normalmente son secuencias peptídicas cortas para las que está disponible un anticuerpo específico. Las etiquetas de epítopo bien conocidas para las que están fácilmente disponibles anticuerpos monoclonales específicos incluyen FLAG, hemaglutinina (HA) del virus de la gripe y etiquetas c-myc. En algunos casos, los dominios de fusión tienen un sitio de escisión de proteasa, tal como para el Factor Xa o la trombina, que permite que la proteasa relevante digiera parcialmente las proteínas de fusión y de ese modo libere las proteínas recombinantes de las mismas. A continuación, las proteínas liberadas pueden aislarse del dominio de fusión mediante una separación por cromatografía posterior. Otros tipos de dominios de fusión que pueden seleccionarse incluyen dominios multimerizantes (por ejemplo, dimerizantes, tetramerizantes) y dominios funcionales (que confieren una función biológica adicional) incluyendo, por ejemplo, dominios constantes de inmunoglobulinas (por ejemplo, dominios Fc).
En determinados casos, los polipéptidos ActRII y ALK4 de la presente descripción contienen una o más modificaciones que son capaces de "estabilizar" los polipéptidos. Por "estabilizar" se entiende cualquier cosa que aumente la semivida in vitro, la semivida en suero, independientemente de si esto se debe a una disminución de la destrucción, una disminución del aclaramiento por el riñón u otro efecto farmacocinético del agente. Por ejemplo, dichas modificaciones mejoran la semivida de los polipéptidos, mejoran la semivida circulatoria de los polipéptidos y/o reducen la degradación proteolítica de los polipéptidos. Dichas modificaciones estabilizadoras incluyen, pero sin limitación, proteínas de fusión (incluyendo, por ejemplo, proteínas de fusión que comprenden un dominio polipeptídico ActRII (o un polipéptido ALK4) y un dominio estabilizador), modificaciones de un sitio de glucosilación (incluyendo, por ejemplo, la adición de un sitio de glucosilación a un polipéptido de la descripción), y modificaciones del resto de carbohidrato (incluyendo, por ejemplo, la eliminación de restos de carbohidrato de un polipéptido de la descripción). Como se usa en esta invención, la expresión "dominio estabilizador" no solo se refiere a un dominio de fusión (por ejemplo, un dominio Fc de inmunoglobulina) como en el caso de las proteínas de fusión, sino que también incluye modificaciones no proteicas tales como un resto carbohidrato o un resto no proteico, tal como polietilenglicol. En determinados casos preferidos, un polipéptido ActRII (o un polipéptido ALK4) se fusiona con un dominio heterólogo que estabiliza el polipéptido (un dominio "estabilizador"), preferentemente un dominio heterólogo que aumenta la estabilidad del polipéptido in vivo. Se sabe que las fusiones con un dominio constante de una inmunoglobulina (por ejemplo, un dominio Fc) confieren propiedades farmacocinéticas deseables en una amplia gama de proteínas. Asimismo, las fusiones con albúmina sérica humana pueden conferir propiedades deseables.
A continuación se muestra un ejemplo de una secuencia de aminoácidos nativa que puede usarse para la porción Fc de IgG1 humana (G1Fc) (SEQ ID NO: 14). El subrayado discontinuo indica la región bisagra y el subrayado continuo indica posiciones con variantes de origen natural. En parte, la descripción proporciona polipéptidos que comprenden, consisten esencialmente o consisten en secuencias de aminoácidos con un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % de identidad con la SEQ ID NO: 14. Las variantes de origen natural en G1Fc incluirían E134D y M136L según el sistema de numeración utilizado en la SEQ ID NO: 14 (véase Uniprot P01857).
1
i, THTCPPCPAp ELLGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV WDVSHEDPE
51 VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK
101 VSNKALPAPI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSREEMTKNQ VSLTCLVKGF
151 YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSKLTV DKSRWQQGNV
201 FSCSVPÍHEAL HNHYTQKSLS LSPGK (SEQ ID N> ): 14)
Opcionalmente, el dominio Fc de IgG1 tiene una o más mutaciones en residuos tales como Asp-265, lisina 322 y Asn-434. En determinados casos, el dominio Fc de IgG1 mutante que tiene una o más de estas mutaciones (por ejemplo, mutación Asp-265) tiene una capacidad reducida de unirse al receptor Fcy en relación con un dominio Fc de tipo silvestre. En otros casos, el dominio Fc mutante que tiene una o más de estas mutaciones (por ejemplo, mutación Asn-434) tiene una mayor capacidad de unión al receptor Fc relacionado con el MHC de clase I (FcRN) en relación con un dominio Fc de IgG1 de tipo silvestre.
A continuación se muestra un ejemplo de una secuencia de aminoácidos nativa que puede usarse para la porción Fc de IgG2 humana (G2Fc) (SEQ ID NO: 15). El subrayado discontinuo indica la región bisagra y el doble subrayado indica las posiciones donde hay conflictos de base de datos en la secuencia (según UniProt P01859). En parte, la descripción proporciona polipéptidos que comprenden, consisten esencialmente o consisten en secuencias de aminoácidos con un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % de identidad con la SEQ ID NO: 15.
VECPPgPAPP VAGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCWV DVSHEDPEVQ
51 FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QFNSTFRWS VLTVVHQDWL NGKEYKCKVS
NKGLPAPIEK TISKTKGQPR EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LTCLVKGFYP
SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPMLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS
201 CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGK (SEQ ID NO 15)
A continuación se muestran dos ejemplos de secuencias de aminoácidos que pueden usarse para la porción Fc de IgG3 humana (G3Fc). La región bisagra en G3Fc puede ser hasta cuatro veces más larga que en otras cadenas Fc y contiene tres segmentos idénticos de 15 residuos precedidos por un segmento similar de 17 residuos. La primera secuencia de G3Fc que se muestra a continuación (SEQ ID NO: 16) contiene una región bisagra corta que consiste en un solo segmento de 15 residuos, mientras que la segunda secuencia de G3Fc (SEQ ID NO: 17) contiene una región bisagra de longitud completa. En cada caso, el subrayado discontinuo indica la región bisagra y el subrayado continuo indica las posiciones con variantes de origen natural según UniProt P01859. En parte, la descripción proporciona polipéptidos que comprenden, consisten esencialmente o consisten en secuencias de aminoácidos con un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % de identidad con las SEQ ID NO: 16 y 17.
1 EPKSCDTPPP CPRCPAPELE GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVWD 51 VSHEDPEVQF KWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTFRWSV LTVLHQDWLN 101 GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKTKGQPRE PQVYTLPPSR EEMTKNQVSL 151 TCLVKGFYPS DIAVEWESSG QPENNYNTTP PMLDSDGSFF LYSKLTVDKS 20 1 RWQQGNIFSC SVMHEALHNR FTQKSLSLSP GK {SEQ ID NO: 16)
1 ELKTPLGDTT HTCPRCPEPK SCDI;pP'PCPR _CPE¡PKS:CCYP _ PPCPRCPEPK 51 SCDTPPPCPR CPAPELLGGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVWDVSH 101 EDFEVQFKWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS TFRWSVLTV LHQDWLNGKE 151 YKCKVSNKAL PAPIEKTISK TKGQPREPQV YTLPPSREEM TKNQVSLTCL 20 1 VKGFYPSDIA VEWESSGQPE NNYNTTPPML DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ
251 QGNIFSCSVM HEALHNRFTQ KSLSLSPGK (SEQ ID NO:
Las variantes de origen natural en G3Fc (por ejemplo, véase Uniprot P01860) incluyen E68Q, P76L, E79Q, Y81F, D97N, N100D, T124A, S169N, S169del, f221Y cuando se convierten al sistema de numeración usado en la SEQ ID NO: 16, y la presente descripción proporciona proteínas de fusión que comprenden dominios G3Fc que contienen una o más de estas variaciones. Además, el gen IgG3 de inmunoglobulina humana (IGHG3) muestra un polimorfismo estructural caracterizado por diferentes longitudes de bisagra [véase Uniprot P01859]. Específicamente, la variante WIS carece de la mayor parte de la región V y de toda la región CH1. Tiene un enlace disulfuro adicional intercatenario en la posición 7 además de la 11 normalmente presente en la región bisagra. La variante ZUC carece de la mayor parte de la región V, toda la región CH1 y parte de la bisagra. La variante OMM puede representar una forma alélica u otra subclase de cadena gamma. La presente descripción proporciona proteínas de fusión adicionales que comprenden dominios G3Fc que contienen una o más de estas variantes.
A continuación se muestra un ejemplo de una secuencia de aminoácidos nativa que puede usarse para la porción Fc de IgG4 humana (G4Fc) (SEQ ID NO: 18). El subrayado discontinuo indica la región bisagra. En parte, la descripción proporciona polipéptidos que comprenden, consisten esencialmente o consisten en secuencias de aminoácidos con un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % de identidad con la SEQ ID NO: 18.
ES K Y G P P C P S_ CPAPEFLGGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVWDVSQ EDPEVQFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQFNS TYRWSVLTV LHQDWLNGKE
101 YKCKVSNKGL PSSIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSQESM TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS RLTVDKSRWQ
201 EGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSLGK (SEQ ID NO: 18)
En esta invención se presentan una diversidad de mutaciones genomanipuladas en el dominio Fc con respecto a la secuencia de G1Fc (SEQ ID NO: 14), y mutaciones análogas en G2Fc, G3Fc y G4Fc pueden derivarse de su alineamiento con G1Fc en la figura 4. Debido a las longitudes de bisagra desiguales, las posiciones Fc análogas basadas en el alineamiento del isotipo (figura 4) poseen diferentes números de aminoácidos en las SEQ ID NO: 14, 15, 16, 17 y 18. También se puede apreciar que una posición de aminoácidos dada en una secuencia de inmunoglobulina que consiste en las regiones bisagra, Ch2 y Ch3 (por ejemplo, SEQ ID NO: 14, 15, 16, 17 y 18) se identificará con un número diferente al de la misma posición cuando la numeración abarque todo el dominio constante de cadena pesada de IgG1 (que consiste en las regiones Ch1, bisagra, Ch2 y Ch3) como en la base de datos Uniprot. Por ejemplo, la correspondencia entre las posiciones de Ch3 seleccionadas en una secuencia de G1 Fc humana (SEQ ID NO: 14), el dominio constante de cadena pesada de IgG1 humana (Uniprot P01857) y la cadena pesada de IgG1 humana es la siguiente.
Figure imgf000045_0001
En determinados casos, los polipéptidos descritos en esta invención pueden formar complejos de proteínas que comprenden al menos un polipéptido ALK4 asociado, covalente o no covalentemente, con al menos un polipéptido ActRIIB. Preferentemente, los polipéptidos descritos en esta invención forman complejos heterodiméricos, aunque también se incluyen complejos heteromultiméricos de orden superior (heteromultímeros) tales como, pero sin limitación, heterotrímeros, heterotetrámeros y estructuras oligoméricas adicionales (véase, por ejemplo, la figura 21­ 23). En algunos casos, los polipéptidos ALK4 y/o ActRIIB comprenden al menos un dominio de multimerización. Como se describe en esta invención, la expresión "dominio de multimerización" se refiere a un aminoácido o secuencia de aminoácidos que promueven la interacción covalente o no covalente entre al menos un primer polipéptido y al menos un segundo polipéptido. Los polipéptidos descritos en esta invención pueden unirse covalente o no covalentemente a un dominio de multimerización. Preferentemente, un dominio de multimerización promueve la interacción entre un primer polipéptido (por ejemplo, un polipéptido ALK4) y un segundo polipéptido (por ejemplo, un polipéptido ActRIIB) para promover la formación de heteromultímeros (por ejemplo, formación de heterodímeros) y opcionalmente dificulta o desfavorece de otro modo la formación de homomultímeros (por ejemplo, formación de homodímeros), aumentando así el rendimiento del heteromultímero deseado (véase, por ejemplo, la figura 22).
Se pueden usar muchos procedimientos conocidos en la técnica para generar heteromultímeros de ALK4:ActRIIB. Por ejemplo, los enlaces disulfuro de origen no natural se pueden construir reemplazando en un primer polipéptido (por ejemplo, un polipéptido ALK4) un aminoácido de origen natural por un residuo que contiene tiol libre, tal como cisteína, de modo que el tiol libre interactúe con otro residuo que contenga tiol libre en un segundo polipéptido (por ejemplo, un polipéptido ActRIIB) de modo que se forma un enlace disulfuro entre el primer y segundo polipéptidos. Ejemplos adicionales de interacciones para promover la formación de heteromultímeros incluyen, pero sin limitación, interacciones iónicas tales como las descritas en Kjaergaard y col., documento WO2007147901; efectos de dirección electrostática tales como los descritos en Kannan y col., documento U.S. 8.592.562; interacciones de hélice superenrollada tales como las descritas en Christensen y col., documento U.S. 20120302737; cremalleras de leucina tales como las descritas en Pack y Plueckthun, (1992) Biochemistry 31: 1579-1584; y motivos de hélice-giro-hélice tales como los descritos en Pack y col., (1993) Bio/Technology 11: 1271-1277. La unión de los diversos segmentos se puede obtener mediante, por ejemplo, unión covalente tal como mediante reticulación química, enlazadores peptídicos, puentes disulfuro, etc., o interacciones de afinidad tales como avidina-biotina o tecnología de cremalleras de leucina.
En determinados casos, un dominio de multimerización puede comprender un componente de un par de interacción. En algunos casos, los polipéptidos descritos en esta invención pueden formar complejos proteicos que comprenden un primer polipéptido asociado covalente o no covalentemente con un segundo polipéptido, donde el primer polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de un polipéptido ALK4 y la secuencia de aminoácidos de un primer miembro de un par de interacción; y el segundo polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de un polipéptido ActRIIB y la secuencia de aminoácidos de un segundo miembro de un par de interacción. El par de interacción puede ser dos secuencias polipeptídicas cualesquiera que interaccionen para formar un complejo, particularmente un complejo heterodimérico, aunque los casos operativos también pueden emplear un par de interacción que puede formar un complejo homodimérico. Un miembro del par de interacción puede fusionarse con un polipéptido Alk4 o ActRIIB como se describe en esta invención, incluyendo, por ejemplo, una secuencia polipeptídica que comprende, consiste esencialmente o consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a la secuencia de cualquiera de las SEQ ID NO: 2, 3, 5, 6, 101 y 103. Se puede seleccionar un par de interacción para conferir una propiedad/actividad mejorada, tal como un aumento de la semivida en suero, o para actuar como un adaptador al que se une otro resto para proporcionar una propiedad/actividad mejorada. Por ejemplo, un resto de polietilenglicol puede unirse a uno o ambos componentes de un par de interacción para proporcionar una propiedad/actividad mejorada, tal como una semivida en suero mejorada.
El primer y segundo miembros del par de interacción pueden ser un par asimétrico, lo que significa que los miembros del par se asocian preferentemente entre sí en lugar de autoasociarse. Por consiguiente, el primer y segundo miembros de un par de interacción asimétrica pueden asociarse para formar un complejo heterodimérico (véase, por ejemplo, la figura 22). Como alternativa, el par de interacción puede ser no guiado, lo que significa que los miembros del par pueden asociarse entre sí o autoasociarse sin una preferencia sustancial y, por lo tanto, pueden tener las mismas o diferentes secuencias de aminoácidos. Por consiguiente, el primer y segundo miembros de un par de interacción no guiado pueden asociarse para formar un complejo homodímero o un complejo heterodimérico. Opcionalmente, el primer miembro del par de interacción (por ejemplo, un par asimétrico o un par de interacción no guiado) se asocia covalentemente con el segundo miembro del par de interacción. Opcionalmente, el primer miembro del par de interacción (por ejemplo, un par asimétrico o un par de interacción no guiado) se asocia no covalentemente con el segundo miembro del par de interacción.
Como ejemplos específicos, la presente descripción proporciona proteínas de fusión que comprenden ALK4 o ActRIIB fusionadas a un polipéptido que comprende un dominio constante de una inmunoglobulina, tal como un dominio CH1, CH2 o CH3 derivado de IgG1, IgG2, IgG3 y/o IgG4 humana que se ha modificado para promover la formación de heteromultímeros. Un problema que surge en la producción a gran escala de proteínas asimétricas basadas en inmunoglobulinas a partir de una única línea celular se conoce como el "problema de asociación de cadenas". Como se afronta de manera prominente en la producción de anticuerpos biespecíficos, el problema de asociación de cadenas se refiere al desafío de producir de manera eficiente una proteína multicatenaria deseada entre las múltiples combinaciones que resultan inherentemente cuando se producen diferentes cadenas pesadas y/o cadenas ligeras en una sola línea celular [Klein y col. (2012) mAbs 4:653-663]. Este problema es más acusado cuando se producen dos cadenas pesadas diferentes y dos cadenas ligeras diferentes en la misma célula, en cuyo caso hay un total de 16 combinaciones de cadenas posibles (aunque algunas de ellas son idénticas) cuando típicamente solo se desea una. No obstante, el mismo principio explica la disminución del rendimiento de una proteína de fusión de múltiples cadenas deseada que incorpora solo dos cadenas pesadas diferentes (asimétricas).
Se conocen diversos procedimientos en la técnica que aumentan el emparejamiento deseado de cadenas polipeptídicas de fusión que contienen Fc en una única línea celular para producir una proteína de fusión asimétrica preferida con rendimientos aceptables [Klein y col. (2012) mAbs 4:653-663; y Spiess y col. (2015) Molecular Immunology 67(2A): 95-106]. Los procedimientos para obtener el emparejamiento deseado de cadenas que contienen Fc incluyen, pero sin limitación, emparejamiento basado en carga (dirección electrostática), emparejamiento estérico de "botón en ojal", emparejamiento de SEEDbody y emparejamiento basado en cremalleras de leucina [Ridgway y col. (1996) Protein Eng 9:617-621; Merchant y col. (1998) Nat Biotech 16:677-681; Davis y col. (2010) Protein Eng Des Sel 23:195-202; Gunasekaran y col. (2010); 285:19637-19646; Wranik y col. (2012) J Biol Chem 287:43331-43339; documentos US5.932.448; WO 1993/011162; WO 2009/089004 y WO 2011/034605]. Como se describe en esta invención, estos procedimientos pueden usarse para generar complejos heteromultiméricos de ALK4-Fc:ActRIIB-Fc. Véase, por ejemplo, la figura 23.
Se han descrito previamente heteromultímeros de ALK4:ActRIIB y el procedimiento para preparar dichos heteromultímeros. Véase, por ejemplo, el documento WO 2016/164497.
Se entiende que diferentes elementos de las proteínas de fusión (por ejemplo, proteínas de fusión Fc de inmunoglobulina) pueden disponerse de cualquier manera que sea consistente con la funcionalidad deseada. Por ejemplo, un dominio polipeptídico ActRII (o polipéptido ALK4) puede colocarse C-terminal con respecto a un dominio heterólogo, o como alternativa, un dominio heterólogo puede colocarse C-terminal con respecto un dominio polipeptídico ActRII (o polipéptido ALK4). No es necesario que el dominio polipeptídico ActRII (o polipéptido ALK4) y el dominio heterólogo sean adyacentes en una proteína de fusión, y pueden incluirse dominios o secuencias de aminoácidos adicionales en el extremo C o N en cualquier dominio o entre los dominios.
Por ejemplo, una proteína de fusión del receptor ActRII (o ALK4) puede comprender una secuencia de aminoácidos como se expone en la fórmula A-B-C. La porción B corresponde a un dominio polipeptídico ActRII (o ALK4). Las porciones A y C pueden ser independientemente cero, uno o más de un aminoácido, y ambas porciones A y C, cuando están presentes, son heterólogas a B. Las porciones A y/o C pueden unirse a la porción B a través de una secuencia enlazadora. Un enlazador puede ser rico en glicina (por ejemplo, 2-10, 2-5, 2-4, 2-3 residuos de glicina) o residuos de glicina y prolina y puede contener, por ejemplo, una única secuencia de treonina/serina y glicinas o secuencias repetidas de treonina/serina y/o glicinas, por ejemplo, singletes GGG (SEQ ID NO: 19), g Gg G (SEQ ID NO: 20), TGGGG(SEQ ID NO: 21), SGGGG(SEQ ID NO: 22), TGGG(SEQ ID NO: 23), SGGG(SEQ ID NO: 24) o GGGGS (SEQ ID NO: 25) o repeticiones. En determinados casos, una proteína de fusión ActRII (o ALK4) comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en la fórmula A-B-C, donde A es una secuencia líder (señal), B consiste en un dominio polipeptídico ActRII (o ALK4) y C es una porción de polipéptido que mejora una o más de la estabilidad in vivo, la semivida in vivo, la captación/administración, la localización o distribución tisular, la formación de complejos proteicos y/o la purificación. En determinados casos, una proteína de fusión ActRII (o ALK4) comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en la fórmula A-B-C, donde A es una secuencia líder de TPA, B consiste en un dominio polipeptídico del receptor ActRII (o ALK4) y C es un dominio Fc de inmunoglobulina.Las proteínas de fusión preferidas comprenden la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 32, 36, 39, 40, 42, 45, 46, 48, 69, 74, 77, 78, 108, 110, 111, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 120, 122 y 124.
En casos preferidos, los polipéptidos ActRII, polipéptidos ALK4 y heteromultímeros de ALK4:ActRIIB a usar según los procedimientos descritos en esta invención son polipéptidos aislados. Como se usa en esta invención, una proteína o polipéptido aislado es uno que se ha separado de un componente de su entorno natural. En algunos casos, un polipéptido de la descripción se purifica en más del 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o del 99 % de pureza según lo determinado, por ejemplo, mediante electroforesis (por ejemplo, SDS-PAGE, isoelectroenfoque (IEF), electroforesis capilar) o cromatográfica (por ejemplo, HPLC de intercambio iónico o de fase inversa). Los procedimientos para evaluar la pureza se conocen bien en la técnica [véase, por ejemplo, Flatman y col., (2007) J. Chromatogr. B 848:79-87]. En algunos casos, los polipéptidos ActRII, los polipéptidos ALK4 y los heteromultímeros de ALK4:ActRIIB a usar según los procedimientos descritos en esta invención son polipéptidos recombinantes.
Los polipéptidos ActRII, los polipéptidos ALK4 y los heteromultímeros de ALK4:ActRIIB de la descripción se pueden producir mediante una diversidad de técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, los polipéptidos de la descripción se pueden sintetizar usando técnicas estándar de química de proteínas tales como las descritas en Bodansky, M. Principles of Peptide Synthesis, Springer Verlag, Berlín (1993) y Grant GA (ed.), Synthetic Peptides: A User's Guide, W. H. Freeman and Company, Nueva York (1992). Además, los sintetizadores peptídicos automatizados están disponibles comercialmente (por ejemplo, Advanced ChemTech Modelo 396; Milligen/Biosearch 9600). Como alternativa, los polipéptidos de la descripción, incluidos fragmentos o variantes de los mismos, pueden producirse de forma recombinante usando diversos sistemas de expresión [por ejemplo, E. coli, células de ovario de hámster chino (CHO), células COS, baculovirus] como se conoce bien en la técnica. En un caso adicional, los polipéptidos modificados o no modificados de la descripción pueden producirse mediante digestión de polipéptidos ActRII de longitud completa producidos de manera recombinante usando, por ejemplo, una proteasa, por ejemplo, tripsina, termolisina, quimotripsina, pepsina o enzima convertidora de aminoácidos básicos emparejados (PACE). Puede usarse análisis informático (usando software disponible comercialmente, por ejemplo, MacVector, Omega, PCGene, Molecular Simulation, Inc.) para identificar sitios de escisión proteolítica. Como alternativa, dichos polipéptidos se pueden producir a partir de polipéptidos ActRII o ALK4 de longitud completa generados de forma recombinante usando escisión química (por ejemplo, bromuro de cianógeno, hidroxilamina, etc.).
3. Ácidos nucleicos que codifican polipéptidos ActRII y ALK4 y variantes de los mismos
En determinados casos, la presente descripción proporciona ácidos nucleicos aislados y/o recombinantes que codifican los polipéptidos ActRII y/o ALK4 (incluyendo fragmentos, variantes funcionales y proteínas de fusión de los mismos). Por ejemplo, la SEQ ID NO: 7 codifica un polipéptido precursor de ActRIIB humano de origen natural (la variante R64 descrita anteriormente), mientras que la s Eq ID NO: 8 codifica el dominio extracelular procesado de ActRIIB (la variante R64 descrita anteriormente). Los ácidos nucleicos en cuestión pueden ser monocatenarios o bicatenarios.Dichos ácidos nucleicos pueden ser moléculas de ADN o ARN. Estos ácidos nucleicos pueden usarse, por ejemplo, en procedimientos para preparar polipéptidos trampa de ligandos basados en ActRII como se describe en esta invención.
Como se usa en esta invención, ácido o ácidos nucleicos aislados se refiere a una molécula de ácido nucleico que se ha separado de un componente de su entorno natural. Un ácido nucleico aislado incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que normalmente contienen la molécula de ácido nucleico, pero la molécula de ácido nucleico está presente extracromosómicamente o en una ubicación cromosómica que es diferente de su ubicación cromosómica natural.
En determinados casos, se entiende que los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos ActRII o ALK4 de la descripción incluyen ácidos nucleicos que son variantes de cualquiera de las SEQ ID NO: 7, 8, 12, 13, 37, 43, 49, 70, 71,72, 73, 75, 76, 80, 81,82, 83, 84, 102, 103, 106, 107, 109, 112, 119, 121, 123 y 135. Las secuencias de nucleótidos variantes incluyen secuencias que difieren en una o más sustituciones, adiciones o deleciones de nucleótidos, incluyendo variantes alélicas y, por lo tanto, incluirán una secuencia codificante que difiera de la secuencia de nucleótidos designada en cualquiera de las SEQ ID NO: 7, 8, 12, 13, 37, 43, 49, 70, 71, 72, 73, 75, 76, 80, 81, 82, 83, 84, 102, 103, 106, 107, 109, 112, 119, 121, 123 y 135.
En determinados casos, los polipéptidos ActRII o ALK4 de la descripción están codificados por secuencias de ácido nucleico aisladas y/o recombinantes que son al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 % 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idénticas a cualquiera de las SEQ ID NO: 7, 8, 12, 13, 37, 43, 49, 70, 71, 72, 73, 75, 76, 80, 81,82, 83, 84, 102, 103, 106, 107, 109, 112, 119, 121, 123 y 135. Un experto en la técnica apreciará que las secuencias de ácido nucleico que son al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 % 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idénticas a las secuencias complementarias a las SEQ ID NO: 7, 8, 12, 13, 37, 43, 49, 70, 71, 72, 73, 75, 76, 80, 81, 82, 83, 84, 102, 103, 106, 107, 109, 112, 119, 121, 123 y 135, y variantes de las mismas, también están dentro del alcance de la presente descripción. En casos adicionales, las secuencias de ácido nucleico de la descripción pueden aislarse, recombinarse y/o fusionarse con una secuencia de nucleótidos heteróloga o en una biblioteca de ADN.
En otros casos, los ácidos nucleicos de la presente descripción también incluyen secuencias de nucleótidos que se hibridan en condiciones muy rigurosas con la secuencia de nucleótidos designada en las SEQ ID NO: 7, 8, 12, 13, 37, 43, 49, 70, 71, 72, 73, 75, 76, 80, 81, 82, 83, 84, 102, 103, 106, 107, 109, 112, 119, 121, 123 y 135, secuencias complementarias de las SEQ ID NO: 7, 8, 12, 13, 37, 43, 49, 70, 71, 72, 73, 75, 76, 80, 81, 82, 83, 84, 102, 103, 106, 107, 109, 112, 119, 121, 123 y 135, o fragmentos de las mismas. Como se ha analizado anteriormente, un experto en la técnica comprenderá fácilmente que se pueden variar las condiciones de rigurosidad apropiadas que promueven la hibridación del ADN. Un experto en la técnica comprenderá fácilmente que se pueden variar las condiciones de rigurosidad apropiadas que promueven la hibridación del ADN. Por ejemplo, se podría realizar la hibridación a 6,0 x cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45 °C seguida de un lavado de 2,0 x SSC a 50 °C. Por ejemplo, la concentración de sal en la etapa de lavado puede seleccionarse de una baja rigurosidad de aproximadamente 2,0 x SSC a 50 °C a una alta rigurosidad de aproximadamente 0,2 x SSC a 50 °C. Además, la temperatura en la etapa de lavado puede aumentarse de condiciones de baja rigurosidad a la temperatura ambiente, aproximadamente 22 °C, a condiciones de alta rigurosidad a aproximadamente 65 °C. Se pueden variar tanto la temperatura como la sal, o la temperatura o la concentración de sal se pueden mantener constantes mientras se cambia la otra variable.En un caso, la descripción proporciona ácidos nucleicos que se hibridan en condiciones de baja rigurosidad de 6 x SSC a temperatura ambiente, seguido de un lavado a 2 x SSC a temperatura ambiente.
Los ácidos nucleicos aislados que difieren de los ácidos nucleicos como se expone en las SEQ ID NO: 7, 8, 12, 13, 37, 43, 49, 70, 71, 72, 73, 75, 76, 80, 81, 82, 83, 84, 102, 103, 106, 107, 109, 112, 119, 121, 123 y 135 con respecto a la degeneración en el código genético también están dentro del alcance de la descripción. Por ejemplo, varios aminoácidos se designan con más de un triplete. Los codones que especifican el mismo aminoácido o sinónimos (por ejemplo, CAU y CAC son sinónimos de histidina) pueden producir mutaciones "silenciosas" que no afectan a la secuencia de aminoácidos de la proteína. Sin embargo, se espera que existan polimorfismos de secuencia de ADN que conduzcan a cambios en las secuencias de aminoácidos de las proteínas en cuestión entre las células de mamífero. Un experto en la técnica apreciará que estas variaciones en uno o más nucleótidos (hasta aproximadamente el 3-5 % de los nucleótidos) de los ácidos nucleicos que codifican una proteína particular pueden existir entre individuos de una especie dada debido a la variación alélica natural. Todas y cada una de estas variaciones de nucleótidos y polimorfismos de aminoácidos resultantes están dentro del alcance de esta descripción.
En determinados casos, los ácidos nucleicos recombinantes de la presente descripción pueden unirse operativamente a una o más secuencias reguladoras de nucleótidos en una construcción de expresión. Las secuencias reguladoras de nucleótidos serán generalmente apropiadas para la célula huésped utilizada para la expresión. Se conocen en la técnica numerosos tipos de vectores de expresión apropiados y secuencias reguladoras adecuadas y se pueden usar en una diversidad de células huésped. Típicamente, una o más secuencias reguladoras de nucleótidos pueden incluir, pero sin limitación, secuencias promotoras, secuencias líder o señal, sitios de unión ribosómica, secuencias de inicio y terminación de la transcripción, secuencias de inicio y terminación de la traducción y secuencias potenciadoras o activadoras. Los promotores constitutivos o inducibles conocidos en la técnica se contemplan en la descripción. Los promotores pueden ser promotores de origen natural o promotores híbridos que combinan elementos de más de un promotor. Una construcción de expresión puede estar presente en una célula de un episoma, tal como un plásmido, o la construcción de expresión puede insertarse en un cromosoma. En algunos casos, el vector de expresión contiene un gen marcador seleccionable para permitir la selección de células huésped transformadas. Los genes marcadores seleccionables se conocen bien en la técnica y pueden variar con la célula huésped utilizada.
En determinados casos, el ácido nucleico en cuestión descrito en esta invención se proporciona en un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido ActRII y/o ALK4 y unido operativamente al menos a una secuencia reguladora. Las secuencias reguladoras se reconocen en la técnica y se seleccionan para dirigir la expresión del polipéptido ActRII y/o ALK4. Por consiguiente, la expresión secuencia reguladora incluye promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión. Se describen secuencias reguladoras de ejemplo en Goeddel; Gene Expression Technology. Methods in Enzymology Academic Press, San Diego, CA (1990). Por ejemplo, puede usarse en estos vectores cualquiera de una amplia diversidad de secuencias de control de expresión que controlan la expresión de una secuencia de ADN cuando se une operativamente a ella para expresar secuencias de ADN que codifican un polipéptido ActRII y/o ALK4. Dichas secuencias de control de expresión útiles incluyen, por ejemplo, los promotores temprano y tardío de SV40, el promotor tet, el promotor temprano inmediato de adenovirus o citomegalovirus, los promotores RSV, el sistema lac, el sistema trp, el sistema TAC o TRC, el promotor T7 cuya expresión está dirigida por la ARN polimerasa T7, el operador principal y las regiones promotoras del fago lambda, las regiones de control de la proteína de la cubierta fd, el promotor de la 3-fosfoglicerato cinasa u otras enzimas glucolíticas, los promotores de la fosfatasa ácida, por ejemplo, Pho5, los promotores de los factores de emparejamiento a de levadura, el promotor poliedro del sistema de baculovirus y otras secuencias conocidas por controlar la expresión de genes de células procariotas o eucariotas o sus virus, y diversas combinaciones de los mismos. Debe entenderse que el diseño del vector de expresión puede depender de dichos factores, tales como la elección de la célula huésped a transformar y/o el tipo de proteína que se desea expresar. Además, también debería considerarse el número de copias del vector, la capacidad de controlar ese número de copias y la expresión de cualquier otra proteína codificada por el vector, tal como marcadores de antibióticos.
Se puede producir un ácido nucleico recombinante de la presente descripción ligando el gen clonado, o una porción del mismo, en un vector adecuado para la expresión en células procariotas, células eucariotas (levadura, de aves, insectos o mamíferos) o ambas. Los vehículos de expresión para la producción de un polipéptido ActRII y/o ALK4 recombinante incluyen plásmidos y otros vectores. Por ejemplo, vectores adecuados incluyen plásmidos de los siguientes tipos: plásmidos derivados de pBR322, plásmidos derivados de pEMBL, plásmidos derivados de pEX, plásmidos derivados de pBTac y plásmidos derivados de pUC para la expresión en células procariotas, tales como E. coli.
Algunos vectores de expresión de mamífero contienen tanto secuencias procarióticas para facilitar la propagación del vector en bacterias, como una o más unidades de transcripción eucariotas que se expresan en células eucariotas. Los vectores derivados de pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo y pHyg son ejemplos de vectores de expresión de mamífero adecuados para la transfección de células eucariotas. Algunos de estos vectores se modifican con secuencias de plásmidos bacterianos, tales como pBR322, para facilitar la replicación y selección de resistencia a fármacos en células tanto procariotas como eucariotas. Como alternativa, pueden utilizarse derivados de virus, tales como el virus del papiloma bovino (BPV-1) o el virus de Epstein-Barr (pHEBo, derivado de pREP y p205) para la expresión transitoria de proteínas en células eucariotas. A continuación se pueden encontrar ejemplos de otros sistemas de expresión virales (incluyendo retrovirales) en la descripción de los sistemas de administración de terapia génica. Los diversos procedimientos empleados en la preparación de los plásmidos y en la transformación de organismos huésped se conocen bien en la técnica. Para otros sistemas de expresión adecuados para células tanto procariotas como eucariotas, así como procedimientos recombinantes generales, por ejemplo, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 3a Ed., ed. por Sambrook, Fritsch y Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001). En algunos casos, puede ser deseable expresar los polipéptidos recombinantes mediante el uso de un sistema de expresión de baculovirus. Los ejemplos de dichos sistemas de expresión de baculovirus incluyen vectores derivados de pVL (tales como pVL1392, pVL1393 y pVL941), vectores derivados de pAcUW (tales como pAcUWI) y vectores derivados de pBlueBac (tales como pBlueBac III que contiene p-gal).
En un caso preferido, se diseñará un vector para la producción de los polipéptidos ActRII y/o ALK4 en cuestión en células CHO, tales como un vector Pcmv-Script (Stratagene, La Jolla, Calif.), vectores pcDNA4 (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) y vectores pCI-neo (Promega, Madison, Wis.). Como resultará evidente, las construcciones génicas en cuestión se pueden usar para provocar la expresión de los polipéptidos ActRII en cuestión en células propagadas en cultivo, por ejemplo, para producir proteínas, incluyendo proteínas de fusión o proteínas variantes, para la purificación.
Esta descripción también se refiere a una célula huésped transfectada con un gen recombinante que incluye una secuencia codificante para uno o más de los polipéptidos ActRII y/o ALK4 en cuestión. La célula huésped puede ser cualquier célula procariota o eucariota. Por ejemplo, un polipéptido ActRII y/o ALK4 de la descripción puede expresarse en células bacterianas tales como E. coli, células de insecto (por ejemplo, usando un sistema de expresión de baculovirus), levadura o células de mamífero [por ejemplo, una línea celular de ovario de hámster chino (CHO)]. Otras células huésped adecuadas son conocidas por los expertos en la técnica.
Por consiguiente, la presente descripción se refiere además a procedimientos para producir los polipéptidos ActRII y/o ALK4 en cuestión. Por ejemplo, una célula huésped transfectada con un vector de expresión que codifica un polipéptido ActRII y/o ALK4 puede cultivarse en condiciones apropiadas para permitir que se produzca la expresión del polipéptido ActRII y/o ALK4. El polipéptido puede secretarse y aislarse de una mezcla de células y medio que contiene el polipéptido. Como alternativa, el polipéptido ActRII y/o ALK4 se puede conservar citoplásmicamente o en una fracción de membrana y las células se pueden recoger, lisar y aislar de la proteína. Un cultivo celular incluye células huésped, medios y otros subproductos. Los medios adecuados para el cultivo celular se conocen bien en la técnica. Los polipéptidos en cuestión se pueden aislar del medio de cultivo celular, células huésped o ambos, utilizando técnicas conocidas en la técnica para purificar proteínas, incluyendo cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de filtración en gel, ultrafiltración, electroforesis, purificación por inmunoafinidad con anticuerpos específicos para epítopos particulares de los polipéptidos ActRII y/o ALK4, y purificación por afinidad con un agente que se une a un dominio fusionado al polipéptido ActRII (por ejemplo, se puede usar una columna de proteína A para purificar proteínas de fusión ActRII-Fc y/o ALK4-Fc). En algunos casos, el polipéptido ActRII y/o ALK4 es una proteína de fusión que contiene un dominio que facilita su purificación.
En algunos casos, la purificación se logra mediante una serie de etapas de cromatografía en columna, incluyendo, por ejemplo, tres o más de las siguientes, en cualquier orden: cromatografía de proteína A, cromatografía de Q-Sepharose, cromatografía de Phenylsepharose, cromatografía de exclusión por tamaño y cromatografía de intercambio catiónico. La purificación se pudo completar con filtración viral e intercambio de tampón. Una proteína ActRII y/o ALK4 se puede purificar hasta una pureza de >90 %, >95 %, >96 %, >98 % o >99 % según lo determinado por cromatografía de exclusión por tamaño y >90 %, >95 %, >96 %, >98 % o >99 % según lo determinado por SDS PAGE. El nivel objetivo de pureza debe ser suficiente para lograr resultados deseables en sistemas de mamíferos, particularmente primates no humanos, roedores (ratones) y seres humanos.
En otros casos, un gen de fusión que codifica una secuencia líder de purificación, tal como una secuencia del sitio de escisión de poli-(His)/enterocinasa en el extremo N de la porción deseada del polipéptido recombinante ActRII y/o ALK4, puede permitir la purificación de la proteína de fusión expresada mediante cromatografía de afinidad usando una resina de metal Ni2+. A continuación, la secuencia líder de purificación se puede eliminar posteriormente mediante tratamiento con enterocinasa para proporcionar el polipéptido ActRII y/o ALK4 purificado. Véase, por ejemplo, Hochuli y col. (1987) J. Chromatography 411: 177; y Janknecht y col. (1991) PNAS USA 88: 8972.
Las técnicas para fabricar genes de fusión se conocen bien. Esencialmente, la unión de diversos fragmentos de ADN que codifican diferentes secuencias de polipéptidos se realiza de acuerdo con técnicas convencionales, empleando extremos romos o escalonados para la ligadura, digestión con enzimas de restricción para proporcionar extremos apropiados, relleno de extremos cohesivos según sea apropiado, tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar una unión no deseada y ligadura enzimática. En otros casos, el gen de fusión puede sintetizarse por técnicas convencionales incluyendo sintetizadores de ADN automatizados. Como alternativa, la amplificación por PCR de fragmentos génicos puede realizarse usando cebadores de anclaje que dan lugar a salientes complementarios entre dos fragmentos génicos consecutivos que posteriormente pueden hibridarse para generar una secuencia génica quimérica. Véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel y col., John Wiley & Sons: 1992.
4. Antagonistas de anticuerpos
En determinados casos, un antagonista de GDF/BMP a usar según los procedimientos y usos descritos en esta invención es un anticuerpo (anticuerpo antagonista de GDF/BMP) o una combinación de anticuerpos. Un anticuerpo antagonista de GDF/BMP, o una combinación de anticuerpos, puede unirse, por ejemplo, a uno o más ligandos de ActRII (por ejemplo, activina, GDF8, GDF11, BMP6, BMP15, BMP10 y/o GDF3), un receptor ActRII (ActRIIA y/o ActRIIB), un receptor de tipo I (ALK4, ALK5 y/o ALK7) y/o un correceptor. Como se describe en esta invención, los anticuerpos antagonistas de GDF/BMP pueden usarse solos o en combinación con una o más terapias de apoyo o agentes activos, para tratar, prevenir o reducir la tasa de progresión y/o la gravedad de la hipertensión pulmonar (HP), particularmente el tratamiento, la prevención o la reducción de la tasa de progresión y/o la gravedad de una o más complicaciones asociadas a la HP.
En determinados casos, un anticuerpo antagonista de GDF/BMP, o una combinación de anticuerpos, es un anticuerpo que inhibe al menos la activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE y/o activina BE). Por lo tanto, en algunos casos, un anticuerpo antagonista de GDF/BMP, o una combinación de anticuerpos, se une al menos a la activina. Como se usa en esta invención, un anticuerpo de activina (o anticuerpo anti-activina) generalmente se refiere a un anticuerpo que se une a la activina con suficiente afinidad como para que el anticuerpo sea útil como un agente de diagnóstico y/o terapéutico en el direccionamiento de la activina. En determinados casos, el grado de unión de un anticuerpo de activina a una proteína no relacionada diferente de activina es menor de aproximadamente el 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % o menor de aproximadamente el 1 % de la unión del anticuerpo a la activina según lo medido, por ejemplo, mediante un radioinmunoensayo (RIA), Biacore u otro ensayo de interacción de proteínas o de afinidad de unión. En determinados casos, un anticuerpo de activina se une a un epítopo de activina que se conserva entre la activina de diferentes especies. En determinados casos preferidos, un anticuerpo anti-activina se une a la activina humana. En algunos casos, un anticuerpo de activina puede inhibir la unión de la activina a un receptor de tipo I y/o tipo II (por ejemplo, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5 y/o ALK7) e inhibir así la señalización mediada por activina (por ejemplo, señalización de Smad). En algunos casos, un anticuerpo de activina puede inhibir la unión de la activina a un correceptor ActRII e inhibir así la señalización mediada por activina (por ejemplo, señalización de Smad). Cabe señalar que la activina A tiene una homología de secuencia similar a la activina B y, por lo tanto, los anticuerpos que se unen a la activina A, en algunos casos, también pueden unirse y/o inhibir la activina B, lo que también se aplica a los anticuerpos antiactivina B. En algunos casos, la descripción se refiere a un anticuerpo multiespecífico (por ejemplo, anticuerpo biespecífico) y usos del mismo, que se une a activina y se une además, por ejemplo, a uno o más ligandos adicionales de GDF/BMP [por ejemplo, GDF11, GDF8, GDF3, Bm P15, BMP10 y Bm P6], uno o más receptores de tipo I y/o receptores de tipo II (por ejemplo, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5 y/o ALK7) y/o uno o más correceptores. En algunos casos, un anticuerpo multiespecífico que se une a activina no se une o no se une sustancialmente a BMP9 (por ejemplo, se une a BMP9 con una Kd de más de 1 x 10'7 M o tiene una unión relativamente modesta, por ejemplo, aproximadamente 1 x 10'8 M o aproximadamente 1 x 10'9 M). En algunos casos, un anticuerpo multiespecífico que se une a activina no se une o no se une sustancialmente a la activina A (por ejemplo, se une a la activina A con una Kd de más de 1 x 10'7 M o tiene una unión relativamente modesta, por ejemplo, aproximadamente 1 x 10'8 M o aproximadamente 1 x 10-9 M). En algunos casos, la descripción se refiere a combinaciones de anticuerpos y usos de los mismos, donde la combinación de anticuerpos comprende un anticuerpo de activina y uno o más anticuerpos adicionales que se unen, por ejemplo, a uno o más ligandos de la superfamilia de GDF/BMP adicionales [por ejemplo, GDF8, GDF11, GDF3, BMP6 y BMP15], uno o más receptores de tipo I y/o receptores de tipo II (por ejemplo, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5 y/o ALK7) y/o uno o más correceptores. En algunos casos, una combinación de anticuerpos que comprende un anticuerpo de activina no comprende un anticuerpo BMP9. En algunos casos, una combinación de anticuerpos que comprende un anticuerpo de activina no comprende un anticuerpo de activina A.
En determinados casos, un anticuerpo antagonista de GDF/BMP, o una combinación de anticuerpos, es un anticuerpo que inhibe al menos la activina B. Por lo tanto, en algunos casos, un anticuerpo antagonista de GDF/BMP, o una combinación de anticuerpos, se une al menos a la activina B. Como se usa en esta invención, un anticuerpo de activina B (o anticuerpo anti-activina B) generalmente se refiere a un anticuerpo que se une a la activina B con suficiente afinidad como para que el anticuerpo sea útil como un agente de diagnóstico y/o terapéutico en el direccionamiento de la activina B. En determinados casos, el grado de unión de un anticuerpo de activina B a una proteína no relacionada diferente de activina B es menor de aproximadamente el 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % o menor de aproximadamente el 1 % de la unión del anticuerpo a la activina según lo medido, por ejemplo, mediante un radioinmunoensayo (RIA), Biacore u otro ensayo de interacción de proteínas o de afinidad de unión. En determinados casos, un anticuerpo de activina B se une a un epítopo de activina B que se conserva entre la activina B de diferentes especies. En determinados casos preferidos, un anticuerpo anti-activina B se une a activina B humana. En algunos casos, un anticuerpo de activina B puede inhibir la unión de la activina B a un receptor de tipo I y/o tipo II (por ejemplo, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5 y/o ALK7) e inhibir así la señalización mediada por activina B (por ejemplo, señalización de Smad). En algunos casos, un anticuerpo de activina B puede inhibir la unión de activina B a un correceptor e inhibir así la señalización mediada por activina B (por ejemplo, señalización de Smad). Cabe señalar que la activina B tiene una homología de secuencia similar a la activina A y, por lo tanto, los anticuerpos que se unen a la activina B, en algunos casos, también pueden unirse a y/o inhibir la activina A. En algunos casos, la descripción se refiere a un anticuerpo multiespecífico (por ejemplo, anticuerpo biespecífico) y usos del mismo, que se une a la activina B y se une además, por ejemplo, a uno o más ligandos de GDF/BMP adicionales [por ejemplo, GDF11, GDF8, GDF3, BMP15, BMP10 y BMP6], uno o más receptores de tipo I y/o receptores de tipo II (por ejemplo, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5 y/o ALK7) y/o uno o más correceptores. En algunos casos, un anticuerpo multiespecífico que se une a activina B no se une o no se une sustancialmente a BMP9 (por ejemplo, se une a b MP9 con una Kd de más de 1 x 10'7 M o tiene una unión relativamente modesta, por ejemplo, aproximadamente 1 x 10'8 M o aproximadamente 1 x 10'9 M). En algunos casos, un anticuerpo multiespecífico que se une a activina B no se une o no se une sustancialmente a la activina A (por ejemplo, se une a la activina A con una KD de más de 1 x 10-7 M o tiene una unión relativamente modesta, por ejemplo, aproximadamente 1 x 10'8 M o aproximadamente 1 x 10'9 M). En algunos casos, la descripción se refiere a combinaciones de anticuerpos y usos de los mismos, donde la combinación de anticuerpos comprende un anticuerpo de activina B y uno o más anticuerpos adicionales que se unen, por ejemplo, a uno o más ligandos de GDF/BMP adicionales [por ejemplo, GDF8, GDF11, GDF3, BMP6, BMP10 y BMP15], uno o más receptores de tipo I y/o receptores de tipo II (por ejemplo, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5 y/o ALK7) y/o uno o más correceptores. En algunos casos, una combinación de anticuerpos que comprende un anticuerpo de activina B no comprende un anticuerpo BMP9. En algunos casos, una combinación de anticuerpos que comprende un anticuerpo de activina B no comprende un anticuerpo de activina A.
En determinados casos, un anticuerpo antagonista de GDF/BMP, o una combinación de anticuerpos, es un anticuerpo que inhibe al menos GDF8. Por lo tanto, en algunos casos, un anticuerpo antagonista de GDF/BMP, o una combinación de anticuerpos, se une al menos a GDF8. Como se usa en esta invención, un anticuerpo GDF8 (o anticuerpo anti-GDF8) generalmente se refiere a un anticuerpo que se une a GDF8 con suficiente afinidad como para que el anticuerpo sea útil como agente de diagnóstico y/o terapéutico en el direccionamiento de GDF8. En determinados casos, el grado de unión de un anticuerpo GDF8 a una proteína no relacionada diferente de GDF8 es menor de aproximadamente el 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % o menor de aproximadamente el 1 % de la unión del anticuerpo a GDF8 según lo medido, por ejemplo, mediante un radioinmunoensayo (RIA), Biacore u otro ensayo de interacción de proteínas o de afinidad de unión. En determinados casos, un anticuerpo GDF8 se une a un epítopo de GDF8 que se conserva entre GDF8 de diferentes especies. En determinados casos preferidos, un anticuerpo anti-GDF8 se une a GDF8 humana. En algunos casos, un anticuerpo GDF8 puede inhibir la unión de GDF8 a un receptor de tipo I y/o tipo 1 (por ejemplo, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5 y/o ALK7) e inhibir así la señalización mediada por GDF8 (por ejemplo, señalización de Smad). En algunos casos, un anticuerpo GDF8 puede inhibir la unión de GDF8 a un correceptor e inhibir así la señalización mediada por GDF8 (por ejemplo, señalización de Smad). Cabe señalar que GDF8 tiene una alta homología de secuencia con GDF11 y, por lo tanto, los anticuerpos que se unen a GDF8, en algunos casos, también pueden unirse a y/o inhibir GDF11. En algunos casos, la descripción se refiere a un anticuerpo multiespecífico (por ejemplo, anticuerpo biespecífico), y usos del mismo, que se une a GDF8 y se une además, por ejemplo, a uno o más ligandos de GDF/BMP adicionales [por ejemplo, activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE, activina BE), GDF11, GDF3, BMP15, BMP10 y BMP6], uno o más receptores de tipo I y/o receptores de tipo II (por ejemplo, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5 y/o ALK7) y/o uno o más correceptores. En algunos casos, un anticuerpo multiespecífico que se une a GDF8 no se une o no se une sustancialmente a BMP9 (por ejemplo, se une a BMP9 con una Kd de más de 1 x 10'7 M o tiene una unión relativamente modesta, por ejemplo, aproximadamente 1 x 10'8 M o aproximadamente 1 x 10'9 M). En algunos casos, un anticuerpo multiespecífico que se une a GDF8 no se une o no se une sustancialmente a la activina A (por ejemplo, se une a la activina A con una Kd de más de 1 x 10'7 M o tiene una unión relativamente modesta, por ejemplo, aproximadamente 1 x 10'8 M o aproximadamente 1 x 10'9 M). En algunos casos, la descripción se refiere a combinaciones de anticuerpos y usos de los mismos, donde la combinación de anticuerpos comprende un anticuerpo GDF8 y uno o más anticuerpos adicionales que se unen, por ejemplo, a uno o más ligandos de GDF/BMP adicionales [por ejemplo, activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE, activina BE), GDF11, GDF3, BMP6, BMP10 y BMP15], uno o más receptores de tipo I y/o receptores de tipo II (por ejemplo, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5 y/o ALK7) y/o uno o más correceptores. En algunos casos, una combinación de anticuerpos que comprende un anticuerpo GDF8 no comprende un anticuerpo BMP9. En algunos casos, una combinación de anticuerpos que comprende un anticuerpo GDF8 no comprende un anticuerpo de activina A.
En determinados casos, un anticuerpo antagonista de GDF/BMP, o una combinación de anticuerpos, es un anticuerpo que inhibe al menos GDF11. Por lo tanto, en algunos casos, un anticuerpo antagonista de GDF/BMP, o una combinación de anticuerpos, se une al menos a GDF11. Como se usa en esta invención, un anticuerpo GDF11 (o anticuerpo anti-GDF11) generalmente se refiere a un anticuerpo que se une a GDF11 con suficiente afinidad como para que el anticuerpo sea útil como agente de diagnóstico y/o terapéutico en el direccionamiento de GDF11. En determinados casos, el grado de unión de un anticuerpo GDF11 a una proteína no relacionada diferente de GDF11 es menor de aproximadamente el 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % o menor de aproximadamente el 1 % de la unión del anticuerpo a GDF11 según lo medido, por ejemplo, mediante un radioinmunoensayo (RIA), Biacore u otro ensayo de interacción de proteínas o de afinidad de unión. En determinados casos, un anticuerpo GDF11 se une a un epítopo de GDF11 que se conserva entre GDF11 de diferentes especies. En determinados casos preferidos, un anticuerpo anti-GDF11 se une a GDF11 humana. En algunos casos, un anticuerpo GDF11 puede inhibir la unión de GDF11 a un receptor de tipo I y/o tipo II (por ejemplo, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5 y/o ALK7) e inhibir así la señalización mediada por g DF11 (por ejemplo, señalización de Smad). En algunos casos, un anticuerpo GDF11 puede inhibir la unión de GDF11 a un correceptor e inhibir así la señalización mediada por GDF11 (por ejemplo, señalización de Smad). Cabe señalar que GDF11 tiene una alta homología de secuencia con GDF8 y, por lo tanto, los anticuerpos que se unen a GDF11, en algunos casos, también pueden unirse a y/o inhibir GDF8. En algunos casos, la descripción se refiere a un anticuerpo multiespecífico (por ejemplo, anticuerpo biespecífico), y usos del mismo, que se une a GDF11 y se une además, por ejemplo, a uno o más ligandos de GDF/BMP adicionales [por ejemplo, activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina Ae , activina BE), GDF8, GDF3, BMP15, BMP10 y BMP6], uno o más receptores de tipo I y/o receptores de tipo II (por ejemplo, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5 y/o ALK7) y/o uno o más correceptores. En algunos casos, un anticuerpo multiespecífico que se une a GDF11 no se une o no se une sustancialmente a BMP9 (por ejemplo, se une a BMP9 con una Kd de más de 1 x 10-7 M o tiene una unión relativamente modesta, por ejemplo, aproximadamente 1 x 10-8 M o aproximadamente 1 x 10-9 M). En algunos casos, un anticuerpo multiespecífico que se une a GDF11 no se une o no se une sustancialmente a la activina A (por ejemplo, se une a la activina A con una Kd de más de 1 x 10-7 M o tiene una unión relativamente modesta, por ejemplo, aproximadamente 1 x 10-8 M o aproximadamente 1 x 10-9 M). En algunos casos, la descripción se refiere a combinaciones de anticuerpos y usos de los mismos, donde la combinación de anticuerpos comprende un anticuerpo GDF11 y uno o más anticuerpos adicionales que se unen, por ejemplo, a uno o más ligandos de GDF/BMP adicionales [por ejemplo, activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE, activina Be ), Gd F8, GDF3, BMP6, BMP10 y BMP15], uno o más receptores de tipo I y/o receptores de tipo II (por ejemplo, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5 y/o ALK7) y/o uno o más correceptores. En algunos casos, una combinación de anticuerpos que comprende un anticuerpo GDF11 no comprende un anticuerpo BMP9. En algunos casos, una combinación de anticuerpos que comprende un anticuerpo GDF11 no comprende un anticuerpo de activina A.
En determinados casos, un anticuerpo antagonista de GDF/BMP, o una combinación de anticuerpos, es un anticuerpo que inhibe al menos BMP6. Por lo tanto, en algunos casos, un anticuerpo antagonista de GDF/BMP, o una combinación de anticuerpos, se une al menos a BMP6. Como se usa en esta invención, un anticuerpo BMP6 (o anticuerpo anti-BMP6) generalmente se refiere a un anticuerpo que puede unirse a BMP6 con suficiente afinidad como para que el anticuerpo sea útil como agente de diagnóstico y/o terapéutico en el direccionamiento de BMP6. En determinados casos, el grado de unión de un anticuerpo BMP6 a una proteína no relacionada diferente de BMP6 es menor de aproximadamente el 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % o menor de aproximadamente el 1 % de la unión del anticuerpo a BMP6 según lo medido, por ejemplo, mediante un radioinmunoensayo (RIA), Biacore u otro ensayo de interacción de proteínas o de afinidad de unión. En determinados casos, un anticuerpo BMP6 se une a un epítopo de BMP6 que se conserva entre BMP6 de diferentes especies. En determinados casos preferidos, un anticuerpo anti-BMP6 se une a BMP6 humana. En algunos casos, un anticuerpo BMP6 puede inhibir la unión de BMP6 a un receptor de tipo I y/o tipo II (por ejemplo, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5 y/o ALK7) e inhibir así la señalización mediada por BMP6 (por ejemplo, señalización de Smad). En algunos casos, un anticuerpo BMP6 puede inhibir la unión de BMP6 a un correceptor e inhibir así la señalización mediada por BMP6 (por ejemplo, señalización de Smad). En algunos casos, la descripción se refiere a un anticuerpo multiespecífico (por ejemplo, anticuerpo biespecífico), y usos del mismo, que se une a BMP6 y se une además, por ejemplo, a uno o más ligandos de GDF/BMP adicionales [por ejemplo, activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina Bc , activina AE, activina BE), GDF8, GDF3, BMP15, BMP10 y GDF11], uno o más receptores de tipo I y/o receptores de tipo II (por ejemplo, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5 y/o ALK7) y/o uno o más correceptores. En algunos casos, un anticuerpo multiespecífico que se une a BMP6 no se une o no se une sustancialmente a BMP9 (por ejemplo, se une a BMP9 con una Kd de más de 1 x 10'7 M o tiene una unión relativamente modesta, por ejemplo, aproximadamente 1 x 10-8 M o aproximadamente 1 x 10-9 M). En algunos casos, un anticuerpo multiespecífico que se une a BMP6 no se une o no se une sustancialmente a la activina A (por ejemplo, se une a la activina A con una Kd de más de 1 x 10'7 M o tiene una unión relativamente modesta, por ejemplo, aproximadamente 1 x 10'8 M o aproximadamente 1 x 10'9 M).
En algunos casos, la descripción se refiere a combinaciones de anticuerpos y usos de los mismos, donde la combinación de anticuerpos comprende un anticuerpo BMP6 y uno o más anticuerpos adicionales que se unen, por ejemplo, a uno o más ligandos de GDF/BMP adicionales [por ejemplo, activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE, activina Be ), Gd F8, GDF11, GDF3, BMP10 y BMP15], uno o más receptores de tipo I y/o receptores de tipo II (por ejemplo, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5 y/o ALK7) y/o uno o más correceptores. En algunos casos, una combinación de anticuerpos que comprende un anticuerpo BMP6 no comprende un anticuerpo BMP9. En algunos casos, una combinación de anticuerpos que comprende un anticuerpo BMP6 no comprende un anticuerpo de activina A.
En determinados casos, un anticuerpo antagonista de GDF/BMP, o una combinación de anticuerpos, es un anticuerpo que inhibe al menos GDF3. Por lo tanto, en algunos casos, un anticuerpo antagonista de GDF/BMP, o una combinación de anticuerpos, se une al menos a GDF3. Como se usa en esta invención, un anticuerpo GDF3 (o anticuerpo anti-GDF3) generalmente se refiere a un anticuerpo que puede unirse a GDF3 con suficiente afinidad como para que el anticuerpo sea útil como agente de diagnóstico y/o terapéutico en el direccionamiento de GDF3. En determinados casos, el grado de unión de un anticuerpo GDF3 a una proteína no relacionada diferente de GDF3 es menor de aproximadamente el 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % o menor de aproximadamente el 1 % de la unión del anticuerpo a GDF3 según lo medido, por ejemplo, mediante un radioinmunoensayo (RIA), Biacore u otro ensayo de interacción de proteínas o de afinidad de unión. En determinados casos, un anticuerpo GDF3 se une a un epítopo de GDF3 que se conserva entre GDF3 de diferentes especies. En determinados casos preferidos, un anticuerpo anti-GDF3 se une a GDF3 humana. En algunos casos, un anticuerpo GDF3 puede inhibir la unión de GDF3 a un receptor de tipo I y/o tipo II (por ejemplo, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5 y/o ALK7) e inhibir así la señalización mediada por GDF3 (por ejemplo, señalización de Smad). En algunos casos, un anticuerpo GDF3 puede inhibir la unión de GDF3 a un correceptor e inhibir así la señalización mediada por GDF3 (por ejemplo, señalización de Smad). En algunos casos, la descripción se refiere a un anticuerpo multiespecífico (por ejemplo, anticuerpo biespecífico), y usos del mismo, que se une a GDF3 y se une además, por ejemplo, a uno o más ligandos de GDF/BMP adicionales [por ejemplo, activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE, activina Be ), Gd F8, BMP6, BMP15, BMP10 y GDF11], uno o más receptores de tipo I y/o receptores de tipo II (por ejemplo, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5 y/o ALK7) y/o uno o más correceptores. En algunos casos, un anticuerpo multiespecífico que se une a GDF3 no se une o no se une sustancialmente a BMP9 (por ejemplo, se une a BMP9 con una Kd de más de 1 x 10'7 M o tiene una unión relativamente modesta, por ejemplo, aproximadamente 1 x 10'8 M o aproximadamente 1 x 10'9 M). En algunos casos, un anticuerpo multiespecífico que se une a GDF3 no se une o no se une sustancialmente a la activina A (por ejemplo, se une a la activina A con una Kd de más de 1 x 10'7 M o tiene una unión relativamente modesta, por ejemplo, aproximadamente 1 x 10'8 M o aproximadamente 1 x 10'9 M). En algunos casos, la descripción se refiere a combinaciones de anticuerpos y usos de los mismos, donde la combinación de anticuerpos comprende un anticuerpo GDF3 y uno o más anticuerpos adicionales que se unen, por ejemplo, a uno o más ligandos de GDF/BMP adicionales [por ejemplo, activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE, activina Be ), Gd F8, GDF11, BMP6, BMP10 y BMP15], uno o más receptores de tipo I y/o receptores de tipo II (por ejemplo, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5 y/o a LK7) y/o uno o más correceptores. En algunos casos, una combinación de anticuerpos que comprende un anticuerpo GDF3 no comprende un anticuerpo BMP9. En algunos casos, una combinación de anticuerpos que comprende un anticuerpo GDF3 no comprende un anticuerpo de activina A.
En determinados casos, un anticuerpo antagonista de GDF/BMP, o una combinación de anticuerpos, es un anticuerpo que inhibe al menos BMP15. Por lo tanto, en algunos casos, un anticuerpo antagonista de GDF/BMP, o una combinación de anticuerpos, se une al menos a BMP15. Como se usa en esta invención, un anticuerpo BMP15 (o anticuerpo anti-BMP15) generalmente se refiere a un anticuerpo que puede unirse a BMP15 con suficiente afinidad como para que el anticuerpo sea útil como agente de diagnóstico y/o terapéutico en el direccionamiento de BMP15. En determinados casos, el grado de unión de un anticuerpo BMP15 a una proteína no relacionada diferente de BMP15 es menor de aproximadamente el 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % o menor de aproximadamente el 1 % de la unión del anticuerpo a BMP15 según lo medido, por ejemplo, mediante un radioinmunoensayo (RIA), Biacore u otro ensayo de interacción de proteínas o de afinidad de unión. En determinados casos, un anticuerpo BMP15 se une a un epítopo de BMP15 que se conserva entre BMP15 de diferentes especies. En determinados casos preferidos, un anticuerpo anti-BMP15 se une a BMP15 humana. En algunos casos, un anticuerpo BMP15 puede inhibir la unión de BMP15 a un receptor de tipo I y/o tipo II (por ejemplo, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5 y/o ALK7) e inhibir así la señalización mediada por BMP15 (por ejemplo, señalización de Smad). En algunos casos, un anticuerpo BMP15 puede inhibir la unión de BMP15 a un correceptor e inhibir así la señalización mediada por BMP15 (por ejemplo, señalización de Smad). En algunos casos, la descripción se refiere a un anticuerpo multiespecífico (por ejemplo, anticuerpo biespecífico), y usos del mismo, que se une a BMP15 y se une además, por ejemplo, a uno o más ligandos de GDF/BMP adicionales [por ejemplo, activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE, activina b E), g Df8, GDF11, GDF3, BMP10 y BMP6], uno o más receptores de tipo I y/o receptores de tipo II (por ejemplo, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5 y/o ALK7) y/o uno o más correceptores. En algunos casos, un anticuerpo multiespecífico que se une a BMP15 no se une o no se une sustancialmente a BMP9 (por ejemplo, se une a BMP9 con una Kd de más de 1 x 10'7 M o tiene una unión relativamente modesta, por ejemplo, aproximadamente 1 x 10'8 M o aproximadamente 1 x 10'9 M). En algunos casos, un anticuerpo multiespecífico que se une a BMP15 no se une o no se une sustancialmente a la activina A (por ejemplo, se une a la activina A con una Kd de más de 1 x 10'7 M o tiene una unión relativamente modesta, por ejemplo, aproximadamente 1 x 10'8 M o aproximadamente 1 x 10'9 M). En algunos casos, la descripción se refiere a combinaciones de anticuerpos y usos de los mismos, donde la combinación de anticuerpos comprende un anticuerpo BMP15 y uno o más anticuerpos adicionales que se unen, por ejemplo, a uno o más ligandos de GDF/BMP adicionales [por ejemplo, activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina Ae y activina BE), GDF8, GDF3, BMP6, BMP10 y GDF11], uno o más receptores de tipo I y/o receptores de tipo II (por ejemplo, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5 y/o ALK7) y/o uno o más correceptores. En algunos casos, una combinación de anticuerpos que comprende un anticuerpo BMP15 no comprende un anticuerpo BMP9. En algunos casos, una combinación de anticuerpos que comprende un anticuerpo BMP15 no comprende un anticuerpo de activina A.
En determinados casos, un anticuerpo antagonista de GDF/BMP, o una combinación de anticuerpos, es un anticuerpo que inhibe al menos BMP10. Por lo tanto, en algunos casos, un anticuerpo antagonista de GDF/BMP, o una combinación de anticuerpos, se une al menos a BMP10. Como se usa en esta invención, un anticuerpo BMP10 (o anticuerpo anti-BMP10) generalmente se refiere a un anticuerpo que puede unirse a BMP10 con suficiente afinidad como para que el anticuerpo sea útil como agente de diagnóstico y/o terapéutico en el direccionamiento de BMP10. En determinados casos, el grado de unión de un anticuerpo BMP10 a una proteína no relacionada diferente de BMP10 es menor de aproximadamente el 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % o menor de aproximadamente el 1 % de la unión del anticuerpo a BMP10 según lo medido, por ejemplo, mediante un radioinmunoensayo (RIA), Biacore u otro ensayo de interacción de proteínas o de afinidad de unión. En determinados casos, un anticuerpo BMP10 se une a un epítopo de BMP10 que se conserva entre BMP10 de diferentes especies. En determinados casos preferidos, un anticuerpo anti-BMP10 se une a BMP10 humana. En algunos casos, un anticuerpo BMP10 puede inhibir la unión de BMP10 a un receptor de tipo I y/o tipo II (por ejemplo, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5 y/o ALK7) e inhibir así la señalización mediada por BMP10 (por ejemplo, señalización de Smad). En algunos casos, un anticuerpo BMP10 puede inhibir la unión de BMP10 a un correceptor e inhibir así la señalización mediada por BMP10 (por ejemplo, señalización de Smad). En algunos casos, la descripción se refiere a un anticuerpo multiespecífico (por ejemplo, anticuerpo biespecífico), y usos del mismo, que se une a BMP10 y se une además, por ejemplo, a uno o más ligandos de GDF/BMP adicionales [por ejemplo, activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE, activina BE), g DF8, GDF11, GDF3 y BMP6], uno o más receptores de tipo I y/o receptores de tipo II (por ejemplo, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5 y/o ALK7) y/o uno o más correceptores. En algunos casos, un anticuerpo multiespecífico que se une a BMP10 no se une o no se une sustancialmente a BMP9 (por ejemplo, se une a BMP9 con una Kd de más de 1 x 10-7 M o tiene una unión relativamente modesta, por ejemplo, aproximadamente 1 x 10-8 M o aproximadamente 1 x 10-9 M). En algunos casos, un anticuerpo multiespecífico que se une a BMP10 no se une o no se une sustancialmente a la activina A (por ejemplo, se une a la activina A con una Kd de más de 1 x 10-7 M o tiene una unión relativamente modesta, por ejemplo, aproximadamente 1 x 10-8 M o aproximadamente 1 x 10-9 M). En algunos casos, la descripción se refiere a combinaciones de anticuerpos y usos de los mismos, donde la combinación de anticuerpos comprende un anticuerpo BMP10 y uno o más anticuerpos adicionales que se unen, por ejemplo, a uno o más ligandos de GDF/BMP adicionales [por ejemplo, activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE y activina BE), GDF8, GDF3, BMP6, BMP10 y GDF11], uno o más receptores de tipo I y/o receptores de tipo II (por ejemplo, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5 y/o ALK7) y/o uno o más correceptores. En algunos casos, una combinación de anticuerpos que comprende un anticuerpo BMP10 no comprende un anticuerpo BMP9. En algunos casos, una combinación de anticuerpos que comprende un anticuerpo BMP10 no comprende un anticuerpo de activina A.
En determinados casos, un anticuerpo antagonista de GDF/BMP, o una combinación de anticuerpos, es un anticuerpo que inhibe al menos ActRIIB. Por lo tanto, en algunos casos, un anticuerpo antagonista de GDF/BMP, o una combinación de anticuerpos, se une al menos a ActRIIB. Como se usa en esta invención, un anticuerpo ActRIIB (o anticuerpo anti-ActRIIB) generalmente se refiere a un anticuerpo que se une a ActRIIB con suficiente afinidad como para que el anticuerpo sea útil como un agente de diagnóstico y/o terapéutico en el direccionamiento de ActRIIB. En determinados casos, el grado de unión de un anticuerpo anti-ActRIIB a una proteína no relacionada diferente de ActRIIB es menor de aproximadamente el 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % o menor de aproximadamente el 1 % de la unión del anticuerpo a ActRIIB según lo medido, por ejemplo, mediante un radioinmunoensayo (RIA), Biacore u otro ensayo de interacción entre proteínas o de afinidad de unión. En determinados casos, un anticuerpo anti-ActRIIB se une a un epítopo de ActRIIB que se conserva entre ActRIIB de diferentes especies. En determinados casos preferidos, un anticuerpo anti-ActRIIB se une a ActRIIB humana. En algunos casos, un anticuerpo anti-ActRIIB puede inhibir la unión de uno o más ligandos de GDF/BMP [por ejemplo, GDF8, activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE y activina BE), GDF11, BMP6, GDF3, BMP10 y BMP15] a ActRIIB. En algunos casos, un anticuerpo anti-ActRIIB es un anticuerpo multiespecífico (por ejemplo, anticuerpo biespecífico) que se une a ActRIIB y uno o más ligandos de GDF/BMP [por ejemplo, GDF11, GDF8, activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC), GDF3, BMP6 y BMP10], un receptor de tipo I (por ejemplo, ALK4, ALK5 y/o ALK7), un correceptor y/o un receptor de tipo II adicional (por ejemplo, ActRIIA). En algunos casos, la descripción se refiere a combinaciones de anticuerpos y usos de los mismos, donde la combinación de anticuerpos comprende un anticuerpo anti-ActRIIB y uno o más anticuerpos adicionales que se unen, por ejemplo, a uno o más ligandos de GDF/BMP adicionales [por ejemplo, GDF11, GDF8, activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE y activina Be ), Bm P6, GDF3 y BMP10], correceptores, receptores de tipo I (por ejemplo, ALK4, ALK5 y/o ALK7) y/o receptores de tipo II adicionales (por ejemplo, ActRIIA). Cabe señalar que ActRIIB tiene similitud de secuencia con ActRIIA y, por lo tanto, los anticuerpos que se unen a ActRIIB, en algunos casos, también pueden unirse a y/o inhibir ActRIIA.
En determinados casos, un anticuerpo antagonista de GDF/BMP, o una combinación de anticuerpos, es un anticuerpo que inhibe al menos ActRIIA. Por lo tanto, en algunos casos, un anticuerpo antagonista de GDF/BMP, o una combinación de anticuerpos, se une al menos a ActRIIA. Como se usa en esta invención, un anticuerpo ActRIIA (o anticuerpo anti-ActRIIA) generalmente se refiere a un anticuerpo que se une a ActRIIA con suficiente afinidad como para que el anticuerpo sea útil como un agente de diagnóstico y/o terapéutico en el direccionamiento de ActRIIA. En determinados casos, el grado de unión de un anticuerpo anti-ActRIIA a una proteína no relacionada diferente de ActRIIA es menor de aproximadamente el 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % o menor de aproximadamente el 1 % de la unión del anticuerpo a ActRIIA según lo medido, por ejemplo, mediante un radioinmunoensayo (RIA), Biacore u otro ensayo de interacción entre proteínas o de afinidad de unión. En determinados casos, un anticuerpo anti-ActRIIA se une a un epítopo de ActRIIA que se conserva entre ActRIIA de diferentes especies. En determinados casos preferidos, un anticuerpo anti-ActRIIA se une a ActRIIA humana. En algunos casos, un anticuerpo anti-ActRIIA puede inhibir la unión de uno o más ligandos de GDF/BMP [por ejemplo, GDF8, activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE y activina BE), GDF11, BMP6, GDF3, BMP10 y BMP15] a ActRIIA. En algunos casos, un anticuerpo anti-ActRIIA es un anticuerpo multiespecífico (por ejemplo, anticuerpo biespecífico) que se une a ActRIIA y uno o más ligandos de GDF/BMP [por ejemplo, GDF11, GDF8, activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC), GDF3, BMP6 y BMP10], un receptor de tipo I (por ejemplo, ALK4, ALK5 y/o ALK7), un correceptor y/o un receptor de tipo II adicional (por ejemplo, ActRIIB). En algunos casos, la descripción se refiere a combinaciones de anticuerpos y usos de los mismos, donde la combinación de anticuerpos comprende un anticuerpo anti-ActRIIA y uno o más anticuerpos adicionales que se unen, por ejemplo, a uno o más ligandos de GDF/BMP adicionales [por ejemplo, GDF11, GDF8, activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE y activina BE), BMP6 y BMP10], correceptores, receptores de tipo I (por ejemplo, ALK4, ALK5 y/o ALK7) y/o receptores de tipo II adicionales (por ejemplo, ActRIIB). Cabe señalar que ActRIIA tiene similitud de secuencia con ActRIIB y, por lo tanto, los anticuerpos que se unen a ActRIIA, en algunos casos, también pueden unirse a y/o inhibir ActRIIB.
En determinados casos, un anticuerpo antagonista de GDF/BMP, o una combinación de anticuerpos, es un anticuerpo que inhibe al menos ALK4. Por lo tanto, en algunos casos, un anticuerpo antagonista de GDF/BMP, o una combinación de anticuerpos, se une al menos a ALK4. Como se usa en esta invención, un anticuerpo ALK4 (anticuerpo anti-ALK4) generalmente se refiere a un anticuerpo que se une a ALK4 con suficiente afinidad como para que el anticuerpo sea útil como agente de diagnóstico y/o terapéutico en el direccionamiento de ALK4. En determinados casos, el grado de unión de un anticuerpo anti-ALK4 a una proteína no relacionada diferente de ALK4 es menor de aproximadamente el 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % o menor de aproximadamente el 1 % de la unión del anticuerpo a ALK4 según lo medido, por ejemplo, mediante un radioinmunoensayo (RIA), Biacore u otro ensayo de interacción entre proteínas o de afinidad de unión. En determinados casos, un anticuerpo anti-ALK4 se une a un epítopo de ALK4 que se conserva entre ALK4 de diferentes especies. En determinados casos preferidos, un anticuerpo anti-ALK4 se une a ALK4 humana. En algunos casos, un anticuerpo anti-ALK4 puede inhibir la unión de uno o más ligandos de GDF/BMP [por ejemplo, GDF8, activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE y activina BE), GDF11, BMP6, GDF3, BMP10 y BMP15] a ALK4. En algunos casos, un anticuerpo anti-ALK4 es un anticuerpo multiespecífico (por ejemplo, anticuerpo biespecífico) que se une a ALK4 y uno o más ligandos de GDF/BMP [por ejemplo, GDF11, GDF8, activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC), Gd F3, BMP6 y BMP10], un receptor de tipo II (por ejemplo, ActRIIA y/o ActRIIB), un correceptor y/o un receptor de tipo I adicional (por ejemplo, ALK5 y/o ALK7). En algunos casos, la descripción se refiere a combinaciones de anticuerpos y usos de los mismos, donde la combinación de anticuerpos comprende un anticuerpo anti-ALK4 y uno o más anticuerpos adicionales que se unen, por ejemplo, a uno o más ligandos de GDF/BMP adicionales [por ejemplo, GDF11, GDF8, activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE y activina BE), BMP6 y BMP10], correceptores, receptores de tipo II (por ejemplo, ActRIIA y/o ActRIIB) y/o receptores de tipo I adicionales (por ejemplo, ALK5 y/o ALK7).
En determinados casos, un anticuerpo antagonista de GDF/BMP, o una combinación de anticuerpos, es un anticuerpo que inhibe al menos ALK5. Por lo tanto, en algunos casos, un anticuerpo antagonista de GDF/BMP, o una combinación de anticuerpos, se une al menos a ALK5. Como se usa en esta invención, un anticuerpo ALK5 (anticuerpo anti-ALK5) generalmente se refiere a un anticuerpo que se une a ALK5 con suficiente afinidad como para que el anticuerpo sea útil como agente de diagnóstico y/o terapéutico en el direccionamiento de ALK5. En determinados casos, el grado de unión de un anticuerpo anti-ALK5 a una proteína no relacionada diferente de ALK5 es menor de aproximadamente el 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % o menor de aproximadamente el 1 % de la unión del anticuerpo a ALK5 según lo medido, por ejemplo, mediante un radioinmunoensayo (RIA), Biacore u otro ensayo de interacción entre proteínas o de afinidad de unión. En determinados casos, un anticuerpo anti-ALK5 se une a un epítopo de ALK5 que se conserva entre ALK5 de diferentes especies. En determinados casos preferidos, un anticuerpo anti-ALK5 se une a ALK5 humana. En algunos casos, un anticuerpo anti-ALK5 puede inhibir la unión de uno o más ligandos de GDF/BMP [por ejemplo, GDF8, activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE y activina BE), GDF11, BMP6, GDF3, BMP10 y BMP15] a ALK5. En algunos casos, un anticuerpo anti-ALK5 es un anticuerpo multiespecífico (por ejemplo, anticuerpo biespecífico) que se une a ALK5 y uno o más ligandos de GDF/BMP [por ejemplo, GDF11, GDF8, activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC), Gd F3, BMP6 y BMP10], un receptor de tipo II (por ejemplo, ActRIIA y/o ActRIIB), un correceptor y/o un receptor de tipo I adicional (por ejemplo, ALK4 y/o ALK7). En algunos casos, la descripción se refiere a combinaciones de anticuerpos y usos de los mismos, donde la combinación de anticuerpos comprende un anticuerpo anti-ALK5 y uno o más anticuerpos adicionales que se unen, por ejemplo, a uno o más ligandos de GDF/BMP adicionales [por ejemplo, GDF11, GDF8, activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina a C, activina BC, activina AE y activina BE), BMP6 y BMP10], correceptores, receptores de tipo II (por ejemplo, ActRIIA y/o ActRIIB) y/o receptores de tipo I adicionales (por ejemplo, ALK4 y/o ALK7).
En determinados casos, un anticuerpo antagonista de GDF/BMP, o una combinación de anticuerpos, es un anticuerpo que inhibe al menos ALK7. Por lo tanto, en algunos casos, un anticuerpo antagonista de GDF/BMP, o una combinación de anticuerpos, se une al menos a ALK7. Como se usa en esta invención, un anticuerpo ALK7 (anticuerpo anti-ALK7) generalmente se refiere a un anticuerpo que se une a ALK7 con suficiente afinidad como para que el anticuerpo sea útil como agente de diagnóstico y/o terapéutico en el direccionamiento de ALK7. En determinados casos, el grado de unión de un anticuerpo anti-ALK7 a una proteína no relacionada diferente de ALK7 es menor de aproximadamente el 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % o menor de aproximadamente el 1 % de la unión del anticuerpo a ALK7 según lo medido, por ejemplo, mediante un radioinmunoensayo (RIA), Biacore u otro ensayo de interacción entre proteínas o de afinidad de unión. En determinados casos, un anticuerpo anti-ALK7 se une a un epítopo de ALK7 que se conserva entre ALK7 de diferentes especies. En determinados casos preferidos, un anticuerpo anti-ALK7 se une a ALK7 humana. En algunos casos, un anticuerpo anti-ALK7 puede inhibir la unión de uno o más ligandos de GDF/BMP [por ejemplo, GDF8, activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE y activina BE), GDF11, BMP6, GDF3, BMP10 y BMP15] a ALK7. En algunos casos, un anticuerpo anti-ALK7 es un anticuerpo multiespecífico (por ejemplo, anticuerpo biespecífico) que se une a ALK7 y uno o más ligandos de GDF/BMP [por ejemplo, GDF11, GDF8, activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC), Gd F3, BMP6 y BMP10], un receptor de tipo II (por ejemplo, ActRIIA y/o ActRIIB), un correceptor y/o un receptor de tipo I adicional (por ejemplo, ALK4 y/o ALK5). En algunos casos, la descripción se refiere a combinaciones de anticuerpos y usos de los mismos, donde la combinación de anticuerpos comprende un anticuerpo anti-ALK7 y uno o más anticuerpos adicionales que se unen, por ejemplo, a uno o más ligandos de GDF/BMP adicionales [por ejemplo, GDF11, GDF8, activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina a C, activina BC, activina AE y activina BE), BMP6 y BMP10], correceptores, receptores de tipo II (por ejemplo, ActRIIA y/o ActRIIB) y/o receptores de tipo I adicionales (por ejemplo, ALK4 y/o ALK5).
El término anticuerpo se usa en esta invención en el sentido más amplio y abarca diversas estructuras de anticuerpo, incluyendo, pero in limitación, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpos siempre que presenten la actividad de unión a antígeno deseada. Un fragmento de anticuerpo se refiere a una molécula distinta de un anticuerpo intacto que comprende una porción de un anticuerpo intacto que se une al antígeno al que se une el anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, pero sin limitación, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo monocatenarias (por ejemplo, scFv); y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos [véase, por ejemplo, Hudson y col. (2003) Nat. Med. 9:129-134; Plückthun, en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., (Springer-Verlag, Nueva York), págs. 269-315 (1994); documento WO 93/16185; y las Pat. de EE.UU. N.° 5.571.894; 5.587-458; y 5.869.046]. Los diacuerpos son fragmentos de anticuerpos con dos sitios de unión a antígeno que pueden ser bivalentes o biespecíficos [véase, por ejemplo, documentos EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson y col. (2003) Nat. Med. 9:129-134 (2003); y Hollinger y col. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448]. También se describen triacuerpos y tetracuerpos también en Hudson y col. (2003) Nat. Med. 9:129-134. Los anticuerpos de dominio único son fragmentos de anticuerpos que comprenden la totalidad o una parte del dominio variable de cadena pesada o la totalidad o una parte del dominio variable de cadena ligera de un anticuerpo. En determinados casos, un anticuerpo de dominio único es un anticuerpo de dominio único humano [véase, por ejemplo, la Pat. de EE.UU. N.° 6.248.516]. Los anticuerpos descritos en esta invención pueden ser anticuerpos policlonales o anticuerpos monoclonales. En determinados casos, los anticuerpos de la presente descripción comprenden un marcador adherido a los mismos y que puede detectarse (por ejemplo, el marcador puede ser un radioisótopo, compuesto fluorescente, enzima o cofactor enzimático).En determinados casos preferidos, los anticuerpos de la presente descripción son anticuerpos aislados. En determinados casos preferidos, los anticuerpos de la presente descripción son anticuerpos recombinantes.
Los anticuerpos en esta invención pueden ser de cualquier clase. La clase de un anticuerpo se refiere al tipo de dominio constante o región constante que posee su cadena pesada. Hay cinco clases principales de anticuerpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varios de estos pueden dividirse en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgAi e IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan alfa, delta, épsilon, gamma y mu.
En general, un anticuerpo para su uso en los procedimientos descritos en esta invención se une específicamente a su antígeno diana, preferentemente con alta afinidad de unión. La afinidad puede expresarse como un valor Kd y refleja la afinidad de unión intrínseca (por ejemplo, con efectos de avidez minimizados). Típicamente, la afinidad de unión se mide in vitro, ya sea en un entorno sin células o asociado a células. Se puede usar cualquiera de varios ensayos conocidos en la técnica, incluidos los descritos en esta invención, para obtener medidas de afinidad de unión que incluyen, por ejemplo, Biacore, ensayo de unión de antígeno radiomarcado (RIA) y ELISA. En algunos casos, los anticuerpos de la presente descripción se unen a sus antígenos diana (por ejemplo, ActRIIB, ActRIIA, ALK4, ALK5, ALK7, activina, GDF11, GDF8, GDF3, BMP15, BMP10 y/o BMP6) con al menos una Kd de 1 x 10'7 o más fuerte, 1 x 10'8 o más fuerte, 1 x 10‘9 o más fuerte, 1 x 10'10 o más fuerte, 1 x 10'11 o más fuerte, 1 x 10‘12 o más fuerte, 1 x 10'13 o más fuerte o 1 x 10'14 o más fuerte.
En determinados casos, la KD se mide mediante RIA realizado con la versión Fab de un anticuerpo de interés y su antígeno diana como se describe en el siguiente ensayo. La afinidad de unión de los Fab a la solución por el antígeno se mide equilibrando el Fab con una concentración mínima de antígeno radiomarcado (por ejemplo, marcado con 125I) en presencia de una serie de titulación de antígeno no marcado, y a continuación capturando el antígeno unido con una placa recubierta de anticuerpo anti-Fab [véase, por ejemplo, Chen y col. (1999) J. Mol. Biol. 293:865-881]. Para establecer las condiciones para el ensayo, las placas de múltiples pocillos (por ejemplo, MICROTITER® de Thermo Scientific) se recubren (por ejemplo, durante una noche) con un anticuerpo anti-Fab de captura (por ejemplo, De Cappel Labs) y posteriormente se bloquean con albúmina sérica bovina, preferentemente a temperatura ambiente (aproximadamente 23 °C). En una placa no adsorbente, el antígeno radiomarcado se mezcla con diluciones seriadas de un Fab de interés [por ejemplo, según la evaluación del anticuerpo anti-VEGF, Fab-12, en Presta y col., (1997) Cancer Res. 57:4593-4599]. A continuación, se incuba el Fab de interés, preferentemente durante una noche, pero la incubación puede continuar durante un periodo más largo (por ejemplo, aproximadamente 65 horas) para asegurar que se alcanza el equilibrio. Posteriormente, las mezclas se transfieren a la placa de captura para su incubación, preferentemente a temperatura ambiente durante aproximadamente una hora. A continuación se retira la solución y la placa se lava varias veces, preferentemente con polisorbato 20 y mezcla de PBS. Cuando las placas se han secado, se añade centelleador (por ejemplo, MICROSCINT® de Packard) y las placas se cuentan en un contador gamma (por ejemplo, TOPCOUNT® de Packard).
Según otros casos, la Kd se mide usando ensayos de resonancia de plasmón superficial usando, por ejemplo, un BIACORE® 2000 o un BIACORE® 3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, nJ) con chips CM5 de antígeno inmovilizado a aproximadamente 10 unidades de respuesta (UR). Brevemente, los chips biosensores de dextrano carboximetilado (CM5, BIACORE, Inc.) se activan con clorhidrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) según las instrucciones del proveedor. Por ejemplo, un antígeno se puede diluir con acetato de sodio 10 mM, a pH 4,8, a 5 |jg/ml (aproximadamente 0,2 |jM) antes de la inyección a un caudal de 5 jl/minuto para lograr aproximadamente 10 unidades de respuesta (UR) de proteína acoplada. Después de la inyección de antígeno, se inyecta etanolamina 1 M para bloquear los grupos sin reaccionar. Para las mediciones cinéticas, se inyectan diluciones en serie dobles de Fab (0,78 nM a 500 nM) en PBS con tensioactivo polisorbato 20 (TWEEN-20®) al 0,05 % (PBST) a un caudal de aproximadamente 25 jl/min. Las tasas de asociación (kasociación) y las tasas de disociación (kdisociación ) se calculan usando, por ejemplo, un modelo de unión de Langmuir simple uno a uno (Software de evaluación BIACORE® versión 3.2) ajustando simultáneamente los sensogramas de asociación y disociación. La constante de disociación de equilibrio (Kd) se calcula como la relación kdisociación/kasociación [véase, por ejemplo, Chen y col., (1999) J. Mol. Biol. 293:865-881]. Si la tasa de asociación excede, por ejemplo, de 106 M'1 s_1 por el ensayo de resonancia de plasmón superficial anterior, entonces la tasa de asociación se puede determinar utilizando una técnica de desactivación fluorescente que mide el aumento o la disminución de la intensidad de emisión de fluorescencia (por ejemplo, excitación = 295 nm; emisión = 340 nm, paso de banda de 16 nm) de un anticuerpo anti-antígeno 20 nM (forma Fab) en PBS en presencia de concentraciones crecientes de antígeno según lo medido en un espectrómetro, tal como un espectrofotómetro equipado con de parada de flujo (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro SLM-AMINCO® serie 8000 (ThermoSpectronic) con una cubeta agitada.
Los fragmentos de anticuerpos se pueden preparar mediante diversas técnicas, incluyendo, pero sin limitación, la digestión proteolítica de un anticuerpo intacto, así como la producción por células huésped recombinantes (por ejemplo, E. coli o fagos), como se describe en esta invención. Se conocen en la técnicas las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos de ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7, activina (activina A, activina B, activina C y activina E), GDF11, GDF8, BMP15, GDF3, BMP10 y BMP6 humanas. Además, se conocen bien en la técnica numerosos procedimientos para generar anticuerpos, algunos de los cuales se describen en esta invención. Por lo tanto, el experto en la técnica puede fabricar de forma rutinaria antagonistas de anticuerpos para su uso según esta descripción basándose en el conocimiento de la técnica y las enseñanzas proporcionadas en esta invención.
En determinados casos, un anticuerpo proporcionado en esta invención es un anticuerpo quimérico. Un anticuerpo quimérico se refiere a un anticuerpo en el que una porción de la cadena pesada y/o ligera se deriva de una fuente o especie particular, mientras que el resto de la cadena pesada y/o ligera se deriva de una fuente o especie diferente. Se describen determinados anticuerpos quiméricos, por ejemplo, en la Pat. de EE.UU. N.° 4.816.567; y Morrison y col., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855. En algunos casos, un anticuerpo quimérico comprende una región variable no humana (por ejemplo, una región variable derivada de un ratón, rata, hámster, conejo o primate no humano, tal como un mono) y una región constante humana. En algunos casos, un anticuerpo quimérico es un anticuerpo de "cambio de clase" en el que la clase o subclase se ha cambiado de la del anticuerpo precursor. En general, los anticuerpos quiméricos incluyen fragmentos de unión a antígeno de los mismos.
En determinados casos, un anticuerpo quimérico proporcionado en esta invención es un anticuerpo humanizado. Un anticuerpo humanizado se refiere a un anticuerpo quimérico que comprende residuos de aminoácidos de regiones hipervariables no humanas (HVR) y residuos de aminoácidos de regiones marco humanas (FR). En determinados casos, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las HVR (por ejemplo, CDR) corresponden a las de un anticuerpo no humano, y todas o sustancialmente todas las FR corresponden a las de un anticuerpo humano. Opcionalmente, un anticuerpo humanizado puede comprender al menos una porción de una región constante de anticuerpo derivada de un anticuerpo humano. Una "forma humanizada" de un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo no humano, se refiere a un anticuerpo que se ha humanizado. Los anticuerpos humanizados y los procedimientos para fabricarlos se revisan, por ejemplo, en Almagro y Fransson (2008) Front. Biosci. 13:1619-1633 y se describen adicionalmente, por ejemplo, en Riechmann y col., (1988) Nature 332:323-329; Queen y col. (1989) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033; Pat. de EE.UU. N.° 5.821.337; 7.527.791; 6.982.321; y Pat. de EE.UU. N.° 7.087.409; Kashmiri y col., (2005) Methods 36:25-34 [que describe el injerto de SDR (a-CDR)]; Padlan, Mol. Immunol. (1991) 28:489-498 (que describe el "acondicionamiento"); Dall'Acqua y col. (2005) Methods 36:43-60 (que describe el "barajado de FR"); Osbourn y col. (2005) Methods 36:61-68; y Klimka y col. Br. J. Cancer (2000) 83:252-260 (que describe el enfoque de "selección guiada" con respecto al enfoque de FR). Las regiones marco humano que se pueden usar para la humanización incluyen, pero sin limitación: regiones del marco seleccionadas usando el procedimiento de "mejor ajuste" [véase, por ejemplo, Sims y col. (1993) J. Immunol. 151:2296]; regiones marco derivadas de la secuencia consenso de anticuerpos humanos de un subgrupo particular de regiones variables de cadena ligera o pesada [véanse, por ejemplo, Carter y col. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285; y Presta y col. (1993) J. Immunol., 151:2623]; regiones marco humanas maduras (mutadas somáticamente) o regiones marco de la línea germinal humana [véase, por ejemplo, Almagro y Fransson (2008) Front. Biosci. 13:1619-1633]; y regiones marco derivadas del cribado de bibliotecas de FR [véase, por ejemplo, Baca y col., (1997) J. Biol. Chem. 272:10678-10684; y Rosok y col., (1996) J. Biol. Chem.
271:22611-22618],
En determinados casos, un anticuerpo proporcionado en esta invención es un anticuerpo humano. Los anticuerpos humanos pueden producirse usando diversas técnicas conocidas en la técnica. Los anticuerpos humanos se describen generalmente en van Dijk y van de Winkel (2008) Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) y Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459. Por ejemplo, los anticuerpos humanos se pueden preparar administrando un inmunógeno (por ejemplo, un polipéptido GDF11, un polipéptido de activina B, un polipéptido ActRIIA o un polipéptido ActRIIB) a un animal transgénico que ha sido modificado para producir anticuerpos humanos intactos o anticuerpos intactos con regiones variables humanas en respuesta al desafío antigénico. Dichos animales contienen típicamente todos o una porción de los locus de inmunoglobulina humana, que reemplazan los locus de inmunoglobulina endógenos, o que están presentes extracromosómicamente o integrados aleatoriamente en los cromosomas del animal. En dichos animales transgénicos, los locus de inmunoglobulina endógenos generalmente se han inactivado. Para una revisión de los procedimientos para obtener anticuerpos humanos a partir de animales transgénicos, véanse, por ejemplo, Lonberg (2005) Nat. Biotech. 23:1117-1125; Pat. de EE.UU. N.° 6.075.181 y 6.150.584 (que describen la tecnología XENOMOUSE™); Pat. de EE.UU. N.° 5.770.429 (que describe la tecnología HuMab®); Pat. de EE.UU. N.° 7.041.870 (que describe la tecnología K-M MOUSE®); y la Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. N.° 2007/0061900 (que describe la tecnología VelociMouse®). Las regiones variables humanas de anticuerpos intactos generados por dichos animales pueden modificarse adicionalmente, por ejemplo, mediante la combinación con una región constante humana diferente.
Los anticuerpos humanos proporcionados en esta invención también se pueden preparar mediante procedimientos basados en hibridomas. Se han descrito líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma de ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos [véanse, por ejemplo, Kozbor J. Immunol., (1984) 133: 3001; Brodeur y col. (1987) Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, págs. 51-63, Marcel Dekker, Inc., Nueva York; y Boerner y col. (1991) J. Immunol., 147: 86]. También se describen anticuerpos humanos generados a través de tecnología de hibridoma de linfocitos B humanos en Li y col., (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562. Los procedimientos adicionales incluyen los descritos, por ejemplo, en la Pat. de EE.UU. N.° 7.189.826 (que describe la producción de anticuerpos IgM humanos monoclonales a partir de líneas celulares de hibridoma) y Ni, Xiandai Mianyixue (2006) 26(4):265-268 (2006) (que describe hibridomas humano-humano). La tecnología de hibridoma humano (Trioma technology) también se describe en Vollmers y Brandlein (2005) Histol. Histopathol., 20(3):927-937 (2005) y Vollmers y Brandlein (2005) Methods Find Exp. Clin. Pharmacol., 27(3): 185-91. Los anticuerpos humanos proporcionados en esta invención también se pueden generar aislando secuencias de dominio variable del clon Fv seleccionadas de bibliotecas de presentación en fagos derivadas de seres humanos. A continuación, dichas secuencias de dominio variable pueden combinarse con un dominio constante humano deseado. Las técnicas para seleccionar anticuerpos humanos a partir de bibliotecas de anticuerpos se conocen en la técnica y se describen en esta invención.
Por ejemplo, los anticuerpos de la presente descripción pueden aislarse mediante el cribado de bibliotecas combinatorias para anticuerpos con la actividad o actividades deseadas. Se conocen en la técnica una diversidad de procedimientos para generar bibliotecas de presentación en fagos y cribar dichas bibliotecas en busca de anticuerpos que posean las características de unión deseadas. Dichos procedimientos se revisan, por ejemplo, en Hoogenboom y col. (2001) en Methods in Molecular Biology 178:1-37, O'Brien y col., Ed., Human Press, Totowa, N.J. y se describen adicionalmente, por ejemplo, en McCafferty y col. (1991) Nature 348:552-554; Clackson y col., (1991) Nature 352: 624­ 628; Marks y col. (1992) J. Mol. Biol. 222:581-597; Marks y Bradbury (2003) en Methods in Molecular Biology 248:161-175, Lo, ed., Human Press, Totowa, N.J.; Sidhu y col. (2004) J. Mol. Biol. 338(2):299-310; Lee y col. (2004) J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093; Fellouse (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472; y Lee y col. (2004) J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132.
En determinados procedimientos de presentación en fagos, los repertorios de genes VH y VL se clonan por separado mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y se recombinan aleatoriamente en bibliotecas de fagos, que a continuación se pueden cribar para detectar fagos de unión a antígenos como se describe en Winter y col. (1994) Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455. Los fagos típicamente muestran fragmentos de anticuerpos, ya sea como fragmentos Fv monocatenarios (scFv) o como fragmentos Fab. Las bibliotecas de fuentes inmunizadas proporcionan anticuerpos de alta afinidad al inmunógeno (por ejemplo, ActRIIA, ActRIIB, activina, GDF11, GDF8, BMP15, GDF3 o BMP6) sin el requisito de construir hibridomas. Como alternativa, el repertorio sin tratar se puede clonar (por ejemplo, de ser humano) para proporcionar una única fuente de anticuerpos contra una amplia gama de no autoantígenos y también autoantígenos sin ninguna inmunización como se describe por Griffiths y col. (1993) EMBO J, 12: 725-734. Finalmente, las bibliotecas sin tratar también se pueden hacer sintéticamente clonando segmentos del gen V no reordenados de células madre y utilizando cebadores de PCR que contienen una secuencia aleatoria para codificar las regiones CDR3 altamente variables y lograr el reordenamiento in vitro, como se describe por Hoogenboom y Winter (1992). J. Mol. Biol., 227: 381-388. Las publicaciones de patente que describen bibliotecas de fagos de anticuerpos humanos incluyen, por ejemplo: La Pat. de EE.UU. N.° 5.750.373, y las Publicaciones de Patente de EE.UU. N.° 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 y 2009/0002360.
En determinados casos, un anticuerpo proporcionado en esta invención es un anticuerpo multiespecífico, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico. Anticuerpos multiespecíficos (típicamente anticuerpos monoclonales) que tienen especificidades de unión por al menos dos epítopos diferentes (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco o seis o más) en uno o más (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más) antígenos.
Las técnicas para preparar anticuerpos multiespecíficos incluyen, pero sin limitación, la coexpresión recombinante de dos pares de cadena pesada/cadena ligera de inmunoglobulina que tienen diferentes especificidades [véanse, por ejemplo, Milstein y Cuello (1983) Nature 305: 537; la Publicación de Patente Internacional n.° WO 93/08829; y Traunecker y col. (1991) Em Bo J. 10: 3655, y la Pat. de EE.UU. N.° 5.731.168 (ingeniería de "botón en ojal")]. También pueden prepararse anticuerpos multiespecíficos genomanipulando los efectos de dirección electrostática para producir moléculas heterodiméricas Fc de anticuerpo (véase, por ejemplo, el documento WO 2009/089004A1); entrecruzando dos o más anticuerpos o fragmentos [véanse, por ejemplo, la Pat. de EE.UU. N.° 4.676.980; y Brennan y col. (1985) Science, 229: 81]; utilizando cremalleras de leucina para producir anticuerpos biespecíficos [véase, por ejemplo, Kostelny y col. (1992) J. Immunol., 148(5): 1547-1553]; utilizando tecnología de "diacuerpo" para elaborar fragmentos de anticuerpos biespecíficos [véase, por ejemplo, Hollinger y col. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448]; utilizando dímeros Fv monocatenarios (sFv) [véase, por ejemplo, Gruber y col. (1994) J. Immunol., 152:5368]; y preparando anticuerpos específicos (véase, por ejemplo, Tutt y col. (1991) J. Immunol. 147: 60. Pueden prepararse anticuerpos multiespecíficos como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpos. También se incluyen en esta invención anticuerpos genomanipulados con tres o más sitios funcionales de unión a antígeno, incluyendo "anticuerpos de pulpo" [véase, por ejemplo, el documento US 2006/0025576A1].
En determinados casos, un anticuerpo descrito en esta invención es un anticuerpo monoclonal. Anticuerpo monoclonal se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos y/o se unen al mismo epítopo, excepto por posibles anticuerpos variantes, por ejemplo, que contienen mutaciones de origen natural o que surgen durante la producción de una preparación de anticuerpo monoclonal, estando dichas variantes generalmente presentes en cantidades menores. A diferencia de las preparaciones de anticuerpos policlonales, que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes epítopos, cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpos monoclonales está dirigido contra un solo epítopo en un antígeno. Por lo tanto, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo según se obtiene de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, y no debe interpretarse que requiere la producción del anticuerpo por algún procedimiento particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales a usar según los presentes procedimientos se pueden preparar mediante una diversidad de técnicas, incluyendo, pero sin limitación, el procedimiento de hibridoma, procedimientos de ADN recombinante, procedimientos de presentación en fagos y procedimientos que utilizan animales transgénicos que contienen todos o parte de los locus de inmunoglobulina humana, siendo descritos en esta invención dichos procedimientos y otros procedimientos de ejemplo para preparar anticuerpos monoclonales.
Por ejemplo, mediante el uso de inmunógenos derivados de activina, se pueden preparar antisueros anti-proteína/antipéptido o anticuerpos monoclonales mediante protocolos estándar [véase, por ejemplo, Antibodies: A Laboratory Manual ed. por Harlow y Lane (1988) Cold Spring Harbor Press: 1988]. Un mamífero, tal como un ratón, un hámster o un conejo, puede inmunizarse con una forma inmunógena del polipéptido de activina, un fragmento antigénico que es capaz de provocar una respuesta de anticuerpos o una proteína de fusión. Las técnicas para conferir inmunogenicidad a una proteína o péptido incluyen la conjugación con portadores u otras técnicas bien conocidas en la técnica. Se puede administrar una porción inmunógena de un polipéptido de activina en presencia de adyuvante. El progreso de la inmunización se puede controlar mediante la detección de títulos de anticuerpo en plasma o suero. Pueden usarse ELISA estándar u otros inmunoensayos con el inmunógeno como antígeno para evaluar los niveles de producción de anticuerpos y/o el nivel de afinidad de unión.
Después de la inmunización de un animal con una preparación antigénica de activina, se pueden obtener antisueros y, si se desea, se pueden aislar anticuerpos policlonales del suero. Para producir anticuerpos monoclonales, se pueden recoger células productoras de anticuerpos (linfocitos) de un animal inmunizado y fusionarse mediante procedimientos estándar de fusión de células somáticas con células inmortalizantes tales como células de mieloma para producir células de hibridoma. Tales técnicas se conocen bien en la técnica e incluyen, por ejemplo, la técnica de hibridoma [véase, por ejemplo, Kohler y Milstein (1975) Nature, 256: 495-497], la técnica de hibridoma de linfocitos B humanos [véase, por ejemplo, Kozbar y col. (1983) Immunology Today, 4:72], y la técnica de hibridoma del VEB para producir anticuerpos monoclonales humanos [Cole y col. (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. págs. 77-96]. Las células de hibridoma pueden cribarse inmunoquímicamente para la producción de anticuerpos específicamente reactivos con un polipéptido de activina y los anticuerpos monoclonales se pueden aislar de un cultivo que comprende dichas células de hibridoma.
En determinados casos, se pueden introducir una o más modificaciones de aminoácidos en la región Fc de un anticuerpo proporcionado en esta invención generando así una variante de la región Fc. La variante de la región Fc puede comprender una secuencia de la región Fc humana (por ejemplo, una región Fc de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humana) que comprende una modificación de aminoácidos (por ejemplo, una sustitución, deleción y/o adición) en una o más posiciones de aminoácidos.
Por ejemplo, la presente descripción contempla una variante de anticuerpo que posee algunas, pero no todas las funciones efectoras, lo que lo convierte en un candidato deseable para aplicaciones en las que la semivida del anticuerpo in vivo es importante pero determinadas funciones efectoras [por ejemplo, la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) y la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC)] son innecesarias o perjudiciales. Se pueden realizar ensayos de citotoxicidad in vitro y/o in vivo para confirmar la reducción/agotamiento de las actividades de CDC y/o ADCC. Por ejemplo, se pueden realizar ensayos de unión al receptor Fc (FcR) para asegurar que el anticuerpo carece de unión a FcyR (por lo tanto, probablemente carece de actividad de ADCC), pero conserva la capacidad de unión a FcRn. Las células primarias para mediar en la ADCC, los linfocitos NK, expresan FcyRIII solamente, mientras que los monocitos expresan FcyRI, FcyRII y FcyRIII. La expresión de FcR en células hematopoyéticas se resume, por ejemplo, en Ravetch y Kinet (1991) Annu. Rev. Immunol. 9:457-492. Se describen ejemplos no limitantes de ensayos in vitro para evaluar la actividad de ADCC de una molécula de interés en la Pat. de EE.UU. N.° 5.500.362; Hellstrom, I. y col. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:7059-7063]; Hellstrom, I y col. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:1499-1502; Pat. de EE.UU. N.° 5.821.337; Bruggemann, M. y col. (1987) J. Exp. Med.
166:1351-1361. Como alternativa, se pueden emplear procedimientos de ensayos no radiactivos (por ejemplo, ACTI™, ensayo de citotoxicidad no radiactiva para citometría de flujo; CellTechnology, Inc. Mountain View, Calif.; y un ensayo de citotoxicidad no radiactiva CytoTox 96®, Promega, Madison, Wis.). Las células efectoras útiles para dichos ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y linfocitos citolíticos naturales (NK). Como alternativa, o adicionalmente, la actividad de ADCC de la molécula de interés puede evaluarse in vivo, por ejemplo, en un modelo animal como el que se describe en Clynes y col. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:652-656. También se pueden realizar ensayos de unión a C1q para confirmar que el anticuerpo es incapaz de unirse a C1q y, por lo tanto, carece de actividad de CDC [véase, por ejemplo, ELISA de unión a C1q y C3c en los documentos Wo 2006/029879 y WO 2005/100402]. Para evaluar la activación del complemento, se puede realizar un ensayo de CDC [véanse, por ejemplo, Gazzano-Santoro y col. (1996) J. Immunol. Methods 202:163; Cragg, M. S. y col. (2003) Blood 101: 1045-1052; y Cragg, M. S y M. J. Glennie (2004) Blood 103:2738-2743]. Las determinaciones de unión a FcRn y aclaramiento/semivida in vivo también se pueden realizar usando procedimientos conocidos en la técnica [véase, por ejemplo, Petkova, S. B. y col. (2006) Intl. Immunol. 18(12): 1759-1769]. Los anticuerpos de la presente descripción con función efectora reducida incluyen aquellos con sustitución de uno o más de los residuos de la región Fc 238, 265, 269, 270, 297, 327 y 329 (Pat. de EE.UU. N.° 6.737.056). Dichos mutantes Fc incluyen mutantes Fc con sustituciones en dos o más de las posiciones de aminoácidos 265, 269, 270, 297 y 327, incluido el mutante Fc denominado "DANA" con sustitución de los residuos 265 y 297 por alanina (Pat. de EE.UU. N.° 7.332.581).
En determinados casos, puede ser deseable crear anticuerpos genomanipulados con cisteína, por ejemplo, "tioMAb", en los que uno o más residuos de un anticuerpo se sustituyen por residuos de cisteína. En casos particulares, los residuos sustituidos se encuentran en sitios accesibles del anticuerpo. Sustituyendo estos residuos por cisteína, los grupos tiol reactivos se posicionan así en sitios accesibles del anticuerpo y pueden usarse para conjugar el anticuerpo con otros restos, tales como restos de fármaco o restos de enlazador-fármaco, para crear un inmunoconjugado, como se describe adicionalmente en esta invención. En determinados casos, uno cualquiera o más de los siguientes residuos pueden estar sustituidos por cisteína: V205 (numeración de Kabat) de la cadena ligera; A118 (numeración EU) de la cadena pesada; y S400 (numeración EU) de la región Fc de cadena pesada. Los anticuerpos genomanipulados con cisteína se pueden generar como se describe, por ejemplo, en la Pat. de EE.UU. N.° 7.521.541.
Además, las técnicas utilizadas para cribar anticuerpos con el fin de identificar un anticuerpo deseable pueden influir en las propiedades del anticuerpo obtenido. Por ejemplo, si se va a usar un anticuerpo para unir un antígeno en solución, puede ser deseable ensayar la unión a la solución. Se encuentran disponibles una diversidad de técnicas diferentes para ensayar interacciones entre anticuerpos y antígenos para identificar anticuerpos particularmente deseables. Dichas técnicas incluyen ELISA, ensayos de unión por resonancia de plasmón superficial (por ejemplo, el ensayo de unión de Biacore, Biacore AB, Uppsala, Suecia), ensayos tipo sándwich (por ejemplo, el sistema de perlas paramagnéticas de IGEN International, Inc., Gaithersburg, Maryland), transferencias de Western, ensayos de inmunoprecipitación e inmunohistoquímica.
En determinados casos, se contemplan variantes de la secuencia de aminoácidos de los anticuerpos y/o los polipéptidos de unión proporcionados en esta invención. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo y/o polipéptido de unión. Las variantes de la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo y/o polipéptidos de unión se pueden preparar introduciendo modificaciones apropiadas en la secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo y/o polipéptido de unión, o mediante síntesis peptídica. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, deleciones y/o inserciones y/o sustituciones de residuos dentro de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo y/o polipéptido de unión. Se puede realizar cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución para llegar a la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas, por ejemplo, unión a diana (por ejemplo, y activina tal como unión a activina E y/o activina C).
Se pueden realizar alteraciones (por ejemplo, sustituciones) en las HVR, por ejemplo, para mejorar la afinidad del anticuerpo. Dichas alteraciones pueden realizarse en "puntos calientes" de HVR, es decir, residuos codificados por codones que experimentan mutación a alta frecuencia durante el proceso de maduración somática [véase, por ejemplo, Chowdhury (2008) Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)] y/o SDR (a-CDR), ensayándose la variante VH o VL resultante para determinar la afinidad de unión. La maduración por afinidad mediante la construcción y reselección de bibliotecas secundarias se ha descrito en la técnica [véanse, por ejemplo, Hoogenboom y col., En Methods in Molecular Biology 178:1-37, O'Brien y col., Ed., Human Press, Totowa, N.J., (2001). En algunos casos de maduración por afinidad, se introduce diversidad en los genes variables elegidos para la maduración mediante cualquiera de una diversidad de procedimientos (por ejemplo, PCR propensa a errores, barajado de cadenas o mutagénesis dirigida por oligonucleótidos). A continuación se crea una biblioteca secundaria. A continuación, la biblioteca se criba para identificar cualquier variante de anticuerpo con la afinidad deseada. Otro procedimiento para introducir diversidad implica enfoques dirigidos a HVR, en los que se asignan aleatoriamente varios residuos de HVR (por ejemplo, 4-6 residuos a la vez). Los residuos de HVR implicados en la unión a antígeno pueden identificarse específicamente, por ejemplo, usando mutagénesis de barrido de alanina o modelado. CDR-H3 y CDR-L3 en particular a menudo son el objetivo.
En determinados casos, pueden producirse sustituciones, inserciones o deleciones dentro de una o más HVR siempre que dichas alteraciones no reduzcan sustancialmente la capacidad del anticuerpo para unirse al antígeno. Por ejemplo, pueden realizarse alteraciones conservadoras (por ejemplo, sustituciones conservadoras como se proporciona en esta invención) que no reducen sustancialmente la afinidad de unión en las HVR. Dichas alteraciones pueden estar fuera de los "puntos calientes" de HVR o SDR. En determinados casos de las secuencias VH y VL variantes proporcionadas anteriormente, cada HVR está inalterada o no contiene más de una, dos o tres sustituciones de aminoácidos.
Un procedimiento útil para la identificación de residuos o regiones del anticuerpo y/o el polipéptido de unión que puede ser el objetivo de la mutagénesis se denomina "mutagénesis de barrido de alanina" como se describe por Cunningham y Wells (1989) Science, 244:1081-1085. En este procedimiento, un residuo o grupo de residuos diana (por ejemplo, residuos cargados tales como Arg, Asp, His, Lys y Glu) se identifican y se reemplazan por un aminoácido neutro o cargado negativamente (por ejemplo, alanina o polialanina) para determinar si se ve afectada la interacción del anticuerpo-antígeno. Pueden introducirse sustituciones adicionales en las ubicaciones de los aminoácidos que demuestren sensibilidad funcional a las sustituciones iniciales. Como alternativa, o adicionalmente, se determina una estructura cristalina de un complejo antígeno-anticuerpo para identificar los puntos de contacto entre el anticuerpo y el antígeno. Dichos residuos de contacto y residuos adyacentes pueden dirigirse o eliminarse como candidatos para la sustitución. Las variantes pueden cribarse para determinar si contienen las propiedades deseadas.
Las inserciones de secuencias de aminoácidos incluyen fusiones amino-terminales y/o carboxilo-terminales que varían en longitud desde un residuo hasta polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como inserciones intrasecuencia de residuos de aminoácidos únicos o múltiples. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un residuo de metionilo N-terminal. Otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo incluyen la fusión del extremo N o C del anticuerpo a una enzima (por ejemplo, para ADEPT) o un polipéptido que aumenta la semivida en suero del anticuerpo.
En determinados casos, un anticuerpo y/o polipéptido de unión proporcionado en esta invención puede modificarse adicionalmente para contener restos no proteicos adicionales que se conocen en la técnica y están fácilmente disponibles. Los restos adecuados para la derivatización del anticuerpo y/o polipéptido de unión incluyen, pero sin limitación, polímeros solubles en agua. Los ejemplos no limitantes de polímeros hidrosolubles incluyen, pero sin limitación, polietilenglicol (PEG), copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anhídrido maleico, poliaminoácidos (homopolímeros o copolímeros aleatorios), y dextrano o poli(n-vinilpirrolidona)polietilenglicol, homopolímeros de propropilenglicol, copolímeros de óxido de prolipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol), alcohol polivinílico y mezclas de los mismos. El propionaldehído de polietilenglicol puede tener ventajas en la fabricación debido a su estabilidad en agua. El polímero puede tener cualquier peso molecular y puede estar ramificado o no ramificado. El número de polímeros unidos al anticuerpo y/o polipéptido de unión puede variar, y si se une más de un polímero, pueden ser moléculas iguales o diferentes. En general, el número y/o tipo de polímeros usados para la derivatización se puede determinar basándose en consideraciones que incluyen, pero sin limitación, las propiedades o funciones particulares del anticuerpo y/o polipéptido de unión a mejorar, si el derivado de anticuerpo y/o derivado de polipéptido de unión se usa en una terapia en condiciones definidas.
5. Antagonistas de molécula pequeña
En otros casos, un antagonista de GDF/BMP a usar según los procedimientos y usos descritos en esta invención es una molécula pequeña (antagonista de molécula pequeña de GDF/BMP), o una combinación de antagonistas de molécula pequeña. Un antagonista de molécula pequeña de GDF/BMP, o una combinación de antagonistas de molécula pequeña, puede inhibir, por ejemplo, uno o más ligandos de GDF/BMP (por ejemplo, activina, GDF11, GDF8, GDF3, b Mp6, BMP10 y/o BMP15), un receptor de tipo I (por ejemplo, ALK4, a Lk5 y/o AlK7), un receptor de tipo II (por ejemplo, ActRIIB y/o ActRIIA), un correceptor y/o uno o más factores de señalización (por ejemplo, proteínas Smad tales como Smads 2 y 3). En algunos casos, un antagonista de molécula pequeña de GDF/BMP, o una combinación de antagonistas de molécula pequeña, inhibe la señalización mediada por uno o más ligandos de GDF/BMP, por ejemplo, como se determina en un ensayo basado en células, tales como los descritos en esta invención. Como se describe en esta invención, los antagonistas de molécula pequeña de GDF/BMP pueden usarse solos o en combinación con una o más terapias de apoyo o agentes activos, para tratar, prevenir o reducir la tasa de progresión y/o la gravedad de la hipertensión pulmonar (HP), particularmente el tratamiento, la prevención o la reducción de la tasa de progresión y/o la gravedad de una o más complicaciones asociadas a la HP.
En algunos casos, un antagonista de molécula pequeña de GDF/BMP, o una combinación de antagonistas de molécula pequeña, inhibe al menos GDF11, opcionalmente que inhibe además uno o más de GDF8, activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina Ab , activina AC, activina BC, activina AE y/o activina BE), GDF3, BMP6, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7 y una o más proteínas Smad (por ejemplo, Smads 2 y 3). En algunos casos, un antagonista de molécula pequeña de GDF/BMP, o una combinación de antagonistas de molécula pequeña, inhibe al menos GDF8, opcionalmente que inhibe además uno o más de GDF11, activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE y/o activina BE), GDF3, BMP6, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7 y una o más proteínas Smad (por ejemplo, Smads 2 y 3). En algunos casos, un antagonista de molécula pequeña de GDF/BMP, o una combinación de antagonistas de molécula pequeña, inhibe al menos una activina (activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE y/o activina BE), opcionalmente que inhibe además uno o más de GDF8, GDF11, GDF3, BMP6, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7 y una o más proteínas Smad (por ejemplo, Smads 2 y 3). En algunos casos, un antagonista de molécula pequeña de GDF/BMP, o una combinación de antagonistas de molécula pequeña, inhibe al menos la activina B, opcionalmente que inhibe además uno o más de GDF8, GDF11, GDF3, BMP6, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7 y una o más proteínas Smad (por ejemplo, Smads 2 y 3). En algunos casos, un antagonista de molécula pequeña de GDF/BMP, o una combinación de antagonistas de molécula pequeña, inhibe al menos BMP6, opcionalmente que inhibe además uno o más de GDF8, activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE y/o activina BE), GDF3, GDF11, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7 y una o más proteínas Smad (por ejemplo, Smads 2 y 3). En algunos casos, un antagonista de molécula pequeña de GDF/BMP, o una combinación de antagonistas de molécula pequeña, inhibe al menos BMP15, opcionalmente que inhibe además uno o más de GDF8, activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE y/o activina BE), GDF3, BMP6, GDF11, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7 y una o más proteínas Smad (por ejemplo, Smads 2 y 3). En algunos casos, un antagonista de molécula pequeña de GDF/BMP, o una combinación de antagonistas de molécula pequeña, inhibe al menos GDF3, opcionalmente que inhibe además uno o más de GDF8, activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE y/o activina BE), BMP15, BMP6, GDF11, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7 y una o más proteínas Smad (por ejemplo, Smads 2 y 3). En algunos casos, un antagonista de molécula pequeña de GDF/BMP, o una combinación de antagonistas de molécula pequeña, inhibe al menos BMP10, opcionalmente que inhibe además uno o más de GDF8, activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE y/o activina BE), BMP15, BMP6, GDF11, GDF3, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7 y una o más proteínas Smad (por ejemplo, Smads 2 y 3). En algunos casos, un antagonista de molécula pequeña de g Df/BMP, o una combinación de antagonistas de molécula pequeña, inhibe al menos ActRIIA, opcionalmente que inhibe además uno o más de GDF8, activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE y/o activina BE), BMP15, BMP6, GDF11, GDF3, BMP10, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7 y una o más proteínas Smad (por ejemplo, Smads 2 y 3). En algunos casos, un antagonista de molécula pequeña de GDF/BMP, o una combinación de antagonistas de molécula pequeña, inhibe al menos ActRIIB, opcionalmente que inhibe además uno o más de GDF8, activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE y/o activina BE), BMP15, BMP6, GDF11, GDF3, ActRIIA, BMP10, ALK4, ALK5, ALK7 y una o más proteínas Smad (por ejemplo, Smads 2 y 3). En algunos casos, un antagonista de molécula pequeña de GDF/BMP, o una combinación de antagonistas de molécula pequeña, inhibe al menos ALK4, opcionalmente que inhibe además uno o más de GDF8, activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE y/o activina BE), BMP15, BMP6, GDF11, GDF3, ActRIIA, ActRIIB, BMP10, ALK5, ALK7 y una o más proteínas Smad (por ejemplo, Smads 2 y 3). En algunos casos, un antagonista de molécula pequeña de GDF/BMP, o una combinación de antagonistas de molécula pequeña, inhibe al menos ALK5, opcionalmente que inhibe además uno o más de GDF8, activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE y/o activina BE), BMP15, BMP6, GDF11, GDF3, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, BMP10, ALK7 y una o más proteínas Simad (por ejemplo, Smads 2 y 3). En algunos casos, un antagonista de molécula pequeña de GDF/BMP, o una combinación de antagonistas de molécula pequeña, inhibe al menos ALK7, opcionalmente que inhibe además uno o más de GDF8, activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE y/o activina BE), BMP15, BMP6, GDF11, GDF3, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, BMP10 y una o más proteínas Smad (por ejemplo, Smads 2 y 3). En algunos casos, un antagonista de molécula pequeña de GDF/BMP, o una combinación de antagonistas de molécula pequeña, como se describe en esta invención, no inhibe o no inhibe sustancialmente BMP9. En algunos casos, un antagonista de molécula pequeña de GDF/BMP, o una combinación de antagonistas de molécula pequeña, como se describe en esta invención, no inhibe o no inhibe sustancialmente la activina A.
Los antagonistas de molécula pequeña de GDF/BMP pueden ser inhibidores directos o indirectos. Por ejemplo, un antagonista indirecto de molécula pequeña, o una combinación de antagonistas de molécula pequeña, puede inhibir la expresión (por ejemplo, la transcripción, traducción, secreción celular o combinaciones de las mismas) de al menos uno o más ligandos de GDF/BMP [por ejemplo, activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina B, activina BC, activina Ae o activina BE), GDF11, BMP15, BMP6, GDF3, BMP10 y/o GDF8], un receptor de tipo I (por ejemplo, ALK4, ALK5 y/o ALK7), receptores de tipo II (por ejemplo, ActRIIA y/o ActRIIB), un correceptor y/o uno o más componentes de señalización cadena abajo (por ejemplo, Smads). Como alternativa, un antagonista directo de molécula pequeña, o una combinación de antagonistas de molécula pequeña, puede unirse directamente a e inhibir, por ejemplo, uno o más ligandos de GDF/BMP [por ejemplo, activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina B, activina Bc , activina AE o activina BE), GDF11, BMP15, BMP6, GDF3, BMP10 y/o GDF8], un receptor de tipo I (por ejemplo, ALK4, ALK5 y/o ALK7), receptores de tipo II (por ejemplo, ActRIIA y/o ActRIIB), un correceptor y/o uno o más componentes de señalización cadena abajo (por ejemplo, Smads). Pueden usarse combinaciones de uno o más antagonistas de molécula pequeña de GDF/BMP indirectos y uno o más directos según los procedimientos descritos en esta invención.
Los antagonistas de molécula pequeña de unión de la presente descripción pueden identificarse y sintetizarse químicamente usando metodología conocida (véanse, por ejemplo, las Publicaciones PCT N.° WO 00/00823 y WO 00/39585). En general, los antagonistas de molécula pequeña de la descripción suelen tener un tamaño de menos de aproximadamente 2000 daltons, como alternativa, de menos de aproximadamente 1500, 750, 500, 250 o 200 daltons de tamaño, donde dichas moléculas pequeñas orgánicas son capaces de unirse, preferentemente específicamente, a un polipéptido como se describe en esta invención. Estos antagonistas de moléculas pequeñas pueden identificarse sin demasiada experimentación utilizando técnicas bien conocidas.A este respecto, se observa que las técnicas para cribar bibliotecas de moléculas pequeñas orgánicas en busca de moléculas que sean capaces de unirse a un polipéptido diana se conocen bien en la técnica (véanse, por ejemplo, las publicaciones de patente internacional N.° WO00/00823 y WO00/39585).
Las moléculas pequeñas orgánicas de unión de la presente descripción puede ser, por ejemplo, aldehídos, cetonas, oximas, hidrazonas, semicarbazonas, carbazidas, aminas primarias, aminas secundarias, aminas terciarias, hidrazinas N-sustituidas, hidrazidas, alcoholes, éteres, tioles, tioéteres, disulfuros, ácidos carboxílicos, ésteres, amidas, ureas, carbamatos, carbonatos, cetales, tiocetales, acetales, tioacetales, haluros de arilo, sulfonatos de arilo, haluros de alquilo, sulfonatos de alquilo, compuestos aromáticos, compuestos heterocíclicos, anilinas, alquenos, alquinos, dioles, aminoalcoholes, oxazolidinas, oxazolinas, tiazolidinas, tiazolinas, enaminas, sulfonamidas, epóxidos, aziridinas, isocianatos, cloruros de sulfonilo, compuestos diazo y cloruros de ácido.
6. Antagonistas de polinucleótidos
En otros casos, un antagonista de GDF/BMP a usar según los procedimientos y usos descritos en esta invención es un polinucleótido (antagonista de polinucleótidos GDF/BMP) o una combinación de polinucleótidos. Un antagonista de polinucleótidos GDF/BMP, o una combinación de antagonistas de polinucleótidos, puede inhibir, por ejemplo, uno o más ligandos de GDF/BMP (por ejemplo, activina, GDF11, GDF8, GDF3, BMP6, BMP10 y/o BMP15), receptores de tipo I (por ejemplo, ALK4, ALK5 y/o a LK7), receptores de tipo II (por ejemplo, ActRIIA y/o ActRIIB), un correceptor y/o un componente de señalización cadena abajo (por ejemplo, Smads). En algunos casos, un polinucleótido GDF/BMP, o una combinación de antagonistas de polinucleótidos, inhibe la señalización mediada por uno o más ligandos de GDF/BMP, por ejemplo, como se determina en un ensayo basado en células, tales como los descritos en esta invención. Como se describe en esta invención, los antagonistas de polinucleótidos GDF/BMP pueden usarse solos o en combinación con una o más terapias de apoyo o agentes activos, para tratar, prevenir o reducir la tasa de progresión y/o la gravedad de la hipertensión pulmonar (HP), particularmente el tratamiento, la prevención o la reducción de la tasa de progresión y/o la gravedad de una o más complicaciones asociadas a la HP.
En algunos casos, un antagonista del polinucleótido GDF/BMP, o una combinación de antagonistas de polinucleótidos, inhibe al menos GDF11, opcionalmente que inhibe además uno o más de GDF8, activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE y/o activina Be ), GDF3, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7 y una o más proteínas Smad (por ejemplo, Smads 2 y 3). En algunos casos, un antagonista del polinucleótido GDF/BMP, o una combinación de antagonistas de polinucleótidos, inhibe al menos GDF8, opcionalmente que inhibe además uno o más de GDF11, activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE y/o activina Be ), GDF3, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7 y una o más proteínas Simad (por ejemplo, Smads 2 y 3). En algunos casos, un antagonista del polinucleótido GDF/BMP, o una combinación de antagonistas de polinucleótidos, inhibe al menos una activina (activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE y/o activina BE), opcionalmente que inhibe además uno o más de GDF8, GDF11, GDF3, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7 y una o más proteínas Smad (por ejemplo, Smads 2 y 3). En algunos casos, un antagonista del polinucleótido GDF/BMP, o una combinación de antagonistas de polinucleótidos, inhibe al menos la activina B, opcionalmente que inhibe además uno o más de GDF8, GDF11, GDF3, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7 y una o más proteínas Smad (por ejemplo, Smads 2 y 3). En algunos casos, un antagonista del polinucleótido GDF/BMP, o una combinación de antagonistas de polinucleótidos, inhibe al menos BMP6, opcionalmente que inhibe además uno o más de GDF8, activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE y/o activina BE), GDf3, GDF11, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7 y una o más proteínas Smad (por ejemplo, Smads 2 y 3). En algunos casos, un antagonista del polinucleótido GDF/BMP, o una combinación de antagonistas de polinucleótidos, inhibe al menos BMP15, opcionalmente que inhibe además uno o más de GDF8, activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE y/o activina Be ), Gd F3, BMP6, GDF11, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7 y una o más proteínas Smad (por ejemplo, Smads 2 y 3). En algunos casos, un antagonista del polinucleótido GDF/BMP, o una combinación de antagonistas de polinucleótidos, inhibe al menos GDF3, opcionalmente que inhibe además uno o más de GDF8, activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE y/o activina BE), BMP15, BMP6, GDF11, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7 y una o más proteínas Smad (por ejemplo, Smads 2 y 3). En algunos casos, un antagonista del polinucleótido GDF/BMP, o una combinación de antagonistas de polinucleótidos, inhibe al menos BMP10, opcionalmente que inhibe además uno o más de GDF8, activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE y/o activina Be ), Bm P15, BMP6, GDF11, GDF3, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7 y una o más proteínas Smad (por ejemplo, Smads 2 y 3). En algunos casos, un antagonista del polinucleótido GDF/BMP, o una combinación de antagonistas de polinucleótidos, inhibe al menos ActRIIA, opcionalmente que inhibe además uno o más de GDF8, activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE y/o activina Be ), Bm P15, BMP6, GDF11, GDF3, BMP10, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7 y una o más proteínas Smad (por ejemplo, Smads 2 y 3). En algunos casos, un antagonista del polinucleótido GDF/BMP, o una combinación de antagonistas de polinucleótidos, inhibe al menos ActRIIB, opcionalmente que inhibe además uno o más de GDF8, activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE y/o activina Be ), Bm P15, BMP6, GDF11, GDF3, ActRIIA, BMP10, ALK4, ALK5, ALK7 y una o más proteínas Smad (por ejemplo, Smads 2 y 3). En algunos casos, un antagonista del polinucleótido GDF/BMP, o una combinación de antagonistas de polinucleótidos, inhibe al menos ALK4, opcionalmente que inhibe además uno o más de GDF8, activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina Ab , activina AC, activina BC, activina AE y/o activina b E), BMP15, BMP6, GDF11, GDF3, ActRIIA, ActRIIB, BMP10, ALK5, ALK7 y una o más proteínas Smad (por ejemplo, Smads 2 y 3). En algunos casos, un antagonista del polinucleótido GDF/BMP, o una combinación de antagonistas de polinucleótidos, inhibe al menos ALK5, opcionalmente que inhibe además uno o más de GDF8, activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina Ab , activina AC, activina BC, activina AE y/o activina BE), BMP15, BMP6, GDF11, GDF3, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, BMP10, ALK7 y una o más proteínas Smad (por ejemplo, Smads 2 y 3). En algunos casos, un antagonista del polinucleótido GDF/BMP, o una combinación de antagonistas de polinucleótidos, inhibe al menos ALK7, opcionalmente que inhibe además uno o más de GDF8, activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina Ab , activina AC, activina BC, activina AE y/o activina BE), BMP15, BMP6, GDF11, GDF3, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, BMP10 y una o más proteínas Smad (por ejemplo, Smads 2 y 3). En algunos casos, un antagonista del polinucleótido GDF/BMP, o una combinación de antagonistas de polinucleótidos, como se describe en esta invención, no inhibe o no inhibe sustancialmente BMP9. En algunos casos, un antagonista del polinucleótido GDF/BMP, o una combinación de antagonistas de polinucleótidos, como se describe en esta invención, no inhibe o no inhibe sustancialmente la activina A.
En algunos casos, los antagonistas de polinucleótidos de la descripción pueden ser un ácido nucleico antisentido, una molécula de ARNi [por ejemplo, ARN interferente pequeño (ARNip), a Rn de horquilla pequeña (ARNhc), microARN (miARN)], un aptámero y/o una ribozima. Las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos de las proteínas GDF11, GDF8, activina (activina A, activina B, activina C y activina E), BMP6, GDF3, ActRIIA, ActRIIB, BMP10, ALK4, ALK5, ALK7, BMP15 y Smad humanas se conocen en la técnica. Además, se conocen bien en la técnica muchos procedimientos diferentes para generar antagonistas de polinucleótidos. Por lo tanto, el experto en la técnica puede fabricar de forma rutinaria antagonistas de polinucleótidos para su uso según esta descripción basándose en el conocimiento de la técnica y las enseñanzas proporcionadas en esta invención.
Puede usarse tecnología antisentido para controlar la expresión génica a través de ADN o ARN antisentido, o mediante la formación de triple hélice. Se analizan técnicas antisentido, por ejemplo, en Okano (1991) J. Neurochem. 56:560; Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, Flo. (1988). La formación de triple hélice se analiza, por ejemplo, en Cooney y col. (1988) Science 241:456; y Dervan y col., (1991) Science 251:1300. Los procedimientos se basan en la unión de un polinucleótido a un ADN o ARN complementario. En algunos casos, los ácidos nucleicos antisentido comprenden una secuencia de ADN o ARN monocatenario que es complementaria al menos a una porción de un transcrito de ARN de un gen descrito en esta invención. Sin embargo, no se requiere una complementariedad absoluta, aunque se prefiere.
Una secuencia "complementaria al menos a una porción de un ARN", a la que se hace referencia en esta invención, significa una secuencia que tiene suficiente complementariedad para poder hibridar con el ARN, formando un dúplex estable; en el caso de ácidos nucleicos antisentido bicatenarios de un gen descrito en esta invención, puede ensayarse así una hebra sencilla del ADN dúplex, o puede ensayarse la formación de tríplex. La capacidad de hibridarse dependerá tanto del grado de complementariedad como de la longitud del ácido nucleico antisentido. Generalmente, cuanto mayor es el ácido nucleico de hibridación, más emparejamientos erróneos de bases con un ARN puede contener y todavía formar un dúplex estable (o tríplex, según sea el caso). Un experto en la técnica puede determinar un grado tolerable de emparejamiento erróneo mediante el uso de procedimientos estándar para determinar el punto de fusión del complejo hibridado.
Los polinucleótidos que son complementarios al extremo 5' del mensaje, por ejemplo, la secuencia no traducida 5' hasta el codón de inicio AUG inclusive, deberían funcionar de la manera más eficaz para inhibir la traducción. Sin embargo, se ha demostrado que las secuencias complementarias a las secuencias no traducidas 3' de los ARNm también son eficaces para inhibir la traducción de los ARNm [véase, por ejemplo, Wagner, R., (1994) Nature 372:333-335]. Por lo tanto, los oligonucleótidos complementarios a las regiones no codificantes, no traducidas 5' o 3' de un gen de la descripción, podrían usarse en un enfoque antisentido para inhibir la traducción de un ARNm endógeno. Los polinucleótidos complementarios a la región no traducida 5' del ARNm deberían incluir el complemento del codón de inicio AUG. Los polinucleótidos antisentido complementarios a las regiones codificantes de ARNm son inhibidores de la traducción menos eficaces, pero podrían usarse según los procedimientos de la presente descripción. Ya sea que estén diseñados para hibridarse con la región 5', 3' o codificante de un ARNm de la descripción, los ácidos nucleicos antisentido deberían tener al menos seis nucleótidos de longitud y son preferentemente oligonucleótidos que varían de 6 a aproximadamente 50 nucleótidos de longitud. En casos específicos, el oligonucleótido tiene al menos 10 nucleótidos, al menos 17 nucleótidos, al menos 25 nucleótidos o al menos 50 nucleótidos.
En un caso, el ácido nucleico antisentido de la presente descripción se produce intracelularmente por transcripción a partir de una secuencia exógena. Por ejemplo, se transcribe un vector o una porción del mismo, produciendo un ácido nucleico antisentido (ARN) de un gen de la descripción. Tal vector contendrá una secuencia que codifique el ácido nucleico antisentido deseado. Tal vector puede permanecer episómico o integrarse cromosómicamente, siempre que pueda transcribirse para producir el ARN antisentido deseado. Dichos vectores pueden construirse mediante procedimientos de tecnología de ADN recombinante estándar en la técnica. Los vectores pueden ser plásmidos, virales u otros conocidos en la técnica, usados para la replicación y expresión en células de vertebrados. La expresión de la secuencia que codifica genes deseados de la presente descripción, o fragmentos de los mismos, puede ser por cualquier promotor conocido en la técnica que actúe en células de vertebrados, preferentemente células humanas. Dichos promotores pueden ser inducibles o constitutivos. Dichos promotores incluyen, pero sin limitación, la región promotora temprana de SV40 [véase, por ejemplo, Benoist y Chambon (1981) Nature 290:304-310], el promotor contenido en la repetición terminal larga 3' del virus del sarcoma de Rous [véase, por ejemplo, Yamamoto y col. (1980) Cell 22:787-797], el promotor de timidina del herpes [véase, por ejemplo, Wagner y col. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445], y las secuencias reguladoras del gen de la metalotioneína [véase, por ejemplo, Brinster, y col. (1982) Nature 296:39-42],
En algunos casos, los antagonistas de polinucleótidos son moléculas de ARN interferente (ARNi) que se dirigen a la expresión de uno o más de: GDF11, GDF8, activina (activina A, activina B, activina C y activina E), BMP6, GDF3, ActRIIA, ActRIIB, BMP10, ALK4, ALK5, ALK7, BMP15 y proteínas Smad. El ARNi se refiere a la expresión de un ARN que interfiere con la expresión del ARNm diana. Específicamente, el ARNi silencia un gen diana al interactuar con el ARNm específico a través de un ARNip (ARN interferente pequeño). A continuación, el complejo de ARN ds se dirige a la degradación por parte de la célula. Una molécula de ARNip es un dúplex de ARN bicatenario de 10 a 50 nucleótidos de longitud, que interfiere con la expresión de un gen diana que es suficientemente complementario (por ejemplo, al menos un 80 % de identidad con el gen). En algunos casos, la molécula de ARNip comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos un 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 o un 100 % idéntica a la secuencia de nucleótidos del gen diana.
Las moléculas de ARNi adicionales incluyen ARN de horquilla corta (ARNhc); también horquilla interferente corta y microARN (miARN). La molécula de ARNhc contiene secuencias sentido y antisentido de un gen diana conectado por un bucle. El ARNhc se transporta desde el núcleo al citoplasma y se degrada junto con el ARNm. Pueden usarse promotores Pol III o U6 para expresar ARN para ARNi. Paddison y col. [Genes & Dev. (2002) 16:948-958, 2002] han utilizado moléculas pequeñas de ARN plegadas en horquillas como medio para afectar al ARNi. Por consiguiente, dichas moléculas de ARN de horquilla corta (ARNhc) también se usan ventajosamente en los procedimientos descritos en esta invención. La longitud del tallo y el bucle de los ARNhc funcionales varía; las longitudes del tallo pueden variar de aproximadamente 25 a aproximadamente 30 nt, y el tamaño del bucle puede variar entre 4 y aproximadamente 25 nt sin afectar a la actividad de silenciamiento. Sin desear quedar ligado a ninguna teoría en particular, se cree que estos ARNhc se asemejan a los productos de ARN bicatenario (ARNbc) de la ARNasa DICER y, en cualquier caso, tienen la misma capacidad para inhibir la expresión de un gen específico. El ARNhc se puede expresar a partir de un vector lentiviral. Un miARN es un ARN monocatenario de aproximadamente 10 a 70 nucleótidos de longitud que se transcribe inicialmente como pre-miARN caracterizado por una estructura de "tallo-bucle", que posteriormente se procesa en miARN maduro después de un procesamiento adicional a través del RISC.
Las moléculas que median en el ARNi, incluyendo, sin limitación, ARNip, pueden producirse in vitro por síntesis química (Hohjoh, FEBS Lett 521:195-199, 2002), hidrólisis de ARNbc (Yang y col., Proc Natl Acad Sci USA 99:9942-9947, 2002), mediante transcripción in vitro con ARN polimerasa T7 (Donzeet y col., Nucleic Acids Res 30:e46, 2002; Yu y col., Proc Natl Acad Sci USA 99:6047-6052, 2002), y por hidrólisis de ARN bicatenario usando una nucleasa tal como ARNasa III de E. coli (Yang y col., Proc Natl Acad Sci USA 99:9942-9947, 2002).
Según otros casos, la descripción proporciona antagonistas de polinucleótidos que incluyen, pero sin limitación, un ADN señuelo, un ADN bicatenario, un ADN monocatenario, un ADN complejado, un ADN encapsulado, un ADN viral, un ADN plasmídico, un ARN desnudo, un ARN encapsulado, un ARN viral, un ARN bicatenario, una molécula capaz de generar interferencia de ARN o combinaciones de los mismos.
En algunos casos, los antagonistas de polinucleótidos de la descripción son aptámeros. Los aptámeros son moléculas de ácido nucleico, incluyendo moléculas de ADN bicatenario y ARN monocatenario, que se unen y forman estructuras terciarias que se unen específicamente a una molécula diana. La generación y el uso terapéutico de aptámeros están bien establecidos en la técnica (véase, por ejemplo, la Pat. de EE.UU. N.° 5.475.096). Se puede encontrar información adicional sobre aptámeros en la Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. N.° 20060148748. Los aptámeros de ácido nucleico se seleccionan usando procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, a través del procedimiento de evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial (SELEX, Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment). SELEX es un procedimiento para la evolución in vitro de moléculas de ácido nucleico con unión altamente específica a moléculas diana como se describe, por ejemplo, en las Pat. de EE.UU. N.° 5.475.096; 5.580.737; 5.567.588; 5.707.796; 5.763.177; 6.011.577; y 6.699.843. Se describe otro procedimiento de cribado para identificar aptámeros en la Pat. de EE.UU. N.° 5.270.163. El proceso SELEX se basa en la capacidad de los ácidos nucleicos para formar una diversidad de estructuras bidimensionales y tridimensionales, así como en la versatilidad química disponible dentro de los monómeros de nucleótidos para actuar como ligandos (formar pares de unión específicos) con prácticamente cualquier compuesto químico, ya sea monomérico o polimérico, incluyendo otras moléculas de ácido nucleico y polipéptidos. Las moléculas de cualquier tamaño o composición pueden servir como dianas. El procedimiento SELEX implica la selección de una mezcla de oligonucleótidos candidatos e iteraciones escalonadas de unión, reparto y amplificación, usando el mismo esquema de selección general, para lograr la afinidad de unión y selectividad deseadas. Partiendo de una mezcla de ácidos nucleicos, que puede comprender un segmento de secuencia aleatoria, el procedimiento SELEX incluye etapas de poner en contacto la mezcla con la diana en condiciones favorables para la unión; repartir los ácidos nucleicos no unidos de aquellos ácidos nucleicos que se han unido específicamente a las moléculas diana; disociar los complejos de ácido nucleico-diana; amplificar los ácidos nucleicos disociados de los complejos ácido nucleico-diana para producir una mezcla de ácidos nucleicos enriquecida con ligando. Las etapas de unión, reparto, disociación y amplificación se repiten a través de tantos ciclos como se desee para producir ligandos de ácido nucleico que se unan con alta afinidad y especificidad a la molécula diana.
Típicamente, dichas moléculas de unión se administran por separado al animal [véase, por ejemplo, O'Connor (1991) J. Neurochem. 56:560], pero dichas moléculas de unión también se pueden expresar in vivo a partir de polinucleótidos captados por una célula huésped y expresados in vivo [véase, por ejemplo, Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, Flo. (1988)].
7. Antagonistas de folistatina y FLRG
En otros casos, un antagonista de GDF/BMP es un polipéptido de folistatina o FLRG. Como se describe en esta invención, los polipéptidos de folistatina y/o FLRG pueden usarse para tratar, prevenir o reducir la tasa de progresión y/o la gravedad de la hipertensión pulmonar (HP), en particular el tratamiento, la prevención o la reducción de la tasa de progresión y/o la gravedad de una o más complicaciones asociadas a la HP.
La expresión "polipéptido de folistatina" incluye polipéptidos que comprenden cualquier polipéptido de folistatina de origen natural, así como cualquier variante del mismo (incluidos mutantes, fragmentos, fusiones y formas peptidomiméticas) que conservan una actividad útil, y además incluye cualquier monómero o multímero funcional de folistatina. En determinados casos preferidos, los polipéptidos de folistatina de la descripción se unen a y/o inhiben la actividad de activina, particularmente activina A. Pueden identificarse variantes de polipéptidos de folistatina que conservan las propiedades de unión a activina basándose en estudios anteriores que implican interacciones de folistatina y activina. Por ejemplo, el documento WO2008/030367 describe dominios de folistatina específicos ("FSD") que demuestran ser importantes para la unión a activina. Como se muestra a continuación en las SEQ ID NO: 28-30, el dominio N-terminal de folistatina ("FSND" SEQ ID NO: 28), FSD2 (SEQ ID NO: 30) y, en menor medida, FSD1 (SEQ ID NO: 29) representan dominios de ejemplo en la folistatina que son importantes para la unión a activina. Además, los procedimientos para preparar y ensayar bibliotecas de polipéptidos se han descrito anteriormente en el contexto de polipéptidos ActRII, y dichos procedimientos también pertenecen a la preparación y ensayo de variantes de folistatina. Los polipéptidos de folistatina incluyen polipéptidos derivados de la secuencia de cualquier folistatina conocida que tenga una secuencia al menos aproximadamente un 80 % idéntica a la secuencia de un polipéptido de folistatina, y opcionalmente al menos un 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de identidad. Los ejemplos de polipéptidos de folistatina incluyen el polipéptido de folistatina maduro o isoformas más cortas u otras variantes del polipéptido precursor de folistatina humana (SEQ ID NO: 26) como se describe, por ejemplo, en el documento WO2005/025601.
La ¡soforma del polipéptido precursor de folistatina humana FST344 es la siguiente:
MVRARHQPGG LCLLLLLLCQ FMEDRSAQAG NCWLRQAKNG RCQVLYKTEL
51 SKEECCSTGR LSTSWTEKDV NDNTLFKWMI FNGGAPNCIP CKETCENVDC
101 GPGKKCRMNK KNKPRCVCAP DCSNITWKGP VCGLDGKTYR NECALLKARC
151 KEQPELEVQY QGRCKKTCRD VFCPGSSTCV VDQTNNAYCV TCNRICFEPA
201 SSEQYLCGND GVTYSSACHL RKATCLLGRS IGLAYEGKCI KAKSCEDIQC
251 TGGKKCLWDF KVGRGRCSLC DELCPDSKSD EPVCASDNAT YASECAMKEA
301 ACSSGVLLEV KHSGSCNSIS EDTEEEEEDE DQDYSFPISS ILEW
(SEQ ID NO: 26; N.° de referencia NCBI NP_037541.1)
El péptido señal está subrayado; también se han subrayado anteriormente los últimos 27 residuos que representan la extensión C-terminal que distingue esta isoforma de folistatina de la isoforma de folistatina más corta FST317 que se muestra a continuación.
La isoforma del polipéptido precursor de folistatina humana FST317 es la siguiente:
I M VRARHQPGG LC LLLLLLC Q FM EDRSAQAG N C W LRQ AKNG RCQ VLYKTEL
51 SKEECCSTGR LSTSW TEEDV ND NTLFKW M I FNGGAPNCIP CKETCENVDC
101 GPGKKCRM NK KNKPRCVCAP DC SNITW KGP VCG LD G KTYR NECALLKARC
151 KEQPELEVQY QGRCKKTCRD VFCPGSSTCV VD Q TN N A YC V TCNRICPEPA
201 SSEQYLCGND G VTYSSACH L RKATCLLG RS IG LAYEG KCI KAKSCEDIQC
251 TGGKKCLW DF KVGRGRCSLC DELCPDSKSD EPVCASDNAT
YASE C AM K E A
301 ACSSGVLLEV KHSGSCN (SEQ ID NO: 27; N.° de referencia NCBI NP 006341.1)
El péptido señal está subrayado.
La secuencia del dominio N-terminal de folistatina (FSND) es la siguiente:
GNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSW TEEDVNDN
TLFKWMIFNGGAPNCIPCK (SEQ ID NO: 28; FSND)
Las secuencias FSD1 y FSD2 son las siguientes:
ETCENVDCGPGKKCRMNKKNKPRCV (SEQ ID NO: 29; ESDI)
KTCRDVFCPG5STCVVDQTNNA YCVT (SEQ ID NO: 30, FSD2)
En otros casos, un agente para su uso según los procedimientos descritos en esta invención es un gen relacionado con la folistatina (FLRG), también conocido como proteína 3 relacionada con folistatina (FSTL3). La expresión "polipéptido FLRG" incluye polipéptidos que comprenden cualquier polipéptido de origen natural de FLRG, así como cualquier variante del mismo (incluidos mutantes, fragmentos, fusiones y formas peptidomiméticas) que conservan una actividad útil. En determinados casos preferidos, los polipéptidos FLRG de la descripción se unen a y/o inhiben la actividad de la activina, particularmente la activina A. Las variantes de los polipéptidos FLRG que conservan las propiedades de unión a activina se pueden identificar usando procedimientos rutinarios para ensayar las interacciones de FLRG y activina (véase, por ejemplo, el documento US 6.537.966). Además, los procedimientos para preparar y ensayar bibliotecas de polipéptidos se han descrito anteriormente en el contexto de polipéptidos ActRII, y dichos procedimientos también pertenecen a la preparación y ensayo de variantes de FLRG. Los polipéptidos FLRG incluyen polipéptidos derivados de la secuencia de cualquier FLRG conocida que tiene una secuencia al menos aproximadamente un 80 % idéntica a la secuencia de un polipéptido FLRG y, opcionalmente, al menos un 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 99 % o más de identidad.
El polipéptido precursor de FLRG humana (precursor de la proteína 3 relacionada con la folistatina) es el siguiente:
! MRPGAPGPLW PLPW G A LA W A VGEVSSMGSG NPAPGGVCW L QQGQEATCSL
51 VLQTDVTRAE CCASGNIDTA WSNLTIIPGNK INLLGFLGLV HCLPCKDSCD
10 1 GVECGPGKAC RMLGGRPRCE CAPDCSGLPA RLQVCGSDGA TYRDECELRA 151 ARCRGHPDLS VMYRGRCRK S CEHWCPRPQ SCVVDQTGSA HCVVCRA APC
201 PVPSSPGQEL C G NNNVTYIS SCHMRQATCF LGRSIGVRHA GSCAGTPEEP
251 PGGESAEEEE NFV (SEQ ID NO: 31; N.° de referencia NCBI NP 005851.1)
El péptido señal está subrayado.
En determinados casos, las variantes funcionales o formas modificadas de los polipéptidos de folistatina y polipéptidos FLRG incluyen proteínas de fusión que tienen al menos una porción del polipéptido de folistatina o polipéptido FLRG y uno o más dominios de fusión, tales como, por ejemplo, dominios que facilitan el aislamiento, la detección, la estabilización o la multimerización del polipéptido. Los dominios de fusión adecuados se han analizado en detalle anteriormente con referencia a los polipéptidos ActRII. En algunos casos, un agente antagonista de la descripción es una proteína de fusión que comprende una porción de unión a activina de un polipéptido de folistatina fusionado a un dominio Fc. En otros casos, un agente antagonista de la descripción es una proteína de fusión que comprende una porción de unión a activina de un polipéptido FLRG fusionado a un dominio Fc.
8. Ensayos de cribado
En determinados casos, la presente descripción se refiere al uso de los antagonistas de GDF/BMP en cuestión (por ejemplo, polipéptidos ActRII y variantes de los mismos) para identificar compuestos (agentes) que pueden usarse para tratar, prevenir o reducir la tasa de progresión y/o la gravedad de la hipertensión pulmonar (HP), en particular el tratamiento, la prevención o la reducción de la tasa de progresión y/o la gravedad de una o más complicaciones asociadas a la HP.
Existen numerosos enfoques para el cribado de agentes terapéuticos para tratar la HP dirigiendo la señalización (por ejemplo, señalización de Smad) de uno o más ligandos de GDF/BMP. En determinados casos, se puede realizar un cribado de compuestos de alto rendimiento para identificar agentes que alteren los efectos mediados por ligandos de GDF/BMP en una línea celular seleccionada. En determinados casos, el ensayo se realiza para cribar e identificar compuestos que inhiban o reduzcan específicamente la unión de un ligando de GDF/BMP (por ejemplo, activina A, activina B, activina AB, activina C, GDF3, BMP6, GDF8, GDF15, GDF11 o BMP10) a su compañero de unión, tal como un receptor de tipo II (por ejemplo, ActRIIA y/o ActRIIB). Como alternativa, el ensayo se puede usar para identificar compuestos que mejoren la unión de un ligando de GDF/BMP a su compañero de unión, tal como un receptor de tipo II. En un caso adicional, los compuestos pueden identificarse por su capacidad para interactuar con un receptor de tipo II.
Será suficiente una diversidad de formatos de ensayo y, a la luz de la presente descripción, los que no se describen expresamente en esta invención serán comprendidos, no obstante, por un experto en la técnica. Como se describe en esta invención, los compuestos de prueba (agentes) de la descripción pueden crearse mediante cualquier procedimiento químico combinatorio. Como alternativa, los compuestos en cuestión pueden ser biomoléculas de origen natural sintetizadas in vivo o in vitro. Los compuestos (agentes) a ensayar para determinar su capacidad para actuar como moduladores del crecimiento tisular pueden producirse, por ejemplo, por bacterias, levaduras, plantas u otros organismos (por ejemplo, productos naturales), producirse químicamente (por ejemplo, moléculas pequeñas, incluyendo peptidomiméticos) o producirse de forma recombinante. Los compuestos de prueba contemplados por la presente descripción incluyen moléculas orgánicas no peptidílicas, péptidos, polipéptidos, peptidomiméticos, azúcares, hormonas y moléculas de ácido nucleico. En determinados casos, el agente de prueba es una molécula pequeña orgánica que tiene un peso molecular de menos de aproximadamente 2.000 Dalton.
Los compuestos de prueba de la descripción se pueden proporcionar como entidades individuales discretas, o se pueden proporcionar en bibliotecas de mayor complejidad, tales como las preparadas mediante química combinatoria. Estas bibliotecas pueden comprender, por ejemplo, alcoholes, haluros de alquilo, aminas, amidas, ésteres, aldehídos, éteres y otras clases de compuestos orgánicos. La presentación de los compuestos de prueba al sistema de prueba puede ser en forma aislada o como mezclas de compuestos, especialmente en las etapas de cribado iniciales. Opcionalmente, los compuestos pueden derivatizarse opcionalmente con otros compuestos y tener grupos derivatizantes que facilitan el aislamiento de los compuestos. Los ejemplos no limitantes de grupos derivatizantes incluyen biotina, fluoresceína, digoxigenina, proteína verde fluorescente, isótopos, polihistidina, perlas magnéticas, glutatión S-transferasa (GST), reticulantes fotoactivatibles o cualquier combinación de los mismos.
En muchos programas de cribado de fármacos que ensayan bibliotecas de compuestos y extractos naturales, son deseables ensayos de alto rendimiento para maximizar el número de compuestos examinados en un periodo de tiempo dado. Los ensayos que se realizan en sistemas libres de células, tales como los que se pueden derivar con proteínas purificadas o semipurificadas, a menudo se prefieren como cribados "primarios", ya que pueden generarse para permitir un desarrollo rápido y una detección relativamente fácil de una alteración en una diana molecular que está mediada por un compuesto de prueba. Además, los efectos de la toxicidad celular o la biodisponibilidad del compuesto de prueba generalmente pueden ignorarse en el sistema in vitro, centrándose en su lugar el ensayo principalmente en el efecto del fármaco sobre la diana molecular, como puede manifestarse en una alteración de la afinidad de unión entre un ligando de GDF/BMP (por ejemplo, activina A, activina B, activina AB, activina C, GDF8, GDF15, GDF11, GDF3, BMP6 o BMP10) a su compañero de unión, tal como un receptor de tipo II (por ejemplo, ActRIIA y/o ActRIIB). Simplemente con fines ilustrativos, en un ensayo de cribado de ejemplo de la presente descripción, el compuesto de interés se pone en contacto con un polipéptido ActRIIB aislado y purificado que normalmente es capaz de unirse a un ligando de ActRIIB, según sea apropiado para la intención del ensayo. A continuación, a la mezcla del compuesto y el polipéptido ActRIIB se le añade una composición que contiene un ligando de ActRIIB (por ejemplo, GDF11). La detección y cuantificación de complejos ActRIIB/ligando de ActRIIB proporciona un medio para determinar la eficacia del compuesto para inhibir (o potenciar) la formación de complejos entre el polipéptido ActRIIB y su proteína de unión. La eficacia del compuesto se puede evaluar generando curvas de respuesta a la dosis a partir de los datos obtenidos usando diversas concentraciones del compuesto de prueba. Además, también se puede realizar un ensayo de control para proporcionar un valor inicial para la comparación. Por ejemplo, en un ensayo de control, se añade el ligando de ActRIIB aislado y purificado a una composición que contiene el polipéptido ActRIIB, y se cuantifica la formación del complejo de ActRIIB/ligando de ActRIIB en ausencia del compuesto de prueba. Se entenderá que, en general, el orden en el que se pueden mezclar los reactivos se puede variar y se pueden mezclar simultáneamente. Además, en lugar de proteínas purificadas, pueden usarse extractos y lisados celulares para producir un sistema de ensayo libre de células adecuado.
La formación de complejos entre el ligando de GDF/BMP y su proteína de unión puede detectarse mediante una diversidad de técnicas. Por ejemplo, la modulación de la formación de complejos se puede cuantificar usando, por ejemplo, proteínas marcadas de forma detectable tales como radiomarcadas (por ejemplo, 32P, 35S, 14C o 3H), marcadas con fluorescencia (por ejemplo, FITC) o polipéptido ActRIIB marcado enzimáticamente y/o su proteína de unión, por inmunoensayo o por detección cromatográfica.
En determinados casos, la presente descripción contempla el uso de ensayos de polarización de fluorescencia y ensayos de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) para medir, directa o indirectamente, el grado de interacción entre un ligando de GDF/BMP y su proteína de unión. Además, otros modos de detección, tales como los basados en guías de ondas ópticas (véanse, por ejemplo, la Publicación PCT WO 96/26432 y la Pat. de EE.UU. N.° 5.677.196), resonancia de plasmón superficial (SPR), sensores de carga de superficie y sensores de fuerza de superficie, son compatibles con muchos casos de la descripción.
Además, la presente descripción contempla el uso de un ensayo de trampa de interacción, también conocido como el "ensayo de dos híbridos", para identificar agentes que interrumpan o potencien la interacción entre un ligando de GDF/BMP y su compañero de unión. Véanse, por ejemplo, la Pat. de e E.UU. N.° 5.283.317; Zervos y col. (1993) Cell 72:223-232; Madura y col. (1993) J Biol Chem 268:12046-12054; Bartel y col. (1993) Biotechniques 14:920-924; e Iwabuchi y col. (1993) Oncogene 8:1693-1696). En un caso específico, la presente descripción contempla el uso de sistemas de dos híbridos inversos para identificar compuestos (por ejemplo, moléculas pequeñas o péptidos) que disocien interacciones entre un ligando de GDF/BMP y su proteína de unión [véanse, por ejemplo, Vidal y Legrain, (1999) Nucleic Acids Res 27:919-29; Vidal y Legrain, (1999) Trends Biotechnol 17:374-81; y las Pat. de EE.UU. N.° 5.525.490; 5.955.280; y 5.965.368].
En determinados casos, los compuestos en cuestión se identifican por su capacidad para interactuar con un ligando de GDF/BMP. La interacción entre el compuesto y el ligando de GDF/BMP puede ser covalente o no covalente. Por ejemplo, dicha interacción se puede identificar a nivel de proteína usando procedimientos bioquímicos in vitro, incluyendo fotorreticulación, unión a ligando radiomarcada y cromatografía de afinidad [véase, por ejemplo, Jakoby WB y col. (1974) Methods in Enzymology 46:1]. En determinados casos, los compuestos se pueden cribar en un ensayo basado en mecanismos, tal como un ensayo para detectar compuestos que se unen a un ligando de GDF/BMP. Esto puede incluir un evento de unión en fase sólida o en fase fluida. Como alternativa, el gen que codifica el ligando de GDF/BMP se puede transfectar con un sistema indicador (por ejemplo, p-galactosidasa, luciferasa o proteína verde fluorescente) en una célula y se puede cribar contra la biblioteca preferentemente mediante cribado de alto rendimiento o con miembros individuales de la biblioteca. Pueden usarse otros ensayos de unión basados en mecanismos; por ejemplo, ensayos de unión que detectan cambios en la energía libre. Los ensayos de unión se pueden realizar con la diana fijada a un pocillo, perla o chip o capturada por un anticuerpo inmovilizado o resuelta por electroforesis capilar. Los compuestos unidos pueden detectarse normalmente usando puntos finales colorimétricos o fluorescencia o resonancia de plasmón superficial.
9. Usos terapéuticos
En parte, la presente descripción se refiere a composiciones para su uso en el tratamiento de la hipertensión pulmonar (por ejemplo, hipertensión arterial pulmonar) que comprenden administrar a un paciente que lo necesite una cantidad eficaz de un antagonista de GDF/BMP (por ejemplo, un antagonista de uno o más de activina, GDF8, GDF11, GDF3, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7 y una o más proteínas Smad). En algunos casos, la descripción contempla composiciones para su uso en el tratamiento de una o más complicaciones de la hipertensión pulmonar (por ejemplo, proliferación de músculo liso y/o células endoteliales en la arteria pulmonar, angiogénesis en la arteria pulmonar, disnea, dolor torácico, remodelación vascular pulmonar, hipertrofia ventricular derecha y fibrosis pulmonar) que comprenden administrar a un paciente que lo necesite una cantidad eficaz de un antagonista de GDF/BMP. En algunos casos, la descripción contempla composiciones para su uso en la prevención de una o más complicaciones de la hipertensión pulmonar que comprenden administrar a un paciente que lo necesite una cantidad eficaz de un antagonista de GDF/BMP. En algunos casos, la descripción contempla composiciones para su uso en la reducción de la tasa de progresión de la hipertensión pulmonar que comprenden administrar a un paciente que lo necesite una cantidad eficaz de un antagonista de GDF/BMP. En algunos casos, la descripción contempla composiciones para su uso en la reducción de la tasa de progresión de una o más complicaciones de la hipertensión pulmonar que comprenden administrar a un paciente que lo necesite una cantidad eficaz de un antagonista de GDF/BMP. En algunos casos, la descripción contempla composiciones para su uso en la reducción de la gravedad de la hipertensión pulmonar que comprenden administrar a un paciente que lo necesite una cantidad eficaz de un antagonista de GDF/BMP. En algunos casos, la descripción contempla composiciones para su uso en la reducción de la gravedad de una o más complicaciones de la hipertensión pulmonar que comprenden administrar a un paciente que lo necesite una cantidad eficaz de un antagonista de GDF/b Mp . Opcionalmente, los procedimientos descritos en esta invención para tratar, prevenir o reducir la tasa de progresión y/o la gravedad de la hipertensión pulmonar, particularmente el tratamiento, la prevención o la reducción de la tasa de progresión y/o la gravedad de una o más complicaciones de la hipertensión pulmonar, pueden comprender además administrar al paciente una o más terapias de apoyo o agentes activos adicionales para tratar la hipertensión pulmonar. Por ejemplo, al paciente también se le puede administrar una o más terapias de apoyo o agentes activos seleccionados de entre el grupo que consiste en: prostaciclina y derivados de la misma (por ejemplo, epoprostenol, treprostinil e iloprost); agonistas del receptor de prostaciclina (por ejemplo, selexipag); antagonistas del receptor de endotelina (por ejemplo, telina, ambrisentán, macitentán y bosentán); bloqueadores de los canales de calcio (por ejemplo, amlodipina, diltiazem y nifedipina; anticoagulantes (por ejemplo, warfarina); diuréticos; oxigenoterapia; septostomía auricular; tromboendarterectomía pulmonar; inhibidores de la fosfodiesterasa tipo 5 (por ejemplo, sildenafilo y tadalafilo); activadores de la guanilato ciclasa soluble (por ejemplo, cinaciguat y riociguat); inhibidores de ASK-1 (por ejemplo, CIIA; SCH79797; GS-4997; MSC2032964 A; 3H-nafto[1,2,3-de]quinilin-2,7-dionas, NQDI-1; 2-tioxo-tiazolidinas, 5-bromo-3-(4-oxo-2-tioxotiazolidin-5-iliden)-1,3-dihidro-indol-2-ona); antagonistas de NF-kB (por ejemplo, dh404, CDDO-epóxido; 2,2­ difluoropropionamida; Imidazol C28 (CDDO-Im); ácido 2-ciano-3,12-dioxoolean-1,9-dien-28-oico (CDDO); ácido 3-acetiloleanólico; ácido 3-trifluoroacetiloleanólico; 28-metil-3-acetiloleanano; 28-metil-3-trifluoroacetiloleanano; ácido 28-metiloxioleanólico; SZC014; SCZ015; SZC017; derivados PEGilados de ácido oleanólico; ácido 3-O-(beta-D-glucopiranosil)oleanólico; ácido 3-O-[beta-D-glucopiranosil-(1-->3)-beta-D-glucopiranosil]oleanólico; ácido 3-O-[beta-D-glucopiranosil-(1-->2)-beta-D-glucopiranosil]oleanólico; 28-O-beta-D-glucopiranosil éster del ácido 3-O-[beta-D-glucopiranosil-(1-->3)-beta-D-glucopiranosil]oleanólico; 28-O-beta-D-glucopiranosil éster del ácido 3-O-[beta-D-glucopiranosil-(1-->2)-beta-D-glucopiranosil]oleanólico; ácido 3-O-[a-L-ramnopiranosil-(1-->3)-beta-D-glucuronopiranosil]oleanólico; 28-O-beta-D-glucopiranosil éster del ácido 3-O-[alfa-L-ramnopiranosil-(1-->3)-beta-D-glucuronopiranosil]oleanólico; ácido 28-O-(3-D-glucopiranosil-oleanólico; ácido 3-O-p-D-glucopiranosil(1^3)-p-D-glucopiranosidurónico (CS1); ácido oleanólico ácido 3-O-p-D-glucopiranosil(1^3)-p-D-glucopiranosidurónico (CS2); 3,11-dioxoolean-12-en-28-olato de metilo (DIOXOL); ZcVl -2; 3-deshidroxi-1,2,5-oxadiazolo[3',4':2,3]oleanolato de metilo), trasplante de pulmón y/o corazón. En algunos casos, al paciente también se le puede administrar un polipéptido BMP9. En algunos casos, el polipéptido BMP9 es un polipéptido BMP9 maduro. En algunos casos, el polipéptido BMP9 comprende un polipéptido del prodominio BMP9. En algunos casos, el polipéptido BMP9 se administra en una preparación farmacéutica, que opcionalmente puede comprender un polipéptido del prodominio BMP9. En dichas preparaciones farmacéuticas de BMP9 que comprenden un polipéptido del prodominio BMP9, el polipéptido BMP9 puede estar asociado no covalentemente con el polipéptido del prodominio BMP9. En algunos casos, las preparaciones farmacéuticas de BMP9 están sustancialmente libres o no comprenden el polipéptido del prodominio BMP9. Los polipéptidos BMP9 (maduros y propolipéptidos), polipéptidos del prodominio BMP9, composiciones farmacéuticas que comprenden los mismos, así como el procedimiento para generar de dichos polipéptidos y composiciones farmacéuticas se describen, por ejemplo, en el documento WO 2013/152213. Como se usa en esta invención, un agente terapéutico que "previene" un trastorno o afección se refiere a un compuesto que, en una muestra estadística, reduce la aparición del trastorno o afección en la muestra tratada en relación con una muestra de control no tratada, o retrasa la aparición o reduce la gravedad de uno o más síntomas del trastorno o afección en relación con la muestra de control no tratada.
En algunos casos, la presente descripción se refiere a composiciones para su uso en el tratamiento de una enfermedad pulmonar intersticial (por ejemplo, fibrosis pulmonar idiopática) que comprenden administrar a un paciente que lo necesite una cantidad eficaz de cualquiera de los antagonistas de GDF/BMP descritos en esta invención (por ejemplo, un antagonista de uno o más de activina, GDF8, GDF11, GDF3, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7 y una o más proteínas Smad). En algunos casos, la enfermedad pulmonar intersticial es fibrosis pulmonar. En algunos casos, la enfermedad pulmonar intersticial es causada por cualquiera de los siguientes: silicosis, asbestosis, beriliosis, neumonitis por hipersensibilidad, uso de fármacos (por ejemplo, antibióticos, fármacos quimioterapéuticos, agentes antiarrítmicos, estatinas), esclerosis sistémica, polimiositis, dermatomiositis, lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide, una infección (por ejemplo, neumonía atípica, neumonía por pneumocystis, tuberculosis, Chlamydia trachomatis y/o virus respiratorio sincitial), carcinomatosis linfangítica, tabaquismo o trastornos del desarrollo. En algunos casos, la enfermedad pulmonar intersticial es idiopática (por ejemplo, sarcoidosis, fibrosis pulmonar idiopática, síndrome de Hamman-Rich y/o síndrome antisintetasa). En casos particulares, la enfermedad pulmonar intersticial es fibrosis pulmonar idiopática. En algunos casos, el tratamiento para la fibrosis pulmonar idiopática se administra en combinación con un agente terapéutico adicional. En algunos casos, el agente terapéutico adicional se selecciona de entre el grupo que consiste en: pirfenidona, N-acetilcisteína, prednisona, azatioprina, nintedanib, derivados de los mismos y combinaciones de los mismos.
El término "tratar", como se usa en esta invención, incluye la mejora o eliminación de la afección una vez que se ha establecido. En cualquier caso, la prevención o el tratamiento pueden discernirse en el diagnóstico proporcionado por un médico u otro proveedor de atención médica y el resultado previsto de la administración del agente terapéutico.
En general, el tratamiento o la prevención de una enfermedad o afección como se describe en la presente descripción se logra mediante la administración de un antagonista de GDF/BMP en una cantidad eficaz. Una cantidad eficaz de un agente se refiere a una cantidad eficaz, en las dosis y durante los periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico o profiláctico deseado. Una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente de la presente descripción puede variar según factores tales como la patología, la edad, el sexo y el peso del individuo, y la capacidad del agente para provocar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad profilácticamente eficaz se refiere a una cantidad eficaz, en las dosis y durante los periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado profiláctico deseado.
Los términos "sujeto", "individuo" o "paciente" son intercambiables en toda la memoria descriptiva y generalmente se refieren a mamíferos. Los mamíferos incluyen, pero sin limitación, animales domesticados (por ejemplo, vacas, ovejas, gatos, perros y caballos), primates (por ejemplo, primates humanos y no humanos tales como monos), conejos y roedores (por ejemplo, ratones y ratas).
La hipertensión pulmonar (HP) se ha clasificado previamente como primaria (idiopática) o secundaria. Recientemente, la Organización Mundial de la Salud (OMS) ha clasificado la hipertensión pulmonar en cinco grupos: Grupo 1: Hipertensión arterial pulmonar (HAP); Grupo 2: hipertensión pulmonar con cardiopatía izquierda; Grupo 3: hipertensión pulmonar con enfermedad pulmonar y/o hipoxemia; Grupo 4: hipertensión pulmonar por enfermedad trombótica y/o embólica crónica; y Grupo 5: afecciones diversas (por ejemplo, sarcoidosis, histiocitosis X, linfangiomatosis y compresión de los vasos pulmonares). Véase, por ejemplo, Rubin (2004) Chest 126:7-10.
En determinados casos, la descripción se refiere a composiciones para su uso en el tratamiento, prevención o reducción de la tasa de progresión y/o la gravedad de la hipertensión pulmonar (por ejemplo, el tratamiento, la prevención o la reducción de la tasa de progresión y/o la gravedad de una o más complicaciones de la hipertensión pulmonar) que comprenden administrar a un paciente que lo necesite una cantidad eficaz de un antagonista de GDF/BMP (por ejemplo, un antagonista de uno o más de activina, GDF8, GDF11, GDF3, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7 y una o más proteínas Smad). En algunos casos, el procedimiento se refiere a pacientes con hipertensión pulmonar que tienen hipertensión arterial pulmonar. En algunos casos, el procedimiento se refiere a pacientes con hipertensión pulmonar que tienen hipertensión pulmonar con cardiopatía izquierda. En algunos casos, el procedimiento se refiere a pacientes con hipertensión pulmonar que tienen enfermedad pulmonar y/o hipoxemia. En algunos casos, el procedimiento se refiere a pacientes con hipertensión pulmonar que tienen enfermedad trombótica y/o embólica crónica. En algunos casos, el procedimiento se refiere a pacientes con hipertensión pulmonar que tienen sarcoidosis, histiocitosis X o linfangiomatosis y compresión de los vasos pulmonares.
La hipertensión arterial pulmonar es una enfermedad grave, progresiva y potencialmente mortal de la vasculatura pulmonar, caracterizada por una vasoconstricción profunda y una proliferación anormal de las células del músculo liso en las paredes de las arterias pulmonares. La constricción grave de los vasos sanguíneos en los pulmones conduce a presiones arteriales pulmonares muy altas. Estas altas presiones dificultan que el corazón bombee sangre a través de los pulmones para oxigenarse. Los pacientes con HAP padecen una extrema dificultad para respirar mientras el corazón lucha por bombear contra estas altas presiones. Los pacientes con HAP típicamente desarrollan aumentos significativos de la resistencia vascular pulmonar (PVR) y elevaciones sostenidas de la presión arterial pulmonar (PAP), que en última instancia conducen a insuficiencia ventricular derecha y la muerte. Los pacientes diagnosticados de HAP tienen un pronóstico desfavorable y una calidad de vida igualmente comprometida, con una esperanza de vida media de 2 a 5 años desde el momento del diagnóstico si no se tratan.
Una diversidad de factores contribuyen a la patogénesis de la hipertensión pulmonar, incluida la proliferación de células pulmonares que pueden contribuir a la remodelación vascular (es decir, hiperplasia). Por ejemplo, la remodelación vascular pulmonar se produce principalmente por la proliferación de células endoteliales arteriales y células del músculo liso de pacientes con hipertensión pulmonar. Se cree que la sobreexpresión de diversas citocinas promueve la hipertensión pulmonar.Además, se ha encontrado que la hipertensión pulmonar puede aumentar por la hiperproliferación de células lisas arteriales pulmonares y células endoteliales pulmonares. Además, la HAP avanzada puede caracterizarse por la muscularización de las arteriolas pulmonares distales, el engrosamiento concéntrico de la íntima y la obstrucción del lumen vascular por la proliferación de células endoteliales. Pietra y col., J. Am. Coll. Cardiol., 43:255-325 (2004).
En determinados casos, la descripción se refiere a composiciones para su uso en el tratamiento, la prevención o la reducción de la tasa de progresión y/o la gravedad de la hipertensión pulmonar (por ejemplo, el tratamiento, la prevención o la reducción de la tasa de progresión y/o la gravedad de una o más complicaciones de la hipertensión pulmonar) que comprenden administrar a un paciente que lo necesite una cantidad eficaz de un antagonista de GDF/BMP (por ejemplo, un antagonista de uno o más de activina, GDF8, GDF11, GDF3, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7 y una o más proteínas Smad), donde el paciente tiene una presión arterial pulmonar (PAP) en reposo de al menos 25 mm Hg (por ejemplo, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 mm Hg). En algunos casos, el procedimiento se refiere a pacientes que tienen una pAp en reposo de al menos 25 mm Hg. En algunos casos, el procedimiento se refiere a pacientes que tienen una PAP en reposo de al menos 30 mm Hg. En algunos casos, el procedimiento se refiere a pacientes que tienen una PAP en reposo de al menos 35 mm Hg. En algunos casos, el procedimiento se refiere a pacientes que tienen una PAP en reposo de al menos 40 mm Hg. En algunos casos, el procedimiento se refiere a pacientes que tienen una PAP en reposo de al menos 45 mm Hg. En algunos casos, el procedimiento se refiere a pacientes que tienen una PAP en reposo de al menos 50 mm Hg.
En algunos casos, la descripción se refiere a composiciones para su uso en el ajuste de uno o más parámetros hemodinámicos en el paciente con HP hacia un nivel más normal (por ejemplo, normal en comparación con personas sanas de edad y sexo similares), que comprenden administrar a un paciente que lo necesite una cantidad eficaz de un antagonista de GDF/BMP (por ejemplo, un antagonista de uno o más de activina, GDF8, GDF11, GDF3, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7 y una o más proteínas Smad).En algunos casos, el procedimiento se refiere a la reducción de la PAP. En algunos casos, el procedimiento se refiere a la reducción de la PAP del paciente en al menos 3 mmHg. En determinados casos, el procedimiento se refiere a la reducción de la PAP del paciente en al menos 5 mmHg. En determinados casos, el procedimiento se refiere a la reducción de la PAP del paciente en al menos 7 mmHg. En determinados casos, el procedimiento se refiere a la reducción de la PAP del paciente en al menos 10 mmHg. En determinados casos, el procedimiento se refiere a la reducción de la PAP del paciente en al menos 12 mmHg. En determinados casos, el procedimiento se refiere a la reducción de la PAP del paciente en al menos 15 mmHg. En determinados casos, el procedimiento se refiere a la reducción de la PAP del paciente en al menos 20 mmHg. En determinados casos, el procedimiento se refiere a la reducción de la PAP del paciente en al menos 25 mmHg. En algunos casos, el procedimiento se refiere a la reducción de la resistencia vascular pulmonar (PVR). En algunos casos, el procedimiento se refiere al aumento de la presión de enclavamiento capilar pulmonar (PCWP). En algunos casos, el procedimiento se refiere al aumento de la presión telediastólica del ventrículo izquierdo (LVEDP).
En determinados casos, la descripción se refiere a composiciones para su uso en el tratamiento, la prevención o la reducción de la tasa de progresión y/o la gravedad de una o más complicaciones de la hipertensión pulmonar que comprenden administrar a un paciente que lo necesite una cantidad eficaz de un antagonista de GDF/BMP (por ejemplo, un antagonista de uno o más de activina, GDF8, GDF11, GDF3, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7 y una o más proteínas Smad). En algunos casos, el procedimiento se refiere al tratamiento, la prevención o la reducción de la tasa de progresión y/o la gravedad de la proliferación celular en la arteria pulmonar de un paciente con hipertensión pulmonar. En algunos casos, el procedimiento se refiere al tratamiento, la prevención o la reducción de la tasa de progresión y/o la gravedad de la proliferación de músculo liso y/o células endoteliales en la arteria pulmonar de un paciente con hipertensión pulmonar. En algunos casos, el procedimiento se refiere al tratamiento, la prevención o la reducción de la tasa de progresión y/o la gravedad de la angiogénesis en la arteria pulmonar de un paciente con hipertensión pulmonar. En algunos casos, el procedimiento se refiere al aumento de la actividad física de un paciente que tiene hipertensión pulmonar. En algunos casos, el procedimiento se refiere al tratamiento, la prevención o la reducción de la tasa de progresión y/o la gravedad de la disnea en un paciente con hipertensión pulmonar. En algunos casos, el procedimiento se refiere al tratamiento, la prevención o la reducción de la tasa de progresión y/o la gravedad del dolor torácico en un paciente con hipertensión pulmonar. En algunos casos, el procedimiento se refiere al tratamiento, la prevención o la reducción de la tasa de progresión y/o la gravedad de la fatiga en un paciente con hipertensión pulmonar. En algunos casos, el procedimiento se refiere al tratamiento, la prevención o la reducción de la tasa de progresión y/o la gravedad de la fibrosis pulmonar en un paciente con hipertensión pulmonar. En algunos casos, el procedimiento se refiere al tratamiento, la prevención o la reducción de la tasa de progresión y/o la gravedad de la fibrosis en un paciente con hipertensión pulmonar. En algunos casos, el procedimiento se refiere al tratamiento, la prevención o la reducción de la tasa de progresión y/o la gravedad de la remodelación vascular pulmonar en un paciente con hipertensión pulmonar.En algunos casos, el procedimiento se refiere al tratamiento, la prevención o la reducción de la tasa de progresión y/o la gravedad de la hipertrofia ventricular derecha en un paciente con hipertensión pulmonar.
En determinados casos, la descripción se refiere a composiciones para su uso en el aumento de la capacidad de ejercicio en un paciente que tiene hipertensión pulmonar que comprenden administrar a un paciente que lo necesite una cantidad eficaz de un antagonista de GDF/BMP (por ejemplo, un antagonista de uno o más de activina, GDF8, GDF11, GDF3, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7 y una o más proteínas Smad). Se puede utilizar cualquier medida adecuada de la capacidad de ejercicio. Por ejemplo, se usa con frecuencia la capacidad de ejercicio en una prueba de caminata de 6 minutos (6MWT), que mide qué tan lejos puede caminar el sujeto en 6 minutos, es decir, la distancia de caminata de 6 minutos (6MWD), para evaluar la gravedad de la hipertensión pulmonar y la progresión de la enfermedad. El índice de disnea de Borg (BDI) es una escala numérica para evaluar la disnea percibida (malestar respiratorio). Mide el grado de disnea, por ejemplo, después de completar la 6MWT, donde un BDI de 0 indica que no hay disnea y 10 indica disnea máxima. En algunos casos, el procedimiento se refiere al aumento de la 6MWD en al menos 10 metros en el paciente que tiene hipertensión pulmonar. En algunos casos, el procedimiento se refiere al aumento de la 6MWd en al menos 20 metros en el paciente que tiene hipertensión pulmonar. En algunos casos, el procedimiento se refiere al aumento de la 6MWD en al menos 30 metros en el paciente que tiene hipertensión pulmonar. En algunos casos, el procedimiento se refiere al aumento de la 6MWD en al menos
40 metros en el paciente que tiene hipertensión pulmonar. En algunos casos, el procedimiento se refiere al aumento de la 6MWD en al menos 50 metros en el paciente que tiene hipertensión pulmonar. En algunos casos, el procedimiento se refiere al aumento de la 6MWd en al menos 60 metros en el paciente que tiene hipertensión pulmonar. En algunos casos, el procedimiento se refiere al aumento de la 6MWD en al menos 70 metros en el paciente que tiene hipertensión pulmonar. En algunos casos, el procedimiento se refiere al aumento de la 6MWD en al menos
80 metros en el paciente que tiene hipertensión pulmonar. En algunos casos, el procedimiento se refiere al aumento de la 6MWD en al menos 90 metros en el paciente que tiene hipertensión pulmonar. En algunos casos, el procedimiento se refiere al aumento de la 6MWD en al menos 100 metros en el paciente que tiene hipertensión pulmonar. En algunos casos, el procedimiento se refiere a la reducción del BDI en al menos 0,5 puntos índice en el paciente que tiene hipertensión pulmonar. En algunos casos, el procedimiento se refiere a la reducción del BDI en al menos 1 punto índice en el paciente que tiene hipertensión pulmonar. En algunos casos, el procedimiento se refiere a la reducción del BDI en al menos 1,5 puntos índice en el paciente que tiene hipertensión pulmonar. En algunos casos, el procedimiento se refiere a la reducción del BDI en al menos 2 puntos índice en el paciente que tiene hipertensión pulmonar. En algunos casos, el procedimiento se refiere a la reducción del BDI en al menos 2,5 puntos índice en el paciente que tiene hipertensión pulmonar. En algunos casos, el procedimiento se refiere a la reducción del BDI en al menos 3 puntos índice en el paciente que tiene hipertensión pulmonar. En algunos casos, el procedimiento se refiere a la reducción del BDI en al menos 3,5 puntos índice en el paciente que tiene hipertensión pulmonar. En algunos casos, el procedimiento se refiere a la reducción del BDI en al menos 4 puntos índice en el paciente que tiene hipertensión pulmonar. En algunos casos, el procedimiento se refiere a la reducción del BDI en al menos 4,5 puntos índice en el paciente que tiene hipertensión pulmonar. En algunos casos, el procedimiento se refiere a la reducción del BDI en al menos 5 puntos índice en el paciente que tiene hipertensión pulmonar. En algunos casos, el procedimiento se refiere a la reducción del BDI en al menos 5,5 puntos índice en el paciente que tiene hipertensión pulmonar. En algunos casos, el procedimiento se refiere a la reducción del BDI en al menos 6 puntos índice en el paciente que tiene hipertensión pulmonar. En algunos casos, el procedimiento se refiere a la reducción del BDI en al menos 6,5 puntos índice en el paciente que tiene hipertensión pulmonar. En algunos casos, el procedimiento se refiere a la reducción del BDI en al menos 7 puntos índice en el paciente que tiene hipertensión pulmonar. En algunos casos, el procedimiento se refiere a la reducción del BDI en al menos 7,5 puntos índice en el paciente que tiene hipertensión pulmonar. En algunos casos, el procedimiento se refiere a la reducción del BDI en al menos 8 puntos índice en el paciente que tiene hipertensión pulmonar. En algunos casos, el procedimiento se refiere a la reducción del BDI en al menos 8,5 puntos índice en el paciente que tiene hipertensión pulmonar. En algunos casos, el procedimiento se refiere a la reducción del BDI en al menos 9 puntos índice en el paciente que tiene hipertensión pulmonar. En algunos casos, el procedimiento se refiere a la reducción del BDI en al menos 9,5 puntos índice en el paciente que tiene hipertensión pulmonar. En algunos casos, el procedimiento se refiere a la reducción del BDI en al menos 3 puntos índice en el paciente que tiene hipertensión pulmonar. En algunos casos, el procedimiento se refiere a la reducción del BDI en 10 puntos índice en el paciente que tiene hipertensión pulmonar.
La hipertensión pulmonar al inicio puede ser leve, moderada o grave, según lo medido, por ejemplo, por la clase funcional de la Organización Mundial de la Salud (OMS), que es una medida de la gravedad de la enfermedad en pacientes con hipertensión pulmonar. La clasificación funcional de la OMS es una adaptación del sistema de la New
York Heart Association (NYHa ) y se utiliza de forma rutinaria para evaluar cualitativamente la tolerancia a la actividad, por ejemplo, para controlar la progresión de la enfermedad y la respuesta al tratamiento (Rubin (2004) Chest 126:7-10). En el sistema de la o Ms se reconocen cuatro clases funcionales: Clase I: Hipertensión pulmonar sin la consiguiente limitación de la actividad física; la actividad física ordinaria no causa demasiada disnea ni fatiga indebida, dolor torácico o amenaza de síncope; Clase II: Hipertensión pulmonar que ocasiona una ligera limitación de la actividad física; paciente cómodo en reposo; la actividad física ordinaria causa demasiada disnea o fatiga, dolor torácico o amenaza de síncope; Clase III: Hipertensión pulmonar que ocasiona una marcada limitación de la actividad física; paciente cómodo en reposo; una actividad menor de lo normal causa demasiada disnea o fatiga, dolor torácico o amenaza de síncope; Clase IV: Hipertensión pulmonar que ocasiona la imposibilidad de realizar actividad física sin síntomas; el paciente manifiesta signos de insuficiencia cardíaca derecha; puede haber disnea y/o fatiga incluso en reposo; la incomodidad aumenta con cualquier actividad física.
En determinados casos, la descripción se refiere a composiciones para su uso en el tratamiento, la prevención o la reducción de la tasa de progresión y/o la gravedad de la hipertensión pulmonar (por ejemplo, el tratamiento, la prevención o la reducción de la tasa de progresión y/o la gravedad de una o más complicaciones de la hipertensión pulmonar) que comprenden administrar a un paciente que lo necesite una cantidad eficaz de un antagonista de GDF/BMP (por ejemplo, un antagonista de uno o más de activina, GDF8, GDF11, GDF3, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7 y una o más proteínas Smad), donde el paciente tiene hipertensión pulmonar de Clase I, Clase II, Clase III o Clase IV reconocida por la OMS. En algunos casos, el procedimiento se refiere a un paciente que tiene hipertensión pulmonar de Clase I según lo reconocido por la OMS. En algunos casos, el procedimiento se refiere a un paciente que tiene hipertensión pulmonar de Clase II según lo reconocido por la OMS. En algunos casos, el procedimiento se refiere a prevenir o retrasar la progresión del paciente de hipertensión pulmonar de Clase I a hipertensión pulmonar de Clase II según lo reconocido por la OMS. En algunos casos, el procedimiento se refiere a promover o aumentar la regresión del paciente de hipertensión pulmonar de Clase II a hipertensión pulmonar de Clase I según lo reconocido por la OMS. En algunos casos, el procedimiento se refiere a un paciente que tiene hipertensión pulmonar de Clase III según lo reconocido por la OMS. En algunos casos, el procedimiento se refiere a prevenir o retrasar la progresión del paciente de hipertensión pulmonar de Clase II a hipertensión pulmonar de Clase III según lo reconocido por la OMS. En algunos casos, el procedimiento se refiere a promover o aumentar la regresión del paciente de hipertensión pulmonar de Clase III a hipertensión pulmonar de Clase II según lo reconocido por la OMS. En algunos casos, el procedimiento se refiere a promover o aumentar la regresión del paciente de hipertensión pulmonar de Clase III a hipertensión pulmonar de Clase I según lo reconocido por la OMS. En algunos casos, el procedimiento se refiere a un paciente que tiene hipertensión pulmonar de Clase IV según lo reconocido por la OMS. En algunos casos, el procedimiento se refiere a prevenir o retrasar la progresión del paciente de hipertensión pulmonar de Clase III a hipertensión pulmonar de Clase IV según lo reconocido por la OMS. En algunos casos, el procedimiento se refiere a promover o aumentar la regresión del paciente de hipertensión pulmonar de Clase IV a hipertensión pulmonar de Clase III según lo reconocido por la OMS. En algunos casos, el procedimiento se refiere a promover o aumentar la regresión del paciente de hipertensión pulmonar de Clase IV a hipertensión pulmonar de Clase II según lo reconocido por la OMS. En algunos casos, el procedimiento se refiere a promover o aumentar la regresión del paciente de hipertensión pulmonar de Clase IV a hipertensión pulmonar de Clase I según lo reconocido por la OMS.
No existe una cura conocida para la hipertensión pulmonar; los procedimientos de tratamiento actuales se centran en prolongar la vida del paciente y mejorar su calidad de vida. Los procedimientos actuales de tratamiento de la hipertensión pulmonar incluyen la administración de: vasodilatadores tales como prostaciclina, epoprostenol y sildenafilo; antagonistas del receptor de endotelina tales como bosentán; bloqueadores de los canales de calcio tales como amlodipina, diltiazem y nifedipina; anticoagulantes tales como warfarina; y diuréticos. El tratamiento de la hipertensión pulmonar también se ha realizado mediante oxigenoterapia, septostomía auricular, tromboendarterectomía pulmonar y trasplante de pulmón y/o corazón. Sin embargo, cada uno de estos procedimientos tiene uno o múltiples inconvenientes que pueden incluir falta de eficacia, efectos secundarios graves, baja conformidad del paciente y alto coste. En determinados casos, el procedimiento se refiere al tratamiento, la prevención o la reducción de la tasa de progresión y/o la gravedad de la hipertensión pulmonar (por ejemplo, el tratamiento, la prevención o la reducción de la tasa de progresión y/o la gravedad de una o más complicaciones de la hipertensión pulmonar) que comprende administrar a un paciente que lo necesite una cantidad eficaz de un antagonista de GDF/BMP (por ejemplo, un antagonista de uno o más de activina, GDF8, GDF11, GDF3, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7 y una o más proteínas Smad) en combinación (por ejemplo, administrados al mismo tiempo o en diferentes momentos, pero generalmente de tal manera que se logren efectos farmacológicos/fisiológicos superpuestos) con uno o más agentes activos adicionales y/o terapias de apoyo para tratar la hipertensión pulmonar (vasodilatadores tales como prostaciclina, epoprostenol y sildenafilo; antagonistas del receptor de endotelina tales como bosentán; bloqueadores de los canales de calcio tales como amlodipina, diltiazem y nifedipina; anticoagulantes tales como warfarina; diuréticos; oxigenoterapia; septostomía auricular; tromboendarterectomía pulmonar; y trasplante de pulmón y/o corazón); polipéptidos BMP9; polipéptidos BMP10; bardoxolona metilo o un derivado del mismo; ácido oleanólico o un derivado del mismo.
En determinados casos, la presente descripción proporciona procedimientos para manejar a un paciente que ha sido tratado con, o es un candidato para ser tratado con, uno o más antagonistas de GDF/BMP de la descripción (por ejemplo, trampas de ligandos tales como polipéptidos ActRIIA, polipéptidos ActRIIB y polipéptidos trampa de g Df ) midiendo uno o más parámetros hematológicos en el paciente. Los parámetros hematológicos pueden usarse para evaluar la dosis apropiada para un paciente que es candidato a ser tratado con el antagonista de la presente descripción, para controlar los parámetros hematológicos durante el tratamiento, para evaluar si ajustar la dosis durante el tratamiento con uno o más antagonistas de la descripción, y/o para evaluar una dosis de mantenimiento apropiada de uno o más antagonistas de la descripción. Si uno o más de los parámetros hematológicos están fuera del nivel normal, la dosis con uno o más antagonistas de GDF/BMP puede reducirse, retrasarse o interrumpirse.
Los parámetros hematológicos que pueden medirse según los procedimientos proporcionados en esta invención incluyen, por ejemplo, niveles de glóbulos rojos, presión arterial, reservas de hierro y otros agentes que se encuentran en los fluidos corporales que se correlacionan con un aumento de los niveles de glóbulos rojos, usando los procedimientos reconocidos en la técnica. Dichos parámetros se pueden determinar usando una muestra de sangre de un paciente. El aumento en los niveles de glóbulos rojos, los niveles de hemoglobina o los niveles de hematocrito puede causar aumentos de la presión arterial.
En un caso, si uno o más parámetros hematológicos están fuera del intervalo normal o en el lado alto de lo normal en un paciente que es candidato a ser tratado con uno o más antagonistas de GDF/BMP, entonces puede retrasarse el inicio de la administración del uno o más antagonistas de la descripción hasta que los parámetros hematológicos hayan vuelto a un nivel normal o aceptable, ya sea de forma natural o a través de una intervención terapéutica. Por ejemplo, si un paciente candidato es hipertenso o prehipertenso, entonces el paciente puede ser tratado con un agente reductor de la presión sanguínea para reducir la presión sanguínea del paciente. Se puede usar cualquier agente reductor de la presión arterial apropiado para la afección individual del paciente, incluyendo, por ejemplo, diuréticos, inhibidores adrenérgicos (incluidos alfabloqueantes y betabloqueantes), vasodilatadores, bloqueadores de los canales de calcio, inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina (ACE) o bloqueadores del receptor de angiotensina II. Como alternativa, la presión arterial puede tratarse con una dieta y una rutina de ejercicio. De manera similar, si un paciente candidato tiene reservas de hierro más bajas de lo normal, o en el lado bajo de lo normal, entonces el paciente puede ser tratado con un régimen apropiado de dieta y/o complementos de hierro hasta que las reservas de hierro del paciente hayan regresado a un nivel normal o aceptable. Para pacientes que tienen niveles de glóbulos rojos y/o niveles de hemoglobina más altos de lo normal, entonces la administración de uno o más antagonistas de la descripción puede retrasarse hasta que los niveles hayan vuelto a un nivel normal o aceptable.
En determinados casos, si uno o más parámetros hematológicos están fuera del intervalo normal o en el lado alto de lo normal en un paciente que es candidato a ser tratado con uno o más antagonistas de GDF/BMP, entonces el inicio de la administración puede no retrasarse. Sin embargo, la cantidad de dosificación o la frecuencia de dosificación del uno o más antagonistas de la descripción puede establecerse en una cantidad que reducirá el riesgo de un aumento inaceptable de los parámetros hematológicos que surge tras la administración del uno o más antagonistas de la descripción. Como alternativa, se puede desarrollar un régimen terapéutico para el paciente que combine uno o más antagonistas de GDF/BMP con un agente terapéutico que aborde el nivel no deseado del parámetro hematológico. Por ejemplo, si el paciente tiene una presión arterial elevada, entonces se puede diseñar un régimen terapéutico que implique la administración de uno o más agentes antagonistas de GDF/BMP y un agente reductor de la presión arterial. Para un paciente que tiene reservas de hierro inferiores a las deseadas, se puede desarrollar un régimen terapéutico que implique uno o más antagonistas de GDF/BMP de la descripción y complementos de hierro.
En un caso, se pueden establecer parámetros iniciales para uno o más parámetros hematológicos para un paciente que es candidato a ser tratado con uno o más antagonistas de GDF/BMP de la descripción y un régimen de dosificación apropiado establecido para ese paciente según el valor o valores iniciales. Como alternativa, los parámetros iniciales establecidos basados en el historial médico de un paciente podrían usarse para informar un régimen de dosificación de antagonista apropiado para un paciente. Por ejemplo, si un paciente sano tiene una lectura de presión arterial inicial establecida que está por encima del intervalo normal definido, puede que no sea necesario llevar la presión arterial del paciente al intervalo que se considera normal para la población general antes del tratamiento con uno o más antagonista de la descripción. Los valores iniciales de un paciente para uno o más parámetros hematológicos antes del tratamiento con uno o más antagonistas de GDF/BMP de la descripción también pueden usarse como valores comparativos relevantes para controlar cualquier cambio en los parámetros hematológicos durante el tratamiento con uno o más antagonistas de la descripción.
En determinados casos, se miden uno o más parámetros hematológicos en pacientes que están siendo tratados con uno o más antagonistas de GDF/BMP. Los parámetros hematológicos se pueden usar para controlar al paciente durante el tratamiento y permitir el ajuste o la terminación de la dosificación con uno o más antagonistas de la descripción o una dosificación adicional con otro agente terapéutico. Por ejemplo, si la administración de uno o más antagonistas de GDF/BMP da como resultado un aumento de la presión arterial, el nivel de glóbulos rojos o el nivel de hemoglobina, o una reducción de las reservas de hierro, entonces la dosis de uno o más antagonistas de la descripción puede reducirse en cantidad o frecuencia con el fin de disminuir los efectos del uno o más antagonistas de la descripción sobre el uno o más parámetros hematológicos. Si la administración de uno o más antagonistas de GDF/BMP da como resultado un cambio en uno o más parámetros hematológicos que es adverso para el paciente, entonces la dosificación del uno o más antagonistas de la descripción puede interrumpirse temporalmente, hasta que el parámetro o parámetros hematológicos vuelvan a un nivel aceptable, o de forma permanente. De manera similar, si uno o más parámetros hematológicos no se están dentro de un intervalo aceptable después de reducir la dosis o la frecuencia de administración del uno o más antagonistas de la descripción, entonces se puede interrumpir la dosificación. Como alternativa, o además de reducir o interrumpir la dosificación con el uno o más antagonistas de la descripción, se puede administrar al paciente un agente terapéutico adicional que aborde el nivel no deseado en el parámetro o parámetros hematológicos, tales como, por ejemplo, un agente reductor de la presión arterial o un complemento de hierro.Por ejemplo, si un paciente que está siendo tratado con uno o más antagonistas de GDF/BMP tiene una presión arterial elevada, entonces la dosificación con uno o más antagonistas de la descripción puede continuar al mismo nivel y se añade un agente reductor de la presión arterial al régimen de tratamiento, se puede reducir la dosificación con uno o más antagonistas de la descripción (por ejemplo, en cantidad y/o frecuencia) y se añade un agente reductor de la presión arterial al régimen de tratamiento, o puede interrumpirse la dosificación con el uno o más antagonistas de la descripción y el paciente puede tratarse con un agente reductor de la presión sanguínea.
10. Composiciones farmacéuticas
Los agentes terapéuticos descritos en esta invención (por ejemplo, antagonistas de GDF/BMP) se pueden formular en composiciones farmacéuticas. Las composiciones farmacéuticas para su uso según la presente descripción se pueden formular de manera convencional usando uno o más portadores o excipientes fisiológicamente aceptables. Generalmente, dichas formulaciones serán sustancialmente apirógenas, según la mayoría de los requisitos reguladores.
En determinados casos, los procedimientos terapéuticos de la descripción incluyen administrar la composición de forma sistémica o local como un implante o dispositivo. Cuando se administra, la composición terapéutica para su uso en esta descripción está en una forma sustancialmente apirógena o apirógena fisiológicamente aceptable. Los agentes terapéuticamente útiles distintos de los antagonistas de GDF/BMP que también pueden incluirse opcionalmente en la composición como se ha descrito anteriormente, pueden administrarse simultánea o secuencialmente con los compuestos en cuestión en los procedimientos descritos en esta invención.
Típicamente, los agentes terapéuticos proteicos descritos en esta invención se administrarán por vía parental y, en particular, por vía intravenosa o subcutánea. Las composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración parenteral pueden comprender uno o más antagonistas de GDF/BMP en combinación con una o más soluciones, dispersiones, suspensiones o emulsiones acuosas o no acuosas isotónicas estériles farmacéuticamente aceptables, o polvos estériles que pueden reconstituirse en soluciones o dispersiones inyectables estériles antes de su uso, que puede contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos, solutos que hacen que la formulación sea isotónica con la sangre del receptor deseado o agentes de suspensión o espesantes. Los ejemplos de portadores acuosos y no acuosos adecuados que pueden emplearse en las composiciones farmacéuticas de la descripción incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol y similares), y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables, tal como oleato de etilo. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de materiales de recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones, y mediante el uso de tensioactivos. Las composiciones y formulaciones pueden presentarse, si se desea, en un envase o dispositivo dispensador que puede contener una o más formas de dosificación unitaria que contienen el principio activo. El envase puede comprender, por ejemplo, una lámina de metal o de plástico, tal como un envase blíster. El envase o dispositivo dispensador puede ir acompañado de instrucciones para su administración.
Además, la composición puede encapsularse o inyectarse en una forma para su administración a un sitio de tejido diana. En determinados casos, las composiciones de la presente descripción pueden incluir una matriz capaz de administrar uno o más compuestos terapéuticos (por ejemplo, antagonistas de GDF/BMP) a un sitio de tejido diana, proporcionando una estructura para el tejido en desarrollo y óptimamente capaz de reabsorberse en el cuerpo. Por ejemplo, la matriz puede proporcionar una liberación lenta del antagonista de GDF/BMP. Dichas matrices pueden estar formadas por materiales actualmente en uso para otras aplicaciones médicas implantadas.
La elección del material de la matriz se basa en la biocompatibilidad, biodegradabilidad, propiedades mecánicas, apariencia cosmética y propiedades de interfaz. La aplicación particular de las composiciones en cuestión definirá la formulación apropiada. Las matrices potenciales para las composiciones pueden ser sulfato de calcio, fosfato de tricalcio, hidroxiapatita, ácido poliláctico y polianhídridos biodegradables y químicamente definidos. Otros materiales potenciales son biodegradables y biológicamente bien definidos, tal como colágeno óseo o dérmico. Otras matrices están compuestas por proteínas puras o componentes de la matriz extracelular. Otras matrices potenciales no son biodegradables y están químicamente definidas, tal como hidroxiapatita sinterizada, biovidrio, aluminatos u otras cerámicas. Las matrices pueden estar compuestas por combinaciones de cualquiera de los tipos de material mencionados anteriormente, tales como ácido poliláctico e hidroxiapatita o colágeno y fosfato de tricalcio. Las biocerámicas se pueden alterar en composición, tal como en aluminato-fosfato de calcio y procesamiento para alterar el tamaño de poro, tamaño de partícula, forma de partícula y biodegradabilidad.
En determinados casos, las composiciones para su uso según la invención se pueden administrar por vía oral, por ejemplo, en forma de cápsulas, sellos, píldoras, comprimidos, pastillas para chupar (usando una base aromatizada, normalmente sacarosa y goma arábiga o tragacanto), polvos, gránulos, o como una solución o suspensión en un líquido acuoso o no acuoso, o como una emulsión líquida de aceite en agua o agua en aceite, o como un elixir o jarabe, o como pastillas (usando una base inerte, tal como gelatina y glicerina, o sacarosa y goma arábiga) y/o como enjuagues bucales y similares, conteniendo cada uno una cantidad predeterminada de un agente como principio activo. También se puede administrar un agente como un bolo, electuario o pasta.
En formas de dosificación sólidas para administración oral (cápsulas, comprimidos, píldoras, grageas, polvos, gránulos y similares), uno o más compuestos terapéuticos de la presente descripción pueden mezclarse con uno o más portadores farmacéuticamente aceptables, tales como citrato de sodio o fosfato de dicalcio y/o cualquiera de los siguientes: (1) cargas o extensores, tales como almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol o ácido silícico; (2) aglutinantes, tales como, por ejemplo, carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidona, sacarosa o goma arábiga; (3) humectantes, tales como glicerol; agentes (4) disgregantes, tales como agar-agar, carbonato de calcio, almidón de patata o tapioca, ácido algínico, determinados silicatos y carbonato de sodio; (5) agentes retardantes de la solución, tales como parafina; (6) aceleradores de absorción, tales como compuestos de amonio cuaternario; (7) agentes humectantes, tales como, por ejemplo, alcohol cetílico y monoestearato de glicerol; (8) absorbentes, tales como caolín y arcilla de bentonita; (9) lubricantes, tales como talco, estearato de calcio, estearato de magnesio, polietilenglicoles sólidos, laurilsulfato de sodio y mezclas de los mismos; y (10) agentes colorantes. En el caso de las cápsulas, comprimidos y píldoras, las composiciones farmacéuticas también pueden comprender agentes tamponantes. También pueden emplearse composiciones sólidas de tipo similar como cargas en cápsulas rellenas de gelatina blanda y dura usando excipientes tales como lactosa o azúcares de la leche, así como polietilenglicoles de alto peso molecular y similares.
Las formas de dosificación líquida para administración oral incluyen emulsiones, microemulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elixires farmacéuticamente aceptables. Además del principio activo, las formas de dosificación líquidas pueden contener diluyentes inertes usados comúnmente en la técnica, tales como agua u otros disolventes, agentes solubilizantes y emulsionantes, tales como alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, aceites (en particular, aceites de semilla de algodón, cacahuete, maíz, germen, oliva, ricino y sésamo), glicerol, alcohol tetrahidrofurílico, polietilenglicoles y ésteres de ácidos grasos de sorbitán, y mezclas de los mismos. Además de los diluyentes inertes, las composiciones orales también pueden incluir adyuvantes tales como agentes humectantes, emulsionantes y de suspensión, agentes edulcorantes, saporíferos, colorantes, aromatizantes y conservantes.
Las suspensiones, además de los compuestos activos, pueden contener agentes de suspensión tales como alcoholes isoestearílicos etoxilados, polioxietilensorbitol y ésteres de sorbitán, celulosa microcristalina, metahidróxido de aluminio, bentonita, agar-agar y tragacanto, y mezclas de los mismos.
Las composiciones de la descripción también pueden contener adyuvantes tales como conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. La prevención de la acción de microorganismos puede garantizarse mediante la inclusión de diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, y similares. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos, tales como azúcares, cloruro de sodio y similares en las composiciones. Además, la absorción prolongada de la forma inyectable del fármaco se puede realizar mediante la inclusión de agentes que retrasen la absorción, tales como monoestearato de aluminio y gelatina.
Se entiende que el régimen de dosificación se determinará por el médico tratante considerando diversos factores que modifiquen la acción de los compuestos en cuestión de la descripción (por ejemplo, antagonistas de GDF/BMP). Los diversos factores incluyen, pero sin limitación, la edad, el sexo y la dieta del paciente, la gravedad de la enfermedad, el momento de la administración y otros factores clínicos. Opcionalmente, la dosificación puede variar con el tipo de matriz utilizada en la reconstitución y los tipos de compuestos en la composición. La adición de otros factores de crecimiento conocidos a la composición final también puede afectar a la dosificación. El progreso se puede controlar mediante la evaluación periódica del crecimiento y/o reparación ósea, por ejemplo, rayos X (incluyendo DEXA), determinaciones histomorfométricas y marcaje con tetraciclina.
En determinados casos, la presente descripción también proporciona terapia génica para la producción in vivo de antagonistas de GDF/BMP. Dicha terapia lograría su efecto terapéutico mediante la introducción de las secuencias de polinucleótidos antagonistas de GDF/BMP en células o tejidos con los trastornos enumerados anteriormente. La administración de secuencias de polinucleótidos antagonistas de GDF/BMP se puede lograr usando un vector de expresión recombinante tal como un virus quimérico o un sistema de dispersión coloidal. Para la administración terapéutica de secuencias de polinucleótidos antagonistas de GDF/BMP se prefiere el uso de liposomas dirigidos.
Diversos vectores virales que pueden utilizarse para terapia génica como se indica en esta invención incluyen adenovirus, virus del herpes, vaccinia o, preferentemente, un virus de ARN tal como un retrovirus. Preferentemente, el vector retroviral es un derivado de un retrovirus murino o aviar. Los ejemplos de vectores retrovirales en los que se puede insertar un solo gen extraño incluyen, pero sin limitación: virus de la leucemia murina de Moloney (MoMuLV), virus del sarcoma murino de Harvey (HaMuSV), virus del tumor mamario murino (MuMTV) y virus del sarcoma de Rous (RSV). Varios vectores retrovirales adicionales pueden incorporar múltiples genes. Todos estos vectores pueden transferir o incorporar un gen para un marcador seleccionable de modo que las células transducidas puedan identificarse y generarse. Los vectores retrovirales pueden hacerse específicos de la diana uniendo, por ejemplo, un azúcar, un glucolípido o una proteína. El direccionamiento preferido se logra mediante el uso de un anticuerpo. Los expertos en la técnica reconocerán que se pueden insertar secuencias de polinucleótidos específicas en el genoma retroviral o unirse a una envoltura viral para permitir la administración específica diana del vector retroviral que contiene el antagonista de GDF/BMP. En casos preferidos, el vector se dirige al hueso o al cartílago.
Como alternativa, las células de cultivo tisular se pueden transfectar directamente con plásmidos que codifican los genes estructurales retrovirales gag, pol y env, mediante transfección convencional con fosfato de calcio. A continuación, estas células se transfectan con el plásmido vector que contiene los genes de interés. Las células resultantes liberan el vector retroviral en el medio de cultivo.
Otro sistema de administración dirigido para polinucleótidos antagonistas de GDF/BMP es un sistema de dispersión coloidal. Los sistemas de dispersión coloidal incluyen complejos de macromoléculas, nanocápsulas, microesferas, perlas y sistemas a base de lípidos que incluyen emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas mixtas y liposomas. El sistema coloidal preferido de esta descripción es un liposoma. Los liposomas son vesículas de membrana artificial que son útiles como vehículos de administración in vitro e in vivo. El ARN, el ADN y los viriones intactos pueden encapsularse en el interior acuoso y administrarse a las células en una forma biológicamente activa (véase, por ejemplo, Fraley, y col., Trends Biochem. Sci., 6:77, 1981). Se conocen en la técnica procedimientos para una transferencia génica eficaz utilizando un vehículo liposómico, véase, por ejemplo, Mannino, y col., Biotechniques, 6:682, 1988. La composición del liposoma es normalmente una combinación de fosfolípidos, normalmente en combinación con esteroides, especialmente colesterol. También se pueden usar otros fosfolípidos u otros lípidos. Las características físicas de los liposomas dependen del pH, la fuerza iónica y la presencia de cationes divalentes. Los ejemplos de lípidos útiles en la producción de liposomas incluyen compuestos de fosfatidilo, tales como fosfatidilglicerol, fosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina, esfingolípidos, cerebrósidos y gangliósidos. Los fosfolípidos ilustrativos incluyen fosfatidilcolina, dipalmitoilfosfatidilcolina y diestearoilfosfatidilcolina de huevo. El direccionamiento de liposomas también es posible basándose, por ejemplo, en la especificidad de los órganos, especificidad de las células y especificidad de los orgánulos y se conoce en la técnica.
La descripción proporciona formulaciones que pueden variarse para incluir ácidos y bases para ajustar el pH; y agentes tamponantes para mantener el pH dentro de un intervalo estrecho.
EJEMPLOS
Habiéndose descrito ahora la descripción generalmente, se entenderá más fácilmente por referencia a los siguientes ejemplos, que se incluyen simplemente con fines ilustrativos de determinados casos de la presente descripción y no pretenden limitar la descripción.
Ejemplo 1: Proteínas de fusión ActRIIa-Fc
Se construyó una proteína de fusión ActRIIA soluble que tenía el dominio extracelular de ActRIIa humana fusionado a un dominio Fc humano o de ratón con un enlazador mínimo intermedio. Las construcciones se denominan ActRIIA-hFc y ActRIIA-mFc, respectivamente.
ActRIIA-hFc se muestra a continuación como purificado a partir de líneas celulares CHO (SEQ ID NO: 32):
n.GRS E TQ ECI. F FN ANW EKDR TN Q T G VHP C YG DKDKRRíIC F A T W KNIS G SIEI
VKQG C W I >DD INC YDRTD C VEKKD SPE V YE C C CE GNM CNEKF S YF P EME VTQPT SNP
VTPKPPTGGGTHTCPPCPAPEILG G PSW LFPPKPKD TLM ISRTPEVTCVVVD VSIÍED P
EYKFNW YVD G VEVH NAKTKPREEO YNSTYRVVSVLT\a,H O D W LNG KEYKCKVSN
KALPVP1EKT1SKAKGOPREPOVYTLPPSREEMTKNOVSLTCLVKGFYPSD1AVEW ES
NGOPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW OOGNVFSCSVM HEALHNHYTQK
SLSLSPGK
Las proteínas ActRIIA-hFc y ActRIIA-mFc se expresaron en líneas celulares CHO.Se consideraron tres secuencias líderes diferentes:
(i) Melitina de abeja melífera (HBML): MKFLVNVALVFMVVYISYIYA (SEQ ID NO: 33)
(ii) Activador del plasminógeno tisular (TPA): MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP (SEQ ID NO: 34)
(iii) Nativa: MGAAAKLAFAVFLISCSSGA (SEQ ID NO: 35).
La forma seleccionada emplea el líder de TPA y tiene la siguiente secuencia de aminoácidos sin procesar: M DAM KRGLCCVLLLCGAVFVSPGAAILGRSETQECLFFNANW EKDRTNQTG VEPCYGDKDKRRHCFATW KNISGSIEIVKQGCW LDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFC CCEGNMCNEKFSYFPEMEVTQPTSNPVTPKPPTGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFP PKPKDTLM ISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNW YVDGVEVFíNAKTKPREEQYNSTY RVVS VLTVLH Q D W LN G KEYKC K VSNK ALPVPIEKTISKAKGQPREPQ VYTLPPSREE M TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK SRW QQGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 36)
Este polipéptido se codifica por la siguiente secuencia de ácido nucleico:
ATGGATGCAATGAAGAGAGGGCTCTGCTGTGTGCTGCTGCTGTGTGGAGC AG TCTTCG Tri'CG CCCG G CG CCG CTATACTTG G TAG ATCAG AAACTCAG G AG TG T C riT T lT T A A T G C T A A T T G G G A A A A A G A C A G A A C C A A T C A A A C rG C n G T T G A A C C G TG TTATG G TG AC AAAG ATAAAC G G C G G C ATTG TTTTG C TAC C TG G AAG AATATT TCTG G TTCCAT']'G AATAG rrG AAACAAG G TTG TTG G CrrG G ATG ATATCAAC ']'G CrrA TG AC AG G AC TG ATTG TG TAG AAAAAAAAG AC AG C C C TG AAG TATATTTC TG TTG C TG TG AG G G C AATATG TG TAATG AAAAG TTTTC TTATTTTC C G G AG ATG G AAG TC A CACAG CCCACTTCAAATCCAG TTACACCTAAG CCACCCACCGG TG G TG G AACTCA CACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTC TTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACAT G CG TGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACG TGGA CGGCGTGG AGGTGC AT A A TGC C A AG A C A A AGCCGCGGGA GG A GC AGT A C AACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGA ATG G CAAG G AG TACAAG TG CAAG G TCTCCAACAAAG CCCTCCCAG TCCCCATCG AG AAAACCATCTCCAAAG CCAAAG G G CAG CCCCG AG AACCACAG G TG TACACCC TGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGG TC AAAG G CTTCTATCCC AGC G A C ATCGCCGTGGAGTGGG AG AGC AATGGGC AGC CGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTT CCTCTATAG CAAG CTCACCG TG G ACAAG AG CAG G TG G CAG CAG G G G AACG TCTT CTCATG CTCCG TG ATG CATG AG G CTCTG CACAACCACTACACG CAG AAG AG CCTC TCCCTG TCTCCG G G TAAATG AG AATTC (SEQ ID NO: 37)
Tanto ActRIIA-hFc como ActRIIA-mFc fueron notablemente susceptibles a la expresión recombinante. Como se muestra en la figura 5, la proteína se purificó como un solo pico de proteína bien definido. La secuenciación N-terminal reveló una única secuencia de -ILGRSETQE (SEQ ID NO: 38). La purificación pudo lograrse mediante una serie de etapas de cromatografía en columna, incluyendo, por ejemplo, tres o más de las siguientes, en cualquier orden: cromatografía de proteína A, cromatografía de Q-Sepharose, cromatografía de Phenylsepharose, cromatografía de exclusión por tamaño y cromatografía de intercambio catiónico. La purificación se pudo completar con filtración viral e intercambio de tampón. La proteína ActRIIA-hFc se purificó a una pureza >98 % según se determinó por cromatografía de exclusión por tamaño y >95 % según se determinó por SDS PAGE.
ActRIIA-hFc y ActRIIA-mFc mostraron una alta afinidad por los ligandos. Se inmovilizaron GDF11 o activina A en un chip CM5 Biacore™ usando un procedimiento estándar de acoplamiento de amina. Las proteínas ActRIIA-hFc y ActRIIA-mFc se cargaron en el sistema y se midió la unión. ActRIIA-hFc se unió a activina con una constante de disociación (Kd) de 5 x 10'12 y se unió a GDF11 con una Kd de 9,96 x 10'9. Véase la figura 6. Utilizando un ensayo de unión similar, se determinó que ActRIIA-hFc tenía una afinidad alta a moderada por otros ligandos de la superfamilia de TGF-beta incluyendo, por ejemplo, activina B, GDF8, BMP6 y BMP10. ActRIIA-mFc se comportó de manera similar. La ActRIIA-hFc fue muy estable en estudios farmacocinéticos. Las ratas recibieron dosis de 1 mg/kg, 3 mg/kg o 10 mg/kg de proteína ActRIIA-hFc y se midieron los niveles en plasma de la proteína en 24, 48, 72, 144 y 168 horas. En un estudio separado, las ratas recibieron dosis de 1 mg/kg, 10 mg/kg o 30 mg/kg. En las ratas, ActRIIA-hFc tenía una semivida en suero de 11-14 días y los niveles circulantes del fármaco fueron bastante altos después de dos semanas (11 pg/ml, 110 pg/ml o 304 pg/ml para las administraciones iniciales de 1 mg/kg, 10 mg/kg o 30 mg/kg, respectivamente). En monos cynomolgus, la semivida en plasma fue sustancialmente mayor de 14 días y los niveles circulantes del fármaco fueron de 25 pg/ml, 304 pg/ml, o 1440 pg/ml para administraciones iniciales de 1 mg/kg, 10 mg/kg o 30 mg/kg, respectivamente.
Ejemplo 2: Caracterización de una proteína ActRIIA-hFc
La proteína de fusión ActRIIA-hFc se expresó en células CHO-DUKX B11 transfectadas de manera estable a partir de un vector pAID4 (ori/potenciador de SV40, promotor de CMV), usando una secuencia líder de plasminógeno tisular de SEQ ID NO: 34. La proteína, purificada como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 1, tenía una secuencia de SEQ ID NO: 32. La porción Fc es una secuencia Fc de IgG1 humana, como se muestra en la SEQ ID NO: 32. El análisis de proteínas revela que la proteína de fusión ActRIIA-hFc se forma como un homodímero con enlace disulfuro. El material expresado en células CHO tiene una mayor afinidad por el ligando de activina B que la informada para una proteína de fusión ActRIIa-hFc expresada en células 293 humanas [véase, del Re y col.
(2004) J Biol Chem. 279(51):53126-53135]. Además, el uso de la secuencia líder de TPA proporcionó una mayor producción que otras secuencias líder y, a diferencia de ActRIIA-Fc expresado con un líder nativo, proporcionó una secuencia N-terminal de alta pureza. El uso de la secuencia líder dio como resultado dos especies principales de ActRIIA-Fc, cada una con una secuencia N-terminal diferente.
Ejemplo 3: Proteínas ActRIIA-Fc alternativas
En la Solicitud de Patente Internacional publicada como WO2006/012627 (véanse, por ejemplo, págs. 55-58) se describe una diversidad de variantes de ActRIIA que pueden usarse según los procedimientos descritos en esta invención. Una construcción alternativa puede tener una deleción de la cola C-terminal (los 15 aminoácidos finales del dominio extracelular de ActRIIA. La secuencia para tal construcción se presenta a continuación (porción Fc subrayada) (SEQ ID NO: 39):
ILGRS E T Q EC'L F FNANW EKD RTN Q TG VEPC YG DKDKRRÍIC F A T W KNIS G SI El VKQG
CW LDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNM CNEKFSYFPEM TGGGTHTCPPCPA
PELLGGP S VFEFPPKPKDTEMISRTPEVTC V V Y D V SITEDPEVKFNW YVD G VE V IIN A K
TKPREEO Y N ST YR V V S VLT\rLHODW LNGKE YK C K V SNKALP VPIEKTISK AKGOPRE
PO V Y T L PP S REEMTKNO V S LT C L V K GF Y P S DI A VEWE S NG OPEN N Y K TTPP VL D SD G
SFFLYSKLTVDKSRW OOGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSPGK
Ejemplo 4: Generación de proteínas de fusión ActRIIB-Fc
Los solicitantes construyeron una proteína de fusión ActRIIB soluble que tenía el dominio extracelular de ActRIIB humano fusionado a un dominio Fc humano o de ratón con un enlazador mínimo intermedio. Las construcciones se denominan ActRIIB-hFc y ActRIIB-mFc, respectivamente.
ActRIIB-hFc se muestra a continuación como purificado a partir de líneas celulares CHO (SEQ ID NO: 40):
GRGEAETRECIYYNANW ELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASW RNSSGTIELVKK
G C W I, DDFN C YDRQEC V ATEENPQ V YF C C C F, GNF CNERF T IIfP E AG GPE V T YEPPPT APTGGGTriTCPPCPAPELLGGPSW ErPPKPKDTLM ISRTPEVTCVVVDVSFIEDPEVK
FNW YVD G VEVH NAKTKPREEO YNSTYRVVSVLTVLH O D W LNG KEYK .CKVSNKAL
PVPIEKTISKAKGOPREPOVYTLPPSREEM TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGO
PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW OOGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLS
LSPGK
Las proteínas ActRIIB-hFc y ActRIIB-mFc se expresaron en líneas celulares CHO.Se consideraron tres secuencias líderes diferentes: (i) Melitina de abeja melífera (HBML), (ii) Activador del plasminógeno tisular (TPA) y (iii) Nativa: MGAAAKLAFAVFLISCSSGA (SEQ ID NO: 41).
La forma seleccionada emplea el líder de TPA y tiene la siguiente secuencia de aminoácidos sin procesar (SEQ ID NO: 42):
M D AM KRG LCCVLLLCG AVFVSPG ASGRGEAETRECIYm ANW ELERTNO SG LERCE GEQDKRLHCYASW RNSSGT1ELVKKGCW LDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCE GNFCNERFTHL PE AGGPEVT YEPPPT APTGGGTFITCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKD TLM ISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNW YVDGVEVFÍNAKTKPREEOYNSTYRVVSV LTVLH O D W LNG KEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKG O PREPOVYTLPPSREEM TKNO VSLTCLYKGFYFSDIAA^EW ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW OO GNVFSCSVM HEALHNHYTOKSLSLSPGK
Este polipéptido se codifica por la siguiente secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 43):
A TGGATGCAAT GAAGAGAGGG CTCTGCTGTG TGCTGCTGCT GTGTGGAGCA
GTCTTCGTTT CGCCCGGCGC CTCTGGGCGT GGGGAGGCTG AGACACGGGA
GTGCATCTAC TACAACGCCA ACTGGGAGCT GGAGCGCACC AACCAGAGCG
GCCTGGAGCG CTGCGAAGGC GAGCAGGACA AGCGGCTGCA CTGCTACGCC
TCCTGGCGCA ACAGCTCTGG CACCATCGAG CTCGTGAAGA AGGGCTGCTG
GCTAGATGAC TTCAACTGCT ACGATAGGCA GGAGTGTGTG GCCACTGAGG
AGAACCCCCA GGTGTACTTC TGCTGCTGTG AAGGCAACTT CTGCAACGAG
CGCTTCACTC ATTTGCCAGA GGCTGGGGGC CCGGAAGTCA CGTACGAGCC
ACCCCCGACA GCCCCCACCG GTGGTGGAAC TCACACATGC CCACCGTGCC
CAGCACCTGA ACTCCTGGGG GGACCGTCAG TCTTCCTCTT CCCCCCAAAA
CCCAAGGACA CCCTCATGAT CTCCCGGACC CCTGAGGTCA CATGCGTGGT
GGTGGACGTG AGCCACGAAG ACCCTGAGGT CAAGTTCAAC TGGTACGTGG
ACGGCGTGGA GGTGCATAAT GCCAAGACAA AGCCGCGGGA GGAGCAGTAC
AACAGCACGT ACCGTGTGGT CAGCGTCCTC ACCGTCCTGC ACCAGGACTG
GCTGAATGGC AAGGAGTACA AGTGCAAGGT CTCCAACAAA GCCCTCCCAG
TCCCCATCGA GAAAACCATC TCCAAAGCCA AAGGGCAGCC CCGAGAACCA
CAGGTGTACA CCCTGCCCCC ATCCCGGGAG GAGATGACCA AGAACCAGGT
CAGCCTGACC TGCCTGGTCA AAGGCTTCTA TCCCAGCGAC ATCGCCGTGG
AGTGGGAGAG CAATGGGCAG CCGGAGAACA ACTACAAGAC CACGCCTCCC
GTGCTGGACT CCGACGGCTC CTTCTTCCTC TATAGCAAGC TCACCGTGGA
CAAGAGCAGG TGGCAGCAGG GGAACGTCTT CTCATGCTCC GTGATGCATG
AGGCTCTGCA CAACCACTAC ACGCAGAAGA GCCTCTCCCT GTCTCCGGGT
AAATGA
La secuenciación N-terminal del material producido por células CHO reveló una secuencia principal de -GRGEAE (SEQ ID NO: 44). Particularmente, otras construcciones informadas en la bibliografía comienzan con una secuencia -SGR...
La purificación pudo lograrse mediante una serie de etapas de cromatografía en columna, incluyendo, por ejemplo, tres o más de las siguientes, en cualquier orden: cromatografía de proteína A, cromatografía de Q-Sepharose, cromatografía de Phenylsepharose, cromatografía de exclusión por tamaño y cromatografía de intercambio catiónico. La purificación se pudo completar con filtración viral e intercambio de tampón.
Las proteínas de fusión ActRIIB-Fc también se expresaron en células HEK293 y células COS. Aunque el material de todas las líneas celulares y las condiciones de cultivo razonables proporcionó una proteína con actividad de construcción muscular in vivo, se observó variabilidad en la potencia relacionada quizás con la selección de la línea celular y/o las condiciones de cultivo.
Los solicitantes generaron una serie de mutaciones en el dominio extracelular de ActRIIB y produjeron estas proteínas mutantes como proteínas de fusión solubles entre ActRIIB extracelular y un dominio Fc. La fusión ActRIIB-Fc de transfondo tiene la secuencia de SEQ ID NO: 40.
Se introdujeron diversas mutaciones, incluyendo truncamientos N y C-terminales, en la proteína ActRIIB-Fc de transfondo. Basándose en los datos presentados en esta invención, se espera que estas construcciones, si se expresan con un líder de TPA, carezcan de la serina N-terminal. Las mutaciones se generaron en el dominio extracelular de ActRIIB mediante mutagénesis por PCR. Después de la PCR, los fragmentos se purificaron a través de una columna Qiagen, se digirieron con SfoI y AgeI y se purificaron en gel. Estos fragmentos se ligaron al vector de expresión pAID4 (véase el documento WO2006/012627) de manera que tras la ligadura se creó una quimera de fusión con IgG1 humana. Tras la transformación en DH5 alfa de E. coli, se recogieron las colonias y se aislaron los ADN. Para las construcciones murinas (mFc), se sustituyó una IgG2a murina por la IgG1 humana. Se verificaron las secuencias de todos los mutantes.Todos los mutantes se produjeron en células HEK293T mediante transfección transitoria. En resumen, en un centrifugador de 500 ml, las células HEK293T se establecieron a 6 x 105 células/ml en medio Freestyle (Invitrogen) en un volumen de 250 ml y se cultivaron durante una noche. Al día siguiente, estas células se trataron con complejo ADN:PEI (1:1) a una concentración final de ADN de 0,5 ug/ml. Después de 4 horas, se añadieron 250 ml de medio y las células se cultivaron durante 7 días. El medio acondicionado se recogió centrifugando las células y se concentró.
Los mutantes se purificaron usando una diversidad de técnicas, incluyendo, por ejemplo, una columna de proteína A, y se eluyeron con tampón de glicina de pH bajo (3,0). Después de la neutralización, estos se dializaron contra PBS. También se produjeron mutantes en células CHO mediante una metodología similar. Los mutantes se ensayaron en ensayos de unión y/o bioensayos descritos en los documentos WO 2008/097541 y WO 2006/012627. En algunos casos, los ensayos se realizaron con medio acondicionado en lugar de proteínas purificadas. Se describen variaciones adicionales de ActRIIB en la Patente de EE.UU. N.° 7.842.663.
El solicitante generó una proteína de fusión ActRIIB(25-131)-hFc, que comprendía el dominio extracelular de ActRIIB humano con truncamientos N-terminal y C-terminal (residuos 25-131 de la proteína nativa SEQ ID NO: 1) fusionado en el extremo N con una secuencia líder de TPA sustituida por el líder de ActRIIB nativo y en el extremo C con un dominio Fc humano a través de un enlazador mínimo (tres residuos de glicina) (figura 7). En la figura 8 se muestra una secuencia de nucleótidos que codifica esta proteína de fusión. Los solicitantes modificaron los codones y encontraron un ácido nucleico variante que codificaba la proteína ActRIIB(25-131)-hFc que proporcionó una mejora sustancial en los niveles de expresión de los transformantes iniciales (figura 9).
La proteína madura tiene una secuencia de aminoácidos de la siguiente manera (N-terminal confirmada por secuenciación N-terminal) (SEQ ID NO: 45):
ETREC1YYNA NWELERTNQS GLERCEGEQP KRLHCYASWR NSSCtí 1ELVK KGCWLPPFNC Y PRO EC VA TE ENPQVYKCCC EGNFCNERFT HLPEAGCtPEV TYEPPPTGGG THTCPPCPAP EIXGGPSVFL FPPKPKPTLM ISRTPFVTCV
VVDVSHEPPE VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD
WLNGKEYKCK VSNKALPAPI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSREEMTKNQ
VSLTCLVKGF YPSPIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLPSPG SFFLYSKLTV
PKSRWQQGNV FSCSVMHEAL HNF1YTQKSLS LSPGK
La molécula expresada se purificó usando una serie de etapas de cromatografía en columna, incluyendo, por ejemplo, tres o más de las siguientes, en cualquier orden: Cromatografía de proteína A, cromatografía de Q Sepharose, cromatografía de Phenylsepharose, cromatografía de exclusión por tamaño y cromatografía de intercambio catiónico. La purificación se pudo completar con filtración viral e intercambio de tampón.
Las afinidades de varios ligandos por ActRIIB(25-131)-hFc y su homólogo de longitud completa ActRIIB(20-134)-hFc se evaluaron in vitro con un instrumento Biacore™, y los resultados se resumen en la tabla a continuación. Los valores de Kd se obtuvieron por ajuste de afinidad en estado estacionario debido a una asociación y disociación muy rápida del complejo, lo que impidió la determinación precisa de la kasociación y la kdisociación. ActRIIB(25-131)-hFc se unió, por ejemplo, a activina A, activina B y GDF11 con alta afinidad.
Afinidades de ligando de las formas ActRIIB-hFc:
Figure imgf000083_0001
Figure imgf000084_0001
Ejemplo 5: Generación de una trampa de GDF
Se construyó una trampa de GDF de la siguiente manera. Un polipéptido que tenía un dominio extracelular modificado de ActRIIB (aminoácidos 20-134 de SEQ ID NO: 1 con una sustitución de L79D) con una unión a activina A muy reducida en relación con GDF11 y/o miostatina (como consecuencia de una sustitución de leucina a aspartato en la posición 79 en SEQ ID NO:1) se fusionó con un dominio Fc humano o de ratón con un enlazador mínimo intermedio. Las construcciones se denominan ActRIIB(L79D 20-134)-hFc y ActRIIB(L79D 20-134)-mFc, respectivamente. Las formas alternativas con un glutamato en lugar de un aspartato en la posición 79 se comportaron de manera similar (L79E). También se generaron formas alternativas con una alanina en lugar de una valina en la posición 226 con respecto a la SEQ ID NO: 64, a continuación, y se realizaron de forma equivalente en todos los aspectos ensayados. El aspartato en la posición 79 (con respecto a la SEQ ID NO: 1) se indica con doble subrayado a continuación. La valina en la posición 226 con respecto a la SEQ ID NO: 64 también se indica mediante doble subrayado a continuación. La trampa de GDF ActRIIB(L79D 20-134)-hFc se muestra a continuación como purificada a partir de líneas celulares CHO (SEQ ID NO: 46).
GRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKK GCWDDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPT APTGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVE>VSHEDPEVK FN W YVD G VEVH N AKTKPREEO YN STYRVVSVLTVLH O D W LN G KEYKC KVSN KAL PVPIEKTISKAKGOPREPOVYTLPPSREEM TKNOVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGO PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW OOGNVFSCSVM HEALHNHYTOKSLS LSPGK
La porción derivada de ActRIIB de la trampa de GDF tiene una secuencia de aminoácidos que se expone a continuación (SEQ ID NO: 47), y esa porción podría usarse como un monómero o como una proteína de fusión no Fc como un monómero, dímero o complejo de orden superior.
GRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKK
GCWDDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPT
APT (SEQ ID NO: 47)
La proteína trampa de GDF se expresó en líneas de células CHO. Se consideraron tres secuencias líderes diferentes:(i) Melitina de abeja melífera (HBML), (ii) Activador del plasminógeno tisular (TPA) y (iii) Nativa.
La forma seleccionada emplea el líder de TPA y tiene la siguiente secuencia de aminoácidos sin procesar: MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSPGASGRGEAETRECIYYNANWELERTNOSGLERCE GEQDKRLHC Y ASWRN S SGTIEL VKK GC WDDDFNC YDRQEC VATEENPQ VYFCCCE GNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPTGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKD TEMI SRTPE VTC VVVD VSHEDPE VKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEO YNSTYRVVS V LTVLHODWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGOPREPOVYTLPPSREEMTKNO VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGOPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWOO GNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 48)
Este polipéptido se codifica por la siguiente secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 49):
A TGGATGCAAT GAAGAGAGGG CTCTGCTGTG TGCTGCTGCT GTGTGGAGCA GTCTTCGTTT CGCCCGGCGC CTCTGGGCGT GGGGAGGCTG AGACACGGGA GTGCATCTAC TACAACGCCA ACTGGGAGCT GGAGCGCACC AACCAGAGCG GCCTGGAGCG CTGCGAAGGC GAGCAGGACA AGCGGCTGCA CTGCTACGCC TCCTGGCGCA ACAGCTCTGG CACCATCGAG CTCGTGAAGA AGGGCTGCTG GGACGATGAC TTCAACTGCT ACGATAGGCA GGAGTGTGTG GCCACTGAGG
AGAACCCCCA GGTGTACTTC TGCTGCTGTG AAGGCAACTT CTGCAACGAG CGCTTCACTC ATTTGCCAGA GGCTGGGGGC CCGGAAGTCA CGTACGAGCC ACCCCCGACA GCCCCCACCG GTGGTGGAAC TCACACATGC CCACCGTGCC CAGCACCTGA ACTCCTGGGG GGACCGTCAG TCTTCCTCTT CCCCCCAAAA CCCAAGGACA CCCTCATGAT CTCCCGGACC CCTGAGGTCA CATGCGTGGT GGTGGACGTG AGCCACGAAG ACCCTGAGGT CAAGTTC AAC TGGTACGTGG ACGGCGTGGA GGTGCATAAT GCCAAGACAA AGCCGCGGGA GGAGCAGTAC AACAGCACGT ACCGTGTGGT CAGCGTCCTC ACCGTCCTGC ACCAGGACTG GCTGAATGGC AAGGAGTACA AGTGCAAGGT CTCCAACAAA GCCCTCCCAG TCCCCATCGA GAAAACCATC TCCAAAGCCA AAGGGCAGCC CCGAGAACCA CAGGTGTACA CCCTGCCCCC ATCCCGGGAG GAGATGACCA AGAACCAGGT CAGCCTGACC TGCCTGGTCA AAGGCTTCTA TCCCAGCGAC ATCGCCGTGG AGTGGGAGAG CAATGGGCAG CCGGAGAACA ACTACAAGAC CACGCCTCCC GTGCTGGACT CCGACGGCTC CTTCTTCCTC TATAGCAAGC TCACCGTGGA CAAGAGCAGG TGGCAGCAGG GGAACGTCTT CTCATGCTCC GTGATGCATG AGGCTCTGCA CAACCACTAC ACGCAGAAGA GCCTCTCCCT GTCTCCGGGT AAATGA
La purificación pudo lograrse mediante una serie de etapas de cromatografía en columna, incluyendo, por ejemplo, tres o más de las siguientes, en cualquier orden: cromatografía de proteína A, cromatografía de Q-Sepharose, cromatografía de Phenylsepharose, cromatografía de exclusión por tamaño y cromatografía de intercambio catiónico. La purificación se pudo completar con filtración viral e intercambio de tampón. En un ejemplo de un esquema de purificación, el medio de cultivo celular se pasa sobre una columna de proteína A, se lava en Tris/NaCl 150 mM (pH 8,0), a continuación se lava en Tris/NaCl 50 mM (pH 8,0) y se eluye con glicina 0,1 M, pH 3,0. El eluido de pH bajo se mantiene a temperatura ambiente durante 30 minutos como etapa de aclaramiento viral. A continuación, el eluido se neutraliza y se pasa sobre una columna de intercambio iónico de Q-Sepharose y se lava en Tris 50 mM a pH 8,0, NaCl 50 mM y se eluye en Tris 50 mM a pH 8,0, con una concentración de NaCl entre 150 mM y 300 mM. A continuación, el eluido se cambia a Tris 50 mM a pH 8,0, sulfato de amonio 1,1 M, se pasa sobre una columna de Phenylsepharose, se lava y se eluye en Tris 50 mM a pH 8,0 con sulfato de amonio entre 150 y 300 mM. El eluido se dializa y se filtra para su uso.
Se describen trampas de GDF adicionales (proteínas de fusión ActRIIB-Fc modificadas para reducir la relación de unión a activina A con respecto a la unión a miostatina o GDF11) en los documentos WO 2008/097541 y WO 2006/012627.
Ejemplo 6: Bioensayo para la señalización mediada por GDF11 y activina
Se usó un ensayo del gen indicador A-204 para evaluar los efectos de las proteínas ActRIIB-Fc y las trampas de GDF sobre la señalización por GDF-11 y activina A. Línea celular: Rabdomiosarcoma humano (derivado de músculo). Vector indicador: pGL3(CAGA)12 (descrito en Dennler y col., 1998, EMBO 17: 3091-3100). El motivo CAGA12 está presente en genes que responden a TGF-beta (por ejemplo, gen PAI-1), por lo que este vector es de uso general para factores de señalización a través de SMAD2 y 3.
Día 1: Dividir las células A-204 en una placa de 48 pocillos.
Día 2: Células A-204 transfectadas con 10 ug de pGL3(CAGA)12 o pGL3(CAGA)12 (10 ug) pRLCMV (1 pg) y Fugene.
Día 3: Añadir factores (diluidos en medio BSA al 0,1 %). Los inhibidores deben preincubarse con factores durante 1 hora antes de añadirlos a las células. Seis horas más tarde, las células se aclararon con PBS y se lisaron. A esto le sigue un ensayo de luciferasa. En ausencia de cualquier inhibidor, la activina A mostró una estimulación 10 veces mayor de la expresión del gen indicador y una DE50 ~2 ng/ml. GDF-11: Estimulación 16 veces mayor, DE50: ~1,5 ng/ml.
ActRIIB(20-134) es un potente inhibidor de, por ejemplo, la actividad de activina A, GDF-8 y GDF-11 en este ensayo. Como se describe a continuación, las variantes de ActRIIB también se ensayaron en este ensayo.
Ejemplo 7: Variantes de ActRIIB-Fc, actividad basada en células
La actividad de las proteínas ActRIIB-Fc y las trampas de GDF se ensayó en un ensayo basado en células como se ha descrito anteriormente. Los resultados se resumen en la tabla a continuación. Algunas variantes se ensayaron en diferentes construcciones de truncamiento C-terminal. Como se ha analizado anteriormente, los truncamientos de cinco o quince aminoácidos provocaron una reducción de la actividad. Las trampas de GDF (variantes L79D y L79E) mostraron una pérdida sustancial de inhibición de la activina A mientras que conservaron la inhibición casi de tipo silvestre de GDF11.
Unión de ActRIIB-Fc soluble a GDF11 activina A:
Figure imgf000086_0001
Figure imgf000087_0001
Actividad deficiente (aproximadamente 1 x 10'6 Ki)
+ Actividad moderada (aproximadamente 1 x 10'7 Ki)
++ Buena actividad (de tipo silvestre) (aproximadamente 1 x 10'8 Ki)
+++ Mayor actividad que la actividad de tipo silvestre
La variante A24N tiene actividad en el ensayo basado en células (anterior) y esto es equivalente a la molécula de tipo silvestre. La variante A24N, y cualquiera de las otras variantes ensayadas anteriormente, se pueden combinar con las moléculas trampa de GDF, tales como las variantes L79D o L79E.
Ejemplo 8: Unión de GDF11 y activina A.
La unión de determinadas proteínas ActRIIB-Fc y trampas de GDF a ligandos se ensayó en un ensayo Biacore™. Las variantes de ActRIIB-Fc o la proteína de tipo silvestre se capturaron en el sistema usando un anticuerpo anti-hFc. Se inyectaron ligandos y se hicieron fluir sobre las proteínas receptoras capturadas. Los resultados se resumen en las tablas a continuación.
Variantes IIB de especificidad de unión a ligando.
Figure imgf000087_0002
Figure imgf000088_0001
Figure imgf000089_0001
Estos datos obtenidos en un ensayo libre de células confirman los datos del ensayo basado en células, lo que demuestra que la variante A24N conserva una actividad de unión a ligando que es similar a la de la molécula ActRIIB(20-134)-hFc y que la molécula L79D o L79E conserva la unión de miostatina y GDF11 pero muestra una unión marcadamente disminuida (no cuantificable) a la activina A.
Se han generado y ensayado otras variantes, como se informa en el documento WO2006/012627. Véanse, por ejemplo, págs. 59-60, usando ligandos acoplados al dispositivo y un receptor de flujo sobre los ligandos acoplados. Particularmente, K74Y, K74F, K74I (y presumiblemente otras sustituciones hidrófobas en K74, tal como K74L) y D80I, provocan una disminución en la relación de unión a activina A (ActA) con respecto a la unión a GDF11, en relación con la molécula K74 de tipo silvestre. A continuación se reproduce una tabla de datos con respecto a estas variantes:
Variantes solubles de ActRIIB-Fc que se unen a GDF11 y activina A (ensayo Biacore™)
Figure imgf000089_0002
Figure imgf000090_0001
* No se observó unión
- Unión <1/5 WT
- Unión ~1/2 WT
WT
+ Aumento de unión <2x
+ Aumento de unión ~5x
+++ Aumento de unión ~10x
++++ Aumento de unión ~40x
Ejemplo 9: Generación de una trampa de GDF con un dominio extracelular de ActRIIB truncado
Se generó una trampa de GDF denominada ActRIIB(L79D 20-134)-hFc mediante la fusión N-terminal del líder de TPA al dominio extracelular de ActRIIB (residuos 20-134 en la SEQ ID NO: 1) que contenía una sustitución de leucina a aspartato (en el residuo 79 en la SEQ ID NO: 1) y una fusión C-terminal del dominio Fc humano con un enlazador mínimo (tres residuos de glicina) (figura 10; SEQ ID NO: 74). En la figura 11 se muestra una secuencia de nucleótidos correspondiente a esta proteína de fusión (SEQ ID NO: 75, hebra sentido; y SEQ ID NO: 76, hebra antisentido). Se generó una trampa de GDF con un dominio extracelular de ActRIIB truncado, denominado ActRIIB(L79D 25-131)-hFc, mediante la fusión N-terminal del líder de TPA al dominio extracelular truncado (residuos 25-131 en la SEQ ID NO:1) que contenía una sustitución de leucina a aspartato (en el residuo 79 en la SEQ ID NO: 1) y una fusión C-terminal del dominio Fc humano con un enlazador mínimo (tres residuos de glicina) (figura 12, SEQ ID NO: 77). La secuencia de la forma purificada de células de ActRIIB(L79D 25-131)-hFc se presenta en la figura 13 (SEQ ID NO: 78). Una secuencia de nucleótidos que codifica esta proteína de fusión se muestra en la figura 15 (SEQ ID NO: 80) junto con su secuencia complementaria (SEQ ID NO: 81), y una secuencia de nucleótidos alternativa que codifica exactamente la misma proteína de fusión se muestra en la figura 16 (SEQ ID NO: 82) y su secuencia complementaria (SEQ ID NO: 83).
Ejemplo 10: Unión selectiva a ligando por trampa de GDF con dominio extracelular de ActRIIB doblemente truncado La afinidad de las trampas de GDF y otras proteínas ActRIIB-hFc por varios ligandos se evaluó in vitro con un instrumento Biacore™. Los resultados se resumen en la tabla a continuación. Los valores de Kd se obtuvieron por ajuste de afinidad en estado estacionario debido a una asociación y disociación muy rápida del complejo, lo que impidió la determinación precisa de la kasociación y la kdisociación.
Selectividad de ligando de las variantes de ActRIIB-hFc:
Figure imgf000091_0001
La trampa de GDF con un dominio extracelular truncado, ActRIIB(L79D 25-131)-hFc, igualó o superó la selectividad de ligando mostrada por la variante más larga, ActRIIB(L79D 20-134)-hFc, con una pérdida pronunciada de la unión a activina A, una pérdida parcial de la unión a activina B y retención casi completa de la unión a GDF11 en comparación con los equivalentes de ActRIIB-hFc que carecen de la sustitución de L79d . Cabe apreciar que el truncamiento en solitario (sin sustitución de L79D) no alteró la selectividad entre los ligandos mostrados aquí [comparar ActRIIB(L79 25-131)-hFc con ActRIIB(L79 20-134)-hFc]. ActRIIB(L79D 25-131)-hFc también conserva una unión de fuerte a intermedia al ligando de señalización de Smad 2/3 GDF8 y los ligandos Smad 1/5/8 BMP6 y BMP10.
Ejemplo 11: Trampa de GDF derivada de ActRIIB5
Otros han informado de una forma soluble alternativa de ActRIIB (denominada ActRIIB5), en la que el exón 4, que incluye el dominio transmembrana de ActRIIB, se ha reemplazado por una secuencia C-terminal diferente (véase, por ejemplo, el documento WO 2007/053775).
La secuencia de ActRIIB5 humana nativa sin su líder es la siguiente:
GRGE AETRECIYYNANWELERTNQ S GLERCEGEQDKRLHC YASWRN S SGTIEL VK
KGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEGPWAST
TIPSGGPEATAAAGDQGSGALWLCLEGPAHE (SEQ ID NO: 50)
Se puede realizar una sustitución de leucina a aspartato, u otras sustituciones ácidas, en la posición nativa 79 (subrayado) como se describe para construir la variante ActRIIB5(L79D), que tiene la siguiente secuencia:
GRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVK
KGCWDDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTFCLPEAGGPEGPWAST
TIPSGGPEATAAAGDQGSGALWLCLEGPAFIE (SEQ ID NO: 51)
Esta variante se puede conectar a Fc humano (doble subrayado) con un enlazador TGGG (subrayado sencillo) para generar una proteína de fusión ActRIIB5(L79D)-hFc humana con la siguiente secuencia:
GRGEAETREC1YYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVK KGC W D DDF N C Y DRQEC V A T E E N PQ V Y F CC C EGN FC N ERFIHLPE AGGPEGP W A ST TÍPSGGPFATAAAGDOGSGAFWFCFFGPAFTFTGGGTHTCPPC PAPFFFGGPSVFF FPPKPKDTI.MTSRTPFVTrVVVDVSHF.DPFVKFNWYVDGVFVHNAKTKPRFF.OYN STYRWSVT.TVT.HODWT.NGKFYKrKVSNKAT.PAPTFKTTSKAKGOPRFPOVYTI.P PSRFF.MTKNOVSFTCFVKGFYPSDTAVF.WF.SNGOPFNNYKTTPPVFDSDGSFFFY SKT.TVDKSRWOOGNVFSCSVMHF.AI.HNHYTOKST.SFSPGK (SEQ ID NO: 52)
Esta construcción puede expresarse en células CHO.
Ejemplo 12: Generación de un heterodímero de ALK4:ActRIIB
Se construyó un complejo heteromérico ALK4-Fc:ActRIIB-Fc que comprendía los dominios extracelulares de ActRIIB humana y ALK4 humana, que se fusionan cada uno por separado a un dominio Fc con un enlazador posicionado entre el dominio extracelular y el dominio Fc. Las construcciones individuales se denominan polipéptido de fusión ActRIIB-Fc y polipéptido de fusión ALK4-Fc, respectivamente, y las secuencias para cada una se proporcionan a continuación. Una metodología para promover la formación de complejos heteroméricos ALK4-Fc:ActRIIB-Fc, a diferencia de los complejos homodiméricos ActRIIB-Fc o ALK4-Fc, es introducir alteraciones en la secuencia de aminoácidos de los dominios Fc para guiar la formación de complejos heteroméricos asimétricos. En esta descripción se describen muchos enfoques diferentes para hacer pares de interacción asimétrica usando dominios Fc.
En un enfoque, ilustrado en las secuencias de polipéptidos ActRIIB-Fc y ALK4-Fc de las SEQ ID NO: 108 y 110 y las SEQ ID NO: 111 y 113, respectivamente, se altera un dominio Fc para introducir aminoácidos catiónicos en la cara de interacción, mientras que el otro dominio Fc se modifica para introducir aminoácidos aniónicos en la cara de interacción. El polipéptido de fusión ActRIIB-Fc y el polipéptido de fusión ALK4-Fc emplean cada uno el líder del activador del plasminógeno tisular (TPA).
La secuencia de polipéptido ActRIIB-Fc (SEQ ID NO: 108) se muestra a continuación:
1 MDAMKRGLCC VLLLCGAVFV SPGASGRGEA ETRECÍYYKA NWELERTNQS 51 GLERCEGEQD KRLHCYASWR NSSGTIELVK KGCWLDDFNC YDRQECVATE
1.01 ENPQVYFCCC EGNFCNERFT HLPEAGGPEV TYEPPPTAPT GGGTHTCPPC
151 PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVWDVSHE DPEVKFNWYV
201 DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRWSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP
251 APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRKEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV
301 EWESNGQPEN NYKTTPPVLK SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH
351 EALHNHYTQK SLSLSPGK {SEQ ID NO: 108 }
La secuencia líder (señal) y el enlazador están subrayados. Para promover la formación de un heterodímero de ALK4-Fc:ActRIIB-Fc en lugar de cualquiera de los posibles complejos homodiméricos, se pueden introducir dos sustituciones de aminoácidos (reemplazando los aminoácidos ácidos por lisina) en el dominio Fc de la proteína de fusión ActRIIB como se indica mediante un doble subrayado anteriormente. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 108 se puede proporcionar opcionalmente con la lisina (K) eliminada del extremo C.
Esta proteína de fusión ActRIIB-Fc se codifica por la siguiente secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 109):
1 ATGGATGCAA TGAAGAGAGG GCTCTGCTGT GTGCTGCTGC TGTGTGGAGC 51 AGTCTTCGTT tcgcc cggcg cctc tgggcg tgg ggaggc t gagacacg gg
101 AGTGCATCTA CTACAACGCC AACTGGGAGC TGGAGCGCAC CAACCAGAGC
151 GGCCTGGAGC GCTGCGAAGG CGAGCAGGAC AAGCGGCTGC ACTGCTACGC
201 CTCCTGGCGC AACAGCTCTG GCACCATCGA GCTCGTGAAG AAGGGCTGCT
251 GGCTAGATGA CTTCAACTGC TACGATAGGC AGGAGTGTGT GGCCACTGAG
301 GAGAACCCCC AGGTGTACTT CTGCTGCTGT GAAGGCAACT TCTGCAACGA
351 GCGCTTCACT CATTTGCCAG AGGCTGGGGG CCCGGAAGTC ACGTACGAGC
401 CACCCCCGAC AGCCCCCACC GGTGGTGGAA CTCACACATG CCCACCGTGC
451 CCAGCACCTG AACTCCTGGG GGGACCGTCA GTCTTCCTCT TCCCCCCAAA
501 ACCCAAGGAC ACCCTCATGA TCTCCCGGAC CCCTGAGGTC ACATGCGTGG
551 TGGTGGACGT GAGCCACGAA GACCCTGAGG TCAAGTTCAA CTGGTACGTG
601 GACGGCGTGG AGGTGCATAA TGCCAAGACA AAGCCGCGGG AGGAGCAGTA
651 CAACAGCACG TACCGTGTGG TCAGCGTCCT CACCGTCCTG CACCAGGACT
701 GGCTGAATGG CAAGGAGTAC AAGTGCAAGG TCTCCAACAA AGCCCTCCCA
751 GCCCCCATCG AGAAAACCAT CTCCAAAGCC AAAGGGCAGC CCCGAGAACC
801 ACAGGTGTAC ACCCTGCCCC CATCCCGGAA GGAGATGACC AAGAACCAGG
851 TCAGCCTGAC CTGCCTGGTC AAAGGCTTCT ATCCCAGCGA CATCGCCGTG
901 GAGTGGGAGA GCAATGGGCA GCCGGAGAAC AACTACAAGA CCACGCCTCC
951 CGTGCTGAAG TCCGACGGCT CCTTCTTCCT CTATAGCAAG CTCACCGTGG
1001 ACAAGAGCAG GTGGCAGCAG GGGAACGTCT TCTCATGCTC CGTGATGCAT
1051 GAGGCTCTGC ACAACCACTA CACGCAGAAG AGCCTCTCCC TGTCTCCGGG
1101 TAAA (SEQ ID NO: 109)
Un polipéptido de fusión ActRIIB-Fc maduro (SEQ ID NO: 110) es de la siguiente manera, y opcionalmente se puede proporcionar con la lisina (K) eliminada del extremo C.
-1 GRGEAETREC IYYNANWELE RTNQSGLERC EGEQDKRLHC YASWRNSSGT
R 1 IELVKKGCWL DDFNCYDRQE CVATEENPQV YFCCCEGNFC NERFTHLPEA
101 GGPEVTYEPP PTAPTGGGTH TCPPCPAPEL LGGPSVFLFP PKPKDTLMIS
113r-iJ, R T P E V T C V W DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE Q Y N S T Y R W S
201 VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS
251 RKEMTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLKSDGSF
301 FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGK
(SEQ ID NO: 110)
Una forma complementaria del polipéptido de fusión ALK4-Fc (SEQ ID NO: 111) es la siguiente:
1 MDAMKRGJXC VLLLCCIAVF'V 3PGA3GPRGV QALLCACT3C LQANYTCETD
51 GñCMVSIFNL DGMEIIHVRTC TPKVELVPAG KPFYCLSSED LRNTHCCYTD
101 YCNRIDLRVP SGHLKEPEHP SMWGPVETGG G THTCPPCPA PELLGGFSVF
151 LFPPKPKDTL MISRTPEVTC W V D V S H E D P EVKFNWYV'DG VEVHNAKTKP
201 REEQYNSTYR W S V L T V L H Q DWLWGKEYKC KV3NKALPAP IEKTI3KAKG
251 QPREPQVYTL PPSREEMTKN QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY
301 DTTPPVLDSD GSFFLYSDLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL
351 3LSPG (SEQ ID NO: 111)
La secuencia líder y el enlazador están subrayados. Para guiar la formación de heterodímeros con el polipéptido de fusión ActRIIB-Fc de las SEQ ID NO: 108 y 110 anteriores, se pueden introducir dos sustituciones de aminoácidos (reemplazando lisinas por ácidos aspártico) en el dominio Fc del polipéptido de fusión ALK4-Fc como se indica por el doble subrayado anteriormente. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 111 se puede proporcionar opcionalmente con la lisina (K) añadida en el extremo C.
Esta proteína de fusión ALK4-Fc se codifica por el siguiente ácido nucleico (SEQ ID NO: 112):
1 ATGGATGCAA TGAAGAGAGG GCTCTGCTGT GTGCTGCTGC TGTGTGGAGC
1 AGTCTTCGTT TCGCCCGGCG CCTCCGGGCC CCGGGGGGTC CAGGCTCTGC
1 TGTGTGCGTG CñCCAGCTGC CTCCAGGCCA ACTACACGTG TGAGACAGAT
1 GGGGCCTGCA TGGTTTCCAT TTTCAATCTG GATGGGATGG AGCACCATGT
1 GCGCACCTGC ATCCCCAAAG TGGAGCTGGT CCCTGCCGGG AAGCCCTTCT
1 ACTGCCTGAG CTCGGAGGAC CTGCGCAACA CCCACTGCTG CTACACTGAC
1 TACTGCAACA GGATCGACTT GAGGGTGCCC AGTGGTCACC TCAAGGAGCC
1 TGAGCACCCG TCCATGTGGG GCCCGGTGGA GACCGGTGGT GGAACTCACA
1 CATGCCCACC GTGCCCAGCA CCTGAACTCC TGGGGGGACC GTCAGTCTTC
1 CTCTTCCCCC CAAAACCCAA GGACACCCTC ATGATCTCCC GGACCCCTGA
1 GGTCACATGC GTGGTGGTGG ACGTGAGCCA CGAAGACCCT GAGGTCAAGT
551 TCAACTGGTA CGTGGACGGC GTGGAGGTGC ATAATGCCAA
GACAAAGCCG
601 CGGGAGGAGC AGTACAACAG CACGTACCGT GTGGTCAGCG
TCCTCACCGT
651 CCTGCACCAG GACTGGCTGA ATGGCAAGGA GTACAAGTGC
AAGGTCTCCA
701 ACAAAGCCCT CCCAGCCCCC ATCGAGAAAA CCATCTCCAA
AGCCAAAGGG
751 CAGCCCCGAG AACCACAGGT GTACACCCTG CCCCCATCCC
GGGAGGAGAT
801 GACCAAGAAC CAGGTCAGCC TGACCTGCCT GGTCAAAGGC
TTCTATCCCA
851 GCGACATCGC CGTGGAGTGG GAGAGCAATG GGCAGCCGGA
GAACAAC TAC
301 GACACCACGC CTCCCGTGCT GGACTCCGAC GGCTCCTTCT
t c c t c t a t a g
951 CGACCTCACC GTGGACAAGA GCAGGTGGCA GCAGGGGAAC
GTCTTCTCAT
1001 GCTCCGTGAT GCATGAGGCT CTGCACAACC ACTACACGCA
GAAGAGCCTC
1051 TCCCTGTCTC CGGGT (SEO ID NO: 112)
Una secuencia de proteína de fusión ALK4-Fc madura (SEQ ID NO: 113) es de la siguiente manera y opcionalmente se puede proporcionar con la lisina (K) añadida en el extremo C.
1 SGPRGVQAI.L CACTSCLQAN YTCETDGACM VSIFNLDGME
HHVRTCIPKV
51 ELVPAGKPFY CLSSEDLRNT HCCYTDYCNR IDLRVPSGHL
KEPEHPSMWG
101 PVETGGGTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR
TPEVTCVWD
151 VSHEDPEVKF MWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRWSV
LTVLHQDWLN
201 GKEYKCKVSN KALPñPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR
EEMTKNQVSL
251 TCLVKGFYPS DIAVEWE3NG QPENNYDTTP PVLDSDGS FF
LYSDLTVDKS
301 RWQQGNVFSC 3VMHEALHNH YTQKSL3LSP G {SEQ ID NO
11 3 )
Las proteínas ActRIIB-Fc y ALK4-Fc de SEQ ID NO: 110 y SEQ ID NO: 113, respectivamente, pueden coexpresarse y purificarse a partir de una línea de células CHO, para dar lugar a un complejo heteromérico que comprende ALK4-Fc:ActRIIB-Fc.
En otro enfoque para promover la formación de complejos heteromultiméricos usando proteínas de fusión Fc asimétricas, los dominios Fc se alteran para introducir interacciones hidrófobas complementarias y un enlace disulfuro intermolecular adicional como se ilustra en las secuencias de polipéptidos ActRIIB-Fc y ALK4-Fc de las SEQ ID NO: 114 y 115 y las SEQ ID NO: 116 y 117, respectivamente. El polipéptido de fusión ActRIIB-Fc y el polipéptido de fusión ALK4-Fc emplean cada uno el líder del activador del plasminógeno tisular (TPA).
La secuencia de polipéptido ActRIIB-Fc (SEQ ID NO: 114) se muestra a continuación:
1 MDAMKRGLCC VLLLCGAVFV SPGASGRGEA ETRECIYYNA
NWELERTNQS
51 GLERCEGEQD KRLHCYASWR NSSGTIELVK KGCWLDDFNC
YDRQECVATE
101 ENPQVYFCCC EGNFCNERFT HLPEAGGPEV TYEPPPTAPT
GGGTHTCPPC
151 PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVWDVSHE
DPEVKFNWYV
201 DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRWSVLTVL HQDWLNGKEY
KCKVSNKALP
251 APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPCREEMT KNQVSLWCLV
KGFYPSDIAV
301 EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ
GNVFSC S VMH
351 EALHNHYTQK SLSLSPGK ( 3EQ ID NO: 114)
La secuencia líder (señal) y el enlazador están subrayados. Para promover la formación del heterodímero de ALK4-Fc:ActRIIB-Fc en lugar de cualquiera de los posibles complejos homodiméricos, se pueden introducir dos sustituciones de aminoácidos (reemplazando una serina por una cisteína y una treonina por un triptófano) en el dominio Fc de la proteína de fusión como se indica por doble subrayado anteriormente. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 114 se puede proporcionar opcionalmente con la lisina (K) eliminada del extremo C.
Un polipéptido de fusión ActRIIB-Fc maduro es el siguiente:
1 GRGEAETREC IYYNANWELE RTNQSGLERC EGEQDKRLHC
YASWRNSSGT
51 IELVKKGCWL DDFNCYDRQE CVATEENPQV YFCCCEGNFC
NERFTHLPEA
101 GGPEVTYEPP PTAPTGGGTH TCPPCPAPEL LGGPSVFLFP
PKPKDTLMIS
151 RTPEVTCWV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE
QYNSTYRWS
201 VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR
EPQVYTLPPC
251 REEMTKNQVS LWCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT
PPVLDSDGSF
301 FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGK
(SEQ ID NO: 115)
Una forma complementaria del polipéptido de fusión ALK4-Fc (SEQ ID NO: 116) es de la siguiente manera y opcionalmente se puede proporcionar con la lisina (K) eliminada del extremo C.
1 MPAMKRGLCC VLLLCGAVFV SPGASGPRGV QALLCACTSC
LQANYTCETD
51 GACMVSIFNL DGMEHHVRTC IPKYSLVPAG KPFYCLSSED
LRNTHCCYTD
101 YCNRIDLRVP SGHLKEPEHP SMWGPVSTGG GTHTCPPCPA
PELLGGPSVF
151 LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VWDVSHEDP EVKFNWYVDG
VEVHNAKTKP
201 REEQYNSTYR WSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKALPAP
IEKTISKAKG
251 QPREPQV£TL PPSREEMTKN QVSL£C£VKG FYPSDIAVEW
ESNGQPENNY
301 KTTPPVLDSD GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VESCSVMHEA
LHNHYTQKSL
351 SLSPGK ¡SEQ ID NO: 115)
La secuencia líder y el enlazador están subrayados. Para guiar la formación de heterodímeros con el polipéptido de fusión ActRIIB-Fc de las SEQ ID NO: 114 y 115 anteriores, se pueden introducir cuatro sustituciones de aminoácidos en el dominio Fc del polipéptido de fusión ALK4 como se indica por el doble subrayado anteriormente. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 116 se puede proporcionar opcionalmente con la lisina (K) eliminada del extremo C. Una secuencia de proteína de fusión ALK4-Fc madura es de la siguiente manera y opcionalmente se puede proporcionar con la lisina (K) eliminada del extremo C.
1 SGPRGVQALL CACTSCLQAN YTCETDGACM VSIFNLDGME
HHVRTCIPKV
51 ELVPAGKPFY CLSSEDLRNT HCCYTDYCNR IDLRVPSGHL
KEPEHPSMWG
101 PVETGGGTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR
TPEVTCVWD
151 VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRWSV
LTVLHQDWLN
201 GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVCTLPPSR
EEMTKNQVSL
251 SCAVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNY'KTTP PVLDSDGSFF
LVSKLTVDKS
301 RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK {SEQ ID NO
117 )
Las proteínas ActRIIB-Fc y ALK4-Fc de SEQ ID NO: 115 y SEQ ID NO: 117, respectivamente, pueden coexpresarse y purificarse a partir de una línea de células CHO, para dar lugar a un complejo heteromérico que comprende ALK4-Fc:ActRIIB-Fc.
La purificación de diversos complejos de ALK4-Fc:ActRIIB-Fc pudo lograrse mediante una serie de etapas de cromatografía en columna, incluyendo, por ejemplo, tres o más de las siguientes, en cualquier orden: cromatografía de proteína A, cromatografía de Q-Sepharose, cromatografía de Phenylsepharose, cromatografía de exclusión por tamaño y cromatografía de intercambio catiónico. La purificación se pudo completar con filtración viral e intercambio de tampón.
En otro enfoque para promover la formación de complejos heteromultiméricos usando proteínas de fusión Fc asimétricas, los dominios Fc se alteran para introducir interacciones hidrófobas complementarias, un enlace disulfuro intermolecular adicional y diferencias electrostáticas entre los dos dominios Fc para facilitar la purificación basada en la carga molecular neta, como se ilustra en las secuencias de polipéptidos ActRIIB-Fc y ALK4-Fc de las SEQ ID NO: 118-121 y 122-125, respectivamente. El polipéptido de fusión ActRIIB-Fc y el polipéptido de fusión ALK4-Fc emplean cada uno el líder del activador del plasminógeno tisular (TPA).
La secuencia de polipéptido ActRIIB-Fc (SEQ ID NO: 118) se muestra a continuación:
1 MDAMKRGLCC VLLLCGAVFV SPGASGRGEA ETRECIYYNA NWELERTNQS
51 GLERCEGEQD KRLHCYASWR NSSGTIELVK KGCWLDDFNC YDRQECVATE
101 ENPQVYFCCC EGNFCWERFT HLPEAGGPEV TYEPPPTAPT GGGTHTCPPC
151 PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCWVDVSHE DPEVKFNWYV
201 DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRWSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP
251 APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPgREEMT ENQVSLWCLV KGFYPSDIAV
301 EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH
351 EALHNHYTQD SLSLSPG (SEQ ID NO: 118)
La secuencia líder y el enlazador están subrayados. Para promover la formación del heterodímero de ALK4-Fc:ActRIIB-Fc en lugar de cualquiera de los posibles complejos homodiméricos, se pueden introducir dos sustituciones de aminoácidos (reemplazando una serina por una cisteína y una treonina por un triptófano) en el dominio Fc de la proteína de fusión como se indica por doble subrayado anteriormente. Para facilitar la purificación del heterodímero de ALK4-Fc:ActRIIB-Fc, también se pueden introducir dos sustituciones de aminoácidos (reemplazando lisinas por aminoácidos ácidos) en el dominio Fc de la proteína de fusión como se indica mediante doble subrayado anteriormente. La secuencia de aminoácidos de s Eq ID NO: 118 se puede proporcionar opcionalmente con una lisina añadida en el extremo C.
Esta proteína de fusión ActRIIB-Fc se codifica por el siguiente ácido nucleico (SEQ ID NO: 119):
1 ATGGATGCAA TGAAGAGAGG GCTCTGCTGT GTGCTGCTGC TGTGTGGAGC
51 AGTCTTCGTT TCGCCCGGCG CCTCTGGGCG TGGGGAGGCT GAGACACGGG
101 AGTGCATCTA CTACAACGCC AACTGGGAGC TGGAGCGCAC CAACCAGAGC
151 GGCCTGGAGC GCTGCGAAGG CGAGCAGGAC AAGCGGCTGC ACTGCTACGC
201 CTCCTGGCGC AACAGCTCTG GCACCATCGA GCTCGTGAAG AAGGGCTGCT
251 GGCTAGATGA CTTCAACTGC TACGATAGGC AGGAGTGTGT GGCCACTGAG
301 GAGAACCCCC AGGTGTACTT CTGCTGCTGT GAAGGCAACT TCTGCAACGA
351 GCGCTTCACT CATTTGCCAG AGGCTGGGGG CCCGGAAGTC ACGTACGAGC
401 CACCCCCGAC AGCCCCCACC GGTGGTGGAA CTCACACATG CCCACCGTGC
451 CCAGCACCTG AACTCCTGGG GGGACCGTCA GTCTTCCTCT TCCCCCCAAA
501 ACCCAAGGAC ACCCTCATGA TCTCCCGGAC CCCTGAGGTC ACATGCGTGG
551 TGGTGGACGT GAGCCACGAA GACCCTGAGG TCAAGTTCAA CTGGTACGTG
601 GACGGCGTGG AGGTGCATAA TGCCAAGACA AAGCCGCGGG AGGAGCAGTA
651 CAACAGCACG TACCGTGTGG TCAGCGTCCT CACCGTCCTG CACCAGGACT
701 GGCTGAATGG CAAGGAGTAC AAGTGCAAGG TCTCCAACAA AGCCCTCCCA
751 GCCCCCATCG AGAAAACCAT CTCCAAAGCC AAAGGGCAGC CCCGAGAACC
801 ACAGGTGTAC ACCCTGCCCC CATGCCGGGA GGAGATGACC GAGAACCAGG
851 TCAGCCTGTG GTGCCTGGTC AAAGGCTTCT ATCCCAGCGA CATCGCCGTG
901 GAGTGGGAGA GCAATGGGCA GCCGGAGAAC AACTACAAGA CCACGCCTCC
951 CGTGCTGGAC TCCGACGGCT CCTTCTTCCT CTATAGCAAG CTCACCGTGG
1001 ACAAGAGCAG GTGGCAGCAG GGGAACGTCT TCTCATGCTC CGTGATGCAT
1051 GAGGCTCTGC ACAACCACTA CACGCAGGAC AGCCTCTCCC TGTCTCCGGG
1101 T (SEQ ID NO: 119)
El polipéptido de fusión ActRIIB-Fc maduro es el siguiente (SEQ ID NO: 120) y opcionalmente se puede proporcionar con una lisina añadida al extremo C.
1 GRGEAETREC IYYNANWELE RTNQSGLERC EGEQDKRLHC YASWRNSSGT
51 IELVKKGCWL DDFNCYDRQE CVATEENPQV YFCCCEGNFC NERFTHLPEA
101 GGPEVTYEPP PTAPTGGGTH TCPPCPAPEL LGGPSVFLFP PKPKDTLMIS
151 RTPEVTCVW DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRWS
201 VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPC
251 REEMTENQVS LWCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF
301 FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQDSLSLS PG
{SEQ ID NO: 120)
Este polipéptido de fusión ActRIIB-Fc se codifica por el siguiente ácido nucleico (SEQ ID NO: 121):
1 GGGCGTGGGG AGGCTGAGAC ACGGGAGTGC ATCTACTACA ACGCCAACTG
51 GGAGCTGGAG CGCACCAACC AGAGCGGCCT GGAGCGCTGC GAAGGCGAGC
101 AGGACAAGCG GCTGCACTGC TACGCCTCCT GGCGCAACAG CTCTGGCACC
151 ATCGAGCTCG TGAAGAAGGG CTGCTGGCTA GATGACTTCA ACTGCTACGA
201 TAGGCAGGAG TGTGTGGCCA CTGAGGAGAA CCCCCAGGTG TACTTCTGCT
251 GCTGTGAAGG CAACTTCTGC AACGAGCGCT TCACTCATTT GCCAGAGGCT
301 GGGGGCCCGG AAGTCACGTA CGAGCCACCC CCGACAGCCC CCACCGGTGG
351 TGGAACTCAC ACATGCCCAC CGTGCCCAGC ACCTGAACTC CTGGGGGGAC
401 CGTCAGTCTT CCTCTTCCCC CCAAAACCCA AGGACACCCT CATGATCTCC
451 CGGACCCCTG AGGTCACATG CGTGGTGGTG GACGTGAGCC ACGAAGACCC 501 tg ag g tc aag tt c a a c t g g t acg tg g acgg cgtggaggtg c a t a a t g c c a
551 AC-ACAAAGCC C-CGGGAGGAG CAGTACAACA GCACGTACCG TGTGGTCAGC
601 GTCCTCACCG TCCTGCACCA GGACTGGCTG AATGGCAAGG AGTACAAGTG
651 CAAGGTCTCC AACAAAGCCC TCCCAGCCCC CATCGAGAAA ACCATCTCCA
701 AAGCCAAAGG GCAGCCCCGA GAACCACAGG TGTACACCCT GCCCCCATGC
751 CGGGAGGAGA TGACCGAGAA CCAGGTCAGC CTGTGGTGCC TGGTCAAAGG
801 CTTCTATCCC AGCGACATCG CCGTGGAGTG GGAGAGCAAT GGGCAGCCGG
851 AGAACAACTA CAAGACCACG CCTCCCGTGC TGGACTCCGA CGGCTCCTTC
901 TTCCTCTATA GCAAGCTCAC CGTGGACAAG AGCAGGTGGC AGCAGGGGAA
951 CGTCTTCTCA TGCTCCGTGA TGCATGAGGC TCTGCACAAC CACTACACGC
1001 AGGACAGCCT CTCCCTGTCT CCGGGT (SEQ ID NO: 121)
La forma complementaria del polipéptido de fusión ALK4-Fc (SEQ ID NO: 122) es de la siguiente manera y opcionalmente puede proporcionarse con la lisina eliminada del extremo C.
1 MDAMKRGLCC VLLLCGAVFV SPGASGPRGV QALLCACTSC LQANYTCETD
51 GACMVSIFNL DGMEHHVRTC IPKVELVPAG KPFYCLSSED LRNTHCCYTD
101 YCNRIDLRVP SGHLKEPEHP SMWGPVETGG GTHTCPPCPA PELLGGPSVF
151 LFPPKPKDTL MISRTPEVTC WVDVSHEDP EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP
201 REEQYNSTYR WSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKALPAP IEKTISKAKG
251 QPREPQV£TL PPSREEMTKN QVSL£CAVKG FYPSDIAVEW ESRGQPENNY
301 KTTPPVLDSE GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL
351 SLSPGK (SEQ ID NO: 122}
La secuencia líder y el enlazador están subrayados. Para guiar la formación de heterodímeros con el polipéptido de fusión ActRIIB-Fc de las SEQ ID NO: 118 y 120 anteriores, pueden introducirse cuatro sustituciones de aminoácidos (reemplazando una tirosina por una cisteína, una treonina por una serina, una leucina por una alanina y una tirosina por una valina) en el dominio Fc del polipéptido de fusión ALK4 como se indica por el doble subrayado anteriormente. Para facilitar la purificación del heterodímero de ALK4-Fc:ActRIIB-Fc, también se pueden introducir dos sustituciones de aminoácidos (reemplazando una asparagina por una arginina y un aspartato por una arginina) en el dominio Fc del polipéptido de fusión ALK4-Fc como se indica por el doble subrayado anteriormente. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 122 se puede proporcionar opcionalmente con la lisina eliminada del extremo C.
Este polipéptido de fusión ALK4-Fc se codifica por el siguiente ácido nucleico (SEQ ID NO: 123):
1 ATGGATGCAA TGAAXAGA33G GCTCTGCTGT GTGCTGCTGC TGTGTGGAGC
51 AGTCTTCGTT TCGCCCGGCG CCTCCGGGCC CCGGGGGGTC CAGGCTCTGC
101 TGTGTGCGTG CACCAGCTGC CTCCACGCCA ACTACACGTG TGAGACAGAT
151 GGGGGGTGCA TGGTTTCCAT TTTCAATCTG GATGGGATGG AGCACCATGT
201 GCGCACCTGC ATCCCCAAAG TGGAGCTGGT CCC1GCCGGG AAGCCCTTCT
251 ACTGCCTGAG CTCGGAGGAC CTGCGCAACA CCCACTGCTG CTACACTGAC
301 TAC TG CAACA GGATCGA.CTT GAGGG1GCCC AGTGGTCACC TCAAGGAGCC
351 TGAGCACCCG TCCATGTGGG GCCCGGTGGA GACCGGTGGT GGAACTCACA
401 CATGCCCACC GTGCCCAGCA CCTGAACTCC TGGGGGGACC GTCAGTCTTC
451 CTCTTCCCCC CAAAACCCAA GGACACCCTC ATGATCTCCC GGACCCCTGA
501 GGTCACATGC kj 1 ü ü i n n i L j 'o
Figure imgf000105_0001
CGAAGACCCT GAGGTCAAGT
551 TCAACTGGTA CGTGGACGGC GTGGAGGTGC ATAATGCCAA GACAAAGCCG
601
Figure imgf000105_0002
AGTACAACAG CACGTACCGT GTGGTCAGCG TCCTCACCGT
651 CCTGCACCAG GACTGGCTGA A.T GGCAAGG A GTACAAGTGC AAGGTCTCCA
701 ACAAAGCCCT CCCAGCCCCC ATCGAGAAAA CCATCTCCAA AGCCAAAGGG
751 CAGCCCCGAG AACCACAGGT GTGCACCCTG CCCCCATCCC GGGAGGAGAT
801 GACCAAGAAC CAGGTCAGCC TGTCCTGCGC CGTCAAAGGC t t c t a t c c c a
851 GCGACATCGC CGTGGAGTGG GAGAGCCGCG GGCAGCCGGA GAACAACTAC
901 AAGACCA2GGC CTCCCGTGCT GGACTCCCGC GGCTCCTTCT TCCTCGTGAG
951 CAAGCTCACC GTGGACAAGA GCAGGTGGCA GCAGGGGAAC GTCTTCTCAT
1001 GCTCCGTGA.T GCA.T GAGGCT C T G CACAACC ACTACACGCA GAAGAGCCTC
1051 TCCCTGTCTC c g g g taaa (SEQ ID NO: 123)
La secuencia del polipéptido de fusión ALK4-Fc maduro es la siguiente (SEQ ID NO: 124) y opcionalmente se puede proporcionar con la lisina eliminada del extremo C.
1 SGPRGVQñLL CACTSCLQAN YTCETDGACM VSIFNLDGME HHVRTCIPKV
51 ELVPAGKPFY CLSSEDLRNT HCCYTDYCNR IDLRVPSGHL KEPEHPSMWG
101 PVETGGGTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVWD
151 VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRWSV LTVLHQDWLN
201 GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVCTLPPSR EEMTKNQVSL
251 SCAVKGFYPS DIAVEWESRG QPENNYKTTP PVLDSRGSFF LVSKLTVDKS
301 RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK (SEQ ID NO: 124)
Este polipéptido de fusión ALK4-Fc se codifica por el siguiente ácido nucleico (SEQ ID NO: 125):
1 rn f'-* /'n x"'' x"1 1'-"'1 f ’'* f~~* f ’'*
i c L u u u L l - ' - u GGGGGGTCCA GGCTCTGCTG
Figure imgf000106_0001
51 CCAGGCCAAC TACACGTGTG AGACAGATGG GGCCTGCATG GTTTCCATTT
101 TCAATCTGGA TGGGATGGAG CACCATGTGC GCACCTGCAT CCCCAAAGTG
151 GAGCTGGTCC CTGCCGGGAA GCCCTTCTAC TGCCTGAGCT CGGA.GGfi.CCT
2 01 GCGCAACACC CACTGCTGCT ACACTGACTA CTGCAACAGG ATCGACTTGA
251 GGGTGCCCAG TGGTCACCTC AAGGAGCCTG AGCACCCGTC CATGTGGGGC
301 CCGGTGGAGA r * o-1 /-< r * rn t-« /-h -T! /-■ {-*
1 '- a Q j x AACTCACACA TGCCCACCGT GCCCAGCACC
351 TGAACTCCTG GGGGGACCGT CAGTCTTCCT
Figure imgf000106_0002
AAACCCAAGG
401 ACACCCTCAT GATCTCCCGG fi.CCCCTGA.GG TCACATGCGT GGTGGTGGAC
451 GTGAGCCACG AAGACCCTGA GGTCAAGTTC AACTGGTACG TGGACGGCGT
501 GGAGGTGCAT AATGCCAAGA CAAAGCCGCG GGAGGAGCAG TACAACAGCA
551 CGTACCGTGT GGTCAGCGTC CTCACCGTCC TGCACCAGGA CTGGCTGAAT
601 GGCAAGGAGT ACAAGTGCAA GGTCTCCAAC AAAGCCCTCC CAGCCCCCAT
651 CGAGAAAACC ATCTCCAAAG CCAAAGGGCA GCCCCGAGAA CCACAGGTGT
701
Figure imgf000106_0003
CCCATCCCGG GAGGAGATGA CCAAGAACCA GGTCAGCCTG
751 TCCTGCGCCG TCAAAGGCTT CTATCCCAGC GACATCGCCG TGGAGTGGGA
801 GAGCCGCGGG CAGCCGGAGA ACAACTACAA GACCACGCCT CCCGTGCTGG
851 ACTCCCGCGG CTCCTTCTTC c tc g tg a g c a AGCTCACCGT GGACAAGAGC
SOI
Figure imgf000106_0004
AGGGGAACG'i' CTTCTCATGC TCCGTGATGC ATGAGGCTCT
951 GCACAACCAC TACACGCAGA AGAGCCTCTC CCTGTCTCCG GGTAAA
(SEQ ID NO : 125)
Las proteínas ActRIIB-Fc y ALK4-Fc de SEQ ID NO: 120 y SEQ ID NO: 124, respectivamente, pueden coexpresarse y purificarse a partir de una línea de células CHO, para dar lugar a un complejo heteromérico que comprende ALK4-Fc:ActRIIB-Fc.
La purificación de diversos complejos de ALK4-Fc:ActRIIB-Fc pudo lograrse mediante una serie de etapas de cromatografía en columna, incluyendo, por ejemplo, tres o más de las siguientes, en cualquier orden: cromatografía de proteína A, cromatografía de Q-Sepharose, cromatografía de Phenylsepharose, cromatografía de exclusión por tamaño, cromatografía de intercambio catiónico, cromatografía de afinidad basada en epítopos (por ejemplo, con un anticuerpo o ligando funcionalmente equivalente dirigido contra un epítopo en ALK4 o ActRIIB) y cromatografía multimodal (por ejemplo, con resina que contiene ligandos electrostáticos e hidrófobos). La purificación se pudo completar con filtración viral e intercambio de tampón.
Ejemplo 13. Perfil de unión a ligando del heterodímero de ALK4-Fc:ActRIIB-Fc en comparación con el homodímero de ActRIIB-Fc y el homodímero de ALK4-Fc
Se usó un ensayo de unión basado en Biacore™ para comparar la selectividad de unión a ligando del complejo heterodimérico de ALK4-Fc:ActRIIB-Fc descrito anteriormente con la de los complejos homodiméricos de ActRIIB-Fc y ALK4-Fc. El heterodímero de ALK4-Fc:ActRIIB-Fc, el homodímero de ActRIIB-Fc y el homodímero de ALK4-Fc se capturaron independientemente en el sistema usando un anticuerpo anti-Fc. Se inyectaron ligandos y se dejaron fluir sobre la proteína receptora capturada. Los resultados se resumen en la tabla siguiente, en la que las tasas de disociación (kd) de ligandos más indicativas de trampas de ligandos eficaces se indican con sombreado en gris.
Figure imgf000107_0001
Estos datos de unión comparativos demuestran que el heterodímero de ALK4-Fc:ActRIIB-Fc tiene un perfil de unión/selectividad alterados en relación con los homodímeros de ActRIIB-Fc o ALK4-Fc. El heterodímero de ALK4-Fc:ActRIIB-Fc muestra una unión mejorada a la activina B en comparación con cualquier homodímero, conserva una unión fuerte a la activina A, GDF8 y GDF11 como se observa con el homodímero de ActRIIB-Fc, y exhibe una unión sustancialmente reducida a BMP9, BMP10 y GDF3. En particular, BMP9 muestra una afinidad baja o nula por el heterodímero de ALK4-Fc:ActRIIB-Fc, mientras que este ligando se une fuertemente al homodímero de ActRIIB-Fc. Al igual que el homodímero de ActRIIB-Fc, el heterodímero conserva la unión de nivel intermedio a BMP6. Véase la figura 19.
Además, se usó un ensayo del gen indicador A-204 para evaluar los efectos del heterodímero de ALK4-Fc:ActRIIB-Fc y el homodímero de ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc en la señalización por la activina A, activina B, GDF11, GDF8, BMP10 y BMP9. Línea celular: Rabdomiosarcoma humano (derivado de músculo). Vector indicador: pGL3(CAGA)12 (como se describe en Dennler y col., 1998, EMBO 17: 3091-3100). El motivo CAGA12 está presente en genes que responden a TGFp (gen PAI-1), por lo que este vector es de uso general para factores de señalización a través de Smad2 y 3. A continuación se describe un ensayo del gen indicador A-204 de ejemplo.
Día 1: Dividir las células A-204 en una placa de 48 pocillos.
Día 2: Células A-204 transfectadas con 10 ug de pGL3(CAGA)12 o pGL3(CAGA)12 (10 ug) pRLCMV (1 ug) y Fugene.
Día 3: Añadir factores (diluidos en medio BSA al 0,1 %). Los inhibidores deben preincubarse con Factores durante una hora antes de añadirlos a las células. Aproximadamente seis horas más tarde, las células se aclaran con PBS y a continuación se lisan.
Después de las etapas anteriores, se realizó un ensayo de luciferasa.
Se determinó que tanto el heterodímero de ALK4-Fc:ActRIIB-Fc como el homodímero de ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc eran potentes inhibidores de la activina A, activina B, GDF11 y GDF8 en este ensayo. En particular, como se puede ver en los datos comparativos de CIso de homodímero/heterodímero ilustrados en la figura 19, el heterodímero de ALK4-Fc:ActRIIB-Fc inhibe las vías de señalización de activina A, activina B, GDF8 y GDF11 de manera similar al homodímero de ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc. Sin embargo, la inhibición del heterodímero de ALK4-Fc:ActRIIB-Fc de las vías de señalización de BMP9 y BMP10 se reduce significativamente en comparación con el homodímero de ActRIIBFc:ActRIIB-Fc. Estos datos son consistentes con los datos de unión analizados anteriormente en los que se observó que tanto el heterodímero de ALK4-Fc:ActRIIB-Fc como el homodímero de ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc muestran una fuerte unión a activina A, activina B, GDF8 y GDF11, pero BMP10 y BMP9 tienen una afinidad significativamente reducida por el heterodímero de ALK4-Fc:ActRIIB-Fc en comparación con el homodímero de ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc.
En conjunto, estos datos demuestran, por lo tanto, que el heterodímero de ALK4-Fc:ActRIIB-Fc es un antagonista más selectivo de activina A, activina B, GDF8 y GDF11 en comparación con el homodímero de ActRIIB-Fc. Por consiguiente, un heterodímero de ALK4-Fc:ActRIIB-Fc será más útil que un homodímero de ActRIIB-Fc en determinadas aplicaciones donde dicho antagonismo selectivo sea ventajoso. Los ejemplos incluyen aplicaciones terapéuticas donde es deseable conservar el antagonismo de uno o más de activina A, activina B, activina AC, GDF8 y GDF11 pero minimizar el antagonismo de uno o más de BMP9, BMP10, GDF3 y BMP6.
Ejemplo 14: Efectos de un polipéptido ActRII y heterodímero de ALK4:ActRIIB sobre la hipertensión pulmonar en un modelo de rata con monocrotalina
Los efectos de una proteína de fusión ActRIIA-mFc (homodímero de ActRIIA-mFc como se describe en el Ejemplo 1), un heterodímero de ALK4-Fc-ActRIIB-Fc (como se describe en los Ejemplos 12 y 13) y sildenafilo (un inhibidor de fosfodiesterasa-5 aprobado para el tratamiento de la HAP) se examinaron en un modelo de rata de hipertensión arterial pulmonar (HAP). En este modelo, las ratas Sprague Dawley recibieron una inyección subcutánea de monocrotalina (MCT) para inducir la HAP 24 horas antes del inicio de la terapia.
Las ratas se separaron en diferentes grupos de tratamiento (10 ratones por grupo): 1) tratamiento con MCT (60 mg/kg administrados i.p. como una dosis única el día 1 del estudio) y solución salina tamponada con Tris (i.p. a 1 ml/kg, cada tres días) (grupo de tratamiento con vehículo), 2) tratamiento con un polipéptido ActRIIA-mFc (10 mg/kg administrados i.p. cada tres días) y MCT (60 mg/kg administrados i.p. como dosis única el día 1 del estudio), 3) tratamiento con un heterodímero de ALK4-Fc:ActRIIB-Fc (10 mg/kg administrados i.p. cada tres días) y MCT (60 mg/kg administrados i.p. como dosis única el día 1 del estudio), 4) tratamiento con sildenafilo (30 mg/kg administrados por vía oral dos veces al día) y MCT (60 mg/kg administrados i.p. como una dosis única el día 1 del estudio), y 5) ratas de control (solución salina tamponada con Tris administrada i.p. a 1 ml/kg, cada tres días). Las ratas se trataron durante 28 días. El peso corporal se registró antes de la primera dosis el día 1 y a continuación semanalmente durante todo el estudio.
El día 28, las ratas se anestesiaron mediante una inyección intraperitoneal de ketamina/xilazina (80/10 mg/kg). Se hizo una incisión en el cuello y se aisló una vena yugular y se ligó anteriormente. Se introdujo un catéter de presión lleno de líquido en la vena yugular derecha para medir la presión arterial pulmonar (PAP). Se hizo otra incisión en la región inguinal, se aisló la arteria femoral y se ligó anteriormente. Se introdujo un catéter de presión Millar en una arteria femoral para medir la presión arterial sistólica, la presión diastólica y la frecuencia cardíaca. La presión arterial media y la PAP derecha se controlaron utilizando el sistema de captura de datos Notocord HEM (Croissy sur Seine, Francia) v3.5 durante aproximadamente 5-10 minutos hasta que se obtuvieron mediciones estables. Durante las mediciones, las ratas se mantuvieron a aproximadamente 37 °C sobre una almohadilla térmica y se controló la temperatura corporal durante todo el procedimiento con una sonda de temperatura rectal. Al final del procedimiento, se sacrificó a las ratas y se extrajeron los corazones y los pulmones. Se pesó todo el corazón. A continuación, se extrajeron las aurículas y se separó el ventrículo izquierdo con tabique (VI S) del ventrículo derecho (VD). Los ventrículos se pesaron por separado. La hipertrofia se evaluó, en parte, calculando VD/VI S. También se pesaron los pulmones.
En comparación con los animales de control, se observó que las ratas tratadas con monocrotalina (grupo de tratamiento con vehículo) tenían un peso corporal reducido, una PAP elevada, hipertrofia cardíaca derecha y un peso pulmonar aumentado, lo que indica el establecimiento de HAP. Las ratas tratadas con sildenafilo no mejoraron el peso corporal en comparación con las ratas tratadas con monocrotalina. Sin embargo, el tratamiento con sildenafilo redujo la PAP elevada en un 30 %, disminuyó la hipertrofia cardíaca derecha en un 18,5 % y disminuyó el peso pulmonar en un 10 % en comparación con las ratas tratadas con monocrotalina. Sorprendentemente, se encontró que tanto ALK4-Fc:ActRIIB-Fc como ActRIIA-mFc tienen efectos significativamente mayores en el tratamiento de la HAP en este modelo en comparación con el sildenafilo. Por ejemplo, el tratamiento con ALK4-Fc:ActRIIB-Fc dio como resultado una mejora del peso corporal (+5,1 %), redujo la PAP elevada en un 44,6 %, disminuyó la hipertrofia cardíaca derecha en un 39,6 % y disminuyó el peso pulmonar en un 19,0 %. Si bien el tratamiento con ActRIIA-mFc no mostró una mejora del peso corporal, tuvo efectos significativos en el tratamiento de otras complicaciones de la HAP. Por ejemplo, el tratamiento con ActRIIA-Fc dio como resultado una reducción de la PAP elevada en un 68 %, una disminución de la hipertrofia cardíaca derecha en un 47,1 % y una disminución del peso pulmonar en un 18,4 %.
Se observaron tendencias similares en la musculatura de los vasos basándose en la puntuación histopatológica. Después de teñir muestras de tejido para detectar aSMA/elastina, 100 arteriolas pulmonares, de entre 10 |jm y 50 |jm de tamaño, por animal se clasificaron como no muscularizadas, parcialmente muscularizadas o completamente muscularizadas. Se determinó que las arteriolas pulmonares de ratas tratadas con vehículo estaban un 62,3 % completamente muscularizadas, un 36,4 % parcialmente muscularizadas y un 1,4 % no muscularizadas. El tratamiento con sildenafilo tuvo solo un efecto modesto en la disminución de la musculatura de los vasos (por ejemplo, las arteriolas pulmonares estaban un 57,9 % completamente muscularizadas, un 41,6 % parcialmente muscularizadas y un 0,9 % no muscularizadas). Por el contrario, el tratamiento con ActRIIA-mFc dio como resultado una disminución significativa de la musculatura de los vasos en comparación con los animales tratados con sildenafilo (por ejemplo, las arteriolas pulmonares estaban un 25,8 % completamente muscularizadas, un 66,9 % parcialmente muscularizadas y un 7,3 % no muscularizadas en comparación con los animales tratados con vehículo). La puntuación histopatológica de la hipertrofia del músculo liso de las arteriolas pulmonares también se registró de la siguiente manera: 0 (normal), 1 (mínima), 2 (leve), 3 (moderada) o 4 (marcada). Las ratas tratadas con vehículo tenían una hipertrofia del músculo liso promedio de moderada a marcada (puntuación de 3,8). De nuevo, se observó que el tratamiento con sildenafilo tiene un efecto modesto sobre la hipertrofia con una puntuación promedio de 3 (moderada). Aunque se observó que los animales tratados con ActRIIA-mFc tenían una reducción significativa en la hipertrofia del músculo liso (puntuación media de 1,6) en comparación con los animales tratados con vehículo y con sildenafilo. En general, el tratamiento con ActRIIA-mFc redujo significativamente la musculatura y la hipertrofia de los vasos en este modelo de HAP.
En conjunto, estos datos demuestran que tanto ActRIIA-mFc como ALK4-Fc:ActRIIB-Fc son eficaces para mejorar diversas complicaciones de la HAP en este modelo inducido por monocrotalina. En particular, tanto ActRIIA-mFc como ALK4-Fc:ActRIIB-Fc tuvieron un efecto mayor en la reducción de la presión arterial, la hipertrofia cardíaca derecha y la muscularización vascular que el observado para el sildenafilo, que es un fármaco aprobado para el tratamiento de la HAP. Además, los datos indican que otros antagonistas de GDF/BMP, en particular los que tienen actividades similares a ActRIIA-mFc y ALK4-Fc:ActRIIB-Fc, pueden ser útiles en el tratamiento de la HAP, en particular en la prevención o la reducción de la gravedad de diversas complicaciones de la HAP.
Ejemplo 15: Efectos de un polipéptido ActRII y un heterodímero de ALK4:ActRIIB sobre la hipertensión pulmonar en el modelo de rata con hipoxia de Sugen
Los efectos de una proteína de fusión ActRIIA-mFc (homodímero de ActRIIA-mFc como se ha descrito en el Ejemplo 1 y sildenafilo (un inhibidor de la fosfodiesterasa-5 aprobado para el tratamiento de HAP) se examinaron adicionalmente en el modelo de hipoxia de Sugen de HAP. En este modelo, las ratas reciben dosis diarias de semaxanib y se colocan en un ambiente con poco oxígeno (aproximadamente un 13 % de oxígeno) para inducir la HAP 24 horas antes del inicio de la terapia.
Las ratas se separaron en diferentes grupos de tratamiento (10 ratones por grupo): 1) tratamiento con semaxanib (200 mg/kg administrados s.c. como una dosis única diaria)/hipoxia y solución salina tamponada con Tris (administrada i.p. a 1 ml/kg, cada tres días) (grupo de tratamiento con vehículo), 2) tratamiento con un polipéptido ActRIIA-mFc (10 mg/kg administrados i.p. cada tres días) y semaxanib (200 mg/kg administrados s.c. como dosis única diaria)/hipoxia, 3) tratamiento con sildenafilo (30 mg/kg administrados por vía oral dos veces al día) y semaxanib (200 mg/kg administrados s.c. como una dosis única diaria)/hipoxia, y 4) ratas de control (solución salina tamponada con Tris administrada i.p. a 1 ml/kg, cada tres días). Las ratas se trataron durante 28 días. El peso corporal se registró antes de la primera dosis el día 1 y a continuación semanalmente durante todo el estudio.
El día 28, las ratas se anestesiaron mediante una inyección intraperitoneal de ketamina/xilazina (80/10 mg/kg). Se hizo una incisión en el cuello y se aisló una vena yugular y se ligó anteriormente. Se introdujo un catéter de presión lleno de líquido en la vena yugular derecha para medir la presión arterial pulmonar (PAP). Se hizo otra incisión en la región inguinal, se aisló la arteria femoral y se ligó anteriormente. Se introdujo un catéter de presión Millar en una arteria femoral para medir la presión arterial sistólica, la presión diastólica y la frecuencia cardíaca. La presión arterial media y la PAP derecha se controlaron utilizando el sistema de captura de datos Notocord HEM (Croissy sur Seine, Francia) v3.5 durante aproximadamente 5-10 minutos hasta que se obtuvieron mediciones estables. Durante las mediciones, las ratas se mantuvieron a aproximadamente 37 °C sobre una almohadilla térmica y se controló la temperatura corporal durante todo el procedimiento con una sonda de temperatura rectal. Al final del procedimiento, se sacrificó a las ratas y se extrajeron los corazones y los pulmones. Se pesó todo el corazón. A continuación, se extrajeron las aurículas y se separó el ventrículo izquierdo con tabique (VI S) del ventrículo derecho (VD). Los ventrículos se pesaron por separado. La hipertrofia se evaluó, en parte, calculando VD/VI S. También se pesaron los pulmones.
En comparación con los animales de control, se observó que las ratas tratadas con semaxanib/hipoxia (grupo de tratamiento con vehículo) tenían un peso corporal reducido, una PAP elevada, hipertrofia cardíaca derecha y un peso pulmonar aumentado, lo que indica el establecimiento de HAP. El tratamiento con sildenafilo redujo la presión arterial pulmonar media en un 22,4 % y disminuyó la hipertrofia cardíaca derecha en un 10 % en comparación con los animales tratados con vehículo. De nuevo, se encontró que el tratamiento con ActRIIA-mFc tiene efectos significativamente mayores en el tratamiento de la HAP en este modelo en comparación con el sildenafilo. Por ejemplo, el tratamiento con ActRIIA-mFc dio como resultado una reducción de la presión arterial pulmonar media en un 51,3 % y una disminución de la hipertrofia cardíaca derecha en un 53,5 % en comparación con los animales tratados con vehículo.
Se observaron tendencias similares en la musculatura de los vasos basándose en la puntuación histopatológica. Después de teñir muestras de tejido para detectar aSMA/elastina, 100 arteriolas pulmonares, de entre 10 pm y 50 pm de tamaño, por animal se clasificaron como no muscularizadas, parcialmente muscularizadas o completamente muscularizadas. Se determinó que las arteriolas pulmonares de ratas tratadas con vehículo estaban un 72,5 % completamente muscularizadas, un 27,4 % parcialmente muscularizadas y un 0,1 % no muscularizadas. El tratamiento con sildenafilo tuvo solo un efecto modesto en la disminución de la musculatura de los vasos (por ejemplo, las arteriolas pulmonares estaban un 67,4 % completamente muscularizadas, un 31,6 % parcialmente muscularizadas y un 1,0 % no muscularizadas) en comparación con los animales tratados con vehículo. Por el contrario, el tratamiento con ActRIIA-mFc dio como resultado una disminución significativa de la musculatura de los vasos en comparación con los animales tratados con sildenafilo (por ejemplo, las arteriolas pulmonares estaban un 29,3 % completamente muscularizadas, un 69,3 % parcialmente muscularizadas y un 1,4 % no muscularizadas en comparación con los animales tratados con vehículo). La puntuación histopatológica de la hipertrofia del músculo liso de las arteriolas pulmonares también se registró de la siguiente manera: 0 (normal), 1 (mínima), 2 (leve), 3 (moderada) o 4 (marcada). Las ratas tratadas con vehículo tenían una hipertrofia del músculo liso promedio de moderada a marcada (puntuación de 3,6). De nuevo, se observó que el tratamiento con sildenafilo tiene un efecto modesto sobre la hipertrofia con una puntuación promedio de 3 (moderada). Aunque se observó que los animales tratados con ActRIIA-mFc tenían una reducción significativa en la hipertrofia del músculo liso (puntuación media de 1,4) en comparación con los animales tratados con sildenafilo. En general, el tratamiento con ActRIIA-mFc redujo significativamente la musculatura y la hipertrofia de los vasos en este modelo de HAP.
Juntos, estos datos demuestran que ActRIIA-mFc es eficaz para mejorar diversas complicaciones de la HAP en el modelo de hipoxia de Sugen. En particular, ActRIIA-mFc tuvo un efecto mayor en la reducción de la presión arterial, la hipertrofia cardíaca derecha y la muscularización de los vasos que el observado para el sildenafilo, que es un fármaco aprobado para el tratamiento de la HAP.Además, los datos indican que otros antagonistas de GDF/BMP, en particular los que tienen actividades similares a ActRIIA-mFc, pueden ser útiles en el tratamiento de la HAP, particularmente en la prevención o la reducción de la gravedad de diversas complicaciones de la HAP.

Claims (24)

REIVINDICACIONES
1. Una composición para su uso en el tratamiento de la hipertensión arterial pulmonar, donde la composición comprende un polipéptido ActRIIA que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32.
2. Una composición para su uso en el tratamiento de la hipertensión arterial pulmonar, donde la composición comprende un polipéptido ActRIIA que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 39.
3. La composición para su uso en la reivindicación 1 o la reivindicación 2, donde el paciente tiene una presión arterial pulmonar (PAP) en reposo de al menos 25 mm Hg.
4. La composición para su uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde el tratamiento reduce la PAP en el paciente; disminuye la hipertrofia ventricular en el paciente; disminuye la hipertrofia del músculo liso en el paciente; disminuye la musculatura de las arteriolas pulmonares en el paciente; disminuye la resistencia vascular pulmonar en el paciente; reduce la resistencia vascular pulmonar en el paciente; aumenta la presión de enclavamiento capilar pulmonar; aumenta la presión telediastólica del ventrículo izquierdo; aumenta la capacidad de ejercicio del paciente; aumenta la distancia de caminata de 6 minutos del paciente; y/o reduce el índice de disnea de Borg (BDI) del paciente.
5. La composición para su uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde el paciente tiene hipertensión pulmonar de Clase funcional II o Clase funcional III según lo reconocido por la Organización Mundial de la Salud.
6. La composición para su uso de la reivindicación 5, donde el tratamiento previene o retrasa la progresión de la Clase funcional de la hipertensión pulmonar.
7. La composición para su uso de la reivindicación 5 o 6, donde el tratamiento promueve o aumenta la regresión de la Clase funcional de la hipertensión pulmonar.
8. La composición para su uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, donde el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 85 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32.
9. La composición para su uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, donde el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32.
10. La composición para su uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, donde el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32.
11. La composición para su uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3-10, donde el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32.
12. La composición para su uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3-11, donde el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32.
13. La composición para su uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3-12, donde el polipéptido consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32.
14. La composición para su uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, donde el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 85 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 39.
15. La composición para su uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-7 o 14, donde el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 39.
16. La composición para su uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, 14 o 15, donde el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 39.
17. La composición para su uso de cualquiera de las reivindicaciones 2-7 o 14-16, donde el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 39.
18. La composición para su uso de cualquiera de las reivindicaciones 2-7 o 14-17, donde el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 39.
19. La composición para su uso de cualquiera de las reivindicaciones 2-7 o 14-18, donde el polipéptido consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 39.
20. La composición para su uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-19, donde el polipéptido forma parte de un complejo proteico homodimérico.
21. La composición para su uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 -20, donde el tratamiento comprende además la administración de uno o más agentes seleccionados entre el grupo que consiste en: vasodilatadores, inhibidores de fosfodiesterasa tipo 5, estimuladores de guanilato ciclasa soluble, agonistas del receptor de prostaciclina y antagonistas del receptor de endotelina.
22. La composición para su uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 -21, donde el paciente ha sido tratado con uno o más vasodilatadores.
23. La composición para su uso de la reivindicación 21 o 22, donde uno o más vasodilatadores se seleccionan entre el grupo que consiste en: bosentán, sildenafilo, beraprost, macitentán, selexipag, epoprostenol, treprostinil, iloprost, ambrisentán y tadalafilo.
24. La composición para su uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-23, donde el polipéptido ActRIIA se une a uno o más ligandos seleccionados entre el grupo que consiste en: activina A, activina B y g Df 11.
ES17828540T 2016-07-15 2017-07-14 Composiciones que comprenden polipéptidos ActRIIA para su uso en el tratamiento de la hipertensión pulmonar Active ES2875905T3 (es)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662362955P 2016-07-15 2016-07-15
US201762453888P 2017-02-02 2017-02-02
US201762510403P 2017-05-24 2017-05-24
PCT/US2017/042157 WO2018013936A1 (en) 2016-07-15 2017-07-14 Compositions and methods for treating pulmonary hypertension

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2875905T3 true ES2875905T3 (es) 2021-11-11

Family

ID=60953378

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES17828540T Active ES2875905T3 (es) 2016-07-15 2017-07-14 Composiciones que comprenden polipéptidos ActRIIA para su uso en el tratamiento de la hipertensión pulmonar

Country Status (22)

Country Link
US (10) US10722558B2 (es)
EP (2) EP3928784A1 (es)
JP (3) JP7220141B2 (es)
KR (1) KR102512157B1 (es)
CN (2) CN109689085A (es)
AU (2) AU2017296040C1 (es)
BR (1) BR112019000790A2 (es)
CA (1) CA3030859C (es)
CY (1) CY1124277T1 (es)
DK (1) DK3496739T3 (es)
ES (1) ES2875905T3 (es)
HR (1) HRP20210694T1 (es)
HU (1) HUE054228T2 (es)
LT (1) LT3496739T (es)
MD (1) MD3496739T2 (es)
MX (2) MX2019000618A (es)
PL (1) PL3496739T3 (es)
PT (1) PT3496739T (es)
RS (1) RS62011B1 (es)
RU (2) RU2021114098A (es)
SI (1) SI3496739T1 (es)
WO (1) WO2018013936A1 (es)

Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201412290D0 (en) 2014-07-10 2014-08-27 Cambridge Entpr Ltd Novel use
MA41052A (fr) 2014-10-09 2017-08-15 Celgene Corp Traitement d'une maladie cardiovasculaire à l'aide de pièges de ligands d'actrii
ES2946160T3 (es) 2014-12-03 2023-07-13 Celgene Corp Antagonistas de activina-ActRII y usos para tratar síndrome mielodisplásico
CA2986432A1 (en) 2015-05-20 2016-11-24 Celgene Corporation In vitro cell culture methods for beta-thalassemia using activin type ii receptor ligand traps
RS62011B1 (sr) * 2016-07-15 2021-07-30 Acceleron Pharma Inc Kompozicije koje sadrže polipeptide actriia za upotrebu u lečenju plućne hipertenzije
US11013785B2 (en) 2016-11-10 2021-05-25 Keros Therapeutics, Inc. Activin receptor type IIA variants and methods of use thereof
WO2019094751A1 (en) 2017-11-09 2019-05-16 Keros Therapeutics, Inc. Activin receptor type iia variants and methods of use thereof
US10407396B2 (en) * 2017-11-16 2019-09-10 Apotex Inc. Crystalline form of selexipag
JP2021518745A (ja) 2018-01-12 2021-08-05 ケロス セラピューティクス インコーポレイテッドＫｅｒｏｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． アクチビンｉｉｂ型受容体変異体およびそれらの使用方法
AU2019266314A1 (en) * 2018-05-09 2020-11-19 Keros Therapeutics, Inc. Activin receptor type iia variants and methods of use thereof
EP4081240A4 (en) * 2019-12-03 2023-12-06 Acceleron Pharma Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATMENT OF PULMONARY HYPERTENSION
EP4073101A4 (en) * 2019-12-10 2024-01-10 Acceleron Pharma Inc SINGLE-ARM ACTRIIA AND ACTRIIB HETEROMULTIMERS AND METHOD FOR TREATING PULMONARY HYPERTENSION
EP4100430A4 (en) * 2020-02-03 2024-04-03 Acceleron Pharma Inc COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING PULMONARY HYPERTENSION
CA3176701A1 (en) * 2020-04-28 2021-11-04 Gang Li Actrii proteins and use in treating post-capillary pulmonary hypertension
WO2021257655A1 (en) * 2020-06-17 2021-12-23 Acceleron Pharma Inc. Actrii-alk4 antagonists and methods of treating heart failure
CN115989035A (zh) * 2020-06-23 2023-04-18 阿塞勒隆制药公司 用于治疗肺动脉高压(pah)的actrii蛋白
EP4274600A1 (en) * 2021-01-08 2023-11-15 Acceleron Pharma Inc. Compositions and methods for treating pulmonary hypertension
WO2022192420A2 (en) * 2021-03-10 2022-09-15 Acceleron Pharma Inc. Actrii proteins and uses thereof
JP2024511315A (ja) * 2021-03-10 2024-03-13 アクセルロン ファーマ インコーポレイテッド Ａｃｔｒｉｉ－ａｌｋ４アンタゴニスト及び心不全の治療方法
KR20230169124A (ko) * 2021-03-10 2023-12-15 악셀레론 파마 인코포레이티드 Actrii-alk4 길항제 및 심부전을 치료하는 방법
EP4351626A2 (en) * 2021-06-11 2024-04-17 Acceleron Pharma Inc. Actrii proteins and uses thereof
WO2022271571A1 (en) * 2021-06-21 2022-12-29 Acceleron Pharma Inc. Compositions and methods for treating pulmonary hypertension
AU2022316103A1 (en) * 2021-07-19 2024-02-08 Acceleron Pharma Inc. Actrii proteins and uses thereof
WO2023108137A1 (en) * 2021-12-10 2023-06-15 Biogen Ma Inc. Modified actriib proteins and methods of use thereof
CN114409721B (zh) * 2022-01-24 2023-07-18 大连理工大学 一类含有亲电弹头的五环三萜衍生物、其制备方法和应用
WO2024035884A1 (en) * 2022-08-10 2024-02-15 Gb002, Inc. Tyrosine kinase inhibitor and activin type 2 receptor antagonist combination therapy for treating pulmonary arterial hypertension (pah)

Family Cites Families (119)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
US5080891A (en) 1987-08-03 1992-01-14 Ddi Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of superoxide dismutase coupled to high molecular weight polyalkylene glycols
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
AU634186B2 (en) 1988-11-11 1993-02-18 Medical Research Council Single domain ligands, receptors comprising said ligands, methods for their production, and use of said ligands and receptors
US5096815A (en) 1989-01-06 1992-03-17 Protein Engineering Corporation Generation and selection of novel dna-binding proteins and polypeptides
US5198346A (en) 1989-01-06 1993-03-30 Protein Engineering Corp. Generation and selection of novel DNA-binding proteins and polypeptides
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5707796A (en) 1990-06-11 1998-01-13 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Method for selecting nucleic acids on the basis of structure
US5567588A (en) 1990-06-11 1996-10-22 University Research Corporation Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: Solution SELEX
US5270163A (en) 1990-06-11 1993-12-14 University Research Corporation Methods for identifying nucleic acid ligands
ES2259800T3 (es) 1990-06-11 2006-10-16 Gilead Sciences, Inc. Procedimientos de uso de ligandos de acido nucleico.
US5763177A (en) 1990-06-11 1998-06-09 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: photoselection of nucleic acid ligands and solution selex
US5580737A (en) 1990-06-11 1996-12-03 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High-affinity nucleic acid ligands that discriminate between theophylline and caffeine
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
EP0564531B1 (en) 1990-12-03 1998-03-25 Genentech, Inc. Enrichment method for variant proteins with altered binding properties
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
JP4124480B2 (ja) 1991-06-14 2008-07-23 ジェネンテック・インコーポレーテッド 免疫グロブリン変異体
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
US5932448A (en) 1991-11-29 1999-08-03 Protein Design Labs., Inc. Bispecific antibody heterodimers
US5288931A (en) * 1991-12-06 1994-02-22 Genentech, Inc. Method for refolding insoluble, misfolded insulin-like growth factor-I into an active conformation
DE69334255D1 (de) 1992-02-06 2009-02-12 Novartis Vaccines & Diagnostic Marker für Krebs und biosynthetisches Bindeprotein dafür
DE69332779T2 (de) 1992-11-17 2003-10-23 Ludwig Inst For Cancer Res Pad Aktivin-rezeptor-ähnliche kinasen, proteine mit serin/threonin kinase domänen und deren anwendungen
US5677196A (en) 1993-05-18 1997-10-14 University Of Utah Research Foundation Apparatus and methods for multi-analyte homogeneous fluoro-immunoassays
US5525490A (en) 1994-03-29 1996-06-11 Onyx Pharmaceuticals, Inc. Reverse two-hybrid method
US5814565A (en) 1995-02-23 1998-09-29 University Of Utah Research Foundation Integrated optic waveguide immunosensor
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
DE69636866D1 (en) 1995-04-11 2007-03-15 Gen Hospital Corp Reverse "two-hybrid"-systeme
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6699843B2 (en) 1995-06-07 2004-03-02 Gilead Sciences, Inc. Method for treatment of tumors using nucleic acid ligands to PDGF
US6011577A (en) 1997-06-30 2000-01-04 Polaroid Corporation Modular optical print head assembly
AU8921698A (en) 1997-08-29 1999-03-16 Human Genome Sciences, Inc. Follistatin-3
US6610833B1 (en) 1997-11-24 2003-08-26 The Institute For Human Genetics And Biochemistry Monoclonal human natural antibodies
BR9813365A (pt) 1997-12-05 2004-06-15 Scripps Research Inst Método para produção e humanização de um anticorpo monoclonal de rato
US6335155B1 (en) 1998-06-26 2002-01-01 Sunesis Pharmaceuticals, Inc. Methods for rapidly identifying small organic molecule ligands for binding to biological target molecules
WO2000000523A1 (en) 1998-06-30 2000-01-06 The Dow Chemical Company Improved syndiotactic monovinylidene aromatic polymerization process
CA2355215A1 (en) 1998-12-28 2000-07-06 Jim Wells Identifying small organic molecule ligands for binding
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
NZ513642A (en) 1999-01-21 2004-02-27 Metamorphix Inc Growth differentiation factor inhibitors and uses therefor
GB9912350D0 (en) * 1999-05-26 1999-07-28 European Molecular Biology Lab Embl Modified cytokine
ATE428719T1 (de) 1999-07-29 2009-05-15 Gilead Sciences Inc Nukleinsäureliganden für den hepatozytischen wachstumsfaktor/dispersionsfaktor (hgf/sf) und seines c-met rezeptors
CA2393869A1 (en) 1999-12-15 2001-06-21 Genetech,Inc. Shotgun scanning, a combinatorial method for mapping functional protein epitopes
NZ521540A (en) 2000-04-11 2004-09-24 Genentech Inc Multivalent antibodies and uses therefor
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
ATE378403T1 (de) 2000-11-30 2007-11-15 Medarex Inc Transchromosomale transgen-nagetiere zur herstellung von humänen antikörpern
FI117667B (fi) * 2001-07-05 2007-01-15 Univ Zuerich Farmaseuttinen koostumus, joka soveltuu käytettäväksi ortopediassa ja hammaslääketieteessä
US20030144203A1 (en) 2001-12-19 2003-07-31 Voyager Pharmaceutical Corporation Methods for slowing senescence and treating and preventing diseases associated with senescence
JP4753578B2 (ja) 2002-06-03 2011-08-24 ジェネンテック， インコーポレイテッド 合成抗体ファージライブラリー
WO2004065416A2 (en) 2003-01-16 2004-08-05 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
US20070135336A1 (en) 2003-09-15 2007-06-14 De Kretser David Follistatin isoforms and uses thereof
JP2007507429A (ja) 2003-10-06 2007-03-29 モナシュ ユニバーシティー 治療方法
JP2007526337A (ja) 2004-03-02 2007-09-13 アクセルロン ファーマ インコーポレーテッド Ａｌｋ７およびミオスタチン阻害剤ならびにその使用
RU2386638C2 (ru) 2004-03-31 2010-04-20 Дженентек, Инк. Гуманизированные анти-тфр-бета-антитела
US7785903B2 (en) 2004-04-09 2010-08-31 Genentech, Inc. Variable domain library and uses
CA2885854C (en) 2004-04-13 2017-02-21 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-p-selectin antibodies
ZA200609227B (en) 2004-04-23 2008-06-25 Celgene Corp Methods of using and compositions comprising thalidomide for the treatment and management of pulmonary hypertension
DK2332977T3 (en) 2004-07-23 2016-02-29 Acceleron Pharma Inc ActRII receptor polypeptides
AU2012244215B2 (en) * 2004-07-23 2014-11-27 Acceleron Pharma Inc. ActRII receptor polypeptides, methods and compositions
TWI380996B (zh) 2004-09-17 2013-01-01 Hoffmann La Roche 抗ｏｘ４０ｌ抗體
NZ580115A (en) 2004-09-23 2010-10-29 Genentech Inc Cysteine engineered antibody light chains and conjugates
US20070056050A1 (en) * 2005-06-29 2007-03-08 Clokie Cameron M L PRODUCTION OF BONE MORPHOGENIC PROTEINS (BMPs) IN TRANSGENIC MAMMALS
US8067562B2 (en) 2005-11-01 2011-11-29 Amgen Inc. Isolated nucleic acid molecule comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:1
WO2007056441A2 (en) 2005-11-07 2007-05-18 Genentech, Inc. Binding polypeptides with diversified and consensus vh/vl hypervariable sequences
EP1971594A2 (en) 2005-11-21 2008-09-24 Biogen Idec MA Inc. Substituted pyrazalones
CA3045808C (en) 2005-11-23 2022-08-16 Acceleron Pharma, Inc. Activin-actriia antagonists and uses for promoting bone growth
WO2007064919A2 (en) 2005-12-02 2007-06-07 Genentech, Inc. Binding polypeptides with restricted diversity sequences
AU2007249408A1 (en) 2006-05-09 2007-11-22 Genentech, Inc. Binding polypeptides with optimized scaffolds
JP2009541275A (ja) 2006-06-22 2009-11-26 ノボ・ノルデイスク・エー／エス 二重特異性抗体の生産
WO2008030367A2 (en) 2006-09-01 2008-03-13 The General Hospital Corporation Selective myostatin inhibitors
EP2099471A2 (en) 2006-12-08 2009-09-16 Acceleron Pharma, Inc. Uses of cerberus, coco and derivatives thereof
CN104524548A (zh) * 2006-12-18 2015-04-22 阿塞勒隆制药公司 活化素-actrii拮抗剂及在提高红细胞水平中的用途
US8895016B2 (en) 2006-12-18 2014-11-25 Acceleron Pharma, Inc. Antagonists of activin-actriia and uses for increasing red blood cell levels
ES2415666T3 (es) * 2007-02-01 2013-07-26 Acceleron Pharma, Inc. Composiciones farmacéuticas que comprenden antagonistas de Activina-ActRIIa para uso en la prevención o el tratamiento de metástasis de cáncer de mama o pérdida ósea relacionada con el cáncer de mama
TW201907946A (zh) 2007-02-02 2019-03-01 美商艾瑟勒朗法瑪公司 衍生自ＡｃｔＲＩＩＢ的變體與其用途
EP2484372A1 (en) * 2007-02-09 2012-08-08 Acceleron Pharma, Inc. Activin-ActRIIa Antagonists and Uses for Promoting Bone Growth in Cancer Patients
CN100592373C (zh) 2007-05-25 2010-02-24 群康科技(深圳)有限公司 液晶显示面板驱动装置及其驱动方法
JP2010529041A (ja) 2007-06-01 2010-08-26 ワイス・エルエルシー Ｂｍｐ−１０活性を調整する方法および組成物
WO2009089004A1 (en) 2008-01-07 2009-07-16 Amgen Inc. Method for making antibody fc-heterodimeric molecules using electrostatic steering effects
KR20180029111A (ko) 2008-05-02 2018-03-19 악셀레론 파마 인코포레이티드 혈관신생 및 혈관주위세포 적용범위의 조정을 위한 ａｌｋ１ 길항제 기재의 방법 및 조성물
WO2009158025A2 (en) 2008-06-26 2009-12-30 Acceleron Pharma Inc. Methods for dosing an actriib antagonist and monitoring of treated patients
HRP20230761T1 (hr) 2008-08-14 2023-10-13 Acceleron Pharma Inc. Gdf zamke
US8138142B2 (en) 2009-01-13 2012-03-20 Acceleron Pharma Inc. Methods for increasing adiponectin in a patient in need thereof
CN107970445B (zh) 2009-03-30 2021-09-07 阿塞勒隆制药公司 Bmp-alk3拮抗剂和促进骨生长的用途
US8293881B2 (en) 2009-06-12 2012-10-23 Acceleron Pharma Inc. Isolated nucleic acid encoding a truncated ActRIIB fusion protein
IL287990B (en) 2009-08-13 2022-07-01 Acceleron Pharma Inc Combined use of gdf traps and erythropoietin receptor activators to increase red blood cell levels
CN104945509A (zh) 2009-09-16 2015-09-30 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 包含卷曲螺旋和/或系链的蛋白质复合体及其用途
WO2011056497A1 (en) 2009-10-26 2011-05-12 Genentech, Inc. Activin receptor type iib compositions and methods of use
WO2011094181A1 (en) 2010-01-26 2011-08-04 Anthrogenesis Corporation Treatment of bone-related cancers using placental stem cells
ES2611187T3 (es) * 2010-03-15 2017-05-05 United Therapeutics Corporation Tratamiento para hipertensión pulmonar
MX346730B (es) 2010-10-15 2017-03-30 Gilead Sciences Inc Composiciones y metodos para el tratamiento de la hipertension pulmonar.
CN103492562B (zh) * 2011-02-03 2017-04-05 佐马技术有限公司 用于增强细菌中功能蛋白表达的方法和材料
US20140303068A1 (en) 2011-10-28 2014-10-09 Paranta Biosciences Limited Method of treating mucus hypersecretion
GR1007832B (el) * 2011-11-21 2013-02-14 Ιδρυμα Ιατροβιολογικων Ερευνων Ακαδημιας Αθηνων, Αδρανοποιητες της ακτιβινης και χρηση τους για την θεραπεια ασθενειων που σχετιζονται με παρεκκλινουσα ενεργοποιηση της "αμυντικης αποκρισης του ξενιστη"
US9809636B2 (en) 2012-04-06 2017-11-07 Acceleron Pharma Inc. Methods for increasing red blood cell levels comprising administering BMP9
LT2882441T (lt) 2012-08-09 2020-07-27 Celgene Corporation Su imunitetu susijusių ir uždegiminių ligų gydymas
EA201590693A1 (ru) 2012-10-05 2015-08-31 Ригель Фармасьютикалс, Инк. Ингибиторы gdf-8
CN112957462A (zh) 2012-10-24 2021-06-15 细胞基因公司 用于治疗贫血的方法
WO2014071158A1 (en) * 2012-11-02 2014-05-08 Celgene Corporation Activin-actrii antagonists and uses for treating bone and other disorders
US10562974B2 (en) 2013-03-13 2020-02-18 University Of Kentucky Research Foundation Methods of administering IgG1 antibodies and methods of suppressing angiogenesis
US9481725B2 (en) 2013-03-14 2016-11-01 Alderbio Holdings, Llc Antibodies to HGF and compositions containing
WO2015037000A1 (en) 2013-09-11 2015-03-19 Compugen Ltd Vstm5 polypeptides and uses thereof as a drug for treatment of cancer, infectious diseases and immune related diseases
EP3685848B1 (en) 2013-11-21 2021-09-15 The Brigham and Women's Hospital, Inc. Compositions and methods for treating pulmonary hypertension
EP3808778A1 (en) 2014-04-18 2021-04-21 Acceleron Pharma Inc. Methods for increasing red blood cell levels and treating sickle-cell disease
CA2951926C (en) * 2014-06-13 2023-01-10 Acceleron Pharma, Inc. Methods and compositions for treating ulcers
CN106794233B (zh) 2014-08-01 2021-11-12 布里格姆及妇女医院股份有限公司 与肺动脉高压的治疗有关的组合物和方法
ES2863564T3 (es) 2015-04-06 2021-10-11 Acceleron Pharma Inc Heteromultímeros ALK7:ActRIIB y usos de los mismos
MA41919A (fr) 2015-04-06 2018-02-13 Acceleron Pharma Inc Hétéromultimères alk4:actriib et leurs utilisations
SG11201708351XA (en) 2015-04-22 2017-11-29 Alivegen Usa Inc Novel hybrid actriib ligand trap proteins for treating muscle wasting diseases
JP6976859B2 (ja) 2015-05-13 2021-12-08 セルジーン コーポレイション ＡｃｔＲＩＩリガンドトラップを用いたβ−サラセミアの治療
CA3031430A1 (en) 2015-07-22 2017-01-26 Scholar Rock, Inc. Gdf11 binding proteins and uses thereof
WO2018009732A1 (en) * 2016-07-08 2018-01-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-activin a antibodies and methods of use thereof for treating pulmonary arterial hypertension
RS62011B1 (sr) * 2016-07-15 2021-07-30 Acceleron Pharma Inc Kompozicije koje sadrže polipeptide actriia za upotrebu u lečenju plućne hipertenzije
KR20240023201A (ko) 2017-05-04 2024-02-20 악셀레론 파마 인코포레이티드 Tgf-베타 수용체 유형 ii 융합 단백질 및 이의 용도

Also Published As

Publication number Publication date
US11318188B2 (en) 2022-05-03
RU2019104084A (ru) 2020-08-18
US20200397865A1 (en) 2020-12-24
KR102512157B1 (ko) 2023-03-21
US11622992B2 (en) 2023-04-11
US11065303B2 (en) 2021-07-20
US20210299220A1 (en) 2021-09-30
US10946067B2 (en) 2021-03-16
SI3496739T1 (sl) 2021-06-30
DK3496739T3 (da) 2021-05-10
MX2021000276A (es) 2021-03-31
KR20190039716A (ko) 2019-04-15
US20200390860A1 (en) 2020-12-17
PT3496739T (pt) 2021-06-21
RU2019104084A3 (es) 2020-09-24
CA3030859A1 (en) 2018-01-18
CA3030859C (en) 2024-04-23
US20180050089A1 (en) 2018-02-22
US10973880B2 (en) 2021-04-13
US20210299216A1 (en) 2021-09-30
AU2017296040A1 (en) 2019-01-31
RU2021114098A (ru) 2021-12-14
AU2017296040B2 (en) 2022-12-22
LT3496739T (lt) 2021-05-25
BR112019000790A2 (pt) 2019-07-02
US20200384080A1 (en) 2020-12-10
US11497794B2 (en) 2022-11-15
JP2024009166A (ja) 2024-01-19
JP7220141B2 (ja) 2023-02-09
US11219666B2 (en) 2022-01-11
AU2017296040C1 (en) 2023-06-22
EP3496739B1 (en) 2021-04-28
EP3496739A4 (en) 2020-04-01
US20230233648A1 (en) 2023-07-27
MX2019000618A (es) 2019-11-28
CN116531490A (zh) 2023-08-04
US20210023174A1 (en) 2021-01-28
EP3496739A1 (en) 2019-06-19
PL3496739T3 (pl) 2021-10-11
HUE054228T2 (hu) 2021-08-30
US20180221447A1 (en) 2018-08-09
WO2018013936A1 (en) 2018-01-18
RU2748278C2 (ru) 2021-05-21
CY1124277T1 (el) 2022-07-22
US10695405B2 (en) 2020-06-30
AU2022283782A1 (en) 2023-02-02
EP3928784A1 (en) 2021-12-29
JP7391139B2 (ja) 2023-12-04
HRP20210694T1 (hr) 2021-09-17
US10722558B2 (en) 2020-07-28
MD3496739T2 (ro) 2021-09-30
RS62011B1 (sr) 2021-07-30
US20200405814A1 (en) 2020-12-31
JP2022107775A (ja) 2022-07-22
JP2019521144A (ja) 2019-07-25
CN109689085A (zh) 2019-04-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2875905T3 (es) Composiciones que comprenden polipéptidos ActRIIA para su uso en el tratamiento de la hipertensión pulmonar
ES2863564T3 (es) Heteromultímeros ALK7:ActRIIB y usos de los mismos
US20170240639A1 (en) Actrii antagonists for use in increasing immune activity
US11857599B2 (en) Compositions and methods for treating spinal muscular atrophy
US20200306340A1 (en) Tgfbeta and actrii antagonists for use in increasing immune activity
KR20230025432A (ko) 심부전 치료용 ActRII-ALK4 길항제 및 방법
US20230183319A1 (en) Variant actriib proteins and uses thereof
US20230129812A1 (en) Compositions and methods for treating pulmonary hypertension
WO2022192404A1 (en) Actrii-alk4 antagonists and methods of treating heart failure