JP2015525792A - Ａｓｇｐｒ抗体およびその使用 - Google Patents

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Abstract

本発明は、一般的に、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）に特異的な抗体、および細胞活性に影響を及ぼすエフェクター部分を選択的に送達するための該抗体の使用に関する。さらに、本発明は、こうした抗体をコードするポリヌクレオチド、ならびにこうしたポリヌクレオチドを含むベクターおよび宿主細胞に関する。本発明はさらに、本発明の抗体を産生するための方法に、そして疾患治療において該抗体を用いる方法に関する。

Description

本発明は、一般的に、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）に特異的な抗体、および細胞活性に影響を及ぼすエフェクター部分を選択的に送達するための該抗体の使用に関する。さらに、本発明は、こうした抗体をコードするポリヌクレオチド、ならびにこうしたポリヌクレオチドを含むベクターおよび宿主細胞に関する。本発明はさらに、本発明の抗体を産生するための方法に、そして疾患治療において該抗体を用いる方法に関する。
アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）は、２つのサブユニット、Ｈ１およびＨ２で構成される膜貫通受容体である。該サブユニットは、細胞外ストーク領域を通じてオリゴマー化すると考えられる。ＡＳＧＰＲは、Ｃ型レクチンファミリー（カルシウムイオン依存性レクチン）のメンバーであり、そして非常に多様な脱シアル化糖タンパク質のエンドサイトーシスおよび分解を仲介する。ＡＳＧＰＲは、肝臓実質細胞（肝細胞）上で選択的に発現され、これによって、肝臓特異的療法の魅力的なターゲットとなっている。多くの肝臓疾患、例えば肝炎、肝硬変または肝細胞癌（ＨＣＣ）は、ウイルス感染、例えばＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）またはＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染によって、直接または間接的に引き起こされうる。ＨＣＶでの慢性感染は、肝硬変およびＨＣＣの主因の１つである。同様に、慢性ＨＢＶ感染は、米国において、慢性肝臓疾患および肝硬変の５〜１０％を構成する。ＨＢＶおよびＨＣＶ感染に関して認可された療法には、インターフェロン（ＩＦＮ）、例えばインターフェロン・アルファが含まれる。しかし、副作用によって、多くの症例において、これらの療法を発展させ、そして広く用いることが妨げられてきている。こうしたＩＦＮ関連副作用は、部分的に、ＩＦＮへの全身曝露後に、末梢血細胞において、インターフェロン刺激遺伝子（ＩＳＧ）が誘導されるためであると考えられる。したがって、肝臓疾患に関するＩＦＮ療法に関連する副作用を最小限にするために、そしてまた、慣用的なインターフェロンの抗ウイルス効果を増大させるために、ＩＦＮを肝臓に選択的に送達することが望ましい。ＡＳＧＰＲは、こうした選択的送達のために、肝細胞上の潜在的なターゲット分子として認識されてきている。例えば、ＷＯ９２／２２３１０は、アシアロ糖タンパク質に組換えＩＦＮをコンジュゲート化することによって、インターフェロンを肝臓にターゲティングするためのアプローチを記載する。同様のアプローチにおいて、インターフェロン分子自体を修飾して、ＡＳＧＰＲに結合するためのアシアロ−インターフェロンを産生してきている（ＥｔｏおよびＴａｋａｈａｓｈｉ， Ｎａｔ Ｍｅｄ ５， ５７７−５８１（１９９９））。より最近、抗ＡＳＧＰＲ単一可変ドメイン（ｄＡｂ）抗体に基づくアプローチも記載されてきている（ＷＯ ２０１１／０８６１４３）。
ＷＯ９２／２２３１０ ＷＯ ２０１１／０８６１４３
ＥｔｏおよびＴａｋａｈａｓｈｉ， Ｎａｔ Ｍｅｄ ５， ５７７−５８１（１９９９）
しかし、これらのアプローチはいずれも、これまでのところ臨床的に成功することが示されておらず、そして療法分子、例えばインターフェロンを肝臓に選択的に送達するための、改善されたターゲティング分子に対する必要性がなおある。本発明の抗体は、いくつかの好適な特性を組み合わせて、例えば肝臓疾患の治療のために、ＡＳＧＰＲ発現細胞にインターフェロンなどのエフェクター部分をターゲティングするのに特に適したものとなっている。
発明の概要
１つの側面において、本発明は、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）に特異的に結合可能な抗体であって、ａ）配列番号１６の重鎖可変領域配列および配列番号１４の軽鎖可変領域配列；ｂ）配列番号４の重鎖可変領域配列および配列番号２の軽鎖可変領域配列；ｃ）配列番号８の重鎖可変領域配列および配列番号６の軽鎖可変領域配列；ｄ）配列番号１２の重鎖可変領域配列および配列番号１０の軽鎖可変領域配列；ｅ）配列番号２０の重鎖可変領域配列および配列番号１８の軽鎖可変領域配列；ｆ）配列番号２４の重鎖可変領域配列および配列番号２２の軽鎖可変領域配列；ｇ）配列番号２８の重鎖可変領域配列および配列番号２６の軽鎖可変領域配列；ｈ）配列番号４の重鎖可変領域配列および配列番号３０の軽鎖可変領域配列；ｉ）配列番号４の重鎖可変領域配列および配列番号３２の軽鎖可変領域配列；ｊ）配列番号４の重鎖可変領域配列および配列番号３４の軽鎖可変領域配列；またはｋ）配列番号２４の重鎖可変領域配列および配列番号２２の軽鎖可変領域配列を含む、前記抗体を提供する。
特定の態様において、抗体は、配列番号１６の重鎖可変領域配列および配列番号１４の軽鎖可変領域配列を含む。別の特定の態様において、抗体は、配列番号４の重鎖可変領域配列および配列番号２の軽鎖可変領域配列を含む。
さらなる側面において、本発明は、ＡＳＧＰＲのエピトープへの結合に関して、配列番号１６の重鎖可変領域配列および配列番号１４の軽鎖可変領域配列を含む抗体と競合する、ＡＳＧＰＲに特異的に結合可能な抗体を提供する。１つの態様において、前記抗体は、ＡＳＧＰＲのストーク領域におけるエピトープを認識する。１つの態様において、前記抗体は、配列番号１６の重鎖可変領域配列および配列番号１４の軽鎖可変領域配列を含む抗体のアフィニティ成熟変異体である。１つの態様において、前記抗体は、配列番号１６の配列に少なくとも約９６％、９７％、９８％または９９％同一である重鎖可変領域配列、および配列番号１４の配列に少なくとも約９６％、９７％、９８％または９９％同一である軽鎖可変領域配列を含む。１つの態様において、前記抗体は、１、２、３、４、５、６または７の、特に２、３、４または５のアミノ酸置換を含む配列番号１４の軽鎖可変領域配列を含む。１つの態様において、前記抗体は、１、２、３、４、５、６または７の、特に２、３、４または５のアミノ酸置換を含む配列番号１６の重鎖可変領域配列を含む。
さらにさらなる側面において、本発明は、ＡＳＧＰＲのエピトープへの結合に関して、配列番号４の重鎖可変領域配列および配列番号２の軽鎖可変領域配列を含む抗体と競合する、ＡＳＧＰＲに特異的に結合可能な抗体を提供する。１つの態様において、前記抗体は、ＡＳＧＰＲの炭水化物認識ドメイン（ＣＲＤ）におけるエピトープを認識する。１つの態様において、前記抗体は、配列番号４の重鎖可変領域配列および配列番号２の軽鎖可変領域配列を含む抗体のアフィニティ成熟変異体である。１つの態様において、前記抗体は、配列番号４の配列に少なくとも約９６％、９７％、９８％または９９％同一である重鎖可変領域配列、および配列番号２の配列に少なくとも約９６％、９７％、９８％または９９％同一である軽鎖可変領域配列を含む。１つの態様において、前記抗体は、１、２、３、４、５、６または７の、特に２、３、４または５のアミノ酸置換を含む配列番号２の軽鎖可変領域配列を含む。１つの態様において、前記抗体は、１、２、３、４、５、６または７の、特に２、３、４または５のアミノ酸置換を含む配列番号４の重鎖可変領域配列を含む。１つの態様において、前記抗体は、ａ）配列番号４の重鎖可変領域配列および配列番号３６の軽鎖可変領域配列；ｂ）配列番号４の重鎖可変領域配列および配列番号３８の軽鎖可変領域配列；ｃ）配列番号８の重鎖可変領域配列および配列番号４０の軽鎖可変領域配列；ｄ）配列番号１２の重鎖可変領域配列および配列番号４２の軽鎖可変領域配列；ｅ）配列番号２０の重鎖可変領域配列および配列番号４４の軽鎖可変領域配列；ｆ）配列番号２４の重鎖可変領域配列および配列番号４６の軽鎖可変領域配列；またはｇ）配列番号２８の重鎖可変領域配列および配列番号４８の軽鎖可変領域配列を含む。
１つの態様において、本発明の抗体は、ヒトおよびカニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍｏｎｋｅｙ）ＡＳＧＰＲに特異的に結合可能である。１つの態様において、抗体は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、Ｆａｂ断片として測定した際、ヒトＡＳＧＰＲに、１μＭより小さい、特に１００ｎＭより小さい、より具体的には１ｎＭより小さい解離定数（ＫＤ）で結合する。１つの態様において、抗体は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）によって、ＩｇＧ１として測定した際、ヒトＡＳＧＰＲに、１μＭより小さい、特に５００ｎＭより小さい、より具体的には１００ｎＭより小さい、またはさらに１０ｎＭより小さいＫＤで結合する。１つの態様において、抗体は、ＡＳＧＰＲへの結合に関して、ＡＳＧＰＲの天然リガンドと競合しない。特定の態様において、ＡＳＧＰＲの前記天然リガンドはアシアロフェチュインである。１つの態様において、抗体は、ＣＬＥＣ１０Ａ、特にヒトＣＬＥＣ１０Ａに検出可能に結合しない。１つの態様において、抗体は、ＡＳＧＰＲ発現を欠く細胞、特にヒト細胞、より具体的にはヒト血液細胞に特異的に結合しない。１つの態様において、抗体は、ＡＳＧＰＲ発現細胞表面上のＡＳＧＰＲに抗体が結合した際、前記細胞に内在化される。特定の態様において、抗体は、前記細胞内に内在化されるのとほぼ同じ速度で、前記細胞表面にリサイクルされて戻る。１つの態様において、抗体は、前記細胞表面上のＡＳＧＰＲに抗体が結合した際、細胞表面で、ＡＳＧＰＲ発現の下方制御を有意には誘導しない。
１つの態様において、本発明の抗体はヒト抗体である。１つの態様において、抗体は、ヒトＦｃ領域、特にＩｇＧ Ｆｃ領域、より具体的にはＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。１つの態様において、抗体は全長抗体である。１つの態様において、抗体は、ＩｇＧクラス抗体、特にＩｇＧ１サブクラス抗体である。１つの態様において、抗体は、Ｆｃ受容体、特にＦｃγ受容体への抗体の結合アフィニティを減少させる修飾を、Ｆｃ領域中に含む。特定の態様において、前記Ｆｃ受容体は活性化Ｆｃ受容体である。さらに特定の態様において、前記Ｆｃ受容体は、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）、およびＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）の群より選択される。より特定の態様において、前記Ｆｃ受容体はＦｃγＲＩＩＩａ、特にヒトＦｃγＲＩＩＩａである。１つの態様において、抗体は、Ｐ３２９、Ｌ２３４およびＬ２３５（ＥＵ番号付け）より選択される位でＦｃ領域中にアミノ酸置換を含む。１つの態様において、抗体は、Ｆｃ領域中にアミノ酸置換Ｐ３２９Ｇ、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ（ＥＵ番号付け）を含む。さらなる態様において、抗体は、２つの非同一抗体重鎖のヘテロ二量体化を促進する修飾を、Ｆｃ領域中に含む。特定の態様において、前記修飾は、抗体重鎖の一方におけるノブ修飾、および２つの抗体重鎖のもう一方における穴修飾を含む、ノブを穴に（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）修飾である。１つの態様において、抗体は、ＣＨ３ドメイン中の２つの抗体重鎖間の界面内に修飾を含み、ｉ）１つの重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基はより大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それによって１つの重鎖のＣＨ３ドメイン中の界面内に突起（「ノブ」）を生成し、これを他方の重鎖のＣＨ３ドメイン中の界面内の空洞（「穴」）中に配置可能であり、そしてｉｉ）他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基はより小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それによって第二のＣＨ３ドメイン中の界面内に空洞（「穴」）を生成し、この中に第一のＣＨ３ドメイン中の界面内の突起（「ノブ」）が配置可能である。１つの態様において、抗体は、１つの抗体重鎖において、アミノ酸置換Ｔ３６６Ｗおよび場合によってアミノ酸置換Ｓ３５４Ｃを、そして他方の抗体重鎖において、アミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖおよび場合によってＹ３４９Ｃを含む。
１つの側面において、本発明は、エフェクター部分が抗体に付着している、上記態様のいずれか記載の、ＡＳＧＰＲに特異的に結合可能な抗体を提供する。１つの態様において、１より多いエフェクター部分が抗体に付着していない。１つの態様において、前記エフェクター部分はサイトカイン分子である。１つの態様において、前記サイトカイン分子は、場合によってペプチドリンカーを通じて、抗体重鎖の１つのカルボキシ末端アミノ酸に、アミノ末端アミノ酸で融合している。１つの態様において、前記サイトカイン分子はヒトサイトカインである。１つの態様において、前記サイトカイン分子はインターフェロン分子である。特定の態様において、前記インターフェロン分子は、インターフェロン・アルファ、特にヒト・インターフェロン・アルファ、より具体的には、ヒト・インターフェロン・アルファ２（配列番号１３８を参照されたい）またはヒト・インターフェロン・アルファ２ａ（配列番号１３９を参照されたい）である。サイトカイン分子がインターフェロン分子である１つの態様において、抗体は、表面上にＡＳＧＰＲを発現する細胞において、抗ウイルス活性を有する。特定の態様において、抗体は、表面上に有意なレベルのＡＳＧＰＲを発現しない細胞においては、抗ウイルス活性をまったく持たない。さらなる特定の態様において、前記抗ウイルス活性は、ウイルス感染の阻害、ウイルス複製の阻害、細胞殺傷の阻害およびインターフェロン刺激遺伝子の誘導より選択される。
本発明はさらに、本発明の抗体をコードする、ポリヌクレオチドを提供する。さらに提供するのは、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、特に発現ベクターである。別の側面において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを含む、宿主細胞を提供する。本発明はまた、（ｉ）前記抗体の発現に適した条件下で、本発明の宿主細胞を培養し、そして（ｉｉ）前記抗体を回収する工程を含む、本発明の抗体を産生するための方法も提供する。やはり提供するのは、前記方法によって産生される、ＡＳＧＰＲに特異的に結合可能な抗体である。
１つの側面において、本発明は、本発明の抗体および薬学的に許容されうるキャリアーを含む、薬学的組成物を提供する。本発明の抗体または薬学的組成物はまた、薬剤として使用するため、そして肝臓疾患、特にウイルス感染、より具体的には肝炎ウイルス感染、特にＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染の治療または予防において使用するためにも提供される。本発明の抗体または薬学的組成物はまた、癌、特に肝臓癌、より具体的には肝細胞癌（ＨＣＣ）の治療または予防において使用するためにも提供される。さらに提供するのは、治療が必要な個体において、疾患を治療するための薬剤製造のための、本発明の抗体の使用、および個体において疾患を治療する方法であって、前記個体に、薬学的に許容されうる型の本発明の抗体を含む組成物の療法的有効量を投与する工程を含む、前記方法である。１つの態様において、前記疾患は肝臓疾患である。より具体的な態様において、前記肝臓疾患はウイルス感染である。さらにより特定の態様において、前記肝臓疾患は肝炎ウイルス感染、特にＨＢＶ感染である。別の態様において、前記疾患は癌である。さらに特定の態様において、前記癌は肝臓癌である。さらにより特定の態様において、前記肝臓癌は肝細胞癌（ＨＣＣ）である。１つの態様において、前記個体は哺乳動物、特にヒトである。さらなる側面において、本発明の抗体は、個体において、ＡＳＧＰＲを発現している細胞をターゲティングするために提供される。やはり提供するのは、個体においてＡＳＧＰＲを発現している細胞をターゲティングするための方法であって、前記個体に、薬学的に許容されうる型の本発明の抗体を含む組成物を投与する工程を含む、前記方法である。１つの態様において、前記細胞は肝臓細胞、特に肝細胞である。１つの態様において、前記個体は哺乳動物、特にヒトである。
生成した抗原構築物の模式図。すべての抗原のヌクレオチド配列を、ヒト由来ＩｇＧ１ Ｆｃ配列のＣ末端に融合させた。ＡＳＧＰＲ１由来ＣＲＤおよびＣＬＥＣ１０Ａ由来ＣＲＤを、Ｆｃ（穴）断片をコードする配列に融合させ、そしてＦｃ二量体あたり単量体ディスプレイを生じるＦｃ（ノブ）断片をコードする配列と同時発現させた。左から右に、Ｆｃ−ＣＲＤ（ＡＳＧＰＲ１）、Ｆｃ−ストーク（ＡＳＧＰＲ１）、Ｆｃ−ストーク−ＣＲＤ（ＡＳＧＰＲ１）、Ｆｃ−ＣＲＤ（ＣＬＥＣ１０Ａ）、Ｆｃ−ストーク（ＣＬＥＣ１０Ａ）、Ｆｃ−ストーク−ＣＲＤ（ＣＬＥＣ１０Ａ）。太い曲線：（Ｇ４Ｓ）３リンカー；太い直線：ＸａおよびＩｇＡｓｅ切断部位。 重鎖および軽鎖のＣＤＲ３領域においてランダム化された一般的なＦａｂライブラリーの生成の模式的概観。第一の工程において、３つのＰＣＲ断片を生成し、これを次いで、（重複伸長によるスプライシング；ＳＯＥ）ＰＣＲによって融合させた。最終断片をゲル精製し、ＮｃｏＩ／ＮｈｅＩで消化し、同様に処理したアクセプター・ファージミドとともに連結し、そして細菌内に形質転換した。ＰＣＲ１（Ａ、Ｂ、Ｃ）：（１）ＬＭＢ３；（２）（Ａ）ＶＩ＿３＿１９＿Ｌ３ｒ＿Ｖ／（Ｂ）ＶＩ＿３＿１９＿Ｌ３ｒ＿ＨＶ／（Ｃ）ＶＩ＿３＿１９＿Ｌ３ｒ＿ＨＬＶ。ＰＣＲ２：（３）ＲＪＨ８０；（４）ＤＰ４７ＣＤＲ３＿ｂａ（ｍｏｄ）。ＰＣＲ３（Ａ、Ｂ、Ｃ）：（５）（Ａ）ＤＰ４７ ｖ４ ４／（Ｂ）ＤＰ４７ ｖ４ ６／（Ｃ）ＤＰ４７ ｖ４ ８；（６）ｆｄｓｅｑｌｏｎｇ。 ヒトＩｇＧ１抗体として、ＨｅｐＧ２細胞に対する選択された抗ヒトＡＳＧＰＲ Ｈ１特異的クローンの結合分析。抗体濃度は３０μｇ／ｍｌであった。アイソタイプ対照抗体は、陰性対照として働いた。 テルビウムで標識した膜貫通ＡＳＧＰＲ Ｈ１−ＳＮＡＰタグ融合タンパク質を発現している一過性トランスフェクション細胞に対するＦＲＥＴ分析。５０〜０．３９ｎＭの範囲の濃度で抗体を添加し、その後、アクセプター分子として、抗ヒトＦｃ−ｄ２（ウェルあたり最終２００ｎＭ）の添加によって、分析を行った。特異的ＦＲＥＴシグナルを３時間後に測定し、そしてＫＤ値を計算した（ＫＤ５１Ａ１２＝２００ｎＭ、ＫＤＲ７Ｆ１２＝２２ｎＭ、ＫＤＲ９Ｅ１０＝６．２ｎＭ、ＫＤＲ５Ｃ２＝５．９ｎＭ、ＫＤ４Ｆ３＝４．５ｎＭ）。 ＡＳＧＰＲに対する天然リガンドであるアシアロフェチュイン、および抗ＡＳＧＰＲ Ｈ１抗体の競合。細胞に対して、示す抗体を希釈列で添加する前に、ＨｅｐＧ２細胞を標識アシアロフェチュインとプレインキュベーションした。細胞に対する両方の構成要素の結合をＦＡＣＳ分析によって分析した。（Ａ）抗体検出；（Ｂ）アシアロフェチュイン検出。 図５の説明と同じ。 ＩｇＧとしての２つの抗ヒトＡＳＧＰＲ Ｈ１抗体クローン５１Ａ１２および４Ｆ３の内在化分析。（Ａ）抗体をＨｅｐＧ２細胞と４℃でインキュベーションして、内在化を防止し、そして細胞をあらかじめ温めた培地中で培養する前に、４℃で洗浄し、そして３７℃で最長１２０分間インキュベーションした。示す時点で試料を採取し、氷上で二次抗体で標識し、そしてＰＦＡを用いて固定した。（Ｂ）（Ａ）に記載するのと同じ工程を行ったが、抗体を細胞と３７℃でインキュベーションして、ＡＳＧＰＲが内在化するのを可能にした。 ＩｇＧとしての２つの抗ヒトＡＳＧＰＲ Ｈ１抗体クローン５１Ａ１２および４Ｆ３の内在化分析。（Ｃ）（Ａ）に記載するのと同じ工程を行ったが、直接ＦＩＴＣ標識抗体を用いた。ＰＥコンジュゲート化抗Ｆｃ抗体を用いて、細胞表面に結合した抗体を検出した。（Ｄ）（Ｃ）と同じ実験を行ったが、ＦＩＴＣシグナルを示し、表面曝露および内在化抗体の両方を示した。 クローン５１Ａ１２のＬＣＤＲ３領域のランダム化戦略。（Ａ）親クローン５１Ａ１２のＬＣＤＲ３タンパク質配列、（Ｂ）システインおよびグリコシル化配列を含まない、ライブラリーのためのテンプレートとして働くプラスミドのＬＣＤＲ３タンパク質配列、および（Ｃ）ＬＣＤＲ３のランダム化位を示す。ライブラリー生成中、三ヌクレオチドプライマーは、システインまたはグリコシル化部位の形成に寄与するアミノ酸をコードする３つ組を排除することを可能にする。 テンプレート５１Ａ１２のＬＣＤＲ３においてランダム化されたアフィニティ突然変異ライブラリーの生成の模式的概観（Ａ８２Ｇ、Ｃ１１２Ｓ、Ｃ１１３Ｓ、Ｓ１１６Ａ）（配列番号３３）。第一の工程において、２つのＰＣＲ断片を生成し、これを次いで、（ＳＯＥ）ＰＣＲによって融合させた。最終断片をゲル精製し、ＮｃｏＩ／ＰｓｔＩで消化し、同様に処理したアクセプター・ファージミドとともに連結し、そして細菌内に形質転換した。ＰＣＲ１：（１）ＬＭＢ３、（２）ＬＣＤＲ３ｒｅｖ．ＰＣＲ２：（３）ＬＣＤＲ３ｒａｎｄ、（４）ｆｄｓｅｑｌｏｎｇ。 ヒトＦａｂ断片としての、ＨｅｐＧ２細胞に対するアフィニティ成熟５１Ａ１２由来クローンの結合分析。１０、３．３、および１．１μｇ／ｍｌのＦａｂ濃度を用いた。親クローン５１Ａ１２（配列番号２および４）、グリコシル化配列を欠くクローン５１Ａ１２（Ｓ１１６Ａ）（配列番号４および３０）、および対照として働く、アフィニティ成熟ライブラリーのテンプレートクローン５１Ａ１２（Ａ８２Ｇ、Ｃ１１２Ｓ、Ｃ１１３Ｓ、Ｓ１１６Ａ）。 ヒトＩｇＧ１抗体としての、ＨｅｐＧ２細胞に対するアフィニティ成熟５１Ａ１２由来クローンの結合分析。０．０１〜２０μｇ／ｍｌの範囲の希釈列の濃度を用いた。親クローン５１Ａ１２（配列番号２および４）は対照として働いた（Ａ）。１０μｇ／ｍｌの濃度でのＨｅｌａ細胞に対する結合分析を陰性対照として用いた（Ｂ）。 生成した抗体−サイトカイン・コンジュゲートの模式図。インターフェロン−α２ａをコードする遺伝子を、ノブ修飾を含むＡＳＧＰＲ Ｈ１特異的抗体重鎖のＣ末端に融合させた。穴修飾を含む対応するＡＳＧＰＲ Ｈ１特異的重鎖および軽鎖の同時発現によって、抗体−サイトカインタンパク質の二価ＡＳＧＰＲ結合を達成する（（Ａ）、２：１価）一方、Ｆｃ（穴）断片配列の発現は、分子あたり１つのみのＡＳＧＰＲ Ｈ１特異的結合部位を含む、単量体抗体−サイトカイン・コンジュゲートを生じた（（Ｂ）、１：１価）。小さい黒点：ＦｃγＲ結合を防止する修飾（例えば、Ｌ２３４Ａ Ｌ２３５Ａ Ｐ３２９Ｇ）。大きい黒点：ヘテロ二量体化を促進する修飾（例えばノブを穴に）。 選択した抗体−ＩＦＮαイムノコンジュゲート（５１Ａ１２ ｋｉｈ ＩｇＧ−ＩＦＮα）の精製および分析的特徴付け。精製法はアフィニティ工程（プロテインＡ）（Ａ）の後、サイズ排除クロマトグラフィ（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）（Ｂ）を伴った。最終産物を分析し、そして分析的サイズ排除クロマトグラフィ（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム）（Ｃ）および微少流体タンパク質分析（Ｃａｌｉｐｅｒ）またはＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｄ）によって特徴付けた（図１４−１９についても同様）。 選択した抗体−ＩＦＮαイムノコンジュゲート（４Ｆ３ ｋｉｈ ＩｇＧ−ＩＦＮα）の精製および分析的特徴付け。 選択した抗体−ＩＦＮαイムノコンジュゲート（５１Ａ１２（Ｃ７）ｋｉｈ ＩｇＧ−ＩＦＮα）の精製および分析的特徴付け。 選択した抗体−ＩＦＮαイムノコンジュゲート（５１Ａ１２（Ｃ１）ｋｉｈ ＩｇＧ−ＩＦＮα）の精製および分析的特徴付け。 選択した抗体−ＩＦＮαイムノコンジュゲート（５１Ａ１２（Ｅ７）ｋｉｈ ＩｇＧ−ＩＦＮα）の精製および分析的特徴付け。 選択した抗体−ＩＦＮαイムノコンジュゲート（アイソタイプ対照ｋｉｈ ＩｇＧ−ＩＦＮα）の精製および分析的特徴付け。 選択した抗体−ＩＦＮαイムノコンジュゲート（一価５１Ａ１２ ｋｉｈ ＩｇＧ−ＩＦＮα）の精製および分析的特徴付け。 ＡＳＧＰＲ特異的ＩｇＧ ｋｉｈ ＩＦＮα融合構築物５１Ａ１２（Ａ）および４Ｆ３（Ｂ）の結合選択性。ＨｅｐＧ２、初代ヒト肝細胞、Ｈｕｈ−７細胞、Ａ５４９細胞、Ｈｅｌａ細胞、および２９３Ｔ細胞を、１μｇ／ｍｌ ５１Ａ１２−ＩＦＮα（Ａ）または４Ｆ３−ＩＦＮα（Ｂ）と、氷上で４５分間インキュベーションした。３回洗浄した後、細胞を二次ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体で氷上で３０分間染色し、そして細胞を３回洗浄した後、Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーターを用いて、分析した。Ｚｅｎｏｎ（登録商標）Ｒ−フィコエリトリン・ヒトＩｇＧ標識キットを製造者の指示にしたがって用いて、１μｇ／ｍｌの直接標識５１Ａ１２ ＩｇＧ ｋｉｈ ＩＦＮα（Ａ）および４Ｆ３ ＩｇＧ ｋｉｈ ＩＦＮα（Ｂ）を用いることによって、ヒトＰＢＭＣに対する結合を行い、アイソタイプＩｇＧ ｋｉｈ ＩＦＮαおよびＣＤ８１ ｍＡｂをそれぞれ、陰性および陽性対照として用いた。 初代ヒト肝細胞およびＨｅｐＧ２細胞に対するＡＳＧＰＲ ｍＡｂ ４Ｆ３−ＩＦＮαの結合飽和曲線。３人の異なるドナー由来のヒト肝細胞（Ａ〜Ｃ）およびＨｅｐＧ２細胞（Ｄ）に対するＡＳＧＰＲ ｍＡｂ ４Ｆ３−ＩＦＮαの結合飽和。細胞を連続希釈した４Ｆ３ ＩｇＧ ｋｉｈ ＩＦＮαと氷上で４５分間インキュベーションした。３回洗浄した後、細胞を二次ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体で氷上で３０分間染色し、そして再び３回洗浄した後、Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーターを用いて、分析した。 特異的抗体の存在下での、長時間に渡るＡＳＧＰＲの表面曝露レベルの分析。ＨｅｐＧ２細胞を、ＡＳＧＰＲ特異的クローン５１Ａ１２ ＩｇＧあるいは対応する一価または二価抗体−サイトカイン・コンジュゲートのいずれかとインキュベーションした。５時間後まで細胞試料を採取し、そしてＡＳＧＰＲに対するＩｇＧ構築物の結合を、抗体（Ａ）またはサイトカイン（Ｂ）のいずれかの検出によって測定した。抗ＣＤ２０抗体（ＧＡ１０１）を陰性対照として用いた。 クローン５１Ａ１２抗体−サイトカイン・コンジュゲートの迅速な内在化。Ａｌｅｘａ４８８標識５１Ａ１２ ＩｇＧ ｋｉｈ ＩＦＮα構築物を、ＨｅｐＧ２細胞とインキュベーションし、そして１０スタック（ｚレベル）に渡って、１時間、共焦点顕微鏡によって、ＡＳＧＰＲが仲介する構築物の内在化を記録した。細胞表面上の抗体−サイトカイン・コンジュゲートの結合は、均質な分布よりもむしろ、クラスターで生じる（Ａ）。細胞表面にひとたび結合すると、コンジュゲートは小胞中に非常に迅速に内在化し、これは、細胞体内に輸送される（Ｂ、単一細胞が取り巻く）。次いで、小胞は、細胞の頂端側にリサイクルされて戻る（未提示）。 ＥＭＣＶ ＣＰＥ（Ａ）およびＨＣＶレプリコン（Ｂ）アッセイにおける、ＡＳＧＰＲ ｍＡｂ−ＩＦＮα分子および他の対照ＩＦＮ分子の抗ウイルス活性。（Ａ）ＥＭＣＶウイルスを添加する前に３時間、連続希釈したＩＦＮ分子でＨｅｌａ細胞を前処理した。細胞を２４時間培養し、そしてＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏを添加することによって、細胞生存度を測定した。（Ｂ）Ｈｕｈ−７ ２２０９レプリコン細胞を、連続希釈したＩＦＮ分子で処理し、そして３日後にルシフェラーゼ活性を測定した。 多様な肝臓および非肝臓細胞における５１Ａ１２−ＩＦＮαによるＩＳＧ誘導。肝臓細胞（初代肝細胞（Ｂ）およびＨｅｐＧ２（Ａ））および非肝臓細胞（ヒトＰＢＭＣ（Ｄ）およびＨｅｌａ（Ｃ））を、多様な連続希釈ＩＦＮα分子で６時間処理し、総ＲＮＡを抽出し、そしてＴａｑＭａｎ ＲＴ−ＰＣＲを用いて、ＩＳＧ ＭＸ１（Ａ、Ｃ）およびＲｓａｄ２（Ｂ、Ｄ）遺伝子発現を定量化した。示すデータは、３またはそれより多い実験由来である。 初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）（Ｂ）およびＨｕｈ７（Ａ）細胞における、５１Ａ１２−ＩＦＮαおよび４Ｆ３−ＩＦＮαによる持続性ＩＳＧ誘導。初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）およびＨｕｈ７細胞を、連続希釈したＩＦＮα分子で、６時間（左）および７２時間（右）処理し、総ＲＮＡを抽出し、そしてＴａｑＭａｎ ＲＴ−ＰＣＲを用いて、ＩＳＧ ＭＸ１（Ａ）およびＲｓａｄ２（Ｂ）遺伝子発現を定量化した。 サル肝臓試料における代表的なＩＳＧ発現。異なる時点で収集した４つの用量群由来のサル肝臓試料を、マイクロアレイによって分析した。４つの代表的なＩＳＧ遺伝子の発現を３Ｄグラフで示す。４つの用量群を示す。各用量群に関して、左から右に、バーは、第−５日、第２日、第４日、および第８日での３匹のサルのＩＳＧ倍誘導を示す。 血液および肝臓遺伝子発現ヒートマップ（ＩＦＮモジュールＭ３．１）。血液ＰＢＭＣおよび肝臓生検試料に対してｍＲＮＡマイクロアレイ分析を行い、そして血液トランスクリプトーム研究から決定される遺伝子モジュールを用いて、そのＩＦＮα反応を分析した（Ｃｈａｕｓｓａｂｅｌら（２００８）， Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２９， １５０−６４）。パネル（Ａ）において、インターフェロン・モジュールＭ３．１の遺伝子に関して、ベースラインからの倍変化発現値（挿入図を参照されたい）を、Ｒ統計パッケージ（ｗｗｗ．ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ）を用いて、血液および肝臓試料の両方に関して、ヒートマップ型にプロットした。肝臓インターフェロン誘導遺伝子の教師なし階層的クラスター形成によって、第１日および第３日、１０μｇ／ｋｇ用量の５１Ａ１２において、非常に誘導されるが、アイソタイプＩＦＮα化合物によっては誘導されないサブセット（破線の長方形）が明らかになる。 （Ｂ）遺伝子のこのサブセットを、肝臓および血液の両方に関してプロットした。このサブセットの教師なし階層的クラスターを形成すると、血液および肝臓の間の発現の示差的パターンが明らかになり、ここで、ヒートマップの上半分は、５１Ａ１２に関する肝臓における誘導であるが、１０μｇ／ｋｇ用量のアイソタイプ−ＩＦＮαでは見られない誘導を示し、そして下半分は、高用量でのアイソタイプ−ＩＦＮαに関して血液のみにおける誘導を示す。
定義
本明細書において、用語は、以下に別に定義しない限り、当該技術分野において一般的に用いられるように用いられる。
「アシアロ糖タンパク質受容体」はＡＳＧＰＲと略され、別に示さない限り、哺乳動物、例えば霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）および齧歯類（例えばマウスおよびラット）を含む、任意の脊椎動物供給源由来の、任意の天然ＡＳＧＰＲを指す。用語は、「全長」のプロセシングされていないＡＳＧＰＲ、ならびに細胞におけるプロセシングから生じるＡＳＧＰＲの任意の型を含む。該用語はまた、ＡＳＧＰＲの天然存在変異体、例えばスプライス変異体またはアレル変異体も含む。１つの態様において、本発明の抗体は、ヒトＡＳＧＰＲ、特にヒトＡＳＧＰＲ Ｈ１、より具体的にはヒトＡＳＧＰＲ Ｈ１の細胞外ドメインに特異的に結合可能である。
ヒトＡＳＧＰＲ Ｈ１（ＣＬＥＣ４Ｈ１としても知られる）のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）寄託番号Ｐ０７３０６（バージョン１３１）、またはＮＣＢＩ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００１６６２．１に示される。ヒトＡＳＧＰＲ Ｈ１の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、アミノ酸６２〜２９１位に渡る。ヒトＦｃ領域に融合したヒトＡＳＧＰＲ Ｈ１ ＥＣＤのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号１２９および１３０に示す。ＡＳＧＰＲ Ｈ１ ＥＣＤは、全長配列のアミノ酸６２位からアミノ酸１６０位あたりに渡るストーク領域（配列番号１２３および１２４は、ヒトＦｃ領域に融合したヒトＡＳＧＰＲ Ｈ１ストーク領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す）、および全長配列のアミノ酸１６１位からアミノ酸２７８位あたりに渡る炭水化物認識ドメイン（ＣＲＤ）（配列番号１１７および１１８は、ヒトＦｃ領域に融合したヒトＡＳＧＰＲ Ｈ１ ＣＲＤ領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す）を含む。
１つの態様において、抗体はまた、カニクイザルＡＳＧＰＲ、特にカニクイザルＡＳＧＰＲ Ｈ１、より具体的にはカニクイザルＡＳＧＰＲ Ｈ１の細胞外ドメインに結合可能である。カニクイザルＡＳＧＰＲ Ｈ１の配列は、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＥＨＨ５７６５４．１に示される。配列番号１３１および１３２は、それぞれ、ヒトＦｃ領域に融合したカニクイザルＡＳＧＰＲ Ｈ１ ＥＣＤのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。
「ヒトＣＬＥＣ１０Ａ」によって、ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｑ８ＩＵＮ９（バーション８６）に記載されるタンパク質、特に全長配列のアミノ酸６１位からアミノ酸３１６位に渡る、前記タンパク質の細胞外ドメインを意味する。配列番号１３３および１３４は、それぞれ、ヒトＦｃ領域に融合したヒトＣＬＥＣ１０Ａ ＥＣＤのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。
本明細書において、用語「コンジュゲート」は、１つのエフェクター部分、およびさらなるペプチド分子、特に抗体を含む、融合ポリペプチド分子を指す。抗体およびエフェクター部分の融合タンパク質は、「イムノコンジュゲート」と称される。本明細書で言及されるような（免疫）コンジュゲートは、融合タンパク質であり、すなわち（免疫）コンジュゲートの構成要素は、直接またはペプチドリンカーを通じてのいずれかで、ペプチド結合によって互いに連結される。
「エピトープ」は、抗体によって結合される抗原の領域である。該用語は、抗体が結合し、抗体−抗原複合体を形成する、ポリペプチド巨大分子上の部位（例えばアミノ酸の連続ストレッチ、または非隣接アミノ酸の異なる領域で構成されるコンホメーション配置）を指す。
「エピトープへの結合に関して競合する抗体」は、競合アッセイにおいて、５０％またはそれより高く、その抗原への参照抗体の結合を遮断し、そして逆に、参照抗体は、競合アッセイにおいて、５０％またはそれより高く、その抗原への抗体の結合を遮断する、抗体を指す。例示的な競合アッセイを本明細書に提供する。
「特異的結合」によって、結合が、抗原に関して選択的であり、そして望ましくないまたは非特異的な相互作用から識別可能であることを意味する。酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）または当業者によく知られる他の技術、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（ＢＩＡｃｏｒｅ装置上で分析）（Ｌｉｌｊｅｂｌａｄら， Ｇｌｙｃｏ Ｊ １７， ３２３−３２９（２０００））、および伝統的な結合アッセイ（Ｈｅｅｌｅｙ， Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｓ ２８， ２１７−２２９（２００２））のいずれかを通じて、抗体が特異的抗原に結合する能力を測定することも可能である。１つの態様において、関連しないタンパク質に対する抗体の結合の度合いは、例えばＳＰＲによって測定した際、抗原への抗体の結合の約１０％未満である。特定の態様において、抗原に結合する抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、または≦０．００１ｎＭ（例えば１０−８Ｍまたはそれ未満、例えば１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ）の解離定数（ＫＤ）を有する。
「アフィニティ」または「結合アフィニティ」は、分子（例えば抗体）の単一結合部位およびその結合パートナー（例えば抗原）の間の非共有相互作用の総計の強度を指す。別に示さない限り、本明細書において、「結合アフィニティ」は、結合対（例えば抗体および抗原）のメンバー間の１：１相互作用を反映する、内因性の結合アフィニティを指す。分子ＸのそのパートナーＹに対するアフィニティは、一般的に、解離定数（ＫＤ）によって表され、これは、解離および会合速度定数（それぞれ、ｋｏｆｆおよびｋｏｎ）の比である。したがって、速度定数の比が同じであり続ける限り、同等のアフィニティは、異なる速度定数を含むことも可能である。アフィニティは、本明細書に記載するものを含めて、当該技術分野に知られる一般的な方法によって測定可能である。アフィニティを測定するための特定の方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である。
「減少した結合」、例えばＦｃ受容体に対する減少した結合は、例えばＳＰＲによって測定した際の、それぞれの相互作用に関するアフィニティの減少を指す。明確にするために、該用語には、アフィニティのゼロまでの減少（または分析法の検出限界より下）、すなわち相互作用の完全な撤廃もまた含まれる。逆に、「増加した結合」は、それぞれの相互作用に関する結合アフィニティの増加を指す。
「内在化」によって、前記分子の細胞内空間への取り込みによって、細胞表面から分子を除去することを意味する。内在化の特定の型は、受容体が仲介するエンドサイトーシスであり、これは、細胞表面（膜貫通）受容体へのリガンドまたは抗体の結合に際して、受容体および結合したリガンドまたは抗体を含有する形質膜小胞の内側への出芽によって起こる。当該技術分野に知られる技術を用いて、内在化を評価してもよい。細胞表面上のタンパク質レベルのＦＡＣＳによる決定に基づく方法を、以下の実施例に記載する。
用語「リサイクリング」は、本明細書において、細胞内へ分子が先に内在化した後の、前記細胞の表面上での前記分子の再出現を指す。リサイクリングは、分子が、内在化に際して、細胞内で分解されないことを示す。リサイクリングが内在化と同じ速度で起こるならば、動的安定状態に到達し、この場合、細胞表面上の分子数は本質的に一定である。リサイクリングは、当該技術分野に周知の技術によって、以下の実施例に記載するように、例えば、ＦＡＣＳによる細胞表面上のタンパク質レベルの決定によって、または（共焦点）顕微鏡法を用いることによって、検出可能である。
「下方制御」によって、細胞表面内または細胞表面での特定のタンパク質、例えば細胞表面受容体のコピー数の減少を意味する。下方制御は、本明細書において、特に、細胞表面上に存在する細胞表面タンパク質のコピー数の、例えば内在化および／または分解、または発現減少による、減少を指す。タンパク質レベルの下方制御は、例えばウェスタンブロット（全体のタンパク質レベルに関して）またはＦＡＣＳ（表面タンパク質レベルに関して）を含めて、当該技術分野において確立された多様な方法によって検出可能である。
本明細書において、用語「エフェクター部分」は、例えばシグナル伝達または他の細胞経路を通じて、細胞活性に影響を及ぼす、分子、特にポリペプチド分子（例えばタンパク質または糖タンパク質）を指す。したがって、細胞膜の外側からのシグナルを伝達して、エフェクター部分に対する１またはそれより多い受容体を所持する細胞における反応を調節する、受容体仲介性シグナル伝達と、エフェクター部分を関連付けることも可能である。１つの態様において、エフェクター部分は、エフェクター部分に対する１またはそれより多い受容体を所持する細胞において、細胞傷害性反応を誘発することも可能である。別の態様において、エフェクター部分は、エフェクター部分に対する１またはそれより多い受容体を所持する細胞において、増殖反応を誘発することも可能である。別の態様において、エフェクター部分は、エフェクター部分に対する受容体を所持する細胞において、分化を誘発することも可能である。別の態様において、エフェクター部分は、エフェクター部分に対する受容体を所持する細胞において、内因性細胞タンパク質の発現を改変する（すなわち上方制御するかまたは下方制御する）ことも可能である。エフェクター部分の限定されない例には、小分子、サイトカイン、増殖因子、ホルモン、酵素、基質、および補因子が含まれる。エフェクター部分を、多様な配置で、抗体と会合させてもよい。
用語「付着」には、化学結合またはペプチド結合を含む、任意の種類の相互作用による連結が含まれる。
「融合」は、ペプチド結合によって、直接、あるいは１またはそれより多いペプチドリンカーを通じて連結される構成要素を指す。
本明細書において、用語「サイトカイン」は、生物学的または細胞機能またはプロセス（例えば免疫、炎症、および造血）を仲介するおよび／または制御する分子を指す。用語「サイトカイン」には、本明細書において、リンホカイン、ケモカイン、モノカイン、およびインターロイキンが含まれる。サイトカインの例には、限定されるわけではないが、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−α、およびＴＮＦ−βが含まれる。特定のサイトカインは、インターフェロン（ＩＦＮ）、特にＩＦＮ−αである。特定の態様において、サイトカインはヒトサイトカインである。特定のサイトカイン、ヒトＩＦＮα２およびＩＦＮα２ａの配列を、それぞれ、配列番号１３８および１３９に示す。
「インターフェロン刺激遺伝子」（ＩＳＧ）は、インターフェロン分子、特にＩＦＮα分子と細胞を接触させることによって、前記細胞におけるその発現が刺激されうる遺伝子を指す。典型的には、ＩＳＧは、インターフェロンに活性化される１またはそれより多いシグナル伝達分子（例えばＳＴＡＴ）が結合し、それによってＩＳＧの発現増進を導く、認識配列（例えばインターフェロン刺激反応要素（ＩＳＲＥ））を含む。ＩＳＧの例には、ＭＸ１（ミクソウイルス耐性１、インターフェロン誘導タンパク質ｐ７８としてもまた知られる）、ＲＳＡＤ２（ラジカルＳ−アデノシルメチオニンドメイン含有２、サイトメガロウイルス誘導遺伝子５としてもまた知られる）、ＨＲＡＳＬＳ２（ＨＲＡＳ様サプレッサー２）、ＩＦＩＴ１（テトラトリコペプチド反復を含むインターフェロン誘導タンパク質１）、およびＩＦＩＴＭ２（インターフェロン誘導性膜貫通タンパク質２）が含まれる。
本明細書において、用語「一本鎖」は、ペプチド結合によって直線状に連結されたアミノ酸単量体を含む分子を指す。１つの態様において、エフェクター部分は、一本鎖ペプチド分子である。一本鎖エフェクター部分の限定されない例には、サイトカイン、増殖因子、ホルモン、酵素、基質、および補因子が含まれる。エフェクター部分がサイトカインであり、そして関心対象のサイトカインが通常、天然で多量体として見出される場合、多量体サイトカインの各サブユニットは、エフェクター部分の一本鎖によって連続してコードされる。したがって、有用な一本鎖エフェクター部分の限定されない例には、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−α、およびＴＮＦ−βが含まれる。
本明細書において、用語「エフェクター部分受容体」は、エフェクター部分に特異的に結合可能なポリペプチド分子を指す。エフェクター部分が、１より多い受容体に特異的に結合する場合、エフェクター部分に特異的に結合するすべての受容体は、そのエフェクター部分に関して、「エフェクター部分受容体」である。例えば、ＩＦＮαがエフェクター部分である場合、ＩＦＮα分子（例えばＩＦＮαに融合した抗体）に結合するエフェクター部分受容体は、ＩＦＮα受容体１または２である（ヒトＩＦＮα受容体１に関しては、ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｐ１７１８１（バージョン１２１）およびＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿０００６２０．２、ならびにヒトＩＦＮα受容体２に関しては、ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｐ４８５５１（バージョン１３１）およびＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑｓ ＮＰ＿９９７４６７．１およびＮＰ＿９９７４６８．１を参照されたい）。
用語「抗体」は、本明細書において、最も広い意味で用いられ、そして限定されるわけではないが、望ましい抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、および抗体断片を含む、多様な抗体構造を含む。
「抗体断片」は、損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）抗体が結合する抗原に結合する損なわれていない抗体の部分を含む、損なわれていない抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、限定されるわけではないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ディアボディ、直鎖抗体、一本鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）、および単一ドメイン抗体が含まれる。特定の抗体断片の概説に関しては、Ｈｕｄｓｏｎら， Ｎａｔ Ｍｅｄ ９， １２９−１３４（２００３）を参照されたい。ｓｃＦｖ断片の概説に関しては、例えばＰｌｕｅｃｋｔｈｕｎ， Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， ｖｏｌ． １１３中， ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ監修， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ． ２６９−３１５（１９９４）を参照されたい；また、ＷＯ ９３／１６１８５；ならびに米国特許第５，５７１，８９４号および第５，５８７，４５８号も参照されたい。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、そして増加したｉｎ ｖｉｖｏ半減期を有するＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片の考察に関しては、米国特許第５，８６９，０４６号を参照されたい。ディアボディは、二価または二重特異性でありうる、２つの抗原結合部位を持つ抗体断片である。例えば、ＥＰ ４０４，０９７； ＷＯ １９９３／０１１６１； Ｈｕｄｓｏｎら， Ｎａｔ Ｍｅｄ ９， １２９−１３４（２００３）；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒら， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０， ６４４４−６４４８（１９９３）を参照されたい。トリアボディおよびテトラボディもまた、Ｈｕｄｓｏら， Ｎａｔ Ｍｅｄ ９， １２９−１３４（２００３）に記載される。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインのすべてまたは一部あるいは軽鎖可変ドメインのすべてまたは一部を含む抗体断片である。特定の態様において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ， Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州ウォルサム；例えば、米国特許第６，２４８，５１６ Ｂ１号を参照されたい）。限定されるわけではないが、本明細書に記載するような、損なわれていない抗体のタンパク質分解的消化、ならびに組換え宿主細胞（例えば大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）またはファージ）による産生を含む、多様な技術によって、抗体断片を作製してもよい。
用語「全長抗体」、「損なわれていない抗体」、および「全抗体」は、本明細書において、交換可能に用いられ、天然抗体構造と実質的に類似の構造を有するか、または本明細書に定義するようなＦｃ領域を含有する重鎖を有する抗体を指す。
「天然抗体」は、多様な構造を持つ天然存在免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然ＩｇＧクラス抗体は、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質であり、ジスルフィド結合された２つの軽鎖および２つの重鎖で構成される。Ｎ末端からＣ末端に、各重鎖は、可変重鎖ドメインまたは重鎖可変ドメインとも称される可変領域（ＶＬ）、その後、重鎖定常領域とも呼ばれる３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端に、各軽鎖は、可変軽鎖ドメインまたは軽鎖可変ドメインとも称される可変領域（ＶＬ）、その後、軽鎖定常領域とも呼ばれる軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を有する。抗体重鎖は、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）またはμ（ＩｇＭ）と称される５つのタイプの１つに割り当て可能であり、これらのいくつかはさらに、サブタイプ、例えばγ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）、γ４（ＩｇＧ４）、α１（ＩｇＡ１）およびα２（ＩｇＡ２）にさらに分割可能である。抗体軽鎖は、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と称される２つのタイプの１つに割り当て可能である。ＩｇＧクラス抗体は、本質的に２つのＦａｂ断片およびＦｃドメインからなり、免疫グロブリンヒンジ領域を通じて連結される。
本明細書において、「Ｆａｂ断片」は、ＶＬドメインおよび軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ）を含む軽鎖断片、ならびにＶＨドメインおよび重鎖の第一の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む、抗体断片を指す。
抗体または免疫グロブリンの「クラス」は、重鎖によって所持される定常ドメインまたは定常領域のタイプを指す。抗体の５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩＧＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがあり、そしてこれらのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２に分割可能である。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと称される。
用語「可変領域」または「可変ドメイン」は、抗原への抗体の結合に関与する抗体重鎖または軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれ、ＶＨおよびＶＬ）は、一般的に、類似の構造を有し、各ドメインは、４つの保存されるフレームワーク領域（ＦＲ）および３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む。例えば、Ｋｉｎｄｔら， Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， 第６版， Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．， ９１ページ（２００７）を参照されたい。単一ＶＨまたはＶＬドメインは、抗原結合特異性を与えるのに十分でありうる。
用語「超可変領域」または「ＨＶＲ」は、本明細書において、配列が超可変であり、そして／または構造的に定義されるループ（「超可変ループ」）を形成する、抗体可変ドメインの領域各々を指す。一般的に、天然の４鎖抗体は、６つのＨＶＲを含み；３つはＶＨ中（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）にあり、そして３つはＶＬ中（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）にある。ＨＶＲは、一般的に、超可変ループ由来、および／または相補性決定領域（ＣＤＲ）由来のアミノ酸残基を含み、後者は最高の配列可変性を持ち、そして／または抗原認識に関与する。例示的な超可変ループは、アミノ酸残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）、９１〜９６（Ｌ３）、２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）、および９６〜１０１（Ｈ３）に存在する（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９６， ９０１−９１７（１９８７））。例示的なＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３）は、Ｌ１のアミノ酸残基２４〜３４、Ｌ２の５０〜５６、Ｌ３の８９〜９７、Ｈ１の３１〜３５Ｂ、Ｈ２の５０〜６５およびＨ３の９５〜１０２に存在する（Ｋａｂａｔら， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， 第５版 Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ（１９９１））。ＶＨ中のＣＤＲ１を例外として、ＣＤＲは、一般的に、超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。ＣＤＲはまた、抗原と接触する残基である「特異性決定残基」または「ＳＤＲ」も含む。ＳＤＲは、短縮−ＣＤＲまたはａ−ＣＤＲと称されるＣＤＲの領域内に含有される。例示的なａ−ＣＤＲ（ａ−ＣＤＲ−Ｌ１、ａ−ＣＤＲ−Ｌ２、ａ−ＣＤＲ−Ｌ３、ａ−ＣＤＲ−Ｈ１、ａ−ＣＤＲ−Ｈ２、およびａ−ＣＤＲ−Ｈ３）は、Ｌ１のアミノ酸残基３１〜３４、Ｌ２の５０〜５５、Ｌ３の８９〜９６、Ｈ１の３１〜３５Ｂ、Ｈ２の５０〜５８、およびＨ３の９５〜１０２に存在する（ＡｌｍａｇｒｏおよびＦｒａｎｓｓｏｎ， Ｆｒｏｎｔ． Ｂｉｏｓｃｉ． １３， １６１９−１６３３（２００８）を参照されたい）。別に示さない限り、ＨＶＲ残基および可変ドメイン中の他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、本明細書において、Ｋａｂａｔら、上記にしたがって番号付けされる（「Ｋａｂａｔ番号付け」と称される）。
「フレームワーク」または「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般的に、４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４からなる。したがって、ＨＶＲおよびＦＲ配列は、一般的に、ＶＨ（またはＶＬ）中、以下の順序で現れる： ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４。
「アフィニティ成熟」抗体は、こうした改変を持たない親抗体と比較して、１またはそれより多い超可変領域（ＨＶＲ）中に１またはそれより多い改変を持つ抗体を指し、こうした改変は、抗原に対する抗体アフィニティの改善を生じる。
用語「親抗体」は、本明細書において、抗体変異体の調製の出発点または基礎として働く抗体を指す。１つの態様において、親抗体は、ヒト化またはヒト抗体である。
「ヒト抗体」は、ヒトまたはヒト細胞によって産生されるか、あるいはヒト抗体レパートリーまたは他のヒト抗体コード配列を利用する非ヒト供給源に由来する抗体のものに対応するアミノ酸配列を所持するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に排除する。
用語「モノクローナル抗体」は、本明細書において、実質的に均質な抗体集団から得られる抗体、すなわち個々の抗体を含む集団が、例えば天然存在突然変異またはモノクローナル抗体調製物の産生中に生じる突然変異を含有するありうる変異体抗体を除いて、同一であり、そして／または同じエピトープに結合する抗体を意味し、こうした変異体は一般的に少量でしか存在しない。典型的には、異なる決定基（エピトープ）に対して向けられる、異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して向けられる。したがって、修飾語句「モノクローナル」は、抗体の実質的に均質な集団から得られているものとしての抗体の特性を示し、そしていかなる特定の方法による抗体の産生も必要とするとは見なされないものとする。例えば、本発明にしたがって用いようとするモノクローナル抗体は、限定されるわけではないが、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージ−ディスプレイ法、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座のすべてまたは一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法を含む、多様な技術によって作製可能であり、こうした方法およびモノクローナル抗体を作製するための他の例示的な方法は、本明細書に記載される。
用語「Ｆｃドメイン」または「Ｆｃ領域」は、本明細書において、定常領域の少なくとも部分を含有する抗体重鎖のＣ末端領域を定義するよう用いられる。該用語には、天然配列Ｆｃ領域および変異体Ｆｃ領域が含まれる。ＩｇＧ Ｆｃ領域は、ＩｇＧ ＣＨ２およびＩｇＧ ＣＨ３ドメインを含む。ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」は、通常、ほぼ２３１位のアミノ酸残基から、ほぼ３４０位のアミノ酸残基に渡る。１つの態様において、炭水化物鎖がＣＨ２ドメインに付着する。ＣＨ２ドメインは、本明細書において、天然配列ＣＨ２ドメインまたは変異体ＣＨ２ドメインであることも可能である。「ＣＨ３ドメイン」は、Ｆｃ領域中のＣ末端からＣＨ２ドメインまでの残基のストレッチを含む（すなわち、ＩｇＧのほぼ３４１位のアミノ酸残基からほぼ４４７位のアミノ酸残基）。ＣＨ３領域は、本明細書において、天然配列ＣＨ３ドメインまたは変異体ＣＨ３ドメイン（例えば、その１つの鎖に、導入された「突起」（「ノブ」）を、そしてその他方の鎖に、対応して導入された「空洞」（「穴」）を持つＣＨ３ドメイン；本明細書に明らかに援用される米国特許第５，８２１，３３３号を参照されたい）であることも可能である。こうした変異体ＣＨ３ドメインを用いて、本明細書に記載するような２つの同一でない抗体重鎖のヘテロ二量体化を促進することも可能である。１つの態様において、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６、またはＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端に渡る。しかし、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在してもまたはしなくてもよい。別に明記しない限り、Ｆｃ領域または定常領域中のアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔら， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， 第５版 Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ， １９９１に記載されるような、ＥＵインデックスとも称されるＥＵ番号付け系にしたがう。
用語「エフェクター機能」は、抗体アイソタイプで異なる、抗体のＦｃ領域に起因するその生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例には：Ｃ１ｑ結合および補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞仲介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、サイトカイン分泌、抗原提示細胞による免疫複合体仲介性抗原取り込み、細胞表面受容体（例えばＢ細胞受容体）の下方制御、およびＢ細胞活性化が含まれる。
「活性化Ｆｃ受容体」は、抗体のＦｃ領域による会合後、受容体所持細胞がエフェクター機能を実行するように刺激する事象を誘発する、Ｆｃ受容体である。活性化Ｆｃ受容体には、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）、およびＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）が含まれる。特定の活性化Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ（ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｐ０８６３７（バージョン１４１）を参照されたい）である。
用語「ペプチドリンカー」は、典型的には約２〜２０アミノ酸である、１またはそれより多いアミノ酸を含むペプチドを指す。ペプチドリンカーは当該技術分野に知られるか、または本明細書に記載される。適切な非免疫原性リンカーペプチドには、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎ、（ＳＧ４）ｎまたはＧ４（ＳＧ４）ｎペプチドリンカーが含まれる。「ｎ」は一般的に１〜１０、典型的には２〜４の間の数字である。
「ヘテロ二量体化を促進する修飾」は、ペプチド主鎖の操作、またはポリペプチド、例えば抗体重鎖の翻訳後修飾であり、ホモ二量体を形成するような、同一ポリペプチドを持つポリペプチドの会合を減少させるかまたは防止する。本明細書において、ヘテロ二量体化を促進する修飾には、特に、二量体を形成することが望ましい２つのポリペプチド各々に作製される別個の修飾が含まれ、ここで、修飾は、２つのポリペプチドの会合を促進するように、互いに相補的である。例えば、ヘテロ二量体化を促進する修飾は、それぞれ、その会合が立体的にまたは静電的に好ましくなるように、二量体を形成することが望ましいポリペプチドの一方または両方の構造または電荷を改変することも可能である。ヘテロ二量体化は、２つの非同一ポリペプチド、例えば重鎖各々に付着しているさらなる構成要素（例えばエフェクター部分）が同じではない２つの抗体重鎖の間で起こる。本発明にしたがった抗体において、ヘテロ二量体化を促進する修飾は、Ｆｃドメイン中、特にＣＨ３ドメイン中である。いくつかの態様において、ヘテロ二量体化を促進する修飾はアミノ酸突然変異、特にアミノ酸置換を含む。特定の態様において、ヘテロ二量体化を促進する修飾は、２つの抗体重鎖各々において、別個のアミノ酸突然変異、具体的にはアミノ酸置換を含む。
「ノブを穴に修飾」は、ＣＨ３ドメイン中の２つの抗体重鎖の間の界面内の修飾を指し、ｉ）１つの重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基はより大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それによって１つの重鎖のＣＨ３ドメイン中の界面内に突起（「ノブ」）を生成し、これを他方の重鎖のＣＨ３ドメイン中の界面内の空洞（「穴」）中に配置可能であり、そしてｉｉ）他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基はより小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それによって第二のＣＨ３ドメイン中の界面内に空洞（「穴」）を生成し、この中に第一のＣＨ３ドメイン中の界面内の突起（「ノブ」）が配置可能である。１つの態様において、「ノブを穴に修飾」は、１つの抗体重鎖において、アミノ酸置換Ｔ３６６Ｗおよび場合によってアミノ酸置換Ｓ３５４Ｃを、そして他方の抗体重鎖において、アミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖおよび場合によってＹ３４９Ｃを含む。
アミノ酸「置換」は、１つのアミノ酸の別のアミノ酸でのポリペプチド中の交換を指す。１つの態様において、アミノ酸は、類似の構造的および／または化学的特性を有する別のアミノ酸で置換され、例えば保存的アミノ酸置換である。「保存的」アミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性、および／または両親媒性性質の類似性に基づいて行われうる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが含まれ；極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが含まれ；陽性荷電（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リジン、およびヒスチジンが含まれ；そして陰性荷電（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーの、別のクラスに対する交換を伴うであろう。例えばアミノ酸置換は、１つのアミノ酸の、異なる構造的および／または化学的特性を有する別のアミノ酸での置換を生じることも可能であり、例えば１つの群（例えば極性）由来のアミノ酸の、異なる群（例えば塩基性）由来の別のアミノ酸での置換がある。当該技術分野に周知の遺伝的または化学的方法を用いて、アミノ酸置換を生成してもよい。遺伝的方法には、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ、遺伝子合成等が含まれうる。遺伝子操作以外の方法によって、アミノ酸側鎖基を改変する方法が意図され、例えば化学修飾もまた有用でありうる。本明細書において、同じアミノ酸置換を示すために、多様な指定が用いられうる。例えば、Ｆｃドメインの３２９位のプロリンからグリシンへの置換は、３２９Ｇ、Ｇ３２９、Ｇ３２９、Ｐ３２９ＧまたはＰｒｏ３２９Ｇｌｙと示されうる。
参照ポリペプチド配列に関する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、配列を整列させ、そして必要であればギャップを導入して最大配列同一性パーセントを達成した後、そしていかなる保存的置換も配列同一性の一部と見なさずに、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である、候補配列中のアミノ酸残基の割合と定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のための整列は、当該技術分野の技術範囲内の多様な方式で、例えば、公的に入手可能なコンピュータソフトウェア、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを用いて、達成可能である。当業者は、配列を整列させるために、適切なパラメータを決定可能であり、これには、比較しようとする配列の全長に渡って、最大整列を達成するのに必要ないかなるアルゴリズムも含まれる。しかし、本明細書の目的のため、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を用いて、アミノ酸同一性％値を生成する。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ， Ｉｎｃ．によって作成され、そしてソースコードは、米国著作権局， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．， ２０５５９にユーザー文書とともにファイリングされ、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下に登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ， Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サウスサンフランシスコから公的に入手可能であるか、またはソースコードからコンパイル可能である。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ（登録商標） Ｖ４．０Ｄを含むＵＮＩＸオペレーティングシステム上で使用するためにはコンパイルしなければならない。すべての配列比較パラメータはＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され、そして多様ではない。ＡＬＩＧＮ−２をアミノ酸配列比較に使用する状況においては、所定のアミノ酸配列Ａの、所定のアミノ酸配列Ｂへの、Ｂとの、またはＢに対するアミノ酸配列同一性％（あるいは所定のアミノ酸配列Ｂへの、Ｂとの、またはＢに対する特定のアミノ酸配列同一性％を有するかまたは含む、所定のアミノ酸配列Ａと表現することも可能である）は、以下のように計算される：
分数Ｘ／Ｙの１００倍
式中、Ｘは、ＡおよびＢのプログラムの整列中の配列整列プログラムＡＬＩＧＮ−２によって同一マッチとスコアリングされたアミノ酸残基の数であり、そしてＹはＢ中のアミノ酸残基総数である。アミノ酸配列Ａの長さが、アミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、Ｂに対するＡのアミノ酸配列同一性％は、Ａに対するＢのアミノ酸配列同一性％と等しくないであろうことが認識されるであろう。別に明記しない限り、本明細書で用いるすべてのアミノ酸配列同一性％値は、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを用いて、直前のパラグラフに記載するように得られる。
「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、本明細書において、交換可能に用いられ、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、そしてＤＮＡおよびＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドまたは塩基、および／またはその類似体、あるいはＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼによって、または合成反応によって、ポリマー内に取り込まれうる任意の基質であってもよい。ポリヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチドおよびその類似体を含んでもよい。ヌクレオチド配列は、非ヌクレオチド構成要素によって中断されてもよい。ポリヌクレオチドは、合成後に作製される修飾（単数または複数）、例えば標識へのコンジュゲート化を含んでもよい。
用語「ベクター」は、本明細書において、連結している別の核酸を増殖させることが可能な核酸分子を指す。該用語には、自己複製核酸構造としてのベクター、ならびに導入されている宿主細胞ゲノム内に取り込まれたベクターが含まれる。特定のベクターは、機能可能であるように連結されている核酸の発現を指示することが可能である。こうしたベクターは、本明細書において、「発現ベクター」と称される。
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」、および「宿主細胞培養」は、交換可能に用いられ、そしてこうした細胞の子孫を含めて、外因性核酸が導入されている細胞を指す。宿主細胞には、「形質転換体」および「形質転換細胞」が含まれ、これには、初代形質転換細胞、および継代数に関わらず、これに由来する子孫が含まれる。子孫は、親細胞と核酸内容物が完全に同一でなくてもよく、突然変異を含有してもよい。元来形質転換された細胞において、スクリーニングされるかまたは選択されたものと同じ機能または生物学的活性を有する突然変異体子孫が、本明細書に含まれる。宿主細胞は、本発明の抗体を生成するために使用可能な任意のタイプの細胞系である。宿主細胞には、培養細胞、例えば哺乳動物培養細胞、例えばいくつかのみ挙げれば、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞またはハイブリドーマ細胞、酵母細胞、昆虫細胞、および植物細胞が含まれるが、また、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物または培養植物または動物組織内に含まれる細胞も含まれる。
剤の「有効量」は、投与される細胞または組織において、生理学的変化を生じるのに必要な量を指す。
剤、例えば薬学的組成物の「療法的有効量」は、望ましい療法的または予防的結果を達成するのに必要な投薬量および期間で、有効な量を指す。剤の療法的有効量、例えば、疾患の不都合な影響を排除するか、減少させるか、遅延させるか、最小限にするか、または防止する。
「個体」または「被験体」は、哺乳動物である。哺乳動物には、限定されるわけではないが、家畜（例えばウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、およびウマ）、霊長類（例えばヒトおよび非ヒト霊長類、例えばサル）、ウサギ、および齧歯類（例えばマウスおよびラット）が含まれる。特に、個体または被験体はヒトである。
用語「薬学的組成物」は、含有される活性成分の生物学的活性が有効であることを可能にするような型で、そして配合物を投与する被験体に対して、許容しえないほど毒性であるさらなる構成要素をまったく含有しない、調製物を指す。
「薬学的に許容されうるキャリアー」は、活性成分以外であり、被験体に対して毒性でない、薬学的組成物中の成分を指す。薬学的に許容されうるキャリアーには、限定されるわけではないが、緩衝剤、賦形剤、安定化剤、または保存剤が含まれる。
本明細書において、「治療」（およびその文法的な変形、例えば「治療する」または「治療すること」）は、治療中の個体において、疾患の天然経過を改変することを試みる臨床的介入を指し、そして予防のため、または臨床病理経過中のいずれで実行することも可能である。治療の望ましい効果には、限定されるわけではないが、疾患の発生または再発の防止、症状の軽減、疾患の任意の直接または間接的病理学的結果の減少、転移の防止、疾患進行速度の減少、疾患状態の回復および緩和、ならびに予後の寛解または改善が含まれる。いくつかの態様において、本発明の抗体を用いて、疾患の発展を遅延させるかまたは疾患の進行を緩慢にする。
本発明の抗体
本発明は、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）に結合する、新規抗体、特にモノクローナル抗体を提供する。
第一の側面において、本発明は、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）に特異的に結合可能な抗体であって、ａ）配列番号１６の重鎖可変領域配列および配列番号１４の軽鎖可変領域配列；ｂ）配列番号４の重鎖可変領域配列および配列番号２の軽鎖可変領域配列；ｃ）配列番号８の重鎖可変領域配列および配列番号６の軽鎖可変領域配列；ｄ）配列番号１２の重鎖可変領域配列および配列番号１０の軽鎖可変領域配列；ｅ）配列番号２０の重鎖可変領域配列および配列番号１８の軽鎖可変領域配列；ｆ）配列番号２４の重鎖可変領域配列および配列番号２２の軽鎖可変領域配列；ｇ）配列番号２８の重鎖可変領域配列および配列番号２６の軽鎖可変領域配列；ｈ）配列番号４の重鎖可変領域配列および配列番号３０の軽鎖可変領域配列；ｉ）配列番号４の重鎖可変領域配列および配列番号３２の軽鎖可変領域配列；ｊ）配列番号４の重鎖可変領域配列および配列番号３４の軽鎖可変領域配列；またはｋ）配列番号２４の重鎖可変領域配列および配列番号２２の軽鎖可変領域配列を含む、前記抗体を提供する。
本発明にしたがって、特定の抗体は、配列番号１６の重鎖可変領域配列および配列番号１４の軽鎖可変領域配列を含む。この抗体クローンは４Ｆ３と称される。本発明にしたがった別の特定の抗体は、配列番号４の重鎖可変領域配列および配列番号２の軽鎖可変領域配列を含む。この抗体は５１Ａ１２と称される。
本発明は、ＡＳＧＰＲに特異的に結合可能であり、そして抗体４Ｆ３とＡＳＧＰＲのエピトープへの結合に関して競合する抗体を提供する。１つの態様において、こうした抗体は、４Ｆ３と同じエピトープに結合する。４Ｆ３抗体は、ＡＳＧＰＲのストーク領域中のエピトープを認識する。したがって、１つの態様において、こうした抗体は、ＡＳＧＰＲのストーク領域中のエピトープを認識する。本発明によってやはり意図されるのは、４Ｆ３抗体のアフィニティ成熟変異体である。１つの態様において、こうした抗体は、配列番号１６の配列に少なくとも約９６％、９７％、９８％または９９％同一である重鎖可変領域配列、および配列番号１４の配列に少なくとも約９６％、９７％、９８％または９９％同一である軽鎖可変領域配列を含む。１つの態様において、こうした抗体は、１、２、３、４、５、６または７の、特に２、３、４または５のアミノ酸置換を含む配列番号１４の軽鎖可変領域配列を含む。１つの態様において、こうした抗体は、１、２、３、４、５、６または７の、特に２、３、４または５のアミノ酸置換を含む配列番号１６の重鎖可変領域配列を含む。４Ｆ３抗体の変異体はまた、変異体軽鎖可変領域とともに、４Ｆ３の重鎖可変領域と同一である重鎖可変領域も含んでもよく、またはその逆でもよい。
本発明はさらに、ＡＳＧＰＲに特異的に結合可能であり、そして抗体５１Ａ１２とＡＳＧＰＲのエピトープへの結合に関して競合する抗体を提供する。１つの態様において、こうした抗体は、５１Ａ１２と同じエピトープに結合する。５１Ａ１２抗体は、ＡＳＧＰＲの炭水化物認識ドメイン（ＣＲＤ）中のエピトープを認識する。したがって、１つの態様において、こうした抗体は、ＡＳＧＰＲのＣＲＤ中のエピトープを認識する。本発明によってやはり意図されるのは、５１Ａ１２抗体のアフィニティ成熟変異体、特に軽鎖ＣＤＲ３または５１Ａ１２のランダム化によって得られる変異体である。１つの態様において、こうした抗体は、配列番号４の配列に少なくとも約９６％、９７％、９８％または９９％同一である重鎖可変領域配列、および配列番号２の配列に少なくとも約９６％、９７％、９８％または９９％同一である軽鎖可変領域配列を含む。１つの態様において、こうした抗体は、１、２、３、４、５、６または７の、特に２、３、４または５のアミノ酸置換を含む配列番号２の軽鎖可変領域配列を含む。１つの態様において、こうした抗体は、１、２、３、４、５、６または７の、特に２、３、４または５のアミノ酸置換を含む配列番号４の重鎖可変領域配列を含む。５１Ａ１２抗体の変異体はまた、変異体軽鎖可変領域とともに、５１Ａ１２の重鎖可変領域と同一である重鎖可変領域も含んでもよく、またはその逆でもよい。１つの態様において、こうした抗体は、ａ）配列番号４の重鎖可変領域配列および配列番号３６の軽鎖可変領域配列；ｂ）配列番号４の重鎖可変領域配列および配列番号３８の軽鎖可変領域配列；ｃ）配列番号８の重鎖可変領域配列および配列番号４０の軽鎖可変領域配列；ｄ）配列番号１２の重鎖可変領域配列および配列番号４２の軽鎖可変領域配列；ｅ）配列番号２０の重鎖可変領域配列および配列番号４４の軽鎖可変領域配列；ｆ）配列番号２４の重鎖可変領域配列および配列番号４６の軽鎖可変領域配列；またはｇ）配列番号２８の重鎖可変領域配列および配列番号４８の軽鎖可変領域配列を含む。
好ましくは、本発明の抗体はヒト抗体であり、すなわち抗体はヒト可変および定常領域を含む。１つの態様において、抗体は、ヒトＦｃ領域、特にヒトＩｇＧ Ｆｃ領域、より具体的にはヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。本発明にしたがった特定の抗体は、全長抗体、特に全長ＩｇＧクラス抗体、より具体的には全長ＩｇＧ１サブクラス抗体である。あるいは、抗体は、抗体断片であってもよい。１つの態様において、抗体は、Ｆａｂ断片またはｓｃＦｖ断片中である。いくつかの態様において、抗体は、免疫グロブリンヒンジ領域、特にヒトＩｇＧヒンジ領域、より具体的にはヒトＩｇＧ１ヒンジ領域によって連結された、Ｆａｂ断片およびＦｃ領域、特にヒトＩｇＧ Ｆｃ領域、より具体的にはヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。特に、抗体は、免疫グロブリンヒンジ領域によって連結された、Ｆａｂ断片およびＦｃ領域を含んでもよく、ここでさらなるＦａｂ断片は存在しない。こうした態様において、抗体は、本質的に、１つのＦａｂ断片を欠く全長抗体である。
本発明の抗体で構成されるＦｃ領域は、天然Ｆｃ領域に比較した際、多様な修飾を含んでもよい。
Ｆｃドメインは、ターゲット組織における優れた集積および好ましい組織−血液分布比に寄与する長い血清半減期を含む、好ましい薬理学的特性を抗体に与えるが、同時に、好ましい抗原所持細胞に対するよりも、Ｆｃ受容体を発現している細胞への抗体の望ましくないターゲティングを導きうる。さらに、Ｆｃ受容体シグナル伝達経路の同時活性化は、サイトカイン放出を導く可能性もあり、これは、特に、付着したエフェクター部分（例えばサイトカイン）を有する抗体において、サイトカイン受容体の過剰な活性化および全身投与に際して重度の副作用を生じうる。したがって、いくつかの態様において、抗体は、非修飾Ｆｃ領域を含む対応する抗体に比較した際、Ｆｃ領域中に、Ｆｃ受容体、特にＦｃγ受容体への抗体の結合アフィニティを減少させる修飾を含む。Ｆｃ受容体への結合は、ＥＬＩＳＡによって、または表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、標準的な装置、例えばＢＩＡｃｏｒｅ装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）および組換え発現によって選られうるものなどのＦｃ受容体を用いて、容易に決定可能である。結合アフィニティを測定するための、特定の例示的なおよび典型的な態様を以下に記載する。１つの態様にしたがって、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ１００装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、ＣＭ５チップ上に固定されたリガンド（Ｆｃ受容体）とともに２５℃で用いた表面プラズモン共鳴によって、Ｆｃ受容体への結合アフィニティを測定する。簡潔には、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、供給者の指示にしたがって、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化する。組換えリガンドを１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５で、０．５〜３０μｇ／ｍｌに希釈した後、１０μｌ／分の流速で注入して、およそ１００〜５０００反応単位（ＲＵ）のカップリングタンパク質を達成する。リガンド注入後、１Ｍエタノールアミンを注入して未反応基をブロッキングする。動力学的測定のため、抗体の３〜５倍の連続希釈（〜０．０１ｎＭ〜３００ｎＭの間の範囲）をＨＢＳ−ＥＰ＋（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％サーファクタントＰ２０、ｐＨ７．４）中、２５℃で、およそ３０〜５０μｌ／分の流速で注入する。会合および解離センサーグラムを同時に適合させることによって、単純な１対１ラングミュア結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ１００評価ソフトウェアバージョン１．１．１）を用いて、会合速度（ｋｏｎ）および解離速度（ｋｏｆｆ）を計算する。平衡解離定数（ＫＤ）を比ｋｏｆｆ/ｋｏｎとして計算する。例えば、Ｃｈｅｎら， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９３， ８６５−８８１（１９９９）を参照されたい。あるいは、特定のＦｃ受容体を発現することが知られる細胞株、例えばＦｃγＩＩＩａ受容体を発現しているＮＫ細胞を用いて、Ｆｃ受容体に対する結合アフィニティ抗体を評価してもよい。
修飾において、Ｆｃ受容体への抗体の結合アフィニティを減少させる１またはそれより多いアミノ酸突然変異を含む。典型的には、同じ１またはそれより多いアミノ酸突然変異が、Ｆｃドメイン中、２つの抗体重鎖の各々に存在する。１つの態様において、前記アミノ酸突然変異は、少なくとも２倍、少なくとも５倍、または少なくとも１０倍、Ｆｃ受容体への抗体の結合アフィニティを減少させる。Ｆｃ受容体への抗体の結合アフィニティを減少させる、１より多いアミノ酸突然変異がある態様において、これらのアミノ酸突然変異の組み合わせは、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、またはさらに少なくとも５０倍、Ｆｃ受容体への抗体の結合アフィニティを減少させうる。１つの態様において、抗体は、非修飾Ｆｃドメインを含む抗体に比較した際、２０％未満、特に１０％未満、より具体的には５％未満の、Ｆｃ受容体に対する結合アフィニティを示す。
１つの態様において、Ｆｃ受容体は、活性化Ｆｃ受容体である。特定の態様において、Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体、より具体的にはＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩまたはＦｃγＲＩＩａ受容体である。好ましくは、これらの受容体各々への結合が減少する。いくつかの態様において、補体構成要素への結合アフィニティ、特にＣ１ｑへの結合アフィニティもまた減少する。１つの態様において、新生Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合アフィニティは減少しない。ＦｃＲｎへの実質的に類似の結合、すなわち前記受容体への抗体の結合アフィニティの保持は、抗体が、ＦｃＲｎへの抗体の非修飾型の結合アフィニティの約７０％より高い結合アフィニティを示す場合、達成されている。本発明の抗体は、こうしたアフィニティの約８０％より高い、そしてさらに約９０％より高いアフィニティを示すことも可能である。１つの態様において、アミノ酸突然変異はアミノ酸置換である。１つの態様において、抗体は、Ｐ３２９位（ＥＵ番号付け）でＦｃ領域中にアミノ酸置換を含む。より具体的な態様において、アミノ酸置換はＰ３２９ＡまたはＰ３２９Ｇ、特にＰ３２９Ｇである。１つの態様において、抗体は、Ｓ２２８、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７およびＰ３３１より選択される位で、Ｆｃ領域中にさらなるアミノ酸置換を含む。より具体的な態様において、さらなるアミノ酸置換は、Ｓ２２８Ｐ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７ＤまたはＰ３３１Ｓである。特定の態様において、抗体は、Ｐ３２９、Ｌ２３４およびＬ２３５位で、Ｆｃ領域中にアミノ酸置換を含む。より具体的な態様において、抗体は、アミノ酸突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ｇ（ＬＡＬＡ Ｐ３２９Ｇ）を含む。アミノ酸置換のこの組み合わせは、本明細書にその全体が援用される、ＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０５５３９３号に記載されるように、ヒトＩｇＧ抗体のＦｃγ受容体結合をほぼ完全に無効にする。ＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０５５３９３号はまた、こうした修飾抗体を調製する方法、およびＦｃ受容体結合またはエフェクター機能などのその特性を決定するための方法も記載する。
当該技術分野に周知の遺伝的または化学的方法を用いて、アミノ酸欠失、置換、挿入または修飾によって、Ｆｃ領域中に修飾を含む抗体を調製することも可能である。遺伝的方法には、コードＤＮＡ配列の部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ、遺伝子合成等が含まれうる。例えば配列決定によって、正しいヌクレオチド変化を検証してもよい。
Ｆｃ受容体結合を減少させる修飾を含む抗体は、一般的に、対応する非修飾抗体と比較した際、エフェクター機能減少、特にＡＤＣＣ減少を有する。いくつかの態様において、抗体はＡＤＣＣ減少を有する。特定の態様において、ＡＤＣＣ減少は、非修飾Ｆｃ領域を含む対応する抗体によって誘導されるＡＤＣＣの２０％未満である。当該技術分野に知られる方法によって、抗体のエフェクター機能を測定することも可能である。関心対象の分子のＡＤＣＣ活性を評価するｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの例は、米国特許第５，５００，３６２号； Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８３， ７０５９−７０６３（１９８６）およびＨｅｌｌｓｔｒｏｍら， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８２， １４９９−１５０２（１９８５）；米国特許第５，８２１，３３７号； Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら， Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １６６， １３５１−１３６１（１９８７）に記載される。あるいは、非放射性アッセイ法を使用してもよい（例えば、フローサイトメトリー用のＡＣＴＩＴＭ非放射性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｉｎｃ． カリフォルニア州マウンテンビュー）；およびＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）を参照されたい）。こうしたアッセイの有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。あるいは、またはさらに、関心対象の分子のＡＤＣＣ活性をｉｎ ｖｉｖｏで、例えばＣｌｙｎｅｓら， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５， ６５２−６５６（１９９８）に開示されるものなどの動物モデルにおいて、評価してもよい。いくつかの態様において、補体構成要素、特にＣ１ｑに対する抗体の結合もまた減少する。したがって、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）もまた減少しうる。Ｃ１ｑ結合アッセイを行って、抗体がＣ１ｑに結合可能であるかどうか、そしてしたがってＣＤＣ活性を有するかどうかを決定してもよい。例えばＷＯ ２００６／０２９８７９およびＷＯ ２００５／１００４０２中のＣ１ｑおよびＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照されたい。補体活性化を評価するため、ＣＤＣアッセイを行ってもよい（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏら， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２， １６３（１９９６）； Ｃｒａｇｇら， Ｂｌｏｏｄ １０１， １０４５−１０５２（２００３）；ならびにＣｒａｇｇおよびＧｌｅｎｎｉｅ， Ｂｌｏｏｄ １０３， ２７３８−２７４３（２００４）を参照されたい）。
上記のそしてＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０５５３９３の抗体に加えて、Ｆｃ受容体結合および／またはエフェクター機能が減少した抗体にはまた、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７および３２９の１またはそれより多くに置換を持つものが含まれる（米国特許第６，７３７，０５６号）。こうしたＦｃ突然変異体には、アミノ酸２６５、２６９、２７０、２９７および３２７位の２またはそれより多くでの置換を含むＦｃ突然変異体が含まれ、残基２６５および２９７のアラニンへの置換を含む、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ突然変異体が含まれる（米国特許第７，３３２，５８１号）。
ＩｇＧ４抗体は、ＩｇＧ１抗体に比較した際、Ｆｃ受容体への減少した結合アフィニティおよび減少したエフェクター機能を示す。したがって、いくつかの態様において、本発明の抗体は、ＩｇＧ４サブクラス抗体、特にヒトＩｇＧ４サブクラス抗体である。１つの態様において、ＩｇＧ４抗体は、Ｓ２２８位で、Ｆｃ領域中にアミノ酸置換、具体的には、アミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含む。Ｆｃ受容体への結合アフィニティおよび／またはそのエフェクター機能をさらに減少させるため、１つの態様において、ＩｇＧ４抗体は、Ｌ２３５位でアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｌ２３５Ｅを含む。別の態様において、ＩｇＧ４抗体は、Ｐ３２９位でアミノ酸置換、具体的には、アミノ酸置換Ｐ３２９Ｇを含む。特定の態様において、ＩｇＧ４抗体は、Ｓ２２８、Ｌ２３５およびＰ３２９位でアミノ酸置換、具体的には、アミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５ＥおよびＰ３２９Ｇを含む。こうした修飾ＩｇＧ４抗体およびそのＦｃγ受容体は、本明細書にその全体が援用される、ＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０５５３９３号に記載される。
本発明にしたがった抗体は、付着したサイトカインなどのエフェクター部分を有してもよい。特定の態様において、抗体は、２つの抗体重鎖の１つに融合したただ１つの単一エフェクター部分を含み、したがって、これらの抗体は、２つの非同一ポリペプチド鎖を含む。同様に、本発明の抗体は、Ｆａｂ断片の１つを欠く全長抗体であってもよく、したがって、全抗体重鎖、ならびにＶＨおよびＣＨ１ドメインを欠く抗体重鎖を含む。これらのポリペプチドの組換え同時発現および続く二量体化は、２つのポリペプチドのいくつかのありうる組み合わせを導き、このうち、２つの非同一ポリペプチドのヘテロ二量体のみが有用である。組換え産生において、こうした抗体の収量および純度を改善するため、したがって、２つの同一ポリペプチド（例えばエフェクター部分を含む２つのポリペプチドまたはエフェクター部分を欠く２つのポリペプチド）のホモ二量体の形成を妨害する、そして／またはエフェクター部分を含むポリペプチドおよびエフェクター部分を欠くポリペプチドのヘテロ二量体の形成を促進する修飾を、抗体のＦｃ領域に導入することが好適でありうる。したがって、いくつかの態様において、本発明の抗体は、Ｆｃ領域中に、２つの非同一抗体重鎖のヘテロ二量体化を促進する修飾を含む。ヒトＩｇＧ抗体の２つの重鎖の間の最も広範なタンパク質−タンパク質相互作用の部位は、Ｆｃ領域のＣＨ３ドメイン中である。したがって、１つの態様において、前記修飾は、Ｆｃ領域のＣＨ３ドメイン中である。特定の態様において、前記修飾はノブを穴に修飾であり、２つの抗体重鎖の一方の抗体重鎖にノブ修飾を、そしてもう一方に穴修飾を含む。ノブを穴に技術は、例えば、ＵＳ ５，７３１，１６８； ＵＳ ７，６９５，９３６； Ｒｉｄｇｗａｙら， Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ ９， ６１７−６２１（１９９６）およびＣａｒｔｅｒ， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ ２４８， ７−１５（２００１）に記載される。一般的に、該方法は、ヘテロ二量体形成を促進し、そしてホモ二量体形成を妨害するため、突起が空洞中に配置可能であるように、第一のポリペプチドの界面に突起（「ノブ」）を、そして第二のポリペプチドの界面中に対応する空洞（「穴」）を導入することを伴う。突起は、第一のポリペプチドの界面から小さいアミノ酸側鎖をより大きい側鎖（例えばチロシンまたはトリプトファン）で置換することによって構築される。突起と同一のまたは類似のサイズの補償空洞は、大きいアミノ酸側鎖をより小さいもの（例えばアラニンまたはスレオニン）で置換することによって、第二のポリペプチドの界面中に生成される。したがって、１つの態様において、抗体は、ＣＨ３ドメイン中の２つの抗体重鎖間の界面内に修飾を含み、ｉ）１つの重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基はより大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それによって１つの重鎖のＣＨ３ドメイン中の界面内に突起（「ノブ」）を生成し、これを他方の重鎖のＣＨ３ドメイン中の界面内の空洞（「穴」）中に配置可能であり、そしてｉｉ）他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基はより小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それによって第二のＣＨ３ドメイン中の界面内に空洞（「穴」）を生成し、この中に第一のＣＨ３ドメイン中の界面内の突起（「ノブ」）が配置可能である。突起および空洞は、例えば部位特異的突然変異誘発によって、またはペプチド合成によって、ポリペプチドをコードする核酸を改変することによって、作製可能である。特定の態様において、ノブ修飾は、２つの抗体重鎖の一方に、アミノ酸置換Ｔ３６６Ｗ（ＥＵ番号付け）を含み、そして穴修飾は、２つの抗体重鎖の他の一方に、アミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ（ＥＵ番号付け）を含む。さらなる特定の態様において、ノブ修飾を含む抗体重鎖は、さらに、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃを含み、そして穴修飾を含む抗体重鎖はさらに、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃを含む。これらの２つのシステイン残基の導入は、Ｆｃ領域中の２つの抗体重鎖間で、ジスルフィド架橋の形成を生じ、二量体をさらに安定化させる（Ｃａｒｔｅｒ， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８， ７−１５（２００１））。別の態様において、２つの非同一抗体重鎖のヘテロ二量体化を促進する修飾は、例えばＰＣＴ公報ＷＯ ２００９／０８９００４に記載されるような、静電ステアリング効果を仲介する修飾を含む。一般的に、この方法は、ホモ二量体形成が静電的に好ましくないが、ヘテロ二量体化が静電的に好ましいように、２つの抗体重鎖の界面の１またはそれより多いアミノ酸残基を、荷電アミノ酸残基によって置換することを含む。抗体が、付着したエフェクター部分を有する特定の態様において、ノブ修飾を含む抗体重鎖のアミノまたはカルボキシ末端アミノ酸にエフェクター部分を融合させる。理論によって束縛されることは望ましくないが、エフェクター部分をノブ含有重鎖に融合させると、２つのエフェクター部分を含むホモ二量体抗体の生成がさらに最小限にされるであろう（２つのノブ含有ポリペプチドの立体構造衝突）。同様に、抗体が、Ｆｃ領域に融合したただ１つのＦａｂ断片を含む態様において、Ｆａｂ断片は、好ましくは、ノブ修飾を含むＦｃ領域の重鎖に融合される。
本発明の抗体は、例えば療法的適用のために特に好適である、いくつかの特性を組み合わせる。例えば、抗体は、ヒトおよびカニクイザルに関して交差反応性であり、これは、例えば、ヒト使用の前に、カニクイザルにおけるｉｎ ｖｉｖｏ研究を可能にする。したがって、１つの態様において、本発明の抗体は、ヒトおよびカニクイザルＡＳＧＰＲに特異的に結合可能である。さらに、本発明の抗体は、特に強いアフィニティおよび／またはアビディティでＡＳＧＰＲに結合する。１つの態様において、抗体は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、Ｆａｂ断片として測定した際、ヒトＡＳＧＰＲに、１μＭより小さい、特に１００ｎＭより小さい、より具体的には１ｎＭより小さい解離定数（ＫＤ）で結合する。ＳＰＲによって結合アフィニティを測定するための方法を本明細書に記載する。特に、測定を２５℃の温度で行う。１つの態様において、ニュートラビジン捕捉によって、ＮＬＣチップ上に固定されたビオチン化一価（ａｖｉ−Ｆｃ−ヒトＡＳＧＰＲ Ｈ１ ＣＲＤ、配列番号１１８）または二価（ａｖｉ−Ｆｃ−ヒトＡＳＧＰＲ Ｈ１ストーク−ＣＲＤ、配列番号１３０）ＡＳＧＰＲ Ｈ１抗原とともに、２５℃でＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６装置（Ｂｉｏｒａｄ）を用いたＳＰＲによって、Ｆａｂ断片としての抗体のアフィニティ（ＫＤ）を測定する。例示的な方法において、固定用の抗原を、ＰＢＳＴ（１０ｍＭリン酸、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．４、０．００５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で１０μｇ／ｍｌに希釈し、そして多様な接触時間で、３０μｌ／分で注入して、垂直配向で、２００、４００または８００反応単位（ＲＵ）の固定レベルを達成する。続いて、分析物（抗体）を注入する。１ショット動力学測定のため、注入方向を水平配向に変化させて、そして精製Ｆａｂ断片の２倍希釈シリーズ（１００〜６．２５ｎＭの間の濃度範囲で多様）を、別個のチャネル１〜５に沿って、１５０または２００ｓの会合時間、および２４０または６００ｓの解離時間で、５０、６０または１００μｌ／分で同時に注入する。緩衝液（ＰＢＳＴ）を第六のチャネルに沿って注入して、参照のための「インライン」ブランクを提供する。会合および解離センサーグラムを同時に適合させることによって、ＰｒｏｔｅＯｎ Ｍａｎａｇｅｒ ｖ３．１ソフトウェアにおいて、単純な１対１ラングミュア結合モデルを用いて、会合速度定数（ｋｏｎ）および解離速度定数（ｋｏｆｆ）を計算する。平衡解離定数（ＫＤ）を、比ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして計算する。１０ｍＭグリシン、ｐＨ１．５を流速１００μｌ／分、３０ｓの接触時間で用いて、水平配向で再生を行う。別の態様において、抗体は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）によって、ＩｇＧ１として測定した際、１μＭより小さい、特に５００ｎＭより小さい、より具体的には１００ｎＭより小さい、またはさらに１０ｎＭより小さいＫＤで、ヒトＡＳＧＰＲに結合する。ＦＲＥＴによって結合アフィニティ（またはアビディティ）を測定するための方法を本明細書に記載する。１つの態様において、ＦＲＥＴドナー分子で標識した全長ＡＳＧＰＲタンパク質を発現している細胞を、抗体と接触させ、そして適切なＦＲＥＴアクセプター分子で標識した二次抗体によって、結合した抗体を検出することによって測定を行う。例示的な方法において、ＳＮＡＰタグをコードするＤＮＡ配列（Ｃｉｓｂｉｏより購入したプラスミド）を、ＰＣＲによって増幅し、そして全長ヒトＡＳＧＰＲ Ｈ１配列を含有する発現ベクター（Ｏｒｉｇｅｎｅ）内に連結する。生じる融合タンパク質は、Ｃ末端ＳＮＡＰタグを伴う全長ＡＳＧＰＲ Ｈ１で構成される。トランスフェクション試薬としてＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を用いて、ＨＥＫ２９３細胞を１０μｇ ＤＮＡでトランスフェクションする。２０時間のインキュベーション時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、そして１００ｎＭ ＳＮＡＰ−Ｌｕｍｉ４Ｔｂ（Ｃｉｓｂｉｏ）を含有するＬａｂＭｅｄ緩衝液（Ｃｉｓｂｉｏ）中で、３７℃で１時間インキュベーションして、ＳＮＡＰタグの特異的標識を導く。続いて、細胞をＬａｂＭｅｄ緩衝液で４回洗浄して、未結合色素を除去する。緩衝液に比較して、６１５ｎｍでのテルビウムの放出を測定することによって、標識効率を決定する。次いで、細胞を−８０℃で最長６ヶ月間凍結保存することも可能である。５０〜０．３９ｎＭの範囲の濃度のＡＳＧＰＲ特異的抗体を、標識細胞（ウェルあたり１００細胞）に添加し，その後、ＦＲＥＴのアクセプター分子として抗ヒトＦｃ−ｄ２（Ｃｉｓｂｉｏ、ウェルあたり最終２００ｎＭ）を添加することによって、アビディティを測定する。ＲＴで３時間のインキュベーション時間後、蛍光読み取り装置（Ｖｉｃｔｏｒ ３、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて、アクセプター色素の放出（６６５ｎｍ）ならびにドナー色素の放出（６１５ｎｍ）を決定する。ドナー放出に対するアクセプター放出の比を計算し、そしてバックグラウンド対照（抗ヒトＦｃ−ｄ２を含む細胞）の比を減じる。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ５ソフトウェアで曲線を分析して、そしてＫＤ値を計算してもよい。本発明の抗体のさらなる利点は、これらが受容体の天然リガンド（アシアロ糖タンパク質、例えばアシアロフェチュイン）とＡＳＧＰＲへの結合に関して競合しないことであり、すなわち、抗体結合は、ＡＳＧＰＲリガンドの存在によって影響を受けず、そしてＡＳＧＰＲの天然機能に干渉しないことである。１つの態様において、抗体は、ＡＳＧＰＲへの結合に関して、ＡＳＧＰＲの天然リガンドと競合しない。特定の態様において、ＡＳＧＰＲの前記天然リガンドは、アシアロフェチュインである。当該技術分野に周知の方法によって、競合を測定してもよい。１つの態様において、ＦＡＣＳによって、例えばＡＳＧＰＲ発現細胞株、蛍光標識リガンド、および異なる蛍光標識を有する二次抗体での、結合した抗体の検出を用いて、ＡＳＧＰＲの天然リガンドとの競合を測定する。例示的な方法において、肝細胞癌細胞株ＨｅｐＧ２を用いる。９６ウェル丸底プレート中、ウェルあたり０．２ミオ（ｍｉｏ）細胞を、４０μｌのＡｌｅｘａ４８８標識アシアロフェチュイン（ウシ胎児血清由来、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ ＃Ａ４７８１、最終濃度１００μｇ／ｍｌ）と、４℃で３０分間インキュベーションする。ＡＳＧＰＲへのリガンド結合はカルシウム依存性であるため、結合はカルシウムの存在下で行う。０．１％ＢＳＡを含有するＨＢＳＳで細胞を１回洗浄することによって、未結合タンパク質を除去する。次いで、４０μｌの抗ＡＳＧＰＲ抗体（３０、６、および１．２５μｇ／ｍｌ最終濃度）を、１００μｇ／ｍｌのアシアロフェチュインの存在下で、細胞に添加する。細胞を４℃で３０分間インキュベーションし、そして細胞を１回洗浄することによって、未結合タンパク質を除去する。ＡＰＣコンジュゲート化ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃガンマ断片特異的二次Ｆ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ ＃１０９−１３６−１７０； ０．１％ＢＳＡを含有するＨＢＳＳ中、作業溶液１：５０）を二次抗体として用いる。４℃で３０分間インキュベーションした後、洗浄することによって、未結合二次抗体を除去する。１％ＰＦＡを用いて細胞を固定し、そしてＢＤ ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩ（ソフトウェアＢＤ ＤＩＶＡ）を用いて、リガンドならびに抗体の結合を分析する。本発明の抗体の主要な利点は、これらがＡＳＧＰＲに対して高い特異性を持つことである。例えばヒトＡＳＧＰＲ Ｈ１に対する強い結合にもかかわらず、抗体は、ヒトＡＳＧＰＲ Ｈ１の最も近い相同体であると同定されたＣＬＥＣ１０Ａに検出可能には結合しない。１つの態様において、抗体は、ＣＬＥＣ１０Ａ、特にヒトＣＬＥＣ１０Ａに検出可能に結合しない。特に、抗体は、結合をＳＰＲ（本明細書に記載するとおり）によって測定した際、ＣＬＥＣ１０Ａに検出可能に結合しない。さらに、抗体は、ＡＳＧＰＲを発現しない細胞には、対応する非ターゲティング化抗体（アイソタイプ対照）と類似の度合いまでしか結合しない。したがって、１つの態様において、抗体は、ＡＳＧＰＲ発現を欠く細胞、特にヒト細胞、より具体的にはヒト血液細胞には、特異的に結合しない。ＡＳＧＰＲ発現を欠く例示的な細胞には、Ｈｅｌａ細胞（子宮頸癌由来のヒト細胞株）、Ａ４５９ヒト非小細胞肺癌細胞、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）細胞、および（ヒト）ＰＢＭＣが含まれる。特定の細胞への結合または結合の欠如は、例えばＦＡＣＳによって容易に決定可能である。こうした方法は、当該技術分野によく確立され、そしてまた、以下の実施例に記載される。抗ＡＳＧＰＲ抗体の重要な特徴は、内在化特性である。例えば、ＡＳＧＰＲ発現細胞にエフェクター部分をターゲティングするために抗体を用いようとする場合、抗体が、エフェクター部分受容体の活性化のために十分に長い時間、細胞表面上に存在することが望ましい。本発明の抗体は、ＡＳＧＰＲへの結合に際して、ＡＳＧＰＲ発現細胞内に内在化するが、これらは細胞内部で分解されることなく、細胞表面にリサイクルされて戻る。したがって、１つの態様において、抗体は、ＡＳＧＰＲを発現する細胞の表面上のＡＳＧＰＲに抗体が結合した際、前記細胞内に内在化される。特定の態様において、抗体は、前記細胞内に内在化されるのとほぼ同じ速度で、前記細胞の表面にリサイクルされて戻る。細胞表面タンパク質およびそれに結合した抗体の内在化およびリサイクリングは、確立された方法、例えばＦＡＣＳまたは（共焦点）顕微鏡技術によって、容易に測定可能である。１つの態様において、内在化および／またはリサイクリングをＦＡＣＳによって測定する。抗体が持続した効果を有するためには、そのターゲット抗原が本質的に一定のレベルで存在することが重要である。しばしば、抗体のターゲット抗原への結合は、後者の下方制御を誘導し、抗体の有効性減少を導く。しかし、本発明の抗体は、こうした効果を持たない。１つの態様において、抗体は、細胞表面上のＡＳＧＰＲへの抗体の結合に際して、前記細胞の表面でのＡＳＧＰＲ発現の下方制御を有意には誘導しない。細胞の表面での抗原発現レベルは、ＦＡＣＳなどの確立された方法によって容易に決定可能である。
付着したエフェクター部分を含む抗体
本発明にしたがった特に有用な抗体は、エフェクター部分、例えばサイトカインが付着した抗体である。エフェクター部分、例えばサイトカインに融合した抗体はまた、本明細書において、イムノコンジュゲートとも称される。付着したエフェクター部分を含む抗体は、単一で、または組み合わせて、本発明の抗体に関連する上記の特徴いずれを取り込んでもよい。
したがって、１つの側面において、本発明は、任意の上記態様にしたがって、ＡＳＧＰＲへの特異的結合が可能な抗体であって、エフェクター部分が抗体に付着している、前記抗体を提供する。１つの態様において、１より多くないエフェクター部分が抗体に付着する。さらなるエフェクター部分が存在しないと、それぞれのエフェクター部分受容体が提示される部位への抗体のターゲティングが減少し、それによって、抗体の実際のターゲット抗原、ＡＳＧＰＲが提示される部位へのターゲティングおよび該部位での集積が改善される。さらに、それぞれのエフェクター部分受容体に対するアビディティ効果が存在しないため、抗体の静脈内投与に際して、末梢血中のエフェクター部分受容体陽性細胞の活性化が減少しうる。本発明で使用するためのエフェクター部分は、一般的に、例えばシグナル伝達経路を通じて、細胞活性に影響を及ぼすポリペプチドである。したがって、本発明で有用なエフェクター部分は、細胞膜外部からシグナルを伝達して、細胞内で反応を調節する、受容体仲介性シグナル伝達に関連することも可能である。例えば、エフェクター部分はサイトカインであってもよい。特定の態様において、エフェクター部分はヒトである。特定の態様において、エフェクター部分は、ペプチド分子であり、そしてペプチド結合を通じて抗体に融合される（すなわち、抗体およびエフェクター分子は、融合タンパク質を形成する）。１つの態様において、エフェクター部分は、一本鎖ペプチド分子である。さらなる態様において、エフェクター部分は、アミノ末端アミノ酸で、抗体の重鎖の１つのカルボキシ末端アミノ酸に、場合によってペプチドリンカーを通じて、融合している。適切な非免疫原性ペプチドリンカーには、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎ、（ＳＧ４）ｎまたはＧ４（ＳＧ４）ｎペプチドリンカーが含まれる。「ｎ」は一般的に１〜１０、典型的には２〜４の間の数字である。上述のように、抗体がＦｃ領域中にノブを穴に修飾を含む態様において、エフェクター部分を、ノブ修飾を含む抗体重鎖に融合させることが好ましい。
１つの態様において、前記エフェクター部分は、サイトカイン分子である。有用なサイトカインの例には、限定されるわけではないが、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−α、およびＴＮＦ−βが含まれる。１つの態様において、前記サイトカイン分子は、アミノ末端アミノ酸で、抗体重鎖の１つのカルボキシ末端アミノ酸に、場合によってペプチドリンカーを通じて、融合している。１つの態様において、前記サイトカイン分子はヒトサイトカインである。１つの態様において、前記サイトカイン分子はインターフェロン分子である。特定の態様において、前記インターフェロン分子はインターフェロン・アルファ、特にヒト・インターフェロン・アルファ、より具体的にはヒト・インターフェロン・アルファ２（配列番号１３８を参照されたい）またはヒト・インターフェロン・アルファ２ａ（配列番号１３９を参照されたい）である。インターフェロン・アルファは、抗ウイルス活性を有することが知られる。したがって、インターフェロン分子を本発明の抗体に付着させると、ウイルス感染ＡＳＧＰＲ発現細胞をターゲティングするのに特に有用である。サイトカイン分子がインターフェロン分子である１つの態様において、抗体は表面上にＡＳＧＰＲを発現している細胞において、抗ウイルス活性を有する。１つの態様において、前記細胞は肝臓細胞、特に肝細胞、より具体的にはヒト肝細胞である。１つの態様において、前記抗ウイルス活性は選択的である。特定の態様において、抗体は、表面上に有意なレベルのＡＳＧＰＲを発現しない細胞において、抗ウイルス活性を持たない。１つの態様において、前記細胞は、血液細胞、特にヒト血液細胞である。１つの態様において、前記抗ウイルス活性。本発明にしたがった抗ＡＳＧＰＲ抗体に付着したインターフェロン分子のこの選択性は、いかなる意図されるターゲット細胞（例えば肝細胞）および影響を受けるべきではない細胞（例えば血液細胞）の間を区別しない、非ターゲティング化インターフェロン分子とは対照的であり、そして主要な毒性の問題を伴わず、ありうる療法的使用に非常に重要である。さらに特定の態様において、前記抗ウイルス活性は、ウイルス感染の阻害、ウイルス複製の阻害、細胞殺傷の阻害および１またはそれより多いインターフェロン刺激遺伝子の誘導より選択される。特定の態様において、１またはそれより多いインターフェロン刺激遺伝子は、ＭＸ１（ミクソウイルス耐性１、インターフェロン誘導性タンパク質ｐ７８としてもまた知られる）、ＲＳＡＤ２（ラジカルＳ−アデノシルメチオニンドメイン含有２、サイトメガロウイルス誘導性遺伝子５としてもまた知られる）、ＨＲＡＳＬＳ２（ＨＲＡＳ様サプレッサー２）、ＩＦＩＴ１（テトラトリコペプチド反復を含むインターフェロン誘導性タンパク質１）、およびＩＦＩＴＭ２（インターフェロン誘導性膜貫通タンパク質２）の群より選択される。１つの態様において、１またはそれより多いインターフェロン刺激遺伝子の誘導は、付着したインターフェロン分子がない対応する抗体による誘導に比較した際、ｍＲＮＡレベルで、少なくとも１．５倍、特に少なくとも２倍、より具体的には少なくとも５倍の誘導である。ｍＲＮＡレベルでの遺伝子誘導は、本明細書に記載するような、定量的逆転写（ＲＴ）ＰＣＲまたはマイクロアレイ分析を含む、当該技術分野でよく確立された方法によって測定可能である。細胞を試験化合物とプレインキュベーションし、その後、ウイルスを添加し、そしてインキュベーション後に生存細胞を定量化する、ウイルス防御アッセイによって、細胞殺傷の阻害を決定してもよい。典型的なこうしたアッセイを実施例に記載する。マディン・ダービー・ウシ腎臓（ＭＤＢＫ）細胞を、抗体および対照と１〜４時間プレインキュベーションする。次いで、水疱性口内炎ウイルスをさらに１６〜２４時間添加する。インキュベーション工程終了時、生存細胞をクリスタルバイオレット染色溶液（０．５％）で染色し、そして６９０ｎｍの参照波長とともに、５５０〜６００ｎｍで、マイクロプレート読み取り装置を用いて、生存細胞の定量化を実行する。ウイルス複製の評価のための例示的なアッセイもまた、実施例中に提供する。このアッセイは、二シストロン性Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）レプリコンで安定トランスフェクションされたＨｕｈ ７由来肝癌細胞株を用い、該レプリコンは、ＨＣＶ ＩＲＥＳによって駆動される第一のオープンリーディングフレームが、ネオマイシン・ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ＮＰＴＩＩ）に融合したレニラ属（ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ遺伝子を含有し、そしてＥＭＣＶ ＩＲＥＳによって駆動される第二のオープンリーディングフレームが、ＮＫ５．１レプリコン・主鎖由来のＨＣＶ非構造遺伝子、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂを含有する。細胞を３７℃で、５％ＣＯ２を含む加湿大気中、ＧｌｕｔａｍａｘＴＭおよび１００ｍｇ／ｍｌピルビン酸ナトリウムを補ったＤＭＥＭ中で培養する。培地には、さらに、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ（ｖ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシンおよび１％（ｖ／ｖ）ジェネティシンを補った。５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中の細胞を、９０μｌ体積中、５０００細胞／ウェルで、９６ウェルプレート中にプレーティングする。プレーティングの２４時間後、抗体（または対照としての培地）を、１２ウェルに渡って３倍希釈で（０．０１〜２０００ｐＭ）、１０μｌ体積中で細胞に添加し、したがって、抗体添加後の最終体積は１００μｌである。レニラ属ルシフェラーゼアッセイ系（Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｅ２８２０）を用いて、レニラ属ルシフェラーゼレポーターシグナルを、抗体を添加した７２時間後に読み取る。対照試料（抗体の非存在下）に比較した際、レニラ属ルシフェラーゼレポーターのレベルの５０％の減少が観察される化合物濃度として、ＥＣ５０値を計算する。ＸＬｆｉｔ４プログラム（ＩＤ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｌｔｄ．、英国サリー）を用いることによって、用量反応曲線およびＥＣ５０値を得る。特定の態様において、本発明にしたがった抗体は、配列番号１６の重鎖可変領域配列および配列番号１４の軽鎖可変領域配列を含む全長ヒトＩｇＧ１抗体であり、前記抗体は、Ｆｃ領域中にＦｃγＲＩＩＩａへの抗体の結合アフィニティを減少させる修飾およびノブを穴に修飾を含み、前記ノブを穴に修飾は、一方の抗体重鎖中にノブ修飾を、そして他方の抗体重鎖に穴修飾を含み、そして前記抗体は、ペプチドリンカーを通じて、抗体重鎖の１つのＣ末端アミノ酸に、Ｎ末端アミノ酸で融合したＩＦＮα２分子を有する。特定の態様において、ＦｃγＲＩＩＩａへの抗体の結合アフィニティを減少させる前記修飾は、各抗体重鎖中にアミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ｇ（ＥＵ番号付け）を含む。さらなる特定の態様において、前記ノブ修飾は、アミノ酸置換Ｔ３６６Ｗを含み、そして穴修飾は、アミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖを含む。さらにさらなる特定の態様において、前記ＩＦＮα２分子は、ノブ修飾を含む抗体重鎖に融合する。さらにより特定の態様において、前記抗体は、配列番号６８、配列番号７０および配列番号７２、または機能性を保持するその変異体のポリペプチド配列を含む。
別の特定の態様において、本発明にしたがった抗体は、配列番号４の重鎖可変領域配列および配列番号２の軽鎖可変領域配列を含む全長ヒトＩｇＧ１抗体であり、前記抗体は、Ｆｃ領域中にＦｃγＲＩＩＩａへの抗体の結合アフィニティを減少させる修飾およびノブを穴に修飾を含み、前記ノブを穴に修飾は、一方の抗体重鎖中にノブ修飾を、そして他方の抗体重鎖に穴修飾を含み、そして前記抗体は、ペプチドリンカーを通じて、抗体重鎖の１つのＣ末端アミノ酸に、Ｎ末端アミノ酸で融合したＩＦＮα２分子を有する。特定の態様において、ＦｃγＲＩＩＩａへの抗体の結合アフィニティを減少させる前記修飾は、各抗体重鎖中にアミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ｇ（ＥＵ番号付け）を含む。さらなる特定の態様において、前記ノブ修飾は、アミノ酸置換Ｔ３６６Ｗを含み、そして穴修飾は、アミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖを含む。さらにさらなる特定の態様において、前記ＩＦＮα２分子は、ノブ修飾を含む抗体重鎖に融合する。さらにより特定の態様において、前記抗体は、配列番号５０、配列番号５２および配列番号５４、または機能性を保持するその変異体のポリペプチド配列を含む。
さらに別の特定の態様において、本発明にしたがった抗体は、配列番号４の重鎖可変領域配列および配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６および配列番号４８の群より選択される軽鎖可変領域配列を含む全長ヒトＩｇＧ１抗体であり、前記抗体は、Ｆｃ領域中に、ＦｃγＲＩＩＩａへの抗体の結合アフィニティを減少させる修飾およびノブを穴に修飾を含み、前記ノブを穴に修飾は、一方の抗体重鎖中にノブ修飾を、そして他方の抗体重鎖に穴修飾を含み、そして前記抗体は、ペプチドリンカーを通じて、抗体重鎖の１つのＣ末端アミノ酸に、Ｎ末端アミノ酸で融合したＩＦＮα２分子を有する。特定の態様において、ＦｃγＲＩＩＩａへの抗体の結合アフィニティを減少させる前記修飾は、各抗体重鎖中にアミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ｇ（ＥＵ番号付け）を含む。さらなる特定の態様において、前記ノブ修飾は、アミノ酸置換Ｔ３６６Ｗを含み、そして穴修飾は、アミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖを含む。さらにさらなる特定の態様において、前記ＩＦＮα２分子は、ノブ修飾を含む抗体重鎖に融合する。さらにより特定の態様において、前記抗体は、配列番号５２、配列番号５４のポリペプチド配列、ならびに配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６および配列番号１０８の群より選択されるポリペプチド配列、または機能性を保持するその変異体のポリペプチド配列を含む。
さらなる態様において、本発明の抗体は、配列番号９２、配列番号５２および配列番号５４、または機能性を保持するその変異体のポリペプチド配列を含む。別の態様において、本発明にしたがった抗体は、配列番号９４、配列番号５２および配列番号５４、または機能性を保持するその変異体のポリペプチド配列を含む。さらにさらなる態様において、本発明にしたがった抗体は、配列番号５６、配列番号５８および配列番号６０、または機能性を保持するその変異体のポリペプチド配列を含む。さらなる態様において、本発明にしたがった抗体は、配列番号６２、配列番号６４および配列番号６６、または機能性を保持するその変異体のポリペプチド配列を含む。さらなる態様において、本発明にしたがった抗体は、配列番号７４、配列番号７６および配列番号７８、または機能性を保持するその変異体のポリペプチド配列を含む。さらなる態様において、本発明にしたがった抗体は、配列番号８０、配列番号８２および配列番号８４、または機能性を保持するその変異体のポリペプチド配列を含む。さらなる態様において、本発明にしたがった抗体は、配列番号８６、配列番号８８および配列番号９０、または機能性を保持するその変異体のポリペプチド配列を含む。
別の態様において、本発明にしたがった抗体は、２つのＦａｂ断片の１つを欠き、そして配列番号１６の重鎖可変領域配列および配列番号１４の軽鎖可変領域配列を含み、前記抗体は、Ｆｃ領域中にＦｃγＲＩＩＩａへの抗体の結合アフィニティを減少させる修飾およびノブを穴に修飾を含み、前記ノブを穴に修飾は、一方の抗体重鎖中にノブ修飾を、そして他方の抗体重鎖に穴修飾を含み、そして前記抗体は、ペプチドリンカーを通じて、抗体重鎖の１つのＣ末端アミノ酸に、Ｎ末端アミノ酸で融合したＩＦＮα２分子を有する。特定の態様において、ＦｃγＲＩＩＩａへの抗体の結合アフィニティを減少させる前記修飾は、各抗体重鎖中にアミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ｇ（ＥＵ番号付け）を含む。さらなる特定の態様において、前記ノブ修飾は、アミノ酸置換Ｔ３６６Ｗを含み、そして穴修飾は、アミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖを含む。さらにさらなる特定の態様において、前記ＩＦＮα２分子は、ノブ修飾を含む抗体重鎖に融合する。さらにより特定の態様において、前記抗体は、配列番号６８、配列番号７０および配列番号１１６、または機能性を保持するその変異体のポリペプチド配列を含む。
別の態様において、本発明にしたがった抗体は、２つのＦａｂ断片の１つを欠き、そして配列番号４の重鎖可変領域配列および配列番号２の軽鎖可変領域配列を含む全長ヒトＩｇＧ１抗体であり、前記抗体は、Ｆｃ領域中に、ＦｃγＲＩＩＩａへの抗体の結合アフィニティを減少させる修飾およびノブを穴に修飾を含み、前記ノブを穴に修飾は、一方の抗体重鎖中にノブ修飾を、そして他方の抗体重鎖に穴修飾を含み、そして前記抗体は、ペプチドリンカーを通じて、抗体重鎖の１つのＣ末端アミノ酸に、Ｎ末端アミノ酸で融合したＩＦＮα２分子を有する。特定の態様において、ＦｃγＲＩＩＩａへの抗体の結合アフィニティを減少させる前記修飾は、各抗体重鎖中にアミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ｇ（ＥＵ番号付け）を含む。さらなる特定の態様において、前記ノブ修飾は、アミノ酸置換Ｔ３６６Ｗを含み、そして穴修飾は、アミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖを含む。さらにさらなる特定の態様において、前記ＩＦＮα２分子は、ノブ修飾を含む抗体重鎖に融合する。さらにより特定の態様において、前記抗体は、配列番号５０、配列番号５２および配列番号１１６、または機能性を保持するその変異体のポリペプチド配列を含む。
さらに別の態様において、本発明にしたがった抗体は、２つのＦａｂ断片の１つを欠き、そして配列番号４の重鎖可変領域配列、ならびに配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６および配列番号４８の群より選択される軽鎖可変領域配列を含む全長ヒトＩｇＧ１抗体であり、前記抗体は、Ｆｃ領域中にＦｃγＲＩＩＩａへの抗体の結合アフィニティを減少させる修飾およびノブを穴に修飾を含み、前記ノブを穴に修飾は、一方の抗体重鎖中にノブ修飾を、そして他方の抗体重鎖に穴修飾を含み、そして前記抗体は、ペプチドリンカーを通じて、抗体重鎖の１つのＣ末端アミノ酸に、Ｎ末端アミノ酸で融合したＩＦＮα２分子を有する。特定の態様において、ＦｃγＲＩＩＩａへの抗体の結合アフィニティを減少させる前記修飾は、各抗体重鎖中にアミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ｇ（ＥＵ番号付け）を含む。さらなる特定の態様において、前記ノブ修飾は、アミノ酸置換Ｔ３６６Ｗを含み、そして穴修飾は、アミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖを含む。さらにさらなる特定の態様において、前記ＩＦＮα２分子は、ノブ修飾を含む抗体重鎖に融合する。さらにより特定の態様において、前記抗体は、配列番号５２、配列番号１１６のポリペプチド配列、ならびに配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６および配列番号１０８の群より選択されるポリペプチド配列、または機能性を保持するその変異体のポリペプチド配列を含む。
さらなる態様において、本発明の抗体は、配列番号９２、配列番号５２および配列番号１１６、または機能性を保持するその変異体のポリペプチド配列を含む。別の態様において、本発明にしたがった抗体は、配列番号９４、配列番号５２および配列番号１１６、または機能性を保持するその変異体のポリペプチド配列を含む。さらにさらなる態様において、本発明にしたがった抗体は、配列番号５６、配列番号５８および配列番号１１６、または機能性を保持するその変異体のポリペプチド配列を含む。さらなる態様において、本発明にしたがった抗体は、配列番号６２、配列番号６４および配列番号１１６、または機能性を保持するその変異体のポリペプチド配列を含む。さらなる態様において、本発明にしたがった抗体は、配列番号７４、配列番号７６および配列番号１１６、または機能性を保持するその変異体のポリペプチド配列を含む。さらなる態様において、本発明にしたがった抗体は、配列番号８０、配列番号８２および配列番号１１６、または機能性を保持するその変異体のポリペプチド配列を含む。さらなる態様において、本発明にしたがった抗体は、配列番号８６、配列番号８８および配列番号１１６、または機能性を保持するその変異体のポリペプチド配列を含む。
本発明の抗体には、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８および１１６に示す配列に、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である配列を有するものが含まれ、その機能性断片または変異体が含まれる。本発明はまた、保存的アミノ酸置換を含むこれらの配列を含む抗体も含む。
ポリヌクレオチド
本発明は、本明細書に記載するような抗体またはその抗原結合部分をコードするポリヌクレオチドをさらに提供する。
本発明のポリヌクレオチドには、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９および１１７に示す配列に、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるものが含まれ、その機能性断片または変異体が含まれる。
本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドを、全抗体をコードする単一ポリヌクレオチドとして、または同時発現される複数の（例えば２またはそれより多い）ポリヌクレオチドとして、発現させてもよい。同時発現されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、例えばジスルフィド結合または他の手段を通じて会合して、機能する抗体を形成してもよい。例えば、抗体の軽鎖部分は、抗体の重鎖部分とは別個のポリヌクレオチドによってコードされてもよい。同時発現された場合、重鎖ポリペプチドは、軽鎖ポリペプチドと会合して抗体を形成するであろう。別の例において、エフェクター部分を含む抗体の重鎖部分は、抗体の他の重鎖部分とは別個のポリヌクレオチドによってコードされてもよい。同時発現された際、重鎖ポリペプチドは会合して、（軽鎖ポリペプチド（単数または複数）とともに）機能する抗体を形成するであろう。
１つの態様において、本発明は、抗体またはその抗原結合部分をコードするポリヌクレオチドに関し、ここで、ポリヌクレオチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６または４８に示すような可変領域配列をコードする配列を含む。別の態様において、本発明は、抗体またはその抗原結合部分をコードするポリヌクレオチドに関し、ここで、ポリヌクレオチドは、配列番号５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８または１１６に示すようなポリペプチド配列をコードする配列を含む。別の態様において、本発明はさらに、抗体またはその抗原結合部分をコードするポリヌクレオチドに関し、ここで、ポリヌクレオチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９および１１７に示す核酸配列に、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を含む。別の態様において、本発明は、抗体またはその抗原結合部分をコードするポリヌクレオチドに関し、ここで、ポリヌクレオチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９または１１７に示す核酸配列を含む。別の態様において、本発明は、抗体またはその抗原結合部分をコードするポリヌクレオチドに関し、ここで、ポリヌクレオチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６または４８のアミノ酸配列に、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である可変領域配列をコードする配列を含む。別の態様において、本発明は、抗体またはその抗原結合部分をコードするポリヌクレオチドに関し、ここで、ポリヌクレオチドは、配列番号５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８または１１６のアミノ酸配列に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるポリペプチド配列をコードする配列を含む。本発明は、抗体またはその抗原結合部分をコードするポリヌクレオチドに関し、ここで、ポリヌクレオチドは、保存的アミノ酸置換を含み、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６または４８の可変領域配列をコードする配列を含む。本発明はまた、抗体またはその抗原結合部分をコードするポリヌクレオチドに関し、ここで、ポリヌクレオチドは、保存的アミノ酸置換を含み、配列番号５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８または１１６のポリペプチド配列をコードする配列を含む。
特定の態様において、ポリヌクレオチドまたは核酸はＤＮＡである。他の態様において、本発明のポリヌクレオチドはＲＮＡ、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形である。本発明のＲＮＡは、一本鎖または二本鎖であってもよい。
組換え法
本発明の抗体を、例えば固相ペプチド合成（例えばＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相合成）または組換え産生によって得てもよい。組換え産生のため、例えば上述のような、抗体（断片）をコードする１またはそれより多いポリヌクレオチドを単離し、そしてさらなるクローニングおよび／または宿主細胞における発現のため、１またはそれより多いベクター内に挿入する。こうしたポリヌクレオチドは、慣用法を用いて、容易に単離および配列決定可能である。１つの態様において、１またはそれより多い本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、好ましくは発現ベクターを提供する。当業者に周知の方法を用いて、適切な転写／翻訳制御シグナルとともに、抗体（断片）のコード配列を含有する発現ベクターを構築することも可能である。これらの方法には、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術およびｉｎ ｖｉｖｏ組換え／遺伝的組換えが含まれる。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら， ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｎ．Ｙ．（１９８９）；およびＡｕｓｕｂｅｌら， ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎ．Ｙ（１９８９）に記載される技術を参照されたい。発現ベクターは、プラスミド、ウイルスの一部であってもよく、あるいは核酸断片でもよい。発現ベクターには、抗体（断片）をコードするポリヌクレオチド（すなわちコード領域）を、プロモーターおよび／または他の転写または翻訳制御要素と機能可能である関連でクローニングした、発現カセットが含まれる。本明細書において、「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸部分である。「停止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ、またはＴＡＡ）は、アミノ酸には翻訳されないものの、存在する場合、コード領域の一部と見なされることも可能であるが、いかなる隣接配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、５’および３’非翻訳領域等も、コード領域の一部ではない。２またはそれより多いコード領域は、単一ポリヌクレオチド構築物中、例えば単一ベクター上に存在していてもよいし、または別個のポリヌクレオチド構築物中、例えば別個の（異なる）ベクター上に存在していてもよい。さらに、任意のベクターが、単一コード領域を含有してもよいし、あるいは２またはそれより多いコード領域を含んでもよく、例えば本発明のベクターは、１またはそれより多いポリペプチドをコードしてもよく、これらは翻訳後にまたは翻訳と同時に、タンパク質分解的切断を通じて、最終タンパク質に分離される。さらに、本発明のベクター、ポリヌクレオチド、または核酸は、本発明の抗体（断片）をコードするポリヌクレオチドに融合したかまたは融合していない、異種コード領域、あるいはその変異体または誘導体をコードしてもよい。異種コード領域には、限定なしに、特殊化要素またはモチーフ、例えば分泌性シグナルペプチドまたは異種機能ドメインが含まれる。機能可能である関連は、遺伝子産物、例えばポリペプチドのコード領域が、遺伝子産物の発現を制御配列（単数または複数）の影響または制御下に配置する方式で、１またはそれより多い制御配列に関連している場合である。２つのＤＮＡ断片（例えばポリペプチドコード領域およびそれに関連するプロモーター）は、プロモーター機能の誘導が、望ましい遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写を生じる場合、そして２つのＤＮＡ断片の間の連結の性質が、発現制御配列が遺伝子産物の発現を導く能力に干渉しないか、またはＤＮＡテンプレートが転写される能力に干渉しない場合、「機能可能であるように関連」している。したがって、プロモーター領域は、プロモーターがその核酸の転写を達成可能である場合、ポリペプチドをコードする核酸と機能可能であるように関連している。プロモーターは、あらかじめ決定された細胞でのみ、ＤＮＡの実質的な転写を指示する細胞特異的プロモーターであってもよい。プロモーターに加えて、他の転写制御要素、例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサー、および転写終結シグナルをポリヌクレオチドと機能可能であるように関連させて、細胞特異的転写を導いてもよい。適切なプロモーターおよび他の転写制御領域を本明細書に開示する。多様な転写制御領域が当業者に知られる。これらには、限定なしに、脊椎動物細胞で機能する転写制御領域、例えば限定されるわけではないが、サイトメガロウイルス（例えば、イントロンＡとコンジュゲート化された極初期プロモーター）、サルウイルス４０（例えば初期プロモーター）、およびレトロウイルス（例えばラウス肉腫ウイルス）由来のプロモーターおよびエンハンサー・セグメントが含まれる。他の転写制御領域には、アクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン、およびウサギａ−グロビンなどの脊椎動物遺伝子由来のもの、ならびに真核細胞において遺伝子発現を制御可能な他の配列が含まれる。さらなる適切な転写制御領域には、組織特異的プロモーターおよびエンハンサー、ならびに誘導性プロモーター（例えばプロモーター誘導性テトラサイクリン）が含まれる。同様に、多様な翻訳制御要素が、当該技術分野の一般の当業者に知られる。これらには、限定されるわけではないが、リボソーム結合部位、翻訳開始および終結コドン、ならびにウイルス系由来の要素（特に内部リボソーム進入部位、またはＩＲＥＳ、ＣＩＴＥ配列としても知られる）が含まれる。発現カセットにはまた、他の特徴、例えば複製起点、および／または染色体組込み要素、例えばレトロウイルス末端反復配列（ＬＴＲ）、またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）反転末端反復（ＩＴＲ）もまた含まれることも可能である。
本発明のポリヌクレオチドおよび核酸コード領域を、本発明のポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドの分泌を指示する分泌性またはシグナルペプチドをコードするさらなるコード領域と関連させてもよい。例えば、抗体の分泌が望ましい場合、シグナル配列をコードするＤＮＡを、本発明の抗体またはその抗原結合部分をコードする核酸の上流に配置してもよい。シグナル仮説によれば、哺乳動物細胞によって分泌されるタンパク質は、シグナルペプチドまたは分泌リーダー配列を有し、こうした配列は、粗面小胞体を渡る成長中のタンパク質鎖の排出が開始されたならば、成熟タンパク質から切断される。一般の当業者は、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドが、一般に、ポリペプチドのＮ末端に融合するシグナルペプチドを有し、翻訳されたポリペプチドからシグナルペプチドが切断されて、ポリペプチドの分泌型または「成熟」型が産生されることを知っている。特定の態様において、天然シグナルペプチド、例えば免疫グロブリン重鎖または軽鎖シグナルペプチド、あるいは機能可能であるように関連したポリペプチドの分泌を指示する能力を保持する、その配列の機能的誘導体を用いる。あるいは、異種哺乳動物シグナルペプチド、またはその機能性誘導体を用いてもよい。例えば、野生型リーダー配列を、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）またはマウスβ−グルクロニダーゼのリーダー配列で置換してもよい。分泌シグナルペプチドの例示的なアミノ酸配列を配列番号１３５〜１３７に示す。
後の精製を容易にする（例えばヒスチジンタグ）か、または抗体標識を補助するために使用可能である低分子タンパク質配列をコードするＤＮＡが、抗体（断片）をコードするポリヌクレオチド内に、またはその末端に含まれてもよい。
さらなる態様において、本発明の１またはそれより多いポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する。特定の態様において、本発明の１またはそれより多いベクターを含む宿主細胞を提供する。ポリヌクレオチドおよびベクターは、それぞれ、ポリヌクレオチドおよびベクターに関連する、本明細書記載の任意の特徴のいずれを、単独で、または組み合わせて取り込んでもよい。１つのこうした態様において、宿主細胞は、本発明の抗体（の一部）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む（例えば、こうしたベクターで形質転換されているかまたはトランスフェクションされている）。本明細書において、用語「宿主細胞」は、本発明の抗体またはその断片を生成するように操作可能な、任意の種類の細胞系を指す。抗体を複製し、そしてその発現を補助するのに適した宿主細胞が当該技術分野に周知である。こうした細胞を、適切なように特定の発現ベクターでトランスフェクションまたは形質導入して、そして多量のベクター含有細胞を、大規模発酵をシードするために増殖させて、臨床的適用のために十分な量の抗体を得ることも可能である。適切な宿主細胞には、原核微生物、例えば大腸菌、または多様な真核細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、昆虫細胞等が含まれる。例えば、特に、グリコシル化が必要でない場合、細菌において、ポリペプチドを産生してもよい。発現後、ポリペプチドを可溶性分画中の細菌細胞ペーストから単離して、そしてさらに精製してもよい。原核生物に加えて、真核微生物、例えば糸状真菌または酵母は、ポリペプチドコードベクターの適切なクローニングまたは発現宿主であり、これには、グリコシル化経路が「ヒト化」されており、部分的にまたは完全にヒトグリコシル化パターンを持つ、ポリペプチドの産生を生じる、真菌および酵母株が含まれる。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２２， １４０９−１４１４（２００４）、およびＬｉら， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２４， ２１０−２１５（２００６）を参照されたい。（グリコシル化）ポリペプチドの発現に適切な宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物および脊椎動物）由来である。無脊椎動物細胞の例には、植物および昆虫細胞が含まれる。昆虫細胞と組み合わせて使用可能な多くのバキュロウイルス株、特にスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞のトランスフェクション用のものが同定されてきている。植物細胞培養もまた、宿主として利用可能である。例えば米国特許第５，９５９，１７７号、第６，０４０，４９８号、第６，４２０，５４８号、第７，１２５，９７８号および第６，４１７，４２９号（トランスジェニック植物において抗体を産生するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＴＭ技術を記載する）を参照されたい。脊椎動物細胞もまた宿主として使用可能である。例えば、懸濁中で増殖するよう適応した哺乳動物細胞株が有用でありうる。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７）；ヒト胚性腎臓株（例えばＧｒａｈａｍら， Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ３６， ５９（１９７７）に記載されるような２９３または２９３Ｔ細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウス・セルトリ細胞（例えばＭａｔｈｅｒ， Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ ２３， ２４３−２５１（１９８０）に記載されるようなＴＭ４細胞）、サル腎臓細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファロー・ラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）、マウス乳腺腫瘍細胞（ＭＭＴ ０６０５６２）、ＴＲＩ細胞（例えばＭａｔｈｅｒら， Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ Ｓｃｉ ３８３， ４４−６８（１９８２）に記載されるようなもの）、ＭＲＣ ５細胞、およびＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株には、ｄｈｆｒ− ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂら， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７７， ４２１６（１９８０））を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞；ならびに骨髄腫細胞株、例えばＹＯ、ＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３およびＳｐ２／０が含まれる。タンパク質産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞株の概説には、ＹａｚａｋｉおよびＷｕ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ． Ｌｏ監修， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔｏｗａ， ＮＪ）， ｐｐ． ２５５−２６８（２００３）を参照されたい。宿主細胞には、いくつかのみを挙げると培養細胞、例えば哺乳動物培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、細菌細胞および植物細胞が含まれるが、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物あるいは培養植物または動物組織内に含まれる細胞も含まれる。１つの態様において、宿主細胞は、真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）細胞またはリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）が含まれる。これらの系において、外来（ｆｏｒｅｉｇｎ）遺伝子を発現するための標準的な技術が当該技術分野に知られる。発現される産物が重鎖および軽鎖の両方を有する抗体であるように、抗体鎖の他方もまた発現するように、抗体の重鎖または軽鎖のいずれかを含むポリペプチドを発現する細胞を操作してもよい。
１つの態様において、本発明にしたがった抗体を産生する方法であって、本明細書に提供するような抗体をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を、抗体の発現に適した条件下で培養し、そして宿主細胞（または宿主細胞培地）から抗体を回収する工程を含む、前記方法を提供する。
抗体をエフェクター部分に融合させる場合、これらの構成要素を、互いに遺伝的に融合させる。その構成要素が、互いに直接、またはリンカー配列を通じて間接的に融合されるように、抗体を設計してもよい。当該技術分野に周知の方法にしたがって、リンカーの組成および長さを決定してもよく、そして有効性に関して試験してもよい。また、望ましい場合、融合物の個々の構成要素を分離するための切断部位、例えばエンドペプチダーゼ認識配列を取り込むため、さらなる配列が含まれてもよい。
特定の態様において、本発明の抗体は、少なくとも、ＡＳＧＰＲに結合可能な抗体可変領域配列を含む。可変領域は、天然または非天然存在抗体およびその断片の一部を形成し、そしてそれらに由来してもよい。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を産生する方法が当該技術分野に周知である（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ， ”Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ”， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， １９８８を参照されたい）。固相合成を用いて非天然存在抗体を構築してもよいし、組換え的に産生してもよいし（例えば米国特許第４，１８６，５６７号に記載されるように）、または例えば、可変重鎖および可変軽鎖を含むコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって、得てもよい（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙに対する米国特許第５，９６９，１０８号を参照されたい）。
本発明において、いかなる動物種の抗体を用いてもよい。本発明で有用な限定されない抗体は、ネズミ、霊長類またはヒト起源のものでありうる。抗体をヒト使用に意図する場合、抗体の定常領域がヒト由来である、抗体のキメラ型を用いてもよい。抗体のヒト化型または完全ヒト型もまた、当該技術分野に周知の方法にしたがって、調製可能である（例えばＷｉｎｔｅｒに対する米国特許第５，５６５，３３２号を参照されたい）。限定されるわけではないが、（ａ）非ヒト（例えばドナー抗体）ＣＤＲを、決定的なフレームワーク残基（例えば優れた抗原結合アフィニティまたは抗体機能を保持するために重要なもの）の保持を伴うまたは伴わないヒト（例えばレシピエント抗体）フレームワークおよび定常領域上に移植すること、（ｂ）非ヒト特異性決定領域（ＳＤＲまたはａ−ＣＤＲ；抗体−抗原相互作用に重要な残基）のみを、ヒトフレームワークおよび定常領域に移植すること、または（ｃ）全非ヒト可変ドメインを移植するが、表面残基の置換によって、ヒト様部分でこれらを「クローキング」することを含む、多様な方法によって、ヒト化を達成してもよい。ヒト化抗体および該抗体を作製する方法は、例えば、ＡｌｍａｇｒｏおよびＦｒａｎｓｓｏｎ， Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ １３， １６１９−１６３３（２００８）に概説され、そしてさらに、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら， Ｎａｔｕｒｅ ３３２， ３２３−３２９（１９８８）； Ｑｕｅｅｎら， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８６， １００２９−１００３３（１９８９）；米国特許第５，８２１，３３７号、第７，５２７，７９１号、第６，９８２，３２１号および第７，０８７，４０９号； Ｊｏｎｅｓら， Ｎａｔｕｒｅ ３２１， ５２２−５２５（１９８６）； Ｍｏｒｒｉｓｏｎら， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８１， ６８５１−６８５５（１９８４）； ＭｏｒｒｉｓｏｎおよびＯｉ， Ａｄｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４４， ６５−９２（１９８８）； Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９， １５３４−１５３６（１９８８）； Ｐａｄｌａｎ， Ｍｏｌｅｃ Ｉｍｍｕｎ ３１（３）， １６９−２１７（１９９４）； Ｋａｓｈｍｉｒｉら， Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６， ２５−３４（２００５）（ＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）移植を記載する）； Ｐａｄｌａｎ， Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２８， ４８９−４９８（１９９１）（「再表面形成（ｒｅｓｕｆａｃｉｎｇ）」を記載する）； Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａら， Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６， ４３−６０（２００５）（「ＦＲシャフリング」を記載する）；ならびにＯｓｂｏｕｒｎら， Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６， ６１−６８（２００５）およびＫｌｉｍｋａら， Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ８３， ２５２−２６０（２０００）（ＦＲシャフリングに向けた、「ガイド付き選択」アプローチを記載する）に記載される。本発明にしたがった特定の抗体は、ヒト抗体である。当該技術分野に知られる多様な技術を用いて、ヒト抗体およびヒト可変領域を産生することも可能である。ヒト抗体は、一般的に、ｖａｎ Ｄｉｊｋおよびｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ， Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ５， ３６８−７４（２００１）ならびにＬｏｎｂｅｒｇ， Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０， ４５０−４５９（２００８）に記載される。ヒト可変領域は、ハイブリドーマ法によって作製されたヒト・モノクローナル抗体の一部を形成してもよいし、そしてこれに由来してもよい（例えば、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ｐｐ． ５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８７）を参照されたい）。また、抗原曝露に反応して、損なわれていないヒト抗体またはヒト可変領域を持つ損なわれていない抗体を産生するよう修飾されているトランスジェニック動物に、免疫原を投与することによって、ヒト抗体およびヒト可変領域を調製してもよい（例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇ， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２３， １１１７−１１２５（２００５）を参照されたい）。また、ヒト由来ファージディスプレイライブラリーから選択されたＦｖクローン可変領域配列を単離することによって、ヒト抗体およびヒト可変領域を生成してもよい（例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７８中， １−３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎら監修， Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔｏｗａ， ＮＪ， ２００１）；およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら， Ｎａｔｕｒｅ ３４８， ５５２−５５４； Ｃｌａｃｋｓｏｎら， Ｎａｔｕｒｅ ３５２， ６２４−６２８（１９９１）を参照されたい）。ファージは、典型的には、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片としてまたはＦａｂ断片としてのいずれかで抗体断片をディスプレイする。ファージディスプレイによる抗体調製の詳細な説明は、実施例に見出されうる。
特定の態様において、例えば、その全内容が本明細書に援用される、ＰＣＴ公報ＷＯ ２０１１／０２０７８３（アフィニティ成熟に関連する実施例を参照されたい）または米国特許出願公報第２００４／０１３２０６６号に開示される方法にしたがって、増進された結合アフィニティを有するように、本発明の抗体を操作する。酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）または当業者によく知られる他の技術、例えば表面プラズモン共鳴技術（Ｌｉｌｊｅｂｌａｄら， Ｇｌｙｃｏ Ｊ １７， ３２３−３２９（２０００））、および伝統的結合アッセイ（Ｈｅｅｌｅｙ， Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｓ ２８， ２１７−２２９（２００２））のいずれかを通じて、本発明の抗体が、特異的抗原決定基に結合する能力を測定してもよい。競合アッセイを用いて、特定の抗原への結合に関して参照抗体と競合する抗体、例えば、ＡＳＧＰＲへの結合に関して、５１Ａ１２抗体と競合する抗体を同定してもよい。特定の態様において、こうした競合抗体は、参照抗体によって結合されるものと同じエピトープ（例えば直鎖またはコンホメーションエピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な例示的な方法が、Ｍｏｒｒｉｓ（１９９６） “Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ． ６６中（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔｏｗａ， ＮＪ）に提供される。例示的な競合アッセイにおいて、固定抗原（例えばＡＳＧＰＲ）を、抗原に結合する第一の標識抗体（例えば５１Ａ１２抗体）、および抗原への結合に関して、第一の抗体と競合する能力に関して試験中である第二の非標識抗体を含む溶液中で、インキュベーションする。第二の抗体は、ハイブリドーマ上清中に存在してもよい。対照として、固定抗原を、第一の標識抗体を含むが第二の非標識抗体を含まない溶液中でインキュベーションする。抗原への第一の抗体の結合を許容する条件下でインキュベーションした後、過剰な非結合抗体を除去し、そして固定抗原と会合している標識の量を測定する。固定抗原と会合している標識の量が、対照試料に比較して試験試料で実質的に減少している場合、これは、抗原への結合に関して、第二の抗体が第一の抗体と競合することを示す。ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８） Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 第１４章（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ）を参照されたい。
本明細書に記載するように調製した抗体を、高性能液体クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、ゲル電気泳動、アフィニティクロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ等の当該技術分野に知られる技術によって精製してもよい。特定のタンパク質を精製するために用いられる実際の条件は、部分的に、純電荷、疎水性、親水性等の要因に応じるであろうし、そして当業者には明らかであろう。アフィニティクロマトグラフィ精製のため、抗体が結合する抗体、リガンド、受容体または抗原を用いてもよい。例えば、本発明の抗体のアフィニティクロマトグラフィ精製のため、プロテインＡまたはプロテインＧを含むマトリックスを用いてもよい。連続プロテインＡまたはＧアフィニティクロマトグラフィおよびサイズ排除クロマトグラフィを用いて、実施例に本質的に記載するような抗体を単離してもよい。ゲル電気泳動、高圧液体クロマトグラフィ等を含む多様な周知の分析法のいずれによって、抗体の純度を決定してもよい。例えば、実施例に記載されるように発現された重鎖融合タンパク質は、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって立証されるように、損なわれておらず、そして適切に組み立てられたことが示された（図１３〜１９を参照されたい）。
組成物、配合物、および投与経路
さらなる側面において、本発明は、例えば以下の療法的方法のいずれかで使用するための、本明細書に提供する任意の抗体を含む薬学的組成物を提供する。１つの態様において、薬学的組成物は、本明細書に提供する任意の抗体、および薬学的に許容されうるキャリアーを含む。別の態様において、薬学的組成物は、本明細書に提供する任意の抗体、および例えば以下に記載するような少なくとも１つのさらなる療法剤を含む。
さらに提供するのは、ｉｎ ｖｉｖｏでの投与に適した型の本発明の抗体を産生する方法であって、（ａ）本発明にしたがった抗体を得て、そして（ｂ）少なくとも１つの薬学的に許容されうるキャリアーとともに、抗体を配合し、それによって、ｉｎ ｖｉｖｏでの投与のための抗体調製物を配合する、前記方法である。
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容されうるキャリアー中に溶解したかまたは分散した、療法的有効量の１またはそれより多い抗体を含む。句「薬学的にまたは薬理学的に許容されうる」は、一般的に、使用する投薬量および濃度で、レシピエントに対して非毒性である、すなわち、適切であるように、動物、例えばヒトに投与した際に、不都合な、アレルギー性のまたは他の有害な反応を生じない、分子実体および組成物を指す。本明細書に援用される、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， 第１８版 Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， １９９０に例示されるように、少なくとも１つの抗体および場合によってさらなる活性成分を含有する薬学的組成物の調製が、本開示を考慮して当業者には知られるであろう。さらに、動物（例えばヒト）投与のため、調製物は、生物学的標準の米国食品医薬品局または他の国における対応する監督官庁によって必要とされるような、無菌性、発熱性、一般的な安全性および純度標準を満たさなければならないことが理解されるであろう。好ましい組成物は、凍結乾燥配合物または水溶液である。本明細書において、「薬学的に許容されうるキャリアー」には、一般の当業者に知られるであろうように、あらゆる溶媒、緩衝液、分散媒体、コーティング、界面活性剤、酸化防止剤、保存剤（例えば抗細菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩、保存剤、酸化防止剤、タンパク質、薬剤、薬剤安定化剤、ポリマー、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、フレーバー剤、色素、同様の物質およびその組み合わせが含まれる（例えば、本明細書に援用されるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， 第１８版 Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， １９９０， ｐｐ．１２８９−１３２９を参照されたい）。任意の慣用的キャリアーが活性成分と不適合である場合を除き、療法的または薬学的組成物中のその使用が意図される。
組成物は、固体型、液体型またはエアロゾル型を投与しようとしているか、そして注射などの投与経路のために無菌である必要があるかどうかに応じて、異なるタイプのキャリアーを含んでもよい。本発明の抗体（および任意のさらなる療法剤）を、静脈内、皮内、動脈内、腹腔内、病変内、頭蓋内、関節内、前立腺内、脾臓内、腎臓内、胸膜内、気管内、鼻内、硝子体内、膣内、直腸内、腫瘍内、筋内、腹腔内、皮下、結膜下、小胞内、粘膜、心膜内、臍内、眼内、経口、局所、局在、吸入による（例えばエアロゾル吸入）、注射、注入、連続注入、局在化灌流で、ターゲット細胞を直接浸し、カテーテルを通じ、洗浄を通じ、クリーム中、脂質組成物（例えばリポソーム）中、または他の方法によって、あるいは一般の当業者に知られるであろうように、前述の任意の組み合わせによって、投与してもよい（例えば、本明細書に援用される、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， 第１８版 Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， １９９０を参照されたい）。非経口投与、特に静脈内注射が、本発明の抗体などのポリペプチド分子を投与するために最も一般的に用いられる。
非経口組成物には、注射、例えば皮下、経皮、病変内、静脈内、動脈内、筋内、クモ膜下内または腹腔内注射による投与のために設計されるものが含まれる。注射のため、本発明の抗体を水溶液、好ましくは生理学的に適合する緩衝液、例えばハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理学的生理食塩水緩衝液中で配合してもよい。溶液は、配合用（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒｙ）剤、例えば懸濁剤、安定化剤および／または分散剤を含有してもよい。あるいは、抗体は、適切なビヒクル、例えば無菌発熱物質不含水で、使用前に構成するための粉末型であってもよい。本発明の抗体を、必要に応じて、以下に列挙する多様な他の成分とともに、適切な溶媒中に必要な量で取り込むことによって、無菌注射可能溶液を調製する。無菌性は、例えば無菌濾過膜を通じた濾過によって、容易に達成可能である。一般的に、基本的分散媒体および／または他の成分を含有する無菌ビヒクル内に、多様な無菌活性成分を取り込むことによって、分散物を調製する。無菌注射可能溶液、懸濁物またはエマルジョンを調製するための無菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、真空乾燥または凍結乾燥技術であり、これらの技術は、活性成分の粉末に加えて、先に無菌濾過した液体培地由来の任意のさらなる望ましい成分を生じる。液体媒体は、必要な場合、適切に緩衝されていなければならず、そして液体希釈剤はまず、十分な生理食塩水またはグルコースで、注射前に等張にされる。組成物は、製造および保存の条件下で安定でなければならず、そして微生物、例えば細菌および真菌の混入作用に対して保持されなければならない。内毒素混入は、安全なレベルに、例えば０．５ｎｇ／ｍｇタンパク質未満に、最小限に維持されなければならないことが認識されるであろう。適切な薬学的に許容されうるキャリアーには、限定されるわけではないが：リン酸、クエン酸、および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む酸化防止剤；保存剤（例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチルまたはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジン；グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む、単糖、二糖、および他の炭水化物；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖、例えばスクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール；塩形成対イオン、例えばナトリウム；金属錯体（例えばＺｎ−タンパク質錯体）；および／または非イオン性界面活性剤、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれる。水性注射懸濁物は、懸濁物の粘性を増加させる化合物、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、デキストラン等を含有してもよい。場合によって、懸濁物はまた、適切な安定化剤、または高濃度溶液の調製を可能にするための、化合物溶解度を増加させる剤も含有してもよい。さらに、適切な油性注射懸濁物として、活性化合物の懸濁物を調製してもよい。適切な親油性溶媒またはビヒクルには、脂肪油、例えばゴマ油、または合成脂肪酸エステル、例えばエチルクリーツ（ｃｌｅａｔｓ）またはトリグリセリド、またはリポソームが含まれる。
例えばコアセルベート化技術によって、または界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えばヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル中、それぞれ、コロイド性薬剤送達系（例えばリポソーム、アルブミン微小球体、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）中に、活性成分を封入してもよい。こうした技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１８版 Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， １９９０）に開示される。持続放出調製物を調製してもよい。持続放出調製物の適切な例には、ポリペプチドを含有する固形疎水性ポリマーの半浸透性マトリックスが含まれ、このマトリックスは、成形物品の形、例えばフィルムまたは微小カプセルであってもよい。特定の態様において、注射可能組成物の延長された吸収は、吸収を遅延させる剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム、ゼラチンまたはその組み合わせの組成物中で用いることによって、達成可能である。
先に記載した組成物に加えて、また、抗体をデポ調製物として配合してもよい。移植によって（例えば皮下または筋内）、または筋内注射によって、こうした長期作用性配合物を投与してもよい。したがって、例えば、適切なポリマー性または疎水性物質とともに（例えば許容されうる油中のエマルジョンとして）、あるいはイオン交換樹脂として、あるいは難溶性誘導体として、例えば難溶性塩として、抗体を配合してもよい。
慣用的な混合、溶解、乳化、被包、捕捉または凍結乾燥法によって、本発明の抗体を含む薬学的組成物を製造することも可能である。１またはそれより多い生理学的に許容されうるキャリアー、希釈剤、賦形剤、またはタンパク質を薬学的に使用可能な調製物にプロセシングするのを容易にする補助剤を用いて、慣用的な方式で薬学的組成物を配合することも可能である。適切な配合物は、選択した投与経路に応じる。
抗体を、遊離酸または塩基中、中性または塩型で、組成物に配合してもよい。薬学的に許容されうる塩は、遊離酸または塩基の生物学的活性を実質的に保持する塩である。これらには、酸付加塩、例えばタンパク質性組成物の未結合（ｆｒｅｅ）アミノ基で形成されるもの、あるいは例えば塩酸もしくはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸もしくはマンデル酸などの有機酸で形成されるものが含まれる。未結合カルボキシル基で形成される塩はまた、無機塩基、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄；あるいは有機塩基、例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジンまたはプロカインに由来してもよい。薬学的塩は、対応する未結合塩基型よりも、水性および他のプロトン性溶媒中でより可溶性である傾向がある。
療法的方法および組成物
本明細書に提供する任意の抗体は、療法的方法で使用可能である。
療法的方法で使用するため、適切な医療行為と一致する様式で、本発明の抗体を配合し、投薬し、そして投与するであろう。この背景で考慮するための要因には、治療しようとする特定の障害、治療しようとする特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、剤の送達部位、投与法、投与スケジューリング、および医療従事者に知られる他の要因が含まれる。
１つの側面において、薬剤として使用するための本発明の抗体を提供する。さらなる側面において、疾患を治療する際に使用するための本発明の抗体を提供する。特定の態様において、治療法で使用するための本発明の抗体を提供する。１つの態様において、本発明は、治療が必要な個体において、疾患を治療する際に使用するための本明細書記載の抗体を提供する。特定の態様において、本発明は、疾患を有する個体を治療する方法であって、療法的有効量の抗体を個体に投与する工程を含む、前記方法において使用するための抗体を提供する。特定の態様において、治療しようとする疾患は肝臓疾患である。例示的な肝臓疾患には、肝炎、肝硬変、または肝臓癌、例えば肝細胞癌が含まれる。特定の態様において、疾患は、ウイルス感染、特に肝炎ウイルス感染、より具体的にはＨＢＶ感染である。別の特定の態様において、疾患は、癌、特に肝臓癌、より具体的には肝細胞癌（ＨＣＣ）である。特定の態様において、方法はさらに、個体に、療法的有効量の少なくとも１つのさらなる療法剤、例えば治療しようとする疾患がウイルス感染である場合は抗ウイルス剤、または治療しようとする疾患が癌である場合は抗癌剤を投与する工程をさらに含む。上記態様のいずれか記載の「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトである。
さらなる側面において、本発明は、治療が必要な個体において疾患を治療するための薬剤の製造または調製における、本発明の抗体の使用を提供する。１つの態様において、薬剤は、疾患を有する個体に、療法的有効量の薬剤を投与する工程を含む、疾患を治療する方法において使用するためのものである。特定の態様において、治療しようとする疾患は肝臓疾患である。特定の態様において、疾患はウイルス感染、特に肝炎ウイルス感染、より具体的にはＨＢＶ感染である。他の態様において、治療しようとする疾患は癌である。特定の態様において、疾患は肝臓癌、特に肝細胞癌（ＨＣＣ）である。１つの態様において、方法はさらに、個体に療法的有効量の少なくとも１つのさらなる療法剤、例えば治療しようとする疾患がウイルス感染である場合は抗ウイルス剤、または治療しようとする疾患が癌である場合は抗癌剤を投与する工程をさらに含む。上記態様のいずれか記載の「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトであることも可能である。
さらなる側面において、本発明は、個体において疾患を治療するための方法であって、本発明の抗体の療法的有効量を、前記個体に投与する工程を含む、前記方法を提供する。１つの態様において、薬学的に許容されうる型で本発明の抗体を含む組成物を前記個体に投与する。特定の態様において、治療しようとする疾患は肝臓疾患である。特定の態様において、疾患はウイルス感染、特に肝炎ウイルス感染、より具体的にはＨＢＶ感染である。他の態様において、治療しようとする疾患は癌である。特定の態様において、疾患は肝臓癌、特に肝細胞癌（ＨＣＣ）である。特定の態様において、方法はさらに、療法的有効量の少なくとも１つのさらなる療法剤、例えば治療しようとする疾患がウイルス感染である場合は抗ウイルス剤、または治療しようとする疾患が癌である場合は抗癌剤を投与する工程をさらに含む。上記態様のいずれか記載の「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトであることも可能である。
本発明の抗体はまた、診断試薬としても有用である。抗原決定基への抗体の結合は、抗体に付着した標識によって、または本発明の抗体に特異的な標識二次抗体を用いることによって、容易に検出可能である。
いくつかの態様において、本発明の抗体の有効量を細胞に投与する。他の態様において、本発明の抗体の療法的有効量を、疾患の治療のため、個体に投与する。
疾患の防止または治療のため、本発明の抗体の適切な投薬量（単独で用いた場合、あるいは１またはそれより多い他のさらなる療法剤と用いた場合）は、治療しようとする疾患のタイプ、投与経路、患者の体重、抗体のタイプ、疾患の重症度および経過、予防的または療法的目的で抗体を投与するか、以前のまたは同時の療法的介入、患者の臨床歴および抗体に対する反応、ならびに主治医の決定権に応じるであろう。投与に関与する医師は、いかなる場合も、個々の被験体に対する、組成物中の活性成分（単数または複数）の濃度、および適切な用量（単数または複数）を決定するであろう。限定されるわけではないが、多様な時点に渡る単一のまたは多数回の投与、ボーラス投与、ならびにパルス注入を含む多様な投薬スケジュールが本明細書に意図される。
１回、または一連の治療に渡って、患者に抗体を適切に投与する。疾患のタイプおよび重症度に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ）の抗体が、例えば１またはそれより多い別個の投与によって、あるいは連続注入によってのいずれかで、患者に投与するための最初の候補投薬量であってもよい。１つの典型的な１日投薬量は、上述の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であってもよい。数日またはそれより長い期間に渡る反復投与に関しては、状態に応じて、治療は、一般的に、疾患症状の望ましい抑制が生じるまで、持続されるであろう。１つの例示的な抗体投薬量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。他の限定されない例において、用量はまた、投与あたり、約１μｇ／ｋｇ体重、約５μｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ／ｋｇ体重、約１００μｇ／ｋｇ体重、約２００μｇ／ｋｇ体重、約３５０μｇ／ｋｇ体重、約５００μｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ／ｋｇ体重、約５ｍｇ／ｋｇ体重、約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約２００ｍｇ／ｋｇ体重、約３５０ｍｇ／ｋｇ体重、約５００ｍｇ／ｋｇ体重から約１０００ｍｇ／ｋｇ体重またはそれより多い範囲、そしてそこから導き出せる任意の範囲を含んでもよい。本明細書に列挙する数値から導き出せる範囲の限定されない例において、上記数値に基づいて、約５ｍｇ／ｋｇ体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約５μｇ／ｋｇ体重〜約５００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲等を投与してもよい。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇ（または任意のその組み合わせ）の１またはそれより多い用量を、患者に投与してもよい。こうした用量を断続的に、例えば毎週または３週ごと（例えば患者が抗体の約２〜約２０、または例えば約６用量を投与されるように）投与してもよい。最初のより高い装填用量の後、１またはそれより多い、より低い用量を投与してもよい。しかし、他の投薬措置が有用でありうる。この療法の進行は、慣用的技術およびアッセイによって、容易に監視される。
本発明の抗体は、一般的に、意図される目的を達成するために有効な量で用いられるであろう。疾患状態を治療するかまたは防止するための使用のため、本発明の抗体、またはその薬学的組成物を、療法的有効量で投与するかまたは適用する。療法的有効量の決定は、特に本明細書に提供する詳細な開示を考慮した際、十分に当業者の能力の範囲内である。
全身投与のため、療法的有効用量をまず、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ、例えば細胞培養アッセイから概算してもよい。次いで、細胞培養において決定されるようなＩＣ５０を含む循環濃度範囲を達成するような用量を、動物モデルにおいて配合してもよい。こうした情報を用いて、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定してもよい。
最初の投薬量をまた、当該技術分野に周知の技術を用いて、ｉｎ ｖｉｖｏデータ、例えば動物モデルから概算してもよい。一般の当業者は、動物データに基づいてヒトへの投与を容易に最適化することも可能である。
投薬量および間隔を個々に調整して、療法的効果を維持するのに十分な抗体血漿レベルを提供してもよい。注射による投与のための有用な患者投薬量は、約０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ／日、典型的には約０．５〜１ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。各日、多数の用量を投与することによって、療法的に有効な血漿レベルを達成してもよい。血漿中のレベルを例えばＨＰＬＣによって測定してもよい。
局所投与または選択的取り込みの場合、抗体の有効局所濃度は、血漿濃度に関連しない可能性もある。当業者は、過度の実験を伴わずに、療法的有効局所投薬量を最適化することを可能にするであろう。
本明細書記載の抗体の療法的有効用量は、一般的に、実質的な毒性を引き起こすことなく、療法的利益を提供するであろう。抗体の毒性および療法的有効性を、細胞培養または実験動物において、標準的薬学的方法によって決定することも可能である。細胞培養アッセイおよび動物研究を用いて、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死性である用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において療法的に有効である用量）を決定してもよい。毒性および療法的効果の間の用量比は、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表されうる、療法的指数である。大きな療法的指数を示す抗体が好ましい。１つの態様において、本発明にしたがった抗体は、高い療法的指数を示す。ヒトで使用するのに適した投薬量範囲を配合する際に、細胞培養アッセイおよび動物研究から得られるデータを用いてもよい。投薬量は好ましくは、ほとんどまたはまったく毒性を伴わず、ＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。多様な要因、例えば使用する投薬型、利用する投与経路、被験体の状態等に応じて、投薬量は、この範囲内で多様でありうる。正確な配合、投与経路および投薬量は、患者の状態を概観して、個々の医師によって選択されてもよい（例えば本明細書にその全体が援用される、Ｆｉｎｇｌら， １９７５，： Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ中， 第１章， ｐ．１）。
本発明の抗体で治療される患者の主治医は、どのようにして、そしていつ、毒性、臓器機能不全等のために、投薬を終結させるか、中断するか、または調整するかを知っているであろう。逆に、主治医はまた、臨床的反応が適切でない（毒性を除く）場合、より高いレベルに治療を調整することも知っているであろう。関心対象の障害の管理において、投与用量の規模は、治療しようとする状態の重症度、投与経路等に応じて、多様であろう。状態の重症度は、例えば、部分的に、標準的予後評価法によって、評価可能である。さらに、用量、そしておそらく用量頻度はまた、個々の患者の年齢、体重、および反応に応じて多様であろう。
他の剤および治療
本発明の抗体を、療法において、１またはそれより多い他の剤と組み合わせて投与してもよい。例えば、本発明の抗体を、少なくとも１つのさらなる療法剤と同時投与してもよい。用語「療法剤」は、こうした治療が必要な個体において、症状または疾患を治療するために投与される任意の剤を含む。こうしたさらなる療法剤は、治療しようとする特定の徴候に適した任意の活性成分、好ましくは互いに不都合に影響しない相補的活性を持つものを含んでもよい。特定の態様において、さらなる療法剤は抗ウイルス剤である。他の態様において、さらなる療法剤は抗癌剤である。
こうした他の剤は、意図する目的のために有効な量で、組み合わせて適切に存在する。こうした他の剤の有効量は、用いる抗体の量、障害または治療のタイプ、および上に論じる他の要因に応じる。抗体は、一般的に、本明細書に記載するものと同じ投薬量および投与経路で、または本明細書に記載する投薬量の１〜９９％で、または経験的に／臨床的に適切と決定される任意の投薬量および任意の経路によって、用いられる。
上述のこうした併用療法は、組み合わせた投与（２またはそれより多い療法剤が同じまたは別個の組成物中で含まれる）、および別個の投与を含み、後者の場合、本発明の抗体の投与は、さらなる療法剤および／またはアジュバントの投与前、投与と同時、および／または投与後に生じてもよい。
製造品
本発明の別の側面において、上記障害の治療、防止および／または診断に有用な物質を含有する製造品を提供する。製造品は、容器およびラベルまたは添付文書を、容器上にまたは容器と関連して含む。適切な容器には、例えば、瓶、バイアル、シリンジ、ＩＶ溶液バッグ等が含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの多様な物質で形成されてもよい。容器は、単独の、あるいは状態を治療し、防止し、そして／または診断するのに有効な別の組成物と組み合わせた、組成物を保持し、そして無菌アクセスポートを有してもよい（例えば、容器は静脈内溶液バッグまたは皮下注射針によって貫通可能な栓を有するバイアルであってもよい）。組成物中の少なくとも１つの活性剤は、本発明の抗体である。標識または添付文書は、組成物を、選択した状態を治療するために用いることを示す。さらに、製造品は、（ａ）組成物を含有する第一の容器であって、組成物が本発明の抗体を含む、前記容器；および（ｂ）組成物を含有する第二の容器であって、組成物がさらなる療法剤を含む、第二の容器を含むことも可能である。本発明のこの態様における製造品は、組成物を用いて、特定の状態を治療することが可能であることを示す、添付文書をさらに含んでもよい。あるいは、またはさらに、製造品は、薬学的に許容されうる緩衝剤、例えば注射用の静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル溶液およびデキストロース溶液を含む第二（または第三）の容器を含んでもよい。これにはさらに、商業的およびユーザーの視点から、他の望ましい物質も含まれてもよく、これには、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、およびシリンジが含まれる。
以下は、本発明の方法および組成物の例である。上に提供する一般的な説明を考慮して、多様な他の態様を実施可能であることが理解される。
組換えＤＮＡ技術
標準法を用いて、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．ら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ； Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８９に記載されるように、ＤＮＡを操作した。製造者の指示にしたがって、分子生物学的試薬を用いた。
ヒト免疫グロブリン軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は： Ｋａｂａｔ， Ｅ．Ａ．ら（１９９１） Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， 第５版， ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ ９１−３２４２に記載される。
ＤＮＡ配列決定
二本鎖配列決定によって、ＤＮＡ配列を決定した。
遺伝子合成
必要な場合、望ましい遺伝子セグメントを、適切なテンプレートを用いてＰＣＲによって生成するか、または自動化遺伝子合成によって、合成オリゴヌクレオチドおよびＰＣＲ産物から、Ｇｅｎｅａｒｔ ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、ドイツ）で合成してもよい。正確な遺伝子配列が入手可能でない場合、最も近い相同体由来の配列に基づいてオリゴヌクレオチドプライマーを設計し、そして適切な組織から生じるＲＮＡから、ＲＴ−ＰＣＲによって遺伝子を単離した。単一制限エンドヌクレアーゼ切断部位が隣接する遺伝子セグメントを、標準的クローニング／配列決定ベクター内にクローニングした。プラスミドＤＮＡを形質転換細菌から精製し、そして濃度をＵＶ分光計によって決定した。サブクローニングした遺伝子断片のＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。それぞれの発現ベクター内へのサブクローニングを可能にするために、適切な制限部位を伴って、遺伝子セグメントを設計した。真核細胞における分泌のためにタンパク質をターゲティングするリーダーペプチドをコードする５’端ＤＮＡ配列を含めて、すべての構築物を設計した。配列番号１３５〜１３７は、例示的なリーダーペプチドを生じる。
抗原発現ベクターのクローニング
関心対象の抗原をコードする増幅ＤＮＡ断片を、インフレームで、可溶性および精製タグとして働くヒトＩｇＧ１ Ｆｃコード断片の下流で、哺乳動物レシピエントベクター内に挿入した（図１）。野生型Ｆｃ配列（配列番号１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３）を含む抗原−Ｆｃ融合物の発現は、ホモ二量体分子を生じた（ａｖｉ−Ｆｃ−ヒトＡＳＧＰＲ Ｈ１ストーク：配列番号１２４、ａｖｉ−Ｆｃ−カニクイザルＡＳＧＰＲ Ｈ１ストーク：配列番号１２６、ａｖｉ−Ｆｃ−ヒトＡＳＧＰＲ Ｈ１ストークＣＲＤ：配列番号１３０、ａｖｉ−Ｆｃ−カニクイザルＡＳＧＰＲ Ｈ１ストークＣＲＤ：配列番号１３２）。タンパク質ＣＬＥＣ１０Ａは、ＡＳＧＰＲ Ｈ１と最も近い相同体と同定され、そして構築物ａｖｉ−Ｆｃ−ヒトＣＬＥＣ１０Ａストーク（配列番号１２８）およびａｖｉ−Ｆｃ−ヒトＣＬＥＣ１０ＡストークＣＲＤ（配列番号１３４）を、選択した結合剤の特異性を試験するために発現させた。単量体状態にある抗原を発現するため、ＤＮＡ断片を、「穴」突然変異を含有するＦｃ部分（配列番号１１７、１１９）に融合させ、そしてＦｃ−「ノブ」（配列番号１２１）対応物とともに発現した（Ｆｃ−ヒトＡＳＧＰＲ Ｈ１ ＣＲＤ：配列番号１１８および１２２、ａｖｉ−Ｆｃ−ヒトＣＬＥＣ１０Ａ ＣＲＤ：配列番号１２０および１２２）。抗原発現は、一般的に、ＭＰＳＶプロモーターによって駆動され、そして転写は、ＣＤＳの下流に位置する合成ポリＡシグナル配列によって終結した。さらに、すべての構築物は、Ｂｉｒ Ａビオチンリガーゼとの同時発現中、特異的ビオチン化を可能にするＮ末端Ａｖｉタグを含有した。発現カセットに加えて、各ベクターは、ＥＢＶ−ＥＢＮＡ発現細胞株における自律複製のためのＥＢＶ ｏｒｉＰ配列を含有した。
抗原および抗体の産生および精製
抗原および抗体の両方を、ＥＢＶ由来タンパク質ＥＢＮＡを安定発現するＨＥＫ ２９３細胞に一過性にトランスフェクションした。同時に、ビオチンリガーゼＢｉｒ Ａをコードするプラスミドを同時トランスフェクションすると、ｉｎ ｖｉｖｏでＡｖｉタグ特異的ビオチン化が可能になった。次いで、プロテインＡカラム、その後、ゲル濾過を用いて、タンパク質を精製した。
一般的なラムダＦａｂライブラリーの生成
以下のＶドメイン対を用いて、ヒト生殖系列遺伝子に基づき、Ｆａｂ形式で、一般的なラムダ抗体ライブラリーを生成した：ＤＰ４７−ラムダライブラリーを生じるＶｌ３＿１９ラムダ軽鎖とＶＨ３＿２３重鎖。ライブラリーを軽鎖のＣＤＲ３（Ｌ３）および重鎖のＣＤＲ３（Ｈ３）においてランダム化し、そして「重複伸長によるスプライシング」（ＳＯＥ）ＰＣＲによって３つの断片から組み立てた。断片１は、ランダム化Ｌ３を含む抗体遺伝子の５’端を含み、断片２は、Ｌ３の終わりからＨ３の始まりに渡る中央定常断片であり、一方、断片３は、ランダム化Ｈ３およびＦａｂ断片の３’部分を含む。以下のプライマー組み合わせを用いて、ライブラリーのためのライブラリー断片を生成した：断片１（ＬＭＢ３（配列番号１４６）−Ｖｌ＿３＿１９＿Ｌ３ｒプライマー（配列番号１４３〜１４５））、断片２（ＲＪＨ８０（配列番号１４８）−ＤＰ４７ＣＤＲ３＿ｂａ（ｍｏｄ）（配列番号１４９））、断片３（ＤＰ４７−ｖ４プライマー（配列番号１４０〜１４２）−ｆｄｓｅｑｌｏｎｇ（配列番号１４７）（表１）。ライブラリー断片産生のためのＰＣＲパラメータは、５分間９４℃の最初の変性、２５周期の６０秒間９４℃、６０秒間５５℃、６０秒間７２℃、および１０分間７２℃の最終伸長であった。組み立てＰＣＲのため、テンプレートとしての３断片の等モル比を用いて、パラメータは、３分間９４℃の最初の変性、および５周期の６０秒間９４℃、６０秒間５５℃、１２０秒間７２℃であった。この段階で、外側プライマーを添加し、そしてさらなる２０周期を行った後、１０分間７２℃の最終伸長を行った（図２）。十分な量の全長ランダム化Ｆａｂ断片を組み立てた後、これらを、同様に処理したアクセプターファージミドベクターと平行して、ＮｃｏＩ／ＮｈｅＩで消化した。１５μｇのＦａｂライブラリー挿入物を１３．３μｇのファージミドベクターと連結した。精製した連結物を６０回の形質転換に用い、１．５ｘ１０９形質転換体を生じた。Ｆａｂライブラリーをディスプレイするファージミド粒子をレスキューし、そして選択に用いるために、ＰＥＧ／ＮａＣｌ精製によって精製した。
表１． 一般的なラムダライブラリーの生成に用いたプライマーの配列
一般的ラムダＦａｂライブラリーからの抗ヒトＡＳＧＰＲ Ｈ１結合剤の選択
ＨＥＫ２９３に発現される、ヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ部分に融合した単量体または二量体ヒトＡＳＧＰＲタンパク質断片（配列番号１１８、１２０、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４）を用いて、ヒトＡＳＧＰＲ Ｈ１の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の全体または断片に対する選択を行った。Ｆｃ「ノブを穴に」形式を用いた単量体Ｆｃ融合物として、ＡＳＧＰＲ Ｈ１ ＣＲＤおよびＣＬＥＣ１０Ａ ＣＲＤを発現する（Ｃ末端に融合したＣＲＤを所持するただ１つのＦｃ）一方、すべてのストーク断片および総ＥＣＤをホモ二量体Ｆｃ融合タンパク質として発現した（図１）。Ｎ末端ａｖｉタグを通じて、ビオチンリガーゼＢｉｒ Ａの同時発現によって、抗原を酵素的にビオチン化した。以下のパターンにしたがって、溶液中で、パニング周期を実行した：（１）Ｆｃ結合剤を回避するため、ＮＵＮＣ ｍａｘｉｓｏｒｐプレート上に１０μｇ／ｍｌでコーティングしたヒトＩｇＧ１を用いて、〜１０１２のファージミド粒子をあらかじめきれいにする（ｐｒｅｃｌｅａｒｉｎｇ）、（２）１００ｎＭビオチン化抗原タンパク質に、あらかじめきれいにした反応の上清由来の非Ｆｃ結合ファージミド粒子を、総体積１ｍｌ中で０．５時間結合させる、（３）ストレプトアビジンでコーティングした５．４ｘ１０７の磁気ビーズを１０分間添加することによって、ビオチン化抗原および付着した特異的結合ファージを捕捉する、（４）５ｘ１ｍｌ ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ−２０および５ｘ１ｍｌ ＰＢＳを用いてビーズを洗浄する、（５）１ｍｌの１００ｍＭトリエチルアミン（ＴＥＡ）を１０分間添加することによってファージ粒子を溶出し、そして５００μｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ７．４を添加することによって中和する、（６）対数期の大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＴＧ１細胞を、上清中のファージ粒子に再感染させ、ヘルパーファージＶＣＳＭ１３に感染させ、そして続いて、続く選択周期で用いようとするファージミド粒子をＰＥＧ／ＮａＣｌ沈殿させる。一定のまたは減少する（１０−７Ｍ〜２ｘ１０−９Ｍ）抗原濃度のいずれかを用いて、３〜５周期に渡って選択を行った。周期２において、ストレプトアビジンビーズの代わりにニュートラビジン・プレートを用いて、抗原−ファージ複合体の捕捉を行った。ＥＬＩＳＡによって、特異的結合剤を以下のように同定した：ウェルあたり１００μｌの５０ｎＭビオチン化ヒトＦｃ−ストーク−ＣＲＤ、Ｆｃ−ＣＲＤ、またはＦｃ−ストークをニュートラビジン・プレート上にコーティングした。Ｆａｂ含有細菌上清を添加し、そして抗Ｆｌａｇ／ＨＲＰ二次抗体を用いることによって、Ｆｌａｇタグを通じて、結合しているＦａｂを検出した。バックグラウンドを超えて有意なシグナルを示すクローンを、配列決定（配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５および２７）およびさらなる分析のため、選考通過とした。
Ｆａｂの精製
細菌培養由来のＦａｂ（配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６および２８として列挙される可変ドメインのタンパク質配列）を、動力学的パラメータの正確な分析のために精製した。各クローンに関して、５００ｍｌの培養に、対応するファージミドを宿する細菌を接種し、そして１ｍＭ ＩＰＴＧで、ＯＤ６００ ０．９に誘導した。その後、培養を２５℃で一晩インキュベーションし、そして遠心分離によって採取した。再懸濁したペレットを２５ｍｌ ＰＰＢ緩衝液（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０％スクロース）中で２０分間インキュベーションした後、細菌を再び遠心分離し、そして上清を採取した。このインキュベーション工程を２５ｍｌの５ｍＭ ＭｇＳＯ４溶液で１回反復した。両方のインキュベーション工程の上清をプールし、濾過し、そしてＩＭＡＣカラム（Ｈｉｓ ｇｒａｖｉｔｒａｐ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に装填した。続いて、カラムを４０ｍｌの洗浄緩衝液（５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、２０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４）で洗浄した。溶出（５００ｍＭ ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール、２０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４ ｐＨ７．４）後、ＰＤ１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて溶出液を再緩衝した。次いで、精製したＦａｂの動力学的パラメータを、２００ｎＭ〜６．２５ｎＭの範囲の希釈列で、ＳＰＲ分析（Ｐｒｏｔｅｏｎ ＸＰＲ３６、Ｂｉｏｒａｄ）によって研究した。
ＳＰＲによるアフィニティ決定
ニュートラビジン捕捉によって、ＮＬＣチップ上に固定された一価（ａｖｉ−Ｆｃ−ヒトＡＳＧＰＲ Ｈ１ ＣＲＤ、配列番号１１８）または二価（ａｖｉ−Ｆｃ−ヒトＡＳＧＰＲ Ｈ１ストーク−ＣＲＤ、配列番号１３０）ＡＳＧＰＲ Ｈ１抗原とともに、２５℃でＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６装置（Ｂｉｏｒａｄ）を用いた表面プラズモン共鳴によって、選択したＦａｂクローンのアフィニティ（ＫＤ）を測定した。組換え抗原（リガンド）の固定：抗原をＰＢＳＴ（１０ｍＭリン酸、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．４、０．００５％ Ｔｗｅｅｎ−２０）で１０μｇ／ｍｌに希釈し、次いで、多様な接触時間で、３０μｌ／分で注入して、垂直配向で２００、４００または８００反応単位（ＲＵ）の固定レベルを達成した。分析物注入：１ショット動力学的測定のため、注入方向を水平配向に変化させて、精製Ｆａｂ（１００〜６．２５ｎＭの濃度範囲で多様）の２倍希釈シリーズを、別個のチャネル１〜５に沿って、１５０または２００ｓの会合時間、および２４０または６００ｓの解離時間で、５０、６０または１００μｌ／分で同時に注入した。緩衝液（ＰＢＳＴ）を第六のチャネルに沿って注入して、参照のための「インライン」ブランクを提供した。会合および解離センサーグラムを同時に適合させることによって、ＰｒｏｔｅＯｎ Ｍａｎａｇｅｒ ｖ３．１ソフトウェアにおいて、単純な１対１ラングミュア結合モデルを用いて、会合速度定数（ｋｏｎ）および解離速度定数（ｋｏｆｆ）を計算した。平衡解離定数（ＫＤ）を、比ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして計算した。１０ｍＭグリシン、ｐＨ１．５を流速１００μｌ／分、３０ｓの接触時間で用いて、水平配向で再生を行った。２つのクローン、５１Ａ１２（配列番号００２および００４）および５２Ｃ４（配列番号００６および００８）は、ＡＳＧＰＲ Ｈ１ ＣＲＤに特異的であることが見出された。顕著なことに、クローン５１Ａ１２は、ナノモル未満の範囲でアフィニティを明らかにした。クローン５Ａ４（配列番号０１０および０１２）、４Ｆ３（配列番号０１４および０１６）、Ｒ５Ｃ２（配列番号０１８および０２０）、Ｒ９Ｅ１０（配列番号０２２および０２４）、およびＲ９Ｅ１０（配列番号０２６および０２８）をＡＳＧＰＲ Ｈ１のストーク領域またはストークおよびＣＲＤの間の界面のいずれかに対して作製した。対応するヒトおよびカニクイザルエピトープに対するアフィニティは同様であった。対照的に、ａｖｉ−ＦｃヒトＣＬＥＣ１０ＡストークＣＲＤ（配列番号１３４）に対しては結合は検出されず、これらの結合剤の高い特異性が立証された。興味深いことに、クローン５Ａ４は、ストーク抗原には強い結合を示したが、ストーク−ＣＲＤに対しては示さなかった。すべての測定の動力学的および熱力学的データを表２に要約する。
表２． 抗ＡＳＧＰＲ Ｈ１ Ｆａｂの動力学的および熱力学的パラメータ
発現ベクターへの可変抗体ドメインのクローニング
ＳＰＲによって対応する抗原に特異的結合を示すすべてのＦａｂを、ＩｇＧ１／ラムダ抗体に変換した。したがって、重鎖および軽鎖ｖドメインのＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片を、インフレームで、ヒトＩｇＧ１定常重鎖またはヒト定常ラムダ軽鎖いずれかを含有するそれぞれのレシピエント哺乳動物発現ベクター内に挿入した。抗体発現は、ＭＰＳＶプロモーターによって駆動され、そして転写は、ＣＤＳの下流に位置する合成ポリＡシグナル配列によって終結した。発現カセットに加えて、各ベクターは、ＥＢＶ−ＥＢＮＡ発現細胞株における自律複製のため、ＥＢＶ ｏｒｉＰ配列を含有した。
ＨｅｐＧ２細胞への抗体の結合分析
肝細胞癌細胞株ＨｅｐＧ２へのヒトＩｇＧ１抗ＡＳＧＰＲ抗体の結合をＦＡＣＳによって測定した。簡潔には、９６ウェル丸底プレート中、ウェルあたり０．２ミオ細胞を、３０μｇ／ｍｌの濃度の抗ＡＳＧＰＲ抗体と、３００μｌ中、４℃で３０分間インキュベーションした。０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳで細胞を洗浄することによって、未結合抗体を除去した。ＦＩＴＣコンジュゲート化ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃガンマ断片特異的二次Ｆ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ ＃１０９−０９６−０９８； ＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ中、作業溶液１：２０）を用いて、結合した抗体を検出した。４℃で３０分間インキュベーションした後、洗浄することによって、未結合抗体を除去し、そして１％ＰＦＡを用いて細胞を固定した。ＢＤ ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩ（ソフトウェアＢＤ ＤＩＶＡ）を用いて、細胞を分析した（図３）。すべての抗体は、ＨｅｐＧ２細胞に強い結合を示した。
蛍光共鳴エネルギー移動アッセイ
蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）分析によって、ＡＳＧＰＲ発現細胞上のエピトープに対するＩｇＧのアビディティを決定した。この分析のため、ＳＮＡＰタグをコードするＤＮＡ配列（Ｃｉｓｂｉｏより購入したプラスミド）をＰＣＲによって増幅し、そして全長ヒトＡＳＧＰＲ Ｈ１配列を含有する発現ベクター（Ｏｒｉｇｅｎｅ）内に連結した。生じた融合タンパク質は、Ｃ末端ＳＮＡＰタグを伴う、全長ＡＳＧＰＲ Ｈ１で構成された。トランスフェクション試薬としてＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を用いて、１０μｇ ＤＮＡで、ＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクションした。２０時間のインキュベーション時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、そして１００ｎＭ ＳＮＡＰ−Ｌｕｍｉ４Ｔｂ（Ｃｉｓｂｉｏ）を含有するＬａｂＭｅｄ緩衝液（Ｃｉｓｂｉｏ）中、３７℃で１時間インキュベーションして、ＳＮＡＰタグの特異的標識を導いた。続いて、細胞をＬａｂＭｅｄ緩衝液で４回洗浄して、未結合色素を除去した。緩衝液に比較して、６１５ｎｍでのテルビウム放出を測定することによって、標識効率を決定した。次いで、細胞を−８０℃で最長６ヶ月間凍結保存した。５０〜０．３９ｎＭの範囲の濃度で、ＡＳＧＰＲ特異的抗体を標識細胞（ウェルあたり１００細胞）に添加し、その後、ＦＲＥＴのアクセプター分子として抗ヒトＦｃ−ｄ２（ウェルあたり最終２００ｎＭ）を添加することによって、アビディティを測定した。ＲＴで３時間のインキュベーション時間後、アクセプター色素（６６５ｎｍ）ならびにドナー色素（６１５ｎｍ）の放出を、蛍光読み取り装置（Ｖｉｃｔｏｒ ３、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて決定した。アクセプター放出対ドナー放出の比を計算し、そしてバックグラウンド対照（抗ｈｕＦｃ−ｄ２を含む細胞）の比を減じた。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ５で曲線を分析して、そしてＫＤ値を計算した。（図４）。クローン４Ｆ３は、ＳＰＲによって測定すると、ＡＳＧＰＲ Ｈ１ストーク−ＣＲＤに対する最低のアフィニティを示す（表２）一方、細胞表面へのＩｇＧとしての結合強度は、強いアビディティによって駆動され、４Ｆ３を、低濃度で最強の結合強度を持つクローンにした。対照的に、ＣＤＲに結合するクローン５１Ａ１２は、ＳＰＲ研究において、精製抗原に対するよりも細胞に対して、低い抗体濃度で、有意により弱い結合強度を示す。
天然ＡＳＧＰＲリガンドとの結合競合
ＡＳＧＰＲの天然リガンドとしての脱シアル化糖タンパク質、例えばアシアロフェチュインと、ＡＳＧＰＲ抗体の競合を、肝細胞癌細胞株ＨｅｐＧ２を用いて分析した。９６ウェル丸底プレート中、ウェルあたり０．２ミオ細胞を、４０μｌのＡｌｅｘａ４８８標識アシアロフェチュイン（ウシ胎児血清由来、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ ＃Ａ４７８１、最終濃度１００μｇ／ｍｌ）と、４℃で３０分間インキュベーションした。ＡＳＧＰＲへのリガンド結合はカルシウム依存性であるため、結合はカルシウムの存在下で行った。０．１％ＢＳＡを含有するＨＢＳＳで細胞を１回洗浄することによって、未結合タンパク質を除去した。次いで、４０μｌの抗ＡＳＧＰＲ抗体（３０、６、および１．２５μｇ／ｍｌ最終濃度）を、１００μｇ／ｍｌのアシアロフェチュインの存在下で、細胞に添加した。細胞を４℃で３０分間インキュベーションし、そして細胞を１回洗浄することによって、未結合タンパク質を除去した。ＡＰＣコンジュゲート化ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃガンマ断片特異的二次Ｆ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ ＃１０９−１３６−１７０； ０．１％ＢＳＡを含有するＨＢＳＳ中、作業溶液１：５０）を二次抗体として用いた。４℃で３０分間インキュベーションした後、洗浄することによって、未結合二次抗体を除去した。１％ＰＦＡを用いて細胞を固定し、そしてＢＤ ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩ（ソフトウェアＢＤ ＤＩＶＡ）を用いて分析した。ＣＤＲ特異的抗体およびストーク−ＣＲＤ特異的抗体の両方の分析によって、抗体は、アシアロフェチュインの存在とは独立にＡＳＧＰＲ Ｈ１に結合し、そして逆も当てはまり、そして結合競合は起こらないことが明らかになった（図５および６）。
内在化研究
ＡＳＧＰＲへの結合後、肝臓細胞内への脱シアル化糖タンパク質の取り込みは、非常に迅速に起こることが知られる。この受容体仲介性エンドサイトーシス中、エンドソーム管腔は、酸性になり、受容体−リガンド複合体が解離することが可能になる。リガンドが、リソソームにおける分解のためにターゲティングされる一方、ＡＳＧＰＲは、リサイクルされて細胞表面に戻ることが示された。細胞表面上での抗体の保持時間を分析するため、肝細胞癌細胞株ＨｅｐＧ２を用いて、ＡＳＧＰＲ−抗体複合体の内在化を分析した。内在化を阻害するため、ＡＳＧＰＲ陽性ＨｅｐＧ２細胞を細胞培地中、４℃にシフトさせた。振盪装置上、４℃で抗体（３０μｇ／ｍｌ）と４５分間インキュベーションした後、冷ＰＢＳで２回洗浄することによって、未結合抗体を除去し、そして細胞を再懸濁し、そしてあらかじめ３７℃に温めた培地中で培養して、受容体仲介エンドサイトーシスを含む細胞代謝を再活性化させた。１つのアリコットを直ちに採取し、そして氷上に保存し、これはゼロ時点に相当した。残りの細胞を３７℃でインキュベーションし、そして５、１５、３０、および１２０分後、さらなる試料を採取し、そして冷ＰＢＳで洗浄して、さらなる内在化を停止させた。ＰＥコンジュゲート化ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃガンマ特異的二次Ｆ（ａｂ’）２抗体断片（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ ＃１０９−１１６−１７０、作業溶液１：５０）を用いて、細胞表面に結合した抗体を検出した。４℃で３０分間インキュベーションした後、０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳで洗浄することによって、未結合抗体を除去した。１％ＰＦＡを用いて細胞を固定し、そしてＢＤ ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩ（ソフトウェアＢＤ ＤＩＶＡ）を用いて分析した。図７Ａは、クローン４Ｆ３および５１Ａ１２の例示的な細胞表面曝露抗体レベルを示す。興味深いことに、細胞外抗体シグナルは、最初の３０分の間に有意に（最大６０％シグナル減少）に減少したが、次いで、残りの時間経過に渡って、減少は遅延された。この結果は、抗体が非常に効率的に内在化するが、次いで、次第に細胞表面にリサイクルされて戻り、一定の内在化およびリサイクリングの動的安定状態条件を導くことを示す。この仮説を支持するため、同じ実験であるが、抗体と細胞のインキュベーションを、細胞培地中、３７℃で４５分間、実行する実験を行った。これらの条件によって、受容体−抗体複合体が形成され、そして全インキュベーション時間中に内在化されることが可能になり、最終的に定常的なエンドサイトーシスおよびリサイクリングの安定状態を導くことが可能になる。その後、温かいＰＢＳで２回洗浄することによって、未結合抗体を除去し、そして細胞を温かい培地に再懸濁した。１つの試料を直ちに採取し、そして氷上に保存し、これはゼロ時点に相当した。残りの細胞を３７℃でインキュベーションし、そして５、１５、３０、および１２０分後、さらなる試料を採取し、そして冷ＰＢＳで洗浄して、さらなる内在化を停止させた。上述のように、表面曝露抗体の検出を行った。ＦＡＣＳ分析によって、シグナル強度の減少は、４℃よりも３７℃で抗体をインキュベーションした後、実験の時間経過中により顕著でないことが明らかになり、３７℃での抗体のインキュベーションが、抗体−受容体複合体の内在化およびリサイクリングの平衡を生じることが示唆された（図７Ｂ）。一定の内在化およびリサイクリングの仮説をさらに支持するため、直接ＦＩＴＣ標識抗体セットを用いて、ＡＳＧＰＲ Ｈ１特異的抗体の内在化をさらに分析した。以前のように、標識抗体をＨｅｐＧ２細胞と４℃でインキュベーションして、抗体がＡＳＧＰＲ Ｈ１に結合するが、内在化しないことを可能にした。振盪装置上、抗体（３０μｇ／ｍｌ）と４℃で４５分間インキュベーションした後、冷ＰＢＳで２回洗浄することによって、未結合抗体を除去し、そして細胞を再懸濁し、そしてあらかじめ３７℃に温めた培地中で培養して、受容体仲介エンドサイトーシスを含む細胞代謝を再活性化させた。０、５、１５、３０、および１２０分後、細胞アリコットを採取し、そして冷ＰＢＳで洗浄して、さらなる内在化を停止させた。ＰＥコンジュゲート化ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃガンマ特異的二次Ｆ（ａｂ’）２抗体断片（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ ＃１０９−１１６−１７０、作業溶液１：５０）を用いて、細胞表面に結合した抗体を検出した。先に見られたように、表面曝露の検出レベルは、安定化される前、最初の３０分の間に有意に減少した（図７Ｃ）。しかし、表面曝露抗体および内在化抗体の両方に相当するＦＩＴＣシグナルによるＩｇＧの検出は、抗体総量が長期に渡って一定のままであることを明らかにした（図７Ｄ）。この結果は、抗体が、定常の内在化およびリサイクリングの動的安定状態条件にあるという知見を強く支持する。
クローン５１Ａ１２に基づくＬ３アフィニティライブラリーの生成
抗体配列の分析によって、５１Ａ１２軽鎖のＣＤＲ３領域中に２つのホットスポット、すなわち２つの隣接するシステインおよびグリコシル化部位が明らかになった（図８）。システインおよびグリコシル化を伴わない５１Ａ１２由来クローンの生成のため、ＬＣＤＲ３をランダム化した成熟ライブラリーを生成した。クローン５１Ａ１２の配列（Ａ８２Ｇ、Ｃ１１２Ｓ、Ｃ１１３Ｓ、Ｓ１１６Ａ）（配列番号３３）をランダム化のテンプレートとして用いた。「ＲＤＩＳＳＮＲＡＶＲＮ」位をコードするトリプレットをセグメント全体に渡ってランダム化した。ライブラリー生成のため、２断片の重複ＰＣＲ産物から生じるＤＮＡ部分をファージベクター内にクローニングした。断片１の生成のため、プライマーの組み合わせＬＣＤＲ３ ｒａｎｄ（配列番号１５１）およびｆｄｓｅｑｌｏｎｇ（配列番号１４７）（表１および３）を用い、テンプレートとしてクローン５１Ａ１２（Ａ８２Ｇ、Ｃ１１２Ｓ、Ｃ１１３Ｓ、Ｓ１１６Ａ）を用いた。増幅条件には、最初の５分間９４℃のインキュベーション工程、その後、各々、３０秒間９４℃変性、３０秒間６０℃アニーリング、および９０秒間７２℃伸長工程からなる２５周期、その後、最終の１０分間７２℃伸長工程が含まれた。生じた断片を、アガロースゲル上で精製した。プライマーの組み合わせＬＣＤＲ３ｒｅｖ（配列番号１５０）およびＬＭＢ３（配列番号１４６）で、断片２を生成した（表１および３）。増幅条件には、最初の５分間９４℃のインキュベーション工程、その後、各々、３０秒間９４℃変性、３０秒間６０℃アニーリング、および３０秒間７２℃伸長工程からなる２５周期、その後、最終の１０分間７２℃伸長工程が含まれた。両方の断片の組み立てのため、等モル量の断片１および２を用いた。増幅条件には、最初の５分間９４℃のインキュベーション工程、その後、各々、１分間９４℃変性、１分間６０℃アニーリング、および１２０秒間７２℃伸長工程からなり、プライマーを伴わない５周期が含まれた。外側プライマーＬＭＢ３およびｆｄｓｅｑｌｏｎｇを添加した後、同じパラメータを用いて、２０のさらなる周期を行った。最後に、最終１０分間７２℃インキュベーション工程を行った。どちらも、生じたゲル精製ＤＮＡ断片およびクローン５１Ａ１２（Ａ８２Ｇ、Ｃ１１２Ｓ、Ｃ１１３Ｓ、Ｓ１１６Ａ）（配列番号３３）を、ＮｃｏＩ／ＰｓｔＩで消化した（図９）。ライブラリーを生成するため、１０μｇ挿入物および３０μｇベクターを用いて、連結を行った。精製した連結物をエレクトロポレーションによって、ＴＧ１細菌内に形質転換して、３ｘ１０９形質転換体を生じた。Ｆａｂライブラリーをディスプレイするファージミド粒子をレスキューし、そして選択に用いるため、ＰＥＧ／ＮａＣｌ精製によって精製した。
表３． Ｌ３アフィニティ成熟ライブラリーの生成に用いたプライマーの配列
システインおよびグリコシル化部位を伴わない、アフィニティ成熟５１Ａ１２由来クローンの選択
標準的プロトコル（Ｓｉｌａｃｃｉら（２００５）， Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ５， ２３４０−５０）を用いたファージディスプレイによって、ＬＣＤＲ３内にシステインおよびグリコシル化部位を含まないアフィニティ成熟５１Ａ１２由来Ｆａｂの生成を行った。第一のパニング周期において、以下の方法にしたがって、溶液中で選択を行った：（１）〜１０１２のファージミド粒子を、１０ｎＭビオチン化Ｆｃ−ＣＲＤに、総体積１ｍｌ中で０．５時間結合させる、（２）ストレプトアビジンでコーティングした５．４ｘ１０７の磁気ビーズを１０分間添加することによって、ビオチン化Ｆｃ−ＣＲＤおよび特異的に結合したファージ粒子を捕捉する、（３）５ｘ１ｍｌ ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ−２０および５ｘ１ｍｌ ＰＢＳを用いてビーズを洗浄する、（４）１ｍｌの１００ｍＭ ＴＥＡを１０分間添加することによってファージ粒子を溶出させ、そして５００μｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ７．４を添加することによって中和する、（５）指数増殖期の大腸菌ＴＧ１細胞を再感染させる、そして（６）ヘルパーファージＶＣＳＭ１３に感染させ、そして続いて、続く選択周期で用いようとするファージミド粒子をＰＥＧ／ＮａＣｌ沈殿させる。減少する（１０−９Ｍ〜０．５ｘ１０−９Ｍ）抗原濃度を用いて、３周期に渡って選択を行った。周期２および３において、ストレプトアビジンビーズの代わりにニュートラビジン・プレートを用いて、抗原−ファージ複合体の捕捉を行った。さらに、ニュートラビジン・プレートを２ｌ ＰＢＳ中で３時間洗浄した。ＥＬＩＳＡによって、特異的結合剤を以下のように同定した：ウェルあたり１００μｌの５０ｎＭビオチン化Ｆｃ−ＣＲＤをニュートラビジン・プレート上にコーティングした。Ｆａｂ含有細菌上清を添加し、そして抗Ｆｌａｇ／ＨＲＰ二次抗体を用いることによって、Ｆｌａｇタグを通じて、結合しているＦａｂを検出した。ＥＬＩＳＡ陽性クローンを、９６ウェル形式で、可溶性Ｆａｂ断片として細菌発現させ、そして上清を、Ｐｒｏｔｅｏｎ ＸＰＲ３６を用いたＳＰＲ分析によって、動力学スクリーニング実験に供した。最高のアフィニティ定数を持つＦａｂを発現しているクローンを同定し、そして対応するファージミドの軽鎖を配列決定した（５１Ａ１２＿Ｃ１、配列番号３５； ５１Ａ１２＿Ｃ７、配列番号３７； ５１Ａ１２＿Ｅ７、配列番号３９； ５１Ａ１２＿Ｈ３、配列番号４１； ５１Ａ１２＿Ａ６、配列番号４３； ５１Ａ１２＿Ｄ１、配列番号４５； ５１Ａ１２＿Ｈ６、配列番号４７）。すべてのクローンは、軽鎖ＣＤＲ３領域中にいかなる決定的なアミノ酸も含まなかった。
ＳＰＲによる、５１Ａ１２に基づくアフィニティ成熟クローンのアフィニティ決定
ニュートラビジン捕捉によって、ＮＬＣチップ上に固定されたビオチン化一価（ａｖｉ−Ｆｃ−ヒトＡＳＧＰＲ Ｈ１ ＣＲＤ、配列番号１１８）または二価（ａｖｉ−Ｆｃ−ヒトＡＳＧＰＲ Ｈ１ストーク−ＣＲＤ、配列番号１３０）ＡＳＧＰＲ Ｈ１抗原とともに、２５℃でＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６装置（Ｂｉｏｒａｄ）を用いた表面プラズモン共鳴によって、親重鎖（配列番号４）およびアフィニティ成熟軽鎖（５１Ａ１２＿Ｃ１、配列番号３６； ５１Ａ１２＿Ｃ７、配列番号３８； ５１Ａ１２＿Ｅ７、配列番号４０； ５１Ａ１２＿Ｈ３、配列番号４２； ５１Ａ１２＿Ａ６、配列番号４４； ５１Ａ１２＿Ｄ１、配列番号４６； ５１Ａ１２＿Ｈ６、配列番号４８）からなる精製５１Ａ１２由来Ｆａｂ断片のアフィニティ（ＫＤ）を測定した。組換え抗原（リガンド）の固定：抗原をＰＢＳＴ（１０ｍＭリン酸、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．４、０．００５％ Ｔｗｅｅｎ−２０）で１０μｇ／ｍｌに希釈し、次いで、多様な接触時間で、３０μｌ／分で注入して、垂直配向で２００、４００または８００反応単位（ＲＵ）の固定レベルを達成した。分析物注入：１ショット動力学的測定のため、注入方向を水平配向に変化させて、精製Ｆａｂ（１２．５〜０．７８ｎＭの濃度範囲で多様）の２倍希釈シリーズを、別個のチャネル１〜５に沿って、１５０または２００ｓの会合時間、および３６００ｓの解離時間で、１００μｌ／分で同時に注入した。緩衝液（ＰＢＳＴ）を第六のチャネルに沿って注入して、参照のための「インライン」ブランクを提供した。会合および解離センサーグラムを同時に適合させることによって、ＰｒｏｔｅＯｎ Ｍａｎａｇｅｒ ｖ３．１ソフトウェアにおいて、単純な１対１ラングミュア結合モデルを用いて、会合速度定数（ｋｏｎ）および解離速度定数（ｋｏｆｆ）を計算した。平衡解離定数（ＫＤ）を、比ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして計算した。１０ｍＭグリシン、ｐＨ１．５を流速１００μｌ／分、３０ｓの接触時間で用いて、水平配向で再生を行った。選択したクローンの大部分は、親クローンと同様のアフィニティを示したが、クローン５１Ａ１２＿Ａ６（配列番号４４）は、有意に改善されたアフィニティを示した（表４）。
表４． アフィニティ成熟抗ＡＳＧＰＲ１ Ｆａｂの動力学的および熱力学的パラメータ
ＨｅｐＧ２細胞へのアフィニティ成熟５１Ａ１２誘導体の結合分析
選択したアフィニティ成熟５１Ａ１２誘導体のＡＳＧＰＲ陽性肝細胞癌細胞株ＨｅｐＧ２への結合を、ＦＡＣＳによって測定した。陰性対照として、ＡＳＧＰＲ陰性細胞株Ｈｅｌａを用いた。９６ウェル丸底プレート中、ウェルあたり０．２ミオ細胞を、精製Ｆａｂ断片（１．１、３．３および１０μｇ／ｍｌ）またはヒトＩｇＧ１変換抗体（０．０１、０．０４、０．１、０．４、１．１、３．３および１０μｇ／ｍｌ）のいずれかと、３００μｌ中、４℃で３０分間インキュベーションした。０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳで細胞を洗浄することによって、未結合抗体を除去した。ＦＩＴＣコンジュゲート化ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）２断片特異的二次Ｆ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ ＃１０９−０９６−０９７）またはＦＩＴＣコンジュゲート化ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃガンマ断片特異的二次Ｆ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ ＃１０９−０９６−０９８； ＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ中、作業溶液１：２０）のいずれかを用いて、結合した分子を検出した。４℃で３０分間インキュベーションした後、洗浄することによって、未結合抗体を除去し、そして１％ＰＦＡを用いて細胞を固定した。ＢＤ ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩ（ソフトウェアＢＤ ＤＩＶＡ）を用いて、細胞を分析した。ＨｅｐＧ２細胞へのＦａｂ結合の分析によって、すべてのクローンの強い結合が明らかになった（図１０）。変異体５１Ａ１２＿Ａ６（配列番号４４）は、ＳＰＲ分析および細胞結合研究の両方において、最強の結合剤であった。ＨｅｐＧ２細胞へのＩｇＧ１変換抗体としてのクローン変異体の結合分析は、すべてのクローンに関して同様に強い結合パターンを生じ（図１１Ａ）、一方、最高抗体濃度でのＨｅｌａ細胞への結合は、非常に弱いかまたは検出不能であり（図１１Ｂ）、これらのクローン変異体の特異性を強調した。
ＩｇＧ−ＩＦＮα ＤＮＡ構築物の生成
ＡＳＧＰＲ Ｈ１抗体、５１Ａ１２、５１Ａ１２（Ｓ１１６Ａ）、５１Ａ１２（Ａ８２Ｇ、Ｓ１１６Ａ）、５２Ｃ４、５Ａ４、４Ｆ３、Ｒ５Ｃ２、Ｒ９Ｅ１０、Ｒ７Ｅ１２、５１Ａ１２＿Ｃ１、５１Ａ１２＿Ｃ７、５１Ａ１２＿Ｅ７、５１Ａ１２＿Ｈ３、５１Ａ１２＿Ａ６、５１Ａ１２＿Ｄ１および５１Ａ１２＿Ｈ６に基づいて、ＡＳＧＰＲ Ｈ１ターゲティング化ＩｇＧ−ＩＦＮα融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を生成し、ここで、１つのインターフェロン−α２ａ（ＩＦＮα）を、図１２Ａに示すように、１つのヘテロ二量体重鎖のＣ末端に融合させた。ＡＳＧＰＲ Ｈ１が選択的に発現される肝臓の肝細胞へのターゲティングは、二価抗体Ｆａｂ領域を通じて達成される（アビディティ効果）。単一ＩＦＮαの存在を生じるヘテロ二量体化は、ノブを穴に（ｋｉｈ）技術を適用することによって達成される。ホモ二量体ＩｇＧサイトカイン融合物の生成を最小限にするため、（Ｇ４Ｓ）３リンカーを通じて、ノブ含有ＩｇＧ重鎖のＣ末端（Ｃ末端Ｌｙｓ残基の欠失を含む）にサイトカインを融合させた。抗体−サイトカイン融合物は、ＩｇＧ様特性を有する。ＦｃγＲ結合／エフェクター機能を減少させ、そしてＦｃＲ同時活性化を防止するため、Ｐ３２９Ｇ Ｌ２３４Ａ Ｌ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）突然変異をＦｃドメイン中に導入した。しかし、ＦｃＲｎ結合は損なわれなかった。これらのイムノコンジュゲートをコードするＤＮＡ配列を、配列番号４９、５１および５３（５１Ａ１２）、配列番号５５、５７および５９（５２Ｃ４）、配列番号９３、５１および５３（５１Ａ１２ Ａ８２Ｇ、Ｓ１１６Ａ）、配列番号９１、５１および５３（５１Ａ１２、Ｓ１１６Ａ）、配列番号６１、６３および６５（５Ａ４）、配列番号６７、６９および７１（４Ｆ３）、配列番号７３、７５および７７（Ｒ５Ｃ２）、配列番号７９、８１および８３（Ｒ９Ｅ１９）、配列番号８５、８７および８９（Ｒ７Ｅ１２）、配列番号９５、５１および５３（５１Ａ１２＿Ｃ１）、配列番号９７、５１および５３（５１Ａ１２＿Ｃ７）、配列番号９９、５１および５３（５１Ａ１２＿Ｅ７）、配列番号１０１、５１および５３（５１Ａ１２＿Ｈ３）、配列番号１０３、５１および５３（５１Ａ１２＿Ａ６）、配列番号１０５、５１および５３（５１Ａ１２＿Ｄ１）、配列番号１０７、５１および５３（５１Ａ１２＿Ｈ６）に示す。さらに、別の穴−重鎖を生成し、ここでは、ＶＨおよびＣＨ１ドメインの両方を欠失させた（配列番号１１５）。生じたＦｃ断片は、全長ノブ重鎖とヘテロ二量体化することが可能であり、単一サイトカイン融合を伴う一価抗体を導いた（図１２Ｂ）。機能アッセイに関する陰性対照として、明記するターゲットにＩｇＧが結合しない対照ＤＰ４７ＧＳ／ＤＰＬ１６非ターゲティング化ＩｇＧ−ＩＦＮａタンパク質をコードする対応するＤＮＡ構築物を生成した。このアイソタイプ・イムノコンジュゲートのＤＮＡ配列を、配列番号１０９、１１１および１１３に提供する。
抗体−サイトカイン構築物の発現および精製
リン酸カルシウムトランスフェクションを用いて、指数関数的に増殖しているＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を哺乳動物発現ベクターで同時トランスフェクションすることによって、イムノコンジュゲートを産生した。あるいは、懸濁中で増殖しているＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）によって、それぞれの発現ベクターでトランスフェクションした。続いて、１アフィニティ工程（プロテインＡ）、その後、サイズ排除クロマトグラフィ（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で構成される方法によって、ＩｇＧ−サイトカイン融合タンパク質を上清から精製した。プロテインＡカラム（ＨｉＴｒａｐ ＰｒｏｔＡ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、２０ｍＭ リン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ７．５中で平衡化した。上清を装填した後、カラムをまず、２０ｍＭ リン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ７．５で洗浄し、そして続いて、１３．３ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ５．４５で洗浄した。ＩｇＧ−サイトカイン融合タンパク質を、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１００ｍＭグリシン、ｐＨ３で溶出させた。分画を中和し、プールし、そして最終配合緩衝液（２５ｍＭリン酸カリウム、１２５ｍＭ塩化ナトリウム、１００ｍＭグリシン、ｐＨ６．７、または２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０）中、サイズ排除クロマトグラフィ（ＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって精製した。アミノ酸配列に基づいて計算したモル消光係数を用いて、光学密度（ＯＤ）を２８０ｎｍで測定することによって、精製タンパク質試料のタンパク質濃度を決定した。イムノコンジュゲートの純度および分子量を、還元剤（５ｍＭ １，４−ジチオトレイトール）の存在下および非存在下で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたはＣａｌｉｐｅｒによって分析した。製造者の指示にしたがって、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）プレキャストゲル系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた（４〜２０％Ｔｒｉｓ−グリシンゲルまたは３〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ＧＬ分析用サイズ排除カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、２ｍＭ ＭＯＰＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２％ＮａＮ３、ｐＨ７．３流動緩衝液中、２５℃でイムノコンジュゲート試料の凝集物含量を分析した。図１３（５１Ａ１２ ｋｉｈ ＩｇＧ ＩＦＮα、配列番号５０、５２、５４）、図１４（４Ｆ３ ｋｉｈ ＩｇＧ ＩＦＮα、配列番号６８、７０、７２）、図１５（５１Ａ１２＿Ｃ１ ｋｉｈ ＩｇＧ ＩＦＮα、配列番号９６、５２、５４）、図１６（５１Ａ１２＿Ｅ７ ｋｉｈ ＩｇＧ ＩＦＮα、配列番号１００、５２、５４）、図１７（５１Ａ１２＿Ｃ７ ｋｉｈ ＩｇＧ ＩＦＮα、配列番号９８、５２、５４）、図１８（非ターゲティング化ｋｉｈ ＩｇＧ ＩＦＮα、配列番号１１０、１１２、１１４）および図１９（一価５１Ａ１２ ｋｉｈ ＩｇＧ ＩＦＮα、配列番号５０、５２、１１６）中、選択したクローンに関して、分析データの要約を示す。
ＳＰＲによる、ＡＳＧＰＲ Ｈ１に対するＩｇＧ−ＩＦＮαイムノコンジュゲートのアフィニティ決定
ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６装置（Ｂｉｏｒａｄ）上で、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、例示的なＩｇＧ−ＩＦＮαイムノコンジュゲートとして用いたクローン５１Ａ１２および５２Ｃ４のＡＳＧＰＲ Ｈ１結合活性を決定し、そして対応する非修飾ＩｇＧ抗体に比較した。ビオチン化ａｖｉ−ＦｃヒトＡＳＧＰＲ Ｈ１ ＣＲＤ抗原をニュートラビジン捕捉によってＮＬＣチップ上に固定した。組換え抗原（リガンド）の固定：抗原をＰＢＳＴ（１０ｍＭリン酸、１５０ｍＭ塩化ナトリウムｐＨ７．４、０．００５％ Ｔｗｅｅｎ−２０）で１０μｇ／ｍｌに希釈し、次いで、多様な接触時間で、３０μｌ／分で注入して、垂直配向で４００反応単位（ＲＵ）の固定レベルを達成した。分析物注入：１ショット動力学的測定のため、注入方向を水平配向に変化させて、精製ＩｇＧ、一価および二価抗体−サイトカイン融合物（５０〜３．２５ｎＭの濃度範囲で多様）の２倍希釈シリーズを、別個のチャネル１〜５に沿って、１２０または２００ｓの会合時間、および３００ｓの解離時間で、５０μｌ／分で同時に注入した。緩衝液（ＰＢＳＴ）を第六のチャネルに沿って注入して、参照のための「インライン」ブランクを提供した。会合および解離センサーグラムを同時に適合させることによって、ＰｒｏｔｅＯｎ Ｍａｎａｇｅｒ ｖ３．１ソフトウェアにおいて、単純な１対１ラングミュア結合モデルを用いて、会合速度定数（ｋｏｎ）および解離速度定数（ｋｏｆｆ）を計算した。平衡解離定数（ＫＤ）を、比ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして計算した。１０ｍＭグリシン、ｐＨ１．５を流速１００μｌ／分、３０ｓの接触時間で用いて、水平配向で再生を行った。データは、方法の誤差内で、ヒトＡＳＧＰＲ Ｈ１に関するアフィニティ（一価ディスプレイ）およびアビディティ（二量体ディスプレイ）が、クローン５１Ａ１２に基づく（配列番号５０、５２、５４）、およびクローン５２Ｃ４に基づく（配列番号５６、５８、６０）イムノコンジュゲート両方に関して保持されることを示す（表５）。
表５． ＡＳＧＰＲ Ｈ１に対するクローン５１Ａ１２および５２Ｃ４の一価および二価結合形式の動力学的および熱力学的パラメータ
ＡＳＧＰＲ陽性および陰性細胞に対するＩｇＧ−ＩＦＮαイムノコンジュゲートの結合
抗体コンジュゲートの特異性を特徴付けるため、抗体−サイトカイン・コンジュゲートをＡＳＧＰＲ陽性および陰性細胞の両方とインキュベーションし、そして特異的結合をＦＡＣＳ分析によって測定した。このため、初代ヒト肝細胞（３人のドナー由来；Ｃｅｌｓｉｓ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（メリーランド州ボルチモア）より購入）、Ｈｕｈ−７細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ａ５４９細胞、Ｈｅｌａ細胞、および２９３Ｔ細胞（各１ｘ１０５）を、１μｇのＡＳＧＰＲ Ｈ１特異的ＩｇＧ ｋｉｈ ＩＦＮα試料と氷上で４５分間インキュベーションした。洗浄後、細胞を標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ二次抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州サンディエゴ）と氷上で３０分間インキュベーションした。３回の洗浄後、Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーターを用いたＦＡＣＳ分析によって、染色した細胞を分析した。すべてのＦＡＣＳアッセイにおいて、アイソタイプ対照コンジュゲート（非ターゲティング化ｋｉｈ ＩｇＧ ＩＦＮα、配列番号１１０、１１２、１１４）を用いて、バックグラウンドを決定し、これを試験抗体に関するＭＦＩ値から減じた。製造者の指示にしたがって、直接標識抗体コンジュゲート（Ｚｅｎｏｎ（登録商標）Ｒ−フィコエリトリン・ヒトＩｇＧ標識キット、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いることによって、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）への結合分析を行った。結合分析によって、クローン５１Ａ１２ ＩｇＧ ｋｉｈ ＩＦＮα（配列番号５０、５２、５４）および４Ｆ３ ＩｇＧ ｋｉｈ ＩＦＮα（配列番号６８、７０、７２）が、ＡＳＧＰＲ陽性細胞に対して高い特異的結合を示す一方、ＡＳＧＰＲ陰性細胞上のシグナルは、アイソタイプ対照コンジュゲートに匹敵したことが明らかになった（図２０）。さらに、クローン４Ｆ３ ＩｇＧ ｋｉｈ ＩＦＮαの結合飽和曲線を分析した。このため、抗体−ＩＦＮαコンジュゲートを、０．０００１〜６．７μｇ／ｍｌの範囲の希釈列で、初代ヒト肝細胞（３人のドナー由来）とインキュベーションし、そしてＦＡＣＳ分析によって結合強度を記録した。図２１に示すように、初代ヒト肝細胞上の、ならびに対照細胞株ＨｅｐＧ２上の結合飽和には、０．２５〜０．７４μｇ／ｍｌ抗体濃度で到達し、そしてより高い抗体濃度は、結合シグナルをさらには有意には増加させなかった。
長期に渡るＨｅｐＧ２細胞上の表面曝露ＡＳＧＰＲレベルの分析
ＡＳＧＰＲへの結合後、肝臓細胞内への脱シアル化糖タンパク質の取り込みは、非常に迅速に起こることが知られる。この受容体仲介性エンドサイトーシス中、エンドソームの管腔は酸性になり、受容体−リガンド複合体が解離することを可能にする。リガンドが、リソソームにおける分解のためにターゲティングされる一方、ＡＳＧＰＲは、リサイクルされて細胞表面に戻ることが示された。受容体結合後の内在化は、いくつかの受容体に関して、受容体発現の下方制御を誘発することが示されたため、抗ＡＳＧＰＲ Ｈ１抗体の存在下での表面曝露ＡＳＧＰＲのレベルを長期に渡って測定した。この実験のため、ＨｅｐＧ２細胞を、最長５時間、ＩｇＧとして、あるいは一価または二価抗体−ＩＦＮα融合タンパク質としてのいずれかのクローン５１Ａ１２由来抗体とインキュベーションした。陰性対照として、ＨｅｐＧ２細胞に対する結合特異性を持たない関連しない抗体を用いた（ＧＡ１０１）（すべての抗体は３０μｇ／ｍｌ）。３７℃でのインキュベーション中、３０、６０、１２０、１８０、および３００分後、試料を採取し、そして冷ＰＢＳで洗浄した。ＡＰＣコンジュゲート化ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃｇ断片特異的二次Ｆ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ、作業溶液１：５０）を用いて、細胞表面に結合した抗体を検出した。４℃で３０分間インキュベーションした後、０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳで洗浄することによって、未結合抗体を除去した。１％ＰＦＡを用いて細胞を固定し、そしてＢＤ ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩ（ソフトウェアＢＤ ＤＩＶＡ）を用いて分析した。抗体−サイトカイン融合物の完全性を検証するため、ＩＦＮαの存在もまた検出した。細胞を、ヒト・インターフェロン・アルファに対するマウス・モノクローナル抗体（ＭＭＨＡ−１、＃２１１０５−１、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、５μｇ／ｍｌ）と４℃で３０分間インキュベーションした。０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳで洗浄することによって、未結合抗体を除去し、そしてＦＩＴＣコンジュゲート化抗マウスＦ（ａｂ’）２断片（Ｓｅｒｏｔｅｃ、ＳＴＡＲ１０５Ｆ；作業溶液１：５０）を二次抗体として用いた。１％ＰＦＡを用いて細胞を固定し、そしてＢＤ ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩ（ソフトウェアＢＤ ＤＩＶＡ）を用いて分析した。図２２に示す結果によって、ＡＳＧＰＲに結合した一定レベルの表面曝露抗体が示され、測定した期間に渡って、結合が誘導する受容体の下方制御はまったくなかった。注目すべきことに、単量体ＩｇＧ−ＩＦＮα構築物は、最強のシグナルを生じ、これはおそらく、ＡＳＧＰＲ複合体あたり単量体ＩｇＧ−ＩＦＮα分子の数の倍が結合可能であるという事実のためである可能性が最も高い（図２２Ａ）。
共焦点顕微鏡
共焦点顕微鏡によって、抗体−サイトカイン融合構築物のＡＳＧＰＲが仲介する内在化の三次元および時間分解分析を行った。この分析のため、細胞インキュベーター中、ＨｅｐＧ２細胞をガラス底プレート（Ｎｕｎｃ）上で５０〜６０％集密に増殖させた。次いで、プレートをあらかじめ温めたＰＢＳ（３７℃）で２回リンスして、ＰＢＳで培地を置換して、そして迅速に顕微鏡ステージ上にプレーティングした（３７℃、５％ＣＯ２）。この実験のため、クローン５１Ａ１２ ｋｉｈ ＩｇＧ ＩＦＮαをＡｌｅｘａ４８８で直接標識した。標識構築物（２０μｇ／ｍｌ）を、顕微鏡ステージで、ＨｅｐＧ２細胞に直接添加した。回転板共焦点顕微鏡を用いて、抗体添加の５分後に獲得を開始した。データ獲得を、３秒ごとに１時間（１００ｘ拡大）、全細胞の厚みをカバーする１０スタック（ｚレベル）で行った。抗体−サイトカイン構築物の、表面曝露ＡＳＧＰＲへの結合は、等しくは分布しておらず、クラスター形成していることが見出された（図２３Ａ）。クラスターは、全表面に渡って広がっていた。この実験の時間分解分析によって、数分以内に、抗体−サイトカイン融合構築物の即時内在化が起こることが明確に明らかであった（図２３Ｂ）。小胞中のＩｇＧ−サイトカイン構築物の内在化後、タンパク質が細胞の頂端側の表面に輸送されて戻る（データ未提示）。
ＳＰＲによる、インターフェロン−アルファ受容体２へのＩｇＧ−ＩＦＮα免疫コンジュゲートのアフィニティ決定
ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６装置（Ｂｉｏｒａｄ）上の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、高アフィニティ・インターフェロン−アルファ受容体２（ＩＦＮＡＲ２）へのＩｇＧ−ＩＦＮアルファ免疫コンジュゲートの結合活性を決定し、そしてロフェロンに比較した。商業的に入手可能なＩＦＮＡＲ２−Ｆｃ融合タンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を標準的アミンカップリングによって、センサーチップ表面上に垂直配向で固定した。１ショット動力学的測定のため、注入方向を水平配向に変化させて、精製抗体−サイトカイン融合物（５０〜３．２５ｎＭの間の濃度範囲で多様）の２倍希釈シリーズを、別個のチャネル１〜５に沿って、１２０または２００ｓの会合時間、および３００ｓの解離時間で、５０μｌ／分で同時に注入した。緩衝液（ＰＢＳＴ）を第六のチャネルに沿って注入して、参照のための「インライン」ブランクを提供した。会合および解離センサーグラムを同時に適合させることによって、ＰｒｏｔｅＯｎ Ｍａｎａｇｅｒ ｖ３．１ソフトウェアにおいて、単純な１対１ラングミュア結合モデルを用いて、会合速度定数（ｋｏｎ）および解離速度定数（ｋｏｆｆ）を計算した。平衡解離定数（ＫＤ）を、比ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして計算した。１０ｍＭグリシン、ｐＨ１．５を流速１００μｌ／分、３０ｓの接触時間で用いて、水平配向で再生を行った。抗体−サイトカイン融合タンパク質の測定されるアフィニティは、ほぼ（ｋｏｎ １．５７ｘ１０６ １／Ｍｓ； ｋｏｆｆ ６．１５ｘ１０−３ １／ｓ； ＫＤ ４ｎＭ）であり、そしてしたがって、組換え産生タンパク質ロフェロンの公表されるアフィニティに匹敵し、ＩｇＧのＣ末端へのＩＦＮαの融合が、ＩＦＮＡＲ２への結合アフィニティにまったく影響を持たないことが示された。
ＡＳＧＰＲ ｍＡｂ−ＩＦＮαの抗ウイルス活性の決定
ＩｇＧ−サイトカイン融合物の一部としてのＩＦＮαの機能的活性を分析するため、そしてロフェロンと比較するため、ＩＦＮα融合構築物の生物学的活性を、ウイルス保護アッセイにおいて試験した。この研究のため、ＭＤＢＫ細胞をロフェロンまたは抗体−サイトカイン融合物のいずれかと、１〜４時間、プレインキュベーションした。次いで、水疱性口内炎ウイルスをさらに１６〜２４時間添加した。このインキュベーション工程終了時、生存細胞をクリスタルバイオレット染色溶液（０．５％）で染色し、そして６９０ｎｍの参照波長とともに、５５０〜６００ｎｍで、マイクロプレート読み取り装置を用いて、生存細胞の定量化を実行した。４パラメータ−ロジスティクスあてはめ関数を用いて、標準化ロフェロン溶液に対して、全用量−反応曲線分析において、すべてのＩｇＧ−サイトカイン構築物の生物学的活性を決定した。表６に示すように、抗体−ＩＦＮα融合構築物は、抗体の結合価とは独立に、約５％のロフェロン活性に対応する活性を示す。ＩｇＧのＣ末端へのＩＦＮαの融合は、ＩＦＮＡＲ２への結合アフィニティにまったく影響を持たないため（上記に示す）、低アフィニティ・インターフェロン−アルファ受容体１（ＩＦＮＡＲ１）への相互作用が立体的に損なわれ、最終的に、ＩＦＮＡＲ全複合体（ｈｏｌｏｃｏｍｐｌｅｘ）のシグナル伝達減少を導く可能性が高い。
表６． ロフェロンに比較した抗体−サイトカイン・コンジュゲートの機能性ＩＦＮα活性
ＨＣＶレプリコンおよびＥＭＣＶ ＣＰＥアッセイにおけるＡＳＧＰＲ特異的ＩｇＧ−ＩＦＮαコンジュゲートの抗ウイルス活性
ＩｇＧ−ＩＦＮα融合タンパク質の機能的活性を特徴付け、そして商業的に入手可能なロフェロンおよびペガシス（ＰＥＧインターフェロン−α２ａ）と比較するため、ＡＳＧＰＲ陽性細胞（Ｈｕｈ７−２２０９−３）およびＡＳＧＰＲ陰性細胞（Ｈｅｌａ）を用いて、抗ウイルス活性を研究した。
ＡＳＧＰＲ陰性細胞に対する化合物の抗ウイルス活性を分析するため、ＨｅＬａ細胞を９６ウェル不透明壁プレート中、１５，０００／ウェルで植え付けた。一晩培養後、ウェルを空にし、そしてＥＭＥＭ（１０％ＦＢＳを含む）中で希釈した５０μｌ抗体−サイトカイン・コンジュゲートを添加した。ＨｅＬａ細胞をＩｇＧ−ＩＦＮα構築物で３７℃で３時間、前処理した後、５０μｌ ＥＭＣＶ（ＶＲ−１７６２、ＡＴＣＣ）を各ウェル内に添加した（ＥＭＥＭ中、２，０００ＴＣＩＤ５０／ウェル）。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏキット（Ｇ７５７２、Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、生存細胞を感染２４時間後に測定した。１００μｌ ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ試薬を各ウェルに添加して、そして穏やかに振盪しながら、室温で１０分間インキュベーションした。次いで、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ Ｍｉｔｈｒａｓルミノメーター（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いることによって、発光シグナルを記録した。結果は、生存細胞の割合に相当し（図２４Ａ）、そしてＥＣ５０値ならびに実験反復数を表７に要約する。ＡＳＧＰＲ陰性Ｈｅｌａ細胞上、ロフェロンに関するＥＣ５０値は、４Ｆ３ ＩｇＧ ｋｉｈ ＩＦＮαなどの他の化合物に関するよりも最大７５倍小さく、この化合物の機能的活性が、試験した他の化合物のものよりはるかに高いことが示される。対照的に、ペガシスの活性は、ＡＳＧＰＲ特異的ＩｇＧ ｋｉｈ ＩＦＮＡαコンジュゲートのものに匹敵した。
二シストロン性ＨＣＶレプリコンの安定トランスフェクションによって、ＡＳＧＰＲ陽性Ｈｕｈ７由来肝癌細胞株２２０９−２３を発展させ、このレプリコンのうち、ＨＣＶ ＩＲＥＳによって駆動される第一のオープンリーディングフレームは、ネオマイシン・ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ＮＰＴＩＩ）と融合したレニラ属ルシフェラーゼ遺伝子を含有し、そしてＥＭＣＶ ＩＲＥＳによって駆動される第二のオープンリーディングフレームは、ＮＫ５．１レプリコン主鎖由来のＨＣＶ非構造遺伝子、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂを含有する。細胞を３７℃で、５％ＣＯ２を含む加湿大気中、ＧｌｕｔａｍａｘＴＭおよび１００ｍｇ／ｍｌピルビン酸ナトリウム（＃１０５６９−０１０）を補ったＤＭＥＭ中で培養した。培地には、さらに、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ（＃１００８２−１３９）、１％（ｖ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシン（＃１５１４０−１２２）および１％（ｖ／ｖ）ジェネティシンを補った。すべての試薬をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎより得た。
５％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ中のＨｕｈ ７ ２２０９−２３細胞を、９０μｌ体積中、５０００細胞／ウェルで、９６ウェルプレート中にプレーティングした。プレーティングした２４時間後、抗体−サイトカイン・コンジュゲート（または対照としての培地）を、１２ウェルに渡って３倍希釈で（０．０１〜２０００ｐＭ）、１０μｌ体積中で添加した。化合物添加後の最終体積は１００μｌであった。レニラ属ルシフェラーゼアッセイ系（Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｅ２８２０）を用いて、レニラ属ルシフェラーゼレポーターシグナルを、化合物を添加した７２時間後に読み取った。対照試料（抗体の非存在下）に比較した際、レニラ属ルシフェラーゼレポーターのレベルの５０％の減少が観察される化合物濃度として、ＥＣ５０値を計算した。ＸＬｆｉｔ４プログラム（ＩＤ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｌｔｄ．、英国サリー）を用いることによって、用量−反応曲線およびＥＣ５０値を得た。ＡＳＧＰＲ陰性細胞に曝露した際の抗体−サイトカイン構築物の減少した抗ウイルス活性（表６および図２４Ａ）にもかかわらず、クローン５１Ａ１２ ＩｇＧ ｋｉｈ ＩＦＮαおよび４Ｆ３ ＩｇＧ ｋｉｈ ＩｇＧは、ＡＳＧＰＲ陽性細胞株Ｈｕｈ７ ２２０９−２３とインキュベーションした際、ロフェロンよりも、ウイルス感染および増殖から、細胞を防御する際に、より強力であった（図２４Ｂおよび表７）。対照的に、アイソタイプ対照（非ターゲティング化ＩｇＧ ｋｉｈ ＩＦＮα）の強度は、有意により低く、ＡＳＧＰＲ Ｈ１に、ＩｇＧ ｋｉｈ ＩＦＮαコンジュゲートをターゲティングする陽性結果を強調した。
表７． 多様なＡＳＧＰＲ Ｈ１特異的抗体−ＩＦＮαコンジュゲートの抗ウイルス活性の要約
肝臓細胞および非肝臓細胞におけるＡＳＧＰＲ特異的ＩｇＧ−ＩＦＮαコンジュゲートのＩＦＮα活性
ＩＦＮαは、数百のＩＦＮ刺激遺伝子（ＩＳＧ）の誘導を通じて、その抗ウイルス活性を発揮する。抗ウイルス活性を検証するため、そしてさらに、ＡＳＧＰＲターゲティングが仲介するＩＦＮα活性増進を確認するため、本発明者らは、肝臓細胞および非肝臓細胞におけるＩＳＧ発現を決定した。肝臓細胞（主に肝細胞およびＨｅｐＧ２）および非肝臓細胞（ヒトＰＢＭＣおよびＨｅｌａ）を多様な連続希釈ＩＦＮα分子で６時間処理し、そして５ＰＲＩＭＥ ＲＮＡ抽出キット（＃ＦＰ２３０２５３０、５ＰＲＩＭＥ、メリーランド州ガイザーズバーグ）を用いて、細胞から総ＲＮＡを抽出した。
ＩＳＧ遺伝子ＭＸ１およびＲＳＡＤ２に関するＴａｑＭａｎ（リアルタイムＰＣＲ）アッセイをカスタム設計した。関心対象のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘプローブ配列内、または関心対象の参照ｍＲＮＡの３’コード配列内にあるようにアッセイを選択した。
ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）７９００ＨＴ配列検出系（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上ですべての遺伝子発現アッセイを実行した。ＰＣＲ混合物は、各反応に関して、１０μｌ ＰｅｒｆｅＣＴａ（登録商標）ｑＰＣＲ ＦａｓｔＭｉｘ、ＲＯＸＴＭ（Ｑｕａｎｔａ）、１μｌ ＴａｑＭａｎまたは０．０６μｌ ＩＤＴアッセイ、および２μｌ ＤＥＰＣ処理水（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）からなった。ｃＤＮＡ試料をＲＮアーゼ不含水（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）中で１０ｎｇ／μｌに希釈し、そして１３μｌの分配前のアッセイＰＣＲ混合物を含有する、３８４ウェル光学プレート（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に、７μｌを添加した。１つのアッセイでターゲット遺伝子に関して、または１つのアッセイで内因性対照遺伝子アッセイ、１８Ｓ、ＧＡＰＤＨ（アカゲザル（Ｒｈｅｓｕｓ））、ＡＣＴＢ（アカゲザル）およびＧＵＳＢ（アカゲザル）に関して、すべての試料をクエリーした（ＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。各測定を３つ組で行った。以下のＰＣＲ条件を用いた：４５℃で２分間、次いで９５℃で３分間、その後、９５℃で１５秒間および６０℃で４５秒間を４０周期。
ターゲット遺伝子の発現レベルを、１８Ｓ、ＡＣＴＢ、ＧＡＰＤＨおよびＧＵＳＢの幾何平均に対して標準化し、そして相対発現（Ｅ）として表した。Ｅ＝２（ΔＣｔ）、式中、ΔＣｔは、参照および増幅が恣意的閾値を超えるターゲット遺伝子周期の間の相違である。図２５に示すように、アイソタイプＩｇＧ ｋｉｈ ＩＦＮα対照は、ロフェロンに比較して減少したＩＳＧ誘導を示し、すべての細胞において、ペガシス（ＰＥＧ−ＩＦＮα）と類似の活性であった。ＡＳＧＰＲ陰性ＨｅｌａおよびＰＢＭＣ細胞において、クローン５１Ａ１２ ＩｇＧ ｋｉｈ ＩＦＮαもまた、アイソタイプ対照と同様の減少した活性を示した。しかし、ＡＳＧＰＲ陽性肝臓細胞ＨｅｐＧ２および初代ヒト肝細胞において、クローン５１Ａ１２ ＩｇＧ ｋｉｈ ＩＦＮαは、アイソタイプ対照と比較して、ロフェロンと類似のレベルまで増進したＩＦＮα活性を示した。この結果は、５１Ａ１２抗体−ＩＦＮαコンジュゲートの上述の増進された抗ウイルス活性を確認する。
これらのＡＳＧＰＲターゲティング化ＩＦＮα分子がＩＦＮα活性を維持しているかどうかを理解するため、本発明者らは、最長７２時間、Ｈｕｈ−７および初代肝細胞におけるＩＳＧ発現を監視した。図２６に示すように、ＡＳＧＰＲターゲティング化ＩＦＮα分子５１Ａ１２ ＩｇＧ ｋｉｈ ＩＦＮαおよび４Ｆ３ ＩｇＧ ｋｉｈ ＩＦＮαはどちらも、７２時間の処理後、持続したＩＳＧ誘導を示し、一方、ペガシスおよびロフェロンは、７２時間で有意に減少したＩＳＧ誘導を示した。
カニクイザル単回用量ＰＫ／ＰＤ研究
ＡＳＧＰＲ抗体に基づいてターゲティングされたＩＦＮα分子が、非肝臓細胞において減少したＩＦＮα活性を、そして肝臓細胞において増進されたＩＦＮα活性を示す（肝臓ターゲティング化ＩＦＮα効果）というｉｎ ｖｉｔｒｏ結果に促され、カニクイザル研究を設計して、ｉｎ ｖｉｖｏで、肝臓ターゲティング化ＩＦＮα効果を確認した。ＡＳＧＰＲ特異的クローン５１Ａ１２は、同一のアフィニティでヒトおよびサルＡＳＧＰＲに結合し、そしてヒトＩＦＮαは、サルにおいて類似の活性を有するため、肝臓ターゲティング化ＩＦＮ概念証明研究のため、サルをＰＫ／ＰＤモデルとして用いることも可能である。サル研究において、本発明者らは、５１Ａ１２ ＩｇＧ ｋｉｈ ＩＦＮαおよびアイソタイプＩｇＧ ｋｉｈ ＩＦＮα対照を直接比較した。どちらの分子も、１または１０μｇ／ｋｇのいずれかの投薬レベルで皮下注射し、サルの血液および肝臓生検試料を投薬前および投薬後に収集し、そしてそのＰＫ（薬物動態学）およびＰＤ（薬力学）を監視した。用量群を表８に列挙する。
表８． １２匹のカニクイザルを以下に示すような４つの群に分けた。
試料収集、トランスファーおよび保存
血液（およそ１ｍｌ）を、投薬５日前、ならびに注射２、６、１２、２４、４８、７２、９６、１６８、および３３６時間後に、各動物から収集した。薬物動態学用の試料を、抗凝血剤を含まずに、試験管に収集した。薬物動態学用の血液を、薬力学的血液収集前に収集した。
遺伝子発現研究のため、血液（およそ２．５ｍｌ）を、投薬５日前、ならびに注射２、６、１２、２４、４８、７２、９６、１６８、および３３６時間後に、各動物から収集した。試料をＰＡＸｇｅｎｅＴＭ血液ＲＮＡ収集試験管内に収集し、そして８〜１０回反転させることによって試験管を混合した。ＰＡＸｇｅｎｅＴＭ血液ＲＮＡ収集試験管が、静脈切開術順序において最後に採血される試験管であった（すなわち、臨床病理および薬物動態学的収集後）。
第−５日、ならびに第２日、第４日、および第８日に、各動物から、腹腔鏡法によって、肝臓組織を肝臓における２つの別個の位置から収集した（少なくとも２５ｍｇ／試料）。各組織試料を切除し、そして直ちに別個のあらかじめ重量測定し、そしてラベリングした凍結バイアル試験管に入れ、そして液体窒素中で瞬間凍結した。即時凍結が必要であるため、試料バイアルは肝臓試料収集後には重量測定されなかった。第−５日および第２日、各動物の第一の肝臓組織アリコットを肝臓の左側葉から採取し、そして各動物の第二の肝臓組織アリコットを肝臓の右側葉から採取した。第４日および第８日、各動物の第一の肝臓組織アリコットを肝臓の左中葉から採取し、そして各動物の第二の肝臓組織アリコットを肝臓の右中葉から採取した。肝臓生検試料を２ｍｌ試験管中、瞬時凍結した。ドライアイス上であらかじめ冷却したＲＮＡｌａｔｅｒ−ＩＣＥ（Ｐ／Ｎ ７０３１、Ａｍｂｉｏｎ）を、凍結組織に添加し、そして−８０℃で保存した。プロトコルにしたがって、血液試料をＰＡＸｇｅｎｅ試験管に入れ、そしてプロセシングするまで−８０℃で保存した。
サル血清試料におけるクローン５１Ａ１２ ＩｇＧ ｋｉｈ ＩＦＮαおよびアイソタイプＩｇＧ ｋｉｈ ＩＦＮα対照の測定
捕捉試薬として抗ＩＦＮα抗体（ロット番号３４４９５−２８、Ｒｏｃｈｅ Ｎｕｔｌｅｙ、米国ニュージャージー州）を、そして検出試薬としてＨＲＰ標識抗ヒトＦｃ抗体（ロット番号Ｗｂｒ７２＿ＭＭ＿０９０６０２、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ドイツ・ペンツベルク）を用いる、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを用いて、カニクイザル血清アリコットを投薬化合物に関して分析した。プレートを抗ＩＦＮα抗体で室温で１時間コーティングした後、プレートを２％ＢＳＡブロッキング緩衝液で１時間処理した。洗浄後、ＨＲＰ標識抗ヒトＦｃ抗体を各ウェルに添加し、そして穏やかに振盪しながら１時間インキュベーションした。洗浄後、１００μｌ／ウェルＴＭＢ基質溶液（＃１１ ４８４ ２８１ ００１、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ドイツ・ペンツベルク）を約２０分間添加した。次いで、５０μｌ／ウェルの２Ｎ ＨＣｌを添加することによって、反応を停止した。プレートを、参照波長６５０ｎｍとともに、４５０ｎｍで２分間以内読み取った。この方法の定量化下限（ＬＬＯＱ）は、１０ｎｇ／ｍｌであった。アッセイの精密度（ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ）（％ＣＶ）および正確性（ａｃｃｕｒａｃｙ）（％相対誤差）は、許容基準を満たした。試料とともに分析したＱＣ試料の分析によって監視されるようなアッセイ性能は、表９に示すとおりであった。血清濃度を表１０〜１３に示す。１０μｇ／ｋｇでのアイソタイプＩｇＧ ｋｉｈ ＩＦＮαの単回注射は、血液中の有意な曝露を生じ、これは、１週間でほぼ１００ｎｇ／ｍｌでピークとなった。対照的に、同じ用量レベルで、５１Ａ１２ ＩｇＧ ｋｉｈ ＩＦＮαは、いかなる時点でも定量化レベル未満であった。どちらの分子も血液中、１μｇ／ｋｇ用量レベルで検出不能であった。ＰＫパラメータを表１４に要約する。
表９． カニクイザル血清におけるクローン５１Ａ１２ ＩｇＧ ｋｉｈ ＩＦＮα品質管理試料の分析性能
表１０． １μｇ／ｋｇアイソタイプＩｇＧ ｋｉｈ ＩＦＮαの血清濃度（ｎｇ／ｍｌ）
表１１． １μｇ／ｋｇ ５１Ａ１２ ＩｇＧ ｋｉｈ ＩＦＮαの血清濃度（ｎｇ／ｍｌ）
表１２． １０μｇ／ｋｇ ５１Ａ１２ ＩｇＧ ｋｉｈ ＩＦＮαの血清濃度（ｎｇ／ｍｌ）
表１３． １０μｇ／ｋｇアイソタイプＩｇＧ ｋｉｈ ＩＦＮαの血清濃度（ｎｇ／ｍｌ）
表１４． １０μｇ／ｋｇアイソタイプ−ＩＦＮαのカニクイザル血清ＰＫパラメータ
ＲＮＡ抽出
９６の肝臓生検試料（４８匹の動物ｘ試料採取あたり２つの生検）から、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｐ／Ｎ ７４１０４）を用いて、総ＲＮＡを抽出し、そしてＮａｎｏｄｒｏｐ ８０００上で定量化した。肝臓試料の総ＲＮＡ品質を、Ｃａｌｉｐｅｒ ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸ上で評価した。すべての試料由来のＲＮＡは、ｑＰＣＲおよびマイクロアレイに基づく遺伝子発現測定を実行するために十分な量および品質であった。
発現分析（Ｒａｌｅｉｇｈ、ノースカロライナ州）で、１２０の血液試料から総ＲＮＡ単離および定量化を行った。Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ２１００上で、血液試料の総ＲＮＡ品質を評価した。すべての試料由来のＲＮＡは、ｑＰＣＲおよびマイクロアレイに基づく遺伝子発現測定を実行するために十分な量および品質であった。
マイクロアレイ分析
２つの別個のプロトコルを用いて、総ＲＮＡをｃＤＮＡに変換した。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ ＨＴ ３’ ＩＶＴ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｐ／Ｎ ９０１２２５）およびＮｕＧＥＮ Ｏｖａｔｉｏｎ ＲＮＡ増幅系Ｖ２（Ｐ／Ｎ ３１００−６０）。
血液
製造者のプロトコルにしたがって、ＧｅｎｅＣｈｉｐ ＨＴ ３’ ＩＶＴ発現キットを用いて、肝臓生検試料由来の１００ｎｇの総ＲＮＡを二本鎖ｃＤＮＡおよび増幅ＲＮＡ（ａＲＮＡ）に変換した。ハイブリダイゼーション混合物は、１２．５μｇ ａＲＮＡ、２ｘハイブリダイゼーション混合物（Ｐ／Ｎ ９００７２０）、ＤＭＳＯ、２０ｘハイブリダイゼーション対照、およびオリゴＢ２対照を含有した。
肝臓
製造者のプロトコルにしたがって、ＮｕＧＥＮ Ｏｖａｔｉｏｎ ＲＮＡ増幅系Ｖ２キットを用いて、血液試料由来の５０ｎｇ総ＲＮＡを一本鎖ｃＤＮＡに変換した。ハイブリダイゼーション混合物は、３μｇ ＳＰＩＡ増幅ｃＤＮＡ、２ｘハイブリダイゼーション混合物（Ｐ／Ｎ ９００７２０）、ＤＭＳＯ、２０ｘハイブリダイゼーション対照、およびオリゴＢ２対照を含有した。
肝臓および血液試料のためのハイブリダイゼーション混合物を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐヒトゲノムＵ１３３ Ｐｌｕｓ ２．０アレイにハイブリダイズさせた。製造者（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）に示唆されるように、染色および洗浄工程を行った。ハイブリダイズしたＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐアレイ各々を、ＧｅｎｅＣｈｉｐスキャナ３０００ ７Ｇ（Ａｇｉｌｅｎｔ／Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）でスキャンした。画像分析をＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧＣＯＳソフトウェアで行った。標準化品質管理測定基準を用いて、生じる．ｃｅｌファイルを評価した。データを標準化し、そして標準データ分析パッケージを用いて、発現値計算／示差発現を決定した。
図２７において、サル肝臓試料における４つの代表的なＩＳＧ、ＨＲＡＳＬＳ２、ＩＴＩ４４、ＩＦＩＴ１、およびＩＦＩＴＭ２の発現をグラフにする。これらの４つのＩＳＧの発現のより頑強な誘導は、アイソタイプＩｇＧ ｋｉｈ ＩＦＮα投薬サルに比較して、５１Ａ１２ ＩｇＧ ｋｉｈ ＩＦＮα投薬サルで見出された。
ＩＦＮ遺伝子発現分析（Ｍ３．１ヒートマップ）
ＩＦＮα分子によるＩＦＮα刺激遺伝子発現をより包括的に分析するため、血液トランスクリプトーム研究（Ｃｈａｕｓｓａｂｅｌら（２００８）， Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２９， １５０−６４）から決定したＩＦＮ遺伝子モジュールを用いて、ＩＦＮα反応を分析した。図２８Ａに示すように、インターフェロン・モジュールＭ３．１の遺伝子のベースラインからの倍変化発現値を、血液および肝臓試料の両方に関して、Ｒ統計パッケージ（ｗｗｗ．ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ）を用いて、ヒートマップ形式でプロットした。肝臓インターフェロン誘導遺伝子の教師なし階層的クラスター形成によって、第１日および第３日に、１０μｇ／ｋｇ用量の５１Ａ１２において非常に誘導されるが、アイソタイプＩＦＮα化合物では誘導されないサブセット（破線の長方形）が明らかになる。教師なし階層的クラスター形成では、このサブセットは、血液および肝臓の間の発現の示差的パターンを明らかにし、ここで、いくつかの遺伝子は、１０μｇ／ｋｇ用量で、５１Ａ１２によって、肝臓においてより有意に誘導されたが、アイソタイプ−ＩＦＮαでは誘導されず、そして他の遺伝子は、高用量で、アイソタイプＩＦＮαによって、血液中でより有意に誘導された（図２８Ｂ）。
要約すると、ＡＳＧＰＲがターゲティングするＩＦＮα分子５１Ａ１２ ＩｇＧ ｋｉｈ ＩＦＮαは、血液中で検出不能な曝露を示し、そしてアイソタイプＩＦＮα対照に比較した際、血液中ではより低いＩＦＮα活性（ＩＳＧ発現刺激）であるが、サル肝臓においてはより高いＩＦＮα活性であった。
前述の発現は、理解を明らかにする目的のため、例示および例によって、ある程度詳細に記載されてきているが、説明および実施例は、本発明の範囲を限定すると見なしてはならない。本明細書に引用するすべての特許および科学文献の開示は、その全体が本明細書に援用される。

Claims (86)

  1. アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）に特異的に結合可能な抗体であって
    ａ）配列番号１６の重鎖可変領域配列および配列番号１４の軽鎖可変領域配列；
    ｂ）配列番号４の重鎖可変領域配列および配列番号２の軽鎖可変領域配列；
    ｃ）配列番号８の重鎖可変領域配列および配列番号６の軽鎖可変領域配列；
    ｄ）配列番号１２の重鎖可変領域配列および配列番号１０の軽鎖可変領域配列；
    ｅ）配列番号２０の重鎖可変領域配列および配列番号１８の軽鎖可変領域配列；
    ｆ）配列番号２４の重鎖可変領域配列および配列番号２２の軽鎖可変領域配列；
    ｇ）配列番号２８の重鎖可変領域配列および配列番号２６の軽鎖可変領域配列；
    ｈ）配列番号４の重鎖可変領域配列および配列番号３０の軽鎖可変領域配列；
    ｉ）配列番号４の重鎖可変領域配列および配列番号３２の軽鎖可変領域配列；
    ｊ）配列番号４の重鎖可変領域配列および配列番号３４の軽鎖可変領域配列；または
    ｋ）配列番号２４の重鎖可変領域配列および配列番号２２の軽鎖可変領域配列
    を含む、前記抗体。
  2. 配列番号１６の重鎖可変領域配列および配列番号１４の軽鎖可変領域配列を含む、請求項１の抗体。
  3. ＡＳＧＰＲのエピトープへの結合に関して、請求項２の抗体と競合する、ＡＳＧＰＲに特異的に結合可能な抗体。
  4. ＡＳＧＰＲのストーク領域におけるエピトープを認識する、請求項３の抗体。
  5. 請求項２の抗体のアフィニティ成熟変異体である、請求項３または４の抗体。
  6. 抗体が、配列番号１６の配列に少なくとも約９６％、９７％、９８％または９９％同一である重鎖可変領域配列、および配列番号１４の配列に少なくとも約９６％、９７％、９８％または９９％同一である軽鎖可変領域配列を含む、請求項３〜５のいずれか一項の抗体。
  7. １、２、３、４、５、６または７の、特に２、３、４または５のアミノ酸置換を含む配列番号１４の軽鎖可変領域配列を含む、請求項３〜６のいずれか一項の抗体。
  8. １、２、３、４、５、６または７の、特に２、３、４または５のアミノ酸置換を含む配列番号１６の重鎖可変領域配列を含む、請求項３〜７のいずれか一項の抗体。
  9. 配列番号４の重鎖可変領域配列および配列番号２の軽鎖可変領域配列を含む、請求項１の抗体。
  10. ＡＳＧＰＲのエピトープへの結合に関して、請求項９の抗体と競合する、ＡＳＧＰＲに特異的に結合可能な抗体。
  11. ＡＳＧＰＲの炭水化物認識ドメイン（ＣＲＤ）におけるエピトープを認識する、請求項１０の抗体。
  12. 請求項９の抗体のアフィニティ成熟変異体である、請求項１０または１１の抗体。
  13. 抗体が、配列番号４の配列に少なくとも約９６％、９７％、９８％または９９％同一である重鎖可変領域配列、および配列番号２の配列に少なくとも約９６％、９７％、９８％または９９％同一である軽鎖可変領域配列を含む、請求項１０〜１２のいずれか一項の抗体。
  14. １、２、３、４、５、６または７の、特に２、３、４または５のアミノ酸置換を含む配列番号２の軽鎖可変領域配列を含む、請求項１０〜１３のいずれか一項の抗体。
  15. １、２、３、４、５、６または７の、特に２、３、４または５のアミノ酸置換を含む配列番号４の重鎖可変領域配列を含む、請求項１０〜１４のいずれか一項の抗体。
  16. ａ）配列番号４の重鎖可変領域配列および配列番号３６の軽鎖可変領域配列；
    ｂ）配列番号４の重鎖可変領域配列および配列番号３８の軽鎖可変領域配列；
    ｃ）配列番号８の重鎖可変領域配列および配列番号４０の軽鎖可変領域配列；
    ｄ）配列番号１２の重鎖可変領域配列および配列番号４２の軽鎖可変領域配列；
    ｅ）配列番号２０の重鎖可変領域配列および配列番号４４の軽鎖可変領域配列；
    ｆ）配列番号２４の重鎖可変領域配列および配列番号４６の軽鎖可変領域配列；または
    ｇ）配列番号２８の重鎖可変領域配列および配列番号４８の軽鎖可変領域配列
    を含む、請求項１０〜１４のいずれか一項の抗体。
  17. ヒトおよびカニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍｏｎｋｅｙ）ＡＳＧＰＲに特異的に結合可能な、先行する請求項のいずれか一項の抗体。
  18. 表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、Ｆａｂ断片として測定した際、ヒトＡＳＧＰＲに、１μＭより小さい、特に１００ｎＭより小さい、より具体的には１ｎＭより小さい解離定数（ＫＤ）で結合する、先行する請求項いずれか一項の抗体。
  19. 蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）によって、ＩｇＧ１として測定した際、ヒトＡＳＧＰＲに、１μＭより小さい、特に５００ｎＭより小さい、より具体的には１００ｎＭより小さい、またはさらに１０ｎＭより小さいＫＤで結合する、先行する請求項いずれか一項の抗体。
  20. ＡＳＧＰＲへの結合に関して、ＡＳＧＰＲの天然リガンドと競合しない、先行する請求項いずれか一項の抗体。
  21. ＡＳＧＰＲの前記天然リガンドがアシアロフェチュインである、請求項２０の抗体。
  22. ＣＬＥＣ１０Ａ、特にヒトＣＬＥＣ１０Ａに検出可能に結合しない、先行する請求項いずれか一項の抗体。
  23. ＡＳＧＰＲ発現を欠く細胞、特にヒト細胞、より具体的にはヒト血液細胞に特異的に結合しない、先行する請求項いずれか一項の抗体。
  24. ＡＳＧＰＲ発現細胞表面上のＡＳＧＰＲに抗体が結合した際、前記細胞に内在化される、先行する請求項いずれか一項の抗体。
  25. 前記細胞内に内在化されるのとほぼ同じ速度で、前記細胞表面にリサイクルされて戻る、請求項２４の抗体。
  26. 前記細胞表面上のＡＳＧＰＲに抗体が結合した際、細胞表面で、ＡＳＧＰＲ発現の下方制御を有意には誘導しない、先行する請求項いずれか一項の抗体。
  27. ヒト抗体である、先行する請求項いずれか一項の抗体。
  28. ヒトＦｃ領域、特にＩｇＧ Ｆｃ領域、より具体的にはＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む、先行する請求項いずれか一項の抗体。
  29. 全長抗体である、先行する請求項いずれか一項の抗体。
  30. ＩｇＧクラス抗体、特にＩｇＧ１サブクラス抗体である、先行する請求項いずれか一項の抗体。
  31. Ｆｃ受容体、特にＦｃγ受容体への抗体の結合アフィニティを減少させる修飾を、Ｆｃ領域中に含む、請求項２８〜３０のいずれか一項の抗体。
  32. 前記Ｆｃ受容体が活性化Ｆｃ受容体である、請求項３１の抗体。
  33. 前記Ｆｃ受容体が、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）、およびＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）の群より選択される、請求項３１または３２の抗体。
  34. 前記Ｆｃ受容体がＦｃγＲＩＩＩａ、特にヒトＦｃγＲＩＩＩａである、請求項３１〜３３のいずれか一項の抗体。
  35. Ｐ３２９、Ｌ２３４およびＬ２３５（ＥＵ番号付け）より選択される位置でＦｃ領域中にアミノ酸置換を含む、請求項３１〜３４のいずれか一項の抗体。
  36. Ｆｃ領域中にアミノ酸置換Ｐ３２９Ｇ、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ（ＥＵ番号付け）を含む、請求項３１〜３５のいずれか一項の抗体。
  37. ２つの非同一抗体重鎖のヘテロ二量体化を促進する修飾を、Ｆｃ領域中に含む、請求項２８〜３６のいずれか一項の抗体。
  38. 前記修飾が、抗体重鎖の一方におけるノブ修飾、および２つの抗体重鎖のもう一方における穴修飾を含む、ノブを穴に（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）修飾である、請求項３７の抗体。
  39. ＣＨ３ドメイン中の２つの抗体重鎖間の界面内に修飾を含む、請求項２８〜３８のいずれか一項の抗体であって、ｉ）１つの重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基はより大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それによって１つの重鎖のＣＨ３ドメイン中の界面内に突起（「ノブ」）を生成し、これを他方の重鎖のＣＨ３ドメイン中の界面内の空洞（「穴」）中に配置可能であり、そしてｉｉ）他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基はより小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それによって第二のＣＨ３ドメイン中の界面内に空洞（「穴」）を生成し、この中に第一のＣＨ３ドメイン中の界面内の突起（「ノブ」）が配置可能である、前記抗体。
  40. １つの抗体重鎖において、アミノ酸置換Ｔ３６６Ｗおよび場合によってアミノ酸置換Ｓ３５４Ｃを、そして他方の抗体重鎖において、アミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖおよび場合によってＹ３４９Ｃを含む、請求項２８〜３９のいずれか一項の抗体。
  41. エフェクター部分が抗体に付着している、先行する請求項いずれか一項の抗体。
  42. １より多いエフェクター部分が抗体に付着していない、請求項４１の抗体。
  43. 前記エフェクター部分がサイトカイン分子である、請求項４１または４２の抗体。
  44. サイトカイン分子が、場合によってペプチドリンカーを通じて、抗体重鎖の１つのカルボキシ末端アミノ酸に、アミノ末端アミノ酸で融合している、請求項４３の抗体。
  45. サイトカイン分子がヒトサイトカインである、請求項４３または４４の抗体。
  46. サイトカイン分子がインターフェロン分子である、請求項４３〜４５のいずれか一項の抗体。
  47. 前記インターフェロン分子が、インターフェロン・アルファ、特にヒト・インターフェロン・アルファ、より具体的には、ヒト・インターフェロン・アルファ２またはヒト・インターフェロン・アルファ２ａである、請求項４６の抗体。
  48. 表面上にＡＳＧＰＲを発現する細胞において、抗ウイルス活性を有する、請求項４６または４７の抗体。
  49. 表面上にＡＳＧＰＲを有意なレベルでは発現しない細胞においては、抗ウイルス活性をまったく持たない、請求項４８の抗体。
  50. 前記抗ウイルス活性が、ウイルス感染の阻害、ウイルス複製の阻害、細胞殺傷の阻害およびインターフェロン刺激遺伝子の誘導より選択される、請求項４８または４９の抗体。
  51. 先行する請求項のいずれか一項の抗体またはその抗原結合部分をコードする、ポリヌクレオチド。
  52. 請求項５１のポリヌクレオチドを含むベクター、特に発現ベクター。
  53. 請求項５１のポリヌクレオチドまたは請求項５２のベクターを含む、宿主細胞。
  54. （ｉ）前記抗体の発現に適した条件下で、請求項５３の宿主細胞を培養し、そして（ｉｉ）前記抗体を回収する工程を含む、請求項１〜５０のいずれか一項の抗体を産生するための方法。
  55. 請求項５４の方法によって産生される、ＡＳＧＰＲに特異的に結合可能な抗体。
  56. 請求項１〜５０または５５のいずれか一項の抗体および薬学的に許容されうるキャリアーを含む、薬学的組成物。
  57. 薬剤として使用するための、請求項１〜５０または５５のいずれか一項の抗体、あるいは請求項５６の薬学的組成物。
  58. 肝臓疾患の治療または予防において使用するための、請求項１〜５０または５５のいずれか一項の抗体、あるいは請求項５６の薬学的組成物。
  59. 前記肝臓疾患がウイルス感染である、請求項５８の抗体または薬学的組成物。
  60. 前記肝臓疾患が肝炎ウイルス感染、特にＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染である、請求項５８または５９の抗体または薬学的組成物。
  61. 癌の治療または予防において使用するための、請求項１〜５０または５５のいずれか一項の抗体、あるいは請求項５６の薬学的組成物。
  62. 前記癌が肝臓癌である、請求項６１の抗体。
  63. 前記肝臓癌が肝細胞癌（ＨＣＣ）である、請求項６２の抗体。
  64. 治療が必要な個体において、疾患を治療するための薬剤製造のための、請求項１〜５０または５５のいずれか一項の抗体の使用。
  65. 前記疾患が肝臓疾患である、請求項６４の使用。
  66. 前記肝臓疾患がウイルス感染である、請求項６５の使用。
  67. 前記肝臓疾患が肝炎ウイルス感染、特にＨＢＶ感染である、請求項６５または６６の使用。
  68. 前記疾患が癌である、請求項６４の使用。
  69. 前記癌が肝臓癌である、請求項６８の使用。
  70. 前記肝臓癌が肝細胞癌（ＨＣＣ）である、請求項６９の使用。
  71. 前記個体が哺乳動物、特にヒトである、請求項６４〜７０のいずれか一項の使用。
  72. 個体において疾患を治療する方法であって、前記個体に、薬学的に許容されうる型の請求項１〜５０または５５のいずれか一項の抗体を含む組成物の療法的有効量を投与する工程を含む、前記方法。
  73. 前記疾患が肝臓疾患である、請求項７２の方法。
  74. 前記肝臓疾患がウイルス感染である、請求項７３の方法。
  75. 前記肝臓疾患が肝炎ウイルス感染、特にＨＢＶ感染である、請求項７３または７４の方法。
  76. 前記疾患が癌である、請求項７２の方法。
  77. 前記癌が肝臓癌である、請求項７６の方法。
  78. 前記肝臓癌が肝細胞癌（ＨＣＣ）である、請求項７７の方法。
  79. 前記個体が哺乳動物、特にヒトである、請求項７２〜７８のいずれか一項の方法。
  80. 個体において、ＡＳＧＰＲを発現している細胞をターゲティングするための、請求項１〜５０または５５のいずれか一項の抗体。
  81. 前記細胞が肝臓細胞、特に肝細胞である、請求項８０の抗体。
  82. 前記個体が哺乳動物、特にヒトである、請求項８０または８１の抗体。
  83. 個体においてＡＳＧＰＲを発現している細胞をターゲティングするための方法であって、前記個体に、薬学的に許容されうる型の請求項１〜５０または５５のいずれか一項の抗体を含む組成物を投与する工程を含む、前記方法。
  84. 前記細胞が肝臓細胞、特に肝細胞である、請求項８３の方法。
  85. 前記個体が哺乳動物、特にヒトである、請求項８３または８４の方法。
  86. 明細書に記載されるとおりの発明。
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