CN113272327A - 抗兔cd19抗体及其使用方法 - Google Patents
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- C12N2502/30—Coculture with; Conditioned medium produced by tumour cells
Abstract
本文报道了一种与兔CD19结合的抗体，所述抗体包含：(a)HVR‑H1，其包含SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:34的氨基酸序列；(b)HVR‑H2，其包含SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36的氨基酸序列；(c)HVR‑H3，其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列；(d)HVR‑L1，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列；(e)HVR‑L2，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；以及(f)HVR‑L3，其包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列，以及使用所述抗体的方法，尤其是在抗体产生兔B细胞的鉴定和选择中使用所述抗体的方法。
Description
技术领域
本发明涉及针对兔CD19的抗体(抗兔CD19抗体)、其生产方法及使用方法。
背景技术
B细胞由祖B细胞和前B细胞发育而来，并且在骨髓中成熟以表达抗原特异性细胞表面抗体分子，然后在淋巴组织内经历未成熟B细胞发育的过渡阶段T1和T2。在脾脏中，大多数B细胞分配到成熟滤泡区室或数量较少的边缘区B1a以及调节性B10细胞亚群中。由外来抗原活化的成熟抗原特异性B细胞发生克隆扩增并且分化为短寿命浆细胞。滤泡性B细胞也可进入生发中心，其中抗原选择的B细胞发生扩增，并且其抗原受体发生亲和力成熟和类别转换重组(CSR)。B细胞离开生发中心，成为记忆B细胞或分化为长寿命浆母细胞，然后迁移到骨髓。B细胞也存在于腹膜腔内，包括可产生白介素-10的调节性B10细胞亚群、可产生大部分天然Ab的B1a亚群以及对TI抗原产生适应性抗体应答的B1b亚群。大多数成熟B细胞表达CD20，而CD19则由成熟B细胞以及一些前B细胞、浆母细胞、短寿命浆细胞和长寿命浆细胞表达。CD19通过腹膜B1a和B1b细胞以更高的密度表达(Tedder,T.F.,NatRev.Rheumatol.5(2009)572-577；LeBien,T.W.和Tedder,T.F.,Blood 112(2008)1570-1580)。
CD19是一种跨膜蛋白(B细胞共受体)。人CD19结构基因编码与B细胞受体组装的细胞表面分子，以便降低抗原受体依赖性刺激的阈值。CD19主要与CD21和CD81一起用作B细胞共受体。正常B细胞分化需要CD19和CD21(Carter,R.H.,等人,Immunol.Res.26(2002)45-54)。活化后，CD19的胞质尾部发生磷酸化，从而导致Src家族激酶结合并且募集PI-3激酶。
针对人CD19的抗体如以下文献中所述：WO 2004/106381；WO 2005/012493；WO2006/089133；WO 2007/002223；WO 2006/133450；WO 2006/121852；WO 2003/048209；US 7,109,304；US 2006/0233791；US 2006/0280738；US 2006/0263357；US 2006/0257398；EP1648512；EP 1629012；US 2008/0138336；WO 2008/022152；WO 2011/147834；以及Bruenke,J.等人，Br.J.Hematol.130(2005)218-228；Vallera,D.A.等人，CancerBiother.Radiopharm.19(2004)11-23；Ghetie,M.A.等人，Blood 104(2004)178-183；Lang,P.等人，Blood 103(2004)3982-3985；Loeffler,A.等人，Blood 95(2000)2098-2103；LeGall,F.等人，FEBS Lett.453(1999)164-168；Li,Q.等人，Cancer Immunol.Immunother.47(1998)121-130；Eberl,G.等人，Clin.Exp.Immunol.114(1998)173-178；Pietersz,G.A.等人，Cancer Immunol.Immunother.41(1995)53-60；Myers,D.E.等人，Leuk.Lymphoma.18(1995)93-102；Bejcek,B.E.等人，Cancer Res.55(1995)2346-2351；Hagen,I.A.等人，Blood 85(1995)3208-3212；Vlasfeld,L.T.等人，Cancer Immunol.Immunother.40(1995)37-47；Rhodes,E.G.等人，Bone Marrow Transplant.10(1992)485-489；Zola,H.等人，Immunol.Cell Biol.69(1991)411-422；Watanabe,M.等人，Cancer Res.50(1990)3245-3248；Uckun,F.M.等人，Blood 71(1988)13-29；Pezzutto,A.等人，J Immunol.138(1987)2793-2799。单克隆抗体SJ25-C1可商购获得(产品编号4737，Sigma-Aldrich Co.USA，SEQID NO:21至SEQ ID NO:24)。WO 2008/022152中提到与FcγRIIIA具有增加的亲和力的抗体。
兔基因组已于2009年完成测序和组装，其冗余度为6.51(参见http://www.broadinstitute.org/science/projects/mammals-models/rabbit/rabbit-genome-sequencing-project).
到目前为止，尚无单克隆抗兔CD19抗体的报道。尽管有所谓的某些多克隆抗体，但抗人CD19抗体或抗小鼠CD19抗体与兔CD19的交叉反应仍无法得到证明。
因此，需要提供单克隆抗兔CD19抗体。
发明内容
本发明涉及一种抗兔CD19抗体及其在标记兔B细胞中的用途。
利用根据本发明所述的抗体，除其他用途外，其至少可以
-表征兔PBMC或脾细胞中的B细胞；
-在抗原淘筛之前或之后，在巨噬细胞耗尽后富集抗原特异性B细胞；
-在与饲养细胞共培养后对B细胞选择性染色(饲养细胞生长超出B细胞多个数量级)；
-筛选和选择具有改进的产率和质量的B细胞(任选地与一种或多种进一步的标记物组合)。
本发明的一个方面是一种与兔CD19特异性结合的经分离的抗体，该抗体包含：(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:34的氨基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36的氨基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；以及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列。
在一个实施例中，抗体为单克隆抗体。
在一个实施例中，抗体为嵌合抗体或人源化抗体。
在一个实施例中，抗体包含SEQ ID NO:30的可变重链结构域和SEQ ID NO:26的可变轻链结构域。
一个方面是一种用于选择B细胞的方法，该方法包括以下步骤：
a)从兔的血液中获得B细胞，
b)将B细胞与根据本发明所述的抗体一起孵育，
c)选择根据本发明所述的抗体与之结合的一种或多种B细胞。
在一个实施例中，该方法进一步包括以下步骤中的一者或多者：
在步骤b)之后和步骤c)之前：将B细胞在共培养基中于37℃孵育1小时，
c)将根据本发明所述的抗体与之结合的一种或多种B细胞(单次)沉积于单独的容器中，
d)将(单次)沉积的细胞与饲养细胞在共培养基中共培养，
e)选择在步骤d)中增殖的B细胞，并由此选择B细胞。
如本文所报告的一个方面是一种用于选择B细胞的方法，该方法包括以下步骤：
a)将B细胞中的每一者或B细胞群(已通过FACS基于根据本发明所述的标记抗体与细胞的结合而沉积为单细胞)与作为饲养细胞的鼠EL-4B5细胞共培养，以及
b)选择在步骤a)中增殖并且分泌抗体的B细胞克隆。
在一个实施例中，共培养在合成饲养混合物的存在下进行，该合成饲养混合物包含IL-1β、TNFα、IL-10以及选自IL-21、SAC、BAFF、IL-2、IL-4和IL-6中的一种或多种。
在一个实施例中，B细胞为兔B细胞。
如本文所报告的一个方面是一种产生与靶抗原结合的抗体的方法，该方法包括以下步骤：
a)共培养B细胞群中的一种或多种B细胞(已通过FACS基于根据本发明所述的标记抗体与细胞的结合沉积于单独的容器中)，任选地在存在鼠EL-4B5细胞作为饲养细胞以及存在IL-1β、TNFα、IL-10和选自IL-21、SAC、BAFF、IL-2、IL-4和IL-6中的一种或多种作为饲养混合物的条件下进行共培养，
b)选择产生与靶抗原特异性结合的抗体的B细胞克隆，
b1)利用逆转录酶PCR确定抗体的编码可变轻链结构域和可变重链结构域的核酸序列，
b2)用包含编码抗体可变轻链结构域和可变重链结构域的核酸序列的核酸转染细胞，
c)培养细胞(其包含编码由步骤b)中所选的B细胞克隆产生的抗体或其人源化变体的核酸)，以及从细胞或培养上清液回收抗体，并由此产生抗体。
在一个实施例中，B细胞为兔B细胞。
如本文所报告的一个方面是一种用于共培养一种或多种兔B细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
-将大量兔B细胞与根据本发明所述的抗体一起孵育/用所述抗体标记大量兔B细胞中的单独B细胞，该抗体缀合至可检测标记物，
-选择/沉积根据本发明所述的抗体已结合至其表面/已标记为单独的B细胞(单次沉积的B细胞)或B细胞集合(在单独的容器中)的一种或多种兔B细胞，以及
-将所述单次沉积的兔B细胞或所述兔B细胞集合与饲养细胞共培养，
-任选地，在共培养后，将获得的细胞混合物与根据本发明所述的抗体一起孵育，该抗体缀合至可检测标记物，以及选择/沉积/计数根据本发明所述的抗体已结合至其表面/已经过标记的兔B细胞。
如本文所报告的一个方面是一种用于选择B细胞/去除培养的非B细胞的方法，该方法包括以下步骤：
a)将B细胞与饲养细胞共培养，所述兔B细胞已作为单细胞或作为细胞集合沉积，
b)将来自步骤a)中所获得的共培养的细胞与根据本发明所述的抗体一起孵育，以及
c)选择根据本发明所述的抗体与之结合的一种或多种B细胞，并由此去除非B细胞。
在一个实施例中，B细胞为兔B细胞。
如本文所报告的一个方面是一种用于在单独沉积的B细胞培养后确定B细胞数量的方法，该方法包括以下步骤：
a)将单次沉积的B细胞与饲养细胞共培养，
b)将来自步骤a)中所获得的共培养的细胞与根据本发明所述的抗体一起孵育，以及
c)通过对根据本发明所述的抗体与之结合的细胞的数量计数，确定培养中的B细胞数量。
在一个实施例中，B细胞为兔B细胞。
本发明的一个方面是一种用于为诸如培养去除细胞混合物中的非B细胞的方法，该方法包括以下步骤：
a)将单次沉积的B细胞或B细胞集合与饲养细胞共培养，
b)将来自步骤a)中所获得的共培养的细胞与根据本发明所述的抗体一起孵育，以及
c)选择根据本发明所述的抗体与之结合的一种或多种细胞，并由此从细胞混合物中选择B细胞并且去除非B细胞。
在一个实施例中，B细胞为兔B细胞。
根据本发明的一个方面是一种用于在单次沉积的B细胞与饲养细胞的共培养中确定B细胞数量的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将单次沉积的B细胞与饲养细胞共培养，
b)将来自步骤a)中所获得的共培养的细胞与根据本发明所述的抗体一起孵育，以及
c)通过对根据本发明所述的抗体与之结合的细胞的数量计数，确定培养中的B细胞数量。
在一个实施例中，B细胞为兔B细胞。
附图说明
图1用融合至FLAG标签的兔CD19的表达质粒转染的重组鼠细胞的FACS分析。使用FITC标记的抗FLAG标签抗体通过细胞表面染色间接确认兔CD19表达。
A：NIH/3T3，转染后24h使用LipofectAmine进行正向转染；
B：C2C12，转染后24h使用LipofectAmine进行正向转染；
C：NIH/3T3，转染后48h使用LipofectAmine进行反向转染。
图2用于鉴定与兔CD19结合的杂交瘤上清液的兔PBMC的FACS分析。用FITC标记的抗兔IgM抗体和杂交瘤上清液对兔PBMC进行双重染色。通过PE标记的抗小鼠IgG抗体形成单个杂交瘤上清液的未标记的小鼠抗体。
A：阳性杂交瘤上清液与rbIgM阳性B细胞上的兔CD19结合；
B：示例性地，阴性杂交瘤上清液不与兔IgM阳性B细胞结合。
图3使用纯化的Alexa 647标记的抗兔CD19抗体，将兔CD19用作B细胞标记物。将单次B细胞分选中使用的门的FACS图与通过索引分选方法生成的图进行比较，发现抗原特异性和分泌IgG的B细胞为兔CD19高度阳性。
A：用于单细胞分选的兔IgG-FITC标记的B细胞(门P8)的FACS图。利用兔B细胞的兔IgM-PE标记作为反染；
B：利用基于抗兔CD19抗体标记(门P5)表征分选的B细胞；
C：通过索引分选方法生成的FACS图，包括示出兔IgG门的兔IgG和抗原特异性ELISA的数据；
D：通过索引分选方法生成的FACS图，包括示出兔CD19门的兔IgG和抗原特异性ELISA的数据。
图4B细胞培养7天后B细胞和饲养细胞的FACS分析。
A：FACS图，示出通过细胞尺寸(FSC；前向散射)和细胞复杂度(SSC；侧向散射)分布的所有细胞；
B：FACS图，示出通过兔CD19染色(Alexa 647)和死细胞(碘化丙啶)分布的所有细胞；
C：包含极少B细胞的孔中B细胞的准确计数。
图5B细胞培养7天后B细胞和饲养细胞的FACS分析。
A：FACS图，示出通过细胞尺寸(FSC)和细胞复杂度(SSC)分布的所有细胞；
B：FACS图，示出通过兔CD19染色(Alexa 647)和死细胞(碘化丙啶)分布的所有细胞；
C：包含大量B细胞的孔中B细胞的准确计数。
图6A：来自兔的外周血淋巴细胞(PBL)的FACS图，示出细胞尺寸(FSC)和细胞复杂度(SSC)。
B：来自兔的PBL的FACS图，示出FITC通道中的细胞尺寸(FSC)和兔IgG染色的细胞群(＝门P5)。
图7A：FACS图，示出用磁珠富集抗原后B细胞的活力。
B：FACS图，示出CD19+B细胞富集后B细胞的活力。
具体实施方式
CD19是一种最佳的全B细胞标记物，因为它在B细胞发育直至最终分化为浆细胞的几乎所有阶段均有表达(参见例如Tedder)。
定义
关于人免疫球蛋白轻链和重链的核苷酸序列的一般信息给出于：Kabat,E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)中。重链和轻链的所有恒定区和结构域的氨基酸位置可根据Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes ofHealth，Bethesda，MD(1991)中描述的Kabat编号***编号，并且在本文中被称为“根据Kabat编号”。具体地，将Kabat编号***(参见Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD(1991)的第647-660页)用于κ和λ同种型的轻链恒定结构域CL，并且将Kabat的EU索引编号***(参见第661-723页)用于恒定重链结构域(CH1、铰链、CH2和CH3，这在本文中通过在此情况下称为“根据Kabat的EU索引编号”而进一步分类)。
必须注意的是，如在本说明书和所附权利要求中所用，单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数指代物，除非上下文另外明确规定。因此，例如，“一个细胞”所指的包括多个此类细胞和该领域技术人员已知的其等效物，如此等等。同样，术语“一个/一种”、“一个/一种或多个/多种”和“至少一个/一种”在本文中可互换使用。
也应注意的是，术语“包含”、“包括”和“具有”可互换使用。
对于本领域的技术人员而言，将例如肽连接基或融合多肽的氨基酸序列转化为相应的编码核酸序列的程序和方法是众所周知的。因此，核酸的特征在于其核酸序列由单独的核苷酸组成，并且特征同样在于由其编码的肽连接基或融合多肽的氨基酸序列。
使用重组DNA技术能够生成核酸衍生物。此类衍生物可例如在一个或几个核苷酸位置处通过取代、改变、交换、缺失或***来修饰。例如，可通过定点突变手段进行修饰或衍生。此类修饰可由该领域技术人员容易地进行(参见，例如，Sambrook,J.等人，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning:A laboratory manual(1999)Cold Spring HarborLaboratory Press,New York,USA)；Hames,B.D.和Higgins,S.G.，《核酸杂交：实践方法》(Nucleic acid hybridization a practical approach(1985)IRL Press,Oxford,England))。
可用于实施本发明的方法和技术在例如1997年出版的Ausubel,F.M.编著的《分子生物学现行方案》(Current Protocols in Molecular Biology)第I至III卷；Glover,N.D.和牛津大学出版社在1985年出版的Hames,B.D.编著的《DNA克隆：实践方法》(DNA Cloning:A Practical Approach)第I卷和第II卷；IRL出版公司在1986年出版的Freshney,R.I.编著的《动物细胞培养：实践方法》(Animal Cell Culture a practical approach)；CHSL出版社在1992年出版的Watson,J.D.等人所撰《重组DNA(第二版)》(Recombinant DNA,SecondEdition)；N.Y.,VCH出版社在1987年出版的Winnacker,E.L.编著《从基因到克隆》(FromGenes to Clones)；美国学术出版社在1998年出版的Celis,J.编著的《细胞生物学(第二版)》(CellBiology,Second Edition)；Alan R.Liss,Inc.,N.Y.在1987年出版的Freshney,R.I.编著《动物细胞培养：基础技术手册(第二版)》(Culture of Animal Cells:A Manualof Basic Technique,Second Edition)中所述。
术语“约”表示其后所跟随的数值的+/-20％范围。在一个实施例中，术语“约”表示其后所跟随的数值的+/-10％范围。在一个实施例中，术语“约”表示其后所跟随的数值的+/-5％范围。
出于本文目的的“受体人框架”是这样的框架，其包含来源于如下所定义的人免疫球蛋白框架或人共有框架的轻链可变结构域(VL)框架或重链可变结构域(VH)框架的氨基酸序列。“来源于”人免疫球蛋白框架或人共有框架的受体人框架可包含与所述人免疫球蛋白框架或人共有框架相同的氨基酸序列，或者其可以包含氨基酸序列变化。在一些方面，氨基酸变化的数量为10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少或2个或更少。在一些方面，VL受体人框架在序列上与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列相同。
“亲和力”是指分子(例如，抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，否则如本文所用，“结合亲和力”是指内在结合亲和力，其反映了结合对的成员(例如，抗体和抗原)之间的1:1相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力一般可由解离常数(kd)表示。亲和力可以通过本领域已知的常规方法测量，包括本文所述的那些方法。
术语“抗兔CD19抗体”和“特异性结合兔CD19的抗体”是指这样的抗体，其能够以足够的亲和力结合兔CD19，使得该抗体可用作靶向兔CD19的诊断剂。
本文的术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且包括各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的兔CD19结合活性即可。
“抗体片段”是指完整抗体以外的分子，其包含完整抗体的一部分，该部分结合至兔CD19。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双体抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
术语“嵌合”抗体是指这样的抗体，在所述抗体中重链和/或轻链的一部分来源于特定来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分来源于不同的来源或物种。
抗体的“类别”是指抗体的重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五大类抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且它们中的一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1，以及IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
如本文所用的术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C-末端区域片段，该C-末端区域片段含有恒定区的至少一部分。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施例中，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基末端。然而，Fc区的C末端赖氨酸(Lys447)或末端甘氨酸-赖氨酸二肽(Gly446-Lys447)可以存在或不存在。根据Kabat EU索引编号。
如本文所用的“(抗体的)恒定区”用于定义免疫球蛋白重链中除可变结构域之外的部分。该术语包括天然序列恒定区和变体恒定区。在一个实施例中，人IgG重链恒定区从Ala114延伸至重链的羧基末端。然而，Fc区的C末端赖氨酸(Lys447)或末端甘氨酸-赖氨酸二肽(Gly446-Lys447)可以存在或不存在。根据Kabat EU索引编号。
根据本发明所述的抗体包含Fc区，在一个实施例中，包含衍生自人源的Fc区。在一个实施例中，Fc区包含人恒定区的所有部分。抗体的Fc区直接参与补体活化、C1q结合、C3活化和Fc受体结合。虽然抗体对补体***的影响取决于某些条件，但与C1q的结合由Fc区中限定的结合位点引起。此类结合位点是现有技术中已知的并且描述于例如以下文献中：Lukas,T.J.，等人，J.Immunol.127(1981)2555-2560；Brunhouse,R.和Cebra,J.J.，Mol.Immunol.16(1979)907-917；Burton,D.R.，等人，Nature 288(1980)338-344；Thommesen,J.E.，等人，Mol.Immunol.37(2000)995-1004；Idusogie,E.E.，等人，J.Immunol.164(2000)4178-4184；Hezareh,M.，等人，J.Virol.75(2001)12161-12168；Morgan,A.，等人，Immunology 86(1995)319-324；以及EP 0 307 434。此类结合位点为例如L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331和P329(根据Kabat EU索引编号)。人亚类IgG1、IgG2和IgG3的抗体通常表现出补体活化、C1q结合和C3活化作用，而IgG4则不激活补体***、不结合C1q并且不激活C3。“抗体的Fc区”是技术人员所熟知的术语，并且基于木瓜蛋白酶对抗体的切割来定义。在一个实施例中，Fc区为人Fc区。在一个实施例中，Fc区属于人IgG1或IgG4亚类。在一个实施例中，Fc区属于人IgG4亚类，其包含突变S228P和/或L235E(根据Kabat EU索引编号)。在一个实施例中，Fc区属于人IgG1亚类，其包含突变L234A、L235A并且任选地包含P329G(根据Kabat EU索引编号)。
如本文所用的术语“可检测标记物”涵盖发色团(荧光或发光基团和染料)、酶、NMR活性基团、金属颗粒或半抗原(诸如洋地黄毒苷)。在一个实施例中，可检测标记物为荧光染料。在一个实施例中，可通过电化学发光检测的金属螯合物也是信号发射基团，特别优选钌螯合物，例如钌(双吡啶基)3 2+螯合物。合适的钌标记基团描述于例如EP 0 580 979、WO 90/05301、WO 90/11511和WO 92/14138中。
“人共有框架”是这样的框架，其表示在人免疫球蛋白VL或VH框架序列的选择中最常存在的氨基酸残基。一般而言，人免疫球蛋白VL或VH序列的选择来自于可变结构域序列的亚组。一般而言，序列的亚组是如Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，NIH Publication 91-3242，Bethesda MD(1991)，第1-3卷中所述的亚组。在一个方面，对于VL，该亚组是如Kabat等人，出处同上中的亚组κI或III。在一个方面，对于VH，该亚组是如Kabat等人，出处同上中的亚组III。
“框架”或“FR”是指除高变区(HVR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由以下四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR和FR序列通常在VH(或VL)中以如下序列出现：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
术语“全长抗体”、“完整抗体”及“全抗体”在本文中可互换地用于指代具有基本上类似于天然抗体结构的结构或具有含有如本文所定义的Fc区的重链的抗体。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”与“宿主细胞培养物”可互换使用并且是指其中已引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞和来源于所述原代转化细胞的子代，不考虑传代次数。子代可能不与亲本细胞的核酸内容物完全一致，而是可能含有突变。本文包括如在原始转化细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物活性的突变子代。
“人共有框架”是这样的框架，其表示在人免疫球蛋白VL或VH框架序列的选择中最常存在的氨基酸残基。一般而言，人免疫球蛋白VL或VH序列的选择来自于可变结构域序列的亚组。一般而言，序列的亚组是如Kabat,E.A.等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，Bethesda MD(1991)，NIH Publication 91-3242，第1-3卷中所述的亚组。在一个实施例中，对于VL，该亚组是如Kabat等人，出处同上中的亚组κI。在一个实施例中，对于VH，该亚组是如Kabat等人，出处同上中的亚组III。
“人源化”抗体是指这样的嵌合抗体，其包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基。在某些实施例中，人源化抗体将基本上包含所有的至少一个，通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有HVR(例如CDR)对应于非人抗体的HVR，并且所有或基本上所有的FR对应于人抗体的FR。人源化抗体任选地可以包含来源于人抗体的抗体恒定区的至少一部分。“人源化形式”的抗体，例如，非人抗体，是指已经进行过人源化的抗体。
如本文所用，术语“高变区”或“HVR”是指以下项中的每一种：包含氨基酸残基延伸体的抗体可变结构域的在序列中高变(“互补决定区”或“CDR”)和/或形成结构上限定的环(“高变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触点”)的区域。通常，抗体包含六个HVR；三个在VH中(H1、H2、H3)，并且三个在VL中(L1、L2、L3)。
HVR包括
(a)存在于氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)处的高变环(Chothia,C和Lesk，A.M.,J.Mol.Biol.196(1987)901-917)；
(b)存在于氨基酸残基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)处的CDR(Kabat,E.A.等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991),NIH Publication 91-3242)；
(c)存在于氨基酸残基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)和93-101(H3)处的抗原接触点(MacCallum等人，J.Mol.Biol.262:732-745(1996))；以及
(d)(a)、(b)和/或(c)的组合，包括氨基酸残基46-56(L2)、47-56(L2)、48-56(L2)、49-56(L2)、26-35(H1)、26-35b(H1)、49-65(H2)、93-102(H3)和94-102(H3)。
除非另外指明，否则可变结构域中的HVR残基和其他残基(例如，FR残基)在本文中根据Kabat等人，出处同上编号。
“分离的”抗体为已从其自然环境的组分中分离的抗体。在一些实施例中，通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(isoelectric focusing,IEF)、毛细管电泳)或色谱(例如，离子交换或反相HPLC)确定，将抗体纯化至大于95％或99％的纯度。有关评估抗体纯度的方法的综述，参见例如：Flatman等人，J.Chromatogr.B 848(2007)79-87。
“经分离的”核酸是指已自其自然环境的组分中分离的核酸分子。分离的核酸包括这样的核酸分子，其包含在通常含有所述核酸分子的细胞中，但所述核酸分子存在于染色体外或与其天然染色***置不同的染色***置处。
“编码抗兔CD19抗体的分离的核酸”是指编码抗体重链和轻链(或其片段)的一个或多个核酸分子，包括在单一载体或单独的载体中的此类核酸分子，以及存在于宿主细胞中一个或多个位置的此类核酸分子。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能的变异抗体(例如，含有天然存在的突变或在单克隆抗体制剂的生产过程中产生，此类变体通常以少量形式呈递)之外，包含该群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂中的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从基本上同质的抗体群体获得的，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术制备，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法，以及利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，在本文中描述了用于制备单克隆抗体的此类方法和其他示例性方法。
“裸抗体”是指不缀合至异源部分(例如，细胞毒性部分)或放射性标记的抗体。
“天然抗体”是指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由经二硫键合的两条相同轻链和两条相同重链组成。从N-末端到C-末端，每条重链具有可变区(VH)(也称为可变重链结构域或重链可变结构域)，接着是三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)，借此，铰链区定位在第一恒定结构域与第二恒定结构域之间。类似地，自N-末端至C-末端，各轻链具有可变区(VL)，也称为可变轻链结构域或轻链可变结构域，继之以恒定轻链(CL)结构域。抗体的轻链基于其恒定结构域的氨基酸序列，可以归属于两种类型中的一种，这两种类型称为卡帕(κ)和兰姆达(λ)。
相对于参照多肽序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”被定义为在比对候选序列与参考多肽序列并引入空位(如果必要的话)以实现最大的序列同一性百分比之后，并且出于比对的目的在不考虑将任何保守取代作为序列同一性的组成部分的情况下，候选序列中的氨基酸残基与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的比对可以以本领域技术范围内的各种方式实现，例如使用可公开获得的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ClustalW、Megalign(DNASTAR)软件或FASTA程序。本领域技术人员可确定用于比对序列的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。另选地，可使用序列比较计算机程序ALIGN-2生成一致性百分比值。ALIGN-2序列比较计算机程序由基因泰克公司编写，并且源代码已经与用户文档一起提交到U.S.Copyright Office,Washington D.C.,20559，在那里以美国版权登记号TXU510087注册，并且如WO 2001/007611所述。
除非另外指明，否则出于本文的目的，用BLOSUM50比较矩阵，使用FASTA包第36.3.8c版或更高版本的ggsearch程序产生氨基酸序列同一性百分比值。FASTA程序包由W.R.Pearson和D.J.Lipman(1988)，“Improved Tools for Biological SequenceAnalysis”，PNAS 85:2444-2448；W.R.Pearson(1996)“Effective protein sequencecomparison”Meth.Enzymol.266:227-258；以及Pearson等人，(1997)Genomics 46:24-36创作并且可从www.fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_down.shtml或www.ebi.ac.uk/Tools/sss/fasta公开获得。另选地，可以使用可在fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/index.cgi处访问的公共服务器来比较序列，使用ggsearch(全局蛋白质：蛋白质)程序和默认选项(BLOSUM50；开放：-10；ext：-2；Ktup＝2)来确保执行全局而非局部比对。在输出的比对标头(alignment header)中给出氨基酸一致性百分比。
如本文所用，术语“CD19”是指兔B淋巴细胞抗原CD19(别名为：分化抗原CD19、B淋巴细胞表面抗原B4、T细胞表面抗原Leu-12)。该术语涵盖“全长”的未加工的兔CD19(SEQ IDNO:02)以及在其细胞中加工产生的任何形式的兔CD19，例如，通过信号肽的切割，只要如本文所报道的抗体与其结合，诸如SEQ ID NO:01及其片段。
术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链的参与抗体与抗原结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守构架区(FR)和三个高变区(HVR)。(参见例如：Kindt,T.J.等人，KubyImmunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，N.Y.(2007)，第91页)。单个VH或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。此外，结合特定抗原的抗体可分别使用来自结合该抗原的抗体的VH或VL结构域来进行分离，以筛选互补VL或VH结构域的文库。参见例如：Portolano,S.等人，J.Immunol.150(1993)880-887；Clackson,T.等人，Nature 352(1991)624-628)。
如本文所用，术语“载体”是指能够载运与其相链接的另一核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体，以及整合入其已被引入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作链接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。
组合物和方法
本发明至少部分地基于以下发现：兔CD19是一种非常有价值的泛兔B细胞标记物。
更详细地，已经发现兔CD19是用于兔B细胞的分析和表征的有利的细胞表面标记物。通过表面呈递的CD19标记兔B细胞可改善B细胞富集或甚至分选。除其他事项外，该改善在于更特定的标记并由此富集/分选/单细胞沉积或/和有利的方法，其中减少了待处理的B细胞的数量，同时增加了产生抗原特异性抗体的B细胞的数量。
本发明至少部分地基于以下发现：与抗兔CD20抗体相比，根据本发明所述的抗兔CD19抗体在用作细胞表面标记物时不导致B细胞的细胞凋亡。
在本发明出现之前，唯一可用于对兔B细胞特异性染色的抗体是针对人转基因兔中细胞表面免疫球蛋白(例如IgG、IgM、IgA或人轻链)的抗体。无特异性B细胞标记物能够对整个B细胞群进行特异性染色。利用根据本发明所述的抗兔CD19抗体，首次能够鉴定并特异性染色整个兔B细胞群。
与其他非啮齿类哺乳动物物种相比，兔CD19序列在外显子#3上包含延伸的间隙(参见比对)。
仓鼠RDLDCGLENR SSGSHRPSSG SHNSSWLYVW AKDHPEVVGT 169
小鼠RDLDCDLRNR SSGSHRSTSG....SQLYVW AKDHPKVWGT 165
大鼠GDLDCDLGNR SSGSHRSTSG....SQLYVW ATDHPEVWKT 165
松鼠EALKCSRGNM SSGGTGLSSA PPNTSQLYVW AKDHPKIWNT 136
兔GGPGCGLGNE SS...........SSQPYVW DRDHPKEWDM 157
狨猴SGQGCGLENR SSEDPSSPSG NLMSSQLYVW AKDRPKIWEG 170
恒河猴GGLGCGLKNR SSEGPSSPSG KLNSSQLYVW AKDRPEMWEG 169
人GGLGCGLKNR SSEGPSSPSG KLMSPKLYVW AKDRPEIWEG 169
猫NDPGCGLGNR SSEGPKPSSG YPTSSQLYVW AKGHPEIWET 165
裸鼹鼠GDLSCGPGNG SSGRPRLAPH HRNNSQLYVW NKGHPEIWEA 169
豚鼠GDFSCGPGNG SSEGPTPSSQ HPNSSQLYVW DKRDSPSWEP 45(SEQ ID NO自上而下为：04、05、06、07、02、08、09、10、11、12、13，其分别对应于TR_ROD:G3I7M5_CRIGR[1039:]、SW:CD19_MOUSE、TR_ROD:F1LNH2_RAT、TR_ROD:I3MSE7_SPETR[38:]、TR_VRT:G1TWR4_RABIT、SW:CD19_CALJA、TR_VRT:F7F486_MACMU、SW:CD19_HUMAN、TR_VRT:M3VZQ6_FELCA、TR_ROD:G5BRD9_HETGA、SW:CD19_CAVPO、SW_ROD:CD19_CAVPO、TR_ROD:H0UXI6_CAVPO)
为从兔基因组中分离出基因，已从兔、人和小鼠中提取5'/3'-UTR区并且进行比较，以形成可将PCR引物置于其中的区域(rb_5UTR_primer_region1(SEQ ID NO:17),rb_5UTR_primer_region2(SEQ ID NO:18),rb_3UTR_primer_region(SEQ ID NO:19))。示例性引物具有SEQ ID NO:53(结合在3'UTR)和SEQ ID NO：54(结合在5'UTR)的序列。
为分离兔CD19基因组DNA，可使用rbCD19 UTR正向引物和rbCD19 UTR反向引物(结合在兔CD19结构基因的5'/3'-UTR序列；SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21)的引物组合或者rbCD19 CDS正向引物和rbCD19 CDS反向引物(分别结合在兔CD19结构基因的起始密码子和终止密码子；SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23)的引物组合。相应的扩增产物的长度分别为1831bp或1663bp。
根据本发明所述的抗体通过用兔CD19表达质粒免疫小鼠而生成。在收获B细胞之前，用转染有兔CD19 DNA的兔CD19呈递细胞增强免疫小鼠的免疫力。将收获的B细胞与骨髓瘤细胞融合，以生成杂交瘤细胞。
增强中使用的表达兔CD19的细胞为NIH/3T3(
CRL-1658TM)小鼠胚胎成纤维细胞，这些细胞已转染有兔CD19-GPI锚着点-FLAG-标签融合多肽转染。兔CD19在细胞内染色中信号强的NIH/3T3细胞的细胞表面上表达良好(24小时后，FITC阳性细胞占约40％)。出乎意料的是，当使用紧密相关的C2C12(
CRL-1772TM)小鼠肌肉成肌细胞时，无法检测到所述构建体的表达(几乎未检测到兔CD19阳性细胞；24小时后，FITC阳性细胞占约9％)。可使用逆转染方法进一步改善兔CD19表达(见图1)。对于CHO和HEK细胞，已证明FLAG标签可用作检测细胞表面表达的兔CD19的替代物(见下表)。
抗-FlagTag抗体-Alexa 488-缀合物＝利用带有Alexa 488标记的抗-Flag-标签抗体检测FLAG-标签
多克隆抗-mIgG抗体-APC-缀合物＝利用带有APC标记的抗鼠IgG抗体检测抗兔CD19抗体
在生成的356个杂交瘤细胞中，仅单个细胞克隆1H2在B细胞表面表达对天然兔CD19有(相当)亲和力的抗兔CD19抗体(参见图2和下表)。
本发明至少部分地基于以下发现：必须遵循特定的免疫方案以分别获得表达B细胞或杂交瘤的抗兔CD19抗体。已经发现，DNA免疫与收获B细胞之前在其表面上表达兔CD19的细胞的增强相结合，可获得表达兔CD19特异性抗体的B细胞。
不受理论的约束，认为在本发明之前尚无抗兔CD19抗体，更不用说单克隆抗体，因为此类抗体非常难以生成。例如，经验表明，利用CD19作为重组蛋白或仅作为重组细胞系进行免疫不引起抗体与B细胞上的天然CD19结合。因此，假设动物体内存在CD19作为天然确认，则进行仅DNA免疫(包括最终细胞增强免疫)。
本文提供针对兔CD19的抗体，这些抗体可用作标记和富集/选择兔B细胞的工具。
不受理论的约束，认为这些抗体可在巨噬细胞耗尽后和/或IgM-IgG+CD19+-B细胞染色等方面有益地使用。
本发明至少部分地基于以下发现：CD19可用于标记B细胞以用于单细胞沉积或细胞集合分选。已经发现，在沉积或分选当天，所有产生抗原特异性IgG的B细胞均呈CD19阳性。因此，可使用兔细胞上的CD19选择产生抗原特异性抗体的B细胞(参见图3和下表)。
根据本发明所述的抗兔CD19抗体可用于检测IgG阳性和IgM阳性B细胞，从而所有抗原特异性IgG阳性B细胞均具有高水平的CD19。利用根据本发明所述的抗体，可首次确定脾脏中的B细胞中呈CD19阳性的细胞占细胞总数的约5.4％，并且外周血单核细胞(PBMC)中呈CD19阳性的细胞占细胞总数的约38.7％。必须指出，在从血液中新鲜分离的兔PBMC中，兔CD19阳性细胞的百分比高于经免疫球蛋白染色的B细胞的总和，表明抗兔CD19抗体是标记所有兔B细胞的优异的标记物。结果如下表所示。
尤其是对于IgG分选的B细胞群，重要的是所有IgG阳性细胞均具有高水平的CD19(参见下表中的数据)。
本发明至少部分地基于以下发现：CD19可用于在B细胞共培养中区分B细胞与饲养细胞。单独沉积的B细胞需要在培养中存在饲养细胞才能生长和***。尽管饲养细胞在与B细胞共培养之前经过辐照以减少其生长和细胞***，但其总数和细胞尺寸与共培养后获得的B细胞的数量和细胞尺寸处于相同的数量级。利用根据本发明所述的抗兔CD19抗体，现在可以在共培养后通过简单的FACS分析来区分饲养细胞和B细胞。从而能够鉴定出B细胞的总数。这允许对其他培养参数(诸如抗体产生速率或产率)进行归一化(见图4和5)。
在本发明之前，不可能根据B细胞计数来估算培养后生长的B细胞克隆的尺寸，因为兔IgG不适合用作细胞表面B细胞标记物，因为其表达在培养期间减少，因此不能用作B细胞标记物。利用根据本发明所述的抗兔CD19抗体解决了这一问题，因为兔CD19在培养后仍会在B细胞上表达，并由此能够对培养后的B细胞进行计数(B细胞/孔＝CD19+门中的事件数量/经FACS处理的体积×样品体积)。
下表显示了培养后36个单孔的B细胞计数(CD19阳性PI细胞)。B细胞计数范围很宽。CD19阳性B细胞计数的计算方法如下：FACS门的计数/150(经FACS处理的体积)×200(总样品体积)。
每次存在B细胞克隆时，均可检测到CD19阳性B细胞并且在忽略活的饲养细胞的情况下计数。可以看出，B细胞克隆的细胞计数(＝细胞总数)在宽范围内高度异质。
B细胞克隆的尺寸是B细胞增殖成功的非常合适的替代标记物。此外，B细胞克隆的尺寸可与先前分选的B细胞群关联，并且ELISA结果能够更好地表征该***。
此外，可以鉴定生长缓慢以及产量低的B细胞，尤其是在饲养细胞过多的情况下。同时，死的饲养细胞不干扰染色和分析/选择过程。由于这种特异性标记，可能直接对培养中(例如，在多孔板的孔中)存在(死或活)饲养细胞的情况下对B细胞进行计数。
本发明至少部分地基于以下发现：沉积时细胞表面上的CD19水平与培养后获得的IgG滴度呈正相关。这种相关性可用于在从兔体内分离后直接选择高产量B细胞，而无需进行共培养。
本发明至少部分地基于以下发现：CD19可用于富集兔B细胞，并由此增加单细胞分选的B细胞群(例如，IgG+B细胞群)，并由此减少不需要的细胞数量。不受理论的约束，该特性尤其能够改善分选结果。
本发明至少部分地基于以下发现：根据本发明所述的抗兔CD19抗体可用于鉴定原代兔B细胞。
利用根据本发明所述的抗体，可以确定样品中(诸如兔PBMC或兔脾细胞中)CD19阳性B细胞的分数。PBMC的结果如下表所示。
市售山羊抗兔IgG多克隆抗体(AbD Serotec STAR121F)缀合至占兔PBMC的0.2％至2％的FITC标记(图6)。
细胞用FITC标记的抗IgG抗体和标记有APC的根据本发明所述的抗兔CD19抗体进行两次染色。随后对细胞进行对于FSC和IgG的索引分选。结果表明，在随后的ELISA中仅CD19和IgG阳性细胞产生IgG。然后检查分选的CD19阳性细胞的百分比。将其用作估算使用根据本发明所述的抗体可以改善分选效率的量度。平均而言，仅对IgG和CD19双阳性细胞进行分选，效率可提高约14％，并且在最佳情况下，可提高20％以上，而IgG阳性或抗原特异性细胞则无任何显著损失。结果如下表所示。
已对基于珠粒的选择/提取过程的不同条件进行了如下测试：
-使用生物素化抗原和链霉亲和素珠进行基于磁珠的淘筛，然后对FSC以及IgG(FITC)和CD19(APC)双重染色细胞进行选通分类，以及
-使用根据本发明所述的生物素化抗CD19抗体和链霉亲和素珠进行基于磁珠的淘筛，然后对FCS以及IgG(FITC)和抗原(APC)
双重染色细胞进行选通分类。
在两种情况下，均使用7AAD进行活/死染色。
已经发现，利用根据本发明所述的抗CD19抗体淘筛导致B细胞的活力增加(提高4倍)。不受理论的约束，认为增加的细胞活力可能是由于减少的交联和活化作用。
本发明至少部分地基于以下发现：通过在淘筛步骤中使用根据本发明所述的抗CD19抗体从细胞群富集B细胞，更高百分比的分选B细胞产生对抗原具有特异性的抗体，如随后的ELISA所示。另外，在交叉反应测定中，阳性细胞也较少，从而可以使用更多的克隆。这可能与细胞活力的提高相关。
下表显示了从不同免疫活动(不同抗原)获得的B细胞的结果。
A.示例性抗兔CD19抗体及其用途
A.1示例性抗体
已经发现兔CD19是用于兔B细胞的分析和表征的有利的细胞表面标记物。通过表面呈递的CD19标记兔B细胞可改善B细胞分选。除其他事项外，该改善在于更特定的标记并由此分选/单细胞沉积或/和有利的方法，其中减少了待处理的B细胞的数量，同时增加了产生抗原特异性抗体的B细胞的数量。
在一个方面，本文提供了一种与兔CD19特异性结合的经分离的抗体，该抗体包含选自以下各项的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个HVR：(a)HVR-H1，其包含SEQ IDNO:32或SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:34的氨基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36的氨基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；以及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列。
在一个方面，本文提供了一种抗兔CD19抗体，该抗体包含选自以下各项的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个HVR：(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；以及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列。
在一个方面，本文提供了一种抗兔CD19抗体，该抗体包含选自以下各项的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个HVR：(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；以及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列。
在一个方面，本文提供了一种抗兔CD19抗体，该抗体包含选自以下各项的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个HVR：(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；以及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列。
在一个方面，本文提供了一种与兔CD19特异性结合的经分离的抗体，该抗体包含：(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:34的氨基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36的氨基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ IDNO:39的氨基酸序列；以及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列。
在一个方面，本文提供了一种抗兔CD19抗体，该抗体包含：(a)HVR-H1，其包含SEQID NO:33的氨基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；以及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列。
在一个方面，本文提供了一种抗兔CD19抗体，该抗体包含：(a)HVR-H1，其包含SEQID NO:32的氨基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；以及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列。
在一个方面，本文提供了一种抗兔CD19抗体，该抗体包含：(a)HVR-H1，其包含SEQID NO:34的氨基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；以及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列。
在另一方面，如本文所报道的抗兔CD19抗体包含：(i)VH结构域，其包含选自以下各项的至少一个、至少两个或所有三个VH HVR序列：(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:32或SEQID NO:33或SEQ ID NO:34的氨基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36的氨基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列；以及(ii)VL结构域，其包含选自以下各项的至少一个、至少两个或所有三个VL HVR序列：(a)HVR-L1，其包含SEQ IDNO:38的氨基酸序列；(b)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；以及(c)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列。
在另一方面，如本文所报道的抗兔CD19抗体包含：(i)VH结构域，其包含选自以下各项的至少一个、至少两个或所有三个VH HVR序列：(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列；以及(ii)VL结构域，其包含选自以下各项的至少一个、至少两个或所有三个VL HVR序列：(a)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列；(b)HVR-L2，其包含SEQ IDNO:39的氨基酸序列；以及(c)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列。
在另一方面，如本文所报道的抗兔CD19抗体包含：(i)VH结构域，其包含选自以下各项的至少一个、至少两个或所有三个VH HVR序列：(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列；以及(ii)VL结构域，其包含选自以下各项的至少一个、至少两个或所有三个VL HVR序列：(a)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列；(b)HVR-L2，其包含SEQ IDNO:39的氨基酸序列；以及(c)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列。
在另一方面，如本文所报道的抗兔CD19抗体包含：(i)VH结构域，其包含选自以下各项的至少一个、至少两个或所有三个VH HVR序列：(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列；以及(ii)VL结构域，其包含选自以下各项的至少一个、至少两个或所有三个VL HVR序列：(a)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列；(b)HVR-L2，其包含SEQ IDNO:39的氨基酸序列；以及(c)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列。
在另一方面，提供的抗兔CD19抗体为人源化抗体。在一个实施例中，人源化抗兔CD19抗体包含如上述实施例中任一项所述的HVR，并且进一步包含受体人框架，例如人免疫球蛋白(种系)框架或人共有框架。
在进一步方面，本文提供了与本文所报道的抗兔CD19抗体结合至相同表位的抗体。例如，在某些实施例中，本文提供了与抗兔CD19抗体结合至相同表位的抗体，该抗体包含SEQ ID NO:30的VH序列以及SEQ ID NO:26的VL序列。
在一个实施例中，根据上述实施例中任一项所述的抗兔CD19抗体为单克隆抗体。在一个实施例中，抗兔CD19抗体为抗体片段，例如Fv、Fab、Fab'、scFv、双体抗体或F(ab')2片段。在另一个实施例中，抗体为全长抗体，例如本文所定义的完整IgG1或IgG 4抗体或其他抗体类别或同种型。
在所有方面的一个实施例中，抗体包含(所有位置均根据Kabat EU索引编号)
i)人IgG1亚类的同源二聚体Fc区，其任选地包含突变P329G、L234A和L235A，或
ii)人IgG4亚类的同源二聚体Fc区，其任选地包含突变P329G、S228P和L235E，或
iii)人IgG1亚类的同源二聚体Fc区，其任选地包含突变(P329G,L234A,L235A)I253A、H310A和H435A或包含突变(P329G,L234A,L235A)H310A、H433A和Y436A，或
iv)它们的异源二聚体Fc区
a)一个Fc区多肽包含突变T366W，并且另一个Fc区多肽包含突变T366S、L368A和Y407V，或者
b)一个Fc区多肽包含突变T366W和Y349C，并且另一个Fc区多肽包含突变T366S、L368A、Y407V和S354C，或者
c)一个Fc区多肽包含突变T366W和S354C，并且另一个Fc区多肽包含突变T366S、L368A、Y407V和Y349C，
或者
v)人IgG1亚类的异源二聚体Fc区，其中两个Fc区多肽均包含突变P329G、L234A和L235A，以及
a)一个Fc区多肽包含突变T366W，并且另一个Fc区多肽包含突变T366S、L368A和Y407V，或者
b)一个Fc区多肽包含突变T366W和Y349C，并且另一个Fc区多肽包含突变T366S、L368A、Y407V和S354C，或者
c)一个Fc区多肽包含突变T366W和S354C，并且另一个Fc区多肽包含突变T366S、L368A、Y407V和Y349C，
或者
vi)人IgG4亚类的异源二聚体Fc区，其中两个Fc区多肽均包含突变P329G、S228P和L235E，以及
a)一个Fc区多肽包含突变T366W，并且另一个Fc区多肽包含突变T366S、L368A和Y407V，或者
b)一个Fc区多肽包含突变T366W和Y349C，并且另一个Fc区多肽包含突变T366S、L368A、Y407V和S354C，或者
c)一个Fc区多肽包含突变T366W和S354C，并且另一个Fc区多肽包含突变T366S、L368A、Y407V和Y349C，
或者
vii)iii)中的一个与vi)、v)和vi)中的一个的组合。
在进一步方面，根据上述实施例中任一项所述的抗兔CD19抗体可单独或组合地结合如以下部分所述的特征：
1.抗体片段
在某些实施例中，本文提供的抗体为抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、Fv和scFv片段以及下文所述的其他片段。关于某些抗体片段的综述，参见Hudson,P.J.等人，Nat.Med.9(2003)129-134。关于scFv片段的综述，参见例如Plueckthun,A.在The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg和Moore主编，Springer-Verlag，New York(1994)，第269-315页中所述；还可参见WO 93/16185；US 5,571,894和US 5,587,458。关于对包含补救受体结合表位残基并具有增加的体内半衰期的Fab片段和F(ab')2片段的讨论，参见US 5,869,046。
双体抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价或双特异性的。参见，例如，EP 0 404 097；WO 1993/01161；Hudson,P.J.等人；Nat.Med.9(2003)129-134；以及Holliger,P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)6444-6448。Hudson,P.J.等人，Nat.Med.9(20039 129-134)中还描述了三体抗体和四体抗体。
单结构域抗体为包含抗体的全部或部分重链可变结构域或全部或部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施例中，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis,Inc.，Waltham，MA；参见US 6,248,516)。
抗体片段可以通过各种技术制备，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及由重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)产生，如本文所述。
2.嵌合抗体和人源化抗体
本文提供的抗体为嵌合抗体。某些嵌合抗体描述于例如以下文献中：US 4,816,567；以及Morrison,S.L.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81(1984)6851-6855。在一个实例中，嵌合抗体包含非人可变区(例如，衍生自小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人灵长动物诸如猴的可变区)和人恒定区。在进一步实例中，嵌合抗体为“类别转换”抗体，其中该类别或亚类相对于亲本抗体已发生改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
人源化抗体为嵌合抗体。通常，非人抗体是人源化抗体，其降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。一般而言，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中HVR例如CDR(或其部分)源自非人抗体，并且FR(或其部分)源自人抗体序列。人源化抗体任选地还将包含人恒定区的至少一部分。在一些实施例中，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如，HVR残基所来源于的抗体)的相应残基取代，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
人源化抗体及其制备方法综述于例如Almagro,J.C.和Fransson,J.,Front.Biosci.13(2008)1619-1633中，并且进一步描述于例如以下文献中：Riechmann,I.等人，Nature 332(1988)323-329；Queen,C.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)10029-10033；US 5,821,337、US 7,527,791、US 6,982,321和US 7,087,409；Kashmiri,S.V.等人，Methods 36(2005)25-34(描述了特异性决定区(SDR)移植)；Padlan,E.A.，Mol.Immunol.28(1991)489-498(描述了“表面再塑”)；Dall’Acqua,W.F.等人，Methods 36(2005)43-60(描述了“FR改组”)；以及Osbourn,J.等人，Methods 36(2005)61-68和Klimka,A.等人，Br.J.Cancer 83(2000)252-260(描述了用于FR改组的“指导选择”方法)。
可用于人源化的人构架区包括但不限于：使用“最佳匹配”方法选择的构架区(参见例如Sims,M.J.等人，J.Immunol.151(1993)2296-2308)；来源于具有轻链可变区或重链可变区的特定亚组的人抗体的共有序列的构架区(参见例如：Carter,P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992)4285-4289；和Presta,L.G.等人，J.Immunol.151(1993)2623-2632)；人成熟(体细胞突变)构架区或人类种系构架区(参见例如Almagro,J.C.和Fransson,J.,Front.Biosci.13(2008)1619-1633)；以及来源于筛选FR文库的构架区(参见例如：Baca,M.等人，J.Biol.Chem.272(1997)10678-10684；和Rosok,M.J.等人，J.Biol.Chem.271(19969 22611-22618))。
3.抗体变体
在某些实施例中，考虑了本文提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，可能期望改善抗体的结合亲和力和/或其他生物特性。抗体的氨基酸序列变体可以通过向编码抗体的核苷酸序列中引入适当的修饰或通过肽合成来制备。此类修饰包括例如抗体氨基酸序列内残基的缺失、和/或***和/或取代。可以进行缺失、***和取代的任何组合以实现最终构建体，前提条件是最终构建体具有所需特征，例如抗原结合。
a)取代、***和缺失变体
在某些实施例中，提供了具有一个或多个氨基酸取代的抗体变体。用于取代突变的目标位点包括HVR和FR。保守型取代显示在下表的“优选取代”标题下。更多实质性改变提供于表1的“示例性取代”标题下，并且在下文参考氨基酸侧链类别进行了进一步描述。可以将氨基酸取代引入目标抗体中，并且对产物进行所需活性(例如，保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性，或改善的ADCC或CDC)筛选。
可根据共同的侧链特性将氨基酸分组：
(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His、Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly，Pro；
(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
非保守性取代将需要用这些类别中的一个的成员交换另一类别。
一种类型的取代变体涉及取代亲本抗体(例如，人源化抗体或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，相对于亲本抗体，选为用于进一步研究的一个或多个所得变体将在某些生物学特性方面(例如，亲和力增加、免疫原性降低)有改变(例如，改善)和/或将基本上保留亲本抗体的某些生物学特性。示例性取代变体是亲和力成熟抗体，其可例如使用诸如本文所述的那些基于噬菌体展示的亲和力成熟技术方便地生成。简言之，将一个或多个HVR残基突变并且将变体抗体展示在噬菌体上并针对特定生物活性(例如结合亲和力)进行筛选。
例如，可改变(例如，取代)HVR，以改善抗体亲和力。此类改变可发生于HVR“热点”中，即由体细胞成熟过程中发生高频突变的密码子编码的残基(参见例如：Chowdhury,P.S.，Methods Mol.Biol.207(2008)179-196)和/或与抗原接触的残基(检测所得变体VH或VL的结合亲和力)。通过构建以及从二级文库中重新选择以实现亲和力成熟的方法已描述于例如Hoogenboom,H.R.等人，Methods in Molecular Biology 178(2002)1-37中。在亲和力成熟的一些实施例中，利用多种方法(例如，易错PCR、链改组或寡核苷酸定点诱变基因)中的任一种将多样性引入选择用于成熟的可变基因中。然后创建一个辅助文库。然后筛选该文库，以鉴定具有所需的亲和力的所有抗体变体。引入多样性的另一种方法涉及HVR定向方法，其中随机分配若干HVR残基(例如，一次分配4-6个残基)。可通过例如丙氨酸扫描诱变或建模来特异性鉴定参与抗原结合的HVR残基。特别是经常靶向CDR-H3和CDR-L3。
在某些实施例中，取代、***或缺失可发生在一个或多个HVR内，只要此类改变基本上不降低抗体的抗原结合能力即可。例如，可在HVR中进行基本上不降低结合亲和力的保守性改变(例如，如本文提供的保守性取代)。此类改变可以在HVR的抗原接触残基之外。在上文提供的变体VH和VL序列的某些实施例中，每个HVR保持不变，或包含不超过一个、两个或三个氨基酸取代。
可用于鉴定可被靶向诱变的抗体残基或区域的方法称作“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham,B.C.和Wells,J.A.，Science 244(1989)1081-1085所述。在此方法中，鉴别残基或一组靶残基(例如，带电残基，诸如Arg、Asp、His、Lys和Glu)并用中性或带负电的氨基酸(例如，丙氨酸或多丙氨酸)代替以确定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可在对初始取代展示功能敏感性的氨基酸位置引入其他取代。另选地或附加地，利用抗原-抗体复合物的晶体结构鉴定抗体与抗原之间的接触点。可靶向或消除作为取代的候选的此类接触残基和相邻残基。可筛选变体以确定它们是否具备期望的特性。
氨基酸序列***包括长度范围为一个残基至含有一百个或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基末端融合，以及一个或多个氨基酸残基的序列内***。末端***的示例包括具有N末端甲硫氨酰残基的抗体。抗体分子的其他***变体包括与增加抗体的血清半衰期的酶(例如对于ADEPT)或多肽的抗体的N末端或C末端的融合。
b)糖基化变体
在某些实施例中，改变本文提供的抗体以增加或降低抗体糖基化的程度。可通过改变氨基酸序列，使得产生或缺失一个或多个糖基化位点，从而实现便利地添加或去除抗体的糖基化位点。
在抗体包含Fc区的情况下，可以改变与其连接的碳水化合物。由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含具有支链的双触角寡糖，所述双触角寡糖通常通过N-连接附接于Fc区的CH2结构域的Asn297。参见例如：Wright,A.和Morrison,S.L.，TIBTECH 15(1997)26-32。寡糖可包括各种碳水化合物，例如，甘露糖、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及附接于双触角寡糖结构的“主干”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些实施例中，可以对本文所报道的抗体中的寡糖进行修饰，以便产生具有某些改善的特性的抗体变体。
在一个实施例中，提供了抗体变体，其具有缺乏连接(直接或间接)至Fc区的岩藻糖的碳水化合物结构。例如，此类抗体中岩藻糖的含量可以为1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。岩藻糖的含量通过计算Asn297糖链中岩藻糖相对于通过MALDI-TOF质谱法(如WO 2008/077546中所述)测定的连接至Asn 297的所有糖结构(例如，复杂、杂交和高甘露糖结构)的总和的平均含量来确定。Asn297是指位于Fc区中约297位的天冬酰胺残基(Fc区残基的EU编号根据Kabat所述的方法进行)；但是，由于抗体中的序列变化微小，因此Asn297也可以位于位置297的上游或下游大约±3个氨基酸，即，在位置294与300之间。此类岩藻糖基化变体可具有改善的ADCC功能。参见例如US 2003/0157108和US 2004/0093621。有关“去岩藻糖化”或“岩藻糖缺陷型”抗体变体包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO2005/035586；WO 2005/035778；WO 2005/053742；WO 2002/031140；Okazaki,A.等人，J.Mol.Biol.336(2004)1239-1249；Yamane-Ohnuki,N.等人，Biotech.Bioeng.87(2004)614-622。能够产生去岩藻糖化抗体的细胞系的实例包括缺乏蛋白质岩藻糖基化的Lec13CHO细胞(Ripka,J.等人，Arch.Biochem.Biophys.249(1986)533-545；US 2003/0157108；和WO 2004/056312，尤其是在实例11中)，以及敲除基因的细胞系，诸如敲除α-1,6-岩藻糖基转移酶基因FUT8的CHO细胞(参见例如：Yamane-Ohnuki,N.等人，Biotech.Bioeng.87(2004)614-622；Kanda,Y.等人，Biotechnol.Bioeng.94(2006)680-688；和WO 2003/085107)。
进一步提供了包含两分型寡糖的抗体变体，例如，其中连接至抗体的Fc区的双角寡糖被GlcNAc两分。此类抗体变体可具有减少的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。此类抗体变体的实例描述于例如WO 2003/011878、US 6,602,684和US 2005/0123546中。还提供了在附接于Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。此类抗体变体可具有改善的CDC功能。此类抗体变体描述于例如WO 1997/30087、WO 1998/58964和WO 1999/22764中。
c)Fc区变体
在某些实施例中，一个或多个氨基酸修饰可引入本文提供的抗体的Fc区中，从而生成Fc区变体。Fc区变体可包含人Fc区序列(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)，其在一个或多个氨基酸位置上包含氨基酸修饰(例如取代)。
在某些实施例中，本文提供了一种抗体变体，其具有一些但不是全部效应子功能，这使其成为其中体内抗体的半衰期很重要但不某些效应子功能(诸如补体和ADCC)不需要或有害的应用中的期望的候选物。可实施体外和/或体内细胞毒性测定，以确认CDC和/或ADCC活性的减少/耗竭。例如，可实施Fc受体(FcR)结合测定以确保缺乏抗体FcγR结合(由此可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn结合能力。用于介导ADCC的原代细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞则表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达汇总于Ravetch,J.V.和Kinet,J.P.，Annu.Rev.Immunol.9(1991)457-492的第464页的表3中。用于评估目标分子的ADCC活性的体外测定的非限制性实例描述于以下文献中：US 5,500,362(参见例如：Hellstrom,I.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83(1986)7059-7063；和Hellstrom,I.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82(1985)1499-1502)；US 5,821,337(参见Bruggemann,M.等人，J.Exp.Med.166(1987)1351-1361)。另选地，可使用非放射性测定方法，参见例如，用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)；以及CytoTox
非放射性细胞毒性测定(Promega,Madison,WI)。用于此类测定的有用效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。另选地或附加地，可例如在诸如在Clynes,R.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(1998)652-656中公开的动物模型中体内评估目标分子的ADCC活性。还可以进行C1q结合测定，以确认抗体无法结合C1q并因此缺乏CDC活性。参见例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评定补体活化，可以执行CDC测定(参见例如：Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods 202(1996)163-171；Cragg,M.S.等人，Blood 101(2003)1045-1052；以及Cragg,M.S.和M.J.Glennie，Blood 103(2004)2738-2743)。FcRn结合和体内清除/半衰期确定也可以使用本领域已知的方法执行(参见例如Petkova,S.B.等人，Int.Immunol.18(2006):1759-1769)。
具有降低的效应子功能的抗体包括具有一个或多个Fc区残基238、265、269、270、297、327和329的取代的那些(US 6,737,056)。此类Fc突变体包括在第265、269、270、297和327位氨基酸的两个或多个处具有取代的Fc突变体，包括所谓的“DANA”Fc突变体，其残基265和297被取代为丙氨酸(US 7,332,581)。
描述了具有改善的或降低的与FcR的结合的某些抗体变体。(参见例如：US 6,737,056；WO 2004/056312；以及Shields,R.L.等人，J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604)
在某些实施例中，抗体变体包含具有改善ADCC的一个或多个氨基酸取代的Fc区，例如在Fc区的位置298、333和/或334处(残基根据EU编号)的取代。
在一些实施例中，改变Fc区以使得C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)发生改变(即，改善或减少)，例如US 6,194,551、WO 99/51642和Idusogie,E.E.等人，J.Immunol.164(2000)4178-4184中所述。
具有延长的半衰期和改善的与新生儿Fc受体(FcRn)结合、负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer，R.L.等人，J.Immunol.117(1976)587-593，以及Kim，J.K.等人，J.Immunol.24(1994)2429-2434)的抗体描述于US2005/0014934中。那些抗体包含这样的Fc区，其中具有改善Fc区与FcRn的结合的一个或多个取代。此类Fc变体包括在以下Fc区残基中的一处或多处具有取代的Fc变体：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如对Fc区残基434的取代(US 7,371,826)。
关于Fc区变体的其他实例，另见：Duncan,A.R.和Winter,G.，Nature 322(1988)738-740；US 5,648,260；US 5,624,821；以及WO 94/29351。
d)经半胱氨酸工程化改造的抗体变体
在某些实施例，可期望产生经半胱氨酸工程化改造的抗体，例如“thioMAbs”，其中抗体的一个或多个残基被半胱氨酸残基取代。在特定实施例中，取代的残基存在于抗体的可接近位点。通过用半胱氨酸取代那些残基，反应性硫醇基团由此定位于抗体的可接近位点，并且可用于将抗体与其他部分，诸如药物部分或连接基-药物部分缀合，以产生免疫缀合物，如本文进一步所述。在某些实施例中，可用半胱氨酸取代下列残基中的任何一个或多个：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；以及重链Fc区的S400(EU编号)。可如例如US 7,521,541中所述生成半胱氨酸工程化改造的抗体。
A.2示例性用途
根据本发明所述的抗兔CD-19抗体可用于需要特异性标记和检测兔B细胞的任何方法中。
各个方法用于
i)从B细胞群或其他细胞中分离出B细胞或B细胞克隆，从而分离的B细胞或B细胞克隆产生与靶标特异性结合的抗体，
ii)共培养单次沉积的B细胞，
iii)标记B细胞以进行计数和选择/沉积，以及
iv)产生抗体。
伴随这些方法，也涵盖并且公开了相应的用途。
一个方面是一种用于选择B细胞的方法，该方法包括以下步骤：
a)从兔的血液中获得B细胞，
b)将B细胞与根据本发明所述的抗体一起孵育，
c)选择根据本发明所述的抗体与之结合的一种或多种B细胞。
在一个实施例中，该方法进一步包括以下步骤中的一者或多者：
在步骤b)之后和步骤c)之前：将B细胞在共培养基中于37℃孵育1小时，
c)将根据本发明所述的抗体与之结合的一种或多种B细胞沉积(于单独的容器中)，
d)将沉积的细胞与饲养细胞在共培养基中共培养，
e)选择在步骤d)中增殖的B细胞，并由此选择B细胞。
如本文所报告的一个方面是一种用于选择B细胞的方法，该方法包括以下步骤：
a)将B细胞中的每一者或B细胞群(已通过FACS基于根据本发明所述的标记抗体与细胞的结合而沉积为单细胞)与作为饲养细胞的鼠EL-4B5细胞共培养，以及
b)选择在步骤a)中增殖并且分泌抗体的B细胞克隆。
如本文所报告的一个方面是一种产生与靶抗原结合的抗体的方法，该方法包括以下步骤：
a)共培养B细胞群中的一种或多种B细胞(已通过FACS基于根据本发明所述的标记抗体与细胞的结合沉积于单独的容器中)，任选地在存在鼠EL-4B5细胞作为饲养细胞以及存在IL-1β、TNFα、IL-10和选自IL-21、SAC、BAFF、IL-2、IL-4和IL-6中的一种或多种作为饲养混合物的条件下进行共培养，
b)选择产生与靶抗原特异性结合的抗体的B细胞克隆，
b1)利用逆转录酶PCR确定抗体的编码可变轻链结构域和可变重链结构域的核酸序列，
b2)用包含编码抗体可变轻链结构域和可变重链结构域的核酸序列的核酸转染细胞，
c)培养细胞(其包含编码由步骤b)中所选的B细胞克隆产生的抗体或其人源化变体的核酸)，以及从细胞或培养上清液回收抗体，并由此产生抗体。
如本文所报告的一个方面是一种用于共培养一种或多种兔B细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
-将大量兔B细胞与根据本发明所述的抗体一起孵育/用所述抗体标记大量兔B细胞中的单独B细胞，该抗体缀合至可检测标记物，
-选择/沉积根据本发明所述的抗体已结合至其表面/已标记为单独的B细胞(单次沉积的B细胞)或B细胞集合的一种或多种兔B细胞，以及
-将所述单次沉积的兔B细胞或所述兔B细胞集合与饲养细胞共培养，
-任选地，在共培养后，将获得的细胞混合物与根据本发明所述的抗体一起孵育，该抗体缀合至可检测标记物，以及选择/沉积/计数根据本发明所述的抗体已结合至其表面/已经过标记的兔B细胞。
本发明的一个方面是一种用于为诸如培养去除细胞混合物中的非B细胞的方法，该方法包括以下步骤：
a)将单次沉积的B细胞或B细胞集合与饲养细胞共培养，
b)将来自步骤a)中所获得的共培养的细胞与根据本发明所述的抗体一起孵育，以及
c)选择根据本发明所述的抗体与之结合的一种或多种细胞，并由此从细胞混合物中选择B细胞并且去除非B细胞。
根据本发明的一个方面是一种用于在单次沉积的B细胞与饲养细胞的共培养中确定B细胞数量的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将单次沉积的B细胞与饲养细胞共培养，
b)将来自步骤a)中所获得的共培养的细胞与根据本发明所述的抗体一起孵育，以及
c)通过对根据本发明所述的抗体与之结合的细胞的数量计数，确定培养中的B细胞数量。
在实施例的所有相应方面中的一个实施例中，共培养在合成饲养混合物的存在下进行，该合成饲养混合物包含IL-1β、TNFα、IL-10以及选自IL-21、SAC、BAFF、IL-2、IL-4和IL-6中的一种或多种。
在所有相应方面或实施例中的一个实施例中，饲养细胞为EL-4B5细胞。
在所有相应方面或实施例中的一个实施例中，饲养细胞的数量(在共培养开始时)少于每个B细胞对应于5×104个饲养细胞。
在所有相应方面或实施例中的一个实施例中，饲养细胞在共培养之前已经过辐照。在一个实施例中，辐照剂量为50Gy或更低。在一个实施例中，辐照剂量为9.5Gy或更低并且高于0Gy。
在所有相应方面或实施例中的一个实施例中，EL-4B5细胞数量少于每个B细胞对应于1×104个EL-4B5细胞(从而在该实施例中，辐照剂量为0Gy)。在一个实施例中，EL-4B5细胞数量少于每个B细胞对应于7.5×103个EL-4B5细胞。
在所有相应方面或实施例中的一个实施例中，共培养另外地在饲养混合物存在下进行。
在所有相应方面或实施例中的一个实施例中，饲养混合物(细胞因子混合物，CM)包含以下各项中的一种或多种：
i)白介素-1β和肿瘤坏死因子α，
ii)白介素-2(IL-2)和/或白介素-10(IL-10)，
iii)金黄色葡萄球菌菌株Cowan细胞(SAC)，
iv)白介素-21(IL-21)以及任选地白介素-2(IL-2)，
v)肿瘤坏死因子家族(BAFF)的B细胞活化因子，
vi)白介素-6(IL-6)，
vii)白介素-4(IL-4)，以及
viii)胸腺细胞培养上清液。
在所有相应方面或实施例中的一个实施例中，饲养混合物包含
至多约2ng/mL(鼠)IL-1β，
至多约2ng/mL(鼠)TNFα，
至多约50ng/mL(鼠)IL-2，
至多约10ng/mL(鼠)IL-10，以及
至多约10ng/mL(鼠)IL-6，
或它们的一部分。
在所有相应方面或实施例中的一个实施例中，饲养混合物包含
至多约2ng/mL的5.5-14×108IU/mg(鼠)IL-1β，
至多约2ng/mL的2.3-2.9×108U/mg(鼠)TNFα，
至多约50ng/mL的6-7(优选6.3)×106IU/mg(鼠)IL-2，
至多约10ng/mL的6-7.5×105IU/mg(鼠)IL-10，以及
至多约10ng/mL的9.2-16.1×108U/mg(鼠)IL-6，
或它们的一部分。
在所有相应方面或实施例中的一个实施例中，饲养混合物的分数在IL-1β、TNFα、IL-2、IL-10和IL-6的所述浓度中的每一个的1.0倍至0.015倍的范围内。
在所有相应方面或实施例中的一个实施例中，饲养混合物的分数选自由以下分数组成的组：IL-1β、TNFα、IL-2、IL-10和IL-6的所述浓度中的每一个的0.75倍、0.5倍、0.32倍、0.25倍、0.1倍、0.066倍、0.032倍、0.015倍、0.01倍、0.0075倍和0.0038倍。
在所有相应方面或实施例中的一个实施例中，饲养混合物进一步包含约0.01ng/mL至1.0ng/mL佛波醇十四酸酯乙酸酯(PMA)。在一个实施例中，饲养混合物进一步包含约0.01ng/mL至0.5ng/mL佛波醇十四酸酯乙酸酯。
在所有相应方面或实施例中的一个实施例中，一种或多种B细胞的(共)培养包括以下步骤：
-在饲养混合物存在下，将一种或多种B细胞与EL-4B5细胞共培养，
其中EL-4B5细胞在共培养之前经9.5Gy或更低的剂量辐照，
其中EL-4B5细胞的数量(在开始共培养时)少于每个B细胞对应于4×104个EL-4B5细胞，
其中饲养混合物包含
至多约2ng/mL的5.5-14×108IU/mg(鼠)IL-1β，
至多约2ng/mL的2.3-2.9×108U/mg(鼠)TNFα，
至多约50ng/mL的6-7(优选6.3)×106IU/mg(鼠)IL-2，
至多约10ng/mL的6-7.5×105IU/mg(鼠)IL-10，以及
至多约10ng/mL的9.2-16.1×108U/mg(鼠)IL-6，
或IL-1β、TNFα、IL-2、IL-10和IL-6的所述浓度中的每一个的0.75倍、0.5倍、0.32倍、0.25倍、0.1倍、0.066倍、0.032倍、0.015倍、0.01倍、0.0075倍或0.0038倍的一部分，
和
其中饲养混合物进一步包含约0.01ng/mL至1.0ng/mL佛波醇十四酸酯乙酸酯。
在所有相应方面或实施例中的一个实施例中，饲养混合物包含金黄色葡萄球菌菌株Cowan细胞(SAC)和胸腺细胞培养上清液。
在所有相应方面或实施例中的一个实施例中，该方法用于共培养一种B细胞。在一个优选实施例中，一种B细胞为单次沉积的B细胞。
在所有相应方面或实施例中的一个实施例中，共培养持续5天至10天。在一个优选实施例中，共培养持续约7天。
如本文所报告的一个方面是一种产生抗体的方法，该方法包括如本文所报道的共培养方法。
如本文所报道的所有方法和用途包括以下步骤：
-将每个单次沉积的B细胞或细胞集合与饲养细胞在共培养基中(单独)共培养，该共培养基中补充有饲养混合物。
共培养的结果是B细胞克隆，即作为单个B细胞的子代的B细胞群。
在所有相应方面或实施例中的一个实施例中，如本文所报道的方法在共培养步骤之前进一步包括以下步骤：
-将已经与根据本发明所述的标记抗体接触的B细胞群中的那些B细胞沉积于一个或多个单独的容器中，并由此使荧光团与B细胞结合和/或不结合。
在所有相应方面或实施例中的一个实施例中，如本文所报道的方法在共培养步骤之前进一步包括以下步骤：
-将已经与根据本发明所述的标记抗体接触的B细胞群中的那些B细胞沉积于一个或多个单独的容器中，并由此使荧光团与作为单个B细胞的B细胞结合和/或不结合。
在所有相应方面或实施例中的一个实施例中，如本文所报道的方法在共培养步骤之前进一步包括以下步骤：
-沉积已经与根据本发明所述的标记抗体以及1至4种另外的抗体(各自特异性结合至不同的B细胞表面抗原)接触的B细胞群中的B细胞，这些细胞作为单个细胞标记有1至5种荧光染料，由此每个抗体缀合至不同的荧光染料。
通过使B细胞群(依次或同时)与荧光标记的抗体接触，以完成标记。由此获得标记的B细胞制剂。荧光标记的抗体中的每一个与不同的B细胞表面标记物/靶标结合。
通过将标记的B细胞制剂引入流式细胞仪，然后将这些细胞沉积为已标记有1至3种荧光标记的单细胞，以完成沉积。由于可以将细胞与多种荧光染料(与细胞分选仪中用于选择细胞的荧光染料一样)一起孵育，因此可以选择存在特异性表面标记物的细胞，并且(任选地)同时选择不存在其他表面标记物的细胞。
完成标记和单细胞沉积以便通过耗尽那些不太可能产生具有预期特征的抗体的B细胞来降低B细胞群的复杂度。标记的抗体与B细胞表面上表现的特异性多肽结合，由此提供阳性选择标记。同样，还可以选择相比于与B细胞一起孵育的标记抗体的数量，仅标记有数量减少的荧光染料的细胞，诸如具有两种荧光标记之一的细胞(即，已经与两种荧光标记的抗体一起孵育，但其中仅一种与B细胞结合)。基于荧光标记抗体与B细胞群中单独B细胞的结合/不结合，可以使用微流体分选装置鉴定并且分离靶B细胞。在选择的同时，还可以确定标记的数量。
在所有相应方面或实施例中的一个实施例中，如本文所报道的方法进一步包含以下步骤：在单细胞沉积之前，将不含饲养细胞的B细胞群/在不存在饲养细胞的情况下在共培养基中一起孵育。在一个实施例中，在约37℃孵育。在一个实施例中，孵育约0.5小时至约2小时。在一个实施例中，孵育约1小时。在一个优选实施例中，在37℃孵育约1小时。
在所有相应方面或实施例中的一个实施例中，如本文所报道的方法进一步包括在沉积步骤之后和共培养步骤之前但添加EL-4B5饲养细胞之前对单细胞沉积的B细胞进行离心的步骤。不受理论的约束，认为由此增加了饲养细胞与B细胞之间的物理接触。在一个实施例中，离心约1min至约30min。在一个实施例中，离心约5min。在一个实施例中，在约100×g至约1,000×g下离心。在一个实施例中，在约300×g下离心。在一个优选实施例中，在约300×g下离心约5min。
在所有相应方面或实施例中的一个实施例中，用于选择/获得B细胞(克隆)的方法进一步包括以下步骤：
a)用(1至5种)荧光染料标记B细胞群中的B细胞(任选地，将B细胞群与特异性结合2至5种不同的预定B细胞表面标记物的2至5种荧光标记抗体一起孵育)，其中一种抗体(与之缀合)为根据本发明所述的抗体，
b)任选地，在共培养基中孵育标记的细胞，
c)将B细胞群中已标记有至少一种(1至5种)荧光染料(并且任选地不带有其他荧光染料标记)的B细胞作为单细胞沉积到EL-4B5饲养细胞上，这些饲养细胞经剂量为9.5Gy或更低的辐照，
d)任选地离心单次沉积的B细胞/饲养细胞混合物，
e)将每个单次沉积的B细胞与饲养细胞在共培养基中(单独)共培养，该共培养基中补充有饲养混合物。
f)选择在步骤e)中增殖并且分泌抗体的B细胞克隆。
在所有相应方面或实施例中的一个实施例中，用于产生特异性结合至靶标的抗体的方法进一步包括以下步骤：
a)用(1至5种)荧光染料标记B细胞群中的B细胞(任选地，将B细胞群与特异性结合2至5种不同的预定B细胞表面标记物的2至5种荧光标记抗体一起孵育)，其中一种抗体(与之缀合)为根据本发明所述的抗体，
b)任选地，在共培养基中孵育细胞，
c)将B细胞群中已标记有至少一种(1至5种)荧光染料(并且任选地不带有其他荧光染料标记)的B细胞作为单细胞沉积到EL-4B5饲养细胞上，这些饲养细胞经剂量为9.5Gy或更低的辐照，
d)任选地离心单次沉积的B细胞/饲养细胞混合物，
e)将每个单次沉积的B细胞与饲养细胞在共培养基中(单独)共培养，该共培养基中补充有饲养混合物。
f)选择步骤e)中分泌抗体的B细胞克隆，
g)i)从步骤g)中选择的B细胞克隆中获得编码分泌的抗体的可变结构域的一种或多种核酸，
ii)如果B细胞克隆并非人B细胞克隆，则使可变结构域人源化，并且提供相应的编码核酸，以及
iii)将一种或多种核酸引入包含编码恒定区的核酸序列的框架中的一种或多种表达载体中，
h)培养已经用步骤g)的一种或多种表达载体转染的细胞(任选地选自CHO和BHK细胞)，并且从细胞或培养上清液回收抗体，并由此产生抗体。
在所有相应方面或实施例中的一个实施例中，用于产生抗体的方法进一步包括以下步骤：
a)用(1至5种)荧光染料标记B细胞群中的B细胞(任选地，将B细胞群与特异性结合2至5种不同的预定B细胞表面标记物的2至5种荧光标记抗体一起孵育)，其中一种抗体(与之缀合)为根据本发明所述的抗体，
b)任选地，在共培养基中孵育细胞，
c)将B细胞群中已标记有至少一种(1至5种)荧光染料(并且任选地不带有其他荧光染料标记)的B细胞作为单细胞沉积到EL-4B5饲养细胞上，这些饲养细胞经剂量为9.5Gy或更低的辐照，
d)任选地离心单次沉积的B细胞/饲养细胞混合物，
e)将每个单次沉积的B细胞与饲养细胞在共培养基中(单独)共培养，该共培养基中补充有饲养混合物。
f)分别确定每种上清液中共培养的B细胞的培养基中分泌的抗体的结合特异性，
g)基于分泌的抗体的结合特性，选择步骤f)的B细胞克隆，
h)利用逆转录酶PCR和核苷酸测序从步骤g)中选择的B细胞克隆中获得分泌的抗体的可变结构域的一种或多种核酸(并由此获得编码核酸的单克隆抗体可变轻链结构域和可变重链结构域)，
i)如果B细胞非人B细胞，则使可变轻链结构域和可变重链结构域人源化并且提供编码人源化可变结构域的核酸，
j)将编码核酸的单克隆抗体可变轻链结构域和可变重链结构域引入用于表达(人或人源化)抗体的一种或多种表达载体中(在包含编码抗体恒定结合域的框架中)，
k)将一种或多种表达载体引入哺乳动物细胞(任选地选自CHO和BHK细胞)中，
l)培养细胞，并且从细胞或细胞培养上清液回收抗体，并由此产生抗体。
在所有相应方面或实施例中的一个实施例中，从B细胞克隆中获得编码分泌的抗体的可变结构域的一种或多种核酸包进一步括以下步骤：
-从抗体产生B细胞克隆中提取总RNA，
-对提取的polyA+mRNA进行单链cDNA合成/逆转录，
-用一组物种特异性引物执行PCR，
-任选地去除PCR引物/纯化PCR产物，
-任选地对PCR产物进行测序。
在所有相应方面或实施例中的一个实施例中，将编码核酸的单克隆抗体轻链可变结构域和/或重链可变结构域引入用于表达(人或人源化)抗体的表达载体的过程进一步包括以下步骤：
-可变轻链结构域和可变重链结构域的T4聚合酶孵育，
-表达载体的线性化和扩增，
-扩增的表达载体的T4聚合酶孵育，
-编码核酸的可变结构域的测序和无连接酶克隆到扩增的表达载体中，以及
-由载体转化的大肠杆菌细胞集合制备一种或多种载体。
在所有相应方面或实施例中的一个实施例中，该方法在紧邻标记步骤之前进一步包括以下步骤：
-将B细胞群与(靶)抗原一起孵育，该抗原可溶、带有荧光标记或固定于固体表面上，并且(仅)回收结合至(固定化)抗原的B细胞。
在所有相应方面或实施例中的一个实施例中，在免疫后至少4天获得来自兔的血液的B细胞群。在一个实施例中，在免疫后4天至最多13天获得来自兔的血液的B细胞群。
在所有相应方面或实施例中的一个实施例中，利用密度梯度离心从血液中获得B细胞群。
在所有相应方面或实施例中的一个实施例中，B细胞为成熟B细胞。在所有相应方面或实施例中的一个实施例中，将单细胞沉积(单独)于多孔板的孔中。
在所有相应方面或实施例中的一个实施例中，饲养混合物为天然胸腺细胞培养上清液(TSN)或限定的和/或合成的饲养混合物。在一个实施例中，从幼小动物的胸腺的胸腺细胞获得胸腺细胞培养上清液。
在所有相应方面或实施例中的一个实施例中，饲养混合物为限定的和/或合成的饲养混合物。在一个实施例中，限定的和/或合成的饲养混合物包含
i)白介素-1β和肿瘤坏死因子α，和/或
ii)白介素-2(IL-2)和/或白介素-10(IL-10)，和/或
iii)金黄色葡萄球菌菌株Cowan细胞(SAC)，和/或
iv)白介素-21(IL-21)以及任选地白介素-2(IL-2)，和/或
v)肿瘤坏死因子家族(BAFF)的B细胞活化因子，和/或
vi)白介素-6(IL-6)，和/或
vii)白介素-4(IL-4)。
在所有相应方面或实施例中的一个实施例中，饲养混合物包含IL-1β和TNF-α以及选自IL-10、IL-21、SAC、BAFF、IL-2、IL-4和IL-6中的一种或多种。
在所有相应方面或实施例中的一个实施例中，饲养混合物包含IL-1β、TNF-α、IL-10、SAC和IL-2。
在所有相应方面或实施例中的一个实施例中，B细胞群为兔B细胞群，并且饲养混合物为胸腺细胞培养上清液。
在所有相应方面或实施例中的一个实施例中，B细胞群为兔B细胞群，并且饲养混合物由IL-1β、TNF-α以及IL-2、IL-6和IL-10中的任意两种组成。
在所有相应方面或实施例中的一个实施例中，B细胞群为兔B细胞群，并且饲养混合物由IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-10组成。
在所有相应方面或实施例中的一个实施例中，B细胞群为兔B细胞群，并且饲养混合物包含IL-1β、TNF-α、IL-10、SAC和IL-2或IL-6。
在所有相应方面或实施例中的一个实施例中，B细胞群为兔B细胞群，并且饲养混合物包含IL-1β、TNF-α、IL-21以及IL-2、IL-10和IL-6中的至少一种。
在所有相应方面或实施例中的一个实施例中，抗体为单克隆抗体。
在所有相应方面或实施例中的一个实施例中，标记为B细胞表面IgG。
在所有相应方面或实施例中的一个优选实施例中，孵育采用根据本发明所述的荧光标记的抗体、荧光标记的抗IgG抗体和荧光标记的抗IgM抗体(标记细胞表面IgG和细胞表面IgM)，并且选择细胞表面CD19、细胞表面IgG呈阳性和细胞表面IgM呈阴性的细胞(得到CD19+IgG+IgM--B细胞的单细胞沉积)。
在所有相应方面或实施例中的一个实施例中，孵育采用根据本发明所述的荧光标记的抗体、荧光标记的抗IgG抗体和荧光标记的抗轻链抗体(标记细胞表面IgG和细胞表面抗体轻链)，并且选择细胞表面CD19、细胞表面IgG和细胞表面抗体轻链呈阳性的细胞(得到IgG+LC+-B细胞的单细胞沉积)。
在所有相应方面或实施例中的一个实施例中，在荧光标记的轻链抗体之外进行孵育(在另外两个标记之外，标记细胞表面抗体轻链)，并且选择细胞表面抗体轻链呈阳性的细胞(得到LC+-B细胞的单细胞沉积)。
在所有相应方面或实施例中的一个优选实施例中，孵育采用根据本发明所述的荧光标记的抗体、荧光标记的抗IgG抗体和荧光标记的抗IgM抗体(标记细胞表面CD19、细胞表面IgG和细胞表面IgM)，并且选择细胞表面CD19和IgG呈阳性和细胞表面IgM呈阴性的细胞(得到CD19+IgG+IgM--B细胞的单细胞沉积)，由此B细胞群已经与(靶)抗原一起孵育，该抗原固定于固体表面上，并且(仅)回收与固定化抗原结合的B细胞，并且与荧光标记的抗体一起孵育。
在所有相应方面或实施例中的一个实施例中，共培养在共培养基中进行，该共培养基包含补充有10％(v/v)FCS、1％(w/v)的200mM谷氨酰胺溶液(包含青霉素和链霉素)、2％(v/v)的100mM丙酮酸钠溶液和1％(v/v)的1M 2-(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪)-乙烷磺酸(HEPES)缓冲液的RPMI1640培养基。在一个实施例中，共培养基进一步包含0.05mMβ-巯基乙醇。
在进一步方法中，根据本发明所述的抗体或其兔CD19结合片段固定于固相上，并且用于捕获兔CD19阳性B细胞。固体表面可以是任何表面，包括多孔板的孔或珠粒(尤其是磁珠)。这些根据本发明所述的固定化抗体可以与根据本发明所述的标记抗体以类似的方式使用，即用于选择性结合兔CD19阳性B细胞。本领域的技术人员了解如何用基于珠粒的方法代替上述方法中基于FACS的步骤。
例如，本发明的一个方面是一种用于选择B细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
a)从兔的血液中获得B细胞，
b)将B细胞与固定至珠粒的根据本发明所述的抗体一起孵育，
c)洗涤珠粒以去除未结合的B细胞，
d)任选地从珠粒回收B细胞，并由此选择根据本发明所述的抗体与之结合的一种或多种B细胞。
在所有相应方面或实施例中的一个实施例中，珠粒为磁珠。在进一步实施例中，方法包括在步骤b)之后和步骤c)之前，将珠粒结合至磁体的步骤bc)。
在所有相应方面或实施例中的一个实施例中，该方法进一步包括以下步骤中的一者或多者：
d)任选地将B细胞在共培养基中于37℃孵育1小时，
e)将一种或多种B细胞或珠粒沉积于单独的容器中，
f)将沉积的细胞与饲养细胞在共培养基中共培养，
g)选择在步骤f)中增殖的B细胞，并由此选择B细胞。
如本文所报告的一个方面是一种用于选择B细胞的方法，该方法包括以下步骤：
a)共培养富集的B细胞群中的B细胞中的每一者与作为饲养细胞的鼠EL-4B5细胞，该细胞群通过结合至根据本发明所述的抗体而获自原始B细胞群，所述抗体自身结合至固体表面，以及
b)选择在步骤a)中增殖并且分泌抗体的B细胞克隆。
如本文所报告的一个方面是一种产生与靶抗原结合的抗体的方法，该方法包括以下步骤：
a)共培养富集的B细胞群中的B细胞中的一种或多种B细胞，该细胞群通过结合至根据本发明所述的抗体而获自原始B细胞群，所述抗体自身结合至固体表面，任选地在存在鼠EL-4B5细胞作为饲养细胞以及存在IL-1β、TNFα、IL-10和选自IL-21、SAC、BAFF、IL-2、IL-4和IL-6中的一种或多种作为饲养混合物的条件下进行共培养，
b)选择产生与靶抗原特异性结合的抗体的B细胞克隆，
b1)利用逆转录酶PCR确定抗体的编码可变轻链结构域和可变重链结构域的核酸序列，
b2)用包含编码抗体可变轻链结构域和可变重链结构域的核酸序列的核酸转染细胞，
c)培养细胞(其包含编码由步骤b)中所选的B细胞克隆产生的抗体或其人源化变体的核酸)，以及从细胞或培养上清液回收抗体，并由此产生抗体。
如本文所报告的一个方面是一种用于共培养一种或多种兔B细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
-将大量兔B细胞与根据本发明所述的抗体一起孵育/用所述抗体标记大量兔B细胞中的单独B细胞，该抗体结合至固体表面，
-选择/沉积根据本发明所述的抗体已结合至其表面的单独B细胞(单次沉积的B细胞)或B细胞集合的一种或多种兔B细胞，以及
-将所述单次沉积的兔B细胞或所述兔B细胞集合与饲养细胞共培养，
-任选地，在共培养后，将获得的细胞混合物与根据本发明所述的抗体一起孵育，该抗体缀合至可检测标记物，以及选择/沉积/计数根据本发明所述的抗体已结合至其表面/已经过标记的兔B细胞。
B.重组方法和组合物
可以使用重组方法和组合物来产生抗体，例如，如在US 4,816,567中所述。在一个实施例中，提供了编码本文所述的抗人CD19抗体的分离的核酸。此类核酸可编码构成抗体的VL的氨基酸序列和/或构成抗体的VH的氨基酸序列(例如抗体的轻链和/或重链)。在进一步实施例中，提供了包含此类核酸的一种或多种载体(例如表达载体)。在进一步实施例中，提供了包含此类核酸的宿主细胞。在一个此类实施例中，宿主细胞包含以下(例如已被用以下转化)：(1)载体，其包含编码包含抗体的VL的氨基酸序列以及包含抗体VH的氨基酸序列的核酸；或(2)第一载体，其包含编码包含抗体的VL的氨基酸序列的核酸；以及第二载体，其包含编码包含抗体的VH的氨基酸序列的核酸。在一个实施例中，宿主细胞是真核细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴细胞(例如Y0、NS0、Sp2/0细胞)。在一个实施例中，提供了一种制备抗兔CD19抗体的方法，其中该方法包括在适于表达抗体的条件下培养包含如上提供的编码抗体的核酸的宿主细胞，以及任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收该抗体。
为重组生产抗兔CD19抗体，将例如如上所述的编码抗体的核酸分离并且***至一个或多个载体中以用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可以使用常规程序来容易地对此类核酸进行分离和测序(例如，通过使用能够与编码抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。
用于克隆或表达编码抗体的载体的合适宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。例如，可以在细菌中产生抗体，特别是当不需要糖基化和Fc效应子功能时。关于在细菌中表达抗体片段和多肽，参见例如US 5,648,237、US 5,789,199和US 5,840,523。(还参见Charlton,K.A.,在：Methods in Molecular Biology，第248卷，Lo,B.K.C.主编，HumanaPress，Totowa，NJ(2003)，第245-254页中，描述的抗体片段在大肠杆菌中的表达。)抗体可在表达后在可溶性级分中从细菌细胞糊中分离，并且可以进一步纯化。
除了原核生物外，诸如丝状真菌或酵母等真核微生物也是用于编码抗体的载体的合适克隆或表达宿主，所述真核微生物包括这样的真菌和酵母菌株，其糖基化途径已经“人源化”，从而导致产生具有部分或完全人糖基化模式的抗体。参见Gerngross,T.U.,Nat.Biotech.22(2004)1409-1414；以及Li,H.等人，Nat.Biotech.24(2006)210-215。
用于表达糖基化抗体的合适宿主细胞也来源于多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物细胞和昆虫细胞。已经鉴定出了许多可以与昆虫细胞一起使用的杆状病毒株，特别是用于转染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。
植物细胞培养物也可用作宿主。参见例如US 5,959,177、US 6,040,498、US 6,420,548、US 7,125,978和US 6,417,429(描述了用于在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
脊椎动物细胞也可用作宿主。例如，适于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他示例是由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾细胞系(如在例如Graham,F.L.等人，J.Gen Virol.36(1977)59-74中所述的293或293细胞)；小仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞尔托利氏细胞(例如在Mather,J.P.,Biol.Reprod.23(1980)243-252中描述的TM4细胞)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人***细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562)；TRI细胞，如例如在Mather,J.P.等人，AnnalsN.Y.Acad.Sci.383(1982)44-68中所述；MRC 5细胞；以及FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub,G.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77(1980)4216-4220)；以及骨髓瘤细胞系，诸如Y0、NS0和Sp2/0。关于适用于抗体产生的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如Yazaki,P.和Wu,A.M.,Methods in Molecular Biology，第248卷，Lo,B.K.C.(编辑)，Humana Press,Totowa,NJ(2004)，第255-268页。
C.用于诊断和检测的方法和组合物
在某些实施例中，本文提供的抗兔CD19抗体中的任一种可用于检测生物样品中兔CD19呈递细胞的存在。如本文所用的术语“检测”涵盖定量或定性检测。在某些实施例中，生物样品包括细胞或组织，诸如血液、血清或血浆。
在一个实施例中，提供了用于诊断或检测方法中的抗兔CD19抗体。这些方面如上文所概述。
在某些实施例中，提供了标记的抗兔CD19抗体。标记包括但不限于直接检测的标记或部分(诸如荧光标记、发色标记、电子致密标记、化学发光标记，以及放射性标记)，以及间接(例如通过酶促反应或分子相互作用)检测的部分(诸如酶或配体)。示例性标记包括但不限于放射性同位素32P、14C、125I、3H和131I；荧光团，诸如稀土螯合物或荧光素(fluorescein)及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹酰、伞形酮；萤光素酶(luciferase)，例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶(US 4,737,456)；萤光素(luciferin)；2,3-二氢二氮杂萘二酮(2,3-dihydrophthalazinedione)；辣根过氧化物酶(HRP)；碱性磷酸酶；β-半乳糖苷酶；葡糖淀粉酶；溶菌酶；糖氧化酶，例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶；杂环氧化酶，诸如尿酸氧化酶和黄嘌呤氧化酶；与采用过氧化氢来氧化染料前体的酶(诸如HRP、乳过氧化物酶，或微过氧化物酶)偶联；生物素/抗生物素蛋白；纺丝标记；噬菌体标记；稳定自由基等。
序列表说明
SEQ ID NO:01 不含信号肽的兔CD19氨基酸序列
SEQ ID NO:02 包含信号肽的兔CD19氨基酸序列
SEQ ID NO:03 兔CD19 cDNA
SEQ ID NO:04 仓鼠CD19氨基酸序列
SEQ ID NO:05 小鼠CD19氨基酸序列
SEQ ID NO:06 大鼠CD19氨基酸序列
SEQ ID NO:07 松鼠CD19氨基酸序列
SEQ ID NO:08 狨猴CD19氨基酸序列
SEQ ID NO:09 恒河猴CD19氨基酸序列
SEQ ID NO:10 人CD19氨基酸序列
SEQ ID NO:11 猫CD19氨基酸序列
SEQ ID NO:12 裸鼹鼠CD19氨基酸序列
SEQ ID NO:13 豚鼠CD19氨基酸序列
SEQ ID NO:14 猪CD19氨基酸序列
SEQ ID NO:15 犬CD19氨基酸序列
SEQ ID NO:16 间隙共有氨基酸序列
SEQ ID NO:17 引物
SEQ ID NO:18 引物
SEQ ID NO:19 引物
SEQ ID NO:20 引物
SEQ ID NO:21 引物
SEQ ID NO:22 引物
SEQ ID NO:23 引物
SEQ ID NO:24 抗体1H2轻链氨基酸序列
SEQ ID NO:25 抗体1H2轻链前导肽氨基酸序列
SEQ ID NO:26 抗体1H2轻链可变结构域氨基酸序列
SEQ ID NO:27 抗体1H2轻链恒定区氨基酸序列
SEQ ID NO:28 抗体1H2重链氨基酸序列
SEQ ID NO:29 抗体1H2重链前导肽氨基酸序列
SEQ ID NO:30 抗体1H2重链可变结构域氨基酸序列
SEQ ID NO:31 抗体1H2重链恒定区氨基酸序列
SEQ ID NO:32 抗体1H2重链HVR-1变体1
SEQ ID NO:33 抗体1H2重链HVR-1变体2
SEQ ID NO:34 抗体1H2重链HVR-1变体3
SEQ ID NO:35 抗体1H2重链HVR-2变体1
SEQ ID NO:36 抗体1H2重链HVR-2变体2
SEQ ID NO:37 抗体1H2重链HVR-3
SEQ ID NO:38 抗体1H2轻链HVR-1
SEQ ID NO:39 抗体1H2轻链HVR-2
SEQ ID NO:40 抗体1H2轻链HVR-3
SEQ ID NO:41 人κ轻链恒定区氨基酸序列
SEQ ID NO:42 人λ轻链恒定区氨基酸序列
SEQ ID NO:43 人IgG1重链恒定区氨基酸序列；白人同种异型
SEQ ID NO:44 人IgG1重链恒定区氨基酸序列；非裔美国人同种异型
SEQ ID NO:45 人IgG1重链恒定区氨基酸序列；LALA变体
SEQ ID NO:46 人IgG1重链恒定区氨基酸序列；LALAPG变体
SEQ ID NO:47 人IgG4重链恒定区氨基酸序列
SEQ ID NO:48 人IgG4重链恒定区氨基酸序列；SPLE变体
SEQ ID NO:49 人IgG4重链恒定区氨基酸序列；SPLEPG变体
SEQ ID NO:50 小鼠κ轻链恒定区氨基酸序列
SEQ ID NO:51 人λ轻链恒定区氨基酸序列
SEQ ID NO:52 GPI锚着点氨基酸序列
SEQ ID NO:53 3'UTR引物
SEQ ID NO:54 5'UTR引物
实例
以下是本发明的方法和组合物的实例。应当理解，在给出以上提供的一般描述的情况下，可以实践各种其他实施例。
尽管为了清楚理解的目的先前已经通过说明和实例相当详细地描述了发明，但是所述说明和实例不应解释为限制本发明的范围。本文引用的所有专利和科学文献的公开内容的全部内容以引用方式明确地并入。
实例1
小鼠抗兔CD19抗体(杂交瘤)的免疫和生成
利用获自Charles River Laboratories International,Inc.的NMRI小鼠进行免疫。根据附录A“动物的住宿和照料指南”将动物圈养在AAALACi认可的动物设施中。所有动物免疫接种方案和实验均已获得上巴伐利亚行政区政府批准(许可号AZ.55.2-1-54-2531-83-13)，并且根据德国动物福利法和欧洲议会和理事会指令2010/63进行。
6-8周龄的NMRI小鼠(n＝5)在三个月的过程中接受基于质粒DNA的免疫接种。为此目的，使用编码兔CD19作为单链分子的质粒DNA。在收获用于杂交瘤融合的脾脏之前，提供了用同一载体瞬时转染的NIH/3T3细胞(ATCC CRL-1658)增强以表达兔CD19。
在首次免疫接种时，将动物用异氟烷麻醉，并且将无菌H2O中的100μg质粒DNA施加于靠近动物尾巴的剃毛部位，以实施皮内(i.d.)免疫接种。在i.d.施用后，在ECM 830电穿孔***(BTX Harvard Apparatus)上使用以下参数对斑点进行电沉积：在1000V/cm下执行两次，每次0.1ms，通过125ms的间隔分开；然后在287.5V/cm下执行四次，每次10ms，也通过125ms的间隔分开。在第14、28、49、63和77天以类似的方式加强免疫。在最后一次免疫接种后六周，分别经静脉(i.v.)和腹膜内(i.p.)注射0.9×10E6 NIH/3T3细胞瞬时转染以表达兔CD19，并且溶于无菌PBS中。72h后，无菌收获脾脏并且准备生成杂交瘤。
根据标准方案进行免疫小鼠脾细胞的融合：在包含5％(v/v)FCS和8-氮鸟苷的RPMI 1640培养基中培养骨髓瘤细胞系P3X63-Ag8653至细胞密度为3×105个细胞/mL。然后收获细胞(1,000rpm,10min,37℃)，并且用50mL RPMI(37℃)洗涤。在相同条件下进行第二次离心步骤后，将细胞重悬于50mL RPMI(37℃)中，然后储存于冰上。利用从经过免疫接种的小鼠中提取的无菌脾脏，通过细胞滤网(70μm)分开单细胞。将单细胞培养物转移至15mL试管中，在冰上孵育10min。孵育后，将细胞悬浮液上清液转移至50mL试管中，收获(250×g,10min,4℃)，并且重悬于15mL RPMI培养基中。
检测细胞密度后，将脾细胞和骨髓瘤细胞以5:1的比例混合并且离心(250×g,10min,37℃)。在轻轻摇动下，向每108个脾细胞中加入1mL聚乙二醇(PEG)，并且将样品在37℃和6％CO2气氛孵育至少30min。孵育后，以250×g(37℃)进行10min来收获细胞，并且重悬于20mL RPMI培养基中。最终，将整个融合样品转移至微量滴定板(MTP，200μL/孔)中，孵育(37℃,6％CO2)，并且用于进一步分析中。
实例2
抗CD19抗体的杂交瘤细胞筛选和细胞生物学功能评估
用于筛选针对兔CD19的抗体的高通量FACS分析
杂交瘤细胞上清液通过小鼠IgG ELISA进行表征。使用标准方案，通过ELISA对包含IgG的培养上清液进行初步筛选：将链霉亲和素包被的384孔MTP与生物素化多克隆抗鼠Fcg区抗体(pAK<MFcg>S-IgH-(IS)-Bi(XOSu))一起孵育。施加50μL/孔的上清液(按1:600稀释)，并且在室温下孵育60min。然后，将样品用0.9％(w/v)NaCl、0.05％(v/v)吐温20、0.2％(v/v)BronidoxL洗涤3次。在IgG的检测中，将样品与过氧化物酶缀合的AffiniPure山羊抗小鼠F(ab')2片段(按1:15,000稀释，50μL/孔)一起孵育，并且在室温孵育60min。按照如上所述的方法进行洗涤后，加入ABTS溶液(1mg/mL，50μL/孔)并且进一步孵育20min。用X ReadPlus读板器(Tecan)在405/492nm的波长下读段。仅IgG阳性杂交瘤上清液经过抗原特异性高通量FACS分析。
应用FACS以筛选杂交瘤并且鉴定那些分泌针对兔CD19的抗体的杂交瘤。所有产生IgG的杂交瘤均通过对经兔IgM结合抗体双重染色的兔外周血单核细胞(PBMC)的FACS分析进行筛选，以鉴定B细胞。
将新鲜分离的兔(PBMC)与FITC标记的抗兔IgM抗体(Southern Biotech)和IgG阳性杂交瘤上清液在冰上一起孵育。孵育45min后，将PBMC用冰冷的PBS洗涤一次，然后重悬于结合杂交瘤上清液的鼠IgG的PE标记的抗小鼠IgG抗体(Invitrogen)中。在冰上继续孵育45min后，将细胞用冰冷的PBS再洗涤一次。最后，将PBMC重悬于冰冷的PBS中并立即进行FACS分析。在FACS分析之前添加浓度为2μg/mL DAPI-HCl以区分死细胞和活细胞。利用配备计算机和FACSDiva软件的Becton Dickinson FACS Canto II设备(BD Biosciences)进行分析。
鉴定与兔IgM阳性B细胞结合的杂交瘤上清液后，通过经rbCD19表达质粒转染的CHO或HEK293细胞的FACS分析确认兔CD19特异性。利用经兔CD19转染的细胞作为阳性细胞，并且利用未转染的CHO或HEK293细胞作为阴性对照。如实例7中所述进行兔CD19染色。
实例3
CD19 结合抗体的表达
通过基因合成生成编码抗体可变结构域的序列。
所有序列均通过测序进行验证。将所有序列克隆到载体中，从而选择并且在大肠杆菌中繁殖(例如，来自载体pUC18的复制起点，氨苄青霉素抗性β-内酰胺酶)。这些载体还包含能够在哺乳动物细胞中表达的盒(例如，爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)的复制起点oriP、来自人巨细胞病毒(HCMV)的即刻早期增强子和启动子以及聚腺苷酸化序列)。
所有编码抗体轻链和重链的基因片段之前均有编码信号肽的DNA序列(例如MGWSCIILFLVATATGVHS；SEQ ID NO:55或MPPPLLLAFL LFLTLGRVRP；SEQ ID NO:56)。这些蛋白质由悬浮液中的瞬时转染人胚胎肾HEK 293细胞表达。在37℃和8％CO2培养这些细胞。转染当天，将细胞以1-2×106个活细胞/mL的密度接种到新鲜培养基中。对等摩尔量的重链和轻链质粒DNA进行共转染。在转染后7天，收集细胞培养上清液，离心(在4℃以14,000×g离心45min)，然后通过0.22μm过滤器过滤。可以将这些上清液冷冻，并且在纯化前储存于-20℃。
实例4
CD19 结合抗体的纯化
将无细胞的杂交瘤上清液加载到经过预平衡的(磷酸盐缓冲液，PBS)蛋白A亲和柱(MabSelectTMSuRe,GE Healthcare,8×100mm)上，接触时间为5分钟。洗涤(PBS，5倍柱体积)后，用25mM柠檬酸/NaOH(pH 3.0)洗脱抗体。用1M Tris将洗脱液的pH调节至5.5，并且在4℃孵育过夜。然后进行最终过滤(0.45μm)：
实例5
CD19 ECD表达细胞的供给以及抗体与这些细胞的结合
用编码与人PSCA GPI锚着点序列(DTDLCNASGA HALQPAAAIL ALLPALGLLL WGPGQL；SEQ ID NO:52)融合的兔CD19(SEQ ID NO:01)胞外域(ECD)的质粒转染细胞，以进行细胞外呈递。为转染NIH/3T3细胞以进行免疫，将1×10E7个细胞接种到三个T175烧瓶中。随后，使用Lipofectamine对溶液中的细胞进行反向转染。48小时后，使用FITC抗FLAG抗体(abcam)和FACS确定40％阳性细胞的转染效率(图1C)。为通过FACS分析确认CD19特异性，将CHO或HEK293细胞用rbCD19转染。使用Lipofectamine转染3×10E5个HEK293细胞和1×10E5个CHO细胞。使用FITC抗FLAG抗体(abcam)，通过FACS确认了48小时后的表达。
实例6
抗兔CD19抗体缀合至可检测标记物
将磷酸盐缓冲液(pH 8.5)中的抗兔CD19抗体调节至蛋白质浓度为约5mg/mL。将D-生物素酰基-氨基己酸-N-羟基琥珀酰亚胺溶于DMSO中，并且以1:5的摩尔比加入抗体溶液中。60min后，加入L-赖氨酸以终止反应，并且用150mM NaCl(pH 7.5)针对50mM磷酸钾缓冲液进行透析，以除去多余的标记试剂。
实例7
用标记的抗兔CD19抗体标记B细胞(包括索引分选方法)
在暗处(4℃)用DPBS中补充有正常小鼠血清(1:20,Southern Biotech)的抗IgGFITC(1:200,AbD Serotec)、抗IgM PE(1:200BD Pharmingen)和抗CD19 A647(1:200,Roche)抗体对B细胞染色30min。随后，洗涤细胞并且将其重悬于冰冷的DPBS中。在配备计算机和FACSDiva软件的Becton Dickinson FACSAria(BD Biosciences)上，在单细胞分选前不久，通过加入浓度为0.5μg/mL的碘化丙啶(PI)(BD Pharmingen)来实现活细胞/死细胞区分。将单个IgG+和IgG+IgM+细胞分选到96孔板中。应用FACSAria的索引分选工具以保存每个分选的孔的CD19表达。如实例9中所述，对细胞进行培养。培养7天后，利用上清液，通过ELISA确定产生IgG的克隆和抗原特异性克隆的数量。在FlowJo中开发了一款插件，该插件将ELISA数据与FACS索引分选数据相结合。该插件将来自ELISA的IgG阳性和抗原特异性孔加入来自抗兔IgG、抗兔IgM和抗兔CD19染色的荧光数据中，因此可以在FlowJo中观察到产生IgG的克隆和抗原特异性克隆。结果表明，所有产生IgG的克隆和所有抗原特异性克隆均为IgG和CD19双阳性。此外，通过检查分选的双阳性细胞的百分比，分选效率(更具体的分选细胞)可提高约14-20％。
实例8
B细胞培养之前的免疫荧光染色和流式细胞分析
利用抗IgG FITC(AbD Serotec)和抗huCk PE(BD Bioscience)抗体进行单细胞筛选。对于表面染色，在暗处于4℃，将来自耗尽和富集步骤的细胞与在PBS中的抗IgG FITC和抗huCk PE抗体一起孵育45min。在染色之后，将PBMC用冰冷的PBS洗涤两次。最后，将PBMC重悬于冰冷的PBS中并立即进行FACS分析。在FACS分析之前加入浓度为0.5μg/mL的碘化丙啶(BD Pharmingen)以区分死细胞和活细胞。利用配备计算机和FACSDiva软件的BectonDickinson FACSAria(BD Biosciences)进行单细胞分选。
实例
9
B 细胞培养
利用Seeber等人(2014)所述的方法进行兔B细胞的培养。简言之，在96孔板中，将经过单细胞分选的兔B细胞与200μL/孔的包含Pansorbin细胞(1:100000)(Calbiochem)和合成细胞因子混合物的EL-4B5培养基一起孵育，如下表所述：
| 化合物 | 最终浓度 |
| mIL-1b | 0.063ng/mL |
| mTNF-α | 0.063ng/mL |
| mIL-2 | 1.58ng/mL |
| mIL-6 | 0.32ng/mL |
| mIL-10 | 0.32ng/mL |
此外，利用0.35ng/μL佛波醇十四酸酯乙酸酯和经γ射线辐照(4Gy)的鼠EL-4B5胸腺瘤细胞(2×10E5个细胞/孔)，并且将细胞置于培养箱中在37℃培养7天。移取B细胞培养的上清液进行筛选，并且将剩余细胞立即在100μL RLT缓冲液(Qiagen)中裂解，并且在-80℃冷冻。
实例10
血液和脾脏中CD19阳性B细胞的确定
对血液进行密度梯度离心以分离PBMC。根据制造商的说明，将脾脏捣碎并且离心，然后用正常红细胞裂解缓冲液裂解红细胞。将来自血液或脾脏的细胞以每孔最多6×106个PBMC的浓度接种于无菌6孔板上的1mL培养基中。在培养箱中于37℃孵育1h期间，细胞培养板上的非特异性粘附导致巨噬细胞耗尽。如实例7所述，对分离的PBMC进行染色和洗涤。在配备计算机和FACSDiva软件的Becton Dickinson FACSCanto(BD Biosciences)上分析细胞群之前不久，利用浓度为0.1μg/mL的DAPI(Biomol)实现活细胞/死细胞区分。利用FlowJov10.0.7对血液和脾脏中的CD19阳性B细胞进行分析。
实例11
共培养后B细胞的计数
如实例7和9所述，对B细胞进行分选，并且与饲养细胞共培养。培养7天后，将96孔培养板以300×g离心5min，除去培养基，将沉淀重悬于包含抗CD19 A647抗体(1:400,Roche)并且补充有正常小鼠血清(1:20,Southern Biotech)的冰冷DPBS中，在暗处(4℃)孵育30min。随后，洗涤细胞并且将其重悬于限定体积的冰冷的DPBS中。在配备计算机和FACSDiva软件的Becton Dickinson FACSCanto(BD Biosciences)上分析细胞群之前不久，加入浓度为0.1μg/mL的DAPI(Biomol)以实现活细胞/死细胞区分。在FACSCanto上设置限定的分析体积并且考虑总样品体积对于精确计算每孔B细胞总数非常重要。使用FlowJov10.0.7进行分析，并且在考虑到总样品体积的情况下使用CD19+细胞数计算B细胞的细胞计数。利用这种方法，由于例如细胞表面IgG在培养过程中减少，因此在内部B细胞克隆方法之后，它首次能够对B细胞克隆中的B细胞进行计数。
实例12
使用根据本发明所述的抗体富集CD19阳性B细胞
如实例10中所述，从血液中分离出经免疫的兔的PBMC，并且如实例8和9所述进行染色和培养。将一半细胞按以下方式处理：在4℃，将生物素化抗兔CD19与PBMC以1:500的稀释比一起孵育15min。将PBMC用冷MACS缓冲液(Miltenyi)洗涤，然后按照制造商说明与链霉亲和素MACS珠(Miltenyi)一起孵育。将细胞用MACS缓冲液洗涤，然后根据制造商的说明使用Miltenyi LS柱进行纯化。在4℃，将纯化的细胞与荧光标记的抗原和抗兔IgG FITC抗体(Southern Biotech)一起孵育15min，随后进行洗涤。首先在4℃将另一半细胞与生物素化抗原(1:10000)一起孵育15min。洗涤细胞，然后根据制造商说明将其与链霉亲和素MACS珠一起孵育。洗涤细胞，并且使其通过LS柱。随后将细胞与荧光标记的抗兔CD19和抗兔IgG抗体一起孵育。最后，将PBMC重悬于冰冷的PBS中，并且立即在BD Aria III上进行分选。根据制造商说明加入7-AAD(BD Pharmingen)以区分死细胞和活细胞。根据尺寸、抗原阳性和IgG阳性对第一半部分细胞进行门控。根据尺寸、CD19阳性和IgG阳性对第二半部分细胞进行门控。如实例9所述，对细胞进行单细胞分选和培养。孵育一周后，使用ELISA确定IgG阳性克隆、特异性克隆和交叉反应性克隆的数量。用抗兔CD19富集后，导致细胞活力升高(图7)、产生IgG的克隆数量增加并且抗原特异性克隆的数量增加。此外，减少了交叉反应性克隆的数量。
Claims (15)
1.一种与兔CD19结合的抗体，所述抗体包含：
(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:34的氨基酸序列，
(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36的氨基酸序列，
(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列，
(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列，
(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列，以及
(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体为单克隆抗体。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的抗体，其中所述抗体为嵌合抗体或人源化抗体。
4.根据权利要求1至2中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含SEQ ID NO:30的可变重链结构域和SEQ ID NO:26的可变轻链结构域。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的抗体，其中所述抗体为全长抗体或抗体片段。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的抗体，其中所述抗体缀合至可检测标记物。
7.根据权利要求6所述的抗体，其中所述可检测标记物为荧光染料。
8.一种用于选择兔B细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将大量兔B细胞与根据权利要求1至7中任一项所述的抗体一起孵育，
b)选择根据权利要求1至7中任一项所述的抗体与之结合的一种或多种B细胞，并由此选择兔B细胞。
9.根据权利要求8所述的方法，其进一步包括以下步骤中的一者或多者：
在步骤b)之后和步骤c)之前：将所述兔B细胞在共培养基中于37℃孵育1小时，和/或
c)单次沉积根据权利要求1至7中任一项所述的抗体与之结合的一种或多种兔B细胞，和/或
d)将单次沉积的兔B细胞与饲养细胞在共培养基中共培养，和/或
e)选择在步骤d)中增殖的兔B细胞，并由此选择兔B细胞。
10.一种用于为培养去除非B细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将兔B细胞与饲养细胞共培养，所述兔B细胞已作为单细胞或作为细胞集合沉积，
b)将来自步骤a)中所获得的共培养的细胞与根据权利要求1至7中任一项所述的抗体一起孵育，以及
c)选择根据权利要求1至7中任一项所述的抗体与之结合的一种或多种兔B细胞，并由此去除非B细胞。
11.一种用于在单次沉积的B细胞与饲养细胞的共培养中确定B细胞数量的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将单次沉积的兔B细胞与饲养细胞共培养，
b)将来自步骤a)中所获得的共培养的细胞与根据权利要求1至7中任一项所述的抗体一起孵育，以及
c)通过对根据权利要求1至7中任一项所述的抗体与之结合的细胞的数量计数，确定所述培养中的B细胞数量。
12.一种用于共培养一种或多种兔B细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
将大量兔B细胞与根据权利要求1至7中任一项所述的抗体一起孵育/用根据权利要求1至7中任一项所述的抗体标记大量兔B细胞中的单独B细胞，
选择/沉积根据权利要求1至7中任一项所述的抗体已结合至其表面/已标记为单独B细胞(单次沉积的B细胞)或B细胞集合的一种或多种兔B细胞，以及
将所述单次沉积的兔B细胞或所述兔B细胞集合与饲养细胞共培养。
13.根据权利要求9至12中任一项所述的方法，其中所述共培养在合成饲养混合物的存在下进行，所述合成饲养混合物包含IL-1β、TNFα、IL-10以及选自IL-21、SAC、BAFF、IL-2、IL-4和IL-6中的一种或多种。
14.一种用于选择B细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
a)从兔的血液中获得B细胞，
b)将所述B细胞与根据权利要求1至5中任一项所述的抗体一起孵育，所述抗体结合至珠粒，
c)去除未结合的B细胞，
d)从所述珠粒回收结合的B细胞，并由此选择一种或多种B细胞。
15.根据权利要求14所述的方法，其进一步包括以下步骤：
e)任选地将所述回收的B细胞在共培养基中于37℃孵育1小时，
f)将一种或多种回收的B细胞沉积于单独的容器中，
g)将沉积的细胞与饲养细胞在共培养基中共培养，
h)选择在步骤g)中增殖的B细胞，并由此选择B细胞。
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