CN102131828B

CN102131828B - 针对人程序性死亡受体pd-1的抗体

Info

Publication number: CN102131828B
Application number: CN200880103544.3A
Authority: CN
Inventors: G·J·卡文; H·范伊宁纳姆; G·J·杜洛斯
Original assignee: MSD Oss BV
Current assignee: Organic agricultural biological sciences Holland Co.,Ltd.; Merck Sharp and Dohme BV
Priority date: 2007-06-18
Filing date: 2008-06-13
Publication date: 2015-06-17
Anticipated expiration: 2028-06-13
Also published as: BR122017025062B1; EP2170959B1; NZ582150A; PT2170959E; ME02093B; CY1114849T1; US20160304606A9; US9834605B2; US20210403560A1; KR101562580B1; NL300788I1; US8900587B2; KR101586617B1; PL2170959T3; DK2170959T3; LTC2170959I2; JP5191537B2; US20130108651A1; CN102131828A; US11117961B2

Abstract

本发明公开了阻断人程序性死亡受体(hPD-1)与其配体(hPD-L1或hPD-L2)及其可变区序列结合的抗体。还公开了通过PD-1途径增加免疫应答活性(或降低下调)的方法。

Description

针对人程序性死亡受体PD-1的抗体

发明背景

程序性死亡受体1(PD-1)是首先在激活的T细胞和B细胞上表达的免疫抑制性受体。该受体与其配体的相互作用在体外和体内一直显示减弱的T细胞应答。阻断PD-1与其配体之一PD-L1间的相互作用显示提高肿瘤特异性CD8⁺T细胞的免疫性，因此，可有助于免疫***清除肿瘤细胞。

PD-1(由基因Pdcd1编码)为与CD28和CTLA-4有关的免疫球蛋白超家族成员。业已显示PD-1当与其配体(PD-L1和/或PD-L2)结合时会负调节抗原受体信号转导。业已弄清鼠PD-1结构以及小鼠PD-1与人PD-L1的共结晶结构(Zhang，X.等，Immunity 20：337-347(2004)；Lin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105：3011-6(2008))。PD-1及类似的家族成员为I型跨膜糖蛋白，其含有负责配体结合的Ig可变型(V-型)结构域和负责结合信号转导分子的胞质尾区。PD-1胞质尾区含有两个基于酪氨酸的信号转导模体ITIM(免疫受体酪氨酸抑制作用模体)和ITSM(免疫受体酪氨酸转换作用模体)。

在T细胞刺激后，PD-1将酪氨酸磷脂酶SHP-2募集到胞质尾区内的ITSM模体，这导致效应分子的去磷酸化作用，效应分子例如有CD3ζ、PKCθ和ZAP70，这些分子参与CD3T细胞信号转导级联。PD-1减量调节T细胞应答的机理与CTLA-4的相似，但又有所不同，因为这两种分子都调控重叠的一系列信号转导蛋白(Parry等，Mol.Cell Biol.25：9543-9553.)。Bennett及合作者表明，仅当激活和抑制两种信号都在同一表面时，PD-1介导的对T细胞信号转导的抑制作用才会有效，这表明PD-1信号转导机制由时间及空间决定(Bennett F.等，J Immunol.170：711-8(2003))。

研究显示PD-1在激活的淋巴细胞(外周CD4⁺和CD8⁺T细胞、B细胞和单核细胞)上表达，并且还显示在胸腺发育期间在CD4^-CD8^-(双阴性)T细胞以及NK-T细胞上表达。

PD-1配体(PD-L1和PD-L2)为组成型表达，或在多种细胞类型中可被诱导，这些细胞类型包括非造血组织以及各种肿瘤类型。PD-L1在B细胞、T细胞、髓样细胞和树突状细胞(DC)上表达，但也在外周细胞(例如微血管内皮细胞)和非淋巴器官(如心脏、肺等)中表达。与此相反，PD-L2仅在巨噬细胞和DC中存在。PD-1配体的表达模式提示了PD-1在维持外周耐受中的作用，并且用于调节在外周中的自我活化的T细胞和B细胞应答。两种配体都为含有胞外区域中的IgV-样和IgC-样结构域的I型跨膜受体。两种配体都含有含未知信号转导模体的短胞质区。

迄今有大量的研究显示PD-1与其配体的相互作用在体外及体内导致抑制淋巴细胞增殖。业已显示破坏PD-1/PD-L1相互作用可增加T细胞增殖和细胞因子产生，并阻断细胞周期进展。最初对Pdcd1^-/-小鼠的分析并没有鉴定任何明显的免疫学表型。然而，老龄小鼠自发发展了与Pdcd1缺陷回交株系不同的自身免疫疾病。这些疾病包括狼疮样增殖性关节炎(C57BL/6)(Nishimura H.等，Int.Immunol.10：1563-1572(1998))、致死性心肌病(BALB/c)(Nishimura H.等，Science 291：319-322(2001))和I型糖尿病(NOD)(Wang J.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 102：11823-11828(2005))。总之，对敲除动物的分析使得清楚了PD-1主要起诱导并调节外周耐受的作用。因此，治疗性阻断PD-1途径可有助于克服免疫耐受。这种选择性阻断可用于治疗癌症或感染以及用于在接种(预防性或治疗性)期间加强免疫性。

在文献中已确定了PD-1在癌症中的作用。已知肿瘤微环境可保护肿瘤细胞免受有效的免疫破坏。最近显示PD-L1在许多小鼠和人肿瘤中表达(并在大多数PD-L1阴性肿瘤细胞系中可由IFNγ诱导)，并被推定介导免疫逃避(Iwai Y.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99：12293-12297(2002)；Strome S.E.等，Cancer Res.，63：6501-6505(2003)。

通过免疫组织化学评估活组织检查业已在人的很多原发性肿瘤中发现PD-1(在肿瘤浸润淋巴细胞上)和/或PD-L1(在肿瘤细胞上)。这样的组织包括肺癌、肝癌、卵巢癌、***、皮肤癌、结肠癌、神经胶质瘤、膀胱癌、乳腺癌、肾癌、食道癌、胃癌、口腔鳞状细胞癌、尿道上皮细胞癌和胰腺癌以及头颈肿瘤(Brown J.A.等，J.Immunol.170：1257-1266(2003)；Dong H.等，Nat.Med.8：793-800(2002)；Wintterle等，Cancer Res.63：7462-7467(2003)；Strome S.E.等，Cancer Res.，63：6501-6505(2003)；Thompson R.H.等，Cancer Res.66：3381-5(2006)；Thompson等，Clin.Cancer Res.13：1757-61(2007)；Nomi T.等，Clin.Cancer Res.13：2151-7.(2007))。更引人注目的是，PD配体在肿瘤细胞上的表达在多种肿瘤类型中与癌症患者预后不良相关联(在Okazaki和Honjo，Int.Immunol.19：813-824(2007)中综述)。

阻断PD-1/PD-L1的相互作用可导致肿瘤特异性T细胞的免疫性提高，因此，有助于由免疫***清除肿瘤细胞。针对这一问题，进行了大量研究。在侵袭性胰腺癌的鼠模型中，T.Nomi等(Clin.Cancer Res.13：2151-2157(2007))证明PD-1/PD-L1阻断的治疗功效。给予针对PD-1或PD-L1的抗体显著抑制肿瘤生长。抗体阻断有效促进了肿瘤活性CD8⁺T细胞浸润到肿瘤中，导致对抗肿瘤效应物(包括IFNγ、粒酶B和穿孔蛋白)的增量调节。另外，作者表明PD-1阻断可与化疗有效联合以产生协同作用。在另一项研究中，使用小鼠鳞状细胞癌模型，对PD-1或PD-L1的抗体阻断显著抑制肿瘤生长(Tsushima F.等，OralOncol.42：268-274(2006))。

在其它研究中，当与肿瘤特异性CTL克隆共同培养时，用PD-L1转染鼠肥大细胞瘤细胞系导致肿瘤细胞的裂解减少。当加入抗PD-L1mAb时，细胞裂解得以恢复(Iwai Y.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99：12293-12297(2002))。研究显示在小鼠肿瘤模型中体内阻断PD1/PD-L1的相互作用提高过继性T细胞转移疗法的功效(Strome S.E.等，Cancer Res.63：6501-6505(2003))。PD-1在癌症治疗中所起作用的另外的证据来自用PD-1敲除小鼠所做的实验。表达PD-L1的骨髓瘤细胞仅在野生型动物中生长(导致肿瘤生长并与动物死亡有关)，而不能在PD-1缺陷型小鼠中生长(Iwai Y.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99：12293-12297(2002))。

R.M.Wong等(Int.Immunol.19：1223-1234(2007))在对人的研究中显示，在用疫苗抗原和来自免疫个体的细胞进行的离体刺激测定中，用全人抗PD-1抗体对PD-1的阻断增加了肿瘤特异性CD8+T细胞(CTL)的绝对数量。在相似的研究中，对PD-L1的抗体阻断导致肿瘤相关抗原特异性细胞毒性T细胞的溶细胞活性提高，以及由肿瘤特异性T_H细胞产生的细胞因子增加(Blank C.等，Int.J.Cancer 119：317-327(2006))。相同作者显示，在体外当与抗CTLA-4阻断联合使用时，PD-L1阻断增强了肿瘤特异性T细胞应答。

总之，PD-1/PD-L1途径是开发癌症治疗的抗体疗法的被充分证实的靶标。抗PD-1抗体还可用于慢性病毒性感染。在急性病毒性感染后产生的记忆CD8⁺T细胞具有很高功能，并构成保护性免疫的重要组分。与此相反，慢性感染的特征常常在于病毒特异性T细胞应答的不同程度的功能受损(衰竭)，这种缺陷是宿主不能消除持续的病原体的主要原因。尽管在感染的早期阶段最初产生功能效应T细胞，但它们在慢性感染期间逐渐失去功能。Barber等(Barber等，Nature 439：682-687(2006))显示，用LCMV实验室毒株感染的小鼠发展为导致血液和其它组织中有高水平病毒的慢性感染。这些小鼠最初会产生较强的T细胞应答，但随着T细胞衰竭而最终受到感染。作者发现在慢性感染小鼠中的效应T细胞的数量和功能下降可通过注射阻断PD-1和PD-L1之间相互作用的抗体来逆转。

最近，有研究显示PD-1在来自HIV感染的个体的T细胞中高度表达，并且受体表达与T细胞功能损伤和疾病进展相关(Day等，Nature443：350-4(2006)；Trautmann L.等，Nat.Med.12：1198-202(2006))。在两项研究中，对配体PD-L1的阻断都显著增加了HIV特异性产IFNγ细胞的体外增殖。

其它研究还涉及PD-1途径在控制病毒感染中的重要性。PD-1敲除小鼠表现出比野生型小鼠更好地控制腺病毒感染(Iwai等，J.Exp.Med.198：39-50(2003))。同样，将HBV特异性T细胞过继性转移到HBV转基因动物中会引发肝炎(Isogawa M.等，Immunity 23：53-63(2005))。这些动物的疾病状态因肝中的抗原识别和肝细胞增量调节PD-1而游移不定。

发明简述

本发明提供结合人和犬PD-1的分离的抗体及抗体片段。在一些实施方案中，所述抗体或抗体片段阻断人PD-L1和人PD-L2与人PD-1的结合。在一些实施方案中，本发明PD-1抗体或抗体片段包括选自以下的一个或多个CDR(抗体互补决定区)：SEQ ID NO：9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20；在另外的实施方案中，包括以下一个或多个重链CDR：SEQ ID NO：12、13、14、18、19和20和/或以下一个或多个轻链CDR：SEQ ID NO：9、10、11、15、16和17。在一些实施方案中，所述抗体或抗体片段为嵌合抗体、人抗体、人源化抗体或它们的片段。

在一个实施方案中，本发明提供结合人PD-1的分离的抗体或抗体片段，其包含：包含CDR SEQ ID NO：9、10和11或任何所述序列变体的轻链；和/或包含CDR SEQ ID NO：12、13和14或任何所述序列变体的重链。

在另一个实施方案中，本发明提供结合人PD-1的分离的抗体或抗体片段，其包含：包含CDR SEQ ID NO：15、16和17或任何所述序列变体的轻链；和/或包含CDR SEQ ID NO：18、19和20或任何所述序列变体的重链。

在一个实施方案中，本发明包括抗体或抗原结合片段，其包含：重链可变区SEQ ID NO：5或其变体；和/或包含SEQ ID NO：6或其变体的轻链可变区。

在一个实施方案中，本发明包括抗体或抗原结合片段，其包含：重链可变区SEQ ID NO：7或其变体；和/或包含SEQ ID NO：8或其变体的轻链可变区。

在一个实施方案中，本发明包括抗体或抗原结合片段，其包含：包含SEQ ID NO：30的20-139位氨基酸残基或其变体的重链可变区；和/或包含SEQ ID NO：32的20-130位氨基酸残基或其变体的轻链可变区。

在一个实施方案中，本发明包括抗体或抗原结合片段，其包含：包含SEQ ID NO：30的20-139位氨基酸残基或其变体的重链可变区；和/或包含SEQ ID NO：33的20-130位氨基酸残基或其变体的轻链可变区。

在一个实施方案中，本发明包括抗体或抗原结合片段，其包含：包含SEQ ID NO：30的20-139位氨基酸残基或其变体的重链可变区；和/或包含SEQ ID NO：34的20-130位氨基酸残基或其变体的轻链可变区。

在一个实施方案中，本发明包括抗体或抗原结合片段，其包含：包含具有与SEQ ID NO：30的20-139位氨基酸残基至少90％同源性的氨基酸序列的重链可变区；和/或包含具有与SEQ ID NO：32、33、34的20-130位氨基酸残基至少90％同源性的氨基酸序列的轻链可变区。

在一个实施方案中，本发明提供结合人PD-1的分离的抗体或抗体片段，其包含：包含SEQ ID NO：31的20-466位氨基酸残基或其变体的重链；和/或包含SEQ ID NO：36的20-237位氨基酸残基或其变体的轻链。

在一个实施方案中，本发明提供结合人PD-1的分离的抗体或抗体片段，其包含：包含SEQ ID NO：31的20-466位氨基酸残基或其变体的重链；和/或包含SEQ ID NO：37的20-237位氨基酸残基或其变体的轻链。

在一个实施方案中，本发明提供结合人PD-1的分离的抗体或抗体片段，其包含：包含SEQ ID NO：31的20-466位氨基酸残基或其变体的重链；和/或包含SEQ ID NO：38的20-237位氨基酸残基或其变体的轻链。

在一个实施方案中，本发明提供结合人PD-1的分离的抗体或抗体片段，其包含：包含SEQ ID NO：35的20-469位氨基酸残基或其变体的重链；和/或包含SEQ ID NO：36的20-237位氨基酸残基或其变体的轻链。

在一个实施方案中，本发明提供结合人PD-1的分离的抗体或抗体片段，其包含：包含SEQ ID NO：35的20-469位氨基酸残基或其变体的重链；和/或包含SEQ ID NO：37的20-237位氨基酸残基或其变体的轻链。

在一个实施方案中，本发明提供结合人PD-1的分离的抗体或抗体片段，其包含：包含SEQ ID NO：35的20-469位氨基酸残基或其变体的重链；和/或包含SEQ ID NO：38的20-237位氨基酸残基或其变体的轻链。

在上述任何实施方案中，本发明抗体或抗体片段的变体可包含一个、两个或三个保守修饰的氨基酸取代。

在上述任何实施方案中，本发明抗体或抗体片段可包含：人重链恒定区或其变体，其中所述变体包含至多20个保守修饰的氨基酸取代；和/或人轻链恒定区或其变体，其中所述变体包含至多20个保守修饰的氨基酸取代。在一些实施方案中，所述变体可包含至多10个保守修饰的氨基酸取代。在一些实施方案中，所述变体可包含至多5个保守修饰的氨基酸取代。在一些实施方案中，所述变体可包含至多3个保守修饰的氨基酸取代。在上述任何实施方案中，人重链恒定区或其变体可为IgG1或IgG4同种型。

在上述任何实施方案中，本发明抗体或抗体片段可以以约100pM或更低的K_D结合人PD-1。在另一个实施方案中，抗体或抗体片段可以以约30pM或更低的K_D结合人PD-1。在另一个实施方案中，抗体或抗体片段可以以与下述抗体接近相同的K_D结合人PD-1：所述抗体具有包含SEQ ID NO：31氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO：32氨基酸序列的轻链。在另一个实施方案中，抗体或抗体片段可以以与下述抗体接近相同的K_D结合人PD-1：所述抗体具有包含SEQ ID NO：31氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO：33氨基酸序列的轻链。

在上述任何实施方案中，本发明抗体或抗体片段可以以约7.5×10⁵1/M·s或更快的k_结合结合人PD-1。在一个实施方案中，抗体或抗体片段可以以约1×10⁶1/M·s或更快的k_结合结合人PD-1。

在上述任何实施方案中，抗体或抗体片段可以以约2×10^-51/s或更慢的k_解离结合人PD-1。在一个实施方案中，抗体或抗体片段可以以约2.7×10^-51/s或更慢的k_解离结合人PD-1。在一个实施方案中，抗体或抗体片段可以以约3×10^-51/s或更慢的k_解离结合人PD-1。

可用任何有效的方法测量K_D、k_结合和k_解离值。在优选的实施方案中，用生物发光干涉测量法(例如，实施例2中所述的ForteBio Octet法)来测量解离常数。在其它优选的实施方案中，可用表面等离子共振技术(例如Biacore)或Kinexa来测量解离常数。

此外，在上述任何实施方案中，本发明抗体或抗体片段可以以约1nM或更低的IC₅₀阻断人PD-L1或人PD-L2与人PD-1的结合。可用本领域任何已知的方法测量配体结合的阻断情况并计算IC₅₀，例如下文实施例中所述的FACS或FMAT法。

本发明还包括与上述任何抗体竞争人PD-1上的结合表位的抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段以约1nM或更低的IC₅₀阻断人PD-L1或人PD-L2与人PD-1的结合。

本发明还包括与上述任何抗体竞争人PD-1上的结合表位的抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段以约100pM或更低的K_D结合人PD-1。在一个实施方案中，抗体或抗体片段以约30pM或更低的K_D结合人PD-1。

本发明还包括与上述任何抗体竞争人PD-1上的结合表位的抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段以与下述抗体接近相同的K_D结合人PD-1：所述抗体具有包含SEQ ID NO：31氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO：32氨基酸序列的轻链。

本发明还包括与上述任何抗体竞争人PD-1上的结合表位的抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段以与下述抗体接近相同的K_D结合人PD-1：所述抗体具有包含SEQ ID NO：31氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO：33氨基酸序列的轻链。

本发明还包括与上述任何抗体竞争人PD-1上的结合表位的抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段以约7.5×10⁵1/M·s或更快的k_结合结合人PD-1。在一个实施方案中，抗体或抗体片段可以以约1×10⁶1/M·s或更快的k_结合结合人PD-1。

本发明还包括与上述任何抗体竞争人PD-1上的结合表位的抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段以约2×10^-51/s或更慢的k_解离结合人PD-1。在一个实施方案中，抗体或抗体片段可以以约2.7×10^-51/s或更慢的k_解离结合人PD-1。在一个实施方案中，抗体或抗体片段可以以约3×10^-51/s或更慢的k_解离结合人PD-1。

在一些实施方案中，本发明抗体或抗体片段为嵌合抗体或嵌合抗体片段。

在一些实施方案中，本发明抗体或抗体片段为人抗体或人抗体片段。

在一些实施方案中，本发明抗体或抗体片段为人源化抗体或人源化抗体片段。

在一些实施方案中，本发明抗体片段为Fab、Fab’、Fab’-SH、Fv、scFv或F(ab’)2抗体片段。

在一些实施方案中，本发明抗体片段为双抗体。

本发明还包括包含上述结合人PD-1的抗体或抗体片段中的任一种的双特异性抗体。

在一些实施方案中，本发明分离的抗PD-1抗体及抗体片段增加了T细胞活化作用(包括但不限于免疫细胞增殖提高、细胞因子分泌提高或活化标记例如CD25和/或CD69的表达提高)，其根据本领域技术人员所知的典型手段来测量。

在上述任何实施方案中，本发明抗体或抗体片段可在离体或体内用葡萄球菌肠毒素B或破伤风类毒素刺激后提高免疫应答。可用本领域任何技术人员已知的方法测定增加的免疫激活作用，例如，定量测定免疫细胞(例如T细胞)增殖情况或由免疫细胞产生的细胞因子(例如由T细胞产生的IFN或IL-2)。

本发明还包括编码本发明抗PD-1抗体及抗体片段的核酸。本发明包括编码SEQ ID NO：5-20和30-38(含或不含前导序列)中所示的氨基酸序列中的任何一种的核酸。本发明还包括包含SEQ ID NO：1-4和21-29(含或不含编码前导序列的核酸)的核酸。

本发明还包括包含编码本发明抗体或抗体片段的核酸的细胞及表达载体。此外，本发明包括制备本发明抗体或抗体片段的方法，该方法包括：(a)在使所述核酸序列表达的条件下在培养基中培养包含编码本发明抗体或抗体片段的核酸的宿主细胞，由此产生包含轻链和重链可变区的多肽；和(b)从所述宿主细胞或培养基回收多肽。

本发明还包括包含与可药用载体或稀释剂组合的本发明抗体或抗体片段的组合物。

本发明还包括提高免疫细胞活性的方法，所述方法包括将治疗有效量的本发明抗体或抗体片段给予需要治疗的对象。在一个实施方案中，所述方法可用于治疗癌症。在另一个实施方案中，所述方法可用于治疗感染或感染性疾病。在又一实施方案中，所述方法可用作疫苗佐剂。在一些实施方案中，所述方法包括进一步给予第二种治疗剂或治疗形式。

在一些实施方案中，本发明包括提高免疫细胞活性的方法，所述方法包括将治疗有效量的本发明抗体或抗体片段给予需要治疗的对象，并进一步包括在源自所述对象的样品中离体测量T细胞激活情况，其中T细胞活性的提高表明应该继续治疗。在其它实施方案中，本发明包括提高免疫细胞活性的方法，所述方法包括将治疗有效量的本发明抗体或抗体片段给予需要治疗的对象，并进一步包括在源自所述对象的样品中离体测量T细胞激活情况，其中T细胞活性提高预示治疗成功的可能性。在一个实施方案中，由以下方法测定T细胞活性的提高：(i)测量SEB诱导产生的选自以下的一种或多种细胞因子：IL-2、TNF、IL-17、IFN、GM-CSF、RANTES、IL-6、IL-8、IL-5和IL-13；或(ii)测量TT诱导产生的选自以下的细胞因子：IL-2、TNF、IL-17、IFN、GM-CSF、RANTES、IL-6、IL-8、IL-5和IL-13。

本发明还包括本发明抗PD-1抗体或抗体片段在用于制备提高免疫应答的药物中的用途。

本发明还包括本发明抗PD-1抗体或抗体片段在用于制备治疗癌症的药物中的用途。

本发明还包括本发明抗PD-1抗体或抗体片段在用作疫苗佐剂中的用途。

本发明还包括包含与治疗剂(例如细菌毒素或放射性毒素)连接的本发明抗PD-1抗体或抗体片段的免疫连接物。细胞毒剂的非限制性实例包括：泰素(taxol)、细胞松弛素B(cytochalasin B)、丝裂霉素(mitomycin)、依托泊苷(etoposide)和长春新碱(vincristine)或其它抗代谢物、烷化剂、抗生素和抗有丝***药。

本发明还包括提高免疫细胞活性或降低免疫细胞下调的方法，所述方法包括让免疫细胞与任何一种本发明抗体或抗体片段接触。该方法可用于治疗癌症或感染性疾病(例如慢性病毒性感染)，或可用作预防性或治疗性疫苗的佐剂。

本发明还包括提高对抗原的免疫应答的方法，所述方法包括让免疫细胞与抗原和抗PD-1抗体或抗体片段接触，以便提高或加强对抗原的免疫应答。该方法可在体内(在受治疗者中)或离体进行。

在一些实施方案中，抗PD-1抗体或抗体片段可与第二治疗剂或治疗形式组合。在一个实施方案中，抗PD-1抗体或抗体片段可与包括施用重组的细胞因子或分泌的免疫因子的癌症治疗组合。组合的非限制性实例包括抗PD-1抗体与重组IL-2或重组IFN 2联合用于治疗黑素瘤或肾细胞癌。重组IL-2增加癌症患者中的T细胞产生。重组IFN 2在被治疗的患者中不但抑制癌细胞生长，而且还提高癌细胞、抗原呈递细胞和其它体细胞上的PD-1的抑制性配体的表达。抗PD-1可与被认为可用于治疗癌症或感染性疾病的其它细胞因子组合。

在一些实施方案中，抗PD-1抗体或抗体片段可与疫苗组合以预防或治疗癌症或感染性疾病。作为非限制性实例，抗PD-1可与以下物质组合：含有与待治疗的癌症或感染有关的一种或多种抗原的蛋白质、肽或DNA疫苗或由用所述抗原刺激(pulsed)的树突细胞组成的疫苗。另一个实施方案包括抗PD-1与(减弱的)癌细胞或全病毒疫苗的用途。一个实施方案涉及抗PD-1疗法与经工程改造而分泌GM-CSF的全细胞癌症疫苗组合。

在一些实施方案中，抗PD-1抗体或抗体片段可与被认为是癌症或感染性疾病中的护理标准的治疗组合。所述组合的基本原理是，由抗PD-1并行提高的免疫活化作用将诱导或促进对护理治疗标准的初始临床反应、诱导长期的临床反应和对疾病的长期免疫控制。

在一个实施方案中，用抗PD-1抗体或抗体片段的治疗可与化疗组合。使用细胞毒剂的化疗将导致癌细胞死亡，由此增加肿瘤抗原的释放。所述增加肿瘤抗原的有效性可导致与抗PD-1治疗的协同作用。提供的非限制性实例为使用氨烯咪胺(decarbazine)或替莫唑胺(temozolomide)治疗黑素瘤和使用吉西他滨(gemcitabine)治疗胰腺癌。

在一个实施方案中，用抗PD-1抗体或抗体片段治疗可与放疗组合。放疗诱导癌细胞死亡，并增加用于呈递和激活免疫细胞的肿瘤抗原的有效性。

在另一个实施方案中，用抗PD-1抗体或抗体片段治疗可与手术组合以从受治疗者中去除癌细胞。

在其它实施方案中，抗PD-1抗体或抗体片段可与能同PD-1阻断产生协同作用的疗法组合，所述疗法包括用于激素消除(hormonedeprivation)或抑制血管生成的靶向药物，或靶向在肿瘤细胞中具有活性的蛋白质的靶向药物，所有这些均导致肿瘤细胞死亡增加和免疫刺激性肿瘤抗原的有效性提高。在与抗PD-1抗体或抗体片段联合的情况下，T细胞活化作用的提高可导致对癌症的持久免疫控制。

在一些实施方案中，抗PD-1抗体或抗体片段可与用于治疗癌症或感染性疾病的另一种治疗性抗体联合。提供的非限制性实例为抗PD-1与靶向Her2/neu或靶向EGF受体的抗体的组合。在另一个非限制性实例中，抗PD-1抗体或抗体片段与靶向VEGF或其受体的治疗组合。在另一个实施方案中，抗PD-1抗体或抗体片段与抗CTLA-4组合。在又一个非限制性实例中，抗PD-1与靶向RSV的抗体组合。

附图简述

图1A和1B显示的实验结果表明来自杂交瘤上清液的被固定化的抗体能减少用固定化的抗CD3和可溶性抗CD28刺激的Jurkat E6.2.11细胞的IL-2分泌。

图2显示的实验结果表明抗人PD-1抗体结合PD-1。图2A为显示在蛋白ELISA中抗PD-1抗体与纯化的PD-1/Fc剂量依赖性结合的曲线图。图2B为显示在CELISA中抗PD-1抗体与在用hPD-1转染的CHO细胞表面上表达的PD-1剂量依赖性结合的曲线图。

图3显示的FMAT实验结果表明抗PD-1抗体与PD-L1和PD-L2竞争结合用人PD-1转染的CHO细胞。图3A的曲线图显示hPD-1.08A和hPD-1.09A对结合PD-L1的剂量依赖性抑制，J116的抑制程度较低。图3B为显示剂量依赖性抑制PD-L2的曲线图。

图4条形图所显示的实验结果表明在抗PD-1、抗PD-L1或抗CTLA-4抗体存在下受SEB刺激的健康供者血细胞产生IL-2得到提高。条形显示在不同供者中IL-2的平均倍数增加(±SEM)。每一条形里面的数字表示所代表的供者的数目。小鼠(m)IgG1是抗PD-1.08A(08A)、抗PD-1.09A(09A)和抗PD-L1的同种型对照。小鼠(m)IgG2a是抗CTLA-4的同种型对照。将各IL-2值与其自己的对照比较，以确定倍数变化(当与只用SEB比较时，IL-2的倍数改变为4意即IL-2生产增加400％)。无＝只有SEB。

图5显示的实验结果表明当用回忆抗原破伤风类毒素刺激时抗PD-1抗体促进T细胞增殖和细胞因子分泌(IL-2和IFNγ)。图5显示浓度依赖性IFNγ分泌。

图6为描述由生物发光干扰测量法(bio-light interferometry)测定的抗PD-1抗体的k_结合和k_解离率的曲线图。对角线表示理论上计算的K_D值。抗体以递升次序列在K_D的右边。

图7条形图显示的实验结果表明在25ug/ml鼠(09A)或人源化抗PD-1抗体(h409A11、h409A16和h409A17)存在下，受SEB刺激的健康供者血细胞产生IL-2得到提高。条形显示在不同供者中IL-2的平均倍数增加(±SEM)。小鼠(m)IgG1是抗PD-1.09A(09A)的同种型对照。人(h)IgG4是h409A11、h409A16和h409A17抗体的同种型对照。将各IL-2值与其自己的对照比较，以确定倍数变化。无＝只有SEB。

发明详述

缩写和定义

在本发明的发明详述和实施例各处中将使用以下缩写：

hPD-1.08A 鼠单克隆抗hPD-1抗体

hPD-1.09A 鼠单克隆抗hPD-1抗体

08A-VH 分离自hPD-1.08A杂交瘤的VH

08A-VK 分离自hPD-1.08A杂交瘤的VK

09A-VH 分离自hPD-1.09A杂交瘤的VH

09A-VK 分离自hPD-1.09A杂交瘤的VK

c109A hPD1.09A抗体的嵌合IgG1形式

c109A-VH 由与hIgG1恒定区融合的鼠09A-VH组成的嵌合重链

c109A-VK 由与人κ恒定区融合的鼠09A-VK组成的嵌合轻链

109A-H 具有零回复突变的人源化IgG1 09A重链序列

409A-H 具有零FWR回复突变的人源化IgG4-09A重链序列

K09A-L-11 含最初具有长11个氨基酸的CDR1的构架的人源化09A-κ序列

K09A-L-16 含最初具有长16个氨基酸的CDR1的构架的人源化09A-κ序列

K09A-L-17 含最初具有长17个氢基酸的CDR1的构架的人源化09A-κ序列

h409A11 包含含有409A-H序列的重链和含有K09A-L-11序列的轻链的09A抗体的人源化IgG4形式

h409A16 包含含409A-H序列的重链和含K09A-L-16序列的轻链的09A抗体的人源化IgG4形式

h409A17 包含含409A-H序列的重链和含K09A-L-17序列的轻链的09A抗体的人源化IgG4形式

hPD-1 人PD-1蛋白

CDR 用Kabat编号***界定的免疫球蛋白可变区中的互补决定区

EC₅₀ 产生50％功效或结合的浓度

ELISA 酶联免疫吸附测定

FW 抗体构架区：将CDR区排除在外的免疫球蛋白可变区

HRP 辣根过氧化物酶

IL-2 白细胞介素2

IFN 干扰素

IC₅₀ 产生50％抑制的浓度

IgG 免疫球蛋白G

Kabat 由Elvin A Kabat倡导的免疫球蛋白比对及编号***

mAb 单克隆抗体

MES 2-(N-吗啉代)乙磺酸

NHS 正常人血清

PCR 聚合酶链式反应

SAM 绵羊抗小鼠(IgG)多克隆抗体

V区在不同抗体之间序列可变的IgG链区段。其延伸到轻链的109位Kabat残基和重链的第113位残基。

VH 免疫球蛋白重链可变区

VK 免疫球蛋白κ轻链可变区

“抗体”是指表现所需生物学活性(例如抑制配体与其受体的结合或通过抑制配体诱导的受体信号转导)的抗体的任何形式。因此，“抗体”以其最广泛的意义来使用，并明确包括但不限于单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体和多特异性抗体(例如双特异性抗体)。

“抗体片段”和“抗体结合片段”意即抗体的抗原结合片段及抗体类似物，其通常包括至少部分母体抗体(parental antibody)的抗原结合区或可变区(例如一个或多个CDR)。抗体片段保留母体抗体的至少某些结合特异性。通常，当基于摩尔来表示活性时，抗体片段保留至少10％的母体结合活性。优选地，抗体片段保留至少20％、50％、70％、80％、90％、95％或100％或更多的母体抗体对靶标的结合亲和力。抗体片段实例包括但不限于：Fab、Fab′、F(ab′)₂和Fv片段；双抗体；线性抗体(linear antibody)；单链抗体分子，例如sc-Fv、单抗体(技术来自Genmab)；纳米抗体(技术来自Domantis)；结构域抗体(技术来自Ablynx)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。工程改造的抗体变体综述于Holliger和Hudson(2005)Nat.Biotechnol.23：1126-1136中。

“Fab片段”由一条轻链和一条重链的C_H1及可变区组成。Fab分子的重链不能与另一个重链分子形成二硫键。

“Fc”区含有包含抗体的C_H1和C_H2结构域的两个重链片段。两个重链片段由两个或多个二硫键并通过CH3结构域的疏水作用保持在一起。

“Fab′片段”含有一条轻链和包含V_H结构域和C_H1结构域以及C_H1和C_H2结构域之间区域的一条重链的部分，由此可在两个Fab′片段的两条重链之间形成链间二硫键以形成F(ab′)₂分子。

“F(ab′)₂片段”含有两条轻链和两条包含C_H1和C_H2结构域之间的恒定区的部分的重链，由此在两条重链间形成链间二硫键。因此，F(ab′)₂片段由通过两条重链间的二硫键保持在一起的两个Fab′片段组成。

“Fv区”包含来自重链和轻链二者的可变区，但缺少恒定区。

“单链Fv抗体”(或“scFv抗体”)是指包含抗体的V_H和V_L结构域的抗体片段，其中这些结构域存在于单个多肽链中。一般而言，Fv多肽另外在V_H和V_L结构域之间包含多肽接头，该接头使得scFv能形成用于抗原结合的所需结构。对于scFv综述，可参见Pluckthun(1994)THE PHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANTIBODIES(单克隆抗体药理学)，第113卷，Rosenburg和Moore主编，Springer-Verlag，New York，第269-315页。还参见国际专利申请公开号WO 88/01649和美国专利第4,946,778号和第5,260,203号。

“双抗体”为具有两个抗原结合位点的小抗体片段。所述片段包含在相同的多肽链中与轻链可变结构域(V_L)连接的重链可变结构域(V_H)(V_H-V_L或V_L-V_H)。通过使用短至不能在同一链的两个结构域之间配对的接头，迫使所述结构域与另一条链的互补结构域配对并形成两个抗原结合位点。双抗体更全面地阐述于例如EP 404,097；WO 93/11161；和Holliger等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448中。

“结构域抗体片段”是仅含有重链可变区或轻链可变区链的具有免疫学功能的免疫球蛋白片段。在某些情况下，两个或多个V_H区与肽接头共价连接以形成二价结构域抗体片段。二价结构域抗体片段的两个V_H区可靶向相同或不同抗原。

本发明抗体片段可包含足以使重链二聚体化(或多聚体化)的恒定区部分，所述重链具有降低的二硫键合的能力，例如，如本文所述改变了通常参与重链间二硫键的铰链半胱氨酸中的至少一个。在另一个实施方案中，抗体片段(例如包含Fc区的抗体片段)保留了当以完整抗体存在时通常与Fc区有关的生物学功能中的至少一种，这些功能例如FcRn结合、抗体半衰期调节、ADCC功能和/或补体结合(例如抗体具有对ADCC功能或补体结合必不可少的糖基化特征)。

术语“嵌合”抗体指这样的抗体以及表现出所需生物学活性的所述抗体的片段：其中部分重链和/或轻链与来源于特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体相应的序列等同或同源，同时所述链的其余部分与来源于另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体相应的序列等同或同源(参见例如美国专利第4,816,567号和Morrison等，1984、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855)。

非人类(例如鼠)抗体的“人源化”形式为含有最小限度的来源于非人类免疫球蛋白序列的嵌合抗体。人源化抗体的大部分为人免疫球蛋白(受体抗体)，其中受体抗体的高变区残基被具有所需特异性、亲和力和能力的非人类物种(供体抗体)高变区的残基置换，非人类物种例如有小鼠、大鼠、兔或非人类灵长类。在某些情况下，人免疫球蛋白的Fv构架区(FR)残基被相应的非人类残基取代。此外，人源化抗体可包含不在受体抗体或供体抗体中存在的残基。进行这些修饰以进一步改进抗体性能。一般而言，人源化抗体包含至少一个且通常为两个可变结构域的几乎全部，其中全部或几乎全部超变环对应于非人类免疫球蛋白的超变环，全部或几乎全部FR区为人免疫球蛋白序列的FR区。人源化抗体还任选包含至少部分免疫球蛋白(通常为人免疫球蛋白)恒定区(Fc)。更详细的资料参见Jones等，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann等，Nature 332：323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。

本文所用术语“超变区”是指负责抗原结合的抗体氨基酸残基。超变区包含以下氨基酸残基：来自序列比对所界定的“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基，例如，轻链可变结构域的24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)位残基和重链可变结构域的31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)位残基，参见Kabat等，1991，Sequences of proteins ofImmunological Interest(免疫目的物的蛋白质序列)，第5版，PublicHealth Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.；和/或来自根据结构来界定的“超变环”(HVL)的残基，例如，轻链可变结构域的26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)位残基和重链可变结构域的26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)位残基，参见Chothia和Leskl，1987，J.Mol.Biol.196：901-917。“构架”残基或“FR”残基为除本文定义的超变区残基之外的可变结构域残基。

“人抗体”为其氨基酸序列对应于由人产生的抗体的氨基酸序列的抗体，和/或业已用任何用于制备本文所示的人抗体的技术制备的抗体。该定义明确排除了包含非人类抗原结合残基的人源化抗体。

“分离的”抗体为业已被鉴定并分离和/或回收自其天然环境组分的抗体。其天然环境的污染组分是会干扰所述抗体的诊断性或治疗性应用的物质，可包括酶、激素和其它蛋白质溶质或非蛋白质溶质。在一些实施方案中，将所述抗体纯化到以下程度：(1)超过95％重量的抗体，最优选超过99％重量，其由Lowry法测定；(2)足以通过用旋杯式测序仪获得N-末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度；或(3)通过在还原或非还原条件下用考马斯蓝或优选银染色的SDS-PAGE确定为同质。分离的抗体包括在重组细胞内的原位的抗体，因为抗体自然环境中的至少一种组分将不存在。然而，分离的抗体通常由至少一个纯化步骤制备。

“分离的”核酸分子为被鉴定并与至少一种污染性核酸分子(通常在抗体核酸的天然来源中与其缔合)分离的核酸分子。分离的核酸分子不同于其天然存在的形式或环境。因此，分离的核酸分子与在其天然细胞中存在的核酸分子有区别。然而，分离的核酸分子包括在如常表达抗体的细胞中所含的核酸分子，例如，所述核酸分子所处的染色***置不同于天然细胞的染色***置。

本文所用术语“单克隆抗体”是指从基本上同种抗体群中获得的抗体，即除了可能少量存在的可能的天然突变体外，构成所述群的各个抗体是一致的。单克隆抗体具有高度特异性，可针对单个的抗原位点。此外，与通常包括针对多个不同的决定簇(表位)的多种不同抗体的常规(多克隆)抗体制备物相反，每种单克隆抗体仅针对抗原上的单个决定簇。修饰语“单克隆”表示从基本上同种抗体群获得的抗体的特性，不能理解为需要通过任何特定方法来制备所述抗体。例如，用于本发明的单克隆抗体可通过由Kohler等(1975，Nature 256：495)首先阐述的杂交瘤方法制备，或可通过重组DNA方法(参见例如美国专利第4,816,567号)制备。“单克隆抗体”还可用例如Clackson等(1991，Nature352：624-628)和Marks等(1991，J.Mol.Biol.222：581-597)所述技术分离自噬菌体抗体文库。本文单克隆抗体明确包括“嵌合”抗体。

本文所用术语“免疫细胞”包括具有造血的起源并在免疫应答中起作用的细胞。免疫细胞包括：淋巴细胞，例如B细胞和T细胞；天然杀伤细胞；髓样细胞，例如单核细胞、巨噬细胞、嗜曙红细胞、肥大细胞、嗜碱细胞和粒细胞。

本文所用“免疫缀合物”是指与治疗性部分缀合的抗PD-1抗体或其片段，所述治疗性部分例如有细菌毒素、胞毒药物或放射性毒素。可用本领域的有效方法使毒性部分与本发明抗体缀合。

本文使用以下核酸双关码：R＝A或G；Y＝C或T；M＝A或C；K＝G或T；S＝G或C；和W＝A或T。

本文所用序列“变体”是指在一个或多个氨基酸残基处不同于所示的序列但保留所得到的分子的生物学活性的序列。

“保守修饰的变体”或“保守的氨基酸取代”是指本领域技术人员已知的氨基酸取代，进行这种取代通常不改变所得到的分子的生物学活性。一般而言，本领域技术人员公认在多肽非必需区的单个氨基酸取代基本上不改变生物学活性(参见例如Watson等，Molecular Biology ofthe Gene(基因的分子生物学)，The Benjamin/Cummings Pub.Co.，第224页(第四版，1987))。这样的例示性取代优选依照以下所示的取代来进行：

例示性保守氨基酸取代

原残基	保守取代
		Ala(A)	Gly；Ser
Arg(R)	Lys，His
		Asn(N)	Gln；His
Asp(D)	Glu；Asn
		Cys(C)	Ser；Ala
Gln(Q)	Asn
		Glu(E)	Asp；Gln
Gly(G)	Ala
		His(H)	Asn；Gln
Ile(I)	Leu；Val
		Leu(L)	Ile；Val
Lys(K)	Arg；His
		Met(M)	Leu；Ile；Tyr
Phe(F)	Tyr；Met；Leu
		Pro(P)	Ala
Ser(S)	Thr
		Thr(T)	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe
		Tyr(Y)	Trp；Phe
Val(V)	Ile；Leu

本文所用的两个序列之间的“％同一性”是指所述序列共有的等同位置的数目的函数(即％同源性＝等同位置数/总位置数x 100)，其中会考虑到空位数目及各空位长度，所述空位需要在进行两个序列最佳比对时引入。序列比较和两个序列之间％同一性的确定可用数学算法来完成。例如，两个氨基酸序列之间的％同一性可用E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl.Biosci.，4：11-17(1988))的算法来确定，该算法业已被引入到ALIGN程序(2.0版)中，其使用PAM120权重残基表，空位长度罚分为12，空位罚分为4。另外，两个氨基酸序列之间的％同一性可用Needleman和Wunsch(J.MoI.Biol.48：444-453(1970))算法来确定，该算法已被引入到GCG软件包的GAP程序(可在www.gcg.com中得到)中，其使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，空位权重为16、14、12、10、8、6或4，长度权重为1、2、3、4、5或6。

本文所用术语“约”是指数值在由本领域一般技术人员所测定的具体值的可接受误差范围内，所述数值部分取决于怎样测量或测定(即测量体系的限度)。例如，在本领域每一次实行中“约”可意味着在1内或超过1的标准差。或者，“约”或“基本上包含”可意味着至多20％的范围。此外，特别对于生物学***或过程而言，该术语可意味着至多一个数量级或数值的至多5倍。除非另外说明，否则当具体值在本申请和权利要求中出现时，“约”或“基本上包含”的含义应该假定为在该具体值的可接受误差范围内。

当提及配体/受体、抗体/抗原或其它结合对时，“特异性”结合是指在蛋白和/或其它生物试剂的异质群体中确定是否存在所述蛋白例如PD-1的结合反应。因此，在所指定的条件下，特定的配体/抗原与特定的受体/抗体结合，并且并不以显著量与样品中存在的其它蛋白结合。

当用“给予”和“治疗”提及动物、人、实验对象、细胞、组织、器官或生物液时，是指将外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人、受治疗者、细胞、组织、器官或生物液接触。“给予”和“治疗”可指例如治疗方法、药动学方法、诊断方法、研究方法和实验方法。治疗细胞包括让试剂与细胞接触以及让试剂与流液接触，其中所述流液与细胞接触。“给予”和“治疗”还意味着例如通过试剂、诊断剂、结合组合物或通过其他细胞对细胞进行体外和离体治疗。

“有效量”包括足以改善或防止医学疾病的症状或病症的量。有效量还意指足以使得可以诊断或促进诊断的量。对具体受治疗者的有效量可视多种因素而变化，例如待治疗的疾病、患者的整体健康状况、给药的方法途径和剂量及副作用的严重性。有效量可为避免显著副作用或毒性作用的最大剂量或给药方案。作用效果将导致提高诊断措施或参数的至少5％、通常至少10％、更通常至少20％、最通常至少30％、优选至少40％、更优选至少50％、最优选至少60％、理想地至少70％、更理想地至少80％和最理想地至少90％，其中100％界定为正常受治疗者所显示的诊断参数(参见例如Maynard等(1996)A Handbook ofSOPs for Good Clinical Practice(良好临床实践的SOP手册)，Interpharm Press，Bocaraton，FL；Dent(2001)Good Laboratory and GoodClinical Practice(良好实验室实践和良好临床实践)，Urch Publ.，London，UK)。

单克隆抗体

可根据本领域知识和技能来制备针对PD-1的单克隆抗体，制备时用PD-1抗原注射试验对象，然后分离表达具有所需序列或功能特性的抗体的杂交瘤。

用常规方法(例如通过用能够特异性结合编码单克隆抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)便可容易地分离编码单克隆抗体的DNA并测定其序列。杂交瘤细胞用作所述DNA的优选来源。所述DNA一经分离便可将其置于表达载体中，然后将该载体转染到宿主细胞中以在重组宿主细胞中实现单克隆抗体的合成，所述宿主细胞例如有大肠杆菌细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵(CHO)细胞或不会另外产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞。抗体的重组制备将在下文更详细地阐述。

在另外的实施方案中，抗体或抗体片段可分离自用McCafferty等(1990，Nature，348：552-554)所述技术制备的抗体噬菌体文库。Clackson等(1991，Nature，352：624-628)和Marks等(1991，J.Mol.Biol.222：581-597)阐述了用噬菌体文库分别分离鼠和人抗体。后来的出版物阐述了通过链改组(Marks等，1992，Bio/Technology，10：779-783)以及作为构建极大噬菌体文库策略的组合感染和体内重组(Waterhouse等，1993，Nuc.Acids.Res.21：2265-2266)来制备高亲和力(nM范围)的人抗体。因此，这些技术是对于用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行的备选。

嵌合抗体

还可对抗体DNA进行修饰，例如通过用人重链和轻链恒定结构域的编码序列取代同源性鼠序列(美国专利第4,816,567号；Morrison等，1984，Proc.Natl Acad.Sci.USA，81：6851)，或通过使编码免疫球蛋白的序列与编码非免疫球蛋白物质(例如蛋白质结构域)的全部或部分序列共价连接。通常用所述非免疫球蛋白物质取代抗体的恒定结构域，或被取代抗体的一个抗原结合位点的可变结构域，以产生二价嵌合抗体，所述二价嵌合抗体包含对抗原具有特异性的一个抗原结合位点和对不同的抗原具有特异性的另一抗原结合位点。

人源化抗体和人抗体

人源化抗体具有一个或多个来自非人类来源的氨基酸残基。非人类氨基酸残基通常被称为“输入(import)”残基，并通常取自“输入”可变结构域。通常可根据Winter及其合作者的方法(Jones等，1986，Nature321：522-525；Riechmann等，1988，Nature，332：323-327；Verhoeyen等，1988，Science 239：1534-1536)，通过用啮齿类动物CDR或CDR序列取代人抗体的相应序列来实施人源化。因此，所述“人源化”抗体为嵌合抗体(美国专利第4,816,567号)，其中极小部分的完整人可变结构域被来自非人类物种的相应序列取代。实际上，人源化抗体通常为其中某些CDR残基和可能的某些FR残基被来自非人类(例如啮齿类动物)抗体的类似位点的残基取代的人抗体。

挑选用于制备人源化抗体的人可变结构域(轻链和重链二者)对于降低抗原性极为重要。根据所谓的“最佳拟合(best fit)”方法，根据已知的人可变结构域序列的完整文库来筛选啮齿类动物抗体的可变结构域序列。然后使最接近啮齿类动物序列的人序列作为用于人源化抗体的人构架(FR)(Sims等，1987，J.Immunol.151：2296；Chothia等，1987，J.Mol.Biol.196：901)。另一方法则利用来源于轻链或重链的特定亚群的所有人抗体共同序列的特定构架。相同的构架可用于若干不同的人源化抗体(Carter等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：4285；Presta等，1993，J.Immnol.151：2623)。

更重要的是对抗体进行人源化，使其保留对抗原的高亲和力和其它有利的生物学性质。为了达到这一目的，根据优选的方法，通过用母体和人源化序列的三维模型分析母体序列及各种概念上的人源化产物的方法来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型一般是可利用的，并为本领域技术人员所熟悉。可利用阐明并显示所挑选的候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构的计算机程序。对这些显示结构的检查使得可以分析残基在候选免疫球蛋白序列功能中所起的可能的作用，即分析影响候选免疫球蛋白与其抗原结合的能力的残基。以此方式，可从受体和输入序列选择并联合FR残基，以便获得所需的抗体特性，例如对一种或多种靶抗原的亲和力提高。一般而言，CDR残基直接并最充分地参与影响抗原结合。

对抗体的人源化是简单的蛋白质工程工作。几乎所有鼠抗体都可通过CDR嫁接来人源化，从而保持抗原结合性。参见Lo，Benny，K.C.编者，载于Antibody Engineering：Methods and Protocols(抗体工程：方法和方案)，第248卷，Humana Press，New Jersey，2004。

或者，现在还可能产生在免疫后在不产生内源性免疫球蛋白下能够产生完整人抗体库的转基因动物(例如小鼠)。例如，业已阐明在嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合缺失完全抑制了内源性抗体产生。将人种系免疫球蛋白基因阵列转移到所述种系突变小鼠中将导致在遇到抗原攻击时产生人抗体。参见例如Jakobovits等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：2551；Jakobovits等，1993，Nature362：255-258；Bruggermann等，1993，Year in Immunology 7：33；和Duchosal等，1992，Nature 355：258。人抗体还可来源于噬菌体展示文库(Hoogenboom等，1991，J.Mol.Biol.227：381；Marks等，J.Mol.Biol.1991，222：581-597；Vaughan等，1996，Nature Biotech 14：309)。

抗体纯化

当使用重组技术时，抗体可产生在细胞内、周质空间或直接分泌到培养基中。若抗体在细胞内产生，则作为第一步，例如通过离心或超滤去除颗粒碎片(宿主细胞或裂解的片段)。Carter等(1992，Bio/Technology 10：163-167)阐述用于分离分泌到大肠杆菌(E.coli)周质空间的抗体的方法。简言之，在乙酸钠(pH 3.5)、EDTA和苯基甲基磺酰氟(PMSF)存在下在约30分钟内使细胞泥浆冻融。通过离心去除细胞碎片。当抗体分泌到培养基中时，通常首先用市售的蛋白质浓缩过滤器(例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元)浓缩来自所述表达***的上清液。可在任何前述步骤中使用蛋白酶抑制剂(例如PMSF)以抑制蛋白水解，可使用抗生素以防止外来污染物生长。

可用例如羟基磷灰石、凝胶电泳、透析和亲和色谱从细胞制备抗体组合物，且亲和色谱是优选纯化技术。蛋白A作为亲和配体的适宜性视取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc区的种类和同种型。可将蛋白A用于纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的抗体(Lindmark等，1983，J.Immunol.Meth.62：1-13)。推荐将蛋白G用于所有小鼠同种型和用于人γ3(Guss等，1986，EMBOJ 5：15671575)。亲和配体所依附的基质最通常为琼脂糖，但可利用其它基质。机械稳定的基质例如可控孔度玻璃或聚(苯乙烯-二乙烯基苯)可比琼脂糖能获得的流速更快且处理时间更短。当抗体包含CH3结构域时，用Bakerbond ABX^TM树脂(J.T.Baker，Phillipsburg，N.J.)来纯化。根据待回收的抗体，还可利用其它蛋白质纯化技术，例如离子交换柱上分级分离、乙醇沉淀、反相HPLC、硅胶色谱法、肝素SEPHAROSETM色谱法、阴离子或阳离子交换树脂(例如聚天冬氨酸柱)色谱法、色谱聚焦法、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀。

在一个实施方案中，糖蛋白可通过以下方法来纯化：使糖蛋白吸附到凝集素基底上(例如凝集素亲和柱)，以从制备物中去除含岩藻糖的糖蛋白并由此富集无岩藻糖的糖蛋白。

药物制剂

本发明包括本发明PD-1抗体或抗体片段的药物制剂。为了制备药物组合物或无菌组合物，让抗体或其片段与可药用载体或赋形剂混合，参见例如Remington′s Pharmaceutical Sciences(雷明顿药物科学)和U.S.Pharmacopeia：National Formulary(美国药典：国家处方)，MackPublishing Company，Easton，PA(1984)。可通过与生理学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合，来制备呈例如冻干粉、浆液、水溶液剂或混悬剂形式的治疗及诊断药物的制剂(参见例如Hardman等(2001)Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics(Goodman和Gilman的治疗剂的药理学基础)，McGraw-Hill，New York，NY；Gennaro(2000)Remington：The Science and Practice of Pharmacy(雷明顿：药物科学和实践)，Lippincott，Williams和Wilkins，New York，NY；Avis等(编辑)(1993)Pharmaceutical Dosage Forms：ParenteralMedications(药物剂型：胃肠外药物)，Marcel Dekker，NY；Lieberman等(编辑)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms：Tablets(药物剂型：片剂)，Marcel Dekker，NY；Lieberman等(编辑)(1990)PharmaceuticalDosage Forms：Disperse Systems(药物剂型：分散***)，Marcel Dekker，NY；Weiner和Kotkoskie(2000)Excipient Toxicity and Safety(赋形剂毒性和安全性)，Marcel Dekker，Inc.，New York，NY)。

可通过标准药物方法，在细胞培养物或实验动物中测定单独给予或与免疫抑制剂联合给予的抗体组合物的毒性和治疗功效，所述方法例如为用于测定LD₅₀(使群体的50％致死的剂量)和ED₅₀(有效治疗群体的50％的剂量)的方法。毒性和治疗效果之间的剂量比是治疗指数，可表示为LD₅₀与ED₅₀之比。从这些细胞培养物测定及动物研究中获得的数据可用于调配用于人的剂量范围。所述化合物的剂量优选在包括毒性极少或无毒性的ED₅₀的循环浓度范围内。可根据采用的剂型及所用的给药途径，使剂量在该范围内变化。

合适的给药途径包括胃肠外给药(例如肌内、静脉内或皮下给药)及口服给药。可按多种常规方式给予用于药物组合物或用于实践本发明方法的抗体，这些方法例如有经口摄取、吸入、局部施用或经皮肤、皮下、腹膜内、胃肠外、动脉内或静脉内注射。在一个实施方案中，静脉内给予本发明的结合化合物。在另一个实施方案中，皮下给予本发明结合化合物。

或者，人们可以以局部而非全身方式(通常为长效制剂或缓释制剂)给予抗体，例如经由将抗体直接注射到作用位点。此外，人们可在靶向药物递送***中给予抗体。

可利用用于选择合适剂量的抗体、细胞因子和小分子的指南(参见例如Wawrzynczak(1996)Antibody Therapy(抗体治疗)，Bios ScientificPub.Ltd，Oxfordshire，UK；Kresina(编辑)(1991)Monoclonal Antibodies，Cytokines and Arthritis(单克隆抗体、细胞因子和关节炎)，MarcelDekker，New York，NY；Bach(编辑)(1993)Monoclonal Antibodies andPeptide Therapy in Autoimmune Diseases(在自身免疫病中的单克隆抗体和肽疗法)，Marcel Dekker，New York，NY；Baert等(2003)New Engl.J.Med.348：601-608；Milgrom等(1999)New Engl.J.Med.341：1966-1973；Slamon等(2001)New Engl.J.Med.344：783-792；Beniaminovitz等(2000)New Engl.J.Med.342：613-619；Ghosh等(2003)New Engl.J.Med.348：24-32；Lipsky等(2000)New Engl.J.Med.343：1594-1602)。

由临床医生例如用本领域已知或怀疑影响治疗或预期影响治疗的参数或因子来测定合适的剂量。通常，开始剂量比最佳剂量稍低，此后少量增加直到达到相对于任何不良副作用所要的或最佳的作用效果。重要的诊断测量包括测量例如炎性症状或所产生的炎性细胞因子的水平。

可通过连续输注或通过以一定间隔(例如一天、一周或每周1-7次)给药来提供抗体、抗体片段和细胞因子。可通过静脉内、皮下、腹膜内、经皮肤、局部、经口、经鼻、经直肠、肌内、大脑内、脊柱内或通过吸入来提供剂量。优选剂量方案是包括避免显著的不合乎需要的副作用的最大剂量或给药频率的方案。周总剂量通常为至少0.05μg/kg体重，更通常为至少0.2μg/kg，最通常为至少0.5μg/kg，典型地为至少1μg/kg，更典型地为至少10μg/kg，最典型地为至少100μg/kg，优选为至少0.2mg/kg，更优选为至少1.0mg/kg，最优选为至少2.0mg/kg，理想地为至少10mg/kg，更理想地为至少25mg/kg，而最理想地为至少50mg/kg(参见例如Yang等(2003)New Engl.J.Med.349：427-434；Herold等(2002)New Engl.J.Med.346：1692-1698；Liu等(1999)J.Neurol.Neurosurg.Psych.67：451-456；Portielji等(20003)Cancer Immunol.Immunother.52：133-144)。基于摩尔/kg计算，小分子治疗剂例如肽模拟物、天然产物或有机化学药剂的所需剂量与抗体或多肽的剂量接近相同。

本文所用“抑制”或“治疗(treat或treatment)”包括延缓与疾病有关的症状的发展和/或减轻所述疾病将要或预期发展的这些症状的严重程度。所述术语还包括减缓已有症状、防止另外的症状和减缓或防止这些症状的潜在原因。因此，所述术语表示业已将有益结果赋予患有疾病的脊椎动物对象。

本文所用术语“治疗有效量”或“有效量”是指当将抗PD-1抗体或其片段单独给予或与另外的治疗剂联合给予细胞、组织或受治疗者时，其有效防止或减缓待治疗的疾病或病症的量。治疗有效剂量进一步指所述化合物足以导致症状减缓的量，所述减缓症状例如为治疗、治愈、防止或减缓相关医学状态，或提高对所述病征的治疗率、治愈率、防止率或减缓率。当施用给个体单独给予的活性成分时，治疗有效量是指该单独的成分。当施用组合时，治疗有效量是指产生治疗效果的活性成分的联合的量，而不论其是联合给予、连续给予还是同时给予。治疗有效量将减轻症状通常至少10％；通常至少20％；优选至少约30％；更优选至少40％和最优选至少50％。

与第二种治疗剂共同给予或治疗的方法在本领域众所周知，参见例如Hardman等(编辑)(2001)Goodman and Gilman’s ThePharmacological Basis of Therapeutics(Goodman和Gilman的治疗剂药理学基础)，第10版，McGraw-Hill，New York，NY；Poole和Peterson(编辑)(2001)Pharmacotherapeutics for Advanced Practice：A PracticalApproach(最新实行的药物治疗学：实践方法)，Lippincott，Williams &Wilkins，Phila.，PA；Chabner和Longo(编辑)(2001)CancerChemotherapy and Biotherapy(癌症化疗和生物疗法)，Lippincott，Williams & Wilkins，Phila.，PA。

本发明药物组合物还可含有其它药剂，包括但不限于细胞毒剂、细胞生长抑制剂、抗血管形成药物或抗代谢药物、靶向肿瘤药物、免疫刺激剂或免疫调节剂或与细胞毒剂、细胞生长抑制剂或其它毒性药物缀合的抗体。也可与其它治疗形式(例如手术、化疗及放射)一起施用所述药物组合物。

典型的兽医、实验或研究对象包括猴、狗、猫、大鼠、小鼠、兔、豚鼠、马和人。

本发明抗体及抗体片段的治疗应用

与人PD-1特异性结合的本发明抗体或抗原结合片段可用于增加、提高、刺激或上调免疫应答。本发明抗体及抗体片段尤其适用于治疗罹患可通过提高T细胞介导的免疫应答来治疗的疾病的受治疗者。优选的受治疗者包括需要提高免疫应答的人患者。

癌症

本发明抗体或抗原结合片段可用于治疗癌症(即抑制肿瘤细胞的生长或存活)。可用本发明抗体抑制其生长的优选的癌症包括通常对免疫疗法有反应的癌症，但还包括迄今与免疫疗法尚无关联的癌症。用于治疗的优选癌症的非限制性实例包括黑素瘤(例如恶性转移性黑素瘤)、肾癌(例如透明细胞癌)、***癌(例如激素难控制的***腺癌)、胰腺腺癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌(例如非小细胞肺癌)、食道癌、头颈鳞状细胞癌、肝癌、卵巢癌、***、甲状腺癌、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、白血病、淋巴瘤和其它恶性肿瘤。另外，本发明包括可用本发明抗体抑制其生长的难治性或复发性癌。

本发明抗体或抗体片段可单独使用或与以下其它物质联合使用：抗肿瘤药或免疫原剂(例如减弱的癌细胞、肿瘤抗原(包括重组蛋白质、肽和糖类分子)、抗原呈递细胞例如用来源于肿瘤的抗原或核酸刺激的树突细胞、免疫刺激细胞因子(例如IL-2、IFNa2、GM-CSF_)和用编码免疫刺激细胞因子(例如但不限于GM-CSF)的基因转染的细胞；标准癌症治疗(例如化疗、放疗或手术)；或其它抗体(包括但不限于针对以下物质的抗体：VEGF、EGFR、Her2/neu、VEGF受体、其它生长因子受体、CD20、CD40、CTLA-4、OX-40、4-IBB和ICOS)。

感染性疾病

本发明抗体或抗体片段还可用于防止或治疗感染和感染性疾病。抗体或抗体片段可单独使用，或与疫苗联合使用，以刺激针对病原体、毒素和自体抗原的免疫应答。抗体或其抗原结合片段可用于刺激对感染人的病毒的免疫应答，这些病毒例如但不限于人免疫缺陷病毒、甲、乙、丙型肝炎病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、人巨细胞病毒、人***瘤病毒、疱疹病毒。抗体或其抗原结合片段可用于刺激对细菌或真菌寄生虫及其它病原体引起的感染的免疫应答。

免疫佐剂

本发明的抗体或抗体片段可与其它重组蛋白和/或肽(例如肿瘤抗原或癌细胞)联合使用，以便提高对这些蛋白的免疫应答(即在接种方案中)。

例如，通过共同给予抗PD-1抗体与目标抗原(例如疫苗)，可将抗PD-1抗体及其抗体片段用于刺激抗原特异性免疫应答。因此，本发明在另一方面提供了增强受治疗者对抗原的免疫应答的方法，所述方法包括给予受治疗者：(i)抗原；和(ii)本发明抗PD-1抗体或其抗原结合部分，以便提高受治疗者对抗原的免疫应答。例如，抗原可为肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原或来自病原体的抗原。所述抗原的非限制性实例包括但不限于肿瘤抗原或来自病毒、细菌或其它病原体的抗原。

Th2介导的疾病

本发明抗PD-1抗体及抗体片段还可用于治疗Th2介导的疾病，例如哮喘和过敏症。这基于本发明抗体可有助于诱导Th1反应的发现。因此，本发明抗体可用于Th2介导的疾病以产生更加平衡的免疫应答。

离体激活T细胞

本发明抗体和抗原片段还可用于离体使抗原特异性T细胞活化并增殖，并为了增加抗肿瘤的抗原特异性T细胞而将这些细胞过继转移到受者中。这些方法还可用于激活T细胞对病原体例如CMV的应答。在抗PD-1抗体存在下离体激活可预期提高过继转移的T细胞的频率和活性。

其它组合疗法

如上文所述，可共同给予本发明抗PD-1抗体及一种或多种其它治疗剂(例如细胞毒剂、放射性毒性剂或免疫抑制剂)。所述抗体可与所述药剂连接(作为免疫复合体)，或可与治疗剂分开给予。在后一种情况下(分开给予)下，可在给予治疗剂之前、之后或并行给予抗体，或可与其它已知的疗法共同给予。

本发明抗体和抗原结合片段还可用于提高供者移植的肿瘤特异性T细胞的有效性。

本发明抗体及抗体片段的非治疗性应用

非治疗性应用的抗PD-1抗体商品已经存在，其通过以下市售品来说明：由eBioscience of San Diego，California，USA所售的J116和J105单克隆抗hPD-1抗体，其用于流式细胞术分析、免疫组织化学和体外功能分析；由R&D Systems of Minneapolis，MN，USA所售的mab1086单克隆抗hPD-1抗体，其用于流式细胞术、蛋白质印迹和ELISA。本发明抗体可用于当前J116、J105和/或Mab1086所提供的任何非治疗目的。

本发明抗体可用作亲和纯化试剂。

所述抗体还可用于诊断测定，例如用于检测PD-1在特定的细胞、组织或血清中的表达。为了诊断应用，通常用可检测的部分标记(直接或间接)抗体。可利用众多标记物，其通常分为以下类别：生物素、荧光染料、放射性核苷酸、酶、碘和生物合成标记物。

本发明抗体可用于任何已知的测定法中，例如竞争性结合测定法，直接和间接夹心测定法和免疫沉淀测定法。Zola，MonoclonalAntibodies：A Manual of Techniques(单克隆抗体：技术手册)，第147-158页(CRC Press，Inc.1987)。

抗体还可用于体内诊断测定。通常用放射性核素(例如¹¹¹In、⁹⁹Tc、⁴C、³1I、¹²⁵I、³H、³²P、³⁵S或¹⁸F)标记抗体，以使可用免疫显像(immunoscintiography)或正电子成像术定位抗原或表达抗体的细胞。

材料保藏

业已将编码人源化抗体h409A11、h409A16和h409A17的重链和轻链的可变区的DNA构建体保藏在美国典型培养物保藏中心专利保藏处(10801 University Blvd.，Manassas，VA)。于2008年6月9日保藏含有编码h409A-11、h409A-16和h409A-17重链的DNA的质粒，其编号为081469_SPD-H。于2008年6月9日保藏含有编码h409A11轻链的DNA的质粒，其编号为0801470_SPD-L-11。于2008年6月9日保藏含有编码h409A16轻链的DNA的质粒，其编号为0801471_SPD-L-16。于2008年6月9日保藏含有编码h409A17轻链的DNA的质粒，其编号为0801472_SPD-L-17。保藏是在布达佩斯条约关于为Purpose of Patent Procedure and the Regulations thereunder(Budapest Treaty)的International Recognition of the Deposit ofMieroorganisms规定下进行的。

前述书面说明部分被认为足以使本领域技术人员能实践本发明。本发明不受保藏的培养物范围的限制，因为保藏的实施方案意欲仅为阐明本发明一方面，任何功能上等同的培养物都在本发明范围内。本文保藏材料并不构成承认本文包含的书面说明不足以实行本发明任何方面(包括其最佳方式)，也不能理解为将权利要求的范围限制到其所代表的特殊例子。实际上，除了本文所展示和阐述的内容之外，本领域技术人员从前述说明中显然可对本发明进行各种修改，这些修改落入所附的权利要求的范围内。

通过参考以下实施例将更充分地理解本发明。然而，这些实施例不应该理解为限制本发明范围。本文提及的所有文献和专利引用都明确地通过引用并入本文。

实施例

实施例1：免疫接种和选择抗PD-1抗体

用hPD-1cDNA免疫小鼠

为了产生针对人PD-1(‘hPD-1’)受体的抗体，通过PCR获得编码hPD-1受体可读框的cDNA，并将其亚克隆到载体pcDNA3.1(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。接下来，用hPD-1稳定转染CHO-K1细胞，用流式细胞术监测表达。分离在其膜上表达人PD-1的CHO-K1克隆并命名为CHO-hPD1。

通过用Helios基因枪(BioRad)和涂覆DNA的金弹(BioRad)根据制造商用法说明进行基因枪免疫来免疫接种小鼠。简言之，用2∶1∶1比例的hPD-1cDNA(克隆到pcDNA3.1中)和既定的市售小鼠Flt3L表达载体及小鼠GM-CSF(二者都来自Aldevron，Fargo ND)涂覆1μm金微粒。用总共1μg的质粒DNA来涂覆500μg的金弹。

具体而言，对7-8周龄的雌性BALB/C小鼠用基因枪在耳上进行免疫接种，在双耳上接受2、3或4个周期的轰击(参见表I)。一只小鼠在腹腔接受5×10⁶个CHO-hPD1细胞的最后加强免疫接种。通过用CHO-hPD-1对比CHO-K1母体细胞的细胞ELISA可检测到两次DNA免疫接种后的小鼠血清中抗hPD-1滴度大约为1∶1000。在最后免疫接种后4天，处死小鼠，根据已有的文献所述(Steenbakkers等，1992，J.Immunol.Meth.152：69-77；Steenbakkers等，1994，Mol.Biol.Rep.19：125-134)制备去除红细胞的脾细胞群，冷冻在-140℃中。

表I：用于在Balb/c小鼠中诱导hPD-1特异性抗体滴度的免疫时间表

第1周

第4周

第7周

第8周

第9周

第10周

第11周

小鼠730

2次轰击hPD1pCDNA3.1

收获脾细胞

小鼠731

2次轰击hPD1pCDNA3.1

4次轰击hPD1pCDNA3.1

5×10⁶个CHO-hPD1

收获脾细胞

小鼠738

2次轰击hPD1pCDNA3.1(mFlt3L+mGM-CSF)

收获脾细胞

选择产生抗PD-1抗体的B细胞

为了挑选产抗人PD-1抗体的B细胞克隆，将来自经hPD-1DNA免疫接种的小鼠(即小鼠730、731和738)(参见表I)的2×10⁷个去除红细胞的脾细胞合并用于B细胞培养。让脾细胞在DMEM/HAM氏F12/10％小牛血清(Hyclone，Logan，UT，USA)中于37℃下在塑料培养瓶中孵育1个小时以除去单核细胞。对非贴壁细胞进行一轮针对CHO-K1细胞的负淘选，接着进行针对CHO-hPD1细胞的正淘选。两个挑选程序都对在21cm²培养皿或T25培养瓶中的汇合生长的培养物于37℃下进行1小时(细胞培养物在使用前接受总剂量为2000RAD的辐射)。在正淘选后，通过用补充有0.132％CaCl₂.2H₂O和0.1％MgCl₂.6H₂O的PBS洗涤10次来除去未结合的细胞。最后，通过胰蛋白酶处理来收获结合的B细胞。

如Steenbakkers等(1994，Mol.Biol.Rep.19：125-134)所述培养所挑选的B细胞并使其永生化。简言之，让所选B细胞与7.5％(v/v)T细胞上清液及50,000个经辐射的(2,500RAD)EL-4B5养育细胞(nursingcell)于终体积为200μL的DMEM/HAM氏F12/10％小牛血清中在96-孔平底组织培养板中混合。在第8天，用以下程序通过CHO-hPD-1细胞ELISA根据其抗hPD-1反应性来对上清液进行筛选。使CHO-K1和CHO-hPD1细胞在平底96-孔板中于50μL DMEM/HAM氏F12/10％FBS中培养到汇合。接下来，加入50μL含有免疫球蛋白的上清液，在37℃孵育1小时。在用PBS-Tween洗涤3次后，加入100μL含(1∶1000稀释的)山羊抗小鼠-辣根过氧化物酶(HRP，Southern，Birmingham，AL，USA)的DMEM/HAM氏F12/10％FBS，在37℃孵育1小时。用PBS-Tween洗涤3次后，用UPO/TMB(Biomerieux，Boxtel，Netherlands)显现固定化的免疫球蛋白。

鉴定了来自该B细胞培养物的13份hPD-1反应性上清液，其显示当固定化在塑料上时抑制Jurkat T细胞活化，通过按照以下公开的程序(Steenbakkers等，1992，J.Immunol.Meth.152：69-77；Steenbakkers等，1994，Mol.Biol.Rep.19：125-134)进行微电融合，使来自阳性孔的B细胞克隆永生化。具体而言，让B细胞与10⁶个NS-1骨髓瘤细胞混合，通过用DMEM/HAM氏F12洗涤去除血清。接着用链霉蛋白酶溶液处理细胞3分钟，随后用融合培养基洗涤。通过30秒、2MHz、400V/cm的交变电场，接着10微秒、3kV/cm的方形高电场脉冲和再次30秒、2MHz、400V/cm的交变电场，在50μL融合槽内实施电融合。最后，将融合槽的内容物转移到杂交瘤选择培养基中，并在有限稀释条件下置于96-孔板上。在融合后第14天，检查培养物中的杂交瘤生长情况，并筛选是否存在对hPD-1的抗体活性。该程序制得5株不同的抗hPD-1杂交瘤，命名为hPD-1.05A、hPD-1.06B、hPD-1.08A、hPD-1.09A和hPD-1.13A，通过有限稀释将它们亚克隆以保护其完整性，并进一步培养以产生抗体。从这些杂交瘤获得的上清液强烈抑制Jurkat E6.2.11细胞在受到抗CD3/抗CD28刺激时产生IL-2(参见图1和下文)。

通过用标准方法的有限稀释对Jurkat E6.1细胞(美国典型培养物保藏中心)进行亚克隆，并测试亚克隆在交联CD3和CD28时提高的产IL-2能力。获得高产IL-2的亚克隆，将其命名为Jurkat E6.2.11，并用于进一步测定。用5μg/mL绵羊抗小鼠Ig(Sheep Anti-Mouse Ig，SAM)在4℃过夜包被Costar 337096-孔测定板。去除过量的SAM，用200μL/孔PBS/10％胎牛血清在室温将板封闭1小时。在用PBS洗涤3次后，用100μL/孔抗CD3(OKT3；10或60ng/mL)在37℃包被1小时。在用PBS洗涤3次后，加入50μL/孔PBS/10％胎牛血清和50μL/孔B细胞或杂交瘤上清液，在37℃孵育30分钟。在用PBS洗涤3次后，加入120μL/孔细胞悬浮液(Jurkat E6.2.11细胞)(含2×10⁵个细胞/孔+0.5μg/mL抗CD28(Sanquin#M1650，Central Laboratory forBloodtransfusion，Amsterdam，NL)的DMEM/F12/10％胎牛血清)。培养6小时后，用来自Pharmingen的抗hIL-2捕获和生物素化的检测抗体对和链霉亲和素-辣根过氧化物酶(Southern Biotech)作为检测试剂，用标准夹心ELISA检查上清液的IL-2生产。为了测定这些抗体与PD-L1相比的功效，大规模制备一小组mAb。用蛋白G亲和色谱纯化这些mAb(参见实施例2)。如上文所述，将纯化的抗体hPD-L1/Fc(重组人B7-H1/Fc嵌合体，R&D systems)或作为阴性对照的小鼠IgG1κ(来自Sigma)以同样的浓度包被含抗CD3的板。加入Jurkat E6.2.11细胞和抗CD28孵育6小时，根据上清液中产生的IL-2来测量T细胞活化情况。结果显示两种抗体(hPD1.08A和hPD1.09A)相对于固定化的PD-L1/Fc抑制功效高8-10倍。

实施例2：鼠抗PD-1抗体的纯化和表征

产生抗PD-1的杂交瘤的稳定化和抗PD-1抗体的纯化

通过让各株杂交瘤接受多轮(＞4)有限稀释从所述杂交瘤获得克隆细胞群。然后在无血清条件下用CELLine生物反应器(Integra-biosciences)培养稳定的杂交瘤细胞6-8天。将15mL含密度为3×10⁶个细胞/mL的细胞的无血清培养基接种到内室中，并经8天使其增殖到大约4×10⁷个细胞/mL。外室加满补充有至多10％BCS(小牛血清)的培养基。在第6-8天，收获内室培养物，用15mL SF培养基洗涤，用杂交瘤细胞重新接种。合并生物反应器上的清液和洗涤物，并离心澄清。通过0.22μM滤膜过滤得到的上清液。为了纯化抗体，将上清液以1∶1稀释在高盐结合缓冲液(1M甘氨酸/2M NaCl，pH 9.0)中，用蛋白G HiTrap 5mL柱(GE healthcare)纯化mAb。在用PBS洗涤后，用0.1M甘氨酸(pH＝2.7)洗脱已结合的抗体，接着用3M Tris中和pH。最后，用PD-10凝胶过滤柱(GE healthcare)以PBS替换缓冲液，用Ultra-15离心浓缩仪(Amicon)浓缩抗体，并用分光光度法进行定量。

市售抗体

在本文所述各种研究中使用以下市售抗体：抗PD-1抗体克隆J116(编号14-9989)购自eBioscience。抗CTLA-4克隆14D3(mAb 16-1529)购自eBioscience。抗PD-1克隆192106(mAb1086)购自R&D systems(编号mAb1086)。同种型对照抗体mIgG1、κ、克隆MOPC21购自Sigma(编号M9269)。同种型对照mIgG1κ(mAb 16-4714)和IgG2a κ(mAb16-4724)购自eBioscience。

结合分析

基于蛋白质和基于细胞的ELISA(‘CELISA’)实验用于测定表观结合亲和力(apparent binding affinity)(报告为EC₅₀值)。在某些情况下，比较抗PD-1抗体的结合情况与市购抗PD-1抗体J116(eBiosciences)和Mab1086(R&D systems)的结合情况。

蛋白质ELISA用于测定抗体与人PD-1/Fc的相对结合。通过室温孵育4小时(或在4℃过夜)将hPD-1/Fc(R&D Systems)固定化在Maxisorp 96-孔板(Nunc)上。通过与含3％BSA的PBST室温孵育1小时来阻断非特异性结合位点。包被后，用PBST洗涤所述板3次。用结合缓冲液(含有0.1％Tween 20和0.3％BSA的PBS)制备抗PD-1抗体的稀释液，将其与固定化的融合蛋白在25℃下孵育1小时。结合后，用PBST洗涤所述板3次，在25℃下用含稀释至1/4,000的过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG(Southern Biotech)的结合缓冲液孵育1小时，再次洗涤，用TMB显色。ELISA结果示于图2中。用半最大结合浓度表示相对结合亲和力的量值(表II)。

还通过CELISA来评估与CHO-hPD-1细胞的结合情况。对于CELISA，在50μL培养基(DMEM/HAM氏F12/10％FBS)中将CHO-hPD-1细胞培养到80-100％汇合。接着加入50μL含有各种浓度的纯化mAb的培养基，在37℃孵育1小时。在用PBS-Tween洗涤3次后，加入100μL山羊-抗小鼠-HRP(Southern Biotech，目录编号1030-05)(在培养基中以1∶1000稀释)，在37℃孵育1小时。在用PBS-Tween再洗涤3次后，用显色过氧化物酶底物TMB(BDBiosciences)来显现固定化的免疫球蛋白。在微量滴定板读数器中测量因过氧化物酶活性而增加的吸光度(450nm)。图2显示了浓度和抗体hPD-1.08A及hPD-1.09A结合情况之间的剂量反应相关性。蛋白质和细胞结合研究的结果概述于表II中。

生物发光干涉测量法(ForteBio)的动力学分析

为了进一步表征抗体的结合特性，在Octet***(ForteBio，MenloPark，CA)上用生物发光干涉测量法对各种抗体进行概况分析(profile)，以阐明结合动力学并计算平衡结合常数。通过用标准胺化学试剂让PD-1-Fc融合蛋白(R&D Systems)与胺反应性生物传感器(Fortebio)偶联来实施该测定。然后观察在各种抗体浓度下抗PD-1mAb与生物传感器的结合情况及所述抗体从生物传感器的解离情况。具体而言，通过将胺反应性生物传感器浸没在含有0.1M MES pH＝5.5的孔中5分钟来使其预湿润。然后用0.1M NHS/0.4M EDC混合物激活生物传感器5分钟。通过将生物传感器浸没在12ug/mL PD-1/Fc的0.1M MES溶液中7.5分钟来与PD-1/Fc融合蛋白(R&D systems)偶联。用1M乙醇胺溶液使生物传感器表面淬灭5分钟。用PBS平衡生物传感器5分钟。通过将生物传感器置于含有各种抗体浓度(含10-80nM由SDS-PAGE纯化的＞99％的抗体的PBS)的孔中来观察与抗PD-1mAb的缔合情况，并监测干涉测量30分钟。在将生物传感器转移到PBS后测量解离，并监测干涉测量信号60分钟。用包含所有测试浓度的1∶1的结合球形拟合模型(binding global fit model)拟合所观察到的结合和解离率(k_obs和k_d)，计算平衡结合常数K_D。动力学研究结果显示于以下表II和图6中。

表II：鼠抗PD-1mAb的生物化学表征概述

两种克隆抗体hPD-1.08A和hPD-1.09A比使用该测定所测试的任何其它mAb都结合得更紧密，且对于hPD-1.08A和hPD-1.09A所测定的K_D分别为24和22pM。与测试的其它抗PD-1抗体相比，亲和力增加是由于所测量的hPD-1.08A和hPD-1.09A解离率减慢而结合率显著加快。

配体阻断

用流式细胞术研究对配体结合的阻断。将表达人PD-1的CHO细胞从贴壁培养瓶中剥离，并在96-孔板中与各种浓度的抗PD-1抗体和恒定浓度(600ng/mL)的未标记的hPD-L 1/Fc或重组人PD-L2/Fc融合蛋白(二者都来自R&D Systems)混合。让混合物在冰上平衡30分钟，用FACS缓冲液(含有1％BCS和0.1％叠氮钠的PBS)洗涤3次，用FITC标记的山羊抗人Fc在冰上再孵育15分钟。用FACS缓冲液再次洗涤细胞并用流式细胞术分析。用Prism(GraphPad软件，San Diego，CA)用非线性回归分析数据并计算IC₅₀值。

计算得到的IC₅₀数据概述于表II中。测定抗体05A、06B和13A以证明与hPD-1结合的K_D在600pM和3nM之间。尽管这些抗体结合紧密，但其各自证明阻断hPD-L1与hPD-1结合的IC₅₀＞10nM。市售抗PD-1抗体J116(eBiosciences)与PD-L1的竞争结合性弱，其计算的IC₅₀超出本实验范围(＞100nM)。对照小鼠IgG1并不与PD-L1竞争结合PD-1。与此相反，高亲和力抗体hPD-1.08A和hPD-1.09A以低于1nM的IC₅₀值抑制PD-L1结合，而以大约1-2nM的IC₅₀值阻断PD-L2结合(表II)。先前的研究报道PD-L2以相对于PD-L1高2-6倍的高亲和力与PD-1结合(Youngnak P.等，2003，Biochem.Biophys.Res.Commun.307、672-677)。

用同类竞争测定法(homogeneous competition assay)确证配体阻断，并用荧光微量测定技术(fluoremetric microvolume assay technology，FMAT)检测。简言之，从贴壁培养瓶剥离CHO.hPD-1，在96-孔板中与各种浓度的抗PD-1抗体和恒定浓度(600ng/mL)的用荧光染料(AlexaFluor 647，Invitrogen)标记的hPD-L1/Fc或hPD-L2/Fc融合蛋白(二者都来自R&D Systems)混合。让混合物在37℃下平衡90分钟，用AB8200 Cellular Detection Analyzer(细胞检测分析仪)(AppliedBiosystems，Foster City，CA)读数。用Prism(GraphPad软件，San Diego，CA)用非线性回归分析数据，计算IC₅₀值。图3显示表明由抗体浓度测定的配体阻断大小的剂量反应实验结果。hPD-L1/Fc和hPD-L2/Fc二者与CHO-hPD-1细胞的结合可受到hPD-1.08A、hPD-1.09A和(程度更小的)J116以剂量依赖方式完全抑制。计算的IC₅₀数据概述于表II中。用流式细胞术确证了所获得的结果，高亲和力的抗体hPD-1.08A和hPD-1.09A以低于1nM的IC₅₀值抑制PD-L1结合。

物种间的交叉反应性

为了评估物种间抗体的交叉反应性，通过PCR克隆小鼠和食蟹猴(cynomolgus macaque)的PD-1受体，并产生稳定转染的CHO-K1细胞。用CELISA测试抗体与食蟹猴受体的结合情况。发现市售抗体J116、hPD-1.08A和hPD-1.09A以相等的亲和力与人及食蟹猴PD-1结合，并以与人PD-1相似的效率阻断hPD-L1/Fc和hPD-L2/Fc与食蟹猴PD-1结合。这并不值得稀奇，因为发现食蟹猴PD-1的胞外部分的氨基酸序列与人PD-1有97％的同一性。除了来自食蟹猴的PD-1外，在实施例3所述的SEB刺激的血细胞培养物中hPD-1.08A和hPD-1.09A也起到阻断恒河猴(rhesus macaques)PD-1的作用。在所用的任何测定中没有一种测试抗体能以可检测的亲和力结合小鼠PD-1。

综上所述，纯化并表征了5种抗PD-1单克隆抗体，所述抗体接受过基于其调节Jurkat功能的能力的分离。这些抗体与PD-1紧密结合(解离常数在20pM-3nM的范围内)并能够以不同的IC₅₀值阻断与PD-L1和PD-L2二者的相互作用。这些抗hPD-1mAb中有4种比最好的市售抗PD-1mAb还要好很多。当加入到溶液中时，每种抗体都起受体拮抗剂作用，最终增强了T细胞应答(参见实施例3)。

实施例3：对抗PD-1抗体的功能概况分析

hPD-1.08A和hPD-1.09A增强了人T细胞对SEB的应答

用来自健康志愿者的血细胞在体外测试了抗PD-1抗体提高T细胞活性的能力。一个测定用于表征用葡萄球菌肠毒素B(SEB)阻断人PD-1受体以动员和激活所有表达Vβ3和Vβ8T细胞受体链的T细胞的功能结果。获取健康人供者血液，以1∶10稀释到培养基中。将稀释的全血铺板(150μl每孔)到96-孔圆底板中，用mAb(用各种浓度)预孵育30-60分钟。然后以10ng/mL-10μg/mL的不同浓度范围加入SEB。在培养2-4天后收集上清液，用ELISA(实施例1中所述)或用标准多重技术(Luminex平台-Biosource细胞因子检测试剂盒)定量测量所产生的IL-2的量。从100ng/mL到高达10μg/mL的SEB滴定显著刺激全血细胞的IL-2产生。通常在用1μg/mL SEB刺激后2-4天，可由ELISA检测到100-1000pg/mL IL-2，视供者而定。hPD-1.08A和hPD-1.09A的加入提高了IL-2产生，在最高测试抗体浓度(25μg/mL)下平均高于对照小鼠IgG1的2-4倍。在对一组独立的健康志愿者实施的实验中对刺激指数取平均值(图4)。这些实验证明hPD-1.08A和hPD-1.09A二者都在SEB刺激稀释的全血细胞下提高IL-2的产生。在SEB刺激全血细胞后PD-1和PD-L1(但PD-L2不是)表达水平随时间上调(由流式细胞术定量测定)。抗PD-L1单克隆抗体(克隆MIH5，Ebiosciences编号16-5982)和抗CTLA-4(克隆14D3，eBiosciences编号16-1529)也在类似条件下诱导IL-2产生的增加，这一发现进一步证实可采用SEB刺激测定法以在操纵共同刺激途径后定量测定T细胞活性(图4)。发现由抗PD-1抗体提高的IL-2产生具有剂量依赖性。除IL-2外，通过Luminex技术还发现TNFα、IL-17、IL-7、IL-6和IFNγ水平受到hPD-1.08A和hPD-1.09A显著调节。这些实验结果表明hPD-1.08A和hPD-1.09可用于刺激人T细胞应答。

用来源于癌症患者的血细胞在体外进一步测试抗PD-1抗体hPD-1.09A提高T细胞活性的能力。按照上述方案测试来自晚期黑素瘤(1名患者)或***癌(3名患者)的患者的血液。在表III中，细胞因子的定量结果表示为：当细胞在25ug/mL hPD-1.09A存在下受刺激时所产生的细胞因子相对于在缺乏抗体下SEB刺激所产生的细胞因子的倍数增加。总的来说，结果发现对于4名患者中的每一位，hPD-1.09A使SEB诱导的IL-2产生提高2-3.5倍。同样地，提高了TNFα、IL-17和IFNγ的产生，而IL-5和IL-13的产生则降低。这些实验表明hPD-1.09A有能力在癌症患者中刺激T细胞应答。此外，这些实验提示了对Th1应答的偏爱性。

表III：在hPD-1.09A存在下SEB刺激的细胞因子产生

hPD-1.08A和hPD-1.09A提高人回忆T细胞对TT攻击的应答

在用于分析抗人PD-1抗体阻断受体与其天然配体相互作用的功能效果的概况的另一测定中，使用了破伤风类毒素(TT)抗原来刺激在健康供者血液中预先存在的记忆T细胞。为该目的，将新鲜制备的PBMC(2×10⁵个细胞)铺板到含RPMI 1640完全培养基(含有5％热灭活的人血清)的96孔圆底板中，与各种浓度的测试抗体预孵育，用100ng/mL浓度的TT(Astarte Biologics)刺激。在收获上清液后，让细胞在37℃、5％CO₂下孵育3-7天。通过ELISA(来自eBioscience的IL-2和IFN-γγELISA检测抗体对组)和多重分析(Luminex平台-Biosource细胞因子检测试剂盒)测定细胞因子浓度。与单独的抗原相比，对PD-1的阻断提高了细胞增殖并显著提高细胞因子(包括IFNγ和IL-2)的产生(图5)。Luminex分析显示在PD-1阻断时提高了细胞因子GM-CSF、RANTES和IL-6的产生。

对***固定石蜡包埋的人细胞中的人PD-1的染色

由于由流式细胞术证明了经SEB刺激的血细胞提高PD-1表达，因而将这些细胞用于判定hPD-1.09A是否能检测用于组织学应用的***固定石蜡包埋组织中的PD-1。用0.1μg/mL SEB刺激人供者外周血单核细胞3天，随后收集非贴壁细胞(主要是淋巴细胞)，用PBS洗涤2次并离心(1100rpm 5分钟)。在4％甲醛中让细胞固定10分钟，将细胞沉淀包埋在琼脂糖中，在乙醇(依次为70％、80％、96％和100％)和二甲苯中脱水，此后在石蜡中包埋。将切片(4μm)固定到载玻片上并进行水合(二甲苯、100％、96％、80％、70％的乙醇、PBS缓冲液)，随后用标准方法在热柠檬酸盐缓冲液中实施抗原提取。用包含0.3％H₂O₂的100％甲醇阻断过氧化物酶活性，用水和PBS、Tween 0.1％漂洗载玻片。在室温下让切片与hPD-1.09A孵育1.5小时，用PBS-Tween漂洗，接着使用标准检测方法。在室温下用苏木精复染载玻片30秒，用二甲苯脱水，固定用于显微镜检查。这些实验显示，与未刺激的PBMC培养物相反的是，使用hPD-1.09A致使来源于SEB刺激的PBMC培养物的淋巴细胞被强烈染色(与同型对照相比)，这表明hPD-1.09A可用作诊断试剂。

实施例4：抗PD-1抗体序列和随后的人源化

克隆免疫球蛋白cDNA

用基于简并引物PCR的方法，测定编码由杂交瘤hPD-1.08A和hPD-1.09A表达的小鼠抗体可变区的DNA序列。简言之，用iScriptSelect cDNA合成试剂盒(Biorad编号1708896)按厂商用法说明制备重链和轻链的基因特异性cDNA。所用PCR引物基于Ig-引物组(Novagen编号69831-3)。用Taq聚合酶按照Novagen引物组方案实施简并PCR反应。由琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。重链和轻链二者的可变区扩增子的预期大小约为500个碱基对。根据厂商指导将反应所得的条带大小合适的2μl的Taq扩增PCR产物克隆到pCR4 TOPO载体(Invitrogen编号K4595-40)中，并转化到DH5-α大肠杆菌中。通过用通用的M13正向和反向引物的菌落PCR筛选克隆，从每个反应选择2-3个克隆用于DNA测序分析。

用通用引物M13正向、M13反向、T3和T7在两个方向上对克隆进行测序。用Seqman分析用于每个克隆的每个测序反应结果。用NCBI Ig-Blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/igblast/)在种系和重排Ig可变区序列数据库中搜索共有序列。hPD-1.08A的Blast结果确定了无终止密码子引入的产生性(框内)重排重链。确定了编码两个不同序列的轻链克隆；一个是无终止密码子引入的产生性(框内)重排轻链，另一个是非产生性重排序列，其含有导致终止密码子在FR4区内的移码。所观察到的非产生性无效转录物很可能来源于骨髓瘤融合配偶体(Carroll W.L.等，Mol.Immunol.25：991-995(1988)，将其排除在外。

hPD-1.09A的Blast结果确定了无终止密码引入的产生性(框内)重排的重链和轻链。通过质谱法确证所表达蛋白的氨基酸序列。序列在所附序列表中公开并在表IV中列出。

表IV：本发明鼠抗人PD-1抗体的序列ID号

SEQ ID NO：	说明
		1	hPD-1.08A重链可变区(DNA)
2	hPD-1.08A轻链可变区(DNA)
		3	hPD-1.09A重链可变区(DNA)
4	hPD-1.09A轻链可变区(DNA)
		5	hPD-1.08A重链可变区(AA)
6	hPD-1.08A轻链可变区(AA)
		7	hPD-1.09A重链可变区(AA)
8	hPD-1.09A轻链可变区(AA)
		9	hPD-1.08A轻链CDR1(AA)
10	hPD-1.08A轻链CDR2(AA)
		11	hPD-1.08A轻链CDR3(AA)
12	hPD-1.08A重链CDR1(AA)
		13	hPD-1.08A重链CDR2(AA)
14	hPD-1.08A重链CDR3(AA)
		15	hPD-1.09A轻链CDR1(AA)
16	hPD-1.09A轻链CDR2(AA)
		17	hPD-1.09A轻链CDR3(AA)
18	hPD-1.09A重链CDR1(AA)
		19	hPD-1.09A重链CDR2(AA)
20	hPD-1.09A重链CDR3(AA)
		21	109A-H重链可变区(DNA)
22	密码子优化的109A-H重链可变区(DNA)
		23	密码子优化的409A-H重链全长(DNA)

24	K09A-L-11轻链可变区(DNA)
		25	K09A-L-16轻链可变区(DNA)
26	K09A-L-17轻链可变区(DNA)
		27	密码子优化的K09A-L-11轻链可变区(DNA)
28	密码子优化的K09A-L-16轻链可变区(DNA)
		29	密码子优化的K09A-L-17轻链可变区(DNA)
30	109A-H重链可变区(AA)
		31	409A-H重链全长(AA)
32	K09A-L-11轻链可变区(AA)
		33	K09A-L-16轻链可变区(AA)
34	K09A-L-17轻链可变区(AA)
		35	109A-H重链全长(AA)
36	K09A-L-11轻链全长(AA)
		37	K09A-L-16轻链全长(AA)
38	K09A-L-17轻链全长(AA)

CDR和构架区按照如下文献注释：Kabat E.A.等，1991，Sequencesof proteins of Immunological interest(免疫目的物的蛋白质序列)，In：NIH Publication No.91-3242，US Department of Health and HumanServices，Bethesda，MD。

构建和表达嵌合c109A抗体

通过将PCR克隆的小鼠hPD-1.09A VL和VH区cDNA分别与人κ和IgG1恒定区连接，来构建嵌合轻链和重链。用PCR引物修饰小鼠cDNA序列的5’和3’端，所述引物设计成为各链增加合适的前导序列，并增加使得能克隆到现有重组抗体表达载体上的限制性位点。

用10μg各种嵌合重链和轻链表达质粒电穿孔COS-7细胞(0.7mL，10⁷/mL)。然后在8mL生长培养基中培养这些细胞3天。用夹心ELISA测量来自COS-7转染上清液的抗体浓度。这显示在3次单独转染中转染的COS-7细胞分泌约295ng/mL的嵌合IgG₁-κ抗体。

用PD-1结合ELISA和CELISA(参见实施例2)测量由经转染的COS-7细胞产生的嵌合抗体的结合情况，结果显示所述嵌合抗体以比得上鼠抗体的亲和力结合PD-1。

人源化抗体设计

用CDR移植技术(参见例如美国专利第5,225,539号)通过MRCT(Cambridge UK)使hPD-1.09A抗体人源化。简言之，将鼠抗体hPD-1.09A的可变链序列与结构生物信息学合作研究协会(ResearchCollaboratory for Structural Bioinformatics，RCSB)蛋白质数据库中的可用序列比较。基于最接近的VH和VK结构生成hPD-1.09A同源性模型。鉴定并分析了与hPD-1.09A具有最高同一性的人序列。(Foote和Winter，J.Mol.Biol.224：487-499(1992)；Morea V.等，Methods20：267-279(2000)；Chothia C.等，J.Mol.Biol.186：651-663(1985).)确定了最合适在其上构建CDR移植重链和轻链的人构架。

对于重链，由基因库登记号AB063829编码的构架确定为最合适。对hPD-1.09A VK序列的分析显示在任何人VK中都未发现其CDR1长度(15个残基)。为了这一原因，分析了3种不同CDR1长度(11、16和17个残基)的构架，以测试哪种CDR1长度可重现hPD-1.09A VK的性能。鉴定了在所选的对结构重要的残基处与hPD-1.09A VK具有最高同一性并具有11、16和17个残基的CDR1长度的人VK序列。选定基因库登记号M29469的构架作为K109A-L-11的基础。选定来自基因库登记号AB064135的构架作为K109A-L-16的基础和来自基因库登记号X72431的构架作为K109A-L-17的基础。

实施直接移植以产生各链的表达构建体。109A-H、K09A-L-11、K09A-L-16和K09A-L-17的DNA和蛋白质序列公开于所附的序列表(表IV)中。

产生了具有稳定阿代尔(Adair)突变(Angal S.等，Mol.Immuol.30：105-108(1993))的IgG4形式的人源化h109A抗体，其中241位丝氨酸(Kabat编号***)转换为脯氨酸。该序列公开在SEQ ID NO：23和31中。

实施例5：人源化抗PD-1抗体的结合特性和功能性质

制备和纯化

通过瞬时转染CHO-S细胞制备人源化抗体h409A11、h409A16和h409A17。细胞在摇瓶中于CD-CHO(Gibco)和C5467培养基(Sigma)中生长8天。通过蛋白A色谱，洗涤，用1M乙酸洗脱并用3M Tris中和，来纯化来自细胞上清液的抗体。最后，将缓冲液换成业已用1MTris碱调整到pH 5.5的100mM乙酸。

结合和动力学分析

如实施例2所述实施基于蛋白质和基于细胞的ELISA以测定表观结合亲和力(表示为EC₅₀值)。各种人源化抗PD-1抗体以比得上鼠母体抗体的EC₅₀值与PD-1/Fc和细胞表达的PD-1结合(表V)。

还用实施例2所述的生物发光干涉测量法实施抗体的动力学结合特性(图6)。两种人源化抗体h409A11和h409A16比使用该测定法所测试的任何其它mAb都结合得更紧密，且所测定的h409A11和h409A16的K_D分别为29和27pM(表V)。与所测的其它抗PD-1抗体相比，亲和力增加主要是由于解离率减慢。结果证明，与鼠母体抗体相似，人源化抗PD-1抗体h409A11、h409A16以测定为低于120pM的K_D与食蟹猴PD-1结合。

配体阻断

如实施例2所述，用同类竞争测定法测量和用FMAT竞争测定法检测人源化抗体阻断PD-L1和PD-L2与PD-1结合的能力。

hPD-L1/Fc和hPD-L2/Fc二者与CHO-hPD-1细胞的结合都可被所测试的任何人源化抗体以剂量依赖方式完全抑制。计算的IC₅₀数据概述于表V中。与鼠母体抗体hPD-1.09A相似，人源化mAb：h409A11、h409A16和h409A17中的每一种都以低于1nM的IC₅₀值抑制与PD-L1和PD-L2结合。结果证明，与鼠母体抗体相似，人源化抗PD-1抗体h409A11、h409A16和h409A17能抑制配体与食蟹猴PD-1的结合，且计算的IC₅₀值低于约1nM。

表V：本发明人源化抗hPD-1抗体的结合特性

人源化mAb增强人T细胞对SEB的应答

如实施例3所述，用来自健康志愿者的血细胞在体外测试人源化抗PD-1抗体增强T细胞活性的能力。培养4天后收集上清液，用ELISA定量测定所产生的IL-2的量。人源化PD-1抗体表现出提高由SEB刺激的IL-2产生的能力(图7)。另外，人源化PD-1抗体在癌症患者血液中提高SEB诱导的IL-2产生，与实施例3中所述的结果相似。

综上所述，人源化mAb h409A11、h409A16和h409A17在人源化过程中保留所有功能活性。h409A11和h409A16mAb在人源化后完全保留了小鼠母体抗体hPD109A的亲和力。

序列表

<110>奥根农股份公司

G.J.卡文

H.范伊宁纳姆

G.J.杜洛斯

<120>针对人程序性死亡受体PD-1的抗体

<130>OR06827

<150>60/944583

<151>2007-06-18

<160>38

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>435

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hPD-1.08A重链可变区

<400>1

atgrgatgga gctgtatcat kctctttttg gtagcaacag ctacaggtgt ccactcccag 60

gtccaactgc agcagcctgg ggctgaactg gtgaagcctg gggcttcagt gaagttgtcc 120

tgcaaggcct ctggctacac cttcaccagt tattatctgt actggatgaa acagaggcct 180

ggacaaggcc ttgagtggat tgggggggtt aatcctagta atggtggtac taacttcagt 240

gagaagttca agagcaaggc cacactgact gtagacaaat cctccagcac agcctacatg 300

caactcagca gcctgacatc tgaggactct gcggtctatt actgtacaag aagggattct 360

aactacgacg ggggctttga ctactggggc caaggcacta ctctcacagt ctcctcagcc 420

aaaacgacac cccca 435

<210>2

<211>453

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hPD-1.08A轻链可变区

<400>2

atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60

gacattgtgc tgacacagtc tcctacttcc ttagctgtat ctctggggca gagggccacc 120

atctcatgca gggccagcaa aagtgtcagt acatctggct ttagttattt gcactggtac 180

caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctttc ttgcatccaa cctagagtct 240

ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 300

cctgtggagg aggaggacgc tgcaacctat tattgtcagc acagttggga gcttccgctc 360

acgttcggtg ctgggaccaa gctggagctg aaacgggctg atgctgcacc aactgtatcc 420

atcttcccac catccagtaa gcttgggaag ggc 453

<210>3

<211>464

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hPD-1.09A重链可变区

<400>3

atgraatgca gctgggttat yctctttttg gtagcaacag ctacaggtgt ccactcccag 60

gtccaactgc agcagcctgg ggctgaactg gtgaagcctg ggacttcagt gaagttgtcc 120

tgcaaggctt ctggctacac cttcaccaac tactatatgt actgggtgaa gcagaggcct 180

ggacaaggcc ttgagtggat tggggggatt aatcctagca atggtggtac taacttcaat 240

gagaagttca agaacaaggc cacactgact gtagacagtt cctccagcac aacctacatg 300

caactcagca gcctgacatc tgaggactct gcggtctatt actgtacaag aagggattat 360

aggttcgaca tgggctttga ctactggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctcagcc 420

aaaacgacac ccccatccgt ytatcccbtg gcccctggaa gctt 464

<210>4

<211>438

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hPD-1.09A轻链可变区

<400>4

atggagwcag acacactsct gytatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggc 60

gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctgggaca gagggccgcc 120

atctcatgca gggccagcaa aggtgtcagt acatctggct atagttattt gcactggtac 180

caacagaaac caggacagtc acccaaactc ctcatctatc ttgcatccta cctagaatct 240

ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 300

cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc acagtaggga ccttccgctc 360

acgttcggta ctgggaccaa gctggagctg aaacgggctg atgctgcacc aactgtatcc 420

atcttcccac catccagt 438

<210>5

<211>122

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>hPD-1.08A重链可变区

<400>5

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Leu Tyr Trp Met Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Gly Val Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Ser Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Arg Asp Ser Asn Tyr Asp Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys

115 120

<210>6

<211>111

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>hPD-1.08A轻链可变区

<400>6

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Thr Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Phe Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Phe Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp

85 90 95

Glu Leu Pro Leu Thr Phc Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105 110

<210>7

<211>122

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>hPD-1.09A重链可变区

<400>7

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Thr

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Tyr Met Tyr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asn Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Ser Ser Ser Ser Thr Thr Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys

115 120

<210>8

<211>111

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>hPD-1.09A轻链可变区

<400>8

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Ala Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phc Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg

85 90 95

Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105 110

<210>9

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>hPD-1.08A轻链CDR1

<400>9

Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Phe Ser Tyr Leu His

1 5 10 15

<210>10

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>hPD-1.08A轻链CDR2

<400>10

Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser

1 5

<210>11

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>hPD-1-08A轻链CDR3

<400>11

Gln His Ser Trp Glu Leu Pro Leu Thr

1 5

<210>12

<211>5

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>hPD-1.08A重链CDR1

<400>12

Ser Tyr Tyr Leu Tyr

1 5

<210>13

<211>17

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>hPD-1.08A重链CDR2

<400>13

Gly Val Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Ser Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Ser

<210>14

<211>11

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>hPD-1.08A重链CDR3

<400>14

Arg Asp Ser Asn Tyr Asp Gly Gly Phe Asp Tyr

1 5 10

<210>15

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>hPD-1.09A轻链CDR1

<400>15

Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Leu His

1 5 10 15

<210>16

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>hPD-1.09A轻链CDR2

<400>16

Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser

1 5

<210>17

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>hPD-1.09A轻链CDR3

<400>17

Gln His Ser Arg Asp Leu Pro Leu Thr

1 5

<210>18

<211>5

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>hPD-1.09A重链CDR1

<400>18

Asn Tyr Tyr Met Tyr

1 5

<210>19

<211>17

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>hPD-1.09A重链CDR2

<400>19

Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Asn

<210>20

<211>11

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>hPD-1.09A重链cDR3

<400>20

Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr

1 5 10

<210>21

<211>417

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>109A-H重链可变区

<220>

<221>信号肽

<222>(1)..(57)

<400>21

atggactgga cctggagcat ccttttcttg gtggcagcac caacaggagc ccactcccaa 60

gtgcagctgg tgcagtctgg agttgaagtg aagaagcccg gggcctcagt gaaggtctcc 120

tgcaaggctt ctggctacac ctttaccaac tactatatgt actgggtgcg acaggcccct 180

ggacaagggc ttgagtggat gggagggatt aatcctagca atggtggtac taacttcaat 240

gagaagttca agaacagagt caccttgacc acagactcat ccacgaccac agcctacatg 300

gaactgaaga gcctgcaatt tgacgacacg gccgtttatt actgtgcgag aagggattat 360

aggttcgaca tgggctttga ctactggggc caagggacca cggtcaccgt ctcgagc 417

<210>22

<211>417

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>密码子优化的109A-H重链可变区

<220>

<221>信号肽

<222>(1)..(57)

<400>22

atggactgga cctggtctat cctgttcctg gtggccgctc ctaccggcgc tcactcccag 60

gtgcagctgg tgcagtccgg cgtggaggtg aagaagcctg gcgcctccgt caaggtgtcc 120

tgcaaggcct ccggctacac cttcaccaac tactacatgt actgggtgcg gcaggctccc 180

ggccagggac tggagtggat gggcggcatc aacccttcca acggcggcac caacttcaac 240

gagaagttca agaaccgggt gaccctgacc accgactcct ccaccaccac cgcctacatg 300

gagctgaagt ccctgcagtt cgacgacacc gccgtgtact actgcgccag gcgggactac 360

cggttcgaca tgggcttcga ctactggggc cagggcacca ccgtgaccgt gtcctcc 417

<210>23

<211>1398

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>密码子优化的409A-H重链全长

<220>

<221>信号肽

<222>(1)..(57)

<400>23

atggccgtgc tgggcctgct gttctgcctg gtgaccttcc cttcctgcgt gctgtcccag 60

gtgcagctgg tgcagtccgg cgtggaggtg aagaagcctg gcgcctccgt caaggtgtcc 120

tgtaaggcct ccggctacac cttcaccaac tactacatgt actgggtgcg gcaggcccca 180

ggccagggac tggagtggat gggcggcatc aacccttcca acggcggcac caacttcaac 240

gagaagttca agaaccgggt gaccctgacc accgactcct ccaccacaac cgcctacatg 300

gaactgaagt ccctgcagtt cgacgacacc gccgtgtact actgcgccag gcgggactac 360

cggttcgaca tgggcttcga ctactggggc cagggcacca ccgtgaccgt gtcctccgct 420

agcaccaagg gcccttccgt gttccctctg gccccttgct cccggtccac ctccgagtcc 480

accgccgctc tgggctgtct ggtgaaggac tacttccctg agcctgtgac cgtgagctgg 540

aactctggcg ccctgacctc cggcgtgcac accttccctg ccgtgctgca gtcctccggc 600

ctgtactccc tgtcctccgt ggtgaccgtg ccttcctcct ccctgggcac caagacctac 660

acctgcaacg tggaccacaa gccttccaac accaaggtgg acaagcgggt ggagtccaag 720

tacggccctc cttgccctcc ctgccctgcc cctgagttcc tgggcggacc ctccgtgttc 780

ctgttccctc ctaagcctaa ggacaccctg atgatctccc ggacccctga ggtgacctgc 840

gtggtggtgg acgtgtccca ggaagatcct gaggtccagt tcaattggta cgtggatggc 900

gtggaggtgc acaacgccaa gaccaagcct cgggaggaac agttcaactc cacctaccgg 960

gtggtgtctg tgctgaccgt gctgcaccag gactggctga acggcaagga atacaagtgc 1020

aaggtcagca acaagggcct gccctcctcc atcgagaaaa ccatctccaa ggccaagggc 1080

cagcctcgcg agcctcaggt gtacaccctg cctcctagcc aggaagagat gaccaagaat 1140

caggtgtccc tgacatgcct ggtgaagggc ttctaccctt ccgatatcgc cgtggagtgg 1200

gagagcaacg gccagccaga gaacaactac aagaccaccc ctcctgtgct ggactccgac 1260

ggctccttct tcctgtactc caggctgacc gtggacaagt cccggtggca ggaaggcaac 1320

gtcttttcct gctccgtgat gcacgaggcc ctgcacaacc actacaccca gaagtccctg 1380

tccctgtctc tgggcaag 1398

<210>24

<211>393

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>K09A-L-11轻链可变区

<220>

<221>信号肽

<222>(1)..(60)

<400>24

atggaagccc cagctcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60

gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 120

ctctcctgca gggccagcaa aggtgtcagt acatctggct atagttattt gcactggtat 180

caacagaaac ctggccaggc tcccaggctc ctcatctatc ttgcatccta cctagaatct 240

ggcgtcccag ccaggttcag tggtagtggg tctgggacag acttcactct caccatcagc 300

agcctagagc ctgaagattt tgcagtttat tactgtcagc acagcaggga ccttccgctc 360

acgttcggcg gagggaccaa agtggagatc aaa 393

<210>25

<211>393

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>K09A-L-16轻链可变区

<220>

<221>信号肽

<222>(1)..(60)

<400>25

atggaaaccc cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60

gaaattgtgc tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 120

atctcctgca gggccagcaa aggtgtcagt acatctggct atagttattt gcattggtac 180

ctccagaagc cagggcagtc tccacagctc ctgatctatc ttgcatccta cctagaatct 240

ggggtccctg acaggttcag tggcagtgga tcaggcacag attttacact gaaaatcagc 300

agagtggagg ctgaggatgt tggggtttat tactgccagc atagtaggga ccttccgctc 360

acgtttggcc aggggaccaa gctggagatc aaa 393

<210>26

<211>393

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>K09A-L-17轻链可变区

<220>

<221>信号肽

<222>(1)..(60)

<400>26

atgaggctcc ctgctcagct cctggggctg ctaatgctct gggtctctgg atccagtggg 60

gatattgtga tgacccagac tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 120

atctcctgca gggccagcaa aggtgtcagt acatctggct atagttattt gcattggtat 180

ctgcagaagc cagggcagtc tccacagctc ctgatctatc ttgcatccta cctagaatct 240

ggagtcccag acaggttcag tggcagtggg tcaggcactg ctttcacact gaaaatcagc 300

agggtggagg ctgaggatgt tggactttat tactgccagc atagtaggga ccttccgctc 360

acgtttggcc aggggaccaa gctggagatc aaa 393

<210>27

<211>390

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>密码子优化的K09A-L-11轻链可变区

<220>

<221>信号肽

<222>(1)..(57)

<400>27

atggcccctg tgcagctgct gggcctgctg gtgctgttcc tgcctgccat gcggtgcgag 60

atcgtgctga cccagtcccc tgccaccctg tccctgagcc ctggcgagcg ggctaccctg 120

agctgcagag cctccaaggg cgtgtccacc tccggctact cctacctgca ctggtatcag 180

cagaagccag gccaggcccc tcggctgctg atctacctgg cctcctacct ggagtccggc 240

gtgcctgccc ggttctccgg ctccggaagc ggcaccgact tcaccctgac catctcctcc 300

ctggagcctg aggacttcgc cgtgtactac tgccagcact cccgggacct gcctctgacc 360

tttggcggcg gaacaaaggt ggagatcaag 390

<210>28

<211>390

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>密码子优化的K09A-L-16轻链可变区

<220>

<221>信号肽

<222>(1)..(57)

<400>28

atggcccctg tgcagctgct gggcctgctg gtgctgttcc tgcctgccat gcggtgcgag 60

atcgtgctga cccagtcccc tctgtccctg cctgtgaccc ctggcgagcc tgcctccatc 120

tcctgccggg cctccaaggg cgtgtccacc tccggctact cctacctgca ctggtatctg 180

cagaagcctg gccagtcccc ccagctgctg atctacctgg cctcctacct ggagtccggc 240

gtgcctgacc ggttctccgg ctccggcagc ggcaccgact tcaccctgaa gatctcccgg 300

gtggaggccg aggacgtggg cgtgtactac tgccagcact cccgggacct gcctctgacc 360

ttcggccagg gcaccaagct ggagatcaag 390

<210>29

<211>390

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>密码子优化的K09A-L-17轻链可变区

<220>

<221>信号肽

<222>(1)..(57)

<400>29

atggcccctg tgcagctgct gggcctgctg gtgctgttcc tgcctgccat gcggtgcgac 60

atcgtgatga cccagacccc tctgtccctg cctgtgaccc ctggcgagcc tgcctccatc 120

tcctgccggg cctccaaggg cgtgtccacc tccggctact cctacctgca ctggtatctg 180

cagaagcctg gccagtcccc tcagctgctg atctacctgg cctcctacct ggagtccggc 240

gtgcctgacc ggttctccgg ctccggaagc ggcaccgctt ttaccctgaa gatctccaga 300

gtggaggccg aggacgtggg cctgtactac tgccagcact cccgggacct gcctctgacc 360

ttcggccagg gcaccaagct ggagatcaag 390

<210>30

<211>139

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>109A-H重链可变区

<220>

<221>信号肽

<222>(1)..(19)

<400>30

Met Asp Trp Thr Trp Ser Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Pro Thr Gly

1 5 10 15

Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Asn Tyr Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Met Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn

65 70 75 80

Glu Lys Phe Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ser Ser Thr Thr

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr

115 120 125

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

130 135

<210>31

<211>466

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>409A-H重链全长

<220>

<221>信号肽

<222>(1)..(19)

<400>31

Met Ala Val Leu Gly Leu Leu Phe Cys Leu Val Thr Phe Pro Ser Cys

1 5 10 15

Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Asn Tyr Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Met Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn

65 70 75 80

Glu Lys Phe Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ser Ser Thr Thr

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr

115 120 125

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly

130 135 140

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser

145 150 155 160

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

165 170 175

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe

180 185 190

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val

195 200 205

Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val

210 215 220

Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys

225 230 235 240

Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly

245 250 255

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

260 265 270

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu

275 280 285

Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

290 295 300

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg

305 310 315 320

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

325 330 335

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu

340 345 350

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

355 360 365

Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

370 375 380

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

385 390 395 400

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

405 410 415

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp

420 425 430

Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

435 440 445

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu

450 455 460

Gly Lys

465

<210>32

<211>130

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>K09A-L-11轻链可变区

<220>

<221>信号肽

<222>(1)..(19)

<400>32

Met Ala Pro Val Gln Leu Leu Gly Leu Leu Val Leu Phe Leu Pro Ala

1 5 10 15

Met Arg Cys Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu

20 25 30

Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val

35 40 45

Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly

50 55 60

Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly

65 70 75 80

Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu

85 90 95

Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln

100 105 110

His Ser Arg Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu

115 120 125

Ile Lys

130

<210>33

<211>130

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>K09A-L-16轻链可变区

<220>

<221>信号肽

<222>(1)..(19)

<400>33

Met Ala Pro Val Gln Leu Leu Gly Leu Leu Val Leu Phe Leu Pro Ala

1 5 10 15

Met Arg Cys Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val

20 25 30

Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val

35 40 45

Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly

50 55 60

Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly

65 70 75 80

Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu

85 90 95

Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln

100 105 110

His Ser Arg Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu

115 120 125

Ile Lys

130

<210>34

<211>130

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>K09A-L-17轻链可变区

<220>

<221>信号肽

<222>(1)..(19)

<400>34

Met Ala Pro Val Gln Leu Leu Gly Leu Leu Val Leu Phe Leu Pro Ala

1 5 10 15

Met Arg Cys Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val

20 25 30

Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val

35 40 45

Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly

50 55 60

Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly

65 70 75 80

Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu

85 90 95

Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Leu Tyr Tyr Cys Gln

100 105 110

His Ser Arg Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu

115 120 125

Ile Lys

130

<210>35

<211>469

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>109A-H重链全长

<220>

<221>信号肽

<222>(1)..(19)

<400>35

Met Ala Val Leu Gly Leu Leu Phe Cys Leu Val Thr Phe Pro Ser Cys

1 5 10 15

Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Asn Tyr Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Met Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn

65 70 75 80

Glu Lys Phe Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ser Ser Thr Thr

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr

115 120 125

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly

130 135 140

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly

145 150 155 160

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

165 170 175

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe

180 185 190

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val

195 200 205

Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val

210 215 220

Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys

225 230 235 240

Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu

245 250 255

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

260 265 270

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

275 280 285

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

290 295 300

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

305 310 315 320

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

325 330 335

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala

340 345 350

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

355 360 365

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln

370 375 380

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

385 390 395 400

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

405 410 415

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

420 425 430

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

435 440 445

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

450 455 460

Leu Ser Pro Gly Lys

465

<210>36

<211>237

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>K09A-L-11轻链全长

<220>

<221>信号肽

<222>(1)..(19)

<400>36

Met Ala Pro Val Gln Leu Leu Gly Leu Leu Val Leu Phe Leu Pro Ala

1 5 10 15

Met Arg Cys Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu

20 25 30

Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val

35 40 45

Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly

50 55 60

Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly

65 70 75 80

Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu

85 90 95

Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln

100 105 110

His Ser Arg Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu

115 120 125

Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser

130 135 140

Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn

145 150 155 160

Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala

165 170 175

Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys

180 185 190

Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp

195 200 205

Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu

210 215 220

Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230 235

<210>37

<211>237

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>K09A-L-16轻链全长

<220>

<221>信号肽

<222>(1)..(19)

<400>37

Met Ala Pro Val Gln Leu Leu Gly Leu Leu Val Leu Phe Leu Pro Ala

1 5 10 15

Met Arg Cys Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val

20 25 30

Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val

35 40 45

Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly

50 55 60

Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly

65 70 75 80

Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu

85 90 95

Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln

100 105 110

His Ser Arg Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu

115 120 125

Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser

130 135 140

Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn

145 150 155 160

Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala

165 170 175

Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys

180 185 190

Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp

195 200 205

Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu

210 215 220

Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230 235

<210>38

<211>237

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>K09A-L-17轻链全长

<220>

<221>信号肽

<222>(1)..(19)

<400>38

Met Ala Pro Val Gln Leu Leu Gly Leu Leu Val Leu Phe Leu Pro Ala

1 5 10 15

Met Arg Cys Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val

20 25 30

Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val

35 40 45

Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly

50 55 60

Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly

65 70 75 80

Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu

85 90 95

Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Leu Tyr Tyr Cys Gln

100 105 110

His Ser Arg Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu

115 120 125

Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser

130 135 140

Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn

145 150 155 160

Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala

165 170 175

Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys

180 185 190

Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp

195 200 205

Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu

210 215 220

Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230 235

Claims

1.结合人PD-1且包含轻链CDRs SEQ ID NOs：15、16和17以及重链CDRs SEQ ID NOs：18、19和20的分离的抗体或抗体片段，其中所述抗体片段选自Fab、Fab’、Fab’-SH、Fv、scFv、F(ab’)₂和双抗体，且其中所述抗体或抗体片段阻断人PD-L1和人PD-L2与人PD-1的结合。

2.结合人PD-1且阻断人PD-L1和人PD-L2与人PD-1的结合的分离的抗体，其中所述抗体包含：

a.SEQ ID NO：7所述的重链可变区，和SEQ ID NO：8所述的轻链可变区；或

b.SEQ ID NO：30的20-139位氨基酸残基所述的重链可变区，和SEQ ID NO：32的20-130位氨基酸残基所述的轻链可变区；或

c.SEQ ID NO：30的20-139位氨基酸残基所述的重链可变区，和SEQ ID NO：33的20-130位氨基酸残基所述的轻链可变区；或

d.SEQ ID NO：30的20-139位氨基酸残基所述的重链可变区，和SEQ ID NO：34的20-130位氨基酸残基所述的轻链可变区。

3.权利要求2的抗体，其包含：

a.SEQ ID NO：31的20-466位氨基酸残基所述的重链，和SEQ IDNO：36的20-237位氨基酸残基所述的轻链；或

b.SEQ ID NO：31的20-466位氨基酸残基所述的重链，和SEQ IDNO：37的20-237位氨基酸残基所述的轻链；或

c.SEQ ID NO：31的20-466位氨基酸残基所述的重链，和SEQ IDNO：38的20-237位氨基酸残基所述的轻链。

4.权利要求1的抗体或抗体片段，其中所述抗体进一步包含γ4或γ1人重链恒定区和人κ轻链恒定区。

5.编码权利要求1-4中任一项的抗体或抗体片段的分离的多核苷酸。

6.权利要求5的分离的多核苷酸，其中抗体包含SEQ ID NO：31的20-466位氨基酸残基所述的重链和SEQ ID NO：36的20-237位氨基酸残基所述的轻链。

7.权利要求6的分离的多核苷酸，其包含：(1)SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：27；或(2)SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：27。

8.包含权利要求5-7中任一项的分离的多核苷酸的表达载体。

9.包含权利要求8的表达载体的分离的宿主细胞。

10.制备权利要求1-4中任一项的抗体或抗体片段的方法，所述方法包括：

a.在能使所述核酸序列表达的条件下于培养基中培养权利要求9的宿主细胞，藉此制备包含轻链和重链可变区的多肽；和

b.从所述宿主细胞或培养基中回收多肽。

11.组合物，所述组合物包含与可药用载体或稀释剂组合的权利要求1-4中任一项抗体或抗体片段。

12.权利要求11的组合物，其中所述抗体包含SEQ ID NO：31的20-466位氨基酸残基所述的重链和SEQ ID NO：36的20-237位氨基酸残基所述的轻链。

13.一种包含SEQ ID NO：31的20-466位氨基酸残基所述的重链和SEQ ID NO：36的20-237位氨基酸残基所述的轻链的分离的抗体。