BR112019013238A2 - Anticorpos anti-pd-1 e usos dos mesmos - Google Patents

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Abstract

a presente invenção refere-se a anticorpos de anti-pd-1 ou fragmentos dos mesmos. em vários exemplos, os anticorpos ou fragmentos dos mesmos, incluem regiões variáveis de cadeia pesada compreendendo regiões determinando complementaridade de cadeia pesada hcdr1 (seq id n°: 1, 7 ou 13), hcdr2 (seq id n°: 2, 8 ou 14), e hcdr3 ( seq id nº: 3, 9 ou 15), e a regiões variáveis de cadeia leve compreendendo regiões determinando complementaridade de cadeia leve lcdr1 (seq id nº: 4, 10 ou 16), lcdr2 (seq id nº: 5, 11 ou 17) e lcdr3 (seq id nº: 6, 12 ou 18). métodos de uso dos anticorpos ou fragmentos dos mesmos para o tratamento e diagnóstico de doenças tais como câncer, infecção ou distúrbios imunológicos também são providos.

Description

ANTECEDENTE [1] O DNA complementar (cDNA) de morte celular programada 1 (PD-1) foi isolado em 1992 de um hibridoma de célula T de murino e de uma linha celular de progenitor hematopoiética passando por apoptose. Estudos genéticos de ablação mostraram que deficiências em PD-1 resultaram em diferentes fenótipos autoimunes em várias linhagens de rato. As células T alogênicas, PD-1-deficientes, com receptores de célula T transgênicos (TCRs) exibiram respostas incrementadas aos aloantígenos, indicando que a PD-1 em células T tem uma função regulamentar negativa em resposta ao antígeno.
[2] Vários estudos contribuíram para a descoberta das moléculas que interagem com o PD-1. Em 1999, um homólogo B7 (B7-H1, também chamado ligante de morte programada 1 [PD-L1]) foi identificado independentemente de PD-1, usando clonagem molecular e pesquisas em base de dados de indicador expressa em sequência humana, baseadas sua homologia com as moléculas da família B7, e foi mostrado que B7-H1 atua como um inibidor de respostas de células T humanas in vitro. Essas duas linhas independentes de estudos se fundiram um ano depois, quando os laboratórios de Freeman, Wood e Honjo mostraram que a B7-H1 (doravante denominada PD-L1) é uma parceira funcional e ligante da PD-1. Em seguida, determinou-se que ratos PD-L1-deficientes (ratos de KO PD-L1) eram propensos à indução de doenças autoimunes, embora esta linhagem de ratos não desenvolvesse espontaneamente tais doenças. Torna-se claro mais tarde, que a interação de PD-L1/PD-1 tem um papel dominante na supressão de respostas de células T in vivo, especialmente no microambiente de tumor.
[3] O estudo inicial imediato mostrou que o PD-L1 tumor
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2/80 associado facilita o apoptose de células T ativadas (Dong H. et al.,” B7-H1 associada a tumor promove o apoptose da célula T: um mecanismo potencial da evasão imune”, Nature medicine, 2002; 8(8): 793800) e também estimula a produção de IL-10 em células T de sangue periférico humano (Dong H, et al.,“B7-H1, um terceiro membro da família B7 coestimula a proliferação de células Tea secreção de interleucina-10”, Nature medicine, 1999; 5 (12): 1365-9) para mediar a supressão imune. É agora conhecido, que os efeitos do PD-L1 na supressão imune são bastante mais complicados. Adicionalmente à apoptose de células T e à indução de IL-10, PD-L1 pode também induzir a disfunção da célula T através de uma variedade de mecanismos. A via PD também demonstrou promover a anergia de célula T in vitro e in vivo.
[4] Recentemente, o FDA aprovou dois anticorpos monoclonais (mAbs) PD-1 para tratar cânceres humanos, um da Bristol-Myers Squibb (Opdivo, nivolumab, MDX-1106, BMS-936558, ONO-4538) e o outro da Merck (Keytruda, pembrolizumab, lambrolizumab, MK-3475). Adicionalmente, mAbs múltiplos ao PD-1 ou ao PD-L1 estão em desenvolvimento ativo em centenas de ensaios clínicos, envolvendo milhares de pacientes. Assim, a terapia do anti-PD gera benefícios clínicos significativos, induzindo a regressão de tumores avançados e metastáticos e melhorando a sobrevivência. Mais importante, a terapia do anti-PD pode ter efeitos duráveis, toxicidade tolerável e mostra ser aplicável a um espectro amplo de tipos do cancro, especialmente em tumores sólidos. Estes achados clínicos ademais validam os princípios do bloqueio da via de PD e colocam a terapia PD em uma categoria original, distinta da terapia tipo-específica de tumor ou personalizada. Devido a seu mecanismo distinto e não sobreposto com outras terapias de câncer, a terapia do anti-PD está no caminho para combinar com quase todos métodos de tratamento de câncer em uma tentativa de amplificar mais a eficácia terapêutica. Além da combinação com
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3/80 várias abordagens de imunoterapia de câncer, tais como vacina contra o câncer, coestimulação e coinibição de anticorpos e terapia celular adotiva, vários ensaios clínicos também são iniciados para combinar terapia anti-PD com quimioterapia, radioterapia e terapia direcionada.
[5] A terapia do anti-PD tomou o estágio central nas imunoterapias contra câncer humano, especialmente para tumores sólidos. Esta terapia é distinta dos agentes terapêuticos imunes anteriores, que amplamente visam impulsionar as respostas imunes sistêmicas ou geram imunidade de novo contra o câncer; em vez disso, a terapia antiPD modula respostas imunes no local do tumor, atinge defeitos imunes induzidos por tumor e repara as respostas imunes em andamento. Enquanto o sucesso clínico da terapia anti-PD para o tratamento de uma variedade de cânceres humanos tem validado essa abordagem, ainda estamos aprendendo com esse caminho e as respostas imunes associadas, que auxiliarão na descoberta e no projeto de novas abordagens aplicáveis clinicamente na imunoterapia de câncer.
SUMÁRIO [6] A presente divulgação fornece anticorpos anti-PD-1 que exibiram excelentes atividades ligantes e inibitórias em proteínas PD1. Um dos testados mostrou inclusive atividades ligantes mais forte do que dois produtos de anticorpos anti-PD-1 reguladoramente testados.
[7] De acordo com uma modalidade da presente divulgação, portanto, é fornecido um anticorpo isolado ou fragmento do mesmo, tendo especificidade para uma proteína de morte celular programada humana 1 (PD-L1), em que o anticorpo ou fragmento do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo regiões determinando complementaridade de cadeia pesada HCDR1, HCDR2 e HCDR3, e uma região variável de cadeia leve compreendendo regiões determinando complementaridade de cadeia leve LCDR1, LCDR2 e LCDR3, em que o HCDR1, HCDR2, HCDR3,
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LCDR1, LCDR2 e LCDR3 são selecionados a partir do grupo consistindo em: (a) HCDR1: GFTFSSYT (SEQ ID N2: 1), HCDR2: ISHGGGDT (SEQ ID N2: 2), HCDR3: ARHSGYERGYYYVMDY (SEQ ID N2: 3), LCDR1: ESVDYYGFSF (SEQ ID N2: 4), LCDR2: AAS (SEQ ID N2: 5), LCDR3: QQSKEVPW (SEQ ID N2: 6); (b) HCDR1: GYTFTSYT (SEQ ID N2: 7), HCDR2: INPTTGYT (SEQ ID N2: 8), HCDR3: ARDDAYYSGY (SEQ ID N2: 9), LCDR1: ENIYSNL (SEQ ID N2: 10), LCDR2: AAK (SEQ ID N2: 11), LCDR3: QHFWGTPWT (SEQ ID N2: 12); e (c) HCDR1: GFAFSSYD (SEQ ID N2: 13), HCDR2: ITIGGGTT (SEQ ID N2: 14), HCDR3: ARHRYDYFAMDN (SEQ ID N2: 15), LCDR1: ENVDNYGINF (SEQ ID N2: 16), LCDR2: VSS (SEQ ID N2: 17), LCDR3: QQSKDVPW (SEQ ID N2: 18).
[8] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento da presente divulgação compreende ainda uma região constante de cadeia pesada, uma região constante de cadeia leve, uma região Fc ou a combinação destas. Em algumas modalidades, a região constante de cadeia leve é uma região de constante de cadeia kappa ou lambda.
[9] O anticorpo ou fragmento do mesmo pode ser um isótipo de IgG, IgM, IgA, IgE ou IgD, em algumas modalidades. Em algumas modalidades, o isótipo é lgG1, lgG2, lgG3 ou lgG4. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento dele é um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado ou um anticorpo inteiramente humano.
[10] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento do mesmo, compreende uma região de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID N2: 35, SEQ ID N2: 37, SEQ ID N2: 39, ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade de sequência para SEQ ID N2:35, SEQ ID N2: 37, ou SEQ ID N2: 39. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento do mesmo compreende uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID N2: 41, SEQ ID N2: 43,
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5/80
SEQ ID N2: 45, ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade de sequência para SEQ ID N2: 41, SEQ ID N2: 43, ou SEQ ID N2: 45.
[11] Em outra modalidade, a presente divulgação fornece um anticorpo isolado ou fragmento do mesmo tendo especificidade para uma proteína de morte celular programada humana 1 (PD-L1), em que o anticorpo ou fragmento do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada, compreendendo regiões determinando complementaridade da cadeia pesada HCDR1, HCDR2 e HCDR3, e uma região variável de cadeia leve, compreendendo regiões determinando complementaridade da cadeia leve LCDR1, LCDR2 e LCDR3, onde HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3 são selecionados do grupo consistindo em:(a) HCDR1: GFTFSSYT (SEQ ID N2: 1), HCDR2: ISHGGGDT (SEQ ID N2: 2), HCDR3: ARHSGYERGYYYVMDY (SEQ ID N2: 3), LCDR1: ESVDYYGFSF (SEQ ID N2: 4), LCDR2: AAS (SEQ ID N2: 5), LCDR3: QQSKEVPW (SEQ ID N2: 6); (b) HCDR1: GYTFTSYT (SEQ ID N2: 7), HCDR2: INPTTGYT (SEQ ID N2: 8), HCDR3: ARDDAYYSGY (SEQ ID N2: 9), LCDR1: ENIYSNL (SEQ ID N2: 10), LCDR2: AAK (SEQ ID N2: 11), LCDR3: QHFWGTPWT (SEQ ID N2: 12); (c) HCDR1: GFAFSSYD (SEQ ID N2: 13), HCDR2: ITIGGGTT (SEQ ID N2: 14), HCDR3: ARHRYDYFAMDN (SEQ ID N2: 15), LCDR1: ENVDNYGINF (SEQ ID N2: 16), LCDR2: VSS (SEQ ID N2: 17), LCDR3: QQSKDVPW (SEQ ID N2: 18); e (d) HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, e LCDR3 , como apresentado em (a)-(c) , mas pelo menos um dos quais inclui um, dois ou três adição de aminoácido, supressão, substituição de aminoácido conservador ou a combinação dos mesmos.
[12] Em algumas modalidades, HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3 são mostrados em qualquer um de (a)-(c), mas um dos quais inclui uma substituição conservadora de aminoáci
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6/80 do. Em algumas modalidades, HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3 são mostrados em qualquer um de (a)-(c), mas dois dos quais de cada um inclui uma substituição conservadora de aminoácido. Em algumas modalidades, HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3 são mostrados em qualquer um de (a)-(c), mas três dos quais de que cada um inclui uma substituição conservadora do aminoácido.
[13] Também se provê, em uma modalidade, uma composição compreendendo o anticorpo ou fragmento da presente divulgação e uma função farmaceuticamente aceitável. Ainda mais se provê fornecido, em uma modalidade, uma célula isolada compreendendo um ou mais polinucleotídeos codificando o anticorpo ou fragmento do mesmo.
[14] Usos e métodos também são providos. Em uma modalidade, é provida uma utilização do anticorpo ou fragmento da presente divulgação, para a fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer. O câncer pode ser selecionado a partir do grupo consistindo em câncer de bexiga, câncer de fígado, câncer do cólon, câncer retal, câncer do endométrio, leucemia, linfoma, câncer pancreático, câncer do pulmão de pequenas células, câncer do pulmão de células não pequenas, câncer da mama, câncer uretral , câncer de cabeça e pescoço, câncer gastrointestinal, câncer de estômago, câncer de esôfago, câncer de ovário, câncer renal, melanoma, câncer de próstata e câncer de tireoide. Também é provido um método de tratamento do câncer em um paciente em necessidade, compreendendo administrar ao paciente o anticorpo ou fragmento da presente divulgação.
[15] Em outra modalidade, a presente divulgação provê um método de tratamento de câncer ou infecção em um paciente em necessidade, compreendendo (a) tratar uma célula, in vitro, com o anticorpo ou fragmento da presente divulgação; e (b) administrar a célula tratada ao paciente. Em algumas modalidades, a célula é uma célula T.
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7/80 [16] Em outra modalidade, se provê um uso do anticorpo ou fragmento do mesmo de qualquer um da presente divulgação, na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma infecção. Em algumas modalidades, a infecção é infecção viral, infecção bacteriana, infecção fúngica ou infecção por um parasita.
[17] Em uma outra modalidade, se provê um uso do anticorpo ou do fragmento dele da presente divulgação para a fabricação de um medicamento para o tratamento de um distúrbio imunológico. Em algumas modalidades o distúrbio imunológico é selecionado a partir do grupo consistindo em infecção, choque séptico associado com infecção, artrite, artrite reumatoide, asma, COPD, doença inflamatória pélvica, doença de Alzheimer, doença inflamatória do intestino , doença de Crohn, colite ulcerosa, doença de Peyronie, doença celíaca, doença da vesícula biliar, doença pilonidal, peritonite, psoríase, vasculite, aderências cirúrgicas, acidente vascular cerebral, diabetes tipo I, doença de Lyme, artrite, meningoencefalite, uveíte autoimune, distúrbios inflamatórios mediados imunológicos do sistema nervoso central e periférico, esclerose múltipla, lúpus e síndrome de Guillain-Barr, dermatite atópica, hepatite autoimune, alveolite fibrosa, doença de Grave, nefropatia de IgA, púrpura trombocitopênica idiopática, doença de Meniere, pênfigo, cirrose biliar primária, sarcoidose, Esclerodermia, granulomatose de Wegener, pancreatite, trauma, doença do enxerto versus hospedeiro, rejeição de transplante, doenças isquêmicas, infarto do miocárdio, aterosclerose, coagulação intravascular, reabsorção óssea, osteoporose, osteoartrite, periodontite, hipoclorídia e infertilidade relacionada à falta de tolerância materno-fetal.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [18] A Figura 1 mostra que todos os cinco isótipos de mAb de hPD-1 podem se ligar a hPD-1 com alta especificidade.
[19] A Figura 2 mostra que o anti-hPD-1 não se liga com hB7-1,
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8/80 hPD-L1, hB7-H3, hB7-H4 e hCD137.
[20] A Figura 3 mostra que a mAb de hPD-1 pode se ligar a ambas proteínas PD-1 de células de macaco cynomolgus e de humanos, sem exibir ligação cruzada ao mPD-1.
[21 ] A Figura 4 mostra que mAbs de hPD-1 pode ter um efeito de bloqueio sobre a ligação de hPD-1 à hPD-L1, dependente da dosagem.
[22] A Figura 5 mostra os efeitos de revogação e de bloqueio de mAbs de hPD-1 quando observado em um ambiente de ligação competitiva.
[23] A Figura 6 mostra os resultados da análise de eletroforese em gel confirmando produtos RACE.
[24] A Figura 7 mostra a capacidade de anticorpos de DNA recombinante para ligar PD-1 (A) e seu efeito de bloqueio sobre a capacidade de ligação de PD-1 a PD-L1 (B).
[25] A Figura 8 mostra que nove anticorpos humanizados apresentaram várias afinidades de ligação a PD-1, incluindo tanto maior quanto menor do que o anticorpo parental.
[26] A Figura 9 mostra que os anticorpos humanizados podem ter um efeito de bloqueio na capacidade de ligação do PD-1 ao PD-L1.
[27] A Figura 10 mostra que os anticorpos humanizados podem ter um efeito de bloqueio na capacidade de ligação do PD-1 ao PD-L2.
[28] A Figura 11 mostra que os mAbs humanizados incrementam a citotoxicidade de alo-células CD8 + CTL contra as células cancerosas in vitro.
[29] A Figura 12 mostra a resposta proliferativa da MLR aos anticorpos anti-hPD-1.
[30] A Figura 13 mostra o perfil de expressão IFNy e IL-2 em sobrenadantes de cultura MLR.
[31] A Figura 14 mostra que a expressão de PD-L1 em linfócitos
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9/80 foi inibida por mAbs de PD-1.
[32] A Figura 15 mostra a atividade antitumoral in vivo de anticorpo PD-1 humanizado.
[33] A Figura 16 apresenta uma comparação entre a afinidade e a cinética de ligação dos anticorpos.
[34] A Figura 17 mostra a comparação dos anticorpos PD-1 no bloqueio PD-1/PD-L1.
[35] A Figura 18 mostra a comparação de mAbs para incrementar a citotoxicidade de alo-células CD8 + CTL contra células cancerosas in vitro.
[36] A Figura 19 mostra a ligação de artigos de teste a hPD-1 ou mPD-1 (ensaios ELISA).
[37] A Figura 20 mostra a ligação de artigos de teste contra células CHOK1 expressando hPD-1 ou cPD-1 usando citometria de fluxo.
[38] A Figura 21 mostra as atividades de bloqueio de artigos de teste em hPD-L1 (esquerda) e hPD-L2 (direita) ligando células CHOK1 expressando hPD-1.
[39] A Figura 22 mostra os níveis de IL-2 (esquerda) e IFN-γ (direita) em ensaios de MLR humano.
[40] A Figura 23 mostra níveis de IFN-γ em tumores projetados e em ensaios de cocultura de células T.
[41] A Figura 24 mostra ligação de epítopo pelos resultados de Elisa (painel superior) e esquemas em sobreposições de epítopo de diferentes artigos de teste (painel inferior).
[42] A Figura 25 mostra a ligação dos anticorpos de Nivolumab (painéis superiores) ou TY101-04-T3-05 (painéis inferiores) a um hPD1 recombinante no nível de baixa imobilização (60 RU, painéis esquerdos) e alto nível de imobilização (960RU, painéis direito).
DESCRIÇÃO DETALHADA
Definições [43] Registra-se que o termo um ou uma entidade se refere a
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10/80 uma ou mais dessa entidade; por exemplo, um anticorpo, é entendido como representando um ou mais anticorpos. Como tal, os termos um (ou uma), um ou mais e pelo menos um podem ser usados alternadamente aqui.
[44] Como aqui utilizado, o termo polipeptídeo destina-se a abranger um polipeptídeo singular, bem como polipeptídeos, o plural e refere-se a uma molécula composta de monômeros (aminoácidos) linearmente ligadas por ligações amida (também conhecidas como ligações peptídicas). O termo polipeptídeo refere-se a qualquer cadeia ou cadeias de dois ou mais aminoácidos, e não se refere a um comprimento específico do produto. Assim, peptídeos, dipeptídeos, tripeptídeos, oligopeptídeos, proteínas, cadeia de aminoácidos, ou qualquer outro termo usado para se referir a uma cadeia ou cadeias de dois ou mais aminoácidos, estão incluídos na definição de polipeptídeo, e o termo polipeptídeo pode ser usado em vez de ou alternadamente com qualquer um destes termos. O termo polipeptídeo destina-se também a referir-se aos produtos de modificações pósexpressão do polipeptídeo, incluindo, sem limitação, glicosilação, acetilação, fosforilação, amidação, derivatização por grupos de proteção/bloqueio conhecidos, divagem proteolítica ou modificação, que não ocorrem naturalmente, de aminoácidos. Um polipeptídeo pode ser derivado de uma fonte biológica natural ou produzido por tecnologia recombinante, mas não é necessariamente traduzido de uma sequência de ácido nucleico designada. Pode ser gerada de qualquer maneira, inclusive por síntese química.
[45] O termo isolado, como aqui utilizado em relação às células, ácidos nucleicos, tais como DNA ou RNA, refere-se a moléculas separadas de outros DNAs ou RNAs, respectivamente, que estão presentes na fonte natural da macromolécula. O termo isolado, como aqui utilizado, também se refere a um ácido nucleico ou peptídeo que
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11/80 é substancialmente livre de material celular, material viral, ou meio de cultura, quando produzido por técnicas de DNA recombinante, ou precursores químicos ou outros produtos químicos, quando quimicamente sintetizado. Além disso, um ácido nucleico isolado pretende incluir fragmentos de ácidos nucleicos que não estão ocorrendo naturalmente como fragmentos e não seriam encontrados no estado natural. O termo isolado também é usado aqui para se referir a células ou polipeptídeos que são isolados de outras proteínas ou tecidos celulares. Os polipeptídeos isolados pretendem abranger ambos polipeptídeos purificados e recombinantes.
[46] Tal como usado neste documento, o termo recombinante como pertinente a polipeptídeos ou polinucleotídeos, significa uma forma de polipeptídeo ou polinucleotídeo que não existe naturalmente, um exemplo não limitante de que pode ser criado através da combinação de polinucleotídeos ou polipeptídeos que normalmente não ocorrería juntos.
[47] Homologia ou identidade ou similaridade refere-se à similaridade de sequência entre dois peptídeos ou entre duas moléculas de ácido nucleico. A homologia pode ser determinada comparandose uma posição em cada sequência que pode ser alinhada para fins de comparação. Quando uma posição na sequência comparada é ocupada pela mesma base ou aminoácido, então as moléculas são homólogas nessa posição. Um grau de homologia entre sequências é uma função do número de posições correspondentes ou homólogas compartilhadas pelas sequências. Uma sequência não relacionada ou não homóloga compartilha menos de 40% de identidade, embora preferencialmente menos de 25% de identidade, com uma das sequências da presente divulgação.
[48] Uma região de polinucleotídeo ou polinucleotídeo (ou uma região polipeptídica ou polipeptídeo) tem uma determinada percenta
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12/80 gem (por exemplo, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99%) de identidade sequencial de outra sequência significa que, quando alinhado, que as percentagens de bases (ou aminoácidos) são os mesmos na comparação das duas sequências. Esse alinhamento e a porcentagem de homologia ou identidade sequencial podem ser determinados por meio de programas de software conhecidos na técnica, por exemplo, aqueles descritos em Ausubel et al. eds. (2007) “Protocolos Atuais em Biologia Molecular”. Preferencialmente, parâmetros default são usados para alinhamento. Um programa de alinhamento é BLAST, usando parâmetros default. Em particular, os programas são BLASTN e BLASTP, usando os seguintes parâmetros default: Código genético = padrão; Filtro = nenhum; Vertente = ambos; Corte = 60; Espera = 10; Matriz = BLOSUM62; Descrições = 50 sequências; Ordenado por = pontuação elevada; Base de dados = não redundante, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + traduções GenBank CDS + SwissProtein + SPupdate + PIR. Os polinucleotídeos biologicamente equivalentes são aqueles que têm homologia de percentual especificado acima anotado e codificando um polipeptídeo que tem a mesma ou similar atividade biológica.
[49] O termo um ácido nucleico equivalente ou polinucleotídeo refere-se a um ácido nucleico tendo uma sequência de nucleotídeo tendo um certo grau de homologia, ou identidade sequencial, com a sequência de nucleotídeo do ácido nucleico ou complemento do mesmo. Um homólogo de um ácido nucleico de cadeia dupla pretende incluir os ácidos nucleicos que têm uma sequência de nucleotídeo que tenha um determinado grau de homologia com ele ou com o complemento dele. Em um aspecto, homólogos de ácidos nucleicos são capazes de hibridizar com o ácido nucleico ou complemento do mesmo. Da mesma forma, um polipeptídeo equivalente refere-se a um polipeptídeo tendo um certo grau de homologia, ou identidade sequencial
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13/80 com a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo de referência. Em alguns aspectos, a identidade sequencial é pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, ou 99%. Em alguns aspectos, o polipeptídeo ou polinucleotídeo equivalente tem um, dois, três, quatro ou cinco adições, supressões, substituições e suas combinações, em comparação com o polipeptídeo ou polinucleotídeo de referência. Em alguns aspectos, a sequência equivalente retém a atividade (por exemplo, ligação epítopo) ou estrutura (por exemplo, ponde de sal) da sequência de referência.
[50] Reações da hibridação podem ser executadas sob condições de “rigor” diferente. Em geral, uma reação de hibridação de rigor baixo é realizada a cerca de 40°C, em cerca de 10 x SSC ou uma solução de temperatura/força iônica equivalente. Uma hibridação de rigor moderado é executada tipicamente a cerca de 50°C, em cerca de 6 x SSC, e uma reação de hibridação de rigor alto é executada geralmente a cerca de 60°C, em cerca de 1 x SSC. As reações da hibridação podem igualmente ser executadas sob “condições fisiológicas” que são bem conhecidas para aquele versado na técnica. Um exemplo não limitante de uma condição fisiológica é a temperatura, a força iônica, o pH e a concentração de Mg2+ normalmente encontrados em uma célula.
[51] Um polinucleotídeo é composto de uma sequência específica de quatro bases nucleotídicas: adenina (A); citosina (C); guanina (G); timina (T) e uracila (U) para timina quando o polinucleotídeo é RNA. Assim, o termo sequência de polinucleotídeo é a representação alfabética de uma molécula de polinucleotídeo. Esta representação alfabética pode ser colocada no banco de dados em um computador tendo uma unidade de processamento central e usado para aplicações de bioinformática, tais como a genômica funcional e a pesquisa de homologia. O termo polimorfismo refere-se à coexistência de mais de
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14/80 uma forma de urn gene ou porção dele. Uma porção de urn gene, do qual há pelo menos duas formas diferentes, isto é, duas sequências nucleotídicas diferentes, é referida como uma região polimórfica de um gene. Uma região polimórfica pode ser um único nucleotídeo, do qual a identidade difere em alelos diferentes.
[52] Os termos polinucleotídeo e oligonucleotídeo são usados alternadamente e referem-se a uma forma polimérica de nucleotídeos de qualquer comprimento, tanto desoxirribonucleotídeos como ribonucleotídeos ou análogos dos mesmos. Os polinucleotídeos podem ter qualquer estrutura tridimensional e podem desempenhar qualquer função, conhecida ou desconhecida. A seguir, são exemplos não limitantes de polinucleotídeos: um gene ou fragmento de gene (por exemplo, uma sonda, iniciador, indicador EST ou SAGE), éxons, introns, RNA mensageiro (mRNA), RNA de transferência, RNA ribossômico, ribozimas, cDNA, dsRNA, siRNA, miRNA, polinucleotídeos recombinantes, polinucleotídeos ramificados, plasmídeos, vetores, ADN isolado de qualquer sequência, RNA isolado de qualquer sequência, sondas de ácido nucleico e iniciadores. Um polinucleotídeo pode compreender nucleotídeos modificados, tais como nucleotídeos metilados e análogos de nucleotídeo. Se presente, as modificações à estrutura do nucleotídeo podem ser transmitidas antes ou depois da montagem do polinucleotídeo. A sequência de nucleotídeos pode ser interrompida por componentes não nucleotídicos. Um polinucleotídeo pode ser adicionalmente modificado após a polimerização, tal como por conjugação com um componente de rotulagem. O termo também se refere a ambas as moléculas de cadeia única ou dupla. A menos que especificado ou exigido de outra maneira, toda a modalidade desta divulgação que é um polinucleotídeo abrange ambas, a forma de cadeia dupla e cada uma das duas formas complementares de cadeia única, conhecidas ou previstas para compor a forma de cadeia dupla.
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15/80 [53] O termo codificar como é aplicado a polinucleotídeos, refere-se a um polinucleotídeo que é dito codificar um polipeptídeo se, em seu estado nativo ou quando manipulado por métodos bem conhecidos para aqueles versados na técnica, ele pode ser transcrito e/ou traduzido para produzir o mRNA para o polipeptídeo e/ou um fragmento do mesmo. A vertente de sentido contrário (antissenso) é o complemento de um tal ácido nucleico, e a sequência de codificação pode ser deduzida a partir daí.
[54] [55] Como aqui utilizado, um anticorpo ou polipeptídeo de ligação de antígeno refere-se a um polipeptídeo ou um complexo polipeptídeo que especificamente reconhece e se liga a um antígeno. Um anticorpo pode ser um anticorpo inteiro e qualquer fragmento de ligação de antígeno ou uma cadeia única do mesmo. Assim, o termo anticorpo inclui qualquer molécula contendo proteína ou peptídeo, que compreende pelo menos uma porção de uma molécula de imunoglobulina tendo atividade biológica de ligação ao antígeno. Exemplos de tais incluem, mas não se limitam a, uma região determinando complementaridade (CDR) de uma cadeia pesada ou leve ou uma porção ligando ligante das mesmas, uma região variável de cadeia pesada ou de cadeia leve, uma região constante cadeia pesada ou de cadeia leve, uma região de estrutura (FR) , ou qualquer poção destas ou pelo menos uma porção de uma proteína de ligação.
[55] Os termos fragmento de anticorpo ou fragmento de ligação antígeno, tal como aqui utilizado, é uma porção de um anticorpo tal como F (ab')2, F (ab)2, Fab', Fab, Fv, scfv e semelhantes. Independentemente da estrutura, um fragmento de anticorpo se liga com o mesmo antígeno que é reconhecido pelo anticorpo intacto. O termo fragmento de anticorpo inclui aptâmeros, spiegelmers e diacorpos. O termo fragmento de anticorpo também inclui qualquer proteína sintética ou geneticamente projetada, que atua como um anticorpo, ligando
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16/80 a um antígeno específico para formar um complexo.
[56] Um fragmento variável de cadeia única ou scFv referese a uma proteína de fusão das regiões variáveis das cadeias pesada (VH) e leves (VL) de imunoglobulinas. Em alguns aspectos, as regiões são conectadas com um peptídeo ligante curto, de dez a cerca de 25 aminoácidos. O ligante pode ser rico em glicina para flexibilidade, bem como serina ou treonina para solubilidade, e pode ligar o terminal N do VH com o terminal C do VL, ou vice-versa. Esta proteína retém a especificidade da imunoglobulina original, apesar da remoção das regiões constantes e da introdução do ligante. As moléculas de ScFv são conhecidas na técnica e são descritas, por exemplo, na patente norteamericana nQ. 5.892.019.
[57] O termo anticorpo engloba várias classes amplas de polipeptídeos, que podem ser distinguidos bioquimicamente. Aqueles versados na técnica apreciarão que as cadeias pesadas estão classificadas como gama, mi, alfa, delta ou épsilon (γ, μ, α, δ, ε), com algumas subclasses entre elas (por exemplo, γ I- γ4). É a natureza desta cadeia que determina a classe do anticorpo como IgG, IgM, IgA IgG, ou IgE, respectivamente. As subclasses da imunoglobulina (isótipos), por exemplo, lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, lgG5, etc. são bem caracterizadas e são conhecidas por conferir especialização funcional. Versões modificadas de cada uma dessas classes e isótipos são prontamente discerníveis para o técnico versado, tendo em vista a divulgação instantânea e, consequentemente, estão dentro do escopo da divulgação instantânea. Todas as classes da imunoglobulina estão claramente dentro do escopo da presente divulgação, a seguinte discussão será dirigida geralmente à classe de IgG de moléculas da imunoglobulina. No que diz respeito a IgG, uma molécula padrão de imunoglobulina compreende dois polipeptídeos de cadeia leve idênticos, de peso molecular de aproximadamente 23.000 Daltons, e dois polipeptídeos de cadeia pe
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17/80 sada idênticos, de peso molecular de 53000-70000. As quatro cadeias são unidas tipicamente por ligações do dissulfeto em uma configuração de Y, onde as cadeias leves engatam as cadeias começando na boca do Y e continuando através da região variável.
[58] Os anticorpos, polipeptídeos de ligação de antígeno, variantes ou derivados destes da divulgação incluem, mas não se limitam a, anticorpos policlonais, monoclonais, multiespecíficos, humanos, humanizados, primatizados ou quiméricos, anticorpos de cadeia única, fragmentos de ligação epítopo, por exemplo, Fab, Fab ' e F(ab ')2, Fd, Fvs, Fvs de cadeia única (scfv), anticorpos de cadeia única, FVS ligados por dissulfeto (sdfv), fragmentos compreendendo um domínio VK ou VH, fragmentos produzidos por uma biblioteca de expressão de Fab e anticorpos ( anti-ld) anti-idiotípicos (incluindo, por exemplo, anticorpos anti-ld a anticorpos leves divulgados neste documento). As moléculas de imunoglobulina ou de anticorpo da divulgação, podem ser de qualquer tipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), classe (por exemplo, IgGI, lgG2, lgG3, lgG4, IgAI e lgA2) ou subclasse da molécula de imunoglobulina.
[59] Cadeias leves são classificadas como kappa ou lambda (K, λ). Cada classe de cadeia pesada pode ser lidada com uma cadeia leve kappa ou do lambda. Em geral, as cadeias leves e pesadas são ligadas covalentemente entre si e as porções de cauda das duas cadeias pesadas são ligadas umas às outras por ligações dissulfeto covalentes ou ligações não covalentes, quando as imunoglobulinas são geradas tanto por hibridomas, B células ou células hospedeiras projetadas geneticamente. Na cadeia pesada, as sequências de aminoácido correm de um terminal N na extremidade bifurcada da configuração de Y, ao terminal C na parte inferior de cada cadeia.
[60] Ambas as cadeias leve e pesada são divididas em regiões de homologia estrutural e funcional. Os termos constante e variável
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18/80 são usados funcionalmente. A este respeito, será apreciado que os domínios variáveis de ambas as porções de cadeia leve (VK) e pesada (VH) determinam o reconhecimento e a especificidade do antígeno. Inversamente, os domínios constantes da cadeia leve (CK) e da cadeia pesada (CH1, CH2 ou CH3) conferem propriedades biológicas importantes, tais como secreção, mobilidade transplacentária, ligação de receptor de FC, ligação de complemento, e semelhantes. Por convenção, a numeração dos domínios de região constantes aumenta enquanto se tornam mais distantes do site de ligação do antígeno ou do terminal amino do anticorpo. A porção terminal N é uma região variável e na porção terminal C está uma região constante; os domínios CH3 e CK, na verdade, compreendem o terminal carboxi da cadeia pesada e leve, respectivamente.
[61] Como indicado acima, a região variável permite que o anticorpo reconheça seletivamente e ligue especificamente epítopos em antígenos. Ou seja, o domínio VK e o domínio VH, ou subconjunto das regiões determinando complementaridade (CDRs), de um anticorpo, se combinam para formar a região variável que define um site de ligação de antígeno tridimensional. Esta estrutura do anticorpo quaternária forma o site de ligação de antígeno presente na extremidade de cada braço do Y. Mais especificamente, o site de ligação de antígeno é definido por três CDRs em cada uma das cadeias VH e VK (i.e., CDR-H1, CdR-H2, CdR-H3, CdR-L1, CdR-L2 e CDR-L3). Em alguns casos, por exemplo, certas moléculas de imunoglobulina, derivadas de espécies cameloides ou projetadas com base em imunoglobulinas cameloides; uma molécula de imunoglobulina completa pode consistir apenas de cadeias pesadas, sem cadeias leves. Veja, por exemplo, HamersCastermanet al., Nature 363:446-448 (1993).
[62] Em anticorpos que ocorrem naturalmente, as seis regiões determinando complementaridade ou CDRs presentes em cada do
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19/80 mínio de ligação de antígeno, são sequências curtas, não contíguas de aminoácidos, que são especificamente posicionadas para formar o domínio de ligação de antígeno, quando o anticorpo assume sua configuração tridimensional em um ambiente aquoso. O restante dos aminoácidos nos domínios de ligação de antígeno, referido como regiões de estrutura, mostra menor variabilidade intermolecular. As regiões de estrutura adotam amplamente uma conformação folha β e os laços de forma dos CDRs que conectam - e em alguns casos fazem parte de - a estrutura de folha β. Assim, as regiões de estrutura atuam para formar um andaime, que provê para o posicionamento das CDRs na orientação correta, por interações intercadeias, não covalentes. O domínio de ligação de antígeno formado pelos CDRs posicionados, define uma complementariedade de superfície ao epítopo no antígeno imunorreativo. Esta superfície de complementariedade promove a ligação não covalente do anticorpo ao seu epítopo cognato. Os aminoácidos compreendendo as CDRs e as regiões de estrutura, respectivamente, podem ser prontamente identificados para qualquer região variável de cadeia leve ou pesada por alguém com habilidades ordinárias na técnica, uma vez que foram precisamente definidas (vide, Sequências de Proteínas de Interesse Imunológico Kabat, E., et al., U.S. Department of Health and Human Services, (1983); e Chothia e Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987)).
[63] No caso em que existam duas ou mais definições de um termo que é usado e/ou aceito dentro da técnica, a definição do termo como usado neste documento, pretende incluir todos esses significados, a menos que explicitamente declarado em contrário. Um exemplo específico é o uso do termo região determinando a complementaridade (CDR) para descrever o antígeno não contíguo que combinando sites encontrados dentro da região variável de polipeptídeos tanto de cadeia pesada como leve. Esta região específica foi descrita por Kabat
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20/80 et al., “Sequences of Proteins of Immunological Interest (1983) e por Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987), que são incorporados aqui como referência em seu conteúdo. As definições de CDR, de acordo com Kabat e Chothia, incluem sobreposição ou subconjuntos de resíduos de aminoácidos, quando comparados entre si. No entanto, a aplicação de qualquer definição para se referir a um CDR de um anticorpo ou variantes do mesmo, pretende estar dentro do escopo do termo como definido e usado neste documento. Os resíduos de aminoácidos adequados, que abrangem as CDRs, como definidas por cada uma das referências acima citadas, são definidos na tabela abaixo como uma comparação. Os números exatos de resíduo, que abrangem um CDR particular, irão variar dependendo da sequência e do tamanho do CDR. Aqueles versados na técnica podem rotineiramente determinar quais resíduos compreendem um CDR particular, dado a sequência de aminoácido de região variável do anticorpo.
Kabat Chothia
CDR-H1 31-35 26-32
CDR-H2 50-65 52-58
CDR-H3 95-102 95-102
CDR-L1 24-34 26-32
CDR-L2 50-56 50-52
CDR-L3 89-97 91-96
[64] Kabat et al. também definiram um sistema de numeração para sequências de domínio variável, que é aplicável a qualquer anticorpo. Alguém com habilidades ordinárias na técnica pode atribuir inequivocamente este sistema de numeração Kabat a qualquer sequência de domínio variável, sem depender de quaisquer dados experimentais além da própria sequência. Como aqui usada, a numeração Kabat refere-se ao sistema de numeração estabelecido por Kabat et al., U.S. Dept, of Health and Human Services, Sequência de Proteínas de Interesse Imunológico (1983).
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21/80 [65] Adicionalmente à tabela acima, o sistema de números Kabat descreve as regiões CDR como segue: CDR-H1 começa aproximadamente no aminoácido 31 (i.e., aproximadamente 9 resíduos após o primeiro resíduo de cisteína), inclui aproximadamente 5-7 aminoácidos, e termina no próximo resíduo de triptofano. CDR-H2 começa no décimo quinto resíduo após o término de CDR-H1, inclui aproximadamente 16-19 aminoácidos e termina no próximo resíduo de arginina ou lisina. CDR-H3 começa aproximadamente no trigésimo terceiro resíduo de aminoácido, após o término de CDR-H2; inclui 3-25 aminoácidos; e termina na sequência W-G-X-G, onde X é qualquer aminoácido. CDR-L1 começa aproximadamente no resíduo 24 (ou seja, seguindo um resíduo de cisteína); inclui aproximadamente 10-17 resíduos; e termina no próximo resíduo de triptofano. CDR-L2 começa aproximadamente no décimo sexto resíduo após o fim de CDR-L1 e inclui aproximadamente 7 resíduos. CDR-L3 começa aproximadamente no trigésimo terceiro resíduo após o fim de CDR-L2 (isto é, seguindo um resíduo do cisteína); inclui aproximadamente 7-11 resíduos e termina na sequência F ou W-G-X-G, onde X é qualquer aminoácido.
[66] Os anticorpos aqui divulgados podem ser de qualquer origem animal, incluindo aves e mamíferos. De preferência, os anticorpos são de humanos, murino, burro, coelho, cabra, porquinho-da- índia, camelo, lhama, cavalo ou galinha. Em outra modalidade, a região variável pode ser condrictoide na origem (por exemplo, de tubarões).
[67] Como aqui usado, o termo região constante da cadeia pesada inclui sequências de aminoácidos derivadas de uma cadeia pesada de imunoglobulina. Um polipeptídeo compreendendo uma região constante de cadeia pesada compreende, pelo menos um de: um domínio CH1, um domínio de articulação (por exemplo, região de articulação superior, média e/ou inferior), um domínio CH2, um domínio CH3, ou uma variante ou fragmento do mesmo. Por exemplo, um poli
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22/80 peptídeo de ligação de antígeno para uso na divulgação, pode compreender uma cadeia de polipeptídeo compreendendo um domínio CH1; uma cadeia de polipeptídeo compreendendo um domínio CH1 em pelo menos uma porção de um domínio da articulação, e um domínio CH2; uma cadeia de polipeptídeo compreendendo um domínio CH1 e um domínio CH3; uma cadeia de polipeptídeo compreendendo um domínio CH1 em pelo menos uma porção de um domínio de articulação, e um domínio CH3, ou uma cadeia de polipeptídeo compreendendo um domínio CH1em pelo menos uma porção de um domínio de articulação, um domínio CH2, e um domínio CH3. Em outra modalidade, um polipeptídeo da divulgação compreende uma cadeia polipeptídica que compreende um domínio CH3. Além disso, um anticorpo para uso na divulgação, pode faltar em pelo menos uma porção de um domínio CH2 (por exemplo, todo ou parte de um domínio CH2). Como estabelecido acima, será entendido por alguém com habilidades ordinárias na técnica que a região constante de cadeia pesada pode ser modificada de tal forma que elas variem em sequência de aminoácidos da molécula de imunoglobulina que ocorre naturalmente.
[68] A região constante de cadeia pesada de um anticorpo aqui divulgado, pode ser derivada de moléculas de imunoglobulina diferentes. Por exemplo, uma região constante de cadeia pesada de um polipeptídeo pode compreender um domínio CH1 derivado de uma molécula de IgGi e uma região de articulação derivada de uma molécula de IgGs. Em um outro exemplo, uma região constante de cadeia pesada pode compreender uma região de articulação derivada, em parte, de uma molécula de IgGi e, em parte, de uma molécula de IgGs. Em outro exemplo, uma porção de cadeia pesada pode incluir uma articulação quimérica derivada, em parte, de uma molécula de IgGi e, em parte, de uma molécula de lgG4.
[69] Como utilizado aqui, o termo região constante da cadeia
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23/80 leve inclui sequências de aminoácido derivadas de cadeia leve de anticorpo. De preferência, a região de constante da cadeia leve compreende pelo menos um de um domínio kappa constante ou domínio lambda constante.
[70] Um par de cadeia leve - cadeia pesada “ se refere a coleção de uma cadeia leve e cadeia pesada que possa formar a um dímero através de uma ligação de dissulfeto entre o domínio do CL da cadeia leve e o domínio CH1 da cadeia pesada.
[71] Como indicado anteriormente, as estruturas da subunidade e a configuração tridimensional das regiões constantes das várias classes de imunoglobulina são bem conhecidas. Tal como aqui usado , o termo domínio VH inclui o domínio variável de terminal amino de uma cadeia pesada de imunoglobulina, e o termo domínio CH1 inclui o primeiro (mais terminal amino) domínio de região constante de uma cadeia pesada de imunoglobulina. O domínio CH1 é adjacente ao domínio VH e é terminal amino para a região de articulação de uma molécula de cadeia pesada de imunoglobulina.
[72] Tal como aqui usado, o termo domínio CH2 inclui a porção de uma molécula de cadeia pesada que se estende, por exemplo, de cerca o resíduo 244 ao resíduo 360 de um anticorpo usando esquemas de numeração convencionais (resíduos 244 a 360, sistema de numeração de Kabat; e resíduos 231-340, sistema de numeração da UE; vide Kabat et al., U.S. Dept, of Health and Human Services, Sequências de Proteínas de Interesse Imunológico (1983). O domínio CH2 é único, pelo fato de que não está estreitamente emparelhado com outro domínio. Em vez disso, duas cadeias de carboidratos ramificadas, N-ligadas, são interpostas entre os dois domínios CH2 de uma molécula IgG nativa intacta. Está também bem documentado que o domínio CH3 se estende do domínio CH2 ao terminal C da molécula de IgG e compreende aproximadamente 108 resíduos.
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24/80 [73] Tal como usado aqui, o termo região de articulação inclui a porção de uma molécula de cadeia pesada que une o domínio CH1 ao domínio CH2. Esta região de articulação compreende aproximadamente 25 resíduos e é flexível, assim permitindo que as duas regiões de ligação de antígeno de terminal N movam-se independente. As regiões de articulação podem ser subdivididas em três domínios distintos: domínio de articulação superior, médio e inferior (Roux et al., J. Immunol. 161:4083 (1998)).
[74] Tal como usado aqui, o termo ligação dissulfeto inclui a ligação covalente formada entre dois átomos de enxofre. O aminoácido cisteína compreende um grupo tiol, que pode formar uma ligação ou ponte dissulfeto com um segundo grupo tiol. Na maioria das moléculas de IgG que ocorrem naturalmente, as regiões CH1 e CK estão ligadas por uma ligação dissulfeto e as duas cadeias pesadas estão ligadas por duas ligações de dissulfeto, em posições correspondentes a 239 e 242, utilizando o sistema de numeração Kabat (posição 226 ou 229, sistema de numeração da UE).
[75] Como utilizado neste documento, o termo anticorpo quimérico define qualquer anticorpo em que o site ou região imunorreativa é obtida ou derivada de uma primeira espécie e a região constante (que pode ser intacta, parcial ou modificada de acordo com a divulgação instantâneo instante) é obtido a partir de uma segunda espécie. Em certas modalidades, a região ou site de ligação alvo será de uma fonte não humana (por exemplo, rato ou primata) e a região constante é humana.
[76] Conforme aqui utilizado, a humanização de percentual é calculada determinando-se o número de diferenças de aminoácidos de estrutura (i.e., diferença não CDR) entre o domínio humanizado e o domínio germinativo, subtraindo esse número do número total de aminoácidos e então dividindo-o pelo número total de aminoácidos e mul-
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25/80 tiplicando por 100.
[77] Por especificamente ligar ou tem especificidade a, geralmente se entende que um anticorpo se liga a um epítopo via seu domínio de ligação de antígeno e que a ligação implica em alguma complementaridade entre o domínio de ligação de antígeno e o epítopo. De acordo com esta definição, um anticorpo é dito especificamente se ligar a um epítopo, quando se liga a esse epítopo, via seu domínio de ligação de antígeno mais prontamente do que iria se ligar a um epítopo aleatório, não relacionado. O termo especificidade é aqui usado para qualificar a afinidade relativa pela qual um determinado anticorpo se liga a um determinado epítopo. Por exemplo, o anticorpo A pode ser considerado ter uma especificidade mais elevada para um dado epítopo do que o anticorpo B, ou o anticorpo A pode ser dito para ligar ao epítopo C com uma especificidade mais elevada do que tem para o epítopo relacionado D.
[78] Conforme usado neste documento, os termos tratar ou tratamento referem-se tanto ao tratamento terapêutico, como medidas profiláticas ou preventivas, em que o objeto é prevenir ou retardar (diminuir) uma alteração ou transtorno fisiológico indesejado, tal como a progressão do câncer. Os resultados clínicos benéficos ou desejados incluem, mas não se limitam a: alívio dos sintomas, diminuição da extensão da doença, estado estabilizado (ou seja, não agravamento) da doença, atraso ou desaceleração da progressão da doença, melhora ou paliação do estado da doença, e remissão (se parcial ou total),se detectável ou indetectável. Tratamento também pode significar prolongar a sobrevida, em comparação com a sobrevivência esperada, se não receber tratamento. Aqueles em necessidade do tratamento, incluem aqueles já com a condição ou o transtorno, bem como aqueles propensos para ter a condição ou o transtorno, ou aqueles em que a condição ou o transtorno devem ser prevenido.
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26/80 [79] Por sujeito ou indivíduo ou animal ou paciente ou mamífero, entende-se qualquer sujeito, particularmente um sujeito mamífero, para quem o diagnóstico, prognóstico, ou terapia é desejada. Os indivíduos mamíferos incluem humanos, animais domésticos, animais de fazenda e zoológico, esporte, ou animais de estimação, tais como cães, gatos, porquinhos-da-índia, coelhos, ratos, camundongos, cavalos, bovinos, vacas, e assim por diante.
[80] Como utilizado neste documento, frases tais como para um paciente em necessidade de tratamento ou sujeito em necessidade de tratamento incluem sujeitos, tais como os de mamíferos, que se beneficiariam da administração de um anticorpo ou composição da presente divulgação utilizada, por exemplo., para detecção, para um procedimento de diagnóstico e/ou para tratamento.
Anticorpos anti-PD-1 [81] A presente divulgação provê anticorpos anti-PD-1, com alta afinidade à proteína PD-1 humana. Os anticorpos testados exibiram atividades de ligação e inibitórias potentes e são úteis para usos terapêuticos e diagnósticos. Além disso, um dos anticorpos humanizados testados (TY101) apresentou afinidades de ligação significativamente mais altas do que dois anticorpos anti-hPD-1 aprovados pelo FDA.
[82] Uma personificação da presente divulgação, portanto, provê um anticorpo anti-PD-1 ou fragmento do mesmo, cujo anticorpo ou fragmento do mesmo pode se ligar especificamente a uma proteína humana de morte programada 1 (PD-1).
[83] De acordo com uma modalidade da presente divulgação, é provido um anticorpo que inclui domínios variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve, com regiões de CDR como um dos grupos de CDR na Tabela 1.
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Tabela 1: Sequências das regiões de CDR
Grupos CDR Sequências (SEQ ID N2:)
CDR grupo 1 HCDR1: GFTFSSYT (1) HCDR2: ISHGGGDT (2) HCDR3: ARHSGYERGYYYVMDY (3) LCDR1: ESVDYYGFSF (4) LCDR2: AAS (5) LCDR3: QQSKEVPW (6)
CDR grupo 2 HCDR1: GYTFTSYT (7) HCDR2: INPTTGYT (8) HCDR3: ARDDAYYSGY (9) LCDR1: ENIYSNL (10) LCDR2: AAK(11) LCDR3: QHFWGTPWT (12)
CDR grupo 3 HCDR1: GFAFSSYD (13) HCDR2: ITIGGGTT (14) HCDR3: ARHRYDYFAMDN (15) LCDR1: ENVDNYGINF (16) LCDR2: VSS (17) LCDR3: QQSKDVPW (18)
[84] Por exemplo, em uma modalidade, é provido um anticorpo isolado ou seu fragmento, tendo especificidade a uma proteína de morte celular programada humana 1 (PD-1), onde o anticorpo ou seu fragmento, compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo regiões determinando complementaridade de cadeia pesada HCDR1, HCDR2 e HCDR3, e uma região de variável de cadeia leve compreendendo regiões determinando complementaridade de cadeia leve LCDR1, LCDR2 e LCDR3, em que os HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3 são HCDR1: GFTFSSYT (ID SEQ NQ.:1), HCDR2: ISHGGGDT (SEQ ID NQ: 2), HCDR3: ARHSGYERGYYYVMDY (SEQ ID NQ: 3), LCDR1: ESVDYYGFSF
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28/80 (SEQ ID N2: 4), LCDR2: AAS (SEQ ID N2: 5), LCDR3: QQSKEVPW (SEQ ID N2: 6).
[85] Por exemplo, em uma modalidade, é provido um anticorpo isolado ou seu fragmento, tendo especificidade a uma proteína de morte celular programada humana 1 (PD-1), onde o anticorpo ou seu fragmento, compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo regiões determinando complementaridade de cadeia pesada HCDR1, HCDR2 e HCDR3, e uma região de variável de cadeia leve compreendendo regiões determinando complementaridade de cadeia leve LCDR1, LCDR2 e LCDR3, em que os HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3 são HCDR1: GYTFTSYT (SEQ ID N2: 7), HCDR2: INPTTGYT (SEQ ID N2: 8), HCDR3: ARDDAYYSGY (SEQ ID N2: 9), LCDR1: ENIYSNL (SEQ ID N2: 10), LCDR2: AAK (SEQ ID N2: 11), LCDR3: QHFWGTPWT (SEQ ID N2: 12).
[86] Por exemplo, em uma modalidade, é provido um anticorpo isolado ou seu fragmento, tendo especificidade a uma proteína de morte celular programada humana 1 (PD-1), onde o anticorpo ou seu fragmento, compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo regiões determinando complementaridade de cadeia pesada HCDR1, HCDR2 e HCDR3, e uma região de variável de cadeia leve compreendendo regiões determinando complementaridade de cadeia leve LCDR1, LCDR2 e LCDR3, em que os HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3 são HCDR1: GFAFSSYD (SEQ ID N2: 13), HCDR2: ITIGGGTT (SEQ ID N2: 14), HCDR3: ARHRYDYFAMDN (SEQ ID N2: 15), LCDR1: ENVDNYGINF (SEQ ID N2: 16), LCDR2: VSS (SEQ ID N2: 17), LCDR3: QQSKDVPW (SEQ ID N2: 18).
[87] Como demonstrado nos exemplos experimentais, os anticorpos que continham essas regiões de CDR, seja o camundongo, humanizado ou quimérico, tinham potentes atividades de ligação e ini
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29/80 bitórias de PD-1. Uma posterior modelagem de computador indicou que certos resíduos dentro do CDR podem ser modificados para reter ou melhorar a propriedade dos anticorpos. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-PD-1 da presente divulgação, inclui a CDR de VH e de VL conforme listado na Tabela 1, com uma, duas ou três modificações adicionais. Tais modificações podem ser adição, supressão ou subestação de aminoácidos.
[88] Em algumas modalidades, a modificação é a substituição, em não mais do que uma posição de ponto quente de cada um das CDRs. Em algumas modalidades, a modificação é a substituição em um, dois ou três posições de ponto quente. Em uma personificação, a modificação é a substituição em uma das posições de ponto quente. Tais substituições, em algumas modalidades, são substituições conservadoras.
[89] Uma substituição do aminoácido conservadora é aquela em que o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido com uma cadeia lateral semelhante. Famílias de resíduos de aminoácido com cadeias laterais semelhantes tem sido definidas na técnica, incluindo cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais sem carga polar (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais apoiares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais betaramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Assim, um resíduo de aminoácido não essencial em um polipeptídeo de imunoglobulina é preferencialmente substituído por outro resíduo de aminoácido da mesma família de cadeia lateral. Em uma outra modalidade, uma corda de aminoácidos pode ser substituída com uma
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30/80 corda estruturalmente similar, que difere na ordem e/ou na composição de membros da família de cadeia lateral.
[90] Exemplos não limitantes de substituições conservadoras de aminoácidos são fornecidos na tabela abaixo, onde uma pontuação de similaridade de 0 ou superior indica substituição conservadora entre os dois aminoácidos.
Matriz de similaridade de aminoácidos
C G P S A T D E N Q H K R V M I L F Y w
w -8 -7 -6 -2 -6 -5 -7 -7 -4 -5 -3 -3 2 -6 -4 -5 -2 0 0 17
Y 0 -5 -5 -3 -3 -3 -4 -4 -2 -4 0 -4 -5 -2 -2 -1 -1 7 10
F -4 -5 -5 -3 -4 -3 -6 -5 -4 -5 -2 -5 -4 -1 0 1 2 9
L -6 -4 -3 -3 -2 -2 -4 -3 -3 -2 -2 -3 -3 2 4 2 6
I -2 -3 -2 -1 -1 0 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -2 4 2 5
M -5 -3 -2 -2 -1 -1 -3 -2 0 -1 -2 0 0 2 6
V -2 -1 -1 -1 0 0 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -2 4
R -4 -3 0 0 -2 -1 -1 -1 0 1 2 3 6
K -5 -2 -1 0 -1 0 0 0 1 1 0 5
H -3 -2 0 -1 -1 -1 1 1 2 3 6
Q -5 -1 0 -1 0 -1 2 2 1 4
N -4 0 -1 1 0 0 2 1 2
E -5 0 -1 0 0 0 3 4
D -5 1 -1 0 0 0 4
T -2 0 0 1 1 3
A -2 1 1 1 2
S 0 1 1 1
P -3 -1 6
G -3 5
C 12
Substituições conservativas de aminoácidos
Para o aminoácido Substituição com
Alanina D-Ala, Gly, Aib, β-Ala, L-Cys, D-Cys
Arginina D-Arg, Lys, D-Lys, Orn D-Orn
Asparagina D-Asn, Asp, D-Asp, Glu, D-GluGln, D-Gln
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Ácido aspártico D-Asp, D-Asn, Asn, Glu, D-Glu, Gin, D-Gln
Cisteína D-Cys, S-Me-Cys, Met, D-Met, Thr, D-Thr, L-Ser, D-Ser
Glutamina D-Gln, Asn, D-Asn, Glu, D-Glu, Asp, D-Asp
Ácido glutâmico D-Glu, D-Asp, Asp, Asn, D-Asn, Gin, D-Gln
Glicina Ala, D-Ala, Pro, D-Pro, Aib, β-Ala
Isoleucina D-Ile, Vai, D-Val, Leu, D-Leu, Met, D-Met
Leucina Vai, D-Val, Met, D-Met, D-Ile, D-Leu, Ile
Lisina D-Lys, Arg, D-Arg, Orn, D-Orn
Metionina D-Met, S-Me-Cys, Ile, D-Ile, Leu, D-Leu,Vai, D-Val
Fenilanina D-Phe, Tyr, D-Tyr, His, D-His, Trp, D-Trp
Prolina D-Pro
Serina D-Ser, Thr, D-Thr, allo-Thr, L-Cys, D-Cys
Treonina D-Thr, Ser, D-Ser, allo-Thr, Met, D-Met, Vai, D-Val
Tirosina D-Tyr, Phe, D-Phe, His, D-His, Trp, D-Trp
Valina D-Val, Leu, D-Leu, lie, D-Ile, Met, D-Met
91] Exemp os não limitantes de VH são fornecidos em SEQ ID
NQ: 27, SEQ ID NQ: 31, SEQ ID NQ: 35, SEQ ID NQ: 37 e SEQ ID NQ: 39. SEQ ID NQ: 27 é um VH de murine. SEQ ID NQ: 31 é VH de um anticorpo quimérico, e SEQ ID NQ: 35, SEQ ID NQ:37, e SEQ ID NQ: 39 são humanizados.
[92] Exemplos não limitantes de VL são fornecidos em SEQ ID NQ: 29, SEQ ID NQ: 33, SEQ ID NQ: 41, SEQ ID NQ: 43 e SEQ ID NQ: 45. SEQ ID NQ: 29 é um VL de murino. SEQ ID NQ: 33 é VL de um anticorpo quimérico, e SEQ ID NQ: 41, SEQ ID NQ: 43 e SEQ ID NQ: 45 são humanizados.
[93] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-1 da presente divulgação inclui um VH de em SEQ ID NQ: 27, SEQ ID NQ: 31, SEQ ID NQ: 35, SEQ ID NQ: 37, ou SEQ ID NQ: 39, um VL de SEQ ID NQ: 29, ID SEQ NQ. : 33, SEQ ID NQ: 41, SEQ ID NQ: 43, ou SEQ ID NQ: 45, ou seus respectivos equivalentes biológicos. Um equivalente biológico de um VH ou VL é uma sequência que inclui os aminoácidos designados, enquanto tendo um total de 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99% de
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32/80 identidade de sequência. Um equivalente biológico de SEQ ID NQ: 27, por exemplo, pode ser um VH que tenha uma identidade de sequência global de 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99% à SEQ ID NQ: 27, mas retém as CDRs.
[94] Também será entendido por alguém com habilidades ordinárias na técnica, que os anticorpos como aqui divulgados podem ser modificados tal que eles variam na sequência de aminoácidos do polipeptídeo de ligação ocorrendo naturalmente a partir do qual eles foram derivados. Por exemplo, um polipeptídeo ou sequência de aminoácidos derivado de uma proteína designada pode ser semelhante, por exemplo, ter uma determinada identidade percentual para a sequência de partida, por exemplo, pode ser 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, ou 99% idêntica à sequência inicial.
[95] Em determinadas modalidades, o anticorpo compreende uma sequência de aminoácido ou uma ou mais unidades, não associados normalmente com um anticorpo. Modificações exemplares são descritas em mais detalhes abaixo. Por exemplo, um anticorpo da divulgação pode incluir uma sequência de ligante flexível, ou pode ser modificado para adicionar uma unidade funcional (por exemplo, PEG, um fármaco, uma toxina ou um rótulo).
[96] Os anticorpos, variantes ou derivados dos mesmos, da divulgação, incluem derivados que são modificados, ou seja, pela fixação covalente de qualquer tipo de molécula ao anticorpo, tal que o anexo covalente não impeça o anticorpo de se ligar ao epítopo. Por exemplo, mas não por limitação, os anticorpos podem ser modificados, por exemplo, por glicosilação, acetilação, peguilação, fosforilação, fosforilação, amidação, derivatização por grupos de proteção/bloqueio conhecidos, divagem proteolítica, ligação a um ligante celular ou outra proteína, etc. Qualquer uma das inúmeras modificações químicas pode ser realizada por técnicas conhecidas, incluindo, mas não limitado
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33/80 a: divagem química específica, acetilação, formilação, síntese metabólica de tunicamicina, etc. Adicionalmente, os anticorpos podem conter um ou mais aminoácidos não clássicos.
[97] Em algumas modalidades, os anticorpos podem ser conjugados a agentes terapêuticos, profármacos, peptídeos, proteínas, enzimas, vírus, lipídios, modificadores de resposta biológica, agentes farmacêuticos, ou PEG.
[98] Os anticorpos podem ser conjugados ou fundidos a um agente terapêutico, que pode incluir rótulos detectáveis, como rótulos radioativos, um imunomodulador, um hormônio, uma enzima, um oligonucleotídeo, um agente terapêutico ou de diagnóstico fotoativo, um agente citotóxico, que pode ser uma droga ou uma toxina, um agente de reforço de ultrassom, um rótulo não radioativo, uma combinação dos mesmos e outros agentes conhecidos na técnica.
[99] Os anticorpos podem ser rotulados detectavelmente, por acoplamento a um composto quimioluminescente. A presença do polipeptídeo ligante antígeno, marcado com quimioluminescência, é então determinada pela detecção da presença de luminescência que surge durante o curso de uma reação química. Exemplos de compostos de rotulagem quimioluminescentes particularmente úteis são luminol, isoluminol, éster de acridinia teromático, imidazol, sal de acridinia e éster de oxalato.
[100] Os anticorpos também podem ser detectavelmente rotulados usando metais emissores de fluorescência, tal como 152Eu, ou outros da série de lantanídeos. Estes metais podem ser anexados ao anticorpo usando grupos quelantes de tal metal, como o ácido dietileno triamino penta cético (DTPA) ou o ácido etileno diamino tetra acético (EDTA). As técnicas para conjugar várias unidades a um anticorpo são bem conhecidas; vide, por exemplo, Arnonet al., Anticorpos Monoclonais para Imunodirecionamento de Drogas em Terapia do Câncer, em
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Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy,, Reisfeldet al. (EDS.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. (1985); Hellstrom et al., Anticorpos para a Entrega de Drogas, em Controlled Drug Delivery (2- ed.), Robinson et al., (EDS.), Marcel Dekker, Inc., pp. 623-53 (1987); Thorpe, Veículos de Anticorpos de Agentes Citotóxicos em Terapia de Câncer: Uma Revisão, em Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (EDS.), pp. 475-506 (1985); Análise, Resultados, e Futuro Potencial do Uso Terapêutico de Anticorpo Radio-rotulado na Terapia de Câncer, em in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (EDS.), Academic Press pp. 303-16 (1985), e Thorpe et al., A Preparação e Propriedades Citotóxicas de Conjugados Anticorpo-toxina , Immunol. Rev. (52:119-58 (1982)). Moléculas Bifuncionais [101] PD-1 é uma molécula de ponto de verificação imune e é igualmente um antígeno de tumor. Como antígeno de tumor direcionando uma molécula, um anticorpo ou um fragmento de ligação de antígeno específico a PD-1, podem ser combinados com um segundo fragmento de ligação de antígeno específico a uma célula imune para gerar um anticorpo biespecífico.
[102] Em algumas modalidades, a célula imune é selecionada a partir do grupo constituído por uma célula T, uma célula B, um monócito, um macrófago, um neutrófilo, uma célula dendrítica, um fagócito, uma célula assassina natural, um eosinófilo, um basófilo e uma célula mastócito. As moléculas na célula imune que podem ser direcionadas incluem, por exemplo, CD3, CD16, CD19, CD28 e CD64. Outros exemplos incluem PD-1, CTLA-4, lag-3 (também conhecida como CD223), CD28, CD122, 4-1 BB (também conhecida como CD137), TIM3, Ox-40 ou OX40L, CD40 ou CD40L, LIGHT, ICOS/ICOSL, GITR/GITRL, TIGIT, CD27, VISTA, B7H3, B7H4, HEVM ou BTLA (também conhecida como CD272), receptores imunoglobulina
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35/80 semelhantes de célula assassina (KIRs), e CD47. Exemplos específicos de biespecificidade incluem, sem limitação, PD-L1/PD-1, PD1/LAG3, PD-1/TIGITe PD-1/CD47.
[103] Como um inibidor de ponto de verificação imune, um anticorpo ou um fragmento de ligação de antígeno específico a PD-1, pode ser combinado com um segundo fragmento de ligação de antígeno específico a um antígeno do tumor para gerar um anticorpo biespecífico. Um antígeno tumoral é uma substância antigênica produzida em células tumorais, ou seja, desencadeia uma resposta imune no hospedeiro. Os antígenos do tumor são úteis em identificar células de tumor e são candidatos potenciais para o uso em terapia de câncer. As proteínas normais no corpo não são antigênicas. Determinadas proteínas, entretanto, são produzidas ou superexpressadas durante a gênese de tumor e parecem assim estranhas ao corpo. Isto pode incluir proteínas normais que são bem sequestradas do sistema imunológico, proteínas que são normalmente produzidas em quantidades extremamente pequenas, proteínas que normalmente são produzidas apenas em certas fases do desenvolvimento, ou proteínas cuja estrutura é modificada devido à mutação.
[104] Uma abundância de antígenos de tumor é conhecida na técnica e os antígenos de tumor novos podem prontamente ser identificados por triagem. Exemplos não limitantes de antígenos tumorais incluem EGFR, Her2, EpCAM, CD20, CD30, CD33, CD47, CD52, CD133, CD73, CEA, gpA33, Mucins, TAG-72, CIX, PSMA, proteína de ligação de folato, GD2, GD3, GM2, VEGF, VEGF, Integrin, ανβ3, α5β1, ERBB2, ERBB3, MET, IGF1R, EPHA3, TRAILR1, TRAILR2, RANKL, FAP e Tenascin.
[105] Em alguns aspectos, a unidade monovalente tem especificidade para uma proteína que é superexpressa em uma célula tumoral, em comparação com uma célula não tumoral correspondente. Uma
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36/80 célula não tumoral correspondente, como usado aqui, refere-se a uma célula não tumoral que é do mesmo tipo de célula que a origem da célula tumoral. Observa-se que tais proteínas não são necessariamente diferentes dos antígenos tumorais. Exemplos não limitantes incluem antígeno carcino-embrionário (CEA), que é superexpresso na maioria dos carcinomas de cólon, reto, mama, pulmão, pâncreas e trato gastrointestinal; receptores de heregulina (HER-2, Neuor c-erbB-2), que é frequentemente superexpresso em cânceres de mama, ovário, cólon, pulmão, próstata e cervical; receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR), que é superexpresso em uma gama de tumores sólidos, incluindo os da mama, cabeça e pescoço, pulmão de células não pequenas e próstata; receptor de asialoglicoproteína; receptor de transferrina; receptor complexo da enzima serpina, que é expressado em hepatócitos; receptor do fator de crescimento do fibroblasto (FGFR), que é superexpressado em células de adenocarcinoma ductal pancreático; receptor de fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR), para terapia genética de antiangiogênese; receptor de folato, que é seletivamente superexpressado em 90% de carcinomas ovarianos não mucinoso; glicocálix de superfície celular; receptores de carboidratos; e o receptor polimérico de imunoglobulina, que é útil para a entrega de gene às células epiteliais respiratórias e atrativo para o tratamento de doenças de pulmão, tais como a fibrose cística. Exemplos não limitantes de biespecificidade a este respeito incluem PD1/EGFR, PD-1/Her2, PD-1/CD33, PD-1/CD133, PD-1/CEA e PD1/VEGF.
[106] O formato diferente de anticorpos biespecíficos é também fornecido. Em algumas modalidades, cada um do fragmento de antiPD-1 e o segundo fragmento é selecionado independentemente de um fragmento Fab, de um fragmento variável de cadeia única (scFv), ou de um anticorpo de domínio único. Em algumas modalidades, o anti
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37/80 corpo biespecífico inclui ainda um fragmento Fc.
[107] Moléculas bifuncionais que incluem não apenas o anticorpo ou o fragmento de ligação de antígeno, são também providas. Como um antígeno do tumor orientando a molécula, um anticorpo ou um fragmento de ligação de antígeno específico a PD-1, tal como aqueles descritos aqui, podem ser combinados com uma citocina imune ou um ligante opcionalmente através de um ligante do peptídeo. As citocinas imunes ligadas ou ligantes incluem, mas não se limitam a: IL-2, II-3, IL4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, 11-12, IL-13, IL-15, GM-CSF, TNF-α, CD40L, OX40L, CD27L, CD30L, 4-1 BBL, LIGHT e GITRL. Tais moléculas bifuncionais podem combinar o efeito de bloqueio do ponto de verificação imune com modulação imune de local de site do tumor.
Codificação de Polinucleotídeos, os Anticorpos e Métodos de Preparação dos Anticorpos [108] A presente divulgação também provê polinucleotídeos isolados ou moléculas de ácidos nucleicos (por exemplo, SEQ ID NQ: 22, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44 e 46) codificando os anticorpos, variantes ou derivados dos mesmos da divulgação. Os polinucleotídeos da presente divulgação podem codificar as regiões variáveis de cadeia pesada e leve inteira dos polipeptídeos de ligação de antígeno, das variações ou dos derivados deles, na mesma molécula de polinucleotídeo ou em moléculas de polinucleotídeo separadas. Adicionalmente, os polinucleotídeos da presente divulgação podem codificar porções das regiões variáveis de cadeia pesada e leve dos polipeptídeos de ligação de antígeno, variantes ou seus derivados, na mesma molécula de polinucleotídeo ou em moléculas de polinucleotídeo separadas.
[109] Métodos de fazer anticorpos são bem conhecidos na técnica e aqui descritos. Em certas modalidades, as regiões variáveis e constantes dos polipeptídeos de ligação de antígeno da presente di
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38/80 vulgação, são completamente humanas. Os anticorpos completamente humanos podem ser feitos usando as técnicas descritas na técnica e como aqui descrito. Por exemplo, os anticorpos completamente humanos contra a um antígeno específico, podem ser preparados administrando o antígeno a um animal transgênica, que seja modificado para produzir tais anticorpos em resposta ao desafio antigénico, mas cujo o loci endógeno foi desabilitado. Técnicas exemplares que podem ser usadas para fazer tais anticorpos, são descritas nas patentes norteamericanas: 6.150.584; 6.458.592; 6.420.140, que são incorporados por referência em suas íntegras.
[110] Em certas modalidades, os anticorpos preparados não conseguirão uma resposta imune deletéria no animal a ser tratado, por exemplo, em um humano. Em uma modalidade, os polipeptídeos de ligação de antígeno, variantes ou derivados dos mesmos da divulgação, são modificados para reduzir sua imunogenicidade usando métodos reconhecidos pela técnica. Por exemplo, os anticorpos podem ser humanizados, primatizados, desimunizados, ou podem ser feitos anticorpos quiméricos. Estes tipos de anticorpos são derivados de um anticorpo não humano, tipicamente um anticorpo murino ou primata, que conserve ou conserve substancialmente as propriedades de ligação de antígeno do anticorpo do progenitor, mas que é menos imunogênico em humanos. Isto pode ser conseguido por vários métodos, incluindo (a) enxertar os domínios variáveis não humanos inteiros em regiões constantes humanas para gerar anticorpos quiméricos; b) enxertar pelo menos uma parte de uma ou mais das regiões determinando complementaridade não humana (CDRs), numa estrutura humana e em regiões constantes com ou sem retenção de resíduos de estrutura críticos; ou (c) transplantar os domínios variáveis não humanos inteiros, mas camuflando eles com uma seção semelhante à humana por substituição de resíduos superficiais. Tais métodos são divulgados em
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Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 57:6851-6855 (1984); Morrison et al., Adv. Immunol. 44:65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun. 25:489-498 (1991); Padlan, Molec. Immun. 31:169-217 (1994), e patentes norte-americanas η2.: 5.585.089, 5.693.761, 5.693.762 e 6.190.370; todos os quais são incorporados por referência na íntegra.
[111] A desimunização também pode ser usada para diminuir a imunogenicidade de um anticorpo. Como aqui usado, o termo desimunização inclui a alteração de um anticorpo para modificar epítopos de célula T (Vide, por exemplo, a publicação de pedido internacional de patente n2.: WO/9852976 A1 e WO/0034317 A2). Por exemplo, sequências de cadeia leve variável e cadeia pesada variável do anticorpo inicial, são analisadas e um mapa de epítopo de célula T humana de cada região V, mostrando a localização dos epítopos em relação às regiões determinando complementaridade (CDRs) e outros resíduos chave dentro da sequência, é criado. Epítopos de célula T individuais do mapa de epítopo de célula T são analisados, a fim identificar substituições alternativas de aminoácido com um baixo risco de alterar a atividade do anticorpo final. Uma série de sequências alternativas de leve variável e pesada variável são projetadas compreendendo combinações de substituições de aminoácidos e essas sequências são subsequentemente incorporadas em uma variedade de polipeptídeos de ligação. Tipicamente, entre 12 e 24 anticorpos variantes são gerados e testados para ligação e/ou função. Genes completos de cadeia pesada e leve compreendendo a variável modificada e as regiões constantes humanas, são clonados então em vetores de expressão e os plasmídeos subsequentes introduzidos em linhas de célula para a produção do anticorpo inteiro. Os anticorpos são comparados então em ensaios bioquímicos e biológicos apropriados, e a variação ótima é identificada.
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40/80 [112] A especificidade de ligação dos polipeptídeos de ligação de antígeno da presente divulgação, pode ser determinada por ensaios in vitro, tais como imunoprecipitação, ensaio de radioimunização (RIA) ou ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA).
[113] Alternativamente, técnicas descritas para a produção de unidades de cadeia única (Patente norte-americana nQ. 4.694.778; Bird, Science 242:423-442 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 55:5879- 5883 (1988); e Ward et al., Nature 334:544-554 (1989)), podem ser adaptados para produzir unidades de cadeia única da presente divulgação. As unidades de cadeia única são formadas ligando os fragmentos de cadeia pesada e cadeia leve da região de Fv, via uma ponte de aminoácido, resultando em um peptídeo de fusão de cadeia única. Técnicas para a montagem de fragmentos de Fv funcionais em E. coli, também podem ser utilizadas (Skerra et al., Science 242:1038-1041 (1988)).
[114] Exemplos de técnicas que podem ser usadas para produzir Fvs de cadeia única (scFvs) e anticorpos, incluem aqueles descritos nas patentes norte-americanas nQ. 4.946.778 e 5.258.498; Huston et al., Methods in Enzymology 203:46-88 (1991); Shu et al., Proc. Natl. Sci. USA 90:1995-1999 (1993); e Skerraet al., Science 240:1038-1040 (1988). Para alguns usos, incluindo uso in vivo de anticorpos em seres humanos e ensaios de detecção in vitro, pode ser preferível usar anticorpos quiméricos, humanizados ou humanos. Um anticorpo quimérico é uma molécula na qual diferentes porções do anticorpo são derivadas de diferentes espécies animais, tais como anticorpos tendo uma região variável derivada de um anticorpo monoclonal murino e uma região constante de imunoglobulina humana. Métodos para a produção de anticorpos quiméricos são conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986); Gillies et al., J. Immunol. Methods 125:191-202 (1989); paten
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41/80 tes norte-americanas nQ. 5.807.715; 4.816.567; e 4.816.397, que são incorporados aqui por referência em sua íntegra.
[115] Anticorpos humanizados são moléculas de anticorpos derivadas de um anticorpo de espécies não humanas, que ligam o antígeno desejado, tendo uma ou mais regiões determinando complementaridade (CDRs) das espécies não humanas e regiões de estrutura de uma molécula de imunoglobulina humana. Muitas vezes, os resíduos de estrutura em regiões de estrutura humanas, serão substituídos com o resíduo correspondente do anticorpo doador de CDR, para alterar, de preferência melhorar, a ligação de antígeno. Estas substituições de estrutura são identificadas por métodos bem conhecidos na técnica, por exemplo, por modelagem das interações do CDR e resíduos de estrutura, para identificar resíduos de estrutura importantes para a ligação de antígeno e comparação de sequências para identificar resíduos de estrutura incomuns em posições específicas. (Veja, por exemplo, Queen et al., patente norte-americana nQ. 5.585.089; Riechmann et al., Nature 332:323 (1988), que são incorporados aqui por referência em sua íntegra). Os anticorpos podem ser humanizados usando uma variedade de métodos conhecidos na técnica, incluindo, por exemplo, enxerto de CDR (EP 239.400; Publicação PCT WO 91/09967; patentes norte-americanas nQ. 5.225.539; 5.530.101; e 5.585.089), laminar ou ressurgir (EP 592.106; EP 519.596; Padlan, Imunologia Molecular 28 (4/5): 489-498 (1991); Studnicka et al., engenharia proteica 7 (6): 805-814 (1994); Aaland. et al., proc. Natl. Sei. USA 91:969-973 (1994)), e embaralhar a cadeia (patente norteamericana nQ. 5.565.332, que é incorporada por referência em sua íntegra).
[116] Anticorpos completamente humanos são particularmente desejáveis para o tratamento terapêutico de pacientes humanos. Anticorpos humanos podem ser feitos por uma variedade de métodos co
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42/80 nhecidos na técnica, que incluem métodos da exposição do fago, usando bibliotecas do anticorpo derivadas de sequências de imunoglobulina humanas. Vide também, patente norte-americana nQ. 4.444.887 e 4.716.111; e publicações PCT de WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735, e WO 91/10741; cada uma das quais é incorporado aqui por referência na sua íntegra.
[117] Os anticorpos humanos também podem ser produzidos usando camundongos transgênicos, que são incapazes de expressar imunoglobulinas endógenas funcionais, mas que podem expressar genes de imunoglobulina humana. Por exemplo, os complexos do gene de imunoglobulina de cadeia leve e pesada humana, podem ser introduzidos aleatoriamente ou por recombinação homóloga dentro de células tronco embrionárias de rato. Alternativamente, a região variável humana, a região constante e a região de diversidade, podem ser introduzidas em células tronco embrionárias de rato, adicionalmente aos genes de cadeia pesada e leve humanos. Os genes de imunoglobulina de cadeia pesada e leve do rato, podem ser tornados não funcionais separada ou simultaneamente, com a introdução de loci de imunoglobulina humana por recombinação homóloga. Em particular, supressão homozigota da região de JH previne a produção de anticorpo endógeno. As células tronco embrionárias modificadas, são expandidas e micro injetadas em blastocistos, para produzir ratos quiméricos. Os ratos quiméricos são criados então para produzir a prole homozigota, que expressa anticorpos humanos. Os ratos transgênicos são imunizados da maneira normal com um antígeno selecionado, por exemplo, tudo ou uma porção de um polipeptídeo alvo desejado. Anticorpos monoclonais direcionados contra o antígeno, podem ser obtidos dos ratos imunizados, transgênicos, usando a tecnologia convencional do hibridoma. Os transgenes de imunoglobulina humanos abrigados pelos ra
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43/80 tos transgênicos, se rearranjam durante a diferenciação de células B, e submetem-se subsequentemente à comutação da classe e à mutação somática. Assim, usando tal técnica, é possível produzir anticorpos IgG, IgA, IgM e IgE terapeuticamente úteis. Para uma visão geral desta tecnologia para a produção de anticorpos humanos, vide Lonberg e Huszarint. Rev. Immunol. 73:65-93 (1995). Para uma discussão detalhada desta tecnologia para produzir anticorpos humanos e anticorpos monoclonais humanos, e protocolos para produzir tais anticorpos, vide, por exemplo, publicações do PCT WO 98/24893; WO 96/34096; WO 96/33735; patentes norte-americanas nQ. 5.413.923; nQ. 5.625.126; nQ. 5.633.425; nQ. 5.569.825; nQ.5.661.016; nQ. 5.545.806; nQ. 5.814.318; e nQ. 5.939.598, que são aqui incorporados por referência na sua íntegra. Adicionalmente, empresas como Abgenix, Inc. (Freemont, Califórnia, EUA) e GenPharm (San Jose, Califórnia, EUA) podem ser contratadas para fornecer anticorpos humanos direcionados contra um antígeno selecionado, usando tecnologia similar à descrita acima.
[118] Os anticorpos completamente humanos que reconhecem um epítopo selecionado, também podem ser gerados usando uma técnica referida como seleção guiada. Nesta técnica, um anticorpo monoclonal não humano selecionado, por exemplo, um anticorpo de rato, é usado para guiar a seleção de um anticorpo completamente humano, que reconhece o mesmo epítopo. (Jespers et al., Bio/tecnologia 72:899-903 (1988). Vide também, patente norte-americana nQ. 5.565.332, que é incorporada pela referência em sua íntegra.) [119] Em outra modalidade, o DNA que codifica os anticorpos monoclonais desejados, pode ser prontamente isolado e sequenciado usando procedimentos convencionais (por exemplo, usando sondas de oligonucleotídeo, que são capazes de se ligar especificamente a genes que codificam os anticorpos murinos de cadeias pesadas e leves). As células de hibridoma isoladas e subclonadas servem como uma
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44/80 fonte preferencial de tal DNA. Uma vez isolado, o DNA pode ser colocado em vetores da expressão, que são transfectados então em células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas, tais como células de E. coli, células de COS símias, células de ovário de Hamster chinês (CHO) ou células de mieloma que, de outra maneira, não produzem imunoglobulinas. Mais particularmente, o DNA isolado (que pode ser sintético como descrito aqui) pode ser usado para clonar sequências de regiões constantes e variáveis, para fabricar anticorpos, conforme descrito em Newman et al., patente norte-americana nQ. 5.658.570, depositada em 25 de janeiro de 1995, que é incorporada por referência aqui. Essencialmente, isto implica a extração do RNA das células selecionadas, a conversão à cDNA, e a amplificação pelo PCR usando iniciadores específicos de Ig. Iniciadores adequados para esta finalidade também são descritos na patente norte-americana nQ. 5.658.570. Como será discutido em mais detalhes abaixo, células transformadas, expressando o anticorpo desejado, podem ser cultivadas em quantidades relativamente grandes para fornecer suprimentos clínicos e comerciais da imunoglobulina.
[120] Adicionalmente, usando técnicas rotineiras de DNA recombinante, uma ou mais das CDRs dos polipeptídeos de ligação de antígeno da presente divulgação, pode ser inserida dentro das regiões de estrutura, por exemplo, em regiões de estrutura humanas, para humanizar um anticorpo não humano. As regiões de estrutura podem ocorrer naturalmente, ou regiões de estrutura de consenso, e preferencialmente regiões de estrutura humanas (vide, por exemplo, Chothia et al., J. mol. Biol. 278:457-479 (1998) para uma lista de regiões de estrutura humana). Preferivelmente, o polinucleotídeo gerado pela combinação das regiões da estrutura e CDRs, codifica um anticorpo que se liga especificamente a pelo menos um epítopo de um polipeptídeo desejado, por exemplo, LIGHT. Preferencialmente, uma ou mais substituições de
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45/80 aminoácidos podem ser feitas dentro das regiões de estrutura, e preferencialmente as substituições de aminoácidos melhoram a ligação do anticorpo ao seu antígeno. Adicionalmente, tais métodos podem ser usados para fazer substituições de aminoácidos ou supressões de um ou mais resíduos de cisteína de região variável, que participam de uma ligação de dissulfeto intracadeia, para gerar moléculas de anticorpos que faltam em uma ou mais ligações de dissulfeto intracadeia. Outras alterações ao polinucleotídeo são englobados pela presente divulgação e dentro da habilidade da técnica.
[121] Além disso, técnicas desenvolvidas para a produção de anticorpos quiméricos (Morrison et al., Proc. Natl. acad. Sei. USA: 851-855 (1984); Neuberger et al., Nature 372:604-608 (1984); Takeda et al., Nature 314:452-454 (1985)) por encaixe de genes de uma molécula de anticorpo de rato, de especificidade de antígeno adequada, juntamente com genes de uma molécula de anticorpo humano, de atividade biológica apropriada, podem ser usadas. Como aqui usado, um anticorpo quimérico é uma molécula em que porções diferentes são derivadas de espécies animais diferentes, tais como aquelas tendo uma região variável derivada de um anticorpo monoclonal murino e de uma região constante de imunoglobulina humana.
[122] Ainda outro meio altamente eficiente para a geração de anticorpos recombinantes é divulgado por Newman, Biotechnology 10:1455-1460 (1992). Especificamente, essa técnica resulta na geração de anticorpos primatizados, que contêm domínios variáveis de macacos e sequências constantes humanas. Esta referência é incorporada por referência na íntegra, neste documento. Além disso, esta técnica também é descrita, comumente atribuída, nas patentes norteamericanas nQ. 5.658.570, 5.693.780 e 5.756.096, cada uma das quais é incorporada aqui por referência.
[123] Alternativamente, as linhas celulares produtoras de anticor
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46/80 pos podem ser selecionadas e cultivadas usando técnicas bem conhecidas pelo especialista nela versado. Tais técnicas são descritas em uma variedade de manuais de laboratório e publicações primárias. Neste sentido, técnicas adequadas para uso na divulgação, conforme descrito abaixo, são descritas em “Protocolos Atuais de Imunologia”, Coligan et al., Eds., Green Publishing Associates e Wiley-lnterscience, John Wiley e Sons, Nova York (1991), que é aqui incorporada por referência em sua totalidade, incluindo suplementos.
[124] Adicionalmente, as técnicas padrão conhecidas daqueles versados na técnica, podem ser usadas para introduzir mutações na sequência de nucleotídeo codificando um anticorpo da divulgação atual, incluindo, mas não limitando, mutagênese direcionada ao site e mutagênese mediada por PCR, que resultam em substituições de aminoácidos. Preferivelmente, as variantes (incluindo os derivados) codificam menos de 50 substituições de aminoácidos, menos de 40 substituições de aminoácidos, menos de 30 substituições de aminoácidos, menos de 25 substituições de aminoácidos, menos de 20 substituições de aminoácidos, menos de 15 substituições de aminoácidos, menos de 10 substituições de aminoácidos, menos de 5 substituições de aminoácidos, menos de 4 substituições de aminoácidos, menos de 3 substituições de aminoácidos, ou menos de 2 substituições de aminoácidos, em relação à região de cadeia pesada variável de referência, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, região da cadeia leve variável, CDR-L1, CDR-L2, ou CDR-L3. Alternativamente, as mutações podem ser introduzidas aleatoriamente ao longo de toda ou parte da sequência de codificação, como por mutagênese de saturação, e os mutantes resultantes podem ser rastreados para atividade biológica para identificar mutantes que mantêm a atividade.
Tratamento de câncer [125] Como descrito aqui, os anticorpos, variantes ou derivados
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47/80 da presente divulgação podem ser utilizados em certos métodos de tratamento e diagnóstico.
[126] A presente divulgação é ademais direcionada a terapias baseadas em anticorpos, que envolvem administrar os anticorpos da revelação a um paciente, tal como um animal, um mamífero e um ser humano, para tratar um ou mais dos distúrbios ou condições aqui descritas. Os compostos terapêuticos da divulgação incluem, mas não se limitam a, anticorpos da divulgação (incluindo variantes e derivados dos mesmos, conforme descrito neste documento) e ácidos nucleicos ou polinucleotídeos, que codificam anticorpos da divulgação (incluindo variantes e derivados dos mesmos, conforme descrito neste documento).
[127] Os anticorpos da divulgação também podem ser utilizados para tratar ou inibir câncer. PD-1 pode ser superexpresso em células tumorais. O PD-1 derivado do tumor pode se ligar a PD-L1 em células imunes, limitando assim a imunidade de células T antitumorais. Resultados com inibidores de molécula pequenas, ou os anticorpos monoclonais que alvejam PD-1 em modelos murino de tumor, indicam que a terapia alvejada de PD-1 é uma alternativa importante e abordagem realística ao controle eficaz de crescimento de tumor. Como demonstrado nos exemplos experimentais, o anti-PD-1 ativa por anticorpos a engrenagem de resposta imune adaptativa, que pode conduzir à sobrevivência melhorada em pacientes de câncer.
[128] Assim, em algumas modalidades, são fornecidos métodos de tratamento de um câncer em um paciente em necessidade do mesmo. O método, em uma modalidade, consiste em administrar ao paciente, uma quantidade efetiva de um anticorpo da divulgação atual. Em algumas modalidades, pelo menos uma das células de câncer (por exemplo, células estromas) no paciente expressa, superexpressa, ou é induzido a expressar PD-1. A indução da expressão de PD-1, por
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48/80 exemplo, pode ser feita pela administração de uma vacina de tumor ou radioterapia.
[129] Tumores que expressam a proteína PD-1 incluem os de câncer de bexiga, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer renal, câncer de mama, câncer de uretral, câncer colorretal, câncer de cabeça e pescoço, câncer de células escamosas, carcinoma de células de Merkel, câncer gastrointestinal, câncer de estômago, câncer de esôfago, câncer de ovário, câncer renal e câncer de pulmão de pequenas células. Assim, os anticorpos atualmente divulgados podem ser usados para tratar qualquer um ou mais desses cânceres.
[130] Terapias celulares, tais como terapias de célula T de receptor quimérico do antígeno (CAR), são fornecidas também na presente divulgação. Uma célula adequada pode ser usada, que é colocada em contato com um anticorpo anti-PD-1 da presente divulgação (ou alternativamente manobrada para expressar um anticorpo anti-PD-1 da presente divulgação). Por meio desse contato ou manobra, a célula pode então ser introduzida a um paciente de câncer em necessidade de um tratamento. O paciente com câncer pode ter um câncer de qualquer um dos tipos como aqui divulgados. A célula (por exemplo, célula T) pode ser, por exemplo, um linfócito T de infiltração tumoral, uma célula T CD4 +, uma célula T CD8 +, ou a combinação das mesmas, sem limitação.
[131] Em algumas modalidades, a célula foi isolada do paciente de câncer por ele ou ela mesmo. Em algumas modalidades, a célula foi fornecida por um doador ou de um banco de células. Quando a célula é isolada do próprio paciente com câncer, as reações imunes indesejáveis podem ser minimizadas.
[132] Doenças ou condições adicionais associadas ao aumento da sobrevida celular, que podem ser tratadas, impedidas, diagnosticadas e/ou prognosticadas com os anticorpos ou variantes ou derivados
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49/80 dos mesmos, da divulgação incluem, mas não estão limitados a, progressão e/ou metástases de malignidades e distúrbios relacionados, tais como leucemia (incluindo leucemias agudas (por exemplo, leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda (incluindo mieloblástica, promielocítica, mielomonocítica, monocítica e eritroleucemia )) e leucemias crônicas (por exemplo, leucemia mielocítica crônica (granulocítica) e leucemia linfocítica crônica)), policitemia vera, linfomas (por exemplo, doença de Hodgkin e doença de não Hodgkin), mieloma múltiplo, macroglobulinemia de Waldenstrom, doença de cadeia pesada, e tumores sólidos incluem, mas não se limitado a, sarcomas e carcinomas, tais como fibrossarcoma, mixossarcoma, lipossarcoma, condrossarcoma, sarcoma osteogénico, cordoma, angiossarcoma, endoteliossarcoma, linfo-angiossarcoma, linfo-angio-endoteliossarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiossarcoma, sarcoma do rabdomio, carcinoma de cólon, câncer pancreático, câncer da mama, câncer de tireoide, câncer endometrial, melanoma, câncer da próstata, câncer ovariano, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basais, adenocarcinoma, carcinoma de glândulas sudoríparas, carcinoma da glândula sebácea, carcinoma papilífero, adenocarcinoma papilares, cis adenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogênico, carcinoma de células renais, hepatoma, carcinoma do duto biliar, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionário, tumor de Wilm , câncer cervical, tumor testicular, carcinoma do pulmão, carcinoma pequeno do pulmão de células pequenas, carcinoma de bexiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, medulo blastoma, craniofarigioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, menangioma, melanoma, neuroblastoma e retinoblastoma.
Tratamento de Infecções e Distúrbios Imunológicos [133] Como demonstrado nos exemplos experimentais, os anti
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50/80 corpos da presente divulgação podem ativar a resposta imune, que pode então ser útil para o tratamento de infecções.
[134] Infecção é a invasão dos tecidos corporais de um organismo por agentes causadores de doença, sua multiplicação e a reação dos tecidos hospedeiros a esses organismos e as toxinas que produzem. Uma infecção pode ser causada por agentes infecciosos, tais como vírus, viroides, príons, bactérias, nematoides, tais como lombrigas parasitárias e vermes, artrópodes, tais como carrapatos, ácaros, pulgas e piolhos, fungos, tal como micose, e outros macroparasitas, tais como tênias e outros helmintos. Em um aspecto, o agente infeccioso é uma bactéria, como a bactéria gram-negativa. Em um aspecto, o agente infeccioso é o vírus, tais como vírus de DNA, vírus de RNA, e vírus transcritor reverso. Exemplos não limitantes de vírus incluem adenovirus, vírus Coxsackie, vírus Epstein-Barr, vírus de hepatite A, vírus de hepatite B, vírus de hepatite C, vírus simplex de herpes tipo 1, vírus simplex de herpes tipo 2, citomegalovírus, vírus de herpes humano tipo 8, HIV, vírus da gripe, vírus do sarampo, vírus da caxumba, papiloma vírus humano, vírus de parainfluenza, poliovirus, vírus da raiva, vírus sincicial respiratório, vírus de rubéola, vírus de varicelazoster.
[135] Também se provê, em algumas modalidades, métodos ou usos do anticorpo ou fragmento do mesmo, para o tratamento de um distúrbio imunológico. Exemplos não limitantes de transtornos imunológicos incluem infecção, choque endotóxico associado com infecção, artrite, artrite reumatoide, asma, COPD, doença inflamatória pélvica, doença de Alzheimer, doença inflamatória intestinal, doença de Crohn, colite ulcerosa, doença de Peyronie, doença celíaca, doença da vesícula biliar, doença pilonidal, peritonite, psoríase, vasculite, aderências cirúrgicas, acidente vascular cerebral, diabetes tipo I, doença de Lyme, artrite, meningoencefalite, uveíte autoimune, distúrbios inflamatórios
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51/80 mediados imunes do sistema nervoso periférico central, esclerose múltipla, lúpus e síndrome de Guillain-Barr, dermatite atópica, hepatite autoimune, alveolite fibrosa, doença de Grave, nefropatia por IgA, idiopática púrpura trombocitopênica, doença de Meniere, pênfigo, cirrose biliar primária, sarcoidose, esclerodermia, granulomatose de Wegener, pancreatite, trauma, doença do enxerto versus hospedeiro, rejeição de transplante, doenças isquêmicas, infarto do miocárdio, aterosclerose, coagulação intravascular, reabsorção óssea, osteoporose, osteoartrite, periodontite, hipoclorídia e infertilidade relacionada à falta de tolerância materno-fetal.
[136] Os anticorpos da presente divulgação podem igualmente ser usados para tratar uma doença infecciosa causada por um microrganismo, ou para matar um microrganismo, alvejando o microrganismo e uma célula imune para efetuar a eliminação do microrganismo. Em um aspecto, o microrganismo é um vírus, incluindo vírus RNA e DNA, uma bactéria gram-positivo, uma bactéria gram-negativo, um protozoário ou um fungo.
[137] Uma dosagem específica e regime de tratamento, para qualquer paciente em particular, dependerá de uma variedade de fatores, incluindo os anticorpos específicos, variante ou derivado dos mesmos usados, a idade do paciente, peso corporal, saúde geral, sexo e dieta, e o tempo de administração, taxa de excreção, combinação de fármacos e a gravidade da doença em particular a ser tratada. O julgamento de tais fatores por cuidadores médicos está dentro da habilidade ordinária na técnica. A quantidade dependerá também do paciente individual a ser tratado, da via de administração, do tipo de formulação, das características do composto utilizado, da gravidade da doença e do efeito desejado. A quantidade utilizada pode ser determinada por princípios farmacológicos e farmacocinéticos, bem conhecidos na técnica.
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52/80 [138] Métodos de administração dos anticorpos ou variantes incluem, mas não estão limitados a, intradérmico, intramuscular, intraperitoneal, intravenoso, subcutâneo, intranasal, epidural e rotas orais. Os polipeptídeos de ligação de antígeno ou composições podem ser administrados por qualquer rota conveniente, por exemplo por infusão ou injeção de bolo, por absorção através de revestimentos epiteliais ou muco cutâneos (por exemplo, mucosa oral, mucosa retal e intestinal, etc.) e podem ser administrados junto com outros agentes biologicamente ativos Assim, composições farmacêuticas contendo os polipeptídeos de ligação de antígeno da divulgação, podem ser administradas oralmente, retalmente, parenteralmente, intracistemalmente, intravaginalmente, intraperitonealmente, topicamente (como por pós, pomadas, gotas ou adesivo transdérmico), bucalmente, ou como spray oral ou nasal.
[139] O termo parenteral, como aqui utilizado, refere-se aos modos de administração que incluem injeção intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intrasternal, subcutânea e intra-articular e infusão.
[140] A administração pode ser sistêmica ou local. Adicionalmente, pode ser desejável introduzir os anticorpos da divulgação no sistema nervoso central, por qualquer rota adequada, incluindo injeção intraventricular e intratecal; a injeção intraventricular pode ser facilitada por um cateter intraventricular, por exemplo, anexado a um reservatório, tal como um reservatório de Ommaya. A administração pulmonar também pode ser empregada, por exemplo, pelo uso de um inalador ou nebulizador, e formulação com um agente aerossolizante.
[141] Pode ser desejável administrar os polipeptídeos de anticorpos ou composições da divulgação localmente, na área que necessita de tratamento; isso pode ser alcançado por, por exemplo e não como por limitação, infusão local durante a cirurgia, aplicação tópica, por exemplo, em conjunção com um curativo após a cirurgia, por injeção,
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53/80 por meio de um cateter, por meio de um supositório, ou por meio de um implante, o dito implante sendo de um material poroso, não poroso ou gelatinoso, incluindo membranas, tais como membranas sialásticas ou fibras. Preferivelmente, ao administrar uma proteína, incluindo um anticorpo da divulgação, deve-se tomar cuidado para usar materiais aos quais a proteína não absorva.
[142] Em uma outra modalidade, os anticorpos ou a composição podem ser entregados em uma vesícula, especialmente um lipossoma (vide Langer, 1990, Science 249:1527-1533; Treat et al., em “Lipossomas na Terapia de Doenças Infecciosas e Câncer1’, Lopez-Berestein e Fidler (EDS.), Liss, Nova York, pp. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., pp. 317-327; vide geralmente ibid.).
[143] 1. Em uma outra modalidade, o polipeptídeo de ligação de antígeno ou composição pode ser entregado em um sistema controlado da liberação. Em uma modalidade, uma bomba pode ser usada (vide Sefton, 1987, CRC Grit. Ref. Biomed. Eng. 14:201; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574). Em outra modalidade, materiais poliméricos podem ser usados (vide Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, J., 1983, Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61; see also Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:105). Em uma outra modalidade, um sistema controlado da liberação pode ser colocado na proximidade do alvo terapêutico, isto é, o cérebro, assim requerendo somente uma fração da dose sistemática (vide, por exemplo, Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)). Outros sistemas de liberação controlada são discutidos na revisão por Langer
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54/80 (1990, Science 249:1527-1533).
[144] Em uma modalidade específica, onde a composição da divulgação compreende um ácido nucleico ou polinucleotídeo codificando uma proteína, o ácido nucleico pode ser administrado in vivo para promover a expressão de sua proteína codificada, o construindo como parte de um vetor de expressão de ácido nucleico adequado e administrando-o de modo que se torne intracelular, por exemplo, pelo uso de um vetor retroviral (vide patente norte-americana nQ. 4.980.286), ou pela injeção direta, ou pelo uso do bombardeamento da micropartícula (por exemplo, uma pistola do gene; Biolistic, DuPont), ou revestimento com lipídios ou receptores de superfície celular ou agentes de transfecção , ou administrando-o em ligação a um peptídeo similar a homeobox , que é conhecido por entrar no núcleo (vide, por exemplo, Joliot et al., 1991, proc. Natl. acad. Sei. EUA 88:1864-1868), etc. Alternativamente, um ácido nucleico pode ser introduzido intracelularmente e incorporado dentro do DNA da célula hospedeira para a expressão, pela recombinação homóloga.
[145] A quantidade de anticorpos da divulgação, que será eficaz no tratamento, inibição e prevenção de uma doença, distúrbio ou condição inflamatória, imune ou maligna, pode ser determinada por técnicas clínicas padrão. Além disso, ensaios in vitro podem, opcionalmente, ser empregados para ajudar a identificar faixas de dosagem ideais. A dose precisa a ser empregada na formulação dependerá também da via de administração e da gravidade da doença, desordem ou condição, e deve ser decidida de acordo com o julgamento do praticante e as circunstâncias de cada paciente. Doses efetivas podem ser extrapoladas de curvas de dose-resposta, derivadas de sistemas de teste de modelo in vitro ou animal.
[146] Como uma proposição generalizada, a dosagem administrada a um paciente, dos polipeptídeos de ligação de antígeno da pre
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55/80 sente divulgação, é tipicamente 0,1 mg/kg a 100 mg/kg do peso corporal do paciente, entre 0,1 mg/kg e 20 mg/kg do peso corporal do paciente, ou 1 mg/kg a 10 mg /kg do peso corporal do paciente. Geralmente, os anticorpos humanos têm uma meia-vida mais longa dentro do corpo humano do que os anticorpos de outras espécies devido à resposta imune aos polipeptídeos estrangeiros. Assim, doses mais baixas de anticorpos humanos e administração menos frequente é muitas vezes possível. Além disso, a dosagem e a frequência da administração de anticorpos da divulgação podem ser reduzidas através do aumento da captação e da penetração tecidual (por exemplo, no cérebro) dos anticorpos, por modificações como, por exemplo, a lipidação.
[147] Os métodos para o tratamento de uma doença, condição ou distúrbio, infecciosa ou maligna, compreendendo a administração de um anticorpo, variante ou derivado do mesmo, da divulgação, são tipicamente testados in vitro, e em seguida, in vivo em um modelo de animal aceitável, para a atividade terapêutica ou profiláctica desejada, antes da utilização em seres humanos. Modelos de animais adequados, incluindo animais transgênicos, são bem conhecidos daqueles com habilidade comum na técnica. Por exemplo, ensaios in vitro para demonstrar a utilidade terapêutica do polipeptídeo de ligação descrito aqui, incluem o efeito de um polipeptídeo de ligação de antígeno em uma linha celular ou em uma amostra de tecido do paciente. O efeito do polipeptídeo de ligação antígeno na linha celular e/ou amostra de tecido pode ser determinado utilizando métodos conhecidos dos versados na técnica, tais como os ensaios divulgados em outros lugares neste documento. De acordo com a divulgação, ensaios in vitro que podem ser usados para determinar se a administração de um polipeptídeo de ligação antígeno específico é indicado, incluem ensaios de cultura celular in vitro, em que uma amostra de tecido do paciente é crescida na cultura e exposta ou de outra maneira administrada, a um
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56/80 composto, e o efeito de tal composto sobre a amostra de tecido é observado.
[148] Vários sistemas de entrega são conhecidos e podem ser usados para administrar um anticorpo da divulgação ou um polinucleotídeo codificando um anticorpo da divulgação, por exemplo, encapsulamento nos lipossomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capazes de expressar o composto, endocitose mediada por receptores (vide, por exemplo, Wu e Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432), construção de um ácido nucleico como parte de um vetor retroviral ou outro, etc.
Métodos de diagnóstico [149] A superexpressão de PD-1 é observada em certas amostras do tumor, e os pacientes que têm as células superexpressando PD-1 são provavelmente responsivas aos tratamentos com os anticorpos de anti-PD-1 da presente divulgação. Assim, os anticorpos da presente divulgação também podem ser utilizados para diagnóstico e prognóstico.
[150] Uma amostra que inclua preferencialmente uma célula, pode ser obtida de um paciente, que pode ser um paciente com câncer ou um paciente que está desejando diagnóstico. A célula é uma célula de um tecido tumoral ou um bloco tumoral, uma amostra de sangue, uma amostra de urina ou qualquer amostra do paciente. Após o prétratamento opcional da amostra, a amostra pode ser incubada com um anticorpo da presente divulgação, sob condições que permitam ao anticorpo interagir com uma proteína PD-1, potencialmente presente na amostra. Métodos, tal como o ELISA, podem ser usados, aproveitando o anticorpo anti-PD-1, para detectar a presença da proteína PD-1 na amostra.
[151] A presença da proteína PD-1 na amostra (opcionalmente com a quantidade ou concentração) pode ser usada para o diagnóstico
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57/80 de câncer, como uma indicação que o paciente é apropriado para um tratamento com o anticorpo, ou como uma indicação de que o paciente respondeu (ou não) a um tratamento contra o câncer. Para um método de prognóstico, a detecção pode ser feita de uma, duas ou mais vezes, em determinadas fases, após o início de um tratamento de câncer, para indicar o andamento do tratamento.
Composições [152] A presente divulgação também fornece composições farmacêuticas. Tais composições compreendem uma quantidade eficaz de um anticorpo e um veículo aceitável. Em algumas modalidades, a composição inclui ainda um segundo agente anticâncer (por exemplo, um inibidor de ponto de verificação imune).
[153] Em uma modalidade específica, o termo farmaceuticamente aceitável significa aprovado por uma agência reguladora do governo federal ou estadual, ou listado na Farmacopeia dos EUA, ou em outra farmacopeia geralmente reconhecida, para uso em animais, e mais particularmente em humanos. Além disso, um veículo farmaceuticamente aceitável será geralmente um enchimento sólido, semissólido ou líquido, não tóxico, diluente, material de encapsulamento ou formulação auxiliar de qualquer tipo.
[154] O termo veículo refere-se a um diluente, adjuvante, excipiente, ou veículo com o qual o terapêutico é administrado. Tais veículos terapêuticos podem ser líquidos estéreis, tais como água e óleos, incluindo aqueles da origem de petróleo, animal, vegetal ou sintética, tal como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de sésamo e semelhantes. A água é um veículo preferido quando a composição farmacêutica é administrada por via intravenosa. Soluções salinas e soluções de dextrose aquosa e de glicerol, também podem ser empregadas como veículos líquidos, especialmente para soluções injetáveis. Excipientes farmacêuticos adequados incluem amido, glicose,
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58/80 lactose, sacarose, gelatina, malte, arroz, farinha, giz, sílica-gel, estearato de sódio, monoestearato de glicerol, talco, cloreto de sódio, leite desnatado seco, glicerol, propileno, glicol, água, etanol e o semelhantes. A composição, se desejado, também pode conter pequenas quantidades de agentes umectantes ou emulsificantes, ou agentes tampão de pH, tais como acetatos, citratos ou fosfatos. Agentes antibacterianos, tais como álcool benzílico ou metil-parabenos; antioxidantes, tais como o ácido ascórbico ou o bissulfito de sódio; agentes quelantes, tal como o ácido etileno diamino tetracético; e os agentes para o ajuste da tonicidade, tais como o cloreto de sódio ou a dextrose, são também previstos. Estas composições podem assumir a forma de soluções, suspensões, emulsão, comprimidos, pílulas, cápsulas, pós, formulações de libertação sustentada e semelhantes. A composição pode ser formulada como um supositório, com ligantes tradicionais e veículos, tais como triglicérides. A formulação oral pode incluir veículos padrão, tais como graus farmacêuticas de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina do sódio, celulose, carbonato de magnésio, etc. Exemplos de veículos farmacêuticos adequados são descritos em na Remington's Pharmaceutical Sciences de E. W. Martin,, incorporado aqui por referência. Tais composições irão conter uma quantidade terapeuticamente eficaz do polipeptídeo de ligação de antígeno, preferivelmente na forma purificada, junto com uma quantidade apropriada de veículo, para prover a formar para a administração apropriada ao paciente. A formulação deve adequar-se ao modo de administração. A preparação parental pode ser colocada em ampolas, seringas descartáveis ou frascos de dose múltipla, feitos de vidro ou plástico.
[155] Em uma modalidade, a composição é formulada de acordo com procedimentos rotineiros como uma composição farmacêutica adaptada para administração intravenosa a seres humanos. Tipicamente, as composições para administração intravenosa são soluções
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59/80 em tampão aquoso isotônico estéril. Quando necessário, a composição também pode incluir um agente solubilizante e um anestésico local, como a lidocaína, para aliviar a dor no local da injeção. Geralmente, os ingredientes são fornecidos separadamente ou misturados em forma de dosagem unitária, por exemplo, como um pó liofilizado seco ou concentrado livre de água, em um recipiente hermeticamente selado, como uma ampola ou sachê indicando a quantidade de agente ativo. Se a composição for administrada por infusão, pode ser colocada com um recipiente de infusão contendo água de grau farmacêutico estéril ou soro fisiológico. Quando a composição é administrada por injeção, uma ampola de água estéril para injeção ou soro fisiológico pode ser provida para que os ingredientes possam ser misturados antes da administração.
[156] Os compostos da divulgação podem ser formulados como formas neutras ou de sal. Os sais farmaceuticamente aceitáveis, incluem aqueles formados com ânions, tais como os derivados de ácido clorídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc., e aqueles formados com cátions, tais como os derivados de sódio, potássio, amônio, cálcio, hidróxidos férricos, isopropilamina, trietilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína, etc.
EXEMPLOS
Exemplo 1: Geração de anticorpos monoclonais humanos contra PD-1 humano
Clonagem de cDNA de comprimento completo [157] Linfócitos T humanos foram isolados de linfócitos de sangue periférico humano (PBMC), com grânulos dos MACS (MiltenyiBiotec). O RNA total foi extraído de células T humanas com o mini kit RNeasy (QIAGEN) e cDNA foi obtido por PCR de transcrição reversa (SuperScript First-Strand Synthesis System, Invitrogen). O cDNA de comprimento completo, codificando o HPD-1, foi gerado por RT-PCR
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60/80 usando o iniciador do senso (5’CTGTCTAGAATGCAGATCCCACAGGCGCC, ID SEQ ID N2.: 47) e o iniciador antissenso (5’-GGATCCTCAGAGGGGCCAAGAGCAGT, SEQ ID N2: 48)) do mRNA de célula T humana. As sequências foram verificadas por sequenciamento de DNA e comparação com banco de dados NCBI (NM-5018,2).
[158] Estabelecer a linha de célula de expressão estável hPD1: após a digestão com Xbal e BamH I, os fragmentos de PCR de HPD-1 foram clonados no vetor (-) pcDNA 3.1 (Invitrogen). Então plasmídeos de comprimento completo de pcdna-HPD-1 foram transfectados em células de ovário de hamster chinês (CHO) usando lipofectamine 2000 (Invitrogen). As linhas celulares expressando estavelmente hPD-1 (CHO/hPD-1) foram selecionadas por G418 e rastreadas por citometria de fluxo.
[159] Produção de proteína de fusão de PD-1IG humano: o cDNA da proteína de fusão de hPD-1 Mig e hPD-1 hlg, contendo domínio extracelular de hPD-1, foi amplificado por PCR de pcDNA-hPD-1 de comprimento completo por iniciadores específicos. Os fragmentos de PCR digeridos com EcoR I e Bgl II foram fundidos ao domínio CH2CH3 de cadeia pesada lgG2a de rato, no pmlgG de plasmídeo expressão ou na cadeia de IgG 1 humano na phlgG de plasmídeo de expressão (H Dong et al. Nat Med. 1999; 5:1365-1369). A proteína no sobrenadante de cultura foi purificada por uma coluna de proteína A. Sepharose (HiTrap protein A HP, GE Healthcare). A proteína purificada foi confirmada pela eletroforese de SDA-PAGE.
[160] Geração de anticorpo monoclonal: Os ratos Balb/c fêmeas, de 8-10 semanas de idade, foram imunizados por via subcutânea (s.c.), em sites múltiplos, com 200 μΙ da emulsão que compreende 100 pg de proteína de fusão de hPD-1 mlg e adjuvante de Freund completo (CFA) (Sigma-Aldrich). 3 semanas mais tarde os ratos foram
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61/80 imunizados com 50-100 pg da proteína com o adjuvante de Freund incompleto (IFA) (Sigma-Aldrich) por s. c., por urn total de três vezes. Os ratos foram sangrados 2 semanas após cada imunização para o teste de título de soro. Quando o título é suficiente, os ratos foram potenciados com 60 pg de proteína em PBS por injeção intraperitoneal (i.p.). Os hibridomas foram obtidos por fusão de células do baço de rato imunizado e linha de célula de mieloma e SP2/0-Ag14 (de ATCC). O rato potencializado foi sacrificado com dióxido de carbono e o baço foi coletado septicamente. O baço inteiro foi dissociado em suspensões de célula única e as células de sangue vermelhas foram lisadas por tampão de ACK. O mieloma de SP2/0-Ag14 e as células de baço foram misturados na proporção de 1:1, em uns tubos de centrifugação cônicos de 50 ml. Após centrifugação, o sobrenadante foi descartado e a fusão celular foi realizada com 50% de polietileno glicol (Roche). As células fundidas foram cultivadas por 8-10 dias em meio da seleção HAT, os sobrenadantes de cultura de hibridoma foram selecionados para ligação ao hPD-1 expressando células com uma transfecção e sistemas de seleção de desempenhos elevados (S Yao et al. Immunity. 2011; 34 (5): 729-40) e o os clones positivos foram confirmados por análise de citometria de fluxo. A subclonagem do hibridoma positivo foi executada usando a técnica de diluição limitante, por pelo menos 5 vezes, para alcançar uma cultura puramente monoclonal.
Exemplo 2: Caracterização de anticorpos monoclonais PD-1 [161] Isótipos dos MAbs: O isótipo de mAbs foi identificado o kit de isotipagem (BD Biosciences). Todos os 5 mAbs de PD-1 mAbs foram identificados ser isótipo IgG 1 e cadeia K.
[162] A especificidade de ligação de anti-hPD-1: as células de CHO que expressam hPD-1 (CHO/hPD-1) na superfície, foram usadas para determinar a especificidade de PD-1 mAbs, por citometria de fluxo. As células de CHO/hPD-1 foram incubadas anti-PD-1 mAbs no ge
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Io. Após a incubação, as células foram lavadas e incubadas com antimlgG-APC (eBiosciences). A análise de citometria de fluxo foi realizada por meio de um FACSVerse (BD Biosciences). Os dados mostraram que todos os cinco mAbs hPD-1 se ligaram com alta especificidade a hPD-1 (Figura 1). Para excluir a possibilidade que os mAbs hPD1 ligam outras proteínas, as células de CHO transfectadas hB7-1, hPD-L1, hB7-H3, hB7-H4, hCD137 ou outras moléculas de proteína, foram marcadas com anti-hPD-1 mAb pela análise de citometria de fluxo. Estas células foram marcadas igualmente com seus respectivos anticorpos positivos, respectivamente como controle positivo. Os dados demonstraram que o mAbdid anti-PD-1 não ligam estas proteínas testadas (Fig.2).
[163] Reatividade cruzada de espécies: para avaliar as especificidades das espécies do anti-hPD-1 mAbs, a célula mononuclear de sangue periférico (PBMC) do macaco cynomolgus (da companhia de biotecnologia de Guangdong Landau) foi isolada do sangue periférico com Ficoll (Sigma-Aldrich). O PBMC foi suspenso no meio de RPMI 1640, contendo 10% de FCS e colocado em uma placa de 24 poços, que foi pré-revestida com 1pg/ml de hCD3. As células foram cultivadas por dois dias. As células foram marcadas com o anti-hPD-1 primeiramente. Após a lavagem, as células foram marcadas com anti-mlgGAPC e CD3-FITC; CD8-PerCP para análise de citometria de fluxo. Adicionalmente, a reatividade transversal dos mAbs para PD-1 de rato foi determinada pela citometria do fluxo usando células CHO transfectadas com PD-1 de rato (CHO/mPD-1).
[164] Os dados demonstraram que o anti-hPD-1 mAb pode ligar a proteinsona PD-1 de célula T, tanto humana, como do macaco cynomolgus; nenhuma ligação cruzada foi encontrada com a PD-1 de rato (Figura 3).
[165] Bloqueio do ligante: para examinar o bloqueio de ligação
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63/80 do ligante, 100 ng de proteína de fusão hPDIhlg foram pré-incubados com a dose indicada de mMAb (400, 300, 200, 100, 50 ng/1 Oul) ou Ig de controle, por 30 min., a 4°C, então usado para marcar as células de CHO/hB7-H1. As células foram lavadas e marcadas adicionalmente com anti-hlgG-APC de cabra. O efeito de bloqueio foi avaliado com citometria de fluxo.
[166] Os dados demonstraram que o anti-hPD-1 mAbs 1 e 2 (Ab1 e Ab2) não têm efeito sobre o bloqueio do ligante. Ab3, Ab4 e Ab5 podem bloquear a proteína de fusão anti-hPD-1 ligada a hPD-L1 de maneira dose-dependente (Figura 4).
[167] Ensaio de ligação competitiva: o ensaio de ligação competitiva foi realizado para investigar onde esses mAbs reconhecem os mesmos ou diferentes sites de ligação da proteína hPD-1. As células CHO/hPD-1 foram pré-incubadas com uma quantidade excessiva (10pg) de cinco mAbs de PD-1 respectivamente, a 4QC por 30 min. Após a lavagem, as células foram incubadas com 50 ng de biotina diferente rotulada com mAbs, a 4QC por 20 min. O efeito de ligação dos mAbs foi medido por meio da análise de citometria de fluxo.
[168] A análise da citometria de fluxo mostrou que Ab4 e Ab5 completamente anulam uma a outra ligando a proteínas hPD-1, uma dose saturada de Ab3 teve parcialmente o efeito de bloqueio à ligação Ab4 e Ab5 e Ab1 e Ab2 não tiveram nenhum efeito do bloco na ligação de Ab4 e de Ab5 a HPD-1 (Figura 5). Portanto, os sites de ligação em PD-1 para Ab4 e Ab5 podem se sobrepor. Ab1 ou Ab2 e Ab4 ou Ab5 ligam-se ao PD-1 através de interfaces diferentes, que também validaram pelo teste de bloqueio de ligante.
Exemplo 3: Sequenciamento de hibridomas produzindo anticorpos de anti PD-1 e humanização de anticorpos [169] Sequenciamento de hibridomas produzindo anticorpo de anti-PD-1: 1 χ 107 células de hibridoma foram coletadas e lavadas
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64/80 com PBS. RNAs mensageiros foram extraídos dos hibridomas usando o mini kit RAeasy (Qiagen). cDNAs de RACE-Ready first-Strand foram sintetizados usando o kit de amplificação SMARTer RACE cDNA (Clontech). Seguindo transcrição reversa, 5 ' reações da PCR RACE foram executadas com o cDNA pronto como o molde e com o iniciador 5 ' iniciador universal (UPM) fornecido pelo kit e pelos 3 ' iniciadores específicos de sequências de gene (GSP1) projetados pela região variável de cadeia pesada IgG 1 de rato e pela cadeia leve k. Os produtos RACE foram determinados pela análise de eletroforese de gel (Figura 6). As produções de PCR foram clonadas em um vetor de T usando o kit de clonagem de Zero Blunt TOPO PCR (Invitrogen). Após transformação, os plasmídeos foram verificados por análise de sequenciamento. Os fragmentos do gene do anticorpo foram analisados usando-se VBASE2 (http://www.vbase2.org). As sequências são divulgadas na Tabela 2.
Tabela 2: Sequência de anticorpos murinos
Nome (SEQ ID N-:) Sequência (sublinhado e negrito apresenta CDR)
Murino Ab2 VH (19) SQVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTSYTMHWVKQRPGQGLEW1GYINPTTGYTN YNQKFKDKANPTTGYTNYNQKFKDKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARDDAY YSGYWGQGTTLTVSS
Murino Ab2 VH (20) TCCCAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAACTGGCAAGACCTGGGGCCTCAGTGAAG ATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTTACTAGTTACACGATGCACTGGGTAAAACAG AGGCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGATACATTAATCCTACTACTGGTTATACTAAT TACAATCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCC TACATGCAATTGAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGAGAT GATGCTTACTACTCGGGCTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA
Murino Ab2 VK (21) D1QMTQSPASLSVSVGETVT1TCRASENIYSNLAWYRQKQGKSPQLLVYAAKNLADGVPS RFSGSGSGTQYSLK1NSLQSEDFGSYYCQHFWGTPWTFGGGTKLE1KR
Murino Ab2 VK (22) GACATCCAGATGACTCAGTCTCCAGCCTCCCTATCTGTATCTGTGGGAGAAACTGTCACC ATCACATGTCGAGCAAGTGAGAATATTTACAGTAATTTAGCATGGTATCGGCAGAAACAG GGAAAATCTCCTCAGCTCCTGGTCTATGCTGCAAAAAACTTAGCAGATGGTGTGCCATCA AGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACACAGTATTCCCTCAAGATCAACAGCCTGCAGTCT GAAGATTTTGGGAGTTATTACTGTCAACATTTTTGGGGTACTCCGTGGACGTTCGGTGGA GGCACCAAGCTGGAAATCAAACGG
Murino Ab3 VH (23) VQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFAFSSYDMSWVRQTPEKRLVWVAYITIGGGTTYYS DTVKRLVWVAY1T1GGGTTYYSDTVKGRFT1SRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARH RYDYFAMDNWGHGT S VTVS S
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Murino Ab3 VH (24) GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCGGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTC TCCTGTGCAGCCTCTGGATTCGCTTTCAGTAGCTATGACATGTCTTGGGTTCGCCAGACT CCGGAGAAGAGGCTGGTGTGGGTCGCATACATTACTATTGGTGGTGGCACCACCTACTAT TCAGACACTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACACCCTGTAC CTGCAAATGAGCAGTCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTGCAAGACATAGG TACGATTACTTCGCTATGGACAACTGGGGTCATGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA
Murino Ab3 VK (25) DI VLTQ S PAS LAVS LEHRAT IS CQASENVDNYGINFMNWEQΗKPAQ P PQLLIYVSSNLGS GVPAKFSGSGSGTDFSLN1HPMEEDDTAMYFCQQSKDVPWTFSGGTKLE1KR
Murino Ab3 VK (26) GACATTGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGAGCACAGGGCCACC ATCTCCTGCCAAGCCAGCGAAAATGTTGATAATTATGGCATTAATTTTATGAACTGGTTC C AAC AC AAAC C AG C AC AG C C AC C C C AAC T C C T CAT C T AT G T T T CAT C C AAC C TAG GAT C C GGGGTCCCTGCCAAGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGACTTCAGCCTCAACATCCAT CCTATGGAAGAAGATGATACTGCAATGTATTTCTGTCAGCAAAGTAAGGACGTTCCGTGG ACGTTCAGTGGAGGCACCAAACTGGAAATCAAACGG
Murino Ab4 VH (27) EVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSSYTMSW1RQTPEKRLEWVAYISHGGGDTYY PDTVKGRFT1SRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARHSGYERGYYYVMDYWGQGTSVT VSS
Murino Ab4 VH (28) GAAGTGAAGTTGGTGGAGTCTGGGGGAGGTTTAGTGCAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTC TCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCTATACCATGTCTTGGATTCGCCAGACT CCAGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCATACATTAGTCATGGTGGTGGTGACACCTACTAT CCAGACACTGTAAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGGGACAATGCCAAGAACACCCTGTAC CTGCAAATGAGCAGTCTGAAGTCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTGCAAGACATAGT GGTTACGAGAGGGGATATTACTATGTTATGGATTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACC GTCTCCTCA
Murino Ab4 VK (29) D1VLTQFPTSLAVSLGQRAT1SCRASESVDYYGFSF1NWFQQKPGQPPKLL1YAASNQGS GVPARFGGSGSGTDFSLNIHPMEEDDTAMYFCQQSKEVPWTFGGGTKLEIK
Murino Ab4 VK (30) GACATTGTGCTGACCCAATTTCCAACTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACC ATCTCCTGCAGAGCCAGCGAAAGTGTTGATTACTATGGCTTTAGTTTTATAAACTGGTTC CAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATGCTGCATCCAACCAGGGATCC GGGGTCCCTGCCAGGTTTGGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCAGCCTCAACATCCAT CCTATGGAGGAGGATGATACTGCAATGTATTTCTGTCAGCAAAGTAAGGAGGTTCCGTGG ACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGG
[170] Expressão da proteína e determinação da função de anticorpo de recombinação: para assegurar a correção da sequência de anticorpo recombinante, as sequências de comprimento completo de cadeia pesada do anticorpo recombinante e de cadeia leve, foram clonadas em vetores pcDNA 3.1 respectivamente e transientemente transfectadas em células HEK 293T. As proteínas do sobrenadante da cultura celular foram purificadas com coluna de proteína G sepharose (GE Healthcare) para avaliação da função.
[171] Os dados de análise de citometria demonstraram que os
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66/80 anticorpos recombinantes podem ligar proteína hPD-1 e podem bloquear a ligação de proteína de fusão hPD-1 à proteína PD-L1 (Figura 7, painéis A, B) [172] Humanização de anticorpos PD-1 anti-humanos: a humanização foi realizada com base em sequências de cadeia pesada variável (VH) e de cadeia leve variável (VL) de hibridomas anti-HPD-1. Geralmente, um mAb quimérico rato-humano, que se compõe de sequências de VH e de VL do rato parental e de região constante lgG4S228P humana e de cadeia κ humana, foram construídos primeiramente. Depois de identificar o caráter do anticorpo quimérico, três sequências VL e três VL, humanizadas foram projetadas e usadas para fazer os nove anticorpos humanizados. A lista de sequências está nas Tabelas 3A e 3B.
Tabela 3A- Anticorpo quimérico (estrutura lgG4-S228P humana)
Nome(SEQ ID Ng:) Sequência (sublinhado em negrito apresenta CDR)
Cadeia pesada quimérica (31) EVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSSYTMSW1RQTPEKRLEWVAYISHGGGDTYY PDTVKGRFT1SRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARHSGYERGYYYVMDYWGQGTSVT VSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL QSSGLYSLSSWTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPFVTCWVDVSQFDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREFQFN STYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSS1EKT1SKAKGQPREPQVYTLPPSQEE MTKNQVSLTCLVKGFYPSD1AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRW QEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
Cadeia pesada quimérica (32) CGAAGTGAAGTTGGTGGAGTCTGGGGGAGGTTTAGTGCAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACT CTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCTATACCATGTCTTGGATTCGCCAGAC TCCAGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCATACATTAGTCATGGTGGTGGTGACACCTACTA TCCAGACACTGTAAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGGGACAATGCCAAGAACACCCTGTA CCTGCAAATGAGCAGTCTGAAGTCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTGCAAGACATAG TGGTTACGAGAGGGGATATTACTATGTTATGGATTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCAC CGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTTCCTCTCGCTCCCTGCAGCCGGAG CACATCCGAGAGCACCGCTGCTCTGGGCTGTCTCGTGAAGGACTACTTCCCTGAACCCGT CACCGTCAGCTGGAATAGCGGCGCCCTGACATCCGGCGTCCACACATTCCCCGCTGTCCT GCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCTCCGTGGTCACCGTGCCTAGCAGCAGCCTGGG AACAAAGACCTACACCTGCAACGTGGACCATAAGCCCTCCAACACCAAGGTGGACAAGCG GGTGGAATCCAAGTATGGACCCCCCTGTCCTCCTTGCCCTGCTCCTGAATTTCTCGGAGG CCCCTCCGTCTTCCTGTTTCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACACC CGAAGTCACCTGCGTCGTGGTGGATGTCAGCCAGGAAGATCCCGAGGTGCAGTTCAACTG GTACGTGGACGGAGTGGAGGTGCATAACGCCAAAACCAAGCCCAGGGAAGAGCAGTTCAA
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CAGCACCTATCGGGTCGTGTCCGTGCTCACCGTCCTGCATCAGGATTGGCTCAACGGCAA GGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCTCCTCCATCGAGAAGACCATCTC CAAGGCTAAGGGCCAACCTCGGGAGCCCCAAGTGTATACCCTCCCTCCCAGCCAGGAGGA GATGACCAAGAATCAAGTGAGCCTGACCTGCCTCGTGAAGGGATTTTACCCCTCCGACAT CGCTGTGGAATGGGAAAGCAATGGCCAACCTGAGAACAACTACAAGACCACACCCCCCGT GCTGGACTCCGATGGCTCCTTCTTCCTGTACAGCAGGCTGACCGTGGACAAATCCCGGTG GCAAGAGGGAAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCTCTCCACAACCACTACAC CCAGAAGAGCCTCTCCCTGAGCCTCGGCAAGTAGTAA
Cadeia D1VLTQFPTSLAVSLGQRAT1SCRASESVDYYGFSF1NWFQQKPGQPPKLL1YAASNQGS
leve qui- GVPARFGGSGSGTDFSLN1HPMEEDDTAMYFCQQSKEVPWTFGGGTKLE1KRTVAAPSVF
mérica IFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQQDSKDSTYSL
(33) TSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Cadeia AGACATTGTGCTGACCCAATTTCCAACTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCAC
leve qui- CATCTCCTGCAGAGCCAGCGAAAGTGTTGATTACTATGGCTTTAGTTTTATAAACTGGTT
mérica CCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATGCTGCATCCAACCAGGGATC
(34) CGGGGTCCCTGCCAGGTTTGGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCAGCCTCAACATCCA TCCTATGGAGGAGGATGATACTGCAATGTATTTCTGTCAGCAAAGTAAGGAGGTTCCGTG GACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAGCGGACCGTGGCCGCCCCCAGCGTGTT CATCTTCCCTCCCAGCGACGAGCAGCTGAAGTCTGGCACCGCCAGCGTGGTGTGCCTGCT GAACAACTTCTACCCCCGCGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGAG CGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAACAGGACTCCAAGGACAGCACCTACAGCCT GACCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGA GGTGACCCACCAGGGACTGTCTAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGCTA A
Tabela 3B - Regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve, humanizadas
Nome ( SEQ ID Ng:) Sequência (sublinhado em negrito apresenta CDR)
variante VH a (35) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMSWVRQAPGKGLEWVSYISHGGGDTYY ADSVKGRFT1SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHSGYERGYYYVMDYWGQGTLVT VSSA
variante VH a (36) CGAAGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACT GTCTTGTGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCTCCAGCTACACCATGTCCTGGGTGCGACAGGC TCCTGGCAAGGGCCTGGAATGGGTGTCCTACATCTCTCACGGCGGAGGCGACACCTACTA CGCCGACTCTGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTA CCTGCAGATGAACTCCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCTCGGCACTC TGGCTACGAGCGGGGCTACTACTACGTGATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTCGTGAC CGTGTCATCTGCT
variante VH b (37) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMSWVRQAPGKGLEWVSYISHGGGDTYY PDSVKGRFT1SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHSGYERGYYYVMDYWGQGTLVT VSS
variante VH b (38) CGAAGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACT GTCTTGTGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCTCCAGCTACACCATGTCCTGGGTGCGACAGGC TCCTGGCAAGGGCCTGGAATGGGTGTCCTACATCTCTCACGGCGGAGGCGACACCTACTA CCCCGACTCTGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTA
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CCTGCAGATGAACTCCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCTCGGCACTC TGGCTACGAGCGGGGCTACTACTACGTGATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTCGTGAC CGTGTCATCTGCT
variante VH c (39) EVKLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMSWVRQAPGKGLEWVSYISHGGGDTYY PDSVKGRFTISRDNSKGGDTYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR HSGYERGYYYVMDYWGKGTTVTVSSA
variante VH c (40) GAAGTGAAGCTGCTGGAATCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTG TCTTGTGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCTCCAGCTACACCATGTCCTGGGTGCGACAGGCT CCTGGCAAGGGCCTGGAATGGGTGTCCTACATCTCTCACGGCGGAGGCGACACCTACTAC CCCGACTCTGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTAC CTGCAGATGAACTCCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCTCGGCACTCT GGCTACGAGCGGGGCTACTACTACGTGATGGACTACTGGGGCAAGGGCACCACCGTGACC GTGTCATCTGCT
variante VH a (41) D1VMTQSPDSLAVSLGERAT1NCKSSESVDYYGFSFLNWFQQKPGQPPKLL1YAASNRES GVPDRFSGSGSGTDFTLT1SSLQAEDVAVYYCQQSKEVPWTFGQGTKLE1KR
variante VH a (42) AGACATCGTGATGACCCAGTCCCCCGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGAGCCAC CATCAACTGCAAGTCCTCCGAGTCCGTGGACTACTACGGCTTCTCCTTCCTGAACTGGTT CCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCTAAGCTGCTGATCTACGCCGCCTCCAACCGCGAGTC TGGCGTGCCCGATAGATTCTCCGGCTCTGGCTCTGGCACCGACTTTACCCTGACCATCAG CTCCCTGCAGGCCGAGGATGTGGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTCCAAAGAGGTGCCCTG GACCTTCGGCCAGGGCACAAAGCTGGAAATCAAGCGG
variante VH b (43) D1VMTQSPDSLAVSLGERAT1NCKASESVDYYGFSFLNWFQQKPGQPPKLL1YAASNRES GVPDRFSGSGSGTDFTLT1SSLQAEDVAVYYCQQSKEVPWTFGQGTKLE1KR
variante VH b (44) AGACATCGTGATGACCCAGTCCCCCGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGAGCCAC CATCAACTGCAAGGCCTCCGAGTCCGTGGACTACTACGGCTTCTCCTTCCTGAACTGGTT CCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCTAAGCTGCTGATCTACGCCGCCTCCAACCGCGAGTC TGGCGTGCCCGATAGATTCTCCGGCTCTGGCTCTGGCACCGACTTTACCCTGACCATCAG CTCCCTGCAGGCCGAGGATGTGGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTCCAAAGAGGTGCCCTG GACCTTCGGCCAGGGCACAAAGCTGGAAATCAAGCGG
variante VH c (45) D1QLTQSPDSLSVSLGERAT1NCKASESVDYYGFSFLNWFQQKPGQPPKLL1YAASNRQS GVPDRFSGSGSGTDFTLT1SSLQAEDVAVYFCQQSKEVPWTFGQGTKLE1KR
variante VH c (46) GACATCCAGCTGACCCAGTCCCCCGACTCCCTGTCTGTGTCTCTGGGCGAGAGAGCCACC ATCAACTGCAAGGCCTCCGAGTCCGTGGACTACTACGGCTTCTCCTTCCTGAACTGGTTC CAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCTAAGCTGCTGATCTACGCCGCCTCCAACCGCCAGTCT GGCGTGCCCGATAGATTCTCCGGCTCTGGCTCTGGCACCGACTTTACCCTGACCATCAGC TCCCTGCAGGCCGAGGATGTGGCCGTGTACTTCTGCCAGCAGTCCAAAGAGGTGCCCTGG ACCTTCGGCCAGGGCACAAAGCTGGAAATCAAGCGG
Exemplo 4: Características e funções de anticorpos humanizados [173] A atividade de ligação dos anticorpos humanizados: células CHO/hPD-1 foram incubadas com mAbs serialmente diluídos. Os efeitos de ligação de nove anticorpos humanizados à proteína PD1 foram avaliados usando análise de citometria de fluxo, e comparados
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69/80 ao anticorpo parental quimérico.
[174] Os resultados da análise da citometria do fluxo mostraram que a atividade de ligação de algumas combinações mutantes é mais elevada do que aquele anticorpo parental; alguns são iguais ou ligeiramente inferiores ao anticorpo parental (Figura 8). As combinações mutantes estão listadas na Tabela 4 abaixo.
Nome Variante VH Variante VK
Variante 1 a a
Variante 2 a b
Variante 3 (TY101) a c
Variante 4 b a
Variante 5 b b
Variante 6 b c
Variante 7 c a
Variante 8 c b
Variante 9 c c
[175] A habilidade de bloqueio dos anticorpos humanizados: a habilidade dos anticorpos humanizados de bloquear a ligação de HPD-1 a HPD-L1 foi medida. 100 ng de hPDImlg foram pré-incubados com diferentes doses de anticorpos humanizados em 10 pl de PBS, por 30 minutos a 4°C, então usados para marcar células CHO/hB7-H1. As células foram lavadas e marcadas mais uma vez com o anti mlgGAPC de cabra. O efeito de bloqueio foi avaliado com citometria de fluxo. Usando um método similar, a habilidade dos anticorpos humanizado de bloquear a ligação e HPD-1 a HPD-L2 foi medida.
[176] Os resultados mostraram que a ligação de hPD-1mlg às células de CHO/hPD-L1 foi inibida em uma maneira dose-dependente por todos os anticorpos humanizados. Algumas combinações mutantes têm maior capacidade de bloqueio do que o anticorpo parental quimérico (Figura 9). Os resultados também mostraram que a ligação das células hPD-1mlg a CHO/hPD-L2 também foi bloqueada (Figura
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10).
[177] Afinidade de ligação e determinação cinética dos anticorpos humanizados: a afinidade de ligação e a cinética dos mAbs PD-1 humanizados que interagem com a proteína hPD-1, foram avaliadas com Biacore T100 (GE Healthcare Life Sciences). As proteínas hPD-1 mlg foram imobilizadas no chip do sensor CM5 pelo acoplamento de amina. Os anticorpos humanizados, filtrados, foram diluídos com tampão HBS-EP pH 7,4 (GE Healthcare Life Sciences) e posteriormente injetados sobre a superfície imibilizada de hPD-1 mlg. Nove concentrações diferentes foram testadas para cada amostra. Parâmetros cinéticos de ligação detalhados (taxa de associação, Ka, taxa de dissociação, KD e constante de afinidade, KD) podem ser determinados pela análise cinética completa.
[178] Os dados da análise mostraram que não havia nenhuma diferença significativa na taxa de ligação (Ka) entre as combinações do mutante e o anticorpo parental quimérico. Três combinações de mutante (3, 6, 9) ficaram próximas ao anticorpo parental quimérico na taxa de dissociação (KD). Todos os anticorpos humanizados têm forte afinidade com os valores KD na faixa nanomolar baixa (10_10M). Dois valores de KD de combinações mutantes (3, 6) foram próximos ao anticorpo parental quimérico (9,89 χ 10_11M) (Tabela 4).
Tabela 4. Determinação de afinidade de ligação e cinética de anticorpos humanizados.
ka (1/Ms) Kd (1/s) KD (M)
Parental 2.88E+05 2.85E-05 9.89E-11
Variante 1 2.10E+05 6.15E-05 2.93E-10
Variante 2 2.10E+05 7.64E-05 3.63E-10
Variante 3 2.42E+05 2.33E-05 9.63E-11
Variante 4 1.19E+05 6.29E-05 3.38E-1O
Variante 5 2.11E+05 6.94E-05 3.29E-10
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Variante 6 2.48E+05 2.23E-05 8.98E-11
Variante 7 2.18E+05 6.48E-05 2.91E-10
Variante 8 2.22E+05 7.95E-05 3.58E-10
Variante 9 2.59E+05 3.20E-05 L23E-10
[179] Efeito de aumento de anti-PD-1 em células positivas do tumor alo CD8+CTL matando CPD-L1 in vitro: baseado no mecanismo antitumoral de anticorpo de anti-PD-1, este exemplo projetou um modelo in vitro para determinar o efeito de aumento de anticorpos de antiPD-1 à matança de célula de tumor por linfócitos citotóxicos CD8+ alogênicos humanos de (alo CD8+ CTL). Primeiramente, os linfócitos CD8+ foram isolados de PBMC humano e cultivados com o melanoma humano irradiado transfectadas em células hB7-1 (624 mel/B7-1), para produzir aloCD8+cito CTL. Então as células alo CD8+ CTL foram cocultivadas com células tumorais de 624 mel/HPD-L1 durante a noite, em uma placa de 96 poços, por 5 dias, na presença de anticorpos humanizados ou controle Ig. As células em poços da placa foram marcadas com 0,5% de violeta cristal e a placa foi lida com o leitor ELISA, a 540 nm. A atividade de matança foi calculada com base na sobrevida das células tumorais.
„.x .... Absorbância de poços de controle de céluia WO % variáveis - absorbância de poços teste %CítotoMCídade = ........................................................................______ X10O
Absorbância de poços de controle 100% variáveis [180] Os resultados demonstraram que algumas combinações mutantes poderíam aumentar a habilidade de células alo-CTL matando células tumorais in vitro (Figura 11).
[181] O melhor conjunto de combinações mutantes (variante 3) foi selecionado e as sequências de codificação de proteínas, foram clonadas em vetores de expressão adequados e transferidas em células CHO para o produto de anticorpo anti-hPD-1, que é referido também como TY101.
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Exemplo 5: As características de TY101 em imunoterapia de câncer.
[182] Reação de linfócito misturado com citocina aumentada (MRL) em PBMC. As células mononucleares, de sangue periférico, humanas (PBMCs) de indivíduos sadios foram isoladas por centrifugação de gradiente de densidade, usando o Ficoll-Hypaque. PBMCs do doador saudável 1 foram irradiados com raios X, em doses de 40 GY como células de estimulador. Os linfócitos T foram isolados com o kit de isolação de células T de pan humano (MiltenylBiotec) do doador saudável 2, como células replicantes. As células replicantes e as células estimulador foram ressuspensas em meios completos RPMI, que contêm 10% FCS e semeadas 2,5 χ 105 células replicantes e 1,25 χ 105 células de estimulador (R/S = 2) por poço em placa de 96 poços, na presença de diluições em série de TY101 ou controle hlgG. As células foram cultivadas a 37° C, por 5 dias, em uma incubadora umidificada com 5% de CO2. A atividade proliferativa das células T foi avaliada pelo Kit-8 de contagem de células (Dojindo Molecular Technologies, Inc) no dia 5. Para detectar citocinas, sobrenadantes de cultura foram coletados no dia 3 e dia 5. A análise de citocinas foi realizada utilizando-se 0 kit “Human Th1/Th2/Th17 Cytometric Bead Array (CBA; BD Biosciences)”.
[183] Os resultados demonstraram que a resposta proliferativa das células T sobre a TY101 foi semelhante a tohlgG (Figura 12). Curiosamente, as citocinas IL-2 e produção de IFNy aumentaram significativamente no sobrenadante de cultura do MLR administrado com TY 101 comparado com 0 hIGg (Figura 13).
[184] Bloqueando a expressão de PD-1 em linfócitos T. A expressão de PD-L1 em células de tumor pode induzir a expressão de PD-1 em linfócitos infiltrando em tumor (TIL) em microambiente de tumor e desencadear a supressão imune de PD-1-dependente. Este
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73/80 exemplo projetou um modelo in vitro para determinar se TY101 pode inibir a expressão hPD-1 em linfócito humano, quando a cultura com hPD-L1 transfectou células de tumor. Linfócitos T humanos, isolados de PBMC humanos, foram cultivados com células hPD-L1 (624/hPDL1) transfectadas de melanoma humano, na presença de 10 pg/ml de TY101 ou controle de IgG, por 4 dias. A expressão de hPD-1 em linfócitos foi detectada por citometria de fluxo.
[185] Os resultados demonstraram que a expressão de PD-1 em linfócitos foi completamente inibida pela adição de TY101 comparado ao meio somente e controle hlgG (Figura 14).
[186] Atividade antitumoral in vivo do anticorpo PD-1 humanizado: o efeito antitumoral in vivo de TY101 foi investigado. Um rato fêmea de 8 semanas de idade, de knock-in de PD-1 humano (fornecido por Shanghai Model Organismus Center, Inc.) foi implantada, por via subcutânea (s. c), no flanco direito, com células tumorais (1 χ 106/rato) de hPD-L1 transfectado MC38 (MC38/hPD-L1) no dia 0. TY101 ou controle IG foi administrado (10mg/kg) via injeção i.p. no dia 6, dia 9 e dial3. O tamanho e a sobrevivência do tumor foram monitorados.
[187] Todos os animais inicialmente apresentavam tumor detectável (4-5mm no dia 6). No entanto, após o tratamento dos ratos portadores de tumores MC38/hPD-L1 com TY101, uma resposta completa ocorreu em 100% dos ratos. Os tumores em todos os cinco ratos, tratados com TY101, regrediram completamente no dia 25. Em contraste, dois de cinco ratos tratados com IgG de controle desenvolveram tumores progressivamente crescentes. Em outros três ratos tratados com controle IgG, embora os tumores também tivessem regredido no dia 32, os tumores em dois ratos foram recidivados logo (Figurei5). Os resultados indicaram que TY101 pode melhorar a eficácia antitumoral in vivo.
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Exemplo 6. Uma comparação das funções de TY101 aos anticorpos PD-1 comerciais [188] Este exemplo selecionou dois anticorpos anti-hPD-1 que estão atualmente aprovados para tratamento clínico de pacientes de câncer, para comparação com TY101: Keytruda da Merck (pembrolizumab) e Opdivo de Bristol-Myers Squibb (nivolumab).
[189] Afinidade e cinética de ligação de anticorpos: A afinidade e a cinética do TY101 foram analisadas por meio do instrumento Biacore T200 (GE Healthcare Life Sciences) e comparados com dois anticorpos comerciais. As proteínas hPD-1mlg foram imobilizadas com baixa concentração (33RU) no chip do sensor CM5, os anticorpos como um analito (fase móvel) para detectar a interação. Os dados mostraram que as taxas de ligação Ka dos três anticorpos não são significativamente diferentes. TY101 é ligeiramente mais baixo do que os anticorpos comerciais. A taxa de dissociação Kd de TY101 é 10 vezes mais lenta do que dos dois anticorpos comerciais e a afinidade KD de TY101 é 4-7 vezes mais forte do que anticorpos comerciais. Os resultados indicaram que TY101is indicativo de uma ligação mais forte (Figura 16).
[190] Comparação de anticorpos PD-1 em bloqueio PD-1/PDL1: o bioensaio de bloqueio PD-1/PD-L1 foi analisado utilizando-se o kit de bioensaios de bloqueio PD-1/PD-L1 (Promega). Células de Jurkat-PD1 em 1 χ 105 células/poço foram estimuladas com células CHOPD-L1 cultivadas durante a noite (cultura iniciada em 5 χ 104 células/poço) em uma placa de TC de 96 poços, opaca, por 5 horas, na presença de diluições seriadas (0-30 pg/ml) de TY101, Pembrolizumab, Nivolumab ou hlgG4 de controle negativo. Após 5 horas da incubação, a ativação da célula de Jurkat-PD-1 foi detectada medindo a atividade da luciferase com substrato de ONE-GIo (Promega) para as unidades de luz relativas (RLU), em um luminómetro de SpectraMAX
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L.
[191] Os dados da análise mostraram TY101 e os dois anticorpos comerciais podem bloquear o trajeto do PD-1/PD-L1. O efeito de bloco de TY101 é semelhante ao de Pembrolizumab e melhor do que o de Nivolumab (Fig.17).
[192] Comparação dos efeitos inibitórios do crescimento de células tumorais in vitro: como descrito anteriormente, as células alo CD8 + CTL foram cocultivadas com células tumorais 624 Mel/PD-L1, cultivadas durante a noite, em uma placa de 96 poços, por 5 dias, na presença de diferentes mAbs e controle IgG. As células foram marcadas com 0,5% de violeta cristal e a placa foi lida com o leitor ELISA a 540 nm. A atividade de matança foi calculada com base na sobrevida das células tumorais.
[193] Os resultados mostraram que todos os três anti-PD-1 mabs foram capazes de melhorar a habilidade da matança de tumor do alo CD8+ CTL. O efeito de melhora do TY101 foi superior ao de dois anticorpos comerciais (Figurei8).
Exemplo 7. Desenvolvimento de clones para TY101 e suas atividades [194] A sequência de TY101 foi clonada em vetores de expressão proprietária e células CHO transfectadas. As linhas de células monoclonais foram estabelecidas utilizando-se ClonePix e/ou diluição limitante. Foram estabelecidos clones múltiplos e anticorpos produzidos por 3 de tais clones (TY101 -01-09, TY101-04-T3-05 e TY101-4G1). Anticorpos de teste ligando a proteínas hPD-1 ou mPD-1 (ELISA) [195] As ligações dos anticorpos ao hPD-1 e a reatividade cruzada às proteínas mPD-1 foram testadas por ELISA. Uma diluição seriada de anticorpos de teste foi adicionada às placas ELISA prérevestidas com 1 pg/ml de hPD-1 ou mPD-1. Foi então adicionado o anticorpo IgG anti-humano de cabra conjugado HRP IgG ou IgG anti
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76/80 rato de cabra, seguido da adição do substrato tetra metil benzidina (TMB) e quantificação com um leitor de microplacas Spectramax Plus 384 (Molecular Device, LLC., Sunnyvale, CA) a 450nm de comprimento de onda. Clones de TY101 testados TY101-01-09, TY101-04-T3-05 e TY101-4G1 mostraram boa ligação à proteína hPD-1, com EC50s na faixa de 0,01 - 0,15 nM. Os anticorpos não apresentaram ligação à proteína MPD-1 (Figura 19).
Anticorpos de teste ligando a hPD-1 e células CHOK1 expressando cPD-1 (citometria de fluxo) [196] As ligações dos anticorpos a hPD-1 e reatividade cruzada a PD-1 (cPD-1) de macaco cynomolgus foram testadas usando células CHOK1 expressando hPD-1 ou cPD-1, por citometria de fluxo. CHOK1-hPD-1, CHOK1-cPD-1 e células CHOK1 em branco foram incubadas com uma diluição seriada de artigos de teste, seguidos por anticorpo IgG (H + L) anti-humano de cabra, conjugado Alexa fluor® 488, e analisados usando um FACSCanto II (BD Biosciences, San Jose, CA). Os clones de TY101 testados TY101-01-09, TY101-04-T3-05 e TY101-4G1, mostraram boa ligação ao CHOK1-hPD-1 com EC50s subnanomolar e às células CHOK1-cPD-1 com EC50s nanomolar de dígito único (Figura 20).
Anticorpos de teste bloqueando a atividade na ligação hPD-1/hPD-L1 ou hPD-1/hPD-L2 (citometria de fluxo) [197] Estes anticorpos foram ademais testados mais para que suas habilidades para bloquear ligações hPD-1/hPD-L1 bem como hPD-1/hPD-L2, que seria a chave para a eficácia potencial em tratamentos pacientes de câncer. As células CHOK1-hPD-1 foram incubadas com uma diluição seriada de artigos de teste misturados com biotina-hPD-L1 ou biotina-hPD-L2. As células foram então incubadas com Alexa 488 rotulada Streptavidin e analisadas usando um FACSCanto II. Anticorpos anti-hPD-1 TY101-01-09, TY101-04-T3-05 e TY101-4G1,
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77/80 bloquearam a ligação de hPD-L1 a células CHOK1 expressando hPD1, com 1,15-1,47 nM IC50s. Eles também bloquearam a ligação hPDL2 com células CHOK1 expressando hPD-1, com 1,52-2,33 nM IC50s (Figura 21).
Ensaio de reação de leucócito humano misturado leucocitária (MLR) para testar o efeito de anticorpos em células T [198] Os efeitos desses anticorpos nas funções das células T foram testados em ensaios de MLR humanos, com células T isoladas de 2 doadores. PBMCs aderentes (principalmente monócitos; isolados do doador 1 e chapeados em placa de cultura celular para permitir aderir) foram cultivados na presença de 100 ng/ml de GM-CSF humano recombinante (rh) e 50 ng/ml de rhlL-4 por 5 dias com meio volume de meio refrescado após 3 dias e 1 μ g/ml de LPS adicionado no dia 6. No dia 7, as células resultantes (principalmente DCs maduras) foram colhidas e tratadas com mitomicina C. Células T de CD3+ foram isoladas dos doadores 2 e 3 por kit de isolamento de células T humanas Easysep™ (seleção negativa, STEMCELL Technologies). Células DCs e T foram cocultivadas na presença de 3 concentrações (5, 0,5, 0, 5 pg/ml) de anticorpos do teste, por 5 dias. Os sobrenadantes foram colhidos após 3 dias para determinar os níveis de IL-2 e após 5 dias (100 μΙ) para determinar os níveis de IFN-γ. Os anticorpos anti-hPD-1 TY10101-09, TY101-04-T3-05 e TY101-4G1 promoveram a secreção de IL-2 e IFN-γ por células de ambos os doadores, de maneira dosedependente, quando comparadas com o controle hlgG4 de isótipo (Figura 22).
Ensaio de cocultura de células T de células-humanas de tumor projetado para testar o efeito de anticorpos em células T [199] Os efeitos destes anticorpos nas funções de célula T foram também testados no ensaio de cocultura de célula T de célula-humana em tumor projetado, usando células T isoladas de 4 doadores diferen
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78/80 tes. Células CD3+ T foram isoladas de PBMCs dos 4 doadores por kit de isolamento de célula T humana EasySep™. As células de tumor projetado Hep3B-OS8-hPDL1, que são células Hep3B (KCLB, catálogo #: 88064) projetadas para expressar estavelmente OS8 (fragmento variável de cadeia única anti-CD3 (scFv)), bem como hPD-L1, foram tratadas com mitomicina C e cocultivadas com células CD3+ T , na presença de 3 concentrações (5, 0,5, 0, 5 pg/ml) de anticorpos do teste por 3 dias e sobrenadantes da cultura foram colhidos para determinar níveis de IFN-γ. Os anticorpos anti-hPD-1: TY101-01-09, TY10104-T3-05 e TY101-4G1 promoveram a secreção de IFN-γ por células de todos os 4 doadores de maneira dose-dependente, quando comparados ao controle hlgG4 de isótipo (Figura 23).
Exemplo 8. Clones de TY101 mostraram melhores afinidades de ligação em comparação com anticorpos anti-hPD-1 aprovados pela FDA
ELISA competitivo para testar sobreposições de epítopo de anticorpo [200] Se estes anticorpos se ligam aos mesmos epítopos que os anticorpos anti-hPD-1 aprovados pela FDA, o Nivolumab ou o Pembrolizumab foram testados num ensaio ELISA competitivo. Uma diluição em série de anticorpos concorrentes e biotina-hPD-1 foram adicionadas às placas ELISA, pré-revestidas com 1 pg/ml de um anticorpo de teste. O HRP conjugado Streptavidina foi então adicionado, seguido pela adição de TMB de substrato e quantificação com um leitor de microplacas SpectraMax Plus 384, a 450nm de comprimento de onda. Anticorpos anti-hPD-1, TY101-01-09, TY101-04-T3-05 e TY101-4G1, quase completamente bloquearam a ligação entre si para hPD-1, sugerindo que eles compartilharam epítopos semelhantes. Os 3 anticorpos também bloquearam a ligação de Nivolumab e Pembrolizumab a hPD-1 quase completamente (93% a 94%), enquanto o Nivolumab e o Pembrolizumab apenas parcialmente bloquearam a ligação destes an
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79/80 ticorpos à hPD-1 (77%-78% para Nivolumab e 46%-49% para Pembrolizumab). Estes dados sugerem que os anticorpos TY101-01-09, TY101-04-T3-05 e TY101-4G1 ligam-se a epítopos diferentes daqueles de Nivolumab e Pembrolizumab, podendo ter maior afinidade com a hPD-1 do que o Nivolumab e o Pembrolizumab (Figura 24).
Afinidade de ligação de anticorpos de teste à hPD-1 determinada pela SPR [201] Para obter uma medição exata das afinidades de ligação ao hPD-1, os anticorpos TY101-01-09, TY101-04-T3-05 e TY101-4G1, bem como o Nivolumab e o Pembrolizumab foram analisados com SPR. Proteína humana PD-1 ECD foi imobilizada no chip do sensor CM5 para o comprimento diferente de tempo para atingir baixo nível de imobilização (em 60 RU) na célula de fluxo 3 e alto nível de imobilização (960 RU) na célula de fluxo 4. Os anticorpos serialmente diluídos (0, 1,5625, 3,125, 6,25, 12,5, 25 e 50 nM) foram injetados em células de fluxo. O tempo de associação foi de 180s e o tempo de dissociação foi de 600s (para Nivolumab e Pembrolizumab) ou 1500S (para TY101-01-09, TY101-04-T3-05 e TY101-4G1). Após sinais da referência (célula de fluxo 1) e das concentrações zero sendo subtraída das amostras, a cinética de ligação foi calculada utilizando o software de avaliação Biacore T200 versão 1.0 e um modelo de ligação 1:1 para encaixe de curva. Não havia nenhuma ligação do lgG4 humano de controle ao hPD-1. Com base nos dados do baixo nível de imobilização da hPD-1 (~ 60 RU; Tabela 3; Figura 23), as taxas de associação ao PD-1 humano por anticorpos anti-hPD-1 TY101-01-09, TY101-04T3-05 e TY101-4G1 foram ligeiramente inferiores às de Nivolumab e Pembrolizumab (por 2-4 dobras). As taxas de dissociação do PD-1 humano destes 3 anticorpos foram mais lentas do que as de Nivolumab e Pembrolizumab por 12 a 30 dobras, resultando na sua afinidade
4-8 dobras melhor do que as de Nivolumab e Pembrolizumab (KD infe
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80/80 rior corresponde a uma melhor afinidade, e vice-versa; Tabela 3).
[202] As afinidades de ligação dos anticorpos anti-hPD-1, TY10101-09, TY101-04-T3-05 e TY101-4G1, ao hPD-1 também foram testadas em alto nível de imobilização de hPD-1. Os anticorpos TY101-0109, TY101-04-T3-05 e TY101-4G1 mostraram taxas de desassociação muito lentas, com desassociação mínima observada mesmo após 1500s de tempo de desassociação (Figura 23). Os dados sugerem que as afinidades de ligação de TY101-01-09, TY101-04-T3-05 e TY1014G1 foram melhores do que as de Nivolumab e Pembrolizumab, principalmente devido à baixa taxa de desassociação (Figura 25).
ir ir ir [203] A presente divulgação não deve ser limitada no escopo pelas modalidades específicas descritas, as quais pretendem ser simples ilustrações de aspetos individuais da divulgação, e quaisquer composições ou métodos que sejam funcionalmente equivalentes, estão no escopo desta divulgação. Será evidente para aqueles versados na técnica, que várias modificações e variações podem ser feitas nos métodos e composições da presente divulgação, sem sair do espírito ou escopo da divulgação. Assim, pretende-se que a presente divulgação cubra as modificações e variações desta divulgação, desde que estejam dentro do escopo das reivindicações anexadas e seus equivalentes.
[204] Todas as publicações e pedidos de patente mencionados neste relatório descritivo, são incorporados por referência à mesma extensão que cada publicação individual ou pedido de patente foi especificamente e individualmente indicado para ser incorporado por referência.

Claims (24)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Anticorpo isolado ou fragmento do mesmo, tendo especificidade para uma proteína de morte celular programada humana 1 (PD-L1), caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo regiões determinando complementaridade de cadeia pesada HCDR1, HCDR2 e HCDR3, e uma região variável de cadeia leve compreendendo regiões determinando complementaridade de cadeia leve LCDR1, LCDR2 e LCDR3, em que o HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3 são selecionados a partir do grupo consistindo em:
    (a) HCDR1: GFTFSSYT (SEQ ID N2: 1), HCDR2: ISHGGGDT (SEQ ID N2: 2), HCDR3: ARHSGYERGYYYVMDY (SEQ ID N2: 3), LCDR1: ESVDYYGFSF (SEQ ID N2: 4), LCDR2: AAS (SEQ ID N2: 5), LCDR3: QQSKEVPW (SEQ ID N2: 6);
    (b) HCDR1: GYTFTSYT (SEQ ID N2: 7), HCDR2: INPTTGYT (SEQ ID N2: 8), HCDR3: ARDDAYYSGY (SEQ ID N2: 9), LCDR1: ENIYSNL (SEQ ID N2: 10), LCDR2: AAK (SEQ ID N2: 11), LCDR3: QHFWGTPWT (SEQ ID N2: 12); e (c) HCDR1: GFAFSSYD (SEQ ID N2: 13), HCDR2: ITIGGGTT (SEQ ID N2: 14), HCDR3: ARHRYDYFAMDN (SEQ ID N2: 15), LCDR1: ENVDNYGINF (SEQ ID N2: 16), LCDR2: VSS (SEQ ID N2: 17), LCDR3: QQSKDVPW (SEQ ID N2: 18).
  2. 2. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma região constante de cadeia pesada, uma região constante de cadeia leve, uma região Fc ou a combinação destas.
  3. 3. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a região constante de cadeia leve é uma região constante de cadeia kappa ou lambda.
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  4. 4. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de queo anticorpo ou fragmento do mesmo é um isótipo de IgG, IgM, IgA, IgE ou IgD.
  5. 5. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o isótipo é lgG1, lgG2, lgG3 ou lgG4.
  6. 6. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento do mesmo é um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado ou um anticorpo inteiramente humano.
  7. 7. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento do mesmo é um anticorpo humanizado.
  8. 8. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável de cadeia pesada, compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NQ: 35, SEQ ID NQ: 37, SEQ ID NQ: 39, ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade de sequência para SEQ ID NQ: 35, SEQ ID NQ: 37, ou SEQ ID NQ: 39.
  9. 9. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável de cadeia leve, compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NQ: 41, SEQ ID NQ: 43, SEQ ID NQ: 45, ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade de sequência para SEQ ID NQ: 41, SEQ ID NQ: 43, ou SEQ ID NQ: 45.
  10. 10. Anticorpo isolado ou fragmento do mesmo, tendo especificidade para uma proteína de morte celular programada humana 1 (PD-L1), caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada, compreendendo complementaridade da cadeia pesada determinando regiões
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    HCDR1, HCDR2 e HCDR3, e uma região variável de cadeia leve, compreendendo a complementaridade da cadeia leve determinando regiões LCDR1, LCDR2 e LCDR3, onde HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3 são selecionados do grupo consistindo em:
    (a) HCDR1: GFTFSSYT (SEQ ID N2: 1), HCDR2: ISHGGGDT (SEQ ID N2: 2), HCDR3: ARHSGYERGYYYVMDY (SEQ ID N2: 3), LCDR1: ESVDYYGFSF (SEQ ID N2: 4), LCDR2: AAS (SEQ ID N2: 5), LCDR3: QQSKEVPW (SEQ ID N2: 6);
    (b) HCDR1: GYTFTSYT (SEQ ID N2: 7), HCDR2: INPTTGYT (SEQ ID N2: 8), HCDR3: ARDDAYYSGY (SEQ ID N2: 9), LCDR1: ENIYSNL (SEQ ID N2: 10), LCDR2: AAK (SEQ ID N2: 11), LCDR3: QHFWGTPWT (SEQ ID N2: 12);
    (c) HCDR1: GFAFSSYD (SEQ ID N2: 13), HCDR2: ITIGGGTT (SEQ ID N2: 14), HCDR3: ARHRYDYFAMDN (SEQ ID N2: 15), LCDR1: ENVDNYGINF (SEQ ID N2: 16), LCDR2: VSS (SEQ ID N2: 17), LCDR3: QQSKDVPW (SEQ ID N2: 18); e (d) HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, e LCDR3, como apresentado em (a)-(c), mas pelo menos um dos quais inclui um, dois ou três, adição de aminoácido, supressão, substituição de aminoácido conservador ou a combinação dos mesmos.
  11. 11. Anticorpo ou fragmento isolado do mesmo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3 são como mostrados em qualquer um de (a)-(c), mas um dos quais inclui uma substituição conservadora de aminoácido.
  12. 12. Anticorpo ou fragmento isolado do mesmo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3 são como mostrados em qualquer um de (a)-(c), mas dois dos quais de cada um inclui uma substituição conservadora de aminoácido.
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    4!Ç>
  13. 13. Anticorpo ou fragmento isolado do mesmo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3 são como mostrados em qualquer um de (a)-(c), mas três dos quais de que cada um inclui uma substituição conservadora do aminoácido.
  14. 14. Composição caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo ou fragmento do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
  15. 15. Célula isolada caracterizada pelo fato de que compreende um ou mais polinucleotideos codificando o anticorpo ou fragmento do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13.
  16. 16. Uso do anticorpo ou fragmento do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de medicamento para o tratamento de câncer.
  17. 17. Uso de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o câncer é selecionado do grupo consistindo em câncer de bexiga, câncer de fígado, câncer do cólon, câncer retal, câncer do endométrio, leucemia, linfoma, câncer pancreático, câncer do pulmão de pequenas células, câncer do pulmão de células não pequenas, câncer da mama, câncer uretral , câncer de cabeça e pescoço, câncer gastrointestinal, câncer de estômago, câncer de esôfago, câncer de ovário, câncer renal, melanoma, câncer de próstata e câncer de tireoide.
  18. 18. Método de tratamento de câncer em um paciente em necessidade do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao paciente o anticorpo ou fragmento do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13.
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  19. 19. Método de tratamento de câncer ou infecção em um paciente em necessidade do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende:
    (a) tratar uma célula, in vitro com o anticorpo ou fragmento do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13; e (b) administrar a célula tratada ao paciente.
  20. 20. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a célula é uma célula T.
  21. 21. Uso do anticorpo ou fragmento do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para o tratamento de uma infecção.
  22. 22. Uso de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a infecção é infecção viral, infecção bacteriana, infecção fúngica ou infecção por um parasita.
  23. 23. Uso do anticorpo ou fragmento do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que é para o tratamento de um distúrbio imunológico.
  24. 24. Uso de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o distúrbio imunológico é selecionado a partir do grupo consistindo em infecção, choque séptico associado com infecção, artrite, artrite reumatoide, asma, COPD, doença inflamatória pélvica, doença de Alzheimer, doença inflamatória do intestino , doença de Crohn, colite ulcerosa, doença de Peyronie, doença celíaca, doença da vesícula biliar, doença pilonidal, peritonite, psoríase, vasculite, aderências cirúrgicas, acidente vascular cerebral, diabetes tipo I, doença de Lyme, artrite, meningoencefalite, uveíte autoimune, distúrbios inflamatórios mediados imunológicos do sistema nervoso central e periférico, esclerose múltipla, lúpus e síndrome de Guillain-Barr, dermatite atópica, hepatite autoimune, alveolite fibrosa, doença de Grave, nefro
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    6/6 patia de IgA, púrpura trombocitopênica idiopática, doença de Meniere, pênfigo, cirrose biliar primária, sarcoidose, Esclerodermia, granulomatose de Wegener, pancreatite, trauma, doença do enxerto versus hospedeiro, rejeição de transplante, doenças isquêmicas, infarto do miocárdio, aterosclerose, coagulação intravascular, reabsorção óssea, osteoporose, osteoartrite, periodontite, hipoclorídia e infertilidade relacionada à falta de tolerância materno-fetal.
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