TW201709929A - 治療癌症的聯合療法 - Google Patents

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Abstract

本發明涉及藥物組合物，其包括特異性結合HER2/neu的第一分子和參與調節免疫檢查點(或其配體)的、特異性結合細胞表面受體(或其配體)的第二分子。本發明尤其涉及其中第二分子結合PD-1的實施方式。本發明也涉及這類藥物組合物治療癌症和其他疾病的用途。

Description

治療癌症的聯合療法
本發明涉及藥物組合物，其包括特異性結合HER2/neu的第一分子和特異性結合細胞表面受體的、參與調節免疫檢查點(或其配體)的第二分子。本發明尤其涉及其中第二分子結合PD-1的實施方式。本發明也涉及這類藥物組合物治療癌症和其他疾病的用途。
I. HER2/neu和HER2/neu受體 細胞生長和分化過程涉及通過特異性受體比如酪氨酸激酶發揮它們作用的生長因數。配體與酪氨酸激酶受體的結合引發一系列事件，其最終導致細胞增殖和分化(Carpenter, G.等(1979) “Epidermal Growth Factor,” Annu Rev Biochem. 48:193-216；Sachs等(1987) “Cell Differentiation And Bypassing Of Genetic Defects In The Suppression Of Malignancy,” Cancer Res. 47:1981-1986)。基於序列相似性和不同的特徵，酪氨酸激酶受體可歸類為若干組。一種這樣的家族是ErbB或表皮生長因數受體家族，其包括稱為HER-1 (也稱為erbB-1或EGFR)、HER2/neu (也稱為HER-2、erbB-2、c-neu或p185)、HER-3 (也稱為erbB-3)，和HER-4 (也稱為erbB-4)的多個受體(見，例如，Carpenter, G.等(1979) “Epidermal Growth Factor,” Annu. Rev. Biochem. 48:193-216；Semba, K.等(1985) “A v-erbB-Related Protooncogene, c-erbB-2, Is Distinct From The c-erbB-1/Epidermal Growth Factor-Receptor Gene And Is Amplified In A Human Salivary Gland Adenocarcinoma,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 82:6497-6501；Coussens, L.等(1985) “Tyrosine Kinase Receptor With Extensive Homology To EGF Receptor Shares Chromosomal Location With neu Oncogene,” Science 230:1132-1139；Bargmann, C.I.等(1986) “Multiple Independent Activations Of The Neu Oncogene By A Point Mutation Altering The Transmembrane Domain Of p185,” Cell 45:649-657；Kraus, M.H.等(1989) “Isolation And Characterization Of ERBB3, A Third Member Of The ERBB/Epidermal Growth Factor Receptor Family: Evidence For Overexpression In A Subset Of Human Mammary Tumors,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:9193-9197；Carraway, K.L.等(1994) “The erbB3 Gene Product Is A Receptor For Heregulin,” J. Biol. Chem. 269:14303-14306；Plowman, G.D.等(1993) “Heregulin Induces Tyrosine Phosphorylation Of HER4/p180erbB4,” Nature 366: 473-475；和Tzahar, E.等(1994) “ErbB-3 and ErbB-4 Function As The Respective Low And High Affinity Receptors Of All neu Differentiation Factor/Heregulin Isoforms,” Biol. Chem. 269: 25226-25233)。
在正常的發育過程和人腫瘤發生過程中，ErbB受體在傳播調節細胞增殖、分化、運動和細胞凋亡的信號中起到重要的作用(Slamon, D.J.等(1989) “Studies Of The HER-2/neu Proto-Oncogene In Human Breast And Ovarian Cancer,” Science 244:707-712)。例如，erbB受體的啟動與以下相關並且刺激它們：下游MAPK-Erk1/2和磷酸肌醇-3-激酶(PI3K)/AKT生長和生存途徑。已經將癌症中這些途徑的失調與疾病進展和難以治療相關聯(Fukazawa, T.等(1996) “Tyrosine Phosphorylation Of Cbl Upon Epidermal Growth Factor (EGF) Stimulation And Its Association With EGF Receptor And Downstream Signaling Proteins,” J. Biol. Chem. 271:14554-14559；Tzahar, E.等(1996) “A Hierarchical Network Of Interreceptor Interactions Determines Signal Transduction By neu Differentiation Factor/Neuregulin And Epidermal Growth Factor,” Mol. Cell. Biol. 16:5276-5287；Lange, C.A.等(1998) “Convergence Of Progesterone And Epidermal Growth Factor Signaling In Breast Cancer. Potentiation Of Mitogen-Activated Protein Kinase Pathways,” J. Biol. Chem. 273:31308-31316；Olayioye, M.A.等(1998) “ErbB-1 And ErbB-2 Acquire Distinct Signaling Properties Dependent Upon Their Dimerization Partner,” Mol. Cell. Biol. 18:5042-5051；Hackel, P.O.等(1999) “Epidermal Growth Factor Receptors: Critical Mediators Of Multiple Receptor Pathways,” Curr. Opin. Cell Biol. 11:184-189)。PI3K/AKT的啟動促進了細胞生存並且增強了腫瘤侵略性，並且報導了AKT2在過表達HER2/neu的乳腺癌中被啟動和過表達(Shak, S. (1999) “Overview Of The Trastuzumab (Herceptin) anti-HER2 Monoclonal Antibody Clinical Program In HER2-Overexpressing Metastatic Breast Cancer,” Semin. Oncol. Suppl 12:71-77；Huang, S.M.等(2000) “Modulation Of Radiation Response After Epidermal Growth Factor Receptor Blockade In Squamous Cell Carcinomas: Inhibition Of Damage Repair, Cell Cycle Kinetics, And Tumor Angiogenesis,” Clinical Cancer Res. 7:2166-2174；Bacus, S.S.等(2002) “AKT2 Is Frequently Upregulated In HER-2/neu-Positive Breast Cancers And May Contribute To Tumor Aggressiveness By Enhancing Cell Survival,” Oncogene 21:3532-3540)。
通過受體的ErbB家族的信號傳導由配體結合啟動，這引發同受體二聚化或異受體二聚化、細胞質尾部的交互的酪氨酸磷酸化和細胞內信號轉導途徑的啟動(Citri, A.等(2003) “The Deaf And The Dumb: The Biology Of ErbB-2 And ErbB-3,” Exp. Cell Res. 284:54-65)。結合和啟動ErbB受體的配體的可用性由各種金屬蛋白酶，比如鋅依賴性金屬蛋白酶的ADAM (a disintegrin and metalloprotease，解鏈蛋白和金屬蛋白酶)家族介導，該家族催化特異性蛋白質的細胞表面胞外域脫落(見Chang, C.和Werb, Z. (2001) “The Many Faces Of Metalloproteases: Cell Growth, Invasion, Angiogenesis And Metastasis,” Trends in Cell Biology 11:S37-S43；Moss, M.L.等(2002) “Shedding Of Membrane Proteins By ADAM Family Proteases,” Essays in Biochemistry 38:141-153；Seals, D.F.等(2003) “The ADAMs Family Of Metalloproteases: Multidomain Proteins With Multiple Functions,” Genes and Development 17:7-30)。具體地，已經證明ADAM家族切割負責啟動ErbB受體的配體，比如APP和Notch (Blobel, C.P. (2005) “ADAMs: Key Components In EGFR Signalling And Development,” Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 6:32-43)。
HER2/neu是ErbB家族的重要成員。它是185 kDa受體蛋白，初始被鑒定為來自化學處理的大鼠的成神經細胞瘤的ERBB2轉化基因的產物。因為其在若干人類癌症和哺乳動物發育中的作用，HER2/neu得到了廣泛研究(Hynes, N.E.等(1994) “The Biology Of erbB-2/neu/HER-2 And Its Role In Cancer,” Biochim. et Biophys. Acta 1198:165-184；Dougall, W.C.等(1994) “The neu-Oncogene: Signal Transduction Pathways, Transformation Mechanisms And Evolving Therapies,” Oncogene 9:2109-2123；Lee, K.F.等(1995) “Requirement For Neuregulin Receptor erbB2 In Neural And Cardiac Development,” Nature 378:394-398)。人HER2/neu基因和HER2/neu蛋白質描述在下述文獻中：Semba, K.等(1985) “A v-erbB-Related Protooncogene, c-erbB-2, Is Distinct From The c-erbB-1/Epidermal Growth Factor-Receptor Gene And Is Amplified In A Human Salivary Gland Adenocarcinoma,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 82: 6497-6501和Yamamoto, T.等(1986) “Similarity Of Protein Encoded By The Human c-erb-B-2 Gene To Epidermal Growth Factor Receptor,” Nature 319:230-234，並且可在GenBank中以登錄號X03363獲得序列。HER2/neu包括四個結構域：配體結合的細胞外結構域；親脂性跨膜結構域；保守的細胞內酪氨酸激酶結構域；和具有若干可被磷酸化的酪氨酸殘基的羧基-末端信號傳導結構域(Plowman, G.D.等(1993) “Ligand-Specific Activation Of HER4/p180erbB4, A Fourth Member Of The Epidermal Growth Factor Receptor Family,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 90:1746-1750)。Franklin, M.C.等(2004) “Insights Into ErbB Signaling From The Structure Of The ErbB2-Pertuzumab Complex,” Cancer Cell. 5(4):317-328描述了HER2/neu細胞外結構域(ECD)的序列，其可獲得自Protein DataBank Record 1S78 (2004)。
HER2/neu用作生長因數受體並且通常由乳腺癌、卵巢癌或肺癌癌的細胞表達。HER2/neu在25-30%的人乳腺癌和卵巢癌中過表達，並且其過表達與受影響的患者中快的臨床進程和差的預後相關(Slamon, D.J.等(1987) “Human Breast Cancer: Correlation Of Relapse And Survival With Amplification Of The HER-2/neu Oncogene,” Science 235:177-182；Slamon, D.J.等(1989) “Studies Of The HER-2/neu Proto-Oncogene In Human Breast And Ovarian Cancer,” Science 244:707-712)。也已經在其他癌的癌細胞中觀察到了HER2/neu的過表達，所述癌包括胃癌、子宮內膜癌、唾液腺癌、肺癌、腎癌、結腸癌、甲狀腺癌、胰腺癌和膀胱癌(見，例如King, C.R.等(1985) “Amplification Of A Novel v-erbB-Related Gene In A Human Mammary Carcinoma,” Science 229:974；McCann, A.等(1990) “c-erbB-2 Oncoprotein Expression In Primary Human Tumors,” Cancer 65:88-92；Yonemura, Y.等(1991) “Evaluation Of Immunoreactivity For erbB-2 Protein As A Marker Of Poor Short Term Prognosis In Gastric Cancer” Cancer Research 51:1034)。
已經將HER2/neu的啟動與乳腺癌患者中對激素療法降低的臨床反應性相關聯(Wright, C. et. al. (1989) “Expression Of c-erbB-2 Oncoprotein: A Prognostic Indicator In Human Breast Cancer,” Cancer Res. 49:2087-2090；Kurokawa, H.等(2001) “Inhibition Of erbB Receptor (HER) Tyrosine Kinases As A Strategy To Abrogate Antiestrogen Resistance In Human Breast Cancer,” Clin. Cancer Res. 7:4436s-42s, 4411s-4412s)。事實上，HER2/neu表達足以傳輸抗***抗性(Benz, C.C.等(1993) “Estrogen-Dependent, Tamoxifen-Resistant Tumorigenic Growth Of MCF-7 Cells Transfected With HER2/neu,” Breast Cancer Res. Treat. 24:85-95)。HER2/neu以及HER-3似乎牽涉***癌患者中激素抗性的發作。約三分之一的***癌患者接收激素療法治療，目標是破壞睾丸和腎上腺雄激素的功能。就乳腺癌而言，抗性是不可避免的。最近的資料提示，源自HER2/neu和HER-3的信號誘導了“激素難治性”的狀態(Mellinghoff, I.K.等(2004) “HER2/neu Kinase-Dependent Modulation Of Androgen Receptor Function Through Effects On DNA Binding And Stability,” Cancer Cell 6:517-527)。
若干截短和剪接形式的HER2/neu是已知的。例如，通過使用內含子中的多腺苷酸化信號產生的可選的轉錄體產生了位於一些胃癌細胞的細胞核周圍的細胞質中的截短ECD (Yamamoto, T.等(1986) “Similarity Of Protein Encoded By The Human c-erb-B-2 Gene To Epidermal Growth Factor Receptor,” Nature 319:230-234；和Scott, G.K.等(1993) “A Truncated Intracellular HER2/neu Receptor Produced By Alternative RNA Processing Affects Growth Of Human Carcinoma Cells,” Mol. Cell. Biol. 13:2247-2257)。HER2/neu的ECD也可在培養中從乳腺癌細胞蛋白水解脫落，其在一些癌症患者的血清中被發現，因此可以作為轉移性乳腺癌和總體差的預後的血清標記物(Petch, L.A.等(1990) “A Truncated, Secreted Form Of The Epidermal Growth Factor Receptor Is Encoded By An Alternatively Spliced Transcript In Normal Rat Tissue,” Mol. Cell. Biol. 10:2973-2982；Leitzel, K.等(1992) “Elevated Soluble c-erbB-2 Antigen Levels In The Serum And Effusions Of A Proportion Of Breast Cancer Patients,” J. Clin. Oncol. 10:1436-1443；Scott, G.K.等(1993) “A Truncated Intracellular HER2/neu Receptor Produced By Alternative RNA Processing Affects Growth Of Human Carcinoma Cells,” Mol. Cell. Biol. 13:2247-2257；和Lee, H.等(1998) “Isolation And Characterization Of Four Alternate c-erbB3 Transcripts Expressed In Ovarian Carcinoma-Derived Cell Lines And Normal Human Tissues,” Oncogene 16:3243-3252)。在一些過表達HER2/neu的癌細胞中，熟知的金屬蛋白酶啟動劑，乙酸4-氨基苯汞(APMA)啟動金屬蛋白酶比如ADAM10和ADAM15，將HER2/neu受體切割成兩個部分：稱為p95的截短的膜相關受體，和稱為p105或ECD105的可溶性ECD(見，例如Molina, M.A.等(2001) “Trastuzumab (Herceptin), A Humanized anti-Her2 Receptor Monoclonal Antibody, Inhibits Basal And Activated Her2 Ectodomain Cleavage In Breast Cancer Cells,” Cancer Res. 61:4744-4749;美國專利公開號2004/0247602)。ECD的損失致使p95受體成為組成型活性酪氨酸激酶，其可遞送生長和生存信號至癌細胞(見，例如，美國專利號6,541,214)。
研究已經顯示在過表達HER2/neu的乳腺癌細胞中，用對HER2/neu特異性的抗體組合化療劑(例如，順鉑、阿黴素(doxoubicin)、紫杉醇)進行治療引起比單獨用化療進行治療更高的細胞毒性應答(Hancock, M.C.等(1991) “A Monoclonal Antibody Against The c-erbB-2 Protein Enhances The Cytotoxicity Of Cis-Diamminedichloroplatinum Against Human Breast And Ovarian Tumor Cell Lines,” Cancer Res. 51:4575-4580；Arteaga, C.L.等(1994) “p185c-erbB-2 Signal Enhances Cisplatin-Induced Cytotoxicity In Human Breast Carcinoma Cells: Association Between An Oncogenic Receptor Tyrosine Kinase And Drug-Induced DNA Repair,” Cancer 54:3758-3765；Pietras, R.J.等(1994) “Antibody to HER-2/neu receptor Blocks DNA Repair After Cisplatin In Human Breast And Ovarian Cancer Cells,” Oncogene 9:1829-1838)。HER2/neu抗體可能增強對化療劑應答的可能的機制是通過調節HER2/neu蛋白質表達或通過干擾DNA修復(Stancovski, I.等(1991) “Mechanistic Aspects Of The Opposing Effects Of Monoclonal Antibodies To The ERBB2 Receptor On Tumor Growth,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:8691-8695；Bacus, S.S.等(1992) “A Ligand For The erbB-2 Oncogene Product (gp30) Induces Differentiation Of Human Breast Cancer Cells,” Cell Growth & Diff. 3:401-411；Bacus, S.S.等(1993) “Neu Differentiation Factor (Heregulin) Induces Expression Of Intercellular Adhesion Molecule 1: Implications For Mammary Tumors,” Cancer Res. 53:5251-5261；Klapper, L.N.等(1997) “A Subclass Of Tumor-Inhibitory Monoclonal Antibodies To ErbB-2/HER2 Blocks Crosstalk With Growth Factor Receptors,” Oncogene 14:2099-2109；Klapper, L.N.等(2000) “Tumor-Inhibitory Antibodies To HER-2/ErbB-2 May Act By Recruiting c-Cbl And Enhancing Ubiquitination Of HER-2,” Cancer Res. 60:3384-3388；Arteaga, C.L.等(2001) “The Epidermal Growth Factor Receptor: From Mutant Oncogene In Nonhuman Cancers To Therapeutic Target In Human Neoplasia,” J Clinical Oncology 19(18s):32s-40s)。
已經開發了靶向HER-1或HER2/neu的許多單克隆抗體和小分子酪氨酸激酶抑制劑。例如，稱為鼠科抗體“4D5”的鼠科單克隆抗體識別位置非常靠近跨膜區的HER2/neu的富含半胱氨酸的II結構域中的細胞外表位元(氨基酸529至627)。用鼠科4D5和人源化4D5治療乳腺癌細胞部分阻斷了HER2/neu-HER-3複合物的NDF/調蛋白啟動，如通過受體磷酸化試驗測量的(Carter, P.等(1992) “Humanization Of An anti-p185HER2 Antibody For Human Cancer Therapy,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 89:4285-4289；Sliwkowski, M.X.等(1999) “Nonclinical Studies Addressing The Mechanism Of Action Of Trastuzumab (Herceptin),” Sem. in Oncol. 26:60-70；Ye, D.等(1999) “Augmentation Of A Humanized anti-HER2 mAb 4D5 Induced Growth Inhibition By A Human-Mouse Chimeric anti-EGF Receptor mAb C225,” Oncogene 18:731-738；Vogel, C.L.等(2001) “First-Line Herceptin Monotherapy In Metastatic Breast Cancer,” Oncology 61(suppl 2):37-42；Vogel, C.L等(2002) “Efficacy And Safety Of Trastuzumab As A Single Agent In First-Line Treatment Of HER2-Overexpressing Metastatic Breast Cancer,” J. Clin. Oncol. 20(3):719-726；Fujimoto-Ouchi, K.等(2002) “Antitumor Activity Of Combinations Of anti-HER-2 Antibody Trastuzumab And Oral Fluoropyrimidines Capecitabine/5'-Dfurd In Human Breast Cancer Models,” Cancer Chemother. Pharmacol. 49:211-216)。但是，向人施用鼠科4D5臨床上失敗了，因為患者迅速發展了人抗鼠抗體(HAMA)應答，從而開發了人源化形式的鼠科4D5。人源化4D5抗體的序列和晶體結構已經描述在下述文獻中：美國專利號6,054,297；Carter, P.等(1992) “Humanization Of An anti-p185HER2 Antibody For Human Cancer Therapy,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 89:4285-4289；和Eigenbrot, C.等(1993) “X-ray Structures Of The Antigen-Binding Domains From Three Variants Of Humanized anti-p185HER2 Antibody 4D5 And Comparison With Molecular Modeling,” J. Mol. Biol. 229:969-995。
開發了稱為“曲妥珠單抗(trastuzumab)”的人源化形式的鼠科4D5抗體(作為赫賽汀®( Herceptin®)由Genentech, Inc.出售)，並且已經批准用於治療涉及HER2/neu的過表達或基因擴增的癌症，包括乳腺癌((Cobleigh, M.A.等(1999) “Multinational Study Of The Efficacy And Safety Of Humanized anti-HER2 Monoclonal Antibody In Women Who Have HER2-Overexpressing Metastatic Breast Cancer That Has Progressed After Chemotherapy For Metastatic Disease,” J. Clin. Oncol. 17:2639-2648)。曲妥珠單抗在體外抑制APMA-介導的HER2/neu切割成ECD和p95部分，並且認為在體外通過不同的機制起作用，包括可能的抑制HER2/neu脫落(Pegram, M.D.等(1998) “Phase II Study Of Receptor-Enhanced Chemosensitivity Using Recombinant Humanized anti-p185HER2/neu Monoclonal Antibody Plus Cisplatin In Patients With HER2/neu-Overexpressing Metastatic Breast Cancer Refractory To Chemotherapy Treatment,” J. Clin. Oncology 16(8):2659-2671；Baselga, J.等(2001) “Mechanism Of Action Of Trastuzumab And Scientific Update,” Seminars in Oncology 28(5)(suppl. 16):4-11；Baselga, J.等(2001) “Mechanism Of Action Of anti-HER2 Monoclonal Antibodies,” Ann. Oncol. 12 (suppl. 1):S35-S41)。但是，曲妥珠單抗療法具有各種缺點，比如心臟毒性和在一些患者中人抗人源化抗體(HAHA)應答的發展。
本文提供了用於癌症療法的新的和改進形式的抗HER2/neu抗體，例如工程化的嵌合4D5抗體，其具有增加的親和力或特異性、降低的HAMA或HAHA應答的可能性、增強的效應子功能等，並且已經在PCT公開WO 2009/123894中描述。在臨床前研究中，已經顯示這類工程化的4D5抗體展示了針對HER2/neu陽性腫瘤，包括低HER2/neu表達子，的增強的ADCC活性，與效應細胞的FcγR變體無關(Nordstrom, J.L.等(2011) “Anti-tumor Activity And Toxicokinetics Analysis Of MGAH22, An anti-HER2 Monoclonal Antibody With Enhanced Fcγ Receptor Binding Properties,” Breast Cancer Research 13(6):R123)。另外，I期研究表明，在患有乳腺癌和胃食管癌的、在HER-2/neu療法之前失敗的患者中，和在患有表達HER2/neu的腫瘤的並且認為曲妥珠單抗對該腫瘤無效的患者中，這類抗體耐受良好並且具有有希望的活性(Burris, H.A.. (2013) “Phase I Study Of margetuximab (MGAH22), An FC-Modified Chimeric Monoclonal Antibody (MAb), in Patients (pts) With Advanced Solid Tumors Expressing The HER2 Oncoprotein,” J. Clin. Oncol. Suppl: abstr. 3004)。因此，這類改進的抗HER2/neu抗體為腫瘤表達低水準的HER2/neu的患者或其他HER2/neu療法無效的患者提供了新的治療選擇。
II.細胞介導的免疫應答 人和其他哺乳動物的免疫系統負責提供抗感染和疾病的保護。這類保護通過體液免疫應答和細胞介導的免疫應答提供。體液應答導致產生抗體和能夠識別和中和外源靶(抗原)的其他生物分子。相比之下，細胞介導的免疫應答涉及通過T細胞啟動巨噬細胞、天然殺傷細胞(NK)和抗原特異性細胞毒性T-淋巴細胞，和回應抗原的識別釋放各種細胞因數(Dong, C.等(2003) “Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules,” Immunolog. Res. 28(1): 39-48)。
T細胞最佳介導針對抗原的免疫應答的能力需要兩種不同的信號傳導相互作用(Viglietta, V.等(2007) “Modulating Co-Stimulation,” Neurotherapeutics 4: 666-675；Korman, A.J.等(2007) “Checkpoint Blockade in Cancer Immunotherapy,” Adv. Immunol. 90: 297-339)。首先，已經排列在抗原呈遞細胞(APC)的表面上的抗原必須被呈遞至抗原特異性幼稚(naïve) CD4+ T細胞。這類呈遞經T細胞受體(TCR)遞送信號，所述T細胞受體引導T細胞啟動對呈遞的抗原特異性的免疫應答。第二，通過APC和不同的T細胞表面分子之間的相互作用介導的一系列共刺激和抑制信號，首先引發T細胞的啟動和增殖，並最終引發它們的抑制。因此，第一信號為免疫應答提供特異性，而第二信號用於確定應答的性質、量級(magnitude)和持續時間。
免疫系統受共刺激和共抑制配體和受體的嚴格控制。這些分子為T細胞啟動提供第二信號，並且提供正信號和負信號的平衡網路，以使針對感染的免疫應答最大化，同時限制對自身的免疫性(Wang, L.等(2011) “VISTA, A Novel Mouse Ig Superfamily Ligand That Negatively Regulates T-Cell Responses,” J. Exp. Med. 10.1084/jem.20100619:1-16；Lepenies, B.等(2008) “The Role Of Negative Costimulators During Parasitic Infections,” Endocrine, Metabolic & Immune Disorders - Drug Targets 8:279-288)。對於保持自身耐受性和調節免疫應答的持續時間和幅度(amplitude)關鍵的抑制途徑統稱為免疫檢查點(immune checkpoint)。尤其重要的是抗原呈遞細胞的B7.1 (CD80)和B7.2 (CD86)配體和CD4+ T-淋巴細胞的CD28和CTLA-4受體之間的結合(Sharpe, A.H.等(2002) “The B7-CD28 Superfamily,” Nature Rev. Immunol. 2: 116-126；Dong, C.等(2003) “Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules,” Immunolog. Res. 28(1): 39-48；Lindley, P.S.等(2009) “The Clinical Utility Of Inhibiting CD28-Mediated Costimulation,” Immunol. Rev. 229: 307-321)。B7.1或B7.2與CD28的結合刺激T細胞啟動；B7.1或B7.2與CTLA-4的結合抑制這類啟動(Dong, C.等(2003) “Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules,” Immunolog. Res. 28(1): 39-48；Lindley, P.S.等(2009) “The Clinical Utility Of Inhibiting CD28-Mediated Costimulation,” Immunol. Rev. 229: 307-321；Greenwald, R.J.等(2005) “The B7 Family Revisited,” Ann. Rev. Immunol. 23: 515-548)。CD28在T細胞的表面上組成型表達(Gross, J.,等(1992) “Identification And Distribution Of The Costimulatory Receptor CD28 In The Mouse,” J. Immunol. 149: 380–388)，而CTLA-4表達在T細胞啟動之後快速上調(Linsley, P.等(1996) “Intracellular Trafficking Of CTLA4 And Focal Localization Towards Sites Of TCR Engagement,” Immunity 4: 535–543)。因為CTLA-4是較高親和力的受體(Sharpe, A.H.等(2002) “The B7-CD28 Superfamily,” Nature Rev. Immunol. 2: 116-126)，結合首先啟動T細胞增殖(經CD28)，然後抑制它(經CTLA-4的初期表達)，從而當不再需要增殖時，抑制該作用。
對CD28受體的配體的進一步研究已經導致鑒定和表徵了一組相關的B7分子(“B7超家族”) (Sharpe, A.H.等(2002) “The B7-CD28 Superfamily,” Nature Rev. Immunol. 2: 116-126；Greenwald, R.J.等(2005) “The B7 Family Revisited,” Ann. Rev. Immunol. 23: 515-548；Collins, M.等(2005) “The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands,” Genome Biol. 6: 223.1-223.7；Loke, P.等(2004) “Emerging Mechanisms Of Immune Regulation: The Extended B7 Family And Regulatory T-Cells.”Arthritis Res. Ther. 6:208-214；Korman, A.J.等(2007) “Checkpoint Blockade in Cancer Immunotherapy,” Adv. Immunol. 90: 297-339；Flies, D.B. 等(2007) “The New B7s: Playing a Pivotal Role in Tumor Immunity,” J. Immunother. 30(3): 251-260；Agarwal, A.等(2008) “The Role Of Positive Costimulatory Molecules In Transplantation And Tolerance,” Curr. Opin. Organ Transplant. 13:366-372；Wang, S.等(2004) “Co-Signaling Molecules Of The B7-CD28 Family In Positive And Negative Regulation Of T Lymphocyte Responses,” Microbes Infect. 6: 759-766)。目前存在若干已知的家族成員：B7.1 (CD80)、B7.2 (CD86)、可誘導的共刺激物配體(ICOS-L)、程式化死亡-1配體(PD-L1；B7-H1)、程式化死亡-2配體(PD-L2；B7-DC)、B7-H3、B7-H4和B7-H6 (Collins, M.等(2005) “The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands,” Genome Biol. 6: 223.1-223.7；Flajnik, M.F.等(2012) “Evolution Of The B7 Family: Co-Evolution Of B7H6 And Nkp30, Identification Of A New B7 Family Member, B7H7, And Of B7’s Historical Relationship With The MHC,” Immunogenetics 64(8): 571-90)。
III. PD-1 程式化死亡-1 (“PD-1”)是廣泛負調節免疫應答的擴展的T細胞調節子的CD28/CTLA-4家族的約31 kD I型膜蛋白成員(Ishida, Y.等(1992) “Induced Expression Of PD-1, A Novel Member Of The Immunoglobulin Gene Superfamily, Upon Programmed Cell Death,” EMBO J. 11:3887-3895；美國專利申請公開號2007/0202100、2008/0311117、2009/00110667；美國專利號6,808,710、7,101,550、7,488,802、7,635,757、7,722,868；PCT公開號WO 01/14557)。
PD-1在啟動的T細胞、B細胞和單核細胞上表達(Agata, Y.等(1996) “Expression Of The PD-1 Antigen On The Surface Of Stimulated Mouse T And B Lymphocytes,” Int. Immunol. 8(5):765-772；Yamazaki, T.等(2002) “Expression Of Programmed Death 1 Ligands By Murine T-Cells And APC,” J. Immunol. 169:5538-5545)，並且以低水準在天然殺傷細胞(NK) T細胞中表達(Nishimura, H.等(2000) “Facilitation Of Beta Selection And Modification Of Positive Selection In The Thymus Of PD-1-Deficient Mice,” J. Exp. Med. 191:891-898；Martin-Orozco, N.等(2007) “Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor Immunity,” Semin. Cancer Biol. 17(4):288-298)。
PD-1的細胞外區域由與CTLA-4中的等同結構域有23%同一性的單免疫球蛋白(Ig)V結構域組成(Martin-Orozco, N.等(2007) “Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor Immunity,” Semin. Cancer Biol. 17(4):288-298)。細胞外IgV結構域之後是跨膜區和細胞內尾部。細胞內尾部包含位於免疫受體酪氨酸基抑制基序和免疫受體酪氨酸基轉換基序中的兩個磷酸化位點，這表明PD-1負調節TCR信號(Ishida, Y.等(1992) “Induced Expression Of PD-1, A Novel Member Of The Immunoglobulin Gene Superfamily, Upon Programmed Cell Death,” EMBO J. 11:3887-3895；Blank, C.等(2006) “Contribution Of The PD-L1/PD-1 Pathway To T-Cell Exhaustion: An Update On Implications For Chronic Infections And Tumor Evasion Cancer,” Immunol. Immunother. 56(5):739-745)。
通過結合B7-H1和B7-DC，PD-1介導其對免疫系統的抑制(Flies, D.B.等(2007) “The New B7s: Playing a Pivotal Role in Tumor Immunity,” J. Immunother. 30(3):251-260；美國專利號6,803,192、7,794,710；美國專利申請公開號2005/0059051、2009/0055944、2009/0274666、2009/0313687；PCT申請號WO 01/39722、WO 02/086083)。
B7-H1和B7-DC廣泛地在人和鼠組織的表面上表達，比如心臟、胎盤、肌肉、胎肝、脾、淋巴結和胸腺以及鼠肝臟、肺、腎、胰腺的胰島細胞和小腸(Martin-Orozco, N.等(2007) “Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor Immunity,” Semin. Cancer Biol. 17(4):288-298)。在人中，已經在人內皮細胞(Chen, Y.等(2005) “Expression of B7-H1 in Inflammatory Renal Tubular Epithelial Cells,” Nephron. Exp. Nephrol. 102:e81-e92；de Haij, S.等(2005) “Renal Tubular Epithelial Cells Modulate T-Cell Responses Via ICOS-L And B7-H1” Kidney Int. 68:2091-2102；Mazanet, M.M.等(2002) “B7-H1 Is Expressed By Human Endothelial Cells And Suppresses T-Cell Cytokine Synthesis,” J. Immunol. 169:3581-3588)、心肌(Brown, J.A.等(2003) “Blockade Of Programmed Death-1 Ligands On Dendritic Cells Enhances T-Cell Activation And Cytokine Production,” J. Immunol. 170:1257-1266)、合胞滋養層(syncyciotrophoblast) (Petroff, M.G.等(2002) “B7 Family Molecules: Novel Immunomodulators At The Maternal-Fetal Interface,” Placenta 23:S95-S101)中發現B7-H1蛋白質表達。分子也由一些組織的駐留型巨噬細胞、已經通過干擾素(IFN)-γ或腫瘤壞死因數(TNF)-α啟動的巨噬細胞表達(Latchman, Y.等(2001) “PD-L2 Is A Second Ligand For PD-1 And Inhibits T-Cell Activation,” Nat. Immunol 2:261-268)，並且中腫瘤中被表達(Dong, H. (2003) “B7-H1 Pathway And Its Role In The Evasion Of Tumor Immunity,” J. Mol. Med. 81:281-287)。
已經發現B7-H1和PD-1之間的相互作用為T-細胞和B細胞提供了重要的負共刺激信號(Martin-Orozco, N.等(2007) “Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor Immunity,” Semin. Cancer Biol. 17(4):288-298)並作為細胞死亡誘導物發揮作用(Ishida, Y.等(1992) “Induced Expression Of PD-1, A Novel Member Of The Immunoglobulin Gene Superfamily, Upon Programmed Cell Death,” EMBO J. 11:3887-3895；Subudhi, S.K.等(2005) “The Balance Of Immune Responses: Costimulation Verse Coinhibition,” J. Molec. Med. 83:193-202)。更具體而言，已經發現低濃度的PD-1受體和B7-H1配體之間的相互作用導致抑制信號的傳遞，所述抑制信號強烈抑制抗原特異性CD8+ T細胞的增殖；在較高濃度下，與PD-1的相互作用不抑制T細胞增殖，但是明顯減少多種細胞因數的產生(Sharpe, A.H.等(2002) “The B7-CD28 Superfamily,” Nature Rev. Immunol. 2:116-126)。已經發現，通過靜息和先前啟動的CD4和CD8 T細胞，和甚至來自臍帶血的幼稚T細胞的T細胞增殖和細胞因數產生受可溶性B7-H1-Fc融合蛋白的抑制(Freeman, G.J.等(2000) “Engagement Of The PD-1 Immunoinhibitory Receptor By A Novel B7 Family Member Leads To Negative Regulation Of Lymphocyte Activation,” J. Exp. Med. 192:1-9；Latchman, Y.等(2001) “PD-L2 Is A Second Ligand For PD-1 And Inhibits T-Cell Activation,” Nature Immunol. 2:261-268；Carter, L.等(2002) “PD-1:PD-L Inhibitory Pathway Affects Both CD4(+) and CD8(+) T-cells And Is Overcome By IL-2,” Eur. J. Immunol. 32(3):634-643；Sharpe, A.H.等(2002) “The B7-CD28 Superfamily,” Nature Rev. Immunol. 2:116-126)。
B7-H1和PD-1抑制T細胞啟動和增殖的作用已經提示，這些生物分子可用作治療炎症和癌症的治療性靶標。因此，已經建議了使用抗PD-1抗體治療感染和腫瘤和上調適應性免疫應答(見，美國專利申請公開號2010/0040614、2010/0028330、2004/0241745、2008/0311117、2009/0217401；美國專利號7,521,051、7,563,869、7,595,048；PCT公開號WO 2004/056875、WO 2008/083174)。Agata, T.等(1996) “Expression Of The PD-1 Antigen On The Surface Of Stimulated Mouse T And B Lymphocytes,” Int. Immunol. 8(5):765-772；和Berger, R.等(2008) “Phase I Safety And Pharmacokinetic Study Of CT-011，A Humanized Antibody Interacting With PD-1, In Patients With Advanced Hematologic Malignancies,” Clin. Cancer Res. 14(10):3044-3051已經報導了能夠特異性結合PD-1的抗體(也見，美國專利號8,008,449和8,552,154；美國專利公開號2007/0166281、2012/0114648、2012/0114649、2013/0017199、2013/0230514和2014/0044738；和PCT專利公開號WO 2003/099196、WO 2004/004771、WO 2004/056875、WO 2004/072286、WO 2006/121168、WO 2007/005874、WO 2008/083174、WO 2009/014708、WO 2009/073533、WO 2012/135408、WO 2012/145549、和WO 2013/014668)。
IV.表達HER2/neu的癌症 HER2/neu的擴增或過表達發生在約25-30%的乳腺癌中(Mitri, Z.等(2012). "The HER2 Receptor in Breast Cancer: Pathophysiology, Clinical Use, and New Advances in Therapy," Chemother Res Pract 2012:742193；Burstein, H.J. (2005) "The Distinctive Nature of HER2-Positive Breast Cancers," N. Engl. J. Med. 353 (16): 1652–4)。也已知過表達發生在卵巢、胃和浸潤形式的子宮癌中(見例如，Yonemura, Y.等(1991) “Evaluation Of Immunoreactivity For erbB-2 Protein As A Marker Of Poor Short Term Prognosis In Gastric Cancer” Cancer Research 51:1034；Lanitis, E. (2012) “Primary Human Ovarian Epithelial Cancer Cells Broadly Express HER2 At Immunologically-Detectable Levels,” PloS One 7(11):e49829;和Tan, M.等(2007). "Molecular Mechanisms Of erbB2-Mediated Breast Cancer Chemoresistance," Adv. Exp. Med. Biol. 608: 119–29)。如上所述，HER2/neu的過表達與增加的疾病復發和差的預後密切相關。但是，HER2/neu也是抗HER2/neu藥物，包括靶向受體的細胞外結構域的單克隆抗體比如曲妥珠單抗和瑪格妥昔單抗(margetuximab)，和小分子腺苷三磷酸(ATP)競爭劑的重要的靶標，所述小分子腺苷三磷酸(ATP)競爭劑能夠阻斷HER2靶特異性劑諸如拉帕替尼(lapatinib)的細胞內結構域中酪氨酸激酶(TK)活性((Gandhi, M.D.等(2014) “Targeted Treatment Of Head And Neck Squamous-Cell Carcinoma: Potential Of Lapatinib,” Onco. Targets Ther. 7:245-251；Opdam, F.L.等(2012) “Lapatinib For Advanced Or Metastatic Breast Cancer,” Oncologist 17(4):536-542；Liao, J.等(2010) “Lapatinib: New Opportunities For Management Of Breast Cancer,” Breast Cancer (Dove Med Press) 2:79-91)。
儘管有效靶向過表達HER2/neu的癌症已經改善了無進展生存(PFS)和總體生存(OS)率，但是表達HER2/neu的轉移性乳腺癌仍是不可治癒的疾病。事實上，許多乳腺癌患者在用HER2/neu靶向劑，比如曲妥珠單抗和拉帕替尼治療之後復發，表明存在從頭開始的(de novo)或獲得的抗性(Tan, M.等(2007). “Molecular Mechanisms Of erbB2-Mediated Breast Cancer Chemoresistance,” Adv. Exp. Med. Biol. 608: 119–29；Singh等(2014) “HER2-Positive Advanced Breast Cancer: Optimizing Patient Outcomes And Opportunities For Drug Development,” British Journal of Cancer 111:1888–1898；Formisano, L.等(2014) “Epidermal Growth Factor-Receptor Activation Modulates Src-Dependent Resistance To Lapatinib In Breast Cancer Models,” Breast Cancer Research 16:R45)。此外，低HER2/neu表達也可能與差的預後相關(Gilcrease M.Z.等(2009) “Even Low-Level HER2 Expression May Be Associated With Worse Outcome In Node-Positive Breast Cancer,” Am J Surg Pathol. 2009 33(5):759-67)。但是，還沒有HER2/neu靶向治療療法被批准用於患表達低水準的HER2/neu的癌症的患者。這些發現突出了開發用於表達HER2/neu的癌症的改進療法的重要性。
因此，儘管之前的進步，但是仍需要改進的組合物和方法，用於治療表達HER2/neu的癌症，尤其是轉移乳腺癌和表達低水準的HER2/neu的癌症。本發明涉及這類組合物和將它們用於治療HER2/neu陽性乳腺癌和表達HER2/neu的其他癌症的方法。
本發明涉及藥物組合物，其包括特異性結合HER2/neu的第一分子和特異性結合細胞表面受體的、參與調節免疫檢查點(或其配體)的第二分子。本發明尤其涉及其中第二分子結合PD-1的實施方式。本發明也涉及這類藥物組合物治療癌症和其他疾病的用途。
具體地，本發明提供了治療癌症的方法，其包括向需要其的受試者施用特異性結合HER2/neu的抗體和特異性結合細胞表面受體或其配體的、調節免疫檢查點的分子。
本發明尤其涉及這類方法的實施方式，其中特異性結合HER2/neu的抗體是“變異的嵌合4D5抗體”，其包括具有SEQ ID NO: 4 的氨基酸序列的輕鏈可變結構域和具有選自SEQ ID NO: 9 、 SEQ ID NO: 11 和SEQID NO: 13 的氨基酸序列的重鏈。
本發明尤其涉及這類方法的實施方式，其中特異性結合細胞表面受體或其配體的、調節免疫檢查點的分子是抗PD-1抗體或其抗原結合片段。
本發明進一步涉及這類方法的實施方式，其中抗PD-1抗體或其抗原結合片段： (a)與下述抗體競爭PD-1結合：尼魯單抗、派姆單抗、皮地珠單抗、抗體EH12.2H7、抗體hPD-1 mAb 2、抗體hPD-1 mAb 7、抗體hPD-1 mAb 9、抗體hPD-1 mAb 15或選自表1的另外的抗PD-1抗體；或 (b)具有下述抗體的三個重鏈CDR和三個輕鏈CDR：尼魯單抗、派姆單抗、皮地珠單抗、抗體EH12.2H7、抗體hPD-1 mAb 2、抗體hPD-1 mAb 7、抗體hPD-1 mAb 9、抗體hPD-1 mAb 15或選自表1的另外的抗PD-1抗體；或 (c)具有下述抗體的重鏈可變結構域和輕鏈可變結構域：尼魯單抗、派姆單抗、皮地珠單抗、抗體EH12.2H7、抗體hPD-1 mAb 2、抗體hPD-1 mAb 7、抗體hPD-1 mAb 9、抗體hPD-1 mAb 15或選自表1的另外的抗PD-1抗體。
本發明進一步涉及這類方法的實施方式，其中抗PD-1抗體或其抗原結合片段包括Fc區。本發明進一步涉及這類方法的實施方式，其中Fc區包括減少變異的Fc區對FcγRIIIa (CD16A)的親和力和/或減少ADCC活性的一個或多個氨基酸修飾。本發明進一步涉及這類方法的實施方式，其中修飾包括下述取代：L234A；L235A；或L234A和L235A。
本發明進一步涉及這類方法的實施方式，其中抗PD-1抗體是尼魯單抗、派姆單抗、皮地珠單抗、抗體EH12.2H7、抗體hPD-1 mAb 2、抗體hPD-1 mAb 7、抗體hPD-1 mAb 9、抗體hPD-1 mAb 15或選自表1的另外的抗PD-1抗體。本發明進一步涉及這類方法的實施方式，其中抗PD-1抗體的抗原結合片段是下述抗體的抗原結合片段：尼魯單抗、派姆單抗、皮地珠單抗、抗體EH12.2H7、抗體hPD-1 mAb 2、抗體hPD-1 mAb 7、抗體hPD-1 mAb 9、抗體hPD-1 mAb 15或選自表1的另外的抗PD-1抗體。
本發明另外涉及這類方法的實施方式，其中特異性結合HER2/neu的抗體(尤其是變異的嵌合4D5抗體)以約6-18 mg/kg體重/三周的劑量施用，和特異性結合細胞表面受體或其配體的、調節免疫檢查點的分子(尤其是抗PD-1抗體)以約200 mg/三周的固定劑量施用。本發明也涉及這類方法的實施方式，其中特異性結合HER2/neu的抗體(尤其是變異的嵌合4D5抗體)以約6-18 mg/kg體重/三周的劑量施用，和特異性結合細胞表面受體或其配體的分子、調節免疫檢查點的(尤其是抗PD-1抗體)以約1-10 mg/kg體重/三周的劑量施用。本發明進一步涉及這類方法的實施方式，其中特異性結合HER2/neu的抗體(尤其變異的嵌合4D5抗體)以每三周約6 mg/kg體重、約10 mg/kg體重、約15 mg/kg體重，或約18 mg/kg體重的劑量施用。本發明進一步涉及這類方法的實施方式，其中特異性結合細胞表面受體或其配體的、調節免疫檢查點的分子(尤其抗PD-1抗體)以約1 mg/kg體重、約2 mg/kg體重、約3 mg/kg體重，或約10 mg/kg體重的劑量施用。
本發明另外涉及這類方法的實施方式，其中特異性結合HER2/neu的抗體(尤其變異的嵌合4D5抗體)和特異性結合細胞表面受體或其配體的、調節免疫檢查點的分子(尤其抗PD-1抗體)在單藥物組合物中被同時施用至受試者。
本發明另外涉及這類方法的實施方式，其中特異性結合HER2/neu的抗體(尤其變異的嵌合4D5抗體)和特異性結合細胞表面受體或其配體的、調節免疫檢查點的分子(尤其抗PD-1抗體)在分開的組合物中同時被施用，使得在24小時時間段內兩種組合物均被施用。
本發明另外涉及這類方法的實施方式，其中特異性結合HER2/neu的抗體(尤其變異的嵌合4D5抗體)和特異性結合細胞表面受體或其配體的、調節免疫檢查點的分子(尤其抗PD-1抗體)在分開的藥物組合物中順序施用至受試者，尤其地，其中第二施用的組合物在施用第一施用的組合物之後至少24小時或更長時間後施用。
本發明尤其涉及這類方法的實施方式，其中癌症是表達HER2/neu的癌症。本發明進一步涉及這類方法的實施方式，其中癌症是乳腺癌、胃癌，***癌、子宮癌、卵巢癌、結腸癌、子宮內膜癌、腎上腺癌、非小細胞肺癌、頭頸癌、喉癌、肝癌、腎癌、惡性膠質瘤或胰腺癌。
本發明另外涉及這類方法的實施方式，其進一步包括施用第三治療劑的步驟，尤其地，其中第三治療劑是抗血管生成劑、抗腫瘤劑、化療劑或細胞毒性劑。
本發明進一步涉及這類方法的實施方式，其中第三治療劑與特異性結合HER2/neu的抗體(尤其變異的嵌合4D5抗體)和/或特異性結合細胞表面受體或其配體的、調節免疫檢查點的分子(尤其抗PD-1抗體)同時施用或分開施用。
本發明進一步涉及這類方法的實施方式，其中特異性結合HER2/neu的抗體是瑪格妥昔單抗和特異性結合細胞表面受體或其配體的、調節免疫檢查點的分子是抗PD-1抗體派姆單抗。
本發明進一步涉及這類方法的實施方式，其中特異性結合HER2/neu的抗體是瑪格妥昔單抗和特異性結合細胞表面受體或其配體的、調節免疫檢查點的分子是抗PD-1抗體尼魯單抗。
本發明進一步涉及這類方法的實施方式，其中特異性結合HER2/neu的抗體是瑪格妥昔單抗和特異性結合細胞表面受體或其配體的、調節免疫檢查點的分子是抗PD-1抗體皮地珠單抗。
本發明進一步涉及這類方法的實施方式，其中特異性結合HER2/neu的抗體是瑪格妥昔單抗和特異性結合細胞表面受體或其配體的、調節免疫檢查點的分子是抗PD-1抗體EH12.2H7。
本發明進一步涉及這類方法的實施方式，其中特異性結合HER2/neu的抗體是瑪格妥昔單抗和特異性結合細胞表面受體或其配體的、調節免疫檢查點的分子是抗PD-1抗體hPD-1 mAb 2。
本發明進一步涉及這類方法的實施方式，其中特異性結合HER2/neu的抗體是瑪格妥昔單抗和特異性結合細胞表面受體或其配體的、調節免疫檢查點的分子是抗PD-1抗體hPD-1 mAb 7。
本發明進一步涉及這類方法的實施方式，其中特異性結合HER2/neu的抗體是瑪格妥昔單抗和特異性結合細胞表面受體或其配體的、調節免疫檢查點的分子是抗PD-1抗體hPD-1 mAb 9。
本發明進一步涉及這類方法的實施方式，其中特異性結合HER2/neu的抗體是瑪格妥昔單抗和特異性結合細胞表面受體或其配體的、調節免疫檢查點的分子是抗PD-1抗體hPD-1 mAb 15。
本發明進一步涉及這類方法的實施方式，其中特異性結合HER2/neu的抗體是瑪格妥昔單抗和特異性結合細胞表面受體或其配體的、調節免疫檢查點的分子是選自表1的抗PD-1抗體。
本發明另外的優勢和特徵將通過下面的詳細說明、附圖和實施例而變得明顯，所述詳細說明、附圖和實施例闡釋了本發明的優選實施方式。
本發明涉及藥物組合物，其包括特異性結合HER2/neu的第一分子和特異性結合細胞表面受體的、參與調節免疫檢查點(或其配體)的第二分子。本發明尤其涉及其中第二分子結合PD-1的實施方式。本發明也涉及這類藥物組合物治療癌症和其他疾病的用途。
尤其地，本發明提供了藥物組合物，其包括： (I)特異性結合HER2/neu的第一抗體，以便可以用作針對過表達HER2/neu的細胞的選擇性細胞毒性劑(例如，針對HER2/neu的變異的嵌合4D5抗體，其與已知的4D5抗體相比，具有減少的糖基化和改變的效應子功能)，和 (II)特異性結合PD-1的第二抗體，以便通過防止向T細胞遞送負信號用於對抗或阻斷PD-1/PD-L1接合(engagement)並且從而維持T-細胞應答。
本發明也提供了在疾病比如癌症的診斷、預後和治療中使用這類組合物的方法。
不限於任何具體的理論，聯合有效靶向抗HER2/neu抗體與抗PD-1抗體的本發明的方法和組合物能夠通過結合癌細胞上的HER2/neu而直接靶向腫瘤，從而減少/阻斷HER2/neu-HER-3複合物的NDF/調蛋白啟動和/或增強抗HER2/neu陽性腫瘤的ADCC活性，和直接增強內源抗腫瘤免疫應答，例如通過結合衰竭的(exhausted)和耐受腫瘤-浸潤淋巴細胞的表面上存在的細胞表面PD-1分子，並且從而削弱這類細胞表面分子結合它們的受體配體的能力並且從而促進免疫系統的啟動。這些性質允許這類治療和組合物用於治療癌症。
現將詳細參考本發明目前優選的實施方式，其與附圖和下述實施例一起用於闡釋本發明的原理。足夠詳細地描述這些實施方式，以確保本領域技術人員能夠實施本發明，並且應當理解，可使用其他實施方式，並且在不背離本發明的精神和範圍的情況下可進行結構、生物和化學變化。除非另外定義，否則本文使用的所有的技術和科學術語具有如本發明所屬領域的普通技術人員通常理解的相同含義。
除非另外指出，否則本發明的實施將採用屬於本領域技能的常規分子生物學技術(包括重組技術)、微生物學技術、細胞生物學技術、生物化學和免疫學技術。這類技術充分闡釋在文獻中，比如：MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Fourth Edition (Sambrook等編輯, 2012) Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY；CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Ausubel, F.M.等編輯, 1987) Greene Pub. Associates, New York, NY；OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS: METHODS AND APPLICATIONS (Methods in Molecular Biology), IMMUNOBIOLOGY 7 (Janeway, C.A.等2007) Garland Science, London, UK；MONOCLONAL ANTIBODIES: A PRACTICAL APPROACH (Shepherd, P.等編輯, 2000) Oxford University Press, USA, New York NY；USING ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL (Harlow, E.等編輯, 1998) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY；和DEVITA, HELLMAN, AND ROSENBERG'S CANCER: PRINCIPLES & PRACTICE OF ONCOLOGY, EIGHTH EDITION, DeVita, V.等編輯 2008, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA。美國臨時專利申請號60/781,564、60/945,523、61/015,106、和61/019,051、和in US 20040185045、US 20040197347、US 20040197866、US 20050037000、US 20050064514、US 20050215767、US 20060134709、US 20060177439、US 20070004909、US 20070036799、US 20070037216、US 20070077246、US 20070244303、US 20080044429、US 20080050371、11/869,410、11/952,568、美國專利號7,112,439、WO 04/063351、WO 06/088494、WO 07/024249、WO 06/113665、WO 07/021841、WO 07/106707和WO/2008/140603中討論了抗體工程化。
V.定義
本發明涉及藥物組合物治療疾病比如癌症的用途，所述藥物組合物包括特異性結合HER2/neu的第一分子和特異性結合細胞表面受體的、參與調節免疫檢查點(或其配體)的第二分子。本發明尤其涉及其中第二分子結合PD-1的實施方式。
如本文所使用，術語“ADCC”指抗體-依賴性細胞毒性，其是體外細胞介導的反應，其中表達Fc　Rs的非特異性細胞毒性細胞(例如，單核細胞，比如天然殺傷(NK)細胞和巨噬細胞)識別靶細胞上結合的抗體並且隨後引起靶細胞的裂解。
如本文所使用，術語“抗體”指免疫球蛋白分子，由於在多肽或蛋白質或非蛋白質分子上存在特定的結構域或部分或構象(“表位”)，其能夠特異性結合這類分子。包含表位的分子可具有免疫原活性，使得其在動物中引起抗體產生應答；這類分子稱為“抗原”。包含表位的分子不一定是免疫原性的。
如本文所使用，術語“抗體”包括單克隆抗體、多特異性抗體、人抗體、人源化抗體、合成抗體、嵌合抗體、多克隆抗體、駱駝源化(camelized)抗體、單鏈Fvs (scFv)、單鏈抗體、特異性結合抗原等的免疫活性抗體片段(例如，能夠結合表位的抗體片段，例如，Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fv片段、包含VL和/或VH結構域或包含這樣的VL結構域的1、2或3個互補決定區(CDR) (即，CDRL1、CDRL2和/或CDRL3)或VH結構域的1、2或3個互補決定區(CDR) (即，CDRH1、CDRH2和/或CDRH3))的片段)、雙功能或多功能抗體、二硫鍵連接的雙特異性Fvs (sdFv)、胞內抗體和雙抗體和任何上述的表位結合片段。尤其地，術語“抗體”旨在包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，即，包含抗原-結合位點的分子。免疫球蛋白分子可以是任何類型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)，類別(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亞類別(見，例如，美國專利公開號: 20040185045、20050037000、20050064514、20050215767、20070004909、20070036799、20070077246和20070244303)。最近數十年已經看到對抗體的治療潛能的興趣的復興，並且抗體已經成為一種主要類型的生物技術衍生的藥物(Chan, C.E.等(2009) “The Use Of Antibodies In The Treatment Of Infectious Diseases,” Singapore Med. J. 50(7): 663-666)。超過200種基於抗體的藥物已經被批准使用或正在開發。
術語“嵌合抗體”指這樣的抗體：其中重鏈和/或輕鏈的一部分與來自一個物種(例如，小鼠)的抗體或抗體類別或亞類別一致或同源，而剩餘部分與另一物種(例如，人)的抗體或抗體類別或亞類別一致或同源，只要它們展示期望的生物活性。本文感興趣的嵌合抗體包括“靈長類源化(primatized)”抗體，其包括源自非人靈長類(例如，舊大陸猴(Old World Monkey)、猿等)的可變結構域抗原結合序列和人恒定區序列。
如本文使用的術語“單克隆抗體”指基本上同質型(homogeneous)抗體群的抗體，即，構成該群體的單個抗體是相同的，除了具有可能以較少量出現的天然產生的突變的可能抗體之外，並且如本文使用的術語“多克隆抗體”指獲得自異質型(heterogeneous)抗體群的抗體。術語“單克隆”指示抗體的特徵是基本上同質型的抗體群，並且不應該被解釋為需要通過特定方法產生抗體(例如，通過雜交瘤、噬菌體選擇、重組表達、轉基因動物等)。術語包括完整的免疫球蛋白以及上面根據“抗體”的定義描述的片段等。製備單克隆抗體的方法是本領域已知的。一種可採用的方法是Kohler, G.等(1975) “Continuous Cultures Of Fused Cells Secreting Antibody Of Predefined Specificity,” Nature 256: 495-497的方法或其改良。典型地，在小鼠、大鼠或兔子中開發單克隆抗體。通過用免疫原性量的包含期望表位的細胞、細胞提取物或蛋白質製品免疫動物產生抗體。免疫原可以是但不限於原代細胞、培養的細胞系、癌細胞、蛋白質、肽、核酸或組織。在用作免疫原之前，用於免疫的細胞可被培養一段時間(例如，至少24小時)。細胞它們本身或與非變性佐劑，比如Ribi組合，可用作免疫原(見，例如，Jennings, V.M. (1995) “Review of Selected Adjuvants Used in Antibody Production,” ILAR J. 37(3): 119-125)。一般而言，當用作免疫原時，細胞應保持完整和優選地能存活。相比於破裂的細胞，完整的細胞可允許抗原被免疫動物更好地檢測。使用變性或烈性(harsh)佐劑例如弗氏佐劑可破壞細胞，因此，其應用受阻。免疫原可以週期性間隔被多次施用，諸如兩週一次或一週一次，或者可以維持在動物中的生存力這樣的方式被施用(例如，在組織重組體中)。可選地，可通過本領域已知的任何方式對現有單克隆抗體和對期望的病原性表位特異性的任何其他等價抗體測序並且重組產生它們。在一個實施方式中，對這類抗體測序，然後將多核苷酸序列克隆至載體中用於表達或增殖。編碼感興趣的抗體的序列可以在宿主細胞中被維持在載體中，並且，宿主細胞然後可被擴張和冷凍，用於將來應用。這類抗體的多核苷酸序列可用於遺傳操作，以產生單特異性或多特異性(例如，雙特異性、三特異性和四特異性)的本發明的分子以及親和力優化的、嵌合抗體、人源化抗體和/或犬源化的抗體，以改善抗體的親和力或其他特徵。
術語“人源化抗體”指一般使用重組體技術產生的嵌合分子，其具有來自非人物種的免疫球蛋白的抗原結合位點和基於人免疫球蛋白的結構和/或序列的分子的剩餘免疫球蛋白結構。抗原結合位元點可包括融合在恒定結構域上的完整可變結構域或僅僅包括移植在可變結構域中適當的框架區上的CDRs。抗原結合位點可以是野生型的或通過一個或多個氨基酸取代被修飾。這消除了人個體中作為免疫原的恒定結構域，但是仍保留對外源可變區的免疫應答的可能性(LoBuglio, A.F.等(1989) “Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86: 4220-4224)。另一方法不僅僅關注提供源自人的恒定區，而且也修飾可變區，以便重塑它們使其盡可能地與人形式接近。已知重鏈和輕鏈的可變區都包含三個CDR，側翼是四個框架區(FR)，所述CDR對所討論的抗原回應不同並且決定結合能力，所述框架區(FR)在給定物種中相對保守並且推定其為CDR提供支架。當針對特定抗原製備非人抗體時，可通過將源自非人抗體的CDR移植在待修飾的人抗體中存在的FR上“重塑”或“人源化”可變區。已經報導了該方法應用於各種抗體：Sato, K. (1993)等“Reshaping A Human Antibody To Inhibit The Interleukin 6-Dependent Tumor Cell Growth,” Cancer Res 53: 851-856。Riechmann, L.等(1988) “Reshaping Human Antibodies for Therapy,” Nature 332:323-327；Verhoeyen, M.等(1988) “Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity,” Science 239:1534-1536；Kettleborough, C. A.等(1991) “Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody By CDR-Grafting: The Importance Of Framework Residues On Loop Conformation,” Protein Engineering 4:773-3783; Maeda, H.等(1991) “Construction Of Reshaped Human Antibodies With HIV-Neutralizing Activity,” Human Antibodies Hybridoma 2:124-134；Gorman, S. D.等(1991) “Reshaping A Therapeutic CD4 Antibody,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:4181-4185；Tempest, P.R.等(1991) “Reshaping A Human Monoclonal Antibody To Inhibit Human Respiratory Syncytial Virus Infection in vivo,” Bio/Technology 9:266-271；Co, M. S.等(1991) “Humanized Antibodies For Antiviral Therapy,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:2869-2873；Carter, P.等(1992) “Humanization Of An Anti-p185her2 Antibody For Human Cancer Therapy,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 89:4285-4289；和Co, M.S.等(1992) “Chimeric And Humanized Antibodies With Specificity For The CD33 Antigen,” J. Immunol. 148:1149-1154。在一些實施方式中，人源化抗體保存所有的CDR序列(例如，人源化的小鼠抗體，其包含來自小鼠抗體的所有六個CDR)。在其他實施方式中，人源化抗體具有其氨基酸序列相對於初始抗體被改變的一個或多個CDR (一個、兩個、三個、四個、五個或六個)，其也稱為“源自”初始抗體的一個或多個CDR的一個或多個CDR(即，源自這類CDR，源自這類CDR氨基酸序列的認知等)。編碼抗體的可變結構域的多核苷酸序列可用於產生這類衍生物，並且改善這類抗體的親和力或其他特徵。使抗體人源化的一般原則涉及保留抗體的抗原結合位點的基本序列，同時用人抗體序列替換抗體非人剩餘部分。使單克隆抗體人源化有四個大體的步驟。這些是：(1)確定起始抗體輕鏈和重鏈可變結構域的核苷酸和預測的氨基酸序列(2)設計人源化抗體或犬源化的抗體，即，在人源化或犬源化過程期間，決定使用哪個抗體框架區(3)實際人源化或犬源化方法/技術和(4)人源化抗體的轉染和表達。見，例如，美國專利號4,816,567、5,807,715、5,866,692和6,331,415。
天然抗體(比如IgG抗體)包括與兩條重鏈複合的兩條輕鏈。每條輕鏈包含可變結構域(VL)和恒定結構域(CL)。每條重鏈包含可變結構域(VH)，三個恒定結構域(CH1、CH2和CH3)，和位於CH1和CH2結構域之間的“鉸鏈”結構域(“H”)。天然產生的免疫球蛋白(例如，IgG)的基本結構單元因此是具有兩條輕鏈和兩條重鏈的四聚體，通常作為約150,000 Da的糖蛋白被表達。每條鏈的氨基端(“N-末端”)部分包括主要負責抗原識別的約100至110或更多氨基酸的可變結構域。每條鏈的羧基端(“C-末端”)部分限定了恒定區，其中輕鏈具有單個恒定結構域而重鏈通常具有三個恒定結構域和鉸鏈結構域。因此，IgG分子的輕鏈的結構是n-VL-CL-c並且IgG重鏈的結構是n-VH-CH1-H-CH2-CH3-c (其中n和c分別表示多肽的N-末端和C-末端)。抗體結合抗原的表位的能力取決於抗體的VL和VH結構域的存在和氨基酸序列。抗體輕鏈和抗體重鏈的相互作用，尤其地，其VL和VH結構域的相互作用形成天然抗體的兩個抗原結合位點之一。天然抗體能夠結合僅僅一個表位種類(即，它們是單特異性的)，儘管它們可結合該種類的多個拷貝(即，展示二價或多價)。IgG分子的可變結構域由互補決定區(CDR)和稱為框架區段(FR)的非CDR區段組成，所述互補決定區(CDR)包含與表位接觸的殘基，所述框架區段一般維持結構和決定CDR環的定位，以便允許這類接觸(儘管某些框架殘基也可接觸抗原)。因此，VL和VH結構域具有結構n-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-c。是(或可用作)抗體輕鏈的第一、第二和第三CDR的多肽在本文分別命名為CDRL1結構域、CDRL2結構域和CDRL3結構域。類似地，是(或可用作)抗體重鏈的第一、第二和第三CDR的多肽在本文分別命名為CDRH1結構域、CDRH2結構域和CDRH3結構域。因此，術語CDRL1結構域、CDRL2結構域、CDRL3結構域、CDRH1結構域、CDRH2結構域和CDRH3結構域指當併入到蛋白質中時使得該蛋白質能夠結合特異性表位的多肽，無論這樣的蛋白質是否是具有輕鏈和重鏈的抗體或雙抗體或單鏈結合分子(例如，scFv、BiTe等)或是另一類型的蛋白質。因此，如本文所使用，術語“抗原結合結構域”指負責這樣的分子特異性結合抗原表位的能力的抗原結合分子的部分。抗原結合片段可包含這樣的抗體的1、2、3、4、5或所有6個CDR結構域，並且，儘管能夠免異性結合這樣的表位，但可展示對與這樣的抗體的表位不同的這樣的表位的特異性、親和力或選擇性。然而，優選地，抗原結合片段包含這樣的抗體的所有6個CDR結構域。抗體的抗原結合片段可以是單多肽鏈(例如，scFv)或可包括兩條或更多條多肽鏈，每條具有氨基末端和羧基末端(例如，雙抗體、Fab片段、F(ab')2片段等)。
如本文所使用，術語“雙抗體”指兩條或更多條多肽鏈或蛋白質的複合物，每條多肽鏈或蛋白質包括至少一個VL和一個VH結構域或其片段，其中兩個結構域包括在單多肽鏈中，但是通過很短的間插連接體分開，以使它們締合形成表位結合位點；因此，需要至少兩條多肽鏈或蛋白質，以便形成雙抗體。在某些實施方式中，“雙抗體分子”包括包含抗體的“Fc”或“鉸鏈-Fc區”的分子。複合物中的多肽鏈可以相同或不同，例如，雙抗體分子可以是同源多聚體或異源多聚體。在具體的方面中，“雙抗體分子”包括二聚體或四聚體或包含VL和VH結構域的所述多肽鏈(例如，同源二聚體雙抗體分子、異源二聚體雙抗體分子等)。包括多聚體蛋白質的單多肽鏈可通過鏈間二硫鍵共價連接至多聚體的至少一個其他肽。
如本文所使用，術語“癌症”指特徵在於存在由細胞的異常的不受控制的生長(這類細胞是“癌細胞”)引起的贅生物或腫瘤的疾病。如本文所使用，術語癌症明確地包括，白血病和淋巴瘤。在一些實施方式中，術語癌症指特徵在於存在仍是局部性的良性腫瘤的疾病。但是，在優選的實施方式中，術語癌症指特徵在於存在已經侵入相鄰身體結構的惡性腫瘤的疾病。這類腫瘤可另外具有擴散至遠端部位的能力。在一些實施方式中，癌症與表達特異性癌症抗原的癌細胞相關。在一些方面中，如本文使用的術語癌症具體指表達HER2/neu的癌症。因此，如本文所使用，術語“表達HER2/neu的癌症”指特徵在於存在表達可檢測水準的HER2/neu的癌細胞的癌症。這類表達HER2/neu的癌症的癌細胞可表達高水準的HER2/neu或低水準的HER2/neu。如本文使用的“高水準的HER2/neu”指特徵在於存在當使用HercepTest® (Dako Cytomation California Inc., Carpenteria, CA)分類時展示2+或更大分數的癌細胞的癌症，或具有通過例如螢光原位雜交(FISH) 已經鑒定為過表達Her2/neu的癌細胞的受試者或患者。如本文所使用，“低水準的HER2”指特徵在於在HercepTest® (Dako Cytomation California Inc., Carpenteria, CA)分類中展示小於2+ (例如，1+)分數的癌細胞的癌症。可用各種診斷/預後測定來確定通過腫瘤的癌細胞表達的HER2的水準。在一個方面中，可通過免疫組織化學(IHC)，例如，通過使用HercepTest® (Dako) 分析HER2過表達。因此，來自腫瘤活組織檢查的石蠟包埋的組織切片可進行IHC試驗並且被給與HER2蛋白質染色強度標準。可選地，或另外，FISH試驗比如INFORM™ (由Ventana, Ariz.出售)或PATHVISION™ (Vysis, Ill.)可在福馬林固定的、石蠟包埋的腫瘤組織上進行，以確定腫瘤中HER2過表達的程度(如果存在的話)。
如本文所使用，術語“病症(disorder)”和“疾病(disease)”可互換使用，指受試者中的病況。尤其地，術語“自身免疫性疾病”與術語“自身免疫病症”可互換使用，指受試者中特徵在於由受試者對自身的細胞、組織和/或器官的免疫反應造成的細胞、組織和/或器官損傷的病況。術語“炎性疾病”與術語“炎症病症”可互換使用，指受試者中特徵在於炎症，優選慢性炎症的病況。自身免疫病症可伴隨炎症或不伴隨驗證。而且，炎症可由或不由自身免疫病症造成。因此，某些病症的特徵可在於自身免疫病症和炎症病症二者，而其他病症特徵可在於僅僅自身免疫病症或僅僅炎症病症。癌症是“增生性病症”的例子(即，與一定程度的不正常的細胞增殖相關的病症)。
如本文所使用，“有效量”的藥物組合物是足夠實現有益的期望的結果的量，所述結果包括但不限於臨床結果，比如縮小腫瘤(在癌症背景，例如，乳腺、胃或***癌的腫瘤)尺寸、阻礙癌細胞生長、延遲轉移發展、減少源自疾病的症狀、提高遭受疾病的患者的生命品質、降低治療疾病需要的其他藥物治療的劑量、比如經靶向和/或內化增強另一藥物的作用、延遲疾病的進展、和/或延長個體的生存。可在一次或多次施用中施加有效量。為了本發明的目的，有效量的藥物、化合物或藥物組合物是足以直接或間接減少(或破壞)癌細胞的增殖或減少和/或延遲癌細胞的發展或生長或轉移的量。在一些實施方式中，藥物、化合物或藥物組合物的有效量可聯合或不聯合另一藥物、化合物或藥物組合物實現。因此，“有效量”可在施用一種或多種化療劑的背景下考慮，並且如聯合一種或多種其他劑，可實現或實現期望的結果，則單劑可視為以有效量施用。儘管個體的需要不同，但是測定每種組分的有效量的最佳範圍是本領域技術人員已知的。下面討論典型劑量。
術語“效應子活性”指歸於抗體Fc區與Fc受體或配體的相互作用的生物活性。抗體可具有一個或多個效應子功能。抗體效應子功能的非限制性例子包括ADCC、C1q結合、補體依賴性細胞毒性(CDC)、細胞表面受體(例如，B細胞受體；BCR)的下調、調理、調理吞噬、細胞結合和玫瑰花結(rosetting)。效應子功能包括抗原的結合之後起作用的那些和不依賴於抗原結合起作用的那些。
如本文使用的，術語“效應細胞”指表達一種或多種Fc受體並介導一種或多種效應子功能的免疫系統的細胞。效應細胞包括但不限於單核細胞、巨噬細胞、嗜中性粒細胞、樹突細胞、嗜伊紅粒細胞、肥大細胞、血小板、B細胞、大顆粒淋巴細胞、朗格漢斯細胞、天然殺傷細胞(NK)，並且可來自任何生物體，包括但不限於人、小鼠、大鼠、兔子和猴子。
術語“Fc受體”或“FcR”在本文用於描述結合抗體的Fc區的受體。示例性FcR是天然序列人FcR。FcR可以是結合IgG抗體的FcR(γ受體，“FcγR”)，並且包括Fc　RI (CD64)、Fc　RII (CD32)、Fc　RIII (CD16)和Fc　RIV 亞類的受體，包括這些受體的等位基因變體和可選剪接形式，例如，存在至少兩種已知的Fc　RII受體，Fc　RIIA和Fc　RIIB。術語FcR也包括新生兒受體，FcRn，其負責將母體的IgG轉移給胎兒。
術語“糖基化位點”指被哺乳動物細胞識別為用於附接寡糖(即，包含兩個或更多個連接在一起的單糖的碳水化合物)的位置的氨基酸殘基。附接碳水化合物，比如寡糖的氨基酸殘基通常是天冬醯胺(N-連接)、絲氨酸(O-連接)和蘇氨酸(O-連接)殘基。N-連接的糖基化指寡糖部分附接至天冬醯胺殘基的側鏈。O-連接的糖基化指寡糖部分附接至羥基氨基酸，例如，絲氨酸或蘇氨酸。本發明的分子可包括一個或多個糖基化位點，包括N-連接的和O-連接的糖基化位點。本領域已知的用於N-連接的或O-連接的糖基化的任何糖基化位元點可根據本發明使用。附接的特定位元點通常具有特徵性的氨基酸序列，稱為“糖基化位點序列”。用於N-連接的糖基化的糖基化位點序列是：N-X-S或N-X-T，其中N指示天冬醯胺，X可以是脯氨酸之外的常規氨基酸的任何氨基酸，S指示絲氨酸和T指示蘇氨酸。天然人IgG的Fc區具有兩個N-連接的糖基化位點，在每個CH2結構域中各有一個，在297位的天冬醯胺 (Asn 297)處。糖基化位點可使用本發明所屬領域熟知的方法引入到本發明的分子中(見例如，IN VITRO MUTAGENESIS, RECOMBINANT DNA: A SHORT COURSE, J. D. Watson,等W.H. Freeman and Company, New York, 1983,第8章, pp. 106-116，其通過引用以其整體併入本文。將糖基化位點引入本發明分子中的示例性方法可包括：修飾或突變分子的氨基酸序列，從而獲得期望的N-X-S或N-X-T序列。同樣地，例如，可通過修飾或突變現有糖基化位點的氨基酸序列，去除糖基化位點，以改變現有的N-X-S或N-X-T序列。
如本文所使用，術語“人抗小鼠抗體(“HAMA”)反應”指當人免疫系統將鼠科抗體視為外源分子並且產生針對其的炎症反應時而發生的有害的免疫原性反應。HAMA反應可造成中毒性休克或死亡。嵌合和人源化抗體通過減少施用抗體的非人部分而降低了HAMA反應的可能性，但是仍存在對這類抗體的人抗人抗體反應(“HAHA反應”)免疫反應的可能性。
如本文所使用，術語“異源”核酸表示引入到宿主細胞中的DNA、RNA等。核酸可源自任何各種來源，包括基因組DNA、mRNA、cDNA、合成DNA和這些的融合物或組合。核酸可包括來自與宿主或接受者細胞相同的細胞或細胞類型的多核苷酸或來自不同細胞類型的多核苷酸，例如，來自哺乳動物或植物，並且可任選地包括標記基因或選擇基因，例如，抗生素抗性基因、溫度抗性基因等。
如本文所使用，術語“免疫調節劑”和其變型指調節宿主的免疫系統的試劑。在某些實施方式中，免疫調節劑是免疫抑制劑。在某些其他實施方式中，免疫調節劑是免疫刺激劑。免疫調節劑包括但不限於小分子、肽、多肽、融合蛋白、抗體、無機分子、模擬劑和有機分子。
如本文所使用，如果分子(例如抗體)相對于分子的可選區域或可選分子與該分子的區域(即，表位元)更經常、更快速、以更長的持久性和/或以更大的親和力反應或締合，則認為分子“特異性”結合該分子的區域。例如，特異性結合HER2/neu表位的抗體是與其結合其他HER2/neu表位或結合非HER2/neu表位相比，以更大的親和力、親合力、更容易和/或以更長的持久性結合這類HER2/neu表位的抗體。同樣地，特異性結合PD-1的表位的抗體與其結合其他PD-1表位或結合非PD-1表位相比，以更大的親和力、親合力、更容易和/或以更長的持久性結合這類表位。通過閱讀該定義，應理解，例如，特異性結合第一靶的抗體(或部分或表位元)可特異性或非特異性或優選或非優選結合第二靶。因此，“特異性結合”不必要求(儘管其可包括)排他性結合。一般而言，觸發上下文相反指出，否則提及“結合”意思是“特異性結合”。抗體特異性結合抗原表位的能力可通過例如，免疫試驗測定。
如本文所使用，術語“核酸分子”包括DNA分子(例如，cDNA或基因組DNA)、RNA分子(例如，mRNA)、DNA和RNA分子的組合或雜交的DNA/RNA分子，以及DNA或RNA分子的類似物。可使用例如，核苷酸類似物產生這類類似物，所述核苷酸類似物包括但不限於肌苷或三苯甲基化堿基。這類類似物也可包括DNA或RNA分子，其包括修飾的骨架，所述修飾的骨架賦予分子有益的性質，比如，例如，核酸酶抗性或增加的跨細胞膜的能力。核酸或核苷酸序列可以是單鏈的、雙鏈的，可包含單鏈和雙鏈部分二者，並且可包含三鏈部分，但是優選地是雙鏈DNA。
如本文所使用，術語“基本的序列同一性”指當為了最大對應性進行比較和比對時，具有至少約80%氨基酸殘基同一性，優選地至少約90%或至少約95%同一性的兩條或更多條序列或亞序列(例如，結構域)。可通過比如下述演算法測量兩條類似序列(例如，抗體可變結構域)之間的序列同一性：Smith, T.F. & Waterman, M.S. (1981) “Comparison Of Biosequences,” Adv. Appl. Math. 2:482 [local homology algorithm（局部同源性演算法）]；Needleman, S.B. & Wunsch, C.D. (1970) “A General Method Applicable To The Search For Similarities In The Amino Acid Sequence Of Two Proteins,” J. Mol. Biol. 48:443 [homology alignment algorithm（同源性比對演算法）], Pearson, W.R. & Lipman, D.J. (1988) “Improved Tools For Biological Sequence Comparison,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85:2444 [search for similarity method（相似性方法的搜索）]；或Altschul, S.F.等, (1990) “Basic Local Alignment Search Tool,” J. Mol. Biol. 215:403-10 [BLAST algorithm（BLAST演算法）]。當使用任何上述演算法時，使用預設參數(對於視窗長度(Window length)、空隙罰分等)。當序列同一性的程度是至少約70%一致，優選地至少約80%一致或至少約90%一致，或甚至至少約95%一致時，則認為第一氨基酸序列與第二氨基酸序列“基本上類似”。當(1)序列同一性的程度是至少約70%一致，優選地至少約80%一致或至少約90%一致，或甚至至少約95%一致，或(2)包括核酸序列的核酸分子編碼多肽，所述多肽與由包括第二序列的核酸分子編碼的多肽是至少約70%一致，優選地至少約80%一致或至少約90%一致，或甚至至少約95%一致時，則認為核酸序列與第二序列“基本上類似”。基本上一致的序列也基本上類似。
當提及抗體時，為每個結構域的氨基酸的分配是根據Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. (National Institutes of Health, Bethesda, MD., (1991) (“Kabat等”)，其明確通過引用併入本文。遍及本說明書，IgG重鏈中“根據Kabat”的恒定殘基的編號指如Kabat等中描述的人IgG1 EU抗體的編號。
術語“鼠科4D5抗體”指美國專利號5,677,171中以ATCC CRL 10463公開的鼠科IgG1抗體。鼠科4D5抗體結合Her2/neu並且具有輕鏈可變結構域和重鏈可變結構域，所述輕鏈可變結構域具有SEQ ID NO: 3的氨基酸序列，並且所述重鏈可變結構域具有SEQ ID NO: 47的氨基酸序列。術語“人源化4D5抗體”指Carter, P.等(1992) (“Humanization Of An Anti-P185her2 Antibody For Human Cancer Therapy,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 89:4285-4289)中公開的IgG抗體。據報導，人源化4D5抗體能夠結合Her2/neu；其輕鏈可變區具有SEQ ID NO: 5的氨基酸序列，並且重鏈可變區具有SEQ ID NO: 48的氨基酸序列。
鼠科4D5抗體的輕鏈可變結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO: 3) (CDRL殘基以底線顯示)：
DIVMTQSHKF MSTSVGDRVS ITCKASQDVN TAVAWYQQKP GHSPKLLIYS ASFRYTGVPD RFTGNRSGTD FTFTISSVQA EDLAVYYCQQ HYTTPPTFGG GTKLEIK
鼠科4D5抗體的重鏈可變結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO: 47) (CDRH殘基以底線顯示)：
QVQLQQSGPE LVKPGASLKL SCTASGFNIK DTYIHWVKQR PEQGLEWIGR IYPTNGYTRY DPKFQDKATI TADTSSNTAY LQVSRLTSED TAVYYCSRWG GDGFYAMDYW GQGASVTVSS
人源化4D5抗體的氨基酸輕鏈可變結構域的序列是(SEQ ID NO: 5) (CDRL殘基以底線顯示)：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDVN TAVAWYQQKP GKAPKLLIYS ASFLESGVPS RFSGSRSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ HYTTPPTFGQ GTKVEIK
人源化4D5抗體的重鏈可變結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO: 48) (CDRH殘基以底線顯示)：
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFNIK DTYIHWVRQA PGKGLEWVAR IYPTNGYTRY ADSVKGRFTI SADTSKNTAY LQMNSLRAED TAVYYCSRWG GDGFYAMDVW GQGTLVTVSS
術語“嵌合4D5抗體”指結合人Her2/neu的IgG抗體，其具有輕鏈和重鏈，所述輕鏈具有SEQ ID NO: 2的氨基酸序列以及所述重鏈具有野生型Fc區；嵌合4D5抗體的重鏈的氨基酸序列顯示在SEQ ID NO: 7中。“變異的嵌合4D5抗體”是結合Her2/neu的IgG抗體，其具有輕鏈和/或重鏈，所述輕鏈和/或重鏈的氨基酸序列與嵌合4D5抗體的氨基酸序列不同 (例如，這樣的IgG抗體：其包括輕鏈和重鏈，所述輕鏈具有SEQ ID NO: 2的氨基酸序列，並且所述重鏈具有SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 13的氨基酸序列)。
VI.結合分子
A.特異性結合HER2/neu的分子
本發明包括的特異性結合HER2/neu的分子包括能夠特異性結合人HER2/neu連續的或不連續的(例如，構象)表位的抗HER2/neu抗體。本發明的方法中使用的HER2/neu抗體優選地也展示結合一個或多個非人物種，尤其地，鼠科、齧齒動物、犬類和靈長類物種(尤其是食蟹猴)的HER2/neu分子的能力。
下面提供了針對HER2/neu的抗體。可通過突變編碼這類抗體的多肽鏈的核酸分子，然後通過分離使用HER2/neu或其肽片段引起的新的分泌抗體的雜交瘤篩選展示特異性結合Her2/neu的能力的表達的抗體或通過其他方式製備其他期望的抗體。人HER/2序列已經描述在Y Yamamoto, T.等(1986) “Similarity Of Protein Encoded By The Human c-erb-B-2 Gene To Epidermal Growth Factor Receptor ,” Nature 319:230-234中，並且序列在 GenBank中可以登錄號X03363得到。
本發明尤其包括嵌合4D5抗體的變體，更尤其涉及特異性結合HER2/neu，優選地人HER2/neu的這類嵌合4D5抗體的變體，其由於輕鏈的可變結構域中去除了糖基化位點而相對於鼠科4D5抗體展示減少的糖基化。尤其地，本發明優選的嵌合抗體在鼠科4D5抗體的輕鏈的可變結構域中缺少糖基化位點，其在鼠科4D5抗體的輕鏈中在65、66和67位包括N-R-S序列。優選地，抗體對於HER2/neu具有增強的結合親和力，並且更優選地，與鼠科4D5抗體相比，本發明的變異的嵌合4D5抗體具有增強的效應子功能，或具有對於HER2/neu的增強的結合親和力和增強的效應子功能。
在優選的實施方式中，嵌合4D5抗體的優選變體包括輕鏈(嵌合 4D5 輕鏈 )，其具有或包括SEQ ID NO: 2 的氨基酸序列。
嵌合4D5抗體輕鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO: 2 ) (CDRL 殘基以底線顯示)： DIVMTQSHKF MSTSVGDRVS ITC KASQDVN TAVA WYQQKP GHSPKLLIY S ASFRYT GVPD RFTGSRSGTD FTFTISSVQA EDLAVYYC QQ HYTTPPT FGG GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC
編碼優選的變異的嵌合4D5抗體的輕鏈的示例性核酸分子是SEQ ID NO: 1 ： gacatcgtga tgacccagtc ccacaagttc atgtccacct ctgtgggcga tagggtcagc atcacctgca aggccagcca ggatgtgaat actgctgtag cctggtatca gcagaaacca ggacattctc ccaaactgct gatttactcc gcatccttcc ggtacactgg agtccctgat cgcttcactg gcagcagatc tgggacagat ttcactttca ccatcagcag tgtgcaggct gaagacctgg cagtttatta ctgtcagcaa cattatacta cacctcccac cttcggaggg ggtaccaagg tggagatcaa acgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag
具有這樣的輕鏈氨基酸序列的抗體在VL區的65位具有修飾，因此缺少在鼠科4D5抗體中發現的N-連接的糖基化位點(見圖1，其描繪了具有N65S修飾的嵌合4D5抗體(SEQ ID NO: 4) 和鼠科4D5抗體(SEQ ID NO: 3)和人源化4D5抗體(SEQ ID NO: 5)的VL區氨基酸序列之間的示例性比較)。在另一優選的實施方式中，本發明的變異的嵌合4D5抗體具有SEQ ID NO: 4的VL區氨基酸序列。
嵌合4D5 VL 區的氨基酸序列(SEQ ID NO: 4 ) (CDRL 殘基以底線顯示)： DIVMTQSHKF MSTSVGDRVS ITC KASQDVN TAVA WYQQKP GHSPKLLIYSASFRYT GVPD RFTGSRSGTD FTFTISSVQA EDLAVYYC QQ HYTTPPT FGG GTKVEIK
嵌合4D5抗體包括具有野生型Fc區的重鏈(“嵌合4D5重鏈”) (SEQ ID NO: 7)，其可由SEQ ID NO: 6的核酸序列編碼。這些序列顯示在下面： 具有野生型Fc區的嵌合4D5重鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO: 7 ) (CDRH 殘基以底線顯示)： QVQLQQSGPE LVKPGASLKL SCTASGFNIK DTYIH WVKQR PEQGLEWIG R IYPTNGYTRY DPKFQD KATI TADTSSNTAY LQVSRLTSED TAVYYCSR WG GDGFYAMDY W GQGASVTVSS ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKRVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK
編碼具有野生型Fc區的嵌合4D5重鏈的示例性核酸分子(SEQ ID NO: 6 )： caggttcagc tgcagcagtc tggccctgag ctggtgaagc caggggcctc actcaagttg tcctgtacag cttctggctt caacatcaaa gacacctata tccactgggt gaaacagagg cctgaacagg gcctggaatg gattggaagg atttatccta ccaatggcta tactagatat gacccaaagt tccaggacaa ggccactatc acagcagaca catcctccaa cacagcctac ctgcaagtca gccgcctgac atctgaggac actgccgtct attactgctc ccggtgggga ggggacggct tctatgctat ggactactgg ggtcagggag cctccgtgac cgtgagctcc gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagccc aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga
在其他實施方式中，本發明考慮採用其重鏈包括變異的Fc區，並且更優選地，“FcMT1 ”、“FcMT2 ”或“FcMT3 ”變異的Fc區的變異的嵌合4D5抗體。這些序列顯示在下面： 具有FcMT1變異的Fc區的變異的嵌合4D5抗體的重鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO: 9 ) (CDRH 殘基以底線顯示))： QVQLQQSGPE LVKPGASLKL SCTASGFNIK DTYIH WVKQR PEQGLEWIG R IYPTNGYTRY DPKFQD KATI TADTSSNTAY LQVSRLTSED TAVYYCSR WG GDGFYAMDY W GQGASVTVSS ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKRVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG PSVFLLPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPPEEQYN STLRVVSILT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPLV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK
編碼具有FcMT1變異的Fc區的變異的嵌合4D5抗體的重鏈的示例性核酸分子(SEQ ID NO: 8 )： caggttcagc tgcagcagtc tggccctgag ctggtgaagc caggggcctc actcaagttg tcctgtacag cttctggctt caacatcaaa gacacctata tccactgggt gaaacagagg cctgaacagg gcctggaatg gattggaagg atttatccta ccaatggcta tactagatat gacccaaagt tccaggacaa ggccactatc acagcagaca catcctccaa cacagcctac ctgcaagtca gccgcctgac atctgaggac actgccgtct attactgctc ccggtgggga ggggacggct tctatgctat ggactactgg ggtcagggag cctccgtgac cgtgagctcc gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagccc aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga ccgtcagtct tcctcttacc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgccggagga gcagtacaac agcacgctcc gtgtggtcag catcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctctcgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga
具有FcMT2變異的Fc區的變異的嵌合4D5抗體的重鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO: 11 ) (CDRH 殘基以底線顯示)： QVQLQQSGPE LVKPGASLKL SCTASGFNIK DTYIH WVKQR PEQGLEWIG R IYPTNGYTRY DPKFQD KATI TADTSSNTAY LQVSRLTSED TAVYYCSR WG GDGFYAMDY W GQGASVTVSS ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKRVEP KSCDKTHTCP PCPAPELVGG PSVFLLPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPPEEQYN STLRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPLV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK
編碼具有FcMT2變異的Fc區的變異的嵌合4D5抗體的重鏈的示例性核酸分子(SEQ ID NO: 10 )： caggttcagc tgcagcagtc tggccctgag ctggtgaagc caggggcctc actcaagttg tcctgtacag cttctggctt caacatcaaa gacacctata tccactgggt gaaacagagg cctgaacagg gcctggaatg gattggaagg atttatccta ccaatggcta tactagatat gacccaaagt tccaggacaa ggccactatc acagcagaca catcctccaa cacagcctac ctgcaagtca gccgcctgac atctgaggac actgccgtct attactgctc ccggtgggga ggggacggct tctatgctat ggactactgg ggtcagggag cctccgtgac cgtgagctcc gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagccc aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cgtgggggga ccgtcagtct tcctcttacc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgccggagga gcagtacaac agcacgctcc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctctcgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga
具有FcMT3變異的Fc區的變異的嵌合4D5抗體的重鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO: 13 ) (CDRH 殘基以底線顯示)： QVQLQQSGPE LVKPGASLKL SCTASGFNIK DTYIH WVKQR PEQGLEWIG R IYPTNGYTRY DPKFQD KATI TADTSSNTAY LQVSRLTSED TAVYYCSR WG GDGFYAMDY W GQGASVTVSS ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKRVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG PSVFLLPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPPEEQYN STLRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK
編碼具有FcMT3變異的Fc區的變異的嵌合4D5抗體的重鏈的示例性核酸分子(SEQ ID NO: 12 )： caggttcagc tgcagcagtc tggccctgag ctggtgaagc caggggcctc actcaagttg tcctgtacag cttctggctt caacatcaaa gacacctata tccactgggt gaaacagagg cctgaacagg gcctggaatg gattggaagg atttatccta ccaatggcta tactagatat gacccaaagt tccaggacaa ggccactatc acagcagaca catcctccaa cacagcctac ctgcaagtca gccgcctgac atctgaggac actgccgtct attactgctc ccggtgggga ggggacggct tctatgctat ggactactgg ggtcagggag cctccgtgac cgtgagctcc gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagccc aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga ccgtcagtct tcctcttacc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgccggagga gcagtacaac agcacgctcc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga
在一個實施方式中，本發明涉及變異的嵌合4D5抗體的用途，所述變異的嵌合4D5抗體具有在Fc區中具有修飾的重鏈，並且所述重鏈由SEQ ID NO: 8 的核酸序列編碼或包括SEQ ID NO: 9 的氨基酸序列或由SEQ ID NO: 10 的核酸序列編碼或包括SEQ ID NO: 11 的氨基酸序列或由SEQ ID NO: 12 的核酸序列編碼或包括SEQ ID NO: 13 的氨基酸序列。
在一個實施方式中，本發明涉及抗HER2/neu抗體的用途，所述抗HER2/neu抗體包括在VL結構域中具有N65S修飾的免疫球蛋白輕鏈和具有修飾的Fc區的免疫球蛋白重鏈。優選地，這類抗HER2/neu抗體是嵌合4D5抗體或變異的嵌合4D5抗體，所述變異的嵌合4D5抗體包括具有SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的輕鏈和具有選自SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 11和SEQ ID NO: 13的氨基酸序列的重鏈。在一些實施方式中，本發明的抗HER2/neu抗體進一步包括輕鏈恒定結構域，所述輕鏈恒定結構域與在一些實施方式中包括至少SEQ ID NO: 4的輕鏈可變結構域融合。在其他實施方式中，抗體是修飾的、是片段或是修飾片段。
根據本發明的各個實施方式構建嵌合4D5抗體，以增強與啟動性低親和力Fc受體的結合，和不改變或僅僅最小程度地增加與低親和力抑制劑受體CD32B (FcγRIIb)的結合。抗體包括下述野生型和Fc優化的抗體： l  ch4D5-野生型Fc，其具有含SEQ ID NO: 2 的氨基酸序列的輕鏈，和含SEQ ID NO: 7 的氨基酸序列的重鏈。ch4D5-野生型Fc在輕鏈上具有N65S取代，這產生去糖基化的輕鏈。 l  ch4D5-FcMT1，其具有含SEQ ID NO: 2 的氨基酸序列的輕鏈，和含SEQ ID NO: 9 的氨基酸序列的重鏈。ch4D5-FcMT1在輕鏈上具有N65S取代，這產生去糖基化的輕鏈，以及在重鏈上具有F243L、R292P、Y300L、V305I和P396L取代(均根據Kabat編號)。ch4D5-FcMT1在與人CD16A（FcγRIII-A）結合方面表現出10倍增加，並且與CD16-158Val 的結合相比，與CD16-158Phe 的結合以成比例更大的方式增強。 l  ch4D5-FcMT2 (“瑪格妥昔單抗 ,” CAS註冊號：1350624-75-7)，其具有含SEQ ID NO: 2 的氨基酸序列的輕鏈，和含SEQ ID NO: 11 的氨基酸序列的重鏈。瑪格妥昔單抗在輕鏈上具有N65S取代，這產生去糖基化的輕鏈，和在重量上具有L235V、F243L、R292P、Y300L和P396L取代(均根據Kabat編號)。該抗體是ch4D5-FcMT1抗體的進一步改良形式，並且具有類似的CD16A結合特性，而且也具有更有利的與CD32B（FcgRII-B）結合的降低。 l  ch4D5-FcMT3，其具有含SEQ ID NO: 2 的氨基酸序列的輕鏈，和含SEQ ID NO: 13 的氨基酸序列的重鏈。ch4D5-FcMT3在輕鏈上具有N65S取代，這產生去糖基化的輕鏈，和在重鏈上具有F243L、R292P和Y300L取代(均根據Kabat編號)。該抗體是ch4D5-FcMT1抗體的進一步改良形式，並且具有類似的CD16A結合特性，但是也具有更有利的與CD32B (FcγRIIB)結合的降低。 l  ch4D5-N297Q (本文也稱為“ch4D5-Ag”)，其具有含SEQ ID NO: 2 的氨基酸序列的輕鏈，和具有N297Q取代的重鏈(根據Kabat編號)。
在圖2中顯示ch4D5-野生型Fc和Fc優化的變體ch4D5-FcMT1、ch4D5-FcMT2和ch4D5-FcMT3的重鏈序列的比較。CDR由在相關殘基下面所顯示的黑線表示。
B.特異性結合PD-1的分子
本發明包括的特異性結合PD-1的分子包括能夠結合人PD-1的連續的或不連續的(例如，構象)部分(表位元)的抗PD-1抗體。本發明的方法中使用的PD-1抗體優選地也展示結合一個或多個非人物種，尤其地，鼠科、齧齒動物、犬科和靈長類物種的PD-1分子的能力。
對PD-1特異性的抗體是已知的(見，例如，美國專利申請號62/198,867、美國專利號5,952,136、7,488,802、7,521,051、8,008,449、8,088,905、8,354,509、8,552,154、8,779,105、8,900,587、9,084,776、PCT專利公開WO 2004/056875、WO 2006/121168、WO 2008/156712、WO 2012/135408、WO 2012/145493、WO 2013/014668、WO 2014/179664、WO 2014/194302和WO 2015/112800)。另外期望的抗體可通過分離使用PD-1或其肽片段產生的分泌抗體的雜交瘤製備。人PD-1 (包括20個氨基酸殘基信號序列(以底線顯示)和268個氨基酸殘基成熟蛋白質)具有氨基酸序列(SEQ ID NO: 14)： MQIPQAPWPV VWAVLQLGWR PGWFLDSPDR PWNPPTFSPA LLVVTEGDNA TFTCSFSNTS ESFVLNWYRM SPSNQTDKLA AFPEDRSQPG QDCRFRVTQL PNGRDFHMSV VRARRNDSGT YLCGAISLAP KAQIKESLRA ELRVTERRAE VPTAHPSPSP RPAGQFQTLV VGVVGGLLGS LVLLVWVLAV ICSRAARGTI GARRTGQPLK EDPSAVPVFS VDYGELDFQW REKTPEPPVP CVPEQTEYAT IVFPSGMGTS SPARRGSADG PRSAQPLRPE DGHCSWPL
優選的抗PD-1抗體具有下述抗體的VL和/或VH結構域：抗人PD-1單克隆抗體“PD-1 mAb 1” (尼魯單抗，CAS註冊號：946414-94-4，也稱為5C4、BMS-936558、ONO-4538、MDX-1106，並且作為OPDIVO®由Bristol-Myers Squibb出售)、“PD-1 mAb 2” (派姆單抗，(之前稱為蘭羅利珠單抗)，CAS註冊號：1374853-91-4，也稱為MK-3475，SCH-900475，並且作為KEYTRUDA®由Merck出售)、“PD-1 mAb 3” (EH12.2H7；Dana Farber)、“PD-1 mAb 4” (皮地珠單抗，CAS註冊號：1036730-42-3也稱為CT-011，CureTech)；或表1中提供的任何抗PD-1抗體；並且更優選的抗PD-1抗體具有這類抗PD-1單克隆抗體的VL區的1、2或所有3個CDR和/或VH結構域的1、2或所有3個CDR。最近已經鑒定了可用于本發明的方法和組合物的具有獨特的結合特徵的另外的抗PD-1抗體(見，美國專利申請號62/198,867)。尤其地，優選的是具有抗PD-1抗體“PD-1 mAb 5” (hPD-1 mAb 2，MacroGenics)；“PD-1 mAb 6” (hPD-1 mAb 7，MacroGenics)；“PD-1 mAb 7” (hPD-1 mAb 9，MacroGenics)；“PD-1 mAb 8” (hPD-1 mAb 15，MacroGenics)的人源化的VH和/或VL結構域的PD-1結合分子；和更優選是具有這類抗PD-1單克隆抗體的VL區的1，2或所有3個CDR和/或VH結構域的1，2或所有3個CDR的PD-1結合分子。這類優選的抗PD-1抗體包括具有變異的Fc區的抗體、雙特異性(或多特異性)抗體、嵌合抗體或人源化抗體、BiTes、雙抗體等。
PD-1 mAb 1的重鏈可變結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 15) (CDRH殘基以底線顯示)： QVQLVESGGG VVQPGRSLRL DCKASGITFS NSGMH WVRQA PGKGLEWVA V IWYDGSKRYY ADSVKG RFTI SRDNSKNTLF LQMNSLRAED TAVYYCAT ND DY WGQGTLVT VSS
PD-1 mAb 1 的CDRH1 (SEQ ID NO: 16) NSGMH
PD-1 mAb 1 的CDRH2 (SEQ ID NO: 17) VIWYDGSKRYYADSVKG
PD-1 mAb 1的CDRH3 (SEQ ID NO: 18) NDDY
PD-1 mAb 1的輕鏈可變結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 19) (CDRL殘基以底線顯示)：
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD ASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ SSNWPRTFGQ GTKVEIK
PD-1 mAb 1的CDRL1(SEQ ID NO: 20) RASQSVSSYLA
PD-1 mAb 1的CDRL2(SEQ ID NO: 21) DASNRAT
PD-1 mAb 1的CDRL3(SEQ ID NO: 22) QQSSNWPRT
PD-1 mAb 2的重鏈可變結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 23) (CDRH殘基以底線顯示)： QVQLVQSGVE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYYMY WVRQA PGQGLEWMG G INPSNGGTNF NEKFKN RVTL TTDSSTTTAY MELKSLQFDD TAVYYCAR RD YRFDMGFDY W GQGTTVTVSS
PD-1 mAb 2的CDRH1 (SEQ ID NO: 24) NYYMY
PD-1 mAb 2的CDRH2 (SEQ ID NO: 25) GINPSNGGTNFNEKFKN
PD-1 mAb 2的CDRH3 (SEQ ID NO: 26) RDYRFDMGFDY
PD-1 mAb 2的輕鏈可變結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 27) (CDRL殘基以底線顯示)： EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSC RASKGVS TSGYSYLH WY QQKPGQAPRL LIY LASYLES GVPARFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY YC QHSRDLPL T FGGGTKVEIK
PD-1 mAb 2的CDRL1 (SEQ ID NO: 28) RASKGVSTSGYSYLH
PD-1 mAb 2的CDRL2 (SEQ ID NO: 29) LASYLES
PD-1 mAb 2的CDRL3 (SEQ ID NO: 30) QHSRDLPLT
PD-1 mAb 3的重鏈可變結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 31) (CDRH殘基以底線顯示)： QVQLQQSGAE LAKPGASVQM SCKASGYSFT SSWIH WVKQR PGQGLEWIG Y IYPSTGFTEY NQKFKD KATL TADKSSSTAY MQLSSLTSED SAVYYCA RWR DSSGYHAMDY WGQGTSVTVSS
PD-1 mAb 3的CDRH1 (SEQ ID NO: 32) SSWIH
PD-1 mAb 3的CDRH2 (SEQ ID NO: 33) YIYPSTGFTEYNQKFKD
PD-1 mAb 3的CDRH3 (SEQ ID NO: 34) RWRDSSGYHAMDY
PD-1 mAb 3的輕鏈可變結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 35) (CDRL殘基以底線顯示)： DIVLTQSPAS LTVSLGQRAT ISC RASQSVS TSGYSYMH WY QQKPGQPPKL LIK FGSNLES GIPARFSGSG SGTDFTLNIH PVEEEDTATY YC QHSWEIPY T FGGGTKLEI K
PD-1 mAb 3的CDRL1 (SEQ ID NO: 36) RASQSVSTSGYSYMH
PD-1 mAb 3的CDRL2 (SEQ ID NO: 37) FGSNLES
PD-1 mAb 3的CDRL3 (SEQ ID NO: 38) QHSWEIPYT
PD-1 mAb 4的重鏈可變結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 39) (CDRH殘基以底線顯示)： QVQLVQSGSE LKKPGASVKI SCKASGYTFT NYGMN WVRQA PGQGLQWMG W INTDSGESTY AEEFKG RFVF SLDTSVNTAY LQITSLTAED TGMYFCVR VG YDALDY WGQG TLVTVSS
PD-1 mAb 4 的CDRH1 (SEQ ID NO: 40) NYGMN
PD-1 mAb 4的CDRH2 (SEQ ID NO: 41) WINTDSGESTYAEEFKG
PD-1 mAb 4的CDRH3 (SEQ ID NO: 42) VGYDALDY
PD-1 mAb 4的輕鏈可變結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 43) (CDRL殘基以底線顯示)： EIVLTQSPSS LSASVGDRVT ITC SARSSVS YMH WFQQKPG KAPKLWIY RT SNLAS GVPSR FSGSGSGTSY CLTINSLQPE DFATYYC QQR SSFPLT FGGG TKLEIK
PD-1 mAb 4的CDRL1 (SEQ ID NO: 44) SARSSVSYMH
PD-1 mAb 4的CDRL2 (SEQ ID NO: 45) RTSNLAS
PD-1 mAb 4 的CDRL3 (SEQ ID NO: 46) QQRSSFPLT
PD-1 mAb 5的重鏈可變結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 53) (CDRH殘基以底線顯示)： EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFVFS SFGMH WVRQA PGKGLEWVA Y ISSGSMSISY ADTVKG RFTI SRDNAKNTLY LQMNSLRTED TALYYCAS LS DYFDY WGQGT TVTVSS
PD-1 mAb 5的CDRH1 (SEQ ID NO: 54) SFGMH
PD-1 mAb 5的CDRH2 (SEQ ID NO: 55) YISSGSMSISYADTVKG
PD-1 mAb 5的CDRH3 (SEQ ID NO: 56) LSDYFDY
PD-1 mAb 5的輕鏈可變結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 57) (CDRL殘基以底線顯示)： DVVMTQSPLS LPVTLGQPAS ISC RSSQSLV HSTGNTYLH W YLQKPGQSPQ LLIY RVSNRF S GVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYC SQTTHVP WT FGQGTKLE IK
PD-1 mAb 5的CDRL1 (SEQ ID NO: 58) RSSQSLVHSTGNTYLH
PD-1 mAb 5 的CDRL2 (SEQ ID NO: 59) RVSNRFS
PD-1 mAb 5的CDRL3 (SEQ ID NO: 60) SQTTHVPWT
PD-1 mAb 6的重鏈可變結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 61 (CDRH殘基以底線顯示)： QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT SYWMN WVRQA PGQGLEWXG V IHPSDSETWL DQKFKD RVTI TVDKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAR EH YGTSPFAY WG QGTLVTVSS 其中X是I或A。
PD-1 mAb 6的CDRH1 (SEQ ID NO: 62) SYWMN
PD-1 mAb 6的CDRH2 (SEQ ID NO: 63) VIHPSDSETWLDQKFKD
PD-1 mAb 6的CDRH3 (SEQ ID NO: 64) EHYGTSPFAY
PD-1 mAb 6的輕鏈可變結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 65) (CDRL殘基以底線顯示)： EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSC RAX1 ESVD NYGMSFMN WF QQKPGQPPKL LIH AASNX2 GS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FC QQSKEVPY T FGGGTKVEI K 其中X1 是N或S和X2 是Q或R；或X1 是N和X2 是Q；或X1 是S和X2 是Q；或X1 是S和X2 是R。
PD-1 mAb 6的CDRL1 (SEQ ID NO: 66) RAX1ESVDNYGMSFMN 其中X1是如上所指示。
PD-1 mAb 6的CDRL2 (SEQ ID NO: 67) AASNX2GS 其中X2是如上所指示。
PD-1 mAb 6的CDRL3 (SEQ ID NO: 68) QQSKEVPYT
在具體的實施方式中，PD-1 mAb 6包括： (a) SEQ ID NO: 61，其中X是I；和SEQ ID NO: 65，其中X1是N和X2是Q；或 (b) SEQ ID NO: 61，其中X是I；和SEQ ID NO: 65，其中X1是S和X2是Q。
PD-1 mAb 7的重鏈可變結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 69) (CDRH殘基以底線顯示)： EVQLVESGGG LX1 RPGGSLKL SCAASGFTFS SYLVX2 WVRQA PGKGLEWX3 A T ISGGGGNTYY SDSVKG RFTI SRDNAKNSLY LQMNSX4 RAED TATYYCAR YG FDGAWFAY WG QGTLVTVSS 其中X1 是V或A；X2 是S或G；X3 是V或T；X4 是L或A；X1 是V，X2 是S，X3 是V，和X4 是L；或X1 是A，X2 是G，X3 是T，和X4 是A
PD-1 mAb 7的CDRH1 (SEQ ID NO: 70) SYLVX2 其中X2是如上所指示。
PD-1 mAb 7的CDRH2 (SEQ ID NO: 71) TISGGGGNTYYSDSVKG
PD-1 mAb 7的CDRH3 (SEQ ID NO: 72) YGFDGAWFAY
PD-1 mAb 7的輕鏈可變結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 73) (CDRL殘基以底線顯示)： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC RASENIY X1 YLA WYQQKP GKAPKLLIY X2 AKTLAA GVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYC QH HYAVPWT FGQ GTKLEIK 其中X1 是N或S和X2 是N或D；X1 是S和X2 是N；或X1 是N和X2 是D
PD-1 mAb 7的CDRL1 (SEQ ID NO: 74) RASENIYX1YLA 其中X1是如上所指示。
PD-1 mAb 7的CDRL2 (SEQ ID NO: 75) X2AKTLAA 其中X2是如上所指示。
PD-1 mAb 7的CDRL3 (SEQ ID NO: 76) QHHYAVPWT
在具體的實施方式中，PD-1 mAb 7包括： (a) SEQ ID NO: 69，其中X1是V，X2是S，X3是V，和X4是L；和SEQ ID NO: 73，其中X1是S和X2是N；或 (b) SEQ ID NO: 69，其中X1是A，X2是G，X3是T，和X4是A；和SEQ ID NO: 73，其中X1是N和X2是D。
PD-1 mAb 8的重鏈可變結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 77) (CDRH殘基以底線顯示)： EVQLVESGGG LVRPGGSLRL SCAASGFTFS SYLIS WVRQA PGKGLEWVA A ISGGGADTYY ADSVKG RFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TATYYCAR RG TYAMDY WGQG TLVTVSS
PD-1 mAb 8 的CDRH1 (SEQ ID NO: 78) SYLIS
PD-1 mAb 8 的CDRH2 (SEQ ID NO: 79) AISGGGADTYYADSVKG
PD-1 mAb 8 的CDRH3 (SEQ ID NO: 80) RGTYAMDY
PD-1 mAb 8的輕鏈可變結構域的氨基酸序(SEQ ID NO: 81) (CDRL殘基以底線顯示)：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASENIY NYLAWYQQKP GKAPKLLIYD AKTLAAGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQH HYAVPWTFGQ GTKLEIK
PD-1 mAb 8的CDRL1 (SEQ ID NO: 82) RASENIYNYLA
PD-1 mAb 8的CDRL2 (SEQ ID NO: 83) DAKTLAA
PD-1 mAb 8的CDRL3 (SEQ ID NO: 84) QHHYAVPWT
在某些實施方式中，可用于本發明的方法和組合物的PD-1抗體包括上面提供的任何抗體(例如，PD-1 mAb 1、PD-1 mAb 2、PD-1 mAb 3、PD-1 mAb 4、PD-1 mAb 5、PD-1 mAb 6、PD-1 mAb 7、PD-1 mAb 8或表1中的任何抗PD-1抗體)的VL和VH結構域、κ CL結構域和IgG4 Fc結構域，任選地缺少C-末端賴氨酸殘基。這類抗體優選地包括IgG4 CH1結構域和鉸鏈，並且更優選地包括穩定化的、包括S228P取代的IgG4鉸鏈(其中編號是根據如Kabat中的EU索引)。
κ CL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 86)是： RTVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASVVCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG NSQESVTEQD SKDSTYSLSS TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK SFNRGEC
IgG4 CH1結構域和穩定化的鉸鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO: 87)是： ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRVES KYGPPCPPCP
下面提供了IgG4 CH2-CH3結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 52)。
命名為“PD-1 mAb 6-ISQ”的示例性抗PD-1抗體包括：具有PD-1 mAb 6 (SEQ ID NO: 65)的VL結構域，其中X1是S和X2是Q，和κ CL (SEQ ID NO: 86)的輕鏈；和具有PD-1 mAb 6 (SEQ ID NO: 61)的VH結構域，其中X1是I，IgG4 CH1結構域、穩定化的IgG 4鉸鏈(SEQ ID NO: 87)和IgG4 CH2-CH3結構域(SEQ ID NO: 52)的重鏈。
PD-1 mAb 6-ISQ的完整輕鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO: 87)顯示在下面(CDRL殘基以底線顯示)： EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSC RASESVD NYGMSFMN WF QQKPGQPPKL LIH AASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FC QQSKEVPY T FGGGTKVEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV THQGLSSPVT KSFNRGEC
PD-1 mAb 6-ISQ的完整重鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO: 88)顯示在下面(CDRH殘基以底線顯示)： QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT SYWMN WVRQA PGQGLEWIG V IHPSDSETWL DQKFKD RVTI TVDKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAR EH YGTSPFAY WG QGTLVTVSSA STKGPSVFPL APCSRSTSES TAALGCLVKD YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSVVTV PSSSLGTKTY TCNVDHKPSN TKVDKRVESK YGPPCPPCPA PEFLGGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSQEDP EVQFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQFNSTYR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKGLPSS IEKTISKAKG QPREPQVYTL PPSQEEMTKN QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPVLDSD GSFFLYSRLT VDKSRWQEGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL SLSLG
另一示例性抗PD-1抗體是PD-1 mAb 1 (尼魯單抗)，其是人抗體，包括具有VL結構域(SEQ ID NO: 19)和κ CL結構域(見例如，SEQ ID NO: 86)的輕鏈；和具有VH結構域(SEQ ID NO: 15)、IgG4 CH1結構域和穩定化的鉸鏈(見例如，SEQ ID NO: 87)、和IgG4 CH2-CH3結構域(見例如，SEQ ID NO: 54)的重鏈。
另一示例性抗PD-1抗體是PD-1 mAb 2 (派姆單抗)，其是人源化抗體，包括具有VL結構域(SEQ ID NO: 27)和κ CL結構域(見例如，SEQ ID NO: 86)的輕鏈；和具有VH結構域(SEQ ID NO: 23)、IgG4 CH1和穩定化的IgG4鉸鏈(見例如，SEQ ID NO: 87)、和IgG4 CH2-CH3結構域(見例如，SEQ ID NO: 52)的重鏈。
C.抗體變體
也考慮可製備抗體變體。變體可在它們的氨基酸序列中相對于天然氨基酸序列在期望位置具有序列修飾(例如，取代、缺失和/或***)。本領域技術人員應該瞭解，氨基酸改變可改變抗體的翻譯後過程，比如改變糖基化位元點的數目或位置或改變膜錨定特徵。在優選的實施方式中，抗體和變體是Fc區變體。
與天然抗體相比，變體可具有相同的或改變的活性。例如，可期望變體具有相同的活性，但是以使得其更穩定或具有更長的體內半衰期的方式被修飾，例如，通過將抗體與白蛋白或補救受體(salvage receptor)結合表位軛合，如在例如美國專利第5,739,277中描述的。或者，例如，可能期望的是抗體對抗原具有增加的結合親和力，但是具有與天然抗體相同的效應子功能，或者可能期望的是抗體對抗原具有相同的結合親和力，但是具有降低的效應子功能。可以通過例如使用體外測定如ELISA測定、表面等離子體共振測定、放射性標記的蛋白結合測定（RIA）或免疫沉澱測定來測試活性。
在功能或免疫同一性上的實質修飾可以通過選擇在維持下列方面的作用方面顯著不同的修飾來完成：(a) 修飾區域的多肽骨架的結構，例如，為片層或螺旋構象；(b) 在靶位點的分子的電荷或疏水性；或 (c) 側鏈的體積(bulk)。還可以採用掃描氨基酸分析來沿著連續序列鑒定一個或多個氨基酸，例如Cunningham和Wells (1989) Science 244:1081-1085所述的。優選的掃描氨基酸是相對較小的中性氨基酸，例如丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸和半胱氨酸。丙氨酸在這個組中通常是優選的掃描氨基酸，因為它是最常見的氨基酸，並且常見於隱藏的和暴露的位置二者中，並且因為它消除了β-碳以外的側鏈並且不太可能改變變體的主鏈構象。如果丙氨酸取代沒有產生足夠量的變體，則可以使用同分異構(isoteric)氨基酸。此外，不參與維持抗體或多肽的正確構象的任何半胱氨酸殘基可以被取代，一般用絲氨酸進行取代，以改善分子的氧化穩定性並阻止異常的交聯。然而，在某些情況下，尤其在抗體是諸如Fv片段等抗體片段時，可以添加半胱氨酸鍵至抗體或多肽以改善其穩定性。
CDR殘基的單氨基酸改變可導致功能性結合喪失的事實(Rudikoff, S. etc. (1982) “Single Amino Acid Substitution Altering Antigen-Binding Specificity,” Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79(6):1979-1983)提供了系統性鑒定可選的功能CDR序列的手段。在用於獲得這類變異的CDR的一個優選的方法中，對編碼CDR的多核苷酸進行誘變(例如經隨機誘變或通過位點定向方法(例如，用編碼突變的基因座的引物進行聚合酶鏈介導的擴增))，以產生具有取代的氨基酸殘基的CDR。通過比較原始(功能) CDR序列的相關殘基的同一性與取代的(非功能)變異的CDR序列的同一性，可鑒定該取代的BLOSUM62.iij取代分數。BLOSUM系統提供了通過分析用於可信比對的序列的資料庫而產生的氨基酸取代的矩陣(Eddy, S.R. (2004) “Where Did The BLOSUM62 Alignment Score Matrix Come From?,” Nature Biotech. 22(8):1035-1036；Henikoff, J.G. (1992) “Amino acid substitution matrices from protein blocks,” Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89:10915-10919；Karlin, S.等(1990) “Methods For Assessing The Statistical Significance Of Molecular Sequence Features By Using General Scoring Schemes,” Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 87:2264-2268；Altschul, S.F. (1991) “Amino Acid Substitution Matrices From An Information Theoretic Perspective,” J. Mol. Biol. 219, 555-565。目前，最高級BLOSUM資料庫是BLOSUM62資料庫(BLOSUM62.iij)。下面表2顯示了BLOSUM62.iij取代分數(分數越高取代越保守，因此取代越可能不影響功能)。例如，如果包括所得CDR的抗原結合片段不能結合ROR1，那麼BLOSUM62.iij取代分數視為不足夠保守，並且選擇和產生具有更高取代分數的新的候選取代。因此，例如，如果原始殘基是谷氨酸(E)，和非功能取代殘基是組氨酸(H)，那麼BLOSUM62.iij取代分數是0，並且更高保守的改變(比如對天冬氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺或賴氨酸的改變)是優選的。
本發明因此考慮使用引導的或隨機誘變，以鑒定改善的CDR。
D.Fc區變體
在傳統的免疫功能中，抗體-抗原複合物與免疫系統的細胞的相互作用產生各種各樣的應答，範圍從效應子功能，比如ADCC、肥大細胞脫粒和吞噬至免疫調節信號，比如調節淋巴細胞增殖和抗體分泌。所有這些相互作用均通過抗體的Fc區或免疫複合物與造血細胞上的專用細胞表面受體的結合而啟動。由抗體和免疫複合物引發的多種細胞應答源自三個Fc受體：FcγRI (CD64)、FcγRII (CD32)和FcγRIII (CD16)的結構異質性。FcγRI (CD64)、FcγRIIA (CD32A)和FcγRIII (CD16)是啟動性(即，免疫系統增強)受體；FcγRIIB (CD32B)是抑制性(即，免疫系統抑制)受體。
IgG1 Fc區的氨基酸序列顯示在下面(如SEQ ID NO: 49，根據Kabat編號)： 231     240         250          260           270         280 APELLGGPSV   FLFPPKPKDT   LMISRTPEVT   CVVVDVSHED   PEVKFNWYVD        290          300          310          320         330 GVEVHNAKTK   PREEQYNSTY   RVVSVLTVLH   QDWLNGKEYK   CKVSNKALPA         340         350          360          370         380 PIEKTISKAK   GQPREPQVYT   LPPSREEMTK   NQVSLTCLVK   GFYPSDIAVE        390          400          410          420         430 WESNGQPENN   YKTTPPVLDS   DGSFFLYSKL   TVDKSRWQQG   NVFSCSVMHE        440        447 ALHNHYTQKS   LSLSPG X 如通過根據Kabat的EU索引編號，其中，X是賴氨酸(K)或不存在。
示例性人IgG2的CH2-CH3結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO: 50 )： 231     240          250         260          270          280 APPVA-GPSV   FLFPPKPKDT   LMISRTPEVT   CVVVDVSHED   PEVQFNWYVD        290          300          310         320          330 GVEVHNAKTK   PREEQFNSTF   RVVSVLTVVH   QDWLNGKEYK   CKVSNKGLPA        340          350          360         370          380 PIEKTISKTK   GQPREPQVYT   LPPSREEMTK   NQVSLTCLVK   GFYPSDISVE        390          400          410         420          430 WESNGQPENN   YKTTPPMLDS   DGSFFLYSKL   TVDKSRWQQG   NVFSCSVMHE        440       447 ALHNHYTQKS   LSLSPG X 如通過根據Kabat的EU索引編號，其中，X是賴氨酸(K)或不存在。
示例性人IgG3的CH2-CH3結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO: 51 )： 231     240           250           260            270           280 APELLGGPSV   FLFPPKPKDT   LMISRTPEVT   CVVVDVSHED   PEVQFKWYVD        290         300           310          320          330 GVEVHNAKTK   PREEQYNSTF   RVVSVLTVLH   QDWLNGKEYK   CKVSNKALPA          340         350           360          370          380 PIEKTISKTK   GQPREPQVYT   LPPSREEMTK   NQVSLTCLVK   GFYPSDIAVE          390         400          410           420          430 WESSGQPENN   YNTTPPMLDS   DGSFFLYSKL   TVDKSRWQQG   NIFSCSVMHE          440       447 ALHNRFTQKS   LSLSPG X 如通過根據Kabat的EU索引編號，其中，X是賴氨酸(K)或不存在。
示例性人IgG4的CH2-CH3結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO: 52 )： 231     240         250          260          270         280 APEFLGGPSV   FLFPPKPKDT   LMISRTPEVT   CVVVDVSQED   PEVQFNWYVD        290         300           310         320         330 GVEVHNAKTK   PREEQFNSTY   RVVSVLTVLH   QDWLNGKEYK   CKVSNKGLPS        340         350           360         370         380 SIEKTISKAK   GQPREPQVYT   LPPSQEEMTK   NQVSLTCLVK   GFYPSDIAVE        390         400           410         420         430 WESNGQPENN   YKTTPPVLDS   DGSFFLYSRL   TVDKSRWQEG   NVFSCSVMHE        440       447 ALHNHYTQKS   LSLSLG X 如通過根據Kabat的EU索引編號，其中，X是賴氨酸(K)或不存在。
在抗體恒定區中的許多不同位置(例如，Fc位置，包括但不限於如通過根據Kabat的EU索引編號的270、272、312、315、356和358位)處已經觀察到了多態性，因此本發明的序列和現有技術的序列之間可能存在稍微的區別。已經充分表徵了人免疫球蛋白的多態性形式。目前，已知18個Gm同種異型：G1m (1、2、3、17)或G1m (a、x、f、z)、G2m (23)或G2m (n)、G3m (5、6、10、11、13、14、15、16、21、24、26、27、28)或G3m (b1、c3、b3、b0、b3、b4、s、t、g1、c5、u、v、g5) (Lefranc,et al. , “The Human IgG Subclasse s: Molecular Analysis Of Structur e, Function And Regulation. ”Pergamon, Oxford, pp. 43-78 (1990)；Lefranc, G.等, 1979, Hum. Genet.: 50, 199-211)。具體考慮本發明的抗體可併入任何免疫球蛋白基因的任何同種異型(allotype)、異同種異型(isoallotype)或單倍型(haplotype)，並且不限於本文提供的序列的同種異型、異同種異型或單倍型。此外，在一些表達系統中，CH3結構域的C-末端氨基酸殘基(上面SEQ ID NOs ： 49-52 粗體和底線顯示的)可在翻譯後去除。因此，CH3結構域的C-末端殘基(上面粗體和加底線顯示的)是本發明的方法中使用的抗體中的任選氨基酸殘基。
本發明的分子可具有變異的Fc區。Fc區的修飾通常導致改變的表型，例如改變的血清半衰期、改變的穩定性、改變的對細胞酶的易感性或改變的效應子功能。就效應子功能而言，可期望修飾本發明的抗體，例如，以便增強抗體在治療癌中的有效性。在某些情況下，期望降低或消除效應子功能，例如在抗體的作用機制涉及阻斷或對抗但不是殺傷攜帶靶抗原的細胞的情況下。當被引導至不期望的細胞諸如其中FcγR以低水準表達的腫瘤和外源細胞時，例如具有低水準FcγRIIB的腫瘤-特異性B細胞(例如，非霍奇金淋巴瘤、CLL和伯基特淋巴瘤)，提高的效應子功能通常是期望的。在所述實施方式中，具有賦予的或增強的效應子功能活性的本發明的分子可用于治療和/或預防疾病、病症或感染，其中增強的效應子功能活性的功效是期望的。
在某些實施方式中，本發明的分子包括Fc區氨基酸的一個或多個修飾，所述修飾降低了Fc區對一個或多個FcγR受體的親和力和親合力，因此降低了本發明的分子對一個或多個FcγR受體的親和力和親合力。在其他實施方式中，本發明的分子包括Fc區氨基酸的一個或多個修飾，所述修飾增加了Fc區對一個或多個FcγR受體的親和力和親合力，因此增加了本發明的分子對一個或多個FcγR受體的親和力和親合力。在其他實施方式中，相對於不包括Fc區或包括野生型Fc區的分子，分子包括變異的Fc區，其中所述變體賦予或介導增加的ADCC活性和/或對FcγRIIA增加的結合。在可選的實施方式中，相對於不包括Fc區或包括野生型Fc區的分子，分子包括變異的Fc區，其中所述變體賦予或介導降低的ADCC活性(或其他效應子功能)和/或對FcγRIIB增加的結合。
在一些實施方式中，本發明包括分子，所述分子包括變異的Fc區，所述變異的Fc區相對於包括野生型Fc區的相當的分子不顯示對任何FcγR的可檢測的結合。在其他實施方式中，本發明包括分子，所述分子包括變異的Fc區，所述變異的Fc區僅僅結合單個FcγR，優選地FcγRIIA、FcγRIIB或FcγRIIIA之一。
本發明的分子可包括對於啟動性和/或抑制性Fcγ受體改變的親和力。在一個實施方式中，抗體或分子包括變異的Fc區，其相對於具有野生型Fc區的相當的分子，具有對於FcγRIIB增加的親和力和對於FcγRIIIA和/或FcγRIIA降低的親和力。在另一實施方式中，本發明的分子包括變異的Fc區，其相對於具有野生型Fc區的相當的分子，具有對於FcγRIIB降低的親和力和對於FcγRIIIA和/或FcγRIIA增加親和力。在仍另一實施方式中，本發明的分子包括變異的Fc區，其相對於具有野生型Fc區的相當的分子，具有對於FcγRIIB降低的親和力和對於FcγRIIIA和/或FcγRIIA降低的親和力。在仍另一實施方式中，本發明的分子包括變異的Fc區，其相對於具有野生型Fc區的相當的分子，具有對於FcγRIIB不變的親和力和對於FcγRIIIA和/或FcγRIIA降低的(或增加的)親和力。
在某些實施方式中，本發明包括免疫球蛋白，其包括對於FcγRIIIA和/或FcγRIIA具有改變的親和力的變異的Fc區，使得免疫球蛋白具有增強的效應子功能，例如，ADCC。效應細胞功能的非限制性例子包括ADCC、抗體依賴性細胞吞噬(ADCP)、吞噬、調理、調理吞噬、細胞結合、玫瑰花結、C1q結合和CDC。
在尤其優選的實施方式中，本發明包括嵌合抗HER2/neu抗體，其包括變異的Fc區，其中所述變體賦予或具有增加的ADCC活性和/或對FcγRIIIA (CD16A)增加的結合，如使用本領域技術人員已知的和本文列舉的方法測量的。根據本發明的方法使用的ADCC試驗可以是NK依賴性或巨噬細胞依賴性的。
在尤其優選的實施方式中，本發明包括特異性結合PD-1的分子，其包括變異的Fc區，其中所述變體賦予或具有降低的ADCC活性和/或對FcγRIIIA (CD16A)降低的結合，如使用本領域技術人員已知和本文列舉的方法測量的。根據本發明的方法使用的ADCC試驗可以是NK依賴性或巨噬細胞依賴性的。在另外優選的實施方式中，本發明包括特異性結合PD-1的分子，其包括變異的Fc區，其中所述變體賦予或具有降低的CDC活性和/或對C1q降低的結合，如使用本領域技術人員已知和本文列舉的方法測量的。
在優選的實施方式中，親和力或效應子功能的改變相對於包括野生型Fc區的相當的分子是至少2倍，優選地至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少50倍或至少100倍。在本發明的其他實施方式中，變異的Fc區特異性結合一個或多個FcR，相對於包括野生型Fc區的分子，親和力是至少65%，優選地至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少100%、至少125%、至少150%、至少175%、至少200%、至少225%或至少250%更大。這類測量可以是體內或體外測試，並且在優選的實施方式中是體外測試比如ELISA或表面等離子共振測試。
在不同的實施方式中，分子包括變異的Fc區，其中所述變體激動(agonize)FcγR受體的至少一種活性或對抗FcγR受體的至少一種活性。在優選的實施方式中，分子包括這樣的變體：其激動(或對抗)FcγRIIB的一種或多種活性，例如，B細胞受體-介導的信號傳導、B細胞的啟動、B細胞增殖、抗體產生、B細胞的細胞內鈣流入、細胞週期進程、FcγRIIB-介導的對FcεRI信號傳導的抑制、FcγRIIB的磷酸化、SHIP募集、SHIP磷酸化和與Shc的締合或在FcγRIIB信號轉導途徑中一個或多個下游分子(例如，MAP激酶、JNK、p38或Akt)的活性。在另一實施方式中，分子包括變體，所述變體激動(或對抗)FcεRI的一種或多種活性，例如，肥大細胞啟動、鈣動員、脫粒、細胞因數產生或5-羥色胺釋放。
在某些實施方式中，分子包括包含結構域的Fc區或來自兩個或更多個IgG同種型(例如，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)的區域。由於它們的鉸鏈和/或Fc區中氨基酸序列的差異，各種IgG同種型展示不同的物理和功能特性，包括血清半衰期、補體結合、FcγR結合親和力和效應子功能活性(例如ADCC、CDC等)，例如如下面文獻所描述：Flesch, B.K. and Neppert, J. (1999) “Functions Of The Fc Receptors For Immunoglobulin G,” J. Clin. Lab. Anal. 14:141-156；Chappel, M.S.等(1993) “Identification Of A Secondary Fc Gamma RI Binding Site Within A Genetically Engineered Human IgG Antibody,” J. Biol. Chem. 33:25124-25131；Chappel, M.S.等(1991) “Identification Of The Fc Gamma Receptor Class I Binding Site In Human IgG Through The Use Of Recombinant IgG1/IgG2 Hybrid And Point-Mutated Antibodies,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:9036-9040；Brüggemann, M.等(1987) “Comparison Of The Effector Functions Of Human Immunoglobulins Using A Matched Set Of Chimeric Antibodies,” J. Exp. Med 166:1351-1361。該類型的變異的Fc區可單獨使用或組合氨基酸修飾使用，以實現Fc-介導的效應子功能和/或結合活性。相對于包括野生型Fc區的本發明的分子，在組合時，氨基酸修飾和IgG鉸鏈/Fc區可展示類似的功能(例如，對FcγRIIA增加的親和力)並且可疊加作用，或更優選地，協同作用，以修飾本發明分子的效應子功能。在其他實施方式中，氨基酸修飾和IgG Fc區可展示相反的功能(例如，對於FcγRIIA分別增加的和降低的親和力)，並且相對於不包括Fc區或包括相同同種型的野生型Fc區的本發明分子，可用于選擇性減輕或降低本發明分子的特定功能。
在優選的具體實施方式中，分子包括變異的Fc區，其中所述變異的Fc區相對於野生型Fc區包括至少一個氨基酸的修飾，以便所述分子具有對FcR改變的親和力，條件是基於諸如由Sondermann, P.等(2000) “The 3.2-A Crystal Structure Of The Human IgG1 Fc Fragment-Fc GammaRIII Complex,”Nature 406:267-273公開的Fc-FcR相互作用的晶體學和結構分析，所述變異Fc區在直接接觸FcγR的位置不具有取代。Fc區中直接接觸FcγR的位置的實例是氨基酸殘基234-239 (鉸鏈區)、氨基酸殘基265-269 (B/C環)、氨基酸殘基297-299 (C’/E環)和氨基酸殘基327-332 (F/G環)。在一些實施方式中，本發明的分子包括變異的Fc區，其包括至少一個殘基的修飾，所述殘基基於結構和晶體學分析不直接接觸FcγR，例如不在Fc-FcγR結合位點內。
變異的Fc區是本領域熟知的，並且任何已知的Fc變體可用于本發明，以賦予或改變包括Fc區的本發明的分子(或其部分)展示的效應子功能，如在例如NK依賴性或巨噬細胞依賴性測定中功能測定的。例如，Antibody Engineering Technology Art (抗體工程化技術工藝)公開了鑒定為改變效應子功能的Fc區變體，並且其中公開的任何適當的均變體可用于本發明的分子。
在某些實施方式中，分子包括變異的Fc區，其在一個或多個區中具有一個或多個氨基酸修飾，所述修飾(一個或多個)(相對於野生型Fc區)改變了變異的Fc區對啟動性FcγR (比如FcγRIIA或FcγRIIIA)相對於對抑制性FcγR (比如FcγRIIB)的親和力比例：
當Fc變體的親和力比大於1時，本發明的方法在為期望增強FcγR介導的效應細胞功能(例如，ADCC)的效力的疾病、病症或感染——例如，癌症或感染疾病——提供治療性或預防性治療或改善其症狀方面尤其有用。在Fc變體的親和力的比小於1的情況下，本發明的方法在為期望降低FcγR介導的效應細胞功能的效力的疾病或病症——例如，自身免疫或炎症病症——提供治療性或預防性治療或改善其症狀方面尤其有用。表3根據它們的親和力比是否大於或小於1列舉了示例性的單、雙、三、四和五突變，並且與這些突變相關的更多資訊可見於Antibody Engineering Technology Art(抗體工程化技術工藝)中。
在具體的實施方式中，在變異的Fc區中，任何氨基酸修飾(例如，取代)在下述任何位置：235、240、241、243、244、247、262、263、269、298、328或330，和優選地，下述殘基的一個或多個：A240、I240、L241、L243、H244、N298、I328或V330。在不同的具體實施方式中，在變異的Fc區中，任何氨基酸修飾(例如，取代)在下述任何位置：268、269、270、272、276、278、283、285、286、289、292、293、301、303、305、307、309、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、416、419、430、434、435、437、438或439，和優選地，下述殘基的一個或多個：H280、Q280、Y280、G290、S290、T290、Y290、N294、K295、P296、D298、N298、P298、V298、I300或L300。
在優選的實施方式中，在以改變的親和力結合FcγR的變異的Fc區中，任何氨基酸修飾(例如，取代)在下述任何位置：255、256、258、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、300、301、303、305、307、309、312、320、322、326、329、330、332、331、333、334、335、337、338、339、340、359、360、373、376、416、419、430、434、435、437、438或439。優選地，變異的Fc區具有任何下述殘基：A256、N268、Q272、D286、Q286、S286、A290、S290、A298、M301、A312、E320、M320、Q320、R320、E322、A326、D326、E326、N326、S326、K330、T339、A333、A334、E334、H334、L334、M334、Q334、V334、K335、Q335、A359、A360或A430。
在不同的實施方式中，在以降低的親和力結合FcγR(經其Fc區)的變異的Fc區中，任何氨基酸修飾(例如，取代)在下述任何位置：252、254、265、268、269、270、278、289、292、293、294、295、296、298、300、301、303、322、324、327、329、333、335、338、340、373、376、382、388、389、414、416、419、434、435、437、438或439。
在不同的實施方式中，在以增強的親和力結合FcγR(經其Fc區)的變異的Fc區中，任何氨基酸修飾(例如，取代)在下述任何位置：280、283、285、286、290、294、295、298、300、301、305、307、309、312、315、331、333、334、337、340、360、378、398或430。在不同的實施方式中、在以增強的親和力結合FcγRIIA的變異的Fc區中，任何下述殘基：A255、A256、A258、A267、A268、N268、A272、Q272、A276、A280、A283、A285、A286、D286、Q286、S286、A290、S290、M301、E320、M320、Q320、R320、E322、A326、D326、E326、S326、K330、A331、Q335、A337或A430。
優選的變體包括在任何下述位置的一個或多個修飾：228、230、231、232、233、234、235、239、240、241、243、244、245、247、262、263、264、265、266、271、273、275、281、284、291、296、297、298、299、302、304、305、313、323、325、326、328、330或332。
尤其優選的變體包括選自組A-AI的一個或多個修飾：
尤其優選的變體包括選自組1-105的一個或多個修飾：
在一個實施方式中，特異性結合HER2/neu的分子(例如，抗HER2/neu抗體)，和/或特異性結合PD-1的分子(例如，抗PD-1抗體)包括在Fc區中具有至少一個修飾的變異的Fc區。在一個實施方式中，特異性結合HER2/neu的分子(例如，抗HER2/neu抗體)包括變異的Fc區，所述變異的Fc區具有至少一個修飾，相對於包括野生型Fc區的相同抗體，所述修飾增強了與FcγRIIA的結合和/或增強了ADCC活性。在某些實施方式中，變異的Fc區包括選自下述的至少一個取代：L235V、F243L、R292P、Y300L、V305I和P396L，其中所述編號是如Kabat中EU索引的編號。
在具體的實施方式中，變異的Fc區包括： (A)選自F243L、R292P、Y300L、V305I和P396L的至少一個取代； (B)選自下述的至少兩個取代： (1) F243L和P396L； (2) F243L和R292P；和 (3) R292P和V305I； (C)選自下述的至少三個取代： (1) F243L、R292P和Y300L； (2) F243L、R292P和V305I； (3) F243L、R292P和P396L；和 (4) R292P、V305I和P396L； (D)選自下述的至少四個取代： (1) F243L、R292P、Y300L和P396L；和 (2) F243L、R292P、V305I和P396L；或 (E)選自下述的至少五個取代： (1) F243L、R292P、Y300L、V305I和P396L；和 (2) L235V、F243L、R292P、Y300L和P396L。
在另一具體的實施方式中，變異的Fc區包括下述取代： (A) F243L、R292P和Y300L； (B) L235V、F243L、R292P、Y300L和P396L；或 (C) F243L、R292P、Y300L、V305I和P396L。
在一個實施方式中，特異性結合PD-1的分子(例如，抗PD-1抗體)，包括變異的Fc區，其相對於包括野生型Fc區的相同抗體具有降低與FcγRIIIA (CD16A)的結合和/或降低ADCC活性的至少一個修飾。在某些實施方式中，變異的Fc區包括選自L234A、L235A、D265A、N297Q和N297G的至少一個取代，其中所述編號是如Kabat中EU索引的編號。在具體的實施方式中，變異的Fc區包括下述取代：L234A和L235A。
可選地，使用固有地展示與FcγRIIIA (CD16A)降低的(或基本上沒有)結合和/或降低的效應子功能(相對於野生型IgG1 Fc區展示的結合(SEQ ID NO: 1))的Fc區。在具體的實施方式中，特異性結合HER2/neu 的分子(例如，抗HER2/neu抗體)，和/或特異性結合PD-1的分子(例如，抗PD-1抗體)，包括IgG2 Fc區(SEQ ID NO: 50)或IgG4 Fc區(SEQ ID NO: 52)，任選地缺少C-末端氨基酸殘基。在使用IgG4 Fc區的情況下，本發明也包括引入穩定化突變，比如S228P，如通Kabat中闡釋的EU索引編號(Lu等, (2008) “The Effect Of A Point Mutation On The Stability Of Igg4 As Monitored By Analytical Ultracentrifugation,” J. Pharmaceutical Sciences 97:960-969)，以減少鏈交換的發生率。本領域已知的其他穩定化突變可引入IgG4 Fc區中(Peters, P等, (2012) “Engineering an Improved IgG4 Molecule with Reduced Disulfide Bond Heterogeneity and Increased Fab Domain Thermal Stability,” J. Biol. Chem. 287:24525-24533；PCT專利公開號WO 2008/145142)。在具體的實施方式中，特異性結合PD-1的分子(例如，抗PD-1抗體)，包括IgG4 Fc區和S228P突變。
在其他實施方式中，本發明包括本領域已知的任何Fc變體，比如下述文獻中公開的那些Fc變體，的用途：Jefferis, R.等(2002) “Interaction Sites On Human IgG-Fc For FcgammaR: Current Models,” Immunol. Lett. 82:57-65；Presta, L.G.等(2002) “Engineering Therapeutic Antibodies For Improved Function,” Biochem. Soc. Trans. 30:487-90；Idusogie, E.E.等(2001) “Engineered Antibodies With Increased Activity To Recruit Complement,” J. Immunol. 166:2571-75；Shields, R.L.等(2001) “High Resolution Mapping Of The Binding Site On Human IgG1 For Fc Gamma RI, Fc Gamma RII, Fc Gamma RIII, And FcRn And Design Of IgG1 Variants With Improved Binding To The Fc gamma R,” J. Biol. Chem. 276:6591-6604；Idusogie, E.E.等(2000) “Mapping Of The C1q Binding Site On Rituxan, A Chimeric Antibody With A Human IgG Fc,” J. Immunol. 164:4178-84；Reddy, M.P.等(2000) “Elimination Of Fc Receptor-Dependent Effector Functions Of A Modified IgG4 Monoclonal Antibody To Human CD4,” J. Immunol. 164:1925-1933；Xu, D.等(2000) “In Vitro Characterization of Five Humanized OKT3 Effector Function Variant Antibodies,” Cell. Immunol. 200:16-26；Armour, K.L.等(1999) “Recombinant human IgG Molecules Lacking Fcgamma Receptor I Binding And Monocyte Triggering Activities,” Eur. J. Immunol. 29:2613-24；Jefferis, R.等(1996) “Modulation Of Fc(Gamma)R And Human Complement Activation By IgG3-Core Oligosaccharide Interactions,” Immunol. Lett. 54:101-04；Lund, J.等(1996) “Multiple Interactions Of IgG With Its Core Oligosaccharide Can Modulate Recognition By Complement And Human Fc Gamma Receptor I And Influence The Synthesis Of Its Oligosaccharide Chains,” J. Immunol. 157:4963-4969；Hutchins等(1995) “Improved Biodistribution, Tumor Targeting, And Reduced Immunogenicity In Mice With A Gamma 4 Variant Of Campath-1H,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 92:11980-84；Jefferis, R.等(1995) “Recognition Sites On Human IgG For Fc Gamma Receptors: The Role Of Glycosylation,” Immunol. Lett. 44:111-17；Lund, J.等(1995) “Oligosaccharide-Protein Interactions In IgG Can Modulate Recognition By Fc Gamma Receptors,” FASEB J. 9:115-19；Alegre, M.L.等(1994) “A Non-Activating "Humanized" Anti-CD3 Monoclonal Antibody Retains Immunosuppressive Properties In Vivo,” Transplantation 57:1537-1543；Lund等(1992) “Multiple Binding Sites On The CH2 Domain Of IgG For Mouse Fc Gamma R11,” Mol. Immunol. 29:53-59；Lund等(1991) “Human Fc Gamma RI And Fc Gamma RII Interact With Distinct But Overlapping Sites On Human IgG,” J. Immunol. 147:2657-2662；Duncan, A.R.等(1988) “Localization Of The Binding Site For The Human High-Affinity Fc Receptor On IgG,” Nature 332:563-564；美國專利號5,624,821、5,885,573、6,194,551、7,276,586和7,317,091和PCT專利公開號WO 00/42072和WO 99/58572。在一些實施方式中，本發明的分子進一步包括一個或多個糖基化位點，以便一個或多個碳水化合物部分被共價連接至分子。優選地，與未修飾的分子相比，Fc區中具有一個或多個糖基化位點和/或一個或多個修飾的本發明的分子賦予或具有增強的抗體介導的效應子功能，例如，增強的ADCC活性。在一些實施方式中，本發明進一步包括這樣的分子：所述分子包括已知直接或間接與Fc區的碳水化合物部分相互作用的氨基酸的一個或多個修飾，所述氨基酸包括但不限於在下述位置的氨基酸：241、243、244、245、245、249、256、258、260、262、264、265、296、299和301。直接或間接與Fc區的碳水化合物部分相互作用的氨基酸是本領域已知的，見，例如，Jefferis, R.等(1995) “Recognition Sites On Human IgG For Fc Gamma Receptors: The Role Of Glycosylation,” Immunol. Lett. 44:111-17。
在另一實施方式中，本發明包括這樣的分子：所述分子已經通過在分子的一個或多個位點中引入一個或多個糖基化位點被修飾，優選不改變分子的功能，例如，與靶抗原或FcγR的結合活性。糖基化位點可被引入到本發明分子的可變結構域和/或恒定結構域中。
因此，在一些實施方式中，本發明包括通過添加或刪除糖基化位點修飾本發明分子的碳水化合物含量的方法。修飾抗體(和包括抗體結構域，例如，Fc區的分子)的碳水化合物含量的方法是本領域熟知的並且包括在本發明中，見，例如，美國專利號6,218,149、EP 0 359 096 B1、美國專利公開號US 2002/0028486、WO 03/035835、美國專利公開號2003/0115614、美國專利號6,218,149、美國專利號6,472,511，其所有均通過引用以其整體併入本文。在其他實施方式中，本發明包括通過刪除分子的一個或多個內源碳水化合物部分，修飾本發明分子的碳水化合物含量的方法。在具體的實施方式中，本發明包括通過修飾與297相鄰的位置而改變抗體Fc區的糖基化位點。在具體的實施方式中，本發明包括修飾296位，從而296位而不是297位被糖基化。
可通過技術，比如在Antibody Engineering Technology Art(抗體工程化技術工藝)中描述的那些技術，或通過其他方式，修飾效應子功能。例如，可在Fc區中引入半胱氨酸殘基，從而允許在該區域中形成鏈間二硫鍵，導致產生可具有改善的內化能力和/或提高的補體-介導的細胞殺傷和ADCC的同源二聚化抗體。見Caron, P.C.等(1992) “Engineered Humanized Dimeric Forms Of IgG Are More Effective Antibodies,” J. Exp. Med. 176:1191-1195；Shopes, B. (1992) “A Genetically Engineered Human IgG Mutant With Enhanced Cytolytic Activity,” J. Immunol. 148(9):2918-2922。也可使用如在Wolff, E.A.等(1993) “Monoclonal Antibody Homodimers: Enhanced Antitumor Activity In Nude Mice,” Cancer Research 53:2560-2565中描述的異源雙功能交聯劑製備具有增強的抗腫瘤活性的同源二聚化抗體。可選地，抗體可被工程化，其具有雙Fc區並且從而可具有增強的補體分解和ADCC能力(Stevenson, G.T.等(1989) “A Chimeric Antibody With Dual Fc Regions (bisFabFc) Prepared By Manipulations At The IgG Hinge,” Anti-Cancer Drug Design 3:219-230。
E.多肽綴合物(Conjugates)
本發明的分子可與異源多肽或其部分經重組融合或化學上綴合(包括共價和非共價綴合)以產生融合蛋白。優選地，本發明的分子(尤其是抗體)與異源多肽的至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90或至少100個氨基酸融合，以產生期望的融合蛋白。融合不必是直接的，也可通過連接體序列發生。分子(例如，抗體和多肽)可與治療劑綴合，以便修飾給定的生物學應答，影響(例如，延長)治療劑的血清半衰期或使治療劑靶向至細胞的特定的亞類。它們也可與標記序列(例如，六組氨酸肽或“flag”標籤)融合，以利於純化。用於將這類治療性部分與抗體綴合的技術是熟知的；見，例如，Hellstrom等, “Antibodies For Drug Delivery”, in Controlled Drug Delivery (第2版, Robinson等(編輯), 1987, pp. 623-53, Marcel Dekker, Inc.)。
另外的融合蛋白可通過基因改組、基序改組、外顯子改組和/或密碼子改組(統稱為“DNA改組”)的技術產生。DNA改組可用于改變本發明分子的活性(例如，具有更高親和力和較低解離速率的抗體)。本發明的分子或它們的編碼核酸在重組之前，可通過易錯PCR、隨機核苷酸***或其他方法進行隨機誘變而被進一步改變。編碼本發明分子的多核苷酸的一個或多個部分，可與一個或多個異源分子的一個或多個組分、基序、區段、部分、結構域、片段等重組。
F.雙抗體和DART®雙抗體
本發明也提供了雙抗體和雙親和力重靶向試劑(尤其是DART®雙抗體(MacroGenics, Inc.))。因此，本發明另外包括雙抗體(尤其地，DART®雙抗體)分子，其包括形成至少兩個表位結合位點的至少兩個共價結合的多肽鏈，其中一個表位結合位點特異性結合HER2/neu和其中第二個表位結合位點結合細胞表面受體(或其配體)，其調節免疫檢查點。優選地，這類雙抗體結合HER2/neu和PD-1。尤其地，包括雙抗體和DART，其包括來自本發明的抗HER2/neu抗體和抗PD-1抗體的抗原結合結構域。
下面描述了同源二聚化雙抗體和穩定的、共價結合的異源二聚化非單-特異性雙抗體的設計和構建，例如，美國專利公開號2013-0295121、2010-0174053和2009-0060910、歐洲專利公開號EP 2714079、EP 2601216、EP 2376109、EP 2158221和PCT公開號WO 2012/162068、WO 2012/018687、WO 2010/080538、WO 2008/157379、WO 2006/113665和Sloan, D.D.等(2015) “Targeting HIV Reservoir in Infected CD4 T Cells by Dual-Affinity Re-targeting Molecules (DARTs) that Bind HIV Envelope and Recruit Cytotoxic T Cells,” PLoS Pathog. 11(11):e1005233. doi: 10.1371/journal.ppat.1005233；Al Hussaini, M.等(2015) “Targeting CD123 In AML Using A T-Cell Directed Dual-Affinity Re-Targeting (DART®) Platform,” Blood 127(1):122-131；Chichili, G.R.等(2015) “A CD3xCD123 Bispecific DART For Redirecting Host T Cells To Myelogenous Leukemia: Preclinical Activity And Safety In Nonhuman Primates,” Sci. Transl. Med. 7(289):289ra82；Moore, P.A.等(2011) “Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T-Cell Killing Of B-Cell Lymphoma,” Blood 117(17):4542-4551；Veri, M.C.等(2010) “Therapeutic Control Of B Cell Activation Via Recruitment Of Fcgamma Receptor IIb (CD32B) Inhibitory Function With A Novel Bispecific Antibody Scaffold,” Arthritis Rheum. 62(7):1933-1943；Johnson, S.等(2010) “Effector Cell Recruitment With Novel Fv-Based Dual-Affinity Re-Targeting Protein Leads To Potent Tumor Cytolysis And in vivo B-Cell Depletion,” J. Mol. Biol. 399(3):436-449；Marvin, J.S.等(2005) “Recombinant Approaches To IgG-Like Bispecific Antibodies,” Acta Pharmacol. Sin. 26:649-658；Olafsen, T.等(2004) “Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications,” Prot. Engr. Des. Sel. 17:21-27；Holliger, P.等(1993) “’Diabodies’: Small Bivalent And Bispecific Antibody Fragments,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 90:6444-6448。雙抗體分子的每條多肽鏈均包括來自相同或不同抗體的VL區和VH區，其被共價連接，以便結構域被限制自組裝。多肽鏈中的兩條的相互作用將產生兩個VL-VH配對，形成兩個表位結合位點，即，二價分子。結構域可通過肽連接體分開並且多肽鏈可被工程化，以在每條鏈上包括至少一個半胱氨酸殘基，從而可形成鏈間二硫鍵來穩定雙抗體。
在優選的實施方式中，雙抗體的第一多肽鏈包括： (i)結構域(A)，其包括對HER2/neu的表位特異性的第一免疫球蛋白的輕鏈可變結構域的結合區(VL1)； (ii)結構域(B)，其包括對PD-1的表位特異性的第二免疫球蛋白的重鏈可變結構域的結合區(VH2)；和 (iii)任選地，結構域(C)。 這類雙抗體的第二多肽鏈包括： (i)結構域(D)，其包括對這類PD-1的表位特異性的第二免疫球蛋白的輕鏈可變結構域的結合區(VL2)； (ii)結構域(E)，包括對這類HER2/neu的表位特異性的第一免疫球蛋白的重鏈可變結構域的結合區(VH1)；和 (iii)任選地，結構域(F)。
雙抗體結構域(A)和(B)不彼此締合形成表位結合位點。類似地，雙抗體結構域(D)和(E)不彼此締合形成表位結合位點。相反地，雙抗體結構域(A)和(E)締合形成結合HER2/neu表位的結合位點，並且雙抗體結構域(B)和(D)締合形成結合PD-1表位的結合位點。
第一和第二多肽鏈的可變結構域可以可選地顛倒，以便雙抗體的第一多肽鏈包括： (i)結構域(A)，其包括對於PD-1的表位特異性的第二免疫球蛋白的輕鏈可變結構域的結合區(VL2)； (ii)結構域(B)，其包括對於HER2/neu的表位特異性的第一免疫球蛋白的重鏈可變結構域的結合區(VH1)；和 (iii)任選地，結構域(C)； 並且這類雙抗體的第二多肽鏈包括： (i)結構域(D)，其包括對於這類HER2/neu的表位特異性的第一免疫球蛋白的輕鏈可變結構域的結合區(VL1)； (ii)結構域(E)，其包括對於這類PD-1的表位特異性的第二免疫球蛋白的重鏈可變結構域的結合區(VH2)；和 (iii)任選地，結構域(F)。
在顛倒的構造中，雙抗體結構域(A)和(E)締合形成結合PD-1表位的結合位點，並且雙抗體結構域(B)和(D)締合形成結合HER2/neu表位的結合位點。
當存在時，結構域(C)和(F)共價締合在一起。結構域(C)和(F)可以是異源二聚體促進結構域，其利於第一和第二多肽鏈的相互作用。異源二聚化結構域可用於產生雙抗體，如下述文獻中描述的：例如，PCT公佈號：WO 2012/162068、WO 2012/018687、WO 2010/080538、WO 2008/157379；和WO 2006/113665，其每一篇通過引用併入本文。結構域(C)和/或(F)可包括Fc結構域或其部分(例如CH2結構域或CH3結構域)。Fc結構域或其部分可源自任何免疫球蛋白同種型或同種異型，包括但不限於，IgA、IgD、IgG、IgE和IgM。在優選的實施方式中，Fc結構域(或其部分)源自IgG。在具體的實施方式中，IgG同種型是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其同種異型。在一個實施方式中，雙抗體分子包括Fc結構域，所述Fc結構域包括獨立地選自任何免疫球蛋白同種型的CH2結構域和CH3結構域(即，Fc結構域包括源自IgG的CH2結構域和源自IgE的CH3結構域或源自IgG1的CH2結構域和源自IgG2的CH3結構域等)。Fc結構域可被工程化到組成本發明的雙抗體分子的多肽鏈中相對於所述多肽鏈的其他結構域或部分的任何位置中(例如，Fc結構域或其部分，可以在多肽鏈的VL和VH結構域的C-末端；或其可以在VL和VH結構域的N-末端；或其可以在一個結構域的N-末端和另一個的C-末端(即，在多肽鏈的兩個結構域之間)等)。
雙抗體分子的多肽鏈中的Fc結構域優選地二聚化，從而導致形成展示免疫球蛋白樣特性，例如，Fc-FcγR，相互作用的雙抗體分子。包括Fc的雙抗體可以是例如包括兩條多肽鏈的二聚體，每條多肽鏈各包括VH結構域、VL結構域和Fc結構域。所述多肽鏈的二聚化產生包括Fc結構域的二價雙抗體，但是結構與未修飾的二價抗體不同。這類雙抗體分子相對于野生型免疫球蛋白展示改變的表型，例如，改變的血清半衰期、結合特性等。在其他實施方式中，包括Fc結構域的雙抗體分子可以是四聚體。這類四聚體包括兩條‘較重的’多肽鏈，即，包括VL、VH和Fc結構域的多肽鏈，和兩條‘較輕的’多肽鏈，即，包括VL和VH的多肽鏈。較輕的鏈和較重的鏈相互作用以形成單體，並且所述單體經它們的未配對的Fc結構域相互作用，以形成Ig樣分子。這類Ig樣雙抗體是四價的。
如上描述形成四特異性的雙抗體分子需要四條不同多肽鏈的相互作用。這類相互作用難以在單細胞重組生產體系中有效率地實現，原因是許多潛在的鏈的變體錯配。降低錯配概率的一個方案是將“杵入臼(knobs-into-holes)”型突變工程化到期望的多肽鏈對中。這類突變相對于同源二聚化有利於異源二聚化。例如，就Fc-Fc-相互作用而言，氨基酸取代(優選地用包括形成“杵”的大側基的氨基酸，例如，色氨酸進行取代)可被引入到CH2或CH3結構域中，以便空間干擾會防止與類似突變的結構域的相互作用，並且會迫使突變的結構域與這樣的結構域配對：在所述結構域中，已經工程化進了互補或適應性突變，即‘臼(hole)’，(例如用甘氨酸進行取代)。這組突變可被工程化到任何組成雙抗體分子的多肽對中，並且進一步地，可被工程化到所述多肽鏈對的任何部分中。相比同二聚化而利於異源二聚化的蛋白質工程的方法是本領域熟知的，尤其就免疫球蛋白樣分子的工程化而言，並且包括在本文中(見例如，Ridgway等(1996) “'Knobs-Into-Holes' Engineering Of Antibody CH3 Domains For Heavy Chain Heterodimerization,” Protein Engr. 9:617-621；Atwell等(1997) “Stable Heterodimers From Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using A Phage Display Library,” J. Mol. Biol. 270: 26-35；和Xie等(2005) “A New Format Of Bispecific Antibody: Highly Efficient Heterodimerization, Expression And Tumor Cell Lysis,” J. Immunol. Methods 296:95-101；其每一篇通過引用以其整體併入本文。
本發明也包括雙抗體分子，其包括變異的Fc或變異的鉸鏈-Fc結構域(或其部分)，相對於相當的野生型Fc結構域或鉸鏈-Fc結構域(或其部分)，所述變異的Fc結構域包括至少一種氨基酸修飾(例如取代，***缺失)。包括變異的Fc結構域或鉸鏈-Fc結構域(或其部分)的分子(例如，抗體)，相對於包括野生型Fc結構域或鉸鏈-Fc結構域或其部分的分子，通常具有改變的表型。變體表型可表達為改變的血清半衰期、改變的穩定性、改變的對細胞酶的易感性或在NK依賴性或巨噬細胞依賴性試驗中測定的改變的效應子功能。上面公開了被鑒定為改變效應子功能的Fc結構域修飾。
本發明也包括這樣的分子，其包括鉸鏈結構域。鉸鏈結構域源自任何免疫球蛋白同種型或包括IgA、IgD、IgG、IgE和IgM的同種異型。在優選的實施方式中，鉸鏈結構域源自IgG，其中IgG同種型是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其同種異型。所述鉸鏈結構域可與Fc結構域一起被工程化到組成雙抗體分子的多肽鏈中，以便雙抗體分子包括鉸鏈-Fc結構域。在某些實施方式中，鉸鏈和Fc結構域獨立地選自本領域已知的或本文列舉的任何免疫球蛋白同種型。在其他實施方式中，鉸鏈和Fc結構域由多肽鏈的至少一個其他結構域，例如VL結構域，分開。鉸鏈結構域，或任選地鉸鏈-Fc結構域，可被工程化到本發明的多肽鏈中相對於所述多肽鏈的其他結構域或部分的任何位置中。在某些實施方式中，本發明的多肽鏈包括鉸鏈結構域，該鉸鏈結構域在多肽鏈的C-末端，其中所述多肽鏈不包括Fc結構域。在仍其他實施方式中，本發明的多肽鏈包括鉸鏈-Fc結構域，該鉸鏈-Fc結構域在多肽鏈的C-末端。在進一步實施方式中，本發明的多肽鏈包括鉸鏈-Fc結構域，該鉸鏈-Fc結構域在多肽鏈的N-末端。
儘管不意圖受具體作用機制的限制，相對於本領域已知的治療抗體，本發明的雙抗體分子展示增強的治療效力，部分是由於雙抗體特異性結合以降低水準表達特定抗原(例如，Her2/neu或PD-1)的靶細胞的能力所致，例如，憑藉雙抗體由於雙抗體-表位相互作用的改善的親合力而較長時間保留在靶細胞上的能力。因此，本發明的雙抗體在治療、預防或管控其中靶抗原在靶細胞群中低水準表達的亞群體的疾病或病症如癌症中具有特別效用。
雙抗體分子可使用各種方法產生，包括從頭蛋白質合成和編碼結合蛋白質的核酸的重組表達。可通過重組方法(例如，較早製備的期望多核苷酸的變體的PCR誘變)或通過固相DNA合成產生期望的核酸序列。優選地使用重組表達方法。因為遺傳密碼的簡並性，多種核酸序列編碼每種免疫球蛋白氨基酸序列，並且本發明包括編碼本文所述的結合蛋白質的所有核酸。
G.抗體的生產
可以以任何各種方式產生或獲得本發明優選實施方式的抗體。例如，這類抗體可從血漿獲得、經合成獲得、經重組獲得或經轉基因獲得、經細胞(例如，雜交瘤培養)獲得等。合成蛋白質的生產已經描述在，例如，Dawson, P.E.等(2000) “Synthesis Of Native Proteins By Chemical Ligation,” Annu. Rev Biochem. 69:923-960；Wilken, J.等(1998) “Chemical Protein Synthesis,” Curr. Opin. Biotechnol. 9(4):412-426；和Kochendoerfer, G.G.等(1999) “Chemical Protein Synthesis,”Curr. Opin. Chem. Biol. 3(6):665-671中。
可通過如下重組製備抗體：首先從宿主動物分離製備的抗體，獲得基因序列，和使用基因序列在宿主細胞(例如，CHO細胞)中重組表達抗體。包含感興趣的多核苷酸的載體可通過許多適當方式中的任何方式被引入到宿主細胞中，所述適當方式包括電穿孔、採用氯化鈣、銣氯化物、磷酸鈣、DEAE-葡聚糖或其他物質的轉染；微彈轟擊(microprojectile bombardment)；脂轉染；和感染(例如，在載體是感染劑諸如痘苗病毒的情況下)。引入載體或多核苷酸的選擇將通常取決於宿主細胞的特徵。
能夠過表達異源DNA的任何宿主細胞均可被使用，用於分離編碼感興趣的抗體、多肽或蛋白質的基因的目的。合適的哺乳動物宿主細胞的非的限制性實例包括但不限於COS、HeLa和CHO細胞。優選地，相比於宿主細胞中相應的感興趣的內源抗體或蛋白質（如果存在），宿主細胞以約5-倍，更優選10-倍，甚至更優選20-倍的水準表達cDNA。通過免疫試驗或FACS實現篩選特異性結合HER2/neu或PD-1的宿主細胞。經細胞(例如，雜交瘤)培養生產抗體已經描述在下述文獻中：例如，Laffly, E.等(2005) “Monoclonal And Recombinant Antibodies, 30 Years After...,” Hum. Antibodies. 14(1-2):33-55；Aldington, S.等(2007) “Scale-Up Of Monoclonal Antibody Purification Processes,” J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 848(1):64-78；S.S. Farid (2006) J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 848(1):8-18；Birch, J.R.等(2006) “Antibody Production,” Adv. Drug Deliv. Rev. 58(5-6):671-685；Even, M.S.等(2006) “Serum-Free Hybridoma Culture: Ethical, Scientific And Safety Considerations,” Trends Biotechnol. 24(3):105-108；Graumann, K.等(2006) “Manufacturing Of Recombinant Therapeutic Proteins In Microbial Systems,” Biotechnol. J. 1(2):164-86、美國專利號7,112,439；和美國專利公開號20070037216和20040197866。
可應用的另一方法是在植物(例如，煙草)或轉基因奶中表達抗體序列。用於在植物或奶中重組表達抗體的適當的方法已經被公開了(見，例如，Peeters, K.等(2001) “Production Of Antibodies And Antibody Fragments In Plants,” Vaccine 19:2756；Lonberg, N.等(1995) “Human Antibodies From Transgenic Mice,” Int. Rev. Immunol 13:65-93；和Pollock等(1999) “Transgenic Milk As A Method For The Production Of Recombinant Antibodies,” J. Immunol Methods 231:147-157)。
製備抗體衍生物，例如，人源化的抗體、優化的抗體、單鏈抗體等的合適的方法是本領域已知的。可經噬菌體展示方法產生具有例如對於其抗原增加的親和力的抗體的衍生物。稱為親和力成熟的技術採用誘變或CDR步移（walking）和使用關聯抗原（cognate antigen）的再選擇，來鑒定與初始抗體或親本抗體相比以更高的親和力結合抗原的抗體(見，例如，Glaser, S.M.等(1992) “Antibody Engineering By Codon-Based Mutagenesis In A Filamentous Phage Vector System,” J. Immunology 149:3903；Wu, H.等(1998) “Stepwise in vitro Affinity Maturation Of Vitaxin, An AlphaV Beta3-mAb,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 95:6037-6042；Yelton, D.E.等(1995) “Affinity Maturation Of The BR96 Anti-Carcinoma Antibody By Codon-Based Mutagenesis,” J. Immunology 155:1994-2004；Schier, R等(1996) “Isolation Of Picomolar Affinity anti-c-erbB-2 Single-Chain Fv By Molecular Evolution Of The Complementarity Determining Regions In The Center Of The Antibody Binding Site,” J. Mol. Bio. 263:551-567)。
可使用轉基因小鼠產生全人抗體(也稱為完全人抗體)，所述小鼠不能表達內源免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因，但是可表達人重鏈和輕鏈基因。用於產生人抗體的該技術的概述描述在以下文獻中：例如，Lonberg, N.等(1995) “Human Antibodies From Transgenic Mice,” Int. Rev. Immunol. 13:65-93，和美國專利號5,633,425。也可使用本領域已知的其他技術，包括噬菌體展示文庫(如Hoogenboom, H.R.等(1991) “By-Passing Immunisation. Human Antibodies From Synthetic Repertoires Of Germline VH Gene Segments Rearranged In Vitro,” J. Mol. Biol. 227:381和Marks, J.D.等(1991) “By-Passing Immunization. Human Antibodies From V-Gene Libraries Displayed On Phage,” J. Mol. Biol. 222:581描述的)或“導向選擇（guided selection）” (如例如Jespers, L.S.等(1994) “Guiding The Selection Of Human Antibodies From Phage Display Repertoires To A Single Epitope Of An Antigen,” Biotechnology 12:899-903中描述的)產生全人抗體。被設計為產生更期望的(例如，全人抗體)或更強免疫應答的轉基因動物也可用於產生人源化抗體或人抗體。這類技術的例子是Xenomouse™ (Abgenix, Inc., Fremont, CA)和HuMAb-Mouse®和TC Mouse™ (都來自Medarex, Inc., Princeton, NJ)。
本發明包括對本文所述抗體(即，抗HER2/neu抗體和抗PD-1抗體)的修飾，包括功能上等同的抗體和不明顯影響這類分子性質的融合多肽以及具有增強的降低的活性的變體。多肽的修飾在本領域中是常規實操作，因而不需要在本文詳細描述。修飾的多肽的實例包括這樣的多肽：其具有氨基酸殘基的保守取代、未明顯有害改變功能活性的氨基酸的一個或多個缺失或添加，或使用化學類似物。可彼此保守取代的氨基酸殘基包括但不限於：甘氨酸/丙氨酸；絲氨酸/蘇氨酸；纈氨酸/異亮氨酸/亮氨酸；天冬醯胺/穀氨醯胺；天冬氨酸/谷氨酸；賴氨酸/精氨酸；和苯基丙氨酸/酪氨酸。這些多肽還包括糖基化和非糖基化多肽以及具有其它翻譯後修飾的多肽，所述其它翻譯後修飾，諸如例如，用不同糖進行糖基化、乙醯化和磷酸化。優選地，氨基酸取代應該是保守的，即，取代的氨基酸會具有與原始氨基酸類似的化學性質。這樣的保守取代在本領域中是已知的，並且已經在上文提供實例。氨基酸修飾範圍可從改變或修飾一個或多個氨基酸到區域諸如可變區的完全重新設計(redesign)。可變結構域中的變化可改變結合親和力和/或特異性。修飾的其它方法包括利用本領域中已知的偶合技術，包括但不限於酶促手段、氧化取代和螯合。修飾可用於例如，連接標籤用於免疫分析，諸如連接放射性部分用於放射免疫分析。修飾的多肽利用本領域中確定的方法製備，並且可利用本領域中已知的標準測定來篩選。
H.結合分子的表徵
可以各種方式表徵結合分子，比如抗體。尤其地，可測試抗體特異性結合抗原，例如，HER2/neu、PD-1的能力，或當分子包括Fc區(或其部分)時，測試展示Fc-FcγR相互作用，即，Fc區(或其部分)特異性結合FcγR的能力。
可用於分析特異性結合、交叉反應性和Fc-FcγR相互作用的免疫試驗包括但不限於使用下述技術的競爭和非競爭試驗系統：比如蛋白質印跡、放射免疫試驗、ELISA (酶聯免疫吸附試驗)、“夾心”免疫試驗、免疫沉澱試驗、沉澱(precipitin)反應、凝膠擴散沉澱(precipitin)反應、免疫層析試驗、免疫擴散試驗、凝集試驗、補體結合試驗、免疫放射測定試驗、螢光免疫試驗和蛋白質A免疫試驗等。(見，例如，Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F.M.等編輯, 1987) Greene Pub. Associates, New York, NY)。
通常通過標準抗體-抗原試驗，比如BIAcore競爭試驗、飽和試驗或免疫試驗比如ELISA或RIA，測量或測定對於靶抗原的結合親和力。使用本領域技術人員已知的任何技術的螢光啟動細胞分選(FACS)可用於基於免疫學或功能的試驗，以表徵本發明的分子。基於表面等離子共振的試驗可用於表徵抗原結合結構域或Fc-FcγR結合的動力學參數。
包括Fc區(或其部分)和/或包括對FcγR特異性的表位元結合結構域的分子與FcγR結合的的表徵可根據Antibody Engineering Technology Art(抗體工程化技術工藝)中描述的方法進行。用於效應細胞功能的試驗是本領域悉知的，例如如下述文獻中所描述的：Perussia, B.等(2000) “Assays for antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) And Reverse ADCC (Redirected Cytotoxicity) In Human Natural Killer Cells,” Methods Mol. Biol. 121:179-192；Lehmann, A.K.等(2000) “Phagocytosis: Measurement By Flow Cytometry,” J. Immunol. Methods 243(1-2):229-242；Baggiolini, M.等(1998) “Cellular Models For The Detection And Evaluation Of Drugs That Modulate Human Phagocyte Activity,” Experientia 44(10):841-848；Brown, E.J. (1994) “In Vitro Assays Of Phagocytic Function Of Human Peripheral Blood Leukocytes: Receptor Modulation And Signal Transduction,” Methods Cell Biol. 45:147-164；和Munn, D.H.等(1990) “Phagocytosis Of Tumor Cells By Human Monocytes Cultured In Recombinant Macrophage Colony-Stimulating Factor,” J. Exp. Med. 172:231-237。
VII.治療方法
特異性結合HER2/neu的分子和特異性結合細胞表面受體(或其配體)的、參與調節免疫檢查點的分子(尤其是PD-1)可用於在患癌症或其他疾病的個體中的治療性目的。在一個實施方式中，同時施用具有這類結合特異性的分子。如本文所使用，這樣的“同時(concurrent)”施用旨在表示： (A)施用包含特異性結合HER2/neu的分子和特異性結合細胞表面受體(或其配體)的、參與調節免疫檢查點的分子(尤其是PD-1)的單藥物組合物。這類分子可以是相同的分子(例如，雙抗體)或可以是不同的分子(例如，抗HER2/neu抗體或其抗原結合片段，和抗PD-1-抗體或其抗原結合片段)。 或； (B) 分開施用兩種或更多種藥物組合物，其中一種組合物包含特異性結合HER2/neu的分子，而其中另一種組合物包含特異性結合細胞表面受體(或其配體)的、參與調節免疫檢查點的分子(尤其是PD-1)，其中組合物在在24小時時間內施用。
在第二個實施方式中，採用兩種不同的分子，並且“相繼(sequentially)”施用分子(例如，施用抗HER2/neu抗體，稍後提供抗PD-1抗體，或反之亦然)。在這類相繼施用中，第二施用的組合物最優選地在施用第一施用的組合物之後至少24小時或更長時間施用。
提供療法(therapy)或“治療(treating)”是指在損傷、病理或病況的治療或改善方面的任何成功跡象，包括任何客觀參數或主觀參數，例如症狀的減輕、減緩、減少；或使患者對損傷、病理或病況更加耐受；減緩退化或衰弱的速率；使退化的終點不太衰弱；或改善患者的身體或精神健康。症狀的治療或改善可以基於客觀參數或主觀參數，包括身體檢查、神經精神檢測和/或精神病學評定的結果。
用於治療的優選受試者包括經受疾病和其他病理狀態的動物，最優選地是哺乳動物物種，比如人或其他靈長類，以及馴養動物，比如狗、貓等。“患者”指受試者，優選哺乳(包括人)。
在一個實施方式中，單克隆抗HER2/neu抗體和單克隆抗PD-1抗體可用於免疫療法，所述免疫療法針對表達HER2/neu的不同組織的癌細胞，尤其是癌細胞，比如乳腺癌、惡性膠質瘤、宮頸癌、轉移結直腸癌、胃癌、肝細胞癌、白血病、肺癌、轉移黑素瘤、血管化胰腺癌和轉移性***癌。這類免疫療法可例如足以減少癌症細胞的細胞***、延遲轉移的發展(例如，發作和程度)和/或促進免疫系統對癌細胞的活性。
應理解，分子以促進在生理學(例如，體內)條件下結合的濃度被施用。分子(例如，抗體或雙抗體)可與增強或引導個體自身免疫應答的另外的試劑，比如增強ADCC的試劑一起施用。
在仍另一實施方式中，一種或多種這類分子(例如，抗體或雙抗體)可與放射性分子、毒素(例如，加利車黴素)、化療分子、脂質體或包含化療化合物的其他小泡綴合或結合，並且被施用至需要這種治療的個體，以使這些化合物靶向包含被抗體識別的抗原的癌症細胞，因此消除癌症或患病的細胞。不限於任何具體的理論，抗體(例如，抗HER2/neu抗體)通過在其表面攜帶HER2/neu的細胞被內化，因此將綴合部分遞送至細胞，以誘導治療作用，並且特異性結合細胞表面受體(或其配體)的、參與調節免疫檢查點的分子(尤其是PD-1)促進免疫系統的啟動。
在仍另一實施方式中，這類分子(例如，抗體或雙抗體)可在外科去除腫瘤時用作輔助療法，以便延遲、抑制或預防轉移的發展。也可在外科手術之前施用分子(新輔助療法)，以便減小腫瘤的尺寸，因此確保外科手術能夠進行或簡化外科手術、在外科手術期間節約組織，和/或減少任何產生的缺陷。
本發明的抗HER2/neu抗體尤其可用於治療和/或預防期望FcγR介導的效應細胞功能(例如，ADCC)的疾病或病症(例如，癌症)。例如，本發明的抗HER2/neu抗體可結合細胞表面抗原和免疫效應細胞(例如，NK細胞)上的FcγR (例如，FcγRIIIA)，刺激針對所述細胞的效應子功能(例如，ADCC、CDC、吞噬、調理等)。在一些實施方式中，本發明的抗HER2/neu抗體尤其適於治療癌症。標準單克隆抗體療法的效力取決於受試者的FcγR多態性。Cartron, G.等(2002) “Therapeutic Activity Of Humanized Anti‐CD20 Monoclonal Antibody And Polymorphism In IgG Fc Receptor FcgammaRIIIa Gene,” Blood 99:754-758；Weng, W.K.等(2003) “Two Immunoglobulin G Fragment C Receptor Polymorphisms Independently Predict Response To Rituximab In Patients With Follicular Lymphoma,” J Clin Oncol. 21(21):3940-3947。這些受體在效應細胞的表面上表達並且介導ADCC。高親和力等位基因提高效應細胞介導ADCC的能力。尤其地，本發明的抗HER2/neu抗體包括變異的Fc區，其展示對於效應細胞上的FcγR增強的親和力(相對於野生型Fc區)，因此為患者提供了更好的免疫治療試劑，無論他們的FcγR多態性如何。
VIII. 可治療的病症
可由本發明的各個實施方式治療的示例性病症包括但不限於增生性病症，尤其是癌症(和更尤其地，表達HER2/neu的癌症)。在各個實施方式中，本發明包括用於治療、預防或管理受試者中疾病或病症的方法和組合物，包括向受試者施用治療有效量的特異性結合HER2/neu的分子和特異性結合細胞表面受體(或其配體)的、參與調節免疫檢查點的分子(例如，PD-1)。例如，本發明的分子尤其用於預防、抑制、減少原發性腫瘤的生長或復原(regression)，以及癌細胞的轉移。儘管不意圖受具體作用機制的限制，但是本發明的分子可介導針對癌細胞的效應子功能、促進免疫系統針對癌細胞的啟動、交聯細胞表面抗原和/或癌細胞上的受體和增強細胞凋亡或負生長調節信號傳導，或其組合，導致腫瘤清除和/或腫瘤減小。
對於FcγRIIB具有降低的親和力和對於FcγRIIIA和/或FcγRIIA具有增加的親和力的抗體在FcγR結合時，可導致增強的啟動應答，因此對於治療和/或預防癌症具有增強的治療效力。可通過本文的方法治療的癌症的非限制性例子包括急性骨髓淋巴瘤、腎上腺癌、腺癌、基底細胞癌症(basal cancer)、膀胱癌、骨癌、骨和結締組織肉瘤、腦癌、乳腺癌、支氣管癌、宮頸癌、絨毛膜癌、慢性淋巴細胞性白血病、慢性骨髓性白血病、結腸癌、結直腸癌、子宮內膜癌、食管癌、眼癌、輸卵管癌、膽囊癌、胃腸癌、神經膠質瘤、毛細胞白血病、肝細胞癌、霍奇金疾病、肝內膽管癌症、關節癌、卡波西氏肉瘤、腎癌、喉癌、肝癌、白血病、肺癌、成淋巴細胞性白血病、淋巴瘤、惡性間皮瘤、成神經管細胞瘤、黑素瘤、間皮瘤、中耳癌、多發性骨髓瘤、骨髓瘤、粘液肉瘤、鼻腔癌、鼻咽癌、成神經細胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小細胞肺癌、鼻癌、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、陽莖癌症（penal cancer）、腹膜癌、咽癌、腦垂體癌、***癌、直腸癌、腎癌、唾液腺癌、皮膚癌、軟組織肉瘤、鱗狀細胞癌、胃癌、睾丸癌、甲狀腺癌、尿道癌、子宮癌、***癌、睾丸癌、外陰癌和腎胚細胞腫瘤。
在一些實施方式中，癌症是造血癌症或血液相關的癌症，比如淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、淋巴惡性腫瘤、脾的癌症和淋巴結的癌症。在優選的實施方式中，癌症是B細胞相關的癌症，比如，例如，高、中或低級淋巴瘤(包括B細胞淋巴瘤比如，例如，伯基特淋巴瘤、彌散性大細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、邊緣區淋巴瘤、粘膜相關的淋巴組織B細胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、小淋巴細胞淋巴瘤和T細胞淋巴瘤)和白血病(包括慢性淋巴細胞性白血病，比如B細胞白血病(CD5+ B淋巴細胞)、慢性骨髓白血病、淋巴白血病，比如急性成淋巴細胞白血病、脊髓發育不良、骨髓白血病，比如急性髓細胞樣白血病，和繼發性白血病)、多發性骨髓瘤，比如漿細胞惡性腫瘤，和其他血液學和/或B細胞或T-細胞相關的癌症。其他示例性癌症是另外的造血細胞的癌症，包括多形核白細胞，比如嗜鹼性粒細胞、嗜伊紅粒細胞、嗜中性粒細胞和單核細胞、樹突細胞、血小板，紅細胞和天然殺傷細胞。
在一些實施方式中，癌症是其中表達HER2/neu的癌症。在一些實施方式中，癌症是其中表達HER2/neu的乳腺癌、胃癌，***癌、子宮癌、卵巢癌、結腸癌、子宮內膜癌、腎上腺癌、非小細胞肺癌、頭頸癌、喉癌、肝癌、腎癌、惡性膠質瘤或胰腺癌。
IX.藥物組合物
本發明分子(例如，抗體或雙抗體)的各種製劑可用于作為藥物組合物的“活性成分”施用。在一些實施方式中，可純(neat)施用這類分子。除了藥理學活性試劑，本發明的組合物可包含本領域熟知的適當的藥學上可接受的載體，包括賦形劑和助劑，其是相對惰性的物質，利於施用藥理學有效的物質，或利於將活性化合物加工成可藥學上用於遞送至作用位點的製劑。例如，賦形劑可給予形狀或一致性或用作稀釋劑。適當的賦形劑包括但不限於穩定劑、濕潤劑和乳化劑、改變滲透性的鹽、封裝劑、緩衝劑，和皮膚滲透增強劑。組合物可為任何合適的形式，例如片劑、丸劑、粉劑、錠劑、囊劑、扁囊劑、酏劑、懸液、乳液、溶液、糖漿、氣霧劑(作為固體或在液體介質中)、包含，例如，多達按重量計10%的活性化合物的軟膏、軟明膠和硬明膠膠囊、栓劑、無菌可注射溶液和無菌包裝的粉末等等，僅列出了幾種非限制性的可選項。這類組合物可通任何已知的方法製備，例如通過在無菌條件下混合活性成分與載體或賦形劑。
適合腸胃外施用的製劑包括水溶性形式的活性化合物的水溶液，例如，水溶性鹽。另外，可施用適於油性注射懸液的活性化合物的懸液。適當的親脂溶劑或媒介包括脂肪油，例如，芝麻油或合成脂肪酸酯，例如，油酸乙酯或甘油三酯。水性注射懸液可包含增加懸浮粘度的物質，其包括，例如，羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇和/或葡聚糖。任選地，懸液也可包含穩定劑。脂質體也可用于封裝用於遞送至細胞的試劑。
用於根據本發明全身性施用的藥物製劑可被配製為用於腸施用、腸胃外施用或局部施用。事實上，所有三種類型的製劑可同時使用以實現活性成分的全身性施用。用於腸胃外和非腸胃外藥物遞送的賦形劑以及製劑闡釋在Remington: The Science And Practice Of Pharmacy, 21st Edition, Lippincott Williams & Wilkins Publishing (2005)中。用於口服施用的適當的製劑包括硬明膠膠囊或軟明膠膠囊、藥丸、片劑，包括包衣片劑、酏劑、懸液、糖漿或吸入劑和其控釋形式。一般而言，這些試劑被配製為通過注射施用(例如，腹膜內、靜脈內、皮下、肌內等)，但是也可使用其他施用形式(例如，口服、粘膜施用等)。因此，本發明的分子(例如，抗HER2/neu抗體、抗PD-1抗體)優選地與藥學上可接受的媒介比如鹽水、林格溶液、右旋糖溶液等組合。
也可配製藥物組合物以便在通過採用本領域已知的程式施用至患者之後，提供活性成分的快速遲釋、持續遲釋或延遲釋放。本發明組合物的物理特徵和化學特徵可以依據施用方式和待治療的具體疾病或病症，根據本領域的技術被改良或優化。組合物可以以單位劑量的形式、在密封容器中或作為試劑盒的一部分被提供，所述試劑盒可以包含使用說明書和/或多個單位劑型。
在具體的實施方式中，治療劑可通過以下方式被摻入到組合物中：例如，封裝在脂質體、微粒、微膠囊中、能夠表達抗體或融合蛋白的重組細胞、受體-介導內吞作用(見，例如，Wu G.Y. and Wu C.H. (1987) “Receptor-Mediated In Vitro Gene Transformation By A Soluble DNA Carrier System,” J. Biol. Chem. 262:4429-4432)、構建作為反轉錄病毒或其他載體的一部分的核酸等。在另一具體的實施方式中，治療劑作為乾燥滅菌冷凍乾燥粉末或無水濃縮物提供在密封容器中並且可用例如水或鹽水重構至適當的濃度，用於施用至受試者。
優選地，治療劑作為乾燥的無菌冷凍乾燥粉末提供在密封容器中，單位劑量為至少5 mg、更優選地至少10 mg、至少15 mg、至少25 mg、至少35 mg、至少45 mg、至少50 mg或至少75 mg。冷凍乾燥粉末應在其初始容器中儲存在2℃和8℃之間並且分子應在重構之後的12小時，優選地6小時、5小時、3小時或1小時內腸胃外施用。在可選的實施方式中，治療劑在指示治療劑的量和濃度的密封容器中以液體形式被提供。優選地，以至少1 mg/ml、更優選地至少2.5 mg/ml、至少5 mg/ml、至少8 mg/ml、至少10 mg/ml、至少15 mg/kg、至少25 mg/ml、至少50 mg/ml、至少100 mg/ml、至少150 mg/ml、至少200 mg/ml的分子將液體形式提供在密封容器中。
當施用大於一種治療劑時，試劑可在相同的製劑中被配製在一起，或可被配製成單獨的組合物。因此，在一些實施方式中，特異性結合HER2/neu的分子和特異性結合細胞表面受體(或其配體)的、參與調節免疫檢查點的分子(例如，PD-1)在相同的藥物組合物中被配製在一起。在可選的實施方式中，分子被配製在分開的藥物組合物中。
X.試劑盒
組合物也可包括在試劑盒中。在非限制性方面中，試劑盒可包括包含治療劑的藥物組合物、用於施用的說明書和/或其他組分。在優選的實施方式中，試劑盒可包括即用型組合物。試劑盒的容器可包括瓶、分配器、包裝、室或其中可放置組分的其他類型的容器。容器在其表面上可包括標記。例如，標記可以是詞語、短語、縮寫、圖片或符號。容器可分配預定量的組分(例如本發明的組合物)。組合物可以以噴霧、氣溶膠或以液體形式或半固體形式分配。容器可以具有噴霧、泵和擠壓機構。在某些方面，試劑盒可以包含用於施用本發明組合物的注射器。
在試劑盒中具有大於一種組分的情況下，它們可包裝在一起，或者，試劑盒一般還包含其中可分別放置另外組分的第二、第三或其他另外的容器。本發明的試劑盒也可包括嚴密容納組分的容器，用於商業出售。這類容器可以包括注塑成型或吹塑成型的塑膠容器，在該塑膠容器中保存期望的瓶、分配器或包裝。試劑盒還可以包括應用試劑盒元件以及使用任何其他組合物、化合物、藥劑、活性成分或試劑盒中未包含的物品的說明書。說明書可包括可實施的變型。說明書可包括例如如何施用、使用和保存產品或組合物的說明。
XI.施用和劑量
本發明組合物的多種施用途徑是可用的。所選的具體方式當然將取決於所選的具體治療劑、施用是用於疾病的預防、診斷還是治療、被治療的醫學病症的嚴重程度以及治療功效所需的劑量。可以使用醫學上可接受的並且產生有效水準的活性化合物而不引起臨床上不可接受的不利影響的任何施用方式來實踐本發明的方法。這樣的施用方式包括但不限於：口服、含服、舌下、吸入、經粘膜、直腸、鼻內、局部、眼部、眼周、眼內、經皮、皮下、動脈內、靜脈內、肌內、腸胃外或輸注方法。在具體的實施方案中，可能期望的是將本發明的藥物組合物局部施用於需要治療的區域；這可以通過例如但絕不限於通過注射或借助於植入物的局部輸注實現，所述植入物是多孔的、非多孔的或凝膠狀的材料，包括膜，如矽橡膠(sialastic)膜或纖維。
如本文所用的術語“治療有效量”意指藥物組合物或方法足以顯示出有意義的患者有益效果的各活性組分的總量，所述有益效果即，慢性病況的治癒或改善、症狀的減少、這種病況治癒速率的增加或在治療組織或周圍組織中某種物質水準的可檢測的改變。當應用于單獨施用的單活性成分時，該術語是指該單獨的成分。當組合應用時，該術語是指產生治療效果的活性成分的組合量，無論其組合施用、連續施用或同時施用。
本發明的製劑中採用的精確劑量將取決於施用的路徑和病況的嚴重性，並且應根據從業者的判斷和每個患者的情況決定，並且可通過標準臨床技術確定。有效的劑量(即，足以有效治療、預防或改善一個或多個與病症相關的症狀的劑量)可從源自體外或動物模型檢測系統的劑量回應曲線外推。因此，具體的劑量方案，即，劑量、時機和重複取決於具體的個體以及該個體的病史，以及施用的路徑。本發明分子的施用的劑量和頻率可通過增強它們的攝入和/或組織滲透，比如例如，通過脂質化，而被減少或改變。
在優選的實施方式中，發明的治療劑以節律性(metronomic)給藥方案通過連續輸注或頻繁施用而不延長休息期(rest period)施用。這種節律性施用可以包括以恒定間隔而沒有休息期的給藥。通常，以較低的劑量使用治療劑，尤其是細胞毒性劑。這種給藥方案涵蓋在延長的時間期內相對較低劑量的長期每日施用，這種施用可以最小化毒副作用並消除休息期。在某些實施方式中，治療劑通過在下列範圍內的長期低劑量或連續輸注被遞送：約24小時至約2天、至約1周、至約2周、至約3周至約1個月至約個2月、至約3個月、至約4個月、至約5個月、至約6個月。這類給藥方案的安排可以通過熟練的腫瘤學家優化。
優選地，使用包括一個或多個劑量的治療方案施用本發明的分子，其中所述治療方案在2天內、3天內、4天內、5天內、6天內或7天內施用。在某些實施方式中，治療方案包括間歇地施用有效量的這類分子的劑量(例如，在給定周的第1天、第2天、第3天和第4天施用劑量並且在該周的其他天不施用分子的劑量。尤其考慮在同一周的第5天、第6天和第7天施用這類分子。典型地，存在1、2、3、4、5或更多個治療療程。每個療程可以是相同的方案或不同的方案。
在另一實施方式中，施用劑量在方案的前四分之一、前一半或前三分之二或四分之三(例如，在4個療程治療的第一、第二或第個三方案中)中上升，直到實現日預防或治療有效量的分子。
可計算施用至患者的這類分子的劑量，以用作單劑療法。可選地，分子可與其他治療性組合物聯合使用，並且向患者施用的劑量比當所述分子用作單劑療法時更低。施用至患者的這類分子(或這類分子的組合)的劑量通常是至少約1.0 mg/kg體重、至少約3 mg/kg體重、至少約5 mg/kg體重、至少約10 mg/kg體重或至少約20 mg/kg體重。對於本發明包括的抗體，向患者施用的劑量通常是1.0 mg/kg至100 mg/kg患者的體重。優選地，向患者施用的劑量在1.0 mg/kg體重和20 mg/kg體重之間、1.0 mg/kg體重和10 mg/kg體重之間、1.0 mg/kg體重和5 mg/kg體重之間、2.0 mg/kg體重和20 mg/kg體重之間、或5 mg/kg體重和20 mg/kg患者的體重之間。在一個實施方式中，向患者施用的劑量在6 mg/kg體重和18 mg/kg體重之間。在另一實施方式中，向患者施用的劑量是6 mg/kg體重、10 mg/kg體重、15 mg/kg體重或18 mg/kg體重。基於患者在基線時的體重施用計算的劑量。體重由基線或確定的穩定狀態( plateau)重量的顯著(≥ 10%)改變將提示重新計算劑量。
可選地，向患者施用固定劑量的這類分子(或這類分子的組合)，無論體重如何。對於本發明包括的抗體，向患者施用的固定劑量通常在50 mg 至 500 mg之間。優選地，向患者施用的固定劑量在50 mg和300 mg之間、100 mg和300 mg之間或100 mg和200 mg之間。在一個實施方式中，向患者施用的固定劑量是200 mg。
經驗上的考慮，比如半衰期，一般有助於確定劑量。與人免疫系統相容的抗體，比如人源化抗體或全人抗體，可用于延長抗體的半衰期並且防止抗體受到宿主免疫系統的攻擊。可確定施用的頻率並且在療法的療程內進行調整，並且是基於減少癌細胞的數量、保持癌細胞的減少、減少癌細胞的增殖，或延遲轉移的發展。可選地，持續釋放抗HER2/neu抗體的製劑可能是適當的。用於實現持續釋放的各種製劑和設備是本領域已知的。
XII.聯合療法
本發明進一步包括進一步聯合本領域技術人員已知的其他療法施用特異性結合HER2/neu的分子和特異性結合細胞表面受體(或其配體)的、參與調節免疫檢查點的分子(例如，PD-1)，用於治療或預防癌症、自身免疫性疾病、炎症或感染疾病，所述其他療法包括但不限於目前標準的和實驗化學療法、激素療法、生物療法、免疫療法、輻射療法或外科手術。在一些實施方式中，本發明的分子(例如本發明的抗HER2/neu和抗PD-1抗體)聯合本領域技術人員已知的治療或預防有效量的一種或多種治療劑施用，用於治療和/或預防癌症，尤其是表達HER2/neu的癌症。
如本文所使用，術語“聯合(combination)”指使用大於一種治療劑。術語“聯合”的使用並不限制治療劑施用給患病症的受試者的順序，也不是意指藥劑準確地在同一時間施用，而是意指本發明的抗體或多肽與其他試劑以某一順序並且在某一時間間隔內施用給哺乳動物，以便使本發明的抗體或多肽可以與其他試劑一起作用從而提供比它們以其他方式施用增加的有益效果。例如，各治療劑（例如，化療、放射療法、激素療法或生物療法）可以在同一時間施用或者在不同的時間點以任何順序順序地施用；然而，如果不在同一時間施用，則他們應在足夠接近的時間施用，以便提供期望的治療或預防效果。各治療劑可以以任何適當的形式並且通過任何合適的途徑單獨施用，例如一種通過口服途徑施用，另一種通過腸胃外途徑施用。
在各個實施方式中，第一治療劑可以在將第二（或隨後）治療劑施用給患病症的受試者之前(例如，5分鐘之前、15分鐘之前、30分鐘之前、45分鐘之前、1小時之前、2小時之前、4小時之前、6小時之前、12小時之前、24小時之前、48小時之前、72小時之前、96小時之前、1周之前、2周之前、3周之前、4周之前、5周之前、6周之前、8周之前或12周之前)，同時或之後(例如，5分鐘之後、15分鐘之後、30分鐘之後、45分鐘之後、1小時之後、2小時之後、4小時之後、6小時之後、12小時之後、24小時之後、48小時之後、72小時之後、96小時之後、1周之後、2周之後、3周之後、4周之後、5周之後、6周之後、8周之後或12周之後)施用。在優選的實施方式中，兩種或更多種試劑在同一患者隨訪中施用，或在不超過12小時的間隔、不超過24小時的間隔或不超過48小時的間隔內施用。
儘管，如上所討論，可採用各種給藥和施用路徑，以便根據本發明向需要其的接受受試者提供特異性結合HER2/neu的分子和特異性結合細胞表面受體或其配體的、調節免疫檢查點的分子的組合，但是某些組合、給藥和施用路徑尤其優選用於這類治療。在這樣的給藥和施用中，應用本發明的變異的嵌合4D5抗體(例如，瑪格妥昔單抗)和本發明的抗PD-1抗體(例如，派姆單抗)的組合是尤其優選的。
變異的嵌合4D5抗體的劑量和抗PD-1抗體的劑量的組合可施用一次或多次(其中這樣的聯合治療方案的每次施用在本文稱為“迴圈”)，每次包括施用6至18 mg，優選地6 mg、10 mg、15 mg或18 mg的變異的嵌合4D5抗體/kg患者體重，和1至10 mg，優選地1 mg、2 mg、3 mg或10 mg的抗PD-1抗體/kg患者體重，或固定的200 mg劑量的抗PD-1抗體。最優選地，一個迴圈將每三周(± 3天)發生一次，直到觀察到疾病或難處理毒性的緩解。
在尤其優選的實施方式中，變異的嵌合4D5抗體(例如，瑪格妥昔單抗)和抗PD-1抗體(例如，派姆單抗)通過IV輸注施用至受試者，約每三周(± 3天)一次，持續至少1個月或更長、至少3個月或更長或至少6個月或更長或至少12個月或更長。至少6個月或更長或至少12個月或更長或直到觀察到疾病或難處理的毒性緩解的治療持續時間是尤其優選的。在這樣的IV施用中，變異的嵌合4D5抗體和抗PD-1抗體可被一起或相繼施用。在尤其優選的實施方式中，變異的嵌合4D5抗體和抗PD-1抗體通過IV輸注以不大於24小時的間隔相繼施用至受試者。在這樣的相繼施用中，變異的嵌合4D5抗體可在施用抗PD-1抗體之前或之後施用。
尤其優選地，為受試者提供多劑量的變異的嵌合4D5抗體和抗PD-1抗體的組合。治療方案可因此包括1個迴圈、至少2個迴圈或大於2個迴圈、至少3個迴圈或大於3個迴圈、至少4個迴圈或大於4個迴圈、至少5個迴圈或大於5個迴圈或至少6個迴圈或大於6個迴圈。每個這樣的迴圈中的每種抗體的劑量可以相同或可與之前施用的劑量不同。因此，例如，療法可包括施用“第一”(或“載入(loading)”)劑量的變異的嵌合4D5抗體，隨後降低的“第二”劑量的變異的嵌合4D5抗體。
在一些實施方式中，以約6、10、15或18 mg/kg的第一劑量施用變異的嵌合4D5抗體，隨後施用第二較低劑量，其中在施用第一劑量之後約三周 (± 3天)施用第二劑量。例如，在變異的嵌合4D5抗體的第一劑量是約18 mg/kg體重時，第二劑量將小於18 mg/kg體重，(例如，約3 mg/kg體重、約6 mg/kg體重、約8 mg/kg體重、約10 mg/kg體重或約15 mg/kg體重)。在一些實施方式中，施用另外的隨後劑量的變異的嵌合4D5抗體，其中在施用第二劑量或之前的隨後劑量之後三周(± 3天)施用隨後劑量。在一些實施方式中，以與第二較低劑量相同濃度施用隨後劑量。在優選的實施方式中，在整個治療療程中施用相同劑量的變異的嵌合4D5抗體。
優選地，不以IV推注或IV團注施用抗體，但是這樣的施用通過IV輸注實現。因此，抗體優選地被稀釋至包括適當的稀釋劑，例如，0.9%氯化鈉的輸注袋中。因為可能發生輸注或過敏反應，所以推薦用於預防這類輸注反應的術前用藥並且應在抗體施用期間觀察防範過敏。尤其優選地，在30分鐘和24小時之間的時期內向受試者施用IV輸注。在某些實施方式中，如果受試者不展示不利的輸注反應的徵兆或症狀，IV輸注優選地在30-180分鐘或30-120分鐘或30-90分鐘內或60分鐘或更短的時間段內遞送。
因此，提供了優選的治療癌症的方法，該方法包括向需要其的受試者以約6至18 mg/kg體重的劑量施用變異的嵌合4D5抗體和以約200 mg的固定劑量施用抗PD-1抗體，其中每種抗體/三周(± 3天)施用一次。在一個實施方式中，變異的嵌合4D5抗體施用的劑量是約6、10、15或18 mg/kg體重。在進一步的實施方式中，變異的嵌合4D5抗體施用的劑量是約6 mg/kg體重和抗PD-1抗體以固定劑量200 mg施用。在進一步的實施方式中，變異的嵌合4D5抗體施用的劑量是約10 mg/kg體重和抗PD-1抗體以固定劑量約200 mg施用。在進一步的實施方式中，變異的嵌合4D5抗體施用的劑量是約15 mg/kg體重和抗PD-1抗體以固定劑量約200 mg施用。在進一步的實施方式中，變異的嵌合4D5抗體施用的劑量是約18 mg/kg體重和抗PD-1抗體以固定劑量約200 mg施用。在任何上述實施方式中，通過IV輸注，在24-小時時間段內施用變異的嵌合4D5抗體和抗PD-1抗體。在任何上述實施方式中，癌症是表達HER2/neu的癌症。在任何上述實施方式中，變異的嵌合4D5抗體是瑪格妥昔單抗和抗PD-1抗體是派姆單抗。在任何上述實施方式中，變異的嵌合4D5抗體是瑪格妥昔單抗和抗PD-1抗體是尼魯單抗。在任何上述實施方式中，變異的嵌合4D5抗體是瑪格妥昔單抗和抗PD-1抗體是皮地珠單抗。在任何上述實施方式中，變異的嵌合4D5抗體是瑪格妥昔單抗和抗PD-1抗體是EH12.2H7。在任何上述實施方式中，變異的嵌合4D5抗體是瑪格妥昔單抗和抗PD-1抗體是hPD-1 mAb 2。在任何上述實施方式中，變異的嵌合4D5抗體是瑪格妥昔單抗和抗PD-1抗體是hPD-1 mAb 7。在任何上述實施方式中，變異的嵌合4D5抗體是瑪格妥昔單抗和抗PD-1抗體是hPD-1 mAb 9。在任何上述實施方式中，變異的嵌合4D5抗體是瑪格妥昔單抗和抗PD-1抗體是hPD-1 mAb 15。在任何上述實施方式中，變異的嵌合4D5抗體是瑪格妥昔單抗和抗PD-1抗體選自表1中提供的抗體。
提供了另一優選的治療癌症的方法，該方法包括向需要其的受試者施用變異的嵌合4D5抗體，劑量為約6至18 mg/kg體重，和抗PD-1抗體，劑量為約1至10 mg/kg，其中每種抗體每三周(± 3天)施用一次。在一個實施方式中，變異的嵌合4D5抗體施用的劑量是約6、10、15或18 mg/kg體重。在進一步的實施方式中，抗PD-1抗體施用的劑量是約1、2、3或10 mg/kg體重。在進一步的實施方式中，變異的嵌合4D5抗體施用的劑量是約6 mg/kg體重和抗PD-1抗體施用的劑量是約1 mg/kg體重。在進一步的實施方式中，變異的嵌合4D5抗體施用的劑量是約6 mg/kg體重和抗PD-1抗體施用的劑量是約2 mg/kg體重。在進一步的實施方式中，變異的嵌合4D5抗體施用的劑量是約6 mg/kg體重和抗PD-1抗體施用的劑量是約10 mg/kg體重。在進一步的實施方式中，變異的嵌合4D5抗體施用的劑量是約10 mg/kg體重和抗PD-1抗體施用的劑量是約1 mg/kg體重。在進一步的實施方式中，變異的嵌合4D5抗體施用的劑量是約10 mg/kg體重和抗PD-1抗體施用的劑量是約2 mg/kg體重。在進一步的實施方式中，變異的嵌合4D5抗體施用的劑量是約10 mg/kg體重和抗PD-1抗體施用的劑量是約10 mg/kg體重。在進一步的實施方式中，變異的嵌合4D5抗體施用的劑量是約15 mg/kg體重和抗PD-1抗體施用的劑量是約1 mg/kg體重。在進一步的實施方式中，變異的嵌合4D5抗體施用的劑量是約16 mg/kg體重和抗PD-1抗體施用的劑量是約2 mg/kg體重。在進一步的實施方式中，變異的嵌合4D5抗體施用的劑量是約15 mg/kg體重和抗PD-1抗體施用的劑量是約10 mg/kg體重。在任何上述實施方式中，通過IV輸注在24-小時時間段內施用變異的嵌合4D5抗體和抗PD-1抗體。在任何上述實施方式中，癌症是表達HER2/neu的癌症。在任何上述實施方式中，變異的嵌合4D5抗體是瑪格妥昔單抗和抗PD-1抗體是派姆單抗。在任何上述實施方式中，變異的嵌合4D5抗體是瑪格妥昔單抗和抗PD-1抗體是尼魯單抗。在任何上述實施方式中，變異的嵌合4D5抗體是瑪格妥昔單抗和抗PD-1抗體是皮地珠單抗。在任何上述實施方式中，變異的嵌合4D5抗體是瑪格妥昔單抗和抗PD-1抗體是EH12.2H7。在任何上述實施方式中，變異的嵌合4D5抗體是瑪格妥昔單抗和抗PD-1抗體是hPD-1 mAb 2。在任何上述實施方式中，變異的嵌合4D5抗體是瑪格妥昔單抗和抗PD-1抗體是hPD-1 mAb 7。在任何上述實施方式中，變異的嵌合4D5抗體是瑪格妥昔單抗和抗PD-1抗體是hPD-1 mAb 9。在任何上述實施方式中，變異的嵌合4D5抗體是瑪格妥昔單抗和抗PD-1抗體是hPD-1 mAb 15。在任何上述實施方式中，變異的嵌合4D5抗體是瑪格妥昔單抗和抗PD-1抗體選自表1提供的抗體。
在某些實施方式中，治療劑迴圈施用至受試者。這類迴圈療法涉及施用第一試劑一段時間，隨後施用第二試劑和/或第三試劑一段時間，並且重複這種順序施用。迴圈療法可減少發展對一種或多種療法的抗性，避免或減少一種療法的副作用，和/或改善治療的效力。示例性迴圈是約每週一次，約每10天一次，約每兩週一次，和約每三週一次。每個迴圈可包括至少1周的休息、至少2周的休息、至少3周的休息。施用的迴圈的數量是約1至約12個迴圈，更通常約2至約10個迴圈，和更通常約2至約8個迴圈。
在治療細胞增生性病症的實施方式中，本發明的分子(例如，抗HER2/neu抗體、抗PD-1抗體)與另一治療劑綴合，或進一步聯合另一治療劑施用，所述另一治療劑比如，但不限於烷基化劑(例如，氮芥或順鉑)、血管生成抑制劑、蒽環類抗生素(例如，柔紅黴素/道諾黴素或多柔比星)、抗生素(例如，放線菌素D、博來黴素或安麯黴素)、抗體(例如，抗VEGF抗體比如貝伐單抗(由Genentech, Inc.以AVASTIN®出售)、抗EGFR抗體比如帕尼單抗(由Amgen, Inc.以VECTIBIXTM出售)或抗整聯蛋白抗體，比如那他珠單抗(由 Biogen Idec and Elan Pharmaceuticals, Inc.以TYSABRI®出售))、抗代謝物(例如，氨甲喋呤或5-氟尿嘧啶)、抗有絲***劑(例如，長春新堿或紫杉醇)、細胞毒素(例如，細胞抑制劑或殺細胞劑)、激素治療劑(例如，選擇性***受體調節劑(例如，他莫昔芬或雷洛昔芬)、芳香酶抑制劑、促黃體激素-釋放激素類似物、促孕劑、腎上腺皮質固醇、***、雄激素、抗***試劑、雄激素受體阻斷劑、5-α還原酶抑制劑、腎上腺產生抑制劑等)、基質金屬蛋白酶抑制劑、放射性元素(例如，α-發射體、γ-發射體等)或任何其他化療劑。
適當的血管生成抑制劑的非限制性例子包括ABT-627、血管生長抑制素(血纖維蛋白溶酶原片段)；抗血管生成RNA構成酶(angiozyme）；抗血管生成抗凝血酶III；Bay 12-9566；氟草胺；貝伐單抗；BMS-275291；雙膦酸鹽；軟骨衍生的抑制劑(CDI)；CAI；CD59補體片段；CEP-7055；Col 3；考布他汀A-4；內皮抑制素(膠原蛋白XVIII片段)；法呢基轉移酶抑制劑(FTI)；纖連蛋白片段；gro-β；鹵夫酮；肝素酶；肝素多聚己糖片段；HMV833；人絨膜促性腺素(hCG)；IM-862；干擾素α/β/γ；干擾素可誘導的蛋白質(IP-10)；白介素-12；絞鏈區5 (kringle 5) (血纖維蛋白溶酶原片段)；馬立馬司他；金屬蛋白酶抑制劑(TIMPs)；2-甲氧***；MMI 270 (CGS 27023A)；MoAb IMC-1C11；新伐司他；NM-3；panzem；PI-88；胎盤核糖核酸酶抑制劑；血纖維蛋白溶酶原啟動抑制劑；血小板因數-4 (PF4)；普馬司他；催乳素16kDa片段；增殖蛋白相關的蛋白質(PRP)；PTK 787/ZK 222594；類視黃醇；索利司他；角鯊胺；SS 3304；SU 5416；SU6668；SU11248；四氫皮質醇-S；四硫鉬酸鹽；沙利度胺；血小板反應蛋白-1 (TSP-1)；TNP-470；轉化生長因數β (TGF-b)；血管抑制素（vasculostatin）；血管形成抑制素(鈣網蛋白片段)；ZD6126和ZD 6474。
用於治療細胞增生性病症的另外的抗體的非限制性例子包括針對下述的抗體：17-1A、αvβ3、AFP、CD3、CD18、CD20、CD22、CD33、CD44、CD52、CEA、CTLA-4、DNA相關的蛋白質、EGF受體、Ep-CAM、GD2-神經節苷脂、gp IIIb/IIIa、gp72、HLA-DR 10β、HLA-DR抗原、IgE、神經節苷脂GD3、MUC-1、nuC242、PEM抗原、SK-1抗原、腫瘤抗原CA125、腫瘤抗原MUC1、VEGF和VEGF-受體。
XIII.實施例
現在已經大體上描述了本發明，通過參考下述實施例，本發明將被更容易理解，通過示例的方式提供實施例而不旨在限制本發明，除非另外指出。
實施例1
BIACore親和力測定
使用BIAcore試驗(BIAcore® instrument 1000, BIAcore Inc., Piscataway, N.J.)和相關的軟體分析洗脫的和純化抗體的結合的動力學參數。通過胺偶聯化學法(通過用NHS/EDC的混合物修飾羧甲基基團)，將HER-2固定在感測器晶片表面的四個流動室(流動室2)之一上，使約1000回應單位（RU）的受體固定於表面上。此後，通過注射1M Et-NH2使未反應的活性酯“脫帽(capped off)”。當準備好適當的表面後，以70 mL/min的流速將ch4D5-FcWT (野生型Fc)、ch4D5和曲妥珠單抗(對照)以6.25 – 200 nM的濃度注射在表面上，達180秒。
收集到整個資料組後，整體擬合所得的結合曲線，並且使用製造商提供的電腦演算法計算速率常數和表觀平衡結合常數，如在可獲得自BIAcore, Inc的BIAevaluation Software Handbook（BIAevaluation軟體手冊）描述的。圖3顯示了SPR分析的圖表結果，並且計算的常數提供在表4中。
實施例2
凋亡
孵育各種細胞系與ch4D5和ch4D5-FcMT1過夜。通過FACS分析測試凋亡，結果顯示在表5中。
實施例3
增殖
併入到DNA中的[3H]胸苷([3H]TdR)用作SKBR3細胞增殖的生物化學指標，以比較本發明的各種嵌合4D5抗體的作用。研究ch4D5-Ag、ch4D5和Ch4D-FcMT1對CD16-158F+和CD16-158V+細胞的作用並且與對照相比較。結果描繪在圖4中。
實施例4
在小鼠(乳腺癌模型)中的抗腫瘤活性
在使用非轉基因和轉基因(hCD16A)小鼠的乳腺癌模型中研究各種抗體的抗腫瘤活性。在第0天，50只Balb/c RAG2-/-非轉基因小鼠被皮下(s.c.)注射JMT-1乳腺癌細胞。將小鼠分成5組，每組10只小鼠，並且每週用ch4D5 N297Q、ch4D5-野生型Fc、ch4D5-FcMT1、ch4D5-FcMT2或PBS (陰性對照)腹膜內(intraperitoneously)(IP)處理一次，持續8周。使用測徑器每週兩次監測腫瘤發展，並且通過下述公式評估腫瘤重量：腫瘤重量= (長度x寬度2)/2。結果顯示在圖5中。23只Balb/c RAG2-/- mCD16-/- hCD16A+轉基因小鼠在第0天被皮下注射JIMT-1乳腺癌細胞。將小鼠分成3組，並且每週用ch4D5-野生型Fc (n=8)、ch4D5-FcMT1 (n=8)或PBS (陰性對照；n=7)腹膜內(IP)處理一次，持續8周。使用測徑器每週兩次監測腫瘤發展，並且通過下述公式評估腫瘤重量：腫瘤重量= (長度x寬度2)/2。結果顯示在圖6。
實施例5
小鼠(卵巢癌模型)中的抗腫瘤活性
使用非轉基因和轉基因(hCD16A)小鼠，研究卵巢癌模型中各種抗體的抗腫瘤活性。來自MacroGenics繁殖群體的22只R3-/- N/N非轉基因小鼠在第0天被皮下注射SKOV-3卵巢癌細胞。將小鼠分成4組，並且每週用ch4D5 N297Q (n=5)、ch4D5-野生型Fc (n=6)、ch4D5-FcMT1 (n=6)或PBS (陰性對照；n=5)腹膜內(IP)處理一次，持續8周。使用測徑器每週兩次監測腫瘤發展，並且通過下述公式評估腫瘤重量：腫瘤重量= (長度x寬度2)/2。這樣的處理對生存的作用顯示在圖7的圖A中。來自MacroGenics繁殖群體的32只R3-/- N/N hCD16A+轉基因小鼠在第0天被皮下注射SKOV-3卵巢癌細胞。將小鼠分成4組，並且每週用ch4D5 N297Q (n=8)、ch4D5-野生型Fc (n=8)、ch4D5-FcMT1 (n=8)或PBS (陰性對照；n=8)腹膜內(IP)處理一次，持續8周。使用測徑器每週兩次監測腫瘤發展，並且通過下述公式評估腫瘤重量：腫瘤重量= (長度x寬度2)/2。這樣的處理對生存的作用顯示在圖7的圖B中。來自MacroGenics繁殖群體的96只mCD16-/- huCD16A FoxN1-/- (nu/nu)轉基因小鼠在第0天被皮下注射SKOV-3卵巢癌細胞。將小鼠分成6組，每組16只小鼠，並且每週用ch4D5-FcMT3、ch4D5-FcMT1、ch4D5-FcMT4、ch4D5、ch4D5Ag或PBS (陰性對照)腹膜內(IP)處理一次，持續8周。使用測徑器每週兩次監測腫瘤發展，並且通過下述公式評估腫瘤重量：腫瘤重量= (長度x寬度2)/2。這樣的處理對生存的作用顯示在圖8中。
實施例6
在各種癌細胞系中的ADCC試驗
圖9圖解對於HER2/neu的各種癌細胞系的代表性免疫組織化學染色。根據它們的HER2/neu染色強度對細胞系進行分級，如在作為DAKO HerceptTest™ (DakoCytomation, Glostrup, Denmark)出售的HER2/neu測試試劑盒中說明的：缺乏HER2/neu染色(DAKO分數0)；弱HER2/neu染色(DAKO分數1+)；中度HER2/neu染色(DAKO分數2+)；和強HER2/neu染色(DAKO分數3+)。圖A-M示出各種細胞系，如表6中顯示。
測試若干ch4D5抗體，包括具有Fc變體結構域的ch4D5抗體，在癌細胞系仲介導ADCC的能力，所述抗體包括ch4D5-FcMT1、ch4D5-FcMT2、ch4D5-FcMT3、ch4D5-FcWT (野生型Fc)、ch4D5 N297Q和曲妥珠單抗(作為對照)。來自驗證試驗的資料(SR £ 20% MR，AICC £ 50% MR)報告在表7中，其中只有當模型符合＞20%的最大裂解時，EC50評估才視為是有效的。通過詢問針對Fc優化的抗體獲得的最佳擬合值與針對Fc野生型ch4D5抗體獲得的最佳擬合值經平方和F檢驗是否是統計學上有差異的，進行EC50和最大裂解參數的比較。也將資料與S形(sigmoidal)劑量回應模型擬合，如圖10-13中所顯示。
實施例7
針對共刺激或檢查點靶的單克隆抗體對T細胞增殖的活性
在allo-MLR試驗的背景下，誘導T細胞回應HLA-錯配(Latchman, Y.E.等(2004) “PD-L1-Deficient Mice Show That PD-L1 On T-Cells, Antigen-Presenting Cells, And Host Tissues Negatively Regulates T-Cells.” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 101(29):10691-10696；Wang, W.等(2008) “PD-L1/PD-1 Signal Deficiency Promotes Allogeneic Immune Responses And Accelerates Heart Allograft Rejection,” Transplantation 86(6):836-44)或促有絲***/藥理學刺激而增殖。已知靶向共刺激分子的激動劑抗體通過強化T細胞信號傳導和穩定促進或驅動T細胞效應子功能的轉錄因數而誘導增生性應答(Melero, I.等(2013) “Agonist Antibodies to TNFR Molecules That Costimulate T and NK Cells,” Clin. Cancer Res. 19(5):1044-1053)。類似地，靶向負調節T-細胞應答的關鍵檢查點分子的拮抗抗體(檢查點抑制劑)可通過保持T細胞信號傳導和效應子功能而誘導增生性應答，從而改善抗腫瘤免疫性(Capece, D.等(2012) “Targeting Costimulatory Molecules to Improve Antitumor Immunity,” J. Biomed. Biotech. 2012:926321)。針對共刺激或檢查點靶的單克隆抗體回應同種異體抗原對增殖的作用可容易在短期混合淋巴細胞(allo-MLR)反應中通過併入3H-胸苷而測量。為了解決針對檢查點抑制劑的抗體增強增殖的能力，產生抗PD-1或抗LAG-3 mAb，將其純化，並且在啟動allo-MLR試驗時，以20、10、5、2.5和1.25 µg/ml外源添加(圖14)。在5-6天結束時，平鋪的96孔用3H-胸苷進行脈衝，並且培養18小時，以測量增殖。評估針對人PD-1、LAG-3和CTLA-4的若干基準抗體它們回應同種異體抗原刺激而增強T細胞增殖的能力。如圖15中顯示，與IgG1同種型對照抗體或包含應答物和刺激劑的對照孔相比，在allo-MLR試驗開始時添加PD-1 mAb 1 (5C4 (BMS-936558)、PD-1 mAb 2 (MK-3475；Merck，蘭羅利珠單抗)或PD-1 mAb 3 (EH12.2H7；Dana Farber)誘導強的T細胞增殖。僅包含輻射的刺激劑細胞的孔顯示沒有增殖。儘管觀察到了劑量依賴性增生性應答，但是與PD-1 mAb 1 (5C4 (BMS-936558)、PD-1 mAb 2 (MK-3475；Merck，蘭羅利珠單抗)或PD-1 mAb 3 (EH12.2H7；Dana Farber)相比，PD-1 mAb 4 (CT-011；CureTech, BAT-1)顯示最小的增殖。用LAG-3 mAb 1 (25F7；BMS-986016，Medarex/BMS)也觀察到了輕微的劑量依賴性增生性應答，其與Yervoy®伊匹單抗、抗CTLA-4 mAb (Bristol-Myers Squib)比較類似。
實施例8
瑪格妥昔單抗和派姆單抗的劑量遞增研究
進行劑量遞增研究，以確定與約200 mg固定劑量的派姆單抗聯合施用的瑪格妥昔單抗的遞增劑量的最大耐受劑量(MTD)或最大施用劑量(MAD) (如果沒有定義MTD)。這隨後可以是組擴展階段(cohort expansion phase)，以進一步定義與在劑量遞增研究中確定的瑪格妥昔單抗劑量的組合的安全性和初始效力。每3周施用瑪格妥昔單抗和派姆單抗一次。在同一天施用兩種試劑，首先施用派姆單抗，隨後施用瑪格妥昔單抗。療法的每個迴圈限定為3周，其中瑪格妥昔單抗和派姆單抗在第1天施用。可在研究期間進行腫瘤評估，優選地，在每兩個迴圈的治療結束時進行腫瘤評估(即，每6週一次[迴圈2、4、6等結束時])。
可在組患者中，以與200 mg派姆單抗聯合的兩個相繼升高的劑量，約10 mg/kg體重和約15 mg/kg體重，評估瑪格妥昔單抗。如果測定在第一劑量組中超過了MTD，則可使用劑量遞降組，以評估與200 mg派姆單抗聯合的瑪格妥昔單抗(6 mg/kg)的較低劑量。可在研究的劑量遞增部分期間探究瑪格妥昔單抗的較高劑量(例如，18 mg/kg)。
對於組擴展階段，招募另外的患者，並且使其以從研究的劑量遞增階段確定的MTD (或MAD)接收瑪格妥昔單抗聯合200 mg派姆單抗。
本說明書提到的所有出版物和專利通過參考併入本文，達到如同具體和單獨指出每個單個出版物或專利申請通過參考以其整體併入的相同程度。儘管已經結合其具體實施方式描述了本發明，但是應當理解，其能夠被進一步修改，並且本申請旨在覆蓋大體上根據本發明原理並且包括與本公開的偏離的本發明的任何變型、用途或改變，只要在本發明所屬領域的已知或習慣實踐內並且如可應用至本文之前所闡釋的本質特徵。
無
圖 1 描繪了比較“嵌合4D5抗體”的輕鏈可變結構域 (SEQ ID NO: 4)與“鼠科4D5抗體”的輕鏈可變結構域(SEQ ID NO: 3)和“人源化4D5抗體”的輕鏈可變結構域(SEQ ID NO: 5)的序列的序列比對。圖 2 描繪了具有野生型(“WT”) Fc區的“嵌合4D5抗體”的重鏈(SEQ ID NO: 7)、具有第一變異的Fc區(“MT1”)的“變異的嵌合4D5抗體MT1”的重鏈(SEQ ID NO: 9)、具有第二變異的Fc區(“MT2”)的“變異的嵌合4D5抗體MT2”的重鏈(SEQ ID NO: 11)和具有第三變異的Fc區(“MT3”)的“變異的嵌合4D5抗體MT3”的重鏈(SEQ ID NO: 13)的序列之間的比較。CDR的殘基由這類殘基下方顯示的黑條表示。圖 3 (圖A-C)描繪了具有野生型Fc的嵌合4D5抗體(“ch4D5-野生型Fc”) (圖A)、4D5 (圖B)和曲妥珠單抗(圖C)結合的BIACore®分析。圖 4 (圖A-D)描繪了ch4D5-Ag (圖A和B)和Ch4D-FcMT1 (圖B和D)在體外對CD16-158F+ (圖A和C)或CD16-158V+ (圖B和D) SKBR3細胞增殖的作用。圖 5 描繪了本發明的各種抗體在非轉基因小鼠中的增強的抗腫瘤活性。圖 6 描繪了本發明的各種抗體在hCD16A轉基因小鼠中的增強的抗腫瘤活性。圖 7 (A-B)描繪了在非轉基因和轉基因小鼠中mFcRIV和hCD16A通過本發明的各種抗體對腫瘤生長抑制的作用。圖 8 描繪了本發明的各種抗體在hCD16A轉基因小鼠中增強的抗腫瘤活性。圖 9 (A-M)圖解了來自各種癌細胞系的細胞針對HER2/neu的代表性免疫組織化學染色。圖A-L表示不同的細胞系，即，圖A：MDA-MB-435、圖B：MDA-MB-231、圖C：A549、圖D：OVCAR-8、圖E：MCF-7、圖F：BT-20、圖G：HT-29、圖H：ZR75-1、圖I：JIMT-1、圖J：MDA-MB-453、圖K：BT-474、圖L：SKBR-3、和圖M：mSKOV-3。圖 10 (A-B)描繪了ADCC試驗的結果，進行ADCC試驗以測試本發明的嵌合4D5抗體變體在具有非常低或沒有HER2/neu表達水準的癌細胞系(圖A中MDA-MB-435、圖B中MDA-MB-231)仲介導ADCC的能力(DAKO分數為0)。圖 11 (A-E)描繪了ADCC試驗的結果，進行ADCC試驗以測試本發明的變異的嵌合4D5抗體在具有低HER2/neu表達水準的癌細胞系(圖A中A549 、圖B中OVCAR-8、圖C中MCF-7、圖D中BT-20、圖E中HT-29)仲介導ADCC的能力(DAKO分數為1+)。圖 12 (A-B)描繪了ADCC試驗的結果，進行ADCC試驗以測試本發明的變異的嵌合4D5抗體在具有中等HER2/neu表達水準的癌細胞系(圖A中ZR75-1、圖B中JIMT-1)仲介導ADCC的能力(DAKO分數為2+)。圖 13 (A-C)描繪了ADCC試驗的結果，進行ADCC試驗以測試本發明的變異的嵌合4D5抗體在具有高HER2/neu表達水準的癌細胞系(圖A中MDA-MB-453 、圖B中BT-474、圖C中SKBR-3、圖D中mSKOV-3)仲介導ADCC的能力(DAKO分數為3+)。圖 14 顯示了用於評估抗PD-1抗體增強T細胞增殖的能力的方案的圖。圖 15 顯示，與IgG1同種型對照抗體相比，在allo-MLR試驗開始時添加PD-1 mAb 1 (5C4；BMS-936558；Bristol-Myers Squibb，尼魯單抗)、PD-1 mAb 2 (MK-3475；Merck，派姆單抗(之前為蘭羅利珠單抗(lambrolizumab)))和PD-1 mAb 3 (EH12.2H7；Dana Farber)誘導強的T細胞增殖應答。也顯示用PD-1 mAb 4 (CT-011；CureTech，皮地珠單抗)、抗CTLA mAb和LAG-3 mAb獲得的增生性應答。應答者(R)細胞是泛T細胞；刺激劑(S)細胞是成熟樹突細胞(mDCs)。

Claims (28)

  1. 一種治療癌症的方法，其包括向需要其的受試者施用： (a)    變異的嵌合4D5抗體，其包括具有SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的輕鏈可變結構域，和具有選自SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 11和SEQ ID NO: 13的氨基酸序列的重鏈；以及 (b)特異性結合細胞表面受體或其配體的、調節免疫檢查點的分子。
  2. 如請求項1所述的方法，其中特異性結合細胞表面受體或其配體的、調節免疫檢查點的所述分子是抗PD-1抗體或其抗原結合片段。
  3. 如請求項2所述的方法，其中所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段： (a)    與下述抗體競爭PD-1結合：尼魯單抗、派姆單抗、皮地珠單抗、抗體EH12.2H7、抗體hPD-1 mAb 2、抗體hPD-1 mAb 7、抗體hPD-1 mAb 9、抗體hPD-1 mAb 15或選自表1的抗PD-1抗體；或 (b)具有下述抗體的三個重鏈CDR和三個輕鏈CDR：尼魯單抗、派姆單抗、皮地珠單抗、抗體EH12.2H7、抗體hPD-1 mAb 2、抗體hPD-1 mAb 7、抗體hPD-1 mAb 9、抗體hPD-1 mAb 15或選自表1的抗PD-1抗體；或 (c)     具有下述抗體的重鏈可變結構域和輕鏈可變結構域：尼魯單抗、派姆單抗、皮地珠單抗、抗體EH12.2H7、抗體hPD-1 mAb 2、抗體hPD-1 mAb 7、抗體hPD-1 mAb 9、抗體hPD-1 mAb 15或選自表1的抗PD-1抗體。
  4. 如請求項2或3所述的方法，其中所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段包括Fc區。
  5. 如請求項4所述的方法，其中所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段包括在Fc區中具有降低ADCC活性的至少一種修飾的變異的Fc區或IgG4 Fc區。
  6. 如請求項2至5任一項所述的方法，其中所述抗PD-1抗體是尼魯單抗、派姆單抗、皮地珠單抗、抗體EH12.2H7、抗體hPD-1 mAb 2、抗體hPD-1 mAb 7、抗體hPD-1 mAb 9、抗體hPD-1 mAb 15或選自表1的抗PD-1抗體。
  7. 如請求項2至6任一項所述的方法，其中所述變異的嵌合4D5抗體以每三周約6-18 mg/kg的劑量施用，和所述抗PD-1抗體以每三周約200 mg的固定劑量施用。
  8. 如請求項2至6任一項所述的方法，其中所述變異的嵌合4D5抗體以每三周約6-18 mg/kg的劑量施用和所述抗PD-1抗體以每三周約1-10 mg/kg的劑量施用。
  9. 如請求項7或8所述的方法，其中所述變異的嵌合4D5抗體以選自每三周6 mg/kg、每三周10 mg/kg、每三周15 mg/kg和每三周18 mg/kg的劑量施用。
  10. 如請求項8或9所述的方法，其中所述抗PD-1以選自每三周1 mg/kg、每三周2 mg/kg、每三周3 mg/kg和每三周10 mg/kg的劑量施用。
  11. 如請求項1至10任一項所述的方法，其中所述變異的嵌合4D5抗體和特異性結合細胞表面受體或其配體的、調節免疫檢查點的所述分子在單藥物組合物中被同時施用至所述受試者。
  12. 如請求項1至10任一項所述的方法，其中所述變異的嵌合4D5抗體和特異性結合細胞表面受體或其配體的、調節免疫檢查點的所述分子在分開的藥物組合物中被同時施用至所述受試者，其中所述分開的組合物在24小時時間內施用。
  13. 如請求項1至10任一項所述的方法，其中所述變異的嵌合4D5抗體和特異性結合細胞表面受體或其配體的、調節免疫檢查點的所述分子在分開的藥物組合物中被順序施用至所述受試者，其中第二個施用的組合物在施用第一個施用的組合物之後至少24小時或更長時間被施用。
  14. 如請求項1至13任一項所述的方法，其中所述癌症是其中表達HER2/neu的癌症。
  15. 如請求項13所述的方法，其中所述癌症是其中表達HER2/neu的乳腺癌、胃癌、***癌、子宮癌、卵巢癌、結腸癌、子宮內膜癌、腎上腺癌、非小細胞肺癌、頭頸癌、喉癌、肝癌、腎癌、惡性膠質瘤或胰腺癌。
  16. 如請求項1至15任一項所述的方法，其中所述治療進一步包括施用第三治療劑的步驟，其中所述第三治療劑選自抗血管生成劑、抗腫瘤劑、化療劑和細胞毒性劑。
  17. 如請求項16所述的方法，其中所述第三治療劑與所述變異的嵌合4D5抗體和/或特異性結合細胞表面受體或其配體的、調節免疫檢查點的所述分子同時施用。
  18. 如請求項16所述的方法，其中所述第三治療劑與所述變異的嵌合4D5抗體和/或特異性結合細胞表面受體或其配體的、調節免疫檢查點的所述分子分開施用。
  19. 如請求項1至18任一項所述的方法，其中所述變異的嵌合4D5抗體是瑪格妥昔單抗。
  20. 如請求項2至19任一項所述的方法，其中所述抗PD-1抗體是派姆單抗。
  21. 如請求項2至19任一項所述的方法，其中所述抗PD-1抗體是尼魯單抗。
  22. 如請求項2至19任一項所述的方法，其中所述抗PD-1抗體是皮地珠單抗。
  23. 如請求項2至19任一項所述的方法，其中所述抗PD-1抗體是抗體EH12.2H7。
  24. 如請求項2至19任一項所述的方法，其中所述抗PD-1抗體是抗體hPD-1 mAb 2。
  25. 如請求項2至19任一項所述的方法，其中所述抗PD-1抗體是抗體hPD-1 mAb 7。
  26. 如請求項2至19任一項所述的方法，其中所述抗PD-1抗體是抗體hPD-1 mAb 9。
  27. 如請求項2至19任一項所述的方法，其中所述抗PD-1抗體是抗體hPD-1 mAb 15。
  28. 請求項2至19任一項所述的方法，其中所述抗PD-1抗體選自表1。
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