JP6526189B2

JP6526189B2 - 抗ｐｄ−ｌ１抗体並びにその治療及び診断のための使用

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Publication number: JP6526189B2
Application number: JP2017519772A
Authority: JP
Inventors: リー，カン; ソン，ジン; ジャン，トン; リー，ユーチャン; レン，ジーイン; カン，ヤンシャン
Original assignee: Beigene Ltd
Current assignee: Beigene Ltd
Priority date: 2014-07-03
Filing date: 2015-07-01
Publication date: 2019-06-05
Anticipated expiration: 2035-07-01
Also published as: KR20170023102A; CN106604742B; JP6734436B2; TWI687438B; US20200283527A1; KR20190089090A; EP3160505A1; US20230279117A1; JP2019172677A; KR102130600B1; CN106604742A; TW201625681A; US11512132B2; US20180215825A1; KR102003754B1; WO2016000619A1; TW202019970A; JP2017522905A; EP3160505A4; CN110156892B

Description

本発明は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体並びに該抗体の治療及び診断のための使用に関する。

ＰＤ−Ｌ１は、最初にＢ７タンパク質ファミリーのメンバー（Ｂ７−Ｈ１として知られている）としてクローン化された（Ｄｏｎｇら、１９９９ＮａｔｕｒｅＭｅｄ５：１３６５）。それは、プログラム化死−１（ＰＤ−１）受容体に結合し、負の調節シグナル伝達経路を活性化して、Ｔ細胞の増殖および活性を阻害する（Ｆｒｅｅｍａｎら、２０００ＪＥｘｐＭｅｄ１９２：１０２７）。したがって、ＰＤ−１リガンド１（ＰＤ−Ｌ１またはＣＤ２７４）とも呼ばれた。今まで、２つの配列関連リガンド（ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｒｅｌａｔｅｄｌｉｇａｎｄ）であるＰＤ−Ｌ１（Ｂ７−Ｈ１）およびＰＤ−Ｌ２（Ｂ７−ＤＣ）は、ＰＤ−１と相互作用し、負の信号を誘導し、ＴＣＲおよびＣＤ２８媒介Ｔ細胞活性化、細胞増殖、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γ等のサイトカインや成長因子の分泌を阻害することが確認された（Ｒｉｌｅｙら、２００９ＩｍｍｕｎｏｌＲｅｖ２２９：１１４）。

ヒトＰＤ−Ｌ１遺伝子は、ＰＤ−Ｌ１が成熟タンパク質として細胞表面上に発現された後に除去されるリーダーペプチドを有する２９０アミノ酸残基の全長タンパク質（ＮＣＢＩ受託番号：ＮＰ＿０５４８６２．１）をコードする。全長ＰＤ−Ｌ１の計算分子量は３３ｋＤである。しかしながら、観察された分子量は、我々および他者からのウエスタンブロットデータによれば、グリコシル化に起因して約５０ｋＤである。

ＰＤ−Ｌ１は、ヒトの心臓、肺、胸腺および血管内皮細胞において構成的に発現され、抗原提示細胞、末梢血単球および他の免疫細胞を含む多くの他のヒトの組織および細胞型において低レベルで発現されたことが分かった（Ｆｒｅｅｍａｎら、２０００ＪＥｘｐＭｅｄ１９２：１０２７；Ｅｐｐｉｈｉｍｅｒら、２００２Ｍｉｃｒｏｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ９：１３３）。ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２、及びＩ型インターフェロンによって刺激された場合、これらの細胞型の多くが、ＰＤ−Ｌ１の発現を増加させることが報告された（Ｂａｌｄら、２０１４ＣａｎｃｅｒＤｉｓｃｏｖ４：６７４−６８７；Ｐｌａｎｅｓら、２０１４ＪＶｉｒｏｌ８８：６６７２−６６８９）。

腫瘍細胞におけるＰＤ−Ｌ１発現の異常な上方調節（アップレギュレーション）は、肺（Ｋｏｎｉｓｈｉら、２００４ＣｌｉｎＣａｎｃｅｒＲｅｓ１０：５０９４）、肝臓（Ｓｈｉら、２００８、ＩｎｔＪＣａｎｃｅｒ１２８：８８７；Ｇａｏら、２００９ＣｌｉｎＣａｎｃｅｒＲｅｓ１５：９７１）、胃（Ｗｕら、２００６ＡｃｔａＨｉｓｔｏｃｈｅｍ１０８：１９）、腎臓（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、２００４ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉ１０１：１７１７４；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、２００７ＣｌｉｎＣａｎｃｅｒＲｅｓ１３：１７５７）、***（Ｇｈｅｂｅｈら、２００６Ｎｅｏｐｌａｓｉａ８：１９０）、卵巣（Ｈａｍａｎｉｓｈｉら、２００７ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉ１０４：３３６０）、膵臓（Ｎｏｍｉら、２００７ＣｌｉｎＣａｎｃｅｒＲｅｓ１３：２１５１）、メラノサイト（Ｈｉｎｏら、２０１０Ｃａｎｃｅｒ１１６：１７５７）および食道（Ｏｈｉｇａｓｈｉら、２００５ＣｌｉｎＣａｎｃｅｒＲｅｓ１１：２９４７）などの異なるタイプの臓器及び組織に関与する様々な癌において報告されている。それらの癌におけるＰＤ−Ｌ１の発現の増加が、患者の生存転帰における不良な予後と関連することは少なくない。

Ｂ７−Ｈ１Ｉｇまたは抗ＰＤ−Ｌ１抗体による、ＰＤ−１受容体に結合するＰＤ−Ｌ１の遮断は、Ｔ細胞の増殖および機能的活性を刺激し（Ｄｏｎｇら、ＮａｔｕｒｅＭｅｄ５：１３６５；Ｆｒｅｅｍａｎら、２０００ＪＥｘｐＭｅｄ１９２：１０２７；Ｔａｍｕｒａら、２００１Ｂｌｏｏｄ９７：１８０９；Ｉｗａｉら、２００２ＰＮＡＳ９９：１２２９３）、腫瘍増殖およびウイルス感染に対する免疫応答を増強させた（Ｉｗａｉら、２００２ＰＮＡＳ９９：１２２９３）。これらは、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１シグナル伝達の阻害が、癌細胞増殖に対してだけでなく、ヒトにおけるウイルス感染および増殖に対しても免疫応答を活性化し得ることを示唆した。一般的な肝細胞感染ウイルスであるＨＢＶおよびＨＣＶは、肝細胞におけるＰＤ−１リガンドの過剰発現を誘導し、Ｔ−エフェクター細胞におけるＰＤ−１シグナル伝達を活性化し、Ｔ細胞枯渇およびウイルス感染に対する耐性をもたらす（Ｂｏｎｉら、Ｖｉｒｏｌ８１：４２１５；Ｇｏｌｄｅｎ−Ｍａｓｏｎら、２００８ＪＩｍｍｕｎｏｌ１８０；３６３７）。同様に、一般的なＨＩＶ感染症は、同様のメカニズムによってヒト免疫系を頻繁に回避する。アンタゴニスト分子によるＰＤ−Ｌ１誘発シグナル伝達の治療的調節は、免疫細胞を寛容から復帰させ、再活性化を通して癌および慢性ウイルス感染を根絶することができる（Ｂｌａｎｋら、２００５ＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎｏｌＩｍｍｕｎｏｔｈｅｒＩｍｍｕｎｏｌ５４：３０７；Ｏｋａｚａｋｉら、２００７ＩｎｔＩｍｍｕｎｏｌ１９：８１３）。

最近、ＰＤ−Ｌ１も、ＰＤ−１への結合のほかに、Ｂ７−１（別のＢ７ファミリーメンバー、ＣＤ８０としても知られている）と特異的に相互作用することが報告されている（Ｂｕｔｔｅら、２００７Ｉｍｍｕｎｉｔｙ２７：１１１）。最初の証拠では、ＰＤ−Ｌ１とＣＤ８０との相互作用がＴ細胞機能および活性に負の調節を及ぼし、マウスにおけるＰＤ−Ｌ１およびＣＤ８０相互作用の遮断がＯＶＡ抗原チャレンジに対するより強い免疫応答を誘発することが示された（Ｐａｒｋら、２０１０Ｂｌｏｏｄ１１６：１２９１）。従って、ＰＤ−１及びＣＤ８０へのＰＤ−Ｌ１の結合を同時に遮断することは、癌およびウイルス感染に対して相加的または相乗的効果を発揮する可能性がある。

本発明は、ＰＤ−Ｌ１媒介シグナル伝達および機能を阻害することで免疫活性化を図る方法及び組成物を提供する。一形態において、本発明は、ヒトＰＤ−Ｌ１に特異的に結合し、本明細書に記載された相補性決定領域（ＣＤＲ）配列を含む、抗体抗原結合ドメインを提供する。ＣＤＲは、組み換えにより（ＣＨＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３）及び（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３）配列をそれぞれ含む重鎖可変領域（Ｖｈ）及び軽鎖可変領域（Ｖｋ）となり、ＰＤ−Ｌ１特異的結合及び／又は機能を保持する。

特定の実施形態では、前記ドメインは、下記（ａ）乃至（ｒ）から選択されたＣＤＲ（相補性決定領域）１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の組み合わせを含み、下記（ａ）乃至（ｒ）において、抗体（Ａｂ）、重鎖（ＨＣ）又は軽鎖（ＬＣ）、及び、ＣＤＲの組み合わせの由来した命名方式（Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴ又は複合）を最初のカラムに示し、太字の残基はＫａｂａｔ命名方式であり、下線のある残基はＩＭＧＴ命名方式である。

特定の実施形態では、前記ドメインは、（ａ）乃至（ｏ）から選択されたＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の組み合わせを含む重鎖可変領域（Ｖｈ）と、（ｐ）乃至（ｒ）から選択されたＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の組み合わせを含む軽鎖可変領域（Ｖｋ）と、を含む。

特定の実施形態では、前記ドメインは、下記（ｃ）、（ｆ）、（ｉ）、（ｌ）、（ｏ）及び（ｒ）から選択されたＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の組み合わせを含む。

特定の実施形態では、前記ドメインは、下記配列を含む、重鎖可変領域（Ｖｈ）又は軽鎖可変領域（Ｖｋ）を含む。
ｍｕ３３３ｖｈ（配列番号６）；
ｍｕ３３３ｖｋ（配列番号８）；
ｈｕ３３３−１Ａｖｈ（配列番号１５）；
ｈｕ３３３−１Ａｖｋ（配列番号１６）；
ｈｕ３３３−２Ｂｖｈ（配列番号１７）；
ｈｕ３３３−３Ａ２ｖｈ（配列番号１８）；
ｈｕ３３３−３Ｃ２ｖｈ（配列番号１９）；
ｈｕ３３３−３Ｈ２ｖｈ（配列番号２０）；
ｈｕ３３３−４Ａ２ｖｈ（配列番号２１）；
ｈｕ３３３−４Ｂ２ｖｈ（配列番号２２）；又は
ｈｕ３３３−４Ｂ２ｖｋ（配列番号２３）。

特定の実施形態では、前記ドメインは、下記配列を含む、重鎖可変領域（Ｖｈ）及び軽鎖可変領域（Ｖｋ）を含む。
ｍｕ３３３ｖｈ及びｖｋ（配列番号６及び８）；
ｈｕ３３３−１Ａｖｈ及びｖｋ（配列番号１５及び１６）；
ｈｕ３３３−２Ｂｖｈ及びｖｋ（配列番号１７及び１６）；
ｈｕ３３３−３Ａ２ｖｈ及びｖｋ（配列番号１８及び２３）；
ｈｕ３３３−３Ｃ２ｖｈ及びｖｋ（配列番号１９及び２３）；
ｈｕ３３３−３Ｈ２ｖｈ及びｖｋ（配列番号２０及び２３）；
ｈｕ３３３−４Ａ２ｖｈ及びｖｋ（配列番号２１及び２３）；及び
ｈｕ３３３−４Ｂ２ｖｈ及びｖｋ（配列番号２２及び２３）。

特定の実施形態では、前記ドメインは、ｈｕ３３３−４Ｂ２ｖｈ（配列番号２２）又はｈｕ３３３−４Ｂ２ｖｋ（配列番号２３）を含む、重鎖可変領域（Ｖｈ）又は軽鎖可変領域（Ｖｋ）を含む。

特定の実施形態では、前記ドメインは、ｈｕ３３３−４Ａ２ｖｈ及びｖｋ（配列番号２１及び２３）又はｈｕ３３３−４Ｂ２ｖｈ及びｖｋ（配列番号２２及び２３）を含む、重鎖可変領域（Ｖｈ）及び軽鎖可変領域（Ｖｋ）を含む。

特定の実施形態では、前記ドメインは、ＰＤ−Ｌ１残基：Ｄ２６及びＲ１１３に特異的に結合する。

本発明はまた、本ＰＤ−Ｌ１結合ドメインを含む抗体、特にモノクローナル抗体、およびＦ（ａｂ）またはＦ（ａｂ）２を提供する。

本発明はまた、本ＰＤ−Ｌ１抗原結合ドメインをコードするｃＤＮＡ等の新規ポリヌクレオチドおよび発現ベクター、そのようなポリヌクレオチドを含む細胞ならびにそのような細胞を含む非ヒト動物を提供する。そのポリヌクレオチドは、発現のために異種転写調節配列に作動可能に連結されてもよく、そのようなベクター、細胞などに組み込まれてもよい。

本発明は、癌もしくはウイルス感染症の判定を受けた個体またはその他のＰＤ−Ｌ１拮抗作用を必要とする個体に前記ドメインを投与することを含む、前記ドメインの使用方法を提供する。

本発明の組成物は、癌、神経変性および感染性、特にウイルス疾患、ヒトＰＤ−１の不適切なまたは有害な発現が状態の病因または病理の１つである他の状態の治療に有用である。したがって、本発明は、本抗ＰＤ−Ｌ１タンパク質を用いて、それを必要とする対象における癌を治療するか、又は、腫瘍進行を阻害する方法を提供し、ヒト化抗ＰＤ−１ｍＡｂは、ＰＤ−１媒介細胞内シグナル伝達による免疫細胞の抑制に関与して疾患の進行、特に癌及びウイルス感染症を引き起こすヒトの疾患を治療するための治療剤として使用される。
また、

本発明はさらに、対象において、癌を治療するか、または、腫瘍進行を阻害する医薬の製造のための本ポリヌクレオチドの使用を提供する。

本発明は、列挙した特定の実施形態の全ての組み合わせを含む。本発明のさらなる実施形態および適用可能性の全範囲は、以下に与えられる詳細な説明から明らかになるであろう。しかし、本発明の精神および範囲内の様々な変更および修正が当業者には明らかになるであろうから、詳細な説明及び特定の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示しているものの、あくまで例示のために挙げられたものと解すべきである。本明細書に引用された全ての刊行物、特許および特許出願（その中の引用を含む）は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

全長ＰＤ−Ｌ１（上）、ＰＤ−Ｌ１／Ｆｃ（中）およびＰＤ−Ｌ１／Ｈｉｓ（下）の概略図である。ＥＣＤ：細胞外ドメイン；Ｌ：リンカー；Ｆｃ：ヒトＩｇＧ４由来のγ４Ｆｃフラグメント；Ｈ：Ｈｉｓタグ；Ｎ：Ｎ末端；Ｃ：Ｃ末端。ＥＬＩＳＡにおけるマウスｍＡｂによる精製ヒトＰＤ−Ｌ１／Ｈｉｓへの用量依存的結合を示す。陰性対照としてのマウスｍＡｂおよびマウスＩｇＧを、各図の左上隅に示した。ＥＬＩＳＡプレートを１００ｎｇ／ウェルでＰＤ−Ｌ１／Ｈｉｓでコーティングした。ＥＬＩＳＡにおける結合シグナル強度は、直接ＯＤ４５０測定値（ｙ軸）にて示した。ｍＡｂまたはマウスＩｇＧの濃度をｘ軸に示した。ＦＡＣＳにおけるマウスｍＡｂによる細胞表面発現ＰＤ−Ｌ１への用量依存的結合を示す。ＨｉｓＨＥＫ２９３／ＰＤ−Ｌ１細胞を、マウス抗ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂまたは対照マウスＩｇＧの連続希釈液で染色した。結合シグナル強度は、ＦＡＣＳ分析におけるＭＦＩ（平均蛍光強度）にて示した。ｍＡｂまたはマウスＩｇＧの濃度をｘ軸に示した。ＨＥＫ２９３／ＯＳ８／ＰＤ−Ｌ１細胞との共培養後のＨｕＴ７８／ＰＤ−１細胞におけるマウス抗ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂ誘発ＩＬ−２分泌の用量依存性応答曲線である。ベースラインは、すべての試験濃度においてマウスＩｇＧ（ｍＩｇＧ）によって誘発された平均ＩＬ−２放出を示す。それぞれは重複データポイントの平均を表す。トップラインは、Ｐｒｉｚｍによる回帰計算に基づく最高ＩＬ−２放出を示す。ＨＥＫ２９３／ＰＤ−Ｌ１細胞との共培養後のＨｕＴ７８／Ｐ３Ｚ細胞におけるマウス抗ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂによって阻害されたＩＬ−２分泌の用量依存的応答曲線である。ＰＤ−Ｌ１およびＰ３Ｚキメラ受容体の結合によって、Ｐ３Ｚキメラ受容体およびＩＬ−２分泌が活性化される。ビオチン結合ＰＤ−１／Ｆｃに対するマウス抗ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂの用量依存競合曲線である。固定量のビオチン−ＰＤ−１−ＥＣＤ／Ｆｃを、ｘ軸に示された漸増濃度の抗ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂと混合した。ＦＡＣＳにより分析した平均蛍光強度（ＭＦＩ）をｙ軸に示した。マウスＧｉｇ（マグ）を陰性対照として用いた。ビオチン結合ＣＤ８０／Ｆｃに対するマウス抗ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂの用量依存的競合曲線である。固定量のビオチン−ＣＤ８０−ＥＣＤ／Ｆｃを、ｘ軸に示された漸増濃度の抗ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂの量と混合した。ＦＡＣＳにより分析した平均蛍光強度（ＭＦＩ）をｙ軸に示した。陰性対照としてマウスＩｇＧ（ｍｕＩｇＧ）を用いた。ドナー３由来の初代ヒトＰＢＭＣにおいてヒト化抗ＰＤ−Ｌ１Ｆａｂによって誘発されたＩＦＮ−γ分泌を示す。ＰＢＭＣをＨＥＫ２９３／ＯＳ８／ＰＤ−Ｌ１細胞と一晩共培養した。馴化培地中のＩＦＮ−γをＥＬＩＳＡによってアッセイした。ＢＳＡを陰性対照として用いた。ドナー１７由来の初代ヒトＰＢＭＣにおいてヒト化抗ＰＤ−Ｌ１Ｆａｂによって誘発されたＩＦＮ−γ分泌を示す。ＰＢＭＣをＨＥＫ２９３／ＯＳ８／ＰＤ−Ｌ１細胞と一晩共培養した。馴化培地中のＩＦＮ−γをＥＬＩＳＡによってアッセイした。ＢＳＡを陰性対照として用いた。野生型（ＩｇＧ１ｗｔ）または変異ヒトＩｇＧ１フォーマット（ＩｇＧ１ｍｃおよびＩｇＧ１ｍｆ）におけるヒト化抗ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂのＣ１ｑ結合をを示す。５０マイクロリットルのヒト化抗ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂの連続希釈液（ｘ軸）をＭａｘｉＳｏｒｐＥＬＩＳＡプレート上にコーティングした。ヒトＣ１ｑ結合（ｙ軸）は、ヒトＣ１ｑに対する特異的モノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡＯＤ４５０測定値によって評価した。野生型（ＩｇＧ１ｗｔ）または変異ヒトＩｇＧ１フォーマット（ＩｇＧ１ｍｃおよびＩｇＧ１ｍｆ）におけるヒト化抗ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂによって誘発された抗体依存的細胞傷害（ＡＤＣＣ）を示す。ＦｃγＲＩＩＩＡでトランスフェクションしたヒトＮＫ９２ＭＩ細胞をエフェクター細胞として使用し、ＨＥＫ２９３／ＰＤ−Ｌ１細胞を標的細胞として使用した。実施例５に記載の乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）放出アッセイに基づいて、細胞傷害の百分率（ｙ軸）を計算した。野生型（ＩｇＧ１ｗｔ）または変異ヒトＩｇＧ１フォーマット（ＩｇＧ１ｍｃおよびＩｇＧ１ｍｆ）におけるヒト化抗ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂの補体依存的細胞傷害（ＣＤＣ）活性を示す。Ｄａｕｄｉ／ＰＤ−Ｌ１細胞を標的細胞として使用し、健常ドナー由来のヒト血清を補体成分の供給源として使用した。リツキシマブ（Ｒｏｃｈｅ）を古典的ＣＤＣアッセイにおける陽性対照として用いた。ＣＤＣの百分率（ｙ軸）は、実施例５に記載の細胞力価グローアッセイに基づいて計算した。ドナー３由来の初代ヒトＰＢＭＣにおけるヒト化抗ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂによって誘発されたＩＦＮ−γ分泌を示す。ＰＢＭＣをＨＥＫ２９３／ＯＳ８／ＰＤ−Ｌ１細胞と一晩共培養した。馴化培地中のＩＦＮ−γをＥＬＩＳＡによってアッセイした。ヒトＩｇＧは陰性対照として機能した。ドナー１７由来の初代ヒトＰＢＭＣにおけるヒト化抗ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂによって誘発されたＩＦＮ−γ分泌を示す。ＰＢＭＣをＨＥＫ２９３／ＯＳ８／ＰＤ−Ｌ１細胞と一晩共培養した。馴化培地中のＩＦＮ−γをＥＬＩＳＡによってアッセイした。ヒトＩｇＧは陰性対照として機能した。ＥＬＩＳＡにおける精製されたヒトＰＤ−Ｌ１／Ｈｉｓに対する抗ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂの用量依存的結合を示す。ＭａｘｉＳｏｒｐＥＬＩＳＡプレートを、５０マイクロリットルのヒトＰＤ−Ｌ１／Ｈｉｓでコーティングした。抗ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂの濃度をｘ軸で示した。結合シグナル強度は、直接ＯＤ_４５０値（ｙ軸）にて示した。ＥＬＩＳＡにおける精製されたカニクイザルＰＤ−Ｌ１／Ｈｉｓに対する抗ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂの用量依存的結合を示す。ＭａｘｉＳｏｒｐＥＬＩＳＡプレートを、５０マイクロリットルのサルＰＤ−Ｌ１／Ｈｉｓでコーティングした。抗ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂの濃度をｘ軸で示した。結合シグナル強度は、直接ＯＤ_４５０値（ｙ軸）にて示した。ＥＬＩＳＡにおける精製されたマウスＰＤ−Ｌ１／Ｈｉｓに対する抗ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂの用量依存的結合を示す。ＭａｘｉＳｏｒｐＥＬＩＳＡプレートを、５０マイクロリットルのマウスＰＤ−Ｌ１／Ｈｉｓでコーティングした。抗ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂの濃度をｘ軸で示した。結合シグナル強度は、直接ＯＤ_４５０値（ｙ軸）にて示した。ＥＬＩＳＡ（上のパネル）およびウエスタンブロット（下のパネル）によって抗ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂの結合エピトープをマッピングしたものであり、ｈｕ３３３−４Ｂ２−ＩｇＧ１によるＰＤ−Ｌ１変異体への結合活性を示す。野生型または変異型ＰＤ−Ｌ１／Ｈｉｓタンパク質を含む馴化培地を用いて、ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロットにより結合活性を評価した。^＊＊は、野生型ＰＤ−Ｌ１に対してｍＡｂ結合活性が２５〜５０％まで低下したＰＤ−Ｌ１変異体を示す。^＊＊＊は野生型ＰＤ−Ｌ１に対してｍＡｂ結合活性が２５％未満に低下したＰＤ−Ｌ１変異体を示す。ＥＬＩＳＡ（上のパネル）およびウエスタンブロット（下のパネル）によって抗ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂの結合エピトープをマッピングしたものであり、Ｙ１−ＩｇＧ１によるＰＤ−Ｌ１変異体への結合活性を示す。野生型または変異型ＰＤ−Ｌ１／Ｈｉｓタンパク質を含む馴化培地を用いて、ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロットにより結合活性を評価した。^＊＊は、野生型ＰＤ−Ｌ１に対してｍＡｂ結合活性が２５〜５０％まで低下したＰＤ−Ｌ１変異体を示す。^＊＊＊は野生型ＰＤ−Ｌ１に対してｍＡｂ結合活性が２５％未満に低下したＰＤ−Ｌ１変異体を示す。ＥＬＩＳＡ（上のパネル）およびウエスタンブロット（下のパネル）によって抗ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂの結合エピトープをマッピングしたものであり、抗ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂによるＤ_２６Ａ変異体ＰＤ−Ｌ１への結合活性を示す。野生型または変異型ＰＤ−Ｌ１／Ｈｉｓタンパク質を含む馴化培地を用いて、ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロットにより結合活性を評価した。^＊＊は、野生型ＰＤ−Ｌ１に対してｍＡｂ結合活性が２５〜５０％まで低下したＰＤ−Ｌ１変異体を示す。＊＊＊は野生型ＰＤ−Ｌ１に対してｍＡｂ結合活性が２５％未満に低下したＰＤ−Ｌ１変異体を示す。ヒト血清タンパク質とＰＤ−Ｌ１抗原との混合物に対する抗ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂの結合アッセイ（ＥＬＩＳＡ）である。ヒト血清とＰＤ−Ｌ１／Ｈｉｓタンパク質との混合物に結合するマウスｍＡｂまたはマウスキメラｍＡｂの用量依存的反応曲線を示す。ＰＢＳ中のＰＤ−Ｌ１／Ｈｉｓタンパク質の連続希釈液を、記載の通り９６ウェルＭａｘｉＳｏｒｐＥＬＩＳＡプレート上にコーティングし、５％の固定最終濃度でヒト血清プール（３人の健常ドナーから）を加えた。３つの指示ｍＡｂ（μｇ／ｍＬ）を各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。ヒト血清タンパク質とＰＤ−Ｌ１抗原との混合物に対する抗ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂの結合アッセイ（ＥＬＩＳＡ）である。ヒストグラムは、各ｍＡｂおよび陰性対照（ｍＡｂなし）について曲線の左側の３つのデータ点（主にヒト血清タンパク質でコーティングされ、ＰＤ−Ｌ１／Ｈｉｓはほとんどコーティングされていない）の平均ＯＤ_４５０値を示した。ｈｕ３３３−４Ｂ２−ＩｇＧ１ｍｆまたはビヒクルで処置したときの平均腫瘍増殖（成長）曲線である。健常ドナー由来のＰＢＭＣおよびヒト癌細胞Ａ４３１を移植したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスを、１０ｍｇ／ｋｇの投与量のｈｕ３３３−４Ｂ２−ＩｇＧ１ｍｆで週に２回処置した。

ＰＤ−Ｌ１は、そのリガンド、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２と結合すると、免疫細胞において抑制性シグナル伝達を開始する。癌の増殖やウイルス感染の場合に、ＰＤ−１シグナル伝達の活性化は、免疫寛容（ｉｍｍｕｎｅｔｏｌｅｒａｎｃｅ）を促進して、癌又はウイルス感染細胞が免疫監視（ｉｍｍｕｎｅｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ）から逃れるようになり、癌転移又はウイルス負荷（ｖｉｒａｌｌｏａｄ）を増加させる。治療薬によるＰＤ−１媒介細胞内シグナル伝達の阻害は、Ｔ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞を含む免疫細胞を活性化することで、癌細胞増殖またはウイルス感染を阻害する免疫細胞機能を増強させるとともに、免疫監視および免疫記憶機能を回復させて、これらのヒトの疾患を治療する。

本発明は、免疫細胞においてＰＤ−Ｌ１誘発細胞内シグナル伝達に拮抗する機能を有する抗体を提供する。マウス抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、フレームワーク領域でヒト抗体と高度に類似するようにヒト化された。改変ヒトＩｇＧ４変異体フォーマットに作製された完全な抗体は、エフェクター機能および物理化学的特性の面でユニークな特徴を有している。開示された抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、癌の治療、ウイルス感染の制御、及び、免疫寛容悪化に機構的に関与する他のヒトの疾患における治療的使用に適している。

文脈が他に示さない限り、用語「抗体」は最も広い意味で使われ、具体的に、抗体（全長モノクローナル抗体を含む）およびＰＤ−Ｌ１を認識できる抗体断片を含む。抗体分子は、通常、単一特異性であるが、独自特異性（ｉｄｉｏｓｐｅｃｉｆｉｃ）、異種特異性（ｈｅｔｅｒｏｓｐｅｃｉｆｉｃ）、または多特異性（ｐｏｌｙｓｐｅｃｉｆｉｃ）としても記載する場合もある。抗体分子は、抗原上の特定の抗原決定基またはエピトープに対する特異的結合部位によって結合する。「抗体断片」とは、全長抗体の一部を含み、一般的にその抗原結合領域または可変領域である。抗体断片の例として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、及びＦｖ断片；二特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）；線形抗体；単鎖抗体分子；および抗原断片から形成された多特異性抗体などがある。

天然及び改変抗体構造は、当該技術分野においてよく知られている。例えば、文献（Ｓｔｒｏｈｌら、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｎｔｉｂｏｄｙｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｃｕｒｒｅｎｔａｎｄｆｕｔｕｒｅａｄｖａｎｃｅｓｄｒｉｖｉｎｇｔｈｅｓｔｒｏｎｇｅｓｔｇｒｏｗｔｈａｒｅａｉｎｔｈｅｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｉｎｄｕｓｔｒｙ、ＷｏｏｄｈｅａｄＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＳｅｒｉｅｓｉｎＢｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅＮｏ．１１、Ｏｃｔ２０１２；Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ２３、１１２６−１１３６（２００５）；Ｃｈａｍｅｓら、ＢｒＪＰｈａｒｍａｃｏｌ．２００９Ｍａｙ；１５７（２）：２２０−２３３）参照。

モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、当業者に周知の方法によって得ることができる。例えば、文献（Ｋｏｈｌｅｒら（１９７５）；米国特許第４，３７６，１１０号；Ａｕｓｕｂｅｌら（１９８７−１９９９）；Ｈａｒｌｏｗら（１９８８）；及びＣｏｌｌｉｇａｎら（１９９３））参照。本発明のｍＡｂは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡを含む任意の免疫グロブリンクラス、及びそれらの任意のサブクラスであってもよい。ｍＡｂを産生するハイブリドーマは、ｉｎｖｉｔｒｏまたはｉｎｖｉｖｏで培養してもよい。ｍＡｂの高力価は、個々のハイブリドーマからの細胞をマウス、例えば、プリスティーン・プライムド（ｐｒｉｓｔｉｎｅ−ｐｒｉｍｅｄ）Ｂａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注射し、所望のモｍＡｂを高濃度で含有する腹水を産生するｉｎｖｉｖｏ産生によって得ることができる。アイソタイプＩｇＭまたはＩｇＧのｍＡｂは、当業者に周知のカラムクロマトグラフィー法を用いて、例えば、腹水から、または培養上清から精製することができる。

「単離（された）ポリヌクレオチド」とは、天然状態でそれに隣接する配列から分離されたポリヌクレオチドセグメントまたは断片、例えば、通常その断片に隣接する配列（例えば、天然のゲノム中の断片に隣接する配列）から取り除かれたＤＮＡ断片をいう。したがって、この用語は、例えば、ベクター、自己複製プラスミドまたはウイルス、または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡへ組み込まれたか、または他の配列とは独立した分離分子（例えば、ｃＤＮＡ断片又はゲノム断片、又はＰＣＲ又は制限酵素消化によって産生されたｃＤＮＡ断片）として存在する、組換えＤＮＡを含む。また、更なるポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えＤＮＡをも含む。

「構造体（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）」とは、１以上のポリヌクレオチド分子が機能的に作動可能に（ｏｐｅｒａｔｉｖｅ）連結された、即ち、作動可能に連結された、ポリヌクレオチド分子を含む、任意の供給源に由来する、ゲノムの組込または自己複製できる、直鎖状または環状の一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド分子、プラスミド、コスミド、ウイルス、自己複製性ポリヌクレオチド分子、またはファージ等任意の組換えポリヌクレオチド分子を意味する。組換え構造体は、典型的に、意図された宿主細胞においてポリヌクレオチドの転写を指令する転写開始調節配列に作動可能に連結された本発明のポリヌクレオチドを含むであろう。異種および非異種（すなわち、内因性）プロモーターは、本発明の核酸の発現を指示するように使用することができる。

「ベクター」とは、軽質転換、すなわち、宿主細胞への異種ＤＮＡの導入のために使用することができる任意の組換えポリヌクレオチド構造体を意味する。ベクターの一つに、付加的なＤＮＡセグメントを連結することができる環状二本鎖ＤＮＡループを指す「プラスミド」がある。別のタイプのベクターには、付加的なＤＮＡセグメントがウイルスゲノムに連結されたウイルスベクターが含まれる。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞内で自己複製可能である（例えば、細菌性複製起点及びエピソーム哺乳動物ベクターを有する細菌ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入の際に宿主細胞に組み込まれて、宿主ゲノムと共に複製される。さらに、特定のベクターは、それらが作動可能に連結された遺伝子の発現を指令することができる。これらのベクターを本願明細書では「発現ベクター」と呼ぶ。

本明細書で使用される「発現ベクター」とは、宿主細胞への形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍ）、トランスフェクト（ｔｒａｎｓｆｅｃｔ）、又は、形質導入された（ｔｒａｎｓｄｕｃｅ）ときに、目的の遺伝子を複製及び発現することができる核酸分子をいう。発現ベクターは、該ベクターを確実に維持し、必要に応じて、宿主内で増幅するための複製起点と、１以上の表現型選択マーカーと、を含む。発現ベクターは、細胞内でポリペプチドを発現させるプロモーターをさらに含む。適切な発現ベクターは、例えば、市販されている種々のｐＵＣプラスミド又はｐＢＲ３２２に由来するプラスミドであってもよい。他の発現ベクターは、バクテリオファージ、ファージミド、またはコスミド発現ベクターに由来するものであってもよい。

配列表の説明

実施例
実施例１抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体の作製
マウスＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、ハイブリドーマ融合技術（変更あり）に基づいて作製した（ＫｏｈｌｅｒａｎｄＭｉｌｓｔｅｉｎ１９７６ＥｕｒＪＩｍｍｕｎｏｌ６：５１１−５１９；Ｍｅｃｈｅｔｎｅｒ２００７ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌＢｉｏｌ３７８：１−１３）。酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）および蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）アッセイで高い結合活性を有するモノクローナル抗体を、細胞系機能分析においてさらなる特徴付けのために選択した。

ＰＤ−Ｌ１及びＣＤ８０組換えタンパク質
公開された配列（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿０１４１４３．３）（配列番号１および２）に基づいて、全長ヒトＰＤ−Ｌ１ｃＤＮＡはＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔ社（中国南京）によって合成された。ヒトＰＤ−Ｌ１（配列番号３および４）のアミノ酸（ＡＡ）１−２３９からなる細胞外ドメインをＰＣＲ増幅し、ＩｇＧ４のＦｃ領域またはＨｉｓタグのいずれかに融合したＣ末端を有するｐｃＤＮＡ３．１系発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国カリフォルニア州カールスバッド）にサブクローニングした。その結果、ＰＤ−Ｌ１−ＥＣＤ／ＦｃおよびＰＤ−Ｌ１−ＥＣＤ／Ｈｉｓ（ＰＤ−Ｌ１／Ｆｃ及びＰＤ−Ｌ１／Ｈｉｓと略称する。）の２つの組換えＰＤ−Ｌ１融合構造体を得た。ＰＤ−Ｌ１融合タンパク質の概略図を図１に示した。組換えＰＤ−Ｌ１融合タンパク質を、メーカー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の指示に従って一過性トランスフェクションによって２９３−Ｆ細胞（カタログ番号Ｒ７９００７、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で発現させた。分泌された組換えタンパク質を含有する馴化培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄｍｅｄｉａ）を収集し、遠心分離（１５０００ｇ、３０分）によって清澄化した。ＰｒｏｔｅｉｎＧＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗカラム（カタログ番号１７０６１８０５、ＧＥＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ、中国上海）を用いてＰＤ−Ｌ１／Ｆｃを精製した。ＰＤ−Ｌ１／Ｈｉｓは、Ｎｉ−セファロース・ファスト・フローアフィニティークロマトグラフィー（カタログ番号１７５３１８０１、ＧＥライフサイエンス社、中国上海）に続くＨｉＬｏａｄ１６／６０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（カタログ番号１７１０６９０１、ＧＥライフサイエンス社、中国上海）を用いるサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。ＰＤ−Ｌ１／ＦｃおよびＰＤ−Ｌ１／Ｈｉｓタンパク質の両方をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に対して透析し、−８０℃の冷凍庫に小分けして保存した。

全長ヒトＰＤ−１ｃＤＮＡを含む発現プラスミドは、Ｏｒｉｇｅｎｅ社（カタログ番号ＳＣ１１７０１１、ＮＣＢＩ受託番号：ＮＭ＿００５０１８．１、中国北京）から入手した。ＰＤ−１のアミノ酸（ＡＡ）１−１６８からなる細胞外ドメインをＰＣＲ増幅し、ヒトＩｇＧ４重鎖のＦｃドメインに融合したＣ末端を有するｐｃＤＮＡ３．１系発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国カリフォルニア州カールスバッド）にサブクローニングし、ＰＤ−１／Ｆｃと略称した。

ヒトＣＤ８０（Ｂ７−１）ｃＤＮＡは、公開された配列（ＮＣＢＩ受託番号：ＮＭ＿００５１９１．３）に基づいてＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔによって合成された。ＣＤ８０の細胞外ドメイン（ＡＡ１−２４２）をＣ末端においてヒトＦｃと融合させ、前述した方法（米国特許第８７３５５５３号）と同様に哺乳動物発現ベクターにサブクローニングした。この融合タンパク質をＣＤ８０−ＥＣＤ／ＦｃまたはＣＤ８０／Ｆｃと命名した。

ＰＤ−Ｌ１を発現する安定な細胞株
ヒトＰＤ−Ｌ１を発現する安定な細胞株は、ＰＤ−Ｌ１を含むｐｃＤＮＡ３．１プラスミドをＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ、米国バージニア州マナサス）にトランスフェクションし、その後、１ｍｌ当たり６００μｇのハイグロマイシンを含む培地（カタログ番号１０６８７−０１０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で選別した。培養皿の表面から単一のコロニーを拾い上げることによって単一のクローンを単離した。すべてのクローンを、ＰＤ−Ｌ１抗体（カタログ番号１７−５９８３、米国サンディエゴのｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いたウエスタンブロット及びＦＡＣＳ分析によりスクリーニングし、ＦＡＣＳ結合分析および機能アッセイにトップ発現クローンを用いた。

免疫化およびハイブリドーマクローンの作製
マウス抗ヒトＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体を、ハイブリドーマ融合技術を用いて作製した。全ての動物プロトコールはＢｅｉＧｅｎｅＡｎｉｍａｌＣａｒｅａｎｄＵｓｅＰｒｏｃｅｄｕｒｅによって評価し、それに従って実施された。１０〜１２週齢のＢａｌｂ／ｃマウス（ＨＦＫＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、中国北京）を皮下および／または腹腔内に３回（注射間隔は３週間）免疫化し、各免疫化は、ＰＤ−Ｌ１／Ｆｃを５〜１０μｇ含有する１００ｕＬのアジュバント（カタログ番号ＫＸ０２１００４１、ＫａｎｇＢｉＱｕａｎ社、中国北京）で行った。２回目の免疫化から２週間経った時点でマウス血清を回収し、ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳによりＰＤ−Ｌ１結合を評価した。このような分析結果の例を表１および表２にまとめた。血清中の抗ＰＤ−Ｌ１結合力価が高いマウスを選択し、ＰＢＳ中５０μｇのＰＤ−Ｌ１／Ｆｃで腹腔内に追加免疫した。追加免疫の３日後、脾細胞を単離し、標準的な技術（Ｍｅｃｈｅｔｎｅｒら、２００７ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌＢｉｏｌ３７８：１−１３）を用いて（一部変更あり）、マウスミエローマ細胞株ＳＰ２／０（ＡＴＣＣ）と融合させた。

ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳによるマウス抗体のＰＤ−Ｌ１結合活性の評価
修正ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｆｌａｎａｇａｎ２００７ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌＢｉｏｌ３７８：３３−５２）によって、ＰＤ−Ｌ１結合活性についてハイブリドーマクローンの上清を最初にスクリーニングした。つまり、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）５０μｌ中にＰＤ−Ｌ１／Ｈｉｓ５０〜２００ｎｇを希釈し、９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（ＪｉｎＣａｎＨｕａ、中国深セン）の各ウェルにコーティングした。ハイブリドーマクローンの培養上清、ＨＲＰ連結抗マウスＩｇＧ抗体（カタログ番号７０７６Ｓ、ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）及びテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（カタログ番号ＰＡ１０７−０１、ＴＩＡＮＧＥＮ社、中国北京）を用いて、プレートリーダー（ｐｌａｔｅｒｅａｄｅｒ）（ＰＨＲＥＡｓｔａｒＦＳ、ＢＭＧＬＡＢＴＥＣＨ、ドイツ）により結合シグナルを波長４５０ｎｍでの吸光度として検出した。ＥＬＩＳＡ陽性クローンを、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）によってさらに確認した。ＰＤ−Ｌ１発現細胞、ＨＥＫ／ＰＤ−Ｌ１（１０^５細胞（数）／ウェル）を、Ｖ底９６ウェルプレート（カタログ番号３８９７、コーニング社）でハイブリドーマクローンからの上清と共にインキュベートした。細胞表面に結合したＰＤ−Ｌ１抗体を、Ｄｙｌｉｇｈｔ６４９標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（カタログ番号４０５３１２、バイオレジェンド社、米国サンディエゴ）で検出し、グアヴァイージサイト８ＨＴフローサイトメータ（ＧｕａｖａｅａｓｙＣｙｔｅ８ＨＴ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、米国）にてモニターした。

ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳアッセイの両方で陽性を示したハイブリドーマクローンを、その後、ヒト免疫細胞系機能分析でテストして、優れた機能活性を有する抗体を同定した。陽性の機能活性を有するハイブリドーマクローンをさらにサブクローニングし、特徴付けした。

サブクローニング及びハイブリドーマ細胞の無血清または低血清培地への適応
ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳおよび機能分析を介した１次スクリーニングからの陽性ハイブリドーマクローンを、限界希釈法によってサブクローニングした。各々の元のクローンからの３つのサブクローンを選択し、ＦＡＣＳ及び機能分析で確認した。機能分析を介して選択されたサブクローンをモノクローナル抗体として定義した。トップ（ｔｏｐ）サブクローンを、精製及び更なる特徴付けのために、０〜３％ＦＢＳを含有するＣＤＭ４ＭＡＢ培地（カタログ番号ＳＨ３０８０１．０２、Ｈｙｃｌｏｎｅ社）での増殖（成長）に適応させた。

モノクローナル抗体の発現及び精製
抗体発現プラスミド（カタログ番号Ｒ７９００７、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で一時的にトランスフェクションした２９３−Ｆ細胞又はハイブリドーマ細胞を、ＣＤＭ４ＭＡｂ培地（カタログ番号ＳＨ３０８０１．０２、Ｈｙｃｌｏｎｅ社）又はＦｒｅｅｓｔｙｌｅ（登録商標）２９３発現培地（カタログ番号１２３３８０１８、インビトロジェン社）のいずれかで培養し、３７℃のＣＯ_２インキュベーター内で５〜７日間インキュベートした。遠心分離（１００００ｇ、３０分）によって馴化培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄｍｅｄｉｕｍ）を収集して細胞又は細胞破片を除去し、そして、精製前に０．２２μｍ膜を通して濾過した。メーカーのガイドに従ってマウスの抗体または組換え抗体を含有する上清を、プロテインＡカラム（カタログ番号１７１２７９０１、ＧＥライフサイエンス社）にかけて、それに結合させ、ＰＢＳで洗浄し、２０ｍＭのクエン酸、１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含有する酸緩衝液（ｐＨ３．５）中で溶出させた。溶出された物質を、１ＭトリスｐＨ８．０で中和させた。この手順により概して９０％超の純度を有する抗体を得た。プロテインＡ親和性精製抗体を、ＰＢＳに対して透析するか、または、ＨｉＬｏａｄ１６／６０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（カタログ番号１７５３１８０１、ＧＥライフサイエンス社）を用いてさらに精製することで、凝集物を除去した。２８０ｎｍでの吸光度の測定、または、ウシＩｇＧ参照基準（カタログ番号２３２１２、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いるブラッドフォードアッセイ（カタログ番号１８５６２１０、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、米国イリノイ州ロックフォード）により、タンパク質濃度を測定した。最終的に得られた抗体調剤を小分けして−８０℃の冷凍庫の中で保存した。

精製モノクローナル抗体の結合活性は、前述したように、ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳ分析で評価した。ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳにおける容量依存的結合曲線を用いて、ｍＡｂの能力を比較した。２つの代表的なマウスｍＡｂの結果を図２及び表３に示した。マウスｍＡｂ３３３（ｍｕ３３３）は、ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳ分析においてそれぞれ０．０３６μｇ／ｍＬ及び０．０９９μｇ／ｍＬのＥＣ_５０（５０％活性における有効濃度）を有する容量依存的結合活性を示した。Ｍｕ２７７は、ＥＬＩＳＡではＭｕ３３３に類似した結合活性を示したが（ＥＣ_５０＝０．０３１μｇ／ｍＬ）、ＦＡＣＳでは低い結合活性を示した（ＥＣ_５０＝０．３７１μｇ／ｍＬ）。対照的に、対照マウスＩｇＧ（ｍｕｌｇＧ）は、両方の分析においてＰＤ−Ｌ１に結合しなかった。

実施例２抗ＰＤ−Ｌ１抗体の機能活性
安定な細胞株の作製
ヒトＴ細胞系機能分析のための安定な細胞株は、米国特許第８７３５５５３号に記載されたものとほぼ同じであった。つまり、膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを含むマウスＣＤ８αのＣ末端及び抗ヒトＣＤ３ｍＡｂＯＫＴ３のｓｃＦｖを含有する融合タンパク質発現プラスミド、ＯＳ８を作製した。ＯＳ８は、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）を直接活性化する膜アンカー型Ｔ細胞エンゲージャー（ｅｎｇａｇｅｒ）として機能し得る。ＯＳ８及びＰＤ−Ｌ１を同時発現させる安定な細胞株は、ＨＥＫ２９３細胞における２つの発現構造体の同時トランスフェクション、その後の１０〜１４日間のハイグロマイシンまたはＧ４１８選択により、作製した。この細胞株を、ＨＥＫ２９／ＯＳ８／ＰＤ−Ｌ１と命名した。同様に、ヒトＰＤ−１を発現するヒトＴ細胞株、ＨｕＴ７８／ＰＤ−１を作製した。ヒトＰＤ−１の細胞外および膜貫通ドメインをヒトＣＤ３ζ鎖の細胞質領域に融合することによって作製されたキメラＰＤ−１発現構造体（Ｐ３Ｚと命名した）との安定なトランスフェクションにより、逆方向シグナル伝達ヒトＴ細胞株、ＨｕＴ７８／Ｐ３Ｚを作製した。このようにして、Ｐ３Ｚは、ＰＤ−１リガンド（ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２）との連結時にＴ細胞を活性化し得る膜結合受容体をコードした。前述した限界希釈によって細胞株をクローニングした（Ｆｕｌｌｅｒ２００１ＣｕｒｒＰｒｏｔｏｃＭｏｌＢｉｏｌ、第１１章、１１．８部）。

ＨｕＴ７８／ＰＤ−１細胞におけるＩＬ−２放出によるＰＤ−Ｌ１抗体機能の決定
抗ＰＤ−Ｌ１抗体がＰＤ−Ｌ１によって誘発されたＰＤ−１シグナル伝達を遮断できるかどうかを調べるために、ＨＥＫ２９３／ＯＳ８／ＰＤ−Ｌ１細胞を抗ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂと１５分間プレインキュベートした後に、３７℃、１ウェルあたり２００μｌのＲＰＭＩ１６４０増殖培地を与えた平底プレートに、ＨｕＴ７８／ＰＤ−１細胞（１ウェル当たり１〜３×１０^４個）と共培養した。１６〜１８時間共培養した後に、上清を回収した。ヒトＩＬ−２Ｒｅａｄｙ−Ｓｅｔ−Ｇｏ！ＥＬＩＳＡキット（カタログ番号８８−７０２５、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、カリフォルニア州サンディエゴ）を用いるＥＬＩＳＡによりＩＬ−２をアッセイした。このアッセイにおいて、抗ＰＤ−Ｌ１抗体によるＰＤ−Ｌ１−ＰＤ−１シグナル伝達の遮断は、ＴＣＲシグナル伝達およびＩＬ−２産生を増強させた。

表４に示すように、ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳ結合陽性ハイブリドーマクローンの上清をこの機能分析でスクリーニングした。ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳアッセイにおいて試験クローンすべてがＰＤ−Ｌ１に結合したが、そのうち僅かのものがＰＤ−Ｌ１−ＰＤ−１シグナル伝達を遮断し、それにより、ＩＬ−２産生を増加させた。残りのクローンは、新鮮培地のみを用いた陰性対照と比較して、ＩＬ−２産生を全く増加させないか、ほとんど増加させなかった。この実験では、ＯＤ４５０測定値カットオフを２．５に設定した。すなわち、このレベルを超えてＩＬ−２産生を刺激したクローンは、アンタゴニスト機能を有すると考えられた（表４）。公開されたデータ（米国公開公報２０１０／０２０３０５６Ａ１）の可変領域に基づいて参照用抗ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂ（Ｙ１と命名した）を合成し、そして、Ｙ１抗体のヒト及びマウスフォーマットの両方は、Ｙ１可変領域をマウス又はヒトＩｇＧ１κの定常領域と融合してそれぞれＹ１−ｍｕＩｇＧ１またはＹ１−ｈｕＩｇＧ１（集合的にＹ１−ｈＩｇＧ１と称する）を作製することで、得られた。Ｙ１−ｍｕＩｇＧ１の機能もこのアッセイで確認された。

遮断活性の定量的評価のために、精製されたマウス抗ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂを、同じアッセイにおいて比較した。図３は、代表的なマウス抗ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂの用量反応曲線を示した。表５は、これらのｍＡｂが誘発し得る最大ＩＬ−２濃度及びＥＣ_５０をまとめたものである。Ｍｕ３３３は、ＰＤ−Ｌ１−ＰＤ−１シグナル伝達の強力なアンタゴニストであり、非常に低いＥＣ_５０で有意なＩＬ−２産生を誘発した。対照的に、ｍＡｂのうちｍｕ２７７は、容量依存的応答曲線、並びに、トップラインシグナル測定値及びＥＣ_５０のパラメーターによって判断したときに、ｍｕ３３３よりも遥かに弱い遮断活性を有していた。陰性対照として、ｍｕＩｇＧはＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１シグナル伝達を遮断せず、ＩＬ−２産生を刺激することができなかった。

ＨｕＴ７８／Ｐ３Ｚ細胞におけるＩＬ−２放出の逆シグナル伝達によるＰＤ−Ｌ１抗体機能の決定
ＨｕＴ７８／Ｐ３Ｚ細胞では、ＰＤ−１媒介性のＴＣＲシグナル伝達は、前節で説明したような設計によって逆転される。このアッセイでは、ＨＥＫ２９３／ＰＤ−Ｌ１細胞を精製ＰＤ−Ｌ１抗体と共に１５分間プレインキュベートした後に、３７℃の平底プレートでＨｕＴ７８／Ｐ３Ｚ細胞と共培養した。１６〜１８時間の共培養の後に、上清を回収し、ＩＬ−２産生を前述したＥＬＩＳＡによってアッセイした。

マウス抗ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂの阻害活性は、用量依存的にＩＬ−２放出の減少と直接的に相関した形で検出された。上記の結果と一致して、ｍｕ３３３は、ＨｕＴ７８細胞上のＰ３Ｚキメラ受容体上のＰＤ−Ｌ１係合を妨げることによってＩＬ−２分泌を阻害する強力な活性を有していた。表６および図６に示すように、ｍｕ３３３は、ＩＣ_５０（最大活性の５０％阻害時のｍＡｂの濃度）に関してｍｕ２７７よりもはるかに強力であり、これはＴ細胞における通常のシグナル伝達で得られた結果と一致した。陰性対照ｍｕＩｇＧは、ＰＤ−Ｌ１／Ｐ３Ｚ誘導性ＩＬ−２産生を阻害することができなかった。

細胞表面発現ＰＤ−Ｌ１に対するＰＤ−１結合の競合的阻害
抗ＰＤ−Ｌ１抗体がＰＤ−Ｌ１へのＰＤ−１結合と競合し得るかどうかを調べるために、ＨＥＫ２９３／ＰＤ−Ｌ１細胞（１ｘ１０^５細胞／ウェル）を、Ｖ底９６ウェルプレートにおいて、ＰＤ−Ｌ１抗体とビオチン結合ＰＤ−１／Ｆｃ融合タンパク質の混合物と共にインキュベートした。メーカー（カタログ番号２１３２７、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉ社）の指示に従って、ＥＺ−ＬｉｎｋＳｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン試薬を用いてＰＤ−１／Ｆｃのビオチン化を行った。ストレプトアビジン−ＡＰＣでプローブされた平均蛍光強度（ＭＦＩ）測定値によって、抗体によるＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−１／Ｆｃ相互作用の阻害をアッセイした（ＧｕａｖａｅａｓｙＣｙｔｅ８ＨＴＦｌｏｗＣｙｔｏｍｅｔｅｒ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、米国）。この方法を用いて、抗ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂの機能強度を評価した。図５および表７に示すように、マウスｍＡｂは競合的にＰＤ−Ｌ１に結合して、ＦＡＣＳアッセイにおいて細胞表面ＰＤ−Ｌ１に結合するビオチン−ＰＤ−１／Ｆｃによって誘発されるＭＦＩ値を阻害する。Ｍｕ３３３は、ｍｕ２７７について２．１７２μｇ／ｍＬのＩＣ_５０と比較して、０．４６３μｇ／ｍＬのＩＣ_５０を有し、より良好な阻害効力を示した。対照的に、対照抗体であるマウスＩｇＧはそのような阻害効果を有さなかった（図５）。

細胞表面ＰＤ−Ｌ１へのＣＤ８０の結合の競合的阻害
ＰＤ−１との相互作用に加えて、ＰＤ−Ｌ１は、別のＢ７ファミリータンパク質であるＢ７−１（「ＣＤ８０」とも呼ばれる）にも結合する（ＢｕｔｔｅＭ．Ｊ．２００７Ｉｍｍｕｎｉｔｙ２７：１１１−１２２）。抗ＰＤ−Ｌ１抗体がＣＤ８０（ＮＣＢＩ受託番号：ＮＰ＿００５１８２．１）のＰＤ−Ｌ１への結合に対して競合するか否かを調べるために、ＨＥＫ２９３／ＰＤ−Ｌ１細胞をＰＤ−Ｌ１抗体とビオチン結合ＣＤ８０／Ｆｃ融合タンパク質の混合物と共にインキュベートした。このアッセイにおいて、抗ＰＤ−Ｌ１抗体によるＰＤ−Ｌ１へのビオチン−ＣＤ８０／Ｆｃ結合の遮断は、結合シグナルの減少（ＭＦＩ値）をもたらした。図６および表８に示すように、ｍｕ３３３は、ｍｕ２７７のＩＣ_５０（０．１６２μｇ／ｍＬ）と比較したとき、１００％の最大阻害および非常に低いＩＣ_５０（０．０５２μｇ／ｍＬ）をもってＰＤ−Ｌ１へのＣＤ８０の結合と競合した。対照的に、マウスＩｇＧはそのような競合効果を有さなかった（図６）。

実施例３マウス抗ＰＤ−Ｌ１抗体の配列分析
選択されたマウスハイブリドーマクローンからの可変領域のクローニングおよび配列決定は、一般的に使用される方法（一部変更あり）に基づいて行われた（ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎおよびＤｕｂｅｌ、２０１０ＡｎｔｉｂｏｄｙＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｖｏｌ１：３−１４）。つまり、ハイブリドーマ細胞を回収し、ＰＢＳで洗浄し、スイング型ローターでの遠心分離（１５００ｒｐｍ）によって回収した。ＵｌｔｒａｐｕｒｅＲＮＡキット（カタログ番号ＣＷ０５８１、ＣＷＢｉｏｔｅｃｈ社、中国北京）をメーカーのプロトコールに従って用いて全細胞ＲＮＡを単離した。

第１鎖ｃＤＮＡは、逆転写酵素（カタログ番号．ＡＨ３０１−０２、ＴｒａｎｓＧｅｎ社、中国北京）を用いて合成した。マウスｍＡｂの重鎖（Ｖｈ）および軽鎖可変領域（Ｖκ）のＰＣＲ増幅を、ＰＣＲ試薬キット（カタログ番号ＡＰ２２１−１２、ＴｒａｎｓＧｅｎ社、中国北京）および上述のマウスＶｈおよびＶκのクローニング用の特異的なプライマーセット（Ｂｒｏｃｋｓ２００１ＭｏｌＭｅｄ７：４６１−４６９）を用いて行った。ＰＣＲ産物をｐＥＡＳＹ−Ｂｌｕｎｔクローニングベクター（カタログ番号ＣＢ１０１−０２、ＴｒａｎｓＧｅｎ社）にサブクローニングした後に、Ｇｅｎｅｗｉｚ（中国北京）によって配列決定した。ＶｈおよびＶｋのアミノ酸配列をＤＮＡ配列決定結果から推定した。

マウスｍＡｂを配列相同性の比較によって分析し、配列相同性およびエピトープ−マッピング結果の両方に基づいてグループ分けした（実施例７参照）。相補性決定領域（ＣＤＲ）は、Ｋａｂａｔ（ＷｕおよびＫａｂａｔ１９７０Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１３２：２１１−２５０）およびＩＭＧＴ（Ｌｅｆｒａｎｃ１９９９ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓｅａｒｃｈ２７：２０９−２１２）システムに基づいて、配列注釈およびインターネット系配列分析（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴ＿ｖｑｕｅｓｔ／ｓｈａｒｅ／ｔｅｘｔｅｓ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）によって定義された。表９は、ＫａｂａｔおよびＩＭＧＴシステムの定義に基づくｍｕ３３３のＣＤＲ（配列番号５−１４）を列挙したものである。

実施例４マウス抗ヒトＰＤ−Ｌ１ｍＡｂのヒト化
マウスｍＡｂの３Ｄ構造のシミュレーション
ＣＤＲループ構造を支持するために重要であり得るフレームワーク残基を同定するために、ｍｕ３３３の可変ドメインの３次元構造をシミュレートした。潜在的に重要なフレームワーク残基は、第１ラウンドの抗体ヒト化において元のマウス残基として保持された。抗体の既知の標準的な構造に基づいて、抗ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂ、ｍｕ３３３の３Ｄ構造をシミュレートするために、抗体について以前に確立された構造モデリング方法（Ｍｏｒｅａら、Ｍｅｔｈｏｄｓ２０００２０：２６７−２７９）を採用した（Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉら、１９９７ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ２７３：９２７−９４８）。つまり、ｍｕ３３３の各可変ドメイン（ＶｋおよびＶｈ）の配列をＰＤＢデータベース（ＰｒｏｔｅｉｎＤａｔａＢａｎｋ、ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）でブラストして、既知の高分解能構造（２．５オングストローム未満の分解能）で最も相同な抗体配列を同定した。ｍｕ３３３（表１０に記載）をモデル化するために選択された構造鋳型は、モデル化されるｍｕ３３３に対し、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２、Ｌ−ＣＤＲ３、Ｈ−ＣＤＲ１、およびＨ−ＣＤＲ２において同じクラスの標準的なループ構造を有していた。ＶκおよびＶｈの鋳型が異なる免疫グロブリンに由来するので、それらは、Ｖｋ−Ｖｈ界面残基のハイブリッド構造を形成するように主鎖原子の最小二乗適合によってまとめられた。Ｖｋ−Ｖｈ界面残基のハイブリッド構造は、スイスモデルプログラム（Ｋｉｅｆｅｒら、２００９ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ３７、Ｄ３８７−Ｄ３９２）によって構造的相同性モデリングの鋳型として用いられた。主鎖コンフォメーションを保持したまま、特定の側鎖コンフォメーションを調整した。親構造およびモデル化構造が同じ残基を有する部位では、側鎖コンフォメーションが保持された。残基が異なる部位では、鋳型構造、回転異性体ライブラリーおよびパッキングを考慮して、側鎖コンフォメーションをモデル化した。相同性モデリングの後に、ＰＬＯＰプログラム（Ｊａｃｏｂｓｏｎら、２００２ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｈｙｓｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ１０６：１１６７３−１１６８０）を用いて相同性モデルを精製して、全原子エネルギーを最小化するとともに、ＶｋおよびＶｈ界面を最適化した。このステップは、立体化学、特に異なる抗体由来の構造セグメントが互いに連結された領域における立体化学を改善するために行われた。ｍｕ３３３可変ドメインのモデル化３Ｄ構造を使用して、構造に基づくヒト化および工学プロセスを誘導した。

ＭＡｂヒト化および工学
抗ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂのヒト化のために、ＩＭＧＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴ＿ｖｑｕｅｓｔ／ｓｈａｒｅ／ｔｅｘｔｅｓ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）及びＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／）ウェブサイトにおいてヒト免疫グロブリン遺伝子データベースをブラストすることによって、ｍｕ３３３可変領域のｃＤＮＡ配列と高度の相同性を共有する配列についてヒト生殖細胞ＩｇＧ遺伝子を検索した。高頻度のヒト抗体レパートリー（Ｇｌａｎｖｉｌｌｅ２００９ＰＮＡＳ１０６：２０２１６−２０２２１）に存在し、ｍｕ３３３と高度に相同である、ヒトＩＧＶκ及びＩＧＶＨ遺伝子を、ヒト化のための鋳型として選択した。

ヒト化は、ＣＤＲ−移植法（ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ２４８：ＡｎｔｉｂｏｄｙＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、ＭｅｔｈｏｄａｎｄＰｒｏｔｏｃｏｌｓ、ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ）により行われ、ヒト化抗体（ｈｕ３３３ｓ）は、自社開発の発現ベクターを用いてヒトＦａｂフォーマットとして改変した（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）。ヒト化の最初のラウンドでは、フレームワーク領域におけるマウスからヒトへのアミノ酸残基の突然変異を模擬３Ｄ構造によって誘導し、最初のバージョンのヒト化抗体３３３（ｈｕ３３３−１Ａ、配列番号１５−１６）ではＣＤＲの標準的な構造を支持するために構造的に重要なマウスフレームワーク残基を保持した。具体的には、ｍｕ３３３ＶｋのＣＤＲをヒト生殖細胞可変遺伝子ＩＧＶＫ１−５のフレームワークに移植し、いかなるマウスのフレームワークをも保持しなかった（配列番号１６）。ｍｕ３３３ＶｈのＣＤＲを、４つのマウスフレームワーク残基（Ｖ_２４、Ｌ_６７、Ｋ_７１およびＶ_７８）を保持したまま、ヒト生殖細胞可変遺伝子ＩＧＶＨ３−７のフレームワークに移植した（配列番号１５）。移植されたすべてのＣＤＲは、ｈｕ３３３−１Ａ（表９および配列番号１５〜１６）のＫａｂａｔのＣＤＲ定義に基づくものであった。以下のｈｕ３３３変異体では、Ｎ末端半分のみが模擬３Ｄ構造に従って抗原結合に重要であると考えられたので、ＫａｂａｔＨ−ＣＤＲ２のＮ末端半分のみを移植した（表１４）。

Ｈｕ３３３−１Ａは、容易に適応するサブクローニング部位を有するヒトＩｇＧＣＨ−１およびκ鎖の定常領域をそれぞれ含む、自社開発の発現ベクターを用いてヒトＦａｂフォーマットとして構築した。ＩｇＧ２ａ−ＣＨ１に結合したｈｕ３３３−１Ａは、精製を容易にするためにＣ末端に８ｘＨｉｓペプチドで標識された。ジスルフィド結合の交換を防止し、ＩｇＧ２ａコンフォメーションにおけるヒトＩｇＧ２を安定化させるために、Ｃ_２３２ＳおよびＣ_２３３Ｓ（Ｋａｂａｔ残基番号付け、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓｏｆｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈｅｄＢｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、ＮＩＨ１９９１）突然変異をＩｇＧ２重鎖に導入した（Ｌｉｇｈｔｌｅら、２０１０ＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉ１９（４）：７５３−７６２）。両方の構造体は、Ｆａｂ成熟配列の上流にシグナルペプチドを含んでいた。ｈｕ３３３−１ＡＦａｂの分泌発現は、上記の２つの構造体の２９３−Ｆ細胞への同時トランスフェクションによって達成され、回収前に６〜７日間培養した。Ｈｉｓ−標識Ｆａｂを、Ｎｉ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗカラム（カタログ番号１７５３１８０１、ＧＥＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ社）、続いてＨｉＬｏａｄ１６／６０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（カタログ番号１７１０６９０１、ＧＥライフサイエンス社）を用いるサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、発現培養上清から精製した。精製したＦａｂをＰＢＳ中で０．５〜５ｍｇ／ｍＬに濃縮し、−８０℃の冷凍庫で小分けして保存した。

抗ＰＤ−Ｌ１Ｆａｂの親和性決定のために、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ−２００（ＧＥＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いてＳＰＲアッセイを行った。つまり、約１００−２００応答単位（ＲＵ）を達成するために、活性化されたＣＭ５バイオセンサーチップ（カタログ番号ＢＲ１００５３０、ＧＥＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ社）にヒトＰＤ−Ｌ１／Ｈｉｓをカップリングさせ、続いて未反応基を１Ｍエタノールアミンで遮断した。０．１２ｎＭ〜９０ｎＭのＦａｂサンプル連続希釈液を３０μＬ／分でＳＰＲランニングバッファー（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４）に注入・混合し、そして、ヒトＰＤ−Ｌ１／Ｈｉｓ上の結合応答は、ブランクフローセル（ｆｌｏｗ−ｃｅｌｌ）からＲＵを差し引いて計算した。会合速度（ｋｏｎ）および解離速度（ｋ_ｏｆｆ）は、１対１ラングミュア結合モデル（ＢＩＡ評価ソフトウェア、ＧＥＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて計算した。平衡解離定数（Ｋｄ）は、ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎの比として計算した。

ｈｕ３３３Ｆａｂの機能活性は、前節で述べたＰＤ−１競合アッセイにおいて確認された。ＳＰＲ測定からのデータ及び機能分析を表１１にまとめた。Ｈｕ３３３−１ＡＦａｂは、非常に遅いｋ_ｏｆｆ（１．５９×１０^−５ｓ^−１）及び速いｋ_ｏｎ（１．６１×１０^６Ｍ^−１ｓ^−１）によって示されるＰＤ−Ｌ１に対する非常に高い親和性（Ｋｄ＝９．８８ｐＭ）を有していた。この実験における５〜１５分の解離時間の間に、コーティングされたＰＤ−Ｌ１からのｈｕ３３３−１ＡＦａｂの解離は非常に遅いか、または事実上存在しなかった。ＰＤ−Ｌ１に対するｈｕ３３３−１ＡＦａｂの親和性は、ＳＰＲ技術の検出限界に近いことが明らかであった。このようなｈｕ３３３−１ＡＦａｂの高い親和性は、試験したすべての機能分析における高い潜在力（効力）と一致した（表１１）。

ｈｕ３３３−１Ａに続いて、Ｖｈのフレームワーク領域の４つのマウス残基を、対応するヒト生殖細胞残基にそれぞれ変換する個々の変異体を行った。同時に、ヒト化レベルをさらに改善するために、本発明者らはまた、Ｈ−ＣＤＲ２（カバットの定義）のＣ末端部分をマウス配列から対応するヒト生殖細胞残基に変更した（表１４、ｈｕ３３３−２Ｂ）。４つのヒト化Ｆａｂはｈｕ３３３−２Ａ（ＶｈのＶ_２４Ａ）、ｈｕ３３３−２Ｂ（ＶｈのＬ_６７Ｆ）、ｈｕ３３３−２Ｃ（ＶｈのＫ_７１Ｒ）およびｈｕ３３３−２Ｄ（ＶｈのＶ_７８Ｌ）であり、それらについては、表１３にＨ−ＣＤＲ２変更と共に示した。すべてのヒト化突然変異は、特定の位置に突然変異を含むプライマーおよび部位特異的突然変異誘発キット（カタログ番号ＦＭ１１１−０２、ＴｒａｎｓＧｅｎ社、中国北京）を用いて行った。所望の突然変異は配列決定分析によって確認した。これらのｈｕ３３３Ｆａｂを発現させ、精製し、前述の結合アッセイおよび機能分析にて試験した。ｈｕ３３３−１Ａと比較して、ｈｕ３３３−２Ａ、ｈｕ３３３−２Ｃおよびｈｕ３３３−２Ｄは、結合親和性および機能性を有意に減少させた。ｈｕ３３３−２Ｂ（配列番号１６および１７）のみがｈｕ３３３−１Ａと類似の結合および機能活性を有していた（表１１）。まとめると、ｈｕ３３３−２Ｂ（配列番号１６および１７）は、強力な結合親和性および機能活性を維持しながら、フレームワーク領域において高いレベルのヒト化を達成できた。

ヒトの治療用抗体として使用することができるｈｕ３３３について可能性のある最良のＶｈおよびＶｋ配列組成を調べるために、本発明者らは、機能活性を維持しながら、生理化学的安定性、アミノ酸組成、予測等電点（ｐＩ）、発現レベル、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）等の抗体の分子特性を考慮してＣＤＲおよびフレームワーク領域に変異を導入することでｈｕ３３３をさらに改変した。

ｈｕ３３３−１ＡのＶｈにおける脱アミノ部位ＮＳ_{７６−７７}をＮＴ_{７６−７７}に変異させて、ｈｕ３３３−３Ａ２（配列番号１８および２３）を作製した。ｈｕ３３３−３Ａ２−ＶｈのＶ６０をＶ６０Ａに変異させた。これは、疎水性の表面曝露を低減した主要なヒトＩＧＶＨ３遺伝子のコンセンサス配列と一致する。この変異構造体には、コード名ｈｕ３３３−３Ｃ２（配列番号１９および２３）が与えられた。別の脱アミド化部位ＮＳ_{７３−７４}を、ｈｕ３３３−３Ｃ２の鋳型上のＴＳ_{７３−７４}に突然変異させた。これも、主要なヒトＩＧＶＨ３遺伝子のコンセンサス配列と一致する。後者はｈｕ３３３−３Ｈ２（配列番号２０および２３）と命名された。表１２にまとめたように、ｈｕ３３３−３Ａ２、ｈｕ３３３−３Ｃ２およびｈｕ３３３−３Ｈ２はすべて、結合親和性に僅かな差はあるだけで強力な機能活性を保持していた。一方、これらの改変ｈｕ３３３変異体は、より良好な予測物理化学的性質を有していた。

ＶｈのＣＤＲ３中の最後の脱アミノ化部位を除去するために、本発明者らは、ｈｕ３３３−３Ａ２およびｈｕ３３３−３Ｈ２の鋳型上のＮＳ_{１０１−１０２}をＴＳ_{１０１−１０２}にそれぞれ変異させた。得られたヒト化ｍＡｂを、ｈｕ３３３−４Ａ２（配列番号２１および２３）およびｈｕ３３３−４Ｂ２（配列番号２２および２３）と命名されたヒトＩｇＧ１Ｆａｂフォーマットに構築した。結合及び機能分析からの結果は、ｈｕ３３３−４Ａ２およびｈｕ３３３−４Ｂ２の両方が、その標的（ＰＤ−１およびＣＤ８０）へのＰＤ−Ｌ１結合の遮断、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−１媒介下流シグナル伝達の阻害等の親和性及び機能活性において非常に類似していた（表１３および表１４）。ｈｕ３３３−３Ｂ２、−３Ｄ２、−３Ｅ２、−３Ｇ２および−３Ｉ２を含むプロセスで行われたいくつかの突然変異は、さまざまな考慮からさらなる開発から除外された。上記ｍＡｂのＣＤＲをｍｕ３３３のＣＤＲと比較した（表１４）。

上に示した全てのヒト化ｍＡｂについて、メーカーの指示に従ってフィコールリンパ球分離培地（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７；カタログ番号１０７７１、Ｓｉｇｍａ社、米国セントルイス）を用いた密度勾配遠心分離によって健常ドナーから単離された初代ヒト免疫細胞、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に対する機能的効果を確認した。その後、アッセイ前のの３日間、４０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３ｍＡｂＯＫＴ３（カタログ番号１６−００３７、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、米国カリフォルニア州サンディエゴ）でＰＢＭＣを刺激した。活性化されたＰＢＭＣ集団は、主にＴ細胞（５０〜７０％）、Ｂ細胞及びＮＫ細胞（１５〜３０％）並びに単球（２〜１０％）で構成されていた。ＴＣＲ／ＣＤ３複合体の関与後のＰＤ−Ｌ１発現腫瘍細胞に対するＴ細胞の応答をよりよく模倣するために、活性化ＰＢＭＣを９６ウェルプレートの各ウェルの中でＨＥＫ２９３／ＯＳ８／ＰＤ−Ｌ１細胞と共培養した。Ｒｅａｄｙ−Ｓｅｔ−Ｇｏ！ＥＬＩＳＡキット（カタログ番号８８−７３１６、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いてＩＦＮ−γレベルを評価するために、ｍＡｂを該培養物に添加し、１５−１８時間共培養し、その後細胞上清を回収することにより、抗ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂの機能効果を試験した。図７に示すように、ｈｕ３３３−２Ｂ、ｈｕ３３３−３Ａ２、ｈｕ３３３−３Ｃ２、ｈｕ３３３−４Ａ２、およびｈｕ３３３−４Ｂ２はいずれも用量依存的にＩＦＮ−γ分泌を増加させた。対照的に、陰性対照、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）は、そのような効果を有さなかった。２つの異なるドナーからのＰＢＭＣを用いて結果を繰り返した。ベースレベル（ｍＡｂなし）およびｍＡｂ処置によるＩＦＮ−γ分泌の変化は、異なるドナー間で異なっていたが、ＩＦＮ−γ分泌の増加の倍数は、全てのｈｕ３３３において同様に用量濃度に依存したままであった。

実施例５改変ヒトＩｇＧ１定常領域への融合によるエフェクター機能を有さない組換え抗ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂの作製
改変ヒトＩｇＧ１定常領域の設計
ＰＤ−Ｌ１は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、マクロファージ、間葉系幹細胞および骨髄由来肥満細胞などの造血細胞、並びに肺、肝細胞、膵島、胎盤合胞体栄養細胞及び血管内皮などの非造血細胞および組織を含む広範な正常ヒト細胞上に発現される（Ｋｅｉｒら、２００６ＪＥｘｐＭｅｄ２０３：８８３−８９５、Ｋｅｉｒら、２００８ＡｎｎＲｅｖＩｍｍｕｎｏｌ２６：６７７−７０４、Ｍｕら、２０１１ＭｅｄｉｃａｌＯｎｃｏｌｏｇｙ２８：６８２−６８８）。ヒト野生型ＩｇＧ−γＦｃ部分に結合したＰＤ−Ｌ１遮断抗体はγＦｃ媒介エフェクター機能、例えば、重要な臓器への望ましくない毒性を引き起こし得る抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を誘導することが期待されている。

最適な物理化学的特性を維持しながら抗ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂに関連するエフェクター機能を除去するために、Ｖｈ配列を、変異ＩｇＧ１定常領域に連結することによりｈｕ３３３−４Ａ２およびｈｕ３３３−４Ｂ２完全抗体を構築し、減少されたか又はゼロのＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）結合またはＣ１ｑ結合活性をスクリーニングして、ＡＤＣＣおよびＣＤＣエフェクター機能を弱めるか又は除去した。ＦｃγＲおよびＣ１ｑとの相互作用に関与するＩｇＧ１Ｆｃの領域は、文献（Ｔａｏら、１９９３、ＪＥｘｐＭｅｄ１７８：６６１−７；Ｃｏｌｅら、１９９７ＪＩｍｍｕｎｏｌ１５９：３６１３−２１；Ａｒｍｏｒら、１９９９年、ＥｕｒＪＩｍｍｕｎｏｌ２９：２６１３−２６２４；Ｉｄｕｓｏｇｉｅら、２０００ＪｏｆＩｍｍｕｎｏｌ１６４：４１７８−４１８４；Ｓｈｉｅｌｄｓら、２００１ＪｏｆＢｉｏｌＣｈｅｍ２７６：６５９１−６６０４；Ｌｕｎｄら、２００２ＩｍｍｕｎｏｌＬｅｔｔｅｒｓ８２：５７−６５；Ｓｔｒｏｈｌら、ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２０：６８５−６９１）に概説されている。まとめると、これらのデータは、ＦｃγＲへの結合のための低ヒンジ領域（ＥＵ命名法に基づくＡＡ_{２３２−２３８}）およびＣ１ｑへの結合のためのＣ_Ｈ２ドメインの構造的にクラスター化された領域（ＥＵ命名法に基づくＤ_２７０、Ｋ_３２２、Ｐ_３２９およびＰ_３３１）の本質的な役割を示した。一方、ＩｇＧ２は、ヒンジ領域におけるＩｇＧ１からのいくつかの配列変異を有するが、それは、ＦｃγＲＩＩＡ_Ｈ１３１以外のほとんどのＦｃγＲに弱く結合するか、または、結合しないことに起因した。実際、一部のＩｇＧ２配列を組み込んだＩｇＧ１ヒンジ配列（大部分）を有するＩｇＧ１／ＩｇＧ２ハイブリッド（ＩｇＧ１Δｂ）は、ほとんどのＦｃγＲに対して有意に減少された結合活性と、弱毒ＡＤＣＣ及びＤＣＤエフェクター機能とを有することが証明された（Ａｒｍｏｒら、１９９９ＥｕｒＪＩｍｍｕｎｏｌ２９：２６１３−２６２４）。

良好な薬理学的および物理化学的特性を考慮した突然変異誘発の合理的設計により、本発明者らは、前述したヒンジ及びＦｃ領域における多数の突然変異体ＩｇＧ１を作製した。これらを、完全な抗体として、ヒンジｈｕ３３３−４Ａ２およびｈｕ３３３−４Ｂ２の可変領域にそれぞれ融合させた。機能分析において良好な特徴を有するＩｇＧ１突然変異体のうち２つ、ＩｇＧ１ｍｃおよびＩｇＧ１ｍｆを、野生型ＩｇＧと比較して表１５に示した。ＩｇＧ１ｍｃ（配列番号２８）は、上記のＩｇＧ１／ＩｇＧ２ハイブリッド由来のさらなる突然変異、Ｖ_２３４Ａ、Ｇ_２３７ＡおよびＰ_２３９Ａの組み合わせを含む。Ｖ_２３４ＡおよびＧ_２３７Ａの突然変異は、ＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＢへの結合をさらに減少させるために、γＦｃ／ＦｃγＲ結合界面における表面疎水性側鎖を減少させるように設計された（Ｌｕｎｄら、１９９２ＭｏｌＩｍｍｕｎｏｌ２９：５３−５９、Ｌｕｎｄら、１９９６ＪＩｍｍｕｎｏｌ１５７：４９６３−４９６９、Ｗｉｎｅｓら、２０００ＪＩｍｍｕｎｏｌ１６４：５３１３−５３１８）。Ｐ_２３９Ａ突然変異は、Ｃ１ｑ結合およびＣＤＣをさらに減少させるように設計された（Ｉｄｕｓｏｇｉｅら、２０００ＪｏｆＩｍｍｕｎｏｌ１６４：４１７８−４１８４）。ＩｇＧ１ｍｆ（配列番号２９）は、アミノ酸残基Ｇ_２３７が変異されなかったことを除けば、ＩｇＧ１ｍｃと類似していた。組換え全長抗ＰＤ−Ｌ１抗体、ｈｕ３３３−４Ａ２−ＩｇＧ１ｍｃ（配列番号３０および３２）、ｈｕ３３３−４Ｂ２−ＩｇＧ１ｍｃ（配列番号３１および３２）およびｈｕ３３３−４Ｂ２−ＩｇＧ１ｍｆ（配列番号３２および３３）をＨＥＫ２９３−Ｆ細胞で発現させ、前節で記載したように精製した。

ＥＬＩＳＡ系ＦｃγＲおよびＣ１ｑ結合アッセイ
ＩｇＧ媒介エフェクター機能は、ＦｃγＲまたは補体成分Ｃ１ｑへの抗体−抗原複合体の結合の後にトリガーされることが十分に報告されている（Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎら、２００８ＮａｔｕｒｅＲｅｖＩｍｍｕｎｏｌ８：３４−４７）。例えば、抗体が細胞表面標的タンパク質に結合し、次いでエフェクター細胞上に発現されたＦｃγＲＩＩＩＡに連結すると、ＡＤＣＣが開始される。ＣＤＣは、抗体がＣ１ｑタンパク質に結合することによって細胞表面標的を架橋するときに活性化され、補体複合体の形成および活性化、並びに標的細胞溶解のカスケード反応をもたらす。ＡＤＣＣ、ＣＤＣおよび他の抗体介在エフェクター機能のプロキシとして、ＦｃγＲおよびＣ１ｑへの抗体結合の生化学アッセイは、ＡＤＣＣおよびＣＤＣの基本的指標として役立ち得る。本発明者らは、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ_Ｈ１３１、ＦｃγＲＩＩＩＡ_Ｒ１３５、ＦｃγＲＩＩＩＡ_Ｆ１５８、ＦｃγＲＩＩＩＡ_Ｖ１５８、ＦｃγＲＩＩＢ、およびＦｃγＲＩＩＩＢを含め、全ての主要なＦｃγＲおよびすべての既知の多型変異体に対する改変定常領域を有する抗ＰＤ−Ｌ１抗体の結合を系統的に評価した。

ＦｃγＲの細胞外ドメインは、前節で説明したように、Ｃ末端Ｈｉｓタグに融合した。一過性トランスフェクションにより２９３−Ｆ細胞で組換えタンパク質を発現させ、前述したＮｉ−セファロースカラム、続いてゲルろ過カラムを用いて精製した。Ｎｉ−キレートプレート（カタログ番号１５２４２、Ｐｉｅｒｃｅ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用したＦｃγＲＩＩＢおよびＦｃγＲＩＩＩＢを除いて、ＮｕｎｃＭａｘｉＳｏｒｐＥＬＩＳＡプレート（カタログ番号４４２４０４、Ｎｕｎｃ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）上に２−５μｇ／ｍＬのＦｃγＲをコーティングした。ウェルの洗浄および遮断後、予備形成された免疫複合体を各ウェルに加え、室温で１〜２時間インキュベートした。予備形成された免疫複合体は、ブロッキングバッファー中に６０ｎｇ／ｍＬのストレプトアビジン−ＨＲＰ、６０ｎｇ／ｍＬのビオチン化Ｆ（ａｂ’）_２ヤギ抗ヒトＩｇＧ（カタログ番号１０９−０６６−０９７、ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓ社、米国ペンシルベニア州ウェストグローブ）、およびヒト化抗ＰＤ−Ｌ１（ｈｕ３３３−４Ａ２またはｈｕ３３３−４Ｂ２）に融合した（記載の）ＩｇＧ１Ｆｃ変異体１〜５μｇ／ｍＬを含有した。プレートを４回洗浄した後、ＩｍｍｏｂｉｌｏｎＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅＳｕｂｓｔｒａｔｅＡ／Ｂ（カタログ番号ＷＢＫＬＳ０５００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いる化学発光により結合シグナルを検出した。表１６は、様々なＦｃγＲに結合する、ｈｕ３３３−４Ａ２−ＩｇＧ１ｍｃ（配列番号３０および３２）、ｈｕ３３３−４Ｂ２−ＩｇＧ１ｍｃ（配列番号３１および３２）およびｈｕ３３３−４Ｂ２−ＩｇＧ１ｍｆ（配列番号３２および３３）の結果をまとめたものである。。ｈｕ３３３−４Ａ２−ＩｇＧ１ｗｔと比較して、３つのＩｇＧ１変異体ｈｕ３３３ｍＡｂはすべて、ＦｃγＲに対する結合活性が非常に低かったが、これは、３つのｈｕ３３３ｍＡｂ全てがＦｃγＲによって媒介されるエフェクター機能を有意に低下させたことを示した。

ＦＡＣＳに基づくＦｃγＲ結合アッセイ
様々なＩｇＧ１フォーマット（ｗｔ、ＩｇＧ１ｍｃ、ＩｇＧ１ｍｆ、配列番号２７−２９）のヒト化抗ＰＤ−Ｌ１のＦｃγＲへの結合も、フローサイトメトリーによって測定した。つまり、ヒトＦｃγＲを発現する一連の安定なＨＥＫ２９３トランスフェクタントを確立した。これらの安定な細胞株は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ_Ｈ１３１、ＦｃγＲＩＩＡ_Ｒ１３１、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩＡ_Ｆ１５８またはＦｃγＲＩＩＩＡ_Ｖ１５８をそれぞれ発現した。マルチサブユニットＦｃγＲ（すなわち、ＦｃγＲＩおよびＦｃγＲＩＩＩＡ）をＦｃＲγサブユニットと同時発現させた。二次抗体（ヤギ抗ヒトＩｇＧＦ（ａｂ’）_２−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８（カタログ番号１０９−５４６−０９７、ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社、米国ペンシルベニア州ウェストグローブ）を用いて、ＩｇＧ１変異体を有する単量体ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂ（表１７）のＦｃγＲ発現ＨＥＫ２９３細胞への結合を検出した。予想通り、ＩｇＧ１ｗｔフォーマットのｈｕ３３３−４Ａ２（ｈｕ３３３−４Ａ２−ＩｇＧ１ｗｔ）は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ_Ｈ１３１およびＦｃγＲＩＩＩＡ_Ｖ１５８に対し強い結合シグナル（ＭＦＩ）を有し、ＦｃγＲＩＩＡ_Ｒ１３１、ＦｃγＲＩＩＢおよびＦｃγＲＩＩＩＡ_Ｆ１５８に対しては弱いが有意な結合シグナルを有していた（表１７）。改変ＩｇＧ１変異体（ｈｕ３３３−４Ａ２−ＩｇＧ１ｍｃ、ｈｕ３３３−４Ｂ２−ＩｇＧ１ｍｃおよびｈｕ３３３−４Ｂ２−ＩｇＧ１ｍｆ、配列番号３０−３３）は、バックグラウンドに近い、有意に減少された結合シグナルを有していた。

抗体は、多価（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ）効果に起因して、免疫複合体の形態において遥かに大きな強度でＦｃγＲに結合することが示されている（Ｂｒｕｈｎｓら、２００９Ｂｌｏｏｄ１１３：３７１６−３７２５）。このような結合は、単量体γＦｃと大部分のＦｃγＲ間の結合力が非常に弱いため、生理学的条件下ではより関連性が高いように思われる。ヒト免疫系はまた、血清中に高レベルで存在する単量体ＩｇＧによるＦｃγＲの非特異的活性化を避けるために、このメカニズムを利用する。免疫複合体の形態のＦｃγＲへの結合を評価するために、様々なＩｇＧ１変異型としてのヒト化３３３ｍＡｂ（１０μｇ／ｍＬ）を、ＦＡＣＳ緩衝液中の３μｇ／ｍＬのビオチン−ＰＤ−Ｌ１／Ｈｉｓおよび１．５μｇ／ｍＬのニュートラアビジン（カタログ番号Ａ−２６６６、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）と予め混合して多価免疫複合体を形成した後に、ＦｃＲＲ発現ＨＥＫ２９３細胞とインキュベートした。結合を検出するために、ヤギ抗ヒトＩｇＧＦ（ａｂ’）_２−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８（カタログ番号１０９−５４６−０９７、ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社）を用いた。表１８に示すように、予備形成された免疫複合体中のｈｕ３３３−４Ａ２−ＩｇＧ１ｗｔは、単量体ＩｇＧ１よりも遥かに優れた強度で低親和性ＦｃγＲ（ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、およびＦｃγＲＩＩＩＡ）に結合した（表１８データ対表１７データ）。さらに、選択されたＩｇＧ１変異体（ｈｕ３３３−４Ａ２−ＩｇＧ１ｍｃ、ｈｕ３３３−４Ｂ２−ＩｇＧ１ｍｃおよびｈｕ３３３−４Ｂ２−ＩｇＧ１ｍｆ、配列番号３０−３３）における抗ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂは、バックグラウンドに近い、有意に減少された結合シグナルを有していた。まとめると、改変ＩｇＧ１フォーマットのヒト化３３３は、ＦｃγＲに対する結合が非常に少ないため、生理的条件下ではＦｃγＲ媒介エフェクター機能をほとんど有さないはずである。

ＥＬＩＳＡ系Ｃ１ｑ結合アッセイは、従来のＥＬＩＳＡ法（少々の変更あり）によって行った。つまり、野生型または改変ＩｇＧ１定常領域のいずれかに融合した指示量のヒト化３３３抗体をＭａｘｉｓｏｒｐＥＬＩＳＡプレート上にコーティングした。遮断および洗浄後、ウェルを２μｇ／ｍＬのヒトＣ１ｑ（カタログ番号Ａ４００、Ｑｕｉｄｅｌ社、米国サンディエゴ）と共に室温で２時間インキュベートした。洗浄後、結合したＣ１ｑを、ＨＲＰ結合抗マウスＩｇＧ（カタログ番号Ａ０１６８、Ｓｉｇｍａ社、中国上海）及びヒトＣ１ｑに対するマウスモノクローナル抗体（カタログ番号Ａ２０１、Ｑｕｉｄｅｌ社）を用いて検出した。図８に示すように、ｈｕ３３３−４Ａ２−ＩｇＧ１ｗｔと対照的に、ｈｕ３３３−４Ａ２−ＩｇＧ１ｍｃ（配列番号３０および３２）、ｈｕ３３３−４Ｂ２−ＩｇＧ１ｍｃ（配列番号３０および３２）及びｈｕ３３３−４Ｂ２−ＩｇＧ１ｍｆ（配列番号３２および３３）を含む改変ＩｇＧ１Ｆｃ変異体を有する３つのｍＡｂにおいて検出可能なＣ１ｑ結合は存在しなかった。これらののデータは、ＩｇＧ１ｍｃ（配列番号２８）またはＩｇＧ１ｍｆフォーマット（配列番号２９）のいずれかのヒト化３３３抗体が非常に低いＣＤＣエフェクター機能を有するか、またはＤＣＤエフェクター機能を有しないことを示した。

ＡＤＣＣ
古典的な抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）は、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６）に結合した抗体によるＮＫ細胞の活性化を伴う。選択されたヒトＩｇＧ１変異体に融合されたヒト化抗ＰＤ−Ｌ１抗体がＡＤＣＣを誘導するか否かを調べるために、ＣＤ１６（Ｖ１５８対立遺伝子）およびＦｃＲγ遺伝子を含む共形質導入発現プラスミドによりＮＫ９２ＭＩ細胞（カタログ番号ＣＲＬ−２４０８、ＡＴＣＣ）から産生されたＮＫ９２ＭＩ／ＣＤ１６Ｖ細胞をエフェクター細胞として使用し、ＰＤ−Ｌ１発現ＨＥＫ２９３細胞株、ＨＥＫ２９３／ＰＤ−Ｌ１を標的細胞として使用した。ｈｕ３３３−ＩｇＧ１変異体（０．０００１〜１μｇ／ｍｌ）の存在下、９６ウェルＶ底プレートの中でエフェクター細胞（１０^５細胞／ウェル）を標的細胞（１０^４細胞／ウェル、Ｅ：Ｔ＝１０）と５時間共培養した。ＨＥＫ２９３／ＰＤ−Ｌ１細胞に対するＮＫ９２ＭＩ／ＣＤ１６細胞の細胞傷害を、ＣｙｔｏＴｏｘ９６非放射性細胞傷害アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ウィスコンシン州マディソン）を用いた乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）放出アッセイにより、測定した。特異的溶解は以下の式により決定した。

ＡＤＣＣアッセイは、ＩｇＧ１ｍｃ及びＩｇＧ１ｍｆフォーマットのｈｕ３３３がＦｃγＲＩＩＩＡに結合しないか、または、ＦｃγＲＩＩＩＡへの結合が有意に減少されたという事実と一致して（前節参照）、ｈｕ３３３−４Ｂ２−ＩｇＧ１ｍｃ（配列番号３１および３２）およびｈｕ３３３−４Ｂ２−ＩｇＧ１ｍｆ（配列番号３２および３３）の両方が、基本レベルのＡＤＣＣのみを有することを示した。対照的に、野生型ＩｇＧ１Ｆｃを有する３３３−４Ａ２−ＩｇＧ１ｗｔは、１μｇ／ｍＬの濃度で２０％の特異的細胞溶解を誘導した（図９）。

ＣＤＣ
ヒトＩｇＧ１抗体は、一般に、古典経路を介して有意な補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を誘導する。選択されたＩｇＧ１変異フォーマット（ＩｇＧ１ｍｃおよびＩｇＧ１ｍｆ）のヒト化抗ＰＤ−Ｌ１抗体がＣＤＣを誘導するかどうかは、ＰＤ−Ｌ１発現Ｂ細胞株、Ｄａｕｄｉ／ＰＤ−Ｌ１および健常ドナーからの新鮮なヒト血清（ＣＤＣに必要なすべての構成要素を含有する）を用いて評価した。ＣＤＣによる細胞溶解を、Ｃｅｌｌｔｉｔｅｒｇｌｏアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ社）によって決定した。つまり、Ｄａｕｄｉ／ＰＤ−Ｌ１細胞（２ｘ１０^４細胞／ウェル）を抗ＰＤ−Ｌ１Ａｂ（０．００１−１０μｇ／ｍＬ）を含む無血清ＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）と共に３７℃で１５分間インキュベートした後に、正常ヒト血清（全容量１２０μＬ）を、９６ウェル平底プレート中に最終濃度１６．６％となるようにで添加した。３７℃で一晩インキュベートした後に、細胞を溶解し、ＡＴＰ濃度についてアッセイした。Ｄａｕｄｉ細胞が構成的にＣＤ２０を発現するので、抗ＣＤ２０ｍＡｂリツキシマブ（Ｒｏｃｈｅ社）を陽性対照として使用した。ＡＴＰの量は、培養物中に存在する細胞の数に正比例する。９６ウェル蛍光光度計（ＰＨＥＲＡＳｔａｒＦＳ、ＢＭＧＬＡＢＴＥＣＨ）を用いて蛍光を測定した。結果は、生存細胞の数に比例する相対蛍光単位（ＲＦＵ）で表した。パーセントＣＤＣ活性は、％ＣＤＣ活性＝［（ＲＦＵ試験−ＲＦＵバックグラウンド）／（全細胞溶解時のＲＦＵ−ＲＦＵバックグラウンド）］×１００として計算した。図１０に示したように、リツキシマブはＣＤ２０^＋Ｄａｕｄｉ／ＰＤ−Ｌ１細胞において安定したＣＤＣを誘導した。対照的に、ｈｕ３３３−４Ｂ２−ＩｇＧ１ｍｃ（配列番号３１および３２）およびｈｕ３３３−４Ｂ２−ＩｇＧ１ｍｆ（配列番号３２および３３）の両方はＣＤＣを示さなかった。野生型ＩｇＧ１Ｆｃを有する抗体（Ａｂ）３３３−４Ａ２−ＩｇＧ１ｗｔは、特に０．３μｇ／ｍＬを超える濃度において低いがベースレベルを上回るＣＤＣ活性を示した。これらのデータは、ＩｇＧ１ｍｃおよびＩｇＧ１ｍｆＦｃフォーマットが補体成分Ｃ１ｑへほとんど結合しないか、または該結合を有意に減少させたという事実と一致した（前節参照）。

実施例６改変ＩｇＧ１フォーマットにおけるヒト化ｍＡｂ３３３の機能活性
上記の改変ＩｇＧ１フォーマットの３つのヒト化ｍＡｂを、細胞系結合アッセイおよび機能評価において特徴付けた。表１９は、ｈｕ３３３−４Ａ２−ＩｇＧ１ｍｃ、ｈｕ３３３−４Ｂ２−ＩｇＧ１ｍｃおよびｈｕ３３３−４Ｂ２−ＩｇＧ１ｍｆ（配列番号３０−３３）に関する研究結果をまとめたものである。

ＦＡＣＳ結合分析は、前節で説明したように行った。抗体の連続希釈液をＨＥＫ２９３／ＰＤ−Ｌ１細胞と共にインキュベートし、ヤギ抗ヒトＩｇＧＦ（ａｂ’）_２−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８（カタログ番号１０９−５４６−０９７、ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社）を用いて結合を検出した。ＨＥＫ２９３細胞の表面上に発現された天然のＰＤ−Ｌ１タンパク質に対して選択されたｍＡｂについて、用量依存的結合活性が見られた。表１９に示すように、ｈｕ３３３−４Ａ２−ＩｇＧ１ｍｃ、ｈｕ３３３−４Ｂ２−ＩｇＧ１ｍｃおよびｈｕ３３３−４Ｂ２−ＩｇＧ１ｍｆは、ＥＣ_５０（５０％活性での有効濃度）が約０．１μｇ／ｍＬであり、ＨＥＫ２９３／ＰＤ−Ｌ１細胞に対し同様の用量依存的結合活性を示した。

ＦＡＣＳ系競合アッセイを、前述したように行った。表１９に示す結果は、ｈｕ３３３−４Ａ２−ＩｇＧ１ｍｃ、ｈｕ３３３−４Ｂ２−ＩｇＧ１ｍｃおよびｈｕ３３３−４Ｂ２−ＩｇＧ１ｍｆが、ＨＥＫ２９３／ＰＤ−Ｌ１細胞へのＰＤ−１／Ｆｃ結合（ＩＣ_５０が０．１６７〜０．１７４μｇ／ｍＬ）およびＣＤ８０／Ｆｃ結合（ＩＣ_５０が０．０７８−０．１１８μｇ／ｍＬ）の両方についてほぼ同じくらい良好に競合することを示した。

精製した抗ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂの機能を、前節で説明したように、ＨｕＴ７８／ＰＤ−１およびＨＥＫ２９３／ＯＳ８／ＰＤ−Ｌ１共培養系（システム）で評価した。表１９に示すように、ヒト化３３３ｍＡｂは、この共培養系においてＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１シグナル伝達の強力なアンタゴニストであり、ＩＬ−２分泌の増加を誘導した。ＦＡＣＳ系競合アッセイの結果と一致して、ｈｕ３３３−４Ａ２−ＩｇＧ１ｍｃ、ｈｕ３３３−４Ｂ２−ＩｇＧ１ｍｃおよびｈｕ３３３−４Ｂ２−ＩｇＧ１ｍｆは、このアッセイにおいて、非常に近いＥＣ_５０（０．０７５−０．０８７μｇ／ｍＬ）および最大誘導ＩＬ−２レベル（２８７〜３００ｐｇ／ｍＬ）を有して同様の効力を示した。

精製された抗ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂの機能も、ＨｕＴ７８／Ｐ３ＺおよびＨＥＫ２９３／ＰＤ−Ｌ１を前述のように共培養した逆方向シグナル伝達系（システム）において評価した。一貫して、ヒト化３３３ｍＡｂは、この共培養系においてＰＤ−Ｌ１／Ｐ３Ｚシグナル伝達の強力な阻害剤であり、ＰＤ−Ｌ１／Ｐ３Ｚにより誘導されたＩＬ−２分泌を阻害した。同様のＩＣ_５０（０．０３７−０．０４５μｇ／ｍＬ）および最大阻害レベル（９９％）により示すように、ｈｕ３３３−４Ａ２−ＩｇＧ１ｍｃ、ｈｕ３３３−４Ｂ２−ＩｇＧ１ｍｃおよびｈｕ３３３−４Ｂ２−ＩｇＧ１ｍｆはやはりこのアッセイにおいても同様の効力を示した（表１９）。

ヒト化３３３抗体も初代ヒト免疫細胞に機能的効果を及ぼすかどうかを調べるために、我々は、主にＴ細胞（５０〜７０％）、Ｂ細胞（１５〜３０％）、ＮＫ細胞（１５〜３０％）、単球（２〜１０％）で構成された、新たに単離された末梢血単核細胞を用いて抗体機能を分析した。ヒトＰＢＭＣを、フィコールリンパ球分離培地（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７；カタログ番号１０７７１、Ｓｉｇｍａ社）を使用してメーカーの指示に従って密度勾配遠心分離によって健常ドナーから単離した。ヒト血液採取はＢｅｉＧｅｎｅの内部手順に従って行った。次いで、アッセイの３日前に、４０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３ｍＡｂＯＫＴ３（カタログ番号１６−００３７、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、カリフォルニア州）でＰＢＭＣを刺激した。ＴＣＲ／ＣＤ３複合体が生成された後にＰＤ−Ｌ１発現腫瘍細胞に対する予め活性化された（ｐｒｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ）Ｔ細胞の応答を模倣するために、９６ウェルの平底プレートの各ウェルにおいてＰＢＭＣ（１×１０^４細胞）をＨＥＫ２９３／ＯＳ８／ＰＤ−Ｌ１細胞（３×１０^４細胞）と共培養した。指示濃度の抗ＰＤ−Ｌ１抗体を培養物に添加した。１５〜１８時間の共培養後に、培養上清を、Ｒｅａｄｙ−Ｓｅｔ−Ｇｏ！ＥＬＩＳＡキット（カタログ番号８８−７３１６、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いたＥＬＩＳＡにより、Ｔ細胞活性化だけでなく他の免疫細胞活性化の最も顕著な指標であるＩＦＮ−γレベルについてアッセイした（Ｔｈａｋｕｒら、２０１２Ｖａｃｃｉｎｅ３０：４９０７−４９２０）。図１１に示すように、予め活性化されたＰＢＭＣとＨＥＫ２９３／ＯＳ８／ＰＤ−Ｌ１細胞との共培養におけるｍＡｂｈｕ３３３−４Ａ２−ＩｇＧ１ｍｃまたはｈｕ３３３−４Ｂ２−ＩｇＧ１ｍｆの存在は、用量依存的にＩＦＮ−γ産生を増加させた。対照として、ｈｕＩｇＧには、ＩＦＮ−γ分泌を刺激するそのような効果はなかった。ｈｕ３３３−４Ａ２−ＩｇＧ１ｍｃおよびｈｕ３３３−４Ｂ２−ＩｇＧ１ｍｆの効力は、親マウス抗体ｍｕ３３３−ＩｇＧに匹敵した。抗体処置なしのＩＦＮ−γのベースレベルはドナー間に異なるが、ｈｕ３３３−４Ａ２−ＩｇＧ１ｍｃ、ｈｕ３３３−４Ｂ２−ＩｇＧ１ｍｆおよびｍｕ３３３−ＩｇＧによって処置されたＰＢＭＣにおけるＩＦＮ−γ分泌の増加は、０．０１〜１０μｇ／ｍＬの抗体処置において統計的に有意であった（ドナーに応じて１０μｇ／ｍＬで約５〜８倍誘導）。

まとめると、これらのデータは、ｈｕ３３３−４Ａ２−ＩｇＧ１ｍｃ、ｈｕ３３３−４Ｂ２−ＩｇＧ１ｍｃおよびｈｕ３３３−４Ｂ２−ＩｇＧ１ｍｆが、すべての細胞株および初代免疫細胞系アッセイにおいてＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用および下流シグナル伝達を遮断する強力なアンタゴニストであることを証明した。それらは、配列において非常に類似しており（フレームワーク領域においてわずかに異なる）、同一の結合エピトープを共有し、非常に類似した結合親和性および特異性を有するので（以下参照）、機能活性および効力において非常に類似していた。

実施例７ヒト化抗ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂの結合親和性および特異性
異なる種からのＰＤ−Ｌ１タンパク質に対する抗ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂの結合特異性
ヒト、カニクイザル（Ｍａｃａｃａｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）およびマウス（Ｍｕｓｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＰＤ−Ｌ１を標的タンパク質として用いて、ｍＡｂｈｕ３３３（ｈｕ３３３−４Ａ２−ＩｇＧ１ｍｃ、ｈｕ３３３−４Ｂ２−ＩｇＧ１ｍｃおよびｈｕ３３３−４Ｂ２−ＩｇＧ１ｍｆ）の結合特異性を調べた。サルＰＤ−Ｌ１／ＨｉｓおよびマウスＰＤ−Ｌ１／Ｈｉｓを、前述したヒトＰＤ−Ｌ１／Ｈｉｓと同様の方法で発現および精製した。Ｙ１は、公表された特許（ＵＳ２０１０／０２０３０５６Ａ１）に従って合成され、ヒトＩｇＧ１ｍｃ変異体に融合された参照機能抗ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂであった。合成された全長ｍＡｂをＹ１−ＩｇＧ１ｍｃと命名した。ＥＬＩＳＡアッセイは、前節で記載したものと基本的に同じ方法で行った。つまり、ＮｕｎｃＭａｘｉＳｏｒｐＥＬＩＳＡプレート（カタログ番号４４２４０４、Ｎｕｎｃ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）の各ウェル上に２００ｎｇのＰＤ−Ｌ１タンパク質をコーティングした。洗浄および遮断後、指示濃度の抗ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂを加え、室温で１時間インキュベートした。洗浄後、ＨＲＰ結合ヤギ抗ヒトＦｃ抗体（カタログ番号Ａ０１７０、Ｓｉｇｍａ社）を用いて、結合した抗ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂを検出した。図１２に示すように、ｈｕ３３３−４Ａ２−ＩｇＧ１ｍｃ（配列番号３０および３２）、ｈｕ３３３−４Ｂ２−ＩｇＧ１ｍｃ（配列番号３１および３２）およびｈｕ３３３−４Ｂ２−ＩｇＧ１ｍｆ（配列番号３２および３３）は、ヒトおよびサルＰＤ−Ｌ１に用量依存的に結合したが、マウスＰＤ−Ｌ１に対してはそうではなかった。それは、元のｍｕ３３３がヒトＰＤ−Ｌ１／Ｆｃで免疫化されたマウスから生成されたこと、並びにヒトおよびサルＰＤ−１が高度の配列相同性（９６％）を共有しているという事実と一致した。対照的に、Ｙ１−ＩｇＧ１ｍｃは、ヒト、サルおよびマウス由来のすべてのＰＤ−Ｌ１タンパク質に結合した。

ＳＰＲによるヒト化抗ＰＤ−Ｌ１Ｆａｂの親和性決定
Ｈｕ３３３−４Ａ２（配列番号２１および２３）、ｈｕ３３３−４Ｂ２（配列番号２２および２３）および参照抗体Ｙ１を、ＶｈおよびＶｋがヒトＩｇＧ１−ＣＨ１のＮ末端およびκ鎖の定常領域にそれぞれ融合されたヒトＩｇＧ１Ｆａｂフォーマットとして構築した。精製を容易にするために、ＩｇＧ１−ＣＨ１をＣ末端のＨｉｓ６タグに融合させた。組換えＦａｂの発現および精製を、前節で記載したように行った。

抗ＰＤ−Ｌ１Ｆａｂの親和性決定のために、前述したように、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ−２００装置（ＧＥＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ社、中国上海）を用いてＳＰＲアッセイを行った。会合速度（ｋ_ｏｎ）および解離速度（ｋ_ｏｆｆ）は、１対１ラングミュア結合モデル（ＢＩＡ評価ソフトウェア、ＧＥＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて計算した。平衡解離定数（Ｋ_ｄ）は、比_ｋｏｆｆ／ｋ_ｏｎとして計算した。

ＳＰＲにより決定された抗ＰＤ−Ｌ１Ｆａｂの結合親和性を表２０に示した。Ｈｕ−３３３−４Ａ２およびｈｕ３３３−４Ｂ２Ｆａｂは、Ｙ１Ｆａｂよりも高い親和性をもってヒトＰＤ−Ｌ１に結合した。それは、より速いｋ_ｏｎ値、より遅いｋ_ｏｆｆ値、及びはるかに小さいＫ_ｄ値によって示された。ｈｕ３３３−４Ａ２およびｈｕ３３３−４Ｂ２Ｆａｂは、サルＰＤ−Ｌ１に対して、ヒトＰＤ−Ｌ１への結合とほぼ同じくらい良好に結合する。対照的に、Ｙ１Ｆａｂは、ヒトＰＤ−Ｌ１に対する結合より約１００倍低い親和性をもってサルＰＤ−Ｌ１に結合する（ヒトＰＤ−Ｌ１に対するＫ_ｄは０．１８ｎＭ、サルＰＤ−Ｌ１に対するＫ_ｄは１６．２ｎＭ）。

抗ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂのエピトープマッピング
ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１複合体の結晶構造に関する以前の報告は、受容体ＰＤ−１と直接相互作用するＰＤ−Ｌ１の重要なアミノ酸（ＡＡ）残基を明らかにした（Ｚｈａｎｇら、２００４Ｉｍｍｕｎｉｔｙ２０：３３７ −３４７；Ｌｉｎら、２００８ＰＮＡＳ１０５：３０１１−３０１６；Ｌａｚａｒ−Ｍｏｌｎａｒら、２００８ＰＮＡＳ１０５：１０４８３−１０４８８）。点突然変異解析により、ＰＤ−Ｌ１への結合に必要とされるＰＤ−Ｌ１配列中の８個のＡＡ残基が同定された。構造誘導突然変異解析からの情報に基づいて、本発明者らは、機能的ｍＡｂがＰＤ−Ｌ１媒介シグナル伝達を遮断する最も有効な方法は、８つの重要なＡＡ残基に結合することによりＰＤ−１と競合することで、ＰＤ−１受容体への結合に必要な結合エピトープを占有することであるという仮説を立てた。この仮説を検証し、かつ機能的なＰＤ−Ｌ１ｍＡｂによる作用機序を理解するために、本発明者らは８つの重要なアミノ酸のそれぞれをＡｌａ、即ち、Ｆ_１９Ａ、Ｉ_５４Ａ、Ｒ_１１３Ａ、Ｍ_１１５Ａ、Ｄ_１２２Ａ、Ｙ_１２３Ａ、Ｋ_１２４ＡおよびＲ_１２５Ａ（Ｌｉｎら、２００８ＰＮＡＳ１０５：３０１１−３０１６に基づくＡＡ残基番号付け）に置き換えることで８つのＰＤ−Ｌ１変異体を作製した。ＦａｓｔＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（カタログ番号ＦＭ１１１、ＴｒａｎｓｇｅｎＢｉｏｔｅｃｈ社、中国北京）を用いるローリングサークル突然変異誘発の鋳型として野生型ＰＤ−Ｌ１／Ｈｉｓ（図１）を用いた。すべての変異体を我々のｐｃＤＮＡ系発現ベクターにサブクローニングし、配列決定により確認した。変異体および野生型ＰＤ−Ｌ１／Ｈｉｓタンパク質を、前節で記載した一過性トランスフェクションによって発現させた。馴化培地（ＣＭ）を培養の４〜６日後に収集し、ウエスタンブロットによって分析して、質および量に関してＰＤ−Ｌ１／Ｈｉｓタンパク質発現を確認した。上清（ＣＭ）は、細胞破片を除去した後、ＥＬＩＳＡ分析またはエピトープマッピングのためのウエスタンブロットで直接使用した。

抗ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂの結合エピトープを研究するために、野生型および変異型ＰＤ−Ｌ１／Ｈｉｓを用いたＥＬＩＳＡアッセイを行った。抗体結合エピトープの比較のために、我々のいくつかのマウスｍＡｂおよび１つの参照抗体Ｙ１−ＩｇＧ１（ＵＳ２０１０／０２０３０５６Ａ１から適合させ、ヒトＩｇＧ１カッパ定常領域に融合させたもの）を研究に加えた。野生型または変異体ＰＤ−Ｌ１／Ｈｉｓを含有する等容積のＣＭを、同じＥＬＩＳＡアッセイのすべてのｍＡｂについて９６ウェルプレートにコーティングした。ＥＬＩＳＡ結果は、野生型ＰＤ−Ｌ１結合シグナルの平均ＥＬＩＳＡ値を標準として用いて標準化した。特異的変異体ＰＤ−Ｌ１に対するＥＬＩＳＡ結合シグナルを、ＰＤ−Ｌ１変異体間の発現変動を均一にするために、特異的変異体ＰＤ−Ｌ１に対して最も高い抗体結合値（１００％として設定）に対してさらに正規化した。データ解析の便宜上、特定のＰＤ−Ｌ１変異体に対するｍＡｂのＥＬＩＳＡ結合シグナルが野生型ＰＤ−Ｌ１に対して５０％未満に低下した場合、対応するアミノ酸突然変異のために結合機能が有意に損なわれたと定めた。同様に、特定の変異体に対するｍＡｂのＥＬＩＳＡ結合シグナルが２５％未満に低下した場合、それは非常に有意であると定めた。

図１３Ａに示すように、ＰＤ−Ｌ１中のアミノ酸残基Ｒ_１１３は、ＰＤ−Ｌ１へのｈｕ３３３−４Ｂ２−ＩｇＧ１結合に重要であり、（ＰＤ−Ｌ１の）突然変異はＰＤ−Ｌ１へのｈｕ３３３−４Ｂ２−ＩｇＧ１結合を有意に損なった。一方、参照抗体Ｙ１−ＩｇＧ１は、特有の結合エピトープを有していた。Ｒ_１１３のほかに、Ｆ_１９、Ｉ_５４、Ｄ_１２２およびＹ_１２３はすべて、その結合に重要なエピトープであった（図１３Ｂ）。本発明者らの研究から、他の抗ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂにおいても結合エピトープの異なるシグネチャが観察された。ｈｕ３３３−４Ｂ２−ＩｇＧ１およびＹ１−ＩｇＧ１抗体のウエスタンブロットデータは、抗原タンパク質が変性されているにもかかわらず、これらの結果を裏付けた。

上記の重要な結合エピトープ突然変異とは別に、突然変異Ｄ_２６Ａも作製した。ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロットの結果は、ＰＤ−Ｌ１の突然変異Ｄ_２６Ａが、ｍＡｂｍｕ３３３、ｈｕ３３３−４Ｂ２−ＩｇＧ１およびＹ１−ＩｇＧ１を含むすべての機能的抗ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂの結合活性を有意に阻害したが、非機能性抗体、例えばｍｕ２６０の結合は阻害しなかったことを示した（図１３Ｃ）。表２１にまとめたように、ｍｕ３３３およびその誘導体ヒト化ｍＡｂと同様に、ｈｕ３３３−４Ｂ２は、ヒトＰＤ−Ｌ１の２個の重要なアミノ酸残基（エピトープ）、Ｄ_２６およびＲ_１１３に結合する。対照的に、ｍＡｂＹ１は、少なくとも６個のアミノ酸残基に結合した。

エピトープマッピング研究を通して、本発明者らは、抗ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂが、結合親和性、結合特異性および機能活性に大きな影響を与え得る分子認識を介して異なるエピトープシグネチャに結合することができることを実証した。例えば、ｈｕ３３３−４Ａ２およびｈｕ３３３−４Ｂ２は、ヒトＰＤ−Ｌ１にのみ結合することができ（図１２Ａ）、マウスＰＤ−Ｌ１に結合することはできない（図１２Ｃ）。対照的に、ヒトおよびマウスのＰＤ−Ｌ１は２６％の配列相違を有するにもかかわらず、Ｙ１はヒトおよびマウスＰＤ−Ｌ１の両方に結合する（図１２Ａおよび１２Ｃ）。

ヒト血清タンパク質への非特異的結合
ｍＡｂｍｕ３３３がヒト血清タンパク質に対する非特異的結合を有するかどうかを調べるために、５％ヒト血清（健常ドナー由来）および（図４Ａのｘ軸に示した）種々の濃度のＰＤ−Ｌ１／Ｈｉｓ抗原でコーティングした９６ウェルＮｕｎｃＭａｘｉｓｏｒｐＥＬＩＳＡプレートを用いて、ＥＬＩＳＡ分析を行った。マウスＩｇＧ１カッパ定常領域に融合したＹ１可変ドメインからなる同量のマウスＰＤ−Ｌ１ＡｂまたはキメラＹ１（Ｙ１−ｍｕＩｇＧ１と命名した）をＥＬＩＳＡ反応に加え、結合を抗マウスＦｃ−ＨＲＰ（カタログ番号Ａ９３０９、Ｓｉｇｍａ社）で検出した。抗体を含まないＰＢＳ緩衝液を陰性対照として含ませた（図１４）。

図１４に示すように、ｍｕ３３３のベースラインＯ．Ｄ．値（非常に低い抗原濃度での測定値）は陰性対照とほぼ同じであったが、Ｙ１−ｍｕＩｇＧ１のベースラインＯ．Ｄ．値は陰性対照（ＰＢＳ）よりも４倍高かった。これは、結合選択性におけるｍｕ３３３及びＹＩ−ｍＩｇＧ１間の差異を示すものであった。ヒト血清の代わりにウシ胎児血清（ＦＢＳ）を用いた同様のアッセイ法を行って、ヒト化ｍＡｂ、ｈｕ３３３−４Ｂ２−ＩｇＧ１ｍｃおよびｈｕ３３３−４Ｂ２−ＩｇＧ１ｍｆの非特異的結合を評価した。その親マウスハイブリドーマｍＡｂに似て、ｈｕ３３３−４Ｂ２−ＩｇＧ１ｍｃおよびｈｕ３３３−４Ｂ２−ＩｇＧ１ｍｆは、ＦＢＳへ結合しなかった。

実施例８薬物動態
マウスにおけるｈｕ３３３−４Ｂ２−ＩｇＧ１ｍｆの薬物動態
すべての動物実験は、ＢｅｉＧｅｎｅＡｎｉｍａｌＣａｒｅａｎｄＵｓｅＰｒｏｃｅｄｕｒｅに従って行った。ヒト化ｍＡｂｈｕ３３３−４Ｂ２−ＩｇＧ１ｍｆ（配列番号３２および３３）の薬物動態を調べるために、１０〜１２週齢の雌のＢａｌｂ／ｃヌードマウス（１８〜２５ｇ）を用いた。単回静脈内（ｉ．ｖ．）または皮下（ｓ．ｃ．）注射のいずれかで１０ｍｇ／ｋｇのｍＡｂｈｕ３３３−４Ｂ２−ＩｇＧ１ｍｆをマウスに投与した。静脈内注射は尾静脈を介して、皮下注射は脇腹に行った。各注射群において、マウスを異なるサブグループに分け、各サブグループにおいて、特定の時点で血液血清を収集した。静脈内注射群においては、注射の２日前、注射してから１５分、３０分、６０分、９０分、６時間、２４時間後に、２日目、３日目、４日目、５日目、７日目、１０日目、１４日目、２１日目及び２８日目に一回血清を収集した。皮下注射群においては、注射の２日前、注射してから１．５時間、６時間、２４時間後に、２日目、３日目、４日目、５日目、７日目、１０日目、１４日目、２１日目、及び２８日目に一回血清を収集した。

ヒトＰＤ−Ｌ１／Ｈｉｓタンパク質を用いたＥＬＩＳＡにより、ｈｕ３３３−４Ｂ２−ＩｇＧ１ｍｆの血清レベルを測定した。つまり、ＮｕｎｃＭａｘｉＳｏｒｐＥＬＩＳＡプレート（カタログ番号４４２４０４、Ｎｕｎｃ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を、３μｇ／ｍＬのヒトＰＤ−Ｌ１／Ｈｉｓタンパク質（１００μＬ／ウェル）で４℃にて一晩コーティングした。プレートを、ＰＢＳ中の３％ウシ血清アルブミン、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ブロッキングバッファー）で室温にて１時間遮断した。洗浄後、連続希釈した血清サンプルおよび精製ｈｕ３３３−４Ｂ２−ＩｇＧ１ｍｆ標準を加え、室温で１時間インキュベートした。洗浄後、結合したｈｕ３３３−４Ｂ２−ＩｇＧ１ｍｆを、ＨＲＰ結合ヤギ抗ヒトＦｃ抗体（カタログ番号Ａ０１７０、Ｓｉｇｍａ社）を用いて検出し、ＴＭＢ基質（カタログ番号Ｔ０４４０、Ｓｉｇｍａ社）を用いて発色させた。非線形回帰を用いて標準曲線を適合させ、ｈｕ３３３−４Ｂ２−ＩｇＧ１ｍｆの血清濃度を標準曲線および希釈係数から推定した。

時間データに対するｈｕ３３３−４Ｂ２−ＩｇＧ１ｍｆの血清濃度は、静脈内（ｉ．ｖ．）及び皮下（ｓ．ｃ．）投与量の非コンパートメントモデル（ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ、Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ）を用いて分析した。クリアランス、分布容積、半減期、平均滞留時間およびバイオアベイラビリティは、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎデータフィッティングから推定した。

マウスのｈｕ３３３−４Ｂ２−ＩｇＧ１ｍｆの薬物動態を表２２にまとめた。静脈内投与後、ｈｕ３３３−４Ｂ２−ＩｇＧ１ｍｆ（配列番号３２および３３）の濃度は二相性の様式で血清から除去された。終末相半減期は約１０−１４日であった。１０ｍｇ／ｋｇの静脈内投与後、クリアランスはマウスにおいて７．９ｍＬ／日／ｋｇであった。皮下投与後、血清中ｈｕ３３３−４Ｂ２−ＩｇＧ１ｍｆのピーク濃度は、同じ投与量の静脈内投与後に記録されたものの約３０〜５０％であった。１０ｍｇ／ｋｇの皮下（ｓ．ｃ．）及び静脈内（ｉ．ｖ．）投与後のＡＵＣの比較は、９０％のバイオアベイラビリティを示した。これらのＰＫパラメーターは全て、典型的なヒト化モノクローナル抗体のものに近く、ｈｕ３３３−４Ｂ２−ＩｇＧ１ｍｆ（配列番号３２および３３）がマウスにおいて良好なｉｎｖｉｖｏ安定性を有することを示した。

カニクイザルにおけるｈｕ３３３−４Ｂ２−ＩｇＧ１ｍｃの薬物動態
ｈｕ３３３−４Ｂ２−ＩｇＧ１ｍｃ（配列番号３１および３２）の薬物動態をカニクイザルで調べた。ヒト化３３３はほとんど同じ親和性をもってヒトおよびサルＰＤ−Ｌ１に結合するので、カニクイザルにおける薬物動態プロフィールは、ヒトにおける薬物動態プロファイルを予測するのに非常に有益かつ拡張性のあるものといえる。薬物投与および血清収集は、３ＤＢｉｏＯｐｔｉｍａのＡｎｉｍａｌＣａｒｅａｎｄＵｓｅＰｒｏｃｅｄｕｒｅに従い、３ＤＢｉｏＯｐｔｉｍａ社（中国蘇州）にて行った。つまり、３〜５才の２匹の雄サルに、１０ｍｇ／ｋｇのｍＡｂｈｕ３３３−４Ｂ２−ＩｇＧ１ｍｃを静脈内（ｉ．ｖ．）単回投与した。投与２日前、投与してから５分、３０分、２時間、６時間、１２時間、２４時間、３６時間後に、および２日、３日、５日、７日、１０日、１５日、２２日、３０日後に、血液サンプル（〜１ｍＬ）を、頭部静脈を介してチューブに収集した。

ＥＬＩＳＡ系バイオアナリシスおよび薬物動態分析を、本質的に上記のように実施した。各時点で、２匹のサルからの平均血清濃度を、投与後２２日および３０日の時点を除いてフィッティングに使用した（これらの２つの時点では、おそらくサルの抗薬物免疫応答に起因して、一匹のサルが加速クリアランス及び検出不能なｈｕ３３３−４Ｂ２−ＩｇＧ１ｍｃ血清レベルを示したので、もう一匹のサルからのデータのみを使用した）。時間データに対するｈｕ３３３−４Ｂ２−ＩｇＧ１ｍｃの血清濃度を、静脈内投与量の非コンパートメントモデルを用いて分析した。

カニクイザルにおけるｈｕ３３３−４Ｂ２−ＩｇＧ１ｍｃの薬物動態を表２３にまとめた。静脈内投与後、ｈｕ３３３−４Ｂ２−ＩｇＧ１ｍｃ濃度は二相性の様式で血清から除去された。末端半減期は約９日間であった。カニクイザルにおける１０ｍｇ／ｋｇの静脈内投与後のクリアランスは６．４ｍＬ／日／ｋｇであった。静脈内投与後、ｈｕ３３３−４Ｂ２−ＩｇＧ１ｍｃのピーク濃度は２８３μｇ／ｍＬであった（投与後５分）。これらのＰＫパラメーターは、ｈｕ３３３−４Ｂ２−ＩｇＧ１ｍｃが、カニクイザルにおいて正常な薬物動態プロファイルを有することを示し、それにより、ヒトにおける正常な薬物動態挙動を予測することができることを示した（Ｄｅｎｇら、２０１１年のｍＡｂ３：６１−６６）。

実施例９ヒト化抗ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂはインビボマウス異種移植片癌モデルにおける腫瘍増殖を阻害する
Ｔ細胞株およびＰＢＭＣに基づく実験では、抗ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂが、ヒト癌細胞を異種移植した免疫不全マウスを利用し、続いてヒトＰＢＭＣを移植し、インビボで癌細胞増殖を阻害するようにｍＡｂ処理を施すマウス癌モデルにおいて有効であることが示された。同種マウス癌モデルを以下のように設計した。雌ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（６〜７週）をシクロホスファミドで前処理した。ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を健常ヒトボランティアの血液から単離し、Ａ４３１類表皮癌細胞（カタログ番号ＣＲＬ−１５５５、ＡＴＣＣ）およびマトリゲルと混合し、動物の右前腹部に皮下注射した。細胞接種後０日目から開始して、動物を１グループ８匹ずつ３グループに無作為に分けた。マウスには、ビヒクル（ＰＢＳ）または１０ｍｇ／ｋｇのｈｕ３３３−４Ｂ２−ＩｇＧ１ｍｆ（配列番号３２および３３）で４週間、週２回（ＢＩＷｉ．ｐ．）の処置を施した。個々の動物の体重および腫瘍体積を週に２回記録し、マウスを研究期間中の毒性の臨床徴候について毎日モニターした。腫瘍体積は、以下の式を用いて計算した：［Ｄ×（ｄ^２）］／２（ここで、Ｄは腫瘍の大直径を表し、ｄは小直径を表す）。

図１５に示すように、抗ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂ（ｈｕ３３３−４Ｂ２−ＩｇＧ１ｍｆ）処置群では、Ａ４３１腫瘍増殖がＰＢＳ処置群よりも遅かった。結果は、記載した抗ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂが、マウスインビボ癌モデルにおける腫瘍細胞増殖を阻害するようにヒト免疫細胞を活性化することができることを示したが、それは、前のセクションで説明したインビトロ実験結果と一致するものであった。

Claims

ヒトＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する抗体抗原結合ドメインであって、
下記（ａ）乃至（ｃ）から選択されたＣＤＲ（相補性決定領域）の組み合わせを含む、抗体抗原結合ドメイン：
（ａ）配列番号９の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１０の重鎖ＣＤＲ２、配列番号１１の重鎖ＣＤＲ３、及び配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１３の軽鎖ＣＤＲ２、配列番号１４の軽鎖ＣＤＲ３；
（ｂ）配列番号９の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２４の重鎖ＣＤＲ２、配列番号２６の重鎖ＣＤＲ３、及び配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１３の軽鎖ＣＤＲ２、配列番号１４の軽鎖ＣＤＲ３；又は
（ｃ）配列番号９の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２５の重鎖ＣＤＲ２、配列番号２６の重鎖ＣＤＲ３、及び配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１３の軽鎖ＣＤＲ２、配列番号１４の軽鎖ＣＤＲ３。
下記配列を含む、重鎖可変領域（Ｖｈ）又は軽鎖可変領域（Ｖｋ）を含む、請求項１に記載の抗体抗原結合ドメイン：
ｍｕ３３３ｖｈ（配列番号６）；
ｍｕ３３３ｖｋ（配列番号８）；
ｈｕ３３３−１Ａｖｈ（配列番号１５）；
ｈｕ３３３−１Ａｖｋ（配列番号１６）；
ｈｕ３３３−４Ａ２ｖｈ（配列番号２１）；
ｈｕ３３３−４Ｂ２ｖｈ（配列番号２２）；又は
ｈｕ３３３−４Ｂ２ｖｋ（配列番号２３）。
下記配列を含む、重鎖可変領域（Ｖｈ）及び軽鎖可変領域（Ｖｋ）を含む、請求項１に記載の抗体抗原結合ドメイン：
ｍｕ３３３ｖｈ及びｖｋ（配列番号６及び８）；
ｈｕ３３３−１Ａｖｈ及びｖｋ（配列番号１５及び１６）；
ｈｕ３３３−４Ａ２ｖｈ及びｖｋ（配列番号２１及び２３）；又は
ｈｕ３３３−４Ｂ２ｖｈ及びｖｋ（配列番号２２及び２３）。
ｈｕ３３３−４Ｂ２ｖｈ（配列番号２２）又はｈｕ３３３−４Ｂ２ｖｋ（配列番号２３）を含む、重鎖可変領域（Ｖｈ）又は軽鎖可変領域（Ｖｋ）を含む、請求項１に記載の抗体抗原結合ドメイン。
ｈｕ３３３−４Ａ２ｖｈ及びｖｋ（配列番号２１及び２３）又はｈｕ３３３−４Ｂ２ｖｈ及びｖｋ（配列番号２２及び２３）を含む、重鎖可変領域（Ｖｈ）及び軽鎖可変領域（Ｖｋ）を含む、請求項１に記載の抗体抗原結合ドメイン。
ＰＤ−Ｌ１残基：Ｄ２６及びＲ１１３に特異的に結合する、請求項１に記載の抗体抗原結合ドメイン。
請求項１〜６の何れか一項に記載の抗体抗原結合ドメインを含む、モノクローナルＩｇＧ抗体。
癌若しくはウイルス感染症の判定を受けた患者、又はその他のＰＤ−Ｌ１拮抗作用を必要とする患者を治療する方法に使用するための請求項１〜６の何れか一項に記載の抗体抗原結合ドメイン。
請求項１〜６の何れか一項に記載の抗体抗原結合ドメインをコードする、発現ベクター。
請求項１〜６の何れか一項に記載の抗体抗原結合ドメインを発現する培養細胞。