CN109069622A - 特异性结合人cd40的拮抗性抗体和使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及特异性结合人CD40的拮抗性抗体、编码该抗体或其抗原结合片段的多核苷酸，以及制备和使用前述物质的方法。

Description

特异性结合人CD40的拮抗性抗体和使用方法
技术领域
本发明涉及特异性结合人CD40的拮抗性抗体、编码该抗体或其抗原结合片段的多核苷酸，以及制备和使用前述物质的方法。
背景技术
细胞表面CD40分子是肿瘤坏死因子受体超家族(TNFR)的成员以及先天性和适应性免疫应答两者中的关键调节因子。CD40组成性地表达于抗原递呈细胞，具体地B细胞、树突状细胞和巨噬细胞上，而且也可存在于成纤维细胞、滑膜细胞、平滑肌细胞、内皮细胞和上皮细胞上。
CD40的天然配体(命名为CD154或CD40L)主要在活化T淋巴细胞和血小板上表达。CD40与CD40L在T细胞上的相互作用包括体液和细胞介导的免疫应答。CD40调节该配体-受体对来活化B细胞以及包括树突状细胞(DC)的其它抗原递呈细胞(APC)，从而驱动T细胞活化。例如，B细胞上CD40的活化诱导B细胞增殖，体细胞超变，分化为抗体分泌细胞并且在次级淋巴器官中的生发中心同种型转换。体外研究已经显示CD40活化对细胞因子产生(例如IL-6、IL-10、IL-12、TNF-α)、粘附分子和共刺激受体(例如ICAM、CD23、CD80和CD86)的表达，以及B淋巴细胞对I类MHC、II类MHC和TAP转运蛋白提高的表达的直接影响。
调节CD40/CD40L相互作用的抗体对治疗疾病，诸如炎性疾病，包括自身免疫性疾病有兴趣。
发明内容
本发明提供一种特异性结合SEQ ID NO:1的人CD40的分离的拮抗性抗体或其抗原结合部分，该分离的拮抗性抗体或其抗原结合部分包含SEQ ID NO:5的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO:61的HCDR2、SEQ ID NO:62的HCDR3、SEQ ID NO:63的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO:9的LCDR2和SEQ ID NO:10的LCDR3。
本发明还提供一种特异性结合SEQ ID NO:1的人CD40的分离的拮抗性抗体或其抗原结合部分，该分离的拮抗性抗体或其抗原结合部分包含特定的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR3、LCDR3、VH、VL、HC和/或LC序列。
本发明还提供一种药物组合物，该药物组合物包含本发明的抗体以及药学上可接受的载体。
本发明还提供一种免疫缀合物，该免疫缀合物包含连接到治疗剂或成像剂的本发明的抗体。
本发明还提供一种分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸编码
SEQ ID NO:11、21、22、23、24、25或26的VH；
SEQ ID NO:12或27的VL；或者
SEQ ID NO:11、21、22、23、24、25或26的VH以及SEQ ID NO:12或27的VL。
本发明还提供一种包含SEQ ID NO:13、14、28、29、30、31、32、33或34的多核苷酸序列的分离的多核苷酸。
本发明还提供一种编码SEQ ID NO:35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45或46的重链的分离的多核苷酸。
本发明还提供一种编码SEQ ID NO:77或78的轻链的分离的多核苷酸。
本发明还提供一种编码SEQ ID NO:35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45或46的重链以及SEQ ID NO:77或78的轻链的分离的多核苷酸。
本发明还提供一种包含SEQ ID NO:35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、77或78的多核苷酸序列的分离的多核苷酸。
本发明还提供一种包含本发明的多核苷酸的载体。
本发明还提供一种包含本发明的载体的宿主细胞。
本发明还提供一种制备特异性结合SEQ ID NO:1的人CD40的拮抗性抗体或其抗原结合部分的方法，该方法包括在抗体被表达的条件下培养本发明的宿主细胞，并且分离所述抗体。
本发明还提供一种治疗患有炎性疾病的受治疗者的方法，该方法包括以足以治疗炎性疾病的时间向对其有需要的受治疗者施用本发明的分离抗体。
本发明还提供本发明的抗体在治疗中使用。
本发明还提供结合到本发明的抗体的抗独特型抗体。
本发明还提供一种包括本发明的抗体的试剂盒。
附图说明
图1示出C40B16(作为野生型IgG1)在相比于Fc效应子沉默抗体D时展示出类似的最小激动作用。Fc效应子沉默ASKP-1240、CFZ533和BMS-986090mAb在相比于C40B16时展示出较高水平的激动作用。激动作用在HEK-BlueTMCD40L NF-κB活化测定中进行评估。
图2示出在测量抗体介导的人树突状细胞(DC)产生IL-12p40的测定中，C40B16并未诱导激动作用，而ASKP-1240、CFZ533和BMS-986090诱导IL-12p40产生。在各自由图中每种抗体的独立柱表示的6种不同抗体浓度(350nM、110nM、35nM、11nM、3.5nM、以及1.1nM)下评价IL-12p40产生。DC+CD40L：阳性对照。仅DC：阴性对照。
图3A示出500ng/ml浓度的抗-CD40抗体C40B176、C40B179、C40B180和C40B183没有诱导树突状细胞(DC)活化，而350nM ASKP-1240诱导IL-12p40产生。在抗体的存在下，由DC的IL-12p40产生对DC活化进行评估。PP1B40：IgG1sigma同种型对照；CNTO9412：IgG4_PAA同种型对照。
图3B示出高浓度的抗-CD40抗体C40B176、C40B179、C40B180和C40B183没有诱导B细胞增殖，而500nM ASKP-1240诱导B细胞增殖。PP1B40：IgG1sigma同种型对照；CNTO9412：IgG4_PAA同种型对照。显示出ASKP-1240两条独立的剂量响应曲线。
具体实施方式
定义
本说明书中所引用的所有出版物，包括但不限于专利和专利申请均以引用方式并入本文，如同在本文中完整给出。
应当了解，本文所用的术语只是为了描述具体实施方案的目的，并非旨在进行限制。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。
如本文所用，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指代，除非上下文中另有明确说明。
虽然与本文所述的那些方法和材料相似或等效的任何方法和材料都可以用于检验本发明的实践中，然而本文描述示例性材料和方法。
“特异性结合”或“特异性地结合”或“结合”是指抗体以比针对非相关抗原更高的亲和力结合到人CD40。通常，抗体以1×10-8M或更小，例如1×10-9M或更小、1×10-10M或更小、1×10-11M或更小、或1×10-12M或更小的解离常数(KD)结合到人CD40，通常以小于其结合到非相关抗原(例如BSA、酪蛋白)的KD的至少一百倍的KD。可使用标准程序来测量解离常数。然而，特异性地结合人CD40的抗体可能对其它相关抗原，例如，对来自其它物种(同源)(诸如人或猴，例如食蟹猕猴(Macaca fascicularis)(cynomolgus,cyno)、黑猩猩(Pantroglodytes)(chimpanzee,chimp)或狨猴(Callithrix jacchus)(common marmoset,marmoset))的相同抗原具有交叉反应性。虽然单特异性抗体特异性地结合一个抗原或一个表位，而双特异性抗体特异性地结合两个不同的抗原或两个不同的表位。
“抗体”广义上是指并且包括免疫球蛋白分子，该免疫球蛋白分子包括单克隆抗体(包括鼠科动物单克隆抗体、人单克隆抗体、人源化单克隆抗体和嵌合单克隆抗体)，抗原结合片断，双特异性或多特异性抗体，二聚、四聚或多聚抗体，单链抗体、结构域抗体，以及包含具有所需特异性的抗原结合位点的免疫球蛋白分子的任何其它经修饰构型。“全长抗体”包含由二硫键互连的两条重链(H)与两条轻链(L)以及它们的多聚体(例如IgM)。每条重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(由结构域CH1、铰链CH2和CH3构成)构成。每条轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)构成。VH和VL区可进一步细分为称作互补决定区(CDR)的超变区，间插有框架区(FR)。各个VH和VL由三个CDR和四个FR片段构成，并按以下顺序从氨基端至羧基端布置：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。
“互补决定区(CDR)”为抗体中的“抗原结合位点”。可使用不同的术语来定义CDR：(i)三个在VH中(HCDR1、HCDR2、HCDR3)并且三个在VL中(LCDR1、LCDR2、LCDR3)的互补决定区(CDR)是基于序列变异性(Wu和Kabat，J Exp Med，第132卷，第211-250页，1970年；Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991年)。(ii)三个在VH(H1、H2、H3)中并且三个在VL(L1、L2、L3)中的“超变区”、“HVR”或“HV”是指抗体可变结构域的在结构上超变的区域，如Chothia和Lesk所定义(Chothia和Lesk，Mol Biol，第196卷，第901-917页，1987年)。国际免疫遗传学(IMGT)数据库(http://www_imgt_org)提供了抗原结合位点的标准化编号和定义。CDR、HV和IMGT描述之间的对应关系在Lefranc等人，Dev ComparatImmunol，第27卷，第55-77页，2003年中有所描述。除非在说明书中另有明确说明，如本文所用，术语“CDR”、“HCDR1”、“HCDR2”、“HCDR3”、“LCDR1”、“LCDR2”和“LCDR3”包括上文所述的任何方法(Kabat、Chothia或IMGT)所定义的CDR。
免疫球蛋白可根据重链恒定结构域氨基酸序列被指定为五种主要种类IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。IgA和IgG进一步亚分类为同种型IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。基于其恒定结构域的氨基酸序列，可将任何脊椎物种的抗体轻链指定为两种完全不同的类型即卡帕(κ)和兰亩达(λ)中的一种。
“抗原结合片段”是指免疫球蛋白分子的保留亲本全长抗体的抗原结合特性的部分。示例性的抗原结合片段为重链互补决定区(HCDR)1、2和/或3、轻链互补决定区(LCDR)1、2和/或3、重链可变区(VH)、或轻链可变区(VL)、Fab、F(ab')2、Fd和Fv片段以及由一个VH结构域或一个VL结构域组成的结构域抗体(dAb)。VH和VL结构域可经由合成接头连接在一起以形成各种类型的单链抗体设计，其中在VH结构域和VL结构域由单独链表达的情况下，VH/VL结构域在分子内或分子间配对，以形成单价抗原结合位点，诸如单链Fv(scFv)或双价抗体；例如在国际专利公布WO1998/44001，国际专利公布WO1988/01649；国际专利公布WO1994/13804；国际专利公布WO1992/01047中所描述的。
“单克隆抗体”是指在每条重链和每条轻链中具有单一氨基酸组成的抗体群，除了可能的熟知改变，诸如从抗体重链中除去C末端赖氨酸之外。除了多特异性单克隆抗体结合两个或更多个不同的抗原或表位之外，单克隆抗体通常结合一个抗原表位。双特异性单克隆抗体结合两个不同的抗原表位。单克隆抗体可在抗体群内具有异质糖基化。单克隆抗体可以是单特异性的或多特异性的，或者是单价的、二价的或多价的。多特异性抗体，诸如双特异性抗体或三特异性抗体包括在术语单克隆抗体中。
“分离抗体”是指基本上不含具有不同抗原特异性的其它抗体的抗体或其抗原结合片段(例如，特异性结合人CD40的分离抗体基本上不含特异性结合除人CD40之外的抗原的抗体)。就双特异性抗体而言，双特异性抗体特异性结合两种感兴趣的抗原，并且基本上不含特异性结合除两种感兴趣抗原之外的抗原的抗体。“分离抗体”涵盖分离至更高纯度的抗体，诸如80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％纯度的抗体。
“人源化抗体”是指其中抗原结合位点来源于非人物种且可变区框架来源于人免疫球蛋白序列的抗体。人源化抗体在框架区中可包括特意引入的突变，使得该框架可能不是表达的人免疫球蛋白序列或种系基因序列的精确拷贝。
“人抗体”是指具有重链可变区和轻链可变区的抗体，其中框架和抗原结合位点两者均来源于人起源的序列。如果抗体包含恒定区或恒定区的一部分，则该恒定区也来源于人起源的序列。
如果抗体的可变区由使用人种系免疫球蛋白或重排免疫球蛋白基因的***获得，则人抗体包含来源于人起源的序列的重链可变区或轻链可变区。此类示例性***为在噬菌体上展示的人免疫球蛋白基因文库，以及转基因非人动物，诸如携带如本文所述的人免疫球蛋白基因座的小鼠或大鼠。在相比于人种系免疫球蛋白序列或重排免疫球蛋白序列时，人抗体通常包含由于例如天然存在的体细胞突变、在框架或抗原结合位点中特意引入置换所引起的氨基酸差异以及在非人动物中克隆和VDJ重组期间引入的氨基酸变化。通常，人抗体的氨基酸序列与由人种系免疫球蛋白基因或重排免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些情况下，人抗体可包含来源于人框架序列分析的共有框架序列(例如Knappik等人，J Mol Biol，第296卷，第57-86页，2000年中所述)；或结合到展示在噬菌体上的人免疫球蛋白基因文库中的合成HCDR3(例如Shi等人，J Mol Biol，第397卷，第385-396页，2010年和国际专利公布WO2009/085462中所述)。
“人抗体”的定义中不包括抗原结合位点来源于非人物种的抗体。
“重组体”包括以重组手段制备、表达、创建或分离的抗体及其它蛋白质。
“表位”是指抗原的与抗体特异性结合的部分。表位通常由部分诸如氨基酸或多糖侧链的化学活性(诸如，极性、非极性或疏水性)表面基团组成，并且可具有特定三维结构特征以及特定电荷特征。表位可由形成构象空间单元的连续和/或不连续氨基酸构成。对于不连续表位，来自抗原的线性序列的不同部分的氨基酸因蛋白质分子的折叠而在三维空间上靠近。
“多特异性”是指特异性结合至少两个不同的抗原或抗原内两个不同的表位，例如三个、四个或五个不同的抗原或表位的抗体。
“双特异性”是指特异性结合两个不同的抗原或同一抗原内的两个不同的表位的抗体。双特异性抗体可对其它相关抗原具有交叉反应性，或者可结合两个或更多个不同的抗原之间所共享的表位。
“变体”是指因一处或多处修饰(例如，置换、***或缺失)而不同于参考多肽或参考多核苷酸的多肽或多核苷酸。
“载体”是指能够在生物***内复制或可在此类***之间移动的多核苷酸。载体多核苷酸通常含有诸如复制起点、聚腺苷酸化信号或选择标记的元件，其功能是促进这些多核苷酸在生物***中的复制或保持。此类生物***的示例可包括细胞、病毒、动物、植物和利用能够复制载体的生物组分再造的生物***。包含载体的多核苷酸可为DNA或RNA分子或这些分子的杂合分子。
“表达载体”是指可用于生物***或再造生物***中以指导由存在于表达载体中的多核苷酸序列编码的多肽的翻译的载体。
“多核苷酸”是指包含糖磷酸酯主链共价连接的核苷酸链或其它等同共价化学物的合成分子。cDNA是多核苷酸的典型示例。
“多肽”或“蛋白质”是指包含由肽键连接以形成多肽的至少两个氨基酸残基的分子。小于50个氨基酸的小多肽可被称为“肽”。
“CD40”或“huCD40”是指人CD40蛋白质。CD40也被称为肿瘤坏死因子受体超家族成员5(TNFRSF5)、CD40L受体或CD154受体。全长人CD40的氨基酸序列示于SEQ ID NO:1中。人全长CD40蛋白质是具有277个氨基酸的I型膜蛋白。信号序列跨越SEQ ID NO:1的残基1-20，胞外结构域跨越SEQ ID NO:1的残基21-193，跨膜结构域跨越SEQ ID NO:1的残基194-215，并且胞质结构域跨越SEQ ID NO:1的残基216-277。在整个说明书，CD40的胞外结构域“CD40ECD”是指SEQ ID NO:1的残基21-193的CD40片段。
“拮抗剂”或“拮抗性”是指特异性结合人CD40并且在细胞测定中CD40L的存在下抑制CD40生物活性的抗体，诸如抑制CD40L-驱动的人B细胞增殖或CD40L-驱动的由人树突状细胞产生IL-12p40。在相比于不含抗体的对照样品时，拮抗剂可以统计意义上显著的方式抑制CD40生物活性。作为另外一种选择，特异性结合人CD40的拮抗性抗体可以约1nM或更小的IC50值抑制CD40生物活性。CD40L在测定中可提供为可溶形式或膜结合形式(例如，提供为表达CD40L的细胞，诸如Jurkat细胞)。
“CD40生物活性”是指由于CD40L与CD40在人细胞上的结合而在细胞中发生的可测量事件。CD40生物活性可例如为人B细胞的增殖或由人树突状细胞的IL-12p40产生，或CD40信号传导途径的下游活化。CD40生物活性可使用已知方法以及本文所述的方法来测量。
“约”意指如由本领域的普通技术人员所确定，在特定值的可接受误差范围内，其部分地取决于如何测量或确定该值，即测量体系的限制。在特定测定、结果或实施方案的上下文中，除非实施例或说明书其它地方内另有明确说明，否则“约”意指在根据本领域惯例的一个标准偏差之内、或至多5％的范围(无论哪个更大)。
“与……联合”意指可将两种或更多种治疗剂以混合物一起、作为单一药剂同时或作为单一药剂以任何顺序依次施用给受治疗者。
“交联”是指在由特异性结合人CD40的抗体结合到顺式或反式FcγRIIb所诱导的细胞上CD40的更高级多聚化，从而导致诱导CD40的激动活性。
本文使用如表1中所示的常规单字母和三字母氨基酸代码。
表1：
氨基酸 三字母代码 单字母代码
丙氨酸 Ala A
精氨酸 Arg R
天冬酰胺 Asn N
天冬氨酸 Asp D
半胱氨酸 Cys C
谷氨酸 Gln E
谷氨酰胺 Glu Q
甘氨酸 Gly G
组氨酸 His H
异亮氨酸 Ile I
赖氨酸 Lys K
甲硫氨酸 Met M
苯丙氨酸 Phe F
脯氨酸 Pro P
丝氨酸 Ser S
苏氨酸 Thr T
色氨酸 Trp W
酪氨酸 Tyr Y
缬氨酸 Val V
本发明的抗体
本发明提供特异性结合人CD40的拮抗性抗体、编码该抗体的多核苷酸、载体、宿主细胞以及使用该抗体的方法。
本发明的抗体为CD40的有效抑制剂并且具有最小的激动活性。有文献记载拮抗性抗CD40抗体虽然是拮抗剂，但也可由于Fc依赖***联而具有激动活性(例如参见US7,537,763)，并且因此在向期望抑制DC40信号转导的受治疗者(诸如患有自身免疫性疾病的患者)施用时具有潜在的安全隐患。因此，期望抑制CD40生物功能的用来治疗病症的优选的抗-CD40抗体是缺乏激动活性，或具有最小激动活性的那些。因此，合适的治疗性CD40抗体将被Fc-工程化以阻断FcγR结合，并且因此缺乏Fc介导的交联和Fc介导的激动作用的潜能。此类效应子沉默Fc-工程化抗体为例如ASKP-1240、CFZ533、BMS-98609和抗体D(“基准抗体”)。ASKP-1240和CFZ533目前正处于炎性或自身免疫性疾病的临床开发当中。
本发明的抗体在相比于基准抗体时展示出改善的特性。在相比于基准抗体ASKP-1240、CFZ533和BMS-986090时，本发明的抗体C40B16具有最小的激动活性并且在较小程度上活化CD40信号转导。因为ASKP-1240、CFZ533和BMS-986090是Fc效应子沉默抗体，所以观察到的这些抗体的激动作用可为表位依赖性的。相反，C40B16是野生型IgG1，并且因此既不具有表位依赖性也不具有Fc依赖性激动作用。此外，本发明的Fc工程化效应子沉默抗体C40B176、C40B179、C40B180和C40B183不仅展示出最小的激动作用，而且在相比于抗体D时效能还改善至多10倍。
本发明提供一种特异性结合SEQ ID NO:1的人CD40的分离的拮抗性抗体或其抗原结合片段，该分离的拮抗性抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:5的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO:61的HCDR2、SEQ ID NO:62的HCDR3、SEQ ID NO:63的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO:9的LCDR2和SEQ ID NO:10的LCDR3。
SEQ ID NO:61、62和63表示特异性结合CD40的拮抗性抗体的HCDR2、HCDR3和LCDR1属序列，该属涵盖翻译后修饰的推定位点已突变的亲本抗体C40B16的变体。该属之内的抗体预计不显示表位的转变，例如预计包含SEQ ID NO:5、61、62、63、9和10的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的抗体在相比于亲本C40B16抗体时具有类似的特征。示例性的此类抗体是包含如表2和表7所示的抗体C40M141、C40M152、C40M142、C40M153、C40M144、C40M155、C40M148、C40M194、C40M198、C40M197、C40M201或C40M126的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3或VH和VL氨基酸序列的抗体。
SEQ ID NO:61属HCDR2序列：
TIX1X2X3GGGTYYADSVKG；其中
X1为N、D或Q；
X2为N、Q或A；并且
X3为S或A。
SEQ ID NO:62属HCDR3序列
EGGKYYYYAX1DV；其中
X1为M或L
SEQ ID NO:63属LCDR1序列
SGDKLGDKYAX1；其中
X1为C或A。
表2：
在一些实施方案中，该抗体与包含以下项的抗体竞争以结合到SEQ ID NO:1的人CD40：
SEQ ID NO:11的重链可变区(VH)和SEQ ID NO:12的轻链可变区(VL)；
SEQ ID NO:25的VH和SEQ ID NO:27的VL，或者
SEQ ID NO:26的VH和SEQ ID NO:27的VL。
在一些实施方案中，相对于包含以下项的抗体所结合的表位，该抗体结合到SEQID NO:1的人CD40上相同的表位：
SEQ ID NO:11的重链可变区(VH)和SEQ ID NO:12的轻链可变区(VL)；
SEQ ID NO:25的VH和SEQ ID NO:27的VL，或者
SEQ ID NO:26的VH和SEQ ID NO:27的VL。
在一些实施方案中，抗体以约1.5×10-10M或更小的解离常数(KD)结合人CD40，此时所述KD在包含0.01％聚山梨醇酯20(PS-20)和100μg/ml牛血清白蛋白的杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水中在25℃下使用ProteOn XPR36***测量。
在一些实施方案中，抗体抑制可溶性人CD40L-驱动的人扁桃体B细胞增殖的IC50值小于约1×10-9M。
在一些实施方案中，抗体抑制可溶性人CD40L-驱动的由人树突状细胞产生IL-12p40的IC50值小于约1×10-9M。
在一些实施方案中，抗体以约1.5×10-10M或更小的解离常数(KD)结合人CD40，此时所述KD在包含0.01％PS-20和100μg/ml牛血清白蛋白的杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水中在25℃使用ProteOn XPR36***测量；抑制可溶性人CD40L-驱动的人扁桃体B细胞增殖，IC50值小于约1×10-9M；并且抑制可溶性人CD40L-驱动的由人树突状细胞产生IL-12p40，IC50值小于约1×10-9M。
在一些实施方案中，抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG1同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG2同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG3同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG4同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG1同种型，并且在相比于野生型IgG1时任选地包含L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S突变。
在一些实施方案中，抗体是IgG1/λ同种型，并且在相比于野生型IgG1时任选地包含L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S突变。
在一些实施方案中，抗体是IgG1/λ同种型，并且在相比于野生型IgG1时包含L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S突变。
在一些实施方案中，抗体是IgG4同种型，并且在相比于野生型IgG4时任选地包含S228P突变。
在一些实施方案中，抗体是IgG4/λ同种型，并且在相比于野生型IgG4时任选地包含S228P突变。
在一些实施方案中，抗体是IgG4/λ同种型，并且在相比于野生型IgG4时包含S228P突变。
在一些实施方案中，抗体是IgG4同种型，并且在相比于野生型IgG4时任选地包含S228P/F234A/L235A突变。
在一些实施方案中，抗体是IgG4/λ同种型，并且在相比于野生型IgG4时任选地包含S228P/F234A/L235A突变。
在一些实施方案中，抗体是IgG4/λ同种型，并且在相比于野生型IgG4时包含S228P/F234A/L235A突变。
在一些实施方案中，抗体是多特异性抗体，诸如双特异性抗体。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗炎性疾病。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗自身免疫性疾病。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗阿狄森氏病。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗强直性脊柱炎。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗动脉粥样硬化。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗自身免疫性肝炎。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗自身免疫性糖尿病。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗格雷夫斯病。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗格-巴二氏综合征。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗桥本氏病。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗特发性血小板减少症。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗炎性肠病(IBD)。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗***性红斑狼疮。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗多发性硬化症。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗重症肌无力。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗牛皮癣。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗关节炎。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗硬皮病。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗干燥综合症。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗***性硬化病。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗移植。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗肾移植。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗皮肤移植。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗骨髓移植。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗移植物抗宿主病(GVHD)。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗I型糖尿病。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗类风湿性关节炎。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗幼年型关节炎。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗银屑病性关节炎。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗赖特综合征。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗痛风性关节炎。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗克罗恩氏病。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗溃疡性结肠炎。
该抗体适于在治疗中使用，例如与第二治疗剂联合治疗炎性疾病。
该抗体适于在治疗中使用，例如与第二治疗剂联合治疗自身免疫性疾病。
该抗体适于在治疗中使用，例如与第二治疗剂联合治疗类风湿性关节炎。
该抗体适于在治疗中使用，例如与第二治疗剂联合治疗***性红斑狼疮。
本发明还提供一种特异性结合SEQ ID NO:1的人CD40的分离的拮抗性抗体或其抗原结合片段，该分离的拮抗性抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO:5、6、7、8、9和10的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，抗体包含分别为SEQ ID NO:11和12的VH和VL。
在一些实施方案中，VH由包含SEQ ID NO:13的多核苷酸序列的多核苷酸编码，并且VL由包含SEQ ID NO:14的多核苷酸序列的多核苷酸编码。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:35的重链和SEQ ID NO:47的轻链。
在一些实施方案中，重链由包含SEQ ID NO:65的多核苷酸序列的多核苷酸编码，并且轻链由包含SEQ ID NO:77的多核苷酸序列的多核苷酸编码。
本发明还提供一种特异性结合SEQ ID NO:1的人CD40的分离的拮抗性抗体或其抗原结合片段，该分离的拮抗性抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO:5、15、7、20、9和10的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，抗体包含分别为SEQ ID NO:21和27的VH和VL。
在一些实施方案中，VH由包含SEQ ID NO:28的多核苷酸序列的多核苷酸编码，并且VL由包含SEQ ID NO:34的多核苷酸序列的多核苷酸编码。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:36的重链和SEQ ID NO:48的轻链。
在一些实施方案中，重链由包含SEQ ID NO:66的多核苷酸序列的多核苷酸编码，并且轻链由包含SEQ ID NO:78的多核苷酸序列的多核苷酸编码。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:37的重链和SEQ ID NO:48的轻链。
在一些实施方案中，重链由包含SEQ ID NO:67的多核苷酸序列的多核苷酸编码，并且轻链由包含SEQ ID NO:78的多核苷酸序列的多核苷酸编码。
本发明还提供一种特异性结合SEQ ID NO:1的人CD40的分离的拮抗性抗体或其抗原结合片段，该分离的拮抗性抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO:5、16、7、20、9和10的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，抗体包含分别为SEQ ID NO:22和27的VH和VL。
在一些实施方案中，VH由包含SEQ ID NO:29的多核苷酸序列的多核苷酸编码，并且VL由包含SEQ ID NO:34的多核苷酸序列的多核苷酸编码。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:38的重链和SEQ ID NO:48的轻链。
在一些实施方案中，重链由包含SEQ ID NO:68的多核苷酸序列的多核苷酸编码，并且轻链由包含SEQ ID NO:78的多核苷酸序列的多核苷酸编码。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:39的重链和SEQ ID NO:48的轻链。
在一些实施方案中，重链由包含SEQ ID NO:69的多核苷酸序列的多核苷酸编码，并且轻链由包含SEQ ID NO:78的多核苷酸序列的多核苷酸编码。
本发明还提供一种特异性结合SEQ ID NO:1的人CD40的分离的拮抗性抗体或其抗原结合片段，该分离的拮抗性抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO:5、17、7、20、9和10的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，抗体包含分别为SEQ ID NO:23和27的VH和VL。
在一些实施方案中，VH由包含SEQ ID NO:30的多核苷酸序列的多核苷酸编码，并且VL由包含SEQ ID NO:34的多核苷酸序列的多核苷酸编码。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:40的重链和SEQ ID NO:48的轻链。
在一些实施方案中，重链由包含SEQ ID NO:70的多核苷酸序列的多核苷酸编码，并且轻链由包含SEQ ID NO:78的多核苷酸序列的多核苷酸编码。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:41的重链和SEQ ID NO:48的轻链。
在一些实施方案中，重链由包含SEQ ID NO:71的多核苷酸序列的多核苷酸编码，并且轻链由包含SEQ ID NO:78的多核苷酸序列的多核苷酸编码。
本发明还提供一种特异性结合SEQ ID NO:1的人CD40的分离的拮抗性抗体或其抗原结合片段，该分离的拮抗性抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO:5、18、7、20、9和10的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，抗体包含分别为SEQ ID NO:24和27的VH和VL。
在一些实施方案中，VH由包含SEQ ID NO:31的多核苷酸序列的多核苷酸编码，并且VL由包含SEQ ID NO:34的多核苷酸序列的多核苷酸编码。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:42的重链和SEQ ID NO:48的轻链。
在一些实施方案中，重链由包含SEQ ID NO:72的多核苷酸序列的多核苷酸编码，并且轻链由包含SEQ ID NO:78的多核苷酸序列的多核苷酸编码。
本发明还提供一种特异性结合SEQ ID NO:1的人CD40的分离的拮抗性抗体或其抗原结合片段，该分离的拮抗性抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO:5、18、19、20、9和10的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，该抗体与包含以下项的抗体竞争以结合到SEQ ID NO:1的人CD40：
SEQ ID NO:11的重链可变区(VH)和SEQ ID NO:12的轻链可变区(VL)；
SEQ ID NO:25的VH和SEQ ID NO:27的VL，或者
SEQ ID NO:26的VH和SEQ ID NO:27的VL。
在一些实施方案中，相对于包含以下项的抗体所结合的表位，该抗体结合到SEQID NO:1的人CD40上相同的表位：
SEQ ID NO:11的重链可变区(VH)和SEQ ID NO:12的轻链可变区(VL)；
SEQ ID NO:25的VH和SEQ ID NO:27的VL，或者
SEQ ID NO:26的VH和SEQ ID NO:27的VL。
在一些实施方案中，抗体以约1.5×10-10M或更小的解离常数(KD)结合人CD40，此时所述KD在包含0.01％PS-20和100μg/ml牛血清白蛋白的杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水中在25℃下使用ProteOn XPR36***测量。
在一些实施方案中，抗体抑制可溶性人CD40L-驱动的人扁桃体B细胞增殖的IC50值小于约1×10-9M。
在一些实施方案中，抗体抑制可溶性人CD40L-驱动的由人树突状细胞产生IL-12p40的IC50值小于约1×10-9M。
在一些实施方案中，抗体以约1.5×10-10M或更小的解离常数(KD)结合人CD40，此时所述KD在包含0.01％PS-20和100μg/ml牛血清白蛋白的杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水中在25℃下使用ProteOn XPR36***测量；抑制可溶性人CD40L-驱动的人扁桃体B细胞增殖，IC50值小于约1×10-9M；抑制可溶性人CD40L-驱动的由人树突状细胞产生IL-12p40，IC50值小于约1×10-9M。
在一些实施方案中，抗体包含分别为SEQ ID NO:25和27的VH和VL。
在一些实施方案中，VH由包含SEQ ID NO:32的多核苷酸序列的多核苷酸编码，并且VL由包含SEQ ID NO:34的多核苷酸序列的多核苷酸编码。
在一些实施方案中，抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG1同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG2同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG3同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG4同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG1同种型，并且在相比于野生型IgG1时任选地包含L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S突变。
在一些实施方案中，抗体是IgG1/λ同种型，并且在相比于野生型IgG1时任选地包含L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S突变。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:25的VH和SEQ ID NO:27的VL并且为IgG1/λ同种型，在相比于野生型IgG1时任选地包含L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S突变。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:25的VH和SEQ ID NO:27的VL并且为IgG1/λ同种型，在相比于野生型IgG1时包含L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S突变。
在一些实施方案中，抗体是IgG4同种型，并且在相比于野生型IgG4时任选地包含S228P突变。
在一些实施方案中，抗体是IgG4/λ同种型，并且在相比于野生型IgG4时任选地包含S228P突变。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:25的VH和SEQ ID NO:27的VL并且为IgG4/λ同种型，在相比于野生型IgG4时任选地包含S228P突变。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:25的VH和SEQ ID NO:27的VL并且为IgG4/λ同种型，在相比于野生型IgG4时包含S228P突变。
在一些实施方案中，抗体是IgG4同种型，并且在相比于野生型IgG4时任选地包含S228P/F234A/L235A突变。
在一些实施方案中，抗体是IgG4/λ同种型，并且在相比于野生型IgG4时任选地包含S228P/F234A/L235A突变。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:25的VH和SEQ ID NO:27的VL并且为IgG4/λ同种型，在相比于野生型IgG4时任选地包含S228P/F234A/L235A突变。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:25的VH和SEQ ID NO:27的VL并且为IgG4/λ同种型，在相比于野生型IgG4时包含S228P/F234A/L235A突变。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:43的重链和SEQ ID NO:48的轻链。
在一些实施方案中，重链由包含SEQ ID NO:73的多核苷酸序列的多核苷酸编码，并且轻链由包含SEQ ID NO:78的多核苷酸序列的多核苷酸编码。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:44的重链和SEQ ID NO:48的轻链。
在一些实施方案中，重链由包含SEQ ID NO:74的多核苷酸序列的多核苷酸编码，并且轻链由包含SEQ ID NO:78的多核苷酸序列的多核苷酸编码。
在一些实施方案中，抗体是多特异性抗体，诸如双特异性抗体。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗炎性疾病。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗自身免疫性疾病。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗阿狄森氏病。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗强直性脊柱炎。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗动脉粥样硬化。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗自身免疫性肝炎。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗自身免疫性糖尿病。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗格雷夫斯病。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗格-巴二氏综合征。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗桥本氏病。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗特发性血小板减少症。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗炎性肠病(IBD)。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗***性红斑狼疮。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗多发性硬化症。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗重症肌无力。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗牛皮癣。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗关节炎。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗硬皮病。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗干燥综合症。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗***性硬化病。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗移植。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗肾移植。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗皮肤移植。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗骨髓移植。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗移植物抗宿主病(GVHD)。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗I型糖尿病。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗类风湿性关节炎。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗幼年型关节炎。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗银屑病性关节炎。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗赖特综合征。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗痛风性关节炎。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗克罗恩氏病。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗溃疡性结肠炎。
该抗体适于在治疗中使用，例如与第二治疗剂联合治疗炎性疾病。
该抗体适于在治疗中使用，例如与第二治疗剂联合治疗自身免疫性疾病。
该抗体适于在治疗中使用，例如与第二治疗剂联合治疗类风湿性关节炎。
该抗体适于在治疗中使用，例如与第二治疗剂联合治疗***性红斑狼疮。
本发明还提供一种特异性结合SEQ ID NO:1的人CD40的分离的拮抗性抗体或其抗原结合片段，该分离的拮抗性抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO:5、17、19、20、9和10的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，该抗体与包含以下项的抗体竞争以结合到SEQ ID NO:1的人CD40：
SEQ ID NO:11的重链可变区(VH)和SEQ ID NO:12的轻链可变区(VL)；
SEQ ID NO:25的VH和SEQ ID NO:27的VL，或者
SEQ ID NO:26的VH和SEQ ID NO:27的VL。
在一些实施方案中，相对于包含以下项的抗体所结合的表位，该抗体结合到SEQID NO:1的人CD40上相同的表位：
SEQ ID NO:11的重链可变区(VH)和SEQ ID NO:12的轻链可变区(VL)；
SEQ ID NO:25的VH和SEQ ID NO:27的VL，或者
SEQ ID NO:26的VH和SEQ ID NO:27的VL。
在一些实施方案中，抗体以约1.5×10-10M或更小的解离常数(KD)结合人CD40，此时所述KD在包含0.01％PS-20和100μg/ml牛血清白蛋白的杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水中在25℃下使用ProteOn XPR36***测量。
在一些实施方案中，抗体抑制可溶性人CD40L-驱动的人扁桃体B细胞增殖的IC50值小于约1×10-9M。
在一些实施方案中，抗体抑制可溶性人CD40L-驱动的由人树突状细胞产生IL-12p40的IC50值小于约1×10-9M。
在一些实施方案中，抗体以约1.5×10-10M或更小的解离常数(KD)结合人CD40，此时所述KD在包含0.01％PS-20和100μg/ml牛血清白蛋白的杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水中在25℃下使用ProteOn XPR36***测量；抑制可溶性人CD40L-驱动的人扁桃体B细胞增殖，IC50值小于约1×10-9M；抑制可溶性人CD40L-驱动的由人树突状细胞产生IL-12p40，IC50值小于约1×10-9M。
在一些实施方案中，抗体包含分别为SEQ ID NO:26和27的VH和VL。
在一些实施方案中，VH由包含SEQ ID NO:33的多核苷酸序列的多核苷酸编码，并且VL由包含SEQ ID NO:34的多核苷酸序列的多核苷酸编码。
在一些实施方案中，抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG1同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG2同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG3同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG4同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG1同种型，并且在相比于野生型IgG1时任选地包含L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S突变。
在一些实施方案中，抗体是IgG1/λ同种型，并且在相比于野生型IgG1时任选地包含L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S突变。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:26的VH和SEQ ID NO:27的VL并且为IgG1/λ同种型，在相比于野生型IgG1时任选地包含L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S突变。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:26的VH和SEQ ID NO:27的VL并且为IgG1/λ同种型，在相比于野生型IgG1时包含L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S突变。
在一些实施方案中，抗体是IgG4同种型，并且在相比于野生型IgG4时任选地包含S228P突变。
在一些实施方案中，抗体是IgG4/λ同种型，并且在相比于野生型IgG4时任选地包含S228P突变。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:26的VH和SEQ ID NO:27的VL并且为IgG4/λ同种型，在相比于野生型IgG4时任选地包含S228P突变。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:26的VH和SEQ ID NO:27的VL并且为IgG4/λ同种型，在相比于野生型IgG4时包含S228P突变。
在一些实施方案中，抗体是IgG4同种型，并且在相比于野生型IgG4时任选地包含S228P/F234A/L235A突变。
在一些实施方案中，抗体是IgG4/λ同种型，并且在相比于野生型IgG4时任选地包含S228P/F234A/L235A突变。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:26的VH和SEQ ID NO:27的VL并且为IgG4/λ同种型，在相比于野生型IgG4时任选地包含S228P/F234A/L235A突变。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:26的VH和SEQ ID NO:27的VL并且为IgG4/λ同种型，在相比于野生型IgG4时包含S228P/F234A/L235A突变。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:45的重链和SEQ ID NO:48的轻链。
在一些实施方案中，重链由包含SEQ ID NO:75的多核苷酸序列的多核苷酸编码，并且轻链由包含SEQ ID NO:78的多核苷酸序列的多核苷酸编码。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:46的重链和SEQ ID NO:48的轻链。
在一些实施方案中，重链由包含SEQ ID NO:76的多核苷酸序列的多核苷酸编码，并且轻链由包含SEQ ID NO:78的多核苷酸序列的多核苷酸编码。
在一些实施方案中，抗体是多特异性抗体，诸如双特异性抗体。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗炎性疾病。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗自身免疫性疾病。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗阿狄森氏病。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗强直性脊柱炎。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗动脉粥样硬化。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗自身免疫性肝炎。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗自身免疫性糖尿病。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗格雷夫斯病。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗格-巴二氏综合征。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗桥本氏病。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗特发性血小板减少症。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗炎性肠病(IBD)。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗***性红斑狼疮。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗多发性硬化症。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗重症肌无力。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗牛皮癣。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗关节炎。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗硬皮病。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗干燥综合症。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗***性硬化病。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗移植。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗肾移植。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗皮肤移植。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗骨髓移植。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗移植物抗宿主病(GVHD)。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗I型糖尿病。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗类风湿性关节炎。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗幼年型关节炎。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗银屑病性关节炎。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗赖特综合征。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗痛风性关节炎。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗克罗恩氏病。
该抗体适于在治疗中使用，例如治疗溃疡性结肠炎。
该抗体适于在治疗中使用，例如与第二治疗剂联合治疗炎性疾病。
该抗体适于在治疗中使用，例如与第二治疗剂联合治疗自身免疫性疾病。
该抗体适于在治疗中使用，例如与第二治疗剂联合治疗类风湿性关节炎。
该抗体适于在治疗中使用，例如与第二治疗剂联合治疗***性红斑狼疮。
可使用以下方案在体外测定与包含特定VH和VL序列的本发明的抗体结合到人CD40之间的竞争：在该测定中使用His-标记的重组可溶性人CD40(CD40-ECD-his)。将5μL的抗-his mAb(10μg/mL，R&D***，MAB050)在室温下直接涂覆在MSD HighBind板上2小时，并且然后在室温下用5％MSD封闭剂A缓冲液封闭附加的2小时。添加25μL的10μg/mL CD40-ECD-his蛋白以被抗-his mAb捕集。在室温轻微振荡下温育2小时后，将板用0.1M HEPES缓冲液(pH 7.4)洗涤3x，之后添加在室温下预温育过30分钟的10nM钌(Ru)标记的参考抗-CD40mAb或其Fab部分与不同浓度(2μM至1nM)的测试抗-CD40抗体的混合物。在室温下轻微振荡温育1小时后，使用0.1M HEPES缓冲液(pH 7.4)洗涤平板3x。将MSD读取缓冲液T用蒸馏水稀释(4倍)并分配到各个孔中，然后用SECTOR成像器6000(Meso Scale Discovery,Gaithersburg,MD)进行分析。当测试抗体使利用Ru标记的参考抗体或其Fab部分在以上测定中获得的MDS信号下降超过90％时，测试抗体与参考抗体(例如包含SEQ ID NO:11的VH和SEQ ID NO:12的VL的抗体，包含SEQ ID NO:25的VH和SEQ ID NO:27的VL的抗体，或包含SEQID NO:26的VH和SEQ DI NO:27的VL的抗体)竞争以结合到人CD40。与包含SEQ ID NO:11的VH和SEQ ID NO:12的VL、SEQ ID NO:25的VH和SEQ ID NO:27的VL或者SEQ ID NO:26的VH和SEQ ID NO:27的VL的抗体竞争以结合到CD40的抗体可通过以下产生：使用噬菌体展示文库分离特异性结合人CD40的抗体，并且筛选出所产生的能够与前述抗体竞争以结合到CD40的抗体。
本发明的抗体结合的CD40表位可例如使用氢/氘化交换(H/D交换)或通过分析与CD40复合的抗体的晶体结构来解析。当通过H/D交换氘化水平差异为至少5％的受抗体保护的80％或更多的CD40氨基酸残基在两种抗体之间相同时，或者当在抗体与CD40的复合物的晶体结构中被测定结合抗体的80％或更多的CD40表面暴露的氨基酸残基在两种抗体之间相同时，两种CD40抗体“结合CD40上相同的表位”。在抗体与CD40的复合物的晶体结构中，表位残基是位于距抗体CDR残基中的任一个距离之内或更小的那些CD40残基。
在H/D交换测定中，将CD40蛋白在存在或不存在抗体情况下在氘化水中温育预定时间，从而导致氘在不受抗体保护的可交换氢原子处引入，之后使蛋白酶消化蛋白质并使用LC-MS分析肽片段。在一个示例性测定中，将5μL的测试抗体(10μg)或5μL的CD40与测试抗体的复合物(分别为10μg和7.35μg)用120μL氧化氘标记缓冲液(50mM磷酸盐、100mM氯化钠，在pH 7.4下)温育0秒、60秒、300秒、1800秒、7200秒和14400秒。通过添加63μL的5M盐酸胍对氘交换进行淬灭，并且最终pH为2.5。使淬灭的样品经受柱上胃蛋白酶/蛋白酶XIII型消化和LC-MS分析。对于胃蛋白酶/蛋白酶XIII型消化，通过添加63μL的5M盐酸胍(最终pH为2.5)使含5μg样品的125μL对照缓冲液(50mM磷酸盐、100mM氯化钠，在pH 7.4下)变性并温育混合物3min。然后，使混合物经受柱上胃蛋白酶/蛋白酶XIII型消化并且使用UPLC-MS***分析所得的肽，该***由联接到Q ExactiveTM混合四极-轨道阱质谱议(Thermo)的WatersAcquity UPLC构成。使用HDX WorkBench软件处理原始MS数据以用于分析H/D交换MS数据。使用氘化肽与其天然形式(t0)之间的平均质量差来计算氘水平。通过用Mascot，针对CD40搜索MS/MS数据进行肽鉴定。前体和产物离子的质量容差分别为20ppm和0.05Da。
对于X射线结晶学，使用标准方案对CD40和测试抗体进行表达和纯化。将CD40/测试抗体复合物在4℃下温育过夜，浓缩，并使用尺寸排阻色谱法从未复合的物种中分离。通过蒸气扩散法从各种已知的测试溶液，例如包含PEG3350、柠檬酸铵和2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)的溶液中结晶该复合物。
与参考抗体结合CD40上相同表位的抗体可通过以下产生：使用噬菌体展示文库分离出结合CD40的抗体，选择与参考抗体100％竞争以结合到CD40的那些抗体，并且通过H/D交换或通过X射线结晶学来鉴定抗体表位。
作为另外一种选择，可使用涵盖表位残基的肽对小鼠或兔子进行免疫，并且可对所产生的抗体在所述区域内的结合进行评价。
抗体对人或cyno CD40的亲和力可使用任何合适的方法通过实验测定。示例性方法利用本领域技术人员已知的ProteOn XPR36、Biacore 3000或KinExA仪器、ELISA或竞争性结合测定。如果在不同的条件(例如，同渗容摩、pH)下测量，则所测的特定抗体对CD40的亲和力可变化。因此，亲和力和其它结合参数(例如，KD、Kon和Koff)的测量通常用标准化条件和标准化缓冲液(诸如本文所述的缓冲液)进行。本领域技术人员将会知道，使用例如Biacore 3000或ProteOn进行亲和力测量的内部误差(测量为标准偏差，SD)通常可在典型检出限内的测量值的5％至33％内。因此术语“约”反映测定中的典型标准偏差。例如，1×10-9M的KD的典型SD为至多±0.33×10-9M。
在B细胞增殖测定中，可将1×105个人扁桃体B细胞在含有glutamax、10％FBS和1％青霉素/链霉素的RPMI培养基中进行培养，可将特异性结合人CD40的抗体中的每种滴定添加到细胞中，之后添加0.5μg/ml可溶性人CD154。在收获并计数之前，可将细胞在37℃下培养48小时，用含3H-胸腺嘧啶核苷(1μCi/孔)的50μl培养基脉冲并且培养16小时至18小时。
在DC IL-12p40产生测定中，可通过将经纯化的人单核细胞(2.5×106个/孔，6孔板)在含有glutamax、25mM HEPES、10％FBS、1％青霉素/链霉素和各50ng的GM-CSF和IL-4的3ml RPMI培养基中培养6天来产生人DC。在第3天，可移除1ml的培养基并用2ml的各自包含50ng/ml的GM-CSF和IL-4的新鲜培养基替换。在第6天，可将DC铺板到96孔板(100,000个细胞/孔)中，之后滴定特异性结合人CD40的抗体中的每种，并且将1μg/ml的可溶性人CD154添加到培养物中。在收集并通过MSD分析上清液IL-12p40之前，可将细胞培养48小时。
本发明的抗体的免疫效应子特性可通过Fc修饰得到增强或沉默。例如，Fc效应子功能诸如C1q结合、补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、吞噬作用、细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)的下调等，可通过修饰促成这些活性的Fc中的残基来提供和/或控制。
在一些实施方案中，本发明的抗体具有与FcγRI,FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa或FcγRIIIb降低的结合。
“降低的结合”是指在相比于不具有突变的亲本抗体与相同FcγR的结合时，在Fc区具有至少一个突变的本发明的抗体与Fcγ受体(FcγR)的结合下降。“降低的结合”可为至少约100倍、至少约500倍、至少约1000倍、至少约5000倍、至少约10,000倍，或至少约20,000倍降低的结合。在实施过程中，表现出与特定FcγR“降低的结合”的抗体是指具有由特定FcγR介导的统计学上不显著的效应子功能的抗体。
在一些实施方案中，本发明的抗体在Fc区中包含至少一个突变，使抗体与FcγR的结合下降。
在一些实施方案中，FcγR是FcγRI、FcγRIIa或FcγRIIIa或FcγRIIIb。
在一些实施方案中，Fc区中的至少一个突变是L234A突变、L235A突变、G237A突变、P238S突变、M252Y突变、S254T突变、T256E突变、H268A突变、A330S突变或P331S突变，其中残基根据EU索引进行编号。
在一些实施方案中，本发明的抗体在Fc区中包含L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S突变，其中残基根据EU索引进行编号。
在一些实施方案中，Fc区中的至少一个突变是V234A突变、G237A突变、P238S突变、M252Y突变、S254T突变、T256E突变、H268A突变、V309L突变、A330S突变或P331S突变，其中残基根据EU索引进行编号。
在一些实施方案中，本发明的抗体在Fc区中包含V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S突变，其中残基根据EU索引进行编号。
在一些实施方案中，本发明的抗体在Fc区中包含S228P突变，其中残基根据EU索引进行编号。
在一些实施方案中，本发明的抗体在Fc区中包含F234A突变，其中残基根据EU索引进行编号。
在一些实施方案中，本发明的抗体在Fc区中包含L235A突变，其中残基根据EU索引进行编号。
在一些实施方案中，本发明的抗体包含S228P/F234A/L235A突变，其中残基根据EU索引进行编号。
本发明的抗体与FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa和FcγRIIIb的缔合可使用Fcγ受体的重组可溶形式或细胞结合形式来评价。例如，直接或间接的例如竞争性结合测量可用来评估本发明的抗体与各种FcγR的相对亲和性和亲合力。在示例性测定中，使用1μg/ml生物素酰化人IgG1和系列稀释的与抗原预复合的测试抗体之间的竞争性结合，对捕集在板上的结合可溶性FcγR的测试抗体进行评价。
在一些实施方案中，在Fc区中包含至少一个突变的本发明的抗体具有减小的抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)、减小的抗体依赖性细胞吞噬作用(“ADCP”)和/或减小的补体依赖性细胞毒性(CDC)。
“抗体依赖性细胞的细胞毒性”、“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是诱导细胞死亡的机制，该机制依赖于抗体包被靶细胞与具有裂解活性的效应细胞(诸如自然杀伤细胞、单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞)经由效应细胞上表达的Fcγ受体(FcγR)发生的相互作用。例如，NK细胞表达FcγRIIIa，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIIIa。为评估本发明的抗体的ADCC活性，可将抗体与免疫效应细胞联合添加到靶细胞中，该免疫效应细胞可被抗原抗体复合物活化，从而导致靶细胞的细胞裂解。通常通过从裂解细胞中释放的标记(例如放射性底物、荧光染料或天然胞内蛋白质)来检测细胞裂解。用于此类测定法的示例性效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和NK细胞。示例性靶细胞包括表达CD40的细胞。
“抗体依赖性细胞吞噬作用”(“ADCP”)是指通过吞噬细胞(诸如巨噬细胞或树突状细胞)的内化作用消除抗体包被的靶细胞的机制。可使用单核细胞衍生的巨噬细胞作为效应细胞以及被工程化为表达GFP或其它标记分子的表达CD40的细胞作为靶细胞对ADCP进行评价。效应细胞:靶细胞比率可为例如4:1。可在含或不含测试CD40抗体的情况下，将效应细胞与靶细胞一起温育4小时。在温育后，可使用细胞消化液(accutase)分离细胞。可用偶联至荧光标记的抗-CD11b抗体和抗-CD14抗体鉴定巨噬细胞，并且可使用标准方法基于CD11+CD14+巨噬细胞中的GFP荧光％确定吞噬百分比。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指诱导细胞死亡的机制，其中靶结合抗体的Fc效应结构域结合并活化补体成分C1q，C1q继而活化补体级联，从而导致靶细胞死亡。补体的活化也可导致补体成分沉积在靶细胞表面上，这些补体成分通过结合白细胞上的补体受体(例如，CR3)来促进ADCC。可例如通过将表达CD40的细胞铺在适当的培养基中，将抗CD4抗体添加到混合物中，之后添加混合的人血清来测量表达CD40的细胞的CDC。在温育期之后，可使用标准方法在FACS测定中将裂解细胞百分比(％)检测为碘化丙啶染色的细胞％。
“减小的ADCC”、“减小的CDC”和“减小的ADCP”是指在相比于不具有突变的相同抗体时，由在Fc区中包含至少一个突变的本发明的抗体介导的ADCC、CDC和/或ADCP在统计意义上显著降低。ADCC、CDC和/或ADCP在诸如本文所述的测定和美国专利8,871,204中所述的测定中进行。
表7所示的包含VH或VL氨基酸序列的本发明的抗体的变体在本发明的范围之内。例如，变体可在VH和/或VL中包含一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四或十五个氨基酸置换，该置换并未不利地影响抗体的特征。在一些实施方案中，对本发明的抗体VH或VL氨基酸序列的序列同一性可为约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。
两个序列之间的百分比同一性是序列所共有的相同位置的数目的函数(即，同一性％＝相同位置的数目/位置总数×100)，考虑到空位的数目和每个空位的长度，需要引入这些参数以用于两个序列的最佳比对。
两个氨基酸序列之间的百分比同一性可使用E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl.Biosci.，第4卷，第11-17页(1988年))的算法(该算法已并入ALIGN程序(版本2.0)中)，使用PAM120加权残基表、空位长度罚分12和空位罚分4来确定。此外，两个氨基酸序列之间的百分比同一性可使用Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.，第48卷，第444-453页(1970年))的算法(该算法已并入GCG软件包中的GAP程序中(可在http://_www_gcg_com获得))，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵、以及16、14、12、10、8、6或4的空位权重和1、2、3、4、5或6的长度权重来确定。
在一些实施方案中，本发明的抗体包含与SEQ ID NO:11、21、22、23、24、25或26的VH具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VH，以及与SEQ ID NO:12或27的VL具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VL，其中该抗体表现出一下特性中的一者或多者：
抑制0.5μg/ml人可溶性CD40L-驱动的人扁桃体B细胞增殖，IC50值小于约1×10- 9M；
抑制1μg/ml人可溶性CD40L-驱动的由人树突状细胞产生IL-12p40，IC50值小于约1×10-9M；或者
结合以约5×10-9M或更小的解离常数(KD)到人CD40，此时所述KD使用实施例4所述的实验设计使用ProteOn XPR36***测量。
在一些实施方案中，本发明的抗体包含与SEQ ID NO:11的VH以及SEQ ID NO:12的VL具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VH和VL。
在一些实施方案中，本发明的抗体包含与SEQ ID NO:21的VH以及SEQ ID NO:27的VL具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VH和VL。
在一些实施方案中，本发明的抗体包含与SEQ ID NO:22的VH以及SEQ ID NO:27的VL具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VH和VL。
在一些实施方案中，本发明的抗体包含与SEQ ID NO:23的VH以及SEQ ID NO:27的VL具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VH和VL。
在一些实施方案中，本发明的抗体包含与SEQ ID NO:24的VH以及SEQ ID NO:27的VL具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VH和VL。
在一些实施方案中，本发明的抗体包含与SEQ ID NO:25的VH以及SEQ ID NO:27的VL具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VH和VL。
在一些实施方案中，本发明的抗体包含与SEQ ID NO:26的VH以及SEQ ID NO:27的VL具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VH和VL。
在一些实施方案中，本发明的抗体包含SEQ ID NO:11的VH和SEQ ID NO:12的VL，其中VH、VL、或VH与VL两者包含一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四或十五个保守氨基酸置换，并且该抗体表现出以下特性中的一者或多者：
抑制0.5μg/ml人可溶性CD40L-驱动的人扁桃体B细胞增殖，IC50值小于约1×10- 9M；
抑制1μg/ml人可溶性CD40L-驱动的由人树突状细胞产生IL-12p40，IC50值小于约1×10-9M；或者
结合以约5×10-9M或更小的解离常数(KD)到人CD40，此时所述KD使用实施例4所述的实验设计使用ProteOn XPR36***测量。
在一些实施方案中，本发明的抗体包含SEQ ID NO:11的VH和SEQ ID NO:12的VL，其中VH、VL、或VH与VL两者包含一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四或十五个保守氨基酸置换。
在一些实施方案中，本发明的抗体包含SEQ ID NO:21的VH和SEQ ID NO:27的VL，其中VH、VL、或VH与VL两者包含一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四或十五个保守氨基酸置换。
在一些实施方案中，本发明的抗体包含SEQ ID NO:22的VH和SEQ ID NO:27的VL，其中VH、VL、或VH与VL两者包含一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四或十五个保守氨基酸置换。
在一些实施方案中，本发明的抗体包含SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:27的VL，其中VH、VL、或VH与VL两者包含一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四或十五个保守氨基酸置换。
在一些实施方案中，本发明的抗体包含SEQ ID NO:24的VH和SEQ ID NO:27的VL，其中VH、VL、或VH与VL两者包含一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四或十五个保守氨基酸置换。
在一些实施方案中，本发明的抗体包含SEQ ID NO:25的VH和SEQ ID NO:27的VL，其中VH、VL、或VH与VL两者包含一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四或十五个保守氨基酸置换。
在一些实施方案中，本发明的抗体包含SEQ ID NO:26的VH和SEQ ID NO:27的VL，其中VH、VL、或VH与VL两者包含一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四或十五个保守氨基酸置换。
“保守修饰”是指不会显著影响或改变含有氨基酸序列的抗体的结合特征的氨基酸修饰。保守修饰包括氨基酸置换、添加和缺失。保守氨基酸置换是其中氨基酸被具有相似侧链的氨基酸残基替换的置换。具有相似侧链的氨基酸残基家族是明确定义的，并且包括具有以下侧链的氨基酸：酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、不带电极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、色氨酸)、芳香族侧链(例如，苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸、酪氨酸)、脂肪族侧链(例如，甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸)、酰胺(例如，天冬酰胺、谷氨酰胺)、β-分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及含硫侧链(半胱氨酸、甲硫氨酸)。此外，多肽中的任何天然残基可用丙氨酸来置换，如此前对于丙氨酸扫描诱变所述(MacLennan等人，Acta Physiol.Scand.Suppl.，第643卷，第55-67页，1998年；Sasaki等人，Adv.Biophys.，第35卷，第1-24页，1998年)。对本发明的抗体的氨基酸置换可通过公知的方法进行，例如通过PCR诱变(美国专利4,683,195)进行。另选地，可使用已知的方法，例如使用随机(NNK)或非随机密码子(例如DVK密码子，其编码11个氨基酸(Ala、Cys、Asp、Glu、Gly、Lys、Asn、Arg、Ser、Tyr、Trp))产生变体文库。可使用本文所述的测定法来测试所得抗体变体的特征。
尽管实施例中所示的实施方案包括成对的可变区，一个来自重链并且一个来自轻链，但本领域技术人员将认识到另选实施方案可包括单一重链可变区或单一轻链可变区。单一可变区可用于筛选能够形成能够例如特异性结合到人CD40的二结构域特异性抗原结合片段的可变结构域。筛选可通过噬菌体展示筛选方法使用例如在国际专利公布WO1992/01047中所公开的分级双组合方法来完成。
本发明的抗体可使用各种技术产生。例如，可使用Kohler和Milstein,Nature，第256卷，第495页，1975年所述的杂交瘤方法来产生单克隆抗体。在杂交瘤方法中，用人、狨猴或cyno CD40或CD40的片段(诸如CD40的可溶形式)来免疫小鼠或其它宿主动物(诸如仓鼠、大鼠、兔子或猴)，之后使用标准方法将来自免疫动物的脾细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice，第59-103页(Academic Press,1986年))。筛选出由单个永生化杂交瘤细胞产生的菌落，以用于制备具有所需特性(诸如结合特异性、交叉反应性或缺乏结合特异性、缺乏交叉反应性，以及抗原的亲和力)的抗体。
可使用各种宿主动物来产生本发明的抗体。例如，可使用Balb/c小鼠来产生抗体。可使用各种技术来人源化由Balb/c小鼠和其它非人动物制备的抗体以产生更类似人的序列。包括选择人受体框架的示例性人源化技术是已知的，并且包括CDR接枝(美国专利5,225,539)、SDR接枝(美国专利6,818,749)、表面重塑(Padlan,Mol Immunol，第28卷，第489-499页，1991年)、特异性决定残基表面重塑(美国专利公布20100261620)、人改型(或人框架改型)(美国专利公布US2009/0118127)、超人源化(Superhumanization)(美国专利7,709,226)和定向选择(Osbourn等人，(2005年)Methods，第36卷，第61-68页，2005年；美国专利5,565,332)。在这些方法中，亲本抗体的CDR被转移到人框架上，该人框架可基于其与亲本框架的总体同源性，基于框架CDR长度、同源性或规范结构信息，或它们的组合进行选择。
可通过以下过程进一步优化人源化抗体以改善其对所需抗原的选择性或亲和力：通过采用诸如如国际专利公布WO90/007861和国际专利公布WO92/22653中所述的所公开的技术，引入修改的框架支持残基来保持结合亲和力(回复突变)，或者通过引入CDR中的任一个的变体来改善例如抗体的亲和力。
基因组中携带人免疫球蛋白(Ig)基因座的转基因小鼠可用于产生抗目标蛋白质的人抗体，并且在例如国际专利公布WO90/04036、美国专利6150584、国际专利公布WO99/45962、国际专利公布WO02/066630、国际专利公布WO02/43478、Lonberg等人，(1994年)Nature，第368卷，第856-859页；Green等人，(1994年)Nature Genet.，第7卷，第13-21页；Green&Jakobovits(1998年)Exp.Med.，第188卷，第483-495页；Lonberg和Huszar(1995年)Int.Rev.Immunol.，第13卷，第65-93页；Bruggemann等人，(1991年)Eur.J.Immunol.，第21卷，第1323-1326页；Fishwild等人，(1996年)Nat.Biotechnol.，第14卷，第845-851页；Mendez等人，(1997年)Nat.Genet.，第15卷，第146-156页；Green(1999年)J.Immunol.Methods，第231卷，第11-23页；Yang等人，(1999年)Cancer Res.，第59卷，第1236-1243页；Brüggemann和Taussig(1997年)Curr.Opin.Biotechnol.，第8卷，第455-458页；国际专利公布WO02/043478)中有所描述。可破坏此类鼠中的内源性免疫球蛋白基因座或使该基因座缺失，并且可使用转染色体或使用微小基因，使用同源或非同源重组将至少一种完整或部分的人免疫球蛋白基因座***小鼠基因组中。可邀请诸如Regeneron(http://_www_regeneron_com)、Harbour Antibodies(http://_www_harbourantibodies_com)、Open Monoclonal Technology,Inc.(OMT)(http://_www_omtinc_net)、KyMab(http://_www_kymab_com)、Trianni(http://_www.trianni_com)和Ablexis(http://_www_ablexis_com)等公司使用如上所述的技术来提供抗所选抗原的人抗体。
人抗体可选自噬菌体展示文库，其中噬菌体被工程化以表达人免疫球蛋白或其部分，诸如Fab、单链抗体(scFv)或者未配对或配对抗体可变区(Knappik等人，J.Mol Biol，第296卷，第57-86页，2000年；Krebs等人，J Immunol Meth，第254卷，第67-84页，2001年；Vaughan等人，Nature Biotechnology，第14卷，第309-314页，1996年；Sheets等人，PITAS(USA)，第95卷，第6157-6162页，1998年；Hoogenboom和Winter,J Mol Biol，第227卷，第381页，1991年；Marks等人，J Mol Biol，第222卷，第581页，1991年)。可例如用噬菌体pIX外壳蛋白从将抗体重链和轻链可变区表达为融合蛋白的噬菌体展示文库中分离出本发明的抗体，如Shi等人，J Mol Biol，第397卷，第385-396页，2010年和国际专利公布WO09/085462)中所述。可从文库中筛选结合到人和/或cyno CD40的噬菌体，并可进一步表征所获得的阳性克隆，从克隆裂解物中分离Fab，并将其表达为全长IgG。用于分离人抗体的此类噬菌体展示方法描述于例如：授予Ladner等人的美国专利5,223,409；5,403,484；和5,571,698；授予Dower等人的美国专利5,427,908和5,580,717；授予McCafferty等人的美国专利5,969,108和6,172,197；以及授予Griffiths等人的美国专利5,885,793；6,521,404；6,544,731；6,555,313；6,582,915和6,593,081。
免疫源性抗原的制备以及单克隆抗体的产生可使用任何合适的技术诸如重组蛋白产生来进行。免疫原性抗原可以纯化蛋白质或蛋白质混合物(包括全细胞或细胞提取物或组织提取物)的形式施用给动物，或抗原可在动物的体内由编码所述抗原或其部分的核酸从头形成。
本发明的抗体可为人抗体或人源化抗体。
在一些实施方案中，本发明的抗体包含来源于人种系基因VH3_3-23(SEQ ID NO:49)的VH框架。
在一些实施方案中，本发明的抗体包含来源于人种系基因VL3_3R(IGLV3-1)(SEQID NO:50)的VL框架。
本发明的抗体可为IgA、IgD、IgE、IgG或IgM型。本发明的抗体可为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4型。
本发明的抗体可被进一步工程化以产生修饰抗体，在相比于亲本抗体时具有类似或改变的特性。可在本发明的抗体中工程化VH、VL、VH和VL、恒定区、VH框架、VL框架、或六个CDR的任一个或全部。
本发明的抗体可通过CDR接枝进行工程化。可将本发明的抗体中的一个或多个CDR序列接枝到不同的框架序列。CDR接枝可使用本文所述的方法进行。在一些实施方案中，本发明的抗体包括：VH，该VH包含SEQ ID NO:5的HDCR1，SEQ ID NO:6、15、16、17或18的HCDR2，SEQ ID NO:7或19的HCDR3；以及VL，该VL包含SEQ ID NO:8或20的LCDR1，SEQ ID NO:9的LCDR2和/或SEQ ID NO:10的LCDR3，其中VH框架不来源于VH3_3-23(SEQ ID NO:49)并且VL框架不来源于VL3_3R(IGLV3-1)(SEQ ID NO:50)。待使用的框架序列可获自公共DNA数据库或包括种系抗体基因序列的已出版参考文献。例如，人重链和轻链可变区基因的种系DNA和编码蛋白质序列可见于the international ImMunoGeneTics information http://_www-imgt_org。能够被用来置换本发明的抗体中现有框架序列的框架序列是显示在氨基酸水平上与C40B16、C40B124、C40B135、C40B125、C40B136、C40B127、C40B138、C40B131、C40B176、C40B180、C40B179或C40B183VH或VL的百分比同一性最高的那些。
亲本和工程化抗体的框架序列还可例如通过回复突变来修饰，以恢复和/或改善所得抗体对抗原的结合，如例如在美国专利6,180,370中有所描述。亲本和工程化抗体的框架序列还可通过使框架区内，或甚至一个或多个CDR区内的一个或多个残基突变来修饰以移除T-细胞表位，从而降低抗体的潜在免疫原性。该方法也被称为“去免疫化”并且在美国专利公布20030153043中进一步详述。
可使本发明的抗体的CDR残基突变，以改善感兴趣的抗体的一个或多个结合特性。可进行定点诱变或PCR介导的诱变以引入一个或多个突变，并可在如本文所述和实施例所提供的体外或体内测定中评价对抗体结合、或其它感兴趣的功能特性的影响。可引入的示例性置换是如上文讨论的保守修饰。此外，通常在CDR区内不超过一个、二个、三个、四个或五个残基被改变。
本发明的抗体可通过诸如糖基化、异构化、去糖基化或非天然存在的共价修饰(诸如添加聚乙二醇部分(聚乙二醇化)和脂化)过程进行翻译后修饰。此类修饰可在体内或体外进行。例如，本发明的抗体可缀合至聚乙二醇(聚乙二醇化)以改善其药代动力学特性。缀合可通过本领域技术人员已知的技术来实施。治疗抗体与PEG的缀合已示出增强药效学，同时不干扰功能(Knigh等人，Platelets，第15卷，第409-418页，2004年；Leong等人，Cytokine，第16卷，第106-119页，2001年；Yang等人，Protein Eng.，第16卷，第761-770页，2003年)。
可经修饰以改善稳定性、选择性、交叉反应性、亲和力、免疫原性或其它所需生物学或生物物理学特性的本发明的抗体或其抗原结合片段处于本发明的范围内。抗体的稳定性受许多因素影响，包括影响其内在稳定性的单独域的核心堆叠，对HC和LC配对具有影响的蛋白质/蛋白质界面相互作用，极性和带电残基的包埋，(4)极性和带电残基的H键网络；以及其它分子内力和分子间力中的表面电荷和极性残基分布(Worn等人，J Mol Biol，第305卷，第989-1010页，2001年)。潜在的结构不稳定残基可根据该抗体的晶体结构或在某些情况下通过分子建模来鉴定，并且该残基对于抗体稳定性的影响可通过生成并评价在所鉴定残基中携带突变的变体来测试。增加抗体稳定性的方法中的一种是升高由差示扫描量热法(DSC)测量的热转变中间点(Tm)。一般来讲，蛋白质的Tm与其稳定性相关并且与其对溶液中的解折叠和变性以及依赖于该蛋白质解折叠倾向的降解过程的易感性成反向相关(Remmele等人，Biopharm，第13卷，第36-46页，2000年)。大量的研究已经发现了通过DSC以热稳定性而测量的制剂物理稳定性的级别与通过其它方法测量的物理稳定性之间的相关性(Gupta等人，AAPS PharmSci 5E8,2003年；Zhang等人，J Pharm Sci，第93卷，第3076-3089页，2004年；Maa等人，Int J Pharm，第140卷，第155-168页，1996年；Bedu-Addo等人，Pharm Res，第21卷，第1353-1361页，2004年；Remmele等人，Pharm Res，第15卷，第200-208页，1997年)。制剂研究表明，Fab Tm对对应的mAb的长期物理稳定性有影响。
在一些实施方案中，本发明的抗体是多特异性抗体。
在一些实施方案中，本发明的抗体是双特异性抗体。
本发明的特异性结合CD40的单特异性拮抗性抗体可被工程化为双特异性抗体，该双特异性抗体也涵盖于本发明的范围内。
全长双特异性抗体可例如使用两个单特异性二价抗体之间的Fab臂交换(例如，半分子交换，交换一个重链-轻链对)通过以下方式产生：在每个半分子中的重链CH3交界处引入置换以促成两个在体外无细胞环境中或使用共表达而具有不同特异性的抗体半分子的异源二聚体形成。Fab臂交换反应是二硫键异构化反应和CH3结构域解离-缔合的结果。亲本单特异性抗体的铰链区中的重链二硫键减少。亲本单特异性抗体中的一个的所得游离半胱氨酸与第二亲本单特异性抗体分子的半胱氨酸残基形成重链间二硫键，并且同时亲本抗体的CH3结构域通过解离-缔合而释放和重新形成。可以将Fab臂的CH3结构域工程化为促成异源二聚化而非同源二聚化。所得产物是具有两个Fab臂或半分子的双特异性抗体，这两个Fab臂或半分子各自结合不同的表位。
双特异性抗体也可使用诸如Triomab/Quadroma(Trion Pharma/FreseniusBiotech)、钮扣(Knob-in-Hole)(Genentech)、CrossMAbs(Roche)和静电诱导的CH3相互作用(Chugai,Amgen,NovoNordisk,Oncomed)、LUZ-Y(Genentech)、链交换工程化结构域体(Strand Exchange Engineered Domain body)(SEEDbody)(EMD Serono)、Biclonic(Merus)以及产品(Genmab A/S)的设计产生。
Triomab quadroma技术可用于产生本发明的全长双特异性抗体。Triomab技术促进在两种亲本嵌合抗体(一种具有IgG2a的亲本mAb和具有大鼠IgG2b恒定区的第二亲本mAb)之间的Fab臂交换，从而产生嵌合双特异性抗体。
“钮扣”策略(参见，例如国际公布WO 2006/028936)可用于产生全长双特异性抗体。简而言之，在人IgG中形成CH3结构域的交界的选定氨基酸可在影响CH3结构域相互作用的位置处突变，以促进异源二聚体形成。将具有小侧链(扣)的氨基酸引入特异性地结合第一抗原的抗体的重链中，并将具有大侧链(钮)的氨基酸引入特异性地结合第二抗原的抗体的重链中。在两种抗体共表达后，由于具有“扣”的重链与具有“钮”的重链的优先相互作用而形成异源二聚体。形成钮和扣的示例性CH3置换对(表示为第一重链的第一CH3结构域中的修饰位置/第二重链的第二CH3结构域中的修饰位置)是：T366Y/F405A、T366W/F405W、F405W/Y407A、T394W/Y407T、T394S/Y407A、T366W/T394S、F405W/T394S和T366W/T366S_L368A_Y407V。
CrossMAb技术可用于产生本发明的全长双特异性抗体。除利用“钮扣”策略促进Fab壁交换之外，CrossMAb在半臂中的一个中具有交换的CH1和CL结构域，以确保所得的双特异性抗体正确的轻链配对(参见例如美国专利8,242,247)。
可使用其它交换策略通过以下产生全长双特异性抗体：在一个或两个臂中，在双特异性抗体中在重链与轻链之间或重链之内交换可变结构域或恒定结构域、或这两种结构域。这些交换包括例如VH-CH1与VL-CL、VH与VL、CH3与CL以及CH3与CH1，如在国际专利公布WO2009/080254、WO2009/080251、WO2009/018386和WO2009/080252中有所描述。
还可使用其它策略，诸如通过在一个CH3表面置换带正电荷的残基并在第二个CH3表面置换带负电荷的残基使用静电相互作用促进重链异源二聚化，如美国专利公布US2010/0015133；美国专利公布US2009/0182127；美国专利公布US2010/028637或美国专利公布US2011/0123532中有所描述。在其它策略中，可通过以下置换(表示为第一重链的第一CH3结构域中的修饰位置/第二重链的第二CH3结构域中的修饰位置)促进异源二聚化：L351Y_F405A_Y407V/T394W、T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V、T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V、L351Y_Y407A/T366A_K409F、L351Y_Y407A/T366V_K409F、Y407A/T366A_K409F、或T350V_L351Y_F405A_Y407V/T350V_T366L_K392L_T394W，如美国专利公布US2012/0149876或美国专利公布US2013/0195849中有所描述。
LUZ-Y技术可用于产生双特异性抗体。在该技术中，将亮氨酸拉链添加到CH3结构域的C末端以驱动由亲本mAb装配异源二聚体，该亲本mAb经后纯化移除，如Wranik等人，(2012年)J Biol Chem，第287卷，第52期，第42221-42229页中有所描述。
SEEDbody技术可用于产生双特异性抗体。SEEDbodies在其恒定结构域中具有被IgA残基置换的所选择的IgG残基，以促进异源二聚化，如在美国专利US20070287170中有所描述。
双特异性抗体也可在体外无细胞环境中通过以下方式产生：在两种单特异性同源二聚抗体的CH3区中引入不对称突变，并在还原条件下由两种亲本单特异性同源二聚抗体形成双特异性异源二聚抗体，以根据国际专利公布WO2011/131746中所述的方法允许二硫键异构化。在所述方法中，将第一单特异性二价抗体和第二单特异性二价抗体工程化为在CH3结构域处具有促进异源二聚体稳定性的某些置换；将这些抗体在足以允许铰链区中的半胱氨酸发生二硫键异构化的还原条件下一起温育；从而通过Fab臂交换产生双特异性抗体。可使用的置换为一个重链中的F405L和另一个重链中的K409R。温育条件最理想地可恢复到非还原条件。可使用的示例性还原剂为2-巯基乙胺(2-MEA)、二硫苏糖醇(DTT)、二硫赤藓糖醇(DTE)、谷胱甘肽、三(2-羧乙基)膦(TCEP)、L-半胱氨酸和β-巯基乙醇。例如，可使用以下条件：在至少25mM 2-MEA的存在下或在至少0.5mM二硫苏糖醇的存在下，在5至8的pH下例如在7.0的pH下或在7.4的pH下，在至少20℃的温度下，温育至少90min。
通常使用标准方法以DNA水平到分子(诸如抗体的恒定结构域)上进行置换。
本发明的抗体可被工程化为各种公知的抗体形式。
在一些实施方案中，双特异性抗体包括：重组IgG样双靶向分子，其中该分子的两侧各自含有至少两种不同抗体的Fab片段或Fab片段的部分；IgG融合分子，其中全长IgG抗体与额外的Fab片段或Fab片段的部分融合；Fc融合分子，其中单链Fv分子或稳定的双体抗体与重链恒定结构域、Fc区或其部分融合；Fab融合分子，其中不同的Fab片段融合在一起；基于ScFv和双体的抗体以及重链抗体(例如结构域抗体、纳米抗体)，其中不同的单链Fv分子或不同的双体抗体或不同的重链抗体(例如结构域抗体、纳米抗体)彼此融合或与另一蛋白质或载体分子融合。
多核苷酸、载体、宿主细胞
本发明还提供编码本发明的抗体重链可变区中的任一个、抗体轻链可变区中的任一个、或抗体重链和/或抗体轻链中的任一个的分离的多核苷酸。
本发明还提供编码SEQ ID NO:11、21、22、23、24、25或26的VH的分离的多核苷酸。
本发明还提供编码SEQ ID NO:12或27的VL的分离的多核苷酸。
本发明还提供编码SEQ ID NO:11、21、22、23、24、25或26的VH以及SEQ ID NO:12或27的VL的分离的多核苷酸。
本发明还提供包含SEQ ID NO:13、14、28、29、30、31、32、33或34的多核苷酸序列的分离的多核苷酸。
本发明还提供编码SEQ ID NO:35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45或46的重链的分离的多核苷酸。
本发明还提供编码SEQ ID NO:77或78的轻链的分离的多核苷酸。
本发明还提供编码SEQ ID NO:35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45或46的重链以及SEQ ID NO:77或78的轻链的分离的多核苷酸。
本发明还提供包含SEQ ID NO:35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、77或78的多核苷酸序列的分离的多核苷酸。
编码本发明的抗体的VH或VL或其片段、或本发明的抗体的重链和轻链的多核苷酸序列能够可操作地连接到一个或多个调节元件，诸如启动子或增强子，该调节元件允许核苷酸序列在预期宿主细胞中的表达。多核苷酸可为cDNA。
本发明还提供了包含本发明的多核苷酸的载体。此类载体可以是质粒载体、病毒载体、用于杆状病毒表达的载体、基于转座子的载体或任何其它适于通过任何手段将本发明的合成多核苷酸引入给定生物体或遗传背景中的载体。例如，将可任选地与恒定区连接的编码本发明的抗体的轻链可变区和/或重链可变区的多核苷酸***表达载体中。轻链和/或重链可被克隆在相同或不同的表达载体中。可将编码免疫球蛋白链的DNA片段可操作地连接到确保免疫球蛋白多肽表达的一个或多个表达载体中的对照序列。此类对照序列包括信号序列、启动子(例如，天然相关联的或异源的启动子)、增强子元件和转录终止子序列并对此类对照序列进行选择，以使其与选择用于表达抗体的宿主细胞相容。载体被结合到适当的宿主后，将宿主保持在适于蛋白质的高水平表达的条件下，该蛋白质由结合的多核苷酸编码。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO:13的多核苷酸和SEQ ID NO:14的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO:28的多核苷酸和SEQ ID NO:34的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO:29的多核苷酸和SEQ ID NO:34的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO:30的多核苷酸和SEQ ID NO:34的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO:31的多核苷酸和SEQ ID NO:34的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO:32的多核苷酸和SEQ ID NO:34的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO:33的多核苷酸和SEQ ID NO:34的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO:65的多核苷酸和SEQ ID NO:77的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO:66的多核苷酸和SEQ ID NO:78的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO:67的多核苷酸和SEQ ID NO:78的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO:68的多核苷酸和SEQ ID NO:78的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO:69的多核苷酸和SEQ ID NO:78的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO:70的多核苷酸和SEQ ID NO:78的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO:71的多核苷酸和SEQ ID NO:78的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO:72的多核苷酸和SEQ ID NO:78的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO:73的多核苷酸和SEQ ID NO:78的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO:74的多核苷酸和SEQ ID NO:78的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO:75的多核苷酸和SEQ ID NO:78的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO:76的多核苷酸和SEQ ID NO:78的多核苷酸。
合适的表达载体通常可以在宿主生物体中作为游离基因或作为宿主染色体DNA的整体部分进行复制。通常，表达载体包含选择标记，诸如氨苄青霉素抗性、潮霉素抗性、四环素抗性、卡那霉素抗性或新霉素抗性，以允许对那些转化了所需DNA序列的细胞进行检测。
合适的启动子和增强子元件是本领域已知的。为了在真核细胞中表达，示例性启动子包括轻链和/或重链免疫球蛋白基因启动子和增强子元件；巨细胞病毒立即早期启动子；单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子；早期和晚期SV40启动子；来自逆转录病毒的长末端重复序列中存在的启动子；小鼠金属硫蛋白-I启动子；以及各种本领域已知的组织特异性启动子。选择适当的载体和启动子在本领域普通技术人员的水平范围内。
许多合适的载体和启动子是本领域技术人员已知的；很多可商购获得以用于产生本主题的重组构建体。以下载体以举例的方式提供。细菌：pBs、phagescript、PsiX174、pBluescript SK、pBs KS、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46a(Stratagene,La Jolla,Calif.,USA)；pTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR540和pRIT5(Pharmacia,Uppsala,Sweden)。真核：pWLneo、pSV2cat、pOG44、PXR1、pSG(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL(Pharmacia)。
本发明还提供一种宿主细胞，该宿主细胞包含本发明的一个或多个载体。“宿主细胞”是指已引入载体的细胞。应该理解，术语宿主细胞不仅旨在指特定的受治疗者细胞，还指此类细胞的子代，并且也指特定主体细胞所产生的稳定细胞系。因为由于突变或者环境影响，在后代中可发生某些修饰，因此此类子代可与母体细胞不同，但仍包括在本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。此类宿主细胞可以是真核细胞、原核细胞、植物细胞或古菌细胞。
原核宿主细胞的示例是大肠杆菌(Escherichia coli)、杆菌属(bacilli)诸如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和其它肠杆菌科(enterobacteriaceae)诸如沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)以及各种假单胞菌属(Pseudomonas)物种。其他微生物诸如酵母也可用于表达。酵母属(Saccharomyces)(例如，酿酒酵母(S.cerevisiae))和毕赤酵母属(Pichia)是合适的酵母宿主细胞的示例。示例性真核细胞可以是哺乳动物、昆虫、禽类或其它动物来源。哺乳动物真核细胞包括无限增殖化细胞系，诸如杂交瘤或骨髓瘤细胞系，诸如SP2/0(美国典型培养物保藏中心(ATCC),Manassas,VA,CRL-1581)、NS0(欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC),Salisbury,Wiltshire,UK,ECACC No.85110503)、FO(ATCCCRL-1646)和Ag653(ATCC CRL-1580)鼠细胞系。一种示例性人骨髓瘤细胞系是U266(ATTCCRL-TIB-196)。其它可用的细胞系包括衍生自中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的那些，诸如CHO-K1SV(Lonza Biologics,Walkersville,MD)、CHO-K1(ATCC CRL-61)或DG44。
本发明还提供一种制备本发明的抗体的方法，该方法包括在抗体被表达的条件下培养本发明的宿主细胞，并且回收由宿主细胞产生的抗体。制备抗体并将其纯化的方法是已知的。一旦被合成(以化学方式或重组方式)后，全部抗体、其二聚体、单个轻链和/或重链、或者其它抗体片段诸如VH和/或VL，可以根据标准程序进行纯化，包括硫酸铵沉淀、亲和色谱柱、柱层析法、高效液相色谱(HPLC)纯化、凝胶电泳等等(参见generally Scopes,Protein Purification(Springer-Verlag,N.Y.,(1982年))。受治疗者抗体可为基本上纯净的，例如，至少约80％至85％纯净、至少约85％至90％纯净、至少约90％至95％纯净、或者至少约98％至99％纯净，或者更加纯净，例如，不含污染物，诸如细胞碎片、除受治疗者抗体之外的大分子等。
本发明还提供用于制备特异性结合SEQ ID NO:1的CD40的拮抗性抗体的方法，所述方法包括：
将编码抗体的VH的第一多核苷酸和编码抗体的VL的第二多核苷酸引入表达载体中；
用表达载体转化宿主细胞；
在VL和VH被表达并形成抗体的条件下，将宿主细胞在培养基中进行培养；以及
从宿主细胞或培养基中回收抗体。
可使用标准分子生物方法将编码本发明的特定VH或VL序列的多核苷酸结合到载体中。使用熟知的方法完成宿主细胞转化、培养、抗体表达和纯化。
治疗方法
本发明的特异性结合CD40的拮抗性抗体，例如抗体C40B16、C40B124、C40B135、C40B125、C40B136、C40B127、C40B138、C40B131、C40B176、C40B180、C40B179或C40B183可用于治疗和/或预防任何病症或疾病，其中拮抗CD40的效应可在治疗学上有效并且可减轻疾病的症状。其示例包括治疗炎性疾病诸如自身免疫性疾病，其中体液免疫的耐受和/或抑制的诱导是治疗学上期望的。可用本发明的抗体治疗的疾病为自身免疫性疾病、阿狄森氏病、强直性脊柱炎、动脉粥样硬化、自身免疫性肝炎、自身免疫性糖尿病、格雷夫斯病、格-巴二氏综合征、桥本氏病、特发性血小板减少症、炎性肠病(IBD)、***性红斑狼疮、多发性硬化症、重症肌无力、牛皮癣、关节炎、硬皮病、干燥综合症、***性硬化病、移植、肾移植、皮肤移植、骨髓移植、移植物抗宿主病(GVHD)、I型糖尿病、类风湿性关节炎、幼年型关节炎、银屑病性关节炎、赖特综合征、强直性脊柱炎、或痛风性关节炎、克罗恩氏病或溃疡性结肠炎。
本发明还提供一种治疗关节炎的方法，该方法包括以足以治疗关节炎的时间向对其有需要的受治疗者施用治疗有效量的本发明的抗体。
在一些实施方案中，关节炎为幼年型关节炎、类风湿性关节炎、银屑病性关节炎、赖特综合征、强直性脊柱炎、或痛风性关节炎。
本发明还提供一种治疗狼疮的方法，该方法包括以足以治疗狼疮的时间向对其有需要的受治疗者施用治疗有效量的本发明的抗体。
在一些实施方案中，狼疮是***性红斑狼疮(SLE)或亚急性皮肤型红斑狼疮(CLE)。
在一些实施方案中，受治疗者患有狼疮性肾炎。
在一些实施方案中，受治疗者患有亚急性皮肤型红斑狼疮。
本发明还提供一种治疗炎性肠病的方法，该方法包括以足以治疗炎性肠病的时间向对其有需要的受治疗者施用治疗有效量的本发明的抗体。
在一些实施方案中，炎性肠病是克罗恩氏病。
在一些实施方案中，炎性肠病是溃疡性结肠炎。
“治疗”(“treatment”或“treat”)是指治疗性处理。需要治疗的受治疗者包括诊断患有疾病或经历疾病症状的至少一种的那些受治疗者。可被治疗的受治疗者还包括易患或感染疾病的那些，或需预防疾病的那些。有益或期望的临床结果包括症状的减轻、疾病程度的减弱、疾病的稳定(即，未恶化)状态、疾病进展的延迟或减慢、疾病状态的改善或缓和，以及缓解(不论是部分缓解还是完全缓解)，不论是可检测的还是不可检测的。有益的治疗结果包括在接受治疗的受治疗者中，炎性细胞因子、粘附分子、蛋白酶、免疫球蛋白、它们的组合的水平降低，抗炎蛋白质的产生增加，自身反应性细胞的数目减少，免疫耐受性增大，自身反应性细胞存活的抑制，和/或由CD154对表达CD40的细胞刺激而介导的一种或多种症状的减轻。
临床反应可使用诸如以下的筛选技术进行评估：磁共振成像(MRI)扫描、x射线照相成像、计算机断层摄影(CT)扫描、流式细胞术或荧光活化细胞分选器(FACS)分析、组织学、宏观病理学和血液化学，包括但不限于可由ELISA、RIA、色谱法等检测到的变化。
本发明的方法可用于治疗属于任何动物分类的受治疗者。可被治疗的受治疗者的示例包括哺乳动物，诸如人、啮齿动物、犬类、猫类和农畜。
本发明的抗体可用于制备用于此类治疗的药物，其中制备该药物以按照本文定义的剂量施用。
本发明的抗体可与第二治疗剂联合施用。
第二治疗剂可为任何已知用于炎性疾病，诸如自身免疫性疾病的疗法，包括已知有用、或者已使用或目前用于治疗的任何药剂或药剂的组合。此类疗法和治疗剂包括外科手术或外科规程(例如脾切除术，***切除术，甲状腺切除术，血浆置换术，白细胞去除术(leukophoresis)，细胞、组织、或器官移植、肠道手术、器官灌注等)、疗法诸如类固醇疗法和非甾体疗法、激素疗法、细胞因子疗法、用皮肤病药剂(例如，用于治疗皮肤病症诸如过敏，接触性皮炎和牛皮癣的局部药剂)的疗法、免疫抑制疗法和其它抗炎药物(包括单克隆抗体)。
第二治疗剂可为皮质类固醇、免疫抑制剂、细胞毒性药物、或B细胞调节剂。
在一些实施方案中，将本发明的抗体与第二治疗剂联合施用。示例性的第二治疗剂为皮质类固醇、非甾体抗炎药(NSAID)、水杨酸盐、羟化氯喹、柳氮磺吡啶、细胞毒性药物、免疫抑制药物免疫调节抗体、甲氨蝶呤、环磷酰胺、咪唑立宾、苯丁酸氮芥、环孢霉素、他克莫司(FK506；ProGrafrM)、麦考酚酸莫酯、和硫唑嘌呤(6-巯嘌呤)、西罗莫司(雷帕霉素)、脱氧精胍菌素、来氟米特以及其丙二腈酰胺(malononitriloamide)类似物；抗-CTLA4抗体与Ig融合体、抗-B淋巴细胞刺激抗体(例如LYMPHOSTAT-BTM)与CTLA4-Ig融合体、抗-CD80抗体、抗-T细胞抗体(诸如抗-CD3(OKT3)、抗-CD4)、皮质类固醇(诸如例如氯倍他索、乌倍他索、氢化可的松、曲安西龙、倍他米松、fluocinole、氟轻松醋酸酯、***、***龙、甲泼尼龙)；非甾体抗炎药(NSAID)，诸如例如柳氮磺吡啶、含氨水杨酸药物(称为5-ASA药剂)、塞来考昔、双氯芬酸、依托度酸、非诺洛芬(fenprofen)、氟比洛芬、布洛芬、酮洛芬、meclofamate、美洛昔康、萘丁美酮、萘普生、噁丙嗪、吡罗昔康、罗非考昔、水杨酸盐、苏灵大和痛灭定；磷酸二酯酶-4抑制剂、抗-TNFα抗体(英夫利昔)、(戈利木单抗)和(阿达木单抗)、萨力多胺或其类似物，诸如来那度胺。
本发明的抗体可与第二治疗剂联合同时、按顺序或单独施用。
如由美国风湿学会(American College of Rheumatology)标准、欧洲风湿病同盟(European League of Rheumatism)标准、或任何其它标准定义的临床反应所测，可使用效果来评估治疗效果或RA。参见例如Felson等人，(1995年)Arthritis Rheum.，第38卷，第727-735页和van Gestel等人，(1996年)Arthritis Rheum.，第39卷，第34-40页。
施用/药物组合物
本发明还提供本发明的特异性结合CD40的拮抗性抗体和药学上可接受的载体的药物组合物。对于治疗使用，可将本发明的抗体制备为药物组合物，该药物组合物含有有效量的抗体作为药学上可接受的载体中的活性成分。“载体”是指用以施用活性化合物的稀释剂、辅助剂、赋形剂或媒介物。此类媒介物可以是液体，诸如水和油，包括来源于石油、动物、植物的油或合成的那些油，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。例如，可使用0.4％盐水和0.3％甘氨酸。这些溶液是无菌的，并且通常不含颗粒物。它们可通过熟知的常规灭菌技术(例如过滤)进行灭菌。该组合物可根据需要含有药学上可接受的辅助物质，以接近生理条件，该辅助物质诸如pH调节剂和缓冲剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂和着色剂等。此类药物组合物中本发明的抗体的浓度可在很大范围内变化，即，从小于约0.5重量％，通常到至少约1重量％至多达5重量％、10重量％、15重量％、20重量％、25重量％、30重量％、35重量％、40重量％、45重量％或50重量％，并且将根据所选择的具体施用方式，主要基于所需的剂量、流体体积、粘度等进行选择。包含其它人蛋白质(例如，人血清白蛋白)的合适的媒介物和制剂在例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy，第21版，Troy,D.B.编辑，Lipincott Williams and Wilkins,Philadelphia,PA 2006年，第5部分，PharmaceuticalManufacturing，第691-1092页(特别参见第958-989页)中有所描述。
本发明的方法中的本发明的抗体的施用方式可为任何合适的途径，诸如非肠道施用，例如真皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内或皮下、粘膜(口腔、鼻内、***内和直肠)或如本领域所熟知的技术人员了解的其它方式。
本发明的抗体可通过任何合适的途径施用给受治疗者，例如通过静脉内(i.v.)输注或弹丸式注射以非肠道方式、以肌肉内方式或皮下方式或腹膜内方式。可在例如15、30、60、90、120、180或240分钟内，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12小时内给予静脉内输注。
向受治疗者给予的剂量足以减轻或至少部分地遏止正在治疗的疾病(“治疗有效量”)，并且可为约0.005mg/kg至约100mg/kg，例如约0.05mg/kg至约20mg/kg，约0.1mg/kg至约20mg/kg，约1mg至约20mg/kg，约4mg/kg，约8mg/kg，约16mg/kg或约24mg/kg，或例如约1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg或10mg/kg，但可甚至更高，例如约15mg/kg、16mg/kg、17mg/kg、18mg/kg、19mg/kg、20mg/kg、21mg/kg、22mg/kg、23mg/kg、24mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、40mg/kg、50mg/kg、60mg/kg、70mg/kg、80mg/kg、90mg/kg或100mg/kg。
也可以给予固定的单位剂量，例如50mg、100mg、200mg、500mg或1000mg，或者剂量可基于患者的表面积，例如500mg/m2、400mg/m2、300mg/m2、250mg/m2、200mg/m2或100mg/m2。通常可施用介于1和8次之间(例如，1、2、3、4、5、6、7或8次)的剂量来治疗炎性疾病，诸如自身免疫性疾病或类风湿性关节炎，但可给予9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多次的剂量。
可在一天、两天、三天、四天、五天、六天、一周、两周、三周、一个月、五周、六周、七周、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月或更长时间之后重复施用本发明的抗体。也可以重复治疗过程，按照慢性施用一样。重复施用可为相同剂量或不同剂量。例如，本发明的抗体可通过静脉内输注以0.1mg/kg、以1mg/kg、以5mg/kg、以8mg/kg或以16mg/kg按一周的时间间隔施用8周，之后以8mg/kg或以16mg/kg按每两周一次的方式施用附加的16周，之后以8mg/kg或以16mg/kg按每四周一次的方式施用。
本发明的抗体可由维持疗法提供，诸如例如每周一次、每月一次、每两月一次、每三月一次、每四月一次、每五月一次、或每六月一次提供一年或多年。
例如，本发明的抗体可在治疗开始后第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40天中的至少一天，或者另选地，在第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20周中的至少一周，或它们的任何组合，使用单次剂量或者每24、12、8、6、4或2小时一次的分次剂量或它们的任何组合，以约0.1mg/kg至100mg/kg的量作为日剂量提供，诸如每天0.5mg/kg、0.9mg/kg、1.0mg/kg、1.1mg/kg、1.5mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg、10mg/kg、11mg/kg、12mg/kg、13mg/kg、14mg/kg、15mg/kg、16mg/kg、17mg/kg、18mg/kg、19mg/kg、20mg/kg、21mg/kg、22mg/kg、23mg/kg、24mg/kg、25mg/kg、26mg/kg、27mg/kg、28mg/kg、29mg/kg、30mg/kg、40mg/kg、45mg/kg、50mg/kg、60mg/kg、70mg/kg、80mg/kg、90mg/kg或100mg/kg。
本发明的抗体也可预防性地施用，以便降低发展为疾病的风险和/或延迟待治疗疾病的发作。
可将用于肌肉内注射的示例性本发明的药物组合物制备成含有1mL无菌缓冲水，以及约1ng/kg至约100mg/kg，例如约50ng/kg至约30mg/kg或约5mg/kg至约25mg/kg的本发明的抗体。
可将用于静脉内输注的示例性本发明的药物组合物制成含有约200mL无菌林格氏溶液以及约8mg至约2400mg、约400mg至约1600mg、或约400mg至800mg的本发明的抗体，以用于施用给80kg的患者。用于制备可非肠道施用的组合物的方法是熟知的并且在例如“Remington's Pharmaceutical Science”，第15版，Mack Publishing Company，Easton，PA中更详细地描述。
有效治疗疾病的本发明的抗体的“治疗有效量”可通过标准研究技术来确定。例如，可采用体外测定来帮助确定最佳剂量范围。任选地，可有效治疗疾病(诸如炎性疾病)的本发明的抗体的剂量可通过对本领域熟知的相关动物模型施用抗体来确定。对具体的有效剂量的选择可由本领域的技术人员根据对多种因素的考量(例如，经由临床试验)来确定。此类因素包括待治疗或预防的疾病、所涉及的症状、患者的体重、患者的免疫状态以及技术人员已知的其他因素。精确剂量也将取决于施用途径以及疾病的严重程度，并且应该根据医生的判断和每个患者的情况来决定。有效剂量可通过来源于体外或动物模型测试体系的剂量响应曲线来推导。可以使用本文所述模型中的任一个来测试本发明的抗体的功效和有效剂量。
可将本发明的抗体冻干以用于储存，并在使用前在合适的载体中复原。此项技术已被证实对常规的蛋白制剂有效，并且可采用熟知的冻干和复原技术。
抗独特型抗体
本发明提供结合到本发明的抗体的抗独特型抗体。
本发明还提供特异性结合包含SEQ ID NO:11的VH和SEQ ID NO:12的VL的抗体的抗独特型抗体。
本发明还提供特异性结合包含SEQ ID NO:21的VH和SEQ ID NO:27的VL的抗体的抗独特型抗体。
本发明还提供特异性结合包含SEQ ID NO:22的VH和SEQ ID NO:27的VL的抗体的抗独特型抗体。
本发明还提供特异性结合包含SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:27的VL的抗体的抗独特型抗体。
本发明还提供特异性结合包含SEQ ID NO:24的VH和SEQ ID NO:27的VL的抗体的抗独特型抗体。
本发明还提供特异性结合包含SEQ ID NO:25的VH和SEQ ID NO:27的VL的抗体的抗独特型抗体。
本发明还提供特异性结合包含SEQ ID NO:26的VH和SEQ ID NO:27的VL的抗体的抗独特型抗体。
抗独特型(Id)抗体是识别抗体的抗原决定簇(例如互补位或CDR)的抗体。Id抗体可为抗原封闭性或非封闭性的。抗原封闭性Id可用于检测样品中的游离抗体(例如本文所述的本发明的CD40抗体)。非封闭性Id可用于检测样品中的总抗体(游离，部分结合到抗原，或完全结合到抗原的抗体)。Id抗体可通过用抗体对正在制备抗Id的动物免疫来制备。
抗Id抗体还可用作免疫原以在另一动物中诱导免疫应答，从而产生所谓的抗-抗Id抗体。抗-抗Id抗体可与诱导抗Id的初始mAb在表位上相同。因此，通过使用针对mAb的独特型决定簇的抗体，可以识别出表达相同特异性抗体的其它克隆。抗Id抗体可以改变(从而产生抗Id抗体变体)并且/或者通过任何合适的技术衍生化。
免疫缀合物
“免疫缀合物”是指缀合至一个或多个异源分子的本发明的抗体。
在一些实施方案中，本发明的抗体缀合至一种或多种细胞毒素剂或成像剂。
示例性细胞毒素剂包括化疗剂或化疗药、生长抑制剂、毒素(例如蛋白毒素，细菌、真菌、植物、或动物来源的酶促活性毒素或其片段)、和放射性核素。
细胞毒素剂可为一种或多种药物，诸如mayatansinoid(参见例如美国专利5,208,020、5,416,06)，奥瑞斯他汀诸如一甲基澳瑞他汀药物部分DE和DF(MMAE和MMAF)(参见例如美国专利5,635,483和5,780,588、以及7,498,298)、多拉司它汀、卡里奇霉素或它们的衍生物(参见例如美国专利5,712,374、5,714,586、5,739,116、5,767,285、5,770,701、5,770,710、5,773,001和5,877,296；Hinman等人，(1993年)Cancer Res，第53卷，第3336-3342页；和Lode等人，(1998年)Cancer Res，第58卷，第2925-2928页)；蒽环类抗生素诸如道诺霉素或多柔比星(参见例如Kratz等人，(2006年)Current Med.Chem，第13卷，第477-523页；Jeffrey等人，(2006年)Bioorganic&Med Chem Letters，第16卷，第358-362页；Torgov et等人，(2005年)Bioconj Chem，第16卷，第717-721页；Nagy等人，(2000年)Proc Natl AcadSci USA，第97卷，第829-834页；Dubowchik等人，Bioorg.&Med.Chem.Letters，第12卷，第1529-1532页(2002年)；King等人，(2002年)J Med Chem，第45卷，第4336-4343页；和美国专利6,630,579)、甲氨蝶呤、长春地辛、紫杉烷诸如多西他赛、紫杉醇、拉洛他赛、tesetaxel和奥他赛。
细胞毒素剂也可为酶促活性毒素或其片段，诸如白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒素A链、蒴莲根毒素A链、α-八叠球菌素、油桐(Aleurites fordii)蛋白质、香石竹毒蛋白、美洲商陆(Phytolacca americana)蛋白质(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻疯树毒素、巴豆毒素、肥阜草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒素、迈托毒素、局限曲霉素、酚霉素、伊诺霉素和单端孢霉烯族化合物。
细胞毒素剂或成像剂也可为放射性核素。示例性放射性核素包括Ac-225、At-211、1-131、I-125、Y-90、Re-186、Re-188、Sm-153、Bi-212、P-32、Pb-212和Lu的放射性同位素。当使用放射性缀合物进行检测时，其可包含用于闪烁扫描研究的放射性原子，例如Tc-99m或I-123，或用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，mri)的自旋标记物，诸如I-123、I-131、In-111、F-19、C-13、N-15或O-17。
本发明的抗体和异源分子的缀合可使用多种双功能蛋白偶联剂进行，该双功能蛋白偶联剂为诸如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-l-羧酸酯(SMCC)、亚氨基噻吩(IT)、亚氨酸酯的双功能衍生物(诸如，二甲基己二酰亚胺盐HQ)、活性酯(诸如，双琥珀酰亚胺辛二酸酯)、醛(诸如，戊二醛)、双-叠氮化合物(诸如，双(对叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如，双(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(诸如，甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(诸如，l,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒蛋白免疫毒素可如Vitetta等人，(1987年)Science，第238卷，第1098页中所述制备。碳14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二乙烯三氨五乙酸(MX-DTPA)是使放射性核苷酸与抗体缀合的示例性螯合剂。参见，例如，W094/11026。接头可为“可裂解接头”，从而促进细胞毒性药物在细胞中释放。例如，可使用酸不稳定性接头、肽酶敏感性接头、光不稳定性接头、二甲基接头或含二硫化物接头(Chari等人，(1992年)Cancer Res，第52卷，第127-131页；美国专利5,208,020)。
本发明的抗体与异源分子的缀合物可用可商购获得(例如来自PierceBiotechnology,Inc.,Rockford,IL.,U.S.A)的交联剂诸如BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、硫代-EMCS、硫代-GMBS、硫代-KMUS、硫代-MBS、硫代-SIAB、硫代-SMCC、和硫代-SMPB、以及SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)进行制备。
本发明还提供一种免疫缀合物，该免疫缀合物包含与细胞毒素剂或成像剂连接的本发明的特异性结合SEQ ID NO:1的CD40的抗体。
诊断用途和试剂盒
试剂盒
本发明还提供包括本发明的特异性结合人CD40的拮抗性抗体的试剂盒。
试剂盒可用于治疗用途并用作诊断试剂盒。
试剂盒可用于检测生物样品中CD40的存在。
在一些实施方案中，试剂盒包括本发明的特异性结合人CD40的拮抗性抗体和用于检测抗体的试剂。试剂盒可包括一个或多个其它元件，该元件包括：使用说明；其它试剂，例如标记物、治疗剂、或者用于使抗体与标记物或治疗剂螯合或以其它方式偶联的药剂、或辐射防护组合物；用于准备施用抗体的装置或其它材料；药学上可接受的载体；以及向受治疗者施用的装置或其它材料。
在一些实施方案中，试剂盒包括在容器中的本发明的抗体和试剂盒的使用说明。
在一些实施方案中，试剂盒中的抗体被标记。
在一些实施方案中，试剂盒包括抗体C40B16、C40B124、C40B135、C40B125、C40B136、C40B127、C40B138、C40B131、C40B176、C40B180、C40B179或C40B183。
检测CD40的方法
本发明还提供了一种检测样品中CD40的方法，该方法包括：获得样品，使样品与本发明的抗体接触，以及检测结合到样品中的CD40的抗体。
在一些实施方案中，样品可来源于尿液、血液、血清、血浆、唾液、腹水、循环细胞、循环肿瘤细胞、非组织缔合的细胞(即游离细胞)、组织(例如手术切除的肿瘤组织、活体组织切片，包括细针抽吸组织)、组织学制备物等。
可使用已知的方法检测本发明的抗体。示例性方法包括使用荧光或化学发光标记物、或放射标记物直接标记抗体，或者使可易于检测的部分(诸如生物素、酶或表位标签)附接到本发明的抗体。示例性的标记物和部分为钌、111In-DOTA、111In-二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和β-半乳糖苷酶、聚-组氨酸(HIS标签)、吖啶染料、花青染料、荧光酮染料、噁嗪染料、菲啶染料、罗丹明染料和染料。
本发明的抗体可用于多种测定以检测样品中的CD40。示例性的测定为蛋白质印迹分析、放射性免疫测定、表面等离振子共振、免疫沉淀、平衡透析、免疫扩散、电化学发光(ECL)免疫测定、以及免疫组织化学、荧光活化细胞分选(FACS)或ELISA测定。
本发明现结合以下具体的、非限制性实施例进行描述。
一般材料和方法
用于研究的抗原的产生
使用标准方法进行抗原的克隆、表达和纯化。所用蛋白质的氨基酸序列如下所示。
全长人CD40(huCD40)；SEQ ID NO:1
MVRLPLQCVLWGCLLTAVHPEPPTACREKQYLINSQCCSLCQPGQKLVSDCTEFTETECLPCGESEFLDTWNRETHCHQHKYCDPNLGLRVQQKGTSETDTICTCEEGWHCTSEACESCVLHRSCSPGFGVKQIATGVSDTICEPCPVGFFSNVSSAFEKCHPWTSCETKDLVVQQAGTNKTDVVCGPQDRLRALVVIPIIFGILFAILLVLVFIKKVAKKPTNKAPHPKQEPQEINFPDDLPGSNTAAPVQETLHGCQPVTQEDGKESRISVQERQ
人CD40胞外结构域(huCD40-ECD)；SEQ ID NO:2
EPPTACREKQYLINSQCCSLCQPGQKLVSDCTEFTETECLPCGESEFLDTWNRETHCHQHKYCDPNLGLRVQQKGTSETDTICTCEEGWHCTSEACESCVLHRSCSPGFGVKQIATGVSDTICEPCPVGFFSNVSSAFEKCHPWTSCETKDLVVQQAGTNKTDVVCGPQDRLR
食蟹猕猴(cynomolgous，本文称为cyno)CD40(cCD40)；SEQ ID NO:3
MVRLPLQCVLWGCLLTAVYPEPPTACREKQYLINSQCCSLCQPGQKLVSDCTEFTETECLPCSESEFLDTWNRETRCHQHKYCDPNLGLRVQQKGTSETDTICTCEEGLHCMSESCESCVPHRSCLPGFGVKQIATGVSDTICEPCPVGFFSNVSSAFEKCRPWTSCETKDLVVQQAGTNKTDVVCGPQDRQRALVVIPICLGILFVILLLVLVFIKKVAKKPNDKAPHPKQEPQEINFLDDLPGSNPAAPVQETLHGCQPVTQEDGKESRISVQERQ
Cyno CD40胞外结构域(cCD40-ECD)；SEQ ID NO:4
EPPTACREKQYLINSQCCSLCQPGQKLVSDCTEFTETECL
PCSESEFLDTWNRETRCHQHKYCDPNLGLRVQQKGTSETDTICTCEEGLHCMSESCESCVPHRSCLPGFGVKQIATGVSDTICEPCPVGFFSNVSSAFEKCRPWTSCETKDLVVQQAGTNKTDVVCGPQDRQR
可溶性人CD154；SEQ ID NO: 60
MQKGDQNPQIAAHVISEASSKTTSVLQWAEKGYYTMSNNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIYAQVTFCSNREASSQAPFIASLCLKSPGRFERILLRAANTHSSAKPCGQQSIHLGGVFELQPGASVFVNVTDPSQVSHGTGFTSFGLLKL
全长人CD154；SEQ ID NO:64
MIETYNQTSPRSAATGLPISMKIFMYLLTVFLITQMIGSALFAVYLHRRLDKIEDERNLHEDFVFMKTIQRCNTGERSLSLLNCEEIKSQFEGFVKDIMLNKEETKKENSFEMQKGDQNPQIAAHVISEASSKTTSVLQWAEKGYYTMSNNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIYAQVTFCSNREASSQAPFIASLCLKSPGRFERILLRAANTHSSAKPCGQQSIHLGGVFELQPGASVFVNVTDPSQVSHGTGFTSFGLL
原代人和cyno树突状细胞(DC)中的结合测定
人单核细胞使用阴性CD14分离试剂盒根据制造商的方案(MACS Miltenyi)从冷冻/新鲜的PBMC中分离。Cyno单核细胞使用阳性CD14分离试剂盒根据制造商的方案(MACSMiltenyi)从新鲜的PBMC中分离。为了产生DC，可在100ng/ml人GM-CSF和人IL-4(Peprotech)存在下将单核细胞在完全RPMI培养基(Invitrogen)中培养5天并且每2天补充培养基。在第5天，用100ng/ml LPS(Sigma)对DC刺激24小时。然后，在100μl体积的流式细胞术缓冲液(PBS+1％FBS；BD Bioscience)中，将细胞在冰上用不同的浓度的测试CD40抗体中的每个染色30分钟，然后用流动缓冲液洗涤两次。然后，将细胞在冰上用APC-缀合的抗人IgG(Jackson ImmunoResearch)以推荐的稀释度(1:100)染色附加的30分钟，并用流动缓冲液洗涤两次。使用Fortessa(BD Bioscience)针对阳性百分比和平均荧光强度(MFI)对细胞进行分析，以测定抗体的结合。
Raji(B细胞淋巴瘤细胞系)和HEK-BlueTM CD40L NF-κB细胞系中的结合测定
Raji细胞获自ATCC，并且HEK-BlueTMCD40L NF-κB细胞系获自Invivogen。根据公司的推荐将细胞在完全RPMI培养基中进行培养。对于原代人和cyno DC中的结合测定，如上所述进行染色。
人DC IL-12p40产生测定
通过将经纯化人单核细胞(2.5×106个/孔，6孔板)在含有glutamax、25mM HEPES、10％FBS、1％青霉素/链霉素和各50ng的GM-CSF和IL-4的3ml RPMI培养基中培养6天来产生人DC。在第3天，移除1ml的培养基并用2ml的各含50ng/ml的GM-CSF和IL-4的新鲜培养基替换。对于激动剂测定，在第6天将DC铺板到96孔板(100,000个细胞/孔)中，之后进行CD40抗体中的每种的滴定。对于拮抗剂测定，在第6天将DC铺板到96孔板(100,000个细胞/孔)中，之后进行CD40抗体中的每种的滴定，并且将1μg/ml的可溶性人CD154(R&D***)添加到培养物中。对于这两种测定，在收集并通过MSD(根据制造商的说明书)分析上清液IL-12p40之前，将细胞培养48小时。对于Jurkat D1.1(ATCC)拮抗剂测定，在第6天将DC铺板到96孔板(10,000个细胞/孔)中，之后进行CD40抗体中的每种的滴定，接着将经照射的Jurkat D1.1细胞(1,000拉德；100,000/孔)添加到培养物中。在收集并通过MSD分析上清液IL-12p40之前，将细胞培养24小时。
人B细胞增殖测定
将人扁桃体B细胞铺板到96孔板(100,000个细胞/孔)的含有glutamax、10％FBS和1％青霉素/链霉素的RPMI培养基中。对于激动剂测定，将CD40抗体中的每种的滴定添加到细胞中并培养48小时。对于拮抗剂测定，将CD40抗体中的每种的滴定添加到细胞中，之后添加0.5μg/ml可溶性人CD154(R&D***)。将细胞在37C下培养48小时。对于Jurkat D1.1拮抗剂测定，连同IL-21(最终100ng/ml，Thermo Fisher Scientific)一起，将CD40抗体中的每种滴定添加到细胞中，然后将经照射的Jurkat D1.1.细胞(5,000拉德；100,000/孔)添加到培养物中并在37C下温育48小时。对于所有测定，在48小时后，在收获并计数之前，将细胞用含3H-胸腺嘧啶核苷(1uCi/孔)的50μl培养基脉冲并培养16小时至18小时。
Cyno B细胞增殖测定
将Cyno脾细胞铺板到96孔板(100,000个细胞/孔)的含有glutamax、10％FBS和1％青霉素/链霉素的RPMI培养基中。将CD40抗体中的每种的滴定添加到细胞中，之后添加0.5μg/ml可溶性人CD154(R&D***)。将细胞在37C下培养48小时。在48小时后，在收获并计数之前，将细胞用含3H-胸腺嘧啶核苷(1uCi/孔)的50μl培养基脉冲并培养16小时至18小时。
HEK-BlueTMCD40L NF-κB活化测定
HEK-BlueTMCD40L细胞系稳定表达人CD40和NF-κB-诱导分泌型胚碱性磷酸酶(SEAP)。HEK-BlueTMCD40L细胞上CD40的活化诱导了下游信号转导事件，从而导致NF-κB活化并分泌SEAP，这可通过QUANTI-BlueTM底物转化率测量。使用这些细胞评估抗体阻断(拮抗)CD40-CD154相互作用或活化(激动)CD40的能力。
HEK-Blue CD40L细胞系中的CD40依赖性NF-kB活化的抑制
使根据供应商的方案维持的HEK-BlueTMCD40L细胞(Invivogen)接种到100μl体积的96孔组织培养板(2.5×104个细胞/孔)中。将测定板覆盖好并培养过夜(37℃，5％CO2)以允许细胞恢复。第二天，使4X rhCD154-ECD-His溶液(80ng/ml最终浓度)与4X CD40抗体、或Fab溶液(1μg/ml至25μg/ml最终浓度)预混合，并且将所得的2X溶液添加到含有细胞的96孔测定板(200μl/孔最终体积)中。在16h至24h温育(37℃，5％CO2)后，在获得650nm处的吸光度读数之前，使40μl等分试样的上清液与160μl的预温热QUANTI-BlueTM(Invivogen)溶液混合并温育30分钟至60分钟。
HEK-Blue CD40L NFkB-SEAP细胞系中的CD40依赖性NF-kB活化
将HEK-BlueTMCD40L细胞如上所述进行接种并恢复过夜。第二天，将2X CD40抗体溶液(1μg/ml至25μg/ml最终浓度)以100μl/孔添加到板中并温育过夜(37℃，5％CO2)。在16h至24h温育(37℃，5％CO2)后，如上所述对40μl等分试样的上清液进行分析。
实施例1：使用表达人免疫球蛋白基因座的大鼠分离特异性结合人CD40的抗体
使用表达人免疫球蛋白基因座的转基因大鼠(OMT,Inc)产生抗体。将内源性免疫球蛋白基因座通过人Igκ和Igλ基因座以及嵌合人/大鼠IgH基因座替代，该嵌合人/大鼠IgH基因座具有连接到大鼠CH基因座的人源V、D和J片段。IgH基因座含有连接到大鼠CH基因座的天然构型的22个人VHs，所有人D和JH片段。的产生和表征描述于Osborn等人J Immunol，第190卷，第1481-1490页，2013年；和国际专利公布WO 14/093908中。
将五只大鼠的单独群体用重组人和cyno CD40 ECD-His或者人和cyno CD40ECD-Fc蛋白质进行免疫。在31天至34天免疫方案之后，从两只大鼠收获得到***并用于产生杂交瘤。对所产生的结合到人和cyno CD40-ECD两者的杂交瘤进行筛选。根据单因素ANOVA用Dunnett的平均比较事后测试，对表现出统计意义上显著结合到人和cyno CD40-ECD两者的杂交瘤进行克隆，并使用标准程序对其V区进行测序。
实施例2：C40B16的工程化
C40B16使用产生，并且基于以下标准在HEK-BlueTMCD40L NF-κB活化测定中鉴定具有拮抗活性：拮抗剂所具有的信号低于经单独的rhCD154-ECD-his处理的HEK-BlueTMCD40L细胞的平均信号的3x标准偏差。
使用标准方法对C40B16 VH和VL进行测序，并将框架序列与最近种系基因序列进行比较以鉴定潜在的免疫原性风险。C40B16VH氨基酸序列与IGHV3-23(SEQ ID NO:49)同源性最高，在框架中具有2个氨基酸变化。C40B16VL的框架与IGLV3-1(SEQ ID NO:50)相同。
通过在VH中的位置R43、H82、N52、S54和/或M108(残基根据SEQ ID NO:11进行编码)处以及VL中的位置C33(残基根据SEQ ID NO:12进行编码)处产生突变，对C40B16的可变区进行工程化以降低可能的免疫原性和/或一个或多个可发展性风险，以消除由未配对半胱氨酸造成的潜在异质性。将所产生的VH/VL结构域克隆为效应子沉默Fc同种型IgG1sigma或IgG4PAA。在相比于野生型IgG1时，IgG1sigma包含突变L234A、L235A、G237A、P238S、H268A、A330S和P331S。在相比于野生型IgG4时，IgG4PAA包含突变S228P、F234A和L235A。残基根据EU索引进行编号。表3示出所产生的抗体和相比于亲本C40B16mAb时引入的突变。在相比于亲本C40B16VL时，C33A突变在所有产生抗体的VL中被工程化。
表4示出抗体的HCDR1和HCDR2氨基酸序列。
表5示出抗体的HCDR3和LCDR1氨基酸序列。
表6示出抗体的LCDR2和LCDR3氨基酸序列。
表7示出抗体的VH区和VL区的氨基酸和cDNA序列的SEQ ID NO。
表8示出抗体的重链和轻链的氨基酸序列的SEQ ID NO。
表9示出对应于SEQ ID NO:11-14、21-52和65-78的氨基酸或多核苷酸序列。
表3：
mAb 相比于C40B16的VH突变 同种型
C40B16 亲本 IgG1
C40B124 R43K、H82Q、N52D、S54A IgG1Sigma
C40B135 R43K、H82Q、N52D、S54A IgG4PAA
C40B125 R43K、H82Q、N52Q、S54A IgG1Sigma
C40B136 R43K、H82Q、N52Q、S54A IgG4PAA
C40B127 R43K、H82Q、N53Q、S54A IgG1Sigma
C40B138 R43K、H82Q、N53Q、S54A IgG4PAA
C40B131 R43K、H82Q、N53A、S54A IgG4PAA
C40B176 R43K、H82Q、N53A、S54A、M108L IgG1Sigma
C40B180 R43K、H82Q、N53A、S54A、M108L IgG4PAA
C40B179 R43K、H82Q、N53Q、S54A、M108L IgG1Sigma
C40B183 R43K、H82Q、N53Q、S54A、M108L IgG4PAA
表4：
表5：
表6：
表7：
表8：
表9：
实施例3：拮抗性抗-CD40抗体的表征
在光谱分析中测试亲本C40B16和工程化变体的拮抗活性，包括抗体抑制人可溶性CD40L(sCD40L)或膜结合的CD40L(mCD40L)-介导的人或cyno B细胞的增殖，以及抑制人DC产生IL-12p40的能力。实验根据实施例1中所述的方案进行。在测定中，膜结合的CD40L设置在Jurkat细胞上。
全部抗体在所执行的测定中展示出拮抗作用。
表10示出抑制可溶性或膜结合的CD40L-驱动的B细胞增殖的IC50值。表11示出抑制可溶性或膜结合的CD40L-驱动的由人树突状细胞产生IL-12p40的IC50值。
表10：
表11：
使用ProteOn XPR36***(BioRad)，使用表面等离子体共振(SPR)评估抗体对人CD40的亲和力。使用用于胺偶联化学的制造商说明书，通过将抗人IgG Fc(Jackson，目录号109-005-098)偶联到GLC芯片(BioRad，目录号176-5011)的改性藻酸盐聚合物层表面来制备生物传感器表面。将大约5000RU(响应单位)mAb固定。在25℃下在运行缓冲液(DPBS+0.01％P20+100μg/ml BSA)中进行动力学实验。为了进行动力学实验，捕集200RU的mAb，之后以5种浓度(以4倍连续稀释)注射分析物(人或cyno CD40)。将缔合相在50μL/min下监测3分钟，然后之后进行15分钟的缓冲液流动(解离相)。在100μL/min下，用100mM H3PO4(Sigma，目录号7961)的两个18秒的脉冲，使芯片表面再生。
使用ProteOn Manager软件处理收集的数据。首先，使用区间(inter-spots)对数据进行背景校正。然后，对于分析物注射，通过使用缓冲液注射来执行数据的双基准减法。使用朗缪尔1:1结合模型进行数据的动力学分析。结果以Ka(结合率)、Kd(解离率)和KD(平衡解离常数)的格式记录。
mAb结合到人CD40的动力学亲和力的汇总示于表12中。对于所有样品，该表中记录的参数获自1:1朗缪尔结合模型。亲和力，KD＝kd/ka。
表12：
实施例4：特异性结合人CD40的拮抗性抗体是CD40/CD40L途径的有效抑制剂并且 展示出最小的激动活性
四种拮抗性抗体(C40B176、C40B179、C40B180和C40B183)相对于目前临床开发的抗-CD40抗体进行基准测试。用于比较的抗体为：Astellas/Kirin ASKP-1240(HC SEQ IDNO:53，LC SEQ ID NO:54，具有S228P和L235E突变的Fc沉默IgG4)、抗体D(HC SEQ ID NO:55，LC SEQ ID NO:56，具有L234A和L235A突变的Fc沉默IgG1；在US8,591,900中描述为抗体B IgG1KOb)、Novartis CFZ533(HC SEQ ID NO:57，LC SEQ ID NO:58，具有N297A突变的Fc沉默IgG1)、以及BMS-986090(HC SEQ ID NO:59，具有S228P突变的IgG4)。
SEQ ID NO:53(ASKP-1240HC)
QLQLQESGPGLLKPSETLSLTCTVSGGSISSPGYYGGWIRQPPGKGLEWIGSIYKSGSTYHNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCTRPVVRYFGWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO:54(ASKP-1240LC)
AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSALAWYQQKPGKAPKLLIYDASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSYPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:55(抗体D HC)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWVAYISSGNRIIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQDGYRYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:56(抗体D LC)
DIVMTQSPDSLAVSLGEKVTINCKSSQSLLNSGNQKNYLTWHQQKPGQPPKLLIYWTSTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYTYPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:57(CFZ533 HC)
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYEESNRYHADSVKGRFTISRDNSKITLYLQMNSLRTEDTAVYYCARDGGIAAPGPDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:58(CFZ533 LC)
DIVMTQSPLSLTVTPGEPASISCRSSQSLLYSNGYNYLDWYLQKPGQSPQVLISLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQARQTPFTFGPGTKVDIRRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:59(BMS-986090 HC)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRDYEMWWVRQAPGKGLERVSAINPQGTRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKLPFRFSDRGQGTLVTVSSASTESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
表13示出测试抗体抑制可溶性或膜结合的CD40L-驱动的人或cyno B细胞增殖的IC50值。表14示出各mAb抑制可溶性或膜结合的CD40L-驱动的由人树突状细胞(CD)产生IL-12p40的IC50值和亲和动力学。mAb C40B176、C40B179、C40B180和C40B183在相比于最佳表现的基准mAb ASKP-1240时表现出类似的效能。
表13：
表14：
使用如实施例1所述的实验方案，在无交联情况下使用HEK-BlueTMCD40L NF-κB活化试验以及由树突状细胞的IL12p40产生作为读出来评估可能不期望的mAb激动活性。除效应子沉默ASKP-1240、CFZ533、BMS-986090和抗体D之外，也对野生型IgG1上的亲本抗体C40B16进行评价。
作为野生型IgG1的C40B16和沉默Fc上的抗体D在测定中表现出类似的不存在激动作用或最小的激动作用。随着抗-CD40抗体浓度的增大，ASKP-1240、CFZ533和BMS-986090表现出一些激动作用。图1示出NF-κB报告基因测定的剂量响应曲线。图2示出使用350nM与1.1nM之间的抗体浓度，抗体介导的DC的IL12p40产生。
结果表明，ASKP-1240、CFZ533和BMS-986090可表现出V-区驱动的激动作用，原因是激动作用表现于效应子沉默Fc中。
另外在DC或B细胞激动测定中以500ng/ml浓度的抗体评估激动作用，从而将ASKP-1240与C40B176、C40B179、C40B180和C40B183进行比较。在较高的抗体浓度下，ASKP-1240诱导DC产生IL-12p40(图3A)和B细胞增殖(图3B)，而C40B176、C40B179、C40B180和C40B183却并非如此。
总而言之，结果表明相比于ASKP-1240、CFZ533和BMS-986090，C40B16以及其变体C40B176、C40B179、C40B180和C40B183，以及抗体D具有降低的激动剂潜能。值得注意的是，该结果也表明在基于细胞的测定中，C40B176、C40B179、C40B180和C40B183的效能比抗体D分子高多达10倍，并且与最有效的基准分子(ASKP-1240)相当。

Claims (34)

1.一种特异性结合SEQ ID NO:1的人CD40的分离的拮抗性抗体或其抗原结合片段，所述分离的拮抗性抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:5的重链互补决定区(HCDR)1、SEQID NO:61的HCDR2、SEQ ID NO:62的HCDR3、SEQ ID NO:63的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQID NO:9的LCDR2和SEQ ID NO:10的LCDR3。
2.根据权利要求1所述的分离抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体与包含以下项的抗体竞争以结合到SEQ ID NO:1的人CD40
a)SEQ ID NO:11的重链可变区(VH)和SEQ ID NO:12的轻链可变区(VL)；
b)SEQ ID NO:25的VH和SEQ ID NO:27的VL；或者
c)SEQ ID NO:26的VH和SEQ ID NO:27的VL。
3.根据权利要求1或2所述的分离抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含以下序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3
a)分别为SEQ ID NO:5、6、7、8、9和10；
b)分别为SEQ ID NO:5、15、7、20、9和10；
c)分别为SEQ ID NO:5、16、7、20、9和10；
d)分别为SEQ ID NO:5、17、7、20、9和10；
e)分别为SEQ ID NO:5、18、7、20、9和10；
f)分别为SEQ ID NO:5、18、19、20、9和10；或者
g)分别为SEQ ID NO:5、17、19、20、9和10。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体以约1.5×10-10M或更小的解离常数(KD)结合人CD40，此时所述KD在包含0.01％聚山梨醇酯20(PS-20)和100μg/ml牛血清白蛋白的杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水中在25℃下使用ProteOn XPR36***测量。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的分离抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体抑制可溶性人CD40L-驱动的人扁桃体B细胞增殖的IC50值小于约1×10-9M。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的分离抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体抑制可溶性人CD40L-驱动的由人树突状细胞产生IL-12p40的IC50值小于约1×10-9M。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的分离抗体或其抗原结合片段，所述分离抗体或其抗原结合片段包含以下序列的VH和VL
a)分别为SEQ ID NO:11和12；
b)分别为SEQ ID NO:21和27；
c)分别为SEQ ID NO:22和27；
d)分别为SEQ ID NO:23和27；
e)分别为SEQ ID NO:24和27；
f)分别为SEQ ID NO:25和27；或者
g)分别为SEQ ID NO:26和27。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的分离抗体或其抗原结合片段，所述分离抗体或其抗原结合片段为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型。
9.根据权利要求8所述的分离抗体或其抗原结合片段，其中在相比于野生型Fc时，所述抗体包含使所述抗体与Fcγ受体的结合降低的Fc区中的至少一个突变。
10.根据权利要求9所述的分离抗体或其抗原结合片段，其中所述Fc区中的所述至少一个突变为S228P突变、F234A突变、L234A突变、L235A突变、G237A突变、P238S突变、H268A突变、A330S突变或P331S突变，其中残基根据EU索引进行编号。
11.根据权利要求9所述的分离抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体为IgG1同种型并且包含L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S突变。
12.根据权利要求9所述的分离抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体为IgG4同种型并且包含S228P/F234A/L235A突变。
13.根据权利要求1至7中任一项所述的分离抗体或其抗原结合片段，所述分离抗体或其抗原结合片段包含以下序列的重链和轻链
a)分别为SEQ ID NO:35和47；
b)分别为SEQ ID NO:36和48；
c)分别为SEQ ID NO:37和48；
d)分别为SEQ ID NO:38和48；
e)分别为SEQ ID NO:39和48；
f)分别为SEQ ID NO:40和48；
g)分别为SEQ ID NO:41和48；
h)分别为SEQ ID NO:42和48；
i)分别为SEQ ID NO:43和48；
j)分别为SEQ ID NO:44和48；
k)分别为SEQ ID NO:45和48；或者
l)分别为SEQ ID NO:46和48。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体为双特异性抗体或多特异性抗体。
15.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1至14中任一项所述的分离抗体或其抗原结合片段以及药学上可接受的载体。
16.一种免疫缀合物，所述免疫缀合物包含连接到细胞毒素剂或成像剂的根据权利要求1至14中任一项所述的分离抗体或其抗原结合片段。
17.一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸编码
a)SEQ ID NO:11、21、22、23、24、25或26的VH；
b)SEQ ID NO:12或27的VL；或者
c)SEQ ID NO:11、21、22、23、24、25或26的VH以及SEQ ID NO:12或27的VL。
18.一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含SEQ ID NO:13、14、28、29、30、31、32、33或34的多核苷酸序列。
19.一种载体，所述载体包含根据权利要求17所述的多核苷酸。
20.一种载体，所述载体包含根据权利要求18所述的多核苷酸。
21.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求19所述的载体。
22.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求20所述的载体。
23.一种制备特异性结合SEQ ID NO:1的人CD40的拮抗性抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括在所述抗体被表达的条件下培养根据权利要求21或22所述的宿主细胞，并且分离所述抗体。
24.一种治疗患有炎性疾病的受治疗者的方法，所述方法包括以足以治疗所述炎性疾病的时间向对其有需要的受治疗者施用根据权利要求1至14中任一项所述的分离抗体或其抗原结合片段。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述炎性疾病为自身免疫性疾病。
26.根据权利要求24所述的方法，其中所述炎性疾病为阿狄森氏病、强直性脊柱炎、动脉粥样硬化、自身免疫性肝炎、自身免疫性糖尿病、格雷夫斯病、格-巴二氏综合征、桥本氏病、特发性血小板减少症、炎性肠病(IBD)、***性红斑狼疮、狼疮性肾炎、亚急性皮肤型红斑狼疮、多发性硬化症、重症肌无力、牛皮癣、关节炎、硬皮病、干燥综合症、***性硬化病、移植、肾移植、皮肤移植、骨髓移植、移植物抗宿主病(GVHD)或I型糖尿病。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述关节炎为类风湿性关节炎、幼年型关节炎、银屑病性关节炎、赖特综合征、强直性脊柱炎或痛风性关节炎。
28.根据权利要求26所述的方法，其中所述IBD为克罗恩氏病或溃疡性结肠炎。
29.根据权利要求24所述的方法，还施用第二治疗剂。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述第二治疗剂为非甾体抗炎药(NSAID)、水杨酸盐、羟化氯喹、柳氮磺吡啶、皮质类固醇、细胞毒性药物、免疫抑制药物和/或抗体。
31.根据权利要求15所述的药物组合物的根据权利要求1至14中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其在治疗中使用。
32.一种结合到根据权利要求7所述的抗体或其抗原结合片段的抗独特型抗体。
33.一种试剂盒，所述试剂盒包括根据权利要求7所述的抗体或其抗原结合片段。
34.根据权利要求33所述的试剂盒，所述试剂盒还包括用于检测所述抗体的试剂和使用说明书。
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