CN103429264A

CN103429264A - 针对人程序性死亡受体pd-1的抗体的稳定制剂和有关的治疗

Info

Publication number: CN103429264A
Application number: CN2012800145404A
Authority: CN
Inventors: M.K.莎马; C.N.纳拉辛汉; K.J.格吉奇; S.P.康
Original assignee: Schering Corp
Current assignee: Merck Sharp and Dohme LLC
Priority date: 2011-03-31
Filing date: 2012-03-29
Publication date: 2013-12-04
Also published as: LT2691112T; KR20140026434A; CY1120359T1; US9220776B2; TR201810298T4; RU2013148537A; CN107854439A; PL2691112T3; AU2012236479A1; RU2015123476A; RU2633509C2; RS57492B1; MX341076B; JP6014116B2; KR20210101336A; KR102289394B1; EP2691112A4; US20140234296A1; CA2830806C; HK1256245A1

Abstract

本发明涉及针对人程序性死亡受体PD-1的抗体或其抗原结合片段的稳定制剂。本发明另外提供了用针对人程序性死亡受体PD-1的抗体或其抗原结合片段的稳定制剂治疗多种癌症和慢性感染的方法。

Description

针对人程序性死亡受体PD-1的抗体的稳定制剂和有关的治疗

相关申请的交叉引用

本申请要求2011年3月31日提交的美国临时专利申请号61/470,121的权益，其通过引用整体并入本文。

技术领域

本发明涉及针对人程序性死亡受体PD-1的抗体或其抗原结合片段的稳定制剂。本发明另外提供了用针对人PD-1的抗体或其抗原结合片段的稳定制剂治疗多种癌症和慢性感染的方法。

背景技术

程序性死亡1（Programmed Death 1，PD-1）（CD28共刺激基因家族的一个成员）在原初T、B和NKT细胞上适度表达，且受淋巴细胞、单核细胞和髓样细胞上的T/B细胞受体信号传递增量调节（1）。PD-1具有2种具有独特表达谱的已知配体：PD-L1（B7-H1）和PD-L2（B7-DC）。PD-L2表达相对有限，且存在于活化的树突细胞、巨噬细胞和单核细胞上以及血管内皮细胞上（1-3）。相比而言，PD-L1更广泛地表达，包括在原初淋巴细胞上，且它的表达在活化的B和T细胞、单核细胞和树突细胞上被诱导。此外，mRNA使它由非淋巴组织（包括血管内皮细胞、上皮细胞和肌细胞）表达。

PD-1被公认为在免疫调节和周围耐受性的维持中起重要作用。在小鼠中证实了这需要在周围组织上的PD-L1表达和在潜在自体反应性的T细胞上的PD-1的连接，以负调控涉及PD-1细胞质结构域中的ITIM序列的T细胞活化(1, 4)。

取决于具体的遗传背景，pdcd1^-/- 小鼠自发地形成狼疮样现象或扩张型心肌病(5, 6)。此外，经证实抗体诱导的PD-1/PD-L1途径的阻断会加速自身免疫性胰岛炎和糖尿病在NOD小鼠中的发作(7)。

经发现，在不同组织中产生的人类癌症会过表达PD-L1或PD-L2。在诸如卵巢癌、肾癌、结肠直肠癌、胰腺癌、肝癌和黑素瘤等大量样品集合中证实了与预后不良和减少的总存活率（不论以后的治疗如何）有关的PD-L1表达(15-26)。类似地，发现在肿瘤浸润性淋巴细胞上的PD-1表达会标志着乳腺癌和黑素瘤中的功能障碍性T细胞(27-28)，并与肾癌中的预后不良有关(29)。使用患者的原代样品证实了PD-1或PD-L1的体外阻断会导致人肿瘤特异性的T细胞活化和细胞因子产生的增强(30)。结果，在几种鼠同系基因型肿瘤模型中，PD-1或PD-L1的阻断显著抑制了肿瘤生长或诱导了完全消退。

发现了阻断PD-1的mAb (h409A11)，并将其开发用于治疗人类癌症患者和慢性病毒感染的患者(描述于共同未决的申请WO2008/156712中)。

产生白介素2 (IL-2)、肿瘤坏死因子(TNF) α、穿孔蛋白、干扰素(IFN) γ(8)的潜力的累积损失以及不能固定对T细胞受体触发的增生性应答，例证了抗原特异性的T细胞功能障碍或耐受性(1)。PD-1途径控制着抗原特异性的T细胞耐受性，并被发现在病毒感染和肿瘤发展中用于控制和逃避有效的T细胞免疫。

在LCMV (小鼠)、HIV、HBV或HCV (人)的慢性感染中，发现抗原特异性的T细胞异常地表达高水平的PD-1，所述PD-1与它们的无反应性或功能障碍状态有关(9)。经证实，在体内(LCMV)或在体外(HIV、HCV、HBV)阻断PD-1-PD-L1相互作用会恢复抗病毒的T细胞活性(10-12)。最近，在猴免疫缺陷病毒感染的猕猴中的PD-1阻断导致了病毒载量的稳固下降和增加的存活率(13)。类似地，在使用长期SIV感染的猕猴的第二项研究中证实了病毒载量的下降(14)。

总之，PD-1/PD-L1途径是被充分证实的开发用于癌症治疗的抗体治疗剂的靶标。抗PD-1抗体还可用于治疗慢性病毒性感染。在急性病毒性感染后产生的记忆CD8⁺T细胞具有很高的功能，并构成保护性免疫的重要组分。相比而言，慢性感染的特征常常在于病毒特异性T细胞应答的不同程度的功能缺损(衰竭)，并且这种缺陷是宿主不能消除持续的病原体的主要原因。尽管在感染的早期阶段最初产生功能效应T细胞，但它们在慢性感染过程中逐渐失去功能。Barber等人(Barber等人, Nature 439: 682-687 (2006))证实，用LCMV实验室毒株感染的小鼠发展为慢性感染，所述慢性感染导致血液和其它组织中的高病毒水平。这些小鼠最初会形成稳健的T细胞应答，但随着T细胞衰竭而最终受到感染。作者发现，通过注射阻断PD-1和PD-L1之间相互作用的抗体，可以逆转在慢性感染小鼠中的效应T细胞的数量和功能的下降。

还已经证实，PD-1在得自HIV感染的个体的T细胞上高度表达，并且受体表达与T细胞功能损伤和疾病进展相关(Day等人, Nature 443:350-4 (2006)；Trautmann L. 等人, Nat. Med. 12: 1198-202 (2006))。在两项研究中，使用针对配体PD-L1的抗体对PD-1途径的阻断显著增加了HIV特异性的、产生IFN-γ细胞的体外增殖。

其它研究还涉及PD-1途径在控制病毒感染中的重要性。PD-1敲除的小鼠表现出比野生型小鼠更好的腺病毒感染的控制(Iwai等人, Exp. Med. 198:39-50 (2003))。并且，将HBV特异性的T细胞过继性转移到HBV转基因动物中会引发肝炎(Isogawa M. 等人, Immunity 23:53-63 (2005))。这些动物的疾病状态由于肝脏中的抗原识别和肝细胞实现的PD-1增量调节而游移不定。

治疗性抗体可以用于阻断细胞因子活性。使用抗体作为体内治疗剂的显著限制是抗体的免疫原性。由于大多数单克隆抗体源自非人物种，在人类中的重复使用会导致针对治疗性抗体的免疫应答的产生。这样的免疫应答至少会导致治疗效果的丧失，并潜在地导致致命的过敏反应。因此，在人类中具有降低的免疫原性的抗体，诸如人源化抗体或全人抗体，对于人类受试者的治疗而言是优选的。对人PD-1特异性的示例性的治疗性抗体公开于共同指定的美国专利申请公开号US2010/0266617和国际专利公开号WO2008/156712中，它们的公开内容特此通过引用整体并入。

用于人类受试者的抗体在使用之前必须储存和运输至施用地点。在受试者中可再现地获得期望的抗体药物水平要求所述药物储存在维持药物的生物活性的制剂中。存在对用于药物用途（例如，用于治疗多种癌症和感染性疾病）的抗-人PD-1抗体的稳定制剂的需要。优选地，这样的制剂将表现出长的贮存期限，在储存和运输时是稳定的，并且适合以高浓度（例如用于皮下施用）和低浓度（例如用于静脉内施用）施用。

发明内容

在某些实施方案中，本发明涉及抗-人PD-1抗体或其抗原结合片段的低压冻干的制剂，其包含：a) 所述抗-人PD-1抗体或其抗原结合片段；b) 组氨酸缓冲液；c) 聚山梨酯80；和d) 蔗糖。

在某些实施方案中，所述制剂当重构时具有5.0至6.0之间的pH。

在某些实施方案中，所述低压冻干的制剂能够在约25 mg/mL至100 mg/mL之间的浓度重构所述抗体或其抗原结合片段。

在某些实施方案中，聚山梨酯80以大约0.02% (w/v)的重量比存在。

在某些实施方案中，蔗糖以大约7% (w/v)的重量比存在。

在其它实施方案中，本发明涉及抗-人PD-1抗体或其抗原结合片段的低压冻干的药物制剂，其通过低压冻干水溶液制成，所述水溶液包含：a) 25-100 mg/mL抗-抗体或其抗原结合片段；b) 约70 mg/mL蔗糖；c) 约0.2 mg/mL聚山梨酯80；和d) pH 5.0-6.0的约10 mM组氨酸缓冲液。

在某些实施方案中，所述抗-人PD-1抗体或其抗原结合片段以约25 mg/mL存在于水溶液中。在某些实施方案中，所述水溶液具有约5.5的pH。

在其它实施方案中，本发明涉及抗-人PD-1抗体或其抗原结合片段的低压冻干的药物制剂，其当重构时包含：a) 25-100 mg/mL抗-人PD-1抗体或其抗原结合片段；b) 约70 mg/mL蔗糖；c) 约0.2 mg/mL聚山梨酯80；和d) 约pH 5.0-pH 6.0的约10 mM组氨酸缓冲液。

在某些实施方案中，所述抗-人PD-1抗体或其抗原结合片段以约25 mg/mL存在于重构的溶液中。在某些实施方案中，所述重构的溶液具有约5.5的pH。

在其它实施方案中，本发明涉及抗-人PD-1抗体或其抗原结合片段的液体药物制剂，所述制剂包含：a) 25-100 mg/mL抗-抗体或其抗原结合片段；b) 约70 mg/mL蔗糖；c) 约0.2 mg/mL聚山梨酯80；和d) pH 5.0-6.0的约10 mM组氨酸缓冲液。

在其它实施方案中，本发明涉及抗-人PD-1抗体或其抗原结合片段的药物制剂，所述药物制剂包含：a) 所述抗-人PD-1抗体或其抗原结合片段；b) 组氨酸缓冲液；c) 聚山梨酯80；和d) 蔗糖。在某些实施方案中，所述制剂当重构时具有5.0至6.0之间的pH。在某些实施方案中，所述聚山梨酯80以大约0.02% (w/v)的重量比存在。在某些实施方案中，所述蔗糖以大约7% (w/v)的重量比存在。

在其它实施方案中，本发明涉及本文中描述的任意制剂，其中所述抗体或其抗原结合片段包含含有选自SEQ ID NO: 9、10、11、15、16和17的3个CDR序列的轻链。

在其它实施方案中，本发明涉及本文中描述的任意制剂，其中所述抗体或其抗原结合片段包含含有选自SEQ ID NO: 12、13、14、18、19和20的3个CDR序列的重链。

在其它实施方案中，本发明涉及本文中描述的任意制剂，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：i) 轻链，其包含3个CDR序列SEQ ID NO: 15、16和17；和ii) 重链，其包含3个CDR序列SEQ ID NO: 8、19和20。

在其它实施方案中，本发明涉及本文中描述的任意制剂，其中所述抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:32的氨基酸残基20-130的轻链可变结构域。

在其它实施方案中，本发明涉及本文中描述的任意制剂，其中所述抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:31的重链可变结构域。

在其它实施方案中，本发明涉及本文中描述的任意制剂，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：i) 轻链，其包含SEQ ID NO: 36的氨基酸残基20-237，和ii) 重链，其包含SEQ ID NO: 31的氨基酸残基20-466。

在其它实施方案中，本发明涉及本文中描述的任意制剂，其中所述抗体选自：h409A11、h409A16和h409A17。

在其它实施方案中，本发明涉及一种治疗有此需要的哺乳动物受试者的慢性感染的方法，所述方法包括：施用有效量的本文中描述的任意制剂。

在其它实施方案中，本发明涉及一种治疗有此需要的哺乳动物受试者的癌症的方法，所述方法包括：施用有效量的本文中描述的任意制剂。在某些实施方案中，所述有效量包括选自1.0 mg/kg、3.0 mg/kg和10 mg/kg的抗-人PD-1抗体的剂量。

附图说明

图1A-B显示了在5℃(24个月)储存的pH 5.5的h409A11的低压冻干的制剂的稳定性数据。

图2A-B显示了在25H条件(25℃、60% RH、12个月)储存的pH 5.5的h409A11的低压冻干的制剂的稳定性数据。

图3A-B显示了在RH4条件(40℃、75% RH、6个月)储存的pH 5.5的h409A11的低压冻干的制剂的稳定性数据。

图4A-B显示了在5℃(24个月)储存的h409A11的低压冻干的制剂的稳定性数据。

图5A-B显示了在25H条件(25℃、60% RH、6个月)储存的pH 5.5的h409A11的低压冻干的制剂的稳定性数据。

图6A-B显示了在RH4条件(40℃、75% RH、6个月)储存的pH 5.5的h409A11的低压冻干的制剂的稳定性数据。

图7A-B显示了在5℃(24个月)储存的h409A11的低压冻干的制剂的稳定性数据。

图8A-B显示了在25H条件(25℃、60% RH、6个月)下的h409A11的低压冻干的制剂的稳定性数据。

图9A-B显示了在RH4条件(40℃、75% RH、6个月)下的h409A11的低压冻干的制剂的稳定性数据。

具体实施方式

本发明提供了抗-PD-1抗体的制剂及其用于治疗多种癌症和感染性疾病的用途。

抗-PD-1抗体h409A11是本文中描述的稳定制剂的示例性抗体。在共同未决的专利公开WO2008/156712中描述了适合用于本发明的制剂中的3种人源化的抗-PD-1单克隆抗体(即，h409A11、h409A16和h509A17)。另外，本文中描述的制剂可用于治疗某些癌症以及慢性感染。表2提供了h409A11的对应CDR序列的列表。表6提供了示例性的抗-PD-1抗体的序列的列表。

根据本发明，可以采用在本领域的技能范围内的常规分子生物学、微生物学、蛋白表达和纯化、抗体和重组DNA技术。这样的技术在文献中进行了充分解释。参见，例如，Sambrook等人(2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 第3版Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, New York; Ausubel等人编(2005) Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, NJ; Bonifacino等人编(2005) Current Protocols in Cell Biology. John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, NJ; Coligan等人编(2005) Current Protocols in Immunology, John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, NJ; Coico等人编(2005) Current Protocols in Microbiology, John Wiley and Sons, Inc. : Hoboken, NJ; Coligan等人编(2005) Current Protocols in Protein Science, John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, NJ；和Enna等人编(2005) Current Protocols in Pharmacology, John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, NJ.; Nucleic Acid Hybridization, Hames & Higgins编(1985); Transcription And Translation, Hames & Higgins, 编(1984); Animal Cell Culture Freshney,编(1986); Immobilized Cells And Enzymes, IRL Press (1986); Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984)；和Harlow and Lane. Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1988)。

I. 定义

本文中使用的术语“抗体”表示，表现出期望的生物活性的任意形式的抗体。因而，它以最宽的含义使用，并具体地涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、嵌合抗体、人源化抗体、全人抗体等，只要它们表现出期望的生物活性即可。

佐剂

本文中使用的术语“佐剂”表示，增强对抗原的免疫应答的化合物或混合物。佐剂可以充当缓慢地释放抗原的组织贮库，也可以充当非特异性地增强免疫应答的淋巴样***活化剂(Hood等人, Immunology, 第 2 版, 1984, Benjamin/Cummings: Menlo Park, California, 第384页)。在没有佐剂存在下用单独抗原进行的首次激发（challenge）经常不会引起体液或细胞免疫应答。佐剂包括、但不限于：完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、皂苷、矿物凝胶（诸如氢氧化铝）、表面活性物质（诸如溶血卵磷脂）、普朗尼克多元醇、聚阴离子、肽、油或烃乳剂、钥孔戚血蓝蛋白和可能有用的人佐剂诸如N-乙酰基-胞壁酰基-L-苏氨酰基-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-正胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺、N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰基-L-丙氨酸-2-(1'-2'-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺、BCG (卡介苗)和短小棒状杆菌（Corynebacterium parvum）。优选地，所述佐剂是药学上可接受的。

细胞因子

术语“细胞因子”是由一个细胞群体释放的、作为细胞间介质作用于其它细胞的蛋白质的一般术语。这样的细胞因子的例子是淋巴因子、单核因子、趋化因子和传统的多肽激素。示例性的细胞因子包括：人IL-2、IFN-γ、IL-6、TNFα、IL-17和IL-5。

细胞毒性剂

本文中使用的术语“细胞毒性剂”表示，抑制或阻止细胞的功能和/或造成细胞的破坏的物质。该术语意图包括放射性同位素(例如，I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰和Re¹⁸⁶)、化学治疗剂和毒素诸如细菌、真菌、植物或动物源的酶活性毒素或其片段。

治疗用途和方法

PD-1阻断剂包括，可以用于增加、增强、刺激或增量调节免疫应答的、特异性地结合人PD-1的那些阻断剂。合乎需要的受试者包括需要增强免疫应答的人类患者，包括具有癌症和/或慢性病毒感染的患者。

癌症

术语“癌症”、“癌性的”或“恶性的”表示或描述哺乳动物中的通常以失调的细胞生长为特征的生理状况。癌症的例子包括、但不限于：癌、淋巴瘤、白血病、母细胞瘤和肉瘤。这样的癌症的更具体的例子包括：鳞状细胞癌、骨髓瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、神经胶质瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、胃肠(道)癌、肾癌、卵巢癌、肝癌、成淋巴细胞性白血病、淋巴细胞白血病、结直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、***癌、甲状腺癌、黑素瘤、软骨肉瘤、神经母细胞瘤、胰腺癌、多形性胶质母细胞瘤、子***、脑癌、胃癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌和头颈癌。

PD-1阻断剂包括用于治疗癌症(即，抑制肿瘤细胞的生长或存活)的那些阻断剂。使用抗-PD-1抗体（诸如人源化的抗-PD-1抗体h409A11）可以抑制其生长的优选的癌症包括通常对免疫疗法有应答的癌症，但是也包括迄今为止尚未与免疫疗法相关联的癌症。用于治疗的优选癌症的非限制性例子包括：黑素瘤(例如，转移性恶性黑素瘤)、肾癌(例如透明细胞癌)、***癌(例如激素难治的***腺癌)、胰腺腺癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌(例如非小细胞肺癌)、食管癌、头颈鳞状细胞癌、肝癌、卵巢癌、子***、甲状腺癌、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、白血病、淋巴瘤和其它肿瘤性质的恶性肿瘤。在本文所述的方法和治疗中包括表现出改善的无疾病存活和总存活的恶性肿瘤（其与肿瘤浸润性淋巴细胞在活组织检查或外科手术材料中的存在有关），例如黑素瘤、结肠直肠癌、肝癌、肾癌、胃癌/食管癌、乳腺癌、胰腺癌和卵巢癌。已知这样的癌症亚型对T淋巴细胞实现的免疫控制敏感。另外，包括使用本文所述的抗体可以抑制其生长的难治的或复发的恶性肿瘤。特别优选的癌症包括以PD-1和/或它的配体PD-L1和/或PD-L2在试验组织样品中的升高表达为特征的那些癌症，包括：卵巢癌、肾癌、结肠直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、食管癌和黑素瘤。可以受益于抗-PD-1抗体（诸如人源化的抗-PD-1抗体h409A11）治疗的其它癌症包括与病毒的持续性感染有关的那些癌症，所述病毒例如人免疫缺陷病毒、甲型、乙型和丙型肝炎病毒、EB病毒、已知在病因上与例如卡波西氏肉瘤、肝癌、鼻咽癌、淋巴瘤、子***、外阴癌、***癌、***癌和口癌有关的人***瘤病毒。

化学治疗剂

“化学治疗剂”是可用于治疗癌症的化学化合物。抗-PD-1抗体可以与任意一种或多种合适的化学治疗剂一起使用。这样的化学治疗剂的例子包括：烷化剂诸如塞替派和环磷酰胺；磺酸烷基酯诸如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶类诸如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌、美妥替派(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa)；乙烯亚胺和甲基密胺，包括六甲蜜胺、三亚乙基密胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基密胺；番荔枝内酯(acetogenin) (尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；喜树碱(包括合成的类似物托泊替康)；苔藓抑素; callystatin; CC-1065 (包括它的合成类似物阿多来新、卡泽来新和比泽来新)；念珠藻环肽(尤其是念珠藻环肽1和念珠藻环肽8)；多拉司他汀；多卡米星(包括合成类似物KW-2189和CBI-TMI)；艾榴塞洛素；水鬼蕉碱；sarcodictyin；海绵抑素；氮芥类诸如苯丁酸氮芥、萘氮芥、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥、盐酸氧氮芥、美法仑、新氮芥、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺、乌拉莫司汀；硝基脲类诸如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀；抗生素类诸如烯二炔抗生素(例如刺孢霉素，尤其是刺孢霉素γ1I和刺孢霉素phiI1, 参见，例如，Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33:183-186 (1994)；达内霉素，包括达内霉素A；二膦酸盐类，诸如氯膦酸盐；埃斯培拉霉素；以及新制癌菌素生色团和有关的色蛋白烯二炔抗生素生色团)、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素、氨茴霉素(authramycin)、偶氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、carabicin、洋红霉素(caminomycin)、嗜癌霉素、色霉素、更生霉素、柔红霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(包括吗啉代-多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯啉代-多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素类诸如丝裂霉素C、麦考酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素(potfiromycin)、嘌罗霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢药诸如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物诸如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物诸如氟达拉滨、6-巯嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物诸如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷；雄激素类诸如卡普睾酮、丙酸屈他雄酮、环硫雄醇、美雄烷、睾内酪；抗肾上腺类诸如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂诸如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基酮戊酸；恩尿嘧啶；安吖啶；bestrabucil；比生群；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；秋水仙胺；地吖醌；elformithine；依利醋铵；埃博霉素；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；美登素类化合物诸如美坦辛和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；尼曲吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；雷佐生；根霉素；西佐喃(sizofuran)；锗螺胺；替奴佐酸；三亚胺醌；2, 2′,2″-三氯三乙胺；单端孢霉烯类(尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verracurin) A、杆孢菌素A和蛇形菌素)；乌拉坦(urethan)；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿糖胞苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；塞替派；紫杉烷类，例如紫杉醇和多西紫杉醇；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物诸如顺铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺消灵；替尼泊苷；依达曲沙；道诺霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄醇诸如视黄酸；卡培他滨；和上述任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。还包括其作用为调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂，诸如抗***类和选择性的***受体调节剂(SERM)，包括、例如，他莫昔芬、雷洛昔芬、屈洛昔芬、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、雷洛昔芬、LY117018、奥那司酮和托瑞米芬(Fareston)；抑制在肾上腺中调节***生成的酶——芳香酶的芳香酶抑制剂，例如，4(5)-咪唑、氨鲁米特、乙酸甲地孕酮、依西美坦、福美坦、法倔唑、伏氯唑、来曲唑和阿那曲唑；和抗雄激素类诸如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；和上述任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。

生长抑制剂

“生长抑制剂”当用于本文中时表示这样的化合物或组合物：其在体外或在体内抑制细胞（尤其是过表达本文中所鉴定的任何基因的癌细胞）的生长。因而，生长抑制剂是显著降低在S期中过表达所述基因的细胞的百分比的药剂。生长抑制剂的例子包括：阻断细胞周期前进(处于S期以外的位置)的药剂，诸如诱导G1停滞和M期停滞的药剂。经典的M期阻断剂包括长春胺类(vincas) (长春新碱和长春碱)、紫杉烷、和拓扑异构酶II抑制剂诸如多柔比星、表柔比星、柔红霉素和依托泊苷。阻滞G1的那些药剂也溢出进入S期停滞，例如，DNA烷化剂诸如达卡巴嗪、氮芥和顺铂。更多信息可参见：The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn和Israel, 编, 第1章，标题为“Cell cycle regulation, oncogens, and antineoplastic drugs”(Murakami等人)(WB Saunders: Philadelphia, 1995)。

与其它药剂相组合的抗体或抗体片段

抗-PD-1抗体或抗体片段可以单独使用，或者与下述联合使用：其它抗肿瘤剂或免疫原性剂(例如，减弱的癌细胞、肿瘤抗原(包括重组蛋白、肽和碳水化合物分子)、抗原呈递细胞诸如用肿瘤衍生的抗原或核酸刺激过的树突细胞、免疫刺激性细胞因子(例如，IL-2、IFNα2、GM-CSF)、和用用编码免疫刺激性细胞因子（诸如但不限于GM-CSF）的基因转染的细胞；标准癌症治疗(例如，化学疗法、放射疗法或外科手术)；或其它抗体(包括、但不限于针对下述物质的抗体：VEGF、EGFR、Her2/neu、VEGF受体、其它生长因子受体、CD20、CD40、CD-40L、CTLA-4、OX-40、4-1BB和ICOS)。

感染性疾病

拮抗剂抗-PD-1抗体或抗体片段还可以用于预防或治疗感染和感染性疾病。这些药剂可单独使用，或与疫苗联合使用，以刺激针对病原体、毒素和自体抗原的免疫应答。所述抗体或其抗原结合片段可用于刺激针对感染人的病毒的免疫应答，所述病毒包括、但不限于：人免疫缺陷病毒、甲型、乙型和丙型肝炎病毒、EB病毒、人巨细胞病毒、人***瘤病毒和疱疹病毒。拮抗剂抗-PD-1抗体或抗体片段可以用于刺激针对细菌或真菌寄生虫及其它病原体感染的免疫应答。乙型肝炎、丙型肝炎和HIV的病毒感染被视作慢性病毒感染。

本文中使用的术语“PD-1结合片段”、“其抗原结合片段”、“其结合片段”或“其片段”包括这样的抗体片段或衍生物：其仍然基本上保留它的结合抗原(人PD-1)和抑制其活性(例如，阻断PD-1与PDL1和PDL2的结合)的生物活性。因此，术语“抗体片段”或PD-1结合片段表示全长抗体的一部分，通常是其抗原结合区或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab')₂和Fv片段；双体；线性抗体；单链抗体分子，例如，sc-Fv；和从抗体片段形成的多特异性抗体。通常，结合片段或衍生物保留它的PD-1抑制活性的至少10%。优选地，结合片段或衍生物保留它的PD-1抑制活性的至少25%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或100% (或更多)，尽管具有足以发挥期望的生物学效应的亲和力的任意结合片段是将会是有用的。PD-1结合片段还意图可以包括变体，所述变体具有基本上不会改变它的生物学活性的保守氨基酸置换。

“结构域抗体”是免疫学上有功能的免疫球蛋白片段，其仅含有重链的可变区或轻链的可变区。在某些情况下，用肽接头共价地连接2个或更多个V_H区域以产生二价结构域抗体。二价结构域抗体的2个V_H区域可以靶向相同的或不同的抗原。

“二价抗体”包含2个抗原结合位点。在某些情况下，所述2个结合位点具有相同的抗原特异性。但是，二价抗体可以是双特异性的。本文中使用的术语“双特异性抗体”表示这样的抗体、通常是单克隆抗体：其具有对至少2种不同抗原表位的结合特异性。在一个实施方案中，所述表位来自相同抗原。在另一个实施方案中，所述表位来自2种不同抗原。用于制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。例如，使用2个免疫球蛋白重链/轻链对的共表达，可以重组地产生双特异性抗体。参见，例如，Milstein等人(1983) Nature 305: 537-39。可替换地，使用化学连接可以制备双特异性抗体。参见，例如，Brennan等人(1985) Science 229:81。双特异性抗体包括双特异性抗体片段。参见，例如，Holliger等人(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-48, Gruber等人(1994) J. Immunol. 152:5368。

本文中使用的术语“单链Fv”或“scFv”抗体表示包含抗体的V_H和V_L结构域的抗体片段，其中这些结构域存在于单个多肽链中。通常，所述Fv多肽另外包含在V_H和V_L结构域之间的多肽接头，所述多肽接头使sFv能够形成抗原结合所需的结构。关于sFv的综述，参见Pluckthun (1994) The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, 第113卷, Rosenburg和Moore编Springer-Verlag, New York, 第269-315页。

本文中的单克隆抗体也包括骆驼源化的单结构域抗体。参见，例如，Muyldermans等人(2001) Trends Biochem. Sci. 26:230; Reichmann等人(1999) J. Immunol. Methods 231:25; WO 94/04678; WO 94/25591；美国专利号6,005,079)。还包括这样的单结构域抗体，其包含2个经过修饰以形成单结构域抗体的V_H结构域。

本文中使用的术语“双体”表示具有2个抗原结合位点的小抗体片段，所述片段包含在相同多肽链中与轻链可变结构域(V_L)相连的重链可变结构域(V_H)(V_H-V_L或V_L-V_H)。通过使用因为过短而不允许在相同链上的2个结构域之间的配对的接头，迫使所述结构域与另一条链的互补结构域配对，并产生2个抗原结合位点。双体更完整地描述于，例如，EP 404,097; WO 93/11161；和Holliger等人(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448。关于经工程改造的抗体变体的综述，通常参见Holliger和Hudson (2005) Nat. Biotechnol. 23:1126-1136。

本文中使用的术语“人源化抗体”表示，含有得自非人(例如，鼠)抗体以及人抗体的序列的抗体形式。这样的抗体含有源自非人免疫球蛋白的最少序列。一般而言，人源化抗体包含至少一个且通常为两个可变结构域的几乎全部，其中全部或几乎全部高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，并且全部或几乎全部FR区为人免疫球蛋白序列的FR区。人源化抗体还任选包含免疫球蛋白(通常为人免疫球蛋白)恒定区(Fc)的至少一部分。人源化形式的啮齿动物抗体通常包含亲本啮齿动物抗体的相同CDR序列，尽管为了增加亲和力、增加人源化抗体的稳定性或为了其它原因可以包括某些氨基酸置换。

本发明的抗体还包括这样的抗体：其具有经修饰的(或被封闭的) Fc区以提供改变的效应子功能。参见，例如，美国专利号5,624,821; WO2003/086310; WO2005/120571; WO2006/0057702; Presta (2006) Adv. Drug Delivery Rev. 58:640-656。这样的修饰可以用于增强或抑制免疫***的多种反应，在诊断和治疗中可能具有有益效果。Fc区的改变包括氨基酸变化(置换、缺失和***)、糖基化或去糖基化、和添加多个Fc。对Fc的改变还可以改变抗体的半衰期（在治疗性抗体的情况下），并且更长的半衰期会导致更低的给药频率、伴随的增加的便利性和减少的物质使用。参见Presta (2005) J. Allergy Clin. Immunol.116:731（734-35）。

术语“全人抗体”表示仅包含人免疫球蛋白蛋白序列的抗体。如果在小鼠中、在小鼠细胞中或在源自小鼠细胞的杂交瘤中生产，全人抗体可以含有鼠碳水化合物链。类似地，“小鼠抗体”表示仅包含小鼠免疫球蛋白序列的抗体。可以在人类中、在具有人免疫球蛋白种系序列的转基因动物中、通过噬菌体展示或其它分子生物学方法制备全人抗体。

本文中使用的术语“高变区”表示负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。高变区包含：来自“互补性决定区”或“CDR”的氨基酸残基（例如轻链可变结构域中的残基24-34 (CDRL1)、50-56 (CDRL2)和89-97 (CDRL3)，和重链可变结构域中的残基31-35 (CDRH1)、50-65 (CDRH2)和95-102 (CDRH3)）(Kabat等人(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.)，和/或来自“高变环”的那些残基(即轻链可变结构域中的残基26-32 (L1)、50-52 (L2)和91-96 (L3)和重链可变结构域中的26-32 (H1)、53-55 (H2)和96-101 (H3)(Chothia和Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917)。本文中使用的术语“框架”或“FR”残基表示，除了在本文中定义为CDR残基的高变区残基以外的那些可变结构域残基。上面的残基编号涉及Kabat编号***，且不一定详细地对应于在所附序列表中的序列编号。

“保守修饰的变体”或“保守置换”表示，氨基酸的置换是本领域技术人员已知的，且可以在通常不改变得到的分子的生物活性的情况下，甚至在多肽的必需区域中产生。这样的示例性置换优选地根据下面表1中所示的那些置换而产生：

。

另外，本领域技术人员公知，一般而言，在多肽的非必需区域中的单个氨基酸置换基本上不会改变生物活性。参见，例如，Watson等人(1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., 第224页(第4版)。

贯穿本说明书和权利要求书中使用的短语“基本上由……组成”或变体指示，包括任何列举的要素或要素的集合，且任选地包括具有与列举的要素类似或不同性质的其它要素，所述其它要素不会实质上改变指定的剂量方案、方法或组合物的基础的或新颖的性能。作为一个非限制性例子，基本上由列举的氨基酸序列组成的结合化合物还可以包括一个或多个氨基酸，包括一个或多个氨基酸残基的置换，所述置换不会实质上影响结合化合物的性能。

“免疫病症”或“免疫障碍”包括，例如，病理性炎症、炎症性病症和自身免疫性病症或疾病。“免疫病症”也表示感染、持续性感染和增殖性病症，诸如癌症、肿瘤和血管生成，包括抵抗被免疫***的根除的感染、肿瘤和癌症。“癌性病症”包括，例如，癌症、癌细胞、肿瘤、血管生成和癌变前的病症诸如发育异常。

所构想的制剂或方法的抗体或源自抗体的抗原结合位点的结合组合物与它的抗原的结合亲和力是与不相关抗原的亲和力的至少2倍、优选至少10倍、更优选至少20倍、且最优选至少100倍。在一个优选实施方案中，所述抗体具有大于约10⁹升/mol的亲和力，这例如通过Scatchard分析来确定。Munsen等人(1980) Analyt. Biochem. 107:220-239。

药物组合物定义

术语“填充剂”包括提供冷冻干燥产品的结构的试剂。用作填充剂的常见例子包括甘露醇、甘氨酸、乳糖和蔗糖。除了提供药学上优美的块状物以外，填充剂也可以在改变分解温度、提供冻融保护和增强长期贮存期间的蛋白稳定性方面赋予有用的特性。这些试剂还可以充当张度调节剂。

术语“缓冲剂”包括，在低压冻干之前将溶液pH维持在可接受范围内的那些试剂，且可以包括琥珀酸盐(琥珀酸钠或琥珀酸钾)、组氨酸、磷酸盐(磷酸钠或磷酸钾)、Tris(三(羟甲基)氨基甲烷)、二乙醇胺、柠檬酸盐(柠檬酸钠)等。本发明的缓冲剂具有在约5.0至约6.0范围内的pH；且优选地具有约5.5的pH。控制pH在该范围内的缓冲剂的例子包括：琥珀酸盐(诸如琥珀酸钠)、葡萄糖酸盐、组氨酸、柠檬酸盐和其它有机酸缓冲剂。在获得示例性的制剂中，适合使用在5.0-6.0的pH范围内的组氨酸、乙酸盐和柠檬酸盐缓冲剂。组氨酸和乙酸盐缓冲剂***的性能优于柠檬酸盐***。组氨酸缓冲液是一种优选的缓冲剂***，因为乙酸盐缓冲剂***与低压冻干法不相容。

术语“冷冻保护剂”通常包括这样的试剂：其给蛋白提供对抗冷冻诱导的应激的稳定性，据推测是通过优先从蛋白表面排除。它们也可以提供在初次和二次干燥以及长期产品贮存过程中的保护。例子是：聚合物诸如葡聚糖和聚乙二醇；糖诸如蔗糖、葡萄糖、海藻糖和乳糖；表面活性剂诸如聚山梨酯；和氨基酸诸如甘氨酸、精氨酸和丝氨酸。

术语“低压冻干法”、“低压冻干的”和“冷冻干燥”表示这样的方法：通过该方法，首先冷冻要干燥的物质，然后通过在真空环境中升华而除去冰或冷冻的溶剂。可以在预低压冻干的制剂中包括赋形剂，以增强低压冻干的产品在贮存后的稳定性。

术语“低压冻干保护剂”包括这样的试剂：其在干燥或“脱水”过程(初次和二次干燥循环)过程中给蛋白提供稳定性，据推测是通过提供无定形玻璃状基质和通过经由氢键与蛋白结合，从而替换在干燥过程中除去的水分子。这会帮助维持蛋白构象、使低压冻干循环过程中的蛋白降解最少化和提高长期产品稳定性。例子包括多元醇或糖诸如蔗糖和海藻糖。

术语“药物制剂”表示这样的制品：其呈使活性成分有效的形式，且其不含有对所述制剂要施用的受试者有毒的其它组分。

“药学上可接受的”赋形剂(媒介物、添加剂)是，可以适当地施用给哺乳动物受试者以提供有效剂量的所用活性成分的那些。

“重构时间”是用溶液将低压冻干的制剂再水合为不含颗粒的澄清溶液所需的时间。

“稳定的”制剂是这样的制剂：其中的蛋白在贮存后基本上保留它的物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物活性。在本领域中可得到用于测量蛋白稳定性的多种分析技术，且综述在：Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee编, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) 和Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10:29-90 (1993)。可以在选定的温度测量稳定性达选定的时间段。

“稳定的”低压冻干的抗体制剂是在下述情况下没有观察到显著变化的低压冻干的抗体制剂：在冷藏温度(2-8℃)保存至少12个月、优选2年、更优选3年；或在室温(23-27℃)保存至少3个月、优选6个月、更优选1年。稳定性的典型的可接受的标准如下。通过SEC-HPLC测得，不超过10%、优选不超过5%的抗体单体发生降解。通过视觉分析，再水合的溶液通常是无色的，或澄清至稍微乳白色。所述制剂的浓度、pH和重量克分子渗透压浓度具有不超过±10%变化。效能通常在参照的50-150%范围内。观察到不超过10%、优选不超过5%的截短。形成不超过10%、优选不超过5%的聚集。

“稳定的”药物抗体制剂(包括低压冻干的制剂、重构的液体、以及作为“最终”制剂的液体制剂(即，以前没有进行低压冻干))是在下述情况下没有观察到显著变化的药物抗体制剂：在冷藏温度(2-8℃)保存至少3个月、优选6个月、更优选1年，且甚至更优选地最多达2年。另外，“稳定的”液体制剂包括这样的液体制剂：其在包括25℃和40℃在内的温度保存包括1个月、3个月、6个月、12个月和/或24个月在内的时段后表现出期望的特征。稳定性的典型的可接受的标准如下。通过SEC-HPLC测得，通常不超过约10%、优选不超过约5%的抗体单体发生降解。通过视觉分析，药物抗体制剂是无色的，或澄清至稍微乳白色。所述制剂的浓度、pH和重量克分子渗透压浓度具有不超过±10%变化。效能通常在参照的50-150范围内。通常，观察到不超过约10%、优选不超过约5%的截短。通常，形成不超过约10%、优选不超过约5%的聚集。

如果在目检颜色和/或澄清度后，或者通过UV光散射、尺寸排阻色谱法(SEC)和动态光散射测得，抗体没有显示出显著的聚集增加、沉淀和/或变性，那么所述抗体在药物制剂中“保留它的物理稳定性”。蛋白构象的变化可以通过荧光光谱法（其确定蛋白三级结构）和通过FTIR光谱法（其确定蛋白二级结构）来评价。

如果抗体没有显示出显著的化学改变，那么所述抗体在药物制剂中“保留它的化学稳定性”。通过检测和定量化学上改变的形式的蛋白，可以评估化学稳定性。经常改变蛋白化学结构的降解过程包括水解或截短(通过诸如尺寸排阻色谱法和SDS-PAGE等方法来评价)、氧化(通过诸如与质谱法或MALDI/TOF/MS结合的肽谱法等方法来评价)、脱酰胺作用(通过诸如离子交换色谱法、毛细管等电聚焦、肽谱法、异天冬氨酸测量等方法来评价)和异构化(通过测量异天冬氨酸含量、肽谱法等来评价)。

如果抗体在给定时间的生物活性是在制备药物制剂时表现出的生物活性的预定范围内，那么所述抗体在药物制剂中“保留它的生物活性”。抗体的生物活性可以例如通过抗原结合测定来确定。

术语“等渗的”是指，目标制剂具有与人血基本上相同的渗透压。等渗制剂通常具有约270-328 mOsm的渗透压。稍微低渗的压力是250-269 mOsm，且稍微高渗的压力是328-350 mOsm。例如，使用蒸气压或冰冷冻型渗透压计，可以测量渗透压。

张度调节剂：使用盐(NaCl、KCl、MgCl₂、CaCl₂等) 作为张度调节剂来控制渗透压。另外，冷冻保护剂/低压冻干保护剂和/或填充剂诸如蔗糖、甘露醇、甘氨酸等可以充当张度调节剂。

分析方法

适合用于评价产品稳定性的分析方法包括尺寸排阻色谱法(SEC)、动态光散射试验(DLS)、示差扫描量热法(DSC)、异天冬氨酸定量、效能、在340 nm的UV、UV光谱法和FTIR. SEC (J. Pharm. Scien., 83:1645-1650, (1994)；Pharm. Res., 11:485 (1994)；J. Pharm. Bio. Anal., 15:1928 (1997)；J. Pharm. Bio. Anal., 14:1133-1140 (1986))测量产品中的单体百分比，并给出可溶性聚集体的量的信息。DSC (Pharm. Res., 15:200 (1998)；Pharm. Res., 9:109 (1982))给出蛋白变性温度和玻璃转化温度的信息。DLS (American Lab. (1991年11月))测量平均扩散系数，并给出可溶性的和不溶性的聚集体的量的信息。在340 nm的UV测量在340 nm的散射光强度，并给出关于可溶性的和不溶性的聚集体的量的信息。UV光谱法测量在278 nm的吸光度，并给出蛋白浓度的信息，FTIR (Eur. J. Pharm. Biopharm., 45:231 (1998)；Pharm. Res., 12:1250 (1995)；J. Pharm. Scien., 85:1290 (1996)；J. Pharm. Scien., 87:1069 (1998))测量一个区域中的酰胺的红外光谱，并给出蛋白二级结构的信息。

使用Isoquant异天冬氨酸检测***(Isoquant Isoaspartate Detection System，Promega)，测量样品中的异天冬氨酸含量。所述试剂盒使用酶蛋白异天冬氨酰基甲基转移酶(PIMT)来特异性地检测异天冬氨酸残基在靶蛋白中的存在。PIMT催化甲基从S-腺苷基-L-蛋氨酸向异天冬氨酸的α-羧基位置的转移，从而在该过程中产生S-腺苷基-L-高半胱氨酸(SAH)。这是相对较小的分子，且通常可以使用在试剂盒中提供的SAH HPLC标准品通过反相HPLC进行分离和定量。

通过抗体的结合它的抗原的能力，可以测量所述抗体的效能或生物鉴别。通过本领域技术人员已知的任意方法，例如，免疫测定法，诸如ELISA (酶联免疫吸附测定)，可以定量抗体与它的抗原的特异性结合。

“重构的”制剂是已经如下制备的制剂：将低压冻干的蛋白制剂溶解在稀释剂中，使得所述蛋白分散在重构的制剂中。重构的制剂适合用于给药（例如胃肠外给药)，且可以任选地适合用于皮下给药。

人源化的抗-PD-1抗体

在WO2008/156712中描述了编码人源化抗体h409A11、h409A16和h409A17的重链和轻链的可变区的DNA构建体。

前述书面说明部分被认为足以使本领域技术人员能够实践本发明。本发明不受保藏的培养物范围的限制，因为保藏的实施方案意欲作为本发明的一个方面的单个例证，任何功能上等同的培养物都在本发明范围内。本文中的保藏材料并不构成承认：本文包含的书面描述不足以实践本发明的任何方面(包括其最佳方式)，也不应解释为将权利要求的范围限制到其所代表的具体例子。实际上，除了本文所展示和描述的那些内容之外，本领域技术人员从前述描述显而易见对本发明的各种修改，并且所述修改落入所附的权利要求的范围内。

提供了示例性的抗-人PD-1抗体的序列；所述序列的总结表提供在表6中。在单独的序列标识符下提供了CDR，如在表2中关于h409A11所示。

通常，人源化的抗-PD-1抗体的氨基酸序列变体的氨基酸序列与重链或轻链的原始人源化抗体氨基酸序列具有至少75%氨基酸序列同一性，更优选至少80%、更优选至少85%、更优选至少90%和最优选至少95%、98%或99%。关于该序列的同一性或同源性在本文中被定义为，在下述情况下，候选序列中与人源化的抗-PD-1残基相同的氨基酸残基的百分比：比对所述序列并如果必要的话引入缺口以实现最大序列同一性百分比，且不考虑作为序列同一性的一部分的任何保守置换。N-端、C-端、或者在抗体序列中的内部延伸、缺失或***都不应当解释为影响序列同一性或同源性。

人源化抗体可以选自任意类型的免疫球蛋白，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE。优选地，所述抗体是IgG抗体。可以使用IgG的任意同种型，包括IgG₁、IgG₂、IgG₃和IgG₄。可以将不同的恒定结构域附加至本文中提供的人源化的V_L和V_H区域。例如，如果本发明的抗体(或片段)的特定预期用途是引发改变的效应子功能，可以使用除了IgG1以外的重链恒定结构域。尽管IgG1抗体会提供长半衰期和效应子功能（诸如补体活化和抗体依赖性的细胞的细胞毒性），这样的活性可能对于抗体的所有用途而言不是合乎需要的。在这样的情况下，可以使用例如IgG4恒定结构域。

同样地，任一类轻链可以用于本文的组合物和方法中。具体地，κ、λ或其变体可用于本组合物和方法中。

根据Kabat的标准序列定义，确定CDR和FR残基。Kabat等人(1987) Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda Md。

可以将信号序列或编码信号序列的核酸序列附加至各个抗体链的N-端，以产生前体蛋白，用于从宿主细胞中分泌。也可以使用替代性的信号序列，并且其中几种可以参见：“SPdb: a Signal Peptide Database.” Choo等人(2005) BMC Bioinformatics 6:249。

人源化的抗-PD-1的生物活性

本发明的制剂包括，当重构或呈液体形式时具有生物活性的抗体及其片段。本文中使用的术语“具有生物活性的”表示这样的抗体或抗体片段：其能够结合期望的抗原表位，并直接地或间接地发挥生物学效应。通常，这些效应源自PD-1与它的配体的结合失败。本文中使用的术语“特异性的”表示，抗体与靶抗原表位的选择性结合。通过在给定的条件的集合下对比与PD-1的结合和与无关的抗原或抗原混合物的结合，可以试验抗体的结合特异性。

低压冻干的药物组合物

治疗性蛋白的低压冻干的制剂会提供几个优点。低压冻干的制剂通常会提供比溶液制剂更好的化学稳定性和因而增加的半衰期。低压冻干的制剂也可根据临床因素（例如施用途径或剂量）以不同浓度重构。例如，如果必需皮下施用，低压冻干的制剂可以高浓度（即在小体积中）重构；或如果静脉内施用，则以低浓度重构。如果特定受试者需要高剂量，特别是如果皮下施用（其中注射体积必须最小化），则高浓度也可为必需的。在美国专利号6,267,958中公开了一种这样的低压冻干的抗体制剂，其特此通过引用整体并入。在美国专利号7,247,707中公开了另一种治疗性蛋白的低压冻干的制剂，其特此通过引用整体并入。

通常，在重构高浓度药物产品（DP，在一个示例性实施方案中，为人源化的抗-PD-1抗体h409A11或其抗原结合片段）的预期下，即在小体积水中重构的预期下，制备低压冻干的制剂。然后可容易地使用水或等渗缓冲液进行后续稀释，以将DP稀释至更低的浓度。通常，在本发明的低压冻干的制剂中包括下述水平的赋形剂：当以高DP浓度重构（例如用于皮下施用）时，其可产生大体等渗的制剂。在大体积水中重构以得到较低DP浓度，必然会降低重构的溶液的张度，但是在非皮下（例如静脉内）施用的情况下，这样的降低影响不大。如果在较低DP浓度下期望等渗性，可在标准的小体积水中重构低压冻干的粉末，然后用等渗稀释液（例如0.9%氯化钠）进一步稀释。

在本发明的一个实施方案中，将人源化的抗-PD-1抗体(或其抗原结合片段)配制为用于重构的低压冻干的粉末，并用于静脉内给药。示例性的制剂描述于表3-4中和图1-9中。在某些实施方案中，以约50 mg/小瓶提供所述抗体(或其抗原结合片段)，并在使用前用无菌注射用水重构。如果需要的话，可使用0.9% 氯化钠注射液（美国药典）在无菌IV容器中无菌稀释重构的抗体。重构制剂的靶pH为5.5±0.5。在不同的实施方案中，本发明的低压冻干的制剂能够将抗-PD-1抗体重构至高浓度，诸如约20、25、30、40、50、60、75、100 mg/mL或更高。

本发明在某些实施方案中提供了一种低压冻干的制剂，其包含人源化的抗-PD-1抗体、在约pH 5.5或在约pH 5.0，例如在约5.1、5.2、5.3、5.4、5.6、5.7、5.8、5.9或6.0的组氨酸缓冲液。

当列举pH值的范围（诸如“在pH 5.5至6.0之间的pH”）时，所述范围旨在包括列举的数值。除非另外说明，pH指重构本发明的低压冻干的制剂后的pH。通常在25℃使用标准玻璃泡pH计测量pH。本文中使用的包含“pH X的组氨酸缓冲液”的溶液指pH为X并包含组氨酸缓冲液的溶液，即所述pH旨在表示指溶液的pH。

表3中的制剂反映了如在小瓶中低压冻干的和如重构的批次制剂中的组分的重量。根据定义，低压冻干的制剂基本上是干燥的，因此浓度的概念不可用于描述它们。以单位剂量小瓶中的组分重量的方式来描述低压冻干的制剂更有用，但这是有问题的，因为其会根据不同剂量或小瓶大小而变化。在描述本发明的低压冻干的制剂时，以相对于在相同样品（例如小瓶）中药用物质(DS)重量的组分的重量的比率来表达组分的量是有用的。这种比率可以表示为百分比。这样的比率反映了本发明的低压冻干的制剂的固有性质，独立于小瓶大小、剂量和重构方案。

在其它实施方案中，以用于制备低压冻干的制剂（诸如预低压冻干的溶液）的预低压冻干的溶液的形式，定义抗-人PD-1抗体或抗原结合片段的低压冻干的制剂。在一个实施方案中，所述预低压冻干的溶液包含浓度为约25mg/mL的抗体或其抗原结合片段。这样的预低压冻干的溶液可以是在pH 4.4-5.2 (包括约4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1.和5.2)，例如优选约pH 4.8或约pH 5.5。

在其它实施方案中，以从低压冻干的制剂产生的重构的溶液（例如表4公开的重构的溶液）的方式，定义抗-人PD-1抗体或抗原结合片段的低压冻干的制剂。

重构的溶液可包含浓度为约10、15、20、25、30、40、50、60、75、80、90或100 mg/mL或更高浓度（诸如150mg/mL、200 mg/mL、250 mg/mL或高达约300 mg/mL）的抗体或其抗原结合片段。这样的重构的溶液可以是在约pH 5.5、或约pH 5.0至约6.0的范围。

本发明的低压冻干的制剂由预低压冻干溶液经低压冻干法(冷冻干燥) 形成。通过冷冻制剂和随后在适于初次干燥的温度使水升华，进行冷冻干燥。在此条件下，产物温度低于制剂的低共熔点或分解温度。在通常约50-250毫托范围的合适压力下，通常，初次干燥的存放温度范围为约-30至25℃（假设产物在初次干燥过程中保持冷冻）。制剂、容纳样品的容器（例如，玻璃小瓶）的大小和类型以及液体的体积决定了干燥所需的时间，所述时间的范围可为几小时至几天（例如40-60小时）。二次干燥阶段可在约0-40℃进行，这主要取决于容器的类型和大小以及采用的蛋白的类型。二次干燥时间由产物中的期望残余湿度水平决定，通常需要至少约5小时。通常，低压冻干的制剂的含水量小于约5%，优选小于约3%。压力可与在初次干燥步骤中应用的压力相同。冷冻干燥条件可以随制剂和小瓶大小而变化。

在某些情况下，可能需要在进行蛋白重构的容器中低压冻干蛋白制剂，以便避免转移步骤。在此情况下的容器可为例如3、5、10、20、50或100 cc小瓶。

在施用前重构本发明的低压冻干的制剂。可以以约10、15、20、25、30、40、50、60、75、80、90或100 mg/mL的浓度或更高的浓度（诸如150mg/mL、200 mg/mL、250 mg/mL或300 mg/mL、最高达约500 mg/mL）重构蛋白。在意图皮下递送重构的制剂的情况下，高蛋白浓度特别有用。然而，对于其它施用途径例如静脉内施用，可能需要较低浓度的蛋白(例如约5-50 mg/mL)。

重构通常在约25℃的温度进行以保证完全水合，尽管根据需要可以应用其它温度。重构所需的时间将取决于例如稀释剂的类型、赋形剂（一种或多种）和蛋白的量。示例性稀释剂包括无菌水、抑菌性注射用水(BWFI)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)、无菌盐水溶液、林格氏溶液或葡萄糖溶液。

预期本发明的低压冻干的制剂会稳定至少约36个月(基于得自图1-9的稳定性数据)。另外，基于得自在聚丙烯试管中重构的h409A11制剂在2-8℃保存24个月的稳定性数据，预期所述液体制剂会表现出至少24个月的稳定性。

与图1-9中所示的结果相一致，已经观察了冷藏的h409A11的重构的制剂的在2年中的稳定性。将聚丙烯试管中的2mL样品在5℃和25H和RH4条件下保存，并在最初、1、3、6、9、12、18和24个月阶段时进行试验。该重构的h409A11制剂在与液体h409A11制剂(即，没有低压冻干的制剂)相同的浓度具有相同的取代基，并预期稳定性是相同的。

液体药物组合物

通过将液体形式的药用物质(例如，抗-人源化的PD-1) (例如，在水性药物制剂中的h409A11)和用缓冲液将它交换进期望的缓冲液中(作为纯化过程的最后一步)，可以制备液体抗体制剂。在该实施方案中，不存在低压冻干步骤。将最终的缓冲液中的药用物质浓缩至期望的浓度。将诸如蔗糖和聚山梨酯80等赋形剂加入药用物质中，并使用适当的缓冲液将它稀释至最终蛋白浓度。使用0.22 μm过滤器过滤最终的配制的药用物质，并装入最终的容器(例如玻璃小瓶)中。这样的液体制剂的例子是包含10 mM组氨酸pH 5.5、7% 蔗糖、0.02% 聚山梨酯80和25 mg/mL h409A11的最终的液体制剂。

可得到多篇参考文献以便于药学上可接受的载体或赋形剂的选择。参见，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences and U.S. Pharmacopeia: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, PA (1984); Hardman等人(2001) Goodman and Gilman ’ s The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, NY; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, NY; Avis等人(编) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman, 等人(编) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman等人(编) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner and Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, NY。

毒性是选择治疗剂的合适剂量的考虑因素，所述治疗剂例如人源化的抗-PD-1抗体(或其抗原结合片段)。抗体组合物的毒性和治疗效果可通过标准药学操作在细胞培养物或实验动物中确定，例如确定LD₅₀ (对50%的群体致命的剂量)和ED₅₀ (在50%的群体中治疗上有效的剂量)。毒性和治疗效果的剂量比率是治疗指数，其可表示为LD₅₀相对于ED₅₀的比率。优选表现出高治疗指数的抗体。从这些细胞培养测定和动物研究获得的数据可用于制定在人类中使用的剂量范围。这样的化合物的剂量优选在包括ED₅₀并具有少量毒性或无毒性的循环浓度范围内。剂量可在此范围内变化，这取决于应用的剂型和使用的施用途径。

合适的施用途径可例如包括胃肠外递送，包括肌肉内、真皮内、皮下、髓内注射、以及鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内。可以许多常规方式，例如腹膜内、胃肠外、动脉内或静脉内注射来施用药物。在其中必须限制溶液体积的施用模式（例如，皮下施用）需要低压冻干的制剂，从而能够以高浓度重构。

可替换地，可以以局部而非全身方式施用抗体，例如，通过将抗体直接注射进以免疫病理学为特征的病原体诱导的病灶，所述抗体经常是在贮库或缓释制剂中。此外，可在靶向的药物递送***中施用抗体，例如在组织特异性抗体包被的脂质体中，所述脂质体靶向例如以免疫病理学为特征的病原体诱导的病灶。所述脂质体将靶向受损的组织并被其选择性摄取。

治疗剂的施用方案的选择取决于一些因素，包括实体的血清或组织周转率（turnover rate）、症状的水平、实体的免疫原性和在生物基质中的靶细胞的可达性。优选地，施用方案会将递送至患者的治疗剂的量最大化，并具有可接受的副作用水平。因此，递送的生物剂的量部分地取决于特定的实体和治疗的病症的严重程度。选择抗体、细胞因子和小分子的合适剂量的指导是可得到的。参见，例如，Wawrzynczak (1996) Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, UK; Kresina (编) (1991) Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, New York, NY; Bach (编) (1993) Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, New York, NY; Baert等人(2003) New Engl. J. Med. 348:601-608; Milgrom等人(1999) New Engl. J. Med. 341:1966-1973; Slamon等人(2001) New Engl. J. Med. 344:783-792; Beniaminovitz等人(2000) New Engl. J. Med. 342:613-619; Ghosh等人(2003) New Engl. J. Med. 348:24-32; Lipsky等人(2000) New Engl. J. Med. 343:1594-1602; Physicians' Desk Reference 2003 (Physicians' Desk Reference, 第57版); Medical Economics Company; ISBN: 1563634457；第57版(2002年11月)。

临床医师会决定合适的剂量，例如使用本领域中已知或疑似会影响治疗或预计会影响治疗的参数或因素。蛋白的合适剂量（“治疗有效量”）将取决于：例如，待治疗的病症，病症的严重程度和过程，是否为了预防或治疗目的而施用蛋白，以前的治疗，患者的临床史和对蛋白的应答，使用的蛋白的类型和主治医师的决定。通常，剂量从比最适剂量略少的量开始，此后以小量增量来增加，直至得到相对于任何不良副作用而言期望的或最适的效果。重要的诊断措施包括例如炎症或产生的炎性细胞因子的水平的症状的那些诊断措施。合适地对患者单次或重复地施用抗体。可单独地或与其它药物或治疗结合地施用抗体。

可以通过连续输注或通过在例如1天，每周1-7次，1周，2周，3周，每个月，每2个月等的间隔的剂量施用药物抗体制剂。优选的剂量方案是包括避免显著不希望的副作用的最大剂量或剂量频率的剂量方案。总的每周剂量通常为至少0.05 μg/kg、0.2 μg/kg、0.5 μg/kg、1 μg/kg、10 μg/kg、100 μg/kg、0.2 mg/kg、1.0 mg/kg、2.0 mg/kg、10 mg/kg、25 mg/kg、50 mg/kg体重或更高。参见，例如，Yang等人(2003) New Engl. J. Med. 349:427-434; Herold等人(2002) New Engl. J. Med. 346:1692-1698; Liu等人(1999) J. Neurol. Neurosurg. Psych. 67:451-456; Portielji等人(20003) Cancer Immunol. Immunother. 52:133-144。小分子治疗剂（例如，肽模拟物、天然产物，或有机化学试剂）的期望剂量与抗体或多肽基本相同，以摩尔/kg为基准。

在某些实施方案中，定量给药包括：在整个治疗过程中给受试者施用递增剂量的1.0、3.0和10 mg/kg的药物制剂，即包含h409A11的制剂。包含h409A11的制剂可以是重构的液体制剂，或者它可以是以前没有低压冻干的液体制剂。时程可以变化，且可以持续，只要得到预期效应即可。在某些实施方案中，剂量递增会持续至最高约10mg/kg的剂量。在某些实施方案中，所述受试者具有黑素瘤或其它形式的实体瘤的组织学或细胞学诊断，且在某些情况下，受试者可以患有不可测量的疾病。在某些实施方案中，所述受试者已经用其它化疗剂治疗过，而在其它实施方案中，所述受试者将是原初治疗者。

在其它实施方案中，定量给药方案包括：在整个治疗过程中施用1、3或10mg/kg的剂量的任一种本文中描述的药物制剂(即包含h409A11的制剂)。对于这样的恒定定量给药方案，剂量之间的间隔是约14天(±2天)。在某些实施方案中，剂量之间的间隔是约21天(±2天)。

在某些实施方案中，所述定量给药方案包括：以患者内剂量递增，施用约0.005mg/kg至约10mg/kg的剂量。在某些实施方案中，以每3周或每2周的间隔，施用5 mg/kg或10 mg/kg的剂量。在其它实施方案中，对于黑素瘤患者或患有其它实体瘤的患者，以3周间隔施用3mg/kg的剂量。在这些实施方案中，患者应当患有不可切除的疾病；但是，患者可以以前接受过外科手术。

在某些实施方案中，给受试者施用30分钟IV输注的本文中描述的任一种药物制剂。在递增剂量的某些实施方案中，在第一剂量和第二剂量之间的给药间隔是约28天(±1天)。在某些实施方案中，在第二剂量和第三剂量之间的间隔是约14天(±2天)。在某些实施方案中，对于第二剂量以后的剂量，给药间隔是约14天(±2天)。

在某些实施方案中，在生物测定法中将使用细胞表面标志物和/或细胞因子标志物（如在共同未决的专利公开WO2012/018538或WO2008/156712中所述），用于涉及PD-1途径的阻断的监测方案、诊断方案、患者选择方案和/或治疗方案。

皮下施用可通过使用注射器或使用其它注射装置（例如Inject-ease^®装置）、笔式注射器、或无针装置（例如MediJector和BioJector^®）注射来进行。

参考下述实施例会最好地理解本发明的广泛范围，所述实施例无意将本发明限制至特定实施方案。仅仅通过实施例给出本文描述的特定实施方案，并且本发明由所附权利要求的术语以及这些权利要求的等同方案的全部范围限定。

实施例

实施例1

抗体生产

h409A11是一种结合人PD-1并阻断PD-1与它的配体PDL1和PDL2的相互作用的人源化的单克隆抗体。所述抗体是在Fc区中具有稳定性的S228P序列改变的IgG4/κ同种型。表2提供了CDR序列的列表。源自该氨基酸序列（不包括糖基化）的重链和轻链的理论分子量分别是49.3kDa和23.7 kDa。通过用hPD-1 DNA免疫小鼠来生产亲本抗体(hPD-1.09A)。如在共同未决的WO2008/156712中所述，使用CDR嫁接技术(例如，美国专利号5,225,539)，由Medical Research Council (英国剑桥)将亲本鼠抗-人PD-1抗体人源化来制备h409A11抗体。

构建了用于表达h409A11的重链和轻链的表达质粒。通过DNA序列分析，确认了编码重链和轻链的核苷酸序列以及它们各自的启动子和聚腺苷酸信号序列。随后使用所述表达载体转染CHO细胞系。基于生长、生产力和生产稳定性，选择表达抗体的克隆，用于制备主种子库(Master Seed Bank，MSB)。然后使用该MSB来制备抗体和产生主细胞库(Master Cell Bank，MCB)。

在摇瓶、培养袋和种子生物反应器中繁殖得自MCB的细胞以制备用于生产生物反应器的接种物，其用于生产抗体产物。进一步加工包括3个色谱法步骤(蛋白A亲和色谱法、阳离子交换色谱法和阴离子交换色谱法)、2个正交病毒清除步骤(低pH病毒灭活和病毒减少过滤)、超滤/渗滤和最终的0.2 μm过滤步骤。

h409A11结构和特征

h409A11是高度选择性的人源化的单克隆抗体，其会阻断人PD-1和它的配体PD-L1和PD-L2之间的相互作用。h409A11在每条重链的Fc结构域内的天冬酰胺297处被异类糖基化，从而产生通常在148.9和149.5 kDa范围内的分子量，而这取决于连接的聚糖链。h409A11的重链和轻链的氨基酸序列显示在SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:36中。不含前导序列的轻链包含SEQ ID NO: 36的氨基酸残基20-237，且不含前导序列的重链包含SEQ ID NO: 31的氨基酸残基20-466。

稳定的人源化的PD-1制剂

在某些实施方案中，稳定的人源化的PD-1（例如，h409A11）是在冷藏条件（温度范围：通常约2-8℃，但是在某些情况下，所述水性制剂可以在其它温度（包括在约25℃和约40℃）在最多达约12个月的时段内表现出稳定性）下在10 mM组氨酸缓冲液（pH 5.0-6.0）中以≥25mg/mL的浓度储存的水溶液。在某些实施方案中，稳定的人源化的PD-1（例如，h409A11）是在10 mM组氨酸缓冲液（pH 5.0-6.0）中以约25 mg/mL的浓度存在的水溶液。稳定的制剂（即，药用物质）通常是澄清至乳白色溶液，且可以含有微粒。

在某些实施方案中，在含有蔗糖和聚山梨酯80的组氨酸缓冲液(pH 5.5)中配制h409A11的液体或冷冻溶液。

其它示例性的制剂包括：低压冻干形式的、在含有蔗糖和聚山梨酯80的组氨酸缓冲液(pH 5.5)中配制的h409A11。

在某些实施方案中，在意图单次使用的小瓶中提供作为低压冻干的粉末的稳定的人源化的PD-1制剂。

在某些实施方案中，用注射用水(WFI)重构稳定的人源化的PD-1制剂，并用适当体积的0.9%注射用氯化钠在无菌IV容器中进行无菌稀释，以形成混合物溶液。

生物活性

通过它的与PD-L1 (PD-1的天然配体)竞争结合人PD-1的能力（在竞争性ELISA中相对于参照物质进行定量），测量人源化的抗-PD-1抗体的生物活性。本文中描述的稳定制剂在长时间段（包括最多达至少约18个月）内表现出生物活性。在图1-9中解释了几批h409A11在不同贮存条件下的稳定性。

人源化的抗-PD-1抗体的稳定制剂

如下制备抗-PD-1抗体的低压冻干的制剂。在表3中提供了h409A11抗体的示例性批次制剂。抗体的终浓度为25 mg/mL。该批制剂可以用于制备低压冻干的50 mg/小瓶单位，如下文参考表4所讨论的。使用来自植物来源的聚山梨酯80。可加入额外的盐酸或氢氧化钠来调节pH至期望的大约5.5 (±0.2)的值。使用无菌注射用水（WFI）使组分达到14 L的终体积。相应地，更小批次可通过按比例减少表3中所列的量来制备。

通过将液体形式的药用物质(例如，得自本文中所描述的批次制剂的抗-人源化的PD-1) (例如，在水性制剂中的h409A11)和用缓冲液将它交换进期望的缓冲液中(作为纯化过程的最后一步)，制备一种示例性的液体抗体制剂。在该情况下，不存在先前的低压冻干步骤。将最终的组氨酸缓冲液中的药用物质浓缩至期望的浓度。将诸如蔗糖和聚山梨酯80等赋形剂加入药用物质中，并使用适当的缓冲液将它稀释至最终蛋白浓度。使用0.22 μm过滤器过滤最终的配制的药用物质，并装入最终的容器(例如玻璃小瓶)中。这样的液体制剂包括包含10 mM组氨酸pH 5.5、7% 蔗糖、0.02% 聚山梨酯80和25 mg/mL h409A11的最终的液体制剂。

Figure 2012800145404100002DEST_PATH_IMAGE003

表4提供了人源化的抗-PD-1的示例性最终低压冻干的制剂的单位组成。

在低压冻干以除去水以后，表4的单位制剂包含1/20,000的表3的批次制剂。加入50 mg DS，其为2.0 mL表3的25 mg/mL批次制剂。给每个小瓶装入2.4 mL，并用2.3 mL sWFI重构，产生大约2.4 mL重构的溶液（由于低压冻干饼的膨胀体积）。

在无菌的20 mm颈、6R DIN、1型玻璃管小瓶中包装药物，用20-mm灰色丁基橡胶塞封闭，并用铝压密封盖密封。将小瓶贮存于2-8℃，在运输时冷藏。

混合（compounding）包括以下步骤。在去了皮重的混合容器中加入需要量的注射用水（WFI）。在混合下加入并溶解蔗糖、组氨酸和植物来源的聚山梨酯80。测量pH，如果需要的话进行调节，以使pH达到约5.4--5.6。使用盐酸和/或氢氧化钠调节pH。将药用物质平衡至环境温度，并将药用物质缓慢加入混合容器中。继续轻柔混合以避免起泡。再次测量pH，如果需要的话，将pH调至大约5.5。加入WFI至本体溶液的最终重量，同时继续轻柔混和。

过滤包括以下步骤。将澄清过滤器(0.22µm)和消毒过滤器(0.22µm) 连接至混合容器。在澄清过滤步骤之后，收集本体溶液的等分试样用于生物负荷试验。使用0.22 μm滤器进行无菌过滤，过滤至无菌容器中。在无菌过滤以后，取出样品的等分试样，用于本体无菌性试验。在产品过滤之后进行滤器完整性试验。

填充包括以下步骤。使用合适的填充设备，将产品溶液无菌填充进灭菌的I型管状玻璃小瓶中，以得到2.4 mL的靶填充体积。在填充过程中进行填充重量检查。将灭菌的冻干型塞（lyo-shape stoppers）部分地置于填充的小瓶中。将填充的小瓶装载进合适的冷冻干燥器中。

低压冻干、加塞和加盖包括以下步骤。使用合适的低压冻干周期将填充的小瓶低压冻干。在低压冻干完成后，用0.22 μm过滤的氮气回填小瓶并完全加塞。将加塞的小瓶从冷冻干燥器中取出并密封它们。

检查得到的小瓶是否有肉眼可见的缺陷，并储存于2-8℃。在冷藏条件下运输制成的单位剂量小瓶。

实施例2

人源化的抗-PD-1抗体的低压冻干的制剂的稳定性试验

图1-9提供了人源化的抗-人PD-1抗体的低压冻干的制剂在不同贮存条件下的稳定性试验数据。以直立构型贮存小瓶。如在下面更详细地讨论的，本发明的制剂以及类似的液体制剂表现出在pH 5.5 (组氨酸缓冲液)低压冻干的抗体在至少24个月中的稳定性。

如下评估稳定性。将样品在6R DIN I型玻璃小瓶中低压冻干，用20 mm溴丁基冻干塞(Helvoet Rubber & Plastic Technologies BV, Hellevoetsluis, 荷兰)和易拉铝密封盖密封。将小瓶在以下贮存条件下置于稳定性台上：5℃(5±3℃)，25H (25，60% 相对湿度)，或RH4 (40℃，70% 相对湿度)。在初始时间点获取样品，并且对于某些样品，在包括1、2、3、6、9、12、18和24个月在内的多个时间点获取样品。

样品稳定性通过图1-9中的表所示的多种特征进行说明。对低压冻干的样品进行肉眼检查，重构，并对重构的制剂进行肉眼检查。测量重构后的样品的pH，通过紫外吸光度测定蛋白浓度。通过CE-SDS技术分析样品，其中在还原和非还原条件下用十二烷基硫酸钠(SDS)将蛋白变性，并使用毛细管电泳(CE)进行分离。所述蛋白基于它们的表观分子量而分离。在非还原条件下，除了主要IgG峰以外的所有物质被归类为杂质。在还原条件下，IgG被拆分为重链和轻链。所有其它物质被归类为杂质。

通过高效尺寸排阻色谱法(HPSEC)进一步评估样品的纯度，其中测定单体的百分比以及高分子量物质（可能为聚集体）和晚期洗脱峰（可能为降解产物）的百分比。

在图1-9中提供了其它样品表征数据。使用高效离子交换色谱法(HP-IEX)，通过揭示酸性或碱性变体的存在来评估纯度。将结果表示为总观察物质的百分比。使用酶联免疫吸附测定（ELISA）进一步表征样品的与人PD-1结合的生物学功能。达到最大结合的一半所需的抗体浓度被称作EC₅₀。通过将试验样品的结合曲线与参照物质(或对照)进行对比(通过EC₅₀的比率(ration))，评估试验样品的效能。将效能表示为参照物质(或对照)的相对效能百分比。还通过电量滴定法测定了低压冻干粉末的含水量。进行颗粒物计数测量以计数≥10 μm和≥25 μm的颗粒。用于这些测量的方法是基于USP<788>。

这些结果证实了本发明的制剂在约pH 5.5在至少24个月内的高稳定性。数据没有揭示这样的随时间趋势：该趋势会反映样品在试验的贮存条件下的不稳定性。

实施例3：初步临床结果

h409A11 (抗-PD-1单克隆抗体)在具有晚期实体瘤的患者中的1期研究

1期试验检验了h409A11的安全性、PK、PD和抗肿瘤活性。在患有标准化学疗法难治的晚期恶性肿瘤的患者中，进行了标签公开的剂量递增研究。在最初的患者集合中，用如本文中所述的稳定的h409A11制剂治疗患有晚期实体瘤的患者。关于外科手术没有限制/约束；但是，患者目前不是外科手术候选人。以1、3或10 mg/kg的IV剂量，招募3-6位患者的组群(3+3设计)。在初始剂量和28天的第1个循环以后，允许患者随后接受每2周施用的多次剂量。对于1期部分A，以1 mg/kg治疗3位患者，以3 mg/kg治疗3位患者，并以10 mg/kg治疗9位患者，都每2周施用。没有患者内剂量递增。使用RECIST 1.1指南，每8周进行放射摄影评估。

9位患者（每个剂量水平3个）完成了剂量限制性毒性(DLT)阶段(28天)。患者具有非小细胞肺癌(NSCLC，n=3)、直肠癌(n=2)、黑素瘤(MEL，n=2)、肉瘤(n=1)或类癌(n=1)。迄今为止，共施用了63个剂量(中位值7/患者；最大12)，没有DLT。在所有剂量中的药物相关的不利事件(AE)包括：1级疲劳(n=3)、恶心(n=2)、腹泻(n=1)、味觉障碍(n=1)、***痛(n=1)和瘙痒(N=1)。报告的1个药物相关的2级AE为瘙痒。没有观察到≥3级的药物相关的AE。PK数据显示在表5中。基于RECIST，1位患有MEL的患者在治疗>6个月时具有部分应答，并在另外3位患有晚期癌症的患者中观察到肿瘤大小减小(稳定疾病)的初步迹象。这些结果表明，h409A11在3个试验的剂量水平(即，1、3和5 mg/kg)被良好地耐受，没有DLT。观察到了抗肿瘤活性的证据。

Figure 2012800145404100002DEST_PATH_IMAGE005

Figure 2012800145404100002DEST_PATH_IMAGE007

如本文（包括所附权利要求书）中使用的，除非上下文另外清楚地指明，词语的单数形式诸如“一个”、“一种”和“所述”包括其对应的复数形式。除非另有说明，本文中提及的蛋白和受试者为人蛋白和受试者，而不是其它物种。

参考文献

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本文中引用的所有参考文献都通过引用并入，其程度如同每篇单独的出版物、数据库条目(例如Genbank序列或GeneID条目)、专利申请或专利被明确地且单独地指出通过引用并入。该通过引用并入的声明由申请人依照37 C.F.R. §1.57(b)(1)提出，涉及各个和每个单独的出版物、数据库条目（例如Genbank序列或GeneID条目）、专利申请或专利，其中各个都依照37 C.F.R. §1.57(b)(2)明确地鉴别，即使这样的引用不紧接于通过引用并入的专门声明。如果包含的话，在说明书中包含的通过引用并入的专门声明不以任何方式弱化该通过引用并入的一般声明。本文中对参考文献的引用无意承认：所述参考文献为有关的现有技术，其也不构成关于这些出版物或文件的内容或日期的任何承认。

**********************************************************

<160> 38 序列。

序列表

<110> Merck Sharp & Dohme Corp.

Sharma, Manoj K.

Narasimhan, Chakravarthy Nachu

Gergich, Kevin

Kang, Soonmo Peter

<120> 针对人程序性死亡受体PD-1的抗体的稳定制剂和有关的治疗

<130> 23060 PCT

<150> 61/470,121

<151> 2011-03-31

<160> 38

<170> PatentIn 3.5版本

<210> 1

<211> 435

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hPD-1.08A重链可变区

<400> 1

atgrgatgga gctgtatcat kctctttttg gtagcaacag ctacaggtgt ccactcccag 60

gtccaactgc agcagcctgg ggctgaactg gtgaagcctg gggcttcagt gaagttgtcc 120

tgcaaggcct ctggctacac cttcaccagt tattatctgt actggatgaa acagaggcct 180

ggacaaggcc ttgagtggat tgggggggtt aatcctagta atggtggtac taacttcagt 240

gagaagttca agagcaaggc cacactgact gtagacaaat cctccagcac agcctacatg 300

caactcagca gcctgacatc tgaggactct gcggtctatt actgtacaag aagggattct 360

aactacgacg ggggctttga ctactggggc caaggcacta ctctcacagt ctcctcagcc 420

aaaacgacac cccca 435

<210> 2

<211> 453

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hPD-1.08A轻链可变区

<400> 2

atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60

gacattgtgc tgacacagtc tcctacttcc ttagctgtat ctctggggca gagggccacc 120

atctcatgca gggccagcaa aagtgtcagt acatctggct ttagttattt gcactggtac 180

caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctttc ttgcatccaa cctagagtct 240

ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 300

cctgtggagg aggaggacgc tgcaacctat tattgtcagc acagttggga gcttccgctc 360

acgttcggtg ctgggaccaa gctggagctg aaacgggctg atgctgcacc aactgtatcc 420

atcttcccac catccagtaa gcttgggaag ggc 453

<210> 3

<211> 464

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hPD-1.09A重链可变区

<400> 3

atgraatgca gctgggttat yctctttttg gtagcaacag ctacaggtgt ccactcccag 60

gtccaactgc agcagcctgg ggctgaactg gtgaagcctg ggacttcagt gaagttgtcc 120

tgcaaggctt ctggctacac cttcaccaac tactatatgt actgggtgaa gcagaggcct 180

ggacaaggcc ttgagtggat tggggggatt aatcctagca atggtggtac taacttcaat 240

gagaagttca agaacaaggc cacactgact gtagacagtt cctccagcac aacctacatg 300

caactcagca gcctgacatc tgaggactct gcggtctatt actgtacaag aagggattat 360

aggttcgaca tgggctttga ctactggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctcagcc 420

aaaacgacac ccccatccgt ytatcccbtg gcccctggaa gctt 464

<210> 4

<211> 438

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hPD-1.09A轻链可变区

<400> 4

atggagwcag acacactsct gytatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggc 60

gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctgggaca gagggccgcc 120

atctcatgca gggccagcaa aggtgtcagt acatctggct atagttattt gcactggtac 180

caacagaaac caggacagtc acccaaactc ctcatctatc ttgcatccta cctagaatct 240

ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 300

cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc acagtaggga ccttccgctc 360

acgttcggta ctgggaccaa gctggagctg aaacgggctg atgctgcacc aactgtatcc 420

atcttcccac catccagt 438

<210> 5

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hPD-1.08A重链可变区

<400> 5

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Leu Tyr Trp Met Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Gly Val Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Ser Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Arg Asp Ser Asn Tyr Asp Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys

115 120

<210> 6

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hPD-1.08A轻链可变区

<400> 6

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Thr Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Phe Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Phe Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp

85 90 95

Glu Leu Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105 110

<210> 7

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hPD-1.09A重链可变区

<400> 7

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Thr

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Tyr Met Tyr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asn Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Ser Ser Ser Ser Thr Thr Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys

115 120

<210> 8

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hPD-1.09A轻链可变区

<400> 8

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Ala Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg

85 90 95

Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105 110

<210> 9

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hPD-1.08A轻链CDR1

<400> 9

Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Phe Ser Tyr Leu His

1 5 10 15

<210> 10

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hPD-1.08A轻链CDR2

<400> 10

Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser

1 5

<210> 11

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hPD-1-08A轻链CDR3

<400> 11

Gln His Ser Trp Glu Leu Pro Leu Thr

1 5

<210> 12

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hPD-1.08A重链CDR1

<400> 12

Ser Tyr Tyr Leu Tyr

1 5

<210> 13

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hPD-1.08A重链CDR2

<400> 13

Gly Val Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Ser Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Ser

<210> 14

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hPD-1.08A重链CDR3

<400> 14

Arg Asp Ser Asn Tyr Asp Gly Gly Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 15

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hPD-1.09A轻链CDR1

<400> 15

Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Leu His

1 5 10 15

<210> 16

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hPD-1.09A轻链CDR2

<400> 16

Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser

1 5

<210> 17

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hPD-1.09A轻链CDR3

<400> 17

Gln His Ser Arg Asp Leu Pro Leu Thr

1 5

<210> 18

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hPD-1.09A重链CDR1

<400> 18

Asn Tyr Tyr Met Tyr

1 5

<210> 19

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hPD-1.09A重链CDR2

<400> 19

Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Asn

<210> 20

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hPD-1.09A重链CDR3

<400> 20

Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 21

<211> 417

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 109A-H重链可变区

<220>

<221> 信号肽

<222> (1)..(57)

<400> 21

atggactgga cctggagcat ccttttcttg gtggcagcac caacaggagc ccactcccaa 60

gtgcagctgg tgcagtctgg agttgaagtg aagaagcccg gggcctcagt gaaggtctcc 120

tgcaaggctt ctggctacac ctttaccaac tactatatgt actgggtgcg acaggcccct 180

ggacaagggc ttgagtggat gggagggatt aatcctagca atggtggtac taacttcaat 240

gagaagttca agaacagagt caccttgacc acagactcat ccacgaccac agcctacatg 300

gaactgaaga gcctgcaatt tgacgacacg gccgtttatt actgtgcgag aagggattat 360

aggttcgaca tgggctttga ctactggggc caagggacca cggtcaccgt ctcgagc 417

<210> 22

<211> 417

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 经过密码子优化的109A-H重链可变区

<220>

<221> 信号肽

<222> (1)..(57)

<400> 22

atggactgga cctggtctat cctgttcctg gtggccgctc ctaccggcgc tcactcccag 60

gtgcagctgg tgcagtccgg cgtggaggtg aagaagcctg gcgcctccgt caaggtgtcc 120

tgcaaggcct ccggctacac cttcaccaac tactacatgt actgggtgcg gcaggctccc 180

ggccagggac tggagtggat gggcggcatc aacccttcca acggcggcac caacttcaac 240

gagaagttca agaaccgggt gaccctgacc accgactcct ccaccaccac cgcctacatg 300

gagctgaagt ccctgcagtt cgacgacacc gccgtgtact actgcgccag gcgggactac 360

cggttcgaca tgggcttcga ctactggggc cagggcacca ccgtgaccgt gtcctcc 417

<210> 23

<211> 1398

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 经过密码子优化的409A-H重链全长

<220>

<221> 信号肽

<222> (1)..(57)

<400> 23

atggccgtgc tgggcctgct gttctgcctg gtgaccttcc cttcctgcgt gctgtcccag 60

gtgcagctgg tgcagtccgg cgtggaggtg aagaagcctg gcgcctccgt caaggtgtcc 120

tgtaaggcct ccggctacac cttcaccaac tactacatgt actgggtgcg gcaggcccca 180

ggccagggac tggagtggat gggcggcatc aacccttcca acggcggcac caacttcaac 240

gagaagttca agaaccgggt gaccctgacc accgactcct ccaccacaac cgcctacatg 300

gaactgaagt ccctgcagtt cgacgacacc gccgtgtact actgcgccag gcgggactac 360

cggttcgaca tgggcttcga ctactggggc cagggcacca ccgtgaccgt gtcctccgct 420

agcaccaagg gcccttccgt gttccctctg gccccttgct cccggtccac ctccgagtcc 480

accgccgctc tgggctgtct ggtgaaggac tacttccctg agcctgtgac cgtgagctgg 540

aactctggcg ccctgacctc cggcgtgcac accttccctg ccgtgctgca gtcctccggc 600

ctgtactccc tgtcctccgt ggtgaccgtg ccttcctcct ccctgggcac caagacctac 660

acctgcaacg tggaccacaa gccttccaac accaaggtgg acaagcgggt ggagtccaag 720

tacggccctc cttgccctcc ctgccctgcc cctgagttcc tgggcggacc ctccgtgttc 780

ctgttccctc ctaagcctaa ggacaccctg atgatctccc ggacccctga ggtgacctgc 840

gtggtggtgg acgtgtccca ggaagatcct gaggtccagt tcaattggta cgtggatggc 900

gtggaggtgc acaacgccaa gaccaagcct cgggaggaac agttcaactc cacctaccgg 960

gtggtgtctg tgctgaccgt gctgcaccag gactggctga acggcaagga atacaagtgc 1020

aaggtcagca acaagggcct gccctcctcc atcgagaaaa ccatctccaa ggccaagggc 1080

cagcctcgcg agcctcaggt gtacaccctg cctcctagcc aggaagagat gaccaagaat 1140

caggtgtccc tgacatgcct ggtgaagggc ttctaccctt ccgatatcgc cgtggagtgg 1200

gagagcaacg gccagccaga gaacaactac aagaccaccc ctcctgtgct ggactccgac 1260

ggctccttct tcctgtactc caggctgacc gtggacaagt cccggtggca ggaaggcaac 1320

gtcttttcct gctccgtgat gcacgaggcc ctgcacaacc actacaccca gaagtccctg 1380

tccctgtctc tgggcaag 1398

<210> 24

<211> 393

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> K09A-L-11轻链可变区

<220>

<221> 信号肽

<222> (1)..(60)

<400> 24

atggaagccc cagctcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60

gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 120

ctctcctgca gggccagcaa aggtgtcagt acatctggct atagttattt gcactggtat 180

caacagaaac ctggccaggc tcccaggctc ctcatctatc ttgcatccta cctagaatct 240

ggcgtcccag ccaggttcag tggtagtggg tctgggacag acttcactct caccatcagc 300

agcctagagc ctgaagattt tgcagtttat tactgtcagc acagcaggga ccttccgctc 360

acgttcggcg gagggaccaa agtggagatc aaa 393

<210> 25

<211> 393

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> K09A-L-16轻链可变区

<220>

<221> 信号肽

<222> (1)..(60)

<400> 25

atggaaaccc cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60

gaaattgtgc tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 120

atctcctgca gggccagcaa aggtgtcagt acatctggct atagttattt gcattggtac 180

ctccagaagc cagggcagtc tccacagctc ctgatctatc ttgcatccta cctagaatct 240

ggggtccctg acaggttcag tggcagtgga tcaggcacag attttacact gaaaatcagc 300

agagtggagg ctgaggatgt tggggtttat tactgccagc atagtaggga ccttccgctc 360

acgtttggcc aggggaccaa gctggagatc aaa 393

<210> 26

<211> 393

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> K09A-L-17轻链可变区

<220>

<221> 信号肽

<222> (1)..(60)

<400> 26

atgaggctcc ctgctcagct cctggggctg ctaatgctct gggtctctgg atccagtggg 60

gatattgtga tgacccagac tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 120

atctcctgca gggccagcaa aggtgtcagt acatctggct atagttattt gcattggtat 180

ctgcagaagc cagggcagtc tccacagctc ctgatctatc ttgcatccta cctagaatct 240

ggagtcccag acaggttcag tggcagtggg tcaggcactg ctttcacact gaaaatcagc 300

agggtggagg ctgaggatgt tggactttat tactgccagc atagtaggga ccttccgctc 360

acgtttggcc aggggaccaa gctggagatc aaa 393

<210> 27

<211> 390

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 经过密码子优化的K09A-L-11轻链可变区

<220>

<221> 信号肽

<222> (1)..(57)

<400> 27

atggcccctg tgcagctgct gggcctgctg gtgctgttcc tgcctgccat gcggtgcgag 60

atcgtgctga cccagtcccc tgccaccctg tccctgagcc ctggcgagcg ggctaccctg 120

agctgcagag cctccaaggg cgtgtccacc tccggctact cctacctgca ctggtatcag 180

cagaagccag gccaggcccc tcggctgctg atctacctgg cctcctacct ggagtccggc 240

gtgcctgccc ggttctccgg ctccggaagc ggcaccgact tcaccctgac catctcctcc 300

ctggagcctg aggacttcgc cgtgtactac tgccagcact cccgggacct gcctctgacc 360

tttggcggcg gaacaaaggt ggagatcaag 390

<210> 28

<211> 390

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 经过密码子优化的K09A-L-16轻链可变区

<220>

<221> 信号肽

<222> (1)..(57)

<400> 28

atggcccctg tgcagctgct gggcctgctg gtgctgttcc tgcctgccat gcggtgcgag 60

atcgtgctga cccagtcccc tctgtccctg cctgtgaccc ctggcgagcc tgcctccatc 120

tcctgccggg cctccaaggg cgtgtccacc tccggctact cctacctgca ctggtatctg 180

cagaagcctg gccagtcccc ccagctgctg atctacctgg cctcctacct ggagtccggc 240

gtgcctgacc ggttctccgg ctccggcagc ggcaccgact tcaccctgaa gatctcccgg 300

gtggaggccg aggacgtggg cgtgtactac tgccagcact cccgggacct gcctctgacc 360

ttcggccagg gcaccaagct ggagatcaag 390

<210> 29

<211> 390

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 经过密码子优化的K09A-L-17轻链可变区

<220>

<221> 信号肽

<222> (1)..(57)

<400> 29

atggcccctg tgcagctgct gggcctgctg gtgctgttcc tgcctgccat gcggtgcgac 60

atcgtgatga cccagacccc tctgtccctg cctgtgaccc ctggcgagcc tgcctccatc 120

tcctgccggg cctccaaggg cgtgtccacc tccggctact cctacctgca ctggtatctg 180

cagaagcctg gccagtcccc tcagctgctg atctacctgg cctcctacct ggagtccggc 240

gtgcctgacc ggttctccgg ctccggaagc ggcaccgctt ttaccctgaa gatctccaga 300

gtggaggccg aggacgtggg cctgtactac tgccagcact cccgggacct gcctctgacc 360

ttcggccagg gcaccaagct ggagatcaag 390

<210> 30

<211> 139

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 109A-H重链可变区

<220>

<221> 信号肽

<222> (1)..(19)

<400> 30

Met Asp Trp Thr Trp Ser Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Pro Thr Gly

1 5 10 15

Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Asn Tyr Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Met Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn

65 70 75 80

Glu Lys Phe Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ser Ser Thr Thr

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr

115 120 125

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

130 135

<210> 31

<211> 466

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 409A-H重链全长

<220>

<221> 信号肽

<222> (1)..(19)

<400> 31

Met Ala Val Leu Gly Leu Leu Phe Cys Leu Val Thr Phe Pro Ser Cys

1 5 10 15

Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Asn Tyr Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Met Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn

65 70 75 80

Glu Lys Phe Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ser Ser Thr Thr

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr

115 120 125

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly

130 135 140

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser

145 150 155 160

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

165 170 175

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe

180 185 190

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val

195 200 205

Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val

210 215 220

Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys

225 230 235 240

Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly

245 250 255

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

260 265 270

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu

275 280 285

Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

290 295 300

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg

305 310 315 320

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

325 330 335

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu

340 345 350

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

355 360 365

Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

370 375 380

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

385 390 395 400

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

405 410 415

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp

420 425 430

Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

435 440 445

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu

450 455 460

Gly Lys

465

<210> 32

<211> 130

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> K09A-L-11轻链可变区

<220>

<221> 信号肽

<222> (1)..(19)

<400> 32

Met Ala Pro Val Gln Leu Leu Gly Leu Leu Val Leu Phe Leu Pro Ala

1 5 10 15

Met Arg Cys Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu

20 25 30

Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val

35 40 45

Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly

50 55 60

Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly

65 70 75 80

Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu

85 90 95

Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln

100 105 110

His Ser Arg Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu

115 120 125

Ile Lys

130

<210> 33

<211> 130

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> K09A-L-16轻链可变区

<220>

<221> 信号肽

<222> (1)..(19)

<400> 33

Met Ala Pro Val Gln Leu Leu Gly Leu Leu Val Leu Phe Leu Pro Ala

1 5 10 15

Met Arg Cys Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val

20 25 30

Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val

35 40 45

Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly

50 55 60

Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly

65 70 75 80

Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu

85 90 95

Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln

100 105 110

His Ser Arg Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu

115 120 125

Ile Lys

130

<210> 34

<211> 130

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> K09A-L-17轻链可变区

<220>

<221> 信号肽

<222> (1)..(19)

<400> 34

Met Ala Pro Val Gln Leu Leu Gly Leu Leu Val Leu Phe Leu Pro Ala

1 5 10 15

Met Arg Cys Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val

20 25 30

Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val

35 40 45

Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly

50 55 60

Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly

65 70 75 80

Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu

85 90 95

Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Leu Tyr Tyr Cys Gln

100 105 110

His Ser Arg Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu

115 120 125

Ile Lys

130

<210> 35

<211> 469

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 109A-H重链全长

<220>

<221> 信号肽

<222> (1)..(19)

<400> 35

Met Ala Val Leu Gly Leu Leu Phe Cys Leu Val Thr Phe Pro Ser Cys

1 5 10 15

Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Asn Tyr Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Met Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn

65 70 75 80

Glu Lys Phe Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ser Ser Thr Thr

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr

115 120 125

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly

130 135 140

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly

145 150 155 160

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

165 170 175

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe

180 185 190

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val

195 200 205

Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val

210 215 220

Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys

225 230 235 240

Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu

245 250 255

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

260 265 270

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

275 280 285

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

290 295 300

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

305 310 315 320

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

325 330 335

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala

340 345 350

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

355 360 365

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln

370 375 380

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

385 390 395 400

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

405 410 415

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

420 425 430

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

435 440 445

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

450 455 460

Leu Ser Pro Gly Lys

465

<210> 36

<211> 237

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> K09A-L-11轻链全长

<220>

<221> 信号肽

<222> (1)..(19)

<400> 36

Met Ala Pro Val Gln Leu Leu Gly Leu Leu Val Leu Phe Leu Pro Ala

1 5 10 15

Met Arg Cys Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu

20 25 30

Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val

35 40 45

Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly

50 55 60

Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly

65 70 75 80

Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu

85 90 95

Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln

100 105 110

His Ser Arg Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu

115 120 125

Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser

130 135 140

Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn

145 150 155 160

Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala

165 170 175

Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys

180 185 190

Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp

195 200 205

Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu

210 215 220

Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230 235

<210> 37

<211> 237

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> K09A-L-16轻链全长

<220>

<221> 信号肽

<222> (1)..(19)

<400> 37

Met Ala Pro Val Gln Leu Leu Gly Leu Leu Val Leu Phe Leu Pro Ala

1 5 10 15

Met Arg Cys Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val

20 25 30

Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val

35 40 45

Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly

50 55 60

Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly

65 70 75 80

Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu

85 90 95

Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln

100 105 110

His Ser Arg Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu

115 120 125

Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser

130 135 140

Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn

145 150 155 160

Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala

165 170 175

Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys

180 185 190

Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp

195 200 205

Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu

210 215 220

Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230 235

<210> 38

<211> 237

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> K09A-L-17轻链全长

<220>

<221> 信号肽

<222> (1)..(19)

<400> 38

Met Ala Pro Val Gln Leu Leu Gly Leu Leu Val Leu Phe Leu Pro Ala

1 5 10 15

Met Arg Cys Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val

20 25 30

Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val

35 40 45

Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly

50 55 60

Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly

65 70 75 80

Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu

85 90 95

Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Leu Tyr Tyr Cys Gln

100 105 110

His Ser Arg Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu

115 120 125

Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser

130 135 140

Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn

145 150 155 160

Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala

165 170 175

Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys

180 185 190

Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp

195 200 205

Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu

210 215 220

Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230 235

Claims

1. 抗-人PD-1抗体或其抗原结合片段的低压冻干的制剂，其包含：

a) 所述抗-人PD-1抗体或其抗原结合片段；

b) 组氨酸缓冲液；

c) 聚山梨酯80；和

d) 蔗糖。

2. 根据权利要求1所述的低压冻干的制剂，其中所述制剂当重构时具有5.0至6.0之间的pH。

3. 根据权利要求1所述的低压冻干的制剂，所述制剂能够在约25 mg/mL至100 mg/mL之间的浓度重构所述抗体或其抗原结合片段。

4. 根据权利要求1所述的低压冻干的制剂，其中聚山梨酯80以大约0.02% (w/v)的重量比存在。

5. 根据权利要求1所述的低压冻干的制剂，其中蔗糖以大约7% (w/v)的重量比存在。

6. 抗-人PD-1抗体或其抗原结合片段的低压冻干的药物制剂，其通过低压冻干水溶液制成，所述水溶液包含：

a) 25-100 mg/mL抗-抗体或其抗原结合片段；

b) 约70 mg/mL蔗糖；

c) 约0.2 mg/mL聚山梨酯80；和

d) pH 5.0-6.0的约10 mM组氨酸缓冲液。

7. 根据权利要求6所述的低压冻干的药物制剂，其中所述抗-人PD-1抗体或其抗原结合片段以约25 mg/mL存在于水溶液中。

8. 根据权利要求6所述的低压冻干的药物制剂，其中所述水溶液具有约5.5的pH。

9. 抗-人PD-1抗体或其抗原结合片段的低压冻干的药物制剂，所述制剂当重构时包含：

a) 25-100 mg/mL抗-人PD-1抗体或其抗原结合片段；

b) 约70 mg/mL蔗糖；

c) 约0.2 mg/mL聚山梨酯80；和

d) 约pH 5.0-pH 6.0的约10 mM组氨酸缓冲液。

10. 根据权利要求9所述的低压冻干的药物制剂，其中所述抗-人PD-1抗体或其抗原结合片段以约25 mg/mL存在于重构的溶液中。

11. 根据权利要求9所述的低压冻干的药物制剂，其中所述重构的溶液具有约5.5的pH。

12. 抗-人PD-1抗体或其抗原结合片段的药物制剂，其包含：

a) 所述抗-人PD-1抗体或其抗原结合片段；

b) 组氨酸缓冲液；

c) 聚山梨酯80；和

d) 蔗糖。

13. 根据权利要求12所述的药物制剂，其中所述制剂当重构时具有5.0至6.0之间的pH。

14. 根据权利要求12所述的药物制剂，其中聚山梨酯80以大约0.02% (w/v)的重量比存在。

15. 根据权利要求12所述的药物制剂，其中蔗糖以大约7% (w/v)的重量比存在。

16. 抗-人PD-1抗体或其抗原结合片段的液体药物制剂，所述制剂包含：

a) 25-100 mg/mL抗-抗体或其抗原结合片段；

b) 约70 mg/mL蔗糖；

c) 约0.2 mg/mL聚山梨酯80；和

d) pH 5.0-6.0的约10 mM组氨酸缓冲液。

17. 根据权利要求1、6、9、12或16中的任一项所述的制剂，其中所述抗体或其抗原结合片段包含含有选自SEQ ID NO: 9、10、11、15、16和17的3个CDR序列的轻链。

18. 根据权利要求1、6、9、12或16中的任一项所述的制剂，其中所述抗体或其抗原结合片段包含含有选自SEQ ID NO: 12、13、14、18、19和20的3个CDR序列的重链。

19. 根据权利要求1、6、9、12或16中的任一项所述的制剂，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：

i) 轻链，其包含3个CDR序列SEQ ID NO: 15、16和17；和

ii) 重链，其包含3个CDR序列SEQ ID NO: 18、19和20。

20. 根据权利要求1、6、9、12或16中的任一项所述的制剂，其中所述抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO: 32的氨基酸残基20-130的轻链可变结构域。

21. 根据权利要求1、6、9、12或16中的任一项所述的制剂，其中所述抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO: 31的氨基酸残基20-466的重链可变结构域。

22. 根据权利要求1、6、9、12或16中的任一项所述的制剂，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：

i) 轻链，其包含SEQ ID NO: 36的氨基酸残基20-237，和

ii) 重链，其包含SEQ ID NO: 31的氨基酸残基20-466。

23. 根据权利要求1、6、9、12或16中的任一项所述的制剂，其中所述抗体选自：h409A11、h409A16和h409A17。

24. 一种治疗有此需要的哺乳动物受试者的慢性感染的方法，所述方法包括：施用有效量的根据权利要求1、6、9、12或16中的任一项所述的制剂。

25. 一种治疗有此需要的哺乳动物受试者的癌症的方法，所述方法包括：施用有效量的根据权利要求1、6、9、12或16中的任一项所述的制剂。

26. 根据权利要求24或25所述的方法，其中所述有效量包含选自约1.0、3.0和10 mg/kg的抗-人PD-1抗体的剂量。

27. 根据权利要求25或26所述的方法，其中所述受试者没有表现出剂量限制性毒性(DLT)。

28. 根据权利要求1、6、9、12或16中的任一项所述的制剂，其中所述抗体在至少约12个月内表现出稳定性。

29. 根据权利要求1、6、9、12或16中的任一项所述的制剂，其中所述抗体在至少约24个月内表现出稳定性。

30. 根据权利要求1、6、9、12或16中的任一项所述的制剂，其中所述抗体在至少约36个月内表现出稳定性。