KR20180100224A - 인간 인터루킨-2에 대한 면역-자극 인간화 단일클론 항체, 및 이의 융합 단백질 - Google Patents

인간 인터루킨-2에 대한 면역-자극 인간화 단일클론 항체, 및 이의 융합 단백질 Download PDF

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KR20180100224A
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나탈리아 아레나스-라미레쯔
이완 베우빈크
오누르 보이만
바바라 브란네띠
안드레아스 카토포디스
시몬 포프
캐더린 레그나이어
차오 조우
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노바르티스 아게
유니베르시태트 취리히
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Abstract

본 발명은 인간 인터루킨-2 (hIL-2)에 결합하는 항체에 관한 것이다. 본 발명은 더욱 구체적으로 hIL-2의 특정 에피토프에 특이적으로 결합하며, 이러한 에피토프에 결합시, CD25에 대한 hIL-2의 결합을 억제하는 특유한 능력을 보여주는 인간화 항체에 관한 것이다.

Description

인간 인터루킨-2에 대한 면역-자극 인간화 단일클론 항체, 및 이의 융합 단백질
기술 분야
본 발명은 인간 인터루킨-2 (hIL-2)에 결합하는 항체에 관한 것이다. 본 발명은 더욱 구체적으로 hIL-2의 특정 에피토프에 특이적으로 결합하며, 이러한 에피토프에 결합시, CD25에 대한 hIL-2의 결합, 및 상기 항체와 hIL-2 사이의 융합을 억제하는 특유한 능력을 보여주는 인간화 항체에 관한 것이다. 더욱이, 본 발명은 hIL-2와 복합된 항체의시험관내 및 생체내 치료적 응용, 및 이러한 융합체의 시험관내 및 생체내 치료적 응용에 관한 것이다.
배경
인터루킨-2 (IL-2)는 전이 종양에 대한 세포독성 림프구를 잠재적으로 자극할 수 있는 사이토카인이다. 그러나, IL-2는 자가면역 질환의 예방에 중요한 소위 CD25+ CD4+ 조절 T 세포들 (T조절 세포들)을 자극할 수 있다. 중요하게는, T조절 세포들은 세포독성 림프구에 의한 항-종양 반응들을 현저히 약화시키므로, IL-2의 유익한 항-종양 효과들을 어느 정도 길항시킬 수 있다. 더욱이, 임상적인 항-종양 반응을 구현함에 필요한 용량에서 IL-2는 독성의 유해 효과를 나타낼 수 있다.
IL-2를 사용하는 면역요법은 1980년대 초 이래 전이성 흑색종 및 전이성 신장 세포 암종의 면역요법으로 사용되어 왔으며, 각각 1996 및 1992년에 FDA의 승인을 받았다. 고 투여량의 IL-2는 약 17%의 객관적 반응률을 나타내고 이러한 치명적인 전이성 암에 걸린 환자들의 약 6-9%가 완전한 퇴행을 보였으나, 이러한 투여량으로 제공되는 IL-2는 빈번하게 독성 유해 효과, 가령, 저혈압, 폐부종, 간 세포 손상, 위장관 독성, 혈관 누출 증후군 (VLS) 및 전신 부종을 초래하였다. 더욱이, 상기 언급한 바와 같이, IL-2는 면역억제성 T조절 세포들을 자극할 수 있고, 결과적으로 항-종양 CD8+ T 세포들 및 NK 세포들의 활성을 약화시킬 수 있다.
몇 가지 인간 IL-2의 변이체들이 존재하며, 개선된 생체내 성질들, 가령, Rosalia 등 Current Opinion in Chemical Biology 2014, 23:39-46에 기재된 성질들을 가지는 IL-2 기반 화합물들을 찾기 위해 서로 다른 전략들이 사용되어왔다.
그러나, 적절한 항-인간 IL-2 항체들이 없음으로 인해 아직까지도 이러한 원리에 기반한 성공적 치료법을 환자들에게 사용할 수 없었다.
발명의 요약
본 출원은 일반적으로 인간 IL-2의 특이적 에피토프에 결합하는 항체들 또는 이의 단편들, 이들의 제조 방법 및 질환 치료 방법들을 비롯한 용도에 관한 것이다.
본 출원에 개시된 항-IL-2 항체들 또는 이의 단편들은 장애, 가령, 암성 장애 (예를 들어 고형 및 연-조직 종양, 및 혈액 종양), 뿐만 아니라 감염성 질환들 (예를 들어 만성 감염성 장애)을 치료, 예방 및/또는 진단하기 위하여 (단독으로 또는 다른 제제들 또는 치료 양식들과 병용하여) 사용될 수 있다. 그러므로, 항-IL-2 항체들 또는 이의 단편들을 포함하는 조성물, 뿐만 아니라 항-IL-2 항체들 또는 이의 단편들, 또는 항-IL-2 항체들 또는 이의 단편들을 포함하는 조성물을 사용하여 암 및/또는 감염성 질환들을 비롯한 다양한 장애를 치료하는 방법이 본 출원에 개시되어 있다.
제 1 양상에서, 본 출원은 서열 번호: 109에 따른 인간 IL-2에 결합하는 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 부분을 제공하며, 이 때 상기 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3를 포함하는 경쇄 가변 영역 및 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하며 LCDR1은 서열 번호: 122를 포함하고; LCDR2는 서열 번호: 123을 포함하고; LCDR3는 서열 번호: 21을 포함하고; HCDR1은 서열 번호: 119를 포함하고; HCDR2는 서열 번호: 120을 포함하고; 그리고 HCDR3은 서열 번호: 121을 포함한다.
한 구체예에서, 상기 제 1 양상에 따른 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 부분은, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 부분이 서열 번호: 19, 서열 번호: 31, 서열 번호: 69, 서열 번호: 72, 서열 번호: 86 및 서열 번호: 90으로 구성된 그룹에서 선택된 LCDR1; 서열 번호: 20 및 서열 번호: 32로 구성된 그룹에서 선택된 LCDR2; 서열 번호: 21에 제시된 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및
서열 번호: 4, 및 서열 번호: 13으로 구성된 그룹에서 선택된 HCDR1; 서열 번호: 2, 및 서열 번호: 12로 구성된 그룹에서 선택된 HCDR2; 및 서열 번호: 3, 서열 번호: 36, 서열 번호: 39, 서열 번호: 42, 및 서열 번호: 45로 구성된 그룹에서 선택된 HCDR3를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
한 추가 구체예에서, 상기 제 1 양상에 따른 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 부분은, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3가 각각 서열 번호: 19, 20 및 21이고, HCDR1, HCDR2 및 HCDR3는 각각 서열 번호: 4, 2 및 3이고; 또는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 각각 서열 번호: 31, 32 및 21이고, HCDR1, HCDR2 및 HCDR3은 각각 서열 번호: 4, 2 및 3이고; 또는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 서열 번호: 19, 20 및 21이고 그리고 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3은 서열 번호: 13, 12 및 3이고; 또는 각각 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 서열 번호: 31, 32 및 21이고 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3은 서열 번호: 13, 12 및 3이고; 또는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 서열 번호: 69, 20 및 21이고 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3는 서열 번호: 4, 2, 및 3이고; 또는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 각각 서열 번호: 31, 32 및 21이고 및 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3은 각각 서열 번호: 4, 2, 및 3이고; 또는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 각각 서열 번호: 69, 20, 및 21이고, 그리고 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3은 각각 서열 번호: 4, 2, 및 3이고; 또는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 각각 서열 번호: 19, 20, 및 21이고, 그리고 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3는 각각 4, 2, 및 36이고; 또는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3는 각각 서열 번호: 69, 20, 및 21이고, 그리고 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3은 각각 서열 번호: 4, 2, 및 36이고; 또는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 각각 서열 번호: 19, 20, 21이고, HCDR1, HCDR2 및 HCDR3은 각각 서열 번호: 4, 2, 및 36이고; 그리고 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 각각 서열 번호: 69, 20, 21이고 그리고 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3은 각각 서열 번호: 4, 2, 및 36이다.
또 다른 구체예에서, 제 1 양상에 따른 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 다음 아미노산 서열들에 최소한 95%, 가령, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 가지는 중쇄 가변 (VH) 및 경쇄 가변 (VL) 영역들을 포함한다: VL, 서열 번호: 25; VH, 서열 번호: 7, 또는 VL, 서열 번호: 27; VH, 서열 번호: 7, 또는 VL, 서열 번호: 34; VH, 서열 번호: 7, 또는 VL, 서열 번호: 25; VH, 서열 번호: 15, 또는 VL, 서열 번호: 27; VH, 서열 번호: 15, 또는 VL, 서열 번호: 34; VH, 서열 번호: 15, 또는 VL, 서열 번호: 25; VH, 서열 번호: 17, 또는 VL, 서열 번호: 27; VH, 서열 번호: 17, 또는 VL, 서열 번호: 34; VH, 서열 번호: 17, 또는 VL, 서열 번호: 70; VH, 서열 번호: 7, 또는 VL, 서열 번호: 25; VH, 서열 번호: 37, 또는 VL, 서열 번호: 70; VH, 서열 번호: 37, VL, 서열 번호: 79; VH, 서열 번호: 7, 또는 VL, 서열 번호: 27; VH, 서열 번호: 37, 또는 VL, 서열 번호: 79; VH, 서열 번호: 37, 또는 VL, 서열 번호: 70; VH, 서열 번호: 17, 또는 VL, 서열 번호: 25; VH, 서열 번호: 49, 또는 VL, 서열 번호: 70; VH, 서열 번호: 49, 또는 VL, 서열 번호: 79; VH, 서열 번호: 17, 또는 VL, 서열 번호: 27; VH, 서열 번호: 49, 또는 VL, 서열 번호: 79; VH, 서열 번호: 49.
한 구체예에서, 제 1 양상에 따른 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 다음 아미노산 서열들을 가지는 중쇄 가변 (VH) 및 경쇄 가변 (VL) 영역들을 가진다: VL, 서열 번호: 25; VH, 서열 번호: 7, 또는 VL, 서열 번호: 27; VH, 서열 번호: 7, 또는 VL, 서열 번호: 34; VH, 서열 번호: 7, 또는 VL, 서열 번호: 25; VH, 서열 번호: 15, 또는 VL, 서열 번호: 27; VH, 서열 번호: 15, 또는 VL, 서열 번호: 34; VH, 서열 번호: 15, 또는 VL, 서열 번호: 25; VH, 서열 번호: 17, 또는 VL, 서열 번호: 27; VH, 서열 번호: 17, 또는 VL, 서열 번호: 34; VH, 서열 번호: 17, 또는 VL, 서열 번호: 70; VH, 서열 번호: 7, 또는 VL, 서열 번호: 25; VH, 서열 번호: 37, 또는 VL, 서열 번호: 70; VH, 서열 번호: 37, VL, 서열 번호: 79; VH, 서열 번호: 7, 또는 VL, 서열 번호: 27; VH, 서열 번호: 37, 또는 VL, 서열 번호: 79; VH, 서열 번호: 37, 또는 VL, 서열 번호: 70; VH, 서열 번호: 17, 또는 VL, 서열 번호: 25; VH, 서열 번호: 49, 또는 VL, 서열 번호: 70; VH, 서열 번호: 49, 또는 VL, 서열 번호: 79; VH, 서열 번호: 17, 또는 VL, 서열 번호: 27; VH, 서열 번호: 49, 또는 VL, 서열 번호: 79; VH, 서열 번호: 49.
상기 구체예들에 따른 단리된 항체는 서열 번호: 93, 서열 번호: 95, 서열 번호: 97, 서열 번호: 99, 서열 번호: 101, 서열 번호: 103 및 서열 번호: 105로 구성된 그룹에서 선택된 Fc 도메인을 포함한다. 한 바람직한 구체예에서, 상기 단리된 항체는 서열 번호: 93, 서열 번호: 101, 서열 번호: 103 또는 서열 번호: 105에 따른 Fc 도메인을 포함한다.
한 특정 구체예에서, 상기 단리된 항체는 서열 번호: 124에 따른 경쇄 및 서열 번호: 126에 따른 중쇄, 또는 서열 번호: 128에 따른 경쇄 및 서열 번호: 130에 따른 중쇄를 포함한다.
본 발명의 제 2 양상에 따르면, 아미노산 K52, P54, K55, T57, R58, T61, F62, K63, Q94, 및 K96을 포함하는 인간 인터루킨-2 (hIL-2) 에피토프에 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제공된다.
한 구체예에서, 상기 제 2 양상에 따른 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은, 아미노산 K52, P54, K55, T57, R58, T61, F62, K63, Q94, 및 K96에 특이적으로 결합한다.
상기 제 2 양상에 따른 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은, 아미노산 K52, P54, K55, T57, R58, T61, F62, K63, Q94, 및 K96 이외에도, 아미노산 N50, N53, N91, L92, A93, 및 N97 중 임의의 하나 이상을 추가로 포함하는 인간 인터루킨-2 (hIL-2) 에피토프에 결합할 수 있다.
한 구체예에서, 상기 제 2 양상에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 아미노산 N50, K52, N53, P54, K55, T57, R58, T61, F62, K63, N91, L92, A93, Q94, K96, 및 N97에 특이적으로 결합한다.
한 구체예에서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은, 차례로 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3를 포함하는 경쇄 가변 영역, 그리고 차례로 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 이 때 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 각각 서열 번호: 231, 232 및 233이고, 그리고 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3은 각각 서열 번호: 181, 182 및 183이고; 또는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 각각 서열 번호: 279, 280 및 281이고, 그리고 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3은 각각 서열 번호: 213, 214 및 215이고; 또는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 각각 서열 번호: 231, 232 및 233이고 그리고 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3은 각각 서열 번호: 213, 214 및 215이고; 또는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 각각 서열 번호: 263, 264 및 265이고 그리고 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3은 각각 서열 번호: 213, 214 및 215이고; 또는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 각각 서열 번호: 263, 264 및 265이고 그리고 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3은 각각 서열 번호: 149, 150 및 151이고; 또는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 각각 서열 번호: 69, 20 및 21이고 그리고 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3은 각각 서열 번호: 197, 198, 및 199이고; 또는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 각각 서열 번호: 231, 232 및 233이고 그리고 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3은 각각 서열 번호: 197, 198, 및 199이다.
한 구체예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 아미노산 서열들 VL, 서열 번호: 243; VH, 서열 번호: 193, 또는 VL, 서열 번호: 391; VH, 서열 번호: 225, 또는 VL, 서열 번호: 243; VH, 서열 번호: 225, 또는 VL, 서열 번호: 275; VH, 서열 번호: 225, 또는 VL, 서열 번호: 275; VH, 서열 번호: 161, 또는 VL, 서열 번호: 70; VH, 서열 번호: 209, 또는 VL, 서열 번호: 243; VH, 서열 번호: 209에 최소한 95% 동일성, 가령, 100% 동일성을 가지는 중쇄 가변 (VH) 및 경쇄 가변 (VL) 영역들을 포함한다.
한 특정 구체예에서, 단리된 항체는 다음 아미노산 서열들을 가지는 중쇄 및 경쇄 영역들을 포함한다; 서열 번호: 195에 따른 중쇄 및 서열 번호: 245에 따른 경쇄, 또는 서열 번호: 227에 따른 중쇄 및 서열 번호: 393에 따른 경쇄, 또는 서열 번호: 227에 따른 중쇄 및 서열 번호: 245에 따른 경쇄, 또는 서열 번호: 227에 따른 중쇄 및 서열 번호: 277에 따른 경쇄, 또는 서열 번호: 163에 따른 중쇄 및 서열 번호: 277에 따른 경쇄, 또는 서열 번호: 211에 따른 중쇄 및 서열 번호: 261에 따른 경쇄, 또는 서열 번호: 211에 따른 중쇄 및 서열 번호: 277에 따른 경쇄.
본 발명의 제 3 양상에 따르면, 본 발명의 상기 제 1 또는 제 2 양상에 따른 항체, 그리고 선택적으로 그러나 바람직하게는 인간 IL-2를 포함하는 조성물이 제공된다.
한 구체예에서, 상기 제 3 양상에 따른 조성물은 서열 번호: 109에 따른 인간 IL-2 또는 서열 번호: 110에 따른 알데스류킨, 바람직하게는 서열 번호: 110에 따른 알데스류킨으로 구성된 그룹에서 선택된 인간 IL-2를 포함한다.
본 발명의 제 4 양상에 따르면, 본 발명의 제 1 또는 제 2 양상에 따른 항체, 및 인간 IL-2를 포함하는 융합 단백질이 제공된다.
한 구체예에서, 항체와 인간 IL-2는 서열 번호: 397, 서열 번호: 398, 서열 번호: 399, 서열 번호: 400, 서열 번호: 401, 서열 번호: 402, 서열 번호: 403, 서열 번호: 404, 서열 번호: 405, 서열 번호: 406, 서열 번호: 407, 서열 번호: 408, 서열 번호: 409, 서열 번호: 410, 및 서열 번호: 411로 구성된 그룹에서, 바람직하게는 서열 번호: 405 또는 서열 번호: 407에서 선택된 링커 서열에 의해 결합된다.
한 구체예에서 융합 단백질은 본 발명의 제 1 또는 제 2 양상에 따른 항체를 포함하고, 이 때 항체의 LCDR1은 Kabat 정의에 따른 잔기 Y27 및 잔기 D30을 포함하고, 이 때 잔기 Y27은 GG 링커로 인간 IL-2의 잔기 N97에 결합되며, 그리고 잔기 D30은 서열 번호: 412에 따른 링커로 인간 IL-2의 잔기 K96 잔기에 결합된다.
본 발명의 제 5 양상에 따르면, 약제로 사용하기 위한, 본 발명의 제 1 또는 제 2 양상에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 본 발명의 제 3 양상에 따른 조성물, 또는 본 발명의 제 4 양상에 따른 융합 단백질이 제공된다.
본 발명의 제 6 양상에 따르면, 약제의 제조에 사용하기 위한, 본 발명의 제 1 또는 제 2 양상에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 본 발명의 제 3 양상에 따른 조성물, 또는 본 발명의 제 4 양상에 따른 융합 단백질이 제공된다.
본 발명의 제 7 양상에 따르면, 암 치료에 사용하기 위한, 본 발명의 제 1 또는 제 2 양상에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 본 발명의 제 3 양상에 따른 조성물, 또는 본 발명의 제 4 양상에 따른 융합 단백질이 제공된다.
본 발명의 제 8 양상에 따르면, 본 발명의 제 1 또는 제 2 양상에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 본 발명의 제 3 양상에 따른 조성물, 또는 본 발명의 제 4 양상에 따른 융합 단백질을 투여함에 의한 암 치료 방법이 제공된다.
본 발명의 제 9 양상에 따르면, 본 발명의 제 1 또는 제 2 양상에 따른 항체, 또는 이의 단편을 인코딩할 수 있는 핵산 분자, 또는 본 발명의 제 4 양상에 따른 융합 단백질을 포함하는 벡터가 제공된다.
본 발명의 제 10 양상에 따르면, 본 발명의 제 8 양상에 따른 벡터를 포함하는 세포가 제공된다.
본 발명의 제 11 양상에 따르면, 본 발명의 제 1 또는 제 2 양상에 따른 인간 인터루킨-2 (hIL-2) 특이적 단일클론 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 제조할 수 있는 세포가 제공된다.
본 발명의 제 12 양상에 따르면, 단일클론 항체를-제조하는 하이브리도마 세포주가 제공되는데, 이러한 세포주는 상기 제조된 항체들이 본 발명의 제 1 또는 제 2 양상인 항체들 또는 본 발명의 제 4 양상에 따른 융합 단백질임을 특징으로 한다.
본 발명의 양상들에 따른 항체들은, 예컨대, 다음 성질들 중 하나 이상을 보유하기 때문에 유리하다. hIL-2에 항체가 결합시 생성되는 mAb*hIL-2 복합체는 인간 IL-2 수용체 알파 (CD25로도 공지됨)에 더 이상 효과적으로 결합할 수 없어, 표면 플라스몬 공명으로 측정시 유리 (비-복합체형성) hIL-2에 대한 인간 CD25의 결합과 비교하여 mAb*hIL-2에 대한 인간 CD25의 결합을 배경 수준으로 효과적으로 감소시킬 수 없다. 더욱이, 상기 항체들은 쥐과 IL-2에 대한 측정가능한 교차 반응성을 전혀 나타내지 않을 수 있다.
도면의 간단한 설명
도 1은 실시예 2에서 수득된 프로류킨®/Fab-NARA1 복합체의 3차원 구조에 대한 개요를 제공한다.
도 2는 에피토프 잔기들의 추가 분석을 제공한다. X-축은 서열 번호: 110에 따른 아미노산 서열 및 넘버링을 열거한다. 서열 번호: 132에 따른 NARA1-Fab에 대한 결합의 결과로서, Y-축의 위쪽은 대응하는 프로류킨®의 잔기로부터 4 Å 이내에 존재하는 NARA1-Fab의 총 원자 수를 보여주며 Y-축의 아래쪽은 대응하는 프로류킨® 잔기의 감소된 용매-접근성 영역 (Å2)을 보여준다.
도 3은 NARA1-Fab에 의해 인식되는 가장 중요한 에피토프 잔기를 도시한다.
도 4는 IL-2/CD25/CD122/CD132 4차 복합체와 프로류킨®/NARA1-Fab 복합체의 중첩을 보여준다.
도 5는 IL-2_C145A (PDB: 3INK), D10 IL-2-뮤테인 ("수퍼카인": PDB: 3QB1), IL-2/CD25/CD122/CD132 (PDB: 2B5I), 및 프로류킨®/NARA1-Fab의 C 나선들의 중첩을 도시한다.
도 6은 인산염 완충 식염수 (PBS), 저용량 인간 IL-2 (IL-2 LD), 고용량 인간 IL-2 (IL-2 HD), 또는 지시된 단일클론 항체들을 사용하여 제조된 IL-2/항체 복합체들을 투여받은 마우스의 비장으로부터 얻은 면역 세포들의 수를 보여준다. 표 14 및 15에 수치들을 나타낸다.
도 7은 도 6에서와 같이 처리된 마우스의 비장으로부터 얻은 CD8+CD44+CD122+ T 세포들의 대표적인 브로모데옥시우리딘 (BrdU) 프로파일을 보여준다.
도 8은 도 6에서와 같이 처리된 마우스의 비장으로부터 얻은 CD3-NK1.1+ NK 세포들의 대표적인 BrdU 프로파일을 보여준다.
도 9 및 도 10은 한 구체예에 따른 융합 단백질을 도시하는 도식이다.
도 11은 한 구체예에 따른 융합 단백질의 정렬을 도시한다.
도 12 내지 15는, 한 예에 따라, 도 6에서와 같이 처리된 마우스의 비장으로부터 얻은 내인성 CD8+ T 세포들, CD8+ CD44+ CD122+ T 세포들, CD4+ T 세포들, CD4+CD25고Foxp3+ T조절 세포들 및 CD3-NK1.1+ NK 세포들의 표현형 특성을 보여준다.
도 16 및 17은 한 예에 따라, 도 6에서와 같이 처리된 마우스의 비장으로부터 얻은 면역 세포 아형들의 수 및 CD8+CD44+ T 세포-대-CD4+CD25고Foxp3+ T조절 세포 비율을 보여준다.
도 18 내지 22는 한 예에 따라, 도 6에서와 같이 처리된 마우스의 비장으로부터 얻은, CD8+, CD8+ CD44+ CD122+ T 세포들, CD3- NK1.1+ DX5+ NK 세포들, CD4+ T 세포들 및 CD4+ CD25+ T 세포들의 대표적인 BrdU 프로파일을 보여준다.
도 23은 한 예에 따라, PBS, 융합 단백질 L15, L20 또는 L25, 또는 인간 IL-2/NARA1 복합체들을 투여받은 마우스의 비장으로부터 얻은 내인성 CD8+ T 세포들 및 NK 세포들의 표현형 특성을 보여준다.
도 24는 한 예에 따라 도 23에서와 같이 처리된 마우스의 비장으로부터 얻은 지시된 면역 세포들의 세포 수를 보여준다.
도 25는 한 예에 따라 도 23에서와 같이 처리된 마우스의 비장으로부터 얻은 CD8+ CD44+ CD122+ T 세포들 및 CD3- NK1.1+NK 세포들의 대표적인 BrdU 프로파일을 보여준다.
도 26은 한 예에 따라, 융합 단백질 L15, L20 또는 L25, 인간 IL-2/NARA1 복합체들, 또는 인간 IL-2의 적정 용량(titrated doses)으로 자극한 CTLL-2 세포들을 사용한 시험관내 실험들로부터 얻은 CTLL-2 세포 증식 곡선들을 보여준다.
도 27은 한 예에 따라, 인간 IL-2/NARA1 복합체, 인간 IL-2, 또는 융합 단백질 L15, L20 또는 L25의 적정 용량으로 자극한 CTLL-2 세포들의 STAT5 인산화 수준을 보여준다.
5. 표의 간단한 설명
표 1은 본 발명의 구체예들에 따른 항-IL-2 항체들에 관한 개요이다.
표 2는 본 발명의 구체예들에 따른 IL-2 뮤테인들에 관한 개요이다.
표 3은 프로류킨®/NARA1-Fab 복합체에 관한 구조적 통계치들을 나타낸다.
표 4는 본 발명의 구체예들에 따른 에피토프 및 파라토프에 관한 개요이다.
표 5는 본 발명의 구체예들에 따른 중쇄 가변 영역들에 관한 개요이다.
표 6은 본 발명의 구체예들에 따른 경쇄 가변 영역들에 관한 개요이다.
표 7은 일부 구체예들에 따른 항체들의 pI 데이터를 포함한다.
표 8은 가변 영역들과 가변 생식계열 영역들의 비교를 포함한다.
표 9는 본 발명의 구체예들에 따른 구조-정제된 가변 영역들을 포함한다.
표 10은 본 발명의 구체예들에 따른 가변 경쇄 및 가변 중쇄들에 대한 정보를 포함한다.
표 11은 본 발명의 구체예들에 따른 경쇄 CDR들을 포함한다.
표 12는 본 발명의 구체예들에 따른 중쇄 CDR들을 포함한다.
표 13은 본 발명의 구체예들에 따른 최적화된 가변 경쇄 및 가변 중쇄들을 포함한다.
표 14는 VH 돌연변이 서열들의 개요이다.
표 15는 VK 돌연변이 서열들의 개요이다.
표 16은 플라스미드 서열들의 개요이다.
표 17은 본 발명의 구체예들에 따른 친화력-성숙 항체들의 개요이다.
표 18은 제 1 세트의 항체들에 관한 서열 개요이다.
표 19는 한 예에 따른 ELISA 수치들의 개요이다.
표 20은 한 예에 따른 EC50 값들의 개요이다.
표 21은 본 발명의 구체예들에 따른 친화력 성숙 항체들의 아형들이다.
표 22는 표 21에 따른 항체들의 아형들에 관한 서열 개요이다.
표 23은 결합 친화력 데이터를 나타낸다.
표 24는 CD8+ T 세포 증식 데이터를 나타낸다.
표 25는 CD8+ T 및 NK 세포 증식 데이터를 나타낸다.
표 26 및 표 27은 세포 수 데이터를 나타낸다.
표 28은 본 발명의 구체예들에 따른 링커 서열들의 개요이다.
표 29는 본 발명의 구체예들에 따른 융합 단백질들의 개요이다.
표 30은 CD8+ T 및 NK 세포 증식 데이터를 나타낸다.
표 31은 CD8+ T, NK 및 T조절 세포 수 데이터를 나타낸다.
표 32 및 표 33은 세포 수 데이터를 나타낸다.
표 34는 세포 수의 비율 데이터를 나타낸다.
표 35 및 표 36은 융합 단백질들의 경쇄 영역 서열들을 나타낸다.
표 37은 융합 단백질들의 개요이다.
표 38은 세포 수 데이터를 나타낸다.
표 39 및 표 40은 한 예에 다른 EC50 수치들을 나타낸다.
표 41은 본 발명을 실시함에 유용한 서열들을 포함하는 서열 목록이다.
상세한 설명
본 출원은 인간 IL-2에 결합하여 이러한 사이토카인의 생체내 기능에 영향을 미치는 항체들 및 이의 단편들에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용되는 "인간 인터루킨-2" 또는 "hIL-2"는, 본 출원에서 서열 번호: 109로 재생성된 UniProt ID 번호 P60568의 인간 IL-2 (야생형 또는 wt)를 의미한다. 본 발명의 다양한 구체예들에서, 인간 야생형 IL-2의 변이체, 아이소형, 및 종 동족체들 또한 포함된다. 따라서, 본 출원의 항체들은, 특정 사례들에서, 인간 이외의 종들로부터의 IL-2와 교차 반응할 수 있다. 특정 구체예들에서, 항체들은 하나 이상의 인간 IL-2 단백질에 대해서 전적으로 특이적일 수 있으며 종 또는 그 외 다른 유형들의 비-인간 교차 반응성을 나타내지 않을 수 있다.
용어 "뮤테인"은 인터루킨-2 단백질에 대한 특이적 치환들이 이루어져있는 폴리펩티드를 의미한다. 투여 양식 및 처리와 관련하여 사용되는 용어 "IL-2 뮤테인"은 1, 2, 3, 4, 또는 5 또는 그 이상의 IL-2 뮤테인들을 의미한다. 예를 들어, IL-2 뮤테인을 사용한 처리는 단일 IL-2 뮤테인, 또는 복수의 IL-2 뮤테인들의 복합을 이용한 치료를 지칭할 수 있다. 인간 IL-2의 한 예는 WO2012/107417A1에 개시된 IL-2 뮤테인으로, wt hIL-2와 비교하여 3개의 돌연변이를 가진다.
프로류킨® (알데스류킨)은 인간 wt IL-2의 변이체의 또 다른 예로, 해당 분야의 숙련된 기술자에게 잘 알려져 있으며, 본 출원에서 서열 번호: 110으로 나타낸다.
본 출원에서 사용되는 용어 "항체" 또는 "IL-2에 대한 항체" 등은 (예컨대, 결합, 입체 장애, 안정화/탈안정화, 공간 분포에 의해) IL-2 에피토프와의 상호작용하여 IL-2 수용체 알파 (CD25로도 명명됨)에 대한 IL-2의 결합을 방해하는 전 항체들을 지칭한다. 자연 발생 "항체"는 이황화 결합에 의해 상호 연결된 최소한 2개의 중 (H) 쇄 및 2개의 경 (L) 쇄를 포함하는 당단백질이다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (본 출원에서 VH로 약칭) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인들, CH1, CH2 및 CH3로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본 출원에서 VL로 약칭) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인, CL로 구성된다. VH 및 VL 영역들은 프레임워크 영역들 (FRs)로 명명되는 보존성이 더 큰 영역들이 사이에 배치되는, 상보성 결정 영역들 (CDRs)로 명명된 초가변성 영역들로 더욱 세분될 수 있다. 각 VH 및 VL은 아미노-말단으로부터 카르복시-말단까지 다음 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR들로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 상기 중쇄 및 경쇄들의 가변 영역들은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 내포한다. 상기 항체들의 불변 영역들은 다양한 면역계 세포들 (예컨대, 효과기 세포들) 및 고전적인 보체계의 제 1 성분 (Clq)을 비롯한, 숙주 조직들 또는 인자들에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다. 용어 "항체"는 예를 들어, 단일클론 항체들, 인간 항체들, 인간화 항체, 카멜리드 항체들, 또는 키메라 항체들을 포함한다. 이러한 항체들은 임의의 아이소형 (예컨대, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 클래스 (예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 서브클래스일 수 있다.
경쇄 및 중쇄들 모두는 구조적 및 기능적 상동성의 영역들로 세분된다. 용어 "불변" 및 "가변"은 기능적으로 사용된다. 이와 관련하여, 경 (VL) 쇄 및 중 (VH) 쇄 부분들 모두의 가변 도메인들이 항원 인식 및 특이성을 결정함이 이해될 것이다. 역으로, 경쇄 (CL) 및 중쇄 (CH1, CH2 또는 CH3)의 불변 도메인들은 중요한 생물학적 성질들, 가령, 분비, 태반경유 이동성, Fc 수용체 결합, 보체 결합, 등을 부여한다. 관례상 불변 영역 도메인들은 항체의 항원-결합 부위 또는 아미노-말단으로부터 더 원위에 있게 되기 때문에 그 넘버링이 증가한다. N-말단은 가변 영역이고 C-말단은 불변 영역이며; CH3 및 CL 도메인들은 사실상 각각 중쇄 및 경쇄의 카르복시-말단을 포함한다. 특히, 용어 "항체"는 구체적으로 IgG-scFv 형식을 포함한다.
본 출원에서 사용되는 용어 항체의 "항원-결합 부분" (또는 간단하게는 "항원 부위")은, 항원 또는 에피토프 (예컨대, IL-2의 부위)에 특이적으로 결합하는 능력을 유지하는 항체의 전장 또는 하나 이상의 단편들, 가령, 단백질을 지칭한다.
"상보성 결정 영역들" ("CDRs")은 Kabat (1991), "서열들 of Proteins of Immunological Interest," 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD ("Kabat" 넘버링 방식), Al-Lazikani 등, (1997) JMB 273, 927-948 ("Chothia" 넘버링 방식) 및 ImMunoGenTics (IMGT) 넘버링 (Lefranc, M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999); Lefranc, M.-P. 등, Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003) ("IMGT" 넘버링 방식) 등에 의하여 기재되는 것들을 포함한, 다수의 공지된 임의의 방법들을 사용하여 결정되는 경계를 가지는 아미노산 서열들이다. 예를 들어, 고전적인 형식들에 있어서, Kabat 방식에서, 중쇄 가변 도메인 (VH)의 CDR 아미노산 잔기들은 31-35 (HCDR1), 50-65 (HCDR2), 및 95-102 (HCDR3)로 넘버링되고; 경쇄 가변 도메인 (VL)의 CDR 아미노산 잔기들은 24-34 (LCDR1), 50-56 (LCDR2), 및 89-97 (LCDR3)로 넘버링된다. Chothia 방식에서 VH의 CDR 아미노산은 26-32 (HCDR1), 52-56 (HCDR2), 및 95-102 (HCDR3)로 넘버링되고; VL의 아미노산 잔기들은 26-32 (LCDR1), 50-52 (LCDR2), 및 91-96 (LCDR3)으로 넘버링된다. Kabat과 Chothia 방식의 CDR 정의들 모두를 복합함으로써, CDRs은 인간 VH의 아미노산 잔기들 26-35 (HCDR1), 50-65 (HCDR2), 및 95-102 (HCDR3) 그리고 인간 VL의 아미노산 잔기들 24-34 (LCDR1), 50-56 (LCDR2), 및 89-97 (LCDR3)로 구성된다. IMGT 방식에서 VH의 CDR 아미노산 잔기들은 대략 26-35 (CDR1), 51-57 (CDR2) 및 93-102 (CDR3)로 넘버링되고, VL의 CDR 아미노산 잔기들은 대략 27-32 (CDR1), 50-52 (CDR2), 및 89-97 (CDR3) ("Kabat" 방식에 따른 넘버링)로 넘버링된다. IMGT 방식에서, 항체의 CDR 영역들은 프로그램 IMGT/DomainGap Align을 사용하여 결정될 수 있다.
용어 "에피토프 결합 도메인" 또는 "EBD"는 표적 에피토프 상의 결합 부위와 (예컨대, 결합, 입체 장애, 안정화/탈안정화, 공간 분포에 의해) 특이적으로 상호작용하는, 항원-결합 부분 (예컨대, 항체 또는 에피토프-결합 단편 또는 이의 유도체)의 부위들을 지칭한다. EBD는 또한 IL-2 에피토프와 (예컨대, 결합, 입체 장애, 안정화/탈안정화, 공간 분포에 의해) 특이적으로 상호작용하여 IL-2 수용체 알파 (CD25)에 대한 IL-2의 결합을 방해하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편들을 지칭한다. 항체 단편들의 예들에는, scFv, Fab 단편, VL, VH, CL 및 CH1 도메인들로 구성된 일가 단편; 힌지 영역에서 이황화물 다리에 의해 연결되는 2개의 Fab 단편들을 포함하는 이가 단편인 F(ab)2 단편; VH 및 CH1 도메인들로 구성된 Fd 단편; 항체 단완의 VL 및 VH 도메인들로 구성된 Fv 단편; VH 도메인으로 구성된 dAb 단편 (Ward 등, (1989) Nature 341:544-546); 그리고 단리된 상보성 결정 영역 (CDR)이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서 사용되는 용어 "에피토프"는 면역글로불린에 대해 높은 친화력으로 결합할 수 있는 임의의 결정인자를 지칭한다. 에피토프는 해당 항원을 특이적으로 표적하는 항체에 의해 결합되는 항원 영역이며, 항원이 단백질인 경우, 항체와 직접 접촉하는 특이적 아미노산을 포함한다. 대부분 종종 에피토프들은 단백질 상에 존재하지만, 일부 경우들에서는, 다른 종류의 분자들, 가령, 핵산 상에 존재할 수 있다. 에피토프 결정인자들은 화학적 활성 표면의 분자 그룹들, 가령, 아미노산, 당 측쇄들, 포스포릴 또는 설폰일 그룹들을 포함할 수 있으며, 특이적인 3차원의 구조적 특성들, 및/또는 특이적 전하 특성들을 가질 수 있다. 더욱이, Fv 단편, VL 및 VH의 2개의 도메인들은 별도의 유전자들에 의해 코드되지만, 이들은 합성 링커에 의한 재조합 방법들을 사용하여 결합될 수 있는데, 이러한 합성 링커는 VL 및 VH 영역들을 짝을 이루게하여 일가 분자들을 형성하고 있는 하나의 단백질 사슬 (단쇄 Fv (scFv)로 공지됨; 예컨대, Bird 등, (1988) Science 242:423-426; 및 Huston 등, (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883 참조)로서 제조될 수 있게 한다.
이러한 단쇄 항체들 또한 용어 "단편", "에피토프-결합 단편" 또는 "항체 단편"에 포함시키고자 한다. 이들 단편들은 해당 분야의 숙련된 기술자들에게 공지된 전형적인 기법들을 사용하여 수득되며, 무손상 항체들과 동일한 방식으로 용도에 따라 선별된다.
항체 단편들은 한 쌍의 탠덤 Fv 분절들 (VH-CH1-VH-CH1)을 포함하는 단쇄 분자들에 혼입될 수 있으며, 이 때 한 쌍의 탠덤 Fv 분절들은 상보적인 경쇄 폴리펩티드들과 함께, 한 쌍의 항원-결합 영역들을 형성하고 (Zapata 등, (1995) Protein Eng. 8:1057-1062; 및 미국 특허 제 5,641,870), 또한 Fab 단편들, F(ab') 단편들, F(ab')2 단편들, 및 항-이디오타입 (항-Id) 항체들 (예컨대, 본 발명의 항체들에 대한 항-Id 항체들을 포함), 및 상기 임의의 에피토프-결합 단편들을 포함한다.
EBD들은 또한 해당 분야에 공지된 바와 같은 단일 도메인 항체들, 맥시바디, 유니바디, 미니바디, 트라이아바디, 테트라바디, v-NAR 및 비스-scFv, (예컨대, Hollinger 및 Hudson, (2005) Nature Biotechnology 23: 1126-1136 참조), 이중특이적 단쇄 다이아바디, 또는 2개의 별도의 에피토프들에 결합하도록 설계된 단쇄 다이아바디를 포함한다. EBD들은 또한 항체-유사 분자들 또는 항체 모방체를 포함하며, 이는 에피토프들에 특이적으로 결합하는 미니바디, 맥시바디, Fn3계 단백질 스캐폴드, 안키린 반복부 (DARpins으로도 공지됨), VASP 폴리펩티드, 조류 췌장 폴리펩티드 (aPP), 테트라넥틴, 아필린 (Affililin), 노틴, SH3 도메인, PDZ 도메인, 텐다미스타트, 네오카르지노스타틴, 단백질 A 도메인, 리포칼린, 트랜스페린, 및 쿠니츠 도메인들을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니며, 이들은 본 발명의 범위에 속한다. 항체 단편들은 폴리펩티드들, 가령, 피브로넥틴 유형 III (Fn3) (피브로넥틴 폴리펩티드 모노바디를 설명하는 미국 특허 제 6,703,199호 참조)에 기반한 스캐폴드에 이식될 수 있다.
본 출원에서 사용되는 어구 "단리된 항체"는, 상이한 항원 특이성을 가지는 다른 항체들이 실질적으로 없는 항체를 지칭한다 (예컨대, IL-2에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 IL-2 이외의 항원들에 특이적으로 결합하는 항체들이 실질적으로 없다). 그러나 IL-2에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 다른 종들의 다른 항원들, 가령, IL-2 분자들에 대하여 교차 반응성을 가질 수 있다. 더욱이, 단리된 항체는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질들이 실질적으로 없을 수 있다.
본 출원에서 사용되는 용어 "1가 항체"는, 표적 분자 상의 단일 에피토프, 가령, IL-2에 결합하는 항체를 지칭한다.
본 출원에서 사용되는 용어 "2가 항체"는, 최소한 2개의 동일한 IL-2 표적 분자들 상의 2개의 에피토프들에 결합하는 항체를 지칭한다. 2가 항체는 또한 표적 IL-2 분자들로 하여금 서로 가교결합하게 할 수 있다. "2가 항체"는 또한 최소한 2개의 동일한 IL-2 표적 분자들 상의 2개의 상이한 에피토프들에 결합하는 항체를 지칭한다.
용어 "다가 항체"는 둘 이상의 원자가를 가지는 단일 결합 분자를 지칭하며, 이 때 "원자가"는 항체 작제물의 분자 하나 당 존재하는 항원-결합 모이어티들의 수로 설명된다. 이와 같이, 단일 결합 분자는 표적 분자 상의 둘 이상의 결합 부위에 결합할 수 있다. 다가 항체들의 예들에는, 2가 항체들, 3가 항체들, 4가 항체들, 5가 항체들, 등, 뿐만 아니라 이중특이적 항체들 및 이중파라토프 항체들이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, IL-2에 있어서, 다가 항체 (예컨대, IL-2 이중파라토프 항체)는 IL-2의 2개 도메인들 각각에 대한 결합 모이어티를 가진다.
다가 항체는 (예컨대, 세포 사멸을 매개 또는 촉진함으로써, 또는 생체이용성인 물질의 양을 조절함으로써) 생물학적 효과를 매개하거나 대상체의 질환 또는 장애를 조절한다.
용어 "다가 항체"는 또한 2개의 별도의 IL-2 표적 분자들에 대하여 둘 이상의 항원-결합 모이어티들을 가지는 단일 결합 분자를 지칭한다. 예를 들어, 항체는 IL-2 표적 분자 및 IL-2가 아닌 제 2 표적 분자 모두에 결합한다. 한 구체예에서, 다가 항체는 4개의 에피토프 결합 도메인들을 가지는 4가 항체이다. 4가 분자는 해당 표적 분자 상의 각 결합 부위에 대해 이중특이적이고 2가 일 수 있다.
본 출원에서 사용되는 용어 "이중파라토프 항체"는, 단일 IL-2 표적 상의 2개의 상이한 에피토프들에 결합하는 항체를 지칭한다. 이 용어는 또한 최소한 2개의 IL-2 표적들의 2개 도메인들에 결합하는 항체, 예컨대, 4가 이중파라토프 항체를 포함한다.
본 출원에서 사용되는 용어 "이중특이적 항체"는, 최소한 2개의 상이한 표적들 (예컨대, IL-2 및 IL-2이 아닌 표적) 상의 둘 이상의 상이한 에피토프들에 결합하는 항체를 지칭한다.
본 출원에서 사용되는 어구 "단일클론 항체" 또는 "단일클론 항체 조성물"은 아미노산 서열과 실질적으로 동일하고 동일한 유전자 출처로부터 유래한, 항체들, 이중특이적 항체들 등을 비롯한 폴리펩티드를 지칭한다. 이 용어는 또한 단일 분자 조성물의 항체 분자들의 제조물 또한 포함한다. 단일클론 항체 조성물은 특정 에피토프에 대한 하나의 결합 특이성 및 친화력을 보여준다.
본 출원에서 사용되는 용어 "인간화 항체" 또는 "인간화 항-IL-2 항체"는 또 다른 포유동물 종들, 가령, 마우스의 생식계열에서 유래된 CDR 서열들이, 인간 프레임워크 서열들에 이식되어 있는 항체들을 포함한다. 추가적인 프레임워크 영역 변형들이 인간 프레임워크 서열들 내에서 뿐만 아니라 또 다른 포유동물 종들의 생식계열에서 유래된 CDR 서열들 내에서 이루어질 수 있다.
본 발명의 인간화 항체는 인간 서열들에 의해 인코딩되지 않는 아미노산 잔기들을 포함할 수 있다 (예컨대, 시험관내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유도에 의해 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이들, 또는 안정성 또는 제작을 촉진시키기 위한 보존적 치환).
본 출원에서 사용되는 용어 "재조합 인간화 항체"는 재조합 수단들에 의해 제조, 발현, 생성, 또는 단리되는 모든 인간 항체들, 가령, 인간화 항체를 발현시키도록 형질전환된 숙주 세포로부터, 예컨대, 트랜스펙토마로부터 단리된 항체들, 및 인간 면역글로불린 유전자 모두 또는 일 부위의 서열들을 다른 DNA 서열들로 스플라이싱하는 것을 포함하는 임의의 다른 수단들에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체들을 포함한다.
본 출원에서 사용되는 용어 "Fc 영역"은 CH3, CH2 그리고 항체의 불변 도메인의 힌지 영역의 최소한 일 부위를 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 선택적으로, Fc 영역은 일부 항체 클래스들에 존재하는 CH4 도메인을 포함할 수 있다. Fc 영역은, 항체의 불변 도메인의 힌지 영역 전체를 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명은 항체의 Fc 영역 및 CH1 영역을 포함한다. 한 구체예에서, 본 발명은 항체의 Fc 영역 및 CH3 영역을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 항체의 불변 도메인의 Fc 영역, CH1 영역 및 카파/람다 영역을 포함한다. 한 구체예에서, 본 발명의 결합 분자는 불변 영역, 예컨대, 중쇄 불변 영역을 포함한다. 한 구체예에서, 이러한 불변 영역은 야생형 불변 영역과 비교하여 변형된다. 즉, 본 출원에 개시된 본 발명의 폴리펩티드들은 3개 중쇄 불변 도메인들 (CH1, CH2 또는 CH3) 중 하나 이상에 대한 및/또는 경쇄 불변 영역 도메인 (CL)에 대한 변경들 또는 변형들을 포함할 수 있다. 예시 변형들에는, 하나 이상의 도메인들에서 하나 이상의 아미노산들의 부가, 결실 또는 치환이 포함된다. 이러한 변화들은 효과기 기능, 반감기, 등을 최적화하기 위해 포함될 수 있다.
본 출원에서 사용되는 용어 "결합 부위"는 항체 또는 항원-결합 단편이 선택적으로 결합하는 IL-2 표적 분자 상의 영역을 포함한다.
용어 "융합 단백질"은 추가 링커 서열에 의한 또는 이러한 서열 없는 2개의 별도의 단백질들의 융합이다.
용어 "링커 서열"은 2개의 단백질들을 연결 또는 결합시키기 위해 사용되는 아미노산 서열이다.
일반적으로, 특정 표적 항원에 특이적인 항체들은 단백질 및/또는 거대분자들의 복합체 혼합물에서 표적 항원 상의 에피토프에 결합할 것이다.
본 출원에서 사용되는 용어 "친화력"은 단일 항원 부위들에서의 항원과 항체 사이의 상호작용 강도를 지칭한다. 각 항원 부위 내에서, 항체 "팔(arm)"의 가변 영역은 수많은 부위들에서의 항원과 약한 비-공유 결합력을 통해 상호작용하며; 상호작용이 많을 수록, 친화력이 더 강해진다. IgG 항체 또는 이의 단편 (예컨대, Fab 단편)에 관하여 본 출원에서 사용되는 용어 "고 친화력"은 표적 항원에 대해 10-8 M 또는 그 미만, 10-9 M 또는 그 미만, 또는 10-10 M, 또는 10-11 M 또는 그 미만, 또는 10-12 M 또는 그 미만, 또는 10-13 M 또는 그 미만의 KD를 가지는 항체를 지칭한다. 그러나 다른 항체 아이소형들에 대한 고 친화력 결합은 10배 다를 수 있다. 예를 들어, IgM 아이소형에 대한 고 친화력 결합은 10-7 M 또는 그 미만, 또는 10-8 M 또는 그 미만의 KD를 가지는 항체를 지칭한다.
본 출원에서 사용되는 용어 "항체결합력(Avidity)"은 항체-항원 복합체의 전체 안정성 또는 강도에 대한 유익한 측정치를 지칭한다. 이는 다음 3가지 주요 인자들에 의해 조절된다: 항체 에피토프 친화력; 항원과 항체 모두의 원자가; 및 상호작용 부분들의 구조적 배열. 궁극적으로 이러한 인자들은 항체의 특이성, 즉, 특정 항체가 정확한 항원 에피토프에 결합할 가능성을 정의한다.
에피토프를 포함하는 주어진 폴리펩티드 영역들은 해당 분야에 널리 공지된 수많은 에피토프 맵핑 기법들을 사용하여 식별될 수 있다. 예컨대, Epitope Mapping 프로토콜 in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, N.J를 참조하라. 예를 들어, 선형 에피토프들은, 예컨대, 고체 지지체 상에서 단백질 분자의 부위들에 해당하는 많은 수의 펩티드들을 동시에 합성하고, 이들 펩티드들이 지지체에 여전히 부착된 상태에서 펩티드들을 항체들과 반응시킴으로써 결정될 수 있다. 이러한 기법들은 해당 분야에 공지이며, 예컨대, 미국 특허 제 4,708,871; Geysen 등, (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8:3998-4002; Geysen 등, (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:78-182; Geysen 등, (1986) Mol. Immunol. 23:709-715에 기재되어 있다. 유사하게, 입체형 에피토프들은 아미노산의 공간적 입체형태를 결정함으로써, 가령, 예컨대, x-선 결정분석법 및 2차원 핵자기 공명법에 의해 용이하게 식별된다. 예컨대, 상기 에피토프 맵핑 프로토콜을 참조하라. 단백질의 항원 영역들은 가령, 예컨대, Oxford Molecular Group사로부터 구입가능한 Omiga version 1.0 소프트웨어 프로그램을 사용하여 계산된 표준 항원성 및 친수도 도표를 사용하여서도 식별될 수 있다. 이 컴퓨터 프로그램은 항원성 프로파일을 결정하기 위하여 Hopp/Woods 법을, Hopp 등, (1981) Proc. Natl. Acad. Sci USA 78:3824-3828; 친수도 도표를 결정하기 위하여 Kyte-Doolittle 기법, Kyte 등, (1982) J. MoI. Biol. 157:105-132을 사용한다.
본 명세서 및 청구범위에서 사용되는, 단수 형태( "a", "an") 및 관사("the")는 문맥상 명확히 달리 지시하지 않는 한, 복수 형태를 포함한다. 예를 들어, 용어 "하나의 세포"는 세포의 혼합물들을 비롯한 복수의 세포들을 포함한다.
범위를 비롯한 모든 수치적 지정들, 예컨대, pH, 온도, 시간, 농도 및 분자량은, 0.1의 증가분만큼 (+) 또는 (-)로 달라지는 근사치들이다. 항상 명확히 언급되는 것은 아니나, 모든 수치적 지정들 앞에 용어 "약"이 선행됨을 이해하여야 한다. 또한, 항상 명확히 언급되는 것은 아니나 본 출원에 기재된 시약들은 단순히 예시이며 이들의 균등구성들은 해당 분야에 공지되어 있음을 이해하여야 한다.
본 출원에서 사용되는 용어 "아미노산"은 자연 및/또는 비자연 또는 합성 아미노산, D 및 L 모두의 광학 이성질체, 아미노산 유사체, 및 펩티도모방체를 지칭한다. 3 또는 그 이상의 아미노산의 펩티드는 그 펩티드 사슬이 짧은 경우 통상적으로 올리고펩티드로 불린다. 펩티드 사슬이 긴 경우, 그 펩티드는 통상적으로 폴리펩티드 또는 단백질로 불린다. 용어 "생물표지자" 또는 "표지자"는 본 출원에서 호환적으로 사용된다. 생물표지자는 핵산 또는 폴리펩티드이며 이러한 폴리펩티드의 상이한 발현 또는 돌연변이의 존재 또는 부재는 본 발명에 따른 항-IL-2 항체를 포함하는 임의의 처리에 대한 민감도를 결정하기 위해 사용된다. 예를 들어, 단백질이 정상 (비-암성) 세포 또는 대조 세포에서 동일한 단백질과 비교하여 번역 후 변형, 제조, 발현, 수준, 안정성 및/또는 활성에 있어서 부족하거나, 돌연변이되거나, 결실되거나, 또는 감소되는 경우, 단백질은 암 세포에 대한 생물표지자이다.
용어 "cDNA"는 상보적 DNA, 즉, 효소, 가령, 역전사효소를 이용하여 cDNA로 제조되는, 하나의 세포 또는 유기체에 존재하는 mRNA 분자들을 지칭한다. "cDNA 라이브러리"는 하나의 세포 또는 유기체에 존재하는 모든 mRNA 분자들의 집합으로, 이들 mRNA 분자들 모두는 효소인 역전사효소를 이용하여 cDNA 분자들로 전환되고, 그 후 "벡터들" (외부 DNA 추가 후 계속하여 복제할 수 있는 다른 DNA 분자들)에 삽입된다. 라이브러리용 벡터들의 예에는 박테리오파지 ("파지"로도 공지됨), 세균을 감염시키는 바이러스들, 예를 들어, 람다 파지가 포함된다. 이 라이브러리는 이후 관심 대상의 특이적 cDNA (그리고 그 결과 mRNA)에 대해 탐침될 수 있다.
용어 "세포 증식성 장애"는 이상 세포 성장 및/또는 분열 또는 기능의 상실로 특징되는 정상적인 생리학적 기능의 조절이상을 포함할 것이다. "세포 증식성 장애"의 예들에는, 과형성증, 신생물, 화생, 및 다양한 자가면역 장애, 예컨대, T 세포 세포사멸의 조절이상으로 특징되는 장애가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
"복합"은 하나의 단위 투약형으로 고정된 복합물, 또는 복합 투여를 지칭하는데, 복합된 투여에서 본 발명의 화합물과 복합 파트너 (예컨대 하기 설명되는 또 다른 약물, "치료제" 또는 "보조제"로도 지칭됨)는 동시에 또는 일정 시간 간격 이내에, 특히, 복합 파트너들이 협동적인, 예컨대, 상승작용적 효과를 나타낼 수 있게 하는 시간 간격 이내에 별도로 독립적으로 투여될 수 있다. 단일 성분들은 하나의 키트로 또는 별도로 포장될 수 있다. 이들 성분들 중 하나 또는 모두는 (예컨대, 분말 또는 액체) 투여에 앞서 원하는 투여량으로 재구성 또는 희석될 수 있다. 본 출원에서 사용되는 용어 "공동-투여" 또는 "복합 투여" 등은 필요로 하는 하나의 대상체 (예컨대, 환자)에 대한 선택된 복합 파트너의 투여를 포함하고자 하며, 상기 제제들이 반드시 동일한 투여 경로 또는 동시에 투여될 필요는 없는 치료 요법을 포함하고자 한다. 본 출원에서 사용되는 용어 "제약학적 복합물"은 하나 이상의 활성 성분을 혼합 또는 조합하여 생성되는 생성물을 의미하며 이러한 활성 성분들의 고정 그리고 비-고정 복합들 모두를 포함한다. 용어 "고정 복합"은 활성 성분들, 예컨대, 본 발명의 화합물 및 복합 파트너가 모두 단일 개체 또는 투약의 형태로 동시에 환자에게 투여되는 것을 의미한다. 용어 "비-고정 복합"은 활성 성분들, 예컨대, 본 발명의 화합물 및 복합 파트너가 모두 별도의 개체로 동시에, 함께 또는 순차적으로 구체적인 시간 제한 없이 환자에게 투여됨을 의미하며, 이러한 투여는 환자의 신체에서 상기 두 성분들의 치료적 유효 수준을 제공한다. 비-고정 복합은 또한 칵테일 치료, 예컨대, 셋 또는 그 이상의 활성 성분들의 투여에도 적용된다.
"유전자"는 전사 및 번역 후 특정 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩할 수 있는 최소한 하나의 해독틀 (ORF)을 내포하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드 서열은 결합되는 유전자의 보다 큰 단편들 또는 전장 코딩 서열들을 식별하기 위해 사용될 수 있다. 보다 큰 단편 서열들의 단리 방법들은 해당 분야의 숙련된 기술자들에게 공지이다.
"유전자 발현" 또는 대안적으로 "유전자 생성물"은 유전자가 전사되고 번역될 때 생성되는 핵산 또는 아미노산 (예컨대, 펩티드 또는 폴리펩티드)을 지칭한다.
본 출원에서 사용되는 "발현"은 DNA가 mRNA로 전사되는 과정 및/또는 전사된 mRNA가 후속하여 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로 번역되는 과정을 지칭한다. 폴리뉴클레오티드가 게놈 DNA로부터 유래한 경우, 발현은 진핵 세포에서 mRNA의 스플라이싱을 포함할 수 있다.
유전자에 사용될 때 "상이하게 발현된"은 해당 유전자로부터 전사 및/또는 번역된 mRNA 또는 해당 유전자에 의해 인코딩되는 단백질의 상이한 생성을 지칭한다. 상이하게 발현된 유전자는 정상 또는 대조 세포의 발현 수준과 비교하여 과발현되거나 저발현(under expressed) 될 수 있다. 그러나 본 출원에서 사용되는, 과발현은 유전자 발현의 증가이며 일반적으로 정상 또는 대조군의 대응 세포 또는 조직에서 탐지되는 것보다 최소한 1.25 배 또는, 대안적으로, 최소한 1.5 배 또는, 대안적으로, 최소한 2 배, 또는 대안적으로, 최소한 3 배 또는 대안적으로, 최소한 4 배 과다한 발현이다. 본 출원에서 사용되는, 저발현은, 유전자 발현의 감소이며 일반적으로 정상 또는 대조군의 대응 세포 또는 조직에서 탐지되는 것보다 최소한 1.25 배, 또는 대안적으로, 최소한 1.5 배, 또는 대안적으로, 최소한 2 배 또는 대안적으로, 최소한 3 배 또는 대안적으로, 최소한 4 배 낮은 발현이다. 용어 "상이하게 발현된"은 또한 암 세포 또는 암성 조직에서의 발현은 탐지되지만 대조 세포 또는 정상 조직 (예컨대 비-암성 세포 또는 조직)에서의 발현은 탐지불가능한 경우를 지칭한다.
상기 유전자의 높은 발현 수준은 유전자의 과발현 또는 유전자 복제수의 증가로 인하여 발생할 수 있다. 이러한 유전자는 또한 음성 조절인자의 탈조절 (deregulation) 또는 부재로 인해 증가된 단백질 수준들로 번역될 수 있다. 마지막으로, 유전자의 고 발현은 단백질의 안정화 증가 또는 단백질 분해 감소로 인해, 단백질이 축적되어 발생할 수 있다.
본 출원에서 사용되는, 용어 암 세포를 "억제하다", "억제하는 것", 또는 암 세포의 "성장을 억제하다" 또는 "증식을 억제하는 것"은 암 세포의 성장을 감속, 중단, 저지 또는 정지하는 것을 지칭하며 반드시 암 세포 성장을 모두 제거하는 것을 나타내는 것은 아니다. 용어 "억제하다" 및 "억제하는 것" 등은, 2개 언급들 간의 정량적 차이를 나타내며; 이러한 2개 언급들 간 최소한 통계적으로 유의한 차이를 지칭한다. 예를 들어, "암 세포들의 성장 억제에 유효한 양"은 세포들의 성장 속도가 처리되지 않은 세포들과 최소한 통계적으로 유이하게 달라지게 됨을 의미한다. 이러한 용어들은 본 출원에서, 예를 들어, 세포 증식 속도에 사용된다.
용어 "단리된"은 폴리뉴클레오티드, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 항체 또는 이의 단편(들)이 일반적으로 성질면에서 연관되어 있는 구성성분들, 세포 및 기타로부터 분리됨을 의미한다. 예를 들어, 단리된 폴리뉴클레오티드는 일반적으로 그 고유한 또는 자연적인 환경안에서, 예컨대, 염색체 상에서 결합되어 있는 3' 및 5' 연속 뉴클레오티드들로부터 분리된다. 해당 분야의 숙련된 기술자들에게 자명한 바와 같이, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 항체, 또는 이의 단편(들)은, 그 자연 발생 대응부와 이를 구별하기 위한 "단리"를 필요로하지 않는다. 또한, "농축된", "분리된" 또는 "희석된" 폴리뉴클레오티드, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 항체 또는 이의 단편(들)은, 부피 당 분자들의 농도 또는 분자수가 이들의 자연 발생 대응구성보다 "농축된" 형태에서 더 크거나 또는 "분리된" 형태에서 더 작다는 점에서, 자연 발생 대응구성과 구별가능하다.
본 출원에서 사용되는 용어 "신생물 세포들," "신생물 질환," "신생물," "종양," "종양 세포들," "암," 및 "암 세포들" (호환적으로 사용됨)은 비교적 자율적 성장을 나타내어, 그 결과 유의미한 세포 증식 제어의 소실 (즉, 조절되지 않는 세포 분화)로 특징되는 이상 성장 표현형을 보이는 세포들을 지칭한다. 신생물 세포들은 악성 또는 양성일 수 있다. "전이성 세포 또는 조직"은 해당 세포가 침습하여 이웃한 신체 구조를 파괴할 수 있음을 의미한다.
용어 "핵산" 및 "폴리뉴클레오티드"는 호환적으로 사용되며 데옥시리보뉴클레오티드들 또는 리보뉴클레오티드들 또는 이의 유사체들인, 임의의 길이의 뉴클레오티드들의 폴리머 형태를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 임의의 3차원 구조를 가질 수 있으며 임의의 기능을 수행할 수 있다. 다음은 폴리뉴클레오티드의 비-제한적 예들이다: 유전자 또는 유전자 단편 (예를 들어, 탐침자, 프라이머, EST 또는 SAGE 태그), 엑손, 인트론, 전령 RNA (mRNA), 전달 RNA, 리보솜 RNA, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지형 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 탐침자, siRNA, shRNA, RNAi 제제, 및 프라이머들. 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 염기, 당 및/또는 인산염에서 변형 또는 치환될 수 있으며, 임의의 다양한 변형들 또는 치환들은 본 명세서에 기재되어 있거나 해당 분야에 공지이다. 폴리뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드들, 가령, 메틸화 뉴클레오티드들 및 뉴클레오티드 유사체들을 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오티드 구조에 대한 변형들은 폴리머 조립 전 또는 이후에 부여될 수 있다. 뉴클레오티드들의 서열은 비-뉴클레오티드 성분들에 의해 중단될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 중합 후, 가령, 표지 성분과의 결합에 의해 추가로 변형될 수 있다. 이 용어는 또한 이중- 및 단일-가닥 분자들 모두를 지칭한다. 달리 특정되거나 또는 요구되지 않는 한, 폴리뉴클레오티드인 본 발명의 임의의 구체예는 이중-가닥 형태 및 이중-가닥 형태를 구성하는 것으로 공지되거나 예상되는 2개의 상보적 단일-가닥 형태들 각각을 모두 포함한다.
용어 "폴리펩티드"는 용어 "단백질"과 호환적으로 사용되며 가장 광범위한 의미에서 둘 또는 그 이상의 아단위 아미노산, 아미노산 유사체들, 또는 펩티도모방체의 화합물을 지칭한다. 이러한 아단위들은 펩티드 결합에 의해 연결될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 이러한 아단위는 다른 결합들, 예컨대, 에스터, 에터 등에 의해 연결될 수 있다.
폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 영역 (또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 영역)은 또 다른 서열에 대한 일정 백분율 (예를 들어, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%)의 "서열 동일성"을 가지는데, 이는 이러한 2개 서열들을 정렬시켜 비교시, 염기들 (또는 아미노산들)의 백분율이 동일함을 의미한다. 이러한 정렬 및 상동성 백분율 또는 서열 동일성은 해당 분야에 공지된 소프트웨어 프로그램, 예를 들어, Current protocol in Molecular Biology, Ausubel 등, eds., (1987) Supplement 30, 섹션 7.7.18, 표 7.7.1에 기재된 프로그램들을 사용하여 결정될 수 있다. 바람직하게는, 기본 매개변수들이 정렬에 사용된다. 바람직한 정렬 프로그램은 BLAST이며 기본 매개변수들을 사용한다. 특히, 바람직한 프로그램들은 BLASTN 및 BLASTP이며, 다음과 같은 기본 매개변수들을 사용한다: 유전자 코드=표준; 필터=없음; 가닥=둘 모두; 컷오프=60; 기대값=10; 매트릭스=BLOSUM62; 기재=50개 서열들; 분류=하이 스코어; 데이터베이스=비-중복.
종양 성장을 "억제하는 것" 또는 "억제"는 종양 세포를 본 발명에 따른 항-IL-2 항체와 접촉시, 본 발명의 화합물에 따른 항-IL-2 항체와 접촉하지 않은 종양 성장과 비교하여 종양 세포 성장이 감소하는 것을 나타낸다. 종양 세포 성장은 종양 크기 측정, 3H-티미딘 혼합 분석을 사용한 종양 세포들의 증식 여부 결정, FDG-PET (플루오로데옥시글루코스 양전자 방출 단층촬영법) 영상법에 의한 포도당 흡수 측정, 또는 종양 세포들 계수를 비롯한 해당 분야에 공지된 임의의 수단들에 의해 평가될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 종양 세포 성장을 "억제하는 것"은 다음 상태들 중 어느 하나 또는 모두를 의미한다: 종양 성장을 감속, 지연 및 정지, 뿐만 아니라 종양 수축. "대상체", "개체" 또는 "환자"는 본 출원에서 호환적으로 사용되며, 척추동물, 바람직하게는 포유동물, 더욱 바람직하게는 인간을 지칭한다. 포유동물에는, 마우스, 유인원, 인간, 가축들, 경기 동물들, 및 애완동물이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
6.1. 항-IL-2 항체들
제 1 양상에서 본 발명은 인간 IL-2에 결합하는 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 부분을 제공하며, 여기서 상기 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 표 11에 따른 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3를 포함하는 경쇄 가변 영역 및 표 12에 따른 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 부분은, 표 6 또는 표 10에 따른 경쇄 가변 영역 및 표 5 또는 표 10에 따른 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구체예들에서 상기 단리된 항체는, 표 10 또는 표 13에 제시된 가변 경쇄들 및 가변 중쇄들을 포함한다.
또 다른 양상에서 본 발명은 인간 IL-2에 결합하는 항체의 변이체 또는 이의 단편을 제공한다. 그러므로 본 발명은 중쇄 또는 경쇄의 모체 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역 서열, 예컨대, 각각 표 5 및 표 6의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열들의 비-CDR 영역들의 아미노산 서열과 최소한 80% 동일한 (최소한 80% 아미노산 서열 동일성을 가지는) 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역 서열의 비-CDR 영역들의 아미노산 서열을 가지는 항체 또는 이의 단편을 제공한다. 중쇄 또는 경쇄의 모체 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역 서열의 비-확장된 CDR 영역들의 아미노산 서열과 최소한 80% 동일한, 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역 서열의 비-확장 CDR 영역들의 아미노산 서열을 가지는 항체들 또는 이의 단편들 또한 본 발명에서 제공된다. 바람직하게는 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역 서열의 비-CDR 영역들의 또는 비-확장된 CDR 영역들의 아미노산 서열 동일성은 최소한 85%, 더욱 바람직하게는 최소한 90%, 그리고 가장 바람직하게는 최소한 95%, 특히 96%,더욱 특히 97%, 더더욱 특히 98%, 가장 특히 99%이며, 예를 들어, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 및 100%가 포함된다.
본 출원은 또한 중쇄 및/또는 경쇄 불변 영역, 특히, 인간 중쇄 및/또는 인간 경쇄 불변 영역을 추가로 포함하는, 인간 IL-2에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 제공한다. 인간 중쇄 불변 영역들은 IgG 1 (IGHG 1), IgG2 (IGHG2), IgG3 (IGHG3), IgG4 (IGHG4), IgAI (IGHAl), IgA2 (IGHA2), IgM (IGHM), IgD (IGHD), 또는 IgE (lGHE)로 구성된 인간 면역글로불린들의 그룹에서 선택될 수 있으며, 인간 증쇄 불변 영역 IgG, 특히, IgG 1 (IGHG 1)이 바람직하다. 인간 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 불변 영역들로 구성되는 인간 면역글로불린들의 그룹에서 선택될 수 있으며, 반면 인간 카파 불변 영역이 바람직하다. 한 바람직한 구체예에서 인간 IL-2에 결합하는 항체 또는 이의 단편은 인간 IgG 1 (IGHG 1) 중쇄 불변 도메인 및 인간 경쇄 카파 불변 도메인을 포함한다.
상기 프레임워크 영역들 또는 CDR 영역들 내에서 이루어지는 변형들 이외에도 또는 이러한 변형들에 대안적으로, 본 발명의 항체들은 Fc 영역 내부에, 전형적으로 항체의 하나 이상의 기능적 성질들, 가령, 혈청 반감기, 보체 결합, Fc 수용체 결합, 및/또는 항원-의존성 세포상 세포독성을 변화시키기 위한 변형들을 포함하도록 유전자 조작될 수 있다.
더욱이, 본 발명의 항체는 화학적으로 변형되거나 (예컨대, 하나 이상의 화학적 모이어티들이 항체에 부착될 수 있음) 또는 항체의 당화를 변화시키기 위해 변형될 수 있다.
본 발명은 인간 IL-2에 특이적으로 결합하여, 그 결과 생체내 변화된 반감기를 가져오는 항체들을 제공한다.
많은 인자들이 단백질의 생체내 반감기에 영향을 줄 수 있다. 예를 들어, 신장 여과, 간에서의 대사, 단백질분해 효소 (프로테아제)에 의한 분해, 및 면역원성 반응들 (예컨대, 항체들에 의한 단백질 중화 및 마크로파지 및 수지상 세포들에 의한 흡수). 본 발명의 항체들 및 이의 항원-결합 단편들의 반감기를 연장시키기 위하여 다양한 전략들이 사용될 수 있다. 예를 들어, 폴리에틸렌글리콜 (PEG), reCODE PEG, 항체 스캐폴드, 폴리시알산 (PSA), 하이드록시에틸 전분 (HES), 알부민-결합 리간드, 및 탄수화물 차폐에 대한 화학적 링키지에 의해; 혈청 단백질, 가령, 알부민, IgG, FcRn, 및 트랜스페린에 결합하는 단백질들에 대한 유전자 융합에 의해; 혈청 단백질, 가령, 나노바디, Fabs, DARPins, 아비머 (avimers), 애피바디 (affibodies), 및 안티칼린에 결합하는 다른 결합 모이어티들에 대한 (유전적 또는 화학적) 커플링에 의해; rPEG, 알부민, 알부민의 도메인, 알부민-결합 단백질, 및 Fc에 대한 유전자 융합에 의해; 또는 나노담체, 서방형 제형, 또는 의학 장치들로의 통합에 의한 전략이 있다.
생체내 항체들의 혈청 순환을 연장시키기 위하여, 불활성 폴리머 분자들, 가령, 고분자량 PEG가 항체들의 N- 또는 C-말단에 대한 PEG의 부위-특이적 결합을 통해 또는 리신 잔기들 상에 존재하는 엡실론-아미노 그룹들을 통해 다기능성 링커에 의해 또는 의하지 않고 상기 항체들 또는 이의 단편에 부착될 수 있다. 항체를 페길화하기 위하여, 항체, 이의 항원-결합 단편은 전형적으로 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 그룹들이 항체 또는 항체 단편에 부착되는 조건하에서 PEG, 가령, PEG의 반응성 에스터 또는 알데하이드 유도체와 반응된다. 페길화는 반응성 PEG 분자 (또는 유사 반응성 수용성 폴리머)와의 아실화 반응 또는 알킬화 반응에 의해 실시될 수 있다. 본 출원에서 사용되는 용어 "폴리에틸렌 글리콜"은 다른 단백질을 유도하기 위해 사용되어 왔던 임의의 PEG 형태들, 가령, 모노 (C1-C10)알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜-말레이미드를 포함하는 것으로 한다. 한 구체예에서, 페길화될 항체는 무당화 항체이다. 생물학적 활성을 최소한으로 소실시키는 선형 또는 분지형 폴리머 유도체화가 사용될 것이다. 상기 항체들에 대한 PEG 분자들의 적절한 결합을 확인하기 위해 결합도를 SDS-PAGE 및 질량 분광분석법으로 면밀히 모니터할 수 있다. 크기-배제 또는 이온-교환 크로마토그래피에 의하여 반응하지 않은 PEG를 항체-PEG 접합체로부터 분리할 수 있다. PEG-유도 항체들을 결합 활성에 대해, 뿐만 아니라 생체내 효능에 대해, 해당 분야의 숙련된 기술자들에게 널리 공지된 방법들을 사용하여, 예를 들어, 본 출원에 기재된 면역분석법으로 테스트할 수 있다. 단백질의 페길화 방법들은 해당 분야에 공지이며 본 발명의 항체들 및 이의 항원-결합 단편들에 적용될 수 있다. 예를 들어, 본 출원에 각각 참고문헌으로 포함되는, Nishimura 등의 EP 0 154 316 그리고 Ishikawa 등의 EP 0 401 384를 참조하라.
다른 변형된 페길화 기술들은 화학적 직교 방향의 유전공학 기술을 재구성하는 것 (ReCODE PEG)을 포함하며, 이는 tRNA 합성효소 및 tRNA를 포함하는 재구성된 시스템을 통해 화학적으로 특정된 측쇄들을 생합성 단백질에 혼입시킨다. 이러한 기술은 30개 이상의 새로운 아미노산을 대장균, 효모, 및 포유동물 세포들의 생합성 단백질에 혼입가능하게 한다. tRNA는 앰버를 종결 코돈으로부터 화학적으로 특정된 아미노산을 혼입시키는 신호를 전달하는 코돈으로 전환시키는, 앰버 코돈이 위치한 모든 장소에 표준 아미노산을 혼입시킨다.
재조합 페길화 기술 (rPEG)은 또한 혈청 반감기 연장을 위해 사용될 수 있다. 이러한 기술은 300-600개의 아미노산 비구조화 단백질 꼬리를 기존의 제약학적 단백질에 유전자 용합하는 것을 포함한다. 이러한 비구조화된 단백질 사슬의 외형적인 분자량은 그 실제 분자량보다 약 15-배 더 크기 때문에, 이 단백질의 혈청 반감기는 상당히 증가된다. 화학적 접합 및 재정제를 필요로 하는 종래의 페길화와 대조적으로, 제작 공정이 상당히 간단하며 생성물은 균질하다.
폴리시알화는 치료 펩티드 및 단백질의 활성 수명을 지연시키고 안정성을 개선하기 위해 천연 폴리머 폴리시알산 (PSA)을 사용하는 또 다른 기술이다. PSA는 시알산의 폴리머이다 (당). 단백질 및 치료 펩티드 약물 전달을 위해 사용될 경우, 폴리시알산은 접합시 보호적 미세환경을 제공한다. 이는 순환 중인 치료 단백질의 활성 수명을 증가시키고 치료 단백질을 면역계가 인식하지 못하게 한다. PSA 폴리머는 인체에서 자연적으로 발견된다. 이는 특정 세균에 의해 받아들여져, 수백만년에 걸쳐 진화하여 자신의 세포벽을 PSA로 피복하게 되었다. 이러한 자연 폴리시알화된 세균들은 그 후 분자 모방에 의해, 신체의 방어시스템을 저지할 수 있었다. 자연의 궁극적 스텔스 기술인 PSA는 이러한 세균으로부터 다량으로 그리고 예정된 물리적 특성을 보유하도록 용이하게 생성될 수 있다. 세균 PSA는 인체내에서 PSA와 화학적으로 동일하기 때문에 단백질에 커플링하였을 때 조차도 전적으로 비-면역원성이다.
또 다른 기술은 항체들에 연결되는 하이드록시에틸 전분 ("HES") 유도체들의 사용을 포함한다. HES는 찰옥수수 전분으로부터 유도된 변형된 자연 폴리머로 신체의 효소들에 의해 대사될 수 있다. HES 용액들은 일반적으로 부족한 혈액량을 대체하고 혈액의 유변학적 성질을 개선하기 위해 투여된다. 항체의 헤실화는 분자의 안정성을 증가시킴으로써, 뿐만 아니라 신장 청소율을 감소시킴으로써 순환 반감기를 연장시킬 수 있으며, 그 결과 생물학적 활성이 증가하게 된다. 상이한 매개변수들, 가령, HES의 분자량을 달리함으로써, 광범위한 HES 항체 접합체들을 주문제작할 수 있다.
하나 이상의 아미노산 변형들 (즉, 치환, 삽입 또는 결실)을 IgG 불변 도메인, 또는 이의 FcRn 결합 단편 (바람직하게는 Fc 또는 힌지 Fc 도메인 단편)에 도입시켜 증가된 생체내 반감기를 가지는 항체들을 또한 생성할 수 있다. 예컨대, 각각 본 출원에 참고문헌으로 포함되는 국제특허출원 제 WO 98/23289호; 국제특허출원 제 WO 97/34631호; 및 미국 특허 제 6,277,375호를 참조하라.
또한, 항체 또는 항체 단편이 생체내에서 더욱 안정해지도록 또는 더 긴 생체내 반감기를 가지도록 하기 위하여 항체들을 알부민에 접합시킬 수 있다. 이 기술들은 해당 분야에 널리 공지이며, 예컨대, 본 출원에 각각 참고문헌으로 포함되는 국제특허출원 제 WO 93/15199, WO 93/15200, 및 WO 01/77137호; 및 유럽 특허 제 EP 413,622호를 참조하라.
반감기를 증가시키는 전략들은 특히 나노바디, 피브로넥틴-계 결합제들, 그리고 증가된 생체내 반감기가 필요한 그 외 다른 항체들 또는 단백질들에서 유용하다.
또 다른 구체예에서, 항체는 그 생물학적 반감기를 증가시키기 위해 변형된다. 다양한 접근법들이 가능하다. 예를 들어, 다음 돌연변이들 중 하나 이상이 도입될 수 있다: 본 출원에 참고문헌으로 포함되는 미국 특허 제 6,277,375호에 기재된 T252L, T254S, T256F. 대안적으로, 생물학적 반감기를 증가시키기 위하여, 항체는, 본 출원에 참고문헌으로 포함되는 Presta 등의 미국 특허 제 5,869,046 및 6,121,022호에 기재된 바와 같이, CH1 또는 CL 영역 내부에 IgG의 Fc 영역의 CH2 도메인의 2개 루프에서 선택된 구제 (salvage) 수용체 결합 에피토프를 내포하도록 변화될 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명에 따른 항체들은 표 1에 따른 경쇄 및 중쇄를 포함한다.
Figure pct00001
6.1.1. 핵산, 벡터 및 숙주 세포들
본 발명은 또한 본 발명의 항-IL-2 항체 또는 이의 일부를 발현시키는 세포주들에 관한 것이다. 본 발명의 항체를 생성하는 세포주들의 생성 및 단리는 해당 분야에 공지된 표준 기법들을 사용하여 이루어질 수 있다. CHO 세포주가 바람직하다 (공공 보관소, 가령, ATCC, 미국 생물 자원 센터, Manassas, VA로부터 입수가능).
본 발명의 항체를 발현시키기 위하여 원핵세포 및 진핵세포 발현 시스템들 (가령, 효모, 배큘로바이러스, 식물, 포유동물 및 기타 동물 세포들, 유전자삽입 동물들, 및 하이브리도마 세포들), 뿐만 아니라 파지 디스플레이 발현 시스템들을 비롯한 널리 다양한 숙주 발현 시스템들이 사용될 수 있다. 적합한 세균 발현 벡터의 한 예는 pUC119이고 적합한 진핵세포 발현 벡터는 약화된 dhfr 선택 시스템을 가지는 변형된 pcDNA3.1 벡터이다. 다른 항체 발현 시스템들 또한 해당 분야에 공지이다.
해당 분야의 숙련된 기술자에게 널리 공지된 바와 같이, 본 발명의 항체는 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 유전자들을 숙주 세포에서 재조합 발현시킴으로써 제조될 수 있다. 재조합적으로 항체를 발현시키기 위하여, 숙주 세포는 항체의 면역글로불린 경쇄 및/또는 중쇄들을 인코딩하는 DNA 단편들을 운반하는 하나 이상의 재조합 발현 벡터들로 형질전환, 형질도입, 감염되며, 그리하여 이러한 경쇄 및/또는 중쇄들이 숙주 세포에서 발현된다. 이러한 중쇄 및 경쇄는 동일 또는 상이한 숙주 세포들에서 발현될 수 있다. 바람직하게는, 재조합 항체들은 숙주 세포들이 배양되는 배지로 분비되며, 이러한 배지로부터 항체들은 회수되거나 정제될 수 있다.
표준 재조합 DNA 방법들을 사용하여, 항체 중쇄 및 경쇄 유전자들을 얻고, 이들 유전자들을 재조합 발현 벡터에 통합시키고, 벡터들을 숙주 세포들에 도입시킨다. 이러한 표준 재조합 DNA 기술들은, 예를 들어, Green and Sambrook (Eds.), Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Fourth Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., 2012에 기재되어 있다.
한 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 항-IL-2 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 벡터, 바람직하게는 (그러나 이에 제한되는 것은 아님) 플라스미드, 재조합 발현 벡터, 효모 발현 벡터, 또는 레트로바이러스 발현 벡터를 제공한다. 벡터의 코딩 영역(들)은 임의의 크기 또는 함량의 링커 서열에 의해 분리될 수 있으며, 바람직하게는 이러한 링커는, 존재하는 경우, 내부 리보솜 유입 부위를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드이다.
본 발명의 항체를 발현시키기 위하여, 표 41에 기재된 바와 같은 부분 아미노산 사슬을 인코딩하는 DNA가 발현 벡터에 삽입되고, 그리하여 유전자는 전사 및 번역 조절 서열들에 작동적으로 연결된다. 발현 벡터 및 발현 조절 서열들은 사용되는 발현 숙주 세포와 상용가능하도록 선택된다. 추가적으로, 재조합 발현 벡터는 숙주 세포로부터 항-IL-2 항체 경쇄 및/또는 중쇄의 분비를 용이하게 하는 신호 펩티드를 인코딩할 수 있다. 항-IL-2 항체 경쇄 및/또는 중쇄 유전자는 벡터에 클로닝되고, 신호 펩티드는 항체 사슬 유전자의 아미노 말단에 작동적으로 인-프레임 연결될 수 있다. 신호 펩티드는 면역글로불린 신호 펩티드 또는 이종 신호 펩티드일 수 있다.
경쇄 및/또는 중쇄들의 발현을 위해, 중쇄 및/또는 경쇄를 인코딩하는 발현 벡터(들)는 표준 기법들, 예컨대, 전기천공, 칼슘 포스페이트 침전, DEAE-덱스트란 형질주입, 형질도입, 감염 등에 의해 숙주 세포에 도입된다. 본 발명의 항체들을 원핵 또는 진핵 숙주 세포들에서 발현시키는 것이 이론적으로는 가능하지만, 진핵세포들이 바람직하며 가장 바람직하게는 포유동물 숙주 세포들인데, 왜냐하면 이러한 세포들은 적절하게 폴드된 그리고 면역학적으로 활성인 항체를 조립 및 분비하기 더욱 쉽기 때문이다.
본 발명의 재조합 항체들을 발현시키기에 바람직한 포유동물 숙주 세포들은, 예컨대, Urlaub 및 Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-20, 1980에 기재된 바와 같은 중국 햄스터 난소 (CHO 세포들)를 포함한다. 항체 유전자들을 인코딩하는 재조합 발현 벡터들이 포유동물 숙주 세포들에 도입되는 경우, 이러한 항체들은 숙주 세포들에서 항체가 발현되기에 또는, 더욱 바람직하게는, 숙주 세포들이 해당 분야에 공지된 적절한 조건들에서 성장되고 있는 배양 배지로 항체가 분비되기에 충분한 시기동안 숙주 세포들을 배양함으로써 제조된다. 항체들은 숙주 세포 및/또는 배양 배지로부터 표준 정제법들을 사용하여 회수될 수 있다.
6.2. IL-2 변이체
본 발명의 특정 구체예들에서, 야생형 (wt)의 인간 IL-2가 사용된다. 이는 UniProt ID 번호 P60568를 가지며 서열 번호: 109로 재생성된다. 또 다른 인간 IL-2의 예는 WO2012/107417A1에 개시된 IL-2 뮤테인으로, wt hIL-2과 비교하여 3개의 돌연변이를 가진다. 알데스류킨 (상표명 프로류킨®)은 인간 IL-2 변이체의 또 다른 예로, 해당 분야의 숙련된 기술자에게 공지되어 있으며, 본 출원에서 서열 번호: 110으로 나타내어진다. IL-2 변이체의 다른 예들은 표 2에서 보는 바와 같은 비-알파 (no-alpha) 뮤테인 및 IL-2 수퍼카인이다.
Figure pct00002
6.3. IL-2/항-IL-2 항체 조합물
한 구체예에서, 상기 기재된 항체들, 또는 이의 항원-결합 부분은, 상기 기재된 바와 같은 인간 IL-2 또는 IL-2 돌연변이체들과 조합된다.
이러한 조합물은 IL-2:항체 결합 부위를 1:1, 2:1 또는 다른 비율로 사전 제조한 혼합물이 될 수 있다.
한 구체예에서, 항-IL-2 항체 및 IL-2는 항체를 제 1 주사, 그리고 항-IL-2 항체/IL-2 조합물을 후속 주사하는 순서로 투여된다.
또 다른 구체예에서, 항-IL-2 항체 및 IL-2는 항-IL-2 항체/IL-2 조합물을 제 1 주사, 그리고 IL-2를 후속 주사하는 순서로 투여된다.
6.4. 제약학적 조성물
본 출원의 제약학적 조성물들은 또한 병용 요법으로, 즉, 다른 제제들과 조합하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 병용 요법은 본 출원에 따른 항-IL-2 항체 또는 이의 단편을 최소한 하나의 다른 항-염증성 또는 또 다른 화학치료제와 조합하여 포함할 수 있다. 병용 요법에서 사용될 수 있는 치료제들의 예들은 하기 병용 요법에 대한 부분에서 더 자세히 설명한다.
본 출원에서 사용되는, "제약학적으로 허용가능한 담체"에는 생리학적으로 상용가능한 임의의 그리고 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제, 등이 포함된다. 담체는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척추 또는 표피 투여 (예컨대, 주사 또는 융합에 의해)에 적합하여야 한다. 한 구체예에서, 담체는 피하 경로에 적합하여야 한다. 투여 경로에 따라, 활성 화합물, 항체, 면역접합체, 또는 이중특이적 분자는, 이러한 화합물을 산의 작용 그리고 이 화합물을 불활성화시킬 수 있는 다른 자연 조건들로부터 보호하기 위한 물질에서 코팅될 수 있다.
본 출원의 제약학적 조성물들은 하나 이상의 제약학적으로 허용가능한 염을 포함할 수 있다. "제약학적으로 허용가능한 염"은 모체 화합물의 필요한 생물학적 활성을 유지하며 원치 않는 독물학적 효과들을 부여하지 않는 염을 지칭한다 (예컨대, Berge, S.M., 등 1977, J. Pharm. Sci. 66:1-19 참조). 이러한 염들의 예들에는 산 부가염 및 염기 부가염이 포함된다. 산 부가염에는 비독성 무기산, 가령, 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬산, 아이오드산, 아인산 등으로부터, 뿐만 아니라 비독성 유기산 가령, 지방족 모노- 및 다이-카르복시산, 페닐-치환된 알칸산, 하이드록시 알칸산, 방향족 산, 지방족 및 방향족 설폰산 등으로부터 유도된 염들이 포함된다. 염기 부가염에는 알칼리 토금속, 가령, 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등으로부터, 뿐만 아니라 비독성 유기 아민, 가령, N,N'-다이벤질에틸렌다이아민, N-메틸글루카민, 클로로프로카인, 콜린, 다이에탄올아민, 에틸렌다이아민, 프로카인 등으로부터 유도된 염들이 포함된다.
본 출원의 제약학적 조성물은 또한 제약학적으로 허용가능한 항-산화제를 포함할 수 있다. 제약학적으로 허용가능한 항산화제들의 예는 다음을 포함한다: 수용성 항산화제들, 가령, 아스코르브산, 시스테인 하이드로클로라이드, 소듐 바이설페이트, 소듐 메타바이설파이트, 소듐 설파이트 등; 지용성 항산화제들, 가령, 아스코르빌 팔미테이트, 부틸레이티드 하이드록시아니솔 (BHA), 부틸레이티드 하이드록시톨루엔 (BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤, 등; 및 금속 킬레이트제, 가령, 시트르산, 에틸렌다이아민 테트라아세트산 (EDTA), 소르비톨, 타르타르산, 인산, 등.
본 출원의 제약학적 조성물들에서 사용될 수 있는 적합한 수성 및 비수성 담체들의 예들에는 물, 에탄올, 폴리올 (가령, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 등), 및 이의 적합한 혼합물들, 식물성 오일, 가령, 올리브 오일, 및 주사가능한 유기 에스터, 가령, 에틸 올레이트가 포함된다. 예를 들면, 코팅 물질, 가령, 레시틴을 사용함으로써, 분산액의 경우 필요한 입경을 유지함으로써, 그리고 계면활성제를 사용함으로써 적절한 유동성이 유지될 수 있다.
이들 조성물들은 또한 보조제, 가령, 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제를 함유할 수도 있다. 미생물들의 존재는 멸균 절차들에 의해 그리고 다양한 항균 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브산, 등을 포함시킴으로써 저해될 수 있다. 또한 등장화제, 가령, 당, 염화 나트륨, 등을 조성물에 포함시키는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 주사가능한 제약학적 형태의 장기 흡수(prolonged absorption)는 흡수를 지연시키는 제제들, 가령, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함시킴으로써 이루어질 수 있다.
제약학적으로 허용가능한 담체에는 멸균 주사 용액 또는 분산물의 즉석 조제를 위한 멸균 수용액 또는 분산물 및 멸균 분말이 포함된다. 제약학적 활성 물질들을 위한 이러한 매질 및 제제들의 사용은 해당 기술 분야에 공지이다. 임의의 종래 매질 또는 제제가 활성 화합물과 상용불가능한 경우를 제외하고, 본 출원의 제약학적 조성물들에서 이의 사용이 고려된다. 보충 활성 화합물 또한 상기 조성물에 혼입될 수 있다.
치료 조성물들은 통상적으로 제조 및 보관 조건하에서 멸균 및 안정하여야 한다. 치료 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 리포좀, 또는 고 약물 농도에 적합한 다른 등급의 구조로서 제형화될 수 있다. 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 이와 유사한 것들) 그리고 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질로 존재할 수 있다. 예를 들면, 코팅, 가령, 레시틴을 사용함으로써, 분산액의 경우 필요한 입경을 유지함으로써, 그리고 계면활성제를 사용함으로써 적절한 유동성이 유지될 수 있다. 많은 경우에, 등장화제, 예를 들어, 당, 폴리알코올, 가령, 만니톨, 소르비톨, 또는 염화 나트륨을 조성물에 포함시킬 수 있다. 주사가능한 조성물의 장기 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어, 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 포함시킴으로써 이루어질 수 있다.
안정한 단백질 (예컨대 항체) 제제들의 개발에 대한 검토는 Cleland 등 1993, Crit. Reviews. Ther. Drug Carrier 체계s 10(4):307-377 및 Wei Wang 1999, Int. J. Pharmaceutcs 185:129-88에서 찾을 수 있다. 또 다른 항체 제제들의 논의는, 예컨대, Daugherty and Mrsny 2006, 진행성 Drug Delivery Reviews 58: 686-706; 미국 특허 제 6,171,586, 4,618,486, 미국 공개특허출원 제 20060286103, PCT 공개특허출원 WO 06/044908, WO 07/095337, WO 04/016286, Colandene 등 2007, J. Pharm. Sci 96: 1598-1608; Schulman 2001, Am. J. Respir. Crit. Care Med. 164:S6-S11 그리고 다른 공지된 참고문헌들에서 찾을 수 있으며, 이들 각각은 본 출원에 참고문헌으로 포함된다.
진피내, 또는 피하 투여에 사용되는 용액 또는 현탁액은 전형적으로 다음 성분들 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 멸균 희석제, 가령, 주사용 물, 식염수 용액, 고정유(fixed oils), 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 그 외 합성 용매; 항박테리아제, 가령, 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 가령, 아스코르브산 또는 소듐 바이설파이트; 킬레이트제, 가령, 에틸렌디아민테트라아세트산; 완충제, 가령, 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트, 및 긴장성(tonicity) 조절을 위한 제제, 가령, 염화 나트륨 또는 포도당. pH는 산 또는 염기, 가령, 염산 또는 수산화 나트륨를 이용하여 조정될 수 있다. 이러한 제제들은 유리 또는 플라스틱으로 제조된 앰플, 휴대용 주사기 또는 다회 투여 바이얼에 봉입될 수 있다.
멸균 주사 용액은 상기 열거된 성분들 중 하나 또는 이들의 조합과 함께 적절한 용매에 필요한 양의 활성 화합물을 혼합한 후, 필요에 따라 멸균 미세여과하여 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산물은 기본 분산 매질 및 상기 열거된 것들 중 필요한 다른 성분들을 함유하는 멸균 운반체에 본 출원의 항체들 또는 단백질을 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사 용액의 제조용 멸균 분말의 경우, 제조 방법은 진공 건조 및 동결-건조 (lyophilization) 이며 이 방법은 사전에 멸균-여과된 이의 용액으로부터 활성 성분과 함께 원하는 임의의 추가 성분으로 된 분말을 산출한다.
한 특정 구체예에서, 본 출원에 따른 항체들은 바이얼에 담긴 액체 제제로서 투여되었다. 바이얼 당 약물의 양은 150 mg 이었다. 이 액체는 pH 6.0 ㅁ 0.5의 150 mg/mL의 항체, 4.8 mM의 L-히스티딘, 15.2 mM L-히스티딘-HCl 220 mM 수크로스 및 0.04% 폴리소르베이트 20을 함유하였다. 원하는 투여량을 완전히 제거하도록 하기 위해 20% 과량이 추가된다.
6.5. 치료 및 다른 용도
본 발명의 항체들은 IL-2-의존성 병태생리학을 가지는 장애의 진단 및 치료에 관여하는 수많은 시험관내 및 생체내 진단 및 치료 용도들을 가진다. 예를 들어, 이들 분자들은 IL-2-의존성 병태생리학을 가지는 다양한 장애를 치료, 예방 및 진단하기 위하여 배양에서, 시험관내 또는 생체외에서 세포들에게, 또는 예컨대, 생체내에서 인간 대상체들에게 투여될 수 있다.
따라서, 한 구체예에서, 본 발명은 본 출원에 개시된 치료적 유효량의 항-IL-2 항체를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 종양 세포들의 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 한 구체예에서, 이 방법은 생체내에서의 암 치료에 적합하다. 한 구체예에서, IL-2에 대한 항체들은 IL-2와 함께, 가령, IL-2와 조합하여 투여된다.
IL-2에 대한 항체들이 하나 이상의 제제들과의 조합물로 투여되는 경우, 조합물은 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다.
또 다른 양상에서, 대상체를 치료하는 방법, 예컨대, 대상체에서 증식성 병태 또는 장애 (예컨대, 암), 예컨대, 고형 종양, 연조직 종양, 또는 전이성 병변을 감소 또는 개선하는 방법이 제공된다.
용어 암은 조직병리학적 유형 또는 침습성 단계와 관계없이, 모든 유형의 암 성장 또는 종양형성 과정들, 전이성 조직 또는 악성으로 형질전환된 세포들, 조직, 또는 장기를 포함하는 의미이다. 암성 장애의 예들에는, 고형 종양, 연조직 종양, 및 전이성 병변들이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 고형 종양의 예들에는 악성 종양, 예컨대, 육종, 선암종, 및 다양한 장기 시스템들의 암종, 가령, 간, 폐, 유방, 림프구, 위장관 (예컨대, 결장), 비뇨생식관 (예컨대, 신장, 요로상피 세포들), 전립선 및 인두에 영향을 주는 암종이 포함된다. 선암종에는 악성 종양, 가령, 대부분의 결장 암, 직장암, 신장-세포 암종, 간암, 폐의 비소세포 암종, 소장암 및 식도암이 포함된다. 한 구체예에서, 상기 암은 흑색종, 예컨대, 진행 단계 흑색종이다. 전술한 암들의 전이성 병변들은 또한 본 발명의 방법들 및 조성물들을 사용하여 치료 또는 예방될 수 있다.
본 출원에 개시된 항체 분자들을 사용하여 성장이 억제될 수 있는 예시적인 암들에는 면역요법에 전형적으로 반응성인 암들이 포함된다. 치료에 바람직한 암들의 비-제한적 예들에는 흑색종 (예컨대, 전이성 악성 흑색종), 신장 암 (예컨대, 투명 세포 암종), 전립선 암 (예컨대, 호르몬 불응성 전립선 선암종), 유방암, 결장 암 및 폐암 (예컨대, 비소세포 폐암)이 포함된다. 추가적으로, 불응성 또는 재발성 악성 종양은 본 출원에 기재된 항체 분자들을 사용하여 치료될 수 있다.
치료될 수 있는 다른 암들의 예들에는 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안구내 악성 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문암, 위식도, 위암, 고환암, 자궁암, 자궁관의 암종, 자궁내막의 암종, 자궁경부의 암종, 질의 암종, 음문의 암종, 호지킨 질환, 비-호지킨 림프종, 식도의 암, 소장의 암, 내분비계의 암, 갑상선의 암, 부갑상선의 암, 부신의 암, 연조직의 육종, 요도의 암, 음경의 암, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프모구 백혈병, 만성 림프구 백혈병을 비롯한 만성 또는 급성 백혈병, 소아기의 고형 종양, 림프구 림프종, 방광의 암, 콩팥 또는 요관의 암, 신우의 암종, 중추신경계 (CNS)의 신생물, 원발성 CNS 림프종, 종양 혈관형성, 척추 축 종양, 뇌줄기 신경아교종, 뇌하수체 샘종, 카포시 육종, 표피유사낭 암, 편평 세포 암, T-세포 림프종, 석면에 의해 유도되는 암을 비롯한 환경적으로 유도되는 암, 및 상기 암들의 조합이 포함된다.
다른 구체예들에서, 암은 혈액 악성 종양 또는 백혈병 또는 림프종을 비롯한 암이지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 항-IL-2 요법은 예컨대, 예를 들어, B-세포 급성 림프구 백혈병 ("BALL"), T-세포 급성 림프구 백혈병 ("TALL"), 급성 림프구 백혈병 (ALL)을 비롯한 급성 백혈병 (그러나 이에 제한되는 것은 아님); 예컨대, 만성 골수성 백혈병 (CML), 만성 림프구 백혈병 (CLL)을 비롯한 하나 이상의 만성 백혈병 (그러나 이에 제한되는 것은 아님); 예컨대, B 세포 전구림프구 백혈병, 모구 형질세포모양 수지상 세포 신생물, 버킷 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종, 소포 림프종, 털세포 백혈병, 소세포- 또는 대 세포-소포 림프종, 악성 림프구증식 병태, MALT 림프종, 외투 세포 림프종, 가장자리 구역 림프종, 다발골수종, 척수형성이상증 및 골수형성이상 증후군, 비-호지킨 림프종, 형질모세포 림프종, 형질세포모양 수지상 세포신생물, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 및 골수성 혈액 세포들의 비효율적인 생성 (또는 형성이상)에 의해 연합되는 혈액 병태들의 다양한 집합인, "전백혈병" 등을 비롯한 (그러나 이에 제한되는 것은 아님) 또 다른 혈액 암들 또는 혈액 병태들을 포함하는, 암 및 악성 종양을 치료하기 위해 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일부 구체예들에서, 림프종 (예컨대, 역형성 대세포 림프종 또는 비-호지킨 림프종)은 ALK 전좌, 예컨대, EML4-ALK 융합을 가지거나 가지는 것으로 식별된다.
한 구체예에서, 상기 암은 폐암 (예컨대, 비소세포 폐암 (NSCLC) (예컨대, 편평 및/또는 비-편평 조직학을 가진 NSCLC)), 흑색종 (예컨대, 진행성 흑색종), 신장 암 (예컨대, a 신장 세포 암종, 예컨대, 투명 세포 신장 세포 암종), 간암, 골수종 (예컨대, 다발골수종), 전립선 암, 유방암 (예컨대, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 또는 Her2/neu 중 하나, 둘 또는 모두를 발현시키지 않는 유방암, 예컨대, 3중 음성 유방암), 결장직장암, 췌장암, 두경부 암 (예컨대, 두경부 편평 세포 암종 (HNSCC), 항문암, 위식도 암, 갑상선 암, 자궁경부 암, 림프구증식성 질환 (예컨대, 이식후 림프구증식성 질환) 또는 혈액 암, T-세포 림프종, 비-호지킨 림프종, 또는 백혈병 (예컨대, 골수성 백혈병)에서 선택된다.
또 다른 구체예에서, 암은 암종 (예컨대, 진행성 또는 전이성 암종), 흑색종 또는 폐암종, 예컨대, 비소세포 폐암종에서 선택된다.
한 구체예에서, 암은 폐암, 예컨대, 비소세포 폐암 (NSCLC)이다. 특정 구체예들에서, 폐암, 예컨대, 비소세포 폐암은, ALK 재배열 또는 전좌, 예컨대, ALK 융합, 예컨대, EML4-ALK 융합을 가지거나 이를 가지는 것으로 식별된다.
또 다른 구체예에서, 암은 염증성 근섬유모세포 종양 (IMT)이다. 특정 구체예들에서, 염증성 근섬유모세포 종양은, ALK 재배열 또는 전좌, 예컨대, ALK 융합, 예컨대, EML4-ALK 융합을 가지거나 이를 가지는 것으로 식별된다.
다른 구체예들에서, 암은 NSCLC이고 이 때 NSCLC는 다음 중 하나 이상으로 특징된다: 표피 성장 인자 수용체 (EGFR)의 이상 활성화, 증폭, 또는 돌연변이. 특정 구체예들에서 암은 NSCLC이고 이 때 NSCLC는 EGFR 엑손 20 삽입, EGFR 엑손 19 결실, EGFR L858R 돌연변이, EGFR T790M, 또는 이의 임의의 조합을 포함하는 것으로 특징된다. 일부 구체예들에서, NSCLC는 EGFR의 L858R 및 T790M 돌연변이를 포함하는 것으로 특징된다. 일부 구체예들에서, NSCLC는 EGFR의 엑손 20 삽입 및 T790M 돌연변이를 포함하는 것으로 특징된다. 일부 구체예들에서, NSCLC는 EGFR의 EGFR 엑손 19 결실 및 T790M 돌연변이를 포함하는 것으로 특징된다. 일부 구체예들에서, NSCLC는 엑손 20 삽입, 엑손 19 결실, L858R 돌연변이, T790M 돌연변이, 및 이의 임의의 조합으로 구성된 그룹에서 선택된 EGFR 돌연변이를 포함하는 것으로 특징된다.
또 다른 구체예에서, 암은 신경모세포종이다.
특정 구체예들에서, 신경모세포종은, ALK 재배열 또는 전좌, 예컨대, ALK 융합, 예컨대, EML4-ALK 융합을 가지거나 이를 가지는 것으로 식별된다. 본 출원에 개시된 방법들 및 조성물들은 전술한 암들과 관련된 전이성 병변들을 치료함에 유용하다.
또 다른 구체예에서, 암은 바이러스 감염, 예컨대, 만성 바이러스 간염이 있거나 없는, 간암종, 예컨대, 진행성 간암종이다.
또 다른 구체예에서, 암은 전립선 암, 예컨대, 진행성 전립선 암이다.
또 다른 구체예에서, 암은 골수종, 예컨대, 다발골수종이다.
또 다른 구체예에서, 암은 신장 암, 예컨대, 신장 세포 암종 (RCC) (예컨대, 전이성 RCC 또는 투명 세포 신장 세포 암종)이다.
한 구체예에서, 암은 흑색종, 예컨대, 진행성 흑색종이다. 한 구체예에서, 암은 다른 요법들에 반응하지 않는 진행성 또는 수술불능성 흑색종이다. 다른 구체예들에서, 암은 BRAF 돌연변이 (예컨대, BRAF V600 돌연변이)를 가진 흑색종이다.
또 다른 구체예에서, 암은 염증성 근섬유모세포 종양 (IMT)이다. 특정 구체예들에서, 염증성 근섬유모세포 종양은, ALK 재배열 또는 전좌, 예컨대, ALK 융합, 예컨대, EML4-ALK 융합을 가지거나 이를 가지는 것으로 식별된다.
또 다른 구체예에서, 암은 신경모세포종이다. 특정 구체예들에서, 신경모세포종은, ALK 재배열 또는 전좌, 예컨대, ALK 융합, 예컨대, EML4-ALK 융합을 가지거나 이를 가지는 것으로 식별된다. 본 출원에 개시된 방법들 및 조성물들은 전술한 암들과 관련된 전이성 병변들을 치료함에 유용하다.
6.6. 병용 요법
본 출원의 항체들, 또는 이의 항원-결합 부분은 단독의 활성 성분으로서 또는 예컨대, 상기 질환들의 치료 또는 예방을 위한, 다른 약물들, 예컨대, 면역조절제 또는 세포독성제 또는 항-암제와 함께, 예컨대, 이에 대한 보조제로서 또는 이에 조합하여 투여될 수 있다.
6.6.1. 예시적인 STING 작용제
한 구체예에서, 조합물은 STING 작용제를 포함한다. 일부 구체예들에서, 조합물은 암, 예컨대, 본 출원에 기재된 암, 예컨대, 고형 종양 (예컨대, 유방암, 편평 세포 암종, 흑색종, 난소암, 자궁관 암종, 복막 암종, 연조직 육종, 흑색종, 유방암, 식도암, 두경부 암,자궁내막암, 자궁경부 암, 또는 기저 세포 암종), 예컨대, 혈액 악성 종양 (예컨대, 백혈병 (예컨대, 만성 림프구 백혈병 (CLL), 또는 림프종 (예컨대, 가장자리 구역 B-세포 림프종, 소 림프구 림프종, 소포 림프종, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종))을 치료하기 위하여 사용된다.
일부 구체예들에서, STING 작용제는 사이클릭 다이뉴클레오티드, 예컨대, 퓨린 또는 피리미딘 핵염기 (예컨대, 아데노신, 구아닌, 우라실, 티민, 또는 시토신 핵염기)를 포함하는 사이클릭 다이뉴클레오티드이다. 일부 구체예들에서, 사이클릭 다이뉴클레오티드의 핵염기는 동일한 핵염기 또는 상이한 핵염기를 포함한다.
일부 구체예들에서, STING 작용제는 아데노신 또는 구아노신 핵염기를 포함한다. 일부 구체예들에서, STING 작용제는 하나의 아데노신 핵염기 및 하나의 구아노신 핵염기를 포함한다. 일부 구체예들에서, STING 작용제는 2개의 아데노신 핵염기 또는 2개의 구아노신 핵염기를 포함한다.
일부 구체예들에서, STING 작용제는 예컨대, 변형된 핵염기, 변형된 리보오스, 또는 변형된 포스페이트 링키지를 포함하는, 변형된 사이클릭 다이뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예들에서, 변형된 사이클릭 다이뉴클레오티드는 변형된 포스페이트 링키지, 예컨대, 티오포스페이트를 포함한다.
일부 구체예들에서, STING 작용제는 2',5' 또는 3',5' 포스페이트 링키지를 가지는 사이클릭 다이뉴클레오티드 (예컨대, 변형된 사이클릭 다이뉴클레오티드)를 포함한다. 일부 구체예들에서, STING 작용제는 포스페이트 링키지들 근방에서 Rp 또는 Sp 입체화학을 가지는 사이클릭 다이뉴클레오티드 (예컨대, 변형된 사이클릭 다이뉴클레오티드)를 포함한다.
일부 구체예들에서, STING 작용제는 Rp,Rp 다이티오 2',3' c-다이-AMP (예컨대, Rp,Rp-다이티오 c-[A(2',5')pA(3',5')p]), 또는 이의 사이클릭 다이뉴클레오티드 유사체이다. 일부 구체예들에서, STING 작용제는 미국 공개특허출원 제 US2015/0056224호에 도시된 화합물이다 (예컨대, 도 2c의 화합물, 예컨대, 화합물 21 또는 화합물 22). 일부 구체예들에서, STING 작용제는 c-[G(2',5')pG(3',5')p], 다이티오 리보오스 O-치환된 이의 유도체, 또는 PCT 공개특허출원 제 WO 2014/189805 및 WO 2014/189806호의 도 4에 도시된 화합물이며, 상기 문헌 각각은 본 출원에 참고문헌으로 포함된다. 일부 구체예들에서, STING 작용제는 c-[A(2',5')pA(3',5')p], 또는 다이티오 리보오스 O-치환된 이의 유도체, 또는 PCT 공개특허출원 제 WO 2014/189805 및 WO 2014/189806호의 도 5에 도시된 화합물이다. 일부 구체예들에서, STING 작용제는 2'-0-프로파길-사이클릭-[A(2',5')pA(3',5')p] (2'-0-프로파길- ML-CDA) 또는 PCT 공개특허출원 제 WO 2014/189806의 도 7에 도시된 화합물이며, 이 문헌은 본 출원에 참고문헌으로 포함된다.
다른 예시적 STING 작용제들이, 예컨대, PCT 공개특허출원 제 WO 2014/189805 및 WO 2014/189806, 그리고 미국 공개특허출원 제 2015/0056225호에 개시되며, 이들 각각은 본 출원에 참고문헌으로 포함된다.
6.6.2. 예시적인 PD-1 억제제들
한 구체예에서, 상기 조합은 항-PD-1, 또는 항-PD-1 리간드 (PD-L1) 항체 분자를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 조합은 암, 예컨대, 본 출원에 기재된 암, 예컨대, 고형 종양 (예컨대, 유방암, 편평 세포 암종, 흑색종, 난소암, 자궁관 암종, 복막 암종, 연조직 육종, 흑색종, 유방암, 식도암, 두경부 암,자궁내막암, 자궁경부 암, 또는 기저 세포 암종), 예컨대, 혈액 악성 종양 (예컨대, 백혈병 (예컨대, 만성 림프구 백혈병 (CLL), 또는 림프종 (예컨대, 가장자리 구역 B-세포 림프종, 소 림프구 림프종, 소포 림프종, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종))을 치료하기 위하여 사용된다.
항-PD-1 항체 분자의 예시적인 비-제한적 조합들 및 용도들은 2015년 7월 30일에 공개된 "Antibody Molecules to PD-1 and Uses Thereof" 제목의 미국 공개특허출원 2015/0210769호에 개시되어 있으며, 이 문헌의 전문은 참고문헌으로 본 출원에 포함된다.
한 구체예에서, 항-PD-1 항체 분자는, BAP049-클론-A, BAP049-클론-B, BAP049-클론-C, BAP049-클론-D, 또는 BAP049-클론-E의 아미노산 서열; 또는 US 2015/0210769의 표 1에 기재된, 또는 US 2015/0210769의 표 1의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열; 또는 전술한 서열들 중 어느 하나와 실질적으로 동일한 (예컨대, 최소한 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한) 서열을 포함하는, 최소한 1 또는 2개의 중쇄 가변 도메인 (선택적으로 불변 영역 포함), 최소한 1 또는 2개의 경쇄 가변 도메인 (선택적으로 불변 영역 포함), 또는 이 둘 모두를 포함한다. 항-PD-1 항체 분자는, 선택적으로, US 2015/0210769의 표 4에 도시된 중쇄, 경쇄, 또는 이 둘 모두의 리더 서열; 또는 이들과 실질적으로 동일한 서열을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 항-PD-1 항체 분자는 본 출원에 기재된 항체, 예컨대, BAP049-hum01, BAP049-hum02, BAP049-hum03, BAP049-hum04, BAP049-hum05, BAP049-hum06, BAP049-hum07, BAP049-hum08, BAP049-hum09, BAP049-hum10, BAP049-hum11, BAP049-hum12, BAP049-hum13, BAP049-hum14, BAP049-hum15, BAP049-hum16, BAP049-클론-A, BAP049-클론-B, BAP049-클론-C, BAP049-클론-D, 또는 BAP049-클론-E에서 선택된 어느 하나의 항체의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역; 또는 US 2015/0210769의 표 1에 기재되거나, 또는 US 2015/0210769의 표 1의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역; 또는 전술한 서열들 중 어느 하나와 실질적으로 동일한 (예컨대, 최소한 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한) 서열의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역의 최소한 1, 2 또는 3개의 상보성 결정 영역들 (CDRs)을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 항-PD-1 항체 분자는 US 2015/0210769의 표 1에 나타낸 아미노산 서열, 또는 표 1에 나타낸 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 중 최소한 1, 2, 또는 3개의 CDR들 (또는 집합적으로 이러한 CDR들 모두)을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 CDR들 중 하나 이상 (또는 집합적으로 이러한 CDR들 모두)은 US 2015/0210769의 표 1에 나타낸 아미노산 서열, 또는 표 1에 나타낸 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열과 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상의 변화들, 예컨대, 아미노산 치환 또는 결실을 가진다.
또 다른 구체예에서, 항-PD-1 항체 분자는 US 2015/0210769의 표 1에 나타낸 아미노산 서열, 또는 US 2015/0210769의 표 1에 나타낸 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 중 최소한 1, 2, 또는 3개의 CDR들 (또는 집합적으로 이러한 CDR들 모두)을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 CDR들 중 하나 이상 (또는 집합적으로 이러한 CDR들 모두)은 US 2015/0210769의 표 1에 나타낸 아미노산 서열, 또는 US 2015/0210769의 표 1에 나타낸 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열과 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상의 변화들, 예컨대, 아미노산 치환 또는 결실을 가진다. 특정 구체예들에서, 항-PD-1 항체 분자는 경쇄 CDR에서 치환, 예컨대, 경쇄의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3에서 하나 이상의 치환을 포함한다. 한 구체예에서, 항-PD-1 항체 분자는 경쇄 가변 영역의 위치 102에서 경쇄 CDR3에서의 치환, 예컨대, US 2015/0210769의 표 1에 따른 경쇄 가변 영역 (예컨대, 비변형된, 쥐과 또는 키메라에 대한 서열 번호: 16 또는 24; 또는 변형된 서열에 대한 서열 번호: 34, 42, 46, 54, 58, 62, 66, 70, 74, 또는 78 중 어느 하나)의 위치 102에서 시스테인의 티로신으로, 또는 시스테인의 세린 잔기로의 치환을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 항-PD-1 항체 분자는 US 2015/0210769의 표 1에 나타낸 아미노산 서열, 또는 US 2015/0210769의 표 1에 나타낸 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 중 최소한 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 CDR들 (또는 집합적으로 이러한 CDR들 모두)을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 CDR들 중 하나 이상 (또는 집합적으로 이러한 CDR들 모두)은 US 2015/0210769의 표 1에 나타낸 아미노산 서열, 또는 US 2015/0210769의 표 1에 나타낸 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열과 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상의 변화들, 예컨대, 아미노산 치환 또는 결실을 가진다.
한 구체예에서, 항-PD-1 항체 분자는 다음을 포함한다:
(a) 각각 US 2015/0210769의 표 1에 개시되어 있는, 서열 번호: 4의 VHCDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 5의 VHCDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 3의 VHCDR3 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및 서열 번호: 13의 VLCDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 14의 VLCDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 33의 VLCDR3 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL);
(b) 각각 US 2015/0210769의 표 1에 개시되어 있는, 서열 번호: 1의 VHCDR1 아미노산 서열; 서열 번호: 2의 VHCDR2 아미노산 서열; 및 서열 번호: 3의 VHCDR3 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 서열 번호: 10의 VLCDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 11의 VLCDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 32의 VLCDR3 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(c) 각각 US 2015/0210769의 표 1에 개시되어 있는, 서열 번호: 224의 VHCDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 5의 VHCDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 3의 VHCDR3 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 서열 번호: 13의 VLCDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 14의 VLCDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 14의 VLCDR3 아미노산 서열을 포함하는 VL; 또는
(d) 각각 US 2015/0210769의 표 1에 개시되어 있는, 서열 번호: 224의 VHCDR1 아미노산 서열; 서열 번호: 2의 VHCDR2 아미노산 서열; 및 서열 번호: 3의 VHCDR3 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 서열 번호: 10의 VLCDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 11의 VLCDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 32의 VLCDR3 아미노산 서열을 포함하는 VL.
하기 본 출원의 조합에 있어서, 또 다른 구체예에서, 항-PD-1 항체 분자는, 각각 US 2015/0210769의 표 1에 개시되어 있는, (i) 서열 번호: 1, 서열 번호: 4, 또는 서열 번호: 224에서 선택된 VHCDR1 아미노산 서열; 서열 번호: 2 또는 서열 번호: 5의 VHCDR2 아미노산 서열; 및 서열 번호: 3의 VHCDR3 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및 (ii) 서열 번호: 10 또는 서열 번호: 13의 VLCDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 11 또는 서열 번호: 14의 VLCDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 32 또는 서열 번호: 33의 VLCDR3 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
다른 구체예들에서, PD-1 억제제는 니볼루맙, 펨브롤리주맙 또는 피딜리주맙에서 선택된 항-PD-1 항체이다.
일부 구체예들에서, 항-PD-1 항체는 니볼루맙이다. 니볼루맙의 다른 명칭에는 MDX- 1106, MDX-1106-04, ONO-4538, 또는 BMS-936558이 포함된다. 일부 구체예들에서, 항-PD- 1 항체는 니볼루맙이다 (CAS 등록 번호: 946414-94-4). 니볼루맙은 특이적으로 PD1을 차단하는 완전 인간 IgG4 단일클론 항체이다. PD1에 특이적으로 결합하는 니볼루맙 (클론 5C4) 및 다른 인간 단일클론 항체들은 US 8,008,449 및 WO2006/121168에 개시되어 있다. 한 구체예에서, PD-1의 억제제는 니볼루맙이고, 본 출원에 개시된 서열 (또는 이와 실질적으로 동일하거나 유사한 서열, 예컨대, 특정된 서열에 최소한 85%, 90%, 95% 동일하거나 그 이상 동일한 서열)을 가진다.
일부 구체예들에서, 항-PD-1 항체는 펨브롤리주맙이다. 펨브롤리주맙 (람브롤리주맙, MK-3475, MK03475, SCH-900475 또는 KEYTRUDA®로도 지칭됨; Merck)은 PD-1에 결합하는 인간화 IgG4 단일클론 항체이다. 펨브롤리주맙 및 다른 인간화 항-PD-1 항체들이 Hamid, O. 등 (2013) New England Journal of Medicine 369 (2): 134-44, US 8,354,509 및 WO2009/114335에 개시되어 있다.
한 구체예에서, PD-1의 억제제는 예컨대, US 8,354,509 및 WO 2009/114335에 개시되어 있는 펨브롤리주맙이며, 본 출원에 개시된 서열 (또는 이와 실질적으로 동일하거나 유사한 서열, 예컨대, 특정된 서열에 최소한 85%, 90%, 95% 동일하거나 그 이상 동일한 서열)을 가진다.
일부 구체예들에서, 항-PD-1 항체는 피딜리주맙이다. 피딜리주맙 (CT-011; Cure Tech)은 PD1에 결합하는 인간화 IgG1k 단일클론 항체이다. 피딜리주맙 및 다른 인간화 항-PD-1 단일클론 항체들은 WO2009/101611에 개시되어 있다.
다른 항-PD1 항체들에는 AMP 514 (Amplimmune)이 포함되며, 그 중에서도, 예컨대, US 8,609,089, US 2010028330, 및/또는 US 20120114649에 개시된 항-PD1 항체들이 포함된다.
일부 구체예들에서, PD-1 억제제는 (예컨대, 불변 영역 (예컨대, 면역글로불린 서열의 Fc 영역)에 융합된 PD-L1 또는 PD-L2의 세포외 또는 PD-1 결합 부위를 포함하는 면역접합체)이다. 일부 구체예들에서, PD-1 억제제는 AMP-224 (B7-DCIg; Amplimmune; 예컨대, WO2010/027827 및 WO2011/066342에 개시됨)이며, 이는 PD-1과 B7-H1 사이의 상호작용을 차단하는 PD-L2 Fc 융합 가용성 수용체이다.
6.6.3. 예시적인 TIM-3 억제제들
한 구체예에서, 상기 조합은 TIM-3 억제제를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 조합은 암, 예컨대, 본 출원에 기재된 암, 예컨대, 고형 종양 (예컨대, 유방암, 편평 세포 암종, 흑색종, 난소암, 자궁관 암종, 복막 암종, 연조직 육종, 흑색종, 유방암, 식도암, 두경부 암,자궁내막암, 자궁경부 암, 또는 기저 세포 암종), 예컨대, 혈액 악성 종양 (예컨대, 백혈병 (예컨대, 만성 림프구 백혈병 (CLL), 또는 림프종 (예컨대, 가장자리 구역 B-세포 림프종, 소 림프구 림프종, 소포 림프종, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종))을 치료하기 위하여 사용된다.
한 구체예에서, 본 출원에 기재된 조합은 TIM-3 억제제를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 조합은 암, 예컨대, 본 출원에 개시된 암, 예컨대, 고형 종양 또는 혈액 악성 종양을 치료하기 위해 사용된다.
항-TIM-3 항체 분자의 예시적인 비-제한적 조합들 및 용도들은 2015년 8월 6일 공개된 "Antibody Molecules to TIM-3 and Uses Thereof" 제목의 US 2015/0218274에 개시되어 있으며, 이 문헌의 전문은 본 출원에 참고문헌으로 포함된다.
한 구체예에서, 항-TIM-3 항체 분자는, ABTIM3, ABTIM3-hum01, ABTIM3-hum02, ABTIM3-hum03, ABTIM3-hum04, ABTIM3-hum05, ABTIM3-hum06, ABTIM3-hum07, ABTIM3-hum08, ABTIM3-hum09, ABTIM3-hum10, ABTIM3-hum11, ABTIM3-hum12, ABTIM3-hum13, ABTIM3-hum14, ABTIM3-hum15, ABTIM3-hum16, ABTIM3-hum17, ABTIM3-hum18, ABTIM3-hum19, ABTIM3-hum20, ABTIM3-hum21, ABTIM3-hum22, ABTIM3-hum23의 아미노산 서열; 또는 US 2015/0218274의 표 1-4에 기재되어 있는 아미노산 서열; 또는 US 2015/0218274의 표 1-4의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열; 또는 전술한 서열들 중 어느 하나와 실질적으로 동일한 (예컨대, 최소한 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한) 서열을 포함하는, 최소한 1 또는 2개의 중쇄 가변 도메인 (선택적으로 불변 영역 포함), 최소한 1 또는 2개의 경쇄 가변 도메인 (선택적으로 불변 영역 포함), 또는 둘 모두를 포함한다. 항-TIM-3 항체 분자는, 선택적으로, US 2015/0218274에 나타낸, 중쇄, 경쇄 또는 둘 모두의 리더 서열; 또는 이들과 실질적으로 동일한 서열을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 항-TIM-3 항체 분자는, 본 출원에 기재된 항체, 예컨대, ABTIM3, ABTIM3-hum01, ABTIM3-hum02, ABTIM3-hum03, ABTIM3-hum04, ABTIM3-hum05, ABTIM3-hum06, ABTIM3-hum07, ABTIM3-hum08, ABTIM3-hum09, ABTIM3-hum10, ABTIM3-hum11, ABTIM3-hum12, ABTIM3-hum13, ABTIM3-hum14, ABTIM3-hum15, ABTIM3-hum16, ABTIM3-hum17, ABTIM3-hum18, ABTIM3-hum19, ABTIM3-hum20, ABTIM3-hum21, ABTIM3-hum22, ABTIM3-hum23에서 선택된 어느 하나의 항체의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역; 또는 US 2015/0218274의 표 1-4에 기재된 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역; 또는 US 2015/0218274의 표 1-4의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역; 또는 전술한 서열들 중 어느 하나와 실질적으로 동일한 (예컨대, 최소한 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한) 서열의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역 중 최소한 1, 2 또는 3개의 상보성 결정 영역들 (CDRs)을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 항-TIM-3 항체 분자는 US 2015/0218274의 표 1-4에 나타낸 아미노산 서열, 또는 US 2015/0218274의 표 1-4에 나타낸 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역의 최소한 1, 2, 또는 3개의 CDR들 (또는 집합적으로 이러한 CDR들 모두)을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 CDR들 중 하나 이상 (또는 집합적으로 이러한 CDR들 모두)은 US 2015/0218274의 표 1-4에 나타낸 아미노산 서열, 또는 US 2015/0218274의 표 1-4에 나타낸 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열과 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상의 변화들, 예컨대, 아미노산 치환 또는 결실을 가진다.
또 다른 구체예에서, 항-TIM-3 항체 분자는 US 2015/0218274의 표 1-4에 나타낸 아미노산 서열, 또는 US 2015/0218274의 표 1-4에 나타낸 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 중 최소한 1, 2, 또는 3개의 CDR들 (또는 집합적으로 이러한 CDR들 모두)을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 CDR들 중 하나 이상 (또는 집합적으로 이러한 CDR들 모두)은 US 2015/0218274의 표 1-4에 나타낸 아미노산 서열, 또는 US 2015/0218274의 표 1-4에 나타낸 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열과 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상의 변화들, 예컨대, 아미노산 치환 또는 결실을 가진다. 특정 구체예들에서, 항-TIM-3 항체 분자는 경쇄 CDR에서 치환, 예컨대, 경쇄의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3에서 하나 이상의 치환을 포함한다.
또다른 구체예에서, 항-TIM-3 항체 분자는 US 2015/0218274의 표 1-4에 나타낸 아미노산 서열, 또는 US 2015/0218274의 표 1-4에 나타낸 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 중 최소한 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR들 (또는 집합적으로 이러한 CDR들 모두)을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 CDR들 중 하나 이상 (또는 집합적으로 이러한 CDR들 모두)은 US 2015/0218274의 표 1-4에 나타낸 아미노산 서열, 또는 US 2015/0218274의 표 1-4에 나타낸 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열과 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상의 변화들, 예컨대, 아미노산 치환 또는 결실을 가진다.
한 구체예에서, 항-TIM-3 항체 분자는 다음을 포함한다:
(a) 각각 US 2015/0218274의 표 1-4에 개시되어 있는, 서열 번호: 9에서 선택된 VHCDR1 아미노산 서열; 서열 번호: 10의 VHCDR2 아미노산 서열; 및 서열 번호: 5의 VHCDR3 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및 서열 번호: 12의 VLCDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 13의 VLCDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 14의 VLCDR3 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL);
(b) 각각 US 2015/0218274의 표 1-4에 개시되어 있는, 서열 번호: 3의 VHCDR1 아미노산 서열; 서열 번호: 4의 VHCDR2 아미노산 서열; 및 서열 번호: 5의 VHCDR3 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 서열 번호: 6의 VLCDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 7의 VLCDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 8의 VLCDR3 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(c) 각각 US 2015/0218274의 표 1-4에 개시되어 있는, 서열 번호: 9의 VHCDR1 아미노산 서열; 서열 번호: 25의 VHCDR2 아미노산 서열; 및 서열 번호: 5의 VHCDR3 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 서열 번호: 12의 VLCDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 13의 VLCDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 14의 VLCDR3 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(d) 각각 US 2015/0218274의 표 1-4에 개시되어 있는, 서열 번호: 3의 VHCDR1 아미노산 서열; 서열 번호: 24의 VHCDR2 아미노산 서열; 및 서열 번호: 5의 VHCDR3 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 서열 번호: 6의 VLCDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 7의 VLCDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 8의 VLCDR3 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(e) 각각 US 2015/0218274의 표 1-4에 개시되어 있는, 서열 번호: 9의 VHCDR1 아미노산 서열; 서열 번호: 31의 VHCDR2 아미노산 서열; 및 서열 번호: 5의 VHCDR3 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 서열 번호: 12의 VLCDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 13의 VLCDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 14의 VLCDR3 아미노산 서열을 포함하는 VL; 또는
(f) 각각 US 2015/0218274의 표 1-4에 개시되어 있는, 서열 번호: 3의 VHCDR1 아미노산 서열; 서열 번호: 30의 VHCDR2 아미노산 서열; 및 서열 번호: 5의 VHCDR3 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 서열 번호: 6의 VLCDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 7의 VLCDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 8의 VLCDR3 아미노산 서열을 포함하는 VL.
예시적인 항-TIM-3 항체들은 미국 특허: 8,552,156, WO 2011/155607, EP 2581113 및 U.S 공개특허출원: 2014/044728에 개시되어 있다.
6.6.4. 예시적인 LAG-3 억제제들
한 구체예에서, 상기 조합은 LAG-3 억제제를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 조합은 암, 예컨대, 본 출원에 기재된 암, 예컨대, 고형 종양 (예컨대, 유방암, 편평 세포 암종, 흑색종, 난소암, 자궁관 암종, 복막 암종, 연조직 육종, 흑색종, 유방암, 식도암, 두경부 암,자궁내막암, 자궁경부 암, 또는 기저 세포 암종), 예컨대, 혈액 악성 종양 (예컨대, 백혈병 (예컨대, 만성 림프구 백혈병 (CLL), 또는 림프종 (예컨대, 가장자리 구역 B-세포 림프종, 소 림프구 림프종, 소포 림프종, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종))을 치료하기 위하여 사용된다.
한 구체예에서, 본 출원에 기재된 조합은 LAG-3 억제제를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 조합은 암, 예컨대, 본 출원에 개시된 암, 예컨대, 고형 종양 또는 혈액 악성 종양을 치료하기 위해 사용된다.
항-LAG-3 항체 분자의 예시적인 비-제한적 조합들과 용도들은 2015년 9월 17일 공개된 "Antibody Molecules to LAG-3 and Uses Thereof" 제목의 US 2015/0259420에 개시되어 있으며, 이 문헌의 전문은 참고문헌으로 본 출원에 포함된다.
한 구체예에서, 항-LAG-3항체 분자는 BAP050-hum01, BAP050-hum02, BAP050-hum03, BAP050-hum04, BAP050-hum05, BAP050-hum06, BAP050-hum07, BAP050-hum08, BAP050-hum09, BAP050-hum10, BAP050-hum11, BAP050-hum12, BAP050-hum13, BAP050-hum14, BAP050-hum15, BAP050-hum16, BAP050-hum17, BAP050-hum18, BAP050-hum19, BAP050-hum20, huBAP050(Ser) (예컨대, BAP050-hum01-Ser, BAP050-hum02-Ser, BAP050-hum03-Ser, BAP050-hum04-Ser, BAP050-hum05-Ser, BAP050-hum06-Ser, BAP050-hum07-Ser, BAP050-hum08-Ser, BAP050-hum09-Ser, BAP050-hum10-Ser, BAP050-hum11-Ser, BAP050-hum12-Ser, BAP050-hum13-Ser, BAP050-hum14-Ser, BAP050-hum15-Ser, BAP050-hum18-Ser, BAP050-hum19-Ser, 또는 BAP050-hum20-Ser), BAP050-클론-F, BAP050-클론-G, BAP050-클론-H, BAP050-클론-I, 또는 BAP050-클론-J 중 어느 하나의 아미노산 서열; 또는 US 2015/0259420의 표 1에 기재된 아미노산 서열, 또는 US 2015/0259420의 표 1의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열; 또는 전술한 서열들 중 어느 하나와 실질적으로 동일한 (예컨대, 최소한 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한) 서열을 포함하는, 최소한 1 또는 2개의 중쇄 가변 도메인 (선택적으로 불변 영역 포함), 최소한 1 또는 2개의 경쇄 가변 도메인 (선택적으로 불변 영역 포함), 또는 둘 모두를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 항-LAG-3 항체 분자는 본 출원에 기재된 항체, 예컨대, BAP050-hum01, BAP050-hum02, BAP050-hum03, BAP050-hum04, BAP050-hum05, BAP050-hum06, BAP050-hum07, BAP050-hum08, BAP050-hum09, BAP050-hum10, BAP050-hum11, BAP050-hum12, BAP050-hum13, BAP050-hum14, BAP050-hum15, BAP050-hum16, BAP050-hum17, BAP050-hum18, BAP050-hum19, BAP050-hum20, huBAP050(Ser) (예컨대, BAP050-hum01-Ser, BAP050-hum02-Ser, BAP050-hum03-Ser, BAP050-hum04-Ser, BAP050-hum05-Ser, BAP050-hum06-Ser, BAP050-hum07-Ser, BAP050-hum08-Ser, BAP050-hum09-Ser, BAP050-hum10-Ser, BAP050-hum11-Ser, BAP050-hum12-Ser, BAP050-hum13-Ser, BAP050-hum14-Ser, BAP050-hum15-Ser, BAP050-hum18-Ser, BAP050-hum19-Ser, 또는 BAP050-hum20-Ser), BAP050-클론-F, BAP050-클론-G, BAP050-클론-H, BAP050-클론-I, 또는 BAP050-클론-J에서 선택된 어느 하나의 항체의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역; 또는 US 2015/0259420의 표 1에 기재된 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역, 또는 US 2015/0259420의 표 1의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역; 또는 전술한 서열들 중 어느 하나와 실질적으로 동일한 (예컨대, 최소한 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한) 서열의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역의 최소한 1, 2, 또는 3개의 상보성 결정 영역들 (CDRs)을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 항-LAG-3 항체 분자는 US 2015/0259420의 표 1에 나타낸 아미노산 서열, 또는 US 2015/0259420의 표 1에 나타낸 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 중 최소한 1, 2, 또는 3개의 CDR들 (또는 집합적으로 이러한 CDR들 모두)을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 CDR들 중 하나 이상 (또는 집합적으로 이러한 CDR들 모두)은 US 2015/0259420의 표 1에 나타낸 아미노산 서열, 또는 US 2015/0259420의 표 1에 나타낸 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열과 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상의 변화들, 예컨대, 아미노산 치환 또는 결실을 가진다.
또 다른 구체예에서, 항-LAG-3 항체 분자는 US 2015/0259420의 표 1에 나타낸 아미노산 서열, 또는 US 2015/0259420의 표 1에 나타낸 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 중 최소한 1, 2, 또는 3개의 CDR들 (또는 집합적으로 이러한 CDR들 모두)을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 CDR들 중 하나 이상 (또는 집합적으로 이러한 CDR들 모두)은 US 2015/0259420의 표 1에 나타낸 아미노산 서열, 또는 US 2015/0259420의 표 1에 나타낸 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열과 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상의 변화들, 예컨대, 아미노산 치환 또는 결실을 가진다. 특정 구체예들에서, 항-PD-L1 항체 분자는 경쇄 CDR에서 치환, 예컨대, 경쇄의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3에서 하나 이상의 치환을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 항-LAG-3 항체 분자는 US 2015/0259420의 표 1에 나타낸 아미노산 서열, 또는 US 2015/0259420의 표 1에 나타낸 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 중 최소한 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 CDR들 (또는 집합적으로 이러한 CDR들 모두)을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 CDR들 중 하나 이상 (또는 집합적으로 이러한 CDR들 모두)은 US 2015/0259420의 표 1에 나타낸 아미노산 서열, 또는 US 2015/0259420의 표 1에 나타낸 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열과 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상의 변화들, 예컨대, 아미노산 치환 또는 결실을 가진다.
한 구체예에서, 항-LAG-3 항체 분자는 다음을 포함한다:
(i) 각각 US 2015/0259420의 표 1에 개시되어 있는, 서열 번호: 1, 서열 번호: 4 또는 서열 번호: 286에서 선택된 VHCDR1 아미노산 서열; 서열 번호: 2의 VHCDR2 아미노산 서열; 및 서열 번호: 3의 VHCDR3 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및
(ii) 각각 US 2015/0259420의 표 1에 개시되어 있는, 서열 번호: 10의 VLCDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 11의 VLCDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 11의 VLCDR3 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL).
또 다른 구체예에서, 항-LAG-3 항체 분자는 다음을 포함한다:
(i) 각각 US 2015/0259420의 표 1에 개시되어 있는, 서열 번호: 1, 서열 번호: 4 또는 서열 번호: 286에서 선택된 VHCDR1 아미노산 서열; 서열 번호: 5의 VHCDR2 아미노산 서열; 및 서열 번호: 3의 VHCDR3 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및
(ii) 각각 US 2015/0259420의 표 1에 개시되어 있는, 서열 번호: 13의 VLCDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 14의 VLCDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 15의 VLCDR3 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL).
한 구체예에서, 항-LAG-3 항체 분자는 서열 번호: 1의 VHCDR1 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 항-LAG-3 항체 분자는 서열 번호: 4의 VHCDR1 아미노산 서열을 포함한다. 또한 또 다른 구체예에서, 항-LAG-3 항체 분자는 서열 번호: 286의 VHCDR1 아미노산 서열을 포함하며, 각각은 US 2015/0259420의 표 1에 개시되어 있다.
일부 구체예들에서, 항-LAG-3 항체는 BMS-986016이다. BMS-986016 (또한 BMS986016로도 지칭됨; Bristol-Myers Squibb)은 LAG-3에 결합하는 단일클론 항체이다. BMS-986016 및 다른 인간화 항-LAG-3 항체들은 US 2011/0150892, WO2010/019570, 및 WO2014/008218에 개시되어 있다.
6.6.5. 예시적인 CTLA-4 억제제들
한 구체예에서, 상기 조합은 CTLA-4 억제제를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 조합은 암, 예컨대, 본 출원에 기재된 암, 예컨대, 고형 종양 (예컨대, 유방암, 편평 세포 암종, 흑색종, 난소암, 자궁관 암종, 복막 암종, 연조직 육종, 흑색종, 유방암, 식도암, 두경부 암,자궁내막암, 자궁경부 암, 또는 기저 세포 암종), 예컨대, 혈액 악성 종양 (예컨대, 백혈병 (예컨대, 만성 림프구 백혈병 (CLL), 또는 림프종 (예컨대, 가장자리 구역 B-세포 림프종, 소 림프구 림프종, 소포 림프종, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종))을 치료하기 위하여 사용된다.
한 구체예에서, 본 출원에 기재된 조합은 CTLA-4 억제제를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 조합은 암, 예컨대, 본 출원에 개시된 암, 예컨대, 고형 종양 또는 혈액 악성 종양을 치료하기 위해 사용된다.
예시적인 항-CTLA4 항체들은 트레멜리무맙 (Pfizer사로부터 구입가능한 IgG2 단일클론 항체, 이전에 티실리무맙, CP-675,206으로 공지됨); 및 이필리무맙 (CTLA-4 항체, MDX-010로도 공지됨, CAS No. 477202-00-9)을 포함한다.
한 구체예에서, 상기 조합은 항-PD-1 항체 분자, 예컨대, 본 출원에 기재된 항-PD-1 항체 분자, 및 항-CTLA-4 항체, 예컨대, 이필리무맙을 포함한다. 사용될 수 있는 예시적인 투여량들은 약 1 내지 10 mg/kg, 예컨대, 3 mg/kg의 항-PD-1 항체 분자 투여량, 및 약 3 mg/kg의 항-CTLA-4 항체, 예컨대, 이필리무맙의 투여량을 포함한다.
다른 예시적인 항-CTLA-4 항체들은, 예컨대, 본 출원에 참고문헌으로 포함되는, 미국 특허 제 5,811,097호에 개시되어 있다.
6.6.6. 예시적인 GITR 조절제
한 구체예에서, 상기 조합은 GITR 조절제, 가령, 작용제 또는 길항제를 포함한다. 한 구체예에서, GITR 조절제는 길항제이다. 일부 구체예들에서, 상기 조합은 암, 예컨대, 본 출원에 기재된 암, 예컨대, 고형 종양 (예컨대, 유방암, 편평 세포 암종, 흑색종, 난소암, 자궁관 암종, 복막 암종, 연조직 육종, 흑색종, 유방암, 식도암, 두경부 암,자궁내막암, 자궁경부 암, 또는 기저 세포 암종), 예컨대, 혈액 악성 종양 (예컨대, 백혈병 (예컨대, 만성 림프구 백혈병 (CLL), 또는 림프종 (예컨대, 가장자리 구역 B-세포 림프종, 소 림프구 림프종, 소포 림프종, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종))을 치료하기 위하여 사용된다.
예시적인 GITR 조절제에는, 예컨대, GITR 융합 단백질 및 항-GITR 항체들 (예컨대, 2가 항-GITR 항체들), 가령, 미국 특허 제: 6,111,090, 유럽 특허 제: 0920505B1, 미국 특허 제: 8,586,023, PCT 공개특허출원 제: WO 2010/003118 및 2011/090754에 기재된 GITR 융합 단백질, 또는, 예컨대, 미국 특허 제: 7,025,962, 유럽 특허 제: 1947183B1, 미국 특허 제: 7,812,135, 미국 특허 제: 8,388,967, 미국 특허 제: 8,591,886, 유럽 특허 제: EP 1866339, PCT 공개특허출원 제: WO 2011/028683, 미국 특허 제: 8,709,424, PCT 공개특허출원 제: WO 2013/039954, 국제 공개특허출원 제: WO2013/039954, 미국 공개특허출원 제: US2014/0072566, 국제 공개특허출원 제: WO2015/026684, PCT 공개특허출원 제: WO2005/007190, PCT 공개특허출원 제: WO 2007/133822, PCT 공개특허출원 제: WO2005/055808, PCT 공개특허출원 제: WO 99/40196, PCT 공개특허출원 제: WO 2001/03720, PCT 공개특허출원 제: WO99/20758, 미국 특허 제: 6,689,607, PCT 공개특허출원 제: WO2006/083289, PCT 공개특허출원 제: WO 2005/115451, 미국 특허 제: 7,618,632, PCT 공개특허출원 제: WO 2011/051726, 국제 공개특허출원 제: WO2004060319, 및 국제 공개특허출원 제: WO2014012479에 기재된 항-GITR 항체가 포함되며, 이들 각각은 본 출원에 참고문헌으로 포함된다.
실시예
실시예 1: 마우스 항-인간 IL-2 항체 NARA1의 생성 및 선별
해당 분야의 숙련된 기술자에게 널리 공지된 방법들에 따라 NARA1로 표기되는 기준 항체를 단리하고 구조적으로 특성화하였다.
Balb/c 마우스를 0, 14 (피하) 및 28 (정맥내)일차에 프로인드 보강제 (F-5881, Sigma)에서의 인간 (h) IL-2 (34-8029, eBioscience)로 면역화시켰다. 항-hIL-2 항체 적정량을 점검하기 위하여 첫번째 면역화 이전 그리고 매 면역화 후 9-11일차에 혈청을 수집하였다. 35일차에, 마우스들을 안락사시키고 비장 세포들을 표준 절차에 따라 수집하였다. 비장세포를 폴리에틸렌 글리콜 1500 (10783641001, Roche)과 5:1 비율의 골수종 세포들과 혼합하였다. Balb/c 마우스를 복막 세척하여 얻은 영양세포층을 사용하여, 10% 초저용량 IgG FBS (16250, Life Technologies), 50 μM 메르캅토에탄올 (313050, Life technologies), 1:100 인슐린-트랜스페린-셀레늄 (41400-045, Life Technologies), 2% IL-6-조건화 배지, 페니실린-스트렙토마이신 (15240, Life Technologies), 젠타마이신 (15750, Life Technologies), 및 하이포잔틴-아미노프테린-티미딘 (HAT, H037, Sigma-Aldrich)으로 보충된 IMDM 선택 배지 (21980, Life Technologies)에서 클론들을 수일간 성장시켰다. 그 후 다클론들을 직접 결합 ELISA을 사용하여 hIL-2 결합에 대해 그리고 경쟁 ELISA를 사용하여 특이성에 대해 선별하고 희석시켜 단일클론 클론들을 얻었다. 단일클론을 증폭시키기 위해, HAT 배지를 하이포잔틴-티미딘 배지 (HT, 41065, Life Technologies)로 교체하였다. 그 후 공급업체의 권장사항에 따라 100 kDa 원심분리 필터 장치들(UFC9100, Merck Millipore)을 사용하여 단일클론들을 농축시켰다. 농축물들을, 경쟁 ELISA를 사용하여 용량-의존 방식으로 그리고 생체내 1.5 μg hIL-2와 복합된 200 μl 농축물을 일일 4회 복막내 주사한 후, T 세포 아형들과 자연 살해 (NK) 세포들을 유세포측정법으로 평가함으로써 특이성에 대해 추가로 테스트하였다. 공급업체의 권장사항에 따라 NARA1을 단백질 G 아가로오스 (20398. ThermoFisher Scientific)를 사용하여 정제하였다.
NARA1의 전장 중쇄 아미노산 서열은 서열 번호: 115이며 NARA1의 전장 경쇄 아미노산 서열은 서열 번호: 117이다.
NARA1의 상응하는 가변 영역들, VH 및 VL 아미노산 서열들은 서열 번호: 111 (가변 중쇄) 및 서열 번호: 113 (가변 경쇄)이다.
NARA1의 전장 경쇄 및 중쇄 뉴클레오티드 코딩 서열들은 서열 번호: 116 (중쇄 코딩 서열, 리더 서열 포함) 및 서열 번호: 118 (경쇄 코딩 서열, 리더 서열 포함)이다.
NARA1의 가변 경쇄 및 중쇄 뉴클레오티드 코딩 서열들은 서열 번호: 112 (가변 중쇄 코딩 서열) 및 서열 번호: 114 (가변 경쇄 코딩 서열)이다.
NARA1의 CDR 영역들은 Kabat 체계를 사용하여 기술된다 (Kabat, E. A., 등 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, 미국 보건복지부, NIH 간행물 제 91-3242, 또한 Zhao&Lu 2009, Molecular Immunology 47:694-700 참조). 용이한 이해를 위하여, CDR 영역들이 Kabat 정의에 따라 기술되는 경우, 이들은 이하에서 각각 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3으로 명명된다. NARA1의 CDR 영역들은 다음과 같다: 서열 번호: 4에 따른 HCDR1, 서열 번호: 2에 따른 HCDR2, 서열 번호: 3에 따른 HCDR3, 서열 번호: 19에 따른 LCDR1, 서열 번호: 20에 따른 LCDR2, 서열 번호: 21에 따른 LCDR3.
실시예 2: NARA1의 결정 구조
(1) 재료 및 방법들
일반적으로 해당 분야의 숙련된 기술자들에게 프로류킨® (알데스류킨)으로 공지된 인간 인터루킨 2 돌연변이체 (서열 번호: 110)의, 항체 NARA 1의 Fab 단편에 결합된 복합체 구조를 결정하였다. 생성된 프로류킨® 상의 잔기들의 넘버링은 wt IL-2의 넘버링에 따라 주어진다.
하기 상세히 논의되는 바와 같이, 프로류킨®과 wt hIL-2 간의 서열상의 차이는 무관하며 프로류킨®은 hIL-2의 구조 분석에 타당한 모델이다.
에피토프를 정의하기 위하여, X-선 결정분석법을 사용하여 상기 복합체의 원자-분해능 구조를 연구하였다. X-선 결정분석법은 항체들 및 이들의 항원들과의 복합체들을 비롯한, 생체분자들에 대한 구조적 데이터를 생성하기 위해 관례적으로 그리고 널리 사용되어 왔던 기법이다 (Adams 등, (2013) Annual Review Biophysics 42:265-287; Garman, (2014) Science 343:1102-1108; Joachimiak, (2009) Current Opinion Structural Biology 19:573-584.)
항원, 프로류킨®은, 부형제들과 함께 동결건조 분말로 상업적으로 구입가능하다 (매 1 mg 프로류킨®은 대략 50mg 만니톨, 0.18mg 소듐 도데실 설페이트, 0.173mg 소듐 다이하이드로겐 포스페이트, 및 0.89mg 다이소듐 하이드로겐 포스페이트와 혼합됨). 복합체 형성에 사용되기 전에, 프로류킨®을 역상 HPLC로 정제하여 부형제들을 제거하였다.
NARA1 (NARA1-Fab)의 Fab 단편을 전장 항체를 파파인 분해한 후 단백질 A 크로마토그래피하여 생성하였다. 요약하면, 6.5ml 전장 NARA1 (pH 7.0의 90mM 염화 나트륨을 보유한 50mM 시트레이트 완충액에서 9mg/ml)을 5mM DTT 및 590ug 파파인과 혼합하였다 (Roche). 분해 반응을 16h 동안 실온에서 유지시켰으며 15ul의 56mM E64 용액 (Roche) 추가에 의해 중단되었다. 그 후 분해 용액을 25mM 트리스, 25mM NaCl, pH 8.0로 10배 희석시키고 25mM 트리스, 25mM NaCl, pH 8.0의 5 컬럼 부피와 평형을 이루는 5ml 단백질 A 컬럼 (GE Healthcare) 위에 로딩하였으며 Fab 단편을 분획 관통-로딩시키고 Fc 단편을 단백질 A 컬럼에 결합시켰다.
복합체를 형성하기 위하여, HPLC 후 프로류킨® 분말을 5.5 mg/ml의 농도로 H2O에 용해시켰다. 과량의 6.6mg 프로류킨®을, 11.5mg의 NARA1 Fab 단편 용액에 한 방울씩 추가하였다. 현재 조건하에서 침전되었던 과량의 프로류킨®을 원심분리를 사용하여 제거하였다. 이후 이 복합체를 25mM 트리스, 25mM NaCl, pH 7.4를 러닝 완충액(running buffer)으로하여 Superdex 200 10x300 (GE Healthcare)을 이용한 겔 여과에 의해 정제하였다.
겔 여과 후 프로류킨®/NARA1-Fab 복합체를 14mg/ml로 농축시키고 시팅 드롭(sitting drops) 증기 확산법으로 선별되었다. 이 단백질 용액을 총 0.4ul의 크기까지 저장 완충액과 1:1로 혼합하였다. 실험들을 Phoenix 로보틱 시스템 (Art Robbins Instruments)으로 셋팅하고, RockImager 호텔 (Formulatrix)에서 19oC에 보관하고, 자동으로 이미지촬영하였다. 선별 후 4일에 20% w/v 폴리에틸렌 글리콜 3350 및 0.2M 소듐 나이트레이트의 조건하에서 결정들을 수확하였다. 데이터 수집에 앞서 결정들을 10% 글리세롤을 함유하는 저장 완충액으로 동결보호시켰으며 액체 질소에서 급속 냉동시켰다. 0.99998 Å의 x-선 방사선 파장을 사용하는 Pilatus 픽셀 검출장치를 구비한 빔 라인 PX-II의 Swiss Light Source (Villigen, Switzerland)에서 회절 데이터들을 수집하였다.
데이터세트를 XDS 및 XSCALE (2010년 12월 6일 버전)로 처리하였으며 IL-2에 대한 탐색 모델로서 단백질 데이터 뱅크 엔트리 "3INK"를 그리고 Fab 단편에 대한 탐색 모델로서 단백질 데이터 뱅크 엔트리 "3TTI"를 사용하는 프로그램 PHASER과 함께 분자 치환법을 사용하여 해당 구조를 분석하였다. 반복 모델 구축 및 정제를 프로그램 Coot (Crystallographic Object-Oriented Toolkit) 및 AUTOBUSTER (Bricogne 등, 2011)을 이용하여 수행하였다. 모든 도면들을 프로그램 PyMOL (Molecular Graphics System; DeLano Scientific: Palo Alto, CA; )을 사용하여 생성하였다.
에피토프 잔기들은 NARA1의 Fab 단편 내 임의의 원자로부터 4Å 거리 안에 있는 프로류킨®의 잔기들로 정의되며 CCP4 프로그램 CONTACT 및 AREAIMOL (Collaborative Computational Project, Number 4, version 6.4.0)에 의해 추가로 확인되었다. 유사하게 파라토프 잔기들은 프로류킨® 내 임의의 원자로부터 4Å 거리 안에 있는 NARA1-Fab의 잔기들로 정의된다.
(2) 결과
프로류킨®/NARA1-Fab 복합체는 단위 셀 크기 a=201.8Å, b= 36.2Å, c= 88.7Å, 알파= 90°, 베타= 102.9°, 감마=90°의 공간 그룹 C 1 2 1에서 1.95 Å인 것으로 나타났다. 상세한 구조적 통계값들에 관하여 표 3을 참고하라. 각 비대칭 단위에서, 하나의 복합체 분자가 존재한다.
Figure pct00003
(3) 에피토프 및 파라토프 분석
도 1은 실시예 1에서 수득된 프로류킨®/Fab-NARA1 복합체의 3차원 구조에 대한 개요를 제공한다. NARA1의 Fab 단편의 경쇄는 A로 표기되고, NARA1의 Fab 단편의 중쇄는 B로 나타내며, NARA1-Fab에 의해 인식되는 에피토프 잔기들은 D로 표기되고, 프로류킨®은 C로 표기되며 돌연변이, C145S는 강조표시한다.
도 2는 에피토프 잔기들의 추가 분석을 제공한다. X-축은 서열 번호: 110에 따른 아미노산 서열 및 넘버링을 열거한다. Y-축의 위쪽은 대응하는 프로류킨® 잔기로부터 4 Å 이내에 존재하는 NARA1-Fab의 총 원자수를 나타내고 Y-축의 아래쪽은 NARA1-Fab에 대한 결합 후 감소된 용매-접근성 영역 (Å2)을 나타낸다.
실시예 1에서 사용된 프로류킨®은 C145S 돌연변이를 함유한다. 도 1에 도시된 바와 같이, C145S는 에피토프 영역에서 멀리 떨어져있다. 또한 실시예 1의 프로류킨® 사이의 Cα 원자들과 CD25, CD122, 및 CD132와 복합체를 형성한 wt hIL-2 (PDB: 2B5I)의 Cα 원자들의 중첩은 0.447 Å의 r.m.s.d를 보여주며, 이는 이 돌연변이가 전체 구조를 방해하지 않음을 나타낸다. 그러므로 C145S 돌연변이가 있는 프로류킨®은 wt hIL-2에 대한 구조 분석에 타당한 모델이다.
hIL-2는 4개-나선 다발의 단백질로, 이들 4개 나선들은 N-말단으로부터 C-말단으로, 각각 A, B, C, 및 D로 명명된다. 도 1에 도시된 바와 같이 NARA1-Fab에 의해 인식되는 에피토프는 입체형태의 에피토프이며 도 2에 도시된 바와 같이 다음과 같은 2개 영역들에 걸쳐 있는데: 하나의 영역 (N50-K63)은 하나의 루프 및 짧은 나선을 포함하고 나선 A와 B를 연결하며, 다른 하나의 영역 (N91-N97)은 하나의 루프를 포함하고 나선 B와 C를 연결한다.
NARA1-Fab의 상호작용 파라토프 잔기들과 함께 에피토프 잔기들을 표 4에 요약한다. 모든 에피토프 잔기들 중에서, 도 2에 도시된 Arg58은 NARA1-Fab와의 결합에 가장 중요한 에피토프 잔기인데, 왜냐하면 이 잔기는 단독으로 NARA1-Fab로부터 42의 상호작용 원자들을 가지며 NARA1-Fab에 결합한 결과 총 감소된 용매-접근성 표면적이 17.7%에 달하기 때문이다. 더욱이, 도 3에 도시된 바와 같이 Arg58은, HCDR1의 Glu35 그리고 LCDR3의 Asp100과 각각 2개의 강한 염-다리들을 형성한다. Arg58은 또한 LCDR3의 Tyr100의 방향족 고리와 π-작용 상호작용을 한다. 잔기들 K52, P54, K55, T57, T61, F62, K63, Q94, 및 K96 또한 NARA1-Fab에 대한 결합에 중요한 것으로 고려되는데, 왜냐하면 도 2에 도시된 바와 같이, 이들 모두 NARA1-Fab로부터 5 이상의 상호작용 원자들 그리고 30Å2 보다 큰 감소된 용매-접근성 영역을 보여주기 때문이다.
Figure pct00004
도 3은 NARA1-Fab를 인식하는 가장 중요한 에피토프 잔기로서 Arg58을 도시한다. A는 프로류킨®을 나타내고, B는 중쇄를 나타내고, 그리고 C는 경쇄를 나타낸다. 관련 잔기들을 막대로 도시한다.
(4) NARA1-Fab 결합 성질
도 4는 IL-2/CD25/CD122/CD132 4차 복합체와 프로류킨®/NARA1-Fab 복합체의 중첩을 보여준다. 이러한 4차 복합체 구조는 PDB 엔트리 "2B5I"에서 유래하는데, 옅은 청록색의 그림 D는 wt hIL-2를 나타내고, 적색의 그림 B는 CD122를 나타내고, 청색의 그림 C는 CD132를 나타내고, 그리고 녹색의 표면 A는 CD25를 나타낸다. 프로류킨®/NARA1-Fab 복합체 구조에서, wt hIL-2와 중첩된 청록색 그림 D는 프로류킨®을 나타내고, 자홍색의 그림 E는 중쇄를 나타내고, 그리고 황색의 그림 F는 경쇄를 나타낸다.
도 4에 도시된 바와 같이 상기 2개 복합체들의 구조적 중첩은 NARA1-Fab가 CD25에 대하여는 직접 경쟁을 형성하지만 CD122/CD132에 대하여는 그렇지 않음을 명확히 보여주며, 이는 NARA1-Fab가 전구-T조절 활성 보다는 주로 전구-T효과기 세포 활성을 나타낸다는 관찰결과와 일관된다.
(5) NARA1-Fab와 복합된 프로류킨®의 C 나선은 4차 복합체에서와 유사한 입체형태를 채택한다.
도 5는 IL-2_C145A (PDB: 3INK), 수퍼카인 (PDB: 3QB1), IL-2/CD25/CD122/CD132 (PDB: 2B5I), 및 프로류킨®/NARA1-Fab의 C 나선들의 중첩을 도시한다.
IL-2와 CD122에서 나선 C 간의 극성 경계면은 이들 2개 부분들 사이의 결합에 중요한 역할을 한다 (Wang 등 (2005) Science 310:1159-1163). 2012년에 Levin, 등은 IL-2 돌연변이체인 수퍼카인이 단독으로 4차 복합체에서와 유사한 입체형태를 채택하는 나선 C를 가지며 이러한 수퍼카인은 CD122에 대해 wtIL-2보다 ~215배 더 높은 결합 친화력을 보여주었음을 입증하였다 (Levin 등, (2012) Nature 484:529-533). 나선 C에서의 이러한 입체형태 변화는 입체형태의 안정화와 연관되며, 이후 CD122에 대한 결합에 있어서 에너지상의 불이익을 감소시킴이 관찰되었다. 도 5에 도시된 바와 같이, NARA1-Fab와 복합체를 형성한 프로류킨®의 나선 C의 입체형태는 또한 수퍼카인에서, 뿐만 아니라 IL-2/CD25/CD122/CD132 4차 복합체에서 관찰된 것과 유사하며, 따라서 프로류킨®/NARA1-Fab 복합체는 CD122에 대해 wt hIL-2가 보여준 것 보다 더 높은 결합 친화력을 나타낼 수 있음이 가능하다.
실시예 3: 마우스 단일클론 항체 NARA1의 인간화
인간 수용자 프레임워크, 복귀 돌연변이, 및 인간 CDR-이식된 수용자 프레임워크들의 결합 성질을 실질적으로 유지 및/또는 개선시키는 돌연변이들의 선택을 포함하는 항-인간 IL-2 마우스 항체 NARA1의 인간화가 본 출원에 기재된다.
인간화 과정은 해당 분야에 잘 설명되어 있다 (Jones, 등 1986, Queen, 등 1989, Riechmann, 등 1988, Verhoeyen, Milstein 및 Winter 1988). 용어 인간화는 비-인간 항체, 예컨대, 쥐과 유래 항체의 항원-결합 부위를, 인간 수용자 프레임워크, 예컨대, 인간 생식계열 서열에 전달하는 것으로 설명된다 (Retter, 등 2005). 항체를 인간화시키는 주된 이론적근거는 인간에서 항체에 대한 면역원성 반응 발달 위험을 최소화하는 것에 있다(Rebello, 등 1999).
항원-결합 부위는 상보성 결정 영역들 (CDRs) (Chothia 및 Lesk 1987, Kabat, 등 1991) 및 CDR 밖의, 즉, 결합에 직접 또는 간접적으로 영향을 미치는 가변 도메인들 (VL 및 VH)의 프레임워크 영역 내부의 위치들을 포함한다. 결합에 직접 영향을 미칠 수 있는 프레임워크 잔기들은, 예를 들어, CDR2와 CDR3 사이에 위치한 소위 "외부" 루프 영역에서 발견될 수 있다. 결합에 간접적으로 영향을 미치는 잔기들은, 예를 들어, 소위 베르니에 구역에서 발견된다 (Foote 및 Winter 1992). 이들은 CDR 입체형태를 지지하는 것으로 생각된다. CDR들 밖의 이들 위치들은 프레임워크 영역들 내 인간 생식계열 수용자 서열에 대한 최종 인간화 항체의 편차 수를 최소화하기에 적합한 수용자 프레임워크를 선택할 때 고려된다.
1. 서열 최적화 친화력 성숙
특정 아미노산 서열 모티프들은 번역후 변형 (PTM) 가령, 당화 (즉, NxS/T, x는 P 이외 모두), 유리 시스테인들의 산화, 탈아미드화 (예컨대 NG) 또는 이성질체화 (예컨대 DG)를 거치는 것으로 공지되어 있다. 이들 모티프들이 CDR 영역들에 존재하는 경우, 이들은 이상적으로 생성물 동질성을 증가시키기 위하여 부위-지시된 돌연변이유도에 의해 제거된다.
친화력 성숙 과정은 해당 분야에 잘 설명되어 있다. 많은 디스플레이 시스템들 중에서, 파지 디스플레이 (Smith 1985) 및 진핵세포들, 가령, 효모 상에서의 디스플레이 ( Boder E. 및 Wittrup K. (1997). Yeast surface display for screening combinatorial polypeptide libraries. Nat Biotechnol., 15(6), pp. 553-7.)가, 항체-항원 상호작용에 관한 선택에 가장 통상적으로 사용되는 시스템들인 것으로 보인다. 이들 디스플레이 시스템들의 이점들은 이들이 광범위한 항원들에 적합하다는 점과 선택 엄격성을 용이하게 조절할 수 있다는 점이다. 파지 디스플레이에서, scFv 또는 Fab 단편들을 디스플레이할 수 있으며 효모에서는 전장 IgG를 또한 디스플레이한다. 이러한 통상적으로 사용되는 방법들은 107 이상의 다양성을 가지는 보다 큰 라이브러리로부터 원하는 항체 변이체를 선택하게 할 수 있다. 보다 작은 다양성, 예컨대 103의 라이브러리들은, 미세-발현 및 ELISA에 의해 선별될 수 있다.
비-표적화 또는 무작위 항체 변이체 라이브러리는 예를 들어, 오류-빈발 (error-prone) PCR (Cadwell 및 Joyce 1994)에 의해 생성될 수 있으며 매우 간단하지만 때때로 제한된 접근법을 제공한다. 또 다른 전략은 항체 후보군의 CDR 지시된 다양화이다. 하나 이상의 CDR들에서 하나 이상의 위치들은, 예를 들어, 축퇴성 올리고 (Thompson, 등 1996), 트라이뉴클레오티드 돌연변이유도 (TRIM) (Kayushin, 등 1996) 또는 해당 분야에 공지된 임의의 다른 접근법을 사용하여 특이적으로 표적될 수 있다.
2. 발현 플라스미드의 생성
인간화 VL 및 VH 도메인들을 코딩하는 DNA 서열들을 호모 사피엔스에 대한 코돈 최적화를 포함하는 GeneArt (Life Technologies Inc. Regensburg, 독일)에서 주문하였다. VL 및 VH 도메인들을 코딩하는 서열들을 절삭하고 붙임으로써 GeneArt 유래 벡터들로부터 포유동물 세포들에서의 분비에 적합한 발현 벡터들로 서브클로닝하였다. 중쇄 및 경쇄들을 개개의 발현 벡터들에 클로닝하여 공동-형질주입시켰다. 발현 벡터 요소들은 프로모터 (사이토메갈로바이러스 (CMV) 인핸서-프로모터), 분비를 촉진시키는 신호 서열, 폴리아데닐화 신호 및 전사 종결인자 (소 성장 호르몬 (BGH) 유전자), 에피좀 복제 및 원핵생물에서의 복제를 가능하게 하는 요소 (예컨대 SV40 복제원점 및 ColE1 또는 해당 분야에 공지된 기타) 및 선택을 가능하게 하는 요소들 (암피실린 내성 유전자 및 제오신 표지자)을 포함한다.
3. 인간화 항체 후보군의 발현 및 정제
SV40 대형 T 항원을 항시적으로 발현시키는 인간 배아 콩팥 세포들 (HEK293-T ATCC11268)은 인간화 및/또는 최적화된 IgG 단백질의 일시 발현에 바람직한 숙주 세포주 중 하나이다. 형질주입은 형질주입 시약으로 PEI (폴리에틸렌이민, MW 25.000 선형, Polysciences, USA 카탈로그 번호 23966)를 사용하여 수행된다. 실온 (RT)의 900 ml 세포 배양 등급의 물에 1 g의 PEI를 조심스럽게 용해시켜 PEI 저장 용액을 제조한다. PEI의 용해를 촉진시키기 위하여, HCl를 추가하여 이 용액을 pH 3-5까지 산성화시킨 후, 최종 pH 7.05까지 NaOH로 중화시킨다. 마지마긍로, 부피를 1L로 조절하고 이 용액을 0.22 μm 필터를 통해 여과시키고, 분취하고 추가 사용시까지 -80℃에서 동결시킨다. 해동되는 경우, 해당 분취액을 -20℃에서 최대 3회까지 재동결시킬 수 있으나 -20℃에서 장기간 보관하여서는 안된다. 상기 세포들의 형질주입 및 증식용으로 Novartis 등록상표의 무-혈청 배양 배지, 그리고 생산/피드 배지로서 ExCell VPRO 무-혈청 배양 배지 (SAFC Biosciences, USA, 카탈로그 번호 24561C)를 사용하여 HEK 293T 세포들을 배양한다. 일시 형질주입을 위해 준비된 세포들을 현탁 배양으로 배양한다. 소규모 (<5L) 형질주입을 위해, 세포들은 5% CO2의 가습 배양기 (종균 플라스크)에서 오비탈 진탕기 (100-120 rpm)의 Corning 진탕 플라스크 (Corning, Tewksbury, MA)에서 성장시킨다. 종균 배양에서 세포들은 형질주입을 위해 지수 증식 상을 유지하여야 하고 (5x105 내지 3x106/mL의 세포 밀도) >90%의 생존력을 보여야 한다. 이러한 범위 밖의 세포 밀도는 희석 후 지연 상 또는 감소된 형질주입 효율을 가져온다. 소규모 (<5L) 형질주입을 위하여 세포들의 분취액을 종균 배양에서 꺼내어 Novartis 무-혈청 배양 배지 최종 부피의 36% 에서 1.4x106 세포들/mL로 조절한다. 상기 DNA를 최종 배양 부피의 7% 에서 1mg/L (최종 부피)로 희석시킨 후 부드럽게 혼합하여 DNA 용액 (용액 1: 1 L 형질주입을 위한 0.5mg의 중쇄 및 0.5 mg의 경쇄 발현 플라스미드)을 제조한다. 세균 오염을 방지하기 위하여, 이 용액을 0.22 μm 필터 (예컨대, Millipore Stericup)를 사용하여 여과시킨다. 그 후 3 mg/L (최종 부피)의 PEI 용액을 또한 최종 배양 부피의 7%에 희석시키고 부드럽게 혼합한다 (용액 2). 두 용액들을 실온 (RT)에서 5-10분간 배양한다. 그 후 용액 2를 부드럽게 혼합하면서 용액 1에 추가하고 실온에서 5-15분 추가 배양한다. 그 후 형질주입 혼합물을 상기 세포들에 추가하고 세포들의 배양을 4 내지 6시간 동안 지속한다. 마지막으로, ExCell® VPRO 무-혈청 배양 배지를 추가하여 총 생산 부피의 50%가 남게 된다. 형질주입 후 세포 배양을 11일 동안 지속한다. 배양물을 4℃에서 20분간 4500 rpm에서 원심분리하여 수확한다 (Heraeus ®, Multifuge 3 S-R, Thermo Scientific, Rockford, IL). 회수된 세포 상청액을 스테리컵 필터 (0.22 μm)를 통해 멸균 여과시키고 추가 처리시까지 4℃에서 보관한다.
4℃ 냉각 캐비넷에서 새로이 살균된 (0.25 M NaOH) HiTrap ProtA MabSelect®SuRe, 5ml 컬럼을 사용하는 "ㅔKTA 100 explorer Air" 크로마토그래피 시스템 상에서 정제를 수행하였다. 컬럼을 5 CV의 PBS (Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA)로 평형을 맞춘 다음, 멸균 여과된 상청액 (2 L)을 4.0 ml/분으로 로딩하였다. 컬럼을 8 CV의 PBS로 세척하여 결합하지 않은 샘플을 용리시키고 다시 5 CV의 PBS로 세척하였다. 항체를 5 CV의 50 mM 시트레이트, 70 mM NaCl pH 3.2로 용리시켰다. 용리액을 3ml 분획들로 수집하였으며; 분획들을 모아서 1 M 트리스 HCl pH10을 이용하여 pH 7로 조절하였다. 풀(pool)을 모아서 멸균 여과하였으며 (Millipore Steriflip, 0.22 um), OD 280 nm를 Spectrophotometer ND-1000 (NanoDrop)에서 측정하고, 단백질 농도를 서열 데이터에 기초하여 계산하였다. 용리액을 응집 (SEC-MALS) 및 순도 (SDS-PAGE, LAL 및 MS)에 대해 테스트하였다. 제 2 정제 단계를 위해, 필요한 경우, 제 1 정제에서 얻은 풀을 새로이 살균된 (0.5 M NaOH) SPX (Hi Load 16/60 Superdex 200 grade 120 mL (GE-Helthcare)에 로딩하였다. 컬럼을 PBS로 평형시키고 PBS 완충액을 사용하여 1 ml/분으로 실험을 수행하였으며, 용리액을 1.2 ml 분획들로 수집하고 제 1 정제 단계에서 기재된 바와 같이 분석하였다.
따라서, 표 5에 강조한 바와 같은 3개의 인간화 가변 중쇄 영역들; VH1, VH3 및 VH5를 생성하였다.
Figure pct00005
또한, 표 6에 강조한 바와 같은 3개의 인간화 가변 경쇄 (카파) 영역들; VK1, VK2 및 VK3를 생성하였다.
Figure pct00006
실시예 4: 구조-수정된 인간화
실시예 2의 결정 구조 NARA1/hIL-2 결과들을 사용하여, 인간화 설계를 다듬었다.
실시예 3의 초기 인간화 서열들과 가장 가까운 생식계열 간의 동일성을 계산하였다. 별도로, 중쇄 및 경쇄들에 대한 등전점 (pI)을 계산하였다. 결과를 하기 표 7에 나타낸다.
Figure pct00007
Figure pct00008
이러한 데이터에 기초하여, 구조 VH3 및 VK3를 정제하기로 하였으며, 그 결과 표 9에 강조된 서열들이 생성되었다. 구조 정보를 사용함으로써 생식계열 정제된 서열이 인간 주형과의 동일성 %를 77%에서 85%로 증가하는데 도움을 주었기 때문에 VH3가 선택되었다.
4.7로부터 5.0으로 pI를 증가시켰기 때문에 VK3가 선택되었다. (VK1는 이미 5.3이고 VK2는 구조 정보를 사용함으로써 pI를 증가시키지 않을 것이기 때문에 우리는 VK3으로 결정하였다.)
Figure pct00009
이러한 6개의 가변 중쇄 및 경쇄 영역들에 기초하여, 서열 번호: 103으로 나타내어지는 N297A 점 돌연변이를 보유한 인간 IgG1 Fc 도메인을 사용하여 표 10에 개략적으로 나타낸 바와 같은 9개의 항체들을 생성하였다.
Figure pct00010
해당 분야의 숙련된 기술자에게 공지된 임의의 Fc 도메인을 사용하여 추가 항체들을 생성할 수 있다. 특히 고려되는 Fc 도메인들은 서열 번호: 93에 따른 비 Fc 변형된 인간 IgG1, 서열 번호: 95에 따른 인간 IgG2, 서열 번호: 97에 따른 인간 IgG3, 서열 번호: 99에 따른 인간 IgG4, 서열 번호: 101에 따른 LALA 돌연변이로 변형된 인간 IgG1 Fc, 서열 번호: 103에 따른 N297A 돌연변이로 변형된 인간 IgG1 Fc, 서열 번호: 105에 따른 DAPA 돌연변이로 변형된 인간 IgG1 Fc이다.
바람직한 구체예에 따르면, Fc 도메인은 서열 번호: 93에 따른 인간 IgG1이며, 보다 더 바람직한 구체예에 따르면, Fc 도메인은 서열 번호: 103에 따른 N297A 돌연변이로 변형된 인간 IgG1 Fc이다.
특정 구체예에 따르면, 항체 104343의 전장 경쇄 서열은 서열 번호: 124에 따르며 전장 중쇄 서열은 서열 번호: 126에 따른다. 또 다른 특정 구체예에 따르면, 항체 104348의 전장 경쇄 서열은 서열 번호: 128에 따르며 전장 중쇄 서열은 서열 번호: 130에 따른다.
실시예 5: 구조 최적화
추가 구조 최적화를 위해 실시예 2의 결정 구조 NARA1/hIL-2 결과들을 사용하여, CDR들의 특정 아미노산 잔기들을 확인하였다. 특히, 소위 DG 부위를 LCDR1에서 확인하고, 또 다른 DG 부위를 HCDR3에서 확인하였다. 놀랍게도, 이들 부위들에서 일부 돌연변이들은 인간 IL-2에 대한 친화력을 극적으로 감소시키는 반면, 그 외 다른 돌연변이들은 친화력에 거의 내지 전혀 영향을 주지 않는다.
PyMOL 또는 MOE와 같은 모형화 소프트웨어를 사용하여 복합체의 구조를 분석하였으며 인간화 서열과 인간 주형 간의 동일성 %를 증가시키기 위하여 추가 인간화를 위해 항원과 가까이 접촉하고 있지 않은 (즉, 항원으로부터 4 옹스트롬 이상 떨어진) CDR 루프들 상의 잔기들을 선택하였다.
Kabat 정의에 따라 생성된 경쇄 (카파) CDR들은 표 11에 있다.
Figure pct00011
Kabat 정의에 따라 생성된 중쇄 CDR들은 표 12에 있다.
Figure pct00012
VH5 돌연변이 D98E는 내성이었던 반면, D98S 및 D98Q는 놀랍게도 내성이 아니었다. 돌연변이 G99A 또한 내성이었다. VK1에 있어서, 돌연변이 D28Q는 내성이었던 반면, 놀랍게도 돌연변이 G29A는 내성이 아니었다.
발명자들의 비-제한적 이론에 따르면, VH D98 아미노산, 및/또는 VL D28 아미노산의, 아미노산 A, G 또는 T로의 치환 또한 내성일 수 있다. 또한, VH G99 아미노산, 또는 VL G29 아미노산의, 아미노산 T 또는 S로의 치환 또한 내성일 수 있다.
이러한 최적화된 가변 중쇄 및 경쇄 영역들에 기초하여, 표 13에 개략적으로 나타낸 바에 따른 가변 경쇄 및 중쇄 영역들, 그리고 N297A 점 돌연변이를 보유한 인간 IgG1 Fc 도메인을 사용하여 12개의 최적화된 항체들을 생성하였다.
Figure pct00013
해당 분야의 숙련된 기술자에게 공지된 임의의 Fc 도메인을 사용하여 추가 항체들을 생성할 수 있다. 특히 고려되는 Fc 도메인들은 서열 번호: 93에 따른 비 Fc 변형된 인간 IgG1, 서열 번호: 95에 따른 인간 IgG2, 서열 번호: 97에 따른 인간 IgG3, 서열 번호: 99에 따른 인간 IgG4, 서열 번호: 101에 따른 LALA 돌연변이로 변형된 인간 IgG1 Fc, 서열 번호: 103에 따른 N297A 돌연변이로 변형된 인간 IgG1 Fc, 서열 번호: 105에 따른 DAPA 돌연변이로 변형된 인간 IgG1 Fc이다.
바람직한 구체예에 따르면, Fc 도메인은 서열 번호: 93에 따른 인간 IgG1이며, 보다 더 바람직한 구체예에 따르면, Fc 도메인은 서열 번호: 103에 따른 N297A 돌연변이로 변형된 인간 IgG1 Fc이다.
한 특정 구체예에 따르면, 항체 104348_VH5D98E_VK1D28Q의 전장 중쇄 서열은 서열 번호: 229에 따르며 이의 전장 경쇄 서열은 서열 번호: 395에 따른다.
실시예 6: 친화력 성숙
인간화 NARA1 (104348_VH5D98E_VK1D28Q)을 다단계 친화력 성숙 과정을 위한 시작 점으로 사용하였으며, 이러한 다단계 친화력 성숙 과정은 효모 표면 상에서 Fab로서 모체 VH (서열 번호: 49) 및 VK (서열 번호: 70)를 클로닝 및 발현하는 것으로 시작하여 비오티닐화 프로류킨®의 최적 및 차선 결합 농도를 결정하게 된다.
요약하면, 모체 또는 야생형 (WT) VH (서열 번호: 49) 및 VK (서열 번호: 70) 서열들을 효모 디스플레이 벡터에서 Fab로서 클로닝하였으며, 효모 디스플레이 벡터는 VH의 카르복실-말단과 인-프레임된 aga2 및 경쇄의 카르복실-말단과 인-프레임된 베타-아밀로이드 (APP-태그)로부터 유래한 6개의 아미노산 태그를 내포한다. 이러한 태그의 탐지는 표면에서의 Fab 발현 수준을 시각으로 볼 수 있게 하여 주며, 이는 해당 분야의 숙련된 기술자에게 널리 공지이다. 효모에서의 벡터 전기천공 후 (Benatuil L. 등 (2010). An improved yeast transformation method for the generation of very large human antibody libraries. Protein Eng Des Sel., 23(4), pp. 155-9.), 상기 세포들을 우라실을 뺀 CM 글루코스 배지에서 성장시켰다. 유도시, 지수 증식기로 성장하는 7.8E+4개의 효모 세포들을 7ml의 유도-배지 (Ura 제외한 CM 갈락토스 배지/0.05% 글루코스)로 세척하고 4000rpm에서 10분 동안 세포들을 회전시켜 펠릿화하였다. 이 펠릿을 유도-배지 (1E+7 세포들/ml)에 재현탁시키고 22oC의 진탕기에서 16 시간 (HR) 동안 성장시켰다. 유도된 효모 세포들 (4E+7)을 4oC 예비-냉각시킨 원심분리기에서 1분 동안 13000 rpm으로 원심분리하여 수집하였다. 펠릿들을 1ml FACS 완충액 (PBS + 0.5% BSA)에 재현탁시킨 후 4oC 예비-냉각시킨 원심분리기에서 13000rpm으로 1분 원심분리하여 세포들을 세척하였다. 효모 펠릿을 1ml FACS 완충액에 재현탁시키고 FACS 완충액에 희석시킨 다양한 농도의 비오티닐화 프로류킨® (0nm / 0.02nM / 0.05nM / 0.15nM / 0.45nM / 1.3nM / 4nM / 12nM / 36nM / 100nM / 333nM / 1μM)을 함유하는 12개 시험관으로 50μl를 옮겼다. 효모를 실온 (RT)에서 1시간 동안 회전장치에서 배양시키고 상기 기재한 바와 같이 1ml FACS 완충액으로 2회 세척하고 펠릿들을 항-APP 마우스 단일클론 항체를 함유하는 200μl FACS 완충액에 재현탁시켰다. RT 회전장치에서 30분 배양 후, 효모를 1ml FACS 완충액으로 2회 세척하고 펠릿들을 200μl 표지 완충액 (알로피코시아닌 (APC)-접합된 스트렙타비딘 / 피코에리트린 (PE)-표지된 항-마우스 항체/FACS 완충액)에 재현탁시켰다. RT 회전장치에서 30분 배양 후, 세포들을 1ml FACS 완충액으로 2회 세척하고 500μl의 냉온 FACS 완충액에 재현탁시키고 FACS 관의 뚜껑을 통해 여과시켰다. 샘플들을 FACS 분석시까지 암실에 두었다. FACS 분석의 게이팅-전략은 PE 신호 (효모 표면에서의 Fab 발현 수준) 및 APC 신호 (비오티닐화 프로류킨®의 결합)가 단일 효모 세포들에 관하여 측정되도록 선택되었다 (단일선). 효모 표면에서 Fab에 대한 비오티닐화 프로류킨®의 결합은 FACS-도표에서 PE-신호 및 APC-신호 모두가 양성이었던 사례들로 시각화될 수 있다 (데이터 도시되지 않음). 예상한 바와 같이, 많은 양의 비오티닐화 프로류킨® (1μM-12nM)으로 효모 배양한 결과 PE 및 APC 모두에 대해 양상인 다수의 사례들이 탐지되었다. 이러한 농도 범위는 최적 농도 범위로 간주되었다. 4nM 및 1.3nM 비오티닐화 프로류킨®으로 효모를 배양한 결과 유사한 수준의 PE 신호 그리고 APC 신호의 현저한 하락이 나타났으며, 이는 효모 표면에서 Fab에 비오티닐화 프로류킨®이 더 적게 결합하였음을 나타내는 것이다. 이러한 농도 범위는 차선 농도로 간주되었다. 1.3nM 미만의 비오티닐화 프로류킨® 농도 (0.45nM / 0.15nM / 0.05nM / 0.02nM)로 배양된 효모는 배경 수준의 APC 신호를 보여주었는데, 이는 Fab에 비오티닐화 프로류킨®이 전혀 결합되지 않았음을 나타낸다.
다음 단계에서, VH (서열 번호: 49) 및 VK (서열 번호: 70)은 GeneMorph II 무작위 돌연변이유도 키트 (Agilent, 카탈로그 #200550)를 사용하여 오류-빈발 (error-prone) PCR에 의해 개별적으로 무작위 돌연변이유도되었다 (Cadwell R. 및 Joyce G. (1994). Mutagenic PCR. PCR Methods Appl., 3(6), pp. 136-40.). 이로부터, 모체 VK (VKp) (서열 번호: 70)와 쌍을 이룬 돌연변이유도된 VH (VHep)로 구성된 Fab들 또는 모체 VH (VHp) (서열 번호: 49)와 쌍을 이룬 돌연변이유도된 VK (VKep)로 구성된 Fab들을 발현시키는 2개의 효모 라이브러리들을 생성하였다 (Benatuil 등 2010). 첫번째 선택 주기에서, 상기 프로토콜을 사용하여 둘 모두의 효모 라이브러리들 (VHep/VKp 및 VHp/VKep) 뿐만 아니라 모체 (VHp/VKp) 발현 효모들을 유도하고 최적 농도 (10nM)의 비오티닐화 프로류킨®으로 FACS를 염색하였다 (1E+9 VHep/VKp 및 VHp/VKep: 1E+7 VHp/VKp). PE 및 APC 모두에 양성인 최소한 80 000개의 효모 세포들이 우라실을 뺀 1ml CM 글루코오스 배지를 내포하는 15ml Falcon 시험관에 FACS 분류되었다. 이러한 선택은 효모 표면에서 기능적 Fab를 발현시키는 효모가 풍부해지게 한다.
첫번째 주기에서 FACS 분류된 효모의 증폭 후, 두번째 주기의 선택이 이루어졌다. VHp/VKp, VHep/VKp 및 VHp/VKep를 발현시키는 효모 (1E+7)를 비오티닐화 프로류킨® 없이, 10nM 비오티닐화 프로류킨® (최적 농도) 또는 2nM 비오티닐화 프로류킨® (차선 농도)과 함께 배양하였으며 및 FACS는 상기와 같이 염색되었다. 상기 관찰된 바와 같이, 10nM 프로류킨®을 이용한 VHp/VKp 발현 효모를 배양한 결과 PE 및 APC 모두에 양성인 상당수의 사례들이 탐지되었다. VHp/VKep 라이브러리를 발현시키는 효모에 대하여 유사한 결과를 얻었다. 놀랍게도, 이 농도에서, APC 신호는 VHep/VKp 라이브러리에서 훨씬 더 강했던 반면 PE 신호는 VHp/VKp 및 VHp/VKep 발현 효모에서 관찰되는 신호에 필적할만 하였으며, 이는 더 많은 비오티닐화 프로류킨®이 효모 표면에서 발현된 Fab들에 결합하였음을 제시한다. 이러한 경향은 효모가 비오티닐화 프로류킨®의 차선 농도로 배양되었을 경우 더더욱 두드러졌다. 이러한 조건들하에서, VHp/VKp 및 VHp/VKep 발현 효모 모두는 PE 및 APC 모두에 양성이었던 사례들이 적게 나타냈던 반면 VHep/VKp를 발현시키는 효모는 유사한 수준의 PE 그러나 훨씬 더 높은 수준의 APC를 나타내었다. 이러한 발견에 기초하여, PE 및 APC 모두에 양성인, 2nM 비오티닐화 프로류킨®으로 배양된 VHep/VKp를 발현시키는 모든 효모 라이브러리들을 전술한 바에 따라 FACS 분류하였다. 10nM 비오티닐화 프로류킨®으로 배양된 VHp/VKep 발현 효모 라이브러리에 대해서도 동일하게 실시하였다.
2개의 라이브러리들의 증폭 후, 플라스미드들을 자이몰라제 (Zymoresearch, 카탈로그 #E1004)와 함께 효모-펠릿을 예비-배양한 후 미니-프렙 스핀 컬럼 (Qiagen, 카탈로그 #27106)을 사용하여 플라스미드를 회수함으로써 효모로부터 플라스미드들을 추출하였다. 회수된 플라스미드들을 세균에 전기천공하고 선택 플레이트에서 성장시켰다. 단일 콜로니들을 취하여 96-웰 플레이트에서 하룻밤동안 성장시킨 후 제조업체의 프로토콜에 따라 Nucleospin 96 플라스미드 Core 키트 (Macherey-Nagel, 카탈로그 #740616.24)를 사용하여 플라스미드를 단리하였다. 플라스미드들을 시퀀싱하고 분석하였다. VH 돌연변이들을 표 14에 요약한다.
관찰된 돌연변이들을 다양한 조합으로 (VH 서열 번호는 표 14 그리고 VK 서열 번호는 표 15) 모체 IgG1 포유동물 발현 벡터에 클로닝하였다 (표 16).
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
후속적으로, VH 및 VK의 야생형 또는 돌연변이 버전들을 인코딩하는 플라스미드에 관한 형질주입 매트릭스를 설계하고 표 17에 나타낸 바와 같은 35개의 독특한 항체들을 생성하였다. 이들 플라스미드들을 제조업체의 프로토콜에 따라 Fugene® HD (Promega, 카탈로그 #E2311)를 사용하여 6-웰 플레이트에서 성장시킨 HEK293F 세포들에 형질주입하였다. 상청액을 형질주입 3일 후에 수확하고 상청액 중의 항체 역가 (내부 처리 대조군, IPC)를 단백질A/HPLC를 사용하여 결정하였다 (Holenstein F. 등 (2015) Automated harvesting and 2-step purification of unclarified 포유동물 cell-culture broths containing antibodies. J Chromatogr A., 1418, pp. 103-9.).
Figure pct00017
Figure pct00018
상기 항체들의 서열들을 표 41에 제시하며, 하기 표 18에 요약한다.
Figure pct00019
Figure pct00020
후속적으로, 상청액 중에 존재하는 상기 항체들의 hIL-2 결합 효율을 ELISA를 사용하여 결정하였다. 요약하면, ELISA 플레이트 (Maxisorp 96-웰 블랙 마이크로타이터 플레이트)들을 4℃에서 하룻밤동안 100μL/웰의 프로류킨® (5μg/ml PBS)으로 코팅하였다. ELISA 플레이트들을 플레이트-세척장치 (BioTek)를 사용하여 TBST (1x TBS/0.05% Tween 20)로 1회 세척하였다. 플레이트들을 350μl/웰 차광 완충액 (TBS/1X 카세인 (Vector laboratories 10X 용액 #SP-5020), 0.22μm 여과)을 추가하여 차광시키고 부드럽게 교반하면서 RT에서 2시간 동안 배양하였다. 차광 완충액 제거 후, 플레이트들을 플레이트 세척장치를 사용하여 TBST로 1회 세척하였다. 상청액들을 차광 완충액에 1:2로 희석시키고 50μl를 지정된 ELISA 플레이트의 웰로 옮겼다. 각 샘플을 3개의 ELISA 플레이트에 제공하였다. 이 3개의 플레이트들을 부드러운 교반하에 RT에서 배양하였다. 2시간 배양 후 이 플레이트들 중 하나를 TBST로 3회 세척한 다음 100μl/웰의 탐지 항체 (TBST/양 다클론 HRP-접합된 항-인간 Fab2; Dianova/Jackson ImmunResearch, 카탈로그 #109-036-006)를 추가하였다. 다른 2개의 플레이트들을 4시간 동안 TBST로 매 시간 3회 세척하거나 12시간 동안 매시간 3회 세척한 후 탐지 항체를 추가하였다. 부드러운 교반하에 RT에서 1시간 배양 후, 웰들을 세척 완충액으로 3회 세척하였으며 플레이트들을 종이 타월의 스택 위에서 건조시킨 후 100μl/웰 BM ChemiLuminesence ELISA 기질 (POD)를 추가하였다 (Roche Diagnostics #11582950001). 암실에서 5분 배양 후 발광 신호를 측정하였다. 35개 항체들에 대한 ELISA 값들을 표 19에 나타낸다. 모든 ELISA 값들은 2개 측정값들에 기초한 평균 값들이다.
Figure pct00021
Figure pct00022
도입된 대부분의 돌연변이들 (예컨대 항체 번호: 8/11/12/13/15/16/20/28/30/31)은 모체 항체 (항체 번호: 1)에 비해 유사하거나 더 낮은 역가를 보였으나 결합 효율을 극적으로 개선시켰다. 12시간의 과다 세척 후에 조차도, 이들 돌연변이체들 중 일부는 여전히 높은 수준의 결합을 나타내었다 (예컨대 항체 번호: 12/13/15/20/28). 다양한 항체들을 정렬시키기 위하여, 상청액들을 연속 희석시키고 결합 친화력을 ELISA로 결정하였다.
EC50 값들을 해당 분야의 숙련된 기술자에게 널리 공지된 표준 방법들에 따라 단백질A/HPLC로 결정된 역가를 사용하여 계산하였다. 결과를 표 20에 요약한다.
Figure pct00023
Figure pct00024
결합 효율 및 돌연변이의 표현에 기초하여, 하나의 패널의 7개 항체들 (표 21)을 선택하고, 발현시키고 정제하여(Holenstein 등 2015) , 추가로 특성화시킨다.
Figure pct00025
선택된 항체들의 서열들을 표 41에 제시하며, 하기 표 22에 요약한다.
Figure pct00026
실시예 7: 결합 친화력
1. 효소-결합 면역흡착 분석법 (ELISA)
해당 분야의 숙련된 기술자에게 널리 공지되어 있는 ELISA를 사용하여 후보군들을 선별하였다.
ELISA 플레이트들 (Corning사)을 PBS 중 10 μg/mL의 인간 IL-2 (프로류킨®)로 4℃에서 하룻밤 동안 코팅하였다. 플레이트들을 PBST로 6회 세척한 다음, 1% BSA/PBST에서 2시간 동안 차광시켰다. 차광 및 세척 후, 항-인간 IL-2 항체들을 1% BSA/PBST에서의 11-점 연속 희석으로 플레이트에 추가하였으며 2시간 동안 교반하였다. 플레이트들을 다시 세척하고, 1%BSA/PBST에서 1:10'000 희석시킨 탐지 항체들, 항-마우스 IgG-비오티닐화 (NARA1) 또는 항-인간 IgG-비오티닐화 (인간화 항체) 항체와 2시간 동안 배양시켰다. 이후 이들 플레이트들을 다시 세척하고 1% BSA/PBS에서 45분 동안 스트렙타비딘-홀스래디쉬 퍼옥시다제와 함께 배양하였다. 세척 후, 기질 (R&D 시스템들)을 플레이트들에 추가하고 3분 후 정지 용액 을 추가하여 효소 반응을 중단시켰다. 이들 플레이트들을 파장 보정을 540nm로 설정한 마이크로플레이트 판독기로 450nm에서 판독하였다.
전 과정을 실온에서 실시하였다.
3회의 독립적 ELISA 실험들의 평균을 표 23에 나타낸다.
2. 용액 평형 역가측정 (SET) 분석
해당 분야의 숙련된 기술자들에게 널리 공지되어 있는 SET 분석을 수행하여 IL-2 단백질에 대한 5가지 인간화 항-IL-2 항체들과 항-IL-2 (NARA1)-마우스 IgG2a의 친화력 (KD)을 결정하고 비교하였다.
용액 평형 역가측정 (SET) 분석으로 단단한 결합제들(tight binders)에 대한 항체-항원 상호작용 친화력(KD)을 결정할 수 있다. 이러한 기법은 상호작용 파트너의 고정 또는 표지를 필요로하지 않으며 강한 상호작용 (KD = pM 내지 저 nM 범위)에 적합하다.
일정한 농도의 항체 혼합물들을 (예상 KD 이하의 농도) 적합한 농도 범위 (상기 KD의 훨씬 이하 및 훨씬 이상)의 항원과 함께 평형에 도달할때까지 공동-배양한다. 항원-코팅된 플레이트들에 상기 혼합물을 옮기고 간단히 배양하여 자유 항체 결합 부위들의 양을 결정한다. 자유 항체는 결과적으로 플레이트에 결합하고 탐지 항체에 의해 탐지된다. 생성된 신호를 항원 농도에 대해 플롯한다. 비-선형 곡선 적합하여 KD를 정확하게 결정한다.
(1) 재료 및 방법
다음 항체들을 사용하였다:
● 항-IL-2 (NARA1)-mIgG2a: 8.7 mg/ml, 150 kDa, 58.00 μM
● 항-IL-2-hsIgG1 104340 (키메라 NARA1 항체): 4.25 mg/ml, 150 kDa, 28.33 μM
● 항-IL-2-hsIgG1 104343: 3.69 mg/ml, 150 kDa, 24.60 μM
● 항-IL-2-hsIgG1 104347: 4.03 mg/ml, 150 kDa, 26.87 μM
● 항-IL-2-hsIgG1 104348: 2.71 mg/ml, 150 kDa, 18.07 μM
● 항-IL-2-hsIgG1 104349: 3.29 mg/ml, 150 kDa, 21.93 μM
항원
● IL-2 (프로류킨®): 1.00 mg/ml, 15.33 kDa, 65.24 μM
● IL-2 (WT): 0.15 mg/ml, 15.55 kDa, 9.65 μM
탐지 항체들
● MSD 설포-태그-표지된 염소 항-인간 항체, Meso Scale Discovery, 카탈로그#R32AJ-5
● MSD 설포-태그-표지된 염소 항-마우스 항체, Jackson IR, 카탈로그#115-005-071
기구 및 소프트웨어
● Discovery Workbench 소프트웨어로 제어되는 MSD SECTOR Imager 6000
● MS Excel 추가 기능 소프트웨어인 XLfit로 데이터 처리
분석 플레이트
● SECTOR Imager 6000용 표준 384-웰 플레이트, Meso Scale Discovery 카탈로그#L21XA
● 폴리프로필렌 384-웰 플레이트, Greiner 카탈로그#781280
시약
● 소 혈청 알부민 (BSA), VWR 카탈로그#422351S
● 인산염 완충 식염수 (PBS) 10x, Teknova 카탈로그#P0195
● MSD 판독 완충액 T 4x, Meso Scale Discovery 카탈로그#R92TC-1
● 트리스-완충 식염수 (TBS) 20x, Teknova 카탈로그#T1680
● 트윈-20, VWR 카탈로그#437082Q
완충액
● 차광 완충액: 1x PBS + 5% (w/v) BSA
● 코팅 완충액: 1x PBS
● 샘플 완충액: 1x PBS + 0.5% (w/v) BSA + 0.02% (v/v) 트윈-20
● 세척 완충액: 1x TBS + 0.05% (v/v) 트윈-20
● 판독 완충액: 1x MSD 판독 완충액
샘플 완충액에서 22회 연속 2n 희석시킨 항원을 제조하였다. 일정 농도의 항체를 추가하였다. 항원과 항체 농도를 하기 열거한다. 각 항원:항체 혼합물 60 μl 부피를 384-웰 폴리프로필렌 미세적정 플레이트 (PP MTP)에 2개씩 분산시켰다. 샘플 완충액을 음성 대조군으로 사용하였으며 항원을 함유하지 않은 샘플을 양성 대조군으로 사용하였다 (B최대). 플레이트를 밀봉시키고 실온 (RT)에서 하룻밤동안 (o/n) 배양하였다.
384-웰의 표준 MSD 분석 플레이트를 2 μg/ml의 IL-2로 o/n 코팅하였다. 세척 완충액으로 3회 세척 후, 플레이트를 RT에서 1 시간 동안 차광 완충액 50 μl/웰로 차광시켰다. 세척 후, 항원:항체 혼합물 30 μl/웰 부피를 PP MTP로부터 코팅된 MSD 플레이트로 옮기고 RT에서 20분 동안 배양하였다.추가 세척 단계 후, 샘플 완충액에서의 30 μl의 탐지 항체 (1:2000로 희석)를 각 웰에 추가하고 RT에서 30분 동안 배양하였다. MSD 플레이트를 세척하고 35 μl/웰의 판독 완충액을 추가하고 5분 동안 배양하였다. ECL 신호를 MSD SECTOR Imager 6000로 측정하였다.
(2) 결과
SET 결과를 표 23에 나타낸다. 테스트한 모든 항-IL-2 항체들은 IL-2 단백질에 대하여 저 pM 범위의 유사한 친화력을 보여주었다 (IL-2 wt 나타내지 않음).
Figure pct00027
표 23에서 볼 수 있는 바와 같이, 대부분의 인간화 항체들은 인간 IL-2에 대해 NARA1과 유사한 결합 친화력을 가진다. 그러나, 놀랍게도, 일부 인간화 항체들은 더 낮은 결합 친화력을 가지는데, 104347의 경우가 그러하다.
실시예 8: IL-2/항-IL-2 mAb 복합체의 시험관내 평가
PBMC 유도-CD8 T 세포 증식 분석으로 인간화 항-IL-2 항체들의 활성을 NARA1과 비교하였다.
5% 인간 혈청을 보충한 완전 RPMI 배지에 버피-코트의 Ficoll를 100000 세포들/웰로 도말한 후 음성 자기 분리 (negative magnetic separation)하여 인간 CD8 T 세포들을 단리하였다. 세포들을 37℃에서 48시간 동안 항-IL-2 항체 단독 (0.5μg/ml)으로 또는 IL-2 (프로류킨®; 0.1μg/ml)과 항-IL-2 항체들 (0.5μg/ml)을 2:1 몰비로 섞은 것으로 자극하였다. 세포들을 3H-티미딘으로 마지막 16시간 동안 펄스하고, 수확하였으며, β-계수기로 증식을 측정하였다. 실험을 3번 실시하였으며 항체 단독의 수는 비자극 세포들의 배경 신호 수준과 동일하였다.
Figure pct00028
표 24에서 보는 바와 같이, 대부분의 인간화 항체는 시험관내 인간 CD8 T 세포 증식의 유도에 관하여 NARA1와 유사한 능력을 가진다.
대체 방법에서, 인간 PBMC 유도-CD8 T 및 NK 세포들에서 7-일 증식 분석하여 일부 인간화 항-IL-2 항체들의 활성을 평가하였다.
Ficoll 밀도 기울기 원심분리에 의하여 버피 코트로부터 정제된 인간 PBMC들을 자기 비드 음전하 선택을 거치게 하여 CD8+ T 및 NK 세포들을 단리하였다. 세포들을 CellTrace Violet 증식 키트로 표지하고 10% 우태 (fetal calf) 혈청으로 보충한 RPMI 1640 배지에서 96 U-바닥 플레이트에 50000 세포들/웰로 도말하였다. 그 후 세포들을 hIL-2 또는 hIL-2/항-IL-2 mAb 복합체 (2:1 몰비, 10-배 연속 희석)로 자극하고 7일 동안 37℃에서 배양하였다. FACS로 측정되는 CellTrace Violet에 의해 증식을 평가하였다. 실험을 3번 실시하였으며 평균 EC50 값들을 2회의 독립 실험결과로부터 계산하였다.
Figure pct00029
실시예 9: IL-2/항-IL-2 mAb 복합체의 생체내 평가
하기 설명하는 바와 같이 IL-2/항-IL-2 mAb 복합체를 투여받은 WT C57BL/6 마우스에서 CD8+ T 세포들, CD4+ T 세포들, 및 NK 세포들의 수를 결정하였다. 이와 동시에, 브로모데옥시우리딘 (BrdU)을 사용하여 CD8+ T 세포들 및 NK 세포들의 증식 수준을 평가하였다.
(1) 재료 및 방법
다음 항체들을 사용하였다: 104340 (키메라 NARA1 항체), 104343, 104347, 104348, 104349, 104341.프로류킨® IL-2가 사용되었다.
이 실험은 2번 수행되었다; 첫번째 실험에는 인간화 104341가 포함되지 않았다.
마우스들에게 1.5 mg (저용량; LD) 또는 20 mg (고용량; HD)의 hIL-2, 또는 hIL-2/단일클론 항체 (각각 1.5 mg 및 15 mg, , 1:1 몰비에 해당)를 4회 연속하여 주사하였다. 마지막 5-브로모-2'-데옥시우리딘 (BrdU) 주사일에 0.8 mg/ml의 식수를 24시간 동안 제공하였다. 다음 날, 마우스들을 희생시키고 비장과 림프절 (LNs)을 유세포측정법으로 분석하였다. 이렇게 하기 위하여, LNs과 비장의 단일 세포 현탁액들을 표준 프로토콜에 따라 제조하였으며 2*106개의 세포들을 유세포측정 분석을 위해 2% 우태 혈청 (FCS), 2 mM EDTA 및 형광색소-접합 항체들과 함께 PBS를 사용하여 염색하였다 (하기 참조).
2가지 상이한 염색이 실시되었다: 첫번째 염색은 CD4+ CD25+ 포크헤드 박스 P3 (FoxP3)+ T 조절 세포들을 식별하고 정량하기 위하여 수행되었다. 이를 위하여, FoxP3 염색 완충액을 사용하고 제조업체의 권장사항 (eBiosciences, 00-5523-00)에 따라, 그리고 다음과 같은 표지자들에 대한 형광색소-접합 항체들을 사용하여 단일 세포 현탁액들을 염색하였다: CD25, CD8a, CD4, CD3, FoxP3.
두 번째 염색은 특정 세포 아형들의 세포 증식을 식별 및 정량하기 위하여 수행되었으며, 이 때 증식된 세포들을 염색하기 위하여 형광색소-접합 항-BrdU 항체가 사용되었다. FITC BrdU 키트를 사용하고 제조업체의 권장사항에 따라 (BD Pharmingen, 51-2354 AK) 그리고 형광색소-접합 항체들 to the 다음과 같은 표지자들에 대한 형광색소-접합 항체들을 사용하여 BrdU 염색을 수행하였다: CD44, CD8a, CD4, NK1.1, CD3, CD122, Brdu.
해당 분야의 숙련된 기술자에게 널리 공지되어 있는 Becton Dickinson LSR Fortessa 유세포측정기를 사용하여 데이터를 수집하였다.
(2) 결과
세포 수 데이터에 관한 결과를 표 26 및 표 27에 나타낸다.
Figure pct00030
Figure pct00031
표 26 및 표 27에서 볼 수 있는 바와 같이, IL-2와 복합체를 형성한 항체들 104343, 104347, 104348, 104349 및 104341은 CD8 및 NK 세포들을 생체내 자극할 수 있다.
또한, 도 6은 마우스의 비장에서 얻은 면역 세포들의 수를 보여준다. 플롯된 값들을 표 23 및 표 24에 나타낸다. 도 7은 마우스 비장에서의 CD8+CD44+CD122+ T 세포들에 관한 대표적인 BrdU 프로파일을 보여준다. 도 8은 마우스 비장에서의 CD3-NK1.1+ NK 세포들에 관한 대표적인 BrdU 프로파일을 보여준다.
이러한 결과로부터, 우리는 IL-2와 조합된 키메라 NARA1 항체 104340과 같이 인간화 항체 104343, 104348, 104349 및 104341이 CD8+ T 세포들 및 NK 세포들을 우선적으로 자극할 수 있다는 결론을 내릴 수 있다. 이는 인간화 104347 항체에 대하여는 그렇지 않다.
실시예 10: 링커를 사용한 IL-2/항-IL-2 mAb 융합 단백질의 생성
실시예 2의 결정 구조 NARA1/hIL-2 결과들을 사용하여, NARA1 중쇄 및 경쇄 N-말단 영역들을 hIL-2에 연결시키는 방법들을 확인하였다.
PyMOL 또는 MOE와 같은 모형화 소프트웨어를 사용하여 복합체의 구조를 분석하였으며, 항체의 항원-결합 부위의 반대쪽에 존재하고, 그리하여 연결에 링커들이 필요함이 관찰되었다. 생성된 융합 단백질은 IL-2, 이어서 링커 영역, 이어서 항체 중쇄 영역으로 구성된다. 링커 영역은 적어도 60 옹스트롬 (Å)의 거리에 걸쳐야 하므로, 최적 연결을 위해 상이한 링커의 길이 그리고 또한 조성을 설계하여 테스트 할 수 있다.
이러한 융합 분자는 또한 IL-2, 이어서 링커, 이어서 항체의 경쇄가 오는 분자일 수도 있다. 이러한 융합 유형에서, 링커 영역은 최소한 50 옹스트롬 (Å)의 거리에 걸쳐야 하므로, 최적 후보군을 찾기 위하여 몇 가지 링커의 길이와 조성을 설계하여 테스트할 수도 있다.
항체 중쇄 또는 경쇄 서열은 서열 번호: 93으로 제시되는 인간 IgG1 Fc 도메인 및 표 10에 보고된 가변 도메인들을 사용하여 생성되어 있는 임의의 항체들이 될 수 있다.
IL-2 서열은 서열 번호: 109로 제시되는 wt IL-2 또는 서열 번호: 110으로 제시되는 알데스류킨일 수 있다.
IL-2의 C-말단 단부와 항체 중쇄 또는 경쇄들의 N-말단 잔기를 연결하기 위해 사용될 수 있는 링커 서열들이 표 28에 기록되어 있다.
Figure pct00032
표 29에 따라 2개의 특이적 융합 단백질들이 생성되었다.
Figure pct00033
실시예 11: IL-2/항-IL-2 mAb 융합 단백질의 생성
NARA1 항체의 중쇄 또는 경쇄로의 IL-2 포매를 유도하기 위하여 복합체 NARA1/hIL-2의 구조가 사용되었다. 항체의 LCDR1 및 잔기 K96과 N97 사이의 hIL-2 나선 B와 나선 C를 연결하는 영역은 추가 조작을 위해 사용될 영역들로 식별될 수 있다. LCDR1은 Kabat 정의에 따른 넘버링으로 Y27d와 D28 사이 그리고 G29와 D30 사이가 개방되었다. hIL-2는 K96과 N97 사이가 개방되었다. 도 9를 참고하라.
항체의 LCDR1의 잔기들 D28G29을 G들로 치환하였다. hIL-2 새로운 N-말단 단부 N97은 GGG 링커에 의해 LCDR1의 새로운 C-말단 단부 Y27d에 연결된다. hIL-2 C-말단 단부 K96은 GGGG 링커에 의해 LCDR1 N-말단 D30에 연결된다. 도 10을 참고하라. hIL-2의 원래 2개의 N- 및 C-말단 단부들은 함께 연결된다, 즉, IL-2-T153 C-말단 잔기는 IL-2 N-말단 잔기 P22에 직접 융합된다. 도 11은 IL-2와 항체 VL 서열들이 어떻게 함께 융합되어 있는지에 관한 도식적 개요이다.
생성된 융합 단백질은 107351로 표기된다.
이러한 조작 절차를 사용하여 hIL-2를 NARA1 항체의 경쇄에 완전히 포매시킬 수 있었다. 이러한 포매는 표 10에 기록되어 있는 임의의 인간화 서열들을 사용하여 이루어질 수 있다. hIL-2를 경쇄에 포매시키기 위해 사용되는 링커의 서열 및 길이는 1 내지 10개의 글리신 (G)의 반복일 수 있으며, LCDR1 Y27d와 hIL-2 N97, LCDR1 D30과 hIL-2 K96이 이들 사이에 임의의 링커 서열 없이 직접 연결되어 있는 융합 또한 테스트할 수 있다. hIL-2의 넘버링은 서열 번호: 109에 제시된 전장 서열을 지칭한다. 서열 번호: 110으로 나타내어지는, 알데스류킨에서의 대응 잔기들 또한 포매 절차를 위해 사용될 수 있다.
실시예 12: IL-2/항-IL-2 mAb 융합 단백질의 활성
인간 PBMC 유래-CD8 T 및 NK 세포들에서 7-일 증식 분석하여 일부 IL-2/항-IL-2 mAb 융합 단백질들의 활성을 평가하였다.
Ficoll 밀도 기울기 원심분리에 의하여 버피 코트로부터 정제된 인간 PBMC들을 자기 비드 음전하 선택을 거치게 하여 CD8+ T 및 NK 세포들을 단리하였다. 세포들을 CellTrace Violet 증식 키트로 표지하고 10% 우태 (fetal calf) 혈청으로 보충한 RPMI 1640 배지에서 96 U-바닥 플레이트에 50000 세포들/웰로 도말하였다. 그 후 세포들을 hIL-2 또는 hIL-2/항-IL-2 mAb 복합체 (2:1 몰비, 10-배 연속 희석)로 자극하고 7일 동안 37℃에서 배양하였다. FACS로 측정되는 CellTrace Violet에 의해 증식을 평가하였다. 실험을 3번 실시하고 평균 EC50 값들을 3번의 독립 실험결과로부터 계산하여 표 30에 나타낸다.
Figure pct00034
25 또는 35개 잔기들의 링커 서열들을 사용한 IL-2/항-IL-2 mAb 융합 단백질들은 각각 NK 세포 증식 및 CD8 T 세포 증식에 대해 활성이 없는 것으로 제한되었다. 대조적으로, 인간화 NARA1 항체의 경쇄에 이식된 IL-2/항-IL-2 mAb 융합 단백질은 CD8 T 세포 증식을 활성화함에 있어 IL-2 단독만큼 효능이 있으며 NK 세포 증식을 자극함에 있어 IL-2 보다 더 효능이 있다.
이러한 후자의 융합 단백질을 후속하여 생체내 평가하였다. 마우스에게 107351 (360 μg/kg, 720 μg/kg 또는 1440 μg/kg) 또는 PBS를 1회 단회 투약하였으며 주사 96h 후에 희생시켰다. 표준 프로토콜에 따라 유세포 측정법으로 비장세포들을 분석하고, 그 결과는 표 31에 요약되어 있다.
Figure pct00035
융합 단백질 107351은 생체내에서 용량-의존 방식으로 조절 T 세포들의 활성화는 매우 제한시키면서 CD8+ 및 NK 세포들의 강력한 증폭을 유도할 수 있다.
실시예 13: 생체내 IL-2/항-IL-2 mAb 복합체 (인간화 및 친화력-성숙 인간화 항-hIL-2 항체들)의 평가
생체내 IL-2/항-IL-2 mAb 복합체의 효과를 평가하기 위하여 2가지 실험 방법을 실시하였다. 첫번째 실험에서, 하기 설명된 바와 같이 IL-2/항-IL-2 mAb 복합체를 2회 주사한 WT C57BL/6 마우스에서 CD8+ T 세포들, CD4+ T 세포들, 및 NK 세포들의 수를 결정하였다. 두번째 실험에서, IL-2/항-IL-2 mAb 복합체들을 1회 주사 후 BrdU를 사용하여 CD8+ T 세포들, CD4+ T 세포들 및 NK 세포들의 증식 수준을 평가하였다.
(1) 재료 및 방법
다음 항체들을 사용하였다: NARA1, 104348, 106260, 108923,108924, 108925, 108926, 108929, 및 108930.
프로류킨® IL-2가 사용되었다.
첫번째 실험에서 1.5 mg의 hIL-2 및 hIL-2/단일클론 항체 (15 mg, 1:1 몰비에 해당)를 1일차 및 3일차에 마우스에게 2회 주사하였다. 5일차에 마우스를 희생시키고 비장과 림프절 (LNs)을 유세포측정법으로 분석하였다. 이렇게 하기 위하여, LNs과 비장의 단일 세포 현탁액들을 표준 프로토콜에 따라 제조하였으며 2-3*106 개의 세포들을 유세포측정 분석을 위해 2% 우태 혈청 (FCS), 2 mM EDTA 및 형광색소-접합 항체들과 함께 PBS를 사용하여 염색하였다 . CD4+ CD25+ 포크헤드 박스 P3 (FoxP3)+ T 조절 세포들 (T조절)을 식별하고 정량하기 위하여 염색을 수행하였다. 이를 위하여, FoxP3 염색 완충액을 사용하고 제조업체의 권장사항 (eBiosciences, 00-5523-00)에 따라, 그리고 다음과 같은 표지자들에 대한 형광색소-접합 항체들을 사용하여 단일 세포 현탁액들을 염색하였다: CD25, CD8a, CD44, CD122, NK1.1, DX5, CD4, CD3, FoxP3.
두번째 실험에서 1.5 mg의 hIL-2 및 hIL-2/단일클론 항체 (15 mg, 1:1 몰비에 해당)를 마우스에게 1회 주사하였다. 이와 동시에, BrdU가 0.8 mg/ml의 식수에 제공되었다. 다음 날 (주사 및 BrdU 제공 24시간 후), 특정 세포 면역 아형들의 세포 증식을 식별 및 정량하기 위하여 염색을 수행하였으며, 이 때 증식된 세포들을 염색하기 위하여 형광색소-접합 항-BrdU 항체가 사용되었다. FITC BrdU 키트를 사용하고 제조업체의 권장사항에 따라 (BD Pharmingen, 51-2354 AK) 그리고 다음과 같은 표지자들에 대한 형광색소-접합 항체들을 사용하여 BrdU 염색을 수행하였다: CD44, CD8a, CD4, NK1.1, CD3, CD122, Brdu, CD4.
해당 분야의 숙련된 기술자에게 널리 공지되어 있는 Becton Dickinson LSR Fortessa 유세포측정기를 사용하여 데이터를 수집하였다.
(2) 결과
세포 수 데이터에 관한 결과를 표 32 및 표 33에 나타낸다.
Figure pct00036
Figure pct00037
Figure pct00038
표 32, 표 33, 및 표 34에서 볼 수 있는 바와 같이, IL-2와 복합체를 형성한 항체들 104348, 106260, 108923, 108924, 108925, 108926, 108929 및 108930은 생체내에서 CD8+ T 세포들 및 NK 세포들을 우선적으로 자극할 수 있다.
또한, 도 12-15는 내인성 CD8+, CD8+ CD44+ CD122+, CD4+ T 세포들, T조절 세포들 및 NK 세포들의 표현형 특성을 보여준다. 도 16-17은 마우스의 비장에서 얻은 면역 세포 아형들의 수를 보여주며; 플롯된 값들을 표 32 , 표 33, 및 표 34에 나타낸다. 도 18-22는 마우스의 비장에서 CD8+, CD8+ CD44+ CD122+ T 세포들, CD3- NK1.1+ DX5+ NK 세포들, CD4+ 및 CD4+ CD25+ T 세포들의 대표적인 BrdU 프로파일을 보여준다. 보는 바와 같이, IL-2와 복합체를 형성한 인간화 항체 104348, 106260 및 친화력 성숙 인간화 항체 108923, 108924, 108925, 108926, 108929 및 108930은 생체내에서 CD4+ 및 CD4+ CD25+ T 세포들에 비해 CD8+ T 세포들 (특히 CD8+ CD44+ CD122+ T 세포들) 및 NK 세포들의 증식 수준을 개선시킨다.
이러한 결과로부터 우리는 모체 NARA1 항체 (105192)와 유사한 인간화 항체 104348, 106260, 및 친화력 성숙 인간화 항체 108923, 108924, 108925, 108926, 108929 및 108930이, hIL-2 (프로류킨®)과 혼합될 때, CD8+ T 세포들 및 NK 세포들을 우선적으로 자극할 수 있다는 결론을 내릴 수 있다.
실시예 14: NARA1-기반 융합 단백질들의 발현 플라스미드 생성
인간 IL-2 (pORF-hIL-2 플라스미드, Invivogen, porf-hIL-2) 및 NARA1의 경쇄를 코딩하는 DNA 서열들을 절단하고 붙여서 서브클로닝하고 표준 클로닝 기법들 (phusion 중합효소, Finnzymes, F-530S을 사용한 PCR 증폭/어셈블리)을 사용하여 결찰시켜, 원하는 프라이머 및 링커들 (예컨대, 표 35, 표 36, 및 표 37에 나타낸 15, 20 또는 25개 아미노산 링커들)을 추가하였다. 생성된 PCR 생성물들을 절단하고 붙여서 포유동물 세포들에서의 분비에 적합한 발현 벡터에 삽입하였다 hIL-2에 융합된 NARA1의 중쇄 및 NARA1의 경쇄를 공동-형질주입이 가능하도록 개개의 발현 벡터들에 클로닝하였다. 발현 벡터 요소들은 프로모터 (사이토메갈로바이러스 (CMV) 인핸서-프로모터), 분비를 촉진시키는 신호 서열, 폴리아데닐화 신호 및 전사 종결인자 (소 성장 호르몬 (BGH) 유전자), 에피좀 복제 및 원핵생물에서의 복제를 가능하게 하는 요소 (예컨대 SV40 복제원점 및 ColE1 또는 해당 분야에 공지된 기타) 및 선택을 가능하게 하는 요소들 (암피실린 내성 유전자 및 제오신 표지자)을 포함한다.
Figure pct00039
실시예 15: NARA1-기반 융합 단백질들의 발현 및 정제
중국 햄스터 난소 (CHO) 세포들은 IgG 단백질의 일시적 발현에 선호되는 숙주 세포주들 중 하나이다. 형질주입은 형질주입 시약으로 PEI (폴리에틸렌이민, MW 25.000 선형, Polysciences, USA 카탈로그 번호 23966)를 사용하여 수행된다. 실온 (RT)의 900 ml 세포 배양 등급의 물에 1 g의 PEI를 조심스럽게 용해시켜 PEI 저장 용액을 제조한다. PEI의 용해를 촉진시키기 위하여, HCl를 추가하여 이 용액을 pH 3-5까지 산성화시킨 후, 최종 pH 7까지 NaOH로 중화시킨다. 마지마긍로, 부피를 1L로 조절하고 이 용액을 0.22 μm 필터를 통해 여과시키고, 분취하고 추가 사용시까지 -80℃에서 동결시킨다. 보충제로서 나트륨 하이포잔틴 및 티미딘 (HT, 41065012, Invitrogen), L-글루타민 (17-605C, Lonza) 및 항생-항진균제 (15240062, ThermoFisher)를 보충한 Power CHO-2D 배지 및 ProCHO-4 배지 (각각 번식 및 형질주입을 위한 무-혈청 배양 배지들, 12-770Q 및 12-029Q Lonza)를 사용하여 CHO 세포들을 배양한다. 일시적 형질주입을 위해 제조된 세포들은 150rpm의 진탕기에서 현탁 배양으로 배양된다. 종균 배양물들의 세포들은 지수 증식상 (1.5x105 내지 3x106/mL의 세포 밀도)을 유지하여야 하며 >98% 형질주입을 위해 >98%의 생존력을 나타내야 한다. 이러한 범위 밖의 세포 밀도는 희석 후 지연 상 또는 감소된 형질주입 효율을 가져온다. 형질주입을 위하여 세포들의 분취액을 종균 배양물에서 꺼내어 Power CHO-4 무-혈청 배양 배지 최종 부피의 50%에서 2x106 개 세포들/mL로 조절한다. 150 mM NaCL 용액에 상기 DNA를 희석시켜 DNA 용액 (100 ml 눈금으로 총 DNA = 125 ug, IL-2에 융합되는 중쇄 및 경쇄(들)을 1:1 몰비로 조절)을 준비한다. 그 후 PEI 용액 (100 ml 눈금으로 0.5ml)을 상기 DNA 용액에 추가한다. 혼합물을 소용돌이치게 혼합하고 (vortexing) 실온에서 10-12분 동안 배양한다. 그 후 형질주입 혼합물을 상기 세포들에 추가하고 세포들의 배양을 3 내지 4시간 동안 지속한다. 마지막으로, Power CHO-2D 무-혈청 배양 배지를 추가하여 총 생산 부피의 50%가 남게 된다. 형질주입 후 세포 배양을 4 내지 6일 동안 지속한다. 배양물을 4℃에서 45분간 4700 rpm에서 원심분리하여 수확한다 (Heraeus ®, Multifuge 3 S-R, Thermo Scientific, Rockford, IL). 회수된 세포 상청액을 스테리컵 필터 (0.22 μm)를 통해 멸균 여과시키고 추가 처리시까지 2.5 mM ETDA 및 소듐 아지드 (0.01%)를 이용하여 4℃에서 보관한다.
단백질 G 아가로오스 (20397, Thermo Scientific)를 사용하여 4℃에서 정제를 실시하였다. 그리하여, 표 36에 강조되어 있는 바와 같이, 15, 20 또는 25개 아미노산 길이의 글리신-세린 링커들에 의해 IL-2의 C 말단이 NARA1의 경쇄의 N-말단에 융합되어 있는 3가지 융합 단백질들을 생성하였다. NARA1의 중쇄는 동일하에 유지된다 (서열 번호: 115).
Figure pct00040
Figure pct00041
실시예 16: 생체내 NARA1-기반 융합 단백질들의 평가
하기 설명하는 바와 같이, L15, L20, L25, 또는 IL-2/NARA1을 투여받은 WT C57BL/6 마우스에서 CD8+ T 세포들, CD4+ T 세포들, 및 NK 세포들의 백분율 및 세포수를 결정하였다. 이와 동시에, 브로모데옥시우리딘 (BrdU)을 사용하여 CD8+ T 세포들 및 NK 세포들의 증식 수준을 평가하였다.
(1) 재료 및 방법
다음 항체들 및 융합 단백질들이 사용되었다: NARA1, L15, L20 및 L25.
재조합 인간 IL-2 (테세류킨 ®)가 사용되었다.
마우스에게 hIL-2/단일클론 항체 (NARA1, 10 mg, 2:1 몰비에 해당), L15, L20, L25 (활성면에서 상응하는 IL-2 양) 또는 PBS와 함께 2 mg (20'000 IU)의 hIL-2를 3회 연속 주사하였다. 마지막 BrdU 주사일에 0.8 mg/ml의 식수를 24시간 동안 제공하였다. 다음 날, 마우스들을 희생시키고 비장과 림프절 (LNs)을 유세포측정법으로 분석하였다. 이렇게 하기 위하여, LNs과 비장의 단일 세포 현탁액들을 표준 프로토콜에 따라 제조하였으며 2*106개의 세포들을 유세포측정 분석을 위해 2% 우태 혈청 (FCS), 2 mM EDTA 및 형광색소-접합 항체들과 함께 PBS를 사용하여 염색하였다 (하기 참조).
2가지 상이한 염색이 실시되었다: 첫번째 염색은 CD4+ CD25+ 포크헤드 박스 P3 (FoxP3)+ T 조절 세포들을 식별하고 정량하기 위하여 수행되었다. 이를 위하여, FoxP3 염색 완충액을 사용하고 제조업체의 권장사항 (eBiosciences, 00-5523-00)에 따라, 그리고 다음과 같은 표지자들에 대한 형광색소-접합 항체들을 사용하여 단일 세포 현탁액들을 염색하였다: CD25, CD8a, CD4, CD3, FoxP3.
두 번째 염색은 특정 세포 아형들의 세포 증식을 식별 및 정량하기 위하여 수행되었으며, 이 때 증식된 세포들을 염색하기 위하여 형광색소-접합 항-BrdU 항체가 사용되었다. FITC BrdU 키트를 사용하고 제조업체의 권장사항에 따라 (BD Pharmingen, 51-2354 AK) 그리고 형광색소-접합 항체들 to the 다음과 같은 표지자들에 대한 형광색소-접합 항체들을 사용하여 BrdU 염색을 수행하였다: CD44, CD8a, CD4, NK1.1, CD3, CD122, Brdu.
해당 분야의 숙련된 기술자에게 널리 공지되어 있는 Becton Dickinson LSR Fortessa 유세포측정기를 사용하여 데이터를 수집하였다.
(2) 결과
세포 수 데이터 결과를 표 38에 나타낸다.
Figure pct00042
표 38에서 볼 수 있는 바와 같이, 융합 단백질 L15, L20 및 L25는 생체내에서 CD8+ T 세포들 및 NK 세포들을 자극할 수 있다.
또한, 도 23은 내인성 CD8+ T 세포들 및 NK 세포들의 표현형 특성을 보여준다. 도 24는 마우스의 비장에서 얻은 면역 세포들의 수를 보여주며, 플롯된 값들을 표 38에 나타낸다. 도 25는 마우스의 비장에서 CD8+ CD44+ CD122+ T 세포들 및 CD3- NK1.1+ NK 세포들의 대표적인 BrdU 프로파일을 보여준다.
이러한 결과로부터, 우리는 인간 IL-2와 조합된 NARA1-기반 융합 단백질들이 모체 NARA1 항체와 유사하게 CD8+ T 세포들 및 NK 세포들을 우선적으로 자극할 수 있다는 결론을 내릴 수 있다.
실시예 17: 시험관내 NARA1-기반 융합 단백질들의 평가
인간 IL-2에 반응하는 CTLL-2 쥐과 세포주를 사용하는 세포 증식 분석에서 NARA1-기반 융합 단백질들의 활성을 NARA1 및 IL-2 단독과 비교하였다.
CTLL-2 세포들을 96-웰 플레이트들 (10000 세포들/웰)에 파종하고 hIL-2, 또는 hIL-2/NARA1 복합체 (2:1 몰비), L15, L20 또는 L25 (상응하는 IL-2 양)를 사용하여 자극하고, 37℃에서 48시간 배양 후 증식을 평가하였다. WST-1 (Sigma-Aldrich)을 최하 4시간 동안 상기 세포들에 추가한 후, iMark 마이크로플레이트 판독기에서 450 nm에서 판독하여 증식을 평가하였다.
실험을 2번 실시하였으며 표 39는 수득된 EC50 값들을 제공한다.
Figure pct00043
표 39에서 보는 바와 같이, NARA1-기반 융합 단백질들은 시험관내 CTLL-2 세포 증식을 유도하는 능력을 가지지만 그 능력은 hIL-2 및 hIL-2/NARA1에 비해 더 낮은 정도이다.
또한, 도 26은 수득된 증식 곡선들을 보여준다.
인간 IL-2에 반응하는 CTLL-2 쥐과 세포주를 사용하는 STAT5 인산화 (P-STAT5) 분석에서 NARA1-기반 융합 단백질들의 활성을 NARA1 및 IL-2 단독과 비교하였다. CTLL-2 (200000 세포들/웰)를 96-웰 플레이트에 파종하고 hIL-2 hIL-2/NARA1 복합체 (2:1 몰비), L15, L20 또는 L25 (상응하는 IL-2 양)을 사용하여 자극하였다. 15분 자극 후 STAT5의 인산화를 평가하고 pSTAT5-특이적 mAbs (BD Biosciences)에 의한 세포내 염색을 사용하여 탐지하였다.
실험을 2번 실시하였으며 표 40은 수득된 EC50 값들을 제공한다.
Figure pct00044
또한, 도 27은 수득된 인산화 수준을 제공한다. 관찰된 바와 같이, 높은 수준의 CD25를 발현시키는 세포들, 가령, CTLL-2 세포들에서 얻은 시험관내 효과는 세포들을 IL-2 또는 IL-2/NARA1로 자극할 때 보다 L15, L20 및 L25로 자극할 때 더 낮다. 이러한 차이는 단 시간에 더욱 두드러진다 (가령, P-STAT5에 있어서 15분 자극). 실제로, 최단 링커: L15로, IL-2는 보다 쉽게 NARA1으로 분해될 수 있으며 이는 단시간에 세포들의 자극을 가능하게 한다. 다른 한편, L20 및 L25 융합체에 있어서, IL-2는 NARA1에 결합된 상태로 더 오래 유지될 수 있어서 CTLL-2 세포들의 자극을 막는다.
서열 표
본 발명을 실시함에 유용한 아미노산 및 뉴클레오티드 서열들을 표 41에 나타낸다. 본 출원의 내용 전반에 걸쳐, 명세서의 내용 (예컨대, 표 41)과 서열 목록 간에 일치하지 않는 부분이 존재하는 경우, 명세서의 내용이 우선한다.
Figure pct00045
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SEQUENCE LISTING <110> NOVARTIS AG UNIVERSITAT ZURICH <120> IMMUNE-STIMULATING HUMANIZED MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST HUMAN INTERLEUKIN-2, AND FUSION PROTEINS THEREOF <130> PAT057199-WO-PCT <140> PCT/IB2017/050127 <141> 2017-01-11 <150> 62/277,113 <151> 2016-01-11 <160> 423 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 1 Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr Leu Ile Glu 1 5 10 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 2 Val Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 3 Trp Arg Gly Asp Gly Tyr Tyr Ala Tyr Phe Asp Val 1 5 10 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source 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of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 113 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp 20 25 30 Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 114 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 114 gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60 atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tatgatggtg atagttatat gaactggtac 120 caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatg ctgcatccaa tctagaatct 180 gggatcccag ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct 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Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 412 Gly Gly Gly Gly 1 <210> 413 <211> 1077 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 413 atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacaaacagt 60 gcacctactt caagttctac aaagaaaaca cagctacaac tggagcattt acttctggat 120 ttacagatga ttttgaatgg aattaataat tacaagaatc ccaaactcac caggatgctc 180 acatttaagt tttacatgcc caagaaggcc acagaactga aacatcttca gtgtctagaa 240 gaagaactca aacctctgga ggaagtgcta aatttagctc aaagcaaaaa ctttcactta 300 agacccaggg acttaatcag caatatcaac gtaatagttc tggaactaaa gggatctgaa 360 acaacattca tgtgtgaata tgctgatgag acagcaacca ttgtagaatt tctgaacaga 420 tggattacct tttgtcaaag catcatctca acactgactg gcgggggagg ttctggcggt 480 gggggatcgg gcggtggagg gagcgacatt gtgctgaccc aatctccagc ttctttggct 540 gtgtctctag ggcagagggc caccatctcc tgcaaggcca gccaaagtgt tgattatgat 600 ggtgatagtt atatgaactg gtaccaacag aaaccaggac agccacccaa actcctcatc 660 tatgctgcat ccaatctaga atctgggatc ccagccaggt ttagtggcag tgggtctggg 720 acagacttca ccctcaacat ccatcctgtg gaggaggagg atgctgcaac ctattactgt 780 cagcaaagta atgaggatcc gtacacgttc ggagggggga ccaagctgga aataaaacgg 840 gctgatgctg caccaactgt atccatcttc ccaccatcca gtgagcagtt aacatctgga 900 ggtgcctcag tcgtgtgctt cttgaacaac ttctacccca aagacatcaa tgtcaagtgg 960 aagattgatg gcagtgaacg acaaaatggc gtcctgaaca gttggactga tcaggacagc 1020 aaagacagca cctacagcat gagcagcacc ctcacgttga ccaaggacga gtatgaa 1077 <210> 414 <211> 1173 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 414 atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacaaacagt 60 gcacctactt caagttctac aaagaaaaca cagctacaac tggagcattt acttctggat 120 ttacagatga ttttgaatgg aattaataat tacaagaatc ccaaactcac caggatgctc 180 acatttaagt tttacatgcc caagaaggcc acagaactga aacatcttca gtgtctagaa 240 gaagaactca aacctctgga ggaagtgcta aatttagctc aaagcaaaaa ctttcactta 300 agacccaggg acttaatcag caatatcaac gtaatagttc tggaactaaa gggatctgaa 360 acaacattca tgtgtgaata tgctgatgag acagcaacca ttgtagaatt tctgaacaga 420 tggattacct tttgtcaaag catcatctca acactgactg gcggtggggg atcagggggc 480 ggaggttctg gaggtggcgg gtcgggggga ggtgggagcg acattgtgct gacccaatct 540 ccagcttctt tggctgtgtc tctagggcag agggccacca tctcctgcaa ggccagccaa 600 agtgttgatt atgatggtga tagttatatg aactggtacc aacagaaacc aggacagcca 660 cccaaactcc tcatctatgc tgcatccaat ctagaatctg ggatcccagc caggtttagt 720 ggcagtgggt ctgggacaga cttcaccctc aacatccatc ctgtggagga ggaggatgct 780 gcaacctatt actgtcagca aagtaatgag gatccgtaca cgttcggagg ggggaccaag 840 ctggaaataa aacgggctga tgctgcacca actgtatcca tcttcccacc atccagtgag 900 cagttaacat ctggaggtgc ctcagtcgtg tgcttcttga acaacttcta ccccaaagac 960 atcaatgtca agtggaagat tgatggcagt gaacgacaaa atggcgtcct gaacagttgg 1020 actgatcagg acagcaaaga cagcacctac agcatgagca gcaccctcac gttgaccaag 1080 gacgagtatg aacgacataa cagctatacc tgtgaggcca ctcacaagac atcaacttca 1140 cccattgtca agagcttcaa caggaatgag tgt 1173 <210> 415 <211> 1188 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 415 atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacaaacagt 60 gcacctactt caagttctac aaagaaaaca cagctacaac tggagcattt acttctggat 120 ttacagatga ttttgaatgg aattaataat tacaagaatc ccaaactcac caggatgctc 180 acatttaagt tttacatgcc caagaaggcc acagaactga aacatcttca gtgtctagaa 240 gaagaactca aacctctgga ggaagtgcta aatttagctc aaagcaaaaa ctttcactta 300 agacccaggg acttaatcag caatatcaac gtaatagttc tggaactaaa gggatctgaa 360 acaacattca tgtgtgaata tgctgatgag acagcaacca ttgtagaatt tctgaacaga 420 tggattacct tttgtcaaag catcatctca acactgactg gcggtggggg atcagggggc 480 ggaggttctg gaggtggcgg gtcgggggga ggtgggagcg gtggcggggg atcagacatt 540 gtgctgaccc aatctccagc ttctttggct gtgtctctag ggcagagggc caccatctcc 600 tgcaaggcca gccaaagtgt tgattatgat ggtgatagtt atatgaactg gtaccaacag 660 aaaccaggac agccacccaa actcctcatc tatgctgcat ccaatctaga atctgggatc 720 ccagccaggt ttagtggcag tgggtctggg acagacttca ccctcaacat ccatcctgtg 780 gaggaggagg atgctgcaac ctattactgt cagcaaagta atgaggatcc gtacacgttc 840 ggagggggga ccaagctgga aataaaacgg gctgatgctg caccaactgt atccatcttc 900 ccaccatcca gtgagcagtt aacatctgga ggtgcctcag tcgtgtgctt cttgaacaac 960 ttctacccca aagacatcaa tgtcaagtgg aagattgatg gcagtgaacg acaaaatggc 1020 gtcctgaaca gttggactga tcaggacagc aaagacagca cctacagcat gagcagcacc 1080 ctcacgttga ccaaggacga gtatgaacga cataacagct atacctgtga ggccactcac 1140 aagacatcaa cttcacccat tgtcaagagc ttcaacagga atgagtgt 1188 <210> 416 <211> 366 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 416 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala 145 150 155 160 Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser 165 170 175 Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 180 185 190 Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser 195 200 205 Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 210 215 220 Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys 225 230 235 240 Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 245 250 255 Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro 260 265 270 Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu 275 280 285 Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly 290 295 300 Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser 305 310 315 320 Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp 325 330 335 Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr 340 345 350 Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 355 360 365 <210> 417 <211> 371 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 417 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser 145 150 155 160 Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys 165 170 175 Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp 180 185 190 Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala 195 200 205 Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 210 215 220 Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala 225 230 235 240 Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly 245 250 255 Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val 260 265 270 Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser 275 280 285 Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys 290 295 300 Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp 305 310 315 320 Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu 325 330 335 Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu 340 345 350 Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg 355 360 365 Asn Glu Cys 370 <210> 418 <211> 376 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 418 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile 145 150 155 160 Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg 165 170 175 Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp 180 185 190 Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu 195 200 205 Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe 210 215 220 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His Pro Val 225 230 235 240 Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Glu Asp 245 250 255 Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp 260 265 270 Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr 275 280 285 Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys 290 295 300 Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly 305 310 315 320 Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser 325 330 335 Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn 340 345 350 Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val 355 360 365 Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 370 375 <210> 419 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 419 caggtgcagc tggtggagag cggcggcggc gtggtgcagc ccggccggag cctgcggctg 60 agctgcgccg ccagcggcta cgccttcacc aactacctga tcgagtgggt gcggcaggcc 120 cccggcaagg gcctggagtg ggtggccgtg atcaaccccg gcagcggcgg caccaactac 180 aacgagaagt tcaagggccg gttcaccatc agcgccgaca agagcaagag caccgcctac 240 ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc ccggtggcgg 300 ggcgagggct actacgccta cttcgacgtg tggggccagg gcaccaccgt gaccgtgagc 360 agc 363 <210> 420 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 420 Ser Gln Ser Val Ser Tyr Asp Ala Asp Ser Tyr 1 5 10 <210> 421 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 421 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Leu Ile Glu Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Val Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Trp Arg Gly Ser Gly Tyr Tyr Ala Tyr Phe Asp Val Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 422 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 422 gaggtgcaat tggtgcagag cggagccgaa gtgaagaagc ccggcgagag cctgaagatc 60 agctgcaagg gcagcggcta cgccttcacc aactacctga tcgagtgggt gcgccagatg 120 cccggcaagg gcctggaatg gatgggcgtg atcaatcctg gcagcggcgg caccaattac 180 aacgagaagt tcaagggcca agtgaccatc agcgccgaca agagcatcag caccgcctac 240 ctccagtggt ccagcctgaa ggccagcgac accgccatgt actactgcgc caggtggcgg 300 ggaagcggct actacgccta cttcgacgtg tggggccagg gcaccacagt gaccgtcagc 360 tca 363 <210> 423 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(10) <223> /note="This sequence may encompass 1-10 Gly residues wherein some positions may be absent" <400> 423 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 10

Claims (31)

  1. 서열 번호: 109에 따른 인간 IL-2에 결합하는 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 부분으로서, 이 때 상기 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3를 포함하는 경쇄 가변 영역 및 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하며 LCDR1은 서열 번호: 122를 포함하고; LCDR2는 서열 번호: 123을 포함하고; LCDR3는 서열 번호: 21을 포함하고; HCDR1은 서열 번호: 119를 포함하고; HCDR2는 서열 번호: 120을 포함하고; 그리고 HCDR3은 서열 번호: 121을 포함함.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 다음을 포함함을 특징으로 하는 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 부분:
    다음을 포함하는 경쇄 가변 영역:
    서열 번호: 19, 서열 번호: 31, 서열 번호: 69, 서열 번호: 72, 서열 번호: 86 및 서열 번호: 90으로 구성된 그룹에서 선택된 LCDR1;
    서열 번호: 20 및 서열 번호: 32로 구성된 그룹에서 선택된 LCDR2;
    서열 번호: 21에 제시된 LCDR3, 및
    다음을 포함하는 중쇄 가변 영역:
    서열 번호: 4, 및 서열 번호: 13으로 구성된 그룹에서 선택된 HCDR1;
    서열 번호: 2, 및 서열 번호: 12로 구성된 그룹에서 선택된 HCDR2; 및
    서열 번호: 3, 서열 번호: 36, 서열 번호: 39, 서열 번호: 42, 및 서열 번호: 45로 구성된 그룹에서 선택된 HCDR3.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서,
    LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 각각 서열 번호: 19, 20 및 21이고, HCDR1, HCDR2 및 HCDR3은 각각 서열 번호: 4, 2 및 3이고; 또는
    LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 각각 서열 번호: 31, 32 및 21이고, HCDR1, HCDR2 및 HCDR3은 각각 서열 번호: 4, 2 및 3이고; 또는
    LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 서열 번호: 19, 20 및 21이고, HCDR1, HCDR2 및 HCDR3은 서열 번호: 13, 12 및 3이고; 또는
    LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 서열 번호: 31, 32 및 21이고, HCDR1, HCDR2 및 HCDR3은 서열 번호: 13, 12 및 3이고; 또는
    LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 서열 번호: 69, 20 및 21이고, HCDR1, HCDR2 및 HCDR3은 각각 서열 번호: 4, 2 및 3이고; 또는
    LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 각각 서열 번호: 31, 32 및 21이고, HCDR1, HCDR2 및 HCDR3은 각각 서열 번호: 4, 2 및 3이고; 또는
    LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 각각 서열 번호: 69, 20 및 21이고, HCDR1, HCDR2 및 HCDR3은 각각 서열 번호: 4, 2 및 3이고; 또는
    LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 각각 서열 번호: 19, 20 및 21이고, HCDR1, HCDR2 및 HCDR3은 각각 서열 번호: 4, 2 및 36이고; 또는
    LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 각각 서열 번호: 69, 20 및 21이고, HCDR1, HCDR2 및 HCDR3은 각각 서열 번호: 4, 2 및 36이고; 또는
    LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 각각 서열 번호: 19, 20 및 21이고, HCDR1, HCDR2 및 HCDR3은 각각 서열 번호: 4, 2 및 36이고; 그리고
    LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 각각 서열 번호: 69, 20 및 21이고, HCDR1, HCDR2 및 HCDR3은 각각 서열 번호: 4, 2 및 36임을 특징으로 하는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 부분.
  4. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중쇄 가변 (VH) 및 경쇄 가변 (VL) 영역들은 다음 아미노산 서열들과 최소한 95% 동일성을 가짐을 특징으로 하는 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 부분:
    VL, 서열 번호: 25; VH, 서열 번호: 7, 또는
    VL, 서열 번호: 27; VH, 서열 번호: 7, 또는
    VL, 서열 번호: 34; VH, 서열 번호: 7, 또는
    VL, 서열 번호: 25; VH, 서열 번호: 15, 또는
    VL, 서열 번호: 27; VH, 서열 번호: 15, 또는
    VL, 서열 번호: 34; VH, 서열 번호: 15, 또는
    VL, 서열 번호: 25; VH, 서열 번호: 17, 또는
    VL, 서열 번호: 27; VH, 서열 번호: 17, 또는
    VL, 서열 번호: 34; VH, 서열 번호: 17, 또는
    VL, 서열 번호: 70; VH, 서열 번호: 7, 또는
    VL, 서열 번호: 25; VH, 서열 번호: 37, 또는
    VL, 서열 번호: 70; VH, 서열 번호: 37, 또는
    VL, 서열 번호: 79; VH, 서열 번호: 7, 또는
    VL, 서열 번호: 27; VH, 서열 번호: 37, 또는
    VL, 서열 번호: 79; VH, 서열 번호: 37, 또는
    VL, 서열 번호: 70; VH, 서열 번호: 17, 또는
    VL, 서열 번호: 25; VH, 서열 번호: 49, 또는
    VL, 서열 번호: 70; VH, 서열 번호: 49, 또는
    VL, 서열 번호: 79; VH, 서열 번호: 17, 또는
    VL, 서열 번호: 27; VH, 서열 번호: 49, 또는
    VL, 서열 번호: 79; VH, 서열 번호: 49.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 중쇄 가변 (VH) 및 경쇄 가변 (VL) 영역들은 다음 아미노산 서열들을 가짐을 특징으로 하는 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 부분:
    VL, 서열 번호: 25; VH, 서열 번호: 7, 또는
    VL, 서열 번호: 27; VH, 서열 번호: 7, 또는
    VL, 서열 번호: 34; VH, 서열 번호: 7, 또는
    VL, 서열 번호: 25; VH, 서열 번호: 15, 또는
    VL, 서열 번호: 27; VH, 서열 번호: 15, 또는
    VL, 서열 번호: 34; VH, 서열 번호: 15, 또는
    VL, 서열 번호: 25; VH, 서열 번호: 17, 또는
    VL, 서열 번호: 27; VH, 서열 번호: 17, 또는
    VL, 서열 번호: 34; VH, 서열 번호: 17, 또는
    VL, 서열 번호: 70; VH, 서열 번호: 7, 또는
    VL, 서열 번호: 25; VH, 서열 번호: 37, 또는
    VL, 서열 번호: 70; VH, 서열 번호: 37, 또는
    VL, 서열 번호: 79; VH, 서열 번호: 7, 또는
    VL, 서열 번호: 27; VH, 서열 번호: 37, 또는
    VL, 서열 번호: 79; VH, 서열 번호: 37, 또는
    VL, 서열 번호: 70; VH, 서열 번호: 17, 또는
    VL, 서열 번호: 25; VH, 서열 번호: 49, 또는
    VL, 서열 번호: 70; VH, 서열 번호: 49, 또는
    VL, 서열 번호: 79; VH, 서열 번호: 17, 또는
    VL, 서열 번호: 27; VH, 서열 번호: 49, 또는
    VL, 서열 번호: 79; VH, 서열 번호: 49.
  6. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호: 93, 서열 번호: 95, 서열 번호: 97, 서열 번호: 99, 서열 번호: 101, 서열 번호: 103 및 서열 번호: 105로 구성된 그룹에서 선택된 Fc 도메인을 포함함을 특징으로 하는 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 부분.
  7. 청구항 6에 있어서, 서열 번호: 93, 서열 번호: 101, 서열 번호: 103 또는 서열 번호: 105에 따른 Fc 도메인을 포함함을 특징으로 하는 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 부분.
  8. 청구항 7에 있어서, 서열 번호: 124에 따른 경쇄 및 서열 번호: 126에 따른 중쇄, 또는 서열 번호: 128에 따른 경쇄 및 서열 번호: 130에 따른 중쇄를 포함함을 특징으로 하는 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 부분.
  9. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 K52, P54, K55, T57, R58, T61, F62, K63, Q94, 및 K96을 포함하는 인간 인터루킨-2 (hIL-2) 에피토프에 결합함을 특징으로 하는 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 부분.
  10. 청구항 9에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 아미노산 K52, P54, K55, T57, R58, T61, F62, K63, Q94, 및 K96에 특이적으로 결합함을 특징으로 하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 에피토프는 아미노산 N50, N53, N91, L92, A93, 및 N97 중 하나 이상을 추가로 포함함을 특징으로 하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  12. 청구항 11에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 아미노산 N50, K52, N53, P54, K55, T57, R58, T61, F62, K63, N91, L92, A93, Q94, K96, 및 N97에 특이적으로 결합함을 특징으로 하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  13. 서열 번호: 109에 따른 인간 IL-2에 결합하는 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 부분으로서, 이 때 상기 항체 또는 이의 항원-결합 부분은, 차례로 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및, 차례로, HCDR1, HCDR2 및 HCDR3를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하며, 여기서
    LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 각각 서열 번호: 231, 232 및 233이고, 그리고 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3은 각각 서열 번호: 181, 182 및 183이고; 또는
    LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 각각 서열 번호: 279, 280 및 281이고, 그리고 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3은 각각 서열 번호: 213, 214 및 215이고; 또는
    LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 각각 서열 번호: 231, 232 및 233이고, 그리고 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3은 각각 서열 번호: 213, 214 및 215이고; 또는
    LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 각각 서열 번호: 263, 264 및 265이고, 그리고 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3은 각각 서열 번호: 213, 214 및 215이고; 또는
    LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 각각 서열 번호: 263, 264 및 265이고, 그리고 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3은 각각 서열 번호: 149, 150 및 151이고; 또는
    LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 각각 서열 번호: 69, 20 및 21이고, 그리고 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3은 각각 서열 번호: 197, 198, 및 199이고; 또는
    LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 각각 서열 번호: 231, 232 및 233이고, 그리고 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3은 각각 서열 번호: 197, 198, 및 199인, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 부분.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 중쇄 가변 (VH) 및 경쇄 가변 (VL) 영역들은 다음 아미노산 서열들과 최소한 95% 동일성을 가짐을 특징으로 하는 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 부분:
    VL, 서열 번호: 243; VH, 서열 번호: 193, 또는
    VL, 서열 번호: 391; VH, 서열 번호: 225, 또는
    VL, 서열 번호: 243; VH, 서열 번호: 225, 또는
    VL, 서열 번호: 275; VH, 서열 번호: 225, 또는
    VL, 서열 번호: 275; VH, 서열 번호: 161, 또는
    VL, 서열 번호: 70; VH, 서열 번호: 209, 또는
    VL, 서열 번호: 243; VH, 서열 번호: 209.
  15. 청구항 14에 있어서, 상기 중쇄 가변 (VH) 및 경쇄 가변 (VL) 영역들은 다음 아미노산 서열들을 가짐을 특징으로 하는 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 부분:
    VL, 서열 번호: 243; VH, 서열 번호: 193, 또는
    VL, 서열 번호: 391; VH, 서열 번호: 225, 또는
    VL, 서열 번호: 243; VH, 서열 번호: 225, 또는
    VL, 서열 번호: 275; VH, 서열 번호: 225, 또는
    VL, 서열 번호: 275; VH, 서열 번호: 161, 또는
    VL, 서열 번호: 70; VH, 서열 번호: 209, 또는
    VL, 서열 번호: 243; VH, 서열 번호: 209.
  16. 청구항 13 내지 15 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호: 93, 서열 번호: 95, 서열 번호: 97, 서열 번호: 99, 서열 번호: 101, 서열 번호: 103 및 서열 번호: 105로 구성된 그룹에서 선택된 Fc 도메인을 포함함을 특징으로 하는 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 부분.
  17. 청구항 15에 있어서, 상기 중쇄 및 경쇄 영역들은 다음 아미노산 서열들을 가짐을 특징으로 하는 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 부분:
    중쇄 서열 번호: 195 및 경쇄 서열 번호: 245, 또는
    중쇄 서열 번호: 227 및 경쇄 서열 번호: 393, 또는
    중쇄 서열 번호: 227 및 경쇄 서열 번호: 245, 또는
    중쇄 서열 번호: 227 및 경쇄 서열 번호: 277, 또는
    중쇄 서열 번호: 163 및 경쇄 서열 번호: 277, 또는
    중쇄 서열 번호: 211 및 경쇄 서열 번호: 261, 또는
    중쇄 서열 번호: 211 및 경쇄 서열 번호: 277.
  18. 전술한 청구항 중 어느 한 항의 항체 및 선택적으로 인간 IL-2를 포함하는 조성물.
  19. 청구항 18에 있어서, 인간 IL-2는 서열 번호: 109에 따른 인간 IL-2 또는 서열 번호: 110에 따른 알데스류킨으로 구성된 그룹에서 선택됨을 특징으로 하는 조성물.
  20. 청구항 1 내지 17 중 어느 한 항의 항체 및 인간 IL-2를 포함하는 융합 단백질.
  21. 청구항 20에 있어서, 상기 항체 및 인간 IL-2는 서열 번호: 397, 서열 번호: 398, 서열 번호: 399, 서열 번호: 400, 서열 번호: 401, 서열 번호: 402, 서열 번호: 403, 서열 번호: 404, 서열 번호: 405, 서열 번호: 406, 서열 번호: 407, 서열 번호: 408, 서열 번호: 409, 서열 번호: 410, 및 서열 번호: 411로 구성된 그룹에서 선택된 링커 서열에 의해 결합됨을 특징으로 하는 융합 단백질.
  22. 청구항 21에 있어서, 상기 링커 서열은 서열 번호: 405 또는 서열 번호: 407임을 특징으로 하는 융합 단백질.
  23. 청구항 20에 있어서, 항체의 LCDR1은 Kabat 정의에 따른 잔기 Y27 및 잔기 D30을 포함하고, 여기서 잔기 Y27은 GG 링커에 의해 인간 IL-2의 잔기 N97에 결합되며, 잔기 D30은 서열 번호: 412에 따른 링커에 의해 인간 IL-2의 잔기 K96에 결합됨을 특징으로 하는 융합 단백질.
  24. 청구항 1 내지 17 중 어느 한 항, 또는 청구항 18 또는 19, 또는 청구항 20 내지 23 중 어느 한 항에 있어서, 약제로 사용됨을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 조성물, 또는 융합 단백질.
  25. 청구항 1 내지 17 중 어느 한 항, 또는 청구항 18 또는 19, 또는 청구항 20 내지 23 중 어느 한 항에 있어서, 약제의 제조에 사용됨을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 조성물, 또는 융합 단백질.
  26. 청구항 1 내지 17 중 어느 한 항, 또는 청구항 18 또는 19, 또는 청구항 20 내지 23 중 어느 한 항에 있어서, 암 치료에 사용됨을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 조성물, 또는 융합 단백질.
  27. 청구항 1 내지 17 중 어느 한 항의 항체, 또는 청구항 18 또는 19의 조성물, 또는 청구항 20 내지 23 중 어느 한 항의 융합 단백질을 투여함에 의한 암 치료 방법.
  28. 청구항 1 내지 17 중 어느 한 항의 항체, 또는 이의 단편 또는 청구항 20 내지 23 중 어느 한 항의 융합 단백질을 인코딩할 수 있는 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  29. 청구항 28의 벡터를 포함하는 세포.
  30. 청구항 1 내지 17 중 어느 한 항의, 인간 인터루킨-2 (hIL-2)-특이적 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 청구항 20 내지 23 중 어느 한 항의 융합 단백질을 제조할 수 있는 세포.
  31. 생성되는 항체들이 청구항 1 내지 17 중 어느 한 항의 항체 또는 청구항 20 내지 23 중 어느 한 항의 융합 단백질임을 특징으로 하는 단일클론 항체-생성 하이브리도마 세포주.
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