TWI773647B - 新穎pd-1免疫調控劑 - Google Patents

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雷尼爾Ｊ 布蘭特詹恩斯
霍里 珍恩 傑克森
成 劉
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史隆凱特林紀念癌症中心
美商尤里卡醫療公司
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Abstract

本文所揭示的內容大體上係關於與免疫功能有關的抗原結合性蛋白質。更具體言之，本文所揭示的內容係關於對PD-1有專一性的重組抗體、嵌合性抗原受體與其片段。

Description

新穎PD-1免疫調控劑 相關申請案之交互參照
本申請案根據2015年6月23日提申的U.S.臨時申請案no.62/183,297與2015年12月11日提申的U.S.臨時申請案no.62/266,398主張優先權；各臨時申請案的內容特此藉由引用方式納入本文所揭示的內容中。
序列表
本申請案包含一序列表，其係於2016年6月16日創造；該檔案(呈ASCII格式)被命名為3314070AWO_SequenceListing_ST25.txt且大小為104千位元組。此檔案係特此藉由引用方式以其整體納入本申請案中。
本文所揭示的內容大體上係關於與免疫功能有關的抗原結合性蛋白質。更具體言之，本文所揭示的內容係關於對PD-1有專一性的重組抗體、嵌合性抗原受體與其片段。
癌症免疫治療之目的係去藉由調控癌症專一性免疫反應來治療惡性疾病。一個主要目標係計畫性細胞死亡(PD-1)受體，其係在經活化T細胞之表面上表現且當與其配體(PD-L1與PD-L2)之一結合時導致細胞內抑制性訊號。
PD-1已被顯示在癌症中扮演某種角色。於人類中，PD-1及/或PD-L1之表現已藉由免疫組織化學來評估而於一些原發腫瘤生檢中發現。如此組織包含肺臟、肝臟、卵巢、子宮頸、皮膚、結腸、神經膠質瘤、膀胱、***、腎臟、食道、胃臟、口鱗狀細胞、泌尿道上皮細胞、與胰臟之癌症以及頭與頸之腫瘤。此外，已將在腫瘤細胞上的PD-配體表現與多種腫瘤類型的癌症患者之差的預後聯結起來。
目前持續對於新治療法(包含瞄準PD-1且以作為PD-1之促效劑或其拮抗劑的方式作用的抗體與其他抗原結合性蛋白質)有需求。
本文所揭示的內容描述抗原結合性蛋白質，諸如抗體與嵌合性抗原受體，其等能夠專一性地結合在T細胞上的與計畫性細胞死亡聯結的蛋白質受體(PD-1)，藉此透過T細胞調控免疫反應。藉由抑制PD-1與其配體(PD-L1)結合，PD-1傳訊途徑之封鎖會抑制T細胞之凋亡。
因此，在一個方面，本文所揭示的內容係關於與PD-1專一性地結合並預防其配體之結合的重組抗原結合性蛋白質、抗體與嵌合性抗原受體或其抗原結合性部分。
因此，在一個方面，本文所揭示的內容係關於重組抗原結合性蛋白質或其抗原結合性片段，其包含以下者之一：(A)一抗原結合區域，其具有選自由以下者所組成的群組的胺基酸序列：SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：142； 其片段、與其同源序列；(B)一抗原結合區域，其包含分別具有選自以下者的胺基酸序列的可變輕鏈(VL)與可變重鏈(VH)：SEQ ID NO：6與8；SEQ ID NO：17與19；SEQ ID NO：28與30；SEQ ID NO：39與41；SEQ ID NO：49與51；SEQ ID NO：57與59；SEQ ID NO：68與70；SEQ ID NO：79與81；SEQ ID NO：90與92；SEQ ID NO：99與101；SEQ ID NO：110與112；SEQ ID NO：121與123；SEQ ID NO：129與131；SEQ ID NO：138與140；其片段、與其同源序列；或(C)一抗原結合區域，其包含：(i)一輕鏈(LC)，其包含分別具有胺基酸序列QSISSY(SEQ ID NO：1)、AAS與QQSYSTPLT(SEQ ID NO：2)的輕鏈互補性決定區域(LCCDR)LCCDR1、LCCDR2與LCCDR3，與一重鏈(HC)，其包含分別具有胺基酸序列GFTSSSYW(SEQ ID NO：4)、IKQDGSEK(SEQ ID NO.5)與ARGGWSYDM(SEQ ID NO：6)的重鏈互補性決定區域(HCCDR)HCCDR1、HCCDR2與HCCDR3；其片段或其同源序列；(ii)一輕鏈(LC)，其包含分別具有胺基酸序列SSNIGAGYA(SEQ ID NO：12)、TNN與QSYDSSLSGVI(SEQ ID NO：13)的LCCDR1、LCCDR2與LCCDR3，與一重鏈(HC)，其包含分別具有胺基酸序列GYTLTELS(SEQ ID NO：14)、FDPEDGET(SEQ ID NO.15)與ARAYYGFDQ(SEQ ID NO：16)的HCCDR1、HCCDR2與HCCDR3；其片段或其同源序列；(iii)一輕鏈(LC)，其包含分別具有胺基酸序列SSNIGNNA(SEQ ID NO：23)、YND與AAWDDSVNGYV(SEQ ID NO：24)的LCCDR1、LCCDR2與LCCDR3，與一重鏈(HC)，其包含分別具有胺基酸序列GYTFTRFG(SEO ID NO：25)、 ISVNNGNT(SEQ ID NO.26)與ARYMYGRRDS(SEQ ID NO：27)的HCCDR1、HCCDR2與HCCDR3；其片段或其同源序列；(iv)一輕鏈(LC)，其包含分別具有胺基酸序列NIGSKS(SEQ ID NO：34)、YDS與QVWDNHSDVV(SEQ ID NO：35)的LCCDR1、LCCDR2與LCCDR3，與一重鏈(HC)，其包含分別具有胺基酸序列RNKFSSYA(SEQ ID NO：36)、ISGSGGTT(SEQ ID NO.37)與ARWYSSYYDV(SEQ ID NO：38)的HCCDR1、HCCDR2與HCCDR3；其片段或其同源序列；(v)一輕鏈(LC)，其包含分別具有胺基酸序列NIGSKS(SEQ ID NO：34)、YDS與QVWDSSSDYV(SEQ ID NO：45)的LCCDR1、LCCDR2與LCCDR3，與一重鏈(HC)，其包含分別具有胺基酸序列GFTFSSYA(SEQ ID NO：46)、ISGSGGST(SEQ ID NO.47)與ARNYISMFDS(SEQ ID NO：48)的HCCDR1、HCCDR2與HCCDR3；其片段或其同源序列；(vi)一輕鏈(LC)，其包含分別具有胺基酸序列NIGSKS(SEQ ID NO：34)、YDS與QVWDSSSDHV(SEQ ID NO：55)的LCCDR1、LCCDR2與LCCDR3，與一重鏈(HC)，其包含分別具有胺基酸序列GFTFSSYA(SEQ ID NO：46)、ISGSGGST(SEQ ID NO.47)與ARGYSSYYDA(SEQ ID NO：56)的HCCDR1、HCCDR2與HCCDR3；其片段或其同源序列；(vii)一輕鏈(LC)，其包含分別具有胺基酸序列RSNIGENT(SEQ ID NO：63)、SNN與AAWDDRLNGYV(SEQ ID NO：64)的LCCDR1、LCCDR2與LCCDR3，與一重鏈(HC)，其包含分別具有胺基酸序列GYTFTNYG(SEQ ID NO：65)、IGAQKGDT(SEQ ID NO.66)與ARSQGVPFDS(SEQ ID NO：67)的HCCDR1、HCCDR2與HCCDR3；其片段或其同源序列； (viii)一輕鏈(LC)，其包含分別具有胺基酸序列RSNIGSNT(SEQ ID NO：74)、NNN與ATWDDSLNEYV(SEQ ID NO：75)的LCCDR1、LCCDR2與LCCDR3，與一重鏈(HC)，其包含分別具有胺基酸序列GYTFTRYG(SEQ ID NO：76)、ISGYNGNT(SEQ ID NO.77)與ARHGYGYHGD(SEQ ID NO：78)的HCCDR1、HCCDR2與HCCDR3；其片段或其同源序列；(ix)一輕鏈(LC)，其包含分別具有胺基酸序列SSNIGAGYV(SEQ ID NO：85)、HNN與QSYDSSLSGWV(SEQ ID NO：86)的LCCDR1、LCCDR2與LCCDR3，與一重鏈(HC)，其包含分別具有胺基酸序列GFTFKDYY(SEQ ID NO：87)、ISTSGNSV(SEQ ID NO.88)與ARSPGHSDYDS(SEQ ID NO：89)的HCCDR1、HCCDR2與HCCDR3；其片段或其同源序列；(x)一輕鏈(LC)，其包含分別具有胺基酸序列NIGDKS(SEQ ID NO：96)、YDS與QVWASGTDHPYVI(SEQ ID NO：97)的LCCDR1、LCCDR2與LCCDR3，與一重鏈(HC)，其包含分別具有胺基酸序列GFTFSSYA(SEQ ID NO：46)、ISGSGGST(SEQ ID NO.47)與ARMYGSYTDM(SEQ ID NO：98)的HCCDR1、HCCDR2與HCCDR3；與其片段或其同源序列；(xi)一輕鏈(LC)，其包含分別具有胺基酸序列SSNIGYNY(SEQ ID NO：105)、RNN與TSWDDSLSGYV(SEQ ID NO：106)的LCCDR1、LCCDR2與LCCDR3，與一重鏈(HC)，其包含分別具有胺基酸序列GNAETNFY(SEQ ID NO：107)、INPSGTDLT(SEQ ID NO.108)與ARQYAYGYSGFDM(SEQ ID NO：109)的HCCDR1、HCCDR2與HCCDR3；其片段或其同源序列；(xii)一輕鏈(LC)，其包含分別具有胺基酸序列QSVSNW(SEQ ID NO：116)、AAS與QQSYSTPIT(SEQ ID NO：117)的LCCDR1、LCCDR2與LCCDR3， 與一重鏈(HC)，其包含分別具有胺基酸序列GYTFTSYY(SEQ ID NO：118)、INPNTGGS(SEQ ID NO.119)與ARGDVTYDE(SEQ ID NO：120)的HCCDR1、HCCDR2與HCCDR3；其片段或其同源序列；(xiii)一輕鏈(LC)，其包含分別具有胺基酸序列NIGSKS(SEQ ID NO：34)、YDD與QVWDINDHYV(SEQ ID NO：127)的LCCDR1、LCCDR2與LCCDR3，與一重鏈(HC)，其包含分別具有胺基酸序列GFTFSSYA(SEQ ID NO：46)、ISGSGGST(SEQ ID NO.47)與ARSQASFMDI(SEQ ID NO：128)的HCCDR1、HCCDR2與HCCDR3；其片段或其同源序列；或(xiv)一輕鏈(LC)，其包含分別具有胺基酸序列NIGSKS(SEQ ID NO：34)、DDS與QVWDSSSDQGV(SEQ ID NO：135)的LCCDR1、LCCDR2與LCCDR3，與一重鏈(HC)，其包含分別具有胺基酸序列GFTFSSYA(SEQ ID NO：46)、IGTGGGT(SEQ ID NO.136)與ARGTGYDGDQ(SEQ ID NO：137)的HCCDR1、HCCDR2與HCCDR3與其片段或其同源序列。
在一些具體態樣中，該重組抗原結合性蛋白質或其抗原結合性片段包含為至少一個所敘述的SEQ ID NO之全長之至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%的所敘述的SEQ ID NO之至少一者之片段。在一些具體態樣中，該重組抗原結合性蛋白質或其抗原結合性片段包含與至少一個所敘述的SEQ ID NO有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、或99.9%一致性的與所敘述的SEQ ID NO之至少一者同源的序列。
在一個相關的方面，本文所揭示的內容係關於重組抗原結合 性蛋白質或其抗原結合性片段，其中該重組抗原結合性蛋白質係抗體、嵌合性抗原受體(CAR)、融合蛋白質或其結合物。在一個具體態樣中，該重組抗原結合性蛋白質或其抗原結合性片段係與治療劑(例如藥物、毒素或細胞毒性部分、放射性同位素、蛋白質或胜肽)結合。
本文所揭示的內容之抗體係全長抗體、完整抗體、其片段與同源序列，包含但不限於Fab片段、F(ab')2片段或單鏈可變片段(scFv)。
於該重組抗原結合性蛋白質中，其抗原結合性區域與人類PD-1之抗原決定基專一性地結合並封阻PD-1與其配體結合。
在一個相關的方面，本文所揭示的內容係關於編碼本文所揭示的內容之抗原結合性蛋白質的核酸以及包含如此核酸或抗原結合性蛋白質的載體與細胞。
在又另一個方面，本文所揭示的內容係關於在接受者中增加T細胞反應的方法，其包含投予治療有效量的抗原結合性蛋白質或其抗原結合性片段。投予治療有效量的該抗原結合性蛋白質或其抗原結合性片段會抑制、減少、調控或廢止由PD-1介導的訊號轉導。
在又另一相關的方面，本文所揭示的內容係關於用於治療具有PD1陽性疾病的接受者的方法，其包含將治療有效量的抗原結合性蛋白質或其抗原結合性片段投予至該接受者。在一個具體態樣中，投予包含該抗原結合性蛋白質或其抗原結合性片段的醫藥組成物。
圖1顯示scFv-Fc殖系對PD-1單體的相對結合親和力。scFv-Fc殖系結合PD-1的能力係藉由偵測與PD-1單體結合的水平來測定。 scFv-Fc殖系之結合親和力被評級，其中殖系31弱地結合且殖系26與27結合最大(31<23<40<18<16=27<26)。
圖2A與B顯示PD-1與其配體(PD-L1)的交互作用之瓦解。A.係用以測量scFv-Fc瓦解PD-1/PD-L1交互作用的能力的競爭性結合分析之概圖。(1)將經生物素化PD-1-Fc與經連續稀釋的ET901 ScFv-Fc(陰性對照組)或抗PD1 ScFv-Fcs混合；與(2)然後將其添加至經PD-L1-Fc塗覆的盤。於步驟(3)，PD-1-Fc與所塗覆的PD-L1間的結合係透過與HRP結合的鏈霉抗生物素顯像。B.為了比較競爭性結合分析結果，將scFv之濃度為1.7-5.25ug/ml之點圈出。殖系40與23具有最弱的瓦解該交互作用的能力且殖系26具有最強的能力(26>27=16>18>31>23=40)。
圖3係所使用的構築體之概圖。將可分泌的scFv設計成包含小鼠kappa前導序列以允許自細胞輸出scFv。使用絲胺酸甘胺酸連接子(G4S)以連接可變重鏈與可變輕鏈。包含HIS/HA標籤以允許偵測scFv。SFG-1928z/scFv反轉錄病毒構築體之概圖描畫5'與3'長末端重複單位(LTR)、剪接提供子(SD)、剪接接受子(SA)、包裝元件(ψ)、CD8前導序列(CD8)、單鏈可變片段(scFv)之可變重(VH)與可變輕(VL)鏈、跨膜功能域(TM)、人類CD28傳訊功能域(hCD28)、人類zeta鏈傳訊功能域(h ζ鏈)與抗PD-1 scFv之位置。
圖4經修飾以表現單單1928z CAR或1928z CAR與PD-1 scFv的人類周邊血液T細胞之擴增。經轉導的T細胞係培養在50IU/ml重組人類IL-2中且擴增被監視。經修飾以表現CAR並分泌抗PD-1 scFv殖系23或27的T細胞有至少與表現單單CAR的T細胞相等的擴增。經修飾以表現 1928z CAR並分泌抗PD-1 scFv殖系16、18、26、31或40的細胞於試管內並未擴增。所顯示的數據係兩個獨立的實驗之代表。
圖5來自分泌抗PD-1 scFv的瞄準腫瘤的T細胞的INF-γ分泌(pg/ml)。表現CAR或CAR且分泌抗PD-1 scFv的T細胞係與CD19+ Raji腫瘤細胞共培養。上清液係以Luminex技術分析以偵測自T細胞分泌的細胞介素之水平。相較於經修飾以表現單單CAR的細胞，經修飾以表現1928z CAR並分泌抗PD-1scFv殖系23與27的T細胞之IFN-γ分泌增加。相較於以單單CAR修飾的細胞，經修飾以表現1928z CAR並分泌抗PD-1 scFv殖系16、18、2、31或40的細胞分泌較少的IFN-γ。
圖6顯示以1928z CAR與Eureka抗PD-1 scFv轉導人類T細胞之結果。(上面的圖)在轉導後，人類T細胞係藉由流動式細胞測量術評估以使用對1928z CAR(19E3)有專一性的抗體偵測CAR表現。對於所有所測試的構築體的轉導效率皆大於55%且係可再現的。(下面的圖)包含Eureka抗PD-1 scFv殖系26、27與40的構築體具有顯著較低的轉導效率，*p<0.05。來自4個獨立的實驗的轉導效率，所顯示的數據係平均+/- SEM。
圖7顯示於經修飾以表現1928z CAR與Eureka抗PD-1 scFv的T細胞中抗PD-1 scFv之存在之功效。在製備西方墨漬溶胞產物前，將經轉導以表現CAR與Eureka抗PD-1 scFvs的人類T細胞以高爾基抑制劑培養4個小時。使用西方墨漬分析以藉由以抗HA抗體探測膜來偵測抗PD-1 scFv。膜係以抗GAPDH抗體作為裝載對照組來探測。
圖8顯示經修飾以表現1928z CAR與抗PD-1 scFv的人類T細胞在PD-L1/L2之存在/不存在下的擴增。將經修飾以表現CAR並分泌抗 PD-1 scFv殖系23、26、27、與40的人類T細胞置於表現人類PD-1L1/L2或不表現其的人工抗原呈現細胞(aAPC，小鼠3T3纖維母細胞)上。在與aAPC培養24個小時後，將CD3/CD28活化性珠粒添加至細胞以刺激增殖(1：2珠粒：T細胞比率)。於3日後，使用台盼藍拒染計算T細胞。相對於在不表現抑制性配體的aAPC上，經修飾以表現1928zCAR與抗PD-1 scFv殖系26與23的T細胞在表現PD-L1/L2的aAPC上增殖減少。相反地，經修飾以表現1928zCAR與抗PD-1 scFv殖系27的T細胞在表現PD-L1/L2的aAPC上的擴增增加。所顯示的數據係一個實驗之代表。
圖9顯示本文所揭示的內容之一些抗原結合性蛋白質之可變輕鏈與可變重鏈之互補性決定區域(CDR)之胺基酸序列。
圖10顯示從抗PD-1專一性scFv產生的單株抗體與在人類T細胞上的PD-1結合。產生來自PD-1專一性scFv的人類單株抗體並將其以經修飾以過度表現人類PD-1(1μg/ml)的人類T細胞培養。使用流動式細胞測量術以使用與FITC結合的山羊抗人類Ig抗體偵測結合的抗體。殖系23、26與27單株抗體分別以51%、78%與67%和P-1人類T細胞結合。對照組抗體(殖系901)不與在T細胞上的人類PD-1結合。所顯示的數據係一個實驗之代表。
圖11顯示經修飾以表現第一世代CAR且在表現PD-L1/L2的aAPC上培養的T細胞於抗PD-1殖系27單株抗體存在時擴增。將經修飾以表現第一世代CD19專一性CAR(19z1)的人類T細胞以抗PD-1單株抗體培養24個小時，然後置於表現PD-L1/L2或不表現其的aAPC上。在以aAPC刺激24個小時後，接著以CD3/CD28珠粒刺激細胞。於三日後，計算細胞。以無 單株抗體(有點的條)、對照組抗體，901(有方格的條)與殖系23(有水平線的條)與26(有垂直線的條)單株抗體培養的19z1 T細胞在表現PD-1配體的aAPC上相較於在無抑制性配體的aAPC上(相對應的無框線條)擴增遠較小。然而，以抗PD-1殖系27單株抗體(有斜線的條)培養的19z1 T細胞在PD-L1/L2 aAPC上擴增至較大的程度。所顯示的數據係一個實驗之代表。
圖12A-12D顯示經進一步修飾以分泌PD-1封阻性scFv(E27)的CAR T細胞之產生。A.產生雙作用子反轉錄病毒構築體，其編碼CD19專一性CAR(稱為1928z)或卵巢腫瘤抗原專一性CAR(稱為4H1128z)與PD-1封阻性scFv(E27)。E27前面有一訊號胜肽(小鼠IgK)以允許該scFv之分泌。亦包含一HA/His標籤以在自T細胞分泌後偵測該scFv。B.人類周邊血液T細胞係以編碼CAR、1928z、或CAR與E27 PD-1封阻性scFv(1928z-E27)的反轉錄病毒構築體轉導。於轉導後，使用流動式細胞測量術以偵測CAR之表現，使用專一性地結合瞄準CD19的CAR的抗體(被稱為19E3)。C.利用來自經轉導人類T細胞的上清液之西方墨漬分析以用抗HA抗體偵測PD-1封阻性scFv。吾人亦研究來自經修飾以表現CAR與對照組scFv(B6，其係使用抗c-myc標籤抗體偵測)的T細胞的scFv分泌。D.進行對兩個CD19+腫瘤目標的標準51Cr釋放分析以確保scFv之分泌並未阻礙CAR使T細胞溶胞能力改變方向的能力。表現單單CAR的CAR T細胞(1928z或4H1128z對照組CAR)、表現CAR與E27 scFv的CAR T細胞(1928z-E27或4H1128z-E27)、或表現CAR與對照組scFv的CAR T細胞(1928z-B6H12.2或4H1128z-B6H12.2)係以經51Cr標記的腫瘤細胞(Raji或Nalm6)培養4個hr。表現CD19專一性CAR的T細胞能夠以相等的水平溶 胞腫瘤目標，且瞄準卵巢的CAR T細胞不能夠溶胞Raji或Nalm6。因此，吾人作出以下結論：scFv之分泌並未阻礙CAR使T細胞溶胞能力改變方向的能力。
圖13A-13D顯示經修飾以表現CAR並分泌PD-1封阻性scFv的T細胞試管內抗拒來自PD-L1-PD-1交互作用的抑制。A.表現單單CAR的T細胞(1928z)、或表現CAR與PD-1封阻性scFv的T細胞(1928z-E27)係培養在3T3細胞空細胞或經修飾以表現人類PD-L1的3T3細胞上。於在3T3餵養細胞上24個小時後，將細胞用以1：3珠粒：T細胞比率添加至培養物的CD3/CD28珠粒刺激。T細胞之擴增係以台盼藍計算測定且將新鮮的珠粒添加至培養物兩次(以箭頭指出)。然而，在3T3空餵養細胞上擴增的1928z T細胞並未在3T3-PD-L1餵養細胞上擴增。相反地，1928z-E27 T細胞在3T3空細胞與3T3-PD-L1餵養細胞上皆擴增，表明對PD-L1-PD-1介導性抑制的抗性。B.如於圖13A中顯示的在3T3空細胞或3T3-PD-L1細胞上培養的T細胞係藉由流動式細胞測量術分析以偵測在抑制性受體(PD-1、2B4與LAG3)上的表現。相較於1928z-E27細胞(未顯示)，1928z細胞表現水平增加的PD-1。當以PD-1+細胞限制時，2B4與LAG3之分析展現1928z細胞相較於1928z-E27細胞具有較高比例的PD-1+、2B4+與LAG3+細胞。C.經轉導T細胞係以Raji-PDL1或Nalm6-PDL1腫瘤細胞以各種效應對目標(E：T)比率(1：1、1：3、1：5)培養72個小時。在以抗CD3與抗CD19抗體染色與計算珠粒後，使用流動式細胞測量術以監視隨時間的腫瘤目標之溶胞與T細胞之擴增。當以PDL1+腫瘤細胞培養時，相較於1928z T細胞(下面的曲線)，1928z-E27細胞(上面的曲線)繼續擴增至較高的水平。D.經轉導的T細胞係以 Nalm6-PDL1腫瘤細胞刺激，如於圖3C中顯示的，係以Nalm6-PDL1腫瘤細胞以1：5 T E：T比率再刺激。於共培養48個小時後，使用流動式細胞測量術以測定腫瘤目標之溶胞。於再刺激後，相較於1928z細胞，1928z-E27維持溶胞PD-L1腫瘤目標的能力。
圖14顯示經修飾以表現CAR並分泌PD-1封阻性scFv的T細胞之活體內抗腫瘤效力。A.SCID-米色小鼠係於第0日經由靜脈內灌注以Raji-PD-L1腫瘤細胞接種。於第1日，小鼠係以106個CAR+ T細胞靜脈內地灌注且臨床地監視存活。使小鼠在發展出後肢麻痺後安樂死。
圖15A-15D係關於PD-1封阻性scFv(E27)之挑選。A PD-1封阻性mAb候選物E27、E26與E23係以各種濃度用於競爭性結合分析以偵測相較於對照組mAb(瞄準在人類中不存在的不全抗原)對PD-1與PD-L1間的結合之阻礙。E23、E26與E27 mAb皆預防了PD-1與PD-L1間的結合。B從於A中使用的E23、E26與E27 mAb設計的PD-1封阻性scFv之設計之概圖，其中訊號胜肽係連接至可變重鏈序列與絲胺酸甘胺酸連接子與可變輕鏈序列。包含此HIS/HA標籤以用於偵測scFv。C在來自經轉導以表現可分泌的scFv與1928z CAR的293Glv9包裝性細胞的SN上的西方墨漬，以抗HA抗體染色。E27 scFv被以最高的水平偵測到且因此係用於此刊物剩下的部分。D在來自PBMC+4H1128z與PBMC+4H1128z的SN上的西方墨漬，以抗HA mAb染色。
圖16A-16E顯示T細胞可被共修飾以表現CAR並分泌PD-1封阻性scFv(E27)。A代表性流動式細胞測量術圖，其展示在以單單1928z CAR(1928z)或1928z CAR與E27 PD-1封阻性scFv(1928z-E27)轉導後， 在以專一性地結合1928z CAR的19E3 mAb染色後的相等的CAR表現。B在來自以抗HA mAb染色的1928z與1928z-E27 T細胞的SN上的西方墨漬，其僅僅於1928z-E27細胞顯示~30kDa蛋白質，顯示E27 scFv係從以1928z-E27轉導的T細胞而非以單單CAR轉導者分泌。C代表性流動式細胞測量術，其展示於轉導後相較於在1928z T細胞上在1928z-E27 T細胞上的PD-1表現之水平較低。D相較於在1928z T細胞上，在1928z-E27 T細胞上的PD-1之表現係統計上顯著較低，所顯示的數據係來自4個獨立實驗的平均+/- SEM。E 4hr 51Cr釋放分析，其展示Raji腫瘤細胞之溶胞未被E27 scFv之分泌影響。1928z與1928z-E27 T細胞相等地溶胞Raji腫瘤細胞。相較於4H1128z T細胞，對照組4H1128z-E27 T細胞未增加Raji細胞之溶胞。所顯示的數據係兩個獨立實驗之代表。
圖17A-17G顯示在CD19+ PD-L1+腫瘤細胞的背景中，CAR與E27之表現會保護T細胞之增殖能力與溶胞能力。A Raji腫瘤細胞係經反轉錄病毒修飾以表現人類PD-L1(Raji-PDL1)與係以對PD-L1有專一性的mAb染色。親本Raji腫瘤(Raji)未表現PD-L1且Raji-PDL1腫瘤細胞表現高水平的PD-L1。B代表性流動式細胞測量術圖，其等顯示如於72hr共培養後以流動式細胞測量術測定的，相較於1928z T細胞，1928z-E27 T細胞溶胞更多的Raji-PDL1腫瘤細胞。C相較於1928z T細胞，1928z-E27 T細胞溶胞統計上顯著更多的Raji-PDL1腫瘤細胞，所顯示的數據係來自4個獨立的實驗的平均+/- SEM。D如由流動式細胞測量術與計算珠粒所測定的，在以Raji-PDL1腫瘤細胞共培養後，1928z-E27 T細胞擴增至更大的數目，所顯示的數據係來自4個獨立的實驗的T細胞+/- SEM之平均總數。E代表性流動 式細胞測量術圖，其顯示在以Raji-PDL1腫瘤細胞共培養7日後，相較於1928z-E27 T細胞，在1928z T細胞上的PD-1表現增加。F關於PD-1染色之陽性細胞百分比與平均螢光強度(MFI)，相較於1928z-E27 T細胞，1928z T細胞表現顯著更多的PD-1。數據係以來自4個獨立的實驗的平均+/- SEM顯示。G代表性流動式細胞測量術圖，其等顯示在以Raji-PDL1共培養7日後，相較於1928z-E27細胞，2B4+PD-1+1928z T細胞之百分比增加。在2B4+PD-1+族群上1928z-E27 T細胞亦表現較少的BTLA與TIM3。所顯示的數據係3個獨立的實驗之代表。
圖18A-18C顯示在PD-L1的背景中E27保護經CD3/CD28刺激的T細胞之增殖能力。A NIH3T3細胞係經反轉錄病毒修飾以表現人類PD-L1(3T3-PDL1)且係以對PD-L1有專一性的mAb染色。親本NIH3T3(3T3-空)未表現PD-L1且3T3-PDL1腫瘤細胞表現高水平的PD-L1。B 1928z與1928z-E27 T細胞係以3T3-空細胞或3T3-PDL1細胞培養並以CD3/CD28珠粒刺激。計算細胞並於第3、6、9與12日再塗盤在新的3T3細胞上。當以3T3-PDL1細胞培養時，相較於以3T3-空細胞培養，1928z T細胞之擴增減少。當在3T3-空細胞或3T3-PDL1細胞上培養時，1928z-E27細胞具有相等的擴增。所顯示的數據係來自4個獨立的實驗的平均擴增倍數+/- SEM。C代表性流動式細胞測量術圖，其等顯示相較於在3T3-空細胞上培養的1928z T細胞，在以3T3-PDL1培養的1928z T細胞上2B4、PD-1、BTLA與TIM3之表現增加。當以3T3-空與3T3-PDL1培養時，1928z-E27細胞具有相等的2B4、PD-1、BTLA-4與TIM3之表現。所顯示的數據係3個獨立的實驗之代表。
圖19顯示分泌E27 scFv的CAR T細胞具有增加的活體內抗 腫瘤功能。SCID-米色小鼠係以Raji-PDL1腫瘤細胞靜脈內地接種，且於次日係以CAR T細胞靜脈內地灌注。相較於以1928z T細胞治療的小鼠，以1928z-E27 T細胞治療的小鼠具有提高的存活。相較於未經治療的小鼠、與以瞄準不相關的抗原的CAR T細胞(4H1128z與4H1128z-E27細胞)治療的小鼠，以1928z T細胞治療的小鼠存活較長。所顯示的數據係來自2個獨立的實驗。
圖20顯示使用抗PD-1抗體ET130-23、ET130-26與ET130-27的PD1/PDL1封阻性ELISA之結果。ET901(陰性對照組)未顯示結合，而ET130-23、ET130-26與ET130-27在介於0.031與10μg/ml間的濃度範圍顯示了對PD1/PDL1結合的封阻性功效。
圖21顯示使用抗PD-1抗體ET130-23、ET130-26與ET130-27的PD1/PDL2封阻性ELISA之結果。ET901(陰性對照組)未顯示結合，而ET130-23、ET130-26與ET130-27在介於0.031與10μg/ml間的濃度範圍顯示了對PD1/PDL1結合的封阻性功效。
於本文中引用的所有公開案、專利案與其他參考文獻係以其等之整體藉由引用方式納入本文所揭示的內容中。
在實踐本文所揭示的內容上，係使用許多分子生物學、微生物學、細胞生物學、生物化學、與免疫學中的習用技術，其等係在所屬技術領域中的技術內。此等技術係於例如以下者中更詳細地描述：Molecular Cloning：a Laboratory Manual第3版，J.F.Sambrook與D.W.Russell，編輯Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001；Recombinant Antibodies for Immunotherapy， Melvyn Little，編輯Cambridge University Press 2009；"Oligonucleotide Synthesis"(M.J.Gait，編輯，1984)；"Animal Cell Culture"(R.I.Freshney，編輯，1987)；"Methods in Enzymology"(Academic Press,Inc.)；"Current Protocols in Molecular Biology"(F.M.Ausubel等人，編輯，1987，且定期補充)；"PCR：The Polymerase Chain Reaction"，(Mullis等人編輯，1994)；"A Practical Guide to Molecular Cloning"(Perbal Bernard V.，1988)；"Phage Display：A Laboratory Manual"(Barbas等人，2001)。此等參考文獻與其他參考文獻之內容(包含對所屬技術領域中具有通常知識者而言是廣為人知且所依賴的標準方案，包含生產商之操作指南)係特此藉由引用方式納入作為本文所揭示的內容之部分。
於以下的描述中，關於術語之使用，會依循某些慣例。一般地，用於本文中的術語係意欲以與該等術語為所屬技術領域中具有通常知識者所知的意義一致的方式理解。
「抗原結合性蛋白質」係蛋白質或多肽，其包含抗原結合性區域或抗原結合性部分，即對其與之結合的另一分子具有強親和力。抗原結合性蛋白質涵蓋抗體、嵌合性抗原受體與融合蛋白質。
如於技術領域中所知的，「抗體」係關於免疫系統之抗原結合性蛋白質。本文中所提及的術語「抗體」包含完整、全長抗體與任何於其中「抗原結合性部分」或「抗原結合性區域」被維持的其片段、或其單鏈。天然存在的「抗體」係醣蛋白，其包含藉由二硫鍵彼此聯結的至少兩個重(H)鏈與兩個輕(L)鏈。各重鏈由重鏈可變區域(於本文中縮寫成VH)與重鏈恆定(CH)區域構成。該重鏈恆定區域由三個功能域(CH1、CH2與CH3)構成。各輕鏈由輕鏈可變區域(於本文中縮寫成VL)與輕鏈 恆定CL區域構成。該輕鏈恆定區域由一個功能域(CL)構成。該VH與VL區域可被進一步再分成具有高度變異的區域(稱為互補性決定區域，CDR)以及散佈於其等間的較保守的區域(稱為構架區域，FR)。各VH與VL係由從胺基端至羧基端以以下順序排列的三個CDR與四個FR構成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈與輕鏈之可變區域包含結合性功能域，其與抗原交互作用。抗體之恆定區域可介導免疫球蛋白與宿主組織或因子(包含形形色色的免疫系統之細胞(例如效應細胞)與經典補體系統之第一組份(Clq))之結合。
用於本文，術語抗體之「抗原結合性部分」或「抗原結合性區域」係關於賦予抗原專一性的抗體之區域或部分；抗原結合性蛋白質(例如抗體)之片段，因此包含維持與抗原(例如HLA-胜肽複合體)專一性地結合的能力的抗體之一或多個片段。咸已顯示抗體之抗原結合性功能可藉由全長抗體之片段進行。為術語抗體之「抗體片段」所涵蓋的抗原結合性片段之實例包含Fab片段，其為由VL、VH、CL與CH1功能域所組成的單價片段；F(ab)2片段，其為包含藉由位於樞紐區域的二硫橋連接的兩個Fab片段的雙價片段；Fd片段，其由VH與CH1功能域所組成；Fv片段，其由抗體之單臂之VL與VH功能域所組成；Fab片段(Ward等人，1989 Nature 341：544-546)，其由VH功能域所組成；與經分離的互補性決定區域(CDR)。
此外，雖然Fv片段之兩個功能域(VL與VH)係由不同的基因編碼，其等可使用重組方法藉由使其等可以其中VL與VH區域配對以形成單價分子的單一蛋白質鏈的形式製作的合成性連接子聯結。此等被稱為單鏈Fv(scFv)；參見例如Bird等人，1988 Science 242：423-426；與Huston 等人，1988 Proc.Natl.Acad.Sci.85：5879-5883。如此單鏈抗體亦意欲被涵蓋在術語抗體之「抗原結合性部分」內。此等抗體片段係使用所屬技術領域中具有通常知識者已知的習用技術獲得，且該等片段係被篩選以以與完整抗體相同的方式利用。
「重組抗體」或「重組抗原結合性蛋白質」係具有已基於結合特徵鑑認與選擇以用於納入重組生產的抗原結合性蛋白質(例如抗體)中的抗原結合部分者。
術語「其同源序列」係關於胺基酸與核苷酸序列，其等與表1-14中顯示的序列具有介於60與99.9%的一致性。在一些具體態樣中，同源序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、或99.9%一致性。在一個具體態樣中，同源序列具有95-99.9%一致性；在另一個具體態樣中，該同源序列具有98-99.9%。
在一個具體態樣中，與人類PD-1專一性地結合的單鏈可變片段(scFv)被挑選與測試。scFv係自為私有完全人類抗體scFv噬菌體文庫(Eureka Therapeutics，Emeryville CA)的噬菌體展示文庫分離。該文庫由來自超過100個白種人與亞洲人健康供者、與來自患有自體免疫疾病(諸如全身性紅斑性狼瘡、硬皮症、等等)的供者的人類抗體庫構成。
用於抗體噬菌體淘選的抗原係重組融合蛋白質，融合至人類IgG1 Fc的PD-1細胞外功能域(PD-1 ECD-Fc功能域。編碼PD-1 ECD與hIgG1 Fc的DNA序列係由Genewiz,Inc.(South Plainfield，NJ)合成。然後將DNA序列次選殖入Eureka之私人的哺乳類動物表現載體中，其然後被轉染至 HEK293細胞中以用於融合蛋白質表現。PD-1 ECD-Fc融合蛋白質係在細胞一個個死掉後藉由標準FPLC方法自HEK293細胞培養基純化。
使用人類scFv抗體噬菌體展示文庫以挑選mAb殖系。簡言之，經生物素化的抗原(PD-1 ECD-Fc融合蛋白質)可首先與人類scFv噬菌體文庫混合，然後抗原-scFv抗體複合物可藉由與鏈霉抗生物素結合的Dynabead M-280通過磁性架拉下。然後可洗提經結合的殖系並將其用於感染大腸桿菌XL1-Blue。於該細菌中表現的scFv噬菌體殖系可被純化(Yasmina NA、等人Probing the binding mechanism and affinity of tanezurmab,arecoimbinant humanized anti-NGF monoclonal antibody,using a repertoire of biosensors.Protein Science 2008；17(8)：1326-1335；Roberts WK、等人Vaccination with CD20 peptides induces a biologically active,specific immune in mice.Blood 2002：99(10)：3748-3755)。可進行淘選3-4輪以富集與PD-1專一性地結合的scFv噬菌體殖系。陽性殖系可藉由標準ELISA方法依靠經生物素化單鏈PD-1測定。陽性殖系可被進一步測試其等與在活細胞表面上的PD-1間的結合，其藉由流動式細胞測量術，使用PD-1+細胞系，例如3T3細胞系。
有些本文所揭示的內容涵蓋的殖系於本文中係稱為殖系14、16、18、19、23、26、27、31、36、37、40、42、46、與47。可變輕(VL)與可變重(VH)鏈胺基酸序列與編碼此等具體態樣的核苷酸序列係於以下表1-14中顯示。在一些具體態樣中，該VL與VH序列係以絲胺酸甘胺酸連接子連接以形成scFv。在一些具體態樣中，可包含HA/His標籤以允許偵測該scFv。
在一些具體態樣中，本文所揭示的內容包含抗體，其具有與 一或多個重鏈之恆定功能域融合的scFv序列以形成具有人類免疫球蛋白之Fc區域的抗體以產生雙價蛋白質，增加該抗體之整體結合性與穩定性。此外，該Fc部分允許其他分子(包含但不限於螢光染劑、細胞毒素、放射性同位素、等等)與抗體的直接結合以(例如)用於抗原定量研究、以固定該抗體以用於親和力測量、用於標靶性遞送治療劑、以使用免疫效應細胞測試Fc介導性細胞毒性與許多其他應用。
在一些具體態樣中，該抗PD-1抗原結合性蛋白質可包含一或多個構架區域胺基酸取代，該等取代經設計以改善蛋白質穩定性、抗體結合性、表現水平或以導入用於結合治療劑的位置。此等scFv然後係用於根據所屬技術領域中具有通常知識者已知的方法製造重組人類單株Ig。
在一些具體態樣中，該抗原結合性蛋白質係嵌合性抗原受體(CAR)。嵌合性抗原受體治療(CAR-T治療)係一種新形式的標靶性免疫治療。其融合單株抗體之精緻的標靶專一性與細胞毒性T細胞所提供的有效細胞毒性與長期持續性。此技術使T細胞能夠取得獨立於內生性TCR的長期新穎抗原專一性。臨床試驗已於以下者中顯示CAR-T治療之臨床顯著的抗腫瘤活性：神經胚細胞瘤(Louis C.U.等人，Blood 118(23)：6050-6056)、B-ALL(Maude S.L.等人，N.Engl.J.Med.371(16)：1507-1517,2014)、CLL(Brentjens R.J.等人，blood 118(18)：4817-4828，2011)、與B細胞淋巴瘤(Kochenderfer J.N.等人，blood.116(20)：4099-4102，2010)。於一個研究中，報導了於30個以CD19-CAR T治療治療的患有B-ALL的患者中90%的完全緩解率(Maude S.L.等人，如上)。
在一些具體態樣中，該嵌合性抗原受體包含細胞外功能域， 其包含抗體部分、跨膜功能域、與細胞內傳訊功能域。在一些具體態樣中，該細胞內傳訊功能域包含CD3 ζ細胞內傳訊序列與共刺激性傳訊序列。在一些具體態樣中，該共刺激性傳訊序列係CD28細胞內傳訊序列。
本文所揭示的內容之其他方面包含(但不限於)使用抗原結合性蛋白質與編碼其等的核酸以治療與PD1聯結的疾病、以用於診斷應用與預後應用以及用作為用於在細胞與組織中偵測PD1的研究工具。包含本文所揭示的抗原結合性蛋白質與核酸的醫藥組成物係被本文所揭示的內容涵蓋。用於藉由使用載體的免疫治療的基於抗體的治療的包含本文所揭示的內容之核酸的載體亦被本文所揭示的內容考慮。載體包含使抗體之表現與分泌成為可能的表現載體、以及針對抗原結合性蛋白質(諸如嵌合性抗原受體，CAR)之細胞表面表現的載體。
包含該等核酸的細胞(例如已以本文所揭示的內容之載體轉染的細胞)亦為本文所揭示的內容涵蓋。
對於用於診斷應用與研究應用，亦提供套組，其包含本文所揭示的內容之PD1抗體或核酸、分析試劑、緩衝劑、與類似者。
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在一個其中該抗原結合性蛋白質係全長抗體的具體態樣中，本文所揭示的內容之抗體之重鏈與輕鏈可為全長(例如抗體可包含至少一個，且較佳係兩個完整的重鏈，與至少一個，且較佳係兩個完整的輕鏈)或可包含抗原結合性部分(Fab、F(ab')2、Fv或單鏈Fv片段(「scFv」))。在其他的具體態樣中，該抗體重鏈恆定區域係選自例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD、與IgE。在一些具體態樣中，該免疫球蛋白同型係選自IgG1、IgG2、IgG3、與IgG4，更具體言之為IgG1(例如人類IgG1)。抗體類型之選擇會取決於該抗體經設計以引起的免疫效應功能。
於構築重組免疫球蛋白中，用於形形色色的免疫球蛋白同型之恆定區域的適當的胺基酸序列與用於製造廣大系列的抗體的方法係所屬 技術領域中具有通常知識者已知。
編碼於本文中鑑認的抗原結合性蛋白質的核酸可用於工程重組免疫效應細胞。例如，用於生產經遺傳修飾的T細胞的方法與載體係技術領域中已知的(參見Brentjens等人，Safety and persistence of adoptively transferred autologous CD19-targeted T cells in patients with relapsed or chemotherapy refractory B-cell leukemias，Blood 118(18)：4817-4828，2011年11月)。
本文所揭示的內容之其他具體態樣包含含有編碼本文所揭示的內容之抗原結合性蛋白質或其抗原結合性片段的核酸的細胞與表現載體。該細胞可為重組免疫效應細胞，諸如經遺傳修飾以表現包含根據本文所揭示的內容的抗原結合區域的嵌合性抗原受體的T細胞。已經工程以製造根據本文所揭示的內容的抗體的細胞亦被本文所揭示的內容涵蓋。
此外，本文所揭示的內容包含製造本文所揭示的內容之抗體或抗體片段的方法，其包含：(a)在其中核酸序列會被表現的條件下於培養基中培養包含編碼本文所揭示的內容之抗體或抗體片段的核酸的重組細胞，藉此製造包含輕鏈與重鏈可變區域的多肽；與(b)自宿主細胞或培養基回收該多肽。
本文所揭示的內容之抗原結合性蛋白質之一些具體態樣涵蓋拮抗性抗PD1抗體以及作為PD1之促效劑而起作用的抗PD1抗體。儘管一些抗PD1抗體係拮抗劑(即其等封阻PD1與其配體間的結合)，其他者係促效劑，具有提高PD-1之免疫抑制訊號的功效的抗體，(例如)使其等有用於治療自體免疫疾病。展現拮抗劑活性的本文所揭示的內容之抗體包含 殖系23與27而殖系16、18、26、31與40似乎作為促效劑起作用。
本文所揭示的內容亦包含本文所揭示的內容之抗PD-1抗體或抗體片段用於製備用於增加免疫反應的醫藥品的用途以及本文所揭示的內容之抗PD-1抗體或抗體片段用於製備用於治療癌症的醫藥品的用途。
包含本文中所揭示的抗原結合性蛋白質、抗體、核酸、載體或包含該核酸或抗原結合性蛋白質的細胞以及醫藥上可接受的載劑的醫藥組成物亦為本文所揭示的內容涵蓋。
本文所揭示的內容亦包含本文所揭示的內容之抗PD-1抗體或抗體片段作為疫苗佐劑的用途。
在另一個方面，本文所揭示的內容係關於免疫結合物，其包含為如本文中所揭示的抗原結合性蛋白質、抗體或其抗原結合性片段的第一組份。該免疫結合物包含為細胞毒素、可偵測標籤、放射性同位素、治療劑、結合性蛋白質或具有第二胺基酸序列的分子的第二組份。在該第二組份係結合性蛋白質或第二抗體的情況下，該結合性蛋白質或第二抗體對與該第一者對其有專一性的HLA-胜肽複合體不同的目標具有結合專一性。
本文所揭示的內容亦係關於用於治療具有與PD-1聯結的疾病的接受者的方法，其包含將治療有效量的如本文中所揭示的抗原結合性蛋白質、抗體或其抗原結合性片段、嵌合性抗原受體(CAR)、編碼該抗原結合性蛋白質的核酸或包含該核酸或蛋白質的細胞投予至該接受者。
所屬技術領域中具有通常知識者會認知到在本發明之範圍與精神內數種具體態樣係可能的。本發明現將藉由參照以下非限制性實施例更詳細描述。以下實施例進一步闡明本發明，但(當然)不應被解釋成 構成任何範圍之限制。
實施例 實施例1
為測試scFvs抑制PD-1連接的能力，產生scFv-Fc功能域(scFv-Fc)融合蛋白質，其中scFv被連接至小鼠Fc(小鼠IgG1a)功能域。然後藉由以人類PD-1單體塗覆ELISA盤來分析scFv-Fc殖系結合PD-1的能力。scFv與PD-1間的結合係使用與HRP結合的抗小鼠IgG1 Fc二級抗體來定量。所有七個抗體皆以劑量依賴性的方式顯示有關於PD1單體的結合活性(圖1)。ET901 ScFv-Fc(小鼠IgG1 Fc)係作為陰性對照組。scFv-Fc殖系之結合親和力被評級，其中殖系31弱地結合且殖系26與27結合最強(31<23<40<18<16=27<26)。
實施例2
為測試scFv-Fc抑制PD-1與PD-L1交互作用的能力，進行如於圖2A中概要性顯示的競爭性配體結合分析。於此分析中，將PD-L1-Fc塗覆至ELISA盤上。將經生物素化的PD1-Fc與經連續稀釋的ET901 ScFv-Fc(陰性對照組)或抗PD1 ScFv-Fc混合且然後將其添加至經PD-L1-Fc塗覆的盤。與塗覆在盤上的PD-L1結合的PD-1-Fc係透過與HRP結合的鏈霉抗生物素顯像(圖2B)。當比較類似濃度的scFv-Fc(圈起)時，瓦解PD-1-PDL1交互作用的能力被評級，其中殖系40與23具有最弱的如此能力且殖系26具有最強的如此能力(26>27=16>18>31>23=40，圖2B)。
實施例3
然後研究此等殖系調節專一性T細胞功能的能力。吾人先 前已產生腫瘤標靶性T細胞，其中T細胞係以反轉錄病毒轉導以表現腫瘤專一性嵌合性抗原受體(CAR)。吾人先前已展示了CAR之表現已使T細胞功能方向改變成瞄準給定抗原(Brentjens、Santos等人2007)。於吾人之實驗室中，吾人使用對CD19有專一性的CAR(稱為1928z)瞄準B細胞惡性腫瘤(Brentjens、Santos等人2007)。吾人先前已展示了經CAR修飾的T細胞已於試管內與活體內且於臨床研究中展示了顯著的抗腫瘤活性(Brentjens、Latouche等人2003；Brentjens、Davila等人2013；Davila、Riviere等人2014)。為測定該等7個scFv殖系是否為促效性(刺激PD-1)、拮抗性(封阻PD-1)或對PD-1無顯著功效，吾人藉由在接近抗PD-1 scFv基因處包含小鼠kappa前導序列而生產了可分泌的scFv(圖3)。吾人然後生產了雙作用子反轉錄病毒載體以誘發1928z CAR之表現與抗PD-1 scFv從經轉導人類周邊血液T細胞之分泌。
實施例4
考慮到PD-1刺激抑制T細胞增殖與功能的能力，吾人隨後試圖界定抗PD-1 scFv對T細胞增殖的功效之特徵。為達成此，自健康供者之周邊血液分離人類T細胞並透過反轉錄病毒轉導修飾其以表現CAR並分泌PD-1-專一性scFv，其使用先前已被描述的方法論(Brentjens、Santos等人2007)。於轉導後，監視經修飾的T細胞之試管內擴增(圖4)。表現1928z CAR並分泌PD-1專一性scFv殖系23與27的T細胞以及經修飾以僅僅表現1928z CAR的T細胞擴增。經修飾以表現CAR並分泌PD-1-專一性scFv殖系16、18、26、31或40的細胞並未增殖，暗示此等PD-1-專一性scFv殖系係促效性，可能刺激PD-1與隨即造成T細胞增殖減少。
實施例5
除了擴增研究外，吾人共培養了T細胞(表現CAR或CAR並分泌PD-1-專一性scFv)與CD19+ Burket氏淋巴瘤腫瘤細胞系Raji並測定了從T細胞分泌的細胞介素之水平。如於圖5中顯示的，相較於經修飾以表現單單CAR的細胞，經修飾以表現1928z CAR並分泌PD-1-專一性scFv殖系23或27的T細胞分泌更多IFN-γ，暗示此等scFv殖系對PD-1傳訊係拮抗性。相較於以單單CAR修飾的細胞，經修飾以表現1928z CAR並分泌PD-1-專一性scFv殖系16、18、2、31或40的細胞分泌較少的IFN-γ，暗示此等scFv對PD-1係促效性且抑制了T細胞功能。
實施例6
經修飾以表現1928 CAR與PD-1封阻性scFv的人類T細胞係藉由流動式細胞測量術分析。在核實CAR之表現(圖6)後，scFv之存在係使用對從經高爾基抑制劑處理的人類T細胞製備的溶胞產物的西方墨漬測定(使用對在scFv設計中納入的HA標籤有專一性的抗體)以允許偵測細胞溶胞產物。相較於其他殖系，經修飾以表現1928z CAR與殖系23的人類T細胞具有顯著較少的scFv蛋白質(圖7)。此等細胞然後被置於表現或不表現PD-1配體PD-L1/L2的3T3小鼠纖維母細胞(人工抗原呈現細胞，aAPC)上。在以aAPC培養24個小時後，將CD3/D28珠粒添加至培養物以活化人類T細胞。於培養人類T細胞3日後，計算aAPC與珠粒人類T細胞以測定PD-1配體之存在是否抑制了珠粒驅動的人類T細胞之擴增，或抗PD-1 scFv是否預防了T細胞擴增之PD-1配體介導性抑制。相較於在不表現抑制性配體的aAPC上，經修飾以表現1928z CAR與抗PD-1 scFv殖系26與 23的T細胞在表現PD-L1/L2的aAPC上的增殖減少(圖8)。相反地，經修飾以表現1928z CAR與抗PD-1 scFv殖系27的T細胞在表現PD-L1/L2的aAPC上的擴增增加。
實施例7
使用技術領域中已知的重組技術，自PD-1專一性scFv產生重組人類單株抗體，即完全人類Ig分子係以與在相對應scFv中找到者相同的可變重鏈與輕鏈製造(參見以上表1-14與圖9)。此等單株抗體與PD-1間的結合係使用流動式細胞測量術展示(參見圖10)。
修飾人類T細胞以過度表現人類PD-1，然後將其以1μg/ml的抗體培養其。殖系27 mAb與PD-1 T細胞結合最大，接著是殖系26且然後是殖系23(圖9)。對照組單株抗體901不與PD-1 T細胞結合。然後將以此等抗體培養的T細胞置於具有珠粒的人工抗原呈現細胞(aAPC)上以測定PD-1配體對T細胞之擴增的影響與單株抗體預防此交互作用的能力。以抗PD-1殖系27單株抗體培養的19z1 T細胞在PD-L1/L2 aAPC上擴增至較大的程度。
實施例8
當存在抗PD-1殖系27單株抗體時，培養在表現PD-L1/L2的aAPC上的經修飾以表現第一世代CAR的T細胞擴增。經修飾以表現第一世代CD19專一性CAR(19z1)的人類T細胞係以抗PD-1單株抗體培養24個小時然後被放置在表現或不表現PD-L1/L2的aAPC上。在以aAPC刺激24個小時後，接著以CD3/CD28珠粒刺激細胞。於三日後，計算細胞。相較於在無抑制性配體的aAPC上(圖11有框的條)，以無單株抗體、對照 組抗體(901)與殖系23與26單株抗體培養的19z1 T細胞在表現PD-1配體的aAPC上擴增遠較小(圖11無框的條)。然而，以抗PD-1殖系27單株抗體培養的19z1 T細胞在PD-L1/L2 aAPC上擴增至較大的程度。所顯示的數據係一個實驗之代表。
實施例9
經進一步修飾以分泌PD-1封阻性scFv(E27)的CAR T細胞之產生。產生雙作用子反轉錄病毒構築體，其編碼CD19專一性CAR(稱為1928z)或卵巢腫瘤抗原專一性CAR(稱為4H1128z)與PD-1封阻性scFv(E27)(圖12A)。E27前面有一訊號胜肽(小鼠IgK)以允許該scFv之分泌。亦包含一HA/His標籤以在自T細胞分泌後偵測該scFv。人類周邊血液T細胞係以編碼CAR、1928z、或CAR與E27 PD-1封阻性scFv(1928z-E27)的反轉錄病毒構築體轉導。於轉導後，使用流動式細胞測量術以偵測CAR之表現，使用專一性地結合瞄準CD19的CAR的抗體(被稱為19E3)(圖12B)。利用來自經轉導人類T細胞的上清液之西方墨漬分析以用抗HA抗體偵測PD-1封阻性scFv(圖12C)。吾人亦研究來自經修飾以表現CAR與對照組scFv(B6，其係使用抗c-myc標籤抗體偵測)的T細胞的scFv分泌。進行對兩個CD19+腫瘤目標的標準51Cr釋放分析以確保scFv之分泌並未阻礙CAR使T細胞溶胞能力改變方向的能力。表現單單CAR的CAR T細胞(1928z或4H1128z對照組CAR)、表現CAR與E27 scFv的CAR T細胞(1928z-E27或4H1128z-E27)、或表現CAR與對照組scFv的CAR T細胞(1928z-B6H12.2或4H1128z-B6H12.2)係以經51Cr標記的腫瘤細胞(Raji或Nalm6)培養4個hr。表現CD19專一性CAR的T細胞能夠以相等的水平溶 胞腫瘤目標，且瞄準卵巢的CAR T細胞不能夠溶胞Raji或Nalm6(圖12D)。因此，吾人作出以下結論：scFv之分泌並未阻礙CAR使T細胞溶胞能力改變方向的能力。
實施例10
經修飾以表現CAR並分泌PD-1封阻性scFv的T細胞試管內抗拒來自PD-L1-PD-1交互作用的抑制。表現單單CAR的T細胞(1928z)、或表現CAR與PD-1封阻性scFv的T細胞(1928z-E27)係培養在3T3細胞空細胞或經修飾以表現人類PD-L1的3T3細胞上。於在3T3餵養細胞上24個小時後，將細胞用以1：3珠粒：T細胞比率添加至培養物的CD3/CD28珠粒刺激。T細胞之擴增係以台盼藍計算測定且將新鮮的珠粒添加至培養物兩次(以箭頭指出)。然而，在3T3空餵養細胞上擴增的1928z T細胞並未在3T3-PD-L1餵養細胞上擴增。相反地，1928z-E27 T細胞在3T3空細胞與3T3-PD-L1餵養細胞上皆擴增，表明對PD-L1-PD-1介導性抑制的抗性(圖13A)。如於圖13A中顯示的在3T3空細胞或3T3-PD-L1細胞上培養的T細胞係藉由流動式細胞測量術分析以偵測在抑制性受體(PD-1、2B4與LAG3)上的表現。相較於1928z-E27細胞(未顯示)，1928z細胞表現水平增加的PD-1。當以PD-1+細胞限制時，2B4與LAG3之分析展現1928z細胞相較於1928z-E27細胞具有較高比例的PD-1+、2B4+與LAG3+細胞(圖13B)。經轉導T細胞係以Raji-PDL1或Nalm6-PDL1腫瘤細胞以各種效應對目標(E：T)比率(1：1、1：3、1：5)培養72個小時。在以抗CD3與抗CD19抗體染色與計算珠粒後，使用流動式細胞測量術以監視隨時間的腫瘤目標之溶胞與T細胞之擴增。當以PDL1+腫瘤細胞培養時，相較於1928z T細胞，1928z-E27 細胞繼續擴增至較高的水平(圖13C)。經轉導的T細胞係以Nalm6-PDL1腫瘤細胞刺激，如於圖3C中顯示的，係以Nalm6-PDL1腫瘤細胞以1：5 T E：T比率再刺激。於共培養48個小時後，使用流動式細胞測量術以測定腫瘤目標之溶胞。於再刺激後，相較於1928z細胞，1928z-E27維持溶胞PD-L1腫瘤目標的能力(圖13D)。
實施例11
經修飾以表現CAR並分泌PD-1封阻性scFv的T細胞之活體內抗腫瘤效力係於圖14中顯示。SCID-米色小鼠係於第0日經由靜脈內灌注以Raji-PD-L1腫瘤細胞接種。於第1日，小鼠係以106個CAR+ T細胞靜脈內地灌注且臨床地監視存活。使小鼠在發展出後肢麻痺後安樂死。
實施例12
PD-1封阻性mAb候選物E27、E26與E23係以各種濃度用於競爭性結合分析以偵測相較於對照組mAb(瞄準在人類中不存在的不全抗原)對PD-1與PD-L1間的結合之阻礙。E23、E26與E27 mAb皆預防了PD-1與PD-L1間的結合(圖15A)。在來自經轉導以表現可分泌的scFv與1928z CAR的293Glv9包裝性細胞的SN上的西方墨漬，以抗HA抗體染色。E27 scFv被以最高的水平偵測到且因此係用於此研究剩下的部分(圖15C)。
實施例13
T細胞可被共修飾以表現CAR並分泌PD-1封阻性scFv(E27)。圖16A係代表性流動式細胞測量術圖，其展示在以單單1928z CAR(1928z)或1928z CAR與E27 PD-1封阻性scFv(1928z-E27)轉導後，在以專一性地結合1928z CAR的19E3 mAb染色後的相等的CAR表現。圖16B顯示在來 自以抗HA mAb染色的1928z與1928z-E27 T細胞的SN上的西方墨漬，其僅僅於1928z-E27細胞顯示~30kDa蛋白質，顯示E27 scFv係從以1928z-E27轉導的T細胞而非以單單CAR轉導者分泌。圖16C係代表性流動式細胞測量術，其展示於轉導後相較於在1928z T細胞上在1928z-E27 T細胞上的PD-1表現之水平較低。相較於在1928z T細胞上，在1928z-E27 T細胞上的PD-1之表現係統計上顯著較低，所顯示的數據係來自4個獨立實驗的平均+/- SEM(圖16D)。4hr 51Cr釋放分析，其展示Raji腫瘤細胞之溶胞未被E27 scFv之分泌影響。1928z與1928z-E27 T細胞相等地溶胞Raji腫瘤細胞。相較於4H1128z T細胞，對照組4H1128z-E27 T細胞未增加Raji細胞之溶胞(圖16E)。所顯示的數據係兩個獨立實驗之代表。
實施例14
在CD19+ PD-L1+腫瘤細胞的背景中，CAR與E27之表現會保護T細胞之增殖能力與溶胞能力。Raji腫瘤細胞係經反轉錄病毒修飾以表現人類PD-L1(Raji-PDL1)與係以對PD-L1有專一性的mAb染色。親本Raji腫瘤(Raji)未表現PD-L1且Raji-PDL1腫瘤細胞表現高水平的PD-L1(圖17A)。圖17B顯示代表性流動式細胞測量術圖，其等顯示如於72hr共培養後以流動式細胞測量術測定的，相較於1928z T細胞，1928z-E27 T細胞溶胞更多的Raji-PDL1腫瘤細胞。相較於1928z T細胞，1928z-E27 T細胞溶胞統計上顯著更多的Raji-PDL1腫瘤細胞，所顯示的數據係來自4個獨立的實驗的平均+/- SEM(圖17C)。如由流動式細胞測量術與計算珠粒所測定的，在以Raji-PDL1腫瘤細胞共培養後，1928z-E27 T細胞擴增至更大的數目，所顯示的數據係來自4個獨立的實驗的T細胞+/- SEM之平均總數(圖17D)。 圖17E顯示代表性流動式細胞測量術圖，其顯示在以Raji-PDL1腫瘤細胞共培養7日後，相較於1928z-E27 T細胞，在1928z T細胞上的PD-1表現增加。關於PD-1染色之陽性細胞百分比與平均螢光強度(MFI)，相較於1928z-E27 T細胞，1928z T細胞表現顯著更多的PD-1。數據係以來自4個獨立的實驗的平均+/- SEM顯示(圖17F)。圖17G顯示代表性流動式細胞測量術圖，其等顯示在以Raji-PDL1共培養7日後，相較於1928z-E27細胞，2B4+PD-1+1928z T細胞之百分比增加。在2B4+PD-1+族群上1928z-E27 T細胞亦表現較少的BTLA與TIM3。所顯示的數據係3個獨立的實驗之代表。
實施例15
在PD-L1的背景中E27保護經CD3/CD28刺激的T細胞之增殖能力。NIH3T3細胞係經反轉錄病毒修飾以表現人類PD-L1(3T3-PDL1)且係以對PD-L1有專一性的mAb染色。親本NIH3T3(3T3-空)未表現PD-L1且3T3-PDL1腫瘤細胞表現高水平的PD-L1(圖18A)。1928z與1928z-E27 T細胞係以3T3-空細胞或3T3-PDL1細胞培養並以CD3/CD28珠粒刺激。計算細胞並於第3、6、9與12日再塗盤在新的3T3細胞上。當以3T3-PDL1細胞培養時，相較於以3T3-空細胞培養，1928z T細胞之擴增減少。當在3T3-空細胞或3T3-PDL1細胞上培養時，1928z-E27細胞具有相等的擴增(圖18B)。所顯示的數據係來自4個獨立的實驗的平均擴增倍數+/- SEM。圖18C係代表性流動式細胞測量術圖，其等顯示相較於在3T3-空細胞上培養的1928z T細胞，在以3T3-PDL1培養的1928z T細胞上2B4、PD-1、BTLA與TIM3之表現增加。當以3T3-空與3T3-PDL1培養時，1928z-E27細胞具有相等的2B4、PD-1、RTLA-4與TIM3之表現。所顯示的數據係3個獨立的實驗之代表。
實施例16
分泌E27 scFv的CAR T細胞具有增加的活體內抗腫瘤功能。SCID-米色小鼠係以Raji-PDL1腫瘤細胞靜脈內地接種，且於次日係以CAR T細胞靜脈內地灌注。如於圖19中顯示的，相較於以1928z T細胞治療的小鼠，以1928z-E27 T細胞治療的小鼠具有提高的存活。相較於未經治療的小鼠、與以瞄準不相關的抗原的CAR T細胞(4H1128z與4H1128z-E27細胞)治療的小鼠，以1928z T細胞治療的小鼠存活較長。所顯示的數據係來自2個獨立的實驗。
實施例17
抗PD-1抗體ET130-23、ET130-26與ET130-27係藉由ELISA測試以檢查對PD1/PDL1結合的封阻性功效。如於圖20中顯示的，ET901(陰性對照組)未顯示結合，而ET130-23、ET130-26與ET130-27在介於0.031與10μg/ml間的濃度範圍顯示了對PD1/PDL1結合的封阻性功效。
類似地，ET130-23、ET130-26與ET130-27係藉由ELISA測試以檢查對PD1/PDL2結合的封阻性功效。如於圖21中顯示的，ET901(陰性對照組)未顯示結合，而ET130-23、ET130-26與ET130-27在相同的濃度範圍顯示對PD1/PDL2結合的封阻性功效。ET130-26顯示最高的對PD1/PDL2的封阻性功效，而ET130-23顯示最低的功效。封阻模式與PD1/PDL1結合平行。
實施例18
研究抗PD-1 scFv或單株抗體之施用中scFv或單株抗體抑制免疫反應與破壞自體免疫疾病的能力。此亦可使用GVHD之小鼠模型研究。 將人類T細胞灌注至經照射處理的NOD.SCID.IL-2R γ-/-中導致人類細胞之移植與嚴重的GVHD，其中人類T細胞攻擊小鼠組織。將分泌抗PD-1 scFv的T細胞(或以注射單株抗體來增強的T細胞)灌注至接受者中並評估GVHD之發展。當抗PD-1 scFv/mAb係促效性時，GVHD反應由於人類T細胞之抑制而被抑制。
例示性具體態樣
1.一種重組抗原結合性蛋白質或其抗原結合性片段，其包含以下者之一：(A)一抗原結合區域，其包含選自由以下者所組成的群組的胺基酸序列：SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：142；其片段與其同源序列；(B)一抗原結合區域，其包含分別具有選自以下者的胺基酸序列的可變輕鏈(VL)與可變重鏈(VH)：SEQ ID NO：6與8；SEQ ID NO：17與19；SEQ ID NO：28與30；SEQ ID NO：39與41；SEQ ID NO：49與51；SEQ ID NO：57與59；SEQ ID NO：68與70；SEQ ID NO：79與81；SEQ ID NO：90與92；SEQ ID NO：99與101；SEQ ID NO：110與112；SEQ ID NO：121與123；SEQ ID NO：129與131；SEQ ID NO：138與140；其片段與其同源序列；(C)一抗原結合區域，其包含：(i)一輕鏈(LC)，其包含分別具有胺基酸序列QSISSY(SEQ ID NO：1)、AAS與QQSYSTPLT(SEQ ID NO：2)的輕鏈互補性決定區域(LCCDR)LCCDR1、 LCCDR2與LCCDR3，與一重鏈(HC)，其包含分別具有胺基酸序列GFTSSSYW(SEQ ID NO：4)、IKQDGSEK(SEQ ID NO.5)與ARGGWSYDM(SEQ ID NO：6)的重鏈互補性決定區域(HCCDR)HCCDR1、HCCDR2與HCCDR3；其片段與其同源序列；(ii)一輕鏈(LC)，其包含分別具有胺基酸序列SSNIGAGYA(SEQ ID NO：12)、TNN與QSYDSSLSGVI(SEQ ID NO：13)的LCCDR1、LCCDR2與LCCDR3，與一重鏈(HC)，其包含分別具有胺基酸序列GYTLTELS(SEQ ID NO：14)、FDPEDGET(SEQ ID NO.15)與ARAYYGFDQ(SEQ ID NO：16)的HCCDR1、HCCDR2與HCCDR3；其片段與其同源序列；(iii)一輕鏈(LC)，其包含分別具有胺基酸序列SSNIGNNA(SEQ ID NO：23)、YND與AAWDDSVNGYV(SEQ ID NO：24)的LCCDR1、LCCDR2與LCCDR3，與一重鏈(HC)，其包含分別具有胺基酸序列GYTFTRFG(SEQ ID NO：25)、ISVNNGNT(SEQ ID NO.26)與ARYMYGRRDS(SEQ ID NO：27)的HCCDR1、HCCDR2與HCCDR3；其片段與其同源序列；(iv)一輕鏈(LC)，其包含分別具有胺基酸序列NIGSKS(SEQ ID NO：34)、YDS與QVWDNHSDVV(SEQ ID NO：35)的LCCDR1、LCCDR2與LCCDR3，與一重鏈(HC)，其包含分別具有胺基酸序列RNKFSSYA(SEQ ID NO：36)、ISGSGGTT(SEQ ID NO.37)與ARWYSSYYDV(SEQ ID NO：38)的HCCDR1、HCCDR2與HCCDR3；其片段與其同源序列；(v)一輕鏈(LC)，其包含分別具有胺基酸序列NIGSKS(SEQ ID NO：34)、YDS與QVWDSSSDYV(SEQ ID NO：45)的LCCDR1、LCCDR2與LCCDR3，與一重鏈(HC)，其包含分別具有胺基酸序列GFTFSSYA(SEQ ID NO：46)、 ISGSGGST(SEQ ID NO.47)與ARNYISMFDS(SEQ ID NO：48)的HCCDR1、HCCDR2與HCCDR3；其片段與其同源序列；(vi)一輕鏈(LC)，其包含分別具有胺基酸序列NIGSKS(SEQ ID NO：34)、YDS與QVWDSSSDHV(SEQ ID NO：55)的LCCDR1、LCCDR2與LCCDR3，與一重鏈(HC)，其包含分別具有胺基酸序列GFTFSSYA(SEQ ID NO：46)、ISGSGGST(SEQ ID NO.47)與ARGYSSYYDA(SEQ ID NO：56)的HCCDR1、HCCDR2與HCCDR3；其片段與其同源序列；(vii)一輕鏈(LC)，其包含分別具有胺基酸序列RSNIGENT(SEQ ID NO：63)、SNN與AAWDDRLNGYV(SEQ ID NO：64)的LCCDR1、LCCDR2與LCCDR3，與一重鏈(HC)，其包含分別具有胺基酸序列GYTFTNYG(SEQ ID NO：65)、IGAQKGDT(SEQ ID NO.66)與ARSQGVPFDS(SEQ ID NO：67)的HCCDR1、HCCDR2與HCCDR3；其片段與其同源序列；(viii)一輕鏈(LC)，其包含分別具有胺基酸序列RSNIGSNT(SEQ ID NO：74)、NNN與ATWDDSLNEYV(SEQ ID NO：75)的LCCDR1、LCCDR2與LCCDR3，與一重鏈(HC)，其包含分別具有胺基酸序列GYTFTRYG(SEQ ID NO：76)、ISGYNGNT(SEQ ID NO.77)與ARHGYGYHGD(SEQ ID NO：78)的HCCDR1、HCCDR2與HCCDR3；其片段與其同源序列；(ix)一輕鏈(LC)，其包含分別具有胺基酸序列SSNIGAGYV(SEQ ID NO：85)、HNN與QSYDSSLSGWV(SEQ ID NO：86)的LCCDR1、LCCDR2與LCCDR3，與一重鏈(HC)，其包含分別具有胺基酸序列GFTFKDYY(SEQ ID NO：87)、ISTSGNSV(SEQ ID NO.88)與ARSPGHSDYDS(SEQ ID NO：89)的HCCDR1、HCCDR2與HCCDR3；其片段與其同源序列； (x)一輕鏈(LC)，其包含分別具有胺基酸序列NIGDKS(SEQ ID NO：96)、YDS與QVWASGTDHPYVI(SEQ ID NO：97)的LCCDR1、LCCDR2與LCCDR3，與一重鏈(HC)，其包含分別具有胺基酸序列GFTFSSYA(SEQ ID NO：46)、ISGSGGST(SEQ ID NO.47)與ARMYGSYTDM(SEQ ID NO：98)的HCCDR1、HCCDR2與HCCDR3；其片段與其同源序列；(xi)一輕鏈(LC)，其包含分別具有胺基酸序列SSNIGYNY(SEQ ID NO：105)、RNN與TSWDDSLSGYV(SEQ ID NO：106)的LCCDR1、LCCDR2與LCCDR3，與一重鏈(HC)，其包含分別具有胺基酸序列GNAFTNFY(SEQ ID NO：107)、INPSGTDLT(SEQ ID NO.108)與ARQYAYGYSGFDM(SEQ ID NO：109)的HCCDR1、HCCDR2與HCCDR3；其片段與其同源序列；(xii)一輕鏈(LC)，其包含分別具有胺基酸序列QSVSNW(SEQ ID NO：116)、AAS與QQSYSTPIT(SEQ ID NO：117)的LCCDR1、LCCDR2與LCCDR3，與一重鏈(HC)，其包含分別具有胺基酸序列GYTFTSYY(SEQ ID NO：118)、INPNTGGS(SEQ ID NO.119)與ARGDVTYDE(SEQ ID NO：120)的HCCDR1、HCCDR2與HCCDR3；其片段與其同源序列；(xiii)一輕鏈(LC)，其包含分別具有胺基酸序列NIGSKS(SEQ ID NO：34)、YDD與QVWDINDHYV(SEQ ID NO：127)的LCCDR1、LCCDR2與LCCDR3，與一重鏈(HC)，其包含分別具有胺基酸序列GFTFSSYA(SEQ ID NO：46)、ISGSGGST(SEQ ID NO.47)與ARSQASFMDI(SEQ ID NO：128)的HCCDR1、HCCDR2與HCCDR3；其片段與其同源序列；或(xiv)-輕鏈(LC)，其包含分別具有胺基酸序列NIGSKS(SEQ ID NO：34)、DDS與QVWDSSSDQGV(SEQ ID NO：135)的LCCDR1、LCCDR2與LCCDR3， 與一重鏈(HC)，其包含分別具有胺基酸序列GFTFSSYA(SEQ ID NO：46)、IGTGGGT(SEQ ID NO.136)與ARGTGYDGDQ(SEQ ID NO：137)的HCCDR1、HCCDR2與HCCDR3；其片段與其同源序列。
2.根據申請專利範圍第1項的重組抗原結合性蛋白質，其中該蛋白質係抗體。
3.根據申請專利範圍第2項的重組抗原結合性蛋白質，其中該抗體係人類抗體。
4.根據申請專利範圍第2項的重組抗原結合性蛋白質，其中該抗體或其抗原結合性片段係完整Ig、Fab、F(ab')2、Fv、或scFv。
5.根據申請專利範圍第1項的抗原結合性蛋白質，其中該抗原結合性蛋白質係PD-1促效劑。
6.根據申請專利範圍第1項的抗原結合性蛋白質，其中該抗原結合性蛋白質係PD-1拮抗劑。
7.根據申請專利範圍第1項的抗原結合性蛋白質，其中該抗原結合性蛋白質係嵌合性抗原受體(CAR)。
8.一種核酸，其編碼根據申請專利範圍第1-7項中任一項的抗原結合性蛋白質。
9.一種載體，其包含根據申請專利範圍第8項的核酸。
10.一種細胞，其包含根據申請專利範圍第1-7項中任一項的抗原結合性蛋白質、根據申請專利範圍第8項的核酸或根據申請專利範圍第9項的載體。
11.一種根據申請專利範圍第1-7項中任一項的抗原結合性 蛋白質，其結合至治療劑。
12.根據申請專利範圍第11項的抗原結合性蛋白質，其中該治療劑係藥物、毒素、放射性同位素、蛋白質、或胜肽。
13.一種醫藥組成物，其包含根據申請專利範圍第1-7項中任一項的抗原結合性蛋白質、根據申請專利範圍第8項的核酸、根據申請專利範圍第9項的載體、根據申請專利範圍第10項的細胞或根據申請專利範圍第11或12項的抗原結合性蛋白質。
14.根據申請專利範圍第13項的醫藥組成物，其進一步包含醫藥上可接受的載劑。
15.一種在接受者中增加T細胞反應的方法，其包含將治療有效量的根據申請專利範圍第1-7項中任一項的抗原結合性蛋白質或其抗原結合性片段、根據申請專利範圍第8項的核酸、根據申請專利範圍第9項的載體、根據申請專利範圍第10項的細胞、根據申請專利範圍第11或12項的抗原結合性蛋白質或根據申請專利範圍第13或14項的醫藥組成物投予至該接受者。
16.根據申請專利範圍第15項的方法，其中該抗原結合性蛋白質或其抗原結合性片段抑制、減少、調控或廢止由PD-1介導的訊號轉導。
17.一種用於治療具有PD1陽性疾病的接受者的方法，其包含將治療有效量的根據申請專利範圍第1-7項中任一項的抗原結合性蛋白質或其抗原結合性片段、根據申請專利範圍第8項的核酸、根據申請專利範圍第9項的載體、根據申請專利範圍第10項的細胞、根據申請專利範圍第11或12項的抗原結合性蛋白質或根據申請專利範圍第13或14項的醫藥 組成物投予至該接受者。
18.根據申請專利範圍第17項的方法，其中該抗原結合性蛋白質或其抗原結合性片段係具有被連接至其的細胞毒性部分的結合物。
19.根據申請專利範圍第17或18項的方法，其中該PD-1陽性疾病係癌症。
20.一種根據申請專利範圍第1-7項中任一項的重組抗PD1抗原結合性蛋白質或其抗原結合性片段、根據申請專利範圍第8項的核酸、根據申請專利範圍第9項的載體、根據申請專利範圍第10項的細胞、根據申請專利範圍第11或12項的抗原結合性蛋白質或根據申請專利範圍第13或14項的醫藥組成物的用途，其係用於藉由抑制PD1結合至PD1配體來治療PD1陽性疾病。
21.根據申請專利範圍第20項的用途，其中該PD1陽性疾病係癌症。
22.一種根據申請專利範圍第1-7項中任一項的重組抗PD1抗原結合性蛋白質或其抗原結合性片段、根據申請專利範圍第8項的核酸、根據申請專利範圍第9項的載體、根據申請專利範圍第10項的細胞、根據申請專利範圍第11或12項的抗原結合性蛋白質或根據申請專利範圍第13或14項的醫藥組成物的用途，其係用於透過抑制PD-1傳訊途徑的免疫調控。
23.一種載體，其包含編碼重組抗PD-1抗原結合性蛋白質的核酸與編碼嵌合性抗原受體的核酸，其中該重組抗PD-1抗原結合性蛋白質與該嵌合性抗原受體不同。
24.一種細胞，其包含根據申請專利範圍第23項的載體。
25.一種細胞，其包含編碼重組抗PD-1抗原結合性蛋白質的核酸與編碼嵌合性抗原受體的核酸，其中該重組抗PD-1抗原結合性蛋白質與該嵌合性抗原受體不同。
26.一種細胞，其包含重組抗PD-1抗原結合性蛋白質與嵌合性抗原受體，其中該重組抗PD-1抗原結合性蛋白質與該嵌合性抗原受體不同。
27.根據申請專利範圍第23-26項中任一項的載體或細胞，其中該嵌合性抗原受體不與PD-1專一性地結合。
28.根據申請專利範圍第23-27項中任一項的載體或細胞，其中該重組抗PD-1抗原結合性蛋白質係抗體。
29.根據申請專利範圍第23-28項中任一項的載體或細胞，其中該重組抗PD-1抗原結合性蛋白質係人類抗體。
30.根據申請專利範圍第23-29項中任一項的載體或細胞，其中該重組抗PD-1抗原結合性蛋白質係完整Ig、Fab、F(ab’)2、Fv、或scFv。
31.根據申請專利範圍第23-30項中任一項的載體或細胞，其中該重組抗PD-1抗原結合性蛋白質係PD-1促效劑。
32.根據申請專利範圍第23-30項中任一項的載體或細胞，其中該重組抗PD-1抗原結合性蛋白質係PD-1拮抗劑。
33.根據申請專利範圍第23-32項中任一項的載體或細胞，其中該重組抗PD-1抗原結合性蛋白質係可分泌的蛋白質。
34.根據申請專利範圍第23-33項中任一項的載體或細胞，其 中該重組抗PD-1抗原結合性蛋白質包含申請專利範圍第1項中敘述的抗原結合區域。
35.根據申請專利範圍第23-34項中任一項的載體或細胞，其中該嵌合性抗原受體專一性地結合至CD-19。
36.根據申請專利範圍第23-35項中任一項的載體或細胞，其中該嵌合性抗原受體可被***人類T細胞膜中。
37.根據申請專利範圍第24-36項中任一項的細胞，其中該細胞係T細胞。
38.一種醫藥組成物，其包含根據申請專利範圍第23-37項中任一項的載體或細胞。
39.根據申請專利範圍第38項的醫藥組成物，其進一步包含醫藥上可接受的載劑。
40.一種在接受者中增加T細胞反應的方法，其包含將治療有效量的根據申請專利範圍第23-37項中任一項的載體或細胞、或根據申請專利範圍第38或39項的醫藥組成物投予至該接受者，其中該重組抗PD-1抗原結合性蛋白質係PD-1拮抗劑。
41.根據申請專利範圍第40項的方法，其中該重組抗PD-1抗原結合性蛋白質抑制、減少、調控或廢止由PD-1介導的訊號轉導。
42.一種在接受者中減少T細胞反應的方法，其包含將治療有效量的根據申請專利範圍第23-37項中任一項的載體或細胞、或根據申請專利範圍第38或39項的醫藥組成物投予至該接受者，其中該重組抗PD-1抗原結合性蛋白質係PD-1促效劑。
43.一種用於治療具有PD1陽性疾病的接受者的方法，其包含將治療有效量的根據申請專利範圍第23-37項中任一項的載體或細胞、或根據申請專利範圍第38或39項的醫藥組成物投予至該接受者。
44.一種用於治療具有PD1陽性疾病的接受者的方法，其包含以編碼重組抗PD-1抗原結合性蛋白質的核酸與編碼嵌合性抗原受體的核酸轉導該接受者之至少一個T細胞，其中該重組抗PD-1抗原結合性蛋白質與該嵌合性抗原受體不同。
45.根據申請專利範圍第44項的方法，其中該嵌合性抗原受體不與PD-1專一性地結合。
46.根據申請專利範圍第42-45項中任一項的方法，其中該PD1陽性疾病係癌症。
47.一種根據申請專利範圍第23-37項中任一項的載體或細胞、或根據申請專利範圍第38或39項的醫藥組成物之用途，其係用於藉由抑制PD1結合至PD1配體來治療PD1陽性疾病。
48.根據申請專利範圍第47項的用途，其中該PD1陽性疾病係癌症。
49.一種根據申請專利範圍第23-37項中任一項的載體或細胞、或根據申請專利範圍第38或39項的醫藥組成物的用途，其係用於透過抑制PD-1傳訊途徑的免疫調控。
50.一種根據申請專利範圍第5項的PD-1促效劑之用途，其係用於治療自體免疾病。
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<400> 60
Figure 105119709-A0305-02-0101-82
<210> 61
<211> 258
<212> PRT
<213> 智人
<400> 61
Figure 105119709-A0305-02-0101-83
Figure 105119709-A0305-02-0102-84
Figure 105119709-A0305-02-0103-85
<210> 62
<211> 777
<212> DNA
<213> 智人
<400> 62
Figure 105119709-A0305-02-0103-197
<210> 63
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 63
Figure 105119709-A0305-02-0103-87
<210> 64
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 64
Figure 105119709-A0305-02-0104-88
<210> 65
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 65
Figure 105119709-A0305-02-0104-89
<210> 66
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 66
Figure 105119709-A0305-02-0104-90
<210> 67
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 67
Figure 105119709-A0305-02-0104-91
<210> 68
<211> 111
<212> PRT
<213> 智人
<400> 68
Figure 105119709-A0305-02-0105-92
<210> 69
<211> 333
<212> DNA
<213> 智人
<400> 69
Figure 105119709-A0305-02-0105-93
<210> 70
<211> 117
<212> PRT
<213> 智人
<400> 70
Figure 105119709-A0305-02-0106-94
<210> 71
<211> 351
<212> DNA
<213> 智人
<400> 71
Figure 105119709-A0305-02-0106-95
Figure 105119709-A0305-02-0107-96
<210> 72
<211> 261
<212> PRT
<213> 智人
<400> 72
Figure 105119709-A0305-02-0107-97
Figure 105119709-A0305-02-0108-98
<210> 73
<211> 786
<212> DNA
<213> 智人
<400> 73
Figure 105119709-A0305-02-0108-99
Figure 105119709-A0305-02-0109-100
<210> 74
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 74
Figure 105119709-A0305-02-0109-101
<210> 75
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 75
Figure 105119709-A0305-02-0109-102
<210> 76
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 76
Figure 105119709-A0305-02-0109-103
<210> 77
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 77
Figure 105119709-A0305-02-0110-104
<210> 78
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 78
Figure 105119709-A0305-02-0110-105
<210> 79
<211> 111
<212> PRT
<213> 智人
<400> 79
Figure 105119709-A0305-02-0110-106
Figure 105119709-A0305-02-0111-107
<210> 80
<211> 333
<212> DNA
<213> 智人
<400> 80
Figure 105119709-A0305-02-0111-198
<210> 81
<211> 117
<212> PRT
<213> 智人
<400> 81
Figure 105119709-A0305-02-0111-109
Figure 105119709-A0305-02-0112-110
<210> 82
<211> 351
<212> DNA
<213> 智人
<400> 82
Figure 105119709-A0305-02-0112-111
<210> 83
<211> 261
<212> PRT
<213> 智人
<400> 83
Figure 105119709-A0305-02-0112-112
Figure 105119709-A0305-02-0113-113
Figure 105119709-A0305-02-0114-114
<210> 84
<211> 786
<212> DNA
<213> 智人
<400> 84
Figure 105119709-A0305-02-0114-115
<210> 85
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 85
Figure 105119709-A0305-02-0114-116
Figure 105119709-A0305-02-0115-117
<210> 86
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 86
Figure 105119709-A0305-02-0115-118
<210> 87
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 87
Figure 105119709-A0305-02-0115-119
<210> 88
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 88
Figure 105119709-A0305-02-0115-120
<210> 89
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 89
Figure 105119709-A0305-02-0115-121
<210> 90
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人
<400> 90
Figure 105119709-A0305-02-0116-122
<210> 91
<211> 336
<212> DNA
<213> 智人
<400> 91
Figure 105119709-A0305-02-0116-123
<210> 92
<211> 118
<212> PRT
<213> 智人
<400> 92
Figure 105119709-A0305-02-0117-124
<210> 93
<211> 354
<212> DNA
<213> 智人
<400> 93
Figure 105119709-A0305-02-0117-125
Figure 105119709-A0305-02-0118-126
<210> 94
<211> 263
<212> PRT
<213> 智人
<400> 94
Figure 105119709-A0305-02-0118-127
Figure 105119709-A0305-02-0119-128
<210> 95
<211> 792
<212> DNA
<213> 智人
<400> 95
Figure 105119709-A0305-02-0119-129
Figure 105119709-A0305-02-0120-130
<210> 96
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人
<400> 96
Figure 105119709-A0305-02-0120-131
<210> 97
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人
<400> 97
Figure 105119709-A0305-02-0120-132
<210> 98
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 98
Figure 105119709-A0305-02-0120-133
<210> 99
<211> 111
<212> PRT
<213> 智人
<400> 99
Figure 105119709-A0305-02-0121-134
<210> 100
<211> 333
<212> DNA
<213> 智人
<400> 100
Figure 105119709-A0305-02-0121-135
Figure 105119709-A0305-02-0122-136
<210> 101
<211> 117
<212> PRT
<213> 智人
<400> 101
Figure 105119709-A0305-02-0122-137
<210> 102
<211> 351
<212> DNA
<213> 智人
<400> 102
Figure 105119709-A0305-02-0123-138
<210> 103
<211> 261
<212> PRT
<213> 智人
<400> 103
Figure 105119709-A0305-02-0123-139
Figure 105119709-A0305-02-0124-140
<210> 104
<211> 786
<212> DNA
<213> 智人
<400> 104
Figure 105119709-A0305-02-0124-141
Figure 105119709-A0305-02-0125-142
<210> 105
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 105
Figure 105119709-A0305-02-0125-143
<210> 106
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 106
Figure 105119709-A0305-02-0125-144
<210> 107
<211> 8
<212> PRT
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Figure 105119709-A0305-02-0126-145
<210> 108
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 108
Figure 105119709-A0305-02-0126-146
<210> 109
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人
<400> 109
Figure 105119709-A0305-02-0126-147
<210> 110
<211> 111
<212> PRT
<213> 智人
<400> 110
Figure 105119709-A0305-02-0126-148
Figure 105119709-A0305-02-0127-149
<210> 111
<211> 333
<212> DNA
<213> 智人
<400> 111
Figure 105119709-A0305-02-0127-150
<210> 112
<211> 121
<212> PRT
<213> 智人
<400> 112
Figure 105119709-A0305-02-0127-151
Figure 105119709-A0305-02-0128-152
<210> 113
<211> 363
<212> DNA
<213> 智人
<400> 113
Figure 105119709-A0305-02-0128-153
<210> 114
<211> 265
<212> PRT
<213> 智人
<400> 114
Figure 105119709-A0305-02-0129-154
Figure 105119709-A0305-02-0130-155
<210> 115
<211> 798
<212> DNA
<213> 智人
<400> 115
Figure 105119709-A0305-02-0130-156
Figure 105119709-A0305-02-0131-157
<210> 116
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人
<400> 116
Figure 105119709-A0305-02-0131-158
<210> 117
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 117
Figure 105119709-A0305-02-0131-159
<210> 118
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 118
Figure 105119709-A0305-02-0131-160
<210> 119
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 119
Figure 105119709-A0305-02-0131-161
<210> 120
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 120
Figure 105119709-A0305-02-0132-162
<210> 121
<211> 108
<212> PRT
<213> 智人
<400> 121
Figure 105119709-A0305-02-0132-163
<210> 122
<211> 324
<212> DNA
<213> 智人
<400> 122
Figure 105119709-A0305-02-0132-164
Figure 105119709-A0305-02-0133-165
<210> 123
<211> 116
<212> PRT
<213> 智人
<400> 123
Figure 105119709-A0305-02-0133-166
<210> 124
<211> 348
<212> DNA
<213> 智人
<400> 124
Figure 105119709-A0305-02-0134-167
<210> 125
<211> 257
<212> PRT
<213> 智人
<400> 125
Figure 105119709-A0305-02-0134-168
Figure 105119709-A0305-02-0135-169
<210> 126
<211> 774
<212> DNA
<213> 智人
<400> 126
Figure 105119709-A0305-02-0136-170
<210> 127
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 127
Figure 105119709-A0305-02-0136-171
<210> 128
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 128
Figure 105119709-A0305-02-0136-172
<210> 129
<211> 108
<212> PRT
<213> 智人
<400> 129
Figure 105119709-A0305-02-0137-173
<210> 130
<211> 324
<212> DNA
<213> 智人
<400> 130
Figure 105119709-A0305-02-0137-174
Figure 105119709-A0305-02-0138-175
<210> 131
<211> 117
<212> PRT
<213> 智人
<400> 131
Figure 105119709-A0305-02-0138-176
<210> 132
<211> 351
<212> DNA
<213> 智人
<400> 132
Figure 105119709-A0305-02-0138-177
Figure 105119709-A0305-02-0139-178
<210> 133
<211> 258
<212> PRT
<213> 智人
<400> 133
Figure 105119709-A0305-02-0139-179
Figure 105119709-A0305-02-0140-180
<210> 134
<211> 777
<212> DNA
<213> 智人
<400> 134
Figure 105119709-A0305-02-0140-181
Figure 105119709-A0305-02-0141-182
<210> 135
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 135
Figure 105119709-A0305-02-0141-183
<210> 136
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 136
Figure 105119709-A0305-02-0141-184
<210> 137
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 137
Figure 105119709-A0305-02-0141-185
Figure 105119709-A0305-02-0142-186
<210> 138
<211> 109
<212> PRT
<213> 智人
<400> 138
Figure 105119709-A0305-02-0142-187
<210> 139
<211> 327
<212> DNA
<213> 智人
<400> 139
Figure 105119709-A0305-02-0142-188
Figure 105119709-A0305-02-0143-189
<210> 140
<211> 116
<212> PRT
<213> 智人
<400> 140
Figure 105119709-A0305-02-0143-190
<210> 141
<211> 348
<212> DNA
<213> 智人
<400> 141
Figure 105119709-A0305-02-0144-191
<210> 142
<211> 258
<212> PRT
<213> 智人
<400> 142
Figure 105119709-A0305-02-0144-192
Figure 105119709-A0305-02-0145-193
<210> 143
<211> 777
<212> DNA
<213> 智人
<400> 143
Figure 105119709-A0305-02-0145-194
Figure 105119709-A0305-02-0146-195

Claims (26)

  1. 一種重組抗原結合性蛋白質，其包含以下者之一：(A)一抗原結合區域，其包含與SEQ ID NO：32有至少95%的同源性或與SEQ ID NO：53有至少95%的同源性之胺基酸序列；(B)一抗原結合區域，其包含可變輕鏈(VL)與可變重鏈(VH)，該可變輕鏈與可變重鏈分別具有與SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：30有至少95%的同源性之胺基酸序列；或分別具有與SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：51有至少95%的同源性之胺基酸序列；及(C)一抗原結合區域，其包含以下者之一：(i)一輕鏈(LC)，其包含分別具有胺基酸序列SSNIGNNA(SEQ ID NO：23)、YND與AAWDDSVNGYV(SEQ ID NO：24)的LCCDR1、LCCDR2與LCCDR3，與一重鏈(HC)，其包含分別具有胺基酸序列GYTFTRFG(SEQ ID NO：25)、ISVNNGNT(SEQ ID NO.26)與ARYMYGRRDS(SEQ ID NO：27)的HCCDR1、HCCDR2與HCCDR3；及(ii)一輕鏈(LC)，其包含分別具有胺基酸序列NIGSKS(SEQ ID NO：34)、YDS與QVWDSSSDYV(SEQ ID NO：45)的LCCDR1、LCCDR2與LCCDR3，與一重鏈(HC)，其包含分別具有胺基酸序列GFTFSSYA(SEQ ID NO：46)、ISGSGGST(SEQ ID NO：47)與ARNYISMFDS(SEQ ID NO：48)的HCCDR1、HCCDR2與HCCDR3；其中該重組抗原結合性蛋白質包含可分泌的scFv，且該可分泌的scFv與計畫性細胞死亡(PD-1)受體專一性地結合。
  2. 根據申請專利範圍第1項的重組抗原結合性蛋白質，其中該蛋白質係 抗體。
  3. 根據申請專利範圍第2項的重組抗原結合性蛋白質，其中該抗體係人類抗體。
  4. 根據申請專利範圍第1項的重組抗原結合性蛋白質，其中該抗原結合性蛋白質係PD-1拮抗劑。
  5. 根據申請專利範圍第1項的重組抗原結合性蛋白質，其中該抗原結合性蛋白質係嵌合性抗原受體(CAR)。
  6. 一種核酸，其編碼根據申請專利範圍第1-5項中任一項的重組抗原結合性蛋白質。
  7. 一種載體，其包含根據申請專利範圍第6項的核酸。
  8. 一種細胞，其包含根據申請專利範圍第1-5項中任一項的重組抗原結合性蛋白質、根據申請專利範圍第6項的核酸或根據申請專利範圍第7項的載體。
  9. 一種醫藥組成物，其包含根據申請專利範圍第1-5項中任一項的重組抗原結合性蛋白質、根據申請專利範圍第6項的核酸、根據申請專利範圍第7項的載體、根據申請專利範圍第8項的細胞。
  10. 一種根據申請專利範圍第1-5項中任一項的重組抗原結合性蛋白質之用途，其係用於製備用於在接受者中增加T細胞反應的醫藥品。
  11. 一種根據申請專利範圍第6項的核酸之用途，其係用於製備用於在接受者中增加T細胞反應的醫藥品。
  12. 一種根據申請專利範圍第7項的載體之用途，其係用於製備用於在接受者中增加T細胞反應的醫藥品。
  13. 一種根據申請專利範圍第8項的細胞之用途，其係用於製備用於在接受者中增加T細胞反應的醫藥品。
  14. 一種根據申請專利範圍第9項的醫藥組成物之用途，其係用於製備用於在接受者中增加T細胞反應的醫藥品。
  15. 一種根據申請專利範圍第1-5項中任一項的重組抗原結合性蛋白質之用途，其係用於製備用於治療具有PD1陽性疾病的接受者的醫藥品。
  16. 一種根據申請專利範圍第6項的核酸之用途，其係用於製備用於治療具有PD1陽性疾病的接受者的醫藥品。
  17. 一種根據申請專利範圍第7項的載體之用途，其係用於製備用於治療具有PD1陽性疾病的接受者的醫藥品。
  18. 一種根據申請專利範圍第8項的細胞之用途，其係用於製備用於治療具有PD1陽性疾病的接受者的醫藥品。
  19. 一種根據申請專利範圍第9項的醫藥組成物之用途，其係用於製備用於治療具有PD1陽性疾病的接受者的醫藥品。
  20. 一種根據申請專利範圍第1-5項中任一項的重組抗原結合性蛋白質之用途，其係用於製備醫藥品，該醫藥品係用於透過抑制PD-1傳訊途徑的免疫調控。
  21. 一種根據申請專利範圍第6項的核酸之用途，其係用於製備醫藥品，該醫藥品係用於透過抑制PD-1傳訊途徑的免疫調控。
  22. 一種根據申請專利範圍第7項的載體之用途，其係用於製備醫藥品，該醫藥品係用於透過抑制PD-1傳訊途徑的免疫調控。
  23. 一種根據申請專利範圍第8項的細胞之用途，其係用於製備醫藥品， 該醫藥品係用於透過抑制PD-1傳訊途徑的免疫調控。
  24. 一種根據申請專利範圍第9項的醫藥組成物之用途，其係用於製備醫藥品，該醫藥品係用於透過抑制PD-1傳訊途徑的免疫調控。
  25. 根據申請專利範圍第8項的細胞，其中該細胞係T細胞。
  26. 一種重組抗原結合性蛋白質，其包含以下者之一：(A)一抗原結合區域，其包含SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：53之胺基酸序列；(B)一抗原結合區域，其包含可變輕鏈(VL)與可變重鏈(VH)，該可變輕鏈與可變重鏈分別具有SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：30之胺基酸序列；或分別具有SEQ ID NO：49與SEQ ID NO：51之胺基酸序列；及(C)一抗原結合區域，其包含以下者之一：(i)一輕鏈(LC)，其包含分別具有胺基酸序列SSNIGNNA(SEQ ID NO：23)、YND與AAWDDSVNGYV(SEQ ID NO：24)的LCCDR1、LCCDR2與LCCDR3，與一重鏈(HC)，其包含分別具有胺基酸序列GYTFTRFG(SEQ ID NO：25)、ISVNNGNT(SEQ ID NO.26)與ARYMYGRRDS(SEQ ID NO：27)的HCCDR1、HCCDR2與HCCDR3；及(ii)一輕鏈(LC)，其包含分別具有胺基酸序列NIGSKS(SEQ ID NO：34)、YDS與QVWDSSSDYV(SEQ ID NO：45)的LCCDR1、LCCDR2與LCCDR3，與一重鏈(HC)，其包含分別具有胺基酸序列GFTFSSYA(SEQ ID NO：46)、ISGSGGST(SEQ ID NO：47)與ARNYISMFDS(SEQ ID NO：48)的HCCDR1、HCCDR2與HCCDR3；其中該重組抗原結合性蛋白質包含可分泌的scFv，且該可分泌的 scFv與計畫性細胞死亡(PD-1)受體專一性地結合。
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