ES2729974T3

ES2729974T3 - Anticuerpo específico de PD-1 y CD3 humanas

Info

Publication number: ES2729974T3
Application number: ES10176748T
Authority: ES
Inventors: Tasuku Honjo; Shiro Shibayama; Kazuhiko Takeda; Masayoshi Matsuo; Takao Yoshida; Masakazu Miyamoto
Original assignee: Ono Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Ono Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2003-01-23
Filing date: 2004-01-22
Publication date: 2019-11-07
Anticipated expiration: 2024-01-22
Also published as: US7563869B2; JP6157574B2; EP1591527A4; EP2270051A3; US8951518B2; EP2270051B1; WO2004072286A1; JP2010229134A; JP2016033169A; EP2270051A2; JPWO2004072286A1; JP5892913B2; US20090263865A1; US20110280878A1; EP1591527B1; KR20050107399A; JP4532409B2; US7998479B2; US8246955B2; US20080025979A1

Abstract

Un anticuerpo biespecifico para su uso en el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria, en donde el anticuerpo biespecifico es una proteina de fusion que comprende: (i) una region variable de la cadena pesada de un anticuerpo anti-PD-1 humana, (ii) una region variable de la cadena ligera de un anticuerpo anti-PD-1 humana, (iii) una region variable de la cadena pesada de un anticuerpo anti-CD3 humana, y (iv) una region variable de la cadena ligera de un anticuerpo anti-CD3 humana, y que se une simultaneamente a la PD-1 humana y a la CD3 humana, en donde dicha CD3 humana se expresa en la misma celula que se expresa dicha PD-1 humana; y en donde la enfermedad autoinmunitaria se selecciona del grupo que consiste en nefritis glomerular, artritis, enfermedad tipo miocardiopatia dilatada, colitis ulcerosa, sindrome de Sjogren, enfermedad de Crohn, lupus eritematoso sistemico, artritis reumatoide cronica, esclerosis multiple, psoriasis, dermatitis de contacto alergica, polimiositis, paquidermia, periarteritis nodosa, fiebre reumatica, vitiligo vulgaris, diabetes mellitus dependiente de insulina, enfermedad de Behcet, enfermedad de Hashimoto, enfermedad de Addison, dermatomiositis, miastenia gravis, sindrome de Reiter, enfermedad de Graves, anemia perniciosa, sindrome de Goodpasture, esterilidad patologica, hepatitis activa cronica, penfigo, purpura trombocitopenica autoinmunitaria y anemia hemolitica autoinmunitaria.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpo específico de PD-1 y CD3 humanas

Campo de la invención

La presente invención se refiere a anticuerpos específicos de la PD-1 humana, anticuerpos biespecíficos que comprenden anticuerpos contra el complejo receptor de linfocitos T humanos o el complejo receptor de linfocitos B humanos, polinucleótidos que los codifican y el uso de los anticuerpos biespecíficos.

Antecedentes de la invención

El sistema inmunitario adquirió el mecanismo que permite responder a varios antígenos extraños. El mecanismo reconoce la diversidad de un receptor de antígeno mediante la recombinación de los fragmentos V, (D) y J de los linfocitos T y linfocitos B. Aunque este mecanismo produjo un resultado que produce linfocitos autorreactivos, estos linfocitos autorreactivos se eliminan mediante la selección negativa en el timo o la médula ósea, y se controlan adicionalmente mediante el mecanismo de autotolerancia de deleción clonal o anergia en la periferia.

Aunque se cree que una enfermedad autoinmunitaria se desarrolla por la degradación de la autotolerancia, se han realizado investigaciones que utilizan varios modelos murinos de enfermedades para dilucidar el mecanismo de la patogénesis. Sin embargo, la etiología de una enfermedad autoinmunitaria y el mecanismo molecular de la autotolerancia siguen sin estar claros. En tal situación, la existencia del ratón, que muestra los síntomas de una enfermedad autoinmunitaria causada por un solo gen deficiente, es muy importante para estudiar la etiología de una enfermedad autoinmunitaria desde un punto de vista de la biología molecular. El ratón CTLA4-/- que causa la infiltración de linfocitos sistémicos letales (Waterhouse P., et al., Science, 270:985-988, 1995, Tivol E.A., et al., Immunity, 3:541-547, 1995), los ratones moth eaten deficientes en SHP-1 (Shulltz L.D., et al., Cell, 73:1445-1454, 1993), el ratón lyn-/- que muestra los síntomas de nefritis glomerular (Hibbs M.L., et al., Cell, 83:301-311, 1995),y el ratón FCRIIB-/-(Bolland S. & Ravetch J.V., Immunity, 13:277-285, 2000) son representativos, y se han estudiado las relaciones de estas moléculas y la autotolerancia.

El gen PD-1, que pertenece a la superfamilia de las inmunoglobulinas, codifica una proteína transmembrana de tipo I de 55 kDa. Tanto la PD-1 de ratón como la PD-1 humana consisten en 288 aminoácidos, y tienen un péptido señal en el extremo N (20 aminoácidos) y una región hidrófoba en la parte media, que es una región transmembrana (The EMBO J., 11(11): 3887-3895, 1992); Publicación de patente japonesa N.° 5-336973; EMBL/GenBank/DDJB Acc. N.° X67914, Genomics, 23:704, 1994; Publicación de patente japonesa N.° 7-291996 (Patente US-5629204).

En el timo, la PD-1 se expresa en la fase de transición entre el estadio CD4-/CD8 a CD4 /CD8+ en timocitos (Nishimura H., et al., Int. Immunol., 8:773-780 (1996), Nishimura H., et al., J. Exp. Med., 191:891-898 (2000)). En la periferia, la PD-1 se expresa en linfocitos T y linfocitos B activados a través del receptor de antígeno (Agata Y., et al., Int. Immunol., 8:765-772 (1996)) y en células de linaje mieloide activadas tales como macrófagos.

La PD-1 tiene un ITIM (motivo inhibidor del inmunorreceptor basado en tirosina) en su región intracelular. Por lo tanto, la PD-1 es un regulador negativo en las respuestas inmunitarias. Dado que los ratones con deficiencia de PD-1 desarrollaron nefritis glomerular y artritis tipo lupus (constitución genética C57BL/6) (Nishimura H., et al., Int. Imuunol., 10: 1563-1572, 1998, Nishimura H., et al., Immunity, 11:141-151, 1999) y enfermedad tipo cardiomiopatía dilatada (constitución genética BALB/c) (Nishimura H., et al., Science, 291:319-322 (2001)), quedó claro que PD-1 actúa como un regulador para el desarrollo de enfermedades autoinmunitarias, especialmente para el mantenimiento de la autotolerancia. Además, se ha descrito que el rechazo del injerto está regulado por la inhibición de la señal de PD-1 (Journal of Immunology, 169, 11:6543-6553 (2001)).

El documento WO 01/14557 identifica B7-4 (PD-L1) como un miembro de la familia B7 de moléculas coestimuladoras y describe que PD-1 es un receptor de las moléculas B7-4. El documento WO 01/14557, y de la misma manera el documento WO 02/078731, se dirigen en términos generales a modular una respuesta inmunitaria positiva o negativa mediante la modulación de PD-1, B7-4 y/o la interacción entre B7-4 y PD-1, abarcando así elementos incluso mutuamente excluyentes. Ambos documentos, WO 01/14557 y WO 02/078731, están formulados en términos similares en lo que se refiere a los anticuerpos biespecíficos, lo que explica que dicho anticuerpo pueda comprender, por ejemplo, un sitio de unión a PD-1 y otro sitio de unión, que se dirige a un receptor activador o inhibidor en una célula para dirigir la molécula a una población celular específica.

Divulgación de la invención

Se piensa que PD-1 es un regulador de varias enfermedades autoinmunitarias, y que es uno de los genes causantes de enfermedades autoinmunitarias. El control de la función de PD-1 puede contribuir al tratamiento médico y el diagnóstico de supresión o potenciación de la función inmunitaria, infección, rechazo de trasplantes y neoplasias. etc. Como resultado de una exhaustiva investigación, los presentes inventores llegaron a la presente invención que se refiere a las sustancias que controlan la función de PD-1.

Los estímulos en los linfocitos, que controlan la inmunidad, se transmiten principalmente a través del receptor de linfocitos T (TCR) en el caso de los linfocitos T, y el receptor de linfocitos B (BCR) en el caso de los linfocitos B, y la posterior fosforilación intracelular juega un papel importante en el mecanismo molecular.

Dado que se ha aclarado que PD-1 regula negativamente varias células inmunocompetentes como linfocitos y células mieloides etc., y que PD-1 tiene un ITIM (motivo inhibidor del inmunorreceptor basado en tirosina) en su región intracelular, los presentes inventores consideraron que el reclutamiento de enzimas de desfosforilación (fosfatasas) podría estar involucrado en el mecanismo molecular de la transducción de señales inhibitorias mediada por PD -1. Por lo tanto, se planteó la hipótesis de que al conseguir que la PD-1 se localice junto con el TCR o BCR podría ejercer la función de la PD-1.

Los presentes inventores confirmaron que la señal inhibitoria de PD-1 se transmitía con la sustancia, que entrecruza físicamente PD-1 con TCR o BCR. Primero, los presentes inventores confirmaron que la idea anterior era correcta utilizando anticuerpos anti-PD-1 y anticuerpos anti-CD3. CD3 es una proteína de membrana expresada en linfocitos T y es un componente de los complejos de TCR. Los anticuerpos divalentes se construyeron formando un puente entre los anticuerpos anti-PD-1 y los anticuerpos anti-CD3. La presente invención se completó aislando cada ADNc que codifica el anticuerpo anti-PD-1 humana y el anticuerpo anti-TCR humano y produciendo un anticuerpo biespecífico producido mediante la construcción de vectores de expresión que pueden expresar proteínas de fusión que comprenden cada sitio de reconocimiento de antígeno de ambos anticuerpos.

La presente invención se define por las reivindicaciones. En particular, la presente invención proporciona:

[1] Un anticuerpo biespecífico para su uso en el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria, en el que el anticuerpo biespecífico es una proteína de fusión que comprende: (i) una región variable de la cadena pesada de un anticuerpo anti-PD-1 humana, (ii) una región variable de la cadena ligera de un anticuerpo anti-PD-1, (iii) una región variable de la cadena pesada de un anticuerpo anti-CD3 humana, y (iv) una región variable de la cadena ligera de un anticuerpo anti-CD3 humana, y que se une a la PD-1 humana y a la CD3 humana simultáneamente, en el que dicha CD3 humana se expresa en la misma célula que se expresa dicha PD-1 humana; y en el que la enfermedad autoinmunitaria se selecciona del grupo que consiste en nefritis glomerular, artritis, enfermedad tipo miocardiopatía dilatada, colitis ulcerosa, síndrome de Sjogren, enfermedad de Crohn, lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide crónica, esclerosis múltiple, psoriasis, dermatitis de contacto alérgica, polimiositis, paquidermia, periarteritis nodosa, fiebre reumática, vitíligo vulgaris, diabetes mellitus dependiente de insulina, enfermedad de Behcet, enfermedad de Hashimoto, enfermedad de Addison, dermatomiositis, miastenia gravis, síndrome de Reiter, enfermedad con de Graves, anemia perniciosa, síndrome de Goodpasture, esterilidad patológica, hepatitis activa crónica, pénfigo, púrpura trombocitopénica autoinmunitaria y anemia hemolítica autoinmunitaria.

[2] El anticuerpo biespecífico para su uso en el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria de acuerdo con [1 ], en el que la enfermedad autoinmunitaria se selecciona de diabetes mellitus dependiente de insulina, lupus eritematoso sistémico y esclerosis múltiple.

[3] El anticuerpo biespecífico para su uso en el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria de acuerdo con [1 ], en el que las siguientes regiones variables están unidas por enlaces peptídicos en el siguiente orden: (i) una región variable de la cadena pesada de un anticuerpo anti-PD-1 humana, (ii) una región variable de la cadena ligera de un anticuerpo anti-PD-1 humana, (iii) una región variable de la cadena pesada de un anticuerpo anti-CD3 humana, y (iv) una región variable de la cadena ligera de un anticuerpo anti-CD3 humana.

[4] El anticuerpo biespecífico para su uso en el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria de acuerdo con [1 ] o [3], en el que (i) la región variable de la cadena pesada del anticuerpo anti-PD-1 humana comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, (ii) la región variable de la cadena ligera del anticuerpo anti-PD-1 humana comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4, (iii) la región variable de la cadena pesada del anticuerpo anti-CD3 humana comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID NO: 6 y (iv) la región variable de la cadena ligera de un anticuerpo anti-CD3 humana comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8.

[5] El anticuerpo biespecífico para su uso en el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria de acuerdo con [4], en el que el anticuerpo biespecífico comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 11.

[6] Un anticuerpo biespecífico que es una proteína de fusión que comprende: (i) una región variable de la cadena pesada de un anticuerpo anti-PD-1 humana que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, (ii) una región variable de la cadena ligera de un anticuerpo anti-PD-1 humana que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4, (iii) una región variable de la cadena pesada de un anticuerpo anti-CD3 humana que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6, y (iv) una región variable de la cadena ligera del anticuerpo anti-CD3 humana que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8, en la que el anticuerpo biespecífico se une a la PD-1 humana y a la CD3 humana simultáneamente, en la que dicha CD3 humana se expresa en la misma célula que se expresa dicha PD-1 humana .

[7] Un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 11.

[8] El polinucleótido de acuerdo con [7], que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 9.

[9] Un vector de duplicación o expresión que comprende el polinucleótido de [7].

[10] Una célula hospedadora transformada por el vector de duplicación o expresión de la reivindicación [9].

La presente divulgación se refiere a lo siguiente:

(1) Una sustancia específica de la PD-1 humana que comprende una parte que reconoce la PD-1 humana, una parte que reconoce una proteína de membrana de la membrana celular de las células que expresan la PD-1 humana, y un enlazador.

(2) La sustancia específica de la PD-1 humana de acuerdo con (1), en la que la parte que reconoce la PD-1 humana es un anticuerpo contra la PD-1 humana o un fragmento parcial del mismo.

(3) La sustancia específica de la PD-1 humana de acuerdo con (1), en la que la parte que reconoce una proteína de membrana de la membrana celular de las células humanas que expresan PD-1 es un anticuerpo contra la proteína de membrana o un fragmento parcial del mismo.

(4) La sustancia específica de la PD-1 humana de acuerdo con (1), que comprende un anticuerpo contra la PD-1 humana o un fragmento parcial del mismo, un anticuerpo contra la proteína de membrana de la membrana celular de células humanas que expresan PD-1 o un fragmento parcial del mismo, y un enlazador.

(5) La sustancia específica de la PD-1 humana de acuerdo con uno cualquiera de (1), (3) y (4), en la que la proteína de membrana es un complejo receptor de linfocitos T humanos o un complejo receptor de linfocitos B humanos.

(6) La sustancia específica de la PD-1 humana de acuerdo con (1) o (4), en la que el enlazador es un péptido. (7) Un anticuerpo biespecífico que comprende un anticuerpo contra la PD-1 humana o un fragmento parcial del mismo, un anticuerpo contra el complejo receptor de linfocitos T humanos o un fragmento parcial del mismo, y un enlazador.

(8) Un anticuerpo biespecífico que comprende un anticuerpo contra la PD-1 humana o un fragmento parcial del mismo, un anticuerpo contra el complejo receptor de linfocitos B humano o un fragmento parcial del mismo, y un enlazador.

(9) El anticuerpo biespecífico de acuerdo con (7) o (8), en el que el enlazador es un péptido.

(10) Un polipéptido sustancialmente puro que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 2, un homólogo del mismo, un fragmento del mismo o un homólogo del fragmento, o un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos en la cual se ha eliminado, sustituido y/o añadido 1-10 aminoácidos del polipéptido, en el que el polipéptido conforma un anticuerpo contra la PD-1 humana.

(11) Un polipéptido sustancialmente puro que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 4, un homólogo del mismo, un fragmento del mismo o un homólogo del fragmento, o un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos en la cual se ha eliminado, sustituido y/o añadido 1-10 aminoácidos del polipéptido,

en el que el polipéptido conforma un anticuerpo contra la PD-1 humana.

(12) Un complejo polipeptídico que comprende los polipéptidos de acuerdo con (10) y (11).

(13) Un polipéptido sustancialmente puro que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 11, un homólogo del mismo, un fragmento del mismo o un homólogo del fragmento, o un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos en la cual se ha eliminado, sustituido y/o añadido 1-10 aminoácidos del polipéptido.

(14) Un polipéptido sustancialmente puro que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 11, un homólogo del mismo, un fragmento del mismo o un homólogo del fragmento, o un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos en la cual se ha eliminado, sustituido y/o añadido 1-10 aminoácidos del polipéptido, que es el anticuerpo biespecífico de acuerdo con uno cualquiera de (7) a (9).

(15) Un polinucleótido que codifica el polipéptido de acuerdo con uno cualquiera de (10), (11), (13) y (14), un homólogo del mismo o un polinucleótido complementario del mismo, o un fragmento del mismo o un homólogo del fragmento.

(16) Un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 3 o la SEQ ID NO: 9, un homólogo del mismo o un polinucleótido complementario del mismo, o un fragmento del mismo o un homólogo del fragmento.

(17) Un vector de duplicación o expresión que comprende el polinucleótido de acuerdo con (15) o (16).

(18) Una célula hospedadora transformada por el vector de duplicación o expresión de acuerdo con (17).

(19) Un método de fabricación de la sustancia de acuerdo con uno cualquiera de (1) a (6), que comprende cultivar la célula hospedadora de acuerdo con (18) en condiciones para expresar la sustancia.

(20) Un método de fabricación del anticuerpo biespecífico de acuerdo con uno cualquiera de (7) a (9), que comprende cultivar la célula hospedadora de acuerdo con (18) en condiciones para expresar el anticuerpo biespecífico.

(21) Un método de fabricación del polipéptido de acuerdo con uno cualquiera de (10) a (14), que comprende cultivar la célula hospedadora de acuerdo con (18) en condiciones para expresar el polipéptido.

(22) Una composición farmacéutica terapéutica y/o preventiva para enfermedades relacionadas con la PD-1 humana, que comprende una cantidad eficaz de la sustancia de acuerdo con uno cualquiera de (1) a (6), el anticuerpo biespecífico de acuerdo con uno cualquiera de (7) a (9), el complejo polipeptídico de acuerdo con (12), o el polipéptido de acuerdo con (13) o (14).

(23) La composición farmacéutica terapéutica y/o preventiva de acuerdo con (22), en la que las enfermedades relacionadas con la PD-1 humana son enfermedades seleccionadas de enfermedades neurodegenerativas, enfermedades autoinmunitarias, colagenosis, rechazo de trasplantes de órganos, tumores y enfermedades infecciosas.

(24) La composición farmacéutica terapéutica y/o preventiva de acuerdo con (22), en la que las enfermedades neurodegenerativas son enfermedades seleccionadas de geriopsicosis, enfermedad de Alzheimer, síndrome de Down, enfermedad de Parkinson, neuropatía diabética, síndrome de Parkinson, enfermedad de Huntington, enfermedad de Machado-Joseph, esclerosis lateral amiotrófica, neuropatía diabética y enfermedad de Creutzfeldt-Jakob.

(25) La composición farmacéutica terapéutica y/o preventiva de acuerdo con (22), en la que las enfermedades autoinmunitarias son enfermedades seleccionadas de nefritis glomerular, artritis, enfermedad tipo miocardiopatía dilatada, colitis ulcerosa, síndrome de Sjogren, enfermedad de Crohn, lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide crónica, esclerosis múltiple, psoriasis, dermatitis alérgica de contacto, polimiosis, paquidermia, periarteritis nodosa, fiebre reumática, vitíligo vulgaris, diabetes mellitus dependiente de insulina, enfermedad de Behcet, enfermedad de Hashimoto, enfermedad de Addison, dermatomiositis, miastenia gravis, síndrome de Reiter, enfermedad de Graves, anemia perniciosa, síndrome de Goodpasture, esterilidad patológica, hepatitis crónica activa, pénfigo, púrpura trombocitopénica autoinmunitaria y anemia hemolítica autoinmunitaria.

La parte que reconoce la PD-1 humana solo tiene que ser una sustancia que reconozca la PD-1 humana, por ejemplo, el anticuerpo anti-PD-1 humana o un fragmento del mismo, la propia PD-1 humana o un fragmento del mismo, un ligando de la PD-1 humana o un fragmento del mismo (Freeman, GJ, et al., Journal of Experimental Medicine, 192, 7:1027-1034 (2000)), PD-L2 humano y PD-H3 humano etc.), y un compuesto orgánico de bajo peso molecular. etc.

Un anticuerpo para la PD-1 humana o un fragmento del mismo puede ser un anticuerpo policlonal o monoclonal completo, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano completo y un anticuerpo acortado del mismo (por ejemplo, F(ab')2, Fab', Fab, Fv) etc. que contiene un anticuerpo anti-PD-1 humana o un fragmento del mismo.

Concretamente, son anticuerpos monoclonales anti-PD-1 humana producidos por hibridomas (número de identificación internacional FERM P-19162) que se depositaron en el Depositario del Organismo Internacional de Patentes del Instituto Nacional de Tecnología y Evaluación en Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japón, el 19 de diciembre de 2002, y que se transfirieron al Depósito Internacional el 5 de junio de 2003 (número de identificación internacional FERM BP-8392), que recibió el nombre de J110. Aunque se prefieren los fragmentos de anticuerpo F(ab')2, Fab', Fab y Fv de estos anticuerpos etc., no se limitan a estos.

Los fragmentos de anticuerpo F(ab')2 Fab', Fab y Fv pueden obtenerse procesando anticuerpos completos con enzima proteasa y, opcionalmente, reduciéndolos. Se pueden producir como anticuerpos, fragmentos de los mismos o proteínas de fusión con otras proteínas y los fragmentos, utilizando el vector de expresión creado por reordenamiento génico utilizando el ADNc separado del hibridoma productor de anticuerpos.

La proteína de membrana de la membrana celular de las células humanas que expresan PD-1 significa la proteína de membrana que se expresa en la membrana celular de la misma célula que las células humanas que expresan PD-1, e incluye cada una de ellas la proteína de membrana de células de cultivo en primera fase humanas o líneas celulares humanas que expresan la PD-1 humana. Por ejemplo, es preferible el complejo receptor de linfocitos T o el complejo receptor de linfocitos B.

La parte que reconoce la proteína de membrana de la membrana celular de las células que expresan la PD-1 humana puede ser una sustancia que reconoce la proteína de membrana que se expresa en la membrana celular de la misma célula que las células que expresan la PD-1 humana, e incluye, por ejemplo, anticuerpos contra la proteína de membrana y fragmentos de los mismos, la propia proteína de membrana y fragmentos de la misma, ligandos para la proteína de membrana y fragmentos de la misma, y compuestos orgánicos de bajo peso molecular que se unen a la proteína de membrana etc.

Los anticuerpos o fragmentos parciales de los mismos contra la proteína de membrana de la membrana celular de las células que expresan la PD-1 humana son anticuerpos o fragmentos parciales de los mismos contra la proteína de membrana que se expresa en la membrana celular de la misma célula que las células que expresan la PD-1 humana , y pueden ser de anticuerpos policlonales o monoclonales completos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos completos y fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, F(ab')2, Fab', Fab, Fv) etc.

Un complejo receptor de linfocitos T es al menos un complejo que comprende el receptor de linfocitos T que consiste en una subunidad a y una subunidad p y CD3 que consiste en una subunidad ^y, una subunidad 8, una subunidad £ y una subunidad Z.

Un complejo receptor de linfocitos B es al menos un complejo que comprende una inmunoglobulina unida a la membrana, una subunidad CD79a y una subunidad CD79p.

Los anticuerpos o fragmentos parciales de los mismos contra un complejo receptor de linfocitos T pueden ser anticuerpos o fragmentos parciales de los mismos que reconocen el complejo receptor de linfocitos T. Estos incluyen anticuerpos o fragmentos parciales de los mismos contra cada subunidad del receptor de linfocitos T y CD3, que compone el complejo del receptor de linfocitos T y pueden ser anticuerpos policlonales o monoclonales completos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos completos y fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, F(ab')2, Fab', Fab, Fv) etc. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales contra CD3 pueden producirse utilizando un hibridoma que ya se ha establecido. Se puede adquirir anti-CD3 (a-CD3£mAb (PharMingen, Inc.)).

Los anticuerpos o fragmentos parciales de los mismos contra un complejo receptor de linfocitos B pueden ser anticuerpos o fragmentos parciales de los mismos que reconocen el complejo receptor de linfocitos B. Incluyen anticuerpos o fragmentos parciales de los mismos contra cada subunidad de inmunoglobulina unida a membrana y CD79, que compone el complejo receptor de linfocitos B, y pueden ser anticuerpos policlonales o monoclonales completos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos completos y fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, F(ab')², Fab', Fab, Fv) etc. Concretamente, se pueden usar anticuerpos anti-BCR comerciales y, por ejemplo, se pueden adquirir anticuerpos policlonales anti-IgG (H+L) (Zymed Laboratories).

La sustancia que comprende la parte que reconoce la PD-1 humana y la parte que reconoce la proteína de membrana de la membrana celular de las células que expresan la PD-1 humana significa una sustancia que puede unirse simultáneamente a un dominio extracelular de la PD-1 humana y a un dominio extracelular de la proteína de membrana de la membrana celular de la misma célula. Concretamente, incluyen anticuerpos biespecíficos que comprenden anticuerpos específicos o fragmentos de los mismos contra la PD-1 humana y anticuerpos específicos o fragmentos de los mismos contra la proteína de membrana de la membrana celular de las células que expresan la PD-1 humana.

Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos asimétricos que tienen dos sitios de reconocimiento de antígeno independientes con dos especificidades antigénicas diferentes. Un método químico muy conocido (Nisonoff, A., et al., Archives of Biochemistry and Biophysics, 90; 460-462 (1961), Brennan, M., et al., Science, 299; 81-83 (1985)) es bien conocido como un método de preparación de los anticuerpos biespecíficos. Los anticuerpos biespecíficos pueden obtenerse hidrolizando respectivamente dos tipos de anticuerpos mediante enzimas y cortando los enlaces disulfuro de las cadenas H mediante agentes reductores, y mezclando y reoxidando a continuación los diferentes tipos de anticuerpos. Recientemente, se ha divulgado un método de preparación que utiliza agentes de reticulación, como glutaraldehído y carbodiimida (JP02-01556).

Se conocen tecnologías que producen directamente los anticuerpos biespecíficos mediante el uso de tecnologías de recombinación génica. Por ejemplo, la producción de anticuerpos biespecíficos (llamado diacuerpo de cadena simple) contra el antígeno carcinoembrionario y la beta-galactosidasa de E. coli ha sido descrita en Alt, FEBS Letter, 454, 90 (1999). Un dominio variable de la cadena pesada (VH) y otro dominio variable de la cadena ligera (VL) del fragmento se conectan con enlazadores para combinarlos entre dos dominios continuos en la misma cadena. Un dominio variable de la cadena pesada (VH) y otro dominio variable de la cadena ligera (VL) del fragmento están conectados con enlazadores para combinarlos entre dos dominios continuos en la misma cadena. Por lo tanto, es inevitable que los dominios VH y VL del fragmento se combinen con los dominios VL y VH complementarios de otro fragmento, y como resultado, se forman dos sitios de unión al antígeno. Aunque se prefieren 3-12 residuos de aminoácidos para los enlazadores peptídicos, la secuencia no está limitada (Hudson, PJ., et al., Journal of Immunology Medicine, 231, 1-2; 177-189 (1999)).

Para la fabricación de los anticuerpos biespecíficos que utilizan hibridomas, se puede recurrir al método de Reading et al., es decir, un método para producir hibridomas híbridos mediante la fusión adicional de dos tipos de hibridomas que producen los anticuerpos monoclonales y posterior selección de hibridomas híbridos que producen los anticuerpos biespecíficos diana (US4474893).

Los anticuerpos biespecíficos que comprenden anticuerpos específicos o fragmentos de los mismos contra la PD-1 humana y anticuerpos específicos o fragmentos de los mismos contra la proteína de membrana de la membrana celular de las células que expresan la PD-1 humana son anticuerpos que pueden unirse simultáneamente al dominio extracelular de la PD-1 humana y al dominio extracelular de la proteína de membrana de la membrana celular de la misma célula.

Los anticuerpos biespecíficos se pueden producir mediante el siguiente método:

(1) los animales son sensibilizados con la PD-1 humana o la proteína de membrana humana como un inmunógeno,

(2) se fusionan las células esplénicas de los animales sensibilizados y las células de mieloma de animales singénicos,

(3) las células que producen anticuerpos monoclonales contra el antígeno sensibilizante (PD-1 humana o proteína de membrana humana) se seleccionan a partir de los hibridomas obtenidos,

(4) se clonan los hibridomas que producen los anticuerpos diana,

(5) se dejan proliferar los hibridomas que producen anticuerpos clonados,

(6) se separan y refinan los anticuerpos producidos,

(7) se producen los anticuerpos biespecíficos mediante la reticulación de los anticuerpos anti-PD-1 humana y los anticuerpos anti-proteína de membrana humana con enlazadores, o

(8) se digieren adicionalmente con pepsina y se separan, y se refinan para obtener F(ab')²,

(9) cada preparado F(ab')²se reduce, se separa y se refina.

(10) los anticuerpos biespecíficos se pueden producir mediante la reticulación de cada FabsH preparado mediante enlazadores.

Los enlazadores no están limitados y pueden ser cualquier cosa que pueda unir la parte que reconoce la proteína de membrana de las células que expresan PD-1 con la parte que reconoce la PD-1 humana, manteniendo un rango apropiado. Más concretamente, incluyen péptidos y amidas. etc.

Se pueden usar como enlazadores productos comerciales, por ejemplo, fenilendimaleimida (Aldrich).

Cuando ambas o una de las sustancias que reconocen respectivamente la proteína de membrana de las células que expresan PD-1 y la PD-1 humana de bajo peso molecular es(son) un compuesto(s) orgánico de peso molecular, (11) utilizando los anticuerpos producidos por la técnica anterior, se detectan las moléculas de bajo peso molecular que inhiben un enlace entre la proteína de membrana humana o la PD-1 humana y cada anticuerpo midiendo con un detector adecuado,

(12) el anticuerpo puede producirse mediante la reticulación de las moléculas de bajo peso molecular, los anticuerpos o el Fab con enlazadores.

Cada proceso se explica concretamente de la siguiente manera.

(1) En la sensibilización, es preferible que la PD-1 humana o la proteína de membrana humana se administren a la cavidad peritoneal o la almohadilla plantar de los animales sensibilizados. Los animales sensibilizados pueden ser animales como el ratón y la rata. etc. de modo que se pueda obtener generalmente el anticuerpo monoclonal, aunque esto no está limitado. Por ejemplo, es suficiente que se administren de una vez de 10 a 200 |jg del antígeno al ratón.

Se extirpa el bazo del animal sensibilizado cuyo título de anticuerpos ha aumentado lo suficiente entre los animales sensibilizados en el apartado anterior (1). La suspensión de las células esplénicas se prepara de la manera habitual. A continuación, se realiza una fusión celular del apartado (2) anterior agregando polietilenglicol (preferiblemente PEG4000) a la mezcla con las células esplénicas obtenidas y las células de mieloma singénicas a 37 °C. Se conocen varios tipos de células de mieloma de ratón, tales como P3 * 63Ag8, P3/NS1/1-Ag4-1 y SP-2/0-Ag-14 y todas ellas se pueden obtener fácilmente.

Es preferible que las células de mieloma sean HGPRT (hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa), se utilizan preferiblemente líneas que no puedan vivir en medios HAT (un medio que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina) y que no secreten anticuerpos. SP-2/0-Ag-Ag- 4.

A continuación, las mezclas de fusión celular obtenidas se siembran en placas de 96 micropocillos a baja densidad, las cuales se cultivan en medio HAT. Al cabo de 1 a 2 semanas, las células de mieloma no fusionadas, los hibridomas de células de mieloma, las células esplénicas no fusionadas y los hibridomas de células esplénicas desaparecen, mientras que solo los hibridomas de células esplénicas y las células de mieloma proliferan.

Al hacer reaccionar el sobrenadante de cultivo de los hibridomas con antígenos en fase sólida y medir los anticuerpos que adsorben específicamente los antígenos utilizando segundos anticuerpos marcados, la selección de los anteriores (3) determina si los hibridomas producen los anticuerpos contra la proteína de la membrana humana o la PD-1 humana o no.

El proceso de (4) se realiza mediante la clonación de hibridomas productores de anticuerpos de acuerdo con el cultivo de agar blando (Monoclonal Antibodies, 372 (1980)). En este caso, también es posible utilizar la dilución limitante.

En el proceso de (5), para obtener una gran cantidad de anticuerpo de manera más eficiente, se puede usar un método para administrar los hibridomas en la cavidad peritoneal del ratón, y separarlos y refinarlos del líquido peritoneal.

En el proceso de (6) se utilizan los métodos habituales, como la extracción con sal, la cromatografía de intercambio iónico, la filtración en gel, la cromatografía hidrófoba y la cromatografía de afinidad. etc. y más eficazmente, se puede usar la cromatografía de afinidad utilizando la proteína A-sepharose CL-4B (Amersham Biosciences K.K.). Dado que los anticuerpos biespecíficos de la presente divulgación se unen específicamente, se pueden usar para la purificación y la concentración, tal como la cromatografía de afinidad. etc. de la PD-1 humana.

En el proceso de (7), por ejemplo, los agentes de reticulación pueden hacer que la sal sódica de sulfo-EMCS (N-(6-maleinimidacaproxi) succinimida) se una a grupos SH (mercapto) o grupos amida de los anticuerpos. Primero, cualquiera de los anticuerpos se somete a reacciones de acoplamiento de amido con sulfo-EMCS. La sulfo-EMCS sin reaccionar se separa por filtración en gel. Los grupos SH (mercapto) del otro anticuerpo que se han reducido por la 2-mercaptoetilamina etc. se hacen reaccionar con grupos maleimida de la sulfo-EMCS que se han unido al primer anticuerpo. Los dos tipos de anticuerpos reticulados mutuamente se separan por filtración en gel.

En el proceso de (8), cada anticuerpo que se obtuvo en el proceso (6) se digirió con pepsina durante 48 horas a 37 °C. Los F(ab')2 digeridos con pepsina se purifican mediante métodos habituales, tales como extracción en sal, cromatografía de intercambio iónico, filtración en gel, cromatografía hidrófoba y cromatografía de afinidad etc. y más eficazmente, se puede usar la filtración en gel con cefaclor S-200 (Amersham Biosciences K.K.).

En el proceso de (9), los F(ab')2 se reducen con 2-mercaptoetanol durante 30 minutos a 30 °C. Los FabsH reducidos se purifican por métodos habituales, como la extracción en sal, la cromatografía de intercambio iónico, la filtración en gel, la cromatografía hidrófoba y la cromatografía de afinidad etc. y más efectivamente, se puede usar filtración en gel usando cefaclor S-200.

En el proceso de (10), los otros anticuerpos de la fracción de FabsH se unen con enlazadores. Los agentes de reticulación solo tienen que unir los grupos mercapto (SH) des FabsH, que se hace reaccionar con fenilendimaleimida durante 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación, se hace reaccionar con 1,3 veces más que el otro FabsH durante 4 horas a temperatura ambiente. La sustancia obtenida que tiene especificidad bivalente se purifica por métodos habituales tales como extracción en sal, cromatografía de intercambio iónico, filtración en gel, cromatografía hidrófoba y cromatografía de afinidad. etc. y más efectivamente, se puede usar filtración en gel usando cefaclor S-200.

En el proceso de (11), los anticuerpos obtenidos en el proceso (6) se pueden usar tal cual, o preferiblemente marcados (por ejemplo, marcaje con biotina y marcaje con FITC). etc.) según el procedimiento común. En el ELISA, los anticuerpos se agregan a los antígenos de fase sólida. A continuación, cuando se usa un anticuerpo secundario marcado con enzima y un anticuerpo marcado con biotina, la unión específica entre los anticuerpos y los antígenos se puede medir con un absorciómetro en presencia de una sustancia cromófora, después de agregar estreptavidina marcada con enzima. Las moléculas de bajo peso molecular que reconocen específicamente la PD-1 o la proteína de membrana se pueden obtener usando este sistema de ensayo.

En el proceso de (12), cuando el otro es un anticuerpo o Fab, este puede unirse a un anticuerpo o Fab introduciendo grupos funcionales adecuados en las moléculas de bajo peso molecular obtenidas. Por ejemplo, si se introducen grupos maleimida, puede unirse a grupos mercapto (SH) del anticuerpo o Fab. Si ambas son moléculas de bajo peso molecular, se pueden sintetizar ambas moléculas.

Por otro lado, el ADNc de cada anticuerpo se puede separar de los hibridomas que producen los anticuerpos monoclonales contra cada antígeno. Mediante la transformación de las células hospedadoras adecuadas usando un vector de expresión que contiene ADN, tanto el ADNc como sus fragmentos parciales se unen mediante métodos de recombinación génica, y las células hospedadoras pueden producir anticuerpos biespecíficos.

Concretamente, los anticuerpos biespecíficos que comprenden los anticuerpos contra la PD-1 humana o fragmentos parciales de los mismos y los anticuerpos contra la proteína de membrana de la membrana celular de las células que expresan la PD-1 humana o fragmentos parciales de los mismos se pueden preparar mediante los siguientes métodos;

(1) Cada gen de anticuerpo se separa de cada hibridoma que produce anticuerpos monoclonales anti-PD-1 humana y anticuerpos monoclonales anti-proteína de membrana respectivamente,

(2) El a Dn de la región variable del gen del anticuerpo monoclonal anti-PD-1 humana y el ADN de la región variable del gen del anticuerpo monoclonal anti-proteína de membrana se enlazan usando un enlazador de ADN. Los vectores de expresión que contienen los fragmentos de ADN enlazados se introducen en células hospedadoras adecuadas,

(3) las células se cultivan en condiciones de cultivo adecuadas y las proteínas producidas se separan y se refinan.

Cada proceso se explica concretamente de la siguiente manera.

El proceso de (1) comprende un proceso de separación de ARN de hibridomas y un proceso de separación de un gen de anticuerpo o ADNc que codifica su péptido parcial.

El proceso de separación del ARN total o del ARNm de los hibridomas puede realizarse de acuerdo con un método bien conocido (un método descrito en Sambrook, J., et al., Molecular Cloning (1989), Cold Spring Harbor Laboratory, o F. M. Ausubel., et al., Current Protocolin Molecular Biology).

Mediante el uso de cebadores de ADN sintéticos que tienen secuencias de nucleótidos parciales de los anticuerpos de la presente divulgación, el ADNc que codifica los genes de los anticuerpos de la presente invención o su péptido parcial se puede amplificar mediante la reacción en cadena de la polimerasa (en lo sucesivo denominada PCR). O, por hibridación con sondas marcadas utilizando fragmentos de ADN o los ADN sintéticos que codifican una parte o la región completa de los anticuerpos de la presente divulgación, el ADNc puede seleccionarse del ADNc contenido en vectores adecuados. La hibridación se puede realizar de acuerdo con un método bien conocido. El gen del anticuerpo puede amplificarse utilizando el ARN total o el ARNm mediante la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (en lo sucesivo denominada RT-PCR).

(2) Como un método para producir los anticuerpos biespecíficos de la presente divulgación, se citan

(i) un método de síntesis de péptidos y

(ii) un método de producción mediante tecnologías de recombinación génica. etc. y el método descrito en (ii) es preferible industrialmente.

El sistema de expresión (sistema hospedador-vector) para producir péptidos mediante el uso de tecnologías de recombinación génica incluye, por ejemplo, el sistema de expresión de bacilos, levaduras, células de insectos y células de mamíferos.

El sistema vectorial incluye plásmidos de E. coli (por ejemplo, pBR322, pBR325, pUC12 y pUC13), plásmidos de Bacillus subtilis (por ejemplo, pUB110, pTP5 y pC194), plásmidos de levadura (por ejemplo, pSH19 y pSH15), bacteriófagos tales como el fago lambda, virus animales tales como retrovirus, virus vaccinia y baculovirus, PA1-11, pXT1, pRc/CMV, pRc/RSV y pcDNAI/Neo etc.

El promotor debe ser un promotor apropiado correspondiente al hospedador de expresión génica. Por ejemplo, cuando se usan células animales como hospedadores, cabe citar el promotor SRa, el promotor SV40, el promotor LTR, el promotor CMV y el promotor HSV-TK etc. Es preferible utilizar el promotor CMV (citomegalovirus), el promotor SRa. etc. En el caso de Escherichia coli, son preferibles el promotor trp, el promotor lac, el promotor recA, el promotor APL, el promotor Ipp y el promotor T7 etc. En el caso de la bacteria Bacillus, son preferibles el promotor SPO1, el promotor SPO2 y el promotor penP etc. En el caso de las levaduras, son preferibles el promotor PHO5, el promotor PGK, el promotor GAP y el promotor ADH, etc.

Además, si es necesario se puede utilizar el vector de expresión que contiene potenciador, señal de corte y empalme, señal poliA, marcador seleccionado y ori de replicación de SV40 (en lo sucesivo se puede denominar SV40ori). etc. El marcador seleccionado incluye, por ejemplo, el gen de la dihidrofolato reductasa (en lo sucesivo se puede denominar dhfr), el gen de resistencia a metotrexato (MTX)), el gen de resistencia a ampicilina (en lo sucesivo se puede denominar Ampr), y el gen de resistencia a neomicina (en lo sucesivo se puede denominar Neor), el gen de resistencia a G418, etc. Especialmente, cuando el gen dhfr se usa como un marcador seleccionado utilizando células de hámster chino deficientes en el gen dhfr, se puede seleccionar un gen diana incluso usando el medio sin timidina. Para que la secuencia señal sea adecuada para los hospedadores si es necesario puede agregarse al lado N-terminal de la proteína de la presente invención. Cuando los hospedadores son Escherichia, se puede usar la secuencia señal PhoA y la secuencia señal OmpA etc. Cuando los hospedadores son bacilos, se puede usar la secuencia señal de la a-amilasa y la secuencia señal de la subtilisina etc. Cuando los hospedadores son bacilos, se puede usar la secuencia señal MFa, la secuencia señal SUC2 etc. Cuando los hospedadores son células animales, se puede usar la secuencia señal de la a-insulina, la secuencia señal del a-interferón y la secuencia señal de anticuerpo etc., respectivamente. Los transformantes pueden fabricarse utilizando el vector que contiene el ADN que codifica la proteína construida.

Mediante el cultivo de Escherichia transformada con el vector de expresión en un medio adecuado, se obtiene el péptido diana de las células del cuerpo. Y, si se usa un péptido señal (por ejemplo, un péptido señal de pelB) de bacterias, el péptido diana se secreta en el periplasma. Además, se puede producir como proteína de fusión con otro péptido. En el caso de la expresión en células de mamíferos, por ejemplo, cultivando células de mamífero transformadas con vectores de expresión adecuados que incluyen ADNc que codifica una proteína diana en un medio adecuado, se secretan al medio los péptidos diana.

Por ejemplo, se pueden utilizar como células hospedadoras Escherichia, bacterias Bacillus, levaduras, células de insectos, insectos y células animales. etc. Por ejemplo, pueden utilizarse como ejemplos concretos de Escherichia, Escherichia coli K12, DH1, JM103, JA221, HB101, C600, JM109, DH5 y DH5a etc. Por ejemplo, el bacilo Bacillus subtilis MI114 etc. puede utilizarse como bacteria Bacillus. Por ejemplo, como levaduras pueden utilizarse Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R - NA87-11A, DKD-5D o 20B-12, Saccharomyces pombe NCYC1913, o NCYC2036, y Pichia pastoris KM71 etc. Cuando el virus es el AcNPV, se pueden utilizar como células de insecto por ejemplo, células de Spodoptera frugiperda (células SF), células MG1 derivadas del estómago medio de Trichoplusia ni, células High FiveTM derivadas del huevo de Trichoplusia ni, células derivadas de Mamestra brassicae, células derivadas de Estigmene acrea etc. Cuando el virus es el BmNPV, se pueden utilizar líneas celulares derivadas del gusano de seda (células N de Bombyx mori; células BmN) etc. Por ejemplo, como células Sf se pueden utilizar células Sf9 (ATCC CRL1711) (Vaughn, J. L., In Vivo, 13; 2 l 3-217 (1977)) y células Sf21 etc. Como insectos se pueden utilizar por ejemplo, larvas de gusano de seda. Por ejemplo, como células animales puede utilizarse COS-1, COS-7, Vero, células de hámster chino CHO (en lo sucesivo, abreviado como células CHO), células de hámster chino CHO deficientes en dhfr (en lo sucesivo, abreviado como células CHO(dhfr-), células de ratón L, AtT-20 de ratón, células de mieloma de ratón, GH3 de rata, linfocitos T HEK293 y células FL humanas etc. Por ejemplo, la transformación en Escherichia se puede realizar de acuerdo con Proc. Natl Acad Sci. USA, 69, 2110 (1972). Por ejemplo, la transformación en Bacillus se puede realizar de acuerdo con Molecular and General Genetic, 168, 111 (1979). Por ejemplo, la transformación en levaduras se puede realizar de acuerdo con Becker, DM., et al., Methods in Enzymology, volumen 194, p.182-187 (1991) o Proc. Natl Acad Sci USA, 75, 1929 (1978). La transformación en células de insectos o insectos se puede realizar de acuerdo con Bio/Technology, 6; 47-55 (1978). La transformación en células animales puede realizarse de acuerdo con CELL TECHNOLOGY SUPPLEMENT 8 NEW CELL TECHNOLOGY EXPERIMENTAL PROTOCOL, Shujunsha, 263 (1995), o Virology, 52, 456 (1973).

(3) Los péptidos obtenidos se purifican mediante los métodos habituales, como extracción en sal, cromatografía de intercambio iónico, filtración en gel, cromatografía hidrófoba y cromatografía de afinidad. etc.

En general, un polipéptido sustancialmente puro que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 11 es un polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos que es 90 % o más, 95, 98, o 99 % o más homóloga con el polipéptido a producir.

Un homólogo del polipéptido sustancialmente puro que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 11 es un polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos que es al menos el 70 % o más, preferiblemente al menos 80, 90 o 95 % o más homóloga con el polipéptido en una región de al menos 20 aminoácidos contiguos, preferiblemente al menos 30, 40, 60 o 100 aminoácidos.

Un fragmento del polipéptido sustancialmente puro que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 2, la s Eq ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 11 es un polipéptido que contiene al menos 10 aminoácidos, preferiblemente al menos 15, 20, 25, 30, 40, 50 o 60 aminoácidos, y un homólogo del mismo es un polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos que es al menos el 70 %, preferiblemente al menos 80, 90 o 95 % o más homóloga con el polipéptido en una región de al menos 10 aminoácidos contiguos, preferiblemente al menos 15, 20, 25, 30, 40, 50 o 60 aminoácidos contiguos.

Un polipéptido sustancialmente puro que comprende una secuencia de aminoácidos en la que se han eliminado uno o varios aminoácidos de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 11 es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos en la que se ha eliminado uno o dos aminoácidos o más (preferiblemente de 1 a aproximadamente 25, más preferiblemente de 1 a aproximadamente 10, además, preferiblemente de 1 a 5) de la secuencia de aminoácidos. Un polipéptido sustancialmente puro que comprende una secuencia de aminoácidos en la que se ha sustituido uno o varios aminoácidos de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 11 es un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos en la que se ha sustituido uno o dos aminoácidos o más (preferiblemente de 1 a aproximadamente 25, más preferiblemente de 1 a aproximadamente 10, además, preferiblemente de 1 a 5).

Un homólogo de un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos de ADN representada por la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 3 o la SEQ ID NO: 9 es un polinucleótido que es al menos 70 %, preferiblemente al menos 80, 90 o más preferiblemente 95 % o más homólogo con el polinucleótido en una región de al menos 20, preferiblemente al menos 30, 40, 60 o 100 nucleótidos contiguos.

Un fragmento del polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos de ADN representada por la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 3 o la SEQ ID NO: 9 es un polinucleótido que contiene un polinucleótido que comprende al menos 20, preferiblemente al menos 30, 40, 50, 60, o 100 nucleótidos contiguos.

Un ADN que hibrida con el ADN que contiene la secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 3 o la SEQ ID NO: 9 en condiciones rigurosas incluye, por ejemplo, aproximadamente un ADN que contiene una secuencia de nucleótidos que es aproximadamente 70 % o más, preferiblemente aproximadamente 80 % o más, más preferiblemente aproximadamente 90 % o más, lo más preferiblemente aproximadamente 95 % o más homóloga con la secuencia de nucleótidos representada respectivamente por la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 3 o la SEQ ID NO: 9.

La hibridación se puede realizar de acuerdo con un método bien conocido o, por ejemplo, un método descrito en J. Sambrook, Molecular Cloning, 2nd Edition, Coldspring Harbor Laboratory. Cuando se utiliza una biblioteca comercial, es posible realizarla de acuerdo con el método adjunto que se describe en las instrucciones de uso. Más preferiblemente, es posible realizarla en condiciones rigurosas. Las condiciones rigurosas son aproximadamente 19 40 mM, preferiblemente aproximadamente 19-20 mM de concentración de NaCl, a aproximadamente 50-70 °C, preferiblemente aproximadamente 60-65 °C. Especialmente, las condiciones más preferibles son aproximadamente 19 mM de concentración de sodio a aproximadamente 65 °C.

Aplicabilidad industrial

Aplicación a la medicina:

El anticuerpo biespecífico de la presente divulgación se puede usar para terapia y/o prevención para las siguientes enfermedades.

El anticuerpo biespecífico de la presente divulgación es útil para la terapia y/o prevención de enfermedades neurodegenerativas (geriopsicosis, enfermedad de Alzheimer, síndrome de Down, enfermedad de Parkinson, neuropatía diabética, síndrome de Parkinson, enfermedad de Huntington, enfermedad de Machado-Joseph), esclerosis lateral amiotrófica, neuropatía diabética y enfermedad de Creutzfeldt-Jakob).

El anticuerpo biespecífico de la presente divulgación es útil para la terapia y/o prevención de enfermedades que aceleran la reacción inmunitaria, por ejemplo, enfermedades autoinmunitarias (nefritis glomerular, artritis, enfermedad tipo cardiomiopatía dilatada, colitis ulcerosa, síndrome de Sjogren, enfermedad de Crohn), lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide crónica, esclerosis múltiple, psoriasis, dermatitis alérgica de contacto, polimiosis, paquidermia, periarteritis nodosa, fiebre reumática, vitíligo vulgaris, diabetes mellitus dependiente de insulina, enfermedad de Behcet, enfermedad de Hashimoto, enfermedad de Addison, dermatomiositis, miastenia gravis, síndrome de Reiter, enfermedad de Graves, anemia perniciosa, síndrome de Goodpasture, esterilidad patológica, hepatitis crónica activa, pénfigo, púrpura trombocitopénica autoinmunitaria y anemia hemolítica autoinmunitaria).

El anticuerpo biespecífico de la presente divulgación es útil para la terapia y/o prevención de la colagenosis (lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide, esclerodermia sistémica, esclerodermia difusa, dermatomiositis, polimiositis, polimiosis, síndrome de Sjogren, enfermedad mixta del tejido conjuntivo, poliarteritis nodosa, y fiebre reumática etc.).

El anticuerpo biespecífico de la presente divulgación es útil para la terapia y/o prevención del rechazo de injertos de órganos, enfermedades alérgicas y enfermedades causadas por la atenuación de la reacción inmunitaria, en la que participa la PD-1, por ejemplo, enfermedades tumorales e infecciosas.

Cuando se usa el anticuerpo biespecífico de la presente divulgación para el propósito anterior, generalmente se administra sistémicamente o localmente, y por vía oral o parenteral.

La dosis es diferente dependiendo de la edad, el peso corporal, los síntomas, el efecto terapéutico, la vía de administración y la duración del tratamiento. etc. Para la administración oral, generalmente, la dosificación varía de 0,1 mg a 100 mg por adulto y se administra por vía oral una vez a varias veces por día, o la dosificación varía de 0,01 mg a 30 mg por adulto y se administra una vez a varias veces por día por vía parenteral, adecuadamente por vía intravenosa, y se administra por vía intravenosa durante 1 a 24 horas por día de forma continua.

Debido a que la dosis cambia de acuerdo con las diversas condiciones descritas anteriormente, hay casos en los que se pueden usar dosis menores o mayores que la dosis anterior.

Cuando se administra una composición de la presente divulgación se utiliza como medicamentos sólidos internos y medicamentos líquidos internos para su uso interno e inyecciones, preparaciones externas, supositorios. etc. para la administración parenteral.

Los medicamentos sólidos internos para administración oral incluyen comprimidos, píldoras, cápsulas, polvos dispersantes, gránulos etc. Las cápsulas incluyen cápsulas duras y cápsulas blandas.

En el caso de tales medicamentos sólidos, se puede fabricar farmacéuticamente uno o más compuestos activos tal cual o una formulación con excipientes (lactosa, manitol, glucosa, celulosa microcristalina y almidón etc.), aglutinantes (hidroxipropilcelulosa, polivinilpirrolidona y aluminato metasilicato de magnesio etc.), disgregantes (celulosa glicolato cálcico etc.), lubricantes (estearato de magnesio etc.), estabilizadores o solubilizantes (glutamato y ácido aspártico etc.) etc. de acuerdo con los métodos habituales. Además, pueden recubrirse opcionalmente con recubrimientos (sacarosa, gelatina, hidroxipropilcelulosa y ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa). etc.) o recubrirse con dos capas o más. Además, pueden incluirse cápsulas de materiales absorbibles tales como gelatina.

Las composiciones líquidas para administración oral incluyen agua, suspensiones, emulsiones, jarabes y elixires farmacéuticamente aceptables. etc. En cuanto a dichos medicamentos líquidos, uno o más compuestos activos pueden disolverse, suspenderse o emulsionarse para obtener un diluyente de uso general (agua purificada, etanol o los líquidos de mezcla). etc. Además, esos medicamentos líquidos pueden contener humectantes, agentes suspensores, agentes emulsionantes, edulcorantes, agentes aromatizantes, agentes saborizantes, conservantes y tampones. etc.

Las inyecciones para administración parenteral incluyen inyecciones sólidas que se disuelven o suspenden en solución, suspensión, emulsión o en el tiempo de uso del disolvente. Las inyecciones se utilizan mediante la disolución, levigación y fusión de uno o más activadores para el disolvente. Como disolvente, se usan, por ejemplo, agua para inyectables, solución salina destilada, aceite vegetal, propilenglicol, polietilenglicol, alcoholes tales como etanol. etc. y se utilizan estas combinaciones. Además, esta inyección puede incluir estabilizadores, solubilizantes (glutamato, ácido aspártico y polisorbato 80 (marca registrada) etc.), agentes de suspensión, agentes emulsionantes, agentes calmantes, tampones y conservantes etc. Estos se esterilizan en el proceso final o se fabrican a partir de la manipulación aséptica. Los medicamentos sólidos asépticos se pueden fabricar como un producto de secado por congelación y se pueden usar haciéndolos asépticos o disolviéndolos en agua destilada aséptica para inyectables u otros solventes antes de su uso.

Otras composiciones que contienen uno o más activador(es) para administración parenteral incluyen líquido para uso externo, medicamento en pomada, medicamento de recubrimiento, inhalador, aerosol, supositorio y pesario para administración intrarrectal que se prescribe de acuerdo con un procedimiento de rutina.

Los aerosoles pueden contener un estabilizador como el hidrógeno sulfito de sodio además del diluyente generalmente utilizado, un tampón que proporciona isotonicidad y un medicamento isotónico como, por ejemplo, cloruro de sodio, citrato de sodio o citratos. Los métodos de producción de los aerosoles se han descrito en detalle, por ejemplo, en la patente US-2.868.691 y en la patente US-3.095.355.

Dado que la PD-1 se refiere a una reacción inmunitaria, la PD-1 también se puede usar para la detección etc., de la sustancia relacionada con la reacción inmunitaria midiendo la expresión de la PD-1 humana utilizando el anticuerpo biespecífico de la presente divulgación.

El anticuerpo biespecífico de la presente divulgación puede comprender una parte que reconoce la PD-1 humana, una parte que reconoce la proteína de membrana de la membrana celular de las células que expresan la PD-1 humana y un enlazador, y es una sustancia excelente que reconoce específicamente la PD-1 humana y la proteína de membrana, y puede transmitir la señal de la PD-1 humana.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra la construcción de un vector de expresión de anticuerpo biespecífico.

La Figura 2 muestra la reactividad de cada anticuerpo biespecífico contra el antígeno de superficie de células X63 expresado en células CD3(-)/PD-1(+) y el antígeno de superficie de células mononucleares de sangre periférica (CMSP) como CD3(+)/PD-1(-). En esta figura, las áreas rellenas del histograma representan la IgG de control y las áreas no rellenas representan la distribución de células positivas para PD-1 o CD3.

La Figura 3 muestra el efecto sobre la respuesta proliferativa de linfocitos T de sangre periférica humanos activados del anticuerpo biespecífico. En esta figura, “-” representa el grupo de adición de IgG de control y “BsAb” representa el grupo de adición de anticuerpo biespecífico, el eje representa la absorbancia de la medición y ** representa P <0,05 en la prueba de significación.

Mejor modo de llevar a cabo la invención.

Los siguientes ejemplos explican la presente invención más concretamente, pero no limitan el alcance de la presente invención.

Ejemplo 1:

Para obtener el ADN que codifica el anticuerpo anti-PD-1 humana y el anticuerpo anti-CD3 humana respectivamente, se aisló cada ARN total del hibridoma J110 (número de identificación internacional: FERM BP-8392) y del hibridoma del anticuerpo anti-CD3 (obtenido de a Tc C: Número ATCC: CRL-8001). La operación se realizó utilizando el Sistema de aislamiento total SV (nombre comercial: adquirido en Promega) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

La biblioteca de ADNc del hibridoma J110 y la biblioteca de ADNc del hibridoma del anticuerpo anti-CD3 se generaron a partir del ARN total (ARN total) mediante el método de cegado de oligo dT usando Ready-To-Go You-Prime First-Strand Beads (nombre comercial: adquirido en Amersham Pharmacia). La operación y el procedimiento se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Se amplificó el ADNc de la región variable de la cadena pesada de IgG y de la cadena ligera de IgG del anticuerpo anti-PD-1 humana y el anticuerpo anti-CD3 humana por reacción de ^pC^rusando Heavy Primers y Light Primers (nombre comercial: adquirido en Amersham Pharmacia), respectivamente. La PCR se llevó a cabo siguiendo las siguientes etapas; como primera etapa a 95 °C durante 2 minutos y como etapas de ciclo a 95 °C durante 30 segundos, a 50 °C durante 30 segundos, y a 72 °C durante 40 segundos, se repitió 30 veces y se dejó a 72 °C durante 5 minutos como último etapa

El producto de la PCR se separó mediante electroforesis en gel de agarosa. El tamaño esperado del fragmento de ADN se recogió y se clonó en el pGEM-T Easy Vector (nombre comercial: adquirido en Promega). A continuación, DH5a de E. coli se transformó con el plásmido. El ADN de la cadena pesada de IgG (SEQ ID NO: 1 o 5) y la cadena ligera de IgG (SEQ ID NO: 3 o 7) se secuenciaron para determinar la secuencia de consenso.

Ejemplo 2:

Los ADN que codifican los anticuerpos biespecíficos se prepararon conectándolos respectivamente a los ADNc separados en el ejemplo 1. El fragmento 1 se preparó conectando el ADNc de la cadena pesada de la IgG (SEQ ID NO: 1) del anticuerpo anti-PD-1 humana y el ADNc de la cadena ligera de la IgG (SEQ ID NO: 7) del anticuerpo anti-CD3 humana por PCR usando el enlazador N.° 1 (SEQ ID NO: 19), el enlazador N.° 2 (SEQ ID NO: 20), el cebador N.° 1 (SEQ ID NO: 14), y cebador N.° 2 (SEQ ID NO: 15) (Figura 1). El fragmento 2 se preparó conectando el ADNc de la cadena pesada de la IgG (SEQ ID NO: 7) del anticuerpo anti-CD3 humana y el ADNc de la cadena ligera de la IgG (SEQ ID N^o: 1) del anticuerpo anti-PD-1 humana mediante PCR utilizando el enlazador N.° 3. (SEQ ID NO: 21), el enlazador N.° 4 (SEQ ID NO: 22), el cebador N.°3 (SEQ ID NO: 16) y el cebador N.°4 (SEQ ID NO: 17) (figura 1). El fragmento 3 se preparó (Figura 1) conectando el fragmento 1 y el fragmento 2 mediante PCR utilizando el enlazador N.° 5 (SEQ ID NO: 23), el enlazador N.° 6 (SEQ ID NO: 24), el cebador N.° 5 (SEQ ID NO: 18), y el cebador N.° 4 (SEQ ID NO: 22) y a continuación se decidió la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 9).

Cada reacción de PCR se realizó respectivamente. La primera PCR se realizó repitiendo 20 veces las siguientes etapas; a 94 °C durante 30 segundos, a 40 °C durante 30 segundos y a 72 °C durante 50 segundos. La 2a PCR se realizó repitiendo 30 veces las siguientes etapas; a 94 °C durante 30 segundos, a 50 °C durante 30 segundos y a 72 °C durante 50 segundos, utilizando la primera solución de PCR como molde.

Cebador N.° 2: 5'-TTTTTTAAGCTTACAGGTCCAGCTGCAGGAGTCA-3' (SEQ ID NO:14)

Cebador N.° 2: 5-TTTTTTGCGGCCGCCCGGTTTATTTCCAACTTTG-3' (SEQ ID NO:15)

Cebador N.° 3: 5'-TTTTTTAAGCTTACAGGTCCAGCTGCAGCAGTCT-3' (SEQ ID NO:16)

Cebador N.° 4: 5'-TTTTTTGCGGCCGCCCGTTTGATTTCCAGCTTGG-3' (SEQ ID NO:17)

Cebador N.° 5: 5'-ATGAACTGGTACCAGCAGAAG-3'(SEQ ID NO:18)

Enlazador N.° 1:

5'-AGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGTTCACAAATTGTT

CTCACCCAGTCTCCAG-3' (SEQ ID NO:19)

Enlazador N.° 2:

5'-CTGGAGACTGGGTGAGAACAATTTGTGAACCGCCTCCACCTGAGGAGAC

GGTGACCGTGGTCCCT-3' (SEQ ID NO:20)

Enlazador N.° 3:

5'-AG GCACCACT CTCACAGT CTCCTC AGGTGG AGGCGGTT CAG ACATCC AG

ATGACCCAGTCTCCAG-3' (SEQ ID NO:21)

Enlazador N.° 4:

5'-CTGGAGACTGGGTCATCTGGATGTCTGAACCGCCTCCACCTGAGGAGAC

TGTGAGAGTGGTGCCT-3' (SEQ ID NO:22)

Enlazador N.° 5:

5-GGGGACAAAGTTGGAAATAAACCGGGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGT

GGCTCTGGCGGTGGCGGATCGCAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGGG-3' (SEQ ID

NO:23)

Enlazador N.° 6:

5'-CCCCAGACTGCTGCAGCTGGACCTGCGATCCGCCACCGCCAGAGCCACC

TCCGCCTGAACCGCCTCCACCCCGGTTTATTTCCAACTTTGTCCCC-3' (SEQ ID

NO:24)

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo biespecífico para su uso en el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria, en donde el anticuerpo biespecífico es una proteína de fusión que comprende:

(i) una región variable de la cadena pesada de un anticuerpo anti-PD-1 humana,

(ii) una región variable de la cadena ligera de un anticuerpo anti-PD-1 humana,

(iii) una región variable de la cadena pesada de un anticuerpo anti-CD3 humana, y

(iv) una región variable de la cadena ligera de un anticuerpo anti-CD3 humana,

y que se une simultáneamente a la PD-1 humana y a la CD3 humana, en donde dicha CD3 humana se expresa en la misma célula que se expresa dicha PD-1 humana; y

en donde la enfermedad autoinmunitaria se selecciona del grupo que consiste en nefritis glomerular, artritis, enfermedad tipo miocardiopatía dilatada, colitis ulcerosa, síndrome de Sjogren, enfermedad de Crohn, lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide crónica, esclerosis múltiple, psoriasis, dermatitis de contacto alérgica, polimiositis, paquidermia, periarteritis nodosa, fiebre reumática, vitíligo vulgaris, diabetes mellitus dependiente de insulina, enfermedad de Behcet, enfermedad de Hashimoto, enfermedad de Addison, dermatomiositis, miastenia gravis, síndrome de Reiter, enfermedad de Graves, anemia perniciosa, síndrome de Goodpasture, esterilidad patológica, hepatitis activa crónica, pénfigo, púrpura trombocitopénica autoinmunitaria y anemia hemolítica autoinmunitaria.

2. El anticuerpo biespecífico para su uso en el tratamiento de la enfermedad autoinmunitaria de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la enfermedad autoinmunitaria se selecciona de diabetes mellitus dependiente de insulina, lupus eritematoso sistémico y esclerosis múltiple.

3. El anticuerpo biespecífico para su uso en el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria de acuerdo con la reivindicación 1, en donde las siguientes regiones variables están unidas por enlazadores peptídicos en el siguiente orden:

(i) una región variable de la cadena pesada de un anticuerpo anti-PD-1 humana,

(iv) una región variable de la cadena ligera de un anticuerpo anti-CD3 humana.

4. El anticuerpo biespecífico para su uso en el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias de acuerdo con la reivindicación 1 o 3, en el que

(i) la región variable de la cadena pesada del anticuerpo anti-PD-1 humana comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2,

(ii) la región variable de la cadena ligera del anticuerpo anti-PD-1 humana comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO 4,

(iii) la región variable de la cadena pesada del anticuerpo anti-CD3 humana comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO 6 y

(iv) la región variable de la cadena ligera del anticuerpo anti-CD3 humana comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO 8.

5. El anticuerpo biespecífico para su uso en el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el anticuerpo biespecífico comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 11.

6. Un anticuerpo biespecífico que es una proteína de fusión que comprende:

(i) una región variable de la cadena pesada de un anticuerpo anti-PD-1 humana que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2,

(ii) una región variable de la cadena ligera de un anticuerpo anti-PD-1 humana que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4,

(iii) una región variable de la cadena pesada de un anticuerpo anti-CD3 humana que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6, y

(iv) una región variable de la cadena ligera de un anticuerpo anti-CD3 humana que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8,

en donde el anticuerpo biespecífico se une simultáneamente a la PD-1 humana y a la CD3 humana, en donde dicha CD3 humana se expresa en la misma célula que se expresa dicha PD-1 humana.

7. Un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 11.

8. El polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 7, que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 9.

9. Un vector de duplicación o expresión que comprende el polinucleótido de la reivindicación 7.

10. Una célula hospedadora transformada por el vector de duplicación o expresión de la reivindicación 9.