CN115916231A

CN115916231A - 编码CD80胞外域Fc融合蛋白的重组弹状病毒

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Publication number: CN115916231A
Application number: CN202180039769.2A
Authority: CN
Inventors: P·穆勒; K·厄伯; P·厄尔曼; G·沃尔曼
Original assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH
Current assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH
Priority date: 2020-06-03
Filing date: 2021-06-02
Publication date: 2023-04-04
Also published as: CO2022017351A2; AR122515A1; IL298648A; WO2021245111A1; EP4161544A1; KR20230020501A; DOP2022000273A; BR112022023753A2; AU2021285068A1; CA3185332A1; ECSP22092003A; CR20220606A; US20210379130A1; PE20231293A1; TW202210499A; CL2022003404A1; MX2022015261A; JP2023527577A

Abstract

本发明涉及溶瘤病毒的领域，且尤其关于一种重组弹状病毒，诸如在其基因组中编码CD80胞外域Fc融合蛋白的水疱性口炎病毒。本发明进一步有关该重组病毒在治疗癌症中的用途，且亦有关用于产生此类病毒的方法。

Description

编码CD80胞外域Fc融合蛋白的重组弹状病毒

技术领域

本发明涉及溶瘤病毒领域，且尤其关于一种在基因组中编码CD80胞外域Fc融合蛋白的重组弹状病毒。本发明进一步有关该重组弹状病毒在治疗癌症中的用途，及有关用于产生此类病毒的方法。

背景技术

溶瘤病毒是新兴类别的生物制品，其选择性地复制于癌细胞中且杀死癌细胞且能够在肿瘤内扩散。尝试进一步改良溶瘤病毒以增加其治疗潜力已导致所谓的武装病毒的产生，所述武装病毒在其基因组中编码肿瘤抗原或免疫调节转基因以改善其在肿瘤治疗中的功效。

在许多情况下，肿瘤中存在极小量的T细胞，且因此存在已被称为“免疫沙漠”的微环境—免疫沙漠是其中免疫***的T细胞无法或并未穿透肿瘤以杀死失去控制的细胞的肿瘤微环境。已假定，为逃避免疫监视，肿瘤通过募集骨髓衍生型抑制细胞或分泌包括TGFβ在内的因子来建立免疫抑制性微环境，其发挥诱导胞外基质基因的表达及抑制促进T细胞浸润至肿瘤所需的趋化因子及细胞因子的表达的双重作用(Pickup M,Novitskiy S,MosesHL.The roles of TGFbeta in the tumour microenvironment.Nat Rev Cancer2013；13:788-99)。此外，研究已发现，肿瘤展现与免疫抑制性微环境对应的基因高表达与多种癌症类型中的不佳结果有关，所述癌症类型包括卵巢癌及结肠直肠癌(Calon A,Lonardo E,Berenguer-Llergo A,Espinet E,Hernando-Momblona X,Iglesias M,等人.Stromal geneexpression defines poor-prognosis subtypes in colorectal cancer.Nat Genet2015；47:320-9；Ryner L,Guan Y,Firestein R,Xiao Y,Choi Y,Rabe C,等人.Upregulation of periostin and reactive stroma is associated with primarychemoresistance and predicts clinical outcomes in epithelial ovariancancer.Clin Cancer Res 2015；21:2941-51；Tothill RW,Tinker AV,George J,Brown R,Fox SB,Lade S,等人.Novel molecular subtypes of serous and endometrioidovarian cancer have been linked to clinical outcome.Clin Cancer Res 2008；14:5198-208)。后天性免疫反应的标志是特异性及记忆性。细胞反应由T细胞介导，所述T细胞表达细胞表面T细胞受体(TCR)，所述受体识别与抗原呈现细胞(APC)上的主要组织兼容复合体(MHC)分子复合的肽抗原。然而，同源TCR与单独的MHC-肽复合物的相互作用(信号1)不触发最佳T细胞活化。除信号1外，正协同刺激受体及负协同刺激受体与其同源配体的结合调节T细胞活化。这种复杂信号传导网络一方面提供最佳T细胞活化，而另一方面防止在生理条件下T细胞的异常活化。CD28(信号2)为T细胞上的主要正协同刺激受体。当信号2(CD28与B7.1(CD80)或B7.2(CD86)相互作用)例如在TAA呈现肿瘤细胞上缺乏时，与TAA特异性T细胞的长期相互作用使T细胞无反应性(无反应性)：即使当TCR与TAA相互作用时，T细胞亦难以传导信号。此情形已在癌症患者中，尤其在长期晚期疾病情形下有所描述。然而，强力T细胞协同刺激可在晚期转移癌症患者中再活化TAA特异性T细胞。

近期的一种方法预见一种溶瘤病毒，其在其基因组中编码IFN-β蛋白质作为载荷(cargo)。在另一方法中，正在临床中探索肿瘤抗原MAGE-A3的表达。除识别适合且有效的载荷之外，自病毒主链表达其他载荷始终存在以下的风险：其不仅将增强抗肿瘤功效且亦将增强抗病毒免疫。必须注意，载荷不将病毒的溶瘤潜力限制于由治疗性载荷的表达获得的益处被溶瘤效力的损失抵消的程度。因此，在本领域需要可用于有效癌症治疗中的进一步改良的武装溶瘤病毒。本领域进一步需要选择性改善T细胞和/或树突状细胞至免疫抑制性肿瘤微环境的浸润。

发明内容

本发明通过提供重组弹状病毒诸如水疱性口炎病毒解决以上需求，该病毒在其基因组中编码CD80胞外域Fc融合蛋白或其功能变体，优选人类CD80胞外域。

应理解，关于特定方面的任何实施方案亦可与还涉及该特定方面的另一实施方案组合，甚至呈包含关于该特定方面的若干实施方案的多个层级及组合。

在第一方面中，本发明涉及一种重组弹状病毒，其在其基因组中编码至少一种CD80胞外域Fc融合蛋白或其功能变体，其中该CD80胞外域Fc融合蛋白包含CD80的胞外域且进一步包含IgG的Fc域。

在一个关于第一方面的实施方案中，该CD80胞外域Fc融合蛋白或其功能变体选自包含以下的组：(i)CD80胞外域Fc融合蛋白，其包含与IgG1的Fc域融合的CD80胞外域，(ii)CD80胞外域Fc融合蛋白，其包含与IgG1的该Fc域融合的CD80胞外域，其中该CD80胞外域包含SEQ ID NO:1或由其组成或与SEQ ID NO:1具有至少80％一致性，(iii)CD80胞外域Fc融合蛋白，其包含与IgG1的该Fc域融合的CD80胞外域，其中该Fc域包含SEQ ID NO:2或由其组成或与SEQ ID NO:2具有至少80％一致性，(iv)CD80胞外域Fc融合蛋白，其包含与IgG1的该Fc域融合的CD80胞外域，其中该CD80胞外域包含SEQ ID NO:1或由其组成或与SEQ ID NO:1具有至少80％一致性及该Fc域包含SEQ ID NO:2或由其组成或与SEQ ID NO:2具有至少80％一致性，(v)CD80胞外域Fc融合蛋白，其包含与IgG1的该Fc域融合的CD80胞外域，其中该CD80胞外域为由SEQ ID NO:4的氨基酸1-207组成或与SEQ ID NO:4的氨基酸1-207具有至少80％一致性及该Fc域为由SEQ ID NO:4的氨基酸208-433组成或与SEQ ID NO:4的氨基酸208-433具有至少80％一致性，(vi)根据(i)-(v)中的任一者的CD80胞外域Fc融合蛋白进一步包含信号肽序列，(vii)CD80胞外域Fc融合蛋白，其包含SEQ ID NO:3或与SEQ ID NO:3具有至少80％一致性。

在一个关于第一方面的实施方案中，该重组弹状病毒为水疱病毒。

在一个关于第一方面的实施方案中，该水疱病毒选自包含以下的组：水疱性口炎阿拉戈斯病毒(vesicular stomatitis alagoas virus)(VSAV)、卡拉加斯病毒(carajásvirus)(CJSV)、章地埔拉病毒(chandipura virus)(CHPV)、科卡尔病毒(cocal virus)(COCV)、水疱性口炎印地安那病毒(vesicular stomatitis Indiana virus)(VSIV)、伊斯法罕病毒(isfahan virus)(ISFV)、马拉巴病毒(maraba virus)(MARAV)、水疱性口炎新泽西病毒(vesicular stomatitis New Jersey virus)(VSNJV)或皮里病毒(piry virus)(PIRYV)，优选为水疱性口炎印地安那病毒(VSIV)或优选为水疱性口炎新泽西病毒(VSNJV)。

在一个关于第一方面的实施方案中，该重组弹状病毒为具有复制能力的。

在一个关于第一方面的实施方案中，该CD80胞外域为人类CD80胞外域。

在一个关于第一方面的实施方案中，该重组弹状病毒缺乏编码糖蛋白G的功能性基因，和/或缺乏功能性糖蛋白G；或编码该糖蛋白G的基因经编码另一病毒的糖蛋白GP的基因置换，和/或该糖蛋白G经另一病毒的该糖蛋白GP置换；或编码该糖蛋白G的基因经编码沙粒状病毒的糖蛋白GP的基因置换，和/或该糖蛋白G经沙粒状病毒的糖蛋白GP置换。在另一优选实施方案中，编码该糖蛋白G的基因经编码丹德农病毒(Dandenong virus)或莫佩亚病毒(Mopeia virus)的糖蛋白GP的基因置换，和/或该糖蛋白G经丹德农病毒或莫佩亚病毒的糖蛋白GP置换。甚至更优选，编码该糖蛋白G的基因经编码淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)的糖蛋白GP的基因置换，和/或该糖蛋白G经LCMV的糖蛋白GP置换。

在关于第一方面的优选实施方案中，本发明提供一种重组水疱性口炎病毒，其在其基因组中编码至少一种CD80胞外域Fc融合蛋白或其功能变体，其中该CD80胞外域Fc融合蛋白包含CD80的胞外域且进一步包含IgG的Fc域。在相关实施方案中，该CD80胞外域Fc融合蛋白选自包含以下的组：(i)CD80胞外域Fc融合蛋白，其包含与IgG1的Fc域融合的CD80胞外域，(ii)CD80胞外域Fc融合蛋白，其包含与IgG1的该Fc域融合的CD80胞外域，其中该CD80胞外域包含SEQ ID NO:1或由其组成或与SEQ ID NO:1具有至少80％一致性，(iii)CD80胞外域Fc融合蛋白，其包含与IgG1的该Fc域融合的CD80胞外域，其中该Fc域包含SEQ ID NO:2或由其组成或与SEQ ID NO:2具有至少80％一致性，(iv)CD80胞外域Fc融合蛋白，其包含与IgG1的该Fc域融合的CD80胞外域，其中该CD80胞外域包含SEQ ID NO:1或由其组成或与SEQID NO:1具有至少80％一致性及该Fc域包含SEQ ID NO:2或由其组成或与SEQ ID NO:2具有至少80％一致性，(v)CD80胞外域Fc融合蛋白，其包含与IgG1的该Fc域融合的CD80胞外域，其中该CD80胞外域为由SEQ ID NO:4的氨基酸1-207组成或与SEQ ID NO:4的氨基酸1-207具有至少80％一致性及该Fc域为由SEQ ID NO:4的氨基酸208-433组成或与SEQ ID NO:4的氨基酸208-433具有至少80％一致性，(vi)根据(i)-(v)中的任一者的CD80胞外域Fc融合蛋白进一步包含信号肽序列，或(vii)CD80胞外域Fc融合蛋白，其包含SEQ ID NO:3或与SEQID NO:3具有至少80％一致性；且其中编码该重组水疱性口炎病毒的糖蛋白G的基因经编码淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)的糖蛋白GP的基因置换，和/或该糖蛋白G经LCMV的糖蛋白GP置换。

在第二方面中，本发明涉及一种重组水疱性口炎病毒，其在其基因组中编码至少水疱性口炎病毒核蛋白(N)、大蛋白(L)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)及至少一种CD80胞外域Fc融合蛋白或其功能变体，其中该CD80胞外域Fc融合蛋白包含CD80的胞外域且进一步包含IgG的Fc域。

在一个关于第二方面的实施方案中，该核蛋白(N)包含如SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:7至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的功能变体。

在一个关于第二方面的实施方案中，该磷蛋白(P)包含如SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:8至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的功能变体。

在一个关于第二方面的实施方案中，该大蛋白(L)包含如SEQ ID NO:9中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:9至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的功能变体。

在一个关于第二方面的实施方案中，该基质蛋白(M)包含如SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:10至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的功能变体。

在关于第二方面的优选实施方案中，该核蛋白(N)包含如SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:7至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的功能变体；该磷蛋白(P)包含如SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:8至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的功能变体；该大蛋白(L)包含如SEQ ID NO:9中所示的氨基酸序列或与SEQ IDNO:9至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的功能变体；及该基质蛋白(M)包含如SEQ IDNO:10中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:10至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的功能变体。

在一个关于第二方面的实施方案中，该重组水疱性口炎病毒是具有复制能力的。

在一个关于第二方面的实施方案中，该重组水疱性口炎病毒缺乏编码糖蛋白G的功能性基因，和/或缺乏功能性糖蛋白G；或编码该糖蛋白G的基因经编码另一病毒的糖蛋白GP的基因置换，和/或该糖蛋白G经另一病毒的该糖蛋白GP置换；或编码该糖蛋白G的基因经编码淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)的糖蛋白GP的基因置换，和/或该糖蛋白G经LCMV的糖蛋白GP置换。

在一个关于第二方面的实施方案中，该CD80胞外域Fc融合蛋白选自包含以下的组：(i)CD80胞外域Fc融合蛋白，其包含与IgG1的Fc域融合的CD80胞外域，(ii)CD80胞外域Fc融合蛋白，其包含与IgG1的该Fc域融合的CD80胞外域，其中该CD80胞外域包含SEQ IDNO:1或由其组成或与SEQ ID NO:1具有至少80％一致性，(iii)CD80胞外域Fc融合蛋白，其包含与IgG1的该Fc域融合的CD80胞外域，其中该Fc域包含SEQ ID NO:2或由其组成或与SEQID NO:2具有至少80％一致性，(iv)CD80胞外域Fc融合蛋白，其包含与IgG1的该Fc域融合的CD80胞外域，其中该CD80胞外域包含SEQ ID NO:1或由其组成或与SEQ ID NO:1具有至少80％一致性及该Fc域包含SEQ ID NO:2或由其组成或与SEQ ID NO:2具有至少80％一致性，(v)CD80胞外域Fc融合蛋白，其包含与IgG1的该Fc域融合的CD80胞外域，其中该CD80胞外域为由SEQ ID NO:4的氨基酸1-207组成或与SEQ ID NO:4的氨基酸1-207具有至少80％一致性及该Fc域为由SEQ ID NO:4的氨基酸208-433组成或与SEQ ID NO:4的氨基酸208-433具有至少80％一致性，(vi)根据(i)-(v)中的任一者的CD80胞外域Fc融合蛋白进一步包含信号肽序列，或(vii)CD80胞外域Fc融合蛋白，其包含SEQ ID NO:3或与SEQ ID NO:3具有至少80％一致性。

在关于第二方面的优选实施方案中，本发明提供一种重组水疱性口炎病毒，其在其基因组中编码水疱性口炎病毒核蛋白(N)、大蛋白(L)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)及至少一种CD80胞外域Fc融合蛋白或其功能变体，其中该CD80胞外域Fc融合蛋白包含CD80的胞外域且进一步包含IgG的Fc域且选自包含以下的组：(i)CD80胞外域Fc融合蛋白，其包含与IgG1的Fc域融合的CD80胞外域，(ii)CD80胞外域Fc融合蛋白，其包含与IgG1的该Fc域融合的CD80胞外域，其中该CD80胞外域包含SEQ ID NO:1或由其组成或与SEQ ID NO:1具有至少80％一致性，(iii)CD80胞外域Fc融合蛋白，其包含与IgG1的该Fc域融合的CD80胞外域，其中该Fc域包含SEQ ID NO:2或由其组成或与SEQ ID NO:2具有至少80％一致性，(iv)CD80胞外域Fc融合蛋白，其包含与IgG1的该Fc域融合的CD80胞外域，其中该CD80胞外域包含SEQ ID NO:1或由其组成或与SEQ ID NO:1具有至少80％一致性及该Fc域包含SEQID NO:2或由其组成或与SEQ ID NO:2具有至少80％一致性，(v)CD80胞外域Fc融合蛋白，其包含与IgG1的该Fc域融合的CD80胞外域，其中该CD80胞外域为由SEQ ID NO:4的氨基酸1-207组成或与SEQ ID NO:4的氨基酸1-207具有至少80％一致性及该Fc域为由SEQ ID NO:4的氨基酸208-433组成或与SEQ ID NO:4的氨基酸208-433具有至少80％一致性，(vi)根据(i)-(v)中的任一者的CD80胞外域Fc融合蛋白进一步包含信号肽序列，或(vii)CD80胞外域Fc融合蛋白，其包含SEQ ID NO:3或与SEQ ID NO:3具有至少80％一致性；且其中编码该水疱性口炎病毒的糖蛋白G的基因经编码淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)的糖蛋白GP的基因置换，和/或该糖蛋白G经LCMV的糖蛋白GP置换，且其中该核蛋白(N)包含如SEQ ID NO:7中所示的氨基酸或与SEQ ID NO:7至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的功能变体；该磷蛋白(P)包含如SEQ ID NO:8中所示的氨基酸或与SEQ ID NO:8至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的功能变体；该大蛋白(L)包含如SEQ ID NO:9中所示的氨基酸或与SEQ IDNO:9至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的功能变体；及该基质蛋白(M)包含如SEQ IDNO:10中所示的氨基酸或与SEQ ID NO:10至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的功能变体。

在第三方面中，本发明提供一种药物组合物，其特征在于该组合物包含根据第一方面或其实施方案中的任一者的重组弹状病毒，或根据第二方面或其实施方案中的任一者的重组水疱性口炎病毒。

在第四方面中，本发明提供根据第一方面或其实施方案中的任一者的重组弹状病毒，或根据第二方面或其实施方案中的任一者的重组水疱性口炎病毒，或根据第三方面或其实施方案中的任一者的药物组合物，其适用作药剂。

在一个关于第四方面的实施方案中，本发明提供一种重组弹状病毒、一种重组水疱性口炎病毒或一种药物组合物，其用于治疗癌症，优选为实体癌。在优选实施方案中，该实体癌选自包含以下的清单：生殖肿瘤、卵巢肿瘤、胰脏肿瘤、睾丸肿瘤、内分泌肿瘤、肠胃肿瘤、肝脏肿瘤、肾脏肿瘤、结肠肿瘤、结肠直肠肿瘤、***、***肿瘤、皮肤肿瘤、黑色素瘤、呼吸道肿瘤、肺肿瘤、***肿瘤、头颈部肿瘤、头颈部鳞状细胞癌瘤(HNSCC)及骨肿瘤。

在一个关于第四方面的实施方案中，该重组弹状病毒、该重组水疱性口炎病毒或该药物组合物待经瘤内或经静脉内施用。在另一相关实施方案中，该重组弹状病毒、该重组水疱性口炎病毒或该药物组合物待经瘤内施用至少一次且后续经静脉内施用。在另一相关实施方案中，该重组弹状病毒、重组水疱性口炎病毒或该药物组合物之后续静脉内施用在初始瘤内施用后1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天或31天给与。

在第五方面中，本发明提供一种组合物，其包含根据第一方面或其实施方案中的任一者的重组弹状病毒或根据第二方面或其实施方案中的任一者的重组水疱性口炎病毒及其他抑制剂，其中该抑制剂为PD-1通路抑制剂或SMAC仿真物。

在一个关于第五方面的实施方案中，该PD-1通路抑制剂为拮抗性抗体，其针对PD-1或PD-L1。在另一相关实施方案中，该SMAC模拟物选自由以下组成的组：来自表2的化合物1至26中的任一者或这些化合物中之一者的药学上可接受的盐。在另一相关实施方案中，该PD-1通路抑制剂选自由以下组成的组的拮抗剂：帕博利珠单抗(pembrolizumab)、纳武单抗(nivolumab)、皮立珠单抗(pidilizumab)、阿替利珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、度伐鲁单抗(durvalumab)、PDR-001、PD1-1、PD1-2、PD1-3、PD1-4及PD1-5(如表1中所示)。在最佳实施方案中，该PD-1通路抑制剂为BI-754091。

在第六方面中，本发明提供一种成套试剂盒，其包含：如第一至第三方面中的任一者或其实施方案中的任一者中所定义的重组弹状病毒、重组水疱性口炎病毒或药物组合物，及如关于第五方面的实施方案中的任一者中所定义的PD-1通路抑制剂或SMAC仿真物。

在第七方面中，本发明提供一种组合治疗，其包含：a)根据第一方面或其实施方案中的任一者的重组弹状病毒，或根据第二方面或其实施方案中的任一者的重组水疱性口炎病毒，或根据第三方面或其实施方案中的任一者的药物组合物，及b)PD-1通路抑制剂或SMAC仿真物。在一个关于第七方面的实施方案中，a)及b)可同时、依序或交替施用。在相关实施方案中，a)及b)经由不同施用途径施用。在另一相关实施方案中，a)经瘤内施用，b)经静脉内施用。

在一个关于第七方面的实施方案中，该PD-1通路抑制剂为拮抗性抗体，其针对PD-1或PD-L1。在相关实施方案中，该PD-1通路抑制剂选自由以下组成的组：帕博利珠单抗、纳武单抗、皮立珠单抗、阿替利珠单抗、阿维鲁单抗、度伐鲁单抗、PDR-001、PD1-1、PD1-2、PD1-3、PD1-4及PD1-5(参见表1)。在另一相关实施方案中，该SMAC模拟物选自由以下组成的组：根据表2的化合物1至26中的任一者或这些化合物中之一者的药学上可接受的盐。

在第八方面中，本发明提供一种病毒产生细胞，其特征在于该细胞产生根据第一方面或其实施方案中的任一者的重组弹状病毒，或根据第二方面或其实施方案中的任一者的重组水疱性口炎病毒。

在一个关于第八方面的实施方案中，该病毒产生细胞为Vero细胞、HEK细胞、HEK293细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或幼仓鼠肾(BHK)细胞。

在第九方面中，本发明提供一种在细胞培养物中产生重组弹状病毒的方法：

(i)使用重组弹状病毒、优选水疱性口炎病毒感染宿主细胞，

(ii)在允许复制该重组弹状病毒的条件下培养该宿主细胞，

(iii)自该细胞培养物收获该重组弹状病毒，

(iv)任选地对病毒收获物进行酶处理，优选用全能核酸酶(benzonase)处理，

(v)通过在阳离子交换整体膜上加载吸附剂或树脂，之后进行洗脱，来捕获该弹状病毒收获物，

(vi)通过对步骤(v)的洗脱液进行粒径筛析、多模态粒径筛析/离子交换或切向流过滤来润饰(Polish)弹状病毒，

(vii)通过超滤/透滤对经润饰弹状病毒进行缓冲液更换，

(viii)对弹状病毒进行无菌过滤。

在一个关于第九方面的实施方案中，该宿主细胞为HEK293细胞。

在一个关于第九方面的实施方案中，该宿主细胞在悬浮液中培养。

在一个关于第九方面的实施方案中，该重组弹状病毒经调配至药物组合物中。在优选实施方案中，根据第一方面或其实施方案中的任一者的重组弹状病毒或根据第二方面或其实施方案中的任一者的重组水疱性口炎病毒经调配至药物组合物中。

附图说明

图1：免疫突触及抗原呈现细胞(APC)与T细胞之间的组成部分的示意性图示。CD80在T细胞活化期间为关键协同刺激分子。高效T细胞刺激需要免疫突触内的两个聚合分子信号。信号1：抗原特异性(TCR:MHC/肽)及信号2.抗原非依赖性(CD28:CD80)。

图2：CD80胞外域(ECD)Fc融合蛋白(二价)的草图。融合蛋白在病毒感染之后表达于经转导肿瘤细胞中。两种CD80胞外域Fc融合单体通过各单体中的半胱氨酸残基之间形成的二硫键共价连接在一起，由此形成CD80胞外域Fc融合蛋白二聚体。

图3A-B比较VSV-GP-CD80-Fc相对于亲本病毒VSV-GP的复制(A)及生存率(B)。HEK293F细胞用VSV-GP或VSV-GP-CD80-Fc感染。Y轴显示以百分比为单位的细胞生存率或基因组复本/ml。感染之后监测细胞生存率及复制至多48h(x轴：感染后小时数)。

图4在来自经VSV-GP或VSV-GP-CD80-Fc感染(各自具有1感染倍率(MOI 1))的HEK293细胞的组织培养物上清液中通过ELISA进行可溶性CD80-Fc检测。针对感染至多48小时之后的不同时间点(x轴)测定CD80-Fc表达(以μg/ml为单位的y轴)。

图5A-B使用CT26.CL25-IFNARKO肿瘤模型(静脉内)，将经VSV-GP-CD80-Fc处理的小鼠的体内功效(A)及体重发展(B)与亲本病毒VSV-GP比较。(A)将小鼠在第0天及第3天用低病毒剂量的2x10⁷个TCID₅₀处理。X轴显示时间(以天为单位)及y轴显示存活的小鼠的百分比。(B)显示与图6A中相同的经处理小鼠的体重发展。X轴显示时间(以天为单位)且y轴显示体重(以g为单位)

图6A-C使用在第0天及第3天用一定病毒剂量的10⁸个TCID₅₀VSV-GP(B)、相同病毒剂量的VSV-GP-CD80-Fc(C)或PBS(A)处理的B16-F1-OVA肿瘤模型(髄腔内)，在经处理的小鼠中比较VSV-GP-CD80-Fc的体内功效与亲本病毒VSV-GP。X轴显示处理后天数(以天为单位)且y轴显示肿瘤体积(以cm³为单位)。

图7A-B使用EMT-6肿瘤模型(髄腔内)及在第0天及第3天用低病毒剂量的2x10⁷个TCID₅₀进行处理，将经处理小鼠(B)中的VSV-GP-CD80-Fc的体内功效与亲本病毒VSV-GP(A)比较。X轴显示处理后天数(以天为单位)且y轴显示肿瘤体积(以cm³为单位)。虚线表示经媒剂处理的小鼠且实线表示用病毒处理的小鼠。

图8获自经处理小鼠的经感染CT26.CL25-IFNARKO肿瘤内的VSV-GP-CD80-Fc复制，如通过感染后在第3天及第7天使用qPCR进行的病毒基因组复本定量所测定。将小鼠用PBS或10⁸个TCID₅₀ VSV-GP-CD80-Fc处理及分别在3或7天之后测定病毒基因组复本/肿瘤(y轴)。

图9在对照、获自经处理小鼠的VSV-GP或VSV-GP-CD80-Fc感染的LLC-IFNARKO肿瘤中对VSV-GP N-蛋白质以及CD80-Fc转录物进行的基于纳米串(NanoString)的测量。将小鼠用作对照或用10⁸个TCID₅₀ VSV-GP或VSV-GP-CD80-Fc处理且3天之后测定病毒N-蛋白质或CD80-Fc的相对表达(y轴)。

图10在对照、获自经处理小鼠的VSV-GP或VSV-GP-CD80-Fc感染的LLC-IFNARKO肿瘤中对VSV-GP N-蛋白质以及CD80-Fc载荷(蛋白质)进行的基于IHC的检测。如图9中处理小鼠且在处理后第3天使用标准方案进行IHC。

图11A-C描绘肿瘤中CD80-Fc作用模式(MoA)的草图。具有成熟、活化DC的热性肿瘤(A)，其提供高效T细胞协同刺激。缺乏DC和/或由不成熟、致耐受性DC子组控制的冷性肿瘤(B)。DC的不存在或不成熟、致耐受性DC子组导致T细胞免疫不佳、克隆无反应性、T细胞功能障碍及细胞死亡。CD80-Fc通过补偿缺乏强力T细胞协同刺激而将冷性肿瘤转化为热性肿瘤(C)。

图12人类混合白血球培养物(将来自两个基因不同个体的T细胞及不成熟树突状细胞共培养，导致同种异体T细胞刺激)用于通过重组CD80-Fc评估T细胞协同刺激。为此目的，用增加量的重组CD80-Fc蛋白质刺激培养物，使用IFNγ分泌作为读数。

图13A-D将人类混合白血球培养物(将来自两个基因不同个体的T细胞及单核细胞共培养)用重组CD80-Fc蛋白(10μg/ml)且在添加或不添加FcγR-阻断剂下(且在不存在人类血清下)刺激，使用IFNγ分泌作为读数。不同子图(A-D)描绘不同供体对。

图14A-F将人类PBMC培养物在或不在低剂量的抗CD3及增加浓度的重组CD80-Fc蛋白(F(ab)2(A,D)、Fc＝IgG4(B,E)或Fc＝IgG1(C,F))刺激，测量IFNγ(A-C)或IL2(D-F)分泌作为读数，其通过对上清液进行标准ELISA检测。

图15在感染后第7天在对照或VSV-GP感染的LLC1-IFNARKO肿瘤中对FcγR进行基于纳米串的测量。将小鼠不处理或经一定病毒剂量的10⁸个TCID₅₀ VSV-GP感染。X轴显示不同FcγR(1、2b、3或4)的测量值且Y轴显示7天后的相对表达。

图16A-C使用ELISPOT及四聚体染色，在CT26.CL25-IFNARKO肿瘤携带小鼠中测定通过VSV-GP-mCD80-Fc相对于VSV-GP的改良诱导肿瘤特异性T细胞。相对于VSV-GP处理的小鼠，gp70-特异性α-肿瘤T细胞在VSV-GP-mCD80-Fc处理的小鼠的脾脏中增加。空心符号表示静脉内处理。实心符号表示静脉内/髄腔内处理。(A)通过ELISPOT自脾脏或(B)通过Dextramer自血液检测gp70特异性T细胞。(C)实验概述。

图17基于发光的读数：共培养Jurkat PD-1报告细胞及CHO-K1-α-CD3/-PDL1。与抗PDL1抗体阿维鲁单抗相比，CD80-Fc不能够防止PD1:PDL1介导的对Jurkat报告细胞株的抑制。

图18A-B报告细胞分析：将Jurkat-PD1(荧光素酶报告细胞)与THP-1-PDL1细胞(表达FcgR)共培养。T细胞活化由此***中的CD33XCD3 BiTE(10nM)触发。(A)用指定浓度的指定试剂(抗PD1＝帕博利珠单抗；抗Dig＝同型对照及重组CD80-Fc)进行处理。(B)抗PD1(10nM)及增加浓度的重组CD80-Fc使Jurkat T细胞活化改良超过个别化合物的活性。

图19A-C使用CT26.CL25-IFNARKO肿瘤模型(静脉内)，经VSV-GP-muCD80-Fc、亲本病毒VSV-GP及重组鼠类CD80-Fc处理的小鼠的体内功效(A)、肿瘤生长曲线(B)及体重变化(C)。(A)将小鼠分别在第0天及第3天用一定病毒剂量的1x10⁸个TCID₅₀处理且在第0天、第3天及第6天用1mg/kg重组鼠类CD80-Fc处理。X轴显示时间(以天为单位)及y轴显示存活的小鼠的百分比。(B)显示与图19A中相同的经处理小鼠随时间推移的平均肿瘤体积。x轴显示时间(以处理开始后的天数为单位)且y轴显示肿瘤体积(以mm³为单位)。数据显示组值平均值，其中末次观测值结转直至达至70％组大小(70％LOCF)。(C)显示与图19A中相同的经处理小鼠的体重变化。x轴显示时间(以处理开始后的天数为单位)且y轴显示与处理开始时的初始体重相比的体重变化(以％为单位)。

具体实施方式

在以下详细描述中，阐述诸多具体详情以提供对本发明的充分理解。然而，本领域普通技术人员将显而易见可在并无这些具体详情中的一些的情况下实践本发明技术。在其他情况下，并未详细示出公知结构及技术以免混淆本发明。仅为方便起见包括标题以辅助阅读，且不应理解为将本发明限于特定方面或实施方案。

弹状病毒

弹状病毒家族包括18个属及134个种，具有大约10-16kb的反义单股RNA基因组(Walke等人,ICTV Virus Taxonomy Profile:Rhabdoviridae,Journal of GeneralVirology,99:447-448(2018))。

弹状病毒家族的成员的表征性特征包括以下中的一或多个：子弹状或杆状粒子，长度100-430nm且直径为45-100nm，包含由基质层及脂质包膜包围的螺旋核衣壳，其中一些弹状病毒具有非包膜丝状病毒。10.8-16.1kb的反义单股RNA大部分未分段。一种基因组，其编码至少5个编码结构蛋白核蛋白(N)、大蛋白(L)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)及糖蛋白(G)的基因。

如本文中所使用，弹状病毒可属于以下的属：硬膜炎病毒(almendravirus)、库里欧病毒(curiovirus)、细胞质弹状病毒(cytorhabdovirus)、双角病毒(dichorhavirus)、暂时热病毒(ephemerovirus)、哈帕病毒(Hapavirus)、莱达特病毒(ledantevirus)、丽沙病毒(lyssavirus)、诺拉弹状病毒(novirhabdovirus)、胞核弹状病毒(nucleorhabdovirus)、鲈鱼弹状病毒(perhabdovirus)、西格马病毒(sigmavirus)、斯普维病毒(sprivivirus)、思瑞普病毒(sripuvirus)、蒂布鲁病毒(tibrovirus)、土帕病毒(tupavirus)、巨脉病毒(varicosavirus)或水疱病毒。

在本文所提及的属内，弹状病毒可属于所列举的物种中的任一者。硬膜炎病毒属包括：树木硬膜炎病毒(arboretum almendravirus)、轻木硬膜炎病毒(balsaalmendravirus)、库特湾硬膜炎病毒(Coot Bay almendravirus)、普埃尔托阿尔门德拉斯硬膜炎病毒(Puerto Almendras almendravirus)、里约奇科硬膜炎病毒(Rio Chicoalmendravirus)；库里欧病毒属包括：库里奥波利斯库里欧病毒(curionopoliscuriovirus)、伊里里库里欧病毒(Iriri curiovirus)、依他纳斯库里欧病毒(Itacaiunascuriovirus)、罗尚博库里欧病毒(Rochambeau curiovirus)；细胞质弹状病毒属包括：苜蓿矮缩细胞质弹状病毒(Alfalfa dwarf cytorhabdovirus)、大麦黄条点花叶细胞质弹状病毒(Barley yellow striate mosaic cytorhabdovirus)、硬花甘蓝坏死性黄化细胞质弹状病毒(Broccoli necrotic yellows cytorhabdovirus)、芋属疾病相关细胞质弹状病毒(Colocasia bobone disease-associated cytorhabdovirus)、羊茅属叶线条细胞质弹状病毒(Festuca leaf streak cytorhabdovirus)、莴苣坏死性黄化细胞质弹状病毒(Lettuce necrotic yellows cytorhabdovirus)、莴苣黄斑驳细胞质弹状病毒(Lettuceyellow mottle cytorhabdovirus)、北方禾谷花叶细胞质弹状病毒(Northern cerealmosaic cytorhabdovirus)、苦苣菜细胞质弹状病毒1型(Sonchus cytorhabdovirus 1)、草莓皱缩细胞质弹状病毒(Strawberry crinkle cytorhabdovirus)、美洲小麦条点花叶细胞质弹状病毒(Wheat American striate mosaic cytorhabdovirus)；双角病毒属包括：咖啡环斑双角病毒(Coffee ringspot dichorhavirus)、兰花斑点双角病毒(Orchid fleckdichorhavirus)；暂时热病毒属包括：阿德莱德河暂时热病毒(Adelaide Riverephemerovirus)、贝里马暂时热病毒(Berrimah ephemerovirus)、牛暂时热病毒(Bovinefever ephemerovirus)、金伯利暂时热病毒(Kimberley ephemerovirus)、库尔平耶暂时热病毒(Koolpinyah ephemerovirus)、科通考讷暂时热病毒(Kotonkan ephemerovirus)、奥博德希延暂时热病毒(Obodhiang ephemerovirus)、亚塔暂时热病毒(Yataephemerovirus)；哈帕病毒属包括：法兰德斯哈帕病毒(Flanders hapavirus)、格雷洛奇哈帕病毒(Gray Lodge hapavirus)、哈特公园哈帕病毒(Hart Park hapavirus)、约英杰卡卡哈帕病毒(Joinjakaka hapavirus)、卡梅斯哈帕病毒(Kamese hapavirus)、拉霍亚哈帕病毒(La Joya hapavirus)、兰德几亚哈帕病毒(Landjia hapavirus)、马尼托巴哈帕病毒(Manitoba hapavirus)、马可哈帕病毒(Marco hapavirus)、莫斯奎里哈帕病毒(Mosqueirohapavirus)、莫苏里哈帕病毒(Mossuril hapavirus)、恩盖恩加哈帕病毒(Ngainganhapavirus)、奥得河哈帕病毒(Ord River hapavirus)、帕里湾哈帕病毒(Parry Creekhapavirus)、沃格贝尔哈帕病毒(Wongabel hapavirus)；莱达特病毒属包括：巴鲁莱达特病毒(Barur ledantevirus)、菲基里尼莱达特病毒(Fikirini ledantevirus)、福冈莱达特病毒(Fukuoka ledantevirus)、金屋原莱达特病毒(Kanyawara ledantevirus)、克恩峡谷莱达特病毒(Kern Canyon ledantevirus)、库拉利巴莱达特病毒(Keuralibaledantevirus)、科伦特莱达特病毒(Kolente ledantevirus)、库马西莱达特病毒(Kumasiledantevirus)、勒当泰克氏莱达特病毒(Le Dantec ledantevirus)、埃尔岗蝙蝠莱达特病毒(Mount Elgon bat ledantevirus)、西莫罗莱达特病毒(Nishimuro ledantevirus)、恩科尔比松莱达特病毒(Nkolbisson ledantevirus)、大分莱达特病毒(Oitaledantevirus)、武汉莱达特病毒(Wuhan ledantevirus)、永嘉莱达特病毒(Yongjialedantevirus)；丽沙病毒属包括：阿拉万丽沙病毒(Aravan lyssavirus)、澳洲蝙蝠丽沙病毒(Australian bat lyssavirus)、波克罗蝙蝠丽沙病毒(Bokeloh bat lyssavirus)、达温黑格丽沙病毒(Duvenhage lyssavirus)、欧洲蝙蝠1型丽沙病毒(European bat1lyssavirus)、欧洲蝙蝠2型丽沙病毒(European bat 2lyssavirus)、甘瑙鲁瓦蝙蝠丽沙病毒(Gannoruwa bat lyssavirus)、伊科马丽沙病毒(Ikoma lyssavirus)、伊尔库特丽沙病毒(Irkut lyssavirus)、苦盏丽沙病毒(Khujand lyssavirus)、拉各斯蝙蝠丽沙病毒(Lagos bat lyssavirus)、莱里达蝙蝠丽沙病毒(Lleida bat lyssavirus)、莫科拉丽沙病毒(Mokola lyssavirus)、狂犬病丽沙病毒(Rabies lyssavirus)、希莫尼蝙蝠丽沙病毒(Shimoni bat lyssavirus)、西高加索蝙蝠丽沙病毒(West Caucasian bat lyssavirus)；诺拉弹状病毒属包括：海勒姆诺拉弹状病毒(Hirame novirhabdovirus)、鱼类诺拉弹状病毒(Piscine novirhabdovirus)、鲑鱼诺拉弹状病毒(Salmonid novirhabdovirus)、乌鳢诺拉弹状病毒(Snakehead novirhabdovirus)；胞核弹状病毒属包括：曼陀罗黄脉胞核弹状病毒(Datura yellow vein nucleorhabdovirus)、茄斑驳矮缩胞核弹状病毒(Eggplantmottled dwarf nucleorhabdovirus)、玉米细条纹胞核弹状病毒(Maize fine streaknucleorhabdovirus)、伊朗玉米花叶胞核弹状病毒(Maize Iranian mosaicnucleorhabdovirus)、玉米花叶胞核弹状病毒(Maize mosaic nucleorhabdovirus)、马铃薯黄矮胞核弹状病毒(Potato yellow dwarf nucleorhabdovirus)、水稻黄矮胞核弹状病毒(Rice yellow stunt nucleorhabdovirus)、苦苣菜黄网胞核弹状病毒(Sonchus yellownet nucleorhabdovirus)、苦苣菜黄脉胞核弹状病毒(Sowthistle yellow veinnucleorhabdovirus)、芋叶脉缺绿胞核弹状病毒(Taro vein chlorosisnucleorhabdovirus)；鲈鱼弹状病毒属包括：鳗鱼鲈鱼弹状病毒(Anguillidperhabdovirus)、鲈鱼弹状病毒(Perch perhabdovirus)、海鳟鱼鲈鱼弹状病毒(Sea troutperhabdovirus)；西格马病毒属包括：果蝇西格马病毒(Drosophila affinissigmavirus)、菠萝果蝇西格马病毒(Drosophila ananassae sigmavirus)、伊米果蝇西格马病毒(Drosophila immigrans sigmavirus)、伊米果蝇西格马病毒(Drosophilamelanogaster sigmavirus)、暗果蝇西格马病毒(Drosophila obscura sigmavirus)、特立蒂斯果蝇西格马病毒(Drosophila tristis sigmavirus)、厩腐蝇西格马病毒(Muscinastabulans sigmavirus)；斯普维病毒属包括：鲤春斯普维病毒(Carp sprivivirus)、狗鱼幼鱼斯普维病毒(Pike fry sprivivirus)；思瑞普病毒属包括：阿尔姆皮瓦思瑞普病毒(Almpiwar sripuvirus)、查科思瑞普病毒(Chaco sripuvirus)、尼亚卡思瑞普病毒(Niakha sripuvirus)、塞纳-马恩省-马恩省-马杜雷拉思瑞普病毒(Sena Madureirasripuvirus)、斯里布尔思瑞普病毒(Sripur sripuvirus)；蒂布鲁病毒属包括：下刚果蒂布鲁病毒(Bas-Congo tibrovirus)、比阿特丽斯山蒂布鲁病毒(Beatrice Hilltibrovirus)、卡森平原蒂布鲁病毒(Coastal Plains tibrovirus)、库波热1型蒂布鲁病毒(Ekpoma 1tibrovirus)、库波热2型蒂布鲁病毒(Ekpoma 2tibrovirus)、斯威特沃特布兰奇蒂布鲁病毒(Sweetwater Branch tibrovirus)、蒂布鲁加尔冈蒂布鲁病毒(tibrogargantibrovirus)；土帕病毒属包括：达勒姆土帕病毒(Durham tupavirus)、克拉马斯土帕病毒(Klamath tupavirus)、图帕伊阿土帕病毒(Tupaia tupavirus)；巨脉病毒属包括：莴苣巨脉伴随巨脉病毒(Lettuce big-vein associated varicosavirus)；水疱病毒属包括：阿拉戈斯水疱病毒(Alagoas vesiculovirus)、美洲蝙蝠水疱病毒(American batvesiculovirus)、卡拉加斯水疱病毒(Carajas vesiculovirus)、章地埔拉水疱病毒(Chandipura vesiculovirus)、科卡尔水疱病毒(Cocal vesiculovirus)、印第安纳水疱病毒(Indiana vesiculovirus)、伊斯法罕水疱病毒(Isfahan vesiculovirus)、朱罗讷水疱病毒(Jurona vesiculovirus)、马尔佩斯泉水疱病毒(Malpais Spring vesiculovirus)、马拉巴水疱病毒(Maraba vesiculovirus)、莫雷顿水疱病毒(Morreton vesiculovirus)、新泽西水疱病毒(New Jersey vesiculovirus)、佩里内特水疱病毒(Perinetvesiculovirus)、皮理病毒水疱病毒(Piry vesiculovirus)、拉迪水疱病毒(Radivesiculovirus)、尤格波格丹诺夫奇水疱病毒(Yug Bogdanovac vesiculovirus)或穆萨病毒(Moussa virus)。

优选地，本发明的重组弹状病毒为溶瘤弹状病毒。就此而言，溶瘤具有本领域已知的其常规含义且是指弹状病毒能够感染及裂解(分解)癌细胞但不能感染及裂解正常细胞(以任何显著程度)。优选地，溶瘤弹状病毒能够在癌细胞内复制。可在本领域技术人员已知的不同分析***中测试溶瘤活性(例示性体外分析由Muik等人,Cancer Res.,74(13),3567-78,2014描述)。应理解，溶瘤弹状病毒可能仅感染及裂解特定类型的癌细胞。此外，溶瘤效应可视癌细胞的类型而变化。

在优选实施方案中，弹状病毒属于水疱病毒属。水疱病毒物种已主要通过血清学手段联合基因组的谱系学分析定义。诸如宿主范围及传输机制的生物特征亦用于区分属内的病毒物种。因此，水疱病毒属形成由自完全L序列推断的最大似然树充分支持的独特单系群。

水疱病毒属内属于不同物种的病毒可具有以下特征中的一或多个：A)L中的最小氨基酸序列分歧度为20％；B)N中的最小氨基酸序列分歧度为10％；C)G中的最小氨基酸序列分歧度为15％；D)可在血清学测试中予以区分；及E)占据不同生态栖位，如通过宿主及或节肢动物载体中的差异所证实。

优选为水疱性口炎病毒(VSV)且尤其为VSV-GP(具有LCMV的GP的重组体)。VSV-GP的有利特性包括以下中的一或多个：极强力及迅速的杀手(<8h)；溶瘤病毒；可全身性施加；趋神经性/神经毒性减小；其裂解性地繁殖且诱导免疫原性细胞死亡；归因于干扰素(IFN)反应而不复制于健康人类细胞中；强烈活化先天性免疫；约3kb的用于免疫调节载荷及抗原的空间；与来自淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)的沙粒状病毒糖蛋白重组；关于神经毒性减小及对中和抗体反应及补体破坏的敏感性小于野生型VSV(VSV-G)的有利安全特征；特异性复制于已不能建立并反应抗病毒先天性免疫反应(例如I型IFN信号传导)的肿瘤细胞中；不能复制于“健康细胞”中以便自正常组织快速排除；肿瘤细胞中的病毒复制使得可诱导免疫原性细胞死亡、释放肿瘤相关抗原、局部发炎且诱导抗肿瘤免疫性。

本发明进一步通过重组水疱性口炎病毒体现，其在其基因组中编码至少水疱性口炎病毒核蛋白(N)、大蛋白(L)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)及至少一种CD80胞外域Fc融合蛋白或其功能变体，优选包含人类CD80胞外域。

在优选实施方案中，重组水疱性口炎病毒在其基因组中编码至少以下水疱性口炎病毒蛋白：核蛋白(N)，其包含如SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:7至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的功能变体；磷蛋白(P)，其包含如SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:8至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的功能变体；大蛋白(L)，其包含如SEQ ID NO:9中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:9至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的功能变体；及基质蛋白(M)，其包含如SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:10至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的功能变体。

本领域技术人员应理解，可对水疱性口炎病毒核蛋白(N)、大蛋白(L)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)或糖蛋白(G)序列进行修饰而不失去那些蛋白质的基本功能。如本文所用的此类功能变体保留其基本功能或活性的全部或部分。举例而言，蛋白质L为聚合酶且在病毒的转录及复制期间具有基本功能。其功能变体必须保留此能力的至少一部分。保留基本功能或活性的良好指征为成功产生仍能够复制且感染肿瘤细胞的病毒(包括这些功能变体)。可在本领域技术人员已知的不同分析***中测试病毒产生及肿瘤细胞中的感染及复制测试(例示性体外分析由Muik等人,Cancer Res.,74(13),3567-78,2014描述)。

在优选实施方案中，重组水疱性口炎病毒在其基因组中编码至少水疱性口炎病毒核蛋白(N)、大蛋白(L)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)及至少一种CD80胞外域Fc融合蛋白或其功能变体，其中大蛋白(L)包含具有SEQ ID NO:9的≥80％序列一致性的氨基酸序列。

在优选实施方案中，重组水疱性口炎病毒在其基因组中编码至少水疱性口炎病毒核蛋白(N)、大蛋白(L)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)及至少一种CD80胞外域Fc融合蛋白或其功能变体，其中核蛋白(N)包含具有SEQ ID NO:7的≥90％序列一致性的氨基酸序列。

在另一优选实施方案中，重组水疱性口炎病毒在其基因组中编码至少水疱性口炎病毒核蛋白(N)、大蛋白(L)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)及至少一种CD80胞外域Fc融合蛋白或其功能变体，其中大蛋白(L)包含具有SEQ ID NO:9的等于或大于80％序列一致性的氨基酸序列且核蛋白(N)包含具有SEQ ID NO:7的≥90％序列一致性的氨基酸序列。

在本发明的优选实施方案中，本发明的重组弹状病毒的RNA基因组包含如SEQ IDNO:24中所示的序列或由其组成。另外，本发明的重组弹状病毒的RNA基因组亦可由其中RNA基因组的核酸根据基因密码简并发生交换(此并不改变各别氨基酸序列)的那些序列组成或包含那些序列。在另一优选实施方案中，本发明的重组弹状病毒的RNA基因组包含与SEQID NO:24一致或与SEQ ID NO:24至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的编码序列或由其组成。

应理解，本发明的重组弹状病毒可在其基因组中编码其他载荷，诸如肿瘤抗原、其他趋化因子、细胞因子或其他免疫调节组件。

在另一实施方案中，本发明的重组弹状病毒另外在其基因组中编码碘化钠同向运输蛋白(NIS)。表达NIS且与(例如)¹²⁵I一起共培育可容许使用NIS作为成像报告体(Carlson等人,Current Gene Therapy,12,33-47,2012)。

重组弹状病毒

已知某些野生型弹状病毒毒株(诸如野生型VSV毒株)被视为具有神经毒性。亦报告，感染个体能够以主要针对糖蛋白的高抗体效价快速建立强体液反应。靶向一般弹状病毒及具体而言VSV的糖蛋白G的中和抗体能够限制病毒扩散且由此介导保护个体免于病毒再感染。然而，病毒中和限制了弹状病毒向癌症患者的重复施加。

为消除这些缺点，弹状病毒野生型糖蛋白G可经来自另一病毒的糖蛋白置换。就此而言，置换糖蛋白是指(i)使用编码另一病毒的糖蛋白GP的基因置换编码野生型糖蛋白G的基因，和/或(ii)使用另一病毒的糖蛋白GP置换野生型糖蛋白G。

在优选实施方案中，弹状病毒糖蛋白G经淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)的糖蛋白GP置换，优选经毒株WE-HPI置换。在甚至更优选实施方案中，弹状病毒为具有淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)的糖蛋白GP、优选具有毒株WE-HPI的水疱性口炎病毒。此类VSV例如描述于WO2010/040526中且命名为VSV-GP。所提供优点为(i)去除了VSV-G介导的神经毒性及(ii)并无抗体的载体中和(如小鼠中所示)。

淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)的糖蛋白GP可以是GP1或GP2。本发明包括来自不同LCMV毒株的糖蛋白。特别是，LCMV-GP可衍生自LCMV野生型或LCMV毒株LCMV-WE、LCMV-WE-HPI、LCMV-WE-HPl opt。在优选实施方案中，编码LCMV的糖蛋白GP的基因编码具有如SEQID NO:11中所示的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO:11的氨基酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列的蛋白质，而包含编码如SEQ ID NO:11中所示的氨基酸序列的糖蛋白GP的重组弹状病毒的功能特性得以维持。

在另一实施方案中，使用丹德农病毒(DANDV)或莫佩亚(MOPV)病毒的糖蛋白GP置换重组弹状病毒糖蛋白G。在更优选实施方案中，重组弹状病毒为水疱性口炎病毒，其中糖蛋白G经丹德农病毒(DANDV)或莫佩亚(MOPV)病毒的糖蛋白GP置换。所提供优点为(i)去除了VSV-G介导的神经毒性及(ii)并无载体性抗体中和(如小鼠中所示)。

丹德农病毒(DANDV)为旧世界沙粒状病毒(old world arenavirus)。迄今为止，仅存在本领域技术人员已知的单一毒株，其包含糖蛋白GP且可在本发明内用作本发明的重组弹状病毒中所包含糖蛋白GP的供体。本发明的重组弹状病毒中所包含的DANDV糖蛋白GP具有超过6个糖基化位点、尤其7个糖基化位点。例示性优选糖蛋白GP为如在Genbank编号EU136038下可获得的DANDV中所包含的糖蛋白GP。在一个实施方案中，编码DNADV的糖蛋白GP的基因编码如SEQ ID NO:12中所示的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO:12的氨基酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的序列，而包含编码如SEQ ID NO:12中所示的氨基酸序列的糖蛋白GP的重组弹状病毒的功能特性得以维持。

莫佩亚病毒(MOPV)为旧世界沙粒状病毒。存在本领域技术人员已知的若干毒株，其包含糖蛋白GP且可在本发明内用作本发明的重组弹状病毒中所包含糖蛋白GP的供体。本发明的重组弹状病毒中所包含的MOPV糖蛋白GP具有超过6个糖基化位点、尤其7个糖基化位点。例示性优选糖蛋白GP为如在Genbank编号AY772170下可获得的莫佩亚病毒中所包含的糖蛋白GP。在一个实施方案中，编码MOPV的糖蛋白GP的基因编码如SEQ ID NO:13中所示的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO:13的氨基酸序列至少60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的序列，而包含编码如SEQ ID NO:13中所示的氨基酸序列的糖蛋白GP的重组弹状病毒的功能特性得以维持。

CD80胞外域Fc融合蛋白

CD80，也称为B7-1，为属于免疫球蛋白超家族的60kD单链I型糖蛋白。CD80表达于活化/成熟抗原呈现细胞，诸如树突状细胞上。CD80结合于CD28及CD152(CTLA-4)。与CD86(B7-2)一起，CD80在调节T细胞活化方面发挥关键作用。CD80与CD28的相互作用为TCR接合复合物中的T细胞活化提供协同刺激信号。其与CTLA-4(例如在调节性T细胞上表达)相互作用，CTLA-4对CD80的亲和力高于CD28且充当CD80的诱饵受体，而非充当抑制性信号传导受体，使T细胞失去关键的协同刺激CD28信号。

在过去，提议溶瘤病毒且特别是VSV-GP可诱导肿瘤细胞裂解以及免疫原性细胞死亡且刺激肿瘤微环境中的先天性免疫细胞。进一步提议，可将免疫调节蛋白编码至溶瘤病毒的基因组中且所述免疫调节蛋白的表达可通过局部免疫刺激活动支持该病毒的溶瘤效应。

自病毒主链表达免疫促进分子(诸如趋化因子和/或细胞因子)的一个挑战在于，不仅必须达成抗肿瘤免疫的增强，而且同时要避免由免疫促进分子引起的抗病毒免疫反应。必须注意，额外的免疫促进分子不会将病毒的溶瘤潜力限制于由治疗性载荷的表达获得的潜在益处被溶瘤效能的损失压倒的程度。

发明人假设，CD80胞外域Fc融合蛋白一方面可在T细胞受体接合的情形下提供有效T细胞协同刺激，且另一方面将不活化自然杀伤细胞(由例如IL2、IL15、CD137活化)，此将在早期限制病毒复制和/或持久性。CD80胞外域Fc融合蛋白为强效协同刺激分子，其在抗原特异性T细胞的引发及再活化方面具有活性。该刺激是关键的，因为T细胞协同刺激信号通常在肿瘤中表达不足，从而导致克隆T细胞无反应性、效应功能缺失及T细胞死亡。

通过提供根据本发明的重组弹状病毒，CD80胞外域Fc融合蛋白的肿瘤限制性复制可引起T细胞协同刺激性融合蛋白的局部表达，其通过在T细胞受体接合(例如肿瘤细胞识别)的情形下以FcγR依赖性方式提供活化信号至T细胞而进一步增强抗肿瘤T细胞免疫。

发明人出人意料地发现，编码CD80胞外域Fc融合蛋白的根据本发明的重组弹状病毒能够诱导肿瘤细胞裂解以及免疫原性细胞死亡且刺激肿瘤微环境中的先天性免疫细胞。此外，在用此类经CD80胞外域Fc融合蛋白武装的重组弹状病毒处理的已建立小鼠肿瘤模型中观测到延长的生存率。

出乎意料地，用编码CD80胞外域Fc融合蛋白的根据本发明的重组弹状病毒进行感染引起经感染肿瘤内的FcγR表达的强力增加。发明人证明，CD80胞外域Fc融合蛋白的最佳生物活性很大程度上视FcγR而定。

不希望受理论所束缚，认为通过编码CD80胞外域Fc融合蛋白的根据本发明的重组弹状病毒获得的强力抗肿瘤效应至少部分地基于CD80胞外域Fc融合蛋白的FcγR依赖性活性，该活性通过在感染根据本发明的重组弹状病毒之后经感染肿瘤中FcγR的增加表达增强。

或者，在此情形下，亦经考虑提供CD86(B7-2)融合蛋白，亦即编码CD86胞外域Fc融合蛋白的重组弹状病毒，且特别是编码CD86胞外域Fc融合蛋白的VSV-GP，其中编码重组水疱性口炎病毒的糖蛋白G的基因经编码淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)的糖蛋白GP的基因置换，和/或糖蛋白G经LCMV的糖蛋白GP置换。

如本文所用的“CD80胞外域Fc融合蛋白”是指融合蛋白或其功能变体，其包含与IgG的Fc域融合的CD80胞外域或由其组成。

“CD80胞外域”包含天然存在的多肽诸如不同同功异型物以及其功能变体或由其组成，优选人类CD80胞外域。

在一个方面中，在基因组中编码至少一种CD80胞外域Fc融合蛋白或其功能变体的重组弹状病毒能够增强T细胞及树突状细胞向肿瘤环境的募集。

在另一方面中，自重组弹状病毒的基因组表达至少一种CD80胞外域Fc融合蛋白或其功能变体为具有冷性肿瘤及低突变负荷的患者提供治疗选项以增强针对不良免疫原性肿瘤的T细胞介导的抗肿瘤T细胞反应。

在另一方面中，自重组弹状病毒的基因组表达至少一种CD80胞外域Fc融合蛋白或其功能变体不诱导额外自然杀伤细胞(超过亲本VSV-GP病毒的效应)且选择性活化抗原特异性T细胞。

在另一方面中，自重组弹状病毒的基因组表达至少一种CD80胞外域Fc融合蛋白或其功能变体未诱导超促效作用。

在另一方面中，自重组弹状病毒的基因组表达至少一种CD80胞外域Fc融合蛋白或其功能变体不增加对重组弹状病毒的早期抗病毒免疫。

在又另一方面中，除由于其可溶性而在肿瘤中局部表达以外，CD80胞外域Fc融合蛋白亦可到达肿瘤引流***(例如***)。

人类CD80蛋白(UniProtKB-P33681|CD80_人类T淋巴细胞活化抗原CD80)包含288个氨基酸总量或由288个氨基酸总量组成且含有信号肽、胞外域及跨膜域/拓朴域：

在一个实施方案中，CD80胞外域Fc融合蛋白的CD80胞外域包含SEQ ID NO:6的氨基酸1-242或由其组成，或与SEQ ID NO:6的氨基酸1-242具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性。

在另一实施方案中，CD80胞外域Fc融合蛋白的CD80胞外域包含以下序列或由以下序列组成：

或与SEQ ID NO:1具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的序列。

在一个实施方案中，CD80胞外域Fc融合蛋白包含信号肽序列。在另一实施方案中，CD80胞外域Fc融合物不包含信号肽序列。

术语“信号肽”或“信号肽序列”描述通常长度为10至30个氨基酸且存在于新合成的分泌或膜多肽的N端末端处的肽序列，其引导多肽穿过或进入细胞的细胞膜(原核生物中的质膜及真核生物中的内质网膜)中。其通常随后移除。特别是，信号肽可以能够将多肽引导至细胞的分泌通路中。

应理解，对于本发明，其他(亦即除野生型之外)信号肽序列可连同CD80胞外域Fc融合蛋白一起使用。此类其他信号肽序列可置换原始野生型信号肽序列。信号肽包括将核糖体中的新合成蛋白质引导至ER且进一步引导至高尔基体(Golgi)复合物以输送至质膜或输送出细胞的肽。其一般包括疏水性氨基酸串且包括免疫球蛋白前导序列以及本领域技术人员已知的其他序列。信号肽尤其包括能够受到信号肽酶作用的肽，该信号肽酶为一种位于内质网的池面上的特异性蛋白酶。信号肽为本领域技术人员所熟知且可包括任何已知信号肽。信号肽经并入蛋白质的N端处且通过信号肽酶加工CD80胞外域Fc融合蛋白产生活性生物形式。

在一个实施方案中，CD80胞外域Fc融合蛋白包含野生型CD80信号肽序列。在优选实施方案中，CD80胞外域Fc融合蛋白包含野生型人类CD80信号肽序列，其为SEQ ID NO:6的氨基酸1-34或与SEQ ID NO:6的氨基酸1-34具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的序列。

在另一实施方案中，CD80胞外域Fc融合蛋白包含具有以下序列的信号肽序列：

MGWSCIILFLVATATGVHS(SEQ ID NO:5)

或与SEQ ID NO:5具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的信号肽序列。

在相关实施方案中，CD80胞外域Fc融合蛋白的CD80胞外域包含SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的序列或由其组成，且进一步包含根据SEQ ID NO:5的信号肽序列或与SEQ ID NO:5具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的信号肽序列。

CD80胞外域Fc融合蛋白亦可包括具有截短信号肽序列的融合蛋白。在此上下文中，截短是指一种信号肽序列，其比原始信号肽序列短但仍保留其功能性的至少一部分以充当信号肽。举例而言，人类CD80信号肽序列包含SEQ ID NO:6的氨基酸1-34或由其组成。具有截短信号肽序列的CD80胞外域Fc融合蛋白可具有SEQ ID NO:6的氨基酸1-34中的33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1。在另一实施例中，信号肽可包含如SEQ ID NO:5中所示的序列或由其组成。具有截短信号肽序列的CD80胞外域Fc融合蛋白可具有SEQ ID NO:5的氨基酸1-18中的18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1。

具有截短信号肽序列的CD80胞外域Fc融合蛋白亦可以是包含SEQ ID No:1或与SEQ ID NO:1具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的序列且另外包含短于原始信号肽序列的信号肽序列的蛋白质。此外，举例而言，信号肽序列可具有SEQ ID NO:6的氨基酸1-34中的33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1，或在另一实施例中，信号肽可包含如SEQ ID NO:5中所示的序列或由其组成。具有截短信号肽序列的CD80胞外域Fc融合蛋白可具有SEQ ID NO:5的氨基酸1-18中的18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1。

CD80胞外域可具有任何来源，包括小鼠及大鼠。优选地，CD80胞外域蛋白质来自人类来源。

IgG的Fc域可与CD80胞外域的N端或C端部分共价融合或在内部位置处融合。在一些实施方案中，IgG分子的Fc域可经由连接肽(诸如GS接头)与CD80胞外域融合。优选地，Fc域与CD80胞外域的C端部分融合。

在一些实施方案中，Fc域具有野生型序列。在其他实施方案中，Fc域为天然或经工程改造的变体。在一些实施方案中，Fc域与其野生型序列相比包含一个或多个突变、取代和/或缺失。在一些实施方案中，选择Fc与一种或多种Fcγ受体(FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIA、FcγRIIIB)具有改变的相互作用的Fc域。优选地，Fc域衍生自人类IgG，诸如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。更优选地，Fc域衍生于人类IgG1。

在优选实施方案中，CD80胞外域Fc融合蛋白的Fc域包含以下序列或由以下序列组成：

或与SEQ ID NO:2具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的序列。

在优选实施方案中，CD80胞外域Fc融合蛋白包含以下序列或由以下序列组成：

或与SEQ ID NO:4具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的序列。

在另一优选实施方案中，CD80胞外域Fc融合蛋白包含与IgG1的Fc域融合的CD80胞外域或由其组成，其中该CD80胞外域包含SEQ ID NO:4的氨基酸1-207或由其组成或与SEQID NO:4的氨基酸1-207具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性且该Fc域包含SEQ ID NO:4的氨基酸208-433或由其组成或与SEQ ID NO:4的氨基酸208-433具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性。

在另一优选实施方案中，CD80胞外域Fc融合蛋白包含以下序列或由以下序列组成：

或与SEQ ID NO:3具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的序列。

如本文所使用，在两个或更多个核酸或多肽序列的情况下，术语“一致”或“一致性百分比”是指在针对最大对应性比较及比对时，两个或更多个序列或子序列相同或具有指定百分比的相同的核苷酸或氨基酸残基。为确定一致性百分比，出于最佳比较目的而比对序列(例如，可在第一氨基酸序列或核酸序列中引入间隙以与第二氨基酸或核酸序列进行最佳比对)。接着比较相对应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。若第一序列中的位置被与第二序列中的相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据，则分子在该位置处一致。两个序列之间之一致性百分比为所述序列共有之一致位置数的函数(亦即，一致性％＝一致位置数/位置(亦即重叠位置)总数×100)。在一些实施方案中，适当时，在序列内引入间隙之后，进行比较的两个序列长度相同(例如不包括延长超过比较序列的额外序列)。

可使用数学算法实现判定两个序列之间之一致性百分比或相似性百分比。用于比较两个序列的数学算法的优选非限制性实施例为Karlin及Altschul,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:2264-2268的算法，如Karlin及Altschul,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5877中所修改。将此类算法并入至Altschul等人,1990,J.Mol.Biol.215:403-410的NBLAST及XBLAST程序中。可用分数＝100、字长＝12的NBLAST程序进行BLAST核苷酸检索以获得与编码相关蛋白质的核酸同源的核苷酸序列。可用分数＝50、字长＝3的XBLAST程序进行BLAST蛋白质检索以获得与相关蛋白质同源的氨基酸序列。为获得用于比较目的之间隙比对，可如Altschul等人,1997,Nucleic Acids Res.25:3389-3402中所描述使用间隙式(Gapped)BLAST。替代地，PSI-Blast可用于进行检测分子(相同)之间的远缘关系的叠代检索。当利用BLAST、间隙式BLAST及PSI-Blast程序时，可使用个别程序(例如XBLAST及NBLAST)的预设参数。用于比较序列的数学算法的另一优选非限制性实施例为Myers及Miller,CABIOS(1989)的算法。此类算法并入ALIGN程序(版本2.0)中，所述程序为GCG序列比对软件包的一部分。当利用ALIGN程序来比较氨基酸序列时，可使用PAM120权重残基表、空位长度罚分12及空位罚分4。用于序列分析的额外算法在本领域为已知的且包括如Torellis及Robotti,1994,Comput.Appl.Biosci.10:3-5中所描述的ADVANCE及ADAM；及Pearson及Lipman,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444-8中所描述的FASTA。在FASTA内，ktup为设定检索的敏感性及速度的对照选项。若ktup＝2，则通过观察比对残基对得到比较的两个序列中的类似区；若ktup＝1，则检查单一比对氨基酸。对于蛋白质序列，ktup可设定为2或1，或对于DNA序列设定为1至6。若ktup未得以指定，则对于蛋白质默认值为2，且对于DNA为6。替代地，可使用CLUSTAL W算法进行蛋白质序列比对，如Higgins等人,1996,Methods Enzymol.266:383-402所描述。

CD80胞外域Fc融合蛋白的功能变体包括前述CD80胞外域Fc融合蛋白的生物活性变体及生物活性片段。功能变体可以在CD80胞外域、Fc域和/或两个域中具有变异。举例而言，WO2017181152中已描述一些CD80胞外域功能变体。在另一实施例中，Fc域的功能变体已描述于WO17079117中且包含例如具有L234F、L235E和/或P331S氨基酸取代的人类IgG1 Fc域。

举例而言，变体可在特定描述CD80胞外域或Fc域蛋白的位置处具有一种或多种不同氨基酸。变体可与此类CD80胞外域或Fc域共有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高氨基酸一致性。片段具有与给定特定描述的CD80胞外域或Fc域蛋白质相同的氨基酸，但可能缺乏CD80胞外域或Fc域蛋白质的特定部分或区域。

CD80胞外域Fc融合蛋白的功能变体仅包括具有生物活性的CD80胞外域Fc融合蛋白的变体及片段。对于本发明，在重组弹状病毒的基因组中被编码的CD80胞外域Fc融合蛋白变体或CD80胞外域Fc融合蛋白片段的生物活性为在其表达于各别细胞或肿瘤细胞中之后测定。此意谓在编码CD80胞外域Fc融合蛋白变体或CD80胞外域Fc融合蛋白片段的重组弹状病毒的情形下测定生物活性(例如在Transwell分析或体外肿瘤模型中)。优选地，生物活性用编码CD80胞外域Fc融合蛋白变体或CD80胞外域Fc融合蛋白片段的水疱病毒测定。更优选地，生物活性用编码CD80胞外域Fc融合蛋白变体或CD80胞外域Fc融合蛋白片段的VSV-GP测定。

生物活性可包括以下能力中的一或多个：化学引诱剂活性、抗肿瘤活性、细胞因子表达的调节，诸如同基因型哺乳动物细胞群体(包括CD8阳性T细胞、CD4阳性T细胞、抗原呈现细胞及肿瘤细胞)中干扰素-γ(IFN-γ)多肽的表达增加或转型生长因子-β(TGF-β)多肽的表达减少。生物活性的测试可例如但不限于根据如实施例中所示的方案进行。出于本发明的目的，若在相同分析及在相同条件下测试，若CD80胞外域Fc融合蛋白的功能变体或片段显示与如SEQ ID NO:3或4(分别具有或不具有信号肽序列)中所示的序列至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的CD80胞外域Fc融合蛋白活性，则其具有生物学活性。

弹状病毒具有反义单股RNA(ssRNA)作为其基因物质(基因组)。反义ssRNA病毒需要RNA聚合酶以形成正义RNA。正义RNA充当病毒mRNA，其翻译成用于产生新病毒物质的蛋白质。利用新形成的病毒，产生更多反义的RNA分子。

典型的弹状病毒基因组编码至少五种按3'-N-P-M-G-L-5'的次序的结构蛋白。基因组可含有结构蛋白质之间的其他短基因间区域或额外基因，且因此长度及组织可能不同。

根据本发明，CD80胞外域Fc融合蛋白基因可引入至弹状病毒基因组的任何位置。视***位点而定，可影响CD80胞外域Fc融合蛋白基因的转录效率。一般而言，CD80胞外域Fc融合蛋白基因的转录效率自3′***至5′***降低。CD80胞外域Fc融合蛋白基因可***至以下基因组位置中：3'-CD80胞外域Fc融合蛋白-N-P-M-G-L-5'、3'-N-CD80胞外域Fc融合蛋白-P-M-G-L-5'、3'-N-P-CD80胞外域Fc融合蛋白-M-G-L-5'、3'-N-P-M-CD80胞外域Fc融合蛋白-G-L-5'、3'-N-P-M-G-CD80胞外域Fc融合蛋白-L-5'或3'-N-P-M-G-L-CD80胞外域Fc融合蛋白-5'。在优选实施方案中，CD80胞外域Fc融合蛋白基因***G蛋白与L蛋白之间。

在肿瘤细胞感染后，将在重组弹状病毒的基因组中编码的CD80胞外域Fc融合蛋白基因转录为正义RNA，且随后由肿瘤细胞翻译为CD80胞外域Fc融合蛋白。术语“编码(encoding/coding)”是指核酸中的特定核苷酸序列充当用于合成生物过程中的其他聚合物及大分子的模板的固有特性，具有限定序列的核苷酸(例如RNA分子)或氨基酸及自其产生的生物特性。因此，若所需蛋白质在细胞或另一生物***中通过mRNA的转录及后续翻译产生，则基因编码蛋白质。编码股(其核苷酸序列与mRNA序列一致)及非编码股两者可充当用于基因转录的模板且可称为编码蛋白质或该基因的其他产物。编码蛋白质的核酸及核苷酸序列可包括内含子。

CD80胞外域Fc融合蛋白基因的转录优选不在其自身启动子的控制下且仅与病毒复制严格相关，确保CD80胞外域Fc融合蛋白从而靶向表达至病毒复制及扩散(肿瘤)的位置。因此，CD80胞外域Fc融合蛋白基因的转录不受诸如启动子或诱导型基因表达组件的其他组件控制。

经翻译CD80胞外域Fc融合蛋白通常在溶液中以包含两种相同单体成熟CD80胞外域Fc融合蛋白的二聚融合蛋白存在。在此实施例中，各单体CD80胞外域Fc融合蛋白包含在IgG Fc域的其C端至N端融合的CD80胞外域。两种CD80胞外域Fc融合单体通过各单体中的半胱氨酸残基之间形成的二硫键共价连接在一起，由此形成CD80胞外域Fc融合蛋白二聚体。

应了解，核酸序列可在所编码多肽的主要序列改变或不改变的情况下变化。编码蛋白质的核酸包括具有不同核苷酸序列但归因于基因密码的简并而编码蛋白质的相同氨基酸序列的任何核酸。选择将导致CD80胞外域Fc融合蛋白，且尤其如本文所公开的任何特异性CD80胞外域Fc融合蛋白的表达的核酸序列在本领域技术人员的知识范围内。编码CD80胞外域Fc融合蛋白的氨基酸序列的核酸分子为通过本领域已知的多种方法制备。这些方法包括(但不限于)自天然来源分离或通过寡核苷酸介导的(或定点)突变诱发、PCR突变诱发及先前制备的CD80胞外域Fc融合蛋白的卡匣突变诱发来制备。

药物组合物

当然，实际药学上的有效量或治疗剂量将视而本领域技术人员已知的因素而定，诸如患者的年龄及体重、施用途径及疾病的严重性。在任何情况下，重组弹状病毒将基于患者的独特病状以使得药学上有效量得以递送的剂量及方式施用。

一般而言，对于治疗和/或缓解本文所提及的疾病、病症及病状且视待治疗的特定疾病、病症或病状、待使用的本发明的特定重组弹状病毒的效能、特定施用途径及所使用的特定药物调配物或组合物而定，通常将例如一周两次、每周一次或以每月一次剂量施用本发明的重组弹状病毒，但可显著改变，尤其视随后提及的参数而定。因此，在一些情况下，使用小于上文给出的最小剂量可以是足够的，而在其他情况下可超过上限。当施用较大量时，在一天内将其分成多个较小剂量可以是可取的。

为用于疗法中，将本发明的重组弹状病毒调配成适合于促进向动物或人类施用的药物组合物。典型调配物可通过使重组病毒与生理学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂以水溶液或水性或非水性悬浮液形式混合来制备。载剂、赋形剂、调节剂或稳定剂在所采用的剂量及浓度下无毒性。其包括缓冲剂***，诸如磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐及其他无机酸或有机酸及其盐；抗氧化剂，包括抗坏血酸及甲硫氨酸；防腐剂，诸如氯化十八烷基二甲基苯甲基铵；氯化六羟季铵；氯化苯甲烃铵、氯化苯索铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟苯甲酸烷酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；以及间甲酚；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮或聚乙二醇(PEG)；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、双糖、寡糖或多糖及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖、蔗糖、海藻糖、糊精或葡聚糖；螯合剂，诸如EDTA；糖醇，诸如甘露醇或山梨糖醇；成盐相对离子，诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或离子或非离子表面活性剂，诸如TWEEN^TM(聚山梨醇酯)、PLURONICS^TM或脂肪酸酯、脂肪酸醚或糖酯。赋形剂亦可具有调节释放或调节吸收的功能。

在一个实施方案中，将本发明的重组弹状病毒调配至包含Tris、精氨酸及任选选用的柠檬酸盐的药物组合物中。优选以约1mM至约100mM的浓度使用Tris。优选以约1mM至约100mM的浓度使用精氨酸。柠檬酸盐可以至多100mM的浓度存在。优选调配物包含约50mMTris及50mM精氨酸。

药物组合物可作为液体、冷冻液体或以冻干形式提供。冷冻液体可以在约0℃与约-85℃之间的温度下储存，包括温度在-70℃与-85℃之间且为约-15℃、-16℃、-17℃、-18℃、-19℃、-20℃、-21℃、-22℃、-23℃、-24℃或约-25℃。

本发明的重组弹状病毒或药物组合物无需但任选与一种或多种当前用于预防或治疗所述病症的药剂一起调配。此类其他药剂的有效量视存在于调配物中的重组抗体的量、病症或治疗的类型及如上文所述的其他因素而定。其一般为以相同剂量且以如本文所描述的施用途径使用，或以约1％至99％的本文所描述的剂量，或以凭经验/在临床上确定适当的任何剂量及任何途径使用。

为预防或治疗疾病，本发明的重组弹状病毒或药物组合物(当单独或与一种或多种其他额外治疗剂组合使用时)的适当剂量将视待治疗的疾病类型、重组弹状病毒的类型、疾病的严重程度及过程、重组弹状病毒出于预防性还是治疗性目的施用、先前疗法、患者临床病史及对重组弹状病毒的反应及主治医师的判断而定。本发明的重组弹状病毒或药物组合物适合一次性或经一连串治疗向患者施用。

视疾病的类型及严重程度而定，通过重组弹状病毒的TCID₅₀测量的约10⁸至10¹³个感染性粒子可以是向患者施用的初始候选剂量，无论例如通过一或多次单独施用或通过连续输注。经历数日或更长时间重复施用时，视病状而定，治疗一般持续至疾病症状发生所需抑制为止。重组弹状病毒之一种例示性剂量将在约10⁸至10¹³个由TCID₅₀测量的感染性粒子的范围内。因此，可向患者施用通过TCID₅₀测量的约10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹、10¹²或10¹³个感染性粒子的一个或多个剂量(或其任何组合)。此类剂量可间歇地施用，例如每周或每三周(例如以使得患者接受约二至约二十或例如约六个剂量的重组弹状病毒)。可施用初始较高起始剂量，之后可施用一种或多种较低剂量，或反之亦然。然而，其他给药方案可以是适用的。此疗法的进程容易通过常规技术及分析来监测。

可使用任何适合的体外分析、基于细胞的分析、体内分析和/或本身已知的动物模型或其任何组合测试本发明的重组弹状病毒及包含其的组合物的功效，其视所涉及的特定疾病而定。适合的分析及动物模型对本领域技术人员将为清楚的，且例如包括以下实施例中所用的分析及动物模型。

当然实际药学上的有效量或治疗剂量将视而本领域技术人员已知的因素而定，诸如患者的年龄及体重、施用途径及疾病的严重性。在任何情况下，本发明的重组弹状病毒将基于患者的独特病状以使得药学上有效量得以递送的剂量及方式施用。

或者，本发明的重组弹状病毒或药物组合物可以约50μl至约100ml(包括该范围内的所有数目)的体积递送，此视待治疗的区域的大小、所用病毒效价、施用途径及方法的所需效应而定。

对于瘤内施用，体积优选在约50μl至约5ml之间，包括以下体积：约100μl、200μl、300μl、400μl、500μl、600μl、700μl、800μl、900μl、1000μl、1100μl、1200μl、1300μl、1400μl、1500μl、1600μl、1700μl、1800μl、1900μl、2000μl、2500μl、3000μl、3500μl、4000μl或约4500μl。在优选实施方案中，体积为约1000μl。

对于全身性施用，例如通过输注重组弹状病毒，体积可自然地更高。或者，重组弹状病毒的浓缩溶液可在输注之前直接在较大体积的输注溶液中稀释。

特别是，对于静脉内施用，体积优选在1ml与100ml之间，包括以下体积：约2ml、3ml、4ml、5ml、6ml、7ml、8ml、9ml、10ml、11ml、12ml、13ml、14ml、15ml、16ml、17ml、18ml、19ml、20ml、25ml、30ml、35ml、40ml、45ml、50ml、55ml、60ml、70ml、75ml、80ml、85ml、90ml、95ml或约100ml。在优选实施方案中，体积在约5ml与15ml之间，更优选地体积为约6ml、7ml、8ml、9ml、10ml、11ml、12ml、13ml或约14ml。

优选地，相同调配物用于瘤内施用及静脉内施用。瘤内与静脉内施用之间的剂量和/或体积比可以是约1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19或约1:20。举例而言，1:1的剂量和/或体积比意谓瘤内以及静脉内施用相同剂量和/或体积，而例如约1:20的剂量和/或体积比意谓比瘤内施用剂量和/或体积高二十倍的静脉内施用剂量和/或体积。优选地，瘤内施用与静脉内施用之间的剂量和/或体积比为约1:9。

重组弹状病毒的有效浓度理想地介于约10⁸与10¹⁴个载体基因组/毫升(vg/mL)之间的范围内。感染性单位可如McLaughlin等人,JVirol.；62(6):1963-73(1988)中所描述测量。优选地，浓度为约1.5×10⁹至约1.5×10¹³，且更优选为约1.5×10⁹至约1.5×10¹¹。在一个实施方案中，有效浓度为约1.5×10⁹。在另一实施方案中，有效浓度为约1.5×10¹⁰。在另一实施方案中，有效浓度为约1.5×10¹¹。在又另一实施方案中，有效浓度为约1.5×10¹²。在另一实施方案中，有效浓度为约1.5×10¹³。在另一实施方案中，有效浓度为约1.5×10¹⁴。可能需要使用最低有效浓度以降低非所需效应的风险。在这些范围内的另外其他剂量可由主治医师考虑所治疗的个体(优选人类)的身体状态、个体的年龄、特定类型的癌症及癌症(若有进展)发展的程度来选择。

重组弹状病毒的有效目标浓度可用TCID₅₀表达。TCID₅₀可例如通过使用史丕曼-卡伯

法来测定。理想地，范围包括1×10⁸/ml与1×10¹⁴/ml个TCID₅₀之间的有效目标浓度。优选地，有效目标浓度为约1×10⁹至约1×10¹²/ml，且更优选地约1×10⁹至约1×10¹¹/ml。在一个实施方案中，有效目标浓度为约1×10¹⁰/ml。在优选实施方案中，目标浓度为5×10¹⁰/ml。在另一实施方案中，有效目标浓度为约1.5×10¹¹/ml。在一个实施方案中，有效目标浓度为约1×10¹²/ml。在另一实施方案中，有效目标浓度为约1.5×10¹³/ml。

重组弹状病毒的有效目标剂量亦可用TCID₅₀表达。理想地，范围包括1×10⁸与1×10¹⁴个TCID₅₀之间的目标剂量。优选地，目标剂量为约1×10⁹至约1×10¹³，且更优选为约1×10⁹至约1×10¹²。在一个实施方案中，有效浓度为约1×10¹⁰。在优选实施方案中，有效浓度为约1×10¹¹。在一个实施方案中，有效浓度为约1×10¹²。在另一实施方案中，有效浓度为约1×10¹³。

在另一方面中，提供一种含有可用于治疗、预防和/或诊断上文所描述的病症的材料的试剂盒或成套试剂盒。试剂盒或成套试剂盒包含容器及在容器上或与容器相联的标签或药品说明书。适合的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可由各种材料形成，诸如玻璃或塑料。容器装有单独或与有效治疗、预防和/或诊断病症的另一组合物组合的组合物，且可具有无菌接取口(例如容器可以是具有可由皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶)。组合物中的至少一种活性剂为本发明的重组弹状病毒或药物组合物。卷标或药品说明书指示组合物用于治疗所选病状。

此外，试剂盒或成套试剂盒可包含(a)其中含有组合物的第一容器，其中该组合物包含本发明的重组弹状病毒或药物组合物；及(b)其中含有组合物的第二容器，其中该组合物包含另一细胞毒性剂或其他治疗剂，诸如PD-1通路抑制剂或SMAC仿真物。本发明的此实施方案中的试剂盒或成套试剂盒可进一步包含指示组合物可用于治疗特定病状、特别是癌症的药品说明书。可替代地或另外，试剂盒或成套试剂盒可进一步包含第二(或第三)容器，该第二(或第三)容器包含药学上可接受的缓冲液，诸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液或右旋糖溶液。其可进一步包括就商业及使用者观点而言所期望的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针及注射器。

在另一方面中，本发明的重组弹状病毒与适用于施用重组弹状病毒的装置，诸如注射器、注射笔、微型泵或其他装置组合使用。优选地，本发明的重组弹状病毒包含于成套试剂盒中，例如亦包括具有重组弹状病毒的使用说明的药品说明书。

医疗用途

本发明的另一方面提供在基因组中编码至少一种CD80胞外域Fc融合蛋白或其功能变体的重组弹状病毒，其用于医学中。

本发明的重组弹状病毒有效诱导肿瘤细胞裂解以及免疫原性细胞死亡且刺激肿瘤微环境中的先天性免疫细胞。因此，本发明的重组弹状病毒可用于治疗和/或预防癌症。

在另一方面中，本发明的重组弹状病毒可用于治疗和/或预防癌症的方法中，该方法包含向罹患癌症的个体施用治疗有效量的重组弹状病毒，由此改善一种或多种癌症症状。

在又另一方面中，本发明另外提供根据本发明的重组弹状病毒的用途，其用以制造用于治疗和/或预防癌症的药剂。

在又另一方面中，本发明的重组弹状病毒可用于治疗和/或预防胃肠癌、肺癌或头颈癌的方法中，该方法包含向罹患胃肠癌、肺癌或头颈癌的个体施用治疗有效量的重组弹状病毒，由此改善胃肠癌、肺癌或头颈癌的一种或多种症状。

为预防或治疗疾病，重组弹状病毒的适当剂量将视各种因素而定，所述因素诸如如上文所定义的待治疗疾病的类型、疾病的严重度及病程、是否为预防或治疗目的而施用重组弹状病毒、先前疗法、患者的临床病史及对重组弹状病毒的反应以及主治医师的判断。重组弹状病毒适于向患者一次性地或经一系列治疗施用。

在一个方面中，癌症为实体癌。实体癌可以是脑癌、子宫内膜癌、***癌、***癌、结肠直肠癌、口咽鳞状细胞癌、胃癌、胃食管结合部腺癌、食管癌、肝细胞癌、胰脏腺癌、胆管癌、膀胱尿路上皮癌、转移性黑色素瘤、***癌、乳腺癌、卵巢癌、头颈鳞状细胞癌(HNSCC)、神经胶母细胞瘤、非小细胞肺癌、脑瘤或小细胞肺癌。优选为治疗胃肠癌、肺癌及头颈癌。

通过任何适宜方式来施用重组弹状病毒，所述方式包括口服、非经肠、皮下、瘤内、静脉内、皮内、腹膜内、肺内及鼻内。非经肠输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。另外，重组弹状病毒适于通过脉动输注施用。在一个方面中，部分视施用的短期或长期性而定，可通过注射，最佳地静脉内或皮下注射来提供给药。

视本发明的特定重组弹状病毒及其特定药物动力学特性及其他特性而定，可每天一次、每两天一次、每三天一次、每四天一次、每五天一次或每六天一次、每周一次、每月一次及其类似方式施用该重组弹状病毒。施用疗程可包括每周一次的长期治疗。“长期”意谓持续时间为至少两周且优选数月或数年。

治疗时程可包括各种疗程且典型将需要经一周、两周、三周或四周的时段向患者施用多个剂量，任选接下来进一步进行一或多轮治疗。在一个方面中，以至多1、2、3、4、5或6个剂量在既定时段内向患者施用本发明的重组弹状病毒。优选地，在三周内达成第一轮治疗。在三周治疗的过程期间，可如以下方案中所描述向患者施用重组弹状病毒：(i)在第0天一次；(ii)在第0天及第3天；(iii)在第0天、第3天及第6天；(iv)在第0天、第3天、第6天及第9天；(v)在第0天及第5天；(vi)在第0天、第5天及第10天；(vii)在第0天、第5天、第10天及第15天。可重复这些疗程且可视第一轮治疗的结果需要第二或第三轮治疗。基于第一轮治疗来计算，第二轮治疗优选地包括进一步在第21天、第42天及第63天进行治疗。在优选实施方案中，根据以下方案向患者施用本发明的重组弹状病毒：在第0天、第3天、第21天、第42天及第63天。

术语“抑制”在本文中在与“改善”及“缓解”相同的情形下使用，意谓减轻或减少疾病的一个或多个特征。本发明的重组弹状病毒或药物组合物将以符合良好医学实践的方式调配、给药及施用。在此情形下，考虑因素包括所治疗的特定病症、所治疗的特定哺乳动物、个别患者的临床病状、病症的病因、药剂递送部位、施用方法、施用时程及医学从业者已知的其他因素。待施用重组弹状病毒的“治疗有效量”将由于此类考虑因素调节，且为预防、改善或治疗癌症临床症状所需的最小量，尤其为对这些病症有效的最小量。

在另一方面中，可多次且以若干剂量来施用本发明的重组弹状病毒。在一个方面中，经瘤内施用第一剂量的重组弹状病毒且经静脉内施用后续剂量的重组弹状病毒。在另一方面中，经瘤内施用第一剂量及至少一个或多个随后剂量的重组弹状病毒且经静脉内施用后续剂量的重组弹状病毒。后续剂量可在初始瘤内施用之后1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天或31天施用。

在另一方面中，经静脉内施用第一剂量的重组弹状病毒且经瘤内施用后续剂量的重组弹状病毒。后续剂量可在初始静脉内施用之后1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天或31天施用。

在另一方面中，经静脉内施用重组弹状病毒且经瘤内施用后续剂量的重组弹状病毒。

在另一方面中，在各时间点经静脉内且经瘤内施用重组弹状病毒。

如上文所陈述，本发明的重组弹状病毒具有用于刺激针对癌细胞的免疫反应的许多效用。观测到强免疫活化潜力受限于肿瘤微环境。因此，在优选方面中，可向患者全身性施用本发明的重组弹状病毒。全身性可施加性是关键属性，这是因为许多癌症高度转移且其允许治疗难以到达以及不可到达的肿瘤病灶。由于此独特免疫刺激特性，根据本发明的重组弹状病毒尤其可用于治疗转移性肿瘤。

一些患者对检查点抑制剂疗法产生抗性且观测到此类患者似乎在IFN通路中累积突变。因此，在一个方面中，本发明的重组弹状病毒及尤其本发明的重组水疱性口炎病毒可用于治疗对检查点抑制剂疗法产生抗性的患者。由于本发明的重组弹状病毒及尤其重组水疱性口炎病毒的独特免疫促进特性，此类经治疗患者可变得适于继续检查点抑制剂疗法。

在优选实施方案中，本发明的重组弹状病毒及尤其本发明的重组水疱性口炎病毒可用于治疗已完成使用PD-1或PD-L1抑制剂(例如PD-1或PD-L1的拮抗性抗体)的检查点抑制剂疗法的非小细胞肺癌患者。

应理解，可使用任一本发明重组弹状病毒或药物组合物来实施上述药物调配物或治疗方法中的任一者。

组合

本发明亦提供组合治疗/方法以与当前使用和/或背景技术中已知的治疗/方法相比提供某些优点。这些优点可包括体内功效(例如，经改良临床反应、反应的延长、反应速率的增加、反应的持续时间、疾病稳定速率、稳定的持续时间、疾病进展的时间、无进展存活期(PFS)和/或总存活期(OS)、稍晚出现的耐药性及类似者)、安全及具有良好耐受性的施用及降低的不良事件的频率及严重程度。

本发明的重组弹状病毒可与其他药理学活性成分组合使用，所述活性成分诸如目前先进技术或标准照护化合物，诸如细胞生长抑制或细胞毒性物质，细胞增殖抑制剂、抗血管生成物质、类固醇、免疫调节剂/检查点抑制剂及类似者。本发明的重组弹状病毒亦可与放射线疗法组合使用。

可与本发明的重组弹状病毒组合施用的细胞生长抑制和/或细胞毒性活性物质包括(但不限于)激素、激素类似物及抗激素、芳香酶抑制剂、LHRH激动剂及拮抗剂、生长因子(诸如(例如)血小板衍生生长因子(PDGF)、纤维母细胞生长因子(FGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子(EGF)、***(IGF)、人类表皮生长因子(HER，例如HER2、HER3、HER4)及肝细胞生长因子(HGF)的生长因子)抑制剂、例如(抗)生长因子抗体、(抗)生长因子受体抗体等抑制剂及酪氨酸激酶抑制剂(诸如(例如)西妥昔单抗(cetuximab)、吉非替尼(gefitinib)、阿法替尼(afatinib)、尼达尼布(nintedanib)、伊马替尼(imatinib)、拉帕替尼(lapatinib)、伯舒替尼(bosutinib)及曲妥珠单抗(trastuzumab))；抗代谢物(例如抗叶酸盐，诸如甲胺喋呤(methotrexate)、雷替曲塞(raltitrexed)；嘧啶类似物，诸如5-氟尿嘧啶(5-FU)、吉西他滨(gemcitabine)、伊立替康(irinotecan)、多柔比星(doxorubicin)、TAS-102、卡培他滨(capecitabine)及吉西他滨(gemcitabine)；嘌呤及腺苷类似物，诸如巯基嘌呤(mercaptopurine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)、克拉屈滨(cladribine)及喷司他汀(pentostatin)、阿糖胞苷(cytarabine)(ara C)、氟达拉滨(fludarabine))；抗肿瘤抗生素(例如蒽环类)；铂衍生物(例如顺铂(cisplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)、卡铂(carboplatin))；烷基化剂(例如***氮芥(estramustin)、美罗利他胺(meclorethamine)、美法仑(melphalan)、氮芥苯丁酸(chlorambucil)、白消安(busulphan)、达喀尔巴

(dacarbazin)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、异环磷酰胺(ifosfamide)、替莫唑胺(temozolomide)、亚硝基脲(诸如(例如)卡莫司汀(carmustin)及洛莫司汀(lomustin))、噻替派(thiotepa))；抗有丝***剂(例如长春花生物碱，诸如(例如)长春碱(vinblastine)、长春地辛(vindesin)、长春瑞滨(vinorelbin)及长春新碱(vincristine)；及紫杉烷(taxane)，诸如太平洋紫杉醇(paclitaxel)、多西他赛(docetaxel))；血管生成抑制剂，包括贝伐珠单抗(bevacizumab)、雷莫芦单抗(ramucirumab)及阿柏西普(aflibercept)；微管蛋白抑制剂；DNA合成抑制剂、PARP抑制剂、拓朴异构酶抑制剂(例如表鬼臼毒素(epipodophyllotoxin)(诸如(例如)依托泊苷(etoposide)及依托泊苷磷酸盐(etopophos))、替尼泊苷(teniposide)、安吖啶(amsacrin)、托泊替康(topotecan)、伊立替康(irinotecan)、米托蒽醌(mitoxantrone))、丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂(例如PDK1抑制剂、Raf抑制剂、A-Raf抑制剂、B-Raf抑制剂、C-Raf抑制剂、mTOR抑制剂、mTORC1/2抑制剂、PI3K抑制剂、PI3Kα抑制剂、双重mTOR/PI3K抑制剂、STK33抑制剂、AKT抑制剂、PLK1抑制剂(诸如伏拉塞替(volasertib))、CDK抑制剂(包括CDK9抑制剂)、Aurora激酶抑制剂)、酪氨酸激酶抑制剂(例如PTK2/FAK抑制剂)、蛋白质蛋白质相互作用抑制剂(protein protein interaction inhibitor)、MEK抑制剂、ERK抑制剂、FLT3抑制剂、BRD4抑制剂、IGF-1R抑制剂、Bcl-xL抑制剂、Bcl-2抑制剂、Bcl-2/Bcl-xL抑制剂、ErbB受体抑制剂、BCR-ABL抑制剂、ABL抑制剂、Src抑制剂、雷帕霉素(rapamycin)类似物(例如依维莫司(everolimus)、替西罗莫司(替西罗莫司)、地磷莫司(ridaforolimus)、西罗莫司(sirolimus))、雄激素合成抑制剂、雄激素受体抑制剂、DNMT抑制剂、HDAC抑制剂、ANG1/2抑制剂、CYP17抑制剂、放射性药品、免疫治疗剂(诸如免疫检查点抑制剂(例如CTLA4、PD1、PD-L1、LAG3及TIM3结合分子/免疫球蛋白，诸如伊匹单抗(ipilimumab)、纳武单抗(nivolumab)、帕博利珠单抗(pembrolizumab))及各种化学治疗剂(诸如阿米福汀(amifostin)、阿那格雷(anagrelid)、罗多耐(clodronat)、非尔司亭(filgrastin)、干扰素、干扰素α、甲酰四氢叶酸(leucovorin)、利妥昔单抗(rituximab)、丙卡巴肼(procarbazine)、左旋咪唑(levamisole)、美司钠(mesna)、米托坦(mitotane)、帕米膦酸盐(pamidronate)及卟吩姆(porfimer))；蛋白酶体抑制剂(诸如硼替佐米(Bortezomib))；Smac及BH3模拟物；恢复p53功能性的药剂，包括mdm2-p53拮抗剂；Wnt/β-连环蛋白信号传导通路抑制剂；Flt3L以及Flt3-刺激性抗体或配体模拟物；SIRPα及CD47阻断疗法；和/或细胞周期蛋白依赖性激酶9抑制剂。

此外，免疫“冷性”至“热性”肿瘤中的潜在转化、骨髓/树突状细胞活化以及CD80-Fc介导的T细胞活化进一步有利地与治疗模式(诸如T细胞接合子)相互作用。因此，在一个实施方案中，本发明的重组弹状病毒可用于与T细胞接合子(诸如双特异性DLL3/CD3结合剂)组合治疗，其提供T细胞受体刺激但无协同刺激。另外，潜在临床组合搭配物亦可包括肿瘤-血管调节剂。因此，在另一实施方案中，本发明的重组弹状病毒可用于与肿瘤血管调节剂(诸如双特异性VEGF/ANG2结合剂)组合治疗。

本发明的重组弹状病毒可与使用PD-1通路抑制剂或SMACm/IAP拮抗剂的治疗组合使用。此类组合治疗可以物质的非固定(例如，自由)组合形式或以固定组合(包括成套试剂盒)形式给出。

在此上下文中，在本发明的含义内的“组合”或“经组合”包括但不限于由混合或组合超过一种活性剂产生的产物且包括固定及非固定(例如，自由)组合(包括试剂盒)及用途，诸如(例如)组分或药剂的同时、并行、依序、连续、交替或单独使用。术语“固定组合”意谓以单一实体或剂量形式向患者同时施用活性剂。术语“非固定组合”意谓在无特定时间限制的情况下，皆以单独实体的形式同时、并行或依序向患者施用活性剂，其中此类施用在患者体内提供治疗有效量的两种化合物。后者亦适用于混合物疗法，例如施用三种或更多种活性剂。

本发明提供重组弹状病毒与PD-1通路抑制剂或SMACm/IAP拮抗剂的组合，其用于治疗如本文所描述的癌症，优选用于治疗实体癌。

本发明亦提供重组弹状病毒与PD-1通路抑制剂或SMACm/IAP拮抗剂的组合的用途，其用于制造供治疗和/或预防如本文所描述的癌症、优选用于治疗实体癌的药剂。

本发明进一步提供用于治疗和/或预防癌症的方法，其包含向罹患癌症的个体施用治疗有效量的本发明的重组弹状病毒及PD-1通路抑制剂或SMACm/IAP拮抗剂，由此改善癌症的一种或多种症状。本发明的重组弹状病毒及PD-1通路抑制剂或SMACm/IAP拮抗剂可同时、依序或交替地施用。

本发明的重组弹状病毒及PD-1通路抑制剂或SMACm/IAP拮抗剂可通过相同施用途径或经由不同施用途径施用。优选地，经静脉内施用PD-1通路抑制剂或SMACm/IAP拮抗剂且经瘤内施用本发明的重组弹状病毒。在另一实施方案中，经静脉内施用PD-1通路抑制剂或SMACm/IAP拮抗剂且经瘤内施用本发明的重组弹状病毒至少一次，且经静脉内施用后续剂量的重组弹状病毒。后续剂量可在初始瘤内施用之后1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天或31天施用。在优选实施方案中，在初始瘤内施用之后21天施用PD-1通路抑制剂或SMACm/IAP拮抗剂。

尤其优选为使用本发明的重组弹状病毒与以下的组合进行治疗：

(i)SMAC模拟物(SMACm)/IAP拮抗剂，

(ii)免疫治疗剂，包括抗PD-1及抗PD-L1药剂以及抗LAG3药剂，诸如帕博利珠单抗及纳武单抗及如WO2017/198741中所公开的抗体。

如本文所提供的组合包含(i)本发明的重组弹状病毒及(iia)PD-1通路抑制剂、优选地针对PD-1或PD-L1的拮抗性抗体或(iib)SMACm/IAP拮抗剂。进一步提供此类包含(i)及(iia)或(i)及(iib)的组合的用途，其用于治疗如本文所描述的癌症。

在另一方面中，提供组合治疗，其包含使用(i)本发明的重组弹状病毒及(iia)PD-1通路抑制剂或(iib)SMACm/IAP拮抗剂。在此类组合治疗中，本发明的重组弹状病毒可与PD-1通路抑制剂或SMACm/IAP拮抗剂同时、依序或交替施用。

举例而言，“同时”施用包括在相同的一般时段内(例如在同一天，但未必同时)施用活性剂。交替施用包括在一时段期间(例如在几天或一周的疗程内)施用一种药剂，随后在后续时段期间(例如在几天或一周的疗程内)施用另一药剂，且接着重复模式持续一个或多个周期。依序或连续施用包括使用一或多次剂量在第一时段期间(例如在几天或一周的疗程内)施用一种药剂，随后使用一或多次剂量在第二时段期间(例如在几天或一周的疗程内)施用另一药剂。亦可采用重叠时程，其包括在治疗期内的不同天数施用活性剂，不必根据常规顺序。亦可采用这些普遍准则的变化形式，例如根据所使用的药剂及个体的病状。

依序治疗时程包括施用本发明的重组弹状病毒之后施用PD-1通路抑制剂或SMACm/IAP拮抗剂。依序治疗时程亦包括施用PD-1通路抑制剂或SMACm/IAP拮抗剂之后施用本发明的重组弹状病毒。依序治疗时程可包括在彼此之后1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天或31天施用。

PD-1通路抑制剂在本发明的含义及其所有实施方案中为抑制PD-1与其受体相互作用的化合物。PD-1通路抑制剂能够削弱PD-1通路信号传导，优选由PD-1受体介导。PD-1抑制剂可以是针对能够拮抗PD-1通路信号传导的PD-1通路的任何成员的任何抑制剂。抑制剂可以是靶向PD-1通路的任何成员的拮抗性抗体，优选针对PD-1受体、PD-L1或PD-L2。另外，PD-1通路抑制剂可以是阻断PD1配体的活性的PD-1受体的片段或PD-1受体。

PD-1拮抗剂是本领域熟知的，例如由Li等人,Int.J.Mol.Sci.2016,17,1151(以引用的方式并入本文中)所综述。根据本发明，可使用任何PD-1拮抗剂，尤其抗体，诸如Li等人所公开的那些抗体，以及下文所公开的其他抗体。优选地，本发明的PD-1拮抗剂及其所有实施方案选自由以下抗体组成的组：

·帕博利珠单抗(抗PD-1抗体)；

·纳武单抗(抗PD-1抗体)；

·皮立珠单抗(抗PD-1抗体)；

·PDR-001(抗PD-1抗体)；

·如下文所公开的PD1-1、PD1-2、PD1-3、PD1-4及PD1-5(抗PD-1抗体)

·阿替利珠单抗(抗PD-L1抗体)；

·阿维鲁单抗(抗PD-L1抗体)；

·度伐鲁单抗(抗PD-L1抗体)。

例如在Hamid,O.等人(2013)New England Journal of Medicine 369(2):134-44中公开的帕博利珠单抗(先前也称为拉立珠单抗(lambrolizumab)；商标名Keytruda；也称为MK-3475)为一种结合于PD-1的人源化IgG4单克隆抗体；其在C228P处含有经设计以预防Fc介导的细胞毒性的突变。帕博利珠单抗(例如)公开于US 8,354,509及WO2009/114335中。其由FDA批准用于治疗罹患不可切除性或转移性黑色素瘤的患者及患有转移性NSCLC的患者。

纳武单抗(CAS登记号：946414-94-4；BMS-936558或MDX1106b)为一种特异性阻断PD-1的完全人类IgG4单克隆抗体，其缺乏可检测的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。纳武单抗(例如)公开于US 8,008,449及WO2006/121168中。其已由FDA批准用于治疗罹患不可切除性或转移性黑色素瘤、转移性NSCLC及晚期肾细胞癌的患者。

皮立珠单抗(CT-011；Cure Tech)是结合于PD-1的人源化IgG1k单克隆抗体。皮立珠单抗例如公开于WO2009/101611中。

PDR-001或PDR001为阻断PD-L1及PD-L2结合至PD-1的高亲和力、配体阻断性、人源化抗PD-1IgG4抗体。PDR-001公开于WO2015/112900及WO2017/019896中。

抗体PD1-1至PD1-5是由如表1中所示的序列定义的抗体分子，其中HC表示(全长)重链且LC表示(全长)轻链：

表1：

特别是，上文所描述的抗PD-1抗体分子具有：

(PD1-1：)重链，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列，及轻链，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列；或

(PD1-2：)重链，其包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列，及轻链，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；或

(PD1-3：)重链，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，及轻链，其包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列；或

(PD1-4：)重链，其包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列，及轻链，其包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列；或

(PD1-5：)重链，其包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列，及轻链，其包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列。

阿替利珠单抗(Tecentriq，也称为MPDL3280A)为靶向PD-L1的噬菌体衍生的人类IgG1k单克隆抗体且描述于(例如)Deng等人.mAbs 2016；8:593-603中。其已由FDA批准用于治疗罹患尿路上皮癌的患者。

阿维鲁单抗为一种完全人类抗PD-L1 IgG1单克隆抗体且描述于例如Boyerinas等人.Cancer Immunol.Res.2015；3:1148-1157中。

度伐鲁单抗(MEDI4736)为一种对PD-L1具有高度特异性的人类IgG1k单克隆抗体且描述于例如Stewart等人.Cancer Immunol.Res.2015；3:1052-1062或Ibrahim等人.Semin.Oncol.2015；42:474-483中。

可使用由Li等人(见上文)公开或在临床试验中已知的其他PD-1拮抗剂(诸如AMP-224、MEDI0680(AMP-514)、REGN2810、BMS-936559、JS001-PD-1、SHR-1210、BMS-936559、TSR-042、JNJ-63723283、MEDI4736、MPDL3280A及MSB0010718C)来替代或补充上文所提及的拮抗剂。

如本文所用，INN意谓亦涵盖具有与源抗体相同或实质上相同的氨基酸序列的所有生物类似抗体，包括但不限于根据美国42USC§262子部分(k)及其他管辖区域的同等规定授权的那些生物类似抗体。

上列PD-1拮抗剂以及其各别制造、治疗用途及特性为本领域已知的。

在一个实施方案中，PD-1拮抗剂为帕博利珠单抗。

在另一实施方案中，PD-1拮抗剂为纳武单抗。

在另一实施方案中，PD-1拮抗剂为皮立珠单抗。

在另一实施方案中，PD-1拮抗剂为阿替利珠单抗。

在另一实施方案中，PD-1拮抗剂为阿维鲁单抗。

在另一实施方案中，PD-1拮抗剂为度伐鲁单抗。

在另一实施方案中，PD-1拮抗剂为PDR-001。

在另一实施方案中，PD-1拮抗剂为PD1-1。

在另一实施方案中，PD-1拮抗剂为PD1-2。

在另一实施方案中，PD-1拮抗剂为PD1-3。

在另一实施方案中，PD-1拮抗剂为PD1-4。

在另一实施方案中，PD-1拮抗剂为PD1-5。

本发明及所有其实施方案的含义内的SMAC模拟物为结合于IAP蛋白且诱导其降解的化合物。优选地，本发明及所有其实施方案内的SMAC模拟物选自由以下组成的组(A0)：

·如WO 2013/127729中所(一般地和/或特定地)公开的SMAC模拟物(亦即化合物)或其药学上可接受的盐；

·如WO 2015/025018中所(一般地和/或特定地)公开的SMAC模拟物(亦即化合物)或其药学上可接受的盐；

·如WO 2015/025019中所(一般地和/或特定地)公开的SMAC模拟物(亦即化合物)或其药学上可接受的盐；

·如WO 2016/023858中所(一般地和/或特定地)公开的SMAC模拟物(亦即化合物)或其药学上可接受的盐；

·如WO 2008/0016893中所(一般地和/或特定地)公开的SMAC模拟物(亦即化合物)或其药学上可接受的盐；

·WO 2008/016893(第28/29页；[122])的例子1中的LCL161(亦即化合物A)或其药学上可接受的盐；

·称为Debio-1143的SMAC模拟物或其药学上可接受的盐；

·称为比林纳潘特(birinapant)的SMAC模拟物或其药学上可接受的盐；

·称为ASTX-660的SMAC模拟物或其药学上可接受的盐；

·称为CUDC-427的SMAC模拟物或其药学上可接受的盐

·表2中的SMAC模拟物1至26中的任一者或其药学上可接受的盐：

表2：

表2中的例子化合物1至10公开于WO 2013/127729中。表2中的例子化合物11至26公开于WO 2016/023858中。

如本文所用的术语“SMAC模拟物/IAP拮抗剂”亦包括呈互变异构体、药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物(包括药学上可接受的盐的水合物或溶剂合物)的形式的上文所列的SMAC模拟物。其亦包括呈所有其固体、优选地晶体形式及呈其药学上可接受的盐的所有晶体形式、水合物及溶剂合物(包括药学上可接受的盐的水合物及溶剂合物)形式的SMAC模拟物。

本领域已知上文所列的所有SMAC模拟物以及各别合成及特性。上文所提及的所有专利申请案均以全文引用的方式并入。

在一个实施方案中，SMAC模拟物为LCL161或其药学上可接受的盐(A1)。

在另一实施方案中，SMAC模拟物为表2中的化合物1或其药学上可接受的盐(A2)。

在另一实施方案中，SMAC模拟物为表2中的化合物2或其药学上可接受的盐(A3)。

在另一实施方案中，SMAC模拟物为表2中的化合物3或其药学上可接受的盐(A4)。

在另一实施方案中，SMAC模拟物为表2中的化合物4或其药学上可接受的盐(A5)。

在另一实施方案中，SMAC模拟物为表2中的化合物5或其药学上可接受的盐(A6)。

在另一实施方案中，SMAC模拟物为表2中的化合物6或其药学上可接受的盐(A7)。

在另一实施方案中，SMAC模拟物为表2中的化合物7或其药学上可接受的盐(A8)。

在另一实施方案中，SMAC模拟物为表2中的化合物8或其药学上可接受的盐(A9)。

在另一实施方案中，SMAC模拟物为表2中的化合物9或其药学上可接受的盐(A10)。

在另一实施方案中，SMAC模拟物为表2中的化合物10或其药学上可接受的盐(A11)。

在另一实施方案中，SMAC模拟物为表2中的化合物11或其药学上可接受的盐(A12)。

在另一实施方案中，SMAC模拟物为表2中的化合物12或其药学上可接受的盐(A13)。

在另一实施方案中，SMAC模拟物为表2中的化合物13或其药学上可接受的盐(A14)。

在另一实施方案中，SMAC模拟物为表2中的化合物14或其药学上可接受的盐(A15)。

在另一实施方案中，SMAC模拟物为表2中的化合物15或其药学上可接受的盐(A16)。

在另一实施方案中，SMAC模拟物为表2中的化合物16或其药学上可接受的盐(A17)。

在另一实施方案中，SMAC模拟物为表2中的化合物17或其药学上可接受的盐(A18)。

在另一实施方案中，SMAC模拟物为表2中的化合物18或其药学上可接受的盐(A19)。

在另一实施方案中，SMAC模拟物为表2中的化合物19或其药学上可接受的盐(A20)。

在另一实施方案中，SMAC模拟物为表2中的化合物20或其药学上可接受的盐(A21)。

在另一实施方案中，SMAC模拟物为表2中的化合物21或其药学上可接受的盐(A22)。

在另一实施方案中，SMAC模拟物为表2中的化合物22或其药学上可接受的盐(A23)。

在另一实施方案中，SMAC模拟物为表2中的化合物23或其药学上可接受的盐(A24)。

在另一实施方案中，SMAC模拟物为表2中的化合物24或其药学上可接受的盐(A25)。

在另一实施方案中，SMAC模拟物为表2中的化合物25或其药学上可接受的盐(A26)。

在另一实施方案中，SMAC模拟物为表2中的化合物26或其药学上可接受的盐(A27)。

就SMAC模拟物的性质而言，所有实施方案(A1)至(A27)皆为实施方案(A0)的优选实施方案。

在关于组合治疗的优选实施方案中，重组弹状病毒为在基因组中编码至少一种选自包含以下的组的CD80胞外域Fc融合蛋白或其功能变体、优选人类CD80胞外域的重组水疱性口炎病毒：(i)CD80胞外域Fc融合蛋白，其包含与IgG1的Fc域融合的CD80胞外域，(ii)CD80胞外域Fc融合蛋白，其包含与IgG1的该Fc域融合的CD80胞外域，其中该CD80胞外域包含SEQ IDNO:1或由其组成或与SEQ ID NO:1具有至少80％一致性，(iii)CD80胞外域Fc融合蛋白，其包含与IgG1的该Fc域融合的CD80胞外域，其中该Fc域包含SEQ ID NO:2或由其组成或与SEQ ID NO:2具有至少80％一致性，(iv)CD80胞外域Fc融合蛋白，其包含与IgG1的该Fc域融合的CD80胞外域，其中该CD80胞外域包含SEQ ID NO:1或由其组成或与SEQ ID NO:1具有至少80％一致性及该Fc域包含SEQ ID NO:2或由其组成或与SEQ ID NO:2具有至少80％一致性，(v)CD80胞外域Fc融合蛋白，其包含与IgG1的该Fc域融合的CD80胞外域，其中该CD80胞外域为由SEQ ID NO:4的氨基酸1-207组成或与SEQ ID NO:4的氨基酸1-207具有至少80％一致性及该Fc域为由SEQ ID NO:4的氨基酸208-433组成或与SEQ ID NO:4的氨基酸208-433具有至少80％一致性，(vi)根据(i)-(v)中的任一者的CD80胞外域Fc融合蛋白进一步包含信号肽序列，或(vii)CD80胞外域Fc融合蛋白，其包含SEQ ID NO:3或与SEQ ID NO:3具有至少80％一致性，其中编码重组水疱性口炎病毒的糖蛋白G的基因经编码淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)的糖蛋白GP的基因置换，和/或该糖蛋白G经LCMV的糖蛋白GP置换。

在关于组合治疗的另一优选实施方案中，重组弹状病毒为重组水疱性口炎病毒，其在其基因组中编码水疱性口炎病毒核蛋白(N)、大蛋白(L)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)及至少一种CD80胞外域Fc融合蛋白或其功能变体、优选人类CD80胞外域，其中该CD80胞外域Fc融合蛋白或其功能变体、选自包含以下的组：(i)CD80胞外域Fc融合蛋白，其包含与IgG1的Fc域融合的CD80胞外域，(ii)CD80胞外域Fc融合蛋白，其包含与IgG1的该Fc域融合的CD80胞外域，其中该CD80胞外域包含SEQ ID NO:1或由其组成或与SEQ ID NO:1具有至少80％一致性，(iii)CD80胞外域Fc融合蛋白，其包含与IgG1的该Fc域融合的CD80胞外域，其中该Fc域包含SEQ ID NO:2或由其组成或与SEQ ID NO:2具有至少80％一致性，(iv)CD80胞外域Fc融合蛋白，其包含与IgG1的该Fc域融合的CD80胞外域，其中该CD80胞外域包含SEQ ID NO:1或由其组成或与SEQ ID NO:1具有至少80％一致性及该Fc域包含SEQ IDNO:2或由其组成或与SEQ ID NO:2具有至少80％一致性，(v)CD80胞外域Fc融合蛋白，其包含与IgG1的该Fc域融合的CD80胞外域，其中该CD80胞外域为由SEQ ID NO:4的氨基酸1-207组成或与SEQ ID NO:4的氨基酸1-207具有至少80％一致性及该Fc域为由SEQ ID NO:4的氨基酸208-433组成或与SEQ ID NO:4的氨基酸208-433具有至少80％一致性，(vi)根据(i)-(v)中的任一者的CD80胞外域Fc融合蛋白进一步包含信号肽序列，或(vii)CD80胞外域Fc融合蛋白，其包含SEQ ID NO:3或与SEQ ID NO:3具有至少80％一致性，其中编码该水疱性口炎病毒的糖蛋白G的基因经编码淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)的糖蛋白GP的基因置换，和/或该糖蛋白G经LCMV的糖蛋白GP置换，且其中该核蛋白(N)包含如SEQ ID NO:7中所示的氨基酸或与SEQ ID NO:7至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的功能变体；该磷蛋白(P)包含如SEQ ID NO:8中所示的氨基酸或与SEQ ID NO:8至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的功能变体；该大蛋白(L)包含如SEQ ID NO:9中所示的氨基酸或与SEQ ID NO:9至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的功能变体；及该基质蛋白(M)包含如SEQ ID NO:10中所示的氨基酸或与SEQ ID NO:10至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的功能变体。

在关于组合治疗的更优选实施方案中，重组弹状病毒为在基因组中编码至少一种CD80胞外域Fc融合蛋白或其功能变体、优选人类CD80胞外域的重组水疱性口炎病毒，其中该CD80胞外域Fc融合蛋白或其功能变体包含SEQ ID NO:3或由其组成或具有与SEQ ID NO:3至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性，其中编码重组水疱性口炎病毒的糖蛋白G的基因经编码淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)的糖蛋白GP的基因置换，和/或该糖蛋白G经LCMV的糖蛋白GP置换。

病毒生成、产生及病毒产生细胞

本发明亦提供一种病毒产生细胞，其特征在于该细胞产生根据本发明的重组弹状病毒或重组水疱性口炎病毒。

细胞可以是任何来源且可以经分离细胞形式或以包含于细胞群体中的细胞形式存在。优选地，产生重组弹状病毒或重组水疱性口炎病毒的细胞为哺乳动物细胞。在更优选实施方案中，本发明的病毒产生细胞的特征在于，哺乳动物细胞为多能成体祖细胞(MAPC)、神经干细胞(NSC)、间叶为干细胞(MSC)、HeLa细胞、HEK细胞、任何HEK293细胞(例如HEK293F或HEK293T)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、幼仓鼠肾(BHK)细胞或Vero细胞或骨髓衍生肿瘤浸润性细胞(BM-TIC)。

或者，病毒产生细胞可以是人类细胞、猴细胞、小鼠细胞或仓鼠细胞。本领域技术人员熟知适用于测试既定细胞是否产生病毒及由此特定细胞是否落入本发明范围内的方法。就此而言，由本发明细胞产生的病毒的量并无特定限制。在感染之后且在并未进一步进行下游处理下，既定细胞培养物的粗制上清液中的优选病毒效价为≥1×10⁷个TCID50/ml或≥1×10⁸个基因组复本/ml。

在特定实施方案中，本发明的病毒产生细胞的特征在于，该细胞包含一个或多个用于表达至少一种选自由以下组成的组的基因的表达卡匣：编码VSV的蛋白质N、L、P及M的基因n、l、p及m以及编码LCMV-GP、丹德农-GP或莫佩亚-GP糖蛋白的基因gp。

本发明含义中的病毒产生细胞包括用于自不可复制型载体产生重组弹状病毒的经典包装细胞以及用于自能够复制的载体产生重组弹状病毒的产生细胞。包装细胞通常包含一个或多个用于表达在待包装各别载体中缺乏和/或为产生病毒所需的必需基因的质体。此类细胞是本领域技术人员已知的，本领域技术人员可选择适合于所需目的的适当细胞株。

本发明的重组弹状病毒可根据本领域技术人员已知的方法来产生，且包括(但不限于)使用(1)转染至细胞中的cDNA，或(2)转染至辅助细胞中的cDNA的组合，或(3)转染至细胞中的cDNA，该细胞进一步用辅助病毒/微型病毒感染以反式提供产生感染性或非感染性重组弹状病毒所需的剩余组分或活性。使用这些方法(例如辅助病毒/微型病毒、辅助细胞株或仅cDNA转染)中的任一者，所需的最少组分为含有用于(1)通过弹状病毒N蛋白、P蛋白及L蛋白衣壳化基因组(或反基因组)RNA及(2)复制基因组或反基因组(复制中间体)RNA等效物的顺式作用信号的DNA分子。

复制组件或复制子为在5'及3'端最少含有弹状病毒的前导序列及尾随序列的RNA股。在基因组意义上，前导***于3'端处且尾随***于5'端处。任何位于此两个复制信号之间的RNA继而将经复制。前导区及尾随区另外必须含有引发转录及复制所需的用于N蛋白衣壳化及聚合酶结合的目的最少顺式作用组件。为制备重组弹状病毒，含有G基因的微型病毒亦含有前导区、尾随区及具有用于产生G蛋白mRNA的适当起始及终止信号的G基因。若微型病毒进一步包含M基因，则必须亦存在用于产生M蛋白mRNA的适当起始及终止信号。

对于任何含于重组弹状病毒基因组内的基因而言，该基因侧接有将容许表达那些基因且产生蛋白质产物的适当转录起始及终止信号(Schnell等人,Journal of Virology,第2318-2323页,1996)。为产生“非感染性”重组弹状病毒，重组弹状病毒必须具有最少复制子组件及N、P及L蛋白且其必须含有M基因。此产生源自细胞、但为非感染性粒子的病毒粒子。为产生“感染性”粒子，病毒粒子必须另外包含可诸如经由使用附接蛋白或受体配体介导病毒粒子结合及融合的蛋白质。弹状病毒的天然受体配体为G蛋白。

可使用任何将允许组装重组弹状病毒的细胞。制备感染性病毒粒子之一种方法包含感染有编码T7 RNA聚合酶或其他适宜噬菌体聚合酶(诸如T3或SP6聚合酶)的质体的适当细胞株。接着可使用含有编码G、N、P、L及M弹状病毒蛋白的基因的个别cDNA转染细胞。这些cDNA将提供用于构建重组弹状病毒粒子的蛋白质。可通过本领域已知的任何方法来转染细胞。

亦将含有弹状病毒基因组RNA等效物的“多顺反子cDNA”转染至细胞株中。若感染性重组弹状病毒粒子意欲裂解于感染细胞中，则必须存在编码N、P、M及L蛋白的基因以及任何异源性核酸区段。若感染性重组弹状病毒粒子并不意欲裂解，则编码M蛋白的基因并不包含于多顺反子DNA中。“多顺反子cDNA”意指至少包含含有编码N、P及L蛋白的基因的转录单元的cDNA。重组弹状病毒多顺反子DNA亦可含有编码蛋白质变体或其多肽片段的基因或治疗性核酸或蛋白质。或者，可反式供应任何待最初与首先产生的病毒粒子缔合的蛋白质或其片段。

亦考虑包含编码CD80胞外域Fc融合蛋白的基因的多顺反子cDNA。所考虑多顺反子cDNA可含有编码蛋白质变体的基因、编码报告体的基因、治疗性核酸和/或N-P-L基因或N-P-L-M基因。生成重组弹状病毒的第一步骤为表达作为cDNA的基因组或反基因组等效物的RNA。接着，该RNA由N蛋白包装且接着由P/L蛋白复制。可回收由此产生的重组病毒。若G蛋白不存在于重组RNA基因组中，则其通常反式供应。若G蛋白及M蛋白二者皆不存在，则二者皆反式供应。对于制备“非感染性弹状病毒”粒子而言，程序可与上文相同，除了转染至细胞中的多顺反子cDNA将仅含有弹状病毒的N、P及L基因。非感染性弹状病毒粒子的多顺反子cDNA可另外含有编码蛋白质的基因。

通常将经转染细胞在所需温度、通常约37℃下培育至少24hr。对于非感染性病毒粒子而言，收集上清液且分离病毒粒子。对于感染性病毒粒子，收获含有病毒的上清液且转移至新鲜细胞中。将新鲜细胞培育大约48小时，且收集上清液。

本发明的其他特征及优点将自以下更详细实施例而变得显而易见，所述实施例以举例方式说明本发明的原理。

实施例

实施例1

生成VSV-GP-huCD80-Fc(IgG1)-病毒拯救

溶瘤病毒VSV-GP的基因组经工程改造以编码CD80-Fc基因以在病毒复制期间于肿瘤位点处局部表达CD80-Fc融合蛋白。借助反向基因学(克隆所关注基因(GOI)、病毒拯救及重复斑块纯化)自含有用于完整VSV-GP病毒基因组的cDNA及人类CD80-Fc的细菌质体来生成具有复制能力的VSV-GP-CD80-Fc病毒变体。pVSV-GP-CD80-Fc质体为基于质体pVSV-XN1(Schnell等人]，后者含有在T7启动子控制下的VSV印第安纳血清型的完整cDNA基因组。为生成pVSV-GP-CD80-Fc变体，通过来自淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV，WE-HPI毒株)的GP包膜蛋白的密码子优化序列取代VSV G包膜蛋白的整个序列。另外，通过吉布森组装(Gibson assembly)将编码CD80-Fc基因的合成核酸***糖蛋白GP与病毒聚合酶L之间。通过CD80-Fc开放阅读框中3'端处的额外VSV起始信号序列及5'端处的额外终止信号序列来确保病毒感染背景中的CD80-Fc基因转录。

通过使用标准转染方法(例如CaPO₄沉淀、脂质体DNA递送)转染HEK293T或任何其他VSV允许细胞株自质体cDNA回收(或拯救)感染性病毒。简言之，使用编码VSV蛋白N、P及L以及密码子优化T7-聚合酶的基于pSF-CAG-amp的表达质体转染HEK293T细胞。另外，共转染编码VSV-GP、VSV-GP-CD80-Fc或其变体的病毒基因组cDNA的质体。在拯救过程的第一步骤中，T7聚合酶自质体编码的病毒cDNA转录病毒RNA基因组。在第二步骤中，自共转染质体外源性表达的VSV-L及-P蛋白进一步扩增病毒RNA基因组。通过VSV-N蛋白使病毒RNA基因组共转录性地衣壳化。另外，P/L聚合酶复合物容许转录整组病毒基因产物N、P、M、GP及L以及所***CD80-Fc变体。随后将病毒RNA基因组包装至含有核糖核蛋白、基质蛋白及病毒包膜GP的感染性VSV粒子中。病毒粒子通过出芽自细胞释放。

首先使拯救病毒在允许细胞株(诸如例如HEK293T)上传代。进行数轮斑块纯化，随后通过标准方法生成病毒种储备液。简言之，使用经拯救的初步种子(pre-seed)的连续十倍稀释液感染HEK293T细胞。在大约两小时之后，将细胞单层洗涤两次且用含有0.8％低熔点琼脂糖的培养基套叠。在感染后24h至48h，挑选斑块且使用病毒进行再一轮的斑块纯化或生成病毒种储备液。

实施例2

病毒适应性的验证-TCID₅₀/细胞杀灭

图3A-B

用低MOI(0.0005)的VSV-GP或VSV-GP-CD80-Fc感染在悬浮液培养物(培养基Freestyle^TM293表达培养基(ThermoFisher Scientific))中生长的HEK293F细胞。在感染当天，细胞的汇合度为60％-70％。对一个孔进行计数(CountessTM细胞计数器，Invitrogen)，随后使用0.005MOI的病毒构建物VSV-GP(GP)或VSV-GP-CD80-Fc中之一者感染其他孔。收获培养物上清液(3mL总体积)且在感染后8h、16h、24h、32h、40h及48h分析样品以用于病毒复制及细胞杀灭。使用通过qPCR在指定时间点于培养物的上清液中检测病毒基因组来评估病毒复制(图3A)。通过在指定时间点对培养物样品中的活细胞进行计数来评估病毒诱导的细胞杀灭(图3B)。两种病毒均表达出同一方式，其指示添加人类CD80-Fc转殖基因并不影响病毒适应性。

实施例3

载荷表达-ELISA

图4

使用ELISA在病毒感染之后的不同时间点分析来自经VSV-GP-CD80-Fc感染的HEK293细胞的上清液。通过经感染的哺乳动物细胞对病毒编码的CD80-Fc融合蛋白的表达通过均以MOI1感染有亲本病毒VSV-GP或编码CD80-Fc的新病毒VSV-GP-CD80-Fc的HEK293细胞来验证。如通过ELISA所测量，在组织培养物上清液中CD80-Fc转殖基因的表达容易在细胞感染后24、31及48小时时检测到。

实施例4

VSV-GP-huCD80-Fc(体内)-CT26.CL25-IFNARKO肿瘤模型(高载荷表达)

图5A-B

使用已经工程改造以缺乏干扰素α受体(IFNAR)的CT26.CL25-IFARKO肿瘤模型，以更好地反映人类患者情况且使得鼠类***中的病毒复制以及载荷表达得到改善，将亲本病毒VSV-GP及编码CD80-Fc的新病毒VSV-GP-CD80-Fc进行背对背比较。为此目的，在第0天及第3天(生存率图)，在具有已建立肿瘤的小鼠中以2×10⁷个TCID₅₀的剂量经静脉内(静脉内)施用两种病毒。如图(A)中所描绘，亲本病毒VSV-GP在此低病毒剂量下不展现携带肿瘤的动物的显著提高的生存率，而用载荷武装的新病毒VSV-GP-CD80-Fc处理使得存活期益处明显优于对照及VSV-GP处理的动物。此外，与对照及VSV-GP处理的动物(B)相比，用CD80-Fc编码病毒处理并未引起体重损失增加，证明此新颖病毒的安全性。

实施例5

VSV-GP-huCD80-Fc(体内)-B16-F1-OVA及EMT-6肿瘤模型(低载荷表达)

图6A-C及图7A-B

在第0天及第3天，用两次肿瘤内(瘤内)注射亲本病毒VSV-GP或编码CD80-Fc的新病毒VSV-GP-CD80-Fc处理低容许肿瘤模型B16-F1-OVA(图6A-C)及EMT-6(图7A-B)，其仅允许最小病毒复制且因此允许载荷(CD80-Fc)表达。仅将具有良好建立肿瘤的小鼠用于注射。与对照及VSV-GP相比，用VSV-GP-CD80-Fc处理B16-F1-OVA肿瘤模型引起肿瘤生长延迟改善。在EMT-6中，与对照(经处理动物的0％)及VSV-GP(经处理动物的8％)处理的小鼠相比，用VSV-GP-CD80-Fc进行的肿瘤模型治疗引起肿瘤清除率提高(经处理动物的33％)。即使在具有低水平的病毒复制及载荷表达的肿瘤中，这些结果证明载荷武装的新颖病毒VSV-GP-CD80-Fc相对于亲本病毒VSV-GP的上升潜力，其与病毒复制的能力紧密相关。

实施例6

体内病毒持久性及复制以及载荷表达

图8-10

将具有已建立CT26.CL25-IFNARKO(干扰素α受体缺失的CT26.CL25肿瘤细胞)肿瘤的Balb/c小鼠用作对照或用1×10⁸个TCID₅₀的VSV-GP-CD80-Fc的单次静脉内注射处理。切除处理后三天及七天的肿瘤；提取完整RNA且使用对VSV n基因具有特异性的qPCR引物进行分析(图8)。将具有已建立LLC1-IFNARKO(干扰素α受体缺失的LLC1肿瘤细胞)肿瘤的C57BL/6小鼠用作对照或用1×10⁸个TCID₅₀的VSV-GP或VSV-GP-CD80-Fc的单次静脉内注射处理。处理后三天，切除肿瘤，且使用来自NanoString的“泛癌症免疫概况分析图”以及病毒及载荷特异性探针(尖峰)根据制造商说明书分析RNA(图9)。综合而言，结果显示经处理动物中VSV-GP-CD80-Fc的活性复制及肿瘤中载荷的mRNA表达。峰值复制为在约第三天观测到。病毒亦续存至多第七天。将具有已建立的LLC1-IFNARKO肿瘤的C57BL/6小鼠用作对照，或用1×10⁸个TCID₅₀的VSV-GP或VSV-GP-CD80-Fc的单次静脉内注射进行处理。处理后三天，将肿瘤切除，经***固定且石蜡包埋。将薄部分用针对VSV-N蛋白或人类CD80蛋白的特异性抗体染色(图10)。N蛋白染色针对VSV-GP及VSV-GP-CD80-Fc而言是类似的，而对于后者而言仅特异性检测到人类CD80。

实施例7

CD80-Fc在人类混合白血球培养物中提供T细胞协同刺激。FcγR阻断减少T细胞活化，亦即Fc的主要作用

图12及图13A-D

人类混合白血球培养物(将选自两个基因不同个体的白血球群体共培养，产生同种异体T细胞刺激)用于评估重组CD80-Fc的T细胞协同刺激潜力(图12及13)以及野生型人类IgG1 Fc对于T细胞协同刺激的贡献(图13)。为此目的，使用IFNγ分泌作为读数，用增加量的重组CD80-Fc刺激图12中的培养物。IFNγ分泌以剂量依赖性方式通过向培养物中添加CD80-Fc得到很大程度上改善，由此验证其T细胞协同刺激潜力。基于这些资料且旨在阐明Fc在CD80-Fc融合蛋白中的贡献，将人类混合白血球培养物再次在添加或不添加FcγR阻断剂的情况下(在无人类血清存在下)用重组CD80-Fc蛋白(10μg/ml)刺激，使用IFNγ作为读数(图13)。不同子图(A-D)描绘不同供体对。通过添加FcγR阻断剂显著降低CD80-Fc介导的T细胞刺激，指示FcγR相互作用及FcγR介导的丛集对CD80-Fc的活性至关重要。

实施例8

CD3活化PBMC中通过CD80-Fc的T细胞活化的FcγR依赖性(F(ab)2及IgG4)

图14A-F

在存在或不存在低剂量的抗CD3(克隆OKT3；10ng/ml)及提高浓度的重组CD80-Fc蛋白下刺激人类PBMC培养物，使用IFNγ(图14A-C)或IL2(图14D-F)作为读数，其通过标准ELISA检测。为证实重组CD80-Fc的T细胞协同刺激潜力以及野生型人类IgG1 Fc对T细胞协同刺激的贡献且验证Fc选择，将以下重组CD80-Fc变体背对背比较：CD80-Fc(病毒载荷与野生型人类IgG1 Fc的重组型，图14C及F))；CD80 FAB(CD80-Fc的F(ab)₂变体，其缺乏Fc但保持二价，图14A及D)及CD80 IgG4(与CD80-Fc类似但具有人类IgG4 Fc，图14B及E)。虽然CD80-Fc本身未显著刺激PBMC，但CD80-Fc与刺激性抗CD3抗体的组合引起T细胞刺激的剂量依赖性增加，如IFNγ及IL2分泌所证明(图14C及F)。相反地，缺少Fc的F(ab)₂变体的CD80-Fc不具有活性且不引起T细胞刺激改善，无论是单独的还是与抗CD3刺激组合亦未如此(图14A及D)。基于IgG4的CD80融合物(图14B及E)显示T细胞协同刺激潜力，但程度比基于IgG1的CD80融合构建物低很多(图14B及F)，其类似于工程改造至新颖病毒VSV-GP-CD80-Fc中的病毒载荷。这些结果再次确认CD80-Fc的FcγR依赖性以及人类IgG1 Fc的选择。此外，缺乏CD80-Fc活性而无伴随TCR刺激证明其有利的安全概况。

实施例9

VSV-GP诱导负载CD80-Fc MoA的经感染肿瘤内的FcγR局部增加

图15

鉴于病毒CD80-Fc载荷对T细胞协同刺激的FcγR依赖性，在肿瘤中探索VSV-GP感染对FcγR表达的影响。为此目的，在感染后第7天在对照或感染VSV-GP的LLC1-IFNARKO肿瘤中对FcγR表达进行基于NanoString的测量。将小鼠不处理或经一定病毒剂量的10⁸个TCID₅₀ VSV-GP感染。X轴显示不同FcγR(1、2b、3或4)的测量值且Y轴显示相对表达。如数据明显示出，经VSV-GP感染的肿瘤出乎意料地展示所有四种所分析的FcγR的表达的强力上调。这些数据为溶瘤病毒VSV-GP与FcγR依赖性、病毒编码的载荷CD80-Fc的有利治疗性相互作用提供机理基础，其有益于在受感染肿瘤内形成病毒介导的FcγR上调。

实施例10

VSV-GP-CD80-Fc诱导优于亲本病毒VSV-GP的肿瘤特异性T细胞免疫

图16A-C

使用CT26.CL25-IFNARKO肿瘤模型阐明病毒编码的CD80-Fc载荷对肿瘤抗原特异性T细胞免疫的影响，该模型用亲本病毒VSV-GP或新病毒VSV-GP-CD80-Fc处理。分别通过ELISPOT(图16A)及基于FACS的Dextramer染色(图16B)在如图16C中所描绘处理的小鼠的脾脏及血液中检测Gp70/肿瘤特异性T细胞。VSV-GP-CD80-Fc组中的肿瘤-抗原特异性T细胞的频率相对于VSV-GP组的显著增加说明新颖、载荷武装的病毒相对于亲本病毒的上升潜力，且此外为新颖溶瘤病毒VSV-GP-CD80-Fc的抗肿瘤活性改善提供免疫/机理基础。

实施例11

CD80-Fc不与PD-L1相互作用

图17

已主张CD80可以能够与程序化细胞死亡1配体1(PD-L1)直接相互作用，由此阻断PD-L1与其受体程序化细胞死亡1(PD-1)在活化T细胞上的抑制相互作用。为确定VSV-GP-CD80-Fc中编码的CD80-Fc融合蛋白是否直接与PD-L1相互作用，我们对经人类PD-L1稳定转染的CHO-K1细胞进行结合研究。将PD-L1特异性抗体阿维鲁单抗用作阳性对照。尽管阿维鲁单抗易于与CHO-K1-PD-L1细胞表面上的PD-L1结合，但重组CD80-Fc蛋白未能在所有测试剂量水平下结合PD-L1。因此得出结论，CD80-Fc不直接结合于PD-L1。

实施例12

α-PD-1及CD80-Fc以相加性方式改善T细胞刺激

图18A-B

为解决以下问题：CD80-Fc介导的T细胞协同刺激与抗体介导的PD-1抑制的组合是否能够相对于单一疗法治疗提供额外益处，我们采用T细胞报导体***，其中表达稳定PD-1的Jurkat T细胞通过上调荧光素酶活性对T细胞受体(TCR)刺激作出反应，该荧光素酶活性为生物化学可检测的。此处将Jurkat-PD-1报告体细胞与稳定表达PD-L1的FcγR阳性THP1-PD-L1细胞(与FcγR阴性CHO-K1细胞相反)共培养。PD-L1与PD-1的相互作用导致Jurkat T细胞活化的抑制，其与在癌症患者中观测到的T细胞抑制相当。TCR刺激通过添加双特异性BiTE分子来达成，该分子使THP1细胞上的CD33与Jurkat T细胞上的CD3连接。如自图18A可见，通过阻断抑制性PD-1:PD-L1相互作用，PD-1阻断抗体帕博利珠单抗能够以剂量依赖型方式恢复CD3xCD33 BiTE介导的T细胞刺激。同时及相当出人意料地，尽管具有抑制性PD-1:PD-L1相互作用，CD80-Fc自身就能够提供T细胞协同刺激且以剂量依赖性方式改善JurkatT细胞活化。使用毛地黄皂苷(Dig)特异性抗体作为同型对照。在图18B中，固定抗PD-1浓度(10nM，呈饱和)与递增的重组CD80-Fc浓度组合。于抗PD-1抗体的上添加CD80-Fc产生优异的T细胞活化，为这些不同治疗模式的有利相互作用提供明确证据，此通过其互补作用模式驱动。

实施例13

VSV-GP-muCD80-Fc(体内)-CT26.CL25-IFNARKO肿瘤模型(高载荷表达)

图19A-C

再次使用CT26.CL25-IFNARKO肿瘤模型，此研究比较重组鼠类CD80Fc、VSV-GP或VSV-GP-muCD80Fc的体内功效。出于此目的，分别在第0天及第3天以一定病毒剂量的1×10⁸个TCID₅₀且在第0天、第3天及第6天以1mg/kg重组鼠类CD80-Fc静脉内处理具有已建立肿瘤的小鼠。

如图19图(A)中所描绘，生存率曲线显示VSV-GP-muCD80Fc治疗组中的治疗结果改善。高于重组CD80Fc蛋白或VSV-GP的显著存活期益处可通过1×10⁸个TCID₅₀ VSV-GP-muCD80Fc显示(对数秩(曼特尔(Mantel)-Cox)测试；P值0.0394)。

图19图(B)中描绘的平均肿瘤尺寸概述单一肿瘤生长曲线且反映在用VSV-GP-muCD80Fc(剂量1×10⁸个TCID₅₀)处理之后的强力肿瘤生长抑制，其表达远远超过VSV-GP以及1mg/kg重组CD80Fc蛋白。

体重下降在第一次注射两种病毒之后被观测到(图19图(C))，然而，立即发生了恢复，不受随后物质注射影响，且在亲本病毒(VSV-GP)与编码muCD80-Fc的病毒(VSV-GP-muCD80Fc)之间无显著差异。

总之此研究尤其将重组鼠类CD80Fc或VSV-GP与VSV-GP-muCD80Fc的体内效应进行比较。其显示通过在病毒主链中实施muCD80Fc，达成对肿瘤生长以及总生存率的协同效应。

序列表

<110> 勃林格殷格翰国际有限公司

<120> 编码CD80胞外域Fc融合蛋白的重组弹状病毒

<130> 01-3411

<160> 24

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 208

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys

1 5 10 15

Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp

20 25 30

Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn

35 40 45

Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr Asn Asn

50 55 60

Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr

65 70 75 80

Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg Glu His

85 90 95

Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr Pro Ser

100 105 110

Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile Ile Cys

115 120 125

Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu Glu Asn

130 135 140

Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp Pro Glu

145 150 155 160

Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met Thr Thr

165 170 175

Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg Val Asn

180 185 190

Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro Asp Asn

195 200 205

<210> 2

<211> 232

<212> PRT

<213> 智人

<400> 2

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

35 40 45

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

50 55 60

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

65 70 75 80

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

85 90 95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

100 105 110

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

115 120 125

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr

130 135 140

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

145 150 155 160

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

165 170 175

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

180 185 190

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

195 200 205

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

210 215 220

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

225 230

<210> 3

<211> 467

<212> PRT

<213> 智人

<400> 3

Met Gly His Thr Arg Arg Gln Gly Thr Ser Pro Ser Lys Cys Pro Tyr

1 5 10 15

Leu Asn Phe Phe Gln Leu Leu Val Leu Ala Gly Leu Ser His Phe Cys

20 25 30

Ser Gly Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu

35 40 45

Ser Cys Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile

50 55 60

Tyr Trp Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp

65 70 75 80

Met Asn Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr

85 90 95

Asn Asn Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly

100 105 110

Thr Tyr Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg

115 120 125

Glu His Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr

130 135 140

Pro Ser Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile

145 150 155 160

Ile Cys Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu

165 170 175

Glu Asn Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp

180 185 190

Pro Glu Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met

195 200 205

Thr Thr Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg

210 215 220

Val Asn Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro

225 230 235 240

Asp Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu

245 250 255

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

260 265 270

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

275 280 285

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

290 295 300

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

305 310 315 320

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

325 330 335

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

340 345 350

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

355 360 365

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

370 375 380

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

385 390 395 400

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

405 410 415

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

420 425 430

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

435 440 445

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

450 455 460

Ser Pro Gly

465

<210> 4

<211> 433

<212> PRT

<213> 智人

<400> 4

Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys

1 5 10 15

Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp

20 25 30

Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn

35 40 45

Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr Asn Asn

50 55 60

Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr

65 70 75 80

Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg Glu His

85 90 95

Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr Pro Ser

100 105 110

Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile Ile Cys

115 120 125

Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu Glu Asn

130 135 140

Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp Pro Glu

145 150 155 160

Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met Thr Thr

165 170 175

Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg Val Asn

180 185 190

Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro Asp Asp

195 200 205

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

210 215 220

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

225 230 235 240

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

245 250 255

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

260 265 270

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

275 280 285

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

290 295 300

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

305 310 315 320

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

325 330 335

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

340 345 350

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

355 360 365

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Gly

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<212> PRT

<213> 小鼠

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<212> PRT

<213> 智人

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<213> 水疱性口炎病毒

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<213> 水疱性口炎病毒

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<212> PRT

<213> 水疱性口炎病毒

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<212> PRT

<213> 水疱性口炎病毒

<400> 10

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225

<210> 11

<211> 498

<212> PRT

<213> 淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒

<400> 11

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195 200 205

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<212> PRT

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Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Ser

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Tyr Ile Ser Gly Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Ser Ser Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg His Ser Asn Val Asn Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro

210 215 220

Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly

435 440 445

<210> 23

<211> 218

<212> PRT

<213> 智人

<400> 23

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Met Ser Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Asp Val Ser

20 25 30

Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Val Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Ile Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys

85 90 95

Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 24

<211> 12603

<212> RNA

<213> 水疱性口炎病毒

<400> 24

ugcuucuguu uguuugguaa uaauaguaau uuuccgaguc cucuuugaaa uugucauuag 60

uuuuacagac aaugucaguu cucuuaguaa cuguuguguc agcaucaagg uuuugaagga 120

cguuuacucc uaggucaccu uaugggccgu cuaaugaagu cuuuuaguuu ccucuaagga 180

gaaauguagu uaugauguuu uucaaacagu cuagauucuc cuauacagau gguuccggag 240

uuuaggccuu uacauaguua guauguacag uugucgauga acauaccucg uaauuuccug 300

uaggccccau ucaaccuauu ucuaaccagu ucaaagccuu auuuguagcc cuuucguccc 360

cuauguuagc cuuauaaacu ggaacauagg aacuuucggg accugccgca ugaaggucua 420

ccucauagcc uacgaagguc uuggucgcgu cuacuguuua ccaacggaaa cauagaugaa 480

ccgaauaugu cucacccguc uuguguuuac ggacuuaugu cuuuuuucga guaccuaccc 540

gacuguuuag uuacguuuua cuaguuacuu gucaaacuug gagaacacgg ucuuccagca 600

cuguaaaaac uacacacccc uuuacuguca uuaauguguu uuuaacagcg acgucaccug 660

uacaagaagg uguacaaguu uuuuguacuu acacggagca agucuaugcc uugauaacaa 720

aggucuaagu uucuaacacg acguaaccgu uguaaaccug uggagacguu uuauuggccu 780

uacagauguc uucuacauug cuggaccuag aacuuggcuc uucaacgucu acuuuaccag 840

guuuacuacg aagguccggu ucuuuaacug uuccggcuaa guauguacgg aauaaacuag 900

cugaaaccua acagaagauu cagagguaua agaaggcagu uuuugggacg gaaggugaag 960

acccccguua acugucgaga agacgagucu agguggucuc guuccuuacg ggcugucgga 1020

cuacuguaac ucauauguag agaaugaugu cguccaaaca acaugcgaau acgucauccu 1080

aggagacggc ugaaccgugu ugucaaaaca caaccucuau uguuuaugug aggucuacua 1140

ucauggccuc cuaacugcug auuacguggc gguguuccgu cucuacacca gcuuaccgag 1200

ccuaccaaac uucuaguuuu gucuuuuggc ugaggacuau acuacgucau acgcuuuucu 1260

cgucaguaca gugacguucc ggauucucuc uucuguuaac cguucauacg auucagucuu 1320

aaacuguuua cugggauauu aagagucuag uggauaauau auaauacgau guauacuuuu 1380

uuugauuguc uauaguaccu auuagagugu uuucaagcac ucauagaguu caggauaaga 1440

gcagaccuag uccgccaucc ucucuaucua cucuagcuuc guguugcucg acuuuucagg 1500

uuaauacuca acaagguucu ccuaccucac cuucucguau gauucgggag aauaaaaguc 1560

cgucgucuac uaagacugug ucuuagacuu ggucuuuaac uucuguuagu uccgaacaua 1620

cguggucuag gucuucgacu cguucaacuu ccgaaauaug uccccggaaa ucuacugaua 1680

cgucuacucc uucaccuaca acauaaauga agccugaccu uugucggacu cgaacuuaga 1740

cugcucguac cuuucuggaa ugccaacugu agcggucucc caaauucacc ucucgucuuu 1800

agggucaccg aaagcugcua auuucgucag cacguuucac gguuuaugac cuuagaccgu 1860

cucacgugua aacuucguag cccucuuccc caguaauacu uccucgcggu cuauugaggc 1920

cuacauauau uccagugagg ucacuacuug uguguaggca ggguuagucu ucgucauagu 1980

cuacaaacca gagagaguuu cuguagguac ugaaagguug gguucuuucg uucagaaguc 2040

ggagaguggu auaggaaccu acuuaacaag aguagaucuc cucucaagua gagacagccu 2100

ccacugccug cuuacagagu auuucuccgg uaggacgagc cggacucuau guuuuucaac 2160

auguuagucc gcucucaguu uauaagagac aucugauacu uuuuuucauu gucuauagug 2220

cuagauucac aauaggguua gguaaguagu acucaaggaa uuucuucuaa gagccagacu 2280

uccccuuucc auucuuuaga uucuuuaauc ccuagcgugg ugggggaaua cuucuccugu 2340

gaucguaccu cauacgaggc ucgcgagguu aacuguuuag gauaaaaccu caacugcucu 2400

accuguggau acuaggcuua guuaauucua uacucuuuaa gaagaaaugu cacuuuuacu 2460

gccaaucuag auuagcaggc aagucuugua ugagucuaca ccgucggcga cauaggguaa 2520

cccuagugua cauguagccu uaccgucccu uugcagggaa gauguuuuag aaccgaaaaa 2580

acccaagaag auuagauuuc cggugagguc gccauaaccg ucuaguucca guuggucuca 2640

uagugcgagu gacgcuuccg ucccgaauaa acgguguauc cuaccccuuc uggggagggu 2700

acgaguuaca uggucucgug aagucuucug guaaguuaua uccagaaaug uucccuugcu 2760

aacucgagug uuacugguag augcuacuac ucagugaccu ucgucgagga uacuagaccc 2820

uaguaaaguu aagaagguuu aaaagacuaa agucucucuu ccggaauuac aaaccggacu 2880

aacagcucuu uuuccguaga ccucgcaccc aggaccugag auagccggug aaguuuacuc 2940

gaucagauug aagaucgaag acuuguuagg ggccaaauga gucagagggg auuaaggucg 3000

gagagcuugu ugauuauagg acagaaaaga uagggauacu uuuuuugauu gucucuagcu 3060

agacaaaugc gcagugccua gggggcccga cguccuuaag cggugguacc cggucuagca 3120

cugguacaag cuccgggacg ggguguagua gcugcuccac uaguuguagc acuaguagca 3180

cgaguaguag uaguggucgu aguuccggca cauguugaag cgguggacgc cguaggaccg 3240

ggaccacucg aaggacaagg accggccguc uucgacgccg uacaugccgg acuuaccggg 3300

gcuauagaug uucccgcaca uggucaaguu cucgcaccuc aagcuguacu cgguggacuu 3360

ggagugguac ggguugcgga cgucgcgguu guuaucggug gugauguagu cguacccguc 3420

gucgccggac cucaacugga agugguugcu gucguaggac uugguguuga agacguugga 3480

guggucgcgg aaguuguucu uuuggaagcu ggugugggag uacucguagc acucgucgga 3540

cguggacucg uagucuccgu ugucguuggu guuccggcac ucgacgcuga aguuguugcc 3600

guagugguag gucauguugg acucgaaguc gcuaggaguc ucgcgguagu cggucacguc 3660

uuggaagucu ccgucucacg accuguacaa gucuuggcgg aagccgccgu ucauguacuc 3720

uucgccgacc ccgacccggc cgucgcugcc guucuggugg accacgucgg ucuggucgau 3780

ggucauggag uaguaggucu ugucuuggac ccucuuggug acgucuaugc ggccuggaaa 3840

gccguacucg ucuuaggaca agcggguccu cuuuugguuc aaggaguggu ccucugaccg 3900

gccguggaag uggaccuggg acucgcuguc gucgccgcac cucuugggac cgccgaugac 3960

ggagugguuc accuacuagg accggcggcu cgacuucacg aagccguugu ggcggcaccg 4020

guucacguug cacuuggugc ugcuccucaa gacgcuguac gacucugagu agcugauguu 4080

guuccggcgg gacucguuca aguucguccu gcaccucucg cgggacgugc acaaguucug 4140

guggcacuug ucggaguagu cgcuggucga cgaguacucu uugguggacu cucuggagua 4200

cccgcacggg augacguuga ugucguucaa gaccauagac cucgugcggu ucuggccgcu 4260

cuggucgcac ggguucacga ccgaccacug guuaccgucg auggacuugc ucugggugaa 4320

gucgcugguc uagcucgucc uucggcuguu guacuagugg cucuacgacu ccuuccugau 4380

guaguucucu gucccgucgu ggggggaccg ggaguaccua gacgaguaca agucgugguc 4440

gcggauggag uagucguaga aggacgugga ccacuucuag gggugggugu cuguguaguu 4500

cccgccgucg acgggguucg gggugucuga gugguuguuc ccguagacgu cgacgccgcg 4560

gaaguuccac gggccgcacu uuugguagac cuucuccucu auucgccggc gaugcuggag 4620

cugauacuuu uuuugauugu cuauaggagc ugcgguggua cccggugugu ucuuccgucc 4680

cuuguucggg gucguucacg gggauggacu ugaagaaagu cgacgaccac gaccggccgg 4740

acucggugaa aacaagaccg cacuaggugc acugguuucu ucacuuucuc cagcggugug 4800

acucgacgcc gguguugcaa agucaccuuc uugaccgggu cuggucuuag augaccgucu 4860

uucuuuucuu uuaccacgac ugguacuacu cgccgcugua cuuguagacc gggcucaugu 4920

ucuuggccug guagaagcug uagugguugu uggacucgua gcacuaagac cgggacuccg 4980

gaagacuacu cccguggaua cucacgcacc acgacuucau gcucuuccug cggaaguucg 5040

cgcucguaga ccggcuucac ugugacucgc acuuccggcu gaaagggugu ggaucguagu 5100

cgcugaagcu cuaggggugg ucguuguagu cugccuagua gacaucgugg ucgccgccga 5160

aaggucucgg aguagacaga accgaccuuu ugccgcuccu ugacuugcgg uaguuguggu 5220

ggcacagagu ccuggggcuc ugucucgaca uacggcacag gucguucgac cugaaguugu 5280

acuggugguu ggugucgaag uacacggacu aauucaugcc gguggacucu cacuuggucu 5340

ggaaguugac cuuguggugg uucguucucg ugaaggggcu gcuguucugg guguggacag 5400

gagguacagg acgaggucuu gacgagccgc cugggaggca caaagacaag ggagguuucg 5460

gauuccugug ggacuacuag ucgucuuggg gacuucacug gacgcaccac caccuacaca 5520

gagugcuccu gggucuucac uucaaguuaa ccaugcaccu gccgcaccuu cacguguugc 5580

gguucugguu cggaucucuc cuugucaugu ugucguggau gucucaccac aggcacgacu 5640

ggcacgacgu aguccugacc gacuugccgu uucucauguu cacguuccac agguuguucc 5700

gggacggacg aggauagcuc uuuugguagu cguuccgguu cccugucggg gcccuuggag 5760

uucacauaug ggacggagga ucggcccuuc ucuacugguu cuuaguccac agggacugga 5820

cggagcacuu cccgaagaug ggaaggcuau agcggcaccu uacccucucg uuaccggucg 5880

gacucuuguu gauguucugu uggggaggac acgaccuguc gcugccgagu aagaaggaca 5940

ugucguuuga cuggcaccug uucucgucua ccgucguccc guuacacaag ucgacgucgc 6000

acuacgugcu ccgggacgug uuggugaugu gggucuuuuc ggacucggac agaggaccga 6060

cuaguugauc ggucuaagaa guacaaaccu gguuuaguug aacacuaugg uacgaguuuc 6120

uccggaguua auauaaacuc aaaaauuaaa aauacuuuuu uugauugucg uuaguaccuu 6180

caggugcuaa aacucuggcu gcucaaguua cuaaaguuac uucuacugau acgguguucu 6240

cuuaaggacu uagggcuacu cgcguacugc augaacuuag uacgacuaau guuggacuua 6300

agaggagauu aaucacuacu auaacuguua aauuaguccu uuaaguuaag agaagguuaa 6360

gggagcuaca cccuaucauu cuugacccua ccucaagaac ucuacaauug caguacaguu 6420

cgguuagggu aggguuguag agucuacgua uuuaccuacc cuucaaccaa uuacagacua 6480

uuaguacuac ggucaguucc cauaucaaaa aauguacuuc accuguuucu ccgucuuuau 6540

uguaaacugc accaccucug gaaguaggcg ccgaccccgu uguuugguua acuuauguag 6600

uuuuuccuuu cuaccugacu gaguaaguuu uaagagcgaa uaaacacagu uuucaaaaac 6660

cugaaugugu ucaacuguaa uuagaauuua cgacagagac uccaccuuaa cgaguugaac 6720

cgcuccugaa aguuuccguu ucagucuucu ucaagaguac cuugcuugua uacguccuaa 6780

ucccaagggu cgaacccagg augaaaauaa agucuuccua cccgaaugaa guucuuugaa 6840

cuauaagauu accuggcuuu gaaagacaau uaccaguuuc uacacuaaua ucccuccuac 6900

guuugccacg auagguacca uacaucuuau cuguuggaca agagucucgu ucuguagaag 6960

agggaagauu uauagauguc uuaaccucua uuuuaacacc ucuccguccc uuuaaaaaga 7020

auacugaacu aauuuuacca ccuuggcuau acguugaacu ucgacuacuu uaaucguucu 7080

cuuaguuccg gaaaucaggg uguuaaggga guaaaacuuu uaguauaguu cugaagacaa 7140

cuacuucccc guuuuuaacu ggcuccauau ucuaaggagg uacuagucua uuacucacac 7200

uuuugucacc uagaguguga ccacuaaaua ccuagcaagu cuguaacccc aguaggaaaa 7260

uaucuaauaa ugugaccuga ucuuuuuaau guaaggguuc auugguacuu cuuucuauaa 7320

cuacacagua uacguuuucg ugaacguuca cuaaaucgag ccuaacaaga uaaaguuguc 7380

aaguuacuag uauuuuucac caagcacuua ccucugaacg agggaguacu aguagggaaa 7440

uuuucaguac aauuucuuuu auguaccggg ugucgacgag uucaaguucu aaaaccucua 7500

uuuaccguac uugaaggcga cuaauuuaca aaacuuuaug ggcugaauga ucuggguagc 7560

uauuauauga gacuguuuuc aguaaguuac uuauccaguc uccacaacuu uguacaggcu 7620

uacuuaggcu ugugaggaua gggaucauuu uuccacaacg ucugauacaa ccuguguuuc 7680

cgaugguuaa ccuuucuuaa agaauuucuc uaacuacucu ucccgaaucu acuacuacua 7740

gauuaauaac cagaauuucc uuuccucucc cuugacuuca accguccauc uaaaaagagg 7800

gauuacagaa ccuuuaacgc ucuuaugaaa cauuaauggc uuauaaacua uuucugagua 7860

aagcagggau acaaauuucc ggacuguuac cgccugcuag auugacguca guaauuuuuc 7920

uacaaucuaa ggaguaggcc gguuccuaac uucaguauac uccguuaaac guaucgguua 7980

guguaacuaa ugcuuuuuac cuuauuggug guuuccuuca auaguuugcc gggucacaag 8040

gcucaauacc cggucaagaa uccaauaggu aggaauuagc ucucuugagu acuuaaaaaa 8100

cucuuuucag aauauaugau guuaccuucu ggucugaacu acgcacaagu guuguugugu 8160

gacuaguuaa guuggagggu ugcucaaaca accguuccug uucucccacc ugaccuucca 8220

gaugccguuu uuccuaccuc auaggaguua gaugaccaau aaguuucucu ccgauuuuag 8280

ucuuugugac gacaguuuca gaaccguguu ccacuauuag uucaauaaac gugugucaua 8340

uuuugcuucu uuagcucuuu gcaacaucuu aaugucccac gagaguuagu uuaccaaaga 8400

uuauuacucu uuuaauacug acguuaguuu uaucccuguc ccuucaaucc ugaaaacuau 8460

uuacugcuac ucugauacgu uagacgucua augaacuuaa uaccuuuuua uggcuaaaag 8520

gcaccucacu aaucucccaa ucucugguuc ucuaccagug cucacugaac acagugguua 8580

cugguuuaug ggugaacacg auuauauuac ucgagucaaa gguguuuacg agaguggcau 8640

cgaguaaaac gacucuuggg uuaguuacgg uacuauguca uguuaauaaa acccuguaaa 8700

cgaucugaga acaacuacua cguacuagga cgagaagcag uuaguaacau acuucaaguu 8760

cuauucuaug gcccgaacgu gucaagauga aaguuuaugc gguacaacau aaaccuggga 8820

agguaaccuc cucacagccc guacagaaac agguccaaaa acuaaucucg gaagggucua 8880

gggcauuguc uuucagagag uaagaccucu aaguagguac auguacgagc uucacucgua 8940

gacuuccucu acucacguca uaaaccuuug gggcucuauc gguucaaagc uuauugagug 9000

uaucuguucg aucaucuucu agguuggaga gacuuguagc gauacccuua cucaggucgc 9060

uugaacaauu ucugacucca auuuuuuacg aauuagcuua guucuguuug guaguccuug 9120

guccacuaau uccuacguug guauauaaac auaguacuuc uccuagccga gucuucaaag 9180

aauaccaguu auuuaggaga caagggaucu aaaaauucac uuaaguuuag uccgugaaaa 9240

aacccucagc gucugcccga guagucagau aaaguuuuaa gagcaugaua agccuugagg 9300

aaauucuuuu ucauaguauc ccuuaaccua cuaaacuaac acuccucacu ccauaggaga 9360

aacuguguaa aucccuuuga aguaaacucu uccccuagua cauuuuacac cuguacaagu 9420

cgaugaguac gacuguguaa uucuauguuu aggaccccgg caugucaaua acccuguuga 9480

caugggguag guaaucuuua caacccaggu guuguagcuu uucucugagg aacacguggu 9540

acauugugua gucccaaguu aauacaaaga cacguaacag gucugcccua gguacugcag 9600

aaaucaagug ccccugguaa cggacgaaua gaucccagau uuuguagacu uagauguaga 9660

uaaaacgucg gaacccuuuc ccuuucguuu cagggugacu aauuuucucg augugcagaa 9720

ucucuacgau agagaaccaa acaacuuggg cugagauuug aucguuacug auaugaaaga 9780

uuguagguga gaaauugucc gcuucuuacc ugguuuuccg ucguacccaa guuuucuugu 9840

cccagacggg aaguauccaa aagcuguaga gccuacucgg uaccacccaa gcguagaguc 9900

ucgugacguc guaacugguc caacuaccgu ugaugucugu gguacucccu agacccucua 9960

gucuuaaagc ugaaaaauaa gguucguugc aacgagauac gaguuuaaug guggugacaa 10020

cguucucugc cuaccuagug gucaacaugu cuaguaauag uauaacggac auucaggaca 10080

aacucugggu aucuucucua gugggaccug aguucauacc ugaugugcgg gggucuacau 10140

aggguacacg acuucuguac cuccuuaccc cuuccaagca ccccuguucu cuauuuuguc 10200

uagauaggaa aucuucccuu aaccuucuua aaucguggac gacucguuag gauaguucag 10260

ccgucuacau auccaaaaga uauaccucug aaccgcauau cuuuuagaug aguacggcuc 10320

cugucaagag auaaaggaga uagauauguu ccagcauaau cuccagcucc aaagaauuuu 10380

cccaacgauc ugccuaauua cucucguuca acgacgguuc auuauguggc cucuucagac 10440

cgaguaaacu ucuccggccg guugcgucac augccuccaa acuaaaugaa cuaacuauuu 10500

aacucacaua guggagguaa ggaaagagaa ugaucuaguc cuggauaauc ucugcuuaau 10560

cuuugcuaag ggguguucua ggguuggagg auaggcuguu cguuggcacu auacccccac 10620

uaacagucuu uaaugaaguu uaugguuacg gcagauuaac uuuucccuuu uaugucuagu 10680

guaauaagug uuaauaccaa uaagagucua cagaauaggu aucugaagua accugguaag 10740

agauaaaggu ggugggagaa cguuuaggau auguucggua aaaauagacc cuuucuauuc 10800

uuacucaacu cucucgaccg uuuagaaaga aguaacgauu cuaguccucu ccccacccuu 10860

cuguauguac acuuuaagaa gugguuccug uauaauaaca caggucuccu uuagucugua 10920

cgaacguuca agcccuaacg auuccuauua uuauuucugu acucgauagg gggaaccccu 10980

ucccuuaggu cucccuguua auguuguuag ggacaaauaa uaugcuggug gggaaugggu 11040

uucuacgauc ucuacggagg uucuuagguu uuaggggacg acaggccuua guccaacccg 11100

guuaaugguu gaccgcgagu aauauuuuaa gccucauaua auguaccuua cccuuaggua 11160

augucccuga agaacucaac accucugccg aggccucccu acugacgacg uaaugaugcu 11220

cuuuuacacg uaucgucucc uuauaaguua ucagacaauc uuaauagucc cagucaguac 11280

gcuccgcgga gaggacucgg ggggucacgg gaucuuugaa auccuccucu auuuagcucu 11340

acacauuuac cacuuuguac aacccuuaua gguagacuga auacacuggg uuccugaacc 11400

cugauaaagg aggcugaguu ucguccgaac cccgaaguuu aacuaaauua acauuaccua 11460

uaccuucaag cccuaagaag augaucggac uuuuaacucu gcuuacaauc uuuaauacac 11520

guggccuaaa accuacucgu uccucaaaau uagauguucu gaauaccuug uauauaaaca 11580

cucucgcuuu ucuuacguca uuguuaggaa ccaggguaca aguucugcca gcugaaucaa 11640

guuugucuua aaucaucaag aguuugcaga cuucauauau accauacauu uccaaacuuc 11700

uuuaauuagc uacuuggguu agggcuaacc agaagguagu uacuuaggac cuuuuuggac 11760

augcguaagg ucaguagucu uguccuuaaa cggucucguu ucuuccaauc auguaugaaa 11820

uggaacuguc cauaagggag gguuaaguaa ggacuaggaa aacauuugua acucugauac 11880

gauguuuaua agccucaugg gugcccacac agaguacgcc gacggaauuu uaguagacua 11940

ucuggacguc uaaauaacug guaaucggaa aaaauauacc gcuaauauag cauaauauug 12000

uaguuaguau agucucaucc uggcuaugga ggcuuggggg guagucuacc uuaacguguu 12060

uuacaccccu agcgauauug accauauucg aaaaccgacu caaacuaccu cuuucuguaa 12120

ggugauauag uugucacaaa ucgucaauag gucguuagua agggcuaauc cacccuccga 12180

caaagucauu uuccuccuau guucgucuuc accucaugau cuccacuacc cgaggguuuu 12240

cuaugggcuu aaagucugag gaaccggggu uagcccuuga ccuagucuag agaccuuaac 12300

caggcuuugg uucaagcaga uuuagguaag uuacucuaga acaaguuagu cgauacagca 12360

ugucaccuau uaguaaacuu uaccaguuua aacgcuucuu uguguccuua cuaacuuacc 12420

uaguuaucug cuuaaaguuu ucuucuggcc agauaugacu acaacuucuc acuggaugug 12480

cuccuuuuga gaaccucucu aauuuuuuag uacuccucug agguuugaaa uucauacuuu 12540

uuuugaaacu aggaauucug ggagaacacc aaaaauaaaa aauagaccaa aacaccagaa 12600

gca 12603

Claims

1.一种重组弹状病毒，其在其基因组中编码至少一种CD80胞外域Fc融合蛋白或其功能变体，其中该CD80胞外域Fc融合蛋白包含CD80的胞外域且进一步包含IgG的Fc域。

2.根据权利要求1的重组弹状病毒，其中该CD80胞外域Fc融合蛋白选自包含以下的组：

(i)CD80胞外域Fc融合蛋白，其包含与IgG1的Fc域融合的CD80胞外域，

(ii)CD80胞外域Fc融合蛋白，其包含与IgG1的该Fc域融合的CD80胞外域，其中该CD80胞外域包含SEQ ID NO:1或由其组成或与SEQ ID NO:1具有至少80％一致性，

(iii)CD80胞外域Fc融合蛋白，其包含与IgG1的该Fc域融合的CD80胞外域，其中该Fc域包含SEQ ID NO:2或由其组成或与SEQ ID NO:2具有至少80％一致性，

(iv)CD80胞外域Fc融合蛋白，其包含与IgG1的该Fc域融合的CD80胞外域，其中该CD80胞外域包含SEQ ID NO:1或由其组成或与SEQ ID NO:1具有至少80％一致性及该Fc域包含SEQ ID NO:2或由其组成或与SEQ ID NO:2具有至少80％一致性，

(v)CD80胞外域Fc融合蛋白，其包含与IgG1的该Fc域融合的CD80胞外域，其中该CD80胞外域为由SEQ ID NO:4的氨基酸1-207组成或与SEQ ID NO:4的氨基酸1-207具有至少80％一致性及该Fc域为由SEQ ID NO:4的氨基酸208-433组成或与SEQ ID NO:4的氨基酸208-433具有至少80％一致性，

(vi)根据(i)-(v)中的任一者的CD80胞外域Fc融合蛋白，其进一步包含信号肽序列，及

(vii)CD80胞外域Fc融合蛋白，其包含SEQ ID NO:3或与SEQ ID NO:3具有至少80％一致性。

3.根据权利要求1至2中任一项的重组弹状病毒，其为水疱病毒(vesiculovirus)。

4.根据权利要求3的重组弹状病毒，其中该水疱病毒选自包含以下的组：水疱性口炎阿拉戈斯病毒(Vesicular stomatitis alagoas virus)(VSAV)、卡拉加斯病毒(Carajásvirus)(CJSV)、章地埔拉病毒(Chandipura virus)(CHPV)、科卡尔病毒(Cocal virus)(COCV)、水疱性口炎印第安纳病毒(Vesicular stomatitis Indiana virus)(VSIV)、伊斯法罕病毒(Isfahan virus)(ISFV)、马拉巴病毒(Maraba virus)(MARAV)、水疱性口炎新泽西病毒(Vesicular stomatitis New Jersey virus)(VSNJV)或皮里病毒(Piry virus)(PIRYV)。

5.根据权利要求3的重组弹状病毒，其为水疱性口炎病毒，优选为水疱性口炎印第安纳病毒(VSIV)或水疱性口炎新泽西病毒(VSNJV)。

6.根据权利要求1至5中任一项的重组弹状病毒，其中该弹状病毒为具有复制能力的。

7.根据权利要求1至6中任一项的重组弹状病毒，其中该弹状病毒

(i)缺乏编码糖蛋白G的功能性基因，和/或

(ii)缺乏功能性糖蛋白G。

8.根据权利要求7的重组弹状病毒，其中

(i)编码该糖蛋白G的基因经编码另一病毒的糖蛋白GP的基因置换，和/或

(ii)该糖蛋白G经另一病毒的该糖蛋白GP置换。

9.根据权利要求8的重组弹状病毒，其中

(i)编码该糖蛋白G的该基因经编码沙粒状病毒(arenavirus)的糖蛋白GP的基因置换，和/或

(ii)该糖蛋白G经沙粒状病毒的该糖蛋白GP置换。

10.根据权利要求8至9中任一项的重组弹状病毒，其中

(i)编码该糖蛋白G的该基因经编码丹德农病毒(Dandenong virus)或莫佩亚病毒(Mopeia virus)的糖蛋白GP的基因置换，和/或

(ii)该糖蛋白G经丹德农病毒或莫佩亚病毒的该糖蛋白GP置换。

11.根据权利要求7至9中任一项的重组弹状病毒，其中

(i)编码该糖蛋白G的该基因经编码淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)的糖蛋白GP的基因置换，和/或

(ii)该糖蛋白G经LCMV的该糖蛋白GP置换。

12.一种重组水疱性口炎病毒，其在其基因组中编码至少一种CD80胞外域Fc融合蛋白或其功能变体，其中该CD80胞外域Fc融合蛋白包含CD80的胞外域且进一步包含IgG的Fc域。

13.根据权利要求12的重组水疱性口炎病毒，其中该CD80胞外域Fc融合蛋白选自包含以下的组：

(vii)CD80胞外域Fc融合蛋白，其包含SEQ ID NO:3或与SEQ ID NO:3具有至少80％一致性，

其中编码该重组水疱性口炎病毒的糖蛋白G的基因经编码淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)的糖蛋白GP的基因置换，和/或该糖蛋白G经LCMV的该糖蛋白GP置换。

14.根据权利要求13的重组水疱性口炎病毒，其中该基因组编码与IgG1的该Fc域融合的CD80胞外域。

15.根据权利要求14的重组水疱性口炎病毒，其中该CD80胞外域包含SEQ ID NO:1或由其组成或与SEQ ID NO:1具有至少80％一致性。

16.根据权利要求14的重组水疱性口炎病毒，其中该Fc域包含SEQ ID NO:2或由其组成或与SEQ ID NO:2具有至少80％一致性。

17.根据权利要求14的重组水疱性口炎病毒，其中该CD80胞外域包含SEQ ID NO:1或由其组成或与SEQ ID NO:1具有至少80％一致性，且该Fc域包含SEQ ID NO:2或由其组成或与SEQ ID NO:2具有至少80％一致性。

18.根据权利要求14至17中任一项的重组水疱性口炎病毒，其进一步包含信号肽序列。

19.根据权利要求13的重组水疱性口炎病毒，其中该基因组编码包含SEQ ID NO:3或与SEQ ID NO:3具有至少80％一致性的CD80胞外域Fc融合蛋白。

20.一种重组水疱性口炎病毒，其在其基因组中编码至少水疱性口炎病毒核蛋白(N)、大蛋白(L)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)及至少一种CD80胞外域Fc融合蛋白或其功能变体，其中该CD80胞外域Fc融合蛋白包含CD80的胞外域且进一步包含IgG的Fc域。

21.根据权利要求20的重组水疱性口炎病毒，其中该核蛋白(N)包含如SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:7至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的功能变体。

22.根据权利要求20或21中任一项的重组水疱性口炎病毒，其中该磷蛋白(P)包含如SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:8至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的功能变体。

23.根据权利要求20至22中任一项的重组水疱性口炎病毒，其中该大蛋白(L)包含如SEQ ID NO:9中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:9至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的功能变体。

24.根据权利要求20至23中任一项的重组水疱性口炎病毒，其中该基质蛋白(M)包含如SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:10至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的功能变体。

25.根据权利要求20至24中任一项的重组水疱性口炎病毒，其中：

该核蛋白(N)包含如SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:7至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的功能变体，

其中该磷蛋白(P)包含如SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:8至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的功能变体，

其中该大蛋白(L)包含如SEQ ID NO:9中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:9至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的功能变体，

该基质蛋白(M)包含如SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:10至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的功能变体。

26.根据权利要求20至25中任一项的重组水疱性口炎病毒，其为具有复制能力的。

27.根据权利要求20至26中任一项的重组水疱性口炎病毒，其

(i)缺乏编码糖蛋白G的功能性基因，和/或

(ii)缺乏功能性糖蛋白G。

28.根据权利要求20至27中任一项的重组水疱性口炎病毒，其中

(ii)该糖蛋白G经另一病毒的该糖蛋白GP置换。

29.根据权利要求20至28中任一项的重组水疱性口炎病毒，其中

(ii)该糖蛋白G经LCMV的该糖蛋白GP置换。

30.根据权利要求20至29中任一项的重组水疱性口炎病毒，其中该CD80胞外域Fc融合蛋白选自包含以下的组

31.一种重组水疱性口炎病毒，其在其基因组中编码水疱性口炎病毒核蛋白(N)、大蛋白(L)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)及至少一种CD80胞外域Fc融合蛋白或其功能变体，其中该CD80胞外域Fc融合蛋白包含CD80的胞外域且进一步包含IgG的Fc域且选自包含以下的组：

其中，编码该水疱性口炎病毒的糖蛋白G的基因经编码淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)的糖蛋白GP的基因置换，和/或该糖蛋白G经LCMV的该糖蛋白GP置换，且其中

该核蛋白(N)包含如SEQ ID NO:7中所示的氨基酸或与SEQ ID NO:7至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的功能变体，

该磷蛋白(P)包含如SEQ ID NO:8中所示的氨基酸或与SEQ ID NO:8至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的功能变体，

该大蛋白(L)包含如SEQ ID NO:9中所示的氨基酸或与SEQ ID NO:9至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的功能变体，且

该基质蛋白(M)包含如SEQ ID NO:10中所示的氨基酸或与SEQ ID NO:10至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的功能变体。

32.一种药物组合物，其特征在于该组合物包含根据权利要求1至11中任一项的重组弹状病毒或根据权利要求12至31中任一项的重组水疱性口炎病毒。

33.一种根据权利要求1至11中任一项的重组弹状病毒、根据权利要求12至31中任一项的重组水疱性口炎病毒或根据权利要求32的药物组合物的用途，其用作药物。

34.一种根据权利要求1至11中任一项的重组弹状病毒、根据权利要求12至31中任一项的重组水疱性口炎病毒或根据权利要求32的药物组合物，其用于治疗癌症、优选地实体癌。

35.根据权利要求34的用于所述用途的重组弹状病毒、重组水疱性口炎病毒或药物组合物，其中该实体癌选自包含以下的清单：生殖肿瘤、卵巢肿瘤、睾丸肿瘤、内分泌肿瘤、肠胃肿瘤、胰脏肿瘤、肝脏肿瘤、肾脏肿瘤、结肠肿瘤、结肠直肠肿瘤、***、***肿瘤、皮肤肿瘤、黑色素瘤、呼吸道肿瘤、肺肿瘤、***肿瘤、头颈部肿瘤、头颈部鳞状细胞癌瘤(HNSCC)及骨肿瘤。

36.根据权利要求33至35中任一项的用于所述用途的重组弹状病毒、重组水疱性口炎病毒或药物组合物，其中该重组弹状病毒、该重组水疱性口炎病毒或该药物组合物待经瘤内或经静脉内施用。

37.根据权利要求34至35中任一项的用于所述用途的重组弹状病毒、重组水疱性口炎病毒或药物组合物，其中该重组弹状病毒、该重组水疱性口炎病毒或该药物组合物待经瘤内施用至少一次且后续经静脉内施用。

38.根据权利要求37的用于所述用途的重组弹状病毒、重组水疱性口炎病毒或药物组合物，其中后续静脉内施用为在初始瘤内施用之后1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天或31天给与。

39.一种组合物，其包含根据前述权利要求中任一项的重组弹状病毒或重组水疱性口炎病毒，且进一步包含PD-1通路抑制剂或SMAC仿真物。

40.根据权利要求39的组合物，其中该PD-1通路抑制剂为拮抗性抗体，其针对PD-1或PD-L1。

41.根据权利要求39的组合物，其中该SMAC模拟物选自由化合物1至26中的任一者组成的组：

或这些化合物中之一者的药学上可接受的盐。

42.根据权利要求39的组合物，其中该PD-1通路抑制剂为选自由以下组成的组的拮抗剂：帕博利珠单抗(pembrolizumab)、纳武单抗(nivolumab)、皮立珠单抗(pidilizumab)、阿替利珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、度伐鲁单抗(durvalumab)、PDR-001、PD1-1、PD1-2、PD1-3、PD1-4及PD1-5。

43.一种成套试剂盒，其包含：

a)根据前述权利要求中任一项所定义的重组弹状病毒、重组水疱性口炎病毒或药物组合物，及

b)根据前述权利要求中任一项所定义的PD-1通路抑制剂或SMAC仿真物。

44.根据权利要求33至35中任一项的用于所述用途的重组弹状病毒、重组水疱性口炎病毒或药物组合物，其与PD-1通路抑制剂或SMAC仿真物组合使用。

45.根据权利要求44的用于所述用途的重组弹状病毒、重组水疱性口炎病毒或药物组合物，其中该重组弹状病毒、该重组水疱性口炎病毒或该药物组合物与该PD-1通路抑制剂或该SMAC模拟物同时、依序或交替施用。

46.根据权利要求44至45的用于所述用途的重组弹状病毒、重组水疱性口炎病毒或药物组合物，其中该SMAC模拟物选自由根据权利要求41的化合物1至26中的任一者或这些化合物中之一者的药学上可接受的盐组成的组。

47.根据权利要求44至45的用于所述用途的重组弹状病毒、重组水疱性口炎病毒或药物组合物，其中该PD-1通路抑制剂选自由以下组成的组：帕博利珠单抗、纳武单抗、皮立珠单抗、阿替利珠单抗、阿维鲁单抗、度伐鲁单抗、PDR-001、PD1-1、PD1-2、PD1-3、PD1-4及PD1-5。

48.根据权利要求44至462中任一项的用于所述用途的重组弹状病毒、重组水疱性口炎病毒或药物组合物，其中该重组弹状病毒、该重组水疱性口炎病毒或该药物组合物为经由与该PD-1通路抑制剂或该SMAC模拟物不同的施用途径施用。

49.根据权利要求44至462中任一项的用于所述用途的重组弹状病毒、重组水疱性口炎病毒或药物组合物，其中该重组弹状病毒、该重组水疱性口炎病毒或该药物组合物经瘤内施用至少一次且该PD-1通路抑制剂或该SMAC模拟物经静脉内施用。

50.一种病毒产生细胞，其特征在于该细胞产生根据前述权利要求中任一项的重组弹状病毒或重组水疱性口炎病毒。

51.根据权利要求50的病毒产生细胞，其中该细胞为Vero细胞、HEK细胞、HEK293细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或幼仓鼠肾(BHK)细胞。

52.一种重组弹状病毒，其在其RNA基因组中编码至少一种CD80胞外域Fc融合蛋白或其功能变体，其中该CD80胞外域Fc融合蛋白包含CD80的胞外域且进一步包含IgG的Fc域，其中该重组弹状病毒的该RNA基因组包含编码序列或由其组成，该编码序列与SEQ ID NO:24一致或与其至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。