NO340443B1

NO340443B1 - Anti-P-selektinantistoffer, preparat omfattende samme, metode for fremstilling av slike samt anvendelser av disse for forebygging og behandling av sykdommer.

Info

Publication number: NO340443B1
Application number: NO20065096A
Authority: NO
Inventors: Erhard Kopetzki; Paul Parren; Yvo Graus; Frank Rebers; Martine Van Vugt; Jacques Himber; Miranda Jansen-Molenaar; Dorothee Kling; Beat Steiner; Anne Stern; Pamela Strein; Kay-Gunnar Stubenrauch; Jan Van De Winkel
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 2004-04-13
Filing date: 2006-11-03
Publication date: 2017-04-24
Also published as: EP2360186B1; IL212350A0; USRE44389E1; JP4633788B2; NZ578643A; CA2885854A1; JP5184569B2; SG172616A1; AU2005233259B2; HK1104562A1; JP5714554B2; PL1737891T3; US20100209423A1; BRPI0509847B1; JP2013063079A; ES2403055T3; RU2368622C2; TW200840824A; BRPI0509847B8; AR048599A1

Description

Foreliggende oppfinnelse angår et antistoff som binder til P-selektin, ikke binder til komplementfaktor Clq og ikke til Fcy reseptorer på NK celler, og som inneholder en Fc del avledet fra human opprinnelse og erkarakterisert vedat nevnte antistoff er av human underklasse lgG4 hvor S228 er erstattet med P og L235 er erstattet med E, som hemmer adhesjonen av leukocytt-lignende HL60 celler til renset P-selectin med en IC50 verdi på fra 0,08 til 0,5 ug/ml og omfatter CDR1, CDR2 og CDR3 regioner av lettkjede variable domener definert av aminosyresekvens SEKV ID NR: 3 og CDR1, CDR2 og CDR3 regioner av tungkjede variabelt domene definert av SEKV ID NR: 4. Beskrivelsen generelt angår anti-P-selektinantistoffer og, spesielt, anti-P-selektinantistoffer som ikke binder komplementfaktor Clq. Foretrukket er disse antistoffene humane eller humaniserte antistoffer.

P-selektin (CD62P, GMP-140, PADGEM, LECAM-3) er et 140 kDa kalsium-avhengig karbohydratbindende protein som uttrykkes på overflaten av aktiverte blodplater og endotel i respons til trombin og andre agonister (McEver et al., J Biol Chem 270:11025

(1995); Varki, Proe Nati Acad Sei USA 91:7390 (1994); Springer TA, Annu Rev Physiol 57:827 (1995)). I begge celletypene blir P-selektin lagret i sekretoriske granuler, dvs. a-granuler i blodplater og Weibel-Palade bodies i endotelceller (McEver et al., J Clin Invest 84:92 (1984)). Det er et type I transmembran glykoprotein som er sammensatt av et NH2-terminalt lektindomene, etterfulgt av et EGF-lignende domene, ni korte konsensusrepetisjoner med homologi til komplementregulerende proteiner, et transmembrandomene og en kort cytoplasmatisk hale (Johnston et al., Cell 56:1033

(1989)). Strukturen av P-selektin er lik strukturen av de andre to medlemmene av selektinfamilien, E- og L-selektin, som enten utrykkes på cytokinaktiverte endotelceller (E-selektin) eller uttrykkes konstitutivt på de fleste klasser av leukocytter (L-selektin).

Alle selektiner er kjent å binde med lav affinitet til små sialylerte, fucosylerte oligosakkarider slik som sialyl Lewis x (sLe<x>; Foxall et al., J Cell Biol 117:895 (1992); Varki, Curr Opin Cell Biol 257:257 (1992)). P- og L-selektin, men ikke E-selektin, binder også til visse sulfaterte karbohydrater, slik som heparinsulfat (for oversikt, se McEver og Cummings, J Clin Invest 100:S97 (1997)). Høyaffinitets ligander for P-selektin er mucinlignende glykoproteiner (McEver et al., J Biol Chem 270:11025 (1995)), som består av en polypeptidryggrad med clustere av sialylerte O-glykaner. En sialomucinligand som P-selektin foretrukket binder til er P-selektin glykoproteinligand-1 (PSGL-1, CD 162), som vanligvis uttrykkes som en homodimer med to disulfidbundne subenheter med relative molekylvekter på omtrent 120 kDa av sirkulerende leukocytter. Bindingssetet for P-selektin er lokalisert til den ytterste NEb-terminale delen av PSGL-1. Gjennom dens binding til dens ligander, medierer P-selektin "rolling" av leukocyttene på aktiverte blodplater og endotelceller. Rolling-prosessen reduserer effektivt hastigheten av bevegelse av leukocytter, hvilket er en forutsetning for fast adhesjon og påfølgende transmigrasjon av leukocytter inn i subendotelet men også for akkumulering av leukocytter i tromber.

Undersøkelser ved anvendelse av P-selektin-defisitte mus og P-selektin-spesifikke blokkerende antistoffer har vist at P-selektin tar del i patofysiologien til en rekke akutte og kroniske inflammatoriske sykdommer omfattende iskemi/reperfusjonsskade (Winn et al., J Clin Invest 92:2042 (1993); Massberg et al., Blood 92:507 (1998)). I tillegg er det et tydelig bidrag av P-selektin i kardiovaskulære sykdommer som har en inflammatorisk komponent slik som aterosklerose (Collins et al., J Exp Med 191: 189 (2000); Johnson et al., J Clin Invest 99:1037 (1997)), restenose (Manka et al., Circulation 103:1000 (2001); Bienvenu et al., Circulation 103:1128 (2001)) og trombose (Kumar et al., Circulation 99:1363 (1999); Andre et al., Proe Nati Acad Sei USA 97:13835 (2000); Blann et al., Br. J. Haematol 108:191 (2000); Myers et al., Thromb Haemostasis 85: 423 (2001). Hemming av P-selektinfunksjon ville åpenbart være effektiv som en terapi ved forskjellige sykdommer som omfatter adherens av leukocytter til vaskulært endotel eller blodplater (se f. eks. WO 93/06863, WO 94/25067).

Antistoffer mot P-selektin er tidligere beskrevet og undersøkt for deres antiinflammatoriske og antitrombotiske effekter. US patent 4,783,399 og WO 93/06863 beskriver mus monoklonale antistoffer mot P-selektin reaktive mot aktiverte blodplater. Geng J. G. et al (J. Biol. Chem., 266 (1991) 22313-22318) beskriver mus monoklonale antistoffer som binder til P-selektin aminosyre (aa)-fragment aa 60-75 (Cys til Glu, hvor tellinger er i henhold til Swiss-Prot sekvens Pl 6109 som omfatter signalsekvensen. WO 93/21956 angir mus monoklonale antistoffer mot P-selektin og humaniserte antistoffer av IgGl subklasse som konkurrerer med et definert antistoff, som binder i nærvær av P-selektinfragment aa 60-75) og i fravær av kalsiumioner.

WO 94/25067 beskriver både et murint monoklonalt anti-P-selektin antistoff (murine PB 1,3 antistoff som sekret fra en cellelinje designert ATCC akvisijsons nr. HB 11041) og humaniserte antistoffer mot P-selektin.

Ingen av de nevnte mus monoklonale antistoffene mot humant P-selektin er anvendelige for behandling av humane pasienter. Et humanisert antistoff mot P-selektin av human IgGl subklasse nevnt i WO 93/21956 er under preklinisk utvikling ( www, mrctechnology. org).

OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN

Oppfinnelsen angår antistofferkarakterisert vedat nevnte antistoffer binder til P-selektin og ikke binder human komplementfaktor Clq og ikke til Fcy reseptorer på NK celler.. Antistoffene ifølge oppfinnelsen inneholder en Fc-del som stammer fra human opprinnelse og erkarakterisert vedat nevnte antistoff er av human underklasse lgG4 hvor S228 er erstattet med P og L235 er erstattet med E, som hemmer adhesjonen av leukocytt-lignende HL60 celler til renset P-selectin med en IC50 verdi på fra 0,08 til 0,5 ug/ml og ved å sammenligne CDR1, CDR2 og CDR3 regioner av lettkjede variable domener definert av aminosyresekvens SEKV ID NR: 3 og CDR1, CDR2 og CDR3 regioner av tungkjede variabelt domene definert av SEKV ID NR: 4

Disse antistoffene er foretrukket humaniserte eller humane antistoffer. Antistoffene har nye og oppfinneriske egenskaper som bevirker en fordel for en pasient som lider av inflammatoriske og trombotiske forstyrrelser, spesielt av perifer arterieokklusiv sykdom (PAOD) og kritisk iskemi i bena (CLI).

KORT BESKRIVELSE AV FIGURENE

Fig. 1 viser at antistoffene ifølge oppfinnelsen hemmer adhesjonen av leukocytt-lignende HL60-celler til renset P-selektin belagt på mikrotiterplater. De muterte antistoffene er mer potente enn det ikke-muterte parentale antistoffet. Fig. 2 viser den hemmende aktiviteten av antistoffene ifølge oppfinnelsen i rosetting-analysen som måler adhesjonen av trombinaktiverte blodplater til HL60-celler. Fig. 3a og 3b viser kryssreaktiviteten av antistoffene ifølge oppfinnelsen med rotte og cynomologus P-selektin. Fig.3a: Anti-P selektin-antistoffene påvirker ikke adhesjonen av trombinaktiverte rotte blodplater til HL60-celler, mens det kommersielt tilgjengelige polyklonale anti-P-selektinantistoffet (Pharmingen 0936IA) hemmer denne interaksjonen. Fig. 3b: Antistoffene ifølge oppfinnelsen hemmer adhesjonen av aktiverte cynomologus blodplater til HL60-celler. Fig. 4a - c viser selektiviteten av antistoffene for P-selektin versus E- og L-selektin ved representative bindingskurver på P-, E- og L-selektin-transfektanter. Antistoffene ifølge oppfinnelsen binder til P-selektin CHO-celler med ECso-verdier i området 0,01 og 0,07 (xg/ml. ECso-verdier for E-selektin CHO-celler og L-selektin 300,19-celler er foretrukket høyere enn 100 ug/ml. Fig. 5 viser den hemmende aktiviteten av antistoffene ifølge oppfinnelsen i et fullstendig humant flytsystem. De hemmer adhesjonen av humane leukocytter til et monolag av blodplater på en konsentrasjonsavhengig måte ved en skjærhastighet ("shear rate") på 65/s. Fig. 6 viser den hemmende virkningen av antistoffene ifølge oppfinnelsen på adhesjonen av leukocytter til humane endotelceller som uttrykker P-selektin. Fig. 6a viser den totale hemmingen av leukocyttadhesjon i % av kontrollen, Fig. 6b viser representativt den hemmende virkningen av ett av antistoffene på det absolutte antallet av de forskjellige undergruppene av leukocytter.

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

I. Definisjoner

Betegnelsen "P-selektin" refererer til et 140 kDa protein uttrykt av humane blodplater og endotelceller, som beskrevet av Hsu-Lin et al., J Biol Chem 259: 9121 (1984) og Mc Ever et al., J Clin Invest 84:92 (1989). Denne type I transmembran glykoprotein er sammensatt av et NEb-terminalt lektin-domene, etterfulgt av et epidermal vekstfaktor (EGF)-lignende domene og ni repeterte konsensus-domener. Det er forankret i membranen ved et enkelt transmembrandomene og inneholder en liten cytoplasmatisk hale. Beskrevet er antistoffer, som er i stand til å hemme én eller flere av de biologiske aktivitetene mediert av P-selektin, for eksempel dets inflammatoriske eller trombotiske aktivitet. Antistoffene binder til P-selektin og virker ved å påvirke bindingen av P-selektin til dets ligand.

Betegnelsen "P-selektin-ligand" relater foretrukket til en høyaffinitets og biologisk relevant ligand for P-selektin slik som den mucinlignende glykoprotein P-selektin-liganden glykoprotein-1 (PSGL-1), som beskrevet av Moore et al.; J Cell Biol 118:2445 (1992), Sako et al, Cell 75:1179 (1993) PSGL-1 er et type I membranprotein med et ekstracellulært domene rikt på seriner, treoniner og proliner, omfattende en rekke av decamer-repetisjoner bundet med clustere av sialylerte O-glykaner. Det uttykkes normalt som en homodimer med to disulfid-bundne subenheter med relative molekylvekter på omtrent 120 kDa av sirkulerende leukocytter. Bindingssetet for P-selektin er lokalisert ved den ytterste Nih-terminale delen av PSGL-1. Sialomucinet GPIba som uttrykkes ved blodplater og har strukturelle likheter med PSGL-1 ble nylig vist å være en blodplate-ligand for P-selektin (Romo et al., J Exp Med 190:803 (1999). De fysiologiske konsekvensene av binding av GPIba til P-selektin er fortsatt under utredning, interaksjonen bidrar imidlertid trolig til "rolling" og adherens av blodplater til aktiverte endotelceller (Berndt et al., Thromb Haemost 86:178 (2001). P-selektin binder også med lav affinitet til små sialylerte, fucosylerte oligosakkarider slik som sialyl Lewis x (Foxall et al., J Cell Biol 117:895 (1992), Varki, Curr Opin Cell Biol 257 (1992) og til bestemte sulfaterte karbohydrater, slik som heparinsulfat (McEver et al., J Biol Chem 270:11025

(1995).

Betegnelsen "antistoff omfatter de forskjellige formene av antistoffer, foretrukket monoklonale antistoffer omfattende men ikke begrenset til hele antistoffer, antistoffragmenter, humane antistoffer, humaniserte antistoffer, kimære antistoffer og genetisk konstruerte antistoffer (varianter eller muterte antistoffer) så lenge de karakteristiske egenskapene i henhold til oppfinnelsen er bibeholdt. Spesielt foretrukket er humane eller humaniserte monoklonale antistoffer, spesielt som rekombinante humane antistoffer.

Betegnelsene "monoklonalt antistoff eller "monoklonalt antistoff-blanding" som anvendt her refererer til en fremstilling av antistoffmolekyler med en enkelt aminosyresammensetning.

Betegnelsen "kimært antistoff refererer til et monoklonalt antistoff som omfatter en variabel region, dvs. bindende region, fra én kilde eller art og minst en del av en konstant region avledet fra en ulik kilde eller art, vanligvis fremstilt ved rekombinant DNA-teknikker. Kimære antistoffer omfattende en murin variabel region og en human konstant region er spesielt foretrukket. Slike murine/humane kimære antistoffer er produktet av uttrykte immunglobulingener omfattende DNA-segmenter som koder for murine immunglobulin variable regioner og DNA-segmenter som koder for humane immunglobulin konstante regioner. Andre former for "kimære antistoffer" er de hvor den konstante regionen har blitt modifisert eller endret fra den av det opprinnelige antistoffet for å frembringe de beskrevne egenskapene, spesielt med hensyn til Clq-binding og/eller Fc reseptor (FcR)-binding. Slike "kimære" antistoffer blir også referert til som "klasse-switchede antistoffer." Metoder for fremstilling av kimære antistoffer omfatter konvensjonelle rekombinant DNA og gentransfeksjonsteknikker nå velkjente på området. Se, feks. Morrison, S.L., et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 81 (1984) 6851-6855; US-patenter nr. 5,202,238 og 5,204,244.

Betegnelsen "humanisert antistoff angir antistoffer hvor strukturen ("framework") eller "komplementaritetsbestemmende regioner" (CDR) er modifisert til å omfatte CDR av et immunglobulin med ulik spesifisitet sammenlignet med den for det parentale immunglobulinet. I en foretrukket utførelsesform blir en murin CDR bundet til struktur ("framework")-regionen av et humant antistoff for å fremstille det "humaniserte antistoffet." Se, feks. Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327; og Neuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270. Spesielt foretrukne CDR'er svarer til de som representerer sekvenser som gjenkjenner antigenene angitt ovenfor for kimære og bifunksjonelle antistoffer. Andre former for "humaniserte antistoffer" er de hvor den konstante regionen har blitt modifisert eller endret fra den for det opprinnelige antistoffet for å frembringe egenskapene, spesielt med hensyn til Clq-binding og/eller Fc reseptor (FcR)-binding.

Betegnelsen "humant antistoff, som anvendt her, skal omfatte antistoffer som har variable og konstante regioner avledet fra human kjønnscelle immunglobulinsekvenser. Humane antistoffer er velkjente på området (van Dijk og van de Winkel, Curr Opin Pharmacol 5:368 (2001). Humane antistoffer kan også fremstilles i transgene dyr (feks. mus) som er i stand til, ved immunisering, å fremstille et fullstendig repertoar av humane antistoffer i fravær av endogen immunglobulinproduksjon. Overføring av den humane kjønnscelle immunglobulingen-samlingen til slik kjønnscellemutant mus vil føre til fremstilling av humane antistoffer ved provokasjon med antigen (se feks. Jakobovits et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 90: 2551-2555 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258

(1993); Bruggemann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993)). Humane antistoffer kan også fremstilles i fagdisplay-biblioteker (Hoogenboom og Winter, J. Mol. Biol., 227:381

(1992); Marks et al., J. Mol. Biol, 222:581 (19991)). Teknikkene ifølge Cole et al. og Boerner et al. er også tilgjengelige for fremstilling av humane monoklonale antistoffer (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, s. 77 (1985) og Boerner et al., J. Immunol., 147(l):86-95 (1991)). Som allerede nevnt for kimære og humaniserte antistoffer omfatter betegnelsen "humant antistoff som anvendt heri også slike antistoffer som blir modifisert i den konstante regionen for å frembringe egenskapene, spesielt med hensyn til Clq-binding og/eller FcR-binding. I tillegg omfatter beskrivelsen humane antistoffer som binder til Clq og/eller FcR Slike humane antistoffer erkarakterisert veden høy selektivitet for P-selektin vs. E- og L-selektin. Slike antistoffer ifølge oppfinnelsen binder til P-selektinuttrykkende celler med ECso-verdier i området 0,01 og 0,07(xg/ml. ECso-verdier for E-selektin og L-selektinuttrykkende celler er fortrinnsvis høyere enn 100 ug/ml. Slike antistoffer er foretrukket anvendelige som intermediater for fremstilling av humane antistoffer med egenskapene ifølge beskrivelsen.

Betegnelsen "rekombinant humant antistoff, som anvendt her, skal omfatte alle humane antistoffer som fremstilles, uttrykkes, dannes eller isoleres ved rekombinante metoder, slik som antistoffer isolert fra en vertscelle slik som en NS0 eller CHO-celle eller fra et dyr (feks. en mus) som er transgen for humane immunglobulingener eller antistoffer uttrykt ved anvendelse av en rekombinant ekspresjonsvektor transfektert inn i en vertscelle. Slike rekombinante humane antistoffer har variable og konstante regioner i en rearrangert form. De rekombinante humane antistoffene ifølge oppfinnelsen blir underlagt in vivo somatisk hypermutasjon. Følgelig er aminosyresekvensene av VH og VL-regionene av de rekombinante antistoffene sekvenser som, selv om de er avledet fra og relatert til human kjønnscelle VH og VL-sekvenser, ikke naturlig kan eksistere innenfor det humane antistoff kjønnscelle-repertoaret in vivo.

Den "variable regionen" (variabel region av en lett kjede (VL), variabel region av en tung kjede (VH)) som anvendt her betyr hvert av paret av lette og tunge kjeder som er direkte involvert i binding av antistoffet til antigenet. Domenene av variable humane lette og tunge kjeder har samme generelle struktur og hvert domene omfatter fire struktur ("framework") (FR)-regioner hvis sekvenser er sterkt konservert, forbundet av tre "hypervariable regioner" (eller komplementaritetsbestemmende regioner, CDR'er). Struktur ("framework")-regionene inntar en P-sheet-konformasjon og CDR'ene kan danne løkker som forbinder P-sheet-strukturen. CDR'ene i hver kjede blir holdt i deres tredimensjonale struktur av struktur ("framework")-regionene og danner sammen med CDR'ene fra den andre kjeden det antigenbindende setet. Antistoffets tung og lett kjede CDR3-regioner har en spesielt viktig funksjon når det gjelder bindingsspesifisiteten/affiniteten av de beskrevne antistoffene og tilveiebringer derfor et ytterligere formål som beskrevet.

Betegnelsene "hypervariabel region" eller "antigenbindende del av et antistoff" når anvendt her refererer til aminosyrerestene av et antistoff som er ansvarlig for antigenbinding. Den hypervariable regionen omfatter aminosyrerester fra de "komplementaritetsbestemmende regionene" eller "CDR'ene". "Struktur" ("framework") eller "FR"-regioner er de variable domene-regionene forskjellig fra de hypervariable region-restene som definert heri. Derfor omfatter de lette og tunge kjedene av et antistoff fra N- til C-terminal ende domenene FRI, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 og FR4. Spesielt er CDR3 fra den tunge kjeden den regionen som bidrar mest til antigenbinding. CDR og FR-regionene blir bestemt i henhold til standard-definisjon ifølge Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) og/eller restene fra en "hypervariabel løkke".

Betegnelsen "nukleinsyre eller nukleinsyremolekyl", som anvendt her, skal omfatte DNA-molekyler og RNA-molekyler. Et nukleinsyremolekyl kan være enkeltrådet eller dobbeltrådet, men er foretrukket dobbeltrådet DNA.

En nukleinsyre er "operabelt bundet" når den er plassert i en funksjonell forbindelse med en annen nukleinsyresekvens. For eksempel er DNA for en presekvens eller sekretorisk leder operabelt bundet til DNA for et polypeptid dersom det uttrykkes som et preprotein som tar del i sekresjonen av polypeptidet; en promoter eller enhancer er operabelt bundet til en kodende sekvens dersom den påvirker transkripsjonen av sekvensen; eller et ribosombindingssete er operabelt bundet til en kodende sekvens dersom det er plassert slik at det letter translasjonen. Generelt betyr "operabelt bundet" at DNA-sekvensene som er forbundet er tilgrensende og, i tilfellet av en sekretorisk leder, påfølgende og i leseramme. Enhancere behøver imidlertid ikke være tilgrensende. Sammenkobling oppnås ved ligering ved passende restriksjonsseter. Hvis slike seter ikke finnes, anvendes syntetiske oligonukleotidadaptere eller linkere i henhold til konvensjonell praksis.

Som anvendt heri anvendes uttrykkene "celle," "cellelinje," og "cellekultur" om hverandre og alle slike betegnelser omfatter avkom. Følgelig omfatter ordene "transformanter" og "transformerte celler" den primære aktuelle cellen og kulturer avledet derfra uten hensyn til antall transformasjoner. Det er også forstått at alle avkom ikke kan være nøyaktig identiske med hensyn til DNA-innhold, på grunn av tilsiktede eller utilsiktede mutasjoner. Varianter av avkom som har samme funksjon eller biologiske aktivitet som screenet for i den opprinnelige transformerte cellen er omfattet. Når særskilte angivelser er tilsiktet, vil det være tydelig fra sammenhengen.

De "konstante domenene" er ikke direkte involvert i binding av et antistoff til et antigen, men fremviser forskjellige effektorfunksjoner. Avhengig av aminosyresekvensen av den konstante regionen av deres tunge kjeder, er antistoffer eller immunglobuliner delt inn i klassene: IgA, IgD, IgE, IgG og IgM og mange av disse kan være ytterligere delt opp i subklasser (isotyper), feks. IgGl, IgG2, IgG3 og IgG4, IgAl og IgA2. De tunge kjede konstante regionene som svarer til de forskjellige klassene av immunglobuliner er betegnet □ , □, □□□□□og □, henholdsvis. Antistoffene ifølge beskrivelsen er fortrinnsvis av IgG-type.

Fc-delen av et antistoff er direkte involvert i komplementaktivering, Clq-binding og Fc-reseptorbinding. Mens innvirkningen av et antistoff på komplementsystemet er avhengig av visse betingelser, er binding til Clq bevirket ved definerte bindingsseter i Fc-delen. Slike bindingsseter er kjent på området og beskrevet feks. av Boakle et al., Nature 282 (1975) 742-743, Lukas et al, J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560, Brunhouse og Cebra, Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917, Burton et al., Nature 288 (1980) 338-344, Thommesen et al, Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004, Idusogie et al., J. Immunol, 164

(2000) 4178-4184, Hezareh et al, J. Virology 75 (2001) 12161-12168, Morgan et al., Immunology 86 (1995) 319-324, EP 0307434. Slike bindingsseter er feks. L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 og P329 (nummerering i henhold til EU-indeks ifølge Kabat, se nedenfor). Antistoffer av subklasse IgGl, IgG2 og IgG3 oppviser vanligvis komplementaktivering og Clq og C3-binding, mens IgG4 ikke aktiverer komplementsystemet og ikke binder Clq og C3. Som anvendt her betyr betegnelsen "Fe-del av human opprinnelse" en Fc-del som er enten en Fc-del av et humant antistoff av subklassen IgG4 eller en Fc-del av et humant antistoff av subklassen IgGl, IgG2 eller IgG3 som er modifisert på en slik måte at ingen Clq-binding og/eller FcR-binding som definert nedenfor kan detekteres. En "Fc-del av et antistoff er en betegnelse velkjent for fagfolk og definert på basis av spalting av antistoffer med papain. Antistoffene ifølge oppfinnelsen inneholder som Fc-del en Fc-del som stammer fra human opprinnelse og fortrinnsvis alle andre deler av de humane konstante regionene. Fc-delen er foretrukket en human Fc-del og spesielt foretrukket enten fra human IgG4 subklasse.

Mest foretrukket er Fc-delene og de tunge kjede konstante regionene vist i SEKV ID NR: 28.

n. Foretrukne utførelsesformer ifølge oppfinnelsen

Foretrukne antistoffer ifølge oppfinnelsen erkarakterisert vedat den variable tung kjede aminosyresekvensen CDR3 av nevnte antistoff er tung kjede CDR3-sekvensene SEKV ID NR: 39.

Foretrukne antistoffer ifølge oppfinnelsen omfatter en variabel tung kjede og en variabel lett kjede,karakterisert vedat den variable tunge kjeden omfatter CDR-sekvensene CDR1, CDR2 og CDR3 og CDR1 er SEKV ID NR: 30, CDR2 er SEKV ID NR: 34, CDR3 er SEKV ID NR: 39, hvor nevnte CDR'er velges uavhengig av hverandre.

Antistoffet ifølge oppfinnelsen er fortrinnsviskarakterisert vedat den variable tunge kjeden omfatter CDR-sekvensene CDR1, CDR2 og CDR3 og CDR1 er SEKV ID NR: 43, CDR2 er valgt fra SEKV ID NR: 45og CDR3 er SEKV ID NR: 48, hvor nevnte CDR'er velges uavhengig av hverandre.

Antistoffet er fortrinnsviskarakterisert vedat det inneholder som tung kjede CDR'er CDR'ene ifølge SEKV ID NR: 4 og som lett kjede CDR'er CDR'ene ifølge SEKV ID NR: 3.

CDR-sekvensene kan bestemmes i henhold til standarddefinisjonen ifølge Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). CDR'er på hver kjede er separert av struktur ("framework")-aminosyrer. CDR'er ifølge SEKV ID NR: 1-22 er vist i SEKV ID NR: 29-52.

Antistoffet ifølge oppfinnelsen er fortrinnsviskarakterisert vedat nevnte antistoff binder P-selektin og omfatter en variabel tung og lett region valgt fra tungkjede variabelt domene definert ved aminosyreselvens SEKV ID NR: 4 og lettkjede variabelt domene definert ved aminosyresekvens SEKV ID NR: 3. Også beskrevet er antistofferkarakterisert vedat disse antistoffene binder P-selektin og omfatter et variabel tung- og lettkjede domene uavhengig valgt fre gruppen bestående av

a) tung kjede variabelt domene definert ved aminosyresekvens SEKV ID NR:2 og lett kjede variabelt domene definert ved SEKV ID NR: 1; b) tung kjede variabelt domene definert ved aminosyresekvens SEKV ID NR:6 og lett kjede variabelt domene definert ved SEKV ID NR:5; c) tung kjede variabelt domene definert ved aminosyresekvens SEKV ID NR:8 og lett kjede variabelt domene definert ved SEKV ID NR:7; d) tung kjede variabelt domene definert ved aminosyresekvens SEKV ID NR: 10 og lett kjede variabelt domene definert ved SEKV ID NR:9; e) tung kjede variabelt domene definert ved aminosyresekvens SEKV ID NR: 12 og lett kjede variabelt domene definert ved SEKV ID NR: 11; f) tung kjede variabelt domene definert ved aminosyresekvens SEKV ID NR: 14 og lett kjede variabelt domene definert ved SEKV ID NR: 13; g) tung kjede variabelt domene definert ved aminosyresekvens SEKV ID NR: 16 og lett kjede variabelt domene definert ved SEKV ID NR: 15; h) tung kjede variabelt domene definert ved aminosyresekvens SEKV ID NR: 18 og lett kjede variabelt domene definert ved SEKV ID NR: 17;

i) tung kjede variabelt domene definert ved aminosyresekvens SEKV ID NR:20 og lett kjede variabelt domene definert ved SEKV ID NR: 19;

j) tung kjede variabelt domene definert ved aminosyresekvens SEKV ID NR:22 og lett kjede variabelt domene definert ved SEKV ID NR:21.

Antistoffet ifølge oppfinnelsen er foretrukketkarakterisert vedat den tunge kjede variable regionen omfatter en aminosyresekvens av SEKV ID NR: 4.

Antistoffet ifølge oppfinnelsen er foretrukketkarakterisert vedat den lette kjede variable regionen omfatter en aminosyresekvens av SEKV ID NR: 3.

Antistoff som binder til P-selektin og ikke binder til komplementfaktor Clq og/ eller Fc-reseptor er beskrevet. Disse antistoffene fremkaller ikke komplementavhengig cytotoksisitet (CDC) og/eller antistoffavhengig cellulær cytotoksisitet (ADCC). Dette antistoffet er foretrukketkarakterisert vedat det binder til P-selektin, inneholder en Fc-del av human opprinnelse og ikke binder komplementfaktor Clq. Mer foretrukket er dette antistoffet et humant eller humanisert antistoff.

Antistoffet beskrevet her er foretrukketkarakterisert vedat de konstante kjedene er av human opprinnelse. Slike konstante kjeder er velkjente på området og er feks. beskrevet av Kabat (se feks. Johnson, G. og Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218). For eksempel omfatter en anvendelig human tung kjede konstant region en aminosyresekvens uavhengig valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR: 28. For eksempel omfatter en anvendelig human lett kjede konstant region en aminosyresekvens av en kappa-lett kjede konstant region ifølge SEKV ID NR: 23.

Effektorfunksj onene mediert av Fc-delen av antistoffets Fc-region refererer til effektorfunksjoner som opererer etter bindingen av et antistoff til et antigen (disse funksjonene omfatter aktivering av komplementkaskaden og/eller celleaktivering ved en Fc-reseptor (FcR)).

Funksjonen av komplementkaskaden kan bedømmes ved CH50-analysen. Røde blodceller fra sau sensibilisert med anti-rød blodcelle-antistoffer (EA) blir tilsatt til testserum for å aktivere den klassiske overføringsbanen ("pathway") som fører til hemolyse. Volumet av serum som er nødvendig for å lysere 50% av de røde blodcellene bestemmer CH50-enheten. AP-CH50 måler de alternative og de terminale overføringsbanene. Metoden er lik bortsett fra at røde blodceller fra kanin anvendes. Den alternative overføringsbanen aktiveres ved tilsetning av testserum.

Clq og to serinproteaser, Cl r og Cl s, danner komplekset Cl, den første komponenten i komplementavhengig cytotoksisitet (CDC)-overføringsbanen. For å aktivere komplementkaskaden binder Cl q til minst to molekyler av IgGl eller ett molekyl av IgM, bundet til det antigene målet (Ward og Ghetie, Therapeutic Immunology 2:77-94 (1995)). Burton beskrev (Molec. Immunol, 22(3):161-206 (1985)) at tung kjede-regionen omfattende aminosyrerestene 318 til 337 er involvert i komplementfiksering. Duncan og Winter rapporterte (Nature 332:738-40 (1988)), ved anvendelse av seterettet mutagenese, at Glu318, Lys320 og Lys322 danner bindingssetet for Clq. Funksjonen av restene Glu318, Lys320 og Lys 322 ved binding av Clq ble bekreftet ved evnen av et kort syntetisk peptid inneholdende disse restene til å hemme komplementmediert ly sis.

Betegnelsen "komplementavhengig cytotoksisitet (CDC)" refererer til lysis av P-selektinuttrykkende humane endotelceller og blodplater ved antistoffet ifølge oppfinnelsen i nærvær av komplement. CDC måles foretrukket ved behandling av P-selektinuttrykkende humane endotelceller og blodplater med et antistoff ifølge oppfinnelsen i nærvær av komplement. Cellene blir foretrukket merket med calcein. CDC er funnet dersom antistoffet induserer lysis av 20% eller mer av målcellene ved en konsentrasjon på 30 □ g/ml. Imidlertid er det funnet at for egenskapene av antistoffene beskrevet her er redusert binding til komplementfaktoren Clq i en ELISA-analyse nødvendig. I en slik analyse blir i prinsippet en ELISA-plate belagt med konsentrasjonsområder av antistoffet, til hvilket renset humant Clq eller humant serum blir tilsatt. Clq-binding blir detektert ved et antistoff rettet mot Clq etterfulgt av et peroksidasemerket konjugat. Deteksjon av binding (maksimal binding Bmaks) blir målt som optisk tetthet ved 405 nm (OD405) for peroksidasesubstrat ABTS (2,2'-Azino-di-[3-etylbenztiazolin-6-sulfonat (6)]. Følgelig angår foreliggende oppfinnelse et antistoff,karakterisert vedat "ikke-binding" av antistoffet til komplementfaktor Clq angir en slik ELISA-analysemåling hvor den maksimale bindingen (Bmaks) av Clq til antistoffet ved en konsentrasjon på 10 ug/ml av antistoffet er < 30% av Bmaks for antistoffet LC 1004-002 for cellelinje hu-Mab<P-selektin>LC 1004-002 (DSM ACC2641).fortrinnsvis 20% eller lavere.

Det er videre foretrukket at et antistoff beskrevet her oppviser en redusert binding til komplementfaktor C3 i en ELISA-analyse. Analysen utføres på samme måte som Clq-analysen. I en slik analyse blir i prinsippet en ELISA-plate belagt med konsentrasjonsområder av antistoffet, til hvilket renset humant C3 eller humant serum blir tilsatt. C3-binding blir detektert ved et antistoff rettet mot C3 fulgt av et peroksidasemerket konjugat. Deteksjon av binding (maksimal binding Bmaks) blir målt som optisk tetthet ved 405 nm (OD405) for peroksidasesubstrat ABTS (2,2'-Azino-di-[3-etylbenztiazolinsulfonat (6)]. Følgelig angår beskrivelsen et antistoff,karakterisert vedat "ikke-binding" av antistoffet til komplementfaktor C3 angir en slik ELISA-analysemåling hvor den maksimale bindingen (Bmaks) av C3 til antistoffet i en konsentrasjon på 10 ug/ml av antistoffet er 10% av Bmaks for antistoff LC 1004-002 for cellelinje hu-Mab<P-selektin>LC 1004-002 (DSM ACC2641)., fortrinnsvis 5% eller lavere.

Betegnelsen "antistoffavhengig cellulær cytotoksisitet (ADCC)" er en funksjon mediert ved Fc-reseptorbinding og refererer til lysis av P-selektinuttrykkende målceller ved et antistoff ifølge beskrivelsen i nærvær av effektorceller. ADCC måles foretrukket ved behandling av en fremstilling av P-selektinuttrykkende endotelceller med et antistoff ifølge oppfinnelsen i nærvær av effektorceller slik som nylig isolerte PBMC (perifere blod mononukleære celler) eller rensede effektorceller fra buffy coats, som monocytter eller NK (naturlige dreperceller)-celler. Målceller blir merket med<51>Cr og deretter inkubert med antistoffene. De merkede cellene blir inkubert med effektorceller og supernatanten blir analysert for frigjort<51>Cr. Kontroller omfatter inkubering av mål-endotelcellene med effektorceller men uten antistoffet. Kapasiteten av antistoffene til å indusere de initielle trinnene som medierer ADCC ble bestemt ved å måle deres binding til Fcy-reseptoruttrykkende celler, slik som granulocytter (som uttrykker FcyRII og RUI), NK-celler (som uttrykker FcyRIII) og monocytter (som uttrykker FcyRI og RU).

Effektorfunksjoner for Fc-reseptorbinding kan medieres ved interaksjonen av Fc-regionen av et antistoff med Fc-reseptorer (FcR), som er spesialiserte celleoverflate-reseptorer på hematopoetiske celler. Fc-reseptorer tilhører immunglobulin-superfamilien og er vist å mediere både fjerning av antistoffbelagte patogener ved fagocytose av immunkomplekser og lysis av erytrocytter og forskjellige andre cellulære mål (feks. tumorceller) belagt med det tilsvarende antistoffet, via antistoffavhengig cellemediert cytotoksisitet (ADCC). Van de Winkel og Anderson, J. Leuk. Biol. 49:511-24 (1991). FcR'er er definert ved deres spesifisitet for isotyper av immunglobulin; Fc-reseptorer for IgG-antistoffer er referert til som FcDR, for IgE som FcDR, for IgA som FcDR og så videre. Fc-reseptorbinding er beskrevet feks. i Ravetch og Kinet, Ann. Rev. Immunol. 9

(1991) 457-492, Capel et al., Immunomethods 4 (1994) 32-34, de Haas et al., J. Lab. Clin.

Med. 126 (1995) 330-341 og Gessner et al, Ann. Hematol. 76 1998) 231-248. Antistoffene beskrevet her oppviser foretrukket en redusert binding til FcD □ reseptorer, foretrukket til FDcRI, -TJA, -UB og/ eller IJJA.

Antistoffene beskrevet her fremkaller foretrukket ikke noen som helst effektorfunksjon og binder ikke til FcDR presentert på NK-celler. Betegnelsen "ingen binding av FcDR" betyr derfor at ved en antistoffkonsentrasjon på 10ug/ml er bindingen av et antistoff ifølge oppfinnelsen til NK-celler 1% eller mindre av bindingen funnet for antistoff LC 1004-002 fra cellelinje hu-Mab<P-selektin>LC 1004-002 (DSM ACC2641).

Mens IgG4 oppviser redusert FcR-binding, oppviser antistoffer av andre IgG subklasser sterk binding. Imidlertid er Pro238, Asp265, Asp270, Asn297 (tap av Fc karbohydrat), Pro329 og 234, 235, 236 og 237 Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434 og His435 rester som dersom endret også gir redusert FcR-binding (Shields et al. J. Biol. Chem. 276 (2001), 6591-6604, Lund et al. FASEB J. 9 (1995), 115-119, Morgan et al. Immunology 86 (1995) 319-324, EP 0307434 ). Foretrukket er et antistoff beskrevet her med hensyn til FcR-binding av IgG4 subklasse med en mutasjon i S228 og/eller L235. Spesielt foretrukket er mutasjonene S228P (IgG4) og/eller L235E (IgG4) Foretrukne kombinasjoner av mutasjoner er også vist i tabell 1.

Betegnelsen "binding til P-selektin" som anvendt her betyr bindingen av antistoffet til P-selektin i enten en BIAcore-analyse (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sverige) eller i en ELISA hvor enten renset P-selektin eller P-selektin CHO-transfektanter er belagt på mikrotiterplater.

I BIAcore-analysen er antistoffet bundet til en overflate og binding av P-selektin blir målt ved overflate plasmonresonans (SPR). Affiniteten av bindingen er definert ved betegnelsene ka (hastighetskonstant for assosiering av antistoffet fra antistoffet/antigenkomplekset), kd (dissosiasjonskonstant) og Kd(kd/ka). Antistoffene beskrevet her oppviser en Kdpå10"<8>eller mindre, fortrinnsvis på ca. 10"11til IO"<9>M (se eksempler). Følgelig angår beskrivelsen et antistoff som beskrevet ovenfor, hvor antistoffet binder til P-selektin med en Ko-verdi på mindre enn 10"<8>M i en BIAcore-analyse, foretrukket hvor Ko-området er 10"<11>til IO"9 M.

Foretrukket er antistoffet av IgG4 human subtype.

Mer foretrukket er antistoffetkarakterisert vedat antistoffet er et antistoff av human subklasse IgG4, inneholdende minst én mutasjon i L235 og S228 (nummerering i henhold til EU-indeks).

I P-selektinspesifikk ELISA blir renset P-selektin belagt på mikrotiterplater og binding av antistoffet til P-selektin blir detektert med et biotinylert anti-humant IgG og de vanlige trinnene i en ELISA. ECso-verdiene i dette analyseområdet varierer foretrukket fra 0,002 og 0,03 ug/ml for P-selektin CHO-celler, dvs. foreliggende oppfinnelse angår antistoffer, hvor EC50-verdiene for P-selektinbinding er i området 0,002 til 0,03 Dg/ml på P-selektinpres enter ende CHO-celler i en ELISA-analyse. I en analyse hvor P-selektinuttrykkende CHO-transfektanter er belagt på mikrotiterplaten, spenner EC50-verdiene fra mellom 0,01 og 0,08 (xg/ml, foretrukket mellom 0,01 og 0,04 (xg/ml.

ECso-verdier for E- og L-selektin-transfektanter er fortrinnsvis høyere enn 100 ug/ml. Antistoffene ifølge oppfinnelsen erkarakterisert vedat de binder minst 1000 ganger mer spesifikt til P-selektin enn til E- og/eller L-selektin som målt ved ECso-verdier i en ELISA-analyse, hvor P- og E- og/eller L-selektin er belagt på mikrotiterplaten.

Betegnelsen "hemme bindingen av P-selektin-liganden til P-selektin" som anvendt her refererer til bindingen av renset eller celle-uttrykt P-selektin til dens ligand presentert på HL60-celler. Bindingen av P-selektin til dens ligand hemmes av antistoffene beskrevet her. Hemmingen blir målt som ICso i in vitro-analyse ved analysering av kapasiteten av antistoffet til å hemme binding av P-selektin til en ligand. Slike analyser er beskrevet i eksemplene. De anvender som egnede kilder for P-selektin affinitetsrenset P-selektin og aktiverte blodplater og som egnede kilder for ligand leukocyttlignende celler, slik som HL60-celler. I slike analyser blir adhesjonen av HL60-celler, som uttrykker PSGL-1 som den fysiologisk relevante liganden for P-selektin, til P-selektin eller aktiverte blodplater målt uten og med økende konsentrasjoner av antistoffet. ICso-verdiene blir målt som gjennomsnittlige verdier av minst tre uavhengige målinger. Hemmende betyr en ICso-verdi på ikke mer enn 1 (xg/ml, fortrinnsvis 0,5 til 0,08 (xg/ml.

Antistoffene ifølge beskrivelsen hemmer adhesjonen av leukocytt-lignende HL60-celler til renset P-selektin med IC50-verdier i området 0,08 til 0,5 ug/ml, fortrinnsvis 0,08 til - 0,11 ug/ml. Adhesjonen av leukocyttlignende HL60-celler til aktiverte blodplater blir hemmet med IC50-verdier i området 0,05 til 0,3 ug/ml.

Følgelig angår ytterligere utførelsesformer av beskrivelsen antistoffer,karakterisert vedat EC50-verdiene for P-selektinbinding er i området 0,01 til 0,08 Dg/ml i en ELISA-analyse hvor P-selektin-uttrykkende CHO-transfektanter er belagt på mikrotiterplaten. Det foretrukne området er 0,01 til 0,04 Dg/ml. EC50-verdiene for E- og L-selektintransfektanter er høyere enn 100 Dg/ml. I en ytterligere utførelsesform hemmer antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse adhesjonen av leukocytt-lignende HL60-celler til renset P-selektin med IC50-verdier på mellom 0,08 til 0,5 Dg/ml. Det foretrukne området er 0,08 til 0,11 Dg/ml.

Antistoffene ifølge beskrivelsen hemmer interaksjonen av leukocytter med et monolag av blodplater ved fortrinnsvis mer enn 70% i et fullstendig humant flytsystem (i en konsentrasjon på 10 ug/ml). I tillegg hemmer disse antistoffene adhesjonen av leukocytter til aktiverte endotelceller i et humant flytsystem i området 60-90 % ved en konsentrasjon på 3 ug/ml (med forskjellige effekter på leukocytt subtyper).

Antistoffene ifølge beskrivelsen er foretrukket i stand til å binde til P-selektin i nærvær av P-selektinfragmentet aa 60-75 (Swiss-Prot sekvens Pl6109) og/eller hemmer ikke-kompetitivt bindingen av et antistoff utskilt av en cellelinje betegnet ATCC Aksesjonsnummer HB 11041 til P-selektin.

Antistoffene beskrivelsen hemmer foretrukket ikke interaksjonen av P-selektin med blodplate membran glykoprotein GPIba i et ELISA-analyseformat. I ELISA glykocalicin, ble den løselige ekstracellulære delen av GPIba immobilisert i brønnene av mikrotiterplater, som beskrevet (Romo et al., J Exp Med 190:803 (1999) og bindingen av renset P-selektin etter preinkubering med P-selektin HuMabs ble detektert med et polyklonalt anti-P-selektinantistoff.

I en ytterligere foretrukket beskrevet utførelsesform, er antistoffetkarakterisert vedat ikke binder til C3-proteinet, mer foretrukketkarakterisert vedat det ikke fremkaller komplementavhengig cytotoksisitet (CDC). Videre kan antistoffet karakteriseres ved at det ikke binder til Fcy-reseptorer på NK-effektorceller. Foretrukket er antistoffetkarakterisertved at det er et antistoff av human subklasse IgG4, inneholdende minst én mutasjon i L235 og S228 (nummerering i henhold til EU-indeks). I en ytterligere foretrukket utførelsesform, er antistoffetkarakterisert vedat det ikke fremkalle antistoffavhengig cellulær cytotoksisitet (ADCC).

I en enda mer foretrukket utførelsesform, er de beskrevne antistoffenekarakterisert vedat de binder til P-selektin og at de omfatter en variabel region uavhengig valgt fra gruppen bestående av

a) lett kjede variabelt domene definert ved aminosyresekvens SEKV ID NR:1 og tung kjede variabelt domene definert ved SEKV ID NR:2; b) lett kjede variabelt domene definert ved aminosyresekvens SEKV ID NR:3 og tung kjede variabelt domene definert ved SEKV ID NR:4; c) lett kjede variabelt domene definert ved aminosyresekvens SEKV ID NR:5 og tung kjede variabelt domene definert ved SEKV ID NR:6; d) lett kjede variabelt domene definert ved aminosyresekvens SEKV ID NR:7 og tung kjede variabelt domene definert ved SEKV ID NR: 8; e) lett kjede variabelt domene definert ved aminosyresekvens SEKV ID NR:9 og tung kjede variabelt domene definert ved SEKV ID NR: 10; f) lett kjede variabelt domene definert ved aminosyresekvens SEKV ID NR: 11 og tung kjede variabelt domene definert ved SEKV ID NR: 12; g) lett kjede variabelt domene definert ved aminosyresekvens SEKV ID NR: 13 og tung kjede variabelt domene definert ved SEKV ID NR: 14; h) lett kjede variabelt domene definert ved aminosyresekvens SEKV ID NR: 15 og tung kjede variabelt domene definert ved SEKV ID NR: 16;

i) lett kjede variabelt domene definert ved aminosyresekvens SEKV ID NR: 17 og

tung kjede variabelt domene definert ved SEKV ID NR: 18;

j) lett kjede variabelt domene definert ved aminosyresekvens SEKV ID NR: 19 og

tung kjede variabelt domene definert ved SEKV ID NR:20; og

k) lett kjede variabelt domene definert ved aminosyresekvens SEKV ID NR:21 og tung kjede variabelt domene definert ved SEKV ID NR:22.

Antistoffene omfatter foretrukket lett kjede variabelt domene definert ved aminosyresekvens SEKV ID NR: 3 og tung kjede variabelt domene definert ved SEKV ID NR:4.

De foretrukne antistoffene erkarakterisert vedat antistoffene er av human IgG4 subklasse. Disse variantene av antistoffer omfatter for eksempel aminosyresekvensen av SEKV ID NR:28.

En "variant" av anti-P-selektinantistoff, refererer her til et molekyl som avviker i aminosyresekvens fra en "parental" anti-P-selektinantistoff-aminosyresekvens i kraft av addisjon, delesjon og/eller substitusjon av én eller flere aminosyrerester i den parentale antistoffsekvensen. I den foretrukne utførelsesformen omfatter varianten én eller flere aminosyresubstitusjoner i én eller flere konstante eller variable regioner av det parentale antistoffet, fortrinnsvis i den konstante regionen. For eksempel kan varianten omfatte minst én, feks. fra omtrent én til omtrent ti og foretrukket fra omtrent to til omtrent fem, substitusjoner i én eller flere variable regioner av det parentale antistoffet. Vanligvis vil varianten ha en aminosyresekvens som har minst 90% aminosyresekvensidentitet med det parentale antistoffets konstante og/eller variable domene-sekvenser, mer foretrukket minst 95% og mest foretrukket minst 99%.

Identitet eller homologi med hensyn til denne sekvensen er definert her som prosentdelen av aminosyrerester i kandidatsekvensen som er identisk med de parentale antistoffrestene, etter sammenstilling av sekvensene og innføring av gaps, om nødvendig, for å oppnå maksimal prosent sekvensidentitet. Ingen av N-terminale, C-terminale eller indre utvidelser, delesjoner eller insersjoner inn i antistoffsekvensen skal oppfattes å påvirke sekvensidentitet eller homologi. Varianten beholder evnen til å binde til humant P-selektin og har foretrukket egenskaper, som er bedre enn de for det parentale antistoffet. For eksempel kan varianten ha en sterkere bindingsaffinitet, forbedret evne til å behandle en sykdom forbundet med kritisk iskemi i bena eller perifer arterieokklusiv sykdom

(CLI/PAOD).

Varianter av antistoffet av spesiell interesse heri er ett som oppviser minst ca. 4 ganger, forbedring i hemmende aktivitet i adhesjonsanalysen sammenlignet med det parentale antistoffet på grunn av eliminering av bindingen til Fcy-reseptorene.

Det "parentale"-antistoffet her er et, som er kodet for av en aminosyresekvens anvendt for fremstilling av varianten. Foretrukket har det parentale antistoffet en human struktur ("framework")-region og har, dersom til stede, humant antistoff konstant region(er). For eksempel kan det parentale antistoffet være et humanisert eller humant antistoff.

Antistoffene beskrevet her omfatter, i tillegg, slike antistoffer som har "konservative sekvensmodifikasjoner", nukleotid og aminosyresekvensmodifikasjoner, som ikke påvirker eller endrer ovennevnte egenskaper av antistoffet ifølge oppfinnelsen. Modifikasjoner kan innføres ved standardteknikker kjent på området, slik som seterettet mutagenese og PCR-mediert mutagenese. Konservative aminosyresubstitusjoner omfatter slike hvor aminosyreresten blir erstattet med en aminosyrerest som har en lignende sidekjede. Familier av aminosyrerester som har lignende sidekjeder er definert på området. Disse familiene omfatter aminosyrer med basiske sidekjeder (feks. lysin, arginin, histidin), sure sidekjeder (feks. asparaginsyre, glutaminsyre), uladede polare sidekjeder (feks. glysin, asparagin, glutamin, serin, treonin, ty rosin, cy stein, tryptofan), ikke-polare sidekjeder (feks. alanin, valin, leucin, isoleucin, prolin, fenylalanin, metionin), beta-forgrenede sidekjeder (feks. treonin, valin, isoleucin) og aromatiske sidekjeder (feks. tyrosin, fenylalanin, tryptofan, histidin). Følgelig kan en predikert ikke-essensiell aminosyrerest i et humant anti-P-selektinantistoff foretrukket erstattes med en annen aminosyrerest fra samme familie av sidekjeder.

Aminosyresubstitusjoner kan gjennomføres ved mutagenese basert på molekylær modellering som beskrevet av Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327 og Queen, C, et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 86 (1989) 10029-10033.

I en ytterligere foretrukket utførelsesform omfatter antistoffene en D-lett kjede konstant region som definert ved SEKV ID NR: 23.

Foretrukne antistoffer ifølge oppfinnelsen er antistoffer definert som IgG4vl (S228P; L235E).

I en ytterligere foretrukket utførelsesform omfatter disse antistoffene også antistoffragmenter valgt fra gruppen bestående av Fab, F(ab')2og enkeltkjede-fragmenter.

Oppfinnelsen omfatter videre en fremgangsmåte for fremstilling av et antistoff beskrevet her omfattende trinnene a) transformere en vertscelle med en første nukleinsyresekvens som koder for en lett kjede av et parentalt humant antistoff beskrevet her og en andre DNA-sekvens som koder for en tung kjede av nevnte parentale humane antistoff hvor Fc-delen er modifisert slik at nevnte Fc-del ikke binder til komplementfaktor Clq og/ eller Fc-reseptor; b) uttrykke nevnte første og andre DNA-sekvens slik at tunge og lette kjeder av nevnte antistoff blir produsert og c) utvinne nevnte antistoff fra vertscellen eller vertscellekulturen.

Beskrivelsen angår også intermediære antistoffer, dvs. anti-P-selektinantistofferkarakterisert vedat disse antistoffene er humane eller humaniserte antistoffer og binder minst 1000 ganger mer spesifikt til P-selektin enn til E- eller L-selektin som målt i en ELISA-analyse hvor P- og E- og/eller L-selektin er belagt på mikrotiterplaten. Disse antistoffene er foretrukket IgG4-antistoffer. Spesielt refererer disse antistoffene til antistoffene produsert av en cellelinje av hu-Mab<P-selektin>LC 1004-002 (DSM ACC2641)

Antistoffene beskrvet her omfatter, i tillegg, slike antistoffer som har "konservative sekvensmodifikasjoner", nukleotid og aminosyresekvens-modifikasjoner, som ikke påvirker eller endrer ovennevnte egenskaper av antistoffet beskrevet her. Modifikasjoner kan innføres ved standardteknikker kjent på området, slik som seterettet mutagenese og PCR-mediert mutagenese. Konservative aminosyresubstitusjoner omfatter slike hvor aminosyreresten blir erstattet med en aminosyrerest som har en lignende sidekjede. Familier av aminosyrerester som har lignende sidekjeder er definert på området. Disse familiene omfatter aminosyrer med basiske sidekjeder (feks. lysin, arginin, histidin), sure sidekjeder (feks. asparaginsyre, glutaminsyre), uladede polare sidekjeder (feks. glysin, asparagin, glutamin, serin, treonin, tyrosin, cystein, tryptofan), ikke-polare sidekjeder (feks. alanin, valin, leucin, isoleucin, prolin, fenylalanin, metionin), beta-forgrenede sidekjeder (feks. treonin, valin, isoleucin) og aromatiske sidekjeder (feks. tyrosin, fenylalanin, tryptofan, histidin). Følgelig kan en predikert ikke-essensiell aminosyrerest i et humant anti-P-selektinantistoff foretrukket erstattes med en annen aminosyrerest fra samme familie av sidekjeder.

Beskrivelsen omfatter også nukleinsyremolekyler som koder for et antistoff nevnt ovenfor, de korresponderende vektorene omfattende disse nukleinsyrene og de korresponderende vertscellene for disse vektorene. Beskrivelsen omfatter en fremgangsmåte for fremstilling av antistoffene omfattende dyrking av de korresponderende vertscellene under betingelser som tillater syntese av nevnte antistoffmolekyler og utvinne nevnte antistoffer fra nevnte kultur, feks. ved å uttrykke en nukleinsyre som koder for en tung kjede og en nukleinsyre som koder for en lett kjede i en prokaryot eller eukaryot vertscelle og utvinne nevnte polypeptid fra nevnte celle.

Diagnostiske og terapeutiske anvendelser av antistoffet er omfattet. Ved én diagnostisk anvendelse tilveiebringer beskrivelsen en fremgangsmåte for å bestemme tilstedeværelsen av P-selektinproteinet omfattende eksponering av en prøve mistenkt for å inneholde P-selektin for anti-P-selektinantistoffet og bestemme binding av antistoffet til prøven. For denne anvendelsen tilveiebringer beskrivelsen et kit omfattende antistoffet og instruksjoner for anvendelse av antistoffet for å detektere P-selektinproteinet.

Antistoffene beskrevet her er anvendelige for behandling av inflammatoriske og trombotiske sykdommer. Slike sykdommer omfatter vaskulære lidelser slik som aterosklerose, arteriell og dyp venetrombose, restenose etter angioplasti eller plassering av stent. Foretrukne anvendelser er for perifer arterieokklusiv sykdom (PAOD) og kritisk iskemi i bena (CLI). Andre anvendelser er behandling av postiskemisk leukocyttmediert vevskade forårsaket av myokardinfarkt, cerebral iskemisk hendelse (feks. slag), nyreinfarkt og lignende. Antistoffene er også egnet for behandling av sepsis, akutt leukocyttmediert lungeskade og allergiske reaksjoner slik som astma. Andre anvendelser er forebygging av avstøtning av organtransplantat og autoimmune sykdommer omfattende revmatoid artritt. I tillegg kan tumormetastase forhindres ved å hemme adhesjon av sirkulerende kreftceller.

Beskrivelsen omfatter videre de ovenfor nevnte antistoffer for behandling av et pattedyr som lider av de ovennevnte inflammatoriske og trombotiske forstyrrelsene, spesielt PAOD og CLI (perifer arterieokklusiv sykdom eller kritisk iskemi i bena).

Oppfinnelsen tilveiebringer videre anvendelse av de ovennevnte antistoffene for terapi, feks. for fremstilling av medikamenter for behandling av disse sykdommene.

Oppfinnelsen angår også anvendelse av antistoffene som definert ovenfor for fremstilling av en farmasøytisk blanding og omfatter en farmasøytisk blanding inneholdende et antistoff som her beskrevet med en farmasøytisk effektiv mengde, eventuelt sammen med en buffer og/eller en adjuvans anvendelig for formulering av antistoffer for farmasøytiske formål.

Farmasøytiske blandinger omfattende slike antistoffer i en farmasøytisk akseptabel bærer er også beskrevet. I én utførelsesform kan den farmasøytiske blandingen omfattes i en fremstilling eller kit.

Beskrivelsen tilveiebringer videre hybridomcellelinjer, som produserer slike antagonistiske monoklonale antistoffer, feks. de er parentale antistoffene også beskrevet.

De foretrukne hybridomcellelinjene beskrevet her, hu-Mab<P-selektin>LC 1004-002 (antistoff HuMab 002) ble deponert, i henhold til Budapestkonvensjonen om internasjonal anerkjennelse av deponeringer av mikroorganismer i forbindelse med behandling av patentsaker, ved Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Tyskland:

Antistoffene som kan oppnås fra nevnte cellelinjer er foretrukne utførelsesformer ifølge oppfinnelsen.

Antistoffene ifølge beskrivelsen blir foretrukket fremstilt ved rekombinante metoder. Slike metoder er vanlig kjent på området og omfatter proteinekspresjon i prokaryote og eukaryote celler med påfølgende isolering av antistoffpolypeptidet og vanligvis rensing til en farmasøytisk akseptabel renhet. For proteinekspresjon blir nukleinsyrer som koder for lette og tunge kjeder eller fragmenter derav insertert i ekspresjonsvektorer ved standardmetoder. Ekspresjonen utføres i passende prokaryote eller eukaryote vertsceller som CHO-celler, NSO-celler, SP2/0-celler, HEK293-celler, COS-celler, gjær eller E.coli-celler og antistoffet utvinnes fra cellene (supernatant eller celler etter lysis).

Rekombinant fremstilling av antistoffer er velkjent på området og beskrevet, for eksempel i oversiktsartiklene ved Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-161; Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880.

Antistoffene kan være til stede i hele celler, i et cellelysat eller i en delvis renset eller hovedsakelig ren form. Rensing utføres for å eliminere andre cellulære komponenter eller andre forurensninger, feks. andre cellulære nukleinsyrer eller proteiner, ved standardteknikker, omfattende alkalisk/SDS-behandling, kolonnekromatografi og andre velkjent på området. Se Ausubel, F., et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing og Wiley Interscience, New York (1987).

Ekspresjon i NSO-celler er beskrevet av, feks. Barnes, L.M., et al., Cytotechnology 32

(2000) 109-123; og Barnes, L.M., et al., Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270. Transient ekspresjon er beskrevet av, feks. Durocher, Y., et al., Nucl. Acids Res. 30 (2002) E9. Kloning av variable domener er beskrevet av Orlandi, R., et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 86 (1989) 3833-3837; Carter, P., et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 89 (1992) 4285-4289; og Norderhaug, L., et al., J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87. Et foretrukket transient ekspresjonssystem (HEK 293) er beskrevet av Schlaeger, E.-J. og Christensen, K., i Cytotechnology 30 (1999) 71-83 og av Schlaeger, E.-J., i J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199.

Kontrollsekvensene som er egnet for prokaryoter, for eksempel, omfatter en promoter, eventuelt en operatorsekvens og et ribosombindingssete. Eukaryote celler er kjent å anvende promotere, enhancere og polyadenyleringssignaler.

Nukleinsyre er "operabelt bundet" når den er plassert i en funksjonell forbindelse med en annen nukleinsyresekvens. For eksempel er DNA for en presekvens eller sekretorisk leder operabelt bundet til DNA for et polypeptid dersom det uttrykkes som et preprotein som tar del i sekresjonen av polypeptidet; en promoter eller enhancer er operabelt bundet til en kodende sekvens dersom den påvirker transkripsjonen av sekvensen; eller et ribosombindingssete er operabelt bundet til en kodende sekvens dersom det er plassert slik at det letter translasjonen. Generelt betyr "operabelt bundet" at DNA-sekvensene som er forbundet er tilgrensende og, i tilfellet av en sekretorisk leder, påfølgende og i leseramme. Enhancere behøver imidlertid ikke være tilgrensende. Sammenkobling oppnås ved ligering ved passende restriksjonsseter. Hvis slike seter ikke finnes, anvendes syntetiske oligonukleotidadaptere eller linkere i henhold til konvensjonell praksis.

De monoklonale antistoffene separeres hensiktsmessig fra dyrkningsmediet ved konvensjonelle rensningmetoder for immunglobulin slik som for eksempel protein A-Sepharose, hydroksylapatitt kromatografi, gelelektroforese, dialyse eller affinitetskromatografi. DNA og RNA som koder for de monoklonale antistoffene isoleres og sekvenseres lett ved anvendelse av konvensjonelle metoder. Hybridomcellene kan tjene som en kilde for slikt DNA og RNA. Når DNA først er isolert kan det inserteres inn i ekspresjonsvektorer, som deretter transfekteres inn i vertsceller slik som HEK 293-celler, CHO-celler eller myelomceller som ellers ikke produserer immunglobulinprotein, for å oppnå syntese av rekombinante monoklonale antistoffer i vertscellene.

Aminosyresekvensvarianter (eller mutanter) av et humant P-selektinantistoff fremstilles ved å innføre passende nukleotidendringer i antistoff DNA'et eller ved nukleotidsyntese. Slike modifikasjoner kan imidlertid gjennomføres kun i et svært begrenset område, feks. som beskrevet ovenfor. For eksempel kan modifikasjonene ikke endre de ovennevnte antistoffkarakteristika slik som IgG isotype og epitopbinding, men kan forbedre utbyttet av den rekombinante fremstillingen, proteinstabiliteten eller lette rensingen.

Hvilken som helst cysteinrest som ikke er involvert i å opprettholde riktig konformasjon av anti-P-selektin-antistoffet kan også substitueres, generelt med serin, for å forbedre den oksydative stabiliteten av molekylet og forhindre abnorm kryssbinding. Omvendt kan cysteinbinding(er) tilføyes til antistoffet for å forbedre dets stabilitet (spesielt når antistoffet er et antistoffragment slik som et Fv-fragment).

En annen type aminosyrevariant av antistoffet endrer det opprinnelige glykosyleringsmønsteret av antistoffet. Med endring menes å deletere én eller flere karbohydratgrupper funnet i antistoffet og/eller tilføye én eller flere glykosyleringsseter som ikke er til stede i antistoffet. Glykosylering av antistoffer er typisk N-bundet. N-bundet refererer til bindingen av karbohydratgruppen til sidekjeden av en asparaginrest. Tripeptidsekvensene asparagin-X-serin og asparagin-X-treonin, hvor X er hvilken som helst aminosyre bortsett fra prolin, er gjenkjennelsessekvensene for enzymatisk binding av karbohydratgruppen til asparaginets sidekjede. Tilstedeværelse av en av disse tripeptidsekvensene i et polypeptid skaper følgelig et potensielt glykosyleringssete. Tilføyelse av glykosyleringsseter til antistoffet oppnås hensiktsmessig ved å endre aminosyresekvensen slik at den inneholder én eller flere av de ovenfor beskrevne tripeptidsekvensene (for N-bundne glykosyleringsseter).

Nukleinsyremolekyler som koder for aminosyresekvensvarianter av anti-P-selektinantistoffer fremstilles ved en rekke metoder kjent på området. Disse metodene omfatter isolering fra en naturlig kilde (i tilfellet av naturlig forekommende aminosyresekvensvarianter) eller fremstilling ved oligonukleotid-mediert (eller seterettet) mutagenese, PCR-mutagenese og kassett-mutagenese av en tidligere fremstilt variant eller en ikke-variant utgave av humanisert anti-P-selektinantistoff.

Beskrivelsen angår også immunokonjugater omfattende antistoffet ifølge oppfinnelsen konjugert til et cytotoksisk middel slik som et kjemoterapeutisk middel, toksin (feks. et enzymatisk aktivt toksin av bakteriell, fungal, plante eller animalsk opprinnelse eller fragmenter derav), en radioaktiv isotop (dvs. et radiokonjugat) eller et prodrug av et middel for forebygging eller behandling av inflammatoriske og trombotiske lidelser, spesielt PAOD og CLI. Konjugater av antistoffet og cytotoksisk middel er fremstilt ved anvendelse av en rekke bifunksjonelle protein koblingsmidler slik som N-succinimidyl-3-(2-pyridylditiol) propionat (SPDP), iminotiolan (IT), bifunksjonelle derivater av imidoestere; (slik som dimetyl-adipimidat HCL), aktive estere (slik som disuccinimidyl-suberat), aldehyder (slik som glutaraldehyd), bis-azido-forbindelser (slik som bis (p-azidobenzoyl) heksandiamin), bis-diazonium-derivater (slik som bis-(p-diazoniumbenzoyl)-etylendiatnin), diisocyanater (slik som tolyen-2,6-diisocyanat) og bis-aktive fluorforbindelser (slik som l,5-difluor-2,4-dinitrobenzen). For eksempel kan et ricin-immunotoksin fremstilles som beskrevet i Vitetta, E.S., et al., Science 238 (1987) 1098-1104). Karbon- 14-merket l-isotiocyanatobenzyl-3-metyldietylen-triaminpentaeddiksyre (MX-DTPA) er et eksempel på chelaterende middel for konjugering av radionukleotid til antistoffet. Se WO 94/11026.

En annen type kovalent modifikasjon omfatter kjemisk eller enzymatisk kobling av glykosider til antistoffet. Disse fremgangsmåtene er fordelaktige ved at de ikke krever produksjon av antistoffet i en vertscelle som har glykosyleringsevner med hensyn til N-eller O-bundet glykosylering. Avhengig av bindingsmetoden som anvendes, kan sukker bindes til (a) arginin og histidin, (b) frie karboksylgrupper, (c) frie sulfhydrylgrupper slik som de fra cystein, (d) frie hydroksylgrupper slik som de fra serin, treonin eller hydroksyprolin, (e) aromatiske rester slik som de fra fenylalanin, tyrosin eller tryptofan eller (f) amidgruppen fra glutamin. Disse metodene er beskrevet i WO 87/05330 og i Aplin, J.D. og Wriston, J.C. Jr., CRC Crit. Rev. Biochem. 4 (1981) 259-306.

Fjerning av hvilke som helst karbohydratgrupper til stede på antistoffet kan gjennomføres kjemisk eller enzymatisk. Kjemisk deglykosylering krever eksponering av antistoffet for forbindelsen trifluormetansulfonsyre eller en ekvivalent forbindelse. Denne behandlingen fører til kløyving av det meste eller alt sukker bortsett fra det forbindende sukkeret (N-acetylglukosamin eller N-acetylgalaktosamin), og etterlater antistoffet intakt. Kjemisk deglykosylering er beskrevet av Sojahr, H.T. og Bahl, O.P., Arch. Biochem. Biophys. 259 (1987) 52-57 og av Edge, A.S., et al. Anal. Biochem. 118 (1981) 131-137. Enzymatisk kløyving av karbohydratgrupper på antistoffer kan oppnås ved anvendelse av en rekke endo- og eksoglykosidaser som beskrevet av Thotakura, N.R. og Bahl, O.P., Meth. Enzymol. 138 (1987) 350-359.

En annen type kovalent modifikasjon av antistoffet omfatter binding av antistoffet til én av en rekke ikke-proteinholdige polymerer, feks., polyetylenglykol, polypropylenglykol eller polyoksyalkylener, på den måten som er angitt i US-patenter nr. 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 eller 4,179,337.

Ved enda et annet aspekt tilveiebringer beskrivelsen isolerte B-celler fra et transgent ikke-humant dyr, feks. en transgen mus, som uttrykker de humane anti-P- selektinantistoffene (feks. de parentale antistoffene produsert av en cellelinje av hu-Mab<P-selektin>LC 1004-002 (DSM ACC2641)) her beskrevet. KM-mus er egnede trans kromosomale mus. KM-musen inneholder et humant tung kjede trans kromosom og et humant kappa lett kjede transgen. De endogene mus tung og lett kjede genene har også blitt brutt ned i KM-musen slik at immunisering av musen fører til produksjon av humane immunglobuliner heller enn mus immunglobuliner. Konstruksjon av KM-mus og anvendelse av dem for å frembringe humane immunglobuliner er beskrevet i detalj i WO 02/43478.

Foretrukket oppnås de isolerte B-cellene fra et transgent ikke-humant dyr, feks. en transgen mus, som har blitt immunisert med en renset eller rekombinant form av P-selektinantigen og/eller celler som uttrykker P-selektin. Foretrukket har det transgene ikke-humane dyret, feks. en transgen mus, et genom som omfatter et humant tung kjede transgen og et humant lett kjede transgen som koder for hele eller en del av et antistoff ifølge oppfinnelsen. De isolerte B-cellene blir deretter immortalisert for å gi en kilde (feks. et hybridom) for humane anti-P-selektinantistoffer. Følgelig tilveiebringer beskrivelsen også et hybridom som er i stand til å produsere humane monoklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen. I én utførelsesform omfatter hybridomet en B-celle oppnådd fra et transgent ikke-humant dyr, feks. en transgen mus som har et genom som omfatter et humant tung kjede transgen og et humant lett kjede transgen som koder for hele eller en del av et antistoff ifølge oppfinnelsen, fusjonert til en immortalisert celle.

I en bestemt utførelsesform er det transgene ikke-humane dyret en transgen mus som har et genom som omfatter et humant tung kjede transgen og et humant lett kjede transgen som koder for hele eller en del av et antistoff ifølge oppfinnelsen. Det transgene ikke-humane dyret kan være immunisert med en renset eller anriket fremstilling av P-selektinantigen og/eller celler som uttrykker P-selektin. Foretrukket er det transgene ikke-humane dyret, feks. den transgene musen, i stand til å produsere P-selektin isotyper av humane monoklonale antistoffer mot P-selektin.

De humane monoklonale antistoffene beskrevet her kan fremstilles ved å immunisere et transgent ikke-humant dyr, feks. en transgen mus, som har et genom som omfatter et humant tung kjede transgen og et humant lett kjede transgen som koder for hele eller en del av et antistoff ifølge oppfinnelsen, med en renset eller anriket fremstilling av P-selektinantigen og/eller celler som uttrykker P-selektin. B-celler (feks. milt B-celler) fra dyret blir deretter oppnådd og fusjonert med myelomceller for å danne immortaliserte, hybridomceller som sekreterer humane monoklonale antistoffer mot P-selektin.

I en foretrukket utførelsesform kan humane monoklonale antistoffer rettet mot P-selektin fremstilles ved anvendelse av transgene mus som bærer deler av det humane immunsystemet heller enn systemet fra mus. Disse transgene musene, referert til her som "HuMab"-mus, inneholder et humant immunglobulingen mini-loki som koder for ikke-rearrangerte humane immunglobulingener som omfatter tung (u og y) og k lett kjede (konstant region-gener), sammen med målrettede mutasjoner som inaktiverer de endogene u og k kjede-loki (Lonberg, N., et al., Nature 368 (1994) 856-859). Følgelig oppviser musen redusert ekspresjon av mus IgM eller K og som respons på immunisering, gjennomgår de innførte humane tunge og lette kjede-transgenene klasse-switching og somatisk mutasjon for å danne høyaffinitets humane IgG monoklonale antistoffer (Lonberg, N., et al., Nature 368 (1994) 856-859; gjennomgått i Lonberg, N., Handbook of Experimental Pharmacology 113 (1994) 49-101; Lonberg, N. og Huszar, D., Intern. Rev. Immunol. 25 (1995) 65-93; og Harding, F. og Lonberg, N., Ann. N. Acad. Sei 764 (1995) 536-546). Fremstilling av HuMab-mus er beskrevet i Taylor, L., et al., Nucleic Acids Research 20 (1992) 6287-6295; Chen, J., et al, International Immunology 5 (1993) 647-656; Tuaillon, N., et al., Proe. Nati. Acad. Sei USA 90 (1993) 3720-3724; Choi, T.K., et al., Nature Genetics 4 (1993) 117-123; Chen, J., et al, EMBO J. 12 (1993) 821-830; Tuaillon, N., et al., Immunol. 152 (1994) 2912-2920; Lonberg, N., et al., Nature 368

(1994) 856-859; Lonberg, N., Handbook of Experimental Pharmacology 113 (1994) 49-101; Taylor, L., et al., Int. Immunol. 6 (1994) 579-591; Lonberg, N. og Huszar, D., Intern. Rev. Immunol. 25 (1995) 65-93; Harding, F. og Lonberg, N., Ann. N. Acad. Sei 764

(1995) 536-546; Fishwild, D.M., et al., Nat. Biotechnol. 14 (1996) 845-851. Se videre US-patenternr. 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299; 5,545,807; 5,770,429; WO 98/24884; WO 94/25585; WO 93/1227; WO 92/22645; og WO 92/03918.

For å fremstille fullstendige humane monoklonale antistoffer mot P-selektin, kan HuMab-mus immuniseres med en renset eller anriket fremstilling av P-selektinantigen og/eller celler som uttrykker P-selektin i henhold til den generelle metoden, som beskrevet av Lonberg, N., et al., Nature 368 (1994) 856-859; Fishwild, D.M., et al., Nat. Biotechnol.

14 (1996) 845-851 og WO 98/24884. Foretrukket vil musene være 6-16 uker gamle ved første immunisering. For eksempel kan en renset eller anriket fremstilling av oppløselig P-selektinantigen (feks. renset fra P-selektin-uttrykkende celler) anvendes for å immunisere HuMab-musene intraperitonealt. I tilfeller hvor immuniseringer ved anvendelse av en renset eller anriket fremstilling av P-selektinantigen ikke resulterer i antistoffer, kan mus immuniseres med celler som uttrykker P-selektin, feks. en tumor cellelinje, for å fremme immunresponser. Kumulativ erfaring med forskjellige antigener har vist at transgene HuMab-mus responderer best når de blir initielt immunisert intraperitonealt (i.p.) med antigen i complete Freund's adjuvans, etterfulgt av i.p. immuniseringer hver andre uke (for eksempel opptil totalt 6) med antigen i incomplete Freund's adjuvans. Immunresponsen kan overvåkes i løpet av immuniseringprotokollen med plasmaprøver oppnådd ved retroorbital tapping. Plasmaet kan screenes ved ELISA og mus med tilstrekkelig titere av anti-P-selektin humant immunglobulin kan anvendes for immortalisering av tilsvarende B-celler. Mus kan boostes intravenøst med antigen 3 til 4 dager før avlivning og fjerning av milten og lymfeknutene. Det er forventet at det kan være nødvendig å utføre 2-3 fusjoner for hvert antigen. Mange mus vil immuniseres for hvert antigen. For eksempel kan totalt tolv HuMab-mus av HCo7 og HCol2-stammene immuniseres.

HCo7-musene har en JKD-forstyrrelse i deres endogene lett kjede (kappa)-gener (som beskrevet i Chen, J., et al., EMBO J. 12 (1993) 821-830), en CMD-forstyrrelse i deres endogene tung kjede-gener (som beskrevet i Eksempel 1 i WO 01/14424), et KCo5 humant kappa lett kjede transgen (som beskrevet i Fishwild, D.M., et al., Nat. Biotechnol. 14

(1996) 845-851) og et HCo7 human tung kjede transgen (som beskrevet i US-patent nr. 5,770,429).

HCol2-musene har en JKD-forstyrrelse i deres endogene lett kjede (kappa)-gener (som beskrevet i Chen, J., et al., EMBO J. 12 (1993) 821-830), en CMD-forstyrrelse i deres endogene tung kjede gener (som beskrevet i Eksempel 1 i WO 01/14424), et KCo5 humant kappa lett kjede transgen (som beskrevet i Fishwild, D.M., et al., Nat. Biotechnol. 14

(1996) 845-851) og et HCol2 human tung kjede transgen (som beskrevet i Eksempel 2 i WO 01/14424). Lymfocyttene fra mus kan isoleres og fusjoneres med en mus myelom cellelinje ved anvendelse av PEG basert på standardmetoder for fremstilling av hybridomer. De resulterende hybridomene blir deretter screenet for fremstilling av antigenspesifikke antistoffer. For eksempel blir enkeltcellesuspensjoner av lymfocytter avledet fra milt og lymfeknute fra immuniserte mus fusjonert til én sjettedel av antallet av SP 2/0 ikke-sekreterende mus myelomceller (ATCC, CRL 1581) med 50% PEG. Celler blir platet ut ved omtrent 2 x 10<5>i flatbunnet mikrotiterplate, etterfulgt av ca. to ukers inkubering i selektivt medium.

Individuelle brønner blir deretter screenet ved ELISA for humane anti-P-selektin monoklonale IgM og IgG-antistoffer. Straks omfattende vekst av hybridomer inntreffer, blir medium analysert, vanligvis etter 10-14 dager. Hybridomene som utskiller antistoffer blir platet ut på nytt, screenet igjen og dersom de fortsatt er positive for human IgG, kan anti-P-selektin monoklonale antistoffer, subklones minst to ganger ved begrensende fortynning ("limiting dilution"). De stabile subklonene blir deretter dyrket in vitro for å produsere antistoff i vevskulturmedium for karakterisering.

Fordi CDR-sekvenser er ansvarlig for antistoff-antigen-interaksjoner, er det mulig å uttrykke rekombinante antistoffer ifølge beskrivelsen ved å konstruere ekspresjonsvektorer som omfatter CDR-sekvensene ifølge oppfinnelsen på struktur ("framework")-sekvenser fra et ulikt humant antistoff (se feks. Riechmann, L., et al., Nature 332 (1998) 323-327; Jones, P., et al., Nature 321 (1986) 522-525; og Queen, C, et al., Proe. Nati. Acad. Se. U.S.A. 86 (1989)10029-10033). Slike struktur ("framework")-sekvenser kan oppnås fra offentlige DNA-databaser som omfatter gensekvenser av human kjønnscelle antistoff. Disse kjønnscellesekvensene vil skille seg fra gensekvenser av modent antistoff fordi de ikke vil omfatte fullstendig sammensatte variable gener, som blir dannet ved V(D)J-sammenføyning under modningen av B-celler. Kjønnscelle-gensekvenser vil også skille seg fra sekvensene av et høyaffinitets sekundært repertoar-antistoff individuelt jevnt over den variable regionen.

Beskrivelsen omfatter videre anvendelse av et antistoff beskrevet her for diagnose av P-selektin in vitro, fortrinnsvis ved en immunologisk analyse for bestemmelse av bindingen mellom P-selektin av en prøve og antistoffet ifølge oppfinnelsen.

I et annet aspekt tilveiebringer foreliggende beskrivelse en blanding, feks. en farmasøytisk blanding, inneholdende ett eller en kombinasjon av humane monoklonale antistoffer eller den antigenbindende delen derav, beskrevet her, formulert sammen med en farmasøytisk akseptabel bærer. Nærmere bestemt er blandingen en farmasøytisk eller en diagnostisk blanding og enda mer spesifikt omfatter den farmasøytiske blandingen et antistoff som definert ovenfor og minst ett farmasøytisk akseptabelt tilsetningsmiddel.

Farmasøytiske blandinger beskrevet her kan også administreres i kombinasjonsterapi, dvs. kombinert med andre midler. Kombinasjonsterapien kan for eksempel omfatte en blanding ifølge foreliggende oppfinnelse med minst ett middel anvendelig for forebygging eller behandling av en sykdom forbundet med kritisk iskemi i bena (CLI/PAOD) eller andre konvensjonell terapi.

Som anvendt heri omfatter "farmasøytisk akseptabel bærer" hvilket som helst og alle løsningsmidler, dispersjonsmedier, belegg, antibakterielle og antifungale midler, isotoniske og absorpsjonsforsinkende midler og lignende som er fysiologisk kompatible. Foretrukket er bæreren egnet for intravenøs, intramuskulær, subkutan, parenteral, spinal eller epidermal administrering (feks. ved injeksjon eller infusjon).

Et "farmasøytisk akseptabelt salt" refererer til et salt som beholder den ønskede biologiske aktiviten av antistoffet og ikke gir noen uønskede toksikologiske effekter (se feks. Berge, S.M., et al., J. Pharm. Sei. 66 (1977) 1-19). Slike salter er beskrevet her. Eksempler på slike salter omfatter syreaddisjonssalter og baseaddisjonssalter. Syreaddisjonssalter omfatter de avledet fra ikke-toksiske uorganiske syrer, slik som salt av saltsyre.

En blanding beskrevet her kan administreres ved en rekke metoder kjent på området. Som det vil forstås av fagfolk, vil ruten og/eller administreringsmetoden variere avhengig av de ønskede resultatene.

Ved administrering av en forbindelse beskrevet her ved bestemte administrasjonsruter, kan det være nødvendig å overtrekke forbindelsen med eller koadministrere forbindelsen med, et materiale for å forhindre inaktivering av forbindelsen. For eksempel kan forbindelsen administreres til et individ i en passende bærer, for eksempel liposomer eller et fortynningsmiddel. Farmasøytisk akseptable fortynningsmidler omfatter saltløsning og vandig buffer-løsninger.

Farmasøytisk akseptable tilsetningsmidler eller bærere omfatter sterile vandige løsninger eller dispersjoner og sterile pulvere for ekstemporert fremstilling av sterile injiserbare løsninger eller dispersjoner. Anvendelse av slike medier og midler for farmasøytisk aktive substanser er kjent på området.

Uttrykkene "parenteral administrering" og "administrert parenteralt" som anvendt heri betyr administreringsmetoder forskjellig fra enteral og topisk administrering, vanligvis ved injeksjon og omfatter, uten begrensning, intravenøs, intramuskulær, intraarteriell, intratekal, intrakapsulær, intraorbital, intrakardiell, intradermal, intraperitoneal, transtrakeal, subkutan, under huden, intraartikulær, subkapsulær, subaraknoidal, intraspinal, epidural og intrasternal injeksjon og infusjon.

Disse blandingene kan også inneholde tilsetningsmidler eller adjuvanser slik som konserveringsmidler, fuktemidler, emulgeringsmidler og dispergeringsmidler. Forebygging av tilstedeværelse av mikroorganismer kan ivaretas både ved steriliseringsmetoder eller aseptiske betingelser ved fremstilling og ved å innbefatte forskjellige antibakterielle og antifungale midler, for eksempel paraben, klorbutanol, fenol, sorbinsyre og lignende. Det kan også være ønskelig å innbefatte isotoniske midler, slik som sukker, natriumklorid og lignende i blandingene. I tillegg kan forlenget absorpsjon av den injiserbare farmasøytiske formen foranlediges ved å innbefatte midler som forsinker absorpsjon slik som aluminiummonostearat og gelatin.

Uansett hvilken administrasjonsrute som velges, formuleres forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse, som kan anvendes i en egnet hydratisert form og/eller de farmasøytiske sammensetningene ifølge beskrivelsen, til farmasøytisk akseptable doseringsformer ved konvensjonelle metoder kjent for fagfolk på området.

Reelle dosenivåer av de aktive bestanddelene i de farmasøytiske sammensetningene ifølge beskrivelsen kan varieres for å oppnå en mengde av den aktive bestanddelen som er effektiv for å oppnå den ønskede terapeutiske responsen for en bestemt pasient, blanding og administreringsmetode, uten å være toksisk for pasienten. De valgte doseringsnivåene vil avhenge av en rekke farmakokinetiske faktorer omfattende aktiviteten av de spesielle blandingene ifølge foreliggende oppfinnelse som anvendes eller ester, salt eller amid derav, administrasjonsruten, tiden for administrering, utskillingshastighet for den spesielle forbindelsen som anvendes, varigheten av behandlingen, andre medikamenter, forbindelser og/eller materialer anvendt i kombinasjon med de spesielle blandingene anvendt, alderen, kjønn, vekt, tilstand, generell helse og tidligere medisinsk historie for pasienten som behandles og lignende faktorer velkjent innen medisin. En typisk ukentlig dose kan variere fra ca. 0,1 mg/kg til ca. 20 mg/kg eller mer, avhengig av faktorene nevnt ovenfor.

Blandingen må være steril og flytende i den grad at blandingen kan leveres med sprøyte. I tillegg til vann, kan bæreren være en isotonisk bufiret saltoppløsning, etanol, polyol (for eksempel glyserol, propylenglykol og flytende polyetylenglykol) og passende blandinger derav.

Passende fluiditet kan opprettholdes, for eksempel ved anvendelse av belegg slik som lecitin, ved opprettholdelse av nødvendig partikkelstørrelse i tilfellet av dispersjon og ved anvendelse av surfaktanter. I mange tilfeller er det foretrukket å omfatte isotoniske midler, for eksempel sukker, polyalkoholer slik som mannitol eller sorbitol og natriumklorid i blandingen. Langvarig absorpsjon av de injiserbare blandingene kan foranlediges ved å omfatte i sammensetningen et middel som forsinker absorpsjon, for eksempel aluminiummonostearat eller gelatin.

Beskrivelsen omfatter en fremgangsmåte for behandling av en pasient med behov for terapi,karakterisert vedå administrere til pasienten en terapeutisk effektiv mengde av et antistoff som binder til P-selektin, inneholder en Fc-del av human opprinnelse og ikke binder komplementfaktor Clq.

Beskrivelsen omfatter anvendelse av et antistoff som binder til selektin, inneholder en Fc-del som stammer fra human opprinnelse og ikke binder komplementfaktor Clq for terapi.

beskrivelsen omfatter anvendelse av et antistoff som binder P-selektin, inneholder en Fc-del avledet av human opprinnelse og ikke binder komplementfaktor Clq for fremstilling av et medikament for forebygging og behandling av inflammatoriske og trombotiske lidelser.

Beskrivelsen omfatter anvendelse av et antistoff som binder til P-selektin, inneholder en Fc-del av human opprinnelse og ikke binder komplementfaktor Clq for behandling av PAOD og CLI.

Beskrivelsen tilveiebringer følgelig et antistoff som binder til P-selektin, ikke binder til komplementfaktor Clq, inneholder en Fc-del avledet av human opprinnelse og erkarakterisert vedat nevnte antistoff er et antistoff av human subklasse IgG4 hvor S228 er erstattet med P og L235 er erstattet med E. I én utførelsesform er antistoffet et humant antistoff. I en annen utførelsesform er antistoffet et humanisert antistoff.

I én utførelsesform tilveiebringer foreliggende beskrivelse et antistoff som binder til P-selektin, ikke binder til komplementfaktor Clq, inneholder en Fc-del av human opprinnelse,karakterisert vedat nevnte antistoff er et antistoff av human subklasse IgG4 hvor S228 er erstattet med P og L235 er erstattet med E, hvor "ikke-binding" av antistoffet til komplementfaktor Clq angir en ELISA-analysemåling hvor den maksimale bindingen (Bmaks) av Clq til antistoffet ved en konsentrasjon på 10 ug/ml av antistoffet er < 30% av Bmaks for antistoffet LC 1004-002 fra cellelinje hu-Mab<P-selektin>LC 1004-002 (DSM ACC2641). I en annen utførelsesform er den maksimale bindingen < 20% av Bmaks for antistoffet LC 1004-002 fra cellelinje hu-Mab<P-selektin>LC 1004-002 (DSM ACC2641).

I én utførelsesform tilveiebringer foreliggende beskrivelse et antistoff som binder til P-selektin, ikke binder til komplementfaktor Clq, inneholder en Fc-del avledet av human opprinnelse,karakterisert vedat nevnte antistoff er et antistoff av human subklasse IgG4 hvor S228 er erstattet med P og L235 er erstattet med E, hvor antistoffet binder til P-selektin med en Ko-verdi på mindre enn 10"<8>M i en BIAcore-analyse. I en annen utførelsesform er Ro-området 10 "n til IO"9 M.

I én utførelsesform tilveiebringer foreliggende beskrivelse et antistoff som binder til P-selektin, ikke binder til komplementfaktor Clq, inneholder en Fc-del avledet av human opprinnelse,karakterisert vedat nevnte antistoff er et antistoff av human subklasse IgG4 hvor S228 er erstattet med P og L235 er erstattet med E, hvor antistoffet binder minst 1000 ganger mer spesifikt til P-selektin enn til E- og/eller L-selektin som målt ved EC50-verdier i en ELISA-analyse, hvor P- og E- og/eller L-selektin er belagt på mikrotiterplate. I en annen utførelsesform er EC50-verdiene for E- og L-selektin transfektanter høyere enn 100 □ g/ml.

I én utførelsesform tilveiebringer foreliggende beskrivelse et antistoff som binder til P-selektin, ikke binder til komplementfaktor Clq, inneholder en Fc-del av human opprinnelse,karakterisert vedat nevnte antistoff er et antistoff av human subklasse IgG4 hvor S228 er erstattet med P og L235 er erstattet med E, hvor antistoffet hemmer adhesjonen av leukocytt-lignende HL60-celler til renset P-selektin med en IC50-verdi på ikke mer enn 1 Dg/ml. I en annen utførelsesform er IC50-verdien i området 0,08 til 0,5 □ g/ml. I enda en annen utførelsesform er IC50-verdien i området 0,08 til 0,11 Dg/ml.

I én utførelsesform tilveiebringer foreliggende beskrivelse et antistoff som binder til P-selektin, ikke binder til komplementfaktor Clq, inneholder en Fc-del av human opprinnelse,karakterisert vedat nevnte antistoff er et antistoff av human subklasse IgG4 hvor S228 er erstattet med P og L235 er erstattet med E, hvor

(a) adhesjonen av leukocytt-lignende HL60-celler til aktiverte blodplater er hemmet med en IC50-verdi på 0,05 til 0,3 Dg/ml; (b) antistoffet hemmer interaksjonen av leukocytter med et monolag av blodplater med mer enn 70%; (c) antistoffet hemmer adhesjonen av leukocytter til aktiverte endotelceller i et humant flytsystem i området 60 til 90% ved en konsentrasjon på 3 Dg/ml; (d) antistoffet ikke binder C3-proteinet; (e) antistoffet ikke fremkaller komplementavhengig cytotoksisitet (CDC); (f) antistoffet ikke binder til Fcy-reseptorer på NK-effektorceller; eller (g) antistoffet ikke fremkaller antistoffavhengig cellulær cytotoksisitet (ADCC).

I én utførelsesform tilveiebringer foreliggende beskrivelse et antistoff som binder til P-selektinkarakterisert vedat den variable tung kjede aminosyresekvensen CDR3 av nevnte antistoffer tung kjede CDR3-sekvensene SEKV ID NR: 39.

I én utførelsesform tilveiebringer foreliggende beskrivelse et antistoff som binder til P-selektin, omfattende en variabel tung kjede og en variabel lett kjede,karakterisert vedat den variable tunge kjeden omfatter CDR-sekvensene CDR1, CDR2 og CDR3 og CDR1 er SEKV ID NR: 30, CDR2 er SEKV ID NR: 34, CDR3 er SEKV ID NR: 39, hvor nevnte CDR'er er valgt uavhengig av hverandre.

I én utførelsesform tilveiebringer foreliggende beskrivelse et antistoffkarakterisert vedat den variable lette kjeden omfatter CDR-sekvensene CDR1, CDR2 og CDR3 og CDR1 er

SEKV ID NR: 43, CDR2 er SEKV ID NR: 45, og CDR3 er SEKV ID NR: 48, hvor nevnte CDR'er er valgt uavhengig av hverandre.

I én utførelsesform tilveiebringer foreliggende beskrivelse et antistoff,karakterisertved at nevnte antistoff binder til P-selektin og at antistoffet omfatter en variabel region uavhengig valgt fra gruppen bestående av lett kjede variabelt domene definert ved aminosyresekvens SEKV ID NR:3 og tung kjede variabelt domene definert ved SEKV ID NR:4.

I én utførelsesform tilveiebringer foreliggende beskrivelse et antistoff som binder til P-selektin, ikke binder til komplementfaktor Clq, inneholder en Fc-del avledet av human opprinnelse, og erkarakterisert vedat nevnte antistoff er et antistoff av human subklasse IgG4 hvor S228 er erstattet med P og L235 er erstattet med E, hvor antistoffet omfatter CDR1, CDR2 og CDR3-regionene av lett kjede variabelt domene definert ved aminosyresekvens SEKV ID NR:3 og CDR1, CDR2 og CDR3-regionene av tung kjede variabelt domene definert ved SEKV ID NR: 4. I en annen utførelsesform omfatter antistoffet lett kjede variabelt domene definert ved aminosyresekvens SEKV ID NR:3 og tung kjede variabelt domene definert ved SEKV ID NR:4.

I én utførelsesform tilveiebringer foreliggende beskrivelse et antistoff som binder til P-selektin, ikke binder til komplementfaktor Clq, inneholder en Fc-del avledet av human opprinnelse, og erkarakterisert vedat nevnte antistoff er et antistoff av human subklasse IgG4 hvor S228 er erstattet med P og L235 er erstattet med E, hvor

(a) antistoffet omfatter minst én aminosyremutasjon i Fc-delen som fører til at antistoffet ikke binder til komplementfaktor Clq; (b) den humane tung kjede konstante regionen omfatter aminosyresekvensen av SEKV ID NR: 28; (c) antistoffet omfatter en D-lett kjede konstant region som definert ved SEKV ID NR:23; (d) antistoffet omfatter minst én aminosyremutasjon som fører til at antistoffet ikke binder til komplement Clq; (e) antistoffet omfatter en tung kjede konstant region valgt fra gruppen bestående av IgGl vi, IgGlv2 og IgG4vl; eller

(f) antistoffet er et Fab, F(ab')2eller et enkeltkjedefragment.

I én utførelsesform tilveiebringer foreliggende oppfinnelse et anti-P-selektinantistoff,karakterisert vedat det er et humant eller humanisert antistoff.

I en annen utførelsesform omfatter antistoffet aminosyresekvensen som definert ved SEKV ID NR:28 □ □ tung kjede konstant region. I enda en annen utførelsesform blir antistoffet produsert av cellelinjen hu-Mab<P-selektin>LC 1004-002 (DSM ACC264)

Det skal forstås at beskrivelsen tilveiebringer utførelsesformene med definisjonene som beskrevet ovenfor og også kombinasjoner derav.

De følgende eksemplene, referansene, sekvenslistene og figurene er gitt for å bidra til forståelse av foreliggende oppfinnelse.Beskrivelse av sekvensenslisten

Forkortelser:

Aminosyrer er forkortet enten i tre (Leu) eller énbokstavskode (L)

Antistoff HuMab 00X betegnes også antistoff 00X

L234 betyr aminosyren leucin i posisjon 234 i henhold til EU-nummerering (Kabat) L234A betyr at aminosyren leucin i posisjon 234 er endret til alanin

PVA236 betyr at i 236-regionen er ELLG i IgGl eller EFLG i IgG4 endret i PVA GLPSS331 betyr at i 331-regionen er ALP AP i IgGl eller GLPAP i IgG2 endret til

GLPSS

Endringer i de andre IgG-subklassene er analoge

EKSEMPLER

Fremstilling av en hybridomcellelinje som produserer anti- P- selektinantistoffer Dyrking av hybridomer

HuMab-hybridomer ble dyrket i IMDM (Cambrex), Føtal klon 1 Bovint serum (Perbio Science), origin Hybridom kloningsfaktor (Igen), natriumpyruvat, penicillin/streptomycin, 2-merkaptoetanol, HAT (Sigma-aldrich) og Kanamycin (Invitrogen) i 37°C og 5% CO2.

Fremstilling av en hybridomcellelinje som produserer anti-P-selektinantistoffer Fremgangsmåte for immunisering av transgene mus

Protokoll A:

10 HCo7 transgene mus (5 hanner og 5 hunner), stamme GG2201 (Medarex, San José, CA, USA) ble immunisert med en rekombinant trunkert form av P-selektin som mangler transmembran og cytoplasmatisk domene av P-selektin og som ble anskaffet fra R&D Systems. For den første immuniseringen ble 50 ug rekombinant P-selektin, oppløst i 100 ul PBS, blandet med 100 ul complete Freunds' adjuvans. For de resterende immuniseringene ble det anvendt rekombinant P-selektin bundet til KLH. For den andre immuniseringen ble 50 ug KLH-bundet rekombinant P-selektin oppløst i 100 ul PBS og blandet med 100 ul incomplete Freunds' adjuvans. For de resterende immuniseringene ble 20 ug KLH-bundet rekombinant P-selektin oppløst i 100 ul PBS og blandet med 100 ul incomplete Freunds' adjuvans. Immuniseringer ble vekslende administrert interperitoneal og subkutant ved å starte med en interperitoneal immunisering.

Protokoll B:

3 HCo7 (alle hunner) og 3 KM (alle hanner) transgene mus, stamme GG2489 (Medarex, San José, CA, USA) ble immunisert med fullengde P-selektin renset fra humane foreldete blodplater ved immunoaffinitetskromatografi (s. nedenfor). For den første immuniseringen ble 50 ug renset P-selektin, oppløst i 100 ul PBS, blandet med 100 ul complete Freunds' adjuvans (CFA; Difco Laboratories, Detroit, USA). For den andre immuniseringen ble 50 ug renset P-selektin, oppløst i 100 ul PBS, blandet med 100 ul incomplete Freunds' adjuvans (ICFA; Difco).

For alle andre immuniseringer ble 20 ug renset P-selektin anvendt og blandet med 100 ul incomplete Freunds' adjuvans.

Antigenspesifikk ELISA

Anti-P-selektin titere i sera fra immuniserte mus ble bestemt ved antigenspesifikk ELISA. Plate (96 flatbunnet ELISA-plate, Greiner) ble belagt med 0,1 ug/ml renset P-selektin oppløst i PBS og belagt natten over ved romtemperatur. Deretter ble brønner blokkert med PBSTC (PBS inneholdende 0,05% Tween 20 (Sigma-Aldrich Chemie BV) og 2% kyllingserum (Gibco)) i 1 time ved romtemperatur.

Test-tappinger av serum ble fortynnet 1:100 i PBSTC og tilsatt til brønnene. Serum oppnådd fra mus før immunisering ble oppløst 1:100 i PBSTC og anvendt som negativ kontroll. Et mus antistoff rettet mot human P-selektin (1/7, egenprodusert ved Roche Basel) ble oppløst 1:100 i PBSTC og anvendt som en positiv kontroll. Plater ble inkubert i 1 time ved romtemperatur. Deretter ble plater vasket to ganger ved anvendelse av PBST (PBS inneholdende 0,05% Tween 20. Gt-a-huIgG-HRP (Jackson) ble fortynnet 1:5000 i PBSTC og tilsatt til brønnene inneholdende test-tappinger og den negative kontrollen. Rb-a-mlgG (Jackson) ble fortynnet 1:3000 i PBSTC og tilsatt til brønnene inneholdende den positive kontrollen. Plater ble inkubert i 1 time ved romtemperatur. Til slutt ble plater vasket to ganger ved anvendelse av PBST og utviklet med nyfremstilt ABTS<®->løsning (1 mg/ml) (ABTS: 2,2'-azino-bis-(3-etylbenztiazolin-6-sulfonsyre) i 30 minutter ved romtemperatur (RT) i mørke. Absorbans ble målt ved 405 nm.

Boosting av mus

Når serumtitere av anti-P-selektin var tilstrekkelige, ble mus i tillegg boostet to ganger med 20 ug rekombinant humant P-selektin i 100 ul PBS, intravenøst 4 og 3 dager før fusjon.

Fremstilling av hybridom

Mus ble avlivet og milten og lymfeknuter som flankerer abdominale aorta og vena cava ble oppsamlet. Fusjon av splenocytter og lymfeknuteceller med fusjonspartneren SP 2,0-celler ble utført i henhold til standardmetoder.

Humane monoklonale antistoffer med variable tunge og lette sekvenser av SEKV ID NR 1-22 ble oppnådd ved immuniseringsmetoden.

K-ELISA

For å bestemme hvorvidt hybridomer som var et resultat av fusjonen produserer humane antistoffer, ble det gjennomført en k-ELISA. ELISA-plater ble belagt med rotte anti-human IgG K-lett kjede antistoff (DAKO) fortynnet 1/10000 i PBS ved inkubering over natten ved 4°C. Etter tømming av brønnene, ble plater blokkert ved inkubering med PBSTC i 1 time ved romtemperatur. Deretter ble brønner inkubert med hybridom kultursupernatant, 1/2 fortynnet i PBSTC. Dyrkningsmedium 1/2 fortynnet i PBSTC ble anvendt som negativ kontroll, K-lett positiv mus serum 1/100 fortynnet i PBSTC tjente som positiv kontroll. Deretter ble brønner vasket tre ganger og ble inkubert med HRP-konjugert rotte anti-human IgG F(ab')2(DAKO), fortynnet 1/2000 i PBSTC i 1 time ved 37°C. Brønner ble vasket tre ganger og analyser ble utviklet med nyfremstilt ABTS<®->løsning (1 mg/ml) i 30 minutter ved romtemperatur (RT) i mørke. Absorbans ble målt ved 405 nm i en ELISA plateleser.

Kloning og sekvensanalyse av anti- P- selektin HuMab variable domener

( K- lette og yl- tunge kjeder)

Nukleotidsekvensene som koder for lett kjede variabel region Vlog tung kjede variabel region Vh av P-selektin HuMabs ble isolert ved en standard cDNA-syntese / PCR-metode.

Totalt RNA ble fremstilt fra lxlO<6>- lxl0<7>hybridomceller ved anvendelse av RNeasy Mini Kit (Qiagen). Hybridomavledet RNA ble anvendt som en templat for cDNA-syntese av første tråd som ble utført i henhold til en konvensjonell metode som anvender en oligo dT-primer. cDNA-syntese av andre tråd og ytterligere PCR-amplifisering av Vlog Vh som koder for cDNA-fragmenter ble utført med revers lett og tung kjede primere komplementære til nukleotidsekvenser av K-lett og yl-tung kjede konstant region og 5'-spesifikk lett og tung kjede primere, henholdsvis. PCR-produktene ble klonet ved anvendelse av TOPO TA-kloningskit fra Invitrogen™ life technologies og pCR4-TOPO som en kloningsvektor. Klonede PCR-produkter ble identifisert ved restriksjonskartlegging av de passende plasmidene ved anvendelse av £coRI for kløyving og forventede beregnede størrelser av DNA-fragmenter på ca. 740 og 790 bp for Vlog Vh, henholdsvis.

DNA-sekvensen av klonede PCR-fragmenter ble bestemt ved dobbelttråd-sekvensering.

GCG (Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin) programvarepakke versjon 10,2 ble anvendt for generell dataprosessering. DNA og proteinsekvenser ble sammenstilt ved anvendelse av GCG-modulen CLUSTALW. Sekvenssammenstillinger ble tabellarisert, redigert og fargekodet ved anvendelse av programmet GENEDOC (versjon 2,1).

Konstruksjon av ekspresjonsplasmider for en anti- P- selektin IgGl HuMab

Gener som koder for anti-P-selektin HuMab lett og tung kjede ble hver for seg satt sammen i ekspresjonsvektorer for mammalsk celle.

Derved ble gensegmentene som koder for anti-P-selektin HuMab lett kjede variabel region (Vl) og human K-lett kjede konstant region (Cl) sammenføyd i likhet med gensegmenter for anti-P-selektin HuMab tung kjede variabel region (Vh) og human yl-tung kjede konstant region (Cm-Hengsel-Cm-Cm).

Generell informasjon angående nukleotidsekvensene av humane lette og tunge kjeder fra hvilke kodonbruken kan deduseres er gitt i: Kabat, E. A., Wu, T. T., Perry, H. M., Gottesman, K. S. og Foeller, C. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Femte Ed., NIH-publikasjon nr 91-3242.

Transkripsjonensenheten for anti-P-selektin HuMab K-lett kjede er sammensatt av de følgende elementene: • Immediate early enhancer og promoter fra humant cytomegalovirus

(HCMV),

• En syntetisk 5'-UT omfattende en Kozak-sekvens,

• En murin immunglobulin tung kjede signalsekvens omfattende signals ekvens-intronet, • Det klonede anti-P-selektin HuMab variabel lett kjede cDNA arrangert med et unikt Bsml restriksjonssete ved 5'-enden og et splice donorsete og et unikt iVbfl-restriksjonssete ved 3'-enden, • Genomisk human K-gen konstant region, omfattende intron 2 mus Ig-K-enhancer [Picard, D. og Schaffner, W. (1984) Nature 307, 80-82] og • Human immunglobulin K-polyadenylering ("poly A")-signalsekvensen.

Transkripsjonsenheten av anti-P-selektin HuMab yl-tung kjede er sammensatt av de følgende elementene: Immediate early enhancer og promoter fra humant cytomegalovirus

(HCMV),

En syntetisk 5'-UT omfattende en Kozak-sekvens,

En modifisert murin immunglobulin tung kjede signalsekvens omfattende

signalsekvens-intronet,

Klonet anti-P-selektin HuMab variabel tung kjede cDNA arrangert med et unikt Bsml restriksjonssete ved 5'-enden og et splice donor sete og et unikt iVbfl-restriksjonssete ved 3'-enden,

Genomisk human yl-tung gen konstant region, omfattende mus lg u-enhancer [Neuberger, M. S. (\ 9S3) Embo J 2, 1373-1378],

Den humane yl-immunglobulin polyadenylering ("poly A")-signalsekvensen.

Funksjonelle elementer av anti-P-selektin HuMab K-lett kjede og Dl-tung kjede ekspresjonsplasmider: I tillegg til anti-P-selektin HuMab K-lett kjede eller Dl-tung kjede ekspresjonskassetten inneholder disse plasmidene

• Et hygromycin resistensgen

• Et replikasjonsorigo, oriP, fra Epstein-Barr virus (EBV)

• Et replikasjonsorigo fra vektoren pUC18 som tillater replikasjon av dette plasmidet i E. coli og • Et J3-laktamasegen som overbringer ampicillinresistens i E. coli.

Konstruksjon av ekspresjonsplasmider for en anti- P- selektin IgG4 HuMab

En anti-P-selektin []4-tung kjede prototype ekspresjonsplasmid ble avledet fra anti-P-selektin Dl-tung kjede ekspresjonsplasmidet ved å erstatte den humane genomiske Dl-konstante regionen og yl-immunglobulin polyadenylering ("poly A")-signalsekvensen med human genomisk D4-konstant region og y4-immunglobulin polyadenyleringssignalsekvensen.

For ekspresjon av anti-P-selektin HuMab K-lette kjeder ble de samme ekspresjonsplasmidene anvendt som beskrevet for IgGl (se ovenfor).

Konstruksjon av ekspresjonsplasmider for mutant ( variant) anti- P- selektin IgGl o<g>JgG4

Ekspresjonsplasmider som koder for mutant anti-P-selektin Dl- og 04-tunge kjeder ble fremstilt ved seterettet mutagenese av villtype ekspresjonsplasmider ved anvendelse av QuickChange™ seterettet mutagenese-kit (Stratagene).

De følgende mutantene ble fremstilt for LC1004-002. Aminosyrer er nummerert i henhold til EU-nummereringen [Edelman, G. M., Cunningham, B. A., Gall, W. E., Gottlieb, P. D., Rutishauser, U. og Waxdal, M. J. (1969) Proe Nati Acad Sei U SA 63, 78-85; Kabat, E. A., Wu, T. T., Perry, H. M., Gottesman, K. S. og Foeller, C. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Femte Ed., NIH-publikasjon nr. 91-3242].

Fremstillin<g>av rekombinante anti P- selektin HuMabs

Rekombinante HuMabs ble dannet ved transient transfeksjon av adherente HEK293-EBNA-celler (ATTC # CRL-10852) dyrket i DMEM (Gibco) supplert med 10 % ultra-lav IgG FCS (Gibco), 2mM Glutamin (Gibco), 1% volum/volum ikke-essensielle aminosyrer (Gibco) og 250 ug/ml G418 (Roche). For transfeksjon ble Fugene™ 6 (Roche) transfeksjonsreagens anvendt i et forhold av reagens (ul) til DNA (ug) i området fra 3:1 til 6:1. Immunglobulin lette og tunge kjeder ble uttrykt fra to forskjellige plasmider ved anvendelse av et molart forhold av lett kjede til tung kjede-kodende plasmid fra 1:2 til 2:1. HuMab-inneholdende cellekultursupernatanter ble høstet ved dag 4 til 11 etter transfeksjon. Supernatanter ble lagret ved -20°C inntil rensing.

Generell informasjon angående rekombinant ekspresjon av humant antistoff i feks. HEK293 er gitt i: Meissner, P., Pick, H., Kulangara, A., Chatellard, P., Friedrich, K. og Wurm, F. M. (2001) BiotechnolBioeng 75,197-203.

Bestemmelse av affiniteten av anti- P- selektin HuMabs

Utstyr:

Instrument: BIACORE<®>2000

Chip: CM5

Kobling: amin kobling

BuffenHBS (HEPES, NaCl), pH 7,4, 25°C

For affinitetsmålinger har kanin anti human Fcy-antistoffer (Dianova) blitt koblet ved amin kobling til overflaten av chipen for presentasjon av antistoffet mot P-selektin. Omtrent 400 RU av anti P-selektinantistoffer ble bundet. Rekombinant P-selektin (R&D Systems) ble tilsatt i forskjellige konsentrasjoner mellom 0-50 nM. Assosiering ble målt ved P-selektininjeksjon i 120 sekunder; dissosiering ble målt ved vasking av chip-overflaten med buffer i 180 sekunder. Affinitetsdata for forskjellige P-selektinantistoffer er vist i Tabell 2. Ved anvendelse av Biaevaluation programvare ble de kinetiske data tilpasset til en 1:1 Langmuir bindingsmodell for P-selektin til foreliggende monoklonale antistoff.

Inhibitorisk aktivitet av P- selektinantistoffene i en cellebasert adhesjon

og rosetting- analyse

Materialer og metoder:

Analyse av celleadhesjon: I adhesjonsanalysen ble effekten av HuMabs på adhesjonen av leukocyttlignende HL60-celler (ATCC CCL 240) til P-selektin belagt på mikrotiterplater evaluert. HL60-cellene ble merket med BCECF-AM (2', 7'-bis-(2-karboksyetyl)-5-(og-6)-karboksyfluorescein-acetoksymetylester; Katnr 216254, Calbiochem). Fullengde renset P-selektin (rensingsprosedyre s. ovenfor) i en konsentrasjon på 1 ug/ml i buffer inneholdende 150 mM NaCl, ImM CaCh, ImM MgCk, 20 mM Tris (pH 7,4) pluss 0,0005% TxlOO ble belagt natten over ved 4°C til 96-brønners plater (Nunc Immunoplate Maxisorp F96). Deretter ble brønnene blokkert med ovennevnte buffer inneholdende 3,5% bovint serumalbumin (BSA, Fluka) i 2 timer ved romtemperatur (RT). Brønnene ble preinkubert med 50 ul av forskjellige fortynninger av P-selektin HuMabs eller referanse mus P-selektinantistoffer (WAPS 12,2, respektiv hybridomcellelinje gitt ved ATCC) i ovennevnte buffer inneholdende 1% BSA i 20 minutter ved RT. De merkede HL60-cellene (50 ul, 70,000 celler/brønn) ble tilsatt og latt binde i 45 min ved RT. I noen forsøk ble HL60-cellene preinkubert med 20 ug/ml human IgGl i 30 minutter før de ble tilsatt til brønnene for å blokkere Fc-reseptorer. Etter fjerning av de ubundne HL60-cellene ved forsiktig vasking (4 ganger med ovennevnte buffer), ble de adherente cellene lysert med 120 ul NP-40 (Fluka; 1% i H2O). 100 ul av supernatene ble overført til plater for å måle den respektive fluorescensen ved en eksitasjonsbølgelengde på 485 nm og en emisjon på 538 nm ved anvendelse av et luminescens spektrometer LS 50B (Perkin Eimer).

Rosetting-analyse: For å bedømme effekten av antistoffene på interaksjonen av aktiverte blodplater med HL60-celler ble det anvendt en rosetting-analyse (Jungi et al, Blood 67:629 ( 1986)) i kombinasjon med dobbel farge cytofluorimetrisk analyse (Evangelista et al., Blood 88:4183 (1996). Vaskede humane blodplater ble fremstilt som beskrevet (Fox et al, Methods Enzymol 215:45 (1992)). De ble aktivert med trombin (endelig kons. 1 U/ml) i 5 min og merket med et FITC-konjugert anti-humant GPUb antistoff pl-36 (Kouns et al., J Biol Chem 267:18844 (1992)). Deretter ble l,4-2xl0<6>blodplater i 70 ul av tyrode-løsningen inkubert med forskjellige fortynninger av HuMabs (100 ul) i mørke i 30 min ved RT. 50 ul av HL60-cellesuspensjonen (i tyrode-løsning) regulert til 20x1 OVml ble tilsatt. HL60-cellene ble merket ved inkubering med 20 ul av et PE (fycoerytrin)-konjugert anti-humant CD45 Ab (Kode nr. 555483, Pharmingen). Etter å ha inkubert de merkede HL60-cellene med blodplatene og HuMabs i 30 min ved romtemperatur i FACS-rør (Becton Dickinson), ble dannelsen av blandede aggregater eller rosetter analysert ved å måle både blodplate og HL60-celle markør-fluorescens ved anvendelse av en FACScan (Becton Dickinson). Forover og side-spredning, så vel som grønne (FITC) og røde (PE) signaler ble ervervet ved logaritmisk amplifisering med eksitasjonsbølgelengde på 488 nm og emisjonsbølgelengde på 530 nm (FITC) og 570 nm (PE), henholdsvis. Elektronisk kompensasjon ble anvendt for å fjerne spektral overlapping. HL60-celler ble identifisert på basis av forover og side-spredning. Styring av tilfeller identifisert som HL60-celler ble utført for å utelukke enkelt-blodplater. Fem tusen HL60 celle-styrte utfall ble målt for hver prøve. En prøve hvor ikke-aktiverte eller trombinaktiverte blodplater ble blandet med HL60-celler i nærvær av EDTA (10 mmol/1) ble anvendt for å sette en terskel på skalaen for grønn fluorescens. Prosentdelen av HL60-celler over terskelen representerer prosentdelen av HL60 celle-bindende blodplater. Skiftet i blodplate markør-fluorescensen mot lavere fluorescensverdier avspeiler reduksjonen av antall blandede aggregater med et høyere antall av adhererende blodplater til fordel for en økning av antallet blandede aggregater med et lavt antall av adhererende blodplater.

Resultater:

I HL60-celleadhesjonsanalysen hemmet P-selektinantistoffene adhesjonen av HL60-cellene til renset P-selektin med IC50-verdier i området 0,08 - 0,5 ug/ml. Selv om mutasjonene var innført i Fc-delen av antistoffet, var både IgG4 og IgGl-variantene av HuMabs mer potente enn det parentale antistoffet med IC50-verdier på 0,08 - 0,11 ug/ml som illustrert i Fig. 1. Ved preinkubering av HL60-cellene med human IgGl, blir potensen av de parentale ikke-muterte antistoffene også økt med en ca. 3 til 4-ganger reduksjon av IC50-verdien, som vist for HuMab 002 i Fig. 1. Dette funnet indikerer at den økte effektiviteten av mutantene i adhesjonsanalysen primært skyldes elimineringen av adhesjonen av HL60-celler til P-selektin via Fc-delen av antistoffet til Fcy-reseptorene.

I rosetting-analysen som evaluerer adhesjonen av humane aktiverte blodplater som uttrykker P-selektin til HL60-celler var IC50-verdiene av HuMabs til og med under de for adhesjonsanalysen på grunn av det lavere antallet av P-selektin-reseptorer i denne analysen (IC50: 0,05 - 0,3 ug/ml, fortrinnsvis mellom 0,05 og 0,2 ug/ml). Effektiviteten av Fc-variantene av de respektive HuMabs har en tendens til å være øket sammenlignet med det ikke-muterte parentale antistoffet (Fig. 2). Preinkubering av HL60-cellene med IgGl og IgG4 før inkuberingen med de aktiverte blodplatene påvirket ikke i betydelig grad den hemmende aktiviteten av både mutantene og det parentale antistoffet, hvilket indikerer en mindre uttalt rolle av den Fcy reseptor-medierte bindingen i rosetting-analysen sammenlignet med adhesjonsanalysen.

Kryssreaktivitet av P- selektinantistoffene med P- selektin fra dyrearter Materialer og metoder: Kryssreaktiviteten av P-selektin HuMabs ble evaluert ved å måle (i) bindingen av HuMabs til aktiverte blodplater fra rotte og cynomologusape ved anvendelse av FACS-analyse og (ii) deres hemmende aktivitet i rosetting-analysen ved evaluering av adhesjonen av rotte og cynomologus blodplater til HL60-celler.

For å måle bindingen av HuMabs til aktiverte rotte og cynomologus-blodplater, ble vaskede rotte og cynomologus blodplater fremstilt på samme måte som ved fremstilling av vaskede humane blodplater (s. ovenfor). De ble aktivert med trombin (endelig kons. 1 U/ml) i 5 min. Aktiverte blodplater ble inkubert med forskjellige fortynninger av HuMabs (20 ul) i 30 min ved RT. Etter binding av HuMabs ble blodplatene fiksert med PF A 2% ved RT i 15 min. Prøver ble vasket med Tyrode-buffer og resuspendert i 300 ml Tyrode. Bindingen av HuMabs ble detektert med et FITC-konjugert F(ab')2-fragment av kanin anti-human IgG (Kode nr. F0056, Dako). Som et kontrollantistoff for hemming av rotte P-selektin ble et kanin anti-humant polyklonalt anti-P-selektinantistoff (Kode nr. 09361A, Pharmingen) anvendt.

For å måle den hemmende virkningen av P-selektin HuMabs i rosetting-analysen, ble vaskede rotte og cynomologus-blodplater fremstilt som beskrevet ovenfor for humane blodplater. Rosetting-analysen ble utført hovedsakelig som beskrevet for humane blodplater. For merkingen av cynomologus-blodplatene ble det FITC-konjugerte anti-human GPUb-antistoffet pl-36 anvendt, mens blodplatene fra rotte ble merket med det FITC-konjugerte mus anti-rotte CD61-antistoffet (Kode nr. 554952, Pharmingen).

Resultater: Ingen av de P-selektinspesifikke antistoffene ifølge oppfinnelsen som hemmer human P-selektin-medierte funksjoner ble vist å binde til rotte P-selektin eller å hemme dannelsen av blandede aggregater bestående av rotte blodplater og HL60-celler, som vist for noen eksempler i Fig. 3a. P-selektin HuMabs binder imidlertid til og hemmer cynomologus P-selektin (Fig. 3b).

Selektivitet av P- selektinantistoffene versus E- og L- selektin

Materialer og metoder: Selektiviteten av P-selektin HuMabs versus E- og L-selektin ble bestemt i en cellefri ELISA som måler bindingen av antistoffene til rekombinant E- og L-selektin (ADP1 og ADP2, R&D Systems) og en cellebasert ELISA som måler bindingen av antistoffene til E-selektin-CHO-transfektanter og L-selektin-300,19-transfektanter (transfektanter ble fremstilt som beskrevet i Goetz et al., J Cell Biol 137:509 (1997); Ley et al., Blood 82:1632 (1993)).

I den cellefri ELISA ble rekombinant P-, E- eller L-selektin i en konsentrasjon på 1 ug/ml i buffer inneholdende 150 mM NaCl, ImM CaCk, ImM MgCb, 20 mM Tris (pH 7,4) pluss 0,0005% TxlOO belagt over natten ved 4°C i 96-brønners plater (Nunc Immunoplate Maxisorp F96). Deretter ble brønnene blokkert med ovennevnte buffer inneholdende 3,5% bovint serumalbumin (BSA, Fluka) i 2 timer ved RT. Brønnene ble preinkubert med 50 ul av forskjellige fortynninger av P-selektin HuMabs eller referanse mus P-, E-selektinantistoff (BBA26; R&D Systems) og geit L-selektinantistoff (AF728; R&D Systems) i ovennevnte buffer inneholdende 1% BSA over natten ved RT. Bindingen av HuMabs ble detektert ved anvendelse av en biotinylert anti-human IgG (Amersham, RPN1003, Endelig konsentrasjon 1:1000) eller for kontrollantistoffene den tilsvarende biotinylerte anti-mus eller anti-geit IgG. Etter inkubering i 1 time ble brønnene vasket (3 ganger) med ovennevnte buffer og 0,1 ml streptavidin-biotinylert peroksidasekompleks (Amersham, RPN1051), fortynnet 1:750 i nevnte buffer inneholdende 0,1% BSA ble tilsatt i 30 min. Brønnene ble deretter vasket og 0,2 ml peroksidasesubstratløsning inneholdende ABTS (2,2'-azino-di-(3-etylbenztiazolin-sulfonat, Boehringer, Mannheim) ble tilsatt (ABTS-stamløsning: 1 ml 40mM ABTS, 5 ul 30% H2O2og 20 ml 0,1M Na-acetat, 0,05 NaH2P04). Reaksjonen ble stanset etter ca. 10 min ved anvendelse av 50 ul 0,1 M citrat og 0,01% NaN3. Fargereaksjonen ble avlest ved 405 nm.

I cellebasert ELISA ble P- og E-selektin-CHO-transfektanter, etter løsning av cellene med celle-dissosieringsløsning (Sigma C5914), sådd ut i hver brønn i 96-brønners plater (TC Mikrowell F96 Nunc 167008) justert til 100,000 celler/brønn og dyrket i respektive medier over natten ved 37°C (medium for P-CHO-transfektanter: DMEM + 10% FCS + 2 mM Glutamin + Penicillin 100 U/ml /Streptomycin 100 ug/ml; medium for E-selektin-transfektanter: HAM F-12 + 10% FCS + 2 mM Glutamin + Penicillin 100 U/ml /Streptomycin 100 ug/ml + 0,1% Fungizon +100 ug/ml Neomycin). Etter fjerning av mediene og blokkering av brønnene med A-T-buffer (150 mM NaCl, ImM CaCk, ImM MgCk, 20 mM Tris (pH 7,4)) inneholdende 3% TopBlock (Kode nr. TB232010; Juro) i 1 time, ble 50 ul av forskjellige fortynninger av P-selektin HuMabs eller referanse mus P- og E-selektinantistoff (s. ovenfor) i ovennevnte buffer inneholdende 1% TopBlock og 0,1% azid tilsatt og inkubert i 60 min ved RT. Etter vasking av brønnene (4 ganger), ble de bundne antistoffene detektert ved anvendelse av samme trinn som nevnt ovenfor for cellefri ELISA.

Siden L-selektin 300,19-celler er suspensjonsceller, måtte det cellebaserte ELISA-formatet modifiseres ved å plate ut L-selektin-300,19-transfektantene i brønner i 96-brønners polystyrenfilterplater (Corning 3510). Ved anvendelse av filterplatene ble blokkerings- og inkuberingsløsninger fjernet ved å filtrere dem gjennom bunnen av platene, men ellers var fremgangsmåten lik den ved anvendelse av P- og E-selektin-CHO-celler. Som kontroller ble ikke-transfekterte CHO og 300,19 anvendt.

Resultater:

Antistoffene ifølge oppfinnelsen var svært selektive versus E- og L-selektin. De bandt til P-selektin-CHO-celler med EC50-verdier i området 0,01 til 0,08 ug/ml, fortrinnsvis i området 0,01 til 0,04 ug/ml, mens EC50-verdiene for E-selektin-CHO-celler og L-selektin-300,19 var klart høyere enn 50 ug/ml, foretrukket høyere enn 100 ug/ml. HuMab 002 hadde høyest selektivitet med en selektivitetsfaktor versus E- og L-selektin på mer enn 4,000 ganger i cellebasert ELISA. Videre binder ikke HuMab 002 til E- og L-selektintransfektanter over baselinenivåer opp til en konsentrasjon på 100 ug/ml. Selektiviteten av Fc-variantene IgG4vl og IgGl v 1 fra HuMab 002 er lik den for det parentale HuMab 002 (Fig 4a-c).

Ex vivo hemmende aktivitet av P- selektinantistoffer i et fullstendig humant blodstrøm- svstem

Effekt av P-selektin HuMabs på leukocyttadhesjon til et blodplate monolag Materialer og metoder: For å undersøke effekten av P-selektinantistoffer på rekrutteringen av leukocytter til skadesteder i karveggen og blodplatetromber, ble et humant blodstrøm-system som tillater måling av interaksjonen av humane leukocytter med humane blodplater ved forskjellige skjærhastigheter anvendt hovedsakelig som beskrevet (Kirchhofer et al., Blood 89:1270

(1997)). I en parallellplate perfusjonsanordning ble humant helblod tappet fra antecubital venen fra en frisk donor perfusert over en kollagenoverflate som simulerer en skadet blottlagt karvegg. Kollagen-belagte dekkglass ble fremstilt som beskrevet (Kirchhofer et al., Blood 89:1270 (1997)). De ble plassert i tre parallellplate perfusjonskammere. For å tillate måling av forskjellige skjærhastigheter (65/s og 280/s) ble det anvendt forskjellige dimensjoner av perfusjonskammere og blodet ble perfusert over det kollagenbelagte dekkglasset ved en konstant blodstrøm på 1 ml/min hvilket ble kontrollert ved individuelle rullepumper ("roller pumps") plassert distalt for perfusjonsanordningen. Umiddelbart etter tapping av blodet fra åren og separering av blodet inn i de tre rørene, ble en GPUb/IIIa-inhibitor (0,5 umol/lamifiban) tilsatt for å forhindre blodplateaggregering og for å danne monolag av blodplater. Samtidig ble P-selektinantistoffene (HuMabs-mutantene, respektive referanseantistoffer eller human IgGl og IgG4 som kontroller) administrert i forskjellige konsentrasjoner og blod-inhibitorblandingen ble deretter ført inn i perfusjonskammeret inneholdende de kollagen-belagte dekkglassene. Etter en perfusjonsperiode på 5,5 minutter, ble PBS perfusert gjennom perfusjonskammeret uten å forstyrre strømmen i 3 min. Etter en kort avbrytelse av strømmen ble kammerene fiksert med 3% paraformaldehyd i PBS ved 1 ml/min i 2 min. Deretter ble dekkglasset fjernet fra kammerene, fiksert igjen i 1 time i 3% paraformaldehyd i PBS ved 4 °C og lagret i PBS-0,03% natriumazid. For å bedømme antallet leukocytter som adhererer til monolaget av blodplater, ble dekkglasset etter lufttørking merket med Diff-Quick-løsning (Dade Behring AG) og innstøpt i Merckoglas (Merck, Tyskland). Et avbildnings-analysesystem (MOD, Imaging Research Inc.) ble anvendt for å bestemme antall leukocytter som adhererer til et standard område orientert vinkelrett til blodstrømmen 1 mm fra begynnelsen av dekkglasset. Ved en skjærhastighet på 65/s og 280/s omfattet området på hvilket antall leukocytter ble tellet 3,1 mm<2>og 2,1 mm<2>, henholdsvis.

Resultater:

P-selektin HuMabs hemmet adhesjonen av leukocytter til monolaget av blodplater på en konsentrasjonsavhengig måte. Ved en skjærhastighet på 65/s og en konsentrasjon på 10 ug/ml hemmet HuMabs adhesjonen av leukocytter med 60 - 99 %, foretrukket 70-99 %. Den hemmende virkningen av HuMabs ble tydeligere ved den høyere skjærhastigheten på 280/s (nærmere den arterielle situasjon) sammenlignet med den venøse skjærhastigheten på 65/s. Totalt, ved en skjærhastighet på 280/s, var antallet adhererende leukocytter lavere enn ved 65/s. Ved sammenligning av Fc-variantene med de respektive parentale antistoffene, hadde de lignende hemmende aktivitet i ex vivo perfusjonskammeret, som vist for HuMab 002 og dens varianter IgG4vl og IgGlvl (Fig. 5). Den økte hemmende aktiviteten av mutantene versus det parentale antistoffet funnet i in vitro-analysen ble ikke observert i ex vivo perfusjonskammeret noe som kan skyldes metningen av Fcy-reseptorene på leukocyttene i humant helblod.

Effekt av P- selektin HuMabs på leukocyttadhesjon til endotelceller Materialer og metoder: For å undersøke det antiinflammatoriske potensialet for P-selektin HuMabs under skjær betingelser, ble ovennevnte humane blodstrøm-system anvendt i oppsetting hvor endotelceller ble belagt på dekkglasset. Humane endotelceller isolert fra venen i navlesnor (HUVEC) ble isolert ved kløyving med kollagenase Type JJ (Roche Sveits) i henhold til metoden ifølge Jaffe et al, 1993 (Vennligst tilføy fullstendig angivelse). De ble dyrket i 1% gelatinbelagte vevskulturkolber i medium 199 (Ml 99, Sigma, Tyskland) supplert med 20% føtalt kalveserum (Gibco, Auckland), 100 IU/ml penicillin (Gibco, Auckland), 0,1 mg/ml streptomycin (Gibco, Auckland), 2 mmol/1 L-glutamin (Gibco, Auckland), 10 U/ml heparin (Sigma) og 50 ug/ml EC vekstsupplement (Sigma, Tyskland). HUVEC ble dyrket til konfluens (ca. 4 dager), passert med trypsin/etylendiamintetraeddiksyre (Gibco, Auckland) og sådd ut på Thermanox plast-dekkglass (ca. 200,000 ECs/dekkglass) tidligere belagt med 1% gelatin (Fluka, Tyskland). HUVEC'ene fikk sette seg og ble konfluente i løpet av 1-2 dager. De ble stimulert med 20 ng/ml JX-4 (R&D Systems) 24 timer før start av perfusjonen og med IO"<4>M histamin (Fluka, Tyskland) 5-10 min før perfusjonen. Hvert forsøk ble utført med HUVEC ved passasje 1. Dekkglass med konfluent monolag av stimulerte HUVEC ble plassert inn i parallellplate perfusjonskammere som beskrevet ovenfor. Som for perfusjonsforsøket beskrevet ovenfor, ble helblod tappet fra friske donorer. Imidlertid ble blodet, i disse forsøkene, antikoagulert med en trombinhemmer Ro-46-6240 (lOuM) og preinkubert med forskjellige konsentrasjoner av P-selektinantistoffene (HuMabs, mutanter, respektive referanseantistoffer) eller human IgGl og IgG4 som kontroller i 5 min like før perfusjon over de aktiverte endotelcellene. Blodstrømmen ble regulert til 1 ml/min, skjærhastigheten 65/s og perfusjonstiden 5,5 min. Etter en vaskeperiode på 3 min med PBS, ble HUVEC ene med de adhererende leukocyttene fiksert med 3% paraformaldehyd i 2 min under de samme flytbetingelsene som beskrevet. Deretter ble dekkglasset fjernet fra kammerene, nedsenket i fersk fikservæske i 1 time og lagret i PBS-0,02% natriumazid. For morfometrisk analyse, ble leukocyttene merket med et mus antistoff mot det vanlige leukocytt antigenet CD45, som ble merket på forhånd ved anvendelse av et modifisert biotinylert anti-mus immunglobulin (Animal Research Kit, Dako, USA). Kjernene ble kontrastfarget med hematoxylin (J. T Baker, Holland).

Resultater:

Stimuleringen av HUVEC'ene med kombinasjonen av IL-4 og histamin resulterte i ekspresjon av P-selektin og adhesjon av forskjellige typer av leukocytter sammen med granulocytter (omfattende PMN og eosinofiler) som utgjør den gjeldende delen av adhererende leukocytter. HuMabs ifølge oppfinnelsen hemmet adhesjonen av den totale leukocyttpopulasjonen med 60-90 % ved 3 ug/ml. Totalt var den hemmende aktiviteten av Fc-variantene ikke betydelig forskjellig fra den for de ikke-muterte HuMabs.

P-selektin HuMabs viser en ulik effekt på de forskjellige subtypene av leukocytter. Effekten på granulocytter er mer uttalt sammenlignet med mononukleære leukocytter. Antistoffene ifølge oppfinnelsen hemmet adhesjonen av granulocytter (omfattende PMNs og eosinofiler) med 90-99 %, monocytter med 50-88 % og lymfocytter med 5-40 %. Den respektive reduksjonen i det absolutte antallet av de forskjellige subtypene av leukocytter er representativt gitt for IgG4vl i Fig. 6.

Potensiale av P- selektin HuMabs med hensyn til aktivering av komplementsystem Clq og C3c-binding ELISA: For å bestemme evnen av antistoffene ifølge oppfinnelsen til å indusere Clq-binding og C3-aktivering, ble det anvendt en ELISA-metode. Clq er del av det adaptive immunsystemet og utløser, ved binding til immunkomplekser, sekvensiell aktivering av mange zymogener. Enzymene i sin tur, bevirker kløyving av C3-molekyler, som kan føre til oppstart av inflammatoriske reaksjoner, opsonisering av fremmede eller avvikende partikler og lysis av cellemembraner.

I prinsippet blir ELISA-platen belagt med konsentrasjonsområder av antistoffet, til hvilket human Clq eller humant samlet serum, som en kilde for C3, blir tilsatt. Clq eller C3 □-binding blir detektert ved et antistoff rettet mot human Clq eller C3 □ etterfulgt av et peroksidasemerket konjugat.

HuMab 002 (hybridom- og transient transfektom-avledet materiale, dens mutante varianter og kontrollantistoffer ble testet i konsentrasjoner på 0,16-20 ug/ml. Som en negativ kontroll ble det anvendt et humant IgG4 (CLB, Nederland, 0,5 ug/ml stock), som binder Clq svært svakt. Human IgGl (Sigma, 2 ug/ml stock) ble inntatt som positiv kontroll. For deteksjon av Clq, ble det anvendt et kanin-antistoff rettet mot Clq (Dako) og et svin anti-kanin IgG-antistoff, konjugert til pepperrot peroksidase (Sigma). For deteksjon av C3D ble det anvendt et mus anti-humant C3-antistoff og et kanin anti-mus IgG-antistoff, konjugert til pepperrot peroksidase (Sigma).

Beregninger angående EC50-verdier eller maksimal binding ved 10 Dg/ml (Bmaks) av HuMab testet ble bestemt ved anvendelse av ikke-lineær regresjon kurvetilpasning (binding ved ett sete) ved anvendelse av Graphpad Prism programvare.

Resultater:

HuMab 002 ifølge oppfinnelsen var i stand til å binde Clq effektivt som angitt ved EC50-verdier på 0,946 □ ug/ml og 1,159 u/ml og Bmaks (OD405)-verdier på 0,987 og 0,711 for hybridom- og transfektomavledet materiale, henholdsvis. Den negative kontrollen human IgG4 bandt som forventet ikke til Clq, som angitt ved en Bmaks-verdi på 0,222 ved OD405. Imidlertid hadde alle de tre Fc-variantene testet (IgG4vl, IgGlvl, IgGlv2) mistet kapasiteten til å binde Clq, som vist ved OD405 Bmaks-verdier på 0,132, 0,119 og 0,132, henholdsvis (Tabell 3). På linje med Clq bindingskapasitetene, inntraff C3-avsetting til HuMab 002 (hybridom- og transfektom-avledet) på en antistoff-konsentrasjonsavhengig måte og EC50-verdier varierte mellom 2,7 Dg/ml og 8,3 Dg/ml. Imidlertid var alle tre Fc-variantene ute av stand til å initiere C3-avleiring, som angitt ved OD405 Bmaks-verdier på 0,104, 0,156 og 0,133, henholdsvis (Tabell 3).

Ettersom HuMab 002 interagerer med komplementkomponenter, har dette antistoffet intrinsisk potensiale til å indusere CDC in vivo. Derfor ble Fc-delen av dette antistoffet modifisert i henhold til oppfinnelsen.

Potensiale av P- selektin HuMabs til å binde til Fcy- reseptorer IgG-antistoffavhengig cytotoksisitets-effekter blir mediert av FcD □ reseptorer på effektorceller. Binding av hybridom- og transfektom-avledede HuMab 002 så vel som de mutante variantene og kontrollantistoffene til FcDR-uttrykkende effektorceller fra humant blod ble studert ved FACS-analyse.

Materialer og metoder:

FcD RI IIAl,6-transfektanter eller nylig isolerte effektorceller ble inkubert med antistoffer og binding av antistoff ble detektert med FITC-merket kanin-anti-human IgG F(ab)2(DAKO) eller FITC-merket kanin-anti-human IgG F(ab)2(BD/Pharmingen). HuMab 002 (transient transfektom- og/eller hybridom-avledet materiale og mutante varianter) ble testet i en konsentrasjon på 1 Dg/ml (HAI,6 transfektanter) eller 10 ug/ml (effektorceller). Fravær av primært antistoff eller human IgG4 (10 ug/ml) ble anvendt som negativ kontroll. For å detektere FcDRI-ekspresjon på UAl,6-celler, ble FITC-merket mus anti-human CD64 (BD/Pharmingen) anvendt. I forsøk ved anvendelse av NK celle-anriket perifert blod mononukleære celler, ble NK-celler identifisert ved dobbel merking ved anvendelse av PE-merket mus-anti-human CD56 (BD/Pharmingen). Granulocytter og monocytter ble identifisert basert på FSC/SSC-profil.

JJAl,6-celler, nAl,6-FcDRI-transfektant og nylig isolerte effektorceller ble inkubert med antistoffer. Binding av antistoff ble detektert med FITC-merket Rb-a-huIgG F(ab)2(DAKO) eller FITC-merket Rb-a-huIgG F(ab)2(BD/Pharmingen).

HuMab 002 (transient transfektom-, hybridomavledet- og mutant variant materiale) ble testet i en konsentrasjon på 1 ug/ml i IIAl,6-FcyRI-transfektant bindingsforsøk. KAI,6 villtypecellene ble anvendt som en negativ kontroll. Som en kontroll for FcyRI-ekspresjon ble m-a-huCD64-FITC (BD/ Pharmingen) anvendt.

HuMab 002 (transient transfektom-, hybridomavledet- og mutant variant materiale) ble testet i en konsentrasjon på 10 ug/ml i effektorcelle-bindingsforsøket. Transient transfektom-materiale ble ikke testet i granulocytt-bindingsforsøket. IgG4 (10 ug/ml) ble anvendt som en negativ kontroll i alle effektorcelle bindingsforsøk med unntak av granulocytt bindingsforsøket.

Helblod ble anriket for NK-celler ved anvendelse av et "NK isolation kit" (Dynal Biotech ASA, Oslo, Norge). NK-celler ble identifisert ved m-a-huCD56-FITC-merking.

PBMCs (perifere blod mononukleære celler) ble oppnådd fra helblod ved anvendelse av Ficoll-metoden som beskrevet i fremgangsmåten vedlagt NK isolerings-kit (Dynal Biotech ASA, Oslo, Norge). Monocytter ble identifisert basert på FSC/SSC-profil. Granulocytter ble isolert fra helblod ved anvendelse av FACS lysisbuffer og identifisert basert på FSC/SSC-profil.

Nylig isolerte effektorceller ble inkubert med antistoffer og binding av antistoff ble detektert med FITC-merket kanin-anti-humant IgG F(ab)2(DAKO) eller FITC-merket kanin-anti-humant IgG F(ab)2(BD/Pharmingen). HuMab 002 (transient transfektom-og/eller hybridom-avledet materiale og mutante varianter) ble testet i en konsentrasjon på 10 ug/ml. Fravær av primært antistoff eller human IgG4 (10 ug/ml) ble anvendt som negativ kontroll. NK-celler ble isolert fra MNC-prøver ved et NK isolerings-kit (Miltenyi Biotec, USA). I forsøk ved anvendelse av NK celle-anrikede perifere blod mononukleære celler, ble NK-celler identifisert ved dobbelt merking ved anvendelse av PE-merket mus-anti-human CD56 (BD/Pharmingen). Granulocytter og monocytter ble isolert i henhold til kjent teknikk på området fra PBMC (feks. Monocytt isolerings-kit (Miltenyi, se ovenfor). Granulocytter og monocytter ble identifisert basert på FSC/SSC-profil.

Resultater:

HuMab 002 i henhold til oppfinnelsen var i stand til å binde til FcR som angitt ved binding til granulocytter, monocytter og NK-celler. Alle tre Fc-variantene testet (IgG4vl, IgGlvl og IgGlv2) hadde fullstendig mistet kapasiteten til å binde til NK-celler (Tabell 4). I tillegg bandt HuMab 002 effektivt til granulocytter og monocytter, mens de mutante variantene oppviste bindingsnivåer komparable med fravær av primært antistoff eller human IgG4, som angitt ved prosentandeler av celler som binder antistoff i Tabellene 5 og 6. Dette indikerer at de mutante variantene mistet kapasiteten til å interagere med FcR på effektorceller.

Ettersom HuMab 002 kan interagere effektivt med FcR, har dette antistoffet intrinsisk potensiale til å indusere antistoffavhengig cellemediert cytotoksisitet in vivo. Inaktivering av interaksjonen med FcR som gjennomført for Fc-variantene ifølge oppfinnelsen forhindrer ADCC på en effektiv måte.

Claims

1. Antistoff,karakterisert vedat det binder til P-selektin, ikke binder til komplementfaktor Clq og ikke til Fcy reseptorer på NK celler, og som inneholder en Fc del avledet fra human opprinnelse og erkarakterisert vedat nevnte antistoff er av human underklasse lgG4 hvor S228 er erstattet med P og L235 er erstattet med E, som hemmer adhesjonen av leukocytt-lignende HL60 celler til renset P-selectin med en IC50 verdi på fra 0,08 til 0,5 ug/ml og omfatter CDR1, CDR2 og CDR3 regioner av lettkjede variable domener definert av aminosyresekvens SEKV ID NR: 3 og CDR1, CDR2 og CDR3 regioner av tungkjede variabelt domene definert av SEKV ID NR: 4.

2. Antistoff ifølge 1,karakterisert vedat det er et humant eller humanisert antistoff.

3. Antistoff ifølge 1 eller 2, omfattende lettkjede variabelt domene definert av aminosyresekvens SEKV ID NR: 3 og tungkjede variabelt domene definert av SEKV ID NR: 4.

4. Antistoff ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 3, hvor den humane tungkjede konstante region omfatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR: 28 og K-lettkjede konstante region er som definert i SEKV ID NR: 23.

5. Nukleinsyremolekyl som koder for et antistoff molekyl ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 4.

6. Vektor omfattende nukleinsyremolekylet ifølge krav 5.

7. Vertscelle omfattende vektoren ifølge krav 6.

8. Metode for fremstilling av et antistoffmolekyl ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 4 omfattende dyrkning av vertscelle ifølge krav 7 under betingelser som tillater syntese av nevnte antistoff molekyl og utvinning av nevnte antistoff molekyl fra nevnte kultur.

9. Antistoff som binder til P-selektin, ikke binder til komplementfaktor Clq og ikke til FcD reseptorer på NK celler, inneholdende en Fc del avledet fra human opprinnelse, hvor antistoffet er fremstilt av en vertscelle ifølge krav 7.

10. Preparat omfattende et antistoff molekyl ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 4 eller 9.

11. Preparat ifølge krav 10, som er et farmasøytisk eller en diagnostisk preparat.

12. Farmasøytisk preparat omfattende et antistoff ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 4 eller 9 og minst ett farmasøytisk akseptabelt tilsetningsmiddel.

13. Antistoff ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 4 eller 9 for anvendelse i forebygging eller behandling av inflammatoriske og trombotiske lidelser.

14. Antistoff ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 4 eller 9 for anvendelse i forebygging eller behandling av inflammatoriske og trombotiske lidelser ifølge krav 13, hvor nevnte lidelse er perifer arteriell okklusiv sykdom (PAOD) eller kritisk lem-ischemi (CLI).

15. Sett omfattende et antistoffmolekyl ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 4 eller 9, et nukleinsyremolekyl ifølge krav 5, en vektor ifølge krav 6 eller en vertscelle ifølge krav 7.