KR102544705B1 - 박테리아 내 2쇄 단백질을 생산하는 방법 - Google Patents

박테리아 내 2쇄 단백질을 생산하는 방법 Download PDF

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Abstract

2쇄를 함유한 재조합 폴리펩티드, 예컨대 알파 쇄 및 베타 쇄를 포함하는, 암 단백질에 대한 면역 가동화 단클론성 T 세포 수용체 (ImmTAC)의 생산 방법이 본원에서 제공된다. 특히, 최적화된 발현 벡터의 및 배양 공정 이용을 통한, 박테리아 내 이종 분비성 단백질의 생산 방법이 제공된다.

Description

박테리아 내 2쇄 단백질을 생산하는 방법{METHODS OF PRODUCING TWO CHAIN PROTEINS IN BACTERIA}
관련 출원(들)의 상호 참조
본 출원은, 이의 전문이 본원에 참고로 포함된, 2014년 11월 5일 수요일자로 출원된 미국 가특허원 제62/075,798호에 대한 우선권을 청구한다.
ASCII 텍스트 파일 상에서의 서열목록 제출
ASCII 텍스트 파일 상에서의 하기 제출된 내용은 이들의 전문이 본원에 참조로 인용된다: 서열 목록의 컴퓨터 판독가능 형태 (CRF) (파일명: 146392035140SEQLIST.TXT, 기록된 날짜: 2015년 11월 5일 목요일, 크기: 2 KB).
기술분야
본 개시내용은 재조합 폴리펩티드, 예컨대 암 단백질에 대한 면역 가동화 단클론성 T 세포 수용체 (ImmTAC)의 생산 방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 개시내용은 최적화된 발현 벡터 및 배양 공정의 사용을 통해 박테리아내 이종성 분비성 단백질의 생산 방법에 관한 것이다.
원핵 숙주 세포에서 재조합 단백질 생산은 1978년 이. 콜라이 내 인간 인슐린의 생산 이래 많은 중요한 치료제의 공급원이 되어 왔다. 분자 생물학 도구 및 지식이 진전됨에 따라, 재조합 치료제의 복합성이 또한 증가되어 있다. 이들 재조합 단백질의 생산은 생성물이 특성 예컨대 적절한 번역, 접힘, 조립, 이황화 결합, 및 주변세포질로 이송을 나타내는 것이 필요하다. 많은 재조합 단백질, 특히 이황화 결합을 갖는 것 (예를 들면, 제한 없이 항체 및 항체 단편를 포함한, 2쇄 단백질)이 원핵 숙주 세포에서 봉입체의 형성을 유발한다는 것이 공지된다 (Spadiut et al., Trends in Biotechnology, 32:54, 2014). 따라서, 산업적 규모로 원핵 숙주 세포에서 적절하게 접혀진 및 조립된 2쇄 단백질의 재조합 생산용 발현계 및 공정에 대한 요구가 있다.
단클론성 항체는, 다양한 질환의 치료를 위하여 이미 승인된 또는 검토중인 수많은 단클론성 항체와, 재조합 치료제의 가장 빠르게 성장하는 유형 중 하나를 나타낸다 (Nelson et al., Nature Review Drug Discovery, 9:767, 2010). 전통적 단클론성 항체는 단일 표적 항원에 결합한다. 많은 질환에 대하여, 1 초과의 표적 항원, 즉, 다중특이적 항체를 결합하는 항체를 사용하는 것이 유리할 수 있다. 상기 항체는 다중 치료 표적에 관한 조합 접근법에서 이용될 수 있다 (참고: 예를 들면, Bostrom et al., Science 323:1610, 2009; 및 Wu et al., Nature Biotechnology, 25:1290, 2007). 예를 들어, 종양 세포의 T 세포-매개된 사멸을 유도하기 위해 암 세포의 표면상에서 발현된 에피토프 및 T 세포 상에서 발현된 에피토프를 동시에 결합하는 이중특이적 항체는 생산될 수 있다 (Shalaby et al., Clinical Immunology, 74:185, 1995).
병상에서 이중특이적 항체의 사용은 산업적으로 관련된 양으로 2쇄 단백질을 생산하기 위한 능력을 필요로 한다. 원핵 숙주 세포에서 재조합 단백질 생산을 개선하는 벡터 구성요소가 기재되어 있는 반면 (참고, 예를 들면, Schlapschy et al., Protein Engineering, Design and Selection, 19:385, 2006; 및 Simmons et al., Journal of Immunological Methods 263: 133, 2002), 본원에서 기재된 결과는 발현 벡터 단독에 대한 변형이 2쇄 단백질의 제조 동안 마주치는 모든 생산 문제를 해결하지 않는다는 것을 입증한다. 실험 규모로 재조합 2쇄 단백질, 예컨대 항체 단편 및 절반-항체를 효율적으로 생산하기 위한 최적의 방법에 대한 필요성이 남아있다.
특허 출원, 특허 공개, 및 UniProtKB/Swiss-Prot 수탁 번호를 포함하는, 본 명세서에서 인용된 모든 참조문헌은, 각 개별 참조가 참고로 편입될 수 있도록 구체적으로 그리고 개별적으로 지적된 바와 같이 그 전체가 참고로 본 명세서에 편입되어 있다.
요약
한 양태에서, 원핵 숙주 세포에서 2쇄를 포함한 폴리펩티드의 생산 방법이 본원에서 제공되고, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: 숙주 세포를 배양시켜 폴리펩티드의 2쇄를 발현시키고, 이로써 발현시 2쇄가 접히고 조립되어 숙주 세포에서 생물학적으로 활성 폴리펩티드를 형성하는 단계; 여기에서 숙주 세포는 (1) 폴리펩티드의 제1 쇄를 암호화한 제1 번역 단위체; (2) 폴리펩티드의 제2쇄를 암호화한 제2 번역 단위체; 및 (3) 펩티딜-프롤릴 이소머라아제, 단백질 이황화 산화환원효소, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 샤페론 단백질을 암호화한 제3 번역 단위체를 포함한 폴리뉴클레오티드를 포함하고; 여기에서 숙주 세포는 하기를 포함한 조건 하에 배양 배지에서 배양되고: 성장 온도 및 성장 교반 속도를 포함한 성장 기, 및 생산 온도 및 생산 교반 속도를 포함한 생산 기, 여기에서 성장 온도는 생산 온도의 2 내지 10℃ 초과이고, 성장 교반 속도는 생산 교반 속도의 50 내지 250 rpm 초과이다; 및 (b) 숙주 세포로부터 생물학적으로 활성 폴리펩티드를 회수하는 단계. 원핵 숙주 세포에서 T 세포 수용체 (TCR) 알파 쇄 및 TCR 베타 쇄를 포함하는, 암에 대한 면역 가동화 단클론성 T 세포 수용체 (ImmTAC)를 생산하는 방법이 또한 제공되며, 상기 방법은 하기를 포함한다: (a) 하기를 포함한 조건하에 상기 숙주 세포를 배양시켜 배양 배지에서 상기 ImmTAC의 TCR 알파 쇄 및 TCR 베타 쇄를 발현시키는 단계: 성장 온도 및 성장 교반 속도를 포함한 성장 기, 및 생산 온도 및 생산 교반 속도를 포함한 생산 기를 포함한 조건하에 배양 배지에서 폴리펩티드의 TCR 알파 쇄 및 TCR 베타 쇄를 발현시켜, 이로써 발현시 접혀지고 조립되어 숙주 세포에서 생물학적 활성 ImmTAC를 형성하는 단계; 여기에서 숙주 세포는 (1) ImmTAC의 TCR 알파 쇄를 암호화한 제1 번역 단위체; (2) ImmTAC의 TCR 베타 쇄를 암호화한 제2 번역 단위체; 및 (3) 펩티딜-프롤릴 이소머라아제, 단백질 이황화 산화환원효소, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 샤페론 단백질을 암호화한 제3 번역 단위체를 포함한 폴리뉴클레오티드를 포함하고; 여기에서 성장 온도는 생산 온도의 2 내지 10℃ 초과이고, 성장 교반 속도는 생산 교반 속도의 50 내지 250 rpm 초과이다; 및 (b) 숙주 세포로부터 생물학적 활성 ImmTAC를 회수하는 단계. 원핵 숙주 세포에서 2쇄를 포함한 폴리펩티드의 생산 방법이 또한 제공되며, (a) 숙주 세포를 배양시켜 폴리펩티드의 2쇄를 발현시키고, 이로써 발현시 2쇄가 접혀지고 조립되어 숙주 세포에서 생물학적으로 활성 폴리펩티드를 형성함; 여기에서 숙주 세포는 하기를 포함한 폴리뉴클레오티드를 포함하고: 폴리펩티드의 제1 쇄를 암호화한 제1 번역 단위체; (2) 폴리펩티드의 제2쇄를 암호화한 제2 번역 단위체; (3) 제1 샤페론 단백질을 암호화한 제3 번역 단위체; (4) 제2 샤페론 단백질을 암호화한 제4 번역 단위체; 및 (5) 제3 샤페론 단백질을 암호화한 제5 번역 단위체, 여기에서 제1, 제2 및 제3 샤페론 단백질은 펩티딜-프롤릴 이소머라아제, 단백질 이황화 산화환원효소, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 여기에서 숙주 세포는 하기를 포함한 조건하에 배양 배지에서 배양되고: 성장 온도 및 성장 교반 속도를 포함한 성장 기, 및 생산 온도 및 생산 교반 속도를 포함한 생산 기, 여기에서 성장 온도는 생산 온도의 2 내지 10℃ 초과이고, 성장 교반 속도는 생산 교반 속도의 50 내지 250 rpm 초과이다; (b) 숙주 세포로부터 생물학적으로 활성 폴리펩티드를 회수함. 원핵 숙주 세포에서 T 세포 수용체 (TCR) 알파 쇄 및 TCR 베타 쇄를 포함하는, 암에 대한 면역 가동화 단클론성 T 세포 수용체 (ImmTAC)를 생산하는 방법이 또한 제공되며, 상기 방법은 하기를 포함한다: (a) 하기를 포함한 조건하에 상기 숙주 세포를 배양시켜 배양 배지에서 상기 ImmTAC의 TCR 알파 쇄 및 TCR 베타 쇄를 발현시키는 단계: 성장 온도 및 성장 교반 속도를 포함한 성장 기, 및 생산 온도 및 생산 교반 속도를 포함한 생산 기, 이로써 발현시 상기 TCR 알파 쇄 및 TCR 베타 쇄가 접혀지고 조립되어 상기 숙주 세포에서 생물학적 활성 ImmTAC를 형성하는 단계; 여기에서 숙주 세포는 하기를 포함한 폴리뉴클레오티드를 포함하고: (1) ImmTAC의 TCR 알파 쇄를 암호화한 제1 번역 단위체; (2) ImmTAC의 TCR 베타 쇄를 암호화한 제2 번역 단위체; (3) 제1 샤페론 단백질을 암호화한 제3 번역 단위체; (4) 제2 샤페론 단백질을 암호화한 제4 번역 단위체; 및 (5) 제3 샤페론 단백질을 암호화한 제5 번역 단위체, 여기에서 제1, 제2 및 제3 샤페론 단백질은 펩티딜-프롤릴 이소머라아제, 단백질 이황화 산화환원효소, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 여기에서 성장 온도는 생산 온도의 2 내지 10℃ 초과이고, 성장 교반 속도는 생산 교반 속도의 50 내지 250 rpm 초과이다; 및 (b) 숙주 세포로부터 생물학적 활성 ImmTAC를 회수한다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 3, 4, 또는 5쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 배양 배지의 pH는 생산 기 동안 6.7 내지 7.3의 범위에서 pH로 유지된다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 추가로 프로모터의 3개 사본을 포함하고, 여기에서 제1 사본은 제1 번역 단위체와 작동가능한 조합이고, 제2 사본은 제2 번역 단위체와 작동가능한 조합이고, 제3개 사본은 제1 쇄, 제2쇄 및 샤페론 단백질의 전사를 구동하기 위한 제3 번역 단위체와 작동가능한 조합이다. 일부 구현예에서, 3 샤페론 단백질의 2개를 암호화한 번역 단위체의 2개는 단일 전사 단위체 (2시스트론성 단위체)의 일부이다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 추가로 각 번역 단위체와 작동가능한 조합으로 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, 프로모터는 유도성 프로모터이다. 일부 구현예에서, 유도성 프로모터는 IPTG 유도의 부재하에 제1 쇄, 제2 쇄 및 샤페론 단백질의 전사를 구동하는 IPTG-유도성 프로모터이다. 일부 구현예에서, 유도성 프로모터는 IPTG 유도의 부재하에 TCR 알파 쇄, TCR 베타 쇄 및 샤페론 단백질의 전사를 구동하는 IPTG-유도성 프로모터이다. 일부 구현예에서, 유도성 프로모터는 배양 배지내 포스페이트가 감손된 경우 제1 쇄, 제2 쇄 및 샤페론 단백질의 전사를 구동하는 Pho 프로모터이다. 일부 구현예에서, 유도성 프로모터는 배양 배지내 포스페이트가 감손된 경우 TCR 알파 쇄, TCR 베타 쇄 및 샤페론 단백질의 전사를 구동하는 Pho 프로모터이다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 추가로 선택가능한 마커를 포함하고 배양 배지는 숙주 세포가 폴리뉴클레오티드를 보유하도록 유발시키는 단일 항생물질로 이루어진 선택제를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 번역 단위체는 제1 쇄의 암호화 영역과 작동가능한 조합으로 제1 번역 개시 영역 (TIR)을 포함하고, 제2 번역 단위체는 제2쇄의 암호화 영역의 작동가능한 조합으로 제2 번역 개시 영역 (TIR)을 포함하고, 여기에서 제1 및 제2 TIR의 상대적 번역 강도는 약 1.0 내지 약 3.0이다. 일부 구현예에서, 제1 번역 단위체는 TCR 알파 쇄의 암호화 영역과 작동가능한 조합으로 제1 번역 개시 영역 (TIR)을 포함하고, 제2 번역 단위체는 TCR 베타 쇄의 암호화 영역의 작동가능한 조합으로 제2 번역 개시 영역 (TIR)을 포함하고, 여기에서 제1 및 제2 TIR의 상대적 번역 강도는 약 1.0 내지 약 3.0이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 샤페론 단백질, 또는 제1 샤페론 단백질은 펩티딜-프롤릴 이소머라아제를 포함한다. 일부 구현예에서, 펩티딜-프롤릴 이소머라아제는 FkpA 단백질이다. 일부 구현예에서, FkpA는 이. 콜라이 FkpA이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 샤페론 단백질은 추가로 단백질 이황화 산화환원효소를 포함하거나 또는 제2 샤페론 단백질 및 제3 샤페론 단백질 중 하나 또는 둘 모두는 단백질 이황화 산화환원효소를 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질 이황화 산화환원효소는 DsbA 단백질 및 DsbC 단백질중 하나 또는 둘 모두이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 단백질 이황화 산화환원효소는 이. 콜라이 DsbA 및 이. 콜라이 DsbC중 하나 또는 둘 모두이다. 일부 구현예에서, 원핵 숙주 세포는 그람-음성 박테리아이다. 일부 구현예에서, 그램-음성 박테리아는 이. 콜라이이다. 일부 구현예에서, 이. 콜라이는, 내인성 프로테아제 활성이 결여된 균주의 것이다. 일부 구현예에서, 이. 콜라이는 degpS210A 돌연변이를 갖는 균주이다. 일부 구현예에서, 이. 콜라이는 W3110 △fhuA △phoA ilvG2096 (Valr) △prc spr43H1 △degP △manA lacIQ △ompT △menE degpS210A의 유전자형을 갖는 균주이다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 숙주 세포에 이종성이다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 이종이량체의 모노머 (예를 들면, 이중-특이적 항체)이다. 일부 구현예에서, TCR 알파 쇄는 TCR 알파 쇄 가변 도메인 및 TCR 알파 쇄 불변 도메인을 포함하고, 그리고 TCR 베타 쇄는 TCR 베타 쇄 가변 도메인 및 TCR 베타 쇄 불변 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드의 2쇄는 적어도 하나의 이황화 결합에 의해 서로 연결된다. 일부 구현예에서, ImmTAC의 2쇄는 적어도 하나의 이황화 결합에 의해 서로 연결된다. 일부 구현예에서, ImmTAC은 추가로 T 세포에 결합하고 T 세포 반응을 유발하는 항체 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 단편은 항-CD3 단일 쇄 항체 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, ImmTAC는, 가공되지 않은 TCR의 항원에 대한 친화도와 비교하여, 항원에 대한 증가된 친화도를 갖도록 가공된 TCR을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드의 2쇄는 폴리펩티드 링커에 의해 서로 연결된다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 제1 쇄 및 제2쇄가 면역글로불린 중쇄 및 면역글로불린 경쇄를 포함하는 1가 항체이다. 일부 구현예에서, 면역글로불린 중쇄는 IgG1 또는 IgG4 이소형이다. 일부 구현예에서, 1가 항체는 항원을 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 항원은 시토카인이다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 케모카인, 인터페론, 인터류킨, 림포카인, 및 종양 괴사 인자로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 혈관 내피 성장 인자이다. 일부 구현예에서, 항원은 IL-4, IL13, IL-14, IL-17, VEGFA 및 VEGFC로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 숙주 세포의 주변세포질로부터 회수된 분비성 단백질이다. 일부 구현예에서, ImmTAC는 숙주 세포의 주변세포질로부터 회수된다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는, 항 CD3 단일 쇄 가변 단편 (scFv)에 융합된 가용성 친화도 증진 T 세포 수용체를 포함하는, 암에 대한 면역 가동화 단클론성 T 세포 수용체 (ImmTAC)이다. 일부 구현예에서, 성장 온도는 성장 기 동안 약 30℃ 내지 약 34℃의 범위이고, 생산 온도는 생산 기 동안 약 25℃ 내지 약 29℃의 범위이다. 일부 구현예에서, 성장 교반 속도는 성장 기 동안 약 600 내지 800 rpm의 범위이고, 생산 교반 속도는 생산 기 동안 약 300 내지 약 500 rpm의 범위이다. 일부 구현예에서, 성장 교반 속도는 생산 기 동안 숙주 세포에서 피크 산소 흡수 속도 0.5 내지 2.5 mmol/L/min 초과의 성장 기 동안 숙주 세포에서 산소 흡수 속도를 달성하는데 충분하다. 일부 구현예에서, 성장 기 동안 숙주 세포의 피크 산소 흡수 속도는 3.5 내지 4.5 mmol/L/min의 범위이고, 생산 기 동안 숙주 세포의 산소 흡수 속도는 1.0 내지 3.0　mmol/L/min의 범위이다. 일부 구현예에서, 성장 교반 속도는 생산 교반 속도보다 약 10% 내지 약 40% (rpm/rpm) 더 높다.
본원에 기재된 다양한 구현예의 특징 중 하나, 일부 또는 모두는 조합되어 본 개시내용의 다른 구현예를 형성할 수 있음이 이해되어야 한다. 본 개시내용의 이러한, 그리고 기타 양태는 당해기술의 숙련가에게 분명할 것이다. 개시내용의 이들 및 다른 구현예는 후술하는 상세한 설명에 의해 추가로 기재된다.
도 1A-C는 xIL13 절반-항체 (hAb) 생산 벡터로부터 총 경쇄 (LC) 및 중쇄 (HC) 하부단위체의 생산을 보여준다. 도 1A는, RP-HPLC에 의해 측정된 바와 같이, TIR1,1 (흑색 바) 및 TIR2,2 (줄무늬 바) 생산 벡터로부터 생산된 LC 및 HC에 대한 총 하부단위체의 그래프를 제공한다. 도 1B는 TIR1,1 생산 벡터로부터 LC 및 HC (흑색 바) 또는 가용성 LC 및 HC (회색 바)에 대한 생산된 총 하부단위체의 그래프를 제공한다. 도 1C는 TIR2,2 생산 벡터로부터 총 LC 및 HC (흑색 바) 또는 가용성 LC 및 HC (회색 바)에 대한 생산된 총 하부단위체의 그래프를 제공한다.
도 2는 이중 칼럼 RP-HPLC로 측정된 바와 같이 TIR1,1 (흑색 바) 또는 TIR2,2 (줄무늬 바) hAb 생산 벡터를 이용한 xIL13 hAb의 역가를 보여준다.
도 3A-B는 박테리아성 숙주 세포에서 단백질의 접힘 및 조립을 예증한다. 도　3A는, 샤페론을 이용한 주변세포질에서 단백질의 접힘 및 조립을 예증하는, 박테리아성 단백질 생산을 도시하는 도식이다. 도 3B는, 펩티딜-프롤릴 이소머라아제 ("Ppiases"), 옥시도리더카타아제, 및 다른 샤페론을 포함한, 샤페론 단백질의 목록이다.
도 4A는 FkpA 변이체를 스크리닝하기 위해 사용된 혼화성 시스템을 보여준다. 도 4B는 항체 LC, HC, 및 FkpA를 암호화한 단일 xIL13 플라스미드 (pxIL13.2.2.FkpAc13)의 발생을 보여준다.
도 5A-B는 FkpA 발현의 적정시 xVEGF IgG1 hAb의 생산을 보여준다. 도 5A는 상이한 수준의 FkpA 발현시 hAb 및 가용 모노머성 중쇄 누적을 보여주는 웨스턴 블롯을 도시하고, 반면에 쿠마씨-염색된 겔은 각 조건하에 총 가용성 단백질 생산을 보여준다. 도 5B A 그래프는 상이한 수준의 FkpA 발현시 생산된 hAb의 역가를 보여준다.
도 6A-B는 상이한 수준의 FkpA 발현시 xIL13 IgG4 hAb의 생산을 보여준다. 도 6A는 상이한 벡터 시스템을 이용하여 생산된 xIL13 hAb의 역가를 보여주는 그래프를 제공하고, 각 조건에서 hAb 및 가용 모노머성 중쇄 누적을 보여주는 웨스턴 블롯에 의해 동반된다. 도 6B는 상이한 벡터 시스템을 이용하여 생산된 FkpA의 양을 보여주는 그래프를 제공하고, 각 조건에서 FkpA의 발현을 보여주는 웨스턴 블롯에 의해 동반된다. 모든 패널에서, "내인성 FkpA 수준"은 플라스미드 암호화 FkpA를 함유하지 않은 박테리아성 숙주 세포를 지칭하고; "혼화성 FkpA 수준"은 별도 (혼화성) 플라스미드로부터 xIL13 및 FkpA의 발현을 지칭하고; "단일 FkpA 수준"은 양쪽 xIL13 및 FkpA를 발현하는 단일 벡터를 지칭한다.
도 7A-B는 FkpA의 유도성 발현시 xIL4 IgG4 hAb의 생산을 보여준다. 도 7A는 hAb 및 가용 모노머성 중쇄 누적을 보여주는 웨스턴 블롯을 도시한다. 도 7B는 FkpA의 유도성 발현을 이용하여 생산된 xIL4 hAb의 역가를 보여주는 그래프이고, FkpA의 발현을 보여주는 웨스턴 블롯에 의해 동반된다. 모든 패널에서, 샘플 1은 xIL4 hAb의 생산용 TIR1,1 벡터를 이용하고 FkpA를 과발현하지 않고; 샘플 2는 xIL4 hAb의 생산용 TIR2,2 벡터를 이용하고 FkpA를 과발현하지 않고; 샘플 3은 TIR1,1을 이용하여 xIL4 hAb 및 IPTG를 생산시켜 FkpA 발현을 유도하고; 샘플 4는 TIR2,2를 이용하여 xIL4 hAb 및 IPTG를 생산시켜 FkpA 발현을 유도한다.
도 8A-C는 FkpA의 발현시 xVEGFC IgG1 hAb의 생산을 보여준다. 도 8A는 상이한 벡터 시스템을 이용한 생산된 xVEGFC hAb의 역가를 보여주는 그래프를 제공한다. 도 8B는, 표지된 채로 FkpA 밴드와, 모든 조건하에 총 가용성 단백질 생산을 보여주는 겔을 도시한다. 도 8C는 xVEGFC hAb 및 가용 모노머성 중쇄의 누적을 보여주는 웨스턴 블롯을 도시한다. 패널 모든 패널에서, 샘플 1은 xVEGFC hAb의 생산용 TIR2,2 벡터를 이용하고 FkpA의 발현용 플라스미드를 함유하지 않고; 샘플 2는 FkpA 발현을 유도하기 위해 xIL4 hAb 및 IPTG 생산용 TIR2,2 벡터를 이용한다.
도 9는 xIL13 hAb (pxIL13.2.2.FkpAc13)의 발현용 제1 플라스미드 및 DsbA 및 DsbC (pJJ247)의 발현용 제2 플라스미드를 사용한 혼화성 플라스미드 시스템을 보여준다.
도 10은, IPTG 유도 있거나 없이, DsbA 및 DsbC의 발현을 위하여 혼화성 플라스미드 및 xIL13.2.2.FkpAc13 생산 플라스미드를 이용하여 경시적으로 xIL13 hAb의 생산을 보여주는 그래프를 제공한다.
도 11A는 xIL14 hAb 혼화성 플라스미드 시스템을 보여준다. 도 11B는 xIL14 hAb LC 및 HC, FkpA, DsbA, 및 DsbC를 암호화한 단일 플라스미드의 발생을 보여준다.
도 12A-B는 FkpA, DsbA, 및 DsbC 발현의 부재하에 (1 및 2, 표지됨); IPTG-유도된 FkpA 발현의 존재하에 (3 및 4, 표지됨); 및 IPTG의 부재하에 FkpA, DsbA, 및 DsbC와 플라스미드의 존재하에 (5 및 6, 표지됨) TIR1,1 또는 TIR2,2 벡터와 xIL4 hAb의 생산을 보여준다. 도 12A는 다양한 조건하에 xIL4 hAb 및 가용 모노머성 중쇄의 누적을 보여주는 웨스턴 블롯을 도시한다. 도 12B는 다양한 조건하에 생산된 xIL4 hAb의 역가를 보여주는 그래프를 제공하고, FkpA의 발현을 보여주는 웨스턴 블롯에 의해 동반된다.
도 13은 FkpA, DsbA, 및 DsbC 발현의 부재하에 (칼럼 1); IPTG-유도된 FkpA 발현의 존재하에 (칼럼 2); 및 IPTG의 부재하에 FkpA, DsbA, 및 DsbC와 플라스미드의 존재하에 (칼럼 3) TIR2,2 벡터와 xVEGFC hAb의 생산을 보여준다.
도 14는 FkpA, DsbA, 및 DsbC 발현의 부재하에 (1 및 3, 표지됨); 및 IPTG의 부재하에 FkpA, DsbA, 및 DsbC와 플라스미드의 존재하에 (2 및 4, 표지됨) TIR1,1 또는 TIR2,2 벡터와 xVEGFA IgG1 hAb의 생산을 보여준다.
도 15는, 항체 발현 벡터 없이 및 DsbA, DsbC, 및 FkpA 과발현 ("대조군") 없이 음성 대조군과 함께, FkpA, DsbA, 및 DsbC가 동일한 벡터 ("단일")로부터 발현된 경우 및 FkpA, DsbA 및 DsbC가 제2 혼화성 벡터 ("혼화성")로부터 발현된 경우 TIR2,2 벡터와 xIL4 hAb의 생산을 보여준다. 웨스턴 블롯은 DsbA, DsbC, 및 FkpA의 발현을 보여준다.
도 16A는 이전에 기재된 pxIL13.2.2.FkpAc13 생산 플라스미드 및 혼화성 산화환원효소 플라스미드 (pJJ247)를 사용한 xIL13 혼화성 플라스미드 시스템을 보여준다. 도 16B는 pxIL13.2.2.FkpAc13 및 pJJ247로부터 개방형 판독 프레임 (ORFs)을 편입하는 단일 플라스미드 (MD157)의 발생을 보여준다.
도 17은 FkpA, DsbA, 및 DsbC가 동일한 벡터 ("단일")로부터 발현된 경우 및 DsbA 및 DsbC가 혼화성 벡터로부터 발현되고 FkpA가 xIL13.2.2.FkpAc13 벡터 ("혼화성")로부터 발현된 경우 TIR2,2 벡터와 xIL13 hAb의 경시적으로 생산을 보여준다. 이들 벡터는 phoA 프로모터를 이용하여 FkpA 발현을 구동한다.
도 18은 IPTG-유도성 프로모터하에 2개 벡터: xIL13 hAb 및 FkpA를 발현한 TIR2,2 벡터, 및 DsbA 및 DsbC를 발현한 벡터를 보유한 세포의 고정된 교반 속도하에 성장된 배양물에서 경시적으로 평균 산소 흡수 속도 (OUR)를 보여준다. OUR은 IPTG의 존재 또는 부재하에 성장된 배양물에 대하여 보여진다. 각 조건에 사용된 샘플의 번호가 제공된다 ("N").
도 19는 IPTG-유도성 프로모터하에 2 벡터: xIL13 hAb 및 FkpA를 발현한 TIR2,2 벡터, 및 DsbA 및 DsbC를 발현한 벡터를 보유한 세포의 고정된 교반 속도하에 성장된 배양물에서 평균 오스몰농도를 보여준다. 오스몰농도는 IPTG의 존재 또는 부재하에 성장된 배양물에 대하여 보여진다. 각 조건에 사용된 샘플의 번호가 제공된다 ("N").
도 20은 IPTG-유도성 프로모터하에 2개 벡터: xIL13 hAb 및 FkpA를 발현한 TIR2,2 벡터, 및 DsbA 및 DsbC를 발현한 벡터를 보유한 세포로부터 경시적으로 생산된 xIL13 hAb의 평균 역가를 보여준다. 생산된 항체의 역가는 IPTG의 존재 또는 부재하에 성장된 배양물에 대하여 보여진다. 각 조건에 사용된 샘플의 번호가 제공된다 ("N").
도 21은 26 시간 동안 650 rpm으로 교반하에 성장된, 그 다음 표지된 OUR 설정값을 달성하기에 충분한 더 낮은 교반 속도로 이동된 배양물에서 경시적으로 평균 OUR을 보여준다. 세포는 IPTG의 부재하에 2개 벡터: xIL13 hAb 및 FkpA를 발현한 TIR2,2 벡터, 및 DsbA 및 DsbC를 발현한 벡터를 보유하였다. 각 조건에 사용된 샘플의 번호가 제공된다 ("N").
도 22는 26 시간 동안 650 rpm으로 교반하에 성장된, 그 다음 표지된 OUR 설정값을 달성하기에 충분한 더 낮은 교반 속도로 이동된 배양물에서 경시적으로 평균 오스몰농도를 보여준다. 세포는 IPTG의 부재하에 2개 벡터: xIL13 hAb 및 FkpA를 발현한 TIR2,2 벡터, 및 발현한 벡터를 보유하였다. 각 조건에 사용된 샘플의 번호가 제공된다 ("N").
도 23은 26 시간 동안 650 rpm으로 교반하에 성장된, 그 다음 표지된 OUR 설정값을 달성하기에 충분한 더 낮은 교반 속도로 이동된 배양물에서 2 시점 (54 및 72 시간)에 xIL13 hAb 생산의 평균 역가를 보여준다. 세포는 IPTG의 부재하에 2개 벡터: xIL13 hAb 및 FkpA를 발현한 TIR2,2 벡터, 및 DsbA 및 DsbC를 발현한 벡터를 보유하였다. 각 조건에 사용된 샘플의 번호가 제공된다 ("N").
도 24는 phoA 프로모터에 의해 유도된 FkpA 및 IPTG의 부재하에 tacII 프로모터에 의해 유도된 DsbA 및 DsbC를 또한 암호화한 TIR2,2 벡터로부터 xIL13 hAb를 생산한 배양물의 경시적으로 평균 세포 밀도 (OD550nm)를 보여준다. 배양물은 28℃ 또는 30℃의 양쪽 성장 및 생산 (Tg/Tp) 상에 대하여 항온에서 성장되었다. 교반 변화는 발효에 26 시간 수행되었다. 각 조건에 사용된 샘플의 번호가 제공된다 ("N").
도 25는 phoA 프로모터에 의해 유도된 FkpA 및 IPTG의 부재하에 tacII 프로모터에 의해 유도된 DsbA 및 DsbC를 또한 암호화한 TIR2,2 벡터로부터 xIL13 hAb를 생산한 세포의 배양물의 경시적으로 평균 OUR을 보여준다. 배양물은 28℃ 또는 30℃의 양쪽 성장 및 생산 (Tg/Tp) 상에 대하여 항온에서 성장되었다. 각 조건에 사용된 샘플의 번호가 제공된다 ("N").
도 26은 phoA 프로모터에 의해 유도된 FkpA 및 IPTG의 부재하에 tacII 프로모터에 의해 유도된 DsbA 및 DsbC를 또한 암호화한 TIR2,2 벡터로부터 xIL13 hAb를 생산한 세포의 배양물에서 경시적으로 평균 포스페이트 농도를 보여준다. 배양물은 28℃ 또는 30℃의 양쪽 성장 및 생산 (Tg/Tp) 상에 대하여 항온에서 성장되었다. 각 조건에 사용된 샘플의 번호가 제공된다 ("N").
도 27은 phoA 프로모터에 의해 유도된 FkpA 및 IPTG의 부재하에 tacII 프로모터에 의해 유도된 DsbA 및 DsbC를 또한 암호화한 TIR2,2 벡터로부터 세포의 배양물에서 생산된 xIL13 hAb의 평균 역가를 보여준다. 배양물은 28℃ 또는 30℃의 양쪽 성장 및 생산 (Tg/Tp) 상에 대하여 항온에서 성장되었다.
도 28는 phoA 프로모터에 의해 유도된 FkpA 및 IPTG의 부재하에 tacII 프로모터에 의해 유도된 DsbA 및 DsbC를 또한 암호화한 TIR2,2 벡터로부터 xIL13 hAb를 생산한 배양물의 경시적으로 평균 세포 밀도 (OD550nm)를 보여준다. 배양물은 28℃ 또는 30℃ (Tg/Tp 28℃ 또는 Tg/Tp 30℃, 각각)의 항온에서 성장되었거나, 또는 성장 기 동안 30℃에서 성장되었고, 그 다음 생산 기 (Tg 30 Tp 28) 동안 28℃까지 이동되었다. 각 조건에 사용된 샘플의 번호가 제공된다 ("N").
도 29는 phoA 프로모터에 의해 유도된 FkpA 및 IPTG의 부재하에 tacII 프로모터에 의해 유도된 DsbA 및 DsbC를 또한 암호화한 TIR2,2 벡터로부터 xIL13 hAb를 생산한 세포의 배양물에서 경시적으로 평균 포스페이트 농도를 보여준다. 배양물은 28℃ 또는 30℃ (Tg/Tp 28℃ 또는 Tg/Tp 30℃, 각각)의 항온에서 성장되었거나, 또는 성장 기 동안 30℃에서 성장되었고, 그 다음 생산 기 (Tg 30 Tp) 동안 28℃까지 이동되었다. 각 조건에 사용된 샘플의 번호가 제공된다 ("N").
도 30은 phoA 프로모터에 의해 유도된 FkpA 및 IPTG의 부재하에 tacII 프로모터에 의해 유도된 DsbA 및 DsbC를 또한 암호화한 TIR2,2 벡터로부터 xIL13 hAb를 생산한 세포의 배양물의 경시적으로 평균 OUR을 보여준다. 배양물은 28℃ 또는 30℃ (Tg/Tp 28℃ 또는 Tg/Tp 30℃, 각각)의 항온에서 성장되었거나, 또는 성장 기 동안 30℃에서 성장되었고, 그 다음 생산 기 (Tg 30 Tp 28) 동안 28℃까지 이동되었다. 각 조건에 사용된 샘플의 번호가 제공된다 ("N").
도 31은 phoA 프로모터에 의해 유도된 FkpA 및 IPTG의 부재하에 tacII 프로모터에 의해 유도된 DsbA 및 DsbC를 또한 암호화한 TIR2,2 벡터로부터 경시적으로 생산된 xIL13 hAb의 평균 역가를 보여준다. 배양물은 28℃ 또는 30℃, 표지됨 (Tg/Tp 28℃ 또는 Tg/Tp 30℃, 각각)의 항온에서 성장되었거나, 또는 성장 기 동안 30℃에서 성장되었고, 그 다음 생산 기 (Tg 30 Tp 28) 동안 28℃까지 이동되었다.
도 32는 동반한 표에서 패턴에 의해 식별된 상이한 공정 조건하에 단일 플라스미드 (MD157)와 xIL13 hAb 역가의 실험 (DoE) 분석의 부분 요인 설계의 결과를 보여준다.
도 33은 IPTG의 부재하에 tacII 프로모터에 의해 유도된 FkpA, DsbA 및 DsbC를 또한 암호화한 TIR2,2 벡터로부터 생산된 xIL4 hAb의 역가를 보여준다. 배양물은 30℃ (Tg/Tp 30℃)의 항온에서 성장되었거나, 또는 성장 기 동안 34℃에서 성장되었고, 그 다음 생산 기 (Tg 34 Tp 25) 동안 25℃까지 이동되었다.
도 34는 동반한 표에서 패턴에 의해 식별된 상이한 공정 조건하에 단일 플라스미드 (MD341)와 xIL17 hAb 역가의 실험 (DoE) 분석의 부분 요인 설계의 결과를 보여준다.
도 35는 제1 적합화 샤페론 단백질 공-발현 및 그 다음 xIL13 hAb 역가에 공정 단계 (예를 들면, 교반 속도, Tg, 및 Tp)의 효과를 보여준다.
도 36A는 66F8 및 67A6 숙주 균주에서 수행된 발효로부터 가용성 xIL13 hAb 역가를 보여준다. 도 36B는 양쪽 66F8 및 67A6 숙주 균주에서 72 시간에 총 xIL13 경쇄 및 중쇄 농도를 보여준다. 양쪽 조건에 대하여 N = 2.
도 37A는 일정 발효 온도에서 66F8 및 67A6 숙주 균주에서 수행된 발효로부터 가용성 xIL4 hAb 역가를 보여준다. 도 37B는 온도 변화를 사용한 발효 조건하에 66F8 및 67A6 숙주 균주에서 수행된 발효로부터 총 가용성 xIL4 hAb 역가를 보여준다. 양쪽 조건에 대하여 N = 2.
도 38A는 xIL4 경쇄 역가를 보여주며, 도 38B는 온도 변화를 사용한 발효 조건하에 66F8 및 67A6 숙주 균주에서 수행된 발효로부터 xIL4 중쇄 역가를 보여준다. 양쪽 조건에 대하여 N = 2.
도 39는 xIL33 hAb 분비 플라스미드의 지도를 제공한다. LC 및 HC 개방형 판독 프레임은 TIR2와 작동가능한 조합으로 독립적으로 배치된다.
도 40은 30℃의 항온 (기저 사례)에서 샤페론 DsbA, DsbC, FkpA의 공-발현의 부재하에 수행된 발효, 및 동일한 공정 조건 (w/ 샤페론)하에 샤페론 DsbA, DsbC 및 FkpA 공-발현의 존재하에 수행된 발효에서 xIL33 hAb의 누적을 예증한다.
도 41은 샤페론 FkpA, DsbA, DsbC를 함유한 xIL33 hAb 단일 플라스미드로 수행된 실험 (DoE)의 설계로부터 aIL33 hAb 역가 차이를 보여준다. DoE 인자는 pH, 성장 온도 (Tg), 생산 온도 (Tp), 및 생산 기 표적 산소 흡수 속도 (OUR)를 포함하였다.
도 42는 TIR1 (서열 식별 번호:1), TIR2 (서열 식별 번호:2) 및 TIR3 (서열 식별 번호:3) FkpA 신호 서열 변이체의 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 단일 뉴클레오티드 치환은 특이적 코돈의 제3 위치에서 실시되었고 FkpA 신호 펩티드 서열 (서열 번호: 4)의 아미노산 서열을 변경하지 않는 동의어 코돈 변화를 나타낸다.
도 43은 TIR1 FkpA 변이체 (플라스미드 19)에 비하여 FkpA TIR 변이체의 정량적 강도를 보여준다.
도 44는 TIR1, TIR2 및 TIR3 FkpA TIR 변이체로 수행된 발효에서 xIL13 hAb의 누적을 보여준다. 각 조건에서 생산된 역가는 TIR1, TIR2 및 TIR3 변이체, 각각에 대하여 1.5, 2.5 및 4.0 g/L이었다.
도 45는 TIR1, TIR2 및 TIR3 FkpA TIR 변이체로 수행된 발효에서 xIL33 hAb의 누적을 보여준다.
도 46은 TIR1, TIR2 및 TIR3 FkpA 변이체로 수행된 발효에서 xIL17 hAb의 누적의 플롯을 보여준다.
도 47A는 FkpA TIR 변이체로 수행된 발효에서 xIL13 hAb의 누적의 플롯을 보여준다. 도 47B는 발효의 끝에서 xIL13 hAb 공정으로부터 가용성 분획에 존재한 FkpA의 수준을 보여준다.
도 48A는 변경된 산소 전달 속도 (OTR) 및 대조군 발효 조건에 대하여 산소 흡수 속도 (OUR)를 보여준다. 변경된 OTR 및 대조군 발효는 약 5 mmol/L/min의 유사한 피크 OUR 및 2.75 mmol/L/min의 유사한 교반후 변화 표적 OUR을 달성하였다. 도 48B는 변경된 OTR 및 대조군 발효 조건에 대하여 성장 프로파일을 보여준다. 변경된 OTR 및 대조군 발효는 유사한 성장 프로파일을 가졌고 모두는 피크 250의 OD550을 달성하였다. xIL13 hAb 대조군 (Ctrl) 최상 조건 = 1 바 배압 (BP), 20 표준 리터 / 분 (SLPM), 및 교반 속도 변화 650 내지 475 rpm. xIL13 hAb 변경된 OTR 조건 = 0.3 바 배압, 13 SLPM, 및 교반 속도 변화 880 내지 650 rpm.
도 49는 변경된 OTR 및 대조 조건에 대하여 xIL13 hAb 누적 프로파일을 보여준다. 변경된 및 대조 조건은 발효 동안 유사한 누적 프로파일을 가졌고 모두는 72 시간에서 최대 평균 역가 4.1 및 4.2 g/L, 각각을 달성하였다.
도 50A-50B는 하기의 플라스미드 입체 배치를 예시한다: TIR1,1 ImmTAC 1 생산 플라스미드 (도 50A), (TIR1,1의 도시와 함께 (도 50B).
도 51은 ImmTAC를 생산하기 위하여 사용되는, 본래의 (즉, 비최적화된) 발효 공정을 예시한다.
도 52는, 발효 공정의 최종 시점에서 누적된, 조립된 ImmTAC의 양 및 알파 및 베타 하부단위체의 총량을 나타낸다.
도 53은 tac 프로모터의 조절 하에서 FkpA ORF를 함유하는 ImmTAC 생산 플라스미드 및 혼화성 플라스미드의 플라스미드 맵을 제공한다.
도 54A는 하기 조건에 대한 가용성 및 가용성 감소된 항-알파 및 항-베타 웨스턴 블롯을 나타낸다: 무 샤페론 (TIR1,1), 유 FkpA (+FkpA), 음성 대조군 (-), 및 ImmTAC 1 양성 대조군 (ImmTAC DP). 상기 화살표는 조립된 ImmTac를 지정한다. 도 54B는 TIR1,1 단독 및 FkpA으로의 TIR1,1 조건에 대한 최종 역가를 나타낸다.
도 55는 ImmTAC을 생산하기 위하여 사용된 개선된 발효 공정 조건을 예시한다.
도 56A-56B는 하기를 나타낸다: 가용성 및 가용성 감소된 항-알파 (도 56A) 및 항-베타 (도 56B) 웨스턴 블롯 (하기 조건에 대한 것임): 무 샤페론 (TIR1,1), 유 FkpA (+FkpA), 유 FkpA 및 신규 공정 조건 (신규 공정 조건 + FkpA), 음성 대조군 (-), 및 ImmTAC 1 양성 대조군 (ImmTAC DP).
도 57은 하기 조건에 대한 최종 역가를 나타낸다: TIR1,1; FkpA로의 TIR1,1; 및 FkpA로의 TIR1,1 및 신규 공정 조건.
도 58은 phoA 프로모터의 조절 하에 ImmTAC 알파 쇄 및 베타 쇄 ORF 및 FkpA ORF를 편입시키는 단일 플라스미드의 작제를 예시한다.
도 59A는 FkpA ORF를 편입시키는 TIR1,1; TIR1,2; 및 TIR2,3 단일 플라스미드에 대한 최종 ImmTAC 1 역가를 나타낸다. 도 59B는 FkpA ORF를 편입시키는, TIR1,1; TIR1,2; 및 TIR2,3 단일 플라스미드에 대한 알파 및 베타 ImmTAC 쇄 둘 모두의 최종 하부단위체 누적을 나타낸다.
도 60A는 하기로 수행되는 발효 유래의 FkpA에 대해 탐침된 웨스턴 블롯을 나타낸다: ImmTAC TIR1,1 생산 플라스미드 및 혼화성 FkpA 플라스미드 및 단일 TIR1,1 플라스미드 (FkpA ORF 함유). 도 60B는 하기 조건에 대한 최종 역가를 나타낸다: TIR1,1 단독; FkpA로의 TIR1,1; TIR1,1 FkpA 혼화성 플라스미드 시스템; 및 TIR1,1 FkpA 단일 플라스미드 시스템.
도 61은 tac 프로모터의 조절 하에서, FkpA, 알파 쇄 및 베타 쇄 ORF를 함유하는 ImmTAC 생산 플라스미드 및 산화환원효소 (예컨대, DsbC)를 함유하는 혼화성 플라스미드의 플라스미드 맵을 제공한다.
도 62는 DsbA 단독, DsbC 단독, 또는 조합된 DsbA 및 DsbC의 ORF(들)을 함유한 혼화성 플라스미드를 갖는 FkpA ORF를 편입시키는 TIR1,1 단일 플라스미드로 수행된 발효 유래의 최종 역가를 나타낸다.
도 63은 TIR1,1 단일 플라스미드 단독; DsbC 혼화성 플라스미드로의 TIR1,1 단일 플라스미드; 및 DsbC 혼화성 플라스미드로의 TIR2,3 단일 플라스미드로 수행된 발효 유래의 최종 역가를 나타낸다.
도 64는 DsbC 혼화성 플라스미드로의, 초기 TIR1,1 생산 플라스미드로부터의 TIR2,3 단일 플라스미드로의 상기 최적화를 사용한 최종 역가의 누적 증가를 나타낸다.
도 65a-65b는 혼화성 FkpA 플라스미드 존재 및 부재 하의 TIR2,3 생산 플라스미드로 시험된 ImmTAC 2 분자를 나타낸다 (FkpA ORF를 편입시키는 단일 TIR1,1 및 TIR2,3 플라스미드로서의, 그리고 혼화성 DsbC 플라스미드로의 FkpA ORF를 편입시키는 단일 TIR1,1 및 TIR2,3 플라스미드로서의). 하기를 나타내는 웨스턴 블롯: 알파 (도 65a) 및 베타 (도 65b) 쇄가 제공된다.
본원에서 제공된 실시예는 다중 쇄 단백질의 각 쇄 (예를 들면, 절반-항체의 경쇄 및 중쇄)를 암호화한 번역 단위체와 조합으로 하나 이상의 특이적 샤페론 단백질의 공-발현이 원핵 숙주 세포 시스템에서 조립된 다중 쇄 단백질의 생산을 증가시킨다는 것을 입증한다. 실시예는 후속의 공정 개선, 예컨대 발효의 특정 상에 대한 특이적 온도 및 교반 속도가 발현 벡터 개선을 넘어 생산 및 강건성에서 유의미한 증대를 유발한다는 것을 추가로 입증한다. 전반적으로, 본원에서 기재된 방법은 예시적 2쇄 폴리펩티드 (예를 들면, 절반 항체)의 생산에서 적어도 10-배 증가를 달성한다.
일 양태에서, 폴리펩티드의 2쇄를 발현시키기 위해 숙주 세포를 순환시킴으로써 원핵 숙주 세포에서 2쇄를 함유한 폴리펩티드의 생산 방법이 본원에서 제공되고, 숙주 세포를 배양시켜 폴리펩티드의 2쇄를 발현시키고, 이로써 발현시 2쇄가 접히고 조립되어 숙주 세포에서 생물학적으로 활성 폴리펩티드를 형성하는 단계; 여기에서 숙주 세포는 (1) 폴리펩티드의 제1 쇄를 암호화한 제1 번역 단위체; (2) 폴리펩티드의 제2쇄를 암호화한 제2 번역 단위체; 및 (3) 펩티딜-프롤릴 이소머라아제, 단백질 이황화 산화환원효소, 및 이들의 조합으로부터 선택된 적어도 하나의 샤페론 단백질을 암호화한 제3 번역 단위체를 포함한 폴리뉴클레오티드를 함유하고; 여기에서 숙주 세포는 하기를 포함한 조건 하에 배양 배지에서 배양되고: 성장 온도 및 성장 교반 속도를 포함한 성장 기, 및 생산 온도 및 생산 교반 속도를 포함한 생산 기, 여기에서 성장 온도는 생산 온도의 2 내지 10℃ 초과이고, 성장 교반 속도는 생산 교반 속도의 50 내지 250 rpm 초과이다; 및 (b) 숙주 세포로부터 생물학적으로 활성 폴리펩티드를 회수하는 단계. 한 양태에서 폴리펩티드는 2쇄로 이루어지고, 반면에 또 다른 양태에서 폴리펩티드는 3, 4, 5 이상의 쇄를 포함한다.
또 다른 양태에서, 폴리펩티드의 2쇄를 발현시키기 위해 숙주 세포를 순환시킴으로써 원핵 숙주 세포에서 2쇄를 함유한 폴리펩티드의 생산 방법이 본원에서 제공되고, 여기에서 발현시 2쇄는 접혀지고 조립되어 숙주 세포에서 생물학적 활성 폴리펩티드를 형성함; 여기에서 숙주 세포는 하기를 포함한 폴리뉴클레오티드를 함유하고: (1) 폴리펩티드의 제1 쇄를 암호화한 제1 번역 단위체; (2) 폴리펩티드의 제2쇄를 암호화한 제2 번역 단위체; (3) 제1 샤페론 단백질을 암호화한 제3 번역 단위체; (4) 제2 샤페론 단백질을 암호화한 제4 번역 단위체; 및 (5) 제3 샤페론 단백질을 암호화한 제5 번역 단위체, 여기에서 제1, 제2, 및 제3 샤페론 단백질은 펩티딜-프롤릴 이소머라아제, 단백질 이황화 산화환원효소, 및 이들의 조합으로부터 선택되고; 여기에서 숙주 세포는 하기를 포함한 조건하에 배양 배지에서 배양되고: 성장 온도 및 성장 교반 속도를 포함한 성장 기, 및 생산 온도 및 생산 교반 속도를 포함한 생산 기, 여기에서 성장 온도는 생산 온도의 2 내지 10℃ 초과이고, 성장 교반 속도는 생산 교반 속도의 50 내지 250 rpm 초과이다; 및 (b) 숙주 세포로부터 생물학적 활성 폴리펩티드를 회수함. 한 양태에서 폴리펩티드는 2쇄로 이루어지고, 반면에 또 다른 양태에서 폴리펩티드는 3, 4, 5 이상의 쇄를 포함한다.
I. 정의
본 개시내용을 상세히 기재하기 전에, 본 개시내용은 특정한 조성물 또는 생물학적 시스템에 제한되지 않으며, 그것은 물론 가변적일 수 있음이 이해되어야 한다. 본원에 사용된 용어는 단지 특정한 구현예를 기재하기 위한 것이며 제한하는 것으로 의도되지 않음이 또한 이해되어야 한다.
본 명세서 및 첨부된 청구항들에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 ("a," "an," 및 "the")는, 그 내용이 다르게 명확히 지시되지 않으면, 복수의 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들면, "분자"에 대한 지칭은 2개 또는 그 초과의 그와 같은 분자의 조합 등을 임의로 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "약"은 본 기술 분야의 숙련가에게 쉽게 공지된 각각의 값에 대한 통상적인 오차 범위를 나타낸다. 본원에서 "약(about)" 값 또는 파라미터에 대한 지칭은 상기 값 또는 파라미터 그 자체에 관한 구현예를 포함한다 (그리고 기술한다). 최대로, 용어 "약"은 본원에서 사용된 바와 같이 값을 참조로, 그 값의 90% 내지 110%를 포함한다 (예를 들면, 제1 및 제2 TIR의 상대적 번역 강도 약 1.0 내지 약 3.0은 0.9 내지 3.3의 범위로 상대적 번역 강도를 지칭한다).
본원에 기재된 개시내용의 측면 및 구현예는 "포함하는(comprising)", "구성되는(consisting) 및 "~로 본질적으로 구성되는"의 측면 및 구현예를 포함하는 것으로 이해된다.
용어 "2쇄를 포함한 폴리펩티드"는, (용어 "2쇄 단백질" 및 "2쇄 폴리펩티드"는 본원에서 교환가능하게 또한 사용될 수 있다), 본원에서 사용된 바와 같이 1 초과의 상이한 폴리펩티드 쇄를 함유한 임의의 폴리펩티드를 지칭하기 위해 의도된다. 일부 구현예에서, 2쇄 단백질은, 제한 없이 이황화 결합을 포함하여, 하나 이상의 분자간 연결을 통해 함께 연결된 2 이상의 폴리펩티드의 거대분자 착물을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 2쇄 단백질은 폴리펩티드 링커에 의해 연결된 2개의 상이한 폴리펩티드 쇄 (예를 들면, 항체 중쇄 및 항체 경쇄)에 속하는 아미노산 서열을 갖는 단일 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 이 경우에, 2쇄 단백질은 단일 쇄를 물리적으로 나타낼 수 있지만, 이들이 2개의 별도 단백질 쇄이면 단일 쇄의 2 이상의 분율은 기능적으로 행동할 수 있다. 예를 들어, 단일 쇄 항체는, 폴리펩티드 링커에 의해 연결되어도, 그럼에도 불구하고 이들이 분자간 연결 (예를 들면, 하나 이상의 이황화 결합)에 의해서만 관련된 별도 폴리펩티드인 것처럼 접혀지고 조립되는 기능적 중쇄 및 기능적 경쇄를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "벡터"는 그것이 연결된 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 벡터의 한 종류는 추가의 DNA 분절을 이에 결찰시킬 수 있는 환형 이중가닥 DNA 루프를 지칭하는 "플라스미드"이다. 벡터의 또 다른 유형은 파아지 벡터이다. 벡터의 또 다른 유형은 바이러스벡터이며, 여기서 추가의 DNA 분절은 바이러스 게놈으로 결찰될 수 있다. 특정 벡터들은 이들이 도입된 숙주 세포에서 자율적으로 복제될 수 있다 (이를 테면, 복제의 세균성 원점 및 에피좀성 포유류 벡터들을 보유하는 세균성 벡터들). 다른 벡터들 (이를 테면, 비-에피좀성 포유류 벡터들)은 숙주 세포 안으로 도입시에 숙주 세포의 게놈안에 통합될 수 있고, 이로 인하여 숙주 게놈과 함께 복제된다. 더욱이, 특정 벡터는 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 주도할 수 있다. 그러한 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터" (또는, 간략히 "재조합 벡터")로 지칭된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태이다. 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 상호교환가능하게 사용될 수 있으며, 플라스미드가 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "시스트론"은 폴리펩티드 쇄 및 인접 조절 영역에 대한 뉴클레오티드 서열 암호화를 포함하는 번역 단위체와 넓은 범위에서 상당한 유전 요소를 지칭하는 것으로 의도된다. "시스트론"은, 예를 들어, 하나 이상의 개방형-판독 프레임, 번역 개시 영역 (TIR; 아래 본원에서 정의됨), 신호 서열 및 종결 영역을 포함할 수 있다.
"다시스트론성" 발현 벡터는 하나의 단일 프로모터의 조절적 제어 하에서, 다중 시스트론을 함유 및 발현하는 단일 벡터를 지칭한다. 다시스트론성 벡터의 통상적인 예시는 1개의 프로모터의 제어 하에서 2개의 상이한 폴리펩티드를 함유 및 발현하는 "2-시스트론성(dicistronic)" 벡터이다. 2-시스트론성 또는 다시스트론성 벡터의 발현에서, 다중 유전자는 우선 단일 번역 단위체로 전사되고, 이후 개별적으로 번역된다.
"전사 단위체"는 단일 RNA 전사체로서 전사되는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. "번역 단위체"는 폴리펩티드를 암호화하는 그리고, 번역된 경우, 폴리펩티드를 생산하는 폴리뉴클레오티드의 분절을 지칭한다. 상기 기재된 바와 같이, 다시스트론성 폴리뉴클레오티드는 다중 번역 단위체와 단일 전사 단위체를 함유할 수 있다.
본 개시내용에 따른 "개별 시스트론" 발현 벡터는 적어도 2개의 개별 프로모터-시스트론 쌍을 포함하는 단일 벡터를 지칭하고, 여기서 각 시스트론은 이의 고유 프로모터의 제어 하에 있다. 개별 시스트론 발현 벡터의 발현에서, 상이한 유전자의 전사 및 번역 둘 다는 개별적이고 독립적이다.
"샤페론 단백질"은 본원에서 사용된 바와 같이, 제한 없이 2쇄 단백질을 포함하여, 다른 거대분자의 접힘 및 조립에 조력하는 임의의 단백질을 지칭한다. 일반적으로, 샤페론 단백질은 단백질 접힘 또는 조립을 촉진시키기 위해 많은 상이한 기전에 의해 작용할 수 있다. 예를 들어, 샤페론 단백질은 단백질 접힘 및/또는 조립을 촉진시킬 수 있고, 쇄 내 이황화 결합의 형성을 촉매화할 수 있고, 단백질 펼침 및/또는 분해 (예를 들면, 오류-접힘 단백질 또는 다중단백질 착물의)를 촉진시킬 수 있고, 응집을 예방할 수 있고, 단백질 분해, 등등에 조력할 수 있다.
"번역 개시 영역" 또는 TIR 또는 번역 개시 영역 또는 번역 개시 서열은, 본원에서 사용된 바와 같이, 관심 유전자의 번역 개시의 효율성을 제공하는 핵산 영역을 지칭한다. 일반적으로, 특정 시스트론 내의 TIR은 리보솜 결합 부위 (RBS) 및 RBS로의 5' 및 3' 서열을 포괄한다. RBS는 최소한으로, 샤인-달가르노(Shine-Dalgarno) 및 개시 코돈 (AUG)을 함유하도록 정의된다. 따라서, TIR은 또한 번역될 핵산 서열 중 적어도 부분을 포함한다. 바람직하게는, 본 개시내용의 TIR은 시스트론 내 경쇄 또는 중쇄에 대하여 암호화하는 서열에 선행하는 신호 펩티드를 암호화하는 분비 신호 서열을 포함한다. TIR 변이체는, TIR의 특성, 예컨대 본원 하기에 정의된 번역 강도를 변경하는, TIR 영역 내 서열 변이체 (특히 치환)을 함유한다. 바람직하게는, 본 개시내용의 TIR 변이체는 시스트론 내 경쇄 또는 중쇄에 대하여 암호화하는 서열에 선행하는 분비 신호 서열의, 우선 2 내지 약 14개, 바람직하게는 4 내지 12, 더욱 바람직하게는 약 6개 코돈 내의 서열 치환을 함유한다.
용어 "번역 강도"는, 본원에서 사용된 바와 같이, 제어 시스템 내 분비된 폴리펩티드의 측정치를 지칭하며, 여기서 TIR의 하나 이상의 변이체는, 상동한 배양 및 검정 조건 하에서 야생형 TIR 또는 일부 다른 대조군과 비교하여, 폴리펩티드의 분비 및 그 결과를 지시하는데 사용된다. 임의의 하나의 이론에 제한됨 없이, "번역 강도"는 본원에서 사용된 바와 같이, 예를 들어 및 제한 없이, mRNA 안정성, 리보솜 결합 부위에 대한 리보솜 결합의 효율, 등등의 평가를 포함할 수 있다.
" 분비 신호 서열" 또는 "신호 서열"은 짧은 신호 펩티드에 대해 암호화하는 핵산 서열을 지칭하며, 이는 세포 막, 일반적으로 원핵생물의 내부 막 또는 내부 막과 외부 막 둘 다를 통하여 새롭게 합성된 관심 단백질을 지시하는데 사용될 수 있다. 이와 같이, 해당 단백질 예컨대 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄 폴리펩티드는 원핵 숙주 세포의 주변세포질에 또는 배양 배지에 분비된다. 분비 신호 서열에 의하여 암호화된 신호 펩티드는 숙주 세포에 내인성이거나, 이는 외인성일 수 있다 (발현될 폴리펩티드에 천연인 신호 펩티드를 포함). 분비 신호 서열은 전형적으로, 발현될 폴리펩티드의 아미노 말단에서 존재하고, 전형적으로 세포질로부터의 폴리펩티드의 생합성 및 분비 사이에서 효소적으로 제거된다. 따라서, 신호 펩티드는 일반적으로 성숙 단백질 생성물에서는 존재하지 않는다.
"작동가능하게 연결된"은, 2개 이상의 성분의 병치를 지칭하며, 기술된 상기 성분은 그것들이 그들의 의도된 방식으로 기능하도록 하는 관계에 있다. 예를 들면, 프로모터는, 이것이 연결된 서열의 전사 또는 발현을 제어 또는 조절할 경우, 암호화 서열에 작동가능하게 연결된다. 필수적인 것은 아니나 일반적으로, "작동적으로 연결된" DNA 서열은 연속적이고, 2개의 단백질 암호화 영역을 결합시킬 필요가 있거나 분비 리더의 경우에, 연속적이고 판독 프레임에 있다. 그러나, 작동가능하게 연결된 프로모터가 일반적으로 암호화 서열의 업스트림에 위치하더라도, 이는 그것과 필수적으로 인접하는 것은 아니다. 작동가능하게 연결된 인핸서는 암호화 서열의 업스트림, 또는 그 내부, 또는 다운스트림에, 그리고 프로모터로부터 상당한 거리에 위치할 수 있다. 연결은, 본 분야에 알려진 재조합 방법, 예를 들어 PCR 방법을 사용하여, 어닐링에 의하여, 또는 편리한 제한 부위에서의 결찰에 의하여 달성된다. 편리한 제한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커는 통상적인 관행에 따라 사용된다.
"조절 요소"는, 본원에서 사용된 바와 같이, 이형 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 폴리펩티드로 전사 및 번역하는데 필요한, 시스로 존재하는 뉴클레오티드 서열이다. 전사 조절 요소는 일반적으로 발현될 유전자 서열 5' 프로모터, 전사 개시 및 종결 부위 및 폴리아데닐화 신호 서열을 포함한다. 용어 "전사 개시 부위"는 1차 전사체, 즉, mRNA 전구체로 편입된 제1 핵산에 상응하는 작제물 내의 핵산을 지칭하며; 전사 개시 부위는 프로모터 서열과 중첩된다.
"프로모터"는 이와 작동가능하게 연결된 유전자 또는 서열의 전사를 조절하는 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 프로모터는 RNA 폴리머라아제 결합 및 전사 개시에 대한 신호를 포함한다. 사용된 프로모터는 선택된 서열의 발현이 고려되는 숙주 세포의 세포 유형에서 기능적일 것이다. 다양한 상이한 공급원으로부터 유래된 구성적이고, 유도가능하고, 그리고 억제가능한 프로모터를 포함하는 다수의 프로모터는 본 분야에 잘 알려져 있고 (그리고 GenBank와 같은 데이터베이스에서 동정됨), (예를 들어, 보관소, 예컨대 ATCC, 뿐만 아니라 다른 상업적 또는 개인적 공급원으로부터 유래된) 클로닝된 폴리뉴클레오티드 내로, 또는 이로서 이용가능하다. 유도성 프로모터로, 프로모터의 활성은 신호, 예를 들면, IPTG 또는 포스페이트 감손의 존재에 대한 반응에서 증가 또는 감소한다.
용어 "숙주 세포" (또는 "재조합 숙주 세포")는, 본원에 사용된 바와 같이, 외인성 폴리뉴클레오티드, 예컨대 재조합 플라스미드 또는 벡터의 유도에 의하여 유전적으로 변경된, 또는 유전적으로 변경될 수 있는 세포를 지칭한다. 그러한 용어는 특정 대상체 세포 뿐만 아니라 이러한 세포의 자손 또는 잠재적인 자손을 지칭하는 것으로 의도된다는 것이 이해된다. 특정 변형이, 예를 들면, 돌연변이 또는 환경적 영향에 기인하여 후속 세대에서 발생할 수 있기 때문에, 그러한 자손은 사실, 부모 세포와 동일하지 않을 수 있지만, 본원에 사용된 용어 "숙주 세포"의 범위 내에 포함된다.
용어 "약제학적 제형"은 활성 성분의 생물학적 활성이 유효하도록 허용하는 형태이고, 제형이 투여될 대상체에 허용 불가능하게 독성이 있는 추가 성분을 함유하지 않는 제조물을 나타낸다. 그러한 제형은 무균성일 수 있다. "약학적으로 허용가능한" 부형제 (비히클, 첨가제)는 이용된 활성 성분의 유효한 용량을 제공하기 위해 대상체 포유동물에 합리적으로 투여될 수 있는 것이다.
치료의 목적을 위한 "대상체" 또는 "개체"는, 인간, 가정용 및 농장용 동물, 및 동물원용, 스포츠용, 또는 애완용 동물, 예컨대 개, 말, 고양이, 소, 등을 포함하여, 포유동물로서 분류된 임의의 동물을 지칭한다. 바람직하게는 포유동물은 인간이다.
용어 "항체"는 본원에서 광범위한 의미로 사용되며, 구체적으로는 단클론성 항체 (전장 단클론성 항체 포함), 다클론성 항체, 다중특이적 항체 (예를 들면, 이중특이적 항체), 및 원하는 생물학적 활성을 나타내기만 한다면 항체 단편을 포함한다.
"단리된" 항체는 그것의 천연 환경의 구성요소로부터 식별되고 분리되고 및/또는 회수된 항체이다. 그 천연 환경의 오염물질 성분은 항체에 대한 연구, 진단적 또는 치료적 사용을 방해할 물질이며, 효소, 호르몬, 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질이 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 (1) 예를 들면, Lowry 방법에 의해 측정된 항체의 95 중량% 초과로, 일부 구현예에서 99 중량% 초과로; (2) 예를 들면, 회전 컵 시쿼네이터를 이용해서 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15 개 잔기를 수득하기 충분한 정도로, 또는 (3) 예를 들면, 쿠마씨 블루 또는 은 염색을 이용해서 환원 또는 비환원 조건 하에 SDS-PAGE에 의해 균질성까지 정제된다. 단리된 항체는 항체의 천연 환경의 적어도 1종의 구성요소가 존재하지 않기 때문에 재조합 세포 내에서 동일계내에 항체를 포함한다. 그러나, 통상적으로, 단리된 항체는 적어도 1종의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
"천연 항체"는 보통 2개의 동일한 경 (L) 쇄 및 2개의 동일한 중 (H) 쇄로 구성된, 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이다. 각 경쇄는 하나의 공유 이황화 결합에 의해 중쇄에 연결되고, 반면 이황화 연결기의 수는 상이한 면역글로불린 이소형의 중쇄 중에서 다변한다. 각 중쇄 및 경쇄는 또한 규칙적으로 이격된 쇄 내 이황화 브릿지를 가진다. 각 중쇄는 하나의 말단에 가변 도메인 (VH)과 그 다음 수많은 불변 도메인을 가진다. 각각의 경쇄는 하나의 말단에 가변 도메인을(VL) 그리고 그 다른 말단에 불변 도메인을 갖는다; 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 정렬되며, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬된다. 특정한 아미노산 잔기가 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 간 인터페이스를 형성하는 것으로 여겨진다.
용어 "불변 도메인"은, 항원 결합 부위를 함유하는, 면역글로불린의 다른 부분, 즉 가변 도메인에 비하여 더욱 보존된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 분자의 부문을 지칭한다. 불변 도메인은 중쇄의 CH1, CH2 및 CH3 도메인 (집합적으로, CH) 및 경쇄의 CHL (또는 CL) 도메인을 함유한다.
항체의 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체의 중쇄 또는 경쇄의 아미노-말단 도메인을 지칭한다. 중쇄의 가변 도메인은 "VH"로 불릴 수 있다. 경쇄의 가변 도메인은 "VL"로 불릴 수 있다. 이들 도메인은 일반적으로 항체의 가장 가변성 부분이고 항원-결합 부위를 함유한다.
용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 부분이 항체 중에 서열에서 광범위하게 상이하고 그리고 그것의 특정한 항원에 대한 각각의 특정한 항체의 결합 및 특이성에서 사용된다는 사실을 지칭한다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인 전체를 통해 고르게 분포되어 있지 않다. 이는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 모두에서 초가변성 영역(HVR)으로 불리는 3 개 절편에 집중된다. 가변 도메인의 보다 고도로 보존된 부분은 프레임워크 영역(FR)으로 불린다. 천연 중쇄 및 경쇄 각각의 가변 도메인은 대부분 베타-시트 배치를 채용하며, 베타-시트 구조를 연결하고 일부 경우에서 그 일부를 형성하는 루프를 형성하는 3 개의 HVR에 의해 연결된 4 개의 FR 영역을 포함한다. 각 쇄에서 HVR은 FR 영역에 의해 가까운 부근에서 함께 유지되며, 다른 쇄로부터의 HVR과 함께 항체의 항원-결합 부위 형성에 기여한다(참고: Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991)). 불변 도메인은 항원에 대한 항체 결합에 직접적으로 관여되지는 않지만, 다양한 효과기 기능, 예컨대 항체-의존적 세포성 독성에서의 항체 참여를 나타낸다.
임의의 포유동물 종으로부터의 항체(면역글로불린) "경쇄"는 그것의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기반하여, 카파(κ) 및 람다(λ)로 불리는 2 개의 명확히 구별되는 유형 중 하나에 배정될 수 있다.
용어 IgG "이소형" 또는 "하위부류"는 본원에서 사용된 바와 같이 그의 불변 영역의 화학적 및 항원성 특징에 의해 정의된 면역글로불린의 임의의 하위부류가 의미된다.
이들의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 항체(면역글로불린)는 상이한 부류로 배정될 수 있다. 면역글로불린의 5개의 주요 부류: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM이 있으며, 이들 중 몇몇은 하위부류(이소형), 예를 들면 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2 로 추가 구분될 수 있다. 면역글로불린의 상이한 부류에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, γ, ε, γ, 및 μ로 불린다. 면역글로불린의 상이한 부류의 하부단위체 구조 및 3-차원 입체배치는 잘 알려지고 일반적으로, 예를 들어, 하기에 기술된다: Abbas et al. Cellular and Mol . Immunology, 4th ed. (W.B. Saunders, Co., 2000). 항체는 하나 이상의 다른 단백질 또는 펩티드와 항체의 공유 또는 비-공유 회합에 의해 형성된 더 큰 융합 분자의 일부일 수 있다.
본원에서 사용된 용어들 "전장 항체", "무손상 항체" 및 "전체 항체"는 상호교환적으로 아래에서 정의된 바와 같이 항체 단편이 아닌 그 실질적으로 무손상 형태의 항체를 나타낸다. 상기 용어는 특히 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 나타낸다.
본원의 목적을 위한 용어 "네이키드 항체(naked antibody)"는 세포독성 모이어티 또는 방사성 표지에 콘주게이트되지 않은 항체이다.
"항체 단편"은 바람직하게는 이들의 항원-결합 영역을 포함하는 무손상 항체의 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 항체 단편은 항원-결합 단편이다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체(linear antibodies); 단일-쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.
항체의 파파인 분해는, 각각이 단일 항원-결합 부위, 및 잔류 "Fc" 단편을 가지고, 그의 명칭이 쉽게 측정화하는 이들의 능력을 반영한 것으로, "Fab" 단편이라 불리는 2개의 동일한 항원-결합 단편을 생산한다. 펩신 처리는 F(ab')2 단편을 산출하는데, 이것은 2개의 항원 결합 부위를 갖고 항원을 여전히 가교결합할 수 있다.
"Fv"는 완전한 항원-결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 일 구현예에서, 2-쇄 Fv 종은 밀접한 비-공유 결합으로 1 개의 중쇄 및 1 개의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 구성된다. 단일-쇄 Fv(scFv) 종에서, 1 개의 중쇄 및 1 개의 경쇄 가변 도메인은 경쇄 및 중쇄가 2-쇄 Fv 종에서와 비슷한 "이량체" 구조로 결합할 수 있도록 가요성 펩티드 링커에 의해 공유 결합될 수 있다. 이는 상기 입체배지에서 각각의 가변 도메인의 3 개의 HVR은 VH-VL 이량체의 표면 상에서 항원-결합 부위를 정의하도록 상호작용한다. 총괄적으로, 6 개의 HVR은 항체에 대한 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 전체 결합 부위에 비해 더 낮은 친화도에서지만, 단일 가변 도메인(또는 항원에 대해 특이적인 3 개의 HVR만을 포함하는 Fv의 절반)도 항원을 인식하고 결합하는 능력을 갖는다.
Fab 단편은 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 함유하고, 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 함유한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카복시 말단에서 몇 개의 잔기를 부가함으로써 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 유리 티올 그룹을 갖는 Fab'에 대한 본원에서의 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 본래 이들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로서 생산되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링이 또한 공지되어 있다.
"단일-쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하며, 여기서 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 쇄에 존재한다. 일반적으로, scFv 폴리펩티드는 VH와 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함하며, 그것은 scFv가 항원 결합을 위한 원하는 구조를 형성할 수 있게 한다. sFv의 재고를 위해, 예를 들어, 하기를 참고한다:
Figure 112017051998554-pct00001
, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York, 1994), pp. 269-315.
용어 "디아바디"는 2 개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편을 나타내며, 이 단편은 동일한 폴리펩티드 쇄(VH-VL)에서 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함한다. 동일한 쇄 상에서 2 개의 도메인 간 쌍형성을 허용하기에는 너무 짧은 링커를 이용함으로써, 도메인은 또 하나의 쇄의 상보적 도메인과 쌍을 이루고 2 개의 항원-결합 부위를 생성하도록 유도된다. 디아바디는 2가 또는 이중특이적일 수 있다. 디아바디는 하기에 더욱 충분히 기술된다: 예를 들면, EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med . 9:129-134 (2003); and Hollinger et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90: 6444-6448 (1993). 트리아바디 및 테트라바디가 또한 하기에 기술된다: Hudson et al., Nat. Med . 9:129-134 (2003)).
용어 "단클론성 항체"는 본원에서 사용된 바와 같이 실질적으로 균질한 항체 집단에서 수득된 항체를 지칭하며, 예컨대 상기 집단을 포함하는 개별 항체는 가능한 돌연변이, 예를 들면 소량으로 존재할 수 있는 천연 발생 돌연변이를 제외하고 동일하다. 따라서, 수식어 "단클론성"은 구별되는 항체의 혼합물이 아닌 항체의 특징을 나타낸다. 특정 구현예에서, 그와 같은 단클론성 항체에는 전형적으로 표적에 결합하는 폴리펩티드 서열을 포함하는 항체가 포함되며, 여기서 상기 표적 결합 폴리펩티드 서열은 복수의 폴리펩티드 서열로부터의 단일 표적 결합 폴리펩티드 서열의 선택이 포함되는 방법에 의해 수득되었다. 예를 들면, 선택 방법은 복수의 클론, 예컨대 하이브리도마 클론, 파아지 클론, 또는 재조합 DNA 클론의 풀로부터의 독특한 클론의 선택일 수 있다. 선택된 표적 결합 서열이, 예를 들면 표적에 대한 친화도를 향상하기 위해, 표적 결합 서열을 인간화하기 위해, 세포 배양에서 그 생성을 향상하기 위해, 생체내 그 면역원성을 감소시키기 위해, 다중특이적 항체를 생성하기 위해 등등 추가 변경될 수 있으며, 변경된 표적 결합 서열을 포함하는 항체가 또한 본 개시내용의 단클론성 항체라는 것이 이해되어야 한다. 전형적으로 상이한 측정인자(에피토프)에 대해 유도된 상이한 항체가 포함되는 다클론성 항체 제조물과는 대조적으로, 단클론성-항체 제조물의 각각의 단클론성 항체는 항원 상의 단일 측정인자에 대해 유도된다. 이들의 특이성에 부가하여, 단클론성-항체 제조물은 이들이 전형적으로 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는다는 점에서 유리하다.
수식어 "단클론성"은 항체의 실질적으로 균질한 집단으로부터 수득되는 항체의 특징을 시사하며, 임의의 특정한 방법에 의한 항체의 생산을 필요로 하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 예를 들어, 본 개시내용에 따라 사용될 단클론성 항체는, 예를 들면 하기를 포함하는 다양한 기술에 의하여 제조될 수 있다: 원핵생물 숙주 세포 내 발현, 하이브리도마 방법 (예컨대, Kohler and Milstein, Nature, 256:495-97 (1975); Hongo et al., Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)), 재조합 DNA 방법 (참고: 예컨대, 미국 특허 번호 4,816,567), 파지-디스플레이 기술 (참고: 예컨대, Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol . Biol . 222: 581-597 (1992); Sidhu et al., J. Mol . Biol . 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol . Biol . 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 101(34): 12467-12472 (2004); 및 Lee et al., J. Immunol . Methods 284(1-2): 119-132 (2004), 및 인간 면역글로불린 유전자좌(locus) 또는 인간 면역글로불린 서열을 암호화하는 유전자의 일부 또는 모두를 갖는 동물에서 인간 또는 인간-유사 항체를 생산하기 위한 기술 (참고: 예를 들면, WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovits et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immunol . 7:33 (1993); 미국 특허 번호 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 및 5,661,016; Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol . 14: 826 (1996); 및 Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol . 13: 65:-93 (1995).
본원의 단클론성 항체는 구체적으로 중쇄 및/또는 경쇄 부분이 특정 종으로부터 유래되거나 특정 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체에서 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이고 나머지 쇄(들)은 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체에서 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 “키메라” 항체, 및 이들이 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한 상기 항체의 단편들을 포함한다 (참고: 예를 들어, 미국 특허 No. 4,816,567; 및 Morrison et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 81:6851-6855 (1984)). 키메라성 항체에는 PRIMATTZED® 항체가 포함되며, 여기서 항체의 상기 항원-결합 영역은, 예를 들면 관심 항원으로 마카크 원숭이를 면역화하여 생성된 항체로부터 유도된다.
비인간 (예를 들어, 뮤린) 항체의 "인간화된" 형태는 비인간 면역글로불린으로부터 유래하는 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 일 구현예에서, 인간화 항체는 수령체의 HVR로부터의 잔기가 원하는 특이성, 친화도, 및/또는 수용력을 갖는 비-인간 종(공여체 항체), 예컨대 마우스, 랫트, 토끼, 또는 비인간 영장류의 HVR로부터의 잔기로 대체되는 인간 면역글로불린(수령체 항체)이다. 일부 예에서, 인간 면역글로불린의 FR 잔기는 대응하는 비-인간 잔기에 의해 대체된다. 더욱이, 인간화된 항체는 수령체 항체에서 또는 공여체 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능을 추가 정련하기 위해 제조될 수 있다. 일반적으로, 인간화된 항체는 실질적으로 적어도 하나, 그리고 전형적으로는 2개의 모든 가변 도메인을 포함할 것이며, 모든 또는 실질적으로 모든 초가변성 루프는 비-인간 면역글로불린의 것과 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 면역글로불린 서열의 것들이다. 상기 인간화된 항체는 임의로 또한 적어도 면역글로불린 불변 영역(Fc) 부분, 전형적으로 인간 면역글로불린의 부분을 포함한다. 추가 세부사항에 대해서는, 예를 들면 하기를 참고한다: Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); 및 Presta, Curr . Op. Struct. Biol . 2:593-596 (1992)). 또한, 예를 들어 하기를 참고한다: Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol . 1:105-115 (1998); Harris, Biochem . Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr . Op. Biotech. 5:428-433 (1994); 및 미국 특허 번호 6,982,321 및 7,087,409.
"인간 항체"는 인간에 의해 생성된 항체에 대응하고/하거나 본원에서 개시된 바와 같은 인간 항체를 제조하기 위한 임의의 기술을 이용해서 제조된 아미노산 서열을 보유하는 것이다. 인간 항체의 이러한 정의는 특히 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 배제한다. 인간 항체는 파지-디스플레이 라이브러리를 포함하는 당해기술에 공지된 다양한 기술을 이용해서 생성될 수 있다. Hoogenboom and Winter, J. Mol . Biol ., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol . Biol ., 222:581 (1991). 또한 인간 단클론성 항체의 제조를 위해 하기에 기재된 방법이 이용 가능하다: Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol ., 147(1):86-95 (1991). 또한 하기를 참고한다: van Dijk and van de Winkel, Curr . Opin . Pharmacol ., 5: 368:-74 (2001). 인간 항체는 항원 유발접종에 반응하여 그와 같은 항체를 생성하기 위해 개질되었지만, 그 내인성 유전자위가 불활성화된 형질전환(transgenic) 동물, 예를 들면 면역화된 제노마우스(예를 들면, 참고: XENOMOUSE™ 기술에 관한 미국 특허 6,075,181 및 6,150,584). 또한 예를 들어, 참고: Li et al., Proc . Natl . Acad . Sci. USA, 103:3557-3562 (2006) (인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통해 생성된 인간 항체에 관함).
"종-의존성 항체"는 이것이 제2 포유동물 종 유래의 상기 항원의 상동체에 대해 갖는 것보다 제1 포유동물 종 유래의 항원에 대해 보다 강한 결합 친화도를 갖는 항체이다. 정상적으로, 종-의존성 항체는 인간 항원(예를 들어, 약 1 x 10-7 M 이하, 바람직하게는, 약 1 x 10-8 M 이하 및 가장 바람직하게는 약 1 x 10-9 M 이하의 결합 친화도(Kd) 값을 갖는다)에 "특이적으로 결합"하지만 인간 항원에 대한 이의 결합 친화도 보다 적어도 약 50배, 또는 적어도 약 500배, 또는 적어도 약 1000배 약한 제2 비인간 포유동물 종 유래의 항원의 상동체에 대해 결합 친화도를 갖는다. 종 의존성 항체는 상기 정의된 임의의 다양한 유형의 항체일 수 있지만 바람직하게 인간화된 또는 인간 항체이다.
본원에서 사용되는 용어 "초가변성 영역", "HVR" 또는 "HV"는 서열이 초가변성이고/이거나 구조적으로 정의된 루프를 형성하는 항체-가변 도메인 영역을 나타낸다. 일반적으로, 항체는 6 개의 HVR; VH에 3 개(H1, H2, H3), 및 VL에 3 개(L1, L2, L3)를 포함한다. 천연 항체에서, H3 및 L3은 6 개 HVR의 가장 큰 다양성을 나타내며, H3은 특히 항체에 대해 미세한 특이성을 부여하는데 있어서 독특한 역할을 담당하는 것으로 여겨진다. 참고: 예를 들면, Xu et al., Immunity 13:37-45 (2000); Johnson and Wu, in Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, N.J., 2003). 사실상, 중쇄만으로 구성된 천연 발생 낙타과(camelid) 항체는 경쇄의 부재 하에서 작용적이고 안정하다. 참고: 예를 들면, Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993); Sheriff et al., Nature Struct . Biol . 3:733-736 (1996)).
수많은 HVR 묘사가 사용되며, 본원에서 포괄된다. 카밧 상보성-측정 영역(CDR)은 서열 가변성에 기반하며, 가장 일반적으로 사용된다(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). 초티아는 대신에, 구조적 루프의 위치를 지칭한다 (Chothia and Lesk, J. Mol . Biol . 196:901-917 (1987)). AbM HVR은 카밧 CDR 및 초티아 구조적 루프 간 절충을 나타내며, Oxford Molecular의 AbM 항체-모델링 소프트웨어에 의해 이용된다. "접촉" HVR은 이용 가능한 착물 측정 구조의 분석에 기반한다. 이들 HVR 각각으로부터의 잔기가 아래에 주지된다.
표 1a. 항체 초가변 영역
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HVR은 하기와 같이 “연장된 HVR”을 포함할 수 있다: 24-36 또는 24-34 (L1), 46-56 또는 50-56 (L2) 및 89-97 또는 89-96 (L3) (VL 중) 및 26-35 (H1), 50-65 또는 49-65 (H2) 및 93-102, 94-102, 또는 95-102 (H3) (VH 중). 초가변 도메인 잔기들은 이들 정의의 각각에 대해 문헌(Kabat et al., 상기)에 따라 넘버링한다.
"프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본원에서 정의된 바와 같이 HVR 잔기 이외의 가변-도메인 잔기이다.
용어 "카밧에서의 가변-도메인 잔기-넘버링" 또는 "카밧에서의 아미노산-위치 넘버링" 및 이들의 변형은 [Kabat et al., 상기]에서 항체 편집의 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 대해 사용된 넘버링 시스템을 지칭한다. 상기 넘버링 시스템을 이용하여, 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 HVR의 단축 또는 이것으로의 삽입에 대응하는 더 적거나 더 많은 아미노산을 포함할 수 있다. 예를 들면, 중쇄 가변 도메인에는 H2의 잔기 52 뒤에 단일 아미노산 삽입(카밧에 따른 잔기 52a) 및 중쇄 FR 잔기 82 뒤에 삽입된 잔기(예를 들면, 카밧에 따른 잔기 82a, 82b, 및 82c 등)가 포함될 수 있다. 잔기의 카밧 넘버링은 항체 서열의 상동성 영역에서 "표준" 카밧 넘버링된 서열과의 정렬에 의해 주어진 항체에 대해 측정될 수 있다.
카밧 넘버링 시스템은 가변 도메인 내 잔기(대략 경쇄의 잔기 1-107 및 중쇄의 잔기 1-113)에 대해 지칭할 때 일반적으로 사용된다(예를 들면, Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). “EU 넘버링 시스템” 또는 “EU 지수” 는 일반적으로, 면역글로불린 중쇄 불변 영역 내의 잔기를 지칭할 경우 사용된다 (예컨대, 상기 Kabat et al. 에 보고된 EU 지수). “카밧으로의 EU 지수"는 인간 IgG1 EU 항체의 잔기 넘버링을 지칭한다.
어구 "선형 항체"는 하기에 기재된 항체를 지칭한다: Zapata et al. (1995 Protein Eng, 8(10):1057-1062). 간단히, 이들 항체는, 상보적 경쇄 폴리펩티드와 함께, 한 쌍의 항원 결합 영역을 형성하는 한 쌍의 탠덤 Fd 분절 (VH-CH1-VH-CH1)을 포함한다. 선형 항체는 이중특이적 또는 단일특이적일 수 있다.
II. 분자 최적화
폴리펩티드의 2쇄를 발현시키기 위해 숙주 세포를 순환시킴으로써 원핵 숙주 세포에서 2쇄를 함유한 폴리펩티드의 생산 방법이 본원에서 제공되고, 숙주 세포를 배양시켜 폴리펩티드의 2쇄를 발현시키고, 이로써 발현시 2쇄가 접히고 조립되어 숙주 세포에서 생물학적으로 활성 폴리펩티드를 형성하는 단계; 여기에서 숙주 세포는 (1) 폴리펩티드의 제1 쇄를 암호화한 제1 번역 단위체; (2) 폴리펩티드의 제2쇄를 암호화한 제2 번역 단위체; 및 (3) 펩티딜-프롤릴 이소머라아제, 단백질 이황화 산화환원효소, 및 이들의 조합으로부터 선택된 적어도 하나의 샤페론 단백질을 암호화한 제3 번역 단위체를 포함한 폴리뉴클레오티드를 함유한다. 또한 폴리펩티드의 2쇄를 발현시키기 위해 숙주 세포를 순환시킴으로써 원핵 숙주 세포에서 2쇄를 함유한 폴리펩티드의 생산 방법이 본원에서 제공되고, 여기에서 발현시 2쇄는 접혀지고 조립되어 숙주 세포에서 생물학적 활성 폴리펩티드를 형성함; 여기에서 숙주 세포는 하기를 포함한 폴리뉴클레오티드를 함유하고: (1) 폴리펩티드의 제1 쇄를 암호화한 제1 번역 단위체; (2) 폴리펩티드의 제2쇄를 암호화한 제2 번역 단위체; (3) 제1 샤페론 단백질을 암호화한 제3 번역 단위체; (4) 제2 샤페론 단백질을 암호화한 제4 번역 단위체; 및 (5) 제3 샤페론 단백질을 암호화한 제5 번역 단위체, 여기에서 제1, 제2, 및 제3 샤페론 단백질은 펩티딜-프롤릴 이소머라아제, 단백질 이황화 산화환원효소, 및 이들의 조합으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 숙주 세포는 폴리펩티드의 2쇄를 발현시키기 위해 배양되고, 여기에서 발현시 2쇄는 접혀지고 조립되어 숙주 세포에서 생물학적 활성 폴리펩티드를 형성한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 2쇄 접힘 및 조립은 적절한 3-차원 2쇄 단백질 형태, 2쇄 단백질 조립, 또는 모두의 최종적인 채택을 촉진시키는 임의의 또는 모든 단계를 지칭할 수 있다. 접힘 및 조립은 그의 적절한 형태 및 접힘으로의 각 쇄의 접힘 및 조립을 지칭할 수 있거나, 또는 2 단백질 쇄의 분자간 연결에 의해 창출된 착물의 접힘 및 조립을 지칭할 수 있다. 유사하게, 각 쇄는 생물학적 활성 폴리펩티드를 형성하기 위해 접힘 및 조립될 수 있거나, 또는 2 단백질 쇄의 분자간 연결에 의해 창출된 착물은, 전체적으로, 생물학적 활성 폴리펩티드를 형성하기 위해 접힘 및 조립될 수 있다.
생물학적 활성 폴리펩티드는 폴리펩티드에 기인된 기능을 실시할 수 있는 임의의 폴리펩티드를 지칭할 수 있다. 생물학적 활성 폴리펩티드의 기능은, 제한 없이, 적절한 접힘 또는 조립, 또 다른 거대분자와 결합 또는 다른 상호작용, 및 효소 활성을 포함할 수 있다. 예증으로써, 생물학적으로 활성 항체는, 아래 추가 상세에 기재된 바와 같이, 제한 없이 에피토프에 대한 결합을 포함한 또는 항체 Fc 영역의 특성을 소지한, 항체에 기인된 적어도 하나의 기능을 실시할 수 있는 항체를 지칭할 수 있다.
샤페론 단백질
일부 구현예에서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 샤페론 단백질을 암호화한 번역 단위체를 함유한다. 상기 기재된 바와 같이, 샤페론 단백질은, 제한 없이 2쇄 단백질을 포함한, 다른 거대분자의 접힘 또는 조립에 조력하는 임의의 단백질을 지칭할 수 있다. 샤페론 단백질의 예는 제한 없이 펩티딜-프롤릴 이소머라아제, 단백질 이황화 산화환원효소, 및 열충격 단백질 (예컨대 Hsp60, Hsp70, Hsp90, 및 Hsp100 단백질)을 포함할 수 있다. 샤페론 단백질은 막을 통해 단백질의 이송, 예를 들면, 원형질막 또는 내형질 망 막을 통해 폴리펩티드 쇄의 전좌에 또한 조력할 수 있다.
일부 구현예에서, 샤페론 단백질은 펩티딜-프롤릴 이소머라아제일 수 있다. 펩티딜-프롤릴 이소머라아제 (용어 "프롤릴 이소머라아제", "로타마아제", 및 "PPiase"는 본원에서 교환가능하게 사용될 수 있다)는 프롤린 또는 프롤릴-이미노펩티드 결합의 시스 및 트랜스 이성질체의 상호전환을 촉매화하는 임의의 효소를 지칭할 수 있다. 상기 반응에 대한 EC 번호는 EC 5.2.1.8이다. 상기 EC 번호에 의해 기재된 반응을 촉매화하기 위해 공지된 또는 예상된 임의의 단백질은 본 개시내용의 펩티딜-프롤릴 이소머라아제일 수 있다. 펩티딜-프롤릴 이소머라아제 활성은 GO 용어 ID GO:0003755로 또한 기재될 수 있다. 상기 GO 용어 ID에 의해 기재된 분자 기능을 소지하기 위해 공지된 또는 예상된 임의의 단백질은 본 개시내용의 펩티딜-프롤릴 이소머라아제일 수 있다.
펩티딜-프롤릴 이소머라아제 활성은 단백질 접힘 및 조립을 촉진시키기 위해 당해 기술에서 공지된다. 일부 구현예에서, 펩티딜-프롤릴 이소머라아제는 적절하게 접혀진 구조가 시스 프롤릴 결합을 포함하는 단백질에 대하여 트랜스 프롤릴 결합을 시스 프롤릴 결합으로 전환시킴으로써 단백질 접힘 및 조립에 조력할 수 있다. 일부 펩티딜-프롤릴 이소머라아제는 시스 프롤릴 결합이 부족한 단백질의 접힘 및 조립을 향상시키기 위해 또한 공지된다 (Bothmann H and Pluckthun A 2000 J. Biol. Chem. 275:17100). 일부 구현예에서, 펩티딜-프롤릴 이소머라아제는 시스 프롤릴 결합이 부족한 단백질의 조립 및 단백질 접힘에 조력할 수 있다. 따라서, 펩티딜-프롤릴 이소머라아제 활성이 본원에서 기재된 방법에 유용한 샤페론 단백질을 식별하기 위해 기능적 특징으로서 작용할 수 있는 반면, 펩티딜-프롤릴 이소머라아제의 유용성은 그의 촉매적 활성 자체에 필연적으로 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 펩티딜-프롤릴 이소머라아제는 FkpA 단백질이다. 일부 구현예에서, FkpA 단백질은 이. 콜라이 FkpA이다. 이. 콜라이 FkpA는 종 이 . 콜라이에 속하는 박테리아의 단리물 또는 임의의 균주에서 fkpA 유전자에 의해 암호화된 임의의 폴리펩티드를 지칭할 수 있다. 일부 구현예에서, 이. 콜라이 FkpA는 EcoGene 수탁 번호 EG12900에 의해 기재된 fkpA 유전자에 의해 암호화된 단백질을 지칭한다. 일부 구현예에서, 이. 콜라이 FkpA는 NCBI RefSeq 수탁 번호 NP_417806에 의해 기재된 서열을 갖는 단백질을 지칭한다.
다른 FkpA 단백질은 당해 기술에 공지되어 있다. FkpA 단백질의 예는, 제한 없이, S. 보이디 펩티딜-프롤릴 이소머라아제 (NCBI RefSeq No. WP_000838252), C. 영가에 펩티딜-프롤릴 이소머라아제 (NCBI RefSeq No. WP_006687366), K. 옥시토카 펩티딜-프롤릴 이소머라아제 (NCBI RefSeq No. WP_004125943), S. 엔테리카 펩티딜-프롤릴 이소머라아제 (NCBI RefSeq No. WP_000838233), K. 뉴모니애 펩티딜-프롤릴 이소머라아제 (NCBI RefSeq No. WP_019704642), S. 세레비지애 FPR3p (NCBI RefSeq No. NP_013637), M. 머스큘러스 Fkpb1a (NCBI RefSeq No. NP_032045), M. 머스큘러스 Fkpb2 (NCBI RefSeq No. NP_032046), H. 사피엔스 FKBP2 (NCBI RefSeq No. NP_001128680), 및 D. 멜라노가스테르 CG14715 (NCBI RefSeq No. NP_650101)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 FkpA 단백질은 이. 콜라이 FkpA에 대해 적어도 약 80%, 적어도 약 81%, 적어도 약 82%, 적어도 약 83%, 적어도 약 84%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 동일성을 갖는다.
일부 구현예에서, 샤페론 단백질은 단백질 이황화 산화환원효소일 수 있다. 단백질 이황화 산화환원효소 (용어 "단백질 이황화 이소머라아제" 및 "티올-이황화 이소머라아제"는 본원에서 교환가능하게 사용될 수 있다)는 단백질에서 이황화 결합의 재배열을 촉매화하는 임의의 효소를 지칭할 수 있다. 예를 들어, 단백질 이황화 산화환원효소는 단백질에서 이황화 결합을 형성하기 위해 시스테인의 산화를 촉매화할 수 있다. 단백질 이황화 산화환원효소는 단백질에서 오류쌍형성된 이황화 결합의 이성질화를 또한 촉매화할 수 있다. 상기 반응의 EC 번호는 EC 5.3.4.1이다. 상기 EC 번호에 의해 기재된 반응을 촉미화하기 위해 공지된 또는 예상된 임의의 단백질은 본 개시내용의 단백질 이황화 산화환원효소일 수 있다. 단백질 이황화 산화환원효소 활성은 GO 용어 ID GO:0015035에 의해 또한 기재될 수 있다. 상기 GO 용어 ID에 의해 기재된 분자 기능을 소지하기 위해 공지된 또는 예상된 임의의 단백질은 본 개시내용의 단백질 이황화 산화환원효소일 수 있다.
단백질 이황화 산화환원효소 활성은 단백질 접힘 및 조립을 촉진시키기 위해 당해 기술에 공지된다. 예를 들어, 단백질 이황화 산화환원효소 활성은 단백질 접힘 및 조립 동안 적절한 분자내 및 분자간 이황화 결합의 형성을 촉진시킨다. 특히, 단백질 이황화 산화환원효소 활성은 원핵 세포의 주변세포질에서 발현되는 이황화 결합을 갖는 단백질에 중요하다.
일부 구현예에서, 단백질 이황화 산화환원효소는 DsbA 단백질이다. 일부 구현예에서, DsbA 단백질은 이. 콜라이 DsbA이다. 이. 콜라이 DsbA는 종 이 . 콜라이에 속하는 박테리아의 단리물 또는 임의의 균주에서 dsbA 유전자에 의해 암호화된 임의의 폴리펩티드를 지칭할 수 있다. 일부 구현예에서, 이. 콜라이 DsbA는 에코진(EcoGene) 수탁 번호 EG11297에 의해 기재된 dsbA 유전자에 의해 암호화된 단백질을 지칭한다. 일부 구현예에서, 이. 콜라이 DsbA는 NCBI RefSeq 수탁 번호 NP_418297에 의해 기재된 서열을 갖는 단백질을 지칭한다.
다른 DsbA 단백질은 당해 기술에 공지되어 있다. DsbA 단백질의 예는, 제한 없이, S. 플렉스네리(S. flexneri ) 티올-이황화 이소머라아제 (NCBI RefSeq No. WP_000725335), S. 다이센테리애(S. dysenteriae) 티올-이황화 이소머라아제 (NCBI RefSeq No. WP_000725348), C. 영가에(C. youngae) 티올-이황화 이소머라아제 (NCBI RefSeq No. WP_006686108), 및 S. 엔테리카(S. enterica) 티올-이황화 이소머라아제 (NCBI RefSeq No. WP_023240584)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 DsbA 단백질은 이. 콜라이 DsbA에 대해 적어도 약 80%, 적어도 약 81%, 적어도 약 82%, 적어도 약 83%, 적어도 약 84%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 동일성을 갖는다.
일부 구현예에서, 단백질 이황화 산화환원효소는 DsbC 단백질이다. 일부 구현예에서, DsbC 단백질은 이. 콜라이 DsbC이다. 이. 콜라이 DsbC는 종 이 . 콜라이에 속하는 박테리아의 단리물 또는 임의의 균주에서 dsbC 유전자에 의해 암호화된 임의의 폴리펩티드를 지칭할 수 있다. 일부 구현예에서, 이. 콜라이 DsbC는 EcoGene 수탁 번호 EG11070에 의해 기재된 dsbC 유전자에 의해 암호화된 단백질을 지칭한다. 일부 구현예에서, 이. 콜라이 DsbC는 NCBI RefSeq 수탁 번호 NP_417369에 의해 기재된 서열을 갖는 단백질을 지칭한다.
다른 DsbC 단백질은 당해 기술에 공지되어 있다. DsbC 단백질의 예는, 제한 없이, S. 손네이(S. sonnei) 단백질-이황화 이소머라아제 (NCBI RefSeq No. WP_000715206), S. 다이센테리애(S. dysenteriae) 단백질-이황화 이소머라아제 (NCBI RefSeq No. WP_000715209), E. 페르구소니(E. fergusonii) 단백질-이황화 이소머라아제 (NCBI RefSeq No. WP_000715225), S. 본고리(S. bongori) 티올:이황화 교환 단백질 DsbC (NCBI RefSeq No. WP_020845161), 및 S. 엔테리카(S. enterica) 단백질 이황화 이소머라아제 DsbC (NCBI RefSeq No. WP_023183515)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 DsbC 단백질은 이. 콜라이 DsbC에 대해 적어도 약 80%, 적어도 약 81%, 적어도 약 82%, 적어도 약 83%, 적어도 약 84%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 동일성을 갖는다.
2개의 아미노산 서열, 또는 2개의 핵산 서열의 퍼센트 동일성을 측정하기 위해, 서열을 최적의 비교 목적을 위해 정렬된다 (예를 들면, 최적의 정렬을 위해 제 1 및 제 2 아미노산 또는 핵산 서열 중 하나 또는 둘 모두에 갭을 도입할 수 있으며 비교를 위해 비-상동 서열을 무시할 수 있다). 일 구현예에서, 비교를 위해 정렬된 참조 서열의 길이는 참조 서열 길이의 적어도 50%, 전형적으로 적어도 75%, 그리고 더 더욱 전형적으로 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%이다. 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오티드 위치에서 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드는 그 다음 비교된다. 제1 서열의 위치가 제2 서열의 상응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드에 의해 점거된 경우, 분자는 그 위치에서 동일하다 (본원에서 사용된 바와 같이 아미노산 또는 핵산 "상동성"은 아미노산 또는 핵산 "상동"과 같다).
이들 두 서열 사이에 퍼센트 동일성은 이들 두 서열의 최적 정렬을 위해 도입되어야 하는 갭의 숫자, 그리고 각 갭의 길이를 고려하여, 이들 서열에 의해 공유된 동일한 위치의 숫자의 함수이다. 서열 비교를 위해, 전형적으로 하나의 서열은 시험 서열이 비교되는 표준 서열로서 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 사용하는 경우, 시험 및 표준 서열은 컴퓨터에 입력하고, 필요한 경우 서브서열 코디네이트를 지정하고 서열 알고리즘 프로그램 파라미터를 지정한다. 디폴트 프로그램 파라미터가 사용될 수 있거나 대안적인 파라미터가 지정될 수 있다. 이어서 상기 서열 비교 알고리즘은 프로그램 파라미터를 기준으로 표준 서열에 상대적인 시험 서열에 대한 % 서열 동일성을 계산한다. 상동성에 대하여 2 서열을 비교한 경우, 서열이 인접할 필요는 없지만, 임의의 갭이 이와 함께 전체 퍼센트 상동성을 감소시킬 패널티를 가질 것이다. blastn에 대하여, 디폴트 파라미터는 갭 개방 패널티 = 5 및 갭 확대 패널티 = 2이다. blastp에 대하여, 디폴트 파라미터갭 개방 패널티 = 11 및 갭 확대 패널티 = 1이다.
본원에 사용된 바와 같은 "비교 창"은 서열이 2개의 서열이 최적으로 정렬된 후 동일한 수의 연속 위치들의 표준 서열과 비교될 수 있는 20 내지 600개, 일반적으로 약 50 내지 약 200개, 보다 일반적으로 약 100 내지 약 150개로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 다수의 연속 위치들 중 어느 하나의 분절에 대한 지칭을 포함한다. 비교를 위한 서열의 정렬 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 비교용 서열의 최적의 정렬은 공지된 알고리즘 (예를 들면, Smith and Waterman, Adv Appl Math, 2:482, 1981의 국부 상동 알고리즘에 의해; Needleman and Wunsch, J Mol Biol, 48:443, 1970의 상동 정렬 알고리즘에 의해; Pearson and Lipman, Proc Natl Acad Sci USA, 85:2444, 1988의 유사성 방법의 조사에 의해; 이들 알고리즘 FASTDB의 컴퓨터화된 실행 (Intelligenetics)에 의해, BLAST (National Center for Biomedical Information), GAP, BESTFIT, FASTA, 및 위스콘신 유전학 소프트웨어 패키지 (Genetics Computer Group, Madison, WI)에서 TFASTA를 이용하여, 또는 매뉴얼 정렬 및 시력 검사에 의해 수행될 수 있다.
퍼센트 서열 상동성 및 서열 유사성의 측정에 적합한 알고리즘의 바람직한 예는 FASTA 알고리즘 (Pearson and Lipman, Proc Natl Acad Sci USA, 85:2444, 1988; and Pearson, Methods Enzymol, 266:227-258, 1996)이다. 퍼센트 상동성을 계산하기 위해 DNA 서열의 FASTA 정렬에 사용된 바람직한 파라미터는 최적화된, BL50 매트릭스 15:-5, k-튜플 = 2; 접합 패널티 = 40, 최적화 = 28; 갭 페널티 - 12, 갭 길이 페널티 = -2; 및 폭 = 16이다.
퍼센트 서열 상동성 및 서열 유사성의 측정에 적합한 알고리즘의 또 다른 바람직한 예는BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘 (Altschul et al., Nuc Acids Res, 25:3389-3402, 1977; and Altschul et al., J Mol Biol, 215:403-410, 1990, 각각)이다. BLAST 및 BLAST 2.0은 본원에 기재된 파라미터와 함께 사용하여 본 개시내용의 핵산 및 단백질에 대한 % 서열 동일성을 측정한다. BLAST 분석 수행용 소프트웨어는 국립 생명공학 정보 센터 (National Center for Biotechnology Information) 웹사이트를 통해 공개적으로 입수가능하다. 상기 알고리즘은 먼저 데이터베이스 서열에서 동일한 길이의 단어로 정렬되는 경우 일부 양성-값 역치 스코어 T와 일치하거나 이를 만족시키는, 탐색 서열에서 길이의 약어 W를 동정함에 의해 고도의 스코어링 서열 쌍(HSP)을 동정함을 포함한다. T는 이웃 워드 스코어 역치(neighborhood word score threshold)라고 한다. 이들 초기 이웃 단어 히트는 이들을 함유하는 보다 긴 HSP를 발견하는 검색을 개시하기 위한 씨드로서 작용한다. 워드 히트(word hit)는 누적 정렬 스코어가 증가될 수 있는 한 각 서열을 따라 양방향으로 연장된다. 누적 스코어는 뉴클레오티드 서열에 대해 파라미터 M (한쌍의 매칭 잔기에 대한 보상 스코어; 항상 > 0) 및 N (미쓰매칭 잔기에 대한 페날티 스코어; 항상< 0)을 사용하여 계산한다. 아미노산 서열에 대해, 스코어링 매트릭스를 사용하여 누적 스코어를 계산한다. 누적 정렬 점수가 이의 최대 달성 값으로부터 X 양만큼 하락하였을 때; 1회 이상의 음의 점수화 잔기 정렬 누적에 기인하여 누적 점수가 0 이하가 되었을 때; 또는 양 서열의 단부에 도달되었을 때, 각 방향에서 워드 히트 확장은 중단된다. 상기 BLAST 알고리즘 파라미터 W, T, 및 X는 정렬 민감성 및 속도를 측정한다. BLASTN 프로그램 (뉴클레오티드 서열에 대한)은 디폴트로서 11의 워드 길이(W), 10의 예상치(E), M=5, N=-4 및 양 가닥의 비교를 사용한다. 아미노산 서열에 대해, BLASTP 프로그램은 디폴트로서 3의 단어길이 및 10의 예상치(E) 및 50의 BLOSUM62 스코어링 매트릭스 (문헌참조: Henikoff and Henikoff, Proc Natl Acad Sci USA, 89:10915, 1989) 정렬치 (B), M=5, N=-4 및 양 가닥의 비교를 사용한다.
BLAST 알고리즘은 전형적으로 "낮은 복합성" 필터를 비활성화한 채로 수행된다. BLAST 알고리즘은 또한 2개의 서열 사이의 유사성의 통계학적 분석을 수행한다 (예를 들면, 참고: Karlin and Altschul, Proc Natl Acad Sci USA, 90:5873-5787, 1993). BLAST 알고리즘에 의하여 제공된 유사성의 일 측정은 최소 총합 확률 (P(N))이며, 이는 2개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 매치가 우연히 발생할 확률의 지표를 제공한다. 예를 들어, 핵산은, 만약 참조 핵산에 대한 시험 핵산의 비교에서의 최소 총합 확률이 약 0.2 미만, 더욱 바람직하게는 약 0.01 미만, 그리고 가장 바람직하게는 약 0.001 미만일 때, 참조 서열과 유사한 것으로 고려된다.
유용한 알고리즘의 또 다른 예는 PILEUP이다. PILEUP은 관계 및 퍼센트 서열 상동성을 보여주기 위해 진행성, 쌍별 정렬을 이용한 관련된 서열의 그룹으로부터 다중 서열 정렬을 창출한다. 정렬을 창출하기 위해 사용된 클러스터링 관계를 보여주는 트리 또는 덴도그램을 또한 작도한다. PILEUP은, 공개된 방법 (Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-153, 1989)과 유사한 방법을 사용하여, 진행성 정렬 방법 (Feng and Doolittle, J Mol Evol, 35:351-360, 1987)의 단순화를 이용한다. 프로그램은, 각각 5,000 뉴클레오티드 또는 아미노산의 최대 길이의, 최대 300 서열을 정렬할 수 있다. 다중 정렬 절차는 2개의 가장 유사한 서열의 쌍별 정렬로 시작하여, 2개 정렬된 서열의 클러스터를 생산한다. 상기 클러스터는 그 다음 정렬된 서열의 클러스터 또는 다음의 가장 관련된 서열로 정렬된다. 서열의 2개 클러스터는 2개의 개별적 서열의 쌍별 정렬의 단순 확대에 의해 정렬된다. 최종 정렬은 일련의 진행성, 쌍별 정렬에 의해 달성된다. 프로그램은 서열 비교의 영역에 대한 특이적 서열 및 그의 아미노산 또는 뉴클레오티드 좌표의 지정 및 프로그램 파라미터의 지정에 의해 실시된다. PILEUP을 비교하여, 참조 서열은하기 파라미터: 디폴트 갭 중량 (3.00), 디폴트 갭 길이 중량 (0.10), 및 칭량된 말단 갭을 이용한 퍼센트 서열 상동성 관계를 측정하기 위해 다른 시험 서열과 비교된다. PILEUP은 GCG 서열 분석 소프트웨어 패키지, 예를 들면, 버전 7.0 (Devereaux et al., Nuc Acids Res, 12:387-395, 1984)로부터 수득될 수 있다.
다중 DNA 및 아미노산 서열 정렬에 적합한 알고리즘의 또 다른 바람직한 예는 CLUSTALW 프로그램이다 (Thompson et al., Nucl Acids. Res, 22:4673-4680, 1994). ClustalW는 서열의 그룹 사이에서 다중 쌍별 비교를 수행하고 이들을 상동성에 기반된 다중 정렬로 조립한다. 갭 개방 및 갭 확대 패널티는 각각 10 및 0.05이었다. 아미노산 정렬에 대하여, BLOSUM 알고리즘은 단백질 중량 매트릭스 (Henikoff and Henikoff, Proc Natl Acad Sci USA, 89:10915-10919, 1992)로서 사용될 수 있다.
발현 카세트 및 벡터
일부 구현예에서, 숙주 세포는 (1) 폴리펩티드의 제1 쇄를 암호화한 제1 번역 단위체; (2) 폴리펩티드의 제2쇄를 암호화한 제2 번역 단위체; 및 (3) 펩티딜-프롤릴 이소머라아제, 단백질 이황화 산화환원효소, 및 이들의 조합으로부터 선택된 적어도 하나의 샤페론 단백질을 암호화한 제3 번역 단위체를 포함한 폴리뉴클레오티드를 함유한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 (1) 폴리펩티드의 제1 쇄를 암호화한 제1 번역 단위체; (2) 폴리펩티드의 제2쇄를 암호화한 제2 번역 단위체; (3) 제1 샤페론 단백질을 암호화한 제3 번역 단위체; (4) 제2 샤페론 단백질을 암호화한 제4 번역 단위체; 및 (5) 제3 샤페론 단백질을 암호화한 제5 번역 단위체를 포함한 폴리뉴클레오티드를 함유하고, 여기에서 제1, 제2, 및 제3 샤페론 단백질은 펩티딜-프롤릴 이소머라아제, 단백질 이황화 산화환원효소, 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 적절하게 접혀진 및 조립된 2쇄 단백질의 증가된 생산이 단일 플라스미드 시스템 (즉, 2쇄 단백질의 각 쇄를 암호화한 번역 단위체 및 하나 이상의 샤페론 단백질을 암호화한 하나 이상의 번역 단위체) 또는 혼화성 플라스미드 시스템 (즉, 2쇄 단백질의 각 쇄를 암호화한 번역 단위체를 함유한 제1 폴리뉴클레오티드 및 하나 이상의 샤페론 단백질을 암호화한 하나 이상의 번역 단위체를 함유한 제2 폴리뉴클레오티드)을 이용하여 달성될 수 있음이 본 개시내용의 발견이다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 추가로 프로모터의 3개 사본을 함유하고, 여기에서 제1 사본은 제1 번역 단위체와 작동가능한 조합이고, 제2 사본은 제2 번역 단위체와 작동가능한 조합이고, 제3개 사본은 제1 쇄, 제2쇄 및 샤페론 단백질의 전사를 구동하기 위해 제3 번역 단위체와 작동가능한 조합이다. 일부 구현예에서, 3개의 샤페론 단백질 중 2개를 암호화한 번역 단위체의 2개는 단일 번역 단위체의 일부이다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 추가로 각 번역 단위체와 작동가능한 조합으로 프로모터를 함유한다.
일부 구현예에서, 프로모터는 유도성 프로모터이다. 상기 기술된 바와 같이, 유도가능한 프로모터의 활성은 신호에 반응하여 증가 또는 감소된다. 예를 들어, 유도성 프로모터는 신호, 예컨대 IPTG의 존재에 대한 반응으로 전사를 촉진시킬 수 있다. 유도성 프로모터는 신호, 예컨대 포스페이트의 부재에 대한 반응으로 전사를 촉진시킬 수 있다. 이들 시나리오 중 하나로, 전사의 양은 신호의 양, 또는 이의 결핍에 비례할 수 있거나 또는 아닐 수 있다. 원핵 숙주 세포에 적합한 유도성 프로모터의 수많은 예는 당해 기술에 공지되어 있다. 이들은 비제한적으로 하기를 포함할 수 있다: lac, tac, trc, trp, pho, recA, tetA, nar, 파아지 PL, cspA, T7, 및 PBAD 프로모터 (참고: Terpe K. 2006 Appl. Microbiol. Biotechnol. 72:211)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 유도성 프로모터의 3 사본은 공동작용의 방식으로 별도 번역 단위체, 예를 들면, 2쇄 단백질 및 샤페론 단백질의 모든 쇄의 발현을 구동하기 위해 사용된다.
일부 구현예에서, 유도성 프로모터는 IPTG-유도성 프로모터이다. IPTG-유도성 프로모터는 lac 오페론 (예를 들면, 알로락토오스)으로부터 전사를 촉진시킬 수 있는 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드 (IPTG) 또는 임의의 다른 락토오스 유도체에 반응성인 방식으로 전사를 촉진시키는 임의의 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭할 수 있다. IPTG-유도성 프로모터의 많은 예는, 제한 없이 tac (예를 들면, tacI, tacII, 등) 프로모터, lac 프로모터, 및 이들의 유도체 (예를 들면, lacUV5, taclac, 등등)을 포함하여, 당해 기술에 공지되어 있다.
일부 구현예에서, 유도성 프로모터는 제1 쇄, 제2쇄 및 샤페론 단백질의 전사를 구동하는 IPTG-유도성 프로모터이다. 샤페론 단백질의 발현을 조절한 IPTG-유도성 프로모터가, IPTG의 유도 없이, IPTG-유도성 프로모터가 IPTG에 의해 유도된 경우 샤페론 단백질의 발현과 비교로, 더 높은 생성물 역가를 촉진시키는 수준에서 샤페론 단백질의 발현을 촉진시키는 것이 본 개시내용의 놀라운 발견이다.
일부 구현예에서, 유도성 프로모터는 배양 배지내 포스페이트가 감손된 경우 제1 쇄, 제2쇄 및 샤페론 단백질의 전사를 구동하는 pho 프로모터이다. pho 프로모터는 세포외 포스페이트 (예를 들어, 무기 포스페이트)에 반응성인 방식으로 전사를 촉진시키는 임의의 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 이. 콜라이에서 포스페이트 (Pho) 레귤론은 세포외 포스페이트를 감지하는 및, 포스페이트 수준에 대한 반응으로, Pho 프로모터를 통한 수많은 다운스트림 유전자의 발현을 조절하는 단백질 구성요소를 포함한다 (참고: 더욱 상세한 설명을 위하여, Hsieh YJ and Wanner BL 2010 Curr. Opin. Microbiol. 13(2):198). 박테리아가 배양 배지에서 성장된 경우, 상기 Pho 레귤론의 발현은 포스페이트 (예를 들면, 무기 포스페이트, Pi)가 배지에서 이용가능한 경우 재생되기 위해 공지되고 포스페이트가 감손된 경우 유도된다. 본원에서 기재된 방법에서 사용된 pho 프로모터의 하나의 비-제한 예는 이. 콜라이 phoA 프로모터이다. 상기 프로모터는 세포 배양 배지에서 포스페이트의 농도에 의존한 방식으로 원핵 숙주 세포에서 재조합 단백질 발현을 조절하기 위해 당해 기술에서 사용되고 널리 공지된다 (참고: Lubke C et al. 1995 Enzyme Microb. Technol. 17(10):923).
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 추가로 선택가능한 마커를 함유하고 배양 배지는 숙주 세포가 폴리뉴클레오티드를 보유하도록 유발시키는 단일 항생물질을 갖는 선택제를 포함한다. 유리하게는, 본원에서 기재된 방법은 하나 이상의 샤페론 단백질의 공-발현으로 2쇄 단백질의 쇄의 생산을 허용하여 이로써 이들 구성요소의 각각을 암호화한 번역 단위체가 모두 단일 폴리뉴클레오티드 (예를 들면, 본원에서 기재된 바와 같이 발현 플라스미드 또는 단일 플라스미드 시스템)에 포함된다. 그와 같은 시스템의 이점은, 이들 성분의 모두가 동일한 플라스미드에 의해 암호화되고, 단 하나의 선택가능한 마커가 원핵 숙주 세포에서 이들 폴리뉴클레오티드의 유지를 위하여 요구된다는 것이다.
선택가능한 마커는, 세포가 선택, 즉, 선택가능한 마커가 부족한 세포(들)의 존재도에 비하여 선택가능한 마커를 보유한 세포(들)의 존재도를 우선적으로 증가시키기 위해 사용된 임의의 조건을 경험하는 경우, 숙주 세포의 생존을 촉진시키는 단백질을 암호화하는 임의의 폴리뉴클레오티드를 지칭할 수 있다. 선택가능한 마커의 예는 항생제의 존재하에 숙주 세포 생존을 촉진시키는 유전자이다. 단일 항생물질을 갖는 상응하는 선택제 및 수많은 선택가능한 마커는 당해 기술에 공지되어 있다. 예를 들어, 그리고 비제한적으로, 다수의 선택가능한 마커 및 상응하는 항생제는 하기에 기술 및 인용된다: Jang CW and Magnuson T 2013 PLoS ONE 8(2):e57075. 일부 구현예에서, 선택가능한 마커는 숙주 세포의 게놈 내에 존재한 유전자 결실을 보완하는 유전자 (예를 들면, 플라스미드로부터 발현된 유전자)를 지칭할 수 있다. 이들 실시예에서, 세포가 선택 (즉, 숙주 게놈으로부터 결실된 유전자의 활성을 요구하는 조건하에 성장)을 경험한 경우, 유전자의 사본은 숙주 게놈의 결핍을 보완하는 플라스미드에 의해 공급하였고, 그렇게 함으로써 외인성 보완 유전자를 보유한 세포(들)에 대해 선택하였다. 상기 유전자는 세포 배지에서 부족한 특이적 영양소를 생산하기 위해 요구된 영양요구성 마커 또는 유전자를 포함할 수 있고, 이의 예는 추가로 본원에서 기재된다. 몇 개의 예시적 선택가능한 마커 및 항생제는 아래 추가로 기재된다.
일부 구현예에서, 제1 번역 단위체는 제1 쇄의 암호화 영역과 작동가능한 조합으로 제1 번역 개시 영역 (TIR)을 포함하고, 제2 번역 단위체는 제2쇄의 암호화 영역과 작동가능한 조합으로 제2 번역 개시 영역 (TIR)을 포함한다. 번역 개시 영역 (TIRs)은 원핵 숙주 세포에서 재조합 단백질의 번역에 주요함이 공지된다 (참고, 예를 들면, Simmons LC and Yansura DG 1996 Nat. Biotechnol. 14:629 및 Vimberg V et al. 2007 BMC Mol. Biol. 8:100). TIR은 번역 단위체의 번역 효율을 측정할 수 있다. TIR은 전형적으로 번역 단위체 특징 예컨대 개시 코돈, 샤인-달가르노 (SD) 서열, 및 번역 인핸서를 포함한다. TIR은 신호 펩티드를 암호화하는 분비 신호 서열을 추가로 포함할 수 있다. TIR의 특징 서열 및 간격은 번역 개시 효율을 조절할 수 있다.
일부 구현예에서, 제1 및 제2 TIR의 상대적 번역 강도는 약 1.0 내지 약 3.0이다. 2쇄 단백질의 각 쇄를 암호화한 번역 단위체를 포함하는 벡터가 본원에서 기재되고, 각 번역 단위체는 TIR을 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "번역 강도"는 번역 단위체의 번역을 통한 폴리펩티드의 생산을 지칭할 수 있다. 상기 생산은, 제한 없이 mRNA 번역, mRNA 안정성, mRNA에 대한 리보솜 결합의 효율, 및 그렇게 함으로써 암호화된 폴리펩티드의 접힘, 조립, 및/또는 전좌를 포함하여, 수많은 특징에 의존할 수 있다. 모든 실험적 TIR 및 대조 TIR이 동일한 조건하에 배양된 유사한 원핵 숙주 세포 (예를 들면, 동일한 속 및 종)에 의해 발현된 경우, 상대적 번역 강도는, 야생형 또는 대조 TIR을 갖는 번역 단위체에 의해 암호화된 폴리펩티드의 생산과 비교로, 특이적 또는 실험적 TIR을 갖는 번역 단위체에 의해 암호화된 폴리펩티드의 생산을 지칭할 수 있다. TIRs의 추가 설명은 미국 특허 번호 8,361,744에서 찾아질 수 있다.
재조합 폴리펩티드
본 개시내용의 특정 양태는 2쇄를 갖는 폴리펩티드의 생산 방법에 관한 것이다. 유리하게는, 본원에서 기재된 방법은 많은 상이한 유형의 단백질, 특히 이황화 결합을 갖는 것, 예컨대 상기 기재된 바와 같이 2쇄 단백질의 발현, 접힘 및 조립의 촉진에 유용할 수 있다. 특정한 2쇄 단백질은 아래 기재되고, 본원에서 기재된 방법은 비제한적으로 이들 특정한 구현예이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 2쇄 단백질은 1 초과의 상이한 폴리펩티드 쇄를 함유한 단백질을 포함할 수 있다. 본원에서 기재된 많은 구현예가 2개의 폴리펩티드 쇄를 갖는 2쇄 단백질을 포함하여도, 2 초과의 폴리펩티드 쇄 (예를 들면, 3 이상의 폴리펩티드)를 갖는 2쇄 단백질이 고려되고 본원에서 기재된 방법에 의해 생산될 수 있다. 상기 기재된 바와 같이, 만일 이들이 2개의 상이한 폴리펩티드 쇄 (예를 들면, 단일 쇄 항체, 단일 쇄 가변형 단편, 등등)이면 그대로 다르게는 결합하는 단일 폴리펩티드 쇄로 만들어진 2쇄 단백질은 또한 고려되고 본원에서 기재된 방법에 의해 생산될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 2쇄 폴리펩티드의 2쇄는 적어도 하나의 이황화 결합에 의해 서로에 연결된다. 이황화 결합은 2개 티올기를 연결하는 임의의 공유 결합을 지칭할 수 있다. 폴리펩티드에서 이황화 결합은 전형적으로 시스테인 잔기의 티올기 사이에서 형성한다. 폴리펩티드 이황화 결합은 많은 폴리펩티드, 예컨대 본 개시내용의 2쇄 단백질의 접힘 및 조립에 중요하다는 것이 당해 기술에 공지되어 있다. 폴리펩티드 이황화 결합은 단일 폴리펩티드 쇄내 시스테인 잔기 사이의 이황화 결합 (즉, 분자내 또는 쇄내 이황화 결합)을 포함할 수 있다. 폴리펩티드 이황화 결합은 별도 폴리펩티드 쇄상에서 발견된 시스테인 잔기 사이의 이황화 결합 (즉, 분자간 또는 쇄간 이황화 결합)을 또한 포함할 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 2쇄 폴리펩티드의 2쇄는 적어도 하나의 이황화 결합에 의해 서로 연결된다.
이황화 결합은 항체 및 항체 단편의 접힘 및 조립에 중요하다는 것이 당해 기술에 공지되어 있다. 상이한 항체 동위원소, 및 동위원소 내의 상이한 하위부류는 이황화 결합의 상이한 패턴을 소유하도록 공지된다. 예를 들어, IgG 항체는, 특정한 IgG 하위부류에 의존하여, 12개의 쇄내 이황화 결합, 각 경쇄와 그의 상응하는 중쇄 사이의 1개의 쇄간 이황화 결합, 및 중쇄 사이의 2 내지 11 쇄간 이황화 결합을 함유할 수 있다 (참고: 더욱 자세한 기술을 위하여, Liu H and May K 2012 MAbs. 4(1):17). IgM (참고, 예컨대, Wiersma EJ 및 Shulman MJ 1995 J. Immunol. 154(10):5265), IgE (참고, 예컨대, Helm BA et al. 1991 Eur. J. Immunol. 21(6):1543), IgA (참고, 예컨대, Chintalacharuvu KR et al. 2002 J. Immunol. 169(9):5072), 및 IgD (참고, 예컨대, Shin SU et al. 1992 Hum. Antibodies Hybridomas 3(2):65)는 접힘 및 조립 동안 이황화 결합을 형성하도록 또한 공지된다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 2쇄 폴리펩티드는 숙주 세포에 대해 이종성이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 숙주 세포에 참조로 사용될 때 이종성 폴리펩티드는, 즉, 숙주 세포가 자연으로부터 단리된 경우, 숙주 세포에서 내인성으로 발현되지 않은 임의의 폴리펩티드를 지칭할 수 있다. 이종성 폴리펩티드는 숙주 세포에 의해 내인성으로 발현될 수 있는 폴리펩티드를 또한 지칭할 수 있지만, 숙주 세포가 자연으로부터 단리된 경우보다 상이한 조절하에 발현된다. 상이한 조절의 예는, 예컨대 이종성 프로모터, 예컨대 유도성 프로모터의 사용에 의해, 제한 없이 발현의 상이한 양, 상이한 자극에 반응으로 발현, 또는 발현의 임의의 다른 변경된 맥락을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 2쇄 폴리펩티드는 이종이량체의 모노머이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 이종이량체는 작동가능한 연결로 2개의 상이한 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 착물을 함유하는 임의의 폴리펩티드 착물을 지칭할 수 있다. 이형이량체의 비-제한 예는 2개의 상이한 항체 모노머 (즉, 작동가능한 연결로 경쇄-중쇄 쌍)로 구성된 이중특이적 또는 2가 항체이다. 상기 예에서, 제1 항원을 인식한 제1 중쇄-경쇄 쌍의 접힘 및 조립은 제1 항체 모노머를 생산한다. 제2 항원을 인식한 제2 중쇄-경쇄 쌍의 접힘 및 조립은 제2 항체 모노머를 생산한다. 이들 모노머는 이종이량체를 형성하기 위해 (이중특이적 항체에 대해 더욱 상세히 아래 기재된) 당해 기술에서 공지된 임의의 수단으로 조립될 수 있다. 이종이량체 항체 형성의 예증적인 예에 관한 더욱 상세한 기술에 대하여, 다음을 참고한다: Ridgway JBB et al. 1996 Protein Eng. 9(7):617.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 2쇄 폴리펩티드는 제1 쇄 및 제2 쇄가 면역글로불린 중쇄 및 면역글로불린 경쇄를 나타내는 1가 항체이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 1가 항체는 중쇄-경쇄 쌍이 제2 중쇄-경쇄 쌍과 작동가능하게 연결되지 않은 중쇄-경쇄 쌍을 형성하기 위해 함께 작동가능하게 연결된 항체 중쇄 및 항체 경쇄로부터 제조된 임의의 폴리펩티드 착물을 지칭할 수 있다. 용어 "절반-항체 (hAb)"는 본원에서 교환가능하게 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 1가 항체는 항원을 특이적으로 결합할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 “이에 특이적으로 결합하는” 또는 “이에 특이적인”은, 표적 (즉, 및 항체 간의 결합과 같은 측정가능하고 재생가능한 상호작용을 지칭하며, 이는 생물학적 분자를 포함하는 분자의 이종성 집단의 존재 하에서의 표적의 존재에 대한 측정요인이다. 예를 들면, 표적 (에피토프일 수 있음)에 결합하거나, 또는 특이적으로 결합하는 항체는 다른 표적에 결합하는 것보다 더 큰 친화도, 결합능으로, 더욱 쉽게, 및/또는 더 긴 지속시간으로 상기 표적에 결합하는 항체이다. 일 구현예에서, 비관련 단백질에 대한 항체의 결합 정도는, 예를 들면, 방사면역검정법(RIA)으로 측정 시, 약 10% 미만의 항체의 결합이다. 특정 구현예에서, 표적에 특이적으로 결합하는 항체는 ≤ 1μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, 또는 ≤ 0.1 nM의 해리 상수 (Kd)를 갖는다. 특정 구현예에서, 항체는 상이한 종으로부터의 단백질 중에서 보존된 단백질의 에피토프에 결합한다. 또 다른 구현예에서, 특이적 결합은 필연적으로 (비록 포함할 수 있어도) 배타적인 결합을 요구하지 않는다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 2쇄 폴리펩티드는 분비성 단백질이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 분비성 단백질은 숙주 세포 주변세포질 또는 세포외 환경 속으로 숙주 세포에 의해 분비되는 임의의 단백질을 지칭할 수 있다. 분비성 단백질은 숙주 세포에 의해 내인성으로 분비되는 단백질일 수 있거나, 또는 분비성 단백질은 숙주 세포에 의해 내인성으로 분비되지 않은 단백질일 수 있지만 그의 분비를 촉진시키기 위해 그와 같은 방식으로 변형된다. 예를 들어, 폴리펩티드의 N-말단에서 전형적으로 발견된, 신호 서열의 존재는 분비를 위하여 분비 경로에 폴리펩티드를 유도할 수 있다. 수많은 신호 서열은 당해 기술에 공지되어 있고 분비 단백질의 분비 촉진 또는 숙주 세포에 의해 자연적으로 분비되지 않은 단백질의 분비 허용에 유용할 수 있다; 참고, 예를 들면, Picken et al., Infect. Immun. 42:269-275 (1983); Simmons and Yansura, Nature Biotechnology 14:629-634 (1996); 및 Humphreys DP et al. 2000 Protein Expr. Purif. 20(2):252. 신호 서열의 하나의 비-제한 예는 열 안정한 장독소 II (STII) 신호 서열이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 2쇄 폴리펩티드는 암에 대한 면역 가동화 단클론성 T 세포 수용체 (ImmTAC)이다. ImmTAC는, 가용성, 단클론성 T 세포 수용체 (TCR)와 항 CD3 단일 쇄 항체 단편 (또는 T 세포에 결합하고 T 세포 반응을 활성화시키는 유사 항체 단편)을 조합하는 융합 단백질을 지칭할 수 있다. 일부 구현예에서, ImmTAC의 가용성, 단클론성 TCR은, 가공되지 않은 TCR (예컨대, 천연 발생 TCR)의 항원에 대한 친화도와 비교하여, 특정 항원에 대한 증가된 친화도를 갖도록 가공될 수 있다. ImmTAC는 비제한적으로 하기를 포함하는 다수의 적용에 대해 사용될 수 있다: ImmTAC에 의하여 인식된 동원 항원을 제시하는, 세포, 예컨대 종양 세포에 대한 T 세포 반응의 활성화. 일부 구현예에서, 가용성 단클론성 TCR은 TCR 알파 쇄 가변 도메인 및 TCR 베타 쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 가용성 단클론성 TCR은 천연 또는 비 천연 이황화 결합에 의하여 연결된 TCR 알파 쇄 불변 도메인 및 TCR 베타 쇄 불변 도메인을 추가로 포함한다. ImmTAC의 더욱 구체적인 서술에 대하여, 예를 들어, 하기를 참고한다: 미국 특허 번호 7,569,664; Liddy et al., Nat. Med. 18:908-7 (2012); 및 Oates and Jakobsen, OncoImmunology 2:e22891 (2013).
일부 구현예에서, 본 개시내용의 분비성 단백질은 숙주 세포의 주변세포질로부터 회수된다. 주변세포질은 내부 또는 세포질 막과 그람-음성 박테리아성 세포의 외막 사이에서 공간을 지칭하기 위해 당해 기술에서 공지된다. 이론에 제한되도록 바램 없이, 주변세포질이 이황화 결합의 형성을 선호하는 산화 환경인 것이 고려된다. 따라서, 그의 적절하게 접혀진 및 조립된 구조의 일부로서 이황화 결합을 갖는 폴리펩티드 (예를 들면, 본 개시내용의 2쇄 단백질)를 주변세포질에 국소화하는 것이 유리할 수 있다 (참고: Schlapschy M et al. 2006 Protein Eng. Des. Sel. 19(8):385).
주변세포질성 단백질의 수많은 회수 방법은 당해 기술에 공지되어 있다. 주변세포질성 단백질의 대규모 정제의 하나의 비-제한 예는 유럽 특허 번호 EP1356052 B1 (참고, 예를 들면, 실시예 4)에 기재된다. 주변세포질성 단백질은 스페로블라스트 제조물로부터 주변세포질성 분획을 추출함으로써 회수될 수 있다 (참고, 예를 들면, Schlapschy M et al. 2006 Protein Eng. Des. Sel. 19(8):385). 일단 주변세포질성 추출물이 생성되면, 주변세포질성 단백질은 당해 기술에서 공지된 임의의 표준 단백질 정제 기술, 예컨대 친화성 정제, 크로마토그래피, 등등으로 정제될 수 있다.
항체
본원에서 기재된 2쇄 단백질은 당해 기술에서 공지된 임의의 적합한 기술에 의해 제조될 수 있다. 2쇄 단백질의 하나의 예시적 부류는 항체이다. 아래 기재된 바와 같이, 항체는 항체 생성을 위한 당해 기술에서 이용가능한 기술을 이용하여 제조되고, 이의 예시적 방법은 하기 섹션에서 더욱 상세히 기재된다. 당해 분야의 숙련가는 아래 기재된 많은 방법이 항체 이외의 2쇄 단백질에 적용될 수 있음을 인식할 것이다.
항체는 해당 항원 (예를 들면, 그리고 제한 없이, PD-L1 (예컨대 인간 PD-L1), HER2, 또는 CD3 (예컨대 인간 CD3), IL13, IL4, VEGFC, VEGFA, 및 VEGF)에 관련된다. 바람직하게는, 항원은 생물학적으로 중요한 폴리펩티드이고 장애를 앓는 포유동물에 항체의 투여는 그 포유동물에서 치료적 이점을 유발할 수 있다.
특정 구현예에서, 본원에서 제공된 항체는 ≤　1μM, ≤　150 nM, ≤　100 nM, ≤　50 nM, ≤　10 nM, ≤　1 nM, ≤　0.1 nM, ≤　0.01 nM, 또는 ≤　0.001 nM (예컨대 10-8 M 이하, 예컨대 10-8 M 내지 10-13 M, 예컨대, 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수 (Kd)를 갖는다.
일 양태에서, Kd는 하기의 검정에 의해 기재된 바와 같은 목적하는 항체의 Fab 버전 및 이의 항원과 함께 수행된 방사능표지된 항원 결합 검정(RIA)에 의해 측정된다. 항원에 대한 Fab의 용액 결합 친화도는 일련의 적정된 비표지된 항원의 존재하에 최소 농도의 (125I)-표지된 항원으로 Fab를 평형화시키고 이어서 결합된 항원을 항-Fab 항체 코팅된 플레이트로 포획함에 의해 측정된다 (예를 들어, 참고: Chen et al., J. Mol . Biol . 293:865-881(1999)). 검정용 조건을 수립하기 위해, MICROTITER® 다중-웰 플레이트 (Thermo Scientific)는 50 mM 탄산나트륨 (pH 9.6)에서 포착 항-Fab 항체 (Cappel Labs)의 5 μg/ml로 밤새 코팅되고, 그리고 그 뒤에 2 내지 5 시간동안 실온 (대략 23℃)에서 PBS내 2% (w/v) 소 혈청 알부민으로 차단된다. 비-흡착제 플레이트 (Nunc #269620)에서, 100 pM 또는 26 pM [125I]-항원은 해당 Fab의 연속 희석액과 혼합된다. 그 다음 해당 Fab는 밤새 항온처리되지만; 그러나, 항온처리는 평형이 달성됨을 식별하기 위해 더 오랜 기간 (예를 들면, 약 65 시간)동안 계속할 수 있다. 그 후에, 혼합물은 실온에서 (예를 들면, 1 시간 동안) 항온처리를 위해 포착 플레이트로 이동된다. 이어서, 상기 용액을 제거하고 플레이트는 PBS 중에서 0.1% 폴리소르베이트 20 (TWEEN-20®)으로 8회 세척하였다. 플레이트를 건조시키는 경우, 150 μl/웰의 섬광제 (MICROSCINT-20 TM; Packard)를 첨가하고 플레이트는 10분 동안 TOPCOUNT TM 감마 카운터 (Packard) 상에서 계수한다. 최대 결합의 20% 이하를 제공하는 각각의 Fab의 농도는 경쟁 결합 검정에 사용하기 위해 선택한다.
또 다른 구현예에 따라서, BIACORE®-2000 또는 BIACORE®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)을 이용한 검정은 ~10 반응 단위체 (RU)에서 고정된 항원 CM5 칩으로 25 ℃에서 수행된다. 간략하게, 카복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩(CM5, BIACORE, Inc.)은 이의 공급업체의 지침에 따라 N-에틸-N’-(3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드 하이드로클로라이드 (EDC) 및 N-하이드록시숙신이미드 (NHS)로 활성화시킨다. 항원은 pH 4.8, 10 mM 아세트산나트륨으로 5 μg/ml (0.2 μΜ) 까지 희석되고, 그 다음 5 μl/분의 유속으로 주입되어 커플링된 단백질의 대략 10 반응 단위체 (RU)를 달성한다. 항원 주사 후, 1 M 에탄올아민을 주사하여 미반응된 그룹을 차단시킨다. 역학적 측정을 위해, 2배 연속 희석된 Fab (0.78 nM 내지 500 nM)를 대략 25 μl/min의 유속으로 25°C 에서 PBS 중에서 0.05% 폴리소르베이트 20 (TWEEN-20TM) 계면활성제 (PBST)와 함께 사용한다. 결합율 (kon) 및 해리율 (koff)은 결합 및 해리 센서그램을 동시에 피팅함에 의해 단순한 1 대 1 랑무이르 결합 모델 (BIACORE ® 평가 소프트웨어 버젼 3.2)을 사용하여 계산한다. 평형 해리 상수 (Kd)는 비율 koff/kon로서 계산한다. 참고: 예를 들면, Chen et al., J. Mol. Biol . 293:865-881 (1999)). 만일 가역속도(on-rate)가 상기 표면 플라스몬 공명 검정에 의해 106 M- 1 s-1 를 초과하면, 분광기, 예컨대 정지-유동 구비된 분광광도계 (Aviv Instruments) 또는 교반된 큐벳을 갖춘 8000-시리즈 SLM-AMINCOTM 분광광도계 (ThermoSpectronic)에서 측정된 바와 같이 항원의 증가 농도의 존재하에 25 ℃에서 pH 7.2, PBS내 20 nM 항-항원 항체 (Fab 형태)의 형광 방출 세기 (여기 = 295 nm; 방출 = 340 nm, 16 nm 대역통과)에서의 증가 또는 감소를 측정하는 형광성 켄칭 기술을 이용함으로써 가역 속도는 측정될 수 있다.
(i) 항원 제조
다른 분자에 선택적으로 콘주게이트된, 가용성 항원 또는 이의 단편은 항체 생성용 면역원으로서 사용될 수 있다. 막투과성 분자, 예컨대 수용체에 대하여, 이들의 단편 (예를 들면 수용체의 세포외 도메인)은 면역원으로서 사용될 수 있다. 대안적으로, 막투과성 분자를 발현한 세포는 면역원으로서 사용될 수 있다. 상기 세포는 천연 공급원 (예를 들면 암 세포주)으로부터 유도될 수 있거나 또는 막투과성 분자를 발현시키기 위해 재조합 기술로 형질전환되는 세포일 수 있다. 항체 제조에 유용한 다른 항원 및 이의 형태는 당해 기술의 숙련가에 명백할 것이다.
(ii) 특정 항체-기반 방법
다클론성 항체는 관련된 항원 및 보조제의 다중 피하 (sc) 또는 복강내 (ip) 주사에 의해 동물에서 바람직하게는 상승된다. 면역화되기 위해 종에서 면역원성인 단백질, 예를 들면, 키홀 림펫 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 티로글로불린, 또는 이중작용성을 갖는 대두 트립신 저해제 또는 유도화제, 예를 들어, 말레이미도벤조일 설포석신이미드 에스테르 (시스테인 잔기를 통한 콘주게이트), N-하이드록시석신이미드 (라이신 잔기를 통한), 글루타르알데하이드, 석신산 무수물, SOCl2, 또는 R1N=C=NR (여기에서 R 및 R1은 상이한 알킬기이다)에 관련된 항원을 콘쥬게이션하는 것이 유용할 수 있다.
동물은, 예를 들면, (토끼 또는 마우스, 각각용) 100 μg 또는 5 μg의 단백질 또는 콘주게이트를 3 용적의 프로인트 완전 보조제와 조합 및 다중 부위에서 진피내로 용액 주사에 의해 항원, 면역원성 콘주게이트, 또는 유도체에 대해 면역화된다. 1 개월 후 동물은 다중 부위에서 피하 주사에 의해 프로인트 완전 보조제에서 펩티드 또는 콘주게이트의 최초 양의 1/5 내지 1/10로 부스팅된다. 7 내지 14 일 후 동물은 채혈되고 혈청은 항체 역가에 대하여 분석된다. 동물은 역가 안정기까지 부스팅된다. 바람직하게는, 동물은 동일한 항원의 콘주게이트로 부스팅되지만, 상이한 단백질에 및/또는 상이한 가교결합 시약을 통해 콘주게이트된다. 콘주게이트는 또한 단백질 융합으로서 재조합 세포 배양물에서 제조될 수 있다. 또한, 응집화 제제 예컨대 명반은 면역 반응을 향상시키기 위해 적합하게 사용된다.
본 개시내용의 단클론성 항체는 하기에 의하여 처음 기술된 하이브리도마 방법을 사용하여 제조될 수 있다: Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), (그리고 추가로 하기에 기술됨: 예를 들어, Hongo et al., Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981), 및 Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) (인간-인간 하이브리도마에 관한 것임). 추가의 방법은 예를 들어 다음의 문헌에 기재된 것들을 포함한다: 미국 특허 번호 7,189,826 (하이브리도마 세포주 유래의 단클론성 인간 천연 IgM 항체에 관한 것임). 인간 하이브리도마 기술 (Trioma technology)은 다음 문헌에 기재되어 있다: Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) and Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005). 일단 원하는 단클론성 항체가 하이브리도마로부터 단리되면, 이들을 암호화한 폴리뉴클레오티드는 원핵 발현 벡터로 아클론화될 수 있고, 항체는 본원에서 기재된 임의의 방법으로 원핵 숙주 세포에서 발현에 의해 생산될 수 있다.
(iii) 라이브러리-유도된 항체
본 개시내용의 항체는 목적하는 활성 또는 활성들을 갖는 항체에 대해 조합 라이브러리를 스크리닝함으로써 단리될 수 있다. 예를 들면, 파지 디스플레이 라이브러리를 생산하고 목적하는 결합 특징 예컨대 실시예 3에 기술된 방법을 갖는 항체에 대해 이러한 라이브러리를 스크리닝하기 위한 각종 방법들이 당업계에 공지되어 있다. 추가의 방법은 예를 들어, 하기에 검토되며: Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001) 추가로 하기에 검토된다: 예를 들어, the McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol . 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol . Biol . 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol . Biol . 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 101(34): 12467-12472 (2004); 및 Lee et al., J. Immunol . Methods 284(1-2): 119-132(2004).
일부 파아지 디스플레이 방법에서, VH 및 VL 유전자 레퍼토리는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 별도로 클로닝되고 파아지 라이브러리에서 무작위로 재조합되며, 이후 하기에 기술된 바와 같이 항원-결합 파아지에 대해 스크리닝될 수 있다: Winter et al., Ann. Rev. Immunol ., 12: 433-455 (1994). 파아지는 전형적으로 단일쇄 Fv (scFv) 단편 또는 Fab 단편으로서 항체 단편을 디스플레이한다. 면역화된 공급원으로부터의 라이브러리는 하이브리도마를 작제할 필요 없이 면역원에 대한 고친화성 항체를 제공한다. 대안적으로, 단순 레퍼토리는 (예를 들면, 인간으로부터) 클로닝되어 하기에 기재된 바와 같이 임의의 면역화 없이 광범위한 비-자가 및 또한 자가 항원에 항체의 단일 공급원을 제공할 수 있다: Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993). 최종적으로, 순수 라이브러리는 또한 줄기 세포로부터 비재배열된 V-유전자 분절을 클로닝하고 고도의 가변성 CDR3 영역을 암호하고 시험관내 재배열을 성취하기 위해 무작위 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용함에 의해 합성적으로 제조될 수 있고, 이는 다음 문헌에 기재된 바와 같다: Hoogenboom and Winter, J. Mol . Biol ., 227: 381:-388 (1992). 인간 항체 파아지 라이브러리를 기재하는 특허 공보는 예를 들어, 다음의 문헌을 포함한다: 미국 특허 번호 5,750,373, 및 미국 특허 공개 번호 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936, 및 2009/0002360.
인간 항체 라이브러리에서 단리된 항체 또는 항체 단편은 본원의 인간 항체 또는 인간 항체 절편으로 간주된다.
(iv) 키메라, 인간화, 및 인간 항체
특정 구현예에서, 본원에서 제공된 항체는 키메라성 항체이다. 특정 키메라성 항체는, 예를 들면 하기에 기재되어 있다: 미국 특허 번호 4,816,567 및 Morrison et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 81:6851-6855 (1984)). 일 예에서, 키메라 항체는 비-인간 가변 영역(예컨대, 마우스, 랫트, 햄스터, 토끼, 또는 비-인간 영장류, 예컨대 원숭이에서 유도된 가변 영역)과 인간 불변영역을 포함한다. 추가의 예에서, 키메라 항체는 부류 또는 하위부류가 모 항체의 부류로부터 변화된 “부류 스위칭된” 항체이다. 키메라 항체는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
특정 구현예에서, 키메라 항체는 인간화된 항체이다. 전형적으로, 비-인간 항체는 인간화되어 인간에 대한 면역원성이 감소되어 있고 모 비-인간 항체의 특이성 및 친화성을 보유한다. 일반적으로, 인간화 항체는, HVR, 예를 들면, CDR, (또는 그 일부)가 비인간 항체로부터 유도되고, FR (또는 그 일부)가 인간 항체 서열로부터 유도되는 하나 또는 그 초과 가변 도메인을 포함한다. 인간화된 항체는 임의로 또한 인간 불변 영역의 적어도 일부를 포함한다. 일부 양태에서, 인간화된 항체에서 일부 FR 잔기들은 예를 들어, 항체 특이성 또는 친화성을 복구하거나 개선시키기 위해 비-인간 항체 (예를 들어, HVR 잔기가 유래된 항체) 기원의 상응하는 잔기들로 치환된다.
인간화 항체 및 이의 제조 방법은, 예를 들면, 하기에 고찰되고: Almagro and Fransson, Front. Biosci . 13:1619-1633 (2008), 그리고 추가로 하기에 기재된다: 예를 들면, Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc . Nat'l Acad . Sci . USA 86:10029-10033 (1989); 미국 특허 번호 5, 821,337, 7,527,791, 6,982,321, 및 7,087,409; Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005) (하기를 기술: SDR (a-CDR) 그래프팅); Padlan, Mol . Immunol . 28:489-498 (1991) ("재표면화" 기재); Dall’Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) ("FR 셔플링" 기재); 및 Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) 및 Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (FR 셔플링에 대한 "유도된 선택" 접근법을 기재함).
인간화를 위해 사용될 수 있는 인간 프레임워크 영역은 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: “베스트-피트” 방법을 사용하여 선택된 프레임워크 영역 (참고: 예를 들어, Sims et al. J. Immunol . 151:2296 (1993)); 특정 서브그룹의 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 인간 항체의 공통 서열로부터 유래된 프레임워크 영역 (참고: 예를 들어, Carter et al. Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 89:4285 (1992); 및 Presta et al. J. Immunol ., 151:2623 (1993)); 인간 성숙(체세포적으로 돌연변이화된) 프레임워크 영역 또는 인간 생식계열 프레임워크 영역(예를 들면, 참고: Almagro and Fransson, Front. Biosci . 13:1619-1633 (2008)); 및 스크리닝 FR 라이브러리로부터 유래된 프레임워크 영역 (참고: 예를 들어, Baca et al., J. Biol . Chem. 272:10678-10684 (1997) 및 Rosok et al., J. Biol . Chem . 271:22611-22618 (1996)).
특정 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 인간 항체이다. 인간 항체는 당해기술에 공지된 다양한 기술을 이용하여 생산될 수 있다. 인간 항체는 일반적으로 다음 문헌에 기재되어 있다: van Dijk and van de Winkel, Curr . Opin . Pharmacol . 5: 368-74 (2001) 및 Lonberg, Curr . Opin . Immunol . 20:450-459 (2008)). 인간 항체는, 예를 들어 및 제한 없이, 본원에서 기재된 임의의 방법으로 원핵 발현 벡터로부터 원핵 숙주 세포에서 발현에 의해 제조될 수 있다.
인간 항체는 또한 인간-유래 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 도메인 서열을 단리함으로써 생성될 수 있다. 상기 가변 도메인 서열은 이어서 목적하는 인간 불변 도메인과 조합될 수 있다. 항체 라이브러리로부터 인간 항체를 선택하기 위한 기술은 하기에 기재되어 있다.
(v) 항체 단편
항체 단편은 전통적 수단, 예컨대 효소 소화로, 또는 재조합 기술로 생성될 수 있다. 특정 상황에서 전체의 항체보다는 항체 단편의 이점이 있다. 단편의 더 작은 크기는 급속 청소능을 허용하고, 고형 종양에 개선된 접근을 유발할 수 있다. 특정 항체 단편의 검토를 위해, 다음을 참고한다: Hudson et al. (2003) Nat. Med . 9:129-134.
항체 단편의 생산을 위하여 다양한 기술이 개발되었다. 전통적으로, 이들 단편은 무손상 항체의 단백분해 소화를 통해 유도되었다 (참고: 예를 들면, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992); 및 Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). 그러나, 이들 단편은 재조합 숙주 세포에 의해 직접적으로 이제 생산될 수 있다. Fab, Fv, 및 ScFv 항체 단편은 모두 이. 콜라이에서 발현되고 분비될 수 있으며, 이로써 이들의 단편들의 많은 양의 용이한 생산을 가능케한다. 항체 단편은 상기 고찰된 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 항체 단편은 항체 파지 라이브러리에서 단리될 수 있다. 대안적으로, Fab'-SH 단편은 대장균에서 직접 회수되고 화학적으로 커플링되어 F(ab')2 단편을 형성할 수 있다(Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). 또 다른 접근에 따르면, F(ab')2 단편은 재조합 숙주 세포 배양으로부터 직접 단리될 수 있다. 재이용 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하는 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')2 단편은 하기에 기재되어 있다: 미국 특허 번호 5,869,046. 항체 단편을 생산하기 위한 다른 기술은 당업자에게 명백할 것이다. 특정 구현예에서, 항체는 단일 쇄 Fv 단편 (scFv)이다. 참고 WO 93/16185; 미국 특허 번호 5,571,894 및 5,587,458. Fv 및 scFv는 불변 영역이 없는 무손상 결합 부위를 갖는 유일한 종이고; 따라서, 이들은 생체내 사용 동안 감소된 비특이적 결합에 적합할 수 있다. scFv 융합 단백질은 scFv의 아미노 또는 카복시 말단에서 효과기 단백질의 융합을 수득하기 위해 작제될 수 있다. 참고: Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, 상기. 항체 단편은 또한, 예를 들면, 미국 특허 번호 5,641,870에서, 예를 들어 기재된 바와 같이 "선형 항체"일 수 있다. 상기 선형 항체는 단일특이적 또는 이중특이적일 수 있다.
(vi) 다중특이적 항체
다중특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 에피토프에 결합 특이성을 갖고, 여기에서 에피토프는 보통 상이한 항원 유래의 것이다. 상기 분자가 정상적으로 2개의 상이한 에피토프 (즉 이중특이적 항체, BsAbs)를 단지 결합하는 반면, 추가의 특이성을 갖는 항체 예컨대 삼중특이적 항체는 본원에서 사용될 때 상기 발현에 의해 포함된다. 이중특이성 항체는 전장 항체 또는 항체 단편 (예컨대, F(ab’)2 이중특이적 항체)으로 제조될 수 있다.
이중특이적 항체를 제조하는 방법은 본 분야에 알려져 있다. 전장 이중특이적 항체의 전통적 생산은 두 면역글로불린 중쇄-경쇄 페어의 공동 발현에 근거하며, 여기서 두 쇄은 상이한 특이성을 갖는다(Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)). 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 집합으로 인하여, 이러한 하이브리도마 (4혼성체(quadroma))는 10개의 상이한 항체 분자의 잠재적 혼합물을 생산하며, 이중 오직 하나만이 정확한 이중특이적 구조를 갖는다. 보통 친화도 크로마토그래피 단계에 의하여 수행되는, 정확한 분자의 정제는 다소 번거롭고, 생성물 산출량은 낮다. 유사한 절차가 하기에 개시된다: WO 93/08829, 및 Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991).
이중특이적 항체 제조를 위한 당해 기술에 공지된 하나의 접근법은 "크놉-인투-홀" 또는 "돌출부-인투-공동" 접근법이다 (참고: 예를 들면, 미국 특허 번호 5,731,168). 상기 접근법에서, 2개의 면역글로불린 폴리펩티드 (예를 들면, 중쇄 폴리펩티드) 각각은 계면을 포함한다. 하나의 면역글로불린 폴리펩티드의 계면은 다른 면역글로불린 폴리펩티드 상에서 상응하는 계면과 상호작용하고, 그렇게 함으로써 2개 면역글로불린 폴리펩티드를 결합시킨다. 이들 계면은 하나의 면역글로불린 폴리펩티드의 계면에 위치한 "크놉" 또는 "돌출부" (이들 용어들은 본원에서 교환가능하게 사용될 수 있다)가 다른 면역글로불린 폴리펩티드의 계면에 위치한 "홀" 또는 "공동" (이들 용어들은 본원에서 교환가능하게 사용될 수 있다)과 상응하도록 가공될 수 있다. 일부 구현예에서, 홀은 크놉과 동일한 또는 유사한 크기이고, 2개의 계면가 상호작용하는 경우, 하나의 계면의 크놉이 다른 계면의 상응하는 홀에 위치할 수 있는 정도로 적합하게 배치된다. 이론에 제한되도록 바램 없이, 이종다량체를 안정화시키고 다른 종, 예를 들어 동종다량체보다 이종다량체의 형성을 선호한다고 생각된다. 일부 구현예에서, 상기 접근법은, 상이한 에피토프에 대하여 결합 특이성을 갖는 2개의 면역글로불린 폴리펩티드를 포함한 이중특이적 항체를 창출하는, 2개의 상이한 면역글로불린 폴리펩티드의 이종다량체화를 촉진시키기 위해 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 크놉은 작은 아미노산 측쇄를 더 큰 측쇄로 대체함으로써 작제될 수 있다. 일부 구현예에서, 홀은 큰 아미노산 측쇄를 더 작은 측쇄로 대체함으로써 작제될 수 있다. 크놉 또는 홀은 최초 계면에 존재할 수 있거나, 또는 이들은 합성으로 도입될 수 있다. 예를 들어, 크놉 또는 홀은 적어도 하나의 "최초" 아미노산 잔기를 적어도 하나의 "도입" 아미노산 잔기로 대체하기 위해 계면을 암호화한 핵산 서열을 변경함으로써 합성으로 도입될 수 있다. 핵산 서열의 변경 방법은 당해 기술에서 잘 알려진 표준 분자 생물학 기술을 포함할 수 있다. 다양한 아미노산 잔기의 측쇄 용적은 하기 표에 나타난다. 일부 구현예에서, 최초 잔기는 작은 측쇄 용적 (예를 들면, 알라닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글리신, 세린, 트레오닌, 또는 발린)을 갖고, 크놉(knob) 형성용 도입 잔기는 천연 발생 아미노산이고 아르기닌, 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 최초 잔기는 큰 측쇄 용적 (예를 들면, 아르기닌, 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판)을 가질 수 있고, 홀 형성용 도입 잔기는 천연 발생 아미노산이고 알라닌, 세린, 트레오닌, 및 발린을 포함할 수 있다.
표 1b. 아미노산 잔기의 특성
Figure 112017051998554-pct00003
a아미노산 분자량 - 물 분자량 값은 하기에서 유래됨: Handbook of Chemistry and Physics, 43rd ed. Cleveland, Chemical Rubber Publishing Co., 1961.
b값은 하기에서 유래됨: A.A. Zamyatnin, Prog. Biophys. Mol. Biol. 24:107-123, 1972.
c값은 하기에서 유래됨: C. Chothia, J. Mol. Biol. 105:1-14, 1975. 접근가능한 표면적은 이 참조문헌의 도 6 내지 20에서 정의된다.
일부 구현예에서, 크놉 또는 홀 형성용 최초 잔기는 이종다량체의 3-차원 구조에 기반하여 식별된다. 3-차원 구조를 수득하기 위하여 당해 기술에 공지된 기술은 X-선 측정학 및 NMR을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 계면은 면역글로불린 불변 도메인의 CH3 도메인이다. 이들 구현예에서, 인간 IgG1의 CH3/CH3 인터페이스는 4 항-평행한 β-가닥에 위치한 각 도메인 상에 16 잔기를 포함한다. 이론에 제한되도록 바램 없이, 돌연변이화된 잔기는 2개의 중심 항-평행한 β-가닥에 바람직하게는 위치하여 크놉이 파트너 CH3 도메인에서 보상성 홀 보다는 주위의 용매에 의해 수용될 수 있는 위험을 최소화시킨다. 일부 구현예에서, 2개의 면역글로불린 폴리펩티드에서 상응하는 크놉 및 홀을 형성한 돌연변이는 하기 표에서 제공된 하나 이상의 쌍에 상응한다.
표 2. 상응하는 크놉-및 홀-형성 돌연변이의 예시적 세트
Figure 112017051998554-pct00004
돌연변이는 최초 잔기, 그 다음 카밧 넘버링 시스템을 이용한 위치, 및 그 다음 도입 잔기에 의해 표시된다 (모든 잔기는 단일-문자 아미노산 코드로 주어진다). 다중 돌연변이는 결장(colon)에 의해 분리된다.
일부 구현예에서, 면역글로불린 폴리펩티드는 상기 표 2에서 열거된 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한 CH3 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 이중특이적 항체는 표 2의 왼쪽 칼럼에서 열거된 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한 CH3 도메인을 포함한 제1 면역글로불린 폴리펩티드, 및 표 2의 오른쪽 칼럼에서 열거된 하나 이상의 상응하는 아미노산 치환을 포함한 CH3 도메인을 포함한 제2 면역글로불린 폴리펩티드를 포함한다.
상기에서 논의된 바와 같이 DNA의 돌연변이 이후, 하나 이상의 상응하는 크놉- 또는 홀-형성 돌연변이를 갖는 변형된 면역글로불린 폴리펩티드를 암호화한 폴리뉴클레오티드는 당해 기술에서 공지된 표준 재조합 기술 및 세포 시스템을 이용하여 발현 및 정제될 수 있다. 참고: 예를 들어, 미국 특허 번호 5,731,168; 5,807,706; 5,821,333; 7,642,228; 7,695,936; 8,216,805; 미국 공보 번호 2013/0089553; 및 Spiess et al., Nature Biotechnology 31: 753-758, 2013. 변형된 면역글로불린 폴리펩티드는 원핵 숙주 세포, 예컨대 이. 콜라이를 이용하여 생산될 수 있다. 상응하는 크놉- 및 홀-보유 면역글로불린 폴리펩티드는 공-배양물내 숙주 세포에서 발현될 수 있고 헤테로다량체로서 함께 정제될 수 있거나, 또는 이들은 단일 배양물에서 발현, 별도로 정제, 및 시험관내 조립될 수 있다. 일부 구현예에서, 박테리아성 숙주 세포의 2개 균주 (하나는 크놉을 갖는 면역글로불린 폴리펩티드를 발현하고, 다른 것은 홀을 갖는 면역글로불린 폴리펩티드를 발현한다)는 당해 기술에서 공지된 표준 박테리아성 배양 기술을 이용하여 공-배양된다. 일부 구현예에서, 2개 균주는, 예를 들면, 배양물에서 동등한 발현 수준을 달성하기 위해 특이적 비로 혼합될 수 있다. 일부 구현예에서, 2개 균주는 50:50, 60:40, 또는 70:30 비로 혼합될 수 있다. 폴리펩티드 발현 이후, 세포는 함께 용해될 수 있고, 단백질은 추출될 수 있다. 호모-다량체 대 헤테로-다량체 종의 존재도 측정을 허용하는 당해 기술에서 공지된 표준 기술은 크기 배제 크로마토그래피를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 각 변형된 면역글로불린 폴리펩티드는 표준 재조합 기술을 이용하여 별도로 발현되고, 이들은 시험관내 함께 조립될 수 있다. 조립은, 예를 들어, 각 변형된 면역글로불린 폴리펩티드의 정제, 이들을 함께 동등한 질량으로 혼합 및 항온처리, 이황화 환원 (예를 들면, 디티오트레이톨로 처리), 농축, 및 폴리펩티드의 재산화에 의해 달성될 수 있다. 형성된 이중특이적 항체는 양이온-교환 크로마토그래피를 포함한 표준 기술을 이용하여 정제될 수 있고 크기 배제 크로마토그래피를 포함한 표준 기술을 이용하여 측정될 수 있다. 이들 방법의 더욱 상세한 설명에 대하여, 다음을 참고한다: Speiss et al., Nat Biotechnol 31:753-8, 2013. 일부 구현예에서, 변형 면역글로불린 폴리펩티드는 상기 기술된 방법을 사용하여 시험관내 조립되고, CHO 세포 내 개별적으로 발현될 수 있다.
상이한 접근에 따라, 원하는 결합 특이성을 갖는 항체 가변 도메인 (항체-항원 조합 부위)은 면역글로불린 불변 도메인 서열로 융합된다. 상기 융합은, 바람직하게는, 힌지, CH2, 및 CH3 영역의 적어도 일부를 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 갖는다. 융합의 적어도 1종에 존재하는, 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)을 갖는 것이 전형적이다. 면역글로불린 중쇄 융합 및, 원할 시 면역글로불린 경쇄를 암호화하는 DNA는 개별 발현 벡터에 삽입되고, 적절한 숙주 유기체에 공-형질감염된다. 이것은 작제물에서 사용된 3개의 폴리펩티드 쇄의 불균등 비가 최적의 수율을 제공하는 경우 구현예에서 3개의 폴리펩티드 단편의 상호 분율 조정에서 큰 가요성을 제공한다. 그러나, 균등 비에서 적어도 2 폴리펩티드 쇄의 발현이 고수율을 유발하는 경우 또는 비가 특정한 유의성이 없는 경우 한 발현 벡터에서 2 또는 모든 3개의 폴리펩티드 쇄에 대한 암호화 서열을 삽입하는 것이 가능하다.
일 구현예에서, 이중특이적 항체는 하나의 아암 내의 제1 결합 특이성을 갖는 혼성체 면역글로불린 중쇄 및 다른 아암 내의 혼성체 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍 (제2 결합 특이성을 제공)으로 구성된다. 이중특이적 분자의 오직 1/2 내의 면역글로불린 경쇄의 존재가 분리의 용이한 방법을 제공하므로, 이러한 비대칭 구조는 원치않는 면역글로불린 쇄 조합으로부터의 원하는 이중특이적 화합물의 분리를 촉진하는 것으로 발견되었다. 이러한 접근은 WO 94/04690에 개시된다. 이중특이적 항체 생성의 추가적인 세부사항에 대해서는, 예를 들어, 하기를 참조한다: Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986).
WO96/27011에 기술된 또 다른 접근에 따르면, 항체 분자 쌍 간의 계면은 재조합 세포 배양으로부터 회수되는 이종이량체 백분율을 최대화하기 위해 가공될 수 있다. 일 계면은 항체 불변 도메인의 CH3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 상기 방법에서, 제1 항체 분자 계면으로부터 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄가 더 큰 측쇄(예로, 티로신 또는 트립토판)로 대체된다. 큰 아미노산 측쇄를 작은 것(예로, 알라닌 또는 트레오닌)으로 대체하여 큰 측쇄(들)에 대해 동일하거나 유사한 크기의 보상적 "내강"이 제2 항체 분자의 계면 상에 생성된다. 이는 동종이량체와 같은 다른 원치 않는 최종 산물에 비해 이종이량체 수율을 증가시키기 위한 기전을 제공한다.
이중특이적 항체에는 가교결합되거나, "이종콘주게이트" 항체가 포함된다. 예를 들어, 이종콘주게이트의 하나의 항체는 애비딘에, 다른 하나는 바이오틴에 결합될 수 있다. 그러한 항체는, 예를 들어, 면역계 세포를 원치 않는 세포로 표적화하는데 제안되어 왔다 (미국 특허 번호 4,676,980), 및 HIV 감염의 치료에 대하여 (WO 91/00360, WO 92/200373, 및 EP 03089). 이종콘주게이트 항체는 임의의 편리한 가교결합 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 적합한 가교결합 제제 및 기술은 당해기술에서 잘 알려지고, 그리고 미국 특허 번호 4,676,980에 기재된다 (다수의 가교결합 기술과 함께).
항체 단편으로부터 이중특이적 항체를 생성하기 위한 기술은 또한 하기 문헌에 기술되어 있다. 예를 들면, 이중특이적 항체는 화학적 연결을 사용하여 제조될 수 있다. [Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)]은 무손상 항체가 F(ab’)2 단편을 생성하기 위하여 단백질가수분해적으로 절단되는 절차를 기술한다. 이러한 단편은 이웃한 디티올을 안정화하고 분자간 이황화 형성을 방지하기 위하여 디티올 복합화제 아비산나트륨의 존재 하에서 환원된다. 생성된 Fab’ 단편은 이후 티오니트로벤조에이트 (TNB) 유도체로 전환된다. Fab’-TNB 유도체 중 하나는 이후 메르캅토에틸아민으로의 환원에 의하여 Fab’-티올로 재전환되고, 기타 Fab’-TNB 유도체의 등몰량으로 혼합되어 이중특이적 항체를 형성한다. 생성된 이중특이적 항체는 효소의 선택적 고정화를 위한 제제로서 사용될 수 있다.
최근 발전은 이. 콜라이로부터 Fab'-SH 단편의 직접적인 회수를 용이하게 하였고, 이는 이중특이적 항체를 형성하기 위해 화학적으로 커플링될 수 있다. Shalaby et al., J. Exp . Med ., 175: 217-225 (1992)는 완전히 인간화된 이중특이적 항체 F(ab’)2 분자의 생산을 기술한다. 각 Fab’ 단편은 이. 콜라이로부터 개별 분비되고, 시험관내에서 화학적으로 커플링 지시되어 이중특이적 항체를 형성하였다.
재조합 세포 배양물로부터 직접 유래한 이중특이적 항체 단편을 제조하고 단리하는 다양한 기술이 또한 기술되었다. 예를 들면, 이중특이적 항체는 류신 지퍼를 사용하여 생산되었다. Kostelny et al., J. Immunol ., 148(5):1547-1553 (1992). Fos 및 Jun 단백질 유래의 류신 지퍼 펩티드는 유전자 융합에 의한 2개의 상이한 항체의 Fab’ 부분에 연결되었다. 항체 동종이량체는 힌지 영역에서 환원되어 모노머를 형성하고, 이후 재-산화되어 항체 이종이량체를 형성하였다. 이러한 방법이 또한 항체 동종이량체의 생산을 위하여 이용될 수 있다. “디아바디” 기술은 하기에 의하여 기술되며: Hollinger et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 90:6444-6448 (1993), 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위한 대안적 기전을 제공하였다. 단편은 동일한 쇄 상의 두 도메인 간 페어링을 허용하기에는 너무 짧은 링커에 의해 경쇄 가변 도메인 (VL) 과 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH) 을 포함한다. 따라서, 한 단편의 VH 및 VL 도메인이 또 다른 단편의 상보적 VH 및 VL 도메인과 페어링하도록 유도되어 두 항원-결합 부위를 형성한다. 단일쇄 Fv (sFv) 이량체의 사용에 의한, 이중특이적 항체 단편의 제조를 위한 기타 전략이 또한 보고되었다. 참고: Gruber et al, J. Immunol, 152:5368 (1994).
이중특이적 항체 단편 제조를 위한 또 다른 기술은 "이중특이적 T 세포 연관체" 또는 BiTE® 접근법이다 (참고, 예를 들면, WO2004/106381, WO2005/061547, WO2007/042261, 및 WO2008/119567). 상기 접근법은 단일 폴리펩티드상에 배열된 2개 항체 가변 도메인을 사용한다. 예를 들어, 단일 폴리펩티드 쇄는 2 단일 쇄 Fv (scFv) 단편을 포함하고, 각각은 2개 도메인 사이에서 분자내 회합을 허용하기에 충분한 길이의 폴리펩티드 링커에 의해 분리된 가변형 중쇄 (VH) 및 가변형 경쇄 (VL) 도메인을 갖는다. 상기 단일 폴리펩티드는 추가로 2개 scFv 단편 사이에서 폴리펩티드 스페이서 서열을 포함한다. 각 scFv는 상이한 에피토프를 인식하고, 이들 에피토프는 상이한 세포 유형에 특이적일 수 있어서, 이로써 각 scFv가 그의 동족 에피토프와 연관되는 경우 2개의 상이한 세포 유형의 세포가 근접해서 접촉되거나 또는 묶여진다. 상기 접근법의 하나의 특정한 구현예는, 표적 세포, 예컨대 악성 또는 종양 세포에 의해 발현된 세포-표면 항원을 인식하는 또 다른 scFv에 연결된, 면역 세포에 의해 발현된 세포-표면 항원, 예를 들면, T 세포상의 CD3 폴리펩티드를 인식한 scFv를 포함한다.
단일 폴리펩티드임에 따라, 이중특이적 T 세포 연관체는 당해 기술에서 공지된 임의의 원핵 세포 발현계을 이용하여 발현될 수 있다. 그러나, 특이적 정제 기술 (참고, 예를 들면, EP1691833)은, 모노머의 의도된 활성 이외의 생물학적 활성을 가질 수 있는, 다른 다량체 종으로부터 모노머성 이중특이적 T 세포 연관체를 분리하는데 필요할 수 있다. 하나의 예시적 정제 반응식에서, 분비된 폴리펩티드를 함유한 용액은 먼저 금속 친화성 크로마토그래피 처리되고, 폴리펩티드는 이미다졸 농도의 구배로 용출된다. 상기 용출물은 음이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 추가로 정제되고, 폴리펩티드는 염화나트륨 농도의 구배로 이용하여 용출된다. 마지막으로, 상기 용출물은 크기 배제 크로마토그래피 처리되어 다량체 종으로부터 모노머를 분리시킨다.
2 초과의 원자가를 갖는 항체가 고려된다. 예를 들어, 삼중특이적 항체가 제조될 수 있다. Tuft et al. J. Immunol . 147: 60 (1991).
일부 구현예에서, 2쇄 단백질은 다중특이적 항체 또는 이중특이적 항체의 일부이다. 다중특이적 항체 또는 이중특이적 항체는 본 개시내용의 2 이상의 1가 항체를 함유할 수 있다.
일부 구현예에서, 이중특이적 항체의 제1 항원 결합 도메인은 하나 이상의 중쇄 불변 도메인을 포함하고, 여기에서 하나 이상의 중쇄 불변 도메인은 제1 CH1 (CH1 1 ) 도메인, 제1 CH2 (CH2 1 ) 도메인, 제1 CH3 (CH3 1 ) 도메인으로부터 선택되고; 이중특이적 항체의 제2 항원 결합 도메인은 하나 이상의 중쇄 불변 도메인을 포함하고, 여기에서 하나 이상의 중쇄 불변 도메인은 제2 CH1 (CH1 2 ) 도메인, 제2 CH2 (CH2 2 ) 도메인, 및 제2 CH3 (CH3 2 ) 도메인으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 제1 항원 결합 도메인의 하나 이상의 중쇄 불변 도메인의 적어도 하나는 제2 항원 결합 도메인의 또 다른 중쇄 불변 도메인과 쌍으로 된다. 일부 구현예에서, CH31 및 CH32 도메인 각각은 돌출부 또는 공동을 포함하고, 여기에서 CH31 도메인에서 돌출부 또는 공동은 CH32 도메인에서 공동 또는 돌출부, 각각에서 위치할 수 있다. 일부 구현예에서, CH31 및 CH32 도메인은 상기 돌출부 및 공동 사이의 계면에서 대면한다. CH31 및 CH32 도메인에서 아미노산 치환의 예시적인 세트는 본원에서 표 2에 보여진다. 일부 구현예에서, CH21 및 CH22 도메인 각각은 돌출부 또는 공동을 포함하고, 여기에서 CH21 도메인에서 돌출부 또는 공동은 CH22 도메인에서 공동 또는 돌출부, 각각에서 위치할 수 있다. 일부 구현예에서, CH21 및 CH22 도메인은 상기 돌출부 및 공동 사이의 계면에서 대면한다. 일부 구현예에서, IgG의 CH31 및/또는 CH32 도메인은 하기에서 보이는 바와 같이 아미노산 넘버링에 따라 347, 349, 350, 351, 366, 368, 370, 392, 394, 395, 398, 399, 405, 407, 및 409로 이루어진 군으로부터 선택된 잔기에서 하나 이상의 아미노산 치환을 함유한다: 도 5 (미국 특허 번호 8,216,805). 일부 구현예에서, 돌출부는 아르기닌 (R) 잔기, 페닐알라닌 (F) 잔기, 티로신 (Y) 잔기, 및 트립토판 (W) 잔기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 도입된 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 공동은 알라닌 (A) 잔기, 세린 (S) 잔기, 트레오닌 (T) 잔기, 및 발린 (V) 잔기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 도입된 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, CH3 및/또는 CH2 도메인은 IgG (예를 들면, IgG1 하위유형, IgG2 하위유형, IgG2A 하위유형, IgG2B 하위유형, IgG3, 하위유형, 또는 IgG4 하위유형)유래의 것이다. 일부 구현예에서, 이중특이적 항체의 하나의 CH3 도메인은 아미노산 치환 T366Y를 포함하고, 다른 CH3 도메인은 아미노산 치환 Y407T를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나의 CH3 도메인은 아미노산 치환 T366W를 포함하고, 다른 CH3 도메인은 아미노산 치환 Y407A를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나의 CH3 도메인은 아미노산 치환 F405A를 포함하고, 다른 CH3 도메인은 아미노산 치환 T394W를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나의 CH3 도메인은 아미노산 치환 T366Y 및 F405A를 포함하고, 다른 CH3 도메인은 아미노산 치환 T394W 및 Y407T를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나의 CH3 도메인은 아미노산 치환 T366W 및 F405W를 포함하고, 다른 CH3 도메인은 아미노산 치환 T394S 및 Y407A를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나의 CH3 도메인은 아미노산 치환 F405W 및 Y407A를 포함하고, 다른 CH3 도메인은 아미노산 치환 T366W 및 T394S를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나의 CH3 도메인은 아미노산 치환 F405W를 포함하고, 다른 CH3 도메인은 아미노산 치환 T394S를 포함한다. 돌연변이는 최초 잔기, 그 다음 카밧 넘버링 시스템을 이용한 위치, 및 그 다음 도입 잔기에 의해 표시된다. 또한, 참고: 하기에서의 넘버링: 도 5 (미국 특허 번호 8,216,805).
(vii) 단일-도메인 항체
일부 구현예에서, 본 개시내용의 항체는 단일-도메인 항체이다. 단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부 또는 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 특정 구현예에서, 단일-부위 항체는 인간 단일-부위 항체(Domantis, Inc., Waltham, Mass.; 참고: 예컨대, 미국 특허 번호 6,248,516 B1). 하나의 구현예에서, 단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 모두 또는 일부로 이루어진다.
(viii) 항체 변이체
일부 구현예에서, 본원에 제공되는 항체의 아미노산 서열 변형이 고려된다. 예를 들어, 상기 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성들을 향상시키는 것이 바람직한 일일 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 상기 항체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 적절할 변화를 도입시킴으로써, 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들면, 항체의 아미노산 서열 내의 잔기의 결실, 및/또는 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 최종 작제물에 도달하도록 결실, 삽입, 및 치환의 임의의 조합이 이루어질 수 있으며, 단 최종 작제물은 목적하는 특징, 예컨대, 항원-결합을 가져야 한다. 아미노산 변경은 서열이 만들어지는 시간에서 대상체 항체 아미노산 서열에 도입될 수 있다.
(ix) 치환, 삽입 및 결실 변이체
특정 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 항체 변이체가 제공된다. 치환적 돌연변이 유발을 위한 목적하는 부위는 HVR 및 FR을 포함한다. 보존적 치환은 "보존적 치환"의 제목하에 표 1에서 보여준다. 보다 실질적 변화는 "예시적 치환"의 표제하에 표 1에 제공되고, 추가로 아미노산 측쇄 부류를 참조로 하기에 기재된 바와 같다. 아미노산 치환은 목적하는 활성, 예컨대, 보유된/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성, 또는 개선된 ADCC 또는 CDC를 위해 선별된 제품 및 관심 항체에 도입될 수 있다.
표 3. 예시적인 치환
Figure 112017051998554-pct00005
아미노산은 통상의 측쇄 성질에 따라 분류될 수 있다:
a. 소수성 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
b. 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
c. 산성: Asp, Glu;
d. 염기성: His, Lys, Arg;
e. 쇄 배향에 영향을 주는 잔기: Gly, Pro;
f. 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존적 치환은 이들 부류 중의 하나의 구성원을 다른 부류로 교체함을 수반할 것이다.
치환형 변이체의 한 유형은 모 항체 (예를 들면 인간화 또는 인간 항체)의 하나 또는 그 초과 초가변 영역 잔기의 치환을 포함한다. 일반적으로, 추가의 연구를 위해 선택되는 생성된 변이체(들)는 친계 항체에 비해 특정 생물학적 특성(예컨대, 증가된 친화도, 감소된 면역원성)에 있어서 변형(예컨대, 개선)을 갖고/갖거나 친계 항체의 특정 생물학적 특성을 실질적으로 보유할 것이다. 예시적인 치환 변이체는 친화도 성숙 항체이며, 이것은, 예를 들면, 본원에 기재된 바와 같은 파지 디스플레이-기반 친화도 성숙 기술을 사용하여 통상적으로 생성될 수 있다. 간단히, 하나 또는 그 초과 HVR 잔기는 돌연변이되고 파아지에서 변이체 항체 표시되고 특정한 생물학적 활성 (예를 들면, 결합 친화도)을 위해 스크리닝된다.
변형(예컨대, 치환)은 HVR에서, 예컨대, 항체 친화도를 개선시키기 위해 이루어질 수 있다. 상기 변경은 HVR "핫스팟," 즉, 체세포 성숙 공정 동안 높은 빈도로 돌연변이하는 코돈에 의해 암호화된 잔기 (참고, 예를 들면, Chowdhury, Methods Mol . Biol. 207:179-196 (2008)), 및/또는 항원을 접촉하는 잔기에 의해 실시될 수 있고, 수득한 변이체 VH 또는 VL은 결합 친화도에 대해 시험된다. 2차 라이브러리로부터 작제하고 재선택함에 의한 친화성 성숙화가 예를 들어, 다음 문헌에 기재되어 있다: Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)). 친화성 성숙화의 일부 양태에서, 다양성이 임의의 다양한 방법 (예를 들어, 오류 발생 경향 PCR, 쇄 셔플링 또는 올리고뉴클레오티드 지시된 돌연변이유발)에 의한 성숙화를 위해 선택되는 가변 유전자에 도입된다. 이후 2차 라이브러리가 형성된다. 이후 라이브러리를 스크리닝하여 목적하는 친화도를 갖는 임의의 항체 변이체를 식별한다. 다양성을 도입하는 또 다른 방법은 HVR-지시된 접근법을 포함하며, 여기서 몇몇 HVR 잔기(예컨대, 한번에 4-6개 잔기)가 무작위화된다. 항원 결합에 관련된 HVR 잔기는 특히, 예컨대, 알라닌 주사 돌연변이유발(alanine scanning mutagenesis) 또는 모델링을 사용하여 식별할 수 있다. 특히, CDR-H3 및 CDR-L3이 흔히 표적화된다.
특정 구현예에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 이러한 변형이 항체가 항원에 결합하는 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한 하나 이상의 HVR 내에서 일어날 수 있다. 예를 들어, 결합 친화도를 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변형 (예를 들어, 본원에 제공된 바와 같은 보존적 치환)이 HVR에 수행될 수 있다. 상기 변형은 HVR “핫스팟” 또는 SDR의 외부에 있을 수 있다. 상기 제공된 변이체 VH 및 VL 서열의 특정 구현예에서, 각각의 HVR는 변형되지 않거나, 또는 하나 이상, 두 개 또는 세 개의 아미노산 치환을 함유하지 않는다.
돌연변이유발을 위해 표적화될 수 있는 항체의 잔기들 또는 영역들의 동정을 위해 유용한 방법은다음 문헌에 기재된 바와 같이 “알라닌 스캐닝 돌연변이유발”로 불리운다: Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085. 이 방법에서는, 표적 잔기들(예컨대, arg, asp, his, lys, 및 glu와 같은 하전된 잔기)의 잔기 또는 그룹을 동정하고 중성 또는 음으로 하전된 아미노산(예컨대, 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 대체하여 항체와 항원의 상호작용이 영향을 받는지를 측정한다. 추가의 치환은 초기 치환에 대한 기능적 감도를 입증하는 아미노산 위치에서 도입될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 항체와 항원 간의 접촉 지점을 식별하기 위한 항원-항체 착물의 측정 구조. 상기 접촉 잔기 및 인접 잔기가 치환을 위한 후보물질로서 표적화되거나 제거될 수 있다. 변이체는 이들이 목적하는 특성을 함유하는지 측정하기 위해 스크리닝될 수 있다.
아미노산 서열 삽입은 1 잔기 내지 100 이상 잔기를 함유하는 폴리펩티드 길이 범위의 아미노- 및/또는 카복실-말단 융합, 뿐만 아니라 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열간 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 항체 분자의 또 다른 삽입 변이체는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드 또는 효소(예컨대, ADEPT에 대한)에 대한 항체의 N- 또는 C-말단에 융합을 포함한다.
(x) Fc 영역 변이체
특정 구현예에서, 1종 이상의 아미노산 변형은 본 명세서에서 제공된 항체의 Fc 영역 안으로 도입될 수 있고, 그렇게 함으로써 Fc 영역 변이체를 생성한다. Fc 영역 변이체는 1종 이상의 아미노산 위치에 아미노산 변형 (예를 들면 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열 (예를 들면, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 본 개시내용은 생체내 항체의 반감기가 여전히 어떤 효과기 기능 (예컨대 보체 및 ADCC)이 중요한 적용에 대해 바람직한 후보자에 불필요한 또는 유해하게 하는, 모든 효과기 기능은 아니지만 일부를 보유하는 항체 변이체를 고려한다. 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 검정은 CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/감손을 식별하기 위해 수행될 수 있다. 예를 들면, Fc 수용체 (FcR) 결합 검정은 항체가 FcγR 결합이 부족하지만 (따라서 유사하게 ADCC 활성 부족), FcRn 결합 능력을 보유하는 것을 확보하기 위해 수행될 수 있다. ADCC, NK 세포 매개용 1차 세포는 Fc(RIII 만을 발현하고, 반면에 단핵구는 Fc(RI, Fc(RII 및 Fc(RIII을 발현한다. 조혈 세포상의 FcR 발현은 다음 문헌의 464 페이지 상의 표 3에 요약되어 있다: Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol . 9:457-492 (1991)). 해당 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 검정의 비-제한적인 예는 하기에 기재된다: 미국 특허 번호 5,500,362 (참고, 예를 들면 Hellstrom, I. et al. Proc . Nat'l Acad. Sci . USA 83:7059-7063 (1986)) 및 Hellstrom, I et al., Proc . Nat'l Acad . Sci. USA 82:1499-1502 (1985); 5,821,337 (참고: Bruggemann, M. et al., J. Exp . Med. 166:1351-1361 (1987)). 대안적으로, 하기와 같은 비-방사능활성 검정 방법이 사용될 수 있다: 예를 들어, 유동 세포측정을 위한 ACTI™ 비-방사능활성 세포독성 검정 (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA); 및 CytoTox 96® 비 방사성 세포독성 검정 (Promega, Madison, WI). 그와 같은 분석을 위해 유용한 효과기 세포에는 말초 혈액 단핵구(PBMC) 및 자연 살해(NK) 세포가 포함된다. 대안적으로, 또는 부가적으로, 관심 분자의 ADCC 활성은 하기와 같이 생체내 평가된다: 예를 들면, 하기에 기술된 바와 같은 동물 모델: Clynes et al. Proc . Nat'l Acad . Sci . USA 95:652-656 (1998). C1q 결합 검정은 또한 항체가 C1q를 결합할 수 없음에 따라서 CDC 활성이 부재임을 식별하기 위해 수행될 수 있다. 참고: 예를 들면, WO 2006/029879 및 WO 2005/100402에서 C1q 및 C3c 결합 ELISA. 보체 활성화를 평가하기 위해, CDC 검정이 수행될 수 있다 (참고: 예를 들면, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol . Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003); 및 Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)). FcRn 결합 및 생체내 청소능/반감기 측정은 또한 당해분야에서 공지된 방법을 이용하여 수행될 수 있다 (참고: 예를 들면, Petkova, S.B. et al., Int ’l. Immunol . 18(12):1759-1769 (2006)).
감소된 효과기 기능을 갖는 항체는 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상의 치환을 갖는 것을 포함한다 (미국 특허 번호 6,737,056). 상기 Fc 돌연변이체는, 알라닌에 대해 잔기 265 및 297의 치환을 갖는 소위 "DANA" Fc 돌연변이체를 포함하여, 2 또는 그 초과의 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327에서 치환을 갖는 Fc 돌연변이체를 포함한다 (미국 특허 번호 7,332,581).
FcRs로의 개선되거나 감소된 결합을 갖는 특정 항체 변이체가 기재되어 있다. (예를 들어, 하기 참고: 미국 특허 번호 6,737,056; WO 2004/056312, 및 Shields et al., J. Biol . Chem . 9(2): 6591-6604 (2001).)
특정 구현예에서, 항체 변이체는 ADCC를 향상시키는 하나 이상의 아미노산 치환, 예컨대, Fc 영역의 위치 298, 333 및/또는 334에서의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다 (잔기의 EU 넘버링). 예시적 구현예에서, 이의 Fc 영역에서 하기 아미노산 치환을 포함한 항체: S298A, E333A, 및 K334A.
일부 구현예에서, 변경은 예를 들어 하기에 기술된 바와 같이, 변경된 (즉, 개선되거나 감소된) C1q 결합 및/또는 보체 의존적 세포독성 (CDC)을 유발하는 Fc 영역 내에서 제조된다: 미국 특허 번호 6,194,551, WO　99/51642, 및 Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).
증가된 반감기 및 태아로의 모체 IgG의 이동에 원인으로 작용하는, 신생아 Fc 수용체 (FcRn)로의 개선된 결합을 갖는 항체 (Guyer et al., J. Immunol . 117:587 (1976) 및 Kim et al., J. Immunol . 24:249 (1994))가 US2005/0014934A1 (Hinton et al.))에 기재되어 있다. 상기 항체는 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합을 개선하는 그안에 하나 또는 그 초과 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 상기 Fc 변이체는 Fc 영역 잔기: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434의 하나 이상에서 치환, 예를 들면, Fc 영역 잔기 434의 치환을 갖는 것을 포함한다 (미국 특허 번호 7,371,826). Fc 영역 변이체의 다른 예에 관하여 또한 하기 참고: Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); 미국 특허 번호 5,648,260; 미국 특허 번호 5,624,821; 및 WO 94/29351.
(xi) 항체 유도체
개시내용의 항체는 당해 기술에 공지되어 있고 및 쉽게 이용가능한 추가의 비단백질성 모이어티를 함유하기 위해 추가로 변형될 수 있다. 특정 구현예에서, 항체의 유도체화에 적합한 모이어티는 수용성 폴리머이다. 수용성 중합체의 비제한적인 예는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산(단독중합체 또는 랜덤 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에톡시화 폴리올(예컨대, 글리세롤), 폴리비닐 알콜, 및 이들의 혼합물을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드가 수중 안정성으로 인해 제조시 이점을 가질 수 있다. 폴리머는 임의의 분자량일 수 있고, 그리고 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 항체에 부착된 폴리머의 수는 다양할 수 있고, 만일 1 초과 폴리머가 부착되면, 이들은 동일 또는 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용된 폴리머의 수 및/또는 유형은, 만일 항체 유도체가 한정된 조건하에서의 요법 등에서 사용된다면, 비제한적으로, 개선되는 항체의 특정한 특성 또는 기능을 포함하는 고려사항에 기반하여 측정될 수 있다.
(xii) 벡터, 숙주 세포 및 재조합 방법
항체는 재조합 방법을 이용하여 또한 생산될 수 있다. 항-항원 항체의 재조합 생산을 위해, 항체를 암호화하는 핵산을 단리하고 추가의 클로닝 (DNA의 증폭) 또는 발현을 위해 복제가능한 벡터 내로 삽입한다. 항체를 암호화하는 DNA는 쉽게 단리되고 (예를 들면, 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 종래의 절차를 사용하여 서열분석될 수 있다. 많은 벡터가 이용가능하다. 벡터 성분은 일반적으로, 비제한적으로, 하기 중 하나 또는 그 초과를 포함한다: 신호 서열, 복제 기원, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터 및 전사 종료 서열.
(a) 신호 서열 성분
본 개시내용의 항체는 직접적으로 뿐만 아니라 이종 폴리펩티드와 함께 융합 폴리펩티드로서 재조합으로 생산될 수 있으며, 상기 이종 펩티드는 바람직하게 신호 서열, 또는 성숙 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에 특이적 절단 부위를 갖는 다른 폴리펩티드이다. 선택된 이종 신호 서열은 바람직하게는 숙주 세포에 의해 인식되고 처리되는 (예를 들면, 신호 펩티다아제에 의해 절단되는) 것이다. 천연 항체 신호 서열을 인지하고 처리하지 못하는 원핵 숙주 세포의 경우, 신호 서열은, 예를 들면, 알칼리성 포스파타제, 페니실리나제, lpp, 또는 열안정성 장독소 II 리더의 그룹으로부터 선택된 원핵 신호 서열로 치환된다.
(b) 복제 기점
모든 발현 및 클로닝 벡터는 벡터를 하나 이상의 선택된 숙주 세포를 복제하게 할 수 있는 핵산 서열을 함유한다. 일반적으로, 클로닝 벡터에서 상기 서열은 백터를 숙주 염색체 DNA와 별개로 복제하게 할 수 있는 것이고, 복제의 기원 또는 자율적으로 복제 서열을 포함한다. 상기 서열은 다양한 원핵 숙주 세포로 잘 알려진다. 예를 들어, 플라스미드 pBR322로부터 복제 기점은 대부분의 그람-음성 박테리아에 적합하다.
(c) 선택 유전자 성분
발현 및 클로닝 벡터는 선택 유전자, 또한 일명 선택가능한 마커를 함유할 수 있다. 전형적인 선택 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들면, 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트, 또는 테트라사이클린에 내성을 부여하는, (b) 영양요구성 결핍을 보완하는, 또는 (c) 착물 배지, 예를 들면, 바실러스용 유전자 암호화 D-알라닌 라세마제로부터 이용불가능한 측정적 영양소를 공급하는 단백질을 암호화한다.
선택 반응식의 하나의 예는 숙주 세포의 성장을 억제하기 위해 약물을 이용한다. 이종성 유전자로 성공적으로 변형된 상기 세포는 약물 내성을 부여한 단백질을 생산하고 따라서 선택 레지멘을 견뎌낸다. 상기 우세한 선택의 예는 약물 네오마이신, 마이코페놀산 및 하이그로마이신을 이용한다.
또 다른 선택 반응식은 유전자 생성물이 특정한 배양 배지에서 성장에 필수적인 유전자를 제거하는 염색체 결실을 갖는 원핵 숙주 세포를 이용한다. 이들 실시예에서, 숙주 세포의 염색체 결실을 보완하는 이종성 유전자로 성공적으로 형질전환된 상기 세포는 특정한 배양 배지에서 성장된 경우 생존할 것이다. 상기 반응식에서 유용한 유전자의 예는 숙주 세포가 특정한 배양 배지에서 성장된 경우 필수 영양소를 생성하기 위해 요구되는 다른 유전자 또는 영양요구성 마커 유전자를 포함할 수 있다.
(d) 프로모터 성분
발현 및 클로닝 벡터는 일반적으로 숙주 유기체에 의해 기술적으로 인식된 및 항체를 암호화한 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유한다. 원핵생물 숙주와 함께 사용되기에 적절한 프로모터는, PhoA 프로모터, β-락타마제 및 락토오스 프로모터 시스템, 알칼리성 포스파타아제 프로모터, 트립토판 (trp) 프로모터, 및 혼성체 프로모터 예컨대 tac 프로모터를 포함한다. 그러나, 다른 공지된 박테리아성 프로모터가 적합하다. 박테리아성 시스템에서 사용하기 위한 프로모터는 또한 항체를 암호화한 DNA에 작동가능하게 연결된 샤인-달가르노 (S.D.) 서열을 함유할 것이다.
(e) 번역 개시 영역 성분
상기 기재된 바와 같이, 번역 개시 영역 (TIRs)은 원핵 숙주 세포에서 재조합 단백질의 번역에 주요함이 공지된다 (참고: 예를 들면, Simmons LC and Yansura DG 1996 Nat. Biotechnol. 14:629 및 Vimberg V et al. 2007 BMC Mol. Biol. 8:100). TIR은 번역 단위체의 번역 효율을 측정할 수 있다. TIR은 전형적으로 번역 단위체 특징 예컨대 개시 코돈, 샤인-달가르노 (SD) 서열, 및 번역 인핸서를 포함한다. TIR은 신호 펩티드를 암호화하는 분비 신호 서열을 추가로 포함할 수 있다. TIR의 특징 서열 및 간격은 번역 개시 효율을 조절할 수 있다. 단백질 생산에서 TIRs의 이용의 추가 설명에 대하여, 다음을 참고한다: 예를 들면, 발현 및 분비 최적화를 위한 번역 개시 영역 (TIR) 및 신호 서열을 기재하는 미국 특허 번호 5,840,523 (Simmons et al.).
(f) 전사 종결 성분
원핵생물 숙주 세포에 사용되는 발현 벡터는 또한 전사의 종결 및 mRNA의 안정화에 필요한 서열을 함유할 수 있다. 원핵 세포에서, 종결부위는 Rho-의존적 또는 Rho-독립적 종결부위를 포함할 수 있다. 원핵 숙주 세포에서 유용한 종결부위의 하나의 예는 제한 없이 λt0 종결부위를 포함한다 (Scholtissek and Grosse, Nucleic Acids Res. 15:3185, 1987).
III. 공정 최적화
폴리펩티드의 2쇄를 발현시키기 위해 숙주 세포를 배양시킴으로써 원핵 숙주 세포에서 2쇄를 함유한 폴리펩티드의 생산 방법이 본원에서 제공되고, 여기에서 발현시 2쇄는 접혀지고 조립되어 숙주 세포에서 생물학적 활성 폴리펩티드를 형성하고, 여기에서 숙주 세포는 하기: 성장 온도 및 성장 교반 속도를 포함한 성장 기, 및 생산 온도 및 생산 교반 속도를 포함한 생산 기를 포함한 조건하에 배양 배지에서 배양되고, 여기에서 성장 온도는 생산 온도의 2 내지 10℃ 초과이고, 성장 교반 속도는 생산 교반 속도의 50 내지 250 rpm 초과이다. 특정 생산 공정 최적화가 본원에서 기재된 데이터에 의해 입증된 바와 같이 2쇄 단백질의 수율에서 극적인 증가를 갖는다는 것이 본 개시내용의 놀라운 발견이다.
(g) 숙주 세포의 선택 및 변형
본 개시내용의 특정 양태는 원핵 숙주 세포에 관한 것이다. 본원에서 벡터에 DNA의 클로닝 또는 발현을 위하여 적합한 원핵생물은 진정박테리아, 예컨대 그램-음성 또는 그램-양성 유기체, 예를 들어, 엔테로박테리아세애 예컨대 에스케리치아 , 예를 들면, 이. 콜라이, 엔테로박터, 어위니아 , 클렙시엘라 , 프로테우스, 살모넬라, 예를 들면, 살모넬라 타이피뮤리움 , 세라티아, 예를 들면, 세라티아 마르체칸스 , 및 시겔라 , 뿐만 아니라 바실러스 예컨대 B. 서브틸리스 및 B. 리케니포르미스 (예를 들면, 1989년 4월 12일 공개된 DD 266,710에 개시된 B. 리케니포르미스 41P), 슈도모나스 예컨대 P. 에어루기노사, 및 스트렙토마이세스를 포함한다. 일 바람직한 이.콜라이 클로닝 숙주는 이.콜라이 294 (ATCC 31,446)이며, 한편 기타 균주 예컨대 이.콜라이 B, 이.콜라이 X1776 (ATCC 31,537), 및 이.콜라이 W3110 (ATCC 27,325)가 적합하다. 이러한 예시는 제한적이기보다 예시적이다.
일부 구현예에서, 원핵 숙주 세포는 그람-음성 박테리아이다. 이러한 예시는 제한적이기보다 예시적이다. 일부 구현예에서, 원핵 숙주 세포는 그람-음성 박테리아이다. 그람-음성 박테리아는 그람 염색에 의해 검출된 펩티도글리칸 층 주위의 외막을 함유하는 임의의 박테리아를 지칭한다. 많은 그람-음성 박테리아성 숙주 세포는 당해 기술에 공지되어 있다. 많은 그램-음성 박테리아성 숙주 세포는 당해 기술에 공지되어 있다. 예를 들어, 그램-음성 박테리아는 제한 없이 프로테오박테리아, 예컨대 알파프로테오박테리아 , 베타프로테오박테리아 , 감마프로테오박테리아 , 제타프로테오박테리아 , 엡실론프로테오박테리아 , 델타프로테오박테리아, 및 아시도박테리아; 시아노박테리아; 및 스피로헤타를 포함하도록 공지된다. 잘 알려진 그램-음성 박테리아는 속 예컨대 에스케리시아 , 살모넬라, 시겔라 , 슈도모나스, 헬리오박터 , 레지오넬라, 나이세리아, 및 클렙시엘라 유래의 종을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 그램-음성 박테리아는 이. 콜라이이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 이. 콜라이는 종 이 . 콜라이에 속하는 박테리아의 단리물 또는 임의의 균주를 지칭할 수 있다. 이. 콜라이는 예컨대 본원에서 기재된 바와 같이 플라스미드로 돌연변이 또는 형질전환에 의해 유전적으로 변형된 균주 또는 천연 발생 균주를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 이. 콜라이는, 내인성 프로테아제 활성이 결여된 균주의 것이다. 이론에 제한되도록 하는 바램 없이, 내인성 프로테아제 활성이 결핍된 균주가 본 개시내용의 재조합 단백질, 예컨대 주변세포질성 단백질의 향상된 생산을 허용할 수 있는 것은, 일부 내인성 프로테아제가 재조합으로 발현된 기재에 대하여 활성을 갖기 때문이라고 생각된다 (참고: 하나의 상기 예에 대하여, Baneyx F and Georgiu G 1990 J. Bacteriol. 172(1):491). 내인성 프로테아제 활성이 결핍된 균주는 내인성 프로테아제를 암호화한 유전자가 돌연변이화된, 결실된, 또는 다르게는 불활성화된 균주를 포함할 수 있다. 상기 유전자의 예는, 제한 없이, degP , prc, 및 ompT를 포함할 수 있다. 다양한 원핵 숙주 세포에서 돌연변이 도입을 위한 (예를 들면, 내인성 프로테아제 활성이 결핍된 균주 가공을 위한) 방법은 당해 기술에서 잘 알려진다; 참고: 예를 들면, Snyder L et al. 2013 Molecular Genetics of Bacteria 4th ed. ASM Press).
특히 글리코실화 및 Fc 효과기 기능이 필요없는 경우, 예컨대 치료적 항체가 종양 세포 파괴에서 그 자체로 유효성을 보이는 세포독성 약물 (예를 들면, 독소)에 콘주게이트된 경우, 2쇄 단백질 예컨대 전장 항체, 항체 융합 단백질, 및 항체 단편은 박테리아에서 생산될 수 있다. 전장 항체는 순환에서 더 큰 반감기를 갖는다. 이. 콜라이에서 생산은 더 빠르고 더욱 비용 효율적이다. 박테리아에서 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현에 대해, 다음 문헌을 참조한다: 예를 들어, 미국 특허 번호 5,648,237 (Carter et. al.), 미국 특허 번호 5,789,199 (Joly et al.), 발현 및 분비 최적화를 위한 번역 개시 영역 (TIR) 및 신호 서열을 기재하는 미국 특허 번호 5,840,523 (Simmons et al.). 또한 참고: Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B. K. C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J., 2003), pp. 245-254 (이. 콜라이 내 항체 단편의 발현을 기술). 발현 후, 항체는 이. 콜라이 세포 페이스트로부터 단리될 수 있고, 예를 들면, 이소형에 의존한 단백질 A 또는 G 칼럼을 통해 정제될 수 있다. 최종 정제는 예를 들면, CHO 세포에서 발현된 항체의 정제 방법과 유사하게 수행될 수 있다.
숙주 세포는 2쇄 단백질 생산을 위한 상기 기술된 발현 또는 클로닝 벡터로 변형되고, 프로모터를 유도하거나, 변형체를 선택하거나, 또는 원하는 서열을 암호화하는 유전자를 증폭하는데 적절한 것으로서 변형된 기존 영양 배지 내에서 배양된다.
(h) 숙주 세포 배양
본 개시내용의 특정 양태는 성장 기 및 생산 기를 포함한 조건하에 배양 배지에서 숙주 세포 배양에 관한 것이다. 각각의 이들 단계는 숙주 세포가 특정한 단계 동안 성장된 조건을 추가로 지칭할 수 있다. 예를 들어, 본원에서 사용된 바와 같이, 성장 기는 성장 온도 및 성장 교반 속도를 포함할 수 있고, 생산 기는 생산 온도 및 생산 교반 속도를 포함할 수 있다.
성장 기는 숙주 세포의 배양물이 기하급수적으로 성장하는 동안의 임의의 시간을 지칭할 수 있다. 성장 온도는 본원에서 사용된 바와 같이 숙주 세포의 성장 기 동안 본 개시내용의 숙주 세포를 함유한 배양 배지의 온도를 지칭할 수 있다. 숙주 세포 배양물의 성장 기는 당해 기술에서 통상적으로 공지된 방법, 예를 들면, 경시적으로 (예를 들면, 약 550 nm, 약 600 nm의 파장, 또는 이들 사이의 파장에서) 배양물의 광학적 밀도 측정 및 지수 성장 기가 중단하는 시간 측정에 의해 측정될 수 있다. 숙주 세포가 pho 프로모터를 갖는 벡터를 함유하면, 성장 기는 숙주 세포의 배양물이 기하급수적으로 성장하는 임의의 시간을 지칭할 수 있고 배양 배지에서 포스페이트의 농도는 pho 프로모터-매개된 유전자 전사의 유도를 예방하기에 충분하다.
생산 기는 숙주 세포의 배양물이 생성물을 생산하는 동안의 임의의 시간을 지칭할 수 있다. 생산 온도는 본원에서 사용된 바와 같이 숙주 세포의 생산 기 동안 본 개시내용의 숙주 세포를 함유한 배양 배지의 온도를 지칭할 수 있다. 숙주 세포가 생성물의 발현을 구동한 pho 프로모터를 갖는 벡터를 함유하면, 생산 기는 배양 배지에서 포스페이트의 농도가 pho 프로모터-매개된 생성물 유전자 전사를 유도하기에 충분히 낮은 동안의 임의의 시간을 지칭할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 숙주 세포는 생산 온도의 2℃ 내지 10℃ 초과의 성장 온도에서 배양된다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 숙주 세포는 생산 온도의 2℃, 3℃, 4℃, 5℃, 6℃, 7℃, 8℃, 9℃, 또는 10℃ 초과 성장 온도에서 배양된다. 일부 구현예에서, 성장 온도는 약 임의의 하기 양 미만만큼 생산 온도 초과이다 (℃): 10, 9.5, 9, 8.5, 8, 7.5, 7, 6.5, 6, 5.5, 5, 4.5, 4, 3.5, 3, 또는 2.5. 일부 구현예에서, 성장 온도는 약 임의의 하기 양 초과만큼 생산 온도 초과이다 (℃): 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 또는 9.5. 즉, 성장 온도는10, 9.5, 9, 8.5, 8, 7.5, 7, 6.5, 6, 5.5, 5, 4.5, 4, 3.5, 3, 또는 2.5의 상한 및 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 또는 9.5의 독립적으로 선택된 하한을 갖는 양의 임의의 범위 만큼 생산 온도 초과이고, 여기에서 하한은 상한 미만이다.
일부 구현예에서, 성장 온도는 성장 기 동안 약 30℃ 내지 약 34℃의 범위이다. 일부 구현예에서, 성장 온도는 성장 기 동안 약 30℃, 약 30.5℃, 약 31℃, 약 31.5℃, 약 32℃, 약 32.5℃, 약 33℃, 약 33.5℃, 또는 약 34℃이다. 일부 구현예에서, 성장 기 동안 성장 온도는 약 임의의 하기 온도 미만이다 (℃): 34, 33.5, 33, 32.5, 32, 31.5, 31, 또는 30.5. 일부 구현예에서, 성장 기 동안 성장 온도는 약 임의의 하기 온도 초과이다 (℃): 30, 30.5, 31, 31.5, 32, 32.5, 33, 또는 33.5. 즉, 성장 기 동안의 성장 온도는 34, 33.5, 33, 32.5, 32, 31.5, 31, 또는 30.5의 상한 및 30, 30.5, 31, 31.5, 32, 32.5, 33, 또는 33.5의 독립적으로 선택된 하한을 갖는 온도의 임의의 범위 만큼 생산 교반 속도 초과일 수 있고, 여기에서 하한은 상한 미만이다.
일부 구현예에서, 생산 온도는 생산 기 동안 약 25℃ 내지 약 29℃의 범위이다. 일부 구현예에서, 생산 온도는 생산 기 동안 약 25℃, 약 25.5℃, 약 26℃, 약 26.5℃, 약 27℃, 약 27.5℃, 약 28℃, 약 28.5℃, 또는 약 29℃이다. 일부 구현예에서, 생산 기 동안 생산 온도는 약 임의의 하기 온도보다 더 작다 (℃): 29, 28.5, 28, 27.5, 27, 26.5, 26, 또는 25.5. 일부 구현예에서, 생산 기 동안 생산 온도는 약 임의의 하기 온도보다 더 크다 (℃): 25, 25.5, 26, 26.5, 27, 27.5, 28, 또는 28.5. 즉, 생산 기 동안의 생산 온도는 29, 28.5, 28, 27.5, 27, 26.5, 26, 또는 25.5의 상한 및 25, 25.5, 26, 26.5, 27, 27.5, 28, 또는 28.5의 독립적으로 선택된 하한을 갖는 온도의 임의의 범위 만큼 생산 교반 속도 초과일 수 있고, 여기에서 하한은 상한 미만이다.
교반 속도는 세포 배양물이 (예를 들면, 교반에 의해) 교반된 속도를 지칭한다. 성장 교반 속도는 본원에서 사용된 바와 같이 본 개시내용의 숙주 세포를 함유한 배양물이 숙주 세포의 성장 기 동안 교반된 속도를 지칭할 수 있다. 생산 교반 속도는 본원에서 사용된 바와 같이 본 개시내용의 숙주 세포를 함유한 배양물이 숙주 세포의 생산 기 동안 교반된 속도를 지칭할 수 있다. 세포 배양물은 세포 배양물의 통기를 유지하기 위해 교반될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 숙주 세포는 생산 교반 속도의 50 내지 250 rpm 초과의 성장 교반 속도에서 배양된다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 숙주 세포는 생산 교반 속도의 50 rpm, 75 rpm, 100 rpm, 125 rpm, 150 rpm, 175 rpm, 200 rpm, 225 rpm, 또는 250 rpm 초과의 성장 교반 속도에서 배양된다. 일부 구현예에서, 성장 교반 속도는 약 임의의 하기 속도 미만 만큼 생산 교반 속도 초과이다 (rpm): 250, 225, 200, 175, 150, 125, 100, 또는 75. 일부 구현예에서, 성장 교반 속도는 약 임의의 하기 속도 초과 만큼 생산 교반 속도 미만이다 (rpm): 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 또는 225. 즉, 성장 교반 속도는 250, 225, 200, 175, 150, 125, 100, 또는 75의 상한 및 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 또는 225의 독립적으로 선택된 하한을 갖는 속도 (rpm)의 임의의 범위 만큼 생산 교반 속도 초과이고, 여기에서 하한은 상한 미만이다.
일부 구현예에서, 성장 교반 속도는 성장 기 동안 약 600 내지 800 rpm의 범위내이다. 일부 구현예에서, 성장 교반 속도는 성장 기 동안 약 600 rpm, 약 625 rpm, 약 650 rpm, 약 675 rpm, 약 700 rpm, 약 725 rpm, 약 750 rpm, 약 775 rpm, 또는 약 800 rpm이다. 일부 구현예에서, 성장 교반 속도는 약 임의의 하기 속도 미만이다 (rpm): 800, 775, 750, 725, 700, 675, 650, 또는 625. 일부 구현예에서, 성장 교반 속도는 약 임의의 하기 속도 초과이다 (rpm): 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 또는 775 (성장 기 동안). 즉, 성장 기 동안의 성장 교반 속도는 800, 775, 750, 725, 700, 675, 650, 또는 625의 상한 및 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 또는 775의 독립적으로 선택된 하한을 갖는 속도 (rpm)의 임의의 범위이고, 여기에서 하한은 상한 미만이다.
일부 구현예에서, 생산 교반 속도는 생산 기 동안 약 300 내지 500 rpm의 범위이다. 일부 구현예에서, 생산 기 동안의 성장 교반 속도는 생산 기 동안 약 300 rpm, 약 325 rpm, 약 350 rpm, 약 375 rpm, 약 400 rpm, 약 425 rpm, 약 450 rpm, 약 475 rpm, 또는 약 500 rpm이다. 일부 구현예에서, 생산 기 동안 생산 교반 속도는 약 임의의 하기 속도 미만이다 (rpm): 500, 475, 450, 425, 400, 375, 350, 또는 325. 일부 구현예에서, 생산 기 동안 생산 교반 속도는 약 임의의 하기 속도보다 더 크다 (rpm): 300, 325, 350, 375, 400,425, 450, 또는 475. 즉, 생산 기 동안의 생산 교반 속도는 500, 475, 450, 425, 400, 375, 350, 또는 325의 상한 및 300, 325, 350, 375, 400,425, 450, 또는 475의 독립적으로 선택된 하한을 갖는 속도 (rpm)의 임의의 범위이고, 여기에서 하한은 상한 미만이다.
이론에 의해 구속됨 없이, 산소 농도가 제한된 경우, 산소 전달 속도 (OTR)가 세포의 산소 흡수 속도 (OUR) 또는 대사성 속도와 동등한 것이 생각된다. OTR의 가공은 교반 속도를 조정함으로써, 따라서 OUR을 가공함으로써 용이하게 될 수 있다. OUR 및 이의 OTR와의 관계에 대한 추가의 기술은 하기에서 발견될 수 있다: Ochoa-Garcia et al., Biotechnol. Adv. 27:153, 2009. 세포 배양물의 OUR의 측정 기술은 당해 기술에 공지되어 있고, 제한 없이, 세포 배양물로부터 배기가스의 조성물을 모니터링하기 위한 질량 분광분석기 이용 및 세포 배양물의 산소 흡수 및 이산화탄소 진화 속도 계산을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 숙주 세포는 생산 기 동안 숙주 세포에서 피크 산소 흡수 속도의 0.5 내지 2.5 mmol/L/min 초과의 성장 기 동안 숙주 세포에서 산소 흡수 속도를 달성하기에 충분한 성장 교반 속도에서 배양된다. 성장 기에 비교시 숙주 세포에서 약 2.5 mmol/L/min 미만의 산소 흡수 속도를 달성하기에 충분한 속도까지 생산 기 동안 세포 배양물의 교반 속도 감소가 생성물, 예컨대 본 개시내용의 2쇄 폴리펩티드의 생산을 크게 향상시키는 것이 본 개시내용의 발견이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 숙주 세포는 생산 기 동안 숙주 세포에서 피크 산소 흡수 속도의 0.5 mmol/L/min, 1.0 mmol/L/min, 1.5 mmol/L/min, 2.0 mmol/L/min, 또는 2.5 mmol/L/min 초과의 성장 기 동안 숙주 세포에서 산소 흡수 속도를 달성하기에 충분한 성장 교반 속도에서 배양된다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 숙주 세포는 생산 기 동안 숙주 세포에서 피크 산소 흡수 속도 초과의 약 임의의 하기 산소 흡수 속도 (mmol/L/min) 미만의 성장 기 동안 숙주 세포에서 산소 흡수 속도를 달성하기에 충분한 성장 교반 속도에서 배양된다: 2.5, 2.0, 1.5, 또는 1.0. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 숙주 세포는 생산 기 동안 숙주 세포에서 피크 산소 흡수 속도 초과의 약 임의의 하기 산소 흡수 속도 (mmol/L/min) 초과의 성장 기 동안 숙주 세포에서 산소 흡수 속도를 달성하기에 충분한 성장 교반 속도에서 배양된다: 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 또는 2.5. 즉, 본 개시내용의 숙주 세포는 생산 기 동안 숙주 세포에서 피크 산소 흡수 속도의 2.5, 2.0, 1.5, 또는 1.0의 상한 및 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 또는 2.5 초과의 독립적으로 선택된 하한을 갖는 산소 흡수 속도 (mmol/L/min)의 임의의 범위의 성장 기 동안 숙주 세포에서 산소 흡수 속도를 달성하기에 충분한 성장 교반 속도에서 배양된다.
일부 구현예에서, 성장 기 동안 숙주 세포의 피크 산소 흡수 속도는 3.5 mmol/L/min 내지 4.5 mmol/L/min의 범위이다. 일부 구현예에서, 성장 기 동안 숙주 세포의 피크 산소 흡수 속도는 3.5 mmol/L/min, 3.75 mmol/L/min, 4.0 mmol/L/min, 4.25 mmol/L/min, 또는 4.5 mmol/L/min이다. 일부 구현예에서, 생산 기 동안 숙주 세포의 산소 흡수 속도는 1.0 mmol/L/min 내지 3.0 mmol/L/min의 범위이다. 일부 구현예에서, 생산 기 동안 숙주 세포의 산소 흡수 속도는 1.0 mmol/L/min, 1.25 mmol/L/min, 1.5 mmol/L/min, 1.75 mmol/L/min, 2.0 mmol/L/min, 2.25 mmol/L/min, 2.5 mmol/L/min, 2.75 mmol/L/min, 또는 3.0 mmol/L/min이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 숙주 세포는 생산 교반 속도보다 약 10% 내지 약 40% (rpm/rpm) 더 높은 성장 교반 속도에서 배양된다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 생산 교반 속도의 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 또는 35% (rpm/rpm)의 하한 및 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 또는 15% (rpm/rpm) 이하의 독립적으로 선택된 상한을 갖는 성장 교반 속도에서 배양된다. 바람직한 구현예에서, 본 개시내용의 숙주 세포는 1 바 배압 및 20 L/min의 통기 속도에서 10 L 발효조에 배양된다.
본 개시내용의 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. "배양 배지"는 본원에서 사용된 바와 같이 본 개시내용의 박테리아의 성장을 지지하는 브로쓰 또는 임의의 조성물을 지칭한다. 적합한 배양 배지는 액체 또는 고체일 수 있고 임의의 영양소, 염, 버퍼, 요소, 및 세포의 성장 및 생존력을 지지하는 다른 화합물을 함유한다. 배양 배지의 공통의 영양소는 질소, 탄소, 아미노산, 탄수화물, 미량 원소, 비타민, 및 미네랄의 공급원을 포함할 수 있다. 이들 영양소는 (정의된 배양 배지에서와 같이) 개별 성분로서 또는 착물 추출물 (예를 들어, 효모 추출물)의 성분로서 부가될 수 있다. 배양 배지는 급속 성장을 지지하기 위해 영양소-풍부 또는 더 느린 성장을 지지하기 위한 최소일 수 있다. 배양 배지는 오염 유기체 (예를 들면, 항생제)의 성장을 저해하기 위해 또는 사멸하기 위해 사용된 임의의 제제를 또한 함유할 수 있다. 배양 배지는 유도성 프로모터 또는 효소의 활성을 대조하기 위해 사용된 임의의 화합물을 또한 함유할 수 있다 (하나의 예로서, IPTG는 lac 오페론 또는 기능적으로 유사한 프로모터에 의해 제어된 임의의 폴리뉴클레오티드의 발현을 유도하기 위해 포함될 수 있다). 적합한 배양 배지의 많은 예는 당해 기술에서 잘 알려지고 제한 없이 M9 배지, 용원성 브로쓰 (LB), 엄청난 브로쓰 (TB), NZY 브로쓰, SOB 배지, 및 YT 브로쓰를 포함한다.
임의의 이들 배지는 필요에 따라 염 (예컨대 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘, 및 포스페이트), 버퍼 (예컨대 HEPES), 뉴클레오티드 (예컨대 아데노신 및 티미딘), 항생제, 항진균제, (마이크로몰 범위에서 최종 농도로 보통 존재한 무기 화합물로서 정의된) 미량 원소, 글루코오스, 및/또는 적절한 에너지 공급원으로 보강될 수 있다. 원핵 세포 배양 배지에서 발견된 전형적인 성분은 효모 추출물, 염 (예를 들면, NaCl), 트립톤, 버퍼 (예를 들면, 포스페이트 버퍼), 글리세롤, 등등을 포함한다. 임의의 다른 필수적인 보충물을 또한 당해기술의 숙련가에게 공지된 적절한 농도로 포함할 수 있다. 배양 조건, 예컨대 온도, pH 등은 발현을 위해 선택된 원핵생물 숙주 세포와 함께 이전에 사용된 조건이며, 숙련가에게 분명할 것이다.
(i) 생물학적 활성 폴리펩티드의 정제
본 개시내용의 특정 양태는 숙주 세포로부터 생물학적 활성 폴리펩티드 회수에 관한 것이다. 본 개시내용의 생물학적으로 활성 폴리펩티드의 전형적으로 회수 (용어 "정제하는" 또는 "정제"는 본원에서 교환가능하게 사용될 수 있다)는 숙주 세포 (또는 폴리펩티드가 배지 속으로 배출되면 세포 배양 배지)로부터 폴리펩티드 단리 및 다른 관련된 거대분자, 예를 들면, 세포성 잔해 및 다른 폴리펩티드로부터 폴리펩티드 정제를 포함한다. 다양한 숙주 세포 구획으로부터 다양한 단백질 정제를 위한 수많은 기술은 당해 기술에 공지되어 있다 (참고, 예를 들면, Evans, Jr., TC and Xu MQ (eds.) Heterologous Gene Expression in E. coli (2011) Methods in Molecular Biology Vol 705, Humana Press). 예시적 기술은 아래 기재되지만, 이들은 숙련가의 이해를 단지 보충하기 위해 예시적 목적으로 포함되고 결코 제한될 의미는 아니다.
재조합 기술을 이용한 경우, 2쇄 단백질 예컨대 분비성 단백질은 주변세포질 공간에서 세포내로 생산될 수 있거나, 또는 배지에 직접적으로 분비될 수 있다. 분비성 단백질이 세포내로 생산되는 경우, 제1 단계로 숙주 세포 또는 용해된 단편인 미립자 잔해가, 예를 들면 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거된다.
일부 구현예에서, 분비성 단백질은 숙주 세포의 주변세포질로부터 회수된다. [Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)]는 이. 콜라이의 원형질막 주위 공간에 분비되는 분비성 단백질을 단리하기 위한 절차를 기재한다. 간략히, 세포 페효모를 아세트산나트륨 (pH 3.5), EDTA, 및 페닐메틸설포닐플루오라이드 (PMSF)의 존재 하에 약 30분에 걸쳐서 해동시킨다. 세포 파편을 원심분리로 제거할 수 있다. 분비성 단백질이 배지 내로 분비되는 경우, 그와 같은 발현계의 상청액은 일반적으로 먼저 상업적으로 이용가능한 단백질 농축 필터, 예를 들면 Amicon 또는 Millipore Pellicon 한외여과 단위체를 이용해서 농축된다. 프로테아제 억제제, 예컨대 PMSF가 단백질분해를 저해하기 위해 임의의 전술된 단계에 포함될 수 있고, 항생제가 우발적인 오염물질의 성장을 예방하기 위해 포함될 수 있다.
세포로부터 제조된 분비성 단백질 조성물은, 예를 들면, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피(hydroxylapatite chromatography), 소수성 상호작용 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 및 친화도 크로마토그래피를 사용하여 정제될 수 있으며, 친화도 크로마토그래피가 전형적으로 바람직한 정제 단계 중 하나이다. 항체에 대하여, 친화성 리간드로서 단백질 A 의 혼화성은 항체에 존재하는 임의의 면역글로불린 Fc 도메인의 종 및 이소형에 의존적이다. 단백질 A는 인간 γ1, γ2, 또는 γ4 중쇄에 기반하는 항체를 정제하기 위해 사용될 수 있다(Lindmark et al., J. Immunol . Meth. 62:1-13 (1983)). 단백질 G는 모든 마우스 이소형 및 인간 γ3에 대해 권장된다(Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)). 친화성 리간드가 부착되는 매트릭스는 매우 종종 아가로스이지만, 다른 매트릭스가 이용가능하다. 기계적으로 안정한 매트릭스, 예컨대 조절된 기공 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠은 아가로스로 달성될 수 있는 것보다 더 빠른 유속 및 더 짧은 가공 시간을 허용한다. 항체가 CH3 도메인을 포함한 경우, Bakerbond ABXTM 수지 (J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.)는 정제에 유용하다. 단백질 정제를 위한 다른 기술 예컨대 이온-교환 칼럼 상의 분획화, 에탄올 침전법, 역상 HPLC, 실리카 상의 크로마토그래피, 헤파린 상의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지 상의 SEPHAROSE™ 크로마토그래피 (예컨대 폴리아스파르트산 칼럼), 크로마토포커싱(chromatofocusing), SDS-PAGE, 및 황산암모늄 침전법이 또한 회수되는 항체에 따라 이용가능하다. 당해 분야의 숙련가는 항체 회수에 유용한 많은 이들 기술이 다른 2쇄 단백질, 예컨대 분비성 단백질을 회수하기 위해 쉽게 적용될 수 있음을 인식할 것이다.
일반적으로, 상기-기재된 방법론과 일치하고/하거나 목적하는 특정 항체에 대해 당해기술의 숙련가에 의해 적절한 것으로 간주되는, 연구, 시험 및 임상에 사용하기 위한 항체를 제조하기 위한 다양한 방법론은 당해기술에 잘-확립되어 있다.
실시예
본 개시내용은 하기 실시예를 참조하여 더 완전히 이해될 것이다. 그러나 이들은 본 개시내용의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본원에 기재된 실시예 및 구현예는 단지 예시적 목적을 위한 것이고, 이들의 견지에서 다양한 변형 또는 변화가 당해기술의 숙련가에게 제시될 것이며, 본 출원의 사상 및 범위 그리고 첨부된 청구범위의 범위 내에 포함될 것임이 이해된다.
약어: Ab (항체), hAb (절반 항체), HC (중쇄), ImmTAC (암에 대한 면역 가동화 단클론성 T 세포 수용체), IPTG (이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드), LC (경쇄), OD (광학적 밀도), ORF (개방형 판독 프레임), OTR (산소 전달 속도), OUR (산소 흡수 속도), Tg (성장 온도), Tp (생산 온도), TIR (번역 개시 영역), xIL4 (항-인터류킨-4), xIL13 (항-인터류킨-13), xIL17 (항-인터류킨-17), 및 xIL33 (항-인터류킨-33).
실시예 1: 절반-항체 생산 역가에 관한 샤페론 및 산화환원효소 수준의 효과
재조합 기술을 이용한 이종성 분비된 단백질의 생산은 많은 치료적 분자에 중요하다. 다중특이적 항체 (예를 들면, 이중특이적 항체)는 많은 중요한 치료 용도, 예컨대 암 및 기타 적용에서 면역요법을 이용한 이종성 분비된 단백질의 하나의 비-제한 예이다. 치료 용도를 위한 다중특이적 항체 생산은 산업적 규모로 이들 항체, 예컨대 절반-항체 (hAbs)의 구축 블록을 생산하기 위한 능력을 요구한다. 상기 요구를 충족시키기 위해, 표준 방법에 대하여 생산에서 유의미한 증가를 수득하는 최적화된 발현 벡터 및 공정 단계가 본원에서 기재된다. 중요하게는, 샤페론 단백질 FkpA, DsbA, 및 DsbC와 조합으로 hAb의 중쇄 (HC) 및 경쇄 (LC) 공-발현을 위한 단일 플라스미드 또는 혼화성 플라스미드 시스템은 조립된 hAb의 생산을 유의미하게 향상시키는 것이 발견되었다. 상기 시스템은 시험되었고 다중 hAbs의 생산을 개선하도록 발견되었고, 많은 분비된 단백질의 생산을 위한 그의 광범위한 유용성을 증명한다. (예를 들면, 배양의 상이한 상에서 교반 속도, pH, FkpA 프로모터, 및 배양물 온도를 포함한) 공정 단계의 후속의 최적화는 생성물 수율에서 더욱 유의미한 증가를 수득하였다.
재료 및 방법
절반-항체 ( hAb ) 벡터 작제
벡터는 EP1356052에 기재된 것과 유사한 방식으로 작제되었다. 특히, 다양한 발현 벡터는 hAbs의 발현을 위하여 제조되었다. 각 벡터에 대하여, 발현 카세트는 EcoRI 부위에서 이. 콜라이 플라스미드 pBR322의 프레임워크로 클로닝되었다 (Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 43:77-90, 1978). 각 발현 카세트는 적어도 하기 구성요소를 함유하였다: (1) 전사의 대조를 위한 phoA 프로모터 (Kikuchi et al., Nucleic Acids Res. 9:5671-5678, 1981); (2) 이. 콜라이 trp, 열 안정한 장독소 II (STII) 신호 서열, 또는 번역 개시를 위하여 양쪽의 조합으로부터 Shine-Dalgarno 서열 (Chang et al., Gene 55:189-196, 1987); 및 (3) 말단 전사에 대한 λt0 종결부위 (Scholtissek and Grosse, Nucleic Acids Res. 15:3185, 1987). 추가로, STII 신호 서열 또는 그 신호 서열의 침묵의 코돈 변이체는 경쇄 또는 중쇄용 암호화 서열을 선행하였다. 상기 서열은 주변세포질속으로 폴리펩티드의 분비를 유도한다 (Picken et al., Infect. Immun. 42:269-275, 1983; 및 Simmons and Yansura, Nature Biotechnology 14:629-634, 1996).
별도 시스트론을 갖는 벡터는 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 유전자의 독립적인 발현을 제공하도록 설계되었다. 상기 벡터에서, 각 쇄를 위한 시스트론 단위체는 그의 자체 PhoA 프로모터의 제어하에 있고 λt0 종결부위가 뒤따랐다. 더욱이, 각 시스트론은 TIR (번역 개시 영역)을 편입하여 모든 경쇄 및 중쇄의 발현을 조절하였다 (Simmons et al., J. Immunol. Meth., 263:133-147, 2002). 예시적 구현예에서, 발현 카세트는, 5'에서 3'까지, 제1 PhoA 프로모터 그 다음 경쇄 (TIR-L + 경쇄) 및 제1 λt0 종결부위용 시스트론, 및 제2 PhoA 프로모터 그 다음 중쇄 (TIR-H + 중쇄) 및 제2 λt0 종결부위용 시스트론을 함유한다. 대안적으로, 발현 카세트는, 5'에서 3'까지, 제1 PhoA 프로모터 그 다음 중쇄 (TIR-H + 중쇄) 및 제1 λt0 종결부위용 시스트론, 및 제2 PhoA 프로모터 그 다음 경쇄 (TIR-L + 경쇄) 및 제2 λt0 종결부위용 시스트론을 함유한다. 모든 TIR-L 및 TIR-H는 STII 신호 서열 또는 이의 변이체 내에 함유된다.
xIL13 및 xIL4 IgG4 hAb 발현 벡터에 대하여 1,1 및 2,2의 TIR 조합은 평가되었다. xIL17 및 xIL33 IgG4 hAb 발현 벡터에 대하여 TIR2,2는 평가되었다. 제1 번호는 경쇄의 TIR 강도를 나타내고 제2는 중쇄의 TIR 강도를 나타낸다. xIL13, xIL4, xIL17 및 xIL33 IgG4 hAbs에 더하여, 다른 IgG1 이소형 hAb 벡터는 작제되었고 시험되었다.
샤페론 발현 플라스미드 작제
xIL13, xIL4, xIL17 및 xIL33 hAbs의 최고 역가를 수득하기 위해 상기 기재된 벡터와 조합되는 샤페론 발현을 측정하기 위해, 플라스미드는 공-발현을 위하여 제공되었다. 수많은 공지된 샤페론은 FkpA 단백질, 샤페론 활성을 갖는 펩티딜프로일 시스-트랜스 이소머라아제를 포함하여 시험되었다. 그렇게 하기 위해, EP1356 052 (참고, 예를 들면, 실시예 9-10, 특히 단락 [0207])에 기재된 바와 같이, FkpA용 ORF를 함유한 혼화성 플라스미드 (pACYC, Novagen, Madison, WI)는 작제되었다.
현재 공정에 대하여 상기 작업을 확대하여, FkpA 혼화성 벡터의 세트는 FkpA 공-발현의 수준을 조절하기 위해 유사하게 생성되었다. FkpA 수준의 조절은 이전에 기재된 바와 같이 신호 펩티드의 최적화를 통해 달성되었다 (Simmons and Yansura, 상기, 1996). 간단히, FkpA ORF의 5' 말단은 FkpA 신호 펩티드 (천연 또는 변이체), 또는 STII 신호 펩티드를 함유하였다. 모든 FkpA 변이체 유전자 작제물은 tacII 프로모터의 제어하에 있었다.
이들 플라스미드는 그 다음 균주 66F8 속으로 상기 기재된 hAb 발현 플라스미드로 공-형질전환되었다. 숙주 균주 66F8의 유전자형은 W3110 △ fhuA △ phoA ilvG2096 (Valr ) △prc spr43H1 △degP △manA lacI Q △ompT △menE 이다.
xIL13 hAb, TIR1,1 및 TIR2,2에 대하여 절반 항체 및 FkpA의 LC 및 HC를 암호화한 플라스미드는 작제되었고 66F8를 변형하기 위해 사용되었다. 이들 플라스미드 작제물에서, FkpA의 발현은 LC용 ORF의 phoA 프로모터 업스트림에 의해 제어되었다. pBR322 플라스미드는 대략 30 사본/세포 (Bolivar et al., Gene, 2:95-113, 1977)에서 전형적으로 유지되고 pACYC 플라스미드는 대략 15 사본/세포 (Chang and Cohen, J. Bacteriol., 134:1141-1156, 1978)에서 전형적으로 유지된다. 이론에 제한되도록 바램 없이, FkpA가 Ab 발현 플라스미드상으로 이동되는 경우 사본 번호는 제조된 FkpA의 양의 증가를 유발할 수 있다는 것이 생각된다.
산화환원효소 플라스미드 작제
FkpA의 공-발현을 위하여 기재된 혼화성 플라스미드 시스템과 유사하게, 혼화성 플라스미드는 이전에 기재된 FkpA TIR 변이체 중 하나를 편입한 hAb 발현 플라스미드와 조합으로 다양한 공지된 산화환원효소를 스크리닝하기 위해 이용되었다. 상기 작업은 pxIL13.2.2.FkpAc13으로서 식별된 TIR2,2 플라스미드로 수행되었다. 게다가 혼화성 플라스미드는 xIL4 및 다른 IgG1 hAbs와 조합으로 FkpA 및 산화환원효소를 스크리닝하기 위해 이용되었다.
최초 산화환원효소 혼화성 플라스미드의 작제는 EP 1356052 (참고, 예를 들면, 실시예 9)에 기재된 바와 같았다. 산화환원효소의 스크리닝은 hAb 발현 플라스미드 xIL13.2.2.FkpAc13을 갖는 혼화성 플라스미드 JJ247로부터 발현을 포함하였다. xIL13 hAb 예에서, 산화환원효소 발현은 1mM IPTG으로 유도되었거나 또는 산화환원효소 수준을 조절하기 위해 유도되지 않은채 남겨졌다.
hAb의 LC 및 HC를 암호화한 단일 플라스미드 및 샤페론 FkpA, DsbA 및 DsbC는 또한 작제되었고 66F8를 변형하기 위해 사용되었다. xIL13 hAb 예에서, FkpA의 발현을 구동하기 위해 사용된 프로모터에서 상이한 2개의 TIR2,2 단일 플라스미드는 작제되었다. 단일 플라스미드 MD157은 FkpA 발현용 phoA 프로모터를 함유하였고 플라스미드 KA01은 tacII 프로모터를 함유하였다. 상이한 프로모터의 사용은 FkpA 발현의 추가 조절을 허용하였다. xIL17 hAb 예에서, TIR2,2 단일 플라스미드는 작제되었고 (MD341), FkpA 발현용 phoA 프로모터를 이용하였다. 모든 단일 플라스미드 조건에서, DsbA 및 DsbC의 발현은 다시스트론성 방식으로 tacII 프로모터의 제어하에 있었다. xIL4 hAb 예에서, 아래 기재된, 혼화성 샤페론 플라스미드 AH8145의 ORFs를 편입한, 및 CB1로서 식별된 TIR2,2 단일 플라스미드는 작제되었다.
상기 기재된 단일 플라스미드 시스템에 더하여, 삼중 샤페론 혼화성 플라스미드 시스템은 모든 IgG1 및 IgG4 이소형의 수많은 hAbs로 또한 평가되었다. 혼화성 플라스미드 시스템에서 이전에 기재된 FkpA TIR 변이체 중 하나는 다시스트론성 DsbA 및 DsbC 혼화성 플라스미드 (JJ247)로 클로닝되었고 AH8145로 식별된다.
발효 공정
대규모 생산은 EP1356052 (참고, 예를 들면, 실시예 4 및 단락 [0159]-[160])에서 본질적으로 기재된 바와 같았다. 각 10-리터 발효에 대하여, (10-15% DMSO를 함유한) 0.5 mL의 냉동된 스톡 배양물은 해동되었고 0.5 mL의 테트라사이클린 용액 (5 mg/ml) 및/또는 2 mL의 카나마이신 용액 (5 mg/mL) 및 2.5 ml 1M 인산나트륨 용액으로 보강된 500 mL의 Soy LB 배지를 함유한 2L 진탕 플라스크를 접종하기 위해 사용되었다. 상기 종자 배양물은 진탕하면서 30℃에서 대략 16 시간 동안 성장되었고 그 다음 10-리터 발효조를 접종하기 위해 사용되었다.
발효조는 1.1 g의 글루코오스, 100 mL의 1M 마그네슘 설페이트, 10 mL의 미량 원소 용액 (1 리터의 최종 용적으로, 100 ml 염산, 27 g 제이철 클로라이드 헥사히드레이트, 8 g 아연 설페이트 헵타히드레이트, 7 g 코발트 클로라이드 헥사히드레이트, 7 g 나트륨 몰리브데이트 디히드레이트, 8 g 구리 설페이트 5수화물, 2 g 붕산, 5 g 망간 설페이트 1수화물), 20 mL의 테트라사이클린 용액 (에탄올내 5 mg/ml) 또는 250 mL의 암피실린 용액 (2 mg/mL), 1개 백(bag)의 HCD 염, (37.5 g 암모늄 설페이트, 19.5 g 인산칼륨 2염기성, 9.75 g 인산나트륨 1염기성 디히드레이트, 7.5 g 나트륨 시트레이트 디히드레이트, 11.3 g 인산칼륨 1염기성), 200 g의 BL4 콩 (콩 단백질 가수분해물), 및 100 그램의 효모 추출물을 함유한 대략 7.0 리터의 배지를 초기에 함유하였다. 발효는 기류의 20 표준 리터 / 분 (slpm)으로 30℃에서 초기에 수행되었고 (비록 상기 범위를 넘은 가끔의 편위는 일부 경우에서 발생하였어도) 7.0 ± 0.2의 pH에서 제어되었다. 발효조의 배압은 1 바 게이지에서 유지되었고 교반 속도는 초기에 650 rpm까지 설정되었다. 아래 실시예 2에서 상세히 논의된 바와 같이, 교반 속도는 발효조에서 산소 전달 속도를 가공하기 위해 또한 가변될 수 있고, 결과적으로, 세포성 호흡 속도를 제어한다. 게다가 아래 실시예 3에서 상세히 논의된 바와 같이, 성장 및 생산 기 동안 온도는 생성물 수율을 최대화하기 위해 조정될 수 있다.
진탕 플라스크로부터 세포-함유 배지로 발효조의 접종 이후, 배양물은 발효조에 농축된 글루코오스 용액을 공급하기 위해 컴퓨터-기반 알고리즘을 이용하여 높은 세포 밀도로 발효조에서 성장되었다. 수산화암모늄 (58% 용액) 및 황산 (24% 용액)은 pH를 제어하기 위해 필요에 따라 발효조에 공급되었다. L-61 기포저지는 포말화를 제어하기 위해 일부 경우에서 또한 부가되었다.
배양물이 대략 40 OD550의 세포 밀도를 달성한 경우, 추가의 100 mL의 1M 마그네슘 설페이트는 발효조에 부가되었다. 추가로, 농축된 염 공급물 (1250 ml의 최종 용적으로 12.5 g 암모늄 설페이트, 32.5 g 칼륨 포스페이트 2염기성, 16.25 g 나트륨 포스페이트 1염기성 디히드레이트, 2.5 g 나트륨 시트레이트 디히드레이트, 18.75 g 칼륨 포스페이트 1염기성, 10 mL의 2.7% 제이철 클로라이드 및 10 mL의 미량 원소)은 발효조에 부가되었고 배양물이 대략 20 OD550를 달성한 경우 2.5 ml/min의 속도로 시작하였고 대략 1250 ml가 발효에 부가될 때까지 계속하였다. 발효는 70-80 시간 동안 전형적으로 계속되었다.
전기영동, 면역블롯 , 및 HPLC 분석용 샘플 제조
비-환원된 가용성 샘플 준비물은 EP1356052 (참고, 예를 들면, 실시예 4, 특히 단락 [0162])에 기재된 것과 유사하다. 특히, 비-환원된 가용성 샘플은 아래와 같이 제조되었다: 발효의 과정 동안 취해진 냉동된, 1 mL 전체의 브로쓰 샘플이 실온에서 해동되었다. 100 μL의 해동된 전체의 브로쓰는 500 μL의 추출 버퍼에 부가되었다. (추출 버퍼: 10 mM Tris, pH 6.8, 5 mM EDTA, 새롭게 부가된 0.2 mg/mL의 hen egg 리소자임, 및 5-10 mM의 최종 농도까지 새롭게 제조된 아이오도아세트산). 전체의 브로쓰 샘플 플러스 추출 버퍼는 5-10 분 동안 얼음상에서 항온처리되었고, 그 다음 2 x 10 펄스 초음파처리되었고, 그 다음 15-20 분 동안 4℃ 및 14,000 rpm에서 원심분리되었다. 상청액은 가용성 분획으로서 제거되었다. SDS-PAGE 및 면역블롯에 의한 분석을 위하여, 가용성 분획은 환원제 없이 2X Novex 트리신 샘플 버퍼로 1:10 희석되었다. 10 μl의 상기 준비물은 10 웰 Novex 10% 비스-Tris NuPage 겔상에 부하되었고 MES 버퍼로 150 V에서 전기영동되었다. 겔은 그 다음 면역블롯에 사용되었거나 또는 쿠마씨 청색으로 염색되었다.
가용성 분획의 샘플은 LC-카파/RP 검정에 의한 분석을 위하여 제출되었다. 상기 검정은 제1 칼럼이 IgG 성분을 함유한 카파-경-쇄를 포착하는 친화성 칼럼이고 제2 칼럼이 역상 칼럼인 2-차원 HPLC 검정이다. 적분 HPLC 워크스테이션은 이중 칼럼 방식으로 구성되었다. 용매 저장기는 하기였다: 용매 1A, 친화성 부하 버퍼; 용매 1B, 친화성 용출 버퍼, 물내 0.2% TFA; 용매 2A, 역상 수성 버퍼, 물내 0.1% TFA; 용매 2B, 역상 유기 용출 버퍼, 80% 아세토니트릴내 0.1% TFA. 제1 칼럼은 Life Technologies (Carlsbad, CA)로부터 구매된 POROS® CaptureSelectTM LC 카파 친화성 칼럼 (2.1x 30 mm)이었다. 친화성 칼럼을 포함한 모든 절차는 주위 온도에서 수행되었다.
제2 칼럼은 Life Technologies (Carlsbad, CA)로부터 구매된 POROS® R2 20μm 역상 칼럼 (2.1x30 mm)이었다. 역상 칼럼 온도는 80℃에서 유지되었다.
친화성 칼럼은 부하 버퍼에서 평형화되었고, 샘플은 2 ml/min의 유속으로 부하되었다. 통과액은 폐기물로 유도되었다. 샘플이 부하된 이후, 친화성 칼럼은 비-특이적으로 결합된 성분을 환원시키기 위해 부하 버퍼 (3 ml)로 세정되었다. 그 다음, 밸브 스위칭에 의해, 친화성 칼럼은 역상 칼럼에 연결되었고 역상 칼럼으로 친화성 포착된 성분을 이동시키기 위해 2 ml/min의 유속으로 용출 버퍼 (5 ml)로 용출되었다. 상기 이동 단계 동안, 적분 UV 검출기는 친화성 칼럼 뒤 및 역상 칼럼 앞에 위치되었고, 따라서 친화성 칼럼의 용출 모니터링은 역상 칼럼에 부하가 되었다. 역상이 된 칼럼으로부터 용출 및 단절 이후, 친화성 칼럼은 물 (2ml)로 세정되었고 그 뒤에 부하 버퍼 (4 ml)로 재-평형화되었다.
부하된 역상 칼럼은 수성 0.1 % TFA (1.1 ml)로 세정되었다. 유속은 2 ml/min으로 설정되었고 급속 구배 (0.25 min)는 35% 용매 2B (0.1% TFA/ 80% 아세토니트릴)까지 실시되었고 그 다음 적은 구배는 3 min에 걸쳐 50% 용매 2B까지였다. 용출은 0.5 min 지나서 100% 용매 2B까지 구배에 의해 완료되었고 1.5 min 동안 유지되었다. 역전된 상 칼럼은 그 다음 0.05 min 지나서 초기 조건으로 되돌려졌고 2 min 동안 유지되어 재-평형화시켰다. 칼럼 용출물은 280 및 214 nm에서 모니터링되었다. 정량화는 역상 칼럼으로부터 분리에 기반된 공지된 농도의 표준의 것과 통합된 피크 면적의 비교로 수행되었다.
발효 공정 동안 생산된 LC 및 HC의 가용성 및 총량은 또한 정량화되었다. 총 RP-HPLC 정량화를 수행하기 위해 발효 브로쓰 샘플은 200 mM와 6 M 구아니딘 HCL, 360 mM TRIS, 2mM EDTA pH 8.6)에서 100 mM DL-디티오트레이톨 (Sigma cat. # 43816)로 10 배 희석되었다. 샘플은 와동되었고, 60℃에서 20분 동안 항온처리되었고 15분 동안 4℃에서 13,000 RPM으로 원심분리되었다. 가용성 분획은 HPLC상으로 주사에 앞서 0.22 um 필터를 이용하여 여과되었다. 사용된 HPLC 시스템은 Agilent Technologies 1290 무한대 시스템이었다. 샘플은 Zorbax 300SB-C3 급속 해상도 (4.6x150 mm 3.5 마이크론) 분석적 칼럼 (cat. #863973-909). 이동 상 A는 SQH2O내 0.1 % 트리플루오로아세트산 (Thermo cat. # 28901)으로 이루어졌고 이동 상 B는 HPLC-등급 아세토니트릴 (Honeywell cat. # AH015-4)내 0.08% 트리플루오로아세트산으로 이루어졌다.
총 가용성 RP-HPLC 정량화를 수행하기 위해 발효 브로쓰 샘플은 모두 균질화되었고 (10,000 RPM) Pro-Scientific DPS-20으로 4회 10초 동안 초음파처리되었다 (88% 진폭). 샘플은 그 다음 15-20 분 동안 4℃ 및 14,000 rpm에서 원심분리되었다. 상청액은 가용성 분획으로서 제거되었고 상기 기재된 바와 같이 RP-HPLC 상에서 변성 및 가공되었다.
결과
hAb 역가에 관한 FkpA 발현의 효과
도 1A에서 보이는 바와 같이, xIL13 hAb TIR1,1 벡터로부터 경쇄 및 중쇄 하부단위체의 생산은 2.9 g/L 및 1.2 g/L, 각각의 경쇄 및 중쇄 생산의 총량을 유발하였다. TIR2,2에 대하여 생산된 경쇄 및 중쇄의 총량은 6.4 g/L 및 4.1 g/L, 각각이었다.
그러나, 총 하부단위체 생산의 양은 유의미한 가용성 하부단위체 누적을 유발하지 않았다. xIL13 TIR1,1 hAb 플라스미드를 이용하여, 생산된 경쇄 및 중쇄의 총 가용성 양은 0.2 g/L 및 0.1 g/L 미만, 각각이었다 (도 1B). TIR2,2 hAb에 대하여 생산된 경쇄 및 중쇄의 총 가용성 양은 0.3 g/L 및 0.3 g/L, 각각이었다 (도 1C). TIR1,1 발효에 대하여 생산되는 조립된 xIL13 hAb의 역가는 단지 0.1 g/L이었고, TIR2,2 발효에 대하여 역가는 0.2 g/L 미만이었다 (도 2). 이들 결과는 hAb 생성물의 접힘 및/또는 조립에서 유의미한 비효율성의 존재를 제안한다. 따라서, 샤페론의 공-발현으로 TIR1,1 및 TIR2,2 플라스미드 이용의 역가에 관한 효과를 평가한 추가 작업은 수행되었다.
몇 개의 부류의 샤페론 단백질은 단백질 접힘 및 조립을 촉진시키기 위해 공지된다 (도 3A-B). 해당 특정한 샤페론은 펩티딜-프롤릴 시스-트랜스 이소머라아제 및 샤페론으로서 기능하기 위해 공지된 FkpA, 및 산화환원효소로서 기능하기 위해 공지된 DsbA 및 DsbC를 포함한다. 실험은 FkpA, DsbA, 및 DsbC의 발현이 hAb 생산에 영향을 미치는지를 시험하기 위해 착수되었다.
특히, hAb HC 및 LC ORFs를 암호화한 별도 플라스미드 (혼화성 플라스미드 시스템) 또는 동일한 플라스미드 (단일 플라스미드 시스템)를 이용한 발현 FkpA의 효과는 조사되었다 (도 4A-B). 단일 발현 플라스미드의 사용은 다중 항생제 사용에 대한 필요성 또는 플라스미드 체류를 확보하기 위한 선택적 압력의 다른 수단을 제거한다. xIL13 hAb에 사용된 단일 플라스미드 시스템에서, FkpA 발현을 구동한 프로모터는 IPTG-유도성 tacII 프로모터에서 phoA 프로모터로 변화되었다. 따라서, 배양물에서 포스페이트 감손은 HC, LC, 및 FkpA의 발현을 유발한다.
FkpA 샤페론 공-발현의 증가된 수준은 IgG1 이소형 hAb (xVEGF)에 대하여 증가된 조립된 hAb에 더하여 가용 모노머성 중쇄 누적의 증가된 양과 상관하였다 (도 5A). 상기 실험에서, 이전에 기재된 바와 같이, FkpA 발현 변이체의 세트는 1 mM IPTG 유도로 스크리닝되었다. FkpA 공-발현 없이, xVEGF hAb의 역가는 0.2 g/L이었고 FkpA 공-발현 (FkpA(wt))의 최고 수준을 갖는 조건에서 hAb 역가는 대략 0.4 g/L이었다 (도 5B).
xIL13 hAb의 생산에 대하여, TIR1,1 또는 TIR2,2 항체 발현 벡터를 이용한 혼화성 플라스미드 시스템 (도 4A에서 보이는 바와 같이, 하나의 플라스미드로부터 xIL13 HC 및 LC 그리고 또 다른 것으로부터 FkpA의 발현)은 시험되었다. FkpA의 공-발현을 구동하기 위해 1mM IPTG로 유도된 혼화성 플라스미드 시스템에 대하여, TIR1,1 플라스미드용 역가는 TIR2,2 플라스미드에 대하여 0.2 g/L 및 0.4 g/L이었다 (도 6A, 레인 3 및 4). 이는 FkpA의 내인성 수준을 갖는 TIR1,1 및 TIR2,2 조건과 비교된 역가에서 대략 2-배수 증가를 유발하였다 (도 6A, 레인 1 및 2). 도 6B는 밀리흡수 단위체 (mAu)으로 초고성능 액체 크로마토그래피 (UPLC) 및 웨스턴 블롯에 의해 측정된 바와 같이 내인성 발현과 비교시 혼화성 시스템에서 유도된 FkpA 발현의 양을 보여준다.
도 4B에서 보이는 FkpA 발현 및 hAb 생산을 위한 단일 플라스미드 시스템은 또한 시험되었다. xIL13 hAb에 대하여, 단일 플라스미드 TIR1,1 및 TIR2,2용 역가는 0.4 g/L 및 0.7 g/L, 각각이었다 (도 6A). 이는 혼화성 플라스미드 시스템에 대한 역가에서 대략 2-배수 증가를 나타냈다. 단일 플라스미드 시스템에서 FkpA의 발현 수준은 유도된 혼화성 플라스미드 시스템에서보다 또한 대략 2-배 더 높았다 (도 6B). FkpA 발현의 증가된 수준은 모든 TIR 조건에서 가용 모노머성 중쇄 누적의 증가된 양과 상관하였다.
제3 hAb (xIL4 IgG4)은 혼화성 플라스미드 시스템으로부터 유도된 FkpA 공-발현을 갖는 양쪽 TIR1,1 및 TIR2,2 조건으로 시험되었다. 상기 실험에서 FkpA(wt) 공-발현은 모든 TIR 조건에서 가용 모노머성 중쇄의 양을 증가하였지만 (도 7A), 생산된 hAb의 역가에서 증가를 유발하지 않았다 (도 7B).
제4 hAb (xVEGFC IgG1)는 혼화성 플라스미드 시스템으로부터 유도된 FkpA 공-발현으로 시험되었다. 상기 실험에서 FkpA(wt) 공-발현은 가용 모노머성 중쇄의 양을 증가시켰고 0.5 g/L에서 0.8 g/L까지 역가를 증가시켰다 (도 8A). 쿠마씨 염색에 의해 측정된 바와 같이 증가된 FkpA 발현 (도 8B)은 가용 모노머성 HC 쇄 누적에서 증가에 상관하였다 (도 8C). 합으로, 이들 결과는 FkpA 발현이 가용 모노머성 중쇄의 누적을 향상시키는 것, 그러나 조립된 hAb 역가에 관한 효과가 가변적이라는 것을 제안한다. 이는 추가 최적화가 바람직하다는 것을 나타낸다.
hAb 역가에 관한 DsbA 및 DsbC 발현의 효과
xIL13 hAb 생산은 산화환원효소 DsbA 및 DsbC의 발현을 위하여 혼화성 플라스미드와 상기 기재된 pxIL13.2.2.FkpAc13 (단일 플라스미드)의 조합에 의해 추가로 최적화되었다 (도 9). pxIL13.2.2.FkpAc13으로 모든 DsbA 및 DsbC (JJ247)를 발현한 플라스미드는 hAb 역가를 증가시켰다. 도 10은 DsbA 및 DsbC의 IPTG 유도의 존재 및 부재하에 경시적으로 생산된 xIL13 hAb의 역가를 보여준다. JJ247을 갖는 pxIL13.2.2.FkpAc13에 대한 최고 역가는 발효에 52 시간에서 달성되었다. 상기 시점에서, IPTG 없는 조건 (비-유도된 조건)에서, xIL13 역가는 1.2 ± 0.2 g/L이었고 IPTG 있는 조건 (유도된 조건)에서xIL13 역가는 1.0 ± 0.2 g/L이었다 (도 10). 시험된 모든 조건에 대하여 52 내지 72 시간으로부터 역가의 하락은 유의미하였고 실시예 2에 기재된 바와 같이 발효 공정 동안 산소 흡수 속도 (OUR)에서의 하락 및 오스몰농도에서의 상승에 기인되었다.
DsbA, DsbC, 및 FkpA (AH8145) 발현을 위한 혼화성 시스템은 xIL4 TIR1,1 및 TIR2,2 Ab 발현 플라스미드로 또한 평가되었다 (도 11A). 모든 3개 샤페론의 비-유도된 공-발현은 0.8 g/L 및 1.2 g/L, 각각의 TIR1,1 및 TIR2,2 역가를 유발하였다 (도 12 레인 5 및 6)이었다. 이는 이전에 기재된 FkpA 혼화성 TIR2,2 조건에 비교시 TIR2,2 조건에 대하여 역가의 대략 6-배수 증가를 나타냈다 (도 12 레인 3 및 4)이었다.
혼화성 비-유도성 AH8145 플라스미드 시스템은 또 다른 hAb로 추가로 평가되었다. xVEGFC IgG1 hAb를 생산하기 위해 TIR2,2-기반 벡터를 이용하여, 비-유도된 혼화성 AH8145 조건은 단지 FkpA 공-발현과 비교시 0.8 g/L에서 1.0 g/L까지 역가를 증가시켰다 (도 13). 모든 TIR1,1 및 TIR2,2 조건을 갖는 제5 hAb (xVEGFA IgG1)은 AH8145 혼화성 플라스미드로 시험되었다. 샤페론 공-발현 없이 모든 TIR1,1 및 TIR2,2 조건에 대한 역가는 유사한, 약 0.9 g/L (도 14 레인 1 및 3)이었다. 비-유도된 AH8145 조건에서 혼화성 플라스미드로, TIR1,1 및 TIR2,2 플라스미드에 대한 역가는 1.2 g/L 및 1.7 g/L, 각각이었다 (도 14 레인 2 및 4)이었다.
AH8145의 샤페론 ORFs를 편입한 xIL4 TIR2,2 단일 플라스미드의 창출은 생성되었고 (CB1) 도 11B에서 실증된다. IPTG의 부가 없이 CB1 플라스미드는 혼화성 플라스미드 시스템으로 관측된 것보다 약간 더 높은 역가를 생산하였다 (도 15). 상기 비교에서 보고된 hAb 역가가 실시예 2에 기재된 바와 같이 최적화된 교반 전략을 이용한 발효로부터 생성되었음을 유의해야 한다. 웨스턴 블롯에 의해, 모든 3개 샤페론의 수준은 CB1로 약간 더 높았다 (도 15). 이론에 제한되도록 바램 없이, 단일 플라스미드 시스템은 고수율을 유발할 수 있는 더 높은 플라스미드 사본 수를 허용할 수 있다.
xIL13 단일 플라스미드 시스템 MD157은 비유도된 혼화성 pxIL13.2.2.FkpAc13 및 JJ247 혼화성 플라스미드 시스템과 비교되었다 (도 16). MD157 단일 플라스미드 조건은 혼화성 시스템에서 1.9 ± 0.04 g/L에 비교된 2.1 ± 0.3 g/L의 역가를 생산하였다 (도 17). 상기 비교로 보고된 역가가 실시예 2에 기재된 바와 같이 최적화된 교반 전략을 이용한 발효로부터 생성되었음을 유의해야 한다.
함께 고려하여, 이들 결과는 DsbA 및 DsbC와 함께 FkpA의 공-발현이 이들 효과를 식별하기 위해 다중 hAb 작제물을 이용하여 조립된 hAb의 생산을 증가시킨다는 것을 입증한다.
실시예 2: 절반-항체 생산에 관한 산소 흡수의 효과
상기 결과는 hAb HC 및 LC와 함께 FkpA, DsbA, 및 DsbC의 공-발현에 의해 달성된 hAb 생산에서 개선을 입증한다. 그러나, 심지어 상기 향상된 생산으로, 역가는 안정기까지 발견되었거나 또는 심지어 생산의 52 시간 이후 시점에서 감소되었다. 따라서, 추가의 실험은 hAb 생산을 추가로 최적화하기 위해 착수되었다.
이전에 기재된 바와 같이, 발효는 기류의 20 표준 리터 / 분 (slpm)으로 30℃에서 초기에 수행되었고 7.0 ± 0.2의 pH에서 제어되었다. 발효조의 배압은 1 바 게이지에서 유지되었고 교반 속도는 초기에 650 rpm까지 설정되었다. 배압의 추가의 바 게이지는 200%의 초기 용해된 산소 농도 (dO2)를 유발하였다. 농축된 글루코오스 용액은 개시 수준의 2% 아래로 낙하된 dO2 신호 이후, 전형적으로 약 2 시간 후 생산 배양물에 공급되었고, 발효의 과정에 걸쳐 연속적으로 공급되어 이로써 글루코오스가 비-제한 영양소이었다.
12 시간에서 배양물내 세포 밀도는 0 퍼센트 또는 그 근처에서 dO2 농도를 측정하는데 충분하였다. 이론에 의해 구속됨 없이, 산소 농도가 제한된 경우, 산소 전달 속도 (OTR)가 세포의 산소 흡수 속도 (OUR) 또는 대사성 속도와 동등한 것이 생각된다. OTR의 가공은 교반 속도 조정에 의해 용이하게 되었고 배양물 OUR에 관한 직접적인 효과를 가졌다. 질량 분광분석기는 발효로부터 배기가스의 조성물을 모니터링하기 위해 사용되었고 발효에서 산소 흡수 및 이산화탄소 진화 속도의 계산을 가능하게 하였다.
도 18에서 보이는 바와 같이, 상기 기재된 JJ247 플라스미드 시스템을 갖는 pxIL13.2.2.FkpAc13에서, 양쪽 유도된 및 비-유도된 TIR2,2 배양물은 시간 12에서 4.25 mmol/L/min의 피크 OUR을 가졌고, 그 후 시점에서 dO2는 제한되었다. 이들 배양물은 650 rpm의 일정 속도에서 교반 하에 성장되었다. 도 19는 경시적으로 이들 배양물의 오스몰농도를 보여준다. 도 18-19와 함께 고려하여, 도 18-19는 50 시간 이후, 세포 배양물 OUR은 빈틈없이 감소하였고 오스몰농도는 상승하였음을 보여준다.
도 20은 이들 배양물에서 경시적으로 생산된 xIL13 hAb 역가를 보여준다. 52 시간에서 1.2 g/L ± 0.2 g/L에서 72 시간에서 0.7 ± 0.04 g/L까지 역가의 하락이 관측되었다. 유사하게, 유도된 조건으로, 52 시간에서 1.0 ± 0.2 g/L에서 72 시간에서 0.5 ± 0.05 g/L까지 하락이 관측되었다. 흥미롭게도, 생산에서 상기 하락은 하락된 동일한 시간 OUR에서 발생하였고 오스몰농도는 이들 배양물에서 상승하였다.
역가에서 하락을 완화시키기 위해 및 오스몰농도에서 상승을 제거하기 위해, 26 시간에서 교반 변화는 비-유도된 TIR2,2 조건으로 평가되었다. 교반 속도는 650 rpm에서 표적 OUR 설정값을 달성한 수준까지 이동되었다. 4개의 상이한 OUR 표적 설정값이 하기와 같이 시험되었다: 대략 1.5, 1.75, 2.0 및 2.5 mmol/L/min. 대략 1.5와 2.0 mmol/L/min 사이에서 OUR 설정값을 갖는 교반 변화는 OUR에서 하락 (도 21) 및 오스몰농도에서 상승 (도 22)을 제거하였다.
중요하게는, 모든 교반 변화 조건에서, 역가는 54 시간에서 비-이동된 조건에서 더 높았다 (도 23). 대략 2.5 mmol/L/min 조건에서 OUR은 ~ 60 시간에서 하락하였고 (도 21) 오스몰농도는 72 시간에서 1200 mOsm의 피크까지 상승하였다 (도 22). 72 시간에서, 대략 2.5 mmol/L/min 조건 역가 (0.7 g/L)는 비-이동된 조건 (0.6 ± 0.1 g/L)으로서 유사한 수준까지 하락하였다. 대략 2.0 mmol/L/min 조건에 대한 평균 역가는 시험된 4개 조건의 최고 (2.4 ± 0.6 g/L)이었지만; 그러나, 역가에서 일부 가변성이 있었고 OUR 프로파일에서 약간의 감소됨이 보여졌다. 대략 1.5 mmol/L/min 조건은 2.1 ± 0.3 g/L의 모든 재생산된 평균 역가를 가졌지만, 그러나 재차 발효에서 후기 OUR 프로파일에서 일부 가변성임이 보여졌다. 대략 1.75 mmol/L/min 조건은 바람직한 설정값으로서 선택되도록 모든 재생가능한 역가 (1.8 ± 0.2 g/L), 뿐만 아니라 일치된 OUR 경향을 가졌다.
이들 결과는 배양물의 교반 속도 시프팅이 OUR에서 관측된 감소 및 오스몰농도에서 상승을 완화시킨다는 것을 입증한다. 중요하게는, 이들 교반 변화는 또한, 특히 후기 생산 시점에서 향상된 hAb 생산 역가를 허용한다.
실시예 3: 절반-항체 생산에 관한 온도의 효과
이전의 실시예가 hAb 생산에서 유의미한 이득을 입증하는 반면, 추가의 시험은 생산 공정을 또한 추가로 최적화하기 위해 착수되었다. 따라서, xIL13 hAb 생산을 위하여, 실시예 1에 기재된 단일 플라스미드 시스템 및 실시예 2에 기재된 대략 1.75 mmol/L/min의 OUR 설정값에서 높은 성능은 개시점으로서 사용되었다. 상기 공정은 아래 기재된 바와 같이 유의미하게 더 큰 생산 수율을 수득하기 위해 또한 추가로 최적화되었다.
본 개시내용의 바람직한 구현예의 발효 공정은 2개의 상이한 분절로 분할될 수 있다: 성장 기 및 생산 기. 성장 기에서, 대부분의 영양소는 과잉이고, 배양물 밀도는 빠르게 증가한다. 생산 기에서, 포스페이트는 제한되고, 성장이 멈추고, 해당 생성물의 발현이 시작한다. hAb 생산에 관한 온도의 효과는 이들 상의 각각에 대하여 시험되었다.
온도 실험과 조합으로 제2 숙주는 평가되었다. 이들 실험에서 MD157 플라스미드는 67A6 생산 숙주로 형질전환되었다. 67A6 균주의 유전자형은 하기이다: W3110 ΔfhuA ΔphoA ilvG + Δprc spr43H1 ΔdegP ΔmanA lacIQ ΔompT ΔmenE742 degPS210A.
67A6 균주는, DegP를 암호화하는, (htrA 및 ptd로서 또한 공지된) degP 유전자의 프로테아제 결핍된 대립유전자의 녹인(knockin)을 함유한다. (프로테아제 Do로서 또한 공지된) DegP는 높은 온도에서 생존을 위하여 요구된 주변세포질성 세린 프로테아제이다. 추가로, DegP는 분자 샤페론으로서 작용한다. 세린에 대한 알라닌의 치환은 DegP의 단백분해 활성을 제거하지만 그의 샤페론 기능에 영향을 미치지 않는다 (Spiess et al., Cell, 97:339-347, 1999).
온도 최적화는 xIL13 TIR2,2 단일 플라스미드 시스템에 대하여 모든 성장 기 (Tg) 및 생산 기 (Tp)에 대해 수행되었다. 도 24는 30℃ 또는 28℃의 일정 Tg/Tp로 성장된 배양물의 성장을 보여준다. 28℃의 일정 Tg/Tp는 30℃의 일정 Tg/Tp에 비교시 성장 속도에서 지체를 유발하였다. 도 25는 이들 온도에서 성장된 배양물의 OUR을 보여준다. 성장 속도와 유사하게, 배양물이 30℃와 비교시 28℃의 일정 Tg/Tp에서 성장된 경우 OUR은 지연된다.
도 26에서 보이는 바와 같이, 포스페이트는 30℃의 일정 Tg/Tp를 이용하여 22±2 시간에서 감손되었다. Tg/Tp가 28℃까지 아래로 이동된 경우, 배양물의 성장 속도는 상기 기재된 바와 같이 지연되었고, 포스페이트 감손은 26±2 시간까지 이동되었다.
도 27은 이들 배양물의 xIL13 hAb 생산을 보여준다. 각 조건에 대하여, 생성물 발현은 포스페이트 감손이 발생한 경우의 시간에서 시작하였다. 일정 28℃ Tg/Tp 조건은 일정 30℃ Tg/Tp 조건에 대하여 1.3 ± 0.2 g/L에 비교시 2.5 ± 0.2 g/L의 최종 역가를 달성하였다.
생산 기에서 시간의 양을 증가시키기 위한 노력으로, 온도 변화 전략은 시험되었다. 상기 실험에서 성장 기 온도는 30℃에서 설정되었고 20 시간에서 온도는 28℃까지 이동되었다. 성장 (도 28), 포스페이트 (도 29), 및 OUR (도 30) (0 및 20 시간에서) 프로파일은 Tg30/Tp28℃ 변화 및 일정 Tg/Tp 30℃ 조건과 유사하였다.
도 31에서 보이는 바와 같이, 생성물 유도의 시간에서 28℃까지 온도 변화의 이용은 일정 Tg/Tp 28℃ 조건하에 생산된 2.5 g/L의 최종 역가에 Tg30/Tp28℃ 조건하에 생산된 3.1 g/L의 최종 역가를 비교하여, 역가에서 추가로 0.6 g/L 증가를 제공하였다. 이들 결과는 더 높은 온도에서 배양물 성장, 그 다음 생산의 시간에서 배양물 온도 감소가 생성물 형성에서 유의미한 증가를 유발할 수 있음을 입증한다.
실험 (DoE)의 부분 요인 설계는 67A6 숙주 균주를 이용한 xIL13 hAb에 대하여 최적의 작동 조건을 측정하기 위해 수행되었다. DoE는 3개의 작동 파라미터 및 FkpA의 수준에 집중하였다.
표 3-1. xIL13 hAb 파라미터
Figure 112017051998554-pct00006
표 3-1에서 보이는 바와 같이, 작동 파라미터는 Tg 및 Tp 뿐만 아니라 pH를 포함하였다. 패턴은 특이적 파라미터에 대한 작동 범위를 지칭하고; (-)는 낮은 값 파라미터를 지칭하고, (+)는 높은 값 파라미터를 지칭하고, 0001 및 0002는 중심 점 파라미터를 지칭한다. Tg는 30 내지 34℃ 범위이었고, Tp는 25 내지 28℃ 범위이었고, pH는 6.7 내지 7.0 범위이었다. 생산된 FkpA의 양은 사용된 프로모터에 의해 조절되었다. 높은 수준의 FkpA는 MD157에 관해 phoA 프로모터로부터 생성되었고 낮은 수준의 FkpA는 KA01에 관해 비-유도된 tac 프로모터로부터 생성되었다. 부분 요인 분석은 10회 실험 실시에 의해 수행되었다.
도 32에서 보이는 바와 같이, 이들 인자는 생산된 xIL13 hAb의 역가에 유의미한 효과를 가졌다. 표 3-1에서 기재된 DoE 실험에 사용된 조건에 의해 생산된 hAb의 역가는 대략 1.5 내지 대략 4.5 g/L 범위이었다.
xIL4 단일 플라스미드 (CB1)는 xIL13 DoE로부터 식별된 최적의 발효 조건 (Tg 34℃, Tp 28℃, pH 7.0)으로 시험되었다. 그러나 CB1 조건에서 IPTG 유도가 없는 tacII 프로모터는 FkpA 발현을 구동하기 위해 사용되었다. xIL14 hAb 역가는 Tg/Tp가 30℃에서 일정하게 유지되었고 pH가 7.0에서 유지된 발효 조건에 비교되었다. xIL4 hAb 역가는 IPTG의 부가 없이 신규 공정 조건으로 1.3 g/L에서 3.1 g/L까지 증가하였다 (도 33).
부분 요인 DoE는 xIL17 hAb에 대한 최적의 작동 조건을 측정하기 위해 수행되었다. MD341 단일 플라스미드는 xIL13 hAb 단일 플라스미드 (MD157) LC 및 HC에 대한 ORFs를 xIL17 LC 및 HC의 ORF로 대체함으로써 작제되었다. 항체 단편 및 샤페론의 발현에 사용된 프로모터는 xIL13 (MD157) 플라스미드와 동일하였다. DoE는 3개의 작동 파라미터에 집중하였다.
표 3-2. xIL17 hAb 파라미터
Figure 112017051998554-pct00007
표 3-2에서 보이는 바와 같이 작동 파라미터는 Tg 및 Tp, 뿐만 아니라 pH를 포함하였다. Tg는 30 내지 34℃ 범위이었고, Tp는 25 내지 30℃ 범위이었고, pH는 6.7 내지 7.3 범위이었다. 도 34는 가장 유의미한 역가 누적이 25℃의 Tp를 갖는 조건에서 달성되었음을 보여준다.
도 35는 xIL13 hAb 역가의 생산에 관한 제1 작동 샤페론 단백질 공-발현 및 그 다음 공정 단계 (예를 들면, 교반 속도, Tg, 및 Tp) 최적화의 효과를 보여준다. 예시적 구현예에서, 분자 최적화 (예를 들면, 샤페론 단백질 발현 및 벡터 특징)는 역가에서 대략 16-배수 증가를 제공하였다. 상기 수준의 생산은 공정 발달 (예를 들면, 교반 속도, Tg, 및 Tp)을 통해 대략 3.5-배 만큼 추가로 향상되었다. 함께 고려하여, 이들 결과는 생산 및 강건성에서 유의미한 이득이 샤페론 발현, 벡터 시스템, 교반 속도, pH, 및 성장/생산 온도를 포함한 최적화 변수를 통해 달성될 수 있음을 입증한다. 궁극적으로, 34℃의 Tg, 25℃의 Tp, 6.7의 pH, 및 phoA 프로모터에 의해 생산된 FkpA의 수준을 갖는 조건이 최고 xIL13 hAb 역가를 유발하였음이 측정되었다.
실시예 4: 절반-항체 생산에 관한 숙주 균주의 효과
이전의 실시예가 hAb 생산에서 유의미한 이득을 입증하는 반면, 추가의 시험은 숙주 균주 66F8 및 67A6 사이에서 hAb 생산의 전위 차이를 특성화하기 위해 착수되었다. 따라서, hAb 생산을 위하여, 실시예 1에서 기재된 높은 성능 단일 플라스미드 시스템, 실시예 2에서 기재된 OUR 변화, 및 실시예 3에서 기재된 온도 변화는 2개의 이. 콜라이 숙주 균주: 66F8 및 67A6. 66F8 균주의 유전자형은 하기이다: W3110 ΔfhuA ΔphoA ilvG + Δprc spr43H1 ΔdegP ΔmanA lacIQ ΔompT ΔmenE742. 67A6 균주의 유전자형은 하기이다: W3110 ΔfhuA ΔphoA ilvG + Δprc spr43H1 ΔdegP ΔmanA lacIQ ΔompT ΔmenE742 degPS210A.
xIL13 hAb는 모든 66F8 및 67A6 숙주 균주에서 발현되었다. 발효는 상기 기재된 바와 같이 온도 및 교반 속도 변화를 사용한 조건하에 수행되었다. 67A6 균주의 이용은 가용성 xIL13 hAb 역가에서 증가 (도 36A) 및 66F8 균주와 비교시 모든 LC 및 HC의 총 하부단위체 누적 (도 36B)을 유발하였다.
xIL4 hAb는 모든 66F8 및 67A6 숙주 균주에서 또한 발현되었다. xIL4 hAb 발효가 30℃의 항온에서 수행된 경우, 약 1.5 g/L의 유사한 역가는 모든 균주로부터 수득되었다 (도 37A). 그러나, Tg가 34℃에서 25℃의 Tp까지 감소되는 발효 조건하에 67A6 균주는 3.0　g/L의 평균을 생산하였고 66F8 균주는 2.0 g/L의 평균을 생산하였다 (도 37B). 게다가, 67A6 발효에서 모든 LC 및 HC의 총 하부단위체 누적은 온도 변화를 사용한 조건하에 66F8 발효보다 더 컸다 (도 38A 및 도 38B).
따라서, 모든 xIL13 hAb 및 xIL4 hAb는 67A6 숙주 균주에 의해 제공된 역가 이점 및 성장 온도에 비하여 감소된 생산 온도의 2개 예이다. 이론에 의해 제한됨 없이, 재조합 단백질 누적은 DegP가 없는 숙주 균주에서 안정기로 보였고, 반면에 돌연변이체 DegPS210A를 갖는 숙주 균주에서, 재조합 단백질은 발효가 끝날 때까지 누적하는 것으로 보였다.
실시예 5: 최적화된 발현 벡터 및 최적화된 배양물 조건을 이용한 xIL33 hAb의 생산
xIL33 hAb (MD501 플라스미드)는 xIL13 hAb 단일 플라스미드 (MD157) LC 및 HC용 ORFs를 xIL33 LC 및 HC의 ORF로 대체함으로써 작제되었다. 항체 단편 및 샤페론의 발현에 사용된 프로모터는 xIL13 (MD157) 플라스미드에 동일하였다 (도 39). 단일 발효는 xIL33 LC 및 HC (MD481)용 ORF만 함유한 xIL33 hAb 발현 벡터로 수행되었다. MD481 플라스미드는 분자 샤페론 DsbA, DsbC 또는 FkpA용 ORFs를 함유하지 않았다. 발효는 30℃의 항온, 7.0의 pH, 및 650 RPM의 교반 속도에서 수행되었다 (도 40의 기저 사례). 다음으로, 단일 발효는 xIL33 LC 및 HC용 ORFs, 뿐만 아니라 분자 샤페론 DsbA, DsbC 또는 FkpA (MD501)용 ORFs를 함유한 xIL33 hAb 발현 벡터로 수행되었다. 동일한 작동 조건은 MD481 발효에 대해서와 같이 MD501 발효에 대해 사용되었다. 단일 플라스미드 (MD501)의 이용은 기본 사례와 비교시 xIL-33 hAb 역가에서 대략 10-배수 증가를 유발하였다.
부분 요인 DoE는 xIL33 hAb MD501 단일 플라스미드를 위한 최적의 배양물 조건을 측정하기 위해 수행되었다. DoE는 67A6 숙주에서 2개 중심 점 복제물을 포함한 10개 실험을 갖는 단편적인 요인으로 4개 파라미터에 집중하였다 (표 5-1). 교반 속도 및 온도 변화는 150의 OD550에서 실시되었다.
표 5-1. xIL33 hAb 파라미터
Figure 112017051998554-pct00008
표 5-1에서 보이는 바와 같이, Tg는 30 내지 34℃ 범위이었고, Tp는 25 내지 30℃ 범위이었고 pH는 6.7 내지 7.3 범위이었고, OUR 설정값은 1.9 내지 2.8 mmol O2/L/min 범위이었다. 도 41은 중심 점 조건이 4.0 ± 0.05 g/L인 달성된 최고 역가를 갖는 역가에 가장 유의미한 이점을 제공하였음을 보여주고, 이는 기저 사례 작동 조건에 비교시 hAb 역가에서 추가 증가와 같다 (도 40). 최상의 배양물 조건은 7.0의 pH, 32℃의 Tg, 27.5℃의 Tp (2 hr 램프), 및 대략 2.3 mmol/Lmin의 표적 OUR (2hr 교반 속도 램프)을 포함하였다.
실시예 6: FkpA 최적화
FkpA의 발현 수준을 최적화하기 위한 노력으로, 2개의 추가 FkpA TIR 변이체는 xIL13, xIL17 및 xIL33 hAbs에 대한 단일 플라스미드 (MD157, MD341 및 MD501 플라스미드)에서 시험되었다. FkpA TIR 변이체는 내인성 FkpA 신호 서열과 비교로 기재된 바와 같이 특성화되었다 (도 42). MD157, MD341 및 MD501 플라스미드는 FkpAc13용 ORF을 편입하였고, 이는 3의 TIR 강도와 상관되었다 (도 43). MD157, MD341 및 MD501 단일 플라스미드에서 FkpAc13 ORF은 FkpA TIR1 또는 TIR2 ORF로 대체되었고 각 hAb에 대하여 이전에 식별된 최적화된 발효 조건에서 시험되었다.
FkpA 발현의 증가된 수준은 증가된 xIL13 hAb 누적과 상관하였다 (도 44). FkpA TIR1 및 TIR2 조건은 0.5 및 2.5 g/L의 최종 FkpA 양 및 1.5 및 2.5 g/L, 각각의 xIL13 hAb 역가를 유발하였다. TIR 3 조건은 4 g/L의 FkpA 및 3.8 g/L의 hAb를 생산하였다. FkpA 발현의 수준은 또한 생산 기 OUR 프로파일에 영향을 가졌다. 전체 FkpA의 적정은 생산된 hAb의 양을 약 3 배만큼 증가시켰다.
xIL33 hAb 발효에서 최저 역가 누적 프로파일은 2.4 g/L의 실시 역가의 말단을 갖는 FkpA TIR1 조건과 상관하였다 (도 45). xIL33 hAb 역가에서 대략 2 배수 증가를 유발하였다 (도 45) (xIL33 TIR2 및 TIR3 조건은 TIR1 조건과 비교된 경우). 데이터는 FkpA의 증가된 수준이 hAb 생산에 유익함을 제안한다.
xIL17 hAb 발효에서 최저 역가 누적 프로파일은 2.0 g/L의 실시 역가의 말단을 갖는 FkpA TIR1 조건과 상관하였다 (도 46).
2개 추가의 FkpA TIR 변이체는 xIL13 hAb에 대하여 이전에 기재된 최상의 조건을 이용하여 시험되었다 (TIR2.3 및 TIR6). TIR2.3 역가 프로파일은 이전에 시험된 TIR2 조건보다 더 높은 경향이었지만, 여전히 대조 TIR3 조건보다 낮았다 (도　47A). TIR6 조건은 TIR 2.3 조건과 유사한 역가 누적 프로파일을 수득하였지만, 그러나 재차 TIR3 대조보다 낮았다. 웨스턴 블롯 분석에 의해 측정된 바와 같이 FkpA 누적은 TIR 변이체를 거친 FkpA의 적정을 보여주었다 (도 47B). 데이터는, xIL13 hAb (MD157 단일 플라스미드)의 경우에서 TIR3인, hAb 생산과 상관하는 FkpA 발현의 최적의 양이 있음을 제안한다.
실시예 7: 산소 전달 속도 ( OTR ) 조건의 효과
실시예 3에서 식별된 xIL13 hAb 최상의 조건은 제2 OTR 전략으로 또한 시험되었다. 실험 (N=3)에서 용기 배압 (BP) 및 살포 속도는 1.0에서 0.3 바까지 및 20에서 13 SLPM까지, 각각으로 감소되었다. 배압 및 살포 속도에서 감소 때문에 OTR에서 손실을 회수하기 위한 노력으로, 성장 및 생산 기 교반 속도는 650에서 880 RPM까지 및 475에서 650 RPM까지 증가되었다. 용기 배압, 살포 속도, 및 교반 속도의 상이한 조합은 이전의 실시예에서 인용된 것과 유사한 OTR 조건을 달성하기 위해 사용될 수 있다.
발효는 전체 발효 공정에 대한 일정 BP로 수행되었다. 변경된 OTR 조건에서 배압은 0.3 바 (N=3)로 유지되었고, 대조 조건에서 배압은 1.0 바 (N=5)로 유지되었다. 발효는 전체 발효 공정에 대한 일정 기류로 수행되었다. 변경된 OTR 조건에서 기류는 13 SLPM (N=3)으로 유지되었고, 대조 조건에서 기류는 20 SLPM (N=5)으로 유지되었다. 발효는 모든 변경된 OTR 및 대조 조건에서 150 OD550으로 교반 변화를 시행하였다. 변경된 OTR 조건에서 초기 교반 속도는 880 RPM까지 설정되었고 650 RPM까지 이동되었고, 대조 조건에서 초기 교반 속도는 650 RPM까지 설정되었고 475 RPM까지 이동되었다.
교반 속도에서의 증가는 살포 및 배압에서의 감소 때문에 OTR에서의 하락을 보상하였다. 변경된 OTR 조건은 대조 조건에 대해 사한 피크 및 생산 기 OUR (도 48A) 및 성장 프로파일 (도 48B)을 유발하였다. 변경된 OTR 조건은 대조 조건과 유사한 누적 프로파일 및 피크 역가 (4.1 ± 0.4 g/L)를 유발하였다 (도 49).
실시예 8: ImmTAC 생산의 최적화
암에 대한 면역 가동화 단클론성 T 세포 수용체 (ImmTAC)는, 항암 요법의 범위에 대해 잠재적으로 유용한 본 개시내용의 2쇄 폴리펩티드이다 (참고: 예컨대, Oates and Jakobsen, OncoImmunology 2:e22891, 2013, 및 Liddy et al., Nat. Med. 18:908-7, 2012). 다중특이적 항체와 유사하게, 치료용 ImmTAC의 생산은 공업적 규모에서의, 이들에 융합된 구축 블록, 예컨대 알파 및 베타 TCR 쇄 및 임의의 폴리펩티드 (예컨대, 항-CD3 효과기 예컨대 scFv)를 생산하는 능력을 요구한다. 이러한 요구를 충족시키기 위하여, 발현 벡터 및 공정 단계를 표준 방법에 비하여 현저한 생산 증가를 산출하도록 최적화하였다. 중요하게, 상기 실시예와 유사하게, FkpA 발현, 공정 변화, TIR 최적화, 및 DsbC 발현이 다중 ImmTAC에 대해 이러한 생산 증가를 제공한다는 것이 발견되었다.
재료 및 방법
ImmTAC 발현 벡터 (도 50A), 1,1; 1,2; 및 2,3의 TIR 조합을 평가하였다. ImmTACS 생산에 대하여 본원에 사용된 바와 같이, 제1 번호는 알파 쇄의 TIR 강도를 나타내고 제2는 베타 쇄의 TIR 강도를 나타낸다 (도 50B).
플라스미드는 숙주 균주, 유전자형 W3110 fhuA phoA ilvG2096 (Valr ) prc spr43H1 degP manA lacI Q ompT menE 로 변형되었다.
초기 발효는, 30 °C 정온 및 pH 7.0에서 수행되고, 4시간 과정으로 24시간에서 개시된 교반 승온을 갖고, 그리고 대략 1.75 mmol/L/min의 OUR을 표적으로 하였다.
그렇게 하기 위해, 유럽 특허 번호 EP1356052B1 및 상기 기술된 바와 같이, FkpA용 ORF를 함유한 혼화성 플라스미드 (pACYC, Novagen, Madison, WI)가 작제되었다. FkpA 유전자 작제물은 tacII 프로모터의 제어하에 있었다.
최초 산화환원효소 혼화성 플라스미드의 작제는 유럽 특허 번호 EP1356052 B1 (참고, 예를 들면, 실시예 9)에 기재된 바와 같았다. 산화환원효소의 스크리닝은 ImmTAC TIR1,1 FkpA 단일 플라스미드로의, 혼화성 플라스미드 JJ141 (DsbC), JJ142 (DsbA) 및 JJ247 (DsbA C)로부터의 발현을 포함하였다. 산화환원효소의 발현을 구동하는데 사용된 tac 프로모터는 유도되지 않았고, 상기 프로모터 유래의 누출성 발현에 의존하였다.
ImmTAC 역가를 검정하기 위하여, 가용성 분획의 샘플을 단백질 L/RP 검정에 의한 분석에 대해 제출하였다. 상기 검정은 제1 칼럼이 IgG 성분을 함유한 가변-경-쇄를 포착하는 친화성 칼럼이고 제2 칼럼이 역상 칼럼인 2-차원 HPLC 검정이다. 적분 HPLC 워크스테이션은 이중 칼럼 방식으로 구성되었다. 용매 저장기는 하기였다: 용매 1A, 친화성 부하 버퍼; PBS; 용매 1B, 친화성 용출 버퍼, 물내 0.2% TFA; 용매 2A, 역상 수성 버퍼, 물내 0.1% TFA; 용매 2B, 역상 유기 용출 버퍼, 아세토니트릴내 0.08% TFA. 친화도 칼럼은 하기를 이용한 인-하우스(in-house) 패킹된 칼럼이었다: Life Technologies (CA, USA)로부터 구매된 POROS® AL 활성화 수지와 결합된, Sigma Aldrich (CA, USA)로부터 구매된 정제 단백질 L. 친화성 칼럼을 포함한 모든 절차는 주위 온도에서 수행되었다.
제2 칼럼은 Mac-Mod (CA, USA)로부터 구매된 HALO C4 단백질 역상 칼럼 (2.1x20 mm)이었다. 역상 칼럼 온도는 80℃에서 유지되었다.
친화성 칼럼은 부하 버퍼에서 평형화되었고, 샘플은 2 ml/min의 유속으로 부하되었다. 통과액은 폐기물로 유도되었다. 샘플이 부하된 이후, 친화성 칼럼은 비-특이적으로 결합된 성분을 환원시키기 위해 부하 버퍼로 세정되었다. 그 다음, 밸브 스위칭에 의해, 친화성 칼럼은 역상 칼럼에 연결되었고 역상 칼럼으로 친화성 포착된 성분을 이동시키기 위해 2 ml/min의 유속으로 용출 버퍼로 용출되었다. 상기 이동 단계 동안, UV 검출기는 친화성 칼럼 뒤 및 역상 칼럼 앞에 위치되었고, 따라서 친화성 칼럼의 용출 모니터링은 역상 칼럼에 부하가 되었다.
용출 이후, 친화성 칼럼은 이후 부하 버퍼로 재-평형화되었다.
부하된 역상 칼럼은 수성 0.1 % TFA로 세정되었다. 유속은 2 ml/min으로 설정되었고 급속 구배 (0.25 min)는 5% 내지 30% 용매 2B (ACN 중 0.08% TFA)까지 실시되었고 그 다음 적은 구배는 34% 용매 2B까지였다. 용출은 재생을 위하여 100% 용매 2B까지 구배에 의해 완료되었다. 역전된 상 칼럼은 그 다음 초기 조건으로 되돌려졌고 재-평형화되었다. 칼럼 용출물은 280 및 214 nm에서 모니터링되었다. 정량화는 역상 칼럼으로부터 분리에 기반된 공지된 농도의 표준의 것과 통합된 피크 면적의 비교로 수행되었다. 이러한 검정에 대한 정량 한계치 (LOQ)는 0.0125 g/L이다.
결과
초기 발효를 하기로 평가하였다: TIR1,1 작제물 (도 51). 조건은 다음과 같았다: 30ºC, pH 7.0, 및 대략 1.75 mmol O2/L/min의 OUR. 발효는 결과로 10 mg/L의 누적 역가를 유발하였다. 총 알파 및 베타 하부단위체 누적치는 각각 550 및 800 mg/L이었다 (도 52).
ImmTAC 역가에 대한 샤페론 발현의 효과를 측정하기 위하여, 상기 기술된 벡터를 사용한 샤페론의 공발현을 위한 플라스미드가 제공된다. 수많은 공지된 샤페론은 FkpA 단백질, 샤페론 활성을 갖는 펩티딜프로일 시스-트랜스 이소머라아제를 포함하여, ImmTAC 발현과 조합하여 시험되었다.
FkpA 혼화성 플라스미드를 이후, 상기 기술된 TIR1,1 ImmTAC 1 발현 플라스미드로 공-변형시켰다 (도 53) (균주 67A6로). 발효 조건은 도 51 및 상기 기술된 초기 발효에서 사용된 것들과 동일하였다. FkpA tac 프로모터를, 상기 배양물이 200 OD550 에 도달하였을 때 1 mM IPTG로 유도하였다. 항-알파 및 항-베타 가용성 웨스턴 블롯은, 하기를 표지하였다: 알파 및 베타 가용성 하부단위체 둘 모두의 누적치 증가 (가용성 감소된 블롯; 도 54A), (조립된 ImmTAC에 더하여). 역가 분석 또한 하기를 표지하였다: 20 mg/L의 최종 역가로의, 무-샤페론 조건과 비교하여, 조립된 ImmTAC에서의 2배 증가 (도 54B).
발효 공정 조건은 후속 ImmTAC 실험에서 변경되었다 (도 55). 모든 후속 발효에서, 교반 승온은 대략 2.5 mmol O2/L/min의 특이적 OUR 설정점을 표적화하였다. 추가로, 성장 온도를 30°C로부터 25°C의 생산 온도까지 감소시키는 온도 변화를 24시간에서 수행하였다.
상기 기술된 FkpA 혼화성 시스템을 사용하고, 200 OD550에서의 1 mM IPTG의 부가를 포함한 변경된 공정 조건이 시험되었다. 상기 변경된 조건의 사용은, 40 mg/L의 최종 역가로의 이전 공정 조건과 비교하여, 역가의 대략 2배의 증가를 유발하였다 (도 57).
ImmTAC TIR1,1; TIR1,2; 및 TIR2,3에 대하여, ImmTAC의 알파 및 베타 쇄를 암호화하는 플라스미드, 및 FkpA가 작제되고, 67A6를 변형하기 위하여 사용되었다 (도 58). 이러한 플라스미드 작제물에서, FkpA ORF는 알파 ORF 및 phoA 프로모터 제어된 전사의 업스트림이었다. pBR322 플라스미드는 대략 30 사본/세포 (Bolivar et al., Gene, 2:95-113, 1977)에서 전형적으로 유지되고 pACYC 플라스미드는 대략 15 사본/세포 (Chang and Cohen, J. Bacteriol., 134:1141-1156, 1978)에서 전형적으로 유지된다. 이론에 제한되도록 바램 없이, FkpA가 ImmTAC 발현 플라스미드상으로 이동되는 경우 사본 번호는 제조된 FkpA의 양의 증가를 유발할 수 있다는 것이 생각된다.
FkpA ORF를 편입시킨 상기 3개의 ImmTAC TIR 변이체 단일 플라스미드는, 상기 기술된 TIR1,1 혼화성 FkpA 시스템보다 높은 역가를 유발하였다. TIR1,2 및 TIR 2,3 조건은 각각, 대략 50 mg/L의 역가를 유발하였으며 (도 59A), 한편 TIR1,1 조건은 65 mg/L의 역가를 유발하였다 (도 59A). TIR2,3 조건에 대하여, 총 알파 및 베타 하부단위체 누적치는 각각 2.5 및 5.5 g/L이었다 (도 59B). TIR1,1 조건에서, 총 알파 및 베타 하부단위체 누적치는 각각 1 g/L 및 2.5 g/L이었다. TIR1,2 조건에서, 알파 및 베타 하부단위체 누적치는 각각 대략 0.8 g/L 및 3.2 g/L이었다 (도 59B).
가용성 FkpA 발현 (웨스턴 블롯에 의한 검정)에 관한 TIR1,1 단일 플라스미드 및 TIR1,1 혼화성 플라스미드 시스템의 비교는, 상기 단일 플라스미드 시스템이 FkpA 생산량의 증가를 유발하였다는 것을 표지하였다 (도 60A). 가용성 FkpA의 증가는, 이전의 혼화성 플라스미드 시스템과 비교하여, 역가의 추가 증가를 유발하였으며, 65 mg/L의 최종 역가를 달성하였다 (도 60B).
FkpA의 공-발현을 위하여 기재된 혼화성 플라스미드 시스템과 유사하게, 혼화성 플라스미드는, 이전에 기재된 FkpA ORF를 편입시킨 TIR1,1 ImmTAC 1과 조합하여 다양한 공지된 산화환원효소를 스크리닝하기 위해 이용되었다 (도 61). DsbA 단독 및 DsbC과 조합된 DsbA의 공발현은 이전의 FkpA 단독 조건과 비교하여, 20 mg/ml의 유사한 역가 감소를 유발하였다. 그러나, DsbC 단독의 공발현은 80 mg/L의 역가를 유발하였고, 이는 조립된 ImmTAC 생산 내 15-20 mg/L 증가에 상응하였다 (도 62). DsbC의 공발현을 갖는 TIR1,1 단일 플라스미드 내 조립된 역가의 증가는, 이전의 FkpA 단일 TIR2,3 조건에서 나타난 증가된 하부단위체 누적이 개별 하부단위체의 접힘 및 조립에 추가 이점을 제공할 수 있고, 역가를 추가로 증가시킬 수 있다는 가설에 도달하게 한다. TIR2,3 FkpA 단일 플라스미드를 DsbC 혼화성 시스템 (N=4)으로 시험하였고, 이는 110 mg/L의 평균 역가를 유발하였다 (도 63).
중요하게도, 상기 기술된 개선된 공정 조건 및 샤페론 FkpA 및 DsbC의 공발현과 결합하여, 알파 및 베타 하부단위체 TIR의 최적화 (도 55), 는 ImmTAC 1 역가dml 10-배 증가를 유발하였다 (도 64). ImmTAC 1 생산까지의 최적화 단계는 하기를 포함한다: FkpA의 공발현, 공정 변화 (증가된 OUR, 보다 염기성인 pH, 온도 변화), FkpA 및 ImmTAC 1, 누출성 DsbC 발현, 및 증가된 TIR 강도를 갖는 단일 플라스미드 시스템.
상기 최적화는 ImmTAC 1를 사용하여 평가되었다. 제2의, 개별 ImmTAC, ImmTAC 2는 상동한 최적화를 사용하여 시험되었다. 도 65a (알파 쇄 블롯) 및 도 65b (베타 쇄 블롯)에 나타난 바와 같이, 상동한 ImmTAC TIR 및 샤페론 조건은 조립된 ImmTAC 2에 가장 큰 이점을 제공한다.
함께 고려하여, 이들 결과는 DsbC 및 중요 공정 개선점과 함께 FkpA의 공-발현이 이들 효과를 식별하기 위해 다중 ImmTAC 작제물을 이용하여 조립된 ImmTAC의 생산을 증가시킨다는 것을 입증한다.
서열
달리 지칭되지 않는다면, 모든 폴리펩티드 서열 N-말단 내지 C-말단이 제시된다.
달리 지칭되지 않는다면, 모든 폴리펩티드 서열 5’ 내지 3’가 제시된다.
FkpA TIR1
GAATTATGAA GTCCCTGTTT AAAGTGACGC TGCTGGCGAC CACAATGGCC GTTGCCCTGC ATGCACCAAT CACTTTTGCT (서열 번호:1)
FkpA TIR2
GAATTATGAA GTCGCTATTC AAAGTGACGC TGCTGGCGAC CACAATGGCC GTTGCCCTGC ATGCACCAAT CACTTTTGCT (서열 번호:2)
FkpA TIR3 (c13)
GAATTATGAA GTCGCTGTTT AAAGTTACGC TGCTGGCGAC CACAATGGCC GTTGCCCTGC ATGCACCAAT CACTTTTGCT (서열 번호:3)
FkpA 신호 펩티드
MKSLFKVTLLATTMAVALHAPITFA
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Claims (28)

  1. T 세포 수용체 (TCR) 알파 쇄 및 TCR 베타 쇄를 포함하는, 암에 대한 면역 가동화 단클론성 T 세포 수용체 (ImmTAC)를 원핵 숙주 세포에서 생산하는 방법이며,
    (a) 성장 온도 및 성장 교반 속도를 포함하는 성장 기, 및
    생산 온도 및 생산 교반 속도를 포함하는 생산 기
    를 포함하는 조건 하에 상기 숙주 세포를 배양 배지에서 배양하여 상기 ImmTAC의 TCR 알파 쇄 및 TCR 베타 쇄를 발현시켜서, 발현시 상기 TCR 알파 쇄 및 TCR 베타 쇄가 접혀지고 조립되어 상기 숙주 세포에서 생물학적 활성 ImmTAC가 형성되도록 하는 단계이며, 여기서
    상기 숙주 세포는
    (1) ImmTAC의 TCR 알파 쇄를 암호화하는 제1 번역 단위체,
    (2) ImmTAC의 TCR 베타 쇄를 암호화하는 제2 번역 단위체,
    (3) 펩티딜-프롤릴 이소머라아제를 암호화하는 제3 번역 단위체로서, 여기서 펩티딜-프롤릴 이소머라아제는 FkpA 단백질인 제3 번역 단위체, 및
    (4) 단백질 이황화 산화환원효소를 암호화하는 제4 번역 단위체로서, 여기서 단백질 이황화 산화환원효소는 DsbC 단백질인 제4 번역 단위체
    를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고,
    상기 성장 온도는 상기 생산 온도보다 2℃ 내지 10℃ 높고,
    상기 성장 교반 속도는 상기 생산 교반 속도보다 50 rpm 내지 250 rpm 높은 것인 단계, 및
    (b) 상기 숙주 세포로부터 상기 생물학적 활성 ImmTAC를 회수하는 단계
    를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 폴리뉴클레오티드가 프로모터의 3개 사본(copy)을 추가로 포함하며,
    제1 사본이 상기 제1 번역 단위체와 작동가능하게 조합되고,
    제2 사본이 상기 제2 번역 단위체와 작동가능하게 조합되고,
    제3 사본이 상기 제3 번역 단위체와 작동가능하게 조합되어,
    상기 TCR 알파 쇄, 상기 TCR 베타 쇄 및 상기 FkpA 단백질의 전사가 구동되는 것인
    방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 제1, 제2, 및 제3 사본의 프로모터 각각이 유도성 프로모터인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 유도성 프로모터가, IPTG 유도의 부재 하에 상기 TCR 알파 쇄, 상기 TCR 베타 쇄 및 상기 FkpA 단백질의 전사를 구동시키는 IPTG-유도성 프로모터인 방법.
  5. 제3항에 있어서, 상기 유도성 프로모터가, 상기 배양 배지에서 포스페이트가 감손된(depleted) 경우에 상기 TCR 알파 쇄, 상기 TCR 베타 쇄 및 상기 FkpA 단백질의 전사를 구동시키는 Pho 프로모터인 방법.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 폴리뉴클레오티드가 선택가능한 마커를 추가로 포함하고,
    상기 배양 배지가 단일 항생물질로 이루어진 선택제를 포함하여, 상기 숙주 세포가 상기 폴리뉴클레오티드를 보유하도록 유발하는 것인
    방법.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 제1 번역 단위체가 상기 TCR 알파 쇄의 암호화 영역과 작동가능하게 조합된 제1 번역 개시 영역 (TIR)을 포함하고,
    상기 제2 번역 단위체가 상기 TCR 베타 쇄의 암호화 영역과 작동가능하게 조합된 제2 번역 개시 영역 (TIR)을 포함하고,
    상기 제1 및 제2 TIR의 상대적 번역 강도가 1.0 내지 3.0인
    방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 FkpA 단백질이 이. 콜라이(E. coli) FkpA 단백질인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 DsbC 단백질이 이. 콜라이 DsbC 단백질인 방법.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 원핵 숙주 세포가 그람(gram)-음성 박테리아인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 그람-음성 박테리아가 이. 콜라이인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 이. 콜라이가 degpS210A 돌연변이를 갖는 균주인 방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 이. 콜라이가 W3110 △fhuA △phoA ilvG2096 (Valr) △prc spr43H1 △degP △manA lacIQ △ompT △menE degpS210A의 유전자형을 갖는 균주인 방법.
  14. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 TCR 알파 쇄가 TCR 알파 쇄 가변 도메인 및 TCR 알파 쇄 불변 도메인을 포함하고,
    상기 TCR 베타 쇄가 TCR 베타 쇄 가변 도메인 및 TCR 베타 쇄 불변 도메인을 포함하는 것인
    방법.
  15. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 ImmTAC의 2개의 쇄가 적어도 하나의 이황화 결합에 의해 서로 연결되는 것인 방법.
  16. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 ImmTAC가, T 세포에 결합하고 T 세포 반응을 활성화하는 항체 단편을 추가로 포함하는 것인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 항체 단편이 항-CD3 단일 쇄 항체 단편을 포함하는 것인 방법.
  18. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 ImmTAC가, 가공(engineered)되지 않은 TCR의 항원 친화도에 비해 증가된 항원 친화도를 갖도록 가공된 TCR을 포함하는 것인 방법.
  19. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 ImmTAC가 상기 숙주 세포의 주변세포질로부터 회수되는 것인 방법.
  20. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 성장 온도가 상기 성장 기 동안 30℃ 내지 34℃의 범위이고,
    상기 생산 온도가 상기 생산 기 동안 25℃ 내지 29℃의 범위이며, 여기서 상기 성장 온도가 상기 생산 온도보다 2 내지 10℃ 높은 것으로 성장 온도와 생산 온도가 선택되는 것인
    방법.
  21. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 성장 교반 속도가, 성장 기 동안의 숙주 세포에서의 산소 흡수 속도가 생산 기 동안의 숙주 세포에서의 피크 산소 흡수 속도보다 0.5 내지 2.5 mmol/L/min 높게 달성되도록 하는데 충분한 것인 방법.
  22. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    성장 기 동안의 숙주 세포에서의 피크 산소 흡수 속도가 3.5 내지 4.5 mmol/L/min의 범위이고,
    생산 기 동안의 숙주 세포에서의 산소 흡수 속도가 1.0 내지 3.0 mmol/L/min의 범위인
    방법.
  23. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 성장 교반 속도가 상기 생산 교반 속도보다 10% 내지 40% 높은 것인 방법.
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