TR201808458T4 - FC-reseptör bazlı afinite kromatografisi. - Google Patents

Abstract

Burada tarif edildiği üzere, genel olarak afinite kromatografisi ligandı olarak bir neonatal Fc reseptörü (FcRn) ve beta-2-mikroglobulin (b2m)'nin kovalent olmayan, immobilize kompleksinin kullanımı ve örneğin antikorun ve bir referans antikorunun tutulma sürelerinin oranını belirleyerek bir antikorun canlı içi yarı-canlılığının belirlenmesi içindir.

Description

TARIFNAME FC-RESEPTÖR BAZLI AFINITE KROMATOGRAFISI Burada, afinite ligandi olarak immobilize insan neonatal Fc reseptörünü içeren bir afinite kromatografisi kolonu kullanimi tarif edilmektedir ÖNCEKI TEKNIK Genel olarak bir immünoglobulin, iki hafif zincir polipeptidleri (hafif zincir) ve iki agir zincir olarak polipeptidleri (agir zincir) olarak adlandirilan polipeptid içerir. Agir ve hafif zincir polipeptitlerden her biri, bir antijen ile etkilesime girebilen baglanma bölgelerini içeren bir degisken alan (degisken bölge)(genellikle polipeptid zincirinin amino terminali kismi) içerir. Agir ve hafif zincir polipeptitlerin her biri bir sabit bölge (genellikle karboksi terminal parçasi) içerir. Agir zincirin sabit bölgesi, antikorun i) fagositik hücreler gibi bir Fc gama reseptörü (FcyR) tasiyan hücrelere veya ii) ayrica Brambell reseptörü olarak bilinen neonatal Fc reseptörünü (FCRn) tasiyan hücrelere baglanmasina aracilik eder.

Ayni zamanda, bu tür bir bilesen (Clq) gibi klasik kompleman sistemin faktörleri de dahil olmak üzere bazi faktörlere baglanmasina aracilik eder.

Neonatal Fc reseptörü (FcRn) ayrica MHC Sinif I-iliskili reseptör olarak bilinir (inceleme için bkz. Ward, E.S. ve Çalismalar sadece bu reseptörün yetiskin yasami boyunca IgG seviyelerini ve dagilimini düzenlemeye hizmet ettigini degil Junghans, R.P. ve Anderson, C.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA dokularinda› birçok baskar rolleri oldugunu göstermistir` Natl. insan, koyun, inek, fare, domuz ve deve gibi birçok türden izole edilmistir (Adamski, P.M., ve ark., M0l.Immun0I. 37 Schnulle, P.M. ve Hurley, W.F., Vet. Immunol. Immunopathol. 91 2377-2381), bu, reseptörün esas olarak tüm memeli türlerinde mevcut oldugunu gösterir. FCRn'nin çoklu fonksiyonlari, IgG'yI hücreler içindeki iizozomal parçalanmadan ayirma ve plazma zarindaki ekzositik olaylar sirasinda bagli yükü serbest birakma yetenegine baglidir (Ober, R.J., ve ark., Proc. Natl. ticaretinin yollarini ve canli içindeki davranisini degistirme potansiyeli göz önüne alindiginda, antikorlarin tasarimlarinin farelerde yari ömrünü uzatmaya (yukarida bahsedilen Ghetie ve ark.) yönelik daha önceki raporu, biyofarmasötik endüstrisinde yogun ilgi alanina dönüsmüstür (Dali'Acqua, W.F., ve ark., J. baglayici polipeptid varyantlarinda, dimerik Fc baglanma proteinleri ve bunlara iliskin yöntemler tarif edilmistir. WO sayili belgede CDR'de amino asit ornatimi yoluyla izoelektrik nokta antikorunun modifiye edilmesine yönelik bir yöntem tarif füzyon proteinlerinin saflastirilmasi için rekombinant FcRn ve bunun varyantlari tarif edilmistir. Magistrelli, G., ve ark., memeli hücrelerinde IgG baglanma çalismalari için yönlendirilmis immobilizasyonu saglayan güçlü rekombinant FçRn üretimini tarif etmektedir (J. Immunol. Meth. in press, available online 12.09.2011L bir IgC'nin iki agir zincir ile iki FcRn molekülüne baglanmasi ile l:2 stokiyometri ortaya çikar (Huber, A.H., ve ark., J.

Josic, D. ve ark., antikorlarin saflastirilmasi için analitik ve preparatif yöntemleri açiklar (Food Technol. Biotechnol. 39 Roopenian, D.C. Ve ark., neonatal Fc reseptörü yasina gelen Pan Hai, ve ark., insan IgGZ Fc'sinde metionin oksidasyonunun protein A ve FCRn'ye baglanma afinitelerini azaltmasini BULUSUN KISA AÇIKLAMASI Bulusun bir yönü, en az bir PC bölgesini içeren antikorlari veya füzyon polipeptidlerini ayirmak için pozitif dogrusal bir pH gradyani ile bir afinite kromatografisinde bir afinite kromatografisi ligandi olarak bir neonatal FC reseptörünün (FcRn) kovalent olmayan kompleksinin immobilize edilmesi ve beta-Z-mikroglobulinin (b2m) kullanilmasidir, burada bir neonatal Fc reseptörü ve beta-Z-mikroglobulinin kovalent olmayan kompleksi, bir kromatografi materyaline baglanir ve kovalent olmayan kompleks, özel bir baglanma çifti yoluyla kati faza baglanir, burada pH gradyani bir birinci pH degerinden ikinci bir pH degerine kadardir; buradaki birinci pH degeri pH 3.5 ila pH 6.4 arasindadir ve ikinci pH degeri pH 7.4 ila pH 9.5 arasindadir, ve burada bir neonatal Fc reseptörü (FcRn) ve beta-2- mikroglobulinin (b2m) kovalent olmayan kompleksi mono- biyotinile edilir ve kati faz streptavidin ile derive Burada tarif edilen yöntem/kullanim ile, canli içi özelliklerinin yakindan iliskili antikor türlerine göre ayrilmasi, izole edilmesi ve karakterize edilmesi, yani tek veya sinirli sayida amino asit kalintisinda farklilik göstermesinin mümkün oldugu bulunmustur.

Bu yüzden, burada tarif edilen yöntemle izole edilen farkli antikor türleri, yani bir amino asit kalintisi farki, amino asit pozisyonlarini etkileyen FcRn ile ilgili yari-Ömrü karakterize etmek/tanimlamak için kullanilabilir.

Böylece, burada tarif edilen yöntemle, bir ana antikorun farkli varyantlarini ayirmak ve bu varyantlar arasindaki spesifik orani belirlemek mümkündür; bu, bilinen türden yöntemlerle mümkün degildir, çünkü bunlar sadece tek tek türlerin degil, modifikasyonlarin toplamini saglarlar (yani karisimi için kütle spektrometrisi, molekülleri içeren varyant 1'in toplamini saglar, yani tek bir varyanti (1) ve ayrica ikinci varyanti (1/2) içeren varyantlari içerir).

Bu i) rekombinant olarak üretilmis insan beta 2 mikroglobulin ile kombinasyon halinde rekombinant olarak üretilen insan FCRnisinin bir kromatografi destegindeki immobilizasyonu ve ii) dogrusal bir pH gradyaninin kombinasyonu ile elde edilebilir.

Verilen kosullar için bir yabani tip IgGl antikorunun yaklasik 42 dakika ila 49 dakika arasinda bir tutulma süresine sahip Oldugu bulunmustur. Bir düzenlemede IgGl alt sinifinin yabani tipli bir Fc bölgesini içeren bir antikor veya Fc-füzyon proteini yaklasik 45 dakikalik bir tutulma süresine sahiptir.

Indirgenmis FcRn baglanmasi ile modifiye edilmis bir Fc- bölgesine sahip olan bir antikor, daha küçük olan bir tutulma süresine sahipken, gelismis FcRn baglanmasina sahip bir modifiye edilmis Fc-bölgesine sahip bir antikor, daha büyük bir tutulma süresine sahiptir. Bi düzenlemede, bir neonatal Fc reseptörü (FcRn) ve beta-2-mikrogl0bulinin (b2m) kovalent olmayan kompleksi bir kati faza baglanir. Bir düzenlemede, kati faz bir kromatografi materyalidir. Bir düzenlemede, bir neonatal Fc reseptörü (FcRn) ve beta-Z-mikroglobulinin (b2m) kovalent olmayan kompleksi biyotinile edilir ve kati faz Bir düzenlemede, beta-Z-mikroglobulin, FcRn ile ayni türdendir.

Bir düzenlemede antikor, füzyon polipeptidinin bir monospesifik antikor veya antikor fragmani veya füzyon polipeptidinin bispesifik bir antikor veya antikor fragmani veya füzyon polipeptidinin bir trispesifik antikor veya antikor fragmani veya füzyon polipeptidinin bir tetraspesifik antikor veya antikor fragmanidir.

Burada tarif edilen örnek bir yöntem, önceden belirlenmis bir canli içinde yari-canliya sahip bir antikorun seçilmesi için bir kromatografinin gerçeklestirildigi bir yöntem ve bir yabani tip IgGl'e göre belirli bir tutulma süresi penceresi içinde bir tutulma süresine sahip olan bir antikorun seçilmesi için bir yöntemdin SEKILLERIN KISA AÇIKLAMASI Burada tarif edilen bir FcRn kolonu kullanilarak bir kromatografinin egrisinin altinda uygulanan antikor ve alanin dogrusalligini göstermektedir.

Burada tarif edilen FcRn kolonunda anti-IGF-lR antikoru yabani tipinin ve YTE-mutantinin kromatogramlni göstermktedir.

Farkli miktarlarda yari antikor karisimlari içeren farkli antikor preparatlarinln FcRn kromatografisi (A/B/C üst sira), CE-SDS analizinde (A/B/C alt sira) görülebilin Farkli miktarlarda antikor monomeri ve kümeleri içeren farkli antikor preparatlarinln FcRn kromatografisini göstermektedir.

Bir FcRn kromatografisinde tutulma süresinin, kromatografli molekül içindeki FC bölgelerinin sayisina etkisini göstermektedir.

FcRn kromatografisi tutulma süresi üzerinde bir antikorun oksidasyonu üzerine etkisim göstermektedir.

Burada tarif edilen FcRn kolonunda anti-Abeta antikoru yabani tipinin ve HE-mutantinin kromatogramini göstermktedir.

FcRn etkilesiminde Met252 ve Met428 oksidasyonunun etkisini göstermektedir. 2 ay boyunca 40 °C'de saklanmis bir IgGl antikoru (egri 2) numunesinin FcRn kolonuna uygulanmasi, okside IgGl antikorunun bir çift tepesine sahip bir önceki elüsyon türüne y0I açarken, 2 ay boyunca 25 °C'de (egri 1) ve -80 °C'de (egri 3) saklnamis IgGl antikorunun örneklerinin FcRn kolonuna uygulanmasi, nerdeyse üstüste binen tepelere sahip sonraki elüsyona yol açar. Kromatografi kosullari: tampon A (20 mM MES, , tampon B (20 mM HEPES, , 0.5 ml/dk akis, tampon A”dan tampon B'ye geçis: 60 dak (standart).

Gerilmis IgGl antikorunun yüzey plazmon rezonansi (SPR) analizini göstermektedir. 2 ay boyunca 40 °C'de saklanmis IgGl antikorunun bir örneginin BIAcore için SPR analizine uygulanmasi, yabani tip ve Met252 ve Met428 oksitlenmis IgGl antikor türleri için farkli sensorgramlari göstermektedir.

FcRn etkilesiminde antikor kümelerinin etkisim göstermektedir. Orijinal numunedeki anti-IL13Ralfa antikorunun FcRn kromatografik analizi, izole edilmis monomerleri ve izole edilmis kümeleri göstermektedir.

Kromatografi kosullari: tampon A (20 mM MES, 150 mM NaCI, pH 5.5), tampon B (20 mM Tris/HCI, 150 mM NaCI, pH 8.8), 0.5 ml/dk akis, tampon A'dan tampon B'ye geçis: 50 dak (standart).

Anti-IL13RaIfa antikor kümelerinin SPR analizim göstermektedir. Izole edilmis anti-IL13Ralfa antikor monomerlerinin (egri 2) ve izole edilmis anti- numunesinde (3) referans standardi olarak anti- göstermektedir.

FcRn transjenik farelerde Fc mutasyonlarinin farmakokinetikler üzerindeki etkisini göstermektedir.

Yabani tip antikor veya üçlü mutant YTE, grup basina 8 hayvana 10 mg/kg'lik tek bir i.v. bolus enjeksiyonu olarak verildi. Sonuçlar, yabani tip antikor (+++, p <0.00l) ile karsilastirildiginda, ortalama olarak ± standart sapma (SD), ANOVA anlamlilik analizim göstermektedir. A: Serum konsantrasyon-zaman egrisinin altindaki bölge, 0 ila 672 saat arasindadir (AUC (0-672)). B: Terminal yari ömür.

BULUSA AIT DÜZENLEMELERIN DETAYLI AÇIKLAMASI Neonatal FC reseptörü (FcRn) canli içi IgG antikorlarinin metabolik sonu içi n önemlidir.

FcRn afinite kromatografisi, IgG numunelerini tepe alani ve tutulmama süresi profili ile ayirt edebilir. FcRn ve IgG arasindaki etkilesimin laboratuar ortaminda analizine imkan verir ve canli içi farmakokinetiklere iliskin terapötik Bu yüzden, mutant ve yabani ti p IgG' I eri n FcRn afi ni te kromatografisi, canli içi farmakokinetigin yari kantitatif olarak öngörülmesi için kullanilabilir. Ayrica FcRn-IgG etkilesimini izlemek için FcRn afinite kromatografisi Örn. IgG yigin karakterizasyonu veya karsilastirilabilirlik çalismalari için kullanilabilir.

Canli içi IgG ve FcRn arasindaki etkilesim mekanizmasina yakindan benzeyen kosullar ile bir standartlastirilmis pH gradyan FcRn afinite sivi kromatografisi yöntemi bulunmustur.

Insan FcRnisi kolonda afinite ligandi olarak immobilize edilmis ve örnegin pH 5.5 ila pH 8.8 arasinda bir dogrusal pH gradyani uygulanmistir. Örnegin, analitik FcRn afinite kromatografisi, IgG numunelerinin ve varyantlarinin tepe motif ve tutlma süresi profiline göre tanimlanmasini ve karakterizasyonunu saglar.

Yöntem, 1) farkli Ig fragmanlari ile ayni IgG'yI, 2) oksitlenmemis IgG formlarindan oksitlenmis IgG formlarini, 3) monomerlerin kümelerini ve 4) FC bölgesinde varyasyonlari olan antikorlari ayirt edebilir.

Yabani ti p IgG' ye göre varyant I gG' I eri n (Fc bölgesi varyantlari) FcRn afinite kromatografi profilindeki degisikliklerin canli içi farmakokinetik profilin öngördürücüsü oldugu bulunmustur. Bu sonuçlar FcRn afi ni te kromatografisinin FcRn-IgG etkilesimlerinin, IgG bütünlügünün ve böyle bir IgG'nin çogunun karakterizasyonu için yararli yeni bir yöntem oldugunu göstermektedir. terimi, sayisal degeri takip eden bir sonraki +/- % 10'Iuk bir araligi ifade eder. Bir düzenlemede, yaklasik terimi, sayisal degeri takip eden bir sonraki +/- % 5'lik bir araligi ifade polipeptidi elde etmek için bir Fc-bölgesinin en az bir FcRn baglayici kismini içeren bir ana antikor veya füzyon polipeptidindeki bir veya daha fazla amino asit kalintisinin ornatimini, eklenmesini veya çikarilmasi ifade eder. kalintisinin baska bir farkli amino asit kalintisi ile degistirilmesini ifade eder (amino asit kalintisinin degistirilmesi). Degistirilen amino asit kalintisi, bir "dogal olarak olusan amino asit kalintilarf, olabilir ve alanin (ÜÇ harfli kod: ala, bir harf kodu: A), arjinin (arg, R), asparagin (asn, N), aspartik asit (asp, D), sistein (cys, C), glutamin (gln, Q), glutamik asit (glu, E), glisin (gly, G) histidin (his, H), izolösin (ile, I L Iösin (Ieu, L), lisin (liz, K), metionin (met, M), fenilalanin (phe, F), prolin (pro, P), serin (ser, S), treonin (thr, T), triptofan (trp, W), tirosin (tyr, Y) ve valin (val, V)'den olusan gruptan seçilir. belirlenmis bir konumda en az bir amino asit kalintisinin katilimini ifade eder. Bir düzenlemede, ekleme bir veya iki amino asit kalintisinin eklenmesi olacaktir. Eklenen amino asit kalintisi/kalintilari, dogal olarak olusan veya dogal olarak meydana gelmeyen herhangi bir amino asit kalintisi olabilir. belirlenmis bir konumda en az bir amino asit kalintisinin çikarilmasini ifade eder. çesitli antikor yapilarini, örnegin bunlarla sinirli olmamak kaydiyla, monoklonal antikorlar, poliklonal antikorlar, multispesifik antikorlar (örnegin bispesifik antikorlar) ve FCRn -- baglama özellikleri göstermeleri kaydiyla antikor fragmanlarini kapsar. bazik maddelerin eklenmesi veya salinmasi nedeniyle çözeltinin pH degerinin degismesini dengeleyebilen bir maddeyi ifade 340 pozisyonuna uzanan bir antikor agir zincir polipeptidinin parçasini belirtir (Kabat'a göre AB numaralandirma sistemi).

Bir düzenlemede bir CH2 alani, DIZI NO: 1 amino asit dizisine sahiptir: APELLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVWDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQ E STYRWSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAK.

Bir düzenlemede bir CH3 alani, DIZI NO: 2 amino asit dizisine sahiptir: GQPREPQ VYTLPPSRDE LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPG.

Bir antikorun i'sinifi” terimi, bu antikorun agir zincirinin sahip oldugu sabit alan veya sabit bölgenin türünü ifade eder.

Bes ana antikor sinifi bulunur: IgA, IgD, IgE, IgG, ve IgM; ve bunlardan birkaçi alt siniflara (izotiplere), örnegin lgGh immünoglobülin siniflarina karsilik gelen agir zincir sabit alanlari, sirasiyla d, 6, 8, V ve u olarak adlandirilir. alaninin ve CH3 alaninin en az bir kismini içeren, insan kökenli bir immünoglobulin agir zincirinin C-terminal bölgesini belirtir. Bir yapilanmada, bir insan IgG agir zincir Fc bölgesi, Cy5226” dan veya Pr0230' dan, agir zincI ri n karboksil ucuna uzanir. Bir düzenlemede bir FC-bölgesi, DIZI NO: 10 ami no asit dizi si ne sahiptir. Ancak, Fc bölgesi ni n C- terminal I izi ni (Lys447) mevcut olabilir veya olmayabilir.

Burada aksi belirtilmedigi sürece, FC bölgesinde veya sabit bölgedeki amino asit kalintilarinin numaralandirilmasi AB numaralandirma sistemine veya diger adiyla AB indeksine göre olup, Kabat ve ark., Sequences of Protei ns of Immunol ogi cal yayinda tarif edilen sekildedir. daha az bosluk ve uzun yari ömür ile sonuçlanir. FcRn, IM pOIipeptitten olusan bir heterodimerik proteindir: Bir 50 kDa sinif I majör doku uyumluluk kompleksi-benzeri protein (d- FcRn) ve bir 15 kDa ß2-mikroglobulin (ß2m). FcRn, IgGlnin FC alaninin CH2-CH3 bölümüne yüksek afinite ile baglanir. IgG ve FcRn arasindaki etkilesim tam olarak pH,a baglidir ve bir l:2 stokiyometri ortaya çikar (Huber, A.H., ve ark., J. Mol. pH,da (pH <6.5) olusur ve nötr hücre yüzeyinde IgG salinir (yaklasik . Etkilesimin pH-duyarli dogasi geregi, endozomlarin asidik ortami içindeki reseptöre baglanarak hücre içi bozunmadan hücreler içi ne pi nosi toz olan IgG' leri n FcRn aracili korumasini kolaylastirir. FcRn daha sonra hücre yüzeyine IgG'nin geri dönüsümünü ve daha sonra FcRn-IgG kompleksinin hücrenin disindaki nötr pH ortamina maruz kalmasi üzerine kan akisina salinmasini kolaylastirir. olarak AB 243 pOZISYOnUndan AB 261 pozisyonuna ve yaklasik AB 275 pozisyonundan AB pozisyonuna 293 ve yaklasik AB 302 pozisyonundan AB 319 pozisyonuna ve yaklasik AB 336 pozisyonundan AB 348 pozisyonuna ve yaklasik olarak AB 367 pozisyonundan AB 393 pozisyonuna ve AB 408 pozisyonuna ve yaklasik AB 424 pozisyonundan AB 440 pozisyonuna uzanan bir antikor agir zincir polipeptidinin parçasini belirtir. Bir düzenlemede, AB'nin Kabat numaralandirmasina göre asagidaki amino asit kalintilarinin biri veya daha fazlasi, F243, P244, degistirilmistir. büyük ölçüde benzer bir yapiya sahip olan veya burada tanimlanan sekilde bir FC bölgesi içeren agir zincirlere sahip olan bir antikoru ifade eder. “Mentese bölgesi" terimi, CHl alanini ve CH2 alanini birlestiren bir antikor agir zincir polipeptidinin parçasini, örnegin Kabatiin AB numara sistemine göre yaklasik 216 pozisyonundan yaklasik 230 pozisyonuna kadar gösterir. Mentese bölgesi, normal olarak, ayni amino asit dizisine sahip iki polipeptitten olusan bir dimerik moleküldür. Mentese bölgesi genellikle yaklasik 25 amino asit kalintisi içerir ve antijen baglanma bölgelerinin bagimsiz olarak hareket etmesine izin verecek sekilde esnektir. Mentese bölgesi üst, orta ve alt mentese alani olmak üzere üç alana kültürü" terimleri birbirlerinin yerine kullanilabilir ve ekzojen nükleik asidin dahil edildigi hücreleri ve bu tür hücrelerin soylarini ifade eder. Konakçi hücreler olup, bunlar primer dönüstürülmüs hücreyi ve pasaj sayisindan bagimsiz olarak bunlardan türetilen soylari içerir. Soy, nükleik asit içerigi bakimindan bir ana hücreyle tamamen özdes olmayabilir ve mutasyonlar içerebilir. Orijinal olarak dönüstürülmüs hücrede taranan ve seçilenle ayni fonksiyon veya biyolojik aktiviteye sahip olan mutant soy da burada dahi edilmistir.

Bir “hümanize” antikor, insan kökenli olmayan asiri degisken bölgelere (HVR) ait amino asit kalintilari ve insan çerçeve bölgelerine (FR) ait amino asit kalintilari içeren bir kimerik antikoru ifade eder. Belirli yapilanmalarda, bir hümanize antikor, en az bir ve tipik olarak iki degisken domenin büyük ölçüde tamamini içerecek olup, burada HVR'lerin (örnegin CDR'ler) tamami veya büyük ölçüde tamami insan kökenli olmayan bir antikorunkilere karsilik gelir ve FRilerin tamami veya büyük ölçüde tamami bir insan antikorununkilere karsilik gelir. Bir hümanize antikor istege bagli olarak, bir insan antikorundan türetilen bir antikor sabit bölgesinin en az bir kismini içerebilir. Bir antikorun, örnegin bir insan kökenli olmayan antikorun bir “hümanize formu”, hümanizasyona ugratilmis bir antikoru ifade eder. sekliyle, bir antikor degisken domeninin, dizide asiri degisken olan ve/Veya yapisal olarak tanimli ilmekler (“asiri degisken ilmekler") olusturan her' bir bölgesini ifade eder.

Genellikle, dogal dört Zincirli antikorlar alti HVR içermekte olup; bunlarin üçü VHide (HlI H2I H3) ve üçü VL,de (L1, L2, L3) bulunur. HVR,ler genellikle asiri degisken ilmeklere ve/veya “komplementerlik belirleyici bölgelere” (CDR'Ier) ait amino asit kalintilari içermekte olup, bunlarin içinden CDR'ler en yüksek dizi degiskenligine sahiptir ve/Veya antijen tanimasinda rol oynar. Örnek niteligindeki asiri degisken ilmekler, , 53- 55 (HZ) ve (Chothia, C. ve Lesk, A.M., J. MoL Ornek CDR,Ier (CDR-Ll, CDR-L2, CDR-L3, CDR-Hl, CDR-H2 ve CDR- E.A., ve ark., Sequences of Proteins of Immunologicm of Health, Bethesda, MD ( ortaya çikar. VH'deki CDRl hariç olmak üzere, CDR”ler genellikle asiri degisken ilmekler olusturan amino asit kalintilari içerir. CDR'ler ayrica “spesifiklik belirleyici kalintilar” veya “SDR'Ier” içermekte olup, bunlar antijene temas eden kalintilardir. SDR7ler, CDR'lerin kisaltilmis (abbreviated) CDR'Ier veya a-CDR'ler adi verilen bölgelerinde bulunur. Örnek niteligindeki a-CDR'ler (a-CDR-Ll, a-CDR-LZ, a- CDR-L3, a-CDR-Hl, a-CDR-HZ ve a-CDR-H3), Ll'In 31-34, L2'nin 1633) 95-102 amino asit kalintilarinda görüiür. AkSI belirtilmedigi sürece, HVR. kalintilari ve degisken domendeki diger kalintilar (örnegin FR kalintilari) burada yukarida geçen Kabat ve ark. referansli yayinda belirtilen sekilde numaralandirilir.

Bir “birey” veya "hasta” bir memelidir. Memeliler, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla, ehlilestirilmis hayvanlar (örnegin inekler, koyun, kediler, köpekler ve atlar), primatlar (örnegin insanlar ve insan harici primatlar, örnegin maymunlar), tavsanlar ve kemirgenleri (örnegin fareler, hamster ve siçanlar) kapsar. Belirli yapilanmalarda, birey veya hasta bir insandir. mutasyonlar içeren ya da bir nwnoklonal antikor preparatinin üretimi sirasinda ortaya çikabilecek olan ve genellikle küçük miktarlarda olan olasi varyantlar haricinde büyük ölçüde homojen bir antikor popülasyonundan, yani popülasyonu içeren her bir antikorun özdes oldugu ve/Veya ayni epitopu bagladigi bir antikor popülasyonundan elde edilen bir antikoru ifade eder. Tipik olarak farkli belirleyicilere (epitoplar) karsi yöneltilmis farkli antikorlar içeren poliklonal antikor preparatlarinin aksine, bir monoklonal antikor preparatinin her bir monoklonal antikoru, bir antijen üzerindeki tek bir belirleyiciye karsi yöneltilmistir. Bu nedenle, “monoklonal” ifadesi, antikorun büyük ölçüde homojen bir antikor popülasyonundan elde edilmis özellikte oldugunu belirtir ve antikorun, herhangi bir belirli yöntemle üretimini gerektirecek sekilde sinirlandirilmamalidir. Örnegin, mevcut bulusa göre kullanilacak olan monoklonal antikorlar, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla, hibridoma metodu, rekombinant DNA yöntemleri, faj sunum yöntemleri ve insan immünglobülin lokuslarinin tamamini veya bir kismini içeren transgenik hayvanlarin kullanildigi yöntemler de dahil olmak üzere çesitli tekniklerle yapilabilir, monoklonal antikorlarin yapimina yönelik bu tür yöntemler ve diger örnek niteligindeki yöntemler burada tarif edilmektedir. meydana gelen immünglobülin moleküllerini ifade eder. örnegin, dogal IgG antikorlari yaklasik 150.000 daltonluk heterotetramerik glikoproteinler olup, disülfit bagiyla baglanan iki özdes hafif zincir ve iki özdes agir zincirden olusur; N ucundan C ucuna dogru, her bir agir zincirin bir degisken bölgesi (VH) bulunmakta olup, buna ayrica bir degisken agir domen veya agir zincir degisken domeni adi verilir` ve bunun ardindan üç sabit domen (CHl, CH2 ve CH3) gelir. Benzer sekilde, N ucundan C ucuna dogru, her bir hafif zincirin bir degisken bölgesi (VL) bulunmakta olup, buna ayrica bir degisken hafif domen veya bir hafif zincir degisken domeni adi verilir* ve bunun ardindan bir sabit hafif (CL) domen gelir. Bir antikorun hafif zinciri, sabit domeninin amino asit dizisine göre kappa (K) ve lambda (Â) olarak adlandirilan iki türden birine ait olabilir. polipeptid zincirinde bitisik amino asit kalintilarina kovalent olarak baglanan, yukarida listelenen dogal olarak olusan amino asit kalintilari disinda bir amino asit kalintisi anlamina gelir. Dogal olarak meydana gelen amino asit kalintilarinin Örnekleri norlösin, ornitin, norvalin, homoserindir. Diger örnekler Ellman ve ark., Meth. Enzim. 202 amino asit kalintilarinin sentezi için örnek niteligindeki yöntem, örn., yukarida geçen Noren ve ark., Science 244 (1989) 182 ve Ellman ve ark 'da tarif edilmektedir.

Bir referans polipeptit dizisine göre “amino asit dizisi özdeslik yüzdesi (%) ifadesi, bir aday dizide, dizilerin hizalanmasi ve maksimum dizi özdesligini elde etmek üzere gerektigi takdirde bosluklarin eklenmesinin ardindan ve herhangi bir konzervatif ornatimin dizi özdesliginin bir parçasi olarak› dikkate alinmamasiyla birlikte, referans polipeptit dizisindeki amino asit kalintilari ile özdes olan amino asit kalintisi yüzdesi olarak tanimlanir. Yüzde amino asit diZI özdesliginin belirlenmesi amaciyla yapilacak olan hizalama, örnegin, BLAST, BLAST-Z, ALIGN veya Megalign (DNASTAR) yazilimi gibi genel kullanima açik bilgisayar yazilimlari kullanilarak, teknikte uzman kisilerce bilinen yollarla gerçeklestirilebilir. Ilgili teknigin uzmanlari, karsilastirilan dizilerin tam uzunlugu boyunca maksimum hizalamayi saglamak için gerekli olan herhangi bir algoritma da dahil olmak üzere, dizilerin hizalanmasi için uygun parametreleri belirleyebilirler. Bununla birlikte, buradaki amaçlar için, % amino asit dizisi özdeslik degerleri, dizi karsilastirma amaçli bilgisayar programi ALIGN-Z kullanilarak elde edilmistir. ALIGN-Z dizi karsilastirma bilgisayar programi Genentech, Inc. tarafindan yazilmistir ve kaynak kodu ABD Telif Hakki Kaydi No TXU510087 altinda kayitli oldugu ABD Telif Haklari Ofisi, Washington D.C., 20559,da kullanici belgeleriyle birlikte dosyalanmistir. ALIGN-Z programi Genentech, Inc., South San Francisco, Californialdan genel kullanima açilmistir ya da kaynak kodundan derlenebilir.

ALIGN-2 programi, örnegin dijital UNIX V4.0D olmak üzere bir UNIX isletim sistemi üzerinde kullanilmak üzere derlenmelidir.

Tüm dIZI karsilastirma parametreleri ALIGN-Z programi ile belirlenir ve degiskenlik göstermez.

Amino asit dizisi karsilastirmalari için ALIGN-Z programinin kullanildigi durumlarda, belirli bir amino asit dizisi A'nin, belirli bir amino asit dizisi B ile veya buna karsi amino asit dIZISI özdeslik yüzdesi (%) (alternatif' olarak, belirli bir amino asit dIZISI B ile veya buna karsi belirli bir amino asit dizisi özdeslik yüzdesine (%) sahip olan veya içeren belirH bir amino asit dizisi A olarak da ifade edilebilir) asagidaki gibi hesaplanmakta olup: X/Y kesiri Çarpi 100 X, bu programin A, ve B hizalamasi sirasindaki ALIGN-Z dIZI hizalama programi ile ayni eslesme olarak puanlanan amino asit kalintilarinin sayisidir ve Y, B'deki toplam amino asit kalintilarinin sayisidir. Amino asit dizisi Ainin uzunlugunun, amino asit dizisi B'nin uzunluguna. esit olmamasi durumunda, A'dan B'ye % amino asit dizisi özdesliginin, B'den A'ya % amino asit dizisi özdesligine esit olmayacagi anlasilacaktir.

Aksi belirtilmedigi sürece, burada kullanilan tüm % amino asit dizisi özdeslik degerleri ALIGN-Z bilgisayar programi kullanilarak hemen önceki paragrafta açiklandigi gibi elde bilesenin biyolojik aktivitesinin etkili olmasina olanak taniyacak bir biçimde bulunan ve formülasyonun uygulanacagi bir hasta için kabul edilemeyecek düzeyde toksik olan hiçbir ilave bilesen içermeyen bir preparati ifade eder. farmasötik bir formülasyonun içinde bulunan, bir hasta için toksik olmayan, bir aktif bilesenin haricindeki bir bileseni ifade eder. Farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyici örnekleri, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla, bir tampon, bir eksipiyan, stabilizör veya koruyucuyu kapsan asidik) bir pH degerinden baslayip daha yüksek (yani daha az asidik, nötr veya alkalin) bir pH degerinde biten bir pH gradyanini ifade eder. Bir düzenlemede, pozitif dogrusal pH gradyani, yaklasik 5.5'lik bir pH degerinde baslar ve yaklasik 8.8”lik bir pH degerinde sona erer. alkalin) bir pH degerinden baslayip daha düsük (yani nötr veya asidik) bir pH degerinde biten bir pH gradyanini ifade eder.

Negatif dogrusal pH gradyani, yaklasik 7.4'iik bir pH degerinde baslayabilir~ ve yaklasikr 6.0'likr bir pH degerinde sona erebiIiL Burada kullanildigi sekliyle, “tedavi” ifadesi (ve bunun varyasyonlari), tedavi edilen bireyin dogal seyrini degistirmek amaciyla yapilan klinik bir girisimi belirtir ve profilaksi amaciyla ya da klinik patolojinin seyri sirasinda gerçeklestirilebilir. Tedavinin istenen etkileri, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla, hastaligin ortaya çikisinin veya nüksetmesinin önlenmesi, semptomlarin hafifletilmesi, hastaligin dogrudan veya dolayli herhangi bir patolojik sonucunun azaltilmasi, metastazin önlenmesi, hastaligin ilerleme hizinin azaltilmasi, hastalik durumunun iyilestirilmesi ya da palyasyonu ve remisyon ve iyilestirilmis prognozu kapsar. agir veya hafif zincirinin, antikorun antijene baglanmasinda rol oynayan domenini ifade eder. Bir dogal antikorun agir zincir ve hafif zincirinin (sirasiyla VH ve VL) degisken domenleri genellikle benzer yapilara sahip olup, her bir domen dört konzervatif çerçeve bölge (FR) ve üç asiri degisken bölge (HVR) içerir (bkz., Örn., Kindt, T.J., ve ark., Kuby Tek bir VH veya VL domeni antijen baglanma spesifikligi saglamak için yeterli olabilir. Ayrica, belirli bir antijeni baglayan antikorlar, bir VH veya VL domeni kullanilarak, antijeni baglayan antikordan izole edilebilir ve böylece sirasiyla tamamlayici VL veya VH domenlerinin bir kütüphanesi taranabilir (bkz., örn., Portolano, S., ve ark., J. Immunol. 624-628). füzyon polipeptidi” terimleri, bir ana molekülün amino asit dizisinden farkli olan bir amino asit dizisine sahip olan molekülleri ifade eder. Tipik olarak bu tür moleküller bir veya daha fazla degisiklige, eklemeye veya çikarmaya sahiptir.

Bir düzenlemede, modifiye edilmis antikor veya modifiye edilmis füzyon polipeptidi, dogal olarak olusmayan bir Fc- bölgesinin en azindan bir kismini içeren bir amino asit dizisi içerir. Bu tür moleküller, ana antikor veya ana füzyon polipeptidi ile % 1001den az dizi özdesligine sahiptir. Bir düzenlemede varyant antikor veya varyant füzyon polipeptidi, ana antikorun veya ana füzyon polipeptidinin amino asit dizin ile yaklasik % 75 ila % loo'den daha az olan amino asit dizi özdesligine sahip olan, özellikle yaklasik % 80 ila % 100,den daha az, özellikle yaklasik % 85 ila % ioolden az, özellikle yaklasik % 90 ila % 100'den az ve özellikle yaklasik % 95 ila düzenlemede ana antikor veya ana füzyon polipeptidi ve varyant antikoru veya varyant füzyon polipeptidi, bir (bir tek), iki veya üç amino asit kalintisi/kalintilari ile farklilik gösterir.

Insan neonatal Fc reseptörü (FcRn) IgG katabolizmasinda önemli bir rol oynar. Bir IgG laboratuvar ortaminda FcRn baglanma özellikleri/karakteristikleri, canli içi farmakokinetik özelliklerinin göstergesidir. Bu tür laboratuvar ortami yöntemleri, antikor gelistirme sirasinda, canli içi çalismalarda tekrarlanmanin önlenebilecegi (azalan hayvan deneyleri, zaman ve maliyetler) büyük bir degere sahip olacaktir. Simdiye kadar, bu tür analizler genellikle plasmon yüzey rezonansi (SPR) deneyleri kullanilarak gerçeklestirilmistir (Wang, W., ve ark., Drug Metab. Disp. 39 lgG baglanma afinitesinin degerlendirilmesi için kalorimetrik ve asimetrik akis alani akis fraksiyonasyon yöntemleri de tarif edilmistir (Huber, A.H., ve ark., J. Mol. BIOI. 230 (2011) 88-98). Kompleks deneylerin yani sira, SPR ile belirlenen laboratuvar ortaminda. FcRn baglanma. parametreleri ile canli içi antikorlarin serum yari ömrü arasindaki korelasyonu arastiran birkaç çalisma, gelismis baglanma reaksiyonu kosullarina ve uygun modellemeye ragmen, simdiye kadar bu tür bir korelasyonu göstermek için basarisiz olmustur (Gurbaxani, B., ve ark., Mol. Immunol. 43 (2006) 121-124). IgG1*in Fc-bölgesi tasarimi, pH 6lda, IgGl'in FcRn'ye afinitesini ve SPR teknolojisi ile ölçülen nötr pH degerinde iyilesmesini saglamak için sinomolgus maymunlarinda gelistirilmis farmakokinetige yol açmamistir (Yeung, Y.A., ve N434A lgGl varyantinda, pH 7.4'te FcRn'ye önemli ölçüde baglanma olmaksizin, pH 6'da FcRn afinitesinde sadece ilimli artislar, pH 7.4,te FcRn saliminin önemini gösteren primatlarda gelistirilmis farmakokinetiklere yol açmistir (bkz. yukarida Yeung, Y.A.).

Bilinen yöntemlerin bir kombinasyonu, FcRn afinite kromatografisi ile karsilastirilabilir analitik sonuçlar ancak artan karmasiklik ve çabalar pahasina elde edebilir.

Mevcut standart yöntemler endozomal baglanma için asidik. pH gerektiren FcRn baglanma özelliklerinin fizyolojik pH bagimliligini uygun sekilde yansitmaz, ancak IgG için nötr pH, hücre yüzeyinde salinir. PH ortaminin FcRn molekülünün kendi kendine birlesme özellikleri üzerinde etkisi vardir. Mevcut yöntemler, belirli bir pH,ta standart kosullar altinda çalisir ve böylece, IgG-FcRn etkilesiminin saglam bir kinetik dEgerlendirmesini engelleyen kompleks FcRn-IgG etkilesiminin bir anlik görüntüsünü tespit eder. Bu ayni zamanda FcRn afinitesinin laboratuvar ortaminda FcRn analizi ve çesitli çalismalarda bulunan canli içi farmakokinetikleri arasindaki korelasyonunun eksik olmasinin nedenlerinden biri olabilir (yukariya bakiniz). veya anormal baglanma özelliklerini belirten bir kalitatif sonuç saglar, ancak anormal baglanma nedenine veya anormal baglanma ile antikor miktarinin kantitatif bir tahminine iliskin bir fikir vermez. Kütle spektrometresi ayrica IgG molekülünün bozulmamis bütünlügünün kalitatif bilgisini verir.

Aksine, FcRn afinite kromatografisi, numuneyi, 1:2, 121 ve 2:2 stokiyometreleri ve bir numunede bulunan farkli tepelerin ayrilmasini ayarlamak için ayarlanabilen bir pH gradyani dahil olmak üzere stokiyometrelerin bir karisimi içinde baskin bir 2:1 stokiyometrisi ile uygun fizyolojik kosullar altinda analiz etmeyi sagiar. Farkli zirveler, egrinin altindaki ilgili bölgeleri tarafindan kanitatiflestirilebilir ve her bir tepeye karsilik gelen eluat, örnegin islevsellik saptamalari, yeniden kromatografi veya kütle spektrometrik analizi için ikincil analize tabi tutulabilir.

Ek olarak, günümüzde bilinen hastaliklarin çesitliligini tedavi etmek için terapötik rejimler saglamak amaciyla ve gelecekte ortaya çikacak olanlarin, Fc-parçasi içeren polipeptitlerin yani sira, kisiye özel antikorlara da ihtiyaç oldugu ortaya çikmaktadir.

Bir antikorun FcRn baglanma özelliklerinin veya füzyon polipeptidi içeren bir PC parçasinin kisiye özel olabilmesi için, FC parçasi aracili efektör fonksiyonlarinda yer alan kalintilar modifiye edilir ve ortaya çikan modifiye edilmis antikorlar ve füzyon polipeptidleri test edilmelidir. GerekH özellikler yerine getirlmezse ayni islem tekrar yapilir.

Bir düzenlemede FC-parçasi, FcRn'ye baglanmaya aracilik eden bir Fc-bölgesinin fraksiyonudur.

Bu yüzden, modifiye edilmis bir antikorun karakteristik özelliklerinde, basit bir kromatografik yönteme dayanan degisiklikleri modifiye eden ve modifiye antikordaki karakteristigindeki degisiklikleri analiz etmek için canli içi çalismalar gerektirmeyen bir yöntemin saglanmasi avantajli olacaktir.

Bazi durumlarda uzatilmis yari ömre sahip antikorlar arzu edilir. Örnegin, bir tedaviye ihtiyaci olan bir hastanin dolasiminda uzatilmis bir yari ömre sahip olan ilaçlar, azaltilmis dozlama veya artirilmis dozlama araliklari gerektirir. Bu antikorlar ayrica, artirilmis maruziyetin bir hastalik bölgesine, örnegin bir tümöre avantajina sahiptir.

Burada tarif edildigi gibi bir yönüyle afinite kromatografisi ligandi olarak neonatal Fc reseptörü (FcRn) ve beta-2- mikroglobulinin hareketsizlestirilmis kovalent olmayan bir kompleksinin kullanilmasidir.

Afinite kromatografisi ligandi olarak, bir neonatal Fc reseptörü (FcRn) ve beta-2-mikroglobulinin bir hareketsizlestirilmis kovalent olmayan kompleksini içeren bir afinite kromatografisi kolonunun beklenmedik bir stabiliteye sahip Oldugu bulunmustur. En az 100 kromatografi döngüsünde ve performans kaybi olmaksizin yaklasik 200 kromatografi döngüsünde (dengel&me-ayirma-yenilenme) kullanilabilir (seçicilik ve/Veya baglama kapasitesi).

Ornek bir afinite kromatografisi kolonu, matris ve kromatografik fonksiyonel gruplarin matrisine bagli kromatografik fonksiyonel grubun, kovalent olmayan neonatal Fc reseptörü (FcRn) ve beta-Z-mikroglobulin kompleksim içermesiyle karakterize edilir.

Ligand olarak kovalent olmayan neonatal Fc reseptörü (FcRn) ve beta-Z-mikroglobulin kompleksini içeren bir kromatografi materyalinin örnek niteliginde bir kullanimi, antikorun ve bir referans antikorunun tutulma sürelerinin oranini belirleyerek bir antikorun canli içi yari-canliliginin belirlenmesi içindir. Referans antikor, tam uzunluktaki bir insan IgGl antikoru olabilir.

Bir antikorun, bir referans antikor ile iliskili olarak canli içi yari-canliligini belirlemek için örnek niteliginde bir yöntem, antikorun ve referans antikorun bir FcRn afinite kolonunda saptanan tutulam sürelerinin oraninin belirlenmesidir.

Bulusun bir yönü, en az bir FC bölgesini içeren antikorlari veya füzyon polipeptidlerini ayirmak için ligand olarak bir neonatal Fc reseptörü (FcRn) ve beta-Z-mikroglobulin olmayan kovalent kompleksini içeren bir kromatografi materyalinin kullanilmasidir.

En az bir FC parçasini içeren antikorlari veya füzyon polipeptidlerini ayirmak için bir yöntem de burada ayrica tarif edilmektedir Bir düzenlemede ayirma, saflastirma, üretme ve analizden seçilir. Örnek niteliginde bir kullanim, IgGl alt sinifinin antikorlarinin IgG3 alt sinifinin antikorlarindan ayrilmasi için Iigand olarak bir neonatal Fc reseptörü (FcRn) ve beta-2- mikroglobulin olmayan bir kovalent kompleksini içeren bir kromatografi materyalinin kullanilmasidir. Örnek niteliginde bir kullanim, bir antikorun metionin oksidasyonunu belirlemek için ligand olarak bir neonatal Fc reseptörü (FcRn) ve beta-Z-mikroglobulin kovalent olmayan bir kompleksi içeren bir kromatografi materyalin kullanilmasidir. Örnek niteliginde bir yöntem, burada tarif edildigi üzere bir afinite kromatografisi yöntemi kullanilarakr bir antikorunr Fc kismindaki FcRn baglayici oksitlenmis metionin kalintilari üzerindeki etkinin saptanmasi için bir yöntemdir. Örnek niteliginde bir kullanim, bir antikorun oligomerizasyon seviyesini belirlemek için Iigand olarak bir neonatal Fc reseptörü (FcRn) ve beta-Z-mikroglobulin kovalent olmayan bir kompleksi içeren bir kromatografi materyalin kullanilmasidir. Örnek niteliginde bir yöntem, burada tarif edildigi üzere bir antikorun oligomerizasyon seviyesini bir afinite kromatografisi yöntemi kullanilarak saptanmasi için bir yöntemdir.

Genel olarak, burada tarif edilen yöntemin baslangiç noktasi, bir ana antikor veya bir ana füzyon polipeptidinin FcRn'ye baglanarak karakterize edilmesidir. Örnek niteliginde bir kullaninn ana antikor` veya ana füzyon polipeptidine kiyasla FcRn için degistirilmis bir baglanma afinitesine sahip olan en az bir modifiye edilmis antikorlar veya modifiye edilmis füzyon polipeptitleri için bir FC- bölgesinin FcRn baglama kismini içeren bir ana antikor veya bir ana füzyon polipeptidinin modifiye edilmis antikorlar veya modifiye edilmis füzyon polipeptitlerinin bir kütüphanesinin taranmasi için ligand olarak bir kovalent olmayan neonatal FC reseptörü (FcRn) ve beta-Z-mikroglobulin kompleksi içeren bir kromatografi materyalin kullanilmasidir. Örnek niteliginde bir yöntem, ana antikor veya ana füzyon polipeptidi ile karsilastirildiginda FcRn için degistirilmis bir baglanma afinitesine sahip olan modifiye edilmis antikorlar veya modifiye edlmis füzyon polipeptidleri için bir FC-bölgesinin en az bir FcRn baglama kismini içeren bir bir ana antikorun veya bir ana füzyon polipeptidinin modifiye edilmis antikorlari veya modifiye edilmis füzyon polipeptitleri kütüphanesini taramak için bir yöntem olup, yöntem asagidaki adimlari içerir: a)kütüphanenin tekil üyelerim ve ana antikor veya ana füzyon polipeptidini burada tarif edildigi gibi bir FcRn afinite kromatografi kolonuna uygulamak; b) kütüphanenin tekil üyelerini bir pH gradyani ile toplamak ve tekil tutulma sürelerini belirlemek; ve C) ana antikor veya ana füzyon polipeptidine kiyasla FcRn için baglanma afinitesini degistirmis antikorlari veya füzyon polipeptidlerini seçmek.

Bir polipeptitlerin bir karisimindan bir Fc-bölgesinin en az bir FcRn baglayici kismini içeren bir antikor veya bir füzyon polipeptidinin saflastirilmasi için bir yöntem tarif edilmektedir, yöntem, burada tarif edildigi gibi bir FcRn afinite kolonuna karisimin uygulanmasini ve bir Fc-bölgesinin en az bir FcRn baglanma kismini içeren bir antikor gradyani veya füzyon polipeptidini elüte ederek, bir pH gradyani ile ve böylece antikorun veya füzyon polipeptidinin saflastirilmasini içerir. Bir düzenlemede bir Fc-bölgesinin FcRn kismi, bir insan Fc-bölgesi veya bir fare Fc-bölgesi veya bir sinomolgus FC-bölgesi veya bir tavsan Fc-bölgesi veya bir hamster Fc- bölgesindedir. oldugunu göstermektedir.

Bir düzenlemede, reaksiyon/üretim karisimi veya ham veya kismen saflastirilmis kültür süpernatanti, bir birinci pH degerinde FcRn afinite kolonuna uygulanmis ve antikor veya füzyon polipeptidi, ikinci bir pH degerinde FcRn afinite Bir düzenlemede, birinci pH degeri yaklasik pH 5 ila yaklasik pH 6,dir. Bir düzenlemede, birinci pH degeri yaklasik pH 5 veya yaklasik pH 5.5 veya yaklasik pH 6'dir.

Bir düzenlemede, birinci pH degeri yaklasik pH 3.5, yaklasik yaklasik pH 6.1, yaklasik pH 6.2, yaklasik pH 6.3, ve yaklasik pH 6.4'teri seçilir.

Bir düzenlemede, ikinci pH degeri yaklasik pH 8 ila yaklasik pH 9,5'dir. Bir düzenlemede, ikinci pH degeri yaklasik pH 8,5 ila yaklasik pH 9'dir. Bir düzenlemede, ikinci pH degeri yaklasik pH 8,8,dir.

Bir düzenlemede, ikinci pH degeri yaklasik pH 8.0, yaklasik pH yaklasik pH 9.2, yaklasik pH 9.3, yaklasik pH 9.4, ve yaklasik pH 9.5'ten seçilir.

Bir düzenlemede, yaklasik pH 3.5, yaklasik pH 3.6, yaklasik pH yaklasik pH 6.2, yaklasik pH 6.3, ve yaklasik pH 6.4'ün verilen ilk pH degerlerinin her biri, yaklasik pH 8.0, 9.1, yaklasik. pH 9.2, yaklasik. pH 9.3, yaklasik. pH 9.4, ve yaklasik pH 9.5,in verilen ikinci pH degerlerinin her biri ile birlestirilir. Örnek niteliginde bir kullanim, neonatal FC reseptörüne (FcRn) degistirilmis baglanma sergileyen en az bir Fc-bölgesinin bir FCRn-baglayici kismini (örnegin, IgGl gibi bir immünoglobulinin sabit bir alani) içeren antikorlari veya füzyon polipeptidlerini tanimlamak için ligand olarak bir neonatal Fc reseptörü (FcRn) ve beta-Z-mikroglobulin olmayan kovalent bir kompleksi içeren bir kromatografi materyalinin kullanilmasidir. Örnek niteliginde bir yöntem, neonatal Fc reseptörüne (FcRn) degistirilmis baglanma sergileyen bir FC-bölgesinin (örnegin baglayici kismini içeren antikorlari veya füzyon polipeptidlerini tanimlamak için bir yöntemdir.

Bu tür modifiye edilmis antikorlar veya füzyon polipeptidleH bir ana antikor veya füzyon polipeptidine kiyasla FcRn'ye baglanmayi arttirir* veya azaltir veya. bir referans antikoru veya referans füzyon proteini ile karsilastirilir ve dolayisiyla serumda artirilmis veya azaltilmis bir yari ömre sahi pt olur.

FCRn Için artirilmis afiniteye sahip Fc-bölge varyantlarinin(yani bir FCRn kolonunda tutulma süresinin uzamasi ancak yine de bir ana antikor veya referans antikoruna kiyasla burada tarif edildigi gibi pH degeri 7.4 olan bir pH degerinden önce elüte edilir), FcRn için afinitesi azaltilmis olanlara kiyasla daha uzun serum yari ömürlerine sahip olduklari tahmin edilmektedir. FcRn için artirilmis afiniteye sahip FC-bölge varyantlari, memelileri, özellikle insanlari tedavi etme yöntemlerinde uygulamalara sahiptir, burada uygulanan antikorun veya füzyon polipeptidinin uzun yari ömrünün istendigi durumlarda, örnegin kronik bir hastalik veya bozuklugun tedavisinde kullanilir. FCRn için azaltilmis afiniteye sahip FC-bölge varyantlari, memelileri, özellikle insanlari tedavi etme yöntemlerinde uygulamalara sahiptir, burada, canli içi teshis görüntüleme gibi, uygulanan antikorun veya füzyon polipeptidinin kisa bir yarilanma ömrü arzu FcRn baglanma afinitesini düsüren Fc-bölge varyantlari plasentayi geçebilecektir ve bu nedenle özellikle dogmamis çocuklarda gebe kadinlarda hastalik veya bozukluklarin tedavisinde kullanilabilmesi çok muhtemeldir. Ek olarak, azaltilmis FcRn baglanma afinitesi, beyin, böbrek ve/veya karacigere uygulama/nakil için amaçlanan ilaçlar için gerekli olabilir. Örnek niteliginde bir kullanim, vaskülatürden böbrek glomerüllerinin epitelyumu boyunca indirgenmis tasima sergileyen antikorlari veya füzyon polipeptitlerini tanimlamak için Iigand olarak bir neonatal Fc reseptörü (FcRn) ve beta-2- mikroglobulin olmayan bir kovalent kompleksini içeren bir kromatografi materyalinin kullanilmasidir.

Burada tarif edildigi gibi modifiye edilmis bir Fc-bölgesim içeren antikor veya füzyon polipeptidi, vaskülatürden böbrek glomerüllerinin epitelyumu boyunca indirgenmis tasima sergileyebilir. Örnek niteliginde bir kullanim, beynin vasküler bosluga giden kan beyin bariyeri boyunca indirgenmis tasima sergileyen antikorlari veya füzyon polipeptitlerini tanimlamak için mikroglobulin olmayan bir kovalent kompleksini içeren bir kromatografi materyalinin kullanilmasidir.

Burada tarif edildigi gibi modifiye edilmis insan kökenli bir Fc-bölgesini içeren antikor veya füzyon polipeptidi, beynin vasküler bosluga giden kan beyin bariyeri (BBB) boyunca indirgenmis tasima sergileyebilir.

Burada, bir FC-bölgesinin en az bir FcRn baglayici kismini içeren bu tür modifiye edilmis antikorlari ve füzyon polipeptidlerini yapma yöntemleri tarif edilmistir.

Her yönüyle burada tarif edilen bir düzenlemede, bir Fc- bölgesinin en az bir kismi, insan kökenli bir Fc-bölgesinin en azindan bir kismidir. Her yönüyle burada tarif edilen bir düzenlemede, FcRn, insan FcRn”si, sinomolgus FcRn'si, fare FcRn'si, siçan FcRn,SI, koyun FcRn'si, köpek FcRn'si ve tavsan FcRn'sinden seçilen FcRn'dir.

Her yönüyle burada tarif edilen bir düzenlemede, beta-2- mikroglobulin, FcRn ile ayni türdendir.

Her yönüyle burada tarif edilen bir düzenlemede, beta-2- mikroglobulin, FcRn ile farkli türdendir.

Bir düzenlemede bir Fc-bölgesinin Fc bölgeleri veya FcRn baglayici kisimlari herhangi bir izotipin agir zincirlerinden türetilir.

Bir düzenlemede, bir FC-bölgesinin en az bir kismi, insan kökenli bir CH2 alaninin en az amino asit kalintilarini (282- 340) içerir (DIZI NO: Ol, Kabat'a göre numaralandirma). Bir düzenlemede, bir` Fc bölgesinin. en az bir kisnu. bir` tani CHZ alanini içerir (Kabatla göre AB numaralandirmasina göre insan kökenli bir antikor agir zincir polipeptid Fc-bölgesinin amino asit kalintilari (231-340) hakkinda). Bir düzenlemede bir FC bölgesinin en az bir kismi en az bir CH2 alani ve en az bir mentese bölgesi (AB numaralandirmasina göre insan kökenli bir antikor agir zincir polipeptid Fc-bölgesinin amino asit kalintilari (216-230) hakkinda) veya bir CH3 alani (AB numaralandirmasina göre insan kökenli bir antikor agir zincir polipeptidi FC-bölgesinin amino asit kalintilari 341-446 hakkinda) içerir. Bir düzenlemede, bir Fc bölgesinin en az bir kismi, insan kökenli bir antikor agir zincirinin bir CHZ ve bir CH3 alanini içerir. Bir düzenlemede, bir Fc-bölgesinin en az bir kismi, bir insan kökenli bir antikor agir zincir Fc- bölgesinin bir mentese, bir CH2 alani ve CH3 alanini içerir.

Insan kökenli Fc-bölgelerinin Fc bölgeleri veya Fc-bölgesinin insan kökenli kisimlari, IgGl (DIZI NO: 03), IgG2 (DIZI NO: 04), IgG3 (DIZI NO: 05), ve IgG4 (DIZI NO: 06) gibi herhangi bir izotipin agir zincirlerinden türetilebilir. Bir düzenlemedei insan izotipi IgGl'dir.

Bir hedefe spesifik olarak baglanan antikorlar, memelilerde, ilgili antijenin (örn., saflastirilmis antijen, bu tür antijenleri veya bu antijeni kodlayan DNA veya hücresel ekstreleri) Ve istege bagli olarak bir yardimcinin çoklu subkutan veya intraperitonal enjeksiyonlari ile yükseltilebilir.

Bir uygulamada antikor, bir monoklonal antikordur. Önceki tüm yönlerin bir düzenlemesinde pH, yaklasik pH 5.5 ila yaklasik pH 8.8 arasinda bir gradyandir.

Genel olarak, baglanma alani bir Fc-bölgesinin en az bir FCRn baglanma kisminin c-ucuna veya N-ucuna kaynastirilir. Örnek niteliginde bir kullanim, canli içi (birlikte-) hedefleme Için pH 7.4,lük bir pH degerinde FCRn,ye baglanma ile antikorlarin seçilmesi için Iigand olarak bir kovalent olmayan neonatal Fc reseptörü (FcRn) ve beta-2-mikroglobulin kompleksini içeren bir kromatografi materyalin kullanilmasidir. Ortak hedefleme, internalizasyon olabilir.

Genel olarak C-terminal His-Avi Tag (DIZI NO: 08) içeren FCRn'nin (insan FCRn için DIZI NO: 07) çözünebilir hücre disi alani, memeli hücrelerinde ßZ-mikroglobulin (Insan beta-2- mikroglobulin için DIZI NO: 09) ile birlikte eksprese edildi.

Kovalent olmayan FcRn-mikroglobulin kompleksi biyotinlendi ve streptavidin türevli sefaroz üzerine yüklendi.

Her yönüyle burada tarif edilen bir düzenlemede, neonatal Fc reseptörü (FcRn) ve beta-Z-mikroglobulinin kovalent olmayan kompleksi bir kati faza baglanir. metal (paramanyetik, ferromanyetik parçaciklar), cam ve seramik gibi maddelerden, silis gibi jel maddelerden yapilmis parçaciklar (mikropartiküller ve boncuklar dahil) silika, alümina ve polimer jeller gibi jel maddeleri; polimer, metal, cam ve/veya seramikten yapilabilen kilcal damarlar; zeolitler ve diger gözenekli maddeler; elektrot; mikrotitre plakalari; kati seritler; ve küvetler, tüpler veya diger spektrometre numune kaplari. Bir deneyin bir kati faz bileseni, atil kati yüzeylerden. bir “kati destegin", bir molekül ile kimyasal olarak etkilesime girmesi amaçlanan, yüzeyinde en az bir kisim içermesiyle ayirt edilir. Bir kati faz, bir çip, tüp, serit, küvet veya mikrotitre plaka gibi sabit bir bilesen olabilir veya boncuklar ve mikropartiküller gibi sabit olmayan bilesenler olabilir. Mikropartiküller homojen analiz formatlari için kati bir destek olarak da kullanilabilir. Hem kovalent olmayan hem de kovalent protein ve diger maddelerin baglanmasina izin veren çesitli mikropartiküller kullanilabilir. Bu tür parçaciklar, polistiren ve poli (metilmetakrilat) gibi polimer parçaciklari; altin nanopartikülleri ve altin kolloidler gibi altin parçaciklari; ve silika, cam ve metal oksit parçaciklari gibi seramik parçaciklari içerir. Örnegin. bakiniz Martin, C.R., ve ark., Bir düzenlemede, kati destek sefarozdur.

Kovalent olmayan kompleksin kati faza konjugasyonu, N-terminal vasitasiyla ve/veya s-amino gruplari (lizin), farkli lizinlerin s-amino gruplari, antikorun amino asit omurgasinin karboksi-, sülfhidriI-, hidroksil- ve/veya fenolik fonksiyonel gruplari vasitasiyla ve/veya antikorun karbohidrat yapisinin seker alkol gruplari vasitasiyla kimyasal olarak baglanma yoluyla gerçeklestirebilir.

Kovalent olmayan kompleks, spesifik bir baglanma çifti yoluyla kati faza konjuge edilir. Kovalent olmayan kompleks, biyotine konjuge edilir ve kati bir destege immobilizasyon, sabit destek, sabitlestirilmis avidin veya streptavidin ile gerçeklestirilir.

Spesifik bir baglanma çifti (birinci bilesen/ikinci bilesen), streptavidin veya avidin/biyotin, antikor/antijen (bkz., örnegin, Hermanson, G.T., ve ark., Bioconjugate Techniques, Academic Press (1996)), lektin/polisakkarit, steroid/steroid baglayici protein, hormon/hormon reseptörü, enzim/substrat, Burada tarfi edilen kullanimlarda. ve yöntemlerde tarif edildigi üzere FcRn afinite kolonuna baglanan antikorun geri kazanimi, dogrusal bir gradyan elüsyonu ile elde edilir.

Dogrusal gradyan bir pH gradyanidir.

Prensipte, herhangi bir tampon maddesi burada tarif edilen yöntemlerde kullanilabilir.

Fare FC-fare FcRn etkilesimi için kritik olan FC kalintilari, bölgeye yönelik mutajenez ile tanimlanmistir (örnegin bkz. numaralandirmasi) etkilesimde yer almaktadir (Medesan, C., ve insan FC'sinin murin FcRn ile etkilesimi için kritik oldugu çalismalari ile FcRn baglanmasinin gelistirilmesi Dali'Acqua ve ark., tarafindan tarif edilmistir (Dall'Acqua, W.F., ve kalintilarinin etkilesim için çok önemli oldugunu göstermistir (Firan, M., ve ark., Int. Immunol. 13 (2001) 993; Shields, çesitli mutant kalintisi tarif edilmis ve incelenmistir.

Farkli elüsyon tamponlari ile elde edilen farkli antikorlarin tutulma süresi asagidaki tabloda gösterilmistir.

Elüsyon tutulma süresi [dak] Her2antikor( Ox40Lant Abetaant Abetaantikor( mutant) (yabani- 150 mM NaCI 8.8”e ayarlandi 300 mM NaCI 8.8'e ayarlandi 50 mM NaCI belirlenmed Tris/HCI, pH _ 43 44 51 - 8.8'e ayarlandi Elüsyon tutulma süresi [dak] HerZantikor( 0x40Lant Abetaant Abetaantikor( mutant) (yabani- 150 mM NaCI belirlenmed Tris/HCI, pH , 48 48.5 63 76 8.6”ya I ayarlandi Bir düzenlemede, örnegin fosforik asit veya bunlarin tuzlari, asetik asit veya bunlarin tuzlari, sitrik asit veya bunlarin tuzlari, morfolin, 2-(N-morfolin0) etansülfonik asit (MES) veya bunlarin tuzlari, histidin veya bunlarin tuzlari, glisin veya bunlarin tuzlari, tris (hidroksimetil) aminometan (TRIS) veya bunun tuzlari veya (4-(2-hidr0ksietil)-1-piperazin etansülfonik asit (HEPES) veya bunlarin tuzlari gibi farmasötik olarak kabul edilebilir tampon maddeler kullanilir.

Bir düzenlemede tampon maddesi, fOSforik. asit veya bunlarin tuzlari veya asetik. asit veya bunlarin tuzlari veya sitrik asit veya bunlarin tuzlari veya histidin veya bunlarin tuzlarindan seçilebilir.

Bir düzenlemede tampon maddesi, lO mM ila 500 mM arasinda bir konsantrasyona sahiptir. Bir düzenlemede tampon maddesi, 10 mM ila 300 rm4 arasinda bir konsantrasyona sahiptir. Bir düzenlemede tampon maddesi, 10 mM ila 250 mM arasinda bir konsantrasyona sahiptir. Bir düzenlemede tampon maddesi, 10 mM ila 100 mM arasinda bir konsantrasyona sahiptir. Bir düzenlemede tampon maddesi, 15 mM ila 50 mM arasinda bir konsantrasyona sahiptir. Bir düzenlemede tampon maddesi 20 mM konsantrasyona sahiptir.

Bir düzenlemede, birinci çözeltideki tampon maddesi ve ikinci çözeltideki tampon maddesi, ayni tampon maddeSIdIr.

Bir düzenlemede, birinci çözeltideki tampon maddesi ve ikinci çözeltideki tampon maddesi, farkli tampon maddesidir.

Bir düzenlemede, birinci çözeltinin pH degeri yaklasik pH 3,5 ila yaklasik pH 7,5'dir. Bir düzenlemede, birinci çözeltinin pH degeri yaklasik pH 5 ila yaklasik pH 65dir. Bir düzenlemede, birinci çözelti pH degeri yaklasik pH 5.5*dir.

Bir düzenlemede, ikinci çözeltinin pH degeri yaklasik pH 7,0 ila yaklasik pH 9,5'dir.

Bir düzenlemede, ikinci çözeltinin pH degeri yaklasik pH 8 ila yaklasik pH 9'dir.

Bir düzenlemede, ikinci çözeltinin pH degeri yaklasik pH 8,2 ila yaklasik pH 8,8'dir.

Ornek bir birinci çözelti, pH 5.5'e ayarlanmis 20 mM MES ve 150 mM NaCl içerir.

Ornek bir IkInCI çözelti, pH 8.8'e ayarlanmis 20 mM TRISVe 150 mM NaCl içerir.

Ornek bir ikinci çözelti, pH 8.6'e ayarlanmis 20 mM HEPES Ornek bir ikinci çözelti, pH 8.2,e ayarlanmis 20 mM TRIS Bir düzenlemede, tamponlanmis çözelti, ilave bir tuz içerir.

Bir düzenlemede,ilave tuz, örnegin sodyum klorür, sodyum sülfat, potasyum klorür, potasyum sülfat, sodyum sitrat veya potasyum sitrattan seçilir. Bir düzenlemede, 50 mM ila 1000 mM ilave tuzun tamponlanmis çözeltisini içerir. Bir düzenlemede, 50 mM ila 750 mM ilave tuzun tamponlanmis çözeltisini içerir.

Bir düzenlemede, 50 mM ila 500 mM ilave tuzun tamponlanmis çözeltisini içerir. Bir düzenlemede, 50 mM ila 750 mM ilave tuzun tamponlanmis çözeltisini içerir. Bir düzenlemede, yaklasik 50 mM ila yaklasik 300 mM ilave tuzun tamponlanmis çözeltisini içerir.

Bir düzenlemede, birinci ve/veya ikinci çözelti sodyum klorür içerir. Bir düzenlemede, birinci ve/veya ikinci çözelti yaklasik 50 mM ila yaklasik 300 mM sodyum klorür içerir.

Tuz ve tampon maddesinin türünün tutulma süresini ve çözünürlügü etkiledigi bulunmustur. Antikorlarin FcRn'ye baglanmasi için optimal bir tuz konsantrasyonu belirlenebilir (. Eger tuz konsantrasyonu FcRn'ye daha yüksek ( baglanirsa azaltilir/daha kisa bir tutulma süresi elde edilir. Ayni durum daha düsük tuz konsantrasyonu için de geçerlidir (50 mM). Test edilen tüm antikorlar için 20 mM HEPES pH 8.6 uzamis tutulma süresidir.

Sekil l'den görülebilecegi gibi, uygulanan antikor miktari, elüte edilen tepe egrisinin altindaki alana dogrusal bir korelasyon göstermektedir.

Sekiz antikor, eksiksiz antikor olarak ve enzim IDES ile ayrildiktan sonra analiz edildi. Ayrilma SDS page ve analitik SEC ile kontrol edildi. Antikorun FC kismi ve Fab kismi preparatif SEC ile ayrildi. Asagidaki Tabloda, Fab kisminin ve FC kisminin eksiksiz antikorunun tutulma süreleri verilmistir. antikorlar tutulma süresi [dak] antikor Fc kismi Fab kismi Her2antik0r(l253H- baglanma yok Belirlenmedi Belirlenmedi anti-IGF-lR antikor anti-ILl3Rd . 44,5 45 baglanma yok antikor anti-Her2 antikor 45 45 baglanma yok anti-6R antikor 45 45 baglanma yok antikorlar tutulma süresi [dak] antikor Fc kismi Fab kismi anti-OX4OL antikor 45 45 baglanma yok anti-Abetaantikor . _ 45 45 baglanma yok (yabani-tip) Abetaantikor(YTE- 52 baglanma yok Genel olarak yabani tip FC kismina (IgGl veya IgGZ veya IgG4) sahip antikorlarin tutulma süresi 45 dakika ila 49 dakika arasinda degisir (36 antijene karsi 35 terapötik antikor ile test edildi, veriler gösterilmemistir).

Asagidaki tabloda, kolon materyali grami basina immobilize edilmis FcRn reseptörü miktarina göre tutulma süresi gösterilmektedir. elüsyon tutulma süresi [dak] 150 mM NaCl HerZantikor( 0x40Lantik Abetaanti Abetaantikor( Tris/HCI, pH mutant) (yabani- 8.8'e tip) ayarlandi tepe 1 tepe 2 1.2 mg FcRn/g _ _ kati faz 3 mg FcRn/g kati faz 6 m9 FCRn/g . . belirlenmedi 48,5 49 53 74 kati faz elüsyon tutulma süresi [dak] 150 mM NaCl Her2antikor( 0x40Lantik Abetaanti Abetaantikor( Tris/HCI, pH mutant) (yabani- 8.8'e tip) ayarlandi tepe 1 tepe 2 12 mg FcRn/g _ _ belirlenmedi 48,5 49 58 75 kati faz Bu yuzden, örnek niteliginde bir kullanim, FAB modifikasyonunu tespit etmek için Iigand olarak bir neonatal Fc reseptörü (FcRn) ve beta-Z-mikroglobulin kovalent olmayan bir komplekü içeren bir kromatografi materyalin kullanilmasidir. Bir düzenlemede modifikasyon glikosilasyon veya yük dagilimidir.

Genel olarak, yöntemlerde tutulma süresi ve burada tarif edilen kullanimlar, pH gradyaninin dikligine ve kullanilan tuz konsantrasyonuna baglidir. Yabani tip antikor referans olarak kullanilmakta ve daha zayif bir baglama daha kisa bir tutulma süresi (= daha önce elüsyon) ile belirtilir , oysa daha kuvvetli bir baglanma daha uzun bir tutulma süresi (= daha sonra elüsyon) ile belirtilmekle birlikte pH 7.4'ün pH degerinden daha önce belirtilmektedir. oldugu ve modifiye edilmis tutulma süreleri gösterdigi bulunmustur. Örnegin anti-Abeta antikoru mutanti YTE, arttirilmis bir tutulma süresi gösterir. Anti-Abeta antikoru YTE-mutantinin ikinci tepesi, Fab bölümünde ilave edilen bir glikosilasyon bölgesine baglidir. Örnegin anti-IGF-lR antikoru mutanti YTE, arttirilmis bir tutulma süresi gösterir (bkz. Sekil 2). antikor tutulma süresi [dak] anti-IGF-lR antikor 44,5 (yabani-tip) anti-IGF- 1Rantik0r(YTE- 57,5 anti-Abeta antikor 45 (yabani-tip) anti-Abeta antikor (YTE- YTE-mutanti terimi üçlü mutant M252Y/s254T/T256E'yi ifade Burada tarif edildigi üzere FcRn kolonu ile FcRn baglanmasi ile ilgili amino asitlerin tanimlanmasinin ve mutantlarin degistirilmemis yabani tip antikor ile karsilastirilmasinin mümkün oldugu bulunmustur. Örnek niteliginde bir kullanim, FcRn baglanmasi ile IIgIH amino asitleri tanimlamak ve degistirilmemis yabani tip antikor ile karsilastirildiginda mutantlari siralamak için mikroglobulin olmayan bir kovalent kompleksini içeren bir kromatografi materyalinin kullanilmasidir.

Bir anti-HerZ antikoru ile elde edilen sonuçlar, asagidaki tabloda gösterilmektedir (örn., örnek referans olarak bkzWO mutasyon tutulma süresi [dak] tutulma süresi M252D baglanma yok - 5254D baglanma yok - R255D 41.4 89 M252H 43.6 94 K288E 45.2 98 L309H 45.5 98 E258H 45.6 99 T256H 46.0 99 K290H 46.2 100 D98E 46.2 100 yabani tip 46.3 100 K317H 46.3 100 E430H 46.4 100 T307H 47.0 102 N434H 52.0 112 FcRn kolonundan geç elüsyon gösteren antikorlarin, kolonunda uzun bir süresine yani FcRn sahip olan antikorlarin, canli içi daha uzun bir yari ömre sahip oldugu bulunmustur. gösterilmistir. içi veriler asagidaki tabloda antikor tutulma suresi [dak] [h] anti-Abeta antikor . . 45.5 103 +/- 51 (yabani tip) anti-Abeta antikor (YTE-mutasyon) anti-IGF-1R antikor . . 45.5 97 +/- 9 (yabani tip) anti-IGF-lR antikor 58 211 +/- 41 (YTE-mutant) Örnek niteliginde bir kullanim, bir antikorun canli içi yari ömrünü belirlemek için ligand olarak bir neonatal Fc reseptörü (FcRn) ve beta-2-mikroglobulin kovalent olmayan bir komplekü içeren bir kromatografi materyalin kullanilmasidir.

FC kisminda YTE-mutasyonlar ile yabani tip IgG ve IgG varyantlari ile yapilan laboratuvar ortaminda ve canli içi deneyler, FcRn afinite kromatografisindaki bulgularin insan FcRn için transjenik fareler ile canli içi farmakokinetik çalismalarinkilerle yari kantitatif bir korelasyon göstermesine Izin verdi (Spiekerman, G.M., ve ark. J. Exp YTE-mutasyonu, oldukça uzun bir yari ömre ve daha yavas plazma atilimina yol açar. Daha UZun canli için yari ömür, FcRn kromatografisinde daha uzun bir tutma süresine karsilik gelmektedir. Yakin zamanda FC tarafindan tasarlanmis bir transtuzumab varyantinin uzatilmis bir yari ömrünün, akis sitometrisi ile ölçüldügü üzere FcRn,ye laboratuvar ortaminda baglanmayi arttirdigi gösterilmistir (Petkova, S.B., ve ark., afinitesine sahip anti-VEGF IgGl antikor bevasizumabin bir varyantinin, insan FcRn transgenik farelerinde bes kat daha uzun bir yari ömre ve sinomolgus maymunlarinda üç kat daha uzun bir yari ömre sahip oldugu gösterilmistir (Zalevsky, J., çikarilmasinin, burada tarif edildigi üzere bir FcRn kolonu kullanilarak elde edilebilecegi bulunmustur. Ornek bir FcRn kolon kromatografisi, Sekil 3'te gösterilmistir. Örnek niteliginde bir kullanim, IgG preparatlarindan yari antikorlarin uzaklastirilmasi için ligand olarak bir neonatal Fc reseptörü (FcRn) ve beta-Z-mikroglobulin kovalent olmayan bir kompleksi içeren bir kromatografi materyalin kullanilmasidir.

Oligomerlerin ve kümeleri burada tarif edildigi üzere FcRn kromatografisi ile ayrilabilecegi bulunmustur (bkz. Sekil 4). Örnek. niteliginde bir kullaninn IgG preparatlarindan antikor kümeleri ve antikor oligomerlerinin uzaklastirilmasi için ligand olarak bir neonatal Fc reseptörü (FcRn) ve beta-2- mikroglobulin kovalent olmayan bir kompleksi içeren bir kromatografi materyalin kullanilmasidir.

Tutma süresinin, analit molekülünde bulunan FC parçalarinin sayisindan etkilendigi bulunmustur. Bu, bir veya iki Fc kismsi içeren yapilar kullanilarak gösterilmistir (bkz. Sekil 5).

Oksidasyonun FcRn baglanmasi üzerinde bir etkisi oldugu Ve FcRn kolonunda gösterilebildigi bulunmustur (bkz. Sekil 6).

Antikor formatinin FcRn kolonuna baglanmasinda bir etkisi olmadigi gösterilmistir. Bu, delik içine topuz formati ve birkaç bispesifik antikor formati için gösterilmistir. Bu nedenle, yeni antikor formatlarinin degerlendirilmesi için FcRn sütunu kullanilabilir.

Kompleks mono-biyotinlendi.

Bir düzenlemede, ligand olarak bir neonatal Fc reseptörü (FcRn) ve beta-Z-mikroglobulinin kovalent olmayan bir kompleksini içeren kromatografi materyali, yöntemlerde en az 100 devirlik bir stabiliteye sahiptir ve burada tarig edildigi sekliyle kullanmaktadir. Bir döngü, birinci pH degerinden, ilgili yöntemin ikinci pH degerine olan bir pH gradyani veya materyalin yenilenmesi için, yöntemin veya kullanimin nihai kosullarindan daha fazla kosul degisikligi gerektirmeyen. bir kullanimdir. Bu yüzden, bir düzenlemede, bir döngü yaklasik pH degeri pH 5,5,ten yaklasik pH degeri 8,8'e kadar olan bir pH gradyanidir. 252 pozisyonunda M'den H' ye bir amino asit degisiminin, 428 pozisyonunda M' den E' ye bir amino asit degisimi ile kombinasyon halinde kisaltilmis bir tutulma süresi ile sonuçlandigi bulunmustur (bkz. Sekil 7).

Oksidasyon ürünleri Met252 ve Met428 ile antikor numunesi, SPR teknigi ve FcRn afinite kromatografisi arasindaki farki göstermektedir. Numunelerin SPRV analizi, referans standardi ile karsilastirildiginda, numunenin yaklasik % 20'sinin baglanmasi için nispi bir fark saptanmis olsa da, bu numunenin heterojenligine iliskin bir öngörü saglamamaktadir. Aksine, ayni numunenin FcRn afinite kromatografisi, referans standardin tutulma süresinde iki ayrik tepe gösterdi ve ikinci tepe, gerilimli numunede antikorun daha düsük pH'ta FCRn kolon materyali ile daha zayif bir etkilesimini gösterecek sekilde önemli ölçüde sola kaymistir.

Burada tarif edildigi üzere, ligand olarak neonatal Fc reseptörünün (FcRn) kovalent olmayan bir kompleksi ve beta-2- mi krogl obul i n içeren bi r kromatografi materyal i, anti kor fragmanlarinin izolasyonu/ayrilmasi için kullanilabilir ve bu nedenle, geleneksel Protein A afinite kromatografisine bir alternatif saglar. Ek olarak burada tafir edildigi üzere kromatografi materyali kullanilarak ayirma, geleneksel Protein A afinite kromatografisine kiyasla, pH degeri gibi daha fizyolojik kosullarda gerçeklestirilebilir.

Ligand olarak neonatal Fc reseptörünün (FcRn) kovalent olmayan bir kompleksi ve beta-2-mikrogl0bulin içeren bir kromatografi materyali, yük varyantlari, glikozilasyon ve deamidasyon gibi modifikasyonlari içeren antikor türlerinin belirlenmesi/ayrilmasi/zenginlestirilmesi için kullanilabilir.

Belirli bir antikor türünün zenginlestirilmesi için seçilen pH gradyanina (baslangiç/bitis pH degeri) bagli olmak üzere mikroglobulin olmayan kovalent bir kompleksi içeren kromatografi materyali kullanilabilir.

Ligand olarak neonatal Fc reseptörünün (FcRn) kovalent olmayan bir kompleksi ve beta-Z-mikroglobulin içeren bir kromatografi materyali, antikor türlerinin moleküler agirlik degisimi/farki ile izolasyonu/zenginlestirilmesi için kullanilabilir.

Ligand olarak neonatal Fc reseptörünün (FcRn) kovalent olmayan bir kompleksi ve beta-Z-mikroglobulin içeren bir kromatografi materyali, moleküldeki FcRn baglanma alaninin sayisina göre antikorlarin izolasyonu/zenginlestirilmesi için kullanilabilir.

Ligand olarak neonatal Fc reseptörünün (FcRn) kovalent olmayan bir kompleksi ve beta-2-mikrogl0bulin içeren bir kromatografi materyali,amino asit modifikasyonlarinin izolasyonu için kullanilabilir.

Ligand olarak neonatal Fc reseptörünün (FcRn) kovalent olmayan bir kompleksi ve beta-Z-mikroglobulin içeren bir kromatografi materyali, delik deligi dimerleri ve yari antikorlar gibi bispesifik antikor yanlis eslestirilmesinin ayristirilmasi/ayristirilmasi için kullanilabilir. Örnek yapilanmalar 1. Bir pozitif dogrusal pH gradyani ile bir afinite kromatografisinde afinite kromatografisi ligandi olarak bir neonatal Fc reseptörü (FcRn) ve beta-2-mikroglobulin (b2m)”nin hareketsiz bir kovalent olmayan kompleksinin kullanilmasi.

Madde l'e göre kullanim olup, özelligi; en az bir FC bölgesini içeren antikorlari veya füzyon polipeptitlerim ayirmak için pozitif bir dogrusal pH gradyani ile bir afinite kromatografisinde olmasiyla karakterize edilmektedin Madde 1 ila Z'den herhangi birine göre kullanim olup, özelligi; neonatal FC reseptörü ve beta-Z-mikroglobulinin, insan kökenin veya fare kökenin veya sinomolgus kökenin veya siçan kökenin veya tavsan kökeninin her birinin bagimsiz olmasiyla karakterize edilmektedir.

Madde 1 ila 3'den herhangi birine göre kullanim olup, özelligi; beta-Z-mikroglobulinin neonatal Fc reseptörü ile ayni türden olmasiyla karakterize edilmektedir.

Madde 1 ila 4'ten herhangi birine göre kullanim. olup, özelligi; neonatal Fc reseptörü ve beta-Z-mikroglobulinin, her biri birbirinden bagimsiz olarak 0 ila 10 amino asit kalintisi modifikasyonu ile insan yabani tip neonatal FC reseptörü ve insan yabani tip beta-2-mikroglobulin olmasiyla karakterize edilmektedir.

Madde 1 ila 5'ten herhangi birine göre kullanim. olup, özelligi; bir neonatal FC reseptörünün (FcRn) ve beta-2- mikroglobulinin (b2m) kovalent olmayan kompleksi bir kati faza baglanmasi ile karakterize edilmektedir.

Madde 6,ya göre kullanini olup, özelligi; kati fazin bir kromatografi materyali olmasiyla karakterize edilmektedir.

Madde 6 ila 7'den herhangi birine göre kullanim. olup, özelligi; bir neonatal FC reseptörünün (FcRn) ve beta-2- mikroglobulinin (b2m) kovalent olmayan kompleksinin biyotinlenmesi ve kati fazin streptavidin ile deriye edilmesiyle karakterize edilmektedir.

Madde 1 ila 8'den herhangi birine göre kullanim olup, özelligi; pH gradyaninin bir birinci pH degerinden ikinci bir pH degerine kadar olmasi; birinci pH degerinin yaklasik pH 3.5 ila yaklasik pH 7.5 arasinda olmasi ve ikinci pH degerinin yaklasik pH 6.0 ila yaklasik pH 9.5 arasinda olmasiyla karakterize edilmektedir.

Madde 1 ila 9'dan herhangi birine göre kullanim. olup, özelligi; birinci pH degerinin yaklasik pH 5.5 ve ikinci pH degerinin yaklasik 8.8 olmasiyla karakterize edilmektedir.

Madde 1 ila 10,dan herhangi birine göre kullanim olup, özelligi; kullanimin, bir antikorun canli içi yari ömrünün, anti korun tutulma süreleri ni n ve bi r referans anti korun oraninin belirlenmesi için olmasiyla karakterize edilmektedir.

Madde 1 ila 10'dan herhangi birine göre kullanim olup, özelligi; kullanimin, bir antikorun metionin oksidasyonünün belirlenmesi için olmasiyla karakterize edilmektedir.

Madde 1 ila 10'dan herhangi birine göre kullanim. olup, özelligi; kullanimin, bir antikorun oligomerizasyon seviyesinin belirlenmesi için olmasiyla karakterize edilmektedir.

Madde 1 ila 10,dan herhangi birine göre kullanim Olup, özelligi; ana antikor veya ana füzyon polipeptidine kiyasla FcRn için degistirilmis bir baglanma afinitesine sahip olan en az bir modifiye edilmis antikorlar veya modifiye edilmis füzyon pol i pepti tl eri içi n bi r FC-bölgesinin FcRn baglama kismini içeren bi r ana anti kor veya bi r ana füzyon polipeptidinin modifiye edilmis antikorlar veya modifiye edilmis füzyon polipeptitlerinin bir kütüphanesinin taranmasi için olmasiyla karakterize edilmektedir.

Madde 1 ila 10'dan herhangi birine göre kullanim olup, özelligi; kullanimin, neonatal Fc reseptörüne degistirilmis baglanma sergileyen bir Fc-bölgesinin en az bir FCRn baglayici kismini içeren antikorlari veya füzyon polipeptitlerini tanimlamak için olmasiyla karakterize edilmektedir.

Madde 1 ila 10'dan herhangi birine göre kullanim olup, özelligi; kullanimin, IgG preparatlarindan yari antikorlarin uzaklastirilmasi için olmasiyla karakterize edilmektedir Madde 1 ila 10'dan herhangi birine göre kullanim. olup, özelligi; kullanimin, IgG preparatlarindan antikor kümelerinin ve antikor oligomerlerinin uzaklastirilmasi için olmasiyla karakterize edilmektedir.

Madde 1 ila l7'den herhangi birine göre kullanim olup, özelligi; füzyon polipeptidinin bir` monospesifik antikor veya antikor fragmani veya füzyon polipeptidinin bISpeSIfIk bir antikor veya antikor fragmani veya füzyon polipeptidinin bir trispesifik antikor veya antikor fragmani veya füzyon polipeptidinin bir tetraspesifik antikor veya antikor fragmani olmasiyla karakterize edilmektedir Bir negatif dogrusal pH gradyani ile bir afinite kromatografisinde afinite kromatografisi ligandi olarak bir neonatal Fc reseptörü (FcRn) ve beta-Z-mikroglobulin (b2m)”nin hareketsiz bir kovalent olmayan kompleksinin kullanilmasi.

Madde 19'e göre kullanim olup, özelligi; en az bir Fc bölgesini içeren antikorlari veya füzyon polipeptitlerini ayirmak için negatif bir dogrusal pH gradyani ile bir afinite kromatografisinde olmasiyla karakterize edilmektedin Madde 19 ila 20'den. herhangi birine göre kullanimi olup, özelligi; neonatal Fc reseptörü ve beta-2-mikroglobulinin, insan kökenin veya fare kökenin veya sinomolgus kökenin veya siçan kökenin veya tavsan kökeninin her birinin bagimsiz olmasiyla karakterize edilmektedir.

Madde 19 ila 21'den herhangi birine göre kullanimi olup, özelligi; beta-Z-mikroglobulinin neonatal Fc reseptörü ile ayni türden olmasiyla karakterize edilmektedir.

Madde 19 ila 22'ten herhangi birine göre kullanini olup, özelligi; neonatal Fc reseptörü ve beta-Z-mikroglobulinin, her biri birbirinden bagimsiz olarak 0 ila 10 amino asit kalintisi modifikasyonu ile insan yabani tip neonatal Fc reseptörü ve insan yabani tip beta-2-mikroglobulin olmasiyla karakterize edilmektedir.

Madde 19 ila 23'ten herhangi birine göre kullanini olup, özelligi; bir neonatal Fc reseptörünün (FCRn) ve beta-2- mikroglobulinin (b2m) kovalent olmayan kompleksi bir kati faza baglanmasi ile karakterize edilmektedir.

Madde 24'ya göre kullanim olup, özelligi; kati fazin bir kromatografi materyali olmasiyla karakterize edilmektedir.

Madde 24 ila 25'den herhangi birine göre kullanini olup, özelligi; bir neonatal Fc reseptörünün (FcRn) ve beta-2- mikroglobulinin (b2m) kovalent olmayan kompleksinin biyotinlenmesi ve kati fazin streptavidin ile derive edilmesiyle karakterize edilmektedir.

Madde 19 ila 26'den herhangi birine göre kullanini olup, özelligi; pH gradyaninin bir birinci pH degerinden ikinci bir pH degerine kadar olmasi; birinci pH degerinin yaklasik pH 7.0 ila yaklasik pH 8.5 arasinda olmasi ve ikinci pH degerinin yaklasik pH 5.5 ila yaklasik pH 6.9 arasinda olmasiyla karakterize edilmektedir.

Madde 19 ila 27'dan herhangi birine göre kullanini olup, özelligi; birinci pH degerinin yaklasik pH 7.4 ve ikinci pH degerinin yaklasik 6.0 olmasiyla karakterize edilmektedir.

Madde 19 ila 28'dan herhangi birine göre kullanimi olup, özelligi; kullanimin, bir antikorun canli içi yari ömrünün, antikorun tutulma sürelerinin ve bir referans antikorun oraninin belirlenmesi için olmasiyla karakterize edilmektedin Madde 19 ila 28'dan herhangi birine göre kullanimi Olup, özelligi; kullanimin, bir antikorun metionin oksidasyonunun belirlenmesi için olmasiyla karakterize edilmektedir.

Madde 19 ila 28'dan herhangi birine göre kullanini olup, özelligi; kullanimin, bir antikorun oligomerizasyon seviyesinin belirlenmesi için olmasiyla karakterize edilmektedir.

Madde 19 ila 28'dan. herhangi birine göre kullanini olup, özelligi; ana antikor veya ana füzyon polipeptidine kiyasla FCRn için degistirilmis bir baglanma afinitesine sahip olan en az bir modifiye edilmis antikorlar veya modifiye edilmis füzyon pol i pepti tl eri içi n bi r FC-bölgesinin FCRn baglama kismini içeren bir ana antikor veya bir ana füzyon polipeptidinin, modifiye edilmis antikorlar veya. modifiye edilmis füzyon polipeptitlerinin bir kütüphanesinin taranmasi için olmasiyla karakterize edilmektedir.

Madde 19 ila 28'dan herhangi birine göre kullanini olup, özelligi; kullanimin, neonatal FC reseptörüne degistirilmis baglanma sergileyen bir Fc-böigesinin en az bir FCRn baglayici kismini içeren antikorlari veya füzyon pOIIpeptitlerini tanimlamak için olmasiyla karakterize edilmektedir.

Madde 19 ila 28'dan herhangi birine göre kullanimi olup, özelligi; kullanimin, IgG preparatlarindan yari antikorlarin uzaklastirilmasi için olmasiyla karakterize edilmektedir.

Madde 19 ila 28'dan herhangi birine göre kullanini olup, özelligi; kullanimin, IgG preparatlarindan antikor kümelerinin ve antikor oligomerlerinin uzaklastirilmasi için olmasiyla karakterize edilmektedir.

Madde 19 ila 35'den. herhangi. birine göre kullanimi olup, özelligi; füzyon poI i pepti di ni n bi r monospesi fi k anti kor veya antikor fragmani veya füzyon polipeptidinin bispesifik bir antikor veya antikor fragmani veya füzyon poI i pepti di ni n bi r tri spesi fi k anti kor veya anti kor fragmani veya füzyon polipeptidinin bir tetraspesifik antikor veya antikor fragmani olmasiyla karakterize edilmektedin göre kullanimi olup, özelligi; kullanimin, IgGl alt sinifinin antikorlarinin IgG3 alt sinifinin antikorlarindan ayrilmasi için olmasiyla karakterize edilmektedir. 1.Antikor Fragmanlari Belirli düzenlemelerde, bir füzyon polipeptidi bir antikor fragmani içerir.Antikor fragmanlari, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, FV ve SCFV fragmanlarini ve asagida tarif edilen diger fragmanlari kapsar.Belirli antikor parçalarini incelemek için bkz. Hudson, incelemek için, bkz. Orn., Plueckthun, A.i In The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg ve Moore (eds.), reseptörü baglayan epitop kalintilari içeren ve canli içi yari ömrü arttirilmis olan Fab ve F(ab')2 fragmanlariyla ilgiH tartisma için bkz. US 5,869,046.

Diakorlar, bivalan veya bispesifik olabilen iki antijen baglanma bölgesine sahip antikor fragmanlaridir.Bkz. Örn., EP tetrakorlar da burada tarif edilmistir; Hudson, P.J. Et al., Tek domenli antikorlar, agir zincir degisken domeninin tamamini veya bir kismini veya bir antikorun hafif zincir degisken domeninin tamamini veya bir kismini içeren antikor fragmanlaridir.Bazi düzenlemelerde, bir tek alanli antikor, bir insan tek alanli antikorudur (Domantis, Inc., Waltham, MA; bkz. örn. U.S. Patent NO. 6,248,516 BlL Antikor fragmanlari, burada tarif edildigi üzere, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla bir bütün antikorun proteolitik kesimi ve ayrica rekombinant konakçi hücrelerle (örnegin E. coli veya faj) üretim de dahil olmak üzere çesitli tekniklerle üretilebilir. 2.Kimerik ve Insanlastirilmis Antikorlar Bazi düzenlemelerde, bir antikor bir kimerik antikordur.Bazi kimerik antikorlar asagida tarif edilmistir, bkz., örn., in US 4,816,567; ve Morrison, S.L., ve ark., Proc Natl Acad Sci.USA insan kökenli olmayan degisken bölgeye (örnegin bir fare, siçan, hamster, tavsan veya insan harici primat, örnegin bir maymundan türetilen bir degisken bölge) ve bir insan sabit bölgesine sahiptir.Bir baska örnekte, bir kimerik antikor bir sinifi veya alt sinifi degistirilmistir.Kimerik antikorlar, bunlarin antijen baglayici fragmanlarini kapsar.

Belirli yapilanmalarda, bir kimerik antikor bir hümanize antikordur.Tipik olarak, bir insan kökenli olmayan antikor hümanize edilerek insanlara immünojenisitesi azaltilirken, ayni zamanda insan kökenli olmayan ana antikorun spesifikligi ve afinitesi korunur.GeneIIikIe, bir hümanize antikor bir veya daha fazla degisken domen içermekte olup, burada, HVR5Ier, örnegin CDR,ler (veya bunlarin kisimlari) bir insan kökenli olmayan antikordan türetilir ve FR'ler (veya bunlarin kisimlari) insan antikor dizilerinden türetilir. Bir hümanize antikor istege bagli olarak ayrica bir insan sabit bölgesinin en az bir kismini içerecektir.Bazi yapilanmalarda, bir hümanize antikordaki bazi FR kalintilari, örnegin antikor spesifisitesini veya afinitesini restore etmek veya iyilestirmek amaciyla, bir insan kökenli olmayan antikora (örnegin HVR kalintilarinin türetildigi antikora) ait IIgIII kalintilarla ornatilir.

Insanlastirilmis antikorlar ve bunlari yapma yöntemleri, örn., 1633'de incelenir ve ayrica, örnegin Riechmann, I., ve ark., ark., Methods 36 ( (describing “resurfacing"); Dall'Acqua, W.F., ve ark., Methods approach to FR shuffling)”de tarif edilir.

Insansilastirma için kullanilabilen insan çati bölgeleri bunlarla sinirli olmamak üzere asagidakileri içermektedir: bölgeleri (bkz, örn. Sims ve ark. J. Immunol. 151 2296 (1993)); hafif ve agir zincir degisken bölgelerin belirli bir alt gruba ait insan antikorlarinin konsensus dizisinden türetilen çati bölgeleri (bkz. örn. Carter ve ark. Proc. Natl. bölgeleri veya insan germ. hatti çati bölgeleri (bkz. örn. kütüphanelerinin taranmasindan türetilen Çati bölgeleri (bkz. 3.Insan Antikorlari Bazi düzenlemelerde, bir antikor` bir insan antikorudur.Insan antikorlari, teknikte bilinen çesitli teknikler kullanilarak üretilebilir.Insan antikorlari genel olarak van Dijk, M.A. ve referansli yayinda tarif edilmektedir.

Insan antikorlari, antijenik yüklemeye yanit olarak bütün (intakt) insan antikorlari veya insan degisken bölgeleri olan bütün antikorlar üretecek sekilde degistirilmis bir transgenik hayvana. bir immünojenin uygulanmasiyla hazirlanabilir.Bu tür hayvanlar tipik olarak insan immünglobülin lokuslarinin tamamini veya bir kismini içermekte olup, bunlar endojenöz immünglobülin lokuslarinin yerini alir ya da kromozom disinda bulunur` veya. hayvanin. kromozomlarinin. içine rastgele entegre edilir.Bu tür transgenik farelerde, endojenöz immünglobülin lokuslar genel olarak etkisizlestirilmistir.Transjenik hayvanlardan insan antikorlarinin elde edilmesi için yöntemlerin incelenmesiyle ilgili olarak, bkz. Lonberg, Nat. teknolojisini tarif eden ABD 5,770,429; K-M MOUSE® teknolojisini tarif eden ABD 7,041,870, ve VelociMouse® tarafindan üretilen bütün (intakt) antikorlardan elde edilen insan degisken bölgeleri, örnegin farkli bir hayvan sabit bölgesiyle birlestirilerek daha fazla degistirilebilir.

Insan antikorlari ayrica hibridoma dayali yöntemlerle üretilebilir.Insan monoklonal antikorlarinin üretimi için insan miyelom ve fare-insan heteromiyelom hücre hatlari da tarif edilmistir(Bkz., örnegin, Kozbor, D., J. Immunol. 133 Üretini Teknikleri. ve Uygulamalari, Marcel Dekker, Inc., New (1991) 86-95).Insan B-hücre hibridoma teknolojisi vasitasiyla üretilen insan antikorlari da Li, J., ve ark., Proc. Natl. edilmistir.Ek yöntemler, örnegin U.S. 7,189,826 sayili belgede (hibridoma hücre hatlarindan monoklonal insan IgM antikorlarinin üretimi tarif edilir) ve Ni, J, Xiandai hibridomalari tarif edilir) tarif edilen yöntemleri kapsar.Insan hibridoma teknolojisi (Trioma teknolojisi) ayrica Vollmers ve Brandlein, Histology ve Histopathology, Methods ve Findings in Experimental ve Clinical Pharmacology Insan antikorlari ayrica insandan türetilen faj sunum kütüphaneleri arasindan seçilen FV klon degisken domen dizilerinin izole edilmesiyle de üretilebilir.Bu tür degisken domen dizileri daha sonra istenen bir insan sabit alaniyla birlestirilebilir.Antikor kütüphanelerinden insan antikorlarinin seçim yöntemleri asagida tarif edilmektedir. 4.Kütüphaneden Türetilen Antikorlar Antikorlar, birlesimsel kütüphanelerin, istenen aktivite veya aktivitelere sahip olan antikorlar için taranmasiyla izole edilebilir.Örnegin, faj sunum kütüphanelerinin olusturulmasina ve bu tür kütüphanelerin istenen baglanma özelliklerine sahip olan antikorlar için taranmasina yönelik çesitli yöntemler ilgili teknikte bilinmektedir.Bu gibi yöntemler, örn., Hoogenboom, H.R., ve ark., Methods in Molecular Biology 178 (2002) 1-37 ve further described, örn., in the McCafferty, J., Belirli faj sunum yöntemlerinde, VH ve VL genlerinin repertuvarlari, polimeraz zincir reaksiyonuyla (PCR) ayri olarak klonlanir ve faj kütüphanelerinde rastgele yeniden birlestirilir ve bunlar daha sonra antijen baglayici faj için tarafindan açiklandigi gibi taranabilir.Faj tipik olarak antikor fragmanlarini tek Zincirli FV (scFV) fragmanlari veya Fab fragmanlari olarak sunar.Immunize kaynaklardan elde edilen kütüphaneler, hibridomalarin olusturulmasina gerek olmaksizin immünojene yüksek afiniteli antikorlar saglar.Alternatif olarakI naif repertuvar klonlanarak (örnegin insandan), yayinda tarif edilen sekilde, immünizasyon olmaksizin çok Çesitli non-self ve ayrica self antijenlere tek bir antikor kaynagi saglanabilir.Son olarak, naif kütüphaneler, 388 referansli yayinda tarif edilen sekilde, yeniden düzenlenmemis V-gen segmentlerinin kök hücrelerden klonlanmasiyla ve rastgele dIZI içeren PCR primerlerinin yüksek düzeyde degisken CDR3 bölgelerinin kodlanmasinda ve laboratuvar ortaminda yeniden düzenlemenin elde edilmesinde kullanilmasiyla sentetik olarak yapilabilir.Insan antikor faj kütüphanelerinin tarif edildigi patent yayinlari örnegin Insan antikor* kütüphanelerinden izole edilen antikorlar` veya antikor fragmanlari, burada insan antikorlari veya insan antikor fragmanlari olarak kabul edilir.

S.Multispesifik antikorlar Bazi düzenlemelerde, bir antikor bir multispesifik antikor, örnegin bir bispesifik antikordur.Multispesifik antikorlar, en az iki farkli domen için baglanma spesifikligi olan monoklonal antikorlardir.Bazi düzenlemelerde, bispesifik antikorlar ayni antijenin iki farkli epitopuna baglanabilir.Bispesifik antikorlar, ayrica, sitotoksik maddelerin, antijen eksprese eden hücrelere lokalize edilmesi için de kullanilabilir.Bispesifik antikorlar, tam uzunluklu antikorlar veya antikor fragmanlari olarak hazirlanabilir. Çoklu spesifik. antikorlarin yapimina yönelik teknikler, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla, farkli spesifiklikleri olan iki immünglobülin agir zincir-hafif zincir çiftinin rekombinant olarak birlikte ifadesini Milstein ve Cuello, tasarimini (bkz. örn. U.S. Patent No. 5,731,168) kapsamaktadir.Multi-spesifik antikorlar, antikor Fc- heterodimerik moleküllerin yapimi için elektrostatik veya daha antikorun çapraz baglanmasiyla (bkz, örn. US bispesifik antikorlarin üretilmesi için lösin fermuarlarin kullanilmasiyla (bkz. örn. Kostelny, S.A., ve ark., J. fragmanlarinin olusturulmasi için “diabody” teknolojisinin kullanilmasiyla (bkz. örn. Holliger, P., ve ark., Proc. Natl.

Acad. Sci. USA 90 ( dimerlerinin kullanilmasiyla (örn. bkz. Gruber, M., ve ark” edildigi gibi trispesifik antikorlarin hazirlanmasiyla olusturulabilmektedir.

Burada ayrica üç veya daha fazla fonksiyonel antijen baglanma bölgesi olan tasarlanmis antikorlar, örnegin “Ahtapot Buradaki antikor veya fragman ayrica farkli antijenlere ve ayni zamanda baska bir farkli antijene, örnegin klothoBeta'ya baglanan bir antijen baglanma bölgesi içeren bir “Çift EtkiH 2010/l45793 sayili belgelerde tarif edilen multispesifik antikorlari da içerir. 6.Antikor Varyantlari Örnegin, antikorun baglanma afinitesinin ve/veya diger biyolojik özelliklerinin iyilestirilmesi arzu edilebilir.Bir antikorun amino asit dizisi varyantlari, antikoru kodlayan nükleotit disizinde uygun degisikliklerin› yapilmasiyla› ya da peptit senteziyle hazirlanabilir.Bu gibi degisiklikler örnegin anti kor un ami no asit dizi leri nde kalintilarin eksiltilmesini ve/veya yerlestirilmesini ve/veya ornatilmasini kapsar.

Eksiltme, yerlestirme ve ornatim islemlerinin herhangi bir kombinasyonu yapilarak son yapiya ulasilabilir; ancak, son yapinin istenen özelliklere, örnegin antijen baglama özelligine sahip olmasi kosulu vardir. a) Ornatim, Yerlestirme ve Çikartma Varyantlari Ornaimsal mutajenez için ilgili bölgeler HVR'ierI ve FRileH kapsar.TabI0 1'de, “örnek niteligindeki ornatimlar" basligi altinda örnek niteligindeki degisiklikler verilmistir ve bunlar asagida amino asit yan zincir siniflarina atif yapilarak daha ayrintili sekilde tarif edilmistir.Konservatif ornatimlar, “tercih edilen ornatimlaf' basligi altinda Tablo A'da gösterilmistir.WAmino asit ornatimlari, ilgili bir antikora ve istenen aktivite, örnegin korunmus/iyilestirilmis antijen baglanmasi, azaltilmis immünojenisite ya da iyilestirilmis ADCC veya CDC için taranan ürünlere dahil edilebilir.

Orijinal Ornek Tercih Edilen Kal inti Ni teligindeki Ornatimlar Ornatimlar Ala (A) Val; Leu; Ile VaI Arg (R) Lys; Gln; Asn Lys Asn (N) Gln; His; Asp, Gln Lys; Arg Asp (D) Glu; Asn Glu Cys (C) Ser; Ala Ser Gln (Q) Asn; Glu Asn Glu (E) Asp; Gln Asp His (H) Asn; Gln; Lys; Arg Ala; Phe; Norlösin Leu (L) Norlösin; Ile; He Val; Met; Ala; Lys (K) Arg; Gln; Asn Arg Met (M) Leu; Phe; He Leu Phe(F) Trp; Leu; Val; Tyr Thr (T) Val; Ser Ser Trp (W) Tyr; Phe Tyr Tyr (Y) Trp; Phe; Thr; Phe Val (V) Ile; Leu; Met; Leu Phe; Ala; Orijinal Ornek Tercih Edilen Kalinti Niteligindeki Ornatimlar Ornatimlar Norlösin Amino asitler asagida verilen ortak yan zincir özelliklerine göre gruplandirilabilir: (1) hidrofobik Norlösin, Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) nötr hidrofilik:Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) asidik Asp, Glu; (4) baziszis, Lys, Arg; (5) zincir yönelimini etkileyen kalintilarzGly, Pro; (6) aromatik:Trp, Tyr, Phe.

Korunumlu olmayan ornatimlar, bu siniflardan birinin bir Elemaninin, baska bir sinifla degistirilmesini saglar.

Bir ornatim varyanti türü, bir ana antikorun (örnegin bir insanlastirilmis veya insan antikorun) bir veya daha fazla asiri degisken bölge kalinntisini içerir.Genellikle, daha fazla incelenmek üzere seçilen elde edilen varyant veya varyantlar, belirli biyolojik özellikleri (örnegin artirilmis afinite, azaltilmis immünojenisite) bakimindan ana antikora göre degisikliklere (örnegin iyilestirmelere) sahip olacak ve ana antikorun belirli biyolojik özelliklerini büyük ölçüde koruyacaktir. Örnek niteligindeki bir ornatimsal varyant, bir afinite matürasyonuna tabi tutulmus antikor olup, bunlar, örnegin burada tarif edilenler gibi faj sunumuna dayali afinite matürasyon teknikleriyle uygun sekilde üretilebilir.Ozetle, bir veya daha fazla HVR› kalintisi mutasyona ugratilir ve varyant antikorlar faj üzerinde görüntülenir ve belirli bir biyolojik aktivite (örnegin baglanma afinitesi) için taranir.

HVR,lerde örnegin antikor afinitesini iyilestirmek için degisiklikler (örnegin ornatimlar) yapilabilir. Bu degisiklikler HVR "duyarli noktalarinda (hotspots)", örnegin somatik matürasyon islemleri (bkz. örn. Chowdhury, P.S., frekanslarda mutasyondan geçen kodonlar tarafindan kodlanan kalintilarda, ve/veya SDR'Iarda (a-CDR) meydana gelebilmektedir ve elde edilen varyant VH veya VL baglanma afinitesi açisindan test edilmektedir. Ikincil kütüphanelerin olusturulmasi ve bunlardan yeniden seçilini yapilmasi yoluyla afinite matürasyonu örnegin Hoogenbooni ve ark., Methods in edilmistir. Bazi afinite matürasyonu yapilanmalarinda, matürasyon için seçilen degisken genlere, çesitli yöntemlerden herhangi biriyle (örnegin hata egilimli PCR, zincir karma veya oligonükleotitle yönlendirilen mutagenez) çesitlilik dahil edilir. Ardindan ikincil bir kütüphane olusturulur. Bu kütüphane daha sonra, istenen afiniteye sahip olan herhangi bir antikor varyantinin tanimlanmasi için taranir. Çesitlilik sunmak için baska bir yöntem, HVR ile yönlendirilen yaklasimlari içermekte olup, burada birkaç HVR kalintisi (örnegin bir seferde 4-6 kalinti) randomize olur. Antijen baglanmasinda rol oynayan HVR kalintilari, örnegin alanin tarama mutajenezi veya modellemesi kullanilarak spesifik olarak tanimlanabilir. Ozellikle CDR-H3 ve CDR-L3 çogunlukla hedef alinir.

Bazi düzenlemelerde, ornatimlar, yerlestirmeler veya Çikartmalar, antikorun antijene baglanma yetenegini büyük ölçüde azaltmadiklari sürece bir veya daha fazla HVR içinde meydana gelebilir. Örnegin, baglanma afinitesini büyük ölçüde azaltmayan konzervatif degisiklikler (örnegin burada saglanan konzervatif ornatimlar) HVR'Ierin içinde olabilir. Bu tür degisiklikler HVR A'duyarli noktalarinin" veya SDR'lerin disinda olabilir. Yukarida saglanan VH ve VL dizilerinin belirli yapilanmalarinda, HVR'lerin her biri ya degismemistir ya da en fazla bir, iki veya üç amino asit ornatimini içerir.

Bir antikorun mutagenez için hedef alinabilecek olan kalintilari veya bölgelerinin tanimlanmasi için kullanisli yöntemlerde birisi, Cunningham, B.C. Ve Wells, J.A., Science bir kalinti veya hedef kalintilarin bir grubu tanimlanir (örnegin arg, asp, his, lys ve glu gibi yüklü kalintilar) ve nötr veya negatif yüklü bir amino asitle (örnegin alanin veya polialanin) degistirilerek, antikorun antijenle etkilesiminin etkilenip etkilenmedigi belirlenir. Ilk ornatimlara fonksiyonel duyarlilik. gösteren amino asit konumlarinda daha fazla ornatim dahil edilebilir. Alternatif veya ek olarak, antikor` ve hedefi arasindaki temas noktalarinin tanimlanmasi için, antijen-antikor kompleksinin bir kristal yapisi incelenebilin Bu tür temas kalintilari ve komsu kalintilar, ornatim adaylari olarak hedeflenebilir veya elimine edilebilir. Varyantlar taranarak istenen özelliklere sahip Olup olmadiklari belirlenebilir.

Amino asit dizi yerlestirmeleri, uzunlugu bir kalinti ila yüz veya daha fazla kalinti içeren polipeptitler arasinda degisen amino ve/Veya karboksil terminal füzyonlari ve ayni zamanda bir veya daha fazla amino asit kalintisinin dizi Içi yerlestirmelerini kapsar. Terminal yerlestirmelerin örnekleri, bir N-terminal metiyonil kalintisi içeren bir antikoru kapsar.

Antikor molekülünün diger yerlestirme varyantlari, antikorun N veya C ucunun, antikorun serumdaki yari ömrünü arttiran bir enzime (örnegin ADEPT için) veya bir polipeptide kaynastirilmasini içerir. b) Glikozilasyon Varyantlari Glikozilasyon bölgelerinin bir antikora eklenmesi veya bundan silinmesi, amino asit dizisinin, bir veya daha fazla glikozilasyon bölgesinin olusturulacagi ya da silinecegi sekilde degistirilmesi yoluyla uygun sekilde saglanabilir.

Antikorun bir Fc bölgesi içermesi durumunda, buna eklenen karbonhidrat degistirilebilir. Memeli hücreleri tarafindan üretilen dogal antikorlar tipik olarak bir dallanmis, iki antenli oligosakkarit içermekte olup, bu genellikle bir N- linkaj vasitasiyla, Fc bölgesinin CHZ domenindeki Asn297'ye baglanir. Bkz., örn., Wright, A. ve Morrison, S.L., TIBTECH 15 (1997) 26-32. Oligosakkarit Çesitli karbonhidratlar, örnegin mannoz, N-asetil glukozamin (GIcNAc), galaktoz ve siyalik asit ve ayni zamanda iki antenli oligosakkarit yapisinin “kök"ünde bir GICNACiye bagli bir fukoz içerebilir. Bazi yapilanmalarda, mevcut bulusun bir antikorunda oligosakkarit degsiklikleri, iyilestirilmis belirli özelliklere sahip olan antikor varyantlarinin olusturulmasi amaciyla yapilabilir. Örnegin, bu tür bir antikordaki fukoz miktari % 1 ila % 80, % degisebilir. Fukoz miktari, Asn297'de seker zinciri içinden ortalama fukoz miktarinin, Asn297'ye bagli tüm glikoyapilarin (örnegin kompleks, hibrit ve yüksek mannoz yapilar) örnegin WO kütle spektrometresiyle ölçülen toplamina kiyasla hesaplanmasiyla belirlenir. Asn297, FC bölgesinde yaklasik 297 pozisyonunda bulunan asparajin kalintisini belirtmekte olup (FC bölgesi kalintilarinin Eu numaralandirmasi); bununla birlikte, Asn297 ayrica antikorlardaki küçük dizi varyasyonlarindan dolayi, 297. pozisyonun ± 3 amino asit akis yukarisinda veya asagisinda, yani 294 ve 300. pozisyonlar arasinda bulunabilir. Bu tür fukozilasyon varyantlari iyilestirilmis ADCC fonksiyonuna sahip olabilir. Bkz., örn, US 614-622. Fukozdan arindirilmis antikorlari üretebilen hücre dizilerinin örnekleri arasinda, protein fukozilasyonundan yoksun Lec 13 CHO hücreleri (Ripka, J., ve ark., Arch. fukoziltransferaz geni, FUT8, nakavt CHO hücreleri (bkz., örn., Yamane-Ohnuki, N., ve arkadaslari, Biotech. Bioeng. 87 Antikor varyantlari ayrica iki esit parçaya bölünmüs oligosakkaritlerle birlikte saglanabilir, örnegin burada antikorun Fc bölgesine bagli olan iki antenli bir oligosakkarit GlcNAc ile iki esit parçaya bölünmüstür. Bu tür antikor varyantlari azaltilmis fukozilasyona ve/Veya iyilestirilmis ADCC fonksiyonuna sahip olabilir. Bu tür edilmektedir. Fc bölgesine bagli oligosakkaritte en az bir galaktoz kalintisina sahip olan antikor varyantlari da ayrica saglanmaktadir. Bu tür antikor varyantlari iyilestirilmis CDC fonksiyonuna sahip olabilir. Bu tür antikor varyantlari, belgelerinde tarif edilmektedir. c) Fc bölgesi varyantlari Bazi düzenlemelerde, bir antikorun Fc bölgesinde bir veya daha fazla amino asit degisikligi yapilabilir ve böylece bir PC bölgesi varyanti olusturulur. FC bölgesi Varyanti, bir veya daha fazla amino asit pozisyonunda bir amino asit degisikligi (örnegin bir ornatim) içeren bir insan Fc bölgesi dizim (örnegin bir insan IgGl, IgGZ, IgG3 veya IgG4 Fc bölgesi) içerebilir.

Laboratuvar ortaminda ve/veya canli içinde sitotoksisite analizleri, CDC ve/veya ADCC aktivitelerinin azaltildiginin/tüketildiginin dogrulanmasi amaciyla gerçeklestirilebilir. Örnegin, Fc reseptör (FCR) baglanma analizleri, antikorun FcyR baglanmasina sahip olmadigini (bu nedenle muhtemelen ADCC aktivitesi içermedigini); ancak FcRn baglanma yetenegini korudugunu dogrulamak amaciyla gerçeklestirilebilir. ADCC'ye aracilik. etmek. için temel hücreler olan NK hücreleri yalnizca EcyRIIi'ü ifade ederken, monositler ise FcvRI, FcyRIl ve Fclellyü ifade eden Hematopoietik hücreler üzerinde FcR ifadesi, Ravetch, J.V. ve sayfa 464,teki Tablo 3”te özetlenmistir. Rev. Immunol. 9 degerlendirmeye yönelik laboratuvar ortami analizlerin sinirlandirici olmayan örnekleri U.S. Patent. No 5,500,362'de açiklanir (bkz, rön., Hellstrom, I., ve ark., Proc. Natl. 1361). Alternatif olarak, radyoaktif olmayan analiz yöntemleri kullanilabilir (bkz. Örnegin AÇTI“, akis sitometrisi için radyoaktif olmayan sitotoksisite analizi (CellTechnoIogy, Inc.

Mountain View, CA); ve CytoTox 96® radyoaktif olmayan sitotoksisite analizi (Promega, Madison, WI). Bu tür deneyler için kullanisli. efektör hücreler arasinda. periferal kan tek çekirdekli hücreler (PBMC) ve dogal öldürücü (NK) hücreler bulunur. Alternatif olarak ya da ilave olarak, ilgi konusu molekülun ADCC aktivitesi, canli içinde, örnegin Clynes ve Clq,yu baglayamadiginin ve bu nedenle CDC aktivitesi içermediginin dogrulanmasi amaciyla Clq baglanma analizleri de gerçeklestirilebilir. Bkz. örnegin Clq ve C3c baglayan ELISA, degerlendirilmesi için bir CDC analizi yapilabilir (bkz., örn, Gazzano-Santoro, H., ve ark., J. Immunol. Methods 202 (1996) baglanmasi ve canli içi klirens/yari ömür tayinleri ayrica ilgili teknikte bilinen yöntemler kullanilarak da gerçeklestirilebilir (bkz., örn., Petkova, 5.8., ve ark., Int. 327 ve 3295dan bir veya daha fazlasinin ornatildigi 270, 297 ve 327. amino asit pozisyonlarindan iki veya daha fazlasinda ornatima sahip olan Fc mutantlarini, örnegin 265 ve 297. kalintilari alanin ile ornatilmis “DANA" adi verilen Fc mutantini kapsar (US 7,332,581).

FcR”lere baglanimi iyilestirilmis veya azaltilmis belirli antikor varyantlari tarif edilmistir. (bkz. Orn., US Bir antikor varyanti, ADCC,yi iyilestiren bir veya daha fazla amino asit ornatimi, örnegin Fc bölgesinin 298, 333 ve/Veya 334. pozisyonlarinda (EU kalinti numaralandirmasi) ornatimlara sahip olan bir Fc bölgesi içerebilir.

Maternal IgG'lerin fetüse aktarilmasindan sorumlu olan, neonatal Fc reseptörüne (FcRn) olan baglanma özelligi iyilesmis olan ve yarilanma ömürleri artmis olan antikorlar, bir Fc bölgesi içermekte olup, bunun içerisinde Fc bölgesinin FcRn'ye baglanmasini iyilestiren bir veya daha fazla ornatim bulunur. Bu tür FC varyantlari, asagidaki FC bölgesi kalintilarindan bir veya daha fazlasi ornatilmis olanlari 424 veya 434, örnegin 434. FC bölgesi kalintisinin ornatimi Ayrica Fc bölgesi varyantlarinin, diger örnekleri ile ilgili bakiniz. d) Sistein tasarlanmis antikor varyantlari Belirli yapilanmalarda, içerisinde bir antikorun bir veya daha fazla kalintisinin sistein kalintilariyla ornatildigi sistein ile degistirilmis antikorlarin, örnegin “tioMAb'Ier”in olusturulmasi avantajli olabilir. Belirli yapilanmalarda, ornatilan kalintilar, antikorun erisilebilir bölgelerinde ortaya çikar. Bu kalintilarin sisteinle ornatilmasi sonucunda, reaktif tIOl gruplari antikorun erisilebilir bölgelerinde konumlanir ve antikorun diger gruplara, örnegin ilaç gruplarina veya baglayici-ilaç gruplarina konjüge edilmesinde ve böylece burada daha ayrintili olarak tarif edilen sekilde bir immün konjügatin olusturulmasinda kullanilabilir. BelirH yapilanmalarda, asagidaki kalintilardan herhangi bir veya daha fazlasi sisteinle ornatilabilirî hafif zincir V205 (Kabat numaralandirmasi); agir zincir A; ve agir zincir FC bölgesi . Sistein tasarlanmis antikorlar, örnegin US 7,521,541 sayili belgede tarif edilen sekilde olusturulabilir. e) Antikor Türevleri Antikorun türevlendirilmesi için uygun gruplar, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla suda çözünebilir polimerleri kapsar.

Suda çözünebilir polimerlerin sinirlandirici olmayan örnekleri, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla, polietilen glikol (PEG), etilen glikol/propilen glikol kopolimerleri, karboksimetilselüloz, dekstran, polivinil alkol, polivinH pirolidon, poIi-1,3-di0ksolan, poIi-1,3,6-tri0ksan, etilen/maleik anhidrit kopolimer, poliaminoasitler (homopolimerler veya rastgele kopolimerler) ve dekstran ya da poli(n-vinil pirolidon)p0lietilen glikol, propropilen glikol homopolimerleri, prolipropilen oksit/etilen oksit kopolimerleri, polioksietillenmis polioller (örnegin gliserol), polivinil alkol ve bunlarin karisimlarini kapsar.

Polietilen glikol propiyonaldehit, su içindeki stabilitesinden dolayi üretimde avantajlara sahip olabilir. Polimer herhangi bir moleküler agirliga sahip olabilir ve dallanmis veya dallanmamis olabilir.

Antikora baglanan polimerlerin sayisi degisiklik gösterebilir ve birden fazla sayida polimerin baglanmasi durumunda, bunlar ayni veya farkli moleküller olabilir. Genel olarak, türevlendirme için kullanilan polimerlerin sayisi ve/Veya türü, örnegin bunlarla sinirli olmamak kaydiyla, antikorun iyilestirilecek belirli özellikleri veya fonksiyonlari, antikor türevinin belirtilen kosullar altinda bir terapide kullanilip kullanilmayacagi ve benzeri durumlar göz Önünde bulundurularak belirlenebilir.

Monoklonal antikorlar üretme yöntemleri ilk olarak Kohler ve bir sekilde katilmasiyla miyelom hücreleriyle rekombinant antikorlarin üretimi tarfi edilmistir (bkz., Oi, ve ark., Antikorlarin kodlayici nükleik asidi (ya tam antikor ya da degisken alanlar için) bir antikor üreten hücreden geleneksel prosedürler kullanilarak izole edilebilir ve dizilebilir.

Izolasyondan sonra kodlayici nükleik asit, bir veya daha fazla ekspresyon vektörüne yerlestirilebilir. Sadece degisken alanin kodlayici nükleik asidi izole edildiyse, ekspresyon vektörü ayni zamanda sirasiyla agir zincir ve/veya hafif zincir sabit bölgesini kodlayan bir nükleik asit içerir (bkz., örn., US ,658,570). Ekspresyon vektörü, antikorlari salgilamayan prokaryotik (E. coli) veya ökaryotik konakçi hücrelere (CHO, HEK, BHK, SP2/0) transfekte edilebilin Kodlayici nükleik asit, bir faj görüntüleme kütüphanesi, bir maya görüntüleme kütüphanesi veya genel olarak hücre yüzeyi görüntüleme kütüphanesi gibi bir görüntüleme kütüphanesinden türetilirse, dogrudan ekspresyon vektörüne klonlanabilir.

Antikorlar, rekombinant yöntemler ve bilesimler, örnegin U.s.

Patent No 4,816,567 referansli yayinda tarif edilenler kullanilarak üretilebilir. Bir yapilanmada, burada tarif edilen bir antikoru kodlayan izole edilmis bir nükleik asit saglanmaktadir. Bu tür nükleik asitler, antikorun VL'sim içeren bir amino asit dizisi ve/veya VH'sini içeren bir amino asit dIZISI kodlayabilir (örnegin antikorun hafif ve/Veya agir zincirleri). Baska bir yapilanmada, bu tür nükleik asitleri içeren bir veya daha fazla vektör (örnegin ifade vektörleri) saglanir. Baska bir yapilanmada, bu tür nükleik asitleri içeren bir konakçi hücre saglanir. Bu tür bir yapilanmada, bir konakçi hücre asagidakileri içerir (örnegin bunlarla dönüstürülmüstür): (1) antikorun VL”sini içeren bir amino asit dizisini ve antikorun VH'sini içeren bir amino asit dizisim içeren bir amino asit dizisini kodlayan bir nükleik asit içeren bir vektör veya (2) antikorun VL'sini içeren bir amino asit dizisini kodlayan bir nükleik asit içeren bir birinci vektör ve antikorun VH'sini içeren bir amino asit dizisini kodlayan bir amino asit içeren bir ikinci vektör. Bir yapilanmada, konakçi hücre ökaryotik olup, örnegin bir Çin Hamsteri Over (CHO) hücresi ya da lenf hücresidir (örnegin YO, N50, Sp20 hücresi). Bir yapilanmada, buradar tarif edildigi üzere bir antikorun yapimi için bir yöntem saglanmakta olup, burada yöntem, yukarida saglandigi üzere antikoru kodlayan bir nükleik asit içeren bir konakçi hücrenin, antikorun ifadesi için. uygun kosullar altinda kültürlenmesini ve istege bagli olarak, antikorun konakçi hücreden (ya da konakçi hücre kültür ortamindan) geri kazanilmasini içerir.

Burada tarif edildigi üzere bir antikorunrekombinant üretimi için, örnegin yukarida tarif edildigi üzere bir antikoru kodlayan nükleik asit izole edilir ve bir konakçi hücre içinde daha fazla klonlama ve/veya ifade için bir veya daha fazla vektörün içine yerlestirilir. Bu tür nükleik asitler kolaylikla izole edilir ve konvansiyonel prosedürler kullanilarak dizilenir (örnegin antikorun agir ve hafif Zincirlerini kodlayan genlere spesifik olarak baglanabilen oligonükleotit problar kullanilarak).

Antikor kodlayici vektörlerin klonlanmasi veya ekspresyonu için uygun konak hücreler, burada tarif edilen prokaryotik ya da ökaryotik hücreleri kapsar, örnegin, özellikle glikozilasyon ve fc efektör fonksiyonu gerekli olmadiginda, bakterilerde antikorlar üretilebilir. Antikor fragmanlarinin ve polipeptitlerin bakteri içinde ifadesi için bkz., örn., US Charlton, K.A., In: Methods in Molecular Biology, Vol. 248, L0, B.K C. (ed.), Humana Press, Totowa, N] (2003), pp. 245- 254, E. C0ii.'de antikor fragmanlarinin ekspresyonunu tarif edilmektedir). Ekspresyonun ardindan, antikor bakteriyel hücre macunundan çözünür bir fraksiyon içinde izole edilebilir ve daha fazla saflastirilabilir.

Prokaryotlarin yani sira, ökaryotik mikroplar, örnegin filamentöz mantarlar ya da mayalar da antikor kodlayici vektörler için uygun klonlama ya da ifade konakçilari olup, bunlarin arasinda glikozilasyon yolaklari ”hümanize edilmis" olan mantar ve maya suslari bulunur ve bunun sonucunda kismen ya da tamamen insan glikozilasyon motifine sahip bir antikorun üretimi saglanir. Bkz. Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 210-215.

Glikozile antikorun ifadesi için uygun konakçi hücreler ayrica çok hücreli organizmalardan (omurgasizlar ve omurgalilar) türetilir. Omurgasiz hücrelerinin örnekleri bitki ve böcek hücrelerini kapsar. Çok sayida baküloviral hücre tanimlanmis olup, bunlar böcek hücreleriyle birlikte, özellikle Spodoptera frugiperda hücrelerinin transfeksiyonu için kullanilabilir.

Bitki hücre kültürleri de konakçi olarak kullanilabilir. Bkz. üretimi Için PLANTIBODIESTM teknolojisi tarif edilmektedirL Omurgali hücreleri de konakçi olarak kullanilabilir. Örnegin, süspansiyon içinde yetisecek sekilde uyarlanmis olan memeli hücre hatlari kullanisli olabilir. Kullanisli konak hücre hatlarina verilebilecek diger örnekler; SV40 (CCS-7) tarafindan dönüstürülen Haymun böbregi CV1; insan embriyonik böbrek hatti (örnegin Graham, F.L., ve ark., J. Gen VirOI. 36 hücreleri); yavru hamster böbrek hücreleri (BHK), fare sertoli referansli yayinda tarif edilen TM4 hücreleri); maymun böbrek hücreleri (CV1); Afrika yesil maymunu böbrek hücreleri (VERO- 76); insan servikal karsinom hücreleri (HELA); köpek böbrek hücreleri (MDCK); bufalo siçani karaciger hücreleri (BRL 3A); insan akciger hücreleri (W138); insan karaciger hücreleri (Hep G2); fare meme tümörü. (MMT 060562): örnegin Mather ve ark. tarif edilen TRI hücreleri; MRC 5 hücreleri ve FS4 hücrelen.

Diger kullanisli memeli konakçi hücre hatlari, Çin hamsteri over (CHO) hücreleri, örnegin DHFR CHO hücreleri (Urlaub, G., miyelom. hücre hatlari, örnegin YO, N80 ve SpZ/O'i içerir.

Antikor üretimine uygun belirli memeli konakçi hücre hatlarinin incelemesi için, bkz. örnegin Yazaki, P. Ve Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, L0, B.K.C.

Asagidaki örnekler, sekiller ve diziler mevcut bulusun anlasilmasina yardimci olmak için verilmekte olup, bulusun gerçek kapsami ise ekteki istemlerde ortaya konmustur.

Ornekler Yöntemler Elektrosprey iyonizasyon kütle spektrometresi (ESI-MS) Protein alikuotlari (50 ug), 115 uL nihai bir örnek hacminin elde edilmesi için ve sodyum fosfat tamponu (0.1 M, pH 7.1) eklenerek deglikozile edildL Karisini 18 saat boyunca 37 °C'de inkübe edildi. Daha sonra indirgemek ve denatüre etmek için 4 M guanidin * HCI (Pierce) içinde 60 uL ve 50 uL 8 M guanidin * HCl eklendi. Karisini 30 dakika boyunca 37 °C'de inkübe edildi.

Numuneler, büyüklük dislanimli kromatografi (Sepharose G-25, izokratik, % 2 formik asit ile % 40 asetonitril) ile tuzdan arindirildi. ESI kitle spektrumlari (+Ve) bir nano ESI kaynagi (TriVersa. NanoMate, Advion) ile donatilmis bir Q-TOF cihazi (maXiSI Bruker) üzerinde kaydedildi. MS parametre ayarlari su sekildeydi: Transfer: Huni RF, 400 Vpp; lSClD Enerji, 0 eV; Çoklu kutup RF, 400 Vpp; Kuadropol: Iyon Enerjisi, 4.0 eV; Düsük Kütle, 600 m/z; Kaynak: Kuru Gaz, 8 L/dak; Kuru Gaz Sicakligi, 160 °C; Çarpisma Hücresi: Çarpisma Enerjisi, 10 eV; Çarpisma RF: 2000 Vpp; Iyon Sogutucu: Iyon Sogutucu RF, 300 Vpp; Transfer Süresi: 120 us; Ön Puls Depolama, 10 us; tarama araligi 600 m/z ila 2000 m/z. Veri degerlendirmesi için kurum içi gelistirilen yazilimlar (MassAnalyzer) kullanildi.

FcRn yüzey plazmon rezonansi (SPR) analizi Yabani tip antikorun ve mutantlarin FcRn7ye baglanma özellikleri, bir BIAcore TlOO cihazi (BIAcore AB, Uppsala, Isveç) kullanilarak yüzey plazmon rezonansi (SPR) teknoloji“ ile analiz edilmistir. Bu sistem moleküler etkilesimlerin incelenmesi için iyi bilinmektedir. Ligand/analit baglantilarinin sürekli olarak gerçek zamanli izlenmesini ve böylece çesitli test ayarlarinda kinetik parametrelerin belirlenmesini saglar. SPR teknolojisi, altinla kaplanmis bir biyoalgilayici çipinin yüzeyine yakin kirilma indisinin ölçümüne dayanmaktadir. Kirilma indeksindeki degisiklikler, immobilize ligandin, çözeltiye enjekte edilen analit ile etkilesiminin neden oldugu yüzeydeki kütle degisikliklerini göstermektedir. Moleküller yüzey üzerinde immobilzie edilmis bir liganda baglanirsa, kütle artar, ayrisma durumunda kütle azalir. Mevcut deneyde, FcRn reseptörü, bir BIAcore CMS- biyoalgilayici çipine (GE Healthcare Bioscience, Uppsala, Isveç) amin eslesmesi yoluyla 400 Tepki Birimi seviyesine (RU) immobilize edilmistir. Deney, oda sicakliginda ve seyreltme tamponu olarak PBS, % 0.05 Tween20 pH 6.0 (GE Healthcare Bioscience) ile oda sicakliginda gerçeklestirilmistir. 200 nM dogal veya okside antikor örnekleri oda sicakliginda 50 uL/dak akis hizinda. enjekte edildi. Birlesme süresi. 180 s, ayrisma fazi 360 s sürdü. Çip yüzeyinin yenilenmesi kisa bir HBS-P, pH 8.0 enjeksiyonu ile elde edildi. SPR-verilerinin degerlendirilmesi, biyolojik tepki sinyali yüksekliginin enjeksiyondan 180 sonra ve enjeksiyondan 300 sonra karsilastirilmasiyla gerçeklestirildi. Karsilik gelen parametreler RU'nun maksimum seviyesi (enjeksiyondan 180 s sonra) ve geç stabilitedir (enjeksiyonun bitiminden 300 s sonraL FcRn afinite kolonunun hazirlanmasi HEK293 hücrelerinde FcRn ekspresyonu FcRn, HEK293 hücrelerinin, FcRn ve beta-2-mikroglobülinin kodlama dizisini içeren iki plazmid ile transfeksiyonu ile geçici olarak eksprese edildi. Transfekte hücreler, çalkalama siselerinde , % 80 nem ve % 7 COz'de kültürlendi. Hücreler 2-3 günde bir 3 ila 4*10S hücre/ml'lik bir yogunluga seyreltildi.

Geçici ekspresyon için, 14 litrelik bir kültür biyoreaktörüne, (N2 ve hava ile gazlama, toplam gaz akisi 200 ml mind) ve 100-400 rpm'lik bir karistirima hizi ile baslandi. Hücre yogunlugu 20*lO5 hücre/ml'ye ulastiginda, 10 mg plazmid. DNA (her Iki plazmidin es molar miktari), 400 ml Opti-MEM (Invitrogen) içinde seyreltildi. Bu karisima 20 ml 293fürin (Invitrogen) eklendi; bu daha sonra oda sicakliginda 15 dakika inkübe edildi ve daha sonra fermentöre aktarildi. Bir sonrah güne kadar, hücreler sürekli modda besinler ile beslendi: günde 500 ml'lik bir hizda bir besleme çözeltisi eklendi ve seviyeyi 2 g/I'nin üzerinde tutmak için gereken sekilde glukoz ilave edildi. Süpernatan, 1 l'lik kova ile bir döner' basli santrifüj kullanilarak transfeksiyondan 7 gün sonra toplandi: 90 dakika için 4000 rpm. Süpernatant (13 L) bir Sartobran P filtresi (0.45 pm + 0.2 pm, Sartorius) ile temizlendi ve FcRn beta-Z-mikroglobulin kompleksi buradan saflastirildi.

Neonatal Fc reseptörünün biyotinilasyonu HEK293 hücrelerinde ßz-mikroglobulin ile birlikte eksprese edilen His-Avi Tag ile FcRn'nin çözünebilir bir ekstraselüler alani, asagidaki gibi saflastirmadan sonra biyotinlendi: ml 20 mM sodyum sitrat tamponu içinde 1.2 mg ila 12 mg FcRn/ßz-mikroglobulin arasinda, 150 rm4 KCl, 250 pl PBS ve 1 tablet Bütün proteaz inhibitörü (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Almanya) içeren pH 5.5, üretici talimatlarina (Bulk BIRA) göre Avidity,den biyotinilasyon kiti kullanilarak bbiyOtInIendI. Biyotinleme reaksiyonu, oda sicakliginda gece boyunca yapildi. Modifiye protein, fazla biyotinin uzaklastirilmasi için gece boyunca 4 °C,de 150 mM NaClI pH 7.5 içeren 20 mM sodyum fosfat tamponuna karsi diyalize edildi.

Streptavidin sefarozuna baglanma Bir* grani streptavidin sefaroz (GE Healthcare), biyotinlenmis ve diyalize edilmis reseptöre ilave edildi (standart analitik uygulama için 3 mg, 1.2 ve 12 mg FcRn/ßz-mikroglobülin) ve iki saat çalkalanarak kuluçkaya birakildi. Reseptör türevli sefaroz, 1 ml XK kolonunda (GE Healthcare) dolduruldu.

FcRn afinite kolonu kullanilarak kromatografi Reseptör türevli sefaroz, l ml”lik bir XK kolonunda (GE Healthcare) dolduruldu ve FcRn kolonu, 150 mM NaCl, pH 5.5 içeren 20 mM 2-(N-m0rf0lin)-etansülfonik asit (MES) tamponu ile dengelendi.

Kosullar: kolon boyutlari: 50 mm X 5 mm yatak yüksekligi: 5 cm yük: 50 pg numune dengeleme tamponu: 150 mM NaCl ile 20 mM MES, pH 5.5'e ayarlandi elüsyon tamponu: 150 mM NaCl ile 20 mM lTis/HCI, pH 8.8'e ayarlandi elüsyon: 30 CV % 100'e kadar elüsyon tamponu, 10 CV elüsyon tamponu içinde 7.5 CV dengeleme tamponu 50 ila 100 pg protein içeren antikor veya füzyon protein örnekleri pH 5.5'e ayarlandi ve ÃKTA eksploratörlO XT veya Dionex Summit (Dionex, Idstein, Germany) kullanilarak FcRn kolonuna uygulandi. 5 cm'iik yatak yüksekligine sahip kolon daha sonra pH 5.5'de 5-10 kolon hacminde dengeleme tamponu 20 mM MES, 150 mM NaCl ile yikandi. Afinite-bagli Fc-içeren proteinler 30 kOIOn hacminde bir pH gradyani ile pH 8.8'de 20 mM TriS/HCl, 150 mM NaCl ile elüt edildi. Modifiye antikorlarin tamamen elüsyonu için, pH 8.8'e kadar gradyani artmistir. Deneyler, oda sicakliginda yürütülmustur. Elüsyon profili 280 nm'de absorbansin sürekli ölçümü ile elde edildi.

Numune enjeksiyonu sonrasi detektöre ulasmak için bir analit tepesi X için elde edilen süre, tutulma süresi olarak adlandirildi.

FcRn kolonunda tutulma süresinin canli içi yari ömre göre korelasyonu Canli içi yari ömür, tekli iv admini. 10 mg/kg (n = 8) ve FcRn kolonundaki tutulma süresine (bkz. tablo) kiyasla insan FcRn transjenik C57BF/6J farelerinde ölçüldü. FcRn kolonundan geç elüsyon gösteren antikorlarin FcRn transjenik. farelerde daha uzun bir yari ömre sahip oldugu bulunmustur. antikor tutulma süresi canli içi yari anti-Abeta antikor (yabani- anti-Abeta antikor (YTE- mutasyon) anti-IGF-IR antikor (yabani- . 45.5 97 +/- 9 anti-IGF-IR antikor (YTE- 58 211 +/-41 Insan FcRn, fare FcRn ve sinomolgus FcRn'sinin saflastirilmasi HekzahIS-etiketli proteinler içeren aritilmis süpernatantlar, 4 °C`de bir Ni-NTA afinite kromatografisi reçinesi (Qiagen, Hanbrechtikon, Isviçre) üzerine yüklenmistir. PH 7.4'te 500 mM NaCl içeren ve 20 mM sirasiyla 100 mM imidazol içeren 20 mM sodyum fosfat tamponu ile yikama asamalarindan sonra, proteinler bir AKTA Prime kromatografi sistemi (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Isveç) üzerinde 300 mM imidazol içeren ayni tamponla toplu elüsyon kullanilarak 2 inl/dk'lik bir akis hizinda elüt edilmistir. Fraksiyonlar havuzlandi ve büyüklük dislanimli kromatografi (SuperdexTM 200, GE Healthcare, Zürih, Isviçre) üzerinde 500 mM NaCI içeren sodyum fosfat tamponunda daha fazla saflastirildi. Saflastirilmis proteinler bir Nanodrop spektrofotometre (Nanodrop Technologies, Wilmington, DE) kullanilarak ölçüldü ve denatüre ve indirgeyici kosullar altinda MES tamponu içinde NuPAGE % 4 ila % 12 arasinda Bis-Tris jelleri üzerinde SDS PAGE ile analiz ediIdL Fare ve sinomolgus FcRn'si afinite kolon kromatografileri Asagidaki tabloda, sinomolgus maymundan FcRn içeren afinite kolonlari üzerinde örnek insan antikorlarinin tutulma süreleri verilmistir. Veriler asagidaki kosullar kullanilarak elde edildi: Elüsyon tamponu: 20 mM TRIS/HCI, 150 mM NaCI, pH 8.5.

Ek açiklama: bkz. Örnek 2. YTE-mutanti terimi üçlü mutant antikor Tutulma süresi [dak] anti-Abeta antikor (yabani- anti-Abeta antikor (YTE- anti-IGF-IR antikor (yabani- 51.2 anti-IGF-IR antikor (YTE- Asagidaki Tabloda, faregiller FcRn,SI üzerinde örnek insan antikorlarinin tutulma süreleri verilmistir. Veriler asagidaki kosullar kullanilarak elde edildi: 1 nü Sefaroz'a baglanmis 1.2 mg reseptör. Elüsyon tamponu: 20 mM TRlS/HCI, 150 mM NaCI, pH 8.5. Ek açiklama: bkz. Örnek 2. Elüsyon tamponu pH degeri 9.5,e ayarlanmadikça, YTE-mutantlari bu tabloya dahil edilmemistir. antikor tutulma süresi [dak] anti-Abeta antikor (yabani- . 54.7 anti-IGF-IR antikor (yabani- . 48.8 Sinomolgus FcRn afinite kolonu, insanlastirilmis antikorlarin baglanmasi ile ilgili insan FcRn afinite kolonuna benzer sekilde davranis sergiler. Diger taraftan, insanlastirilmis antikorlarin siçan FcRn kolonuna baglanmasi, daha sonraki tutulma ile görülebilecegi gibi insan FcRn afinite kolonundan daha güçlüdür.

Antikor fragmanlarinin üretimi F(ab')2 fragmani ve FC bölgesi fragmani, lOO mM Tris, pH 8.0 ile seyreltilmis tam uzunluklu lzl antikoriun 50 ug antikor basina 1 ug IdeS sistein proteazi eklendi ve 2 saat 37 °c'de inkübasyon ile hazirlandi. Elde edilen bölünme ürünIeH F(ab')2 ve Pc, bir AKTA Eksploratör kromatografi sistemi (GE Healthcare, Uppsala, Isveç) kullanilarak bir büyüklük dislanimli kromatografi (SEC) kolonunda (Superdex 200, GE Healthcare, Zürih, Isviçre) ayrildi ve tepe fraksiyonlari havuzlandi. Ayni kolondaki moleküler agirlik standartlari, tutulma sürelerine göre iki bölünme ürününü tanimlamak için kullanilmistir.

Tam uzunluklu antikorlarin tutulma süreleri belirgin sekilde degismistir. Aksine, test edilen› tüm, antikorlarin ilgili Fc bölümlerinin tutulma süreleri neredeyse birbirinden farkli Tam uzunluktaki antikorlarin bölünmesi için plazmin kullanildiginda, ayni bulgular elde edildi (veriler gösterilmemistir).

FcRn kolonunda tutulma süresinin oksidasyon durumuna göre korelasyonu FcRn afinite kromatografisinde antikorun oksidasyonunun tutulma süresi üzerindeki etkisi üzerinde Çalisilmistir. Bir 40 °C,de saklanmasiyla gözlemlendi. Modifiye ve oksitlenmis antikor örnekleri, FcRn afinite kromatografisi ve FcRn yüzey plazmon rezonansi (SPR) teknolojisi ile analiz edildi.

Antikorun oksidasyonu, peptit haritalamasi ve elektrosprey iyonizasyon kütle spektrometresi (ESI-MS) ile karakterize ESI-MS verileri, IgGl antikorunun agir zincirlerinin yaklasik altinda tamponda (20 mM His/His*HCl, 240 mM Trehaloz, % 0.02 polisorbat 20) saklandiktan sonra, Met252 ve Met428 kalintilarina maruz kalan çözücüde oksitlendigini ortaya Çikarmistir. 40 oCde oksitlenmis antikor içeren numuneler ve -80 °C”de ve 25 °C'de saklanan numuneler, daha önce FcRn*nin immobilize edildigi bir afinite kolonuna uygulandiginda, iki ana tepe ayrilabilir (Sekil 8). Sekil 8,deki ikinci tepe, daha uzun tutulma süresine sahip olan iki örtüsen egriden olusur ve °C'de ve -80 °C'de saklanan numunelerde modifiye antikorun elüsyon süresine karsilik gelirken, daha önceki elüsyon tepesi Met252 ve Met428 oksitlenmis antikoru temsil eder. Oksitlenmis Met252 ve Met428'in varligi, ESI-MS ile gerilimli numunede saptanan 16 Da kütle kaymasi ile desteklenmistir. BlAcore'da SPR ile gerilimli (40 °C) antikor numunesinin analizi, FcRn kromatografisinde oldugu gibi iki farkli antikor türüyle, yani yabani tip antikor ve Met252- ve Met428-0ksidize antikor ile oldugu gibi sensorgramda ayni tepki modelini göstermistir FcRn kolonunda tutulma süresinin küme olusumuna göre korelasyonu Afinite kromatografisindeki antikor küme olusumunun FcRn etkilesimi üzerindeki etkisi, bir anti-IL13RaIfa antikoru için degerlendirildi. Antikor monomeri ve küme fraksiyonlari, büyüklük dislanimli kromatografi (SEC) ve ilgili tepelerin havuzlanmasiyla izole edildi. Fraksiyonlarin FcRn etkilesimi, afinite kromatografisi ve SPR teknolojisi ile analiz edildi.

Büyüklük dislanimli kromatografi (SEC), anti-IL13Ralfa antikor monomerlerini ve FcRn kolon kromatografisi için multimerik kümeleri içeren üç anti-IL13RaIfa antikor fraksiyonunu izole etmek için kullanildi. Kromatogramin tepe noktasina dayanarak, FcRn afinite kromatografisi için kullanilan anti-IL13Raifa antikorunun numunesi, % 57 monomerleri ve % 43 anti-IL13RaIfa antikor kümelerini içerir. FcRn afinite kromatografisindeki fraksiyonlanmamis numunenin analizi, farkli tutulma süreleriyle iki ana tepe ortaya çikardi (Sekil 10). Daha uzun tutulma süresine sahip olan daha küçük tepe, küme fraksiyonununkine karsilik gelirken, daha hizli elüsyon tepesinin ana kismi, monomer fraksiyonuna karsilik geldi.

Yüzey plazmon rezonans (SPR) analizinde, bir anti-IL13RaIfa antikor referans standardi, kümeler (havuz 1) ve monomerler (havuz 2) ve dogal havuz ile zenginlestirilmis iki farkli sekilde havuzlanmis fraksiyon ile karsilastirilmistir. Natif yigim ve havuzlanmis fraksiyonlarin tam bilesimi asagidaki tabloda açiklanmistir.

TABLO: Bir anti-lLlBRalfa antikorunun dogal ve zenginlestirilmis havuzlanmis fraksiyonlarinin bilesimi. monomerl Fc- kümeler er [%1 dimerler [%1 Baslangiç havuzu monomer bakimindan zengin havuz 2 numunesinin sensorgrami, anti-ILl3Ralfa antikor referans standardina en yakin olaniydi, ardindan bunu küme bakimindan zayif numunenin sensorgrami izledi. Aksine, küme bakimindan zengin havuz l, SPR analizinde FCRn'ye neredeyse iki kat yüksek bir baglanma ile karakterize edildi (Sekil ll).

Insan FcRn'li farelerde farmakokinetik çalisma Tüm prosedürler Laboratuvar Hayvani Bakiminin Degerlendirilmesi ve Akreditasyonu Dernegi,nin (www.aaalac.org) yönergeleri dogrultusunda gerçeklestirilmistir. Çalisma Almanya Oberbayem Bölge Konseyi tarafindan onaylanmistir.

Erkek ve disi CS7BL/6J fareleri (arka plan): fare FcRn eksikligi, ancak insan FcRn (hchRn (276) -/tg (30, 31) için hemizigöz transgenik farmakokinetik çalisma boyunca kullanilmistir.

Uygulama zamaninda, hayvanlar 17 g ila 25 g arasinda agirliga sahiptir. Ilgili antikor, kuyruk damari yoluyla tek bir intravenöz bolus enjeksiyonu olarak verildi.

Sinirli kan hacmi nedeniyle, dört erkek ve dört disi hayvandan olusan üç gruptan her birinin dokuz örnekleme zaman noktasini, yani hayvan basina üç örnekleme zaman noktasini kapsamasi gerekti. Kan numuneleri grup 1'de uygulamadan 5 dakika, 24 saat ve 336 saat sonra, grup 2'de uygulamadan 2 saat, 168 saat ve 504 saat sonra ve grup 3'te uygulamadan 8 saat, 48 saat ve 672 saat sonra alindi. Yaklasik 100 uL'lik kan numuneleri retrobulber ponksiyon ile elde edildi ve pihtilasmaya imkan vermek için oda sicakliginda 60 dakika saklandi. En az 40 pL'Iik serum numuneleri 9,300 X glde 4 °C`de 3 dakika santrifüj edilerek elde edildi ve hemen dondurularak test edilene kadar -20 °Clde saklandi.

Siçan serumundaki insan terapötik antikorlarin serum konsantrasyonlari, uygulanan antikorun ve varyantlarinin antijen baglama bölgesi (Fab) için spesifik olan bir antijenle yakalanmis enzim baglantili immünosorban tahlili (ELISA) ile belirlendi. Tüm reaktifler veya numuneler, oda sicakliginda, 400 rpm,de bir çalkalayicida inkübe edildi. Her yikama adimi üç döngü içeriyordu. Kisaca, streptavidin kapli mikrotitre plakalari, analiz tamponunda seyreltilmis biyotinlenmis antikor ile kaplanmistir. Fosfat tamponlu salin-polisorbat 20 (TweenZO) ile yikandiktan sonra, çesitli seyreltimlerde serum numuneleri eklendi ve 1 saat boyunca inkübe edildi.

Yikandiktan sonra, insan terapötik antikorlari, fare IgG ile çapraz reaksiyona girmeyen digoksijenin ile konjuge edilmis insan Fcy'sine Özgü monoklonal antikor Fab parçalari ile sonraki inkübasyon ile tespit edildi. Yikandiktan sonra, yabanturpu peroksidaz (HRP) ile konjuge edilmis bir anti- digoksijenin antikoru ilave edildi ve 1 saat boyunca inkübe edildi. Yikamadan sonra, renkli bir reaksiyon ürünü olusturmak için ABTS (2,2'Azin0-di[3-etiIbenztiazolin sülfonat; Roche Diagnostics, Almanya) HRP substrati olarak ilave edildi. Elde edilen reaksiyon ürününün absorbansi, 490 nm'de referans dalga boyu ile 405 nm”de okundu. Tüm serum numuneleri ve pozitif veya negatif kontrol örnekleri tekrarlayicilarda analiz edildi ve referans standardina göre kalibre edildi.

Farmakokinetik parametreler, bölüm 5.2.1, WinNonIinTM (Pharsight, St. Louis, MO, ABD), farmakokinetik degerlendirme programi kullanilarak bölüm disi analiz ile hesaplandi.

Kisaca, konsantrasyon/zaman egrisi AUC (0-672) altindaki alan, O'dan sonsuza kadar dogrusal trapezoidal cetveli (dogrusal enterpolasyon ile) ile hesaplandi. Görünen terminal yari ömrü (Tip) asagidaki denklemden elde edilmistir: Tim = InZ/Az.

Toplam vücut kleransi (CL), doz/AUC olarak hesaplandi. Yabani- tip antikor ve varyantlari arasindaki farmakokinetik parametrelerde istatistiksel olarak önemli farkliliklar ANOVA analizi ile belirlenmistir.

Fare FcRn'si için C57BF/6J farelerininin eksikliginde farmakokinetik çalismasi, ancak insan FcRn (hchRn (276) -/tg) için hemizigöz transjenik, YTE mutasyonunun antikorun farmakokinetigini gelistirdigini göstermistir (Sekil 12).

Istatistiksel önem seviyesinde, YTE mutanti, yabani-tipte antikor ile kiyaslandiginda 1.74 kat daha yüksek bir EAA (0- 672), 1.95 kat daha yavas bir açiklik ve 2.2 kat daha uzun bir terminal yari ömrüne sahipti (Tablo).

TABLO Insan FcRn'li transjenik farelere 10 mg/kg,lik tek bir iv bolus enjeksiyonundan sonra ELISA ile ölçülen serum konsantrasyonlarinin bölümler arasi olmayan analizi ile elde edilen yabani tip antikor ve üçlü mutant YTE için farmakokinetik parametreler.0rta1ama ± SD, grup basina n = 8, yabani tip antikor ile karsilastirildiginda ANOVA anlamlilik analizi (+++, p <, 0 ila 672 saat arasinda serum konsantrasyon-zaman egrisinin altindaki bölge. anti kor AUC( 0-672) KI er ens terminal yari yabani -ti p 0.0107 ± DIZI LISTESI <110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> FC-reseptör bazli afinite kromatografisi <130> 30801 WO <160> 10 <170> Patentln versiyon 3.5 <210> 1 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 <210> 2 <211> 106 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 fnrmfmîrr ; :mx-p. 1,; .ww :\4 <210> 3 <211> 330 <212> PRT Homo sapiens <400> 3 vol »Lv n; .n !1; Aiqi .li :in .u .iJyv ?rw im `im 'yil ;5. '7751: :va: › 7.. Lv. Mb ;u My uy :~. ru.“- m` ..u `N .i. i.“ a.. 4, a“,- .Av Su: wi .. 4._ mi .u n02' ~^` i. :m :n Iirnîzr i i n; 7-; m. »9 v( -y, u. in I'pViL u 1** _ ; v.. »ip cgu -i.. :n 7:... »:4 02'.` in mu` Isil› <210> 4 <211> 326 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 p.. Iniuv: Tv( 44.20 .41 ;n .Man :ar vw ,i n x 1- in ai: zu <210> 5 <211> 377 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 <210> 6 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 1 ' i', <210> 7 <211> 274 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 i." ar.` i;.- 4" im` :w 'w .n .'15 .1. u..- .L 4.. Mi 2; A4; .Li m 'yk :u v, -i-:i <210> 8 <211> 21 <212> PRT <213> Yapay Dizi <220> <223> HIS-AVITAG <400> 8 <210> 9 <211> 99 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 im. w.,- ni. ::N im. .'Ns - im. .7A iyv mi ;p uy am :-. Evrim:: &N 2,. sz› . - w» ya .'r 'iiî yi' . .spiu 'in »-. nu -iu vw 'iv <210> 10 <211> 227 <212> PRT <213> Yapay Dizi <220> <223> Fc-Bölgesi <400> 10

Claims (11)

ISTEMLER

1. En az bir Fc bölgesini içeren antikorlari veya füzyon polipeptidlerini ayirmak için pozitif dogrusal bir pH gradyani ile bir afinite kromatografisinde bir afinite kromatografisi ligandi olarak bir neonatal Fc reseptörünün (FcRn) kovalent olmayan kompleksinin immobilize edilmesi ve beta-2- mikroglobulinin (b2m) kullanilmasi olup, özelligi; bir neonatal Fc reseptörünün ve beta-Z-mikroglobulinin kovalent olmayan kompleksinin, bir kromatografi materyaline baglannmasi ve kovalent olmayan kompleksin, özel bir baglanma çifti yoluyla kati faza baglanmasi, pH gradyaninin bir birinci pH degerinden ikinci bir pH degerine kadar olmasi; birinci pH degerinin pH 3.5 ila pH 6.4 arasinda olmasi ve ikinci pH degerinin pH 7.4 ila pH 9.5 arasinda olmasi, ve bir neonatal Fc reseptörünün (FcRn) ve beta-Z-mikroglobulinin (b2m) kovalent olmayan kompleksinin mono-biyotinile edilmesi ve kati faz streptavidin ile derive edilmesidir.

2. Istem l'e göre kullanim olup, özelligi; neonatal FC reseptörü ve beta-Z-mikroglobulinin, her biri birbirinden bagimsiz olarak () ila ll) amino asit kalintisi. modifikasyonu ile insan yabani tip neonatal Fc reseptörü ve insan yabani tip beta-Z-mikroglobulin olmasiyla karakterize edilmektedir.

3. Isteni l ila Z'den herhangi birine göre kullanim Olup, özelligi; birinci ;HI degerinin yaklasik pH ESAS ve ikinci pH degerinin yaklasik 8.8 olmasiyla karakterize edilmektedih

4. Isteni 1 ila 3'den herhangi birine göre kullanini olup, Özelligi; kullanimin, bir antikorun canli içi yari ömrünün, antikorun tutulma sürelerinin ve bir referans antikorun oraninin belirlenmesi için olmasiyla karakterize edilmektedir.

5. Isteni 1 ila 3iden herhangi birine göre kullanim olup, özelligi; kullanimin, bir antikorun metionin oksidasyonunun belirlenmesi için olmasiyla karakterize edilmektedin

6. Isteni l ila 37den herhangi birine göre kullanini Olup, özelligi; kullanimin, bir antikorun oligomerizasyon seviyesinin belirlenmesi için olmasiyla karakterize edilmektedir.

7. Isteni 1 ila 3'den herhangi birine göre kullanim. olup, özelligi; ana antikor veya ana füzyon polipeptidine kiyasla FcRn için degistirilmis bir baglanma afinitesine sahip olan en az bir modifiye edilmis antikorlar veya modifiye edilmis füzyon polipeptitleri için bir FC-bölgesinin FcRn baglama kismini içeren bir ana antikor veya bir ana füzyon polipeptidinin modifiye edilmis antikorlar veya modifiye edilmis füzyon polipeptitlerinin bir kütüphanesinin taranmasi için olmasiyla karakterize edilmektedir.

8. Isteni 1 ila 3'den herhangi birine göre kullanim Olup, özelligi; kullanimin, neonatal FC reseptörüne degistirilmis baglanma sergileyen bir Fc-bölgesinin en az bir FcRn baglayici kismini içeren antikorlari veya füzyon polipeptitlerini tanimlamak için olmasiyla karakterize edilmektedir.

9. Isteni 1 ila 3'den herhangi birine göre kullanim. olup, özelligi; kullanimin, IgG preparatlarindan yari antikorlarin uzaklastirilmasi için olmasiyla karakterize edilmektedir.

10. Isteni 1 ila 3'dan herhangi birine göre kullanim. olup, özelligi; kullanimin, lgG preparatlarindan antikor kümelerinin ve antikor oligomerlerinin UZaklastirilmasi için olmasiyla karakterize edilmektedir.

11. Isteni 1 ila lO'dan herhangi birine göre kullanimi Olup, özelligi; füzyon polipeptidinin bir monospesifik antikor veya antikor fragmani veya füzyon polipeptidinin bispesifik bir antikor veya antikor fragmani veya füzyon polipeptidinin bir trispesifik antikor veya antikor fragmani veya füzyon polipeptidinin bir tetraspesifik antikor veya antikor fragmani olmasiyla karakterize edilmektedir.