CN105246508A - Mek抑制剂化合物与her3/egfr抑制剂化合物的组合及使用方法 - Google Patents

Mek抑制剂化合物与her3/egfr抑制剂化合物的组合及使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供包含MEK抑制剂(诸如GDC-0973或GDC-0623)或其药学可接受盐和HER3/EGFR抑制剂(诸如MEHD7945A)的组合。该组合对于治疗高增殖性病症(诸如癌症)特别有用。

Description

MEK抑制剂化合物与HER3/EGFR抑制剂化合物的组合及使用方法
发明领域
本发明一般涉及具有针对高增殖性病症诸如癌症的活性的化合物的药物组合，包括抑制MEK途径的化合物与阻断HER3/EGFR的化合物的组合。本发明还涉及使用所述组合体外、原位、和体内诊断或治疗哺乳动物细胞或有关病理状况的方法。
发明背景
蛋白质激酶(PK)是通过转移来自ATP的末端(伽马)磷酸根来催化蛋白质的酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸残基上的羟基基团磷酸化的酶。通过信号转导途径，这些酶调控细胞生长、分化和增殖，即细胞生命的实质上所有方面总是依赖于PK活性(Hardie,G.andHanks,S.(1995)TheProteinKinaseFactsBook.IandII,AcademicPress,SanDiego,CA)。并且，异常PK活性已经与一大群病症联系起来，范围从相对不危及生命的疾病诸如银屑病至极端致命的疾病诸如成胶质细胞瘤(脑癌)。蛋白质激酶是治疗性调控的一种重要靶物类别(Cohen,P.(2002)NatureRev.DrugDiscovery1:309)。
MEK是一种双重特异性激酶，磷酸化ERK1和2上的酪氨酸和苏氨酸，这是活化所需要的。两种相关基因编码MEK1和MEK2，它们在对ERK的结合方面是不同的。HER3是一种能被神经调蛋白和NTAK结合和活化的受体酪氨酸激酶。EGFR是一种跨膜糖蛋白，是表皮生长因子家族的成员的受体。
当前，仍然需要可用于治疗高增殖性疾病(诸如癌症)的改进方法和组合物。
发明概述
已经确定了在体外和在体内抑制癌细胞生长的改进效果能通过抑制MEK、HER3和EGFR来实现。例如，已经发现在体外和在体内抑制癌细胞生长的改进效果能通过施用GDC-0973或GDC-0623或其药学可接受盐和MEHD7945A的组合来实现。该组合和方法在高增殖性病症(诸如癌症)的治疗中会是有用。在某些实施方案中，施用该组合可提供协同效应。
因而，本发明的某些实施方案提供治疗剂组合，其包含小分子MEK抑制剂GDC-0973(式I)或其药学可接受盐(参见WO2007/044515)，其具有结构：
或小分子MEK抑制剂GDC-0623(式II)或其药学可接受盐(参见WO2009/085983)，其具有结构：
与MEHD7945A(一种双重作用抗体，其包含两个相同抗原结合域，它们均特异性结合HER3和EGFR二者)(参见Schaeferetal.,CancerCell,20,472-486(2011)和WO2010/108127(例如图33)中的DL11f)组合。MEHD7945A和GDC-0973或GDC-0623可以存在于两种分开的药物组合物中或一起存在于单一药物组合物中。
因而，本发明的某些实施方案涉及GDC-0973或GDC-0623或其药学可接受盐；和MEHD7945A的组合，用于高增殖性病症的治疗性处理。
在某些实施方案中，该高增殖性病症为癌症。
在某些实施方案中，该癌症与KRAS突变有关。
在某些实施方案中，该癌症选自结肠直肠、间皮瘤、子宫内膜、胰腺、乳腺、肺、卵巢、***、黑素瘤、胃、结肠、肾、头和颈、和成胶质细胞瘤。
在某些实施方案中，GDC-0973或其药学可接受盐与MEHD7945A组合施用。
在某些实施方案中，GDC-0623或其药学可接受盐与MEHD7945A组合施用。
在某些实施方案中，GDC-0973或GDC-0623或其药学可接受盐与MEHD7945A同时施用。
在某些实施方案中，GDC-0973或GDC-0623或其药学可接受盐和MEHD7945A序贯施用。
本发明的某些实施方案涉及GDC-0973或GDC-0623或其药学可接受盐；和MEHD7945A的组合，用于改善具有高增殖性病症的患者的生命质量的治疗性用途。
本发明的某些实施方案涉及GDC-0973或GDC-0623或其药学可接受盐；和MEHD7945A的组合，用于治疗高增殖性病症。
本发明的某些实施方案涉及GDC-0973或GDC-0623或其药学可接受盐；和MEHD7945A的组合在制备用于治疗患者中的高增殖性病症的药物中的用途。
本发明的某些实施方案涉及试剂盒，其包含GDC-0973或GDC-0623或其药学可接受盐；和MEHD7945A、容器、和包装插页或标签，该包装插页或标签指示施用GDC-0973或GDC-0623或其药学可接受盐；和MEHD7945A来治疗高增殖性病症。
本发明的某些实施方案涉及包含GDC-0973或GDC-0623或其药学可接受盐和MEHD7945A的产品，作为组合制剂，供高增殖性病症(例如癌症)的治疗中分开、同时或序贯使用。
本发明的某些实施方案涉及用于在患者中治疗高增殖性病症(例如癌症)的方法，其包括对该患者施用GDC-0973和GDC-0623或其药学可接受盐；和MEHD7945A的组合。
附图简述
图1是一幅图，证明MEHD7945A结合HER3-ECD和EGFR-ECD二者。
图2A和B是图，证明MEHD7945A抑制EGFR和HER2/HER3依赖性信号传导。
图3是一幅图，显示FaDu癌症模型中MEHD7945A对肿瘤生长的抑制。
图4是众多鼠异种移植物模型中MEHD7945A与西妥昔单抗(cetuximab)或抗HER3相比的肿瘤生长抑制效果的汇总。
图5是一幅图，证明GDC-0973和GDC-0623有效抑制B-RAF突变体肿瘤细胞生长。
图6是一幅图，证明GDC-0973和GDC-0623有效抑制KRAS突变体肿瘤细胞生长。
图7是一幅图，证明鼠异种移植物CRCKRASDLD-1(A)和LS180(B)模型中单一药剂和组合处理对pAkt和pERK水平的影响。
图8是一幅图，证明MEHD7945A、GDC-0973和GDC-0623的单一药剂和组合处理的肿瘤生长抑制效果。
图9证明用cobimetinib处理的TGFα刺激的LS180或DLD-1细胞显示出升高的AKT磷酸化。
图10是一幅图，证明MEHD7945A和cobimetinib组合对KRAS突变体细胞系LS180增殖的抑制。
图11A是一幅图，证明CD-1裸鼠中cobimetinib与MEHD7945A的组合对LS180结肠直肠腺癌肿瘤异种移植物的影响；图11B是一张表，汇总来自图11A的数据。
图12A是一幅图，证明的C.B-17SCID米色小鼠中cobimetinib与MEHD7945A的组合对KRAS突变体DLD-1结肠直肠腺癌肿瘤异种移植物的影响；图12B是一张表，汇总来自图12A的数据。
图13A是一幅图，证明NCr裸鼠中cobimetinib与MEHD7945A的组合对BxPC3导管胰腺异种移植物肿瘤的影响；图13B是一张表，汇总此项研究的抗肿瘤活性；图13C是一张表，汇总此项研究的肿瘤进展前时间和响应。
发明详述
I.定义
必须注意的是，如本文中和所附权利要求中使用的，单数形式“一个/一种”和“该”包括复数指代物，除非上下文另外清楚地指示。
贯穿本说明书和权利要求书中，词“包含/包括”或其变体将理解为暗示纳入所述整数或整数组，但不排除任何其他整数或整数组。
术语“抗体”在本文中以最广义使用，而且具体涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体、和抗体片段，只要它们展现期望的生物学活性。术语“多特异性抗体”以最广义使用，而且具体涵盖包含具有多表位特异性(即能够特异性结合一种生物学分子上的两种或更多种不同表位或能够特异性结合两种或更多种不同生物学分子上的表位)的抗原结合域的抗体。抗原结合域的一个具体例子是由重链可变域(VH)和轻链可变域(VL)构成的VHVL单元。此类多特异性抗体包括但不限于全长抗体、具有两个或更多个VL和VH域的抗体、诸如Fab、Fv、dsFv、scFv、双抗体(diabody)、双特异性双抗体和三抗体(triabody)等抗体片段、已经共价或非共价连接的抗体片段。“双特异性抗体”是包含能够特异性结合一种生物学分子上的两种不同表位或能够特异性结合两种不同生物学分子上的表位的抗原结合域的多特异性抗体。双特异性抗体在本文中也称作具有“双重特异性”或是“双重特异性的”。
在某些实施方案中，本发明的抗体对其靶HER(一种或多种)具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM、或≤0.001nM的解离常数(Kd)(例如10-8M或更少，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。
基本的4链抗体单元是由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)构成的异四聚体糖蛋白(IgM抗体由5个基本的异四聚体单元及称作J链的另外多肽组成，因此包含10个抗原结合位点；而分泌型IgA抗体可聚合形成包含2-5个基本的4链单元及J链的多价装配物)。在IgG的情况中，4链单元通常是约150,000道尔顿。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而两条重链通过一个或多个二硫键彼此相连，二硫键的数目取决于重链的同种型。每条重链和轻链还具有间隔规律的链内二硫桥。每条重链在N-末端具有一个可变域(VH)，接着是三个(对于α和γ链)或四个(对于μ和ε同种型)恒定域(CH)。每条轻链在N-末端具有一个可变域(VL)，接着是其另一端的一个恒定域(CL)。VL与VH排列在一起，而CL与重链的第一恒定域(CH1)排列在一起。认为特定的氨基酸残基在轻链和重链可变域之间形成界面。成对的一个VH和一个VL一起形成一个抗原结合位点。关于不同类别抗体的结构和性质，参见例如《BasicandClinicalImmunology》，第8版，DanielP.Stites,AbbaI.Terr和TristramG.Parslow编，Appleton&Lange，Norwalk，CT，1994年，第71页和第6章。
来自任何脊椎动物物种的轻链，根据其恒定域氨基酸序列，可归入两种截然不同类型中的一种，称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。根据其重链(CH)恒定域氨基酸序列，免疫球蛋白可归入不同的类别或同种型。有五类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，分别具有称作α、δ、ε、γ和μ的重链。根据CH序列和功能的较小差异，γ和α类可进一步分为亚类，例如人类表达下列亚类：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。
术语“可变的”指可变域中的某些区段在抗体序列中差异广泛的实情。V结构域介导抗原结合并限定特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，变异性并非均匀分布于可变域跨越的110个氨基酸。事实上，V区由15-30个氨基酸，称作框架区(FR)的相对不变异的区段及将框架区分开的称作“高变区”或HVR的极度变异的较短区域构成。天然重链和轻链的可变域各自包含四个FR，它们大多采取β-折叠构象，通过形成环状连接且在有些情况中形成β-折叠结构一部分的三个高变区连接。每条链中的高变区通过FR非常接近的保持在一起，并与另一条链的高变区一起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等，《SequencesofProteinsofImmunologicalInterest》，第5版，PublicHealthService，NationalInstitutesofHealth，Bethesda，MD，1991年)。恒定域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应器功能，诸如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)中抗体的参与。
术语“高变区”、“HVR”或“HV”在用于本文时指抗体可变域中序列上高度可变和/或形成结构上定义的环的区域。通常，抗体包含六个HVR：三个在VH中(HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3)，三个在VL中(HVR-L1、HVR-L2、HVR-L3)。在天然抗体中，H3和L3展示这六个HVR的最大多样性，而且认为特别是H3在赋予抗体以精密特异性中发挥独特作用。参见例如Xu等，Immunity13:37-45(2000)；Johnson和Wu,于:MethodsinMolecularBiology248:1-25(Lo编,HumanPress,Totowa,NJ,2003)。事实上，仅由重链组成的天然存在骆驼(camelid)抗体在缺乏轻链时是有功能的且稳定的。参见例如Hamers-Casterman等,Nature363:446-448(1993)；Sheriff等,NatureStruct.Biol.3:733-736(1996)。
HVR一般包含来自高变环和/或来自“互补性决定区”(CDR)的氨基酸残基，后者具有最高序列变异性和/或涉及抗原识别。本文中使用且涵盖许多HVR的叙述。Kabat互补决定区(CDR)是以序列变异性为基础的，而且是最常用的(Kabat等,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD.(1991))。Chothia改为指结构环的位置(Chothia和LeskJ.Mol.Biol.196:901-917(1987))。AbMHVR代表KabatHVR与Chothia结构环之间的折衷，而且得到OxfordMolecular的AbM抗体建模软件的使用。“接触”HVR是以对可获得的复合物晶体结构的分析为基础的。下文记录了这些HVR中每一个的残基。
HVR可包括如下“延伸的HVR”：VL中的24-36或24-34(L1)、46-56或50-56(L2)和89-97或89-96(L3)及VH中的26-35(H1)、50-65或47-65(H2)和93-102、94-102、或95-102(H3)。对于这些定义中的每一个，可变域残基是依照Kabat等,见上文编号的。
“框架”或“FR”残基指可变域中除本文中所定义的HVR残基外的那些残基。
术语“依照Kabat的可变域残基编号方式”或“依照Kabat的氨基酸位置编号方式”及其变体指Kabat等,见上文中用于抗体重链可变域或轻链可变域编辑的编号***。使用此编号***，实际的线性氨基酸序列可包含较少或另外的氨基酸，对应于可变域FR或HVR的缩短或***。例如，重链可变域可包含H2残基52后的单一氨基酸***(依照Kabat为残基52a)及重链FR残基82后的***残基(例如依照Kabat为残基82a、82b和82c等)。给定抗体的Kabat残基编号方式可通过将抗体序列与“标准”Kabat编号序列对比同源区来确定。
Kabat编号***一般在提及可变域中的残基(大约是轻链残基1-107和重链残基1-113)时使用(例如Kabatetal.,SequencesofImmunologicalInterest.5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,Md.(1991))。“EU编号***”或“EU索引”一般在提及免疫球蛋白重链恒定区中的残基时使用(例如Kabatetal.,见上文中报告的EU索引)。“如Kabat中的EU索引”指人IgG1EU抗体的残基编号方式。除非本文中另有说明，提及抗体可变域中的残基编号指根据Kabat编号***的残基编号方式。除非本文中另有说明，提及抗体恒定域中的残基编号指根据EU编号***的残基编号方式(例如参见WO2006/073941)。
“亲和力”指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶(例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有指示，如本文中使用的，“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗体和抗原)之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以用解离常数(Kd)来表述。亲和力可以通过本领域知道的常用方法来测量，包括本文中所描述的方法。
“亲和力成熟的”抗体指在抗体的一个或多个HVR或框架区中具有一处或多处改变、导致该抗体对抗原的亲和力与没有那些改变的亲本抗体相比有所改进的抗体。在一个实施方案，亲和力成熟的抗体具有纳摩尔或甚至皮摩尔量级的对靶抗原的亲和力。亲和力成熟的抗体可使用本领域已知的某些规程来生成。例如，Marks等,Bio/Technology10:779-783(1992)记载了通过VH和VL结构域改组进行的亲和力成熟。以下文献记载了HVR和/或框架残基的随机诱变：例如，Barbas等,Proc.Nat.Acad.Sci.USA91:3809-3813(1994)；Schier等,Gene169:147-155(1995)；Yelton等,J.Immunol.155:1994-2004(1995)；Jackson等,J.Immunol.154(7):3310-9(1995)；Hawkins等,J.Mol.Biol.226:889-896(1992)。
抗体的“类”指其重链拥有的恒定域或恒定区的类型。抗体有5大类：IgA、IgD、IgE、IgG、和IgM，并且这些中的几种可以进一步分成亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、和IgA2。与不同类免疫球蛋白对应的重链恒定域分别称作α、δ、ε、γ、和μ。
术语“患者”(可互换地称作“个体”和“受试者”)指人患者。患者可以是“癌症患者”，即罹患或有风险患上癌症的一种或多种症状的患者。
术语“治疗”或“处理”指治疗性处理，其中目的是预防或减缓(减轻)不想要的生理变化或病症，诸如癌症的生长、形成或传播。为了本发明的目的，有益的或期望的临床结果包括但不限于症状缓解、疾病程度减弱、疾病状态稳定(即没有恶化)、疾病进展延迟或减缓、疾病状态改善或减轻、和消退(无论是部分的或者是全部的)，无论是检测得到的或者是检测不到的。“治疗”或“处理”还可表示与不接受治疗的预期存活相比延长存活。那些需要治疗的包括那些早就具有状况或病症的，例如具有癌症的患者。
短语“治疗有效量”表示如下的量，其(i)治疗本文所述特定疾病、状况、或病症，(ii)减轻、改善、或消除特定疾病、状况、或病症的一种或多种症状，或(iii)预防或延迟本文所述特定疾病、状况、或病症的一种或多种症状的发作。在癌症的情况中，治疗有效量可减少癌细胞数目；缩小肿瘤体积；抑制(例如一定程度地减缓，优选停止)癌细胞浸润入周围器官中；抑制(例如一定程度地减缓，优选停止)肿瘤转移；一定程度地抑制肿瘤生长；和/或一定程度地减轻与癌症有关的一种或多种症状。就该组合可预防癌细胞生长和/或杀死现有癌细胞的程度而言，它可以是抑制细胞的和/或毒害细胞的。对于癌症疗法，可以例如通过评估疾病发展前时间(TTP)和/或测定响应率(RR)来测量功效。
术语“癌症”和“癌性”指或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长不受调节的生理状况。“肿瘤”包含一个或多个癌性细胞。癌症的例子包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤、和白血病或淋巴样恶性。此类癌症的更具体例子包括鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌(“NSCLC”)、肺的腺癌和肺的鳞癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(gastricorstomachcancer)(包括胃肠癌)、胰腺癌、成胶质细胞瘤、***、卵巢癌、肝癌(livercancer)、膀胱癌、肝瘤(hepatoma)、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌(kidneyorrenalcancer)、***癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepaticcarcinoma)、***癌、***癌、及头和颈癌。如本文中使用的，胃癌包括能在胃的任何部分中发生且可扩散遍及胃和其它器官(特别是食道、肺、***、和肝)的胃癌。
“化学治疗剂”指可用于治疗癌症(不管作用机制)的生物学(例如大分子)或化学(例如小分子)化合物。
“铂剂”是包含铂的化疗剂，例如卡铂、顺铂、和奥沙利铂。
术语“哺乳动物”包括但不限于人、小鼠、大鼠、豚鼠、猴、犬、猫、马、牛、猪、绵羊、和家禽。在一个实施方案中，哺乳动物为人。
术语“包装插页”用于指通常包括在商业包装的治疗用产品中的说明书，它们包含有关涉及此类治疗用产品应用的适应征、用法、剂量、施用、禁忌症和/或警告的信息。
如本文中使用的，短语“药学可接受盐”指化合物的药学可接受的有机或无机盐。例示性的盐包括但不限于bismesylate、硫酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、草酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、异烟酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、酸式柠檬酸盐、酒石酸盐、油酸盐、丹宁酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐、富马酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐、糖酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲基磺酸盐(甲磺酸盐)、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、和扑酸盐(即1,1’-亚甲基-双(2-羟基-3-萘甲酸))盐。药学可接受盐可能牵涉包含另一种分子，诸如乙酸盐离子、琥珀酸盐离子或其它抗衡离子。抗衡离子可以是稳定母体化合物电荷的任何有机或无机模块。另外，药学可接受盐可以在其结构中具有超过一种带电荷原子。在多种带电荷原子作为药学可接受盐的组成部分的情况中可以具有多种抗衡离子。因此，药学可接受盐可具有一种或多种带电荷原子和/或一种或多种抗衡离子。
期望的药学可接受的盐可以通过本领域可得的任何合适方法来制备。例如用无机酸(诸如氢氯酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、甲磺酸、磷酸等等)或用有机酸(诸如乙酸、马来酸、琥珀酸、扁桃酸、富马酸/延胡索酸、丙二酸、丙酮酸、草酸、乙醇酸、水杨酸、吡喃糖苷酸(pyranosidylacid)(诸如葡萄糖醛酸或半乳糖醛酸)、α羟酸(诸如柠檬酸或酒石酸)、氨基酸(诸如天冬氨酸或谷氨酸)、芳香酸(诸如苯甲酸或肉桂酸)、磺酸(诸如对甲苯磺酸或乙磺酸)、等等)处理游离碱。文献中讨论了一般认为适合于自碱性药学化合物形成药学有用或可接受的盐的酸，例如P.Stahl等，CamilleG.(编)HandbookofPharmaceuticalSalts.Properties，SelectionandUse.(2002)Zurich：Wiley-VCH；S.Berge等，JournalofPharmaceuticalSciences(1977)66(1)119；P.Gould，InternationalJ.ofPharmaceutics(1986)33201217；Anderson等，ThePracticeofMedicinalChemistry(1996)，AcademicPress，NewYork；Remington’sPharmaceuticalSciences，第18版，(1995)MackPublishingCo.，EastonPA；和TheOrangeBook(Food&DrugAdministration，Washington，D.C.，它们的网站)。通过述及将这些公开内容收入本文。
短语“药学可接受的”指明该物质或组合物是在化学和/或毒理学方面与构成配制剂的其它成分和/或用它治疗的患者相容的。
如本文中所使用的，术语“协同的”指比两种或更多种单一药剂的加和效果更有效的治疗剂组合。协同相互作用的确定可以基于自本领域已知测定法获得的结果。可以用CalcuSyn软件使用Chou和Talalay组合法和剂量-效果分析来分析这些测定法的结果以获得组合指数(ChouandTalalay,1984,Adv.EnzymeRegul.22：27-55)。可以利用标准程序来分析本文中提供的组合以量化抗癌药间的协同、加和和拮抗效应。一种例示性程序是ChouandTalalay,in“NewAvenuesinDevelopmentalCancerChemotherapy”,AcademicPress,1987,第2章中所记载的。组合指数小于0.8的值指示协同，大于1.2的值指示拮抗，而介于0.8至1.2之间的值指示加和效应。组合疗法可提供“协同性”和证明是“协同的”，即一起使用活性成分时所实现的效果大于分开使用化合物所致效果的和。如此，在一个实施方案中，组合量的活性组分有效提供协同效应(在本文中也称作协同有效量)。当活性成分如下所述时可获得协同效应：(1)以组合的单位剂量配制剂共配制和同时施用或递送；(2)作为分开的配制剂交替或平行递送；或(3)通过一些其它方案。当在交替疗法中递送时，当化合物序贯施用或递送时(例如通过分开的注射器中的不同注射)可获得协同效应。一般而言，在交替疗法期间，序贯地(即连续地)施用有效剂量的每种活性组分，而在组合疗法中，一起施用有效剂量的两种或更多种活性组分。使用BLISS独立性模型和最高单一药剂(HSA)模型(Leháretal.2007,MolecularSystemsBiology3:80)二者来评估组合效果。BLISS得分量化单一药剂的的强化的程度，而且正的BLISS得分(大于0)提示大于简单叠加。大于250的累积正BLISS得分认为是在测试的浓度范围内观察到强协同性。HSA得分(大于0)提示组合效果大于在相应浓度的单一药剂响应的最大值。
在提供针对给定高增殖性病症的改进治疗以外，施用本发明的某些组合可以与接受不同治疗的相同患者经历的生命质量相比改善患者的生命质量。例如，将组合施用于患者可提供与只接受药剂个体之一作为疗法的相同患者会经历的生命质量相比改善的生命质量。例如，本文所述组合的组合疗法可降低需要的治疗剂的剂量。组合疗法还可降低或消除对使用化疗剂的需要和与高剂量化疗剂有关的副作用(例如恶心、呕吐、脱发、皮疹、食欲减退、体重减轻、等)。该组合还可引起肿瘤负荷和相关不利事件(诸如疼痛、器官功能障碍、体重减轻、等)降低。因而，本发明的一个方面提供用于治疗用途的组合，用于改善用本文所述药剂治疗高增殖性病症的患者的生命质量。
一个方面包括罹患癌症的患者中肿瘤生长抑制(TGI)的方法，其包括对该患者施用本文所述组合。在某些实施方案中，该组合提供协同效应。
在某些实施方案中，该组合的TGI大于单独的GDC-0973和GDC-0623或MEHD7945A任一的TGI。在某些实施方案中，该组合的TGI比单独的药剂的TGI大约10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70或75％。
测量TGI的方法是本领域已知的。在一种例示性方法中，在治疗之前和之后自患者测定并比较平均肿瘤体积。可以使用本领域任何方法在两个维度(长度和宽度)上测量肿瘤体积，例如UltraCalIV测径器(FredV.FowlerCompany)或PET(正电子发射断层摄影术)或一些其它方法。可以使用公式肿瘤体积(mm3)＝(长度x宽度2)x0.5。在多个时间段测量肿瘤体积可以使用混合建模线性混合效应(LinearMixedEffects，LME)办法(Pinheiroetal.2009)来进行。此办法能解决重复测量(和多名患者)二者。可以在每个剂量水平使用三次回归样条将非线性概况拟合至肿瘤体积的时间过程。然后可以在混合模型内将这些非线性概况与剂量关联起来。使用下式，以相对于媒介的百分比拟合曲线下面积(AUC)/天，可以计算作为媒介百分比的肿瘤生长抑制：
使用此公式，100％的TGI值指示肿瘤停滞，大于约1％但小于约100％指示肿瘤生长抑制，而大于约100％指示肿瘤消退。
II.MEK和HER3/EGFR抑制剂
A.MEK抑制剂
本发明涉及MEK抑制剂及其在与HER3和EGFR抑制剂的组合疗法中的用途。MEK抑制剂已有广泛综述(S.Price,PutativeAllostericMEK1andMEK2inhibitors,ExpertOpin.Ther.Patents,200818(6):603；J.I.Trujillo,MEKInhibitors:apatentreview2008-2010ExpertOpin.Ther.Patents201121(7):1045)。优选地，MEK抑制剂选自GDC-0973(cobimetinib)、GDC-0623、AZD6244(selumetinib)、AZD8330、BAY86-9766(refametinib)、GSK-1120212(trametinib)、ARRY-162、MSC1936369、MK162、TAK733和PD-325901。最优选地，MEK抑制剂为GDC-0973(cobimetinib)或GDC-0623。
GDC-0973是MEK1和MEK2(RAS/RAF途径的中心成分)的一种口服可利用的，有力的且高度选择性的抑制剂。GDC-0973具有化学文摘登记号(CAS)934660-93-2和化学结构：
GDC-0623具有化学文摘登记号(CAS)1168091-68-6和化学结构：
A.制备MEK抑制剂：GDC-0973和GDC-0623
MEK抑制剂GDC-0973(式I)或其药学可接受盐可以如WO2007044515实施例22所述或者如Rice等人(K.D.Riceetal.,NovelCarboxamide-BasedAllostericMEKinhibitors:DiscoveryandOptimizationEffortstowardXL518(GDC-0973),Med.Chem.Lett.20123:416)所述来制备。
MEK抑制剂GDC-0623(式II)或其药学可接受盐可以例如如WO2009/085983实施例5所述来制备。
B.HER3/EGFR抑制剂
本发明涉及抑制HER3、EGFR、或HER3和EGFR二者的化合物及其在与MEK抑制剂的组合疗法中的用途。HER3、EGFR、和双重HER3/EGFR抑制剂可以是抗体或其它抗原结合蛋白、小分子、核酸(诸如siRNA)、或任何其它此类分子。
在一个实施方案中，组合疗法涉及HER3抑制剂。例示性抗HER3抗体记载于WO2011076683(Mab205.10.1、Mab205.10.2、Mab205.10.3)、US7846440、US7705130和US5968511。
在一个实施方案中，组合疗法涉及EGFR抑制剂。EGFR抑制剂的例子包括MAb579(ATCCCRLHB8506)，MAb455(ATCCCRLHB8507)，MAb225(ATCCCRL8508)，MAb528(ATCCCRL8509)(参见美国专利No.4,943,533，Mendelsohn等人)及其变体，诸如嵌合化225(C225或西妥昔单抗；)和重定型人225(H225)(参见WO96/40210，ImcloneSystemsInc.)；IMC-11F8，一种完全人的EGFR靶向性抗体(Imclone)；结合II型突变体EGFR的抗体(美国专利No.5,212,290)；美国专利No.5,891,996中记载的结合EGFR的人源化和嵌合抗体；和结合EGFR的人抗体，诸如ABX-EGF或Panitumumab(参见WO98/50433，Abgenix/Amgen)；EMD55900(Stragliottoetal.,Eur.J.Cancer32A:636-640(1996))；EMD7200(matuzumab)，针对EGFR、与EGF和TGF-α二者竞争EGFR结合的一种人源化EGFR抗体(EMD/Merck)；人EGFR抗体，HuMax-EGFR(GenMab)；称作E1.1，E2.4，E2.5，E6.2，E6.4，E2.11，E6.3和E7.6.3且记载于US6,235,883的完全人的抗体；MDX-447(MedarexInc)；和mAb806或人源化mAb806(Johnsetal.,J.Biol.Chem.279(29):30375-30384(2004))。抗EGFR抗体可以缀合有细胞毒剂，如此生成免疫缀合物(参见例如EP659,439A2，MerckPatentGmbH)。EGFR抑制剂包括小分子，诸如美国专利No.5,616,582，5,457,105，5,475,001，5,654,307，5,679,683，6,084,095，6,265,410，6,455,534，6,521,620，6,596,726，6,713,484，5,770,599，6,140,332，5,866,572，6,399,602，6,344,459，6,602,863，6,391,874，6,344,455，5,760,041，6,002,008，和5,747,498，以及PCT公开文本WO98/14451，WO98/50038，WO99/09016，和WO99/24037中记载的化合物。特定小分子EGFR抑制剂包括OSI-774(CP-358774，厄洛替尼，Genentech/OSIPharmaceuticals)；PD183805(CI1033，2-丙烯酰胺，N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-7-[3-(4-吗啉基)丙氧基]-6-喹唑啉基]-，二盐酸盐，PfizerInc.)；ZD1839，吉非替尼(4-(3’-氯-4’-氟苯胺基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉代丙氧基)喹唑啉，AstraZeneca)；ZM105180(6-氨基-4-(3-甲基苯基-氨基)-喹唑啉，Zeneca)；BIBX-1382(N8-(3-氯-4-氟-苯基)-N2-(1-甲基-哌啶-4-基)-嘧啶并[5,4-d]嘧啶-2,8-二胺，BoehringerIngelheim)；PKI-166((R)-4-[4-[(1-苯基乙基)氨基]-1H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基]-酚)；(R)-6-(4-羟基苯基)-4-[(1-苯基乙基)氨基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶；CL-387785(N-[4-[(3-溴苯基)氨基]-6-喹唑啉基]-2-丁炔酰胺)；EKB-569(N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-3-氰基-7-乙氧基-6-喹啉基]-4-(二甲基氨基)-2-丁烯酰胺)(Wyeth)；AG1478(Sugen)；和AG1571(SU5271；Sugen)。
在一个实施方案中，组合疗法涉及双特异性HER3/EGFR抑制剂。在一个实施方案中，双特异性HER3/EGFR抑制剂是双特异性抗体。在一个实施方案中，双特异性HER3/EGFR抑制剂是包含特异性结合HER3和EGFR二者的抗原结合域的双特异性抗体。在一个实施方案中，双特异性HER3/EGFR抑制剂是包含两个相同抗原结合域(它们均特异性结合HER3和EGFR二者)的双特异性抗体。此类抗体记载于WO2010108127、US20100255010和Schaeferetal.,CancerCell,20:472-486(2011)。包含特异性结合HER3和EGFR二者的抗原结合域的一种此类特定双特异性HER3/EGFR抑制剂是DL11f，也称作MEHD7945A。MEHD7945A能够结合EGFR的域III和HER3的域III。MEHD7945A还能够结合Fcγ受体且具有引发抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的潜力。MEHD7945A在多种非临床模型中显示有力的抗肿瘤活性，包括对抗EGFR治疗剂不响应的模型。
双重作用抗体MEHD7945A(其包含两个相同抗原结合域，它们均特异性结合HER3和EGFR二者)可以如WO2010/108127(参见DL11f，例如图33)和Schaeferetal.,CancerCell,20,472-486(2011)所述来制备。MEHD7945A的重链可变域的氨基酸序列提供于SEQIDNO:1，而MEHD7945A的轻链可变域的氨基酸序列提供于SEQIDNO:2。
在一个实施方案中，双特异性HER3/EGFR抗体包含特异性结合HER3和EGFR的抗原结合域，其中该抗体包含VH，该VH包含氨基酸序列SEQIDNO:1的一个、两个、和/或三个HVR。在一个实施方案中，双特异性HER3/EGFR抗体包含特异性结合HER3和EGFR的抗原结合域，其中该抗体包含VH和VL，该VH包含氨基酸序列SEQIDNO:1的一个、两个、和/或三个HVR，该VL包含氨基酸序列SEQIDNO:2的一个、两个、和/或三个HVR。在一个实施方案中，双特异性HER3/EGFR抗体包含特异性结合HER3和EGFR的抗原结合域，其中该抗体包含VH和VL，该VH包含氨基酸序列SEQIDNO:1的所有三个HVR，该VL包含氨基酸序列SEQIDNO:2的所有三个HVR。在一些实施方案中，HVR为延伸的HVR。在一个具体实施方案中，HVR-H1包含氨基酸序列LSGDWIH(SEQIDNO:3)，HVR-H2包含氨基酸序列VGEISAAGGYTD(SEQIDNO:4)，HVR-H3包含氨基酸序列ARESRVSFEAAMDY(SEQIDNO:5)，HVR-L1包含氨基酸序列NIATDVA(SEQIDNO:6)，HVR-L2包含氨基酸序列SASF(SEQIDNO:7)，且HVR-L3包含氨基酸序列SEPEPYT(SEQIDNO:8)。
在一个实施方案中，双特异性HER3/EGFR抗体包含特异性结合HER3和EGFR的抗原结合域，其中该抗体包含与氨基酸序列SEQIDNO:1具有至少80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％序列同一性的VH。在一个具体实施方案中，包含与氨基酸序列SEQIDNO:1具有至少80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％序列同一性的VH的双特异性HER3/EGFR抗体包含：包含氨基酸序列LSGDWIH(SEQIDNO:3)的HVR-H1，包含氨基酸序列VGEISAAGGYTD(SEQIDNO:4)的HVR-H2，和包含氨基酸序列ARESRVSFEAAMDY(SEQIDNO:5)的HVR-H3。
在一个实施方案中，双特异性HER3/EGFR抗体包含特异性结合HER3和EGFR的抗原结合域，其中该抗体包含与氨基酸序列SEQIDNO:2具有至少80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％序列同一性的VL。在一个具体实施方案中，包含与氨基酸序列SEQIDNO:2具有至少80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％序列同一性的VL的双特异性HER3/EGFR抗体包含：包含氨基酸序列NIATDVA(SEQIDNO:6)的HVR-L1，包含氨基酸序列SASF(SEQIDNO:7)的HVR-L2，和包含氨基酸序列SEPEPYT(SEQIDNO:8)的HVR-L3。
在一个实施方案中，双特异性HER3/EGFR抗体包含特异性结合HER3和EGFR的抗原结合域，其中该抗体包含与氨基酸序列SEQIDNO:1具有至少80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％序列同一性的VH和与氨基酸序列SEQIDNO:2具有至少80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％序列同一性的VL。在一个实施方案中，包含与氨基酸序列SEQIDNO:1具有至少80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％序列同一性的VH和与氨基酸序列SEQIDNO:2具有至少80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％序列同一性的VL的双特异性HER3/EGFR抗体包含：包含氨基酸序列LSGDWIH(SEQIDNO:3)的HVR-H1，包含氨基酸序列VGEISAAGGYTD(SEQIDNO:4)的HVR-H2，和包含氨基酸序列ARESRVSFEAAMDY(SEQIDNO:5)的HVR-H3，包含氨基酸序列NIATDVA(SEQIDNO:6)的HVR-L1，包含氨基酸序列SASF(SEQIDNO:7)的HVR-L2，和包含氨基酸序列SEPEPYT(SEQIDNO:8)的HVR-L3。
在一个实施方案中，双特异性HER3/EGFR抗体包含特异性结合HER3和EGFR的抗原结合域，其中该抗体包含VH，该VH包含氨基酸序列SEQIDNO:1。在一个实施方案中，双特异性HER3/EGFR抗体包含特异性结合HER3和EGFR的抗原结合域，其中该抗体包含VL，该VL包含氨基酸序列SEQIDNO:2。在一个实施方案中，双特异性HER3/EGFR抗体包含特异性结合HER3和EGFR的抗原结合域，其中该抗体包含VH和VL，该VH包含氨基酸序列SEQIDNO:1，该VL包含氨基酸序列SEQIDNO:2。
在一个实施方案中，双特异性HER3/EGFR抗体包含特异性结合HER3和EGFR的抗原结合域，其中该抗体包含重链，该重链包含氨基酸序列SEQIDNO:9。在一个实施方案中，双特异性HER3/EGFR抗体包含特异性结合HER3和EGFR的抗原结合域，其中该抗体包含轻链，该轻链包含氨基酸序列SEQIDNO:10。在一个实施方案中，双特异性HER3/EGFR抗体包含特异性结合HER3和EGFR的抗原结合域，其中该抗体包含重链和轻链，该重链包含氨基酸序列SEQIDNO:9，该轻链包含氨基酸序列SEQIDNO:10。
在一些实施方案中，包含特异性结合EGFR和HER3的抗原结合域的双特异性HER3/EGFR抗体是全长IgG1抗体。
C.抗体制备
1.抗体亲和力
在某些实施方案中，本文中提供的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM、或≤0.001nM的解离常数(Kd)(例如10-8M或更少，例如10-8M至10-13M，例如，10-9M至10-13M)。
在一个实施方案中，Kd是通过放射性标记抗原结合测定法(RIA)来测量的，如下面的测定法所述用Fab型式的感兴趣抗体及其抗原实施。通过在存在未标记抗原的滴定系列的情况中用最小浓度的(125I)标记抗原平衡Fab，然后用抗Fab抗体包被板捕捉结合的抗原来测量Fab对抗原的溶液结合亲和力(见例如Chen等,J.Mol.Biol.293:865-881(1999))。为了建立测定法的条件，将多孔板(ThermoScientific)用50mM碳酸钠(pH9.6)中的5μg/ml捕捉用抗Fab抗体(CappelLabs)包被过夜，随后用PBS中的2％(w/v)牛血清清蛋白于室温(约23℃)封闭2-5小时。在非吸附板(Nunc#269620)中，将100pM或26pM[125I]-抗原与连续稀释的感兴趣Fab(例如与Presta等,CancerRes.57:4593-4599(1997)中抗VEGF抗体，Fab-12的评估一致)混合。然后将感兴趣的Fab温育过夜；然而，温育可持续更长时间(例如约65小时)以确保达到平衡。此后，将混合物转移至捕捉板，于室温温育(例如1小时)。然后除去溶液，并用PBS中的0.1％聚山梨酯20洗板8次。平板干燥后，加入150μl/孔闪烁液(MICROSCINT-20TM；Packard)，然后在TOPCOUNTTM伽马计数器(Packard)上对平板计数10分钟。选择各Fab给出小于或等于最大结合之20％的浓度用于竞争性结合测定法。
依照另一个实施方案，Kd是使用表面等离振子共振测定法测量的，于25℃使用固定化抗原CM5芯片在约10个响应单位(RU)使用-2000或-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)进行。简言之，依照供应商的用法说明书用盐酸N-乙基-N’-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5,BIACORE,Inc.)。将抗原用10mM乙酸钠pH4.8稀释至5μg/ml(约0.2μM)，然后以5μl/分钟的流速注射以获得约10个响应单位(RU)的偶联蛋白质。注入抗原后，注入1M乙醇胺以封闭未反应基团。为了进行动力学测量，于25℃以约25μl/分钟的流速注入在含0.05％聚山梨酯20(TWEEN-20TM)表面活性剂的PBS(PBST)中两倍连续稀释的Fab(0.78nM至500nM)。使用简单一对一朗格缪尔(Langmuir)结合模型(EvaluationSoftwareversion3.2)通过同时拟合结合和解离传感图计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。平衡解离常数(Kd)以比率koff/kon计算。见例如Chen等,J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。如果根据上文表面等离振子共振测定法，结合速率超过106M-1S-1，那么结合速率可使用荧光淬灭技术来测定，即根据分光计诸如配备了断流装置的分光光度计(AvivInstruments)或8000系列SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯的测量，在存在浓度渐增的抗原的情况中，测量PBSpH7.2中20nM抗抗原抗体(Fab形式)于25℃的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的升高或降低。
2.抗体片段
在某些实施方案中，本文中提供的抗体是抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、Fv、和scFv片段，及下文所描述的其它片段。关于某些抗体片段的综述，见Hudson等Nat.Med.9:129-134(2003)。关于scFv片段的综述，见例如Pluckthün,于ThePharmacologyofMonoclonalAntibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编,(Springer-Verlag,NewYork),第269-315页(1994)；还可见WO93/16185；及美国专利No.5,571,894和5,587,458。关于包含补救受体结合表位残基，并且具有延长的体内半衰期的Fab和F(ab’)2片段的讨论，见美国专利No.5,869,046。
双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价的或双特异性的。见例如EP404,097；WO1993/01161；Hudson等,Nat.Med.9:129-134(2003)；及Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993)。三抗体和四抗体也记载于Hudson等,Nat.Med.9:129-134(2003)。
单域抗体是包含抗体的整个或部分重链可变域或整个或部分轻链可变域的抗体片段。在某些实施方案中，单域抗体是人单域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA；见例如美国专利No.6,248,516B1)。
可以通过多种技术，包括但不限于对完整抗体的蛋白水解消化及重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)的生成来生成抗体片段，如本文中所描述的。
3.嵌合的和人源化的抗体
在某些实施方案中，本文中提供的抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体记载于例如美国专利No.4,816,567；及Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))。在一个例子中，嵌合抗体包含非人可变区(例如，自小鼠、大鼠、仓鼠、家兔、或非人灵长类，诸如猴衍生的可变区)和人恒定区。在又一个例子中，嵌合抗体是“类转换的”抗体，其中类或亚类已经自亲本抗体的类或亚类改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，将非人抗体人源化以降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。一般地，人源化抗体包含一个或多个可变域，其中HVR，例如CDR(或其部分)自非人抗体衍生，而FR(或其部分)自人抗体序列衍生。任选地，人源化抗体还会至少包含人恒定区的一部分。在一些实施方案中，将人源化抗体中的一些FR残基用来自非人抗体(例如衍生HVR残基的抗体)的相应残基替代，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
人源化抗体及其生成方法综述于例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)，并且进一步记载于例如Riechmann等,Nature332:323-329(1988)；Queen等,Proc.Nat’lAcad.Sci.USA86:10029-10033(1989)；美国专利No.5,821,337,7,527,791,6,982,321和7,087,409；Kashmiri等,Methods36:25-34(2005)(描述了SDR(a-CDR)嫁接)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述了“重修表面”)；Dall’Acqua等,Methods36:43-60(2005)(描述了“FR改组”)；及Osbourn等,Methods36:61-68(2005)和Klimka等,Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述了FR改组的“引导选择”方法)。
可以用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳拟合(best-fit)”方法选择的框架区(见例如Sims等J.Immunol.151:2296(1993))；自轻或重链可变区的特定亚组的人抗体的共有序列衍生的框架区(见例如Carter等Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；及Presta等J.Immunol.,151:2623(1993))；人成熟的(体细胞突变的)框架区或人种系框架区(见例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；和通过筛选FR文库衍生的框架区(见例如Baca等,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)及Rosok等,J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。
4.人抗体
在某些实施方案中，本文中提供的抗体是人抗体。可以使用本领域中已知的多种技术来生成人抗体。一般地，人抗体记载于vanDijk和vandeWinkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)及Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)。
可以通过对转基因动物施用免疫原来制备人抗体，所述转基因动物已经修饰为响应抗原性攻击而生成完整人抗体或具有人可变区的完整抗体。此类动物通常含有所有或部分人免疫球蛋白基因座，其替换内源免疫球蛋白基因座，或者其在染色体外存在或随机整合入动物的染色体中。在此类转基因小鼠中，一般已经将内源免疫球蛋白基因座灭活。关于自转基因动物获得人抗体的方法的综述，见Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。还可见例如美国专利No.6,075,181和6,150,584，其描述了XENOMOUSETM技术；美国专利No.5,770,429，其描述了技术；美国专利No.7,041,870，其描述了K-M技术，和美国专利申请公开文本No.US2007/0061900，其描述了技术)。可以例如通过与不同人恒定区组合进一步修饰来自由此类动物生成的完整抗体的人可变区。
也可以通过基于杂交瘤的方法生成人抗体。已经描述了用于生成人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异骨髓瘤细胞系(见例如KozborJ.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等,MonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplications,第51-63页(MarcelDekker,Inc.,NewYork,1987)；及Boerner等,J.Immunol.,147:86(1991))。经由人B细胞杂交瘤技术生成的人抗体也记载于Li等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)。其它方法包括那些例如记载于美国专利No.7,189,826(其描述了自杂交瘤细胞系生成单克隆人IgM抗体)和Ni,XiandaiMianyixue,26(4):265-268(2006)(其描述了人-人杂交瘤)的。人杂交瘤技术(Trioma技术)也记载于Vollmers和Brandlein,HistologyandHistopathology,20(3):927-937(2005)及Vollmers和Brandlein,MethodsandFindingsinExperimentalandClinicalPharmacology,27(3):185-91(2005)。
也可以通过分离自人衍生的噬菌体展示文库选择的Fv克隆可变域序列生成人抗体。然后，可以将此类可变域序列与期望的人恒定域组合。下文描述了自抗体文库选择人抗体的技术。
5.文库衍生的抗体
可以通过对组合文库筛选具有期望的一种或多种活性的抗体来分离本发明的抗体。例如，用于生成噬菌体展示文库并对此类文库筛选拥有期望结合特征的抗体的多种方法是本领域中已知的。此类方法综述于例如Hoogenboom等于MethodsinMolecularBiology178:1-37(O’Brien等编,HumanPress,Totowa,NJ,2001)，并且进一步记载于例如McCafferty等,Nature348:552-554；Clackson等,Nature352:624-628(1991)；Marks等,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks和Bradbury,于MethodsinMolecularBiology248:161-175(Lo编,HumanPress,Totowa,NJ,2003)；Sidhu等,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA101(34):12467-12472(2004)；及Lee等,J.Immunol.Methods284(1-2):119-132(2004)。
在某些噬菌体展示方法中，将VH和VL基因的全集分别通过聚合酶链式反应(PCR)克隆，并在噬菌体文库中随机重组，然后可以对所述噬菌体文库筛选抗原结合噬菌体，如记载于Winter等,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)的。噬菌体通常以单链Fv(scFv)片段或以Fab片段展示抗体片段。来自经免疫的来源的文库提供针对免疫原的高亲和力抗体，而不需要构建杂交瘤。或者，可以(例如自人)克隆天然全集以在没有任何免疫的情况中提供针对一大批非自身和还有自身抗原的抗体的单一来源，如由Griffiths等,EMBOJ,12:725-734(1993)描述的。最后，也可以通过自干细胞克隆未重排的V基因区段，并使用含有随机序列的PCR引物编码高度可变的CDR3区并在体外实现重排来合成生成未免疫文库，如由Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)所描述的。描述人抗体噬菌体文库的专利公开文本包括例如：美国专利No.5,750,373、和美国专利公开文本No.2005/0079574,2005/0119455,2005/0266000,2007/0117126,2007/0160598,2007/0237764,2007/0292936和2009/0002360。
认为自人抗体文库分离的抗体或抗体片段是本文中的人抗体或人抗体片段。
6.多特异性抗体
在某些实施方案中，本文中提供的抗体是多特异性抗体，例如包含两个抗原结合域(各自对独特靶特异性)的传统双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，结合特异性之一针对HER3，而另一种针对任何其它抗原。在某些实施方案中，双特异性抗体可以结合HER3的两个不同表位。也可以使用双特异性抗体来将细胞毒剂定位于表达HER3的细胞。双特异性抗体可以以全长抗体或抗体片段制备。
用于生成多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两对免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(见Milstein和Cuello,Nature305:537(1983))、WO93/08829、和Traunecker等,EMBOJ.10:3655(1991))、和“节-入-穴”工程化(见例如美国专利No.5,731,168)。也可以通过用于生成抗体Fc-异二聚体分子的工程化静电操纵效应(WO2009/089004A1)；交联两个或更多个抗体或片段(见例如美国专利No.4,676,980,及Brennan等,Science,229:81(1985))；使用亮氨酸拉链来生成双特异性抗体(见例如Kostelny等,J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992))；使用用于生成双特异性抗体片段的“双抗体”技术(见例如Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993))；及使用单链Fv(sFv)二聚体(见例如Gruber等,J.Immunol.,152:5368(1994))；及如例如Tutt等J.Immunol.147:60(1991)中所描述的，制备三特异性抗体来生成多特异性抗体。
本文中还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化改造抗体，包括“章鱼抗体”(见例如US2006/0025576A1)。
本文中的抗体或片段还包括包含结合HER3及另一种不同抗原的抗原结合位点的“双重作用FAb”或“DAF”(见例如US2008/0069820)。此类双特异性HER3/EGFR抑制剂的例子在本文中有描述且包括例示性的DL11f(MEHD7945A)抗体。
7.抗体变体
在某些实施方案中，涵盖本文中提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，可以期望改善抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。可以通过将合适的修饰引入编码抗体的核苷酸序列中，或者通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如对抗体的氨基酸序列内的残基的删除、和/或***和/或替代。可以进行删除、***、和替代的任何组合以得到最终的构建体，只要最终的构建体拥有期望的特征，例如，抗原结合。
a)替代、***、和删除变体
在某些实施方案中，提供了具有一处或多处氨基酸替代的抗体变体。替代诱变感兴趣的位点包括HVR和FR。保守替代在表1中在“保守的替代”的标题下显示。更实质的变化在表1中在“例示性替代”的标题下提供，并且如下文参照氨基酸侧链类别进一步描述的。可以将氨基酸替代引入感兴趣的抗体中，并且对产物筛选期望的活性，例如保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性、或改善的ADCC或CDC。
表1
依照共同的侧链特性，氨基酸可以如下分组：
(1)疏水性的：正亮氨酸,Met,Ala,Val,Leu,Ile；
(2)中性、亲水性的：Cys,Ser,Thr,Asn,Gln；
(3)酸性的：Asp,Glu；
(4)碱性的：His,Lys,Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly,Pro；
(6)芳香族的：Trp,Tyr,Phe。
非保守替代会需要用这些类别之一的成员替换另一个类别的。
一类替代变体牵涉替代亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。一般地，为进一步研究选择的所得变体相对于亲本抗体会具有某些生物学特性的改变(例如改善)(例如升高的亲和力、降低的免疫原性)和/或会基本上保留亲本抗体的某些生物学特性。例示性的替代变体是亲和力成熟的抗体，其可以例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术诸如本文中所描述的那些技术来方便地生成。简言之，将一个或多个HVR残基突变，并将变体抗体在噬菌体上展示，并对其筛选特定的生物学活性(例如结合亲和力)。
可以对HVR做出变化(例如，替代)，例如以改善抗体亲和力。可以对HVR“热点”，即由在体细胞成熟过程期间以高频率经历突变的密码子编码的残基(见例如Chowdhury,MethodsMol.Biol.207:179-196(2008))，和/或SDR(a-CDR)做出此类变化，其中对所得的变体VH或VL测试结合亲和力。通过次级文库的构建和再选择进行的亲和力成熟已经记载于例如Hoogenboom等于MethodsinMolecularBiology178:1-37(O’Brien等编,HumanPress,Totowa,NJ,(2001))。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法(例如，易错PCR、链改组、或寡核苷酸指导的诱变)将多样性引入为成熟选择的可变基因。然后，创建次级文库。然后，筛选文库以鉴定具有期望的亲和力的任何抗体变体。另一种引入多样性的方法牵涉HVR指导的方法，其中将几个HVR残基(例如，一次4-6个残基)随机化。可以例如使用丙氨酸扫描诱变或建模来特异性鉴定牵涉抗原结合的HVR残基。特别地，经常靶向CDR-H3和CDR-L3。
在某些实施方案中，可以在一个或多个HVR内发生替代、***、或删除，只要此类变化不实质性降低抗体结合抗原的能力。例如，可以对HVR做出保守变化(例如，保守替代，如本文中提供的)，其不实质性降低结合亲和力。此类变化可以在HVR“热点”或SDR以外。在上文提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中，每个HVR是未改变的，或者含有不超过1、2或3处氨基酸替代。
一种可用于鉴定抗体中可以作为诱变靶位的残基或区域的方法称作“丙氨酸扫描诱变”，如由Cunningham和Wells(1989)Science,244:1081-1085所描述的。在此方法中，将残基或靶残基的组(例如，带电荷的残基诸如arg、asp、his、lys、和glu)鉴定，并用中性或带负电荷的氨基酸(例如，丙氨酸或多丙氨酸)替换以测定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可以在对初始替代表明功能敏感性的氨基酸位置引入进一步的替代。或者/另外，利用抗原-抗体复合物的晶体结构来鉴定抗体与抗原间的接触点。作为替代的候选，可以靶向或消除此类接触残基和邻近残基。可以筛选变体以确定它们是否含有期望的特性。
氨基酸序列***包括长度范围为1个残基至含有100或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基端融合，及单个或多个氨基酸残基的序列内***。末端***的例子包括具有N端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其它***变体包括抗体的N或C端与酶(例如对于ADEPT)或延长抗体的血清半衰期的多肽的融合物。
b)糖基化变体
在某些实施方案中，改变本文中提供的抗体以提高或降低抗体糖基化的程度。可以通过改变氨基酸序列，使得创建或消除一个或多个糖基化位点来方便地实现对抗体的糖基化位点的添加或删除。
在抗体包含Fc区的情况中，可以改变其附着的碳水化合物。由哺乳动物细胞生成的天然抗体通常包含分支的、双触角寡糖，其一般通过N连接附着于Fc区的CH2域的Asn297。见例如Wright等TIBTECH15:26-32(1997)。寡糖可以包括各种碳水化合物，例如，甘露糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖、和唾液酸，以及附着于双触角寡糖结构“主干”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方案中，可以对本发明抗体中的寡糖进行修饰以创建具有某些改善的特性的抗体变体。
在一个实施方案中，提供了抗体变体，其具有缺乏附着(直接或间接)于Fc区的岩藻糖的碳水化合物结构。例如，此类抗体中的岩藻糖量可以是1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。通过相对于附着于Asn297的所有糖结构(例如，复合的、杂合的和高甘露糖的结构)的总和，计算Asn297处糖链内岩藻糖的平均量来测定岩藻糖量，如通过MALDI-TOF质谱术测量的，例如如记载于WO2008/077546的。Asn297指位于Fc区中的约第297位(Fc区残基的Eu编号方式)的天冬酰胺残基；然而，Asn297也可以由于抗体中的微小序列变异而位于第297位上游或下游约±3个氨基酸，即在第294位和第300位之间。此类岩藻糖基化变体可以具有改善的ADCC功能。见例如美国专利公开文本No.US2003/0157108(Presta,L.)；US2004/0093621(KyowaHakkoKogyoCo.,Ltd)。涉及“脱岩藻糖基化的”或“岩藻糖缺乏的”抗体变体的出版物的例子包括：US2003/0157108；WO2000/61739；WO2001/29246；US2003/0115614；US2002/0164328；US2004/0093621；US2004/0132140；US2004/0110704；US2004/0110282；US2004/0109865；WO2003/085119；WO2003/084570；WO2005/035586；WO2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等Biotech.Bioeng.87:614(2004)。能够生成脱岩藻糖基化抗体的细胞系的例子包括蛋白质岩藻糖基化缺陷的Lec13CHO细胞(Ripka等Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；美国专利申请NoUS2003/0157108A1,Presta,L；及WO2004/056312A1,Adams等，尤其在实施例11)，和敲除细胞系，诸如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因FUT8敲除CHO细胞(见例如Yamane-Ohnuki等Biotech.Bioeng.87:614(2004)；Kanda,Y.等,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006)；及WO2003/085107)。
进一步提供了具有两分型寡糖的抗体变体，例如其中附着于抗体Fc区的双触角寡糖是通过GlcNAc两分的。此类抗体变体可以具有降低的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。此类抗体变体的例子记载于例如WO2003/011878(Jean-Mairet等)；美国专利No.6,602,684(Umana等)；及US2005/0123546(Umana等)。还提供了在附着于Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。此类抗体变体可以具有改善的CDC功能。此类抗体变体记载于例如WO1997/30087(Patel等)；WO1998/58964(Raju,S.)；及WO1999/22764(Raju,S.)。
c)Fc区变体
在某些实施方案中，可以将一处或多处氨基酸修饰引入本文中提供的抗体的Fc区中，由此生成Fc区变体。Fc区变体可以包含在一个或多个氨基酸位置包含氨基酸修饰(例如替代)的人Fc区序列(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)。
在某些实施方案中，本发明涵盖拥有一些但不是所有效应器功能的抗体变体，所述效应器功能使其成为如下应用的期望候选物，其中抗体的体内半衰期是重要的，而某些效应器功能(诸如补体和ADCC)是不必要的或有害的。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定法以确认CDC和/或ADCC活性的降低/消减。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定法以确保抗体缺乏FcγR结合(因此有可能缺乏ADCC活性)，但是保留FcRn结合能力。介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。在Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)的第464页上的表3中汇总了造血细胞上的FcR表达。评估感兴趣分子的ADCC活性的体外测定法的非限制性例子记载于美国专利No.5,500,362(见例如Hellstrom,I.等Proc.Nat’lAcad.Sci.USA83:7059-7063(1986))和Hellstrom,I等,Proc.Nat’lAcad.Sci.USA82:1499-1502(1985)；5,821,337(见Bruggemann,M.等,J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))。或者，可以采用非放射性测定方法(见例如用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定法(CellTechnology,Inc.MountainView,CA；和CytoTox非放射性细胞毒性测定法(Promega,Madison,WI))。对于此类测定法有用的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可以在体内评估感兴趣分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如披露于Clynes等Proc.Nat’lAcad.Sci.USA95:652-656(1998)的。也可以实施C1q结合测定法以确认抗体不能结合C1q，并且因此缺乏CDC活性。见例如WO2006/029879和WO2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可以实施CDC测定法(见例如Gazzano-Santoro等,J.Immunol.Methods202:163(1996)；Cragg,M.S.等,Blood101:1045-1052(2003)；及Cragg,M.S.和M.J.Glennie,Blood103:2738-2743(2004))。也可以使用本领域中已知的方法来实施FcRn结合和体内清除/半衰期测定(见例如Petkova,S.B.等,Int’l.Immunol.18(12):1759-1769(2006))。
具有降低的效应器功能的抗体包括那些具有Fc区残基238,265,269,270,297,327和329中的一个或多个的替代的(美国专利No.6,737,056)。此类Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327中的两处或更多处具有替代的Fc突变体，包括残基265和297替代成丙氨酸的所谓的“DANA”Fc突变体(美国专利No.7,332,581)。
描述了具有改善的或降低的对FcR的结合的某些抗体变体(见例如美国专利No.6,737,056；WO2004/056312，及Shields等,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001))。
在某些实施方案中，抗体变体包含具有改善ADCC的一处或多处氨基酸替代，例如Fc区的位置298、333、和/或334(残基的EU编号方式)的替代的Fc区。
在一些实施方案中，对Fc区做出改变，其导致改变的(即，改善的或降低的)C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，例如，如记载于美国专利No.6,194,551、WO99/51642、及Idusogie等J.Immunol.164:4178-4184(2000)的。
具有延长的半衰期和改善的对新生儿Fc受体(FcRn)的结合的抗体记载于US2005/0014934A1(Hinton等)，新生儿Fc受体(FcRn)负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer等,J.Immunol.117:587(1976)及Kim等,J.Immunol.24:249(1994))。那些抗体包含其中具有改善Fc区对FcRn结合的一处或多处替代的Fc区。此类Fc变体包括那些在Fc区残基238,256,265,272,286,303,305,307,311,312,317,340,356,360,362,376,378,380,382,413,424或434中的一处或多处具有替代，例如，Fc区残基434的替代的(美国专利No.7,371,826)。
还可见Duncan和Winter,Nature322:738-40(1988)；美国专利No.5,648,260；美国专利No.5,624,821；及WO94/29351，其关注Fc区变体的其它例子。
d)经半胱氨酸工程化改造的抗体变体
在某些实施方案中，可以期望创建经半胱氨酸工程化改造的抗体，例如，“thioMAb”，其中抗体的一个或多个残基用半胱氨酸残基替代。在具体的实施方案中，替代的残基存在于抗体的可接近位点。通过用半胱氨酸替代那些残基，反应性硫醇基团由此定位于抗体的可接近位点，并且可以用于将抗体与其它模块，诸如药物模块或接头-药物模块缀合，以创建免疫缀合物，如本文中进一步描述的。在某些实施方案中，可以用半胱氨酸替代下列残基之任一个或多个：轻链的V205(Kabat编号方式)；重链的A118(EU编号方式)；和重链Fc区的S400(EU编号方式)。可以如例如美国专利No.7,521,541所述生成经半胱氨酸工程化改造的抗体。
e)抗体衍生物
在某些实施方案中，可以进一步修饰本文中提供的抗体以含有本领域知道的且易于获得的额外非蛋白质性质模块。适合于抗体衍生化的模块包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、右旋糖苷、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三口恶烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或随机共聚物)、和右旋糖苷或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。由于其在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛在生产中可能具有优势。聚合物可以是任何分子量，而且可以是分支的或不分支的。附着到抗体上的聚合物数目可以变化，而且如果附着了超过一个聚合物，那么它们可以是相同或不同的分子。一般而言，可根据下列考虑来确定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型，包括但不限于抗体要改进的具体特性或功能、抗体衍生物是否将用于指定条件下的治疗等。
在另一个实施方案中，提供了抗体和可以通过暴露于辐射选择性加热的非蛋白质性质模块的缀合物。在一个实施方案中，非蛋白质性质模块是碳纳米管(Kam等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA102:11600-11605(2005))。辐射可以是任何波长的，并且包括但不限于对普通细胞没有损害，但是将非蛋白质性质模块加热至抗体-非蛋白质性质模块附近的细胞被杀死的温度的波长。
f)重组方法和组合物
可以使用重组方法和组合物来生成抗体，例如，如记载于美国专利No.4,816,567的。在一个实施方案中，提供了编码本文中所描述的抗HER3/抗EGFR抗体(包括双特异性抗体)的分离的核酸。此类核酸可以编码包含抗体VL的氨基酸序列和/或包含抗体VH的氨基酸序列(例如，抗体的轻和/或重链)。在又一个实施方案中，提供了包含此类核酸的一种或多种载体(例如，表达载体)。在又一个实施方案中，提供了包含此类核酸的宿主细胞。在一个此类实施方案中，宿主细胞包含(例如，已经用下列载体转化)：(1)包含核酸的载体，所述核酸编码包含抗体的VL的氨基酸序列和包含抗体的VH的氨基酸序列，或(2)第一载体和第二载体，所述第一载体包含编码包含抗体的VL的氨基酸序列的核酸，所述第二载体包含编码包含抗体的VH的氨基酸序列的核酸。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如，Y0、NS0、Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供了生成抗体(包括双特异性抗体)的方法，其中该方法包括在适合于表达抗体的条件下培养包含编码抗体的核酸的宿主细胞，如上文提供的，并且任选地，自宿主细胞(或宿主细胞培养液)回收抗体。
对于抗体(包括双特异性抗体)的重组生成，将编码抗体的核酸(例如如上文所描述的)分离，并***一种或多种载体中，以在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可以使用常规规程将此类核酸容易地分离并测序(例如，通过使用寡核苷酸探针来进行，所述寡核苷酸探针能够特异性结合编码抗体的重和轻链的基因)。
适合于克隆或表达抗体编码载体的宿主细胞包括本文中所描述的原核或真核细胞。例如，可以在细菌中生成抗体，特别是在不需要糖基化和Fc效应器功能时。对于抗体片段和多肽在细菌中的表达，见例如美国专利No.5,648,237,5,789,199和5,840,523(还可见Charlton,MethodsinMolecularBiology,第248卷(B.K.C.Lo编,HumanaPress,Totowa,NJ,2003),第245-254页，其描述了抗体片段在大肠杆菌(E.coli.)中的表达)。表达后，可以将抗体在可溶性级分中自细菌细胞团糊分离，并可以进一步纯化。
在原核生物外，真核微生物诸如丝状真菌或酵母是适合于抗体编码载体的克隆或表达宿主，包括其糖基化途径已经“人源化”，导致生成具有部分或完全人的糖基化样式的抗体的真菌和酵母菌株。见Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004),及Li等,Nat.Biotech.24:210-215(2006)。
适合于表达糖基化抗体的宿主细胞也自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)衍生。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已经鉴定出许多杆状病毒株，其可以与昆虫细胞一起使用，特别是用于转染草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞。
也可以利用植物细胞培养物作为宿主。见例如美国专利No.5,959,177,6,040,498,6,420,548,7,125,978和6,417,429(其描述了用于在转基因植物中生成抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
也可以使用脊椎动物细胞作为宿主。例如，适合于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可以是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其它例子是经SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(293或293细胞，如记载于例如Graham等,J.GenVirol.36:59(1977)的)；幼年仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4细胞，如记载于例如Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980)的)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人***细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK；牛鼠(buffalorat)肝细胞(BRL3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(HepG2)；小鼠***肿瘤(MMT060562)；TRI细胞，如记载于例如Mather等,AnnalsN.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)的；MRC5细胞；和FS4细胞。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216(1980))；和骨髓瘤细胞系诸如Y0、NS0和Sp2/0。关于适合于抗体生成的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，见例如Yazaki和Wu,MethodsinMolecularBiology,第248卷(B.K.C.Lo编,HumanaPress,Totowa,NJ),第255-268页(2003)。
III.组合物
本发明的药物组合物或配制剂包括本文所述组合。
本文所述化合物或其药学可接受盐可以以未溶剂化的以及与药学可接受溶剂诸如水，乙醇，等等溶剂化的形式存在，而且本发明涵盖溶剂化的和未溶剂化的二者形式。
化合物或其药学可接受盐还可以以不同互变体形式存在，而且本发明的范围内涵盖所有此类形式。术语“互变体(tautomer)”或“互变体形式”指经低能障可互变的具有不同能量的结构异构体。例如，质子互变体(也称作质子移变互变体)包括经质子迁移的互变，诸如酮-烯醇和亚胺-烯胺异构化。化合价互变体包括通过重新组织一些成键电子的互变。
药物组合物涵盖散装组合物和个体剂量单位二者，其包含超过一种(例如两种)药学活性剂以及任何药学无活性赋形剂，稀释剂，载体，或助流剂。散装组合物(bulkcompostion)和每个单独的剂量单位(individualdosageunit)可含有固定量的上述药学活性剂。散装组合物指尚未形成个体剂量单位的物质。一种例示性的剂量单位是口服剂量单位，诸如片剂，丸剂，胶囊剂，等等。类似地，本文所述通过施用本发明的药物组合物来治疗患者的方法也意图涵盖施用散装组合物和单个剂量单位。
药物组合物还涵盖同位素标记的化合物，它们与本文所述化合物相同，只是一个或多个原子被具有与自然界通常找到的原子质量或质量数不同的原子质量或质量数的原子替换。规定的任何特定原子或元素的所有同位素涵盖在本发明化合物及其用途的范围内。能掺入化合物的例示性同位素包括氢，碳，氮，氧，磷，硫，氟，氯和碘的同位素，诸如2H，3H，11C，13C，14C，13N，15N，15O，17O，18O，32P，33P，35S，18F，36Cl，123I和125I。某些同位素标记的本发明化合物(例如那些用3H和14C标记的)在化合物和/或底物组织分布测定法中是有用的。氚(3H)和碳-14(14C)同位素因它们易于制备和可检测性而有用。另外，用更重的同位素诸如氘(2H)替代可提供某些治疗优势，其源自更大的代谢稳定性(例如体内半衰期延长或剂量需求降低)，并因此在有些情况中是优选的。发射正电子的同位素，诸如15O，13N，11C和18F，可用于正电子发射断层成像术(PET)研究以检查底物受体占据。
依照标准药学实践来配制化合物的药学可接受盐，供用于治疗性处理哺乳动物(包括人，诸如男人和女人)中高增殖性病症(诸如癌症，诸如三重阴性乳腺癌)的治疗剂组合中使用。本发明提供药物组合物，其包含与一种或多种药学可接受载体，助流剂，稀释剂，或赋形剂联合的本文所述组合。
合适的载体，稀释剂和赋形剂是本领域技术人员公知的，而且包括下述物质，诸如碳水化合物，蜡，水溶性和/或可膨胀聚合物，亲水性或疏水性物质，明胶，油，溶剂，水等等。所使用的具体载体，稀释剂或赋形剂会取决于应用本发明化合物的手段和目的。一般基于本领域技术人员公认对哺乳动物施用安全(GRAS)的溶剂来选择溶剂。一般而言，安全的溶剂是无毒的水性溶剂，诸如水和其它在水中可溶或易混合的无毒溶剂。合适的水性溶剂包括水，乙醇，丙二醇，聚乙二醇(例如PEG400，PEG300)，等及其混合物。配制剂还可以包括一种或多种缓冲剂，稳定剂，表面活性剂，湿润剂，润滑剂，乳化剂，悬浮剂，防腐剂，抗氧化剂，不透明剂，助流剂，操作助剂，着色剂，增甜剂，芳香剂，矫味剂和其它已知添加剂以提供药物(即本发明的化合物或其药物组合物)精致的外观或帮助制造药学产品(即药物)。
可以使用常规溶解和混合规程来制备配制剂。例如，在存在一种或多种上文所述赋形剂下在合适的溶剂中溶解散装药物物质(即本发明的化合物或化合物的稳定化形式(例如，与环糊精衍生物或其它已知的络合剂复合)。本发明的化合物通常配制成药学剂量形式，以提供可容易控制剂量的药物和使得患者顺从处方方案。
可以以多种方式包装供施用的药物组合物(或配制剂)，这取决于用于施用药物的方法。一般而言，分发的物品包括容器，其中沉积有适宜形式的药物配制剂。合适的容器是本领域技术人员公知的，而且包括诸如瓶(塑料的和玻璃的)，囊，安瓿，塑料袋，金属筒，等等材料。容器还可以包括防干扰装置以防止不慎存取包装的内容物。另外，容器上沉积有描述容器的内容物的标签。标签还可以包括适宜的警告。
可以制备化合物的药物配制剂，供各种路径和类型的施用。例如，可以任选以冻干配制剂，碾碎的粉末，或水溶液的形式将具有期望纯度的化合物或其药学可接受盐与药学可接受稀释剂，载剂，赋形剂或稳定剂(Remington'sPharmaceuticalSciences(1995)第18版，MackPubl.Co.，Easton，PA)混合。可以通过于环境温度与适宜的pH，及于期望的纯度，与生理学可接受载体(即在所采用的剂量和浓度对接受者无毒的载体)混合来进行配制。配制剂的pH主要取决于具体用途和化合物的浓度，但是范围可以是约3至约8。
药物配制剂优选是无菌的。具体而言，用于体内施用的配制剂必须是无菌的。这种无菌易于通过无菌滤膜过滤来实现。
药物配制剂通常能作为固体组合物，冻干配制剂或作为水溶液来贮存。
药物配制剂会以与优良医学实践一致的方式(例如量，浓度，时间表，疗程，媒介和施用路径)来进行剂量给药和施用。在此语境中要考虑的因素包括所治疗的具体病症，所治疗的具体哺乳动物，患者个体的临床状况，病症的起因，药剂的递送部位，施用方法，施用时间表，和医学从业人员知道的其它因素。要施用的“治疗有效量”会由此类考虑来决定，而且是预防，改善，或治疗凝血因子介导的病症所必需的最小量。此类量优选低于对宿主有毒或低于使得宿主显著更易于出血的量。
可接受的稀释剂，载体，赋形剂和稳定剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，并且包括：缓冲剂，诸如磷酸盐，柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯己双铵；苯扎氯铵，苄索氯铵；酚，丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烃基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(低于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，组氨酸，精氨酸或赖氨酸；单糖类，二糖类和其它碳水化合物，包括葡萄糖，甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖，甘露醇，海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子，诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEENTM，PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。活性药物组分还可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)，在胶状药物递送***中(例如脂质体，清蛋白微球体，微乳剂，纳米颗粒和纳米胶囊)，或在粗滴乳状液中。此类技术披露于Remington'sPharmaceuticalSciences第18版，(1995)MackPubl.Co.，Easton，PA。
可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有化合物或其药学可接受盐的固体疏水性聚合物半透性基质，该基质是定型产品的形式，例如薄膜或微胶囊。持续释放基质的例子包括聚酯，水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))，聚交酯(US3,773,919)，L-谷氨酸和L-谷氨酸γ-乙酯的共聚物，不可降解的乙烯-乙酸乙烯，可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRONDEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球体)及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。
药物配制剂包括那些适合于本文详述的施用路径的。配制剂可以方便地以单位剂量形式存在，而且可以通过药学领域公知的任何方法来制备。技术和配方一般见Remington'sPharmaceuticalSciences第18版(1995)MackPublishingCo.，Easton，PA。此类方法包括使活性组分与构成一种或多种辅助组分的载体联合的步骤。一般而言，通过均匀且紧密地使活性组分与液体载体或粉碎的固体载体或二者联合，然后在必要时使产物定形来制备配制剂。
适合于口服施用的组合的配制剂可以制备成离散的单位，诸如丸剂，硬的或软的，例如明胶胶囊剂，扁囊剂，含片，锭剂，水性或油性悬浮液，可分散粉剂或颗粒剂，乳状液，糖浆剂或西也剂，各含有预定量的GDC-0973或GDC-0623，或其药学可接受盐；和MEHD7945A。可以作为组合配制剂在丸剂，胶囊剂，溶液或悬浮液中配制一定量的GDC-0973或GDC-0623或其药学可接受盐；和MEHD7945A。或者，可以在丸剂，胶囊剂，溶液或悬浮液中分开配制组合，供交替施用。
配制剂可以依照本领域已知用于制造药物组合物的任何方法来制备，而且此类组合物可以含有一种或多种药剂，包括增甜剂，矫味剂，着色剂和防腐剂，以提供美味的制品。压制片剂可以通过在合适的机器中压迫自由流形式(诸如粉末或颗粒)的活性组分来制备，任选混合有粘合剂，润滑剂，惰性稀释剂，防腐剂，表面活性剂或分散剂。铸制片剂可以通过在合适的机器中浇铸用惰性液体稀释剂弄湿的粉状活性组分的混合物来制备。片剂可以任选包被或刻痕，而且任选配制，以自其提供活性组分的缓慢或受控释放。药物配制剂的片剂赋形剂可以包括：填充剂(或稀释剂)，以提高构成片剂的粉状药物的散装体积；崩解剂，当它被摄入时，以促进片剂分解成小碎片，理想的是各药物微粒，并促进药物的快速溶解和吸收；粘合剂，以确保能形成具有所需机械强度的微粒颗粒剂和片剂，并在片剂压制后保持它成一体，防止它在包装，运输和例行操作期间分解成其成分粉末；助流剂，以在生产期间改进构成片剂的粉末的流动性；润滑剂，以确保制成片剂的粉末不会在制造期间粘附至用于压制片剂的设备。它们改进粉末混合物经过压片机的流动并使制成的片剂自设备喷出时的摩擦和破裂最小化；抗粘附剂，功能与助流剂相似，降低制造期间构成片剂的粉末和用于冲压出片剂形状的机器之间的粘附；掺入片剂的矫味剂，以给予片剂更令人愉快的味道或掩盖令人不快的味道，和着色剂，以帮助鉴别和患者顺从。
含有与适合于制备片剂的无毒药学可接受赋形剂混合的活性组分的片剂是可接受的。这些赋形剂可以是例如惰性稀释剂，诸如碳酸钙或钠，乳糖，磷酸钙或钠；粒化和崩解剂，诸如玉米淀粉，或海藻酸；粘合剂，诸如淀粉，明胶或***胶；和润滑剂，诸如硬脂酸镁，硬脂酸或滑石。片剂可以是未包被的，或者可以通过已知技术来包被，包括微囊化，以延迟胃肠道中的崩解和吸收，并由此提供较长一段时间里的持续作用。例如，可以单独地或与蜡一起地采用延迟时间的材料，诸如甘油基单硬脂酸酯或甘油基二硬脂酸酯。
为了治疗眼或其它外部组织，例如口和皮肤，配制剂优选作为以例如0.075至20％w/w的量含有活性组分的表面软膏剂或乳膏来应用。当配制成软膏剂时，可以与石蜡或水易混合的软膏剂基材一起或采用活性组分。或者，可以与水包油乳膏基材一起在乳膏中配制活性组分。
如果需要，乳膏基材的水相可以包括多羟基醇，即具有两个或更多个羟基的醇，诸如丙二醇，丁烷1,3-二醇，甘露醇，山梨醇，甘油和聚乙二醇(包括PEG400)及其混合物。表面配制剂可以根据需要包括增强活性组分经由皮肤或其它受影响区域吸收或穿透的化合物。此类皮肤穿透增强剂的例子包括二甲亚砜及相关类似物。
本发明的乳状液的油相可以以已知方式自已知组分构建，包括至少一种乳化剂与脂肪或油，或与脂肪和油二者的混合物。优选的是，与起稳定剂作用的亲脂性乳化剂一起包括亲水性乳化剂。总而言之，在有或无稳定剂的情况中，乳化剂构成乳化蜡，而且蜡与油和脂肪一起构成乳化软膏基材，其形成乳膏配制剂的油性分散相。适合于在配制剂中使用的乳化剂和乳状液稳定剂包括60，80，十六醇十八醇混合物，苯甲醇，肉豆蔻醇，甘油基单硬脂酸酯和月桂基硫酸钠。
药物配制剂的水性悬浮液含有与适合于制备水性悬浮液的赋形剂混合的活性材料。此类赋形剂包括：悬浮剂，诸如羧甲基纤维素钠，交联羧甲纤维素，聚维酮，甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素，藻酸钠，聚乙烯吡咯烷酮，黄芪胶和***胶；和分散剂或湿润剂，诸如天然存在的磷脂(例如卵磷脂)，烯烃氧化物与脂肪酸的缩合产物(例如聚氧乙烯硬脂酸酯)，环氧乙烷与长链脂族醇的缩合产物(例如十七碳乙烯氧基鲸蜡醇)，环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物(例如聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯)。水性悬浮液还可以含有一种或多种防腐剂，诸如对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯；一种或多种着色剂；一种或多种矫味剂；和一种或多种增甜剂，诸如蔗糖或糖精。
药物组合物可以是无菌可注射制剂形式，诸如无菌可注射水性或油性悬浮液。可以依照已知技术，使用上文所述那些合适的分散剂或湿润剂和悬浮剂来配制这种悬浮液。无菌可注射制剂可以是在无毒胃肠外可接受稀释剂或溶剂中的溶液或悬浮液，诸如在1,3-丁二醇中或自冻干粉制备的溶液。在可以采用的可接受的媒介和溶剂中有水，林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。另外，可以方便地采用无菌非挥发性油作为溶剂或悬浮介质。为了这一目的，可以采用任何温和的非挥发性油，包括合成的甘油单酯或二酯。另外，脂肪酸诸如油酸同样可以用于制备可注射制剂。
可以与载体材料联合以产生单个剂量形式的活性组分的量会根据所治疗的宿主和具体的施用模式而变化。例如，预定对人口服施用的时间-释放配制剂可以含有大约1至1000mg的活性材料，其与适当和方便量的载体材料复合，载体材料可以在总组合物的约5至约95％(重量：重量)变化。可以制备药物组合物来提供容易测量的量供施用。例如，预定用于静脉内输注的水溶液可以含有约3至500μg的活性组分每毫升溶液，以便能以约30mL/小时的速率输注合适的体积。
适合于胃肠外施用的配制剂包括水性和非水性无菌注射溶液，其可以含有抗氧化剂，缓冲剂，抑菌剂和使得配制剂与预定接受者的血液等渗的溶质；和水性和非水性无菌悬浮液，其可以包括悬浮剂和增稠剂。
适合于表面施用于眼的配制剂还包括滴眼液，其中活性组分在适合于活性组分的载体(尤其是水性溶剂)中溶解或悬浮。活性组分优选以约0.5至20％w/w，例如约0.5至10％w/w，例如约1.5％w/w的浓度存在于此类配制剂中。
适合于在口中表面施用的配制剂包括在调味基材(通常是蔗糖和***胶或黄芪胶)中包含活性组分的锭剂；在惰性基材(诸如明胶和甘油，或蔗糖和***胶)中包含活性组分的软锭剂(pastilles)；和在合适的液体载体中包含活性组分的漱口水。
用于直肠施用的配制剂可以作为具有合适基材(包括例如可可脂或水杨酸盐)的栓剂存在。
适合于肺内或鼻部施用的配制剂具有例如0.1至500微米范围内的粒度(包括介于0.1和500微米之间的范围中的粒度，增量几微米，诸如0.5，1，30微米，35微米，等)，其通过经鼻道快速吸入或通过经口吸入从而到达肺泡囊来施用。合适的配制剂包括活性组分的水性或油性溶液。适合于气雾剂或干粉施用的配制剂可以依照常规方法来制备，而且可以与其它治疗剂诸如以前用于治疗或预防下文所述病症的化合物一起递送。
适合于***施用的配制剂可以作为在活性组分之外含有诸如本领域已知适宜的载体的***栓(pessaries)，棉塞(tampons)，乳膏剂，凝胶剂，糊剂，泡沫剂或喷雾配制剂存在。
可以将配制剂包装在单剂(unit-dose)或多剂(multi-dose)容器中，例如密封的安瓿和管形瓶，而且可以将其在冷冻干燥(冻干)条件下贮存，在使用前仅需要添加无菌液体载体，例如水以便即刻注射。由先前所述类型的无菌粉末，颗粒和片剂制备临时注射的溶液和悬浮液。优选的单位剂量配制剂为那些含有如上所述每日剂量或单位每日亚剂量或其合适的部分的活性组分的。
本发明进一步提供了兽用组合物，其包含本文所述组合及其兽用载剂。兽用载体为可用于施用所述组合物目的的材料，并且可以为固体，液体或气态物质，或为其它方面惰性物质或在兽药领域中可接受的，与活性组分相容的物质。可以胃肠外，口服或通过任何其它期望途径来施用这些兽用组合物。
IV.组合疗法
本发明的一个方面提供用于在患者中治疗癌症的组合疗法，其中该组合疗法包括对该患者施用MEK抑制剂、EGFR抑制剂、和HER3抑制剂。
在一个实施方案中，组合疗法的MEK抑制剂为GDC-0973或GDC-0623。GDC-0973和GDC-0623是MEK1/2(活化ERK1/2的激酶)的有力的且高选择性的小分子变构抑制剂。抑制MEK1/2是一种有希望的策略，用于控制依赖于MEK/ERK途径中的异常信号传导的肿瘤的生长。临床前研究已经证明两种抑制剂均有效抑制携带与许多肿瘤类型有关的活化性B-RAF突变的肿瘤细胞生长，其中GDC-0973在这种模型中显示更多的活性。图5。临床前研究已经证明两种抑制剂均有效抑制携带与许多肿瘤类型有关的活化性Ras突变的肿瘤细胞生长，其中GDC-0623在这种模型中显示更多的活性。图6。
在一个实施方案中，HER3抑制剂和EGFR抑制剂功能存在于相同分子中，例如能够结合并抑制HER3和EGFR二者的生物学活性的双特异性抗体。在一个实施方案中，HER3和EGFR抑制剂是特异性结合HER3和EGFR二者的双特异性抗体。在一个实施方案中，HER3和EGFR抑制剂是包含两个相同抗原结合域(每个均特异性结合HER3和EGFR二者)的双特异性抗体。
在一个实施方案中，包含两个相同抗原结合域(每个均特异性结合HER3和EGFR二者)的HER3和EGFR双特异性抗体为抗体MEHD7945A。MEHD7945A阻断配体结合其EGFR和HER3靶物。MEHD7945A抗体以约1.9nM的Kd结合EGFR且以约0.4mM的Kd结合HER3(参见WO2010/108127和Schaeferetal.,CancerCell,20:472-486(2011))。MEHD7945A抑制EGFR和HER2/HER3依赖性信号传导。并且，MEHD7945A作为单一药剂抑制MAPK和PI3K信号传导。
MEK抑制剂与HER3和EGFR抑制剂(一种或多种)的组合提供抑制RAS/MEK和PI3K/AKT途径二者的方法，如此提供更加有效的抗癌疗法。组合疗法还会用来预防或延迟可归于对MEK抑制观察到的PI3K/AKT途径激活的内在的或获得的抗性，及预防或延迟经由RAS途径激活介导的内在的或获得的抗性。并且，组合疗法会用来阻断两种已建立的EGFR抗性机制-KRAS突变和HER3活化。
MEK抑制剂、HER3抑制剂和EGFR抑制剂可以在单一药物组合物中配制。或者，该组合可以作为两种药物组合物存在，其中第一药物组合物包括MEK抑制剂、HER3抑制剂和EGFR抑制剂中的一项，且第二药物组合物包含MEK抑制剂、HER3抑制剂或EGFR抑制剂中的两项，其中MEK抑制剂、HER3抑制剂和EGFR抑制剂不存在于第一药物组合物和第二药物组合物二者中。在一些实施方案中，该组合可作为两种药物组合物存在，其中第一药物组合物包括MEK抑制剂且第二药物组合物包含HER3抑制剂和EGFR抑制剂。在一些实施方案中，该组合可以作为三种药物组合物存在，其中三种药物组合物每种包括MEK抑制剂、HER3抑制剂或EGFR抑制剂中的一种。
当组合包含双重HER3/EGFR抑制剂(诸如MEHD7945A)时，MEK抑制剂和双重HER3/EGFR抑制剂可以在单一药物组合物中配制，或者MEK抑制剂可以在第一药物组合物中配制而双重HER3/EGFR抑制剂可以在第二药物组合物中配制。
如实施例中证明的，MEHD7945A和cobimetinib(GDC-0973)的组合在体外和在体内产生有力的活性。结肠直肠细胞系中的体外信号传导研究证明MEHD7945A和cobimetinib的组合在抑制AKT和ERK信号传导方面的效果优于单一药剂活性。增殖抑制在组合组也得到增强。在结肠癌的KRAS突变体异种移植物模型中，组合组展现与单一药剂组相比升高的体内功效，支持如下假说，即组合抑制信号传导受体EGFR和HER3和并行抑制RAS/RAF/MEK途径是阻止补偿性途径激活，由此增强效力必需的。在胰腺野生型KRAS异种移植物模型中，在组合组中看到与单一药剂处理相比升高的体内功效，提示MEHD7945A和cobimetinib的组合在胰腺癌中也是有益的。
可以与化疗剂组合采用组合来治疗高增殖性疾病或病症，包括肿瘤、癌症、和新生物组织，以及恶变前和非新生物或非恶性高增殖性病症。在某些实施方案中，组合在剂量给药方案中作为组合疗法与具有抗高增殖性特性或可用于治疗高增殖性病症的另一种化合物组合。剂量给药方案的别的化合物优选具有与组合互补的活性，使得它们不会不利地彼此影响。此类化合物可以以对于预定目的有效的量施用。在一个实施方案中，通过如下的剂量给药方案施用治疗剂组合，其中在每天两次至每三周一次(q3wk)的范围中施用治疗有效量的MEK抑制剂化合物(诸如GDC-0973或GDC-0623)或其药学可接受盐，并在每天两次至每三周一次的范围中施用治疗有效量的HER3/EGFR抑制剂(一种或多种)(诸如MEHD7945A)。
组合疗法可以作为同时或序贯方案来施用。当序贯施用时，可以以两次或更多次施用来施用组合。组合施用包括使用分开的配制剂的共施用，和任意次序的连续施用，其中优选有一段时间所有活性剂同时发挥它们的生物学活性。
在本发明的一个具体方面，可以在HER3/EGFR抑制剂(一种或多种)(诸如MEHD7945A)施用开始后约1至约10天的时间段施用MEK抑制剂化合物(诸如GDC-0973或GDC-0623)或其药学可接受盐。在本发明的另一个具体方面，可以在HER3/EGFR抑制剂(一种或多种)(诸如MEHD7945A)施用开始前约至10天的时间段施用MEK抑制剂化合物(诸如GDC-0973或GDC-0623)或其药学可接受盐。在本发明的另一个具体方面，MEK抑制剂化合物(诸如GDC-0973或GDC-0623)或其药学可接受盐的施用和HER3/EGFR抑制剂(一种或多种)(诸如MEHD7945A)的施用在同一天开始。
在本发明的一个具体方面，可以在MEK抑制剂化合物(诸如GDC-0973或GDC-0623)或其药学可接受盐施用开始后约1至约10天的时间段施用HER3/EGFR抑制剂(一种或多种)(诸如MEHD7945A)。在本发明的另一个具体方面，可以在MEK抑制剂化合物(诸如GDC-0973或GDC-0623)或其药学可接受盐施用开始前约1至10天施用HER3/EGFR抑制剂(一种或多种)(诸如MEHD7945A)。在本发明的另一个具体方面，HER3/EGFR抑制剂(一种或多种)(诸如MEHD7945A)的施用和MEK抑制剂化合物(诸如GDC-0973或GDC-0623)或其药学可接受盐的施用在同一天开始。
任何上述共施用药剂的合适剂量就是那些当前使用的，而且可以由于新鉴定的药剂和其它化疗剂或治疗的组合作用(协同)而降低，诸如为了提高治疗指数或减轻毒性或其它副作用或后果。
在抗癌疗法的一个特定实施方案中，治疗剂组合可以与手术疗法和放疗组合。会选择组合的量和施用的相对时机以实现期望的组合治疗效果。
V.组合疗法的剂量方案
式I或II的MEK抑制剂化合物或其药学可接受盐用于治疗人患者的剂量范围可以自约20mg至约1600mg化合物。一种典型剂量可以是约50mg至约800mg化合物。可以一天一次(QD)、每天两次(BID)、或更加频繁地施用一剂，取决于药动学(PK)和药效学(PD)特性，包括特定化合物的吸收、分布、代谢、和***。另外，毒性因素可影响剂量和施用剂量给药方案。当口服施用时，可以在规定时间段里可每天两次、每天一次或更不频繁地(诸如每周一次或每两周或三周一次)摄取丸剂、胶囊剂、或片剂。可以将方案重复一定数目周期的疗法。
抗体(诸如MEHD7945A)用于治疗人患者的剂量范围可以自约0.05mg/kg至约30mg/kg。如此，可以对患者施用一或多剂约0.5mg/kg，2.0mg/kg，4.0mg/kg，10mg/kg，12mg/kg，13mg/kg，14mg.kg，15mg/kg，20mg/kg，25mg/kg，或30mg/kg(或其任意组合)。可以每天或间歇地(例如每周、每两周、或每三周)施用此类剂量。
在一个特定实施方案中，用于人患者的剂量是每两周(Q2W)通过IV施用的1100mgMEHD7945A和每天(QD)通过口服施用的40mgGDC-0973(cobimetinib)。在另一个特定实施方案中，用于人患者的剂量是1100mgMEHD7945AIVQ2W和50mg口服QDGDC-0973(cobimetinib)。在另一个特定实施方案中，用于人患者的剂量是1100mgMEHD7945AIVQ2W和60mg口服QDGDC-0973(cobimetinib)。在另一个特定实施方案中，用于人患者的剂量是1100mgMEHD7945AIVQ2W和70mg口服QDGDC-0973(cobimetinib)。在另一个特定实施方案中，用于人患者的剂量是1100mgMEHD7945AIVQ2W和80mg口服QDGDC-0973(cobimetinib)。在这些特定实施方案中，患者接受1100mgMEHD7945AIVQ2W；GDC-0973(cobimetinib)会施用连续21天，接着停7天。
在另一个特定实施方案中，用于人患者的剂量是每两周(Q2W)通过IV施用的1100mgMEHD7945A和一周一次口服施用的40mgGDC-0973(cobimetinib)。在另一个特定实施方案中，用于人患者的剂量是1100mgMEHD7945AIVQ2W和50mg口服QDGDC-0973(cobimetinib)口服施用一周一次。在另一个特定实施方案中，用于人患者的剂量是1100mgMEHD7945AIVQ2W和60mg口服QDGDC-0973(cobimetinib)口服施用一周一次。在另一个特定实施方案中，用于人患者的剂量是1100mgMEHD7945AIVQ2W和70mg口服QDGDC-0973(cobimetinib)口服施用一周一次。在另一个特定实施方案中，用于人患者的剂量是1100mgMEHD7945AIVQ2W和80mg口服QDGDC-0973(cobimetinib)口服施用一周一次。
在另一个特定实施方案中，用于人患者的剂量是每两周(Q2W)通过IV施用的1100mgMEHD7945A和一周两次口服施用的40mgGDC-0973(cobimetinib)。在另一个特定实施方案中，用于人患者的剂量是1100mgMEHD7945AIVQ2W和50mg口服QDGDC-0973(cobimetinib)口服施用一周两次。在另一个特定实施方案中，用于人患者的剂量是1100mgMEHD7945AIVQ2W和60mg口服QDGDC-0973(cobimetinib)口服施用一周两次。在另一个特定实施方案中，用于人患者的剂量是1100mgMEHD7945AIVQ2W和70mg口服QDGDC-0973(cobimetinib)口服施用一周两次。在另一个特定实施方案中，用于人患者的剂量是1100mgMEHD7945AIVQ2W和80mg口服QDGDC-0973(cobimetinib)口服施用一周两次。
在另一个特定实施方案中，用于人患者的剂量是每两周(Q2W)通过IV施用的1100mgMEHD7945A和一周三次口服施用的40mgGDC-0973(cobimetinib)。在另一个特定实施方案中，用于人患者的剂量是1100mgMEHD7945AIVQ2W和50mg口服QDGDC-0973(cobimetinib)口服施用一周三次。在另一个特定实施方案中，用于人患者的剂量是1100mgMEHD7945AIVQ2W和60mg口服QDGDC-0973(cobimetinib)口服施用一周三次。在另一个特定实施方案中，用于人患者的剂量是1100mgMEHD7945AIVQ2W和70mg口服QDGDC-0973(cobimetinib)口服施用一周三次。在另一个特定实施方案中，用于人患者的剂量是1100mgMEHD7945AIVQ2W和80mg口服QDGDC-0973(cobimetinib)口服施用一周三次。
在另一个特定实施方案中，用于人患者的剂量是每两周(Q2W)通过IV施用的1100mgMEHD7945A和一周四次口服施用的40mgGDC-0973(cobimetinib)。在另一个特定实施方案中，用于人患者的剂量是1100mgMEHD7945AIVQ2W和50mg口服QDGDC-0973(cobimetinib)口服施用一周四次。在另一个特定实施方案中，用于人患者的剂量是1100mgMEHD7945AIVQ2W和60mg口服QDGDC-0973(cobimetinib)口服施用一周四次。在另一个特定实施方案中，用于人患者的剂量是1100mgMEHD7945AIVQ2W和70mg口服QDGDC-0973(cobimetinib)口服施用一周四次。在另一个特定实施方案中，用于人患者的剂量是1100mgMEHD7945AIVQ2W和80mg口服QDGDC-0973(cobimetinib)口服施用一周四次。
在另一个特定实施方案中，用于人患者的剂量是每两周(Q2W)通过IV施用的1100mgMEHD7945A和一周五次口服施用的40mgGDC-0973(cobimetinib)。在另一个特定实施方案中，用于人患者的剂量是1100mgMEHD7945AIVQ2W和50mg口服QDGDC-0973(cobimetinib)口服施用一周五次。在另一个特定实施方案中，用于人患者的剂量是1100mgMEHD7945AIVQ2W和60mg口服QDGDC-0973(cobimetinib)口服施用一周五次。在另一个特定实施方案中，用于人患者的剂量是1100mgMEHD7945AIVQ2W和70mg口服QDGDC-0973(cobimetinib)口服施用一周五次。在另一个特定实施方案中，用于人患者的剂量是1100mgMEHD7945AIVQ2W和80mg口服QDGDC-0973(cobimetinib)口服施用一周五次。
在另一个特定实施方案中，用于人患者的剂量是每两周(Q2W)通过IV施用的1100mgMEHD7945A和一周六次口服施用的40mgGDC-0973(cobimetinib)。在另一个特定实施方案中，用于人患者的剂量是1100mgMEHD7945AIVQ2W和50mg口服QDGDC-0973(cobimetinib)口服施用一周六次。在另一个特定实施方案中，用于人患者的剂量是1100mgMEHD7945AIVQ2W和60mg口服QDGDC-0973(cobimetinib)口服施用一周六次。在另一个特定实施方案中，用于人患者的剂量是1100mgMEHD7945AIVQ2W和70mg口服QDGDC-0973(cobimetinib)口服施用一周六次。在另一个特定实施方案中，用于人患者的剂量是1100mgMEHD7945AIVQ2W和80mg口服QDGDC-0973(cobimetinib)口服施用一周六次。
在另一个特定实施方案中，用于人患者的剂量是一周一次(QW)通过IV施用的400mgMEHD7945A和一周一次口服施用的40mgGDC-0973(cobimetinib)。在另一个特定实施方案中，用于人患者的剂量是400mgMEHD7945AIVQW和50mg口服QDGDC-0973(cobimetinib)口服施用一周一次。在另一个特定实施方案中，用于人患者的剂量是400mgMEHD7945AIVQW和60mg口服QDGDC-0973(cobimetinib)口服施用一周一次。在另一个特定实施方案中，用于人患者的剂量是400mgMEHD7945AIVQW和70mg口服QDGDC-0973(cobimetinib)口服施用一周一次。在另一个特定实施方案中，用于人患者的剂量是400mgMEHD7945AIVQW和80mg口服QDGDC-0973(cobimetinib)口服施用一周一次。
在另一个特定实施方案中，用于人患者的剂量是QW通过IV施用的400mgMEHD7945A和一周两次口服施用的40mgGDC-0973(cobimetinib)。在另一个特定实施方案中，用于人患者的剂量是400mgMEHD7945AIVQW和50mg口服QDGDC-0973(cobimetinib)口服施用一周两次。在另一个特定实施方案中，用于人患者的剂量是400mgMEHD7945AIVQW和60mg口服QDGDC-0973(cobimetinib)口服施用一周两次。在另一个特定实施方案中，用于人患者的剂量是400mgMEHD7945AIVQW和70mg口服QDGDC-0973(cobimetinib)口服施用一周两次。在另一个特定实施方案中，用于人患者的剂量是400mgMEHD7945AIVQW和80mg口服QDGDC-0973(cobimetinib)口服施用一周两次。
在另一个特定实施方案中，用于人患者的剂量是QW通过IV施用的400mgMEHD7945A和一周三次口服施用的40mgGDC-0973(cobimetinib)。在另一个特定实施方案中，用于人患者的剂量是400mgMEHD7945AIVQW和50mg口服QDGDC-0973(cobimetinib)口服施用一周三次。在另一个特定实施方案中，用于人患者的剂量是400mgMEHD7945AIVQW和60mg口服QDGDC-0973(cobimetinib)口服施用一周三次。在另一个特定实施方案中，用于人患者的剂量是400mgMEHD7945AIVQW和70mg口服QDGDC-0973(cobimetinib)口服施用一周三次。在另一个特定实施方案中，用于人患者的剂量是400mgMEHD7945AIVQW和80mg口服QDGDC-0973(cobimetinib)口服施用一周三次。
在另一个特定实施方案中，用于人患者的剂量是QW通过IV施用的400mgMEHD7945A和一周四次口服施用的40mgGDC-0973(cobimetinib)。在另一个特定实施方案中，用于人患者的剂量是400mgMEHD7945AIVQW和50mg口服QDGDC-0973(cobimetinib)口服施用一周四次。在另一个特定实施方案中，用于人患者的剂量是400mgMEHD7945AIVQW和60mg口服QDGDC-0973(cobimetinib)口服施用一周四次。在另一个特定实施方案中，用于人患者的剂量是400mgMEHD7945AIVQW和70mg口服QDGDC-0973(cobimetinib)口服施用一周四次。在另一个特定实施方案中，用于人患者的剂量是400mgMEHD7945AIVQW和80mg口服QDGDC-0973(cobimetinib)口服施用一周四次。
在另一个特定实施方案中，用于人患者的剂量是QW通过IV施用的400mgMEHD7945A和一周五次口服施用的40mgGDC-0973(cobimetinib)。在另一个特定实施方案中，用于人患者的剂量是400mgMEHD7945AIVQW和50mg口服QDGDC-0973(cobimetinib)口服施用一周五次。在另一个特定实施方案中，用于人患者的剂量是400mgMEHD7945AIVQW和60mg口服QDGDC-0973(cobimetinib)口服施用一周五次。在另一个特定实施方案中，用于人患者的剂量是400mgMEHD7945AIVQW和70mg口服QDGDC-0973(cobimetinib)口服施用一周五次。在另一个特定实施方案中，用于人患者的剂量是400mgMEHD7945AIVQW和80mg口服QDGDC-0973(cobimetinib)口服施用一周五次。
在另一个特定实施方案中，用于人患者的剂量是QW通过IV施用的400mgMEHD7945A和一周六次口服施用的40mgGDC-0973(cobimetinib)。在另一个特定实施方案中，用于人患者的剂量是400mgMEHD7945AIVQW和50mg口服QDGDC-0973(cobimetinib)口服施用一周六次。在另一个特定实施方案中，用于人患者的剂量是400mgMEHD7945AIVQW和60mg口服QDGDC-0973(cobimetinib)口服施用一周六次。在另一个特定实施方案中，用于人患者的剂量是400mgMEHD7945AIVQW和70mg口服QDGDC-0973(cobimetinib)口服施用一周六次。在另一个特定实施方案中，用于人患者的剂量是400mgMEHD7945AIVQW和80mg口服QDGDC-0973(cobimetinib)口服施用一周六次。
VI.治疗方法
本文中提供的治疗剂组合对于治疗患者中的疾病、状况和/或病症(包括但不限于那些受AKT激酶调控的)是有用的。能依照本发明的方法治疗的癌症包括但不限于结肠直肠、间皮瘤、子宫内膜、胰腺、乳腺、肺、卵巢、***、黑素瘤、胃、结肠、肾、头和颈、和成胶质细胞瘤。
本发明的组合可提供某些癌症表型的改进效果。例如，本发明的某些组合可针对与RAS突变(诸如KRAS突变)、EGFR突变(诸如T790M)、PTEN突变(或低或无状态)、AKT突变(或高pAKT表达或扩增水平)、PI3K突变、或上述的组合有关的癌症提供改进效果。在一个实施方案中，癌症包含第12或13位处的KRAS突变。在某些实施方案中，KRAS突变为G12A、G12C、G12D、G12R、G12S、G12V、G13C、或G13D。
因而，本文所述某些组合可以是针对这些类型的癌症特别有用。GDC-0973已经显示针对KRAS驱动的肿瘤(它们在结肠、胰腺和肺肿瘤中是常见的)具有改进功效。
PTEN无(或低)状态可以通过本领域已知的任何合适手段来测量。在一个例子中，使用IHC。或者，可以使用Western印迹分析。针对PTEN的抗体是商品化的(CellSignalingTechnology,Beverly,MA，CascadeBiosciences,Winchester,MA)。用于PTEN状态的IHC和Western印迹分析的例示性规程记载于Neshat,M.S.,etal.,EnhancedsensitivityofPTEN-deficienttumorstoinhibitionofFRAP/mTOR,Proc.NatlAcad.Sci.USA98,10314-10319(2001)和Perren,A.,etal.,ImmunohistochemicalEvidenceofLossofPTENExpressioninPrimaryDuctalAdenocarcinomasoftheBreast,AmericanJournalofPathology,Vol.155,No.4,October1999。另外，与AKT突变或PI3K突变有关的癌症可以使用本领域已知的技术来鉴定。
给定样品中与非活化的或非磷酸化的AKT水平相比，AKT的活化或磷酸化水平(“pAKT”)可以通过本领域已知方法来测量。pAKT状态可以就比(例如肿瘤细胞中的pAKT的量除以相同类型的非瘤性细胞中的pAKT的量)或减法(例如肿瘤细胞中的pAKT的量减去相同类型的细胞或非瘤性细胞中的pAKT的量)而言来表述。pAKT概况也可以就途径活化水平(通过测量AKT的磷酸化下游靶物(例如pGSK或PRAS40)的量)而言来表述。高pAKT指样品中比基线值要高的总体AKT的活化或磷酸化水平。在一个例子中，基线值是给定细胞类型的pAKT基础水平。在另一个例子中，基线值是给定样品细胞(例如非癌性细胞)群中的pAKT平均或均值水平。在另一个例子中，高pAKT指与来自相同哺乳动物或患者群的、相同类型的正常、健康(例如非癌性)细胞的平均值相比，在细胞中过表达或过扩增磷酸化的或活化的AKT的肿瘤细胞。pAKT概况还可以与其它标志物(例如FOXO3，一种定位概况)联合使用，用于预测某些PI3k/AKT激酶途径抑制剂的功效。用于测试PI3k、KRAS和AKT突变的存在的试剂盒是商品化的(Qiagen)。
在一个具体的方面，本发明提供用于治疗具有与PTEN突变或表达丧失、AKT突变或扩增、PI3K突变或扩增、或其组合有关的癌症的患者的方法，其包括对该患者施用本发明的组合。在另一个方面，本发明提供用于鉴定具有能用本发明的组合治疗的癌症的患者的方法，其包括鉴定该患者的癌症是否与PTEN突变或表达丧失、AKT突变或扩增、PI3K突变或扩增、或其组合有关，其中该患者的癌症与PTEN突变或表达丧失、AKT突变或扩增、PI3K突变或扩增、或其组合有关指示能用本发明的组合治疗的癌症。在又一个方面，本发明提供一种方法，其进一步包括用本发明的组合治疗如此鉴定的患者。在一个实施方案中，该癌症为卵巢、乳腺、黑素瘤、结肠、头和颈、或非小细胞肺癌。
VII.制品
在本发明的另一个实施方案中，提供含有可用于治疗上文所述疾病和病症的组合的制品，或“试剂盒”。在一个实施方案中，所述试剂盒包含容器和本文所述组合。
所述试剂盒可以进一步包含标签或包装插页，其在容器上或与容器有关。术语“包装插页”用于指通常包括在治疗用产品的商业包装中的说明书，它们包含有关涉及此类治疗用产品应用的适应征，用法，剂量，施用，禁忌症和/或警告的信息。合适的容器包括例如瓶，管形瓶，注射器，泡罩包，等，所述容器可以由各种材料，诸如玻璃或塑料形成。容器可以装有有效治疗所述状况的组合或其配制剂，而且可以具有无菌存取口(例如容器可以是具有皮下注射针头可刺穿的塞子的静脉内溶液袋或管形瓶)。标签或包装插页指示组合物用于治疗所选择的状况，诸如癌症。在一个实施方案中，标签或包装插页指示包含组合的组合物可用于治疗源自异常细胞生长的病症。标签或包装插页还可以指示组合物可用于治疗其它病症。或者/另外，制品可以进一步包括第二容器，其装有药学可接受缓冲液，诸如注射用抑菌水(BWFI)，磷酸盐缓冲盐水，林格氏溶液和右旋糖溶液。它可以进一步包括从商业和用户立场看想要的其它材料，包括其它缓冲液，稀释剂，滤器，针头，和注射器。
试剂盒可以进一步包括关于施用组合和(如果存在的话)第二药物配制剂的指导。例如，如果试剂盒包括包含GDC-0973或GDC-0623或其药学可接受盐的第一组合物和包含MEHD7945A的第二药物配制剂，那么试剂盒可以进一步包括关于对有所需要的患者同时，序贯或分开施用第一和第二药物组合物的指导。
在另一个实施方案中，试剂盒适合于递送固体口服形式的组合，诸如片剂或胶囊剂。此类试剂盒优选包括多个单位剂量。此类试剂盒可包括卡片，其中各剂量以它们意图使用的次序定位(oriented)。此类试剂盒的一个例子是“泡罩包”。泡罩包是包装工业公知的，而且广泛用于包装制药学剂量单位形式。如果需要，可以提供记忆辅助物，例如数字，字母，其它标记的形式或者日历插页，指示治疗时间表中要施用剂量的日子。
依照一个实施方案，试剂盒可以包括(a)第一容器，其中装有GDC-0973或GDC-0623或其药学可接受盐；(b)第二容器，其中装有MEHD7945A，和(c)第三容器，其中装有第三药物配制剂，其中所述第三药物配制剂包含具有抗高增殖性活性的另一种化合物。或者/另外，试剂盒可以进一步包括第三容器，其装有制药学可接受缓冲液，诸如注射用抑菌水(BWFI)，磷酸盐缓冲盐水，林格氏溶液和右旋糖溶液。它可以进一步包括从商业和用户立场看想要的其它材料，包括其它缓冲液，稀释剂，滤器，针头，和注射器。
若试剂盒包含GDC-0973或GDC-0623或其药学可接受盐和MEHD7945A的组合物，则试剂盒可以包括多个容器来装分开的组合物，诸如分开的瓶或分开的箔包，然而，分开的组合物也可以装在单个，不分隔的容器内。典型地，试剂盒包括关于施用分开的成分的指导。当不同成分优选以不同剂量形式施用(例如口服和胃肠外)，以不同剂量间隔施用，或者当开处方的内科医师希望调整(titration)组合的各成分时，这种试剂盒形式是特别有利的。
VIII.实施例
为了例示本发明，包括下列实施例。然而，应当理解，这些实施例不限制本发明，而只是意图提示实施本发明的方法。
实施例1：MEHD7945A是对HER3和EGFR二者特异性的
MEHD7945A是一种抗体，其包含的抗原结合域具有针对EGFR和HER3二者的结合特异性(WO2010/108127和Schaeferetal.,CancerCell,20:472-486(2011))。通常，通过连接两种不同抗原结合分子(每种模块只能够结合一种抗原)来构建双靶向剂。相反，在MEHD7945A中，每个模块(Fab)能结合两种抗原任一，如此具有自亲合效应引发增强的结合亲和力的潜力。为了确认MEHD7945A的两个相同Fab每个均能结合EGFR或HER3任一，实施了一种竞争性结合测定法。渐增量的EGFR-ECD以剂量依赖性方式减少结合固定化HER3-ECD的MEHD7945A。相反，可溶性HER3-ECD蛋白质自固定化EGFR-ECD竞争MEHD7945A。正如预期的，鉴于它们的相对结合常数，与MEHD7945A对固定化HER3-ECD的结合竞争需要较高浓度的可溶性EGFR-ECD(图1)。图1中的结果表述为MEHD7945A浓度对OD。如指示的，在所示可溶性竞争物存在下：1×＝0.02μg/ml，10×＝0.2μg/ml，100×＝2μg/ml，1000×＝20μg/ml，测定法检查MEHD7945A对固定化HER3-ECD或EGFR-ECD的结合。图1中的结果表述为DL11f浓度对OD。
实施例2：MEHD7945A抑制EGFR和HER2/HER3依赖性信号传导
测定了MEHD7945A在细胞信号传导测定法中的双重活性。为了评估对HER3的抑制性功能，使用MCF-7细胞(对该细胞，NRG处理有力活化HER2/HER3途径)。NRG刺激之前的MEHD7945A处理以剂量依赖性方式有力抑制HER3磷酸化，且显著降低AKT和ERK1/2磷酸化(图2A)。MEHD7945A抑制HER3磷酸化(IC50为0.05μg/ml)、AKT磷酸化(IC50值为0.19μg/ml)、和ERK1/2磷酸化(IC50值为1.13μg/ml)。用具有相当的对HER3的结合亲和力的针对HER3的单特异性抗体抗HER3处理实现了相似结果。抗HER3抑制HER3磷酸化(IC50为0.12μg/ml)、AKT磷酸化(IC50值为0.74μg/ml)、和ERK1/2磷酸化(IC50为1.83μg/ml)。配体刺激前用MEHD7945A预处理EGFR-NR6细胞，并测定了DL11f分别以0.03和0.16μg/ml的IC50值抑制EGFR和ERK1/2磷酸化(图2B)。单特异性EGFR抗体西妥昔单抗在抑制EGFR磷酸化和下游信号传导分子方面是更加有效的，这可能是由于更高的对EGFR的结合亲和力。此外，β细胞素(betacellulin)和双调蛋白(amphiregulin)诱导的EGFR磷酸化也受MEHD7945A抑制。在A431和BxPC3细胞中MEHD7945A像抗HER3和西妥昔单抗的组合一样有力地抑制ERK1/2和AKT途径。
如下实施测定法。将用所示浓度的MEHD7945A或抗HER3处理的MCF-7细胞用0.5nMNRG刺激10分钟。对细胞裂解物进行免疫印迹以检测pHER3(Tyr1289)、pAKT(Ser473)、pERK1/2(Thr202/Tyr204)、和总HER3。图2A。用所示浓度的MEHD7945A或西妥昔单抗处理EGFR-NR6细胞1小时，之后用5nMTGF-α刺激10分钟。对细胞裂解物进行免疫印迹以检测pERK1/2(Thr202/Tyr204)、总EGFR、和磷酸化EGFR。由于EGFR-NR6细胞只表达EGFR，因此使用pTyr抗体检测EGFR的所有潜在磷酸化位点。
实施例3：MEHD7945A在众多癌症模型中有活性
Fadu异种移植物模型(一种头和颈鳞状细胞癌模型)中的体内活性
在具有自Fadu细胞(ATCCHTB-43，Manassas，Va.)衍生的已建立肿瘤的小鼠中测试MEHD7945A、一种商品化抗EGFR抗体、和一种抗HER3抗体。在CB17SCID小鼠中皮下接种5x106个FaDu细胞。如下将肿瘤大小相似的动物随机化入处理分组(n＝9/组)：媒介(MEHD7945A配制缓冲液)，抗EGFR抗体(25mg/kg)，抗HER3抗体(50mg/kg)，和MEHD7945A(25mg/kg)。腹膜内施用处理，在随机化那天以2倍加载剂量(分别为50或100mg/kg)开始并继以每周一次，总共4次处理。如图3所示，MEHD7945A在FaDu头和颈癌模型中有活性，且在抑制肿瘤生长方面比抗EGFR特异性或抗HER3特异性抗体任一更加有效。
MEHD7945A在别的癌症类型中有活性
图4提供MEHD7945A在其中显示活性的一些别的癌症类型的汇总，以及西妥昔单抗或单特异性抗HER3抗体对该癌症类型的相对活性。用于产生此汇总的测定法的详情提供于WO2010/108127。简言之，用25mg/kgMEHD7945A、25mg/kg西妥昔单抗、50mg/kg抗HER3或25mg/kg西妥昔单抗加50mg/kg抗HER3的组合处理小鼠，一周一次，4个周期。用30mg/kgMEHD7945A、30mg/kg西妥昔单抗、60mg/kg抗HER3或30mg/kg西妥昔单抗加60mg/kg抗HER3的组合处理MAXF449、OVXF550和LX983，一周一次，4个周期。对于所有处理，初始剂量为2倍加载剂量。基于大多数小鼠维持在媒介组中的研究最后一天，为每项研究计算肿瘤生长抑制(TGI)的百分比。低于25％的TGI表示为-，25-50％的TGI表示为+，51-75％的TGI表示为++，而76％及以上的TGI表示为+++。NSCLC＝非小细胞肺癌，HNSSC＝头和颈鳞状细胞癌，CRC＝结肠直肠癌，n/a＝不适用。OVXF550、MAXF449和LXF983模型是人患者衍生的移植物模型。
实施例4：MEHD7945A与GDC-0973或GDC-0623任一的组合导致的pERK阻抑比由单药疗法提供的pERK阻抑要好。
MEK抑制剂任一作为单一药剂的处理导致pAkt水平升高，而组合疗法降低pAKT水平至基线水平。并且，MEHD7945A与GDC-0973或GDC-0623任一的组合在Kras突变体模型中导致比单药疗法要好的pERK阻抑(图7)。在此测定法中，MEHD7945A以10μg/ml存在，GDC-0973以1μM存在，GDC-0623以μM存在，而调蛋白(HRG)以10nM存在。
实施例5：MEHD7945A和GDC-0973或GDC-0623任一的组合疗法在CRCKRAS突变体癌症的临床前模型中优于单药疗法。
用作为单一药剂的MEHD7945A、GDC-0973和GDC-0623和由MEHD7945A与GDC-0973和MEHD7945A与GDC-0623组成的组合处理KRAS突变体结肠直肠癌的小鼠LS180异种移植物肿瘤模型。处理组如下：01–媒介对照；03-GDC-0973(10mg/kg，PO，QD)；04-GDC-0623(5mg/kg，PO，QD)；06-MEHD7945A(25mg/kg，IV，QW)；08-GDC-0973(10mg/kg，PO，QD)+MEHD7945A(25mg/kg，IV，QW)；09-GDC-0623(5mg/kg，PO，QD)+MEHD7945A(25mg/kg，IV，QW)。
在处理过程里测量肿瘤体积，结果显示于图8。如图8所示，MEHD7945A与GDC-0973或GDC-0623任一的组合优于单药处理。
实施例6：KRAS突变体结肠直肠细胞系中MEHD7945A和GDC-0973的组合的体外效果
在KRAS突变体结肠直肠细胞系中使用MEHD7945A和cobimetinib或这两种药剂的组合体外探索对RAS/RAF/MEK和PI3K/AKT途径的抑制。选择了两种KRAS突变体结肠直肠细胞系来评估cobimetinib对磷酸化AKT(pAKT)的潜在上调(抑制负反馈环所致)。已经在数种细胞***中描述了MEK抑制后的pAKT上调(Mirzoevaetal.,2009；Diepetal.,2011；Turkeetal.,2012)。此外，我们调查了将MEHD7945A添加至cobimetinib处理是否能增强pAKT和pERK1/2抑制。用10μg/mLMEHD7945A，0.05μMcobimetinib、或其组合预处理LS180细胞1小时，之后用5nMTGFα刺激12分钟。用10μg/mLMEHD7945A，0.025μMcobimetinib、或其组合预处理DLD-1细胞1小时，之后用5nMTGFα刺激12分钟。对细胞裂解物进行免疫印迹以检测EGFR磷酸化(pEGFR1068)、AKT磷酸化(pAKTS473)、和ERK1/2磷酸化(pERK1/2T202/Y204)，及EGFR、AKT、或ERK1/2的总蛋白质水平。结果显示于图9(左边小图＝LS180细胞，右边小图＝DLD-1细胞)(EGFR＝表皮生长因子受体；ERK＝胞外信号调节的激酶；p＝磷酸化的；TGFα＝转化生长因子α)
用cobimetinib处理的TGFα刺激的LS180或DLD-1细胞显示出与对照裂解物(第2道)相比升高的AKT磷酸化(图9，第4道)，这提示MEK抑制剂诱导的反馈环的存在(Mirzoevaetal.,2009；Diepetal.,2011；Turkeetal.,2012)。
低剂量的cobimetinib(0.05μM用于LS180细胞，0.025μM用于DLD-1细胞)只实现了对ERK1/2磷酸化的部分抑制(分别见图9左边和右边小图)。然而，在两种细胞系中cobimetinib加MEHD7945A的低剂量组合均导致强pERK和pAKT下调(见图9，第5道)。在图9中，左边小图展示用10μg/mLMEHD7945A、0.05μMcobimetinib、或组合预处理1小时，之后用5nMTGFα刺激12分钟的LS180细胞。右边小图展示用10μg/mLMEHD7945A、0.025μMcobimetinib、或组合预处理1小时，之后用5nMTGFα刺激12分钟的DLD-1细胞。对细胞裂解物进行免疫印迹以检测EGFR磷酸化(pEGFR1068)、AKT磷酸化(pAKTS473)、和ERK1/2磷酸化(pERK1/2T202/Y204)，及EGFR、AKT、或ERK1/2的总蛋白质水平。
为了测试KRAS突变体细胞系中组合抑制MEK1/2和EGFR/HER3的抗增殖效果，在5μg/mLMEHD7945A存在或缺失下用渐增浓度的cobimetinib(0.17-10,000nM)处理LS180细胞。MEHD7945A和cobimetinib的组合导致与单独的cobimetinib的抗增殖效果相比更强的细胞存活力降低。结果显示于图10(结果表述成RFU(相对荧光单位)，对SMI(小分子抑制剂)浓度绘图。关于数据分析，使用一种4参数曲线拟合程序。数据代表三项独立实验)。
实施例7：LS180和DLD-1异种移植物模型中MEHD7945A与cobimetinib的组合研究
在KRAS突变体结肠直肠异种移植物模型LS180和DLD-1中进行了MEHD7945A和cobimetinib的组合研究。由于它们的KRAS突变体状态和它们的EGFR和HER3表达，选择了这两种模型。作为水溶液以3或10mg/mL口服施用cobimetinib，一天一次，达21天。IV施用MEHD7945A，一周一次，直至到达第21天。在研究过程里每周两次记录肿瘤大小和体重。当肿瘤体积超过2000mm3时或如果体重损失≥它们起始重量20％的话，迅速对小鼠处以安乐死。
为了恰当分析随时间来自相同动物的肿瘤体积的重复测量，使用一种混合建模办法(Pinheiroetal.,2009)。这种办法解决重复测量和研究结束前非处理相关动物终结所致适度退出率二者。作为媒介的百分比(％TGI)或肿瘤进展前时间(TTP)，使用此分析来测定肿瘤生长抑制。
LS180模型
随机化后，给予携带LS180肿瘤的小鼠口服(PO)强饲法剂量0(媒介)、3、或10mg/kgcobimetinib(表述为游离碱当量)，一天一次(QD)，达21天。经静脉内(IV)推注给予小鼠25mg/kgMEHD7945A，一周一次(QW)，总共3次注射。在接受两种药剂的组中，先施用cobimetinib，紧接着施用MEHD7945A。
以3或10mg/kg施用cobimetinib或以25mg/kg施用MEHD7945A分别导致28％、63％、和44％TGI。cobimetinib和MEHD7945A的组合具有与单药活性相比更强的抗肿瘤活性。3和10mg/kgcobimetinib与25mg/kgMEHD7945A分别导致48％和79％TGI。数据显示于图11A，研究汇总于图11B。在图11中，CI＝置信区间；HB#8＝组氨酸缓冲液8；MCT＝0.5％(w/v)甲基纤维素、0.2％(w/v)聚山梨酯80；TGI＝肿瘤生长抑制；w/v＝重量每体积。
DLD-1
随机化后，给予携带DLD-1肿瘤的小鼠PO强饲法剂量0(媒介)、3、或10mg/kgcobimetinib(表述为游离碱当量)，QD，达21天。小鼠经IV推注接受25mg/kgMEHD7945A，QW，总共3次注射。在接受两种药剂的组中，先施用cobimetinib，紧接着施用MEHD7945A。
以3和10mg/kg施用cobimetinib和以25mg/kg施用MEHD7945A分别导致39％、62％、和62％TGI。然而，3和10mg/kg与25mg/kgMEHD7945A的组合导致90％和108％TGI。数据显示于图12A，研究汇总于图12B。
实施例8：胰腺BxPC3异种移植物模型中MEHD7945A与cobimetinib的组合研究
随机化后，给予小鼠PO强饲法剂量0(媒介)、1、或5mg/kgcobimetinib(表述为游离碱当量)，QD，达21天。经IV推注给予小鼠25mg/kgMEHD7945A，QW，总共3次注射。在接受两种药剂的组中，先施用cobimetinib，紧接着施用MEHD7945A。
以1和5mg/kg施用cobimetinib和以25mg/kg施用MEHD7945A分别导致88％、109％、和107％TGI。以1或5mg/kg施用cobimetinib组合以25mg/kg施用MEHD7945A分别导致113％和114％TGI。数据显示于图13A，研究汇总于图13B。给药21天后对每个组监测肿瘤进展至两倍(2x)初始肿瘤体积的时间(TTP)(见图13C)。在媒介对照分支中，TTP2x为4.5天。以1mg/kg和5mg/kg用单一药剂cobimetinib处理小鼠分别延长TTP2x至22天和33天。用单一药剂MEHD7945A处理小鼠延长TTP2x至39.5天。MEHD7945A加1mg/kgcobimetinib的组合延长TTP2x至50.5天。类似地，MEHD7945A加5mg/kgcobimetinib组合延长TTP2x至56天。在5mg/kgcobimetinib加MEHD7945A组中的3只动物中看到定义为完全响应(CR)的肿瘤体积缩小100％，但是在任何其它处理组中没有看到(见图13C)。在图13中，CI＝置信区间；CR＝完全响应(肿瘤体积缩小100％)；HB#8＝组氨酸缓冲液；MCT＝0.5％(w/v)甲基纤维素、0.2％(w/v)聚山梨酯80；NA＝未实现；PR＝部分响应(肿瘤体积缩小≥50-99％)；TTP＝肿瘤进展至两倍(2x)或五倍(5x)初始肿瘤体积的时间代表以天计的组平均值。
通过提述收录本文中引用的所有文件。虽然描述了本发明的某些实施方案，而且出于例示目的已经列出了许多细节，但是某些细节可以变化而不背离本发明的基本原理。由于众多修改和变化对于本领域技术人员会是显而易见的，因此不希望将本发明限制于本文中描述的精确构建和工艺。因而，可认为所有合适的修改和等同方案落在所附权利要求书限定的范围内。
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Claims (32)

1.一种药物产品，其包含(i)GDC-0973或GDC-0623，或其药学可接受盐；和(ii)MEHD7945A，供高增殖性病症的治疗中并行或序贯使用。
2.权利要求1的药物产品，其中该高增殖性病症为癌症。
3.权利要求2的药物产品，其中该癌症与KRAS突变有关。
4.权利要求2或3的药物产品，其中该癌症与AKT突变、过表达或扩增有关。
5.权利要求2-4任一项的药物产品，其中该癌症与PI3K突变、过表达或扩增有关。
6.权利要求2-5任一项的药物产品，其中该癌症选自结肠直肠、间皮瘤、子宫内膜、胰腺、乳腺、肺、卵巢、***、黑素瘤、胃、结肠、肾、头和颈、和成胶质细胞瘤。
7.权利要求1-6任一项的药物产品，其中GDC-0973或其药学可接受盐与MEHD7945A组合施用。
8.权利要求1-6任一项的药物产品，其中GDC-0623或其药学可接受盐与MEHD7945A组合施用。
9.权利要求1-6任一项的药物产品，其中GDC-0973或GDC-0623或其药学可接受盐与MEHD7945A同时施用。
10.权利要求1-6任一项的药物产品，其中GDC-0973或GDC-0623或其药学可接受盐和MEHD7945A序贯施用。
11.一种药物产品，其包含(i)GDC-0973或GDC-0623或其药学可接受盐；和(ii)MEHD7945A，作为组合制剂供并行或序贯使用，用于改善具有高增殖性病症的患者的生命质量。
12.如下的药物产品在制备用于治疗高增殖性病症的药物中的用途，该药物产品包含(i)包含GDC-0973或GDC-0623或其药学可接受盐的第一组合物；和(ii)包含MEHD7945A的第二组合物。
13.权利要求12的用途，其中该高增殖性病症为癌症。
14.权利要求13的用途，其中该癌症与KRAS突变有关。
15.权利要求13或14的用途，其中该癌症与AKT突变、过表达或扩增有关。
16.权利要求13-15任一项的用途，其中该癌症与PI3K突变、过表达或扩增有关。
17.权利要求13-16任一项的用途，其中该癌症选自、结肠直肠、间皮瘤、子宫内膜、胰腺、乳腺、肺、卵巢、***、黑素瘤、胃、结肠、肾、头和颈、和成胶质细胞瘤。
18.权利要求12-17任一项的用途，其中GDC-0973或其药学可接受盐与MEHD7945A组合施用。
19.权利要求12-17任一项的用途，其中GDC-0623或其药学可接受盐与MEHD7945A组合施用。
20.权利要求12-17任一项的用途，其中GDC-0973或GDC-0623或其药学可接受盐与MEHD7945A同时施用。
21.权利要求12-17任一项的用途，其中GDC-0973或GDC-0623或其药学可接受盐和MEHD7945A序贯施用。
22.一种试剂盒，其包含GDC-0973或GDC-0623或其药学可接受盐；和MEHD7945A、容器、和包装插页或标签，该包装插页或标签指示施用GDC-0068或GDC-0941或其药学可接受盐；和MEHD7945A来治疗患者中的高增殖性病症。
23.一种用于在患者中治疗高增殖性病症的方法，其包括对该患者施用治疗有效量的(i)GDC-0973或GDC-0623或其药学可接受盐；和(ii)MEHD7945A。
24.权利要求23的方法，其中该高增殖性病症为癌症。
25.权利要求24的方法，其中该癌症与KRAS突变有关。
26.权利要求24或25的方法，其中该癌症与AKT突变、过表达或扩增有关。
27.权利要求24-26任一项的方法，其中该癌症与PI3K突变、过表达或扩增有关。
28.权利要求24-27任一项的方法，其中该癌症选自结肠直肠、间皮瘤、子宫内膜、胰腺、乳腺、肺、卵巢、***、黑素瘤、胃、结肠、肾、头和颈、和成胶质细胞瘤。
29.权利要求23-28任一项的方法，其中GDC-0973或其药学可接受盐与MEHD7945A组合施用。
30.权利要求23-28任一项的方法，其中GDC-0623或其药学可接受盐与MEHD7945A组合施用。
31.权利要求23-28任一项的方法，其中GDC-0973或GDC-0623或其药学可接受盐与MEHD7945A同时施用。
32.权利要求23-28任一项的方法，其中GDC-0973或GDC-0623或其药学可接受盐和MEHD7945A序贯施用。
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