CN1942483B - 抗p型选凝素抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及抗P型选凝素抗体，并且特别是涉及含有人源衍生的Fc部分并且不结合补体因子C1q的抗P型选凝素抗体及其变体。这些抗体具有新颖性和创造性特性，对患有重度肢体局部缺血或周围动脉硬化闭塞症(CLI/PAOD)的患者有益处。

Description

抗P型选凝素抗体
本发明总体上涉及抗P型选凝素抗体并且特别是不结合补体因子C1q的抗P型选凝素抗体。优选地，这些抗体是人抗体或人源化抗体。
P型选凝素(CD62P、GMP-140、PADGEM、LECAM-3)是对凝血酶和其它激动剂反应时在活化的血小板和活化的内皮细胞表面表达的140kDa钙依赖性结合糖的蛋白质(McEver等，J Biol Chem 270：11025(1995)；Varki，Proc Natl Acad Sci USA 91：7390(1994)；Springer TA，Annu RevPhysiol 57：827(1995))。在这两种细胞类型中，P型选凝素贮藏于分泌性颗粒内，即血小板的α-颗粒和内皮细胞的Weibel-Palade体内(McEver等，J Clin Invest 84：92(1984))。P型选凝素是由氨基端的凝集素结构域、紧随其后的EGF样结构域、九个与补体调节蛋白同源的短共有重复序列、跨膜结构域和短胞质尾区构成的I型跨膜糖蛋白(Johnston等，Cell 56：1033(1989))。P型选凝素的结构类似于选凝素家族的另外两个成员：E型选凝素及L型选凝素，它们在细胞因子活化的内皮细胞上表达(E型选凝素)或在绝大部分类型的白细胞上组成型表达(L型选凝素)。
已知全部选凝素以低亲和性结合至唾液酰化、岩藻糖基化的小寡糖，例如唾液酰路易斯x(sLex；Foxall等，J Cell Biol 117：895(1992)；Varki，Curr OpinCell Biol 257：257(1992))。P型选凝素和L型选凝素还结合特定的硫酸化多糖如硫酸肝素，但E型选凝素不结合(综述参见McEver和Cummings，J Clin Invest 100：S97(1997))。对P型选凝素的高亲和性配体是由附带唾液酰化O-聚糖簇的多肽骨架组成的粘蛋白样糖蛋白(McEver等，J Biol Chem 270：11025(1995))。与P型选凝素偏嗜性结合的一种唾酸粘蛋白配体是由循环白细胞正常表达为带两个由二硫键连接的亚基的同型二聚体的P型选凝素糖蛋白配体-1(PSGL-1，CD162)，其相对分子量接近120kDa。P型选凝素的结合位点位于PSGL-1的氨基最末端部分。P型选凝素通过与其配体的结合介导白细胞在活化的血小板和活化的内皮细胞上滚动。这种滚动过程有效地降低了白细胞运动的速度，这不仅是白细胞牢固粘着于内皮以及随后变移进入内皮下的前提条件，也是白细胞在血栓内聚集的前提条件。
利用P型选凝素缺陷性小鼠和P型选凝素特异性阻断抗体开展的研究已证实P型选凝素参与多种急性和慢性炎性疾病的病理生理学，包括局部缺血/再灌注损伤(Winn等，J Clin Invest 92：2042(1993)；Massberg等，Blood 92：507(1998))。此外，P型选凝素在涉及炎性成分的心血管疾病如动脉粥样硬化症(Collins等，J Exp Med 191：189(2000)；Johnson等，JClin Invest 99：1037(1997))、再狭窄(Manka等，Circulation 103：1000(2001)；Bienvenu等，Circulation 103：1128(2001))和血栓症(Kumar等，Circulation 99：1363(1999)；Andre等，Proc Natl Acad Sci USA 97：13835(2000)；Blann等，Br.J.Haematol 108：191(2000)；Myers等，ThrombHaemostasis 85：423(2001)中也有明确作用。显而易见，对P型选凝素功能抑制作为一种疗法将在涉及白细胞对血管内皮或血小板粘着的多种疾病中有效(参见例如WO 93/06863)。
抗P型选凝素抗体已在本领域内描述并已对它们的抗炎效果和抗血栓效果进行了研究。美国专利4,783,399和WO 93/06863描述了与活化的血小板反应的小鼠抗P型选凝素单克隆抗体。Geng J.G.等(J.Biol.Chem.，266(1991)22313-22318)描述了结合P型选凝素的氨基酸(aa)片段aa60-75(Cys至Glu，根据包含信号序列的Swiss-Prot序列P16109编号)的小鼠单克隆抗体。WO 93/21956涉及与一种明确的抗体竞争、可以在P型选凝素片段(aa 60-75)存在及无钙离子时结合的小鼠抗P型选凝素单克隆抗体和人源化抗体IgG1亚类。没有一种所提及的抗人P型选凝素小鼠单克隆抗体用于治疗人类患者。在WO 93/21956中所提及的人源化的抗P型选凝素人抗体IgG1亚类正处在临床前开发阶段(www.mrctechnology.org)。
发明概述
本发明涉及特征如下的抗体：该抗体结合P型选凝素并且不结合人补体因子C1q。优选地，该抗体还不结合NK细胞表面的人Fcγ受体。本发明的抗体含有人源衍生的Fc部分。优选地，这些抗体是人源化抗体或人抗体。这些抗体具有新颖性和创造性特性，对患有炎性疾病和血栓性疾病、尤其患有周围动脉硬化闭塞症(PAOD)和重度肢体局部缺血(CLI)的患者有益处。
附图简述
图1显示本发明的抗体抑制白细胞样HL60细胞对包被于微量滴定板上的纯化的P型选凝素的粘着。突变的抗体比未突变亲本抗体更有效。
图2显示本发明的抗体在测量凝血酶活化的血小板对HL60细胞粘着的玫瑰花结鉴定法中的抑制活性。
图3a和3b描述本发明的抗体与大鼠P型选凝素和食蟹猴P型选凝素的交叉反应性。图3a：抗P型选凝素抗体不影响凝血酶活化的大鼠血小板对HL60细胞的粘着，而可商业性获得的抗P型选凝素多克隆抗体(Pharmingen 09361A)抑制这种相互作用。图3b：本发明的抗体抑制活化的食蟹猴血小板对HL60细胞的粘着。
图4a-c通过在P型选凝素转化子、E型选凝素转化子和L型选凝素转化子上的代表性结合曲线证实抗体对P型选凝素、E型选凝素和L型选凝素的选择性。本发明的抗体以0.01-0.07μg/ml范围的EC50值结合P型选凝素CHO细胞。在E型选凝素CHO细胞和L型选凝素300.19细胞上的EC50值优选地高于100μg/ml。
图5描述本发明的抗体在完全人流式***中的抑制活性。本发明抗体以65次/秒的剪切速率(shear rate)以浓度依赖性方式抑制人白细胞对血小板单层的粘着。
图6描述本发明的抗体对白细胞粘着于表达P型选凝素的人内皮细胞的抑制效果。图6a以对照的％显示对白细胞粘着的总抑制，图6b代表性地表现多种抗体中的一种抗体对不同白细胞亚群的绝对数的抑制效果。
发明详述
I.定义
术语“P型选凝素”指如Hsu-Lin等，J Biol Chem 259：9121(1984)和Mc Ever等，J Clin Invest 84：92(1989)所描述的由人血小板和内皮细胞表达的140kDa蛋白质。这种I型跨膜糖蛋白由氨基端的凝集素结构域、紧随其后的表皮生长因子(EGF)样结构域和九个共有重复序列结构域组成。该糖蛋白通过一个单跨膜结构域锚定于膜并且含有一个短胞质尾区。本发明提供能够抑制一种或多种由P型选凝素介导的活性例如其炎性活性或血栓性活性的抗体。这类抗体结合P型选凝素并通过干扰P型选凝素对其配体的结合发挥作用。
术语“P型选凝素配体”优选地涉及P型选凝素的高亲和性配体和与生物学相关性配体，如由Moore等；J.Cell Biol 118：2445(1992)，Sako等，Cell 75：1179(1993)描述的粘蛋白样糖蛋白P型选凝素配体糖蛋白-1(PSGL-1)。PSGL-1是带胞外结构域富含丝氨酸、苏氨酸和脯氨酸的I型膜蛋白质，该蛋白质包含一系列与唾液酰化O-聚糖簇连接的十聚体重复区。PSGL-1通常由循环白细胞表达为带两个由二硫键连接的亚基并且相对分子量接近120kDa的同型二聚体。P型选凝素的结合位点位于PSGL-1的氨基最末端部分。最近证实由血小板表达并与PSGL-1具有结构相似性的唾酸粘蛋白GPIbα是P型选凝素的血小板配体(Romo等，J Exp Med190：803(1999)。GPIbα结合P型选凝素的生理结果仍处于研究中，不过这种相互作用似乎对血小板的滚动和其粘着于活化的内皮细胞有贡献(Berndt等，Thromb Haemost 86：178(2001)。P型选凝素还以低亲和性结合唾酰化、岩藻糖基化的小寡糖如唾酰基路易斯x(Foxall等，JCell Biol117：895(1992)，Varki，Curr OpinCell Biol 257(1992)和特定的硫酸化多糖，如硫酸肝素(McEver等，J Biol Chem 270：11025(1995)。
术语“抗体”包括多种形式的抗体，优选地是单克隆抗体，包括但不限于完整抗体、抗体片段、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体和基因工程抗体(变异抗体或突变抗体)，只要其保留本发明的特征性特性即可。特别优选的是人单克隆抗体或人源化的单克隆抗体，尤其是作为重组人抗体。
如本文中所用，术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”指的是具有一种氨基酸组成的抗体分子的制品。
术语“嵌合抗体”指的是通常由重组DNA技术制备的单克隆抗体，其包含来自一个来源或一个种属的可变区即结合区和衍生自不同来源或不同种属的恒定区的至少一部分。特别优选的是包含鼠可变区和人恒定区的嵌合抗体。此类鼠/人嵌合抗体是包含编码鼠免疫球蛋白可变区的DNA片段和编码人免疫球蛋白恒定区的DNA片段的免疫球蛋白基因的表达产物。本发明所包含的“嵌合抗体”的其它形式是其中恒定区相对原始抗体的恒定区已进行修饰或改变以产生根据本发明的特性，尤其关于C1q结合和/或Fc受体(FcR)结合特性改变的嵌合抗体。此类“嵌合抗体”也称作“类别转换抗体”。产生嵌合抗体的方法包括目前在本领域内众所周知的常规重组DNA技术和基因转染技术。参见例如Morrison，S.L.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81(1984)6851-6855；美国专利号5,202,238和5,204,244。
术语“人源化抗体”指这样的抗体，其中构架或“互补决定区”(CDR)已被修饰以便包含与亲本免疫球蛋白特异性相比具有不同特异性的免疫球蛋白CDR。在一个优选的实施方案中，将鼠CDR向人抗体的构架区内移植以产生“人源化抗体”。参见例如Riechmann，L.等，Nature 332(1988)323-327以及Neuberger，M.S.等，Nature 314(1985)268-270。特别优选的CDR对应于这样的CDR，其代表识别以上提及的针对嵌合抗体和双功能性抗体的抗原的序列。本发明所包括的“人源化抗体”的其他形式是其中恒定区相对于原始抗体的恒定区已进行修饰或改变以产生根据本发明的特性、尤其关于C1q结合和/或Fc受体(FcR)结合特性的那些人源化抗体。
如本文中所用，术语“人抗体”旨在包括具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。人抗体在本领域内是众所周知的(vanDijk和van de Winkel，Curr Opin Pharmacol 5：368(2001))。还可在免疫后能产生完整的人抗体库而不产生内源性免疫球蛋白的转基因动物(例如小鼠)中产生人抗体。人种系免疫球蛋白基因阵列转入此类种系突变的小鼠中将导致在以抗原攻击后产生人抗体(参见例如Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：2551-2555(1993)；Jakobovits等，Nature，362：255-258(1993)；Bruggemann等，Year in Immuno.，7：33(1993))。还可以在噬菌体展示文库(Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.，227：381(1992)；Marks等，J.Mol.Biol，222：581(19991))中产生人抗体。Cole等和Boerner等的技术也可用于制备人单克隆抗体(Cole等，Monoclonal Antibodies and CancerTherapy，Alan R.Liss，第77页(1985)以及Boerner等，J.Immunol.，147(1)：86-95(1991))。如对本发明的嵌合抗体和人源化抗体提及，如本文中所用的术语“人抗体”还包含在恒定区中已进行修饰以产生本发明的特性、尤其关于C1q结合和/或Fc受体(FcR)结合特性的抗体。此外，本发明包括结合C1q和/或FcR的人抗体。此类人抗体特征在于：对P型选凝素的选择性高于对E型选凝素和L型选凝素的选择性。此类本发明的抗体以0.01-0.07μg/ml范围内的EC50结合于表达P型选凝素的细胞。在表达E型选凝素和L型选凝素的细胞上的EC50值优选地高于100μg/ml。此类抗体优选地作为制备具有本发明特点的人抗体的中间体使用。
如本文中所用，术语“重组人抗体”旨在包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的全部人抗体，例如从宿主细胞如NS0或CHO细胞或从人免疫球蛋白基因的转基因动物(例如小鼠)分离的抗体，或利用宿主细胞内已转染的重组表达载体表达的抗体。此类重组人抗体具有重排形式的可变区和恒定区。本发明的重组人抗体已经历体内(in vivo)的体细胞高变作用。因此，重组抗体中的VH和VL区的氨基酸序列是这样的序列，它们虽然衍生自人种系VH和VL序列并与之相关，但是可以不在体内的人抗体种系库中天然存在。
如本文中所用，“可变区”(轻链(VL)可变区、重链(VH)可变区)指的是重链和轻链对中直接参与使抗体结合抗原的每一可变区。人可变轻链和重链的结构域具有相同的一般结构并且每个结构域包含序列大部分为保守的四个构架(FR)区，其由三个“高变区”(或互补决定区，CDR)连接。构架区为β片层构象并且CDR可以形成连接β片层结构的环。每条链中的CDR通过构架区稳定它们的三维结构并且与来自另一条链的CDR共同形成抗原结合位点。抗体重链CDR3区和轻链CDR3区在本发明抗体的结合特异性/亲和性中发挥特别重要的作用并且因此作为本发明的另一个目的。
当在本文中使用时，术语“高变区”或“抗体的抗原结合部分”指在抗体中负责结合抗原的氨基酸残基。高变区包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基。“构架”或“FR”区是那些除如本文中所定义的高变区残基以外的可变结构域区域。因此，抗体的轻链和重链从N-末端至C-末端包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。特别地，重链的CDR3是对抗原结合贡献最大的区域。CDR和FR区根据Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，PublicHealth Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)的标准定义来确定和/或是那些来自“高变环”的残基。
如本文中所用，术语“核酸”或“核酸分子”旨在包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以呈单链或呈双链，但是优选地是双链DNA。
当核酸与另一个核酸序列处于功能性联系时，该核酸为“有效地连接”。例如，若前序列或分泌性前导区的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白，则其与这种多肽的DNA有效连接；若启动子或增强子影响某编码序列的转录，则其与该编码序列有效地连接；或者若核糖体结合位点如此安置以至于促进翻译，则其与编码序列有效地连接。通常，“有效地连接”意指所连接的DNA序列是邻接的，而且在分泌性前导区的情形中是邻接的并且处在可读相。然而，增强子没有必要呈邻接。在方便的限制性位点内，通过连接作用完成连接。若此类限制性位点不存在，则根据常规习惯使用合成性寡核苷酸衔接体或接头。
如本文中所用，互换使用词语“细胞”、“细胞系”和“细胞培养”并且这些命名均包含子代。因此，表述“转化体”和“转化的细胞”包括原代的受试细胞以及因此所衍生的培养物而不论转移的次数。还应当理解的是因有意突变或无意突变，全部子代可以在DNA内容上不严格地相同。包括作为从最初所转化细胞中筛选出的具有相同功能或生物学活性的变异子代。在打算明确指示时，从上下文将显而易见。
虽然“恒定结构域”不直接参与抗体结合抗原，但是表现出多种效应子功能。抗体或免疫球蛋白根据它们重链恒定区的氨基酸序列划分为如下类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且可将这些类别中的几个类别进一步划分为亚类(同种型)，如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4、IgA1和IgA2。将对应于不同类别免疫球蛋白的重链恒定区分别称作α、δ、ε、γ和μ。本发明的抗体优选地是IgG型。
抗体的Fc部分直接参与补体活化、C1q结合及Fc受体结合。尽管抗体对补体***的影响依赖某些条件，但是对C1q的结合是由Fc部分中明确的结合位点引起。此类结合位点在本领域内为已知并且例如由Boakle等，Nature 282(1975)742-743、Lukas等，J.Immunol.127(1981)2555-2560、Brunhouse和Cebra，Mol.Immunol.16(1979)907-917、Burton等，Nature 288(1980)338-344、Thommesen等，Mol.Immunol.37(2000)995-1004、Idusogie等，J.Immunol.164(2000)4178-4184、Hezareh等，J.Virology 75(2001)12161-12168、Morgan等，Immunology 86(1995)319-324、EP 0307434描述。此类结合位点例如是L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331和P329(根据Kabat的EU指数编号，见以下)。IgG1、IgG2和IgG3亚类的抗体通常表现出补体活化作用以及结合C1q和C3，而IgG4不活化补体***并且不结合C1q和C3。如本文中所用，术语“人源衍生的Fc部分”指这样的Fc部分，其是人抗体IgG4亚类的Fc部分或者是以如此方式受到修饰以至于不能检测到如下所定义的C1q结合和/或FcR结合的人抗体IgG1、IgG2或IgG3亚类的Fc部分。“抗体的Fc部分”是本领域技术人员众所周知的术语并且基于木瓜蛋白酶对抗体的切割来定义。本发明的抗体含有人源衍生的Fc部分作为Fc部分并且优选地含有人恒定区的所有其他部分。优选地，Fc部分是人Fc部分，并且尤其优选地是来自人IgG4亚类或是来自人IgG1亚类的已突变的Fc部分。最优选的是示于SEQ ID NO：25-28中或不带PVA236突变的SEQ ID NO：25中的Fc部分和重链恒定区。
II.本发明的优选实施方案
本发明包含结合P型选凝素的表征如下的抗体：该抗体的可变重链氨基酸序列CDR3选自重链CDR3序列SEQ ID NO：38、39、40、41或42。
本发明优选地提供结合P型选凝素的包含可变重链和可变轻链的表征如下的抗体：可变重链包含CDR序列CDR1、CDR2和CDR3，并且CDR1选自SEQ ID NO：29、30、31、32，CDR2选自SEQ ID NO：33、34、35、36、37，CDR3选自SEQ ID NO：38、39、40、41、42、其中相互独立地选择所述的CDR。
本发明抗体优选地特征在于：可变轻链包含CDR序列CDR1、CDR2和CDR3，并且CDR1选自SEQ ID NO：43、44，CDR2选自SEQ ID NO：45、46以及CDR3选自SEQ ID NO：47、48、49、50、51、52，其中相互独立地选择所述的CDR。
抗体优选地特征在于：含有作为重链CDR的SEQ ID NO：2的CDR以及作为轻链CDR的SEQ ID NO：1的CDR；作为重链CDR的SEQ IDNO：4的CDR以及作为轻链CDR的SEQ ID NO：3的CDR；作为重链CDR的SEQ ID NO：6的CDR以及作为轻链CDR的SEQ ID NO：5的CDR；作为重链CDR的SEQ ID NO：8的CDR以及作为轻链CDR的SEQ IDNO：7的CDR；作为重链CDR的SEQ ID NO：10的CDR以及作为轻链CDR的SEQ ID NO：9的CDR；作为重链CDR的SEQ ID NO：12的CDR以及作为轻链CDR的SEQ ID NO：11的CDR；作为重链CDR的SEQ IDNO：14的CDR以及作为轻链CDR的SEQ ID NO：13的CDR；作为重链CDR的SEQ ID NO：16的CDR以及作为轻链CDR的SEQ ID NO：15的CDR；作为重链CDR的SEQ ID NO：18的CDR以及作为轻链CDR的SEQ ID NO：17的CDR；作为重链CDR的SEQ ID NO：20的CDR以及作为轻链CDR的SEQ ID NO：19的CDR；作为重链CDR的SEQ ID NO：22的CDR以及作为轻链CDR的SEQ ID NO：21的CDR。
CDR序列可根据Kabat等《Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest》第五版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)的标准定义来确定。每条链中的CDR通过构架氨基酸分隔。SEQ ID NO：1-22的CDR示于SEQ ID NO：29-52。
本发明抗体优选地特征在于：该抗体结合P型选凝素并且包含独立选自如下的可变重链区和可变轻链区：
a)由氨基酸序列SEQ ID NO：2定义的重链可变结构域和由SEQ IDNO：1定义的轻链可变结构域；
b)由氨基酸序列SEQ ID NO：4定义的重链可变结构域和由SEQ IDNO：3定义的轻链可变结构域；
c)由氨基酸序列SEQ ID NO：6定义的重链可变结构域和由SEQ IDNO：5定义的轻链可变结构域；
d)由氨基酸序列SEQ ID NO：8定义的重链可变结构域和由SEQ IDNO：7定义的轻链可变结构域；
e)由氨基酸序列SEQ ID NO：10定义的重链可变结构域和由SEQ IDNO：9定义的轻链可变结构域；
f)由氨基酸序列SEQ ID NO：12定义的重链可变结构域和由SEQ IDNO：11定义的轻链可变结构域；
g)由氨基酸序列SEQ ID NO：14定义的重链可变结构域和由SEQ IDNO：13定义的轻链可变结构域；
h)由氨基酸序列SEQ ID NO：16定义的重链可变结构域和由氨基酸序列SEQ ID NO：15定义的轻链可变结构域；
i)由氨基酸序列SEQ ID NO：18定义的重链可变结构域和由SEQ IDNO：17定义的轻链可变结构域；
j)由氨基酸序列SEQ ID NO：20定义的重链可变结构域和由SEQ IDNO：19定义的轻链可变结构域；
k)由氨基酸序列SEQ ID NO：22定义的重链可变结构域和由SEQ IDNO：21定义的轻链可变结构域。
本发明抗体优选地特征在于：重链可变区包含独立选自SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20和22的氨基酸序列。
本发明抗体优选地特征在于：轻链可变区包含独立选自SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19和21的氨基酸序列。
本发明涉及结合P型选凝素并且不结合补体因子C1q和/或Fc受体的抗体。这些抗体不引起依赖补体的细胞毒性(CDC)和/或抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)。优选地，抗体特征在于：它结合P型选凝素、含有人源衍生的Fc部分并且不结合补体因子C1q。更优选地，抗体是人抗体或人源化抗体。
本发明抗体优选地特征在于：恒定链为人类来源。此类恒定链在本领域内是众所周知的并且例如由Kabat描述(参见例如Johnson，G.以及Wu，T.T.，Nucleic Acid Res.28(2000)214-218)。例如，有用的人重链恒定区包含独立选自SEQ ID NO：24、25、26、27和28的氨基酸序列。例如，有用的人轻链恒定区包含κ-轻链恒定区SEQ ID NO：23的氨基酸序列。
抗体Fc区中的Fc部分所介导的效应子功能指的是在抗体结合抗原后起作用的效应子功能(这些功能涉及活化补体级联***和/或通过Fc受体(FcR)活化细胞)。
可通过CH50鉴定法评估补体级联***的功能。向试验血清中添加用抗红细胞抗体(EA)致敏的绵羊红细胞以便活化可引起溶血的经典途径。裂解50％红细胞所需的血清体积决定CH50单位。AP-CH50测量旁路途径和终末途径。此方法除使用兔红细胞以外与CH50鉴定法相似。在添加试验血清后即活化旁路途径。
C1q和两种丝氨酸蛋白酶C1r及C1s形成依赖补体的细胞毒性(CDC)途径中的第一种成分即C1复合体。为了活化补体级联***，C1q结合于已结合靶抗原的至少两个分子的IgG1或一个分子的IgM(Ward和Ghetie，Therapeutic Immunology 2：77-94(1995))。Burton描述了(Molec.Immunol.，22(3)：161-206(1985))包含第318至337位氨基酸残基的重链区参与补体固定。Duncan和Winter(Nature 332：738-40(1988))使用定点诱变，报道Glu318、Lys320和Lys322形成C1q的结合位点。通过含有Glu318、Lys320和Lys 322残基的合成短肽抑制补体介导性裂解的能力证实这些残基在结合C1q中的作用。
术语“依赖补体的细胞毒性(CDC)”指本发明抗体在补体存在时裂解表达P型选凝素的人内皮细胞和血小板。CDC优选地通过在补体存在时用本发明的抗体处理表达P型选凝素的人内皮细胞和血小板来测量。这些细胞优选地用钙荧光素标记。若抗体在30μg/ml浓度时诱导20％或更多靶细胞的裂解则出现CDC。然而本发明人发现对于本发明抗体的特点而言，在ELISA鉴定法中对补体因子C1q减少的结合是必需的。在该鉴定法中，ELISA板原则上用浓度范围的抗体包被，随后向平板添加纯化的人C1q或人血清。通过抗C1q的抗体和随后通过过氧化物酶标记的缀合物检测C1q结合。将检测结合(最大结合：Bmax)测量为过氧化物酶底物ABTS(2，2′-连氮基-双-[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(6)]在405nm(OD405)处的光密度。因此，本发明涉及表征如下的抗体：抗体对补体因子C1q的不结合指的是这种ELISA鉴定法测定，其中C1q对抗体浓度为10μg/ml时的抗体的最大结合(Bmax)小于等于对hu-Mab<P型选凝素>LC 1004-002(DSMACC2641)细胞系的LC 1004-002抗体的Bmax的30％，优选地小于等于20％或更低。
更优选地，本发明的抗体在ELISA鉴定法中显示出对补体因子C3减弱的结合。此鉴定法按照如C1q鉴定法相同的方式进行。在该鉴定法中，ELISA板原则上以浓度范围的抗体包被，随后向平板添加纯化的人C3或人血清。通过抗C3的抗体，随后通过过氧化物酶标记的缀合物检测C3的结合。将检测结合(最大结合：Bmax)测量为过氧化物酶底物ABTS(2，2′-连氮基-双-[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(6)]在405nm(OD405)处的光密度。因此，本发明涉及表征如下的抗体：抗体对补体因子C3的不结合指的是这种ELISA鉴定法测定，其中C3对抗体浓度为10μg/ml时的抗体的最大结合(Bmax)是对hu-Mab<P型选凝素>LC 1004-002(DSM ACC2641)细胞系的LC 1004-002抗体的Bmax的10％，优选地是5％或更低。
术语“抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)”是由Fc受体结合介导的功能，并且指的是在效应细胞存在时裂解表达P型选凝素的靶细胞。ADCC优选地通过在效应细胞存在时，如新鲜分离的PBMC(外周血单核细胞)或从暗黄覆盖层(buffy coats)纯化的效应细胞如单核细胞或NK(天然杀伤)细胞，用本发明抗体处理表达P型选凝素的内皮细胞的制备物来测量。靶细胞用51Cr标记，随后与抗体温育。将标记的细胞与效应细胞温育并且分析上清液中所释放的51Cr。对照包括将靶标内皮细胞与效应细胞温育但不与抗体温育。通过测量抗体对表达Fcγ受体的细胞如粒细胞(表达FcγRII和FcγRIII)、NK细胞(表达FcγRIII)和单核细胞(表达FcγRI和FcγRII)的结合测定抗体诱导介导ADCC的初始步骤的能力。
可通过抗体Fc区域与造血细胞上的特化细胞表面受体Fc受体(FcR)的相互作用来介导Fc受体结合的效应子功能。Fc受体属于免疫球蛋白超家族并已证实Fc受体既介导通过吞噬免疫复合物清除包被抗体的病原体，也介导通过依赖抗体的细胞毒性(ADCC)裂解包被有相应抗体的红细胞和多种其它细胞性靶标(例如肿瘤细胞)(Van de Winkel和Anderson，J.Leuk.Biol.49：511-24(1991))。FcR通过它们对免疫球蛋白同种型的特异性来定义；对IgG抗体的Fc受体称作FcγR，对IgE抗体的Fc受体称作FcεR，对IgA抗体的Fc受体称作FcαR等。Fc受体的结合在例如Ravetch和Kinet，Ann.Rev.Immunol.9(1991)457-492、Capel等，Immunomethods4(1994)32-34、de Haas等，J.Lab.Clin.Med.126(1995)330-341以及Gessner等，Ann.Hematol.76(1998)231-248中描述。本发明抗体优选地显示出对Fcγ受体、优选地对FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB和/或FcγRIIIA的减弱结合。
本发明的抗体优选地不引起任何效应子功能并且不结合存在于NK细胞上的FcγR。因此，术语“不结合FcγR”意指在抗体浓度为10μg/ml时，本发明抗体对NK细胞的结合是已发现的对hu-Mab<P型选凝素>LC1004-002(DSM ACC2641)细胞系的LC 1004-002抗体结合的1％或更低。
虽然IgG4显示出减弱的FcR结合，但其它IgG亚类的抗体显示出强结合。然而，Pro238、Asp265、Asp270、Asn297(丢失Fc糖)、Pro329和234、235、236和237、Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434以及His435是在改变后也引起减弱的FcR结合的残基(Shields等，J.Biol.Chem.276(2001)，6591-6604、Lund等，FASEB J.9(1995)，115-119、Morgan等，Immunology 86(1995)319-324、EP 0307434)。本发明的抗体优选地涉及在S228、L234、L235和/或D265具有突变、和/或含有PVA236或GLPSS331突变的IgG4亚类的FcR结合或者IgG1或IgG2亚类的FcR结合。突变S228P(IgG4)、L234A(IgG1)、L235A(IgG1)、L235E(IgG4)、GLPSS331(IgG1)和/或PVA236(IgG1)为特别地优选。优选的突变组合还示于表1中。一个额外优选的组合是D265A/N297A。
如本文中所用，术语“结合P型选凝素”意指在BIAcore鉴定法(Pharmacia Biosensor AB，Uppsala，瑞典)或在ELISA中抗体对P型选凝素的结合，其中纯化的P型选凝素或者P型选凝素CHO转化子包被于微量滴定板上。
在BIAcore鉴定法中，抗体结合于表面上并且通过表面胞质共振(SPR)测定P型选凝素的结合。结合的亲和性由术语ka(来自抗体/抗原复合物中的抗体的结合速率常数)、kd(解离常数)以及KD(kd/ka)来定义。本发明的抗体显示10-8M或更低、优选地是大约10-11-10-9M的KD(参见实施例)。因此，本发明涉及如上述的抗体，其中抗体在BIAcore鉴定法中以小于10-8M的KD值结合P型选凝素，优选地其中KD范围在10-11-10-9M。
优选地，抗体是IgG1或IgG4人亚型。
更优选地，抗体特征在于：抗体是在L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331和/或P329中含有至少一个突变的人抗体IgG1亚类或在L235和S228中含有至少一个突变的人抗体IgG4亚类(根据EU指数编号)。
在P型选凝素特异性ELISA中，在微量滴定板内包被纯化的P型选凝素并且以生物素化的抗人IgG和ELISA的常规步骤测定抗体对P型选凝素的结合。此鉴定法中的EC50值范围在P型选凝素CHO细胞上优选地在0.002-0.03μg/ml之间，即本发明涉及这样的抗体，其中对于P型选凝素结合的EC50值范围在ELISA鉴定法中在存在P型选凝素的CHO细胞上是0.002-0.03μg/ml。在其中表达P型选凝素的CHO转化子包被于在微量滴定板内的鉴定法中，EC50值范围在0.01-0.08μg/ml间，优选地在0.01-0.04μg/ml间。
在E型选凝素转化子和L型选凝素转化子上的EC50值优选地高于100μg/ml。本发明的抗体特征在于：如在其中P型选凝素以及E型选凝素和/或L型选凝素包被于微量滴定板内的ELISA鉴定法中所测定的EC50值，抗体结合P型选凝素的特异性比结合E型选凝素和/或L型选凝素的特异性高至少1000倍。
如本文中所用，术语“抑制P型选凝素配体对P型选凝素的结合”指纯化的或由细胞表达的P型选凝素对其在HL60细胞表面的配体的结合。P型选凝素对其配体的结合被本发明的抗体抑制。该抑制可在分析抗体抑制P型选凝素对配体结合的能力的体外鉴定法中测量为IC50。在实施例中描述了此类鉴定法。将这类鉴定法中使用亲和纯化的P型选凝素和活化血小板作为P型选凝素的合适来源，并将白细胞样细胞如HL60细胞用作配体的合适来源。在此类鉴定法中，不用升高浓度的抗体或使用升高浓度的抗体测量了表达为P型选凝素生理相关性配体的PSGL-1的HL60细胞对P型选凝素或活化血小板的粘着。将IC50值测量为至少三次独立测量值的平均值。抑制意指不超过1μg/ml、优选地是0.5-0.08μg/ml的IC50值。
本发明抗体在0.08-0.5μg/ml、优选地在0.08-0.11μg/ml的IC50值范围内抑制白细胞样HL60细胞对纯化的P型选凝素的粘着。在0.05-0.3μg/ml的IC50值范围内抑制白细胞样HL60细胞对活化的血小板的粘着。
因此，本发明的另一个实施方案涉及表征如下的抗体：结合P型选凝素的EC50值在表达P型选凝素的CHO转化子包被于微量滴定板内的ELISA鉴定法中是在0.01-0.08μg/ml范围内。优选的范围是0.01-0.04μg/ml。在E型选凝素转化子和L型选凝素转化子上的EC50值高于100μg/ml。在另一个实施方案中，本发明的抗体以0.08-0.5μg/ml间的IC50值抑制白细胞样HL60细胞对纯化的P型选凝素的粘着。优选的范围是0.08-0.11μg/ml。
本发明的抗体在完全人流式***(以10μg/ml的浓度)中抑制白细胞与血小板单层的相互作用优选地大于70％。此外，这些抗体在浓度为3μg/ml时在人流式***中以60-90％的范围抑制白细胞对活化的内皮细胞的粘着(对不同白细胞亚型具有不同影响)。
本发明的抗体优选地能够在P型选凝素氨基酸片段aa60-75(Swiss-Prot序列P16109)存在时结合P型选凝素和/或非竞争性地抑制由命名为ATCC登录号HB11041细胞系分泌的抗体对P型选凝素的结合。
本发明抗体优选地在ELISA鉴定法方式中不抑制P型选凝素与血小板膜糖蛋白GPIbα的相互作用。在ELISA糖萼蛋白中，在微量滴定板的孔内如(Romo等，J Exp Med 190：803(1999)所述固定GPIbα的可溶性细胞外部分，并且在用P型选凝素HuMab预温育后，用抗P型选凝素多克隆抗体检测纯化的P型选凝素的结合。
在本发明另一个优选的实施方案中，抗体的特征在于不结合C3蛋白质，更优选地特征在于：它不引起依赖补体的细胞毒性(CDC)。此外，抗体可以表征为它不结合NK效应细胞表面的Fcγ受体。优选地，抗体的特征在于：它是在L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331和/或P329中含有至少一个突变的人抗体IgG1亚类或者是在L235和S228中含有至少一个突变的人抗体IgG4亚类(根据EU指数编号)。在另一个优选的实施方案中，抗体的特征在于：它不引起抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)。
在一个更优选的实施方案中，本发明的抗体特征在于：它们结合P型选凝素并且它们包含独立选自如下的可变区：
a)由氨基酸序列SEQ ID NO：1定义的轻链可变结构域和由SEQ IDNO：2定义的重链可变结构域；
b)由氨基酸序列SEQ ID NO：3定义的轻链可变结构域和由SEQ IDNO：4定义的重链可变结构域；
c)由氨基酸序列SEQ ID NO：5定义的轻链可变结构域和由SEQ IDNO：6定义的重链可变结构域；
d)由氨基酸序列SEQ ID NO：7定义的轻链可变结构域和由SEQ IDNO：8定义的重链可变结构域；
e)由氨基酸序列SEQ ID NO：9定义的轻链可变结构域和由SEQ IDNO：10定义的重链可变结构域；
f)由氨基酸序列SEQ ID NO：11定义的轻链可变结构域和由SEQ IDNO：12定义的重链可变结构域；
g)由氨基酸序列SEQ ID NO：13定义的轻链可变结构域和由SEQ IDNO：14定义的重链可变结构域；
h)由氨基酸序列SEQ ID NO：15定义的轻链可变结构域和由SEQ IDNO：16定义的重链可变结构域；
i)由氨基酸序列SEQ ID NO：17定义的轻链可变结构域和由SEQ IDNO：18定义的重链可变结构域；
j)由氨基酸序列SEQ ID NO：19定义的轻链可变结构域和由SEQ IDNO：20定义的重链可变结构域；和
k)由氨基酸序列SEQ ID NO：21定义的轻链可变结构域和由SEQ IDNO：22定义的重链可变结构域。
优选地，抗体包含由氨基酸序列SEQ ID NO：3定义的轻链可变结构域和由SEQ ID NO：4定义的重链可变结构域。
优选的抗体特征在于：抗体是人IgG4亚类或包含至少一种导致不结合补体因子C1q的氨基酸突变。这些变体抗体包含例如独立选自SEQ IDNO：25或SEQ ID NO：26以及SEQ ID NO：28的氨基酸序列。
在本文中，抗P型选凝素“变体”抗体指这样的分子，其因在抗P型选凝素“亲本”抗体氨基酸序列内添加、缺失和/或替换一个或多个氨基酸残基而在氨基酸序列上与亲本抗体序列不同。在一个优选的实施方案中，变体在亲本抗体的一个或多个恒定区或可变区、优选地在恒定区内包含一个或多个氨基酸替换。例如，变体可以在亲本抗体的一个或多个可变区内包含至少1个，例如大约1个至大约10个，并且优选地大约2个至大约5个替换。通常，变体具有与亲本抗体的恒定结构域序列和/或可变结构域序列至少90％、更优选至少95％并且最优选至少99％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
在本文中，将对这种序列的同一性或同源性定义为在比对和根据需要导入缺口以获得最大序列同一性百分数后，候选序列中与亲本抗体残基相同的氨基酸残基的百分数。抗体序列的N末端、C末端或内部延伸、缺失或***均不构成影响序列同一性或同源性。变体保留了结合人P型选凝素的能力并且优选地具有优于亲本抗体特性的特性。例如，变体可具有较强的结合亲和性、增强的治疗重度肢体局部缺血或周围动脉硬化闭塞症(CLI/PAOD)相关性疾病的能力。
本文中特别感兴趣的变体抗体是当与亲本抗体相比时，因消除对Fcγ受体的结合而在粘着鉴定法中在抑制活性上表现出至少大约4倍增强的变体抗体。
在本文中，“亲本”抗体是由制备变体的氨基酸序列编码的抗体。优选地，亲本抗体具有人构架区并且根据需要具有人抗体恒定区。例如，亲本抗体可以是人源化抗体或人抗体。
此外，本发明的抗体包括了具有不影响或不改变以上提及的本发明抗体特征的“保守序列修饰”、核苷酸序列修饰和氨基酸序列修饰的抗体。可以通过本领域内已知的标准技术如定点诱变和PCR-介导性诱变导入修饰。保守氨基酸替换包括其中用具有相似侧链的另一种氨基酸残基替换某氨基酸残基的保守氨基酸替换。在本领域中已经定义了具有相似氨基酸侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、具有β分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，可以优选地用来自相同侧链家族的另一种氨基酸残基替代在人抗P型选凝素抗体中被预测为非必需的氨基酸残基。
可基于如由Riechmann，L.等，Nature 332(1988)323-327和Queen，C.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)10029-10033描述的分子模建，通过诱变实施氨基酸替换。
在另一个优选的实施方案中，抗体包含如由SEQ ID NO：23定义的κ-轻链恒定区。
本发明优选的抗体是定义为IgG1v1(PVA-236；GLPSS331，由E233P；L234V；L235A；ΔG236；A327G；A330S；P331S具体描述)、IgG1v2(L234A；L235A)和IgG4v1(S228P；L235E)的抗体。
在另一个优选的实施方案中，这些抗体还包含选自Fab、F(ab’)2和单链片段的抗体片段。
本发明还包括用于产生本发明抗体的方法，包括步骤a)用编码本发明亲本人抗体轻链的第一核酸序列和编码该亲本人抗体重链的第二DNA序列转化宿主细胞，其中Fc部分已进行修饰以至该Fc部分不结合补体因子C1q和/或Fc受体；b)表达所述第一DNA序列和第二DNA序列以便产生抗体的重链和轻链和c)从宿主细胞或宿主细胞培养物获得抗体。
本发明还涉及表征如下的中间抗体即抗P型选凝素抗体：这些抗体是人抗体或人源化抗体并且如在其中P型选凝素和E型选凝素和/或L型选凝素包被于微量滴定板内的ELISA鉴定法中所测定，这些抗体结合P型选凝素的特异性比结合E型选凝素或L型选凝素的特异性高至少1000倍。优选地，这些抗体是IgG1或IgG4抗体。这些抗体还可以包含如由SEQ IDNO：24γ1重链恒定区或SEQ ID NO：27γ4重链恒定区定义的氨基酸序列。特别地，这些抗体指由选自细胞系hu-Mab<P型选凝素>LC 1004-001(DSM ACC2640)、hu-Mab<P型选凝素>LC 1004-002(DSM ACC2641)和hu-Mab<P型选凝素>LC 1004-017(DSM ACC2642)产生的抗体。
此外，本发明的抗体包括了具有不影响或不改变以上提及的本发明抗体特征的“保守性序列修饰”、核苷酸序列修饰和氨基酸序列修饰的一类抗体。可以通过本领域内所知的标准技术如定点诱变和PCR-介导性诱变导入修饰。保守性氨基酸替换包括其中用具有相似侧链的另一种氨基酸残基替换某氨基酸残基保守性氨基酸替换。在本领域中已经定义了具有相似氨基酸侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、具有β分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，可以优选地用来自相同侧链家族的另一种氨基酸残基替代在人抗P型选凝素抗体中被预测为非必需的氨基酸残基。
可基于如由Riechmann，L.等，Nature 332(1988)323-327和Queen，C.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)10029-10033描述的分子模建，通过诱变实施氨基酸替换。
本发明还包括编码如上提及的抗体的核酸分子、包含这些核酸的相应载体和这些载体的相应宿主细胞。本发明包括用于制备抗体的方法，其包括在允许合成所述抗体分子的条件下培养相应的宿主细胞以及从该培养物中获得此抗体，例如通过在原核宿主细胞或真核宿主细胞中表达编码重链的核酸以及编码轻链的核酸并从所述的细胞中回收此多肽。
也考虑了抗体的诊断用途和治疗用途。在一个诊断应用中，本发明提供用于确定P型选凝素蛋白质存在的方法，其包括将怀疑含有P型选凝素的样品与抗P型选凝素抗体接触并测定抗体对样品的结合。为此用途，本发明提供包含该抗体和使用抗体检测P型选凝素蛋白质的说明书的试剂盒。
本发明的抗体用于治疗炎性疾病和血栓性疾病。此类疾病包括血管疾病如动脉粥样硬化、动脉和深部静脉血栓形成、血管成形术或支架放置后再狭窄。优选的应用是周围动脉硬化闭塞症(PAOD)和重度肢体局部缺血(CLI)。另一些应用是治疗因心急梗死引起的缺血后白细胞介导性组织损伤、脑缺血事件(例如中风)、肾梗死等。此类抗体还适用于治疗败血症、急性白细胞介导性肺损伤和过敏反应如哮喘。其他应用是预防器官移植排斥和包括类风湿性关节炎在内的自身免疫性疾病。此外，可以通过抑制循环癌细胞的粘着预防肿瘤转移。
本发明还提供用于治疗患有以上提及的炎性疾病和血栓性疾病、特别是PAOD和CLI(周围动脉硬化闭塞症或重度肢体局部缺血)的哺乳动物的方法。
本发明还提供以上抗体用于治疗的用途，例如用于制造治疗这类疾病的药物的用途。
本发明还涉及如上定义的抗体用于制备药物组合物的用途，并且包括含有药用有效量的本发明抗体，任选地含有对于因药用目的而配制抗体有用的缓冲剂和/或辅助剂的药物组合物。
本发明还提供了包含于可药用载体中的此类抗体的药物组合物。在一个实施方案中，可以在制品或试剂盒内包含药物组合物。
本发明还提供可产生本发明的此类拮抗性单克隆抗体例如亲本抗体的杂交瘤细胞系。
在国际认可用于专利程序目的的微生物保藏布达佩斯条约下，将本发明优选的杂交瘤细胞系：hu-Mab<P型选凝素>LC 1004-001(HuMab001抗体)、hu-Mab<P型选凝素>LC 1004-002(HuMab002抗体)和hu-Mab<P型选凝素>LC 1004-017(HuMab017抗体)保藏在德国的德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und ZellkulturenGmbH；DSMZ)：
  细胞系   保藏编号   保藏日期
  hu-Mab<P型选凝素>LC 1004-001   DSM ACC2640   2004年3月30日
  hu-Mab<P型选凝素>LC 1004-002   DSM ACC2641   2004年3月30日
  hu-Mab<P型选凝素>LC 1004-017   DSM ACC2642   2004年3月30日
可从所述的细胞系得到的抗体是本发明优选的实施方案。
优选地通过重组方法产生本发明的抗体。此类方法在本领域内是众所周知的并且包括在原核细胞和真核细胞中表达蛋白质，随后分离抗体多肽并且通常纯化至可药用的纯度。为了表达蛋白质，通过标准方法将编码重链和轻链的核酸或其片段插至表达载体内。在适宜的原核宿主细胞或真核宿主细胞如CHO细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、HEK293细胞、COS细胞、酵母或大肠杆菌(E.coli)细胞内进行表达，并且从细胞(上清液或裂解后的细胞)回收抗体。
抗体的重组性生产在本领域内是众所周知的并且在例如Makrides，S.C.，Protein Expr.Purif.17(1999)183-202；Geisse，S.等，Protein Expr.Purif.8(1996)271-282；Kaufman，R.J.，Mol.Biotechnol.16(2000)151-161；Werner，R.G.，Drug Res.48(1998)870-880的综述中进行描述。
抗体可以在完整细胞、细胞裂解物中以部分纯化或基本纯化的形式存在。为了消除其它细胞性成分或污染物，如其它的细胞核酸或蛋白质，通过包括本领域内众所周知的碱处理/SDS处理、柱层析和其它等在内的标准技术纯化。参见Ausubel，F.等编辑《Current Protocols in MolecularBiology》，Greene Publishing and Wiley Interscience，New York(1987)。
在NS0细胞中的表达由例如Barnes，L.M.等，Cytotechnology 32(2000)109-123；和Barnes，L.M.等，Biotech.Bioeng.73(2001)261-270描述。瞬时表达由例如Durocher，Y.等，Nucl.Acids.Res.30(2002)E9描述。可变结构域的克隆由Orlandi，R.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)3833-3837；Carter，P.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992)4285-4289和Norderhaug，L.等，J.Immunol.Methods 204(1997)77-87描述。优选的瞬时表达***(HEK 293)由Schlaeger，E.-J.和Christensen，K.在Cytotechnology 30(1999)71-83中和由Schlaeger，E.-J.在J.Immunol.Methods 194(1996)191-199中描述。
适用于原核生物的控制序列包括例如启动子，任选地包括操纵子序列，以及核糖体结合位点。已知真核细胞使用启动子、增强子和聚腺苷酸化作用信号。
当核酸与另一个核酸序列处于功能性联系时，该核酸为“有效地连接”。例如，若前序列或分泌性前导区的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白，则其与这种多肽的DNA有效连接；若启动子或增强子影响某编码序列的转录，则其与此编码序列有效地连接；或者若核糖体结合位点如此安置以至于促进翻译，则其与编码序列有效地连接。通常，“有效地连接”意指所连接的DNA序列是邻接的，而且在分泌性前导区的情形中是邻接的并且处于可读框内。然而，增强子没有必要呈邻接。在方便的限制性位点内，通过连接作用完成连接。若此类限制性位点不存在，则根据常规习惯使用合成性寡核苷酸衔接体或接头。
通过常规的免疫球蛋白纯化方法例如蛋白质A-Sepharose、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析从培养基中合适地分离单克隆抗体。使用常规方法易于分离编码单克隆抗体的DNA和RNA并对其测序。杂交瘤细胞可作为此类DNA和RNA的来源。可将分离后的DNA插至表达载体内，随后将该表达载体转染至本不产生免疫球蛋白的宿主细胞如HEK293细胞、CHO细胞或骨髓瘤细胞内，以便在宿主细胞内合成重组单克隆抗体。
通过向抗体DNA中导入适宜的核苷酸变化或者通过核苷酸的合成制备人P型选凝素抗体的氨基酸序列变体(或突变体)。然而例如如上所述，仅在极其有限范围内进行此类修饰。例如，修饰不改变以上提及的抗体特性如IgG同种型和表位结合，但可以提高重组生产的产率、蛋白质稳定性或促进纯化。
也可以替换任何不参与维持抗P型选凝素抗体正确构象的半胱氨酸残基，以便提高分子的氧化稳定性和阻止异常交联，通常使用丝氨酸进行替换。反之，可以向抗体中引入半胱氨酸键，以便提高抗体的稳定性(特别是当抗体是抗体片段例如Fv片段时)。
抗体的另一类型氨基酸变体改变了抗体的原始糖基化模式。改变意味删除一个或多个在抗体中存在的糖部分和/或添加一个或多个在抗体中不存在的糖基化位点。抗体的糖基化一般是N型连接。N型连接指糖部分连接于天冬酰胺残基的侧链。天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸三肽序列是糖部分与天冬酰胺侧链发生酶连接的识别序列，其中X是除脯氨酸以外的任一氨基酸。因此，在多肽中出现这类三肽中的任何一个将产生潜在的糖基化位点。向抗体中添加糖基化位点可通过改变氨基酸序列以使其含有一个或多个上述的三肽序列(对于N型连接的糖基化位点)而方便地实现。
通过本领域内所知的多种方法制备了编码抗P型选凝素抗体氨基酸序列变体的核酸分子。这些方法包括，但不限于(在天然存在的氨基酸序列变体情况下)从天然来源分离或通过对较早制备的人源化抗P型选凝素抗体的变异或非变异形式进行寡核苷酸介导的(或位点定向的)诱变、PCR诱变以及盒式诱变。
本发明还涉及免疫连接物，其包含缀合的本发明抗体，其中抗体缀合至细胞毒性剂如化疗剂、毒素(例如细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段)、放射性同位素(即放射缀合物)或用于预防或治疗炎性疾病和血栓性疾病、特别是PAOD和CLI的炎性疾病和血栓性疾病的药剂的前体药物。使用双功能蛋白质偶联剂如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫醇)丙酸酯(SPDP)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酯的双功能衍生物(如二甲基己二酰亚胺酯HCL)、活性酯(如二琥珀酰亚氨基辛二酸酯)、醛(如戊二醛)、双-叠氮复合物(如双-(对叠氮苯甲酰基)己二胺)、双-重氮衍生物(如双-(对重氮苯甲酰基)-亚乙基二胺)、二异氰酸酯(如甲苯2，6-二异氰酸酯)和双-活性氟化合物(如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)制备抗体和细胞毒性剂的缀合物。例如，可如Vitetta，E.S.等，Science 238(1987)1098-1104)所描述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酰苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于使放射性核苷酸缀合至抗体的示例性螯合剂。参见WO 94/11026。
共价修饰的另一个类型涉及以化学方式或酶方式向抗体偶联糖苷。这些方法的有利之处在于它们不需要在具有N连接或O连接糖基化作用能力的宿主细胞内产生抗体。根据所用的偶联模式，可以将糖连接于(a)精氨酸和组氨酸、(b)游离羧基、(c)游离巯基如半胱氨酸的巯基、(d)游离羟基如丝氨酸、苏氨酸或羟脯氨酸中的游离羟基、(e)芳香族残基，如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸中的芳香族残基或(f)谷氨酰胺中的酰胺基。这些方法在WO 87/05330以及Aplin，J.D.和Wriston，J.C.Jr.，CRC Crit.Rev.Biochem.(1981)259-306中描述。
可以通过化学方式或酶方式除去存在于抗体中的任何糖部分。化学性去糖基化需要使抗体暴露于化合物三氟甲磺酸或等同化合物。这种处理引起除连接糖(N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺)以外的大部分糖或全部糖的切除，同时保留完整的抗体。化学性去糖基化由Sojahr，H.T.，and Bahl，O.P.，Arch.Biochem.Biophys.259(1987)52-57和Edge，A.S.，等Anal.Biochem.118(1981)131-137描述。可以如Thotakura，N.R.和Bahl，O.P.，Meth.Enzymol.138(1987)350-359所述，通过使用多种的外切糖苷酶和内切糖苷酶完成抗体中糖部分的酶切除。
抗体共价修饰的另一个类型包括以如美国专利号4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337中所述的方式使抗体连接于多种非蛋白聚合物中的一种，如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯。
在另一个方面，本发明提供了来自非人转基因动物例如转基因小鼠的经分离B-细胞，其表达本发明的人抗P型选凝素抗体(例如由选自hu-Mab<P型选凝素>LC 1004-001(DSM ACC2640)、hu-Mab<P型选凝素>LC 1004-002(DSM ACC2641)和hu-Mab<P型选凝素>LC 1004-017(DSMACC2642)的细胞系产生的亲本抗体)。KM小鼠是合适的转染色体小鼠。KM小鼠含有人重链转染色体和人κ轻链转基因。在KM小鼠中，内源的小鼠重链基因和轻链基因也被破坏，以至对小鼠的免疫引起产生人免疫球蛋白而不是小鼠免疫球蛋白。在WO 02/43478中详述了KM小鼠的构建和它们用于产生人免疫球蛋白的用途。
优选地，分离的B细胞从用纯化或重组形式的P型选凝素抗原和/或表达P型选凝素的细胞免疫的转基因非人类动物例如转基因小鼠得到。优选地，转基因的非人类动物例如转基因小鼠具有在其中包含编码本发明的完整或部分抗体的人重链转基因和人轻链转基因的基因组。随后，将分离的B-细胞永生化以作为人抗P型选凝素抗体的来源(例如杂交瘤)。因此，本发明还提供能够产生本发明的人单克隆抗体的杂交瘤。在一个实施方案中，杂交瘤包括从转基因非人类动物例如转基因小鼠得到的并且已与永生化细胞融合的B细胞，其中所述转基因非人类动物具有在其中包含编码本发明的完整或部分抗体的人重链转基因和人轻链转基因的基因组。
在一个具体的实施方案中，转基因非人类动物是具有在其中包含编码本发明完整或部分抗体的人重链转基因和人轻链转基因的基因组的转基因小鼠。转基因非人类动物可用已纯化或富集的P型选凝素抗原制品和/或表达P型选凝素的细胞来免疫。优选地，转基因非人类动物例如转基因小鼠能够产生抗P型选凝素的人单克隆抗体的P型选凝素同种型。
通过用已纯化或富集的P型选凝素抗原制品和/或表达P型选凝素的细胞免疫转基因非人类动物例如转基因小鼠可产生本发明的人单克隆抗体，其中所述转基因非人类动物具有在其中包含编码本发明的完整或部分抗体的人重链转基因和人轻链转基因的基因组。随后得到动物的B细胞(例如脾B细胞)并且使之与骨髓瘤细胞融合以便形成分泌抗P型选凝素的人单克隆抗体的永生杂交瘤细胞。
在一个优选的实施方案中，抗P型选凝素的人单克隆抗体可使用携带部分人免疫***而非小鼠***的转基因小鼠生成。这些文中称作“HuMab”小鼠的转基因小鼠含有编码未重排的包含重链(μ和γ)和κ轻链(恒定区基因)的人免疫球蛋白基因的微基因座，并含有使内源性μ链和κ链基因座失活的靶向性突变(Lonberg，N.等，Nature 368(1994)856-859)。因此，该小鼠表现出降低的小鼠IgM或IgK表达并且在免疫后，所导入的人重链转基因和人轻链转基因发生类型转换和体细胞突变以便产生高亲和性的人IgG单克隆抗体(Lonberg，N.等，Nature 368(1994)856-859；综述见于Lonberg，N.，Handbook of Experimental Pharmacology 113(1994)49-101；Lonberg，N.和Huszar，D.，Intern.Rev.Immunol.25(1995)65-93以及Harding，F.和Lonberg，N.，Ann.N.Acad.Sci 764(1995)536-546)。在Taylor，L.等，Neucleic Acids Research 20(1992)6287-6295；Chen，J.等，InternationalImmunology 5(1993)647-656；Tuaillon，N.等，Proc.Natl.Acad.Sci USA 90(1993)3720-3724；Choi，T.K.等，Nature Genetics 4(1993)117-123；Chen，J.等，EMBO J.12(1993)821-830；Tuaillon，N.等，Immunol.152(1994)2912-2920；Lonberg，N.等，Nature 368(1994)856-859；Lonberg，N.，Handbook of Experimental Pharmacology 113(1994)49-101；Taylor，L.等，Int.Immunol.6(1994)579-591；Lonberg，N.和Huszar，D.，Intern.Rev.Immunol.25(1995)65-93；Harding，F.和Lonberg，N.，Ann.N.Acad.Sci764(1995)536-546；Fishwild，D.M.等，Nat.Biotechnol.14(1996)845-851中描述了HuMab小鼠的产生，所有文章此处完整引用作为参考。更详细参见美国专利号5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,789,650；5,877,397；5,661,016；5,814,318；5,874,299；5,545,807；5,770,429；WO 98/24884；WO 94/25585；WO 93/1227；WO 92/22645和WO 92/03918。
为了产生完全的抗P型选凝素人单克隆抗体，可以如Lonberg，N.等，Nature 368(1994)856-859；Fishwild，D.M.等，Nat.Biotechnol.14(1996)845-851和WO 98/24884所述，根据常用方法，用已纯化或富集的P型选凝素抗原制品和/或表达P型选凝素的细胞免疫HuMab小鼠。优选地，小鼠在首次免疫时为6-16周龄。例如，可用已纯化或富集(例如从表达P型选凝素的细胞中纯化)的可溶性P型选凝素抗原制品在腹膜内免疫HuMab小鼠。在用已纯化或富集的P型选凝素抗原制品免疫不产生抗体时，还可以使用表达P型选凝素的细胞例如肿瘤细胞系免疫小鼠以促进免疫反应。对于多种抗原的累积经验证实首次用在完全弗氏佐剂中的抗原腹膜内(i.p.)免疫，随后以不完全弗氏佐剂中的抗原每隔一星期(例如总计为6个星期)i.p.免疫，HuMab转基因小鼠产生最佳的反应。可以在免疫方案实施期间用眶后采血得到的血浆样品监测免疫反应。可通过ELISA筛查血浆，并且可将具有足够高滴度抗P型选凝素人免疫球蛋白的小鼠用于相应B细胞的永生化。小鼠可以在处死并取出脾脏和***前3至4天以静脉内用抗原加强免疫。对于每种抗原，预期需要进行2-3次融合。对于每种抗原，将免疫数只小鼠。例如可免疫总共12只HCo7和HCo12系HuMab小鼠。
HCo7小鼠具有在其内源性轻链(κ)基因中的JKD破坏(如Chen，J.等，EMBO J.12(1993)821-830中所述)、在其内源性重链基因中的CMD破坏(如WO 01/14424的实施例1中所述)、KCo5人κ轻链转基因(如在Fishwild，D.M.等，Nat.Biotechnol.14(1996)845-851中所述)以及HCo7人重链转基因(如在美国专利号5,770,429中所述)。
HCo12小鼠具有在其内源性轻链(κ)基因中的JKD破坏(如在Chen，J.等，EMBO J.12(1993)821-830中所述)、在其内源性重链基因中的CMD破坏(如在WO 01/14424的实施例1中所述)、KCo5人κ轻链转基因(如在Fishwild，D.M.等，Nat.Biotechnol.14(1996)845-851中所述)以及HCo12人重链转基因(如在WO 01/14424的实施例2中所述)。可分离小鼠淋巴细胞并且基于标准方案使用PEG使之与小鼠骨髓瘤细胞系融合以产生杂交瘤。随后筛选得到的产生抗原特异性抗体的杂交瘤。例如，将来自免疫小鼠的脾源或***源的淋巴细胞单细胞悬液与六分之一量的非分泌性SP2/0小鼠骨髓瘤细胞(ATCC，CRL 1581)和50％PEG融合。在平底微量滴定板内接种大约2×105个细胞，随后在选择性培养基内培育大约2星期。
随后通过ELISA筛选各孔的抗P型选凝素人IgM和IgG单克隆抗体。一旦出现大量的杂交瘤生长，则分析培养基，通常在10-14天后。将分泌抗体的杂交瘤再次接种，再次筛选，并且若仍显示人IgG的抗P型选凝素单克隆抗体阳性，则可通过有限稀释法进行至少两次亚克隆。随后在体外培养稳定的亚克隆以便在组织培养中产生用于表征的抗体。
因为CDR序列负责抗体-抗原的相互作用，故可以通过构建将本发明CDR序列在源自不同人抗体构架序列中包含的表达载体来表达本发明的重组抗体(参见例如Riechmann，L.等，Nature 332(1998)323-327；Jones，P.等，Nature 321(1986)522-525；和Queen，C.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86(1989)10029-10033)。此类构架序列可从包含人抗体种系基因序列的公共DNA数据库得到。这些种系序列之所以与成熟抗体基因序列不同，在于它们不包含在B细胞成熟期间由V(D)J连接形成的已完全组装的可变基因。种系基因序列还与高亲和性的二级库抗体的序列均匀地在可变区内的个别地方不同。
本发明还包括本发明的抗体用于体外诊断P型选凝素的用途，优选地通过测定样品的P型选凝素与本发明抗体间结合的免疫学鉴定法体外诊断。
在另一个方面，本发明提供了组合物例如药物组合物，其含有与可药用载体共同配制的本发明的一种或组合的人单克隆抗体或其抗原结合部分。更具体地，组合物是药物组合物或诊断用组合物，并且药物组合物甚至更具体地包含如上定义的抗体和至少一种可药用的赋形剂。
本发明的药物组合物还可以以联合疗法即与其它药剂联合施用。例如，联合疗法可包含本发明的组合物和至少一种用于预防或治疗重度肢体局部缺血(CLI/PAOD)相关性疾病或其它常规疗法中的药剂。
如本文中所用，“可药用的载体”包括生理上可兼容的任何以及所有溶剂、分散介质、包衣剂、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和延迟吸收剂等。优选地，载体适用于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊髓或表皮施用(例如通过注射或输注)。
“可药用盐”指保持抗体的目的生物学活性并且不产生任何非目的毒性效果的盐(参见例如Berge，S.M.等，J.Pharm.Sci.66(1977)1-19)。在本发明中包括此类盐。此类盐的实例包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括那些衍生自无毒无机酸的酸加成盐，如盐酸盐。
可以通过本领域内所知的多种方法施用本发明的组合物。如技术人员可理解，施用的途径和/或方式将根据目的结果变化。
为通过某些施用途径施用本发明的化合物，需要将化合物用某材料包被或与该材料共同施用以防止化合物失活。例如，化合物可在适宜的载体如脂质体或稀释剂中向受试者施用。可药用的稀释剂包括盐水和缓冲水溶液。
可药用的赋形剂或载体包括灭菌的水溶液或分散剂以及用于临用前制备的灭菌可注射溶液或分散剂的灭菌粉末。在本领域内已知此类介质和药剂作为药用活性物质的用途。
如本文中所用，短语“肠胃外施用”和“经肠胃外施用”意指除肠道施用和局部施用以外的施用模式，一般通过注射，并且包括且不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、角质层下、关节内、被膜下、蛛网膜下、椎内、硬膜外和胸骨内的注射和输注。
这些组合物还可以包含赋形剂或辅料如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可通过预先的灭菌方法以及通过包含多种抗菌剂和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、酚\山梨酸等确保阻止微生物的存在。在组合物中包含等渗剂如糖、氯化钠等也是受欢迎的。此外，可通过包含延缓吸收的试剂如单硬脂酸铝和明胶延长可注射形式药物的吸收。
无论选择何种施用途径，通过本领域技术人员所知的常规方法将本发明的可以以合适水化形式使用的化合物和/或本发明药物组合物配制为可药用的剂型。
本发明药物组合物中的活性成分的实际剂量水平可以变动，以便得到可有效实现对特定患者、组合物和施用模式所需要的治疗反应而对患者无毒的活性成分量。所选择的剂量水平取决于多种药物动力学因素，包括所应用的本发明的特定组合物或其酯、盐或酰胺的活性、施用途径、施用时间、所应用的特定化合物的***速率、治疗持续期、与所应用的特定化合物联合使用的其它药物、化合物和/或材料、受治疗患者的年龄、性别、体重、状况、总体健康和先前医疗史和其它在医学领域内众所周知的因素。代表性的每周剂量范围可以是大约0.1mg/kg-大约20mg/kg或更高，这取决于如上提及的因素。
组合物必须是无菌的并且具有如此程度的流动性以至可通过注射器送递该组合物。除水以外，载体还可以是等渗的缓冲盐溶液、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇及液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。
可例如通过使用包衣剂如卵磷脂、通过在分散剂中维持目的粒径、通过使用表面活性剂来维持适度的流动性。在许多情况下，优选在组合物中包含等渗剂例如糖、多元醇如甘露醇或山梨醇以及氯化钠。可通过在组合物中包含延缓吸收的试剂如单硬脂酸铝或明胶实现可注射组合物的长期吸收。
本发明包括用于治疗需治疗患者的方法，其特征在于：通过向患者施用治疗有效量的结合P型选凝素的、含有人源衍生的Fc部分并且不结合补体因子C1q的抗体。
本发明包括结合P型选凝素的、含有人源衍生的Fc部分并且不结合补体因子C1q的抗体用于治疗的用途。
本发明包括结合P型选凝素的、含有人源衍生的Fc部分并且不结合补体因子C1q的抗体用于制备预防和治疗炎性疾病和血栓性疾病的药物的用途。
本发明包括结合P型选凝素的、含有人源衍生的Fc部分并且不结合补体因子C1q的抗体用于治疗PAOD和CLI的用途。
因此，本发明提供了结合P型选凝素、不结合补体因子C1q、含有人源衍生的Fc部分的抗体，并且特征在于：该抗体是在L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331和/或P329中含有至少一个突变的人抗体IgG1亚类或者是其中S228替换为P并且L235替换为E的人抗体IgG4亚类。在一个实施方案中，抗体是人抗体。在另一个实施方案中，抗体是人源化抗体。
在一个实施方案中，本发明提供了结合P型选凝素、不结合补体因子C1q、含有人源衍生的Fc部分的抗体，并且特征在于：该抗体是在L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331和/或P329中含有至少一个突变的人抗体IgG1亚类或者是其中S228替换为P并且L235替换为E的人抗体IgG4亚类，其中抗体不结合补体因子C1q指的是ELISA鉴定法测定，其中在抗体的浓度为10μg/ml时C1q对抗体的最大结合(Bmax)小于等于对细胞系hu-Mab<P型选凝素>LC 1004-002(DSMACC2641)的抗体LC 1004-002的Bmax的30％。在另一个实施方案中，最大结合小于等于对细胞系hu-Mab<P型选凝素>LC 1004-002(DSMACC2641)的抗体LC 1004-002的Bmax的20％。
在一个实施方案中，本发明提供了结合P型选凝素、不结合补体因子C1q、含有人源衍生的Fc部分的抗体，并且特征在于：该抗体是在L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331和/或P329中含有至少一个突变的人抗体IgG1亚类或者是其中S228替换为P并且L235替换为E的人抗体IgG4亚类，其中抗体在BIAcore鉴定法以低于10-8M的KD值结合P型选凝素。在另一个实施方案中，KD范围是10-11-10-9M。
在一个实施方案中，本发明提供了结合P型选凝素、不结合补体因子C1q、含有人源衍生的Fc部分的抗体，并且特征在于：该抗体是在L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331和/或P329中含有至少一个突变的人抗体IgG1亚类或者是其中S228替换为P并且L235替换为E的人抗体IgG4亚类，其中如在P型选凝素以及E型选凝素和/或L型选凝素包被于微量滴定板的ELISA鉴定法中所测定的EC50值，抗体结合P型选凝素的特异性比结合E型选凝素和/或L型选凝素的特异性高至少1000倍。在另一个实施方案中，E型选凝素转化子和L型选凝素转化子的EC50值高于100μg/ml。
在一个实施方案中，本发明提供了结合P型选凝素、不结合补体因子C1q、含有人源衍生的Fc部分的抗体，并且特征在于：该抗体是在L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331和/或P329中含有至少一个突变的人抗体IgG1亚类或者是其中S228替换为P并且L235替换为E的人抗体IgG4亚类，其中抗体以不超过1μg/ml的IC50值抑制白细胞样HL60细胞对纯化的P型选凝素的粘着。在另一个实施方案中，IC50值的范围是0.08-0.5μg/ml。仍在另一个实施方案中，IC50值的范围是0.08-0.11μg/ml。
在一个实施方案中，本发明提供了结合P型选凝素、不结合补体因子C1q、含有人源衍生的Fc部分的抗体，并且特征在于：该抗体是在L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331和/或P329中含有至少一个突变的人抗体IgG1亚类或者是其中S228替换为P并且L235替换为E的人抗体IgG4亚类，其中
(a)以0.05-0.3μg/ml的IC50值抑制白细胞样HL60细胞对活化的血小板的粘着；
(b)抗体对白细胞与血小板单层的相互作用的抑制大于70％；
(c)抗体在3μg/ml浓度时在人流式***中对白细胞粘着于活化的内皮细胞的抑制在60-90％范围间；
(d)抗体不结合C3蛋白；
(e)抗体不引起依赖补体的细胞毒性(CDC)；
(f)抗体不结合NK效应细胞上的Fcγ受体；或
(g)抗体不引起抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)。
在另一个实施方案中，本发明提供了结合P型选凝素的特征如下的抗体：该抗体的可变重链氨基酸序列CDR3选自SEQ ID NO：38、39、40、41或42的重链CDR3序列。
在一个实施方案中，本发明提供了包含可变重链和可变轻链的结合P型选凝素的特征如下的抗体：可变重链包含CDR序列CDR1、CDR2和CDR3，并且CDR1选自SEQ ID NO：29、30、31、32，CDR2选自SEQ IDNO：33、34、35、36、37，CDR3选自SEQ ID NO：38、39、40、41、42，其中彼此独立地选择所述的CDR。
在一个实施方案中，本发明提供特征如下的抗体：可变轻链包含CDR序列CDR1、CDR2和CDR3，并且CDR1选自SEQ ID NO：43、44，CDR2选自SEQ ID NO：45、46以及CDR3选自SEQ ID NO：47、48、49、50、51、52，其中彼此独立地选择所述的CDR。
在一个实施方案中，本发明提供特征如下的抗体：该抗体结合P型选凝素并且抗体包含独立选自如下的可变区：
a)由氨基酸序列SEQ ID NO：1定义的轻链可变结构域和由SEQ IDNO：2定义的重链可变结构域；
b)由氨基酸序列SEQ ID NO：3定义的轻链可变结构域和由SEQ IDNO：4定义的重链可变结构域；
c)由氨基酸序列SEQ ID NO：5定义的轻链可变结构域和由SEQ IDNO：6定义的重链可变结构域；
d)由氨基酸序列SEQ ID NO：7定义的轻链可变结构域和由SEQ IDNO：8定义的重链可变结构域；
e)由氨基酸序列SEQ ID NO：9定义的轻链可变结构域和由SEQ IDNO：10定义的重链可变结构域；
f)由氨基酸序列SEQ ID NO：11定义的轻链可变结构域和由SEQ IDNO：12定义的重链可变结构域；
g)由氨基酸序列SEQ ID NO：13定义的轻链可变结构域和由SEQ IDNO：14定义的重链可变结构域；
h)由氨基酸序列SEQ ID NO：15定义的轻链可变结构域和由SEQ IDNO：16定义的重链可变结构域；
i)由氨基酸序列SEQ ID NO：17定义的轻链可变结构域和由SEQ IDNO：18定义的重链可变结构域；
j)由氨基酸序列SEQ ID NO：19定义的轻链可变结构域和由SEQ IDNO：20定义的重链可变结构域；和
k)由氨基酸序列SEQ ID NO：21定义的轻链可变结构域和由SEQ IDNO：22定义的重链可变结构域。
在一个实施方案中，本发明提供了结合P型选凝素、不结合补体因子C1q、含有人源衍生的Fc部分的抗体，并且特征在于：该抗体是在L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331和/或P329中含有至少一个突变的人抗体IgG1亚类或者是其中S228替换为P并且L235替换为E的人抗体IgG4亚类，其中抗体包含由氨基酸序列SEQ ID NO：3定义的轻链可变结构域中的CDR1、CDR2和CDR3区域以及由SEQ ID NO：4定义的重链可变结构域中的CDR1、CDR2和CDR3区域。在另一个实施方案中，抗体包含由氨基酸序列SEQ ID NO：3定义的轻链可变结构域和由SEQ ID NO：4定义的重链可变结构域。
在一个实施方案中，本发明提供了结合P型选凝素、不结合补体因子C1q、含有人源衍生的Fc部分的抗体，并且特征在于：该抗体是在L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331和/或P329中含有至少一个突变的人抗体IgG1亚类或者是其中S228替换为P并且L235替换为E的人抗体IgG4亚类，其中
(a)抗体包含至少一个在Fc部分中的导致不结合补体因子C1q的氨基酸突变；
(b)人重链恒定区包含独立选自SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26和28的氨基酸序列；
(c)抗体包含如SEQ ID NO：23所定义的κ轻链恒定区；
(d)抗体包含至少一个导致不结合补体C1q的氨基酸突变；
(e)抗体包含选自IgG1v1、IgG1v2和IgG4v1的重链恒定区；或
(f)抗体是Fab、F(ab′)2或单链片段。
在一个实施方案中，本发明提供特征如下的抗P型选凝素抗体：该抗体a)是人抗体或人源化抗体，以及b)如在其中P型选凝素以及E型选凝素和/或L型选凝素包被于微量滴定板的ELISA鉴定法中所测定的EC50值，抗体结合P型选凝素的特异性比结合E型选凝素和/或L型选凝素的特异性高至少1000倍。在一个实施方案中，抗体包含如SEQ ID NO：24、25或26γ1重链恒定区或SEQ ID NO：27或28γ4重链恒定区所定义的氨基酸序列。仍在另一个实施方案中，抗体由选自hu-Mab<P型选凝素>LC1004-001(DSM ACC2640)、hu-Mab<P型选凝素>LC 1004-002(DSMACC2641)和hu-+Mab<P型选凝素>LC 1004-017(DSM ACC2642)的细胞系产生。
可以理解本发明提供了具有如段落[00129]至[00141]中所述定义的实施方案及其组合。
提供如下实施例、参考文献、序列表和附图以便辅助理解本发明、后附权利要求书中所述的本发明的实际范围。可以理解在不脱离本发明的精神下可对如前所述的方法进行改变。
序列表的描述
SEQ ID NO：1LC1004-001轻链，HuMab1004-001的可变结构域
SEQ ID NO：2LC1004-001重链，HuMab1004-001的可变结构域
SEQ ID NO：3LC 1004-002轻链，HuMab002可变结构域
SEQ ID NO：4LC 1004-002重链，HuMab002可变结构域
SEQ ID NO：5LC 1004-003轻链，的可变结构域HuMab003
SEQ ID NO：6LC 1004-003重链，HuMab003的可变结构域
SEQ ID NO：7LC 1004-004轻链(I)，HuMab004(I)的可变结构域
SEQ ID NO：8LC 1004-004重链(I)，HuMab004(I)的可变结构域
SEQ ID NO：9LC 1004-004轻链(II)，HuMab004(II)的可变结构域
SEQ ID NO：10LC 1004-004重链(II)，HuMab004(II)的可变结构域
SEQ ID NO：11轻链，HuMab005的可变结构域
SEQ ID NO：12重链，HuMab005的可变结构域
SEQ ID NO：13轻链，HuMab010(I)的可变结构域
SEQ ID NO：14重链，HuMab010(I)的可变结构域
SEQ ID NO：15轻链，HuMab010(II)的可变结构域
SEQ ID NO：16重链，HuMab010(II)的可变结构域
SEQ ID NO：17轻链，HuMab010(III)的可变结构域
SEQ ID NO：18重链，HuMab010(III)的可变结构域
SEQ ID NO：19轻链，HuMab011的可变结构域
SEQ ID NO：20重链，HuMab011的可变结构域
SEQ ID NO：21轻链，HuMab017的可变结构域
SEQ ID NO：22重链，HuMab017的可变结构域
SEQ ID NO：23κ轻链恒定区
SEQ ID NO：24γ1重链恒定区
SEQ ID NO：25γ1重链恒定区PVA236/GLPSS331(IgG1v1)
SEQ ID NO：26γ1重链恒定区L234A/L235A(IgG1v2)
SEQ ID NO：27γ4重链恒定区
SEQ ID NO：28γ4重链恒定区S228/L235E(IgG4v1)
SEQ ID NO：29-32重链CDR1
SEQ ID NO：33-37重链CDR2
SEQ ID NO：38-42重链CDR3
SEQ ID NO：43-44轻链CDR1
SEQ ID NO：45-46轻链CDR2
SEQ ID NO：47-52轻链CDR3
缩写：
将氨基酸缩写为三字母代码(Leu)或单字母代码(L)
还将抗体HuMab00X称作抗体00X
L234指根据EU编号(Kabat)在234位置处的亮氨酸
L234A指将234位置处的亮氨酸变成丙氨酸
PVA236指将IgG1中236区ELLG或IgG4中的EFLG修改为PVA
GLPSS331指将IgG1中的331区ALPAP或IgG2中的GLPAP变为GLPSS
在其它IgG亚类中进行类似修改
实施例
产生抗P型选凝素抗体的杂交瘤细胞系的生成
杂交瘤的培养
将HuMab杂交瘤在37℃和5％CO2于IMDM(Cambrex)、胎克隆1牛血清(Perbio Science)、原始杂交瘤克隆因子(Igen)、丙酮酸钠、青霉素/链霉素、2-巯基乙醇、HAT(Sigma-Aldrich)和卡那霉素(Invitrogen)内培养。
产生抗P型选凝素抗体的杂交瘤细胞系的生成
转基因小鼠的免疫程序
方案A：
将10只HCo7转基因小鼠(5只雄性和5只雌性)、GG2201系(Medarex，San José，CA，美国)用购买自R&D System的缺乏P型选凝素跨膜结构域和胞内结构域的截短形式的重组P型选凝素免疫。对于首次免疫，将溶解于100μl PBS的50μg重组P型选凝素与100μl弗氏完全佐剂混和。对于余下的免疫，使用与KLH偶联的重组P型选凝素。对于第二次免疫，将50μg与KLH偶联的重组P型选凝素溶解于100μl PBS并与100μl弗氏不完全佐剂混和。对于其它的免疫，将20μg与KLH偶联的重组P型选凝素溶解于100μl PBS并与100μl弗氏不完全佐剂混和。轮流以腹膜内免疫和皮下免疫实施免疫，并首先进行腹膜内免疫。
方案B：
将3只HCo7转基因小鼠(全为雌性)、3KM(全为雄性)转基因小鼠、GG2489系(Medarex，San José，CA，美国)用来自人衰老血小板的通过免疫亲和层析(见以下)所纯化的全长P型选凝素免疫。对于首次免疫，将溶解于100μl PBS的纯化的50μg P型选凝素与100μl弗氏完全佐剂(CFA；Difco Laboratories，Detroit，美国)混和。对于第二次免疫，将溶解于100μl PBS的纯化的50μg P型选凝素与100μl弗氏不完全佐剂(ICFA；Difco)混和。
对于所有其它免疫，使用20μg纯化的P型选凝素并且使之与100μl弗氏不完全佐剂混和。
抗原特异性ELISA
通过抗原特异性ELISA测定已免疫小鼠血清中的抗P型选凝素滴度。将平板(96孔平底ELISA板，Greiner)以溶解于PBS的0.1μg/ml的纯化P型选凝素包被并且在室温下包被过夜。此后，以PBSTC(含有0.05％Tween20(Sigma-Aldrich Chemie BV)和2％鸡血清(Gibco)的PBS)在室温下封闭各孔1小时。
受试的血清样品按1∶100在PBSTC中稀释并且加入各孔内。将自免疫前小鼠得到的血清按1∶100在PBSTC中溶解并用作阴性对照。将小鼠抗人P型选凝素抗体(1/7，由Roche Basel自行生产)按1∶100在PBSTC中溶解并用作阳性对照。将平板在室温下温育1小时。随后平板用PBST(含有0.05％Tween 20的PBS)洗涤两次。将Gt-α-huIgG-HRP(Jackson)按1∶5000在PBSTC中稀释并加入含有受试的样品和阴性对照的孔内。将Rb-α-mIgG(Jackson)按1∶3000在PBSTC中稀释并加入含有阳性对照的孔内。将平板在室温下温育1小时。最后平板用PBST洗涤两次并用新鲜制备的ABTS溶液(1mg/ml)(ABTS：2，2’-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸))在室温下黑暗中显色30分钟。在405nm测定吸收值。
小鼠的加强免疫
当抗P型选凝素的血清滴度足够高时，在融合前3天和4天用100μl在PBS中的20μg重组人P型选凝素对小鼠进行两次静脉内额外强化免疫。
杂交瘤生成
处死小鼠并且收集脾脏和分布在腹主动脉和腔静脉两侧的***。根据标准操作方法进行脾细胞和***细胞与融合细胞SP 2.0细胞的融合。
通过本免疫程序获得了具有SEQ ID NO 1-22的可变重链序列和可变轻链序列的人单克隆抗体。
κ-ELISA
为确定从融合得到的杂交瘤是否生成人抗体，进行了κ-ELISA。ELISA板以PBS中按1/10000稀释的大鼠抗人IgG κ-轻链抗体(DAKO)通过在4℃温育过夜包被。在倾尽各孔后，将平板与PBSTC在室温下温育1小时封闭。此后，各孔与PBSTC中按1/2稀释的杂交瘤培养上清液温育。将PBSTC中按1/2稀释的培养基用作阴性对照，PBSTC中按1/2稀释的κ-轻链阳性小鼠血清作为阳性对照。随后，将各孔洗涤两次并且与PBSTC中按1/2000稀释的HRP-缀合的大鼠抗人IgG F(ab’)2(DAKO)在37℃温育1小时。将各孔洗涤三次并且分析平板以新鲜制备的ABTS
Figure G05811205920061019D000392
溶液(1mg/ml)在室温(RT)下黑暗中显色30分钟。用ELISA板读数仪于405nm处测定吸收值。
抗P型选凝素HuMab的可变结构域的克隆和序列分析
(κ-轻链和γ1-重链)
通过标准的cDNA合成/PCR方法分离了编码P型选凝素HuMab的轻链可变区VL和重链可变区VH的核苷酸序列。
使用RNeasy
Figure G05811205920061019D000401
微量试剂盒(Qiagen)从1×106-1×107个杂交瘤细胞制备总RNA。使用来自杂交瘤的RNA作为根据常规方法利用寡脱氧胸苷(dT)引物进行的第一链cDNA合成的模板。分别用互补于κ-轻链恒定区核苷酸序列和γ1-重链恒定区核苷酸序列的反向轻链引物和反向重链引物以及5’-特异性轻链引物和5’-特异性重链引物进行第二链cDNA合成以及进一步PCR扩增编码VL和VH的cDNA片段。使用来自InvitrogenTM LifeTechnologies的TOPO TA克隆试剂盒和作为克隆载体的pCR4-TOPO对PCR产物克隆。使用EcoRI消化，通过适宜质粒的限制酶切作图鉴定已克隆的PCR产物并且所预期/计算的VL和VH DNA片段的大小分别是大约740bp和790bp。
通过双链测序测定已克隆的PCR片段的DNA序列。
使用10.2版GCG(Genetics Computer Group，Madison，Wisconsin)软件包进行常规数据处理。使用GCG modul CLUSTALW比对DNA序列和蛋白质序列。对于序列比对，使用程序GENEDOC(2.1版)制表、编辑和标记颜色。
抗P型选凝素IgG1 HuMab表达质粒的构建
在哺乳动物细胞表达载体中分别组装抗P型选凝素HuMab轻链编码基因和重链编码基因。
为此，将编码抗P型选凝素HuMab轻链可变区(VL)和人κ-轻链恒定区(CL)的基因片段连接，将编码抗P型选凝素HuMab重链可变区(VH)和人γ1-重链恒定区(CH1-铰链-CH2-CH3)的基因片段连接。
在Kabat，E.A.，Wu，T.T.、Perry，H.M.，Gottesman，K.S.和Foeller，C.(1991)SEQuence of Proteins of Immunology Interest，第五版，NIHPublication No 91-3242中描述了关于人轻链和重链核苷酸序列的一般信息，从中可以推断出密码子的用途。
抗P型选凝素HuMabκ-轻链的转录单位包含如下元件：
·来自人巨细胞病毒(HCMV)的立即早期增强子和启动子，
·包含Kozak序列的合成的5’-UT，
·包含信号序列内含子的鼠免疫球蛋白重链信号序列，
·在其5’端安置单一BsmI限制性位点以及剪接供***点并在3’端带单一NotI限制性位点的克隆的抗P型选凝素HuMab可变轻链cDNA，
·包含小鼠内含子2Ig-κ增强子[Picard，D.和Schaffner，W.(1984)Nature 307，80-82]的人基因组κ-基因恒定区和
·人免疫球蛋白κ-聚腺苷酸化(“poly A”)信号序列。
抗P型选凝素HuMabγ1-重链的转录单位包含如下元件：
·来自人巨细胞病毒(HCMV)的立即早期增强子和启动子，
·包含Kozak序列的合成的5’-UT，
·包含信号序列内含子的已修饰的鼠免疫球蛋白重链信号序列，
·在其5’端安置单一BsmI限制性位点以及剪接供***点并在3’端带单一NotI限制性位点的已克隆的抗P型选凝素HuMab可变重链cDNA，
·包含小鼠Igμ-增强子(Neuberger，M.S.(1983)Embo J 2，1373-1378)的人基因组γ1-重链基因恒定区，
·人γ1-免疫球蛋白聚腺苷酸化(“poly A”)信号序列。
抗P型选凝素HuMabκ-轻链和γ1-重链表达质粒的功能元件：除抗P型选凝素HuMabκ-轻链或γ1-重链表达盒以外，这些质粒还包含
·潮霉素抗性基因，
·Epstein-Barr病毒(EBV)的复制起点oriP，
·允许此质粒在大肠杆菌中复制的来自载体pUC18的复制起点，和
·赋予大肠杆菌氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因。
抗P型选凝素IgG4 HuMab表达质粒的构建
通过将人基因组γ1-恒定区和γ1-免疫球蛋白聚腺苷酸化(“poly A”)信号序列替换为人基因组γ4-恒定区和γ4-免疫球蛋白聚腺苷酸化信号序列，从抗P型选凝素γ1-重链表达质粒衍生抗P型选凝素γ4-重链的原型表达质粒。
为了表达抗P型选凝素HuMabκ-轻链，使用如对IgG1所描述的相同表达质粒(见上文)。
突变的(变异的)抗P型选凝素IgG1和IgG4表达质粒的构建
通过使用QuickChangeTM定点诱变试剂盒(Stratagene)对野生型表达质粒进行定点诱变，产生了编码突变抗P型选凝素γ1-重链和γ4-重链的表达质粒。
对于LC1004-002产生如下突变体。氨基酸根据EU编号[Edelman，G.M.、Cunningham，B.A.、Gall，W.E.、Gottlieb，P.D.、Rutishauser，U.和Waxdal，M.J.(1969)Proc Natl Acad Sci USA 63，78-85；Kabat，E.A.、Wu，T.T.、Perry，H.M.、Gottesman，K.S.和Foeller，C.(1991)SEQuence ofProteins of Immunology Interest，第五版，No 91-3242]进行编号。
重组抗P型选凝素HuMab的产生
通过瞬时转染在补加10％超低IgG FCS(Gibco)，2mM谷氨酰胺(Gibco)、1％体积比非必需氨基酸(Gibco)和250μg/ml G418(Roche)的DMEM(Gibco)中培养的贴壁HEK293-EBNA细胞(ATTC#CRL-10852)产生重组HuMab。为了转染，在试剂(μl)对DNA(μg)比例3∶1-6∶1时使用转染试剂FugeneTM 6(Roche)。使用1∶2-2∶1轻链编码质粒对重链编码质粒的摩尔比，从两个不同质粒表达免疫球蛋白轻链和重链。在转染后第4天至第11天收获含有HuMab的细胞培养上清液。将上清液贮存于-20℃直至纯化。
在Meissner，P.，Pick，H.，Kulangara，A.，Chatellard，P.，Friedrich，K.和Wurm，F.M.(2001)Biotechnol Bioeng 75，197-203中描述了有关例如在HEK293中重组表达人抗体的一般信息。
抗P型选凝素HuMah亲和性的测定
设备：
仪器：BIACORE2000
芯片：CM5
偶联法：胺偶联法
缓冲液：HBS(HEPES，NaCl)，pH 7.4，25℃
为了测量亲和性，通过胺偶联法将兔抗人Fcγ抗体(Dianova)偶联于用来呈现抗P型选凝素抗体的芯片表面。结合大致400RU抗P型选凝素抗体。以0-50nM间的多个浓度加入重组P型选凝素(R&D Systems)。通过注入P型选凝素120秒测量结合，通过以缓冲液洗涤芯片表面180秒测量解离。不同的抗P型选凝素抗体的亲和性数据示于表2。使用Biaevaluation软件将动力学数据拟合为P型选凝素对所呈递的单克隆抗体的1∶1朗缪尔结合模型。
P型选凝素抗体在基于细胞的粘着鉴定法
和玫瑰花结鉴定法中的抑制活性
材料和方法：
细胞粘着鉴定法：在此粘着鉴定法中评估HuMab对白细胞样HL60细胞(ATCC CCL 240)粘着于微量滴定板上包被的P型选凝素的作用。HL60细胞用BCECF-AM(2’，7’-双-(2-羧乙基)-5-(和-6)-羧基荧光黄乙酰氧甲基酯；目录号216254，Calbiochem)标记。全长的纯化P型选凝素(纯化方法如上)在含有150mM NaCl、1mM CaCl2、1mM MgCl2、20mM Tris(pH 7.4)和0.0005％T×100缓冲液中以1μg/ml的浓度在96孔板(NuncImmuno Plate Maxisorp F96)中4℃包被过夜。此后，各孔用含3.5％牛血清白蛋白(BSA，Fluka)的如上提及的缓冲液在室温(RT)封闭2小时。各孔用50μl在含1％BSA的如上提及的缓冲液中作不同稀释的P型选凝素HuMab或小鼠P型选凝素参考抗体(WAPS 12.2，各杂交瘤细胞系由ATCC提供)在室温下预温育20分钟。加入标记的HL60细胞(50μl，70,000个细胞/孔)并允许在室温下结合45分钟。在某些实验中，HL60细胞在加入各孔前与20μg/ml人IgG1预温育30分钟以封闭Fc受体。通过(用以上提及的缓冲液4次)温和洗涤除去未结合的HL60细胞后，用120μl NP-40(Fluka；在H2O中1％)裂解粘着的细胞。将100μl上清液转移至平板内以使用荧光分光光度计LS 50B(Perkin Elmer)在485nm激发波长和538nm发射波长处测量相应的荧光。
玫瑰花结鉴定法：为评估抗体对活化的血小板与HL60细胞相互作用的影响，使用结合双色细胞荧光测量分析(Evangelista等，Blood 88：4183(1996))的玫瑰花结鉴定法(Jungi等，Blood 67：629(1986))。如(Fox等，Methods Enzymol 215：45(1992))所述制备洗涤的人血小板。洗涤的人血小板用凝血酶(终浓度1U/ml)活化5分钟并用FITC-缀合的抗人GPIIb抗体pl-36(Kouns等，J Biol Chem 267：18844(1992))标记。随后将70μl蒂罗德溶液中的1.4-2×106个血小板与不同稀释度的HuMab(100μl)在室温下黑暗中温育30分钟。加入50μl调整为20×106个/ml的HL60细胞悬液(在蒂罗德溶液中)。HL60细胞通过与20μl缀合PE(藻红蛋白)的抗人CD45Ab(目录编号555483，Pharmingen)温育来标记。将标记的HL60细胞与血小板和HuMab在FACS管(Becton Dickinson)中室温下温育30分钟后，使用FACScan(Becton Dickinson)通过测量血小板标记荧光和HL60细胞标记荧光，对混和的聚集物或玫瑰花结的形成进行分析。通过对数放大作用，以488nm激发波长和分别为530nm(FITC)和570nm(PE)发射波长获得前向角散射和侧向角散射以及绿色(FITC)信号和红色(PE)信号。使用电子补偿消除波谱重叠。HL60细胞基于前向角散射和侧向角散射进行鉴定。对鉴定为HL60细胞的事件设门以排除单个血小板。对于每个样品测量五千个已设门的HL60细胞事件。将在EDTA(10mmol/l)存在时混和了非活化血小板和HL60细胞或由凝血酶活化的血小板和HL60细胞的样品用来设置绿色荧光的阈值。高于该阈值的HL60细胞百分数代表结合血小板的HL60细胞的百分数。血小板标记荧光向较低荧光值的移动表明具有较高数量粘着性血小板的混和聚集物数量的降低有利于具有小量粘着性血小板的混和聚集物数量的增加。
结果：
在HL60细胞粘着鉴定法中，P型选凝素抗体以0.08-0.5μg/ml范围的IC50值抑制HL60细胞对纯化P型选凝素的粘着。虽然在抗体的Fc部分中导入突变，但是如图1中0.08-0.11μg/ml的IC50值所示，HuMab的IgG4和IgG1变体均比亲本抗体更有效。当将HL60细胞与人IgG1预温育时，如图1中对HuMab002所显示，未突变亲本抗体的效力也以大约3至4倍IC50值降低的方式得到提高。这个发现表明突变体在粘着鉴定法中增加的效力主要归因于消除了HL60细胞通过抗Fcγ受体的抗体Fc部分对P型选凝素的粘着。
在对表达P型选凝素的活化人血小板粘着至HL60细胞进行评价的瑰花环鉴定法中，HuMab的IC50值因为本鉴定法中较少的P型选凝素受体数目均低于粘着鉴定法中的IC50(IC50：0.05-0.3μg/ml、优选地在0.05-0.2μg/ml之间)。与未突变的亲本抗体相比，相应HuMab的Fc变体的功效倾向增加(图2)。在与活化的血小板温育前，HL60细胞与IgG1和与IgG4预温育没有显著影响突变体和亲本抗体的抑制活性，这表明与粘着鉴定法相比，在玫瑰花结鉴定法中Fcγ受体介导的结合不起明显作用。
P型选凝素抗体与动物物种来源的P型选凝素的交叉反应性
材料和方法：通过(i)使用FACS分析测量P型选凝素HuMab对来自大鼠和食蟹猴的活化血小板的结合以及测量(ii)在评估大鼠血小板和食蟹猴血小板对HL60细胞粘着的玫瑰花结鉴定法中P型选凝素HuMab的抑制活性评价该抗体的交叉反应性。
为测量HuMab对活化的大鼠血小板和食蟹猴血小板的结合，与制备洗涤的人血小板(参见以上)类似，制备洗涤的大鼠血小板和食蟹猴血小板。它们用凝血酶(终浓度1U/ml)活化5分钟，活化的血小板与不同稀释度的HuMab(20μl)在室温下温育30分钟。在结合HuMab后，血小板用2％的PFA在室温下固定15分钟。将样品用蒂罗德缓冲液洗涤并且重悬于300ml蒂罗德缓冲液内。用FITC-缀合的兔抗人IgG F(ab’)2片段(目录编号F0056，Dako)检测HuMab结合。使用兔抗人P型选凝素多克隆抗体(目录编号09361A，Pharmingen)作为抑制大鼠P型选凝素的对照抗体。
如以上对人血小板所述制备洗涤的大鼠血小板和食蟹猴血小板。如对人血小板所述开展玫瑰花结鉴定法。为标记食蟹猴血小板，使用FITC-缀合的抗人GPIIb抗体pl-36，而用FITC-缀合的小鼠抗大鼠CD61抗体(目录编号554952，Pharmingen)标记大鼠血小板。
结果：如图3a中的某些实施例所示，证实可抑制人P型选凝素所介导功能的本发明P型选凝素特异性抗体均不结合大鼠P型选凝素或均不抑制由大鼠血小板和HL60细胞组成的混合聚集物的形成。然而P型选凝素HuMab结合并抑制食蟹猴血小板P型选凝素(图3b)。
P型选凝素抗体对E型选凝素和L型选凝素的选择性
材料和方法：P型选凝素HuMab对E型选凝素和L型选凝素(ADP1和ADP2，R&D Systems)的选择性在测量抗体对重组E型选凝素和L型选凝素结合的无细胞ELISA中测定以及测量抗体对E型选凝素-CHO转化子和L型选凝素-300.19转化子(如Goetz等，J.Cell Biol 137：509(1997)；Ley等，Blood 82：1632(1993)中所述生成转化子)结合的基于细胞的ELISA中测定。
在无细胞ELISA中，将溶于含150mM NaCl、1mM CaCl2、1mMMgCl2、20mM Tris(pH 7.4)和0.0005％T×100缓冲液中的1μg/ml浓度的重组P型选凝素、E型选凝素或L型选凝素在96孔板(Nunc ImmunoplateMaxisorp F96)中4℃包被过夜。各孔以含有3.5％牛血清白蛋白(BSA，Fluka)的如上提及的缓冲液在室温下封闭2小时。各孔用50μl在含有1％BSA的如上提及缓冲液中作不同稀释的P型选凝素HuMab或小鼠P型选凝素、E型选凝素参考抗体(BBA26；R&D Systems)和山羊L型选凝素参考抗体(AF728；R&D Systems)于室温预温育过夜。使用生物素化的抗人IgG(Amersham，RPN1003，终浓度1∶1000)或对于对照抗体，以生物素化的抗小鼠IgG或抗山羊IgG检测HuMab的结合。温育1小时后，以如上提及的缓冲液洗涤各孔(3次)，并加入0.1ml在含有0.1％BSA的所提及缓冲液中按1∶750稀释的链霉亲合素生物素化过氧化物酶复合体(Amersham，RPN1051)作用30分钟。随后洗涤各孔并加入0.2ml含有ABTS(2，2′-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)，Boehringer，Mannheim)的过氧化物酶底物溶液(ABTS贮液：1ml 40mM ABTS、5μl 30％H2O2和20ml 0.1M乙酸钠、0.05NaH2PO4)。大约10分钟后，使用50μl 0.1M柠檬酸和0.01％NaN3终止反应。在405nm处对颜色反应读数。
在基于细胞的ELISA中，用细胞解离溶液(Sigma C5914)使细胞脱离壁后，将P型选凝素-CHO-转化子和E型选凝素-CHO-转化子接种至96孔板(TC Microwell F96 Nunc 167008)的各孔内并调节至100,000个细胞/孔，在各自的培养基内于37℃培养过夜(用于P-CHO-转化子的培养基：DMEM+10％FCS+2mM谷氨酰胺+青霉素100U/ml/链霉素100μg/ml；用于E型选凝素转化子的培养基：HAM F-12+10％FCS+2mM谷氨酰胺+青霉素100U/ml/链霉素100μg/ml+0.1％两性霉素+100μg/ml新霉素)。在除去培养基并且以含有3％TopBlock(目录编号TB232010；Juro)的A-T缓冲液(150mM NaCl，1mM CaCl2，1mM MgCl2，20mM Tris(pH 7.4))封闭各孔1小时后，加入50μl溶于含1％TopBlock和0.1％叠氮化合物的以上提及缓冲液中的P型选凝素HuMab或小鼠P型选凝素参考抗体和小鼠E型选凝素参考抗体(参见如上)并在室温下温育60分钟。在洗涤各孔(4次)后，使用如上提及的用于无细胞ELISA的相同步骤检测结合的抗体。
因为L型选凝素300.19细胞是悬浮的细胞，必需将L型选凝素-300.19转化子在96孔聚苯乙烯过滤平板(Corning 3510)中的各孔内接种，从而对基于细胞的ELISA方法加以调整。使用滤器平板封闭和温育后，将溶液通过平板底部过滤除去，但除此之外本方案与使用P型选凝素-CHO细胞和E型选凝素-CHO细胞的方案相似。使用未转染的CHO和未转染的300.19作为对照。
结果：
本发明抗体相对E型选凝素和L型选凝素而言对P型选凝素呈高度选择性。它们以0.01-0.08μg/ml、优选地以0.01-0.04μg/ml范围的EC50值结合P型选凝素-CHO细胞，其中在E型选凝素-CHO细胞和L型选凝素-300.19上的EC50值明显高于50μg/ml、优选地高于100μg/ml。HuMab002在基于细胞的ELISA中具有对E型选凝素和L型选凝素超过4,000倍选择因子指数的最高选择性。此外，HuMab002在高于基线水平直至浓度为100μg/ml时仍不与E型选凝素和L型选凝素转化子结合。HuMab002的Fc变体IgG4v1和IgG1v1的选择性与亲本HuMab002的选择性类似(图4a-c)。
P型选凝素抗体在完全人血液流式***中的离体(ex vivo)抑制活性
P型选凝素HuMab对白细胞粘着血小板单层的影响
材料和方法：
为说明P型选凝素抗体对将白细胞招募至血管壁损伤和血小板血栓形成位置处的作用，基本上如(Kirchhofer等，Blood 89：1270(1997))所描述，使用允许测量人白细胞与人血小板以不同剪切速率相互作用的人血液流式***。在平行的平板灌注装置中，将抽取自健康供体肘前静脉的人全血在模拟受损的裸露血管壁的胶原表面撒布。如(Kirchhofer等，Blood 89：1270(1997))所描述制备已包被胶原的盖玻片。将它们在三个平行的平板灌注室内放置。为了允许测量不同剪切速率(65次/秒和280次/秒)，使用不同大小的灌注室，并且以受到安装于灌注装置远端的滚柱泵控制的1ml/分钟的恒定血流灌注血液至包被胶原的盖玻片上。从静脉中抽取血液后并分成三个管后，立即加入GPIIb/IIIa抑制剂(0.5μmol/拉米非班)以阻止血小板聚集和产生血小板单层。与此同时施以不同浓度的P型选凝素抗体(HuMab、突变体、作为对照的各自参考抗体或人IgG1和IgG4)，随后使血液抑制剂混合物进入包含了包被胶原的盖玻片的灌注室内。在5.5分钟灌注期后，使PBS通过灌注室灌注3分钟而不中断液流。在短暂中断液流后，在1ml/分钟时用PBS中的3％多聚甲醛固定灌注室2分钟。随后将盖玻片从灌注室内取出，再次用PBS中的3％多聚甲醛于4℃下固定1小时并在含0.03％叠氮钠的PBS中贮存。为评估粘着于血小板单层的白细胞的数目，盖玻片在空气干燥后以Diff-Quick溶液(Dade Behring AG)染色并包埋入Merckoglas(Merck，德国)。使用图像分析***(MCID，Imaging ResearchInc.)以确定粘着于对血流方向垂直且离盖玻片开始处1mm远的标准区内的白细胞数目。在65次/秒和280次/秒的剪切速率时，在其表面计数白细胞的面积分别是3.1mm2和2.1mm2。
结果：
P型选凝素HuMab以浓度依赖方式抑制白细胞对血小板单层的粘着，在65次/秒的剪切速率和10μg/ml浓度时，HuMab抑制60-99％、优选地70-99％的白细胞粘着。与65次/秒的静脉剪切速率相比，HuMab的抑制效果在较高的280次/秒剪切速率(接近于动脉的情形)下更明显。总之，在280次/秒剪切速率时，粘着的白细胞数目比在65次/秒时低。当Fc变体与分别的亲本抗体相比时，它们在离体灌注室内具有类似于HuMab002及其变体IgG4v1和IgG1v1所显示出的抑制活性(图5)。在体外鉴定法中已发现的突变体较亲本抗体增强的抑制活性在离体的灌注室内未观察到，其可能归咎于在人全血中的白细胞Fcγ受体的饱和。
P型选凝素HuMab对白细胞粘着内皮细胞的影响
材料和方法：
为说明P型选凝素在剪切条件下的抗炎效力，在盖玻片上已包被内皮细胞的情形下中使用以上提及的人血液流式***。来自脐带的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)根据Jaffe等，1993的方法，通过胶原酶II型(Roche瑞士)消化分离。将它们在包被1％明胶的组织培养容器内于补加20％胎牛血清(Gibco，Auckland)，100IU/ml青霉素(Gibco，Auckland)、0.1mg/ml链霉素(Gibco，Auckland)、2mmol/l L-谷氨酰胺(Gibco，Auckland)、10U/ml肝素(Sigma)和50μg/ml EC生长补充物(Sigma，德国)的培养基199(M199，Sigma，德国)中培养。HUVEC生长至汇合(大约4天)，用胰蛋白酶/乙二胺四乙酸(Gibco，Auckland)传代并且在事先用1％明胶(Fluka，德国)包被的Thermanox塑料盖玻片(大约200,000个EC/盖玻片)上接种。可允许HUVEC定植并经过1-2天变成汇合。在开始灌注前24小时用20ng/mlIL-4(R&D Systems)刺激HUVEC并在灌注前5-10分钟用10-4M组胺(Fluka，德国)刺激HUVEC。每次实验使用第一次传代的HUVEC进行。如以上所述，将具有已刺激的HUVEC汇合单层的盖玻片置于平行平板灌注室内。与如上所述的灌注实验相似，从健康供体中抽取全血。不过在这些实验中，血液用凝血酶抑制剂Ro-46-6240(10μM)抗凝并在向活化的内皮细胞上灌注前即刻，与不同浓度的P型选凝素抗体(HuMab、突变体、各自的参考抗体)或作为对照的人IgG1和IgG4预温育5分钟。将血流调节至1ml/分钟，剪切速率为65次/秒并且灌注时间是5.5分钟。在用PBS洗涤3分钟后，将具粘着性白细胞的HUVEC用3％多聚甲醛在如已描述的相同流动条件下固定2分钟。随后，将盖玻片从室内取出，在新鲜固定剂中浸没1小时，并在含0.02％叠氮钠的PBS中保存。对于形态学分析，白细胞用小鼠抗白细胞共同抗原CD45抗体染色，其中该抗体事先使用修饰的生物素化抗小鼠免疫球蛋白(Animal Research Kits，Dako，美国)标记。细胞核用苏木精(J.T Baker，荷兰)进行复染。
结果：
用IL-4和组胺组合刺激HUVEC，引起P型选凝素的表达和不同类型白细胞的粘着，其中构成粘着性白细胞的主要部分为粒细胞(包括PMN和嗜酸性粒细胞)。本发明的HuMab在3μg/ml时抑制总白细胞群体60-90％的粘着。Fc变体的总体抑制活性与未突变的HuMab的总体抑制活性相比较，没有显著差异。
P型选凝素HuMab对不同的白细胞亚型表现出差异性影响。与单核白细胞相比，对粒细胞的影响更显著。本发明的抗体抑制90-99％的粒细胞(包括PMN和嗜酸性粒细胞)粘着、50-88％的单核细胞粘着以及5-40％的淋巴细胞粘着。在图6中代表性显示IgG4v1对不同白细胞亚型的绝对数目分别的下降。
P型选凝素HuMab活化补体***的潜力
C1q和C3c结合ELISA：
使用ELISA方法测定本发明抗体诱导C1q结合和C3a活化的能力。C1q是适应性免疫的部分并且在结合免疫复合物后启动数个酶原依次活化。这些酶反过来引起C3分子切割，这可导致发生炎症反应、调理外来或异常颗粒和裂解细胞膜。
原则上，ELISA板以浓度范围内的抗体包被，将人C1q或作为C3来源的人合并血清加入该平板内。通过抗C1q或C3ε抗体及随后的过氧化物酶标记的缀合物检测C1q或C3ε的结合。
HuMab002(杂交瘤来源的材料和瞬时转染瘤来源的材料)、其突变变体及对照抗体在浓度为0.16-20μg/ml进行测试。使用极微弱结合C1q的人IgG4(CLB，荷兰，0.5μg/ml贮存)作为阴性对照。包含人IgG1(Sigma，2μg/ml贮存)作为阳性对照。为检测C1q，使用兔抗C1q抗体(Dako)和缀合辣根过氧化物酶的猪抗兔IgG抗体(Sigma)。为检测C3ε，使用小鼠抗人C3抗体和缀合辣根过氧化物酶的兔抗小鼠IgG抗体(Sigma)。
使用Graphpad Prism软件以非线性回归曲线拟合(单位点结合)计算在10μg/ml HuMab时的EC50值或最大结合(Bmax)。
结果：
如由来自杂交瘤的材料和来自瞬时转染瘤的材料的EC50值0.946μg/ml和1.159μg/ml，以及Bmax(OD405)值0.987和0.711分别显示，本发明的HuMab002能够有效地结合C1q。如所预期，由OD405的Bmax值0.222显示，人IgG4阴性对照不结合C1q。然而分别如OD405的Bmax值0.132、0.119和0.132所示(表3)，全部三种受试的Fc-变体(IgG4v1、IgG1v1、IgG1v2)均丧失结合C1q的能力。与C1q结合能力一致，C3对(来自杂交瘤和来自转染瘤)HuMab002的沉积以抗体浓度依赖方式发生，并且EC50值范围在2.7μg/ml-8.3μg/ml间。然而如由OD405Bmax值0.104、0.156和0.133分别显示(表3)，全部三种Fc-变体均不能启动C3沉积。
因为HuMab002与补体成分相互作用，所以该抗体具有内在的诱导体内(in vivo)CDC的潜力。因此，根据本发明修饰了该抗体的Fc部分。
Figure G05811205920061019D000531
P型选凝素HuMab结合Fcγ受体的潜力
IgG抗体依赖的细胞毒性效应由效应细胞上的Fcγ受体介导。通过FACS分析研究了来自杂交瘤和来自转染瘤的HuMab002以及突变变体和对照抗体对来自人血液的表达FcγR的效应细胞的结合。
材料和方法：
将FcγRI IIA1.6转化子或新鲜分离的效应细胞与抗体温育，并且用FITC标记的兔抗人IgG F(ab)2(DAKO)或FITC标记的兔抗人IgG F(ab)2(BD/Pharmingen)检测抗体结合。HuMab002(瞬时的来自转染瘤的和/或来自杂交瘤的材料以及突变变体)在浓度为1μg/ml(IIA1.6转化子)或10μg/ml(效应细胞)时进行测试。用一级抗体或人IgG4(10μg/ml)缺乏作为阴性对照。为检测IIA1.6细胞上的FcγRI表达，使用FITC标记的小鼠抗人CD64(BD/Pharmingen)。在使用已富集NK细胞的外周血单核细胞的实验中，通过使用PE标记的小鼠抗人CD56(BD/Pharmingen)的双染色鉴定NK细胞。基于FSC/SSC图谱鉴定粒细胞和单核细胞。
将IIA1.6细胞、IIA1.6-FcγRI转化子和新鲜分离的效应细胞与抗体温育。用FITC标记的Rb-α-huIgG F(ab)2(DAKO)或FITC标记的Rb-α-huIgG F(ab)2(BD/Pharmingen)检测抗体结合。
HuMab002(瞬时的来自转染瘤的材料、来自杂交瘤的材料和突变变体材料)在IIA1.6-FcγRI转化子结合鉴定法中以1μg/ml的浓度进行测试。使用IIA1.6野生型细胞作为阴性对照。使用m-α-huCD64-FITC(BD/Pharmingen)作为FcγRI表达的对照。
HuMab002(瞬时的来自转染瘤的材料、来自杂交瘤的材料和突变变体材料)在效应细胞结合鉴定法中以10μg/ml的浓度进行测试。在粒细胞结合鉴定法中不测试瞬时的转染瘤材料。使用IgG4(10μg/ml)作为在除了粒细胞结合鉴定法以外的所有其它效应细胞结合鉴定法中的阴性对照。
使用NK分离试剂盒(Dynal Biotech ASA，Oslo，挪威)富集全血中的NK细胞，通过m-α-huCD56-FITC染色鉴定NK细胞。
如NK分离试剂盒(Dynal Biotech ASA，Oslo，挪威)中包含的手册所描述，使用Ficoll方法从全血分离PBMC(外周血单核细胞)。基于FSC/SSC图谱鉴定单核细胞。使用FACS裂解缓冲液从全血分离粒细胞并且基于FSC/SSC图谱进行鉴定。
将新鲜分离的效应细胞与抗体温育，并且用FITC标记的兔抗人IgGF(ab)2(DAKO)或FITC标记的兔抗人IgG F(ab)2(BD/Pharmingen)检测抗体结合。HuMab002(瞬时的来自转染瘤的和/或来自杂交瘤的材料以及突变变体)在10μg/ml浓度下进行测试。用一级抗体或人IgG4(10μg/ml)缺乏作为阴性对照。通过NK分离试剂盒(Miltenyi Biotec，美国)从MNC样品分离NK细胞。在使用富集NK细胞的外周血单核细胞的实验中，通过使用PE标记的小鼠抗人CD56(BD/Pharmingen)的双染色鉴定NK细胞。根据本领域现有技术从PBMC(例如单核细胞分离试剂盒(参见以上Miltenyi))分离粒细胞和单核细胞。基于FSC/SSC图谱鉴定粒细胞和单核细胞。
结果：
如通过对粒细胞、单核细胞和NK细胞的结合所显示，本发明的HuMab002能够结合FcR。全部三种受试的Fc变体(IgG4v1、IgG1v1和IgG1v2)完全丧失结合NK细胞的能力(表4)。此外，HuMab002有效地结合粒细胞和单核细胞，同时如表5和表6中结合细胞的抗体的百分数所显示，该突变变体表现出与在一级抗体或人IgG4缺乏时可比的结合水平。这表明该突变变体丧失与效应细胞上的FcR相互作用的能力。
因为HuMab002可有效地与FcR相互作用，故这种抗体具有内在的诱导体内(in vivo)抗体依赖细胞毒性的潜力。本发明Fc-变体与FcR相互作用的丧失以有效方式防止了ADCC。
Figure G05811205920061019D000561

Claims (20)

1.人抗体或人源化抗体，其选自：
(a)抗体，其中轻链可变区由氨基酸序列SEQ ID NO：1定义，并且重链可变区由氨基酸序列SEQ ID NO：2定义；
(b)抗体，其中轻链可变区由氨基酸序列SEQ ID NO：3定义，并且重链可变区由氨基酸序列SEQ ID NO：4定义；
(c)抗体，其中轻链可变区由氨基酸序列SEQ ID NO：5定义，并且重链可变区由氨基酸序列SEQ ID NO：6定义；
(d)抗体，其中轻链可变区由氨基酸序列SEQ ID NO：7定义，并且重链可变区由氨基酸序列SEQ ID NO：8定义；
(e)抗体，其中轻链可变区由氨基酸序列SEQ ID NO：9定义，并且重链可变区由氨基酸序列SEQ ID NO：10定义；
(f)抗体，其中轻链可变区由氨基酸序列SEQ ID NO：11定义，并且重链可变区由氨基酸序列SEQ ID NO：12定义；
(g)抗体，其中轻链可变区由氨基酸序列SEQ ID NO：13定义，并且重链可变区由氨基酸序列SEQ ID NO：14定义；
(h)抗体，其中轻链可变区由氨基酸序列SEQ ID NO：15定义，并且重链可变区由氨基酸序列SEQ ID NO：16定义；
(i)抗体，其中轻链可变区由氨基酸序列SEQ ID NO：17定义，并且重链可变区由氨基酸序列SEQ ID NO：18定义；
(j)抗体，其中轻链可变区由氨基酸序列SEQ ID NO：19定义，并且重链可变区由氨基酸序列SEQ ID NO：20定义；和
(k)抗体，其中轻链可变区由氨基酸序列SEQ ID NO：21定义，并且重链可变区由氨基酸序列SEQ ID NO：22定义。
2.权利要求1所述的抗体，其还包含由氨基酸序列SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、或SEQ ID NO：28定义的重链恒定区。
3.权利要求1所述的抗体，其还包含由氨基酸序列SEQ ID NO：23定义的轻链恒定区。
4.权利要求1所述的抗体，其还包含由氨基酸序列SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、或SEQ ID NO：28定义的重链恒定区和由氨基酸序列SEQ ID NO：23定义的轻链恒定区。
5.权利要求1所述的抗体，其中轻链可变区由氨基酸序列SEQ ID NO：3定义，并且重链可变区由氨基酸序列SEQ ID NO：4定义。
6.权利要求5所述的抗体，其还包含由氨基酸序列SEQ ID NO：28定义的重链恒定区。
7.权利要求5所述的抗体，其还包含由氨基酸序列SEQ ID NO：23定义的轻链恒定区。
8.权利要求5所述的抗体，其还包含由氨基酸序列SEQ ID NO：28定义的重链恒定区和由氨基酸序列SEQ ID NO：23定义的轻链恒定区。
9.杂交瘤细胞系DSM ACC2640、DSM ACC2641或DSM ACC2642。
10.抗P型选凝素抗体，其获自杂交瘤细胞系DSM ACC2640、DSMACC2641或DSM ACC2642。
11.核酸分子，其编码权利要求1至8中任一项所述的抗体分子。
12.载体，其包含权利要求11的核酸分子。
13.宿主细胞，其包含权利要求12的载体。
14.用于制备权利要求1至8中任一项所述的抗体分子的方法，其包括在允许合成所述抗体分子的条件下培养权利要求13的宿主细胞以及从所述培养物回收所述抗体分子。
15.组合物，其包含权利要求1至8中任一项所述的抗体分子。
16.权利要求15的组合物，其是药物组合物或诊断用组合物。
17.药物组合物，其包含权利要求1至8中任一项所述的抗体和至少一种可药用赋形剂。
18.如权利要求1至8中任一项所述抗体的用途，用于制备预防和治疗炎性疾病和血栓性疾病的药物。
19.权利要求18的用途，用于制备治疗缩写是PAOD的周围动脉硬化闭塞症或缩写是CLI的重度肢体局部缺血的药物。
20.试剂盒，其包含权利要求1至8中任一项所述的抗体分子、权利要求11的核酸分子、权利要求12的载体或权利要求13的宿主细胞。
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