TW201335187A

TW201335187A - 抗ｌｒｐ５抗體及使用方法

Info

Publication number: TW201335187A
Application number: TW102102128A
Authority: TW
Inventors: Weilan Ye; Yan Wu; Jeremy Bryant Burton; Cecilia Chiu
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 2012-01-18
Filing date: 2013-01-18
Publication date: 2013-09-01
Also published as: NZ626520A; KR20140116490A; EP2804629A1; US10035854B2; CN104066449A; CA2862422A1; EA201491357A1; US20190010228A1; SG11201404198TA; WO2013109819A1; US20170166636A1; CN104066449B; IN2014DN05885A; IL233317A0; PH12014501605A1; BR112014017518A8; MX2014008157A; SG10201601747XA; CL2014001888A1; HK1197187A1

Abstract

本發明提供抗LRP5抗體以及其製備及使用方法。

Description

抗LRP5抗體及使用方法

本發明係關於抗LRP5抗體及其使用方法。

相關申請案之交叉參考

本申請案依據35 USC 119(e)主張2012年1月18日申請之美國臨時申請案第61/588,100號之權益，該案之內容以引用的方式併入本文中。

現已明確證實，血管生成為引起多種病症之發病機制的重要因素。此等病症包括實體腫瘤及轉移、眼內新血管疾病(諸如視網膜病變，例如糖尿病性視網膜病、視網膜靜脈阻塞(RVO)、濕性年齡相關性黃斑變性(AMD)、新血管青光眼)、移植角膜組織及其他組織之免疫排斥反應及類風濕關節炎。Duda等人，J.Clin.Oncology 25(26)：4033-42(2007)；Kesisis等人，Curr.Pharm.Des.13：2795-809(2007)；Zhang及Ma Prog.Ret.& Eye Res.26：1-37(2007)。

視網膜自向視網膜內部供血之視網膜血管及向外部供血之脈絡膜血管接受血液供給。視網膜血管損害發生於若干疾病過程中，包括糖尿病視網膜病變、早產兒視網膜病變及中心性及分支性視網膜靜脈阻塞(缺血性視網膜病變)。由此損害引起之視網膜缺血導致非所要的新血管形成。脈絡膜新血管形成發生於許多其他疾病過程中，包括AMD。相比之下，視網膜之不完全血管化為患有某些遺傳性疾病之患者的標誌，該等疾病例如有家族性滲出性玻璃體視網膜病變(familial exudative vitreoretinopathy，FEVR)、柯氏症(Coats' disease)及因Wnt受體Frizzled4(Fzd4)、共受體LRP5或所分泌配位體Norrin之突變引起的諾里氏症(Norrie disease)(Berger等人，Nature Genet.1：199-203(1992)；Chen等人，Nature Genet.1：204-208(1992)；Robitaille等人，Nature Genet.32：326-30(2002)；Toomes等人，Am.J.Hum.Genet.74：721-30(2004))。另一種蛋白質Tspan12已顯示牽涉Norrin信號傳導(Junge等人，Cell 139：299-311(2009)及WO 2010/030813)。亦報導Tspan12基因突變為FEVR之病因(Poulter等人，Invest Ophthalmol Vis Sci.14；53(6)：2873-9(2012)；Yang等人，Molecular Vision 17：1128-1135(2011)；Poulter等人，The American Journal of Human Genetics 86,248-253(2010))。此等遺傳性疾病之模型可在相應同源基因剔除之小鼠中獲得。

儘管在眼血管生成之領域內已取得多項進展，但仍需要鑑別目標及開發可補充或增強現有療法之功效的方式。

本發明提供抗LRP5抗體以及其製備及使用方法，尤其為使用其來治療與血管生成有關之病狀及疾病的方法。

在一個態樣中，本發明提供結合至低密度脂蛋白受體相關蛋白5(LRP5)之經分離抗體，其中該抗體增強Norrin活性及/或Norrin/Fzd4信號傳導。在一些實施例中，抗體為單株抗體。在一些實施例中，抗體為人類、人類化或嵌合抗體。在一些實施例中，抗體為結合LRP5之抗體片段。

在一些實施例中，抗體包含：(a)HVR-H3，包含胺基酸序列YYRYAPYRSLGMDV(SEQ ID NO：23)或其中X₁為A或R的WIPQSYPFX₁SYKSGFDY(SEQ ID NO：24)；(b)HVR-L3，包含其中 X₁為L或S的胺基酸序列QQYYX₁YPFT(SEQ ID NO：25)；及(c)HVR-H2，包含其中X₁為A或G、X₂為A或S、X₃為P或S、X₄為S或W的胺基酸序列GX₁ISX₂X₃GX₄STYYADSVKG(SEQ ID NO：26)，或SRISSNGGSTYYADSVKG(SEQ ID NO：27)。在一些實施例中，抗體包含：(a)HVR-H1，包含其中X₁為H或S的胺基酸序列GFTFSSYAMX₁(SEQ ID NO：28)；(b)HVR-H2，包含其中X₁為A或G、X₂為A或S、X₃為P或S、X₄為S或W的胺基酸序列GX₁ISX₂X₃GX₄STYYADSVKG(SEQ ID NO：26)，或SRISSNGGSTYYADSVKG(SEQ ID NO：27)；及(c)HVR-H3，包含胺基酸序列YYRYAPYRSLGMDV(SEQ ID NO：23)或其中X₁為A或R的WIPQSYPFX₁SYKSGFDY(SEQ ID NO：24)。在一些實施例中，抗體進一步包含(a)HVR-L1，包含胺基酸序列RASQGISSYLA(SEQ ID NO：29)或其中X₁為A、G、S或V、X₂為I或M、X₃為F、G、S或Y且X₄為G、S或Y的RASQX₁X₂X₃X₄YLA(SEQ ID NO：30)；(b)HVR-L2，包含胺基酸序列AASSLQS(SEQ ID NO：31)或其中X₁為S或T且X₂為L或R的DASX₁X₂ES(SEQ ID NO：32)；及(c)HVR-L3，包含其中X₁為L或S的胺基酸序列QQYYX₁YPFT(SEQ ID NO：33)。在一些實施例中，抗體包含：(a)HVR-L1，包含胺基酸序列RASQGISSYLA(SEQ ID NO：29)或其中X₁為A、G、S或V、X₂為I或M、X₃為G、F、Y或S且X₄為G、Y或S的RASQX₁X₂X₃X₄YLA(SEQ ID NO：30)；(b)HVR-L2，包含胺基酸序列AASSLQS(SEQ ID NO：31)或其中X₁為S或T且X₂為L或R的DASX₁X₂ES(SEQ ID NO：32)；及(c)HVR-L3，包含其中X₁為L或S的胺基酸序列QQYYX₁YPFT(SEQ ID NO：33)。在一些實施例中，抗體包含一或多個選自由SEQ ID NO：34至37組成之群的重鏈可變域構架序列。在一些實施例中，抗體包含：(a)VH序列，其與SEQ ID NO：1至11之一之胺基酸序列具有至少95%序列一致性；(b)VL序列，其與SEQ ID NO：12至22之一之胺基酸序列具有至少95%序列一致性；或(c)如(a)中之VH序列及如(b)中之VL序列。在一些實施例中，抗體包含SEQ ID NO：1至11之一之VH序列。在一些實施例中，抗體包含SEQ ID NO：12至22之一之VL序列。在一些實施例中，抗體包含SEQ ID NO：1至11之一之VH序列及SEQ ID NO：12至22之一之VL序列。在一些實施例中，抗體包含圖4及圖5中所示之抗體之VH及VL序列。在一些實施例中，抗體為全長IgG1抗體。

在另一態樣中，本發明提供編碼本發明抗體之經分離核酸。在一些實施例中，本發明提供包含本發明核酸之宿主細胞。在一些實施例中，本發明提供產生抗體之方法，包含培養本發明之宿主細胞以便產生抗體。在一些實施例中，該方法進一步包含自宿主細胞回收抗體。

在一些實施例中，本發明提供包含本發明抗體及細胞毒性劑之免疫結合物。在一些實施例中，本發明提供包含本發明抗體及醫藥學上可接受之載劑的醫藥調配物。在一些實施例中，醫藥調配物進一步包含另一種治療劑，例如VEGF拮抗劑(包括例如抗VEGF抗體或抗體片段，例如蘭尼單抗(ranibizumab)；可溶性VEGF受體，例如阿柏西普(aflibercept)；或適體，例如哌加他尼(pegaptanib))、Tspan12促效劑、纖維蛋白溶酶、纖維蛋白溶酶原、組織纖維蛋白溶酶原活化劑、TNF-α抑制劑及/或類固醇，例如曲安西龍(triamcinolone)或***(dexamethasone)。

在一些實施例中，本發明提供用作藥劑之本發明抗體。在一些實施例中，本發明提供用於治療視網膜病變之本發明抗體，該視網膜病變包括增生性糖尿病視網膜病變、CNV、AMD、糖尿病及其他缺血相關性視網膜病變、DME、病理性近視、馮希伯-林島氏症(von Hippel-Lindau disease)、眼組織漿菌病、CRVO、BRVO、角膜新血管形成、視網膜新血管形成、ROP、FEVR、柯氏症、諾里氏症、OPPG(骨質疏鬆-假神經膠質瘤症候群)、結膜下出血或高血壓性視網膜病變。在一些實施例中，本發明提供用於增強Norrin活性及/或Norrin/Fzd4信號傳導之本發明抗體。在一些實施例中，本發明提供用於製備藥劑之本發明抗體。在一些實施例中，藥劑係用於治療視網膜病變，包括增生性糖尿病視網膜病變、CNV、AMD、糖尿病及其他缺血相關性視網膜病變、DME、病理性近視、馮希伯-林島氏症、眼組織漿菌病、CRVO、BRVO、角膜新血管形成、視網膜新血管形成、ROP、FEVR、柯氏症、諾里氏症、OPPG(骨質疏鬆-假神經膠質瘤症候群)、結膜下出血或高血壓性視網膜病變。在一些實施例中，藥劑係用於增強Norrin活性及/或Norrin/Fzd4信號傳導。

在一些實施例中，本發明提供治療患有視網膜病變之個體的方法，該視網膜病變包括增生性糖尿病視網膜病變、CNV、AMD、糖尿病及其他缺血相關性視網膜病變、DME、病理性近視、馮希伯-林島氏症、眼組織漿菌病、CRVO、BRVO、角膜新血管形成、視網膜新血管形成、ROP、FEVR、柯氏症、諾里氏症、OPPG(骨質疏鬆-假神經膠質瘤症候群)、結膜下出血或高血壓性視網膜病變，該方法包含向該個體投與有效量之本發明抗體。在一些實施例中，方法進一步包含向個體投與有效量之另一種治療劑，例如VEGF拮抗劑(包括例如抗VEGF抗體或抗體片段，例如蘭尼單抗；可溶性VEGF受體，例如阿柏西普；或適體，例如哌加他尼)、重組NORRIN蛋白、Tspan12促效劑、纖維蛋白溶酶、纖維蛋白溶酶原、組織纖維蛋白溶酶原活化劑、TNF-α抑制劑及/或類固醇，例如曲安西龍或***。在一些實施例中，本發明提供增強個體中之Norrin活性及/或Norrin/Fzd4信號傳導的方法，包含向該個體投與有效量之本發明抗體以增強Norrin活性及/或Norrin/Fzd4信號傳導。在一些實施例中，本發明提供挽救個體中因 Norrin及/或Fzd4突變所引起之信號傳導缺陷的方法，包含投與如技術方案1之抗體。

圖1A及1B顯示抗LRP5抗體增強Norrin/Fzd4介導之信號傳導且挽救Fzd4_M157V突變。在此圖中使用字首「P6C」，而在說明書之其他處可互換地使用「YW629」。

圖2A及2B顯示抗LRP5抗體增強Norrin活性且挽救人類視網膜內皮微血管細胞(HREMVC)中之Tspan12損失。在此圖中使用字首「P6C」，而在說明書之其他處可互換地使用「YW629」。

圖3A及3B顯示抗LRP5抗體部分地挽救Tspan12基因剔除小鼠中之血管缺陷。在此圖中使用字首「P6C」，而在說明書之其他處可互換地使用「YW629」。

圖4A及4B顯示各種抗LRP5抗體之重鏈可變區序列，其中CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3被框出。此等序列之對應SEQ ID NO：如下：YW629.42(SEQ ID NO：1)、YW629.42.57(SEQ ID NO：2)、YW629.42.58(SEQ ID NO：3)、YW629.42.65(SEQ ID NO：4)、YW629.51(SEQ ID NO：5)、YW629.51.13(SEQ ID NO：6)、YW629.51.61(SEQ ID NO：7)、YW629.51.63(SEQ ID NO：8)、YW629.51.77(SEQ ID NO：9)、YW629.51.78(SEQ ID NO：10)及YW629.51.80(SEQ ID NO：11)。

圖5A及5B顯示各種抗LRP5抗體之輕鏈可變區序列，其中CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3被框出。此等序列之對應SEQ ID NO：如下：YW629.42(SEQ ID NO：12)、YW629.42.57(SEQ ID NO：13)、YW629.42.58(SEQ ID NO：14)、YW629.42.65(SEQ ID NO：15)、YW629.51(SEQ ID NO：16)、YW629.51.13(SEQ ID NO：17)、YW629.51.61(SEQ ID NO：18)、YW629.51.63(SEQ ID NO：19)、 YW629.51.77(SEQ ID NO：20)、YW629.51.78(SEQ ID NO：21)及YW629.51.80(SEQ ID NO：22)。

圖6A及6B顯示抗LRP5抗體部分地挽救與Tspan12基因剔除有關的視網膜血管缺陷。

圖7A至7C顯示抗LRP5抗體在血管視網膜疾病之氧氣誘發性視網膜病變模型中促進血管再生長且減少病理性血管生成。

圖8A至8C顯示抗LRP5抗體增強Norrin及Wnt7b信號傳導，但同時拮抗Wnt3a信號傳導。

圖9A及9B顯示抗LRP5抗體挽救配位體或受體組分之會減少受體群集之突變的信號傳導缺陷。

圖10A及10B顯示抗LRP5抗體介導之Norrin信號傳導增強(而非Wnt3a信號傳導之抑制)需要抗體為二價。

I.定義

出於本文目的，「受體人類構架」為包含來源於人類免疫球蛋白構架或人類共同構架(如以下所定義)之輕鏈可變域(VL)構架或重鏈可變域(VH)構架之胺基酸序列的構架。「來源於」人類免疫球蛋白構架或人類共同構架之受體人類構架可包含人類免疫球蛋白構架或人類共同構架之相同胺基酸序列，或其可含有胺基酸序列變化。在一些實施例中，胺基酸變化之數目為10個或10個以下、9個或9個以下、8個或8個以下、7個或7個以下、6個或6個以下、5個或5個以下、4個或4個以下、3個或3個以下、或2個或2個以下。在一些實施例中，VL受體人類構架序列與VL人類免疫球蛋白構架序列或人類共同構架序列一致。

「親和力」係指分子(例如抗體)之單一結合位點與該分子之結合搭配物(例如抗原)之間的非共價相互作用之總和之強度。除非另有說明，否則如本文所使用之「結合親和力」係指反映結合對(例如抗體與抗原)成員之間1：1相互作用之固有結合親和力。分子X對其搭配物Y之親和力一般可由解離常數(Kd)表示。可藉由此項技術中已知之常用方法(包括本文所述之方法)量測親和力。量測結合親和力之特定說明性及例示性實施例在下文中加以描述。

「親和力成熟」抗體係指相較於在一或多個高變區(HVR)中不具有一或多個變化之親本抗體，在一或多個高變區(HVR)中具有一或多個變化之抗體，此等變化使抗體對抗原之親和力得到改良。

術語「抗LRP5抗體」及「結合至LRP5之抗體」係指能夠以足夠親和力結合LRP5的抗體，因此該抗體適用作靶向LRP5之診斷劑及/或治療劑。在一個實施例中，抗LRP5抗體結合至無關之非LRP5蛋白的程度比抗體結合至LRP5之程度小約10%，如藉由例如放射免疫分析(RIA)所量測。在某些實施例中，結合至LRP5之抗體具有1 μM、100 nM、10 nM、1nM、0.1 nM、0.01 nM或0.001 nM(例如10^-8 M或小於10^-8 M，例如10^-8 M至10^-13 M，例如10^-9 M至10^-13 M)之解離常數(Kd)。在某些實施例中，抗LRP5抗體結合至LRP5之抗原決定基，該抗原決定基在不同物種之LRP5中為保守的。

術語「抗體」在本文中以最廣泛意義使用且涵蓋各種抗體結構，包括(但不限於)單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)及抗體片段，只要其展現所要抗原結合活性即可。

「抗體片段」係指非完整抗體之分子，其包含結合完整抗體所結合之抗原的完整抗體之一部分。抗體片段之實例包括(但不限於)Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')₂；雙功能抗體(diabodies)；線性抗體；單鏈抗體分子(例如scFv)；及由抗體片段形成之多特異性抗體。

與參照抗體「結合至相同抗原決定基之抗體」係指在競爭分析中將參照抗體與其抗原結合阻斷50%或50%以上之抗體，及反之，參照抗體在競爭分析中將抗體與其抗原結合阻斷50%或50%以上。本文提供一種例示性競爭分析。

術語「嵌合」抗體係指重鏈及/或輕鏈之一部分來源於特定來源或物種，而重鏈及/或輕鏈之其餘部分來源於不同來源或物種之抗體。

抗體之「類別」係指其重鏈所具有之恆定域或恆定區之類型。抗體主要存在5類：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且其中若干可進一步分為子類(同型)，例如IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁及IgA₂。對應於不同類之免疫球蛋白的重鏈穩定域分別稱為α、δ、ε、γ及μ。

如本文所用之術語「細胞毒性劑」係指抑制或防止細胞功能及/或引起細胞死亡或破壞之物質。細胞毒性劑包括(但不限於)放射性同位素(例如At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、P³²、Pb²¹²、及Lu放射性同位素)；化學治療劑或藥物(例如甲胺喋呤(methotrexate)、阿德力黴素(adriamicin)、長春花生物鹼(長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、依託泊苷(etoposide))、小紅莓(doxorubicin)、美法侖(melphalan)、絲裂黴素C(mitomycin C)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、道諾黴素(daunorubicin)或其他嵌入劑)；生長抑制劑；酶及其片段，諸如核分解酶；抗生素；毒素，諸如細菌、真菌、植物或動物來源之小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段及/或變異體；及下文所揭示之各種抗腫瘤劑或抗癌劑。

「效應功能」係指可歸因於抗體之Fc區之彼等生物活性，其隨抗體同型而變化。抗體效應功能之實例包括：C1q結合及補體依賴性細胞毒性(CDC)；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細胞表面受體(例如B細胞受體)之下調；及B細胞活化。

藥劑(例如醫藥調配物)之「有效量」係指在必需劑量下且在必需時間內有效達成所要治療或防治結果之量。

本文中之術語「Fc區」用於界定免疫球蛋白重鏈中含有至少一部分恆定區之C端區域。該術語包括原生序列Fc區及變異Fc區。在一個實施例中，人類IgG重鏈Fc區自Cys226或自Pro230延伸至重鏈之羧基端。然而，Fc區之C端離胺酸(Lys447)可能存在或可能不存在。除非本文另外說明，否則Fc區或恆定區中之胺基酸殘基的編號係根據EU編號系統，亦稱為EU索引，如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中所述。

「構架」或「FR」係指除高變區(HVR)殘基之外的可變域殘基。可變域之FR一般由4個FR結構域組成：FR1、FR2、FR3及FR4。因此，HVR及FR序列一般以以下順序出現於VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。

術語「全長抗體」、「完整抗體」及「完全抗體」在本文中可互換使用來指代結構實質上類似於天然抗體結構或具有含有如本文所定義之Fc區之重鏈的抗體。

術語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及「宿主細胞培養物」可互換使用且指已引入了外源性核酸之細胞，包括此等細胞之子代。宿主細胞包括「轉型體」及「轉型細胞」，其包括一次轉型細胞及源自其之子代(不管繼代次數)。子代之核酸含量與母細胞可能不完全相同，但可含有突變。本文包括針對原始轉型細胞所篩選或選擇之具有相同功能或生物活性之突變子代。

「人類抗體」為胺基酸序列對應於由人類或人類細胞產生或來源於利用人類抗體譜系或其他人類抗體編碼序列之非人類來源之抗體之胺基酸序列的抗體。人類抗體之此定義尤其排除包含非人類抗原結合殘基之人類化抗體。

「人類共同構架」為代表所選人類免疫球蛋白VL或VH構架序列中最常出現之胺基酸殘基的構架。一般而言，人類免疫球蛋白VL或VH序列係選自可變域序列之子群。一般而言，序列之子群為以下文獻中之子群：Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，NIH出版號91-3242,Bethesda MD(1991)，第1-3卷。在一個實施例中，對於VL而言，子群為如Kabat等人(同上文)中之子群κI。在一實施例中，對於VH而言，子群為如Kabat等人(同上文)中之子群III。

「人類化」抗體係指包含來自非人類HVR之胺基酸殘基及來自人類FR之胺基酸殘基的嵌合抗體。在某些實施例中，人類化抗體將包含至少一個且通常為兩個可變域之實質上全部，其中全部或實質上全部HVR(例如CDR)皆對應於非人類抗體之HVR，且全部或實質上全部FR皆對應於人類抗體之FR。人類化抗體視情況可包含來源於人類抗體之抗體恆定區的至少一部分。抗體(例如非人類抗體)之「人類化形式」係指已進行人類化之抗體。

如本文所用之術語「高變區」或「HVR」係指抗體可變域中在序列上高度可變及/或形成結構確定之環(「高變環」)的各區。一般而言，原生四鏈抗體包含6個HVR；3個在VH(H1、H2、H3)中且3個在VL(L1、L2、L3)中。HVR一般包含來自高變環及/或「互補決定區」(CDR)之胺基酸殘基，互補決定區具有最高序列變異性及/或涉及抗原識別。例示性高變環出現在胺基酸殘基26至32(L1)、50至52(L2)、91至96(L3)、26至32(H1)、53至55(H2)及96至101(H3)處。(Chothia及Lesk,J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。例示性CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3)出現在L1之胺基酸殘基24至34、L2之胺基酸殘基50至56、L3之胺基酸殘基89至97、H1之胺基酸殘基31至35B、H2之胺基酸殘基50至65及H3之胺基酸殘基95 至102處。(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版。Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))。除VH中之CDR1外，CDR一般包含形成高變環之胺基酸殘基。CDR亦包含「特異性決定殘基」或「SDR」，該等殘基為接觸抗原之殘基。SDR包含於CDR區域內，稱為縮寫CDR或a-CDR。例示性a-CDR(a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2及a-CDR-H3)出現在L1之胺基酸殘基31至34、L2之胺基酸殘基50至55、L3之胺基酸殘基89至96、H1之胺基酸殘基31至35B、H2之胺基酸殘基50至58及H3之胺基酸殘基95至102處。(參見Almagro及Fransson,Front.Biosci.13：1619-1633(2008))。除非另有說明，否則在本文中可變域中之HVR殘基及其他殘基(例如FR殘基)係根據Kabat等人之上述文獻進行編號。

「免疫結合物」為與一或多個異源分子(包括(但不限於)細胞毒性劑)結合之抗體。

「個體(individual或subject)」為哺乳動物。哺乳動物包括(但不限於)馴養動物(例如牛、綿羊、貓、狗及馬)、靈長類動物(例如人類及非人類靈長類動物，諸如猴)、家兔及齧齒動物(例如小鼠及大鼠)。在某些實施例中，個體為人類。

「經分離」抗體為已與其天然環境之組分分離之抗體。在一些實施例中，抗體被純化至大於95%或99%純度，如藉由例如電泳(例如SDS-PAGE、等電聚焦(IEF)、毛細管電泳)或層析(例如離子交換或逆相HPLC)所測定。關於評定抗體純度之方法的綜述，參見例如Flatman等人，J.Chromatogr.B 848：79-87(2007)。

「經分離」核酸係指已與其天然環境之組分分離之核酸分子。經分離核酸包括細胞中所含之核酸分子，該等細胞通常含有核酸分子，但該核酸分子存在於染色體外或存在於不同於其天然染色體位置之染色體位置上。

「編碼抗LRP5抗體之經分離核酸」係指編碼抗體重鏈及輕鏈(或其片段)之一或多個核酸分子，包括處於單個載體或各別載體中之該(等)核酸分子，及存在於宿主細胞中之一或多個位置上之該(等)核酸分子。

如本文所用之術語「單株抗體」係指自一群實質上均質之抗體獲得的抗體，亦即除可能之變異型抗體(例如含有天然產生之突變或在產生單株抗體製劑期間出現之變異型抗體，此等變異體通常以較小量存在)之外，構成該群體之個別抗體相同及/或結合相同抗原決定基。與通常包括針對不同決定子(抗原決定基)之不同抗體之多株抗體製劑相反，單株抗體製劑之各單株抗體係針對抗原上之單個決定子。因此，修飾語「單株」指示抗體在獲自實質上均質之抗體群體時的特徵，且不應視為需要藉由任何特定方法產生抗體。舉例而言，根據本發明使用之單株抗體可藉由多種技術製造，包括(但不限於)融合瘤法、重組DNA法、噬菌體呈現法及利用含有所有或一部分人類免疫球蛋白基因座之轉殖基因動物的方法，該等方法及用於製造單株抗體之其他例示性方法描述於本文中。

「裸抗體」係指未與異源部分(例如細胞毒性部分)或放射性標記結合之抗體。裸抗體可存在於醫藥調配物中。

「天然抗體」係指具有不同結構之天然產生之免疫球蛋白分子。舉例而言，天然IgG抗體為約150,000道爾頓之雜四聚醣蛋白，由經二硫鍵鍵結之兩條相同輕鏈及兩條相同重鏈構成。自N端至C端，各重鏈具有可變區(VH)，亦稱為可變重域或重鏈可變域，繼而為3個恆定域(CH1、CH2及CH3)。類似地，自N端至C端，各輕鏈具有可變區(VL)，亦稱為可變輕域或輕鏈可變域，繼而為恆定輕(CL)域。免疫球蛋白輕鏈可基於其恆定域之胺基酸序列歸為兩種類型中之一種，稱為κ及λ。

術語「藥品說明書」用於指市售治療產品包裝中慣常包括之說明書，其含有關於適應症、用法、劑量、投與、組合療法、禁忌症之資訊及/或關於使用該治療產品之警告。

相對於參考多肽序列之「胺基酸序列一致性百分比(%)」定義為在比對參考多肽序列與候選序列且必要時引入間隙以達成最大序列一致性百分比之後，且在不將任何保守型取代視為序列一致性之一部分的情況下，候選序列中與參考多肽序列中之胺基酸殘基一致的胺基酸殘基之百分比。可以此項技術內之多種方式，例如使用公開可得之電腦軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體，達成比對以測定胺基酸序列一致性百分比。熟習此項技術者可確定適於比對序列之參數，包括為在所比較序列之全長上達成最大對準所需要的任何演算法。然而，出於本文之目的，使用序列比較電腦程式ALIGN-2來產生胺基酸序列一致性%值。ALIGN-2序列比較電腦程式由Genentech,Inc.創作，且源程式碼已與使用說明書一起在美國版權局(U.S.Copyright Office)(Washington D.C.,20559)存檔，以美國版權登記號TXU510087登記。ALIGN-2程式可自Genentech,Inc.(South San Francisco,California)公開獲得，或可自源程式碼編譯。ALIGN-2程式應經編譯以供在UNIX操作系統(包括數位UNIX V4.0D)上使用。所有序列比較參數均由ALIGN-2程式設定且不變。

在採用ALIGN-2進行胺基酸序列比較之情況下，如下計算既定胺基酸序列A對於、與、或相對於既定胺基酸序列B之胺基酸序列一致性%(或者可稱為既定胺基酸序列A具有或包含某一對於、與、或相對於既定胺基酸序列B之胺基酸序列一致性%)： 100乘以分數X/Y其中X為在A與B之程式比對中由序列比對程式ALIGN-2評為一致匹配的胺基酸殘基數目，且其中Y為B中胺基酸殘基總數。應瞭解，若胺基酸序列A之長度不等於胺基酸序列B之長度，則A與B之胺基酸序列一致性百分比將不等於B與A之胺基酸序列一致性百分比。除非另外明確規定，否則本文中使用之所有胺基酸序列一致性百分比值均使用ALIGN-2電腦程式如前一段中所述而獲得。

術語「醫藥調配物」係指呈某種形式以允許所含活性成分之生物活性有效且不含對該調配物所投與之個體有不可接受之毒性之其他組分的製劑。

「醫藥學上可接受之載劑」係指醫藥調配物中除活性成分以外的對個體無毒之成分。醫藥學上可接受之載劑包括(但不限於)緩衝劑、賦形劑、穩定劑或防腐劑。

除非另外指明，否則如本文所用之術語「低密度脂蛋白受體相關蛋白5」或「LRP5」係指來源於任何脊椎動物之任何原生LRP5，包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類)及齧齒動物(例如小鼠及大鼠)。該術語包括未加工的「全長」LRP5以及在細胞中加工所產生之任何形式之LRP5。該術語亦包括天然存在之LRP5變異體，例如剪接變異體或對偶基因變異體。例示性人類LRP5之胺基酸序列如下：

(SEQ ID NO：42)。

如本文所用之「治療(treatment)」(及其文法變體，諸如「治療(treat)」或「治療(treating」)係指試圖改變所治療之個體的自然病程之臨床介入，且可為了預防而進行或在臨床病理學病程中進行。所要治療作用包括(但不限於)預防疾病出現或復發、緩解症狀、減少疾病之任何直接或間接病理後果、預防轉移、降低疾病進展速率、改善或減輕疾病病狀、及緩和或改善預後。在一些實施例中，本發明抗體用於延遲疾病產生或減緩疾病進展。

術語「可變區」或「可變域」係指抗體重鏈或輕鏈中參與抗體結合於抗原之域。天然抗體之重鏈及輕鏈之可變域(分別為VH及VL) 通常具有類似結構，其中各域包含4個保守構架區(FR)及3個高變區(HVR)。(參見例如Kindt等人，Kuby Immunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，第91頁(2007))。單一VH或VL域可足以賦予抗原結合特異性。此外，結合特定抗原之抗體可使用來自結合該抗原之抗體的VH或VL域分別篩選互補VL域或VH域之文庫來進行分離。參見例如Portolano等人，J.Immunol.150：880-887(1993)；Clarkson等人，Nature 352：624-628(1991)。

如本文所用之術語「載體」係指一種核酸分子，其能夠傳播其所連接之另一核酸。該術語包括呈自我複製型核酸結構(self-replicating nucleic acid structure)形式之載體以及併入其所引入之宿主細胞之基因組中的載體。某些載體能夠引導其可操作地連接之核酸之表現。此等載體在本文中稱為「表現載體」。

II.組合物及方法

在一個態樣中，本發明係部分地基於發現可增強Norrin及/或Norrin/Frizzled4信號傳導之抗體。在某些實施例中，提供結合至LRP5之抗體。本發明抗體適用於例如診斷或治療視網膜病變，包括增生性糖尿病視網膜病變、CNV、AMD、糖尿病及其他缺血相關性視網膜病變、DME、病理性近視、馮希伯-林島氏症、眼組織漿菌病、CRVO、BRVO、角膜新血管形成、視網膜新血管形成、ROP、FEVR、柯氏症、諾里氏症、OPPG(骨質疏鬆-假神經膠質瘤症候群)、結膜下出血及高血壓性視網膜病變。

A.例示性抗LRP5抗體

在一個態樣中，本發明提供結合至LRP5之經分離抗體。在某些實施例中，抗LRP5抗體增強Norrin活性及/或Norrin/Fzd4信號傳導。

在一個態樣中，本發明提供一種抗PRO抗體，包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自以下之HVR：(a)包含胺基酸序列 SEQ ID NO：28之HVR-H1；(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：26或27之HVR-H2；(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：23或24之HVR-H3；(d)包含胺基酸序列SEQ ID NO：29或30之HVR-L1；(e)包含胺基酸序列SEQ ID NO：31或32之HVR-L2；及(f)包含胺基酸序列SEQ ID NO：33之HVR-L3。

在一個態樣中，本發明提供一種抗體，包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下之VH HVR序列：(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：28的HVR-H1；(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：26或27的HVR-H2；及(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：23或24的HVR-H3。在一個實施例中，抗體包含含有胺基酸序列SEQ ID NO：23或24的HVR-H3。在另一個實施例中，抗體包含含有胺基酸序列SEQ ID NO：23或24的HVR-H3及含有胺基酸序列SEQ ID NO：33的HVR-L3。在另一個實施例中，抗體包含含有胺基酸序列SEQ ID NO：23或24的HVR-H3、含有胺基酸序列SEQ ID NO：33的HVR-L3及含有胺基酸序列SEQ ID NO：26或27的HVR-H2。在另一個實施例中，抗體包含(a)含有胺基酸序列SEQ ID NO：28的HVR-H1；(b)含有胺基酸序列SEQ ID NO：26或27的HVR-H2；及(c)含有胺基酸序列SEQ ID NO：23或24的HVR-H3。

在另一態樣中，本發明提供一種抗體，包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下之VL HVR序列：(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：29或30的HVR-L1；(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：31或32的HVR-L2；及(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：33的HVR-L3。在一個實施例中，抗體包含(a)含有胺基酸序列SEQ ID NO：29或30的HVR-L1；(b)含有胺基酸序列SEQ ID NO：31或32的HVR-L2；及(c)含有胺基酸序列SEQ ID NO：33的HVR-L3。

在另一態樣中，本發明抗體包含(a)VH域，包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下之VH HVR序列：(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO：28的HVR-H1、(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：26或27的HVR-H2及(iii)包含選自SEQ ID NO：23或24之胺基酸序列的HVR-H3；及(b)VL域，包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下之VL HVR序列：(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO：29或30的HVR-L1、(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：31或32的HVR-L2；及(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：33的HVR-L3。

在另一態樣中，本發明提供包含以下之抗體：(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：28的HVR-H1；(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：26或27的HVR-H2；(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：23或24的HVR-H3；(d)包含胺基酸序列SEQ ID NO：29或30的HVR-L1；(e)包含胺基酸序列SEQ ID NO：31或32的HVR-L2；及(f)包含選自SEQ ID NO：33之胺基酸序列的HVR-L3。

在任一上述實施例中，抗LRP5抗體可被人類化。在一個實施例中，抗LRP5抗體包含如任一上述實施例中之HVR，且進一步包含受體人類構架，例如人類免疫球蛋白構架或人類共同構架。在另一個實施例中，抗LRP5抗體包含如任一上述實施例中之HVR，且進一步包含含有FR序列的VH或VL，其中FR序列如下。對於重鏈而言，FR1包含序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(SEQ ID NO：34)，FR2包含序列WVRQAPGKGLEWV(SEQ ID NO：35)，FR3包含序列RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO：36)，FR4包含序列WGQ(SEQ ID NO：37)。對於輕鏈而言，FR1包含序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO：38)，FR2包含序列WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO：39)，FR3包含序列GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO：40)，FR4包含序列FGQGTKVEIKR(SEQ ID NO：41)。

在另一態樣中，抗LRP5抗體包含與SEQ ID NO：1至11中任一者之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的重鏈可變域(VH)序列。在某些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的VH序列相對於參考序列含有取代(例如保守性取代)、***或缺失，但包含該序列的抗LRP5抗體保留結合至LRP5的能力。在某些實施例中，在SEQ ID NO：1至11之任一者中總共有1至10個胺基酸經取代、***及/或缺失。在某些實施例中，取代、***或缺失存在於HVR外部之區域中(亦即在FR中)。視情況，抗LRP5抗體包含SEQ ID NO：1至11之任一者中的VH序列，包括該序列之轉譯後修飾。在一個特定實施例中，VH包含一個、兩個或三個選自以下之HVR：(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：28的HVR-H1，(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：26或27的HVR-H2，及(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：23或24的HVR-H3。

在另一態樣中，提供抗LRP5抗體，其中該抗體包含與SEQ ID NO：12至22之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的輕鏈可變域(VL)。在某些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的VL序列相對於參考序列含有取代(例如保守性取代)、***或缺失，但包含該序列的抗PRO抗體保留結合至PRO的能力。在某些實施例中，在SEQ ID NO：12-22中總共有1至10個胺基酸經取代、***及/或缺失。在某些實施例中，取代、***或缺失發生於HVRs外部之區域中(亦即FR中)。視情況，抗LRP5抗體包含SEQ ID NO：12至22中之VL序列，包括該序列之轉譯後修飾。在一個特定實施例中，VL包含一個、兩個或三個選自以下之HVR：(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：29或30的HVR-L1；(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：31或32的HVR-L2；及(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：33的HVR-L3。

在另一個態樣中，提供一種抗LRP5抗體，其中該抗體包含如上文所提供之任一實施例中之VH，及如上文所提供之任一實施例中之VL。在一個實施例中，抗體分別包含SEQ ID NO：1至11及SEQ ID NO：12至22之任一者中的VH及VL序列，包括該等序列之轉譯後修飾。在一些實施例中，抗體包含如下VH及VL序列：SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：12；SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：13；SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：14；SEQ ID NO：4及SEQ ID NO：15；SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：16；SEQ ID NO：6及SEQ ID NO：17；SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：18；SEQ ID NO：8及SEQ ID NO：19；SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：20；SEQ ID NO：10及SEQ ID NO：21；或SEQ ID NO：11及SEQ ID NO：22。

在另一態樣中，本發明提供與本文所提供之抗LRP5抗體結合相同抗原決定基的抗體。舉例而言，在某些實施例中，提供與抗LRP5抗體結合相同抗原決定基的抗體，該抗LRP5抗體包含SEQ ID NO：1之VH序列及SEQ ID NO：12之VL序列或包含SEQ ID NO：5之VH序列及SEQ ID NO：16之VL序列。

在本發明之另一態樣中，根據任一上述實施例之抗LRP5抗體為單株抗體，包括嵌合抗體、人類化抗體或人類抗體。在一個實施例中，抗LRP5抗體為抗體片段，例如Fv、Fab、Fab'、scFv、雙功能抗體或F(ab')₂片段。在另一實施例中，該抗體為全長抗體，例如完整IgG1抗體或如本文所定義之其他抗體類別或同型。

在另一態樣中，根據任一上述實施例之抗LRP5抗體可併入如下文章節1-7中所述之任一特徵(單一或組合)。

1.抗體親和力

在某些實施例中，本文提供之抗體具有1 μM、100 nM、10 nM、1 nM、0.1 nM、0.01 nM或0.001 nM(例如10^-8 M或小於10^-8 M，例如10^-8 M至10^-13 M，例如10^-9 M至10^-13 M)之解離常數(Kd)。

在一個實施例中，藉由放射性標記抗原結合分析(RIA)來量測Kd，該分析係用相關抗體之Fab型式及其抗原，如以下分析所述來進行。藉由在未標記抗原滴定系列存在下使Fab與最小濃度之經(¹²⁵I)標記抗原平衡，接著用經抗Fab抗體塗佈之培養盤捕獲結合抗原來量測Fab對抗原之溶液結合親和力(參見例如Chen等人，J.Mol.Biol.293：865-881(1999))。為建立分析條件，用50 mM碳酸鈉(pH 9.6)中之5 μg/ml捕捉性抗Fab抗體(Cappel Labs)將MICROTITER^®多孔盤(Thermo Scientific)塗佈隔夜，隨後在室溫(約23℃)下用PBS中之2%(w/v)牛血清白蛋白阻斷2至5小時。在無吸附劑培養盤(Nunc #269620)中，將100 pM或26 pM[¹²⁵I]抗原與連續稀釋之相關Fab混合(例如根據抗VEGF抗體Fab-12之評估，Presta等人，Cancer Res.57：4593-4599(1997))。接著培育相關Fab隔夜；然而，培育可持續較長時期(例如約65小時)以確保達到平衡。隨後，在室溫下將混合物轉移至捕捉盤中用於培育(例如1小時)。接著移除溶液且用含0.1%聚山梨醇酯20(TWEEN-20^®)之PBS將盤洗滌8次。當盤乾燥時，添加150微升/孔之閃爍體(MICROSCINT-20^TM；Packard)，且在TOPCOUNT^TM γ計數器(Packard)上對盤計數十分鐘。選擇小於或等於20%之最大結合之各Fab濃度用於競爭性結合分析。

根據另一實施例，使用表面電漿子共振分析，使用BIACORE^®-2000或BIACORE^®-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)，在25℃下，用固著抗原CM5晶片，在約10個反應單位(RU)下量測Kd。簡言之，根據供應商說明書，用N-乙基-N'-(3-二甲基胺基丙基)-碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)及N-羥基丁二醯亞胺(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物感應器晶片(CM5,BIACORE,Inc.)。用10 mM乙酸鈉(pH 4.8)稀釋抗原至5 μg/ml(約0.2 μM)，再以5微升/分鐘之流速注射，以獲得約10個反應單位(RU)之偶合蛋白。繼注射抗原之後，注射1 M乙醇胺以阻斷未反應基團。進行動力學量測時，在25℃下，以約25 μl/min之流速注射Fab於含0.05%聚山梨醇酯20(TWEEN-20^TM)界面活性劑之PBS(PBST)中的兩倍連續稀釋液(0.78 nM至500 nM)。使用簡單的一對一朗繆爾結合模型(one-to-one Langmuir binding model)(BIACORE^®評估軟體3.2版)，同時擬合締合及解離感測器圖譜來計算締合速率(k_on)及解離速率(k_off)。以k_off/k_on比率來計算平衡解離常數(Kd)。參見例如Chen等人，J.Mol.Biol.293：865-881(1999)。若藉由上述表面電漿共振分析測定之締合速率超過10⁶ M^-1s^-1，則可藉由使用螢光淬滅技術來測定締合速率，該技術量測在25℃下、在遞增濃度之抗原存在下PBS(pH 7.2)中之20 nM抗抗原抗體(Fab形式)之螢光發射強度的增加或減少(激發=295 nm；發射=340 nm，16 nm帶通)，如在分光計(諸如配備停流之分光光度計(Aviv Instruments)或具有攪拌比色管之8000系列SLM-AMINCO^TM分光光度計(ThermoSpectronic))中所量測。

2.抗體片段

在某些實施例中，本文提供之抗體為抗體片段。抗體片段包括(但不限於)Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')₂、Fv及scFv片段及下文所述之其他片段。關於某些抗體片段之綜述，參見Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)。關於scFv片段之綜述，參見例如Pluckthün,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg及Moore編，(Springer-Verlag,New York)，第269-315頁(1994)；亦參見WO 93/16185；及美國專利第5,571,894號及第5,587,458號。關於包含補救受體結合抗原決定基殘基且具有延長之活體內半衰期的Fab及F(ab')₂之論述，參見美國專利第5,869,046號。

雙功能抗體為可為二價或雙特異性之具有兩個抗原結合位點之抗體片段。參見例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)；及Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)。三功能抗體及四功能抗體亦描述於Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)中。

單域抗體為包含抗體之所有或一部分重鏈可變域或所有或一部分輕鏈可變域之抗體片段。在某些實施例中，單域抗體為人類單域抗體(Domantis,Inc.,Waltham,MA；參見例如美國專利第6,248,516 B1號)。

抗體片段可藉由多種技術製備，包括(但不限於)如本文所述之完整抗體之蛋白水解消化以及藉由重組宿主細胞(例如大腸桿菌或噬菌體)產生。

3.嵌合及人類化抗體

在某些實施例中，本文提供之抗體為嵌合抗體。某些嵌合抗體描述於例如美國專利第4,816,567號；及Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81：6851-6855(1984)中。在一個實例中，嵌合抗體包含非人類可變區(例如來源於小鼠、大鼠、倉鼠、兔或非人類靈長類動物(諸如猴)之可變區)及人類恆定區。在另一實例中，嵌合抗體為「類別轉換」抗體，其中類別或子類已自親本抗體之類別或子類改變。嵌合抗體包括其抗原結合片段。

在某些實施例中，嵌合抗體為人類化抗體。通常，對非人類抗體進行人類化以降低對人類之免疫原性，同時保留親本非人類抗體之特異性及親和力。一般而言，人類化抗體包含一或多個可變域，其中HVR(例如CDR)(或其一部分)來源於非人類抗體，且FR(或其部分)來源於人類抗體序列。人類化抗體視情況亦將包含人類恆定區之至少一部分。在一些實施例中，人類化抗體中之一些FR殘基經來自非人類抗體(例如HVR殘基所來源之抗體)之相應殘基取代，例如以恢復或改良抗體特異性或親和力。

人類化抗體及其製備方法綜述於例如Almagro及Fransson,Front.Biosci.13：1619-1633(2008)，且進一步描述於例如Riechmann等人，Nature 332：323-329(1988)；Queen等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 86：10029-10033(1989)；美國專利第5,821,337號、第7,527,791號、第6,982,321號及第7,087,409號；Kashmiri等人，Methods 36：25-34(2005)(描述SDR(a-CDR)移植)；Padlan,Mol.Immunol.28：489-498(1991)(描述「表面置換」)；Dall'Acqua等人，Methods 36：43-60(2005)(描述「FR改組」)；及Osbourn等人，Methods 36：61-68(2005)及Klimka等人，Br.J.Cancer,83：252-260(2000)(描述FR改組之「導向選擇」方法)。

可用於人類化之人類構架區包括(但不限於)：使用「最佳擬合」方法選擇的構架區(參見例如Sims等人，J.Immunol.151：2296(1993))；來源於輕鏈或重鏈可變區之特定子群的人類抗體之共同序列的構架區(參見例如Carter等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89：4285(1992)；及Presta等人，J.Immunol.,151：2623(1993))；人類成熟(體細胞突變)構架區或人類生殖系構架區(參見例如Almagro及Fransson,Front.Biosci.13：1619-1633(2008))；及篩選FR文庫所產生之構架區(參見例如Baca等人，J.Biol.Chem.272：10678-10684(1997)及Rosok等人，J.Biol.Chem.271：22611-22618(1996))。

4.人類抗體

在某些實施例中，本文提供之抗體為人類抗體。人類抗體可使用此項技術中已知之各種技術製備。人類抗體一般性描述於van Dijk及van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5：368-74(2001)及Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20：450-459(2008)中。

人類抗體可藉由向轉殖基因動物投與免疫原來製備，該轉殖基因動物已經修飾以回應於抗原攻擊而產生完整人類抗體或具有人類可變區之完整抗體。此等動物通常含有置換內源性免疫球蛋白基因座或存在於染色體外或隨機整合至動物染色體中之全部或部分人類免疫球蛋白基因座。在此等轉殖基因小鼠中，內源性免疫球蛋白基因座通常已不活化。關於由轉殖基因動物獲得人類抗體之方法的綜述，參見Lonberg,Nat.Biotech.23：1117-1125(2005)。亦參見例如描述XENOMOUSE^TM技術的美國專利第6,075,181號及第6,150,584號；描述HUMAB®技術的美國專利第5,770,429號；描述K-M MOUSE®技術的美國專利第7,041,870號，及描述VELOCIMOUSE®技術的美國專利申請公開案第US 2007/0061900號)。來自由此等動物產生之完整抗體之人類可變區可例如藉由與不同人類恆定區組合來進一步修飾。

人類抗體亦可藉由基於融合瘤之方法製備。已描述用於產生人類單株抗體之人類骨髓瘤及小鼠-人類異源骨髓瘤細胞株。(參見例如Kozbor J.Immunol.,133：3001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，第51-63頁(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；及Boerner等人，J.Immunol.,147：86(1991))。經由人類B細胞融合瘤技術產生的人類抗體亦描述於Li等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103：3557-3562(2006)中。其他方法包括例如以下文獻中描述之方法：美國專利第7,189,826號(描述自融合瘤細胞株產生單株人類IgM抗體)及Ni,Xiandai Mianyixue,26(4)：265-268(2006)(描述人類-人類融合瘤)。人類融合瘤技術(三體雜交瘤(Trioma)技術)亦描述於Vollmers及Brandlein,Histology and Histopathology,20(3)：927-937(2005)以及Vollmers及Brandlein,Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology,27(3)：185-91(2005)中。

人類抗體亦可藉由分離自人類源噬菌體呈現文庫選擇之Fv純系可變域序列產生。此等可變域序列接著可與所要人類恆定域組合。下文描述自抗體文庫選擇人類抗體之技術。

5.自文庫獲得之抗體

本發明抗體可藉由篩選組合文庫中具有所要活性之抗體來分離。舉例而言，此項技術中已知用於產生噬菌體呈現文庫及篩選此等文庫中具有所要結合特徵之抗體的多種方法。此等方法評述於例如Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology 178：1-37(O'Brien等人編，Human Press,Totowa,NJ,2001)中且進一步描述於例如McCafferty等人，Nature 348：552-554；Clackson等人，Nature 352：624-628(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.222：581-597(1992)；Marks及Bradbury,Methods in Molecular Biology 248：161-175(Lo編，Human Press,Totowa,NJ,2003)；Sidhu等人，J.Mol.Biol.338(2)：299-310(2004)；Lee等人，J.Mol.Biol.340(5)：1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34)：12467-12472(2004)；及Lee等人，J.Immunol.Methods 284(1-2)：119-132(2004)。

在某些噬菌體呈現方法中，藉由聚合酶鏈反應(PCR)分別選殖VH及VL基因之譜系且在噬菌體文庫中隨機重組，隨後可如Winter等人，Ann.Rev.Immunol.,12：433-455(1994)中所述篩選抗原結合噬菌體。噬菌體通常以單鏈Fv(scFv)片段或Fab片段形式呈現抗體片段。來自經免疫來源之文庫提供抗免疫原之高親和力抗體而無需構築融合瘤。或者，如Griffiths等人，EMBO J,12：725-734(1993)所述，可(例如自人類)選殖原生譜系以提供抗多種非自體抗原以及自體抗原之抗體的單一來源而無需任何免疫接種。最後，如Hoogenboom及Winter,J.Mol.Biol.,227：381-388(1992)所述，亦可藉由自幹細胞選殖未重排之V基因區段且使用含有隨機序列之PCR引子編碼高變CDR3區且完成活體外重排來合成製造原生文庫。描述人類抗體噬菌體文庫的專利公開案包括例如：美國專利第5,750,373號，及美國專利公開案第2005/0079574號、第2005/0119455號、第2005/0266000號、第2007/0117126號、第2007/0160598號、第2007/0237764號、第2007/0292936號及第2009/0002360號。

自人類抗體文庫分離之抗體或抗體片段在本文中視為人類抗體或人類抗體片段。

6.多特異性抗體

在某些實施例中，本文提供之抗體為多特異性抗體，例如雙特異性抗體。多特異性抗體為對至少兩個不同位點具有結合特異性之單株抗體。在某些實施例中，結合特異性之一係針對LRP5而另一個係針對其他任何抗原。在某些實施例中，另一種結合特異性係針對血管內皮生長因子(VEGF)。在某些實施例中，雙特異性抗體可結合至LRP5之兩種不同抗原決定基。雙特異性抗體亦可用於使細胞毒性劑定位於表現LRP5之細胞。雙特異性抗體可製備成全長抗體或抗體片段。

製備多特異性抗體之技術包括(但不限於)對具有不同特異性之兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對進行重組共表現(參見Milstein及Cuello,Nature 305：537(1983))；WO 93/08829；及Traunecker等人，EMBO J.10：3655(1991))及「杵臼(knob-in-hole)」工程化(參見例如美國專利第5,731,168號)。多特異性抗體亦可如下製備：工程改造靜電控制效應以製備抗體Fc雜二聚分子(WO 2009/089004A1)；使兩個或兩個以上抗體或片段交聯(參見例如美國專利第4,676,980號及Brennan等人，Science,229：81(1985))；使用白胺酸拉鏈製備雙特異性抗體(參見例如Kostelny等人，J.Immunol.,148(5)：1547-1553(1992))；使用「雙功能抗體」技術製備雙特異性抗體片段(參見例如Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90：6444-6448(1993))；及使用單鏈Fv(sFv)二聚體(參見例如Gruber等人，J.Immunol.,152：5368(1994))；及製備三特異性抗體，如例如Tutt等人J.Immunol.147：60(1991)中所述。

具有三個或三個以上功能性抗原結合位點之經工程改造抗體(包括「章魚抗體(Octopus antibody)」)亦包括在本文中(參見例如US 2006/0025576A1)。

本文之抗體或片段亦包括包含結合至LRP5以及另一不同抗原之抗原結合位點的「雙作用FAb」或「DAF」(參見例如US 2008/0069820)。

7.抗體變異體

在某些實施例中，涵蓋本文提供之抗體之胺基酸序列變異體。舉例而言，可需要改良抗體之結合親和力及/或其他生物學特性。抗體之胺基酸序列變異體可藉由將適當修飾引入編碼該抗體之核苷酸序列中或藉由肽合成進行製備。此等修飾包括例如在抗體之胺基酸序列內進行殘基之缺失及/或***及/或取代。可進行缺失、***及取代之任何組合以獲得最終構築體，其限制條件為最終構築體具有所要特徵，例如抗原結合。

a)取代、***及缺失變異體

在某些實施例中，提供具有一或多個胺基酸取代之抗體變異體。用於進行取代突變誘發之相關位點包括HVR及FR。保守性取代展示於表1中之標題「保守性取代」下。更多實質性變化提供於表1中之標題「例示性取代」下且如下文關於胺基酸側鏈類別所進一步描述。胺基酸取代可引入相關抗體中且篩選具有所要活性(例如保留/改良之抗原結合、降低之免疫原性或改良之ADCC或CDC)的產物。

胺基酸可根據共有側鏈性質進行分類：(1)疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)鹼性：His、Lys、Arg；(5)影響鏈取向之殘基：Gly、Pro；(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。

非保守性取代將需要將此等類別之一之成員換成另一類別。

一種類型之取代變異體涉及取代親本抗體(例如人類化抗體或人類抗體)之一或多個高變區殘基。一般而言，選用於進一步研究之所得變異體相對於親本抗體將在某些生物性質方面具有改進(例如改良)(例如增加之親和力、降低之免疫原性)及/或將實質上保留親本抗體之某些生物性質。一種例示性取代變異體為親和力成熟抗體，其宜使用例如基於噬菌體呈現之親和力成熟技術(諸如本文所述之技術)產生。簡言之，使一或多個HVR殘基突變且在噬菌體上呈現變異型抗體並篩選具有特定生物活性(例如結合親和力)之變異型抗體。

可在HVR中進行改變(例如取代)例如以改良抗體親和力。此等改變可在HVR「熱點(hotspot)」(亦即由在體細胞成熟過程中以高頻率發生突變之密碼子編碼之殘基)(參見例如Chowdhury,Methods Mol.Biol.207：179-196(2008))及/或SDR(a-CDR)中進行，且測試所得變異型VH或VL之結合親和力。藉由構建並自二級文庫再選擇來進行親和力成熟已描述於例如Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology 178：1-37(O'Brien等人編，Human Press,Totowa,NJ,(2001))中。在親和力成熟之一些實施例中，藉由多種方法之任一者(例如易出錯PCR、鏈改組或寡核苷酸引導之突變誘發)將多樣性引入選用於成熟之可變基因中。接著產生二級文庫。接著篩選文庫以鑑別具有所要親和力之任何抗體變異體。引入多樣性之另一方法涉及HVR引導方法，其中使若干HVR殘基(例如一次4-6個殘基)隨機化。參與抗原結合之HVR殘基可例如使用丙胺酸掃描突變誘發或模型化來逐一鑑別。尤其常以CDR-H3及CDR-L3為目標。

在某些實施例中，取代、***或缺失可發生在一或多個HVR內，只要此等改變不實質上降低抗體結合抗原之能力即可。舉例而言，可在HVR中進行不實質上降低結合親和力之保守性改變(例如如本文所提供之保守性取代)。此等改變可在HVR「熱點」或SDR之外部。在以上提供之變異型VH及VL序列之某些實施例中，各HVR未改變或含有不超過一個、兩個或三個胺基酸取代。

一種適用於鑑別抗體中可作為突變誘發目標之殘基或區域的方法稱為「丙胺酸掃描突變誘發」，如Cunningham及Wells(1989)science,244：1081-1085所述。在此方法中，鑑別出一個殘基或一組目標殘基(例如帶電荷殘基，諸如arg、asp、his、lys及glu)且置換為中性或帶負電荷胺基酸(例如丙胺酸或聚丙胺酸)以確定抗體與抗原之相互作用是否受到影響。可在對初始取代顯示功能敏感性之胺基酸位置引入其他取代。或者或另外，利用抗原-抗體複合物之晶體結構來鑑別抗體與抗原之間的接觸點。此等接觸殘基及鄰近殘基可作為取代候選物之目標或排除在取代候選物之外。可篩選變異體以確定其是否含有所要性質。

胺基酸序列***物包括長度為一個殘基至含有一百個或更多殘基之多肽之胺基及/或羧基未端融合體，以及具有單個或多個胺基酸殘基之序列內***物。末端***之實例包括具有N末端甲硫胺醯基殘基之抗體。抗體分子之其他***變異體包括抗體之N末端或C末端與酶(例如，對於ADEPT而言)或增加抗體之血清半衰期之多肽的融合體。

b)糖基化變異體

在某些實施例中，對本文提供之抗體進行改變以增加或減小抗體糖基化之程度。在抗體上添加糖基化位點或使抗體缺失糖基化位點宜藉由改變胺基酸序列以便產生或移除一或多個糖基化位點來達成。

在抗體包含Fc區之情況下，可改變連接於其之碳水化合物。由哺乳動物細胞產生之原生抗體通常包含分支雙觸角(biantennary)寡醣，其通常藉由N-鍵聯連接至Fc區之CH2域的Asn297。參見例如Wright等人TIBTECH 15：26-32(1997)。寡醣可包括各種碳水化合物，例如甘露糖、N-乙醯基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖及唾液酸，以及連接至雙觸寡醣結構之「主幹」中之GlcNAc的海藻糖。在一些實施例中，可對本發明抗體中之寡醣進行修飾以產生具有某些改良性質之抗體變異體。

在一個實施例中，提供碳水化合物結構中缺乏與Fc區連接(直接或間接)之海藻糖的抗體變異體。舉例而言，此抗體中海藻糖之量可為1%至80%、1%至65%、5%至65%或20%至40%。如例如WO 2008/077546中所述，藉由相對於與Asn 297連接之所有醣結構(例如複合、雜交及高甘露糖結構)之總和計算Asn297處糖鏈內海藻糖的平均量來測定海藻糖之量，如藉由MALDI-TOF質譜所量測。Asn297係指大致位於Fc區中位置297(Fc區殘基之Eu編號)處之天冬醯胺殘基；然而，歸因於抗體中之微小序列變化，Asn297亦可能位於位置297之上游或下游約±3個胺基酸處，亦即介於位置294與300之間。此等海藻糖基化變異體可具有改良之ADCC功能。參見例如美國專利公開案第US 2003/0157108號(Presta,L.)；US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。關於「去海藻糖化」或「海藻糖缺乏」抗體之公開案之實例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO 2005/053742；WO 2002/031140；Okazaki等人，J.Mol.Biol.336：1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人，Biotech.Bioeng.87：614(2004)。能夠產生去海藻糖化抗體之細胞株實例包括缺乏蛋白質海藻糖化的Lec13 CHO細胞(Ripka等人，Arch.Biochem.Biophys.249：533-545(1986)；美國專利申請案第US 2003/0157108 A1號，Presta,L；及WO 2004/056312 A1，Adams等人，尤其在實例11中)，及基因剔除細胞株，諸如α-1,6-海藻糖基轉移酶基因FUT8剔除CHO細胞(參見例如Yamane-Ohnuki等人，Biotech.Bioeng.87：614(2004)；Kanda,Y.等人，Biotechnol.Bioeng.,94(4)：680-688(2006)；及WO2003/085107)。

另外提供具有對分寡醣之抗體變異體，例如其中與抗體之Fc區連接之雙觸角寡醣由GlcNAc對分。此等抗體變異體可具有降低之海藻糖基化及/或改良之ADCC功能。該等抗體變異體之實例描述於例如WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)、美國專利第6,602,684號(Umana等人)及US 2005/0123546(Umana等人)中。亦提供寡醣中至少1個半乳糖殘基連接至Fc區之抗體變異體。此等抗體變異體可具有改良之CDC功能。此等抗體變異體描述於例如WO 1997/30087(Patel等人)；WO 1998/58964(Raju,S.)；及WO 1999/22764(Raju,S.)中。

c)Fc區變異體

在某些實施例中，可將一或多個胺基酸修飾引入本文提供之抗體之Fc區中，藉此產生Fc區變異體。Fc區變異體可包含在一或多個胺基酸位置包含胺基酸修飾(例如取代)之人類Fc區序列(例如人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區)。

在某些實施例中，本發明涵蓋具有一些而非所有效應功能之抗體變異體，此使得該抗體成為合乎應用需要之候選物，在該等應用中，活體內抗體半衰期較重要，而某些效應功能(諸如補體及ADCC)為不必要或有害的。可進行活體外及/或活體內細胞毒性分析以確認CDC及/或ADCC活性之降低/衰竭。舉例而言，可進行Fc受體(FcR)結合分析，以確保抗體缺乏FcγR結合能力(從而可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn結合能力。介導ADCC之初級細胞NK細胞僅表現FcγRIII，而單核細胞表現FcγRI、FcγRII及FcγRIII。FcR在造血細胞上之表現概括於Ravetch及Kinet,Annu.Rev.Immunol.9：457-492(1991)之第464頁之表3中。評估相關分子之ADCC活性之活體外分析的非限的非限制性實例描述於美國專利第5,500,362號中(參見例如Hellstrom,I.等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 83：7059-7063(1986))及Hellstrom,I等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 82：1499-1502(1985)；5,821,337(參見Bruggemann,M.等人，J.Exp.Med.166：1351-1361(1987))。或者，可使用非放射性分析方法(參見例如流動式細胞測量術之ACTI^TM非放射性細胞毒性分析(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)；及CytoTox 96^®非放射性細胞毒性分析(Promega,Madison,WI))。用於該等分析之適用效應細胞包括周圍血液單核細胞(PBMC)及天然殺手(NK)細胞。或者或另外，可在活體內，例如在動物模型(諸如在Clynes等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 95：652-656(1998)中揭示之彼動物模型)中，評估相關分子之ADCC活性。亦可進行C1q結合分析以確認抗體無法與C1q結合且因此缺乏CDC活性。參見例如WO 2006/029879及WO 2005/100402中之C1q及C3c結合ELISA。為評估補體活化，可進行CDC分析(參見例如Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods 202：163(1996)；Cragg,M.S.等人，Blood 101：1045-1052(2003)；及Cragg,M.S.及M.J.Glennie,Blood 103：2738-2743(2004))。亦可使用此項技術中已知之方法進行FcRn結合及活體內清除率/半衰期測定(參見例如Petkova,s.B.等人，Int'l.Immunol.18(12)：1759-1769(2006))。

效應功能降低之抗體包括Fc區殘基238、265、269、270、297、327及329中之一或多者經取代的抗體(美國專利第6,737,056號)。該等Fc突變體包括在胺基酸位置265、269、270、297及327中之兩者或兩者以上處具有取代之Fc突變體，包括殘基265及297取代為丙胺酸之所謂的「DANA」Fc突變體(美國專利第7,332,581號)。

與FcR之結合得到改良或減弱之某些抗體變異體已有描述。(參見例如美國專利第6,737,056號；WO 2004/056312；及Shields等人，J. Biol.Chem.9(2)：6591-6604(2001))。

在某些實施例中，抗體變異體包含具有改良ADCC之一或多個胺基酸取代，例如Fc區之位置298、333及/或334(殘基之EU編號)處之取代的Fc區。

在一些實施例中，在Fc區中產生改變，致使C1q結合及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)改變(亦即改良或削弱)，例如如美國專利第6,194,551號、WO 99/51642及Idusogie等人，J.Immunol.164：4178-4184(2000)中所述。

半衰期增加且與新生兒Fc受體(FcRn)之結合得以改良之抗體描述於US2005/0014934A1(Hinton等人)中，新生兒Fc受體負責將母體IgG轉移至胎兒(Guyer等人，J.Immunol.117：587(1976)及Kim等人，J.Immunol.24：249(1994))。此等抗體包含其中一或多個取代使Fc區與FcRn之結合改良的Fc區。此等Fc變異體包括在以下Fc區殘基中之一或多者處具有取代之Fc變異體：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如Fc區殘基434之取代(美國專利第7,371,826號)。

關於Fc區變異體之其他實例，亦參見Duncan及Winter,Nature 322：738-40(1988)；美國專利第5,648,260號；美國專利第5,624,821號；及WO 94/29351。

d)半胱胺酸工程改造抗體變異體

在某些實施例中，可能需要產生半胱胺酸工程改造抗體，例如「thioMAb」，其中抗體之一或多個殘基經半胱胺酸殘基取代。在特定實施例中，經取代之殘基存在於抗體之可達位點處。藉由用半胱胺酸取代彼等殘基，反應性硫醇基藉此定位於抗體之可達位點且可用於使抗體與其他部分(諸如藥物部分或連接子-藥物部分)結合以產生如本文中進一步描述之免疫結合物。在某些實施例中，任一或多個以下殘基可用半胱胺酸取代：輕鏈之V205(Kabat編號)；重鏈之A118(EU編號)；及重鏈Fc區之S400(EU編號)。半胱胺酸工程改造抗體可如例如美國專利第7,521,541號中所述來產生。

e)抗體衍生物

在某些實施例中，本文提供之抗體可進行進一步修飾以含有此項技術中已知且易於獲得之其他非蛋白質部分。適於衍生化抗體之部分包括(但不限於)水溶性聚合物。水溶性聚合物之非限制性實例包括(但不限於)聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚-1,3-二氧戊環、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/順丁烯二酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或無規共聚物)及葡聚糖或聚(N-乙烯吡咯啶酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙烯多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛因其於水中之穩定性而可具有製造優勢。聚合物可具有任何分子量，且可有分支或無分支。連接至抗體之聚合物數目可變化，且若連接一種以上聚合物，則該等聚合物可為相同或不同分子。一般而言，用於衍生化之聚合物數目及/或類型可基於包括(但不限於)待改良抗體之特定性質或功能，抗體衍生物是否將用於限定條件下之療法等考慮來確定。

在另一實施例中，提供抗體與可藉由暴露於輻射來選擇性加熱之非蛋白部分的結合物。在一個實施例中，非蛋白部分為碳奈米管(Kam等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102：11600-11605(2005))。此輻射可具有任一波長，且包括(但不限於)不損傷一般細胞但能將非蛋白部分加熱至可殺死抗體-非蛋白部分近側之細胞之溫度的波長。

B.重組方法及組合物

舉例而言，可使用如美國專利第4,816,567號中所述之重組法及組合物來產生抗體。在一個實施例中，提供編碼本文所述之抗LRP5抗體的分離核酸。此核酸可編碼包含VL之胺基酸序列及/或包含抗體之VH之胺基酸序列(例如抗體之輕鏈及/或重鏈)。在另一實施例中，提供一或多種包含此核酸之載體(例如表現載體)。在另一實施例中，提供包含此核酸之宿主細胞。在一此類實施例中，宿主細胞包含(例如已經以下轉型)：(1)包含核酸之載體，該核酸編碼包含抗體VL之胺基酸序列及包含抗體VH之胺基酸序列，或(2)包含編碼包含抗體VL之胺基酸序列之核酸的第一載體；及包含編碼包含抗體VH之胺基酸序列之核酸的第二載體。在一個實施例中，宿主細胞為真核細胞，例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或淋巴細胞(例如Y0、NS0、Sp20細胞)。在一個實施例中，提供一種製備抗LRP5抗體之方法，其中該方法包含在適於表現該抗體之條件下培養如上文所提供之包含編碼該抗體之核酸的宿主細胞，及視情況自該宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收該抗體。

為了重組產生抗LRP5抗體，分離編碼例如如上所述之抗體之核酸且***一或多個載體中以供在宿主細胞中進一步選殖及/或表現。此核酸可易於使用習知程序(例如使用能夠與編碼抗體之重鏈及輕鏈之基因特異性結合的寡核苷酸探針)分離及定序。

適於選殖或表現抗體編碼載體之宿主細胞包括本文所述之原核或真核細胞。舉例而言，抗體可於細菌中產生，尤其在不需要糖基化及Fc效應功能時。關於在細菌中表現抗體片段及多肽，參見例如美國專利第5,648,237號、第5,789,199號及第5,840,523號。(亦參見Charlton,Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo編，Humana Press,Totowa,NJ,2003)，第245至254頁，其描述抗體片段在大腸桿菌中之表現)。表現之後，可自細菌細胞漿中分離存於可溶性部分中的抗體且可進一步純化。

除原核生物外，諸如絲狀真菌或酵母之真核微生物為適於抗體編碼載體之選殖或表現宿主，包括真菌及酵母菌株，其糖基化路徑已經「人類化」，從而以部分或完全人類糖基化型態產生抗體。參見Gerngross,Nat.Biotech.22：1409-1414(2004)及Li等人，Nat.Biotech.24：210-215(2006)。

適於表現糖基化抗體之宿主細胞亦可自多細胞生物體(無脊椎動物及脊椎動物)獲得。無脊椎動物細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。已識別出可與昆蟲細胞聯合使用且尤其用於轉染草地黏蟲(Spodoptera frugiperda)細胞之眾多桿狀病毒病毒株。

植物細胞培養物亦可用作宿主。參見例如美國專利第5,959,177號、第6,040,498號、第6,420,548號、第7,125,978號及第6,417,429號(描述在轉殖基因植物中產生抗體的PLANTIBODIES^TM技術)。

脊椎動物細胞亦可用作宿主。舉例而言，可使用適於在懸浮液中生長之哺乳動物細胞株。有用哺乳動物宿主細胞株之其他實例為經SV40轉型之猴腎CV1細胞株(COS-7)；人類胚腎細胞株(293或293細胞，如例如Graham等人，J.Gen Virol.36：59(1977)中所述)；幼倉鼠腎細胞(BHK)；小鼠足細胞(TM4細胞，如例如Mather,Biol.Reprod.23：243-251(1980))中所述)；猴腎細胞(CV1)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76)；人類宮頸癌細胞(HELA)；犬腎細胞(MDCK)；大鼠肝細胞(BRL 3A)；人類肺細胞(W138)；人類肝細胞(Hep G2)；小鼠***腫瘤(MMT 060562)；TRI細胞，如例如Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982)中所述；MRC 5細胞；及FS4細胞。其他有用的哺乳動物宿主細胞株包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，包括DHFR^- CHO細胞(Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))；及骨髓瘤細胞株，諸如Y0、NS0及Sp2/0。關於適於產生抗體之某些哺乳動物宿主細胞株的綜述，參見例如Yazaki及Wu,Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo編，Humana Press,Totowa,NJ,2003)，第255-268頁。

C.分析

本文提供之抗LRP5抗體可藉由此項技術中已知之各種分析、針對其物理/化學性質及/或生物學活性進行鑑別、篩選或表徵。

1.結合分析及其他分析

在一個態樣中，測試本發明抗體之抗原結合活性，例如藉由已知方法(諸如ELISA、西方墨點法等)測試。

在另一態樣中，可利用競爭性分析鑑別與YW629.42或YW629.51競爭結合至LRP5的抗體。在某些實施例中，此競爭性抗體結合的抗原決定基(例如線性或構形抗原決定基)與YW629.42或YW629.51結合的抗原決定基相同。用於對抗體所結合之抗原決定基進行定位之詳細例示性方法提供於Morris(1996)「Epitope Mapping Protocols」,Methods in Molecular Biology vol.66(Humana Press,Totowa,NJ)中。

在例示性競爭分析中，在溶液中培育固定之LRP5，該溶液包含結合至LRP5的第一標記抗體(例如YW629.42或YW629.51)及正欲測試與第一抗體競爭結合至LRP5之能力的第二未標記抗體。第二抗體可存在於融合瘤上清液中。作為對照，在包含第一標記抗體、但未包含第二未標記抗體的溶液中培育固定之LRP5。在允許第一抗體結合至LRP5的條件下培育之後，移除過量的未結合抗體，且量測與固定之LRP5締合之標記量。若測試樣品中與固定之LRP5締合之標記量相對於對照樣品實質上減少，則此表示第二抗體與第一抗體競爭結合至LRP5。參見Harlow及Lane(1988)Antibodies：A Laboratory Manual第14章(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)。

2.活性分析

在一個態樣中，提供鑑別具有生物活性之抗LRP5抗體的分析。生物活性可包括例如結合至LRP5、增強Norrin活性或增強Norrin/Fzd4信號傳導。亦提供在活體內及/或在活體外具有此生物活性之抗體。

在某些實施例中，測試本發明抗體之此生物活性。在一個例示性Wnt/Norrin活化分析中，在293T細胞中用Topflash螢光素酶報導質體短暫表現LRP5及Fzd4蛋白或相關變異體(亦即Fzd4_M157V)。使表現此等蛋白質之細胞暴露於Norrin或Wnt配位體且在37℃培育16小時之後，藉由量測螢光素酶發光量來確定活化程度。若藉由在LRP5抗體存在下添加配位體而使發光量實質上增加，則此表示抗體增強Fzd4/Norrin信號傳導。在使用Fzd4_M157V時(在Norrin存在下已減弱信號傳導)，在LRP5抗體存在下發光增強被視為挽救Fzd4信號傳導之不足。

在另一種Wnt/Norrin活化分析中，可使所培養之人類視網膜內皮細胞在LRP5抗體或對照抗體存在下暴露於Norrin或Wnt配位體24至48小時，且可藉由定量RT-PCR測定已知Wnt報導基因(亦即Axin-2或PV-1)之含量。在對照抗體情形中，在添加Norrin及Wnt配位體之後，相對於不添加配位體，Axin-2 RNA之量將增加，而PV-1 RNA之量將降低。若存在LRP5抗體，則增強Norrin信號傳導會造成Axin-2進一步增加，而相反地PV-1進一步降低。亦可對於用siRNA處理以降低Tspan12表現的細胞進行此分析。在Tspan12表現減少的細胞中，在Norrin存在下Axin-2無變化。若LRP5抗體(而非對照抗體)能夠在無Tspan12表現下引起Axin-2增加，則此抗體視為可挽救因Tspan12喪失所引起之Fzd4/Norrin信號傳導之缺陷。

D.免疫結合物

本發明亦提供包含本文之抗LRP5抗體與一或多種細胞毒性劑結合之免疫結合物，該等細胞毒性劑諸如化學治療劑或藥物、生長抑制劑、毒素(例如蛋白質毒素；細菌、真菌、植物或動物來源之酶活性毒素；或其片段)、或放射性同位素。

在一個實施例中，免疫結合物為抗體-藥物結合物(ADC)，其中抗體結合至一或多種藥物，包括(但不限於)類美登素(maytansinoid)(參見美國專利第5,208,020號、第5,416,064號及歐洲專利EP 0 425 235 B1)；奧利斯塔汀(auristatin)，諸如單甲基奧利斯塔汀藥物部分DE及DF(MMAE及MMAF)(參見美國專利第5,635,483號及第5,780,588號，及第7,498,298號)；海兔毒素(dolastatin)；卡奇黴素(calicheamicin)或其衍生物(參見美國專利第5,712,374號、第5,714,586號、第5,739,116號、第5,767,285號、第5,770,701號、第5,770,710號、第5,773,001號及第5,877,296號；Hinman等人，Cancer Res.53：3336-3342(1993)；及Lode等人，Cancer Res.58：2925-2928(1998))；蒽環黴素(anthra-cycline)，諸如道諾黴素(daunomycin)或阿黴素(doxorubicin)(參見Kratz等人，Current Med.Chem.13：477-523(2006)；Jeffrey等人，Bioorganic & Med.Chem.Letters 16：358-362(2006)；Torgov等人，Bioconj.Chem.16：717-721(2005)；Nagy等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：829-834(2000)；Dubowchik等人，Bioorg.& Med.Chem.Letters 12：1529-1532(2002)；King等人，J.Med.Chem.45：4336-4343(2002)；及美國專利第6,630,579號)；甲胺喋呤(methotrexate)；長春地辛(vindesine)；紫杉烷，諸如多西他賽(docetaxel)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、拉羅他賽(larotaxel)、替司他賽(tesetaxel)及奧他賽(ortataxel)；新月毒素(trichothecene)；及CC1065。

在另一實施例中，免疫結合物包含如本文所述之抗體與酶活性毒素或其片段之結合物，該等毒素或其片段包括(但不限於)白喉(diphtheria)A鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素(exotoxin)A鏈(來自綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa))、篦麻毒素(ricin)A鏈、相思子毒素(abrin)A鏈、莫迪素(modeccin)A鏈、α帚麴菌素(alpha- sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素(dianthin)蛋白、洋商陸(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制劑、麻瘋樹毒蛋白(curcin)、巴豆毒素(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制劑、白樹素(gelonin)、有絲***素(mitogellin)、侷限麴菌素(restrictocin)、酚黴素(phenomycin)、伊諾黴素(enomycin)及新月毒素(tricothecene)。

在另一實施例中，免疫結合物包含如本文所述之抗體與放射性原子結合而形成的放射性結合物。多種放射性同位素可用於產生放射性結合物。實例包括At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、P³²、Pb²¹²及Lu之放射性同位素。當放射性結合物用於偵測時，其可包含用於閃爍攝影研究之放射性原子，例如tc99m或I123；用於核磁共振(NMR)成像(亦稱為磁共振成像，mri)之自旋標記，諸如再次碘-123、碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳或鐵。

抗體與細胞毒性劑之結合物可使用多種雙官能蛋白質偶合劑製備，諸如N-丁二醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)、丁二醯亞胺基-4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸酯(SMCC)、亞胺基硫雜環戊烷(IT)、亞胺基酯之雙官能衍生物(諸如二亞胺代己二酸二甲酯鹽酸鹽)、活性酯(諸如辛二酸二丁二醯亞胺基酯)、醛(諸如戊二醛)、雙疊氮基化合物(諸如雙(對疊氮基苯甲醯基)己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙-(對二重氮苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2,6-二異氰酸酯)、及雙活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。舉例而言，蓖麻毒素免疫毒素可如Vitetta等人，Science,238：1098(1987)中所述來製備。碳14標記之1-異硫氰氧基苯甲基-3-甲基二伸乙三胺五乙酸(MX-DTPA)為一種用於使放射性核苷酸與抗體結合之例示性螯合劑。參見WO94/11026。連接子可為有助於細胞毒性藥物在細胞中釋放之「可裂解連接子」。舉例而言，可使用酸不穩定性連接子、肽酶敏感性連接子、光不穩定性連接子、二甲基連接子或含有二硫化物之連接子(Chari等人，Cancer Res.52：127-131(1992)；美國專利第5,208,020號)。

本文之免疫結合物或ADC明確涵蓋(但不限於)用以下可購得(例如自Pierce Biotechnology,Inc.,Rockford,IL.,U.S.A購得)之交聯試劑製備的此等結合物，該等交聯試劑包括(但不限於)BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、sulfo-EMCS、sulfo-GMBS、sulfo-KMUS、sulfo-MBS、sulfo-SIAB、sulfo-SMCC及sulfo-SMPB、及SVSB(丁二醯亞胺基-(4-乙烯基碸)苯甲酸酯)。

E.用於診斷及偵測之方法及組合物

在某些實施例中，本文提供之任一種抗LRP5抗體適用於偵測生物樣品中LRP5之存在。如本文所用之術語「偵測」涵蓋定量或定性偵測。在某些實施例中，生物樣品包含細胞或組織，諸如眼組織，包括視網膜組織。

在一個實施例中，提供用於診斷或偵測方法中的抗LRP5抗體。在另一個態樣中，提供偵測生物樣品中LRP5之存在的方法。在某些實施例中，方法包含使生物樣品與如本文所述之抗LRP5抗體在允許抗LRP5抗體結合至LRP5的條件下接觸，及偵測抗LRP5抗體與LRP5之間是否形成複合物。此方法可為活體外或活體內方法。在一個實施例中，抗LRP5抗體用於選擇適於用抗LRP5抗體治療的個體，例如其中LRP5為用於選擇患者之生物標記。

可使用本發明抗體診斷之例示性病症包括視網膜病變，包括增生性糖尿病視網膜病變、CNV、AMD、糖尿病及其他缺血相關性視網膜病變、DME、病理性近視、馮希伯-林島氏症、眼組織漿菌病、 CRVO、BRVO、角膜新血管形成、視網膜新血管形成、ROP、FEVR、柯氏症、諾里氏症、OPPG(骨質疏鬆-假神經膠質瘤症候群)、結膜下出血及高血壓性視網膜病變。

在某些實施例中，提供經標記之抗LRP5抗體。標記包括(但不限於)直接偵測之標記或部分(諸如螢光標記、發色標記、電子緻密標記、化學發光標記及放射性標記)、以及間接偵測(例如經由酶促反應或分子相互作用)之部分(諸如酶或配位體)。例示性標記包括(但不限於)放射性同位素³²P、¹⁴C、¹²⁵I、³H及¹³¹I；螢光團，諸如稀土螯合物或螢光素(fluorescein)及其衍生物；若丹明(rhodamine)及其衍生物；丹醯基(dansyl)；傘酮(umbelliferone)；螢光素酶，例如螢火蟲螢光素酶及細菌螢光素酶(美國專利第4,737,456號)；螢光素(luciferin)；2,3-二氫酞嗪二酮；辣根過氧化酶(HRP)；鹼性磷酸酶；β-半乳糖苷酶；葡糖澱粉酶；溶菌酶；醣氧化酶，例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶及葡萄糖-6-磷酸脫氫酶；雜環氧化酶，諸如尿酸酶及黃嘌呤氧化酶，以及使用過氧化氫來氧化染料前驅物之酶(諸如HRP、乳過氧化酶或微過氧化酶)；生物素/抗生物素蛋白；自旋標記；噬菌體標記；穩定自由基及其類似物。

F.醫藥調配物

如本文所述之抗LRP5抗體之醫藥調配物係藉由混合具有所要純度之該抗體與一或多種視情況選用之醫藥學上可接受之載劑(Remington's Pharmaceutical Sciences第16版，Osol,A.編(1980))而製備成凍乾調配物或水溶液形式。醫藥學上可接受之載劑在所用劑量及濃度下對接受者通常無毒，且包括(但不限於)：緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如氯化十八烷基二甲基苯甲基銨；氯化六羥季銨(hexamethonium chloride)；氯化苯甲烴銨(benzalkonium chloride)；苄索氯銨(benzethonium chloride)；苯酚；丁醇或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(少於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖，諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽相對離子，諸如鈉；金屬錯合物(例如Zn-蛋白質錯合物)；及/或非離子型界面活性劑，諸如聚乙二醇(PEG)。本文之例示性醫藥學上可接受之載劑進一步包括間質性藥物分散劑，諸如可溶性中性活性玻尿酸酶醣蛋白(sHASEGP)，例如人類可溶性PH-20玻尿酸酶醣蛋白，諸如rHuPH20(HYLENEX^®,Baxter International,Inc.)。某些例示性sHASEGP及使用方法(包括rHuPH20)描述於美國專利公開案第2005/0260186號及第2006/0104968號中。在一態樣中，sHASEGP與一或多種其他葡萄糖胺聚糖(諸如硫酸軟骨素酶)組合。

例示性凍乾抗體調配物描述於美國專利第6,267,958號中。水性抗體調配物包括美國專利第6,171,586號及WO2006/044908中所述之彼等物，後者調配物包括組胺酸乙酸鹽緩衝液。

本文之調配物亦可含有一種以上為所治療之特定適應症所必需的活性成分，較佳為具有不會對彼此產生不利影響之補充性活性的活性成分。舉例而言，可能需要進一步提供VEGF拮抗劑(包括例如抗VEGF抗體或抗體片段，例如蘭尼單抗、可溶性VEGF受體或其片段，例如阿柏西普，或適體，例如哌加他尼)、Tspan12促效劑、纖維蛋白溶酶、纖維蛋白溶酶原、組織纖維蛋白溶酶原活化劑、曲安西龍、TNF-α抑制劑及/或***。此等活性成分適合以有效達成預定目的之量組合存在。

活性成分可嵌埋於例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合所製備之微膠囊中，例如分別為羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊，嵌埋於膠狀藥物傳遞系統(例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米粒子及奈米囊劑)中或嵌埋於***液中。該等技術揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences第16版，Osol,A.編(1980)中。

可製備持續釋放製劑。持續釋放型製劑之適合實例包括含有抗體之固體疏水性聚合物的半透性基質，此等基質呈成形物品(例如薄膜或微膠囊)之形式。

欲用於活體內投藥之調配物通常無菌。無菌可容易實現，例如藉由無菌過濾膜過濾。

G.治療方法及組合物

本文提供之任一種抗LRP5抗體可用於治療方法中。

在一個態樣中，提供用作藥劑之抗LRP5抗體。在其他態樣中，提供用於治療視網膜病變之抗LRP5抗體，該視網膜病變包括增生性糖尿病視網膜病變、CNV、AMD、糖尿病及其他缺血相關性視網膜病變、DME、病理性近視、馮希伯-林島氏症、眼組織漿菌病、CRVO、BRVO、角膜新血管形成、視網膜新血管形成、ROP、FEVR、柯氏症、諾里氏症、OPPG(骨質疏鬆-假神經膠質瘤症候群)、結膜下出血及高血壓性視網膜病變。在某些實施例中，提供治療方法中使用的抗LRP5抗體。在某些實施例中，本發明提供治療個體之方法中使用的抗LRP5抗體，該個體患有視網膜病變，包括增生性糖尿病視網膜病變、CNV、AMD、糖尿病及其他缺血相關性視網膜病變、DME、病理性近視、馮希伯-林島氏症、眼組織漿菌病、CRVO、BRVO、角膜新血管形成、視網膜新血管形成、ROP、FEVR、柯氏症、諾里氏症、OPPG(骨質疏鬆-假神經膠質瘤症候群)、結膜下出血或高血壓性視網膜病變，該方法包含向該個體投與有效量之抗LRP5抗體。在一個此類實施例中，該方法進一步包含投與該個體有效量之至少一種其他治療劑，例如，如下文所述。在其他實施例中，本發明提供用於增強Norrin活性及/或增強Norrin/Fzd4信號傳導的抗LRP5抗體。在某些實施例中，本發明提供使個體中之Norrin活性增強及/或使Norrin/Fzd4信號傳導增強的方法中使用的抗LRP5抗體，該方法包含向個體投與有效量之抗LRP5抗體以增強Norrin活性及/或增強Norrin/Fzd4信號傳導。根據任一上述實施例之「個體」較佳為人類。

在另一態樣中，本發明提供抗LRP5抗體用於製造或製備藥劑的用途。在一個實施例中，該藥劑係用於治療視網膜病變，包括增生性糖尿病視網膜病變、CNV、AMD、糖尿病及其他缺血相關性視網膜病變、DME、病理性近視、馮希伯-林島氏症、眼組織漿菌病、CRVO、BRVO、角膜新血管形成、視網膜新血管形成、ROP、FEVR、柯氏症、諾里氏症、OPPG(骨質疏鬆-假神經膠質瘤症候群)、結膜下出血或高血壓性視網膜病變。在另一個實施例中，藥劑係用於治療視網膜病變之方法中，該視網膜病變包括增生性糖尿病視網膜病變、CNV、AMD、糖尿病及其他缺血相關性視網膜病變、DME、病理性近視、馮希伯-林島氏症、眼組織漿菌病、CRVO、BRVO、角膜新血管形成、視網膜新血管形成、ROP、FEVR、柯氏症、諾里氏症、OPPG(骨質疏鬆-假神經膠質瘤症候群)、結膜下出血或高血壓性視網膜病變，該方法包含向患有包括以下之視網膜病變之個體投與有效量之該藥劑：增生性糖尿病視網膜病變、CNV、AMD、糖尿病及其他缺血相關性視網膜病變、DME、病理性近視、馮希伯-林島氏症、眼組織漿菌病、CRVO、BRVO、角膜新血管形成、視網膜新血管形成、ROP、FEVR、柯氏症、諾里氏症、OPPG (骨質疏鬆-假神經膠質瘤症候群)、結膜下出血或高血壓性視網膜病變。在一個此類實施例中，該方法進一步包含投與該個體有效量之至少一種其他治療劑，例如，如下文所述。在另一個實施例中，藥劑係用於增強Norrin活性及/或增強Norrin/Fzd4信號傳導。在另一個實施例中，藥劑係用於使個體中之Norrin活性增強及/或使Norrin/Fzd4信號傳導增強的方法，該方法包含向個體投與有效量之藥劑以增強Norrin活性及/或增強Norrin/Fzd4信號傳導。根據任一上述實施例之「個體」可為人類。

在另一個態樣中，本發明提供用於治療視網膜病變的方法，該視網膜病變包括增生性糖尿病視網膜病變、CNV、AMD、糖尿病及其他缺血相關性視網膜病變、DME、病理性近視、馮希伯-林島氏症、眼組織漿菌病、CRVO、BRVO、角膜新血管形成、視網膜新血管形成、ROP、FEVR、柯氏症、諾里氏症、OPPG(骨質疏鬆-假神經膠質瘤症候群)、結膜下出血及高血壓性視網膜病變。在一個實施例中，方法包含向患有此視網膜病變之個體投與有效量之抗LRP5抗體，該視網膜病變包括增生性糖尿病視網膜病變、CNV、AMD、糖尿病及其他缺血相關性視網膜病變、DME、病理性近視、馮希伯-林島氏症、眼組織漿菌病、CRVO、BRVO、角膜新血管形成、視網膜新血管形成、ROP、FEVR、柯氏症、諾里氏症、OPPG(骨質疏鬆-假神經膠質瘤症候群)、結膜下出血或高血壓性視網膜病變。在一此類實施例中，方法進一步包含向個體投與有效量之至少一種如下文所述之其他治療劑。根據任一上述實施例之「個體」可為人類。

在另一個態樣中，本發明提供使個體中之Norrin活性增強及/或使Norrin/Fzd4信號傳導增強的方法。在一個實施例中，方法包含向個體投與有效量之抗LRP5抗體以增強Norrin活性及/或增強Norrin/Fzd4信號傳導。在一個實施例中，「個體」為人類。

在另一態樣中，本發明提供包含本文所提供之任何抗LRP5抗體之醫藥調配物，其例如用於任何上述治療方法中。在一個實施例中，醫藥調配物包含本文提供之任一種抗LRP5抗體及醫藥學上可接受之載劑。在另一個實施例中，醫藥調配物包含本文提供之任一種抗LRP5抗體及至少一種另一種例如如下文所述的治療劑。

本發明抗體可單獨或與其他藥劑組合用於療法中。舉例而言，本發明抗體可與至少一種其他治療劑共投藥。在某些實施例中，另一種治療劑為VEGF拮抗劑(包括例如抗VEGF抗體或抗體片段，例如蘭尼單抗、可溶性VEGF受體或其片段，例如阿柏西普，或適體，例如哌加他尼)、Tspan12促效劑、纖維蛋白溶酶、纖維蛋白溶酶原、組織纖維蛋白溶酶原活化劑、曲安西龍、TNF-α抑制劑及/或***。

上述該等組合療法涵蓋組合投藥(其中兩種或兩種以上治療劑包括在同一或各別調配物中)，及分別投藥，在此情況下，本發明抗體之投與可在其他治療劑及/或佐劑投與之前、同時及/或之後進行。

本發明抗體(及任何其他治療劑)可藉由任何適合方式投與，包括非經腸、肺內及鼻內，及在需要局部治療時之眼內投藥(例如玻璃體內投藥)。非經腸輸液包括肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下投藥。可藉由任何適合途徑給藥，例如藉由注射，諸如玻璃體內，此部分地視投藥為暫時或為長期而定。本文涵蓋多種給藥時程，包括(但不限於)在多個時間點單次或多次投與、團式投與及脈衝輸注。

本發明之抗體將以符合良好醫療實務之方式加以調配、給藥及投與。在此背景下考慮之因素包括所治療之特定病症、所治療之特定哺乳動物、個別患者之臨床病狀、病症之起因、藥劑之傳遞位點、投藥方法、投藥時程及從業醫生已知之其他因素。抗體無需但視情況可與一或多種當前用於預防或治療所述病症之藥劑一起調配。該等其他藥劑之有效量視調配物中存在之抗體之量、病症或治療之類型以及其他上述因素而定。該等藥劑通常以相同劑量且利用本文中所述之投藥途徑使用，或以本文中所述劑量之約1%至99%使用，或以任意劑量且憑經驗/臨床上確定為適當的任何途徑使用。

為預防或治療疾病，本發明抗體之適當劑量(當單獨或與一或多種其他額外治療劑組合使用時)將視以下而定：所治療疾病之類型、抗體類型、疾病之嚴重度及病程、投與抗體以達成預防抑或治療目的、先前療法、患者之臨床病史及對抗體之反應以及主治醫師之判斷。抗體適於一次性或經一系列治療投與患者。無論藉由一或多次各別投藥，或藉由連續輸注，視疾病類型及嚴重程度而定，抗體投與患者的初始候選劑量為例如約1 μg/kg至15 mg/kg(例如0.1 mg/kg-10 mg/kg)。一種典型日劑量的範圍可為約1 μg/kg至100 mg/kg或高於100 mg/kg劑量，此視上述因素而定。對於歷經數天或更長時間的重複投藥，治療視病狀而定通常可持續至疾病症候群發生所要抑制為止。抗體之一種例示性劑量在約0.05 mg/kg至約10 mg/kg之範圍內。因此，可將約0.5 mg/kg、2.0 mg/kg、4.0 mg/kg或10 mg/kg中之一或多個劑量(或其任何組合)投與患者。該等劑量可間歇地投與，例如每週或每三週(例如使得患者接受約二至約二十或例如約六個劑量的抗體)。初始可投與較高負荷劑量，隨後可投與一或多個較低劑量。然而，其他給藥方案可為適用的。此療法之進程易於藉由習知技術及分析監控。

應瞭解，任何上述調配物或治療方法均可使用本發明之免疫結合物(替代抗LRP5抗體或除抗LRP5抗體之外)來進行。

H.製品

在本發明之另一態樣中，提供一種含有適用於治療、預防及/或診斷上述病症之物質的製品。該製品包含容器及貼於該容器上或該容器隨附之標籤或包裝說明書。適合容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。該等容器可由諸如玻璃或塑膠之多種材料形成。容器容納組合物自身或與可有效治療、預防及/或診斷病狀之另一組合物組合之組合物，且可具有無菌進入口(例如容器可為具有可由皮下注射針刺穿之塞子的靜脈內溶液袋或小瓶)。組合物中之至少一種活性劑為本發明之抗體。標籤或包裝說明書指示該組合物用於治療所選病狀。此外，該製品可包含(a)內含組合物的第一容器，其中該組合物包含本發明之抗體；及(b)內含組合物的第二容器，其中該組合物包含另一種細胞毒性劑或治療劑。本發明之實施例中的製品可進一步包含指示組合物可用於治療特定病狀的包裝說明書。或者或另外，該製品可進一步包含含有醫藥學上可接受之緩衝液(諸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)及葡萄糖溶液)的第二(或第三)容器。其可進一步包括就商業及使用者觀點而言所需之其他物質，包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針及注射器。

應瞭解，任一上述製品可包括本發明之免疫結合物(替代抗LRP5抗體或除抗LRP5抗體之外)。

III.實例

以下為本發明方法及組合物之實例。應瞭解，考慮到上文提供之一般說明，可實施各種其他實施例。

實例1：產生抗LRP5抗體 文庫分選及篩選以鑑别抗LRP5-E3/E4抗體

產生若干LRP5表現構築體，包括編碼整個胞外區、所有四個β-推進器域E1-4、各單獨β-推進器域及E3-E4的彼等構築體，且發現僅編碼E3-E4域之純系產生大量的所表現之可溶性蛋白質。因此，使用內部產生的經生物素標記之人類LRP5域E3-E4(SEQ ID NO：42之E644-Q1263)作為抗原用於文庫分選。Nunc 96孔Maxisorp®免疫盤在4℃下用NeutrAvidin®(Fisher Scientific,#89890,10 μg/ml)或抗生蛋白鏈菌素(Fisher Scientific,#21125,10 μg/ml)塗佈隔夜且在室溫下用噬菌體阻斷緩衝液PBST(磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)及1%(w/v)牛血清白蛋白(BSA)及0.05%(v/v)吐溫(tween)20)阻斷1小時。經生物素標記之LRP5-E3/E4(10 μg/ml)接著在室溫下藉由NeutrAvidin®/抗生蛋白鏈菌素捕捉至盤上持續1小時。人類抗體之合成噬菌體文庫(參見例如Lee等人，J.Immunol.Meth.284：119-132,2004；Liang等人，J.Molec.Biol.366：815-829,2007)各別地添加至抗原盤中且在室溫下培育隔夜。次日，對塗佈抗原之盤以PBT(具有0.05% Tween® 20之PBS)洗滌十次，且所結合之噬菌體以50 mM HCl及500 mM NaCl溶離30分鐘且以相等體積之1 M Tris鹼(pH 7.5)中和。所回收之噬菌體在大腸桿菌XL-1 Blue細胞中擴增。在隨後幾輪選擇期間，將抗體噬菌體與塗佈抗原之盤之培育縮短至2-3小時，且逐漸增強盤洗滌之嚴格度。

在6輪淘選後，觀測到顯著富集。自文庫軌跡各選出96個純系以確定其是否特異性結合至人類LRP5E3/E4。對此等純系之可變區進行PCR定序以鑑別獨特序列純系。

對噬菌體上清液按1：5稀釋於ELISA(酶聯免疫吸附分析)緩衝液(具有0.5% BSA、0.05% Tween® 20之PBS)中，總體積為100 μl，且轉移至塗佈目標蛋白質之盤(1 μg/ml LRP5E3/E4直接塗佈隔夜)或塗佈中性鏈親和素/抗生蛋白鏈菌素之盤(5 μg/ml各蛋白質)中。將盤輕緩振盪1小時以允許噬菌體結合至塗佈蛋白質之盤。對盤用PBS-0.05% Tween® 20洗滌十次。藉由添加含有結合辣根過氧化酶(HRP)之抗M13抗體之ELISA緩衝液(1：5000)且在室溫下培育30分鐘來定量結合。對盤用PBS-0.05% Tween® 20洗滌十次。接著，向孔中每孔添加100微升1：1比率之3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(TMB)過氧化酶受質及過氧化酶溶液B(H₂O₂)(Kirkegaard-Perry Laboratories(Gaithersburg,MD))且在室溫下培育5分鐘。藉由向各孔中添加100 μl 0.1 M磷酸(H₃PO₄)且在室溫下培育5分鐘來中止反應。在450 nm下使用標準ELISA盤讀取器測定各孔中之黃色OD(光學密度)。利用以下方程式計算OD降低率(%)。

OD_450nm降低率(%)=[(具有競爭劑之孔之OD_450nm)/(無競爭劑之孔之OD_450nm)]*100

選出對LRP5E3/E4之OD_450nm比背景高至少5倍的純系且藉由將個別純系之V_L及V_H區域分別選殖於LPG3及LPG4載體中而重組成全長人類IgG1。此等純系隨後在哺乳動物CHO細胞中短暫表現，且用蛋白質A管柱純化。

構築體文庫及用於親和力改良來源於合成噬菌體文庫之純系的淘選策略

針對在基於細胞之分析中有望顯示活性的各純系YW629.42及YW629.51，產生在CDR L3中含有4個終止密碼子(TAA)且在M13噬菌體表面上呈現單價Fab的噬菌粒。此等噬菌粒充當Kunkel突變誘發之模板以便構建親和力成熟文庫。在親和力成熟中使用軟隨機化策略，其中使用偏向野生型核苷酸之鹼基之70-10-10-10混合物合成誘發突變的DNA，以在所選位置獲得約50%之突變率(Gallop等人，Journal of Medicinal Chemistry 37：1233-1251(1994))。選擇CDR環之四種不同組合：H1/L3、H2/L3、H3/L3及L1/L2/L3以供隨機化。

在親和力改良選擇中，首先在限制試劑條件下對內部產生之LRP5E3/E4進行生物素標記。以遞增之嚴格度對噬菌體文庫進行六輪溶液分選。在第一輪溶液分選時，在預塗LRP5E3/E4之盤中，在1% BSA及0.05% Tween® 20中將3 O.D./ml之噬菌體輸入量培育3小時。對各孔用PBS-0.05% Tween® 20洗滌10次。所結合之噬菌體用150微升/孔50 mM HCl、500 mM KCl溶離30分鐘，且隨後用50微升/孔1 M Tris pH8中和，加以滴定且擴增以用於下一輪。在隨後幾輪中淘選噬菌體文庫係以溶液相進行，其中噬菌體文庫與100 μl SuperBlock緩衝液(Pierce Biotechnology)中之初始濃度為100 nM的經生物素標記之目標蛋白質(濃度係基於親本純系噬菌體IC50值)在室溫下培育2小時。對混合物用SuperBlock進一步稀釋(10X)，且在室溫下，在輕緩振盪下，向塗佈NeutrAvidin®之孔(10 μg/ml)每孔施加100 μl持續30分鐘。為了測定背景結合，在塗佈中性鏈親和素之培養盤上捕捉含有噬菌體之對照孔。接著洗滌所結合之噬菌體，加以溶離且擴增，如針對第一輪所述。在遞增的選擇嚴格度下進行五輪以上之溶液分選。開始兩輪係藉由將經生物素標記之目標蛋白質濃度自100 nM降至0.5 nM來進行締合速率選擇，且最後兩輪係藉由添加過量之未經生物素標記之目標蛋白質(300至1000倍以上)以在室溫下競爭自較弱結合物脫離來進行解離速率選擇。

高通量親和力篩選ELISA(單點競爭)

自第六輪淘選選出群落以用於篩選。群落在96孔盤(Falcon)中於1毫升/孔之具有50 μg/ml羧苄青黴素(carbenicillin)及1×10¹⁰/ml M13KO7的2YT培養基中，在37℃生長隔夜。包括來自同一盤之經XL-1感染之親本噬菌體群落作為對照。96孔Nunc Maxisorp®盤在4℃用每孔100 μl之含有LRP5E3/E4(0.5 μg/ml)之PBS塗佈隔夜。對盤用150 μl之含有1% BSA及0.05% Tween® 20之PBS 20阻斷1小時。

將35 μl噬菌體上清液用75 μl具有或不具有5 nM LRP5E3/4之ELISA(酶聯免疫吸附分析)緩衝液(具有0.5% BSA、0.05% Tween® 20之PBS)稀釋且在F盤(NUNC)中在室溫下培育1小時。向塗佈抗原之盤中並排地轉移95 μl混合物。將盤輕緩振盪15分鐘且用PBS-0.05% Tween® 20洗滌10次。藉由添加含有結合辣根過氧化酶(HRP)之抗M13抗體之ELISA緩衝液(1：2500)且在室溫下培育30分鐘來定量結合。對各盤用PBS-0.05% Tween® 20洗滌10次。接著，向孔中每孔添加100 μl過氧化酶受質且在室溫下培育5分鐘。藉由向各孔中添加100 μl 0.1 M磷酸(H₃PO₄)且在室溫下培育5分鐘來中止反應。在450 nm下使用標準ELISA盤讀取器測定各孔之O.D.(光學密度)。與親本噬菌體之孔之OD_450nm降低率(%)(100%)相比，選出OD_450nm降低率(%)低於50%的純系用於序列分析。與親本純系相比，在噬菌體製備中選擇獨特純系來測定針對目標抗原LRP5E3/E4之結合親和力(噬菌體IC50)。使顯示最大親和力改良之純系重組成人類IgG1用於抗體產生且進一步進行BIAcore^TM結合動力學分析及其他活體外或活體內分析。藉由此方法鑑別之某些抗體的可變域序列顯示於圖4及圖5中。在此說明書中，字首「YW629」與「P6C」可互換地使用。因此，例如描述為YW629.51.61之抗體與P6C.51.61相同。

表徵抗LRP5抗體(BIAcore)

使用BIAcore^TM-T100儀器，藉由表面電漿子共振(SPR)來量測抗LRP5E3/E4 IgG之結合親和力。抗LRP5E3/E4人類IgG由塗佈於CM5生物感測器晶片上之小鼠抗人類Fc抗體(GE Healthcare，產品目錄號BR-1008-39)捕捉以達成約200個反應單位(RU)。在動力學量測中，在25℃下，以30 μl/min流速注射人類LRP5E3/E4(GNE)於HBS-P緩衝液(10 mM HEPES pH 7.4，0.15 M NaCl，0.005%界面活性劑P20)中之兩倍連續稀釋液(500 nM至0.245 nM)。使用簡單的一對一朗繆爾結合模型(BIAcore評估軟體2.0.2版)計算締合速率(k _on)及解離速率(k _off)。以比率k _off/k _on計算平衡解離常數(K _D)。圖4及圖5中對抗體之此分析的結果顯示於下表2中。

實例2：鑑別具有Norrin途徑增強活性之抗體

Norrin經由包含LRP5、Frizzled4(FZD4)及四跨膜蛋白12(Tspan12)之膜複合物傳導信號。在Norrin(例如Norrin-C95R)、FZD4(例如FZD4-M157V)及Tspan12(例如Tspan12-G188R)中之每一者中已鑑別出展現信號傳導缺陷的突變體。測試各種LRP5抗體影響Norrin介導之信號傳導的能力。

在24孔盤中，對1.6×10⁵個細胞/孔用DNA混合物轉染，該DNA混合物含有b-連環蛋白報導體混合物(TOPFlash、pRL-CMV，及pCan-myc-lef-1)、LRP5及Fzd4或Fzd4-M157V。轉染後24小時，添加指定量之各LRP5抗體。1小時後，如所指示向孔中添加125 ng/ml重組Norrin。在37℃再培育16小時之後，溶解細胞且使用Promega Dual-Glo®試劑量測螢火蟲及海腎螢光素酶表現。相對於海腎表現校正螢火蟲螢光素酶值。Norrin活化報導基因表現的程度為無配位體情況下的約5倍。在所測試之所有抗體中，在0.1-1 μg/ml下，添加漸增量之抗體使Norrin活性增強約10倍(圖1A)。當在轉染中用Fzd4-M157V取代Fzd4時，Norrin活化僅降低1/2。添加LRP5抗體可挽救信號傳導缺陷至反映野生型Fzd4的程度(圖1B)。此等資料表明，抗LRP5抗體增強Norrin/Fzd4信號傳導且挽救Fzd4-M157V突變。

將3×10⁵個人類視網膜內皮微血管細胞(HREMVC)接種於6孔皿中。次日，添加10 μg/ml指定抗體，接著1小時後添加1.25 μg/ml Norrin。再過24小時後，分離RNA以用於以Q-PCR分析Norrin目標基因PV-1(由Norrin下調)及Axin-2(由Norrin上調)。相對於無配位體，添加Norrin使Axin-2表現上調約1.6倍且使PV-1下調約0.7倍。添加指定LRP5抗體使Axin-2進一步上調至約2倍且使PV-1下調至約0.5倍(圖2A)。將3×10⁵個HREMVC接種於6孔皿中。一旦細胞附著(約4小時)，即使用DharmaFECT®轉染試劑將其用100 nM對照物或Tspan12 siRNA轉染。次日，將細胞接種於24孔盤中且用指定抗體及配位體處理(如同上述)。如藉由量測Axin-2基因表現所指出，阻斷Tspan12基因表現可防止Norrin活化。添加10 μg/ml指定LRP-5抗體部分地挽救此不足的Norrin信號傳導(圖2B)。此等資料表明，LRP5抗體增強Norrin活性且挽救Tspan12損失。

接著測試抗LRP5抗體活體內活性。自P3至P14，對Tspan12基因剔除(KO)及野生型同窩出生者每日用25 mg/kg抗gD(陰性對照抗體)或抗LRP5抗體(YW629.42)處理。在P15時，摘眼且收集視網膜以便用經生物素標記之異構凝集素(isolectin)B4將血管染色。對視網膜用抗生蛋白鏈菌素-AF488染色，加以完整固定且使用共焦顯微術成像。自經由各視網膜厚度捕捉之1.6微米堆疊編譯XY及Z投影。正如所料，Tspan12 KO視網膜血管止於表層血管叢中且僅在神經節細胞層下方形成病理性小血管叢。用P6C.42處理(而非用對照抗體抗gD處理)可藉由促進深層血管化及減少異常血管叢集來部分地挽救Tspan12 KO血管缺陷(圖3A)。在P15時，Tspan12 KO小鼠未能形成野生型小鼠中典型的內部叢狀(IPL)血管床。相較於經抗gD處理之小鼠中之類似區域，YW629.42處理使IPL血管結構部分地修復。(n=3隻動物/處理組；圖3B)。此等資料證明，抗LRP5抗體在活體內部分地挽救Tspan12基因剔除小鼠中之血管缺陷。

Tspan12 KO及異型接合同窩出生者亦用25 mg/kg抗gD或抗LRP5抗體(P6C.51.61)處理。關於圖6A中所示之資料，自p6至P15每日對小鼠進行處理且在P16時處死(6隻小鼠/處理組)。摘眼且收集視網膜以便用經生物素標記之異構凝集素B4將血管染色。對視網膜用抗生蛋白鏈菌素-AF488染色，加以完整固定且使用共焦顯微術成像。自經由各視網膜厚度捕捉之1.6微米堆疊編譯XY及Z投影。Tspan12+/-小鼠顯示正常視網膜血管結構，其由三個不同的血管層組成(圖6A左圖，標度條100 μm)。正如所料，經對照抗體抗gD處理之Tspan12-/-小鼠的視網膜血管止於表層血管叢且在神經節細胞層下方形成病理性小血管叢(圖6A中圖)。用P6C.51.61處理可藉由促進深層血管化及減少異常血管叢集來部分地挽救Tspan12血管缺陷(圖6A右圖)。關於圖6B中所示之資料，自P3至P15每日對小鼠進行處理，接著自P15至P30每隔一天進行處理(8隻小鼠/處理組)。在P31時，摘眼且收集視網膜且如上所述加以處理。內叢狀層(IPL)中之血管藉由共焦顯微術來成像。Tspan12+/-小鼠之IPL含有典型的健康毛細血管網(圖6B左圖，標度條50 μm)，而經抗gD對照抗體處理之Tspan12-/-未能形成毛細血管網且在IPL中顯現異常血管片段(圖6B中圖)。用P6C.51.61處理可部分地恢復IPL中毛細血管網之形成(圖6B右圖)。

接著在氧氣誘發之視網膜病變(OIR)模型中測試抗LRP5抗體，該模型可概示成人視網膜血管病症之某些病理性特徵，諸如視網膜靜脈阻塞及糖尿病視網膜病變中之毛細血管滲漏及病理性血管生成。該模型由2個階段組成：出生後第7日至第12日(P7至P12)之高氧階段，其導致中央視網膜之血管閉塞；及自P12至P17的相對低氧階段，其引起病理性血管生成。簡言之，在階段1期間，將P7新生小鼠置放於由75%氧氣組成之高氧室中保持5天。在此階段期間，現存視網膜血管結構退化，導致中心處之視神經頭部周圍的血管閉塞。在第二階段期間，在由20%氧氣組成之室內空氣中飼養P12小鼠。中央血管閉塞引起低氧反應，導致病理性血管生成。關於圖7A中所示之資料，對C57B16/N小鼠執行如上文所述的OIR程序。自P12至P17，對小鼠每日用25 mg/kg抗gD(陰性對照抗體)或抗LRP5抗體(PC6.51.61)處理。在P17時，摘眼，收集視網膜且用異構凝集素B4染色，如上文所述。使用Fiji成像軟體量測總視網膜面積、血管閉塞面積(在中心處概示)及病理性血管結構。圖7B顯示資料之分析結果，儘管處理組之間的視網膜總面積不存在顯著差異，但經P6C.51.61處理之小鼠在血管閉塞區域內的血管再生長程度比經抗gD處理之同窩出生者顯著更大。圖7C顯示，經P6C.51.61處理之動物中的血管再生長增強，同時病理性血管形成的傾向相對於抗gD處理組減小。n=5隻動物/處理組。

實例3：分析增強抗LRP5抗體活性之Norrin途徑

進行實驗以瞭解本發明抗LRP5抗體作用於Norrin途徑及其其他組分的機制。在24孔盤中，對1.6×10⁵個細胞/孔用含有TOPFlash、pRL-CMV及pCan-myc-lef-1、LRP5、FZD-4及編碼指定配位體(Norrin或Wnt7b或Wnt3a)之cDNA的DNA混合物轉染。在轉染後第16個小時，添加10 μg/ml P6C.61.51抗體。在37℃下再培育16小時之後，溶解細胞且使用Promega Dual-Glo®試劑量測螢火蟲及海腎螢光素酶表現。相對於海腎表現校正螢火蟲螢光素酶值。圖8A顯示Norrin活化報導基因表現的程度為無配位體情況下的約6倍且添加10 μg/ml P6C.51.61使Norrin活性增強3倍(相對於單獨Norrin)。圖7B顯示的實驗證明，Wnt7b活化螢光素酶表現的程度為不存在抗體情況下的約20倍，而P6C.51.61增強螢光素酶表現為Wnt7b的2倍。圖7C顯示，Wnt3a之存在活化螢光素酶表現的程度為不存在抗體情況下的40倍以上，但在P6C.51.61存在下此活性受到顯著拮抗。綜合而言，此等資料顯示P6C.51.61增強Norrin及Wnt7b信號傳導，但拮抗Wnt3a信號傳導。

Fzd4_M157V及Norrin_C95R為患有FEVR系列病症之患者中存在的突變且此等突變導致Fzd4/LRP5/Norrin受體複合物之群集減少(Junge等人，Cell 139：299-311(2009))。Junge等人證明，Tspan12之過度表現可挽救與Fzd4_M157V及Norrin_C95R有關之群集缺陷且使信號傳導恢復至野生型程度。已測試P6C.51.61是否使受體複合物群集且類似地挽救此等突變。在24孔盤中，對1.6×10⁵個細胞/孔用含有TOPFlash、pRL-CMV、pCan-myc-lef-1、LRP5、Fzd4或Fzd4_M157V及Norrin或Norrin_C95R之DNA混合物轉染。轉染後第16個小時，如所指示添加10 μg/ml P6C.61.51抗體。在37℃下再培育16小時之後，溶解細胞且使用Promega Dual-Glo®試劑量測螢火蟲及海腎螢光素酶表現。相對於海腎表現校正螢火蟲螢光素酶值。圖8A顯示，Norrin活化報導基因表現的程度為在野生型Fzd4存在下無配位體情況的約6倍。在此等條件下，添加10 μg/ml P6C.51.61增強Norrin活性的程度為單獨Norrin的3倍。當在轉染中用Fzd4_M157V取代Fzd4時，Norrin活化相對於無配位體情況減少至約2倍。添加P6C.51.61挽救Fzd4_M157V信號傳導缺陷至反映野生型野生型Fzd4的程度(點線)。圖8B顯示，在抗體不存在下，但在P6C.51.61存在下用Norrin_C95R置換Norrin導致途徑活化顯著降低，Norrin_C95R活性被恢復至與野生型Norrin有關的程度(點線)。此等結果證明，P6C.51.61挽救會減少受體群集之受體組分中的突變。

接著測試具有活性之抗體價之影響。發現抗LRP5增強Norrin信號傳導需要雙價結合，但抑制Wnt3a信號傳導不需要雙價結合。在24孔盤中，對1.6×10⁵個細胞/孔用含有TOPFlash、pRL-CMV及pCan-myc-lef-1、LRP5及FZD-4之DNA混合物轉染。在轉染後24小時，添加指定量之各LRP5抗體。1小時後，添加125 ng/ml重組Norrin或200 ng/ml Wnt3a。在37℃下再培育16小時之後，溶解細胞且使用Promega Dual-Glo®試劑量測螢火蟲及海腎螢光素酶表現。相對於海腎表現校正螢火蟲螢光素酶值。圖10A顯示，Norrin活化報導基因表現的程度為無配位體之對照情況的約8倍。添加10 μg/ml雙價LRP5抗體 (P6C.51)使Norrin活性增強2倍以上，但添加10 μg/ml單價(Fab)LRP5抗體未能增強Norrin信號傳導。圖10B顯示，抗LRP5抗體在10 μg/ml雙價或單價LRP5存在下拮抗Wnt3a信號傳導。此等資料表明，受體複合物群集需要抗LRP5 MAb之雙價性質，已知此為Norrin信號傳導所需。

雖然為了清楚理解之目的已藉助於說明及實例詳述了上述發明，但該等說明及實例不應解釋為限制本發明之範疇。本文引用之所有專利及科學文獻的揭示內容以全文引用的方式明確併入本文中。

<110> 美商建南德克公司

<120> 抗LRP5抗體及使用方法

<130> P4855R1

<140> 102102128

<141> 2013-01-18

<150> 61/588,100

<151> 2012-01-18

<160> 42

<170> PatentIn version 3.5

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<222> (9)..(9)

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<222> (2)..(2)

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<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(6)

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<220>

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<212> PRT

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<213> 智人

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Claims

一種結合至低密度脂蛋白受體相關蛋白5(LRP5)之經分離之抗體，其中該抗體增強Norrin活性及/或Norrin/Fzd4信號傳導。
如請求項1之抗體，其為單株抗體。
如請求項1之抗體，其為人類抗體、人類化抗體或嵌合抗體。
如請求項1之抗體，其為結合LRP5之抗體片段。
如請求項1之抗體，其中該抗體包含：(a)HVR-H3，包含胺基酸序列YYRYAPYRSLGMDV(SEQ ID NO：23)或WIPQSYPFX₁SYKSGFDY，其中X₁為A或R(SEQ ID NO：24)；(b)HVR-L3，包含胺基酸序列QQYYX₁YPFT，其中X₁為L或S(SEQ ID NO：25)；及(c)HVR-H2，包含胺基酸序列GX₁ISX₂X₃GX₄STYYADSVKG，其中X₁為A或G，X₂為A或S，X₃為P或S，X₄為S或W(SEQ ID NO：26)，或SRISSNGGSTYYADSVKG(SEQ ID NO：27)。
如請求項1之抗體，其中該抗體包含：(a)HVR-H1，包含胺基酸序列GFTFSSYAMX₁，其中X₁為H或S(SEQ ID NO：28)；(b)HVR-H2，包含胺基酸序列GX₁ISX₂X₃GX₄STYYADSVKG，其中X₁為A或G，X₂為A或S，X₃為P或S，X₄為S或W(SEQ ID NO：26)，或SRISSNGGSTYYADSVKG(SEQ ID NO：27)；及(c)HVR-H3，包含胺基酸序列YYRYAPYRSLGMDV(SEQ ID NO：23)或WIPQSYPFX₁SYKSGFDY，其中X₁為A或R(SEQ ID NO：24)。
如請求項6之抗體，其進一步包含：(a)HVR-L1，包含胺基酸序列RASQGISSYLA(SEQ ID NO：29)或RASQX₁X₂X₃X₄YLA，其中X₁為A、G、S或V，X₂為I或M，X₃為F、G、S或Y，且X₄為G、S或Y(SEQ ID NO：30)；(b)HVR-L2，包含胺基酸序列AASSLQS(SEQ ID NO：31)或DASX₁X₂ES，其中X₁為S或T且X₂為L或R (SEQ ID NO：32)；及(c)HVR-L3，包含胺基酸序列QQYYX₁YPFT，其中X₁為L或S(SEQ ID NO：33)。
如請求項1之抗體，其包含：(a)HVR-L1，包含胺基酸序列RASQGISSYLA(SEQ ID NO：29)或RASQX₁X₂X₃X₄YLA，其中X₁為A、G、S或V，X₂為I或M，X₃為G、F、Y或S，且X₄為G、Y或S(SEQ ID NO：30)；(b)HVR-L2，包含胺基酸序列AASSLQS(SEQ ID NO：31)或DASX₁X₂ES，其中X₁為S或T且X₂為L或R(SEQ ID NO：32)；及(c)HVR-L3，包含胺基酸序列QQYYX₁YPFT，其中X₁為L或S(SEQ ID NO：33)。
如請求項6之抗體，其進一步包含一或多個選自由SEQ ID NO：34至37組成之群的重鏈可變域構架序列。
如請求項1之抗體，其包含：(a)VH序列，其與SEQ ID NO：1至11之一之胺基酸序列具有至少95%序列一致性；(b)VL序列，其與SEQ ID NO：12至22之一之胺基酸序列具有至少95%序列一致性；或(c)如(a)中之VH序列及如(b)中之VL序列。
如請求項10之抗體，其包含SEQ ID NO：1至11之一之VH序列。
如請求項10之抗體，其包含SEQ ID NO：12至22之一之VL序列。
一種抗體，其包含SEQ ID NO：1至11之一之VH序列及SEQ ID NO：12至22之一之VL序列。
如請求項1之抗體，其為全長IgG1抗體。
一種經分離之核酸，其編碼如請求項1之抗體。
一種宿主細胞，其包含如請求項15之核酸。
一種產生抗體之方法，其包含培養如請求項16之宿主細胞以產生該抗體。
一種免疫結合物，其包含如請求項1之抗體及細胞毒性劑。
一種醫藥調配物，其包含如請求項1之抗體及醫藥學上可接受之載劑。
如請求項1之抗體，其係用作藥劑。
如請求項1之抗體，其用於治療視網膜病變，包括增生性糖尿病視網膜病變、CNV、AMD、糖尿病及其他缺血相關視網膜病變、DME、病理性近視、馮希伯-林島氏症(von Hippel-Lindau disease)、眼組織漿菌病、CRVO、BRVO、角膜新血管形成、視網膜新血管形成、ROP、FEVR、柯氏症(Coats' disease)、諾里氏症(Norrie Disease)、OPPG(骨質疏鬆-假神經膠質瘤症候群)、結膜下出血或高血壓性視網膜病變。
如請求項1之抗體，其用於增強Norrin活性及/或Norrin/Fzd4信號傳導。
一種如請求項1之抗體的用途，其係用於製備藥劑。
如請求項23之用途，其中該藥劑係用於治療視網膜病變，包括增生性糖尿病視網膜病變、CNV、AMD、糖尿病及其他缺血相關視網膜病變、DME、病理性近視、馮希伯-林島氏症、眼組織漿菌病、CRVO、BRVO、角膜新血管形成、視網膜新血管形成、ROP、FEVR、柯氏症、諾里氏症、OPPG(骨質疏鬆-假神經膠質瘤症候群)、結膜下出血或高血壓性視網膜病變。
如請求項23之用途，其中該藥劑係用於增強Norrin活性及/或Norrin/Fzd4信號傳導。
一種如請求項1之抗體的用途，其係用於製備用以增強個體之Norrin活性及/或Norrin/Fzd4信號傳導的藥劑。
一種如請求項1之抗體的用途，其係用於製備用以挽救個體中因Norrin及/或Fzd4突變所引起之信號傳導缺陷的藥劑。