CN105899533B

CN105899533B - 人源化的抗-Tau(pS422)抗体和使用方法

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Publication number: CN105899533B
Application number: CN201480069764.4A
Authority: CN
Inventors: 约尔格·本兹; 贝恩德·博尔曼; 吉·乔治; 乌尔里希·格普费特; 菲奥娜·格吕宁格尔; 胡贝特·克滕贝格尔; 奥拉夫·蒙迪戈; 米夏埃尔·施雷埃姆
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2013-12-20
Filing date: 2014-12-17
Publication date: 2019-10-11
Anticipated expiration: 2034-12-17
Also published as: AU2014368696A1; HRP20200384T1; SI3083680T1; RS60031B1; HK1223953A1; US20170129949A1; CA2932958A1; JP6608827B2; TW201529600A; PE20161032A1; US20200223912A1; EA201600473A1; CR20160270A; CN105899533A; WO2015091656A1; TWI545132B; US20150175685A1; PL3083680T3; IL245862A0; CL2016001519A1

Abstract

本发明提供人源化的抗人Tau(pS422)抗体和使用其的方法。

Description

人源化的抗-Tau(pS422)抗体和使用方法

发明领域

本发明涉及特异结合SEQ ID NO:03的磷酸化的Tau片段的人源化的抗-Tau(pS422)抗体，及其用于治疗脑疾病的用途。

背景

人Tau(微管相关蛋白Tau(神经原纤维缠结蛋白,配对螺旋丝-Tau(Pairedhelical filament-Tau),PHF-Tau))是主要在轴突中发现的神经元的微管相关蛋白，其功能是促进微管蛋白聚合并稳定微管。在人脑中发现八种同种型(同种型A,B,C,D,E,F,G,胎儿-Tau)，最长的同种型包含441个氨基酸(同种型F,Uniprot P10636-8)。Tau及其性质也被Reynolds,C.H.等,J.Neurochem.69(1997)191-198描述。

处于超磷酸化形式的Tau是配对螺旋丝(PHF)的主要成分，配对螺旋丝(PHF)是阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)脑中神经原纤维损伤的结构单元。Tau可在其丝氨酸或苏氨酸残基被数种不同的激酶(包括GSK3β,cdk5,MARK和MAP激酶家族的成员)磷酸化。

Tau病(tauopathies)以Tau的异常超磷酸化为特征，并且根据Iqbal,K.等(Biochim.Biophysica Acta 1739(2005)198-210)，Tau病是：

·阿尔茨海默病(Alzheimer disease)，包括该病的仅有缠结的形式(tangle-only form)

·唐氏综合征，成人病例(Down syndrome,adult cases)

·关岛型帕金森综合征痴呆复合征(Guam Parkinsonism dementia complex)

·拳击员痴呆(Dementia pugilistica)

·皮克病(Pick disease)

·具有嗜银颗粒的痴呆(Dementia with argyrophilic grains)

·额颞叶痴呆(Fronto-temporal dementia)

·皮质基底节变性(Cortico-basal degeneration)

·苍白球脑桥黑质变性(Pallido-ponto-nigral degeneration)

·进行性核上性麻痹(Progressive supranuclear palsy)

·具有缠结的格-施-沙病(Gerstmann––Scheinker disease withtangles)。

迄今为止，在阿尔茨海默病的脑中已经发现近40个丝氨酸(S)/苏氨酸(T)磷酸化位点(Hanger,D.P.等,J.Biol.Chem.282(2007)23645-23654)。在阿尔茨海默病中Tau病理学的发展与其磷酸化状态有关。然而，40个磷酸化位点的大部分不与疾病病理学相关，因为它们也在从健康的、胎儿脑组织提取的Tau中发现。仅有一些磷酸化位点是疾病状态特有的，推测其负责异常的、聚集和特征性的不溶性，它们定义了阿尔茨海默脑PHFs中的Tau(Morishima-Kawashima,M.等,J.Biol.Chem.270(1995)823-829)。根据Pei,J.J.等,(J.Alzheimer’s Disease 14(2008)385-392)，现有文献对于这些位点中的哪些是AD脑特异性的提供了有限且不清楚的信息。Pei使用一系列Tau的磷酸特异性抗体并测量它们在来自22个AD患者和10个对照的内侧颞叶皮质的匀浆中的水平。

Bussiere,T.等(神经病理学学报(Acta Neuropathol.)97(1999)221-230)描述了Tau蛋白上磷酸化的丝氨酸422是在数种具有神经原纤维变性的疾病中发现的病理性表位。Augustinack,J.C.等,(神经病理学学报(Acta Neuropathol)103(2002)26-35)描述了pS422与阿尔茨海默病中神经元病理学的严重性相关。Guillozet-Bongaarts,A.(神经化学杂志(J.Neurochem)97(2006)1005-1014)描述了Tau在丝氨酸422的磷酸化是PHFs成熟过程的一部分。也发现Tau pS422与阿尔茨海默病的各种转基因小鼠模型中的病理学发展相关。因此，Deters,N.等在生物化学和生物物理学研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Commun.)379(2009)400-405中提到双重转基因Dom5/pR5小鼠显示7倍数目增加的含有特异性磷酸化病理性S422表位的海马神经元。Goetz,J.等(科学(Science)293(2001)1491-1495)报道注射Aβ42原纤维的Tau P301L转基因小鼠脑中出现在S422处磷酸化的Tau。

EP 2 009 104涉及来自阿尔茨海默病PHFs的Tau蛋白磷酸化状态中存在的Tau蛋白的表位，以及所述表位用于产生特异性检测阿尔茨海默Tau蛋白的抗体中的应用。WO2002/062851和US 7,446,180涉及对异常截短形式的Tau蛋白具有特异性的抗体以及与阿尔茨海默病和相关Tau病有关的诊断和治疗方面。

WO 98/22120涉及治疗患有阿尔茨海默病的患者的方法，包括向该患者施用针对氨基酸约207至约222，氨基酸约224至约240和氨基酸约390至约408的磷酸化Tau片段的抗体的步骤。使用磷酸化Tau片段379–408[P-Ser396,404]来疫苗接种Tau转基因小鼠的动物研究在Asuni,A.A.等,神经科学杂志(J.Neuroscience)27(2007)9115-9129中提及。US2008/0050383涉及通过施用Tau蛋白片段治疗和预防受试者中阿尔茨海默病或其它Tau病的方法。

Hasegawa，M.，等人(FEBS Lett.384(1996)25-30)报道了对微管相关蛋白tau中磷酸丝氨酸422特异的单克隆抗体(AP422)。

在WO 01/55725中，报道了用于体内诊断tau蛋白病变(tauopathy)和/或用于体内相对于非tau蛋白病变差异诊断tau蛋白病变的方法的特异识别tau的抗体和特异识别磷酸化-tau(181)的抗体。

在WO 02/027017中，报道了从具有磷酸化的丝氨酸的多肽免疫原制备的抗体。WO02/062851涉及对Tau蛋白的异常截短形式具有特异性的抗体以及与阿尔茨海默病和相关Tau蛋白病变相关的诊断和治疗方面。

在WO 2004/016655中，报道了对中枢神经***(CNS)tau蛋白特异的抗体，其中所述抗体特异识别CNS tau蛋白，但不识别外周神经***tau蛋白，并且其中所述抗体特异识别作为表位的由编码tau蛋白的基因的外显子4编码的氨基酸序列和由其外显子5编码的氨基酸序列之间的连接部分的氨基酸序列。

针对Tau pS422的单克隆抗体在例如EP 1 876 185中描述。针对Tau pS422的多克隆抗体是可商购的(例如ProSci Inc.和Biosource International)。

在WO 2006/055178中，报道了抑制tau蛋白在Ser202/Thr205处的磷酸化的方法，所述方法包括将含有tau蛋白的样品与结合淀粉样蛋白β-衍生的扩散性配体的抗体或抗原结合片段相接触，由此抑制tau蛋白在Ser202/Thr205处的磷酸化。

在WO 2007/019273中报道了特异结合在tyr394和/或tyr310处磷酸化的tau的抗体制剂。在Asuni，A.A.等人，J.Neuroscience 27(2007)9115-9129中提及其中磷酸化的Tau片段379–408[P-Ser396,404]用于免疫接种Tau转基因小鼠的动物研究。

EP 2 009 104涉及来自阿尔茨海默病PHFs的Tau蛋白中以磷酸化状态出现的Tau蛋白的表位，并涉及所述表位用于产生特异检测阿尔茨海默病Tau蛋白的抗体的用途。

US 2008/0050383涉及通过施用Tau蛋白片段治疗和预防受试者中阿尔茨海默病或其他Tau蛋白病变的方法。

在WO 2010/037135中，报道了分离的、合成的或重组多肽或肽，其包含含有或由针对血脑屏障(BBB)受体的配体或等效物组成的第一结构域和含有或由减缓蛋白聚集体的聚集速率、抑制蛋白聚集体的形成，或逆转、消化或溶解蛋白聚集体的酶或组合物组成的第二结构域。在WO2010/115843中报道了能够体外和/或体内识别和结合tau蛋白的抗体，特别是单克隆抗体或其功能部分。

在WO 2011/026031中，报道了特异结合tau寡聚物并且不结合可溶tau或tau纤丝的单克隆抗体或其片段，其用于治疗蛋白病变例如阿尔茨海默病、进行性核上性麻痹和皮质基底节变性。在WO 2011/053565中报道了特异结合在Ser(238)和Thr(245)中的一个或多个处磷酸化的人tau蛋白的分离的抗体。

在WO 2012/045882中，报道了特异结合哺乳动物Tau蛋白上的磷酸化表位的抗体，其用于治疗神经变性病症如Tau蛋白病变，和用于治疗或缓解认知缺陷。在WO 2012/049570中报道了人单克隆抗-tau抗体或其tau结合片段。在WO 2012/106363中报道了用于预防或治疗受试者中阿尔茨海默病或其他tau蛋白病变的方法，其包括向需要对于阿尔茨海默病或其他tau蛋白病变的治疗的人施用抗体，所述抗体对tau蛋白的异常形式具有特异性，所述抗体对正常tau蛋白不显示结合和/或反应性，并且在有效预防或治疗阿尔茨海默病或其他tau蛋白病变的条件下和以有效预防或治疗阿尔茨海默病或其他tau蛋白病变的量施用。

在WO 2012/149365中，报道了对聚集的tau显示反应性并且对非聚集的Tau基本上不显示反应性的抗体，其中所述聚集的tau包含直接或通过接头在一个或多个半胱氨酸处彼此交联的至少两个tau蛋白。

在WO 2010/142423中报道了用于治疗Tau蛋白病变例如阿尔茨海默病的组合物，其包含结合Tau的抗体、在特异结合特定的磷酸化的Tau的特定位置处磷酸化的丝氨酸修饰的化合物及其片段以及载体。

在EP 1 876 185A中，报道了识别磷酸化的多肽的抗体。在WO 2013/151762中，报道了人源化的tau抗体。在WO 2014/016737中，报道了针对人磷酸化的tau的新的鸡单克隆抗体及其用途。在WO 2014/016737中报道了针对人磷酸化的tau的新的鸡蛋克隆抗体及其用途。在WO 2012/149365中报道了对病理性的tau二聚体和前丝状病理性tau寡聚物具有选择性的抗体和它们在治疗、诊断和监控Tau蛋白病变中的用途。

概述

本发明提供抗人Tau(pS422)抗体，尤其是人源化的抗人Tau(pS422)抗体，及其使用方法。

如本文报道的人源化的抗体不可通过标准人源化方法获得。其需要在氨基酸序列中引入非标准突变，以获得具有与包含具有SEQ ID NO:07和SEQ ID NO:11的氨基酸序列的可变结构域的母体兔抗体相当的结合特性的人源化的抗体。这是特别重要的，因为如本文报道的抗体意在跨过人血脑屏障并且在人脑内起作用。因此，在当前情形中，为了直接应用，通常应用的对于人源化的抗体的选择标准不足够严格。

如本文报道的一个方面是特异结合人Tau(pS422)的(人源化的)抗体，其中所述抗体

i)特异结合具有SEQ ID NO:03的氨基酸序列的多肽，和/或

ii)于1μg/mL不结合全长人Tau(SEQ ID NO:01)，和/或

iii)特异结合在位置422处的丝氨酸处磷酸化的全长人Tau(SEQ ID NO:02)，和/或

iv)特异结合在位置422处的丝氨酸处磷酸化的人Tau(SEQ ID NO:02)的聚集体，和/或

v)特异结合具有SEQ ID NO:01的氨基酸序列并且具有氨基酸突变S422A的人Tau。

如本文报道的抗体显示关于在位置422处的丝氨酸处磷酸化的人Tau，关于未磷酸化的野生型人Tau和Tau突变体S422A的选择性。所述未磷酸化的野生型人Tau和所述Tau突变体S422A分别根本不被结合或以较低的亲和力被结合。

如本文报道的一个方面是特异结合人Tau(pS422)的(人源化的)抗体，其特征在于所述抗体

a)在重链可变结构域中包含SEQ ID NO:08、18和10的HVR，或

b)在重链可变结构域中包含SEQ ID NO:08、09和10的HVR。

在一个实施方案中，所述抗体

a)在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO:13、14和15的HVR，或

b)在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO:12、05和15的HVR。

在一个实施方案中，所述抗体

a)在重链可变结构域中包含SEQ ID NO:08、18和10的HVR，并且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO:13、14和15的HVR，或

b)在重链可变结构域中包含SEQ ID NO:08、09和10的HVR，并且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO:12、05和15的HVR，或

c)在重链可变结构域中包含SEQ ID NO:08，09和10的HVR，并且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO:13、14和15的HVR。

在一个实施方案中，所述抗体包含

a)SEQ ID NO:20的重链可变结构域和SEQ ID NO:17的轻链可变结构域，或

b)SEQ ID NO:19的重链可变结构域和SEQ ID NO:16的轻链可变结构域，或

c)SEQ ID NO:19的重链可变结构域和SEQ ID NO:17的轻链可变结构域，或

d)SEQ ID NO:21的重链可变结构域和SEQ ID NO:17的轻链可变结构域。

在一个实施方案中，所述抗体用于治疗阿尔茨海默病。

在一个实施方案中，所述抗体是效应子功能沉默的。在一个实施方案中，所述抗体不具有效应子功能。在一个实施方案中，所述抗体是人IgG1亚类的并且在两条重链中都具有突变L234A、L235A和P329G(根据Kabat的EU索引编号)。

在一个实施方案中，所述抗体

i)特异结合具有SEQ ID NO:03的氨基酸序列的多肽，和/或

ii)于1μg/mL不结合全长人Tau(SEQ ID NO:01)，和/或

iv)特异结合在位置422处的丝氨酸处磷酸化的人Tau(SEQ ID NO:02)的聚集体。

在一个实施方案中，所述抗体对以下具有如下EC₅₀值

a)对于具有SEQ ID NO:03的氨基酸序列的人Tau(pS422)片段，6ng/mL或更小，和/或

b)对于具有SEQ ID NO:02的氨基酸序列的全长人Tau(pS422)，4.5ng/mL或更小，和/或

c)对于具有SEQ ID NO:02的氨基酸序列的人Tau(pS422)的聚集体，30ng/mL或更小，和/或

d)对于具有SEQ ID NO:01的氨基酸序列并且具有氨基酸突变S422A的人Tau，125ng/mL或更小。

在一个实施方案中，所述抗体特异结合人Tau(pS422)(SEQ ID NO:02)并且不结合人Tau(SEQ ID NO:01)。

在一个实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。

在一个实施方案中，所述抗体是结合人Tau(pS422)并且具有以下性质的抗体片段：

i)特异结合具有SEQ ID NO:03的氨基酸序列的多肽，和/或

ii)于1μg/mL不结合全长人Tau(SEQ ID NO:01)，和/或

v)特异结合具有SEQ ID NO:01的氨基酸序列并且具有氨基酸突变S422A的全长人Tau，和/或

vi)对于具有SEQ ID NO:03的氨基酸序列的人Tau(pS422)片段具有6ng/mL或更小的EC₅₀值，和/或

vii)对于具有SEQ ID NO:02的氨基酸序列的全长人Tau(pS422)具有4.5ng/mL或更小的EC₅₀值，和/或

viii)对于具有SEQ ID NO:02的氨基酸序列的人Tau(pS422)的聚集体具有30ng/mL或更小的EC₅₀值，和/或

ix)对于具有SEQ ID NO:01的氨基酸序列并且具有氨基酸突变S422A的人Tau具有125ng/mL或更小的EC₅₀值。

在一个实施方案中，所述抗体是

a)人IgG1亚类的全长抗体，或

b)人IgG4亚类的全长抗体，或

c)具有突变L234A、L235A和P329G的人IgG1亚类的全长抗体，

d)具有突变S228P、L235E和P329G的人IgG4亚类全长抗体，

e)在两条重链中都具有突变L234A、L235A和P329G和在一条重链中具有突变T366W和S354C并且在相应的另一重链中具有突变T366S、L368A、Y407V和Y349C的人IgG1亚类的全长抗体，或

f)在两条重链中都具有突变S228P和P329G和在一条重链中具有突变T366W和S354C并且在相应的另一重链中具有突变T366S、L368A、Y407V和Y349C的人IgG4亚类的全长抗体。

如本文报道的一个方面是(人源化的)抗人Tau(pS422)抗体，其特征在于

a)所述抗体包含两条抗体重链，其各自包含重链可变结构域和重链恒定区，其中

i)所述可变结构域包含SEQ ID NO:08、SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:10的HVR,

ii)所述恒定区是人IgG1恒定区，其中C-末端赖氨酸残基可以存在或不存在，并且

iii)所述恒定区包含氨基酸改变L234A、L235A和P329G，

b)所述抗体包含两条抗体轻链，其各自包含轻链可变结构域和轻链恒定结构域，其中

i)所述可变结构域包含SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15的HVR,

ii)所述恒定区是人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区,

并且

c)所述抗体

i)特异结合具有SEQ ID NO:03的氨基酸序列的多肽，和/或

ii)于1μg/mL不结合全长人Tau(SEQ ID NO:01)，和/或

a)所述抗体包含两个抗体重链，其各自包含重链可变结构域和重链恒定区，其中

i)所述可变结构域包含SEQ ID NO:08、SEQ ID NO:09和SEQ ID NO:10的HVR,

iii)所述恒定区包含氨基酸改变L234A、L235A和P329G，

b)所述抗体包含两个抗体轻链，其各自包含轻链可变结构域和轻链恒定结构域，其中

i)所述可变结构域包含SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:05和SEQ ID NO:15的HVR,

ii)所述恒定区是人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区,

并且

c)所述抗体

i)特异结合具有SEQ ID NO:03的氨基酸序列的多肽，和/或

ii)于1μg/mL不结合全长人Tau(SEQ ID NO:01)，和/或

i)所述可变结构域包含SEQ ID NO:08、SEQ ID NO:09和SEQ ID NO:10的HVR,

iii)所述恒定区包含氨基酸改变L234A、L235A和P329G，

i)所述可变结构域包含SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15的HVR,

ii)所述恒定区是人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区,

并且

c)所述抗体

i)特异结合具有SEQ ID NO:03的氨基酸序列的多肽，和/或

ii)于1μg/mL不结合全长人Tau(SEQ ID NO:01)，和/或

i)所述可变结构域具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列,

iii)所述恒定区包含氨基酸改变L234A、L235A和P329G，

i)所述可变结构域具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列,

ii)所述恒定区是人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区,

并且

c)所述抗体

i)特异结合具有SEQ ID NO:03的氨基酸序列的多肽，和/或

ii)于1μg/mL不结合全长人Tau(SEQ ID NO:01)，和/或

i)所述可变结构域具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列,

iii)所述恒定区包含氨基酸改变L234A、L235A和P329G，

i)所述可变结构域具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列,

ii)所述恒定区是人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区,

并且

c)所述抗体

i)特异结合具有SEQ ID NO:03的氨基酸序列的多肽，和/或

ii)于1μg/mL不结合全长人Tau(SEQ ID NO:01)，和/或

i)所述可变结构域具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列,

iii)所述恒定区包含氨基酸改变L234A、L235A和P329G，

i)所述可变结构域具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列,

ii)所述恒定区是人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区,

并且

c)所述抗体

i)特异结合具有SEQ ID NO:03的氨基酸序列的多肽，和/或

ii)于1μg/mL不结合全长人Tau(SEQ ID NO:01)，和/或

i)所述可变结构域具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列,

iii)所述恒定区包含氨基酸改变L234A、L235A和P329G，

i)所述可变结构域具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列,

ii)所述恒定区是人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区,

并且

c)所述抗体

i)特异结合具有SEQ ID NO:03的氨基酸序列的多肽，和/或

ii)于1μg/mL不结合全长人Tau(SEQ ID NO:01)，和/或

在所有方面的一个优选实施方案中，所述抗人Tau(pS422)抗体特征在于所述抗体在重链可变结构域中位置4、24和78处具有缬氨酸残基。

在所有方面的一个优选实施方案中，所述抗人Tau(pS422)抗体特征在于所述抗体在重链可变结构域中位置71处具有精氨酸残基。

如本文报道的一个方面是编码如本文报道的(人源化的)抗体的分离的核酸。

如本文报道的一个方面是宿主细胞，其包含如本文报道的核酸。

如本文报道的一个方面是产生(人源化的)抗体的方法，其包括培养如本文报道的宿主细胞从而产生抗体的步骤。

在一个实施方案中，所述方法还包括从细胞或培养基回收抗体的步骤。

如本文报道的一个方面是药物制剂，其包含如本文报道的(人源化的)抗体和药用载体。

在一个实施方案中，所述药物制剂还包含另外的治疗剂。

在一个实施方案中，所述另外的治疗剂是抗-淀粉样蛋白治疗剂。在一个实施方案中，所述抗-淀粉样蛋白治疗剂是抗人α-突触核蛋白抗体或抗-Abeta抗体。

如本文报道的一个方面是如本文报道的(人源化的)抗体，其用作药物。

如本文报道的一个方面是如本文报道的(人源化的)抗体，其用于治疗阿尔茨海默病。

如本文报道的一个方面是如本文报道的(人源化的)抗体，其用于治疗前驱(prodromal)阿尔茨海默病。

如本文报道的一个方面是如本文报道的(人源化的)抗体，其用于治疗轻度阿尔茨海默病。

如本文报道的一个方面是如本文报道的(人源化的)抗体，其用于减轻Tau(pS422)-引起的神经变性。

如本文报道的一个方面是如本文报道的(人源化的)抗体，其用于维持认知和功能。

如本文报道的一个方面是如本文报道的(人源化的)抗体，其用于减缓认知和功能下降的速率。

如本文报道的一个方面是如本文报道的(人源化的)抗体，其用于减缓神经原纤维缠结积累速率。

在前述方面的一个实施方案中，所述用途是通过清除Tau(pS422)而减轻神经原纤维缠结负荷。

在前述方面的一个实施方案中，所述用途是通过防止神经原纤维缠结建立。

在前述方面的一个实施方案中，所述用途是通过移除/清除神经原纤维缠结。

在一个实施方案中，所述防止和/或移除通过促进Tau聚集体的细胞内清除。

在前述方面的一个实施方案中，所述用途是通过抑制神经原纤维缠结扩散。在一个实施方案中，所述抑制是通过防止病理性Tau形式/种子的神经元间转移。

本发明的其他方面是治疗方法，其包括施用如本文报道的(人源化的)抗体，用于治疗阿尔茨海默病，用于治疗前驱阿尔茨海默病，用于治疗轻度阿尔茨海默病，用于减轻Tau(pS422)-引起的神经变性，用于维持认知和功能，用于减缓认知和功能下降速率，和/或用于减缓神经原纤维缠结积累的速率。

如本文报道的一个方面是如本文报道的(人源化的)抗体在制备药物中的用途。

在一个实施方案中，所述药物用于治疗阿尔茨海默病。

在一个实施方案中，所述药物用于治疗前驱阿尔茨海默病。

在一个实施方案中，所述药物用于治疗轻度阿尔茨海默病。

在一个实施方案中，所述药物用于减轻Tau(pS422)引起的神经变性。

在一个实施方案中，所述药物用于维持认知和功能。

在一个实施方案中，所述药物用于减缓认知和功能下降速率。

如本文报道的一个方面是治疗患有阿尔茨海默病的个体的方法，所述方法包括向个体施用有效量的如本文报道的(人源化的)抗人Tau(pS422)抗体。

如本文报道的一个方面是减轻个体中Tau(pS422)引起的神经变性的方法，其包括向个体施用有效量的如本文报道的(人源化的)抗人Tau(pS422)抗体以减轻Tau(pS422)引起的神经变性。

如本文报道的一个方面是维持个体中认知和功能的方法，其包括向个体施用有效量的如本文报道的(人源化的)抗人Tau(pS422)抗体以维持认知和功能。

如本文报道的一个方面是减缓个体中认知和功能下降速率的方法，其包括向个体施用有效量的如本文报道的(人源化的)抗人Tau(pS422)抗体以减缓认知和功能下降速率。

如本文报道的一个方面是如本文报道的(人源化的)抗人Tau(pS422)抗体在减轻Tau(pS422)引起的神经变性方面的用途。

如本文报道的一个方面是如本文报道的(人源化的)抗人Tau(pS422)抗体在维持认知和功能方面的用途。

如本文报道的一个方面是如本文报道的(人源化的)抗人Tau(pS422)抗体在减缓认知和功能下降中的用途。

如本文报道的抗体可用于治疗阿尔茨海默病。

利用如本文报道的(人源化的)抗体可以进行阿尔茨海默病和神经病理学的进程的抑制/减轻。

如本文报道的(人源化的)抗体可以用于保护免于发展为阿尔茨海默病或甚至用于终止阿尔茨海默病的进展。

在一个实施方案中，如本文报道的(人源化的)抗体i)结合Tau(pS422)转基因小鼠和阿尔茨海默病患者的脑切片上的Tau(pS422)；和/或标记Tau(pS422)转基因细胞中的Tau(pS422)。

如本文报道的(人源化的)抗体可以用于治疗阿尔茨海默病。

如本文报道的一个方面是特异结合人Tau(pS422)中SEQ ID NO:03的氨基酸序列的(人源化的)抗体。

如本文报道的(人源化的)抗体特异结合/识别人Tau(pS422)的早期和晚期疾病相关形式。

如本文报道的一个方面是如本文报道的(人源化的)抗体用于预防人Tau(pS422)-相关阿尔茨海默病扩散的用途。

如本文报道的一个方面是如本文报道的(人源化的)抗体用于减少溶酶体膜分解的用途。

如本文报道的一个方面是如本文报道的(人源化的)抗体用于针对人Tau(pS422)诱导的去稳定和/或分解作用使溶酶体膜稳定的用途。

如本文报道的一个方面是如本文报道的(人源化的)抗体用于防止阿尔茨海默病进展的用途。

如本文报道的(人源化的)抗体通过抗体介导的对人Tau(pS422)接种和细胞间扩散的抑制而行使功能。

如本文报道的(人源化的)抗体通过结合人Tau(pS422)来保护溶酶体免于纤维损伤。

附图简述

图1:兔和人源化的轻链可变结构域的序列比对；CDR用框框出。

图2:兔和人源化的重链可变结构域的序列比对；CDR用框框出。

图3:人源化的VH和VL的不同组合与(A)磷酸化的tau肽，(B)磷酸化的全长人tau，(C)非磷酸化的tau肽，(D)非磷酸化的全长人tau的生化结合；(1)＝VH00/VL00，(2)＝VH32/VL21，(3)＝VH20/VL22，(4)＝VH32/VL22，(5)＝VH33/VL22；包被浓度:磷酸化的tau肽:50ng/ml，所有其他靶标:1μg/ml；(如果磷酸化的tau肽以1μg/ml包被，则获得类似的结果(数据未显示))。

图4:人源化的VH和VL的不同组合与(A)＝全长人tau S422A突变体，(B)＝聚集的人Tau(pS422)的生化结合；(1)＝VH00/VL00，(2)＝VH32/VL21，(3)＝VH20/VL22，(4)＝VH32/VL22，(5)＝VH33/VL22；包被浓度:磷酸化的tau肽:50ng/ml，所有其他靶标:1μg/ml；(如果磷酸化的tau肽以1μg/ml包被，则获得类似的结果(数据未显示))。

图5:显示选择的人源化的VH/VL组合的选择性的蛋白质印迹；(1)＝VH00/VL00，(2)＝VH32/VL21，(3)＝VH20/VL22，(4)＝VH32/VL22，(5)＝VH33/VL22。

图6:对阿尔茨海默病患者的脑提取物中的超磷酸化的tau的结合；(1)＝VH00/VL00，(2)＝VH32/VL21，(3)＝VH32/VL22。

序列简述

SEQ ID NO:01人Tau蛋白同种型F(441残基)

SEQ ID NO:02在位置422的丝氨酸残基处磷酸化的人Tau蛋白同种型F(441残基)

SEQ ID NO:03在位置7(对应于SEQ ID NO:01的位置422)处具有磷酸化的丝氨酸的人Tau蛋白(SEQ ID NO:01的残基416至430)的片段:Ser-Ile-Asp-Met-Val-Asp-Ser(PO₃H₂)-Pro-Gln-Leu-Ala-Thr-Leu-Ala-Asp

SEQ ID NO:04兔抗体086CDRL1-QSSQSVRTNKLA

SEQ ID NO:05兔抗体086CDRL2-SASTLDF

SEQ ID NO:06兔抗体086CDRL3-LGYFDCSIADCVA

SEQ ID NO:07兔抗体086VL00

SEQ ID NO:08兔抗体086CDRH1-SNAIN

SEQ ID NO:09兔抗体086CDRH2-YIAVSGNTYYASWAKG

SEQ ID NO:10兔抗体086CDRH3-SNI

SEQ ID NO:11兔抗体086VH00

SEQ ID NO:12人源化的CDRL1变体1–RSSQSVRTNKLA

SEQ ID NO:13人源化的CDRL1变体2–RSSQSVRTNRLA

SEQ ID NO:14人源化的CDRL2变体1–SASTLDY

SEQ ID NO:15人源化的CDRL3变体1–LGYFDSSADIVA

SEQ ID NO:16人源化的VL变体1–VL21

SEQ ID NO:17人源化的VL变体2–VL22

SEQ ID NO:18人源化的CDRH2–YIAVSGNTYYADSVKG

SEQ ID NO:19人源化的VH变体1–VH32

SEQ ID NO:20人源化的VH变体2–VH20

SEQ ID NO:21人源化的VH变体3–VH33

SEQ ID NO:22人源化的CDRL2变体2–SASTLQS

SEQ ID NO:23人源化的CDRL2变体3–SASTLES

SEQ ID NO:24人源化的CDRL3变体2–LGYFDSSIADSVA

SEQ ID NO:25人源化的CDRL3变体3–LGYFDSSIADRVA

SEQ ID NO:26人源化的CDRL3变体4–LGYFDPSIADPVA

SEQ ID NO:27人源化的CDRL3变体5–LGYFDSSIADIVA

SEQ ID NO:28人源化的CDRL3变体6–LGYFDPSADPIA

SEQ ID NO:29人源化的CDRL3变体7–LGYFDPSADPVA

SEQ ID NO:30人源化的CDRL1变体3–RASQGVRTNKLA

SEQ ID NO:31人源化的CDRL1变体4–RASQSVRTNKLA

SEQ ID NO:32人源化的VL变体4–VL01

SEQ ID NO:33人源化的VL变体5–VL09

SEQ ID NO:34人源化的VL变体6–VL12

SEQ ID NO:35人源化的VL变体7–VL15

SEQ ID NO:36人源化的VL变体8–VL16

SEQ ID NO:37人源化的VL变体9–VL17

SEQ ID NO:38人源化的VL变体10–VL19

SEQ ID NO:39人源化的VL变体11–VL28

SEQ ID NO:40人源化的VL变体12–VL33

SEQ ID NO:41人源化的VL变体13–VL35

SEQ ID NO:42人源化的VL变体14–VL39

SEQ ID NO:43人源化的VL变体15–VL40

SEQ ID NO:44人源化的VL变体16–VL41

SEQ ID NO:45人源化的VL变体17–VL42

SEQ ID NO:46人源化的VH变体4–VH01

SEQ ID NO:47人源化的VH变体5–VH02

SEQ ID NO:48人源化的VH变体6–VH03

SEQ ID NO:49人源化的VH变体7–VH04

SEQ ID NO:50人源化的VH变体8–VH14

SEQ ID NO:51人源化的VH变体9–VH15

SEQ ID NO:52人源化的VH变体10–VH18

SEQ ID NO:53人源化的VH变体11–VH19

SEQ ID NO:54人源化的VH变体12–VH22

SEQ ID NO:55人源化的VH变体13–VH23

SEQ ID NO:56人源化的VH变体14–VH24

SEQ ID NO:57人源化的VH变体15–VH31

序列对应表:

发明实施方案详述

I.定义

用于本文中的目的的“接受人框架”是如下文所述的包含源自人免疫球蛋白框架或人共有框架的轻链可变结构域(VL)框架或重链可变结构域(VH)框架的氨基酸序列的框架。“源自”人免疫球蛋白框架或人共有框架的接受人框架可以包含其相同氨基酸序列，或其可以含有氨基酸序列改变。在一些实施方案中，氨基酸改变的数量是10个或更少，9个或更少，8个或更少，7个或更少，6个或更少，5个或更少，4个或更少，3个或更少，或2个或更少。在一些实施方案中，VL接受人框架在序列上与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列相同。

“亲和力”是指分子(例如，抗体)的单个结合位点及其结合伙伴(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，如本文使用的，“结合亲和力”是指反映结合对(例如，抗体和抗原)的成员之间的1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X对其伙伴Y的亲和力通常可以由解离常数(kd)表示。亲和力可以通过本领域中已知的一般方法测量，包括本文中描述的那些。用于测量结合亲和力的具体说明性和示例性实施方案在下文中描述。

“亲和力成熟的”抗体是指与不具有这些改变的母体抗体相比，在一个以上高变区(HVRs)中具有一个以上该改变的抗体，该改变导致抗体对抗原的亲和力的改善。

术语“抗人Tau(pS422)抗体”和“结合人Tau(pS422)的抗体”是指能够以足够的亲和力结合人Tau(pS422)的抗体，从而所述抗体可在靶向人Tau(pS422)中用作诊断和/或治疗剂。在一个实施方案中，如例如，通过放射免疫测定(RIA)测量的，抗人Tau(pS422)抗体对不相关、非-人Tau(pS422)蛋白的结合程度小于抗体对人Tau(pS422)的结合的约10％。

以最宽泛的意义使用本文中的术语"抗体"，并且包括各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、和抗体片段，只要它们显示所希望的抗原-结合活性即可。

"抗体片段"是指不是完整抗体的分子，其包含结合完整抗体结合的抗原的完整抗体的部分。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab′、Fab’-SH、F(ab′)₂；双抗体(diabodies)；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。

“结合”与参照抗体“相同的表位的抗体”是指在竞争测定中以50％以上阻断参照抗体与其抗原的结合的抗体，并且反过来，参照抗体在竞争测定中以50％以上阻断抗体对其抗原的结合。在一个实施方案中，结合与参照抗体相同的表位的抗体以50％以上阻断参照抗体与其抗原的结合。在一个实施方案中，结合与参照抗体相同的表位的抗体以80％以上阻断参照抗体与其抗原的结合。在一个实施方案中，结合与参照抗体相同的表位的抗体以90％以上阻断参照抗体与其抗原的结合。在一个实施方案中，结合与参照抗体相同的表位的抗体以95％以上阻断参照抗体与其抗原的结合。在一个优选的实施方案中，结合与参照抗体相同的表位的抗体与抗原上与参照抗体相同的残基具有结合相互作用。

术语"嵌合"抗体是指其中重链和/或轻链的部分源自特定来源或物种，而重链和/或轻链的剩余部分源自不同来源或物种的抗体。

抗体的“类型”是指其重链具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五种主要的抗体类型：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如，IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁和IgA₂。对应于免疫球蛋白的不同类型的重链恒定结构域分别被称为α、δ、ε、γ、和μ。

“效应子功能”是指归因于抗体的Fc区的那些生物活性，其随着抗体类型而变化。抗体效应子功能的实例包括:C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体-依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调；和B细胞激活。

药剂，例如，药物制剂的"有效量"，是指在需要的剂量和时期有效获得所需治疗或预防结果的量。

本文中的术语“Fc-区”用于定义含有至少一部分恒定区的免疫球蛋白重链的C-末端区域。术语包括天然序列Fc-区和变体Fc-区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc-区从Cys226，或从Pro230延伸到重链的羧基末端。然而，Fc-区的C-末端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。除非本文中另有说明，Fc-区或恒定区中的氨基酸残基编号根据EU编号***，也称为EU索引，如Kabat，E.A.等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)，NIH Publication 91-3242中描述的。

"框架"或"FR"是指除了高变区(HVR)残基的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由四个FR结构域组成:FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR和FR序列在VH(或VL)中通常以以下顺序出现:

FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。

本文中可交换地使用术语“全长抗体”、“完整抗体”和“完全抗体”，是指具有与天然抗体结构基本上类似的结构或具有含有如本文定义的Fc-区的重链的抗体。术语“全长抗体”表示由通过二硫键连接的两条抗体轻链多肽和两条抗体重链多肽组成的多聚体多肽，其中在所述两条抗体重链多肽中，C-末端赖氨酸残基(K)可以存在或不存在。

术语"宿主细胞"、"宿主细胞系"和"宿主细胞培养物"可交换使用，是指向其中引入外源核酸的细胞，包括所述细胞的子代。宿主细胞包括"转化子"和"转化的细胞"，其包括原代转化的细胞和从其衍生的子代(不考虑传代数)。子代的核酸含量可以不完全与母细胞相同，而是可以含有突变。具有与对于在最初细胞中筛选或选择的相同功能或生物活性的突变体子代包括在本文中。

“人共有框架”是代表在人免疫球蛋白VL或VH框架序列的选择中最常存在的氨基酸残基的框架。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列的选择来自可变结构域序列亚群。通常，序列的亚群是如Kabat，E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Bethesda MD(1991)，NIH Publication 91-3242，第1-3卷中的亚群。在一个实施方案中，对于VL，亚群是如在Kabat等人，见前中的亚群κI。在一个实施方案中，对于VH，亚群是如Kabat等人，见前中的亚群III。

“人源化的”抗体是指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化的抗体将包含基本上至少一个，并且通常两个可变结构域中的全部，其中全部或基本上全部HVRs(例如，CDRs)对应于非人抗体的那些，并且全部或基本上全部FR对应于人抗体的那些。人源化的抗体可以任选地包含至少一部分源自人抗体的抗体恒定区。抗体，例如，非人抗体的“人源化形式”是指经历人源化的抗体。

如本文使用的术语“高变区”或“HVR”，是指抗体可变结构域在序列上高变(“互补决定区”或“CDR”)并且形成结构限定的环(“高变环”)，和/或含有抗原-接触残基(“抗原接触部位(antigen contacts)”)的各个区域。通常，抗体包含六个HVRs；三个在VH(H1、H2、H3)中，并且三个在VL(L1、L2、L3)中。

本文中HVR包括

(a)高变环，其存在于氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)、和96-101(H3)处(Chothia，C.和Lesk，A.M.，J.Mol.Biol.196(1987)901-917)；

(b)CDR，其存在于氨基酸残基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)、和95-102(H3)处(Kabat，E.A.等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)，NIH Publication 91-3242)；

(c)抗原接触部位，其存在于氨基酸残基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)、和93-101(H3)处(MacCallum等人J.Mol.Biol.262:732-745(1996))；以及

(d)(a)、(b)、和/或(c)的组合，包括HVR氨基酸残基46-56(L2)、47-56(L2)、48-56(L2)、49-56(L2)、26-35(H1)、26-35b(H1)、49-65(H2)、93-102(H3)、和94-102(H3)。

除非另有说明，HVR残基和可变结构域中的其他残基(例如，FR残基)在本文中根据Kabat等人，见前编号。

“免疫缀合物”是缀合于一个以上异源分子的抗体。

“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括，但不限于，驯养动物(例如牛、绵羊、猫、狗、和马)，灵长类(例如，人和非人灵长类如猴)、兔和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，所述个体或受试者是人。

"分离的"抗体是从其天然环境的成分分离的抗体。在一些实施方案中，如通过例如，电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱(例如，离子交换或反相HPLC)，抗体被纯化至大于95％或99％纯度。对于评价抗体纯度的方法的综述，参见，例如，Flatman，S.等人，J.Chromatogr.B 848(2007)79-87。

"分离的"核酸是指从其天然环境的成分分离的核酸分子。分离的核酸包括包含在通常含有所述核酸分子，但所述核酸分子存在于染色体外或在与其天然染色***置不同的染色***置处的细胞中的核酸分子。

“编码抗人Tau(pS422)抗体的分离的核酸的”是指一个以上编码抗体重链和轻链(或其片段)的核酸分子，包括单个载体或分离的载体中的这样的一种或多种核酸分子，和存在于宿主细胞中一个以上位置的这样的一种或多种核酸分子。

术语"单克隆抗体"如本文使用的是指获自基本上同源的抗体群体的抗体，即，组成所述群体的单个抗体是相同的和/或结合相同表位，除了可能的变体抗体以外，例如，所述变体抗体含有天然发生的突变或在单克隆抗体制备期间产生，所述变体通常少量存在。与多克隆抗体制剂(其典型地包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体)相对，单克隆抗体制剂的各个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。由此，定语“单克隆”抗体表示获自基本上同源的抗体群体的特征，并且不被认为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，要根据本发明使用的单克隆抗体可以通过多种技术制备，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法、和使用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，这些方法和其他用于制备单克隆抗体的示例性方法在本文中描述。

"天然抗体"是指具有各种结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异四聚的糖蛋白，由二硫键键合的两个相同轻链和两个相同重链构成。从N-末端至C-末端，各个重链具有可变区(VH)，也称为可变重结构域或重链可变结构域，接着三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)。类似地，从N-末端至C-末端，各个轻链具有可变区(VL)，也称为可变轻结构域或轻链可变结构域，接着恒定轻(CL)结构域。抗体的轻链可以指定为基于其恒定结构域的氨基酸序列的称为kappa(κ)和lambda(λ)的两种类型中的一种。

术语“药品说明书(package insert)”用于指通常包括在治疗性产品的商业包装中的使用说明，其含有关于适应症、使用、剂量、施用、组合治疗、禁忌症和/或关于使用这样的治疗产品的警告。

相对于参照多肽序列的“百分数(％)氨基酸序列同一性"定义为在比对序列并且如果需要引入空隙以获得最大百分数序列同一性，并且不考虑任何保守取代为序列同一性的部分后，候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分数。为了确定百分数氨基酸序列同一性的比对可以以本领技术人员知晓的各种方式实现，例如，使用公众可获得的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适当参数，包括实现被比较的序列的全长的最大比对所需的任何算法。然而，为了本文中的目的，使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生％氨基酸序列同一性值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech，Inc.创作，并且源代码已经与用户文件一起提交到美国版权局(U.S.Copyright Office)，Washington D.C.，20559，在那里，其在美国版权登记号TXU510087下登记。公众可从Genentech，Inc.，South San Francisco，California获得ALIGN-2程序，或可以从源代码编辑。应该编辑ALIGN-2程序以在UNIX操作***上使用，包括数字UNIX V4.0D。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设置并且不改变。

在ALIGN-2用于氨基酸序列比较的情况下，给定氨基酸序列A对、与或针对给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(其可以备选地叙述为具有或包含对、与或针对给定氨基酸序列B的某％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)如下计算:

100乘以分数X/Y

其中X是得分为通过序列比对程序ALIGN-2，在该程序的A和B比对中完全匹配的氨基酸残基的数量，并且其中Y是B中氨基酸残基的总数。将理解，在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度的情况下，A与B的％氨基酸序列同一性将不等于B与A的％氨基酸序列同一性。除非另外特别陈述，本文使用的所有％氨基酸序列同一性值如紧接的段落中描述的使用ALIGN-2计算机程序获得。

术语"药物制剂"是指这样的形式的制剂，所述形式允许其中含有的活性成分的生物活性有效，并且所述制剂不含有对制剂将施用于的受试者有不可接受的毒性的另外的成分。

“药用载体”是指药物制剂中除了活性成分之外的成分，其对受试者无毒。药用载体包括，但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。

如本文使用的术语“人Tau(pS422)”，是指天然的人Tau(pS422)(UniProtP37840)。术语包括“全长”，未加工的人Tau(pS422)以及由在细胞中加工得到的人Tau(pS422)的任何形式。术语还包括天然存在的人Tau(pS422)的变体，例如，突变体、剪接变体或等位基因变体。人Tau(pS422)的氨基酸序列显示在SEQ ID NO:02中。

如本文使用的，“治疗(treatment)”(及其语法变化形式如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指改变被治疗的个体的天然过程的尝试中的临床干预，并且可以进行用于预防或在临床病理学过程期间进行。希望的治疗效果包括，但不限于，防止疾病发生或复发、缓解症状、减轻疾病的任何直接或间接病理后果、预防转移、减小疾病进展速率、改善或减轻疾病状态、和缓和或改善的预后。在一些实施方案中，本发明的抗体用于延迟疾病的发展或减缓疾病的进展。

术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链的参与抗体与抗原结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别是VH和VL)通常具有类似结构，各个结构域包含四个保守的框架区(FR)和三个高变区(HVR)。(参见，例如，Kindt，T.J.等人KubyImmunology，第6版，W.H.Freeman & Co.，N.Y.(2007)，第91页)单个VH或VL结构域可能足以赋予抗原-结合特异性。此外，结合特定抗原的抗体可以使用来自结合抗原的抗体的VH或VL结构域以分别筛选互补的VL或VH结构域库而分离。参见，例如，Portolano，S.等人，J.Immunol.150(1993)880-887；Clackson，T.等人，Nature 352(1991)624-628)。

如本文使用的，术语"载体"，是指能够扩增与其连接的另一核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制的核酸结构的载体以及整合入宿主细胞(其被引入其中)的基因组的载体。某些载体能够指导它们可操作地连接的核酸的表达。这样的载体在本文中被称为"表达载体"。

II.组合物和方法

A.示例性人源化的抗人Tau(pS422)抗体

如本文报道的人源化的抗体不可通过标准人源化方法获得。需要在氨基酸序列中引入非标准突变以获得具有与母体兔抗体相当的结合特性的人源化的抗体。这特别重要，因为如本文报道的抗体意在跨越人血脑屏障并在人脑内起作用。因此，用于选择人源化抗体的通常应用的标准的严格程度不足以直接用于本案。

已经发现，为了获的合适的和可开发的人源化的抗体，在CDRL3(轻链CDR3)中形成二硫键的两个半胱氨酸必需分别被丝氨酸和异亮氨酸替代。除了保证相同CDRL3的正确取向之外，存在于兔CDRL3中间的异亮氨酸残基被缺失，得到比母体兔CDRL3少一个氨基酸残基的人源化的CDRL3。

还进一步发现，在重链位置4、24和78处维持三个缬氨酸氨基酸残基是有利的。不受该理论限制，猜想这些残基是保证重链可变区的抗原结合环的正确呈递所需的。此外，位置71处精氨酸残基的存在是有利的。

不同人源化的轻链可变结构域的序列比对显示在图1中。不同人源化的重链可变结构域的序列比对显示在图2中。如本文使用的所有编号基于Kabat可变结构域编号方案。

在下表中，显示分别与人源化的重链可变结构域VH14和VH20组合的兔轻链可变结构域的不同人源化的变体的特性。结合伙伴是人Tau(pS422)。

参考值VH00与VL00(兔抗体):

25℃:kd＝2.6E-04；t/2＝44min.

37℃:ka＝3.7E+04，kd＝5.25E-03，KD＝1.4E-08，t/2＝22min.

在下表中，显示分别与人源化的轻链可变结构域VL17和VL19组合的兔轻链可变结构域的不同人源化的变体的特性。

参考值VH00与VL00(兔抗体):

25℃:kd＝2.6E-04；t/2＝44min.

37℃:ka＝3.7E+04，kd＝5.25E-03，KD＝1.4E-08，t/2＝22min.

在下表中显示不同VH/VL组合的动力学常数。

人源化的VH和VL的不同组合的生物化学结合显示在图3和4中。

在下表中显示不同VH/VL组合的结合特异性(EC50值，以[ng/ml]计)。

从图5中显示的蛋白质印迹可以看出选择的人源化的VH/VL组合对人tau突变体S422A的灵敏度。所有人源化的变体选择性地结合在S422磷酸化的人tau。对母体兔抗体的非S422磷酸化表位存在低水平的x-反应性，但在这一点，显示的人源化的变体具有比母体兔抗体弱的交叉反应性。

在图6中，显示对于母体兔抗体和对于选择的人源化的抗人Tau(pS422)抗体，对阿尔茨海默病患者的脑提取物中PHF-tau的结合。

下表概述了选择的人源化的VH/VL组合的生物学性质。

在一个方面，本发明提供(人源化的)抗人Tau(pS422)抗体，其包含至少一个、或两个、或三个、或四个、或五个、或六个选自以下的HVR：(a)包含SEQ ID NO:08的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HVR-L3。

在一个方面，本发明提供(人源化的)抗人Tau(pS422)抗体，其包含至少一个、或两个、或三个、或四个、或五个、或六个选自以下的HVR：(a)包含SEQ ID NO:08的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:09的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:05的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HVR-L3。

在一个方面，本发明提供(人源化的)抗人Tau(pS422)抗体，其包含至少一个、或两个、或三个、或四个、或五个、或六个选自以下的HVR：(a)包含SEQ ID NO:08的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:09的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HVR-L3。

在一个方面，本发明提供(人源化的)抗体，其包含至少一个、至少两个、或所有三个选自以下的VH HVR序列：

i)(a)包含SEQ ID NO:08的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HVR-H3；或

ii)(a)包含SEQ ID NO:08的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:09的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HVR-H3。

在一个实施方案中，所述抗体包含

在另一个实施方案中，所述抗体还包含至少一个、至少两个、或所有三个选自以下的VL HVR序列：

i)(a)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HVR-L3；或

ii)(a)包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:05的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HVR-L3。

在进一步的实施方案中，所述抗体包含

在一个方面，本发明提供(人源化的)抗体，包含

i)(a)包含SEQ ID NO:08的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HVR-L3，或

ii)(a)包含SEQ ID NO:08的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:09的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:05的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ IDNO:15的氨基酸序列的HVR-L3，或

iii)(a)包含SEQ ID NO:08的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:09的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ IDNO:15的氨基酸序列的HVR-L3。

在另一实施方案中，相对于参照序列，VH或VL含有取代(例如保守取代)、***、或缺失，但包含该序列的抗人Tau(pS422)抗体保留结合人Tau(pS422)的能力。

在本发明的进一步方面，根据上述实施方案中任一个的抗人Tau(pS422)抗体是单克隆抗体，包括嵌合、人源化或人抗体。在一个实施方案中，抗人Tau(pS422)抗体是抗体片段，例如，Fv、Fab、Fab’、scFv、双抗体、或F(ab’)₂片段。在另一实施方案中，所述抗体是全长抗体，例如，完整IgG1或IgG 4抗体或如本文定义的其他抗体类型或同种型。

如本文报道的(人源化的)抗体降低转基因TauPS2APP小鼠的脑中的Tau(pS422)水平。

在进一步的方面，根据上述实施方案中任一个的(人源化的)抗人Tau(pS422)抗体可以单独或组合并入如以下1-7节中描述的任何特征：

1.抗体亲和力

在某些实施方案中，本文提供的抗体具有≤100nM，≤50nM，或1nM至100nM之间(例如10^-7M或更少，例如从10^-7M至10^-9M)的解离常数(KD)。

在一个实施方案中，Kd通过放射标记的抗原结合测定(RIA)测量。在一个实施方案中，RIA以研究的抗体的Fab版本及其抗原进行。例如，FAB对于抗原的溶液结合亲和力通过在未标记的抗原滴定系列的存在下利用最小浓度的(¹²⁵I)-标记的抗原平衡Fab，然后用抗-Fab抗体-包被的板捕获结合的抗原来测量(参见，例如，Chen，Y.等人，J.Mol.Biol.293(1999)865-881)。为了建立测定条件，将多孔板(Thermo Scientific)用5μg/ml的捕获抗-Fab抗体(Cappel Labs)在50mM碳酸钠(pH 9.6)中包被过夜，并且随后用PBS中的2％(w/v)牛血清白蛋白在室温(大约23℃)包被二至五小时。在非吸附板(Nunc#269620)中，将100pM或26pM[¹²⁵I]-抗原与研究的Fab的系列稀释物混合(例如，与在Presta，L.G.等人，Cancer Res.57(1997)4593-4599中对抗-VEGF抗体，Fab-12的评价一致)。然后将研究的Fab孵育过夜；然而，孵育可以继续更长时期(例如，约65小时)以保证达到平衡。之后，将混合物转移至捕获平板用于在室温孵育(例如，一小时)。然后移除溶液并将平板用PBS中的0.1％聚山梨醇酯20洗涤八次。当平板干燥时，加入150μl/孔的闪烁液(scintillant)(MICROSCINT-20^TM；Packard)，并且将平板在TOPCOUNT^TM计数器(Packard)上计数十分钟。选择各个Fab的给出小于或等于最大结合的20％的浓度用于竞争结合测定。

根据另一个实施方案，Kd使用表面等离子共振测量。例如，使用-2000或-3000(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)的测定在25℃利用以～10响应单位(RU)固定的抗原CM5芯片进行。在一个实施方案中，根据供应商的使用说明将羧甲基化的葡聚糖生物传感器芯片(CM5，BIACORE，Inc.)用N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化。将抗原用10mM乙酸钠，pH4.8，稀释至5μg/ml(～0.2μM)，然后以5μl/分钟的流速注射获得大约10响应单位(RU)的偶联的蛋白。注射抗原后，注入1M乙醇胺以封闭未反应的基团。为了动力学测量，将两倍系列稀释的Fab(0.78nM至500nM)在具有0.05％聚山梨醇酯20(TWEEN-20^TM)表面活性剂的PBS(PBST)中以大约25μl/min的速率在25℃注射。使用简单的一对一Langmuir结合模型(评价软件版本3.2)，通过同时拟合结合和解离传感曲线计算结合常数(k_on)和解离常数(k_off)。平衡解离常数(Kd)计算为比率k_off/k_on(参见，例如，Chen，Y.等人，J.Mol.Biol.293(1999)865-881)。如果通过上述表面等离子共振测定结合速率(on-rate)超过10⁶M^-1s^-1，则结合速率可以通过使用荧光猝灭技术测定，该技术在分光计，如停流装备的分光光度计(Aviv Instruments)或具有搅拌容器的8000-系列SLM-AMINCO^TM分光光度计(ThermoSpectronic)中测量的增加的抗原浓度的存在下，测量PBS，pH 7.2中的20nM抗-抗原抗体(Fab形式)在25℃的荧光发生强度的增加或减少(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)。

2.抗体片段

在某些实施方案中，本文中提供的抗体是抗体片段。抗体片段包括，但不限于Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)₂、Fv、和scFv片段以及下文描述的其他片段。对于特定抗体片段的综述，参见Hudson，P.J.等人，Nat.Med.9(2003)129-134。对于scFv片段的综述，参见，例如，Plueckthun，A.，In；The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg和Moore(编辑)，Springer-Verlag，纽约(1994)，pp.269-315；还参见WO 93/16185；US 5,571,894和US 5,587,458。对于包含营救受体结合表位残基并且具有增加的体内半衰期的Fab和F(ab′)₂片段的讨论，参见US 5,869,046。

双抗体是具有两个抗原-结合位点的抗体片段，其可以是双价的或双特异的。参见，例如，EP 0 404 097；WO 1993/01161；Hudson，P.J.等人，Nat.Med.9(2003)129-134；和Holliger，P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(1993)6444-6448。三抗体(Triabodies)和四抗体(tetrabodies)也在Hudson，P.J.等人，Nat.Med.9(20039 129-134)中描述。

单结构域抗体是包含抗体的重链可变结构域的全部或部分或抗体的轻链可变结构域的全部或部分的抗体片段。在某些实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis，Inc.，Waltham，MA；参见，例如，US 6,248,516)。

抗体片段可以通过多种技术制备，包括但不限于蛋白水解消化完整抗体以及通过重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)产生，如本文中所述的。

3.人源化的抗体

通常，非人抗体被人源化以减小对人的免疫原性，同时保留母体非人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化的抗体包含一个以上可变结构域，其中HVR，例如，CDR，(或其部分)源自非人抗体，并且FR(或其部分)源自人抗体序列。人源化的抗体还将任选地包含至少一部分或全长人恒定区。在一些实施方案中，人源化的抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如HVR残基源自的抗体)的相应残基取代，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。

人源化的抗体和制备它们的方法，例如，在Almagro，J.C.和Fransson，J.，Front.Biosci.13(2008)1619-1633中综述，并且进一步例如，在Riechmann，I.等人，Nature332(1988)323-329；Queen，C.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)10029-10033；US5，821,337，US 7,527,791，US 6,982,321，和US 7,087,409；Kashmiri，S.V.等人，Methods36(2005)25-34(描述特异性决定区(SDR)接枝)；Padlan，E.A.，Mol.Immunol.28(1991)489-498(描述“表面重塑(resurfacing)”)；Dall’Acqua，W.F.等人，Methods 36(2005)43-60(描述“FR改组(shuffling)”)；和Osbourn，J.等人，Methods 36(2005)61-68和Klimka，A.等人，Br.J.Cancer 83(2000)252-260(描述对于FR改组的“导向选择”方法)中描述。

可以用于人源化的人框架区包括但不限于:使用"最佳匹配(best-fit)"方法选择的框架区(参见，例如，Sims，M.J.等人，J.Immunol.151(1993)2296-2308；源自轻链或重链可变区的特定亚群的人抗体的共有序列的框架区(参见，例如，Carter，P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992)4285-4289；和Presta，L.G.等人，J.Immunol.151(1993)2623-2632)；人成熟(体细胞成熟的)框架区或人生殖系框架区(参见，例如，Almagro，J.C.和Fransson，J.，Front.Biosci.13(2008)1619-1633)；和源自筛选FR库的框架区(参见，例如，Baca，M.等人，J.Biol.Chem.272(1997)10678-10684和Rosok，M.J.等人，J.Biol.Chem.271(19969 22611-22618)。

4.多特异性抗体

在某些实施方案中，本文中提供的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，结合特异性中的一种针对人Tau(pS422)并且另一种针对任何其他抗原。在某些实施方案中，双特异性抗体可以结合人Tau(pS422)的两个不同表位。双特异性抗体可以制备为全长抗体或抗体片段。

制备多特异性抗体的技术包括，但不限于，重组共表达两个具有不同特异性的免疫球蛋白重链-轻链对(参见Milstein，C.和Cuello，A.C.，Nature305(1983)537-540，WO93/08829，以及Traunecker，A.等人，EMBO J.10(1991)3655-3659)，和“旋钮于孔中(knob-in-hole)”改造(参见，例如，US 5,731,168)。多特异性抗体还可以通过改造静电转向效果来制备，用于制备抗体Fc-异二聚分子(WO 2009/089004)；交联两个以上抗体或片段(参见，例如，US 4,676,980，和Brennan，M.等人，Science 229(1985)81-83)；使用亮氨酸拉链产生双特异性抗体(参见，例如，Kostelny，S.A.等人，J.Immunol.148(1992)1547-1553；使用"双抗体"技术制备双特异性抗体片段(参见，例如，Holliger，P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)6444-6448)；和使用单链Fv(sFv)二聚体(参见，例如Gruber，M等人，J.Immunol.152(1994)5368-5374)；以及制备所述的三特异性抗体，例如，在Tutt，A.等人，J.Immunol.147(1991)60-69)中。

具有三个以上功能性抗原结合位点的改造的抗体，包括“Octopus抗体,”也包括在本文中(参见，例如US 2006/0025576)。

本文中的抗体或片段还包括“双重作用Fab”或“DAF”，其包含结合人Tau(pS422)以及另一不同抗原的抗原结合位点(参见，例如US 2008/0069820)。

本文中的抗体或片段还包括在以下中描述的多特异性抗体：

WO 2009/080251、WO 2009/080252、WO 2009/080253、WO 2009/080254、WO 2010/112193、WO 2010/115589、WO 2010/136172、WO 2010/145792和WO 2010/145793。

5.抗体变体

在某些实施方案中，考虑本文提供的抗体氨基酸序列变体。例如，可以希望改善抗体的结合亲和力和/或其他生物性质。抗体的氨基酸序列变体可以通过将适当的修饰引编码抗体的核苷酸序列，或通过肽合成来制备。所述修饰包括，例如，从抗体的氨基酸序列缺失残基，和/或***残基到抗体的氨基酸序列中和/或取代抗体的氨基酸序列内的残基。可以进行缺失、***和取代的任意组合以获得最终构建体，条件是，最终构建体具有希望的特性，例如，抗原结合。

a)取代、***和缺失变体

在某些实施方案中，提供具有一个以上氨基酸取代的抗体变体。取代性诱变的研究位点包括HVR和FR。保守取代在以下标题为"优选的取代"的表中显示。更多的重要改变在以下标题为"示例性取代"表中显示，并且如以下参考氨基酸侧链类型描述的。可以将氨基酸取代引入研究的抗体和对于所需活性，例如，保留/改善的抗原结合、减少的免疫原性、或改善的ADCC或CDC进行筛选的产物。

表

氨基酸可以根据常见侧链性质分组：

(1)疏水的:正亮氨酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile；

(2)中性亲水的:Cys，Ser，Thr，Asn，Gln；

(3)酸性的:Asp，Glu；

(4)碱性的:His，Lys，Arg；

(5)影响侧链取向的残基:Gly，Pro；

(6)芳族的:Trp，Tyr，Phe.

非保守性取代将需要将这些类型中的一种的一个成员交换为其他类型。

取代性变体的一种类型涉及取代母体抗体(例如人源化的抗体)的一个以上高变区残基。通常，选择用于进一步研究的得到的一种或多种变体相对于母体抗体将具有某些生物性质(例如改善)(例如增加的亲和力、降低的免疫原性)和/或将具有基本上保留的母体抗体的某些生物性质的修饰。示例性取代性变体是亲和力成熟的抗体，其可以例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术(如本文中描述的那些)容易地产生。简言之，一个以上HVR残基突变并且变体抗体展示在噬菌体上并且对具体生物活性(例如结合亲和力)进行筛选。

改变(例如，取代)可以在HVR中进行，以例如改善抗体亲和力。这样的改变可以在HVR“热点”(即，编码在体细胞成熟过程中以高频率经历突变的密码子的残基(参见，例如，Chowdhury，P.S.，Methods Mol.Biol.207(2008)179-196)，和/或接触抗原的残基)中进行，对得到的变体VH或VL测试结合亲和力。在例如，Hoogenboom，H.R.等人在Methods inMolecular Biology 178(2002)1-37中描述了通过构建次级库并从中重新选择来进行亲和力成熟。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法(例如，易错PCR，链改组(chainshuffling)，或寡核苷酸定向诱变)中的任一种在选择用于成熟的可变基因中引入多样性。然后产生次级库。然后对库筛选以鉴定具有所需亲和力的任意抗体变体。引入多样性的另一方法涉及HVR-定向的方法，其中随机化多种HVR残基(例如，一次4-6个残基)。参与抗原结合的HVR残基可以例如，使用丙氨酸扫描诱变或建模(modeling)具体识别。尤其是经常靶向CDR-H3和CDR-L3。

在某些实施方案中，取代、***或缺失可以在一个以上HVR内发生，只要所述改变基本上不降低抗体结合抗原的能力即可。例如，基本上不减少结合亲和力的保守改变(例如，本文中提供的保守取代)可以在HVR中进行。所述改变可以，例如，在HVR中的抗原接触残基外侧。在上文提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中，各个HVR或者未改变，或含有不多于一个、两个或三个氨基酸取代。

用于鉴别可以被靶向用于诱变的抗体的残基或区域的有用方法称为"丙氨酸扫描诱变"，如由Cunningham，B.C.和Wells，J.A.，Science 244(1989)1081-1085描述的。在该方法中，鉴别靶标残基的残基或基团(例如，带电残基如arg、asp、his、lys和glu)并被中性或带负电氨基酸(例如，丙氨酸或聚丙氨酸)替代来确定抗体与抗原的相互作用是否受影响。进一步取代可以在氨基酸位置引入，所述氨基酸位置显示对初步取代功能敏感。备选地，或此外，抗原-抗体复合体的晶体结构鉴别抗体和抗原之间的接触点。作为用于取代的候选物，可以靶向或消除该接触残基和相邻残基。可以筛选变体以确定它们是否含有所需性质。

氨基酸序列***包括长度从一个残基至含有一百个以上残基的多肽的氨基和/或羧基末端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内***。末端***的实例包括具有N-末端甲硫氨酰残基的抗体。抗体分子的其他***变体包括抗体的N-或C-末端与酶(例如对于ADEPT)或多肽的融合，其增加抗体的血清半衰期。

b)糖基化变体

在某些实施方案中，改变本文中提供的抗体以增加或减少抗体糖基化的程度。向抗体添加或缺失糖基化位点可以通过改变氨基酸序列方便地完成，从而产生或去除一个以上糖基化位点。

在所述抗体包含Fc-区的情况下，可以改变连接于其的碳水化合物。通过哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含通常通过N-连接连接于Fc-区的CH2结构域的Asn297的支链、双分支的寡糖(参见，例如，Wright，A.和Morrison，S.L.，TIBTECH 15(1997)26-32)。寡糖可以包括各种碳水化合物，例如，甘露糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)，半乳糖和唾液酸，以及以双分支寡糖结构的“茎”连接于GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方案中，可以进行本发明的抗体中的寡糖的修饰以产生具有特定改善的性质的抗体变体。

c)Fc-区变体

在某些实施方案中，可以将一个以上氨基酸修饰引入本文中提供的抗体的Fc-区中，从而产生Fc-区变体。Fc-区变体可以包含在一个以上氨基酸位置具有氨基酸修饰(例如取代)的人Fc-区序列(例如人IgG1，IgG2，IgG3或IgG4Fc-区)。

在某些实施方案中，本发明考虑具有一些但不是全部效应子功能的抗体变体，这使其成为用于其中抗体的体内半衰期是重要的，但某些效应子功能(如补体和ADCC)是不需要的或有害的应用的希望的候选物。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定以确认CDC和/或ADCC活性的减少/减损。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定以保证抗体缺少FcγR结合(因此可能缺少ADCC活性)，但保留FcRn结合能力。用于介导ADCC的原代细胞，NK细胞，仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI，FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达总结在Ravetch，J.V.和Kinet，J.P.，Annu.Rev.Immunol.9(1991)457-492的第464页的表3中。体外测定以评价研究的分子的ADCC活性的非限制性实例在US 5,500,362(参见，例如Hellstrom，I.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83(1986)7059-7063；和Hellstrom，I.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82(1985)1499-1502)；US 5,821,337(参见Bruggemann，M.等人，J.Exp.Med.166(1987)1351-1361)中描述。备选地，可以使用非放射活性测定方法(参见，例如，用于流式细胞术的ACTI^TM非放射活性细胞毒性(CellTechnology，Inc.Mountain View，CA；和CytoTox 非放射活性细胞毒性测定(Promega，Madison，WI)。可用于该测定的效应子细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。备选地，或此外，可以在体内，例如在动物模型，如Clynes，R.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(1998)652-656中公开的那样评价研究的分子的ADCC活性。还可以进行C1q结合测定以确认抗体不能结合C1q并且因此缺少CDC活性。参见，例如，WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评价补体激活，可以进行CDC测定(参见，例如，Gazzano-Santoro，H.等人，J.Immunol.Methods 202(1996)163-171；Cragg，M.S.等人，Blood 101(2003)1045-1052；和Cragg，M.S.和M.J.Glennie，Blood 103(2004)2738-2743)。还可以使用本领域已知的方法进行FcRn结合和体内清除/半衰期确定(参见，例如，Petkova，S.B.等人，Int.Immunol.18(2006:1759-1769)。

具有减小的效应子功能的抗体包括具有Fc-区残基238，265，269，270，297，327和329中的一个或多个取代的那些(US 6,737,056)。该Fc-区突变体包括在氨基酸位置265，269，270，297和327中的两个或多个处具有取代的Fc-区突变体，包括残基265和297取代为丙氨酸(US 7,332,581)的所谓的“DANA”Fc-区突变体。

描述了某些具有改善的或减少的对FcR的结合的抗体变体(参见，例如，US 6,737,056；WO 2004/056312，和Shields，R.L.等人，J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604)。

在一些实施方案中，在Fc-区进行改变，导致改变的(即减少)C1q结合和/或补体依赖细胞毒性(CDC)，例如，US 6,194,551，WO 99/51642，和Idusogie，E.E.等人，J.Immunol.164(2000)4178-4184中描述的。

具有增加的半衰期和改善的对新生儿Fc受体(FcRn)(其负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer，R.L.等人，J.Immunol.117(1976)587-593，和Kim，J.K.等人，J.Immunol.24(1994)2429-2434))的结合的抗体在US2005/0014934中描述。那些抗体包含其中具有一个以上改善Fc-区对FcRn的结合的取代的Fc-区。所述Fc-区变体包括在以下Fc-区残基中的一个或多个处具有取代的那些:238，256，265，272，286，303，305，307，311，312，317，340，356，360，362，376，378，380，382，413，424或434，例如，Fc-区残基434的取代(US 7,371,826)。

关于Fc-区变体的其他实例，还参见Duncan，A.R.和Winter，G.，Nature322(1988)738-740；US 5,648,260；US 5,624,821；和WO 94/29351。

d)半胱氨酸改造的抗体变体

在某些实施方案中，可以希望产生半胱氨酸改造的抗体，例如“硫代MAbs”，其中抗体的一个以上残基被半胱氨酸残基取代。在特定实施方案中，取代的残基存在于抗体的可接近位点处。通过用半胱氨酸取代那些残基，由此反应性巯基位于抗体的可接近位点并且可以用于将抗体缀合于其他部分，如药物部分或接头药物部分，以产生免疫缀合物，如本文中进一步描述的。在某些实施方案中，以下残基的任意一个或多个可以被半胱氨酸取代:轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；和重链Fc-区的S400(EU编号)。半胱氨酸改造的抗体可以如例如，US 7,521,541中描述产生。

e)抗体衍生物

在某些实施方案中，本文中提供的抗体可以进一步修饰为含有本领域中已知的且可容易获得的另外的非蛋白部分。适于抗体的衍生的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括，但不限于，聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二噁烷、聚-1,3,6-三噁烷，乙烯/马来酸酐共聚物、多聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)、和葡聚糖或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇(propropylene glycol)均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛由于其在水中的稳定性而在制造方面可以具有优势。聚合物可以是任意分子量的，并且可以是分支的或未分支的。连接于抗体的聚合物的数量可以改变，并且如果连接多于一个聚合物，则它们可以是相同或不同分子。通常，用于衍生的聚合物的数量和/或类型可以基于包括但不限于要改善的抗体的特定性质或功能，抗体衍生物是否将在限定的条件下用于治疗等的考虑而确定。

在另一实施方案中，提供可以通过暴露于照射而选择性被加热的抗体和非蛋白部分的缀合物。在一个实施方案中，非蛋白部分是碳纳米管(Kam，N.W.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102(2005)11600-11605)。照射可以是任意波长的，并且包括，但不限于，不对普通细胞有害的波长，但其将非蛋白部分加热至接近抗体-非蛋白部分的细胞被杀伤的温度。

B.重组方法和组合物

可以使用重组方法和组合物，例如，US 4,816,567中所述的制备抗体。在一个实施方案中，提供编码本文中描述的抗人Tau(pS422)抗体的分离的核酸。所述核酸可以编码包含VL的氨基酸序列和/或包含抗体的VH的氨基酸序列(例如，抗体的轻和/或重链)。在进一步的实施方案中，提供一个以上包含所述核酸的载体(例如，表达载体)。在进一步的实施方案中，提供包含所述核酸的宿主细胞。在一个这样的实施方案中，宿主细胞包含(例如，转化有):(1)包含编码包含抗体的VL的氨基酸序列和包含抗体的VH的氨基酸序列的核酸的载体，或(2)包含编码包含抗体的VL的氨基酸序列的核酸的第一载体和包含编码包含抗体的VH的氨基酸序列的核酸的第二载体。在一个实施方案中，所述宿主细胞是真核的，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴细胞(例如，Y0，NS0，Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供制备抗人Tau(pS422)抗体的方法，其中所述方法包括在适于表达抗体的条件下培养包含编码如上文提供的抗体的核酸的宿主细胞，并且任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收抗体。

为了重组生产抗人Tau(pS422)抗体，分离编码例如本文所述的抗体的核酸，并且***一个以上载体用于进一步在宿主细胞中克隆和/或表达。所述核酸可以容易地使用常规步骤分离和测序(例如，通过使用能够特异结合编码抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。

用于克隆或表达抗体-编码载体的合适的宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。例如，抗体可以在细菌中生产，尤其是当不需要糖基化和Fc效应子功能时。对于在细菌中表达抗体片段和多肽，参见，例如，US 5,648,237，US 5,789,199，和US 5,840,523。(还参见Charlton，K.A.，在:Methods in Molecular Biology，第248卷，Lo，B.K.C.(编辑)，Humana Press，Totowa，NJ(2003)，pp.245-254中，其描述了在大肠杆菌中表达抗体片段)表达后，可以从细菌细胞糊以可溶的级分分离抗体并且可以进一步纯化。

除了原核生物以外，真核生物如丝状真菌或酵母是抗体-编码载体的合适的克隆或表达宿主，包括糖基化通路被“人源化的”真菌和酵母菌株，导致产生具有部分或完全人糖基化模式的抗体。参见Gerngross，T.U.，Nat.Biotech.22(2004)1409-1414；和Li，H.等人，Nat.Biotech.24(2006)210-215。

用于表达糖基化的抗体的合适的宿主细胞还源自多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了很多可以用于与昆虫细胞联合的杆状病毒株，特别是对于草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞的转染。

植物细胞培养物也可以用作宿主。参见，例如，US 5,959,177，US 6,040,498，US6,420,548，US 7,125,978和US 6,417,429(描述了用于在转基因植物中生产抗体的PLANTIBODIES^TM技术)。

也可以使用脊椎动物细胞作为宿主。例如，可以使用在悬浮液中适应生长的哺乳动物细胞系。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例是用SV40(COS-7)转化的猴肾CV1系；人胚胎肾系(如例如在Graham，F.L.等人，J.Gen Virol.36(1977)59-74中描述的293或293细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠睾丸支持细胞(如例如，在Mather，J.P.，Biol.Reprod.23(1980)243-252中描述的TM4细胞)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人***细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK；布法罗(buffalo)大鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562)；如例如在Mather，J.P.等人，AnnalsN.Y.Acad.Sci.383(1982)44-68中描述的TRI细胞；MRC 5细胞；和FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR^-CHO细胞(Urlaub，G.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77(1980)4216-4220)；和骨髓瘤细胞系如Y0、NS0和Sp2/0。对于适于抗体生产的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见，例如，Yazaki，P.和Wu，A.M.，Methods in Molecular Biology，第248卷，Lo，B.K.C.(ed.)，Humana Press，Totowa，NJ(2004)，pp.255-268。

C.测定

可以通过本领域中已知的各种测定，鉴定本文提供的抗人Tau(pS422)抗体，筛选或表征它们的物理/化学性质和/或生物活性。

1.结合测定和其他测定

在一个方面，例如，通过已知方法如ELISA、αLISA、蛋白质印迹、抗体或反相测定等对本发明的抗体测试其抗原结合活性等。

在示例性ELISA或αLISA测定中，溶液(细胞上清，细胞或组织裂解物、体液等)中的Tau(pS422)被特异结合Tau(pS422)上的第一表位或某种构象的Tau(pS422)的捕获抗体结合，并且特异结合第二表位或Tau(pS422)的构象的检测抗体与检测实体偶联。结果读取基于检测实体(化学发光、荧光、能量转移引起的发光等)。在一些情况中，同一抗体可以在同一测定中用作捕获和检测抗体以检测Tau(pS422)的聚集形式(参见例如Tokuda，T.等人，Neurology 75(2010)1766-1772)。

在抗体阵列的情况中，将抗体点在玻璃或硝酸纤维素芯片上。将载玻片封闭并用含有Tau(pS422)的溶液孵育，洗涤以去除未结合的抗体并且用荧光标记的相应二抗检测结合的抗体。通过荧光载玻片扫描器测量荧光信号。类似地，对于反相阵列，将重组Tau(pS422)、细胞上清、细胞或组织裂解物、体液等点在玻璃或硝酸纤维素芯片上。将载玻片封闭并且将个体阵列用针对Tau(pS422)上的特定表位的抗体孵育。洗去未结合的抗体并且利用荧光标记的对应二抗检测结合的抗体。通过荧光载玻片扫描器测量荧光信号(Dernick，G.，等人，J.Lipid Res.52(2011)2323-2331)。

在蛋白质印迹的实例中，将源自细胞上清、细胞或组织裂解物、体液等的聚集的重组Tau(pS422)或Tau(pS422)在SDS PAGE或天然凝胶条件中通过分子量分离并且印迹到硝酸纤维素或PVDF膜上。封闭后，将膜与对Tau(pS422)的氨基酸序列或构象特异的抗体孵育。然后将膜洗涤以去除未结合的抗体。用与检测实体偶联的相应二抗检测结合的抗体，用于化学发光或荧光或其方式的检测。对Tau(pS422)的氨基酸序列特异的抗体将结合各种聚集形式和因此各种分子量的Tau(pS422)，只要表位不被聚集所遮盖。另一方面，构象特异的抗体将仅检测Tau(pS422)的某些聚集形式，仅在特定分子量处显示条带(参见例如Towbin，H.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA76(1979)4350-4353；Burnette，W.N.，Anal.Biochem.112(1981)195-203)。

在另一方面，竞争测定可以用于鉴定与如本文报道的(人源化的)抗体竞争结合人Tau(pS422)的抗体。在某些实施方案中，这样的竞争性抗体结合被如本文报道的(人源化的)抗体结合的相同表位(例如，线性或构象表位)。在Morris，G.E.(ed.)，Epitipe MappingProtocols，于:Methods in Molecular Biology，第66卷，Humana Press，Totowa，NJ(1996)中提供用于将抗体结合表位制图的详细的示例性方法。

在示例性竞争测定中，将固定的人Tau(pS422)在包含结合人Tau(pS422)的第一标记的抗体和测试其与第一抗体竞争结合人Tau(pS422)的能力的第二未标记的抗体的溶液中孵育。作为对照，将固定的人Tau(pS422)在包含第一标记的抗体但不包含第二未标记的抗体的溶液中孵育。在允许第一抗体结合人Tau(pS422)的条件下孵育后，移除过量未结合的抗体，并且测量与固定的人Tau(pS422)关联的标记的量。如果与固定的人Tau(pS422)关联的标记的量在测试样品中相对于对照样品显著减少，则表明第二抗体与第一抗体竞争结合人Tau(pS422)(参见例如，Harlow，E.和Lane，D.,Antibodies:A Laboratory Manual，第14章，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1988))。

2.活性测定

在一个方面，提供用于鉴定具有生物活性的抗人Tau(pS422)抗体的测定。生物活性可以包括，例如，保护免受/减少/抑制Tau(pS422)引起的细胞毒性，和/或保护免受/减少/抑制寡聚的人Tau(pS422)的细胞至细胞的传输，和/或减少LUHMES细胞中Tau(pS422)-引起的胱天蛋白酶活性。还提供在体内和/或体外具有该生物活性的抗体。

在某些实施方案中，对本发明的抗体测试所述生物活性。

保护性生物活性可以通过加入含有分泌的Tau(pS422)的条件培养基来评价，所述分泌的Tau(pS422)引起接受者神经元细胞的细胞死亡。该毒性可以通过加入如本文所述的保护性抗体来逆转。之前已经确立了分泌的Tau(pS422)的毒性(Emmanouilidou，E.，等人，J.Neurosci.，30(2010)6838-6851)。

D.用于诊断和检测的方法和组合物

在某些实施方案中，本文中提供的抗人Tau(pS422)抗体中的任一种可用于检测生物样品中人Tau(pS422)的存在。如本文使用的术语“检测”包括定量或定性检测。在某些实施方案中，生物样品包含细胞或组织，如脑组织。

在一个实施方案中，提供用于诊断或检测方法的抗人Tau(pS422)抗体。在进一步的方面，提供检测生物样品中人Tau(pS422)的存在的方法。在某些实施方案中，所述方法包括将生物样品与本文所述的抗人Tau(pS422)抗体在允许抗人Tau(pS422)抗体与人Tau(pS422)结合的条件下接触，并且检测在抗人Tau(pS422)抗体和人Tau(pS422)之间是否形成复合体。所述方法可以是体外或体内方法。在一个实施方案中，例如在人Tau(pS422)是用于选择患者的生物标志物的情况下，抗人Tau(pS422)抗体用于选择适于用抗人Tau(pS422)抗体治疗的受试者。

可以使用本发明的抗体诊断的示例性病症包括具有脑铁积累类型1的神经变性(neurodegeneration with brain iron accumulation type 1，NBIA1)、单纯性自主神经衰竭(pure autonomic failure)、唐氏综合征(Down’s syndrome)、关岛复合体(complexof Guam)、和多种路易小体综合征(Lewy body disorder)如弥漫性路易小体疾病(DLBD)，阿尔茨海默病的路易小体变体(LBVAD)，某些形式的高歇氏病(Gaucher’s disease)，和帕金森病痴呆(PDD)。

在某些实施方案中，提供标记的抗人Tau(pS422)抗体。标记包括，但不限于，直接检测的标记或部分(如荧光、发色团、电子密度、化学发光、和放射性标记)，以及例如通过酶反应或分子相互作用间接检测的部分(moieties)，如酶或配体。示例性标记包括，但不限于，放射性同位素³²P、¹⁴C、¹²⁵I、³H和¹³¹I，荧光团如稀土螯合物或荧光素及其衍生物，罗丹明及其衍生物，丹磺酰基、伞形酮、荧光素酶(例如，萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶(US 4,737,456))、荧光素、2,3-二氢酞嗪二酮、辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如，葡糖氧化酶、半乳糖氧化酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶)、杂环氧化酶(如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)，其与酶偶联，所述酶使用过氧化氢氧化染料前体如HRP、乳过氧化物酶，或微过氧化物酶，生物素/亲和素，自旋标记，噬菌体标记，稳定的自由基等。

E.药物制剂

如本文所述的抗人Tau(pS422)抗体的药物制剂通过将具有所需纯度的所述抗体与一种以上任选的药用载体混合来制备(Remington′s Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A.(编辑)(1980))，为冻干制剂或水溶液的形式。药用载体在使用的剂量和浓度下通常对接受者无毒，并且包括，但不限于:缓冲液如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六烃季铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；雷琐辛；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚(乙烯吡咯烷酮)；氨基酸如甘氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸、或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物(包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐反离子如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂如聚乙二醇(PEG)。本文中的示例性药用载体还包括间质药分散剂如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如，人可溶PH-20透明质酸酶糖蛋白，如rhuPH20(Baxter International，Inc.)。某些示例性sHASEGP和使用方法(包括rhuPH20)在US 2005/0260186和US 2006/0104968中描述。在一个方面，将sHASEGP与一种以上另外的糖胺聚糖酶如软骨素酶组合。

示例性冻干的抗体制剂在US 6,267,958中描述。水性抗体制剂包括US 6,171,586和WO 2006/044908中描述的那些，后者的制剂包括组氨酸醋酸盐缓冲液。

本文中的制剂还可以含有多于一种对于治疗的特定适应证所需的活性成分，优选具有彼此不有害影响的补充活性的那些。例如，可以希望进一步提供[[列出可能与抗人Tau(pS422)抗体组合的药物]]。所述活性成分适当地以对于预期目的有效的量组合存在。

活性成分可以捕获在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中，例如，分别在胶体药物递送***(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)中或粗乳状液中的羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊中。该技术在Remington′s Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A.(编辑)(1980)中公开。

可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适的实例包括含有抗体的固体疏水聚合物的半渗透基质，所述基质为成型物品形式，例如膜或微胶囊。

用于体内施用的制剂通常是无菌的。可以例如，通过经无菌滤膜过滤容易地实现无菌。

F.治疗方法和组合物

本文中提供的抗人Tau(pS422)抗体中的任一种可以用于治疗方法。

在一个方面，提供用作药物的抗人Tau(pS422)抗体。在进一步的方面，提供用于治疗阿尔茨海默病的抗人Tau(pS422)抗体。在某些实施方案中，提供用于治疗的方法的抗人Tau(pS422)抗体。在某些实施方案中，本发明提供抗人Tau(pS422)抗体，其用于治疗患有阿尔茨海默病的个体的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的抗人Tau(pS422)抗体。在一个这样的实施方案中，所述方法进一步包括向所述个体施用有效量的至少一种例如，如下文所述的另外的治疗剂。在进一步的实施方案中，本发明提供抗人Tau(pS422)抗体，其用于抑制人神经元和胶质细胞中Tau(pS422)引起的细胞毒性，或抑制神经元和胶质细胞之间寡聚人Tau(pS422)的细胞-至-细胞传输，或减少Tau(pS422)-引起的胱天蛋白酶活性。在某些实施方案中，本发明提供抗人Tau(pS422)抗体，其用于在个体中抑制人神经元和胶质细胞中Tau(pS422)引起的细胞毒性，或抑制神经元和胶质细胞之间寡聚人Tau(pS422)的细胞-至-细胞传输，或减少Tau(pS422)-引起的胱天蛋白酶活性的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的抗人Tau(pS422)抗体以抑制人神经元和胶质细胞中Tau(pS422)引起的细胞毒性，或抑制神经元和胶质细胞之间寡聚人Tau(pS422)的细胞-至-细胞传输，或减少Tau(pS422)-引起的胱天蛋白酶活性。根据上述实施方案中任一项的“个体”优选为人。

在进一步的方面，本发明提供抗人Tau(pS422)抗体在制造或制备药物中的用途。在一个实施方案中，所述药物用于治疗阿尔茨海默病。在进一步的实施方案中，所述药物用于治疗阿尔茨海默病的方法，所述方法包括向患有阿尔茨海默病的个体施用有效量的所述药物。在一个这样的实施方案中，所述方法进一步包括向所述个体施用有效量至少一种例如如下文所述的另外的治疗剂。在进一步的实施方案中，所述药物用于抑制人神经元和胶质细胞中Tau(pS422)引起的细胞毒性，或用于抑制神经元和胶质细胞之间寡聚人Tau(pS422)的细胞-至-细胞传输，或用于减少Tau(pS422)-引起的胱天蛋白酶活性。在进一步的实施方案中，所述药物用于在个体中抑制人神经元和胶质细胞中Tau(pS422)引起的细胞毒性，或抑制神经元和胶质细胞之间寡聚人Tau(pS422)的细胞-至-细胞传输，或减少Tau(pS422)-引起的胱天蛋白酶活性的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的所述药物以抑制人神经元和胶质细胞中Tau(pS422)引起的细胞毒性，或抑制神经元和胶质细胞之间寡聚人Tau(pS422)的细胞-至-细胞传输，或减少Tau(pS422)-引起的胱天蛋白酶活性。根据上述实施方案中任一项的“个体”优选为人。

在进一步的方面，本发明提供用于治疗阿尔茨海默病的方法。在一个实施方案中，所述方法包括向患有所述阿尔茨海默病的个体施用有效量的抗人Tau(pS422)抗体。在一个这样的实施方案中，所述方法进一步包括向所述个体施用有效量的至少一种如下文所述的另外的治疗剂。根据上述实施方案中任一个的“个体”可以为人。

在进一步的方面，本发明提供在个体中抑制人神经元和胶质细胞中Tau(pS422)引起的细胞毒性，或抑制神经元和胶质细胞之间寡聚人Tau(pS422)的细胞-至-细胞传输，或减少Tau(pS422)-引起的胱天蛋白酶的方法。在一个实施方案中，所述方法包括向所述个体施用有效量的抗人Tau(pS422)抗体以抑制人神经元和胶质细胞中Tau(pS422)引起的细胞毒性，或抑制神经元和胶质细胞之间寡聚人Tau(pS422)的细胞-至-细胞传输，或减少Tau(pS422)-引起的胱天蛋白酶活性。在一个实施方案中，“个体”是人。

在进一步的方面，本发明提供包含本文中提供的抗人Tau(pS422)抗体中的任一种的药物制剂，其例如，用于上述治疗方法中的任一种。在一个实施方案中，药物制剂包含本文中提供的抗人Tau(pS422)抗体中的任一种和药用载体。在另一实施方案中，药物制剂包含本文中提供的抗人Tau(pS422)抗体中的任一种和至少一种例如，如下文所述的另外的治疗剂。

在治疗中，本发明的抗体可以单独使用或与其他药剂组合使用。例如，本发明的抗体可以与至少一种另外的治疗剂共同施用。

上述所述组合治疗包括组合施用(在两种以上治疗剂包括在同一制剂或分开制剂中的情况下)，和分开施用(在此情况下，本发明的抗体的施用可以在施用另外的治疗剂或药剂之前、与其同时和/或在其之后发生)。在一个实施方案中，抗人Tau(pS422)抗体的施用和另外的治疗剂的施用彼此在约一个月内，或在约一周、两周或三周内，或在约一天、两天、三天、四天、五天、或六天内发生。

本发明的抗体(和任意的另外的治疗剂)可以通过任意合适的方式施用，包括肠胃外、腹膜内、和鼻内施用，并且如果需要局部治疗，病灶内施用。肠胃外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。剂量给药可以通过任何合适的途径，例如通过注射，如静脉内或皮下注射，这部分取决于施用是短暂的或长期的。各种剂量给药时间安排包括但不限于经多个时间点单次或多次施用，本文中考虑快速推注(bolus)施用和脉冲输注。

本发明的抗体将以与良好医学实践一致的方式配制、剂量给药和施用。在该情况下考虑的因素包括治疗的特定病症、治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床状况、病症的原因、药剂递送位点、施用方法、施用时间安排、和开业医生已知的其他因素。抗体不需要，但任选地与一种以上目前用于预防或治疗研究的疾病的药剂一起配制。所述其他药剂的有效量取决于存在于制剂中的抗体的量、病症或治疗的类型、和上文讨论的其他因素。这些通常以相同的剂量并且以本文中所述的施用途径，或本文所述的约1至99％的剂量，或以经验上/临床上确定为合适的任何剂量和任何途径使用。

为了预防或治疗疾病，本发明的抗体的适当剂量(当单独使用或与一种以上其他另外的治疗剂组合使用)将取决于要治疗的疾病类型、抗体的类型、疾病的严重度和过程、抗体是否施用用于预防或治疗目的、之前的治疗、患者的临床史和对抗体的反应、以及主治医师的自由裁量。一次或经一系列治疗，将抗体适当地施用于患者。不论例如，通过一次以上分开的施用，或通过连续输注，取决于疾病的类型和严重度，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.5mg/kg-10mg/kg)的抗体可以是用于施用于患者的初始候选剂量。一个典型的每日剂量可能范围从约1μg/kg至100mg/kg以上，这取决于上述因素。对于经数天或更长的重复施用(取决于病况)，通常将持续治疗直到所希望的对疾病症状的遏制发生。抗体的一个示例性剂量将在约0.05mg/kg至约10mg/kg的范围内。因此，一个以上剂量的约0.5mg/kg，2.0mg/kg，4.0mg/kg或10mg/kg(或其任意组合)可以施用给患者。所述剂量可以间断地施用，例如每周或每三周使用(例如以致患者接收约二至约二十，或例如约六个剂量的抗体)。可以施用初始的更高加载剂量，接着一次以上的较低剂量。然而，可以使用其他剂量方案。该治疗的过程容易通过常规技术和测定监控。

要理解，替代抗人Tau(pS422)抗体或除了抗人Tau(pS422)抗体之外，还使用本发明的免疫缀合物实施任意上述制剂或治疗方法。

III.制品

在本发明的另一方面，提供含有可用于治疗、预防和/或诊断上述病症的材料的制品。制品包含容器和关于容器或与容器相关的标记或药品说明书。合适的容器包括，例如，瓶、小瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可以由多种材料如玻璃或塑料形成。容器容纳组合物(所述组合物自身或与其他组合物组合有效用于治疗、预防和/或诊断病况)，并且可以具有无菌接入口(例如所述容器可以是具有可由皮下注射针刺破的塞子的静脉内溶液袋或小瓶)。组合物中至少一种活性剂是本发明的抗体。标记或药品说明书表明组合物用于治疗选择的病况。此外，所述制品可以包含(a)其中含有组合物的第一容器，其中所述组合物包含本发明的抗体；和(b)其中含有组合物的第二容器，其中所述组合物包含进一步的细胞毒性或另外的治疗剂。本发明的该实施方案中的制品可以进一步包含药品说明书，其说明该组合物可以用于治疗特定病况。备选地，或此外，所述制品可以进一步含有包含药用缓冲剂的第二(或第三)容器，所述缓冲剂如用于注射的抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格溶液和葡萄糖溶液。其可以进一步包括从商业和用户的立场所希望的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针头和注射器。

要理解，替代抗人Tau(pS422)抗体或除了抗人Tau(pS422)抗体之外，任意上述制品可以包括本发明的免疫缀合物。

IV.具体实施方案

1.特异结合人Tau(pS422)的人源化的抗体，其中所述抗体

i)特异结合具有SEQ ID NO:03的氨基酸序列的多肽，和/或

ii)于1μg/mL不结合全长人Tau(SEQ ID NO:01)，和/或

2.特异结合人Tau(pS422)的人源化的抗体，其中所述抗体

a)在重链可变结构域中包含SEQ ID NO:08，18和10的HVR，或

b)在重链可变结构域中包含SEQ ID NO:08，09和10的HVR。

3.根据第2项所述的人源化的抗体，其还

a)在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO:13，14和15的HVR，或

b)在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO:12，05和15的HVR。

4.根据第2至3项中任一项所述的人源化的抗体，其

a)在重链可变结构域中包含SEQ ID NO:08，18和10的HVR，并且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO:13，14和15的HVR，或

b)在重链可变结构域中包含SEQ ID NO:08，09和10的HVR，并且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO:12，05和15的HVR，或

c)在在重链可变结构域中包含SEQ ID NO:08，09和10的HVR，并且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO:13，14和15的HVR。

5.根据第2至4项中任一项所述的人源化的抗体，其包含

6.根据第2至5项中任一项所述的人源化的抗体，其中所述抗体用于治疗阿尔茨海默病。

7.根据第2至6项中任一项所述的人源化的抗体，其中所述抗体是效应子功能沉默的。

8.根据第2至7项中任一项所述的人源化的抗体，其中所述抗体不具有效应子功能。

9.根据第2至8项中任一项所述的人源化的抗体，其中所述抗体

i)特异结合具有SEQ ID NO:03的氨基酸序列的多肽，和/或

ii)于1μg/mL不结合全长人Tau(SEQ ID NO:01)，和/或

10.根据第2至9项中任一项所述的人源化的抗体，其中所述抗体对于以下具有以下EC₅₀值

a)对于具有SEQ ID NO:03的氨基酸序列的人Tau(pS422)片段为6ng/mL或更小，和/或

b)对于具有SEQ ID NO:02的氨基酸序列的全长人Tau(pS422)为4.5ng/mL或更小，和/或

c)对于具有SEQ ID NO:02的氨基酸序列的人Tau(pS422)的聚集体为30ng/mL或更小，和/或

d)对于具有SEQ ID NO:01的氨基酸序列并且具有氨基酸突变S422A的人Tau为125ng/mL或更小。

11.根据第2至10项中任一项所述的人源化的抗体，其中所述抗体特异结合人Tau(pS422)(SEQ ID NO:02)并且不结合人Tau(SEQ ID NO:01)。

12.根据第1至11项中任一项所述的人源化的抗体，其中所述抗体在重链可变结构域的位置4、24和78处具有缬氨酸残基。

13.根据第1至12项中任一项所述的人源化的抗体，其中所述抗体在重链可变结构域的位置71处具有精氨酸残基。

14.根据第2至13项中任一项所述的人源化的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。

15.根据第2至10项中任一项所述的人源化的抗体，其中所述抗体是结合人Tau(pS422)的抗体片段并且

i)特异结合具有SEQ ID NO:03的氨基酸序列的多肽，和/或

ii)于1μg/mL不结合全长人Tau(SEQ ID NO:01)，和/或

16.根据第2至14项中任一项所述的人源化的抗体，其中所述抗体是

a)人IgG1亚类的全长抗体，或

b)人IgG4亚类的全长抗体，或

c)具有突变L234A、L235A和P329G的人IgG1亚类的全长抗体，

d)具有突变S228P、L235E和P329G的人IgG4亚类的全长抗体，

e)在两条重链中具有突变L234A、L235A和P329G和在一条重链中具有突变T366W和S354C并且在相应的另一重链中具有突变T366S，L368A，Y407V和Y349C的人IgG1亚类的全长抗体，或

f)在两条重链中具有突变S228P和P329G和在一条重链中具有突变T366W和S354C并且在相应的另一重链中具有突变T366S，L368A，Y407V和Y349C的人IgG4亚类的全长抗体。

17.人源化的抗人Tau(pS422)抗体，其中

i)可变结构域包含SEQ ID NO:08，SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:10的HVR,

iii)所述恒定区包含氨基酸改变L234A、L235A和P329G，

i)可变结构域包含SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15的HVR,

ii)所述恒定区是人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区,

和

c)所述抗体

i)特异结合具有SEQ ID NO:03的氨基酸序列的多肽，和/或

ii)于1μg/mL不结合全长人Tau(SEQ ID NO:01)，和/或

18.人源化的抗人Tau(pS422)抗体，其中

i)所述可变结构域包含SEQ ID NO:08、SEQ ID NO:09和SEQ ID NO:10的HVR,

iii)所述恒定区包含氨基酸改变L234A、L235A和P329G，

i)所述可变结构域包含SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:05和SEQ ID NO:15的HVR,

ii)所述恒定区是人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区,

和

c)所述抗体

i)特异结合具有SEQ ID NO:03的氨基酸序列的多肽，和/或

ii)于1μg/mL不结合全长人Tau(SEQ ID NO:01)，和/或

19.人源化的抗人Tau(pS422)抗体，其中

i)所述可变结构域包含SEQ ID NO:08、SEQ ID NO:09和SEQ ID NO:10的HVR,

iii)所述恒定区包含氨基酸改变L234A、L235A和P329G，

i)所述可变结构域包含SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15的HVR,

ii)所述恒定区是人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区,

和

c)所述抗体

i)特异结合具有SEQ ID NO:03的氨基酸序列的多肽，和/或

ii)于1μg/mL不结合全长人Tau(SEQ ID NO:01)，和/或

20.人源化的抗人Tau(pS422)抗体，其中

i)所述可变结构域具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列,

iii)所述恒定区包含氨基酸改变L234A、L235A和P329G，

i)所述可变结构域具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列,

ii)所述恒定区是人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区,

和

c)所述抗体

i)特异结合具有SEQ ID NO:03的氨基酸序列的多肽，和/或

ii)于1μg/mL不结合全长人Tau(SEQ ID NO:01)，和/或

21.人源化的抗人Tau(pS422)抗体，其中

i)所述可变结构域具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列,

iii)所述恒定区包含氨基酸改变L234A、L235A和P329G，

i)所述可变结构域具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列,

ii)所述恒定区是人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区,

和

c)所述抗体

i)特异结合具有SEQ ID NO:03的氨基酸序列的多肽，和/或

ii)于1μg/mL不结合全长人Tau(SEQ ID NO:01)，和/或

22.人源化的抗人Tau(pS422)抗体，其中

i)所述可变结构域具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列,

iii)所述恒定区包含氨基酸改变L234A、L235A和P329G，

i)所述可变结构域具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列,

ii)所述恒定区是人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区,

和

c)所述抗体

i)特异结合具有SEQ ID NO:03的氨基酸序列的多肽，和/或

ii)于1μg/mL不结合全长人Tau(SEQ ID NO:01)，和/或

23.人源化的抗人Tau(pS422)抗体，其中

i)所述可变结构域具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列,

iii)所述恒定区包含氨基酸改变L234A、L235A和P329G，

i)所述可变结构域具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列,

ii)所述恒定区是人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区,

和

c)所述抗体

i)特异结合具有SEQ ID NO:03的氨基酸序列的多肽，和/或

ii)于1μg/mL不结合全长人Tau(SEQ ID NO:01)，和/或

ix)对于具有SEQ ID NO:01的氨基酸序列并且具有氨基酸突变S422A的人Tau具有125ng/mL或更小的EC₅₀值.

25.分离的核酸，其编码根据第1至24项中任一项所述的人源化的抗体。

26.宿主细胞，其包含根据第25项所述的核酸。

27.产生根据第1至23项中任一项所述的人源化的抗体的方法，其包括培养如本文报道的宿主细胞从而产生人源化的抗体的步骤。

28.根据第27项所述的方法，其还包含从细胞或培养基回收人源化的抗体的步骤。

29.药物制剂，其包含根据第1至23项中任一项所述的人源化的抗体和药用载体。

30.根据第29项所述的药物制剂，其还包含另外的治疗剂。

31.根据第30项所述的药物制剂，其中所述另外的治疗剂是抗-淀粉样蛋白治疗剂。

32.根据第31项所述的药物制剂，其中所述抗-淀粉样蛋白治疗剂是抗人α-突触核蛋白抗体或抗-Abeta抗体。

33.根据第1至23项中任一项所述的人源化的抗体，其用作药物。

34.根据第1至23项中任一项所述的人源化的抗体，其用于治疗阿尔茨海默病。

35.根据第1至23项中任一项所述的人源化的抗体，其用于治疗前驱阿尔茨海默病。

36.根据第1至23项中任一项所述的人源化的抗体，其用于治疗轻度阿尔茨海默病。

37.根据第1至23项中任一项所述的人源化的抗体，其用于减轻Tau(pS422)-引起的神经变性。

38.根据第1至23项中任一项所述的人源化的抗体，其用于维持认知和功能。

39.根据第1至23项中任一项所述的人源化的抗体，其用于减缓认知和功能下降的速率。

40.根据第1至23项中任一项所述的人源化的抗体用于制备药物的用途。

41.根据第33和40项中任一项所述的用途，其中所述药物用于治疗阿尔茨海默病。

42.根据第33和40至41项中任一项所述的用途，其中所述药物用于治疗前驱阿尔茨海默病。

43.根据第33和40至42项中任一项所述的用途，其中所述药物用于治疗轻度阿尔茨海默病。

44.根据第33和40至43项中任一项所述的用途，其中所述药物用于减轻Tau(pS422)引起的神经变性。

45.根据第33和40至44项中任一项所述的用途，其中所述药物用于维持认知和功能。

46.根据第33和40至45项中任一项所述的用途，其中所述药物用于减缓认知和功能下降的速率。

47.治疗患有阿尔茨海默病的个体的方法，其包括向个体施用有效量的根据1至23项任一项所述的人源化的抗人Tau(pS422)抗体。

48.在个体中减轻Tau(pS422)引起的神经变性的方法，其包括向个体施用有效量的根据第1至23项中任一项所述的人源化的抗人Tau(pS422)抗体以减轻Tau(pS422)引起的神经变性。

49.维持个体中认知和功能的方法，其包括向个体施用有效量的根据第1至23项中任一项所述的人源化的抗人Tau(pS422)抗体以维持认知和功能。

50.减缓个体中认知和功能下降速率的方法，其包括向个体施用有效量的根据第1至23项中任一项所述的人源化的抗人Tau(pS422)抗体以减缓认知和功能下降速率。

51.根据第1至23项中任一项所述的人源化的抗人Tau(pS422)抗体在减轻Tau(pS422)引起的神经变性方面的用途。

52.根据第1至23项中任一项所述的人源化的抗人Tau(pS422)抗体在维持认知和功能方面的用途。

53.根据第1至23项中任一项所述的人源化的抗人Tau(pS422)抗体在减缓认知和功能下降方面的用途。

54.根据第1至23项中任一项所述的人源化的抗体，其中所述抗体i)结合Tau(pS422)转基因小鼠和阿尔茨海默病患者的脑切片上的Tau(pS422)；和/或标记Tau(pS422)转基因细胞中的Tau(pS422)。

55.根据第1至23项中任一项所述的人源化的抗体，其中所述抗体特异结合/识别早期和晚期疾病相关的人Tau(pS422)形式。

56.根据第1至23项中任一项所述的人源化的抗体用于预防人Tau(pS422)-相关阿尔茨海默病扩散的用途。

57.根据第1至23项中任一项所述的人源化的抗体用于减少溶酶体膜分解(disintegration)的用途。

58.根据第1至23项中任一项所述的人源化的抗体针对人Tau(pS422)引起的去稳定和/或分解作用的用于稳定溶酶体膜的用途。

59.根据第1至23项中任一项所述的人源化的抗体用于防止阿尔茨海默病进展的用途。

V.实例

以下是本发明的方法和组合物的实施例。要理解，考虑到上文提供的一般描述，可以实践多种其他实施方案。

材料和方法

重组DNA技术

如在Sambrook，J.等人，Molecular cloning:A laboratory manual；Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，1989中描述的，使用标准方法操作DNA。根据制造商的使用说明使用分子生物试剂。

基因和寡核苷酸合成

通过在Geneart GmbH(Regensburg，Germany)化学合成制备所需的基因片段。将合成的基因片段克隆入大肠杆菌质粒中用于繁殖/扩增。亚克隆的基因片段的DNA序列通过DNA测序验证。备选地，通过将化学合成的寡核苷酸退火或经由PCR组装短的合成的DNA片段。通过metabion GmbH(Planegg-Martinsried，Germany)制备各个寡核苷酸。

试剂

如果没有另外陈述，根据制造商的方案如所提供的使用所有商业化学品、抗体或试剂盒。

实施例1

制备和纯化兔抗体

免疫

来自Charles River Laboratories International,Inc.的NZW兔用于免疫。偶联在KLH上的磷酸肽Tau(416-430)[pS422]以浓度为1mg/ml溶解于K₃PO₄缓冲液pH 7.0并且与完全弗氏佐剂(CFA)(1:1)混合直至产生稳定乳剂。三只兔接收真皮内(i.d.)注射2ml的乳剂，随之为第二次肌内(i.m.)和第三次皮下(s.c.)注射，每次用1ml以一周的间隔注射。两周后进行第四次i.m.注射1ml，接着以四周的间隔进行两次进一步的s.c.注射1ml。在第三、四、五、六次注射后4-6天收集每只动物的10ml外周全血样品，并用于FACS中的单细胞分选。在相同时间收集每只动物的另外0.5ml血清并且用于确定Tau(416-463)[pS422]特异性抗体应答。

抗体应答

对免疫的抗体应答使用ELISA通过连续稀释的血清来确定，其中30ng/孔的生物素化的Tau(416-430)[pS422]在1x PBS中在4℃于链霉亲和素预包被的96孔微量滴定板(MC1347,Micro Coat Biotechnologie GmbH,Bernried,德国)上温育过夜。对于检测，连接至辣根过氧化物酶(The Jackson laboratory)的山羊抗兔IgG以1:16000稀释使用。来自罗氏诊断(RocheDiagnostics GmbH)的随时可用的BM Blue POD底物(沉淀四甲基联苯胺(TMB))用于显示。通过1N HCl终止反应并且在Tecan Infinite中通过450/690nm测量。

B-细胞克隆

板的包被

无菌链霉亲和素包被的6孔板(细胞培养级)与3种生物素化的对照肽(未磷酸化的Tau(416-430),MCAK_人(88-102)[95-pSer]和MAP2_人(1802-1816)[pSer-1802])的混合物或与生物素化的磷酸肽Tau(416-430)[pS422](每种以PBS中0.5-1μg/ml的浓度)一起在室温温育1小时。使用前以无菌PBS洗涤板三次。细胞培养6孔板用碳酸盐缓冲液(0.1M碳酸氢钠,34mM碳酸氢二钠(Disodiumhydrogencarbonate),pH 9.55)中2μg/ml KLH(匙孔血蓝蛋白)在4℃包被过夜。使用前在无菌PBS中洗涤板三次。

分离兔外周血单核细胞(PBMC)

在淋巴细胞分离哺乳动物(lympholyte mammal)(Cedarlane Laboratories)上的密度离心(进行其以分离兔PBMC)之前，含EDTA的全血用1xPBS稀释两倍。用抗体染色之前洗涤PBMCs两次。

EL-4B5培养基

RPMI 1640(Pan Biotech,Aidenbach,德国)，补充有10％FCS(Hyclone,Logan,UT,USA),2mM谷氨酰胺,1％青霉素/链霉素溶液(PAA,Pasching,Austria),2mM丙酮酸钠,10mMHEPES(PAN Biotech,Aidenbach,德国)和0.05mMβ-巯基乙醇(Gibco,Paisley,苏格兰)。

巨噬细胞/单核细胞的清除

无菌6孔板(细胞培养级)用于通过非特异性粘附清除巨噬细胞和单核细胞。孔用KLH(匙孔血蓝蛋白)或用链霉亲和素和对照肽包被。每个孔填充最大4ml培养基和至多6x10⁶个来自免疫的兔的外周血单核细胞，并且允许在恒温箱中37℃结合1小时。上清液中50％的细胞用于淘选(panning)步骤；剩余的50％的细胞直接进行免疫荧光染色和单细胞分选。

在肽上淘选B细胞

用链霉亲和素和生物素化的肽Tau(416-430)[pS422]包被的6孔组织培养板接种至多6x10⁶个细胞/4ml培养基，并且允许在恒温箱中在37℃结合1小时。未粘附的细胞通过用1xPBS小心地洗涤孔1-2次去除。剩余的粘着细胞通过胰蛋白酶在恒温箱中在37℃10分钟进行脱附，然后在培养基中洗涤两次。细胞保持在冰上直至进行免疫荧光染色。

免疫荧光染色和单细胞分选

用于单细胞分选的抗兔IgG FITC来自AbD Serotec(STAR121F,Düsseldorf,德国)。对于表面染色，来自清除和淘选步骤的细胞与PBS中抗兔IgG FITC抗体在冷室内于暗中在4℃滚动温育30分钟。离心后，上清液通过抽吸去除。PBMCs用冰冷PBS进行2个循环的离心和洗涤。最后，PBMCs在冰冷PBS中重悬浮并且立即进行FACS分析。在FACS分析前添加5μg/ml浓度的碘化丙啶(BD Pharmingen,San Diego,CA,USA)以便分辨死亡细胞和活细胞。FACS使用带有FACSDiva软件的Becton Dickinson FACSAria(BD Biosciences,USA)进行，单个、FITC-标记的活细胞沉积于96孔板中。

B-细胞培养

B细胞培养通过类似于Zubler,R.H.等,免疫学杂志(J.Immunol.)134(1985)3662-3668所述的方法制备。简言之，单个分选的B细胞在96孔板中培养，用210μl/孔EL-4B5培养基和Pansorbin细胞(1:20000)(Calbiochem(Merck),Darmstadt,德国),5％兔胸腺细胞上清液和γ-照射的EL-4-B5鼠胸腺瘤细胞(2×10⁴个/孔)于恒温箱中在5％CO₂的气氛中37℃培养7天。为了筛选，去除B细胞培养上清液，立即收获细胞用于可变区基因克隆或在100μlRLT缓冲液(Qiagen,Hilden,德国)中冰冻于-80℃。

B-细胞克隆筛选

通过ELISA筛选B细胞培养上清液对生物素化的Tau(416-430)[pS422]的结合。非磷酸化的Tau(416-430),KLH(匙孔血蓝蛋白)和不相关的磷酸肽MCAK_人(88-102)[95-pSer]用作对照抗原。对于ELISA板的制备，链霉亲和素预包被的微量滴定板与50ng/ml的生物素化的Tau(415-430)[pS422]在室温温育1小时。KLH或对照肽的包被于1μg/mL进行。B细胞上清液以1:5至1:10稀释并且与抗原包被的微量滴定板温育60分钟。强烈洗涤后，兔抗体的结合用绵羊抗兔IgG地高辛缀合的检测抗体(Chemicon AQ301D)检测。与TMB在室温温育后，测量在370nm-492nm的吸光度。与生物素化的Tau(416-430)[pS422]但是不与KLH和MCAK_人(88-102)[95-pSer]产生高于背景的信号的B细胞克隆被进一步考虑，并且进行可变区基因克隆。

V-结构域的PCR扩增和测序

总RNA使用Nucleo8/96RNA试剂盒(Macherey&Nagel；740709.4,740698)根据制造商的方案制备。所有步骤在epMotion 5075液体处理***(Eppendorf)上进行。RNA用60μl无RNAse水洗脱。6μl的RNA用于通过逆转录酶反应使用Superscript III第一链合成超混合物(Superscript III First-Strand Synthesis SuperMix，Invitrogen 18080-400)和寡聚dT引物根据制造商的说明产生cDNA。4μl的cDNA用于扩增免疫球蛋白重链和轻链可变区(VH和VL)，使用AccuPrime Super Mix(Invitrogen12344-040)，终体积50μl，使用引物rbHCfinal.up和rbHCfinal.do用于重链和使用引物rbLCfinal.up和rbLCfinal.do用于轻链(参见下表)。PCR条件如下:热启动于94℃5min；94℃,20s,70℃,20s,68℃,45s,35个循环；最终延伸在68℃进行7min。

表:

50μl PCR溶液中的8μl加载于48E-Gel 2％(Invitrogen G8008-02)上。阳性PCR反应物使用NucleoExtract II试剂盒(Macherey&Nagel；740609250)根据制造商的方案清洁并且洗脱在50μl洗脱缓冲液中。12μl的纯化的PCR产物在两个方向上使用rbHCfinal.up和rbHCfinal.do用于重链和rbLCfinal.up和rbLCfinal.do用于轻链(参见上表)进行直接测序。

兔单克隆抗体和兔/小鼠嵌合抗体的重组表达

为了重组表达兔单克隆抗体，编码VH或VL的PCR产物作为cDNA通过悬突(overhang)克隆方法(Haun,R.S.等,生物技术(BioTechniques)13(1992)515-518；Li,M.Z.,等,自然方法(Nature Methods)4(2007)251-256)克隆至表达载体中。编码兔κ或γ恒定区的线性化表达质粒和VL或VH***物通过PCR使用重叠引物扩增。纯化的PCR产物与产生单链悬突的T4DNA聚合酶温育。反应通过添加dCTP终止。下一步，质粒和***物组合并且与诱导位点特异性重组的RecA温育。重组质粒转化入大肠杆菌中。次日，挑选生长的克隆并且通过质粒制备、限制性分析和DNA测序测试正确重组的质粒。对于抗体表达，分离的HC和LC质粒瞬时共转染至HEK293细胞中，1周后收获上清液。为了克隆和表达兔小鼠嵌合抗体，VH和VL区通过PCR扩增并且亚克隆至含有小鼠恒定κ区或小鼠恒定γ1区的表达载体中。兔/小鼠嵌合HC和LC质粒被分离，通过限制性分析和DNA测序检测正确的***，并且瞬时共转染至HEK293细胞中。转染后一周收集上清液。

抗体纯化

在MabSelectSuRe^TM柱(GE Healthcare)上从细胞培养上清液中纯化重组表达的兔抗体。样品装载前，柱用25mmol/L Tris-HCl,25mmol/L NaCl,pH 7.4平衡。抗体洗脱用50mmol/L乙酸盐pH 3.14完成。洗脱的样品立即装载于脱盐柱(Sephadex G25,GEHealthcare)并且在20mmol/L His-HCl,140mmol/L NaCl pH 6.0中洗脱。这种缓冲液也用于储存纯化的抗体。在纯化过程中一般存储温度是4℃，室温，在分装后为-80℃。来自细胞培养上清液的重组表达的兔/小鼠嵌合抗体在MabSelectSuRe^TM柱(GE Healthcare)上纯化。样品装载前，柱用1x PBS,pH 7.4平衡。抗体洗脱用100mmol/L柠檬酸盐pH 3.0完成。洗脱的样品立即用2mol/L Tris/HCl pH 9.0中和。然后，抗体装载于尺寸排阻柱(Superdex 200,GE Healthcare)上并且在20mmol/L His-HCl,140mmol/L NaCl pH 6.0中洗脱。这种缓冲液也用于储存纯化的抗体。在纯化过程中一般存储温度是4℃，室温，在分装后为-80℃。

实施例2

抗-Tau pS422单克隆兔抗体对在pS422磷酸化的Tau是高度选择性的并且结合TaupS422的原纤维聚集体

ELISA

兔单克隆抗体在HEK 293细胞中重组表达。通过ELISA测试细胞培养上清液或纯化的兔抗体对生物素化的Tau(416-430)[pS422],非磷酸化的Tau(416-430),KLH(匙孔血蓝蛋白)和不相关的磷酸肽MCAK_人(88-102)[95-pSer]的结合。为了制备ELISA板，链霉亲和素预包被的微量滴定板与50ng/ml的生物素化的Tau(415-430)[pS422]在室温温育1小时。用KLH或对照肽的包被于1μg/mL进行。不同浓度的兔抗Tau pS422抗体(Abcam AB51071)或含有兔抗体的上清液在抗原标记的微量滴定板中温育60分钟。强烈洗涤后，兔抗体的结合用绵羊抗兔IgG地高辛缀合的检测抗体(Chemicon AQ301D)检测。与TMB在室温温育后，测量在370nm-492nm的吸光度。抗体结合通过其EC50值表征。结合生物素化的Tau(416-430)[pS422]和非磷酸化的Tau(416-430)肽的抗体通过其EC50值表征。与KLH或MCAK磷酸肽的交叉反应性在高浓度(即细胞培养上清液的1:5稀释)下通过单点测量来估计。结果显示于下表中。发现结合Tau磷酸肽的EC50值比结合Tau肽的EC50值低超过100倍，表明与非磷酸化的Tau肽相比较，对磷酸化的Tau片段至少100倍的选择性。对于所有抗体，与KLH和MCAK对照磷酸肽的结合在背景水平，其是用Tau磷酸肽测量的最大值的约1<3％。

表:

也测试了对可溶性和聚集的全长Tau pS422的特异性。Tau pS422的原纤维聚集体(300μg/ml)在RT过夜包被于基于聚苯乙烯的Maxisorb微量滴定板(Nunc)。以类似的方式，可溶性全长Tau和Tau pS422包被于Maxisorb微量滴定板。添加兔抗Tau pS422抗体对照(Abcam AB51071)或纯化的兔抗体并且以至多1000ng/ml的浓度温育60分钟。强烈洗涤后，对兔抗体的结合用绵羊抗兔IgG地高辛缀合的检测抗体(Chemicon AQ301D)检测。与TMB在室温温育后，测量在370nm-492nm的吸光度。抗体结合通过其EC50值表征。结果显示于下表中。

表:

兔单克隆抗体以低于1ng/ml的EC50值结合Tau-pS422蛋白。检测的原纤维的TaupS422的EC50值范围为0.4ng/ml至14ng/ml。结合非磷酸化的全长Tau蛋白的信号与背景水平不可区分。因此，估计相比于Tau，每种抗体以至少100倍的选择性结合Tau pS422和原纤维的Tau pS422。

BIAcore^TM

通过BIAcore^TM分析进一步研究和确认对原纤维的Tau pS422聚集体的结合。测量使用BIAcore 3000仪器在37℃实施。***和样品缓冲液是HBS-EP(10mM HEPES,150mMNaCl,3.4mM EDTA,0.005％聚山梨酯20(v/v))。BIAcore^TMCM5传感器芯片进行预处理程序。对于流动池FC1,FC2,FC3和FC4相继注射0.1％SDS,50mM NaOH,10mM HCl和100mM H₃PO₄达30秒。使用BIAcore 3000^TMwizard v.4.1根据制造商说明书进行胺偶联程序。在EDC/NHS活化传感器表面后，非-磷酸选择性的抗-Tau抗体mAb<TAU>M-4/53-IgG固定在传感器流动池FC2,FC3和FC4上。作为对照，针对CK-MM(肌酸激酶同种型)的抗体，其识别不相关抗原，被捕获于FC1。mAb<TAU>M-4/53-IgG和针对CK-MM的抗体以30μg/ml稀释在10mM NaAc pH 5.0中，并且以10μl/min注射7min接触时间以固定10.000RU的抗体捕获***。表面通过1M乙醇胺去活化。传感器通过5个循环的用磷酸化的丝状Tau蛋白(原液0.3mg/ml，在HBS-EP中1:100稀释)作为溶液中的分析物以10μl/min进行2min来适应。再生用10mM甘氨酸pH 2.5以30μl/min进行3min。推定结合mAb 4/53的分析物不解离pTau丝，因为没有观察到pTau丝从mAb 4/53的解离。对于所有进一步的测量循环，0.3mg/ml pTau丝在HBS-EP缓冲液中稀释1:100并且以10μl/min注射1min，以便以异质夹心方式(heterogeneous sandwich-mode)将pTau呈递给相应抗体分析物。抗体分析物在HBS-EP缓冲液中稀释至100nM浓度并且以20μl/min注射3min至***中。3min解离后，通过以100μl/min 2次注射10mM甘氨酸pH 2.5 1min随之以100μl/min HBS洗涤15秒使传感器表面再生。监测相互作用的结合和解离相。由于溶液中的抗体分析物是二价的，所以抗体亲抗原性负荷的(avidity-burdened)抗体-pTau动力学通过二相性解离模型表征，其由下述组成：快速的基于亲和力(affinity-based)的早期解离步骤，随之是后面的复合物解离中的抗体亲抗原性稳定的(avidity-stabilized)但是限速的动力学步骤。分析物注射结束后10秒(早期)和50秒(晚期)，如果可能，定量kd和t/2(diss)。动力学测量使用双重参照程序评价。首先来自FC1参照的信号被扣除以纠正缓冲液体积效应和非特异性结合。次之0nM分析物注射被扣除以纠正来自各自捕获***的一级抗体的解离。动力学速率使用Langmuir 1.1解离拟合模型、根据BIAcore^TM评价软件v.4.1进行评价。抗原/抗体复合物稳定性半衰期(min)根据公式ln(2)/60*kd计算。

结果总结于下表中。

表:

实施例3

抗-Tau pS422单克隆兔抗体对阿尔茨海默病患者脑切片中细胞内pTau的结合

通过免疫荧光染色实验，使用来自AD患者的人脑组织的低温切片来研究通过单克隆兔抗-Tau pS422抗体特异性和灵敏性免疫组织化学检测阿尔茨海默病脑组织中的pTau病理学。该程序与实施例X(鼠抗体)中所述的基本相同。兔IgGs通过山羊抗兔Alexa缀合的二抗(Invitrogen/Molecular Probes A11034)检测。对于克隆Mab 005,Mab 019,Mab 020,Mab 085,Mab 086和Mab 097，pTau沉积和丝的特异性和灵敏性染色是明显的。细胞内pTau沉积，如大的神经原纤维缠结和延长的嗜中性粒细胞丝线是显著的。对于所有研究的克隆，确定了范围在0.08和0.016μg/ml之间的最小有效浓度，其表明对真正的人pTau沉积的高敏感性的结合。

实施例4

兔抗人Tau(pS422)抗体的人源化

如本文使用的“可变结构域”(轻链(VL)的可变结构域，重链(VH)的可变结构域)表示直接参与抗体与Tau(pS422)抗原的结合的轻链和重链结构域对的每一个。可变轻链和重链结构域具有相同的一般结构并且每个结构域包含由三个“高变区”连接的序列广泛保守的四个框架(FR)区。

计算机模拟(in silico)分析兔抗体mAb 086的VH和VL结构域的结构，并且与人VH和VL结构域的结构数据库(IMGT)比较。选择一组结构最类似的V结构域用于将兔抗体的CDR接枝到选择的人VH和VL结构域上。此外，考虑一级序列的相似性，通过将兔抗体的VH和VL结构域的一级序列与人V结构域组库(repertoire)比对来缩小对人V结构域的选择。在一些人源化变体中在人框架区内引入向兔母体残基的回复突变。类似地，在适于可能增加对抗原的亲和力的情况下，在一些变体中引入CDR的突变，以维持CDR三级结构，并且移除不希望的特征如半胱氨酸残基或可以在抗体纯化后经历修饰的残基。

将含有人源化的变体中的每一个的重链和轻链载体以矩阵的方式共转染入微量滴定培养板中的HEK293悬浮细胞中，获得表达所有可能轻链/重链组合的全尺寸IgG的细胞培养物。在37℃5天的培养后，收获上清并以微量滴定规模通过蛋白A亲和层析纯化。

实施例5

重组表达载体的产生

a)用于表达使用人IgG1恒定区的免疫球蛋白重链的载体的产生

编码包含人IgG1恒定区(CH1，铰链，CH2，CH3)和源自兔抗体Mab086的人源化的抗人Tau(pS422)抗体VH结构域的融合基因的人源化的重链，通过将编码各个抗人Tau(pS422)-特异性抗体VH结构域的DNA片段与编码人IgG1恒定区的序列元件融合来组装。

所述人IgG1恒定区具有以下氨基酸序列:

(SEQ ID NO:58)。

表达载体还包含来自载体pUC18的复制起点(其允许该质粒在大肠杆菌中复制)和在大肠杆菌中赋予氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因。

抗体重链的转录单位在5’至3’方向上包含以下功能元件：

-来自人巨细胞病毒(P-CMV)的立即早期增强子和启动子，其包括内含子A，

-人重链免疫球蛋白5’-非翻译区(5’UTR),

-鼠免疫球蛋白重链信号序列,

-编码重链可变(VH)结构域的核酸,

-编码人IgG1恒定区的核酸，和

-牛生长激素多聚腺苷酸化序列(BGH pA)。

b)表达使用人Ig-κ恒定区的免疫球蛋白轻链的载体的产生

编码包含人Ig-κ恒定区(CL-κ)和源自兔抗体Mab 086的抗人Tau(pS422)抗体VL(κ)结构域的融合基因的人源化的κ轻链通过将编码各个抗人Tau(pS422)抗体VL(κ)结构域的DNA片段与编码人Ig-κ恒定区的序列元件融合来组装。

所述人Ig-κ恒定区具有以下氨基酸序列:

(SEQ ID NO:59)。

所述表达载体还包含来自载体pUC18的复制起点(其允许该质粒在大肠杆菌中复制)和在大肠杆菌中赋予氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因。

抗体κ轻链的转录单位在5’至3’方向上包含以下功能元件:

-来自人巨细胞病毒(P-CMV)的立即早期增强子和启动子，其包括内含子A,

-人重链免疫球蛋白5’-非翻译区(5’UTR),

-鼠免疫球蛋白重链信号序列,

-编码轻链可变(VL)结构域的核酸,

-编码人Ig-κ恒定区的核酸，和

-牛生长激素多聚腺苷酸化序列(BGH pA)。

c)用于表达使用人Ig-λ恒定区的免疫球蛋白轻链的载体的产生

编码包含人Ig-λ恒定区(CL-λ)和源自兔抗体Mab 086的抗人Tau(pS422)抗体VL(λ)结构域的融合基因的人源化的λ轻链通过将编码各个抗人Tau(pS422)抗体VL(λ)结构域的DNA片段与编码人Ig-λ恒定区的序列元件融合来组装。

所述人Ig-λ恒定区具有以下氨基酸序列:

(SEQ ID NO:60)。

抗体λ轻链的转录单位在5’至3’方向上包含以下功能元件:

-人重链免疫球蛋白5’-非翻译区(5’UTR),

-鼠免疫球蛋白重链信号序列,

-编码可变轻链(VL)结构域的核酸,

-编码人Ig-λ恒定区的核酸，和

-牛生长激素多聚腺苷酸化序列(BGH pA)。

d)用于使用人Ig-κ恒定区的免疫球蛋白κ轻链的表达的载体的产生

编码包含人Ig-κ恒定区(CL-κ)和源自兔抗体Mab 086的抗人Tau(S422)抗体VL(κ)结构域的融合基因的人Ig-κ轻链，通过将编码各个抗人Tau(pS422)-抗体VL(κ)结构域的DNA片段与编码人Ig-κ恒定区的序列元件融合来组装。该构建体在基因组结构中，即内含子存在于信号肽中以及在VL(κ)和CL-κ结构域之间。

抗体κ轻链的转录单位在5’至3’方向上包含以下功能元件:

-来自人巨细胞病毒(P-CMV)的立即早期增强子和启动子

-人重链免疫球蛋白5’-非翻译区(5’UTR),

-鼠免疫球蛋白重链信号序列,

-编码轻链可变(VL)结构域的核酸,

-人IgGκ恒定区，和

-牛生长激素多聚腺苷酸化序列(BGH pA)。

e)用于表达使用人Ig-λ恒定区的免疫球蛋白λ轻链的载体的产生

编码包含人Ig-λ恒定区(CL-λ)和源自兔抗体Mab 086的抗人Tau(S422)抗体VL(λ)结构域的融合基因的人Ig-λ轻链，通过将编码各个抗人Tau(pS422)-抗体VL(λ)结构域的DNA片段与编码人Ig-λ恒定区的序列元件融合来组装。该构建体在基因组结构中，即内含子存在于信号肽中以及在VL(λ)和CL-λ结构域之间。

抗体λ轻链的转录单位在5’至3’方向上包含以下功能元件:

-来自人巨细胞病毒(P-CMV)的立即早期增强子和启动子

-人重链免疫球蛋白5’-非翻译区(5’UTR),

-鼠免疫球蛋白重链信号序列,

-编码轻链可变(VL)结构域的核酸,

-人IgGλ恒定区，和

-牛生长激素多聚腺苷酸化序列(BGH pA)。

实施例6

抗人Tau(pS422)抗体的重组生产

在F17培养基(Invitrogen Corp.)中培养的瞬时转染的HEK293细胞(人胚肾细胞系293-衍生的)中生产抗体。对于如在实施例5中描述的各个载体的转染，使用"无293(293-Free)"转染试剂(Novagen)。从个体表达质粒表达抗体。如在制造商的使用说明中指明的进行转染。转染后三至七天，收获含有重组抗体的细胞培养上清。在降低的温度(例如-80℃)储存上清，直到纯化。

关于在例如HEK293细胞中重组表达人免疫球蛋白的一般信息在:Meissner，P.等人，Biotechnol.Bioeng.75(2001)197-203中给出。

实施例7

重组抗人Tau(pS422)抗体的纯化

过滤含有抗体的培养上清并通过两个层析步骤纯化。

使用用PBS(1mM KH₂PO₄，10mM Na₂HPO₄，137mM NaCl，2.7mM KCl)，pH 7.4平衡的HiTrap MabSelectSuRe(GE Healthcare)，通过亲和层析捕获抗体。通过用平衡缓冲液洗涤移除未结合的蛋白，并且用25mM柠檬酸盐缓冲液，pH 3.1回收抗体，其在洗脱后立即用1MTris-碱，pH 9.0调节至pH 6.0。

使用Superdex 200^TM(GE Healthcare)上的尺寸排阻层析作为第二纯化步骤。在20mM组氨酸缓冲液，0.14M NaCl，pH 6.0中进行尺寸排阻层析。将含有抗体的溶液用装有Biomax-SK膜的Ultrafree-CL离心过滤设备(Millipore，Billerica，MA，USA)浓缩并在-80℃储存。

实施例8

动力学筛选

根据Schraeml等人(Schraeml，M.和M.Biehl，Methods Mol.Biol.901(2012)171-181)在装有BIAcore CM5传感器的BIAcore 4000仪器上进行动力学筛选。BIAcore 4000仪器在软件版本V1.1的控制下。根据制造商的说明将BIAcore CM5系列S芯片安装入所述仪器并且液体动力学处理和预处理。仪器缓冲液为HBS-EP缓冲液(10mM HEPES(pH 7.4)，150mMNaCl，1mM EDTA，0.05％(w/v)P20)。在传感器表面准备抗体捕获***。使用NHS/EDC化学将具有人IgG-Fc特异性的多克隆山羊抗人抗体(Jackson Lab.)以在10mM乙酸钠缓冲液(pH5)中的30μg/ml，以10,000RU固定于仪器的流路池1、2、3和4中的点1、2、4和5。在各个流路池中，在点1和点5上捕获抗体。点2和点4用作参照点。将传感器用1M乙醇胺溶液去活化。将人源化的抗体衍生物以在补充以1mg/ml CMD(羧甲基右旋糖苷)的仪器缓冲液中44nM至70nM的浓度施用。将抗体以30μl/min的流速注射2min。表面存在的抗体的捕获水平(CL)以相对响应单位(RU)测量。将溶液中的分析物、磷酸化的人tau蛋白、非磷酸化的人tau蛋白和磷酸化的人tau突变体蛋白T422S以300nM，以30μl/min的流速注射3min。监测解离5min。捕获***通过以30μL/min向所有流路池注射10mM甘氨酸缓冲液pH 1.7达1min来再生。两个报告点(在分析物注射结束之前不久记录的信号(表示为结合晚期(BL))和解离时间结束之前不久记录的信号，(稳定晚期(SL)))用于表征动力学筛选性能。此外，根据Langmuir模型计算解离速率常数kd(1/s)并且根据公式ln(2)/(60*kd)以分钟计，计算抗体/抗原复合体半衰期。根据公式MR＝(结合晚期(RU))/(捕获水平(RU))*(MW(抗体)/(MW(抗原))计算摩尔比(MR)。在传感器配置以合适量的抗体配体捕获水平的情形中，各个抗体应该能够至少功能性结合溶液中的一种分析物，其由MR＝1.0的摩尔比来表示。然后，摩尔比还是分析物结合的化合价模式的指征。对于结合两个分析物的抗体，最大化合价可以是MR＝2，每个Fab化合价为一。

在另一个实施方案中，在25℃和37℃，使用相同实验设置，但使用在0nM(缓冲液)，1.2nM，3.7nM，11.1nM，33.3nM，100nM和300nM的溶液中的多种浓度系列的各个分析物，确定动力学速率。从浓度依赖性结合行为，使用BIAcore评价软件，根据制造商的使用说明和具有RMAX整体(global)的Langmuir 1.1模型，计算动力学数据。

实施例9

ELISA

向未包被的Maxisorb板中加入PBS中的非生物素化的肽/蛋白/聚集体，并且向链霉亲和素包被的Maxisorb板中加入PBS中的生物素化的肽/蛋白/聚集体，并孵育过夜。弃上清并且将孔用90μl洗涤缓冲液(1x PBS/0.1％吐温20)洗涤三次。通过孵育1h，剩余的反应性点用封闭缓冲液(1xPBS/2％BSA(牛血清白蛋白级分V，无脂肪酸，Roche，Cat.No.:10735078001)/0.05％吐温20)封闭。弃上清并且将孔用90μl洗涤缓冲液洗涤三次。以在ELISA缓冲液(1xPBS/0.5％BSA(牛血清白蛋白级分V，无脂肪酸，Roche，Cat.No.:10735078001)/0.05％吐温20)中的12个稀释(1:2)制备样品和对照抗体，起始浓度为500ng/mL。在室温在摇床上孵育时间为60分钟。弃上清并且将孔用90μl洗涤缓冲液洗涤三次。在ELISA缓冲液中制备二抗溶液。将总共25μl抗体混合物转移到测定板的所有孔中并且之后将板在室温在摇床上孵育60分钟。弃上清并且将孔用90μl洗涤缓冲液洗涤三次。向所有孔中加入25μl的ABTS溶液。在405nm–492nm读取吸光度。

Claims

1.一种特异结合人Tau pS422的人源化的抗体，其中所述抗体

a)在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：08、18和10的HVR，并且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：13、14和15的HVR，或

b)在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：08、09和10的HVR，并且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：12、05和15的HVR，或

c)在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：08、09和10的HVR，并且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：13，14和15的HVR。

2.根据权利要求1所述的人源化的抗体，其包含

a)SEQ ID NO：20的重链可变结构域和SEQ ID NO：17的轻链可变结构域，或

b)SEQ ID NO：19的重链可变结构域和SEQ ID NO：16的轻链可变结构域，或

c)SEQ ID NO：19的重链可变结构域和SEQ ID NO：17的轻链可变结构域，或

d)SEQ ID NO：21的重链可变结构域和SEQ ID NO：17的轻链可变结构域。

3.根据权利要求1至2中任一项所述的人源化的抗体，其中所述抗体是效应子功能沉默的。

4.根据权利要求1至2中任一项所述的人源化的抗体，其中所述抗体

i)特异结合具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的多肽，和/或

ii)于1μg/mL不结合SEQ ID NO：01表示的全长人Tau，和/或

iii)特异结合SEQ ID NO：02表示的在位置422处的丝氨酸处磷酸化的全长人Tau，和/或

iv)特异结合SEQ ID NO：02表示的在位置422处的丝氨酸处磷酸化的人Tau的聚集体。

5.根据权利要求1至2中任一项所述的人源化的抗体，其中所述抗体：

a)对于具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的人Tau pS422片段，EC₅₀值为6ng/mL或更小，和/或

b)对于具有SEQ ID NO：02的氨基酸序列的全长人Tau pS422，EC₅₀值为4.5ng/mL或更小，和/或

c)对于具有SEQ ID NO：02的氨基酸序列的人Tau pS422的聚集体，EC₅₀值为30ng/mL或更小，和/或

d)对于具有SEQ ID NO：01的氨基酸序列并且具有氨基酸突变S422A的人Tau，EC₅₀值为125ng/mL或更小。

6.根据权利要求1至2中任一项所述的人源化的抗体，其中所述抗体特异结合SEQ IDNO：02表示的人Tau pS422并且不结合SEQ ID NO：01表示的人Tau。

7.根据权利要求1至2中任一项所述的人源化的抗体，其中所述抗体是

a)人IgG1亚类的全长抗体，或

b)人IgG4亚类的全长抗体，或

c)具有突变L234A、L235A和P329G的人IgG1亚类的全长抗体，

d)具有突变S228P、L235E和P329G的人IgG4亚类的全长抗体，

e)人IgG1亚类的全长抗体，其在两条重链中都具有突变L234A、L235A和P329G和在一条重链中具有突变T366W和S354C并且在相应的另一重链中具有突变T366S、L368A、Y407V和Y349C，或

f)人IgG4亚类的全长抗体，其在两条重链中都具有突变S228P、L235E和P329G和在一条重链中具有突变T366W和S354C并且在相应的另一重链中具有突变T366S，L368A、Y407V和Y349C。

8.一种药物制剂，其包含根据权利要求1至7中任一项所述的人源化的抗体和药用载体。

9.根据权利要求8所述的药物制剂，其还包含抗人α-突触核蛋白抗体或抗-Abeta抗体。

10.根据权利要求1至7中任一项所述的人源化的抗体在制备药物中的用途。

11.根据权利要求10所述的用途，其中所述药物用于治疗阿尔茨海默病。

12.根据权利要求10至11中任一项所述的用途，其中所述药物用于治疗前驱阿尔茨海默病。

13.根据权利要求10至11中任一项所述的用途，其中所述药物用于治疗轻度阿尔茨海默病。

14.根据权利要求10至11中任一项所述的用途，其中所述药物用于减轻Tau pS422引起的神经变性。

15.根据权利要求10至11中任一项所述的用途，其中所述药物用于维持认知和功能。

16.根据权利要求10至11中任一项所述的用途，其中所述药物用于减缓认知和功能下降的速率。

17.根据权利要求1至7中任一项所述的人源化的抗人Tau pS422抗体在减轻Tau pS422引起的神经变性中的用途。