BR112012022044A2

BR112012022044A2 - ''anticorpo,imunoconjugado,formulação farmacêutica,uso do anticorpo,método de tratamento,anticorpo biespecifico isolado e célula hospedeira''.

Info

Publication number: BR112012022044A2
Application number: BR112012022044-6A
Authority: BR
Inventors: Eric Bourhis; Tim Christopher Cao; Venita De Almeida; Yan Gong; Yan Wu; Andrea Cochran; Bonnee Rubinfeld; James Ernst; Mark Solloway; Mike Costa; Paul Polakis; Rami Hannoush; Rick Carano
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 2010-03-24
Filing date: 2011-03-23
Publication date: 2020-08-25
Also published as: US20110256127A1; CA2791991A1; KR101899835B1; EP2550295A1; US9556267B2; KR20130012256A; RU2587625C2; IL221371A0; WO2011119661A1; RU2012145086A; SG184033A1; US8846041B2; HK1178175A1; AU2011232514A1; US20140363439A1; AR080795A1; TW201138823A; JP2013529060A; CN102906117A; JP6093692B2

Abstract

ANTICORPOS, ANTICORPO BIESPECÍFICO, FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS, IMUNOCONJUGADO, ÁCIDO NUCLEICO, CÉLULA HOSPEDEIRA, USO DE UM ANTICORPO OU ANTICORPO BIESPECÍFICO, USO DE UMA FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA E USO DE UM ANTICORPO A invenção fornece anticorpos anti-LRP6 e métodos de uso dos mesmos. Um aspecto particular da invenção fornece anticorpos anti-LRP6 biespecificos que inibem sinalização por múltiplas isofomias de Wnt.

Description

“ANTICORPOS, ANTICORPO BIESPECÍFICO, FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS, IMUNOCONJUGADO, ÁCIDO NUCLEICO, CÉLULA HOSPEDEIRA, USO DE UM ANTICORPO OU ANTICORPO BIESPECÍFICO,

USO DE UMA FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA E USO DE UM ANTICORPO” Este pedido reivindica o benefício de pedido provisório de patente US 61/317.137, depositado em 24 de março de 2010 e pedido provisório de patente US 61/394.836 depositado em 20 de outubro de 2010, cujas divulgações dos mesmos são integralmente incorporadas ao presente pedido como referência.

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a anticorpos anti-LRP6 e métodos de uso dos mesmos para o tratamento de câncer ou disfunções ósseas.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Similar à maioria de outros morfogênios e vias de sinalização de fatores de crescimento, a sinalização de Wnt de mamíferos é posicionada várias vezes durante o desenvolvimento e a homeostase do tecido através do uso de 19 ligantes diferentes, 10 receptores e correceptores múltiplos, incluindo a LRP5/6, Rori/2 e Ryk (van Amerongen e Nusse, 2009). Além disso, os diferentes antagonistas secretados que se ligam tanto a Wnts, como SFRP1/2/3/4/5 e WIF1 como a LRP5/6, incluindo DKK1/2/4 e SOST, modulam as interações entre os ligantes e receptores. Estas proteínas de membrana e extracelulares e suas isoformas múltiplas fornecem regulação diferencial no nível de expressão e interações de proteínas combinatórias. A maioria das —isoformas de Wnt parece ser capaz de se ligar a correceptores LRP5/6 e acoplamentos especificos clássicos LRP5/6, ou sinalização de Wnt dependente de B-catenina. Wnt heterodimeriza LRP5/6 e FZD para mediar fosforilação do domínio intracelular LRP5/6 e ligação de Axin (Tamai et a/., 2000; Semenov et al., 2001; Tamai et al., 2004). DVL é trazido para o complexo se ligando diretamente tanto a Axin como a FZD e a oligomerização de DVL provavelmente amplia esses complexos de proteína na face citoplasmática da membrana que sequestra GSK3 e inibe sua fosforilação e desestabilização de — fB-catenina (Mi et al, 2006; Bilic et al., 2007; Schwarz-Romond et al., 2007; Cselenyi et al., 2008; Piao et al., 2008; Zeng et a/., 2008; Wu et al., 2009). O número excepcionalmente grande de isoformas de ligantes, que exibem considerável divergência de sequência primária, que medeiam a sinalização de Wnt clássica de mamíferos contrasta com o par de —correceptores altamente homólogos. Os domínios extracelulares LRP6 e LRP5 consistem amplamente em quatro regiões homólogas, denominadas E1 a E4 de N a C-terminal, cada um contendo B-propulsor tipo YWTD e domínio similar a EGF (Jeon et a/., 2001). Cada repetição em uma posição similar em LRP6 e LRP5 é altamente conservada, enquanto que as repetições diferentes dentro da mesma proteina são consideravelmente mais divergentes. Curiosamente, Bourhis et a/. (2010) demonstraram que Wnt9b se liga exclusivamente na região E1-E2 in vitro, enquanto que Wnt3a se liga apenas a um fragmento que contém E3-E4, sugerindo que cada repetição, ou uma combinação de duas repetições adjacentes, se liga a um subgrupo de isoformas de Wnt. Esse arranjo pode acomodar a diversidade de proteínas Wnt e, possivelmente, também permite a sua regulação diferencial por ligantes antagonistas de LRP5/6. Nos receptores de Notch e de VEGF, essas regiões extracelulares contêm repetições de domínios lg e similares a EGF, respectivamente, a ligação de isoformas ligantes múltiplas está localizada na mesma região de uma ou duas repetições, embora a presença de outras repetições possa melhorar a ligação. (Rebay et a/., 1991; Davis-Smyth et a/., 1996; Cunningham et al., 1997).

Para receptores tirosina-quinases, a dimerização induzida por ligante inicia o estímulo da atividade e sinalização de quinase. Embora a heterodimerização de receptor-correceptor induzida por ligante seja necessária para a sinalização clássica de Wnt, não há papel claramente definido para homodimerização de LRP5/6 ou FZD. A dimerização forçada de diferentes proteinas LRP6 recombinantes pode ativar ou inibir sinalização de Wnt.

A sinalização de Wnt dependente de B-catenina é iniciada por uma isoforma de Wnt que se liga tanto ao receptor FZD como ao correceptor LRP5/6, que então monta um complexo multimérico na face da membrana citoplasmática para recrutar e iniciar a quinase GSK3. Se e como “mecanicamente as interações entre diferentes isoformas de Wnt e receptores podem modular este processo continua a ser determinado.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO Um aspecto da invenção fornece um anticorpo isolado que se liga a LRP6, em que o anticorpo inibe sinalização induzida por uma primeira isoforma de Wnt e potencializa sinalização induzida por uma segunda isoforma de Wnt. Em uma realização, a primeira isoforma de Wnt é selecionada a partir do grupo que consiste em Wnt3 e Wnt3a. Em uma realização, a segunda isoforma de Wnt é selecionada a partir do grupo que consiste em Wnt 1, 2, 2b, 4,6, 7a, 7b, 8a, 9a, 9b, 10a e 10b. Em outra realização, a primeira isoforma de Wnté selecionada a partir do grupo que consiste em 1, 2, 2b, 6, 8a, 9a, 9b e 10b e a segunda isoforma de Wnt é selecionada a partir do grupo que consiste em Wnt3 e Wnt3a.

Um aspecto da invenção fornece um anticorpo que se liga à região E3-E4 de LRP6. Outro aspecto da invenção fornece um anticorpo que —seligaàregião E1-E2 de LRP6. Ainda outro aspecto fornece um anticorpo que se liga a duas regiões diferentes de LRP6, como região E1-E2 de LRP6 e a região E3-E4. Em um aspecto, esses anticorpos inibem sinalização de Wnt induzida pela combinação de Wnt1 e Wnt3a. Em um aspecto, esses anticorpos inibem sinalização autócrina de Wnt.

Um aspecto da invenção fornece um método de tratamento de um indivíduo que tem câncer, que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade efetiva de um anticorpo isolado que se liga a LRP6 e inibe sinalização induzida por uma isoforma de Wnt selecionada a partir do grupo que consiste em Wnt3 e Wnt3a, e um anticorpo isolado que se liga a LRP6 e inibe sinalização induzida por uma isoforma de Wnt selecionada a partir do grupo que consiste em Wnt 1, 2, 2b, 6, 8a, 9a, 9b e 10b.

Outro aspecto da invenção fornece um método de tratamento de um indivíduo que tem câncer, que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade efetiva de um anticorpo isolado que se liga a LRP6 e inibe sinalização induzida por Wnt3 e Wnt3a, e um anticorpo isolado que se liga a LRPG6 e inibe sinalização induzida por Wnt 1, 2, 2b, 6, 8a, 9a, 9b e 10b.

Outro aspecto da invenção fornece um método de tratamento de um indivíduo que tem câncer, que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade efetiva de um anticorpo isolado que se liga a LRP6 e inibe sinalização induzida por Wnt3 e Wnt3a, e um anticorpo isolado que se liga a LRPG6 e inibe sinalização induzida por Wnt 1, 2, 2b, 4, 6, 7a, 7b, 8a, 9a, 9b, 10a e 10b.

Um aspecto da invenção fornece um método de tratamento de um indivíduo que tem uma disfunção óssea, como osteoporose, osteoartrite, fraturas ósseas e lesões ósseas, que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade efetiva de um anticorpo anti-LRP6 descrito no presente pedido.

Outro aspecto da invenção fornece um método para potencializar sinalização de Wnt induzida por uma isoforma de Wnt em um indivíduo, que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade efetiva de um anticorpo anti-LRP6 descrito no presente pedido e a isoforma de Wnt para potencializar sinalização de Wnt induzida pela isoforma Wnt.

São também fornecidos anticorpos anti-LRP6 específicos, incluindo anticorpos anti-LRP6 biespecíficos. Em uma realização, o anticorpo isolado que se liga a LRP6 compreende um VH que compreende uma 5 — sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 15. Em uma realização, o anticorpo compreende ainda uma VL que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 12. Em uma realização, o anticorpo isolado que se liga a LRP6 compreende um VH que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de homologia com uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO:

15. Em uma realização, o anticorpo isolado que se liga a LRP6 compreende ainda uma VL que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de homologia com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 12.

Em uma realização, o anticorpo é um anticorpo biespecífico isolado que se liga a duas diferentes regiões de LRP6, em que o anticorpo compreende um VH que compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partirdo grupo que consiste em SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 15. Em uma realização, o anticorpo biespecífico compreende um VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15 e um segundo VH que compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 13.

Em uma realização, o anticorpo biespecífico compreende ainda uma VL que compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 12.

Em uma realização, o anticorpo biespecífico que se liga a duas regiões diferentes de LRP6 compreende um VH que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de homologia com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, ou SEQ ID NO: 15. Em uma realização, o anticorpo biespecífico que se liga a duas regiões diferentes de LRP6 compreende uma primeira VH que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de homologia com uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15 e um segundo VH que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de homologia com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 13. Em uma realização, o anticorpo biespecífico compreende ainda uma VL que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de homologia com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 10 e SEQIDNO:12.

Em uma realização, o anticorpo biespecífico isolado que se liga a duas regiões diferentes de LRP6 compreende um primeiro domínio VH que compreende pelo menos uma, pelo menos duas ou todas as três sequências HVR de VH selecionadas a partir de (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 17; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18; e (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19 e compreende um segundo domínio VH que compreende pelo menos uma, pelo menos duas ou todas as três sequências HVR de VH selecionadas a partir de (d) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22; (e) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: (23); e (f) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24. Em uma realização, o anticorpo biespecífico isolado que se liga a duas regiões diferentes de LRP6 compreende um primeiro domínio VH que compreende todas as três sequências HVR de VH de (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 17; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18; (c) HVR-H3 que compreende a — sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19 e compreende um segundo domínio VH que compreende todas as três sequências HVR de VH de (d) HVR- H1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22; (e) HVR- H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23; e (f) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24.

Em uma realização, o anticorpo biespecífico isolado que se liga a duas regiões diferentes de LRP6 compreende um primeiro domínio VH que compreende pelo menos uma, pelo menos duas ou todas as três sequências HVR de VH selecionadas a partir de (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 17; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18; (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21 e compreende um segundo domínio VH que compreende pelo menos uma, pelo menos duas ou todas as três sequências HVR de VH selecionadas a partir de (d) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22; (e) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23; e (f) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24. Em uma realização, o anticorpo biespecífico isolado que se liga a duas regiões diferentes de LRP6 compreende um primeiro domínio VH que compreende todas as três sequências HVR de VH de (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 17; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18; (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21 e compreende um segundo domínio VH que compreende todas as três sequências HVR de VH de (d) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22; (e) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23; e (f) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24. Em uma realização, o anticorpo biespecífico isolado que se liga a — duas regiões diferentes de LRP6 compreende um primeiro domínio VH que compreende pelo menos uma, pelo menos duas ou todas as três sequências HVR de VH selecionadas a partir de (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18; (c) HVR-H3 SEQ ID NO: 19 e compreende um segundo domínio VH que compreende pelo menos uma, pelo menos duas ou todas as três sequências HVR de VH selecionadas a partir de (d) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22; (e) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23; e (f) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24. Em uma realização, o anticorpo biespecífico isolado que se liga a duas regiões diferentes de LRP6, em que o anticorpo compreende um primeiro domínio VH que compreende todas as três sequências HVR de VH de (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18; (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19 e compreende um segundo domínio VH que compreende todas as três sequências HVR de VH de (d) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22; (e) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23; e (f) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24. Em uma realização, o anticorpo biespecífico nas realizações acima compreende ainda pelo menos uma, pelo menos duas ou todos as três sequências HVR de VL selecionadas a partir de (a) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 25; (b) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26; (c) HVR-L3 SEQ ID NO: 27.

Em uma realização, o anticorpo biespecífico nas realizações acima compreende ainda pelo menos uma, pelo menos duas ou todos as três sequências HVR de VL selecionadas a partir de (a) HVR-L1 que compreende a —sequênciade aminoácidos da SEQ ID NO: 25; (b) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26; (c) HVR-L3 SEQ ID NO: 28.

Uma realização fornece um anticorpo biespecífico isolado que se liga a duas regiões diferentes do LRP6, em que o anticorpo compreende uma primeira VH, que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15 eum segundo VH selecionada a partir do grupo que consiste em um VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 13. Em uma realização, este anticorpo ainda compreende uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 12. Em uma realização, o anticorpo biespecífico compreende uma primeira WVH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15 e um segundo VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10.

Em uma realização, o anticorpo biespecífico inibe sinalização induzida por uma isoforma de Wnt selecionada a partir do grupo que consiste em Wnt3 e Wnt3a, e inibe a sinalização induzida por uma isoforma de Wnt selecionada a partir do grupo que consiste em Wnt 1, 2, 2b, 6, 8a, 9a, 9b e 10b. Em uma realização, o anticorpo biespecífico inibe ainda a sinalização induzida por uma isoforma Wnt selecionada a partir do grupo que consiste em Wnt 4, 7a, 7b e 10a. Em uma realização, o anticorpo biespecífico inibe sinalização —autócrinade Wnt.

Um aspecto da invenção fornece um anticorpo biespecífico que inibe sinalização induzida por uma isoforma de Wnt selecionada a partir do grupo que consiste em Wnt3 e Wnt3a e inibe sinalização induzida por uma isoforma de Wnt selecionada a partir do grupo que consiste em Wnt 1, 2, 2b, 6, 8a, 9a, 9h e 10b. Em uma realização, o anticorpo biespecífico inibe ainda sinalização induzida por uma isoforma Wnt selecionada a partir do grupo que consiste em Wnt 4, 7a, 7b e 10a.

Um aspecto da invenção fornece um anticorpo que compete para se ligar a LRP6 com qualquer um dos anticorpos anti-LRP6, incluindo os anticorpos biespecíficos descritos no presente pedido.

Outro aspecto da invenção fornece um anticorpo que se liga aos mesmos dois epítopos que o anticorpo biespecífico descrito no presente pedido. Em uma realização, um dos dois epítopos compreende os resíduos de aminoácidos R28, E51, D52, V70, S71, E73, L95, S96, D98, E115, RI41 e N185 de LRP6. Em uma realização, um dos dois epítopos compreende os resíduos de aminoácidos R28, E51, D52, V70, S71, E73, L95, S96, D98, E115, R141, N185, R29, W188, K202, P225, H226, S243 e F266 de LRP6.

Outro aspecto da invenção fornece um ácido nucleico isolado que codifica um anticorpo anti-LRP6 descrito no presente pedido. Outro aspecto fornece uma célula hospedeira que compreende um ácido nucleico.

Um aspecto da invenção fornece um imunoconjugado que compreende um anticorpo anti-LRP6 descrito no presente pedido e um agente citotóxico. Outro aspecto fornece uma formulação farmacêutica que compreende um anticorpo anti-LRP6 descrito no presente pedido e um veículo farmaceuticamente aceitável.

Um aspecto da invenção fornece um anticorpo anti-LRP6 descrito no presente pedido para uso como um medicamento. Um aspecto fornece um anticorpo anti-LRP6 descrito no presente pedido para uso no tratamento de câncer ou de uma disfunção óssea. Um aspecto fornece um anticorpo anti- LRPG6 descrito no presente pedido para uso na inibição de sinalização induzida por uma primeira isoforma de Wnt e potencialização de sinalização induzida

| por uma segunda isoforma de Wnt. Um aspecto fornece o uso de um anticorpo anti-LRP6 descrito no presente pedido para uso na fabricação de um medicamento útil no tratamento de, por exemplo, câncer ou uma disfunção Óssea.

Um aspecto da invenção fornece um método de tratamento de um indivíduo que tem câncer, como câncer de pulmão de células não pequenas, câncer de mama, câncer pancreático, câncer de ovário, câncer de rim, câncer de próstata, que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade efetiva de um anticorpo anti-LRP6 descrito no presente pedido.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DAS FIGURAS Figura 1A. Gráfico mostrando a inibição da atividade de luciferase repórter de Wnt em células HEK293 induzida com 0,1 mg/ml de Wnt3a purificada por anticorpos contra a proteína LRP6.E3-E4.

Figura 1B. Análise Western blot de células HEK293 tanto não estimuladas como induzidas com Wnt3a e tratadas com o anticorpo LRP6 indicado ou proteína purificada.

Figura 1C. Gráfico mostrando que o anticorpo YVW210.09 potencializa atividade do gene repórter Wnt de uma maneira proporcional à concentração de Wnt3a nas células HEK293.

Figura 2A. Gráfico mostrando a inibição dependente da concentração e a potencialização de sinalização autócrina de Wnt em células de teratocarcinoma transfectadas com luciferases repórter e tratadas com anticorpos LRP6, tanto individualmente como em combinação, ou com Fzd8CRD-Fc-proteína Fc.

Figura 2B. Gráfico mostrando o resultado da análise de expressão qPCR de genes SAX1 GAD1 induzidos por Wnt e gene LEFTY2 reprimido por Wnt em células PA-1 tratadas com ou sem 0,3 mg/ml de proteína Wnt3a, e tratadas com 10 mg/ml de anticorpo YW211.31, anticorpo monoclonal anti-gD

(controle negativo) ou proteína Fzd8CRD-Fc (controle positivo). Os dados são normalizados para amostras das células sem adição (NA) de Wnt3a.

Figura 3. Tabela resumida mostrando os efeitos de anticorpos LRP6 e Proteína FZd8CRD-Fc na sinalização autócrina nas linhagens celulares.

Figura 4A. Gráfico representado o resultado da análise de expressão qPCR de mRNA de AXIN2 nas quatro linhagens celulares tratadas com 25 ug/ml de anticorpo YW211.31.57 ou Fzd8CRD-protepina Fc, com ou sem (NA) 0,2 ug/ml de Wnt3a.

Figura 4B. Gráfico representado que a expressão de genes induzidos por Wnt em células NCI-H23 é potencializada por YW211.31.57 e antagonizada pelo anticorpo YW210.09 (30 pg/ml). A proteína CD4-Fc (30 ug/ml) serve como um controle negativo.

Figura 4C. Gráfico representado que a expressão de genes induzidos por Wnt em células M14 é potencializada por YW211.31.57 e antagonizada pelo anticorpo YW210.09 (30 ug/ml).

Figura 4D. Gráfico mostrando inibição dependente de concentração de sinalização estimulada pelo anticorpo YW211.31.57 em células Hs578T integradas de maneira estável com luciferase repórter de Wnt.

Figura 4E. Gráfico mostrando potencialização dependente de concentração de sinalização autócrina de Wnt pelo anticorpo YW211.31.57 em células Hs578T integradas de maneira estável com luciferase repórter de Wnt.

Figura 4F. Gráfico mostrando que células EKVX transfectadas com luciferase repórter exibem potencialização de sinalização autócrina de Wnt (NA) e antagonismo de sinalização induzida por Wnt3a pelo anticorpo YW211.31.57.

Figura 4G. Gráfico mostrando que a potencialização mediada por anticorpo de sinalização autócrina de Wnt é inibida por 5 ug/ml de Proteína

Fzd8CRD-Fc. Figura 5. Tabela resumida dos efeitos de 10 mg/ml de anticorpos LRP6 ou Proteína FZzd8CRD-Fc na sinalização induzida por transfecção de constructos de expressão para isoformas de Wnt em linhagens celulares HEK293 ou Hs578T integradas de maneira estável com luciferase repórter de Wnt. A expressão de luciferase repórter de Wnt é normalizada para o número de células e adicionalmente normalizada para os níveis em células transfectadas com o mesmo constructo de expressão, mas não tratadas com proteínas.

Figura 6. Tabela resumida dos efeitos de 10 mg/ml de anticorpos LRPG6 ou Proteína FZd8CRD-Fc na sinalização de linhagens celulares HEK293 integradas de maneira estável com luciferase repórter de Wnt. A sinalização foi induzida por transfecção de constructos de expressão para as proteínas quiméricas consistindo em isoformas de Wnt fundidas a isoformas de FZD ou LRP6.A expressão de luciferase repórter de Wnt é normalizada para o número de células e adicionalmente normalizada para os níveis em células transfectadas com o mesmo constructo de expressão, mas não tratadas com proteínas.

Figura 7. Tabela resumida dos efeitos de 10 mg/ml de anticorpos LRP6 ou combinações de anticorpo na sinalização induzida por transfecção de constructos de expressão para isoformas de Wnt em linhagens celulares integradas de maneira estável com luciferase repórter de Wnt. A expressão de luciferase repórter de Wnt é normalizada para o número de células e adicionalmente normalizada para os níveis em células transfectadas com o —mesmo constructo de expressão, mas não tratadas com proteínas.

Figura 8A. Gráfico mostrando que a combinação de anticorpos YW211.31.57 e YW210.09 inibe sinalização de células HEK293 integradas de maneira estável com luciferase repórter de Wnt que foram transfectadas para expressão tanto de Wnt3a, Wnt1 como Wnt3a e Wnt1. O anticorpo Anti-gD e a proteína FZd8CRD-Fc são mostrados como controles negativo e positivo, respectivamente, para inibição de sinalização de Wnt.

Figura 8B. Gráfico mostrando que a combinação de anticorpos YW211.31.57 e YWZ210.09 potencializa sinalização autócrina de Wnt em células Hs578T.

Figura 8C. Gráfico mostrando que a combinação de anticorpos YW211.31.57 e YWZ210.09 potencializa sinalização autócrina de Wnt em células EKVX.

Figuras 9A e B. Ensaio de interferometria de biocamada com proteína LRP6 E1-E4 imobilizada em biossensores de estreptavidina indicando que o anticorpo YW211.31.57 inibe ligação de Wnt3ôa e Wnt9b a LRP6 e o anticorpo YW210.09 inibe apenas ligação a Wnt9b.

Figura 9C. O ensaio de interferometria de biocamada com fragmento menor de LRP6 não sobreposto que mostra que Wnt3a se liga à região E3-E4, e esta interação é bloqueada tanto pelo anticorpo YW211.31 intacto como de um braço.

Figura 9D. O ensaio de interferometria de biocamada com fragmento menor de LRP6 não sobreposto mostra que o anticorpo YW210.09 seligaao fragmento da proteina LRP6 E1-E2 e compete com ligação a Wnt9b.

Figura 9E. Ensaio de interferometria de biocamada mostrando que os anticorpos YW211.31.57 e YW210.09 podem se ligar juntos à proteina LRP6.E1-E4 imobilizada quando adicionados sequencialmente em qualquer ordem, confirmado epítopos separados.

Figura 10A. Gráfico mostrando regressão de crescimento de tumores de aloenxerto MMTV-Wnt1 quando camundongos são tratados com anticorpo YW210.09, similar àquele observado com proteína FZzd8CRD-Fc.

Figura 10B. Gráfico mostrando que tumores de xenoenxerto

Ntera-2 exibem expressão reduzida de mRNA de SP5 por análise qPCR em camundongos tratados com anticorpo YW211.31 intacto ou de um braço, mas não com anticorpo YW210.09.

Figura 10C. Gráfico mostrando YW210.09, mas não YW211.31.62, tratamento com anticorpo de explante de calvária de camundongo em cultura aumentou significativamente a densidade mineral óssea (BMD) de osso parietal calcificado, similar ao tratamento com RANK- proteína Fc.

Figura 11A. Gráfico mostrando anticorpo anti-LRP6 biespecífico produzido em células de E. coli ou HEK293 inibe de maneira similar em um modo dependente de concentração a atividade de luciferase repórter de Wnt em células HEK293 induzidas com 0,1 ug/ml de Wnt3a purificada. Os valores IC50 são 0,032 e 0,014 pg/ml, respectivamente.

Figura 11B. Gráfico mostrando o efeito do tratamento com o tampão controle indicado (PBS), anticorpo, combinação de anticorpo, ou Proteína Fzd8CRD-Fc (10 ug/ml cada) na sinalização autócrina de Wnt em células PA-1 e M14 integradas de forma estável com luciferase repórter de Wnt, e células CAL-51 transfectadas com repórter, foram tratadas com o tampão controle indicado (PBS), anticorpo, combinação de anticorpo, ou Proteína FZzd8CRD-Fc (10 pg/ml de cada) com (C) ou sem (B) estimulação por 0,1 ug/ml de Wnt3a.

Figura 11C. Gráfico mostrando o efeito do tratamento com o tampão controle indicado (PBS), anticorpo, combinação de anticorpo ou Proteína Fzd8CRD-Fc (10 ug/ml cada) em células PA-1 e M14 integradas de maneira estável com luciferase repórter de Wnt, e células CAL-51 transfectadas com repórter, estimuladas por 0,1 ug/ml de Wnt3a.

Figura 12. Tabela resumida dos efeitos de anticorpos ou proteína Fzd8CRD (10 ug/ml) sobre a sinalização induzida por transfecção de constructos de expressão de isoformas de Wnt em linhagens celulares HEK293 ou Hs578T estavelmente integradas com a luciferase repórter de Wnt. Figura 13A. Análise Western de células HEK293 com ou sem transfecção de Wnt3a e tratadas com o anticorpo indicado ou proteína —Fzd8CRD-Fc (5 ug/ml) durante 18 h. Níveis de B-actina ou de proteína GAPDH são mostrados como controles de carga de amostra para os géis superiores e inferiores, respectivamente. Figura 13B. Gráfico mostrando tumores de xenoenxerto M14 em camundongos SCID-bg tratados por 16 h com 30 mg/kg de anticorpo biespecífico LRP6 ou proteína FZd8CRD, mas não com anticorpo anti-gD controle, exibem expressão reduzida de mMRNA de AXIN2 e APCDD1 por análise qPCR. Figura 14. Vista detalhada da interação CDR H3 com resíduos do canal de LRP6 que mostram a importante rede de interação feita por motivo NAVK. Figura 15. Detalhe da interação feita por CDR H1,2, L1,2e3. Figura 16. Região variável da cadeia pesada (VH) de anticorpos anti-LRP6 exemplares mostrando CDRs de Kabat. Figura 17. Região variável da cadeia leve (VL) de anticorpos anti- LRP6 exemplares mostrando CDRs de Kabat.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS REALIZAÇÕES DA INVENÇÃO |. DEFINIÇÕES Uma “estrutura humana aceitante" para os propósitos descritos no presente pedido é uma estrutura que compreende a sequência de aminoácidos de uma estrutura de domínio variável da cadeia leve (VL) ou uma estrutura de domínio variável da cadeia pesada (VH) derivada a partir de uma estrutura de imunoglobulina humana ou de uma estrutura consenso humana, conforme definido abaixo. Uma estrutura humana aceitante “derivada a partir de" uma estrutura de imunoglobulina humana ou de uma estrutura consenso humana pode compreender a mesma sequência de aminoácidos desta ou pode conter trocas na sequência de aminoácidos. Em algumas realizações, o número de trocas de aminoácidos é 10 ou menos, 9 ou menos, 8 ou menos, 7 ou menos, 6 — oumenos,5 ou menos, 4 ou menos, 3 ou menos ou 2 ou menos. Em algumas realizações, a estrutura humana aceitante VL é idêntica na sequência à sequência de estrutura de imunoglobulina humana VL ou sequência de estrutura consenso humana. “Afinidade” refere-se à força da soma total de interações não —covalentes entre um único sítio de ligação de uma molécula (por exemplo, um anticorpo) e seu parceiro de ligação (por exemplo, um antígeno). A menos que indicado de outra forma, como usado no presente pedido, “afinidade de ligação” refere-se à afinidade de ligação intrínseca que reflete uma interação 1:1 entre membros de um par de ligação (por exemplo, anticorpo e antígeno). A afinidade de uma molécula X para o seu parceiro Y pode ser geralmente representada pela constante de dissociação (Kd). A afinidade pode ser medida por métodos comuns conhecidos na técnica, incluindo aqueles descritos no presente pedido. llustrativo específico e realizações exemplares para medir afinidade de ligação estão descritos a seguir.

Um anticorpo de “afinidade madura" refere-se a um anticorpo com uma ou mais alterações em uma ou mais regiões hipervariáveis do mesmo, em comparação a um anticorpo parental que não possui essas alterações, como alterações que resultam em um aprimoramento na afinidade do anticorpo para o antígeno.

Os termos “anticorpo anti-LRP6" e “um anticorpo que se liga À LRPG6”" refere-se a um anticorpo que é capaz de se ligar a LRP6 com afinidade suficiente, de modo que o anticorpo seja útil como um agente de diagnóstico e/ou terapêutico para atingir LRP6. Em uma realização, a medida de ligação de um anticorpo anti-LRP6 a uma proteína LRP6 não relacionada é menor que cerca de 10% da ligação do anticorpo a LRP6 conforme medido, por exemplo, por um radioimunoensaio (RIA). Em certas realizações, um anticorpo que se liga a LRP6 tem uma constante de dissociação (Kd) de £ 1uM, < 100 nM, < 10 nM,<1nM, <01nM,<001nM, ou < 0,001 nM (por exemplo, 10º M ou menos, por exemplo, de 10º M a 10º? M, por exemplo, de 10º M a 10”?. Em certas realizações, um anticorpo anti-LRP6 se liga a um epítopo de LRP6 que é conservado entre LRP6 de diferentes espécies.

O termo “anticorpo” no presente pedido é usado no sentido mais amplo e engloba várias estruturas de anticorpos, incluindo, mas não se limitando a, anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) e fragmentos de anticorpos, desde que eles exibam a atividade de ligação de antígeno desejada.

Um “fragmento de anticorpo” refere-se a uma molécula diferente de um anticorpo intacto, que compreende uma porção de um anticorpo intacto que se liga ao antígeno ao qual se liga o anticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem, mas não se limitam a, Fv, Fab, Fab', Fab”- SH, F(ab')2, diacorpos, anticorpos lineares, moléculas de anticorpo de cadeia única (por exemplo, scFv) e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpos.

Um “anticorpo que se liga ao mesmo epítopo”, como um anticorpo de referência, refere-se a um anticorpo que bloqueia a ligação do anticorpo de referência ao seu antígeno em um teste competitivo em 50% ou mais, e inversamente, o anticorpo de referência bloqueia a ligação do anticorpo ao seu antígeno em um teste competitivo em 50% ou mais. Um ensaio de competição exemplar é fornecido no presente pedido.

Os termos “câncer” e “canceroso” referem-se ou descrevem a condição fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada pelo crescimento/proliferação celular irregular. Exemplos de câncer incluem, mas não se limitam a, carcinoma, linfoma (por exemplo, linfoma de Hodgkin e linfoma não Hodgkin), blastoma, sarcoma e leucemia. Exemplos mais específicos de tais cânceres incluem câncer celular escamoso, câncer de pulmão de célula pequena, câncer de pulmão de células não pequenas, adenocarcinoma de pulmão, carcinoma escamoso de pulmão, câncer de peritônio, câncer hepatocelular, câncer gastrointestinal, câncer pancreático, glioma, câncer cervical, câncer ovariano, câncer de fígado, câncer de bexiga, hepatoma, câncer de mama, câncer de cólon, câncer colorretal, carcinoma endometrial ou uterino, carcinoma glandular salivar, câncer de rim, câncer de fígado, câncer de próstata, câncer de vulva, câncer de tireoide, carcinoma hepático, leucemia e outras disfunções linfoproliferativas, e vários tipos de câncer de cabeça e pescoço.

Um “agente quimioterapêutico” refere-se a um composto químico útil no tratamento de câncer. Exemplos de agentes quimioterapêuticos incluem agentes alquiladores como tiotepa e ciclosfosfamida CYTOXANº: alquil sulfonados como bussulfano, improssulfano e pipossulfano; aziridinas como benzodopa, —carboquona, meturedopay e uredopa; etileniminas e —metilamelaminas incluindo altretamina, trietilenemelamina, trietilenefosforamida, trietilenetiofosforamida e trimetilolomelamina; acetogeninas — (especialmente — bulatacina e bulatacinona); delta-9- tetraidrocanabinol — (dronabinol, MARINOL?); — beta-lapacona; lapacol; colchicinas; ácido betulínico; uma camptotecina (incluindo a sintética análoga topotecano — (HYCAMTIN%, CPT-11 (irinoteccan, CAMPTOSAR?), acetilcamptotecina, — scopolectina, e 9-aminocamptotecina); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluindo suas análogas adozelesina, carzelesina e bizelesina sintética); podofilotoxina; ácido podofilínico; teniposida; criptoficinas

| (particularmente criptoficina 1 e criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluindo as sintéticas análogas, KW-2189 e CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; uma sarcodictina; espongistatina; mostardas de nitrogênio como clorambucila, clornafazina, clorofosfamida, estramustina, ifosfamida,

—mecloretamina, hidrocloreto óxido de mecloretamina, melfalan, novembiquin, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracil; nitrosureias como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, e ranimnustina; antibióticos como os antibióticos enedina (por exemplo, caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gamma11l e caliqueamicina ômega 11 (consulte,

por exemplo, Nicolaou et al., Angew.

Chem Intl.

Ed.

Engl., 33: 183-186 (1994)); CDP323, um inibidor de integrina alfa-4 oral; dinemicina, incluindo dinemicina

A; uma esperamicina; assim como neocarzinostatina cromófora e antibióticos cromóforos de cromoproteínas enedina relacionadas), aclacinomisinas, actinomíicinas, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina,

carminomíicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorubicina, 6-diazo-5-o0xo-L-norleucina, doxorrubicina (incluindo ADRIAMYCINº, — morfolino-doxorrubicina, — cianomorfolino-doxorubicina, —2- pirrolino-doxorubicina, injeção de lipossomo HCI doxorrubicina (DOXILÔ), doxorubicina lipossomal TLC D-99 (MYOCETO), doxorrubicina lipossomal peguilada (CAELYXº), e deoxidoxorrubicina), epirubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicina como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, — olivomiícinas, — peplomicina, — potfiromicina, — puromícina, quelamicina, — rodorrubicina, —estreptonigrina, streptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatinay zorubicina; anti-metabólitos como metotrexato,

—gencitabina (GEMZARº), permetrexed (ALIMTA?); tegafur (UFTORAL9), capecitabina (XELODAº), uma epotilona, e 5-flúor uracil (5-FU); análogos de ácido fólico como denopterina,y metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina;

análogos de pirimidina como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; anti-adrenais como aminoglutetimida, mitotane, trilostane; ácido fólico reabastecedor como ácido frolínico; aceglatona; glicosídeo aldofosfamida ; ácido aminolevulínico; eniluraci; ansacrina; bestrabucila; bisantreno;y edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptínio; etoglucídio; nitrato de gálio; hidroxiureia; lentinan; lonidainina; maitansinoides como maitansina e ansamitocinas; — mitoguazona; mitoxantronay mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; losoxantrona; 2-etil hidrazido; procarbazina; complexo de polissacarídeo PSKº (JHS Natural Products, Eugene, OR); razoxano; rizoxino; sizofirano; espirogermânio; ácido tenuazônico; triaziquona; 2,2' 2”-triclorotrietillamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A e anguidina); uretano; vindesina (ELDISINEº, FILDESINº) dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; —arabinosida (“Ara-C”); tiotepa; taxoide, por exemplo, paclitaxel (TAXOL?), fórmula de paclitaxel de nanopartículas de albumina-engenherada (ABRAXANE'M), e docetaxel (TAXOTERES); cloranbucila; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; agentes platina como cisplatina, oxaliplatina (por exemplo, ELOXATINO), e carboplatina; vincas, que previnem polimerização da tubulha de formação de microtúbulos, incluindo vinblastina (VELBANº), vincristina (ONCOVINº), vindesina (ELDISINES, FILDESINO), e vinorelbina (NAVELBINE?); etoposídeo (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; leucovovina; novantrona; edatrexato; daunomicina; aminopterina; ibandronato; inibidor topoisomerase RFS 2000; difluormetilornitina (DMFO); retinoides como ácido —retinoico, incluindo bexaroteno (TARGRETINS); bisfosfonatos como clodronato (por exemplo, BONEFOSº ou OSTACº), etidronato (DIDROCALº), NE-58095, ácido —zoledrônico/zoledronato = (ZOMETA?), alendronato (FOSAMAXº), pamidronato (AREDIA9), tiludronato (SKELID?), ou risedronato (ACTONELº);

troxacitabiha — (um análogo citosina —nucleosídeo — 1,3-dioxolana); oligonucleotídeos antisense , particularmente aqueles que inibem expressão de genes nas vias de sinalização envolvidas na proliferação celular anormal, como, por exemplo, PKC-alfa, Raf, H-Ras, e receptor do fator de crescimento —epidermal (EGF-R); vacinas como vacina THERATOPES e vacinas de terapia de gene, por examplo, vacina ALLOVECTINº, vacina LEUVECTINS, e vacina VAXID?; inibidor topoisomerase 1 (por exemplo, LURTOTECANO); rmRH (por exemplo, ABARELIXº); BAY439006 (sorafenibe; Bayer); SU-11248 (sunitinibe, SUTENTº, Pfizer); perifosina, inibidor COX-2 (por exemplo, celecoxibe ou etoricoxibe), inibidor proteosomo (por exemplo, PS341); bortezomibe (VELCADE9); CCI1-779; tipifarnibe (R11577); orafenibe, ABT510; Bcl-2 inibidor como oblimerseno de sódio (GENASENSEº); pixantrona; inibidores EGFR (consulte definição abaixo); inibidor tirosina quinase (consulte definição abaixo); e sais farmaceuticamente aceitáveis, ácidos ou derivados de qualquer dos acima; bem como combinações de dois ou mais dos acima como CHOP, uma abreviação para uma terapia combinada de ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina, e prednisolona, e FOLFOX, uma abreviação para um regime de tratamento com oxaliplatina (ELOXATIN%) combinado com 5-FU e leucovovina.

Agentes quimioterapêuticos, como definido no presente pedido incluem “agentes anti-hormonais” ou “terapêuticos endócrinos” que agem para regular, reduzir, bloquear ou inibir os efeitos de hormônios que podem promover o crescimento de câncer.

Eles podem ser os próprios hormônios, que incluem, mas não se limitam a: antiestrogênio com mistura de perfil agonista/antagonista, incluindo, tamoxifeno (NOLVADEXº), 4 —hidroxitamoxifeno, toremifeno (FARESTON9), idoxifeno, droloxifeno, raloxifeno (EVISTAS), trioxifeno, queoxifeno, e moduladores seletivos do receptor de estrogênio (SERMs) como SERM3; anti-estrogênios puros sem propriedades agonista, como fulvestrant (FASLODEXº), e EM80O (esses agentes podem bloquear a dimerização do receptor de estrogênio (ER), inibir ligação do DNA, aumentar a rotatividade de ER, e/ou suprimir os níveis de ER); inibidores aromatase, incluindo inibidores aromatase esteroidais como formestano e exemestano (AROMASINº), e inibidores aromatase não esteroidais como —anastrazola (ARIMIDEXº), letrozola (FEMARA?) e aminoglutetimida, e outros inibidores aromatase incluem vorozola (RIVISOR?), acetato de megestrol (MEGASES9), fadrozola, e 4(5)-imidazola; hormônios agonistas de liberação de hormônio luteinizante, incluindo leuprolida (LUPRONº e ELIGARDº), goserelina, buserelina, e tripterelina; esteroides sexuais, incluindo progestinas como acetato de megestrol e acetato de medroxiprogesterona, estrogênios como dietilstlbestrol e premarina e andrógenos/retinoides — como fluoximesterona, todo ácido transretiônico e fenretinida; onapristona; anti- progesterona; reguladores baixos do receptor de estrogênio (ERDs); anti- andrógenos como flutamida, nilutamida e bicalutamida; testolactona; e sais farmaceuticamente aceitáveis, ácidos ou derivados de qualquer dos acima; assim como combinações de dois ou mais dos acima.

O termo de anticorpo “quimérico” refere-se a um anticorpo em que uma porção da cadeia pesada e/ou da cadeia leve é derivada de uma fonte ou espécie específica, enquanto o restante da cadeia pesada e/ou da cadeia leve é derivadode uma fonte ou espécie diferente.

A “classe” de um anticorpo refere-se ao tipo de domínio constante ou região constante de sua cadeia pesada. Existem cinco classes principais de anticorpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e várias destas podem, ainda, ser divididas em subclasses (isotipos), por exemplo, I9G1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 elA? Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de imunoglobulinas são chamados de a, 5, £€, v, e À, respectivamente.

O termo “agente citotóxico”, como usado no presente pedido,

refere-se a uma substância que inibe ou previne a função celular e/ou causa morte ou destruição das células. Agentes citotóxicos incluem, mas não se limitam a isótopos radioativos (por exemplo, At2!1, 1131, (128, yºo, Re'*6, Ret, sm'*º, BP? Pp? PR? e isótopos radioativos de Lu), agentes — quimioterapêuticos ou drogas, por exemplo, metotrexato, adriamicina, alcaloides da vinca (vincristina, vinblastina,y etoposídeo), doxorrubicina, melfalan, mitomicina C, clorambucila, daunorrubicina ou outros agentes intercalantes), agentes inibidores do crescimento, enzimas e fragmentos dos mesmos, como enzimas nucleolíticas, antibióticos, toxinas como toxinas de molécula pequena ou toxinas enzimaticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, incluindo fragmentos e/ou variantes dos mesmos, e os vários agentes antitumor ou anticâncer divulgados abaixo.

“Funções efetoras” referem-se àquelas atividades biológicas atribuíveis à região Fc de um anticorpo, que variam conforme o isotipo do anticorpo. Exemplos de funções efetoras de anticorpos incluem: ligação C1qg e citoxicidade dependente de complemento (CDC), ligação do receptor Fc, citoxicidade — celular dependente de anticorpo (ADCC), fagocitose, infrarregulação de receptores de superfície celular (por exemplo, receptor de célula B) e ativação de célula B.

Uma “quantidade efetiva” de um agente, por exemplo, uma formulação farmacêutica, refere-se a uma quantidade efetiva nas dosagens e por períodos de tempo necessários para alcançar o resultado terapêutico ou profilático desejado.

O termo “região Fc" no presente pedido é usado para definir uma região C- terminal de uma cadeia pesada da imunoglobulina que contém pelo menos uma porção da região constante. O termo inclui regiões Fc de sequência nativa e regiões Fc variantes. Em uma realização, uma região Fc da cadeia pesada de imunoglobulina humana se estende a partir de Cys226 ou de Pro230 até a terminação carboxila da cadeia pesada.

Entretanto, a lisina C-terminal (Lys447) da região Fc pode ou não estar presente.

A menos que especificado de outra forma no presente pedido, a numeração de resíduos de aminoácidos na região Fc ou região constante é de acordo com o sistema de numeração EU, também denominado índice EU, conforme descrito em Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5º Ed.

Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991. “Região de estrutura” ou “FR” refere-se a resíduos de domínio variável, exceto resíduos da região hipervariável (HVR). A FR de um domínio variável geralmente consiste em quatro domínios FR: FR1, FR2, FR3 e FRA4. Consequentemente, as sequências de HVR e FR geralmente aparecem na seguinte sequência em VH (ou VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FRA4. Os termos “anticorpo inteiro,” “anticorpo intacto” e “anticorpo completo” são usados alternadamente no presente pedido para se referir a um anticorpo que tem uma estrutura substancialmente similar a uma estrutura de anticorpo nativo ou que tem cadeias pesadas que contêm uma região Fc conforme definido no presente pedido.

Os termos “célula hospedeira”, “linhagem celular hospedeira" e “cultura celular hospedeira” são usados alternadamente e referem-se a células em que o ácido nucleico exógeno foi introduzido, incluindo a progênie dessas.

Células hospedeiras incluem “transformantes” e “células transformadas”, que incluem a célula primária transformada e a progênie derivada a partir das mesmas sem consideração ao número de passagens.

A progênie pode não ser completamente idêntica a uma célula parental no conteúdo de ácido nucleico, —mas pode conter mutações.

Progênies mutantes que têm a mesma função ou atividade biológica como as triadas ou selecionadas para a célula originalmente transformada são incluídas no presente pedido.

Um “anticorpo humano” é aquele que possui uma sequência de aminoácidos que corresponde àquela de um anticorpo produzido por uma célula humana ou uma célula humana derivada de uma fonte não humana que utiliza repertórios de anticorpos humanos ou outras sequências que codificam anticorpos humanos. Essa definição de um anticorpo humano especificamente exclui um anticorpo humanizado que compreende resíduos de ligação de antígenos não humanos.

Uma “estrutura consenso humana” é uma estrutura que representa resíduos de aminoácidos de ocorrência mais comum em uma seleção de sequências de estrutura VL ou VH de imunoglobulina humana.

Geralmente, a seleção de sequências VL ou VH de imunoglobulina humana é a partir de um subgrupo de sequências de domínio variável. Geralmente, o subgrupo de sequências é um subgrupo como em Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5º edição, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), volumes 1 a 3. Em uma realização, para VL,, o subgrupo é subgrupo kappa, como em Kabat ef al, acima. Em uma realização, para VH, o subgrupo é subgrupo Ill como em Kabat et al, acima.

Um “anticorpo humanizado” refere-se a um anticorpo quimérico que compreende resíduos de aminoácidos de HVRs não humanas e resíduos de aminoácidos de Frs humanas. Em certas realizações, um anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois domínios variáveis, em que todas ou substancialmente todas as HVRs correspondem àquelas de um anticorpo não humano e todas ou substancialmente todas as FRs correspondem àquelas de um anticorpo humano. Um anticorpo humanizado pode opcionalmente compreender pelo menos uma porção de uma região constante do anticorpo derivada a partir de um anticorpo humano. Uma “forma humanizada” de um anticorpo, por exemplo, um anticorpo não humano, refere-se a um anticorpo que foi submetido à humanização.

| O termo “região hipervariável” ou “HVR”, como usado no presente pedido, refere-se a cada uma das regiões de um domínio variável do anticorpo que são hipervariáveis na sequência e/ou formas estruturalmente definidas como alças (“alças hipervariáveis”). Geralmente, anticorpos de quatro cadeias nativas compreendem seis HVRs, três na VH (H1, H2, H3) e três na VL (L1, L2, L3). HVRs geralmente compreendem resíduos de aminoácidos das alças hipervariáveis e/ou das "regiões determinantes de complementaridade” (CDRs), sendo esta última de variabilidade de sequência mais alta e/ou envolvida no reconhecimento de antígeno.

Alças hipervariáveis exemplares ocorrem nos resíduos de aminoácidos 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) e 96-101 (H3). (Chothia e Lesk, J.

Mol.

Biol. 196:901-917 (1987).) CDRs exemplares (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3) ocorrem nos resíduos de aminoácidos 24 a 34 de L1, 50 a 56 de L2, 89 a 97 de L3, 31 a 35B de H1, 50 a 65 de H2, e 95 a 102 de H3. (Kabat et al.

Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). Com exceção de CDR1 na VH, CDRs geralmente compreendem os resíduos de aminoácidos que formam as alças hipervariáveis.

CDRs também compreendem “resíduos determinantes de especificidade,” ou “SDRs,” que são resíduos que entram em contato com o antígeno.

SDRs são incluídos nas regiõês das CDRs chamadas CDRs abrevidas ou a-CDRs. a-CDRs exemplares (a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2 e a-CDR-H3) ocorrem nos resíduos de aminoácidos 31 a 34 de L1, 50 a 55 de L2, 89 a 96 de L3, 31 a 35B de H1, 50 a 58 de H2, e 95 a 102 de H3. (Consulte Almagro e Fransson, Front.

Biosci. 13:1619-1633 (2008)) A menos que indicado de outra forma, resíduos de HVR e outros resíduos no domínio variável (por exemplo, resíduos de FR) são numerados no presente pedido de acordo com Kabat et a/. acima.

Um “imunoconjugado” é um anticorpo conjugado a uma ou mais moléculas heterólogas incluindo, mas não se limitando a um agente citotóxico.

Um “indivíduo” ou “sujeito” é um mamífero. Mamíferos incluem, mas não se limitam a, animais domesticados (por exemplo, vacas, ovelhas, gatos, cães e cavalos), primatas (por exemplo, primatas humanos e não — humanos como macacos), coelhos e roedores (por exemplo, camundongos e ratos). Em certas realizações, o indivíduo ou sujeito é um humano.

Um anticorpo “isolado” é aquele que foi separado de um componente de seu ambiente natural. Em algumas realizações, um anticorpo é purificado para mais de 95% ou 99% de pureza, conforme determinado, por exemplo, por eletroforese (por exemplo, SDS-PAGE, focalização isoelétrica (IEF), eletroforese capilar) ou cromatografia (por exemplo, troca iônica ou HPLC de fase reversa). Para revisão de métodos para avaliação de pureza de anticorpo consulte, por exemplo, Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007).

Um ácido nucleico “isolado” refere-se a uma molécula de ácido nucleico que foi separada de um componente de seu ambiente natural. Uma molécula isolada inclui uma molécula de ácido nucleico contida nas células que normalmente contêm a molécula de ácido nucleico, mas a molécula de ácido nucleico está presente fora do cromossomo ou em um local do cromossomo diferente daquele de localização natural no cromossomo.

“Ácido nucleico isolado que codifica um anticorpo anti-LRP6" refere-se a uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam as cadeias pesada e leve de anticorpo (ou fragmentos do mesmo), incluindo molécula(s) de ácido nucleico em um único vetor ou vetores separados, e essa(s) —molécula(s) de ácido nucleico(s) se apresenta(m) em um ou mais locais em uma célula hospedeira.

O termo “anticorpo monoclonal”, como usado no presente pedido, refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogênea, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos e/ou se ligam ao mesmo epítopo, exceto por possíveis anticorpos variantes, por exemplo, que contêm mutações que ocorrem naturalmente ou que surgem durante a produção de uma preparação de anticorpo monocional, essas variantes geralmente estando presentes em menores quantidades. Ao contrário das preparações de anticorpo policlonal que tipicamente incluem diferentes anticorpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal de uma preparação de anticorpo monocional é dirigida contra um único determinante em um antígeno. Dessa forma, o modificador “monoclonal” indica o caráter do anticorpo como sendo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogênea e não deve ser interpretado como uma exigência de produção do anticorpo por qualquer método específico. Por exemplo, os anticorpos monocionais a serem usados de acordo com a presente invenção podem ser fabricados por uma variedade de técnicas incluindo, mas não se limitando ao método de hibridoma, métodos de DNA recombinante, métodos de exibição por fago, e métodos que utilizam animais transgênicos contendo todos ou parte dos /oci da imunoglobulina humana, esses métodos e outros métodos exemplares para fabricação de anticorpos monoclonais são descritos no presente pedido.

Um “anticorpo nu” refere-se a um anticorpo que não é conjugado a um componente heterólogo (por exemplo, componente citotóxico) ou radiomarcado. O anticorpo nu pode estar presente em uma formulação farmacêutica.

“Anticorpos nativos" referem-se a moléculas de imunoglobulina que ocorrem naturalmente com diferentes estruturas. Por exemplo, os anticorpos IgG nativos são glicoproteínas heterotetraméricas de cerca de

150.000 daltons, compostas por duas cadeias leves idênticas e duas cadeias pesadas idênticas que são ligadas por bissulfeto. A partir da terminação N até C, cada cadeia pesada tem uma região variável (VH), também chamada de domínio variável pesado ou um domínio variável da cadeia pesada, seguido por três domínios constantes (CH1, CH2 e CH3). De maneira similar, a partir da terminação N até C, cada cadeia leve tem uma região variável (VL), também chamada de domínio variável leve ou um domínio variável da cadeia leve, seguido por um domínio constante leve (CL). A cadeia leve de um anticorpo pode ser designada para um dos dois tipos, chamados kappa (K) e lambda (À), com base na sequência de aminoácidos de seu domínio constante.

O termo “bula” é usado para se referir às instruções incluídas como de costume em embalagens comerciais de produtos terapêuticos, que contêm informações sobre as indicações, uso, dosagem, administração, terapia de combinação, contra indicações e/ou advertências referentes ao uso desses produtos terapêuticos.

Porcentagem (%) de identidade de sequência de aminoácidos” em relação a uma sequência de polipeptídeo de referência é definida como a porcentagem de resíduos de aminoácidos em uma sequência candidata que são idênticos aos resíduos de aminoácidos na sequência do polipeptídeo de referência, após alinhamento das sequências e introdução de gaps, se — necessário, para alcançar a porcentagem máxima de identidade de sequência, sem considerar qualquer substituição conservativa como parte da identidade de sequência. Alinhamento, para os propósitos de determinação da porcentagem de identidade de sequência de aminoácidos, pode ser alcançado de várias maneiras, as quais estão dentro da técnica, por exemplo, com o uso de — programas de computação disponíveis publicamente, como os programas de computação BLAST, BLAST-2, ALIGN ou Megalign (DNASTAR). Os técnicos no assunto podem determinar parâmetros apropriados para alinhamento de sequências, incluindo quaisquer algoritmos necessários para alcançar o alinhamento máximo ao longo das sequências inteiras sendo comparadas.

Para os propósitos no presente pedido, no entanto, valores de % de identidade de sequência de aminoácidos gerados com o uso do programa de computador de comparação de sequência, ALIGN-2, que foi desenvolvido pela Genentech, Inc. eocódigo da fonte foi depositado com documentação de usuário no US Copyright Office, Washington, DC, 20559, registrado sob US Copyright Registration Nº TXU510087. O programa ALIGN-2 está publicamente disponível junto à Genentech, Inc., South San Francisco, Califórnia, ou pode ser compilado a partir do código fonte.

O programa ALIGN-2 deve ser compilado para uso em um sistema operacional UNIX, inclusive UNIX V4.0D digital.

Todos os parâmetros de comparação de sequência são definidos pelo programa ALIGN-2 e não variam.

Nas situações em que o ALIGN-2 é empregado para comparações de sequências de aminoácido, a % de identidade de sequência de aminoácidos de uma dada sequência de aminoácidos A em relação uma dada sequência de aminoácidos B (que pode alternativamente ser formulada como uma dada sequência de aminoácidos A que tem ou compreende certa % de identidade de sequência de aminoácidos em relação a uma dada sequência de aminoácidos B) é calculada como a seguir: 100 vezes a fração X/Y onde X é o número de resíduos de aminoácidos conseguidos em relação a comparações idênticas pelo programa de alinhamento de sequências ALIGN-2 nesse alinhamento de programa de A e B e onde Y é o número total de resíduos de aminoácidos em B.

Estima-se que quando o comprimento da sequência de aminoácidos A não é igual ao comprimento da sequência de aminoácidos B, a % de identidade de sequência de aminoácidos A em relação a B não é igual à % de identidade de sequência de aminoácidos B em relação a A.

A menos que especificamente declarado de outra forma, todos os valores de % de identidade de sequência de aminoácidos usados no presente pedido são obtidos conforme descrito no parágrafo imediatamente anterior, com o uso de o programa de computação ALIGN-2. O termo “formulação farmacêutica” refere-se a uma preparação — que está em tal forma a permitir a atividade biológica de um ingrediente ativo contido na mesma ser efetiva, e que não contém componentes adicionais que são inaceitavelmente tóxicos para um sujeito ao qual a formulação seria administrada.

Um “veículo farmaceuticamente aceitável” refere-se a um ingrediente em uma formulação farmacêutica, que não seja um ingrediente ativo, o qual não é tóxico a um sujeito.

Um veículo farmaceuticamente aceitável inclui, mas não se limita a, um tampão, excipiente, estabilizante ou conservante.

O termo “LRP6”, como usado no presente pedido, refere-se a qualquer LRP6 nativo de qualquer fonte de vertebrados, incluindo mamíferos, como primatas (por exemplo, humanos) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos), a menos que indicado de outra forma.

Os termos englobam LRP6 “inteiro” não processado, bem como qualquer forma de LRP6 que resulte do processamento na célula.

O termo também engloba variantes de ocorrência natural de LRP6, por exemplo, variantes splice ou variantes alélicas.

A sequência de aminoácidos de uma LRP6 humana exemplar é mostrada na SEQ ID NO: 29. Consulte também número de acesso AAI43726 no NCBI, Strausberg, R.

L., et al., Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

U.-S.A. 99 : 16899-16903 (2002) (He, X, et al, Development, 131:1663-1677 (2004); Chen, M., et al., J.

Biol.

Chem. ,284:35040-35048 (2009). Como usado no presente pedido, “tratamento” (e variações gramaticais do mesmo como “tratar” ou “tratando”) refere-se à intervenção clínica em uma tentativa de alterar o curso natural do indivíduo sendo tratado, e pode ser realizado tanto para profilaxia como durante o curso da patologia clínica. Efeitos desejados de tratamento incluem, mas não são limitados a, prevenção de ocorrência ou recorrência da doença, alívio de sintomas, diminuição de quaisquer consequências patológicas diretas ou indiretas da doença, prevenção de metástases, diminuição da taxa de progressão da doença, melhora ou estados de alívio da doença e moderação ou prognósticos de melhora. Em algumas realizações, anticorpos da invenção são usados para retardar o desenvolvimento de uma doença ou reduzir a progressão de uma doença.

O termo “região variável" ou “domínio variável” refere-se ao domínio de uma cadeia pesada ou leve de um anticorpo que está envolvida na ligação do anticorpo ao antígeno. Os domínios variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve (VH e VL, respectivamente) de um anticorpo nativo, geralmente têm estruturas similares, com cada domínio compreendendo quatro regiões de estrutura conservadas (FRs) e três regiões hipervariáveis (HVRs). (Consulte, por exemplo, Kindt et al. Kuby Immunology, 6º ed., W.H. Freeman and Co,, página 91 (2007)). Um único domínio VH ou VL pode ser suficiente para conferir especificidade de ligação ao antígeno. Além disso, os anticorpos que se ligam a um antígeno específico podem ser isolados com o uso de um domínio VH ou VL de um anticorpo que se liga ao antígeno para selecionar uma biblioteca de domínios de VL. ou VH complementares, respectivamente. Consulte, por exemplo, Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991).

O termo “vetor”, como usado no presente pedido, refere-se a uma — molécula de ácido nucleico capaz de reproduzir outro ácido nucleico ao qual está ligado. O termo inclui o vetor como uma estrutura de ácido nucleico autorreplicante, bem como o vetor incorporado no genoma de uma célula hospedeira na qual este foi introduzido. Certos vetores são capazes de dirigir a expressão de ácidos nucleicos para os quais eles são ligados de maneira funcional.

Esses vetores são denominados no presente pedido de “vetores de expressão”. Il.

COMPOSIÇÕES E MÉTODOS A presente invenção fornece anticorpos anti-LRP6 com a inesperada capacidade para inibir sinalização por algumas isoformas de Wnt e potencializar sinalização por outras isoformas.

Conforme descrito nos Exemplos, dois anticorpos anti-LRP6 caracterizados mostram ainda atividades recíprocas na maior parte de Wnts, com um anticorpo antagonista e o outro potencializador.

Esses dois anticorpos se ligam a diferentes regiões de LRP6 (como fazem as diferentes isoformas de Wnt) e a inibição da sinalização resulta do bloqueio da ligação de Wnt.

Com base na sua interação com anticorpos anti-LRP6 da invenção, as 14 isoformas de Wnt testadas podem ser agrupados em três classes: Wnt3 e Wnt3a são inibidas por um anticorpo anti-LRP6 YW211.31 e potencializadas por um anticorpo anti-LRP6 YW210.09; Wnts 1, 2, 2B, 6, 8A, 9A, 9B e 10B são potencializadas por um anticorpo anti-LRP6 YW211.31 e antagonizada por um anticorpo anti-LRP6 YVW210.09; e Wnts 4, 7A, 7B e 10A são potencializadas por um anticorpo anti-LRP6 YW211.31 e não inibidas por um anticorpo anti-LRP6 YW210.09 (Figura 3C). Essas classificações obviamente não correspondem à filogenia proposta de genes de Wnt, embora a subfamília Wnt3/3a seja a mais divergente evolutivamente (Cho et al., 2010). Combinações de anticorpos anti-LRP6 que inibem classes diferentes de isoformas de Wnt podem ser usadas para fornecer um terapêutico efetivo para tratar doenças associadas com a sinalização de Wnt.

A dimerização de LRP6 mediada por anticorpo pode potencializar sinalização apenas quando uma isoforma de Wnt também é capaz de se ligar ao complexo, presumivelmente recrutando FZD.

A sinalização autócrina de Wnt endógena em diferentes linhagens celulares pode ser tanto antagonizada como aumentada pelos anticorpos LRP6. Esta complexidade de interações correceptor-ligante pode permitir a regulação diferencial de sinalização por isoformas de Wnt, e pode ser explorada com anticorpos para manipular a sinalização de Wnt diferencialmente em tecidos específicos ou estados de doença.

Em algumas realizações, os anticorpos anti-LRP6 podem inibir sinalização autócrina de Wnt ou endógena em alguns tipos celulares e potencializam sinalização autócrina em outros tipos celulares. Em algumas realizações, os anticorpos anti-LRP6 mediam a dimerização de LRP6 e melhoraram ou potencializam sinalização na presença de uma isoforma de Wnt que, simultaneamente, se liga a LRP6. Em algumas realizações, os anticorpos anti-LRP6 potencializam sinalização de Wnt por inibição da ligação de antagonistas de Wnt, como isoformas de DKK e SOST.

Os anticorpos anti-LRP6 podem ser usado para modular seletivamente os processos que são ativados ou inibidos pela sinalização induzida pela isoforma de Wnt. Esses processos incluem, por exemplo, proliferação celular, especificação de destino celular e autorrenovação de células-tronco em diferentes tipos de câncer e processos de desenvolvimento.

Os antiLRP6 são úteis, por exemplo, para o tratamento de disfunções mediadas por Wnt, como câncer e disfunções dos ossos ou sistema ósseo e disfunções vasculares. Exemplos de câncer que podem ser tratados com o uso de anticorpos anti-LRP6 incluem câncer de pulmão de células pequenas, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer hepatocelular, câncer — gastrointestinal, câncer pancreático, câncer de ovário, câncer de fígado, câncer de bexiga, hepatoma, câncer de mama, câncer de cólon, câncer colorretal, carcinoma do endométrio ou uterino, carcinoma de glândulas salivares, câncer renal (incluindo carcinoma de células renais), câncer de fígado, câncer de próstata. Exemplos de disfunções esqueléticas ou ósseas que podem ser tratados com o uso de anticorpos anti-LRP6 incluem osteoporose, osteoartrite, fraturas ósseas e lesões ósseas. Exemplos de disfunções vasculares que podem ser tratadas com o uso de anticorpos anti-LRP6 incluem doenças vasculares da retina, como doença de Norrie, osteoporose-síindrome de pseudoglioma (OPPG), vitreorretinopatia exsudativa familiar (FEVR), retinopatia da prematuridade (ROP), retinopatia diabética, degeneração macular relacionada à idade, retinopatia da prematuridade, doença de Coat e reação similar a Coat, oclusão da artéria ou veia central da retina, e condições relacionadas com o miocárdio, como enfarte do miocárdio e doença cardíaca isquêmica.

Consequentemente, um aspecto da invenção fornece um anticorpo que se liga a LRP6, em que o anticorpo inibe sinalização induzida por uma isoforma de Wnt e potencializa sinalização induzida por outra isoforma de Wnt. Em uma realização, o anticorpo inibe sinalização por Wnt3 e/ou Wnt3a. Em uma realização, o anticorpo potencializa sinalização por Wnt 1, 2, 2b, 4,6, 7a, 7b, 8a, 9a, 9b, 10a e/ou 10b. Em uma realização, o anticorpo inibe sinalização por Wnt3 e/ou Wnt3a e potencializa sinalização por Wnt 1, 2, 2b, 4, 6, 7a, 7b, 8a, 9a, 9b, 10a e/ou 10b. Em uma realização, o anticorpo inibe sinalização por Wnt3 e Wnt3a e potencializa sinalização por Wnt 1, 2, 2b, 4,6, 7a, 7b, 8a, 9a, 9b, 10a e 10b. Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 se liga à região E3-E4 (primeiro e segundo beta-propulsores) de LRP6.

Em outra realização, o anticorpo inibe sinalização por Wnt 1, 2, 2b, 6, 8a, 9a, 9b e/ou 10b. Em uma realização, o anticorpo potencializa sinalização por Wnt3ô e/ou Wnt3a. Em uma realização, o anticorpo inibe sinalização por Wnt 1, 2, 2b, 6, 8a, 9a, 9b e/ou 10b e potencializa sinalização por Wnt3 e/ou Wnt3a. Em uma realização, o anticorpo inibe sinalização por Wnt 1, 2, 2b, 6, 8a, 9a, 9b e/ou 10b e potencializa sinalização por Wnt3 e/ou i 37 Wnt3a. Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 se liga à região E1-E2 (terceiro e quarto beta-propulsores) de LRP6.

Outro aspecto da invenção fornece anticorpos anti-LRP6 multiespecíficos. Conforme “mostrado nos exemplos, os anticorpos —multiespecíficos, em algumas realizações, têm a benefício de inibir todas as três classes de isoformas de Wnt. Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 é um anticorpo multiespecífico capaz de se ligar a duas ou mais regiões ou epítopos diferentes de LRP6. Em uma realização, o anticorpo multiespecífico é um anticorpo biespecífico capaz de se ligar especificamente a duas regiões diferentes de LRP6. Em uma realização, o anticorpo biespecífico se liga à região E1-E2 de LRP6 e se liga à região E3-E4 de LRP6. Em uma realização, o anticorpo multiespecífico inibe sinalização induzida por uma isoforma de Wnt selecionada a partir do grupo que consiste em Wnt3 e Wnt3a, e inibe sinalização induzida por uma isoforma de Whnt selecionada a partir do grupo que consiste em Wnt 1, 2, 2b, 6, 8a, 9a, 9b e 10b. Em uma realização, o anticorpo multiespecífico inibe sinalização induzida por uma isoforma de Wnt selecionada a partir do grupo que consiste em Wnt3 e Wnt3a, e inibe a sinalização induzida por uma isoforma de Wnt selecionada a partir do grupo que consiste em Wnt 1, 2, 2b, 6, 8a, 9a, 9b e 10b e ainda inibe sinalização induzida por uma isoforma de Wnt selecionada a partir do grupo que consiste em Wnt 4, 7a, 7b e 10a. Em uma realização, o anticorpo multiespecífico inibe sinalização de Wnt induzida pela combinação de Wnt1 e Wnt3a. Em uma realização, o anticorpo multiespecífico inibe sinalização autócrina de Wnt. Em certas realizações, o anticorpo multiespecífico é um anticorpo —biespecífico inibe sinalização induzida por uma isoforma de Wnt selecionada a partir do grupo que consiste em Wnt3 e Wnt3a, e inibe sinalização induzida por uma isoforma de Wnt selecionada a partir do grupo que consiste em Wnt 1, 2, 2b, 6, 8a, 9a, 9b e 10b. Em certas realizações, o anticorpo multiespecífico é um

40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90%. Em uma realização, a expressão de genes alvo de Wnt é determinada com o uso de um ensaio de expressão gênica, como PCR, incluindo qPCR.

Outro aspecto da invenção fornece anticorpos que se ligam a LRP6e competem para se ligar com qualquer um dos anticorpos anti-LRP6 descritos no presente pedido.

Outro aspecto da invenção fornece anticorpos que se ligam ao mesmo epítopo em LRP6 como qualquer um dos anticorpo anti-LRP6 descritos no presente pedido.

A.

ANTICORPOS ANTI-LRP6 EXEMPLARES Um aspecto da invenção fornece um anticorpo anti-LRP6 que é um anticorpo monoclonal, incluindo um anticorpo quimérico, humanizado ou humano.

Em uma realização, um anticorpo anti-LRP6 é gerado com o uso de bibliotecas de fago.

Em uma realização, um anticorpo anti-LRP6 é um fragmento de anticorpo, por exemplo, um fragmento Fav, Fab, Fab', scFv, —diacorpo ou F(ab')z.

Em outra realização. o anticorpo é um anticorpo inteiro, por exemplo, um anticorpo IgG1 intacto ou outra classe de anticorpo ou isotipo conforme definido no presente pedido.

Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 compreende uma sequência da cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos da Tabela 2. Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 compreende uma sequência da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos da Tabela 2. Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 compreende uma sequência da cadeia pesada e uma sequência da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos da Tabela 2. Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 compreende uma . sequência da cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1. Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 compreende uma sequência da cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da

SEQ ID NO: 2. Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 compreende uma sequência da cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 e uma sequência da cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2.

Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 compreende uma sequência da cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3. Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 compreende uma sequência da cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4. Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 compreende uma sequência da cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3 e uma sequência da cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4.

Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 compreende uma sequência da cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQIDNO: 5. Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 compreende uma sequência da cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6. Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 compreende uma sequência da cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEOQ ID NO: 5 e uma sequência da cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6.

Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 compreende uma sequência da cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7. Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 compreende uma sequência da cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQIDNO: 8. Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 compreende uma sequência da cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7 e uma sequência da cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8.

Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 compreende um domínio variável da cadeia pesada (VH) das sequências de aminoácidos da Tabela 3. Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 compreende um domínio variável da cadeia leve (VL) das sequências de aminoácidos da Tabela 3. Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 compreende um VH e um VL das sequências de aminoácidos da Tabela 3.

Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 compreende o domínio variável da cadeia pesada (VH) da cadeia pesada da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1. Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 compreende o domínio variável da cadeia leve (VL) da sequência da cadeia leve da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2. Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 compreende o VH da cadeia pesada da sequência de aminoácidos da cadeia pesada da SEQ ID NO: 1 e o VL da sequência da cadeia leve da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2.

Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 compreende um domínio variável da cadeia pesada (VH) que compreende a sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 9. Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 compreende um domínio variável da cadeia leve (VL) que compreende a sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 10. Em uma realização, o anticorpo anticLRP6 compreende um VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9 e um VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10.

Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 compreende o domínio variável da cadeia pesada (VH) da cadeia pesada da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3. Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 compreende o domínio variável da cadeia leve (VL) da sequência da cadeia leve da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4. Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 compreende o VH da cadeia pesada da sequência de aminoácidos da cadeia pesada da SEQ ID NO: 3 e o VL da sequência da cadeia leve da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4.

Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 compreende um domínio variável da cadeia pesada (VH) que compreende a sequências de — aminoácidos da SEQ ID NO: 11. Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 compreende um domínio variável da cadeia leve (VL) que compreende a sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 12. Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 compreende um VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11 e um VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12.

Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 compreende o domínio variável da cadeia pesada (VH) da cadeia pesada da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5. Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 compreende o domínio variável da cadeia leve (VL) da sequência da cadeia leve da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6. Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 compreende o VH da cadeia pesada da sequência de aminoácidos da cadeia pesada da SEQ ID NO: 5 e o VL da sequência da cadeia leve da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6.

Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 compreende um domínio variável da cadeia pesada (VH) que compreende a sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 13. Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 compreende um domínio variável da cadeia leve (VL) que compreende a sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 14. Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 compreende um VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13 e um VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14.

Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 compreende o domínio variável da cadeia pesada (VH) da cadeia pesada da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7. Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 compreende o domínio variável da cadeia leve (VL) da sequência da cadeia leve da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8. Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 compreende o VH da cadeia pesada da sequência de aminoácidos da cadeia pesada da SEQ ID NO: 7 e o VL da sequência da cadeia leve da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8.

Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 compreende um domínio variável da cadeia pesada (VH) que compreende a sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 15. Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 compreende um domínio variável da cadeia leve (VL) que compreende a sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 16. Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 compreende um VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15 e um VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16.

Outro aspecto da invenção fornece um anticorpo anti-LRP6 multiespecífico. Em uma realização, o anticorpo multiespecífico compreende uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de pelo menos uma das SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO:

7. Em uma realização, o anticorpo multiespecífico compreende uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de pelo menos duas das SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, ou SEQ ID NO: 7. Em uma realização, o anticorpo multiespecífico é um anticorpo biespecífico que compreende uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de pelo menos uma das 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 7. Em uma realização, o anticorpo biespecífico compreende uma primeira cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 e uma segunda cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7. Em uma realização, o anticorpo biespecífico compreende uma primeira cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3 e uma segunda cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7. Em uma realização, o anticorpo biespecífico compreende uma primeira cadeia pesada que compreende a sequência de —aminoácidosdaSEQID NO: 5 e uma segunda cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7.

Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 multiespecífico compreende o VH da cadeia pesada da sequência de aminoácidos de pelo menos uma das SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO:

7.Em uma realização, o anticorpo multiespecífico compreende o VH da cadeia pesada da sequência de aminoácidos de pelo menos uma das SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 7. Em uma realização, o anticorpo multiespecífico é um anticorpo biespecífico que compreende o VH da cadeia pesada da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQIDNO:5 ou SEQ ID NO: 7. Em uma realização, o anticorpo biespecífico compreende o VH da cadeia pesada da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 e compreende o VH da cadeia pesada da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7. Em uma realização, o anticorpo biespecífico compreende o VH da cadeia pesada da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3 e compreende o VH da cadeia pesada da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7. Em uma realização, o anticorpo biespecífico compreende o VH da cadeia pesada da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5 e compreende o VH da cadeia pesada da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7. Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 multiespecífico compreende um VH que compreende a sequência de aminoácidos de pelo menos uma das SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 15. Em uma realização, o anticorpo multiespecífico compreende um VH que compreende a sequência de aminoácidos de pelo menos duas das SEQ ID

NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 15. Em uma realização, o anticorpo multiespecífico é um anticorpo biespecífico que compreende um VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 15. Em uma realização, o anticorpo — biespecífico compreende uma primeira VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9 e um segundo VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15. Em uma realização, o anticorpo biespecífico compreende uma primeira VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11 e um segundo VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15. Em uma realização, o anticorpo biespecífico compreende uma primeira VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13 e um segundo VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15. Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 compreende pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis HVRs selecionadas a partir de (a) HVR-H1 das sequências de aminoácidos de HVR-H1 da Tabela 4; (b) HVR-H2 das sequências de aminoácidos de HVR-H2 da Tabela 4; (c) HVR-H3 das sequências de aminoácidos de HVR-H3 da Table 4; (dj) HVR-L1 das sequências de aminoácidos de HVR-L1 da Tabela 4; (e) HVR-L2 das sequências de aminoácidos de HVR-L2 da Tabela 4; e (f) HVR-L3 das sequências de aminoácidos de HVR-L3 da Tabela 4.

Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 compreende um VH que compreende pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis HVRs selecionadas a partir de (a) HVR-H1 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 1; (b) HVR-H2 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 1; (c) HVR-H3 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 1; (d) HVR-L1 da cadeia leve da SEQ ID NO: 2; (e) HVR-L2 da cadeia leve da SEQ ID NO: 2; e (f) HVR-L3 da cadeia leve da SEQ ID NO: 2.

Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 compreende pelo

| menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências HVR de VH selecionadas a partir de (a) HVR-H1 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 1; (b) HVR-H2 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 1; (c) HVR-H3 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 1. Em uma realização, o anticorpo compreende HVR-H3 da cadeia —pesadada SEQ ID NO: 1. Em outra realização, o anticorpo compreende HVR- H3 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 1 e HVR-L3 da cadeia leve da SEQ ID NO: 2. Em uma realização adicional, o anticorpo compreende HVR-H3 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 1, HVR-L3 da cadeia leve da SEQ ID NO: 2, e HVR-H2 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 1. Em uma realização adicional, o anticorpo compreende (a) HVR-H1 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 1; (b) HVR-H2 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 1; e (c) HVR-H3 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 1. Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 compreende pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências HVR de VH selecionadas a partir de (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 17; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18; (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19. Em uma realização, o anticorpo compreende HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19. Em outra realização, o anticorpo compreende HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19 e HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27. Em uma realização adicional, o anticorpo compreende HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19, HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQID NO: 27, e HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18. Em uma realização adicional, o anticorpo compreende (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 17; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18; e

| (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19. Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 compreende pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências HVR de VL selecionadas a partir de (a) HVR-L1 da cadeia leve da SEQ ID NO: 2; (b) HVR- —L2 da cadeialevedaSEQID NO: 2; e (c) HVR-L3 da cadeia leve da SEQ ID NO: 2. Em uma realização, o anticorpo compreende (a) HVR-L1 da cadeia leve da SEQ ID NO: 2; (b) HVR-L2 da cadeia leve da SEQ ID NO: 2; e (c) HVR-L3 da cadeia leve da SEQ ID NO: 2. Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 compreende (a) um domínio VH que compreende pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências HVR de VH selecionadas a partir de () HVR-H1 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 1; (ii) HVR-H2 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 1; e (iii) HVR-H3 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 1; e (b) um domínio VL que compreende pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências HVRde VL selecionadas a partir de (a) HVR-L1 da cadeia leve da SEQ ID NO: 2; (li) HVR-L2 da cadeia leve da SEQ ID NO: 2,e (c) HVR-L3 da cadeia leve da SEQ ID NO: 2. Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 compreende (a) um domínio VH que compreende pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências HVR de VH selecionadas a partir de (1) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: (17), (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18, e (iii) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19; e (b) um domínio VL que compreende pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências HVR de VL selecionadas a partir de () HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 25; (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26; e (c) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27.

| Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo que compreende (a) HVR-H1 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 1; (b) HVR-H2 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 1; (c) HVR-H3 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 1; (d) HVR-L1 da cadeia leve da SEQ ID NO: 2; (e) HVR-L2 da cadeia leve daSEQIDNO:2;e(f) HVR-L3 da cadeia leve da SEQ ID NO: 2.

Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo que compreende (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 17; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18; (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQID NO: 19; (d) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 25; (e) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26; e (f) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27.

Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 compreende pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis HVRs selecionadas a partir de (a) HVR-H1 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 3; (b) HVR-H2 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 3; (c) HVR-H3 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 3; (d) HVR-L1 da cadeia leve da SEQ ID NO: 4; (e) HVR-L2 da cadeia leve da SEQ ID NO: 4; e (f) HVR-L3 da cadeia leve da SEQ ID NO: 4.

Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 compreende pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências HVR de VH selecionadas a partir de (a) HVR-H1 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 3; (b) HVR-H2 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 3; (c) HVR-H3 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 3. Em uma realização, o anticorpo compreende HVR-H3 da cadeia —pesadada SEQ ID NO: 3. Em outra realização, o anticorpo compreende HVR- H3 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 3 e HVR-L3 da cadeia leve da SEQ ID NO: 4. Em uma realização adicional, o anticorpo compreende HVR-H3 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 3, HVR-L3 da cadeia leve da SEQ ID NO: 4, e

HVR-H2 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 3. Em uma realização adicional, o anticorpo compreende (a) HVR-H1 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 3; (b) HVR-H2 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 3; e (c) HVR-H3 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 3.

Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 compreende pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências HVR de VH selecionadas a partir de (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 17; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18; (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21. Em uma realização, o anticorpo compreende uma HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:

21. Em outra realização, o anticorpo compreende HVR-H3 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 21 e HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 28. Em uma realização adicional, o anticorpo compreende uma HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21, HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 28, e uma HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:

18. Em uma realização adicional, o anticorpo compreende uma (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 17; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18; e (c) HVR- H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21. Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 compreende pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências HVR de VL selecionadas a partir de (a) HVR-L1 da cadeia leve da SEQ ID NO: 4; (b) HVR- L2 da cadeialeveda SEQ ID NO: 4; e (c) HVR-L3 da cadeia leve da SEQ ID NO: 4. Em uma realização, o anticorpo compreende (a) HVR-L1 da cadeia leve da SEQ ID NO: 4; (b) HVR-L2 da cadeia leve da SEQ ID NO: 4; e (c) HVR-L3 da cadeia leve da SEQ ID NO: 4.

Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 compreende pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências HVR de VL selecionadas a partir de (a) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 25; (b) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26; e (c) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 28. Em uma realização, o anticorpo compreende (a) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 25; (b) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26; e (c) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 28. Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 compreende (a) um domínio VH que compreende pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências HVR de VH selecionadas a partir de (1) HVR-H1 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 3; (ii) HVR-H2 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 3; e (iii) HVR-H3 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 3; e (b) um domínio VL que compreende pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências HVR de VL selecionadas a partir de (a) HVR-L1 da cadeia leve da SEQ ID NO: 4; (li) HVR-L2 da cadeia leve da SEQ ID NO: 4,e (c) HVR-L3 da cadeia leve da SEQ ID NO: 4.

Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 compreende (a) um domínio VH que compreende pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências HVR de VH selecionadas a partir de uma (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: (17), (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18, e (iii) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21; e (b) um domínio VL que compreende pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências HVR de VL selecionadas a partir de uma (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 25; (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26; e (c) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 28.

Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo que compreende (a) HVR-H1 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 3; (b) HVR-H2 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 3; (c) HVR-H3 da cadeia pesada da SEQ ID —NO:3;(d)HVR-L1 da cadeia leve da SEQ ID NO: 4; (e) HVR-L2 da cadeia leve da SEQ ID NO: 4; e (f) HVR-L3 da cadeia leve da SEQ ID NO: 4.

Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo que compreende uma (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 17; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQID NO: 18; (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21; (d) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 25; (e) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26; e (f) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 28.

Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 compreende pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis HVRs selecionadas a partir de (a) HVR-H1 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 5; (b) HVR-H2 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 5; (c) HVR-H3 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 5; (d) HVR-L1 da cadeia leve da SEQ ID NO: 6; (e) HVR-L2 da cadeia leve da SEQ ID NO: 6; e (PN HVR-L3 da cadeia leve da SEQ ID NO: 6.

Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 compreende pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências HVR de VH selecionadas a partir de (a) HVR-H1 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 5; (b) HVR-H2 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 5; (c) HVR-H3 da cadeia pesada da —SEQIDNO:5.Em uma realização, o anticorpo compreende HVR-H3 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 5. Em outra realização, o anticorpo compreende HVR- H3 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 5 e HVR-L3 da cadeia leve da SEQ ID NO: 6. Em uma realização adicional, o anticorpo compreende HVR-H3 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 5, HVR-L3 da cadeia leve da SEQ ID NO: 6, e HVR-H2 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 5. Em uma realização adicional, o anticorpo compreende (a) HVR-H1 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 5; (b) HVR-H2 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 5; e (c) HVR-H3 da cadeia pesada daSEQIDNO:S5.

Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 compreende pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências HVR de VH selecionadas a partir de uma (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18; (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19. Em uma realização, o anticorpo compreende uma HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:

19. Em outra realização, o anticorpo compreende uma HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19 e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27. Em uma realização adicional, o anticorpo compreende uma HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19, HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27, e HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18. Em uma realização adicional, o anticorpo compreende uma (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 20; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18; e (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19.

Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 compreende pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências HVR de VL selecionadas a partir de (a) HVR-L1 da cadeia leve da SEQ ID NO: 6; (b) HVR- L2 da cadeia leve da SEQ ID NO: 6; e (c) HVR-L3 da cadeia leve da SEQ ID NO: 6. Em uma realização, o anticorpo compreende (a) HVR-L1 da cadeia leve

| da SEQ ID NO: 6; (b) HVR-L2 da cadeia leve da SEQ ID NO: 6; e (c) HVR-L3 da cadeia leve da SEQ ID NO: 6.

Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 compreende (a) um domínio VH que compreende pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências HVR de VH selecionadas a partir de (i) HVR-H1 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 5; (ii) HVR-H2 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 5; e (iii) HVR-H3 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 5; e (b) um domínio VL que compreende pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências HVR de VL selecionadas a partir de (a) HVR-L1 da cadeia leve da SEQ ID NO: 6; (ii) HVR-L2 da cadeia leve da SEQ ID NO: 6,e (c) HVR-L3 da cadeia leve da SEQ ID NO: 6.

Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 compreende (a) um domínio VH que compreende pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências HVR de VH selecionadas a partir de uma (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: (20), (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18, e (iii) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19; e (b) um domínio VL que compreende pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências HVR de VL selecionadas a partir de uma (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 25; (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26; e (c) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27.

Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo que compreende (a) HVR-H1 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 5; (b) HVR-H2 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 5; (c) HVR-H3 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 5; (d) HVR-L1 da cadeia leve da SEQ ID NO: 6; (e) HVR-L2 da cadeia leve da SEQ ID NO: 6; e (f) HVR-L3 da cadeia leve da SEQ ID NO: 6.

Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo que compreende uma (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18; (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19; (d) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQIDNO: 25; (e) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26; e (f) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27. Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 compreende pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis HVRs selecionadas a partir de (a) HVR-H1 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 7; (b) HVR-H2 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 7; (c) HVR-H3 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 7; (d) HVR-L1 da cadeia leve da SEQ ID NO: 8; (e) HVR-L2 da cadeia leve da SEQ ID NO: 8; e (f) HVR-L3 da cadeia leve da SEQ ID NO: 8. Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 compreende pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências HVR de VH selecionadas a partir de (a) HVR-H1 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 7; (b) HVR-H2 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 7; (c) HVR-H3 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 7. Em uma realização, o anticorpo compreende HVR-H3 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 7. Em outra realização, o anticorpo compreende HVR- H3 da cadeiapesadada SEQ ID NO: 7 e HVR-L3 da cadeia leve da SEQ ID NO: 8. Em uma realização adicional, o anticorpo compreende HVR-H3 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 7, HVR-L3 da cadeia leve da SEQ ID NO: 8, e HVR-H2 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 7. Em uma realização adicional, o anticorpo compreende (a) HVR-H1 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 7; (b) —HVR-H2 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 7; e (c) HVR-H3 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 7. Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 compreende pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências HVR de VH selecionadas a partir de uma (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23; (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24. Em uma realização, o anticorpo compreende uma HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:

24. Em outra realização, o anticorpo compreende uma HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24 e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27. Em uma realização adicional, o anticorpo compreende uma HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24, HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27, e HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23. Em uma realização adicional, o anticorpo compreende uma (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 22; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23; e (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24. Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 compreende pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências HVR de VL selecionadas a partir de (a) HVR-L1 da cadeia leve da SEQ ID NO: 8; (b) HVR- L2 da cadeia leve da SEQ ID NO: 8; e (c) HVR-L3 da cadeia leve da SEQ ID NO: 8. Em uma realização, o anticorpo compreende (a) HVR-L1 da cadeia leve da SEQ ID NO: 8; (b) HVR-L2 da cadeia leve da SEQ ID NO: 8; e (c) HVR-L3 da cadeia leve da SEQ ID NO: 8.

Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 compreende (a) um domínio VH que compreende pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências HVR de VH selecionadas a partir de (i) HVR-H1 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 7; (ii) HVR-H2 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 7; e (ii) HVR-H3 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 7; e (b) um domínio VL que compreende pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências HVR de VL selecionadas a partir de (a) HVR-L1 da cadeia leve da SEQ ID NO: 8; (li) HVR-L2 da cadeia leve da SEQ ID NO: 8,e (c) HVR-L3 da cadeia leve da SEQ ID NO: 8.

Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 compreende (a) um domínio VH que compreende pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências HVR de VH selecionadas a partir de uma (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: (22), (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23, e (iii) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24; e (b) um domínio VL que compreende pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências HVR de VL selecionadas a partir de uma (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 25; (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26; e (c) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27.

Em outra realização, a invenção fornece um anticorpo que compreende (a) HVR-H1 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 7; (b) HVR-H2 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 7; (c) HVR-H3 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 7; (d) HVR-L1 da cadeia leve da SEQ ID NO: 8; (e) HVR-L2 da cadeia leve daSEQIDNO:8;e(f) HVR-L3 da cadeia leve da SEQ ID NO: 8.

Em outra realização, a invenção fornece um anticorpo que compreende uma (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23; (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQID NO: 24; (d) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 25; (e) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26; e (f) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27.

Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 é um anticorpo anti- LRP6 multiespecífico que compreende um primeiro domínio VH que compreende pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências HVR de VH selecionadas a partir de (a) HVR-H1 da cadeia pesada da SEQ ID —NO:1;(b) HVR-H2 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 1; (c) HVR-H3 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 1 e compreende um segundo domínio VH que compreende pelo menos uma, pelo menos duas ou todas as três sequências HVR de VH selecionadas a partir de (d) HVR-H1 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 7; (e) HVR-H2 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 7; (f) HVR-H3 da cadeia pesadadaSEQID NO: 7.

Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 é um anticorpo anti- LRP6 multiespecífico que compreende um primeiro domínio VH que compreende pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências HVR de VH selecionadas a partir de uma (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 17; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18; (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19 e compreende um segundo domínio VH que compreende pelo menos uma, pelo menos duas ou todas as três sequências HVR de VH selecionadas a partir de uma (d) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22; (e) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23; (f) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24. Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 é um anticorpo anti- , LRP6 multiespecífico que compreende um primeiro domínio VH que — compreende todas as três sequências HVR de VH selecionadas a partir de (a) HVR-H1 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 1; (b) HVR-H2 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 1; (c) HVR-H3 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 1 e compreende um segundo domínio VH que compreende todas as três sequências HVR de

VH de (d) HVR-H1 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 7; (e) HVR-H2 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 7; (f) HVR-H3 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 7. Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 é um anticorpo anti- LRP6 multiespecífico que compreende um primeiro domínio VH que compreende todas as três sequências HVR de VH selecionadas a partir de uma (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 17; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18; (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19 e compreende um segundo domínio VH que compreende todas as três sequências HVR de VH de uma (d) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22; (e) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23; (f) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24. Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 é um anticorpo anti- LRP6 multiespecífico que compreende um primeiro domínio VH que compreende pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências HVR de VH selecionadas a partir de (a) HVR-H1 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 3; (b) HVR-H2 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 3; (c) HVR-H3 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 3 e compreende um segundo domínio VH que compreende pelo menos uma, pelo menos duas ou todas as três sequências HVR de VH selecionadas a partir de (d) HVR-H1 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 7; (e) HVR-H2 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 7; (f) HVR-H3 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 7. Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 é um anticorpo anti- LRP6 multiespecífico que compreende um primeiro domínio VH que compreende pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências HVR de VH selecionadas a partir de uma (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 17; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18; (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21 e compreende um segundo domínio VH que compreende pelo menos uma, pelo menos duas ou todas as três sequências HVR de VH selecionadas a partir de uma (d) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22; (e) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23; (f) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24. Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 é um anticorpo anti- LRP6 multiespecífico que compreende um primeiro domínio VH que compreende todas as três sequências HVR de VH selecionadas a partir de (a) HVR-H1 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 3; (b) HVR-H2 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 3; (c) HVR-H3 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 3 e compreende um segundo domínio VH que compreende todas as três sequências HVR de VH de (d) HVR-H1 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 7; (e) HVR-H2 da cadeia —pesadadaSEQID NO: 7; (f) HVR-H3 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 7. Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 é um anticorpo anti- LRP6 multiespecífico que compreende um primeiro domínio VH que compreende todas as três sequências HVR de VH selecionadas a partir de uma (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 17; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18; (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21 e compreende um segundo domínio VH que compreende todas as três sequências HVR de VH de uma (d) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22; (e) HVR-H2 que compreende a sequência de —aminoácidos da SEQ ID NO: 23; (f) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24. Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 é um anticorpo anti- LRP6 multiespecífico que compreende um primeiro domínio VH que compreende pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências HVR de VH selecionadas a partir de (a) HVR-H1 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 5; (b) HVR-H2 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 5; (c) HVR-H3 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 5 e compreende um segundo domínio VH que compreende pelo menos uma, pelo menos duas ou todas as três sequências HVR de VH selecionadas a partir de (d) HVR-H1 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 7; (e) HVR-H2 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 7; (f) HVR-H3 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 7. Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 é um anticorpo anti- LRP6 multiespecífico que compreende um primeiro domínio VH que compreende pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências HVR de VH selecionadas a partir de uma (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18; (c) HVR-H3 que compreende a — sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19 e compreende um segundo domínio VH que compreende pelo menos uma, pelo menos duas ou todas as três sequências HVR de VH selecionadas a partir de uma (d) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22; (e) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23; (f) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24. Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 é um anticorpo anti- LRP6 multiespecífico que compreende um primeiro domínio VH que compreende todas as três sequências HVR de VH selecionadas a partir de (a) HVR-H1 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 5; (b) HVR-H2 da cadeia pesada da SEQIDNO:5;(c) HVR-H3 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 5 e compreende um segundo domínio VH que compreende todas as três sequências HVR de VH de (d) HVR-H1 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 7; (e) HVR-H2 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 7; (f) HVR-H3 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 7.

Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 é um anticorpo anti- LRP6 multiespecífico que compreende um primeiro domínio VH que compreende todas as três sequências HVR de VH selecionadas a partir de uma (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20; (b)HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18; (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19 e compreende um segundo domínio VH que compreende todas as três sequências HVR de VH de uma (d) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22; (e) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23; (f) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24.

Em qualquer uma das realizações acima de anticorpos anti-LRP6 multiespecíficos, os anticorpos ainda compreendem pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências HVR de VL de (a) HVR-L1 da cadeia leveda SEQID NO: 2; (b) HVR-L2 da cadeia leve da SEQ ID NO: 2; e (c) HVR- L3 da cadeia leve da SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4. Em uma realização, o anticorpo compreende (a) HVR-L1 da cadeia leve da SEQ ID NO: 2; (b) HVR- L2 da cadeia leve da SEQ ID NO: 2; e (c) HVR-L3 da cadeia leve da SEQ ID NO: 2. Em uma realização, o anticorpo compreende (a) HVR-L1 da cadeia leve da SEQID NO: 2; (b) HVR-L2 da cadeia leve da SEQ ID NO: 2; e (c) HVR-L3 da cadeia leve da SEQ ID NO: 4.

Em qualquer uma das realizações acima de anticorpos anti-LRP6 multiespecíficos, os anticorpos ainda compreendem pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências HVR de VL selecionadas a partir de (a) HVR-L1 que compreende os aminoácidos da SEQ ID NO: 25; (b) HVR-L2 que compreende os aminoácidos da SEQ ID NO: 26; e (c) HVR-L3 que compreende os aminoácidos da SEQ ID NO: 27 ou SEQ ID NO: 28. Em uma realização, o anticorpo compreende uma (a) HVR-L1 que compreende os aminoácidos da SEQ ID NO: 25; (b) HVR-L2 que compreende os aminoácidos da SEQ ID NO: 26; e (c) HVR-L3 que compreende os aminoácidos da SEQ ID NO: 27. Em uma realização, o anticorpo compreende (a) HVR-L1 que compreende os aminoácidos da SEQ ID NO: 25; (b) HVR-L2 que compreende os aminoácidos da SEQ ID NO: 26; e (c) HVR-L3 que compreende os aminoácidos da SEQ ID NO: 28.

Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 ou anticorpo anti-LRP6 multiespecífico compreende uma HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos N X1 X2 K (SEQ ID NO: 41). Em uma realização, o anticorpo anti- LRP6 ou anticorpo anti-LRP6 multiespecífico compreende uma HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos N X1 X2 K (SEQ ID NO: 42). Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 ou anticorpo anti-LRP6 multiespecífico compreende uma HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos N X1IVK (SEQ ID NO: 43). Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 ou anticorpo anti-LRP6 multiespecífico compreende uma HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos NX1IK (SEQ ID NO: 44). Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 ou anticorpo anti-LRP6 multiespecífico compreende uma HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos NX1IVKN (SEQ ID NO: 45). Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 ou anticorpo antilLRP6 multiespecífico compreende uma HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos NX1IIKN (SEQ ID NO: 46). Nas realizações acima, X1 é um aminoácido e X2 é l ou V, ou XT é A, S, F, T, Y, ou LeX2élouV;ouX1éA S,F,T,Y, ouLeX2élouX1éA S,F,T,Y,ouL eXx2év.

Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 ou anticorpo anti-LRP6 multiespecífico compreende uma HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos NAVK (SEQ ID NO: 47). Em uma realização, o anticorpo anti- LRP6 ou anticorpo anti-LRP6 multiespecífico compreende uma HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos NAIK (SEQ ID NO: 48). Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 ou anticorpo anticLRP6 multiespecífico compreende uma HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos NAVKN (SEQ ID NO: 49). Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 ou anticorpo anti-LRP6 multiespecífico compreende uma HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos NAIKN (SEQ ID NO: 50).

Em qualquer uma das realizações acima, um anticorpo anti-LRP6 é humanizado. Em uma realização, um anticorpo anti-LRP6 compreende HVRs como em qualquer uma das realizações acima, e ainda compreende uma estrutura humana aceitante, por exemplo, uma estrutura de imunoglobulina humana ou uma estrutura consenso humana.

Em outro aspecto, um anticorpo anti-LRP6 compreende uma sequência de domínio variável da cadeia pesada (VH) que tem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com um VH da cadeia pesada da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO:

7. Em outro aspecto, um anticorpo anti-LRP6 compreende uma sequência de domínio variável da cadeia pesada (VH) que tem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência coma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 15. Em certas realizações, uma sequência de VH que tem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade contém substituições (por exemplo, substituições conservativas), inserções ou deleções relativas à sequência de referência, mas um anticorpo —antiLRP6 que compreende essa sequência mantém a capacidade para se ligar ao LRP6. Em certas realizações, um total de 1 a 10 aminoácidos foram substituídos, inseridos e/ou deletados no VH da SEQ ID NO:16. 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 7 ou na SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ

ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 15. Em outro aspecto, um anticorpo anti-LRP6 compreende uma sequência da cadeia pesada que tem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a — sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 7. Em certas realizações, uma sequência da cadeia pesada que tem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade contém substituições (por exemplo, substituições conservativas), inserções ou deleções relativas à sequência de referência, mas um anticorpo —anti-LRP6 que compreende essa sequência mantém a capacidade para se ligar ao LRP6. Em certas realizações, um total de 1 a 10 aminoácidos foram substituídos, inseridos e/ou deletados na SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 7. Em certas realizações, substituições, inserções ou deleções ocorrem nas regiões fora das HVRs (isto é, nas FRs). Opcionalmente, o anticorpo anti-LRP6 compreende a cadeia pesada e/ou VH da cadeia pesada da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 7, incluindo modificações pós-tradução dessa sequência. Em outro aspecto, é fornecido um anticorpo anti-LRP6, em que o anticorpo compreende um domínio variável da cadeia leve (VL) que tem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com um VL da cadeia leve da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO:

8. Em outro aspecto, é fornecido um anticorpo anti-LRP6, em que o anticorpo compreende um domínio variável da cadeia leve (VL) que tem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 16. Em certas realizações,

uma sequência de VL que tem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade contém substituições (por exemplo, substituições conservativas), inserções ou deleções relativas à sequência de referência, mas um anticorpo anti-LRP6 que compreende essa sequência — mantém a capacidade para se ligar ao LRP6. Em certas realizações, um total de 1 a 10 aminoácidos foram substituídos, inseridos e/ou deletados no VL da SEQ ID NO:16, 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 8 ou na SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 16. Em outro aspecto, é fornecido um anticorpo anti-LRP6, em que o anticorpo compreende uma cadeia leve (VL) que tem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 8. Em certas realizações, uma sequência da cadeia leve que tem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade contém substituições (por exemplo, substituições conservativas), inserções ou deleções relativas à sequência de referência, mas um anticorpo anti-LRP6 que compreende essa sequência mantém a capacidade para se ligar ao LRP6. Em certas realizações, um total de 1 a 10 aminoácidos foram substituídos, inseridos e/ou deletados na SEQ ID NO: 2, SEQIDNO:4,SEQID NO: 6 ou SEQ ID NO: 8. Em certas realizações, as substituições, inserções ou deleções ocorrem nas regiões fora das HVRs (isto é, nas FRs). Opcionalmente, o anticorpo anti-LRP6 compreende a cadeia leve e/ou sequência de VL na SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, ou SEQ ID NO: 8, incluindo modificações pós-tradução dessa sequência.

Em outro aspecto, é fornecido um anticorpo anti-LRP6, em que o anticorpo compreende um VH como em qualquer uma das realizações fornecidas acima, e um VL como em qualquer uma das realizações fornecidas acima.

Em um aspecto adicional, a invenção fornece um anticorpo que se liga ao mesmo epítopo que um anticorpo anti-LRP6 fornecido no presente pedido. Por exemplo, em certas realizações, é fornecido um anticorpo que se ligaaomesmo epítopo que um anticorpo anti-LRP6 selecionado a partir de um anticorpo anti-LRP6 que compreende uma sequência de VH da SEQ ID NO: 9 e uma sequência de VL da SEQ ID NO: 10, ou uma sequência de VH da SEQ ID NO: 11 e uma sequência de VL da SEQ ID NO: 12, ou uma sequência de VH da SEQ ID NO: 13 e uma sequência de VL da SEQ ID NO: 14, ou uma sequência de VH da SEQ ID NO: 15 e uma sequência de VL da SEQ ID NO:

16. Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 se liga a um epítopo que é compreendido de resíduos de aminoácidos na região E1-E2 de LRP6. Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 se liga a um epítopo que é compreendido de resíduos de aminoácidos na região ES-E4 de LRP6. Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 é um anticorpo biespecífico que se liga a um epítopo que é compreendido de resíduos de aminoácidos presentes na região E1-E2 de LRPG6 e se liga a um epítopo que é compreendido de resíduos de aminoácidos presentes na região E3-E4 de LRP6.

Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 se liga a um epítopo —conformacional que inclui os resíduos R28, E51, D52, V70, S71, E73, L95, S96, D98, E115, R141 e N185 de LRP6. Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 se liga a um epítopo conformacional que inclui os resíduos R28, E51, D52, V70, S71, E73, L95, S96, D98, E115, R141, N185, R29, W188, K202, P225, H226, S243 e F266 de LRP6.

Em uma realização, o anticorpo anti-LRP6 interage com pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, pelo menos dez, pelo menos onze, ou todos os resíduos de aminoácidos R28,

E51, D52, V70, S71, E73, L95, S96, D98, E115, R141 e N185 do B-propulsor E1 de LRP6. Em uma realização adicional, o anticorpo anti-LRP6 ainda interage com pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete dos resíduos R29, —WI188,K202,P225,H226,S243 e F266 de LRP6.

Em um aspecto adicional, um anticorpo anti-LRP6 de acordo com qualquer uma das realizações acima pode incorporar qualquer uma das características individualmente ou em combinação, conforme descrito nas Seções 1 a 7 abaixo:

1. AFINIDADE DE ANTICORPO Em certas realizações, um anticorpo fornecido no presente pedido tem uma constante de dissociação (Kd) de €< 1uM, £ 100 nM, € 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM, ou < 0,001 nM (por exemplo, 10º M ou menor, por exemplo, de 10º M a 10º M, por exemplo, de 10º M a 10º M).

Em uma realização, Kd é medido por um ensaio de ligação de antígeno radiomarcado (RIA) realizado com a versão Fab de um anticorpo de interesse e seu antígeno, conforme descrito pelo ensaio a seguir. A afinidade de ligação da solução de Fabs para o antígeno é medida por equilíbrio de Fab com uma concentração mínima de antígeno marcado com (1251) na presença de uma série de titulação de antígeno não marcado e então capturando o antígeno ligado com uma placa revestida com anticorpo Fab (consulte, por exemplo, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)). Para estabelecer as condições para o ensaio, placas de multipoços MICROTITERº (Thermo Scientific) são revestidas durante a noite com 5 ug/ml de um anticorpo anti-Fab de captura (Cappel Labs) em 50 mM de carbonato de sódio (pH 9,6), e subsequentemente bloqueado com albumina de soro bovino a 2% (p/v) em PBS por duas a cinco horas em temperatura ambiente (aproximadamente 23ºC). Em uma placa não adsorvente (Nunc nº 269620), 100 pM ou 26 pM de antígeno marcado com ***1 são misturados com uma série de diluições de um Fab de interesse (por exemplo, consistente com a avaliação do anticorpo anti- VEGF, Fab-12, em Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)). O Fab de interesse é então incubado durante a noite; no entanto, a incubação pode — continuar por um período maior (por exemplo, cerca de 65 horas) para garantir que o equilíbrio seja alcançado. Posteriormente, as misturas são transferidas para a placa de captura para incubação em temperatura ambiente (por exemplo, por uma hora). A solução é então removida e a placa lavada oito vezes com polissorbato 20 0,1% (TWEEN-20º) em PBS. Quando as placas estiverem secas, é adicionado 150 ul/poço de cintilante (MICROSCINT-20""; Packard) e as placas são contadas em um contador gama TOPCOUNTTY (Packard) por dez minutos. As concentrações de cada Fab que fornecem ligação máxima menor ou igual a 20% são escolhidas para uso em ensaios de ligação competitiva.

De acordo com outra realização, Kd é medido com o uso de ensaios de ressonância plasmônica de superfície com o uso de um BIACOREº- 2000 ou um BIACORE?-3000 (BlAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25ºC com chips CMS de antígeno imobilizado a aproximadamente 10 unidades de resposta (RU). Por curto tempo, chips biossensor de dextrano carboximetilado (CM5, BIACORE, Inc) são ativados com hidrocloreto de N-eti-Nn- (3- dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) e N-hidroxisuccinimida (NHS), de acordo com as instruções do fornecedor. O antígeno é diluído com 10 mM de acetato de sódio, pH 4,8, em 5 pg/ml (aproximadamente 0,2 UM) antes da injeção a uma taxa de fluxo de 5 ul/minuto para atingir aproximadamente 10 unidades de resposta (RU) de proteína acoplada. Seguindo a injeção de antígeno, 1M de etanolamina é injetado para bloquear grupos não reagidos. Para medições cinéticas, duas diluições em série de Fab (0,78 nM a 500 nM) são injetadas em PBS com tensoativo polissorbato 20 0,05% (TWEEN 207")

i (PBST) a 25ºC a uma taxa de fluxo de aproximadamente 25 ul/min. As taxas de associação (Kon) e taxas de dissociação (Ko) são calculadas com o uso de um modelo de ligação Langmuir um-para-um simples (BIACOREº Programa de Avaliação versão 3.2) por ajuste simultâneo do sensorgrama de associação e — dissociação. A constante de equilíbrio de dissociação (Kd) é calculada como a razão Kot/Kon. Consulte, por exemplo, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999). Se a taxa de associação exceder 10º M' Sº pelo ensaio de ressonância plasmônica de superfície acima, então a taxa de associação pode ser determinada pelo uso de uma técnica de extinção de fluorescência que mede o aumento ou diminuição na intensidade de emissão de fluorescência (excitação = 295 nm; emissão = 340 nm, 16 nm de bandas de passagem) a 25ºC de 20nM de um anticorpo anti-antígeno em PBS (forma Fab), pH 7,2, na presença de concentrações crescentes de antígeno conforme medido em um espectrômetro, como um espectrômetro equipado com parada de fluxo (Aviv Instrtumentsy ou um espectrômetto SLM-AMINCO'Y série 8000 (ThermoSpectronic) com um cadinho misturador.

2. FRAGMENTOS DE ANTICORPOS Em certas realizações, o anticorpo fornecido no presente pedido é um fragmento de anticorpo. Fragmento de anticorpos incluem, mas não se limitam a, fragmentos Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv e scFv, e outros fragmentos descritos abaixo. Para uma revisão de certos fragmentos de anticorpos, consulte Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003). Para uma revisão de fragmentos scFv, consulte, por exemplo, Pluckthun em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg e Moore eds., (Springer-Verlag, Nova York), páginas 269-315 (1994); consulte também documento WO 93/16185; e patentes US 5.571.894 e 5.587.458. Para discussão de fragmentos Fab e F(ab')2 que compreendem resíduos de epítopo que se ligam a receptores de resgate e têm meia vida aumentada in vivo,

consulte patente US 5.869.046.

Diacorpos são fragmentos de anticorpos com dois sítios de ligação de antígeno que podem ser bivalentes ou biespecíficos. Consulte, por exemplo, patente EP 404.097; documento WO 1993/01161; Hudson et a/., Nat.

Med 9:129-134 (2003); e Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444- 6448 (1993). Triacorpos e tetracorpos também são descritos em Hudson et a/. Nat. Med. 9:129-134 (2003). Anticorpos com domínio único são fragmentos que compreendem todo ou uma porção do domínio variável da cadeia pesada ou todo ou uma porção do domínio variável da cadeia leve de um anticorpo. Em certas realizações, um anticorpo com domínio único é um anticorpo com domínio único humano (Domantis, Inc., Waltham, MA; consulte, por exemplo, patente US 6.248.516 B1). Fragmentos de anticorpos podem ser fabricados por várias técnicas incluindo, mas não se limitando a, digestão proteolítica de um anticorpo intacto, bem como produção por células hospedeiras recombinantes (por exemplo, E. coli ou fago), conforme descrito no presente pedido.

3. ANTICORPOS QUIMÉRICOS E HUMANIZADOS Em certas realizações, um anticorpo fornecido no presente pedido é um anticorpo quimérico. Anticorpos quiméricos são descritos, por exemplo, na patente US 4.816.567; e Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). Em um exemplo, um anticorpo quimérico compreende uma região variável não humana (por exemplo, uma região variável derivada de um camundongo, rato, hamster, coelho ou primata não humano, como um macaco) e uma região constante humana. Em um exemplo adicional, um anticorpo quimérico é um anticorpo com “mudança de classe” em que a classe ou a subclasse foi alterada a partir daquela do anticorpo parental. Os anticorpos quiméricos incluem fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos.

i Em certas realizações, um anticorpo é um anticorpo humanizado. Tipicamente, um anticorpo não humano é humanizado para reduzir a imunogenicidade para humanos, embora mantendo a especificidade e afinidade do anticorpo parental não humano. Geralmente, um anticorpo — humanizado compreende um ou mais domínios variáveis, em que, por exemplo, HVRs, por exemplo, CDRs, (ou porções das mesmas) são derivadas de um anticorpo não humano, e FRs (ou porções dos mesmos) são derivados de sequências de anticorpos humanos. Um anticorpo humanizado opcionalmente compreenderá pelo menos uma porção de uma região constante humana. Em algumas realizações, alguns resíduos de FR em um anticorpo humanizado são substituídos por resíduos correspondentes de um anticorpo não humano (por exemplo, o anticorpo a partir do qual os resíduos de HVR são derivados), por exemplo, para restaurar ou melhorar a especificidade ou afinidade do anticorpo.

Os anticorpos humanizados e métodos para sua fabricação são revisados, por exemplo, em Almagro e Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008), e são ainda descritos, por exemplo, em Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci, USA 86:10029-10033 (1989); patentes US 5, 821.337, 7.527.791, 6.982.321, e 7.087.409; Kashmiri et al Methods 36:25-34 (2005) (que descrevem enxerto de SDR (a-CDR)); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) (que descrevem “recomposição”); Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) (que descrevem “mistura de FR”); e Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) e Klimka et a/., Br. J. Cancer, 83:252- 260 (2000) (que descrevem a abordagem de “seleção guiada” para mistura de FR).

Regiões de estrutura humanas que podem ser usadas para a humanização incluem, mas não se limitam a: regiões de estrutura selecionadas com o uso do método de “melhor ajuste” (consulte, por exemplo, Sims et al. J.

Immunol. 151:2296 (1993)); regiões de estrutura derivadas da sequência consenso de anticorpos humanos de um subgrupo específico de regiões variáveis da cadeia pesada (consulte, por exemplo, Carter et al. Proc. Natl.

Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); e Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)); regiões de estrutura maduras humanas (mutadas somaticamente) ou regiões de estrutura de linhagem germinativa humana (consulte, por exemplo, Almagro e Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)); e regiões de estrutura derivadas de bibliotecas de seleção de FR (consulte, por exemplo, Baca et al, J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) e Rosok et al, J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996).

4. ANTICORPOS HUMANOS Em certas realizações, um anticorpo fornecido no presente pedido é um anticorpo humano. Anticorpos humanos podem ser produzidos com o uso de várias técnicas conhecidas. Anticorpos humanos são descritos em geral em van Dijkke van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) e Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008).

Os anticorpos humanos podem ser preparados por administração de um imunógeno para um animal transgênico, que foi modificado para produzir anticorpos humanos intactos ou anticorpos intactos com regiões variáveis humanas em resposta à estimulação antigênica. Esses animais tipicamente contêm toda ou uma porção dos loci de imunoglobulina humana, que substituem os /oci de imunoglobulinas endógenas, ou que estão presentes fora do cromossomo ou integrados aleatoriamente nos cromossomas do animal. Nesses camundongos transgênicos, os /oci de imunoglobulina — endógena geralmente foram inativados. Para revisão de métodos para obter anticorpos humanos a partir de animais transgênicos consulte, Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005). Consulte também, patentes US 6.075.181 e

6.150.584 que descrevem tecnologia XENOMOUSET"Y; patente US 5.770.429 que descreve tecnologia HUMABº; patente US 7.041.870 que descreve tecnologia KM MOUSES”, e publicação de patente US 2007/0061900, que descreve tecnologia VELOCIMOUSES?). Regiões variáveis humanas de anticorpos intactos gerados por esses animais podem ainda ser modificadas, porexemplo, por combinação com uma região constante humana diferente.

Anticorpos humanos também podem ser fabricados por métodos baseados em hibridoma.

Linhagens celulares de mieloma humano e heteromieloma humano de camundongo foram descritas para produção de anticorpos monoclonais humanos. (Consulte, por exemplo, Kozbor J.

Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, páginas 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nova York, 1987)); e Boerner et al., J.

Immunol., 147: 86 (1991).) Anticorpos humanos gerados através de tecnologia de hibridoma de células B também são descritos em Li ef al., Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA, 103:3557-3562 (2006). Métodos adicionais incluem aqueles descritos, por exemplo, na patente US 7.189.826 (que descreve a produção de anticorpos IgM monoclonais humanos de linhagens celulares de hibridomas) e Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) (que descrevem hibridomas humanos de humanos). A tecnologia de hibridoma humano (tecnologia Trioma) também é descrita em Vollmers e Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) e Vollmers e Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005). Anticorpos humanos também podem ser gerados por isolamento de sequências de domínio variável de clone de Fv selecionadas a partir de bibliotecas de exibição por fago derivadas de humanos.

Essas sequências de domínio variável podem então ser combinadas com um domínio constante humano desejado.

Técnicas para deleção de anticorpos humanos a partir de bibliotecas de anticorpo são descritas abaixo.

5. ANTICORPOS DERIVADOS DE BIBLIOTECAS

Os anticorpos da invenção podem ser isolados por seleção de bibliotecas combinatórias para anticorpos com a atividade ou atividades desejadas.

Por exemplo, vários métodos são conhecidos na técnica para geração de bibliotecas de anticorpo exibidas por fago e seleção de tais bibliotecas para anticorpos que possuam as características de ligação desejadas.

Esses métodos são revisados, por exemplo, em Hoogenboom et al. em Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001) e ainda descritos, por exemplo, em McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J.

Mol.

Biol. 222: 581-597 (1992); Marks e Bradbury, em Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J.

Mol.

Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J.

Mol.

Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA 101(34): 12467-12472 (2004); e Lee et al,

dJ Immunol.

Methods 284(1-2): 119-132(2004). Em certos métodos de exibição por fago, repertórios de genes de VH e VL são clonados separadamente por reação em cadeia da polimerase (PCR) e recombinados aleatoriamente em bibliotecas de fago, que podem ser então selecionados para fago de ligação de antígeno, conforme descrito em Winter ef al, Ann.

Rev.

Immunol., 12: 433-455 (1994). Fago tipicamente exibe fragmentos de anticorpos, tanto como fragmentos Fv de cadeia única (scFv) ou como fragmentos Fab.

Bibliotecas a partir de fontes imunizadas fornecem anticorpos com alta afinidade ao imunógeno sem a necessidade de construção de hibridomas.

De modo alternativo, o repertório virgem pode ser clonado (por exemplo, de humano) para fornecer uma fonte única de anticorpos humanos para uma grande variedade de antígenos não próprios e também próprios sem qualquer imunização, conforme descrito por Griffiths et al, EMBO J, 12: 725- 734 (1993). Finalmente, bibliotecas virgens também podem ser produzidas sinteticamente por clonagem dos segmentos do gene V rearranjados a partir de células-tronco e utilizando primers de PCR que contém sequência aleatória para codificar as regiõês de CDR3 altamente variáveis e para realizar o rearranjo in vitro, conforme descrito por Hoogenboom e Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992). Publicações de patentes que descrevem bibliotecas de fago de anticorpo humano incluem, por exemplo: patente US 5.750.373, e publicações de patentes US 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 e 2009/0002360. Os anticorpos ou fragmentos de anticorpos isolados a partir de bibliotecas de anticorpos humanos são considerados anticorpos humanos ou fragmentos de anticorpos humanos descritos no presente pedido.

6. ANTICORPOS MULTIESPECÍFICOS Em certas realizações, um anticorpo fornecido no presente pedido é um anticorpo multiespecífico, por exemplo, um anticorpo biespecífico. Os anticorpos multiespecíficos são anticorpos monoclonais que têm especificidades de ligação para pelo menos dois antígenos diferentes. Em certas realizações, uma das especificidades de ligação é para LRP6 e a outra é para qualquer outro antígeno. Em certas realizações, um anticorpo biespecífico se liga a dois epítopos diferentes de LRP6. Anticorpos biespecíficos também podem ser usados para localizar agentes citotóxicos para células que expressam LRP6. Anticorpos biespecíficos podem ser preparados como anticorpos inteiros ou fragmentos de anticorpos.

As técnicas para fabricação de anticorpos multiespecíficos incluem, mas não se limitam a, coexpressão recombinante de dois pares de cadeia pesada-cadeia leve de imunoglobulina que têm especificidades diferentes (consulte, Milstein e Cuello, Nature 305: 537 (1983)), documento WO 93/08829, e Traunecker et al, EMBO J. 10: 3655 (1991)), e engenharia de “protuberância em orifício” (consulte, por exemplo, patente US 5.731.168).

Anticorpos multiespecíficos também podem ser fabricados por engenharia de direcionamento eletrostático para fabricação de anticorpos Fc-moléculas heterodiméricas (documento WO 2009/089004A1); reticulação de dois ou mais anticorpos ou fragmentos (consulte, por exemplo, patente US 4.676.980, e Brennan etal, Science, 229: 81 (1985)); com o uso de fechos de leucina para produzir anticorpos biespecíficos (consulte, por exemplo, Kostelny et al, J. Immunol., 148(5): 1547-1553 (1992)); com o uso de tecnologia de “diacorpo” para fabricação de fragmentos de anticorpo biespecífico (consulte, por exemplo, Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)); e como uso de dímeros de Fv de cadeia única (sFv) (consulte, por exemplo, Gruber et al, J. Immunol., 152:5368 (1994)); e preparação de anticorpos triespecíficos conforme descrito, por exemplo, em Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991). Anticorpos elaborados geneticamente com três ou mais sítios de ligação de antígeno funcionais, incluindo “anticorpos polvo”, também são incluídos no presente pedido (consulte, por exemplo, patente US 2006/0025576A1). O anticorpo ou fragmento no presente pedido também inclui um “FAb de ação dupla” ou “DAF” que compreende um sítio de ligação de antígeno que seligaaLRP6 bem como a um outro antígeno diferente (consulte, patente US 2008/0069820, por exemplo).

7. ANTICORPOS VARIANTES Em certas realizações, são contempladas sequências de aminoácidos variantes dos anticorpos fornecidos no presente pedido. Por exemplo, pode ser desejável aprimorar a afinidade de ligação e/ou outras propriedades biológicas do anticorpo. Sequências de aminoácidos variantes de um anticorpo podem ser preparadas por introdução apropriada de modificações na sequência de nucleotídeos que codifica o anticorpo, ou por síntese peptídica.

Essas modificações incluem, por exemplo, deleções, inserções e/ou substituições de resíduos dentro das sequências de aminoácidos do anticorpo.

Qualquer combinação de deleção, inserção e substituição pode ser feita para se chegar ao constructo final, contanto que o constructo final possua as características desejadas, por exemplo, ligação de antígeno.

A) SUBSTITUIÇÕES, INSERÇÕES E DELEÇÕES VARIANTES Em certas realizações, são fornecidos anticorpos variantes que têm uma ou mais substituições de aminoácidos.

Sítios de interesse para mutagênese de substituição incluem as HVRs e FRs.

Substituições conservativas são mostradas na Tabela 1 sob o título de “substituições conservativas”. Mais mudanças substanciais são fornecidas na Tabela 1, sob o título de “substituições exemplares”, e conforme mais adiante descritas abaixo, em referência às classes de cadeia laterais de aminoácidos.

As substituições de aminoácidos podem ser introduzidas em um anticorpo de interesse e os produtos selecionados para uma atividade desejada, por exemplo, ligação de antígeno retida/aprimorada, diminuição de imunogenicidade e ADCC ou CDC aprimorada.

TABELA 1

[en | noteuena Te vamenae te | te Os aminoácidos podem ser agrupados de acordo com as propriedades da cadeia lateral comuns: (1) hidrofóbico: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, lle; (2) hidrofílico neutro: Cys, Ser, Thr, Asn, Gn; (3) ácido: Asp, Glu; (4) básico: His, Lys, Arg; (5) resíduos que influenciam na orientação da cadeia: Gly, Pro; (6) aromático: Trp, Tyr, Phe.

Substituições não conservativas irão implicar na troca de um membro de uma dessas classes por outra classe.

Um tipo de variante de substituição envolve substituição de um ou mais resíduos da região hipervariável de um anticorpo parental (por exemplo, um anticorpo humano ou humanizado). Geralmente, a(s) variante(s) resultante(s) selecionada(s) para mais adiante estudar se terá modificações (por exemplo, aprimoramentos) em certas propriedades biológicas (por exemplo, afinidade aumentada, imunogenicidade reduzida) em relação ao

| anticorpo —parental e/ou se terá certas propriedades biológicas substancialmente retidas do anticorpo parental.

Uma variante substituta exemplar é um anticorpo de afinidade madura, que pode ser convenientemente gerado, por exemplo, com o uso de técnicas de maturação de afinidade com base na exibição por fago conforme essas descritas no presente pedido.

Por curto tempo, um ou mais resíduos de HVR são mutados e os anticorpos variantes exibidos em fago e selecionados para uma atividade biológica particular (por exemplo, afinidade de ligação) Alterações (por exemplo, substituições) podem ser feitas em HVRs, por exemplo, para aprimorar a afinidade do anticorpo.

Essas alterações podem ser feitas em “hotspots” de HVR, isto é, resíduos codificados por códons que sofrem mutação em alta frequência durante o processo de maturação somático (consulte, por exemplo, Chowdhury, Methods Mol.

Biol. 207:179-196 (2008)), e/ou SDRs (a-CDRs), com a VH ou VL variante resultante sendo testada para afinidade de ligação.

Maturação de afinidade por construção e nova seleção a partir de bibliotecas secundárias foram descritas em, por exemplo, Hoogenboom et al. em Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al, ed, Human Press, Totowa, NJ, (2001)) Em algumas realizações de maturação de afinidade é introduzida diversidade nos genes variáveis escolhidos para maturação por qualquer um de uma variedade de métodos (por exemplo, PCR propensa a erro, mistura de cadeia ou mutagênese direcionada ao oligonucleotídeo). Uma biblioteca secundária é então criada.

A biblioteca é então selecionada para identificar quaisquer anticorpos variantes com a afinidade desejada.

Qualquer método para introduzir diversidade envolve abordagens direcionadas a HVR, na qual diversos resíduos de HVR (por exemplo, 4 a 6 resíduos de uma vez) são randomizados.

Resíduos de HVR envolvidos em ligação de antígeno podem ser especificamente identificados, por exemplo, com o uso de mutagênese ou

| modelagem de varredura de alanina. CDR-H3 e CDR-L3 em particular, são muitas vezes alvo.

Em certas realizações, substituições, inserções ou deleções podem ocorrer dentro de uma ou mais HVRs contanto que essas alterações não reduzam — substancialmente a capacidade do anticorpo se ligar ao antígeno. Por exemplo, alterações conservativas (por exemplo, substituições conservativas conforme fornecida no presente pedido) que não reduzam substancialmente a afinidade de ligação podem ser feitas em HVRs. Essas alterações podem estar fora de “hotspots” de HVR ou SDRs. Em certas realizações das sequências de VH e VL variantes fornecidas acima, cada HVR tanto não é alterada como contêm não mais que uma, duas ou três substituições de aminoácidos.

Um método útil para identificação de resíduos ou regiões de um anticorpo que podem ser direcionadas para mutagênese é chamado de "mutagênese de varredura de alanina” conforme descrito por Cunningham e Wells (1989) Science, 244:1081-1085. Nesse método, um resíduo ou grupo de resíduos alvo (por exemplo, resíduos carregados como arg, asp, his, lys e glu) são identificados e substituídos por um aminoácido carregado negativamente ou neutro (por exemplo, alanina ou polialanina) para determinar se a interação do anticorpo com o antígeno é afetada. Além disso, podem ser introduzidas substituições nas localizações de aminoácidos que demonstram sensibilidade funcional às substituições iniciais. De maneira alternativa ou adicionalmente, uma estrutura cristalina de um complexo antigeno-anticorpo para identificar pontos de contato entre o anticorpo e o antígeno. Esses resíduos de contato e resíduos vizinhos podem ser direcionados ou eliminados como candidatos para — substituição. As variantes podem ser selecionadas para determinar se contêm as propriedades desejadas.

Inserções de sequência de aminoácidos incluem fusões na terminação amina e/ou carboxila, variando, em comprimento, de um resíduo

| até polipeptídeos que contêm uma centena ou mais de resíduos, bem como inserções intrassequência de resíduos de aminoácidos únicos ou múltiplos. Exemplos de inserções terminais incluem um anticorpo com um resíduo metionil N-terminal. Outras variantes de inserção da molécula de anticorpo incluem a fusão à terminação N ou terminação C do anticorpo a uma enzima (por exemplo, para ADEPT) ou um polipeptídeo que aumenta a meia-vida do anticorpo no soro.

B) VARIANTES DE GLICOSILAÇÃO Em certas realizações da invenção, um anticorpo fornecido no presente pedido é alterado para aumentar ou diminuir a medida na qual o anticorpo é glicosilado. A adição ou deleção de sítios de glicosilação a um anticorpo pode ser convenientemente realizada por alteração da sequência de aminoácidos, como aquela em que um ou mais dos sítios de glicosilação são criadas ou removidas.

Onde o anticorpo compreende uma região Fc, o carboidrato ligado ao mesmo pode ser alterado. Anticorpos nativos produzidos por células de mamíferos tipicamente compreendem um oligossacarídeo biantenário ramíificado que geralmente é ligado por uma ligação N ao Asn297 do domínio CH2 da região Fc. Consulte, por exemplo, Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997) O oligossacarídeo pode incluir vários carboidratos, por exemplo, manose, N-acetil glicosamina (GICcNAc), galactose e ácido siálico, bem como uma fucose ligada a uma GIcNAc no “tronco” da estrutura do oligossacarídeo biantenário. Em algumas realizações, as modificações do oligossacarídeo em um anticorpo da invenção podem ser feitas a fim de criar anticorpos variantes com certas propriedades aprimoradas.

Em uma realização, anticorpos variantes são fornecidos tendo uma estrutura de carboidrato desprovida de fucose ligada (direta ou indiretamente) a uma região Fc. Por exemplo, a quantidade de fucose nesse i anticorpo pode ser de 1% a 80%, de 1% a 65%, de 5% a 65% ou de 20% a 40%. A quantidade de fucose é determinada pelo cálculo da quantidade média de fucose na cadeia de açúcar em Asn297, em relação à soma de todas as glicoestruturas ligadas a Asn297 (por exemplo, estruturas do tipo complexo, —altamanose e híbridas) conforme medido por espectrometria de massa MALDI- TOF, conforme descrito no documento WO 2008/077546, por exemplo.

Asn297 refere-se ao resíduo de asparagina localizado próximo da posição 297 na região Fc (numeração Eu de resíduos da região Fc), no entanto, Asn297 também pode estar localizado a cerca de mais ou menos 3 aminoácidos a montante ou a jusante da posição 297, isto é, entre as posições 294 e 300, devido a menores variações de sequência em anticorpos.

Essas fucosilações variantes podem ter função ADCC aprimorada.

Consulte, por exemplo, publicações de patentes US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Exemplos de publicações relacionadas a anticorpos variantes “defucosilados" ou “deficientes em fucose"” incluem: patente US 2003/0157108; documento WO 2000/61739; documento WO 2001/29246; patente US 2003/0115614; patente US 2002/0164328; patente US 2004/0093621; patente US 2004/0132140; patente US 2004/0110704; patente US 2004/0110282; patente US 2004/0109865; documento WO 2003/085119; documento WO 2003/084570; documento WO 2005/035586; documento WO 2005/035778; documento WO 2005/053742; Okazaki et al.

J.

Mol.

Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al.

Biotech.

Bioeng. 87: 614 (2004). Exemplos de linhagens celulares capazes de produzir anticorpos defucosilados incluem células Lec13 CHO deficientes em proteína de fucosilação (Ripka et al.

Arch.

Biochem.

Biophys. 249:533-545 (1986); pedido de patente US 2003/0157108 A1, Presta, L; e documento WO 2004/056312 A1, Adams et al., especialmente no Exemplo 11), e linhagens celulares knockout, como gene alfa-1,6-fucosiltransferase, FUT8, células CHO Knockout (consulte, por

| exemplo, Yamane-Ohnuki et a/. Biotech.

Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol.

Bioeng., 94(4):680-688 (2006); e documento WO2003/085107). Anticorpos variantes são fornecidos mais adiante com oligossacarídeos divididos, por exemplo, na qual um oligossacarídeo —biantenário ligado a região Fc do anticorpo é dividido por GIcNAc.

Esses anticorpos variantes podem ter fucosilação reduzida e/ou função ADCC aprimorada.

Exemplos desses anticorpos variantes são descritos, por exemplo, no documento WO 2003/011878 (Jean-Mairet et a/.); patente US 6.602.684 (Umana et a/.); e patente US 2005/0123546 (Umana et al). Também são fornecidos anticorpos variantes com pelo menos um resíduo de galactose no oligossacarídeo ligado à região Fc.

Esses anticorpos variantes podem ter função CDC aprimorada.

Esses anticorpos variantes são descritos, por exemplo, no documento WO 1997/30087 (Patel et al); documento WO 1998/58964 (Raju, S.); e documento WO 1999/22764 (Raju, S.). C) REGIÕES FC VARIANTES Em certas realizações, uma ou mais modificações de aminoácidos podem ser introduzidas dentro da região Fc de um anticorpo fornecido no presente pedido, através disso gerando uma região Fc variante.

A região Fc variante pode compreender uma sequência de região Fc humana (por exemplo, uma região Fc de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 humana) que compreende uma modificação de aminoácido (por exemplo, uma substituição) em uma ou mais posições de aminoácidos.

Em certas realizações, a invenção contempla um anticorpo variante que possui algumas, mas não todas as funções efetoras, que fazem desse um candidato desejável para aplicações em que a meia vida do anticorpo in vivo é ainda importante para certas funções efetoras (como complemento e ADCC) não necessárias ou deletérias.

Ensaios de citotoxicidade in vitro e/ou in vivo podem ser conduzidos para confirmar a redução/depleção de atividades CDC e/ou ADCC. Por exemplo, ensaios de ligação do receptor Fc (FCcR) podem ser conduzidos para assegurar que o anticorpo é desprovido de ligação ao FceyR (então provavelmente sendo desprovido de atividade ADCC), mas mantém capacidade de ligação ao FcRn.

As células principais para mediação de ADCC, células NK, expressam somente Fc(RIll, enquanto que monócitos expressam Fc(RI, Fe(RIl and Fe(RIIl. À expressão de FcR em células hematopoiéticas está resumida na Tabela 3 na página 464 de Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-492 (1991). Exemplos não limitantes de ensaios in vitro para avaliar atividade ADCC de uma molécula de interesse são descritos na patente US 5.500.362 (consulte, por exemplo, Hellstrom, 1., et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)) e Hellstrom, | et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985);

5.821.337 (consulte Bruggemann, M. et al, J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)). De maneira alternativa, os métodos de ensaios não radioativos podem ser empregados (consulte, por exemplo, ACTI"Y ensaio de citotoxicidade não radioativo para fluxo citométrico (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA; e CytoTox 96º ensaio de citotoxicidade não radioativo (Promega, Madison, WI). Células efetoras úteis para esses ensaios incluem células mononucleares do sangue periférico (PBMC) e células Natural Killer (NK). De maneira alternativa ou adicionalmente, a atividade ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo animal conforme divulgado em Clynes et al, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998). Ensaios de ligação C1qg também podem ser realizados para confirmar se o anticorpo é incapaz de se ligar a C1g e, então, desprovido de atividade CDC. Consulte, por exemplo, ligação C1iq e C3c em ELISA nos documentos WO 2006/029879 e WO 2005/100402. Para avaliar ativação de complemento, um ensaio CDC pode ser realizado (consulte, por exemplo, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003); e

| Cragg, M.S. e M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)). Ligação FcRn e determinações de liberação/meia vida in vivo também podem ser realizadas com o uso de métodos conhecidos na técnica (consulte, por exemplo, Petkova, S.B. et al., Int'l. Imnmunol. 18(12):1759-1769 (2006)).

Anticorpos com função efetora reduzida incluem aqueles com substituições de um ou mais resíduos da região Fc 238, 265, 269, 270, 297, 327 e 329 (patente US 6.737.056). Esses mutantes Fc incluem mutantes Fc com substituições em duas ou mais posições dos aminoácidos 265, 269, 270, 297 e 327, incluindo o também conhecido como mutante Fc “DANA” com substituições dos resíduos 265 e 297 para alanina (patente US 7.332.581).

Certos anticorpos variantes com ligação aprimorada ou reduzida para FcRs são descritos. (Consulte, por exemplo, patente US 6.737.056, documento WO 2004/056312 e Shields et a/., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001).) Em certas realizações, um anticorpo variante compreende uma região Fc com uma ou mais substituições de aminoácidos que aprimoram ADCC, por exemplo, substituições nas posições 298, 333 e/ou 334 da região Fc (numeração de resíduos EU).

Em algumas realizações, são feitas alterações na região Fc que resultam em ligação C1iq alterada (isto é, tanto aprimorada como reduzida) e/ou Citotoxicidade Dependente de Complemento (CDC), por exemplo, conforme descrito na patente US 6.194.551, documento WO 99/51642 e Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).

Anticorpos com meia vida aumentada e ligação aprimorada para o — receptor Fc neonatal (FCRn), que é responsável por transferir as IgGs maternas para os fetos (Guyer et al, J. Immunol. 117:587 (1976) e Kim et al, J. Immunol.24:249 (1994)), são descritos na patente US 2005/0014934A1 (Hinton et al). Esses anticorpos compreendem uma região Fc com uma ou mais substituições nesse, que aprimoram a ligação da região Fc ao FcRn. Essas variantes Fc incluem aquelas com substituições em um ou mais resíduos da região Fc: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 ou 434, por exemplo, substituição do — resíduo 434 da região Fc (patente US 7.371.826).

Consulte também, Duncan & Winter Nature 322:738-40 (1988); patente US 5.648.260; patente US 5.624.821; e documento WO 94/29351 com respeito a outros exemplos de regiões Fc variantes.

D) ANTICORPOS VARIANTES ELABORADOS GENETICAMENTE COM CISTEÍNA Em ainda outro aspecto, pode ser desejável a criação de anticorpos elaborados geneticamente com cisteina, por exemplo, “thioMAbs”, em que um ou mais resíduos de um anticorpo são substituídos com resíduos de cisteina. Em realizações específicas, os resíduos substitutos ocorrem em sítios acessíveis do anticorpo. Substituindo-se esses resíduos por cisteina, os grupos tióis reativos são através disso posicionados em sítios acessíveis do anticorpo e podem ser usados para conjugar o anticorpo a outros componentes, como componente droga ou componentes ligante-droga, para criar um imunoconjugado, conforme descrito mais adiante no presente pedido. Em certas realizações, qualquer um ou mais dos seguintes resíduos podem ser substituídos por cisteina: V205 (numeração Kabat) da cadeia leve; A118 (numeração EU) da cadeia pesada; e S400 (numeração EU) da região Fc da cadeia pesada. Anticorpos elaborados geneticamente com cisteína podem ser gerados conforme descrito, por exemplo, na patente US 7.521.541.

E) ANTICORPOS DERIVADOS Em certas realizações, um anticorpo fornecido no presente pedido pode ser mais adiante modificado para conter componentes não proteináceos adicionais que são conhecidos na técnica e facilmente disponíveis. Os componentes adequados para derivatização do anticorpo incluem mas não se limitam a, polímeros solúveis em água. Exemplos não limitantes de polímeros solúveis em água incluem, mas não se limitam a, polietileno glicol (PEG), copolímeros de etileno glicol/propileno glicol, carboximetilcelulose, dextrana, álcool polivinílico, polivinil pirrolidona, poli- 1, 3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolimero anidrido etileno/maleico, poliaminoácidos (tanto homopolímeros como copolímeros aleatórios), e dextrana ou poli(n-vinil pirrolidona)polietileno glicol, homopolimeros de propropileno glicol, copolímeros de óxido de prolipropileno/óxido de etileno, polióis polioxietilado (por exemplo, glicerol), álcool polivinílico e misturas dos mesmos. Propionaldeído de polietileno glicol pode ter vantagens na fabricação, devido a sua estabilidade em água. O polímero pode ter qualquer peso molecular e pode ser ramificado ou não ramificado. O número de polímeros ligados ao anticorpo pode variar, e se mais de um polímero estiver ligado, eles podem ter moléculas iguais ou diferentes. Em geral, o número e/ou tipo de polímeros usados para derivatização pode ser determinado com base nas considerações que incluem, mas não se limitam a, propriedades específicas ou funções do anticorpo a serem aprimoradas, se o anticorpo derivado será usado em uma terapia mediante condições definidas, etc.

Em outra realização, são fornecidos conjugados de um anticorpo e componentes não proteináceos que podem ser seletivamente aquecidos por exposição à radiação. Em uma realização, o componente não proteináceo é um nanotubo de carbono (Kam et a/., Proc. Natl. Acad. Sci USA 102: 11600-11605 (2005)). A radiação pode ter qualquer comprimento de onda e inclui, mas não se limita a, comprimentos de onda que não são prejudiciais às células comuns, mas que aquecem oO componente não proteináceo a uma temperatura na qual as células próximas ao componente não proteináceo do anticorpo são destruídas.

B. MÉTODOS RECOMBINANTES E COMPOSIÇÕES Anticorpos podem ser produzidos com o uso de métodos recombinantes e composições, por exemplo, conforme descrito na patente US

4.816.567. Em uma realização, é fornecido o ácido nucleico isolado que codifica um anticorpo anti-LRP6 descrito na presente invenção. Esse ácido nucleico pode codificar uma sequência de aminoácidos que compreendem a VL e/ou uma sequência de aminoácidos que compreende a VH do anticorpo (por exemplo, as cadeias leves e/ou pesadas do anticorpo). Em uma realização adicional, são fornecidos um ou mais vetores (por exemplo, vetores de expressão) que compreendem esse ácido nucleico. Em uma realização adicional, é fornecida uma célula hospedeira que compreende esse ácido nucleico. Nessa realização, uma célula hospedeira compreende (por exemplo, foi transformada com): (1) um vetor que compreende um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos que compreende a VL do anticorpo e uma sequência de aminoácidos que compreende a VH do anticorpo, ou (2) um primeiro vetor que compreende um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos que compreende a VL do anticorpo e um segundo vetor que compreende um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos que compreende a VH do anticorpo. Em uma realização, a célula hospedeira é —eucarionte, por exemplo, célula de Ovário de Hamster Chinês (CHO) ou célula linfoide (por exemplo, célula YO, NSO0, Sp20). Em uma realização, um método de fabricação de um anticorpo anti-LRP6 é fornecido, sendo que o método compreende cultivar uma célula hospedeira que compreende um ácido nucleico que codifica o anticorpo, conforme fornecido acima, mediante condições adequadas para expressão do anticorpo e opcionalmente recuperação do anticorpo a partir da célula hospedeira (ou meio de cultura da célula hospedeira). Para produção recombinante de um anticorpo anti-LRP6, o ácido nucleico que codifica um anticorpo, por exemplo, conforme descrito acima, é isolado e inserido em um ou mais vetores para clonagem e/ou expressão adicional em uma célula hospedeira. Esse ácido nucleico pode ser isolado e sequenciado de imediato com o uso de procedimentos convencionais (por exemplo, com o uso de sondas de oligonucleotídeos que são capazes de se ligar especificamente aos genes que codificam as cadeias pesadas e leves do anticorpo).

Células hospedeiras adequadas para clonagem ou expressão de vetores que codificam anticorpos incluem células procariontes ou eucariontes descritas na presente invenção. Por exemplo, os anticorpos podem ser produzidos em bactérias, em particular quando não é necessária glicosilação e função efetora Fc. Para expressão de fragmentos de anticorpos e polipeptídeos em bactérias, consulte, por exemplo, patentes US

5.648.237, 5.789.199 e 5.840.523. (Consulte também Charlton, Methods in Molecular Biology, Volume 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), páginas 245-254, descrição de expressão de fragmentos de anticorpos em E. coli.) Após expressão, o anticorpo pode ser isolado a partir da pasta celular bacteriana em uma fração solúvel e, além disso, pode ser purificado.

Além de procariontes, micróbios eucariontes como fungos filamentosos ou leveduras são clonagens adequadas ou expressão de hospedeiros para vetores que codificam anticorpos, incluindo fungos e leveduras cujas vias de glicosilação foram “humanizadas”, resultando na produção de um anticorpo com um padrão de glicosilação parcialmente ou totalmente humano. Consulte Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004), elietal, Nat. Biotech. 24:210-215 (2006).

Células hospedeiras adequadas para a expressão de anticorpo glicosilado também são derivadas a partir de organismos multicelulares (invertebrados e vertebrados). Exemplos de células de invertebrados incluem células vegetais e de insetos. Foram identificadas numerosas linhagens de baculovírus que podem ser usadas em conjunto com células de inseto, particularmente para transfecção de células de Spodoptera frugiperda. Culturas de células vegetais também podem ser usadas como — hospedeiras. Consulte, por exemplo, patentes US 5.959.177, 6.040.498,

6.420.548, 7.125.978 e 6.417.429 (descrevendo tecnologia PLANTIBODIES"Y para produção de anticorpos em plantas transgênicas).

Células de vertebrados também podem ser usadas como hospedeiras. Por exemplo, linhagens celulares de mamíferos que são adaptadas para crescer em suspensão podem ser úteis. Outros exemplos de linhagens celulares hospedeiras de mamíferos úteis são linhagens CV1 de rim de macaco transformadas por SV40 (COS-7), linhagem de rim embrionário humano (células 293 ou 293 conforme descrito, por exemplo, em Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)), células de rim de filhotes de hamster (BHK), células de Sertoli de camundongo (células TM4, conforme descrito, por exemplo, em Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)), células de rim de macaco (CV1), células de rim de macaco verde africano (VERO-76), células de carcinoma cervical humano (HELA), células de rim canino (MDCK), células de fígado de rato búfalo (BRL 3A), células de pulmão humano (W138), células de fígado humano (Hep G2), tumor mamário de camundongo (MMT 060562), células TRI, conforme descrito, por exemplo, em Mather et al, Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982), células MRC 5 e células FS4. Outras linhagens celulares hospedeiras de mamíferos úteis incluem células de ovário de hamster chinês (CHO), incluindo células DHFR-CHO (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA ?77:4216 (1980)) e linhagens celulares de mieloma como YO, NS0 e Sp2/0. Para uma revisão de determinadas linhagens celulares hospedeiras de mamíferos adequadas para produção de anticorpo, consulte, por exemplo, Yazaki e Wu, Methods in Molecular Biology, Volume 248 (B.K.C. Lo, ed.,

Humana Press, Totowa, NJ), páginas 255-268 (2003). C. ENSAIOS Os anticorpos anti-LRP6 fornecidos no presente pedido podem ser identificados, selecionados ou caracterizados por suas propriedades fisicas/químicas e/ou atividades biológicas por vários ensaios conhecidos na técnica.

1. ENSAIOS DE LIGAÇÃO E OUTROS ENSAIOS Em um aspecto, um anticorpo da invenção é testado quanto à sua atividade de ligação de antígeno, por exemplo, por métodos conhecidos como ELISA, Western blot, etc.

Em outro aspecto, ensaios de competição podem ser usados para identificar um anticorpo que compete com um anticorpo anti-LRP6 da invenção para se ligar a LRP6. Em certas realizações, esse anticorpo de competição se liga ao mesmo epítopo (por exemplo, um epítopo linear ou um conformacional) que é ligado por um anticorpo anti-LRP6 da invenção. Métodos exemplares detalhados para mapeamento de um epítopo ao qual um anticorpo se liga são fornecidos em Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols”, em Methods in Molecular Biology volume 66 (Humana Press, Totowa, NJ).

Em um ensaio de competição exemplar, o LRP6 imobilizado é incubado em uma solução que compreende um primeiro anticorpo marcado que se liga ao LRP6 e um segundo anticorpo não marcado que é testado quanto à sua capacidade para competir com o primeiro anticorpo para ligação a LRP6. O segundo anticorpo pode estar presente em um sobrenadante de hibridoma. Como controle, LRP6 imobilizado é incubado em uma solução que — compreende o primeiro anticorpo marcado, mas não o segundo anticorpo não marcado. Após incubação mediante condições permissivas para ligação do primeiro anticorpo ao LRP6, o excesso de anticorpo não ligado é removido e a quantidade de marcador associado com LRP6 imobilizado é medida. Se a quantidade de marcador associado ao LRP6 imobilizado é substancialmente reduzida na amostra de teste em relação à amostra controle, então isso indica que o segundo anticorpo está competindo com o primeiro anticorpo para ligação ao LRP6. Consulte Harlow e Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, capítulo 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).

2. ENSAIOS DE ATIVIDADE Em um aspecto, são fornecidos ensaios para identificar anticorpos anti-LRP6 dos mesmos que têm atividade biológica. A atividade biológica pode incluir, por exemplo, inibição ou potencialização de sinalização mediada pela isoforma de Wnt, massa/conteúdo ósseo modulado, inibição de proliferação celular, aumento de proliferação celular. Também são fornecidos anticorpos que têm atividade biológica in vivo e/ou in vitro. Em certas realizações, um anticorpo da invenção é testado quanto a essa atividade biológica. Ensaios específicos usados para testar as — atividades biológicas são fornecidos nos Exemplos. D. IMUNOCONJUGADOS A invenção também fornece imunoconjugados que compreendem um anticorpo anti-LRP6 do presente pedido conjugado a um ou mais agentes citotóxicos, como agentes quimioterapêuticos ou drogas, agentes inibidores de crescimento, toxinas (por exemplo, toxinas proteicas, toxinas enzimaticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, ou fragmentos das mesmas), ou isótopos radioativos. Em uma realização, um imunoconjugado é um conjugado anticorpo-droga (ADC), no qual um anticorpo é conjugado com uma ou mais drogas incluindo, mas não se limitando a um maitansinoide (consulte patentes US 5.208.020, 5.416.064 e patente europeia EP 0 425 235 B1); uma auristatina como componentes droga monometilauristatina DE e DF (MMAE e MMAF) (consulte patentes US 5.635.483 e 5.780.588 e 7.498.298); uma dolastatina;

uma caliqueamicina ou derivados dos mesmos (consulte patentes US

5.712.374, 5.714.586, 5.739.116, 5.767.285, 5.770.701, 5.770.710, 5.773.001 e

5.877.296; Hinman et a/., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993); e Lode et al., Cancer Res. 58:2925-2928 (1998)); uma antraciclina como daunomicina ou —doxorrubicina (consulte Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgov et al., Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005); Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529- 1532 (2002); King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002); e patente US

6.630.579); metotrexato; vindesina; um taxano como docetaxel, paclitaxel, larotaxel, tesetaxel e ortataxel; um tricotecene; e CC1065.

Em outra realização, um imunoconjugado compreende um anticorpo, conforme descrito no presente pedido, conjugado a uma toxina ativa enzimaticamente ou fragmento da mesma incluindo, mas não se limitando a toxina de difteria, cadeia A da abrina, cadeia A da modecina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteinas da diantina, proteínas da Phytolaca americana (PAPI, PAPIIl e PAP-S), inibidor carantia momordica, curcina, crotina, inibidor sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina e os tricotecenos.

Em outra realização, um imunoconjugado compreende um anticorpo conforme descrito no presente pedido, conjugado a um átomo radioativo para formar um radioconjugado. Uma variedade de isótopos radioativos está disponível para a produção de radioconjugados. Exemplos incluem AE, (191, (125, º, Ret, Re'*, sm'*S, BiP?, p*º, Pb?!? e isótopos — radioativos de Lu. Quando o radioconjugado é usado para detecção, esse pode compreender um átomo radioativo para estudos cintigráficos, por exemplo, to” ou 11º, ou um marcador giratório para imagem de ressonância magnética nuclear (NMR) (também conhecida como imagem de ressonância magnética,

mri), como novamente iodo-123, iodo-131, índio-111, flúor-19, carbono-13, nitrogênio-15, oxigênio-17, gadolínio, manganês ou ferro.

Conjugados de um anticorpo e agente citotóxico podem ser produzidos com o uso de uma variedade de agentes de acoplamento de proteina —bifuncionais como propionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditio) (SPDP), succinimidil-4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato, iminotiolano (IT), derivados de imidoésteres bifuncionais (como dimetil adipimidato HCI), ésteres ativos (como disuccinimidil suberato), aldeídos (como glutaraldeído), compostos bis-azido (como bis-(p-azidobenzoil) hexanediamina), derivados de bis-diazônio (como bis-(p-diazoniumbenzoil)-etilenediamina), diisocianatos (como tolueno 2,6- diisocianato) e compostos de flúor bis-ativo (como 1,5-difluoro-2 4-dinitrobenzeno). Por exemplo, uma imunotoxina ricina pode ser preparada conforme descrito em Vitetta et al, Science 238:1098 (1987). O ácido triamino pentaacético 1- isotiocianatobenzil-3-metildietileno marcado com carbono 14 (MX-DTPA) é um agente quelante exemplar para a conjugação de radionucleotídeo ao anticorpo. Consulte documento WO 94/11026. O ligante pode ser um “ligante clivável” que facilita a liberação de uma droga citotóxica na célula. Por exemplo, um ligante instável ácido, ligante sensível a peptidase, ligante fotolábil, ligante dimetil ou ligante que contém bissulfeto (Chari et al. Cancer Res. 52:127-131 (1992); patente US5.208.020) pode ser usado.

Os imunoconjugados ou ADCs no presente pedido são expressamente contemplados, mas não se limitam a esses conjugados preparados com reagentes reticulantes incluindo, mas não se limitando a, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, —SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo- SMCC, e sulfo-SMPB, e SVSB (succinimidil-(4-vinilsulfona) benzoato) que estão comercialmente disponíveis (por exemplo, junto à Pierce Biotecnologia, Inc., Rockford, IL., EUA).

E. MÉTODOS E COMPOSIÇÕES PARA DIAGNÓSTICOS E DETECÇÃO Em certas realizações, qualquer um dos anticorpos anti-LRP6 fornecidos na presente invenção é útil para detectar a presença de LRP6 em uma amostra biológica. O termo “detecção”, como usado no presente pedido, — engloba detecção quantitativa ou qualitativa. Em certas realizações, a amostra biológica compreende uma célula ou tecido.

Em uma realização, é fornecido um anticorpo anti-LRP6 para uso em um método de diagnóstico ou detecção. Em um aspecto adicional, é fornecido um método para detectar a presença de LRP6 em uma amostra biológica. Em certas realizações, o método compreende colocar a amostra biológica em contato com um anticorpo anti-LRP6 conforme descrito no presente pedido mediante condições permissivas para ligação do anticorpo anti-LRP6 ao LRP6, e detectar se é formado um complexo entre o anticorpo anti-LRP6 e LRP6. Esse método pode ser um método in vitro ou in vivo. Em uma realização, um anticorpo anti-LRP6 é usado para selecionar sujeitos elegíveis para terapia com um anticorpo anti-LRP6, por exemplo, onde LRP6 é um biomarcador para seleção de pacientes.

Disfunções exemplares que podem ser diagnosticadas com o uso de um anticorpo da invenção incluem câncer e disfunções do sistema esquelético.

Em certas realizações, são fornecidos anticorpos anti-LRP6 marcados. Os marcadores incluem, mas não se limitam a, marcadores ou componentes que são detectados diretamente (como marcadores fluorescentes, cromofóricos, eletrodensos, quimioluminescentes e radioativos), bem como componentes, como enzimas ou ligantes, que são detectados indiretamente, por exemplo, através de uma reação enzimática ou interação molecular. Marcadores exemplares incluem, mas não se limitam a, os radioisótopos *ºP, 1*C, 121, 3H e **!, fluoróforos como quelatos terras raras ou fluorescina e seus derivados, rodamina e seus derivados, dansila, umbeliferona, luciferases, por exemplo, luciferase de vagalume e luciferase bacteriana (patente US 4.737.456), luciferina,y 2,3-desidroftalazinedionas, peroxidase de rábano silvestre (HRP), fosfatase alcalina, B-galactosidase, —glicoamilase, lisozima, sacarídeos oxidases, por exemplo, glicose oxidase, galactose oxidase e glicose-6-fosfato desidrogenase, oxidases heterocíclicas como uricase e xantina oxidase, acoplamentos com uma enzima que emprega peróxido de hidrogênio para oxidar um corante precursor como HRP, lactoperoxidase ou microperoxidase, biotina/avidina, biotina/estreptavidina, biotina/estreptavidina-B-galactosidase com MUG, marcadores spin, marcadores bacteriófagos, radicais livres estáveis e similares.

F. FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS Formulações farmacêuticas de um anticorpo anti-LRP6 conforme descritas no presente pedido são preparadas por mistura desse anticorpo que tem o grau desejado de pureza com um ou mais veículos opcionais farmaceuticamente aceitáveis (Remington's Pharmaceutical Sciences 16º edição, Osol, A. Ed. (1980)), sob a forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Veículos farmaceuticamente aceitáveis são geralmente não tóxicos para receptores nas dosagens e concentrações empregadas e incluem, mas não se limitam a: tampões como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (como octadecildimetilbenzil cloreto de amônio, cloreto de hexametônio, cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio, fenol, butil ou álcool benzílico, alcil parabenos, como metil ou propil parabeno, catecol, resorcinol, ciclohexanol, 3- —pentanol e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos que aproximadamente 10 resíduos); proteínas, como albumina de soro, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos como polivinilpirrolidona; aminoácidos como glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina; monossacarídeos,

dissacarídeos e outros carboidratos incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes como EDTA; açúcares como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; formação de sais de contra íons como sódio; complexos metálicos (por exemplo, complexos Zn-proteína); e/ou surfactantes não iônicos como polietileno glicol (PEG). Veículos farmaceuticamente aceitáveis exemplares no presente pedido ainda incluem agentes de dispersão de drogas intersticiais como glicoproteínas hialuronidase neutra ativa solúvel (SsSHASEGP), por exemplo, glicoproteínas hialuronidase PH-20 solúvel humana, como rHuPH20 (HYLENEXº, Baxter International, Inc.). Certas sHASEGPs exemplares e métodos de uso, incluindo rHuPHZ20, são descritas nas publicações de patentes US 2005/0260186 e 2006/0104968. Em um aspecto, uma sHASEGP é combinada com uma ou mais glicosaminoglicanases adicionais como condroitinases.

Formulações de anticorpos liofilizados exemplares são descritas na patente US 6.267.958.Erro! Nenhuma seqúuência foi especificada. As formulações de anticorpos aquosos incluem aquelas descritas na patente US

6.171.586 e no documento VWO2006/044908, as últimas formulações incluindo um tampão acetato de histidina.

A formulação no presente pedido também pode conter mais de um ingrediente ativo, conforme necessário para a indicação específica a ser tratada, preferencialmente aquelas com atividades complementares que não afetem contrariamente uma a outra. Esses ingredientes ativos estão adequadamente presentes em combinação em quantidades que são efetivas para o propósito pretendido.

Os ingredientes ativos podem ser retidos em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e microcápsulas de poli-(metilmetacilato), respectivamente, em sistemas de distribuição de droga coloidal (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, = microemulsões, —nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Essas técnicas são divulgadas em Remington's Pharmaceutical Sciences 16º edição, Osol, A. Ed. (1980).

Podem ser preparadas preparações de liberação sustentada. Exemplos adequados de preparações de liberação sustentada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos que contêm o anticorpo, cujas matrizes estão sob a forma de artigos moldados, por exemplo, filmes ou microcápsulas.

As formulações a serem usadas para administração in vivo geralmente são estéreis. A esterilidade pode ser facilmente realizada, por exemplo, por filtração através de membranas de filtração estéreis.

G. MÉTODOS TERAPÊUTICOS E COMPOSIÇÕES Qualquer um dos anticorpos anti-LRP6 fornecidos no presente —pedidopodem ser usados em métodos terapêuticos.

Em um aspecto, é fornecido um anticorpo anti-LRP6 para uso como um medicamento. Em aspectos adicionais, é fornecido um anticorpo anti- LRP6 para uso no tratamento de uma disfunção mediada por Wnt, como câncer ou uma disfunção esquelética ou óssea. Em certas realizações, é fornecido um anticorpo anti-LRP6 para uso em um método de tratamento. Em certas realizações, a invenção fornece um anticorpo anti-LRP6 para uso em um método de tratamento de um indivíduo que tem câncer ou uma disfunção esquelética ou óssea que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade efetiva do anticorpo anti-LRP6. Nessa realização, o método ainda — compreende administrar ao indivíduo uma quantidade efetiva de pelo menos um agente terapêutico adicional, por exemplo, conforme descrito abaixo. Em realizações adicionais, a invenção fornece um anticorpo anti-LRP6 para uso na inibição de sinalização induzida por uma primeira isoforma de Wnt e

| potencialização de sinalização induzida por uma segunda isoforma de Wnt. Em certas realizações, a invenção fornece um anticorpo anti-LRP6 para uso em um método de inibição de sinalização induzido por uma primeira isoforma de Wnt e potencialização de sinalização induzida por uma segunda isoforma de Wnt em um indivíduo, que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade efetiva do anticorpo anti-LRP6 para inibir sinalização induzida por uma primeira isoforma de Wnt e potencializa sinalização induzida por uma segunda isoforma de Wnt. Um “indivíduo”, de acordo com qualquer uma das realizações acima é preferencialmente um humano.

Em um aspecto adicional, a invenção fornece o uso de um anticorpo anti-LRP6 na fabricação ou preparação de um medicamento. Em uma realização, o medicamento é para tratamento de uma disfunção mediada por Wnt, como câncer ou uma disfunção esquelética ou óssea. Em uma realização adicional, o medicamento é para uso em um método de tratamento de uma disfunção mediada por Wnt, como câncer ou uma disfunção esquelética ou óssea, que compreende administrar a um indivíduo que tem a disfunção mediada por Wnt uma quantidade efetiva do medicamento. Nessa realização, o método ainda compreende administrar ao indivíduo uma quantidade efetiva de pelo menos um agente terapêutico adicional, por exemplo, conforme descrito abaixo. Um “indivíduo”, de acordo com qualquer uma das realizações acima pode ser um humano.

Em um aspecto adicional, a invenção fornece um método para tratamento de uma disfunção mediada por Wnt, como câncer ou uma disfunção esquelética ou óssea. Em uma realização, o método compreende administrar a —um indivíduo que tem essa disfunção mediada por Wnt uma quantidade efetiva de um anticorpo anti-LRP6. Nessa realização, o método ainda compreende administrar ao indivíduo uma quantidade efetiva de pelo menos um agente terapêutico adicional, conforme descrito abaixo. Um “indivíduo”, de acordo com qualquer uma das realizações acima pode ser um humano. Em uma realização, a disfunção mediada por Wnt é um câncer como, por exemplo, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer de mama, câncer pancreático, câncer ovariano, câncer de rim ou câncer de próstata. Em outra realização, a disfunção mediada por Wnt é uma disfunção esquelética ou óssea, como, por exemplo, osteoporose, osteoartrite, fraturas Ósseas ou lesões ósseas. Uma realização fornece um método de tratamento para um indivíduo que tem câncer compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade efetiva de um anticorpo que se liga ao LRP6 e inibe sinalização induzida por uma isoforma de Wnt selecionado a partir do grupo que consiste em Wnt3 e Wnt3a, e um anticorpo que se liga ao LRP6 e inibe sinalização induzida por uma isoforma de Wnt selecionado a partir do grupo que consiste em Wnt 1,2, 2b, 6, 8a, 9a, 9b e 10b. Outra realização fornece um método de tratamento para um indivíduo que tem câncer compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade efetiva de um anticorpo que se liga ao LRP6 e inibe sinalização induzida por Wnt3 e Wnt3a, e um anticorpo que se liga ao LRP6 e inibe sinalização induzida por Wnt 1, 2, 2b, 6, 8a, 9a, 9b e 10b. Outra realização fornece um método de tratamento para um indivíduo que tem câncer compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade efetiva de um anticorpo que se liga ao LRP6 e inibe sinalização induzida por Wnt3 e Wnt3a, e um anticorpo que se liga ao LRP6 e inibe sinalização induzida por Wnt 1, 2, 2b, 4,6,7a, 7b, 8a, 9a, 9b, 10a e 10b.

Em um aspecto adicional, a invenção fornece um método para potencialização de sinalização de Wnt induzida por uma isoforma de Wnt em um indivíduo, que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade efetiva de um anticorpo anti-LRP6 que potencializa sinalização pela isoforma de Wnt e a isoforma de Wnt potencializa sinalização de Wnt induzida pela isoforma de Wnt. Em um aspecto adicional, a invenção fornece formulações farmacêuticas que compreendem qualquer um dos anticorpos anti-LRP6 fornecidos no presente pedido, por exemplo, para uso em qualquer dos métodos terapêuticos acima. Em uma realização, uma formulação farmacêutica compreende qualquer um dos anticorpos anti-LRP6 fornecidos no presente pedido e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em outra realização, uma formulação farmacêutica compreende qualquer um dos anticorpos anti-LRP6 fornecidos no presente pedido e pelo menos um agente terapêutico adicional, por exemplo, conforme descrito acima.

Anticorpos da invenção podem ser usados tanto sozinhos como em combinação com outros agentes em uma terapia. Por exemplo, um anticorpo da invenção pode ser coadministrado com pelo menos um agente terapêutico adicional. Em certas realizações, um agente terapêutico adicional é um agente quimioterapêutico. Em outra realização, o agente é um anticorpo que é efetivo em tratamento de câncer, em tratamento esquelético ou disfunções ósseas. Essas combinações de terapia apontadas acima englobam administração combinada (quando dois ou mais agentes terapêuticos estão incluídos na mesma formulação ou separados), e administração separada, nesse caso, a administração do anticorpo da invenção pode ocorrer antes, simultaneamente e/ou após a administração do agente terapêutico adicional e/ou adjuvante. Anticorpos da invenção também podem ser usados em combinação com radioterapia.

Um anticorpo da invenção (e qualquer agente terapêutico adicional) pode ser administrado por qualquer meio adequado, incluindo parenteral, intrapulmonar e intranasal, e se desejado, para tratamento local, administração intralesional. Infusões parenterais incluem administração intramuscular, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal ou subcutânea. A dosagem pode ser por qualquer rota adequada, por exemplo, por injeções, como injeções intravenosa ou subcutânea, dependendo em parte, se a administração é breve ou contínua. Várias programações de dosagem que incluem, mas não se limitam a, administrações únicas ou múltiplas durante vários períodos, administração em bolus e infusão de pulso são contempladas no presente pedido.

Anticorpos da invenção seriam formulados, dosados e administrados de um modo consistente com as boas práticas médicas. Os fatores para consideração nesse contexto incluem a disfunção específica a ser tratada, o mamífero específico a ser tratado, a condição clínica de cada paciente, a causa da disfunção, o local de distribuição do agente, o método de administração, o cronograma de administração e outros fatores conhecidos pelos médicos. O anticorpo não precisa ser, mas é opcionalmente formulado com um ou mais agentes atualmente usados para prevenir ou tratar a disfunção em questão. A quantidade efetiva desses outros agentes depende da quantidade de anticorpo presente na formulação, do tipo de disfunção ou tratamento e dos outros fatores discutidos acima. Esses são geralmente usados na mesma dosagem e com rotas de administração conforme descritas no presente pedido, ou cerca de 1 a 99% das dosagens descritas no presente pedido, ou qualquer dosagem e por qualquer rota que seja empiricamente/clinicamente determinada como sendo apropriada. Para a prevenção ou tratamento de doença, a dosagem apropriada de um anticorpo da invenção (quando usado sozinho ou em —combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais) dependerá do tipo de doença a ser tratada, do tipo de anticorpo, da severidade e curso da doença, se o anticorpo é administrado para propósitos preventivos ou terapêuticos, terapias prévias, o histórico clínico do paciente e a resposta ao anticorpo, e do diagnóstico do médico. O anticorpo é adequadamente administrado ao paciente de uma vez ou no decorrer de uma série de tratamentos. Dependendo do tipo e da severidade da doença, cerca de 1 ug/kg a 15 mg/kg (por exemplo, 0,1 mg/kg a 10 mg/kg) de anticorpo pode ser uma — dosagem candidata inicial para administrar ao paciente, por exemplo, tanto por uma ou mais administrações separadas como por infusão contínua. Uma dosagem diária típica pode variar de cerca de 1 ug/kg a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Para administrações repetidas no decorrer de vários dias ou mais tempo, dependendo da condição, o tratamento seria geralmente mantido até ocorrer uma supressão desejada dos sintomas da doença. Uma dosagem exemplar do anticorpo seria na faixa de cerca de 0,05 mg/kg a cerca de 10 mg/kg. Dessa forma, uma ou mais doses de cerca de 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg ou 10 mg/kg (ou qualquer combinação dessas) pode ser administrada ao paciente. Essas doses podem ser administradas intermitentemente, por exemplo, a cada semana ou a cada três semanas (por exemplo, de modo que o paciente receba cerca de duas a cerca de vinte ou, por exemplo, cerca de seis doses do anticorpo). Uma dose de carga inicial mais alta pode ser administrada, seguida de uma ou mais doses mais baixas. O progresso dessa terapia é facilmente monitorado por técnicas e ensaios convencionais.

Entende-se que qualquer uma das formulações ou métodos terapêuticos acima podem ser executados com o uso de um imunoconjugado da invenção no lugar de, ou em adição a um anticorpo anti-LRP6.

H. ARTIGOS DE FABRICAÇÃO Em outro aspecto da invenção, é fornecido um artigo de fabricação que contém materiais úteis para o tratamento, prevenção e/ou diagnóstico das disfunções descritas acima. O artigo de fabricação compreende um recipiente e um rótulo ou bula no recipiente ou associada a esse. Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas, bolsas para solução |V, etc. Os recipientes podem ser fabricados a partir de uma variedade de materiais, como vidro ou plástico. O recipiente contém uma composição que é por si mesma ou combinada com outra composição, efetiva para tratamento, prevenção e/ou diagnóstico da condição e pode ter um orifício de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser uma bolsa de solução intravenosa ou um frasco que tem uma tampa perfurável para uma agulha de injeção hipodérmica).

Pelo menos um agente ativo na composição é um anticorpo da invenção. O rótulo ou bula indicam que a composição é usada para tratar a condição recomendada. Além disso, o artigo de fabricação pode compreender (a) um primeiro recipiente com uma composição contida no mesmo, em que a composição compreende um anticorpo da invenção; e (b) um segundo recipiente com uma composição contida no mesmo, em que a composição compreende um agente citotóxico adicional ou de outro modo um agente terapêutico.

O artigo de fabricação nessa realização da invenção pode, além disso, compreender uma bula indicando que as composições podem ser usadas para tratar uma condição específica.

De maneira alternativa ou adicionalmente, o artigo de fabricação pode, ainda, compreender um segundo (ou terceiro) recipiente que compreende um tampão farmaceuticamente aceitável, como água bacteriostática para injeção (BWFI), fosfato tamponado salino, solução de Ringere solução de dextrose. Além disso, pode incluir outros materiais desejáveis do ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas.

Deve-se entender que qualquer um dos artigos de fabricação acima podem incluir um imunoconjugado da invenção no lugar de, ou em adição a um anticorpo anti-LRP6. Il. EXEMPLOS A seguir estão os exemplos de métodos e composições da invenção. Entende-se que várias outras realizações podem ser praticadas, dada a descrição geral fornecida acima. EXEMPLO 1

PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS

CULTURA CELULAR E ENSAIOS CELULARES As linhagens celulares de EKVX e M14 cresceram em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino e 2 mM de glutamina; as células JHH-1 cresceram em Meio de Williams E com os mesmos suplementos. Todas as outras linhagens celulares foram obtidas a partir de American Type Culture Collection (ATCC) e mantidas conforme recomendado. As células foram transfectadas com reagente de transfecção FuGENE 6 (Roche) em placas de 24 poços de acordo com as recomendações do fabricante. Para os ensaios de luciferase repórter, uma mistura de DNA de ' expressão do plasmídio foi transfectada: 7,5 ng de TOPglow (Upstate) ou luciferase de WNT repórter de vagalume TOPbrite (Zhang et a/., 2009), 0,5 ng de luciferase pRL-SV40 de Renilla (Promega) e 1 ng de LEF1. As células foram tratadas com anticorpos durante 16 a 20h, começando 24h depois da transfecção. A proteína Wnt3a (purificada de acordo com X ou adquirido de R&D Systems) foi adicionada às células que começaram 1h depois do início do tratamento com anticorpo. As células foram coletadas em 150 ul de tampão de lise (DeAlmeida et a/l., 2007) e a luminescência foi testada por 30 a 50 ul de lisato com o uso de Dual-Glo Luciferase System (Promega) e Envision Multilabel Reader (PerkinElmer). Os níveis de luciferase de vagalume foram normalizados para eficácia de transfecção para os níveis de luciferase de Renilla e as unidades relativas de luciferase (RLU) foram adicionalmente normalizadas para o nível nas células não estimuladas com Wnt3a.

As linhagens celulaaes HEK293 e Hs578T se integraram — estavelmente com o repórter TOPbrite e foram selecionadas para resistência à higromicina. A expressão de luciferase repórter de Wnt é normalizada para numerar a célula com base na estabilidade integrada do ensaio de luciferase de Renilla induzida por SV40 para as células HEK293 ou no ensaio de viabilidade celular MultiTox-Fluor (Promega) para as células Hs578T. Os constructos de quimera de Wnt foram feitos por clonagem inteira : de Wnt1 ou Wnt3a a montante de FZD4, FZD5 ou LRP6 inteiro no vetor de expressão de pRK5. O ligante de 24 aminoácidos (GGGSGGGT)3 foi inserido entre as sequências de Wnt e FZD ou LRP6 (Cong et a/., 2004). O anticorpo variante YW211.31 de um braço foi produzido em E. coli —porcoexpressão das cadeias pesadas e leves de YW211.31.62 com um domínio Fc truncado com o uso de tecnologia de engenharia “protuberâncias em orifícios (Ridgway, J.B.B. et al., Protein Engineering 9:617-621 (1996). Para o anticorpo de reticulação, o anticorpo IgG anti-humano de cabra específico para Fc ou o . fragmento F(ab')2 (Sigma-Aldrich) foi incubado com o anticorpo YW211.31 de um —braçodurante 1h antes de adicionar a mistura às células.

Para a análises de Western, 1,2 x 10º células de HEK293 foram semeadas em placas de 10 cm e tratadas 3 dias depois com 10 ug/ml de anticorpo ou X ug/ml de DKK1 (R&D Systems) ou proteina Fzd8CRD-Fc (DeAlmeida et al., 2007) durante 1 h antes de adicionar 0,2 ug/ml de proteína Wnt3a por um tempo — adicional de 1h. As células foram lavadas duas vezes com PBS frio e lisadas em 0,5 ml de tampão de lise em gelo. 20 ug de proteína foi eletroforeticamente resolvida em um gel de SDS-poliacrilamida desnaturada (4 a 12%), transferida para membrana de nitrocelulose contra fosfo e LRP6 total (Cell Signaling Technology), B-

catenina (BD Transduction Laboratories), B-actina e GAPDH. As proteínas foram visualizadas com o uso de anticorpos secundários marcados com infravermelho (Rockland Immunochemicals) e gerador de imagem Odyssey (LI-COR). Para a análise de expressão de PCR quantitativo em tempo real —(qPCR),oRNA foiisolado a partir das células com o uso do kit RNeasy (QIAGEN) e as reações foram realizadas com o Kit de Reagentes TagMan One-Step RT-PCR Master Mix (Applied Biosystems) no 7900 HT Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems). Os níveis de RNA relativos foram calculados com o uso do método de AACt e normalizados para níveis de RNA de GAPDH humano ou de Rpl19 de | 10 camundongo e adicionalmente normalizados para amostras de células sem adição ' (NA) de Whnt3a, anticorpo ou outras proteínas. O primer e conjuntos de sonda, listadas 5' a 3' para primer forward, primer reverso e sequências de sonda, respectivamente, são SP5: AATGCTGCTGAACTGAATAGAAA (SEQ ID NO: 32), AACCGGTCCTAGCGAAAMA (SEQ ID NO: 33), CCGAGCACTGTTTCAAATCTCCCA (SEQ ID NO: 34); ZNRF3: TGAGAGTGTGACATTGTTGGAA (SEQ ID NO: 35), GTAAAATCTGTGTGCAATTATCATGT (SEQ ID NO: 36), AATCATTGAAAATGACTAACACAAGACCCTGTAAAT (SEQ ID NO: 37); Mmp7 de camundongo: TEAGGACGCAGGAGTGAA (SEQ ID NO: 38), CCCAGAGAGTGGCCAAAT (SEQ ID NO: 39), CCTGTTTGCTGCCACCCATGA (SEQ ID NO: 40).

Os primers e sondas usados para APCDD1, AXIN2, GAD1, LEFTY2 e SAX1 humano e para Rpl19 e Axin2 de camundongo foram anteriormente descritos (DeAlmeida, et al. (2007); Liu et a/., (2010)).

Os primers e as sondas de GAPDH foram adquiridos da Applied Biosystems. Para os ensaios de gene repórter e qPCR, todas as figuras representam a média e o desvio padrão de três ou quatro replicantes experimentais.

SELEÇÃO E MATURAÇÃO DE AFINIDADE DE AnNTICORPO LRP6

Os fragmentos de cDNA de LRP6 humano que codificam as regiões E1-E2 (aminoácidos A19-R644 da SEQ ID NO: 29) e E3S-E4 (aminoácidos V629-G1244 da SEQ ID NO: 29) foram separadamente clonadas em um vetor de expressão de mamífero que continha a sequência sinal de HSVearegiãoFc de lgG humana como um tag de proteína (SEQ ID NO: 30 (E1-E2-fo); SEQ ID NO: 31 (E3S-E4-fo)). As proteínas LRP6.E1-E2-Fe e LRP6.E3-E4-Fc foram expressas em células de CHO por transfecção transitória e purificada por cromatografia de afinidade de Proteína A/G.

As proteinas LRP6.E1-E2-Fc e LRP6.E3-E4-Fc também foram usadas | 10 individualmente para selecionar uma biblioteca de exibição por fago de Fab sintético humano.

Depois da seleção na proteína LRP6 imobilizada, os clones de fago foram isolados e confirmados por ELISA de fago para ligação ao fragmento de proteína de fusão LRP6-Fc e sem proteína de Fc.

Os clones de Fab em fago foram, então, reformatados para expressão como anticorpos —monoclonais de IgG1 humanos. 24 clones da cadeia pesada do anticorpo único contra LRP6.E1-E2-Fc e 22 clones contra LRP6.E3-E4-Fc foram transfectados e de forma transitória expressos em células HEK293 com uma cadeia leve kappa humana derivada de Herceptina e a proteina IgG foi purificada por cromatografia de afinidade.

As preparações de anticorpos de grande escala subsequentes foram produzidas por transfecção transitória em células de CHO.

O anticorpo YW211.31 foi maturado por afinidade com o uso da proteína LRP6.E3-E4 marcada com His.

Três combinações diferentes de alças de CDR (H1/L3, H2/L3 e H3/L3) foram marcados para randomização em bibliotecas separadas por resíduos selecionados por randomização leve.

Além disso, acombinação de CDR L1/L2/L3 foi direcionada para randomização forte.

No primeiro ciclo de seleção, o fago das bibliotecas randomizadas foram selecionados com proteína LRP6.E3-4-His imobilizada, seguido por cinco ciclos de seleção de solução de fase na qual a concentração de LRP6.E3-4-His foi graduamente reduzida de 300 nM para 0,5 nM e um excesso de 100 vezes de proteína LRP6.E3-4-Fc foi adicionado para depletar os anticorpos com taxas de dissociação mais rápidas.

Onze clones de fago foram purificados e todos mostraram afinidade aprimorada para LRP3.E3-E4 conforme determinado por ELISA de competição em fago.

A sequência desses clones exibiu de 1 a 6 alterações de aminoácidos na CDR-H1, CDR-H3 e CDR-L3. As constantes da taxa de dissociação dos anticorpos purificados foram avaliadas por análise de ressonância plasmônica de superfície com o uso de um instrumento BlAcore.

ENSAIO DE LIGAÇÃO DE PROTEÍNA LRP6 DE INTERFEROMETRIA DE BIOCAMADA i 10 A interferometria de biocamada foi realizada conforme 1 anteriormente descrito (Bourhis et a/., 2010). Por curto tempo, as proteínas LP6 marcadas com His foram purificadas por células de inseto infectado com baculovírus com o uso do sistema AviTag (GeneCopoeia). As cinéticas de ligação foram medidas no Octet RED System (ForteBio) com o uso de —Biossensores FA de Alta Ligação de Estreptavidina carregados com 20 ug/ml de proteina LRP6. Wnt3ôa humano purificado sem veículo e Wnt9b de camundongo foram obtidos da R&D Systems e a proteina DKK1 purificada foi i produzida conforme anteriormente descrito (Bourhis et a/., 2010). , ESTUDOS DE TUMORES E Ossos Os tumores de camundongos transgênicos MMTV-Wnt1 foram passados em coxins adiposos de mamífero de camundongos de C57BL/6, mecanicamente e enzimaticamente dissociados, ressuspensos em Matrigel e Solução Salina Equilibrada de Hank (HBSS) e injetado no coxim adiposo de mamífero de camundongos nu NCr atímico (Taconic). Os tratamentos foram iniciados uma vez que os volumes tumorais atingiram 250 a 800 mmº.

Para cada grupo de tratamento, dez camundongos foram administrados com 30 mg/kg de anticorpo ou proteína por via intraperitonial (IP) a cada dois dias.

O volume tumoral foi analisado com o uso de calibre de medição.

O crescimento tumoral e os estudos in vivo de xenoenxerto Ntera- 2 foram realizados conforme anteriormente descrito (DeAlmeida et a/., 2007). Por curto tempo, os camundongos nus atímicos NU/NU (Charles River) foram injetados por via subcutânea com 10 milhões de células de Ntera-2 (em —Matrigela50% em HBSS) por camundongo, dividido em grupos de quatro ou cinco animais, uma vez que os volumes tumorais médios atingiram de 535 a 595 mm? e injetados com uma dose IP única de 100 mg/kg de anticorpo ou 30 mg/kg de proteina FZd8CRD-Fc.

As amostras tumorais e de soro sanguíneo foram coletadas 16 h depois do tratamento.

Os tumores foram i 10 —homogeneizados com o uso do sistema TissueLyser (QIAGEN) e o RNA foi extraído com o uso do kit RNeasy (QIAGEN). As calvárias foram coletadas e cultivadas conforme descrito por Mohammad et a/., 2008. Por curto tempo, as calvárias foram dissecadas de filhotes de camundongo de 2 dias de idade, cortadas pela metade e separadas da dura máter, vasos e escalpo.

As calvárias foram cultivadas em placas de cultura de tecido em meio BGJb suplementado com albumina de soro bovino a 0,1% e 100 U/ml cada de penicilina e estreptomicina durante 1 dia antes de tratar com 10 ug/ml de anticorpo ou proteína durante 7 dias.

Os ossos foram cultivados em uma atmosfera umidificada de 5% de CO, a 37ºC.

Foram obtidas imagens de calvária de camundongo com um sistema de micro-CT de raio-x pCT 40 (SCANCO Medical, Basserdorf, Suiça). Os dados de micro-CT foram adquiridos com os seguintes parâmetros: nível de energia do tubo de raio-x = 45 kV, corrente = 177 JA, tempo de integração = 300 mseg, 2000 projeções.

As imagens axiais foram obtidas em uma resolução isotrópica de 6 um.

Foi usado para calibração um fantom de hidroxiapatita (HA). As imagens de micro-CT foram analisadas com Analyze (AnalyzeDirect Inc., Lenexa, KS, USA). As projeções de intensidade máxima e as interpretações de superfície tridimensionais no plano transversal foram criadas para cada amostra.

As margens ósseas parietais foram manualmente desenhadas com o uso da ferramenta Trace a fim de segmentar a região parietal. Dentro dessa região, foram calculados o volume da amostra e a densidade mineral óssea média (BMD). Um limiar de 0,3 gm-HA/cmº foi aplicado à região a fim de calcular a —BMD média apenas de tecido calcificado dentro da região. O limiar também foi usado para calcular a porcentagem de volume calcificado da região parietal por divisão do número de voxels de calcificado sobre o total de voxels para a região parietal. Os parâmetros a seguir foram analisados para cada amostra: volume da região parietal, BMD de voxels calcificado da região parietal e a porcentagem da região parietal calcificada. As diferenças entre os grupos foram consideradas significativas se os valores de p foram menores que 0,05 pelo teste de Dunnett. Todos os experimentos com o uso de camundongos foram realizados de acordo com as diretrizes da Genentech Institutional Animal Care and Use Committee. EXEMPLO 2

ISOLAMENTO DE ANTAGONISTA DE WNT E POTENCIALIZAÇÃO DE ANTICORPOS MonocrLoNnAIs LRP6 Para desenvolver as moléculas terapêuticas candidatas para manipular a sinalização de Wnt, foram gerados os anticorpos que podem inibir ou aumentar sinalização induzida pela proteina Wnt3a. LRP6.E1-E2-Fc recombinante (SEQ ID NO: 30) e LRP6.E3-E4-Fc (SEQ ID NO: 31) foram usadas proteínas para seleção de uma biblioteca de exibição por fago de Fab sintético humano e confirmada a ligação de clones de fago isolados para LRP6 —porELISA. 24 clones únicos da cadeia pesada do anticorpo contra LRP6.E1-E2 e 22 clones contra LRP6.E3-E4 foram isolados, reformatados e expressos como anticorpos IgG1 humanos. Seis dos anticorpos LRP6.E3-E4 inibiram em uma forma dependente de concentração a atividade de luciferase repórter de

Wnt em células HEK293 induzidas com 0,1 mg/ml de Wnt3a purificada (Figura 1A.

Barras de erro desse e de todos os outros gráficos, exceto onde apontado, representam o desvio padrão de, pelo menos, 3 amostras de replicação). Esses anticorpos foram designados a YW211.03, YW211.08, YW211.11, YW211.12, YW211.31 e YW211.33. Nenhum dos anticorpos LRP6.E1-E2 exibiram essa inibição.

O anticorpo YW211.31 que reconhecem o domínio LRP6.E3-E4 foi o mais potente na sinalização da inibição em células HEK293 estimuladas por Wnt3a, com um IC50 de aproximadamente 1 ug/ml (ou 6 nM). O anticorpo YW211.31 inibiu fosforilação de LRP6 induzida por Wntda e a estabilização de proteínas B-catenina sem afetar os níveis de proteína LRP6, semelhante às proteínas Fzd8CRD e DKK1 purificadas (Figura 1B, que mostra a análise de Western de células HEK293 tanto não estimuladas ou induzidas com Wnt3a e tratadas com anticorpo LRP6 indicado ou proteína purificada (níveis de proteína b-actina e GAPDH são mostrados como controles de carregamento da amostra)). Os experimentos de RNAi demonstraram que apenas a banda de peso molecular inferior reconhecida pelo anticorpo policlonal b-catenina representa a proteína b-catenina.

O anticorpo YW211.31 também pode antagonizar a função de Lrp6 de camundongo, uma vez que ele inibiu parcialmente a atividade repórter induzida por Wnt3a em células de NIH/ST3de camundongo e a estabilização da proteína B-catenina em células L de camundongo.

O anticorpo YW211.31 tem uma afinidade de ligação de cerca de 2 nM por ressonância plasmônica de superfície (SPR) e 0,6 nM por análise de Scatchard.

Para aprimorar a afinidade e a possível potência do anticorpo YW211.31, 0 clone foi maturado por afinidade com o uso da proteina E3-E4 de LRP6 marcada por His e as bibliotecas combinatórias de CDR nas quais os resíduos de CDR selecionados foram direcionados para randomização.

Quatro clones de fago que mostram a maioria da afinidade aprimorada por ELISA de competição em fago YW211.31.11, YW211.31.11, 35, YW211.31.57 e YW211.31.62 foram reformatados e expressos como IgGs humanas inteiras. As constantes da taxa de dissociação de todos as quatro IgGs maturadas por afinidade foram reduzidos, levando a afinidades aprimoradas para os dois — melhores anticorpos, YW211.31.57 e YW211.31.62, de KD 0,27 e 0,17 nM, respectivamente. YW211.31.57 e YW211.31.62 também mostraram potência aprimorada na inibição de sinalização em células HEK293 estimuladas por Wnt3a com valores de IC50 de aproximadamente 0,1 ug/ml (0,6 nM).

Nenhum dos anticorpos se isolou na seleção de sinalização ativada em células HEK293 na ausência de estímulo com proteina Wnt3a exógena, no entanto, cinco dos anticorpos LRP6 E1-E2 e dois dos anticorpos E3-E4 potencializaram sinalização induzida por Wnt3a, pelo menos, 2 vezes. Em células NIH/8T3 de camundongo, YVW210.09, um anticorpo E1-E2 também potencializou sinalização induzida por Wnt3a pelo menos, 1,5 vezes, indicando que ele também reconhece LRP6 de camundongo. Em células de HEK293, a magnitude de aumento de sinalização induzida por Wnt3a por anticorpo YVW210.09 é proporcional à concentração de Wnt3a (Figura 1C). O anticorpo YVW210.09 interage com a proteina E1-E2 de LRP6 humana com um KD de 5 nm, conforme medido por análise de SPR. O teste de ELISA mostra que todos os anticorpos antagonistas e que potencializam especificamente se ligam apenas ao fragmento de proteína LRP6 envolvida durante seu isolamento e nenhum reconhece tanto E1-E2 como E3-E4. A análise de FACS indicou que a proteina E1-E4 de LRP6 solúvel bloqueia de maneira eficiente e completa a ligação de YW211.31.57 e YW210.09 para as células HEK293, que indicam — que esses anticorpos não reconhecem outras proteínas de superfície celular.

EXEMPLO 3 EFEITOS DOS ANTICORPOS MONOCLONAIS LRP6 NA SINALIZAÇÃO AUTÓCRINA DE

WNT

A capacidade dos anticorpos LRP6 para antagonizar ou potencializar sinalização endógena ou autócrina de Wnt foi determinada com o uso de uma variedade de linhagens celulares tumorais (Bafico et a/., 2004; DeAlmeida et al, 2007; Akiri et al., 2009). Nas linhagens celulares de —teratocarcinoma PA-1 e NTERA-2, o anticorpo YW211.31 inibe atividade repórter induzida pela sinalização autócrina de Wnt com potência semelhante àquela observada com Wnt3a exógena (Figura 2A que mostra a inibição e a potencialização de sinalização autócrina de Wnt em células de teratocarcinoma de PA-1 transfectadas com luciferases repórteres e tratadas com anticorpos LRP6, tanto individualmente como em combinação, ou proteína FZd8CRD-Fce (controle positivo)).

Em células PA1, a inibição de sinalização de Wnt pelo anticorpo YW211.31 também é observada para a expressão de genes alvo Wnt endógenos (Figura 2B). A Figura 2B mostra os resultados de análise de expressão de qPCR dos genes SAX1 e GAD1 induzidos por Wnt e LEFTY2 do gene reprimido por Wnt em células PA-1 tratadas com ou sem 0,3 mg/ml de proteína Wnt3a e tratados com 10 mg/ml de anticorpo YW211.31, anticorpo monoclonal anti-gD como um controle negativo ou proteina FZzd8CRD-Fe como uma amostra controle positiva e adicionalmente normalizados para amostras decélulassem adição (NA) de Wnt3a. O anticorpo inibe parcialmente a expressão de SAX1, GAD1 e APCDD1 que é induzido tanto pela proteína Wnt3a exógena como mantida por sinalização de Wnt autócrina endógena. Inversamente, a repressão da expressão de LEFTY2 pela proteína Wnt3a ou sinalização autócrina de Wnt é aliviada pelo anticorpo YW211.31. Em contraste a YW211.31, o anticorpo YW210.09 potencializa tanto sinalização autócrina de Wnt como induzida por Whnt3a em linhagens celulares PA-1 e NTERA-2 por ensaios de gene reporter (Figura 2A). Enquanto a inibição de sinalização de Wnt pelo anticorpo

YW211.31.57/ aumenta progressivamente com a maior concentração do anticorpo, a potencialização por YW210.09 e outros anticorpos pode diminuir em altas concentrações de anticorpo em alguns tipos celulares, como as células PA-1. Isto pode sugerir que a dimerização do receptor de LRP6 é — necessária para a potencialização, uma vez que as altas concentrações do anticorpo favoreceriam as interações monovalentes e, assim, o limite da reticulação das moléculas de LRP6. O tratamento das células de PA-1 ou NTERA-2 com uma combinação dos anticorpos YW211.31.57 e YW210.09 antagoniza tanto a sinalização autócrina de Wnt como induzida por Wnat3a, similar ao efeito do YW211.31.57 sozinho.

Para identificar as linhagens celulares adicionais que exibem a sinalização autócrina de Wnt, as linhagens celulares com expressão relativamente alta de MRNA de Axin2 ou fosfo-LRP5/6 foram testados para a inibição de sinalização de Wnt pela proteína FZd8CRD-Fc em testes de gene repórter de luciferase de Wnt. Nove linhagens celulares exibiram a sinalização autócrina de Wnt que foi inibida pela proteina FZd8CRD-Fc, incluindo as células NSCLC NCI-H23 e NCI-H2030 e as células de sarcoma de tecido macio SW872 e HT-1080 que foram anteriormente relatados para ter a sinalização endógena de Wnt com base nos testes com outros antagonistas Wnt (Guo et al,2008; Akiri et a/., 2009; Nguyen et a/., 2009). A Figura 3 mostra um resumo dos dados analisados por análise de variância de uma via (ANOVA) (com valor de p <0,01). Os testes foram realizados com o uso de 10 mg/ml dos anticorpos, exceto para as células NCI-H358 e HT-1080 que foram tratadas com 1 mg/ml do anticorpo YW211.31.57 ou YW210.09, respectivamente, para aumentar a potencialização dos efeitos.

A sinalização de Wnt foi ainda induzida em todas as nove linhagens celulares por proteína Wnt3a exógena e o anticorpo YW211.31.57 inibiu esta resposta a Wnt3a (Figuras 3, 4A, 4D e 4F). Surpreendentemente, o anticorpo YW211.31.57 potencializou sinalização autócrina de Wnt em todas as nove linhagens celulares, enquanto que YVW210.09 potencializou sinalização autócrina de Wnt em cinco linhagens e inibiu em três linhagens (Figuraa 3, 4A a 4C, 4E e 4F). Esta atividade recíproca do anticorpo YW211.31.57 sobre a sinalização autócrina e induzida por Wnt3a foi observada não apenas com o uso de luciferase repórter, mas também para a expressão dos genes alvo de Wnt endógenos, como Axn2 nas seis linhagens celulares testadas (Figuras 4A, 4B e 4C). Nas linhagens celulares de EKVX e de Hs578T de carcinoma de mama, o aumento na sinalização de Wnt pelo anticorpo YW211.31 foi confirmado como dependente de Wnt(s) autócrina(s) pela demonstração de que este aumento é bloqueado pela proteína FZd8CRD-Fc (Figura 46). À potencialização de sinalização de Wnt autócrina em células EKVX e Hs578T é também observada com outros cinco antagonistas do anticorpo de sinalização induzida por Wnt3a identificados na seleção.

Na Figura 4A, a análise de expressão de qPCR de mRNA AXIN2 em HT-1080, EKVX, NCI-H358 e Hs578T indica que o anticorpo YW211.31.57 (25 mg/ml) potencializa sinalização autócrina de Wnt (NA) e inibe sinalização induzida por Wnt3a (0,2 mg/ml), enquanto Fzd8CRD-Fc (25 mg/ml) antagoniza tanto a sinalização autócrina (NA) como induzida por Wn3a.

Nas Figuras 4B e 4C,aexpressão do gene induzido por WnT em células NCI-H23 (B) e M14 (C) é potencializado por YW211.31.57 e antagonizado pelo anticorpo YW210.09 (30 mg/ml). Os tratamentos de Wnt3a (0,2 mg/ml) e de FZd8CRD-Fc (30 mg/ml) são mostrados como controles positivos para a potencialização e a inibição, respectivamente, de sinalização autócrina de Wnt e a proteína CD4-Fc (B)ouo anticorpo anti-cgD (C) serve como um controle negativo (30 ma/ml). Para as células M14 (C), a expressão de AXIN2 e SP5 é potencializada mais vigor pela proteína Wnt3a ou anticorpo YW211.31.57 do que a expressão de APCDD1 e ZNRF3. As Figuras 4D e 4E mostram que nas células Hs578T estavelmente integradas com luciferase repórter de Wnt, o anticorpo YW211.31.57 mostra a inibição dependente da concentração da sinalização estimulada por Wnt3a (D) e a potencialização de sinalização autócrina de Wnt (E), enquanto a proteína FZd8CRD-Fc e o anticorpo YVW210.09 potencializa sinalização com ou sem (NA) estímulo de 0,1 mg/ml de Wnt3a. Os experimentos de RNAi indicam que pelo menos 41% da sinalização induzida por Wnt3a em células Hs578T é dependente da expressão de LRP5 e esta sinalização é prevista como sendo inibida pela proteína Fzd8CRD-Fc, mas não pelo anticorpo YW211.31.57. Neste experimento, a luciferase orientada por SVA40 foi não transfectada para normalização e, em vez disso, os tratamentos do anticorpo e da proteína foram confirmados independentemente como não apresentando efeito significativo sobre a viabilidade desta linhagem celular. As Figuras 4F e 4G mostram que as células EKVX transfectadas com a luciferase repórter de Wnt também exibem a potencialização de sinalização autócrina de Wnt e antagonismo da sinalização induzida por WNt3a pelo anticorpo YW211.31.57. A potencialização mediada por anticorpo de sinalização autócrina de Wnt é inibida por 5 mg/ml de Fzd8CRD-proteína Fc.

EXEMPLO 4 ATIVIDADES RECÍPROCAS DE ANTICORPOS LRP6 EM DIFERENTES ISOFORMAS DE WnNnT O anticorpo YW211.31 inibe sinalização induzida pela proteina Wnt3a exógena em todas as linhagens celulares, mas pode ainda inibir ou potencializar sinalização autócrina de Wnt de uma maneira dependente da linhagem celular, o que sugere que a isoforma de Wnt específica que orienta o sinal autócrino especifica a atividade do anticorpo. Portanto, a atividade do anticorpo sobre a sinalização induzida pela expressão exógena de Wnt3a e outras isoformas de Wnt foi determinada. A sinalização de Wnt induzida pela transfecção de Wnt3a nas células HEK293 ou Hs578T é inibida pelo anticorpo

YW211.31.57 com potência similar à inibição da sinalização induzida pelo tratamento da proteína Wnt3a.

Surpreendentemente, a sinalização induzida pela expressão de Wn1 em ambas as linhagens celulares foi potencializada pelo anticorpo YW211.31.57. Ambas as sinalizações de Wnt1 e Wnt3a são inibidas pela proteina FZd8CRD-Fc, como esperado.

A potencialização de sinalização também foi observada com os outros anticorpos antagonistas Wnt3a identificados na seleção.

O anticorpo YWZ210.09 também exibiu atividades opostas contra a sinalização induzida por Wnt3a e Wnt1, que foram as atividades recíprocas de YW211.31.57; isto é, a potencialização de Wnt3a e a inibição de sinalização de Wnt1. O anticorpo YW210.09 também inibe sinalização de Wnt1 no crescimento de células tumorais em cultura de tumores de camundongo MMTV-Wnt1, como observado pela expressão reduzida dos genes alvo Wnt Axin2 e Mmp7 a um nível similar ao do tratamento de Fzd8CRD-proteína Fc.

Nas células MMTV-Wnt1, o anticorpo YW211.31.57 falhou em potencializar sinalização de Wnt1l, possivelmente devido à sinalização de Wnt1 já ser máxima nessas células.

Ao demonstrar que os anticorpos YW211.31.57 e YW210.09 apresentam atividades recíprocas na sinalização de Wnt iniciada por Wnt3a e Wnt1, esta análise também foi realizada em mais 11 de 19 genes Wnt que induzem mais que dobro de luciferase repórter em células HEK293. A Figura 5 fornece um resumo dos dados, ensaios realizados com o uso de 10 ug/ml dos anticorpos, 10 pg/ml de FZd8CRD.

Apenas as atividades Wnt3a e Wnt3 inibidas pelo anticorpo YW211.31.57 e ambas são potencializadas por YW210.09. Sete isoformas de Wnt além da WNt1 são potencializadas por YW211.31.57 e —inibidas por YW210.09. Uma terceira classe de isoformas de Wnt (Wnt7a, 7b e 10a) exibe a atividade de sinalização que não é exibida pelo anticorpo e é potencializada por pelo menos YW211.31.57. Nas células Hs578T transfectadas com as diferentes isoformas de Wnt, os anticorpos exibem a maiorias destas mesmas atividades.

Em especial, YW211.31.57 inibe Wnt3 e Wnt3a e potencializa todas as 11 das outras isoformas de Wnt que induzem a luciferase repórter pelo menos em duas vezes.

YVW210.09 também potencializa Wnt3 e Wnt3a em células Hs578T, bem como inibe 5 das 7 isoformas de Wnt que são antagonizados em células HEK293 e capazes de serem testadas em células Hs578T.

As outras duas isoformas de Wnt nesta classe, Wnt8a e Wnt9b, não são afetadas pelo anticorpo YW210.09 nas células Hs578T.

Uma vez que os experimentos de RNAi indicam que a sinalização de Wnt3a em Hs578T, mas não em células HEK293 é transferida por LRP6 e LRP5, Wnt 8a e Wnt9b podem sinalizar principalmente por meio de LRP5 nas células Hs578T.

Como nas células HEK293, as isoformas de Wnt na terceira classe não são inibidas por ambos os anticorpos nas células Hs587T e podemos adicionar a esta classe Wnt4, que não induz a sinalização nas células HEK293. Apenas a atividade de Wnt7b nesta classe se comporta de maneira diferente porque o anticorpo YW210.09 potencializa sua sinalização em Hs578T, mas não nas células HEK293. Ao contrário das atividades específicas da isoforma de Whnt dos anticorpos YW211.31.57 e YW210.09, a proteína FZd8CRD-Fc pode inibir com potência a atividade de todas Wnts com a exceção de Wnt6 e Wnt9b nas células HEK293. Nas células Hs578T, a sinalização autócrina de Wnté potencializado pelos anticorpos YW211.31.57 e YWZ210.09, como é a sinalização induzida pela expressão de Wnt4, Wnt7a e Wnt7b.

Assim, essas três isoformas de Wnt são candidatas para aqueles que orientam a sinalização autócrina nas células Hs578T.

Vários siRNAs contra Wnt7b, mas não as outras isoformas de —Wnt, inibem sinalização autócrina em células Hs578T, identificando a proteína Wnt específica que media a sinalização.

Uma vez que a sinalização autócrina de Wnt em células PA-1 é inibida pelo anticorpo YW211.31.57 e potencializada por YW210.09, Wnt3 ou Wnt3a provavelmente ativa sinalização endógena nestas células.

Realmente, siRNAs contra Wnt3, mas não Wnt3a inibe a sinalização autócrina de Wnt em células PA-1. Em células NCI-H23 NSCLC e em células de melanoma M14, a potencialização de sinalização autócrina de Wnt pelo anticorpo YW211.31 e o antagonismo por YW210.09 são consistentes coma sinalização endógena que inibe o RNAi de Wnt2 em célula NCI-H23, e com a expressão endógena de Wnt1 em células M14. com o uso de vários SIiRNAs, confirmamos que a expressão de Wnt2 em células NCI-H23 e células

Wnt1 em M14 são necessárias para a sinalização autócrina de Wnt.

Uma vez que todos os anticorpos isolados da seleção no Exemplo 2 que antagonizam a sinalização em células HEK293 estimuladas por Wnt3a também inibem a estimulação de Wnt3a em todas as outras linhagens testadas e também inibem sinalização autócrina de Wnt em linhagens celulares de teratocarnoma, foi inesperada que esses anticorpos potencializam sinalização autócrina de Wnt em outras 9 linhagens celulares testadas.

Além disso, o anticorpo YW210.09 potencializa sinalização de Wnt3a em todas as linhagens celulares e aumenta a sinalização autócrina em 7 linhagens celulares, mas inibe sinalização endógena em 3 outras linhagens.

Esses estudos mostram que as diferentes isoformas de Wnt (expressas na mesma linhagem celular) determinam a atividade dos anticorpos LRP6 e que o antagonista de Wnt3a e anticorpos que potencializam também têm efeitos recíprocos na maioria das outras proteínas Wnt.

Esses estudos também mostram que a introdução de diferentes isoformas de Wnt na mesma linhagem celular determina a atividade dos anticorpos LRP6, e que o antagonista de Wnt3ôa e anticorpos que potencializam também têm efeitos recíprocos na maioria das outras proteínas —Wnt.

Com base na sua interação funcional com dois anticorpos LRP6, as 14 isoformas de Wnt testadas podem ser agrupadas em três classes: Wnt3 e Whnt3a são inibidas por YW211.31 e potencializadas por YW210.09; Wnts 1, 2, 2b, 6, 8a, 9a, 9b e 10b são potencializados por YW211.31 e antagonizados por

YW210.09; e Wnts 4, 7a, 7b, e 10a são potencializados por YW211.31 e não inibidas por YW210.09 (Figura 5). Essas classificações obviamente não correspondem à filogenia proposta de genes de Wnt, embora a subfamília Wnt3/3a seja a mais divergente evolutivamente (Cho et a/., 2010). EXEMPLO 5

DIFERENTES ATIVIDADES DE ESPECIFICIDADE DE ISOFORMAS DE WANT DE ANTICORPOS LRP6 Diferentes isoformas de Wnt podem se ligar preferencialmente a diferentes isoformas de FZD expressas de forma endógena em várias linhagens celulares e poderia contabilizar hipoteticamente para as atividades diferenciais para nossos anticorpos LRP6. Para examinar essa possibilidade, as proteínas quiméricas que se ligam covalentemente a diferentes pares de Wnt-FZD foram construídas para testar se a isoforma específica para Wnt ou FZD determina a atividade do anticorpo LRP6. Wnt3a ou Wnt1 fundidos a FZD4 ou FZD5 potencialmente ativam sinalização de Wnt nas células HEK293 na ausência presumida da expressão endógena de Wnt, enquanto a superexpressão de FZD4 ou FZDS5 não induz a sinalização de Wnt. O anticorpo YW211.31.57 inibe atividade de sinalização de Wnt3a fundido a FZD4 ou FZD5 e potencializa atividade de Wnt1 fundida a FZD4 ou FZD5 (a Figura 6 fornece um resumo dos dados, ensaios realizados com o uso de 10 pg/ml dos anticorpos, 10 ug/ml de FZd8CRD). O anticorpo YW210.09 mostra a atividade recíproca contra as quimeras Wnt1, que inibem ambos. Assim, a atividade do anticorpo correlaciona com a isoforma Wnt e não com a isoforma FZD. A proteina FZd8CRD-Fc não tem efeito sobre a sinalização induzida por qualquer uma das quatro quimeras Wnt-FZD, — consistentes com as quimeras que funcionam de maneira independentemente do sítio de ligação de FZD de Wnts. A expressão de quimeras que se fundem a Wnt1 ou Wnt3a para LRP6 induzir Wnt que sinaliza muito mais potencialmente que a superexpressão de LRP6. Os anticorpos YW211.31.57 e YW210.09 não são capazes de inibir esta indução, consistentes com a hipótese de que a função inibidora dos anticorpos é dependente do bloqueio da ligação de Wnt para LRP6 (Figura 6). Este estudo confirma que a isoforma de Wnt e não FZD determina as — atividades dos anticorpos. As fusões da proteína quimérica das isoformas de Wnt com LRP6, mas não FZD, são insensíveis à inibição pelos anticorpos LRP6, o que sugere que o antagonismo pode ser mediado pelo bloqueio das interações ligante- correceptor. Isto é confirmado pelos estudos de ligação in vitro para Wnt3a e anticorpo YW210.09, que se liga competitivamente dentro da região E3-E4 de LRP8 e para Wnt9be anticorpo YW211.31, que compete para se ligar à região E1-E2. Os epítopos dos dois anticorpos LRP6, cada um define um sítio de ligação para uma classe diferente de isoformas de Wnt, um dentro de E1-E2 e um dentro dos domínios E3-E4. Pelo menos, um terço do sítio de ligação de Wnt é previsto para as isoformas que não são inibidas pelo anticorpo nem pela combinação, e parece — provável que cada um dos quatro domínios repetidos se liga a um subconjunto diferente de isoformas de Wnt. Esta organização modular pode permitir divergência estrutural dos diferentes Wnts e seus sítios de ligação para acomodar a regulação diferencial pela ligação de Wnt e dos antagonistas de ligação do correceptor, como isoformas de proteína SFRP e DKK, respectivamente. EXEMPLO 6

POTENCIALIZAÇÃO MEDIADA POR ANTICORPO DE SINALIZAÇÃO DE WNT ENVOLVE A DIMERIZAÇÃO DE LRP6 A potencialização de sinalização autócrina de Wnt pelo anticorpo YWZ211.31 necessita de efeitos de avidez, presumivelmente através da dimerização —delRP6.O fragmento Fab monovalente de YW211.31 e do anticorpo YW211.31 de um braço recombinante não exibe potencialização de sinalização autócrina de Wnt em células EKVX e Hs578T em concentrações que inibe sinalização induzida por Wnt3a nestas linhagens celulares. Por outro lado, o fragmento Fab YW211.31 e mAb de um braço inibem Wnt autócrino e a sinalização induzida por Wnt3a na linhagem celular de teratocarcinoma PA-1 com potência semelhante ao anticorpo IgG intacto.

Para testar se a reticulação do anticorpo YW211.31 de um braço restauraria a função potencializadora da molécula de IgG inteira, a linhagem celular de sarcoma de tecido mole HT-1080 que exibe Wnt autócrina e a sinalização induzida por Wnt2 potencializada por anticorpo YW211.31.57 foi usada, bem como a apoptose induzida por anticorpo Apomab que é aumentada por reticulação de Fc (Adams et al., 2008). O anticorpo YW211.31 de um braço não tem efeito sobre a sinalização autócrina de Wnt ou a sinalização induzida por transfecção de Wnt2. Mediante condições de reticulação com os anticorpos anti-Fc que aumentam a apoptose mediada por Apomab, foi determinado que a reticulação do anticorpo de um braço parcialmente reconstitui a potencialização de ambas, sinalização autócrina de Wnt e Wnt2 observada com o anticorpo YW211.31.57 completo.

A potencialização de Wnt mediada por anticorpo precisa da —dimerização do correceptor, uma vez que os formatos de anticorpo de um braço e Fab falham em aumentar a sinalização de Wnt, exceto quando reticulados.

Além disso, os dados com base em células ou dados bioquímicos apresentados no presente pedido indicam que a ligação de Wnt para LRP6 reticulado também é necessária para a potencialização de sinalização, presumivelmente o que reflete em uma exigência para o recrutamento mediado por Wnt de FXD no complexo.

Uma pequena fração do LRP6 superexpresso pode ser identificada como um homodímero na superfície celular e a dimerização precisa do domínio extracelular, entretanto, não é claro se isso contribui para a sinalização da b-catenina independente de Wnt induzida pela superexpressão de LRPG6 (Liu et a/., 2003). À —deleçãodo domínio extracelular LRP6 também ativa a sinalização dependente de Wnt e a dimerização extracelular forçada desta proteína recombinante por métodos diferentes que podem aumentar ou inibir esta atividade (Liu et a/., 2003; Cong et al., 2004). Wnt induz a agregação de LRPG6 e a fosforilação na membrana plasmática que necessita da função de homo-oligomerização da proteína DVL intracelular (Bilic et al, 2007). Esses grandes agregados também contêm Axina e GSK3 e provavelmente inibem a degradação da b-catenina. EXEMPLO 7 — POTENCIALIZAÇÃO MEDIADA POR ANTICORPO DE SINALIZAÇÃO DE WANT POR INIBIÇÃO

DE LIGAÇÃO DE ANTAGONISTAS DE WNT Inibição da atividade de antagonistas de LRP6 extracelular como isoformas DKK1 e SOST também pode potencializar sinalização de Wnt (Niida et a/., 2004). A proteína DKK1 exógena inibe sinalização induzida por Wnt1l em células HEK293 e o anticorpo YW211.31.57 pode bloquear esse antagonismo e até potencializar sinalização em concentração suficientemente elevada na presença da proteína DKK1 (Figura 4G). Em contraste, anticorpo de um braço YW211.31 apenas inibe muito fracamente o antagonismo de DKK1 de sinalização de Wnt1l nessas mesmas concentrações.

O anticorpo completo YW211.31.57 efetivamente antagoniza atividade de DKK1 em todas as concentrações testadas de DKK1, enquanto que o anticorpo de um braço tem efeito mínimo ou nenhum efeito, mesmo em concentração baixa de DKK1. O antagonismo potente de atividade DKK1 exógena observado com o anticorpo YW211.31 de um braço, mas não com o inteiro pode contribuir para a atividade de potencialização de Wnt específica para o anticorpo completo. De maneira alternativa, uma vez que a proteina DKK1 não foi capaz de inibir completamente a sinalização induzida por Wnt1 nesse ensaio, também é possível que o anticorpo YW211.31 intacto simplesmente potencialize o sinal remanescente através de dimerização de LRP6.

Visto que a inibição do anticorpo de interação de DKK1 com LRP6 não necessariamente confere atividade de potencialização de Wnt, e antagonismo de DKK1 parece requerer dimerização de LRP6, a inibição de atividade de DKK1 é provavelmente mediada predominantemente por potencialização de sinalização residual por Wnt ligada ao correceptor.

ExEMPLO 8

ANTAGONISMO DE SINALIZAÇÃO DE WNT PREDOMINA EM COMBINAÇÕES DE AnTICoRPOS LRP6 Os ensaios acima indicam que Wnt3a e Wnt3 se ligam dentro da região E1-E2 de LRP6 e são inibidos a partir da ligação por anticorpo YW211.31.57. São previstas isoformas de Wnt na classe Wnt1 se ligarem a região E3-E4, e essa ligação é bloqueada pelo anticorpo YW210.09. Sem estar ligada a qualquer teoria, a potenciação de sinalização de Wnt poderia ocorrer quando tanto uma isoforma de Wnt como um anticorpo é capaz de se ligar à mesma molécula de LRP6, presumidamente exigindo recrutamento de FZD pela dimerização de Wnt e LRP6 pelo anticorpo. Esse modelo prevê que a combinação de ambos os anticorpos poderiam inibir sinalização induzida por qualquer classe de isoformas de Wnt uma vez que, embora a dimerização de LRPG6 provavelmente ainda ocorra, a ligação de Wnt seria bloqueada por um ou por outro anticorpo. Conforme previsto, o tratamento de células HEK293 simultaneamente com anticorpos YW211.31.57 e YW210.09 inibe sinalização iniciada por expressão tanto de Wnt3a como Wnt1 (Figura 7 e 8A). O ensaio apresentado na Figura 8A foi realizado em células HEK293 estavelmente integradas com luciferase repórter de Wnt que foram transfectadas com constructos de expressão tanto de Wnt3a, Wnt1 como de Wnt3a e Wnt1. Todos os anticorpos e proteínas foram usados em 10 pg/ml cada um. Essa análise foi — estendida a outras três isoformas de Wnt na classe Wnt1 e a combinação de anticorpos YW211.31.57 e YW210.09 foi incluída para inibir sinalização de Wnt para uma extensão semelhante ao YW210.09 sozinho (Figura 7). Quando tanto Wnt3ãa como Wnt1l são expressas simultaneamente, nenhum anticorpo antagoniza sinalização de Wnt, mas a combinação de ambos os anticorpos inibem sinalização (Figura 8A). Uma possível explicação para esse resultado é que cada anticorpo inibe ligação de apenas uma isoforma de Wnt, e ambos os anticorpos são capazes de se ligar simultaneamente às moléculas LRP6 para —bloquearambos os sítios de ligação de Wnt.

As quatro isoformas de Whnt na terceira classe que não são antagonizadas pelos anticorpos YW211.31.57 ou YW210.09 pode se ligar a um sítio no LRP6 não bloqueado por qualquer anticorpo ou, de maneira alternativa, podem ter a capacidade de se ligar a qualquer um dos sítios de ligação de Wnt definidos pelos anticorpos. Para cada uma dessas isoformas de Wnt, a combinação de ambos os anticorpos também não inibe suas sinalizações, mas de preferência potencializa ou não afeta sua atividade, sugerindo que essas isoformas de Wnt podem se ligar a um sítio que é diferente dos epítopos YW211.31.57 e YW210.09 (Figura 7).

As atividades observadas da combinação dos anticorpos YW211.31.57 e YW210.09 na sinalização de Wnt induzidas por isoformas de Wnt exógenas também se estenderam para endógenas, sinalização autócrina de Wnt. Em linhagens celulares de teratocarcinoma PA-1 e Ntera-2, na qual o anticorpo YW211.31.57 inibe e YW210.09 potencializa sinalização autócrina de Wnt, a combinação de anticorpo inibe sinalização (Figura 2A). Em células Hs578T e EKVX, onde ambos os anticorpos potencializam sinalização autócrina de Wnt, a combinação de anticorpo também potencializa (Figura 8B e 80).

EXEMPLO 9 ANTICORPOS LRP6 INIBEM LIGAÇÃO DE WNT A SÍTIOS MÚLTIPLOS DE MANEIRA

DIFERENTE As atividades recíprocas dos anticorpos LRP6 sugeriram que YW211.31.57 YW210.09 interagem com sítios de ligação de isoformas de Wnt distintos no LRP6, e que a ligação de Wnt competiu pelo anticorpo antagonista mas permitiu o anticorpo de potencialização.

Um ensaio de interferometria de biocamada que mede ligações de proteínas Wnt purificadas, fragmentos de proteína de domínio extracelular de LRP6 imobilizado (consulte Exemplo 1) — demonstraram que Wnt3a se liga à região E3-E4 de LRP6, onde o epítopo para o anticorpo YW211.31.57 reside e Wnt9b ( na mesma classe que Wnt1 para interações de anticorpos) liga-se apenas à região E1-E2, onde o anticorpo também se liga a YW210.09 (Bourhis et a/. (2010). O anticorpo YW211.31.57, mas não o YW210.09, inibe ligação de Wnt3a ao fragmento de proteína LRP6.E1-E4 (Figura 9A). De modo contrário, YW210.09 mas não YW211.31.57 inibe ligação de Wnt9b a LRP6.E1-E4 (Figura 9B). Nesses ensaios, permitiu-se que o anticorpo que se liga à proteína LRP6 alcançasse o equilíbrio, e a mudança no comprimento de onda subsequente no padrão de interferência é mostrada para fases de associação e dissociação de ligação às proteínas de Wnt

Inibição mediada por anticorpo de ligação de Wnt também pode ser detectada com o uso de fragmentos de ligação de Wnt menores, E3-E4 para Wnt3a e E1-E2 para Wnt9b (Figura 9C e 9D). O anticorpo de um braço YW211.31 também pode inibir ligação de Wnt3a ao fragmento E3-E4. Além disso, YW211.31.57 e YWZ210.09 também podem ser ligados de maneira sequencial à proteina LRP6.E3-E4 sem competição e quando adicionados em qualquer ordem (Figura 9E). A competição para ligação entre apenas Wnt3a e o anticorpo YW211.31.57, e entre apenas Wnt9b e YVW210.09, em sítios diferentes na proteína LRP6 se correlacionam com a atividade inibidora de cada um dos anticorpos contra a sinalização por uma isoforma de Wnt específica.

O ensaio de interferometria de biocamada previamente mostrou que a proteina DKK1 purificada podia se ligar tanto a fragmentos E3-E4 como

E1-E2 de LRPG6, e que essa ligação poderia inibir ligação de Wnt3a e Wnt9b a essas respectivas regiões de proteínas. (Bourhis et a/. (2010)). Esse ensaio foi usado para demonstrar que os anticorpos YW211.31.57 e YW210.09 podem inibir cada ligação de DKK1 à proteína LRP6.E1-E4). O anticorpo YW211.31.57 também inibe ligação de DKK1 à proteina LRP6.E3-E4, e o anticorpo YW210.09 bloqueia a ligação de DKK1 ao fragmento LRP6.E1-E2. O anticorpo YW211.31 de um braço retém completamente essa atividade inibidora, mesmo que ele não possa potencializar sinalização de Wnt nem antagonizar de maneira significativa atividade de DKK1 na sinalização de Wnt em células. Esse resultado sugere que o antagonismo de DKK1 provavelmente não contribui de maneira significativa para potencialização mediada por anticorpos de sinalização de Wnt EXEMPLO 10 ANTICORPOS LRP6 SÃO ATIVOS EM TUMORES E FORMAÇÃO ÓSSEA INDUZIDOS POR

WNT Para começar a explorar a eficácia terapêutica antitumor dos anticorpos LRP6, foram tratados dois modelos de tumores induzidos por ligante Wnt. Aloenxertos de tumor mamário transgênico de MMTV-Wnt1 dependentes de expressão de Wnt1 e xenoenxertos de teratocarinoma Ntera-2 humano induzidos por sinalização autócrina de Wnt de uma isoforma de Wnt desconhecida (DeAlmeida et al., 2007). Foram usadas células isoladas a partir de tumores mamários de camundongo transgênico MMTV-Wnt1l para estabelecer tumores em camundongos nus atímicos, que foram tratados com anticorpo de dois em dois dias. Foi observado regressão rápida e sustentada do tumor com o anticorpo YWZ210.09, semelhante à proteína FZzd8CRD-Fc (Figura 10A). O anticorpo YW211.31.57 não alterou o crescimento do tumor, mediante essas condições, em comparação ao tampão controle (PBS) ou tratamento com o anticorpo anti-gD. Foi administrado 30 mg/kg de anticorpo ou proteína a cada dois dias nos camundongos (ponta da flecha) (Figura 10A). Esses resultados são consistentes com os efeitos do anticorpo acima descrito sobre a expressão do gene alvo de Wnt para células tumorais MMTV-Wnt1 tratadas em cultura de tecidos.

Células de teratocarcinoma Ntera-2 também foram usadas para estabelecer tumores de xenoenxertos em camundongos nus atímicos, que foram tratados tanto com anticorpo como com proteína Fzd8CRD-Fc. O RNA extraído a partir de tumores tratados com anticorpos YWZ211.31.57, YW211.31 de um braço ou a combinação de YW211.31.57 e YW210.09 revela expressão reduzida de gene SP5 alvo de Wnt para 41 a 57% do nível de tumores de camundongos controle injetados com tampão, enquanto que o tratamento com proteina FZd8CRD-Fc reduziu a expressão de SP5 para 8,0%. Os níveis de mMRNA de SP5 foram normalizados para níveis de MRNA de GAPDH no mesmo tumor e, adicionalmente, normalizado para tumores tratados com PBS.

Todos os tratamentos exceto YW210.09 exibiram valor de p < 0,005 por ANOVA em comparação ao PBS controle. (Figura 10B). A expressão de Axin2 foi reduzida para apenas 56,2% por FzZdêCRD-Fc, e nenhuma alteração significativa na expressão de Axin2 foi detectada com qualquer um dos tratamentos com anticorpo. O tratamento com o anticorpo YW210.09 não afetou significativamente a expressão tanto de SP5 como de Axin2. As amostras de soro analisadas quanto à inibição ou potencialização de sinalização induzida por Wntôda em células HEK293 confirmam que os anticorpos e proteínas injetados retêm pelo menos alguma atividade in vivo durante a exposição de 16 h.

Uma vez que a ativação ou potencialização de sinalização de Wnt podem aumentar a massa óssea por diferenciação e função dos osteoblastos aprimorados, indiretamente, por inibição da diferenciação dos osteoclastos (Glass et al., 2005), foi testada a atividade de anticorpos LRP6 nos ossos de calvárias de camundongo em cultura organotípica. Explantes de calvária microdissecados foram cultivados com anticorpo ou RANK-Fc e, em seguida, o volume e densidade de osso parietal foram analisados por tomografia microcomputadorizada. Com o uso da análise de histograma de amostras controle, as faixas de atenuação de raios-X foram definidas para tecidos calcificados (osso) e não calcificados (cartilagem). O tratamento com o anticorpo YW210.09 aumentou significativamente a média da densidade mineral óssea (BMD) de osso parietal calcificado em 7,4%, semelhante ao aumento de 6,8% observado com o tratamento com RANK-Fc para inibir diferenciação de osteoclastos (Figura 10C; Hsu et a/., 1999). O tratamento com o anticorpo YW211.31.62 não alterou significativamente a BMD parietal calcificada. Todos os tratamentos foram com 10 ug/ml de anticorpo ou proteína, durante 7 dias. Na Figura 10C, os pontos de dados representam oito metades de calvária de quatro camundongos de cada grupo de tratamento; média e erro padrão da média são mostrados como linhas horizontais e verticais, respectivamente. Apenas os tratamentos com YW210.09 e RANK-Fc diferem significativamente das amostras não tratadas com valores de p inferiores a 0,01 e 0,05, respectivamente, pelo teste de Dunnett (p < 0,05 para ambos pelo teste D.

O volume da região óssea parietal total (calcificada e não calcificada) e a proporção de osso calcificado nessa região não foram alteradas de forma significativa por tratamentos com anticorpos ou RANK-Fc, sugerindo que o anticorpo YW210.09 pode aprimorar a mineralização sem alterações brutas na proliferação celular.

EXEMPLO 11 ANTICORPO BIESPECÍFICO LRP6 AGE COMO UM INIBIDOR DE PAN-WNT Protuberâncias em orifícios elaboradas geneticamente (Atwell et al., 1997) foram usadas para construir uma IgG biespecífica híbrida com heterodímeros de cadeia pesada YW211.31.62 e YW210.09. Esse anticorpo biespecífico LRP6, produzido tanto em E. coli como células HEK293, antagoniza sinalização induzida por Wnt3a (0,1 pg/ml) em células HEK293 (Figura 11A) linhagens celulares de tumor PA-1, M14 e CAL-51 (Figura 11C). De forma notável, o anticorpo biespecífico inibe, pelo menos, tão potencialmente como YW211.31 e não retém a atividade potencializadora de Wnt3a de YW210.09. O anticorpo biespecífico também inibe sinalização autócrina de Wnt em todas as três linhagens celulares tumorais testadas (Figura 11B), preservando a atividade inibidora do anticorpo YW211.31 em células PA-1 e de YW210.09 em células M14. De forma interessante, mesmo que YW211.31 potencialize e YW210.09 não tenha efeito sobre a sinalização autócrina de Wnt em células de carcinoma de mama CAL-51, o anticorpo biespecífico inibe sinalização. Essa atividade antagonista nova não é observada com a combinação de anticorpos YW211.31 e YW210.09. Nos ensaios acima, as células PA-1 e M14 se integraram de forma estável com a luciferase repórter de Wnt, e as células CAL-51 transfectadas com o repórter, foram tratadas com o tampão controle indicado (PBS), anticorpo, combinação de anticorpo ou proteína Fzd8CRD-Fc (10 ug/ml cada) com (11C) ou sem (11B) estimulação de 0,1 ug/ml de Wnt3a.

Quando testado em sinalização induzida por transfecção de 13 isoformas de Wnt em células HEK293, o anticorpo biespecífico inibe todas Wnts que são bloqueadas tanto por YW211.31 como YW210.09 (Figura 12). Os ensaios resumidos na Tabela 12 determinaram os efeitos dos anticorpos ou proteinas (10 upo/ml) sobre a sinalização induzida por transfecção de —constructos de expressão de isoformas de Wnt em linhagens celulares HEK293 ou Hs578T estavelmente integradas com a luciferase repórter de Wnt. A atividade repórter foi normalizada para o número de células e adicionalmente, normalizada para o nível de células transfectadas com o mesmo constructo de expressão, mas não tratadas com anticorpo ou proteína.

O anti-gD foi usado como controle.

Foram considerados valores de expressão (fold-change values) relevantes quando estavam fora da faixa observada com o tratamento de anticorpo anti-gD controle: inferior a 0,80 para inibição e superior a 1,30 para a — potencialização em células HEK293, e inferior a 0,65 para a inibição e superior a 1,30 para potencialização em células Hs578T.

Semelhante à combinação de anticorpos YW211.31 e YW210.09, e ao contrário do anticorpo sozinho, os blocos de anticorpos biespecíficos de sinalização induzida pela combinação de Wnt1 e Wnt3a (Figura 12). De modo inesperado, o anticorpo biespecífico também reduz sinalização pelas três Wnts que não são inibidas pelos anticorpos homodiméricos, sozinhos ou em combinação.

Essas atividades antagonistas do anticorpo biespecífico também são observadas em células Hs578T, com a possível exceção de uma ausência de efeito sobre sinalização induzida por Wnt7a.

Foi examinada a capacidade do anticorpo biespecífico em inibir estabilização induzida por Wnt3a de proteína B-catenina.

Células HEK293 com ou sem transfecção de Wnt3a foram tratadas com YW211.31, YW210.09, ou o anticorpo biespecífico, ou com proteinas FZzd8CRD-Fc controle, ou anti-gD, a uma concentração de 5 ug/ml durante 18 horas e os níveis de proteina R- catenina e níveis de LRP5/6 fosforiladas foram determinadas por análise de Western blot.

Figura 13A.

Em células HEK293, o anticorpo biespecífico inibe estabilização induzida por Wnt3a de proteina B-catenina, semelhante à YW211.31 e ao contrário da YW210.09 que aumenta os níveis de &-catenina (Figura 13A). Tanto o anticorpo biespecífico como YW211.31, mas não —YW210.09, bloqueiam indução por Wnt3a de uma espécie de peso molecular elevado de LRP5/6 fosforilada.

De forma surpreendente, enquanto YW211.31 e YW210.09 não afetam os níveis de estado estacionário de proteína LRPG6 total, o anticorpo biespecífico aumenta a proteína LRP6 com ou sem indução de

Whnt3a. Na ausência de estimulação de Wnt, essa LRP6 estabilizada pode ter um ligeiro aumento de fosforilação de Ser1490, embora o anticorpo biespecífico não afete a atividade repórter de Wnt em células HEK293, na ausência de Wnt.

A capacidade do anticorpo biespecífico inibir sinalização de Wnt in vivo também foi determinada. Camundongos SCID-bg com tumores de xenoenxerto de melanoma M14 foram injetados com 30 mg/kg de anticorpo biespecífico LRP6, proteina FZzd8CRD (controle positivo) ou anticorpo anti-gD (controle negativo). Após 16 horas de tratamento, o RNA foi extraído e examinado por qPCR para expressão de genes alvo de Wnt. Os níveis de mMRNA foram normalizados para níveis de MRNA de GAPDH no mesmo tumor e, adicionalmente, normalizados para tumores tratados com anti-gD. Todos os tratamentos com anticorpos biespecíficos e Fzd8CRD exibiram valores de p < 0,001 por ANOVA em comparação ao anti-gD controle. Conforme mostrado na Figura 13B, o anticorpo biespecífico LRP6 inibiu sinalização de Wnt no crescimento de células de melanoma M14 como tumores de xenoenxertos. O RNA extraído a partir de tumores tratados com o anticorpo mostrou expressão reduzida de genes alvo AXIN2 e APCDD1 de Wnt para 46 a 57% e 35 a 38%, respectivamente, dos níveis de tumores tratados com o anticorpo anti-gD controle. Esses níveis de expressão reduzida são semelhantes aos observados com injeção de proteina FzZd8CRD, e indicam que o anticorpo biespecífico é estável e ativo in vivo.

EXEMPLO 12 ESTRUTURA DO COMPLEXO LRP6 E1-YW210.09 FAB A estrutura cristal do primeiro B-propulsor e do domínio EGF de LRP6 (também chamada de E1) em complexo com YVW210.09 Fab foi determinada por substituição molecular e refinada para 1,9 À de resolução com R e Rfree de 0,175 e 0,220, respectivamente. A unidade cristalográfica assimétrica é composta de um domínio LRP6 E1 e um YW210.09 Fab. À densidade de elétrons interpretáveis permitiu rastreio dos resíduos Ala 20 a Lys 324 para o domínio E1 e, os resíduos de Asp 1 a Glu 213 e Glu 1 a Lys 214 para a cadeia leve e cadeia pesada de Fab, respectivamente, com exceção dos — resíduos Ser 127 a Thr 131 de cadeia pesada de Fab (numeração Kabat é usada por tudo).

O domínio E1 de LRP6 é montado em uma arquitetura modular que compreende um módulo de B-propulsor um fator de crescimento epidérmico (EGF) como módulo. O B-propulsor consiste de seis lâminas formadas por uma folha à antiparalela de quatro fitas dispostas de maneira radial com a borda N-terminal de frente para o canal central e os motivos YWTD localizados na segunda fita de cada lâmina. A estrutura B-propulsora LRP6 E1 se parece com a de LDLr (Jeon, H., et a/., 2001) com um rmsd de 0,83 À, quando sobreposta a 245 átomos C-a apesar de uma identidade de sequência de apenas 36%. A maioria dos resíduos conservados são concentrados em torno dos motivos principais de YWTD formando as folhas B, essenciais para a integridade da estrutura B-propulsora enquanto que os resíduos de superfície são altamente diversos contribuindo para a diversidade funcional desses receptores. LRP6 usa seu domínio similar ao EGF para bloquear a primeira e sexta lâmina do propulsor e manter sua resistência mecânica. O módulo similar ao EGF se estende para fora da terminação C a partir do B-propulsor através de um ligante de 10 resíduos e se dobra novamente para o lado inferior do B-propulsor, acoplando a uma superfície entre a terceira e quarta lâmina. A interação entre o EGF e o B-propulsor é extensa, conforme indicado pela ampla área de superfície total enterrada de 1226 À2, e forma de maneira complementar 0,74. Três resíduos, Leu 296, Leu 298 e Met 299, na primeira fita É do módulo EGF constituem um núcleo hidrofóbico que empacota em uma cavidade complementar do B-propulsor,

circundada por algumas interações polares diretas ou mediadas por água.

Essas características também são observadas nas estruturas LDLR (Jeon, H.,

et al., 2001; Rudenko, G,, et a/., 2002). YW210.08 Fab reconhece uma região na parte superior central do —BB-propulsor, uma área que é frequentemente encontrada para ser envolvida em interações proteina-proteína (Springer, T.

A., 1998). O parátopo é composto de resíduos de cinco das CDRs, incluindo três CDRs da cadeia pesada (H1, H2, H3) e duas CDRs da cadeia leve (L1 e L3). A ligação do anticorpo ao B- propulsor enterrado em uma área total de 1691Ã2 com uma pontuação de —complementaridade de forma de 0,76. Uma correção ácida na face superior do B-propulsor ocupa aproximadamente um terço da área total, mas mal se sobrepõe com o epítopo YW210. Pelo contrário, áreas discretas reconhecem a cadeia pesada e leve.

Os contatos diretos formados pelas CDRs da cadeia pesada representam 80% da área enterrada com CDR H3 sozinha responsável pormaisde 50%. Esse segmento é composto de 17 resíduos, entre os quais resíduos His 98 a Lys 100c formam contatos diretos com o B-propulsor.

De maneira importante, Asn 100 do anticorpo faz um par de ligações de hidrogênio com Asn 185 de LRP6 formando uma interação “aperto de mão” (Figura 16). Além disso, a posição de conformação incomum das cadeias principais de Val —100beLys100c em um grupo carbonila que interage com Arg 28 de LRP6 na parte posterior, e dois grupos NH, que interagem com a correção ácida através de duas moléculas de água (Wat1 e Wat2) na parte da frente (Figura 14). A cadeia lateral Lys 100c também neutraliza a correção ácida por ligações de hidrogênio com Val 70 e Ser 96 carbonilas de cadeia principal de LRP6. Arg 141 de LRP6 está ancorada no meio e interage com a ponte de água Wat2, Asn 185 de LRP6 e Ala 100a de YW210.09. Arg 141 aparece para integrar as duas redes de ligação de hidrogênio juntas.

Adicionalmente, a cadeia lateral Val 100b acopla dentro de uma cavidade hidrofóbica no canal central do B-

propulsor. Portanto, a sequência NAVK de YW210.09 H3 exibe padrão de ligação extraordinário com o B-propulsor El de LRP6. As outras CDRs interagem com resíduos nos parâmetros sobre a parte superior do B-propulsor. Outros resíduos envolvidos na ligação de H3 a LRP6 incluem E51, D52, V70, S71,E73,L95,S96, D98 e E115. H1 e H2 tocam na quinta e sexta lâmina, enquanto L1 e L3 tocam a sexta, a primeira e a segunda lâmina (Figura 15). Resíduos de LRP6 adicionais envolvidos na ligação de YW210.09 a LRP6 incluem R29, W188, K202, P225, H226, S243 e F266. As interações de empacotamento cristalinas não estão diretamente envolvidas nas áreas onde o YVW210.09 entra em contato com o epítopo de LRP6, indicando que a estrutura cristalina deve refletir a forma como as duas moléculas interagem na solução.

A interação entre o motivo NAVKN H3 de CDR distinta (SEQ ID NO: 49) e o B- propulsor E1 LRP6 é altamente semelhante à interação relatada entre Laminina e Nidogen (Takagi, J., et a/., 2003). Em ambos os casos, os contactos significativos são feitas através do aperto de mão de Asn descrito acima e um resíduo hidrofóbico ramificado que entra em uma cavidade hidrofóbica formada pela parte superior do canal central do B-propulsor, que está fechado em ambos os propulsores por um obturador de Phe. DKk1 Humano apresenta um motivo (Aminoácidos 40 a 44: NAIKN (SEQ ID NO: 50)) que é, exceto seu lle 42, idêntico ao motivo encontrado na alça H3 da CDR de YVW210.09. Esse motivo é estritamente conservado entre espécies e membros da família, exceto DKkk3, apontando em direção de uma função específica para esse motivo na biologia de Dkks. O motivo conservado encontra-se na terminação N de Dkk1, uma região que não tenha sido considerada antes (Brott, B. K., e Sokol, S. Y., 2002) e que foi prevista ser desordenada. Além disso, esse motivo específico também é conservado nas outras duas proteínas que regulam a sinalização de Wnt através de interação com LRP5/6 em outras palavras Esclerostina (Semenov, M,., et a/., 2005) e Wise (lItasaki, N., et a/., 2003). Essas duas proteinas pertencem à mesma super família de proteínas cisteina knot (McDonald, N. Q., e Hendrickson, W. A., 1993) e exibem o motivo identificado em sua alça número 2, também chamada de “calcanhar” dessa dobra conservada (Lintern, K. B., et a/., 2009; Veverka, V., et al., 2009). EXEMPLO 13 ANTICORPOS ANTI-LRP6 EXEMPLARES As sequências de aminoácidos de certos anticorpos anti-LRP6 são fornecidas na Lista de Sequências. As Tabelas 2 a 4 fornecem uma descrição das sequências. Os alinhamentos das sequências de aminoácidos dos domínios VH e VL de anticorpos anti-LRP6 são fornecidos nas Figuras 16 e 17. TABELA 2

CADEIAS PESADA E LEVE [| sSEQD [| DPesciçãoã SEQ ID NO: 1 Cadeia Pesada de YW211.31 SEQ ID NO: 2 Cadeia Leve de YW211.31 SEQ ID NO: 3 Cadeia Pesada de YW211.31.57 Cadeia Leve de YW211.31.57 SEQID NO: 5 Cadeia Pesada de YW211.31.62 SEQ ID NO: 6 Cadeia Leve de YW211.31.62 SEQ ID NO: 7 Cadeia Pesada de YW210.09 SEQ ID NO: 8 Cadeia Leve de YW210.09 TABELA 3

REGIÕES VARIÁVEIS DAS CADEIAS PESADA E LEVE sa Beserição = SEQIDNO:9 Região Variável da Cadeia Pesada de YW211.31

[LO SERMD TE Bbestrigto OO . Região Variável da Cadeia Leve de YW211.31; YW211.03; YW211.08; SEQD NO: 10 YW211.11; YW211.12; YW211.33; YW211.31.35 SEQ ID NO: 11 Região Variável da Cadeia Pesada de YW211.31.57 SEQ ID NO: 12 Região Variável da Cadeia Leve de YW211.31.57 SEQ ID NO: 13 Região Variável da Cadeia Pesada de YW211.31.62 SEQ ID NO: 14 Região Variável da Cadeia Leve de YW211.31.62 SEQ ID NO: 15 Região Variável da Cadeia Pesada de YW210.09 SEQ ID NO: 16 Região Variável da Cadeia Leve de YW210.09 SEQ ID NO: 51 Região Variável da Cadeia Pesada de YW211.03 SEQ ID NO: 52 Região Variável da Cadeia Pesada de YW211.08 SEQ ID NO: 53 Região Variável da Cadeia Pesada de YW211.11 SEQ ID NO: 54 Região Variável da Cadeia Pesada de YW211.12 SEQ ID NO: 55 Região Variável da Cadeia Pesada de YW211.33 SEQ ID NO: 56 Região Variável da Cadeia Pesada de YW211.31.11 SEQ ID NO: 57 Região Variável da Cadeia Pesada de YW211.31.35 SEQ ID NO: 58 Região Variável da Cadeia Leve de YW211.31.11 TABELA 4

HVRS DAS CADEIAS PESADA E LEVE SEQ ID NO: 17 YW211.31 HVR-H1; YW211.31.57 HVR-H1 . YW211.31 HVR-H2; YW211.31.57 HVR-H2; SEQ ID NO: 18 YW211.31.62 HVR-H2 . YW211.31 HVR-H3; SEQ ID NO: 19 NYW211.31.62 HVR-H3 SEQ ID NO: 20 YW211.31.62 HVR-H1 SEQ ID NO: 21 YW211.31.57 HVR-H3 SEQ ID NO: 22 YW210.09 HVR-H1 SEQ ID NO: 23 YW210.09 HVR-H2 SEQ ID NO: 24 YW210.09 HVR-H3 . YW211.31 HVR-L1; YW211.31.57 HVR-L1; SEQ ID NO: 25 VW211.31.62 HVR-L1; YW210.09 HVR-L1 . YW211.31 HVR-L2; YW211.31.57 HVR-L2; SEQ ID No: 26 YW211.31.62 HVR-L2; YW210.09 HVR-L2 SEQ ID NO: 27 YW211.31 HVR-L3;YW211.31.62 HVR-L3; YW210.09 HVR-L3 SEQ ID NO: 28 YW211.31.57 HVR-L3 Embora a invenção acima mencionada tenha sido descrita com algum detalhe a título de ilustração e exemplos para propósitos de clareza de — entendimento, as descrições e exemplos não devem ser interpretados como limitação ao escopo da invenção. As divulgações de todas as patentes e literaturas científicas citadas no presente pedido são expressamente incorporadas em sua totalidade como referência.

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. ANTICORPO isolado, que se liga a LRP6, caracterizado pelo fato de que o anticorpo inibe sinalização induzida por uma primeira isoforma de Wnt e potencializa sinalização induzida por uma segunda isoforma de Wnt.

2. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a primeira isoforma de Wnt é selecionada a partir do grupo que consiste em Wnt3 e Wnt3a e a segunda isoforma de Wnt é selecionada a partir do grupo que consiste em Wnt 1, 2, 2b, 4, 8, 7a, 7b,8a,9a,9b, 10a e 10b.

3. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o anticorpo se liga à região E3-E4 de LRP6.

4, ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio VH que compreende (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; e (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19, e um VL que compreende (9) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25; (h) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26; e (i) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27.

5. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende um VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 e um VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10.

6. ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio VH que compreende (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQIDNO: 18; e (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, e um VL que compreende (9) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25; (h) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26; e (i) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQID NO: 28.

7. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende um VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 e um VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12.

8. ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio VH que compreende (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de

SEQ ID NO: 20 (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; e (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQIDNO:19, e um VL que compreende (9) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25; (h) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQIDNO:26;e (i) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27.

9. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende um VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 e um VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14.

10. ANTICORPO, caracterizado pelo fato de que compete para se ligar a LRP6 com o anticorpo conforme definido em uma das reivindicações 4 a 9.

11. ANTICORPO, caracterizado pelo fato de que se liga ao mesmo epítopo em LRP6 que o anticorpo conforme definido em uma das reivindicações 4 a 9.

12. — ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a primeira isoforma de Wnt é selecionada a partir do grupo que consiste em Wnt 1, 2, 2b, 6, 8a, 9a, 9b, e 10b e a segunda isoforma de Wnt é selecionada a partir do grupo que consiste em Wnt3 e Wnt3a.

13. —ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1 ou 12, caracterizado pelo fato de que o anticorpo se liga à região E1-E2 de LRP6.

14. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 12 ou 13, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio VH que compreende (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de —SEQIDNO:22; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; e (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24, e um VL que compreende (ga) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25; (h) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26; e (i) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27.

15. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende um VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 e um VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16.

16. ANTICORPO, caracterizado pelo fato de que compete para se ligar a LRP6 com o anticorpo conforme definido na reivindicação 14 ou 15.

17. ANTICORPO, caracterizado pelo fato de que se liga ao mesmo epítopo em LRP6 que o anticorpo conforme definido na reivindicação 14 ou 15.

18. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o epítopo compreende resíduos de aminoácidos R28, E51, D52, V70, S71, E73, L95, S96, D98, E115, R141, e N185 de LRP6 (SEQ ID NO: 29).

19. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o epítopo adicionalmente compreende 5 resíduos de aminoácidos R29, W188, K202, P225, H226, S243, e F266 de LRP6 (SEQ ID NO: 29).

20. ANTICORPO BIESPECÍFICO isolado, que se liga a duas regiões diferentes de LRP6, caracterizado pelo fato de que o anticorpo se liga à região E3-E4 de LRP6 e à região E1-E2 de LRP6.

21. ANTICORPO BIESPECÍFICO, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende um primeiro domínio VH que compreende (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; e (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19, um primeiro domínio VL que compreende (g) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25; (h) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26; e (i) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de —SEQID NO: 27, um segundo domínio VH que compreende (d) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22;

(e) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; e (f) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24, e um segundo domínio VL que compreende (9) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25; (h) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26; e (i) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27.

22. ANTICORPO BIESPECÍFICO, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende um primeiro VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQIDNO:13, um primeiro VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, um segundo VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15,e um segundo VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14.

23. — ANTICORPO BIESPECÍFICO, de acordo com uma das reivindicações 20 a 22, caracterizado pelo fato de que o anticorpo inibe sinalização induzida por uma isoforma de Whnt selecionada a partir do grupo que consiste em Wnt3eWnt3a e inibe sinalização induzida por uma isoforma de Wnt selecionada a partir do grupo que consiste em Wnt 1, 2, 2b, 6, 8a, 9a, 9b, e 10b.

24. — ANTICORPO BIESPECÍFICO, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o anticorpo inibe sinalização autócrina de Wnt.

25. ANTICORPO, caracterizado pelo fato de que compete para se ligar a LRP6 com o anticorpo biespecífico conforme definido na reivindicação 22.

26. ANTICORPO, caracterizado pelo fato de que se liga aos — mesmos dois epítopos que o anticorpo biespecífico conforme definido na reivindicação 22.

27. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que um dos dois epíitopos compreende resíduos de aminoácidos R28, E51, D52, V70, S71, E73, L95, S96, D98, E115, R141,eN185 de LRP6 (SEQ ID NO: 29).

28. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o um dos dois epítopos adicionalmente compreende R29, W188, K202, P225, H226, S243, e F266 de LRP6 (SEQ ID NO: 29).

29. ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações 10, 11, 16 a 19 e 25 a 28, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo monoclonal.

30. ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações 10, 11, 16 a 19 e 25 a 28, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo quimérico, humano ou humanizado.

31. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo quimérico.

32. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo humano.

33. “ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo humanizado.

34. FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo ou anticorpo biespecífico conforme definido em uma das reivindicações 1 a 33 e um veículo farmaceuticamente aceitável.

35. “FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada pelo fato de que compreende i) o anticorpo conforme definido em uma das reivindicações 3 a 11, ii) o anticorpo conforme definido em uma das reivindicações 13a19, iii) e um veículo farmaceuticamente aceitável.

36. IMUNOCONJUGADO, caracterizado pelo fato de que compreende o anticorpo ou anticorpo biespecífico conforme definido em uma das reivindicações 1 a 33 e um agente citotóxico.

37. ÁCIDO NUCLEICO isolado, caracterizado pelo fato de que codifica o anticorpo ou anticorpo biespecífico conforme definido em uma das reivindicações | a 33.

38. —CÉLULA HOSPEDEIRA, caracterizada pelo fato de que compreende o ácido nucleico conforme definido na reivindicação 37.

39. USO DE UM ANTICORPO OU ANTICORPO BIESPECÍFICO, conforme definido em uma das reivindicações 1 a 33, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer.

40. USO DE UMA FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA, conforme definida na reivindicação 34 ou 35, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer.

41, USO, de acordo com a reivindicação 39 ou 40, caracterizado pelo fato de que o câncer é câncer de pulmão de células não pequenas, câncer de mama, câncer pancreático, câncer de ovário, câncer de rim ou câncer de próstata.

42. USO DE UM ANTICORPO, conforme definido em uma das reivindicações 12 a 22, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma disfunção esquelética.

43. "USO, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que a disfunção esquelética é osteoporose, osteoartrite, fraturas ósseas ou lessões ósseas.

Ss HR < 15d Fã E E 3 KH EE é E 2 7 NE é o à E E FR Z Ab 21 E ex o > E E E É E] Ee) É NnZ ES E É al=l=l=-Tol=[|=I-Jol=I=-Jel=--Je==-Te==-lo ú/ elo rieilo riSeilo rieilo riejlo Trielo r nijo o o o [=) o YW211.03 | vw211.08 | Yw211.11 | vw211.12 | Yw211.31 | vw211.33 LRP6 mAb (ug/ml) Fig. 1A NA YW21131 DKK1 Fzd8gCRD Wnt3a (1 h): co + fo + cor | e + Fosfo- A, EA AL B-catenina | suma emos eme ps Mm Em nm Em Fig. 1B

—o— Wnt3a 50 | "E YW210.09 mAb + Wnt3a —e- NA 2 —4- YW210.09 mAb ”. E 4o Pá S ” BD 3 Ps : Pa . 10 quer o = " o 0.02 0.04 0.06 0.08 o1 Wnt3a (ug/ml) Fig. 1C

Células PA-1 3 4 8.9+0.2 XE 35 = g 3 s 2 2 OS os F o 2 [1 Em EXE ema es —— 0111 10 [01] 1 10 [01|1 10 [01 1 10 PBS Fzd8CRD YW211.31.57 YW210.09 YW211+210 (ug/ml) (ug/ml) (ug/ml) (ug/ml) Fig. 2A Células PA-1 9 EZAPBS 8 À EXZg9D mAb 3 7 2 EXB FzdecRD 3 Z pia | MNE 211.31 CN 2 É És à S z Á E 4 Z É ” | Ó À G df NIZIN BZ208 B20% B20= 0208 DDS NA Wnt3a NA Wnt3a NA Wnt3a SAX1 GAD1 LEFTY2 Fig. 2B

Valor de expressão na sinalização Tipo detumor — Linhagem celular autócrina de Wnt com tratamento YW211.31.57 | YW210.09] FZd8dCRD Ntera-2 0.33 1.60 0.07 PA-1 0.11 3.34 0.08 [Mama O msszer froB faz oa NSCLC EKVX 3.16 0.95 0.34 NCI-H23 215 0.37 0.35 NCI-H358 1.43 0.66 0.47 NCI-H2030 |6.10 2.02 0.29 Sarcoma de tecido SW872 3.42 1.81 0.67 mole HT-1080 2.90 1.44 0.43 Fig. 3

ENA EEE vntea q 22.0+1.4 Zz "IM “x 9 we 8 27 3 % 5 2 É 3 8 2 =” : ER É 23 EM "8 Be" 8-nr8! RO g8/5/e/e 5 e e m5/2/8/5/s *jR/ 8 / | a/8/"/a/8/"|2/8 =| =| =| = o =| SN =| SN =| N = | gN >= = = >= HT-1080 EKVX NCI-H358 Hs578T Fig. 4A

Células NCI-H23 6 a

Z Ss = e s E E õS = Ee x Fãs E 2 FS = fo = PES E fã z Z E É O E] LÃ O Es NA CD4-Fc —Wntda FZdBCRD YW211.| YW210.

31.57 os Fig. 4B Células M14 3 Ea 1 2 2 E

Células 578T: estimuladas por Wnt3a 120 100 = 80 6

E FZ

FI À EE é “LI Fo DZ SE 01 1 10 [01 1 10 1 10 PBS | YW211,.31.57 FzZd8CRD YW210.09 (ug/ml) (ug/ml) (ug/ml) Fig. 4D Células Hs578T: Wnt autócrina 4 33 [rá 2 > sos õ Hp : Á : ” o Á [E 5 e 01 1 10 [01 1 10 1 10 PBS| YW211.31.57 FzdêCRD YW210.09 (ug/ml) (ug/ml) (ugiml) Fig. 4E

Células EKVX 3 3 - EZANA X ; [2 qria EEB Wnt3a SS es É ES TI Se nã o 8 3 = ES Ea ão & > E E FAO Z ga Bi F 1EAA A | é É PAZ PBS 0.1 1 10 Fzd8gcCRD YW211.31.57 (ug/ml) Fig. 4F Células EKVX: Wnt autócrina

2.5 >= Xz 2 o 3 15 3 1 3 E z FÃ & os À ro, Ga Exa 1 10 1 10 PBS YW211.31 FzZd8CRD| YW211.31 (ug/ml) (ugiml) + FzZdbCRD Fig. 4G

= |2 | | ESTO) | 2 |[Slo alo e mor so sa ? NIZ me oo E O = = = 8 ulo ols 00 oo so colo ooo &Ê " Ss lo | s Ss & o Ss 2 = Na fo «= aro wo oo «o ox é ES SENSE SS DES Sm 8 NOJO O O O O Oo OoOfliN y à ofj— HI8 o 8 e & E 3/8 s|2 | 5º o E) 4/0 E) 3/5 cl og ale e oro — calo «o m collo TE Seo eje à = 6 oó ósseo Ol> ól>/ o ole nm O NO + Io o x eo 2 la | = | Z Se ale s é euoacl noo o 8 | Sor aNensoar| Nm 2 nulo olo oooooOooOooOSO ooo fo € > = ENE) uu ge o || a lSloolb o TN =Nol aomr E [Ela Ns aOSmoor|l Tr o = - sl ld ooocoo0oo0ooS5 ror 8 nfs | PIS 2 | SE SS | | um /2 = | | Sjm 218 ES = Ss TS no co TN dd OO + O O alfes SS 2 2CSTST$S0 3S8 OS 81 5 oe o 9 E os eo osa | a | 8 | 3 o | | S | | se 8 o o SS W2O Ss. ool> 8 e elos aeçsSSPT|E == 28 : SS ESSSSSSS|S=s2S|Z

S ã

Expressão Valor de expressão na sinalização de Wnt com tratamento H Wnt3a-Fzd5 | 0.09 0.93 0.99 “ao Wnt1-Fzds J4.63 3 1.23 Wnt1-LRP6 | 1.23 112 0.28 Valor de expressão na sinalização de Wnt Expressão — | com tratamento YW211.31.57 YW211.31.57 |YW210.09 |+ YW210.09 . Fig. 7 Wnt1 1.57 0.30 0.42 Wnt8A 3.37 0.37 0.22 Wnt9B 1.38 0.67 0.46 Wnt10B 3.03 0.16 10.08 Wnt7A 3.54 1.42 1.98 Wnt10A 2.53 1.07 0.83

FzdBCRD YW211+210 YWw210.09 E ã YW211.31.57 & = anti-gD =

PBS É FZdBscRD E YW211+210 q EX vw21009 — O

E Yw2113157 E O antso

PBS [:]] FZdscRD | YWw211+210 ET Ywa1009 8 - E vw211.31.57 E Estes] antigD E Pes o o o oo o o o o co o x a TOPbrite/SV40 RLU (normalizado para nenhum Wnt)

Células Hs578T: Wnt autócrina 2 25 o“ o 2

L 2 E el oo = 11 = Es A é A Eee os A" | Eee Es Bs 8 STA | Ee [E ES r o A | Exa Es ES

0.1 1 10 [01 1 10 [01 1 10 PBS | YW211.31.57 YW210.09 YW211+210 (ugi/ml) (ug/ml!) (ug/ml) Fig. 8B Células EKVX: Wnt autócrina 3 4 «x 35 gs 3 > 25 8 2 E 15 Em Fe) RE 1 à, E a FZ E A e a E D [E RS] ES) 01 1 10 [01 1 10 [01 1 10 PBS | YW211.31.57 YW210.09 YW211+210 (ug/ml) (ugiml) (ug/ml) Fig. 8C

Ligação E1-E4 de LRP6 m—— Wnt3a (200 nM) 174 |/--- Wnt3a + YW210.09 (200 nM) —— Wnt3a + YW211.31.57 (200 nM)

0.8 E os o O A É o o o Pd e Bo os - SS = Co . ” Ts. 02 /, í . Fig. 9A o 400 800 1200 1600 Tempo (seg) Ligação E1-E4 de LRP6 mm Wnt9b (200 nM) === Wnt9b + YW210.09 (200 nM) — Wnt9b + YW211.31.57 (200 nM)

1.5

E

E Ss 1 &

S ke 3 =

0.5 Fig. 9B . o 400 800 1200 1600 Tempo (seg)

Ligação E3-E4 de LRP6 — Wnt3a (200 nM) — Wnt3a + YW211.31.57 (200 nM) 32 Wnt3a + OA-YW211 (200 nM)

2.5 2

Ê z 1.5 Ss 2 1 =

0.5 o TT messes -0.5 , o 400 800 1200 1600 Fig. 9C Tempo (seg) Ligação E1-E2 de LRP6 — Wnt9b (200 nM) === Wnt9b + YW210.09 (200 nM) 12 1

E E o8 q

É 8 os = 04 Leer Too. 02 É Fig. 9D o o 400 800 1200 1600 Tempo (seg)

Ligação E1-E4 de LRP6 —— YW210.09,então YW211.31.57

5.52 1177 YW211.31.57,então YW210.09 ' í ' E , T 4514/ = 1 Ss ' E ' 3 1 = ' 4 h Fig. 9E 3; [ 500 1000 1500 2000 2500 Tempo (seg) Tumores MMTV-Wnt 1 1,400 —e-PBS — 1,200 --B--anti-cgD E —e YW210.09 E 10009 | -a-YW211.31.57 ê ' —»-- Fzd8CRD Pr 2 800 em o Dra Ss FERE S$ 600%. DO Sa É oem 2 aooAMÉ " s d. o > 200 TI o [ 1 2 3 4 5 6 7 Dias após o primeiro tratamento Fig. 10A

Tumores Ntera-2 o a GS 14

S 2 12 E 14 po o FL, & o8 DO É o6

E so DA PBS YW211. OA- YW210.09 — FzdBCRD

31.57 YW211.31 Fig. 10B 530 " & 520 2 10 . a " > 500 É " ". S 490 É " É 480 O 470 2 ” " É 460 3 —+— 450 i " 8 o 40 " = = P 430 " 420 Nãotratado ' yWw211.31.62 ' YW210.09 RANK-Fc Fig. 10C

Células HEK293 (estimulada por Wnt3a) 35 30 —e— E. coli produzida —e— HEK293 produzida = = q 25

SS 3 20

E 82 15 = & o 10 fa o / o 0.1 1 10 Concentração de mAb Biespecífico LRP6 (ug/ml) Fig. 11A

= o o x TI o dBi do ê o [| mÔ ss 4 a F | = 3 mm o o: - > > 8 UU sata ú = o í

E í — Uns o o x o a R o TOPbrite/SV40 (ou AFC) RLU sz Oo Ts2 S So $ DB | 8 | Ê 3 z 8 mo = No 2 3 O ds E

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Sem Wnt3a Wnt3a 8 = É & = o o SS 2 3 a 3 2 É & 2 a sô 2 E sã às mo E Õ = & & E E à ES pesenna [= a 1] Fosto- [O ECOS tRp566 |O eo [ED DA Ma eta bo pecra oa —] sa [ESA ese a =] Fig. 13A Tumores M14 12 E AXIN2 ge! FER EB APCDD1 2 o

0.8 pao s aaa os DE FETEm o a o o E So SO anti-gD anti-LRP6 biespecíffico — FzdBCRD Fig. 13B

: 21/23 Fig. 14

FA : & PA VEODS SS /N100d xa!

RBS RO SS WAS A Em PRP QATOda A SAI Cala TAI AZ QN xo = v Ko0cADA dO o IN wo & fo F % E t? WI183.. CS — = SM" oi niss. A SM do AO SE, SE Ff d e à e É Ro à X NS east : E a > Fig 15 Pe SS A] 1 ns FR eWat5 ) | R2 o Â 56X Est) As SA X ) SF i F266 natf — | o Z SAN HA NA EA 3 SW X PA o é a ANSV53 “eWat4 OS Je disto 7 JOR, q Re SOS Wa gt bo DATA VE wi sales SU SE a MA TIN SA À ” Wa BS AR . Lo, SANS N X

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' 1 Resumo “ANTICORPOS, ANTICORPO BIESPECÍFICO, FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS, IMUNOCONJUGADO, ÁCIDO NUCLEICO, CÉLULA HOSPEDEIRA, USO DE UM ANTICORPO OU ANTICORPO BIESPECÍFICO,

USO DE UMA FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA E USO DE UM ANTICORPO” A invenção fornece anticorpos anti-LRP6 e métodos de uso dos mesmos. Um aspecto particular da invenção fornece anticorpos anti-LRP6 biespecíficos que inibem sinalização por múltiplas isoformas de Wnt.