CN111511400A

CN111511400A - 抗vegf抗体及其使用方法

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Publication number: CN111511400A
Application number: CN201880083210.8A
Authority: CN
Inventors: 斯特凡·登格尔; 塞巴斯蒂安·芬恩; 盖伊·乔治; 约尔格·默勒肯; 弗朗西斯卡·罗斯; 埃丝特·科尼斯布格
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2017-12-29
Filing date: 2018-12-21
Publication date: 2020-08-07
Also published as: WO2019129679A1; WO2019129677A1; JP7436365B2; US20210047395A1; US11820816B2; JP2021508472A; US20210079080A1; CN111479588A; EP3731864A1; JP2021508471A; EP3731865A1

Abstract

本发明涉及抗VEGF抗体及其制备方法和用途。

Description

抗VEGF抗体及其使用方法

发明领域

本发明涉及抑制血管发生的抗体，更特别地涉及抗VEGF抗体，及其使用方法。

背景技术

本发明提供抗VEGF抗体，其优先抑制VEGF与VEGF-R2的结合而不是VEGF与VEGF-R1的结合。在抑制血管发生的同时，此类抗体由于其特异性的阻断特性而具有改善的安全性。

血管发生是从先前存在的血管和/或循环内皮干细胞发展新的脉管结构(Asahara，M.，等人，Science，275(5302)：964-967，1997；Springer等人，Mol.Cell，2(5)：549-558，1998；Folkman和Shing，J.Biol.Chem.，267：10931-10934，1992)。尽管血管发生在许多生理过程中起着重要作用，但是它也与多种病症的发病机理有关，包括实体瘤、眼内新生血管综合症如增生性视网膜病变或年龄相关性黄斑变性(AMD)、类风湿性关节炎和银屑病(Folkman，J.，等人，J.Biol.Chem.267(1992)10931-10934；Klagsbrun，M.，等人，Annu.Rev.Physiol.53(1991)217-239；和Garner，A.，Vascular diseases，in：Pathobiology of ocular disease，A dynamic approach，Garner，A.，和Klintworth，G.K.(编)，第2版，Marcel Dekker，纽约(1994)，第1625-1710页)。

正常和恶性组织中的血管发生是通过平衡血管发生刺激剂和血管发生抑制剂调节的，所述刺激剂和抑制剂在靶组织和远处部位产生(Fidler等人，Cancer J.Sci.Am.，4Suppl 1：S58-66，1998；McNamara等人，Br.J Surg.，85(8)：1044-1055.1998)。血管内皮生长因子-A(VEGF，也称为血管通透性因子，VPF)是血管发生的主要刺激物。人VEGF(SEQ IDNo：29)描述于例如Leung，D.W.，等人，Science 246(1989)中。VEGF参与与肿瘤和眼内病症相关的正常和异常血管发生和新血管形成的调节(Ferrara，N.，等人，Endocr.Rev.18(1997)4-25；Berkman，R.A.，等人，J.Clin.Invest.91(1993)153-159；Brown，L.F.，等人，Human Pathol.26(1995)86-91；Brown，L.F.，等人，Cancer Res.53(1993)4727-4735；Mattern，J.，等人，Brit.J.Cancer.73(1996)931-934；和Dvorak，H.F.，等人，Am.J.Pathol.146(1995)1029-1039)。VEGF是一种已经从几种来源中分离出的同型二聚体糖蛋白。VEGF对内皮细胞显示出高度特异性的有丝***促进活性。VEGF在胚胎血管发生期间的新血管形成中和在成年期间(during adult life)的血管发生中具有重要的调节功能(Carmeliet，P.，等人，Nature，380(1996)435-439；Ferrara，N.，等人，Nature，380(1996)439-442；综述于Ferrara，N.，等人，Endocr.Rev.18(1997)4-25中)。

在多种病症的发病机理中作为血管发生的关键刺激物的VEGF的鉴定导致多种尝试来阻断VEGF活性，例如，通过抗VEGF受体抗体、可溶性受体构建体、反义策略、针对VEGF的RNA适体和低分子量VEGF受体酪氨酸激酶(RTK)抑制剂(Siemeister等人CancerMetastasis Rev.，17(2)：241-248.，1998)。抗VEGF抗体被描述为抑制小鼠中多种人肿瘤细胞系的生长(Kim，K.J.，等人，Nature 362(1993)841-844；Warren，S.R.，等人，J.Clin.Invest.95(1995)1789-1797；Borgstrom，P.，等人，Cancer Res.56(1996)4032-4039；和Melnyk，O.，等人，Cancer Res.56(1996)921-924)。WO 94/10202、WO 98/45332、WO 2005/00900和WO 00/35956涉及针对VEGF的抗体。人源化单克隆抗体贝伐单抗(以商标名

出售)是用于肿瘤治疗WO98/45331中的抗VEGF抗体。雷珠单抗(商品名

)是与贝伐单抗

源自相同的亲本鼠抗体的单克隆抗体片段。它比亲本分子小得多，并且已经被亲和力成熟以提供与VEGF-A的更强结合(WO98/45331)。它是一种抗血管发生化合物，已被批准用于治疗“湿性”类型的年龄相关性黄斑变性(wAMD)(一种常见形式的年龄相关性视力丧失)。

被批准用于临床应用的抗VEGF抗体，例如

和

抑制VEGF与两种受体的结合，VEGF-R1(FLT-1，fms样酪氨酸激酶)和VEGF-R2(KDR/FLK-1，胎儿肝激酶)。VEGF-R1和VEGF-R2是密切相关的受体酪氨酸激酶(RTK)。尽管假设VEGF-R2主要负责VEGF介导的血管发生(Holash，J.，等人，Proc Natl Acad Sci U S A.2002年8月20日；99(17)：11393-8)，已知VEGF-R1具有与血管发生无关的其它重要的生物学作用，例如在破骨细胞分化中(Aldridge，S.E，等人，Biochem Biophys Res Commun.2005年9月30日；335(3)：793-8)。

已经报道了一些抗VEGF抗体，其优先抑制VEGF与VEGF-R2的结合，但不显著抑制VEGF与VEGF-R1的结合(WO200064946描述了称为“2C3”的抗体，WO2009060198描述了称为“r84”的抗体，WO2012089176描述了称为“L3H6”的抗体，和EP3006465描述了称为“HF2-1”、“HF2-5”、“HF2-9”和“HF2-11”的抗体)。通过阻断VEGF与VEGF-R2的结合，而不是与VEGF-R1的结合，描述了所述抗体具有改善的安全特性，并且不显示与抗VEGF治疗相关的常见毒性相关副作用(Brekken，R.A.，等人，Cancer Res.2000年9月15日；60(18)：5117-24；Sullivan，L.A.，等人，PLoS One，2010年8月6日；5(8)：e12031)。

由于开发提供这种有利性能并同时表现出所需特性和足够亲和力以使它们适于临床应用的抗体不是直接的方法，因此仍然需要改善的VEGF抑制剂。

发明概述

本发明提供抗VEGF抗体及其使用方法。

本发明的一个方面是结合VEGF的抗体，其中所述抗体与VEGF的结合显著抑制VEGF与VEGF受体VEGF-R2的结合，而不显著抑制VEGF与VEGF受体VEGF-R1的结合。

本发明的另一个方面是结合VEGF的抗体，其中所述抗体与VEGF的结合选择性抑制VEGF与VEGF R2的结合。

本发明的另一个方面是结合VEGF的抗体，其中所述抗体与VEGF的结合完全抑制VEGF与VEGF-R2的结合，并且其中所述抗体与VEGF的结合不完全抑制VEGF与VEGF-R1的结合。

本发明的另一个方面是结合VEGF的抗体，其中所述抗体以≤150pM的亲和力结合VEGF，如在25℃的温度下通过表面等离子共振所测量的，并且其中所述抗体以更高或大约相同的亲和力结合VEGF，如在37℃的温度下通过表面等离子共振所测量的。

本发明的另一方面是结合VEGF的抗体，所述抗体与包含SEQ ID NO：01的VH序列和SEQ ID NO：02的VL序列的抗体结合相同的表位。

本发明的另一方面是结合VEGF的抗体，其中所述抗体包含重链可变结构域(VH)，所述重链可变结构域包含

(a)CDR-H1，其包含SEQ ID NO：03的氨基酸序列，

(B)CDR-H2，其包含选自SEQ ID NO：04、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：12的组的氨基酸序列，和

(c)CDR-H3，其包含SEQ ID NO：05的氨基酸序列；和

其中所述抗体包含轻链可变结构域(VL)，所述轻链可变结构域包含

(d)CDR-L1，其包含SEQ ID NO：06的氨基酸序列，

(e)CDR-L2，其包含SEQ ID NO：07的氨基酸序列；和

(f)CDR-L3，其包含SEQ ID NO：08的氨基酸序列。

在一个实施方案中，所述抗体包含SEQ ID NO：01的VH序列和SEQ ID NO：02的VL序列。在一个实施方案中，所述抗体包含SEQ ID NO：09的VH序列和SEQ ID NO：02的VL序列。在一个实施方案中，所述抗体包含SEQ ID NO：11的VH序列和SEQ ID NO：02的VL序列。在一个实施方案中，所述抗体包含SEQ ID NO：33的VH序列和SEQ ID NO：02的VL序列。在一个实施方案中，所述抗体包含SEQ ID NO：42的VH序列和SEQ ID NO：02的VL序列。在一个实施方案中，所述抗体包含SEQ ID NO：44的VH序列和SEQ ID NO：02的VL序列。

本发明的另一方面是特异性结合VEGF的抗体，其包含SEQ ID NO：01的VH序列和SEQ ID NO：02的VL序列。本发明的另一方面是抗体，其是具有SEQ ID NO：01的VH序列和SEQID NO：02的VL序列的抗体的亲和力成熟变体。本发明的另一方面是结合VEGF的抗体，所述抗体与具有SEQ ID NO：01的VH序列和SEQ ID NO：02的VL序列的抗体结合相同的表位。

本发明的另一方面是特异性结合VEGF的抗体，其包含SEQ ID NO：09的VH序列和SEQ ID NO：02的VL序列。

本发明的另一方面是特异性结合VEGF的抗体，其包含SEQ ID NO：11的VH序列和SEQ ID NO：02的VL序列。

本发明的另一方面是特异性结合VEGF的抗体，其包含SEQ ID NO：33的VH序列和SEQ ID NO：02的VL序列。

本发明的另一方面是特异性结合VEGF的抗体，其包含SEQ ID NO：42的VH序列和SEQ ID NO：02的VL序列。

本发明的另一方面是特异性结合VEGF的抗体，其包含SEQ ID NO：44的VH序列和SEQ ID NO：02的VL序列。

本发明的另一方面是编码本发明抗体的分离的核酸。

本发明的另一方面是包含本发明核酸的宿主细胞。

本发明的另一方面是产生与VEGF结合的抗体的方法，其包括在适于表达所述抗体的条件下培养本发明的宿主细胞。本发明的另一方面是通过所述方法产生的抗体。

本发明的另一方面是包含本发明抗体和药学上可接受载体的药物组合物。

本发明的另一方面是本发明的抗体或本发明的药物组合物，其用作药物。

本发明的另一方面是本发明的抗体或本发明的药物组合物，其用于治疗VEGF相关疾病，例如癌症或眼疾病。

本发明的另一方面是本发明的抗体或本发明的药物组合物在制备药物中的用途。

本发明的另一方面是本发明的抗体或本发明的药物组合物在制备用于抑制血管发生的药物中的用途。

本发明的另一方面是治疗患有VEGF相关疾病例如癌症或眼疾病的个体的方法，包括向所述个体施用有效量的本发明的抗体或本发明的药物组合物。

本发明的另一方面是抑制个体中血管发生的方法，包括向所述个体施用有效量的本发明的抗体或本发明的药物组合物以抑制血管发生。

本发明提供新的抗VEGF抗体，其表现出特别有价值的性质，如高亲和性、高稳定性和改善的安全特性，例如通过避免由通过VEGF-R1阻断VEGF-信号传导引起的副作用。本发明提供的抗体表现出允许抗体片段的治疗应用的高亲和性。本发明的抗体表现出有价值的性质，其对患有VEGF相关疾病的患者产生益处，所述疾病例如癌症、血管疾病或眼疾病(例如年龄相关性黄斑变性)。

附图说明

图1：与VEGF-R1结构域2(红色)和与VEGF-R2结构域2和3(蓝色)复合的VEGF二聚体(紫色)的晶体结构。

图2：如实施例2所述，在抗体Fab片段的存在下对VEGF与VEGF-R1和VEGF-R2的结合的抑制(VEGF：VEGF-R2/R1抑制ELISA)。

图3：如实施例4所述，通过ELISA确定的抗VEGF抗体的VEGF结合。

图4A：如实施例6所述，在本发明的抗VEGF抗体VEGF-0089、VEGF-0113、VEGF-0114和雷珠单抗以及L3H6 Fab的存在下，VEGF与VEGF-R2的结合的抑制，(0.4nM VEGF)。

图4B：如实施例6中所述，在本发明的抗VEGF抗体VEGF-0089和现有技术抗体2C3、r84和L3H6的存在下，VEGF与VEGF-R2结合的抑制，(0.7nM VEGF)。

图5：如实施例6中所述，在抗VEGF抗体的存在下VEGF与VEGF-R1的结合的抑制(0.7nM VEGF)。

图6：如实施例6中所述，在抗VEGF抗体的存在下VEGF与VEGF-R1的结合的抑制(0.34nM VEGF)。

图7：如实施例6中所述，在抗VEGF抗体的存在下VEGF与VEGF-R2的结合的抑制(0.34nM VEGF)。

图8：如实施例11中所述，在抗VEGF抗体的存在下VEGF与VEGF-R1的结合的抑制(0.34nM VEGF)。

图9：如实施例11中所述，在抗VEGF抗体的存在下VEGF与VEGF-R1的结合的抑制(0.7nM VEGF)。

图10：如实施例11中所述，在抗VEGF抗体的存在下VEGF与VEGF-R2的结合的抑制(0.34nM VEGF)。

图11：如实施例11中所述，在抗VEGF抗体的存在下VEGF与VEGF-R2的结合的抑制(0.7nM VEGF)。

图12：根据实施例13，如X射线晶体学所确定的，与抗VEGF抗体VEGF-0089复合的VEGF二聚体(紫色)的晶体结构。

图13：根据实施例13，如通过X射线晶体学所确定的，在VEGF-A121(SEQ ID NO：45)的二聚体中由VEGF-0089 Fab片段结合的表位氨基酸。在

的距离内与VEGF-0089 Fab片段接触的每一个VEGF-A121分子中包含的氨基酸位置以黑色突出显示。

具体实施方式

1.定义

本文的术语“抗体”以最广义使用，涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的抗原结合活性即可。

“天然抗体”指具有变化的结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异源四聚体糖蛋白，其由通过二硫键结合的两条相同的轻链和两条相同的重链组成。从N端至C端，每条重链具有可变结构域(VH)，也称为可变重结构域或重链可变区，其后是三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)。类似地，从N端到C端，每条轻链具有可变结构域(VL)，也称为可变轻结构域或轻链可变区，其后是恒定轻(CL)结构域。

术语“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”在本文可互换使用，指具有与天然抗体结构基本类似的结构或具有含有如本文所限定的Fc区的重链的抗体。

“分离的”抗体是已经与其天然环境的组分分开的抗体。在一些实施方案中，抗体纯化至大于95％或99％的纯度，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或层析(例如，离子交换或反相HPLC)方法所测定的。关于评估抗体纯度的方法的综述，参见例如Flatman等，J.Chromatogr.B 848：79-87(2007)。

“人抗体”指拥有与由人或人细胞生成的或利用人抗体全集或其它人抗体编码序列自非人来源衍生的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列的抗体。人抗体的此定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。

处于本文中的目的，“受体人构架”是包含衍生自人免疫球蛋白构架或人共有构架的轻链可变结构域(VL)构架或重链可变结构域(VH)构架的氨基酸序列的构架，如下文所定义的。

“构架”或“FR”是指除高变区(HVR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。HVR和FR序列在VH(或VL)中通常以下述顺序出现：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。

如本文所用的术语“高变区”或“HVR”是指抗体可变结构域中的序列上高度可变的(“互补决定区”或“CDR”)和/或形成结构上限定的环的(“高变环”)和/或含有抗原接触残基的(“抗原接触”)每个区域。通常，抗体包含六个HVR：三个在VH中(H1、H2、H3)，且三个在VL中(L1、L2、L3)。本文中的示例性HVR包括：

(a)在氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)处出现的高变环(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987))；

(b)在氨基酸残基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)处出现的CDR(Kabat等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991))；

(c)在氨基酸残基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)和93-101(H3)处出现的抗原(MacCallum等人J.Mol.Biol.262：732-745(1996))；和

(d)(a)、(b)和/或(c)的组合，包括HVR氨基酸残基46-56(L2)、47-56(L2)、48-56(L2)、49-56(L2)、26-35(H1)、26-35b(H1)、49-65(H2)、93-102(H3)和94-102(H3)。

除非另有说明，可变结构域中的HVR(例如CDR)残基和其它残基(例如FR残基)在本文中根据Kabat等人(见上文)进行编号。

抗体的“类”是指其重链拥有的恒定结构域或恒定区的类型。抗体有5大类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的几种可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁和IgA₂。在某些实施方案中，抗体是IgG₁同种型。在某些实施方案中，该抗体是具有P329G、L234A和L235A突变以降低Fc区效应子功能的IgG₁同种型。在其他实施方案中，抗体是IgG₂同种型。在某些实施方案中，该抗体是在铰链区具有S228P突变以改善IgG₄抗体稳定性的IgG₄同种型。对应于不同类的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。基于其恒定结构域的氨基酸序列，抗体的轻链可以被分配给称为kappa(κ)和lambda(λ)的两个类型中的一个。

术语“Fc区”在本文中用于定义免疫球蛋白重链的至少含有恒定区一部分的的C-末端区。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基末端。然而，Fc区的C-末端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。除非本文另有说明，否则Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号是依照EU编号***(也称为EU索引)进行的，如在Kabat等，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD，1991中所述。

“效应子功能”是指归因于抗体的Fc区的那些生物活性，其随抗体同种型而变化。抗体效应子功能的例子包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调；和B细胞活化。

除非另有说明，本文所用的术语“VEGF”是指来自任何脊椎动物来源(包括哺乳动物，例如灵长类(例如人)和啮齿类(例如小鼠和大鼠))的任何天然VEGF。该术语涵盖“全长的”、未加工的VEGF以及由在细胞中加工产生的任何形式的VEGF。该术语还涵盖VEGF的天然存在的变体，例如剪接变体或等位变体。示例性的人VEGF的氨基酸序列示于SEQ ID NO：29。

术语“抗VEGF抗体”和“结合VEGF的抗体”指能够以足够的亲和力与VEGF结合的抗体，使得该抗体在靶向VEGF中可用作诊断剂和/或治疗剂。在一个实施方案中，抗VEGF抗体与无关的非VEGF蛋白质的结合程度小于所述抗体与VEGF的结合的约10％，如例如，通过表面等离子共振(SPR)所测量的。在某些实施方案中，结合VEGF的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10-8M或更低，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)的解离常数(Kd)。当抗体具有1μM或更低的Kd时，则称该抗体“特异性结合”VEGF。

“亲和力”指分子(例如抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间非共价相互作用的总和的强度。除非另外指明，如本文所用，“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗体和抗原)之间1：1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可由解离常数(Kd)表示。亲和力可以通过本领域已知的常规方法，包括本文所述的那些方法来测量。下面描述了用于测量结合亲和力的具体说明性和示例性实施方案。

术语“可变区”或“可变结构域”是指牵涉抗体与抗原结合的抗体重链或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守构架区(FR)和三个高变区(HVR)。(参见，例如Kindt等人KubyImmunology，第6版，W.H.Freeman和Co.，第91页(2007).)单个VH或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。此外，结合特定抗原的抗体可以分别使用来自结合此抗原的抗体的VH或VL结构域以筛选互补VL或VH结构域的文库而分离。参见，例如，Portolano等人，J.Immunol.150：880-887(1993)；Clarkson等人，Nature 352：624-628(1991)。

如本文使用的，术语“单克隆抗体”指从一群基本上同质的抗体中获得的抗体，即构成该群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位，除了可能的变体抗体(例如，含有天然存在的突变或在单克隆抗体制剂的生产过程中出现的变体抗体，这样的变体通常以少量存在)之外，。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，单克隆抗体制备物中的每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆”指示抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法来产生抗体。例如，依照本发明的单克隆抗体可以通过多种技术制备，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法和利用含有全部或部分的人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，这样的方法和用于制备单克隆抗体的其它示例性方法在本文描述。

“抗体片段”指不同于完整抗体的分子，其包含完整抗体的部分，所述部分与完整抗体所结合的抗原相结合。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab′)2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。

相对于参考多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为在将候选序列与参考多肽序列进行比对并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性，且出于比对的目的，不将任何保守置换视为序列同一性的一部分之后，候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分数。用于确定百分比氨基酸序列同一性的比对可以用以本领域技术范围内的的各种方式实现，例如，使用公众可获得的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、Clustal W、Megalign(DNASTAR)软件或FASTA程序包。本领域技术人员可以确定用于比对序列的合适参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。然而，为了本文的目的，使用FASTA软件包版本36.3.8c或更高版本的ggsearch程序以及BLOSUM50比较矩阵产生％氨基酸序列同一性值。FASTA程序包由W.R.Pearson和D.J.Lipman(1988)，“Improved Tools for Biological Sequence Analysis”，PNAS 85：2444-2448；W.R.Pearson(1996)“Effective protein sequence comparison”Meth.Enzymol.266：227-258；和Pearson等人(1997)Genomics 46：24-36编写，并且公开地可获自www.fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_down.shtml或www.ebi.ac.uk/Tools/sss/fasta。备选地，可使用在fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/index.cgi上可访问的公共服务器来比较序列，使用ggsearch(全局蛋白质：蛋白质)程序和默认选项(BLOSUM50；open：-10；ext：-2；Ktup＝2)以确保进行全局比对而不是局部比对。百分比氨基酸序列同一性在输出比对标题中给出。

“亲和力成熟的”抗体是指与不具有下述改变的亲本抗体相比，在一个或更多个高变区(HVR)具有一个或更多个改变的抗体，所述改变导致抗体针对抗原的亲和力的改善。

术语“表位”表示抗VEGF抗体结合的蛋白质的或非蛋白质的抗原上的位点。表位可以由连续的氨基酸连续段(线性表位)形成，或者包含非连续的氨基酸(构象表位)，例如由于抗原的折叠(即通过蛋白质抗原的三级折叠)而空间接近。在蛋白质抗原暴露于变性剂后，线性表位通常仍然被抗VEGF抗体结合，而构象表位通常在用变性剂处理后被破坏。表位包含独特空间构象中的至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个或8-10个氨基酸。

可以使用本领域常规方法进行结合特定表位的抗体(即，结合相同表位的那些)的筛选，所述方法诸如例如但不限于，丙氨酸扫描、肽印迹(参见Meth.Mol.Biol.248(2004)443-463)、肽切割分析、表位切除、表位提取、抗原的化学修饰(参见Prot.Sci.9(2000)487-496)和交叉封闭(参见“Antibodies”，Harlow和Lane(Cold Spring Harbor Press，ColdSpring Harb.，NY)。

基于抗原结构的抗体谱(ASAP)，也称为修饰辅助谱(MAP)，允许基于来自多个化学或酶修饰的抗原表面的每个抗体的结合谱，将多个特异性结合VEGF的单克隆抗体分箱(参见，例如US2004/0101920)。每个箱(bin)中的抗体结合相同表位，所述相同表位可以是与由另一个箱代表的表位明显不同或部分重叠的独特表位。

在一些实施方案中，如果抗原中减少或消除一种抗体的结合的基本上所有氨基酸突变也减少或消除另一种抗体的结合，则认为两种抗体结合相同表位。如果仅有减少或消除一种抗体的结合的氨基酸突变的子集减少或消除另一种抗体的结合，则认为两种抗体具有“重叠表位”。

“免疫缀合物”是与一个或更多个异源分子(包括但不限于细胞毒性剂)缀合的抗体。

术语“核酸”，“核酸分子”或“多核苷酸”包括包含核苷酸的聚合物的任何化合物和/或物质。每个核苷酸由碱基，特别是嘌呤或嘧啶碱基(即胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U))、糖(即脱氧核糖或核糖)和磷酸基团组成。通常，核酸分子由碱基的序列描述，由此所述碱基代表核酸分子的一级结构(线性结构)。碱基的序列通常表示为5′至3′。在本文中，术语核酸分子涵盖脱氧核糖核酸(DNA)，包括例如互补DNA(cDNA)和基因组DNA、核糖核酸(RNA)，特别是信使RNA(mRNA)、DNA或RNA的合成形式，以及包含两种或更多种这些分子的混合的聚合物。核酸分子可以是线性的或环状的。此外，术语核酸分子包括有义链和反义链二者，以及单链和双链形式。而且，本文所述的核酸分子可含有天然存在的或非天然存在的核苷酸。非天然存在的核苷酸的例子包括具有衍生的糖或磷酸骨架键合或化学修饰的残基的修饰的核苷酸碱基。核酸分子还涵盖DNA和RNA分子，其适合作为载体用于在体外和/或体内，例如在宿主或患者中，直接表达本发明的抗体。此类DNA(例如cDNA)或RNA(例如mRNA)载体可以是未修饰的或修饰的。例如，可以对mRNA进行化学修饰以增强RNA载体的稳定性和/或被编码分子的表达，从而可以将mRNA注入到受试者内以在体内产生抗体(参见例如Stadler等人，Nature Medicine 2017，published online 2017年6月12日，doi：10.1038/nm.4356或EP 2 101 823 B1)。

“分离的”核酸指已经与其天然环境的组分分开的核酸分子。分离的核酸包括在下述细胞中含有的核酸分子，所述细胞通常含有该核酸分子，但该核酸分子存在于染色体外或存在于不同于其天然染色***置的染色***置处。

“编码抗VEGF抗体的分离的核酸”指编码抗体重链和轻链(或其片段)的一个或更多个核酸分子，包括在单一载体或分开的载体中的这样的一个或更多个核酸分子，和存在于宿主细胞中一个或更多个位置的这样的一个或更多个核酸分子。

本文所用的术语“载体”是指能够扩增与其连接的另一个核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制型核酸结构的载体以及整合入已引入该载体的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与它们可操作连接的核酸的表达。这样的载体在本文中称为“表达载体”。

术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换地使用，并且是指其中引入外源核酸的细胞，包括这种细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“经转化的细胞”，其包括原代的经转化的细胞和来源于其的后代，而不考虑传代的次数。后代在核酸内容物上可能与亲本细胞不完全相同，而是可以包含突变。本文中包括具有与在初始转化的细胞中筛选或选择的相同功能或生物学活性的突变体后代。

术语“药物组合物”或“药物制剂”指这样的制剂，其以允许包含在其中的活性成分的生物学活性有效的形式存在，并且不含有对施用所述药物组合物的受试者具有不可接受的毒性的另外的成分。

试剂例如药物组合物的“有效量”是指在需要的剂量和时间阶段有效获得所需的治疗或预防结果的量。

“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于家养动物(例如，牛、绵羊、猫、狗和马)、灵长类动物(例如，人和非人灵长类动物如猴)、兔以及啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或受试者是人。

“药学上可接受的载体”是指药物组合物或制剂中的活性成分以外的成分，其对受试者是无毒的。药学上可接受的载体包括，但不限于，缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。

术语“包装插页”用于指通常包括在治疗产品的商业包装中的说明书，其包含关于适应证、用法、剂量、施用、组合疗法、禁忌症的信息和/或关于使用这样的治疗产品的警告。

如本文所用，“治疗(treatment)”(及其语法变化如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)指在试图改变所治疗的个体疾病的自然进程中的临床干预，并且可以是为了预防或在临床病理学的进程中进行的临床干预。治疗的理想效果包括，但不限于，防止疾病发生或复发，缓解症状，减轻疾病的任何直接或间接病理学后果，预防转移，降低疾病进展速率，改善或减轻疾病状态，和消退或改善的预后。在一些实施方案中，本发明的抗体用于延缓疾病的发展或减缓疾病的进展。

2.本发明的实施方案的具体描述

在一个方面中，本发明部分基于使用抗VEGF抗体抑制血管发生。在某些实施方案中，提供结合VEGF的抗体。本发明的抗体可用于例如诊断或治疗VEGF相关疾病，诸如例如癌症或眼疾病。

A.示例性抗VEGF抗体

在一个方面中，本发明提供结合VEGF的抗体。在一个方面中，提供结合VEGF的分离的抗体。在一个方面中，本发明提供特异性结合VEGF的抗体。在某些实施方案中，抗VEGF抗体

a)其中所述抗体与VEGF的结合显著抑制VEGF与VEGF受体VEGF-R2的结合，而不显著抑制VEGF与VEGF受体VEGF-R1的结合，和/或

b)其中所述抗体以≤150pM的亲和力结合VEGF，如在25℃的温度下通过表面等离子共振所测量的，并且其中所述抗体以更高或大约相同的亲和力结合VEGF，如在37℃的温度下通过表面等离子共振所测量的。

在一个方面中，本发明提供抗VEGF抗体，其包含选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR：(a)CDR-H1，其包含SEQ ID NO：03的氨基酸序列；(b)CDR-H2，其包含SEQ ID NO：04的氨基酸序列；(c)CDR-H3，其包含SEQ ID NO：05的氨基酸序列；(d)CDR-L1，其包含SEQ ID NO：06的氨基酸序列；(e)CDR-L2，其包含SEQ ID NO：07的氨基酸序列；和(f)CDR-L3，其包含SEQ ID NO：08的氨基酸序列。包含此组CDR氨基酸序列的一个示例性抗体是本文中称为“VEGF-0089”的抗体。

在一个方面中，本发明提供一种抗体，其包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VH CDR序列：(a)CDR-H1，其包含SEQ ID NO：03的氨基酸序列；(b)CDR-H2，其包含SEQID NO：04的氨基酸序列；和(c)CDR-H3，其包含SEQ ID NO：05的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述抗体包含CDR-H3，其包含SEQ ID NO：05的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述抗体包含CDR-H3和CDR-L3，其中所述CDR-H3包含SEQ ID NO：05的氨基酸序列，所述CDR-L3包含SEQ ID NO：08的氨基酸序列。在另外的实施方案中，所述抗体包含CDR-H3、CDR-L3和CDR-H2，其中所述CDR-H3包含SEQ ID NO：05的氨基酸序列，所述CDR-L3包含SEQ ID NO：08的氨基酸序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO：04的氨基酸序列。在另外的实施方案中，抗体包含(a)CDR-H1，其包含SEQ ID NO：03的氨基酸序列；(b)CDR-H2，其包含SEQ ID NO：04的氨基酸序列；和(c)CDR-H3，其包含SEQ ID NO：05的氨基酸序列。

在另一个方面，本发明提供一种抗体，其包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VL CDR序列：(a)CDR-L1，其包含SEQ ID NO：06的氨基酸序列；(b)CDR-L2，其包含SEQID NO：07的氨基酸序列；和(c)CDR-L3，其包含SEQ ID NO：08的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述抗体包含(a)CDR-L1，其包含SEQ ID NO：06的氨基酸序列；(b)CDR-L2，其包含SEQID NO：07的氨基酸序列；和(c)CDR-L3，其包含SEQ ID NO：08的氨基酸序列。

在另一个方面，本发明的抗体包含(a)VH结构域，其包含选自选自以下的CDR序列的至少一个、至少两个或全部三个VH CDR序列：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO：03的氨基酸序列：(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO：04的氨基酸序列；和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO：05的氨基酸序列；以及(b)VL结构域，其包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VLCDR序列：(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO：06的氨基酸序列；(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO：07的氨基酸序列；和(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO：08的氨基酸序列。

在另一个方面，本发明的抗体包含(a)VH结构域，其包含(a)CDR-H1，其包含SEQ IDNO：03的氨基酸序列：(b)CDR-H3，其包含SEQ ID NO：05的氨基酸序列；和(b)VL结构域，其包含(c)CDR-L1，其包含SEQ ID NO：06的氨基酸序列；(d)CDR-L2，其包含SEQ ID NO：07的氨基酸序列；和(e)CDR-L3，其包含SEQ ID NO：08的氨基酸序列。

在另一个方面中，本发明提供包含以下各项的抗体：(a)CDR-H1，其包含SEQ IDNO：03的氨基酸序列；(b)CDR-H2，其包含SEQ ID NO：04的氨基酸序列；(c)CDR-H3，其包含SEQ ID NO：05的氨基酸序列；(d)CDR-L1，其包含SEQ ID NO：06的氨基酸序列；(e)CDR-L2，其包含SEQ ID NO：07的氨基酸序列；和(f)CDR-L3，其包含SEQ ID NO：08的氨基酸序列。包含此组CDR氨基酸序列的一个示例性抗体是本文中称为“VEGF-0089”的抗体。

在某些实施方案中，如上提供的抗VEGF抗体的任何一个或更多个氨基酸在CDR-H2(SEQ ID NO：04)的以下CDR位置处突变：位置4、6、7和8。

在某些实施方案中，置换是如本文所提供的保守置换或缺失。在某些实施方案中，以下置换或缺失中的任何一个或更多个可以以任何组合进行：在CDR-H2(SEQ ID NO：04)中：位置N4S，G6P，在位置7的氨基酸G的缺失和I8F。

在另一个方面，本发明的抗体包含(a)VH结构域，其包含(i)CDR-H1，其包含SEQ IDNO：03的氨基酸序列：(ii)CDR-H2，其2与SEQ ID NO：04的氨基酸序列具有至少80％序列同一性；和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO：05的氨基酸序列；和(b)VL结构域，其包含(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO：06的氨基酸序列；(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO：07的氨基酸序列；和(iii) CDR-L3，其包含SEQ ID NO：08的氨基酸序列。

在另一个方面，本发明的抗体包含(a)VH结构域，其包含(i)CDR-H1，其包含SEQ IDNO：03的氨基酸序列：(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列；和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO：05的氨基酸序列；和(b)VL结构域，其包含(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO：06的氨基酸序列；(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO：07的氨基酸序列；和(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO：08的氨基酸序列。在根据本发明的此方面的抗体中，CDR-H2包含SEQ ID NO：30的氨基酸，其是以下共有序列：SIGX₁GX₂X₃X₄YTYYADSVKG(SEQ ID NO：30)，其中X₁，X₂和X₄彼此独立地选自来自于任何天然存在的氨基酸，并且其中X₃选自任何天然存在的氨基酸或缺口(无氨基酸)。

在另一个方面，本发明的抗体包含(a)VH结构域，其包含(i)CDR-H1，其包含SEQ IDNO：03的氨基酸序列：(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列；和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO：05的氨基酸序列；和(b)VL结构域，其包含(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO：06的氨基酸序列；(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO：07的氨基酸序列；和(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO：08的氨基酸序列。在根据本发明的此方面的抗体中，CDR-H2包含SEQ ID NO：31的氨基酸，其为以下共有序列：SIGX₁GX₂X₃X₄YTYYADSVKG(SEQ ID NO：31)，其中X₁选自N或S，X₂选自G或P，X₃为缺口(无氨基酸)或G；以及X₄选自I或F。

在另一个方面中，本发明提供包含以下各项的抗体：(a)CDR-H1，其包含SEQ IDNO：03的氨基酸序列；(b)CDR-H2，其包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列；(c)CDR-H3，其包含SEQ ID NO：05的氨基酸序列；(d)CDR-L1，其包含SEQ ID NO：06的氨基酸序列；(e)CDR-L2，其包含SEQ ID NO：07的氨基酸序列；和(f)CDR-L3，其包含SEQ ID NO：08的氨基酸序列。包含此组CDR氨基酸序列的示例性抗体是本文中称为“VEGF-0113”和“VEGF-P1AE3520”的抗体。

在另一个方面中，本发明提供包含以下各项的抗体：(a)CDR-H1，其包含SEQ IDNO：03的氨基酸序列；(b)CDR-H2，其包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列；(c)CDR-H3，其包含SEQ ID NO：05的氨基酸序列；(d)CDR-L1，其包含SEQ ID NO：06的氨基酸序列；(e)CDR-L2，其包含SEQ ID NO：07的氨基酸序列；和(f)CDR-L3，其包含SEQ ID NO：08的氨基酸序列。包含此组CDR氨基酸序列的示例性抗体是本文中称为“VEGF-0114”和“VEGF-P1AE3521”的抗体。

在一个实施方案中，抗VEGF抗体进一步包含受体人构架，例如人免疫球蛋白构架或人共有构架。

在另一个方面，抗VEGF抗体包含与SEQ ID NO：01的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列含有相对于参考序列的置换(例如保守置换)、***或缺失，但是包含该序列的抗VEGF抗体保留结合VEGF的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO：01中总共1至10个氨基酸被置换、***和/或缺失。在某些实施方案中，置换、***或缺失发生在CDR外部的区域中(即，FR中)。任选地，抗VEGF抗体包含SEQ ID NO：01中的VH序列，包括那个序列的翻译后修饰。在具体的实施方案中，VH包含选自以下各项的一个、两个或三个CDR：(a)CDRCDR-H1，其包含SEQ ID NO：03的氨基酸序列，(b)CDR-H2，其包含SEQ ID NO：04的氨基酸序列，和(c)CDR-H3，其包含SEQ ID NO：05的氨基酸序列。

在另一个方面，提供抗VEGF抗体，其中所述抗体包含与SEQ ID NO：02的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域(VL)序列。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列含有相对于参考序列的置换(例如保守置换)、***或缺失，但是包含该序列的抗VEGF抗体保留结合VEGF的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO：02中总共1至10个氨基酸被置换、***和/或缺失。在某些实施方案中，置换、***或缺失发生在CDR外部的区域中(即，FR中)。任选地，抗VEGF抗体包含SEQ ID NO：02中的VL序列，包括那个序列的翻译后修饰。在具体的实施方案中，VL包含一个、两个或三个选自以下的CDR：(a)CDR-L1，其包含SEQ ID NO：06的氨基酸序列；(b)CDR-L2，其包含SEQ IDNO：07的氨基酸序列；和(c)CDR-L3，其包含SEQ ID NO：08的氨基酸序列。

在另一方面，提供抗VEGF抗体，其中所述抗体包含如以上提供的任何实施方案中的VH序列和如以上提供的任何实施方案中的VL序列。在一个实施方案中，所述抗体包含分别在SEQ ID NO：01和SEQ ID NO：02中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，所述抗体包含SEQ ID NO：01的VH结构域和SEQ ID NO：02的VL结构域。包含所述VH和VL结构域的一个示例性抗体是本文中称为“VEGF-0089”的抗体。

在另一方面，提供抗VEGF抗体，其中所述抗体包含如以上提供的任何实施方案中的VH序列和如以上提供的任何实施方案中的VL序列。在一个实施方案中，所述抗体包含分别在SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：02中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，所述抗体包含SEQ ID NO：33的VH结构域和SEQ ID NO：02的VL结构域。包含所述VH和VL结构域的一个示例性抗体是本文中称为“VEGF-P1AD8675”的抗体。

在另一个方面，抗VEGF抗体包含与SEQ ID NO：09的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列含有相对于参考序列的置换(例如保守置换)、***或缺失，但是包含该序列的抗VEGF抗体保留结合VEGF的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO：09中总共1至10个氨基酸被置换、***和/或缺失。在某些实施方案中，置换、***或缺失发生在CDR外部的区域中(即，FR中)。任选地，抗VEGF抗体包含SEQ ID NO：09中的VH序列，包括那个序列的翻译后修饰。在具体的实施方案中，VH包含选自以下各项的一个、两个或三个CDR：(a)CDR-H1，其包含SEQ ID NO：03的氨基酸序列，(b)CDR-H2，其包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列，和(c)CDR-H3，其包含SEQ ID NO：05的氨基酸序列。

在另一方面，提供抗VEGF抗体，其中所述抗体包含如以上提供的任何实施方案中的VH序列和如以上提供的任何实施方案中的VL序列。在一个实施方案中，所述抗体包含分别在SEQ ID NO：09和SEQ ID NO：02中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，所述抗体包含SEQ ID NO：09的VH结构域和SEQ ID NO：02的VL结构域。包含所述VH和VL结构域的一个示例性抗体是本文中称为“VEGF-0113”的抗体。

在另一方面，提供抗VEGF抗体，其中所述抗体包含如以上提供的任何实施方案中的VH序列和如以上提供的任何实施方案中的VL序列。在一个实施方案中，所述抗体包含分别在SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：02中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，所述抗体包含SEQ ID NO：43的VH结构域和SEQ ID NO：02的VL结构域。包含所述VH和VL结构域的一个示例性抗体是本文中称为“VEGF-P1AE3520”的抗体。在另一个方面，抗VEGF抗体包含与SEQ ID NO：11的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列含有相对于参考序列的置换(例如保守置换)、***或缺失，但是包含该序列的抗VEGF抗体保留结合VEGF的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO：11中总共1至10个氨基酸被置换、***和/或缺失。在某些实施方案中，置换、***或缺失发生在CDR外部的区域中(即，FR中)。任选地，抗VEGF抗体包含SEQ ID NO：11中的VH序列，包括那个序列的翻译后修饰。在具体的实施方案中，VH包含选自以下各项的一个、两个或三个CDR：(a)CDR-H1，其包含SEQ IDNO：03的氨基酸序列，(b)CDR-H2，其包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列，和(c)CDR-H3，其包含SEQ ID NO：05的氨基酸序列。

在另一方面，提供抗VEGF抗体，其中所述抗体包含如以上提供的任何实施方案中的VH序列和如以上提供的任何实施方案中的VL序列。在一个实施方案中，所述抗体包含分别在SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：02中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，所述抗体包含SEQ ID NO：11的VH结构域和SEQ ID NO：02的VL结构域。包含所述VH和VL结构域的一个示例性抗体是本文中称为“VEGF-0114”的抗体。

在另一方面，提供抗VEGF抗体，其中所述抗体包含如以上提供的任何实施方案中的VH序列和如以上提供的任何实施方案中的VL序列。在一个实施方案中，所述抗体包含分别在SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：02中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，所述抗体包含SEQ ID NO：45的VH结构域和SEQ ID NO：02的VL结构域。包含所述VH和VL结构域的一个示例性抗体是本文中称为“VEGF-P1AE3521”的抗体。

在所有方面的一个实施方案中，抗体包含CDR-H2，所述CDR-H2包含选自SEQ IDNO：04、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：12的组的氨基酸序列。

在所有方面的一个实施方案中，抗体包含H-FR3，所述H-FR3包含选自SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：47的组的氨基酸序列。

在另外的方面，本发明提供与本文提供的抗VEGF抗体结合相同表位的抗体。例如，在某些实施方案中，提供与抗VEGF抗体结合相同表位的抗体，所述抗VEGF抗体包含SEQ IDNO：01的VH序列和SEQ ID NO：02的VL序列。在一个实施方案中，所述抗VEGF抗体与本文所述的抗体VEGF-0089结合相同的表位，如通过X射线晶体学所测量的。在一个实施方案中，所述抗VEGF抗体与本文所述的抗体VEGF-0089结合相同的表位，如通过实施例13中所述的x射线晶体学所测量的。在一个实施方案中，提供结合VEGF-A121的二聚体上的构象表位的抗体，其中VEGF-A121包含SEQ ID NO：45的氨基酸序列，其中所述表位在VEGF二聚体内的单独VEGF-A121分子之一中包含氨基酸F17、M18、D19、Y21、Q22、R23、Y25、H27、P28、I29、E30、M55、N62、L66、N100、K101、C102、E103、C104、R105和P106；和在VEGF二聚体内的另一个单独VEGF-A121分子中包含氨基酸E30、K48、M81和Q87。根据SEQ ID NO：45所示的VEGF-A121的氨基酸序列中的氨基酸位置进行编号(也参见图13)。在一个实施方案中，表位是通过X射线晶体学测量的。

在本发明的另一个方面，根据上述实施方案中任一项的抗VEGF抗体是单克隆抗体，包括人抗体。在一个实施方案中，抗VEGF抗体是抗体片段，例如Fv、Fab、Fab’、scFv、双抗体或F(ab’)2片段。在一个实施方案中，抗VEGF抗体是Fab片段。在另一个实施方案中，抗体是全长抗体，例如完整的IgG1抗体或如本文定义的其他抗体类或同种型。

在另一方面，根据上述实施方案中任一项的抗VEGF抗体可单独或组合地掺入以下1-6节中所述的任何特征：

1.抗体亲和力

在某些实施方案中，本文提供的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM或≤1nM(例如10^-8M或更低，例如10^-8M至10^-13M，例如10^-9M至10^-13M)的解离常数(Kd)。

在一个实施方案中，本文提供的抗体以≤150pM的亲和力(即具有≤150pM的解离常数(Kd))结合VEGF。

在一个实施方案中，本文提供的抗体的Fab片段以≤150pM的亲和力(即具有≤150pM的解离常数(Kd))结合VEGF。在一个实施方案中，本文提供的抗体以≤150pM的亲和力结合VEGF，如在25℃的温度下通过表面等离子共振所测量的。在一个实施方案中，本文提供的抗体以≤150pM的亲和力结合VEGF，如在37℃的温度下通过表面等离子共振所测量的。在一个实施方案中，本文提供的抗体以≤150pM的亲和力结合VEGF，如在25℃和37℃的温度下通过表面等离子共振所测量的。

在一个实施方案中，本文提供的抗体以≤150pM的亲和力结合VEGF，如在25℃的温度下通过表面等离子共振所测量的，并且所述抗体以更高或大约相同的亲和力结合VEGF，如在37℃的温度下通过表面等离子共振所测量的。“大约相同的亲和力”是指抗体在37℃的亲和力(即，Kd)在抗体在25℃的亲和力(即，Kd)的+/-5％的范围内。

在一个实施方案中，Kd是使用

表面等离子共振测定法测量的。在一个实施方案中，Kd是使用如实施例2中所述的表面等离子共振测定法测量的。

例如，使用

-T-200a BIACORE

(BIAcore，Inc.，Uppsala)的测定在25℃使用固定化的抗原CM5芯片以～10个应答单位(RU)进行。在一个实施方案中，依照供应商的说明书，用N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖酐生物传感器芯片(CM5，BIAcore，Inc.)。用10mM乙酸钠pH4.8将抗原稀释至5μg/ml(～0.2μM)，然后以5μl/分钟的流速注入，以获得约10个应答单位(RU)的偶联蛋白质。注入抗原后，注入1M乙醇胺以封闭未反应的基团。为了进行动力学测量，将两倍连续稀释的Fab(0.78nM至500nM)在25℃以约25μl/min的流速注射在具有0.05％聚山梨醇酯20(TWEEN-20TM)表面活性剂的PBS(PBST)中。使用简单一对一朗格缪尔(Langmuir)结合模型(

Evaluation Software version 3.2)，通过同时拟合结合和解离传感图，计算结合速率(k_on)和解离速率(k_off)。平衡解离常数(Kd)计算为比率k_off/k_on。参见例如Chen等人，J.Mol.Biol.293：865-881(1999)。如果通过上述表面等离子共振测定法，结合速率(on-rate)超过106M-1s-1，那么结合速率可使用荧光淬灭技术来测定，即根据分光计诸如配备了断流装置的分光光度计(Aviv Instruments)或8000系列SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯的测量，在存在浓度渐增的抗原的情况中，测量PBS pH 7.2中20nM抗抗原抗体(Fab形式)于25℃的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的升高或降低。

2.抗体片段

在某些实施方案中，本文提供的抗体是抗体片段。“抗体片段”指除完整抗体之外的分子，其包含完整抗体的部分，所述部分保留了特异性结合抗原的能力。抗体片段包括但不限于Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)₂、Fv、单链Fab(scFab)；单链可变片段(scFv)和单结构域抗体(dAbs)。对于某些抗体片段的综述，请参见Holliger和Hudson，Nature Biotechnology23：1126-1136(2005)。

在一个实施方案中，抗体片段是Fab，Fab′，Fab′-SH或F(ab′)₂片段，特别是Fab片段。木瓜蛋白酶对完整抗体的消化产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，其各自含有重链和轻链可变结构域(分别为VH和VL)以及轻链恒定结构域(CL)和重链第一恒定结构域(CH1)。因此，术语“Fab片段”指包含含有VL结构域和CL结构域的轻链和含有VH结构域和CH1结构域的重链片段的抗体片段。Fab’片段与Fab片段的不同之处在于在CH1结构域的羧基末端处添加残基，包括来自抗体铰链区的一个或更多个半胱氨酸。Fab’-SH是其中恒定结构域的半胱氨酸残基携带有游离的硫醇基团的Fab’片段。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原结合位点(两个Fab片段)和部分Fc区的F(ab′)₂片段。对于包含拯救受体(salvagereceptor)结合表位残基并具有升高的体内半衰期的Fab和F(ab′)₂片段的讨论，参见美国专利No.5,869,046。

在另一个实施方案中，抗体片段是双抗体、三抗体或四抗体。双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价或双特异性的。参见，例如，EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)；和Hollinger等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)。三抗体和四抗体也描述于Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)中。

在另外的实施方案中，抗体片段是单链Fab片段。“单链Fab片段”或“scFab”是由抗体重链可变结构域(VH)、抗体重链恒定结构域1(CH1)、抗体轻链可变结构域(VL)、抗体轻链恒定结构域(CL)和接头组成的多肽，其中所述抗体结构域和所述接头在N-末端至C-末端方向具有以下顺序之一：a)VH-CH1-接头-VL-CL，b)VL-CL-接头-VH-CH1，c)VH-CL-接头-VL-CH1或d)VL-CH1-接头-VH-CL。特别地，所述接头是至少30个氨基酸，优选32至50个氨基酸的多肽。所述单链Fab片段通过CL结构域和CH1结构域之间的天然二硫键稳定。此外，这些单链Fab片段可以通过***半胱氨酸残基(例如根据Kabat编号的可变重链中的位置44和可变轻链中的位置100)产生链间二硫键而进一步稳定。

在另一个实施方案中，抗体片段是单链可变区片段(scFv)。“单链可变片段”或“scFv”是通过接头连接的抗体的重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的融合蛋白。特别地，接头是10-25个氨基酸的短多肽，通常富含甘氨酸以提供柔性，以及富含丝氨酸或苏氨酸以提供可溶性，并且可将VH的N-末端与VL的C-末端连接，或反之亦然。尽管除去了恒定区并引入了接头，但该蛋白质仍保留了原始抗体的特异性。对于scFv片段的综述，参见，例如，Pluückthun，in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，vol.113，Rosenburg and Moore编.，(Springer-Verlag，New York)，pp.269-315(1994)；还参见WO93/16185；和美国专利No.5,571,894和5,587,458。

抗体片段可以通过多种技术制备，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞(例如大肠杆菌)重组产生，如本文所述。

3.人抗体

在某些实施方案中，本文提供的抗体是人抗体。可使用本领域中已知的多种技术来制备人抗体。人抗体一般描述于van Dijk和van de Winkel，Curr.Opin.Pharmacol.5：368-74(2001)和Lonberg，Curr.Opin.Immunol.20：450-459(2008)中。

4.多特异性抗体

在某些实施方案中，本文提供的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点(即，不同抗原上的不同表位或相同抗原上的不同表位)具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，多特异性抗体具有三种或更多种结合特异性。在某些实施方案中，结合特异性之一是对VEGF的，而其他的(两种或更多种)特异性是对任何其他抗原的。在某些实施方案中，双特异性抗体可结合至VEGF的两个(或更多个)不同的表位。多特异性(例如双特异性)抗体也可用于将细胞毒性剂或细胞定位到表达VEGF的细胞。多特异性抗体可制备为全长抗体或抗体片段。

用于制备多特异性抗体的技术包括，但不限于，具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(参见MMilstein和Cuello，Nature 305：537(1983))，和“节-入-穴(knob-in-hole)”工程改造(参见，例如，美国专利No.5,731,168和Atwell等人，J.Mol.Biol.270：26(1997))。也可通过以下方法制备多特异性抗体：用于制备抗体Fc-异二聚体分子的工程化静电操纵效应(WO 2009/089004)；将两个或更多个抗体或片段交联(参见例如美国专利No.4,676,980，及Brennan等人，Science，229：81(1985))；使用亮氨酸拉链来产生双特异性抗体(参见，例如Kostelny等人，J.Immunol.，148(5)：1547-1553(1992)和WO 2011/034605)；使用常见的轻链技术规避轻链错配问题(参见，例如，WO 98/50431)；使用“双抗体”技术来制备双特异性抗体片段(参见，例如Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993))；及使用单链Fv(sFv)二聚体(参见，例如Gruber等人，J.Immunol.，152：5368(1994))；及如例如Tutt等人，J.Immunol.147：60(1991)中所述制备三特异性抗体。

本文中也包括具有三个或更多个抗原结合位点的经工程改造抗体，包括例如“章鱼抗体(Octopus antibodies)”或DVD-Ig(参见例如WO 2001/77342和WO 2008/024715)。具有三个或更多个抗原结合位点的多特异性抗体的其他例子可以在WO 2010/115589，WO2010/112193，WO 2010/136172，WO2010/145792和WO 2013/026831中找到。

多特异性抗体还可以以，在相同抗原特异性的一个或更多个结合臂中具有结构域交叉(即通过交换VH/VL结构域)的不对称形式提供(参见例如WO2009/080252和WO2015/150447)、CH1/CL结构域(参见例如WO2009/080253)或完整的Fab臂(参见例如WO2009/080251、WO2016/016299，还参见Schaefer等人，PNAS，108(2011)1187-1191，和Klein等人，MAbs 8(2016)1010-20)。在一个实施方案中，多特异性抗体包含跨Fab片段。术语“跨Fab片段”或“交叉Fab片段”指其中重链和轻链的可变区或恒定区交换的Fab片段。跨Fab片段包含由轻链可变区(VL)和重链恒定区1(CH1)组成的多肽链，以及由重链可变区(VH)和轻链恒定区(CL)组成的多肽链。不对称Fab臂也可通过将带电荷或不带电荷的氨基酸突变引入结构域界面以指导正确的Fab配对来工程改造。参见例如WO2016/172485。

多特异性抗体的各种其它分子格式是本领域已知的，并且包括在本文中(参见例如Spiess等人，Mol Immunol 67(2015)95-106)。

5.抗体变体

在某些实施方案中，设想了本文提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，可能需要改变抗体的结合亲和力和/或其他生物学特性。可通过在编码抗体的核苷酸序列中引入适当修饰或通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。这些修饰包括例如抗体氨基酸序列内的残基的缺失和/或向其中***和/或对其置换残基。可以进行缺失、***和置换的任何组合，以得到最终构建体，条件是最终构建体具有所需特征，例如抗原结合。

a)置换、***和缺失变体

在某些实施方案中，提供具有一个或更多个氨基酸置换的抗体变体。用于置换性诱变的感兴趣的位点包括HVR(例如CDR)和FR。保守性置换显示在表I中的“优选的置换”的标题下。更多实质性变化在表I中的“示例性置换”的标题下提供，且如下文关于氨基酸侧链类进一步所描述的。可将氨基酸置换引入感兴趣的抗体中，并筛选产物以获得所需活性，例如保持/改善的抗原结合、降低的免疫原性、或改善的ADCC或CDC。

表1

可根据常见侧链特性将氨基酸分组：

(1)疏水性：正亮氨酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile；

(2)中性亲水性：Cys，Ser，Thr，Asn，Gln；

(3)酸性：Asp，Glu；

(4)碱性His，Lys，Arg；

(5)影响链取向的残基：Gly，Pro；

(6)芳香族的：Trp，Tyr，Phe.

非保守性置换将需要将这些类别之一的成员换成另一类别的成员。

一种类型的置换变体牵涉置换亲本抗体(例如人源化抗体或人抗体)的一个或更多个高变区残基。一般地，为进一步研究选择的所得变体相对于亲本抗体会具有某些生物学特性的改变(例如改善)(例如，升高的亲和力、降低的免疫原性)，和/或将基本上保留亲本抗体的某些生物学特性。示例性置换变体是亲和力成熟的抗体，其可例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术，例如本文中所述的那些，方便地生成。简言之，将一个或更多个HVR(例如CDR)残基突变，且将变体抗体展示在噬菌体上，并对其筛选特定生物学活性(例如结合亲和力)。

可在HVR(例如CDR)中进行变化(例如置换)，例如以改善抗体亲和力。可在HVR“热点”(即，由在体细胞成熟过程中以高频率经历突变的密码子编码的残基)(参见例如Chowdhury，Methods Mol.Biol.207：179-196(2008))中作出此类变化；和/或在接触抗原的残基中作出此类变化，对所得变体VH或VL测试结合亲和力。通过次级文库的构建和再选择进行的亲和力成熟已经描述于例如Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology178：1-37(O′Brien等人编，Human Press，Totowa，NJ，(2001))。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法(例如易错PCR(error-prone PCR)、链改组或寡核苷酸指导的诱变)中的任一种将多样性引入经选择用于成熟的可变基因中。随后建立次级文库。随后筛选该文库以鉴定具有所需亲和力的任何抗体变体。另一种引入多样性的方法牵涉HVR(例如CDR)指导的方法，其中随机化若干个HVR残基(例如每次4-6个残基)。可例如使用丙氨酸扫描诱变或建模，特定地鉴定牵涉抗原结合的HVR(例如CDR)残基。特定地，通常靶向CDR-H3及CDR-L3。

在某些实施方案中，置换、***或缺失可在一个或更多个HVR(例如CDR)内进行，只要这些改变不实质上降低抗体结合抗原的能力即可。例如，可在HVR(例如CDR)中作出保守变化(例如保守替代，如本文中提供的)，其没有实质性降低结合亲和力。。例如，这些改变可在HVR(例如CDR)中的抗原接触残基的外部。在上文提供的变体VH及VL序列的某些实施方案中，每个HVR未经改变，或含有不超过一个、两个或三个氨基酸置换。

可用于鉴定抗体的可被靶向用于诱变的残基或区域的方法称作“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham和Wells(1989)Science，244：1081-1085中描述的。在此方法中，残基或靶残基的组(例如，诸如arg、asp、his、lys和glu等带电荷的残基)被鉴定且由中性或带负电氨基酸(例如丙氨酸或聚丙氨酸)替代，以确定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可在对初始置换表明功能敏感性的氨基酸位置处引入进一步的置换。备选地或另外地，抗原-抗体复合物的晶体结构可用于鉴定抗体与抗原之间的接触点。这些接触残基及邻近残基可以作为置换候选物被靶向或消除。可以筛选变体以确定其是否含有所需特性。

氨基酸序列***包括长度在一个残基至含有一百个或更多个残基的多肽范围内的氨基端和/或羧基端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内***。末端***的例子包括具有N端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其他***变体包括抗体的N末端或C末端与酶(例如，针对ADEPT(抗体导向的酶前药治疗))或升高抗体的血清半衰期的多肽的融合。

b)糖基化变体

在某些实施方案中，改变本文所提供的抗体以提高或降低抗体被糖基化的程度。对抗体的糖基化位点的添加或缺失可通过改变氨基酸序列以便建立或移除一个或更多个糖基化位点而方便地实现。

在抗体包含Fc区的情况下，可以改变附接Fc区的寡糖。由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含分支的、双触角寡糖，其一般通过N连接附接于Fc区的CH2域的Asn297。参见，例如，Wright等人，TIBTECH 15：26-32(1997)。寡糖可包括各种碳水化合物，例如甘露糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖及唾液酸，以及与双触角寡糖结构的“主干”中的GlcNAc附接的岩藻糖。在一些实施方案中，可对本发明抗体中的寡糖进行修饰，以创建具有某些改善特性的抗体变体。

在一个实施方案中，提供具有非岩藻糖基化寡糖的抗体变体，即缺少(直接或间接地)附接至Fc区的岩藻糖的寡糖结构。这种非岩藻糖基化寡糖(也称为“无岩藻糖基化(oligosaccharide)”寡糖)尤其是N-连接的寡糖，其缺乏与双触角寡糖结构的主干中的第一GlcNAc附接的岩藻糖残基。在一个实施方案中，提供与天然或亲本抗体相比在Fc区中具有升高比例的非岩藻糖基化寡糖的抗体变体。例如，非岩藻糖基化寡糖的比例可以是至少约20％、至少约40％、至少约60％、至少约80％或甚至约100％(即不存在岩藻糖基化寡糖)。非岩藻糖基化寡糖的百分比是缺乏岩藻糖残基的寡糖的(平均)量相对于附接于Asn297的所有寡糖(例如，复合、杂合和高甘露糖结构)的总和，如通过MALDI-TOF质谱法所测量的，例如如WO2006/082515中所述。Asn297是指位于Fc区中约位置297处(Fc区残基的EU编号)的天冬酰胺残基；然而，由于抗体中的微小序列变化，Asn297也可能位于位置297的上游或下游约±3个氨基酸处，即介于位置294与300之间。在Fc区中具有升高比例的非岩藻糖基化寡糖的此类抗体可以具有改善的FcγRIIIa受体结合和/或改善的效应子功能，特别是改善的ADCC功能。参见例如US 2003/0157108；US 2004/0093621。

能够产生具有减少的去岩藻糖基化的抗体的细胞系的例子包括蛋白质岩藻糖基化缺乏的Lec13 CHO细胞(Ripka等人，Arch.Biochem.Biophys.249：533-545(1986)；US2003/0157108；和WO 2004/056312，尤其实施例11)；和基因敲除细胞系，例如敲除α-1，6-岩藻糖基转移酶基因FUT8的CHO细胞(参见例如Yamane-Ohnuki等人Biotech.Bioeng.87：614-622(2004)；Kanda，Y.，等人，Biotechnol.Bioeng.，94(4)：680-688(2006)；和WO2003/085107)；或具有降低的或消除的GDP-岩藻糖合成或转运蛋白活性的细胞(参见例如，US2004259150，US2005031613，US2004132140，US2004110282)。

在另一个实施方案中，提供具有两分型寡糖(bisected oligosaccharide)的抗体变体，例如其中与抗体Fc区附接的双触角寡糖是通过GlcNAc两分的。这些抗体变体可具有如上所述的降低的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。此类抗体变体的例子描述于例如Umana等人，Nat Biotechnol 17，176-180(1999)；Ferrara等人，Biotechn Bioeng 93，851-861(2006)；WO 99/54342；WO 2004/065540，WO 2003/011878中。

还提供在与Fc区附接的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。这些抗体变体可具有改善的CDC功能。这些抗体变体在例如WO 1997/30087；WO 1998/58964；和WO1999/22764中描述。

c)Fc区变体

在某些实施方案中，可在本文所提供抗体的Fc区中引入一个或更多个氨基酸修饰，由此产生Fc区变体。Fc区变体可包含在一个或更多个氨基酸位置处包含氨基酸修饰(例如置换)的人Fc区序列(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)。

在某些实施方案中，本发明涵盖拥有一些但非所有效应子功能的抗体变体，所述效应子功能使其成为应用的理想候选物，在所述应用中抗体的体内半衰期是重要的，但某些效应子功能(例如补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC))是不必要或有害的。可进行体外和/或体内细胞毒性测定以确认CDC和/或ADCC活性的降低/消耗。例如，可进行Fc受体(FcR)结合测定以确保抗体缺乏FcγR结合(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn结合能力。用于介导ADCC的主要细胞，NK细胞，仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。FcR在造血细胞上的表达总结于Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9：457-492(1991)的第464页上的表3中。评估感兴趣的分子的ADCC活性的体外测定的非限制性例子描述于美国专利No.5,500,362(参见，例如Hellstrom，I.，等人Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 83：7059-7063(1986))和Hellstrom，I等人，Proc.Nat’lAcad.Sci.USA 82：1499-1502(1985)；5,821,337(参见Bruggemann，M.，等人，J.Exp.Med.166：1351-1361(1987))中。或者，可采用非放射性测定方法(参见，例如，用于流式细胞术的ACTI^TM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology，Inc.Mountain View，CA)；和CytoTox

非放射性细胞毒性测定(Promega，Madison，WI))。用于此类测定的有用的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。备选地或另外地，感兴趣的分子的ADCC活性可在体内评估，例如，在诸如Clynes等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 95：652-656(1998)中所公开的动物模型中评估。也可实施C1q结合测定，以确认抗体不能结合C1q且因此缺乏CDC活性。参见，例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为评估补体活化，可实施CDC测定(参见，例如Gazzano-Santoro等人，厂Immunol.Methods202：163(1996)；Cragg，M.S.，等人，Blood 101：1045-1052(2003)；和Cragg，M.S.和M.J.Glennie，Blood 103：2738-2743(2004))。也可使用本领域中已知的方法实施FcRn结合及体内清除/半衰期测定(参见，例如，Petkova，S.B.，等人，Int’l.Immunol.18(12)：1759-1769(2006)；WO 2013/120929 Al)。

具有降低的效应子功能的抗体包括具有Fc区残基238、265、269、270、297、327和329中一个或更多个置换的那些抗体(美国专利No.6,737,056)。此类Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327的两个或更多个位置处具有置换的Fc突变体，包括具有残基265和297置换为丙氨酸的所谓的“DANA”Fc突变体(美国专利No.7,332,581)。

描述了具有改善或减少的与FcR结合的某些抗体变体。(参见，例如美国专利No.6,737,056；WO 2004/056312，和Shields等人.，J.Biol.Chem.9(2)：6591-6604(2001))。

在某些实施方案中，抗体变体包含具有一个或更多个改善ADCC的氨基酸置换的Fc区，例如在Fc区的位置298、333和/或334(残基的EU编号)处的置换。

在某些实施方案中，抗体变体包含具有一个或更多个减少FcγR结合的氨基酸置换的Fc区，例如在Fc区的位置234和235(残基的EU编号)处的置换。在一个实施方案中，置换是L234A和L235A(LALA)。在某些实施方案中，抗体变体在源自人IgG1 Fc区的Fc区中进一步包含D265A和/或P329G。在一个实施方案中，在源自人IgG1 Fc区域的Fc区中的置换是L234A、L235A和P329G(LALA-PG)。(参见，例如，WO 2012/130831)。在另一个实施方案中，在源自人IgG1 Fc区域的Fc区中的置换是L234A、L235A和D265A(LALA-DA)。

在一些实施方案中，在Fc区中进行改变，其导致改变的(即，改善的或降低的)C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，例如，如美国专利No.6,194,551，WO 99/51642和Idusogie等人.，J.Immunol.164：4178-4184(2000)中所述。

US2005/0014934(Hinton等人)中描述具有升高的半衰期及改善的与新生儿Fc受体(FcRn)的结合的抗体，新生儿FcRn负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer等人，J.Immunol.117：587(1976)和Kim等人，J.Immunol.24：249(1994))。那些抗体包含其中具有改善Fc区对FcRn的结合的一个或更多个置换的Fc区。此类Fc变体包括在Fc区残基238、252、254、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434中的一处或更多处具有置换(例如，Fc区残基434的置换)的那些Fc变体(参见，例如，美国专利No.7,371,826；Dall′Acqua，W.F.，等人J.Biol.Chem.281(2006)23514-23524)。

通过定点诱变已经鉴定了对小鼠Fc-小鼠FcRn相互作用关键的Fc区残基(参见例如Dall’Acqua，W.F.，等人J.Immunol 169(2002)5171-5180)。残基I253、H310、H433、N434和H435(根据Kabat的EU编号)牵涉相互作用(Medesan，C.，等人，Eur.J.Immunol.26(1996)2533；Firan，M.，等人，Int.Immunol.13(2001)993；Kim，J.K.，等人，Eur.J.Immunol.24(1994)542)。发现残基I253、H310和H435对于人Fc与鼠FcRn的相互作用是关键的(Kim，J.K.，等人，Eur.J.Immunol.29(1999)2819)。对人Fc-人FcRn复合物的已经研究表明，残基I253、S254、H435和Y436对于相互作用是关键的(Firan，M.，等人，Int.Immunol.13(2001)993；Shields，R.L.，等人，J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604)。在Yeung，Y.A.，等人(J.Immunol.182(2009)7667-7671)中，已经报道和检查了残基248至259和301至317和376至382和424-437的各种突变体。

在某些实施方案中，抗体变体包含具有一个或更多个减少FcRn结合的氨基酸置换的Fc区，例如在Fc区的位置253、和/或310和/或435(残基的EU编号)处的置换。在某些实施方案中，抗体变体包含在位置253、310和435具有氨基酸置换的Fc区。在一个实施方案中，置换是在源自人IgG1 Fc区域的Fc区中的I253A、H310A和H435A。参见，例如，Grevys，A.，等人，J.Immunol.194(2015)5497-5508。

在某些实施方案中，抗体变体包含具有一个或更多个减少FcRn结合的氨基酸置换的Fc区，例如在Fc区的位置310、和/或433和/或436(残基的EU编号)处的置换。在某些实施方案中，抗体变体包含在位置310、433和436具有氨基酸置换的Fc区。在一个实施方案中，置换是在源自人IgG1 Fc区的Fc区中的H310A、H433A和Y436A。(参见，例如，WO 2014/177460Al)。

在某些实施方案中，抗体变体包含具有一个或更多个升高FcRn结合的氨基酸置换的Fc区，例如在Fc区的位置252、和/或254和/或256(残基的EU编号)处的置换。在某些实施方案中，抗体变体包含在位置252、254和256具有氨基酸置换的Fc区。在一个实施方案中，置换是在源自人IgG1 Fc区的Fc区中的M252Y、S254T和T256E。

还参见Duncan&Winter，Nature 322：738-40(1988)；美国专利No.5,648,260；美国专利No.5,624,821；和WO 94/29351，它们涉及Fc区变体的其他例子。

d)半胱氨酸工程改造的抗体变体

在某些实施方案中，可能需要创建半胱氨酸工程改造的抗体，例如THIOMAB^TM抗体，其中抗体的一个或更多个残基用半胱氨酸残基置换。在具体的实施方案中，置换的残基出现在抗体的可接近位点。通过用半胱氨酸置换那些残基，反应性巯基基团从而被定位在抗体的可接近位点，并可用于将抗体缀合至其他部分，例如药物部分或接头-药物部分，以创建免疫缀合物，如本文进一步所述。半胱氨酸工程改造的抗体可以如例如在美国专利No.7,521,541、8,30,930、7,855,275、9,000,130或WO2016040856中所述生成。

6.免疫缀合物

本发明还提供免疫缀合物，其包含与一种或更多种治疗剂例如细胞毒性剂，化学治疗剂，药物，生长抑制剂，毒素(例如蛋白质毒素、细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素缀合(化学键合)的本文中的抗-VEGF抗体。

在一个实施方案中，免疫缀合物是抗体-药物缀合物(ADC)，其中抗体与上述一种或更多种治疗剂缀合。抗体通常使用接头与一种或更多种治疗剂连接。包括治疗剂和药物及接头的例子的ADC技术的概述列于Pharmacol Review 68：3-19(2016)中。

在另一个实施方案中，免疫缀合物包含与酶活性毒素或其片段缀合的如本文所述的抗体，所述酶活性毒素或其片段包括但不限于白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒素A链、相思豆毒素A链、蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链、α-八叠球菌素(sarcin)、油桐(Aleurites fordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陆毒蛋白(Phytolaca americana protein)(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制物、麻疯树毒蛋白、巴豆毒素、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制物、白树毒素、丝裂霉素、局限曲霉素、酚霉素、依诺霉素和单端孢菌毒素(tricothecenes)。

在另一个实施方案中，免疫缀合物包含本文所述抗体，该抗体与放射性原子缀合以形成放射缀合物。多种放射性同位素可用于产生放射性缀合物。例子包括At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、P³²、pb²¹²和Lu的放射性同位素。当放射性缀合物用于检测时，其可包含放射性原子用于闪烁照相研究，例如Ttc-99m或I¹²³，或自旋标记用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，MRI)，例如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。

抗体和细胞毒性剂的缀合物可以使用多种双功能蛋白偶联剂制备，所述蛋白偶联剂例如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯(例如己二亚氨酸二甲酯二盐酸盐(dimethyl adipimidate HCl))、活性酯(例如双琥珀酰亚胺辛二酸酯)、醛(例如戊二醛)、双叠氮化合物(例如双(对-叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(例如双(对-重氮基苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(例如甲苯2，6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(例如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)的双功能衍生物。例如，蓖麻毒素免疫毒素可如Vitetta等人，Science 238：1098(1987)中所述制备。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体缀合的示例性螯合剂。参见WO94/11026。接头可以是便于细胞中细胞毒性药物释放的“可切割的接头”。例如，可以使用酸不稳定性接头、肽酶敏感性接头、光不稳定性接头、二甲基接头或含二硫化物的接头(Chari等人，Cancer Res.52：127-131(1992)；美国专利No.5,208,020)。

本文的免疫缀合物或ADC明确地考虑但不限于用下列交联剂制备的此类缀合物，所述交联剂包括但不限于商业上可获得(例如，购自Pierce Biotechnology，Inc.，Rockford，IL.，U.S.A)的BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC和磺基-SMPB以及SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)。

B.重组方法和组合物

抗体可以使用重组方法和组合物来产生，例如，如US4,816,567中所述。对于这些方法，提供编码抗体的一个或更多个分离的核酸。

在天然抗体或天然抗体片段的情况下，需要两个核酸，一个用于轻链或其片段，一个用于重链或其片段。此类核酸编码包含抗体VL的氨基酸序列和/或包含抗体VH的氨基酸序列(例如抗体的轻链和/或重链)。这些核酸可以在相同的表达载体上或在不同的表达载体上。

在具有异二聚体重链的双特异性抗体的情况下，需要四个核酸，一个用于第一轻链，一个用于包含第一异源单体Fc区多肽的第一重链，一个用于第二轻链，并且一个用于包含第二异源单体Fc区多肽的第二重链。这四个核酸可包含在一个或更多个核酸分子或表达载体中。此类核酸编码包含第一VL的氨基酸序列和/或包含包括第一异源单体Fc区的第一VH的氨基酸序列和/或包含第二VL的氨基酸序列和/或包含包括抗体的第二异源单体Fc区的第二VH的氨基酸序列(例如，抗体的第一和/或第二轻链和/或第一和/或第二重链)。这些核酸可以在相同的表达载体上或在不同的表达载体上，通常这些核酸位于两个或三个表达载体上，即一个载体可包含这些核酸中的多于一个。这些双特异性抗体的例子是CrossMabs(参见，例如Schaefer，W.，等人，PNAS，108(2011)11187-1191)。例如，异源单体重链之一包含所谓的“节突变(knob mutations)”(T366W和任选的S354C或Y349C之一)，另一个包含所谓的“穴突变(hole mutations)”(T366S、L368A和Y407V和任选的Y349C或S354C)(参见例如Carter，P.，等人，Immunotechnol.2(1996)73)，根据Kabat EU编号。

在一个实施方案中，提供编码如本文报道的方法中使用的抗体的分离的核酸。

在一个实施方案中，提供制备抗VEGF抗体的方法，其中所述方法包括，在适合抗体表达的条件下，培养包含编码所述抗体的核酸的宿主细胞，如上文所提供的，和任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收所述抗体。

为了重组产生抗VEGF抗体，将编码抗体(例如上文所描述的抗体)的核酸分离并***一个或更多个载体中，用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。此类核酸可以使用常规程序容易地分离和测序(例如通过使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)，或者通过重组方法产生或通过化学合成获得。

用于克隆或表达编码抗体的载体的适当宿主细胞包括本文描述的原核或真核细胞。例如，抗体可在细菌中产生，特别当不需要糖基化和Fc效应子功能时。对于抗体片段和多肽在细菌中的表达，参见，例如，US 5,648,237、US 5,789,199和US 5,840,523。(还参见Charlton，K.A.，In：Methods in Molecular Biology，卷248，Lo，B.K.C.编，Humana Press，Totowa，NJ(2003)，第245-254页，其描述抗体片段在大肠杆菌中的表达。)在表达后，抗体可以以可溶级分从细菌细胞糊状物中分离，并且可进一步纯化。

除了原核生物以外，真核微生物诸如丝状真菌或酵母也是用于编码抗体的载体的合适的克隆或表达宿主，包括真菌和酵母菌株，其糖基化途径已经“人源化”，导致产生具有部分或完全人糖基化模式的抗体。参见Gerngross，T.U.，Nat.Biotech.22(2004)1409-1414；和Li，H.，等人，Nat.Biotech.24(2006)210-215。

适于表达(糖基化)抗体的合适的宿主细胞也源自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了许多杆状病毒株，其可与昆虫细胞联合使用，特别是用于草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞的转染。

还可利用植物细胞培养物作为宿主。参见，例如，US 5,959,177，US 6,040,498，US6,420,548，US 7，125,978，和US 6,417,429(其描述了用于在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIES^TM技术)。

也可将脊椎动物细胞用作宿主。例如，适应于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其它例子是经SV40转化的猴肾CVl系(COS-7)；人胚肾系(293或293T细胞，如例如Graham，F.L.，等人，J.Gen Virol.36(1977)59-74中所描述的)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4细胞，如例如在Mather，J.P.，Biol.Reprod.23(1980)243-252中所描述的)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人***细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；水牛鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠***肿瘤(MMT 060562)；TRI细胞(如例如Mather，J.P.，等人，Annals N.Y.Acad.Sci.383(1982)44-68中所描述的)；MRC 5细胞；和FS4细胞。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub，G.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77(1980)4216-4220)；以及骨髓瘤细胞系，如Y0、NS0和Sp2/0。关于适合产生抗体的某些哺乳动物宿主细胞系的综述参见例如Yazaki，P.和Wu，A.M.，Methods in Molecular Biology，Vol.248，Lo，B.K.C.(编)，Humana Press，Totowa，NJ(2004)，第255-268页。

在一个实施方案中，宿主细胞是真核的，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如，Y0，NS0，Sp20细胞)。

C.结合测定法

本文提供的抗VEGF抗体可以通过本领域已知的多种测定法对其物理/化学特征和/或生物学活性进行鉴定、筛选或表征。

在一个方面中，例如通过已知方法如ELISA、蛋白印迹法等，测试本发明的抗体的抗原结合活性。

在另一个方面，竞争测定法可用于鉴定与包含SEQ ID NO：01的VH结构域和SEQ IDNO：02的VL结构域的抗体竞争结合VEGF的抗体。

在示例性的竞争测定中，将固定的VEGF在包含第一标记抗体和第二未标记的抗体的溶液中温育，所述第一标记抗体与包含SEQ ID NO：01的VH结构域和SEQ ID NO：02的VL结构域的VEGF结合(例如抗VEGF-0089)，所述第二未标记的抗体被检测其与第一抗体竞争结合VEGF的能力。第二抗体可以存在于杂交瘤上清中。作为对照，将固定的VEGF在包含第一标记的抗体而不包含第二未标记的抗体的溶液中温育。在允许第一抗体与VEGF结合的条件下温育后，去除过量的未结合的抗体，并且测量与固定的VEGF缔合的标记的量。如果相对于对照样品，在测试样品中，与固定的VEGF缔合的标记的量实质性减少，则指示第二抗体与第一抗体竞争对VEGF的结合。参见Harlow和Lane(1988)Antibodies：A Laboratory Manualch.14(Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY)。

D.药物组合物

在另外的方面，提供包含本文提供的任何抗体的药物组合物，例如，用于以下任何治疗方法。在一个方面，药物组合物包含本文提供的任何抗体和药学上可接受的载体。在另一个方面，药物组合物包含本文提供的任何抗体和至少一种另外的治疗剂，例如如下所述的。

本文所述的抗VEGF抗体的药物组合物通过以下制备：将具有所需纯度的此类抗体与一种或更多种任选的药学上可接受的载体混合(Remington’s PharmaceuticalSciences第16版，Osol，A.Ed.(1980))，所述药物组合物为冻干组合物或水溶液的形式。药学上可接受的载体通常在所用剂量和浓度下对接受者无毒，并且包括但不限于：缓冲剂，如组氨酸、磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐及其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸及甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯(alkyl paraben)，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐反荷离子，如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。本文中的示例性药学上可接受的载体进一步包括间质(insterstitial)药物分散剂，如可溶性中性-活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，如rHuPH20(

Halozyme，Inc.)。某些示例性sHASEGP及使用方法，包括rHuPH20，描述于美国专利公开No.2005/0260186和2006/0104968中。在一方面中，sHASEGP与一个或更多个另外的糖胺聚糖酶例如软骨素酶组合。

示例性的冻干抗体组合物描述于美国专利No.6,267,958中。水性抗体组合物包括美国专利No.6,171,586和WO2006/044908中所述的那些，后者的组合物包括组氨酸-乙酸盐缓冲剂。

可以将活性成分截留于例如通过凝聚技术或通过界面聚合所制备的微囊中，例如，分别是羟甲基纤维素或明胶微囊及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微囊中、胶状药物递送***(例如脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米颗粒及纳米胶囊)中或粗滴乳状液中。这些技术公开于Remington’s Pharmaceutical Sciences第16版，Osol，A.编(1980)中。

可以制备用于持续释放的药物组合物。持续释放制剂的合适例子包括含有抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质，该基质为成型制品的形式，例如，膜或微胶囊。

用于体内施用的药物组合物通常是无菌的。无菌性可以容易地实现，例如，通过穿过无菌滤膜过滤实现。

E.治疗方法和施用途径

本文提供的任何抗VEGF抗体可用于治疗方法。

在一个方面中，提供抗VEGF抗体，其用作药物。在另外的方面，提供抗VEGF抗体，其用于治疗VEGF相关疾病(例如癌症或眼疾病)。在某些实施方案中，提供抗VEGF抗体，其用于治疗方法。在某些实施方案中，本发明提供抗VEGF抗体，其用于治疗具有VEGF相关疾病例如癌症或眼疾病的个体的方法中，所述方法包括向所述个体施用有效量的抗VEGF抗体。在一个这样的实施方案中，所述方法进一步包括向个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂(例如一种、两种、三种、四种、五种或六种另外的治疗剂)，例如，如下所述。在进一步的实施方案中，本发明提供抗VEGF抗体，其用于抑制血管发生。在某些实施方案中，本发明提供抗VEGF抗体，其用于抑制个体中血管发生的方法，所述方法包括向个体施用有效量的抗VEGF抗体以抑制血管发生。根据任意以上实施方案的“个体”优选地是人。

在又一个方面，本发明提供抗-VEGF抗体在药物的制造或制备中的用途。在一个实施方案中，药物用于治疗VEGF相关疾病，例如癌症或眼疾病。在进一步的实施方案中，药物用于治疗VEGF相关疾病，例如癌症或眼疾病的方法，所述方法包括向具有VEGF相关疾病例如癌症或眼疾病的个体施用有效量的药物。在一个此类实施方案中，所述方法进一步包括向个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂，例如如下文所述。在进一步的实施方案中，所述药物用于抑制血管发生。在进一步的实施方案中，所述药物用于抑制个体中的血管发生的方法，所述方法包括向个体施用有效量的药物，以抑制血管发生。根据任意以上实施方案的“个体”可以是人。

在又一个的方面，本发明提供用于治疗VEGF相关疾病的方法，例如癌症或眼疾病。在一个实施方案中，所述方法包括向具有这种VEGF相关疾病例如癌症或眼疾病的个体施用有效量的抗VEGF抗体。在一个此类实施方案中，所述方法进一步包括向个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂，如下文所述。根据任意以上实施方案的“个体”可以是人。

在又一个的方面，本发明提供用于抑制个体中血管发生的方法。在一个实施方案中，所述方法包括向个体施用有效量的抗VEGF抗体以抑制血管发生。在一个实施例中，“个体”是人。

在又一个的方面，提供包含本文提供的任何抗VEGF抗体的药物组合物，例如，其用于以上任何治疗方法。在一个实施方案中，药物组合物包含本文提供的任何抗VEGF抗体和药学上可接受的载体。在另一个实施方案中，药物组合物包含本文提供的任何抗VEGF抗体和例如如下所述的至少一种另外的治疗剂。

本发明的抗体可单独使用或与其他试剂联合用于治疗。例如，本发明的抗体可与至少一种另外的治疗剂共同施用。

本发明的抗体(和任何另外的治疗剂)可通过任何合适的手段施用，包括肠胃外，肺内和鼻内，并且如果需要局部治疗，则病灶内施用。肠胃外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。给药可以通过任何适当的途径，例如，通过注射，诸如静脉内或皮下注射，这部分取决于施用是短期的还是长期的。本文考虑多种给药时间方案，包括但不限于，单次或在多个时间点多次施用，推注施用和脉冲输注。

本发明的抗体将以符合良好医疗实践的方式配制、给药和施用。在此背景下考虑的因素包括所治疗的具体病症、所治疗的具体哺乳动物、个体患者的临床状况、病症的起因、试剂的递送部位、施用方法、施用时间安排以及医学从业者已知的其他因素。抗体无需但任选地与目前用于预防或治疗所述病症的一种或更多种试剂一起配制。此类其它试剂的有效量取决于药物组合物中存在的抗体的量、病症或治疗的类型以及上文讨论的其它因素。这些通常以与本文所述相同的剂量和施用路径使用，或以本文所述剂量的约1至99％使用，或以任何剂量使用，并通过经验/临床确定为合适的任何途径使用。

为了预防或治疗疾病，本发明的抗体(当单独使用或与一种或更多种其他另外的治疗剂组合使用时)的适当的剂量将取决于待治疗的疾病的类型，抗体的类型，疾病的严重性和病程，抗体是为预防还是治疗目的施用，之前的治疗，患者的临床病史和对抗体的响应，和主治医师的判断。抗体恰当地以一次或经过一系列治疗施用于患者。取决于疾病的类型和严重性，约1μg/kg至15mg/kg(例如，0.1mg/kg-10mg/kg)的抗体可以是用于施用至患者的初始候选剂量，不管例如是通过一次或更多次分开的施用还是通过连续输注。一种典型的每日剂量可能在约1μg/kg至100mg/kg或更多的范围内，这取决于上文提及的因素。对于在数天或更长的时间的重复施用，取决于病况，治疗一般会维持，直到出现疾病症状的期望遏制。抗体的一个示例性剂量将在约0.05mg/kg至约10mg/kg的范围内。因此，可以向患者施用一个或更多个剂量的约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或其任意组合)。此类剂量可以间歇地施用，例如每周或每三周施用(例如，使得患者接受约两至约二十或例如约六个剂量的抗体)。可以施用初始较高负荷剂量，随后施用一个或更多个较低剂量。这种治疗的进展易于通过常规技术和测定法来监测。

F.制品

在本发明的另一方面中，提供一种制品，所述制品包含可用于治疗、预防和/或诊断上述病症的材料。该制品包含容器和在容器上或与容器联合的标签或包装插页(packageinsert)。合适的容器包括，例如，瓶子、管形瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可以自各种材料诸如玻璃或塑料形成。容器装有单独或与另一种组合物组合有效治疗，预防和/或诊断疾患的组合物，并且可具有无菌的存取口(例如，容器可以是具有由皮下注射针可刺穿的塞子的静脉内溶液袋或管形瓶)。组合物中的至少一种活性试剂是本发明的抗体。标签或包装插页指示使用该组合物是来治疗选择的病况。此外，制品可以包含：(a)其中装有组合物的第一容器，其中所述组合物包含本发明的抗体；和(b)其中装有组合物的第二容器，其中所述组合物包含另外的细胞毒性剂或其他方面的治疗剂。本发明的该实施方案中的制品可进一步包含包装插页，所述包装插页指示所述组合物可以用于治疗特定病况。备选地，或另外地，制品可进一步包含第二(或第三)容器，所述第二(或第三)容器包含药学上可接受的缓冲液，如抑菌注射用水(BWFI)，磷酸盐缓冲盐水，林格溶液和右旋糖溶液。从商业和用户立场，它可进一步包括所需的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、滤器、针头和注射器。

3.本发明的具体实施方案

下面列出了本发明的具体实施方案。

1.结合VEGF的抗体，其中所述抗体与VEGF的结合显著抑制VEGF与VEGF受体VEGF-R2的结合，而不显著抑制VEGF与VEGF受体VEGF-R1的结合。

2.结合VEGF的抗体，其中所述抗体以≤150pM的亲和力结合VEGF，如在25℃的温度下通过表面等离子共振所测量的，和其中所述抗体以更高或大约相同的亲和力结合VEGF，如在37℃的温度下通过表面等离子共振所测量的。

3.结合VEGF的抗体，

b)其中所述抗体以≤150pM的亲和力结合VEGF，如在25℃的温度下通过表面等离子共振所测量的，和其中所述抗体以更高或大约相同的亲和力结合VEGF，如在37℃的温度下通过表面等离子共振所测量的。

4.实施方案1至3中任一项所述的抗体，其中所述抗体的Fab片段的结合显著抑制VEGF与VEGF受体VEGF-R2的结合，而不显著抑制VEGF与VEGF受体VEGF-R1的结合。

5.实施方案1至4中任一项所述的抗体，其中所述抗体的Fab片段以≤150pM的亲和力结合VEGF，如在25℃的温度下通过表面等离子共振所测量的，和如在37℃的温度下通过表面等离子共振所测量的。

6.结合VEGF的抗体，其中所述抗体包含重链可变结构域(VH)，所述重链可变结构域包含

(a)CDR-H1，其包含SEQ ID NO：03的氨基酸序列，

(c)CDR-H3，其包含SEQ ID NO：05的氨基酸序列；和

(d)CDR-L1，其包含SEQ ID NO：06的氨基酸序列，

(e)CDR-L2，其包含SEQ ID NO：07的氨基酸序列；和

(f)CDR-L3，其包含SEQ ID NO：08的氨基酸序列。

7.实施方案1至5中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含重链可变结构域(VH)，所述重链可变结构域包含

(a)CDR-H1，其包含SEQ ID NO：03的氨基酸序列，

(c)CDR-H3，其包含SEQ ID NO：05的氨基酸序列；和

(d)CDR-L1，其包含SEQ ID NO：06的氨基酸序列，

(e)CDR-L2，其包含SEQ ID NO：07的氨基酸序列；和

(f)CDR-L3，其包含SEQ ID NO：08的氨基酸序列。

8.实施方案1至7中任一项所述的抗体，其是单克隆抗体。

9.实施方案1至8中任一项所述的抗体，其是人抗体。

10.实施方案1至9中任一项所述的抗体，其是结合VEGF的抗体片段。

11.实施方案1至10中任一项所述的抗体，其包含与SEQ ID NO：01的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VH序列；和与SEQ ID NO：02的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VL序列。

12.实施方案1至11中任一项所述的抗体，其包含与SEQ ID NO：01的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VH序列；和SEQ ID NO：02的VL序列。

13.实施方案1至12中任一项所述的抗体，其包含SEQ ID NO：01的VH序列和SEQ IDNO：02的VL序列。

14.实施方案1至12中任一项所述的抗体，其包含SEQ ID NO：09的VH序列和SEQ IDNO：02的VL序列。

15.实施方案1至12中任一项所述的抗体，其包含SEQ ID NO：11的VH序列和SEQ IDNO：02的VL序列。

16.实施方案1至12中任一项所述的抗体，其包含SEQ ID NO：33的VH序列和SEQ IDNO：02的VL序列。

17.实施方案1至12中任一项所述的抗体，其包含SEQ ID NO：42的VH序列和SEQ IDNO：02的VL序列。

18.实施方案1至12中任一项所述的抗体，其包含SEQ ID NO：44的VH序列和SEQ IDNO：02的VL序列。

19.特异性结合VEGF的抗体，其包含SEQ ID NO：01的VH序列和SEQ ID NO：02的VL序列。

20.特异性结合VEGF的抗体，其包含SEQ ID NO：09的VH序列和SEQ ID NO：02的VL序列。

21.特异性结合VEGF的抗体，其包含SEQ ID NO：11的VH序列和SEQ ID NO：02的VL序列。

22.特异性结合VEGF的抗体，其包含SEQ ID NO：33的VH序列和SEQ ID NO：02的VL序列。

23.特异性结合VEGF的抗体，其包含SEQ ID NO：42的VH序列和SEQ ID NO：02的VL序列。

24.特异性结合VEGF的抗体，其包含SEQ ID NO：44的VH序列和SEQ ID NO：02的VL序列。

25.实施方案1至24中任一项所述的抗体，其是全长IgG1抗体。

26.实施方案1至24中任一项所述的抗体，其是Fab片段。

27.实施方案1至26中任一项所述的抗体，其中所述抗体以≤150pM的亲和力结合VEGF，如在25℃的温度下通过表面等离子共振所测量的。

28.实施方案1至27中任一项所述的抗体，其中所述抗体是多特异性抗体。

29.实施方案1至28中任一项所述的抗体，其包含

(a)选自SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：32，SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：43的组的氨基酸序列的重链；和

(b)SEQ ID NO：14的轻链。

30.实施方案1至28中任一项所述的抗体，其包含SEQ ID NO：13的重链和SEQ IDNO：14的轻链。

31.实施方案1至28中任一项所述的抗体，其包含SEQ ID NO：15的重链和SEQ IDNO：14的轻链。

32.实施方案1至28中任一项所述的抗体，其包含SEQ ID NO：16的重链和SEQ IDNO：14的轻链。

33.实施方案1至28中任一项所述的抗体，其包含SEQ ID NO：32的重链和SEQ IDNO：14的轻链。

34.实施方案1至28中任一项所述的抗体，其包含(a)VH结构域，所述VH结构域包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO：03的氨基酸序列：(ii)CDR-H2，其与SEQ ID NO：04的氨基酸序列具有至少80％序列同一性；和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO：05的氨基酸序列；和(b)VL结构域，所述VL结构域包含(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO：06的氨基酸序列；(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO：07的氨基酸序列；和(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO：08的氨基酸序列。

35.结合VEGF的抗体，其是具有SEQ ID NO：01的VH序列和SEQ ID NO：02的VL序列的抗体的亲和力成熟变体。

36.结合VEGF的抗体，其是具有SEQ ID NO：01的VH序列和SEQ ID NO：02的VL序列的抗体的变体，其中所述抗体显著抑制VEGF与VEGF受体VEGF-R2的结合，而没有显著抑制VEGF与VEGF受体VEGF-R1的结合。

37.结合VEGF的抗体，其与具有SEQ ID NO：01的VH序列和SEQ ID NO：02的VL序列的抗体结合相同的表位。

38.前述实施方案中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含CDR-H2，所述CDR-H2包含选自SEQ ID NO：04、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：12的组的氨基酸序列。

39.前述实施方案中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含H-FR3，所述H-FR3包含选自SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：47的组的氨基酸序列。

40.分离的核酸，其编码实施方案1至37中任一项所述的抗体。

41.宿主细胞，其包含实施方案36所述的核酸。

42.产生与VEGF结合的抗体的方法，包括在适于表达所述抗体的条件下培养实施方案37所述的宿主细胞。

43.实施方案38所述的方法，其进一步包括从所述宿主细胞回收所述抗体。

44.通过实施方案38或39所述的方法产生的抗体。

45.药物组合物，其包含实施方案1至35中任一项所述的抗体和药学上可接受的载体。

46.实施方案1至35中任一项所述的抗体或实施方案41所述的药物组合物，其用作药物。

47.实施方案1至35中任一项所述的抗体或实施方案41中任一项所述的药物组合物，其用于治疗VEGF相关疾病。

48.实施方案1至35中任一项所述的抗体或实施方案41中任一项所述的药物组合物，其用于治疗癌症。

49.实施方案1至35中任一项所述的抗体或实施方案41中任一项所述的药物组合物，其用于治疗眼疾病。

50.实施方案1至35中任一项所述的抗体或实施方案41所述的药物组合物在制备用于治疗VEGF相关疾病的药物中的用途。

51.实施方案1至35中任一项所述的抗体或实施方案41所述的药物组合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。

52.实施方案1至35中任一项所述的抗体或实施方案41所述的药物组合物在制备用于治疗眼疾病的药物中的用途。

53.实施方案1至35中任一项所述的抗体或实施方案41所述的药物组合物在制备用于抑制血管发生的药物中的用途。

54.治疗患有VEGF相关疾病的个体的方法，其包括向所述个体施用有效量的实施方案1至35中任一项所述的抗体或实施方案41所述的药物组合物。

55.抑制个体中血管发生的方法，其包括向所述个体施用有效量的实施方案1至35中任一项所述的抗体或实施方案41所述的药物组合物以抑制血管发生。

氨基酸序列的描述

下面列出了VH和VL结构域的氨基酸序列，包括抗VEGF抗体VEGF-0089、VEGF-0113和VEGF-0114的标记HVR(HVR以粗体加下划线的字母表示)：

抗体VEGF-0089：

VH结构域(SEQ ID NO：01)

VL结构域(SEQ ID NO：02)

抗体VEGF-0113：

VH结构域(SEQ ID NO：09)

VL结构域(SEQ ID NO：02)

抗体VEGF-0114：

VH结构域(SEQ ID NO：11)

VL结构域(SEQ ID NO：02)

抗体VEGF-P1AD8675：

VH结构域(SEQ ID NO：33)

VL结构域(SEQ ID NO：02)

抗体VEGF-P1AE3520：

VH结构域(SEQ ID NO：42)

VL结构域(SEQ ID NO：02)

抗体VEGF-P1AE3521：

VH结构域(SEQ ID NO：44)

VL结构域(SEQ ID NO：02)

实施例

以下是本发明的方法和组合物的实施例。应该理解，在上文提供的一般性描述下，可以实施多种其他的实施方案。

实施例1：

人抗VEGF抗体(抗体VEGF-0089)的生成

图1描述了与VEGF-R1结构域2和VEGF-R3结构域2和3复合的人VEGF二聚体的晶体结构的重叠(overlay)。该叠加(superimposition)指示VEGF受体二者结合VEGF二聚体上的高度相似的区域，因此以相同的方式产生结合VEGF而不抑制VEGF与受体VEGF-R1和VEGF-R2二者的结合的抗体似乎是高度挑战性的。与此一致，在本领域已知的多种抗VEGF抗体中，仅有少数抗体被报道选择性阻断VEGF与VEGF-R2的结合而不是VEGF与VEGF-R1的结合。

本文所述的抗体VEGF-0089源自罗氏专有的转基因兔，其在用VEGF衍生的抗原免疫后表达人源化抗体库。包含人免疫球蛋白基因座的转基因兔报道于WO2000/46251、WO2002/12437、WO2005/007696、WO2006/047367、US2007/0033661和WO2008/027986中。根据附录A“动物的住宿和照料指南(accommodation)”，将动物圈养在AAALAC认可的动物设施中。所有动物免疫方案和实验均得到Upper Bavaria政府的批准(许可号55.2-1-54-2532-90-14)，并按照德国动物福利条例和欧洲议会和委员会的指令2010/63进行。

转基因兔的免疫

简言之，用与匙孔虫戚血蓝蛋白(KLH)(自制)偶联的重组人VEGF-121蛋白免疫12-16周龄的兔(n＝3)。所有动物在第0天通过皮内施用用完全弗氏佐剂(CFA)乳化的400μg蛋白质免疫，接着在第1、2、6、11和14周通过交替肌内和皮下注射用200ug蛋白质乳剂免疫。从第4次免疫开始，在免疫后第4、5和6天，采集血液。制备血清，用于通过ELISA确定免疫原特异性兔和人特异性免疫球蛋白滴度，分离外周单核细胞，其在B细胞克隆过程中用作抗原特异性B细胞的来源。

从转基因兔克隆B细胞

兔外周血单核细胞(PBMC)的分离：从经免疫的兔中取血液样品。将含有EDTA的全血用1x PBS(PAA)稀释两倍，然后使用哺乳动物淋巴细胞分离液(lympholyte mammal)哺乳动物(Cedarlane Laboratories)根据制造商的说明书进行密度离心。用1×PBS洗涤PBMC两次。

EL-4 B5培养基：使用补充有10％FCS(Pan Biotech)、2mM谷氨酰胺、1％青霉素/链霉素溶液(Gibco)、2mM丙酮酸钠、10mM HEPES(PAN Biotech)和0.05mM b-巯基乙醇(Invitrogen)的RPMI 1640(Pan Biotech)。

板的包被：无菌细胞培养6孔板用在碳酸盐缓冲液(0.1M碳酸氢钠，34mM碳酸氢二钠，pH 9,55)中的2μg/ml KLH包被，在4℃过夜。使用前，将板在无菌PBS中洗涤3次。

巨噬细胞/单核细胞或人Fc结合物的耗竭：将PBMC接种在无菌6孔板(细胞培养级)上，以通过非特异性粘附耗竭巨噬细胞和单核细胞。每个孔最多填充4ml培养基和来自免疫兔的至多6×10e6 PBMC，并允许在培养箱中于37℃结合1h。上清液中的细胞(外周血淋巴细胞(PBL))用于抗原淘选步骤。

免疫荧光染色和流式细胞术：抗IgG FITC(AbD Serotec)和抗huCk PE(Dianova)抗体用于单细胞分选。对于表面染色，将来自耗竭和富集步骤的细胞与抗IgG FITC和抗huCk PE抗体在PBS中温育，并在4℃在黑暗中温育45分钟。染色后，PBMC用冰冷的PBS洗涤两次。最后，将PBMC重新悬浮于冰冷的PBS中并立即进行FACS分析。在FACS分析前添加浓度为5μg/ml的碘化丙锭(BD Pharmingen)以区分死细胞和活细胞。将装配有计算机和FACSDiva^TM软件的Becton Dickinson FACSAria^TM(BD Biosciences)用于单细胞分选。

B细胞培养：兔B细胞的培养通过Seeber等人(S Seeber等人PLoS One 9(2)，e86184.2014年2月04日)中描述的方法进行。简言之，将单个分选的兔B细胞在96孔板中与含有

细胞(1∶100000)(Calbiochem)、5％兔胸腺细胞上清液(MicroCoat)和γ-照射的鼠EL-4B5胸腺瘤细胞(5×10e5细胞/孔)的200μl/孔EL-4B5培养基在37℃下在培养箱中温育7天。除去B细胞培养的上清液用于筛选，且立即收获剩余的细胞，并在-80℃下在100μl RLT缓冲液(Qiagen)中冷冻。

分离编码抗体V结构域的RNA。为了重组表达抗体，将编码VH或VL的PCR产物作为cDNA克隆到表达载体中，并瞬时转化到HEK-293细胞中。

从筛选中选择了包含SEQ ID NO：01的VH结构域和SEQ ID NO：02的VL结构域的抗体。该抗体在本文中也称为抗体“VEGF-0089”。为了随后的分析，生成VEGF-0089作为Fab片段的抗体(本文称为“VEGF-0089 Fab片段”或简称为“VEGF-0089 Fab”)，其具有人VH和VL结构域和兔衍生的轻链恒定结构域(CLκ)和重链恒定结构域(CH1)。VEGF-0089 Fab片段的重链的氨基酸序列是SEQ ID NO：13。VEGF-0089 Fab片段的轻链的氨基酸序列是SEQ ID NO：14。

实施例2：

生成的人抗VEGF抗体(抗体VEGF-0089)的表征

VEGF与抗体VEGF-0089 Fab片段与的结合通过如下所述的表面等离子共振(SPR)来评估。

通过表面等离子共振(SPR)确定抗体结合亲和力

使用标准胺偶联化学法将抗His捕获抗体(GE Healthcare 28995056)固定至系列S传感器芯片C1(GE Healthcare 29104990)，导致500-1000共振单位(RU)的表面密度。作为运行和稀释缓冲液，使用HBS-P+(10mM HEPES，150mMNaCl，pH 7.4，0.05％表面活性剂P20)，测量温度分别设定为25℃和37℃。hVEGF-A121被捕获到表面，结果捕获水平为5至35RU。注射抗VEGF抗体的稀释系列(0.37-30nM)120s，以30μl/min的流速监测解离至少600s。通过注入10mM甘氨酸(pH 1.5)60s使表面再生。通过减去空白注入和减去从未捕获hVEGF-A121的对照流动池获得的响应来校正本体折射率差异(bulk refractive index)。速率常数使用Langmuir 1∶1结合模型在

评价软件内计算。

结果，VEGF-0089 Fab片段的KD被确定为134pM(在25℃的温度下)。

为了进一步表征所述抗体，如下所述评估在VEGF-0089 Fab片段的存在下VEGF与其受体VEGF-R1和VEGF-R2结合的抑制：

在抗体Fab片段的存在下VEGF与VEGF-R1和VEGF-R2结合的抑制(VEGF：VEGF-R2/R1抑制ELISA)。

将384孔链霉抗生物素板(Nunc/Microcoat#11974998001)用0.25μg/ml生物素化的VEGF-R1或0.5μg/ml生物素化的VEGF-R2(自制，在DPBS(1x)(PAN，#P04-36500)中各25μl/孔)包被。将板在室温下温育1小时。平行地，将浓度为0.7nM的VEGF-121-His(自制)与不同稀释度(12x 1∶2稀释步骤，以500nM的浓度开始)的抗体温育。该预温育步骤是在384孔PP板(Weidmann medical technology，#23490-101)中于1x OSEP缓冲液中(双蒸水(bidestwater)，10x，罗氏，#11 666 789 001+0.5％牛血清白蛋白级分V，无脂肪酸，罗氏，#10 735086 001+0,05％Tween 20)中进行的。将板在室温下温育1小时。用90μl/孔PBST-缓冲液(双蒸水，10xPBS罗氏#11666789001+0.1％Tween20)洗涤VEGF-R1/VEGF-R2包被的链霉抗生物素板3次之后，将来自VEGF抗体预温育板的25μl样品转移至包被的链霉抗生物素板，其随后在室温下温育1小时。用90μl/孔PBST-缓冲液洗涤3次后，添加25μl/孔1x OSEP中的检测抗体(抗His POD，Bethyl，#A190-114P，1∶12000)。在室温下温育1h后，将板用90μl PBST缓冲液洗涤3次。同时将25μl TMB(罗氏，#11835033001)添加到所有孔中。在室温下温育10分钟后，在Tecan Safire 2读数器上在370nm/492nm处检测信号。

作为对照和临床中使用的现有技术抗VEGF抗体的代表，

(雷珠单抗，SEQ ID NO：23的重链氨基酸序列，SEQ ID NO：24的轻链氨基酸序列)是在相同条件下评估的。结果显示在图2中。

结果指示VEGF-0089 Fab片段能够完全阻断VEGF与VEGF-R2的结合。VEGF-0089Fab片段没有完全阻断VEGF与VEGF-R1的结合。因此，认为VEGF-0089 Fab片段选择性地通过VEGF-R2而不是通过VEGF-R1阻断VEGF-信号传导。如图2中所示，现有技术抗体

能够完全阻断VEGF与两种受体VEGF-R2和VEGF R1的结合。

实施例3：

人抗VEGF抗体VEGF-0089的改善

为了进一步改善抗体的特性，生成了抗体VEGF-0089的抗体变体。

从各种抗体候选物中，选择两种抗体，其中在H-CDR2环中，H-CDR2环内的三甘氨酸连续段中间的甘氨酸被置换或缺失。

VEGF-0113抗体

VEGF-0089抗体的第一变体是包含SEQ ID NO：09的重链可变结构域和SEQ ID NO：02的轻链可变结构域的抗体。该抗体在本文中称为“VEGF-0113”抗体，并且-当作为具有兔衍生的CLκ和CH1结构域的Fab片段提供时-该抗体被称为“VEGF-0113 Fab片段”或简称为“VEGF-0113 Fab”。本文所用的VEGF-0113 Fab片段包含SEQ ID NO：15的重链和SEQ ID NO：14的轻链。VEGF-0113抗体与抗体VEGF-0089的区别之处仅在于H-CDR2的氨基酸序列，因为VEGF-0089抗体H-CDR2的位置6处的甘氨酸残基被脯氨酸残基置换：

VEGF-0089的H-CDR2 SIGNGGGIYTYYADSVKG(SEQ ID NO：04)

VEGF-0113的H-CDR2 SIGNGPGIYTYYADSVKG(SEQ ID NO：10)

当与VEGF-0089的H-CDR2中的三甘氨酸连续段“GGG”相比时，在VEGF-0113的H-CDR2中实现的氨基酸基序“GPG”赋予H-CDR2环更少的构象自由度。

VEGF-0114抗体

VEGF-0089抗体的第二变体是包含SEQ ID NO：11的重链可变结构域和SEQ ID NO：02的轻链可变结构域的抗体。该抗体在本文中称为“VEGF-0114”抗体，并且当作为具有兔衍生的CLκ和CH1结构域的Fab片段提供时，该抗体被称为“VEGF-0114 Fab片段”或简称为“VEGF-0114Fab”。本文所用的VEGF-0114 Fab片段包含SEQ ID NO：16的重链和SEQ ID NO：14的轻链。VEGF-0114抗体与抗体VEGF-0089的区别之处仅在于H-CDR2的氨基酸序列，因为VEGF-0089抗体的H-CDR2的位置4处的天冬酰胺残基被丝氨酸残基置换，VEGF-0089抗体的H-CDR2的位置7处的甘氨酸残基被去除，且位置8处的异亮氨酸残基被苯丙氨酸残基替代：

VEGF-0089的H-CDR2 SIGNGGGIYTYYADSVKG(SEQ ID NO：04)

VEGF-0114的H-CDR2

(SEQ ID NO：12)

为了生成抗体VEGF-0114，去除VEGF-0089的H-CDR2中的三甘氨酸连续段“GGG”中的第三个甘氨酸残基。另外，在三甘氨酸连续段之后，引入苯丙氨酸替代异亮氨酸(isolycine)残基。

实施例4：

通过直接ELISA评估抗VEGF抗体与VEGF的结合

通过如下直接ELISA评估现有技术抗体2C3和r84与VEGF的结合：

VEGF结合ELISA

将

MaxiSorp^TM384孔μ透明板(#464718)用1μg/ml VEGF-121-His(自制)包被，并在室温下温育1小时。用90μl/孔PBST-缓冲液(双蒸水，10xPBS罗氏#11666789001+0.1％

20)洗涤3次后，加入90μl/孔的封闭缓冲液(双蒸水，10xPBS罗氏#11666789001+2％牛血清白蛋白级分V，不含脂肪酸，罗氏，#10735078001+0,05％

20)，并在室温下温育1h。用90μl/孔PBST-缓冲液洗涤3次后，将25μl起始浓度为60nM的抗体稀释系列(16x 1∶2稀释步骤)加入VEGF包被的孔中。在室温下温育1h后，再次将板用90μl/孔PBST缓冲液洗涤3次。添加25μl/孔的在1x PBS(10x，罗氏，#11666789001)+0.5％牛血清白蛋白级分V，无脂肪酸，罗氏，#10 735 086 001+0,05％Tween 20)中的检测抗体(抗c-mycPOD(Bethyl，#A190-104P，1∶16000)或抗huλLC(Bethyl，#A80-116P，1∶15000)或F(ab’)2片段山羊抗hu IgG Fcy片段特异性(JIR，#109-036-098，1∶2000)或山羊抗hu Ig κ LC(Millipore，#AP502P，1∶2000)，并将板在室温下温育1小时。用90μl PBST缓冲液洗涤3次后，将25μl TMB(罗氏，#11 835 033 001)添加到每个孔中。在室温下温育3min后，在TecanSafire2读数器上在370nm/492nm处检测信号。

分别测试了本发明抗体的Fab片段。测试了以下抗体(参见表1)：

表1：本发明抗体的氨基酸序列

使用与实施例1(HEK-293细胞的瞬时转化)中所述相同的方法生成现有技术抗体。平行分析以下现有技术抗体Fab片段：雷珠单抗

现有技术抗体2C3的Fab片段(公开于WO200064946)，r84(公开于WO2009060198)和L3H6(公开于WO2012089176)。此外，分析抗体2C3和r84作为全长IgG1抗体。

所用的现有技术抗体的氨基酸序列列于表2中。

表2：现有技术抗体的氨基酸序列：

	重链	轻链
			2C3 Fab	SEQ ID NO：17	SEQ ID NO：18
r84 Fab	SEQ ID NO：19	SEQ ID NO：20
			2C3 IgG1	SEQ ID NO：25	SEQ ID NO：26
r84 IgG1	SEQ ID NO：27	SEQ ID NO：28
			L3H6 Fab	SEQ ID NO：21	SEQ ID NO：22
雷珠单抗	SEQ ID NO：23	SEQ ID NO：24

结果显示在图3中。尽管在用于抗体2C3的测定条件下没有观察到VEGF结合，但对于现有技术抗体r84和L3H6确认了VEGF结合。证明了当用作Fab片段而不是全长IgG1时，由于缺乏亲合力，抗体r84的抗原结合显著降低。对于所有测试的本发明抗体，VEGF结合都得到了证实。

实施例5：

本发明抗体的结合亲和力

使用与实施例2中所述相同的方法，通过SPR确定抗体的亲和力。测试了表1和表2中列出的所有Fab片段。

如上所述，评估了本发明抗体以及现有技术抗体的亲和力。结果显示在表3中。

表3：抗VEGF抗体的亲和力

	在25℃的KD[pM]	在37℃的KD[pM]
			VEGF-0089 Fab	134	99
VEGF-0113 Fab	21	17
			VEGF-0114 Fab	55	56
2C3 Fab	tbd	tbd
			r84 Fab	tbd	tbd
L3H6 Fab	3356	4517
			雷珠单抗	154+/-47	507

实施例6：

在抗VEGF抗体的存在下抑制VEGF与VEGF-R2的结合

在本发明的抗体Fab片段存在下，VEGF与VEGF-R2和VEGF-R1的分别结合如下述测试。

将384孔链霉亲和素板(Nunc/Microcoat#11974998001)用0.25μg/ml生物素化的VEGF-R1或0.5kg/ml生物素化的VEGF-R2(自制，在DPBS(1x)(PAN，#P04-36500)中各自25μl/孔)包被。将板在室温下温育1h。平行地，将浓度为0.7nM的VEGF-121-His(自制)与不同稀释度(12x 1：2稀释步骤，以500nM的浓度开始)的抗体温育。该预温育步骤是在384孔PP板(Weidmann medical technology，#23490-101)中于1x OSEP缓冲液中(双蒸水，10x，罗氏，#11 666 789 001+0.5％牛血清白蛋白组分V，无脂肪酸，罗氏，#10 735 086 001+0,05％Tween 20)中进行的。将板在室温下温育1h。用90μl/孔PBST-缓冲液(双蒸水，10xPBS罗氏#11666789001+0.1％

20)洗涤VEGF-R1/VEGF-R2包被的链霉抗生物素板3次之后，将来自VEGF抗体预温育板的25μl样品转移至包被的链霉抗生物素板，其随后在室温下温育1小时。用90μl/孔PBST-缓冲液洗涤3次后，添加25μl/孔1x OSEP中的检测抗体(抗His POD，Bethyl，#A190-114P，1∶12000)。在室温下温育1h后，将板用90μl PBST缓冲液洗涤3次。同时将25μl TMB(罗氏，#11 835 033 001)添加到所有孔中。在室温下温育10分钟后，在TecanSafire 2读数器上在370nm/492nm处检测信号。

在第一个实验中，测试了本发明的抗体VEGF-0089、VEGF-0113和VEGF-0114(参见表1)，并在0.4nM VEGF的存在下分析了现有技术抗体L3H6 Fab和雷珠单抗(参见表2)。作为阴性对照，还在不存在VEGF的情况下，分析了雷珠单抗(在图中表示为“雷珠单抗w/o hisVEGF”)。结果显示在图4A中。

在第二个实验中，在0.7nM VEGF的存在下，如实施例2所述分析表1和表2中列出的所有抗体。结果显示在图4B中。

在用于测试的现有技术抗体的实验设置中，没有评估到VEGF与VEGF-R2的结合的抑制。在与上述相同的条件下重复实验，但是使用0.34nM VEGF-121-His代替0.7nM。结果显示在图7中。

在该实验设置中，对于高浓度的现有技术抗体r84 IgG1、r84 Fab和L3H6 Fab观察到了VEGF与VEGF-R2结合的抑制。本发明的抗体VEGF-0089 Fab、VEGF-0113 Fab和VEGR-0114 Fab在所有测试浓度下均抑制VEGF与VEGF-R2的结合。

实施例7：

在抗VEGF抗体的存在下VEGF与VEGF-R1的结合的抑制

在本发明的抗体Fab片段存在下，如实施例6所述测试VEGF与VEGF-R1的结合。测试了表1和表2中列出的所有抗体。结果显示在图5中。

在用于测试的现有技术抗体2C3、R84和L3H6的实验设置中，没有评估到VEGF与VEGF-R1的结合的抑制。

在与上述相同的条件下重复实验，但是使用0.34nM VEGF-121-His代替0.7nM。结果显示在图5中。

实施例8：

通过报告基因测定法(RGA)评估抗VEGF抗体的IC50

本发明的抗VEGF抗体(参见表1)以20nM到0.02nM的九个浓度进行测试。测试了现有技术抗体雷珠单抗(参见表2)作为对照。

简言之，在白色96孔多滴定板的每孔，将37.5μl抗体溶液/孔与37.5μl VEGF-A121：25ng/ml/孔混合，并在室温下温育30分钟。随后，每40000个细胞/孔添加75μl/孔HEK293-NFAT-RE-Luc2P/KDR悬浮液，并在37℃、5％CO₂下温育5小时。最后，添加100μl/孔Bio-Glo^TM试剂，并使用Tecan Infinite Reader测定发光。结果显示在表4中。

表4：抗VEGF抗体的IC50

	IC50[nM]
		VEGF-0089	0,59
VEGF-0113	0,63
		VEGF-0114	1,34
雷珠单抗	0,81

数据证实所有测试抗体对VEGF的拮抗性结合。

实施例9：

提供人抗VEGF抗体VEGF-0089的改善的变体

生成了抗体VEGF-0089的另外的改善的抗体变体，特别是为了改善抑制VEGF与VEGF-R2的结合而不是VEGF与VEGF-R1结合的偏好。从各种抗体候选物中，选择了表5中列出的三种候选物。表5中所列的抗体Fab片段是使用与实施例1(HEK-293细胞的瞬时转化)中所述相同的方法生成生的。

表5：本发明抗体的氨基酸序列

实施例10：

本发明抗体的结合亲和力

使用与实施例2中所述相同的方法，通过SPR确定抗体的亲和力。测试了如表1和表5中列出的本发明抗体的所有Fab片段。另外，如上所述评估另外的现有技术抗体HF2-1、HF2-5、HF2-9和HF2-11(在EP3006465中公开)。那些另外的现有技术抗体的氨基酸序列示于表6中。

表6：EP3006465中公开的现有技术抗体的氨基酸序列

	重链	轻链
			HF2-1 Fab	SEQ ID NO：34	SEQ ID NO：35
HF2-5 Fab	SEQ ID NO：36	SEQ ID NO：35
			HF2-9 Fab	SEQ ID NO：37	SEQ ID NO：38
HF2-11 Fab	SEQ ID NO：39	SEQ ID NO：40

结果显示在表7中。

表7：抗VEGF抗体的亲和力

	在25℃的KD[pM]	在37℃的KD[pM]
			VEGF-0089 Fab	143	110
VEGF-0113 Fab	22	29
			VEGF-0114 Fab	50	54
VEGF-P1AD8675	88	65
			VEGF-P1AE3520	31	39
VEGF-P1AE3521	32	61
			HF2-1 Fab	279	574
HF2-5 Fab	52	109
			HF2-9 Fab	24	51
HF2-11 Fab	32	62

实施例11：

在抗VEGF抗体的存在下抑制VEGF与VEGF-R2或VEGF-R1的结合

在本发明的抗体Fab片段存在下，如实施例2所述测试VEGF与VEGF-R2和VEGF-R2的结合。

在这些实验中，测试了本发明的抗体VEGF-0089、VEGF-0113、VEGF-0114、VEGF-P1AD8675、VEGF-P1AE3520和VEGF-P1AE3521(参见表1和表5)，并在VEGF的存在下分析了现有技术抗体HF2-1、HF2-5、HF2-9和HF2-11(参见表6)以及雷珠单抗(参见表2)。结果显示于图8和图10(存在0.34nM VEGF)以及图9和图11(存在0.7nM VEGF)中。

所测试的现有技术抗体不显著抑制VEGF与VEGF受体VEGF-R1的结合。本发明所有测试的抗体优先抑制VEGF与VEGF-R2的结合，而不是VEGF与VEGF-R1的结合。

实施例12：

本发明示例性抗体的化学稳定性

本发明示例性抗体Fab片段的化学稳定性如下测试：

化学降解测试：

将抗体样品配制在20mM His/HisCl、140mM NaCl、pH6.0中，并分成三个等分试样：将一个等分试样重新缓冲在PBS中，分别地，将两个等分试样保持在原始制剂中。将PBS等分试样和一个His/HisCl等分试样在40℃(His/NaCl)或37℃(PBS)以1mg/ml温育2周(2w)，将PBS样品进一步温育总计4周(4w)。第三个对照等分样品贮存于-80℃。在温育结束后，分析样品的相对活性浓度(Biacore；将每种结合物的两个受压力的(stressed)等分试样的活性浓度均标准化为未受压力的4℃等分试样)、聚集(SEC)和片段化(毛细管电泳或SDS-PAGE)，并与未处理的对照进行比较。

对于尺寸排阻UHPLC(＝SEC)，使用诸如TSKgel UP-SW3000的层析凝胶，根据蛋白质在溶液中的分子大小来分离蛋白质。利用该方法，分析蛋白质溶液的单体、高分子种类(例如聚集体、二聚体、杂质)和低分子种类(例如降解产物、杂质)的相对含量。0.2M磷酸钾，0.25M KCl，pH 6.2用作流动相。稀释蛋白质溶液，例如以5μl的体积注入～50μ的蛋白质，并在25℃下以0.3ml/min的流速分析，在280nm处进行蛋白质检测。如产品特定信息文件中的典型色谱图所示，进行峰定义和峰积分。

分析了抗体VEGF-0089、VEGF-0113、VEGF-0114、VEGF-P1AD8675、VEGF-P1AE3520和VEGF-P1AE3521的Fab片段(参见表1和表5)。结果显示在表8和表9中。

表8：改善的抗体Fab片段的压力后的VEGF结合活性

表9：改善的抗体Fab片段的压力后(4周，pH 7.4，37℃)的分子完整性

实施例13：

生成的与VEGF-二聚体复合的抗体VEGF-0089的X射线晶体学和表位测定

根据本领域已知的标准方法分析如上所述的VEGF-0089 Fab片段的晶体结构。

如下进行与VEGF-A121复合的VEGF-0089 Fab片段的X射线晶体学：

二聚体复合物VEGF-A121-VEGF-0089 Fab的复合物形成和纯化。为了形成复合物，将VEGF-0089 Fab片段和人VEGF-A121(Peprotech)以1.1∶1的摩尔比混合。在4℃下过夜温育16小时后，在Superdex200(16/600)柱上，在20mM MES，150mM NaCl，pH 6.5中通过凝胶过滤层析纯化复合物。合并含有二聚体复合物的级分并浓缩至1.44mg/ml。

二聚体VEGF-A121-VEGF-0089 Fab复合物的结晶。初始结晶试验是在21℃下以11.5mg/ml的蛋白质浓度在座滴式蒸汽扩散装置中进行的。在1天内从0.1M Tris pH8.5、0.2M LiSO4、1.26M(NH4)₂SO₄中出现晶体。板状晶体在一周内生长至150x100x30μm的最终尺寸。从筛选板直接收获晶体，而没有任何进一步的优化步骤。

数据收集和结构确定。为了收集数据，将晶体在沉淀剂溶液中在100K下快速冷却，加入15％乙二醇作为冷冻保护剂。在瑞士光源(Villigen，瑞士)的光束线X10SA处使用PILATUS 6M检测器在

的波长下收集衍射数据。数据已经用XDS(Kabsch，W.ActaCryst.D66，133-144(2010))处理，并用SADABS(BRUKER)衡量(scale)。该晶体属于空间群C2，晶胞(cell)轴为

β＝104.54°，并且衍射至

的分辨率。使用Fab片段和VEGF的相关内部结构的坐标作为搜索模型，通过用PHASER进行分子替代来确定结构(McCoy，A.J，Grosse-Kunstleve，R.W.，Adams，P.D.，Storoni，L.C.，和Read，R.J.J.Appl.Cryst.40，658-674(2007))。来自CCP4套件(CollaborativeComputational Project，Number 4Acta Cryst.D50，760-763(1994))和Buster(Bricogne，G.，Blanc，E.，Brandl，M.，Flensburg，C.，Keller，P.，Paciorek，W.，Roversi，P.，Sharff，A.，Smart，O.S.，Vonrhein，C.，Womack，T.O.(2011).Buster版本2.9.5Cambridge，UnitedKingdom：Global Phasing Ltd)的程序用于随后修正(refinement)数据。使用差异电子密度的手动重建蛋白质是用COOT(Emsley，P.，Lohkamp，B.，Scott，W.G.and Cowtan，K.ActaCryst D66，486-501(2010))完成的。这两种结构的数据收集和修正统计总结于表10中。所有的图示都是用PYMOL(DeLano Scientific，Palo Alto，CA，2002)制备的。

表10：数据收集和结构修正统计

¹括号中的值指最高分辨率壳层。

²R_merge＝∑|I-<I＞|/∑I，其中I是强度。

³R_work＝Σ|F_o-＜F_c＞|/ΣF_o，其中Fo是所观察到的，并且Fc是所计算的结构因子振幅。

⁴R_free是基于在修正过程中省略的5％的总数据计算的。

与人VEGF-A121二聚体复合的两个VEGF-0089 Fab片段的晶体结构示意图如图12所示。在

距离内与抗体VEGF-A0089 Fab片段接触的VEGF-A121二聚体中的氨基酸残基形成在VEGF-A121二聚体上的由VEGF-0089 Fab结合的构象表位。VEGF-A121的氨基酸序列为SEQ ID NO：45。图13中突出显示了VEGF二聚体中两个VEGF-A121分子上的表位中包含的氨基酸的图示。

抗体VEGF-0089 Fab结合VEGF-A121二聚体上的以下表位：

-在VEGF二聚体内的单独VEGF-A121分子之一中的氨基酸F17、M18、D19、Y21、Q22、R23、Y25、H27、P28、I29、E30、M55、N62、L66、N100、K101、C102、E103、C104、R105和P106；以及

-在VEGF二聚体内的另一个单独VEGF-A121分子中的氨基酸E30、K48、M81和Q87。

尽管出于清楚理解的目的，已经通过图示和实施例的方式详细地描述了前述发明，但是描述和实施例不应被解释为限制本发明的范围。本文引用的所有专利和科学文献的公开内容明确地通过引用以其整体并入。

Claims

1.结合VEGF的抗体，

a)其中所述抗体与VEGF的结合显著抑制VEGF与VEGF受体VEGF-R2的结合，而不显著抑制VEGF与VEGF受体VEGF-R1的结合，和

b)其中所述抗体以≤150pM的亲和力结合VEGF，如在25℃的温度下通过表面等离子共振所测量的，和如在37℃的温度下通过表面等离子共振所测量的。

2.结合VEGF的抗体，其中所述抗体包含

a)VH结构域，其包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO：03的氨基酸序列；(ii)CDR-H2，其与SEQ ID NO：04的氨基酸序列具有至少80％序列同一性；和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO：05的氨基酸序列；和

b)VL结构域，其包含(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO：06的氨基酸序列；(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO：07的氨基酸序列；和(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO：08的氨基酸序列。

3.权利要求2所述的抗体，其包含

(a)CDR-H1，其包含SEQ ID NO：04的氨基酸序列，

(c)CDR-H3，其包含SEQ ID NO：05的氨基酸序列；和

(d)CDR-L1，其包含SEQ ID NO：06的氨基酸序列，

(e)CDR-L2，其包含SEQ ID NO：07的氨基酸序列；和

(f)CDR-L3，其包含SEQ ID NO：08的氨基酸序列。

4.权利要求1至3中任一项所述的抗体，其包含与SEQ ID NO：01的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VH序列；和SEQ ID NO：02的VL序列。

5.权利要求1至4中任一项所述的抗体，其包含

(a)SEQ ID NO：01的VH序列和SEQ ID NO：02的VL序列，

(b)SEQ ID NO：09的VH序列和SEQ ID NO：02的VL序列，

(c)SEQ ID NO：11的VH序列和SEQ ID NO：02的VL序列，

(d)SEQ ID NO：33的VH序列和SEQ ID NO：02的VL序列，

(e)SEQ ID NO：42的VH序列和SEQ ID NO：02的VL序列，或

(f)SEQ ID NO：44的VH序列和SEQ ID NO：02的VL序列。

6.权利要求1至5中任一项所述的抗体，其是Fab片段。

7.权利要求2至6中任一项所述的抗体，其中所述抗体以≤150pM的亲和力结合VEGF，如在25℃的温度下通过表面等离子共振所测量的。

8.前述权利要求中任一项所述的抗体，其与包含SEQ ID NO：01的VH序列和SEQ ID NO：02的VL序列的抗体结合相同的表位。

9.结合VEGF的抗体，其是具有SEQ ID NO：01的VH序列和SEQ ID NO：02的VL序列的抗体的亲和力成熟变体。

10.结合VEGF的抗体，其与具有SEQ ID NO：01的VH序列和SEQ ID NO：02的VL序列的抗体结合相同的表位。

11.分离的核酸，其编码权利要求1至11中任一项所述的抗体。

12.宿主细胞，其包含权利要求11所述的核酸。

13.产生与VEGF结合的抗体的方法，包括在适于表达所述抗体的条件下培养权利要求13所述的宿主细胞。

14.药物组合物，其包含权利要求1至11中任一项所述的抗体和药学上可接受的载体。

15.权利要求14所述的药物组合物，其进一步包含另外的治疗剂。

16.权利要求1至10中任一项所述的抗体或权利要求14至15中任一项所述的药物组合物，其用作药物。

17.权利要求1至10中任一项所述的抗体或权利要求14至15中任一项所述的药物组合物，其用于治疗VEGF相关疾病。

18.权利要求1至10中任一项所述的抗体或权利要求14至15中任一项所述的药物组合物在制备药物中的用途。

19.权利要求1至10中任一项所述的抗体或权利要求14至15中任一项所述的药物组合物在制备用于抑制血管发生的药物中的用途。

20.治疗患有VEGF相关疾病的个体的方法，其包括向所述个体施用有效量的权利要求1至10中任一项所述的抗体或权利要求14至15中任一项所述的药物组合物。

21.权利要求20所述的方法，其进一步包括向所述个体施用另外的治疗剂。

22.抑制个体中血管发生的方法，其包括向所述个体施用有效量的权利要求1至10中任一项所述的抗体或权利要求14至15中任一项所述的药物组合物以抑制血管发生。