TW202144419A - Ｔｉｅ２結合劑及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供 Tie-2 抗體及其片段與共軛物以及其使用方法。

Description

TIE2　結合劑及其使用方法
當前揭露之主題係關於包括抗 Tie2 抗體之 Tie2 結合劑，以及使用該結合劑之共軛物及方法。
Tie2 為用於治療各種眼部病症之有前景的治療標靶 (參閱，例如，Campochiaro 與 Peters, 2016, Curr Diab Rep, 16:126，Whitehead 等人，2019, J Diabetes Res, 2019:5140521，Hussain 等人，2019, Expert Opin Investig Drug, 28:861-869)。Tie2 為藉由內皮細胞特異性表現之受體酪胺酸激酶，並且業經顯示促進內皮安定化以及減低血管滲透性。已知血管滲漏對於若干常見眼部病症之視覺損害有所貢獻，包括但不限於糖尿病性黃斑水腫 (DME)、糖尿病性視網膜病變 (DR) 及年齡相關性黃斑退化 (AMD)。
經最廣泛研究之 Tie2 配體為血管生成素 1 (Ang1) 及血管生成素 2 (Ang2)。Ang1 為 Tie2 強促效劑，並且其業經顯示抑制眼部新血管形成以及血液視網膜屏障之分解 (參閱，例如，Nambu 等人，2004, Gene Therapy, 11:865-873)。Ang2 為 Tie2 之情境依賴性拮抗劑，並且其表現之增加與多種眼部病症相關，包括 DME、濕性 AMD、DR、轉移、敗血症及發炎。除此之外，Ang2 競爭性地與 Tie2 結合並且抑制 Ang1 訊號傳導，導致內皮及血管不安定、血液視網膜屏障之分解以及發炎 (Klaassen 等人，2013, Prog Retin Eye Res, 34:19-48，Saharinen 等人，2017, Nat Rev Drug Discov, 16:635-661)。
Tie 受體，包括 Tie1 及 Tie2，係第 1 型跨膜蛋白受體酪胺酸激酶 (RTK) (Ramsauer, M. & D’Amore, P.A.J. Clin. Invest. (2002);110:1615–1617)。Tie 代表具有免疫球蛋白及 EGF 同源域之酪胺酸激酶受體。Tie2 位於所有形成血管之內皮細胞中以及小鼠胚胎之心內膜中 (Korhonen 等人，Blood (1992);80:2548- 2555)。Tie2 之胞外域或細胞外域 (「ECD」) 包括三個免疫球蛋白 (Ig) 域 (Ig1、Ig2 及 Ig3)、三個表皮生長因子 (EGF) 域及纖維接合素第 III 型域 (FNIII)。Tie2 之 Ig-EGF 區域介導血管生成素識別及結合 (Fiedler, U. 等人，J. Biol. Chem. (2003);278:1721–1727；Barton, W.A., 等人，Structure (2005);13:825–832)。
業經鑑定了 Tie2 受體之兩個配體：血管生成素-1 (Ang1) 及血管生成素-2 (Ang2)。Ang-1 為一種 Tie2 促效劑，其結合以及誘導 Tie2 之酪胺酸磷酸化，並且其於體內之表現與血管發育密切相關 (Davis 等人，Cell (1996);87: 1161-1169)。缺乏 Ang-1 之小鼠展現出血管生成缺陷，與彼等於缺乏 Tie2 之小鼠中所見者相類，這支持 Ang-1 為 Tie2 之主要生理配體以及 Tie2 具有關鍵之體內血管生成動作 (Suri 等人，Cell (1996);87:1171- 1180)。Ang-1 為抗發炎性，促進血管完整性，並且減低血管滲透性。Ang2 被鑑定為 Tie2 的天然出現之拮抗劑。Ang2 之基因轉殖過度表現中斷小鼠胚胎中之血管形成 (Maisonpierre 等人，Science 277: 55-60,1997)。Ang2 可為促炎性，中斷 EC 靜止，並且增加血管滲透性。總體而言，研究支持 Ang1/Ang2/Tie2 系統於血管生成中扮演關鍵角色。鑒於 Tie2 於血管生成中之重要作用，識別 Tie2 之試劑以及使用此等試劑之方法係所欲者。此外，用作 Tie2 促效劑並且可減低血管滲透性或增加血管完整性之組合物具有作為治療劑，尤其用於治療眼部病症之極大潛能。
本發明提供抗 Tie2 抗體，包含該抗 Tie2 抗體或其片段之組合物 (例如，共軛物)，以及使用其之方法。
當前揭露之主題提供特異性結合 Tie2 之分離抗體，或其抗原結合片段，包含至少一種或多種抗 Tie2 抗體或其抗原結合片段之組合物，以及使用其之方法。於一些示例性實施例中，抗 Tie2 抗體為 Fab。
於一態樣中，提供特異性結合 Tie2 之抗體或其抗原結合片段，其中，該抗 Tie2 抗體包含重鏈 (HC) 可變域 (VH 域) 及輕鏈 (LC) 可變域 (VL 域)，其中，該 VH 域包含：包含 NTDIS (SEQ ID NO: 3) 之胺基酸序列的 CDR-H1，包含 RISPSDGNTYYADSVKG (SEQ ID NO: 4) 之胺基酸序列的 CDR-H2，以及，包含 (a) RTRWASX1AX2DY (SEQ ID NO: 5，其中，X1 為 M、L、K、F、Y、R、N、Q、H 或 W，以及/或者 X2 為 F、Y、L、Q、I、K 或 H)、(b) RTRWASWAMDY (SEQ ID NO: 6) 或 (c) RTRWASWAFDY (SEQ ID NO: 7) 之胺基酸序列的 CDR-H3；該 VL 域包含：包含 RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8) 之胺基酸序列的 CDR-L1，包含 SASFLYS (SEQ ID NO: 9) 之胺基酸序列的 CDR-L2，以及，包含 QQSYTTPPT (SEQ ID NO: 10) 之胺基酸序列的 CDR-L3。於一些實施例中，CDR-H3 包含 SEQ ID NO: 6 或 SEQ ID NO: 7。於特定實施例中，CDR-H3 包含 SEQ ID NO: 7。
於一些實施例中，該抗 Tie2 抗體包含 SEQ ID NO: 11 之 VH 骨架 FR1 序列，SEQ ID NO: 12 之 VH 骨架 FR2 序列，SEQ ID NO: 13 之 VH 骨架 FR3 序列，及/或 SEQ ID NO: 14 之 VH 骨架 FR4 序列。於其他實施例中，該抗 Tie2 抗體包含 SEQ ID NO: 15 之 VL 骨架 FR1 序列，SEQ ID NO: 16 之 VL 骨架 FR2 序列，SEQ ID NO: 17 之 VL 骨架 FR3 序列，及/或 SEQ ID NO: 18 之 VL 骨架 FR3 序列。
於一些實施例中，該抗 Tie2 抗體包含 VH 域及 VL 域，其中，該 VH 域包含：包含 SEQ ID NO: 3 之胺基酸序列的 CDR-H1，包含 SEQ ID NO: 4 之胺基酸序列的 CDR-H2，以及，包含 (a) SEQ ID NO: 5 (其中，X1 為 M、L、K、F、Y、R、N、Q、H 或 W，以及/或者 X2 為 F、Y、L、Q、I、K 或 H)、(b) SEQ ID NO: 6 或 (c) SEQ ID NO: 7 之胺基酸序列的 CDR-H3；該 VL 域包含：包含 SEQ ID NO: 8 之胺基酸序列的 CDR-L1，包含 SEQ ID NO: 9 之胺基酸序列的 CDR-L2，以及，包含 SEQ ID NO: 10 之胺基酸序列的 CDR-L3。於其他實施例中，CDR-H3 包含 SEQ ID NO: 6 或 SEQ ID NO: 7。於特定實施例中，CDR-H3 包含 SEQ ID NO: 7。於又其他實施例中，該 VH 域與 SEQ ID NO: 20 具有至少 90%、95%、96%、97%、98% 或 99% 之同一性，以及，該 VL 域與 SEQ ID NO: 21 具有至少 90%、95%、96%、97%、98% 或 99% 之同一性。
於一些實施例中，該抗 Tie2 抗體或其抗原結合片段包含 SEQ ID NO: 19 或 SEQ ID NO: 22 之 VH 域序列以及 SEQ ID NO: 21 之 VL 域序列。
於一些實施例中，該抗 Tie2 抗體包含 SEQ ID NO: 20 之 VH 域序列。於其他實施例中，該抗 Tie2 抗體包含 SEQ ID NO: 21 之 VL 域序列。於又其他實施例中，該抗 Tie2 抗體包含 SEQ ID NO: 20 之 VH 域序列及 SEQ ID NO: 21 之 VL 域序列。
於一些實施例中，該抗 Tie2 抗體或其片段包含 SEQ ID NO: 55 之重鏈 (HC) 域序列及 SEQ ID NO: 25 之輕鏈 (LC) 域序列。於其他實施例中，該抗 Tie2 抗體或其片段包含 SEQ ID NO: 23 之重鏈 (HC) 域序列及 SEQ ID NO: 56 之輕鏈 (LC) 域序列。
於一些態樣中，提供特異性結合 Tie2 之抗體或其抗原結合片段，其包含 VH 域及 VL 域，該 VH 域包含：包含 SEQ ID NO: 28 之胺基酸序列的 CDR-H1，包含 SEQ ID NO: 29 之胺基酸序列的 CDR-H2，以及包含 SEQ ID NO: 30 之胺基酸序列的 CDR-H3；該 VL 域包含：包含 SEQ ID NO: 8 之胺基酸序列的 CDR-L1，包含 SEQ ID NO: 9 之胺基酸序列的 CDR-L2，以及包含 SEQ ID NO: 10 之胺基酸序列的 CDR-L3。於一些實施例中，該 VH 域包含與 SEQ ID NO: 31 具有至少 90%、95%、96%、97%、98% 或 99% 同一性之胺基酸序列，以及，該 VL 域包含與 SEQ ID NO: 21 具有至少 90%、95%、96%、97%、98% 或 99% 同一性之胺基酸序列。於又其他實施例中，該 VH 域包含 SEQ ID NO: 31，以及，該 VL 域包含 SEQ ID NO: 21。於其他實施例中，該 HC 包含 SEQ ID NO: 32，以及，該 LC 包含 SEQ ID NO: 25。
於一些態樣中，提供特異性結合 Tie2 之抗體或其抗原結合片段，其包含 VH 域及 VL 域，該 VH 域包含：包含 SEQ ID NO: 33 之胺基酸序列的 CDR-H1，包含 SEQ ID NO: 34 之胺基酸序列的 CDR-H2，以及包含 SEQ ID NO: 35 之胺基酸序列的 CDR-H3；該 VL 域包含：包含 SEQ ID NO: 8 之胺基酸序列的 CDR-L1，包含 SEQ ID NO: 9 之胺基酸序列的 CDR-L2，以及包含 SEQ ID NO: 10 之胺基酸序列的 CDR-L3。於一些實施例中，該 VH 域包含與 SEQ ID NO: 36 具有至少 90%、95%、96%、97%、98% 或 99% 同一性之胺基酸序列，以及，該 VL 域包含與 SEQ ID NO: 21 具有至少 90%、95%、96%、97%、98% 或 99% 同一性之胺基酸序列。於又其他實施例中，該 VH 域包含 SEQ ID NO: 36，以及，該 VL 域包含 SEQ ID NO: 21。於其他實施例中，該 HC 包含 SEQ ID NO: 37，以及，該 LC 包含 SEQ ID NO: 25。
於一些態樣中，提供特異性結合 Tie2 之抗體或其抗原結合片段，其包含 VL 域及 VH 域，該 VL 域包含：包含 SEQ ID NO: 8 之 CDR-L1，包含 SEQ ID NO: 9 之 CDR-L2，以及包含 SEQ ID NO: 10 之 CDR-L3；該 VH 域包含：(a) 包含g SEQ ID NO: 38 之 CDR-H1、包含 SEQ ID NO: 39 之 CDR-H2 以及包含 SEQ ID NO: 40 之 CDR-H3；(b) 包含 SEQ ID NO: 43 之 CDR-H1、包含 SEQ ID NO: 44 之 CDR-H2 以及包含 SEQ ID NO: 45 之 CDR-H3；或 (c) 包含 SEQ ID NO: 48 之 CDR-H1、包含 SEQ ID NO: 49 之 CDR-H2 以及包含 SEQ ID NO: 50 之 CDR-H3。於其他實施例中，該 VL 域包含與 SEQ ID NO: 21 具有至少 90%、95%、96%、97%、98% 或 99% 同一性之胺基酸序列，以及，該 VH 域包含：包含分別與 (d) SEQ ID NO: 41、(e) SEQ ID NO: 46 或 (f) SEQ ID NO: 51 具有至少 90%、95%、96%、97%、98% 或 99% 同一性之胺基酸序列的 (a)、(b) 或 (c)。
於一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段包含 SEQ ID NO: 21 之 LC 以及包含 SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 46 或 SEQ ID NO: 52 之 HC。
於一些態樣中，提供特異性結合 Tie2 之抗體或其抗原結合片段，其包含 2 個 VH 域以及 2 個 VL 域，該 VH 域包含：在 N 端至 C 端方向上，包含 SEQ ID NO: 6 之 CDR-H1、包含 SEQ ID NO: 8 之 CDR-H2、包含 SEQ ID NO: 9 之 CDR-H3、包含 SEQ ID NO: 48 之 CDR-H1、包含 SEQ ID NO: 49 之 CDR-H2 以及包含 SEQ ID NO: 50 之 CDR-H3；該 VL 域包含：在 N 端至 C 端方向上，包含 SEQ ID NO: 8 之胺基酸序列的 CDR-L1、包含 SEQ ID NO: 9 之胺基酸序列的 CDR-L2、包含 SEQ ID NO: 10 之胺基酸序列的 CDR-L3、包含 SEQ ID NO: 8 之胺基酸序列的 CDR-L1、包含 SEQ ID NO: 9 之胺基酸序列的 CDR-L2 以及包含 SEQ ID NO: 10 之胺基酸序列的 CDR-L3。於一些實施例中，該 HC 包含 SEQ ID NO: 54，以及，該 LC 包含 SEQ ID NO: 53。
於一些實施例中，該抗 Tie2 抗體或其抗原結合片段包含經改造半胱胺酸，其中，該經改造半胱胺酸位於 HC 恆定域中及/或 LC 恆定域中。於其他實施例中，該經改造半胱胺酸選自重鏈中之 T120C、G166C、G178C、T187C 及 T209C，以及輕鏈中之 Q124C、R142C、Q155C、L201C、T206C、K107C、K126C 及 K149C，其中，該殘基號係根據 EU 編號。於其他實施例中，該抗 Tie2 抗體或其抗原結合片段為 Fab，其中，該 Fab 之 HC 終止於胺基酸 CDKTHTSPPC (SEQ ID NO: 83) 處。於一些實施例中，該 Fab 終止於 SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 84、SEQ ID NO: 85 或 SEQ ID NO: 86 之胺基酸序列處。
在一些方面，抗 Tie2 拮抗劑抗體為單株抗體。
於一些實施例中，該抗 Tie2 抗體為人源化抗體、嵌合抗體或人類抗體。
於一些實施例中，該抗 Tie2 抗體為全長 IgG1 或全長 IgM 抗體。
於一些實施例中，該抗 Tie2 抗體或其片段與 Tie2 結合，其中，Tie2 為與 SEQ ID NO: 1 具有至少 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 同一性之蛋白質。
於較佳實施例中，該抗 Tie2 抗體或其片段為 Fab。
於一些實施例中，該抗 Tie2 抗體為抗體或 Fab，其與包含 SEQ ID NO: 22 之 VH 序列及 SEQ ID NO: 21 之 VL 序列之抗 Tie2 抗體競爭。
於一些實施例中，該抗 Tie2 抗體或其片段不與 Tie2 之 Ig1 域結合。於其他實施例中，該抗 Tie2 抗體或其片段不與 Tie2 之 EGF 域結合。於又其他實施例中，該抗 Tie2 抗體或其片段不與 Tie2 之 Ig3 域結合。於再其他實施例中，該抗 Tie2 抗體或其片段不與 Tie2 蛋白質之 FNIII 域結合。
於一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段的與食蟹獼猴 Tie2 結合。於其他實施例中，該食蟹獼猴 Tie2 包含 SEQ ID NO: 2 之胺基酸序列或其變異體。
於一些實施例中，該與 Tie2 結合之抗體或其抗原結合片段為多特異性抗體。於其他實施例中，該多特異性抗體與 Tie2 及 VEGF 結合。於其他實施例中，該多特異性抗體與 Tie2 及 因子 D 結合。於又其他實施例中，該多特異性抗體與 Tie2 及 Ang2 結合。
於一些實施例中，該抗 Tie2 抗體為多特異性抗體，其激活 Tie2。於其他實施例中，該多特異性抗體與 Tie2 及 VEGF 結合，其中，該多特異性抗體可以激活 Tie2。於其他實施例中，該多特異性抗體與 Tie2 及因子 D 結合，其中，該多特異性抗體可以激活 Tie2。於又其他實施例中，該多特異性抗體與 Tie2 及 Ang2結合，其中，該多特異性抗體可以激活 Tie2。
於一態樣中，提供編碼抗 Tie2 抗體或其抗原結合片段之分離核酸。
於一態樣中，提供包含編碼抗 Tie2 抗體或其抗原結合片段之分離核酸的宿主細胞。
於一態樣中，提供製備結合 Tie2 之抗體或其抗原結合片段的方法。於一些實施例中，該方法包括，於適用於抗 Tie2 抗體表現之條件下，培養包含編碼該抗 Tie2 抗體之核酸的宿主細胞。於其他實施例中，該方法復包括從該宿主細胞回收該抗 Tie2 抗體。
於一態樣中，提供藉由上述方法製備之抗 Tie2 抗體。
於一態樣中，提供共軛物，其包含根據本文所揭露之實施例所述的至少兩個特異性結合 Tie2 之抗體或其抗原結合片段，以及多臂部分。於較佳實施例中，該至少兩個抗 Tie2 抗體各自為 Fab。
於一些實施例中，該共軛物包含結合 Tie2 之抗 Tie2 抗體，以及多臂部分，其中，該多臂部分與至少 2 個抗 Tie2 Fab 連接。於一些實施例中，該多臂部分與至少 2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 個抗 Tie2 Fab 連接。於其他實施例中，該多臂部分與 2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 個抗 Tie2 Fab 連接。於又其他實施例中，該多臂部分與 6 或 8 個抗 Tie2 Fab 連接。於再其他實施例中，該多臂部分與 8 個抗 Tie2 Fab 連接。於較佳實施例中，該多臂部分與 6 個抗 Tie2 Fab 連接。
於一態樣中，該共軛物結合並且激活 Tie2 活性。
於一些實施例中，該結合 Tie2 之共軛物激活 AKT 磷酸化。於其他實施例中，AKT 磷酸化之激活藉由體外測定中經磷酸化之 AKT 蛋白質增加而得以證明。於其他實施例中，該 Tie2 結合劑激活 Tie2 之磷酸化。於又其他實施例中，該 Tie2 磷酸化之激活於體外量測。
於一些實施例中，將 Tie2 表現細胞曝露於該共軛物並不減低該等細胞中之 Tie2 蛋白含量。於其他實施例中，該曝露並不將該等細胞中之 Tie2 蛋白含量降幅超過 5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60% 或 75%。於再其他實施例中，該曝露將該等細胞中之 Tie2 蛋白含量降幅少於 5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60% 或 75%。於又其他實施例中，該曝露將該細胞中之 Tie2 蛋白含量降幅超過約 25% 但少於約 75%，超過約 50% 但少於約 75%，或超過約 60% 但少於約 80%。於一些實施例中，於將該 Tie2 結合劑與 Tie2 表現細胞一起體外孵化之前及之後，藉由西方墨點法量測 Tie2 蛋白含量。於其他實施例中，該孵化於 37℃ 進行 10 至 36 小時或 12 至 24 小時。
於一些實施例中，該抗 Tie2 抗體或其抗原結合片段具有從 0.1 uM 至 10 uM、從 0.01 uM 至 10 uM 或從 0.1 至 100 uM 範圍的平衡解離常數 (Kd)。
於一些實施例中，包含該多臂部分及該抗 Tie2 抗體或其抗原結合片段之共軛物增加 Tie2 至細胞-細胞接合之轉位。
於一些實施例中，該共軛物減低血管滲透性。
於一些實施例中，該共軛物促成血管安定性及/或增加血管完整性。
於一些實施例中，該共軛物並不抑制或減低 Ang1 與 Tie2 之結合。
於一些實施例中，該共軛物抑制或減低 Ang2 與 Tie2 之結合。
於一些實施例中，該共軛物活性使用體外測定法量測。
於一些實施例中，該多臂多元醇選自由二聚體、四聚體、六聚體及八聚體所組成之群組。於較佳實施例中，該多臂多元醇為六聚體或八聚體。於較佳實施例中，該多臂多元醇為六聚體。
於一些實施例中，該多元醇為聚(環氧烷)聚合物。於其他實施例中，該多元醇為聚(烷二醇)聚合物。於再其他實施例中，該多元醇為聚乙二醇 (PEG)。於一些實施例中，該 PEG 為經官能化之多臂 PEG。
於一些實施例中，該 PEG 具有通式 (Ia) 之結構：
Figure 02_image001
其中，每一 m 表示該多元醇 (PEG) 之特定臂的長度或尺寸並且獨立為約 45 至約 1000、約 20 至約 1000、約 10 至約 1000、約 3 至約 250、約 3 至約 200、約 3 至約 100、約 10 至約50、約 10 至約30、約 20 至約30、約 50 至約 200 或約 100 至約 150 的整數；以及，n 為約 1 至約 10 的整數；每一 R1 獨立地或不存在或為連接基團；以及，每一 R2 獨立地或為氫或為末端反應性基團；其中，至少一個 R2 為末端反應性基團。於一些實施例中，R2 獨立地選自硫醇反應性基團、胺基反應性基團及其組合。
於一些實施例中，該 PEG 具有通式 (Ia) 之結構，其中，n 為 1 至 3 之整數。
於一些實施例中，該 PEG 具有通式 (Ia) 之結構，其中，n 為 1，以及，該多臂 PEG 為四聚體。
於一些實施例中，該 PEG 具有通式 (Ia) 之結構，其中，n 為 2，以及，該多臂 PEG 為六聚體。於此類實施例中，該六聚體具有通式 (Ib) 之結構：
Figure 02_image003
(Ib)
其中，每一 m 獨立地為 約 45 至約 1000、約 20 至約 1000、約 10 至約 1000、約 3 至約 250、約 3 至約 200、約 3 至約 100、約 10 至約 50、約 10 至約 30、約 20 至約 30、約 50 至約 200 或約 100 至約 150之整數；每一 R1 獨立地或不存在或為連接基團；以及，每一 R2 獨立地或為氫或為末端反應性基團；其中，至少一個 R2 為末端反應性基團並且與如上所揭示之抗 Tie2 抗體片段或 Fa b共價連接。於一些實施例中，每一 m 獨立地為約 15 至 35 或約 20 至 30 之整數。於其他實施例中，每一 m 獨立地為約 22 之整數。
於一些實施例中，R1 與 R2 一起具有結構
Figure 02_image005
，其中，R2 為馬來醯二胺；
於一些實施例中，該 PEG 具有通式 (Ia) 之結構，其中，n 為 3，以及，該多臂 PEG 為八聚體。於此類實施例中，該八聚體具有通式 (Ic) 之結構：
Figure 02_image007
(Ic)
其中，每一 m 獨立地為 3 至 250 之整數；每一 R1 獨立地或不存在或為連接基團；以及，每一 R2 獨立地或為氫或為末端反應性基團；其中，至少一個 R2 為末端反應性基團並且與如上所揭示之抗 Tie2 Fab 共價連接。於一些實施例中，每一 m 獨立地為 15 至 35 之整數。於其他實施例中，每一 m 獨立地為約 22 之整數。
於一些實施例中，本文所揭示之至少兩個抗 Tie2 抗體片段或 Fab 與該多臂多元醇共價連接。於其他實施例中，該共軛物之多臂多元醇透過半胱胺酸胺基酸之游離硫醇基基團與該至少兩個抗 Tie2 抗體片段或 Fab 共價連接。於其他實施例中，該半胱胺酸胺基酸為經改造半胱胺酸。於再其他實施例中，該半胱胺酸胺基酸位於該抗 Tie2 恆定域中。於其他實施例中，該半胱胺酸胺基酸位於該抗 Tie2 Fab 之重鏈 (HC) 或輕鏈 (LC) 的 C 端。於較佳實施例中，該半胱胺酸胺基酸不位於 HC 或 LC 之 N 端或 C 端。
於一些實施例中，包含抗 Tie2 抗體或其抗原結合片段之共軛物包含位於其 HC 及/或 LC 中的經改造半胱胺酸。於其他實施例中，該經改造半胱胺酸選自 HC 中之 T120C、G166C、G178C、T187C 及 T209C；或者該經改造半胱胺酸選自 LC 中之 Q124C、R142C、Q155C、L201C、T206C、K107C、K126C 及 K149C，其中，該經改造半胱胺酸的殘基號係根據 EU 編號。
於一些實施例中，該共軛物包含多臂多元醇，其透過離胺酸胺基酸之游離胺基基團與該至少兩個抗 Tie2 抗體片段或 Fab 共價連接。於其他實施例中，該離胺酸胺基酸位於該抗 Tie2 抗體片段或 Fab 之恆定區域中。於又其他實施例中，該離胺酸胺基酸位於該抗 Tie2 抗體片段或 Fab 之重鏈或輕鏈的 C 端。於另選之實施例中，該 Tie2 結合劑並不透過離胺酸之游離胺基基團與該至少兩個抗 Tie2 Fab 共價連接。
於一些實施例中，於體外生理條件下，每一月有少於 20%、少於 15% 或少於 10% 之該共軛物去共軛。於其他實施例中，於體內生理條件下，每一月有少於 20%、少於 15% 或少於 10% 之該共軛物去共軛。
於一些實施例中，該共軛物隨著時間延長而安定，在生理條件下，其 Tie2 結合能力每一損失少於 20%、少於 15% 或少於 10%。
於一態樣中，提供包含抗 Tie2 抗體或其抗原結合片段以及多臂部分之共軛物，其中，該多臂部分包含 IgM 分子。於其他實施例中，該 IgM 分子包含 J 鏈，並且該多臂部分包含 5 個抗 Tie2 Fab，其中，該 5 個抗 Tie2 Fab 之大約每一個皆與該 IgM 分子連接。於又其他實施例中，該 IgM 分子不包含 J 鏈，並且該多臂部分包含 6 個抗 Tie2 Fab，其中，該 6 個抗 Tie2 Fab 中的每一個皆與該 IgM 分子連接。
於一些實施例中，該共軛物包含 IgM 分子，該 IgM 分子為具有胺基酸取代之 IgM 變異體，藉此，該 IgM 變異體減低或消除補體依賴性細胞毒性 (CDC) 活性。於較佳實施例中，該 IgM 變異體包含基於 EU 編號之 P436G 取代。
於一態樣中，提供包含抗 Tie2 抗體或其抗原結合片段及多臂部分之共軛物，其中，該多臂部分包含至少 2、4、6、8 或 10 個肽，其中，該等肽之大約每一個皆與抗 Tie2 Fab 共價連接。於一些實施例中，該抗 Tie2 Fab 序列終止於殘基 221、222、223、224 或 225 (EU 編號) 處。於其他實施例中，該等肽之每一個皆為核苷二磷酸激酶 (NDK) 肽。於又其他實施例中，該等 NDK 肽之每一個包含與 SEQ ID NO: 71 具有至少 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 同一性的胺基酸序列。
於一些實施例中，該等 NDK 肽之每一個在其 N 端末端處與該抗 Tie2 Fab 重鏈或輕鏈之 C 端末端連接。於其他實施例中，連接子存在於 Fab 重鏈或輕鏈與該肽之間。於又其他實施例中，該連接子為胺基酸連接子。於再其他實施例中，該胺基酸連接子包含 2、3、4、5、6、7、8、2 至 20、5 至 10 或 4 至 10 個胺基酸。於其他實施例中，該連接子包含甘胺酸。
於一些實施例中，該多臂部分包含 6 或 8 個肽。於其他實施例中，該多臂部分包含 6 個肽。於較佳實施例中，該多臂部分包含 6 個 NDK 肽。
於一態樣中，提供包含抗體或其抗原結合片段以及多臂部分之共軛物，其中，該多臂部分包含 IgM 分子。於其他實施例中，該 IgM 分子包含 J 鏈，並且該多臂部分包含 5 個抗體片段、Fab 或其抗原結合片段，其中，該 5 個抗體片段、Fab 或其抗原結合片段中大約每一個皆與該 IgM 分子連接。於又其他實施例中，該 IgM 分子不包含 J 鏈，並且該多臂部分包含 6 個抗體片段、Fab 或其抗原結合片段，其中，該 6 個抗體片段、Fab 或其抗原結合片段中每一個皆與該 IgM 分子連接。
於一些實施例中，該共軛物包含 IgM 分子，該 IgM 分子為具有胺基酸取代之 IgM 變異體，藉此，該 IgM 變異體減低或消除補體依賴性細胞毒性 (CDC) 活性。於較佳實施例中，該 IgM 變異體包含基於 EU 編號之 P436G 取代。
於一態樣中，提供包含抗體、抗體片段、Fab 或其抗原結合片段及多臂部分之共軛物，其中，該多臂部分包含至少 2、4、6、8 或 10 個肽，其中，該等肽之大約每一個皆與該抗體、抗體片段、Fab 或其抗原結合片段共價連接。於一些實施例中，該抗體、抗體片段、Fab 或其抗原結合片段序列終止於殘基 221、222、223、224 或 225 (EU 編號) 處。於其他實施例中，該等肽之每一個皆為核苷二磷酸激酶 (NDK) 肽。於又其他實施例中，該等 NDK 肽之每一個包含與 SEQ ID NO: 71 具有至少 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 同一性的胺基酸序列。
於一些實施例中，該等 NDK 肽之每一個皆在其 N 端末端處與該抗體、抗體片段、Fab 或其抗原結合片段之重鏈或輕鏈的 C 端末端連接。於其他實施例中，連接子存在於 Fab 重鏈或輕鏈與該肽之間。於又其他實施例中，該連接子為胺基酸連接子。於再其他實施例中，該胺基酸連接子包含 2、3、4、5、6、7、8、2 至 20、5 至 10 或 4 至 10 個胺基酸。於其他實施例中，該連接子包含甘胺酸。
於一些實施例中，該多臂部分包含 6 或 8 個肽。於其他實施例中，該多臂部分包含 6 個肽。於較佳實施例中，該多臂部分包含 6 個 NDK 肽。
於一態樣中，提供醫藥組成物，其包含根據本揭露之抗 Tie2 抗體或其片段以及醫藥上可接受之載劑、賦形劑或稀釋劑。於一些實施例中，該醫藥組成物包含如本文所述之抗 Tie2 結合劑以及醫藥上可接受之載劑，該抗 Tie2 結合劑包含複數個與多臂部分連接之抗 Tie2 Fab。
於一些實施例中，該包含抗 Tie2 抗體或 Tie2 結合劑之醫藥組成物復包含另外治療劑。於其他實施例中，該附加治療劑選自由抗 VEGF 抗體、抗 Tie2 抗體及抗 Ang2 抗體所組成之群組。於一些實施例中，該另外治療劑選自 Ang2 拮抗劑、VEGF 拮抗劑、VEGF 捕捉劑、抗 VEGF 抗體、抗 Ang2 抗體以及補體成分拮抗劑。
於一些實施例中，前述醫藥組成物之任何一個可用作藥劑。
於一些實施例中，前述醫藥組成物之任何一個可用於製造用於治療受試者眼部病症之藥劑。
於一些實施例中，前述醫藥組成物之任何一個可用於減低或抑制患有眼部病症之受試者的病理性血管滲透性。
於另一態樣中，前述醫藥組成物之任何一個可用於治療受試者眼部病症。
於一態樣中，提供用於治療需要進行治療之個體的方法，其包括向該患者投予如本文所揭示之抗 Tie2 抗體及/或 Tie2 結合劑。於一些實施例中，該方法包括向該個體投予如本文所揭示之醫藥組成物，該醫藥組成物包含如本文所揭示之抗 Tie2 共軛物。
於一些實施例中，該個體業經診斷為患有血管疾患。於其他實施例中，該個體業經診斷為患有眼部血管疾患。
於另一態樣中，本發明之特徵在於抑制患有與不良之血管滲透性相關疾患之患者血管滲透性的方法，該方法包括向該受試者投予有效量之前述抗體或共軛物之任一者，從而抑制該受試者之血管滲透性。
於另一態樣中，本發明之特徵在於治療與不良之血管滲透性相關之疾患的方法，該方法包括向需要此治療之受試者投予有效量之前述抗體或共軛物之任一者。
於一些實施例中，該個體業經診斷為患有與 Tie2 途徑相關之疾患。
於一些實施例中，該個體業經診斷為患有選自由下列所組成之群組的眼部疾患：糖尿病性黃斑水腫 (DME)、年齡相關性黃斑退化 (AMD) (包括乾性及濕性 (非滲出性及滲出性) 形式)、脈絡膜新血管形成 (CNV)、眼色素層炎、糖尿病性視網膜病變、局部缺血相關視網膜病、病理性近視、逢希伯-林道病、眼睛組織胞漿菌病、視網膜中央靜脈阻塞 (CRVO)、角膜新血管形成、青光眼、無水腫之視網膜病、以及視網膜新血管形成。
於一些實施例中，該個體業經接受使用抗 VEGF 抗體治療。於其他實施例中，該個體並未經歷抗 VEGF 抗體之治療功效，經歷了減低的抗 VEGF 抗體之治療功效，及/或停止經歷抗 VEGF 抗體之治療功效。
在一些實施例中，該方法復包括向該個體投予第二治療劑。於其他實施例中，該第二治療劑選自由抗 VEGF 抗體、抗 Ang2 抗體、抗 VEGF/抗 Ang2 雙特異性抗體、VEGF 拮抗劑及 Ang2 拮抗劑所組成之群組。
相關申請的交叉引用
本申請案請求於 2020 年 3 月 24 日遞交之美國臨時專利申請案第 62/993930 號及於 2020 年 6 月 30 日遞交之美國臨時專利申請案第 63/046318 之優先權，該等申請案藉由引用以其整體併入本文。 序列表
本申請包含序列表，該序列表已經以 ASCII 格式以電子方式提交，並以引用方式以其全部內容併入本文。所述 ASCII 副本創建於 2021 年 3 月 17 日，命名為 P35891-WO_SeqList.txt，大小為 107,354 位元組。
Ⅰ. 界定
除非本文另做定義，否則術語「包含」應包括術語「由...組成」。
如本文所用之與具體值 (例如，溫度、濃度、時間等) 關聯使用的術語「約」應指代該術語「約」所指代之具體值的 +/- 1% 之變更。
就本文目的而言，「接受者人骨架 (acceptor human framework)」是包含衍生自人免疫球蛋白骨架或人共通骨架的輕鏈可變域 (VL) 骨架或重鏈可變域 (VH) 骨架的胺基酸序列的骨架，如下定義。「衍生自」人免疫球蛋白骨架或人共通骨架的接受者人骨架可包含其相同的胺基酸序列，或者其可含有胺基酸序列變化。於一些實施例中，胺基酸變更數目為 10 或更少、9 或更少、8 或更少、7 或更少、6 或更少、5 或更少、4 或更少、3 或更少、或 2 或更少。於一些實施例中，VL 受體人骨架與 VL 人免疫球蛋白骨架序列或人共通骨架序列的序列相同。
「親和力」係指分子 (例如抗體) 之單一結合位點與其結合搭配物 (例如抗原) 之間的非共價交互作用總和的強度。除非另有說明，否則如本文中所使用的「結合親和力」，係指反映結合對成員 (例如抗體及抗原) 之間 1:1 交互作用之內在結合親和力。分子 X 與其配偶體 Y 的親和力通常可以用解離常數 (Kd) 表示。可以藉由本領域已知的常規方法測量親和力，包括彼等本文所述之方法。下面描述了用於測量結合親和力的具體的說明性和示例性實施例。
術語「親和力成熟」之抗體是指在一或多個高變區 (HVR) 中具有一或多種變化之抗體，與不具有此等變化之親本抗體相比，此類變化引起該抗體對抗原之親和力的改善。
術語「抗 Tie2 抗體」、「與 Tie2 結合之抗體」、和「與 Tie2 特異性結合之抗體」指代能夠以足夠親和力結合 Tie2 之抗體，因此該抗體可用作靶向 Tie2 之治療劑及/或診斷劑。在一個實施例中，抗 Tie2 拮抗劑抗體與無關、非 Tie2 蛋白質結合之程度低於該抗體與 Tie2 結合約 10%，其藉由例如放射免疫測定 (RIA) 所量測。於某些實施例中，結合至 Tie2 之抗體之解離常數 (KD ) 為 ≤ 1μM、≤ 100 nM、≤ 10 nM、≤ 1 nM、≤ 0.1 nM、≤ 0.01 nM、或≤ 0.001 nM (例如 10-8 M 或更低，例如 10-8 M 至 10-13 M，例如 10-9 至 10-13 M )。在某些實施例中，抗 Tie2 拮抗劑抗體結合至 Tie2 之抗原決定位，其在不同物種之 Tie2 是保守性。
本文中的術語「抗體」以最廣義使用且涵蓋各種抗體結構，包括但不限於單株抗體、多株抗體、多特異性抗體 (例如，雙特異性抗體) 及抗體片段，只要其等展示出所欲抗原結合活性即可。
「抗體片段」係指除完整抗體以外的分子，其包含結合完整抗體所結合抗原之完整抗體的一部分。抗體片段之實例包括但不限於 Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab’)2 、雙功能抗體、線性抗體、單鏈抗體分子 (例如，scFv) 及抗原片段形成的多特異性抗體。
術語「全長抗體」、「完整抗體」及「全抗體」在本文中可互換使用，係指具有與天然抗體結構實質上類似的結構之抗體或具有含有本文定義的 Fc 區域的重鏈之抗體。
如本文所用， 「Fab」指代包含重鏈恆定區之抗體，其包含 CH1 域或 CH1 域之足夠部分以與輕鏈恆定區形成二硫鍵，但不含 CH2 域或 CH3 域。如本文所用，Fab 可以包含鉸鏈區之一個或多個胺基酸。因此，如本文所用，術語「Fab」涵蓋 Fab’ 抗體。Fab 可以包含另外之非原生胺基酸，諸如 C 端半胱胺酸，於該情況下，其可能指代為 Fab-C。如下文所檢討，術語 Fab-C 亦涵蓋包含鉸鏈區之原生胺基酸 (包括位於 C 端處之原生半胱胺酸) 的 Fab。於一些實施例中，Fab 包含經改造半胱胺酸 (亦即，Fab 可以為 THIOMAB)。於一些實施例中，經改造半胱胺酸為位於 Fab HC 及/或 LC 多肽序列中之半胱胺酸胺基酸殘基，其被取代為非半胱胺酸胺基酸殘基。
「Fab-C」指代具有 C 端半胱胺酸之 Fab，其可以為出現在該殘基位置處之原生半胱胺酸 (諸如來自鉸鏈區之半胱胺酸)，或者可以為添加到 C 端之不對應於原生半胱胺酸的半胱胺酸。
「Fab-SH」指代具有游離硫基基團之 Fab。於一些實施例中，該游離巰基基團定位在 Fab 之 C 端的最末 10 個胺基酸處。Fab-C 抗體典型亦為 Fab-SH 抗體。
與參考抗體「結合在相同表位的抗體」所指的抗體，是在競爭性測定中阻斷參考抗體與其抗原結合 50% 或更多，且反之，參考抗體在競爭性測定中阻斷該抗體與其抗原結合 50% 或更多。本文提供例示性競爭測定。
術語「嵌合」抗體指代其中重鏈及/或輕鏈的一部分源自特定來源或物種，而重鏈及/或輕鏈的其餘部分源自不同來源或物種的抗體。
抗體之「類別 (class)」係指為其重鏈所具有的恆定域或恆定區之類型。有五大類抗體：IgA、IgD、IgE、IgG、及 IgM，且彼等中的幾種可進一步分為次類 (同型 (isotype))，例如 IgG1 、IgG2 、IgG3 、IgG4 、IgA1 及 IgA2 。對應於不同類別之免疫球蛋白的重鏈恆定域分別稱為 α、δ、ε、γ 及 μ。
本文中使用之術語「共軛物」，根據其最廣泛之定義，意為接合或連接在一起。當分子如同它們接合在一起那樣動作或操作時，則分子「經共軛」。「共軛物」為與一個或多個異源分子共軛之抗體 (例如，Fab)，該異源分子包括但不限於多元醇。於特定實施例中，「共軛物」指代與多臂部分共價鍵合之抗體 (例如，抗體片段，如本文中詳述)。於特定實施例中，該多臂部分為多元醇、IgM 分子或多聚體 (例如，六聚體) 型式之肽。
除非另有說明，否則如本文所使用之術語「Tie2」指代來自任何脊椎動物來源之任何天然 Tie2，該脊椎動物包括哺乳動物，諸如靈長類動物 (例如，人) 以及囓齒動物 (例如，小鼠及大鼠)。該術語涵蓋「全長」、未處理之 Tie2 以及在細胞處理中得到的任何形式的 Tie2。該術語亦涵蓋天然生成之 Tie2 變異體，例如，剪接變異體或對偶基因變異體。示例性人類 Tie2 蛋白質之胺基酸序列具有 NCBI 參考號 NP_000450 (SEQ ID NO: 1)。
如本文所用，術語「細胞毒性劑」指代抑制或阻止細胞功能及/或引起細胞死亡或破壞的物質。細胞毒性劑包括但不限於放射性同位素 (例如，At211 、I131 、I125 、Y90 、Re186 、Re188 、Sm153 、Bi212 、P32 、Pb212 和 Lu 的放射性同位素)；化學治療劑或藥物 (例如，胺甲喋呤、阿黴素、長春花生物鹼 (長春新鹼、長春鹼、依托泊苷)，多柔比星、黴法蘭、絲裂黴素 C、氯芥苯丁酸、道諾黴素或其他嵌入劑)；生長抑制劑；酶及其片段，諸如核酸酶；抗生素；毒素，諸如小分子毒素或細菌、真菌、植物或動物來源的酶活性毒素，包括其片段及/或變異體；以及下文所揭示之各種抗腫瘤或抗癌劑。
「效用功能 (effector function)」，係指歸因於抗體的 Fc 區域的那些生物活性，其隨抗體同型而變化。抗體效用功能的實例包括：C1q 結合和補體依賴性細胞毒性 (CDC)；Fc 受體結合；抗體依賴性細胞介導的細胞毒性 (ADCC)；吞噬作用；下調細胞表面受體（例如，B 細胞受體）；及 B 細胞活化。
藥劑例如醫藥調配物之「治療有效量」指代在必要之給藥劑量及時間段內有效實現所欲之治療或預防效果的量。
本文中的術語「Fc 區域」，用於定義包含至少一部分恆定區域的免疫球蛋白重鏈的 C 端區域。該術語包括天然序列 Fc 區域和變異 Fc 區域。於一個實施例中，人 IgG 重鏈 Fc 區域從 Cys226 或 Pro230 延伸至重鏈之羧基端。然而，Fc 區域的 C 端離胺酸 (Lys447) 可以存在或可以不存在。除非本文另有說明，否則 Fc 區域或恆定區中胺基酸殘基之編號根據 EU 編號系統 (也稱為 EU 指數) 進行，如 Kabat 等人所述 (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991) (另見上文)。
「骨架 (framework)」或「FR」係指除高變區 (hypervariable region) (HVR) 殘基之外的可變域殘基。可變域之 FR 通常由四個 FR 域組成：FR1、FR2、FR3、及 FR4。因此，HVR 及 FR 序列通常以如下順序出現在 VH (或 VL) 中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
術語「宿主細胞」、「宿主細胞系」及「宿主細胞培養物」可互換使用，指代已向其中引入外源性核酸的細胞，包括此等細胞的子代細胞。宿主細胞包括「轉化子」和「轉化細胞」，其包括原代轉化細胞及由其衍生的子代細胞，而與傳代次數無關。子代細胞之核酸含量可能與親代細胞不完全相同，但可能含有突變。本文中包括具有與原始轉化細胞中篩選或選擇的功能或生物學活性相同的功能或生物活性的突變子代細胞。
「人抗體 (human antibody)」為具有胺基酸序列之抗體，該胺基酸序列對應於由人或人體細胞產生或自利用人抗體譜系 (antibody repertoire) 或其他人抗體編碼序列之非人來源衍生之抗體之胺基酸序列。人抗體的該定義特定地排除包含非人抗原結合殘基之人源化抗體。
「人共通骨架」是代表一系列人免疫球蛋白 VL 或 VH 骨架序列中最常見的胺基酸殘基的骨架。通常，人免疫球蛋白 VL 或 VH 序列的選擇來自可變域序列的次群組。通常，序列的亞組是如 Kabat 等人在Sequences of Proteins of Immunological Interest (第 5 版，NIH Publication 91-3242，Bethesda MD (1991)，第 1-3 卷) 中所述之亞組。 於一個實施例中，對於 VL，亞組為如 Kabat 等人在上述文獻中所述之亞組 κI。於一個實施例中，對於 VH，亞組為如 Kabat 等人在上述文獻中所述之亞組 III。
「人源化 (humanized)」抗體係指包含來自非人 HVR 之胺基酸殘基及來自人 FR 之胺基酸殘基之嵌合抗體。在某些實施例中，人源化抗體將包括實質上所有至少一個 (且通常兩個) 可變域，其中所有或實質上所有 HVR (例如 CDR) 對應於非人抗體之其等，及所有或實質上所有 FR 對應對於人抗體之其等。人源化抗體視情況可包含衍生自人抗體之抗體恆定區之至少一部分。抗體 (例如非人抗體) 之「人源化形式 (humanized form)」係指已經歷人源化之抗體。
術語「可變區 (variable region)」或「可變域 (variable domain)」係指參與抗體與抗原結合的抗體重鏈或輕鏈之域。天然抗體之重鏈及輕鏈 (分別為 VH 及 VL) 之可變域通常具有類似的結構，且每個域均包含四個保守性骨架區 (FR) 及三個高變區 (HVR)。(參見，例如，Kindt 等人Kuby Immunology , 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)。)單個 VH 或 VL 域可能足以賦予抗原結合特異性。此外，可以使用 VH 或 VL 域從結合抗原的抗體中分離結合特定抗原的抗體，以分別篩選互補 VL 或 VH 域的文庫。參見，例如，Portolano 等人，J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson 等人，Nature 352:624-628 (1991)。
當在本文中使用時，術語「高變區」、「HVR」或「HV」指代抗體可變域中序列具有高變性 (本文中亦指代為「互補決定區」或「CDR」) 及/或形成結構上界定之環的區域。一般而言，抗體包含六個 HVR；三個在 VH 中 (H1、H2、H3)，及三個在 VL 中 (L1、L2、L3)。在天然抗體中，H3 和 L3 在六個 HVR 中表現出最多的多樣性，尤其是據信 H3 在賦予抗體優良特異性方面發揮獨特的作用。參見例如 Xu 等人，Immunity 13:37-45 (2000)；Johnson 與 Wu, inMethods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, 編, Human Press, Totowa, N.J., 2003)。實際上，在不存在輕鏈的情況下，僅由重鏈組成的天然駱駝科抗體具有功能和穩定性。參見例如 Hamers-Casterman 等人，Nature 363:446-448 (1993)；Sheriff 等人，Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996)。
HVR 的許多描述在使用中，並涵蓋於本文中。Kabat 互補決定區 (CDR) 基於序列變異性，且為最常用者 (Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest , 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))。Chothia 替代地提及結構環之位置 (Chothia 及 LeskJ. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))。AbM HVR 代表 Kabat HVR 和 Chothia 結構環之間的中間物，並被 Oxford Molecular 的 AbM 抗體建模軟體所採用。「Contact」HVR 基於對可用複雜晶體結構的分析。這些 HVR 中的每一個的殘基如下所示。環 Kabat           AbM             Chothia        Contact L1        L24-L34       L24-L34      L26-L32      L30-L36 L2        L50-L56       L50-L56      L50-L52      L46-L55 L3        L89-L97       L89-L97      L91-L96      L89-L96 H1        H31-H35B   H26-H35B   H26-H32     H30-H35B (Kabat 編號) H1        H31-H35      H26-H35     H26-H32     H30-H35 (Chothia 編號) H2        H50-H65      H50-H58     H53-H55     H47-H58 H3        H95-H102    H95-H102   H96-H101   H93-H101
HVRs 可包含如下「延長 HVR」：VL 中之 24-36 或 24-34 (L1)、46-56 或 50-56 (L2) 和 89-97 或 89-96 (L3)，及 VH 中之 26-35 (H1)、50-65 或 49-65 (H2) 和 93-102、94-102 或 95-102 (H3)。關於此等定義中之每一者，可變域殘基根據 Kabat 等人 (見上文) 編號。
術語「如 Kabat 中的可變域殘基編號」或「如 Kabat 中的胺基酸位置編號」及其變體是指用於上文的 Kabat 等人中抗體彙編的重鏈可變域或輕鏈可變域的編號系統。使用該編號系統，實際線性胺基酸序列可包含較少或額外的胺基酸，其對應於可變域的 FR 或 HVR 的縮短或***。例如，重鏈可變域可包括在 H2 的殘基 52 之後單個胺基酸*** (根據 Kabat 為殘基 52a) 和在重鏈 FR 殘基 82 之後的***殘基 (例如，根據 Kabat 為殘基 82a、82b、和 82c 等)。可藉由比對給定抗體之序列同源性區域與「標準」Kabat 編號序列來確定該抗體之殘基的 Kabat 編號。
當提到可變域中的殘基時，一般使用 Kabat 編號系統 (大約是輕鏈的殘基 1-107 和重鏈的殘基 1-113) (例如，Kabat 等人，上文)。當提及免疫球蛋白重鏈恆定區域中的殘基時，通常使用「EU 編號系統」或「EU 索引」(例如，Kabat 等人，上文中所報導的 EU 索引)。「如 Kabat 中的 EU 索引」是指人 IgG1 EU 抗體的殘基編號。除非本文另有說明，否則提及抗體可變域中的殘基編號是指 Kabat 編號系統的殘基編號。除非本文另有說明，否則提及抗體恆定域中的殘基編號意指 EU 編號系統之殘基編號 (例如，參閱美國專利申請公開第 2008/0181888 號，針對 EU 編號之圖式)。
「免疫共軛物」是與一個或多個異源分子共軛之抗體，其包括但不限於細胞毒性劑。
「個體」或「受試者」為哺乳動物。哺乳動物包括但不限於馴養的動物 (例如牛、綿羊、貓、狗和馬)、靈長類動物 (例如人及非人類靈長類動物諸如猴)、兔以及囓齒動物 (例如小鼠及大鼠)。於某些實施例中，個體或受試者為人類。
「經分离之」抗體是從其自然環境的組分中分離出來之抗體。在一些實施例中，將抗體純化至大於 95% 或 99% 純度，藉由 (例如) 電泳 (例如 SDS-PAGE、等電位聚焦 (IEF)、毛細管電泳) 或層析 (例如，離子交換或反相 HPLC) 來測定。關於評估抗體純度之方法的綜述，參見例如 Flatman 等人，J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)。
「分離」核酸指代已經與其天然環境之成分分離的核酸分子。分離的核酸包括通常包含核酸分子之細胞中所含之核酸分子，但是核酸分子存在於染色體外或與自然染色體位置不同之染色體位置。
「分離之編碼抗體例如抗 Tie2 抗體的核酸」指代編碼抗體重鏈及輕鏈 (或其片段) 之一種或多種核酸分子，包括在單個載體或單獨載體中之此等核酸分子，並且此等核酸分子存在於宿主細胞中的一個或多個位置。
如本文中所使用的術語「單株抗體 (monoclonal antibody)」，指代獲自實質上同質抗體群體之抗體，即群體中包含的個別抗體為相同的及/或結合相同抗原決定基，但不包括 (例如) 含有天然生成之突變或產生於單株抗體製劑生產過程中的可能的變異抗體，此等變異體通常以少量存在。與通常包括針對不同決定位 (抗原決定基) 之不同抗體之多株抗體製劑相反，單株抗體製劑之每個單株抗體係針對於抗原上的單一決定位。因此，修飾詞「單株」表示抗體之特徵係獲自實質上同質之抗體群體，且不應解釋為需要藉由任何特定方法產生抗體。例如，意欲根據本發明使用的單株抗體可藉由多種技術來製造，包括但不限於融合瘤方法、重組 DNA 方法、噬菌體展示方法、及利用包含全部或部分人免疫球蛋白基因座之轉殖基因動物之方法，本文描述此等方法及用於製備單株抗體之其他例示性方法。
「裸抗體」係指未與異源部分 (例如，細胞毒性部分) 或放射性標記結合之抗體。裸抗體可存在於醫藥調配物中。
「天然抗體」指代具有不同結構的天然生成之免疫球蛋白分子。例如，Ig 天然 IgG 抗體為約 150,000 道耳頓、由二條相同的輕鏈及二條相同的重鏈經二硫鍵鍵合所構成之異四聚體糖蛋白。從 N 端至 C 端，每條重鏈具有可變區 (VH)，亦稱為可變重鏈域或重鏈可變域，接著係三個恆定域 (CH1、CH2 及 CH3)。類似地，從 N 端至 C 端，每條輕鏈具有可變區 (VL)，亦稱為可變輕鏈域或輕鏈可變域，接著係輕鏈恆定 (CL) 域。基於其恆定域之胺基酸序列，抗體之輕鏈可被歸類為兩種類型中的一種，稱為卡帕 (κ) 及蘭姆達 (λ)。
術語「藥品說明書」用於指代通常包含在治療性產品的商業包裝中的說明，該說明包含有關使用此等治療性產品的適應症、用法、劑量、投予途徑、聯合療法、禁忌症及/或警告等資訊。
相對於參比多肽序列所述之「百分比 (%) 胺基酸序列同一性」，定義為候選序列中胺基酸殘基與參比多肽序列中之胺基酸殘基相同之百分比，在比對序列並引入差異後 (如有必要)，可實現最大的序列同一性百分比，並且不考慮將任何保守取代作為序列同一性之一部分。為確定胺基酸序列同一性百分比之目的而進行的比對可透過本領域中技術範圍內之各種方式實現，例如，使用公眾可取得的電腦軟體諸如 BLAST、BLAST-2、ALIGN 或 Megalign (DNASTAR) 軟件。本領域之技術人員可確定用於比對序列之合適參數，包括在所比較之序列全長上實現最大比對所需之任何演算法。然而，出於本文的目的，使用序列比較電腦程式 ALIGN-2 產生 ％ 胺基酸序列同一性值。ALIGN-2 序列比較電腦程式由建南德克公司 (Genentech，Inc.) 編寫，原始程式碼已與用戶文檔一起存檔於美國版權局，華盛頓特區，20559，並以美國版權註冊號 TXU510087 進行註冊。ALIGN-2 程式可從加利福尼亞南三藩市的 建南德克公司 (Genentech，Inc.) 公眾可取得，亦可以從原始程式碼進行編譯。ALIGN-2 程式應編譯為在 UNIX 作業系統（包括數位 UNIX V4.0D）上使用。所有序列比較參數均由 ALIGN-2 程式設置，並且沒有變化。
在使用 ALIGN-2 進行胺基酸序列比較的情況下，既定胺基酸序列 A 對、與、或相對於既定胺基酸序列 B 的 % 胺基酸序列同一性（其視情況表述為既定胺基酸序列 A，其對、與、或相對於既定胺基酸序列 B 具有或包含一定 % 的胺基酸序列同一性）計算如下： 100 乘以分數 X/Y
其中 X 是序列比對程式 ALIGN-2 在 A 與 B 程式比對中評分為同一匹配的胺基酸殘基數，Y 是 B 中胺基酸殘基的總數。應當理解的是，在胺基酸序列 A 的長度不等於胺基酸序列 B 的長度的情況下，A 與 B 的 ％ 胺基酸序列同一性將不等於 B 與 A 的 ％ 胺基酸序列同一性。除非另有特別說明，否則如前一段所述，使用 ALIGN-2 電腦程式獲得本文使用的所有 ％ 胺基酸序列同一值。
術語「醫藥調配物」指代以下製劑，其形式為允許其中所含之活性成分的生物活性有效，並且不包含對製劑將投予之受試者具有不可接受之毒性的其他成分。
「醫藥上可接受之載劑」指代醫藥調配物中除對受試者無毒之活性成分以外的成分。醫藥上可接受之載劑包括但不限於緩衝劑、賦形劑、安定劑或防腐劑。
術語「多元醇」廣義上指代多羥基之醇化合物。例如，多元醇可以為任何水溶性聚(環氧烷)聚合物，並且可具有線性鏈或分支鏈。較佳之多元醇包括彼等於一個或多個羥基位置經化學基團諸如具有介於一個與四個之間之碳的烷基取代者。典型地，多元醇為聚(烷二醇)，較佳為聚乙二醇 (PEG)。惟，彼等熟悉本領域者可知，其他多元醇類諸如聚丙二醇及聚乙二醇-聚丙二醇共聚物，可使用本文針對 PEG 描述之用於共軛之技術採用之。本揭露之多元醇包括彼等本領域中習知者以及彼等可諸如從可商業獲得之來源公開獲得者。
如本文中所使用的「治療 (treatment)」（及其語法變體，諸如「治療 (treat)」或「治療 (treating)」），係指試圖改變受治療受試者之疾病自然病程的臨床干預，並且可進行預防或在臨床病理過程中執行。期望之治療效果包括但不限於預防疾病之發生或複發、減輕症狀、減輕疾病之任何直接或間接病理後果、預防轉移、降低疾病進展之速度、改善或減輕疾病狀態、緩解或改善預後。於一些實施例中，本發明之抗體用於延遲疾病之發展或減慢疾病之進展。
如本文所用，術語「載體」指代能夠傳遞與其連接之另一核酸的核酸分子。該術語包括作為自我複制核酸結構之載體以及摻入已引入該宿主細胞的基因體中的載體。某些載體能夠指導與其可操作地連接的核酸的表現。此等載體於本文中稱為「表現載體」。
「端口遞送系統」或「PDS」為用於眼部之可植入裝置，其具有可再填充之儲器，允許在延長之時間內進行治療劑之遞送。植入物係構造為具有與儲器連通之再填充端口以及決定將藥物釋放至眼內之速率的釋放控制元件。參閱，例如，US20100174272、8,277,830、8,399,006、8,795,712 及 8,808,727。
「小口徑針」指代用於流體組合物之注射用針，其為約 30、29、28、27、26、25、24、23 或 22 號或更高，諸如 30 號針。於一些實施例中，該小口徑針具有標準尺寸之針壁。於另一實施例中，該小口徑針具有薄針壁，其對於黏性溶液可能為較佳者。
Ⅱ . 組成物及方法
本文提供新穎 Tie2 促效劑，其激活 Tie2 功能，如藉由例如 Tie2 之磷酸化而得以證明。於內源性促效劑 Ang1 不足或不存在的情況下，直接促效更有效地激活 Tie2 訊號傳導，驅動視力改善，從而可能在治療上具有優勢。因為 Tie2 之激活劑可能既阻斷 Ang2 之結合 (阻斷 Ang2 拮抗劑功能) 亦直接結合 Tie2 以激活 Tie2 活性，例如，增加 Tie2 及/或 Akt 之磷酸化，故其可能比 Ang2 之抑制劑更具優勢。業經表明，Tie2 之激活需要 Tie2 在與配體結合時集簇，據此，本文提供之 Tie2 促效劑為多聚的，較佳為六聚的或八聚的。本文所揭示之多聚 Tie2 促效劑可具有額外之出乎意料的優勢，亦即，於體外或體內不顯著減低細胞 Tie2 水準。此外，本文所揭示之多聚 Tie2 促效劑可經調配以進行玻璃體內注射，並且具備賦予優勢藥物動力學並因此賦予藥效動力學之分子尺寸。提供資料以顯示，多聚 Tie2 促效劑減低內皮細胞膜滲透性並強化細胞-細胞接合 (參閱，例如，實例 10)。
於一個態樣中，本發明部分地基於結合 Tie2 之抗體。特別地，本文提供結合劑 (本文中亦指代為共軛物)，其包含超過一種抗 Tie2 抗體或其抗原結合片段，諸如 (但不限於) 抗 Tie2 Fab。可能較佳者為，該結合劑包含超過 4 個 (例如，包含 5、6、7、8、9 或 10 個) 抗 Tie2 抗體，例如，超過 4 個抗 Tie2 Fab，使得 Tie2 結合劑與定位在細胞表面上之 Tie2 的結合與 Tie2 激活相關聯。Tie2 集簇亦可在該結合劑與 Tie2 結合時發生。
於一些實施例中，較佳係具有 Tie2 結合劑，當其與蛋白質表面上之 Tie2 結合時，其並不造成該細胞表面上之 Tie2 蛋白含量之顯著降幅。於一些實施例中，激活 Tie2 之 Tie2 結合劑包含抗 Tie2 抗體 (Fab)，該抗體對 Tie2 之親和力在約 0.1 μM 至10 μM 範圍內。
Tie2 蛋白質之激活可於體外藉由使用通常技術人士已知之材料及方法量測 Tie2 蛋白質之磷酸化的增加 (例如，藉由西方墨點法) 或量測相關 Akt 蛋白質 (AKT 絲胺酸/蘇胺酸激酶 1，例如，GenBank 登錄號 NP_001014431) 之磷酸化的增加而量測之。 於某些實施例中，提供與 Tie2 結合之抗體以及包含超過一種結合 Tie2 之抗體的組合物。本發明之抗體及包含多個抗體之組合物可用於例如診斷或治療與 Tie2 功能相關之血管滲透性疾患，尤其是眼部疾患。
A. 示例性抗 Tie2 結合劑
於一個態樣中，本發明提供 Tie2 結合劑，其包含與 Tie2 結合之分離抗體。於一些實施例中，該 Tie2 結合劑包含多臂部分，其中，該等臂之每一者與抗 Tie2 抗體或其片段共軛或連接。於較佳實施例中，該抗 Tie2 抗體或其片段為抗 Tie2 Fab。多臂部分之實例包括但不限於多臂多元醇 (例如，聚乙二醇 (PEG))、IgM 以及多聚例如六聚肽。於某些實施例中，提供 Tie2 結合劑，其包含超過一個抗 Tie2 抗體或其片段，其中，該抗 Tie2 抗體 (當並非該 Tie2 結合劑之一部分，但視情況型式化為全長抗體) 與 Tie2 結合，結合親和力為諸如小於 100 μM、或小於 50 μM 或小於 10 μM 之 KD 及/或大於 1 μM 之 KD 。應理解，親和力係使用抗體而非包含超過一種抗 Tie2 抗體之 Tie2 結合劑量測。於一些實施例中，親和力為單價親和力。再者，提供 Tie2 結合劑及 Tie2 抗體，其激活 Tie2 活性 (例如，作為 Tie2 促效劑而發揮作用)。例如，Tie2 之激活係藉由在體外測定中量測 Tie2 之磷酸化的增加及/或 AKT 之磷酸化的增加而量測之。於一些實施例中，該 Tie2 結合劑並不將細胞中之 Tie2 蛋白質水準下調 (降低) 超過約 5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、75% 或 85%。於另選之實施例中，該 Tie2 結合劑將細胞中之 Tie2 蛋白含量降幅少於約 5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60% 或 75%。於一些實施例中，該 Tie2 結合劑減低血管滲透性。血管內皮細胞滲透性之降幅可於體內或體外量測。於一些實施例中，Tie2 結合劑可增加 Tie2 至細胞-細胞接合之轉位及/或促成肌動蛋白及/或鈣黏蛋白之結構組織化。於較佳實施例中，該 Tie2 結合劑包含六聚 PEG 分子，其中，該 6 個臂之每一者與抗 Tie2 Fab 結合。可替代地，該 PEG 分子包含 8 個臂。於一些實施例中，該 Tie2 結合劑包含超過 1 個本文所揭示之抗 Tie2 抗體或其片段。本發明亦提供結合 Tie2 之抗 Tie2 抗體或其片段。於一些實施例中，該抗 Tie2 抗體或其片段與 Tie2 之 Ig2 域結合 (例如，與至少部分地存在於 SEQ ID NO: 1 之胺基酸殘基 23 至 120 內的表位結合)。
於一個態樣中，本發明提供特異性結合 Tie2 之抗體或其抗原結合片段，其包含選自下列之至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個 CDR：(a) 包含 SEQ ID NO: 3 之胺基酸序列的 CDR-H1；(b) 包含 SEQ ID NO: 4 之胺基酸序列的 CDR-H2；(c) 包含 (a) SEQ ID NO: 5 (其中，X1 為 M、L、K、F、Y、R、N、Q、H 或 W，以及/或者 X2 為 F、Y、L、Q、I、K 或 H)、SEQ ID NO: 6 或 SEQ ID NO: 7 之胺基酸序列的 CDR-H3；(d) 包含 SEQ ID NO: 8 之胺基酸序列的 CDR-L1；(e) 包含 SEQ ID NO: 9 之胺基酸序列的 HVR-L2，以及 (f) 包含 SEQ ID NO: 10 之胺基酸序列的 HVR-L3。於特定實施例中，該 CDR-H3 包含 SEQ ID NO: 7。
於一個態樣中，本發明提供包含選自下列之至少一個、至少兩個或全部三個 VH 域 CDR 序列的抗體：(a) 包含 SEQ ID NO: 3 之胺基酸序列的 CDR-H1；(b) 包含 SEQ ID NO: 4 之胺基酸序列的 CDR-H2；及 (c) 包含 SEQ ID NO: 5 之胺基酸序列的 CDR-H3，其中，X1 為 M、L、K、F、Y、R、N、Q、H 或 W 及/或 X2 為 F、Y、L、Q、I、K 或 H。上述取代之全部可能組合皆為 SEQ ID NO: 5 之共通序列所涵蓋。於一個實施例中，該 CDR-H3 包含 SEQ ID NO: 6 之胺基酸序列。於另一實施例中，該 CDR-H3 包含 SEQ ID NO: 7 之胺基酸序列
於另一態樣中，本發明提供包含選自下列之至少一個、至少兩個或全部三個 VL 域 CDR 序列的抗體：(a) 包含 SEQ ID NO: 8 之胺基酸序列的 HVR-L1；(b) 包含 SEQ ID NO: 9 之胺基酸序列的 CDR-L2；及 (c) 包含 SEQ ID NO: 10 之胺基酸序列的 CDR-L3。於一個實施例中，該 VL 域包含 (a) 包含 SEQ ID NO: 8 之胺基酸序列的 CDR-L1；(b) 包含 SEQ ID NO: 9 之胺基酸序列的 CDR-L2；及 (c) 包含 SEQ ID NO: 10 之胺基酸序列的 CDR-L3。
於另一態樣中，本發明之抗體包含：(a) VH 域，該 VH 域包含選自下列之至少一個、至少兩個或全部三個 VH CDR 序列：(i) 包含 SEQ ID NO: 3 之胺基酸序列的 CDR-H1；(ii) 包含 SEQ ID NO: 4 之胺基酸序列的 CDR-H2；及 (iii) 包含 SEQ ID NO: 5 (其中，X1 為 M、L、K、F、Y、R、N、Q、H 或 W 及/或 X2 為 F、Y、L、Q、I、K 或 H)、SEQ ID NO: 6 及 SEQ ID NO: 7 之胺基酸序列的 CDR-H3；以及 (b) VL 域，該 VL 域包含選自下列之至少一個、至少兩個或全部三個 VL CDR 序列：(i) 包含 SEQ ID NO: 8 之胺基酸序列的 CDR-L1；(ii) 包含 SEQ ID NO: 9 之胺基酸序列的 CDR-L2；及 (c) 包含 SEQ ID NO: 10 之胺基酸序列的 CDR-L3。
於另一態樣中，本發明提供包含 VH 域及 VL 域之抗體，其中，該 VH 域包含：(a) 包含 SEQ ID NO: 3 之胺基酸序列的 CDR-H1；(b) 包含 SEQ ID NO: 4 之胺基酸序列的 CDR-H2；(c) 包含 SEQ ID NO: 5 (其中，X1 為 M、L、K、F、Y、R、N、Q、H 或 W，以及/或者 X2 為 F、Y、L、Q、I、K 或 H)、SEQ ID NO: 6 或 SEQ ID NO: 7 之胺基酸序列的 HVR-H3；該 VL 域包含：(d) 包含 SEQ ID NO: 8 之胺基酸序列的 CDR-L1；(e) 包含 SEQ ID NO: 9 之胺基酸序列的 CDR-L2，以及 (f) 包含選自 SEQ ID NO: 10 之胺基酸序列的 CDR-L3。於一些實施例中，該 VH 域包含與 SEQ ID NO: 20 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 序列同一性之序列，並且該 VL 域包含與 SEQ ID NO: 21 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 序列同一性之序列。
在以上任何實施例中，抗 Tie2 抗體可為人源化的。於一個實施例中，抗 Tie2 抗體包含如上述實施例中任一者所述之 CDR，並且復包含人受體骨架，例如人免疫球蛋白骨架或人共通骨架。於另一實施例中，該抗 Tie2 抗體包含如上述實施例中任一者中所述之 CDR，並且復包含 SEQ ID NO: 11 之 VH 骨架 FR1 序列，SEQ ID NO: 12 之 VH 骨架 FR2 序列，SEQ ID NO: 13 之 VH 骨架 FR3 序列，及/或 SEQ ID NO: 14 之 VH 骨架 FR4 序列。於其他實施例中，該抗 Tie2 抗體包含 SEQ ID NO: 15 之 VL 骨架 FR1 序列，SEQ ID NO: 16 之 VL 骨架 FR2 序列，SEQ ID NO: 17 之 VL 骨架 FR3 序列，及/或 SEQ ID NO: 18 之 VL 骨架 FR3 序列。
於另一態樣中，抗 Tie2 抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變域 (VH) 序列，該 VH 序列與 SEQ ID NO: 20 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 之序列同一性。於某些實施例中，具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 之同一性的 VH 序列包含相對於參考序列的取代 (例如保守取代)、***或缺失，但是包含該序列的抗 Tie2 抗體保留與 Tie2 結合之能力。於某些實施例中，在 SEQ ID NO: 20 中，共有 1 至 10 個胺基酸被取代、***及/或缺失。於某些實施例中，取代、***或缺失發生在 CDR 以外的區域 (即，在 FR 中)。視情況，抗 Tie2 抗體包含 SEQ ID NO: 20 中之 VH 序列，其包括該序列之轉譯後修飾。於一個特定實施例中，該 VH 包含選自下列之一個、兩個或三個 CDR：(a) 包含 SEQ ID NO: 3 之 胺基酸序列的 CDR-H1；(b) 包含 SEQ ID NO: 4 之胺基酸序列的 CDR-H2；及 (c) 包含 SEQ ID NO: 7 之胺基酸序列的 CDR-H3。
於另一態樣中，提供抗 Tie2 抗體，其中，該抗體包含輕鏈可變域 (VL) 序列，該 VL 序列與 SEQ ID NO: 21 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 之序列同一性。於某些實施例中，具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 之同一性的 VL 序列包含相對於參考序列的取代 (例如保守取代)、***或缺失，但是包含該序列的抗 Tie2 抗體保留與 Tie2 結合之能力。於某些實施例中，在 SEQ ID NO: 21 中，共有 1 至 10 個胺基酸被取代、***及/或缺失。於某些實施例中，取代、***或缺失發生在 HVR 以外的區域 (即，在 FR 中)。視情況，抗 Tie2 抗體包含 SEQ ID NO: 21 中之 VL 序列，其包括該序列之轉譯後修飾。於一個特定實施例中，該 VL 包含選自下列之一個、兩個或三個 HVR：(a) 包含 SEQ ID NO: 8 之胺基酸序列的 HVR-L1；(b) 包含 SEQ ID NO: 9 之胺基酸序列的 HVR-L2；及 (c) 包含 SEQ ID NO: 10 之胺基酸序列的 HVR-L3。
於另一態樣中，提供抗 Tie2 抗體，其中，該抗體包含上文提供之實施例中任一者中的 VH 及上文提供之實施例中任一者中的 VL。於一個實施例中，該抗體包含分別為 SEQ ID NO: 20 及 SEQ ID NO: 21 之 VH 及 VL 序列，其包括彼等序列之轉譯後修飾。
在又一方面，本發明提供了一種與本文提供之抗 Tie2 抗體結合至同一抗原決定基的抗體。例如，於某些實施例中，提供與抗 Tie2 抗體結合至同一表位之抗體，其包含 SEQ ID NO: 20 之 VH 序列和 SEQ ID NO: 21 之 VL 序列。於某些實施例中，提供與 Tie2 片段諸如 Tie2 之 Ig1 域內之表位結合的抗體，其中，該 Ig1 域包含 SEQ ID NO: 1 之胺基酸 23-120。
於本發明之又一態樣中，根據以上實施例中之任一者之抗 Tie2 抗體為單株抗體，包括嵌合抗體、人源化抗體或人類抗體。於一個實施例中，抗 Tie2 抗體為抗體片段，例如 Fv、Fab、Fab’、scFv、雙抗體或 F(ab’)2 片段。於另一實施例中，抗體為全長抗體，例如本文所定義之完整 IgG1 抗體或其他抗體類別或同型。
於又一態樣中，如以下章節 1-7 中所揭示，根據以上實施例中之任一者之抗 Tie2 抗體可單獨或組合地結合任何特徵：
1. 抗體親和力
於某些實施例中，本文提供之抗體的解離常數 (Kd) 為 ≤ 10 μM、≤ 100 μM、≤ 10 μM、≤ 1 μM、≤ 100 nM、≤ 10 nM、≤ 1 nM、≤ 0.1 nM、≤ 0.01 nM 或 ≤ 0.001 nM 及/或 ≥ 0.01 μM、0.1 μM 或 1 μM (例如，10-5 M 或更低、10-6 M 或更多、10-8 M 或更低，例如，1 μM 至 10 μM，例如，0.1 μM 至 10 μM，例如，10-6 M 至 10-9 M，例如，10-8 M 至 10-13 M，例如，10-9 M 至 10-13 M)。
在一實施例中，Kd 是藉由放射性標記的抗原結合測定 (adiolabeled antigen binding assay，RIA) 來測量。在一個態樣中，RIA 是用所關注的抗體的 Fab 形式及其抗原來進行。例如，通過在滴定系列之無標記抗原的存在下用最小濃度的 (125 I) 標記的抗原平衡 Fab，然後用抗 Fab 抗體塗布之平板捕獲結合抗原，來測量 Fab 對抗原之溶液結合親和力 (參見例如 Chen 等人，J. Mol. Biol. 293:865-881(1999))。為確定測定的條件，用溶於 50 mM 碳酸鈉 (pH 9.6) 中的 5 μg/ml 捕獲抗 Fab 抗體 (Cappel Labs) 將 MICROTITER® 多孔板 (Thermo Scientific) 塗布隔夜，然後在室溫 (約 23°C) 下用溶於 PBS 中的 2% (w/v) 牛血清白蛋白封閉二至五小時。在非吸附板 (Nunc #269620) 中，將 100 pM 或 26 pM [125 I]-抗原與目標 Fab 的系列稀釋液混合 (例如，與 Presta 等人在Cancer Res. 57:4593-4599 (1997) 中所述之抗 VEGF 抗體 Fab-12 的評估結果一致)。然後將目標 Fab 過夜孵化；但是，可繼續孵育更長時間 (例如約 65 小時)，以確保達到平衡。此後，將混合物轉移之捕獲板上，在室溫下進行孵化 (例如，孵化 1 小時)。然後除去溶液，用溶於 PBS 中的 0.1% 聚山梨糖醇酯 20 (TWEEN-20® ) 將板洗滌八次。當平盤乾燥後，添加 150 μl/孔的閃爍劑 (MICROSCINT-20TM ；Packard)，並將平盤在 TOPCOUNTTM 伽瑪計數器 (Packard) 上計數十分鐘。選擇提供小於或等於最大結合濃度的 20% 的各種 Fab 的濃度以用於競爭性結合測定中。
根據另一實施例，使用 BIACORE® 表面電漿共振測定測量 Kd。例如，使用 BIACORE® -2000 或 BIACORE® -3000 (BIAcore, Inc.，Piscataway，NJ) 在 25℃ 用固定化抗原 CM5 晶片以約 10 反應單位 (RU) 進行測定。在一個態樣中，根據供應商的說明，用N -乙基-N' -(3-二甲基胺基丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽 (EDC) 和N -羥基琥珀醯亞胺 (NHS) 活化羧甲基化葡聚醣生物感測器晶片 (CM5，BIACORE, Inc.)。用 10 mM 乙酸鈉 (pH 4.8) 將抗原稀釋至 5 μg/ml (~0.2 μM)，然後以 5 μl/分鐘的流速注入，以獲得大約 10 反應單位 (RU) 的偶合蛋白。注入抗原後，注入 1 M 乙醇胺以封閉未反應的基團。在動力學測量中，將 Fab 之兩倍連續稀釋液 (0.78 nM 至 500 nM) 在 25°C 下以約 25 μl/min 的流速注入含 0.05% 聚山梨糖醇酯 20 (TWEEN-20TM ) 界面活性劑 (PBST) 的 PBS 中。使用簡單的一對一朗繆爾結合模型 (one-to-one Langmuir binding model) (BIACORE® 評估軟體 3.2 版)，藉由同時擬合結合及解離感測器圖譜來計算締合速率 (kon) 及解離速率 (koff)。平衡解離常數 (Kd) 係計算為 koff/kon 之比率。參閱，例如，Chen 等人，J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)。若藉由上述表面電漿子共振分析測定之締合速率超過 106 M-1 s-1，則締合速率可使用螢光淬滅技術量測，該技術在如光譜儀 (諸如具有攪拌式比色管之止流裝備型分光光度計 (Aviv Instruments) 或 8000-系列 SLM-AMINCOTM 分光光度計 (ThermoSpectronic)) 中所量測之濃度增加之抗原存在下，在 25℃ 量測 PBS (pH 值 7.2) 中之 20 nM 抗-抗原抗體 (Fab 形式) 之螢光發射強度 (激發 = 295 nm；發射 = 340 nm，16 nm 帶通) 的增加或減少。
2. 抗體片段
於某些實施例中，本文提供之抗體為抗體片段。抗體片段包括但不限於 Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2 、Fv 和 scFv 片段以及下文所述之其他片段。關於某些抗體片段的綜述，參見 Hudson 等人，Nat. Med. 9:129-134 (2003)。關於 scFv 片段的綜述，參見例如 Pluckthün，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies ，第 113卷，Rosenburg 及 Moore 編，Springer-Verlag，New York，第 269-315 頁 (1994)；亦可參見 WO 93/16185；及美國專利第 5,571,894 號及第 5,587,458 號。關於包含補救受體結合抗原決定基殘基且具有增加的體內半衰期之 Fab 及 F(ab')2 片段的論述，參見美國第 5,869,046 號專利。
於一些實施例中，Fab 片段之重鏈的 C 端終止於胺基酸「CDKTHT」 (SEQ ID NO: 75)、「CDKTHL」 (SEQ ID NO: 76)、「CDKTH」 (SEQ ID NO: 77)、「CDKT」 (SEQ ID NO: 78)、「CDK」或「CD」處。於一些實施例中，Fab 片段之重鏈的 C 端終止於序列 CDKTHX (SEQ ID NO: 79) 處，其中，X 為除 T 之外的胺基酸。位於 C 端處之截短及/或突變可能能夠減低或消除針對 Fab 之AHA 反應活性，而不破壞熱安定性或表現。於一些實施例中，Fab 片段之重鏈的 C 端終止於胺基酸「CDKTHTC」 (SEQ ID NO: 80)、「CDKTHTCPPC」 (SEQ ID NO: 81)、「CDKTHTCPPS」 (SEQ ID NO: 82)、「CDKTHTSPPC」 (SEQ ID NO: 83)、「CDKTHTAPPC」(SEQ ID NO: 84)、「CDKTHTSGGC」(SEQ ID NO: 85) 或「CYGPPC」(SEQ ID NO: 86) 處。於一些此類實施例中，C 端胺基酸中之游離半胱胺酸可能適於例如與聚合物諸如 PEG 共軛。
雙功能抗體為具有兩個抗原結合位點 (其可係二價或雙特異性的) 之抗體片段。參閱，例如，EP404097；WO 1993/01161；Hudson 等人，Nat. Med. 9:129-134 (2003)；以及 Hollinger 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)。三功能抗體及四功能抗體亦揭示於 Hudson 等人，Nat. Med. 9:129-134 (2003) 中。
單域抗體為包含抗體之重鏈可變域之全部或部分或抗體之輕鏈可變域之全部或部分之抗體片段。在某些實施例中，單域抗體為人單域抗體 (Domantis, Inc.，Waltham, MA；參見例如美國第 6,248,516 B1 號專利)。
抗體片段可藉由各種技術製造，包括但不限於如本文所述之完整抗體之蛋白水解消化以及重組宿主細胞 (例如大腸桿菌 或噬菌體) 之產生。
3. 嵌合和人源化抗體
於某些實施例中，本文所提供之抗體為嵌合抗體。某些嵌合抗體描述於例如美國專利號 4,816,567；及 Morrison 等人， Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 81:6851-6855 (1984)。在一個實例中，嵌合抗體包含非人可變區 (例如，來源於小鼠、大鼠、倉鼠、兔或非人類靈長類動物如猴的可變區) 及人恆定區。在又一個實例中，嵌合抗體為「類別轉換」抗體，其中類或子類相比於其親代抗體已發生變更。嵌合抗體包括其抗原結合片段。
在某些態樣中，嵌合抗體為人源化抗體。通常，非人抗體為人源化抗體以降低對人的免疫原性，同時保留親代非人抗體之特異性及親和力。通常，人源化抗體包含一個或多個可變域，其中 HVR 如 CDR (或其部分) 來源於非人抗體，並且 FR (或其部分) 來源於人抗體序列。人源化抗體視情況將包含人恆定區之至少一部分。在一些實施例中，人源化抗體中的一些 FR 殘基經來自非人抗體 (例如衍生 HVR 殘基之抗體) 之對應殘基取代，以例如恢復或改善抗體特異性或親和力。
人源化抗體及其製備方法綜述於例如 Almagro 和 Fransson，Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008) 中，並且進一步描述於例如：Riechmann 等人， Nature 332:323-329 (1988)；Queen 等人，Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989)；US 專利號 5,821,337、7,527,791、6,982,321 和 7,087,409；Kashmiri等人 ，Methods 36:25-34 (2005) (具體描述了決定區 (SDR) 接枝)；Padlan，Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) (描述了「表面重塑」)；Dall'Acqua 等人，Methods 36:43-60 (2005) (描述了「FR 改組」)；Osbourn 等人，Methods 36:61-68 (2005)；及 Klimka 等人，Br. J. Cancer ，83:252-260 (2000) (描述了 FR 改組的「導向選擇」法)。
可以用於人源化的人抗體骨架區包括但不限於：使用「最佳匹配」方法選擇的骨架區 (參閱，例如，Sims 等人J. Immunol. 151:2296 (1993))；來源於輕鏈或重鏈可變區之特定子群的人抗體共通序列的骨架區 (參閱，例如，Carter 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA ，89:4285 (1992)；及 Presta 等人J. Immunol. ，151:2623 (1993))；人類成熟 (體細胞突變) 骨架區或人種系骨架區 (參閱，例如，Almagro 與 Fransson，Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008))；以及來源於篩選 FR 庫的骨架區 (參閱，例如，Baca 等人，J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997)；及 Rosok 等人，J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996))。
4. 人抗體
於某些實施例中，本文所提供之抗體為人類抗體。可使用此領域中所公知的各種技術生產人抗體。人抗體一般性描述於：van Dijk 和 van de Winkel，Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001)；及 Lonberg，Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)。
可透過對轉基因動物投予免疫原來製備人抗體，該轉基因動物已被修飾以響應於抗原攻擊而產生完整的人抗體或具有人可變區的完整抗體。此等動物通常包含全部或部分人免疫球蛋白基因座，其取代內源性免疫球蛋白基因座，或存在於染色體外或隨機整合到動物的染色體中。在此等轉基因小鼠中，內源性免疫球蛋白基因座通常已被滅活。有關從轉基因動物中獲得人抗體的方法的綜述，參見 Lonberg，Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)。另見例如：美國專利號 6,075,181 和 6,150,584 (描述了 XENOMOUSETM 技術)；美國專利號 5,770,429 (描述了 HuMab® 技術)；美國專利號 7,041,870 (描述了 K-M MOUSE® 技術)；及美國專利申請公開號 US 2007/0061900 (描述了 VelociMouse® 技術)。由此等動物產生的來源於完整抗體的人可變區可被進一步修飾，例如透過與不同的人恆定區結合來修飾。
人抗體也可透過基於融合瘤的方法進行製備。用於生產人單株抗體的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤細胞系已有描述。(參見例如：KozborJ. Immunol. ，133: 3001 (1984)；Brodeur 等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications ，pp. 51-63 (Marcel Dekker，Inc.，New York，1987)；及 Boerner 等人，J. Immunol .，147: 86 (1991)。)透過人 B 細胞雜交瘤技術產生的人抗體也描述於 Li 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 103:3557-3562 (2006)。其他方法包括描述於例如以下文獻中的那些：美國第 7,189,826 號專利 (描述了由雜交瘤細胞系生產單株人 IgM 抗體)，及 Ni，Xiandai Mianyixue ，226(4):265-268 (2006) (描述了人-人雜交瘤)。人融合瘤技術 (Trioma 技術) 也描述於以下文獻中：Vollmers 和 Brandlein，Histology and Histopathology ，20(3):927-937 (2005)；及 Vollmers 和 Brandlein，Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology ，27(3):185-91 (2005)。
人抗體也可以藉由分離選自人源性噬菌體展示庫的 Fv 選殖株可變域序列來產生。然後可以將此等可變域序列與所需的人恆定域結合。下文描述了從抗體庫中選擇人抗體的技術。
5. 來源於文庫之抗體
用於本發明之抗體可通過篩選組合文庫中具有所需之一種或多種活性的抗體來分離。例如，此領域中所知之多種方法用於產生噬菌體展示庫並篩選此等庫中具有所欲之結合特性的抗體。此等方法綜述於例如：Hoogenboom 等人，收錄於Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien 等人主編，Human Press，Totowa，NJ，2001) 中，並且進一步描述於例如：McCafferty 等人，Nature 348:552-554；Clackson 等人，Nature 352: 624-628 (1991)；Marks 等人，J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992)；Marks 和 Bradbury，收錄於Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo 主編，Human Press，Totowa，NJ，2003)；Sidhu 等人，J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004)；Lee 等人，J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004)；Fellouse,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004)；及 Lee 等人，J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004)。
在某些噬菌體展示方法中，透過聚合酶鏈鎖反應 (PCR) 分別選殖 VH 和 VL 基因庫，並在噬菌體庫中隨機重組，然後可按照以下文獻所述之方法篩選抗原結合噬菌體：Winter 等人，Ann. Rev. Immunol. ，12: 433-455 (1994)。噬菌體通常以單鏈 Fv (scFv) 片段或 Fab 片段展示抗體片段。來自免疫源的庫無需構建融合瘤即可向免疫原提供高親和力抗體。可替代地，可以在不進行任何免疫作用的情況下選殖天然譜系 (例如，來自人) 以向各種非自身以及自身抗原提供抗體的單一來源，如 Griffiths 等人在EMBO J. 12: 725-734 (1993) 中所述。最後，還可以透過選殖幹細胞中未重排的 V 基因片段，並使用包含隨機序列的 PCR 引子來編碼高變異性 CDR3 區域並在體外 完成重排，由此合成天然庫，如 Hoogenboom 和 Winter 在J. Mol. Biol. ，227: 381-388 (1992) 中所述。描述人抗體噬菌體庫的專利公開包括例如：美國第 5,750,373 號專利及美國專利公開號 2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936 和 2009/0002360。
從人抗體庫分離的抗體或抗體片段在本文中被視作人抗體或人抗體片段。
6. 多特異性抗體
於某些實施例中，本文提供之抗體為多特異性抗體，例如，雙特異性抗體。多特異性抗體是對至少兩個不同位點具有結合特異性的單株抗體。在某些方面，結合特異性之一為對 Tie2 的結合特異性，而其他特異性則為針對任何其他抗原。在一些方面，雙特異性抗體可與 Tie2 的兩個不同表位結合。雙特異性抗體可與 Tie2 的兩個不同表位結合。雙特異性抗體可製成全長抗體或抗體片段。
製備多特異性抗體的技術包括但不限於具有不同特異性之兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對的重組共表現 (參見：Milstein 等人，Nature 305: 537，1983；WO 93/08829；及 Traunecker 等人，EMBO J. 10: 3655，1991) 和「杵臼」工程化 (參見例如美國第 5,731,168 號專利)。多特異性抗體亦可透過以下方法製備：用於製備抗體 Fc-異二聚體分子的工程靜電轉向效應 (WO 2009/089004A1)；交聯兩個或更多個抗體或片段 (參閱，例如，美國專利第 4,676,980 號；及 Brennan 等人， Science , 229: 81 (1985))；使用白胺酸拉鏈產生雙特異性抗體 (參閱，例如，Kostelny 等人，J. Immunol. , 148(5):1547-1553 (1992))；使用「雙抗體」技術製備雙鏈抗體片段 (參閱，例如，Hollinger 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 90:6444-6448 (1993))；以及使用單鏈 Fv (sFv) 二聚體 (參閱，例如，Gruber 等人，J. Immunol. , 152:5368 (1994))；以及按照例如 Tutt 等人，J. Immunol. 147: 60 (1991) 中所揭示之方法製備三特異性抗體。
本文還包括具有三個或更多個抗原結合位點之工程化抗體，包括「章魚抗體」(Octopus antibodies) (參見例如 US 2006/0025576A1)。
本文的抗體或片段亦包括「雙重動作 FAb」或「DAF」，其包含與 Tie2 以及另一不同抗原結合的抗原結合位點 (例如，參閱 US 2008/0069820)。
7. 抗體變異體
在某些態樣中，考慮到本文提供之抗體的胺基酸序列變異體。例如，可能希望改善抗體的結合親和力及/或其他生物學特性。可藉由將適當的修飾引入編碼抗體的核苷酸序列中，或藉由肽合成來製備抗體之胺基酸序列變異體。此等修飾包括例如抗體之胺基酸序列中的殘基的缺失及/或***及/或取代。可實施缺失、***和取代之任意組合以得到最終構建體，前提條件是最終構建體具有所需之特徵，例如抗原結合特徵。
a ） 取代、***和刪除變異體
在某些態樣中，提供了具有一個或多個胺基酸取代的抗體變異體。取代誘變的目標位點包括 HVR 和 FR。保守取代列於表 1 之「較佳取代」標題下。表 1 中之「示例性取代」標題下提供了更多實質性變更，並且下文將參考胺基酸側鏈類別進行進一步描述。可將胺基酸取代引入目標抗體中，並篩選具有所需活性之產物，例如，保留/改善的抗原結合特徵、降低的免疫原性或改善的 ADCC 或 CDC。
表 1
原始 殘基 例示性 取代 較佳 取代
Ala (A) Val；Leu；Ile Val
Arg (R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn (N) Gln；His；Asp；Lys；Arg Gln
Asp (D) Glu；Asn Glu
Cys (C) Ser；Ala Ser
Gln (Q) Asn；Glu Asn
Glu (E) Asp；Gln Asp
Gly (G) Ala Ala
His (H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile (I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；正白胺酸 Leu
Leu (L) 正白胺酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys (K) Arg；Gln；Asn Arg
Met (M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe (F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro (P) Ala Ala
Ser (S) Thr Thr
Thr (T) Val；Ser Ser
Trp (W) Tyr；Phe Tyr
Tyr (Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val (V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正白胺酸 Leu
胺基酸可根據常見的側鏈特性進行分組： (1) 疏水性：正白胺酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile； (2) 中性親水性：Cys，Ser，Thr，Asn，Gln； (3) 酸性：Asp，Glu； (4) 鹼性：His，Lys，Arg; (5) 影響鏈取向之殘基：Gly，Pro； (6) 芳香族：Trp，Tyr，Phe。
非保守性替換需要將這些類別中之一類的成員交換為另一類的成員。
一種類型的取代變異體涉及取代一個或多個親代抗體 (例如，人源化或人抗體) 之高變區殘基。通常，選擇用於進一步研究之所得變異體將相對於親代抗體在某些生物學特性 (例如提高親和力、降低免疫原性) 上具有修飾 (例如，改善) 及/或基本上保留親代抗體之某些生物學特性。例示性取代變異體是親和力成熟的抗體，其可以方便地產生，例如，使用基於噬菌體展示的親和力成熟技術，例如本文所述的那些。簡言之，一個或多個 HVR 殘基發生突變，並且變異抗體在噬菌體上展示並篩選出特定的生物活性 (例如，結合親和力)。
可以在 CDR 中進行更改 (例如，取代)，以改善抗體親和力。此等修改可以在 CDR 「熱點」中進行，即由密碼子編碼的殘基在體細胞成熟過程中經歷發生高頻突變 (參閱，例如，Chowdhury,Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)) 及/或與抗原接觸的殘基，並測試所得變異體 VH 或 VL 之結合親和力。透過構建並從二級文庫中重新選擇以實現親和力成熟，例如 Hoogenboom 等人在Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien 等人主編，Human Press，Totowa，NJ，(2001)) 中所述。在親和力成熟的一些實施方案中，透過多種方法（例如，易錯 PCR、鏈改組或寡核苷酸定向誘變）中的任一種將多樣性引入選擇用於成熟的變異基因中。然後創建第二庫。然後篩選該庫，以識別具有所需之親和力的任何抗體變異體。引入多樣性的另一種方法是 CDR 定向方法，其中將若干 CDR 殘基 (例如，每次 4-6 個殘基) 隨機化。可藉由例如丙胺酸掃描誘變或建模以特異性識別參與抗原結合的 CDR 殘基。特別地，CDR-H3 和 CDR-L3 經常成為靶點。
在某些方面，在一個或多個 CDR 內可能發生取代、***或缺失，只要此等修改不顯著降低抗體以結合抗原的能力即可。例如，可在 CDR 中進行實質上不降低結合親和力的保守性改變 (例如，本文所提供之保守性取代)。例如，此等修改可能在 CDR 中之抗原接觸殘基之外。在上文提供之變異體 VH 和 VL 序列的某些實施例中，每個 CDR 均未改變，或包含不超過一個、兩個或三個胺基酸取代。
如 Cunningham 與 Wells (1989)Science , 244:1081-1085 所揭示，用於識別可能誘變的抗體殘基或區域的一種有用的方法稱為「丙胺酸掃描誘變」。可替代地或另外地，可使用抗原-抗體複合物之晶體結構來識別抗體與抗原之間的接觸點。此等接觸殘基和鄰近殘基可靶向或消除為取代的候選物。可篩選變異體以確定它們是否包含所需之特性。
胺基酸序列***包括胺基及/或羧基末端融合體之長度，從一個殘基到包含一百個或更多殘基之多肽，以及單個或多個胺基酸殘基的序列內***。末端***的實例包括具有 N 端甲硫胺醯基殘基的抗體。抗體分子之其他***變異體包括與抗體的 N 端或 C 端融合的酶 (例如，對於 ADEPT) 或提高抗體血清半衰期之多肽。
b ） 醣基化變異體
在某些實施例中，改變本文提供的抗體以增加或減少抗體發生糖基化之程度。抗體中添加或刪除醣基化位點可透過改變胺基酸序列以使得產生或去除一個或多個醣基化位點而方便地實現。
當抗體包含 Fc 區域時，可改變與其相連的碳水化合物。哺乳動物細胞產生的天然抗體通常包含支化的雙天線型寡糖，其通常透過 N 鍵連接至 Fc 區域 CH2 域之 Asn297。參見例如 Wright 等人TIBTECH 15:26-32 (1997)。寡糖可包括各種碳水化合物，例如甘露糖、N-乙醯基葡糖胺 (GlcNAc)、半乳糖和唾液酸以及在雙天線型寡糖結構之「莖」中連接至 GlcNAc 的岩藻糖。在一些實施例中，可對本發明之抗體中的寡糖進行修飾，以產生具有某些改善之特性的抗體變異體。
在一個態樣中，提供了具有缺少 (直接或間接地) 連接至 Fc 區域的岩藻糖的碳水化合物結構之抗體變異體。例如，此等抗體中的岩藻糖含量可為 1% 至 80%、1% 至 65%、5% 至 65% 或 20% 至 40%。 藉由計算 Asn297 糖鏈中岩藻糖的平均含量來測定岩藻糖相對於藉由 MALDI-TOF 質譜測得的連接至 Asn 297 的所有糖結構 (例如複雜型、雜合型和高甘露糖型) 的總和之含量，例如 WO 2008/077546 中所述。Asn297 係指位於 Fc 區域位置 297 附近之天冬醯胺殘基 (Fc 區域殘基的 EU 編號)；但是，Asn297 也可以位於位置 297 上游或下游大約 ±3 個胺基酸處，即由於抗體之微小序列變化而介於位置 294 和 300 之間。此類岩藻糖基化變異體可具有改善的 ADCC 功能。參見例如美國專利公開號 US 2003/0157108 (Presta, L.)；US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd)。與「去岩藻糖基化」或「岩藻糖缺乏」抗體變異體相關的出版物示例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki 等人， J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004)；Yamane-Ohnuki 等人， Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)。能夠產生去岩藻糖基化抗體之細胞株的實例包括缺乏蛋白質岩藻糖基化之 Lec13 CHO 細胞 (Ripka 等人，Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)；美國專利申請號 US 2003/0157108 A1，Presta, L；及 WO 2004/056312 A1，Adams等人 ，尤其是在實例 11 中)；和敲除細胞株，諸如敲除 α-1,6-岩藻糖基轉移酶基因FUT8 的 CHO 細胞 (參見例如 Yamane-Ohnuki 等人，Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)；Kanda, Y. 等人，Biotechnol. Bioeng ，94(4):680-688 (2006)；及 WO2003/085107)。
進一步提供了具有二等分之寡糖的抗體變異體，例如，其中連接至抗體之 Fc 區域的雙天線型寡糖被 GlcNAc 平分。此等抗體變異體可具有減少的岩藻糖基化及/或改善的 ADCC 功能。此等抗體變異體的實例描述於例如：WO 2003/011878 (Jean-Mairet 等人)；美國第 6,602,684 號專利 (Umana 等人)；及 US 2005/0123546 (Umana等人 )。還提供了在寡糖上具有至少一個連接至 Fc 區域之半乳糖殘基的抗體變異體。此等抗體變異體可具有改善的 CDC 功能。此等抗體變異體描述於例如 WO 1997/30087 (Patel 等人)、WO 1998/58964 (Raju, S.) 及 WO 1999/22764 (Raju, S.) 中。
c ） Fc 區域變異體
在某些方面，可在本文所提供之抗體的 Fc 區域中引入一個或多個胺基酸修飾，從而產生 Fc 區域變異體。Fc 區域變異體可包含人 Fc 區域序列 (例如 ，人 IgG1、IgG2、IgG3 或 IgG4 Fc 區域)，其在一個或多個胺基酸位置包含胺基酸修飾 (例如 ，取代)。
在某些態樣中，本發明考慮了一种具有一部分但非全部效應子功能的抗體變異體，使其成為以下應用中所需之候選抗體：其中抗體體內半衰期很重要，但某些效應子功能 (例如補體和 ADCC) 是不必要或有害的。可實施體外 及/或體內 細胞毒性測定，以確認 CDC 及/或 ADCC 活性之下降/耗竭。例如，可實施 Fc 受體 (FcR) 結合測定，以確保抗體缺乏 FcγR 結合 (因此可能缺乏 ADCC 活性)，但保留 FcRn 結合能力。介導 ADCC 之原代細胞 NK 細胞僅表現 Fc(RIII，而單核細胞則表現 Fc(RI、Fc(RII 及 Fc(RIII。FcR 在造血細胞上之表現匯總於 Ravetch 和 Kinet 的論文 (Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)) 之第 464 頁的表 3 中。用於評估目標分子之 ADCC 活性的體外 測定方法的非限制性實例描述於美國專利號 5,500,362 中 (參見例如 Hellstrom, I. 等人，Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)) 和 Hellstrom, I 等人，Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985)；5,821,337 (參見 Bruggemann, M. 等人，J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987))。可替代地，可采用非放射性測定方法 (參見例如：用於流式細胞術的 ACTI™ 非放射性細胞毒性測定 (CellTechnology，Inc. Mountain View，CA)；及 CytoTox 96® 非放射性細胞毒性測定 (Promega，Madison，WI))。用於此等測定的有用的效應細胞包括外周血單核細胞 (PBMC) 及自然殺手 (NK) 細胞。可替代地或另外地 ，可在例如 Clynes等人 在Proc. Natl Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998) 中揭示的動物模型中在體內評估目標分子之 ADCC 活性。還可實施 C1q 結合測定以確認該抗體無法結合 C1q 並因此缺乏 CDC 活性。參見例如 WO 2006/029879 及 WO 2005/100402 中的 C1q 和 C3c 結合 ELISA。為評估補體活化，可實施 CDC 測定 (參見例如：Gazzano-Santoro等人 ，J. Immunol. Methods 202:163 (1996)；Cragg, M.S. 等人，Blood 101:1045-1052 (2003)；及 Cragg, M.S. 和 M.J. Glennie，Blood 103:2738-2743 (2004))。FcRn 結合及體內清除率/半衰期測定也可使用本領域中已知的方法進行 (參閱，例如，Petkova, S.B. 等人，Int’l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006))。
效應子功能下降的抗體包括一個或多個 Fc 區域殘基 238、265、269、270、297、327 和 329 被取代之抗體 (美國第 6,737,056 號專利)。此等 Fc 變異體包括在胺基酸位置 265、269、270、297 和 327 中的兩個或更多個取代的 Fc 變異體，包括所謂的「DANA」 Fc 變異體，其中殘基 265 和 297 被丙胺酸取代 (美國專利號 7,332,581)。
其中描述了某些與 FcR 的結合能力得到改善或減弱的抗體變異體。(參閱，例如，美國專利第 6,737,056 號；WO 2004/056312 及 Shields 等人，J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)。)
在某些態樣中，抗體變異體包含具有一個或多個胺基酸取代的 Fc 區域，這些取代改善了 ADCC，例如 Fc 區域的位置 298、333 及/或 334 (殘基的 EU 編號) 處之取代。
在某些方面，在 Fc 區域中進行修改，得到修改 (即 改善或減少) 之 C1q 結合及/或補體依賴性細胞毒性 (CDC)，例如美國專利號 6,194,551、WO 99/51642 及 Idusogie 等人，J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000) 所述。
具有更長半衰期並改善了與新生兒 Fc 受體 (FcRn) (其負責將母體 IgG 轉移給胎兒，見 Guyer 等人，J. Immunol. 117:587 (1976) 和 Kim 等人，J. Immunol. 24:249 (1994)) 之結合的抗體描述於 US2005/0014934A1 (Hinton 等人) 中。那些抗體包含其中具有一個或多個取代之 Fc 區域，其改善了 Fc 區域與 FcRn 之結合。此等 Fc 變異體包括在一個或多個 Fc 區域殘基上發生取代之 Fc 變體：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424 或 434，例如，Fc 區域殘基 434 的置換（美國專利號 7,371,826）。
另參見 Duncan & Winter,Nature 322:738-40 (1988)；美國專利號 5,648,260；美國專利號 5,624,821；及 WO 94/29351 涉及 Fc 區域變異體的其他實例。
d ） 半胱胺酸工程化抗體變異體
在某些態樣中，可能希望創建胱胺酸工程化抗體，例如「thioMAb」，其中抗體之一個或多個殘基被半胱胺酸殘基取代。在特定態樣中，取代殘基出現在抗體之可進入的位點。透過用半胱胺酸取代那些殘基，反應性硫醇基團由此被定位在抗體之可進入的位點，並可用於使抗體與其他部分 (例如藥物部分或連接子-藥物部分) 綴合，以形成免疫共軛物，如本文進一步所述。在某些態樣中，以下任何一個或多個殘基可被半胱胺酸取代：輕鏈的 V205 (EU 編號)；重鏈的 A118 (EU 編號)；及重鏈 Fc 區域的 S400 (EU 編號)。半胱胺酸工程化抗體可按照例如美國第 7,521,541 號專利所述之方法產生。
e ） 抗體衍生物
在某些態樣中，可進一步修飾本文所提供之抗體，以使其包含本技術領域中已知且容易獲得的附加的非蛋白質部分。適用於抗體之衍生化的部分包括但不限於水溶性聚合物。水溶性聚合物之非限制性實例包括但不限於聚乙二醇 (PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、葡聚醣、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚-1,3-二氧戊環、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/馬來酸酐共聚物、聚胺基酸 (均聚物或無規共聚物) 以及右旋糖酐或聚(N-乙烯吡咯啶酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、環氧丙烷/環氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇 (例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛由於其水中之穩定性而可能在製造中具有優勢。該聚合物可具有任何分子量，並且可以為支鏈聚合物或非支鏈聚合物。連接至抗體的聚合物之數量可以變化，並且如果連接的聚合物超過一種，則它們可以為相同或不同之分子。通常，用於衍生化的聚合物之數量及/或類型可基於以下考慮因素來確定，這些考慮因素包括但不限於待改善之抗體的特定性質或功能、抗體衍生物是否將用於指定條件下的治療中等。
在另一態樣中，提供了可透過曝露於輻射而選擇性加熱之抗體和非蛋白質部分的共軛物。在一個態樣中，非蛋白質部分為奈米碳管 (Kam 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605，2005)。輻射可具有任何波長，並且包括但不限於不損害普通細胞但是將非蛋白質部分加熱至接近抗體-非蛋白質部分的細胞被殺死之溫度的波長。
B. 重組方法和組成物
可使用重組方法和組成物來生產抗體，例如 US 4,816,567 中所述。在一個實施例中，提供編碼如本文中抗 Tie2 抗體之經分離之核酸。此等核酸編碼包含 VL 之胺基酸序列及/或包含抗體之 VH 之胺基酸序列 (例如，抗體之輕鏈及/或重鏈)。在一進一步實施例中，提供一個或多個包含此核酸之載體 (例如，表現載體)。在一進一步實施例中，提供包含此核酸之宿主細胞。在此實施例中，宿主細胞包含 (例如，已轉化)：(1) 包含核酸之載體編碼包含抗體之 VL 之胺基酸序列及包含抗體之 VH 之胺基酸序列，或 (2) 包含核酸之第一載體編碼包含抗體之 VL 之胺基酸序列及包含核酸之第二載體編碼包含抗體之 VH 之胺基酸序列。在一個實施例中，宿主細胞為真核細胞，例如中華倉鼠卵巢 (CHO) 細胞或淋巴樣細胞 (例如，Y0、NS0、Sp20 細胞)。在一個方面，提供了一種製備抗 Tie2 抗體之方法，其中該方法包括在適合於抗體表現的條件下培養包含如上所述之編碼抗體的核酸的宿主細胞，並視情況從宿主細胞 (或宿主細胞培養基) 中回收該抗體。
在重組生產抗 Tie2 抗體時，將例如上述之編碼抗體之核酸分離並***一種或多種載體中，以在宿主細胞中進一步選殖及/或表現。此等核酸可藉由常規方法 (例如，使用能夠與編碼抗體重鏈和輕鏈的基因特異性結合的寡核苷酸探針) 輕易地分離並定序。
適用於選殖或表現編碼抗體之載體的宿主細胞包括本文所述之原核或真核細胞。例如，抗體可能在細菌中產生，特別是在無需醣基化和 Fc 效用功能的情況下。有關抗體片段和多肽在細菌中之表現，參見例如美國第 5,648,237、5,789,199 和 5,840,523 號專利。(另見 Charlton，Methods in Molecular Biology ，第 248 卷 (B.K.C. Lo 主編，Humana Press，Totowa，NJ，2003)，第 245-254 頁，其中描述了抗體片段在大腸桿菌 中之表現。)在表現後，抗體可與細菌細胞糊中的可溶性部分分離， 並可經過進一步純化。
除原核生物以外，真核微生物 (如絲狀真菌或酵母菌) 也為合適的抗體編碼載體的選殖或表現宿主，包括其醣基化途徑已被「人源化」的真菌和酵母菌株，從而導致具有部分或完全人糖基化模式的多肽的產生。參見：Gerngross，Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004)；及 Li 等人，Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)。
用於表現糖基化抗體的合適的宿主細胞也來源於多細胞生物 (無脊椎動物和脊椎動物)。無脊椎動物細胞之實例包括植物和昆蟲細胞。已鑑定出許多桿狀病毒株，它們可以與昆蟲細胞結合使用，特別是用於轉染草地貪夜蛾 (Spodoptera frugiperda ) 細胞。
植物細胞培養物也可以用作宿主。參見 例如美國專利號 5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978 及 6,417,429 (描述了在基因轉殖植物中生產抗體的 PLANTIBODIESTM 技術)。
脊椎動物細胞也可用作宿主。例如，可使用適於在懸浮液中生長的哺乳動物細胞係。可用哺乳動物宿主細胞株的其他實例包括：由 SV40 (COS-7) 轉化的猴腎 CV1 系；人胚胎腎系 (例如，Graham 等人，J. Gen Virol. 36:59 (1977) 中所述之 293 或 293 細胞)；幼倉鼠腎細胞 (BHK)；小鼠睾丸支持細胞 (例如，Mather,Biol. Reprod. 23:243-251 (1980) {tc "Mather, Biol. Reprod. 23\\:243-251 (1980) " \f D} 中所述之 TM4 細胞)；猴腎細胞 (CV1)；非洲綠猴腎細胞 (VERO-76)；人子宮頸癌細胞 (HELA)；犬腎細胞 (MDCK)；Buffalo 大鼠肝細胞 (BRL 3A)；人肺細胞 (W138)；人肝細胞 (Hep G2)；小鼠乳腺腫瘤 (MMT 060562)；TRI 細胞 (例如，Mather 等人，Annals N.Y.Acad. Sci . 383:44-68 (1982) 所述)；MRC 5 細胞；及 FS4 細胞。其他可用的哺乳動物宿主細胞系包括中華倉鼠卵巢 (CHO) 細胞，包括 DHFR- CHO 細胞 (Urlaub 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980))；及骨髓瘤細胞系，例如 Y0、NS0 和 Sp2/0。有關某些適用於抗體生產的哺乳動物宿主細胞系的綜述，參見例如：Yazaki 和 Wu，Methods in Molecular Biology ，第 248 卷 (B.K.C. Lo 主編，Humana Press，Totowa, NJ)，第 255-268 頁 (2003)。
C. 測定
可採用此領域中所習知的各種測定法對本文所提供之抗 Tie2 抗體的物理/化學性質及/或生物活性進行鑑別、篩選或表徵。
1. 結合測定及其他測定
於一個態樣中，藉由已知方法例如 ELISA、BIACore® 、FACS 或西方墨點法測試本發明之抗體的抗原結合活性。
於另一態樣中，可使用競爭測定來鑑定與抗 Tie2 抗體競爭之抗體，該抗 Tie2 抗體 (本文中指代為 Tie2.1M100cF) 包含用於與 Tie2 結合之 VH 及 VL，該 VH 包含 SEQ ID NO: 20 之序列，而該 VL 包含 SEQ ID NO: 21 之序列。於某些實施例中，此競爭性抗體與為抗 Tie2 抗體所結合之同一表位 (例如，線性或構形表位) 結合，該抗 Tie2 抗體包含 VH 及 VL，該 VH 包含 SEQ ID NO: 20 之序列，而該 VL 包含 SEQ ID NO: 21 之序列。用於將抗原決定基映射至抗體結合的詳細例示性方法提供於 Morris (1996) 「Epitope Mapping Protocols」 (在Methods in Molecular Biology 第 66 卷 (Humana Press, Totowa, NJ) 中)。
在一種示例性競爭測定中，將固定化 Tie2 置於包含與 Tie2 結合之第一標記抗體 (例如，Tie2.1M100cF) 及第二無標記抗體(正在測試其與第一抗體競爭與 Tie2 結合的能力) 的溶液中孵化。第二抗體可存在於雜交瘤上澄液中。作為對照，將固定化 Tie2 置於包含第一標記抗體但不包含第二未標記抗體的溶液中進行孵育。在允許第一抗體與 Tie2 結合的條件下孵化後，去除多餘的未結合抗體，並測量與固定化 Tie2 相關聯之標記物的量。如果試驗樣品中與固定化 Tie2 相關的標記物的數量相對於對照樣品而言明顯減少，則表明第二抗體正在與第一抗體競爭與 Tie2 的結合。參見 Harlow 和 Lane (1988)Antibodies:A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)。
2. 活性測定
於一個態樣中，提供鑑定以辨認具有所欲生物活性之其抗 Tie2 抗體的測定法。生物活性可能包括，例如，於體內、體外或擬體內，與 Tie2 或其片段結合、與 Ang1 及/或 Ang2 競爭與 Tie2 之結合、激活 Tie2 蛋白質之磷酸化、激活 Akt 之磷酸化、及/或減低血管內皮細胞滲透性。亦提供於體內及/或體外具有此等生物活性之抗體。於某些實施例中，測試本發明之抗體的此生物活性。
於一些實施例中，提供用於測定 Tie2 激活 (抗 Tie2 共軛物) 活性之測定法，諸如藉由磷-AKT (pAKT) 測定法，其中，藉由 Tie2 共軛物激活 AKT 磷酸化指示該共軛物具有激活 (促效劑) 活性。如通常技術人士已知者以及如下文實例 3 中所揭示，AKT 之激活可藉由各種方法予以證明，包括例如使用對經磷酸化之 AKT 為特異性之抗體進行對經磷酸化之 AKT 的西方墨點偵檢或藉由 FRET 測定法。
於一些實施例中，提供用於測定抗 Tie2 抗體或抗體共軛物、融合蛋白或其聚合性調配物之安定性 (例如，熱安定性) 的測定法。例如，抗體或抗體共軛物、融合蛋白或其聚合性調配物之安定性可使用本領域中已知之任意方法測定，例如，微差掃描螢光測定 (DSF)、圓二色譜 (CD)、蛋白質內源螢光、微差掃描熱量法、光譜法、光散射 (例如，動態光散射 (DLS) 及靜態光散射 (SLS))、自交互作用層析術 (SIC)。
於一些實施例中，提供用於測定抗 Tie2 共軛物之安定性的測定法。測定之安定性可如本文所揭示者測定，例如，使用毛細管電泳雷射誘導型螢光 (CE-LIF)，如例如實例 13 中所揭示者進行。
D. 免疫共軛物
本發明亦提供包含如本文所述之抗 Tie2 抗體的免疫共軛物，其共軛 (化學鍵合) 至一種或多種治療劑，例如細胞毒性劑、化學治療劑、藥物、生長抑制劑、毒素 (例如，來源於細菌、真菌、植物或動物之蛋白毒素、酶活性毒素或其片段) 或放射性同位素。
E. 共軛物
本發明亦提供共軛物，其包含與一種或多種異源分子諸如多元醇共軛的本文所提供之任意抗 Tie2 抗體或其 Tie2 共軛片段。
1. 多臂聚合物
於一些實施例中，本揭露之共軛物可藉由下述者作成：藉由將抗 Tie2 Fab 或其變異體與多臂聚合物共軛而將本文所揭示之抗 Tie2 抗體衍生化。應知悉，提供具有所欲尺寸或所選平均分子量之本文所揭共軛物的任意多臂聚合物為適用於在構造本發明之抗體-聚合物共軛物中使用。
多種聚合物適用於醫藥中。參閱，例如，Davis 等人，Biomedical Polymers: Polymeric Materials and Pharmaceuticals for Biomedical Use, pp. 441-451 (1980)。於本揭露之一些實施例中，使用非蛋白質性聚合物來形成本揭露之共軛物。該非蛋白質性聚合物通常為親水性合成聚合物，亦即，自然界中尚未發現之聚合物。惟，自然界中存在以及藉由重組或體外方法製造之聚合物亦可能是可用的，從天然來源分離之聚合物亦可能是可用的。
於一些實施例中，藉由將 Fab 或其變異體與多臂多元醇共軛 (例如，共價連接) 而將抗 Tie2 Fab 衍生化。因此，於一些實施例中，本揭露針對包含與一種或多種多臂多元醇 (較佳六臂多元醇) 共價連接之本文所揭露之一種或多種抗 Tie2 Fab 或其變異體的共軛物。所採用之多元醇可以為任何水溶性聚(環氧烷)聚合物，並且可具有線性鏈或分支鏈。合適之多元醇包括彼等於一個或多個羥基位置經化學基團諸如具有介於一個與四個之間之碳的烷基取代者。典型地，該多元醇為聚(烷二醇)，諸如聚乙二醇 (PEG)，因此，為了易於描述，檢討之剩餘部分為關於一種示例性實施例，其中所採用之多元醇為 PEG，並且將該多元醇與多肽共軛之制程稱為「PEG 化」。惟，彼等熟悉本領域者可知，其他多元醇類諸如聚丙二醇及聚乙二醇-聚丙二醇共聚體，可使用類似於本文針對 PEG 描述之彼等的用於共軛之技術採用之。
用來形成本揭露之共軛物的多元醇為多臂多元醇。如本文所用，「多臂多元醇」指代包含核心結構之多元醇，並且至少兩個臂附接至該核心結構。該多臂多元醇可為，例如，二聚體 (兩個臂)、四聚體 (四個臂)、六聚體 (六個臂)、八聚體 (八個臂) 等。於一些態樣中，該多臂多元醇為多臂 PEG。
於抗 Tie2 抗體或抗體變異體之 PEG 化中使用的多臂 PEG 之重量平均分子量可變，並且典型可為約 500 至約 300,000 道爾頓 (D) 之範圍。於一些實施例中，該多臂 PEG 之重量平均分子量為約 1,000 至約 100,000 D、約 1,000 至約 40,000 D、約 1,000 至約 20,000 D、約 1,000 至約 10,000 D、約 10,000 至約 20,000 D、約 5,000 至約 10,000 D 或約 1,000 至 5,000 D。於較佳實施例中，使用重量平均分子量為約 6,000 D 之多臂 PEG 進行 PEG 化。
多種用於蛋白質 PEG 化之方法為本領域中已知者。製造與 PEG 共軛之蛋白質的具體方法包括美國專利第 4,179,337 號、美國專利第 4,935,465 號及美國專利第 5,849,535 號中所揭示之方法，該等美國專利全部藉由引用而以其整體併入本文。典型地，該蛋白質經由該蛋白質之胺基酸殘基中的一者或多者與該聚合物上之末端反應性基團共價鍵合。本文中，具有該 (等) 反應性基團之聚合物涉及為經激活或官能化之聚合物 (例如，經官能化之 PEG)。該反應性基團選擇性地與該抗體或抗體變異體上之游離硫醇基或胺基或其他反應性基團反應。該多臂 PEG 聚合物可以隨機或位點特異性方式與該抗體或抗體變異體上之硫醇基或胺基或其他反應性基團偶合。惟，應理解，為了獲得最優結果，所選擇之反應性基團的類型及量以及所採用之聚合物的類型及量將取決於所採用之特定抗體或抗體變異體，以限制並較佳基本上阻止該反應性基團與該抗體上太多的活性基團反應。由於在一些情況下或許不可能充分限制或阻止這一點，對於每莫耳之抗體，典型可採用約 0.05 至約 1000 莫耳或在一些實施例中約 0.05 至約 200 莫耳的經官能化之聚合物，取決於抗體濃度。對於每莫耳抗體，經官能化之聚合物的最終量為下述者之評估：維持最優活性，同時優化 (若可能) 該抗體於玻璃樣液、視網膜及/或眼房液中之半衰期。
儘管殘基可以為該抗體或抗體變異體上之任意胺基酸，諸如 N 末端胺基酸基團，但於一些實施例中，該反應性基團為半胱胺酸，其透過其游離硫醇基團與經官能化之聚合物的反應性基團連接，例如，如 WO 99/03887、WO 94/12219、WO 94/22466、美國專利第 5,206,344 號、美國專利第 5,166,322 號及美國專利第 5,206,344 號中所示，該等專利全部藉由引用而以其整體併入本文。於此類實施例中，該聚合可包含能夠與親本抗體上之硫醇基或硫醇基團特異性反應的至少一個末端反應性基團。此類基團包括但不限於，馬來醯亞胺、硫醇基、硫醇、三氟甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、吖[口+元]、環氧化物、吡啶基二硫化物、琥珀醯亞胺基酯、-NH2 、醛、鹵代乙酸酯、鹵代乙醯胺及對硝基苯基碳酸酯等。該聚合物可使用適用於所選偶合系統化學特性之任意方案與親本抗體偶合，諸如美國專利第 4,179,337 號、美國專利第 7,122,636 號及 Jevsevar, 等人，Biotech J., Vol. 5, pp. 113-128 (2010) 中所揭示之方案及系統。可替代地，該反應性胺基酸可以為離胺酸，其透過其游離 ε-胺基基團 (參閱，例如，藉由引用併入本文之 WO 93/00109) 與經官能化之聚合物的反應性基團連接；或麩胺酸或天冬胺酸，其透過醯胺鍵與聚合物連接。然後，該聚合物之反應性基團可與例如蛋白質之 α (alpha) 及 ε (epsilon) 胺或硫醇基基團反應以形成共價鍵。應知悉，本揭露並不限於在抗體或抗體片段與聚合物之間使用特定類型之連接的共軛物。
適用於製備本揭露之共軛物的經官能化之多臂 PEG 可藉由大量傳統反應製造。例如，PEG 之 N-羥基琥珀醯亞胺酯 (M-NHS-PEG) 可從 PEG-單甲醚藉由與 N,N'-二環己基碳二亞胺 (DCC) 及 N-羥基琥珀醯亞胺 (NHS) 反應而製備，根據 Buckmann 與 Merr, Makromol.Chem., Vol. 182, pp. 1379-1384 (1981) 之方法進行。此外，PEG 末端羥基基團可轉化為與胺基基團，例如，藉由與硫醯溴反應以形成 PEG-Br，之後藉由使用過量之氨進行胺解以形成 PEG-NH2 。然後，可使用標準偶合試劑諸如 Woodward 氏試劑 K 將 PEG-NH2 與感興趣之抗體或抗體變異體共軛。再者，可例如藉由使用 MnO2 進行氧化而將 PEG 末端 CH2 OH 基團轉化為醛基團。可藉由使用試劑諸如氰基硼氫化物進行還原性烷基化而將該醛基團與抗體或抗體變異體共軛。
於一些實施例中，用來製備本揭露之共軛物的多臂 PEG 具有通式 (I) 之結構：
Figure 02_image009
其中，該 PEG 為相同或不同之 –(CH2 CH2 O)m-，其中，每一 m 表示該多元醇 (PEG) 之特定臂的長度或尺寸並且獨立地為約 45 至約 1000、約 3 至約 250、或約 50 至約 200、或約 100 至約 150 的整數；並且l 為 ≥ 2 之整數，較佳為 2 或 3。
於一些實施例中，該多臂 PEG 具有通式 (I) 之結構，其中，l 為 2，以及，該多臂 PEG 為六聚體。於另一實施例中，該多臂 PEG 具有通式 (I) 之結構，其中，l 為 3，以及，該多臂 PEG 為八聚體。
可使用上揭之任意技術將具有通式 (I) 之結構的多臂 PEG 官能化以產生經官能化之多臂 PEG，以例如附接適用於與抗體 (例如，抗體片段) 反應或共軛之末端反應性基團。惟，於其他實施例中，該多臂 PEG 可透過多官能交聯劑與抗 Tie2 抗體共價連接，該交聯劑與待交聯之該 PEG 以及該抗體或抗體變異體之一個或多個胺基酸殘基反應，如例如美國專利第 7,122,636 號中所揭示，該專利藉由引用而以其整體併入本文。
於其他態樣中，用來製備本揭露之共軛物的多臂 PEG 為包含至少一個末端反應性基團的經官能化之多臂 PEG。該末端反應性基團可直接與抗 Tie2 抗體共軛以形成本揭露之共軛物。於一些實施例中，該經官能化之多臂 PEG 具有通式 (Ia) 之結構：
Figure 02_image001
其中，每一 m 表示該多元醇 (PEG) 之特定臂的長度或尺寸並且獨立為約 45 至約 1000、約 3 至約 250、或約 50 至約 200、或約 20 至 30、或約 100 至約 150 的整數；以及，n 為約 1 至約 10 的整數；每一 R1 獨立地或不存在或為連接基團；以及，每一 R2 獨立地或為氫或為末端反應性基團；其中，至少一個 R2 為末端反應性基團。於一些實施例中，R2 獨立地選自硫醇反應性基團、胺基反應性基團及其組合。
於一些實施例中，該經官能化之多臂 PEG 具有通式 (Ia) 之結構，其中，n 為 2 至 3 之整數。於較佳實施例中，該經官能化之多臂 PEG 具有通式 (Ia) 之結構，其中，n 為 2，以及，該多臂 PEG 為六聚體。於另一實施例中，該經官能化之多臂 PEG 具有通式 (Ia) 之結構，其中，n 為 3，以及，該多臂 PEG 為八聚體。於較佳實施例中，該經官能化之多臂 PEG 具有通式 (Ia) 之結構，其中，n 為 2，如第 39 圖中所示。
於另一實施例中，用來製備本揭露之共軛物的多臂 PEG 具有通式 (II) 之結構：
Figure 02_image012
其中，每一 m 表示該多元醇 (PEG) 之特定臂的長度或尺寸並且獨立地為約 45 至約 1000、約 3 至約 250、或約 50 至約 200、或約 100 至約 150 的整數；並且 n 為約 1 至約 10 之整數。
於一些實施例中，該多臂 PEG 具有通式 (II) 之結構，其中，n 為 2，以及，該多臂 PEG 為四聚體。於另一實施例中，該多臂 PEG 具有通式 (II) 之結構，其中，n 為 4，以及，該多臂 PEG 為六聚體。於另一實施例中，該多臂 PEG 具有通式 (II) 之結構，其中，n 為 6，以及，該多臂 PEG 為八聚體。
於另一實施例中，用來製備本揭露之共軛物的多臂 PEG 具有通式 (III) 之結構：
Figure 02_image014
其中，每一 m 表示該多元醇 (PEG) 之特定臂的長度或尺寸並且獨立地為約 45 至約 1000、約 3 至約 250、或約 50 至約 200、或約 100 至約 150 的整數；並且 n 為約 1 至約 10 之整數。
於一些實施例中，該多臂 PEG 具有通式 (III) 之結構，其中，n 為 2，以及，該多臂 PEG 為四聚體。於另一實施例中，該多臂 PEG 具有通式 (III) 之結構，其中，n 為 4，以及，該多臂 PEG 為六聚體。於另一實施例中，該多臂 PEG 具有通式 (III) 之結構，其中，n 為 6，以及，該多臂 PEG 為八聚體。
於另一實施例中，用來製備本揭露之共軛物的多臂 PEG 具有通式 (IV) 之結構：
Figure 02_image016
(IV)
其中，每一 m 表示該多元醇 (PEG) 之特定臂的長度或尺寸並且獨立地為約 45 至約 1000、約 3 至約 250、或約 50 至約 200、或約 100 至約 150 的整數。
可使用上揭之任意技術將具有通式 (I) 至 (IV) 中任一者之結構的多臂 PEG 官能化以產生經官能化之多臂 PEG，以例如附接適用於與抗體 (例如，抗體片段) 反應或共軛之末端反應性基團。惟，於其他實施例中，該多臂 PEG 可透過多官能交聯劑與抗 Tie2 抗體共價連接，該交聯劑與待交聯之該 PEG 以及該抗體或抗體變異體之一個或多個胺基酸殘基反應，如例如美國專利第 7,122,636 號中所揭示，該專利藉由引用而以其整體併入本文。
於其他態樣中，用來製備本揭露之共軛物的多臂 PEG 為包含至少一個末端反應性基團的經官能化之多臂 PEG。該末端反應性基團可直接與抗 Tie2 抗體共軛以形成本揭露之共軛物。於一些實施例中，該經官能化之多臂 PEG 具有通式 (Ia) 之結構：
Figure 02_image001
其中，每一 m 表示該多元醇 (PEG) 之特定臂的長度或尺寸並且獨立為約 45 至約 1000、約 3 至約 250、或約 50 至約 200、或約 100 至約 150 的整數；以及，n 為約 1 至約 10 的整數；每一 R1 獨立地或不存在或為連接基團；以及，每一 R2 獨立地或為氫或為末端反應性基團；其中，至少一個 R2 為末端反應性基團。於一些實施例中，R2 獨立地選自硫醇反應性基團、胺基反應性基團及其組合。
於一些實施例中，該經官能化之多臂 PEG 具有通式 (Ia) 之結構，其中，n 為 1 至 3 之整數。於一些實施例中，該經官能化之多臂 PEG 具有通式 (Ia) 之結構，其中，n 為 1，以及，該多臂 PEG 為四聚體。於另一實施例中，該經官能化之多臂 PEG 具有通式 (Ia) 之結構，其中，n 為 2，以及，該多臂 PEG 為六聚體。於另一實施例中，該經官能化之多臂 PEG 具有通式 (Ia) 之結構，其中，n 為 3，以及，該多臂 PEG 為八聚體。於此類實施例中，該六聚體具有通式 (Ib) 之結構：
Figure 02_image003
(Ib)
其中，m、R1 及 R2 如上文所定義。
具有通式 (Ib) 之結構的多臂 PEG 具有二新戊四醇 (DP) 核心結構，並且本文中亦指代為 DP 六聚體。
於一些實施例中，該經官能化之多臂 PEG 具有通式 (Ib) 或 (Ic) 之結構，其中，每一 R1 當存在時為相同或不同，並且當 R1 與 R2 合併在一起時選自
Figure 02_image020
；
Figure 02_image022
；
Figure 02_image024
；
Figure 02_image026
；
Figure 02_image028
；
Figure 02_image030
；
Figure 02_image032
；
Figure 02_image034
；
Figure 02_image036
；
Figure 02_image005
；
Figure 02_image039
；
Figure 02_image041
；
Figure 02_image043
；
Figure 02_image045
；以及
Figure 02_image047
；及其組合；其中，每一 i 獨立地為 0 至 10 之整數；j 為 0 至 10 之整數；以及 R2 如本文中所定義。於一些實施例中，每一 R1 為連接基團。
於一些實施例中，該經官能化之多臂 PEG 具有通式 (Ib) 或 (Ic) 之結構，其中，當 R1 與 R2 合併在一起時為
Figure 02_image049
，其中，i、j 及 R2 如本文中所定義。於一些實施例中，當 R1 與 R2 合併在一起時為
Figure 02_image049
，其中，i 為 2；j 為 2 或 3，以及，R2 如本文中所定義。
於一些實施例中，該經官能化之多臂 PEG 具有通式 (Ib) 之結構，其中，每一 R2 獨立地選自馬來醯亞胺、硫醇基、硫醇、三氟甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、吖[口+元]、過氧化物、吡啶基二硫化物、琥珀醯亞胺基酯、-NH2 、醛、鹵代乙酸酯、鹵代乙醯胺、及對硝基苯基碳酸酯。於一些實施例中，每一 R2 獨立地為選自溴乙酸酯、碘乙酸酯、氯乙酸酯及其組合之鹵代乙酸酯。於一些實施例中，每一 R2 獨立地為選自溴乙醯胺、碘乙醯胺、氯乙醯胺及其組合之鹵代乙醯胺。於一些實施例中，R2 為馬來醯亞胺。
於一些實施例中，該經官能化之多臂 PEG 具有通式 (Ia) 或 (Ib) 之結構，其中每一 R2 為馬來醯亞胺。於一些實施例中，該經官能化之多臂 PEG 具有通式 (Ia) 或 (Ib) 之結構，其中，當 R1 與 R2 合併在一起時為
Figure 02_image052
，其中，i 及 j 如上文中所定義。於一些實施例中，該經官能化之多臂 PEG 具有通式 (Ia) 或 (Ib) 之結構，其中，當 R1 與 R2 合併在一起時為
Figure 02_image052
，其中，i 為 2 且 j 為 2。
於另一態樣中，用來製備本揭露之共軛物的經官能化之多臂 PEG 具有通式 (IIa) 之結構：
Figure 02_image055
其中，每一 m 表示該多元醇 (PEG) 之特定臂的長度或尺寸並且獨立為約 45 至約 1000、約 3 至約 250、或約 50 至約 200、或約 100 至約 150 的整數；以及，n 為約 1 至約 10 的整數；每一 R1 獨立地或不存在或為連接基團；以及，每一 R2 獨立地或為氫或為末端反應性基團；其中，至少一個 R2 為末端反應性基團。於一些實施例中，R2 獨立地選自硫醇反應性基團、胺基反應性基團及其組合。
於一些實施例中，該經官能化之多臂 PEG 具有通式 (IIa) 之結構，其中，n 為 2 至 6 之整數。於一些實施例中，該經官能化之多臂 PEG 具有通式 (IIa) 之結構，其中，n 為 2，以及，該多臂 PEG 為四聚體。於一些實施例中，該經官能化之多臂 PEG 具有通式 (IIa) 之結構，其中，n 為 3。於另一實施例中，該經官能化之多臂 PEG 具有通式 (IIa) 之結構，其中，n 為 4，以及，該多臂 PEG 為六聚體。於另一實施例中，該經官能化之多臂 PEG 具有通式 (IIa) 之結構，其中，n 為 6，以及，該多臂 PEG 為八聚體。具有通式 (IIa) 之結構的八聚體具有六聚甘油 (HG) 核心結構，並且本文中亦指代為 HG 八聚體。
於一些實施例中，該經官能化之多臂 PEG 具有通式 (IIa) 之結構，其中，每一 R1 當存在時為相同或不同，並且當 R1 與 R2 合併在一起時選自
Figure 02_image020
；
Figure 02_image022
；
Figure 02_image024
；
Figure 02_image026
；
Figure 02_image028
；
Figure 02_image030
；
Figure 02_image032
；
Figure 02_image034
；
Figure 02_image036
；
Figure 02_image005
；
Figure 02_image039
；
Figure 02_image041
；
Figure 02_image043
；
Figure 02_image045
；以及
Figure 02_image047
；及其組合；其中，每一 i 獨立地為 0 至 10 之整數；j 為 0 至 10 之整數；以及 R2 如本文中所定義。於一些實施例中，每一 R1 為連接基團。
於一些實施例中，該經官能化之多臂 PEG 具有通式 (IIa) 之結構，其中，當 R1 與 R2 合併在一起時為
Figure 02_image049
，其中，i、j 及 R2 如本文中所定義。於一些實施例中，當 R1 與 R2 合併在一起時為
Figure 02_image049
，其中，i 為 2；j 為 2 或 3，以及，R2 如本文中所定義。
於一些實施例中，該經官能化之多臂 PEG 具有通式 (IIa) 之結構，其中，每一 R2 獨立地選自馬來醯亞胺、硫醇基、硫醇、三氟甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、吖[口+元]、過氧化物、吡啶基二硫化物、琥珀醯亞胺基酯、-NH2 、醛、鹵代乙酸酯、鹵代乙醯胺、及對硝基苯基碳酸酯。於一些實施例中，每一 R2 獨立地為選自溴乙酸酯、碘乙酸酯、氯乙酸酯及其組合之鹵代乙酸酯。於一些實施例中，每一 R2 獨立地為選自溴乙醯胺、碘乙醯胺、氯乙醯胺及其組合之鹵代乙醯胺。於一些實施例中，R2 為馬來醯亞胺。
於一些實施例中，該經官能化之多臂 PEG 具有通式 (IIa) 之結構，其中每一 R2 為馬來醯亞胺。於一些實施例中，該經官能化之多臂 PEG 具有通式 (IIa) 之結構，其中，當 R1 與 R2 合併在一起時為
Figure 02_image052
，其中，i 及 j 如上文中所定義。於一些實施例中，該經官能化之多臂 PEG 具有通式 (IIa) 之結構，其中，當 R1 與 R2 合併在一起時為
Figure 02_image052
，其中，i 為 2 且 j 為 2。
於另一態樣中，該經官能化之多臂 PEG 具有通式 (IIIa) 之結構：
Figure 02_image071
其中，每一 m 表示該多元醇 (PEG) 之特定臂的長度或尺寸並且獨立為約 45 至約 1000、或約 3 至約 250、或約 50 至約 200、或約 100 至約 150 的整數；以及，n 為約 1 至約 10 的整數；每一 R1 獨立地或不存在或為連接基團；以及，每一 R2 獨立地或為氫或為末端反應性基團；其中，至少一個 R2 為末端反應性基團。於一些實施例中，R2 獨立地選自硫醇反應性基團、胺基反應性基團及其組合。
於一些實施例中，該經官能化之多臂 PEG 具有通式 (IIIa) 之結構，其中，n 為 2 至 6 之整數。於一些實施例中，該經官能化之多臂 PEG 具有通式 (IIIa) 之結構，其中，n 為 2，以及，該多臂 PEG 為四聚體。於另一實施例中，該經官能化之多臂 PEG 具有通式 (IIIa) 之結構，其中，n 為 4，以及，該多臂 PEG 為六聚體。於另一實施例中，該經官能化之多臂 PEG 具有通式 (IIIa) 之結構，其中，n 為 6，以及，該多臂 PEG 為八聚體。具有通式 (IIIa) 之結構的八聚體具有六甘油 (HGEO) 核心結構，並且本文中亦指代為 HGEO 八聚體。
於一些實施例中，該經官能化之多臂 PEG 具有通式 (IIIa) 之結構，其中，每一 R1 當存在時為相同或不同，並且當 R1 與 R2 合併在一起時選自
Figure 02_image020
；
Figure 02_image022
；
Figure 02_image024
；
Figure 02_image026
；
Figure 02_image028
；
Figure 02_image030
；
Figure 02_image032
；
Figure 02_image034
；
Figure 02_image036
；
Figure 02_image005
；
Figure 02_image039
；
Figure 02_image041
；
Figure 02_image043
；
Figure 02_image045
；以及
Figure 02_image047
；及其組合；其中，每一 i 獨立地為 0 至 10 之整數；j 為 0 至 10 之整數；以及 R2 如本文中所定義。於一些實施例中，每一 R1 為連接基團。
於一些實施例中，該經官能化之多臂 PEG 具有通式 (IIIa) 之結構，其中，當 R1 與 R2 合併在一起時為
Figure 02_image049
，其中，i、j 及 R2 如本文中所定義。於一些實施例中，當 R1 與 R2 合併在一起時為
Figure 02_image049
，其中，i 為 2；j 為 2 或 3，以及，R2 如本文中所定義。
於一些實施例中，該經官能化之多臂 PEG 具有通式 (IIIa) 之結構，其中，每一 R2 獨立地選自馬來醯亞胺、硫醇基、硫醇、三氟甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、吖[口+元]、過氧化物、吡啶基二硫化物、琥珀醯亞胺基酯、-NH2 、醛、鹵代乙酸酯、鹵代乙醯胺、及對硝基苯基碳酸酯。於一些實施例中，每一 R2 獨立地為選自溴乙酸酯、碘乙酸酯、氯乙酸酯及其組合之鹵代乙酸酯。於一些實施例中，每一 R2 獨立地為選自溴乙醯胺、碘乙醯胺、氯乙醯胺及其組合之鹵代乙醯胺。於一些實施例中，R2 為馬來醯亞胺。
於一些實施例中，該經官能化之多臂 PEG 具有通式 (IIIa) 之結構，其中每一 R2 為馬來醯亞胺。於一些實施例中，該經官能化之多臂 PEG 具有通式 (IIIa) 之結構，其中，當 R1 與 R2 合併在一起時為
Figure 02_image052
，其中，i 及 j 如上文中所定義。於一些實施例中，該經官能化之多臂 PEG 具有通式 (IIIa) 之結構，其中，當 R1 與 R2 合併在一起時為
Figure 02_image052
，其中，i 為 3 且 j 為 2。
於另一態樣中，該經官能化之多臂 PEG 具有通式 (IVa) 之結構：
Figure 02_image090
其中，每一 m 表示該多元醇 (PEG) 之特定臂的長度或尺寸並且獨立為約 45 至約 1000、約 3 至約 250、或約 50 至約 200、或約 100 至約 150 的整數；每一 R1 獨立地或不存在或為連接基團；以及，每一 R2 獨立地或為氫或為末端反應性基團；其中，至少一個 R2 為末端反應性基團。於一些實施例中，R2 獨立地選自硫醇反應性基團、胺基反應性基團及其組合。
具有通式 (IVa) 之結構的多臂 PEG 具有丁二醇核心結構，並且本文中亦指代為 DX 八聚體。
於一些實施例中，該經官能化之多臂 PEG 具有通式 (IVa) 之結構，其中，每一 R1 當存在時為相同或不同，並且當 R1 與 R2 合併在一起時選自
Figure 02_image020
；
Figure 02_image022
；
Figure 02_image024
；
Figure 02_image026
；
Figure 02_image028
；
Figure 02_image030
；
Figure 02_image032
；
Figure 02_image034
；
Figure 02_image036
；
Figure 02_image005
；
Figure 02_image039
；
Figure 02_image041
；
Figure 02_image043
；
Figure 02_image045
；以及
Figure 02_image047
；及其組合；其中，每一 i 獨立地為 0 至 10 之整數；j 為 0 至 10 之整數；以及 R2 如本文中所定義。於一些實施例中，每一 R1 為連接基團。
於一些實施例中，該經官能化之多臂 PEG 具有通式 (IVa) 之結構，其中，當 R1 與 R2 合併在一起時為
Figure 02_image049
，其中，i、j 及 R2 如本文中所定義。於一些實施例中，當 R1 與 R2 合併在一起時為
Figure 02_image049
，其中，i 為 2；j 為 2 或 3，以及，R2 如本文中所定義。
於一些實施例中，每一 R2 獨立地選自馬來醯亞胺、硫醇基、硫醇、三氟甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、吖[口+元]、過氧化物、吡啶基二硫化物、琥珀醯亞胺基酯、-NH2 、醛、鹵代乙酸酯、鹵代乙醯胺、及對硝基苯基碳酸酯。於一些實施例中，每一 R2 獨立地為選自溴乙酸酯、碘乙酸酯、氯乙酸酯及其組合之鹵代乙酸酯。於一些實施例中，每一 R2 獨立地為選自溴乙醯胺、碘乙醯胺、氯乙醯胺及其組合之鹵代乙醯胺。於一些實施例中，R2 為馬來醯亞胺。
於一些實施例中，該經官能化之多臂 PEG 具有通式 (IVa) 之結構，其中每一 R2 為馬來醯亞胺。於一些實施例中，該經官能化之多臂 PEG 具有通式 (IVa) 之結構，其中，當 R1 與 R2 合併在一起時為
Figure 02_image052
，其中，i 及 j 如上文中所定義。於一些實施例中，該經官能化之多臂 PEG 具有通式 (IVa) 之結構，其中，當 R1 與 R2 合併在一起時為
Figure 02_image052
，其中，i 為 3 且 j 為 2。
適用於本揭露之其他經官能化之多臂 PEG 揭示於美國專利申請案公開第 2011/0286956 號及美國專利申請案公開第 2015/0073155 號中，兩者皆藉由引用而以其整體併入本文。
適用於本揭露之經官能化之多臂 PEG 亦可自多個供應商購得。例如，JenKem Technology, USA 販售經馬來醯亞胺官能化之 PEG 六聚體及八聚體 (例如，6ARM (DP)-PEG-MAL 及 8ARM (TP)-PEG-MAL)。NOF America Corp. 亦販售經馬來醯亞胺官能化之 PEG 八聚體 (例如，Sunbright® HGEO-400MA；Sunbright® DX-400MA) 及四聚體 (例如，Sunbright® PTE-400MA)。
於特定實施例中，所揭示之多臂 PEG 之活性衍生物為多臂 PEG 之活性 NHS 酯衍生物，具有下述通式 (IV) 之結構：
Figure 02_image103
(IV)
其中，R 為二新戊四醇。
1. 多元醇共軛物
於一些實施例中，本揭露針對包含一個或多個本文所揭露之抗 Tie2 抗體或抗體變體以及一個或多個多臂多元醇之共軛物 (例如，Tie2 結合劑)，其中，該共軛物藉由將至少一個抗 Tie2 Fab 或 Fab 變異體與多元醇共價連接而製備。於一些實施例中，該多臂多元醇為 PEG。於較佳實施例中，該 PEG 為六聚體。於其他實施例中，該 PEG 為八聚體。於一些實施例中，該 PEG 具有通式 (Ia) 之結構。
本揭露之共軛物可藉由與每一多臂 PEG 共軛之抗 Tie2 抗體 (Fab) 的數目進行特徵。本文中，此為指代為「fab 化」或「fab 化程度」。與每一 PEG 共軛之抗 Tie2 Fab 的數目可依據多種因素而變，包括：1) PEG 中臂之數目；2) PEG 上之末端反應性基團的數目及/或反應活性；3) PEG 之核心結構；及/或 4) PEG 化反應條件。用於製備共軛物之多臂 PEG 的高度多分散性在一些情況下可能使得對最終共軛物之分析複雜化，特別是使得準確地確定每一 PEG 之 Fab 數目更為困難且不確定。據此，用來形成共軛物之 PEG 典型將具有約 1 至約 1.35 範圍內之多分散性 (使用本領域已知方法測定)，並且於多個實施例中將具有約 1 至約 1.25、約 1 至約 1.2、約 1 至約 1.15、約 1 至約 1.1、約 1.05、或甚至約 1 之多分散性。
於一些實施例中，本揭露之共軛物包含六臂 PEG，其中，至少一個抗 Tie2 Fab 或變異體與該 PEG 共價連接。於另一實施例中，本揭露之共軛物包含六臂 PEG，其中，至少 2 個、至少 3 個、至少 4 個、至少 5 個、或至少 6 個抗 Tie2 Fab 與該 PEG 共價連接。於另一實施例中，本揭露之共軛物包含八臂 PEG，其中，至少 2 個、至少 3 個、至少 4 個、至少 5 個、至少 6 個、至少 7 個、或至少 8 個抗 Tie2 Fab 與該 PEG 共價連接。於另一實施例中，本揭露之共軛物包含六臂 PEG，其中，至少 4 個、至少 5 個、或至少 6 個抗 Tie2 Fab 與該 PEG 共價連接。於一些實施例中，本揭露之共軛物包含六臂 PEG，其中，4 至 6 個或 5 至 6 個抗 Tie2 Fab 與該 PEG 共價連接。於另一實施例中，本揭露之共軛物包含六臂 PEG，其中，4 至 6 個抗 Tie2 Fab 與該 PEG 共價連接。於另一實施例中，本揭露之共軛物包含六臂 PEG，其中，4 至 6 個或 5 個抗 Tie2 Fab 與該 PEG 共價連接。
於一些實施例中，本揭露之共軛物包含具有通式 (Ia)、(IIa)、(IIIa) 或 (IVa) 中任一者之結構的多臂 PEG。於此類實施例中，至少一個 R2 與本文所揭示之抗 Tie2 Fab 或變異體共價連接。於一些實施例中，具有通式 (Ia)、(IIa)、(IIIa) 或 (IVa) 中任一者之結構的多臂 PEG 為六聚體，並且至少 2 個、至少 3 個、至少 4 個、至少 5 個或全部 6 個 R2 基團與本文所揭示之抗 Tie2 Fab 或變異體共價連接。
於一些實施例中，本揭露之共軛物包括其中該多臂多元醇共價附接至親本抗體上一個或多個特定位點的品種，亦即，聚合物附接為以親本抗體或抗體片段中之特定區域或者一個或多個特定胺基酸殘基為標靶。可使用標準誘變技術來改變親本抗體或抗體片段中潛在 PEG 化位點的數目及/或位置。因此，在胺基酸取代引入或替換胺基酸諸如半胱胺酸及離胺酸之程度上，本揭露之抗 Tie2 抗體及其變異體可含有比天然序列抗 Tie2 更大或更小數量之潛在 PEG 化位點。
如上文所檢討，聚合物之位點特異性共軛最常藉由附接至親本抗體或抗體片段中之半胱胺酸殘基而達成。於此類實施例中，偶合化學法可例如利用親本抗體中半胱胺酸殘基的未處於二硫橋中之游離硫醇基基團。
於一些實施例中，自然地存在於親本 Fab 中之一個或多個半胱胺酸殘基用作附接位點進行聚合物共軛。於其他實施例中，Fab 或變異體上之游離胺基基團可使用 2-亞胺基-硫雜環戊烷 (Traut 氏試劑) 硫醇化，然後與例如經馬來醯亞胺官能化之 PEG 偶合，如 Pedley, 等人，Br. J. Cancer , Vol. 70, pp. 1126-1130 (1994) 中所揭示。 於另一實施例中，出於向聚合物提供一個或多個特異性附接位點之目的，將一個或多個半胱胺酸殘基改造到親本 Fab 之選定的一個或多個位點中。
經半胱胺酸改造之抗體先前業經有所揭示 (美國專利公開第 2007/0092940 號及Junutula, J. R., et al,J. Immunol Methods , Vol. 332(l-2), pp. 41-52 (2008)，其全部藉由引用而以其整體併入本文)。於一些實施例中，經半胱胺酸改造之抗體可為親本抗體。此等為有用於生成在特定位置 (典型在恆定區內，例如，CL 或 CH 1 內) 具有游離半胱胺酸的抗體片段。經改造為含有半胱胺酸之親本抗體於本文中指代為「ThioMab」，而無論製造方法如何，自此類經半胱胺酸改造之抗體製造的 Fab 片段於本文中指代為「ThioFab」。如先前所述 (參閱，例如，美國專利公開第 2007/0092940 號及 Junutula, J. R., 等人，J. Immunol Methods , Vol. 332(l-2), pp. 41-52 (2008))，對於具有被替換 (「改造」) 之半胱胺酸 (Cys) 殘基的突變體，評估新引入之經改造半胱胺酸硫醇基團的反應活性。硫醇反應活性值為 0 至 1.0 範圍內之相對數值項，並且可針對任意經半胱胺酸改造之抗體量測之。除了具有反應性硫醇基團之外，應選擇 ThioMab 使得它們保持抗原結合能力。經半胱胺酸改造之抗體的設計、選擇及製備先前得以詳細揭示 (參見，例如，WO 2011/069104，其藉由引用而併入本文)。於一些實施例中，經改造半胱胺酸被引入重鏈或輕鏈之恆定域中。因此，經半胱胺酸改造之抗體保持其野生類型、親本抗體對應物之抗原結合能力，並且因此能夠與抗原特異性結合。
於一些實施例中，本揭露為關於抗體片段-聚合物共軛物，其中，該抗體片段為 Fab，以及，該聚合物附接至 Fab 片段之輕鏈或重鏈中的一個或多個半胱胺酸殘基，該半胱胺酸殘基一般將會形成連接輕鏈與重鏈之鏈間二硫鍵。
於另一態樣中，本揭露為關於抗體片段-聚合物共軛物，其中，該抗體片段為 Fab-C，以及，該聚合物附接為以 Fab-C 片段之鉸鏈區為標靶。於一些實施例中，自然地存在於抗體片段鉸鏈區中的一個或多個半胱胺酸殘基被用來附接聚合物。於另一實施例中，出於向聚合物提供一個或多個特異性附接位點之目的，將一個或多個半胱胺酸殘基改造到 Fab-C 片段之鉸鏈區中。於一些實施例中，出於提供一個用於聚合物共軛之附接位點的目的，藉由將一個半胱胺酸添加到 C 端末端而修飾本文所揭露之抗 Tie2 Fab。於另一實施例中，出於提供兩個用於聚合物共軛之附接位點的目的，藉由將四個另外殘基 CPPC (SEQ ID NO: 87) 添加到 C 端末端而修飾本文所揭露之抗 Tie2 Fab。於又另一實施例中，出於提供一個用於聚合物共軛之附接位點的目的，藉由將四個另外殘基 SPPC (SEQ ID NO: 88) 添加到 C 端末端而修飾本文所揭露之抗 Tie2 Fab。
PEG 化之程度及位點亦可藉由調節反應條件諸如經官能化之 PEG 與蛋白質之相對濃度以及 pH 而操縱之。用於所欲程度之 PEG 化的合適條件可藉由改變標準 PEG 化反應之參數而經驗性地確定。
抗 Tie2 Fab 及變異體之 PEG 化係藉由任意傳統方法實施。合適之 PEG 化條件詳述於 WO 2011/069104 及 WO 03/029420 中，兩者皆藉由引用而以其整體併入本文。
3. 多元醇共軛物之特徵
經 PEG 化之蛋白質可藉由 SDS-PAGE、凝膠過濾、NMR、肽圖分析、液相層析-質譜及體外生物學測定法特徵。典型地，首先藉由 SDS-PAGE 顯示 fab 化之程度。於 10% SDS 中之聚丙烯醯胺凝膠電泳典型在 10 mM Tris-HCl pH 8.0 中運行，以 100 mM NaCl 作為洗提緩衝液。為了證明哪一個殘基被 PEG 化，可使用蛋白酶諸如胰蛋白酶及 Lys-C 蛋白酶執行肽圖分析。因此，經 PEG 化及未經 PEG 化之抗體的樣品可使用蛋白酶諸如 Lys-C 蛋白酶消化，並藉由諸如反相 HPLC 之技術分離所得之肽。所產生之肽的層析圖可與先前針對抗 Tie2 多肽測定之肽譜比較。
然後，每一峰可藉由質譜法分析以驗證該峰中共軛物之尺寸。依據共軛中所使用之 PEG 以及該峰中共軛物之尺寸，可評估與 PEG 共軛之抗體或其變異體的數目。與 PEG 基團共軛之片段於進樣後往往不保留在 HPLC 管柱上並且從層析圖中消失。這種從層析圖中消失為在應含有至少一個可 PEG 化之胺基酸殘基的特定片段上 PEG 化的標誌。可使用本領域中已知之方法，經進一步測定 PEG 化之抗 Tie Fab 與 Tie2 交互作用之能力以及其他生物活性。
PEG 化改變抗體藥物之物理及化學特性，並且可導致改善之藥物動力學行為諸如改善之安定性、降低之免疫原性、延長之循環時間以及增加之眼內滯留時間。
於一些實施例中，與相對應的未共軛之抗 Tie2 Fab 相比，本揭露之共軛物在經由單次玻璃體內注射投予至哺乳動物 (例如，人) 眼睛內之後具有增加之半衰期。於一些實施例中，半衰期之增加為相對應的未共軛之抗 Tie2 Fab 半衰期的至少 1.4 倍、或至少 1.8 倍、或至少 2 倍。
3. 作為共軛物之 IgM 多聚體
於一些實施例中，本揭露之 Tie2 結合劑可藉由將超過一個本文所揭示之抗 Tie2 抗體與 IgM 分子之 CH1 域連接而作成，例如，使用重組表現方法以 (經由肽鍵) 將 IgM CH1 域之 C 端融合至如本文所揭示之抗 Tie2 抗體之 N 端。IgM 被證實為可抗體治療劑之可行型式 (參閱，例如，Hanala, 2012, MAbs, 4:555-561)。IgM 之「單體」成分由兩個各自含有兩個 Ig 域之輕鏈 (LC) 以及兩個含有五個 Ig 域及短的經截短之 C 端尾部的重鏈 (HC) 組成。此等四條鏈組成以形成 HC-LC 同源二聚體之均二聚體。接著，該等均二聚體共價關聯為含有五個均二聚體及 J 鏈 (JC) (五聚體) 或六個均二聚體 (六聚體) 之環狀結構，五聚體及六聚體分別含有十個及十二個結合位點。不受縛於理論，可能者為，多個可變片段 (Fv) 之密切結合使得 IgM 能夠結合標靶而無需親和力成熟，並因此能夠用作前哨適應性免疫受體。
於特定實施例中，抗 Tie2 抗體為 Fab。IgM 蛋白質 (多聚體) 可包括或不包括 J 鏈，使得在 J 鏈存在下能夠形成五聚體 (並且可包含至多 5 個抗 Tie2 抗體)，並且在 J 鏈不存在下形成六聚體 (並且可包含至多 5 個抗 Tie2 抗體)。於一些實施例中，藉由改變 IgM 重鏈或輕鏈之比率 (以形成六聚體) 或重鏈與輕鏈與 J 鏈之比率 (以形成五聚體) 而生產六聚體。據此，於一些實施例中，該 Tie2 結合劑為多聚體，其包含 IgM 蛋白質及至少 2 個、至少 3 個、至少 4 個、至少 5 個或至少 6 個本文所揭示之抗 Tie2 抗體以形成能夠激活 Tie2 之多聚體。抗 Tie2 IgM 分子為經設計並顯示以激活 Tie2 活性 (參閱，實例 7)。
使用如本文所揭示之重組 IgM 型式構造的抗 Tie2 多聚體共軛物，由於其相對於單一 Fab 之相對大的分子半徑潛在地導致分子擴散出玻璃體液進入眼房液內及血液內之速度較慢，故可用於眼部治療劑。如下文實例 7 中所揭示，藉由光散射評估發現流體動力學半徑 (Rh ) 為大約 12 nM，並且六聚體之預測分子量 (~1050 kD) 略超過五聚體之彼等 (~950 kD)
亦探究重組 IgM 分子之全身性半衰期，因為可能所欲者為具有快速之全身清除以限制眼部治療劑對於眼睛之活性。如實例 7 中所揭示，於靜脈內注射後，經重組表現之 IgM 五聚體及六聚體比自人類血清分離之 IgM 被更快速地清除。復確定，此等重組 IgM 分子相對於 N 連接聚醣之唾液酸百分比低於自血清分離之 IgM，暗示重組抗 Tie2 IgM 分子之清除速率可能藉由設計表現系統而得以控制，該表現系統修飾 N 連接醣基化中之唾液酸水準。
先前業經報告，IgM 經由補體依賴性細胞毒性 (CDC) 有效地招募 C1q 以及誘導標靶細胞殺傷。此活性對於眼部治療劑可為不良者。據此，如實例 7 中所揭示，為設計 IgM 變異體 P434G (EU 編號)，並且其顯示業經移除全部可偵檢之補體活性。
3. 六聚肽多聚體作為共軛物
本揭露亦涵蓋包含多個抗原結合劑 (例如，抗體或其抗原結合片段) 之共軛物，每一抗原結合劑連接至自然地形成多聚體之肽，例如，NDK 肽。於一些實施例中，本揭露之 Tie2 結合劑可藉由將超過一個本文所揭示之抗 Tie2 Fab 與肽多聚體連接而作成。肽多聚體包含至少 2 個、至少 3 個、至少 4 個、至少 5 個、至少 6 個、至少 7 個或至少 8 個肽，當於重組表現系統中表現時，該等多個肽自然地折疊以形成單個多臂結構。常規分子改造技術及材料為用以表現該肽，其將會形成作為融合體之多聚體，其中，抗原結合蛋白 (例如，抗體或其片段) 表現於形成多聚體之肽的 N 端或 C 端。於特定實施例中，多聚體中多個肽為相同，並且表現載體為構造為將該肽之 C 端或 N 端分別與抗 Tie2 抗體或其片段 (例如，經由肽鍵) 連接，如本揭露所教示。
於特定實施例中，多聚肽之肽為具有均六聚四級結構的真核生物核苷二磷酸激酶 (NDK) 酶之部分。存在若干種可用來設計多聚體之 NDK 酶，包括 NDK1 (例如，SEQ ID NO: 69)、NDK2 (例如，SEQ ID NO: 70)、NDK3 (例如，SEQ ID NO: 71)、NDK4 (例如，SEQ ID NO: 72)、NDK5 (例如，SEQ ID NO: 73)。於較佳實施例中，該 NDK 為衍生自例如 UniProt 登錄號 P22887 的 NDK3 肽。SEQ ID NO: 74 提供於其 C 端與 NDK3 N 端連接之 Tie2.1.M100cF 的序列。於這一較佳實施例中，Fab 輕鏈包含 SEQ ID NO: 21。(參閱，例如，下述實例 8。)
E. 用於診斷和檢測之方法及組成物
於某些實施例中，本文提供的任何抗 Tie2 抗體可用於偵檢生物樣品是否存在 Tie2。如本文所用的術語「檢測」，涵蓋定量或定性檢測。在某些實施例中，生物樣品包括細胞或組織，諸如視網膜組織 (光受器及下方視網膜色素上皮細胞 (RPE) 及脈絡膜毛細管)。
在一個實施例中，提供了一種用於診斷或檢測方法中的抗 Tie2 抗體。在另一方面，提供了一種檢測生物樣品中是否存在 Tie2 的方法。在某些實施例中，該方法包括在允許抗 Tie2 抗體與 Tie2 結合的條件下使生物樣品與本文所述之抗 Tie2 抗體接觸，並檢測抗 Tie2 抗體與 Tie2 之間是否形成複合物。此等方法可為體外 或體內 方法。在一個實施例中，使用抗 Tie2 抗體來選擇適合使用抗 Tie2 抗體進行治療的受試者，例如 Tie2 為用於選擇患者的生物標志物。
在某些方面，提供了標記的抗 Tie2 抗體。標記包括但不限於直接檢測的標記或部分 (例如螢光、髮色、電子緻密、化學發光和放射性標記)，以及間接檢測 (例如，透過酶促反應或分子相互作用) 的部分，例如酶或配體。例示性標記包括但不限於：放射性同位素32 P、14 C、125 I、3 H 及131 I；螢光團，例如稀土螯合物或螢光素及其衍生物；玫瑰紅及其衍生物；丹磺醯基；繖形酮；螢光素酶，例如螢火蟲螢光素酶和細菌螢光素酶 (美國專利號 4,737,456)；螢光素；2,3-二氫鄰苯二甲二酮；辣根過氧化物酶 (HRP)；鹼性磷酸酶；β-半乳糖苷酶；葡糖澱粉酶；溶菌酶；醣類氧化酶，例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖 6-磷酸脫氫酶；雜環氧化酶，例如尿酸酶和黃嘌呤氧化酶，與採用過氧化氫氧化染料前體 (例如 HRP、乳過氧化酶或微過氧化酶) 的酶結合使用；生物素/抗生物素蛋白；旋轉標記；噬菌體標記；穩定自由基等。
F. 醫藥調配物
藉由將具有所欲純度之磁力抗 Tie2 抗體或 Tie2 共軛物與凍乾調配物或水溶液形式的一種或多種視需要之醫藥上可接受之載劑 (Remington's Pharmaceutical Sciences ， 第 16 版，Osol, A. Ed. (1980)) 混合來製備如本文所揭示之抗 Tie2 抗體或 Tie2 共軛物的醫藥調配物。醫藥上可接受之載劑在採用的劑量和濃度下通常對受體無毒，其包括但不限於：緩衝劑，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和蛋胺酸；防腐劑 (例如十八烷基二甲基芐基氯化銨；六甲基氯化銨；苯扎氯銨；芐索銨氯化物；苯酚、丁醇或芐醇；對羥基苯甲酸烷基酯，如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇和間甲酚)；低分子量 (小於約 10 個殘基) 多肽；蛋白質，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，例如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，例如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、二糖及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑 (例如 EDTA)；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽相對離子，例如 鈉；金屬錯合物 (例如鋅蛋白錯合物)；及/或非離子界面活性劑，例如聚乙二醇 (PEG)。本申請中的示例性醫藥上可接受之載劑還進一步包括間質藥物分散劑，諸如可溶性中性活性透明質酸酶糖蛋白 (sHASEGP)，例如人可溶性 PH-20 透明質酸酶糖蛋白，諸如 rHuPH20 (HYLENEX® , Baxter International, Inc.)。某些例示性 sHASEGP 及用法 (包括 rHuPH20) 描述於美國專利公開號 2005/0260186 和 2006/0104968 中。在一個態樣，sHASEGP 與一種或多種附加的糖胺聚醣酶諸如軟骨素酶結合在一起。
示例性凍乾抗體調配物描述於美國專利第 6,267,958 號中。水性抗體製劑包括在美國專利號 6,171,586 和 WO2006/044908 中描述的那些，後者的製劑包括組氨酸-乙酸鹽緩衝劑。
本文所述之製劑還可包含適合於所治療的特定適應症的多於一種活性成分，較佳地，為那些相互無不利影響的具有互補活性成分。例如，可能所欲者為復提供選自由下列所組成之群組的第二生物分子：IL-6；IL-6R；IL-13；IL-13R；PDGF；血管生成素；Ang2；Tie2；S1P；整合素 αvβ3、αvβ5 及 α5β1；β 細胞素 (betacellulin)；apelin/APJ；紅血球生成素；補體因子 D；TNFα；HtrA1；VEGF 受體；ST-2 受體；以及在基因上與 AMD 風險關聯之蛋白質，諸如補體途徑成分 C2、因子 B、因子 H、CFHR3、C3b、C5、C5a 及 C3a；HtrA1；ARMS2；TIMP3；HLA；介白素-8 (IL-8)；CX3CR1；TLR3；TLR4；CETP；LIPC；COL10A1；以及 TNFRSF10A。可替代地或另外地，第二生物分子為與選自由下列所組成之群組的子特異性結合的抗體或其片段：IL-6；IL-6R；IL-13；IL-13R；PDGF；血管生成素；Ang2；Tie2；S1P；整合素 αvβ3、αvβ5 及 α5β1；β 細胞素 (betacellulin)；apelin/APJ；紅血球生成素；補體因子 D；TNFα；HtrA1；VEGF 受體；ST-2 受體；以及在基因上與 AMD 風險關聯之蛋白質，諸如補體途徑成分 C2、因子 B、因子 H、CFHR3、C3b、C5、C5a 及 C3a；HtrA1；ARMS2；TIMP3；HLA；介白素-8 (IL-8)；CX3CR1；TLR3；TLR4；CETP；LIPC；COL10A1；以及 TNFRSF10A。於某些實施例中，另外化合物為與 VEGF 及/或 Ang2 及/或 IL-1β 結合之抗體，或其抗原結合片段。 此等活性成分適宜地以對預期目的有效的量組合存在。
活性成分可以包載在例如透過凝聚技術或透過介面聚合製備的微囊 (例如，分別為羥甲基纖維素微囊或明膠微囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微囊) 中、膠體藥物遞送系統 (例如脂質體、白蛋白微球、微乳、奈米顆粒和奈米囊 (nanocapsule)) 中或粗滴乳狀液中。此等技術揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)。
可以製備緩釋製劑。緩釋製劑的適宜的實例包括含有抗體的固體疏水聚合物的半透性基質，該基質是成形物品的形式，例如膜或微膠囊。
用於體內 投予的製劑通常是無菌的。無菌性可易於例如藉由無菌濾膜過濾來實現。
本文所揭示之用於預防或治療眼部疾病或病症的共軛物典型藉由眼部、眼內及/或玻璃體內注射、及/或鞏膜後注射、及/或筋膜下注射、及/或脈絡膜上注射、及/或以滴眼液及/或軟膏形式外用投予而投予。本揭露之此類組合物可藉由多種方法遞送，例如，作為允許將化合物緩慢釋放入玻璃體中之裝置及/或儲庫進行玻璃體內遞送，包括參考文獻諸如 Intraocular Drug Delivery, Jaffe, Jaffe, Ashton, and Pearson, editors, Taylor & Francis (March 2006) 中揭示之彼等。於一個實例中，該裝置可以為迷你幫浦及/或基質及/或被動擴散系統及/或經膠囊化之單元，其在延長之時間段內釋放該化合物 (Intraocular Drug Delivery, Jaffe, Jaffe, Ashton, and Pearson, editors, Taylor & Francis (March 2006)。亦可使用其他施用方法，包括但不限於，外用、腸胃外、皮下、腹膜內、肺內、鼻內及病灶內投予。腸胃外輸注包括肌內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下投予。
用於眼部、眼內或玻璃體內投予之調配物可藉由本領域中已知之方法並使用本領域中已知之成分製備。對於有效治療之主要要求為透過眼睛之適宜滲透。不同藥物可外用遞送之眼睛前部疾病，視網膜疾病需要位點特異性更高之途徑。滴眼液及軟膏極少滲透到研究後部，並且血眼屏障阻礙全身性投予之藥物滲透到眼部組織內。據此，一般選擇以治療視網膜疾病諸如 DME 及 AMD 的用於藥物遞送之方法為直接玻璃體內注射。玻璃體內注射一般以一定間隔重複，該間隔取決於患者狀況以及所遞送之藥物的特性及半衰期。對於眼內 (例如，玻璃體內) 滲透，較小尺寸之分子一般為較佳者。
於一些實施例中，本文所揭示之抗體及共軛物可調配為用於使用可植入端口遞送系統 (PDS) 遞送。如先前所關注，PDS 為可再填充之裝置，其中，釋放入玻璃體內為收到包含鈦玻料之多孔金屬膜的控制。於一些實施例中，由於儲器之體積小，故使用 PDS 進行有效遞送要求蛋白質濃度高。據此，於一些實施例中，本文所揭示之抗體及共軛物係以高濃度調配。於一些實施例中，本文所揭示之抗體及共軛物可以至少 150 mg/ml、至少 160 mg/ml、至少 170 mg/ml、至少 180 mg/ml、至少 190 mg/ml、至少 200 mg/ml、或至少 210 mg/ml、或至少 220 mg/ml、或至少 230 mg/ml、或至少 240 mg/ml、或至少 250 mg/ml、或至少 260 mg/ml、或至少 270 mg/ml、或至少 280 mg/ml、或至少 290 mg/ml、或至少 300 mg/ml 之濃度調配。於一些實施例中，本文所揭示之抗體及共軛物可以介於 150 mg/ml 與 350 mg/ml、介於 150 mg/ml 與 300 mg/ml、介於 170 mg/ml 與 300 mg/ml、介於 200 mg/ml 與 300 mg/ml、或介於 170 mg/ml 與 220 mg/ml 之間的濃度調配。
G. 治療方法和組成物
本文提供之任何抗 Tie2 抗體或共軛物皆可用於治療方法中。根據本文之任一實施例的「個體」、「患者」或「受試者」可以為人。
本揭露之抗 Tie2 共軛物可用於治療哺乳動物。於一些實施例中，例如，抗 Tie2 共軛物投予至非人哺乳動物以用於獲得臨床前資料。待治療之示例性非人哺乳動物包括對其執行臨床前研究之非人靈長類動物、狗、貓、豬、嚙齒動物及其他哺乳動物。此類哺乳動物可以為關於待使用該抗體治療之疾病而建立之動物模型，或者可用以研究感興趣之抗體的毒性。於每一此等實施例中，可對哺乳動物執行劑量遞增研究。
抗 Tie2 共軛物可藉由任意合適手段施用，包括腸胃外、皮下、腹膜內、玻璃體內、肺內及鼻內施用，以及，若對於局部免疫抑制治療為所欲者，病灶內投予。腸胃外輸注包括肌內、靜脈內、動脈內、腹膜內、玻璃體內及皮下投予。此外，該共軛物適用於藉由脈衝輸注投予，尤其是對於遞減劑量之抗體或其抗體變異體或其片段 (例如，抗原結合片段)。於一些實施例中，給藥可藉由注射諸如靜脈內或皮下注射進行，部分地取決於短暫投予還是長期投予。
對於疾病之預防或治療，抗 Tie2 抗體或共軛物的適當劑量將取決於待治療的疾病的類型、疾病之嚴重度及病程、為了預防還是治療目的而投予該抗體、既往治療、患者的臨床病史及對該抗體的反應以及主治醫師的判斷。
依據疾病之類型及嚴重程度，約 1-25 mg/眼 (每隻眼睛 0.015 mg/kg – 0.36 mg/kg ) 的抗體可以為例如藉由一次或多次分開投予或藉由連續輸注來對患者投予的初始候選劑量。對於在幾天或更長時間內重複投予，視病症而定，持續治療直至出現所欲之疾病症狀抑制。但是，可以使用其他劑量方案。藉由習用技術和測定很容易監測此治療的進展。示例性給藥方法揭露於 WO 94/04188 中。
於一個態樣中，提供用作藥劑的抗 Tie2 抗體 或共軛物。於進一步之態樣中，提供用於治療眼部疾病或疾患之抗 Tie2 抗體或共軛物。於某些實施例，提供用於治療方法中的抗 Tie2 抗體或共軛物。於某些實施例中，本發明提供用於治療患有眼部疾病或疾患之個體的方法中的抗 Tie2 抗體，該方法包含向該個體投予有效量之抗 Tie2 抗體或共軛物。在一個此類實施例中，該方法復包括將有效量之至少一種另外治療劑 (例如下文所述) 投予至個體。於進一步之實施例中，本發明提供用於增加血管內皮細胞膜完整性及/或減低血管滲漏的抗 Tie2 抗體或共軛物。於某些實施例中，本發明提供用於在個體中增加血管內皮細胞膜完整性及/或減低血管滲漏的方法中使用的抗 Tie2 抗體或共軛物，該方法包括向該個體投予有效之抗 Tie2 抗體或共軛物以增加血管內皮細胞膜完整性及/或減低血管滲漏。 根據上述任一實施例的「個體」較佳地為人。
如本文中所用，術語「眼部病症」包括與病理性血管生成及/或萎縮之任何眼部病症 (本文中亦可互換地指代為「眼部疾病」)。眼部病症之特徵可以為經改變或不受調控之新血管擴增及/或侵入眼部組織諸如視網膜或角膜之結構內。眼部病症之特徵可以為視網膜組織 (光受器及下方視網膜色素上皮細胞 (RPE) 及脈絡膜毛細管) 之萎縮。
糖尿病性黃斑水腫 (DME) 為由被稱為糖尿病性視網膜病變 (DR) 之糖尿病併發症造成。這一眼睛疾病可發生在被診斷為第 1 型或第 2 型糖尿病之人中。DME 定義為中央凹視網膜增厚 2 實盤直徑以內，並且可為局部性或彌散性者。DME 與伴有血液視網膜屏障破壞之視網膜微血管改變相關聯，造成血漿成分滲漏進入周圍之視網膜內，導致視網膜水腫。
非限制性眼部病症包括，例如，糖尿病性黃斑水腫 (DME) (例如，局部性非中心性 DME 及累及中央凹之彌散性 DME)、糖尿病性視網膜病變 (DR) (例如，增殖性 DR (PDR)、非增殖性 DR (NPDR) 及高海拔 DR)、不存在水腫之視網膜病變、其他局部缺血相關性視網膜病變、AMD (例如，濕性 AMD、乾性 AMD、中度 AMD、晚期 AMD 及地圖狀萎縮 (GA))、黃斑退化、黃斑水腫、視網膜病變、ROP、視網膜靜脈阻塞 (RVO) (例如，中央性 (CRVO) 及分支性 (BRVO) 形式)、CNV (例如，近視性 CNV)、角膜新血管形成、與角膜新血管形成相關之疾病、視網膜新血管形成、與視網膜/脈絡膜新血管形成相關之疾病、中心性漿液性脈絡膜視網膜病變 (CSR)、病理性近視、逢希伯-林道病、眼睛組織漿菌症、FEVR、Coats 氏病、Norrie 氏病、與骨質疏鬆症-假神經膠質瘤症候群 (OPPG) 相關之視網膜異常、結膜下出血、皮膚發紅、眼部新血管病、新血管青光眼、色素性視網膜炎 (RP)、高血壓性視網膜病變、視網膜血管瘤性增殖、黃斑毛細血管擴張、虹膜新血管形成、眼內新血管形成、視網膜退化、囊樣黃斑水腫 (CME)、血管炎、視盤水腫、視網膜炎 (包括但不限於 CMV 視網膜炎)、眼部黑色素瘤、視網膜胚細胞瘤、結膜炎 (例如，感染性結膜炎及非感染性 (例如，過敏性) 結膜炎)、萊伯氏先天性黑矇 (亦稱為 Leber 氏先天性黑矇或 LCA)、眼色素層炎 (包括感染性及非感染性眼色素層炎)、脈絡膜炎 (例如，多灶性脈絡膜炎)、眼睛組織胞漿菌病、瞼炎、乾眼症、創傷性眼損傷、Sjögren 氏病及其他眼科疾病，其中，該疾病或疾患與眼部新血管形成、血管滲漏及/或視網膜水腫或視網膜萎縮相關聯。另外示例性眼部病症包括視網膜劈裂症 (視網膜神經感測層之不正常剝離)、與皮膚發紅相關之疾病 (瞼角之新血管形成) 以及由纖維小管或纖維組織之不正常增殖造成之疾病 (包括全部形式之增殖性玻璃體視網膜病變)。
與角膜新血管形成相關之示例性疾病包括但不限於，流行性角膜結膜炎、維生素 A 缺乏症、隱形眼鏡過度磨損、過敏性角膜炎、上邊緣性角膜炎、角膜病乾燥性角膜炎 (terygium keratitis sicca)、Sjögren 氏症候群、痤瘡、phylectenulosis、梅毒、分枝桿菌感染、脂質退化、化學品燒傷、細菌性潰瘍、真菌性潰瘍、單純性皰疹病毒感染、帶狀皰疹病毒感染、原蟲感染、卡波西肉瘤、蠶蝕性角膜潰瘍、Terrien 氏邊際退化、邊際性角質退化、類風濕性關節炎、全身性狼瘡、多動脈炎、創傷、Wegener 類肉瘤病、鞏膜炎、Stevens-Johnson 氏症候群、類天皰瘡放射狀角膜切開術及角膜圖像排斥反應 (corneal graph rejection).
與脈絡膜新血管形成及視網膜血管系缺陷 (包括增加之血管滲漏、動脈瘤及毛細血管滴落) 相關的示例性疾病包括但不限於，糖尿病性視網膜病變、黃斑退化、鐮狀細胞貧血、肉瘤、梅毒、彈性纖維假黃瘤、Paget 氏病、靜脈阻塞、動脈阻塞、頸動脈阻塞性疾病、慢性眼色素層炎/玻璃體炎、分支桿菌感染、Lyme 氏病、全身性紅斑狼瘡、早產兒視網膜病變、視網膜水腫 (包括黃斑水腫)、Eales 病、貝塞特氏病、視網膜炎或脈絡膜炎造成之感染、預設性眼部組織胞漿菌病、Best 氏病 (卵黃狀黃斑退化)、近視、視盤小凹 (optic pits)、睫狀體扁平部炎、視網膜脫落 (例如，慢性視網膜脫落)、血液高度黏稠症、弓蟲症、創傷及雷射後併發症。
與視網膜組織 (光受器及下方 RPE) 相關之示例性疾病包括但不限於，萎縮性或非滲出性 AMD (例如，地圖狀萎縮或晚期乾性 AMD)、黃斑萎縮 (例如，與新血管形成相關之萎縮及/或地圖狀萎縮)、糖尿病性視網膜病變、斯特格氏病、Skorsby 眼底萎縮症、視網膜劈裂症及色素性視網膜炎。
例如，於某些實施例中，前述任意方法復包括投予一種或多種另外化合物。於某些實施例中，Tie2 結合劑或共軛物或其聚合物調配物與另外化合物同步投予。於某些實施例中，Tie2 結合劑或共軛物或其聚合物調配物於另外化合物之前或之後投予。於某些實施例中，該另外化合物與選自由下列所組成之群組的第二生物分子結合：IL-1β；IL-6；IL-6R；IL-13；IL-13R；PDGF；血管生成素；Ang2；Tie2；S1P；整合素 αvβ3、αvβ5 及 α5β1；β 細胞素 (betacellulin)；apelin/APJ；紅血球生成素；補體因子 D；TNFα；HtrA1；VEGF 受體；ST-2 受體；以及在基因上與 AMD 風險關聯之蛋白質，諸如補體途徑成分 C2、因子 B、因子 H、CFHR3、C3b、C5、C5a 及 C3a；HtrA1；ARMS2；TIMP3；HLA；介白素-8 (IL-8)；CX3CR1；TLR3；TLR4；CETP；LIPC；COL10A1；以及 TNFRSF10A。於某些實施例中，該另外化合物為抗體或其抗原結合片段。於根據 (或如應用於) 上述任何實施例之某些實施例中，該眼部病症為選自由下列所組成之群組的眼內新血管疾病：增殖性視網膜病變、脈絡膜新血管形成 (CNV)、年齡相關性黃斑退化 (AMD)、糖尿病性及其他局部缺血相關性視網膜病變、糖尿病性黃斑水腫,、病理性近視、逢希伯-林道病、眼睛組織胞漿菌病、視網膜靜脈阻塞 (RVO) (包括 CRVO 及 BRVO)、角膜新血管形成、視網膜新血管形成及早產兒視網膜病變 (ROP)。例如，於一些情況下，該另外化合物為雙特異性抗體 (例如，抗 VEGF/抗 Ang2 雙特異性抗體，諸如 RG-7716 或 WO 2010/069532 或 WO 2016/073157 中揭露之任意雙特異性抗 VEGF/抗 Ang2 雙特異性抗體或其變異體。於另一實例中，於一些情況下，該另外化合物為抗 IL-6 抗體，例如，EBI-031 (十一種生物治療劑，參閱，例如，WO 2016/073890)、斯妥昔單抗 (siltuximab (SYLVANT®))、奧羅珠單抗 (olokizumab)、克拉扎珠單抗 (clazakizumab)、斯魯庫單抗 (sirukumab)、艾西莫單抗 (elsilimomab)、OPR-003、MEDI5117、PF-04236921 或其變異體。於再進一步之實例中，於一些情況下，該另外化合物為抗 IL-6R 抗體，例如，托西利珠單抗 (tocilizumab (ACTEMRA®)) (參閱，例如，WO 1992/019579)、沙立蘆人單抗 (sarilumab)、ALX-0061、SA237 或其變異體。
於一些情況下，本揭露之 Tie2 結合劑或共軛物及/或其聚合性調配物可與至少一種另外治療劑聯合投予，以用於治療眼部病症例如本文所揭示之眼部病症 (例如，DME、DR、AMD (例如，濕性 AMD)、RVO 或 GA)。在用於治療眼部病症之聯合療法中使用的示例性另外治療劑包括而不限於，抗血管生成劑諸如 VEGF 拮抗劑，包括例如抗 VEGF 抗體 (例如，抗 VEGF Fab LUCENTIS® (拉尼比珠單抗 (ranibizumab)))、可溶性受體融合蛋白 (例如，重組可溶性受體融合蛋白 EYLEA® (阿柏西普 (aflibercept)，亦稱為 VEGF Trap Eye；Regeneron/Aventis))、適體 (例如，抗 VEGF peg 化之適體 MACUGEN® (哌加他尼鈉 (pegaptanib sodium)；NeXstar Pharmaceuticals/OSI Pharmaceuticals)) 及 VEGFR 酪胺酸激酶抑制劑 (例如，4-(4-溴-2-氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉 (ZD6474)、4-(4-氟-2-甲基吲哚-5-基氧基)-6-甲氧基-7-(3-吡咯烷-1-基丙氧基)喹唑啉 (AZD2171)、瓦塔拉尼 (vatalanib (PTK787))、色瑪米尼 (semaxaminib) (SU5416；SUGEN) 及 SUTENT® (舒尼替尼 (sunitinib)))；色胺醯基-tRNA 合成酶 (TrpRS)；角鯊胺；RETAANE® (用於儲庫懸浮體之阿奈可他 (anecortave)；Alcon, Inc.)；康普瑞汀 (Combretastatin) A4 前驅藥 (CA4P)；MIFEPREX® (美服培酮-ru486)；筋膜下丙酮特安皮質醇；玻璃體內晶形丙酮特安皮質醇；基質金屬蛋白酶抑制劑 (例如，普林斯他 (Prinomastat) (AG3340；Pfizer))；丙酮氟洛皮質醇 (包括氟洛皮質醇眼內移植物；Bausch & Lomb/控制遞送系統)；力諾胺 (linomide)；整合素 β3 功能之抑制劑；血管抑素及其組合。可與本發明之 Tie2 結合劑或共軛物聯合投予之此類及其他治療劑揭示於美國專利申請第 US 2014/0017244 中，該專利申請藉由引用而以其整體併入本文。
可與 Tie2 結合劑或共軛物及/或其聚合性調配物聯合施用以治療眼部病症 (例如，DME、DR、AMD、RVO 或 GA) 的另外治療劑之進一步實例包括但不限於，VISUDYNE® (維替泊芬 (verteporfin)；一種光激活之藥物，其典型與使用非熱學雷射進行之光動力治療協同使用)、PKC412、恩多維昂 (Endovion) (NS 3728；NeuroSearch A/S)、神經滋養因子 (例如，源自膠細胞之神經滋養因子 (GDNF) 及睫狀神經滋養因子 (CNTF))、地爾硫卓 (diltiazem)、多佐胺 (dorzolamide)、PHOTOTROP®、9-順式視黃醛、眼部藥物 (例如，碘磷靈 (phospholine iodide)、二乙氧磷醯硫膽鹼 (echothiophate) 或碳酸酐酶抑制劑)、維沃司他 (veovastat) (AE-941；AEterna Laboratories, Inc.)、Sirna-027 (AGF-745；Sima Therapeutics, Inc.)、神經滋養素 (包括，僅作示例，NT-4/5，Genentech)、Cand5 (Acuity Pharmaceuticals)、INS-37217 (Inspire Pharmaceuticals)、整合素拮抗劑 (包括彼等來自 Jerini AG 及 Abbott Laboratories 者)、EG-3306 (Ark Therapeutics Ltd.)、BDM-E (BioDiem Ltd.)、沙利多邁 (如例如 EntreMed, Inc. 所用)、心肌營養素-1 (Genentech)、2-甲氧基*** (Allergan/Oculex)、DL-8234 (Toray Industries)、NTC-200 (Neurotech)、四硫代鉬酸鹽 (University of Michigan)、LYN-002 (Lynkeus Biotech)、微藻化合物 (Aquasearch/Albany, Mera Pharmaceuticals)、D-9120 (Celltech Group plc)、ATX-S10 (Hamamatsu Photonics)、TGF-β 2 (Genzyme/Celtrix)、酪胺酸激酶抑制劑 (例如，彼等來自 Allergan、SUGEN 或 Pfizer 者)、NX-278-L (NeXstar Pharmaceuticals/Gilead Sciences)、Opt-24 (OPTIS France SA)、視網膜細胞神經節神經保護劑 (Cogent Neurosciences)、N-硝基吡唑衍生物 (Texas A&M University System)、KP-102 (Krenitsky Pharmaceuticals)、環孢素 A、用於光動力治療中之治療劑 (例如，VISUDYNE®；受體靶向之 PDT，Bristol-Myers Squibb, Co.；用於與 PDT 一起注射之卟吩姆鈉 (porfimer sodium)；維替泊芬，QLT Inc.；與 PDT 合用之羅他泊芬 (rostaporfin)，Miravent Medical Technologies；與 PDT 合用之塔拉泊芬鈉 (talaporfin sodium)，Nippon Petroleum；以及莫特沙芬鎦 (motexafin lutetium)，Pharmacyclics、Inc.)、反義寡核苷酸 (包括，舉例而言，由 Novagali Pharma SA 測試之產品以及 ISIS-13650，Ionis Pharmaceuticals) 及其組合。
Tie2 結合劑或共軛物及/或其聚合性調配物可與治療或手術過程聯合投予以用於治療眼部病症 (例如，DME、DR、AMD、RVO 或 GA) 之，該治療或手術過程包括，例如，雷射光凝 (例如，全視網膜光凝 (PRP))、隱結雷射作用、黃斑裂孔手術、黃斑轉位手術、可植入袖珍望遠鏡、PHI-運動血管造影 (亦稱為微雷射治療及分支血管治療 (feeder vessel treatment))、光子束治療、微刺激治療、視網膜脫落及玻璃體手術、鞏膜屈曲 (scleral buckle)、黃斑下手術、經瞳孔熱療、光系統 I 治療、RNA 干擾 (RNAi) 之使用、體外流變過程 (亦稱為膜差濾及流變治療)、微晶片植入、幹細胞治療、基因替換治療、核糖核酸酵素基因治療 (包括用於缺氧反應元件之基因治療，Oxford Biomedica；Lentipak，Genetix；以及 PDEF 基因治療，GenVec)、光受器/視網膜細胞移植 (包括可移植視網膜上皮細胞，Diacrin, Inc.；視網膜細胞移植物，例如，Astellas Pharma US, Inc., ReNeuron, CHA Biotech)、針灸術及其組合。
於一些情況下，本發明之 Tie2 結合劑或共軛物及/或其聚合性調配物可與抗血管生成劑聯合投予，以用於治療眼部病症 (例如，DME、DR、AMD、RVO 或 GA)。任意合適之抗血管生成劑可與本發明之 Tie2 結合劑或共軛物聯合使用，包括但不限於，Carmeliet 等人 Nature 407:249-257, 2000 中所列述之彼等。於一些實施例中，該抗血管生成劑為 VEGF 拮抗劑，包括但不限於，抗 VEGF 抗體 (例如，抗 VEGF Fab LUCENTIS® (拉尼比珠單抗)、RTH-258 (以前名為 ESBA-1008，一種抗 VEGF 單鏈抗體片段；Novartis) 或雙特異性抗 VEGF 抗體 (例如，抗 VEGF/抗血管生成素 2 雙特異性抗體諸如 RG-7716；Roche))、可溶性重組受體融合蛋白 (例如，EYLEA® (阿柏西普))、VEGF 變異體、可溶性 VEGFR 片段、能夠阻斷 VEGF 之適體 (例如，哌加他尼) 或 VEGFR、中和抗 VEGFR 抗體、VEGFR 酪胺酸激酶之小分子抑制劑、抗 VEGF DARPin® (例如，阿比西帕聚乙二醇 (abicipar pegol)，Molecular Partners AG/Allergan)、抑制 VEGF 或 VEGFR 之表現的小干擾 RNA、VEGFR 酪胺酸激酶抑制劑 (例如，4-(4-溴-2-氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉 (ZD6474)、4-(4-氟-2-甲基吲哚-5-基氧基)-6-甲氧基-7-(3-吡咯烷-1-基丙氧基)喹唑啉 (AZD2171)、瓦塔拉尼 (PTK787)、色瑪米尼 (SU5416；SUGEN) 及 SUTENT® (舒尼替尼) 及其組合)。於一些情況下，抗 Tie2 抗體或其片段可與靶向第二生物分子之抗體或其片段或其他治療劑合用，該第二生物分子包括但不限於 IL-1β；IL-6；IL-6R；PDGF (例如，PDGF-BB)；血管生成素；血管生成素 2；Tie2；S1P；整合素 αvβ3、αvβ5 及 α5β1；β 細胞素；apelin/APJ；紅血球生成素；補體因子 D；TNFα；HtrA1；VEGF 受體 (例如，VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、mbVEGFR 或 sVEGFR)；ST-2 受體；以及在基因上與年齡相關性黃斑退化 (AMD) 風險關聯之蛋白質，諸如補體途徑成分 C2、因子 B、因子 H、CFHR3、C3b、C5、C5a 及 C3a；HtrA1；ARMS2；TIMP3；HLA；IL-8；CX3CR1；TLR3；TLR4；CETP；LIPC；COL10A1；以及 TNFRSF10A。例如，於一些情況下，該另外化合物為雙特異性抗體 (例如，抗 VEGF/抗 Ang2 雙特異性抗體，諸如 RG-7716 或 WO 2010/069532 或 WO 2016/073157 中揭露之任意雙特異性抗 VEGF/抗 Ang2 雙特異性抗體或其變異體)。
可與抗 Tie2 共軛物及/或其聚合性調配物聯合投予以用於治療眼部病症 (例如，DME、DR、AMD、RVO 或 GA) 的其他合適抗血管生成劑包括皮質類固醇、血管生成抑制性類固醇、醋酸阿奈可他、血管抑素、內皮抑素、酪胺酸激酶抑制劑、基質金屬蛋白酶 (MMP) 抑制劑、似胰島素生長因子結合蛋白 3 (IGFBP3)、源自基質細胞之因子 (SDF-1) 拮抗劑 (例如，抗 SDF-1 抗體)、源自色素上皮細胞之因子 (PEDF)、似 γ-分泌酶 δ 配體 4、整合素拮抗劑、缺氧誘導因子 (HIF)-1α 拮抗劑、蛋白質激酶 CK2 拮抗劑、抑制位於新血管形成位點處之幹細胞 (例如，內皮祖細胞) 的藥物 (例如，抗血管內皮鈣黏蛋白 (CD-144) 抗體及/或抗 SDF-1 抗體) 及其組合。
於進一步之實例中，於一些情況下，Tie2 結合共軛物及/或其聚合性調配物可與具有抗新血管形成活性之藥物聯合投予以用於治療眼部病症 (例如，DME、DR、AMD、RVO 或 GA)，該藥物為諸如抗炎藥物、哺乳動物靶向之雷帕黴素 (mTOR) 抑制劑 (例如，雷帕黴素、AFINITOR® (依維莫司 (everolimus)) 及 TORISEL® (西羅莫司 (temsirolimus)))、環孢素、腫瘤壞死因子 (TNF) 拮抗劑 (例如，抗 TNFα 抗體或其抗原結合片段 (例如，英夫利昔單抗、阿達木單抗、賽妥珠單抗 (certolizumab pegol) 及戈利木單抗) 或可溶性受體融合蛋白 (例如，依那西普 (etanercept)))、抗補體藥物、非類固醇抗炎藥物 (NSAID) 或其組合。
於再進一步之實例中，於一些情況下，Tie2 結合共軛物及/或其聚合性調配物可與神經保護性藥物聯合投予，該藥物可有效地減低乾性 AMD 到濕性 AMD 之進展，諸如被稱為「神經類固醇類」之一類藥物，其包括藥物諸如去氫表雄固酮 (DHEA) (商標名：PRASTERA™ 及 FIDELIN®)、去氫表雄固酮硫酸酯及孕烯醇酮硫酸酯。
任意合適之 AMD 治療劑可作為另外治療劑與本發明之 Tie2 結合共軛物及/或其聚合性調配物聯合投予以治療眼部病症 (例如，DME、DR、AMD、RVO 或 GA)，包括但不限於，VEGF 拮抗劑，例如，抗 VEGF 抗體 (例如，LUCENTIS® (蘭尼單抗 (ranibizumab),)、RTH-258 (以前名為 ESBA-1008，一種抗 VEGF 單鏈抗體片段；Novartis) 或雙特異性抗 VEGF 抗體 (例如，抗 VEGF/抗血管生成素 2 雙特異性抗體諸如 RG-7716；Roche))、可溶性 VEGF 受體融合蛋白 (例如，EYLEA® (阿柏西普))、抗 VEGF DARPin® (例如，阿比西帕聚乙二醇 (abicipar pegol)；Molecular Partners AG/Allergan) 或抗 VEGF 適體 (例如，MACUGEN® (哌加他尼鈉))；源自血小板之生長因子 (PDGF) 拮抗劑，例如，抗 PDGFR 抗體 (例如，REGN2176-3)、抗 PDGF-BB peg 化適體 (例如 FOVISTA®；Ophthotech/Novartis)、可溶性 PDGFR 受體融合蛋白或雙重 PDGF/VEGF 拮抗劑 (例如，小分子抑制劑 (例如，DE-120 (Santen) 或 X-82 (TyrogeneX)) 或雙特異性抗 PDGF/抗 VEGF 抗體))；與光動力治療合用之 VISUDYNE® (維替泊芬)；抗氧化劑；補體系統拮抗劑，例如，補體因子 C5 拮抗劑 (例如，小分子抑制劑 (例如，ARC-1905；Opthotech) 或抗 C5 抗體 (例如，LFG-316；Novartis)、備解素拮抗劑 (例如，抗備解素抗體，例如，CLG-561；Alcon) 或補體因子 D 拮抗劑 (例如，抗補體因子 D 抗體，例如，蘭帕麗珠單抗 (lampalizumab)；Roche))；C3 阻斷肽 (例如，APL-2,，Appellis)；視覺週期休試劑 (例如，依米司他鹽酸鹽 (emixustat hydrochloride))；角鯊胺 (例如，OHR-102；Ohr Pharmaceutical)；維生素及礦物質補充劑 (例如，彼等揭示於 Age-Related Eye Disease Study 1 (AREDS1；鋅及/或抗氧化劑) 及 Study 2 (AREDS2；鋅、抗氧化劑、葉黃素、玉米黃素及/或 ω-3 脂肪酸))；基於細胞之治療，例如，NT-501 (Renexus)；PH-05206388 (Pfizer)、huCNS-SC 細胞移植 (StemCells)、CNTO-2476 (臍帶幹細胞系； Janssen)、OpRegen (RPE 細胞之懸浮液；Cell Cure Neurosciences) 或 MA09-hRPE 細胞移植 (Ocata Therapeutics)；組織因子拮抗劑 (例如，hI-con1；Iconic Therapeutics)；α-腎上腺素性受體促效劑 (例如，酒石酸溴莫尼定 (brimonidine tartrate)； Allergan)；肽疫苗 (例如，S-646240；Shionogi)；類澱粉 β 拮抗劑 (例如，抗 β 類澱粉單株抗體，例如，GSK-933776)；S1P 拮抗劑 (例如，抗 S1P 抗體，例如，iSONEP™；Lpath Inc)；ROBO4 拮抗劑 (例如，抗 ROBO4 抗體，例如，DS-7080a；Daiichi Sankyo)；表現內皮抑素及血管抑素之慢病毒載體 (例如，RetinoStat) 及其組合。於一些情況下，AMD 治療劑 (包括前述任意 AMD 治療劑) 可共同調配。例如，抗 PDGFR 抗體 REGN2176-3 可與阿柏西普 (EYLEA®) 共同調配。於一些情況下，此共調配物可與本發明之 Tie2 結合劑或共軛物聯合投予。於一些情況下，該眼部病症為 DME 及/或 DR。於一些情況下，該眼部病症為 AMD (例如，濕性 AMD)。
Tie2 結合共軛物及/或其聚合性調配物可與 LUCENTIS® (蘭尼單抗) 聯合投予，以用於治療眼部病症 (例如，DME、DR、AMD、RVO 或 GA)。於一些情況下，該眼部病症為 DME 及/或 DR。於一些情況下，該眼部病症為 AMD (例如，濕性 AMD)。於一些情況下，該眼部病症為 GA。
Tie2 結合共軛物及/或其聚合性調配物可與 EYLEA® (阿柏西普) 聯合投予，以用於治療眼部病症 (例如，DME、DR、AMD、RVO 或 GA)。於一些情況下，該眼部病症為 DME 及/或 DR。於一些情況下，該眼部病症為 AMD (例如，濕性 AMD)。於一些情況下，該眼部病症為 GA。
Tie2 結合共軛物及/或其聚合性調配物可與 MACUGEN® (哌加他尼鈉) 聯合投予，以用於治療眼部病症 (例如，DME、DR、AMD、RVO 或 GA)。於一些情況下，該眼部病症為 DME 及/或 DR。於一些情況下，該眼部病症為 AMD (例如，濕性 AMD)。於一些情況下，該眼部病症為 GA。
Tie2 結合共軛物及/或其聚合性調配物可與 VISUDYNE® (維替泊芬) 及與之合用之光動力治療聯合投予，以用於治療眼部病症 (例如，DME、DR、AMD、RVO 或 GA)。於一些情況下，該眼部病症為 DME 及/或 DR。於一些情況下，該眼部病症為 AMD (例如，濕性 AMD)。於一些情況下，該眼部病症為 GA。
Tie2 結合共軛物及/或其聚合性調配物可與 PDGF 拮抗劑聯合投予，以用於治療眼部病症 (例如，DME、DR、AMD、RVO 或 GA)。可與本發明之 Tie2 結合共軛物聯合施用的示例性 PDGF 拮抗劑包括抗 PDGF 抗體、抗 PDGFR 抗體、小分子抑制劑 (例如，角鯊胺)、抗 PDGF-B peg 化適體諸如 FOVISTA® (E10030；Ophthotech/Novartis) 或雙重 PDGF/VEGF 拮抗劑 (例如，小分子抑制劑 (例如，DE-120 (Santen) 或 X-82 (TyrogeneX)) 或雙特異性抗 PDGF/抗 VEGF 抗體)。例如，FOVISTA® 可作為本發明之 Tie2 結合劑或共軛物的輔助治療而投予。OHR-102 可與 VEGF 拮抗劑諸如 LUCENTIS® 或 EYLEA® 聯合投予。於一些實施例中，本發明之 Tie2 結合劑或共軛物可與 OHR-102、LUCENTIS® 及/或 EYLEA® 聯合投予。於一些情況下，該眼部病症為 DME 及/或 DR。於一些情況下，該眼部病症為 AMD (例如，濕性 AMD)。於一些情況下，該眼部病症為 GA。
Tie2 結合共軛物及/或其聚合性調配物可與 RTH-258 聯合投予，以用於治療眼部病症 (例如，DME、DR、AMD、RVO 或 GA)。例如，RTH-258 可藉由玻璃體內注射或眼部輸注投予。於一些情況下，該眼部病症為 DME 及/或 DR。於一些情況下，該眼部病症為 AMD (例如，濕性 AMD)。於一些情況下，該眼部病症為 GA。
Tie2 結合共軛物及/或其聚合性調配物可與阿比西帕聚乙二醇聯合投予，以用於治療眼部病症 (例如，DME、DR、AMD、RVO 或 GA)。於一些情況下，該眼部病症為 DME 及/或 DR。於一些情況下，該眼部病症為 AMD (例如，濕性 AMD)。於一些情況下，該眼部病症為 GA。
Tie2 結合共軛物及/或其聚合性調配物可與阿比西帕聚乙二醇聯合投予，以用於治療眼部病症 (例如，DME、DR、AMD、RVO 或 GA)。於一些情況下，該眼部病症為 DME 及/或 DR。於一些情況下，該眼部病症為 AMD (例如，濕性 AMD)。於一些情況下，該眼部病症為 GA。
任意合適 DME 及/或 DR 治療劑可與 Tie2 結合共軛物及/或其聚合性調配物聯合投予，以用於治療眼部病症 (例如，DME、DR、DME、RVO 或 GA)，包括但不限於，VEGF 拮抗劑 (例如， LUCENTIS® 或 EYLEA®)、皮質類固醇 (例如，皮脂類故障植入物 (例如，OZURDEX® (***玻璃體內植入物) 或 ILUVIEN® (丙酮氟洛皮質醇玻璃體內植入物)) 或經調配用於藉由玻璃體內注射施用之皮質類固醇 (例如，丙酮特安皮質醇)) 或其組合。於一些情況下，該眼部病症為 DME 及/或 DR。
Tie2 結合共軛物及/或其聚合性調配物可與 LUCENTIS® (蘭尼單抗) 聯合投予，以用於治療 DME 及/或 DR (例如，NPDR 或 PDR)。
Tie2 結合共軛物及/或其聚合性調配物可與 EYLEA® (阿柏西普) 聯合投予，以用於治療 DME 及/或 DR (例如，NPDR 或 PDR)。
Tie2 結合共軛物及/或其聚合性調配物可與 OZURDEX® (***玻璃體內植入物) 聯合投予，以用於治療 DME 及/或 DR。
Tie2 結合共軛物及/或其聚合性調配物可與 ILUVIEN® (***玻璃體內植入物) 聯合投予，以用於治療 DME 及/或 DR。
於一些情況下，TAO/PRN 治療方案或 TAE 治療方案可用來投予與 Tie2 結合共軛物及/或其聚合性調配物合用之 AMD 治療劑 (例如，拉尼比珠單抗或阿柏西普)。於一些情況下，該眼部病症為 DME 及/或 DR。於一些情況下，該眼部病症為 AMD (例如，濕性 AMD)。於一些情況下，該眼部病症為 GA。
上文述及之此等聯合療法涵蓋聯合施用 (其中兩種或多種治療劑包含在同一或單獨的醫藥組成物中)，以及單獨投予，在這種情況下，本發明之 Tie2 集合共軛物的施用可在施用附加的一種或多種治療劑之前、同時及/或之後發生。於一個實施例中，Tie2 結合共軛物或聚合性調配物之投予以及另外治療劑之施用彼此於約 1、2、3、4 或 5 個月內、或約 1、3 或 4 週內、或約 1、2、3、4、5 或 6 天內發生。
進一步預期，Tie2 結合共軛物及/或其聚合性調配物用於治療青光眼。青光眼為一組以至少部分地由於眼內壓力 (IOP) 升高所致之眼睛進行性損傷為特徵的眼部疾病 (Merck Manual of Diagnosis and Therapy (1999))。另外地，青光眼之特徵為視網膜神經節細胞 (RGC) 死亡、軸突喪失以及視神經頭部之出現率提高 (Alward, "Medical Management of Glaucoma," N Eng J Med, 1998; 339:1298-1307)。可於視力喪失發生之前藉由視野測試並且藉由對視神經之檢眼鏡檢查以偵檢「杯凹」(cupping)，從而診斷青光眼。正常成年人之均值 IOP 為 15 至 16 mm Hg；正常範圍為 10 至 21 mm Hg。一種形式之青光眼管理為基於使用典型應用之藥品降低 IOP (「Glaucoma」, Lancet, 1999; 354:1803-1810)。
當前存在五個主要類別之用以降低 IOP 的藥品：β-腎上腺素性拮抗劑、腎上腺素性促效劑、擬副交感神經劑、似***素類似物及碳酸酐酶抑制劑。儘管大多數藥品為外部適用於眼睛，但它們可造成嚴重的全身性副作用並且對患者之生命品質造成負面影響。如果指示 IOP 之額外降低或如果藥品沒能成功降低 IOP，則下一步一般為雷射小梁成形術 (laser trabeculoplasty)。如果 IOP 仍未得到充分控制，則指示進行切開式青光眼手術。IOP 之降低雖然顯著減低神經元喪失之程度，但並不確保疾病進展之停止，因為 RGC 可能繼續喪失。對於 IOP 調控與醫學或手術干預後視野喪失間之關聯的近期研究顯示，如果 IOP 較低，則反映於視野測試中之持續神經元喪失可以減少。青光眼性視神經病變可能是由於 RGC 及其軸突之特異性病理生理學改變及後續死亡所致。RGC 死亡制程被認為是兩個階段之制程，主要損傷造成損害之啟動，之後為緩慢之繼發性退化，該繼發性退化可歸因於退化細胞周圍之惡劣環境。
本發明之另一態樣中提供了本發明之抗 Tie2 共軛物在藥劑的製造或製備中的用途。於一個實施例中，該藥劑用於治療眼部病症 (例如，DME、DR、AMD、RVO 或 GA)。於較佳實施例中，該藥劑用於治療 DME 及/或 DR。於進一步之實施例中，該藥劑用於治療眼部病症 (例如，DME、DR、AMD、RVO 或 GA) 的方法中，該方法包括向患有該眼部病症的個體投予有效量之藥劑。在一個此類實施例中，該方法復包括將有效量之至少一種另外治療劑 (例如下文所述) 投予至個體。於進一步之實施例中，該藥劑用於減低尤其是眼睛內之血管滲透性。於進一步之實施例中，該藥劑用於減低個體尤其是眼睛內之血管滲透性的方法中，該方法包括向該個體投予有效量之藥劑以減低血管滲透性，尤其是在眼睛內。根據上述任一實施例的「個體」可以是人。
於進一步之態樣中，本發明提供用於治療眼部病症 (例如，DME、DR、AMD、RVO 或 GA) 之方法。於一個實施例中，該方法包括向患有此類眼部病症 (例如，DME、DR、AMD、RVO 或 GA) 之個體投予有效量的本發明之 Tie2 結合共軛物。在一個該等實施例中，該方法進一步包含將有效量之至少一種額外的治療劑 (如下文所述) 投予個體。根據上述任一實施例的「個體」可以是人。
於進一步之態樣中，本發明提供用於減低個體尤其是眼睛內之血管滲透性的方法。於一個實施例中，該方法包括向個體投予有效量的本發明之 Tie2 結合共軛物以減低尤其是眼睛內之血管滲透性。在一個實施例中，「個體」為人。
於進一步之態樣中，本發明提供包含本文所提供的本發明之任意 Tie2 結合共軛物的醫藥調配物，例如用於以上任意治療方法。於一個實施例中，醫藥調配物包含本文所提供的本發明之任意 Tie2 結合共軛物及醫藥上可接受之載劑。於另一實施例中，醫藥調配物包含本文所提供的本發明之任意 Tie2 結合共軛物及至少一種另外治療劑，例如，如上文所揭示。
上面提到的此等聯合療法涵蓋聯合施用 (其中兩種或多種治療劑包含在同一或單獨的醫藥組成物中)，以及單獨施用，在這種情況下，本發明之抗體的施用可在投予附加的一種或多種治療劑之前、同時及/或之後發生。於一個實施例中，抗 Tie2 共軛物之投予及另外治療劑之投予彼此發生在約 1 個月內，或約 1、2 或 3 週內，或約 1、2、3、4、5 或 6 天內。
本發明之 Tie2 共軛物 (及任意其他治療劑) 可藉由任意合適手段投予，包括腸胃外、肺內及鼻內投予，並且如果需要局部治療，則可以採用病灶內投予。腸胃外輸注包括肌內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下投予。給藥可通過任何合適的途徑進行，例如通過注射，例如靜脈內或皮下注射，部分取決於短暫給藥還是長期投予。本文中考慮各種給藥方案，其包括但不限於在多種時間點單次或多次投予、快速注射投予和脈衝輸注。
本發明之 Tie2 結合共軛物將按照與良好醫學實踐一致的方式進行配製、給藥及投予。此背景中考慮的因素包括待治療的具體障礙、待治療的具體哺乳動物、個體患者的臨床病症、障礙的原因、遞送藥物的部位、投予方法、投予日程及醫療從業者已知的其他因素。該抗體並非必須、但可以視情況與一種或多種目前用於預防或治療所述疾病之藥劑一起配製。此等其他治療劑的有效量取決於存在於調製劑中存在的抗體量、病症或治療的類型以及上文討論的其他因素。這些通常以與本文中所述相同的劑量和投予途徑，或本文中所述劑量的約 1% 至 99%，或以經驗上/臨床上確定為適當的任何劑量和藉由任何途徑使用。
對於疾病的預防或治療，本發明之共軛物的適當劑量 (單獨使用或與一種或多種其他治療劑組合使用) 將取決於待治療的疾病的類型、抗體的類型、疾病的嚴重度和病程、為了預防或是治療的目的投予該共軛物、之前的治療、患者的臨床病史及對該抗體的反應及主治醫師的判斷。在一次或一系列的治療中適宜地對患者投予共軛物。根據疾病的類型及嚴重程度，約 1 µg/kg 至 15 mg/kg (例如，0.1 mg/kg – 10 mg/kg) 之共軛物可為例如藉由一次或多次分開投予或藉由連續輸注來對患者施用的初始候選劑量。根據上述因素，一種典型的日劑量可在約 1 µg/kg 至 100 mg/kg 或更多的範圍內。對於在幾天或更長時間內重複投予，視病症而定，治療通常將持續直至出現所需的疾病症狀抑制。共軛物之一種示例性劑量將在從 0.05 mg/kg 至約 10 mg/kg 的範圍內。因此，可以對患者投予約 0.5 mg/kg、2.0 mg/kg、4.0 mg/kg 或 10 mg/kg 中的一種或多種劑量 (或其任意組合)。此等劑量可以間歇投予，例如每週或每三週投予 (例如，使得患者接受約 2 種至約 20 種或例如約 6 種劑量之共軛物)。可以施用初始較高的負荷劑量，然後投予一種或多種較低的劑量。藉由習用技術和測定很容易監測此治療的進展
應理解，上述任意調配物及資料方法皆可使用代替本發明之 Tie2 結合共軛物或除本發明之 Tie2 結合共軛物外的本發明之免疫共軛物進行。
H. 製成品
本發明的另一方面提供包含用於治療、預防及/或診斷上述疾病的製成品。製成品包括容器及容器上或與容器相關的標籤或藥品說明書。合適的容器包括例如瓶、小瓶、注射器、IV 溶液袋等。容器可以由多種材料例如玻璃或塑膠形成。該容器可容納組合物，該組合物本身或與有效治療、預防及/或診斷疾病的另一組合物結合使用，並可能具有無菌入口 (例如，容器可為具有可藉由皮下注射針頭穿孔的塞子的靜脈內溶液袋或小管)。組合物中之至少一種活性劑為本發明之 Tie2 結合劑或共軛物。標籤或藥品說明書指示該組成物用於治療所選擇的疾病。此外，該製品可能包括 (a) 其中包含有組合物的第一容器，其中，該組合物包含本發明之 Tie2 結合劑或共軛物；及 (b) 其中包含有組合物的第二容器，其中，組合物包含其他細胞毒性或其他治療劑。本發明之此實施例中的製成品可以進一步包含指示組成物可以用於治療具體疾病的藥品說明書。可替代地或另外地，製品可以進一步包含第二 (或第三) 容器，該容器包含醫藥上可接受之緩衝劑，諸如抑菌注射用水 (BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、Ringer 溶液及葡萄糖溶液。從商業和使用者的角度來看，它可以進一步包含其他材料，其中包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針頭和注射器。
應理解，上述任意製品皆可包括代替 Tie2 結合共軛物或除 Tie2 結合共軛物外的本發明之免疫共軛物。
Ⅰ 本發明之具體實施例
下文中列述本發明之具體實施例。 1.一種特異性結合至 Tie2 之經分離抗體或其片段，其中該抗體包含： 重鏈可變域 (VH)，該重鏈可變域包含 (a) CDR-H1，其包含胺基酸序列 NTDIS (SEQ ID NO: 3)，(b) CDR-H2，其包含胺基酸序列 RISPSDGNTYYADSVKG (SEQ ID NO:4)，及 (c) CDR-H3，其包含胺基酸序列 RTRWASX1AX2DY (SEQ ID NO:5)，其中 X1 為 M、L、K、F、Y、R、N、Q、H 或 W 及/或 X2 為 F、Y、L、Q、I、K 或 H；及輕鏈可變域 (VL)，該輕鏈可變域包含 (d) CDR-L1，其包含胺基酸序列 RASQDVSTAVA (SEQ ID NO:8)，(e) CDR-L2，其包含胺基酸序列 SASFLYS (SEQ ID NO:9)，及 (f) CDR-L3，其包含胺基酸序列 QQSYTTPPT (SEQ ID NO:10)。 2.如前述實施例之抗體，其中，該 CDR-H3 包含胺基酸序列 RTRWASWAMDY (SEQ ID NO: 6)。 3.如實施例 1 之抗體，其中該 CDR-H3 包含胺基酸序列 RTRWASWAFDY (SEQ ID NO: 7)。 4.如前述實施例中任一項之抗體，其為單株抗體。 5.如前述實施例中任一項之抗體，其為人源化抗體或嵌合抗體。 6.如前述實施例中任一項之抗體，其為與 Tie2 結合之抗體片段。 7.如前述實施例中任一項之抗體，其為 Fab 片段。 10.如實施例 1 至 7 中任一項之抗體，其包含：VL 域，其包含與 SEQ ID NO: 21 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性的胺基酸序列；及 VH 域，其包含與 SEQ ID NO: 20 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性的胺基酸序列。 11.如實施例 1 至 7 中任一項之抗體，其包含：VL 域，其包含與 SEQ ID NO: 21 之胺基酸序列具有至少 96% 序列同一性的胺基酸序列；及 VH 域，其包含與 SEQ ID NO: 20 之胺基酸序列具有至少 96% 序列同一性的胺基酸序列。 12.如實施例 1 至 7 中任一項之抗體，其包含：VL 域，其包含與 SEQ ID NO: 21 之胺基酸序列具有至少 97% 序列同一性的胺基酸序列；及 VH 域，其包含與 SEQ ID NO: 20 之胺基酸序列具有至少 97% 序列同一性的胺基酸序列。 13.如實施例 1 至 7 中任一項之抗體，其包含：VL 域，其包含與 SEQ ID NO: 21 之胺基酸序列具有至少 98% 序列同一性的胺基酸序列；及 VH 域，其包含與 SEQ ID NO: 20 之胺基酸序列具有至少 98% 序列同一性的胺基酸序列。 14.如實施例 1 至 7 中任一項之抗體，其包含：VL 域，其包含與 SEQ ID NO: 21 之胺基酸序列具有至少 99% 序列同一性的胺基酸序列；及 VH 域，其包含與 SEQ ID NO: 20 之胺基酸序列具有至少 99% 序列同一性的胺基酸序列。 15.如前述實施例中任一項之抗體，其中，該抗體包含：SEQ ID NO: 21 之 VL 序列及 SEQ ID NO: 19 之 VH 序列；SEQ ID NO: 21 之 VL 序列及 SEQ ID NO: 22 之 VH 序列；或 SEQ ID NO: 21 之 VL 序列及 SEQ ID NO: 20 之 VH 序列。 16.如前述實施例中任一項之抗體，其中，該抗體包含經改造半胱胺酸。 17.如實施例 16 之抗體，其中 該經改造半胱胺酸選自 HC 中之 T120C、G166C、G178C、T187C 及 T209C；或者該經改造半胱胺酸選自 LC 中之 Q124C、R142C、Q155C、L201C、T206C、K107C、K126C 及 K149C；其中，該經改造半胱胺酸的殘基號係根據 EU 編號。 18.如實施例 16 或 17 之抗體，其中該經改造半胱胺酸選自 HC 中之 T209C 及 LC 中之 T206C。 19.如實施例 16 至 18 中任一項之抗體，其中該經改造半胱胺酸為 LC 中之 T206C。 20.如實施例 16 至 18 中任一項之抗體，其中該經改造半胱胺酸為 HC 中之 T209C。 21.如前述實施例中任一項之抗體，其包含：LC，其包含與 SEQ ID NO: 25 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性的胺基酸序列；及 HC，其包含與 SEQ ID NO: 55 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性的胺基酸序列。 22.如前述實施例中任一項之抗體，其包含：LC，其包含與 SEQ ID NO: 25 之胺基酸序列具有至少 96% 序列同一性的胺基酸序列；及 HC，其包含與 SEQ ID NO: 55 之胺基酸序列具有至少 96% 序列同一性的胺基酸序列。 23.如前述實施例中任一項之抗體，其包含：LC，其包含與 SEQ ID NO: 25 之胺基酸序列具有至少 97% 序列同一性的胺基酸序列；及 HC，其包含與 SEQ ID NO: 55 之胺基酸序列具有至少 97% 序列同一性的胺基酸序列。 24.如前述實施例中任一項之抗體，其包含：LC，其包含與 SEQ ID NO: 25 之胺基酸序列具有至少 98% 序列同一性的胺基酸序列；及 HC，其包含與 SEQ ID NO: 55 之胺基酸序列具有至少 98% 序列同一性的胺基酸序列。 25.如前述實施例中任一項之抗體，其包含：LC，其包含與 SEQ ID NO: 25 之胺基酸序列具有至少 99% 序列同一性的胺基酸序列；及 HC，其包含與 SEQ ID NO: 55 之胺基酸序列具有至少 99% 序列同一性的胺基酸序列。 26.如前述實施例中任一項之抗體，其中該抗體包含：包含 SEQ ID NO: 25 之序列之 LC 及包含 SEQ ID NO: 55 之序列之 HC。 27.如實施例 1 至 25 中任一項之抗體，其中該抗體包含：包含 SEQ ID NO: 25 之序列之 LC 及包含選自 SEQ ID NO: 89、SEQ ID NO: 90、SEQ ID NO: 91 及 SEQ ID NO: 92 之序列之 HC。 28.如實施例 1 至 20 中任一項之抗體，其包含：LC，其包含與 SEQ ID NO: 56 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性的胺基酸序列；及 HC，其包含與 SEQ ID NO: 23 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性的胺基酸序列。 29.如實施例 1 至 20 中任一項之抗體，其包含：LC，其包含與 SEQ ID NO: 56 之胺基酸序列具有至少 96% 序列同一性的胺基酸序列；及 HC，其包含與 SEQ ID NO: 23 之胺基酸序列具有至少 96% 序列同一性的胺基酸序列。 30.如實施例 1 至 20 中任一項之抗體，其包含：LC，其包含與 SEQ ID NO: 56 之胺基酸序列具有至少 97% 序列同一性的胺基酸序列；及 HC，其包含與 SEQ ID NO: 23 之胺基酸序列具有至少 97% 序列同一性的胺基酸序列。 31.如實施例 1 至 20 中任一項之抗體，其包含：LC，其包含與 SEQ ID NO: 56 之胺基酸序列具有至少 98% 序列同一性的胺基酸序列；及 HC，其包含與 SEQ ID NO: 23 之胺基酸序列具有至少 98% 序列同一性的胺基酸序列。 32.如實施例 1 至 20 中任一項之抗體，其包含：LC，其包含與 SEQ ID NO: 56 之胺基酸序列具有至少 99% 序列同一性的胺基酸序列；及 HC，其包含與 SEQ ID NO: 23 之胺基酸序列具有至少 99% 序列同一性的胺基酸序列。 33.如實施例 1 至 20 中任一項之抗體，其中該抗體包含：包含 SEQ ID NO: 56 之序列之 LC 及包含 SEQ ID NO: 90、SEQ ID NO: 91 或 SEQ ID NO: 23 之序列之 HC。 34.一種與 Tie-2 特異性結合之抗體，其中，該抗體包含：包含 SEQ ID NO: 55 之序列之 HC 及包含 SEQ ID NO: 25 之序列之 LC。 35.一種經分離之核酸，其編碼如前述實施例中任一項之抗體。 36.一種經分離之宿主細胞，其包含如實施例 38 之核酸。 37.一種製造與 Tie-2 結合之抗體的方法，其包括在適合於表現該抗體之條件下培養如實施例 39 之宿主細胞。 38.一種結合至 Tie2 之共軛物，其中，該共軛物包含至少兩種、至少三種、至少四種、至少五種、至少六種、至少七種、或至少八種如實施例 1 至 34 中任一項之抗體，其中，該等抗體中之每一者連接至多聚化部分。 39.如實施例 38 之共軛物，其中，該共軛物於體外或體內細胞測定中激活 Tie2 之磷酸化。 40.如實施例 38 或 39 之共軛物，其中，該共軛物於體外測定中造成 Tie2 蛋白含量降幅少於 25%、少於 50% 或少於 75%；或者其中，該共軛物於體外測定中並不造成 Tie-2 蛋白含量降幅超過 25%、超過 50% 或超過 75%。 41.如實施例 38 至 40 之共軛物，其中，該共軛物減低血管滲透性，如藉由體外屏障功能測定法所測定。 42.如實施例 38 至 42 中任一項之共軛物，其中，該多聚化部分包含多元醇、多肽、及/或肽。 43.如實施例 42 之共軛物，其中，該多元醇選自二聚體、四聚體、六聚體及八聚體之多臂多元醇。 44.如實施例 43 之共軛物，其中，該多臂多元醇為六聚體。 45.如實施例 43 或 44 之共軛物，其中，該多臂多元醇為八聚體。 46.如實施例 42 至 45 中任一項之共軛物，其中，該多元醇為聚乙二醇 (PEG)。 47.如實施例 42 至 45 中任一項之共軛物，其中，該多元醇透過半胱胺酸胺基酸之游離硫醇基基團與至少兩個抗體共價連接。 48.如實施例 47 之共軛物，其中，該半胱胺酸胺基酸為經改造半胱胺酸。 49.如實施例 48 之共軛物，其中，該經改造半胱胺酸位於抗體之 HC 及/或 LC 恆定區內。 50.如實施例 48 或 49 之共軛物，其中該經改造半胱胺酸選自 HC 中之 T120C、G166C、G178C、T187C 及 T209C；或者 該經改造半胱胺酸選自由以下所組成之群組：LC 中之 Q124C、R142C、Q155C、L201C、T206C、K107C、K126C、及 K149C；其中，該殘基號係根據 EU 編號。 51.如實施例 48 至 50 中任一項之共軛物，其中，該經改造半胱胺酸為 LC 中之 T206C，其中該殘基號係根據 EU 編號。 52.如實施例 48 至 50 中任一項之共軛物，其中，該經改造半胱胺酸為 HC 中之 T209C，其中該殘基號係根據 EU 編號。 53.如實施例 42 至 45 中任一項之共軛物，其中，該多元醇透過離胺酸胺基酸之游離胺基與至少一個抗體共價連接。 54.如實施例 53 之共軛物，其中，該離胺酸胺基酸位於抗體之 HC 或 LC 恆定區內，及/或該離胺酸胺基酸位於抗體之重鏈或輕鏈的 C 末端處。 55.如實施例 46 至 54 中任一項之共軛物，其中，該 PEG 具有約 500 道爾頓 (Da) 至約 300,000 Da 或約 500 Da 至約 20,000 Da 之重量平均分子量。 56.如實施例 46 至 55 中任一項之共軛物，其中，該 PEG 具有約 6000 Da 之重量平均分子量。 57.如實施例 46 至 56 中任一項之共軛物，其中，該 PEG 包含二新戊四醇六聚體或八聚體核心。 58.如實施例 46 至 57 中任一項之共軛物，其中，該 PEG 具有通式 (Ia) 之結構：
Figure 02_image001
其中，n 為整數 1 至 10；每一 m 獨立地為整數 3 至 250；每一 R1 獨立地不存在或為連接基團；且每一 R2 獨立地為氫或末端反應性基團； 其中，至少一個 R2 為末端反應性基團且與如請求項 1 至 14 中任一項之抗體共價連接。 59. 如實施例 46 至 57 中任一項之共軛物，其中，該 PEG 具有通式 (Ib) 之結構：
Figure 02_image003
其中，每一 m 獨立地為整數 3 至 250；每一 R1 獨立地不存在或為連接基團；且每一 R2 獨立地為氫或末端反應性基團； 其中，至少一個 R2 為末端反應性基團且與如請求項 1 至 14 中任一項之抗體共價連接。 60.如實施例 59 之共軛物，其中，每一 m 獨立地為整數 15 至35，較佳為約 20 至 30。 61.如實施例 43 至 60 中任一項之共軛物，其中，該共軛物係藉由將至少一個如實施例 1 至 34 中任一項之抗體與多臂多元醇共價連接而製備。 62.一種包含與 Tie-2 特異性結合之抗體的共軛物，其中，該抗體包含 SEQ ID NO: 20 之 VH 序列及 SEQ ID NO: 21 之 VL 序列，其中，該抗體與具有通式 (Ib) 之結構的聚乙二醇共價連接：
Figure 02_image003
其中，每一 m 獨立地為整數 3 至 250；每一 R1 獨立地不存在或為連接基團；且每一 R2 獨立地為氫或末端反應性基團； 其中，至少一個 R2 為末端反應性基團且與抗體共價連接。 63.如實施例 62 之共軛物，其中，m 為 10 至 200 之整數。 64.如實施例 62 或 63 之共軛物，其中，m 為 20 至 30 之整數。 65. 如實施例 58 至 64 中任一項之共軛物，其中，R1 為不存在，或者，其中，R1 選自由下列所組成之群組：
Figure 02_image020
；
Figure 02_image022
；
Figure 02_image024
；
Figure 02_image026
；
Figure 02_image028
；
Figure 02_image030
；
Figure 02_image032
；
Figure 02_image034
；
Figure 02_image036
；
Figure 02_image005
；
Figure 02_image039
；
Figure 02_image041
；
Figure 02_image043
；
Figure 02_image045
；及
Figure 02_image047
；及其組合；其中每一 i 獨立地為整數 0 至 10；j 為整數 0 至 10；且 R2 為選自由以下所組成之群組的末端反應性基團：硫醇反應性基團、胺基反應性基團、及其組合。 66.如實施例 58 至 65 中任一項之共軛物，每一 R2 獨立地選自由下列所組成之群組：馬來醯亞胺、硫醇基、硫醇、三氟甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、吖[口+元]、過氧化物、吡啶基二硫化物、琥珀醯亞胺基酯、-NH2 、醛、鹵代乙酸酯、鹵代乙醯胺、及對硝基苯基碳酸酯。 67.如實施例 58 至 66 中任一項之共軛物，其中，R2 為馬來醯亞胺。 68.如實施例 43 至 67 中任一項之共軛物，其中，該共軛物係藉由將至少一個如請求項 1 至 34 中任一項之抗體與多臂多元醇共價連接而製備。 69.一種醫藥組成物，其包含根據實施例 38 至 68 中任一項之共軛物以及醫藥上可接受之載劑。 70.根據實施例 69 之醫藥組成物，其中該共軛物之濃度為約 50 mg/ml 至約 300 mg/ml。 71.根據實施例 69 或 70 之醫藥組成物，其復包含另外治療劑。 72.根據實施例 71 之醫藥組成物，其中該另外治療劑選自由下列所組成之群組：VEGF 拮抗劑、 Ang2 拮抗劑、HtrA1 拮抗劑、及 IL33 拮抗劑、補體成分拮抗劑、及第二 Tie2 促效劑。 73.根據實施例 72 之醫藥組成物，其中，該 VEGF 拮抗劑選自由 VEGF 捕捉劑及抗 VEGF 抗體所組成之群組。 74.一種用於經眼遞送之長效遞送裝置，其包含根據實施例 79 至 73 之醫藥組成物及用於將該組合物經玻璃體內遞送至患者的構件，其中該組合物在原位長時間保持有效。 75.一種治療有需要之受試者之 Tie2 路徑介導之病症的方法，其包括向該受試者投予有效量之如實施例 1 至 34 中任一項之抗體、如實施例 38 至 68 中任一項之共軛物、或如實施例 69 至 73 中任一項之醫藥組成物。 76.如實施例 75 之方法，其中，該 Tie2 路徑介導之病症為血管滲透性疾患。 77.如實施例 75 或 76 之方法，其中，該 Tie2 路徑介導之病症為眼睛疾病。 78.如實施例 77 之方法，其中，該眼睛疾病選自糖尿病性黃斑水腫 (DME)、糖尿病性視網膜病變、年齡相關性黃斑退化 (AMD) (包括乾性及濕性 (非滲出性及滲出性) 形式)、脈絡膜新血管形成 (CNV)、眼色素層炎、缺血相關性視網膜病變、病理性近視、逢希伯-林道病 (von Hippel-Lindau disease)、眼睛組織胞漿菌病、視網膜中央靜脈阻塞 (CRVO)、角膜新血管形成、青光眼、及視網膜新血管形成。 79.如實施例 75 至 78 中任一項之方法，其中，該眼睛疾病為 DME。 80.如實施例 75 至 79 中任一項之方法，其中，該方法包括使用可植入端口遞送系統投予抗體、共軛物或醫藥調配物。 81.如實施例 75 至 79 中任一項之方法，其中，該方法包括藉由靜脈內投予來投予抗體、共軛物或醫藥調配物。 82.如實施例 81 之方法，其中，該靜脈內投予透過窄口徑針進行。 83.如實施例 82 之方法，其中，該窄口徑針為約 30、29、28、27、26、25、24、23 或 22 號。 84.如實施例第 75 項至第 83 項中任一項之方法，其進一步包含將另外治療劑投予該個體。
Ⅲ 實例
以下為本發明之方法和組成物的實例。應當理解，鑒於上文給出的一般描述，可以實施各種其他實施例。
實例 1 – 源自天然噬菌體庫之抗 Tie 2 抗體的生成
與 Tie2 之細胞外域 (ECD) 結合的抗體初始為選自噬菌體展示合成抗體庫，該庫係藉由如下文所揭示將合成多樣性引入重鏈 CDR 內之溶劑曝露位置處而於單一人骨架上構建。針對 ECD 以及 ECD 之多種子域而篩查噬菌體。
用於庫構造之噬菌質體
噬菌質體 pV0350-2b 及 pV0350-4 設計為用以分別將 Fab 模板單價地或二價地展示於 M13 噬菌體顆粒之表面上。Fab 模板為基於 h4D5 抗體，該抗體為人源化抗體，其識別被稱為 Her-2 (erbB2) 之癌症相關抗原。h4D5 序列藉由聚合酶連鎖反應使用 humAb4D5 版本 8 (「humAb4D5-8」) 序列獲得 (Carter 等人，(1992) PNAS 89:4285-4289)。h4D5 核酸序列編碼來自小鼠單株抗體的經修飾 CDR 區，該單株抗體具有對於人類共通序列 Fab 骨架中之 Her-2 的特異性。詳而言，該序列含有位於 VH 及 CH1 域 (HC 區) 上游之 κ 輕鏈 (LC 區)。作成抗 Her-2 抗體之方法以及可變域序列之一致性提供於美國專利第 5,821,337 號及第 6,054,297 號中。
藉由在 phoA 啟動子之控制下修飾先前所揭示的業經用於人生長激素 (hGH) 之噬菌體展示的噬菌質體 (pHGHam-gIII)，構造載體 pV0350-2b。編碼 stII 分泌訊號序列的以及與 M13 次要外殼蛋白 P3 (cP3) 之 C 端域融合之 hGH 的 phGHam-gIII 中之開讀框被替換為含有兩個開讀框之 DNA 片段。第一開讀框編碼 h4D5 輕鏈 (版本 8)，而第二開讀框編碼與 cP3 融合之 h4D5 重鏈的可變域 (VH) 及第一恆定域 (CH1)；每一蛋白質藉由 N 端 stII 訊號序列引導分泌。位於重鏈片段與 cP3 之間的琥珀終止密碼子 (amber stop codon) 被刪除，因為業經證明這一修飾增加展示於噬菌體上之 Fab 水準。將表位標籤添加到 h4D5 輕鏈之 C 端 (gD 標籤)。用於雙價展示之載體 (pV0350-4) 與 pV0350-2b 相同，但將編碼 GCN4 白胺酸拉鏈之 DNA 片段***重鏈 CH1 結構域 cP3 直接，如所揭示者。於兩種噬菌質體中在三個位置處進一步修飾輕鏈基因，以編碼最常見於天然抗體序列之 Kabat 資料庫中的胺基酸；詳而言，將 Arg66 改變為 Gly，並且將 Asn30 及 His91 改變為 Ser。發現此等改變增加 Fab 於噬菌體上之表現及展示。使用 Kunkel 等人之方法執行定點誘變 (Kunkel, J. D., 等人，(1987) Methods Enzymol 154:367-82)。
如所揭示者，使用寡核苷酸定點誘變及 pV0350-2b 或 pV0350-4 之「終止模板」生成噬菌體展示庫 (Lee, C.V., 等人，(2004) J. Immunol. Methods 284:119-132；Lee, C.V., 等人，(2004) JMB 340:1073-1093)。終止密碼子 (TAA) 包埋於全部三個重鏈 CDR 中。此等於誘變反應過程中由簡併退化寡核苷酸之混合物修復，該等寡核苷酸於編碼 CDR-H1、CDR-H2 及 CDR-H3 之序列上退火，並且將位於被選擇進行隨機化之位置處的密碼子替換為定制之簡併密碼子。誘變反應為電穿孔於大腸桿菌 SS320 細胞內，並且令培養物於 30℃ 在以h KO7 輔助噬菌體、50 g/ml 之卡本西林及 50 g/ml 之康黴素補充的 2YT 培養液中生長過夜。如所揭示者，藉由使用 PEG/NaCl 沉澱而從培養基中收穫噬菌體 (Sidhu, S.S. 等人，(2000), Methods Enzymol. 328:333-363)。每一電穿孔反應使用 ~1011 個大腸桿菌細胞以及 ~10 ug 之 DNA，並且導致 1×109–5×109 個轉形體。
使用定制之簡併寡核苷酸作成特殊庫以模擬 CDR-H1 己基 CDR-H2 之天然多樣性 (如上之 Lee, C.V, 等人，(2004), JMB 中之表 1)：具有 Fab.zip 模板之庫 3 (Lib-3)。參閱，如上之 Lee, C.V, 等人，(2004) 中揭示之 Lib-3。將用於 CDR-H1 及 CDR-H2 之兩個至四個寡核苷酸合併以增加天然多樣性之覆蓋率。Lib-3 使用分別用於 CDR-H1 及 CDR-H2 之寡核苷酸 H1a 及 H1b (比率 2:1) 及 H2a-c (比率 1:2:0.1) (參閱，如上之 Lee, C.V. 等人 (2004), JMB 之表 1，關於寡核苷酸之描述)。
對於 CDR-H3 中之位置 95–100，Lib-3 由一組具有經擴張之 CDR-H3 長度的包含 NNS 密碼子 (或 NNK 密碼子) 或 NNS 密碼子之經修飾版本 (XYZ 密碼子) 的庫組成，該等庫在密碼子三聯體之每一位置處含有不相等的核苷酸比率。NNS 密碼子涵蓋 32 個密碼子並且編碼全部 20 種胺基酸。X 含有 38% G、19% A、26% T 及 17% C；Y c含有 31% G、34% A、17% T 及 18% C；以及 Z 含有 24% G 及 76% C。關於 Lib-3 之 CDR-H3 設計揭示於如上之 Lee, C.V. 等人，(2004) 之表 5 中。對於每一 CDR-H3 長度執行獨立之誘變反應並且進行電穿孔，但對於 7 個及 8 個殘基之長度一起進行電穿孔。
每一庫中之完全 Fab 的噬菌體展示水準係藉由量測 48 種隨機拾取之殖株與抗 gD 抗體的結合而檢查。對於 Lib-3，針對不同之 CDR-H3 長度觀察到相似之展示水準，但合併有最長 CDR-H3 (15–19 個殘基) 之庫具有減低的 Fab 展示殖株之百分比 (15–30%)。這可能反映了當使用超長合成寡核苷酸時減低之誘變效率。
噬菌體分選
針對多種 Tie2 細胞外域 (ECD) 蛋白質，對上揭之 Lib-3 進行分選。Tie2 ECD 由下列構成：從膜遠端到膜近端，3 個 IgG 域 (Ig1 及 Ig2)、3 個 EGF 域 (EGF1-3)、第三 IgG 域 (Ig3) 以及 3 個纖維接合素第 III 型域 (FN3) (參閱，例如，圖 1)。生成構造體以編碼全細胞外域 (ECD)、膜近端 FN3 域或不具有 FN3 域之 ECD (稱為 ECD5)。因此，配體結合域 Ig2 由 ECD 構造體及 ECD5 構造體兩者編碼，但不由 FN3 構造體編碼。所編碼之蛋白質在 C 端融合至 hIgG1 (對於人及食蟹獼猴蛋白質) 或 mIgG2a (對於鼠及大鼠蛋白) 之 Fc 區域或融合至 C 端 Flag 標籤 (對於所有物種)。圖 1 例示了用於淘選的蛋白質。亦使用兩種 C 端 Fc 融合體或 Flag 標籤生成用於人、鼠及大鼠 Tie1受體之全 ECD 構造體。
Tie2 ECD 蛋白質之表現及純化
從中國倉鼠卵巢 (CHO) 細胞條件化培養基中表現並純化經 flag 標籤化之 Tie2 ECD。於 11-14 天之後，收穫該條件化培養基並濃縮大約十倍。將濃縮物加載到抗 flag-標籤管柱上，並且用結合緩衝液洗滌，該緩衝液含有 25 mM TRIS、150 mM NaCl、1mM EDTA、 0.1% Triton X-114 及 0.1% Triton X-110，pH 7.5、。然後，經 flag 標籤化之蛋白質用 pH 3.0 的 50 mM N 檸檬酸鹽及 150 mM NaCl 溶析，然後使用 1 M 精胺酸、pH 9.0 的 400 mM 琥珀酸中和至 pH 5.0。將經溶析之蛋白質加載到處於磷酸鹽緩衝鹽水中之尺寸排阻管柱 (Superdex 200 或 Superdex 75) 上並收集級分；將單體峰級分合併，濃縮，並進行 0.2 um 過濾。
對於淘選，於 4℃，用處於 PBS 中之標靶 Tie2 抗原 (5 ug/ml) 以 100 ul/孔將 96 孔 Nunc Maxisorp 板包被過夜。用 65 ul 1% 阻斷蛋白質將該板阻斷 30 分鐘 (min)，並且用 40 ul 1% Tween20 再阻斷 30 min (阻斷蛋白質：第 1 輪：牛血清白蛋白 (BSA)；第 2 輪：酪蛋白；第 3 輪：牛血清白蛋白 (BSA)；第 4 輪：酪蛋白)。之後，用具有 0.1% 土溫 20 的 1% BSA 將噬菌體庫稀釋至 ~ 3-5 OD/ml (1 OD = 1.13 x 1013 個噬菌體/ml)。通常，噬菌體輸入為：第 1 輪 3-5 OD/ml，第 2 輪 3 OD/ml，第 3 輪 ~ 0.5 - 1 OD/ml 及第 4 輪 ~ 0.1 - 0.5 OD/ml。將經稀釋之噬菌體於室溫孵化 30 min。用 PBS 及 0.05% 土溫 20 將該等孔連續洗滌至少 5 次。於室溫，將經阻斷之噬菌體庫以 100 ul/孔添加到 8 個經標靶抗原包被之孔及 2 個未包被之孔，添加時間為 2 小時 (hr)。用 PBS 及 0.05% 土溫 20 將該等板連續洗滌至少 10 次。從淘選之第 3 輪開始，將 1uM 奧瑪珠單抗作為含無關 Fc 之蛋白質、Tie2.ECD5、或抗體抗 Tie2.20 (配體阻斷) 添加到噬菌體庫中，添加時間一小時，然後將混合物施加到經 Tie2 包被之孔上，結合 2 hr。用 100 ul/孔之100 mM HCl 於室溫將噬菌體稀釋 20 min。將經稀釋中噬菌體 (來自經包被之孔) 及背景噬菌體 (來自未包被之孔) 收集到獨立之管中。藉由添加 1/10 體積 1 M Tris pH 11.0 到兩個管中而中和經稀釋之收集物。將 BSA 以 0.1% 之最終濃度添加到經稀釋之噬菌體的管中。為了評定噬菌體之效價，將 90 ul 之對數期 XL-1 (OD 600 nm ~0.1 - 0.3) 用 10 ul 經稀釋之噬菌體或背景噬菌體在 37℃ 感染 30 min。之後，用 90 ul 2YT 將經感染之細胞以 10 倍增量進行連續稀釋。將經感染之細胞的 10 ul 等量小樣鋪板於卡本西林板上。
為了在淘選輪次之間傳播噬菌體，使用大約 400ul 的經稀釋之噬菌體於 37℃ 將 ~4 ml 對數期 XL-1 (OD 600 nm ~0.1 - 0.3) 感染 30 - 45 min。於 37℃，將輔助噬菌體 KO7 及卡本西林以 1 x 1010 pfu/ml KO7 及 50 ug/ml 卡本西林之最終濃度添加到感染中，添加時間一小時。令培養物於最終體積為 20~25 ml 的具有卡本西林 50 ug/ml 及 50 ug/ml 康黴素的 2YT 培養基中生長，於 37℃ 生長 4 hr 並且於 30℃ 生長過夜 (或至少 18 hr)。次日，藉由將細胞以 8000 rpm 旋轉沉降 10 min 而純化庫噬菌體。收集上澄液。以 1/5 之上澄液體積添加 20% PEG/2.5M NaCl，混合，並於冰上靜置 5 min。將噬菌體以 12000 rpm 離心成球丸 15 min。球丸再次以 5000 rpm 旋轉 5 min。將球丸再懸浮於 1 ml PBS 中並且以 12000 rpm 旋轉沉降 15 min 以澄清碎片，並添加 PEG/NaCl 進行沉澱。將噬菌體球丸再懸浮於 PBS 中。於 268 nm 讀取再懸浮之噬菌體球丸的 OD。
篩查性 ELISA 測定法
藉由 ELISA 對來自第四輪之殖株進行 Tie2 結合及特異性的篩查。藉由使用 Tie2 蛋白質或無關蛋白質以 65 ul/孔 (1 ug/ml，在包被緩衝液中) 於 4℃ 將 96 孔微量滴定板之孔包被過夜，執行篩查性 ELISA。於 96 管板中，令來自第四輪之殖株於 37℃ 在具有 50 ug/ml 卡本西林及輔助噬菌體 KO7 的 400 ul 2YT 培養基中生長過夜。將該等板以 3000 rpm 旋轉沉降 10 min。將 30 ul 之培養物上澄液與 60 ul 之 ELISA 緩衝液 (PBS，具有 0.5% BSA 及 0.05% Tween20) 一起添加到經 Tie2 包被之板中，並且於室溫孵化 1 hr。將板用 PBS - 0.05% Tween20 及 100 ul/孔之辣根過氧化物酶 (HRP) 共軛之抗 M13 抗體 (1/5000 稀釋於 PBS 加上 0.5% BSA 及 0.05% Tween20 中) 於室溫洗滌 30 min (Sidhu 等人，見上文)。用 PBS - 0.05% Tween20 洗滌該等孔，然後將 100 ul/孔的 1:1 比率之 3,3',5,5'-四甲基聯苯胺 (TMB) 過氧化物酶受質及過氧化物酶溶液 B (H2 O2 ) ((Kirkegaard­Perry Laboratories (Gaithersburg, MD)) 添加到每孔中，並且於室溫孵化 5 min。藉由添加 100 ul 1M 磷酸 (H3 PO4 ) 到每孔中而終止反應，並使用標準 ELISA 讀板器於 450 nm 測定該等孔之 OD。
進一步分析具有與上述背景結合之 Tie2 並且具備 Tie2 結合物種特異性及與含無關 Fc 之蛋白質之低結合的殖株 (奧瑪珠單抗)。下表 2 至 5 匯總了結合資料。表 2 至 5 中無一顯示結合至奧馬珠單抗。
表 2
ELISA 篩查- 結合至
Ab 所淘選之蛋白質 huECD5 mECD5 huFN3 mFN3
Tie2.1 huECD5.Fc +++ +++    
Tie2.2 huECD5.Fc +++ -    
Tie2.3 huECD5.Fc +++ +++    
Tie2.4 huECD5.Fc +++ +++    
Tie2.5 huECD5.Fc +++ +++    
Tie2.6 huECD5.Fc +++ +++    
Tie2.7 huECD5.Fc +++ -    
Tie2.8 huECD5.Fc +++ +/-    
Tie2.9 huECD5.Fc +++ ++    
Tie2.10 huECD5.Flag +++ +++    
Tie2.11 huECD5.Flag +++ -    
Tie2.12 huECD5.Flag +++ +++    
Tie2.13 huECD5.Flag +++ +++    
Tie2.14 hFN3.fc     +++ -
Tie2.15 hECD5.Flag +++ +++    
Tie2.16 hECD5.Flag +++ -    
Tie2.17 hFN3.Fc     +++ -
Tie2.18 mECD5.Fc +++ +++    
Tie2.19 mECD5.Fc +++ +++    
Tie2.20 mECD5.Fc +++ +++    
表 3
ELISA 篩查- 結合至
Ab 所淘選之蛋白質 hFullECD mFullECD
Tie2.21 hfull.Flag +++ +++
Tie2.22 hECD5.Flag +++ +++
Tie2.23 hECD5.Flag +++ +++
Tie2.24 hECD5.Flag +++ +++
Tie2.25 hECD5.Flag +++ +++
Tie2.26 hECD5.Flag +++ ++
Tie2.27 mFN3.Fc - +++
表 4
ELISA 篩查- 結合至
Ab 所淘選之蛋白質 hFull.Fc mFull.Fc rFull.Fc
Tie2.28 hfull.Fc +++ ++ +++
Tie2.29 hfull.Fc +++ +++ +++
Tie2.30 hfull.Fc +++ +++ +++
Tie2.31 hfull.Fc +++ +++ +++
Tie2.32 hfull.Fc +++ +++ +++
Tie2.33 hfull.Fc +++ +++ +++
Tie2.34 rfull.Fc-ECD5 +++ +++ +++
Tie2.35 mfull.Fc +++ +++ +++
Tie2.36 mfull.Fc +++ +++ +++
Tie2.37 mfull.Fc-ECD5 +++ +++ +++
Tie2.38 mfull.Fc-aTie2.20 +++ +++ +++
表 5
ELISA 篩查- 結合至
Ab 所淘選之蛋白質 hFullECD rFull.ECD hFN3 rECD5
Tie2.39 mful.Fc-aTie2.20 +++ +++
Tie2.40 mful.Fc-aTie2.20 +++ +++
Tie2.41 mful.Fc-aTie2.20 +++ +++
Tie2.42 mful.Fc-aTie2.20 ++ +++ +++
Tie2.43 rfull.Fc-ECD5 +++ +++ +++
Tie2.44 rfull.Fc-ECD5 - +++ - +++
Tie2.45 rfull.Fc-ECD5 +++ +++ ++
Tie2.46 rfull.Fc-ECD5 - +++ - +++
Tie2.47 rfull.Fc-ECD5 - +++ - +++
Tie2.48 rfull.Fc-aTie2.20 +++ +++ +++
Tie2.49 rfull.Fc-aTie2.20 +++ +++ +++
Tie2.50 rfull.Fc-aTie2.20 +++ +++ +++
Tie2.51 rfull.Fc-aTie2.20 - +++ - +++
Tie2.52 rfull.Fc-aTie2.20 +++ +++ +++
抗 Tie2 IgG 表現及純化
將上文鑑定之具有所欲物種特異性及低無關蛋白質結合的陽性結合劑測序，並且將抗 Tie2 重鏈之可變域轉殖到先前涉及用於在哺乳動物細胞內進行短暫的人 IgG1 表現的載體中。(Lee 等人，2004a)。
使用由上文生成之構造物編碼的重鏈及 4D5 輕鏈 (SEQ ID NO: 25) 進行 293 短暫的轉染，從而表現所得抗 Tie2 人 IgG。使用蛋白質 A 親和力層析術將 IgG 從轉染上澄液中純化，並藉由 ELISA 針對 Tie2 結合證實、Tie1 結合及表位譜進行篩查。八種抗體未進一步分析，因為 hIgG 蛋白質或未表現或表現極差。
實例 2 – 源自噬菌體庫之抗 Tie 2 抗體的生成
Tie2 結合
為了證實藉由抗 Tie2 抗體進行之 Tie2 結合，使用 ELISA 型式，其中，於 4℃，將被構造為如上所述之 IgG1 型式的Tie2 細胞外構造體以 2 ug/ml 在 65 ul PBS 中在 Maxisorp 免疫板上固定過夜。將抗 Tie2 IgG 之連續稀釋物施加到具有經固化之 Tie2 的板上，該板先前業經使用 1% BSA 於 PBS 中之溶液阻斷並於室溫孵化 20 min。洗滌該板，並使用上述方法用抗 huFC 共軛之 HRP 二級抗體偵檢。圖 2A 及圖 2B 顯示多種殖株與人 Tie2 ECD 之結合。
亦使用經固定化之 Tie1 蛋白質使用結合 ELISA 來評估 Tie1 結合。提供於圖 3A 及圖 3B 中之結果顯示若干種抗 Tie2 抗體與 Tie1 結合的缺乏，證明此等抗 Tie2 抗體特異性結合 Tie2。
配體阻斷
為了評估抗 Tie2 抗體之 Ang1 及 Ang2 配體阻斷活性，使用競爭性 ELISA 型式。於此測定法中，將 hAng2 (GenBank 登錄號 NP_001137) 或 hAng1 (GenBank 登錄號 NP_000450) 固定在 Maxisorp 免疫板上 (2 ug/ml)，並將經生物素化之 huTie2ECD.Fc 與具有抗 Tie2 抗體之連續稀釋物的溶液中平衡，然後用經固定化之 hAng1 或 hAng2 捕獲未結合的生物素-Tie2.ECD.Fc，並使用鏈黴親和素共軛之 HRP 偵檢。此等結果顯示，Ang1 及 Ang2 兩者至少抗 Tie2 抗體 Tie2.1、Tie2.12 及 Tie2.20 阻斷 (參閱，圖 4A 及圖 4B)。
實例 3 – 抗 Tie2 抗體之功能分析
進一步分析上文鑑定為能夠特異性結合 Tie2 之抗 Tie2 抗體，以鑑定彼等能夠發揮作為 Tie2 促效劑之功能。使用兩者皆已知表現 Tie2 之人臍靜脈內皮細胞 (HUVEC) 及大鼠主動脈內皮細胞 (RAEC)，評估具有經證實之 Tie2 結合之抗 Tie2 IgG 的功能活性 (參閱，圖 5A 及圖 5B)。
磷 -AKT (pAKT) 之刺激
執行實驗以評估抗 Tie2 抗體關於 Tie2 激活之功能。作為 Tie2 促效劑的根據本揭露之 Tie2 共軛物預期結合至並且激活 Tie2，導致下游之 AKT 酶激活。AKT 之激活可藉由 AKT 蛋白質磷酸化以產生 pAKT 而得以證明，如下文所揭示。AKT 之磷酸化係藉由使用對於經磷酸化之 AKT 具有特異性之抗體的西方墨點分析或藉由 FRET 測定法測定，如下文所揭示。
細胞及抗體：HUVEC 購自 Lonza (目錄號 CC-2517；Lonza, Ltd., Basel, Switzerland)。RAEC 購自 VEC Technologies 並且於生長培養基 (目錄號 MCDB-131 10；VEC Technologies, Inc., Rensselaer, NY) 中培養。抗 Tie2 抗體於建南德克公司  (Genentech, Inc.) (South San Francisco, CA) 製備。多株山羊抗 hIgG 用作交聯劑 (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA)。
HUVEC 之製備：HUVEC (人血管內皮細胞) 係經胰蛋白酶化並以 0.4 x105 細胞/孔在 100 µl 培養基中種植於無菌 96 孔板 (Corning® Costar®，目錄號 3997) 中，將該板於 37℃、5% CO2 孵化箱中孵化過夜。去除培養基，將 100 µL 預熱之血清飢餓培養基 (Basal Medium EndoGROTM；目錄號 SCME-BM，MilliporeSigma) 添加到該板之每一孔中。將該板於 37℃、5% CO2 孵化箱中孵化 3 hr，然後用抗 Tie2 抗體孵化。
RAEC 之製備：將 RAEC (大鼠主動脈內皮細胞) 以 12,000 個細胞/孔之密度種植在 96 孔細胞培養板中，並且於 100 µl EGM2 MV 培養基 (Lonza, Ltd.) 中在 37℃ 及 5% CO2 培養過夜。過夜培養之後，將細胞於具有 0.1% BSA 之 EBM2 基礎培養基 (Lonza, Ltd.) 中飢餓培養 3 小時，然後用抗 Tie2 抗體孵化。
為了測試交聯抗 Tie2 抗體之效應，將處於測定緩衝液 (基礎培養基 + 0.2% BSA) 中之 20 µg/ml 交聯劑 (多株山羊抗 hIgG1) 與相等體積之 60 µg/ml 抗 Tie2 二價抗體混合，並於 RT 孵化 1 hr。孵化之後，對 hIgG1 與抗 Tie2-IgG 抗體之混合物進行 3 倍連續稀釋。
為了測試其他 Tie2 抗體，將該等分子於測定緩衝液中稀釋至起始之高原液濃度 (典型為 30-1000 µg/ml)， 然後進行 (典型為 2 至 10 倍) 連續稀釋。於去除血清飢餓培養基之後，將此等稀釋物 (50 µl) 添加到每孔中，並將該板於 37℃、5% CO2 孵化 15 分鐘。去除溶液，並將含有來自磷-AKT1/2/3 Ser473 細胞套組 (目錄號 64AKSPEH；Cisbio, Codolet, France) 之阻斷緩衝液的 50 µl 裂解緩衝液添加到細胞中。於輕柔搖動下，將該板於室溫孵化約 30 min 至 45 min，於 -80℃ 保存直到使用為止，或直接用於 FRET 測定中。
西方墨點測定法：將 HUVEC 細胞以 1 x 106 個細胞/孔鋪板於 Endogro 培養基中，並且於 37℃ 孵化 16-18 小時。 將培養基改變為 0.1% BSA Endogro 基礎培養基，持續時間為 4-5 小時，然後進行刺激。將細胞於 37℃ 用相關 Tie-2 促效劑孵化 30 min，用 pH 7.4 的冷磷酸鹽緩衝鹽水洗滌三次。將細胞置於冰上並且用含有 Roche 完全蛋白酶及磷酸酶抑制劑 (Thermo Scientific，目錄號 1861281) 的 100 ul/孔之 RIPA 緩衝液 (Sigma，目錄號 20-188) 孵化 5 min。使用細胞刮棒從孔中收穫裂解液，並以 17,800 x g 離心 10 min。藉由 SDS-PAGE (8% NuPAGE Bis-Tris (Invitrogen, NW800085)) 評估上澄液，然後轉移至硝化纖維素膜。 將膜於室溫用處於 TBS-T 中之 5% BSA 阻斷 1 hr，並且使用兔抗 pAKT (Cell Signaling Technologies，目錄號 9271S) 於阻斷緩衝液中探查。用 TBS-T 洗滌 4 次之後，用 HRP 抗兔 Ig (1:10,000) (GE Healthcare，NA934V) 於 RT 對膜探查 1 hr。將膜用 TBS-T 洗滌 3 次，並且用 ECL 試劑 (Thermo Scientific，32132) 於室溫孵化 5 min，然後將墨點曝露於膜上。
FRET 測定法：將細胞裂解物 (15 µl) 於冰上融化，然後在 384 孔微量板 (目錄號 784080；Greiner Bio-One North America, Inc., Monroe, NC) 中與 5 µl 的來自磷-AKT Ser473 套組之每一磷-AKT d2 抗體及磷-AKT 穴狀化合物 (Cryptate) 抗體的 1:40 稀釋物混合，並將該板於室溫孵化 4 hr 或於 4℃ 孵化過夜，並且在 CLARIOstar (BMG LABTECH，軟體版本：5.01 R2) 上於 620 nm 及 665 nm 讀取。對於每一個體孔，資料係計算為接納者與供者發射訊號之比率乘以 104。
於一試圖鑑定抗 Tie2 抗體能夠激活 Tie2 活性之嘗試中，如上文詳細鑑定之結合 Tie-2 的抗體係型式化為人 IgG1 (hIgG1) 抗體並且測試其刺激 AKT 磷酸化 (以生成 pAKT) 的能力，該磷酸化位於 Tie2 激活之下游。使用下列重組抗 Tie2 抗體 (hIgG1) 測試 RAEC：Tie2.1、Tie2.4、Tie2.5、Tie2.16 及 Tie.2.20，測試時間 10 分鐘。對細胞裂解液進行 pAKT 之西方墨點 (WB) 分析。圖 6A 顯示，於這一機遇細胞之體外測定中，抗 Tie2 抗體 Tie2.1 及 Tie2.20 之孵化增加了 AKT 磷酸化，並且 Tie2.1 具有比 Tie2.20 更強之 Tie2 促效劑效應。
之後，執行實驗以評估交聯在抗 Tie2 抗體之促效劑活性上的效應。於 pAKT 測定中，用 Tie2.1 或 Tie2.20 孵化抗 hIgG1交聯抗體。如圖 6B 中所示，Tie2.1 之交聯進一步增加了其激活 Tie2 之能力，如藉由增加之 AKT 磷酸化所測定。
於一試圖鑑定另外促效性抗 Tie2 抗體之嘗試中，亦使用了基於 HTRF 之測定 (Cisbio)。將 RAEC 用重組抗 Tie2 抗體 (hIgG1) 處理 10 分鐘。對細胞裂解液進行 pAKT 之 HTRF 分析 (cisbio)。如圖 7A 中所示，發現顯著增加 pAKT 水準 (用作 Tie2 促效劑) 之抗體至少包括 Tie2.24、Tie2.31、Tie2.32、T2.33、Tie2.38 及 Tie2.1，其中 Tie2.1 具有強活性。
咸認為，當被 Tie2 IgG (全長) 抗體結合時之 Tie2 激活水準可能部分地由於反應混合物內 IgG 分子之非特異性聚集所致。如圖 7B 中所示，與具有較低百分比 (例如，0.15%) 之聚集體的 Tie2.1 抗體製劑相比，具有較高百分比 (例如，3.5%) 之聚集體的 Tie2.1 抗體製劑展現更強之促效活性。圖 7B 復顯示，交聯抗 hIgG1 增強了 Tie2.1 之促效活性。不受縛於理論，咸信，Tie2 被抗 Tie2 促效劑抗體激活可能受到 Tie2 結合抗體之交聯的促進。
實例 4 – 源自天然噬菌體庫之抗 Tie2 抗體的分類
使用噬菌體 ELISA 及 Octet 量測兩者執行抗 Tie2 抗體之分類，以進一步特徵抗 Tie2 抗體與 Tie2 受體蛋白質之結合並且鑑定具有共有表位之彼等抗體。
對於噬菌體 ELISA，將 huTie2ECD.Fc 蛋白質以 2 ug/ml 於 65 ul PBS 中在 Maxisorp 免疫板上於 4℃ 固定過夜。將型式化為 IgG 之抗 Tie2 抗體 Tie2.1、Tie2.20、Tie2.34 或抗 Tie2 抗體 13H10 (抗 Tie2 受體促效劑抗體，揭示於美國專利第 6,365,154 號中) 的連續稀釋物施加到具有經固定化 huTie2ECD.Fc 的板上，該板先前業經使用 1% BSA 於 PBS 中阻斷並且於室溫孵化 1 小時。將抗 Tie2 噬菌體於室溫以 0.1 的 OD268nm/mL 添加 15 min。然後洗滌該板，並使用上述方法用抗 M13 共軛之 HRP 二級抗體偵檢。訊號隨著連續稀釋之抗體降低而增加，指示測試噬菌體與連續稀釋之抗體競爭，暗示它們結合相同之位點或表位。
如藉由上述 ELISA 測定之表位結合係藉由 Octet 表位分類測定法使用 Octet RED384 (Pall Forte Bio Corporation, Menlo Park, CA) 及標準夾心型式分類測定法予以證實。詳而言，以經生物素化之 hTie2.ECD.Fc 蛋白質 (10 ug/mL) 包被鏈黴親和素生物感測器 (Pall Forte Bio Corporation)，然後曝露於基準抗 Tie2 hIgG1 (50 ug/mL Ab1、Ab20、13H10)，之後曝露於第二 (測試) 抗 Tie2 hIgG1。使 Forte Bio’s 資料分析軟體處理資料。被第二 (測試) 抗體額外結合指示未被佔據之表位 (非競爭者)，而無結合指示表位阻斷 (競爭者)。具有從 Ab20 (Tie2.20) 獲得之資料的實驗之例示提供於圖 8A 及圖 8B 中。關於其他抗 Tie2 抗體之資料未顯示。
ELISA 及 Octet 分類測定分析之結果匯總並例示於圖 9 中，顯示哪些抗 Tie2 抗體彼此競爭並且可能結合相同或相似表位。詳而言，上文揭示之結合測定法證，源自噬菌體之抗體 Tie2.1 (Ab1)、Tie2.12 (Ab12)、Tie2.24 (Ab24) 及 Tie2.33 (Ab33) 全部與 Tie2 IgG2 域結合，阻斷 Ang1 及 Ang2 與 Tie2 之結合，並且為 Tie2 促效劑 (例如，增強 AKT 及/或 Tie2 之磷酸化，及/或增強血管內皮細胞膜完整性)。
總體而言，結果指示，存在至少 3 個被本文所揭示之抗 Tie2 抗體結合的表位類別。此等至少 3 個表位類別例示於圖 9 中。
抗 Tie2 IgG 抗體的親和力測定
使用 Biacore T200 儀器 (GE Life Sciences) 測定所選抗 Tie2 hIgG 之單價親和力。將抗人 Fc 共價固定在 Series S CM5 Biacore 感測器晶片上以使得能夠進行對抗 Tie2 抗體之非共價捕獲，並且使用多循環動力學實驗型式於 25℃ 實時監控人或大鼠 Tie2ECD.flag 之結合。於循環之間，使用 3 M MgCl2 將表面再生。使用 Biacore 評估軟體 (GE Life Sciences) 以將 1:1 結合模型擬合至資料，藉由動力學分析測定單價親和力。結果匯總於表 6 中。
表 6
  Biacore 親和力 (kD)
抗體 hTie2.flag rTie2.flag
Ab1 1.2 uM 1.6 uM
Ab4 59 nM 250 nM
Ab12 52 nM 116 nM
Ab20 7.6 nM 21 nM
Ab24 822 nM 2.8 uM
Ab31 31 nM 221 nM
Ab32 408 nM 901 nM
Ab34 155 nM 57 nM
Ab38 376 nM 2.2 uM
實例 5 – 抗 Tie2 抗體之體內生成
除了噬菌體庫之外，亦藉由動物免疫作用進行可用於治療性應用之抗 Tie2 抗體的生成。
兔免疫作用。 使用人及食蟹獼猴 Tie2 之 ECD (SEQ ID NO: 1，殘基 23-442) 將紐西蘭白兔作用\免疫，並使用與印行文獻相關之修訂方案分離單個 B 細胞，例如，參閱，Seeber 等人，PLoS ONE 9(2), 2014。藉由 ELISA 分析 B 細胞培養物上澄液與人、大鼠及食蟹獼猴 Tie2 以及無關對照蛋白質的結合，並藉由 FACS 分析與 HUVEC 細胞的結合。裂解 Tie2 特異性 B 細胞，立即在 -80℃ 冷凍保存，直至進行分子選殖。如前所述，將來自兔 B 細胞的各種單株抗體之可變區 (VH 及 VL) 選殖到所提取之 mRNA 的表現載體中，例如，參閱，Seeber 等人，PLoS ONE 9(2), 2014。個別的重組兔抗體在 Expi293 細胞中表現，然後用蛋白 A 純化，然後對純化的抗 Tie2 抗體進行功能活性測定及動力學篩選。
大鼠免疫作用。 以類似方式將大鼠作用\免疫，並且使用經修飾之融合配偶體生成融合瘤 (例如，參閱，Price 等人，J Immunol Methods 31;343(1):28-41 (2009))。對多種條件進行優化，以使得能夠將個體 IgG+ huTie2 融合融分選到單個孔內，然後於分選後進行另外培養。藉由 ELISA 分析所得之融合瘤上澄液與人、鼠及食蟹獼猴 Tie2 以及無關對照蛋白質的結合，並藉由 FACS 分析與 HUVEC 細胞的結合，使用蛋白質 A 純化陽性樣品以進行後續之功能及動力學特徵。
使用抗 IgG 交聯劑急性大鼠及兔殖株之功能篩查。
關於 Tie2 促效作用下游之 pAKT 誘導來特徵上揭之從大鼠及兔免疫作用生成的抗體。
細胞及抗體 ：人臍靜脈內皮 (HUVEC) 細胞
購自 Lonza (目錄號 CC-2517；批號 0000321046)，而大鼠主動脈內皮細胞 (RAEC) 購自 VEC Technologies並於生長培養基 (VEC Technologies,INC，目錄號 MCDB-131 10) 中培養。抗 Tie2 抗體於 Genentech 製備。用作交聯劑之物種特異性抗體購自 Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc。
HUVEC 之製備 ：HUVEC 為經胰蛋白酶化並以 0.4 x105 細胞/孔在 100 µl 培養基中種植於無菌 96 孔板 (Costar，目錄號 3997) 中，將該板於 37℃、5% CO2 孵化箱中孵化過夜。去除培養基，將 100 µL 預熱之血清飢餓培養基 (Basal Medium EndoGROTM ；目錄號 SCME-BM) 添加到該板之每一孔中。將該板於 37℃、5% CO2 孵化箱中孵化 3 小時，然後用 Tie-2 促效劑孵化。
RAEC 之製備： 將 RAEC 以 12,000 個細胞/孔之密度種植在 96 孔細胞培養板中，並且於 100 µl EGM2 MV 培養基中在 37 °C 及 5% CO2 培養過夜。過夜培養之後，將細胞於具有 0.1% BSA 之 EBM2 基礎培養基中飢餓培養 3 小時，然後用 Tie-2 促效劑孵化。
為了測試經交聯之抗 Tie2 抗體，即將處於測定緩衝液 (來自 GNE 培養基製備工廠之基礎培養基 + 0.2% BSA) 中的 20µg/ml 交聯劑與相等體積之 60µg/ml 抗 Tie2 二價抗體混合，並於 RT 孵化 1 hr。孵化之後，對抗體進行 3 倍連續稀釋。
為了測試其他 Tie2 促效劑，將該等分子於測定緩衝液中稀釋至起始之高原液濃度 (典型為 30-1000 µg/ml)， 然後進行 (典型為 2 至 10 倍) 連續稀釋。於去除血清飢餓培養基之後，將此等稀釋物 (50 µl) 添加至每一孔中，並將該板於 37℃、5% CO2 孵化 15 min。去除溶液，將 50 ul 的含有來自 pAKT Ser473 套組 (Cisbio，參考號 64AKSPEH) 之阻斷緩衝液的裂解緩衝液添加到細胞中。於輕柔搖動下，將該板於室溫孵化約 30 min 至 45min，於 -80℃ 冷凍直到使用為止，或直接用於 FRET 測定中。
FRET 測定法 ：將細胞裂解物 (15 µl) 於冰上融化，然後在 384 孔微量板 (Greiner Bio-One North America, Inc.，目錄號 784080) 中與 5 µl 的來自 pAKT Ser473 套組之每一磷-AKT d2 抗體及磷-AKT 穴狀化合物 (Cryptate) 抗體的 1:40 稀釋物混合，並將該板於室溫孵化 4 hr 或於 4℃ 冰箱中過夜，並且在 CLARIOstar (BMG LABTECH，軟體版本：5.01 R2) 上於 620 nm 及 665 nm 讀取。對於每一個體孔，資料係計算為接納者與供者發射訊號之比率乘以 104 。
重組抗體生成。
藉由基因合成生成編碼重鏈可變域及輕鏈可變域之 DNA，並將其分別***用於 IgG1 抗體重鏈及輕鏈表現的哺乳動物載體中。編輯一下可變域序列以去除明顯未配對之半胱胺酸殘基以及 NX[S/T] N-醣基化模體。藉由使用編碼該抗體重鏈及輕鏈之哺乳動物表現載體對 Expi293 細胞進行短暫的轉染而產生重組抗體。重鏈及輕鏈於獨立之載體上編碼，並且使用 1:2 比率之重鏈表現載體與輕鏈表現載體轉染。藉由親和力層析術從細胞培養上澄液純化抗體。於一些情況下，對抗體進行基於 SEC 之另外純化步驟。
使用 Biacore T200 儀器 (GE Life Sciences) 篩查與人及食蟹獼猴 Tie2 結合之抗體。簡言之，使用 S 系列 CM5 晶片、人類抗體捕獲套組及胺偶合套組 (GE Life Sciences) 生成人類抗體捕獲晶片。使用 10 µl/分鐘之流速及 20 秒之接觸時間捕獲了稀釋至 5 µg/ml 的抗體。300 nM 及 1500 nM 重組人類及食蟹獼猴 Tie2 細胞外域與所捕獲之抗體的結合為於 37℃ 使用單週期動力學方法以 50 µl/分鐘之流速、60 秒之接觸時間及 120 秒之解離時間進行分析。於週期之間，使用 3M MgCl2 以 30 µl/分鐘注射 30 秒來再生晶片。使用 Biacore T200 評估軟體 (GE Life Sciences) 評估資料。使用將參數 RI 設定為零之 1:1 結合模型獲得動力學常數。取所選擇之抗體 (表 7A 至表 7B；ch 表示兔 Ab；TEK 表示大鼠 Ab) 繼續進行 Fab-NDK 型式之二級活性篩查 (參閱，下文之實例 8)。
表 7A
  重組人 Tie2 ECD
抗體 配體水準 (RU) 結合響應，1500nM huTie2 (RU) Rmax (RU) ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M)
抗 gD 589.3 17.0 3.3 - - -
Tie2.1 488.6 169.9 471.3 1E +05 3E-01 3E-06
490.5 165.6 448.1 1E +05 3E-01 3E-06
ch15E4.2 351.3 337.6 342.2 2E +05 1E-02 7E-08
354.1 339.7 338.7 2E +05 1E-02 6E-08
381.5 361.3 363.8 2E +05 1E-02 7E-08
ch10D10.2 903.8 934.3 948.7 2E +05 1E-02 6E-08
ch12B5.2 619.3 230.5 216.5 2E +05 4E-03 2E-08
ch13H11.2 711.7 693.8 685.3 6E +04 1E-03 2E-08
ch14A8.2 953.3 569.5 649.0 2E +04 1E-03 5E-08
ch14D8.2 578.8 573.8 585.1 7E +04 5E-03 8E-08
ch14E10.2 755.2 315.9 398.0 2E +05 8E-02 5E-07
ch18E7.2 949.6 946.7 928.3 2E +05 1E-03 7E-09
ch1B7.2 581.7 370.5 446.5 1E +05 4E-02 4E-07
ch1B7.3 531.5 210.6 333.6 4E +07 4E +01 1E-06
ch25C8.2 1117.6 998.5 990.4 5E +04 4E-04 7E-09
ch28C9.2 470.2 313.5 433.5 1E +04 6E-04 4E-08
ch28E12.2 849.7 750.8 754.6 4E +04 2E-04 5E-09
ch6H6.2 625.1 605.8 630.7 8E +04 8E-03 9E-08
ch6H6.3 522.9 490.6 519.2 9E +04 1E-02 1E-07
TEK-1006 601.8 629.5 621.5 7E +04 6E-04 8E-09
TEK-1053 354.2 369.6 364.0 7E +04 7E-04 1E-08
TEK-1060 656.1 635.8 654.0 1E +05 8E-03 7E-08
TEK-1194 649.1 604.9 591.0 1E +05 3E-03 2E-08
TEK-1248 610.9 601.6 612.5 9E +05 2E-03 2E-09
TEK-166 650.6 671.1 659.3 2E +05 5E-04 2E-09
TEK-198 651.2 609.5 604.9 6E +04 7E-04 1E-08
TEK-233 583.7 598.5 593.3 1E +05 3E-03 3E-08
TEK-323 540.5 473.4 470.2 9E +04 3E-03 4E-08
TEK-327 498.1 490.2 488.1 6E +04 8E-04 1E-08
TEK-522 564.1 535.9 527.6 7E +04 6E-04 8E-09
TEK-535 567.6 604.5 591.1 1E +05 1E-03 7E-09
TEK-628 516.4 468.3 468.5 5E +04 2E-03 4E-08
TEK-685 659.9 588.3 629.7 9E +04 1E-02 1E-07
TEK-69 694.5 628.9 617.0 1E +05 3E-03 3E-08
TEK-768 573.8 132.2 361.3 6E +04 2E-01 3E-06
表 7B
重組食蟹獼猴 Tie2 ECD
抗體 配體水準 (RU) 結合響應，1500nM cyTie2 (RU) Rmax (RU) ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M)
抗 gD 591.1 16.1 2.3 - - -
Tie2.1 488.9 158.4 516.9 9E +04 3E-01 4E-06
488.2 151.9 498.0 9E +04 3E-01 4E-06
ch15E4.2 350.5 320.5 325.7 1E +05 9E-03 8E-08
348.6 318.4 317.9 1E +05 9E-03 6E-08
382.3 344.5 347.6 1E +05 9E-03 8E-08
ch10D10.2 913.5 853.7 928.1 2E +05 3E-02 2E-07
ch12B5.2 618.3 214.0 201.0 3E +05 4E-03 1E-08
ch13H11.2 713.6 667.8 662.4 5E +04 1E-03 3E-08
ch14A8.2 952.1 676.1 695.8 3E +04 8E-04 3E-08
ch14D8.2 579.4 557.7 568.6 7E +04 5E-03 8E-08
ch14E10.2 761.9 292.9 378.5 2E +05 8E-02 5E-07
ch18E7.2 932.2 899.5 883.1 2E +05 1E-03 8E-09
ch1B7.2 583.7 396.5 445.4 6E +04 2E-02 2E-07
ch1B7.3 535.1 263.4 407.2 8E +04 7E-02 9E-07
ch25C8.2 1125.2 974.3 962.8 6E +04 5E-04 7E-09
ch28C9.2 470.6 360.0 433.2 2E +04 5E-04 3E-08
ch28E12.2 852.5 762.0 760.3 4E +04 2E-04 4E-09
ch6H6.2 632.8 588.9 613.4 8E +04 7E-03 9E-08
ch6H6.3 518.9 467.3 495.3 9E +04 1E-02 1E-07
TEK-1006 602.5 597.2 590.1 6E +04 6E-04 9E-09
TEK-1053 353.3 360.3 354.2 9E +04 8E-04 9E-09
TEK-1060 650.1 617.3 628.6 1E +05 6E-03 5E-08
TEK-1194 645.7 565.5 549.5 2E +05 2E-03 1E-08
TEK-1248 603.8 572.2 580.6 9E +05 2E-03 2E-09
TEK-166 647.5 646.3 635.1 2E +05 5E-04 2E-09
TEK-198 640.6 574.5 571.2 5E +04 6E-04 1E-08
TEK-233 582.0 559.4 552.9 8E +04 2E-03 3E-08
TEK-323 536.8 449.3 442.9 1E +05 3E-03 3E-08
TEK-327 496.4 475.0 472.6 7E +04 1E-03 2E-08
TEK-522 566.7 511.7 505.3 6E +04 7E-04 1E-08
TEK-535 565.4 583.3 569.9 2E +05 1E-03 8E-09
TEK-628 516.5 453.5 454.3 4E +04 2E-03 4E-08
TEK-685 658.8 543.7 598.6 7E +04 1E-02 2E-07
TEK-69 692.7 588.1 573.4 1E +05 2E-03 2E-08
TEK-768 572.0 122.2 368.2 5E +04 2E-01 4E-06
HTP 表位分類。
將藉由動物免疫作用生成之抗體以及所選的實例 1 中揭示之源自噬菌體之抗體型式化為 hIgG1 骨幹，並且使用配備 DA v6.19.3, IBIS SUIT, SprintX & Carterra 表位工具軟體之 CFM2/MX96 SPR 系統 (Wasatch Microfluidics，現為 Carterra) 執行分類。  使用 pH 4.5 之 10 mM 醋酸鈉固定化緩衝液，藉由胺偶合將抗體固定 SPR 感測器稜鏡 CMD 200 M (Xantec Bioanalytics) 上。使用 CFM2 儀器執行固定化，然後將感測器稜鏡轉移到 IBIS MX96 儀器以進行基於 SPR 的競爭分析。  使用 HBS-EP 運行緩衝液 (10 mM HEPES，150 mM NaCl，0.05% 土溫 20，pH 7.4，1 mM EDTA)，將經固定化之抗體首先曝露於 1 µM 重組人類 Tie2 細胞外域，然後曝露於 20 ug/ml 溶液中之抗體。  結果顯示於圖 11A 至 11B 中，並且指示若干不同之 Tie2 夾心特徵。  圖 11A 至 11B 中之結果典型解釋為證明所分析之抗體組中多個 (例如，至少 8 個) 不同 Tie2 表位的存在。有趣的是，資料顯示，Tie2.1、Tie2.1M100cF (揭示於後文實例 11 中)、Tie2.12 及 Tie2.24 全部能夠發揮 Tie2 促效劑之作用，歸類到一起。
實例 6 – 生成 PEG 共軛之抗 Tie2 Fab 多聚體
如上文實例 3 中所示，抗 Tie2 抗體對 Tie2 之激活被經結合至抗 Tie2 抗體的交聯促進。據此，設計並生成多聚 Tie2 結合組合物以測定將具有優化治療功效之多聚體構形。
所採用之一種多聚方法為使用多臂聚乙二醇 (PEG) 分子作為核心，其中每一臂連接或共軛至單個抗 Tie2 Fab 分子。使用顯示以高親和力與 Tie2 特異性結合並且發揮 Tie2 促效劑作用 (當與 Tie2 交互作用時激活 AKT 磷酸化) 之 Tie2.1 Fab 來測試各種多聚體構形。詳而言，Tie2.1 Fab 經修飾，使得重鏈之 C 端經修飾以包括胺基酸殘基 SPPC (SEQ ID NO: 89)，提供 PEG 部分可共軛至之連接子及半胱胺酸。該「Tie2.1-SPPC」 Fab 共軛至具有數目及長度可變之臂的 PEG-馬來醯亞胺骨幹 (多臂 PEG-馬來醯亞胺獲自 JenKem Technology USA, Plano, TX)。
Fab 純化及去阻斷
全部層析樹脂皆來源於 GE Healthcare。
Fab 於大腸桿菌中表現。將大腸桿菌球丸再次以 1.5L/Kg 懸浮在 pH 7.5 的 25 mM TrisHCl、150 mM NaCl、5 mM EDTA (EQ) 中，並且以 1000 巴微流控兩次。將 PEI 緩慢添加至最終濃度為 0.4%，然後於 4℃ 攪拌過夜。然後將懸浮液以 15,000 g 離心 60 min 並將上澄液 0.22 um 過濾。然後將大腸桿菌濾液加載到 1.2 L Gammabind Plus (GBP) 管柱上，以 30 ml/min 於 EQ 中平衡，然後用 2 CV 之 EQ 以 30 ml/min 洗滌，以 4 CV 之含有 0.1% TX114 及 0.1% TX100 之 EQ 以 5 ml/min 洗滌。之後用 2 CV 之 EQ 以 30 ml/min 洗滌，然後用 2CV 的 25 mM 琥珀酸鹽 pH 6.0 以 30ml/min 洗滌，並且用 0.15M 醋酸以 30 ml/min 溶析。隨著溶析液流出管柱，用 pH 9.0 之 1 M Tris 將其中和至 pH 5.0。
可替代地，將大腸桿菌濾液加載到 1.7 L Capto L 管柱上，於 EQ 中以 35 ml/min 平衡，然後用 2 CV 之 EQ 以 50 ml/min 洗滌，用 5 CV 之含有 0.1% (v/v) Triton X114 及 0.1%(v/v) Triton X100 的 EQ 以 4 ml/min 洗滌，然後用 50 ml/min 2CV EQ 洗滌，然後用 pH 6.0 之 25 mM 琥珀酸鹽以 50 ml/min 洗滌，並且用 0.15 M 醋酸以 50 ml/min 溶析。隨著溶析液流出管柱，用 pH 9.0 之 1 M Tris 將其中和至 pH 5.0。
用 pH 5.0 之 20 mM 醋酸鈉 (A) 將經中和之 GBP 或 Capto L 溶析液稀釋一倍至三倍，並且加載到陽離子交換樹脂 (SPHP) 上。用含有 0.1% Triton X114 及 0.1% Triton X100 之 2 CV (A) 5 CV (A) 洗滌管柱，之後用 2CV (A) 洗滌，然後使用含有 1M NaCl (B) 之 (A) 的 10 CV 0-20% 梯度進行梯度溶析，收集級分。將含有 Fab 峰之級分合併。
使用 pH 8.5 之 1M Tris 將經純化之 Fab 池調節至 pH 8.0，並將 EDTA 添加至最終濃度為 2 mM。為了減低 Fab，將 50 倍過量之 DTT 添加到溶液中，然後於 22℃ 孵化過夜，並藉由質譜法檢查加成物之去除。
使用 10% 醋酸將 pH 調節至 5.2 之後，將減低之 Fab 結合至 SPHP，用 10 CV 之 pH 5.0 的 25 mM 醋酸鈉洗滌，並且用 pH 8.0 的 50 mM Tris、150 mM NaCl 溶析。用 pH 8.5 之 1 M Tris 將經溶析之 Fab 池帶至 pH 8.0，添加 2 mM EDTA，並且使用 15 倍莫耳過量之 DHAA 進行再氧化。於藉由質譜檢查 Fab 之再氧化之後 1.5 小時；如果必要，添加另外 10 倍莫耳過量之 DHAA，將樣品孵化 1 小時並再次檢查。然後，使用 10% 醋酸將經再氧化之 Fab 的 pH 調節至 5，並且於如上所述之 SPHP 管柱純化，但使用 20 CV 10-60% 梯度 (B = 25 mM 醋酸鈉，300 mM 氯化鈉，pH 5.0) 溶析，將主要峰進行 10 kD 濃縮並 0.2um 過濾。其他 Fab 可經純化，並以基本相同之方法去阻斷。
六聚體共軛及純化
於 pH 5.0 之 25 mM NaOAC、150 mM NaCl、2 mM EDTA 中，將 Tie2.1-SPPC 共軛至 10 mg/mL 左右之濃度的來自 JenKem 的 6KDa PEG 六聚體。於平衡至室溫之後，將來自 JenKem 之 6 KDa PEG 六聚體以 3 mM 之濃度懸浮於 pH 5.0 之 25 mM 醋酸鈉中。將 pH 保持為低於 pH 6 以避免馬來醯亞胺開環。一旦 PEG 可溶解，即將其以 9:1 (Fab:PEG) 之莫耳比率添加至 Tie2.1-SPPC 其阻斷之 Fab 中。然後，於輕柔搖動下，將混合物於室溫放置過夜。於共軛之後，使用粒徑篩析層析法 (SEC) 於Superdex-200 管柱上以 pH 5.5 之 20 mM His-醋酸鹽、150 mM NaCl 純化 Tie2.1 Fab PEG 六聚體，該純化步驟從共軛混合物中去除過量 Fab 及聚集體。運行經還原劑未經還原之 NuPage 4-12% Bis tris 凝膠，以確定哪些共軛物級分需要進一步純化以富集六聚體。將共軛物級分合併，並且使用來自 GE 之 SP Sepharose 高效能強陽離子交換樹脂的陽離子交換法 (CEX) 進一步純化，以富集 6 種 Fab/PEG。CEX 步驟於 pH 5.0 之 25 mM 醋酸鈉中運行，並且使於緩衝液 B 中 20% 至 33.4% 的梯度 (緩衝液 B 為 pH 5.0 之 25 mM NaOAC、300 mM NaCl) 於 44.5 CV 中溶析，然後以 33.4%-50% B 之梯度溶析 10 min，並最終用 100% B 溶析。少數不同之不同級分的迷你池如上所述於凝膠上運行，並使用該資料來決定合併哪些級分。將迷你池 3 合併，然後以 40 mg/mL 調配在 pH 7.2 的 PBS 中。
然後，最終樣品於分析性 SEC 上運行，使用 TSKgel G3000SW xl 管柱，以 0.2 M KPO4 、pH 6.2 之 0.25 M KCl、15% 異丙醇作為緩衝液，測定所存在之聚集體的百分比。其亦如早前所揭示於凝膠上運行。
FabIgG 純化
將 CHO 條件化培養基在 MabSelect Sure 親和力管柱 (GE Healthcare) 上純化，之後在粒徑篩析層析法 (SEC) S200 管柱上純化。可替代地，將親和力溶析液稀釋並加載到陽離子交換管柱 (SPHP) 上，然後洗滌並用鹽梯度溶析。然後，將經純化之單體峰濃縮並透析到調配物緩衝液中，並且經 0.2 um 無菌過濾。
FabIgG 與六聚體 pAKT 活性之比較
Tie2.1.38 為雙表位 Fab-IgG，其激活 Tie2 (HC 於本文中提供為 SEQ ID NO: 54，LC 於本文中提供為 SEQ ID NO: 53)。執行實驗以評估 PEG-六聚體型式之 Tie2.1 (6 kDa PEG 於 HC 之 C 端經由 SPPC 連接) 以及 Tie2.1.38 (藉由 IgG 型式提供交聯) 的能力。使用 Tie2.1-PEG-六聚體觀察到了更高效力之激活 (圖 12A)。
經由多臂 PEG 多聚化之抗 Tie2 Fab 的促效劑活性
用 RAEC 孵化 10 µg/ml 之 PEG-多聚體，並如所揭示者評估 pAKT 水準之改變 (實例 3)。具有更多臂及/或具有較短臂者具有更高活性之傾向，其中 6-臂、6kDa 核心者及 8 臂、20 kDa 核心者顯示接近最大的活性 (圖 12B)。
實例 7 – 使用 IgM 型式之抗 Tie2 Fab 的多聚化
使用 IgM 型式發展了另一種將抗 Tie2 Fab 多聚化之方法。將編碼來自 Tie2.1 之 VH 的 DNA 融合到 IgM CH1 上。不受縛於理論，咸信，多個可變片段 (Fv) 之密切結合使得 IgM 能夠結合標靶而無需親和力成熟 (Boes, 2000, Mol Immunol, 37:1141-1149)。
IgM 表現及純化的優化。
如製造商所推薦，人類 IgM (huIgM) 係表現於 30 ml 之 Expi293 細胞培養物中 (例如，參閱，「Expi293 Expression System, User Guide」，印行號 MAN0007814，來自 ThermoFisher Scientific)。將多種比率之 IgM 重鏈與輕鏈 (六聚體) 或重鏈與輕鏈與 J 鏈 (五聚體) 轉染到細胞內。 根據製造商之建議，使用 Capto L 樹脂 (GE healthcare) 對多收穫之上澄液進行親和力純化 (例如，參閱 Lombana 等人，2019, mAbs, 11:1122-1138)。 藉由 A280 評估蛋白質之總產量，並且藉由分析性 SEC 使用 Waters Xbridge BEH SEC 450 埃管柱評估純度。圖 13A 顯示多種比率之 huIgM 重鏈與輕鏈與 J 鏈 (若包括) 對於從親和力管柱分離出之蛋白質總產量的影響。
藉由使用比率為 1:1 或 2:1 的包含 LC 及 HC 之質體與質體 DNA 轉染細胞而繼續進行六聚體優化。每一比率導致相似之總蛋白質產量 (2.5-3 mg，來自 30 ml 表現)，惟，1:1 比率下之產物品質似乎有所改善且存在之 LC 二聚體的量減低。藉由將 J 鏈包括於轉染中而實施推定五聚體之表現。於 4:4:1 LC:HC:JC 之最優比率下，表現及產物品質皆得以最大化 (圖 13A 至 13B)。值得注意的是，於最優條件下，相對於 JC 的 LC 及 HC DNA 之高水準接近於最終 IgM 五聚體中的 10:10:1 鏈比率。
由於五聚及六聚 IgM 之表現具有優化之鏈比率，故放大了人及鼠六聚及五聚 IgM 之表現及純化。經由兩步純化，從 CHO 細胞分離了大約 20 mg/L 的經純化之六聚或五聚 IgM。儘管於該制程下表現之 IgG 的短暫的產量比典型者低 3 至 4 倍，但相對容易之純化與對於眼部藥物的低材料要求一起應促進製造之可行性。藉由 SDS-PAGE 證實人 IgM 之鏈組成，並且對經還原劑去糖基化之物質的 LC-MS 顯示 LC、HC 及 JC (若有) 的存在。粒徑篩析層析法顯示對應於五聚及六聚鼠 IgM 的單分散峰以及對應於六聚人 IgM 的單分散峰。從 SEC 溶析出之五聚人 IgM 處於兩個靠近的相關峰中，兩者皆含有 J 鏈並且具有高的 SEC 表觀分子量。藉由光散射評估發現流體動力學半徑 (Rh ) 為大約 12 nM，並且六聚體之預測分子量 (~1050 kDa) 略超過五聚體之彼等 (~950 kDa) (下表 9)。
表 9
Mw (kDa) Rg(avg) (nm) Rh(avg) (nm) Rg/Rh
BSA 66.6 (±0.3%) N.D. 3.5 (±0.7%) N.D.
雷珠單抗 (Lucentis) 50.5 (±0.5%) N.D. 3.0 (±0.9%) N.D.
赫賽汀 (Herceptin) 149.9 (±0.4%) N.D. 5.3 (±0.5%) N.D.
鼠 IgM 五聚體 958.3 (±0.3%) 10.8 (±1.1%) 12.3 (±0.4%) 0.878
鼠 IgM 六聚體 1047.7 (±0.3%) 10.8 (±0.9%) 12.6 (±0.3%) 0.857
人 IgM 六聚體 1023.1 (±0.3%) 11.5 (±0.8%) 12.6 (±0.3%) 0.913
人 IgM 五聚體 Pk 1 ( 主峰) 948.2 (±0.3%) 11.3 (±1.2%) 12.6 (±0.4%) 0.897
人 IgM 五聚體 Pk 2 ( 主峰) 938.2 (±0.3%) 9.2 (±1.6%) 11.6 (±0.4%) 0.793
迴轉半徑與流體動力學半徑之比率 (Rg/Rh) 提供了對於分子形狀之一些見解，球形分子平均為 ~0.775，而更加伸長之分子傾向於更高。單分散 IgM 之分散度為 0.85-0.91 之範圍，與預期結構一致。為了進一步評估 IgM 之聚合物鑑定特徵，使用負染色 TEM 及無參照物 2D 歸類法來描述 IgM 顆粒之架構，結果似乎與顆粒的預期幾何學相匹配。在對應於推定人五聚體之兩個峰之間沒有觀察到明顯差異。選擇人 IgM 六聚體峰進行進一步探究。人工收集 110 張 TEM 顯微照片，得到總計 1500 個顆粒。  使用 Relion 套件 (Scheres, 2015, J Struct Biol, 189:114-122) 進行三輪無參照物 2D 歸類之後，發現大部分顆粒組織化為六聚體結構。少量顆粒 (＜2%) 被細化為五聚體。與先前對 IgM 五聚體之結構探究一致 (Czajkowsky 與 Shao, 2009, Proc Natl, Acad Sci USA, 106:14960-14965)，CH3 及 CH4 域似乎形成與影像平面正交之莖狀域。  此外，儘管附接至相同 Fc 之多對 Fab 似乎是共平面的，但存在一些標誌標明位於相鄰 Fc 上之 Fab 偏移。部分偏移可能允許六聚體將所有鏈容納在空間擁擠的環境中。基於此等資料，選擇人六聚 IgM 作為較佳之治療支架，因為改善之生產純度及 JC 之不存在兩者皆簡化了製造並避免了對於考量聚合性 Ig 受體介導之體內結合的需求。
用於眼內投予之 IgM 的特徵
之後，使用紐西蘭白兔作為模型系統探究了 IgM 對於眼部應用的適用性。先前業經將兔體內之 PK 參數與食蟹獼猴及人體內之結果關聯。為了最小化抗藥物抗體干擾 IgM 之藥物動力學評估的風險，生成了全兔 IgM 六聚體 (兔 IgM Fc，其具有靶向細胞內表位置兔 Fv)。為了避免頻繁重複注射，將所注射之蛋白質的量最大化，並因此將所注射之蛋白質的濃度最大化。據此，蛋白質黏度引起了極大關注。評估 IgM 六聚體之黏度並與先前業經探索之其他多價化合物比較 (Shatz 等人，2019, PLoS ONE, 14:e0218613-e0218613)，詳而言，8-臂 40 kDa 分支鏈 PEG 及四臂 20 kDa 分支鏈 PEG 分別終止於 8 個及 4 個 Fab (圖 13C)。全部三種物質之黏度計讀數顯示預期之對數線性響應。在容易進行玻璃體內施用而無患者疼痛或注射器過度背壓 (~10-50 cP) 的黏度下，與其他型式相比，可投予大約兩倍質量之 IgM。
對 rabIgM 之 SEC-MALS 分析發現流體動力學半徑為 12.9 +/- 1.1 nM，明顯大於先前針對 Fab 觀察到的 2.5 nM 半徑。為了評估分子尺寸之該增加的功能性後果，用 Alexafluor 488 標記兔 Fab 及 IgM，並分別將 0.5 mg 或 1.2 mg 經玻璃體內投予至紐西蘭白兔。於 28 天中取得活體定量螢光量測，表明兩種治療劑中每一者之持續性 (圖 13D)。於該實驗中，Fab 顯示 3.5 天之半衰期，與針對其他 Fab 在兔玻璃體內觀察到的 ~3.4 天之典型半衰期相當 (Crowell 等人，2019, Trans Vis Sci Tech, 8:1-9)。IgM 顯示 7.8 天的實質上延長之曝露，與其更大之尺寸一致。
IgM 之全身性曝露亦引起關注，蓋因迅速全身性清除幫助將眼部治療劑之活性限定於眼睛處。 儘管先前對從血清或腹水中分離之 IgM 的探究業經報告了為期幾天的半衰期 (例如，Maiorella 等人，Biotechnology (NY), 1993, 11:387-392)，重組生產之材料的清除快得多 (例如，Rasche 等人，2015, Haematologica, 100:377-384)。為了證實此等發現，將非結合重組人 IgM 五聚體及六聚體之 PK 於從人血清分離之 IgM 比較 (圖 13E)。經靜脈內注射入 SCID 小鼠之後，重組 IgM 五聚體及六聚體被快速清除 (t1/2 分別為 0.25 及 0.50 天)，而所分離之 IgM 顯示更為延長之曝露 (t1/2 = 2.1-2.9 d)。 假設快速清除可能是由於 IgM 的差異性聚醣佔據率或組成。每個人五聚體中存在至多 51 個 N 連接聚醣，而每個人六聚體中為 60 個。為了支持該理論，聚醣分析顯示，從人血清純化之 IgM 上的聚醣有 75% 含有至少一個唾液酸，相比之下，重組六聚體及五聚體中分別為 24% 及 29% (圖 13F)。
用以最小化 huIgM 突變體之補體活性的蛋白質改造。
IgM 具有充分建立之補體依賴性細胞毒性 (CDC)，這對於 Tie-2 促效劑而言可能為不良者。為了鑑定將會減低潛在 CDC 之 hIgM Fc 突變體，將來自利妥昔單抗 (抗 CD20 抗體) 之可變區融合至 hIgM 之恆定區上。利妥昔單抗 IgG 為習知誘導 CDC。 該利妥昔單抗-IgM 與所選之 Fc 突變一起表現為 hIgM 六聚體並純化。為了研究 IgM 之影響，基本上如所揭示者評估補體活性 (例如，參閱 Gazzano-Santoro 等人，J Immunol Meth, 22, 163-171 (1997))。 簡言之，於 1/5 人補體稀釋液 (最終體積為 100 uL) 之存在下，將 IgM 之 3 倍連續稀釋物添加到 50,000 Wil-2S 細胞中，並將混合物於 37℃ 孵化 2 h。將阿爾瑪藍 (Alamar Blue (Aldrich)) 50 uL 添加到板中，並將它們於 37℃ 再孵化 5 h。將板冷卻至 RT，持續 10 min。使用於 530 nM 激發並且於 590 nM 發射之 96 孔螢光儀讀取螢光，螢光之降低指示 CDC 介導之細胞裂解。用共通 N 連接醣基化模體中之突變評估四個位點 (N171Q、N332Q、N395Q、N563Q) (圖 13G)。
儘管此等突變可改善可製造性或全身性 PK，但它們並不影響 CDC。另外地，顯示減低小鼠 IgM 之 CDC 的 S406N 突變 (例如，參閱，Wright 等人 J Biol Chem, 265(18), 10506-10513, (1990)) 並不影響人 IgM。重要的是，P434G 突變體完全消除了 CDC 活性，使得 IgM 六聚體可用作眼部治療劑
IgM 與 PEG- 六聚體活性之比較。
特徵 IgM 用於眼部投予之適用性之後，吾等接下來轉而探究它們激活相關訊號傳導途徑的能力。表現以 Tie2 為標靶之 IgM 六聚體，並分析它們驅動 Tie2 下游之磷-AKT 訊號傳導的能力。用遞增劑量的以內皮細胞為標靶之 Tie2.1-hIgM 六聚體、Tie2.1 PEG 六聚體 (Tie2.1 Fab，終止於共軛至 PEG-六聚體之 SPPC) 或未靶向之抗 CD20 hIgM 六聚體將大鼠主動脈內皮細胞處理 15 分鐘，裂解，並使用均相時間解析螢光評估細胞內磷-AKT 水準。僅在使用 Tie2.1-hIgM 及 Tie2.1 PEG 六聚體時見到了細胞磷-AKT 水準的增加 (圖 13H)。在不存在交聯的情況下，使用相對應之 IgG 時沒有見到活性 (資料未顯示)。有趣的是，儘管 Tie2.1hIgM 六聚體及 Tie2.1 PEG 六聚體在皮莫耳濃度下有活性，但 pAKT 之產生於高濃度下受到部分抑制。據推測，六聚體於細胞表面上之超飽和減低 Tie2 之集簇程度，並因此減低下游訊號傳導。不過，於 100 nM IgM (大約 100 ug/ml)，達到大約 30% 之最大活性。此等資料表明，Tie2.1 六聚體似乎在至少 3 個數量級之蛋白質濃度範圍內驅動 Tie2 訊號傳導。
實例 8 – 用於鑑定及比較 Tie2 促效劑抗體之代用六聚體型式的研發
於一試圖增加備選抗體篩查方法之通量及相關性的嘗試中，檢索並鑑定均六聚性蛋白質，其可藉由在基因上將 Fab 重鏈之 C 端融合至六聚體之抑制亞基的 N 端而用作抗 Tie2 Fab 與六聚體多臂 PEG 之共軛的代用品 (參閱，圖 14A)。據此推斷，此融合蛋白將會促進用於體外分析之 Fab 六聚體的生產而無需將純化之 Fab 的化學共軛。此外，此融合蛋白將會用作PEG-Fab 六聚體之體外代用品，進行潛在新的抗 Tie2 促效劑抗體備選物之體外活性評估。
真核生物核苷二磷酸激酶 (NDK) 酵素具有均六聚性四級結構 (Lascu 等人，2000, J Bioenerg Biomembr, 32:227-236)，且具有曝露之 N- 端 (Moréra 等人，1994, J Mol Biol, 243:873-890)。此外，業經報導了無半胱胺酸之高度熱安定 NDK 序列 (Akanuma 等人，2013, Proc Natl Acad Sci USA, 110:11067-11072)。據此推斷，源自該酵素家族之胺基酸序列與測試 Fab 之 C 端的基因性融合可能使得能夠進行 Fab 六聚體之表現及純化，該六聚體具有與 PEG-Fab 六聚體類似之幾何學但更適於常規表現及純化方法，從而促進例如在 HUVEC pAKT 測定法中對多種備選抗體進行基於細胞的活性分析。
Fab-NDK 融合蛋白之設計及生成。
因此，生成了一組 Fab-NDK 融合蛋白，其中，編碼 Tie2.1 或陰性對照抗體 (gD.5B6) 之 Fab 的重鏈 C 端在基因上融合至 5 種不同備選 NDK 序列中之一者。NDK 序列選自文獻 (表 10)，如下文所揭示者修飾，並且經由基因合成構造編碼與 NDK 序列融合之 Fab 重鏈的表現載體。重鏈表現載體與輕鏈表現載體之比率為 2:1、1:1 及 1:2，並且分別由欄標題 H2L1、H1L1 及 H1L2 指示。表 10 提供融合蛋白產量。
表 10
融合蛋白* NDK 序列來源 純化蛋白質產量 (mg)
Tie2.1 Fab gD.5B6 Fab
H2L1 H1L1 H1L2 H2L1 H1L1 H1L2
Fab-NDK1 (SEQ ID NO:69) Akanuma 等人，2013 (同上) 0.05 0.26 0.78 0.00 0.00 0.21
Fab-NDK2 (SEQ ID NO:70) Akanuma 等人，2013 (同上) 0.16 0.60 1.22 0.00 0.03 0.25
Fab-NDK3 (SEQ ID NO:71) Uniprot P22887 0.23 0.65 1.53 0.10 0.34 0.86
Fab-NDK4 (SEQ ID NO:72) Uniprot P15532 0.18 0.57 1.59 0.00 0.20 0.47
Fab-NDK5 (SEQ ID NO:73) Uniprot Q01768 0.24 0.98 1.91 0.09 0.33 0.80
*SEQ ID NO 僅用於 NDK 肽序列
於每一情況下，Fab HC 包括且終止於胺基酸 KTHT (胺基酸 222-225，根據 EU 編號)，並且由 4 個甘胺酸殘基組成之短連接子序列被*** Fab 重鏈與 NDK 序列之間以提供另外之柔軟。亦藉由去除 N 端甲硫胺酸殘基並且藉由組胺酸 118 到***酸之突變而編輯 NDK 序列，該突變為文獻中報導之用以令催化活性失活之突變 (Postel 與 Ferrone, 1994, J Biol Chem, 269:8627-8630)。Fab 輕鏈係編碼於獨立表現載體上而無需另外修飾。
使用 Fab-NDK 重鏈及輕鏈表現載體對 Expi293 細胞進行共轉染，並且使用親和力層析樹脂 Capto L 樹脂 (GE Healthcare) 純化產物，該樹脂為設計用於含有 κ 輕鏈之抗體片段的純化。選擇 Fab-NDK3 及 Fab-NDK5 融合蛋白藉由粒徑篩析層析法進行另外之純化，並且藉由分析性粒徑篩析層析法 (SEC) 使用基於磷酸鹽之運行緩衝液 (200 mM KH2 PO4 ，250 mM KCl，pH 7.0) 及 TSK3000 管柱 (Tosoh Biosciences) 證實所得樣品之純度。
藉由多角度光散射 (MALS) 測定型式化為 Fab-NDK3 或 Fab-NDK5 之 Tie2.1 的流體動力學半徑，結果匯總於下表 11 中。明顯可見，與針對 Tie2.1 PEG-Fab 六聚體而獨立測定者相比，型式化為 Fab-NDK3 或 Fab-NDK5 之 Tie2.1 的流體動力學半徑為有利。
表 11
融合蛋白 從蛋白質序列預測 來自 SEC-MALS 分析
分子量 分子量 流體動力學半徑
Tie2.1 Fab-NDK3 386 kDa 403 kDa 7.5 nm
抗 gD Fab-NDK3 389 kDa 408 kDa 6.2 nm
Tie2.1 Fab-NDK5 389 kDa 409 kDa 7.3 nm
抗 gD Fab-NDK5 392 kDa 未測定 (訊號不充分)
Tie2.1 Fab-NDK 構造體之功能評估
然後，使用實例 3 中揭示之方法，於 HUVEC pAKT測定中評估 Fab-NDK3 及 Fab-NDK5 型式之 Tie2 激活。於 HUVEC pAKT 測定中，以 Fab-NDK3 及 Fab-NDK5 型式評估Tie2.1 及陰性對照抗體之 Tie2 激活。結果提供於圖 14B 中。
Fab-NDK3 及 Fab-NDK5 型式之 Tie2.1 顯示與 PEG-Fab 六聚體型式之 Tie2.1 相似的響應特徵。當以 Fab-NDK3 型式評估時，陰性對照抗體顯示與其他陰性對照抗體諸如緩衝液及陰性對照 PEG-Fab 六聚體相似之響應特徵，但當以 Fab-NDK5 型式評估時，陰性對照在一些濃度下造成 pAKT 訊號傳導。因此，吾等決定使用 Fab-NDK3 型式進行新抗 Tie2 抗體之二級篩查，並且更通常亦作為 PEG-Fab 六聚體之體外代用品。
於 HUVEC pAKT 測定中針對 Tie2 促效作用篩查蛋白質六聚體。
於 HUVEC 細胞中，篩查代用六聚體 Fab-NDK3 型式之抗 Tie2 抗體的 pAKT 訊號傳導活性。除了 2 個例外，抗體在 8 個濃度下評估，此等濃度由從 30 µg/ml之最高濃度開始之三倍稀釋組成，並且覆蓋超過三個數量級。2 個例外是由於樣品可用性，並且由 TEK-1053 (其僅在較低濃度下評估) 及 ch18E7 (其不能以 Fab-NDK3 型式生成)。如圖 14A 所表明，Tie2.1 Fab-PEG 六聚體之活性與 Tie2.1 Fab-NDK 分子非常類似，證實 NDK 六聚體共軛物作為六聚 PEG 共軛物代用品是有效的。據此，NDK 六聚體型式可用於評估作為多聚體之抗 Tie2 多種抗體 Fab 的促效劑活性 (例如，參閱，圖14A 及圖 14B)。
實例 9 – 抗 Tie2 抗體在 Tie2 細胞水準上之效應
如本文中詳細揭示者，抗 Tie2 促效劑抗體之治療性用途部分地依賴於抗體與 Tie2 受體蛋白之結合。據此，進行試驗以確定將抗 Tie2 投予至細胞樣品或動物是否在 Tie2 蛋白含量上具有任意效應。評估包含如上文所揭示者生成中抗 Tie2 抗體的組合物，並使用 HUVEC 比較它們在體外誘導細胞 Tie2 含量減低的能力。
抗 Tie2 抗體在 Tie2 水準上之效應的體外分析。
將 HUVEC (Millipore，目錄號 SCCE001) 以 1x106 每孔於 Endogro 培養基中種植在 6 孔板中。添加抗 Tie2 抗體至最終濃度為 10 ug/ml，並且於 37℃ 孵化 16 至 18 小時。然後用冰冷之 PBS 將細胞洗滌三次，在冰上於以蛋白酶抑制劑與磷酸酶抑制劑混合液 (Thermo Scientific，目錄號 1861281) 補充的 100ul RIPA 緩衝液 (Sigma，目錄號 20-188) 中裂解。將細胞裂解液以 14,000 rpm 在 4℃ 離心 10 min，然後進行抗 Tie2 西方墨點 (WB) 分析。使用小鼠抗 Tie2 一級抗體 (BD，目錄號 557039) 及二級偵檢抗體 (HRP 抗小鼠 Ig，GE Healthcare，目錄號 NA931V) 執行標準 WB 分析。結果顯示於圖 16A 至 16C 中。如圖 16A 中可見，藉由動物免疫作用生成之抗 Tie2 抗體 (大鼠抗體 TEK-1A5、TEK-166、TEK-535、TEK-1248、TEK-69、TEK233-V2，以及兔抗體 ch1B7.C90Q、CH6H6.3) 顯著減 Tie2 水準，如當以六聚體型式評估時藉由 WB 偵檢者。相比之下，抗 Tie2 結合劑 Tie2.12、Tie2.24、Tie2.1.M100cF 及 Tie2.1-PEG-六聚體造成 Tie2 蛋白含量之降幅要小得多 (圖 16A 至 16C)。
抗 Tie2 抗體在 Tie2 水準上之效應的體內分析。
為了於體外測定中評估抗 Tie2 抗體在 Tie2 水準上之效應，向 8 至 9 週齡 C57BL/6 小鼠 (Charles River) 經由 IP 注射以 20 mg/kg 給藥 Tie2 促效劑。於抗 Tie2 抗體投予之後的不同時間點，將小鼠 CO2 下安樂死。解剖出小鼠肺組織，並且在速凍後於 -80°C 儲存。將約 20 mg 之小鼠肺組織於含有蛋白酶及磷酸酶抑制劑混合液 (Thermo Scientific，目錄號 1861281) 之 1 ml 冰冷 RIPA 緩衝液 (Sigma，目錄號 20-188) 中均質化。藉由離心澄清之後，施用抗 Tie2 (BD，目錄號 557039) 與作為二級偵檢抗體之 HRP 抗小鼠 IgG Ab (GE Healthcare，目錄號 NA931V) 一起對組織裂解液進行 WB 分析。施用化學發光(EC) 試劑 (Thermo Scientific，目錄號 32132) 將 WB 膜顯影。如圖 17 中所示，Fab2.1 PEG 六聚體抗體在降低 Tie2 蛋白含量上之效應比藉由抗 Tie2 Fab-IgG 1.38 發揮之效應小得多。
實例 10 – 抗 Tie2 抗體之保護效應
抗 Tie2 促效劑在內皮完整性上之效應
激活 Tie2 之保護性效應係假定減低內皮細胞屏障之破壞。施用 HUVEC 滲透性測定法來量測當前揭露之抗 Tie2 促效抗體 Tie2.1 之內皮細胞 (EC) 滲漏。測定方法例示於圖 18A 中。
HUVEC 細胞 (Millipore，目錄號 SCCE001) 為以 0.1x106 每孔種植在 24 跨孔 (trans-well) 板 (Millipore，目錄號：ECM644) 中，該種植於完全 Endogro 培養基 (Millipore，目錄號 SCME002) 中進行。三天後，將培養基改變為基礎 Endogro 培養基，之後孵化 16 小時。然後，添加 10 ug/ml 中促效 Tie2 抗體。孵化 30 min 或 16 至 18 小時後，將 50 ul 的 5 mg/ml FITC-聚葡糖 (Sigma，目錄號 FD40) 添加到每一嵌入物中。在不同時間點，從每一孔之接收盤取 50 ul 之培養基，並藉由微量板讀板器量測 (激發濾光片：485 nm，發射濾光片 535nm)。
呈現於圖 18B 中之結果顯示，Tie2.1 PEG 六聚體在保護 HUVEC 細胞免於饑餓誘導之滲漏中是有效的。使用重組 Ang1 (其為一種促效性 Tie2 配體) 作為陽性對照。
使用 Tie2 促效劑之全身性投予進行的體內血管滲透性測定。
向五至八週齡 Balb/c 小鼠 (Charles River) 經腹膜內 (IP) 或靜脈內 (IV) 注射給藥 Tie2 促效劑。 18 小時之後，經由 IV 注射給予 1% 的伊凡氏藍 (Sigma，目錄號 206334)。十分鐘後，將小鼠於異氟烷下麻醉，將 VEGF (內部製備) 注射到小鼠耳部。注射 VEGF 後三十分鐘，藉由 CO2 將動物安樂死並切下小鼠耳朵。用甲醯胺 (Sigma，目錄號 47670-1L-F) 提取業經外滲至耳部組織內的伊凡氏藍，並於 620 nm 進行光譜學定量。測定方法例示於圖 19A 中。如圖 19B 中所示，Tie2.1-PEG-六聚體減低了伊凡氏藍到耳部組織內的滲漏。
使用 Tie2 促效劑之局部投予進行的體內血管滲透性測定。
向五至八週齡 Balb/c 小鼠 (Charles River) 經由 IV 注射給藥 1% 的伊凡氏藍 (Sigma，目錄號 206334)。十分鐘後，將小鼠在異氟烷下麻醉，將抗 VEGF G6.31 或 Tie2 促效劑六聚體 PEG Fab2.1 與 VEGF (內部製備) 經皮下注射到小鼠耳朵內。三十分鐘後，藉由 CO2 將小鼠安樂死並切下小鼠耳朵。用甲醯胺 (Sigma，目錄號 47670-1L-F) 提取業經外滲至耳部組織內的伊凡氏藍，並於 620 nm 進行光譜學定量。測定方案例示於圖 20A 中。圖 20B 顯示，Tie2.1-PEG-六聚體能夠減低 VEGF 誘導之血管滲透性。
使用 Tie2 促效劑之全身性投予進行的體內血管滲透性測定。
向五至八週齡 Balb/c 小鼠 (Charles River) 經由腹膜內給藥抗 Tie2 Fab-IgG 1.38。7 天後，收穫肺組織，並藉由西方墨點法分析 Tie2 蛋白含量 (圖 21A)。
向五至八週齡 Balb/c 小鼠 (Charles River) 經由腹膜內給藥抗 Tie2 Fab-IgG 1.38。4 小時至 24 小時之後，經由 IV 注射給予 1% 的伊凡氏藍 (Sigma，目錄號 206334)。十分鐘後，將小鼠於異氟烷下麻醉，將 VEGF (內部製備) 或 LPS (igma，目錄號 L3012) 注射到小鼠耳部。注射 VEGF 或 LPS 後三十分鐘，藉由 CO2 將動物安樂死並切下小鼠耳朵。用甲醯胺 (Sigma，目錄號 47670-1L-F) 提取業經外滲至耳部組織內的伊凡氏藍，並於 620 nm 進行光譜學定量。圖 21B 顯示，抗 Tie2.1.38 IgG 抗體降低 VEGF 誘導之血管滲透性。
抗 Tie2 促效劑在 VE- 鈣黏蛋白及 F- 肌動蛋白上之效應。
將 HUVEC 細胞 (Millipore，目錄號 SCCE001) 以 0.2x106 每孔於 Endogro 培養基中種植在 4 孔腔室載玻片中。三天後，將培養基改變為基礎 Endogro 培養基。孵化 3 小時後，添加 10 ug/ml Tie2 促效抗體。於抗體處理之後，將細胞用冰冷 PBS 洗滌 3 次並且用 3% 聚甲醛 (PFA) (Electron Microscopy Sciences，目錄號 15710-S) 於室溫 (RT) 固定 20 分鐘。經固定之細胞用冰冷 PBS 洗滌 3 次，並且用 0.1% Triton-PBS 於 RT 透化 10 min。用阻斷緩衝液 (10% 正常驢血清 + PBS + 0.1%Triton-X100) 於 RT 阻斷 1 小時後，將細胞用小鼠抗人 VE-鈣黏蛋白 (BD，目錄號 555661) 以 1:250 之稀釋度於 4℃ 孵化過夜。使用 Alexa Fluor™ 633 蠅虎蕈鹼 (Invitrogen，目錄號 A22284) 進行 F-肌動蛋白染色。載玻片用 PBS-T 於 RT 洗滌 5 次，然後用 1:500 稀釋之 Alexa Fluor 549 驢抗小鼠 IgG (H+L) (Jackson ImmunoResearch，目錄號 715-505-150) 於黑暗中在 RT 孵化 2 小時。於室溫，將載玻片 PBS-T 洗滌 4 次，之後用 PBS 洗滌 2 次。然後，將載玻片用 1:10000 稀釋的 5 mg/ml DAPI (Sigma，目錄號 D9542-1MG) 於 RT 染色 10 min，用 Prolong Gold 不變色試劑 (Invitrogen，目錄號 P36930) 封固。使用 Leica 共焦顯微鏡獲得螢光圖像。圖 22 顯示，曝露於抗 Tie2 Tie2.1-PEG-六聚體或 Tie1.1.38 導致從動態細胞-細胞接合到線性細胞-細胞接合之改變 (上圖)，以及減低之 F 肌動蛋白應力纖維及增加之皮層肌動蛋白 (下圖)。
實例 11 – 治療性 Tie2 結合分子之設計
安定性，例如，化學安定劑及氧化安定的，對於可行治療劑是重要的。當設計可能具有最優製造、儲存及體內半衰期之治療劑時，應理解獨特生物製劑之安定性特徵。
化學安定性。
為了評估蛋白質可發育性及體內安定性兩者之化學安定性，將 Tie2.1 Fab (HC 具有 SEQ ID NO: 90，LC 具有 SEQ ID NO: 25) 經緩衝液交換到低離子強度緩衝液中並濃縮至 1 mg/ml，經緩衝液交換到 pH 7.4 之磷酸鹽緩衝鹽水 (PBS) 中並濃縮至 1 mg/ml，或經緩衝液交換到具有聚山梨醇酯之高離子強度離胺酸緩衝液中並濃縮至 150 mg/ml (參閱，例如，Xu 等人 Mol Pharm, 2018, 15:4529-4537)。將樣品於 40℃ (組胺酸緩衝液) 或 37℃ (PBS) 孵化 2 週，藉由粒徑篩析層析法 (SEC) 分析，並且用毛細管等電聚焦 (iCIEF) 對主峰之消失及另外峰之出現成像。亦藉由胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶及/ LysC 消化熱應力材料，並藉由 LC-MS/MS 分析含有 CDR 殘基之肽，以證明天冬醯胺去醯胺化及/或天冬胺酸異構化。
於此等條件下，於組胺酸緩衝液中之 1 mg/ml Tie2.1 Fab 顯示，藉由 SEC 確定主峰無損失並且藉由 iCIEF 測得 1.3% 之主峰損失。於 150 mg/ml，其分別顯示 0.3% 及 3.0% 之損失。於 PBS 應力下，主峰損失 0.1% 及 9.6%。CDR 中的所有可偵檢之天冬醯胺及天冬胺酸皆顯示，於測試條件下，修飾之水準改變少於 0.2%。
Tie2.1 之氧化安定性
為了評估蛋白質可發育性及體內安定性兩者之氧化安定性，將 Tie2.1 Fab (與上文相同) 經緩衝液交換到低離子強度組胺酸緩衝液中並使用 2,2’-偶氮-雙-(2-胺基丙烷)二鹽酸鹽 (AAPH) 施加應力 (例如，參閱，Xu 等人，2018, Mol Pharm, 15:4529-4537)。亦藉由胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶及/ LysC 消化應力材料，並藉由 LC-MS/MS 分析含有 CDR 殘基之肽，以證明甲硫胺酸及/或色胺酸氧化。
於此等條件下，Tie2.1 Fab 顯示 W98 及 W100a 之氧化增加 39.3%，並且 M100c 之氧化增加 3.1%。
具有改善之氧化安定性之變異體的設計
表現並純化 hIgG1 型式的 Tie2.1 W98 及 W100a 之多種變異體。將抗 Tie-2 變異體與山羊抗人 IgG Fc 交聯，並將該混合物一式兩份添加到大鼠主動脈內皮細胞中，最終濃度分別為 20 ug/ml 及 7 ug/ml。如上文所揭示者 (實例 3) 評估磷-AKT 水準之改變，並繪製為磷-AKT 訊號之平均改變
圖 23 顯示，Tie2.1 hIgG1 之色胺酸 98 及 100a 變異體對於驅動 Tie-2 下游之磷-AKT 訊號傳導的影響。在這一組 25 個所測試之突變中，於 W98 處之突變無一維持活性。於單個點處，位於 W100a 處之突變似乎維持活性。詳而言，至少變異體 Tie2.1.W100aL、Tie2.1.W100aK、Tie2.1.W100aM、Tie2.1.W1001F、Tie2.1.W100aY、Tie2.1.W100aR、Tie2.1.W100aN、Tie2.1.W100aN、Tie2.1.W100aQ、Tie2.1.W100aH 維持激活磷-AKT 訊號傳導之能力 (作為 Tie2 促效劑而動作)。
如所揭示者 (實例 6)，將兩種 W100a 變異體 (W100aL 及 W100aK) 表現為具有 C 端 SPPC 序列之 Fab 並且共軛至六臂 6 kDa PEG 核心。 如所揭示者 (實例 3)，將多種濃度之 PEG-六聚體與原代人視網膜微血管內皮細胞 (ACBRI 181，Cell Systems Inc., Kirkland, WA) 一起孵化，並評估磷-AKT 水準之改變。W100aL 及 W100aK 兩者皆於較低濃度下顯示輕微減低之活性 (圖 24)
實例 12 – 抗 Tie2 抗體共軛物之體內研究
使用食蟹獼猴進行非臨床研究以評估受試者耐受抗 Tie2 抗體共軛物投予之能力並且確定是否發生任意副作用。將具有 6kDa PEG-六聚體核心之 Tie 2.1 Fab-SPPC (HC 具有 SEQ ID NO: 89 並且 LC 具有 SEQ ID NO: 25) 經由每 2 週 50 ul 玻璃體內 (ITV) 注射 (2 mg 劑量) 投予至 2 隻雄性食蟹獼猴之雙眼內，總計施用 3 個劑量。劑量由委員會認證之獸醫眼科醫師投予。為了模擬臨床給藥，於顳下象限中向眼睛給藥。對動物觀察 5 週，並且耐受性評估為基於綜合性臨床眼科評估 (狹縫燈活組織檢視法、間接檢眼鏡及眼壓量測)、眼睛之臨床及解剖病理學。
該 5 週 ITV 重複給藥研究顯示，投予具有 6kDa PEG-馬來醯亞胺六聚體核心之 Tie 2.1 Fab-SPPC 在猴體內耐受良好。短暫的眼部發炎峰值於第 3 天出現，第 8 天降低，並隨著重複給藥而減少。於眼部組織病理學評估中關注到的微小至輕微之單核發炎細胞與對於人源化蛋白質之免疫原性反應一致。
實例 13 – 抗 Tie2 抗體共軛物之體內研究
於另一臨床前研究中，在以 2 mg/眼進行單次雙側玻璃體內 (ITV) 注射之後，於雄性食蟹獼猴中研究抗 Tie2.1 PEG-六聚體的眼部 PK。執行該研究以量測 Tie2.1 PEG-六聚體於玻璃體液、眼房液及血清中之水準。另外地，對玻璃體樣品評估 Tie2.1 Fab 分子之體內氧化以及該氧化在該分子之擬體內活性上的效應。動物照護係根據「動物福祉法案：實驗室動物照護及使用指南」以及科文斯實驗室動物福祉辦公室 (Office of Laboratory Animal Welfare of Covance) 規定者進行。
抗 gD Fab 六聚體-SPPC 用作對照群組，並且亦以相同劑量水準 (2 mg/眼) 測試之。為了分離動物之群組，藉由 IV 路徑以 4 mg/動物給藥 Tie2.1 PEG-六聚體。將體重 2 至 4 kg 的大約 2 至 4 歲之原生雄性食蟹獼猴分配至多個劑量群組。對於 ITV 劑量群組，將測試品及對照品經由單次 ITV 注射投予至每隻眼睛，並且對其進行長達 21 天之觀察。由獸醫眼科醫師於大約 7 點鐘位置對右眼執行眼部劑量投予，並且於大約 5 點鐘位置對左眼執行眼部劑量投予。注射體積限制為 50 µL/眼。ITV 給藥之後，在第 1 天 (給藥後 4 小時)、第 2 天 (僅測試品群組)、第 7 天、第 14 天及第 21 天將動物安樂死 (每個時間點每一群組 2 隻動物)，以收集眼部樣品 (玻璃體液及眼房液) 進行 PK 估計。亦於 0.25 小時、2 小時、4 小時、8 小時、12 小時、24 小時、第 3 天、第5 天、第7 天、第10 天、第14 天及第 21 天，從全部存活動物收集血液樣品並收集在血清分離管中，以進行 PK 估計。於 IV 群組之情況下，劑量為經由隱靜脈投予，於 0.083 小時、0.25 小時、0.5 小時、2 小時、4 小時、8 小時、12 小時、24 小時、2 天、第3 天、第4 天、第5 天、第7 天、第10 天、第14 天及第 21 天收集非末端血液樣品 (但並非眼部樣品) 進行 PK 估計。收集之後，將血液樣品靜置 60 min，並旋轉沉降以將血清慢慢倒入 2D 條形碼管中。
全部血清樣品皆於 -70°C 儲存，直到使用人 IgG ELISA 進行藥物濃度測定為止。將 Nunc® MaxiSorp™ 384 孔板 (Nalge Nunc International, Rochester, NY) 用稀釋於包被緩衝液 (0.05 M 碳酸鹽/碳酸氫鹽緩衝液，pH 9.6) 中之 0.5 μg/mL 綿羊抗人 IgG 抗體 (Binding Site, San Diego, CA, USA) 包被，並且於 4℃ 孵化過夜。該板用洗滌緩衝液 (0.5% Tween-20 於 PBS 緩衝液中，pH 7.4) 洗滌 3 次，並且用阻斷緩衝液 (PBS/0.5 % BSA/15 ppm Proclin，pH 7.4) 於 RT 處理 1 至 2 小時。該板用洗滌緩衝液洗滌 3 次，然後將稀釋於樣品緩衝劑 (PBS/0.5% BSA/0.05% 土溫 20/5 mM EDTA/0.25% CHAPS/0.35 M NaCl/15 ppm Proclin，pH 7.4) 中之樣品添加到孔中，並且於 RT 孵化 2 小時。該板用洗滌緩衝液洗滌 6 次之後，將偵檢抗體山羊抗人 IgG (H+L) -辣根過氧化物酶 (HRP) (Bethyl Laboratories, Inc., Montgomery, TX, USA) 於測定緩衝液 (PBS/0.5% BSA/15 ppm Proclin/0.05% 土溫 20，pH7.4) 中稀釋至 100 ng/mL 並添加到孔中。將板於振蕩器上在 RT 孵化 1 小時，然後用洗滌緩衝液洗滌 6 次，使用 TMB 過氧化物酶受質顯影 (Moss Inc., Pasadena, Maryland) 20 分鐘，之後添加 1 M 磷酸以終止反應。相對於 620 nm 之參考波長，於 450 nm 量測吸光度。樣品濃度為從標準曲線之 4 參數擬合外推而得。可報告之測定範圍為 0.16 ng/mL 至 5 ng/mL (食蟹獼猴血清之 LLOQ 為 2 ng/mL，而眼房液及玻璃體液之 LLOQ 則為 16ng/mL)。
亦於第 -7 天、第 7 天、第 14 天及第 21 天從所有群組收集血清樣品進行抗藥物抗體 (ADA) 估計。藉由下述者測定 ADA：將 1ug/mL 於包被緩衝液 (0.05 M 碳酸鹽/碳酸氫鹽緩衝液，pH 9.6) 中之抗 Tie2 六聚體或抗 gD 六聚體以直接包被到 Nunc® MaxiSorp™ 384 孔板 (Nalge Nunc International, Rochester, NY) 上，並且於 4℃ 孵化過夜。該板用洗滌緩衝液 (0.5% Tween-20 於 PBS 緩衝液中，pH 7.4) 洗滌 3 次，並且用阻斷緩衝液 (PBS/0.5 % BSA/15 ppm Proclin，pH 7.4) 於 RT 處理 1 至 2 小時。該板再次用洗滌緩衝液洗滌 3 次，然後將稀釋於樣品緩衝劑 (PBS/0.5% BSA/0.05% 土溫 20/5 mM EDTA/0.25% CHAPS/0.35 M NaCl/15 ppm Proclin，pH 7.4) 中之樣品添加到孔中，並且於 RT 孵化 2 小時。該板用洗滌緩衝液洗滌 6 次之後，將偵檢抗體山羊抗人 IgG (Fcγ) -辣根過氧化物酶 (HRP) (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) 於測定緩衝液 (PBS/0.5% BSA/15 ppm Proclin/0.05% 土溫 20，pH7.4) 中稀釋至 80 ng/mL 並添加到孔中。將板於振蕩器上在 RT 孵化 1 小時，然後用洗滌緩衝液洗滌 6 次，使用 TMB 過氧化物酶受質顯影 (Moss Inc., Pasadena, Maryland) 20 分鐘，之後添加 1 M 磷酸以終止反應。相對於 620 nm 之參考波長，於 450 nm 量測吸光度。 基於天然個體動物之分佈，統計性地導出切斷點。結果報告每一樣品之效價，其為樣品 OD 跨越切斷點 OD 處之稀釋度的對數。該測定之最小稀釋度為 1:100。＜2.0 之對數效價意為其低於最小稀釋度下之切斷點，因此，該動物為陰性。
除了上文述及之群組之外，該研究中亦測試了眼部聯合群組，其中，抗 gD Fab 六聚體與 Tie2.1 PEG-六聚體藉由 ITV 注射一起給藥 (間隔 10 min；Tie2.1 PEG-六聚體，之後為抗 gD Fab 六聚體)。該群組之目標為評估預給藥測試品對於對照群組之眼部 PK 的潛在影響。兩種化合物皆以與單一藥劑群組中相同之劑量水準 (亦即，2 mg/眼) 給藥，並且此等群組中之劑量體積為限制為 100 µL/眼 (包括兩種化合物)。
使用抗 Tie2 ELISA 測定抗 Tie2 Fab 六聚體濃度之水準。將 Nunc® MaxiSorp™ 384 孔板 (Nalge Nunc International, Rochester, NY) 用稀釋於包被緩衝液 (0.05 M 碳酸鹽/碳酸氫鹽緩衝液，pH 9.6) 中之 1.0 μg/mL 重組人 Tie2 抗體 (Abcam, Cambridge, MA) 包被，並且於 4℃ 孵化過夜。該板用洗滌緩衝液 (0.5% Tween-20 於 PBS 緩衝液中，pH 7.4) 洗滌 3 次，並且用阻斷緩衝液 (PBS/0.5 % BSA/15 ppm Proclin，pH 7.4) 於 RT 處理 1 至 2 小時。該板再次用洗滌緩衝液洗滌 3 次，然後將稀釋於樣品緩衝劑 (PBS/0.5% BSA/0.05% 土溫 20/5 mM EDTA/0.25% CHAPS/0.35 M NaCl/15 ppm Proclin，pH 7.4) 中之樣品添加到孔中，並且於 RT 孵化 2 小時。該板用洗滌緩衝液洗滌 6 次，然後將偵檢抗體山羊抗人 IgG (H+L) -辣根過氧化物酶 (HRP) (Bethyl Laboratories, Inc., Montgomery, TX, USA) 於測定緩衝液 (PBS/0.5% BSA/15 ppm Proclin/0.05% 土溫 20，pH7.4) 中稀釋至 100 ng/mL 並添加到孔中，並且於 RT 在振蕩器上孵化 1 小時。將板用洗滌緩衝液洗滌 6 次，使用 TMB 過氧化物酶受質顯影 (Moss Inc., Pasadena, Maryland) 20 分鐘，之後添加 1 M 磷酸以終止反應。相對於 620 nm 之參考波長，於 450 nm 量測吸光度。樣品濃度為從標準曲線之 4 參數擬合外推而得。可報告之測定範圍為 0.31 ng/mL 至 10 ng/mL (食蟹獼猴血清之 LLOQ 為 6 ng/mL，而眼房液及玻璃體液之 LLOQ 則為 31ng/mL)。
使用抗 gD ELISA 測定抗 gD Fab 六聚體濃度之水準。將 Nunc® MaxiSorp™ 384 孔板 (Nalge Nunc International, Rochester, NY) 用稀釋於包被緩衝液 (0.05 M 碳酸鹽/碳酸氫鹽緩衝液，pH 9.6) 中之 1.0 μg/mL gD (內部製備，Req 361937) 包被，並且於 4℃ 孵化過夜。該板用洗滌緩衝液 (0.5% Tween-20 於 PBS 緩衝液中，pH 7.4) 洗滌 3 次，並且用阻斷緩衝液 (PBS/0.5 % BSA/15 ppm Proclin，pH 7.4) 於 RT 處理 1 至 2 小時。該板再次用洗滌緩衝液洗滌 3 次，然後將稀釋於樣品緩衝劑 (PBS/0.5% BSA/0.05% 土溫 20/5 mM EDTA/0.25% CHAPS/0.35 M NaCl/15 ppm Proclin，pH 7.4) 中之樣品添加到孔中，並且於 RT 孵化 2 小時。該板用洗滌緩衝液洗滌 6 次之後，將偵檢抗體山羊抗人 IgG (H+L) -辣根過氧化物酶 (HRP) (Bethyl Laboratories, Inc., Montgomery, TX, USA) 於測定緩衝液 (PBS/0.5% BSA/15 ppm Proclin/0.05% 土溫 20，pH7.4) 中稀釋至 100 ng/mL 並添加到孔中。將板於振蕩器上在 RT 孵化 1 小時，然後用洗滌緩衝液洗滌 6 次，使用 TMB 過氧化物酶受質顯影 (Moss Inc., Pasadena, Maryland) 20 分鐘，之後添加 1 M 磷酸以終止反應。相對於 620 nm 之參考波長，於 450 nm 量測吸光度。樣品濃度為從標準曲線之 4 參數擬合外推而得。可報告之測定範圍為 0.31 ng/mL 至 10 ng/mL (食蟹獼猴血清之 LLOQ 為 6 ng/mL，而眼房液及玻璃體液之 LLOQ 則為 31ng/mL)。
使用非隔室分析方法 (於 Phoenix WinNonlin 版本 6.4 上，Pharsight Corp, Mountain View, CA) 並採用標稱時間及劑量執行跨多種基質之濃度-時間資料的 PK 分析。於眼部隔室中，Tie2.1 PEG-六聚體及抗 gD Fab 六聚體兩者皆顯示相當之 PK 特徵。兩種化合物於玻璃體液中之半衰期為大約 5 天，而於眼房液中為大約 4 天 (表 12)。這與 Shatz 等人 (2016, Mol Pharm, 13:2996-3003) 及 Crowell 等人 (2019, Transl Vis Sci Technol 8(6):1) 提出之基於尺寸的眼部動力學一致，於該等文獻中，作者業經於兔體內證明，生物製劑於 ITV 注射後的眼部 PK 主要受分子尺寸亦即 Rh 之影響 (Shatz 等人，2016，見上文)。
圖 25 提供抗 Tie2.1 Fab 六聚體及抗 gD Fab 六聚體在單次玻璃體內或靜脈內給藥至雄性食蟹獼猴之後的藥物動力學曲線。
下表 12 詳述抗 Tie2.1 Fab 六聚體及抗 gD Fab 六聚體在單次玻璃體內或靜脈內給藥至雄性食蟹獼猴之後的藥物動力學參數。
表 12
基質 組 Cmax (µg/mL) Tmax ( 天) AUC0-t (µg· 天/mL) t1/2 ( 天) CL (mL/ 天) % F
血清 1 (ITV，2 mg/眼) 9.80 ± 1.22 1.00 101 ± 10.1 3.83 NA NA
2 (ITV，2 mg/眼) 3.48 ± 0.868 0.500 9.00 ± 1.44 2.26 NA 28.8
3 (IV，4 mg/動物) 42.5 ± 5.12 0.0579 31.3 ± 5.19 0.261 130 ± 23 NA
眼房液 1 (ITV，2 mg/眼) 245 ± 48.7 0.167 1120 ± 171 3.59 NA NA
2 (ITV，2 mg/眼) 290 ± 59.1 0.167 918 ± 68.4 4.11 NA NA
玻璃體液 1 (ITV，2 mg/眼) 641 ± 25.4 0.167 3500 ± 102 4.55 0.559 NA
2 (ITV，2 mg/眼) 570 ± 63.3 0.167 3460 ± 152 4.99 0.543 NA
IV - 靜脈內；ITV – 玻璃體內；NA - 不可用。 Cmax 、AUC 及 CL 揭示為值 ± SE (若可能) 第 1 群組投予抗 gD Fab 六聚體 (40 mg/mL)。 第 2 群組投予抗 Tie 2.1 Fab 六聚體 (40 mg/mL) 第 3 群組投予抗 Tie2.1 Fab 六聚體 (4 mg/mL)
有趣的是，跨包括具有 4 至 5 天之半衰期的血清在內的全部基質，抗 gD 六聚體 Fab 之 PK 是相當的。於此相比，抗 Tie2.1 Fab 六聚體於眼部及血清隔室中具有截然不同之 PK 特徵，亦即，與眼部 PK (半衰期為 4 至 5 天)，全身性 PK (血清半衰期為大約 2.3 天) 相對較快。不受縛於理論，該研究之觀察結果 (抗 Tie2.1 Fab 六聚體於 ITV 給藥後的較快之全身性 PK) 可歸因於藥物-標靶交互作用導致對 PK 的影響，該交互作用一般指代為標靶介導之藥物沉積 (TMDD)。除了眼部隔室之外，標靶 (Tie2) 亦已知表現於血管組織中。由於血管組織之豐富性，與眼部組織相比，TMDD 之影響可能在血清隔室中而不是在眼部隔室中更為明顯。對血清樣品之 ADA 分析顯示，關於測試品及對照品兩者皆觀察到了最小 ADA，並且 ADA 對於血清 PK 沒有明顯影響。未收集 ADA 樣品以評估對眼部動力學之影響。  該研究中未探究 ADA 對於眼部基質中之 PK 的影響。Tie2.1 PEG-六聚體於 IV 推注給藥後在血清中之 PK 亦相對更快，如藉由大約 0.3 天之半衰期所指示者。於 IV 及 IVT 投予後之血清半衰期的這一差異業經明確地證明了 Tie2.1 PEG-六聚體於 ITV 給藥後在血清中之誤換動力學 (flip-flop kinetics) 的出現。Tie2.1 PEG-六聚體於 ITV 給藥後之絕對生物可用度為 29%。該研究中 ITV 劑量群組之結果表明，對於新穎型式，於 ITV 後之血清 PK 可能不總是充分代表眼部 PK。因此，除了血清 PK 之外，尤其是對於新穎型式及動作機制，就選擇用作眼部治療劑之分子而言，探究眼部 PK 至關重要。
來自聯合群組之兩種化合物 (抗 gD Fab 六聚體 + Tie2.1 PEG-六聚體共同給藥) 的跨多種基質之 PK與其各自單一藥劑治療群組相當 (資料未顯示)。於任意基質中，共同給藥對於每一化合物之 PK 皆無值得關注之影響。
對來自體內研究之樣品中的體內 Tie2.1 PEG- 六聚體去共軛產物進行定量
去共軛產物之下限定量。
使用毛細管電泳雷射誘導型螢光 (CE-LIF)，對在將 Tie2.1 PEG-六聚體經玻璃體內投予至食蟹獼猴後生成的 Tie2.1 PEG-六聚體去共軛產物進行定量。為了評估 Tie2.1 PEG-六聚體及其降解物之定量下限，作成了Tie2.1 PEG-六聚體、Tie2.1 PEG-五聚體及未共軛之 Tie2.1 Fab 單體標準品，以 1:1:1 質量比率混合，並且以 500 µg/mL 至 10 µg/mL 範圍內之不同濃度加標到 PBS 緩衝液或 VH 基質中。使用先前報導之方案並做微小修飾而製備樣品 (Salas-Solano 等人，2006, Anal Chem, 78:6583-6594)。簡言之，首先以 1:1 之體積比率將樣品與 pH 6.7 之 Na3 PO4 混合。然後將 4% 十二烷基硫酸鈉 (SDS) 與 150 mM N-乙基馬來醯亞胺 (NEM) 一起添加到樣品混合物中，並於 70℃ 孵化 5 分鐘。冷卻至室溫後，添加 3-(2-呋喃基)喹啉酮-2-甲醛 (FQ) 染料 (ThermoFisher Scientific)，然後添加氰化鉀。然後將樣品混合物於 50℃ 孵化 10 min。冷卻至室溫後，將樣品加載到 PA 800 plus 毛細管電泳儀 (Sciex) 上。使用先前揭示之 CE-LIF 方法 (Michels 等人，2007, Anal Chem, 79:5963-5971) 並對樣品注射時間做微小修飾，以最大化對於體內樣品之靈敏度。對於 LIF 偵檢，激發波長為 488 nm 並且偵檢波長為 600 nm。
如圖 26 中所示，於緩衝劑加標實驗中，在來自全部加標濃度之重疊電泳圖上，六聚體、五聚體及單體完全分離。
使用經積分之峰面積計算每一物質之豐度百分比。具有以 1:1:1 質量比率以不同濃度加標到緩衝液中之完整 Tie2.1 PEG-六聚體、Tie2.1 PEG-五聚體及 Tie2.1 Fab 單體的相對百分比呈現於下表 13 中 (其他微量物質未顯示)。
表 13
每一物質之加標濃度 (ug/ml) 單體 % ：五聚體 % ：六聚體 %
500 30:33:34
250 31:32:34
100 31:32:34
50 31:32:34
10 31:32:34
此等資料表明，低至 10 µg/mL 為止，六聚體、五聚體及單體 Fab 始終可以定量 (在比率接近 1:1:1 的這一情況下)。因為基質蛋白干擾，單體峰未計入 VH 加標實驗之相對定量中，如圖 27 中所示。惟，在重疊之電泳圖上，六聚體峰與五聚體峰完全分離並且顯示可忽略不計之基質干擾，這要感謝它們的大尺寸及較晚之遷移時間。
當使用經積分之峰面積計算兩種物質的相對豐度時，完整六聚體與五聚體之比率始終接近 1:1，如下表 14 中所示。
表 14
每一物質之加標濃度 (ug/ml) 五聚體 % ：六聚體 %
500 46:50
250 46:49
100 46:49
50 47:49
10 48:50
抗 Tie2 六聚體及其降解物於食蟹獼猴藥物動力學樣品中之相對定量。
於來自上文所揭示之食蟹獼猴研究的樣品中量測 Tie2.1 PEG-六聚體及其降解物。於若干時間點，包括第 1、3、8、15 及 22 天，從食蟹獼猴之玻璃體液 (VH) 組織收集 PK 樣品。所收集之樣品以與上揭者相同之方式處理。來自在不同時間點收集之 PK 樣品的重疊之 CE-LIF e電泳圖顯示於圖 28 中，其重疊了來自不同時間點之 Tie2.1-PEG-六聚體 PK 樣品。
使用經積分之峰面積將完整六聚體峰及降解物五聚體峰定量，並顯示於下表 15 中 (將其他微量物質定量但資料未顯示)。
表 15
PK 採樣時間點 五聚體 % 六聚體 %
起始材料 10% 80%
第 1 天 17% 71%
第 5 天 27% 57%
第 8 天 31% 50%
第 15 天 33% 50%
第 22 天 32% 49%
將抗 Tie2 六聚體及五聚體相對豐度對不同時間點作圖，顯示於圖 29 中。此等結果表明，起始材料中存在一些五聚體，並且體內發生去共軛，這進一步增加了五聚體之相對豐度，但相對豐度於第 8 天左右開始穩定。
從食蟹獼猴樣品獲得之 Tie2.1-PEG 六聚體的分析性特徵 。
分析來自食蟹獼猴之樣品以評估 Tie2.1 共軛物之氧化。如下所述，測定對 Tie2.1 共軛物之以胺基酸殘基水準存在之氧化的偵檢及定量。將 40 uL 含有 Tie2.1 共軛物之生物基質 (例如，玻璃體液) 與 80 uL 之變性溶液 (8 M 尿素、25 mM 1,4-二硫蘇糖醇、100 mM 碳酸氫銨，全部溶於水中)。將混合物在 25℃ 孵化 30 分鐘。然後，將 10 uL 的 500 mM 碘乙醯胺添加到混合物中，並將混合物於黑暗中在 25℃ 孵化 30 分鐘。然後，將 10 uL Asp-N (Promega) 以 0.1 mg/mL 濃度 (於水中) 添加到混合物中。另外地，將 180 uL 的水添加到混合物中。然後將混合物在 37°C 孵化 1 小時。將 10 uL 胰蛋白酶/Lys-C (Promega) 以 0.2 mg/mL 濃度 (於水中) 添加到混合物中。將混合物在 37°C 孵化 3 小時。將 35 uL 之混合物進樣到與 Thermo Orbitrap Elite MS 偶合之 Waters Nanoacquity LC 中。然後，使用 Thermo Fisher Scientific BioPharma Finder 軟體分析所收集之原始資料。使用該軟體，透過高解析度質量資料與 CID 碎裂資料之組合來鑑定胺基酸水準上之修飾 (例如，氧化)。詳而言，藉由觀察 +16 Da 之質量偏移 (或整數倍數) 鑑定氧化。使用串聯 MS (CID 碎裂模式) 透過肽測序測定具體位置。資料顯示，體內氧化之具體位置為位於圖 30A 之 M100c 處 (本文中亦揭露為位於 SEQ ID NO: 22 之位置 107 的 M)。對來自食蟹獼猴之樣品的該分析中未觀察到色胺酸殘基之氧化。
此外，藉由觀察於 CID 碎裂後之特徵性 -64 Da 質量偏移而證實甲硫胺酸氧化。藉由將與經氧化物質相關之離子強度除以原生 (未氧化物質) 離子強度，經由 MS 測定定量。定量資料例示於圖 30B 中，顯示在 2 隻不同食蟹獼猴的眼睛中存在令人驚奇的高程度之 M100c 氧化。由於未在體外觀察到該程度之 M100c 氧化 (參閱，實例 11)，此等資料出乎意料。
M100c 氧化於體外在 Tie2.1 之活性上的效應。
為了證實 Tie2.1 M100c 之氧化可造成這一抗 Tie2 分子功能之減低，令 Tie2.1 經歷氧化條件以生成此等於 M100c 處經氧化之分子。將抗 Tie2 Fab 及六聚體之製劑經緩衝液交換到 pH 5.5 的 20 mM 組胺酸醋酸酯中。兩種樣品皆稀釋至 1 mg 蛋白質/ml。將 30% (w/v) 過氧化氫稀釋於水中以提供 5% (w/v) 原液。將過氧化氫原液添加到每一樣品中，以給出 0.06% (w/v) 之最終 H2 O2 濃度。向每一樣品之獨立等量小樣加標相等體積之緩衝液以用作對照。所有樣品皆經保護免於光照，並且於 5℃ 孵化 15 小時。經由添加T 20 倍莫耳過量之 L-甲硫胺酸將氧化反應淬滅，之後使用 PD-10 管柱脫鹽。使用上揭之 LC-MS 方法測得六聚體之氧化程度為約 65%。藉由先前揭示之 pAKT 測定法，評估多種濃度的經氧化之六聚體、經緩衝液處理 (未氧化) 之六聚體及多種對照。發現，氧化將經氧化之材料的活性減低了大約 50%，如圖 31 中所示。
從食蟹獼猴玻璃體液分離之六聚體的特異性活性。
為了理解體內氧化對於六聚體功能之影響，藉由將食蟹獼猴玻璃體樣品與給藥至食蟹獼猴玻璃體分離物中之給藥方案的標準曲線比較，測定活性 Tie2.1 PEG-六聚體之量。將此等數字與藉由 ELISA 發現之濃度 (上揭) 比較。圖 32 顯示藉由 ELISA 測定之 Tie2.1 PEG-六聚體的量以及藉由 pAKT 測定法測定之該分子的總活性。圖 33 顯示從食蟹獼猴玻璃體樣品分離之 Tie2.1 PEG-六聚體的具體活性。經正規化之活性 (活性濃度/總濃度) 顯示，21 天內食蟹獼猴玻璃體中具體活性的進行性損失，導致在最終時間點時保留 47% 活性。
實例 14 – 安定 Tie2.1 M100c 變異體之選擇
使用基因合成生成了編碼 Tie2.1 之 19 種變異體的 IgG1 重鏈表現載體，其中，VH 殘基 M100c 被替換為 19 種可選天然胺基酸之每一者。藉由使用編碼所欲之重鏈及輕鏈序列的表現載體對 Expi293 細胞進行短暫的共轉染而將 Tie2.1 變異體以 IgG 型式表現，並且藉由親和力層析術純化抗體蛋白質。
使用表面電漿子共振重組 (SPR)，於 Biacore T200 儀器 (GE Life Sciences) 上評估人及食蟹獼猴 Tie2 與 Tie2.1 hIgG1 變異體之結合。使用 S 系列 CM5 晶片 (GE Life Sciences)、人類抗體捕獲套組 (GE Life Sciences) 及胺偶合套組 (GE Life Sciences) 生成人類抗體捕獲晶片。使用 20 秒之接觸時間及 10 µl/min 之流速，非共價地捕獲在運行緩衝液 (10 mM HEPES、150 mM NaCl、0.05% 土溫 20、1 mM EDTA，pH 7.4) 中稀釋至 5 µg/ml 的抗體。於 37℃，使用單週期動力學方法分析與 300 nM 及 1500 nM 重組 Tie2 的結合，所使用之接觸時間為 60 秒，解離時間為 120 秒，並且流速為 50 µl/min。於週期之間，藉由以 30 µl/min 之流速進行 30 秒之 3M MgCl2 注射而將表面再生。從報告點表 ( Report Point Table) (Biacore 評估軟體 v3.0，GE Life Sciences) 獲得抗體捕獲水準及分析物結合水準之值。藉由下述者分析結果：將抗體捕獲水準之感測器圖正規化，然後比較所觀察之 Tie2 結合訊號的幅度。結果係顯示為經正規化之結合訊號，藉由將分析物結合反應 (以任意反應單位量測) 除以抗體捕獲水準 (以任意反應單位量測) 而計算。顯示來自 2 個實驗之結果，提供 Tie2.1 及 Tie2.1 變異體與重組 Tie2 ECD 結合的 SPR 分析結果。表 16：實驗 A；表 17：實驗 B。
表 16
實驗 A 經正規化之結合訊號
注射 1 注射 2
緩衝液 人 Tie2 (300 nM) 食蟹獼猴 Tie2 (300 nM) 緩衝液 人 Tie2 (1500 nM) 食蟹獼猴 Tie2 (1500 nM)
對照 抗 gD 0.00 0.01 0.01 0.02 0.03 0.03
Tie2.1 (平行測定) Tie2.1.M100c 0.00 0.10 0.08 0.01 0.35 0.33
Tie2.1.M100c 0.00 0.09 0.08 0.01 0.34 0.32
Tie2.1.M100c 0.00 0.10 0.08 0.02 0.35 0.32
所選之 Tie2.1 變異體 Tie2.1.M100cF 0.00 0.14 0.12 0.01 0.44 0.42
Tie2.1.M100cY 0.01 0.15 0.13 0.02 0.46 0.44
Tie2.1.M100cL 0.01 0.13 0.11 0.02 0.42 0.40
Tie2.1.M100cQ 0.00 0.10 0.09 0.02 0.33 0.31
Tie2.1.M100cI 0.00 0.04 0.03 0.01 0.14 0.12
表 17
實驗 B 經正規化之結合訊號
注射 1 注射 2
緩衝液 人 Tie2 (300 nM) 食蟹獼猴 Tie2 (300 nM) 緩衝液 人 Tie2 (1500 nM) 食蟹獼猴 Tie2 (1500 nM)
另外對照 Tie2.1 0.00 0.09 0.08 0.02 0.30 0.29
Tie2.1 0.00 0.08 0.07 0.02 0.29 0.28
Tie2.1 0.00 0.09 0.08 0.02 0.31 0.29
VH.M100c 組 Tie2.1.M100c 0.00 0.10 0.09 0.02 0.36 0.34
Tie2.1.M100cF 0.01 0.16 0.14 0.02 0.48 0.46
Tie2.1.M100cY 0.00 0.15 0.13 0.03 0.47 0.45
Tie2.1.M100cL 0.00 0.12 0.10 0.01 0.41 0.39
Tie2.1.M100cK 0.00 0.13 0.11 0.02 0.41 0.39
Tie2.1.M100cH 0.00 0.11 0.10 0.02 0.39 0.36
Tie2.1.M100cN 0.00 0.11 0.10 0.02 0.38 0.36
Tie2.1.M100cC 0.00 0.11 0.10 0.01 0.37 0.35
Tie2.1.M100cQ 0.01 0.09 0.08 0.03 0.32 0.31
Tie2.1.M100cW 0.00 0.08 0.07 0.01 0.31 0.29
Tie2.1.M100cS 0.01 0.06 0.05 0.03 0.23 0.21
Tie2.1.M100cR 0.00 0.06 0.05 0.01 0.22 0.20
Tie2.1.M100cG 0.00 0.06 0.05 0.02 0.21 0.20
Tie2.1.M100cD 0.00 0.04 0.03 0.01 0.16 0.15
Tie2.1.M100cV 0.00 0.04 0.04 0.02 0.16 0.15
Tie2.1.M100cI 0.01 0.03 0.03 0.03 0.14 0.13
Tie2.1.M100cA 0.00 0.03 0.03 0.01 0.14 0.13
Tie2.1.M100cE 0.00 0.03 0.03 0.02 0.12 0.11
Tie2.1.M100cP 0.00 0.02 0.02 0.03 0.11 0.10
Tie2.1.M100cT 0.00 0.02 0.02 0.01 0.10 0.09
Tie2.1.M100cF 之設計。
藉由 SPR 對 VH.M100c 變異體進行之初始篩查指示，若干不同之胺基酸可替換殘基 VH.M100c，同時保持與 Tie2 結合 (參閱上文)。人生殖系抗體序列常常在對應於源自噬菌體之抗體 Tie2.1 中 VH.M100c 的位置處含有甲硫胺酸 (M) 或***酸 (F) (www.IMGT.org，Giudicelli 等人，2005, Nucleic Acids Res, 33:D256-D261)。  吾等因此推斷，變異體 Tie2.1.M100cF 可能比其他變異體更不可能引起抗藥物免疫反應，並且對該變異體進行了更深入之分析性。
Tie2.1.M100cF 之高解析度親和力評估。
為了證實 M100cF 突變導致具有類似或改善的對於人及食蟹獼猴 Tie2 之親和力的抗體，重複上揭之 SPR 實驗並進行旨在改善結果之解析度的大量修飾。  將 Tie2.1 及 Tie2.1 變異體 hIgG1 抗體稀釋到 0.5 µg/ml，並各自以 15 秒、30 秒及 45 秒之接觸時間進行非共價捕獲，生成三種針對每一所測試抗體的不同表面密度。使用高效多週期動力學型式分析與重組人及食蟹獼猴 Tie2 之結合，所使用之接觸時間為 60 秒，解離時間為 60 秒，流速為 100 µl/min，並且 Tie2 濃度為 5 µM、2.5 µM、1.25 µM、625 nM、313 nM 及 156 nM。  濃度為 5 µM、2.5 µM 及 1.25 µM 之 Tie2 係注射兩次。使用 Biacore T200 評估軟體 v3.0 (GE Life Sciences) 分析結果。  使用具有多個 Rmax 之 1:1 結合模型並將 RI 設定為零，將來自所有三種表面密度之結果一起分析。  獲得與 Tie2.1 及 Tie2.1.M100cF 兩者結合之人 Tie2 的具有高可信度之動力學常數 (對於 Rmax1、Rmax2、Rmax3、ka 及 kd，T 值 ＞ 100) (表 18)。
表 18
   Tie2.1 Tie2.1.M100cF
動力學 分析 穩態分析 動力學 分析 穩態分析
締合速率常數 (ka) 1.8 x 105 M-1 s-1 不可用 2.2 x 105 M-1 s-1 不可用
解離速率常數 (kd) 4.5 x 10-1 s-1 不可用 3.9 x 10-1 s-1 不可用
平衡解離常數 (KD ) 3 µM 3 µM 2 µM 2 µM
對相同數據集之穩態分析導致與彼等經由動力學分析獲得者相似之 KD 值 (表 18)。對於結合至重組食蟹獼猴 Tie2，觀察到相似的 Ka、Kd 及 KD 值 (表 19) 。
表 19
   Tie2.1 Tie2.1.M100cF
動力學 分析 穩態分析 動力學 分析 穩態分析
締合速率常數 (ka) 1.5 x 105 M-1 s-1 不可用 1.9 x 105 M-1 s-1 不可用
解離速率常數 (kd) 4.4 x 10-1 s-1 不可用 3.7 x 10-1 s-1 不可用
平衡解離常數 (KD ) 3 µM 3 µM 2 µM 2 µM
實例 15 – 變異體抗 Tie2 PEG 共軛物之分析
儘管本文所提供之揭露證明，包含與多臂部分共軛並且可激活 Tie2 活性之抗 Tie2.1 抗體的組合物具有有益之活性及治療價值諸如在治療眼疾中，但所欲者係鑑定具有最優特性包括安定性之共軛物。出於這一原因，設計不同之 Tie2.1 PEG 六聚體共軛物並測試之，以評估不同共軛位點之效應。於該實例中，將 6kDa PEG-六聚體馬來醯亞胺與經改造 Tie2.1 Fab (ThioFab) 共軛，以在 Fab 蛋白質內之策略性位置處含有半胱胺酸。
藉由替換重鏈或輕鏈之位於所指示位置處的胺基酸殘基而引入半胱胺酸，例如，HC T120C 意為 Tie2.1M100cF 之 HC 經改造使得位於位置 120 處之 Thr 被改變為 Cys。「SPPC」指示一種 ThioFab 分子，其中，重鏈 C1 域之 C 端經改造以將 Tie2.1M100cF 之位置 226-229 (EU 編號) 處的殘基 CPPC 改變為 SPPC。
將變異體 Tie2.1M100cF ThioFab 分子與商業上可獲得的具有圖 39 所示核心結構的馬來醯亞胺官能化之六臂 PEG (JenKem Technology，產品號 6ARM(DP)-MAL-6000) 共軛。
製備變異體 Tie2.1M100cF 共軛物，並將其以 1 mg/ml 濃度於 37℃ 儲存 4 週。如實例 13 中所揭示者量測去共軛。每一共軛物在 21 天內之去共軛百分比。結果提供於表 34 中。
使用如實例 3 中所揭示之 HUVEC pAKT 測定法量測此等共軛物中每一者之活性，並將結果顯示於圖 35A 及圖 35B 中。
實例 16 – 變異體抗 Tie2 PEG 共軛物之體內安定性
為了研究上文所揭示之變異體抗 Tie2 PEG 共軛物的體內安定性，選擇 3 種共軛物，將其在單劑量研究中投予至食蟹獼猴。該 3 種共軛物為 Tie2.1M100cF Fab-SPPC、Tie2.1M100cF, LC T206C 及 Tie2.1M100cF, HC T209C。詳而言，以 2 mg/眼進行雙側注射而投予。總計 18 隻動物包括於 3 個群組中：第 1 群組：投予 Tie2.1M100cF Fab-SPPC 之 6 隻動物；第 2 群組：投予 Tie2.1M100cF, LC T206C 之 6 隻動物；第 3 群組：投予 Tie2.1M100cF, HC T209C 之 6 隻動物。評估除了包括共軛物安定性分析之外，亦包括眼部及血清 PK、血清 ADA 及血壓 (於第 1 群組之 2 隻動物中)。
於血清、玻璃體液及眼房液樣品中之 PK 特徵提供於圖 36 中，並且 PK 參數報告於表 20 中。
儘管在眼房液中針對 Tie2.1M100cF HC-T209C Fab-PEG 六聚體觀察到微小差異諸如輕微較低之 Cmax ，但所有 3 種測試共軛物之間的總體眼部 PK (於玻璃體液及眼房液中) 在很大程度上是相當的。與在獼猴玻璃體液中報告之典型 Fab t1/2 (~ 2-3 天，基於來自 Genentech 進行之 ITV 研究的食蟹獼猴中 Fab 的歷史資料 (Crowell 等人 (2019, Transl Vis Sci Technol 8(6):1)) 相比，所有 3 種共軛物皆顯示相對更長的於眼部隔室中之滯留時間 (t1/2 在 3.20 至 3.76 天之範圍) 並且具有相對較高之 t1/2 ，指示六聚體共軛物於眼部隔室中的基於尺寸之 PK。
ThioFab 共軛物 (Tie2.1M100cF LC-T206C Fab-PEG 六聚體及 Tie2.1M100cF HC-T209C Fab-PEG 六聚體) 的血清 PK 優於 SPPC 共軛物 (Tie2.1M100cF SPPC Fab-PEG 六聚體)。由於共軛方法差異所致之體內安定性差異可能會是共軛物之間這一系統性 PK 差異的驅動因子。看起來，對於所有 3 種測試共軛物，誤換動力學可能在 ITV 給藥後發生在血清中 (基於 PK)，並且例示了藥物從玻璃體液中釋放可能是速率限制步驟，而該步驟可能驅動血清隔室中的 PK。
表 20
基質 組 ( 劑量) Cmax (µg/mL) AUC0-t (µg· 天/mL) t1/2 ( 天) CL 或 CL/F* (mL/ 天)
玻璃體液 1 (ITV，2 mg/眼) 591 ± 85.9 3180 ± 309 3.65 0.697
2 (ITV，2 mg/眼) 788 ± 278 4810 ± 1120 3.76 0.502
3 (ITV，2 mg/眼) 520 ± 94.8 3460 ± 340 3.20 0.585
眼房液 1 (ITV，2 mg/眼) 122 ± 53.4 575 ± 188 3.63a 3.83
2 (ITV，2 mg/眼) 118 ± 13.0 634 ± 55.3 3.70a 3.81
3 (ITV，2 mg/眼) 57.4 ± 21.2 440 ± 77.2 3.46a 4.59
血清 1 (ITV，2 mg/眼) 1.23 ± 0.533 2.76 ± 0.59 6.95 1620
2 (ITV，2 mg/眼) 1.06 ± 0.356 4.99 ± 0.799 3.66 984
3 (ITV，2 mg/眼) 1.39 ± 0.200 6.18 ± 0.505 3.49 659
Cmax 及 AUC 揭示為值 ± SE。第 1 群組：抗-Tie2.1_M100cF_SPPC_Fab-PEG 六聚體 第 2 群組：抗-Tie2.1_M100cF_LCT206C_Fab-PEG 六聚體 第 3 群組：抗-Tie2.1_M100cF_HCT209C_Fab-PEG 六聚體 *：CL 為針對玻璃體液，CL/F 為針對眼房液及血清 a：Cmax 用於計算 t1/2 。
使用取自動物之玻璃體液樣品評估 ThioFab 共軛物之安定性，其中，於第 0、7 及 21 天量測樣品中完整共軛物的百分比。結果呈現於圖 37 中。
亦於第 0、7 及 21 天量測樣品中共軛物之活性。藉由在如實例 3 中揭示之 pAkt FRET 測定法中測試玻璃體液而量測 pAkt 活性。藉由使用 pAkt FRET 測定法中之標準曲線，將活性六聚體定量。如圖 38A 及 39A 中所示，於 21 天內，所有共軛物於玻璃體液中皆保留擬體內活性。
序列之表
序列識別號 説明 序列
3 Tie 2.1 HC CDR1 NTDIS
4 Tie 2.1 HC CDR2 RISPSDGNTYYADSVKG
5 Tie 2.1 HC CDR3 RTRWASX1 AX2 DY (其中，X1 為 M、L、K、F、Y、R、N、Q、H 或 W；及/或 X2 為 F、Y、L、Q、I、K 或 H)
6 Tie 2.1 HC CDR3 RTRWASWAMDY
7 Tie 2.1 HC CDR3M100cF RTRWASWAFDY
8 Tie 2.1 LC CDR1 RASQDVSTAVA
9 Tie 2.1 LC CDR2 SASFLYS
10 Tie 2.1 LC CDR3 QQSYTTPPT
11 Tie 2.1 HC FR1 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS
12 Tie 2.1 HC FR2 WVRQAPGKGLEWVG
13 Tie 2.1 HC FR3 RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAR
14 Tie 2.1 HC FR4 QGTLVTVSS
15 Tie 2.1 LC FR1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC
16 Tie 2.1 LC FR2 WYQQKPGKAPKLLIY
17 Tie 2.1 LC FR3 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC
18 Tie 2.1 LC FR4 FGQGTKVEI
19 Tie 2.1 HC 可變域 (具有 X1 及 X2 之 CDR3) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNTDISWVRQAPGKGLEWVGRISPSDGNTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRTRWASX1 AX2 DYWGQGTLVTVSS
20 Tie 2.1 HC M100cF 可變域 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNTDISWVRQAPGKGLEWVGRISPSDGNTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRTRWASWAFDYWGQGTLVTVSS
21 Tie 2.1 LC 可變域 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYTTPPTFGQGTKVEIK
22 Tie 2.1 HC 可變域 (無突變) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNTDISWVRQAPGKGLEWVGRISPSDGNTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRTRWASWAMDYWGQGTLVTVSS
23 Tie 2.1 完整 HC.M100cF EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNTDISWVRQAPGKGLEWVGRISPSDGNTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRTRWASWAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD
24 Tie 2.1 HC (HV & C1 T209C) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNTDISWVRQAPGKGLEWVGRISPSDGNTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRTRWASWAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNCKVDKKVEPKSCD
25 Tie 2.1 完整 LC DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
26 Tie2.1 HC 恆定域 (僅 C1) ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNCKVDKKVEPKSCD
27 Tie2.1 LC 恆定域 (僅 C1) RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
28 Tie 2.12 HC CDR1 SYWIH
29 Tie 2.12 HC CDR2 AISPNDGSTYYADSVKG
30 Tie 2.12 HC CDR3 SRYYGQRLVYYVMDY
31 Tie 2.12 HC 可變域 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWIHWVRQAPGKGLEWVAAISPNDGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSRYYGQRLVYYVMDYWGQGTLVTVSS
32 Tie 2.12 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWIHWVRQAPGKGLEWVAAISPNDGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSRYYGQRLVYYVMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD
33 Tie 2.24 HC CDR1 SSGIS
34 Tie 2.24 HC CDR2 TINPYGGDTYYADSVKG
35 Tie 2.24 HC CDR3 FYRFLSSGMDY
36 Tie 2.24 HC 可變域 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTSSGISWVRQAPGKGLEWVATINPYGGDTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARFYRFLSSGMDYWGQGTLVTVSS
37 Tie 2.24 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTSSGISWVRQAPGKGLEWVATINPYGGDTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARFYRFLSSGMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD
38 Tie 2.33 HC CDR1 GSWIS
39 Tie 2.33 HC CDR2 RINPYDGNTYYADSVKG
40 Tie 2.33 HC CDR3 NNRFPTWFDY
41 Tie 2.33 HC 可變域 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGSWISWVRQAPGKGLEWVARINPYDGNTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARNNRFPTWFDYWGQGTLVTVSS
42 Tie 2.33 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGSWISWVRQAPGKGLEWVARINPYDGNTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARNNRFPTWFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD
43 Tie 2.34 HC CDR1 DTYIH
44 Tie 2.34 HC CDR2 VIYPDNGATYYADSVKG
45 Tie 2.34 HC CDR3 EFACARCVYG
46 Tie 2.34 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDTYIHWVRQAPGKGLEWVAVIYPDNGATYYADSVKGTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAREFACARCVYGMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD
47 Tie 2.34 HC 可變域 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDTYIHWVRQAPGKGLEWVAVIYPDNGATYYADSVKGTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAREFACARCVYGMDYWGQGTLVTVSS
48 Tie 2.38 HC CDR1 NSAIH
49 Tie 2.38 HC CDR2 SITPYNGYTYYADSVKG
50 Tie 2.38 HC CDR3 RQSYSYVMDY
51 Tie 2.38 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNSAIHWVRQAPGKGLEWVASITPYNGYTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRQSYSYVMDYWGQGTLVTVSS
52 Tie 2.38 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNSAIHWVRQAPGKGLEWVASITPYNGYTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRQSYSYVMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD
53 抗 Tie2 Fab-IgG 1.38 LC DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
54 抗 Tie2 Fab-IgG 1.38 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNTDISWVRQAPGKGLEWVGRISPSDGNTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRTRWASWAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTGGGGSGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNSAIHWVRQAPGKGLEWVASITPYNGYTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRQSYSYVMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLAQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNAYTQKSLSLSPGK
55 Tie2.1M100cF-HC-T209C EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNTDISWVRQAPGKGLEWVGRISPSDGNTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRTRWASWAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNCKVDKKVEPKSCD
56 Tie2.1M100cF-LC-T206C DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVCKSFNRGEC
57 Tie2.1M100cF-HC-SPPC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNTDISWVRQAPGKGLEWVGRISPSDGNTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRTRWASWAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTSPPC
58 Tie2.1M100cF-HC-T120C EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNTDISWVRQAPGKGLEWVGRISPSDGNTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRTRWASWAFDYWGQGTLVTVSSASCKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD
59 Tie2.1M100cF-HC-G166C EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNTDISWVRQAPGKGLEWVGRISPSDGNTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRTRWASWAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSCVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD
60 Tie2.1M100cF-HC-G178C EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNTDISWVRQAPGKGLEWVGRISPSDGNTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRTRWASWAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSCLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD
61 Tie2.1M100cF-HC-T187C EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNTDISWVRQAPGKGLEWVGRISPSDGNTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRTRWASWAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVCVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD
62 Tie2.1M100cF-LC-Q124C DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDECLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
63 Tie2.1M100cF-LC-R142C DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPCEAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
64 Tie2.1M100cF-LC-Q155C DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALCSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
65 Tie2.1M100cF-LC-L201C DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGCSSPVTKSFNRGEC
66 Tie2.1M100cF-LC-K107C DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYTTPPTFGQGTKVEICRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
67 Tie2.1M100cF-LC-L126C DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLCSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
68 Tie2.1M100cF-LC-K149C DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWCVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
69 NDK1 肽 ERTFVMIKPDGVQRGLIGEIISRFERKGLKIVAMKMMRISREMAEKHYAEHREKPFFSALVDYITSGPVVAMVLEGKNAVEVVRKMVGATNPKEAAPGTIRGDFGLDVGKNVIFASDSPESAEREISLFFKDEELVEW
70 NDK2 肽 ERTFVMIKPDGVQRGLIGEIISRFERKGFKIVAMKLMRISQELAEKHYAEHREKPFFSGLVDFITSGPVVAMVLEGKNVVEVVRKMIGATNPKEAAPGTIRGDFGMSVGKNVIFGSDSLESAEREISLFFKDEELVEW
71 NDK3 肽 STNKVNKERTFLAVKPDGVARGLVGEIIARYEKKGFVLVGLKQLVPTKDLAESHYAEHKERPFFGGLVSFITSGPVVAMVFEGKGVVASARLMIGVTNPLASAPGSIRGDFGVDVGRNIIFGSDSVESANREIALWFKPEELLTEVKPNPNLYE
72 NDK4 肽 ANSERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFLQASEDLLKEHYTDLKDRPFFTGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNPADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIFGSDSVKSAEKEISLWFQPEELVEYKSCAQNWIYE
73 NDK5 肽 ANLERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVAMKFLRASEEHLKQHYIDLKDRPFFPGLVKYMNSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNPADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIFGSDSVESAEKEIHLWFKPEELIDYKSCAHDWVYE
74 Tie2.1.M100cF.Fab.NDK3 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNTDISWVRQAPGKGLEWVGRISPSDGNTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRTRWASWAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTGGGGSTNKVNKERTFLAVKPDGVARGLVGEIIARYEKKGFVLVGLKQLVPTKDLAESHYAEHKERPFFGGLVSFITSGPVVAMVFEGKGVVASARLMIGVTNPLASAPGSIRGDFGVDVGRNIIFGSDSVESANREIALWFKPEELLTEVKPNPNLYE
75    CDKTHT
76    CDKTHL
77    CDKTH
78    CDKT
79    CDKTHX，其中，X 為除 T 之外的胺基酸
80    CDKTHTC
81    CDKTHTCPPC
82    CDKTHTCPPS
83    CDKTHTSPPC
84    CDKTHTAPPC
85    CDKTHTSGGC
86    CYGPPC
87    CPPC
88    SPPC
89 Tie2.1M100cF-HC-SPPC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNTDISWVRQAPGKGLEWVGRISPSDGNTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRTRWASWAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTSPPC
90 Tie2.1 HC (M100c, T209) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNTDISWVRQAPGKGLEWVGRISPSDGNTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRTRWASWAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD
91 Tie2.1 HC (CDR3X1X2, T209) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNTDISWVRQAPGKGLEWVGRISPSDGNTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRTRWASX1 AX2 DYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD
92 Tie2.1 HC (CDR3X1X2 T209C) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNTDISWVRQAPGKGLEWVGRISPSDGNTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRTRWASX1AX2DYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNCKVDKKVEPKSCD
儘管為了清楚理解起見，藉由圖示和實例的方式對上述發明進行了詳細描述，但是這些描述和實例不應被解釋為限製本發明的範圍。本文引用的所有專利和科學文獻的揭示內容均以引用的方式明確納入其全部內容。
圖 1.提供於淘選 VH 文庫中使用之 Tie2 域的示意圖。 圖 2A 至 2B 顯示評估抗 Tie2 抗體 Tie2.1、Tie2.10、Tie2.11 及 Tie2.12 與小鼠 Tie2 ECD5 域之結合 (圖 2A) 以及與人類 Tie2 ECD5 域之結合 (圖 2B) 的測定結果。該 ECD5 域包含 Tie2 之 Ig1、Ig2、EGF 及 Ig3 域。 圖 3A 至 3B 顯示評估抗 Tie2 抗體 Tie2.1、Tie2.10、Tie2.11 及 Tie2.12 (圖 3A) 以及 Tie2.2、Tie2.3、Tie2.4、Tie2.5、Tie2.7、Tie2.9、Tie2.15、Tie2.16、Tie2.17 及 Tie2.20 (圖 3B ) 與人類 Tie1 之結合的測定結果。 圖 4A 至 4B 顯示評估藉由抗 Tie2 抗體 Tie2.1、Tie2.12 及 Tie2.20 阻斷 Tie2 與 Ang1 間交互作用 (圖 4A ) 及 Tie2 與 Ang2 間交互作用 (圖 4B) 的測定結果。 圖 5A 至 5B 顯示評估抗 Tie2 抗體 Tie2.1、Tie2.10、Tie2.11 及 Tie2.12 結合到 HUVEC 上 (圖 5A) 以及 RAEC 上 (圖 5B) 的測定結果。 圖 6A 至 6B 顯示評估抗 Tie2 抗體 Tie2.1、Tie2.4、Tie2.5 及 Tie2.20 於 RAEC 中激活 AKT 磷酸化 (圖 6A) 以及評估抗 Tie2 抗體之抗 IgG 交聯在 AKT 磷酸化上之效應 (圖 6B) 的測定結果。經磷酸化之 AKT 的水準藉由西方墨點分析測定。 圖 7A 至 7B 顯示評估抗 Tie2 抗體 Tie2.1、Tie2.22、Tie2.23、Tie2.24、Tie2.27、Tie2.28、Tie2.31、Tie2.33、Tie2.34、Tie2.34、Tie2.38 及 Tie2.1 激活 AKT 磷酸化的測定結果 (圖 7A)。圖 7B 顯示抗 Tie2 抗體聚集或抗 IgG 交聯在抗 Tie2 抗體 Tie2.1 之誘導 AKT 磷酸化之活性上的效應。經磷酸化之 AKT 的水準藉由 FRET 分析測定。 圖 8A 至 8B 例示使用 ELISA 進行抗 Tie2 抗體之分類研究的方法 (圖 8A ) 及結果 (圖 8B)。 圖 9 為示意圖，其例示本揭露之抗 Tie2 抗體所結合至之 Tie2 上的抗原決定群。 圖 10A 及 10B 顯示抗 Tie2 抗體 Tie2.1 (SEQ ID NO: 22)、Tie2.1.M100cF (SEQ ID NO: 20)、Tie2.12 (SEQ ID NO: 31)、Tie2.24 (SEQ ID NO: 36)、Tie2.33 (SEQ ID NO: 41) 及 Tie2.38 (SEQ ID NO: 51) 之重鏈可變區 (VH) (圖 10A) 與抗 Tie2 抗體 Tie2.1 (SEQ ID NO: 21)、Tie2.1.M100cF (SEQ ID NO: 21)、Tie2.12 (SEQ ID NO: 21)、Tie2.24 (SEQ ID NO: 21)、Tie2.33 (SEQ ID NO: 21) 及 Tie2.38 (SEQ ID NO: 21) 之輕鏈可變區 (VL) (圖 10B) 的胺基酸序列之序列比對。 圖 11A 至 11B 例示使用經由噬菌體展示或動物免疫作用生成之各種抗 Tie2.1 抗體進行之分類測定的結果。圖 11A 提供一系列經共價固定化之抗體及處於溶液中之若干該等抗體，而圖 11B 提供處於溶液中之該系列抗體中之餘者。 圖 12A 至 12B 顯示評估多聚體抗 Tie2 抗體之促效劑活性的測定結果。圖 12A 比較作為 PEG 六聚體及作為雙表位 FabIgG (1.38) 之 Tie2.1 的 AKT 磷酸化活性。圖 12B 比較抗 Tie2 抗體之多聚體型式。 圖 13A 至 13B 顯示各種比率之 huIgM 重鏈與輕鏈 (不具有或具有 J 鏈) 在親和力管柱分離出之蛋白質總產量上的效應，藉由總蛋白質 A280 (圖 13A ) 及 SEC 曲線 (圖 13B ) 量測。 圖 13C 顯示 IgM 之流變學量測，與靶向因子 D (fD) 之眼部多價 PEG 型式進行比較。 圖 13D 顯示非結合 IgM 及非結合 Fab 之玻璃體藥物動力學分析。 圖 13E 顯示 IgM 之全身藥物動力學分析，將非結合重組 hIgM 五聚體及重組 hIgM 六聚體與從人類血清分離之 IgM 進行比較，藥物經靜脈內注射入雌性 SCID 小鼠體內。圖 13E 顯示血清 IgM 水準。 圖 13F 顯示來自血清樣品之總體 N 連接聚醣的 LC-MS 分析。 圖 13G 至 13H 顯示特徵 IgM 多聚體型式之抗 Tie2 抗體的測定結果。圖 13G 顯示評估 IgM 恆定域中之突變的互補測定結果。圖 13H 例示 IgM 六聚體型式之抗 Tie 抗體的促效劑活性。 圖 14A 至 14B 顯示經由肽部分連接之六聚體型式之抗 Tie2 抗體的設計及分析。圖 14A 為多聚體設計之示意圖。圖 14B 顯示 AKT 磷酸化測定結果，將經由 NDK 肽、IgM 及多臂 PEG 連接之六聚體型式之抗 Tie2 抗體進行比較。 圖 15A 至 15B 顯示評估六聚體型式之各種抗 Tie2 抗體之促效劑活性的 AKT 磷酸化測定結果。顯示針對 Tie2.1、Tie2.38、Tie2.33 (圖 15A) 以及 Tie2.1、Tie2.1.M100cF、Tie2.12、Tie2.24 (圖 15B) 之結果。 圖 16A 至 16C 顯示評估抗 Tie2 抗體於體外測定法中在 Tie2 蛋白質之細胞水準上之效應的測定結果。圖 16A、圖 16B 及圖 16C 之每一者對將 HUVEC 曝露於經由噬菌體展示及動物免疫作用生成之抗 Tie2 抗體時的 Tie2 水準進行比較。圖 16A、圖 16B 及圖 16C 中之所有測定皆藉由西方墨點法分析。 圖 17 顯示評估抗 Tie2 抗體在該 Tie2 蛋白含量之細胞水準上之效應的體內測定結果。 圖 18A 至 18B 例示研究抗 Tie2.1 抗體在內皮細胞屏障滲透性上之效應之體外內皮細胞測定法的測定方法 (圖 18A ) 及結果 (圖 18B )。 圖 19A 至 19B 例示研究抗 Tie2.1 抗體在 VEGF 誘導型血管滲漏上之效應之體內血管滲透性測定法的測定方法 (圖 19A ) 及結果 (圖 19B )。 圖 20A 至 20B 例示研究抗 Tie2.1 抗體或抗 VEGF 抗體在 VEGF 誘導型血管滲漏上之效應之體內血管滲透性測定法的測定方法 (圖 20A) 及結果 (圖 20B)。 圖 21A 至 21B 例示藉由西方墨點分析測得的雙表位抗 Tie2 促效劑 (抗 Tie2 Fab-IgF 1.38) 在 Tie2 之蛋白含量上之體內效應 (圖 21A)，以及研究抗 Tie2 Fab-IgG 1.38 在 VEGF 誘導型血管滲漏上之效應的體內血管滲透性測定結果 (圖 21B)。 圖 22 顯示抗 Tie2 促效劑於經培養之 HUVEC 中在 VE 鈣黏蛋白 (上圖) 及 F 肌動蛋白 (下圖) 之細胞組織化上的效應。 圖 23 顯示評估 IG1 型式之 Tie2.1 抗 Tie2 抗體變異體之促效劑活性的 AKT 磷酸化測定結果。 圖 24 顯示評估六聚體型式之 Tie2.1 抗 Tie2 共軛物變異體之促效劑活性與非 PEG 共軛 Tie2.1 Fab (無六聚體) 相比的 AKT 磷酸化測定結果。 圖 25 顯示抗 Tie2 Fab 六聚體共軛物於眼部注射到食蟹獼猴體內後的藥物動力學。 圖 26 至 27 顯示抗 Tie2.1 PEG 共軛物之電泳圖分析，其中單體峰計入 (圖 26 ) 或不計入 (圖 27 ) 相對定量中。 圖 28 顯示取自食蟹獼猴玻璃體液之樣品中抗 Tie2.1 PEG 共軛物的電泳圖分析。 圖 29 顯示抗 Tie2 PEG 共軛物六聚體與五聚體之相對量。 圖 30A 至 30B 提供例示於 21 天內取自食蟹獼猴眼部之樣品 (圖 30B) 中的 M100c 氧化 (圖 30A) 的資料。 圖 31 顯示氧化在 pAKT 活性上之效應。 圖 32 至 33 顯示去共軛在 pAKT 活性上之效應 (圖 32)，標準化值圖示於圖 33 中。 圖 34 例示 PEG 結合位點定位在去共軛上之效應。 圖 35A 顯示 PEG 結合位點定位在活性上之效應。 圖 35B 顯示 PEG 結合位點定位在活性上之效應。 圖 36 顯示不同 Tie2.1M100cF PEG 共軛物之藥物動力學。 圖 37 比較不同 Tie2.1M100cF PEG 共軛物之體內安定性。 圖 38A 至 38B 比較不同 Tie2.1M100cF PEG 共軛物之活性。圖 38A 顯示 pAKT 活性，而圖 38B 顯示經由 ELISA 測定之總共軛物水準。 圖 39 顯示 PEG 共軛物六聚體核心分子之結構，其與根據本揭露之抗 Tie2 抗體共軛。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
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Claims (48)

  1. 一種與 Tie2 特異性結合之經分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其片段包含： 重鏈可變域 (VH)，該重鏈可變域包含 (a) CDR-H1，其包含胺基酸序列 NTDIS (SEQ ID NO: 3)，(b) CDR-H2，其包含胺基酸序列 RISPSDGNTYYADSVKG (SEQ ID NO:4)，及 (c) CDR-H3，其包含胺基酸序列 RTRWASX1AX2DY (SEQ ID NO:5)，其中 X1 為 M、L、K、F、Y、R、N、Q、H 或 W 及/或 X2 為 F、Y、L、Q、I、K 或 H；及輕鏈可變域 (VL)，該輕鏈可變域包含 (d) CDR-L1，其包含胺基酸序列 RASQDVSTAVA (SEQ ID NO:8)，(e) CDR-L2，其包含胺基酸序列 SASFLYS (SEQ ID NO:9)，及 (f) CDR-L3，其包含胺基酸序列 QQSYTTPPT (SEQ ID NO:10)。
  2. 如請求項 1 之抗體或其抗原結合片段，其中該 CDR-H3 包含胺基酸序列 RTRWASWAMDY (SEQ ID NO:6)。
  3. 如請求項 1 或 2 之抗體或其抗原結合片段，其中該 CDR-H3 包含胺基酸序列 RTRWASWAFDY (SEQ ID NO:7)。
  4. 如前述請求項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其係單株抗體、人類化抗體、抗體片段、及/或嵌合抗體。
  5. 如前述請求項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其為結合 Tie2 之 Fab 片段。
  6. 如請求項 1 至 5 中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含：VL 域，其包含與 SEQ ID NO:21 之胺基酸序列具有至少 90% 序列同一性的胺基酸序列；及 VH 域，其包含與 SEQ ID NO:20 之胺基酸序列具有至少 90% 序列同一性的胺基酸序列。
  7. 如請求項 1 至 6 中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含：VL 域，其包含與 SEQ ID NO:21 之胺基酸序列具有至少 99% 序列同一性的胺基酸序列；及 VH 域，其包含與 SEQ ID NO:20 之胺基酸序列具有至少 99% 序列同一性的胺基酸序列。
  8. 如前述請求項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含 SEQ ID NO:21 之 VL 序列及 SEQ ID NO:20 之 VH 序列。
  9. 如請求項 1 至 8 中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含經改造半胱胺酸，其中 該經改造半胱胺酸選自 HC 中之 T120C、G166C、G178C、T187C 及 T209C；或 該經改造半胱胺酸選自 LC 中之 Q124C、R142C、Q155C、L201C、T206C、K107C、K126C 及 K149C； 其中該經改造半胱胺酸之殘基號是根據 EU 編號。
  10. 如請求項 9 之抗體或其抗原結合片段，其中該經改造半胱胺酸選自該 HC 中之 T209C 及該 LC 中之 T206C。
  11. 如請求項 9 或 10 之抗體或其抗原結合片段，其中該經改造半胱胺酸為 LC 中之 T206C。
  12. 如請求項 9 或 10 之抗體或其抗原結合片段，其中該經改造半胱胺酸為 HC 中之 T209C。
  13. 如前述請求項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含：LC，其包含與 SEQ ID NO:25 之胺基酸序列具有至少 90% 序列同一性的胺基酸序列；及 HC，其包含與 SEQ ID NO:55 之胺基酸序列具有至少 90% 序列同一性的胺基酸序列。
  14. 如前述請求項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含：LC，其包含與 SEQ ID NO:25 之胺基酸序列具有至少 99% 序列同一性的胺基酸序列；及 HC，其包含與 SEQ ID NO:55 之胺基酸序列具有至少 99% 序列同一性的胺基酸序列。
  15. 如前述請求項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含：LC，其包含 SEQ ID NO:25 之序列；及 HC，其包含 SEQ ID NO:55 之序列。
  16. 如前述請求項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中 HC 恆定區終止於位置 221 (EU 編號) 處。
  17. 一種與 Tie-2 特異性結合之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含 SEQ ID NO:55 之 HC 序列及 SEQ ID NO:25 之 LC 序列。
  18. 一種與 Tie-2 特異性結合之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含 SEQ ID NO:23 之 HC 序列及 SEQ ID NO:56 之 LC 序列。
  19. 一種經分離核酸，其編碼如前述請求項中任一項之抗體或其抗原結合片段。
  20. 一種宿主細胞，其包含如請求項 19 之核酸。
  21. 一種與 Tie2 結合之共軛物，其中該共軛物包含至少兩種、至少三種、至少四種、至少五種、至少六種、至少七種或至少八種如請求項 1 至 18 中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該等抗體或其抗原結合片段中之每一者連接至多聚化部分。
  22. 如請求項 21 之共軛物，其中該共軛物使得活體外測定中之 Tie2 蛋白含量降幅小於 25%、小於 50% 或小於 75%。
  23. 如請求項 21 或 22 之共軛物，其中該共軛物並不使得活體外測定中之 Tie-2 蛋白含量降幅大於 25%、大於 50% 或大於 75%。
  24. 如請求項 21 至 23 中任一項之共軛物，其中該多聚化部分包含多元醇、多肽及/或肽。
  25. 如請求項 21 至 24 中任一項之共軛物，其中該多聚化部分包含多元醇，其中該多元醇為選自二聚體、四聚體、六聚體及八聚體之多臂多元醇。
  26. 如請求項 25 之共軛物，其中該多臂多元醇為六聚體。
  27. 如請求項 24 至 26 中任一項之共軛物，其中該多元醇為聚乙二醇 (PEG)。
  28. 如請求項 24 至 27 中任一項之共軛物，其中該多元醇經由經改造半胱胺酸胺基酸之游離硫醇基共價連接至至少兩種抗體或其抗原結合片段，其中該經改造半胱胺酸選自由以下所組成之群組： HC 中之 T120C、G166C、G178C、T187C 及 T209C；或 該經改造半胱胺酸選自由以下所組成之群組：LC 中之 Q124C、R142C、Q155C、L201C、T206C、K107C、K126C 及 K149C； 其中該殘基號是根據 EU 編號。
  29. 如請求項 28 之共軛物，其中該經改造半胱胺酸為該 LC 中之 T206C，其中該殘基號是根據 EU 編號。
  30. 如請求項 28 之共軛物，其中該經改造半胱胺酸為該 HC 中之 T209C，其中該殘基號是根據 EU 編號。
  31. 如請求項 25 至 27 中任一項之共軛物，其中該多元醇經由離胺酸胺基酸之游離胺基共價連接至至少一種抗體。
  32. 如請求項 27 至 31 中任一項之共軛物，其中該 PEG 具有約 500 道爾頓 (Da) 至約 300,000 Da 之重量平均分子量。
  33. 如請求項 27 至 32 中任一項之共軛物，其中該 PEG 具有通式 (Ib) 之結構：
    Figure 03_image003
    其中每一 m 獨立地為整數 3 至 250；每一 R1 獨立地不存在或為連接基團；且每一 R2 獨立地為氫或末端反應性基團； 其中至少一個 R2 為末端反應性基團且共價連接至如請求項 1 至 14 中任一項之抗體或其抗原結合片段。
  34. 如請求項 33 之共軛物，其中至少一個 R1 為連接基團，其中 R1 及 R2 當在一起時選自：
    Figure 03_image020
    ；
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    ；
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    ；
    Figure 03_image026
    ；
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    ；
    Figure 03_image030
    ；
    Figure 03_image032
    ；
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    ；
    Figure 03_image036
    ；
    Figure 03_image005
    ；
    Figure 03_image039
    ；
    Figure 03_image041
    ；
    Figure 03_image043
    ；
    Figure 03_image045
    ；及
    Figure 03_image047
    ；及其組合；其中每一 i 獨立地為整數 0 至 10；j 為整數 0 至 10；且 R2 為選自由以下所組成之群組的末端反應性基團：硫醇反應性基團、胺基反應性基團、及其組合。
  35. 如請求項 33 或請求項 34 之共軛物，其中至少 1 個 R2 為馬來醯胺且共價連接至該抗體或其抗原結合片段。
  36. 如請求項 33 至 35 中任一項之共軛物，其中每一 R2 為馬來醯胺。
  37. 一種結合 Tie2 之共軛物，其包含： Fab，其包含具有 SEQ ID NO:55 之 HC 及具有 SEQ ID NO:25 之 LC；共軛至具有式 1(b) 結構之多元醇：
    Figure 03_image003
    ； 其中每一 m 獨立地為整數 20 至 30，其中 R1 及 R2 在一起具有結構
    Figure 03_image005
    ，其中 R2 為馬來醯胺；且 其中該多元醇在殘基 C209 (EU 編號) 處連接至 Fab HC。
  38. 一種醫藥組成物，其包含如請求項 21 至 37 中任一項之共軛物及醫藥上可接受之載劑。
  39. 如請求項 38 之醫藥組成物，其進一步包含另一治療劑，其中該另一治療劑選自由以下所組成之群組：VEGF 拮抗劑、Ang2 拮抗劑、HtrA1 拮抗劑、及 IL33 拮抗劑、補體成分拮抗劑、及第二 Tie2 促效劑。
  40. 一種用於經眼遞送之長效遞送裝置，其包含如請求項 38 或 39 之醫藥組成物及用於將該組成物經玻璃體內遞送至患者的構件，其中該組成物在原位長時間保持有效。
  41. 一種治療有需要之受試者的 Tie2 路徑介導之病症之方法，其包含向該受試者投予有效量之如請求項 1 至 18 中任一項之抗體或其抗原結合片段、如請求項 21 至 36 中任一項之共軛物、或如請求項 37 至 38 中任一項之醫藥組成物。
  42. 如請求項 41 之方法，其中該 Tie2 路徑介導之病症為血管滲透性病症。
  43. 如請求項 41 或 42 之方法，其中該 Tie2 路徑介導之病症為眼睛疾病。
  44. 如請求項 43 之方法，其中該眼睛疾病選自糖尿病性黃斑水腫 (DME)、糖尿病性視網膜病變、包括乾性及濕性 (非滲出性及滲出性) 形式之年齡相關性黃斑退化 (AMD)、脈絡膜新血管形成 (CNV)、葡萄膜炎、局部缺血相關性視網膜病變、病理性近視、逢希伯-林道病 (von Hippel-Lindau disease)、眼睛組織胞漿菌病、視網膜中央靜脈阻塞 (CRVO)、角膜新血管形成、青光眼及視網膜新血管形成。
  45. 如請求項 43 或 44 之方法，其中該眼睛疾病為 DME。
  46. 如請求項 1 至 18 中任一項之抗體或如請求項 21 至 39 中任一項之共軛物，其用作藥劑。
  47. 如請求項 1 至 18 中任一項之抗體或如請求項 21 至 39 中任一項之共軛物，其用於治療有需要之受試者的 Tie2 路徑介導之病症及/或眼部病症。
  48. 一種如請求項 1 至 18 中任一項之抗體或如請求項 21 至 39 中任一項之共軛物之用途，其用以製造用於治療有需要之受試者的 Tie2 路徑介導之病症及/或眼部病症的藥劑。
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2022011752A (es) * 2020-03-24 2022-10-18 Genentech Inc Agentes de fijacion a tie2 y metodos de uso.

Family Cites Families (111)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
GB8430252D0 (en) 1984-11-30 1985-01-09 Beecham Group Plc Compounds
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
US5206344A (en) 1985-06-26 1993-04-27 Cetus Oncology Corporation Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
WO1988007089A1 (en) 1987-03-18 1988-09-22 Medical Research Council Altered antibodies
AU634186B2 (en) 1988-11-11 1993-02-18 Medical Research Council Single domain ligands, receptors comprising said ligands, methods for their production, and use of said ligands and receptors
US5166322A (en) 1989-04-21 1992-11-24 Genetics Institute Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
EP0564531B1 (en) 1990-12-03 1998-03-25 Genentech, Inc. Enrichment method for variant proteins with altered binding properties
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
US5144088A (en) 1991-04-26 1992-09-01 Aristech Chemical Corporation Manufacture of neopentyl glycol (I)
JP4124480B2 (ja) 1991-06-14 2008-07-23 ジェネンテック・インコーポレーテッド 免疫グロブリン変異体
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
AU2147192A (en) 1991-06-28 1993-01-25 Genentech Inc. Method of stimulating immune response using growth hormone
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
WO1993006217A1 (en) 1991-09-19 1993-04-01 Genentech, Inc. EXPRESSION IN E. COLI OF ANTIBODY FRAGMENTS HAVING AT LEAST A CYSTEINE PRESENT AS A FREE THIOL, USE FOR THE PRODUCTION OF BIFUNCTIONAL F(ab')2 ANTIBODIES
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
DE69334255D1 (de) 1992-02-06 2009-02-12 Novartis Vaccines & Diagnostic Marker für Krebs und biosynthetisches Bindeprotein dafür
WO1994004188A1 (en) 1992-08-21 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for treating an lfa-1-mediated disorder
EP0679095A1 (en) 1992-11-25 1995-11-02 Amgen Boulder Inc. Modified insulin-like growth factors
CA2160154A1 (en) 1993-04-07 1994-10-13 George N. Cox Methods of using insulin-like growth factor binding proteins
EP0714409A1 (en) 1993-06-16 1996-06-05 Celltech Therapeutics Limited Antibodies
US5789199A (en) 1994-11-03 1998-08-04 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
PT1568772E (pt) 1995-09-21 2010-04-14 Genentech Inc Variantes da hormona do crescimento humana
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
US7122636B1 (en) 1997-02-21 2006-10-17 Genentech, Inc. Antibody fragment-polymer conjugates and uses of same
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
CA2293829C (en) 1997-06-24 2011-06-14 Genentech, Inc. Methods and compositions for galactosylated glycoproteins
EP1881005B1 (en) 1997-07-14 2013-04-03 Bolder Biotechnology, Inc. Derivatives of G-CSF and related proteins
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
AU759779B2 (en) 1997-10-31 2003-05-01 Genentech Inc. Methods and compositions comprising glycoprotein glycoforms
US6610833B1 (en) 1997-11-24 2003-08-26 The Institute For Human Genetics And Biochemistry Monoclonal human natural antibodies
BR9813365A (pt) 1997-12-05 2004-06-15 Scripps Research Inst Método para produção e humanização de um anticorpo monoclonal de rato
DK1068241T3 (da) 1998-04-02 2008-02-04 Genentech Inc Antistofvarianter og fragmenter deraf
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
PT1071700E (pt) 1998-04-20 2010-04-23 Glycart Biotechnology Ag Modificação por glicosilação de anticorpos para melhorar a citotoxicidade celular dependente de anticorpos
US6365154B1 (en) 1998-09-28 2002-04-02 Smithkline Beecham Corporation Tie2 agonist antibodies
US6376653B1 (en) * 1998-09-28 2002-04-23 Smithkline Beecham Plc Tie2 antagonist antibodies
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
ES2694002T3 (es) 1999-01-15 2018-12-17 Genentech, Inc. Polipéptido que comprende una región Fc de IgG1 humana variante
PT1914244E (pt) 1999-04-09 2013-07-26 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Processo para regular a actividade de moléculas funcionais sob o ponto de vista imunológico
WO2001025454A2 (en) 1999-10-04 2001-04-12 Medicago Inc. Method for regulating transcription of foreign genes in the presence of nitrogen
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
JP4668498B2 (ja) 1999-10-19 2011-04-13 協和発酵キリン株式会社 ポリペプチドの製造方法
CA2393869A1 (en) 1999-12-15 2001-06-21 Genetech,Inc. Shotgun scanning, a combinatorial method for mapping functional protein epitopes
NZ521540A (en) 2000-04-11 2004-09-24 Genentech Inc Multivalent antibodies and uses therefor
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
CA2785941C (en) 2000-10-06 2017-01-10 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Antibody composition-producing cell
US7064191B2 (en) 2000-10-06 2006-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
ATE378403T1 (de) 2000-11-30 2007-11-15 Medarex Inc Transchromosomale transgen-nagetiere zur herstellung von humänen antikörpern
CN1555411A (zh) 2001-08-03 2004-12-15 ���迨�����＼���ɷݹ�˾ 抗体-依赖性细胞毒性增大的抗体糖基化变体
EP2348043A1 (en) 2001-10-02 2011-07-27 Genentech, Inc. APO-2 ligand variants and uses thereof
EP1443961B1 (en) 2001-10-25 2009-05-06 Genentech, Inc. Glycoprotein compositions
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
JP4628679B2 (ja) 2002-04-09 2011-02-09 協和発酵キリン株式会社 Ｇｄｐ−フコースの輸送に関与する蛋白質の活性が低下または欠失した細胞
AU2003236018A1 (en) 2002-04-09 2003-10-20 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. METHOD OF ENHANCING ACTIVITY OF ANTIBODY COMPOSITION OF BINDING TO FcGamma RECEPTOR IIIa
JPWO2003085107A1 (ja) 2002-04-09 2005-08-11 協和醗酵工業株式会社 ゲノムが改変された細胞
US7691568B2 (en) 2002-04-09 2010-04-06 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd Antibody composition-containing medicament
EP1498490A4 (en) 2002-04-09 2006-11-29 Kyowa Hakko Kogyo Kk PROCESS FOR PREPARING ANTIBODY COMPOSITION
CA2481925A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Therapeutic agent for patients having human fc.gamma.riiia
JP4753578B2 (ja) 2002-06-03 2011-08-24 ジェネンテック， インコーポレイテッド 合成抗体ファージライブラリー
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
EP1572744B1 (en) 2002-12-16 2010-06-09 Genentech, Inc. Immunoglobulin variants and uses thereof
WO2004065416A2 (en) 2003-01-16 2004-08-05 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
WO2005035586A1 (ja) 2003-10-08 2005-04-21 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 融合蛋白質組成物
EP1705251A4 (en) 2003-10-09 2009-10-28 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd PROCESS FOR PRODUCING ANTIBODY COMPOSITION BY RNA INHIBITION OF FUNCTION OF $ G (A) 1,6-FUCOSYLTRANSFERASE
RS55723B1 (sr) 2003-11-05 2017-07-31 Roche Glycart Ag Molekuli koji se vezuju za antigen sa povećanim afinitetom vezivanja za fc receptor i efektornom funkcijom
WO2005053742A1 (ja) 2003-12-04 2005-06-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 抗体組成物を含有する医薬
RU2386638C2 (ru) 2004-03-31 2010-04-20 Дженентек, Инк. Гуманизированные анти-тфр-бета-антитела
US7785903B2 (en) 2004-04-09 2010-08-31 Genentech, Inc. Variable domain library and uses
CA2885854C (en) 2004-04-13 2017-02-21 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-p-selectin antibodies
TWI380996B (zh) 2004-09-17 2013-01-01 Hoffmann La Roche 抗ｏｘ４０ｌ抗體
NZ580115A (en) 2004-09-23 2010-10-29 Genentech Inc Cysteine engineered antibody light chains and conjugates
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
AU2005323025A1 (en) 2004-12-31 2006-07-13 Biogen Idec Ma Inc. Polypeptides that bind BR3 and uses thereof
WO2007056441A2 (en) 2005-11-07 2007-05-18 Genentech, Inc. Binding polypeptides with diversified and consensus vh/vl hypervariable sequences
WO2007064919A2 (en) 2005-12-02 2007-06-07 Genentech, Inc. Binding polypeptides with restricted diversity sequences
AU2007249408A1 (en) 2006-05-09 2007-11-22 Genentech, Inc. Binding polypeptides with optimized scaffolds
US10118970B2 (en) 2006-08-30 2018-11-06 Genentech, Inc. Multispecific antibodies
US20080226635A1 (en) 2006-12-22 2008-09-18 Hans Koll Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
CN100592373C (zh) 2007-05-25 2010-02-24 群康科技(深圳)有限公司 液晶显示面板驱动装置及其驱动方法
WO2009089004A1 (en) 2008-01-07 2009-07-16 Amgen Inc. Method for making antibody fc-heterodimeric molecules using electrostatic steering effects
CN101724144A (zh) 2008-11-03 2010-06-09 北京键凯科技有限公司 新型的多臂聚乙二醇及其制备方法和应用
US8133979B2 (en) 2008-12-16 2012-03-13 Hoffmann-La Roche Inc. Antibodies against human angiopoietin 2
AU2009333100B2 (en) 2009-01-02 2014-08-14 Alcon Research, Ltd. In-situ refillable ophthalmic implant
CA3045436A1 (en) 2009-01-29 2010-08-05 Forsight Vision4, Inc. Posterior segment drug delivery
CA2781682A1 (en) 2009-12-04 2011-06-09 Genentech, Inc. Multispecific antibodies, antibody analogs, compositions, and methods
JP6051998B2 (ja) 2012-03-30 2016-12-27 日油株式会社 マルチアーム型ポリエチレングリコール誘導体、その中間体及び製造方法
JP6154900B2 (ja) 2012-07-13 2017-06-28 ロシュ グリクアート アクチェンゲゼルシャフト 二重特異性抗ｖｅｇｆ／抗ａｎｇ−２抗体及び眼血管疾患の処置におけるそれらの使用
WO2016010014A1 (ja) * 2014-07-15 2016-01-21 アステラス製薬株式会社 新規抗ヒトＴｉｅ２抗体
WO2016073157A1 (en) 2014-11-06 2016-05-12 Genentech, Inc. Anti-ang2 antibodies and methods of use thereof
MA51554A (fr) 2014-11-07 2020-11-18 Sesen Bio Inc Anticorps il-6 améliorés
EP3805265A4 (en) * 2018-06-07 2022-07-06 Institute for Basic Science ANTIBODIES BINDING TO TIE2 AND USES THEREOF
WO2019235856A1 (ko) * 2018-06-07 2019-12-12 기초과학연구원 Tie2에 결합하는 항체 및 이의 용도
MX2022011752A (es) * 2020-03-24 2022-10-18 Genentech Inc Agentes de fijacion a tie2 y metodos de uso.

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