CN114051500A - 包含白细胞介素-2突变体和抗cd8抗体的免疫缀合物 - Google Patents

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Abstract

本发明总体涉及免疫缀合物，特别地涉及包含白细胞介素‑2多肽突变体和与CD8结合的抗体的免疫缀合物。此外，本发明涉及编码所述免疫缀合物的多核苷酸分子，以及包含此类多核苷酸分子的载体和宿主细胞。本发明进一步涉及用于产生所述突变免疫缀合物的方法、包含所述突变免疫缀合物的药物组合物，以及其用途。

Description

包含白细胞介素-2突变体和抗CD8抗体的免疫缀合物
技术领域
本发明总体上涉及免疫缀合物，特别地涉及包含白细胞介素-2多肽突变体和与CD8结合的抗体的免疫缀合物，所述免疫缀合物仅对CD8+细胞具有强顺式靶向作用。此外，本发明涉及编码所述免疫缀合物的多核苷酸分子，以及包含此类多核苷酸分子的载体和宿主细胞。本发明进一步涉及用于产生所述突变体免疫缀合物的方法、包含所述突变体免疫缀合物的药物组合物，以及其用途。
背景技术
白细胞介素-2(Interleukin-2，IL-2)，也称为T细胞生长因子(T cell growthfactor，TCGF)，是在淋巴细胞产生、存活和体内平衡中起着核心作用的15.5kDa球状糖蛋白。它具有133个氨基酸的长度并且由四个反向平行的两亲性α-螺旋组成，所述四个反向平行的两亲性α-螺旋形成其功能必不可少的四元结构(Smith,Science 240,1169-76(1988)；Bazan,Science 257,410-413(1992))。来自不同物种的IL-2的序列见于NCBI RefSeq号NP000577(人)、NP032392(小鼠)、NP446288(大鼠)或NP517425(黑猩猩)下。
IL-2通过与IL-2受体(IL-2R)结合来介导其作用，所述IL-2受体由至多三个单独亚基组成，所述至多三个单独亚基的不同缔合可以产生IL-2亲和力不同的受体形式。α(CD25)、β(CD122)和γ(γc，CD132)亚基的缔合产生高亲和力的三聚IL-2受体。由β亚基和γ亚基组成的二聚IL-2受体被称为中等亲和力IL-2R受体。α亚基形成低亲和力的单体IL-2受体。尽管中等亲和力的二聚IL-2受体以比高亲和力的三聚受体低约100倍的亲和力结合IL-2，但是二聚和三聚IL-2受体变体都能够在IL-2结合时传递信号(Minami等人，Annu RevImmunol 11,245-268(1993))。因此，α-亚基CD25对IL-2信号传导不是必需的。α-亚基赋予与其受体的高亲和力结合，而β亚基CD122和γ亚基对信号传导至关重要(Krieg等人，ProcNatl Acad Sci 107,11906-11(2010))。包含CD25的三聚IL-2受体由(静息)CD4+叉头框P3(FoxP3)+调节性T(Treg)细胞表达。它们也在常规活化的T细胞上被瞬时诱导，而在静息状态下，这些细胞仅表达二聚IL-2受体。Treg细胞在体内始终表达最高水平的CD25(Fontenot等人，Nature Immunol 6,1142-51(2005))。
IL-2主要由活化的T细胞合成，特别是由CD4+辅助T细胞合成。它刺激T细胞的增殖和分化、诱导细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)的产生和外周血淋巴细胞向细胞毒性细胞和淋巴因子激活杀伤(lymphokine-activated killer，LAK)细胞的分化、促进T细胞的细胞因子和溶细胞分子表达、有助于B细胞的增殖和分化以及B细胞的免疫球蛋白合成，并刺激自然杀伤(natural killer，NK)细胞的产生、增殖和活化(例如在Waldmann,Nat Rev Immunol 6,595-601(2009)；Olejniczak和Kasprzak,Med Sci Monit14,RA179-89(2008)；Malek,Annu Rev Immunol 26,453-79(2008)中所综述)。
其在体内扩增淋巴细胞群并增加这些细胞的效应功能的能力赋予了IL-2抗肿瘤作用，使得IL-2免疫疗法成为用于某些转移性癌症的有吸引力的治疗选择。因此，高剂量IL-2治疗已被批准用于患有转移性肾细胞癌和恶性黑素瘤的患者。
然而，IL-2在免疫应答中具有双重功能，因为它不仅介导效应细胞的扩增和活性，而且还在维持外周免疫耐受中起关键作用。
外周自身耐受的主要机制是IL-2诱导T细胞的活化诱导细胞死亡(activation-induced cell death，AICD)。AICD是一种通过接合细胞表面表达的死亡受体(诸如CD95(也称为Fas))或TNF受体而使完全活化的T细胞经历程序性细胞死亡的过程。当在增殖期间表达高亲和力IL-2受体(在先前暴露于IL-2之后)的抗原活化的T细胞经由T细胞受体(T cellreceptor，TCR)/CD3复合物而被抗原再次刺激时，Fas配体(Fas ligand，FasL)和/或肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)的表达被诱导，使得细胞对Fas介导的凋亡敏感。该过程为IL-2依赖性的(Lenardo,Nature 353,858-61(1991))并经由STAT5介导。通过AICD在T淋巴细胞中的过程，不仅可以针对自身抗原建立耐受性，而且还可以针对明显不是宿主构成的组成部分的持久性抗原(诸如肿瘤抗原)建立耐受性。
此外，IL-2还参与维持外周CD4+CD25+调节性T(Treg)细胞(Fontenot等人，NatureImmunol 6,1142-51(2005)；D’Cruz和Klein，Nature Immunol 6,1152-59(2005)；Maloy和Powrie，Nature Immunol 6,1171-72(2005))，所述细胞还被称为抑制性T细胞。它们通过在抑制性T细胞的帮助和活化下进行细胞间接触，或通过释放诸如IL-10或TGF-β之类的免疫抑制性细胞因子，来抑制效应T细胞对它们的(自身的)靶标的破坏。Treg细胞的耗竭显示为增强IL-2诱导的抗肿瘤免疫性(Imai等人，Cancer Sci 98,416-23(2007))。
因此，IL-2对于抑制肿瘤生长不是最佳的，因为在IL-2存在下，产生的CTL可能将肿瘤识别为自身并经历AICD，或者免疫应答可能被IL-2依赖性Treg细胞抑制。
与IL-2免疫疗法有关的另一个问题是因重组人IL-2治疗产生的副作用。接受高剂量IL-2治疗的患者经常经历严重的心血管、肺、肾、肝、胃肠、神经、皮肤、血液和全身不良事件，所述不良事件需要进行密切监测和住院治疗。这些副作用中的大多数可以通过所谓的血管(或毛细血管)渗漏综合征(vascular leak syndrome，VLS)的发展来解释，所述VLS是血管通透性的病理性增大导致多个器官中的流体外渗(导致例如肺和皮肤水肿以及肝细胞损伤)和血管内流体耗尽(导致血压下降和心率补偿性增高)。除了消除IL-2之外，VLS没有别的治疗方法。已经在患者中测试了低剂量IL-2方案来避免VLS，但是代价是次优的治疗结果。VLS被认为是由于从IL-2活化的NK细胞释放诸如肿瘤坏死因子(tumor necrosisfactor，TNF)-α之类的促炎细胞因子而引起的，然而最近已显示IL-2诱导的肺水肿是因IL-2与肺内皮细胞直接结合而引起的，所述肺内皮细胞表达低至中等水平的功能性αβγIL-2受体(Krieg等人，Proc Nat Acad Sci USA 107,11906-11(2010))。
已经采取了几种方法来克服与IL-2免疫疗法相关的这些问题。例如，已发现IL-2与某些抗IL-2单克隆抗体的组合增强IL-2的体内治疗效果(Kamimura等人，J Immunol177,306-14(2006)；Boyman等人，Science 311,1924-27(2006))。在另选方法中，IL-2已经以各种方式突变以降低其毒性和/或增强其功效。Hu等人(Blood 101,4853-4861(2003)，美国专利公开号2003/0124678)已经用色氨酸取代IL-2的位置38处的精氨酸残基以消除IL-2的血管通透性活性。Shanafelt等人(Nature Biotechnol 18,1197-1202(2000))已将天冬酰胺88突变为精氨酸以使T细胞的选择性增强超过NK细胞的选择性。Heaton等人(CancerRes 53,2597-602(1993)；美国专利号5,229,109)已经引入两种突变Arg38Ala和Phe42Lys来减少NK细胞的促炎细胞因子分泌。Gillies等人(美国专利公开号2007/0036752)已经取代了IL-2的三个残基(Asp20Thr、Asn88Arg和Gln126Asp)，该三个残基有助于对中等亲和力的IL-2受体的亲和力以减少VLS。Gillies等人(WO 2008/0034473)还已经通过氨基酸取代Arg38Trp和Phe42Lys而使IL-2与CD25的界面突变，以减少与CD25的相互作用和Treg细胞的活化，从而增强功效。为了同样的目的，Wittrup等人(WO 2009/061853)已经产生了IL-2突变体，所述IL-2突变体具有增强的CD25亲和力，但不会使受体活化，因此充当拮抗剂。引入的突变旨在破坏与受体的β亚基和/或γ亚基的相互作用。
在WO 2012/107417中描述了被设计用于克服上述与IL-2免疫疗法相关的问题(由VLS诱导引起的毒性、由AICD诱导引起的肿瘤耐受，以及由Treg细胞活化引起的免疫抑制)的特殊IL-2多肽突变体。用丙氨酸取代IL-2的42位的苯丙氨酸残基，用丙氨酸取代的45位的酪氨酸残基并且用甘氨酸取代的72位的亮氨酸残基，从而基本上消除了该IL-2多肽突变体与IL-2受体(CD25)的α亚基的结合。
此外，对于上述方法，可以通过将IL-2选择性靶向肿瘤来改善IL-2免疫疗法，例如以包含与肿瘤细胞上表达的抗原结合的抗体的免疫缀合物的形式。已经描述了几种此类免疫缀合物(参见例如Ko等人，J Immunother(2004)27,232-239；Klein等人，Oncoimmunology(2017)6(3),e1277306)。
然而，肿瘤可能能够通过使抗体的靶抗原脱落、突变或下调来逃避这种靶向。此外，在主动排除淋巴细胞的肿瘤微环境中，靶向肿瘤的IL-2可能不会与诸如细胞毒性T淋巴细胞(CTL)之类的效应细胞最佳接触。
因此，仍然需要进一步改善IL-2免疫疗法。一种可以避免肿瘤靶向问题的方法是将IL-2直接靶向效应细胞，特别是CTL。
Ghasemi等人已经描述了IL-2与NKG2D结合蛋白的一种融合蛋白(Ghashemi等人，Nat Comm(2016)7,12878)，该融合蛋白用于将IL-2靶向携带NKG2D的细胞，诸如天然杀伤(NK)细胞。
肿瘤组织中免疫细胞的数量、类型和空间分布的表征可以提供有关癌症诊断、预后、疗法选择和对疗法的应答的关键信息。具体而言，CD8+细胞毒性淋巴细胞一直被报道为在各种癌症中具有诊断和预后意义。与CD8结合的抗体描述于例如WO 2019/033043 A2中。
发明内容
本发明提供了一种用IL-2的突变形式进行靶向的新方法，所述方法具有直接对诸如细胞毒性T淋巴细胞之类的免疫效应细胞而非肿瘤细胞进行免疫治疗的有利特性。对免疫效应细胞的靶向是通过将所述IL-2分子突变体缀合至与CD8结合的抗体而实现的。
本发明中使用的所述IL-2突变体已经被设计用于克服与IL-2免疫疗法相关的问题，特别是由VLS诱导引起的毒性、由AICD诱导引起的肿瘤耐受，以及由Treg细胞活化引起的免疫抑制。除了如上所述避免肿瘤从肿瘤靶向逃逸之外，将所述IL-2突变体靶向免疫效应细胞还可以进一步增加CTL相对于免疫抑制Treg细胞的优先活化。如本文公开的与CD8结合的抗体对CD8+细胞具有强顺式靶向作用。因此，它们不会干扰T细胞抗原受体(TCR)和肽结合的主要组织相容性复合体(pMHC)的相互作用。在这方面，抗体是非功能性的。
在第一方面，本发明提供一种免疫缀合物，所述免疫缀合物包含突变体白细胞介素-2(IL-2)多肽和与CD8结合的抗体，其中所述IL-2多肽是包含氨基酸取代F42A、Y45A和L72G(相对于如SEQ ID NO:13所示的人IL-2序列编号)的IL-2多肽突变体。
在另一方面，本发明提供一种包含突变体白介素-2(IL-2)多肽和与CD8结合的抗体的免疫缀合物，其中所述IL-2多肽突变体是包含氨基酸取代F42A、Y45A和L72G(相对于如SEQ ID NO:13所示的人IL-2序列编号)的人IL-2分子；并且其中所述抗体包括：(a)重链可变区(VH)，其包括：含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链互补决定区(HCDR)1、含有SEQ IDNO:2的氨基酸序列的HCDR 2及含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR 3；以及(b)轻链可变区(VL)，其包括：含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的轻链互补决定区(LCDR)1、含有SEQ IDNO:5的氨基酸序列的LCDR 2及含有SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:28的氨基酸序列的LCDR 3。
在另一方面，本发明提供包含白介素-2(IL-2)多肽突变体和与CD8结合的抗体的免疫缀合物，其中所述IL-2多肽突变体是包含氨基酸取代F42A、Y45A和L72G(相对于人IL-2序列SEQ ID NO:13编号)的人IL-2分子；并且其中所述抗体包括：(a)重链可变区(VH)，其包含与SEQ ID NO:7的氨基酸序列有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列，和(b)轻链可变区(VL)，其包含与SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:29的氨基酸序列有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列。
在本发明的免疫缀合物的一些实施例中，所述IL-2多肽突变体进一步包含所述氨基酸取代T3A和/或所述氨基酸取代C125A。
在一些实施例中，所述IL-2多肽突变体包含如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述免疫缀合物包含不超过一种IL-2多肽突变体。在一些此类实施例中，所述抗体包含包括第一亚基和第二亚基(composed of a first and a secondsubunit，由第一亚基和第二亚基组成)的Fc结构域。在一些此类实施例中，所述Fc结构域是IgG类，特别是IgG1亚类的Fc结构域和/或人Fc结构域。在一些实施例中，所述抗体是IgG类，特别是IgG1亚类免疫球蛋白。
在一些实施例中，其中所述免疫缀合物包含Fc结构域，所述Fc结构域包含促进所述Fc结构域的所述第一亚基和所述第二亚基的缔合的修饰。在一些实施例中，在所述Fc结构域的所述第一亚基的CH3结构域中，氨基酸残基被具有较大侧链体积的氨基酸残基替换，从而在所述第一亚基的CH3结构域内产生突起，所述突起可定位在所述第二亚基的CH3结构域内的空腔中；而在所述Fc结构域的所述第二亚基的CH3结构域中，氨基酸残基被具有较小侧链体积的氨基酸残基替换，从而在所述第二亚基的CH3结构域内产生空腔，所述第一亚基的CH3结构域内的所述突起可定位在所述空腔内。在一些实施例中，在所述Fc结构域的所述第一亚基中，366位的苏氨酸残基被色氨酸残基替换(T366W)；而在所述Fc结构域的所述第二亚基中，407位的酪氨酸残基被缬氨酸残基替换(Y407V)，并且任选地，366位的苏氨酸残基被丝氨酸残基替换(T366S)，并且368位的亮氨酸残基被丙氨酸残基替换(L368A)(根据Kabat EU索引编号)。在一些此类实施例中，在所述Fc结构域的所述第一亚基中，另外，354位的丝氨酸残基被半胱氨酸残基(S354C)替代或356位的谷氨酸残基被半胱氨酸残基(E356C)替代，并且在所述Fc结构域的所述第二亚基中，另外，349位的酪氨酸残基被半胱氨酸残基(Y349C)替代(根据Kabat的EU索引编号)。在一些实施例中，所述IL-2多肽突变体在其氨基末端氨基酸处与所述Fc结构域的所述亚基中的一个亚基的羧基末端氨基酸融合，特别是与所述Fc结构域的第一亚基的所述羧基末端氨基酸融合，任选地，通过连接肽进行融合。18.在一些此类实施例中，所述连接连接肽具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
在一些实施例中，其中所述免疫缀合物包含Fc结构域，所述Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代减少与Fc受体，特别是Fcγ受体的结合，和/或降低效应子功能，特别是抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)。在一些此类实施例中，所述一个或多个氨基酸取代位于选自L234、L235和P329(Kabat EU索引编号)的组的一个或多个位置处。在一些实施例中，Fc结构域的每个亚基包含氨基酸取代L234A、L235A和P329G(Kabat EU索引编号)。
在根据本发明的一些实施例中，所述免疫缀合物包括：含有与SEQ ID NO:9或SEQID NO:30的酸序列有至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列的多肽，含有与SEQ ID NO:10的序列有至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列的多肽，以及含有与SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的序列有至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列的多肽。
在一些实施例中，所述免疫缀合物包括含有SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:29的氨基酸序列的多肽、含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的多肽和含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的多肽。
在一些实施例中，所述免疫缀合物包括含有SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:29的氨基酸序列的多肽、含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的多肽和含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的多肽。
在一些实施例中，所述免疫缀合物基本上由通过连接序列接合的IL-2多肽突变体和IgG1免疫球蛋白分子组成。
本发明进一步提供了一种或多种编码本文所述的本发明的免疫缀合物的分离的多核苷酸、一种或多种包含所述多核苷酸的载体(特别是表达载体)以及包含所述多核苷酸或所述载体的宿主细胞。
还提供了一种产生包含IL-2多肽突变体和与CD8结合的抗体的免疫缀合物的方法，所述方法包括(a)在适合于表达所述免疫缀合物的条件下培养本发明的宿主细胞，以及任选地(b)回收所述免疫缀合物。本发明还提供了一种免疫缀合物，所述免疫缀合物包含IL-2多肽突变体和与CD8结合的抗体，所述免疫缀合物是通过所述方法产生的。
本发明还提供了一种药物组合物和使用本发明的免疫缀合物的方法，所述药物组合物包含本发明的免疫缀合物和药用载体。
具体地，本发明包括根据本发明的免疫缀合物，所述免疫缀合物用作药物和用于治疗疾病。在一个特定实施例中，所述疾病是癌症。
本发明还包括根据本发明的免疫缀合物在制备用于治疗疾病的药物中的用途。在一个特定实施例中，所述疾病是癌症。
进一步提供了一种治疗个体的疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含药用形式的根据本发明的免疫缀合物。在一个特定实施例中，所述疾病是癌症。
进一步提供了一种刺激个体的免疫***的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的组合物，所述组合物包含药用形式的根据本发明的免疫缀合物。
附图说明
图1A和图1B.包含IL-2多肽突变体的IgG-IL-2免疫缀合物形式的示意图。(图1A)双臂抗CD8；(图2A)单臂抗CD8。
图2.通过流式细胞术来确定与抗FAP-IL2v(FAP-IL2v)相比，双臂抗CD8-IL2v(CD8-IL2v TA)和单臂抗CD8-IL2v(CD8-IL2v OA)与静息PBMC内的CD8 T细胞的结合。用荧光标记的抗人Fc特异性二抗来检测分子。使用PBMC的CD3和CD8染色来鉴定CD8 T细胞。
图3A、图3B、图3C和图3D.通过流式细胞术来确定利用CD8-IL2v TA、CD8-IL2v OA和FAP-IL2v处理静息PBMC后，CD8 T细胞(图3A)、CD4 T细胞(图3C)、调节性T细胞(图3D)和NK细胞(图3D)中的STAT5磷酸化。
图4A、图4B和图4C.通过流式细胞术来确定利用CD8-IL2v TA、CD8-IL2v OA和FAP-IL2v的PBMC内的NK细胞(图4C)、CD4 T细胞(图4B)和CD8 T细胞(图4C)的增殖。
图5A、图5B、图5C和图5D.通过流式细胞术来确定利用CD8-IL2v TA、CD8-IL2vOKT8.v11 TA和FAP-IL2v处理静息PBMC后CD8 T细胞(图5A)、NK细胞(图5B)、CD4 T细胞(图5C)和调节性T细胞(图5D)中的STAT5磷酸化。
具体实施方式
定义
除非在下文中另外定义，否则本文使用的术语通常如本领域中所使用的。
除非另外指明，否则如本文所用的术语“白细胞介素-2”或“IL-2”是指来自任何脊椎动物来源的任何天然IL-2，所述脊椎动物来源包括诸如灵长类动物(例如人)之类的哺乳动物，以及啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。该术语包括未加工的IL-2以及通过细胞中加工产生的任何形式的IL-2。该术语还涵盖天然存在的IL-2变体，例如剪接变体或等位基因变体。示例性人IL-2的氨基酸序列示出于SEQ ID NO:13中。未加工的人IL-2另外包含具有SEQ IDNO:19所示氨基酸序列的N末端20氨基酸信号肽，该信号肽在成熟IL-2分子中不存在。
如本文所用的术语“IL-2突变体”或“IL-2多肽突变体”旨在涵盖各种形式的IL-2分子的任何突变形式，包括全长IL-2、截短形式的IL-2，以及IL-2与另一分子诸如通过融合或化学缀合连接的形式。当关于IL-2使用时，“全长”旨在表示成熟的天然长度IL-2分子。例如，全长人IL-2是指具有133个氨基酸的分子(参见例如SEQ ID NO:13)。各种形式的IL-2突变体表征为具有至少一种影响IL-2与CD25相互作用的氨基酸突变。该突变可涉及对通常位于该位置的野生型氨基酸残基的取代、缺失、截短或修饰。通过氨基酸取代获得的突变体是优选的。除非另外指明，否则IL-2突变体在本文中可称为IL-2突变体肽序列、IL-2多肽突变体、IL-2蛋白质突变体或IL-2突变体类似物。
本文中关于SEQ ID NO:13所示的序列进行了对各种形式的IL-2的命名。本文可使用各种名称来指示相同的突变。例如，42位从苯丙氨酸到丙氨酸的突变可以表示为42A、A42、A42、F42A或Phe42Ala。
如本文所用的“人IL-2分子”是指这样的IL-2分子，所述IL-2分子包含与如SEQ IDNO:13所示的人IL-2序列有至少约90％、至少约91％，至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％或至少约96％的同一性的氨基酸序列。具体地，序列同一性为至少约95％，更特别地至少约96％。在特定实施例中，人IL-2分子是全长IL-2分子。
如本文所用的术语“氨基酸突变”表示涵盖氨基酸取代、缺失、***和修饰。可以进行取代、缺失、***和修饰的任何组合以获得最终构建体，前提条件是所述最终构建体具有所需特征，例如减少的与CD25的结合。氨基酸序列缺失和***包括氨基酸的氨基末端和/或羧基末端缺失和***。末端缺失的实例是全长人IL-2的位置1中的丙氨酸残基的缺失。优选的氨基酸突变是氨基酸取代。出于改变例如IL-2多肽的结合特征的目的，非保守氨基酸取代，即用具有不同结构和/或化学性质的另一种氨基酸取代一种氨基酸，是特别优选的。优选的氨基酸取代包括用亲水性氨基酸取代疏水性氨基酸。氨基酸取代包括用非天然存在的氨基酸或用二十种标准氨基酸的天然存在的氨基酸衍生物(例如4-羟基脯氨酸、3-甲基组氨酸、鸟氨酸、高丝氨酸、5-羟基赖氨酸)进行替代。可以使用本领域熟知的遗传或化学方法来产生氨基酸突变。遗传方法可包括定点诱变、PCR、基因合成等。设想通过除基因工程之外的方法(诸如化学修饰)改变氨基酸侧链基团的方法也是有用的。
如本文所用，“野生型”形式的IL-2是IL-2的一种形式，所述野生型形式与IL-2多肽突变体在其他方面相同，不同之处在于野生型形式在IL-2多肽突变体的每个氨基酸位置处具有野生型氨基酸。例如，如果IL-2突变体是全长IL-2(即IL-2未与任何其他分子融合或缀合)，则该突变体的野生型形式是全长天然IL-2。如果IL-2突变体是IL-2与IL-2下游编码的另一种多肽(例如抗体链)之间的融合体，则该IL-2突变体的野生型形式是与相同的下游多肽融合的、具有野生型氨基酸序列的IL-2。此外，如果IL-2突变体是IL-2的截短形式(IL-2的非截短部分内的突变或修饰的序列)，则该IL-2突变体的野生型形式是具有野生型序列的类似截短的IL-2。出于比较各种形式的IL-2突变体与相应的野生型形式的IL-2的IL-2受体结合亲和力或生物活性的目的，术语野生型涵盖这样形式的IL-2，所述形式包含与天然存在的天然IL-2相比不影响IL-2受体结合的一个或多个氨基酸突变，例如将对应于人IL-2的残基125的位置处用半胱氨酸取代丙氨酸。在一些实施例中，用于本发明目的的野生型IL-2包含氨基酸取代C125A(参见SEQ ID NO:20)。在根据本发明的某些实施例中，与IL-2多肽突变体相比较的野生型IL-2多肽包含如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。在其他实施例中，与IL-2多肽突变体相比较的野生型IL-2多肽包含如SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列。
除非另外指明，否则如本文所用的术语“CD25”或“IL-2受体的α亚基”是指来自任何脊椎动物来源的任何天然CD25，所述脊椎动物来源包括诸如灵长类动物(例如人)之类的哺乳动物，以及啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。该术语包括“全长”的未加工CD25，以及通过细胞中加工产生的任何形式的CD25。该术语还涵盖天然存在的CD25变体，例如剪接变体或等位基因变体。在某些实施例中，CD25是人CD25。人CD25的氨基酸序列见于例如UniProt登录号P01589(第185版)。
如本文所用的术语“高亲和力IL-2受体”是指异源三聚形式的IL-2受体，其由受体γ亚基(也称为共同细胞因子受体γ亚基、γc或CD132，参见UniProt登录号P14784(第192版))、受体β亚基(也称为CD122或p70，参见UniProt登录号P31785(第197版))和受体α亚基(也称为CD25或p55，参见UniProt登录号P01589(第185版))组成。相比之下，术语“中间亲和力IL-2受体”是指仅包含γ亚基和β亚基，而不含α亚基的IL-2受体(综述请参见例如Olejniczak和Kasprzak，Med Sci Monit 14,RA179-189(2008))。
“亲和力”是指分子(例如，受体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如，配体)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指明，否则如本文所用，“结合亲和力”是指固有结合亲和力，该固有结合亲和力反映了结合对的成员(例如，抗原结合部分与抗原，或者受体与其配体)之间的1:1相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以用解离常数(KD)表示，所述解离常数是解离速率常数与缔合速率常数(分别为koff和kon)的比率。因此，等效亲和力可以包括不同的速率常数，只要速率常数的比率保持相同即可。亲和力可以通过本领域中已知的完善确立的方法(包括本文所述的那些方法)来测量。测量亲和力的特定方法是表面等离子体共振(SPR)。
突变型或野生型IL-2多肽对各种形式的IL-2受体的亲和力可以根据WO 2012/107417中叙述的方法，通过表面等离子体共振(SPR)，使用诸如BIAcore仪器(GEHealthcare)之类的标准仪器和诸如可通过重组表达获得的受体亚基来测定(参见例如Shanafelt等人，Nature Biotechnol 18,1197-1202(2000))。或者，可以使用已知表达一种或另一种该形式的受体的细胞系来评估IL-2突变体对不同形式的IL-2受体的结合亲和力。下文将描述用于测量结合亲和力的具体说明性和示例性实施例。
“调节性T细胞”或“Treg细胞”是指能够抑制其他T细胞的应答的特殊类型的CD4+T细胞。Treg细胞表征为表达IL-2受体(CD25)的α亚基和转录因子叉头框P3(FOXP3)(Sakaguchi,Annu Rev Immunol 22,531-62(2004))，并且在诱导和维持对抗原(包括由肿瘤表达的抗原)的外周自身耐受性中起关键作用。Treg细胞需要IL-2来实现其功能和发展及诱导其抑制特征。
如本文所用，术语“效应细胞”是指介导IL-2的细胞毒性效应的淋巴细胞群体。效应细胞包括效应T细胞，诸如CD8+细胞毒性T细胞、NK细胞、淋巴因子激活杀伤(LAK)细胞和巨噬细胞/单核细胞。
“特异性结合”是指结合对于抗原具有选择性，并且可以与不需要的或非特异性的相互作用区分开。抗体结合特定抗原(例如CD8)的能力可以通过酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)或本领域技术人员熟悉的其他技术来测量，所述其他技术为例如表面等离子体共振(SPR)技术(例如在BIAcore仪器上分析的)(Liljeblad等人，Glyco J 17,323-329(2000))和传统的结合测定法(Heeley,Endocr Res28,217-229(2002))。在一个实施例中，抗体与无关蛋白质的结合程度为所述抗体与抗原结合的小于约10％，如例如通过SPR所测量的。包含在本文所述的免疫缀合物中的抗体与CD8特异性结合。
如本文所用，术语“多肽”是指由通过酰胺键(也称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)构成的分子。术语“多肽”是指具有两个或更多个氨基酸的任何链，而不是指产物的特定长度。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”或用于指代具有两个或更多个氨基酸的链的任何其他术语包括在“多肽”的定义内，并且术语“多肽”可以代替这些术语中的任何一者使用，或与这些术语中的任何一者可互换地使用。术语“多肽”还旨在指代多肽的表达后修饰产物，所述表达后修饰包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、用已知保护/阻断基团衍生化、蛋白水解切割，或用非天然存在的氨基酸进行修饰。多肽可以源自天然生物来源或通过重组技术产生，而不一定从指定的核酸序列翻译而来。它可以以任何方式生成，包括通过化学合成。多肽可以具有确定的三维结构，但它们不一定具有这种结构。具有确定的三维结构的多肽被称为折叠的；并且不具有确定的三维结构，而是可以采用大量不同构象的多肽则被称为未折叠的。
“分离的”多肽或变体或其衍生物意指不是处于其天然环境中的多肽。不需要特定的纯化水平。例如，可以从多肽的天然或自然环境中移出分离的多肽。在宿主细胞中表达的重组产生的多肽和蛋白被认为是出于本发明的目的而分离的，已经通过任何合适的技术分离、分级或部分或基本上纯化的天然或重组多肽也被认为是出于本发明的目的而分离的。
相对于参考多肽序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”被定义为在比对候选序列与参考多肽序列并且引入空位(如果必要的话)以实现最大的序列同一性百分比之后，并且在不考虑将任何保守取代作为序列同一性的组成部分的情况下，候选序列中的氨基酸残基与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的比对可以通过本领域技术范围内的各种方式实现，例如使用公众可获得的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、Clustal W、Megalign(DNASTAR)软件或FASTA程序包。本领域技术人员可确定用于比对序列的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。然而，出于本文的目的，用BLOSUM50比较矩阵，使用FASTA包第36.3.8c版或更高版本的ggsearch程序产生氨基酸序列同一性％的值。FASTA程序包由W.R.Pearson和D.J.Lipman(1988),“Improved Tools for Biological Sequence Analysis”,PNAS 85:2444-2448；W.R.Pearson(1996)“Effective protein sequence comparison”Meth.Enzymol.266:227-258；以及Pearson等人，(1997)Genomics 46:24-36，并且可公开地从http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_down.shtml获得。或者，可以使用可在http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/index.cgi处访问的公共服务器来比较序列，使用ggsearch(全局蛋白质：蛋白质)程序和默认选项(BLOSUM50；开放：-10；ext：-2；Ktup＝2)来确保执行全局而非局部比对。在输出的比对标头(alignment header)中给出氨基酸同一性百分比。
术语“多核苷酸”是指分离的核酸分子或构建体，例如信使RNA(messenger RNA，mRNA)、病毒来源的RNA，或质粒DNA(plasmid DNA，pDNA)。多核苷酸可包含常规磷酸二酯键或非常规键(例如酰胺键，诸如在肽核酸(PNA)中存在的)。术语“核酸分子”是指存在于多核苷酸中的任何一个或多个核酸区段，例如DNA或RNA片段。
“分离的”核酸分子或多核苷酸意指已从其天然环境中取出的核酸分子、DNA或RNA。例如，编码包含在载体中的多肽的重组多核苷酸出于本发明的目的被视为分离的。分离的多核苷酸的另外的实施例包括维持在异源宿主细胞中的重组多核苷酸或处于溶液中的纯化的(部分地或基本上纯化的)多核苷酸。分离的多核苷酸包括多核苷酸分子，该多核苷酸分子包含在通常包含多核苷酸分子的细胞中，但该多核苷酸分子存在于染色体外或存在于与其天然染色***置不同的染色***置上。分离的RNA分子包括本发明的体内或体外RNA转录物，以及正链和负链形式及双链形式。根据本发明的分离的多核苷酸或核酸还包括通过合成产生的此类分子。此外，多核苷酸或核酸可以是或可包括调控元件，诸如启动子、核糖体结合位点或转录终止子。
“编码[例如本发明的免疫缀合物]的分离的多核苷酸(或核酸)”是指编码抗体重链和轻链和/或IL-2多肽(或其片段)的一种或多种多核苷酸分子，包括在单个载体或单独载体中的此类多核苷酸分子，以及存在于宿主细胞中的一个或多个位置处的此类核酸分子。
术语“表达盒”是指重组或合成产生的多核苷酸，以及允许特定核酸在靶细胞中转录的一系列指定核酸元件。重组表达盒可以掺入质粒、染色体、线粒体DNA、质粒DNA、病毒或核酸片段中。典型地，表达载体的重组表达盒部分除其他序列之外还包括待转录的核酸序列和启动子。在某些实施例中，表达盒包含编码本发明的免疫缀合物或其片段的多核苷酸序列。
术语“载体”或“表达载体”是指用于将与其可操作地缔合的特定基因引入细胞中并且指导所述特定基因在细胞中表达的DNA分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体，以及整合入其已被引入的宿主细胞的基因组中的载体。本发明的表达载体包含表达盒。表达载体允许大量稳定mRNA的转录。表达载体在细胞内之后，就通过细胞转录和/或翻译机制产生由该基因编码的核糖核酸分子或蛋白质。在一个实施例中，本发明的表达载体包含表达盒，所述表达盒包含编码本发明的免疫缀合物或其片段的多核苷酸序列。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”与“宿主细胞培养物”可互换使用并且是指其中已引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞和来源于所述原代转化细胞的子代，不考虑传代次数。子代可能不与亲本细胞的核酸内容物完全一致，而是可能含有突变。本文包括如在原始转化细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物活性的突变子代。宿主细胞是可用于产生本发明的免疫缀合物的任何类型的细胞***。宿主细胞包括培养的细胞，例如哺乳动物的培养细胞，诸如仅举几个示例HEK细胞、CHO细胞、BHK细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、YO骨髓瘤细胞、P3X63小鼠骨髓瘤细胞、PER细胞、PER.C6细胞或杂交瘤细胞、酵母细胞、昆虫细胞和植物细胞，还包括转基因动物、转基因植物或培养的植物或动物组织中包含的细胞。
本文的术语“抗体”在最广泛意义上使用并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、单价抗体(例如，单臂抗体)，以及抗体片段，只要它们表现出所需的抗原结合活性，即与CD8(诸如人CD8、食蟹猴CD8和/或恒河猴CD8)结合即可。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即除了可能的变异抗体外，该群体中包括的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位，所述可能的变异抗体例如含有天然存在的突变或是在单克隆抗体制备物的生产过程中产生的，此类变体通常以微量存在。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂中的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从基本上同质的抗体群体获得的，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术制备，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法，以及利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，在本文中描述了用于制备单克隆抗体的此类方法和其他示例性方法。
“分离的”抗体是已经从其天然环境的组分中分离出的抗体，即不在其天然环境中的抗体。不需要特定的纯化水平。例如，可以从抗体的天然或自然环境中取出分离的抗体。在宿主细胞中表达的重组产生的抗体被认为是出于本发明的目的而分离的，已经通过任何合适的技术分离、分级或部分或基本上纯化的天然或重组抗体也被认为是出于本发明的目的而分离的。如此，分离出本发明的免疫缀合物。在一些实施例中，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(isoelectric focusing,IEF)、毛细管电泳)或色谱(例如，离子交换或反相HPLC)方法测定的，将抗体纯化至大于95％或99％的纯度。关于评定抗体纯度的方法的综述，请参见例如Flatman等人，J.Chromatogr.B 848:79-87(2007)。
术语“全长抗体”、“完整抗体”和“整个抗体”在本文中可互换使用以指代具有与天然抗体结构基本上相似的结构的抗体。
“抗体片段”是指除了完整抗体以外的分子，其包含完整抗体的一部分，该部分与完整抗体所结合的抗原结合。抗体片段的示例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2，双体抗体、线性抗体、单链抗体分子(例如scFv)，以及单结构域抗体。关于某些抗体片段的综述，请参见Holliger和Hudson,Nature Biotechnology 23:1126-1136(2005)。关于scFv片段的综述，参见例如Plückthun在The harmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994)中所述；还参见WO 93/16185；以及美国专利Nos 5,571,894和5,587,458。对于包含挽救受体结合表位残基且具有延长的体内半衰期的Fab片段和F(ab')2片段的讨论，参见美国专利号5,869,046。双体抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价或双特异性的。参见例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人，Nat Med 9,129-134(2003)；以及Hollinger等人，Proc Natl Acad Sci USA 90,6444-6448(1993)。在Hudson等人，Nat Med9,129-134(2003)中也描述了三体抗体和四体抗体。单结构域抗体为包含抗体的重链可变结构域的全部或部分或轻链可变结构域的全部或部分的抗体片段。在某些实施例中，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis,Inc.，Waltham，MA；参见例如美国专利6,248,516B1)。抗体片段可以通过各种技术制备，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及由重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)产生，如本文所述。
术语“免疫球蛋白分子”是指具有天然存在的抗体的结构的蛋白质。例如，IgG类免疫球蛋白是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，其由通过二硫键键合的两条轻链和两条重链组成。从N-末端到C-末端，每条重链具有可变结构域(VH)(也称为可变重链结构域或重链可变区)，接着是三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)(也称为重链恒定区)。类似地，从N-末端到C-末端，每条轻链具有可变结构域(VL)(也称为可变轻链结构域或轻链可变区)，接着是一个恒定轻链(CL)结构域(也称为轻链恒定区)。免疫球蛋白的重链可配属为以下五种类型中的一种：称为α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)或μ(IgM)，它们中的一些可进一步分为亚型，例如γ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)、γ4(IgG4)、α1(IgA1)和α2(IgA2)。免疫球蛋白的轻链可以基于其恒定结构域的氨基酸序列而被配属为以下两种类型中的一种：称为卡帕(κ)和拉姆达(λ)。免疫球蛋白实质上由通过免疫球蛋白铰链区连接的两个Fab分子和一个Fc结构域组成。
术语“抗原结合结构域”是指抗体的一部分，该部分包含与抗原的部分或全部特异性结合并互补的区域。抗原结合结构域可以由例如一个或多个抗体可变结构域(也称为抗体可变区)提供。具体地，抗原结合结构域包含抗体轻链可变结构域(VL)和抗体重链可变结构域(VH)。
术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链的参与抗体与抗原结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守框架区(FR)和三个高变区(HVR)。参见例如，Kindt等人，KubyImmunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，第91页(2007)。单个VH或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。如本文所用，与可变区序列有关的“Kabat编号”是指由Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)提出的编号***。
如本文所用，重链和轻链的所有恒定区和恒定结构域的氨基酸位置根据Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)中描述的Kabat编号***进行编号，并且在本文中被称为“根据Kabat编号”或“Kabat编号”。具体地讲，将Kabat编号***(参见Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)的第647页至第660页)用于κ和λ同种型的轻链恒定结构域Cl，并且将Kabat EU索引编号***(参见第661页至第723页)用于重链恒定结构域(CH1、铰链、CH2和CH3)，这在本文中通过在此种情况下称为“根据Kabat EU索引编号”来进一步阐明。
如本文所用，术语“高变区”或“HVR”是指以下项中的每一种：抗体可变结构域的在序列中高变(“互补决定区”或“CDR”)和/或形成结构上限定的环(“高变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触点”)的区域。通常，抗体包含六个HVR；三个在VH中(H1、H2、H3)，并且三个在VL中(L1、L2、L3)。本文中的示例性HVR包括：
(a)在氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)处发生的高可变环(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196:901-917(1987))；
(b)在氨基酸残基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)处发生的CDR(Kabat等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))；
(c)在氨基酸残基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)和93-101(H3)处发生的抗原接触点(MacCallum等人，J.Mol.Biol.262:732-745(1996))；以及
(d)(a)、(b)和/或(c)的组合，包括HVR氨基酸残基46-56(L2)、47-56(L2)、48-56(L2)、49-56(L2)、26-35(H1)、26-35b(H1)、49-65(H2)、93-102(H3)和94-102(H3)。
除非另外指明，否则可变结构域中的HVR残基和其他残基(例如，FR残基)在本文中根据Kabat等人，出处同上编号。
“框架”或“FR”是指除高变区(HVR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由以下四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR序列和FR序列通常在VH(或VL)中以如下次序出现：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
“人源化”抗体是指这样的嵌合抗体，其包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基。在某些实施例中，人源化抗体将基本上包含所有的至少一个，通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有HVR(例如CDR)对应于非人抗体的HVR，并且所有或基本上所有的FR对应于人抗体的FR。此类可变结构域在本文中称为“人源化可变区”。人源化抗体任选地可以包含来源于人抗体的抗体恒定区的至少一部分。在一些实施例中，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如，HVR残基所来源于的抗体)的相应残基取代，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。抗体(例如非人抗体)的“人源化形式”是指已经历人源化的抗体。本发明涵盖的其他形式的“人源化抗体”是这样的抗体，相对于原始抗体，所述抗体中的恒定区已经经过了另外修饰或改变，以产生根据本发明的特性，特别是关于C1q结合和/或Fc受体(FcR)结合的特性。
“人抗体”是这样的抗体，该抗体具有的氨基酸序列对应于由人或人细胞产生的抗体的氨基酸序列，或来源于利用人抗体库或其他人抗体编码序列的非人源的抗体的氨基酸序列。人抗体的该定义特别地排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。在某些实施例中，人抗体来源于非人转基因哺乳动物，例如小鼠、大鼠或兔子。在某些实施例中，人抗体来源于杂交瘤细胞系。在本文中从人抗体文库分离出的抗体或抗体片段也被认为是人抗体或人抗体片段。
抗体或免疫球蛋白的“类”是指其重链具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五大类抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且它们中的一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1，以及IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
本文的术语“Fc结构域”或“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C末端区，该C末端区含有恒定区的至少一部分。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。尽管IgG重链Fc区的边界可能略有不同，但是人IgG重链Fc区通常被定义为从Cys226或从Pro230延伸至该重链的羧基末端。然而，由宿主细胞产生的抗体可以经历对来自重链的C末端的一个或多个，特别是一个或两个氨基酸的翻译后切割。因此，由宿主细胞通过表达编码全长重链的特定核酸分子产生的抗体可以包括全长重链，或者该抗体可以包括全长重链的切割变体(在本文中也称为“经切割的变体重链”)。这可能是重链的最后两个C末端氨基酸为甘氨酸(G446)和赖氨酸(K447，根据Kabat EU索引)的情况。因此，Fc区的C末端赖氨酸(Lys447)或C末端甘氨酸(Gly446)和赖氨酸(K447)可以存在或可以不存在。如果没有另外指明，则包含Fc结构域(或如本文所定义的Fc结构域的亚基)的重链的氨基酸序列在本文中被表示为没有C末端甘氨酸-赖氨酸二肽。在本发明的一个实施例中，包括如本文所指定的Fc结构域的亚基的重链包含在根据本发明的免疫缀合物中，该重链包含另外的C末端甘氨酸-赖氨酸二肽(G446和K447，根据Kabat的EU索引编号)。在本发明的一个实施例中，包含如本文所指定的Fc结构域的亚基的重链包含在根据本发明的免疫缀合物中，该重链包含另外的C末端甘氨酸残基(G446，根据Kabat的EU索引编号)。本发明的组合物，诸如本文所述的药物组合物，包含本发明的免疫缀合物群体。该免疫缀合物群体可包含具有全长重链的分子和具有经切割的变体重链的分子。该免疫缀合物群体可以由具有全长重链的分子和具有经切割的变体重链的分子的混合物组成，其中至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的所述免疫缀合物具有经切割的变体重链。在本发明的一个实施例中，包含本发明的免疫缀合物群体的组合物包含这样的免疫缀合物，所述免疫缀合物包含这样的重链，所述重链包含如本文所指定的Fc结构域的亚基以及另外的C末端甘氨酸-赖氨酸二肽(G446和K447，根据Kabat的EU索引编号)。在本发明的一个实施例中，包含本发明的免疫缀合物群体的组合物包含这样的免疫缀合物，所述免疫缀合物包含这样的重链，所述重链包含如本文所指定的Fc结构域的亚基以及另外的C末端甘氨酸残基(G446，根据Kabat的EU索引编号)。在本发明的一个实施例中，这种组合物包含免疫缀合物群体，所述免疫缀合物群体由以下分子构成：包含这样的重链的分子，所述重链包含如本文所指定的Fc结构域的亚基；包含这样的重链的分子，所述重链包含如本文所指定的Fc结构域的亚基以及另外的C末端甘氨酸残基(G446，根据Kabat的EU索引编号)；以及包含这样的重链的分子，所述重链包含如本文所指定的Fc结构域的亚基以及另外的C末端甘氨酸-赖氨酸二肽(G446和K447，根据Kabat的EU索引编号)。除非本文另外指明，否则Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号是根据EU编号***(也称为EU索引)来编号的，如在Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991(还可参见上文)中所述。如本文所用的Fc结构域的“亚基”是指形成二聚Fc结构域的两种多肽中的一种，即包含免疫球蛋白重链的C末端恒定区的多肽，该多肽能够稳定自缔合。例如，IgG Fc结构域的亚基包含IgG CH2和IgG CH3恒定结构域。
“促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基缔合的修饰”是对肽骨架的操纵或Fc结构域亚基的翻译后修饰，其减少或防止包含Fc结构域亚基的多肽与相同多肽缔合以形成同源二聚体。如本文所用，“促进缔合的修饰”特别包括对期望缔合的两个Fc结构域亚基(即Fc结构域的第一亚基和第二亚基)中的每一者进行的单独修饰，其中所述修饰彼此互补以促进这两个Fc结构域亚基的缔合。例如，促进缔合的修饰可以改变所述Fc结构域亚基中的一者或两者的结构或电荷，以便分别使它们的缔合在空间上或静电上有利。因此，(异源)二聚化发生在包含第一Fc结构域亚基的多肽与包含第二Fc结构域亚基的多肽之间，这在融合至每个亚基的另外组分(例如抗原结合部分)不相同的意义上可能是不同的。在一些实施例中，促进缔合的修饰包括Fc结构域中的氨基酸突变，特别是氨基酸取代。在一个特定实施例中，促进缔合的修饰包括对Fc结构域的两个亚基中的每一个的单独氨基酸突变，特别是氨基酸取代。
当关于抗体使用时，术语“效应子功能”是指可归因于抗体的Fc区的那些生物活性，该等生物活性随抗体同种型而变化。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、细胞因子分泌、免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取、下调细胞表面受体(例如B细胞受体)，以及B细胞活化。
抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)是导致免疫效应细胞裂解抗体包被的靶细胞的免疫机制。靶细胞是与包含Fc区的抗体或其衍生物特异性结合的细胞，该特异性结合通常是通过Fc区的N末端的蛋白质部分。如本文所用，术语“降低的ADCC”被定义为在靶细胞周围的培养基中给定抗体浓度下在给定时间内通过上面定义的ADCC机制裂解的靶细胞数量减少，和/或在靶细胞周围的培养基中通过ADCC机制在给定时间内实现对给定数量的靶细胞的裂解所必需的抗体浓度增加。ADCC降低是相对于使用相同的标准生产、纯化、配制和储存方法(该等方法为本领域技术人员已知的)，由相同类型的宿主细胞产生但尚未被工程化的相同抗体介导的ADCC。例如，由在Fc结构域中包含降低ADCC的氨基酸取代的抗体介导的ADCC的降低是相对于由在Fc结构域中没有该氨基酸取代的相同抗体介导的ADCC。用于测量ADCC的合适测定法是本领域中熟知的(参见例如PCT公开号WO 2006/082515或PCT公开号WO 2012/130831)。
“活化性Fc受体”是这样的Fc受体：其在被抗体的Fc结构域接合后引发刺激携带该受体的细胞执行效应子功能的信号传导事件。人活化性Fc受体包括FcγRIIIa(CD16a)、FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)和FcαRI(CD89)。
如本文所用，术语“工程化、工程化的、工程改造”被认为包括对肽骨架的任何操纵，或对天然存在的或重组的多肽或其片段的翻译后修饰。工程改造包括对氨基酸序列、糖基化模式或单独氨基酸的侧链基团的修饰，以及这些方法的组合。
“降低的结合”，例如降低的与Fc受体或CD25的结合，是指对相应相互作用的亲和力降低，如例如通过SPR所测量的。为清楚起见，该术语还包括将亲和力降低至零(或低于分析方法的检测极限)，即完全消除相互作用。相反地，“增加的结合”是指对相应相互作用的结合亲和力增加。
如本文所用，术语“免疫缀合物”是指包含至少一种IL-2分子和至少一种抗体的多肽分子。IL-2分子可以通过各种相互作用和以如本文所述的各种构型与抗体连接。在特定实施例中，IL-2分子通过肽连接基与抗体融合。根据本发明的特定免疫缀合物基本上由通过一个或多个(一种或多种)连接序列接合的一个(一种)IL-2分子和一个(一种)抗体组成。
“融合”是指组分(例如抗体和IL-2分子)直接地或经由一个或多个肽连接基而通过肽键连接。
如本文所用，关于Fc结构域亚基等的术语“第一”和“第二”用于方便当存在多于一个类型的部分时进行区分。除非明确说明，否则这些术语的使用并非旨在赋予免疫缀合物特定次序或取向。
药剂的“有效量”是指在药剂所施用至的细胞或组织中导致生理变化所必需的量。
药剂(例如药物组合物)的“治疗有效量”是指在必要的剂量和时间段下有效实现所需治疗或预防结果的量。治疗有效量的药剂例如消除、减少、延迟、最小化或预防疾病的不良影响。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类动物(例如人和非人灵长类动物，诸如猴)、兔以及啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)。具体地，个体或受试者是人。
术语“药物组合物”是指这样的制备物，该制备物的形式允许该制备物中所含的活性成分的生物活性有效，并且该制备物不含对所述组合物将施用至的受试者具有不可接受的毒性的附加组分。
“药用载体”是指药物组合物中除活性成分外的对受试者无毒的成分。药用载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂，或防腐剂。
如本文所用，“治疗(treatment)”(及其语法变体，诸如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指试图改变所治疗个体的疾病的自然病程，并且可以执行以用于预防或在临床病理学过程中执行的临床干预。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、减轻症状、削弱疾病的任何直接或间接病理学后果、预防转移、降低疾病进展的速率、改善或减轻疾病状态，以及缓解或改善预后。在一些实施例中，本发明的免疫缀合物用于延迟疾病的发展或减缓疾病的进展。
实施例的具体描述
IL-2多肽突变体
根据本发明的免疫缀合物包含具有对于免疫疗法有利的性质的IL-2多肽突变体。具体地，在IL-2多肽突变体中消除了IL-2的有助于毒性而对IL-2的功效不是必需的药理学性质。此类IL-2多肽突变体详细描述于WO2012/107417中，该专利以引用方式整体并入本文。如上所述，不同形式的IL-2受体由不同的亚基组成，并且表现出不同的IL-2亲和力。由β和γ受体亚基组成的中等亲和力IL-2受体在静息效应细胞上表达，并且足以用于IL-2信号传导。另外包含该受体的α亚基的高亲和力IL-2受体，主要在调节性T(Treg)细胞上以及活化的效应细胞上表达，其中该受体与IL-2的接合可分别促进Treg细胞介导的免疫抑制或活化诱导的细胞死亡(AICD)。因此，不受理论的束缚，降低或消除IL-2对该IL-2受体的α亚基的亲和力应当减少IL-2诱导的调节性T细胞对效应细胞功能的下调和通过AICD过程实现的肿瘤耐受性的发展。在另一方面，保持对中等亲和力IL-2受体的亲和力应该保持IL-2对如NK和T细胞等效应细胞的增殖和活化的诱导。
包含在根据本发明的免疫缀合物中的白细胞介素-2(IL-2)多肽突变体包含这样的至少一个氨基酸突变，各自与野生型IL-2多肽相比，该至少一个氨基酸突变消除或降低IL-2多肽突变体对IL-2受体的α亚基的亲和力并且保留了IL-2多肽突变体对中等亲和力IL-2受体的亲和力。
具有降低的CD25亲和力的人IL-2(hIL-2)的突变体可以例如通过氨基酸位置35、38、42、43、45或72或它们的组合处的氨基酸取代产生(对应于如SEQ ID NO:13所示的人IL-2氨基酸序列编号)。示例性氨基酸取代包括K35E、K35A、R38A、R38E、R38N、R38F、R38S、R38L、R38G、R38Y、R38W、F42L、F42A、F42G、F42S、F42T、F42Q、F42E、F42N、F42D、F42R、F42K、K43E、Y45A、Y45G、Y45S、Y45T、Y45Q、Y45E、Y45N、Y45D、Y45R、Y45K、L72G、L72A、L72S、L72T、L72Q、L72E、L72N、L72D、L72R，以及L72K。可用于本发明免疫缀合物的特定IL-2突变体包含在与人IL-2的残基42、45或72，或它们的组合对应的氨基酸位置处的氨基酸突变。在一个实施例中，所述氨基酸突变是选自由以下项组成的组的氨基酸取代：F42A、F42G、F42S、F42T、F42Q、F42E、F42N、F42D、F42R、F42K、Y45A、Y45G、Y45S、Y45T、Y45Q、Y45E、Y45N、Y45D、Y45R、Y45K、L72G、L72A、L72S、L72T、L72Q、L72E、L72N、L72D、L72R和L72K，更具体地是选自F42A、Y45A和L72G的组的氨基酸取代。与IL-2突变体的野生型形式相比，这些突变体表现出对中等亲和力的IL-2受体基本上相似的结合亲和力，并且对IL-2受体的α亚基和高亲和力IL-2受体具有大幅降低的亲和力。
有用突变体的其他特征可包括诱导携带IL-2受体的T细胞和/或NK细胞增殖的能力，在携带IL-2受体的T细胞和/或NK细胞中诱导IL-2信号传导的能力，使NK细胞产生干扰素(IFN)-γ作为次级细胞因子的能力，降低的诱导外周血单核细胞(PBMC)对次级细胞因子(特别是IL-10和TNF-α)进行加工(elaboration)的能力，降低的活化调节性T细胞的能力，降低的诱导T细胞凋亡的能力，以及降低的体内毒性特征。
可用于本发明的特定IL-2多肽突变体包含三个氨基酸突变，该三个氨基酸突变消除或降低IL-2多肽突变体对IL-2受体的α亚基的亲和力，但保留IL-2多肽突变体对中等亲和力IL-2受体的亲和力。在一个实施例中，所述三个氨基酸突变位于与人IL-2的残基42、45和72对应的位置处。在一个实施例中，所述三个氨基酸突变是氨基酸取代。在一个实施例中，所述三个氨基酸突变是选自以下项的组的氨基酸取代：F42A、F42G、F42S、F42T、F42Q、F42E、F42N、F42D、F42R、F42K、Y45A、Y45G、Y45S、Y45T、Y45Q、Y45E、Y45N、Y45D、Y45R、Y45K、L72G、L72A、L72S、L72T、L72Q、L72E、L72N、L72D、L72R，以及L72K。在一个具体实施例中，所述三个氨基酸突变是氨基酸取代F42A、Y45A和L72G(对应于如SEQ ID NO:13所示的人IL-2氨基酸序列编号)。
在某些实施例中，所述氨基酸突变使IL-2多肽突变体对IL-2受体的α亚基的亲和力降低至少5倍，具体地至少10倍，更具体地至少25倍。在存在多于一个降低IL-2多肽突变体对IL-2受体的α亚基的亲和力的氨基酸突变的实施例中，这些氨基酸突变的组合可使IL-2多肽突变体对IL-2受体的α亚基的亲和力降低至少30倍、至少50倍，或甚至至少100倍。在一个实施例中，所述氨基酸突变或氨基酸突变的组合消除了IL-2多肽突变体对IL-2受体的α亚基的亲和力，使得通过表面等离子体共振检测不到结合。
当IL-2突变体表现出大于该IL-2突变体的野生型形式对中等亲和力IL-2受体的亲和力的大于约70％时，实现了基本上相似的与中等亲和力受体的结合，即保留IL-2多肽突变体对所述受体的亲和力。本发明的IL-2突变体可表现出大于约80％，甚至大于约90％的此种亲和力。
降低IL-2对IL-2受体的α亚基的亲和力与消除IL-2的O糖基化的组合产生了具有改善性质的IL-2蛋白质。例如，当IL-2多肽突变体在诸如CHO或HEK细胞之类的哺乳动物细胞中表达时，消除O糖基化位点导致更均质的产物。
因此，在某些实施例中，IL-2多肽突变体包含另外的氨基酸突变，该另外的氨基酸突变消除了在与人IL-2的残基3对应的位置处的IL-2的O糖基化位点。在一个实施例中，消除与人IL-2的残基3对应的位置处的IL-2的O糖基化位点的所述另外的氨基酸突变是氨基酸取代。示例性氨基酸取代包括T3A、T3G、T3Q、T3E、T3N、T3D、T3R、T3K，以及T3P。在一个具体实施例中，所述另外的氨基酸突变是氨基酸取代T3A。
在某些实施例中，IL-2多肽突变体基本上是全长IL-2分子。在某些实施例中，IL-2多肽突变体是人IL-2分子。在一个实施例中，IL-2多肽突变体包含具有至少一个氨基酸突变的SEQ ID NO:13所示氨基酸序列，与包含不具有所述突变的SEQ ID NO:13所示氨基酸序列的IL-2多肽相比，该至少一个氨基酸突变消除或降低IL-2多肽突变体对IL-2受体的α亚基的亲和力但保留IL-2多肽突变体对中等亲和力IL-2受体的亲和力。在另一个实施例中，IL-2多肽突变体包含具有至少一个氨基酸突变的SEQ ID NO:13所示氨基酸序列，与包含不具有所述突变的SEQ ID NO:13所示氨基酸序列的IL-2多肽相比，该至少一个氨基酸突变消除或降低IL-2多肽突变体对IL-2受体的α亚基的亲和力但保留IL-2多肽突变体对中等亲和力IL-2受体的亲和力。
在一个具体实施例中，IL-2多肽突变体可以引发选自由以下项组成的组的细胞反应中的一种或多种细胞反应：活化T淋巴细胞的增殖、活化T淋巴细胞的分化、细胞毒性T细胞(CTL)活性、活化B细胞的增殖、活化B细胞的分化、自然杀伤(NK)细胞的增殖、NK细胞的分化、活化T细胞或NK细胞进行细胞因子分泌，以及NK/淋巴细胞活化杀伤(LAK)抗肿瘤细胞毒性。
在一个实施例中，与野生型IL-2多肽相比，IL-2多肽突变体具有降低诱导调节性T细胞中IL-2信号传导的能力。在一个实施例中，与野生型IL-2多肽相比，IL-2多肽突变体在T细胞中诱导较少的活化诱导细胞死亡(AICD)。在一个实施例中，与野生型IL-2多肽相比，IL-2多肽突变体具有降低的体内毒性特征。在一个实施例中，与野生型IL-2多肽相比，IL-2多肽突变体具有延长的血清半衰期。
可用于本发明的特定IL-2多肽突变体在与人IL-2的残基3、42、45和72对应的位置处包含四个氨基酸取代。具体的氨基酸取代是T3A、F42A、Y45A和L72G。如WO 2012/107417中所证实的，所述四重IL-2多肽突变体表现为没有可检测的与CD25的结合、降低的诱导T细胞凋亡的能力、降低的诱导Treg细胞中IL-2信号传导的能力，以及降低的体内毒性特征。然而，它保留了在效应细胞中活化IL-2信号传导、诱导效应细胞增殖，以及通过NK细胞产生IFN-γ作为次级细胞因子的能力。
此外，如WO 2012/107417中所述，所述IL-2多肽突变体具有进一步有利的性质，诸如降低的表面疏水性、良好的稳定性和良好的表达产率。出乎意料的是，与野生型IL-2相比，所述IL-2多肽突变体还提供延长的血清半衰期。
用于本发明的IL-2突变体，除了在形成IL-2与CD25或糖基化位点的界面的IL-2区域中具有突变外，还可以在这些区域之外的氨基酸序列中具有一个或多个突变。人IL-2中的此类另外突变可提供额外的优点，诸如增强的表达或稳定性。例如，如在美国专利号4,518,584中所述，125位的半胱氨酸可以用中性氨基酸(诸如丝氨酸、丙氨酸、苏氨酸或缬氨酸)替代，从而分别产生C125S IL-2、C125A IL-2、C125T IL-2或C125V IL-2。如其中所述，还可以使IL-2的N末端丙氨酸残基缺失，从而产生诸如des-A1 C125S或des-A1 C125A之类的突变。另选地或结合地，IL-2突变体可包括这样的突变，通过所述突变通常在野生型人IL-2的104位存在的甲硫氨酸被诸如丙氨酸之类的中性氨基酸替代(参见美国专利号5,206,344)。所得突变体，例如des-A1 M104A IL-2、des-A1 M104A C125S IL-2、M104A IL-2、M104A C125A IL-2、des-A1 M104A C125A IL-2、或M104A C125S IL-2(这些和其他突变体可见于美国专利号5,116,943中和Weiger等人，Eur J Biochem 180,295-300(1989)中)可以与本发明的特定IL-2突变体结合使用。
因此，在某些实施例中，IL-2多肽突变体在与人IL-2的残基125对应的位置处包含另外的氨基酸突变。在一个实施例中，所述另外的氨基酸突变是氨基酸取代C125A。
技术人员将能够确定哪些另外的突变可以为本发明的目的提供额外的优点。例如，将理解IL-2序列中的降低或消除IL-2对中等亲和力的IL-2受体的亲和力的氨基酸突变，诸如D20T、N88R或Q126D(参见例如US 2007/0036752)，可能不适合包括在根据本发明的IL-2多肽突变体中。
在一个实施例中，与相应的野生型IL-2序列(例如如SEQ ID NO:13所示的人IL-2氨基酸序列)相比，IL-2多肽突变体包含不超过12个、不超过11个、不超过10个、不超过9个、不超过8个、不超过7个、不超过6个，或不超过5个氨基酸突变。在一个特定实施例中，与相应的野生型IL-2序列(例如如SEQ ID NO:13所示的人IL-2氨基酸序列)相比，IL-2多肽突变体包含不超过5个氨基酸突变。
在一个实施例中，IL-2多肽突变体包含SEQ ID NO:14所示氨基酸序列。在一个实施例中，IL-2多肽突变体由SEQ ID NO:14所示氨基酸序列组成。
免疫缀合物
如本文所述的免疫缀合物包含IL分子和抗体。此类免疫缀合物通过直接靶向IL-2(例如进入肿瘤微环境)而显著增加IL-2疗法的功效。根据本发明，包含在免疫缀合物中的抗体可以是完整抗体或免疫球蛋白，或其具有生物学功能(诸如抗原特异性结合亲和力)的部分或变体。
免疫缀合物治疗的一般益处是显而易见的。例如，包含在免疫缀合物中的抗体识别肿瘤特异性表位并导致免疫缀合物分子靶向肿瘤部位。因此，可以将高浓度的IL-2递送到肿瘤微环境中，从而使用比未缀合的IL-2所需的低得多的剂量的免疫缀合物导致本文提及的多种免疫效应细胞的活化和增殖。此外，由于IL-2以免疫缀合物的形式应用允许细胞因子本身的较低剂量，所以IL-2的不良副作用的可能性被限制，并且借助于免疫缀合物将IL-2靶向体内的特定部位也可导致与使用未缀合的IL-2获得的相比减少的全身暴露和因此更小的副作用。此外，与未缀合的IL-2相比，免疫缀合物的循环半衰期延长有助于该免疫缀合物的功效。然而，IL-2免疫缀合物的该特征可能再次加重IL-2分子的潜在副作用：由于IL-2免疫缀合物在血流中的循环半衰期相对于未缀合的IL-2显著延长，因此IL-2或融合蛋白分子的其他部分活化通常存在于脉管***中的组分的可能性增加。同样的问题适用于含有与另一部分(诸如Fc或白蛋白)融合的IL-2的其他融合蛋白，会导致循环中IL-2的半衰期延长。因此，包含如本文和WO 2012/107417中所述的IL-2多肽突变体的免疫缀合物与IL-2的野生型形式相比具有降低的毒性是特别有利的。
如上所述，将IL-2直接靶向免疫效应细胞而不是肿瘤细胞可为对IL-2免疫疗法有利。
因此，本发明提供了如先前所述的IL-2多肽突变体以及与CD8结合的抗体。在一个实施例中，IL-2多肽突变体和抗体形成融合蛋白，即IL-2多肽突变体与抗体共享肽键。在一些实施例中，抗体包含包括第一亚基和第二亚基的Fc结构域。在一个具体实施例中，IL-2多肽突变体在其氨基末端氨基酸处与Fc结构域的亚基中的一个亚基的羧基末端氨基酸融合，任选地，通过连接肽进行融合。在一些实施例中，抗体为全长抗体。在一些实施例中，抗体是免疫球蛋白分子，特别是IgG类免疫球蛋白分子，更特别是IgG1亚类免疫球蛋白分子。在一个此类实施例中，IL-2多肽突变体与免疫球蛋白重链中的一个重链共享氨基末端肽键。在某些实施例中，抗体是抗体片段。在一些实施例中，抗体是Fab分子或scFv分子。在一个实施例中，抗体是Fab分子。在另一个实施例中，抗体是scFv分子。免疫缀合物还可包含多于一个(一种)抗体。当免疫缀合物中包含多于一个抗体，例如第一抗体和第二抗体时，各抗体可以独立地选自各种形式的抗体和抗体片段。例如，第一抗体可以是Fab分子，并且第二抗体可以是scFv分子。在一个具体实施例中，所述第一抗体和所述第二抗体中的每一者是scFv分子，或者所述第一抗体和所述第二抗体中的每一者是Fab分子。在一个特定实施例中，所述第一抗体和所述第二抗体中的每一者是Fab分子。在一个实施例中，所述第一抗体和所述第二抗体中的每一者与CD8结合。
免疫缀合物形式
示例性的免疫缀合物形式描述于PCT公开号WO 2011/020783中，该专利全文以引用方式并入本文。这些免疫缀合物包含至少两个抗体。因此，在一个实施例中，根据本发明的免疫缀合物包含如本文所述的IL-2多肽突变体，以及至少第一抗体和第二抗体。在一个特定实施例中，所述第一抗体和所述第二抗体独立地选自由以下项组成的组：Fv分子，特别是scFv分子；以及Fab分子。在一个具体实施例中，所述IL-2多肽突变体与所述第一抗体共享氨基末端肽键或羧基末端肽键，并且所述第二抗体与i)IL-2多肽突变体或ii)第一抗体共享氨基末端肽键或羧基末端肽键。在一个特定实施例中，免疫缀合物基本上由通过一个或多个连接序列接合的IL-2多肽突变体以及第一抗体和第二抗体(特别是Fab分子)组成。这种形式具有以下优点：它们以高亲和力与靶抗原(CD8)结合，但仅提供与IL-2受体的单体结合，从而避免将免疫缀合物靶向至在除了靶位点以外的其他位置处的携带IL-2受体的免疫细胞。在一个特定实施例中，IL-2多肽突变体与第一抗体，特别是第一Fab分子共享羧基末端肽键，并且进一步与第二抗体，特别是第二Fab分子共享氨基末端肽键。在另一个实施例中，第一抗体，特别是第一Fab分子，与IL-2多肽突变体共享羧基末端肽键，并且进一步与第二抗体，特别是第二Fab分子共享氨基末端肽键。在另一个实施例中，第一抗体，特别是第一Fab分子，与第一IL-2多肽突变体共享氨基末端肽键，并且进一步与第二抗体，特别是第二Fab分子共享羧基末端肽。在一个特定实施例中，IL-2多肽突变体与第一重链可变区共享羧基末端肽键，并且还与第二重链可变区共享氨基末端肽键。在另一个实施例中，IL-2多肽突变体与第一轻链可变区共享羧基末端肽键，并且还与第二轻链可变区共享氨基末端肽键。在另一个实施例中，第一重链或轻链可变区通过羧基末端肽键与IL-2多肽突变体接合，并且还通过氨基末端肽键与第二重链或轻链可变区接合。在另一个实施例中，第一重链或轻链可变区通过氨基末端肽键与IL-2多肽突变体接合，并且还通过羧基末端肽键与第二重链或轻链可变区接合。在一个实施例中，IL-2多肽突变体与第一Fab重链或轻链共享羧基末端肽键，并且还与第二Fab重链或轻链共享氨基末端肽键。在另一个实施例中，第一Fab重链或轻链与IL-2多肽突变体共享羧基末端肽键，并且进一步与第二Fab重链或轻链共享氨基末端肽键。在其他实施例中，第一Fab重链或轻链与IL-2多肽突变体共享氨基末端肽键，并且还与第二Fab重链或轻链共享羧基末端肽键。在一个实施例中，免疫缀合物包含与一个或多个scFv分子共享氨基末端肽键，并且还与一个或多个scFv分子共享羧基末端肽键的IL-2多肽突变体。
然而，根据本发明的免疫缀合物的特别合适的形式包括免疫球蛋白分子作为抗体。此类免疫缀合物形式描述于WO 2012/146628中，该专利全文以引用方式并入本文。
因此，在一个特定实施例中，免疫缀合物包含如本文所述的IL-2多肽突变体和与CD8结合的免疫球蛋白分子，特别是IgG分子，更特别是IgG1分子。在一个实施例中，免疫缀合物包含不超过一种IL-2多肽突变体。在一个实施例中，免疫球蛋白分子是人。在一个实施例中，免疫球蛋白分子包含人恒定区，例如人CH1、CH2、CH3和/或CL结构域。在一个实施例中，免疫球蛋白包含人Fc结构域，特别是人IgG1 Fc结构域。在一个实施例中，IL-2多肽突变体与免疫球蛋白分子共享氨基末端肽键或羧基末端肽键。在一个实施例中，免疫缀合物基本上由以下组成：通过一个或多个连接序列接合的IL-2多肽突变体和免疫球蛋白分子，特别是IgG分子，更特别地是IgG1分子。在一个具体实施例中，IL-2多肽突变体在其氨基末端氨基酸处与免疫球蛋白重链中的一条免疫球蛋白重链的羧基末端氨基酸融合，任选地，通过连接肽进行融合。
IL-2多肽突变体可以直接或通过连接肽与抗体融合，所述连接肽包含一个或多个氨基酸(通常约2-20个氨基酸)。连接肽是本领域中已知的并在本文中描述的。合适的非免疫原性连接肽包括例如(G4S)n、(SG4)n、(G4S)n或G4(SG4)n连接肽。“n”通常为1至10的整数，通常为2至4。在一个实施例中，连接肽的长度为至少5个氨基酸，在一个实施例中长度为5至100个氨基酸，在另一实施例中为10至50个氨基酸。在一个特定实施例中，连接肽的长度为15个氨基酸。在一个实施例中，连接肽是(GxS)n或(GxS)nGm，其中G＝甘氨酸，S＝丝氨酸，并且(x＝3、n＝3、4、5或6，并且m＝0、1、2或3)或(x＝4、n＝2、3、4或5并且m＝0、1、2或3)，在一个实施例中，x＝4并且n＝2或3，在另一实施例中，x＝4并且n＝3。在一个特定实施例中，连接肽是(G4S)3(SEQ ID NO:15)。在一个实施例中，连接肽具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列(或由其组成)。
在一个特定实施例中，免疫缀合物包含突变IL-2分子和与CD8结合的免疫球蛋白分子，特别是IgG1亚类免疫球蛋白分子，其中突变IL-2分子在其氨基末端氨基酸处通过如SEQ ID NO:15所示的连接肽与免疫球蛋白重链中的一者的羧基末端氨基酸融合。
在一个特定实施例中，免疫缀合物包含突变IL-2分子和与CD8结合的抗体，其中所述抗体包含包括第一亚基和第二亚基的Fc结构域，特别是人IgG1 Fc结构域，并且突变IL-2分子在其氨基末端氨基酸处通过如SEQ ID NO:15所示的连接肽与Fc结构域的亚基中的一个亚基的羧基末端氨基酸融合。
CD8抗体
包含在本发明的免疫缀合物中的抗体与CD8，特别是人CD8结合，并且能够将IL-2多肽突变体引导至表达CD8的靶位点，特别是表达CD8的T细胞，例如与肿瘤相关的T细胞。
可用于本发明的免疫缀合物中的合适的CD8抗体描述于PCT公开WO 2019/033043A2中，该专利的全部内容以引用方式并入本文。
本发明的免疫缀合物可以包含可以与相同或不同抗原结合的两个或更多个(两种或更多种)抗体。然而，在特定实施例中，这些抗体中的每一者都与CD8结合。在一个实施例中，包含在本发明的免疫缀合物中的抗体是单特异性的。在一个特定实施例中，免疫缀合物包含单一的单特异性抗体，特别是单特异性免疫球蛋白分子。
抗体可以是保持与CD8，特别是人CD8特异性结合的任何类型的抗体或其片段。抗体片段包括但不限于Fv分子、scFv分子、Fab分子和F(ab')2分子。然而，在特定实施例中，抗体是全长抗体。在一些实施例中，抗体包含包括第一亚基和第二亚基的Fc结构域。在一些实施例中，抗体是免疫球蛋白，特别是IgG类，更特别是IgG1亚类免疫球蛋白。
在一些实施例中，抗体为单克隆抗体。
功能特性
本文提供的抗CD8抗体具有以下特征中的一项或多项：(a)抗体不抑制或刺激CD8+T细胞的活化；(b)抗体不诱导CD8+T细胞增殖；(c)抗体不诱导IFNγ产生；(d)抗体特异性结合人CD8；(e)抗体特异性结合恒河猴CD8；(f)抗体特异性结合食蟹猴CD8；(g)抗体不结合CD4+细胞；(g)抗体不结合CD3-细胞；；和(h)抗体不会从循环中消耗CD8+T细胞。可以使用众所周知的方法，例如PCT申请WO 2019/033043 A2中使用的方法来评估此类特征。
抗CD8抗体是以足够的亲和力和特异性来与CD8结合的抗体。在某些实施例中，抗CD8抗体以约1μM、100nM、50nM、40nM、30nM、20nM、10nM、5nM、1nM、0.5nM、0.1nM、0.05nM或0.001nM(例如10-8M或更少，例如从10-8M到10-13M，例如，从10-9M到10-13M)中的任一项(包括这些值之间的任何范围)的Kn结合人CD8。在某些实施例中，抗CD8抗体以约1μM、100nM、50nM、40nM、30nM、20nM、10nM、5nM、1nM、0.5nM、0.1nM、0.05nM或0.001nM(例如10-8M或更少，例如从10-8M到10-13M，例如，从10-9M到10-13M)中的任一项(包括这些值之间的任何范围)的Kn结合恒河猴CD8。在某些实施例中，抗CD8抗体以1μM、100nM、50nM、40nM、30nM、20nM、10nM、5nM、1nM、0.5nM、0.1nM、0.05nM或0.001nM(例如10-8M或更少，例如从10-8M到10-13M，例如从10-9M到10-13M)(包括这些值之间的任何范围)的Kn结合食蟹猴CD8。
在某些实施例中，抗CD8抗体(a)以约1μM、100nM、50nM、40nM、30nM、20nM、10nM、5nM、1nM、0.5nM、0.1nM、0.05nM或0.001nM(例如10-8M或更少，例如从10-8M到10-13M，例如，从10-9M到10-13M)(包括这些值之间的任何范围)的Kn结合人CD8，(b)以约1μM、100nM、50nM、40nM、30nM、20nM、10nM、5nM、1nM、0.5nM、1.1nM、0.05nM或0.001nM(例如10-8M或更少，例如从10-8M到10-13M，例如从10-9M到10-13M)(包括这些值之间的任何范围)的Kn结合恒河猴CDS，和(c)以约1μM、100nM、50nM、40nM、30nM、20nM、10nM、5nM、1nM、0.5nM、0.1nM、0.05nM或0.001nM(例如10-8M或更少，例如从10-8M到10-13M，例如，从10-9M到10-13M)(包括这些值之间的任何范围)的Kn结合食蟹猴CD8。本文提供的抗CD8抗体对人CD8、恒河猴CD8和/或食蟹猴CD8的Kn可以通过本领域已知的任何方法确定，所述方法包括但不限于例如ELISA、荧光活化细胞分选(FACS)分析、放射免疫沉淀(RIA)和表面等离子体共振(SPR)。在某些实施例中，本文提供的抗CD8抗体对人CD8、恒河猴CD8和/或食蟹猴CD8的Kn经由SPR来确定。在某些实施例中，本文提供的抗CD8抗体对人CD8、恒河猴CD8和/或食蟹猴CD8的Kn经由F ACS来确定。
在某些实施例中，本文提供的抗CD8抗体不结合(例如特异性结合)小鼠CD8。在某些实施例中，抗CD8抗体不结合(例如特异性结合)大鼠CD8。在某些实施例中，抗CDS抗体不结合(例如特异性结合)小鼠CD8或大鼠CD8，例如，如经由SPR和/或FACS确定的。
在一些实施例中，抗体包括：含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HCDR1、含有SEQ IDNO:2的氨基酸序列的HCDR2、含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR3、含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的LCDR1、含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR2、以及含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR3。
在一些实施例中，抗体包括：(a)重链可变区(VH)，其包括：含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HCDR1、含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HCDR2、含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR3；以及(b)轻链可变区(VL)，其包括：含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的LCDR1、含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR2、及含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR3。在一些实施例中，重链和/或轻链可变区是人源化可变区。在一些实施例中，重链和/或轻链可变区包含人构架区(FR)。
在一些实施例中，抗体包含重链可变区(VH)，其包含与SEQ ID NO:7的氨基酸序列有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，抗体包含轻链可变区(VL)，其包含与SEQ ID NO:8的氨基酸序列有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，抗体包含：(a)重链可变区(VH)，其包含与SEQ ID NO:7的氨基酸序列有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列，以及(b)轻链可变区(VL)，其包含与SEQ ID NO:8的氨基酸序列有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列。
在一个特定实施例中，抗体包含：(a)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及(b)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
在一些实施例中，抗体包括：含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HCDR1、含有SEQ IDNO:2的氨基酸序列的HCDR2、含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR3、含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的LCDR1、含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR2、以及含有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的LCDR3。
在一些实施例中，抗体包括：(a)重链可变区(VH)，其包括：含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HCDR1、含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HCDR2、含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR3；以及(b)轻链可变区(VL)，其包括：含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的LCDR1、含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR2、及含有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的LCDR3。在一些实施例中，重链和/或轻链可变区是人源化可变区。在一些实施例中，重链和/或轻链可变区包含人构架区(FR)。
在一些实施例中，抗体包含重链可变区(VH)，其包含与SEQ ID NO:7的氨基酸序列有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，抗体包含轻链可变区(VL)，其包含与SEQ ID NO:29的氨基酸序列有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，抗体包含：(a)重链可变区(VH)，其包含与SEQ ID NO:7的氨基酸序列有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列，以及(b)轻链可变区(VL)，其包含与SEQ ID NO:29的氨基酸序列有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列。
在一个特定实施例中，抗体包含：(a)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及(b)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列。
在一些实施例中，抗体为人源化抗体。在一个实施例中，抗体是包含人恒定区的免疫球蛋白分子，特别是包含人CH1、CH2、CH3和/或CL结构域的IgG类免疫球蛋白分子。人恒定结构域的示例性序列在SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23(分别为人κ和λCL结构域)和SEQ IDNO:24(人IgG1重链恒定结构域CH1-CH2-CH3)中给出。在一些实施例中，抗体包含轻链恒定区，所述轻链恒定区包含SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23的氨基酸序列，特别是SEQ ID NO:24的氨基酸序列。在一些实施例中，抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含与SEQ IDNO:24的氨基酸序列有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列。特别地，重链恒定区可包含如本文所述的Fc结构域中的氨基酸突变。
Fc结构域
在特定实施例中，包含在根据本发明的免疫缀合物中的抗体包含包括第一亚基和第二亚基的Fc结构域。抗体的Fc结构域由包含免疫球蛋白分子的重链结构域的一对多肽链组成。例如，免疫球蛋白G(IgG)分子的Fc结构域是二聚体，该二聚体的每个亚基包含CH2和CH3 IgG重链恒定结构域。Fc结构域的两个亚基能够彼此稳定缔合。在一个实施例中，本发明的免疫缀合物包含不超过一个Fc结构域。
在一个实施例中，包含在免疫缀合物中的抗体的Fc结构域是IgG Fc结构域。在一个特定实施例中，Fc结构域是IgG1 Fc结构域。在另一个实施例中，Fc结构域是IgG4 Fc结构域。在一个更具体的实施例中，Fc结构域是IgG4 Fc结构域，所述结构域包含S228位的氨基酸取代(Kabat EU索引编号)，特别是氨基酸取代S228P。该氨基酸取代减少了IgG4抗体的体内Fab臂交换(参见Stubenrauch等人，Drug Metabolism and Disposition 38,84-91(2010))。在另一特定实施例中，Fc结构域是人Fc结构域。在一个甚至更特定的实施例中，Fc结构域是人IgG1 Fc结构域。人IgG1 Fc区的示例性序列以SEQ ID NO:21给出。
促进异源二聚化的Fc结构域修饰
根据本发明的免疫缀合物包含IL-2多肽突变体，特别是单个(不超过一个)IL-2多肽突变体，所述IL-2多肽突变体与Fc结构域的所述两个亚基中的一个或另一个亚基融合，由此所述Fc结构域的两个亚基通常包含在两条不相同的多肽链中。这些多肽的重组共表达和随后的二聚化导致了两种多肽的几种可能的组合。为了在重组生产中提高免疫缀合物的产率和纯度，因此将有利的是在抗体的Fc结构域中引入促进所需多肽的缔合的修饰。
因此，在特定实施例中，包含在根据本发明的免疫缀合物中的抗体的Fc结构域包含促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基的缔合的修饰。人IgG Fc结构域的两个亚基之间最广泛的蛋白质间相互作用位点在Fc结构域的CH3结构域中。因此，在一个实施例中，所述修饰位于Fc结构域的CH3结构域中。
存在几种对Fc结构域的CH3结构域进行修饰以实施异源二聚化的方法，这些方法例如在WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012058768、WO2013157954、WO 2013096291中详细描述。通常，在所有此类方法中，Fc结构域的第一亚基的CH3结构域和Fc结构域的第二亚基的CH3结构域都以互补的方式工程化，使得每个CH3结构域(或包含其的重链)可以不再与其自身同源二聚化，而是被迫与互补工程化的其他CH3结构域异源二聚化(使得第一和第二CH3结构域异源二聚化并且在两个第一或两个第二CH3结构域之间不形成同源二聚体)。
在一个具体实施例中，所述促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基缔合的修饰是所谓的“突出物入孔”修饰，所述修饰包含在Fc结构域的两个亚基中的一个亚基中进行“突出物”修饰并且在Fc结构域的两个亚基中的另一个亚基中进行“孔”修饰。
杵臼结构技术描述于例如US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway等人，Prot Eng9，617-621(1996)和Carter，J Immunol Meth 248，7-15(2001)中。通常，该方法涉及在第一多肽的界面处引入凸起(“突起”)并在第二多肽的界面中引入相应的空腔(“孔”)，使得所述凸起可以定位在所述空腔中，以便促进异二聚体的形成并阻碍同二聚体的形成。凸起是通过用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)取代来自第一多肽的界面的小氨基酸侧链而构建的。具有与凸起相同或相似大小的补偿空腔是通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)取代大氨基酸侧链而在第二多肽的界面中创建的。
因此，在一个特定实施例中，在包含在所述免疫缀合物中的抗体的Fc结构域的所述第一亚基的所述CH3结构域中，氨基酸残基被具有较大侧链体积的氨基酸残基替换，从而在所述第一亚基的所述CH3结构域内产生突起，所述突起可定位在所述第二亚基的所述CH3结构域内的空腔中，并且在所述Fc结构域的所述第二亚基的所述CH3结构域中，氨基酸残基被具有较小侧链体积的氨基酸残基替换，从而在所述第二亚基的所述CH3结构域内产生空腔，所述第一亚基的所述CH3结构域内的所述突起可定位在所述空腔内。
优选地，所述具有较大侧链体积的氨基酸残基选自由精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)组成的组。
优选地，所述具有较小侧链体积的氨基酸残基选自由丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)和缬氨酸(V)组成的组。
凸起和空腔可以通过改变编码多肽的核酸来制备，例如通过位点特异性诱变或通过肽合成。
在一个具体实施例中，在Fc结构域的第一亚基(“杵”亚基)的CH3结构域中，366位的苏氨酸残基被色氨酸残基替换(T366W)，并且在Fc结构域的第二亚基(“臼”亚基)的CH3结构域中，407位的酪氨酸残基被缬氨酸残基替换(Y407V)。在一个实施例中，在Fc结构域的第二亚基中，另外地366位的苏氨酸残基被丝氨酸残基(T366S)替代，并且368位的亮氨酸残基被丙氨酸残基(L368A)替代(根据Kabat的EU索引编号)。
在又一个实施例中，在Fc结构域的第一亚基中，另外地354位的丝氨酸残基被半胱氨酸残基(S354C)替代或356位的谷氨酸残基被半胱氨酸残基(E356C)替代(特别地354位的丝氨酸残基被半胱氨酸残基取代)，并且在Fc结构域的第二亚基中，另外地349位的酪氨酸残基被半胱氨酸残基(Y349C)替代(根据Kabat的EU索引编号)。引入这两个半胱氨酸残基导致在Fc结构域的两个亚基之间形成二硫桥，从而进一步稳定所述二聚体(Carter,JImmunol Methods 248,7-15(2001))。
在一个特定实施例中，Fc结构域的第一亚基包含氨基酸取代S354C和T366W，并且Fc结构域的第二亚基包含氨基酸取代Y349C、T366S、L368A和Y407V(根据Kabat的EU索引编号)。
在一些实施例中，Fc结构域的第二亚基另外包含氨基酸取代H435R和Y436F(根据Kabat EU索引编号)。
在一个特定实施例中，IL-2多肽突变体与Fc结构域的第一亚基(包含“突出物”修饰)融合(任选地，通过连接肽进行融合)。不希望受理论束缚，IL-2多肽突变体与Fc结构域的含有突出物的亚基的融合将(进一步)最小化包含两个IL-2多肽突变体的免疫缀合物的产生(两个含有突出物的多肽的空间位阻)。
用于实施异源二聚化的其他CH3修饰技术被考虑为根据本发明的替代方案，并且描述于例如WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012/058768、WO2013/157954、WO 2013/096291中。
在一个实施例中，替代地使用EP 1870459中描述的异源二聚化方法。该方法基于在Fc结构域的两个亚基之间的CH3/CH3结构域界面中的特定氨基酸位置处引入带有相反电荷的荷电氨基酸。包含在本发明的免疫缀合物中的抗体的一个优选实施例是氨基酸突变R409D；在(Fc结构域的)两个CH3结构域中的一个中的K370E，以及氨基酸突变D399K；在Fc结构域的CH3结构域中的另一个中的E357K(根据Kabat EU索引编号)。
在另一个实施例中，包含在本发明的免疫缀合物中的抗体包含在Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中的氨基酸突变T366W和在Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中的氨基酸突变T366S、L368A、Y407V，以及另外地氨基酸突变R409D；在Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中的K370E，以及氨基酸突变D399K；在Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中的E357K(根据Kabat EU索引编号)。
在另一个实施例中，包含在本发明的免疫缀合物中的抗体包含在Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中的氨基酸突变S354C、T366W和在Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中的氨基酸突变Y349C、T366S、L368A、Y407V，或者所述抗体在包含Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中的氨基酸突变Y349C、T366W和在Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中的氨基酸突变S354C、T366S、L368A、Y407V，以及另外地氨基酸突变R409D；在Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中的K370E，以及氨基酸突变D399K；在Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中的E357K(所有根据Kabat EU索引编号)。
在一个实施例中，替代地使用WO 2013/157953中描述的异源二聚化方法。在一个实施例中，第一CH3结构域包含氨基酸突变T366K，并且第二CH3结构域包含氨基酸突变L351D(编号根据Kabat EU索引)。在另一实施例中，第一CH3结构域包含另外的氨基酸突变L351K。在另一实施例中，第二CH3结构域还包含选自由Y349E、Y349D和L368E(优选L368E)组成的组的氨基酸突变(编号根据Kabat EU索引)。
在一个实施例中，替代地使用WO 2012/058768中描述的异源二聚化方法。在一个实施例中，第一CH3结构域包含氨基酸突变L351Y、Y407A，并且第二CH3结构域包含氨基酸突变T366A、K409F。在另一实施例中，第二CH3结构域包含在T411、D399、S400、F405、N390或K392位的进一步氨基酸突变，例如选自：a)T411N、T411R、T411Q、T411K、T411D、T411E或T411W，b)D399R、D399W、D399Y或D399K，c)S400E、S400D、S400R或S400K，d)F405I、F405M、F405T、F405S、F405V或F405W，e)N390R、N390K或N390D，f)K392V、K392M、K392R、K392L、K392F或K392E(根据Kabat EU索引编号)。在另一实施例中，第一CH3结构域包含氨基酸突变L351Y、Y407A，并且第二CH3结构域包含氨基酸突变T366V、K409F。在另一实施例中，第一CH3结构域包含氨基酸突变Y407A，并且第二CH3结构域包含氨基酸突变T366A、K409F。在另一实施例中，第二CH3结构域还包含氨基酸突变K392E、T411E、D399R和S400R(根据Kabat的EU索引编号)。
在一个实施例中，替代地使用WO 2011/143545中描述的异源二聚化方法，例如在选自由368和409组成的组的位置处进行氨基酸修饰(根据Kabat EU索引编号)。
在一个实施例中，替代地使用WO 2011/090762中描述的异源二聚化方法，该异源二聚化方法也使用上述突出物入孔技术。在一个实施例中，第一CH3结构域包含氨基酸突变T366W，并且第二CH3结构域包含氨基酸突变Y407A。在一个实施例中，第一CH3结构域包含氨基酸突变T366Y，并且第二CH3结构域包含氨基酸突变Y407T(编号根据Kabat EU索引)。
在一个实施例中，包含在免疫缀合物中的抗体或其Fc结构域为IgG2亚类，并且替代地使用在WO 2010/129304中描述的异源二聚化方法。
在一个替代实施例中，促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基缔合的修饰包括介导静电转向效应的修饰，例如如在PCT公开WO 2009/089004中所述。通常，所述方法涉及用带电荷的氨基酸残基替换两个Fc结构域亚基的界面处的一个或多个氨基酸残基，使得同源二聚体形成变得在静电上不利，但异源二聚化在静电上有利。在一个此类实施例中，第一CH3结构域包含用带负电荷的氨基酸对K392或N392进行的氨基酸取代(例如谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)，优选K392D或N392D)，并且第二CH3结构域包含用带正电荷的氨基酸对D399、E356、D356或E357进行的氨基酸取代(例如赖氨酸(K)或精氨酸(R)，优选D399K、E356K、D356K或E357K，更优选D399K和E356K)。在另一实施例中，第一CH3结构域还包含用带负电荷的氨基酸对K409或R409进行的氨基酸取代(例如谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)，优选K409D或R409D)。在另一实施例中，第一CH3结构域进一步或替代地包含用带负电荷的氨基酸(例如谷氨酸(E)或天冬氨酸(D))对K439和/或K370进行的氨基酸取代(所有根据Kabat EU索引编号)。
在又一实施例中，替代地使用WO 2007/147901中描述的异源二聚化方法。在一个实施例中，第一CH3结构域包含氨基酸突变K253E、D282K和K322D，并且第二CH3结构域包含氨基酸突变D239K、E240K和K292D(根据Kabat的EU索引编号)。
在又一实施例中，可替代地使用WO 2007/110205中描述的异源二聚化方法。
在一个实施例中，Fc结构域的第一亚基包含氨基酸取代K392D和K409D，并且Fc结构域的第二亚基包含氨基酸取代D356K和D399K(根据Kabat编号EU指数)。
降低Fc受体结合和/或效应子功能的Fc结构域修饰
Fc结构域赋予免疫缀合物有利的药代动力学性质，包括有助于在靶组织中良好积累的长血清半衰期和有利的组织-血液分配比。然而，同时，其可能导致免疫缀合物不期望地靶向至表达Fc受体的细胞，而不是优选的抗原携带细胞。此外，Fc受体信号传导通路的共活化可导致细胞因子释放，所述细胞因子释放与IL-2多肽和免疫缀合物的长半衰期组合，在全身施用后导致对细胞因子受体的过度活化和严重的副作用。与此一致，已经描述了与输注反应相关的常规IgG-IL-2免疫缀合物(参见例如King等人，JClin Oncol 22,4463-4473(2004))。
因此，在特定实施例中，与天然IgG1 Fc结构域相比，包含在根据本发明的免疫缀合物中的抗体的Fc结构域表现出降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应子功能。在一个此类实施例中，Fc结构域(或包含所述Fc结构域的抗体)表现出与天然IgG1 Fc结构域(或包含天然IgG1 Fc结构域的抗体)相比小于50％，优选小于20％，更优选小于10％并且最优选小于5％的对Fc受体的结合亲和力，和/或与天然IgG1 Fc结构域结构域(或包含天然IgG1 Fc结构域的抗体)相比小于50％，优选小于20％，更优选小于10％并且最优选小于5％的效应子功能。在一个实施例中，Fc结构域结构域(或包含所述Fc结构域的抗体)基本上不与Fc受体结合和/或诱导效应子功能。在一个特定实施例中，Fc受体是Fcγ受体。在一个实施例中，Fc受体是人Fc受体。在一个实施例中，Fc受体是活化Fc受体。在一个具体实施例中，Fc受体是活化人Fcγ受体，更特别地是人FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最特别地是人FcγRIIIa。在一个实施例中，效应子功能是选自CDC、ADCC、ADCP和细胞因子分泌的组中的一种或多种效应子功能。在一个特定实施例中，效应子功能是ADCC。在一个实施例中，与天然IgG1Fc结构域结构域相比，Fc结构域结构域对新生Fc受体(FcRn)表现出基本相似的结合亲和力。当Fc结构域(或包含所述Fc结构域的抗体)表现出天然IgG1 Fc结构域(或包含天然IgG1 Fc结构域的抗体)对FcRn的结合亲和力的大于约70％，特别地大于约80％，更特别地大于约90％时，实现了基本上相似的与FcRn的结合。
在某些实施例中，Fc结构域经工程化以与非工程化的Fc结构域相比具有降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应子功能。在特定实施例中，包含在免疫缀合物中的抗体的Fc结构域包含降低Fc结构域对Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能的一个或多个氨基酸突变。典型地，相同的一个或多个氨基酸突变存在于Fc结构域的两个亚基中的每一个中。在一个实施例中，氨基酸突变降低Fc结构域对Fc受体的结合亲和力。在一个实施例中，氨基酸突变将Fc结构域对Fc受体的结合亲和力降低至少2倍、至少5倍或至少10倍。在存在多于一个降低Fc结构域对Fc受体的结合亲和力的氨基酸突变的实施例中，这些氨基酸突变的组合可以将Fc结构域对Fc受体的结合亲和力降低至少10倍、至少20倍，或甚至至少50倍。在一个实施例中，与包含非工程化的Fc结构域的抗体相比，包含工程化的Fc结构域的抗体表现出对Fc受体的结合亲和力的小于20％，特别地小于10％，更特别地小于5％。在一个特定实施例中，Fc受体是Fcγ受体。在一些实施例中，Fc受体是人Fc受体。在一些实施例中，Fc受体是活化Fc受体。在一个具体实施例中，Fc受体是活化人Fcγ受体，更特别地是人FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最特别地是人FcγRIIIa。优选地，与这些受体中的每一个的结合降低。在一些实施例中，对补体组分的结合亲和力，特别是对C1q的结合亲和力也降低。在一个实施例中，对新生Fc受体(FcRn)的结合亲和力没有降低。当所述Fc结构域(或包含所述Fc结构域的抗体)表现出非工程化形式的所述Fc结构域(或包含所述非工程化形式的所述Fc结构域的抗体)对FcRn的结合亲和力的大于约70％时，实现了基本上相似的与FcRn的结合，即保持了Fc结构域对所述受体的结合亲和力。Fc结构域或包含所述Fc结构域的包含在本发明的免疫缀合物中的抗体可表现出这种亲和力的大于约80％并且甚至大于约90％。在某些实施例中，包含在免疫缀合物中的抗体的Fc结构域经工程化以与非工程化的Fc结构域相比具有降低的效应子功能。降低的效应子功能可包括但不限于以下项中的一种或多种：降低的补体依赖性细胞毒性(CDC)、降低的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、降低的抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、减少的细胞因子分泌、减少的免疫复合物介导的抗原呈递细胞对抗原的摄取、减少的与NK细胞的结合、减少的与巨噬细胞的结合、减少的与单核细胞的结合、减少的与多形核细胞的结合、减少的直接信号传导诱导的细胞凋亡、减少的靶结合抗体的交联、减少的树突细胞成熟，或减少的T细胞致敏。在一个实施例中，降低的效应子功能是选自降低的CDC、降低的ADCC、降低的ADCP和减少的细胞因子分泌的组中的一种或多种的降低的效应子功能。在一个特定实施例中，降低的效应子功能是降低的ADCC。在一个实施例中，降低的ADCC为由非工程化的Fc结构域(或包含非工程化的Fc结构域的抗体)诱导的ADCC的小于20％。
在一个实施例中，降低Fc结构域对Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能的氨基酸突变是氨基酸取代。在一个实施例中，Fc结构域包含在选自E233、L234、L235、N297、P331和P329的组的位置处的氨基酸取代(根据Kabat EU索引编号)。在一个更具体的实施例中，Fc结构域包含在选自L234、L235和P329的组的位置处的氨基酸取代(根据Kabat EU索引编号)。在一些实施例中，Fc结构域包含氨基酸取代L234A和L235A(根据Kabat EU索引编号)。在一个此类实施例中，Fc结构域是IgG1 Fc结构域，特别地是人IgG1 Fc结构域。在一个实施例中，Fc结构域包含在位置P329处的氨基酸取代。在一个更具体的实施例中，氨基酸取代是P329A或P329G，特别地是P329G(根据Kabat EU索引编号)。在一个实施例中，所述Fc结构域包含在位置P329处的氨基酸取代，和在选自E233、L234、L235、N297和P331的位置处的进一步氨基酸取代(根据Kabat EU索引编号)。在一个更具体的实施例中，所述进一步氨基酸取代是E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D或P331S。在特定实施例中，Fc结构域包含在位置P329、L234和L235处的氨基酸取代(根据Kabat EU索引编号)。在更特定的实施例中，Fc结构域包含氨基酸突变L234A、L235A和P329G(“P329G LALA”、“PGLALA”或“LALAPG”)。具体地，在特定实施例中，Fc结构域的每个亚基包含氨基酸取代L234A、L235A和P329G(Kabat EU索引编号)，即在Fc结构域的第一亚基和第二亚基中的每一者中，234位的亮氨酸残基被用丙氨酸残基替代(L234A)，235位的亮氨酸残基被用丙氨酸残基替代(L235A)，并且329位的脯氨酸残基被用甘氨酸残基替代(P329G)(根据Kabat的EU索引编号)。在一个此类实施例中，Fc结构域是IgG1 Fc结构域，特别地是人IgG1 Fc结构域。氨基酸取代的“P329G LALA”组合几乎完全消除了人IgG1 Fc结构域的Fcγ受体(以及补体)结合，如在PCT公开号WO 2012/130831中所述，该PCT公开的全部内容以引用方式并入本文。WO 2012/130831还描述了制备此类突变Fc结构域的方法和确定其性质(诸如Fc受体结合或效应子功能)的方法。
与IgG1抗体相比，IgG4抗体表现出降低的对Fc受体的结合亲和力和降低的效应子功能。因此，在一些实施例中，包含在本发明的免疫缀合物中的抗体的Fc结构域是IgG4 Fc结构域，特别是人IgG4 Fc结构域。在一个实施例中，IgG4 Fc结构域包含在位置S228处的氨基酸取代，特别是氨基酸取代S228P(根据Kabat EU索引编号)。为了进一步降低其对Fc受体的结合亲和力和/或其效应子功能，在一个实施例中，IgG4 Fc结构域包含在位置L235处的氨基酸取代，特别是氨基酸取代L235E(根据Kabat EU索引编号)。在另一个实施例中，IgG4Fc结构域包含P329位的氨基酸取代，特别地是氨基酸取代P329G(根据Kabat的EU索引编号)。在一个特定实施例中，IgG4 Fc结构域包含S228、L235和P329位的氨基酸取代，特别地是氨基酸取代S228P、L235E和P329G(根据Kabat的EU索引编号)。这种IgG4 Fc结构域突变体以及它们的Fcγ受体结合性质描述于PCT公开号WO 2012/130831中，该PCT公开的全部内容以引用方式并入本文。
在一个特定实施例中，与天然IgG1 Fc结构域相比表现出降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应子功能的Fc结构域是包含氨基酸取代L234A、L235A和任选的P329G的人IgG1 Fc结构域，或包含氨基酸取代S228P、L235E和任选的P329G的人IgG4 Fc结构域(根据Kabat的EU索引编号)。
在某些实施例中，已消除了Fc结构域的N糖基化。在一个此类实施例中，Fc结构域包含N297位的氨基酸突变，特别地是用丙氨酸(N297A)或天冬氨酸(N297D)替代天冬酰胺的氨基酸取代(根据Kabat的EU索引编号)。
除了上文和PCT公开号WO 2012/130831中所述的Fc结构域外，具有减少的Fc受体结合和/或降低的效应子功能的Fc结构域还包括具有对Fc结构域残基238、265、269、270、297、327和329中的一者或多者的取代的那些Fc结构域(美国专利号6,737,056)(根据Kabat的EU索引编号)。此类Fc突变体包括在第265、269、270、297和327位氨基酸中两个或更多个处具有取代的Fc突变体，包括所谓的“DANA”Fc突变体，其残基265和297被取代为丙氨酸(美国专利No.7,332,581)。
可以使用本领域熟知的遗传或化学方法，通过氨基酸缺失、取代、***或修饰来制备突变Fc结构域。遗传方法可包括对编码DNA序列的位点特异性诱变、PCR、基因合成等。可以例如通过测序来验证正确的核苷酸变化。
与Fc受体的结合可以例如通过ELISA或通过表面等离子体共振(SPR)使用标准仪器(诸如BIAcore仪器(GE Healthcare))容易地确定，并且Fc受体诸如可以通过重组表达获得。替代地，可以使用已知表达特定Fc受体的细胞系(诸如表达FcγIIIa受体的人NK细胞)来评估Fc结构域或包含所述Fc结构域的抗体对Fc受体的结合亲和力。
Fc结构域，或包含Fc结构域的抗体的效应子功能，可以通过本领域已知的方法来测量。用于评定感兴趣的分子的ADCC活性的体外测定的示例描述于美国专利号5,500,362；Hellstrom等人，Proc Natl Acad Sci USA 83,7059-7063(1986)和Hellstrom等人，ProcNatl Acad Sci USA 82,1499-1502(1985)；美国专利号5,821,337；Bruggemann等人，J ExpMed 166,1351-1361(1987)中。另选地，可以使用非放射性测定方法(参见例如，用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)；以及CytoTox
Figure BDA0003446097740000471
非放射性细胞毒性测定(Promega,Madison,WI))。用于此类测定的有用效应物细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。另选地或另外地，可例如在诸如在Clynes等人，Proc Natl Acad Sci USA 95,652-656(1998)中公开的动物模型中体内评定感兴趣的分子的ADCC活性。
在一些实施例中，Fc结构域与补体组分，特别是C1q的结合减少。因此，在一些实施例中，其中Fc结构域经工程化以具有降低的效应子功能，所述降低的效应子功能包括降低的CDC。可以进行C1q结合测定以确定Fc结构域或包含所述Fc结构域的抗体是否能够结合C1q并因此具有CDC活性。参见例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体活化，可以执行CDC测定(参见例如Gazzano-Santoro等人，J ImmunolMethods 202,163(1996)；Cragg等人，Blood 101,1045-1052(2003)；以及Cragg和Glennie，Blood 103,2738-2743(2004))。
FcRn结合和体内清除/半衰期测定也可以使用本领域已知的方法执行(参见例如Petkova,S.B.等人，Int’l.Immunol.18(12):1759-1769(2006)；WO 2013/120929)。
本发明的特定方面
在一个方面，本发明提供了一种免疫缀合物，所述免疫缀合物包含IL-2多肽突变体和与CD8结合的抗体，
其中所述IL-2多肽突变体是包含氨基酸取代F42A、Y45A和L72G(相对于人IL-2序列SEQ ID NO:13编号)的人IL-2分子；并且
其中抗体包含：(a)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及(b)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
在一个方面，本发明提供了一种免疫缀合物，所述免疫缀合物包含IL-2多肽突变体和与CD8结合的抗体，
其中该IL-2多肽突变体是人IL-2分子，其包含氨基酸取代T3A、F42A、Y45A、L72G和C125A(对应于如SEQ ID NO:13所示的人IL-2氨基酸序列编号)；并且
其中抗体包含：(a)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及(b)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
在一个方面，本发明提供了一种免疫缀合物，所述免疫缀合物包含IL-2多肽突变体和与CD8结合的抗体，
其中该IL-2多肽突变体包含如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列；并且
其中抗体包含：(a)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及(b)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
在根据本发明上述方面中任一方面的一个实施例中，抗体是IgG类免疫球蛋白，所述IgG类免疫球蛋白包含包括第一亚基和第二亚基的人IgG1Fc结构域，
其中在所述Fc结构域的所述第一亚基中，366位的苏氨酸残基被色氨酸残基替换(T366W)；而在所述Fc结构域的所述第二亚基中，407位的酪氨酸残基被缬氨酸残基替换(Y407V)，并且任选地，366位的苏氨酸残基被丝氨酸残基替换(T366S)，并且368位的亮氨酸残基被丙氨酸残基替换(L368A)(根据Kabat EU索引编号)，
并且其中进一步地Fc结构域的每个亚基包含氨基酸取代L234A、L235A和P329G(Kabat EU索引编号)。
在此实施例中，IL-2多肽突变体可以在其氨基末端氨基酸处通过如SEQ ID NO:15所示的连接肽与Fc结构域的第一亚基的羧基末端氨基酸融合。
在一个方面，本发明提供一种免疫缀合物，所述免疫缀合物包括：含有与SEQ IDNO:9的序列有至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列的多肽，含有与SEQ ID NO:10的序列有至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列的多肽，以及含有与SEQ ID NO:11的序列有至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列的多肽。
在一个优选实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，所述免疫缀合物包含含有SEQID NO:9的氨基酸序列的多肽、含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的多肽、以及含有SEQ IDNO:11的氨基酸序列的多肽。在更优选的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，所述免疫缀合物包括含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的两个多肽、含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的多肽和含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的多肽。
在一个方面，本发明提供一种免疫缀合物，所述免疫缀合物包括：含有与SEQ IDNO:9的序列有至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列的多肽，含有与SEQ ID NO:10的序列有至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列的多肽，以及含有与SEQ ID NO:12的序列有至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列的多肽。
在优选的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，所述免疫缀合物包含含有SEQID NO:9的氨基酸序列的多肽、含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的多肽、以及含有SEQ IDNO:12的氨基酸序列的多肽。
在另一方面，本发明提供一种包含IL-2多肽突变体和与CD8结合的抗体的免疫缀合物，其中所述IL-2多肽突变体是包含氨基酸取代F42A、Y45A和L72G(相对于人IL-2序列SEQ ID NO:13编号)的人IL-2分子；并且其中所述抗体包括：(a)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，和(b)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列。
在一个方面，本发明提供一种包含IL-2多肽突变体和与CD8结合的抗体的免疫缀合物，其中所述IL-2多肽突变体是包含氨基酸取代T3A、F42A、Y45A、L72G和C125A(相对于人IL-2序列SEQ ID NO:13编号)的人IL-2分子；并且其中所述抗体包括：(a)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，和(b)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列。
在一个方面，本发明提供一种包含IL-2多肽突变体和与CD8结合的抗体的免疫缀合物，其中所述IL-2多肽突变体包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列；并且其中所述抗体包括：(a)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，和(b)轻链可变区(VL)，其包含SEQID NO:29的氨基酸序列。
在根据本发明上述方面中任一方面的一个实施例中，抗体是IgG类免疫球蛋白，所述IgG类免疫球蛋白包含包括第一亚基和第二亚基的人IgG1 Fc结构域，
其中在所述Fc结构域的所述第一亚基中，366位的苏氨酸残基被色氨酸残基替换(T366W)；而在所述Fc结构域的所述第二亚基中，407位的酪氨酸残基被缬氨酸残基替换(Y407V)，并且任选地，366位的苏氨酸残基被丝氨酸残基替换(T366S)，并且368位的亮氨酸残基被丙氨酸残基替换(L368A)(根据Kabat EU索引编号)，并且其中进一步地，Fc结构域的每个亚基包含氨基酸取代L234A、L235A和P329G(Kabat EU索引编号)。
在此实施例中，IL-2多肽突变体可以在其氨基末端氨基酸处通过如SEQ ID NO:15所示的连接肽与Fc结构域的第一亚基的羧基末端氨基酸融合。
在一个方面，本发明提供一种免疫缀合物，所述免疫缀合物包括：含有与SEQ IDNO:30的序列有至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列的多肽，含有与SEQ ID NO:10的序列有至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列的多肽，以及含有与SEQ ID NO:11的序列有至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列的多肽。
在一个优选实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，所述免疫缀合物包含含有SEQID NO:30的氨基酸序列的多肽、含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的多肽、以及含有SEQ IDNO:11的氨基酸序列的多肽。在更优选的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，所述免疫缀合物包括含有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的两个多肽、含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的多肽和含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的多肽。
在一个方面，本发明提供一种免疫缀合物，所述免疫缀合物包括：含有与SEQ IDNO:30的序列有至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列的多肽，含有与SEQ ID NO:10的序列有至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列的多肽，以及含有与SEQ ID NO:12的序列有至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列的多肽。
在优选的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，所述免疫缀合物包含含有SEQID NO:30的氨基酸序列的多肽、含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的多肽、以及含有SEQ IDNO:12的氨基酸序列的多肽。
多核苷酸
本发明还提供了编码如本文所述的免疫缀合物或其片段的分离的多核苷酸。在一些实施例中，所述片段是抗原结合片段。
编码本发明免疫缀合物的多核苷酸可以表达为编码完整免疫缀合物的单个多核苷酸，或表达为共表达的多个(例如，两个或更多个)多核苷酸。由共表达的多核苷酸编码的多肽可以经由例如二硫键或其他方式缔合以形成功能性免疫缀合物。例如，抗体的轻链部分可以由来自包含抗体的重链部分和IL-2多肽突变体的免疫缀合物部分的单独多核苷酸编码。当共表达时，重链多肽将与轻链多肽缔合以形成免疫缀合物。在另一个实例中，包含两个Fc结构域亚基中的一个亚基和IL-2多肽突变体的免疫缀合物部分可以由来自包含所述两个Fc结构域亚基中的另一个亚基的免疫缀合物部分的单独多核苷酸编码。当共表达时，Fc结构域亚基将缔合以形成Fc结构域。
在一些实施例中，分离的多核苷酸编码如本文所述的根据本发明的完整免疫缀合物。在其他实施例中，分离的多核苷酸编码包含在如本文所述的根据本发明的免疫缀合物中的多肽。
在一个实施例中，本发明的分离的多核苷酸编码包含在免疫缀合物中的抗体的重链(例如免疫球蛋白重链)和IL-2多肽突变体。在另一个实施例中，本发明的分离的多核苷酸编码包含在免疫缀合物中的抗体的轻链。
在某些实施例中，多核苷酸或核酸是DNA。在其他实施例中，本发明的多核苷酸是RNA，例如以信使RNA(mRNA)的形式。本发明的RNA可以是单链或双链的。
重组方法
可用本领域中熟知的遗传或化学方法通过缺失、取代、***或修饰来制备可用于本发明中的IL-2多肽突变体。遗传方法可包括对编码DNA序列的位点特异性诱变、PCR、基因合成等。可以例如通过测序来验证正确的核苷酸变化。就此而言，天然IL-2的核苷酸序列已由Taniguchi等人(Nature 302,305-10(1983))描述，并且编码人IL-2的核酸可从诸如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(Rockville MD)之类的公共保藏机构获得。天然人IL-2的序列示出于SEQ ID NO:13中。取代或***可涉及天然和非天然的氨基酸残基。氨基酸修饰包括众所周知的化学修饰方法，诸如添加糖基化位点或碳水化合物附接等。
本发明的免疫缀合物可以例如通过固态肽合成(例如Merrifield固相合成)或重组生产获得。对于重组生产，将例如如上所述的编码免疫缀合物(片段)的一种或多种多核苷酸分离并***至一个或多个载体中以用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。此类多核苷酸可使用常规方法容易地分离并且测序。在一个实施例中，提供了一种载体，优选为表达载体，该载体包含本发明的多核苷酸中的一种或多种多核苷酸。可以使用本领域技术人员熟知的方法来构建含有免疫缀合物(片段)的编码序列以及适当转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内重组/遗传重组。参见，例如在Maniatis等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,N.Y.(1989)；和Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y(1989)中描述的技术。表达载体可以是质粒、病毒的一部分，或者可以是核酸片段。表达载体包括表达盒，编码免疫缀合物(片段)的多核苷酸(即编码区)与启动子和/或其他转录或翻译控制元件可操作缔合地克隆至所述表达盒中。如本文所用，“编码区”是核酸的一部分，该部分由翻译成氨基酸的密码子组成。尽管“终止密码子”(TAG、TGA或TAA)未被翻译成氨基酸，但其(如果存在的话)可被认为是编码区的一部分，而任何侧翼序列，例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子、5'和3'非翻译区等不是编码区的一部分。两个或更多个编码区可存在于单个多核苷酸构建体中(例如在单个载体上)，或在单独的多核苷酸构建体中(例如在单独的(不同的)载体上)。此外，任何载体可含有单一编码区，或可包含两个或更多个编码区，例如本发明的载体可以编码一种或多种多肽，该一种或多种多肽在翻译后或翻译时通过蛋白水解切割分离成最终的蛋白质。此外，本发明的载体、多核苷酸或核酸可编码异源编码区，该异源编码区与编码本发明的免疫缀合物的多核苷酸或其变体或衍生物融合或不融合。异源编码区包括但不限于特化元件或基序，诸如分泌信号肽或异源功能结构域。可操作缔合是当基因产物(例如多肽)的编码区以某种方式与一个或多个调控序列缔合，以使基因产物的表达处于调控序列的影响或控制下。如果启动子功能的诱导导致编码所需基因产物的mRNA的转录，并且如果两个DNA片段之间的连接性质不干扰表达调控序列指导基因产物表达的能力或干扰待转录的基因模板的能力，则该两个DNA片段(诸如多肽编码区和与其相关的启动子)是“可操作地缔合的”。因此，如果启动子能够影响该核酸的转录，则启动子区域将与编码多肽的核酸可操作地缔合。启动子可以是细胞特异性启动子，该细胞特异性启动子仅在预定细胞中指导DNA的实质转录。除启动子外，其他转录控制元件，例如增强子、操纵子、阻遏物和转录终止信号，可以与多核苷酸可操作地缔合以指导细胞特异性转录。本文公开了合适的启动子和其他转录控制区。多种转录控制区是本领域技术人员已知的。这些转录控制区包括但不限于在脊椎动物细胞中起作用的转录控制区，诸如但不限于来自巨细胞病毒的启动子和增强子区段(例如立即早期启动子结合内含子-A)、猿猴病毒40(例如早期启动子)和逆转录病毒(诸如例如劳氏肉瘤病毒)。其他转录控制区包括来源于脊椎动物基因(诸如肌动蛋白、热休克蛋白、牛生长激素和兔β珠蛋白)的那些转录控制区，以及能够控制真核细胞中基因表达的其他序列。其他合适的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及诱导型启动子(例如四环素可诱导启动子)。类似地，各种翻译控制元件是本领域普通技术人员已知的。这些翻译控制元件包括但不限于核糖体结合位点、翻译起始和终止密码子，以及来源于病毒***的元件(特别是内部核糖体进入位点，或IRES，也称为CITE序列)。表达盒还可以包括其他特征，诸如复制起点，和/或染色体整合元件，诸如逆转录病毒长末端重复序列(LTR)，或腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)。
本发明的多核苷酸和核酸编码区可以与编码分泌肽或信号肽的附加编码区缔合，所述附加编码区指导由本发明的多核苷酸编码的多肽的分泌。根据信号假设，由哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号肽或分泌前导序列，一旦已经起始跨粗面内质网输出生长的蛋白质链，该信号肽或分泌前导序列就被从成熟蛋白质上切割下来。本领域普通技术人员知道由脊椎动物细胞分泌的多肽通常具有与所述多肽的N末端融合的信号肽，所述信号肽被从翻译的多肽上切割下来以产生所述多肽的分泌或“成熟”形式。例如，人IL-2被翻译为在多肽的N末端具有20个氨基酸的信号序列，随后将该信号序列切除以产生成熟的133个氨基酸的人IL-2。在某些实施例中，使用天然信号肽(例如IL-2信号肽或免疫球蛋白重链或轻链信号肽)，或保留指导与其可操作地缔合的多肽分泌的能力的该序列的功能性衍生物。可替代地，可以使用异源哺乳动物信号肽或其功能衍生物。例如，野生型前导序列可以被人组织纤溶酶原活化剂(TPA)或小鼠β葡糖醛酸酶的前导序列取代。
编码可用于促进后续纯化的短蛋白质序列(例如组氨酸标签)或帮助标记免疫缀合物的DNA可包含在免疫缀合物(片段)编码多核苷酸的内部或末端。
在另一实施例中，提供了包含一种或多种本发明的多核苷酸的宿主细胞。在某些实施例中，提供了包含一种或多种本发明的载体的宿主细胞。多核苷酸和载体可以单独或组合地渗入本文中分别关于多核苷酸和载体描述的任何特征。在一个此类实施例中，宿主细胞包含一种或多种载体(例如已经用一种或多种载体转化或转染)，该一种或多种载体包含编码本发明免疫缀合物的一种或多种多核苷酸。如本文所用，术语“宿主细胞”是指可以被工程化以产生本发明的免疫缀合物或其片段的任何种类的细胞***。适于复制和支持免疫缀合物表达的宿主细胞是本领域中熟知的。此类细胞可以用特定的表达载体适当地转染或转导，并且可以生长大量含有载体的细胞以用于接种大规模发酵罐来获得足够量的免疫缀合物用于临床应用。合适的宿主细胞包括原核微生物，诸如大肠杆菌，或各种真核细胞，诸如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、昆虫细胞等。例如，多肽可以在细菌中产生，特别是当不需要糖基化时。多肽在表达后可以在可溶性级分中从细菌细胞糊状物中分离，并可以进一步纯化。除原核生物外，诸如丝状真菌或酵母之类的真核微生物也是用于编码多肽的载体的合适克隆或表达宿主，包括这样的真菌和酵母菌株，该真菌和酵母菌株的糖基化途径已经被“人源化”，从而导致产生具有部分或完全人糖基化模式的多肽。参见Gerngross,NatBiotech 22,1409-1414(2004)和Li等人，Nat Biotech 24,210-215(2006)。用于表达(糖基化)多肽的合适宿主细胞还来源于多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物细胞和昆虫细胞。已经鉴定出了许多可以与昆虫细胞一起使用的杆状病毒株，特别是用于转染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。植物细胞培养物也可用作宿主。参见例如美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述了用于在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术)。脊椎动物细胞也可用作宿主。例如，适于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例为由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(293或293T细胞，如例如在Graham等人，J Gen Virol 36,59(1977)中所述)、幼仓鼠肾细胞(BHK)、小鼠塞尔托利氏细胞(TM4细胞，如例如在Mather,Biol Reprod 23,243-251(1980)中所述)、猴肾细胞(CV1)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76)、人***细胞(HELA)、犬肾细胞(MDCK)、布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A)、人肺细胞(W138)、人肝细胞(Hep G2)、小鼠乳腺肿瘤细胞(MMT 060562)、TRI细胞(如例如在Mather等人，Annals N.Y.Acad Sci 383,44-68(1982)中所述)、MRC 5细胞，以及FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括dhfr-CHO细胞(Urlaub等人，Proc Natl Acad Sci USA 77,4216(1980))；以及骨髓瘤细胞系，诸如YO、NS0、P3X63和Sp2/0。关于适用于蛋白质生产的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，请参见例如Yazaki和Wu，Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo编辑，Humana Press,Totowa,NJ)，第255-268页(2003)。宿主细胞包括培养细胞，例如仅举几个例子而言哺乳动物培养细胞、酵母细胞、昆虫细胞、细菌细胞和植物细胞，还包括转基因动物、转基因植物或培养植物或动物组织中所包含的细胞。在一个实施例中，宿主细胞是真核细胞，优选哺乳动物细胞，诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚肾(HEK)细胞或淋巴细胞(例如，Y0、NS0、Sp20细胞)。
用于在这些***中表达外源基因的标准技术是本领域已知的。表达与抗体的重链或轻链融合的IL-2多肽突变体的细胞可以经工程化以便也表达所述抗体链中的另一条抗体链，使得表达的突变IL-2融合产物是具有重链或轻链两者的抗体。
在一个实施例中，提供了产生根据本发明的免疫缀合物的方法，其中所述方法包括在适于表达免疫缀合物的条件下培养包含一种或多种编码如本文所提供的免疫缀合物的多核苷酸的宿主细胞，以及任选地从该宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收免疫缀合物。
在本发明的免疫缀合物中，IL-2多肽突变体可以与抗体基因融合，或者可以与抗体化学缀合。IL-2多肽与抗体的基因融合可经设计以使得IL-2序列直接与多肽融合或通过连接序列间接与多肽融合。连接基的组成和长度可以根据本领域熟知的方法测定，并且可以测试连接基的功效。本文描述了特定的连接肽。如果需要的话，还可包括另外的序列(例如内肽酶识别序列)以掺入切割位点来分离融合的各个组分。另外，IL-2融合蛋白也可以使用本领域熟知的多肽合成方法(例如Merrifield固相合成)来化学合成。IL-2多肽突变体可以使用熟知的化学缀合方法与其他分子(例如抗体)化学缀合。双官能交联剂(诸如本领域熟知的同官能和异官能交联剂)可用于此目的。使用的交联剂的类型取决于与IL-2偶联的分子的性质，并且可以由本领域技术人员容易地鉴定。替代地或另外，IL-2突变体和/或其预期缀合的分子可以化学衍生化，使得IL-2突变体和/或其预期缀合的分子两者可以在单独的反应中缀合，这也是本领域中熟知的。
本发明的免疫缀合物包含抗体。产生抗体的方法是本领域熟知的(参见例如Harlow和Lane，"Antibodies,a laboratory manual",Cold Spring Harbor Laboratory,1988)。非天然存在的抗体可以使用固相肽合成来构建，可以重组产生(例如，如在美国专利号4,186,567中所述)，或者可以例如通过筛选包含可变重链和可变轻链的组合文库来获得(参见例如McCafferty的美国专利号5,969,108)。免疫缀合物、抗体及其制备方法也详细描述于例如PCT公开号WO 2011/020783、WO 2012/107417和WO 2012/146628中，该等PCT公开各自以引用方式整体并入本文。
任何动物物种的抗体均可以用于本发明的免疫缀合物中。可用于本发明的非限制性抗体可以是鼠、灵长类或人源的。如果免疫缀合物旨在用于人类使用，则可以使用嵌合形式的抗体，其中该抗体的恒定区来自人。也可以根据本领域熟知的方法来制备人源化或完全人形式的抗体(参见例如Winter的美国专利号5,565,332)。人源化可通过各种方法实现，所述各种方法包括但不限于(a)将非人(例如供体抗体)CDR移植到人(例如受体抗体)架构和恒定区上，所述架构和恒定区有或没有保留关键架构残基(例如对于保持良好的抗原结合亲和力或抗体功能来说重要的关键架构残基)，(b)仅将非人特异性决定区(SDR或a-CDR；对抗体-抗原相互作用至关重要的残基)移植到人架构和恒定区上，或者(c)移植整个非人可变结构域，但通过替换表面残基而用人样区段“隐藏”它们。人源化抗体及其制备方法在例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)中综述，并且进一步描述于例如Riechmann等人，Nature 332:323-329(1988)；Queen等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA86:10029-10033(1989)；美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Kashmiri等人，Methods 36:25-34(2005)(描述了特异性决定区(SDR)移植)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述了“表面再塑”)；Dall’Acqua等人，Methods 36:43-60(2005)(描述了“FR改组”)；以及Osbourn等人，Methods 36:61-68(2005)和Klimka等人，Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述了用于FR改组的“指导选择”方法)中。可用于人源化的人架构区包括但不限于：使用“最佳匹配”方法选择的架构区(参见例如Sims等人，J.Immunol.151:2296(1993))；来源于具有轻链或重链可变区的特定子组的人抗体的共有序列的架构区(参见例如Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；以及Presta等人，J.Immunol.,151:2623(1993))；人成熟(体细胞突变)架构区或人类种系架构区(参见例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；以及来源于筛选FR文库的架构区(参见例如Baca等人，J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)和Rosok等人，J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。
可以使用本领域已知的各种技术来产生人抗体。人抗体一般描述于van Dijk和van de Winkel,Curr Opin Pharmacol 5,368-74(2001)和Lonberg,Curr Opin Immunol20,450-459(2008)中。可以通过以下方式来制备人抗体：将免疫原施用于转基因动物，所述转基因动物已被修饰以响应于抗原激发而产生具有人可变区的完整人抗体或完整抗体。此类动物通常含有全部或部分人免疫球蛋白基因座，所述全部或部分人免疫球蛋白基因座替代内源性免疫球蛋白基因座，或者在动物的染色体外存在或随机整合至动物的染色体中。在此类转基因小鼠中，内源性免疫球蛋白基因座通常已被灭活。关于从转基因动物获得人抗体的方法的综述，参见Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。还参见例如描述XENOMOUSETM技术的美国专利号6,075,181和6,150,584；描述
Figure BDA0003446097740000581
技术的美国专利号5,770,429；描述K-M
Figure BDA0003446097740000582
技术的美国专利号7,041,870，以及描述
Figure BDA0003446097740000583
技术的美国专利申请公开号US 2007/0061900)。可以进一步修饰来自由此类动物产生的完整抗体的人可变区，例如通过与不同的人恒定区组合。
人抗体也可以通过基于杂交瘤的方法制备。已经描述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人杂交骨髓瘤细胞系。(参见例如Kozbor J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；以及Boerner等人，J.Immunol.,147:86(1991)。)经由人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体也描述于Li等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)中。另外的方法包括例如在美国专利号7,189,826(描述了从杂交瘤细胞系产生单克隆人IgM抗体)和Ni,Xiandai Mianyixue,26(4):265-268(2006)(描述了人-人杂交瘤)中描述的那些方法。人类杂交瘤技术(Trioma技术)也描述于Vollmers和Brandlein,Histology and Histopathology,20(3):927-937(2005)和Vollmers和Brandlein,Methods and Findings in Experimental and ClinicalPharmacology,27(3):185-91(2005)中。
如本文所述，还可以通过从人抗体文库中分离来产生人抗体。
可以通过筛选组合文库中具有一种或多种所需活性的抗体来分离可用于本发明的抗体。用于筛选组合文库的方法综述于例如Lerner等人，Nature Reviews 16:498-508(2016)中。例如，本领域已知多种方法用于产生噬菌体展示文库并筛选此类文库以获得具有所需结合特征的抗体。此类方法综述于例如Frenzel等人，mAbs 8:1177-1194(2016)；Bazan等人，Human Vaccines and Immunotherapeutics 8:1817-1828(2012)和Zhao等人，Critical Reviews in Biotechnology 36:276-289(2016)中，以及Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology 178:1-37(O’Brien等人编辑，Human Press,Totowa,NJ,2001)中和Marks和Bradbury,Methods in Molecular Biology 248:161-175(Lo编辑，Human Press,Totowa,NJ,2003)中。
在某些噬菌体展示方法中，将VH和VL基因的所有组成成分通过聚合酶链式反应(PCR)单独克隆，并在噬菌体文库中随机重组，然后可以从所述噬菌体文库中筛选抗原结合噬菌体，如在Winter等人，Annual Review of Immunology 12:433-455(1994)中所描述的。噬菌体通常将抗体片段展示为单链Fv(scFv)片段或Fab片段。来自经免疫的来源的文库提供针对免疫原的高亲和力抗体，而无需构建杂交瘤。或者，可以克隆所有天然组成成分(例如，来自人的所有天然组成成分)以提供针对广泛的非自身抗原和自身抗原的抗体的单一来源，而无需任何免疫，如由Griffiths等人在EMBO Journal 12:725-734(1993)中所描述的。最后，还通过以下方式来合成天然文库：克隆来自干细胞的未重排的V基因区段；以及使用含有随机序列的PCR引物来编码高度可变的CDR3区并完成体外重排，如由Hoogenboom和Winter在Journal of Molecular Biology 227:381-388(1992)中所描述的。描述人抗体噬菌体文库的专利出版物包括，例如：美国专利号5,750,373；7,985,840；7,785,903和8,679,490以及美国专利公开号2005/0079574、2007/0117126、2007/0237764和2007/0292936。本领域已知用于筛选具有一种或多种所需活性的抗体的组合文库的方法的其他实例包括核糖体和mRNA展示，以及对细菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞或酵母细胞进行抗体展示和选择的方法。用于酵母表面展示的方法综述于例如Scholler等人，Methods in MolecularBiology 503:135-56(2012)和Cherf等人，Methods in Molecular biology 1319:155-175(2015)以及Zhao等人，Methods in Molecular Biology 889:73-84(2012)中。用于核糖体展示的方法描述于例如He等人，Nucleic Acids Research 25:5132-5134(1997)和Hanes等人，PNAS 94:4937-4942(1997)中。
可能需要对本发明的免疫缀合物进行进一步的化学修饰。例如，通过与基本上直链的聚合物(例如聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG))缀合，可以改善免疫原性和短半衰期的问题(参见例如WO 87/00056)。
如本文所述制备的免疫缀合物可通过本领域已知的技术纯化，所述技术为诸如高效液相色谱、离子交换色谱、凝胶电泳、亲和色谱、尺寸排阻色谱等。用于纯化特定蛋白质的实际条件将部分取决于诸如净电荷、疏水性、亲水性等因素，并且对于本领域技术人员而言将是显而易见的。对于亲和色谱纯化，可以使用与免疫缀合物结合的抗体、配体、受体或抗原。例如，可以使用特异性结合IL-2多肽突变体的抗体。对于本发明免疫缀合物的亲和色谱纯化，可以使用具有蛋白A或蛋白G的基质。例如，基本上如实例中所述，可使用顺序蛋白A或G亲和色谱和尺寸排阻色谱来分离免疫缀合物。免疫缀合物的纯度可以通过各种熟知的分析方法中的任何一种来确定，所述各种熟知的分析方法包括凝胶电泳、高压液相色谱等。
组合物、配方和施用途径
在另一方面，本发明提供包含如本文所述的免疫缀合物的药物组合物，所述药物组合物例如用于任何以下治疗方法。在一个实施例中，药物组合物包含本文提供的任何免疫缀合物，以及药用载体。在另一个实施例中，药物组合物包含本文提供的任何免疫缀合物，以及至少一种另外的治疗剂，例如如下所述。
还提供了一种以适于体内施用的形式产生本发明的免疫缀合物的方法，该方法包括(a)获得根据本发明的免疫缀合物，以及(b)用至少一种药用载体配制该免疫缀合物，由此配制免疫缀合物制剂以用于体内施用。
本发明的药物组合物包含溶解或分散在药用载体中的治疗有效量的免疫缀合物。术语“药学上或药理学上可接受的”是指分子实体和组合物在所采用的剂量和浓度下通常对接受者无毒，即当视情况而定施用于动物(例如人)时不产生不利的、过敏的或其他不良反应。根据本公开内容，含有免疫缀合物和任选的另外的活性成分的药物组合物的制备将对本领域技术人员而言是已知的，如由Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack Printing Company,1990例示的，该文献以引用方式并入本文。此外，对于动物(例如，人)施用，应理解制备物应满足FDA生物标准办公室或其他国家/地区相应当局所要求的无菌性、产热原性、一般安全性和纯度标准。优选的组合物是冻干制剂或水溶液。如本文所使用的，“药用载体”包括任何和所有的溶剂、缓冲液、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗细菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、抗氧化剂、蛋白质、药物、药物稳定剂、聚合物、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料，类似物质以及它们的组合，如本领域普通技术人员应已知的(参见例如Remington'sPharmaceutical Sciences，第18版，Mack Printing Company,1990，第1289-1329页，该文献以引用方式并入本文)。除了任何常规载体与活性成分不相容的情况之外，所述载体在治疗或药物组合物中的用途是可预期的。
本发明的免疫缀合物(和任何另外的治疗剂)可以通过任何合适的方式施用，包括肠胃外、肺内和鼻内，并且如果需要的话用于局部治疗、病灶内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。投配可以通过任何合适的途径进行，例如通过注射，诸如静脉内或皮下注射，部分取决于施用是短暂的还是长期的。
肠胃外组合物包括设计用于通过注射(例如，皮下、皮内、病灶内、静脉内、动脉内、肌内、鞘内或腹膜内注射)施用的那些组合物。对于注射，本发明的免疫缀合物可以在水溶液中配制，优选在生理上相容的缓冲液(诸如Hanks溶液、Ringer溶液或生理盐水缓冲液)中配制。溶液可含有配制剂(formulatory agent)，诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，免疫缀合物可以是粉末形式，以用于在使用前用合适的媒介物(例如无菌无热原水)重构。通过根据需要将本发明的免疫缀合物以所需的量与下面列举的各种其他成分一起掺入适当的溶剂中来制备无菌可注射溶液。例如，无菌可以通过无菌过滤膜过滤而容易地实现。通常，通过将各种灭菌的活性成分掺入含有基础分散培养基和/或其他成分的无菌媒介物中来制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液、悬浮液或乳液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥或冻干技术，所述真空干燥或冻干技术产生来自先前无菌过滤的液体培养基的活性成分加上任何附加所需成分的粉末。如果需要的话，液体培养基应适当缓冲，并且在注射之前应首先使用足够的盐水或葡萄糖来使液体稀释剂等渗。该组合物必须是在制造和贮存条件下稳定的，并且保存为抗诸如细菌和真菌等微生物的污染作用。应当理解，内毒素污染应以例如低于0.5ng/mg蛋白质的安全水平保持最低。合适的药用载体包括但不限于：缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六烃季铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，诸如钠；金属络合物(例如锌蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇(PEG)。水性注射悬浮液可含有增加悬浮液粘度的化合物，诸如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇、葡聚糖等。任选地，悬浮液还可含有合适的稳定剂或增大化合物溶解度的试剂，以允许制备高浓度溶液。另外，活性化合物的悬浮液可以制备成适当的油性注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油，诸如芝麻油；或合成脂肪酸酯，诸如油酸乙酯或甘油三酯；或脂质体。
活性成分可以包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合而制备的微胶囊(例如分别为羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中；在胶体药物递送***(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)中；或在粗乳液中。此类技术在Remington's Pharmaceutical Sciences(第18版，Mack Printing Company,1990)中公开。可以制备缓释制备物。缓释制备物的合适示例包括含有多肽的固态疏水聚合物的半透性基质，所述基质是例如膜或微胶囊等成型制品的形式。在特定实施例中，可注射组合物的延长吸收可以通过在所述组合物中使用延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝、明胶或它们的组合)来实现。
除了先前描述的组合物之外，免疫缀合物还可以配制成贮库制剂。此类长效制剂可以通过植入(例如皮下或肌内植入)或通过肌内注射施用。因此，例如，免疫缀合物可以用合适的聚合或疏水材料配制(例如作为可接受油中的乳液)或用离子交换树脂配制，或配制为微溶的衍生物，例如配制为微溶盐。
包含本发明免疫缀合物的药物组合物可通过常规混合、溶解、乳化、包封、包埋或冻干的手段制备。药物组合物可以使用一种或多种生理上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或助剂以常规方式配制，所述载体、稀释剂、赋形剂或助剂有助于将蛋白质加工成可以在药学上使用的制备物。适当的配方取决于所选择的施用途径。
免疫缀合物可以配制成游离酸或碱、中性或盐形式的组合物。药用盐是基本上保留游离酸或游离碱的生物活性的盐。这些药用盐包括酸加成盐，例如与蛋白质组合物的游离氨基形成的酸加成盐，或与无机酸(诸如盐酸或磷酸)或有机酸(如乙酸、草酸、酒石酸或扁桃酸)形成的酸加成盐。用游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱，诸如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁；或者有机碱，诸如异丙胺、三甲胺、组氨酸或普鲁卡因。与相应的游离碱形式相比，药用盐倾向于更易溶于水性和其他质子溶剂中。
治疗方法和组合物
本文提供的任何免疫缀合物可用于治疗方法。本发明的免疫缀合物可用作免疫治疗剂，例如用于治疗癌症。
为了用于治疗方法中，本发明的免疫缀合物将以符合良好医学实践的方式配制、投配和施用。在这种情况下需要考虑的因素包括所治疗的特定疾患、所治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床病症、疾患的原因、药剂的递送部位、施用方法、施用的时间安排，以及执业医师已知的其他因素。
本发明的免疫缀合物可特别用于治疗对宿主免疫***的刺激是有益的疾病状态，特别是需要增强的细胞免疫应答的疾病。这些疾病状态可包括宿主免疫应答不足或缺乏的疾病状态。可以施用本发明的免疫缀合物的疾病状态包括例如细胞免疫应答应是特异性免疫的关键机制的肿瘤或感染。本发明的免疫缀合物可以本身或在任何合适的药物组合物中施用。
在一个方面，将本发明的免疫缀合物提供为用作药物。在其他方面，将本发明的免疫缀合物提供为用于治疗疾病。在某些实施例中，提供了用于治疗方法的本发明的免疫缀合物。在一个实施例中，本发明提供如本文所述的免疫缀合物，以用于治疗有需要的个体的疾病。在某些实施例中，本发明提供免疫缀合物以用于治疗患有疾病的个体的方法中，该方法包括向所述个体施用治疗有效量的所述免疫缀合物。在某些实施例中，待治疗的疾病是增殖性疾病。在一个特定实施例中，所述疾病是癌症。在某些实施例中，该方法还包括向个体施用治疗有效量的至少一种另外的治疗剂，例如如果待治疗的疾病是癌症，则使用抗癌剂。在其他实施例中，本发明提供免疫缀合物以用于刺激免疫***。在某些实施例中，本发明提供免疫缀合物以用于刺激个体的免疫***的方法中，所述方法包括向所述个体施用有效量的所述免疫缀合物以刺激免疫***。根据任何上述实施例的“个体”是哺乳动物，优选人。根据任何上述实施例的“对免疫***的刺激”可以包括以下项中的任何一种或多种：免疫功能的普遍增强、T细胞功能的增强，B细胞功能的增强、淋巴细胞功能的恢复、IL-2受体表达的增多、T细胞反应性的增强，自然杀伤细胞活性或淋巴因子活化杀伤(LAK)细胞活性的增强，等等。
在另一方面，本发明提供了本发明的免疫缀合物在制造或制备药物中的用途。在一个实施例中，所述药物用于治疗有此需要的个体的疾病。在一个实施例中，所述药物用于治疗疾病的方法中，所述方法包括向具有所述疾病的个体施用治疗有效量的所述药物。在某些实施例中，待治疗的疾病是增殖性疾病。在一个特定实施例中，所述疾病是癌症。在一个实施例中，该方法还包括向个体施用治疗有效量的至少一种另外的治疗剂，例如如果待治疗的疾病是癌症，则使用抗癌剂。在另一实施例中，所述药物用于刺激免疫***。在另一实施例中，所述药物用于刺激个体的免疫***的方法中，所述方法包括向所述个体施用有效量的所述药物以刺激免疫***。根据上述实施例中的任一实施例的“个体”可以是哺乳动物，优选地是人。根据任何上述实施例的“对免疫***的刺激”可以包括以下项中的任何一种或多种：免疫功能的普遍增强、T细胞功能的增强，B细胞功能的增强、淋巴细胞功能的恢复、IL-2受体表达的增多、T细胞反应性的增强，自然杀伤细胞活性或淋巴因子活化杀伤(LAK)细胞活性的增强，等等。
在另一方面，本发明提供了治疗个体疾病的方法。在一个实施例中，所述方法包括向患有这种疾病的个体施用治疗有效量的本发明的免疫缀合物。在一个实施例中，向所述个体施用组合物，所述组合物包含药用形式的本发明的免疫缀合物。在某些实施例中，待治疗的疾病是增殖性疾病。在一个特定实施例中，所述疾病是癌症。在某些实施例中，该方法还包括向个体施用治疗有效量的至少一种另外的治疗剂，例如如果待治疗的疾病是癌症，则使用抗癌剂。在另一方面，本发明提供了刺激个体的免疫***的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的免疫缀合物以刺激免疫***。根据上述实施例中的任一实施例的“个体”可以是哺乳动物，优选地是人。根据任何上述实施例的“对免疫***的刺激”可以包括以下项中的任何一种或多种：免疫功能的普遍增强、T细胞功能的增强，B细胞功能的增强、淋巴细胞功能的恢复、IL-2受体表达的增多、T细胞反应性的增强，自然杀伤细胞活性或淋巴因子活化杀伤(LAK)细胞活性的增强，等等。
在某些实施例中，待治疗的疾病是增殖性疾病，特定是癌症。癌症的非限制性实例包括膀胱癌、脑癌、头颈癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、***、子宫内膜癌、食道癌、结肠癌、结直肠癌、直肠癌、胃癌、***癌、血癌、皮肤癌、鳞状细胞癌、骨癌，以及肾癌。可以使用本发明的免疫缀合物治疗的其他细胞增殖病症包括但不限于位于以下部位中的肿瘤：腹部、骨骼、***、消化***、肝脏、胰腺、腹膜、内分泌腺(肾上腺、甲状旁腺、垂体、睾丸、卵巢、胸腺、甲状腺)、眼睛、头颈部、神经***(中枢和外周神经***)、淋巴***、骨盆、皮肤、软组织、脾脏、胸部，以及泌尿生殖***。还包括癌前病症或病变和癌转移。在某些实施例中，癌症选自由以下项组成的组：肾癌、皮肤癌、肺癌、结直肠癌、乳腺癌、脑癌、头颈癌、***癌和膀胱癌。技术人员容易认识到，在许多情况下，免疫缀合物可能不提供治愈，而可能仅提供部分益处。在一些实施例中，具有一些益处的生理变化也被认为是治疗上有益的。因此，在一些实施例中，提供生理变化的免疫缀合物的量被认为是“有效量”或“治疗有效量”。需要治疗的受试者、患者或个体通常是哺乳动物，更特别地是人。
在一些实施例中，将有效量的本发明的免疫缀合物施用于细胞。在其他实施例中，将治疗有效量的本发明的免疫缀合物施用于个体以治疗疾病。
为预防或治疗疾病，本发明的免疫缀合物的适当剂量(当单独使用或与一种或多种其他另外的治疗剂组合使用时)将取决于待治疗的疾病类型、施用途径、患者的体重、分子的类型(例如包含或不包含Fc结构域)、疾病的严重程度和病程、免疫缀合物是施用用于预防目的还是治疗目的、既往或同时进行的治疗干预、患者的临床病史和对免疫缀合物的反应，以及主治医师的判断。在任何情况下，负责施用的执业者将针对个体受试者来确定组合物中活性成分的浓度和适当剂量。本文考虑了各种投配时间安排，包括但不限于在各个时间点处的单次或多次施用、推注施用，以及脉冲输注。
免疫缀合物适当地一次或在一系列治疗中施用于患者。根据疾病的类型和严重程度，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)的免疫缀合物可以是用于施用于患者的初始候选剂量，无论是例如通过一次或多次单独的施用，还是通过连续输注。取决于上述因素，一种典型的日剂量的范围可以为约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于数天或更长时间的重复施用，取决于病症，治疗通常会持续直至发生所需的疾病症状抑制。免疫缀合物的一个示例性剂量应在约0.005mg/kg至约10mg/kg的范围内。在其他非限制性实例中，剂量还可包括每次施用约1微克/kg/体重、约5微克/kg/体重、约10微克/kg/体重、约50微克/kg/体重、约100微克/kg/体重、约200微克/kg/体重、约350微克/kg/体重、约500微克/kg/体重、约1毫克/kg/体重、约5毫克/kg/体重、约10毫克/kg/体重、约50毫克/kg/体重、约100毫克/kg/体重、约200毫克/kg/体重、约350毫克/kg/体重、约500毫克/kg/体重，至约1000mg/kg/体重或更多，以及从其中推导出的任何范围。在从本文所列数字可推导出的范围的非限制性实例中，约5mg/kg/体重至约100mg/kg/体重、约5微克/kg/体重至约500毫克/kg/体重等的范围可以基于上述数值施用。因此，可以向患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、5.0mg/kg或10mg/kg(或它们的任何组合)的一个或多个(一种或多种)剂量。此类剂量可以间歇施用，例如每周或每三周施用(例如，使得患者接受约两次至约二十次，或例如约六次剂量的免疫缀合物)。可施用初始较高负荷剂量，然后施用一种或多种较低剂量。然而，其他剂量方案可能有用。通过常规技术和测定可以容易地监测该疗法的进展。
本发明的免疫缀合物将通常以有效实现预期目的的量使用。为用于治疗或预防病症，将本发明的免疫缀合物或其药物组合物以治疗有效量施用或施加。治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内，特别是根据本文提供的详细公开内容。
对于全身施用，治疗有效剂量可以最初根据体外测定(诸如细胞培养物测定)来进行估计。可以随后在动物模型中配制剂量，以实现包括如在细胞培养中测定的IC50循环浓度范围。此类信息可用于更准确地确定对人类的有用剂量。
初始剂量也可以使用本领域公知的技术，根据体内数据(例如动物模型)来估计。本领域的普通技术人员可以基于动物数据来容易地优化对人的施用。
可以单独地调节剂量的量和间隔，以提供足以维持治疗效果的免疫缀合物的血浆水平。通过注射施用的常用患者剂量的范围是约0.1至50mg/kg/天，通常约0.5至1mg/kg/天。通过每天施用多个剂量可以实现治疗有效的血浆水平。可以例如通过HPLC来测量血浆中的水平。
在局部施用或选择性摄取的情况下，免疫缀合物的有效局部浓度可能与血浆浓度无关。本领域技术人员将能够在无需过多实验的情况下优化治疗有效的局部剂量。
本文所述的治疗有效剂量的免疫缀合物将通常在不会引起实质毒性的情况下提供治疗益处。免疫缀合物的毒性和治疗功效可通过标准药学方法在细胞培养或实验动物中测定。细胞培养测定和动物研究可以用于测定LD50(致死群体的50％的剂量)和ED50(在群体的50％中治疗有效的剂量)。毒性和疗效之间的剂量比是治疗指数，所述治疗指数可以表示为比率LD50/ED50。表现出大治疗指数的免疫缀合物是优选的。在一个实施例中，根据本发明的免疫缀合物表现出高治疗指数。从细胞培养测定和动物研究获得的数据可用于配制适用于人类的一系列剂量。剂量优选在包括几乎没有毒性或没有毒性的ED50的循环浓度的范围内。剂量可以取决于多种因素而在该范围内变化，所述多种因素为例如所采用的剂型、所利用的施用途径、受试者的病症等。确切的配方、施用途径和剂量可以由个体医师根据患者的状况进行选择。(参见例如Fingl等人，1975，在：The Pharmacological Basis ofTherapeutics，第1章，第1页中，该文献的全部内容以引用方式并入本文中)。
用本发明的免疫缀合物治疗的患者的主治医师应知道由于毒性、器官功能障碍等而如何以及何时终止、中断或调节施用。相反地，如果临床应答(response，反应)不充分(排除毒性)，则主治医师也会知道将治疗调节到更高水平。在目标疾患的管理中施用的剂量的大小将随着待治疗病症的严重程度、施用途径等而变化。例如，可以部分地通过标准预后评估方法来评估病症的严重性。此外，剂量和可能的剂量频率也将根据个体患者的年龄、体重和应答而变化。
包含如本文所述的IL-2多肽突变体的免疫缀合物的最大治疗剂量可以相对于用于包含野生型IL-2的免疫缀合物的最大治疗剂量增长。
其他药剂和治疗
根据本发明的免疫缀合物可以与治疗中的一种或多种其他药剂组合施用。例如，本发明的免疫缀合物可与至少一种另外的治疗剂共同施用。术语“治疗剂”包括被施用以治疗需要这种治疗的个体的症状或疾病的任何药剂。此类附加治疗剂可包含适合于所治疗的具体适应症的任何活性成分，优选地是具有不会彼此不利地影响的互补活性的活性成分。在某些实施例中，另外的治疗剂是免疫调节剂、细胞生长抑制剂、细胞粘附抑制剂、细胞毒性剂、细胞凋亡激活剂，或增加细胞对凋亡诱导剂的敏感性的试剂。在一个特定实施例中，另外的治疗剂是抗癌剂，例如微管破坏剂、抗代谢物、拓扑异构酶抑制剂、DNA嵌入剂、烷化剂、激素疗法、激酶抑制剂、受体拮抗剂、肿瘤细胞凋亡活化剂，或抗血管生成剂。
此类其他药剂适当地以对预期目的有效的量组合存在。此类其他药剂的有效量取决于所用免疫缀合物的量、病症或治疗的类型，以及上面讨论的其他因素。免疫缀合物通常以与本文所述相同的剂量和施用途径使用，或以本文所述剂量的约1％至99％使用，或以经验地/临床上确定为合适的任何剂量和任何途径使用。
上述此类组合疗法包括联合施用(其中两种或更多种治疗剂包括在相同或不同的组合物中)和单独施用，在单独施用的情况下，本发明的免疫缀合物的施用可以在施用另外的治疗剂和/或佐剂之前、同时和/或之后进行。本发明的免疫缀合物也可以与放射疗法组合使用。
制品
在本发明的另一方面中，提供了一种制品，其含有可用于治疗、预防和/或诊断上述疾患的物质。该制品包括容器和在所述容器上或与所述容器相关的标签或包装插页(package insert)。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、静脉注射(IV)溶液袋等。所述容器可以由诸如玻璃或塑料等多种材料形成。所述容器容纳组合物，该组合物本身或与另一种组合物组合能够有效地用于治疗、预防和/或诊断病症，并且所述容器可以具有无菌进入口(例如，所述容器可以是具有能够被皮下注射针刺穿的塞子的静脉注射溶液袋或小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是本发明的免疫缀合物。标签或包装插页指示该组合物用于治疗所选择的病症。此外，制品可包括(a)第一容器，所述第一容器中含有组合物，其中所述组合物包含本发明的免疫缀合物；以及(b)第二容器，所述第二容器中含有组合物，其中所述组合物包含另外的细胞毒性剂或其他治疗剂。本发明的该实施例中的制品可进一步包含包装插页，所述包装插页指示组合物可用于治疗特定病症。可替代地或另外地，制品还可包括第二(或第三)容器，该二(或第三)容器包括药用缓冲液，诸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。制品还可以包括从商业和用户角度所需的其他物质，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头和注射器。
氨基酸序列
Figure BDA0003446097740000701
Figure BDA0003446097740000711
Figure BDA0003446097740000721
Figure BDA0003446097740000731
实例
以下是本发明的方法和组合物的实例。应当理解，在给出以上提供的一般描述的情况下，可以实践各种其他实施例。
实例1
实例1.1产生靶向人CD8的抗CD8-IL2v TA缀合物和抗CD8-IL2v OA缀合物
缩写“TA”在本文中表示“双臂”。缩写“OA”在本文中表示“单臂”。术语“抗CD8-IL2vTA”和“CD8-IL2v TA”在本文中可互换使用。术语“抗CD8-IL2v OA”和“CD8-IL2v OA”在本文中可互换使用。
所有基因的表达都受人CMV启动子-内含子A-5'UTR盒的控制。BGH聚腺苷酸化信号位于基因的下游。为了在HEK293 EBNA细胞中使用，载体包含用于质粒的稳定附加体维持的oriP元件(element，要素)。
实例1.2在HEK293 EBNA细胞中产生IgG样蛋白
通过瞬时转染HEK293 EBNA细胞来产生IgG-IL2分子。对于抗CD8-IL2v TA，用以下比例的对应表达载体来转染细胞：1:1:2(“载体重链(VH-CH1-CH2-CH3)”:“载体重链(VH-CH1-CH2-CH3-IL2v)”:“载体轻链(VL-CL)”)。对于抗CD8-IL2v OA，用以下比例的对应表达载体来转染细胞：1:1:1比(“载体重链(VH-CH1-CH2-CH3)”:“载体重链(CH2-CH3-IL2v)”:“载体轻链(VL-CL)”)。对细胞进行离心，然后用经过预热的CD CHO培养基(Thermo Fisher，目录号10743029)代替原培养基。将表达载体在CD CHO培养基中混合，加入PEI(聚乙烯亚胺，Polysciences，Inc，目录号23966-1)，将溶液涡旋混合，并且在室温下孵育10分钟。然后，将细胞(2Mio/ml)与载体/PEI溶液混合，将其转移至烧瓶中，并且置于振荡培养箱中，在5％CO2的气氛下于37℃下孵育3小时。孵育后，加入含有补充剂(占总体积的80％)的Excell培养基(W.Zhou和A.Kantardjieff，Mammalian Cell Cultures for BiologicsManufacturing，DOI：10.1007/978-3-642-54050-9；2014)。转染后1天，加入补充剂(饲料，占总体积的12％)。7天后，通过离心和随后的过滤(0.2μm过滤器)收获细胞上清液，并且使用如下所示的标准方法从收获的上清液中纯化蛋白质。
实例1.3 IgG样蛋白的纯化
参照标准方案从过滤的细胞培养物上清液中纯化蛋白。简言之，利用Protein A亲和色谱法(平衡缓冲液：20mM柠檬酸钠，20mM磷酸钠，pH 7.5；洗脱缓冲液：20mM柠檬酸钠、100mM NaCl、100mM甘氨酸pH 3.0)。在pH 3.0下实现洗脱，随后立即中和样品的pH。通过离心(Millipore
Figure BDA0003446097740000741
ULTRA-15(Art.Nr.:UFC903096)浓缩蛋白质，然后利用尺寸排阻色谱法在20mM组氨酸、140mM氯化钠(pH 6.0)中将聚集蛋白质与单体蛋白质分离。
实例1.4 IgG样蛋白的分析
通过测量280nm处的吸光度来测定纯化的蛋白质的浓度，其中根据Pace等人(Protein Science,1995,4,2411-1423)所述的方法，使用基于氨基酸序列计算得出的质量消光系数。在存在和不存在还原剂的情况下，使用LabChipGXII(Perkin Elmer)，通过CE-SDS分析蛋白质的纯度和分子量。通过HPLC色谱法在25℃下如下进行聚集体含量的测定：使用分析型尺寸排阻色谱柱(TSKgel G3000 SW XL或UP-SW3000)，在运行缓冲液(分别为25mMK2HPO4、125mM NaCl、200mM L-精氨酸单盐酸盐(pH 6.7)或200mM KH2PO4、250mM KCl(pH6.2))中平衡。
以可比较的且良好的质量纯化两种IgG-IL2v构建体，通过尺寸排阻色谱法确定的单体含量高于98％。主峰百分比(由CE-SDS确定)高于92％。纯化后的产率(以mg为单位的纯化量除以以L为单位产生的上清液体积)对于抗CD8-IL2v TA为2.1mg/L，且对于抗CD8-IL2vOA为7.8mg/L。
抗CD8-IL2v TA由具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的两个多肽、具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的一个多肽和具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的一个多肽组成(形式：A2HK)。抗CD8-IL2v OA由具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的一个多肽、具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的一个多肽和具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的一个多肽组成(形式：AHK)。
抗CD8(OKT8.v11)-IL2v TA由具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的两个多肽、具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的一个多肽和具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的一个多肽组成(形式：A2HK)。术语“抗CD8(OKT8.v11)-IL2v TA”、“抗CD8-IL2v OKT8.v11 TA”和“CD8-IL2v OKT8.v11 TA”在本文中可互换使用。抗CD8(OKT8.v11)-IL2v OA由具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的一个多肽、具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的一个多肽和具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的一个多肽组成(形式：AHK)。术语“抗CD8(OKT8.v11)-IL2v OA”、“抗CD8-IL2v OKT8.v11 OA”和“CD8-IL2v OKT8.v11 OA”在本文中可互换使用。
本实例中制备的缀合物进一步用于以下实例中。
实例2
抗CD8-IL2v TA和抗CD8-IL2v OA与CD8 T细胞的结合
对来自健康供体的新鲜分离的PBMC进行计数并转移到96孔圆底板中(每孔100,000个细胞)。将细胞用FACS缓冲液(PBS、2％FBS、5mM EDTA、0.025％NaN3)洗涤，并用30μl的指定分子在FACS缓冲液中在4℃下染色30分钟。用FACS缓冲液洗涤细胞两次以移除未结合的分子。然后将20μl稀释的FITC抗人Fc特异性二抗(1:50稀释，109-096-098，JacksonImmunoResearch)与用于检测CD8 T细胞的CD3 PE抗体(344806，BioLegend)和CD8 APC-Cy7抗体(557834，BD Bioscience)一起添加到所述细胞中。在4℃下温育30分钟后，通过用FACS缓冲液洗涤两次来移除未结合的抗体。最后，将细胞重新悬浮在FACS缓冲液中，并使用BDFortessa门控对CD3+CD8+细胞(CD8 T细胞)进行测量。
与FAP-IL2v(例如，如WO2012107417A1中所公开的，其通过引用并入本文；FAP-IL2v包含根据SEQ ID NO:25、26和27的多肽)相比，评估了抗CD8-IL2v TA和抗CD8-IL2v OA分子与PBMC内的CD8 T细胞结合的能力。如图2所示，抗CD8-IL2v TA显示出与CD8 T细胞的结合非常强，抗CD8-IL2v OA与CD8 T细胞的结合较弱，但仍比FAP-IL2v强得多。这与抗CD8-IL2v OA只可以与CD8单价结合，而抗CD8-IL2v TA可以与CD8二价结合，从而导致后者对CD8的亲和力更高的事实一致。IL2v对与CD8 T细胞结合的贡献很小，如FAP-IL2v所见，因为静息CD8 T细胞的IL2Rβ/γ表达与CD8表达相比较低(图2)。
实例3
用抗CD8-IL2v TA和抗CD8-IL2v OA处理后免疫细胞的STAT5磷酸化将来自健康供体的新鲜分离的PBMC接种在温热的培养基(RPMI1640,10％FCS,2mM谷氨酰胺)中，置于96孔圆底板(200,000个细胞/孔)中。将板以300g离心10min并去除上清液。将细胞重新悬浮在100μl含IL2v缀合物的培养基中并在37℃下刺激20min。为了保持磷酸化状态，在刺激后立即将细胞用等量的预热的Cytofix缓冲液(554655,BD Bioscience)在37℃下固定10min。然后将板以300g离心10min并去除上清液。为了允许细胞内染色，将细胞在200μl PhosflowPerm缓冲液III(558050,BD Bioscience)中在4℃下透化30min。然后将细胞用150μl冷FACS缓冲液洗涤两次，并分离到两个96孔圆底板中，并各自用20μl的抗体混合物I或II在冰箱中染色60min。使用抗体混合物I来染色CD4 T细胞和调节性T细胞中的pSTAT5，并且使用抗体混合物II来染色CD8 T细胞和NK细胞中的pSTAT5。然后将细胞用FACS缓冲液洗涤两次，并每孔重悬于含有2％PFA的200μl FACS缓冲液中。使用BD Fortessa流式细胞仪门控对CD8 T细胞(CD3+CD8+)、NK细胞(CD3-CD56+、CD4 T细胞(CD4+)和Tregs(CD4+CD25+FoxP3+)执行分析。
表1.FACS抗体混合物I(CD4 T细胞和调节性T细胞)
Figure BDA0003446097740000771
表2.FACS抗体混合物II(CD8 T细胞和NK细胞)
Figure BDA0003446097740000772
将抗CD8-IL2v TA和抗CD8-IL2v OA诱导STAT5磷酸化的功能活性与FAP-IL2v对PBMC内的不同免疫细胞亚群的功能活性进行比较。STAT5磷酸化用作IL2受体(IL2R)活化的标志物。如图3所示，在CD4 T细胞和调节性T细胞(Treg)上，所有三种测试分子在诱导STAT5磷酸化方面具有相同的活性。在CD8 T细胞上，抗CD8-IL2v TA和抗CD8-IL2v OA在诱导STAT5磷酸化方面具有更高的效力，而抗CD8-IL2v TA的效力略强于抗CD8-IL2v OA。在NK细胞上，抗CD8-IL2v TA和抗CD8-IL2v OA的效力比FAP-IL2v稍强，可能是因为NK细胞的一部分对CD8呈阳性。这些数据表明，将IL2v靶向CD8 T细胞可以经由IL2v强烈增强IL2R的活化，并且这种效果仅以顺式介导，因为CD8阴性T细胞上的IL2R活化没有增加(图3)。
实例4
用CD8-IL2v和CD8-IL2v OA治疗后免疫细胞的增殖
来自健康供体的新鲜分离的PBMC用CFSE(5(6)-羧基荧光素二乙酸酯N-琥珀酰亚胺酯，21888，Sigma-Aldrich)来标记。简单地说，3000万个PBMC用PBS洗涤一次。平行地，CSFE储备溶液(2mM在DMSO中)在PBS中按1:20稀释。将PBMC重新悬浮在30ml预热的PBS中，添加30μl CFSE溶液并立即混合细胞。为了最佳标记，将细胞在37℃下温育15分钟。然后添加10ml预热培养基(RPMI1640、10％FCS、1％谷氨酰胺)以停止标记反应。将细胞以400g旋转减慢(spun down，离心)10分钟，然后重新悬浮在20ml新鲜培养基中，并在37℃下再温育30分钟。最后，将细胞用培养基洗涤一次并以每毫升100万个细胞重新悬浮于新鲜培养基中。将标记的PBMC接种在96孔圆底板中(每孔100'000个细胞)，并用指定分子处理5天。温育后，将细胞用FACS缓冲液洗涤一次，并用20μl CD3 APC-Cy7(557834,BD Bioscience)、CD8 APC(克隆SK1、344722、BioLegend)、CD4 PE(300508,BioLegend)和CD56 BV421(318328,BioLegend)在FACS缓冲液中的混合物在4℃下染色30分钟。然后用FACS缓冲液洗涤PBMC两次，然后用在FACS缓冲液中的1％PFA固定它们并用BD Fortessa测量荧光。通过测量CD8 T细胞(CD3+CD8+)、CD4 T细胞(CD3+CD4+)和NK细胞(CD3-CD56+)的CFSE稀释来确定增殖。
与FAP-IL2v相比，测试了CD8-IL2v和CD8-IL2v OA诱导CD8 T细胞、CD4 T细胞和NK细胞增殖的能力。如图4所示，CD8-IL2v TA和CD8-IL2v OA具有与FAP-IL2v相似的诱导CD4T细胞和NK细胞增殖的活性。相比之下，在CD8 T细胞上，这两种分子在诱导增殖方面比FAP-IL2v更有效力，因为这些分子经由CD8直接靶向这些细胞。CD8-IL2v TA的效力高约1300倍，而CD8-IL2v OA的效力高约200倍。这与在CD8 T细胞上观察到的结合和STAT5磷酸化的差异一致。
实例4
用CD8-IL2v TA和CD8-IL2v OKT8.v11 TA处理后免疫细胞的STAT5磷酸化
将来自健康供体的新鲜分离的PBMC接种在温热的培养基(RPMI1640,10％FCS,2mM谷氨酰胺)中，置于96孔圆底板(200,000个细胞/孔)中。将板以300g离心10min并去除上清液。将细胞重新悬浮在100μl含IL2v分子的培养基中并在37℃下刺激20min。为了保持磷酸化状态，在刺激后立即将细胞用等量的预热的Cytofix缓冲液(554655,BD Bioscience)在37℃下固定10min。然后将板以300g离心10min并去除上清液。为了允许细胞内染色，将细胞在200μl Phosflow Perm缓冲液III(558050,BD Bioscience)中在4℃下透化30min。然后将细胞用150μl冷FACS缓冲液洗涤两次，并分离到两个96孔圆底板中，并各自用20μl的抗体混合物I或II在冰箱中染色60min。使用抗体混合物I来染色CD4 T细胞和调节性T细胞中的pSTAT5，并且使用抗体混合物II来染色CD8 T细胞和NK细胞中的pSTAT5。然后将细胞用FACS缓冲液洗涤两次，并每孔重悬于含有2％PFA的200μl FACS缓冲液中。使用BD Fortessa流式细胞仪门控对CD8 T细胞(CD3+CD8+)、NK细胞(CD3-CD56+、CD4 T细胞(CD4+)和Tregs(CD4+CD25+FoxP3+)执行分析。
表3.FACS抗体混合物I(CD4 T细胞和调节性T细胞)
Figure BDA0003446097740000791
Figure BDA0003446097740000801
表4.FACS抗体混合物II(CD8 T细胞和NK细胞)
Figure BDA0003446097740000802
将CD8-IL2v TA和CD8-IL2v OKT8.v11 TA诱导STAT5磷酸化的功能活性与FAP-IL2v对PBMC内的不同免疫细胞亚群的功能活性进行比较。STAT5磷酸化用作IL2受体(IL2R)活化的标志物。在CD4 T细胞和调节性T细胞(Treg)上，所有三种测试分子在诱导STAT5磷酸化方面显示出相同的活性。在CD8 T细胞上，CD8-IL2v TA和CD8-IL2v OKT8.v11 TA在诱导STAT5磷酸化方面表现出更高的效力，但CD8-IL2v TA和CD8-IL2v OKT8.v11 TA之间的活化没有差异。在NK细胞上，CD8-IL2v TA和CD8-IL2v OKT8.v11 TA的效力比FAP-IL2v稍强，可能是因为NK细胞的一部分对CD8呈阳性。这些数据表明，将IL2v靶向CD8 T细胞可以经由IL2v强烈增强IL2R的活化，并且这种效果仅以顺式介导，因为CD8阴性T细胞上的IL2R活化没有增加(图5)。
***
尽管为了清楚理解的目的既往已经通过说明和实例相当详细地描述了发明，但是所述说明和实例不应解释为限制本发明的范围。本文引用的所有专利和科学文献的公开内容的全部内容以引用方式明确地并入。
序列表
<110> 豪夫迈·罗氏有限公司
<120> 免疫缀合物
<130> P35369
<160> 30
<170> PatentIn 版本 3.5
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 1
Asp Thr Tyr Ile His
1 5
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 2
Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Thr Leu Tyr Ala Ser Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 3
Gly Tyr Gly Tyr Tyr Val Phe Asp His
1 5
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 4
Arg Thr Ser Arg Ser Ile Ser Gln Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 5
Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser
1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 6
Gln Gln His Asn Glu Asn Pro Leu Thr
1 5
<210> 7
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 7
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Thr Leu Tyr Ala Ser Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Arg Gly Tyr Gly Tyr Tyr Val Phe Asp His Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 8
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 8
Asp Val Gln Ile Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Arg Ser Ile Ser Gln Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Glu Lys Pro Gly Lys Thr Asn Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Asn Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 9
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 9
Asp Val Gln Ile Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Arg Ser Ile Ser Gln Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Glu Lys Pro Gly Lys Thr Asn Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Asn Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 10
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 10
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Thr Leu Tyr Ala Ser Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Arg Gly Tyr Gly Tyr Tyr Val Phe Asp His Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys
355 360 365
Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 11
<211> 595
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 11
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Thr Leu Tyr Ala Ser Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Arg Gly Tyr Gly Tyr Tyr Val Phe Asp His Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
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Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys
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Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
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Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
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Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
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Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile
565 570 575
Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile Ile Ser
580 585 590
Thr Leu Thr
595
<210> 12
<211> 374
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 12
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
225 230 235 240
Ser Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu
245 250 255
His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr
260 265 270
Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro
275 280 285
Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu
290 295 300
Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe His
305 310 315 320
Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu
325 330 335
Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr
340 345 350
Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser
355 360 365
Ile Ile Ser Thr Leu Thr
370
<210> 13
<211> 133
<212> PRT
<213> 智人
<400> 13
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 14
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 14
Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro Lys
35 40 45
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50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 15
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 15
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 16
<211> 133
<212> PRT
<213> 智人
<400> 16
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
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Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 17
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 17
Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 18
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 18
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 19
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 19
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser
20
<210> 20
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 20
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
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Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 21
<211> 225
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 21
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
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Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
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Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
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Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
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210 215 220
Pro
225
<210> 22
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 22
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
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<210> 23
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 23
Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1 5 10 15
Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe
20 25 30
Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val
35 40 45
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Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser
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His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu
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Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
100 105
<210> 24
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 24
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
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Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
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195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 25
<211> 604
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 25
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp
180 185 190
Pro Ser Gln Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys
210 215 220
Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys
225 230 235 240
Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val
245 250 255
Val Val Ala Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe
260 265 270
Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Lys Pro Arg Glu Glu
275 280 285
Gln Ile Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His
290 295 300
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala
305 310 315 320
Ala Phe Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg
325 330 335
Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met
340 345 350
Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asn Phe Phe Pro
355 360 365
Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn
370 375 380
Tyr Asp Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val
385 390 395 400
Tyr Ser Asp Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr
405 410 415
Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu
420 425 430
Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
435 440 445
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Ser Ser
450 455 460
Ser Thr Ala Glu Ala Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln
465 470 475 480
Gln His Leu Glu Gln Leu Leu Met Asp Leu Gln Glu Leu Leu Ser Arg
485 490 495
Met Glu Asn Tyr Arg Asn Leu Lys Leu Pro Arg Met Leu Thr Ala Lys
500 505 510
Phe Ala Leu Pro Lys Gln Ala Thr Glu Leu Lys Asp Leu Gln Cys Leu
515 520 525
Glu Asp Glu Leu Gly Pro Leu Arg His Val Leu Asp Gly Thr Gln Ser
530 535 540
Lys Ser Phe Gln Leu Glu Asp Ala Glu Asn Phe Ile Ser Asn Ile Arg
545 550 555 560
Val Thr Val Val Lys Leu Lys Gly Ser Asp Asn Thr Phe Glu Cys Gln
565 570 575
Phe Asp Asp Glu Ser Ala Thr Val Val Asp Phe Leu Arg Arg Trp Ile
580 585 590
Ala Phe Ala Gln Ser Ile Ile Ser Thr Ser Pro Gln
595 600
<210> 26
<211> 441
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 26
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp
180 185 190
Pro Ser Gln Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys
210 215 220
Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys
225 230 235 240
Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val
245 250 255
Val Val Ala Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe
260 265 270
Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Lys Pro Arg Glu Glu
275 280 285
Gln Ile Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His
290 295 300
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala
305 310 315 320
Ala Phe Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg
325 330 335
Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Lys Gln Met
340 345 350
Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asn Phe Phe Pro
355 360 365
Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn
370 375 380
Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Lys Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val
385 390 395 400
Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr
405 410 415
Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu
420 425 430
Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
435 440
<210> 27
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 27
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Asn Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala
100 105 110
Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser
115 120 125
Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp
130 135 140
Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val
145 150 155 160
Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser
180 185 190
Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210 215
<210> 28
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 28
Gln Gln Val Asn Glu Phe Pro Pro Thr
1 5
<210> 29
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 29
Asp Val Gln Ile Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Arg Ser Ile Ser Gln Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Glu Lys Pro Gly Lys Thr Asn Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Asn Glu Phe Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 30
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 30
Asp Val Gln Ile Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Arg Ser Ile Ser Gln Tyr
20 25 30
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35 40 45
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Asn Glu Phe Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210

Claims (38)

1.一种免疫缀合物，其包含白细胞介素-2(IL-2)多肽突变体和与CD8结合的抗体，其中所述IL-2多肽是包含氨基酸取代F42A、Y45A和L72G(相对于人IL-2序列SEQ ID NO:13编号)的IL-2多肽突变体。
2.根据权利要求1所述的免疫缀合物，
其中所述IL-2多肽突变体是包含氨基酸取代F42A、Y45A和L72G(相对于人IL-2序列SEQID NO:13编号)的人IL-2分子；并且
其中所述抗体包含：(a)重链可变区(VH)，其包含含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链互补决定区(HCDR)1、含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HCDR 2、含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR 3；和(b)轻链可变区(VL)，其包含含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的轻链互补决定区(LCDR)1、含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR 2和含有SEQ ID NO:6或SEQ IDNO:28的氨基酸序列的LCDR 3。
3.根据权利要求1或2所述的免疫缀合物，其中所述IL-2多肽是IL-2多肽突变体，
其中所述IL-2多肽突变体是包含氨基酸取代F42A、Y45A和L72G(相对于人IL-2序列SEQID NO:13编号)的人IL-2分子；并且
其中所述抗体包含：(a)重链可变区(VH)，其包含与SEQ ID NO:7的氨基酸序列有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；和(b)轻链可变区(VL)，其包含与SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:29的氨基酸序列有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的免疫缀合物，其中所述IL-2多肽突变体进一步包含氨基酸取代T3A和/或氨基酸取代C125A。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的免疫缀合物，其中所述IL-2多肽突变体包含SEQID NO:14的序列。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含不超过一个IL-2多肽突变体。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的免疫缀合物，其中所述抗体包含包括第一亚基和第二亚基的Fc结构域。
8.根据权利要求7所述的免疫缀合物，其中所述Fc结构域是IgG类Fc结构域，特别是IgG1亚类Fc结构域。
9.根据权利要求7或8所述的免疫缀合物，其中所述Fc结构域是人Fc结构域。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的免疫缀合物，其中所述抗体是IgG类免疫球蛋白，特别是IgG1亚类免疫球蛋白。
11.根据权利要求7至10中任一项所述的免疫缀合物，其中所述Fc结构域包含促进所述Fc结构域的所述第一亚基和所述第二亚基的缔合的修饰。
12.根据权利要求7至11中任一项所述的免疫缀合物，其中在所述Fc结构域的所述第一亚基的CH3结构域中，氨基酸残基被具有较大侧链体积的氨基酸残基替换，从而在所述第一亚基的CH3结构域内产生突起，所述突起可定位在所述第二亚基的CH3结构域内的空腔中；并且在所述Fc结构域的所述第二亚基的CH3结构域中，氨基酸残基被具有较小侧链体积的氨基酸残基替换，从而在所述第二亚基的CH3结构域内产生空腔，所述第一亚基的CH3结构域内的所述突起可定位在所述空腔内。
13.根据权利要求9至12中任一项所述的免疫缀合物，其中在所述Fc结构域的所述第一亚基中，位置366处的苏氨酸残基被色氨酸残基替换(T366W)；并且在所述Fc结构域的所述第二亚基中，位置407处的酪氨酸残基被缬氨酸残基替换(Y407V)，并且任选地，位置366处的苏氨酸残基被丝氨酸残基替换(T366S)，且位置368处的亮氨酸残基被丙氨酸残基替换(L368A)(根据Kabat EU索引编号)。
14.根据权利要求13所述的免疫缀合物，其中在所述Fc结构域的所述第一亚基中，另外地，位置354处的丝氨酸残基被半胱氨酸残基替换(S354C)或位置356处的谷氨酸残基被半胱氨酸残基替换(E356C)；并且在所述Fc结构域的所述第二亚基中，另外地，位置349处的酪氨酸残基被半胱氨酸残基替换(Y349C)(根据Kabat EU索引编号)。
15.根据权利要求9至14中任一项所述的免疫缀合物，其中所述IL-2多肽突变体在其氨基末端氨基酸处与所述Fc结构域的所述亚基中的一个亚基的羧基末端氨基酸融合，特别是与所述Fc结构域的所述第一亚基的羧基末端氨基酸融合，任选地通过连接肽进行融合。
16.根据权利要求15所述的免疫缀合物，其中所述连接肽具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
17.根据权利要求9至15中任一项所述的免疫缀合物，其中所述Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代减少与Fc受体，特别是Fcγ受体的结合，和/或降低效应子功能，特别是抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
18.根据权利要求17所述的免疫缀合物，其中所述一个或多个氨基酸取代位于选自L234、L235和P329(Kabat EU索引编号)的组的一个或多个位置处。
19.根据权利要求9至18中任一项所述的免疫缀合物，其中所述Fc结构域的每个亚基包含氨基酸取代L234A、L235A和P329G(Kabat EU索引编号)。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的免疫缀合物，其包含：含有与SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:30的序列有至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的多肽，含有与SEQ ID NO:10的序列有至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的多肽，和含有与SEQ ID NO:11或SEQID NO:12的序列有至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的多肽。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的免疫缀合物，其包含含有SEQ ID NO:9或SEQID NO:30的氨基酸序列的多肽、含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的多肽和含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的多肽。
22.根据权利要求1至20中任一项所述的免疫缀合物，其包含含有SEQ ID NO:9或SEQID NO:30的氨基酸序列的多肽、含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的多肽和含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的多肽。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的免疫缀合物，其基本上由通过连接序列接合的IL-2多肽突变体和IgG1免疫球蛋白分子组成。
24.一种或多种分离的多核苷酸，其编码根据权利要求1至23中任一项所述的免疫缀合物。
25.一种或多种载体，特别是表达载体，所述载体包含根据权利要求24所述的多核苷酸。
26.一种宿主细胞，其包含根据权利要求24所述的多核苷酸或根据权利要求25所述的载体。
27.一种产生包含IL-2多肽突变体和与CD8结合的抗体的免疫缀合物的方法，所述方法包括(a)在适合于表达所述免疫缀合物的条件下培养根据权利要求25所述的宿主细胞，以及任选地(b)回收所述免疫缀合物。
28.一种免疫缀合物，其包含IL-2多肽突变体和与CD8结合的抗体，所述免疫缀合物是通过根据权利要求27所述的方法产生的。
29.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至23或权利要求28中任一项所述的免疫缀合物以及药用载体。
30.根据权利要求1至23或权利要求28中任一项所述的免疫缀合物，其用作药物。
31.根据权利要求1至23或权利要求28中任一项所述的免疫缀合物，其用于治疗疾病。
32.根据权利要求31所述的用于治疗疾病的免疫缀合物，其中所述疾病是癌症。
33.根据权利要求1至23或权利要求28中任一项所述的免疫缀合物在制备用于治疗疾病的药物中的用途。
34.根据权利要求33所述的用途，其中所述疾病是癌症。
35.一种治疗个体的疾病的方法，其包括向所述个体施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含药用形式的根据权利要求1至23或权利要求28中任一项所述的免疫缀合物。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述疾病是癌症。
37.一种刺激个体的免疫***的方法，其包括向所述个体施用有效量的组合物，所述组合物包含药用形式的根据权利要求1至23或权利要求28中任一项所述的免疫缀合物。
38.如前所述的本发明。
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